FI118424B - Nukleiinihappoanalogit ja niiden käyttö diagnostisissa ja analyyttisissä toimenpiteissä - Google Patents

Nukleiinihappoanalogit ja niiden käyttö diagnostisissa ja analyyttisissä toimenpiteissä Download PDF

Info

Publication number
FI118424B
FI118424B FI935208A FI935208A FI118424B FI 118424 B FI118424 B FI 118424B FI 935208 A FI935208 A FI 935208A FI 935208 A FI935208 A FI 935208A FI 118424 B FI118424 B FI 118424B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
nucleic acid
analogue
hydrogen
pna
acid analogue
Prior art date
Application number
FI935208A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI935208A0 (fi
FI935208A (fi
Inventor
Michael Egholm
Peter Eigil Nielsen
Rolf Henrik Berg
Ole Buchardt
Original Assignee
Michael Egholm
Peter Eigil Nielsen
Berg Rolf H
Buchardt Dorte
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27220741&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI118424(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from DK98691A external-priority patent/DK98691D0/da
Priority claimed from DK98791A external-priority patent/DK98791D0/da
Application filed by Michael Egholm, Peter Eigil Nielsen, Berg Rolf H, Buchardt Dorte filed Critical Michael Egholm
Publication of FI935208A0 publication Critical patent/FI935208A0/fi
Publication of FI935208A publication Critical patent/FI935208A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI118424B publication Critical patent/FI118424B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

118424
Nukleiinihappoanalogit ja niiden käyttö diagnostisissa ja analyyttisissä toimenpiteissä
Nukleinsyraanaloger och deras användning i diagnostiska och analytiska procedurer
Oheisen keksinnön kohteena on tiettyjen nukleiinihappoanalogien käyttö diagnostiikassa, esimerkiksi yhden tai useamman kemiallisen tai mikrobiologisen kokonaisuuden kiinnittämiseen, toteamiseen, havaitsemiseen (ilmaisuun), tunnistamiseen tai määrittämiseen (kvantitointiin).
Oligodioksiribonukleotidejä (oligo-DNA-molekyylejä) käytetään yhä useammin diagnostisissa toimenpiteissä. Niitä on esimerkiksi alettu käyttää spesifisten mikro-organismien läsnäolon testaamiseen tai perinnöllisen taipumuksen, esimerkiksi sairastumistaipumuksen läsnäolon testaamiseen oikeustieteessä ja yleensäkin mikrobiologiassa. Oligo-DNA-molekyylien käytöt tällä alalla riippuvat luonnollisestikin tällaisten oligo-DNA-molekyylien kyvystä hybridisoitua komplementaarisiin eli niitä täydentäviin vastinnukleiinihapposekvensseihin. Esimerkiksi, leimattuja oligo-DNA-koettimia käytetään hybridisaatiomäärityksissä spesifisten sekvenssien läsnäolon tutkimiseksi immobilisoiduista kohde-DNA-molekyyleistä. Monistamiseen tähtäävissä toimenpiteissä oligo-DNA-molekyylien hybridisoitumisominaisuutta käytetään oligo-DNA-alukkeiden hybridisoimiseksi • · • · * · · * · monistettaviin mallinemolekyyleihin.
• · • · ··· • · i 1.J Nykyään kyetään syntetisoimaan jopa 100 emäsparin pituisia oligo-DNA-molekyylejä • 1 · •tj · käyttäen kiinteään kantajaan perustuvaa menetelmää ja täysin automaattisia m • 1.ί synteesilaitteita on saatavana kaupallisesti. Huomiota on kiinnitetty kuitenkin • · · • · · *.· 1 myös mahdollisuuteen muodostaa synteettisiä DNA-analogeja, jotka kykenevät hybridisoitumaan luonnolliseen DNA:hän sekvenssin suhteen spesifisellä tavalla, • · • · ··· ί mutta joilla on kuitenkin edullisesti erilaisia kemiallisia ominaisuuksia ··· • » • · ··· DNA:hän itseensä verrattuna. Tämän työn suurimpana motivaationa on ollut • ♦ • · f ·. ·♦ tällaisten yhdisteiden mahdollinen käyttö ,fanti-sense”-lääkkeissä, joissa 1 tavanomaisten oligo-DNA-molekyylien käyttö on vaikeata siksi, että tällaisilla • « l ; ; muokkaamattomilla oliaonukleotideillä on lyhyt puoliintumisaika in vivo • · ------- ' ·»« • · • · ♦ ·· 2 118424 nukleaasien luonnollisen läsnäolon seurauksena, niiden valmistaminen millaisena määränä tahansa on vaikeata ja kallista ja niiden kyky tunkeutua solukalvojen läpi on huono.
Esimerkiksi kansainvälisessä (PCT) patenttihakemuksessa WO 86/05518 on kuvattu DNA-analogit, joiden runko käsittää ligandien, tyypillisesti nukleotidiemästen sekvenssin, jonka esitetään kykenevän hybridisoitumaan sekvenssin suhteen spesifisesti luonnossa esiintyviin nukleiinihappoihin. Hakemuksessa on kuvattu lukuisia erilaisia runkorakenteita. Siinä ei ole kuitenkaan esitetty spesifisiä esimerkkejä tällaisten yhdisteiden aikaansaamisesta, eikä siinä ole esitetty tietoja, jotka osoittaisivat näiden patenttivaatimuksissa määriteltyjen analogien affiniteetin DNA:n suhteen.
Kansainvälisen (PCT) patenttihakemuksen WO 86/05519 vaatimuksissa on määritelty diagnostiset reagenssit ja järjestelmät, jotka käsittävät samantyyppisiä DNA-analogeja, mutta tässäkään julkaisussa ei ole esitetty esimerkkejä.
Kansainvälisessä (PCT) patenttihakemuksessa WO 89/12060 on kuvattu oligonukleotidianalogit, jotka perustuvat erilaisiin rakennelohkoihin, joista ne on syntetisoitu. Näistä rakennelohkoista on esitetty esimerkkejä, kun taas ·1·1· esimerkein ei ole esitetty oligonukleotidianalogin varsinaista valmistamista • · ·’2; näistä lohkoista, joten osoitus näiden analogien suorituskyvystä puuttuu.
M· • · • · • ·« .1 ,1 Tunnettua on edelleen muokata DNA-runkoa siten, että kyky vastustaa nukleaasia • · · • · · I.".1 saadaan paremmaksi, ja yleisesti siten, että DNA:n käyttökelpoisuus "anti- • · • · #... sense"-hoitomenetelmissä saadaan paremmaksi. Muita tehtyjä yrityksiä DNA- • · 1
analogien suunnittelemiseksi on esitetty edellä mainitun patenttijulkaisun WO
; ,·, 86/05518 johdanto-osassa.
• · · ··1 1 • · *...1 Yleisenä kokemuksena on ollut, että luonnollisen DNA:n rungon muokkaaminen 2 • 1 ·.1·; johtaa tämän muokatun oligonukleotidin ja sitä täydentävän normaalin • · vastinoligonukleotidin välille muodostuneen hybridin stabiilisuuden ·1'1; pienenemiseen, joka stabiilisuus määritetään mittaamalla Tm-arvo. Näin ollen · «M • · · f·· 3 118424 tällä alalla vallitsevan yleisen käsityksen mukaan rungon muokkaaminen johtaa aina hybridin destabilisoitumiseen eli pienempiin Tm-arvoihin, ja tästä syystä muokkauksen pitäisi olla mahdollisimman pieni sellaisten hybridien saamiseksi, joiden tapauksessa parhaana saavutettavana tuloksena on vain vähän pienentynyt Tm-arvo.
Oheisen keksinnön kohteena on sellaisten rakenteeltaan uudenlaisten nukleiinihappoanalogien käyttö diagnostiikassa tai analytiikassa, joilla analogeilla on edullisesti sellainen aikaisemmin tuntematon ominaisuus, että ne hybridit, joita ne muodostavat niitä täydentävän sekvenssin käsittävien tavanomaisten nukleiinihappojen kanssa, ovat stabiilimpia Tm-arvon suhteen kuin sellainen samankaltainen hybridi, jonka vastaavan sekvenssin käsittävä tavanomainen nukleiinihappo olisi muodostanut, ja/tai että niillä on suurempi selektiivisyys niitä täydentävän sekvenssin suhteen verrattuna yhteensopimattomuuksia sisältäviin sekvensseihin kuin mainitulla vastaavalla tavanomaisella nukleiinihapolla, jolla on vastaava sekvenssi.
Oheisessa keksinnössä saadaan aikaan nukleiinihappoanalogi, jota voidaan käyttää yhden tai useamman kemiallisen tai mikrobiologisen kokonaisuuden vangitsemiseen, toteamiseen, havaitsemiseen (ilmaisuun), tunnistamiseen tai määrittämiseen 9 · 9*9 • · (kvantitoimiseen), joka analogi on *·» • · **· (a) peptidinukleiinihappo (ΡΝΔ), jonka käsittämässä polyamidirungossa on • · · * 9 9 t* lukuisia ligandeja vastaavissa, mainittua runkoa pitkin ja toisistaan jollakin • · · * · · ***,' etäisyydellä sijaitsevissa asemissa, näiden ligandien ollessa toisistaan • · · • · ... riippumatta luonnossa esiintyviä nukleoemäksiä, luonnossa esiintymättömiä * 9 9 • * * nukleoemäksiä tai nukleoemäksiä sitovia ryhmiä, kunkin mainitun ligandin ollessa j >·> sitoutunut suoraan tai epäsuoraan mainitussa rungossa läsnäolevaan typpiatomiin • * · ··· « .***. ja pääasiassa vähintään 4-8 väliatomin erottaessa näitä typpiatomeja, joissa • · 99 #* , mainittu ligandi on kiinni, toisistaan tässä rungossa, mainitun analogin • · · • 99 , käsittäessä havaittavan leiman tai siihen ollessa konjugoituna havaittava leima; • 9 • (b) sellainen nukleiinihappoanalogi, joka kykenee hybridisoitumaan täydentävän • 9 9 9 * 9 9 9 • * vastinsekvenssin käsittävään nukleiinihappoon siten, että muodostuu hybridi, • 9 9 9 9 9 9 4 118424 joka on stabiilimpi lämmön vaikutuksesta tapahtuvaa denaturoitumista vastaan kuin sellainen hybridi, joka on muodostunut mainittua analogia vastaavasta tavanomaisesta deoksiribonukleotidistä ja mainitusta nukleiinihaposta, mainitun analogin käsittäessä havaittavan leiman tai siihen ollessa konjugoituneena havaittava leima; tai (c) sellainen nukleiinihappoanalogi, joka kykenee hybridisoitumaan kaksijuosteiseen nukleiinihappoon, jonka yhden juosteen sekvenssi on mainittua analogia täydentävä vastine siten, että toinen juoste syrjäytyy mainitusta yhdestä juosteesta, mainitun analogin käsittäessä havaittavan leiman tai siihen ollessa konjugoituneena havaittava leima.
Edellä kohdassa (a) määriteltyjen nukleiinihappoanalogien (PNA) tapauksessa rungon typpiatomien välissä on edullisesti viisi atomia. Kaavan I (alla) mukaisissa nukleiinihappoanalogeissa tämän on todettu johtavan voimakkaimpaan DNA:han kohdistuvaan affiniteettiin. Kuitenkin eräissä tapauksissa saattaa olla toivottavaa pienentää PNA-analogien ja DNA:n välistä sitouturaislujuutta sijoittamalla yksi tai useampi ligandi optimaaliseen välimatkaan verrattuna epäedullisemmalle etäisyydelle, esimerkiksi yli 5 atomin, esimerkiksi jopa 14 tai useamman atomin etäisyydelle toisistaan.
• · • · · • · * * * Edullisesti korkeintaan 25 % ligandien välisistä etäisyyksistä on 6 atomia tai * · t · ***. enemmän. Edullisemmin korkeintaan 10-15 % ligandien välisistä etäisyyksistä on 6 • · · • ·· . . atomia tai enemmän. Itse atsa-typpiatomeja, joihin ligandit ovat sitoutuneet • · · • · · ··* · ·· · (suoraan tai kytkijäryhmien välityksellä), ei lasketa mukaan edellä mainittuihin • · • · ,··· etäisyyksiin.
• · ·
Vaihtoehtoinen tai lisämenetelmä DNA-sitoutumisen lujuuden heikentämiseksi on • · • · · ··· * jättää pois tiettyjä ligandeja ja sijoittaa niiden paikalle sellainen ryhmä, ··· • · • ♦ ··* joka myötävaikuttaa vain vähän tai ei lainkaan DNA-sitoutumiseen, esimerkiksi • · • 9 · ·. ·· vety. Edullisesti korkeintaan 25 %:ssa, esimerkiksi korkeintaan 10-15 %:ssa * ligandiasemista on sitomaton ryhmä.
• • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 9 9 9 · ··· 5 118424
Esimerkkeinä ligandeista voidaan mainita joko neljä varsinaista luonnossa esiintyvää DNA-emästä (eli tyrniini, sytosiini, adeniini tai guaniini) tai muut luonnossa esiintyvät nukleo-emäkset (esim. inosiini, urasiili, 5-metyylisytosiini tai tio-urasiili) tai keinotekoiset emäkset (esim. bromiurasiili, at-sa-adeniinit tai atsaguaniinit, jne. ), jotka ovat kiinnittyneet peptidirunkoon sopivan kytkijän välityksellä.
Edullisten suoritusmuotojen mukaisesti keksinnössä käytetyillä nukleiinihappoanalogeilla on yleinen kaava (I): L1 L2 Ln 1 1 1 2 1 n A1 A2 An I, 1 I o 2 >n
Q\ -G1 2>B2 ^G2----- Λn .I
\C1 "d 1 '"c2 "D2 ""C D
(i) missä: n on vähintään 2, kukin L1-L“ on valittu toisistaan riippumatta vedyn, hydrok- * .* sin, (Ci-C.*)-alkanoyylin, luonnossa esiintyvien nukleoemästen, luonnossa esiintymättömien nukleoemästen, aromaattisten ryh- »/·; mien, DNA-väliryhmien, nukleoemäksiä sitovien ryhmien ja re- jportteriligandien joukosta siten, että vähintään yksi symbo- »**’♦ leista li-L“ tarkoittaa luonnossa esiintyvää nukleoemästä, 0 0 luonnossa esiintymätöntä nukleoemästä, DNA-väli ryhmää tai nukleoemäksiä sitovaa ryhmää; #·, kukin A1-A” on yksinkertainen sidos, metyleeniryhmä tai ryhmä, jolla on kaava (Ha) tai (Hb): • te • · t • r, [rl [il [rl [rlj --C--Y C--tai--G--Y--C--C— :;i: l I» l l L JpL Jq L JrL Js (IXa) (Hb) 6 118424 missä: X on O, S, Se, NR3, CHa tai C(CH3)a; Y on yksinkertainen sidos, O, S tai NR·4; sekä p että q ovat alueella 1-5 oleva kokonaisluku, summan p+q ollessa korkeintaan 10; sekä r että s ovat nolla tai alueella 1-5 oleva kokonaisluku, summan r+s ollessa korkeintaan 10; sekä Rl että R2 on valittu toisistaan riippumatta vedyn, mahdollisesti hydroksilla tai alkoksilla tai alkyylitiolla substi-tuoituneen (Ci-C*)-alkyylin, hydroksin, alkoksin, alkyylition, aminon ja halogeenin joukosta; ja sekä R3 että R4 on valittu toisistaan riippumatta vedyn, (Ci-C*)-alkyylin, hydroksilla tai alkoksilla tai alkyylitiolla substituoituneen (Cx-C3)-alkyylin, hydroksin, alkoksin, alkyylition ja aminon joukosta; kukin B^-B" on N tai R3N*, missä R3 on edellä esitetyn määritelmän mukainen; kukin C^C" on CR®R7, CHR®CHR7 tai CR®RTCHa, missä R« on vety ja R7 on valittu luonnossa esiintyvien alfa-aminohappojen sivuketjujen joukosta tai R® ja R7 on valittu toisistaan riippumatta vedyn, (Ca-Ce) -alkyylin, aryylin, aralkyylin, hetero-aryylin, hydroksin, (Cx-Ce)-alkoksin, (Ci-C«)-alkyylition, NR3R4: n ja SR3; n joukosta, joissa kaavoissa R3 ja R4 ovat • ·’ edellä esitettyjen määritelmien mukaisia, ja R3 on vety, ;·** (Ci-Ce) -alkyyli, hydroksilla, alkoksilla tai alkyylitiolla V·· substituoitunut (Ci-Ce)-alkyyli tai R* ja R7 täydentävät yh- * · · dessä alisyklisen tai heterosyklisen järjestelmän; :*·[: kukin d1-D*1 on CR6R7, CHaCReR7 tai CHR®CHR7, missä R® ja R7 :T; ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaisia; kukin G1-G*1-1 on • · ·
0 S O O
1 I I I
-N-C-, -N-C-, -N-S- tai -N--S-
III II
.···. R3 R3 R3 R3 o • · • · · * * · * · · · ;*·.· suuntautuneena kummalla tavalla tahansa, ja joissa kaavoissa « « 7 118424 R3 on edellä esitetyn määritelmän mukainen; Q on -CO*H, -CONR' R" , -SOsH tai -SOaNR' R" tai ryhmän -COaH tai -SOsH aktivoitu johdannainen; ja I on -NHR' “ R" " tai -NR' " C ( O) R"" , joissa kaavoissa R', R", R'" ja R"" on valittu toisistaan riippumatta vedyn, alkyylin, aminoa suojaavien ryhmien, re-portteriligandien, väliryhmien, kelaatinmuodostajien, peptidien, proteiinien, hiilihydraattien, lipidien, steroidien, oligonukleotidien sekä liukoisten ja liukenemattomien polymeerien joukosta. Vaihtoehtoisesti C ja D voivat olla CHR*(CHa)sCHR-7, missä S voi olla 0-2.
Edullisilla peptidinukleiinihapoilla on yleinen kaava (III): I \ °Y(CH!)| 0 Ογ(ΟΗ,), N Sh-r1 ° R7 J n (III) • ·
»M
..·* missä: • · ·.*·* kukin L on valittu toisistaan riippumatta vedyn, fenyylin, • * ·.· · heterosyklien, joissa on esimerkiksi yksi, kaksi tai kolme : rengasta, luonnossa esiintyvien nukleoemästen ja luonnossa esiintymättömien nukleoemästen joukosta; • kukin R7' on valittu toisistaan riippumatta vedyn ja luonnossa esiintyvien alfa-aminohappojen sivuketjujen joukosta; n on alueella 1-60 oleva kokonaisluku; • · · kukin k, 1 ja m on toisistaan riippumatta nolla tai alueella 1-5 oleva kokonaisluku; lukujen k ja m summa on edullisesti 1 • · · tai 2/ edullisemmin 1;
On OH, NHa tai -NHLysNHa; ja R*· on H tai COCHa.
• ·· • t 118424 s
Erityisen edullisia ovat sellaiset kaavan (III) mukaiset yhdisteet joissa kukin L on valittu toisistaan riippumatta ryhmästä, joka koostuu nukleoemäksistä tyrniini (T), adeniini (A), sytosiini (C), guaniini (G) ja urasiili (U), erityisesti tyrniini, ja n on alueella 1-30, erityisesti 4-20 oleva kokonaisluku. Esimerkki tällaisesta yhdisteestä on esitetty kuviossa 1, josta nähdään rakenteellinen samankaltaisuus tällaisten yhdisteiden ja yksijuosteisen DNA: n välillä.
Keksinnön mukaiset peptidinukleiinihapot voidaan syntetisoida soveltamalla tavanomaisia peptidisynteesitoimenpiteitä, jotka toteutetaan joko liuoksessa tai kiinteän faasin avulla. Käytetyt syntonit voivat olla erityisesti suunniteltuja monomeeri-sia aminohappoja tai niiden aktivoituja johdannaisia, jotka on suojattu tavanomaisilla suojaavilla ryhmillä. Oligonukleotidi-analogit voidaan myös syntetisoida käyttäen vastaavia dihappo-ja ja diamiineja.
Näin ollen monomeerisyntonit, joita käytetään oheisessa keksinnössä käyttökelpoisten yhdisteiden tuottamiseen, on voitu valita ryhmästä, joka koostuu aminohapoista, dihapoista ja diamiineista, joilla on yleinen kaava:
·1. L L L
I I I
.1··. f f f er or • · • · · • · · • ·· 1 • · • 1 · • 1 e 1 • ·« • · (IV) (V) (VI) • · · t missä L, A, B, C ja D ovat edellä esitettyjen määritelmien • 1 · mukaisia lukuunottamatta sitä, että mitkä tahansa niissä esiin- : 1 tyvät aminoryhmät on voitu suojata aminoa suojaavalla ryhmäl-··« lä; E on COOH, CSOH, SOOH, SOaOH tai niiden aktivoitu johdan- nainen; ja F on NHR3 tai NPgR3, missä R3 on edellä esitetyn ,·. · määritelmän mukainen ja Pg on aminoa suoj aava ryhmä.
• · · • 1 9 118424
Edulliset monomeerisyntonit ovat aminohappoja, joilla on kaava (VII):
V
HOOC. .N, J v^^nh2 R7’ (VII) tai niiden johdannaisia, joissa aminoryhmä on suojattu ja/tai happopääte aktivoitu, missä L on valittu vedyn, fenyylin, heterosyklien, luonnossa esiintyvien nukleoemästen, luonnossa esiintymättömien nukleoemästen ja niiden suojattujen johdannaisten joukosta; ja R7' on valittu riippumattomalla tavalla vedyn ja luonnossa esiintyvien alfa-aminohappojen sivuketjujen joukosta. Erityisen edullisia ovat sellaiset syntonit, joilla on kaava (4), missä R7' on vety ja L on valittu ryhmästä, joka koostuu nukleoemäksistä tyrniini (T), adoniini (A), sytosiini (C), guaniini (G) ja urasiili (U) sekä niiden suojatuista j ohdannaisista.
, Keksinnön mukaisesti keksintö kattaa edellä määriteltyjen nuk- leiinihappoanalogien käytön yhden tai useamman kemiallisen tai • · ·*! mikrobiologisen kokonaisuuden vangitsemiseen, toteamiseen, il- *. *: maisemiseen, tunnistamiseen tai kvantitoimiseen. Ensisijaises- • · · ti ilmaistavan kokonaisuuden on tarkoitus olla nukleiinihappo ·* · • ja tämä kokonaisuus ilmaistaan hybridisaatiolla sen nukleiini- :T: happoemästen tunnusomaisten sekvenssien perusteella.
Edellä määriteltyjä nukleiinihappoanalogej a voidaan käyttää ,··*. menetelmässä nukleiinihapon vangitsemiseksi, jossa menetelmäs- • · · *· ^ sä tämä nukleiinihappo saatetaan kosketukseen hybridi s oivissa * * olosuhteissa oheisessa keksinnössä käyttökelpoisen, kiinteään • · · kantajaan immobilisoidun nukleiinihappoanalogin kanssa, jonka immobili soidun nukleiinihappoanalogin ligandi sekvenssi voi • · · · .·. : hybridisoitua mainittuun vangittavaan nukleiinihappoon tai • ·· nukleiinihappoanalogiin.
10 118424
Kiinteä kantaja voi olla mitä erilaisimmassa muodossa, mikä on tunnettua tavanomaisten, affiniteettiin perustuvaan vangitsemiseen käyttökelpoisten oligonukleotidien immobilisoinnista. Kiinteä kantaja voi olla esimerkiksi malja, suodatin, moni-kuoppainen malja tai upotettava liuska. Se voi olla erillisinä hiukkasina kuten helminä ja tällaisia hiukkasia voidaan pitää pylväässä, jonka läpi nukleiinihappoja sisältävät liuokset voidaan johtaa toivottujen lajien vangitsemiseksi niistä.
Vangittu nukleiinihappo voidaan todeta, ilmaista, tunnistaa tai kvantitoida monella erilaisella menetelmällä. Koska pesun jälkeen vangittu nukleiinihappo voi olla ainoa järjestelmään jäänyt nukleiinihappo, se voidaan ilmaista millä tahansa rea-genssijärjestelmällä, jota voidaan käyttää nukleiinihapon läsnäolon osoittamiseen riippumatta siitä, onko se spesifinen vangitun sekvenssin suhteen vai ei. Niinpä esimerkiksi, jos vangittu nukleiinihappo on DNA ja suhteellisen lyhyt PNA on vanginnut sen yksijuosteisessa muodossa, niin vapaana roikkuva-yksijuosteinen DNA voidaan pilkkoa nukleaasilla ja pilkkoutu-mistuotteet voidaan tunnistaa tavanomaiseen tapaan. Mikäli DNA on kaksijuosteinen ja PNA on nytkin suhteellisen lyhyt, niin DNA: n se osa, joka jää alkuperäiseen kaksijuosteiseen muotoon- • ·’ sa (siis jota PNA ei syrjäytä), voidaan ilmaista tavanomaisten • ·· DNA-väliryhmien avulla, jotka väliryhmät eivät sitoudu PNA- ·.*·: DNA-dupleksiin. Nukleiinihappoja tunnistavia vasta-aineita • · •t· J voidaan käyttää immobilisoituun nukleiinihappoanalogiin sitou- ;*·*: tuneiden nukleiinihappojen (RNA, kaksijuosteinen DNA tai yksi- ·**· juosteinen DNA) ilmaisemiseen.
• ,·, Nukleiinihappolaj ien affiniteettiin perustuvassa vangitsemi- f sessa, jossa käytetään kiinteään kantajaan immobilisoituj a • * · tavanomaisia oligonukleotidejä, kohdenukleiinihappo on taval-*·**· lisesti puhdistettava. Näytteessä mahdollisesti läsnäolevat nukleaasit hyökkäävät herkästi immobili soidun nukleiinihapon ]·. kimppuun. Käytännössä spesifinen sitoutuminen on vähäistä ja
*V\ epäspesifistä sitoutumista esiintyy runsaasti. Edelleen, DNA
S mm * * on denaturoitava yksijuosteiseen muotoon ennen vangitsemista.
11 118424
Nukleaasit eivät hyökkää kovinkaan herkästi edellä esitetyn kaavan (I) mukaisten nukleiinihappoanalogien kimppuun, ja näiden analogien tapauksessa spesifinen sitoutuminen on tyypillisesti runsaampaa johtuen siitä, että niiden affiniteetti täydentävän vastinsekvenssin käsittävän nukleiinihapon suhteen on suurempi kuin se affiniteetti, johon päästään käyttäen immobilisoituna lajina tavanomaisia oligonukleotidejä. Edelleen, oheisen keksinnön mukaisesti käytetyt nukleiinihappoana-logit kykenevät tyypillisesti hybridisoitumaan täydentävän vastinsekvenssin käsittäviin nukleiinihappoihin ilman, että näitä nukleiinihappoja olisi ensin denaturoitava yksijuostei-seen muotoon. Sen jälkeen, kun kohdenukleiinihappo on vangittu, se voidaan vapauttaa immobilisoidusta nukleiinihappoanalo-gista alistamalla immobilisoitu nukleiinihappoanalogi ja vangittu nukleiinihappo dehybridisoiviin olosuhteisiin, esimerkiksi käsittelemällä niitä lämmöllä ja dimetyyliformamidilla.
Esimerkiksi immobilisoitu nukleiinihappoanalogi voi käsittää peräkkäisiä ligandeja kuten tymiiniä, jotka kykenevät hybridi-soitumaan mRNA: n poly-A-häntiin mRNA: n vangitsemiseksi.
Keksintöön sisältyy affiniteettiin perustuva vangitseva pyi-väs, joka käsittää edellä kuvattuja immobilisoituja nukleiini- * t ;·*! happoanalogej a.
• * · * ·· • · e * I Täten voidaan nähdä, että oheinen keksintö kohdistuu myös PNA- i ti » • *,: -molekyylien edulliseen käyttöön kiinteätä faasia hyväksikäytti ί tävässä biokemiassa (katso esim. "Solid-Phase Biochemistry
Analytical and Synthetic Aspects", W. H. Scouten, ed. , John ··· Wiley & Sons, New York, 1983), erityisesti kiinteään faasiin • *· · perustuvissa bioj ärjestelmissä, etenkin biomääritykeissä tai • 4 kiinteään faasiin perustuvissa tekniikoissa, jotka liittyvät [ * toisiaan täydentävien vastinnukleiinihappojen diagnostiseen ·...* ilmaisemiseen/kvantitoimiseen tai af finiteettipuhdistukseen (katso esim. "Affinity Chromatography - A Practical Approach",
MM
ί**.ί P. D. G. Dean, W. S. Johnson ja F. A. Middle, toim. , IRL Press
Ltd., Oxford 1986; "Nucleic Acid Hybridization - A Practical 12 118424
Approach", B. D. Harnes ja S. J. Higgins, IRL Press Ltd., Oxford 1987). Nykyisissä menetelmissä tällaisten biomääritysten tai puhdistustekniikoiden toteuttamiseksi käytetään lähes yksinomaan "normaaleja" tai hieman muokattuja oligonukleotidejä, jotka on joko adsorboitu fysikaalisesti tai sidottu olennaisesti pysyvällä kovalenttisella ankkuroivalla sidoksella helminä oleviin kiinteisiin kantajiin, joista esimerkkeinä voidaan mainita selluloosa, lasihelmet, mukaan lukien sellaiset helmet, joiden huokoisuus on hallittu (Mizutani et ai., J. Chro-matogr,, 1986, 356, 202), "Sephadex", "Sepharose", agaroosi, polyakryyliamidi, huokoinen hiukkasmainen alumiinioksidi, hyd-roksialkyyli-metakrylaattigeelit, dioliin sidottu piidioksidi, huokoiset keraamiset materiaalit tai rajamateriaalit kuten nailonia ja nitroselluloosaa olevat suodatinlevyt. Eräässä esimerkissä käytettiin oligo-dT: n kemiallista synteesiä sellu-loosahelmien pinnalla poly A-hännän sisältävän mRNA:n affi-niteettieristämiseksi (Gilham teoksessa "Methods in Enzymology", L. Grossman ja K. Moldave, toim. voi. 21, osa D, sivu 191, Academic Press, New York ja Lontoo, 1971). Kaikkia edellä mainittuja menetelmiä voidaan käyttää oheisen keksinnön yhteydessä. Kuitenkin, mikäli mahdollista, keksinnön puitteissa käytetään mieluumin kyseessä olevien molekyylien kovalent-. tista sitomista kuin fysikaalista adsorptiota, koska fysikaali- . seen adsorptioon liittyy se haitta, että osa immobilisoiduista molekyyleistä voi huuhtoutua ulos (desorboitua) hybridi saati on e · tai affiniteettiprosessin aikana. Näin ollen tällöin ei kyetä e · : juuri lainkaan säätämään kantajamateriaalin pinnalle adsorboi- dun lajin sitä määrää, joka menetetään biomääritys/puhdistus- ·*·*· toimenpiteen kuluessa kantajan läpikäymien erilaisten käsitte- lyjen aikana. Tämän ongelman vakavuus riippuu luonnollisesti- ,·, kin suureksi osaksi siitä nopeudesta, jolla adsorboituneiden "J·, ja "vapaiden" lajien välinen tasapaino asettuu. Tietyissä • * * tapauksissa saattaa olla käytännöllisesti katsoen mahdotonta *!**: toteuttaa kvantitatiivinen määritys hyväksyttävällä tarkkuudel- ί,,,ϊ la ja/tai toistettavuudella. Yleensä on odotettavaa, että adsorboituneen lajin menetys sen seurauksena, että kantajaa ]"*. käsitellään ruuminnesteillä, vesipitoisilla reagensseilla tai • · * * huuhteluvällaineilla, on selvintä niiden lajien kohdalla, 13 118424 joilla on suhteellisen pieni molekyylipaino. Toisin kuin oligo-nukleotidit, PNA-molekyylit voidaan kiinnittää helpommin kiinteiden kantajien pinnalle, koska ne sisältävät vahvoja nukleo-fiilisiä ja/tai elektrofiilisiä keskuksia. Lisäksi oligonukleo-tidien suora kasaaminen kiinteiden kantajien pinnalle kärsii immobilisoidun molekyylin erittäin alhaisesta kuormituksesta, johtuen pääasiassa niiden materiaalien pienestä pintakapasitee-tista, jotka materiaalit tekevät mahdolliseksi tekniikan nykytason mukaisen fosforamidiittikernian onnistuneen käytön oligo-nukleotidien muodostamiseksi. (Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. , 1981, 22, 1859; Caruthers, Science, 1985, 232, 281). Tähän liittyvänä haittana on myös se, että vain suhteellisen lyhyitä oligonukleotidejä voidaan saada käytämällä vaihtoehtoista fosfiittitriesterimenetelmää (Letsinger ja Mahade-van, J, Am. Chem. Soc. , 1976, 98, 3655), joka sopii sellaisil le kiinteille kantajille, joilla on suuri pinta-ala/kuormitus-kapasiteetti. Mitä tulee puolestaan tavanomaiseen, kiinteään faasiin perustuvaan peptidisynteesiin, niin viimeksimainitut kantajat ovat kuitenkin erinomaisia materiaaleja immobilisoitu-jen PNA-molekyylien muodostamista ajatellen (sivuketjujen suo-jaavat ryhmät voidaan poistaa syntetisoidusta PNA-ketjusta pilkkomatta ankkuroivaa sidosta, joka pitää ketjun kiinni kiin-. teässä kantajassa). Täten PNA-lajit hyötyvät edellä kuvatuista *,· kiinteään faasiin perustuvista tekniikoista ajatellen paljon • i ··*] suurempaa (ja kuitenkin sekvenssin suhteen spesifistä) sitoutu- *: misaffiniteettia täydentävien vastinnukleiinihappojen suhteen • · : sekä lisäksi kaksi juos teisissa rakenteissa läsnäolevien nukle- ·· e • *(S i ini happojen ainutlaatuisesta sekvenssin suhteen spesifisestä !*:*: tunnnistamisesta (sekä voimakkaasta sitoutumisesta näihin nuk- leiinihappoihin). Niitä voidaan myös kuormittaa kiinteiden kan-tajien pinnalle suuria määriä, jolloin kiinteään faasiin pe- te·· ,♦··. rustuvan tekniikan herkkyys/kapasiteetti paranee edelleen.
• · · *· Edelleen, tietyntyyppisiä tutkimuksia, jotka liittyvät PNA: n * ’ käyttöön kiinteään faasiin perustuvassa biokemiassa, voidaan ··· toteuttaa, helpottaa tai nopeuttaa huomattavasti käyttämällä jokin aika sitten kuvattua "valolla ohjattua, kolmiulotteises- ···· ,*. j ti kohdennettavaa, rinnakkaista kemiallista synteesi" teknologi- • ·· aa (Fodor et ai., Science,, 1991, 251, 767), jossa tekniikassa 14 118424 on yhdistetty kiinteän faasin kemia ja fotolitografia tuhansien hyvin erilaisten, mutta tunnistettavien, pysyvästi immobi-lisoitujen yhdisteiden (kuten peptidien) tuottamiseksi olennaisesti samanaikaisesti.
On todettu, että kaavan I mukaisilla PNA-yhdisteillä on ominaisuus, jota ei olla todettu koskaan aikaisemmin, nimittäin se ominaisuus, että tällainen nukleiinihappoanalogi kykenee hybri-disoitumaan kaksijuosteisessa muodossa olevaan tavanomaiseen nukleiinihappoon, ja että se kykenee tällaisissa olosuhteissa hybridisoitumaan sellaiseen juosteeseen, jonka sekvenssi täydentää tätä analogia, ja syrjäyttämään toisen juosteen alkuperäisestä kaksinkertaisesta nukleiinihaposta. Tällainen tunnistaminen voi tapahtua 5-60 emäsparin pituisissa dsDNA- (kaksi juosteisissa DNA-) sekvensseissä. Mielenkiinto kohdistuu 10-20 emäksen pituisiin sekvensseihin, koska tämä on se pituus-alue, jolta löydetään prokarioottien ja eukarioottien ainutlaatuisia DNA-sekvenssejä. Erityisen mielenkiintoisia ovat rea-genssit, jotka tunnistavat 17-18 emästä, koska tämä on ihmisen perimässä esiintyvien ainutlaatuisten sekvenssien pituus.
Samoin on todettu, että kun tällainen hybridisaatioreaktio , toteutetaan liuoksessa, niin nukleiinihappoanalogin toinen * * *’ juoste, jolla on sama sekvenssi kuin ensimmäisellä juosteella, f I· * * ...* hybridisoituu myös täydentävän vastinketjun käsittävään nukle- • · \*·: iinihapppojuosteeseen siten, että muodostuu kolmoiskierrera- • · IJ ϊ kenne, jossa PNA: n kaksi samankaltaista juostetta on hybridi- ΓΛ soitunut tavanomaisen nukleiinihapon yhteen juosteeseen. Ole- 1*;*· tetaan, että ensimmäinen PNA-juoste hybridisoituu tavanomai- silla, emästen välisillä vetysidoksilla, kun taas PNA: n toinen juoste sijoittuu lähtödupleksissa olevaan suureen uraan Hoog-steen-parinmuodostuksen avulla. Mikäli PNA on immobilisoitu « * · \ kiinteään kantajaan, niin tällöin todetaan hybridisoitumista *•**5 kaksi juos teiseen nukleiinihappoon yhden juosteen syrjäytyessä • · e ί<#ι* siitä, mutta kolmoiskierrerakenteiden muodostuminen voi estyä PNA: n immobilisoinnilla.
«e·* « e • · · e • ♦ 15 118424
Oheiseen keksintöön sisältyy edellä kuvatun kaltainen nukleii-nihappoanalogi, johon on sisällytetty ilmaistava leima tai joka on konjugoitu tällaiseen leimaan. Yleisesti, näihin PNA-yhdisteisiin voidaan soveltaa kaikkia tällä hetkellä tunnettuja menetelmiä peptidien, DNA-molekyylien ja/tai RNA-molekyylien leimaamiseksi. Niinpä näistä leimaamismenetelmistä voidaan mainita radioisotooppileimoj en, entsyymileimoj en, biotiinin, spin-leimoj en, fluorof orien, kemiluminesenssileimoj en, antigee-nileimojen ja vasta-aineleimojen käyttö.
Edellä kuvattuja leimattuja PNA-yhdisteitä voidaan käyttää menetelmissä kohdenukleiinihappojen toteamiseksi, ilmaisemiseksi tai kvantitoimiseksi, joissa menetelmissä mainittu kohde hybridisoidaan edellä määriteltyyn leimattuun nukleiinihappo-analogiin, joka käsittää riittävästi täydentävän vastinketjun, niiden hybridisoimiseksi keskenään hybridisoivissa olosuhteissa, minkä jälkeen kohteeseen tällä tavalla hybridisoituneessa nukleiinihappoanalogissa läsnäoleva leima ilmaistaan tai kvan-titoidaan.
Valinnaisesti, kohde voidaan immobilisoida substraattiin ennen hybridisaatiota.
ψ « « ·’ Tällaisessa menetelmässä kohde voi immobi li soitua substraat- M· tiin siten, että kohteen ensimmäinen alue hybridisoituu vangit- • · \**ί sevaan nukleiinihappoon tai nukleiinihappoanalogiin, jonka sek-venssi täydentää riittävällä tavalla mainittua ensimmäistä ;1·** aluetta hybridisoituekseen sen kanssa, ja joka on itse immobi- }1♦1· lisoitu mainittuun substraattiin, ja leimattu nukleiinihappo- t analogi voi hybridisoitua kohteen toiseen alueeseen.
· · v
Edellä on kuvattu ainakin oheisen keksinnön mukaisten edullis- ♦ 1 1 *, ten nukleiinihappoanalogien kyky hybridisoitua kaksijuostei- **’1· seen kohdenukleiinihappoon ja syrjäyttää siitä yksi juoste.
Oheisen keksinnön kohteena on menetelmä yhden juosteen syrjäytin tämiseksi kaksinkertaisesta nukleiinihaposta, jossa menetelmäs- *11', sä mainittuun kaksinkertaiseen nukleiinihappoon hybridisoidaan • 1· • 1 edellä määritelty nukleiinihappoanalogi, jolla on mainitun 16 118424 kaksinkertaisen nukleiinihapon toiseen juosteeseen kohdistuvaa affiniteettia, joka on riittävä mainitun yhden juosteen syrjäyttämiseksi siitä.
Oheiseen keksintöön kuuluu menetelmä kaksijuosteisen kohdenuk-leiinihapon ilmaisemiseksi, tunnistamiseksi tai kvantitoimiseksi, jossa menetelmässä tähän kohdenukleiinihappoon hybridi-soidaan edellä määritelty syrjäyttävä nukleiinihappoanalogi, joka kykenee syrjäyttämään yhden juosteen kaksijuosteisestä kohteesta, jossa toinen juoste käsittää syrjäyttävää nukleiinihappoanalogi a täydentävän vastinsekvenssin, mainitun syrjäyttävän nukleiinihappoanalogin käsittäessä kaksijuosteisen kohteen mainittua toista juostetta riittävästi täydentävän vastinsekvenssin siten, että se hybridisoituu siihen ja syrjäyttää kohteen mainitun yhden juosteen yksinkertaisena juosteenä, minkä jälkeen mainittu yksi juoste ilmaistaan tai kvantitoi-daan kaksijuosteisestä kohteesta syrjäytymisen jälkeen.
Syrjäytynyt juoste voidaan pilkkoa kappaleiksi ja näiden kappaleiden läsnäolo voidaan ilmaista. Tämä syrjäytynyt juoste voidaan pilkkoa edullisesti nukleaasin avulla. Niinpä spesifisen kaksijuosteisen kohdenukleiinihapposekvenssin läsnäolo , voidaan ilmaista hybridisoimalla siihen täydentävä PNA juos- *.;* teen syrjäyttämiseksi siitä siten, että reaktioseokseen saa- ··»! daan yksi juos teista DNA: ta, minkä jälkeen tämä yksi juos teinen \ DNA pilkotaan nukleaasilla nukleotidien tuottamiseksi, joiden e m : nukleotidien läsnäolo voidaan ilmaista osoituksena siitä, että | V alunperin oli läsnä erityisesti kaksijuosteista kohde-DNA: ta.
<··» »· · • · 9
Oheisen keksinnön kohteena ovat lisäksi diagnostiikassa käyt-,ϊ. tökelpoiset reagenssipakkaukset, jotka sisältävät vähintään ,'i\ yhtä edellä määriteltyä nukleiinihappoanalogia, ja jotka käsit- tävät edullisesti vähintään yhtä sellaista nukleiinihappoana-logia, joka on leimattu, esim. leimattua PNA: ta, sekä vähin- ·«· tään yhtä ilmaisevaa reagenssia, jota voidaan käyttää mainitun ,·. leiman ilmaisemiseen.
e »Mf • » I * · * «» # 9 17 118424
Yleensä nämä nukleiinihappoanalogit toimitetaan liuoksessa, hybridisaatiopuskurissa. Tällainen reagenssipakkaus sisältää yleensä myös vähintään yhtä pesupuskuriliuosta.
Mikäli nukleiinihappoanalogi on leimattu epäsuoraan, esimerkiksi biotiinilla, niin tämä reagenssipakkaus voi myös sisältää entsyymileiman ja sellaisen materiaalin kuten avidiinin, joka kykenee sitoutumaan nukleiinihappoanalogissa olevaan leimaan, välistä konjugaattia.
Mikäli nukleiinihappoanalogi on leimattu entsyymillä joko suoraan tai epäsuoraan, niin reagenssipakkaus voi sisältää tämän entsyymin sellaista substraattia, joka voi osallistua tämän entsyymin välittämään havaittavaan reaktioon.
Keksintöä kuvataan seuraavassa edelleen yksityiskohtaisemmin ja sitä havainnollistetaan viittaamalla liitteenä oleviin kuvioihin, joissa:
Kuvio 1 esittää luonnossa esiintyvää deoksiribo-oligonukleoti-diä (A) sekä keksinnön mukaista peptidinukleiinihappoa (PNA) (B).
Kuviossa 2 on esitetty esimerkkejä luonnossa esiintyvistä ja ,*.· luonnossa esiintymättömistä nukleoemäksistä DNA: n tunnistami- ·’1: seksi sekä reportteri ryhmiä.
* · · • · • * · • 1· • · : Kuvio 3 havainnollistaa kaavamaisesti (a) valopilkkomista yhdisteellä Acr1-(Taeg)io-Lys-NHa (Acr TioLys-NHa); (b) valo- • · [·:*. jalanjälkeä, joka on saatu yhdisteen Acr1-(Taeg)io-Lys-NHa • · · diatso-kytketyllä akridiinilla, sekä edullista KMnO1-pilkko- . mistä; sekä (c) Si-nukleaasilla parannettua pilkkomista ja (d) • · · ...J Acr1-(Taeg) ιο-Lys-NHa-sitomiskohdan pilkkomista micrococcus-* nukleaasilla.
* · .2· Kuviossa 4 on esitetty esimerkkejä PNA-monomeerisyntoneista.
* · · • · ·
Kuviossa 5 nähdään Acr1-ligandi ja PNA, Acr1-(Taeg) io-Lys-NHa.
* * · * · · • · 2 18 118424
Kuvio 6 esittää yleistä kaaviota monomeerisyntoneiden valmistamiseksi.
Kuvio 7 esittää yleistä kaavaa Acr1-ligandin valmistamiseksi.
Kuvio 8 esittää yleistä kaavaa kiinteään faasiin perustuvaa PNA-synteesiä varten, kaavion havainnollistaessa lineaaristen suojaamattomien PNA-amidien valmistusta.
Kuvio 9 esittää seuraavia analyyttisiä HPLC-kromatogrammeja: (A) raaka H-[Taeg]ls-NHa HF-pilkkomisen jälkeen (ennen lyofili-sointia); (B) raaka Acr1-[Taeg]xa-NHa HF-pilkkomisen jälkeen (ennen lyofilisointia); sekä (C) puhdistettu
Acr1-[Taeg]xs-NHa. Puskuri A: 5 % CHsCN/95 % HaO/O, 0445 % TFA; puskuri B: 60 % CH3CN/40 % HaO/O, 0390 % TFA; lineaarinen gradi-entti, 0->100 % B: tä 30 minuutissa; virtausnopeus 1,2 ml/min; pylväs: Vydac Cxe (5 μιη, 0, 46 x 25 cm).
Kuvio 10 esittää seuraavia analyyttisiä HPLC-kromatogrammeja: (A) puhdistettu H-[Taeg]xo-Lys-NHa ja (B) puhdistettu H-[Ta-eg]s-Caeg-[Taeg]Λ-Lys-NHa, saatu käyttäen samoja olosuhteita kuin kuviossa 9.
*
Kuviot 11a ja 11b esittävät yhdisteen AcrTio-Lys sitomista ·**': dAxo: een. 5'-3sP-leimattua oligonukleotidiä (1) (5'-GATCCA10G) :*·,· inkuboitiin AcrTxo-Lys: n puuttuessa tai läsnäollessa ja oligo- • 1 : nukleotidin (2) (5'-GATCCTxoG) puuttuessa tai läsnäollessa ja * ·· · näytteet analysoitiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla • · [···, (PAGE) ja autoradiografialla “luonnollisissa olosuhteissa " * * · (kuvio 11a) tai “denaturoivissa olosuhteissa" (kuvio 11b). 1 2 3 · ···· Kuviot 12a-c esittävät dsDNA-AcrTxo-Lys-NHa-kompleksin kemial- V * lista, vaiokemiallista ja entsymaattista määrittämistä. Ac- ·:··· rT10-Lys-NHa: n ja päästään 3aP: llä leimatun DNA-kappaleen, .*··. joka sisälsi dAio/dTxo-kohdesekvenssin, väliset kompleksit mää-• · · ·. ritettiin affiniteettiin perustuvalla valopilkkomisella (kuvio 2 3 12a, urat 1-3; kuvio 12b, urat 1-3), määrittämällä valojalan- ♦ · * · · • ♦ · • · 19 118424 jälki (kuvio 12a, urat 5-6), käyttämällä kaliumpermanganaatti-koetinta (kuvio 12b, urat 4-6) tai käyttämällä koettimena staphylococcus -nukleasia (kuvio 12b, urat 8-10) tai nukleaasia Si (kuvio 12c). Koettimen käyttö kohdistui joko A-juosteeseen (kuvio 12a) tai T-juosteeseen (kuviot 12b,c).
Kuvio 13 esittää toimenpidettä suojattujen PNA-syntoneiden syntetisoimiseksi.
Kuvio 14 esittää toimenpidettä suojatun adeniinimonomeerisyn-tonin syntetisoimiseksi.
Kuvio 15 esittää toimenpidettä suojatun guaniinimonomeerisyn-tonin syntetisoimiseksi.
Kuviossa 16 on esitetty esimerkkejä PNA-rungon muutoksista.
Kuvio 17 esittää toimenpidettä tymiinimonomeerisyntoneiden syntetisoimiseksi, joissa syntoneissa sivuketjut vastaavat normaaleja aminohappoja.
Kuviot 18a ja 18b esittävät vastaavasti toimenpiteitä tyrniini-monomeerisyntonin aminopropyylianalogin ja propionyylianalogin s y nt e ti s oi mi s eks i.
* • · ·**': Kuvio 19 esittää toimenpidettä tymiinimonomeerisyntonin amino- etyyli-β-ai aniini analogi n syntetisoimiseksi.
• • · I · · • · « • ·· * :V. Kuvio 20 esittää PAGE-autoradiografia, joka osoittaa, että • · ,···, PNA-yhdisteet -Tio, -TeC ja -TeCa sitoutuvat kaksijuosteiseen • » t DNA: hän suurella sekvenssispesifisyydellä.
·· · ·*·· Kuvio 21 esittää käyrää, joka perustuu PAGE-autoradiogrammien • · V * densitometriseen skannaukseen, ja josta nähdään se kinetiikka, :·*: jolla PNA-Tio sitoutuu kaksi juos teiseen kohteeseen.
··· • · • · e·· ·. Kuvio 22 esittää PAGE-autoradiogrammien densitometriseen skan-• · · *···. naukseen perustuvaa käyrää, josta nähdään kaksi juosteiseen • · · « ·· • · 20 118424
Aio/Tio-DNA-kohteeseen sitoutuneiden eripituisten PNA-yhdistei-den lämpöstabiilisuudet.
Kuvio 23 esittää elektroforeettista geelivärjäystä, joka osoittaa, että DNA: hän kohdistuva restriktioentsyymin aktiivisuus estyy, kun PNA on sitoutunut lähelle restriktioentsyymin tunnistus kohtaa.
Kuvio 24 esittää PAGE-autoradiogrammia, joka osoittaa, että lasI-leimattu PNA-Tio sitoutuu sitä täydentävään vastin-dAio-ol i gonukl eot i di i n.
Kuviot 25a-c osoittavat sitä prosentuaalista sitoutumista, johon päästään erilaisissa lämpötiloissa immobilisoidun PNA: n ja yhteensopivien tai yhden emäksen suhteen yhteensopimatto-mien oligo-DNA-molekyylien välillä.
Kuvio 26 on autoradiogrammi, joka esittää RNA-polymeraasin aikaansaaman kopioitumisen inhiboitumista kopioidussa juos-teessa olevasta Tio PNA: s ta johtuen.
Kuvio 27 on autoradiogrammi leimattujen kaksijuosteisten plas- midi-DNA-molekyylien seoksesta, jotka molekyylit on vangittu yhtä niistä täydentävällä immobilisoidulla vastinsekvenssillä ·*. ja pesty eri lämpötiloissa.
• · • e· • : ···
Kuviossa 28 on yhdistetty etidiumbromidigeeli ja sen autoradio- ·*,·, grammi, yhdistelmän esittäessä kaksijuosteisen plasmidi-DNA: n » · * II*.* kvantitatiivista määrittämistä PNA: n avulla toteutetulla juos- • · · ^ *.,I teen syrjäytyksellä.
# · · * · · e
Kaavan I mukaisissa PNA-yhdisteissä ja niiden valmistuksessa ,.ΙΓ käytetyissä monomeerisyntoneissa ligandi L on pääasiassa luon-• · V * nossa esiintyvä nukleoemäs kiinnittyneenä luonnossa esiinty-vään asemaan, eli asemaan 9 adeniinin tai guaniinin tapaukses-sa ja asemaan 1 tymiinin tai sytosiinin tapauksessa. Vaihtoeh- • · *1* toisesti kukin eräistä ligandeista L voi olla luonnossa esiin-* ..ΙΓ tymätön nukleoemäs (nukleoemäs anal ogi), muu emästä sitova • · i * · • ♦♦ • · 21 118424 ryhmä, aromaattinen ryhmä, (C1-C4)-alkanoyyli, hydroksi tai jopa vety. Kuviossa 2 on esitetty eräitä tyypillisiä nukleo-emäsligandeja ja havainnollistavia synteettisiä ligandeja. Edelleen, L voi olla DNA-väliryhmä, reportteriligandi kuten esimerkiksi fluorofori, radioaktiivinen leima, spin-leima, hap-teeni tai proteiinin tunnistava ligandi kuten biotiini.
Monomeerisyntoneissa L voi olla varustettu suojaavilla ryhmillä. Tätä havainnollistetaan kuviossa 4, jossa Pgl on happo, emäs tai hydrogenolyyttisesti tai valokemiallisesti irtipilk-koutuva suojaava ryhmä kuten esimerkiksi t-butoksikarbonyyli (Boc), fluorenyylimetyylioksikarbonyyli (Fmoc) tai 2-nitro-bentsyyli (2Nb).
Kytkijä A voi olla hyvin erilainen ryhmä kuten -CR1RaCO-, -CR1RaCS-, -CR1R3CSe-, -CR1RaCNHR3-, -CR1R*C=CHa- ja -CRlRaC-C(CH3)a-, missä Rl, Ra ja R3 ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaisia. A on edullisesti metyleenikarbonyyli (-CHaCO-). A voi olla myös pitempiketjuinen ryhmä kuten propa-noyyli, butanoyyli tai pentanoyyli tai vastaava johdannainen, jossa 0 on korvattu X: n toisella arvolla tai ketju on substi-tuoitu R*R3:11a, tai se on heterogeeninen ja sisältää Y: n. Edelleen, A voi olla (Ca-C«)-aikyleeniketju, RlR2:11a substi- tuoitunut (Ca-Ce)-aikyleeniketju tai se voi olla heterogeeni-.V nen, sisältäen Y: n. Eräissä tapauksissa A voi olla vain yksin-kertainen sidos.
• M
• · • t · · · * e : Keksinnön edullisessa muodossa B on typpiatomi, jolloin aki- ie· · raalinen runko on mahdollinen. B voi olla myös R3N-, missä R3 *·;·. on edellä esitetyn määritelmän mukainen.
• e e , Keksinnön edullisessa muodossa C on -CReR7-, mutta se voi olla • e · ···· myös kaksi hiiltä käsittävä yksikkö, eli -CHReCHRT- tai *·] * -CReR‘7CHa-, missä Re ja R7 ovat edellä esitettyjen määritel-*;··· mien mukaisia. R* jaR7 voivat olla myös heteroaryyliryhmä .·*·. kuten esimerkiksi pyrrolyyli/ furyyli, tionyyli, imidatsolyy- • · · ·, li, pyridyyli, pyrimidinyyli, indolyyli tai ne voivat yhdessä • · · •*·^ täydentää alisyklisen järjestelmän, josta esimerkkeinä voidaan * · · * »· t · 22 118424 mainita 1,2-syklobutaanidiyyli, 1, 2-syklopentaanidiyyli tai 1, 2-sykloheksaanidiyyli.
Keksinnön edullisessa muodossa monomeerisyntonissa oleva E on COOH tai sen aktivoitunut johdannainen ja oligomeerissa oleva G on -CONR3-. (Kaavassa I edullisesti -R3NOC-s murtautuneena). Kuten edellä on määritelty/ E voi olla myös CSOH/ SOOH, SOaOH tai niiden aktivoitu johdannainen/ jolloin oligomeerissa läsnäoleva G on muodossa -CSNR3-, -SONR3- ja -SOaNR3-, vastaavasti. Aktivointi voidaan toteuttaa esimerkiksi käyttämällä hap-poanhydridiä tai aktiivista esterijohdannaista, jolloin symbolin E esittämissä ryhmissä läsnäoleva vety korvautuu sellaisella irtoavalla ryhmällä, joka sopii kasvavan rungon muodostamiseen.
Rungon muodostavat aminohapot voivat olla samanlaisia tai erilaisia. Olemme todenneet, että 2-aminoetyyliglysiiniin perustuvat aminohapot soveltuvat erityisen hyvin keksinnön tavoitteisiin.
Eräissä tapauksissa saattaa olla mielenkiintoista kiinnittää ligandeja kumpaankin päätteeseen (Q, I) PNA-yhdisteiden sitou-tumisominaisuuksien muokkaamiseksi. Edustavista ligandeista voidaan mainita DNA-väliryhmät, jotka parantavat kaksijuostei-.*,· sen DNA: n sitoutumista, tai emäksiset ryhmät kuten lysiini tai \ti polylysiini, jotka lujittavat PNA: n sitoutumista sähköstaatti-sen vuorovaikutuksen seurauksena. Negatiivisesti varautuneiden * m • ·*· ryhmien pienentämiseksi esimerkiksi sellaisia ryhmiä kuten • •e ♦ karboksi- ja sulforyhmiä voidaan käyttää. Syntonien suunnitte- « ·;·, lu sallii lisäksi tällaisten muiden ryhmien sijoittamisen s * · muualle kuin päättäviin asemiin.
» ·** ,..J PNA-oligomeerit voidaan konjugoida pienimolekyylisiin vaikut-* * · V * tajaligandeihin kuten esimerkiksi sellaisiin ligandeihin, *:··: joilla on nukleaasi aktiivi s uutta tai alkyloivaa aktiivisuutta, tai reportteriligandeihin (fluoresoivat leimat, spin-leimat, ·♦· \ radioaktiiviset leimat, proteiinin tunnistavat ligandit, esi- *·♦ merkiksi biotiini tai hapteenit). Keksinnön erään muun piir- ** · • «e • · 23 118424 teen mukaisesti PNA: t on konjugoitu peptideihin tai proteiineihin, joilla peptideillä on signaaliaktiivisuutta ja jotka proteiinit ovat esimerkiksi entsyymejä, kopioi nti tekijöitä tai vasta-aineita. PNA: t voidaan myös kiinnittää vesiliukoisiin tai veteen liukenemattomiin polymeereihin. Keksinnön erään muun piirteen mukaisesti nämä PNA-yhdisteet konjugoidaan oligo-nukleotideihin tai hiilihydraatteihin. Tarvittaessa PNA-oligo-meeri voidaan syntetisoida jonkin kiinteään kantajaan kiinnitetyn kokonaisuuden (esim. peptidi ketjun, reportterin, väli ryhmän tai muuntyyppisen, ligandin sisältävän ryhmän) pinnalle.
Keksinnössä käyttökelpoisten PNA-yhdisteiden synteesiä tarkastellaan seuraavassa yksityiskohtaisesti, kuvion 1 esittäessä erästä edullista PNA-esimerkkiä ja verratessa sen rakennetta täydentävän vastinjuosteen rakenteeseen.
PNA-oligomeerien ja -polymeerien synteesi
Periaate, jonka mukaan molekyylejä ankkuroidaan kiinteän matriisin pinnalle, ja joka helpottaa välituotteiden käsittelyä kemiallisten muutosreaktioiden aikana, tunnetaan kiinteään faasiin perustuvana synteesinä tai Merrifield-synteesinä (katso esim. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. , 1963, 85, 2149, sekä Science, 1986, 232, 341). Vakiintuneissa menetelmissä, joilla peptidejä kootaan aminohapoista vaiheittain tai yksi aminohap- * „V po kerrallaan kiinteää faasia käyttäen, käytetään normaalisti helminä olevaa matriisia, joka on tehty jonkin verran silloi-tetusta styreeni -di vinyylibentseeni-sekapolymeerista, joka • silloitettu sekapolymeeri on muodostettu helmipolymeroimalla II» ♦ ?·.·. styreenimonomeeria, johon on lisätty divinyylibentseenien seos- *···, ta. Tavallisesti käytetään 1-2 % olevaa silloitusta. Tällaista matriisia voidaan myös käyttää oheisen keksinnön mukaisessa . (kuvio 8) kiinteään faasiin perustuvassa PNA-synteesissä.
»»*» »*· * * · V * Mitä tulee kiinteän faasin alustavaan funktionalisointiin, ♦···· alalla on kuvattu enemmän kuin 50 menetelmää perinteiseen, j"*. kiinteätä faasia hyväksikäyttävään peptidisynteesiin liittyen e·· (katso esim. Barany ja Merrifield teoksessa "The Peptides", ··· **»!f voi. 2, Academic Press, New York, 1979, sivut 1-284; sekä
• · I
• «e • · 24 118424
Stewart ja Young, "Solid Phase Peptide Syntesis", 2. painos, Pierce Chemical Company, Illinois, 1984). Tavallisimmin käytetään reaktioita, joilla saadaan liitetyksi funktionaalinen kloorimetyyliryhmä (Merrifield-hartsi; kloorimetyyli-metyyli-eetteri /SnCl^-reakti olla) , funktionaalinen aminometyyliryhmä (N-hydroksimetyyliftaali-imidireaktiolla; katso Mitchell et ai., Tetrahedron Lett., 1976, 3795), sekä funktionaalinen bents hydryyli amino ryhmä (Piettä et ai. , J. Chem. Soc. , 1970, 650). Tämän funktionaalisen ryhmän tehtävänä on sen luonteesta riippumatta muodostaa ankkuroiva sidos kiinteänä kantajana toimivan sekapolymeerin ja tähän kiinteään kantajaan liitettävän ensimmäisen aminohapon C-päätteen välille. Ylensä on tarkoituksenmukaista ilmoittaa funktionaalisen ryhmän "pitoisuus" muodossa millimoolia grammaa kohden (mmol/g). Muista ensimmäisenä liitetyistä reaktiivisista funktionaalisista ryhmistä voidaan mainita 4-metyylibentshydryyliamino ja 4-metoksibents-hydryyliamino. Näitä kaikkia vakiintuneita menetelmiä voidaan käyttää periaatteessa oheisen keksinnön yhteydessä. PNA-syn-teesin kannalta edullisissa menetelmissä käytetään aminometyy-liä ensimmäisenä funktionaalisena ryhmänä, koska aminometyyli on erityisen edullinen "väliryhmien" tai "tarttumisryhmien" liittämisen kannalta, johtuen funktionaalisessa aminometyyli-ryhmässä läsnäolevan aminoryhmän reaktiivisuudesta ajatellen amidisidosten olennaisesti kvantitatiivista muodostumista kar- .*.· boksyylihapporyhmään, joka sijaitsee väliryhmän muodostavan • ·· ‘"i reagenssin yhdessä päässä. Alalla on kuvattu suuri joukko asiaan liittyviä, väliryhmän tai tarttumis ryhmän muodostavia • · • bi funktionaalisi a reagensseja (katso Barany et ai., Int. J.
* · · ·
Peptide Protein Res. , 1987, 30, 705), erityisesti sellaisia • · reagensseja, jotka ovat reaktiivisia esimerkiksi funktionaali- • * * sessa aminometyyliryhmässä esiintyvien aminoryhmien suhteen.
. Esimerkkeinä näistä bifunktionaalisista reagensseista voidaan ·· · mainita 4-(haloalkyyli Jaryyli-alemmat alkaanihapot kuten • · · *.* * 4-(bromimetyyli) fenyylietikkahappo, Boc-aminoasyyli-4-(oksime- *:·*: tyyli)aryyli-alemmat alkaanihapot kuten Boc-aminoasyyli-4-(ok- ;***; simetyyli) fenyylietikkahappo, N-Boc-p-asyylibentshydryyliamii- • · · nit kuten N-Boc-p-glutaroyylibentshydryyliamiini, N-Boc-4' - • · * *":¥ (alempialkyyli)-p-asyylibentshydryyliamiinit kuten N-Boc-4'-me- • · · * · · • · 25 118424 tyyli-p-glutaroyylibentshydryyliamiini, N-Boc-4' - (alempi alkok-si)-p-asyylibentshydryyliamiinit kuten N-Boc-4'-metoksi-p-glu-taroyyli-bentshydryyliamiini ja 4-hydroksimetyylifenoksietikka-happo. Eräs väliryhmätyyppi, joka liittyy erityisesti oheiseen keksintöön, on fenyyliasetamidometyyli (Pam)-tarttumisryhmä (Mitchell ja Merrifield, J. Org. Chem. , 1976, 41 2015), joka on, 4-fenyyliasetamidometyyliryhmän elektroneja puoleensavetävästä vaikutuksesta johtuen, noin 100 kertaa stabiilimpi kuin klassinen bentsyyliesterisidos aminoa suojaavana ryhmänä toimivan Boc-ryhmän poistamiseen käytetyn reagenssin eli trifluo-rietikkahapon (TFA) suhteen.
Tiettyjen funktionaalisten ryhmien (esim. bentshydryyliaminon, 4-metyylibentshydryyliaminon ja 4-metoksibentshydryyliaminon), jotka on voitu liittää syntetisoidun PNA-ketjun irrottamiseksi kiinteästä kantajasta siten, että PNA-ketjun C-pääte on amidi-muodossa, tapauksessa ei tarvitse liittää väliryhmiä. Mitä tahansa tällaista funktionaalista ryhmää voidaan käyttää edullisesti oheisen keksinnön yhteydessä.
Väliryhmien tai tarttumisryhmien liittämiseen liittyvä vaihtoehtoinen strategia on niinkutsuttu “edeltäkäsin muodostetun tarttumisryhmän" strategia (katso Tam et ai. , Synthesis, 1979, 955-957), joka tekee mahdolliseksi ensimmäisen aminohapon kyt-.*.· kemisen täydellisen hallitsemisen, ja joka estää niiden kompli-**]]; kaatioiden mahdollisuudet, jotka komplikaatiot johtuvat epätoi- :*·.· vottujen, peptidi- tai PNA-synteesiin liittymättömien funktio-• · : .*. naalisten ryhmien läsnäolosta. Tässä strategiassa väliryhmät • ** · tai tarttumisryhmät, jotka ovat edellä kuvattua tyyppiä, saate- • · I··*, taan reagoimaan sen ensimmäisen aminohapon kanssa, joka amino-• · · happo halutaan liittää kiinteään kantajaan, tämän aminohapon , ollessa N-suojattu ja sen muut sivuketjut, jotka eivät osallis-··· tu toivotun PNA-ketjun jatkamiseen, on valinnaisesti myös • · · V * suojattu. Näin ollen niissä tapauksissa, joissa väliryhmä tai * ·;··{ tarttumis ryhmä on toivottava, kiinteään kantajaan kytkettävä ensimmäinen aminohappo voidaan joko kytkeä väliryhmän, joka on • « · ·. sidottu alunperin liitettyyn funktionaaliseen ryhmään (esimer-* · · ··” kiksi aminometyyliryhmään), vapaaseen reaktiiviseen päähän tai • · · • · · • · 26 118424 se voidaan saattaa reagoimaan väliryhmän muodostavan reagens-sin kanssa. Sitten väliryhmän muodostava reagenssi saatetaan reagoimaan alunperin liitetyn funktionaalisen ryhmän kanssa. Muista käyttökelpoisista ankkurointimenetelmistä voidaan mainita "moninkertaisesti irrotettavat" hartsit (Tam et ai., Tetrahedron Lett. , 1979, 4935; sekä J. Am. Chem. Soc. . 1980, 102, 611; Tam, J. Orcf. Chem. , 1985, 50, 5291), joiden tapauksessa voidaan käyttää yhtä useampia irrotustapoja, minkä ansiosta synteesin suunnittelu voi olla joustavampaa.
N-suojaukseen valitaan sopivasti tert. -butyylioksikarbonyyli-ryhmä (Boc-ryhmä) (Carpino, J. Am. Chem. Soc. , 1957, 79, 4427; McKay et ai. , J. Am. Chem. Soc. , 1957, 79, 4686; Anderson et ai., J. Am. Chem. Soc. , 1957, 79, 6180), normaalisti yhdistet tynä bentsyyliin perustuviin ryhmiin sivuketjujen suojaamiseksi, sekä 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyliryhmä (Fmoc-ryhmä) (Carpino, et ai. , J. Am. Chem. Soc. , 1970, 92, 5748; sekä J.
Org. Chem. , 1972, 37, 3404), normaalisti yhdistettynä tert. - butyyliin (tBu) mahdollisten sivuketjujen suojaamiseksi, vaikka olemassa onkin lukuisia muitakin mahdollisuuksia, jotka ovat hyvin tuttuja tavanomaisen, kiinteään faasiin perustuvan peptidisynteesin alalla. Mäin ollen olemassa on suuri joukko muita käyttökelpoisia aminoryhmää suojaavia ryhmiä, joista voidaan mainita Adoc (Hass et ai., J. Am. Chem. Soc. , 1966, 88, 1988), Bpoc (Sieber, Helv. Chem. Acta. , 1968, 51, 614), *„φί Mcb (Brady, et ai., J. Org. Chem. , 1977, 42, 143), Bic (Kemp, :\j et ai. , Tetrahedron, 1975, 4624), o-nitrofenyylisulfenyyli : (Nps) (Zervas, et ai., J. Am. Chem. Soc. , 1963, 85, 3660) sekä |V. ditiasukkinoyyli (Dts) (Barany, et ai., J. Am. Chem. Soc., 1977, 99, 7363). Nämä aminoryhmää suojaavat ryhmät, erityises- • · · ti ne, jotka perustuvat laajasti käytettyyn funktionaaliseen . uretaaniryhmään, estävät onnistuneesti rasemoitumisen [jota • Il välittää helposti muodostuvien oksatsolinoni-välituotteiden * « · *·] * (atslaktonin) tautomeroituminen; Goodman, et ai. , J. Am. Chem.
*:**: Soc. , 1964, 86, 2918] useimpien α-aminohappojen kytkemisen :"*· aikana. Tällaisten aminoa suojaavien ryhmien lisäksi monia m *. erilaisia, muutoin "arvottomia" ei-uretaanityyppisiä, aminoa • e · **·*, suojaavia ryhmiä voidaan käyttää koottaessa PNA-molekyylejä, • · · • ·· • · 27 118424 erityisesti akiraalisista yksiköistä muodostettavia PNA-mole-kyylejä. Täten oheisen keksinnön puitteissa ei voida käyttää ainoastaan edellä mainittuja aminoa suojaavia ryhmiä (tai näistä ryhmistä saatuja johdannaisia), vaan käyttökelpoisia ovat käytännöllisesti katsoen kaikki sellaiset aminoa suojaavat ryhmät, jotka täyttävät suureksi osaksi seuraavat vaatimukset: (1) ne ovat stabiileja miedoille hapoille (karboksyy- liryhmällä ei merkittävää vaikutusta); (2) ne ovat stabiileja miedoille emäksille tai nukleofiileille (kyseessä olevalla aminoryhmällä ei merkittävää vaikutusta); (3) ne kestävät asylointia (aktivoiduilla aminohapoilla ei merkittävää vaikutusta). Lisäksi: (4) suojaava ryhmä on kyettävä poistamaan lähes kvantitatiivisesti ilman vakavia sivureaktioita ja (5) liitettävän aminohapon mahdollisen optisen yhtenäisyyden tulisi edullisesti säilyä hyvin kytkemisen aikana. Lopuksi, sivu-ketjuja suojaavien ryhmien valinta riippuu yleisesti valitusta aminoa suojaavasta ryhmästä, koska sivuketjun funktionaalisten ryhmien suojauksen on kestettävä aminoryhmää suojaavien ryhmien toistuvia poistotoimenpiteitä. Tämä pätee riippumatta siitä, perustuuko PNA-molekyylien kemialliseen kokoamiseen käytetty strategia esimerkiksi aminoryhmiä ja sivuketjuja suojaavien ryhmien erilaiseen happostabiilisuuteen (kuten asianlaita on esimerkiksi edellä mainitussa "Boc-bentsyyli" -lähestyrnistavassa), vai käytetäänkö siinä ortogonaalista, eli ,*'· kemoselektiivistä suojausta (kuten asianlaita on edellä maini- ·***: tussa " Fmoc-tBu" -lähestymistavassa).
··· • e • · · • ·· * · : Ensimmäisen aminohapon kytkemisen jälkeen seuraavana vaiheena • · · 4 ··,·. tässä kiinteään faasiin perustuvassa synteesissä on toivotun PNA-ketjun järjestelmällinen kokoaminen. Tämä kokoaminen kä- • · · * sittää toistuvia suojaavan ryhmän poisto/kytkentäjaksoja.
Viimeksi kytketyssä aminohapossa läsnäoleva tilapäinen suojaa- ·· · ...i va ryhmä kuten Boc- tai Fmoc-ryhmä poistetaan kvantitatiivi- »ti !.* * sesti sopivalla käsittelyllä, esimerkiksi asidolyysillä, joka ····· toteutetaan esimerkiksi tri fluorietikkahapolla Boc: n tapauk- ,*··. sessa, tai emäskäsittelyllä, esimerkiksi piperidiiniä käyttäen • • Fmoc: n tapauksessa siten, että N-päätteen amiinifunktio saa- e·· •••i daan vapaaksi.
• · • » · • ·· · 28 118424
Sitten seuraavaksi toivottu N-suojattu aminohappo kytketään viimeksi kytketyn aminohapon N-päätteeseen. Aminohapon C-päät-teen tällainen kytkeminen viimeksi liitetyn aminohapon N-päätteeseen voidaan toteuttaa usealla eri tavalla. Esimerkiksi/ se voidaan sitoa saattamalla uusi aimnohappo sellaiseen muotoon/ jossa sen karboksyyliryhmä on aktivoitu millä tahansa usealla mahdollisella menetelmällä/ mukaan lukien aktiivisen esterijohdannaisen alustava muodostaminen, joista esterijohdannaisiata voidaan mainita 2, 4, 5-trikloorifenyyliesteri (Pless, et ai., Helv. Chim. Acta, 1963, 46, 1609), ftalimidoesteri (Nefkens, et ai., J. Am. Chem. Soc. , 1961, 83, 1263), pentakloorifenyy-liesteri (Kupryszewski, Rocz. Chem. , 1961, 35, 595), pentafluo-rifenyyliesteri (Kovacs, et ai., J. Am. Chem. Soc. , 1963, 85, 183), o-nitrofenyyliesteri (Bodanzsky, Nature, 1955, 175, 685), imidatsoliesteri (Li, et ai., J. Am. Chem. Soc. , 1970, 92, 7608) sekä 3-hydroksi-4-okso-3,4-dihydrokinatsoliini (Dhbt-OH-) esteri (Konig et ai., Chem. Ber.. 1973, 103, 2024 ja 2034), tai anhydridin kuten symmetrisen anhydridin alustava muodostaminen (Wieland et ai., Angew. Chem. Int. Ed. Enql. , 1971, 10, 336). Vaihtoehtoisesti, kytkettävän aminohapon karboksyyli ryhmä voidaan saattaa reagoimaan suoraan viimeksi kytketyn aminohapon N-päätteen kanssa käyttäen apuna konden-sointireagenssia kuten esimerkiksi disykloheksyylikarbodi-imi- * . .* dia (Sheehan, et ai., J. Am. Chem. Soo. , 1955, 77 1067) tai ··« sen johdannaisia. Bentsotriatsolyyli-N-oksitris-dimetyyliami-nofosfonium-heksafluorifosfaattia (BOP) eli "Castro: n reagens-: :*: siä" (katso esim. Rivaille et ai. , Tetrahedron, 1980. 36.
*4« « " {V. 3413) suositellaan koottaessa PNA-molekyylejä, jotka sisältä- • · vät sekundäärisiä aminoryhmiä. Lopuksi, aktivoidut PNA-mono-meerit, jotka ovat analogisia jokin aika sitten kuvattujen ^ aminohappofluoridien suhteen (Caprino, J. Am. Chem. Soc. , "·* 1990, 112, 9651), ovat myös hyvin lupaavia ajatellen käyttöä * · s * PNA-synteesissä.
e ·
Toivotun PNA-ketjun, suojaavat ryhmät mukaan lukien, kokoami-sen jälkeen seuraavana vaiheena on normaalisti suojaavien **,**, ryhmien poistaminen PNA-ketjun aminohappo-osista ja synteti- * ’m 29 118424 soidun PNA: n irrotus kiinteästä kantajasta. Nämä toimenpiteet voidaan toteuttaa olennaisesti samanaikaisesti, jolloin vapaa PNA-molekyyli saadaan toivotussa muodossa. Vaihtoehtoisesti tapauksissa, joissa kaksi erikseen syntetisoitua PNA-ketjua on tarkoitus kondensoida, tämä saadaan mahdolliseksi valitsemalla sopiva väliryhmä synteesin alussa toivottujen PNA-ketjujen irrottamiseksi niiden vastaavista kiinteistä kantajista (kummankin peptidiketjun käsittäessä edelleen sivuketjuja suojaavat ryhmät), ja poistamalla lopuksi sivuketjuja suoj aavat ryhmät esimerkiksi sen jälkeen, kun nämä kaksi sivuketjuistaan suojattua peptidiketjua on kytketty toisiinsa pitemmän PNA-ket-jun muodostamiseksi.
Edellä mainitussa "Boc-bentsyyli" -suojausmenetelmässä suojaa-vien ryhmien lopullinen poistaminen sivuketjuista ja PNA-mole-kyylin vapauttaminen kiinteästä kantajasta toteutetaan useimmiten käyttämällä vahvoja happoja kuten vedetöntä fluorivetyä HF (Sakakibara, et ai., Bull. Chem. Soc. Jpn. , 1965, 38, 4921), boori-tris-(trifluoriasetaattia) (Pless, et ai., Helv. Chim. Acta, 1973, 46, 1609), sekä sulfonihappoja kuten trifluorime- taanisulfonihappoa ja metaanisulfonihappoa (Yajima, et ai., J. Chem. Soc. , Chem. Comm. , 1974, 107). Tämä tavanomainen vahvaan happoon (esim. vedettömään fluorivetyyn HF) perustuva menetelmä suojaavien ryhmien poistamiseksi tuottaa hyvin reaktii-,*.· visia hiilikationej a, jotka saattavat johtaa PNA-ketjussa ***[: herkkien jäännösten alkyloitumiseen ja asyloitumiseen. Tällai- ·',· set sivureaktiot voidaan välttää vain osittain puhdistavien f · ί .*, lisäaineiden kuten anisolin, fenolin, dimetyylisulfidin ja
*M I
merkaptoetanolin läsnäollessa, ja tästä syystä sulfidia apuna- t » ]··*, käyttävää asidolyyttistä Sn2-menetelmää suojaavien ryhmien • · · poistamiseksi (Tam, et ai. , J. Am. Chem. Soc. , 1983, 105, 6442; sekä J. Am. Chem, Soc. , 1986, 108, 5242), niinkutsuttua ·*· " low"-menetelmää, joka poistaa haitallisten hiilikationien M» V : esiasteet inerttejä sulfoniumsuoloja muodostaen, käytetään *··; usein peptidi- ja PNA-synteesissä joko yksinään tai yhdessä .··*. "high"-menetelmien kanssa. Muista menetelmistä, joita käyte- • · · \ tään erikoistapauksissa harvemmin suojaavien ryhmien poistami- • I» *··· seen ja/tai PNA: n lopulliseen irrottamiseen kiinteästä kanta- • ·* • · 30 118424 jasta, voidaan mainita esimerkiksi emäskatalysoitu alkoholyysi (Barton, et ai., J. Am. Chem. Soc., 1973, 95, 4501) ja ammono-lyysi sekä hydratsinolyysi (Bodanszky, et ai., Chem. Ind. , 1964, 1423), hydrogenolyysi (Jones, Tetrahedron Lett., 1977, 2853, ja Schlatter, et ai., Tetrahedron Lett. , 1977, 2861) sekä fotolyysi (Rch ja Gurwara, J. Am. Chem. Soc. , 1975, 97, 1575).
Lopuksi, toisin kuin "normaaleiden" peptidien synteesissä, akiraalisten PNA-molekyylien, esimerkiksi aminoetyyliglysyyli-runkoyksikköihin perustuvien molekyylien vaiheittain tapahtuva ketjun muodostaminen voidaan aloittaa joko N-päätteestä tai C-päätteestä, koska kytkentäreaktioissa ei tapahdu rasemoitumista.
Sen havainnon, että useimmat toimenpiteet ovat samanlaisia kiinteään faasiin perustuvan peptidisynteesin synteesijaksois-sa (kuten asianlaita on myös kiinteään faasiin perustuvassa PNA-synteesissä), perusteella jokin aika sitten on alettu käyttää uutta matriisia PEPS (Berg, et ai., J. Am. Chem. Soc. , 1989, 111, 8024, sekä kansainvälinen patenttihakemus WO
90/02749) monien peptidien valmistuksen helpottamiseksi. Tämä matriisi käsittää polyeteenikalvon (PE-kalvon), jossa on kiinni pitkäketjuisia polystyreeni- (PS-) oksia (molekyylipaino * suuruusluokkaa 10*). Kalvon kuormituskapasiteetti on yhtä '***! suuri kuin helminä olevalla matriisilla, mutta PEPS-matriisiin liittyy lisäksi se etu, että se soveltuu samanaikaisesti usei- * · : .*· siin synteeseihin. Niinpä kiinteään fasiin perustuvan peptidi-• ·* · j\·. synteesin uudessa suoritusmuodossa tästä PEPS-kalvosta on /··, tehty erillisiä leimattuja arkkeja, joista kukin toimii erilli- f · « senä osastona. Synteesijaksojen kaikkien identtisten vaiheiden t aikana näitä arkkeja pidetään yhdessä, vain yhdessä reaktioas-··· •••j tiassa monien peptidien samanaikaiseksi valmistamiseksi nopeu-V * della, joka on lähellä sitä nopeutta, jolla vain yhtä peptidiä ···♦· valmistetaan tavanomaisilla menetelmillä. Pääteltiin, että ,***. kantajana toimivan PEPS-kalvon, joka käsittää kyseessä olevaan «e· *, erityiseen kemiaan mukautettuja kytkijä- tai väliryhraiä, pitäi-··» si olla erityisen arvokas monien PNA-molekyylien synteesissä, e · * • e · 31 118424 joiden molekyylien syntetisoiminen on periaatteessa helppoa, koska tavallisesti tarvitaan vain neljä erilaista reaktio-osastoa, yksi kutakin neljää "pseudo-nukleotidi"-yksikköä varten. Näin ollen tämä PEPS-kalvokantaja on testattu onnistuneesti lukuisissa PNA-synteeseissä, jotka on toteutettu rinnakkain ja olennaisesti yhtäaikaa. PEPS: in avulla saatujen tuotteiden saanto ja laatu oli samankaltainen kuin käytettäessä kantajana perinteistä, helminä olevaa polystyreeniä. Samoin ne kokeet, jotka on toteutettu käyttäen PEPS-polymeerin muita geometrisia muotoja kuten esimerkiksi huovikemattoa, kudottua verkkoa, tikkuja tai mikrokuoppalevyjä, eivät ole osoittaneet millään tavalla rajoittunutta synteesitehoa.
Kahta muuta menetelmää, joita on ehdotettu suurten peptidimää-rien samanaikaiseen synteesiin, voidaan myös käyttää lukuisten erilaisten PNA-molekyylien valmistamiseen. Näistä menetelmistä ensimmäisessä (Geysen, et ai. , Prop. Natl. Acad. Sei. OSA, 1984, 3998) käytetään akryylihapolla oksastettuja polyeteeni-sauvoja ja 96-kuoppaista mikrotiitterilevyä kasvavien peptidi-ketjujen immobilisoimiseksi ja osastoihin jaetun synteesin suorittamiseksi. Tämä menetelmä on erittäin tehokas, mutta sitä voidaan käyttää vain mikrogrammatasolla. Toisessa menetelmässä (Houghten, Proc, Natl. Acad. Sei. USA, 1985, 82, 5131) käytetään "teepussia", joka sisältää perinteisesti käy- ψ tettyjä polymeerihelmiä. Oheisen keksinnön yhteydessä tehdyis-’*’· tä muista asiaanliittyvistä ehdotuksista lukuisten peptidien •\* tai PNA-molekyylien syntetisoimiseksi voidaan mainita kahden • · ; erilaisen kantajan, joilla on erilainen tiheys, samanaikainen ««« e ;v. käyttö (Tregear, teoksessa "Chemistry and Biology of Pepti- • t *.,ί des", J. Meienhofer, toim., Ann Arbor Sei. Pubi., Ann Arbor, • e · ' ' ' ' ' ees * 1972, sivut 175-178), reaktioastioiden yhdistäminen jakosar- jalla (Gorman, Anal. Biochem. , 1984, 136, 397), useita pylväi- •et ” ··« tä ja kiinteätä faasia hyväksikäyttävä synteesi (esim.
V : Krchnak, et ai. , Int. J. Peptide Protein Res. , 1989, 33, 209; sekä Holm ja Meldal, julkaisussa "Proceedings of the 20th.
,···, European Peptide Symposium",, G. Jung ja E. Bayer, toim., **] Walter de Gruyter & Co., Berliini, 1989, sivut 208-210), sekä
IM
"·! selluloosapaperin käyttö (Eichler, et ai. , Collect. Czech.
• « " • t · « »« e · 32 118424
Chem. Commun. , 1989, 54, 1746).
Vaikka tällä hetkellä kiinteään faasiin perustuvassa PNA-syn-teesissä edullisina pidetäänkin tavanomaista, silloittuneesta styreeni/divinyylibentseeni-sekapolymeerista muodostuvaa matriisia ja PEPS-kantajaa, niin rajoittamattomina esimerkkeinä mahdollisesti käyttökelpoisista kiinteistä kantajista voidaan kuitenkin mainita: (1) hiukkaset, jotka perustuvat N, N'-bisak- ryloyylietyleenidiamiinilla, mukaan lukien tunnettu määrä N-tert. -butoksikarbonyyli-beeta-alanyyli-N' -akryloyyli-heksa-metyleenidiamiinia, sillostettuihin dimetyyliakryyliamidin sekapolymeereihin. Useita väliryhmämolekyylejä lisätään tyypillisesti beeta-alanyyliryhmän välityksellä, joita väliryhmämolekyylejä seuraavat sitten aminohappojäännöksistä muodostuvat alayksiköt. Samoin beeta-alanyyliä sisältävä monomeeri voidaan korvata akryloyylisarkosiinimonomeerilla polymeroinnin aikana hartsihelmien muodostamiseksi. Polymerointia seuraa helmien reaktio etyleenidiamiinin kanssa sellaisten hartsi-hiukkasten muodostamiseksi, jotka hiukkaset sisältävät primäärejä amiineja kovalenttisesti sitoutuneina funnktionaalisinä ryhminä. Nämä polyakryyliamidiin perustuvat kantajat ovat suhteellisesti hydrofiilisempia kuin polystyreeniin perustuvat kantajat, ja niitä käytetään tavallisesti yhdessä polaaristen . aproottisten liuottimien kanssa, joista liuottimista voidaan mainita dimetyyliformamidi, dimetyyli-asetamidi, N-metyylipyr- * · ···* rolidoni ja muut vastaavat (katso Atherton et ai., J. Am.
* · *i Chem. Soc. , 1975, 97 6584, Bioorg, Chem. , 1979, 8, 351), sekä • · :.· · J. C. S. Perkin I 538 (1981); (2) kiinteiden kantajien toinen • '/· ryhmä perustuu piidioksidia sisältäviin hiukkasiin kuten huo- :T: koisiin lasihelmiin ja silikageeliin. Eräs esimerkki on trik- loori-[3-(4-kloorimetyyli)-fenyyli]propyylisilaanin ja huokois-.:. ten lasihelmien välinen reaktiotuote (katso Parr ja Grohmann,
Angew. Chem. Intern. Ed., 1972, 11, 314), iota yhtiö Waters • · e ui i
*· Associates, Framingham, MA, USA, myy tavaramerkkinä " PORASIL
: E". Samalla tavalla käyttökelpoiseksi on kuvattu 1, 4-dihydrok- ··· si-metyylibentseenin ja piidioksidin välinen monoesteri (jota e yhtiö Waters Associates markkinoi tavaramerkkinä "BIOPAK") .·! : (katso Bayer ia Jung, Tetrahedron Lett., 1970, 4503); (3) • e* 1 r • · 33 118424 käyttökelpoisten kiinteiden kantajien kolmas yleinen tyyppi voidaan kuvata yhdistelmämateriaaleiksi siinä suhteessa, että ne sisältävät kahta varsinaista aineosaa: hartsia ja toista materiaalia, joka on myös olennaisesti inerttiä tässä orgaanisessa synteesireaktiossa käytetyissä olosuhteissa. Esimerkkinä voidaan mainita komposiitti (katso Scott, et ai., J. Chrom. Sei. , 1971, 9, 577), jossa käytetään lasihiukkasia, jotka on pinnoitettu hydrofobisella, silloitetulla styreenipolymeeril-la, joka sisältää reaktiivisia kloorimetyyliryhmiä, ja jota saatiin yhtiöstä Northgate Laboratories, Inc. , Hamden, CT, USA. Toinen esimerkkinä mainittava yhdistelmämateriaali sisältää fluorattua eteenipolymeeria olevan ytimen, jonka pinnalle on oksastettu polystyreeniä (katso Kent ja Merrifield, Israel J. Chem. , 1978, 17, 243; sekä van Rietschoten teoksessa "Pepti des 1974", Y. Wolman, toim. , Wiley & Sons, New York, 1975, sivut 113-116); sekä (4) toisiinsa rajoittuvat, muuta kuin PEPS: iä olevat kiinteät kantajat, kuten puuvilla-arkki (Lebl ja Eichler, Peptide Res. , 1989, 2, 232) ja hydroksipropyyliak-rylaatilla pinnoitetut polypropyleenikalvot (Daniels, et ai., Tetrahedron Lett., 1989, 4345) soveltuvat myös PNA-synteesiin.
Oheisessa keksinnössä kiinteään faasiin perustuva PNA-synteesi toteutetaan tavallisesti panoksittain riippumatta siitä, toteutetaanko synteesi käsin vain automaattisesti. Suurin osa * J.I synteeseistä voidaan kuitenkin toteuttaa yhtä hyvin jatkuvaan · virtaukseen perustuvalla tavalla, jolloin kantaja on pakattu • * · pylväisiin (Bayer, et ai., Tetrahedron Lett. , 1970, 4503; ja i Scott, et ai., J. Chromatoqr. Sei. , 1971, 9, 577). Mitä tulee * * · ί *.· jatkuvaan virtaukseen ja kiinteään faasiin perustuvaan syntee-• · · V i siin, jäykkä poly(dimetyyliakryyliamidi)-piimaakantaja (Atherton, et ai., J. Chem. Soc. Chem. Commun.. 1981, 1151) on osoit-··· tautunut siinä erityisen käyttökelpoiseksi, mutta toinen arvo- • e·# kas suoritusmuoto perustuu tavanomaiseen sekapolyistyreeni -*. 1 % divinyylibentseeni)kantajaan (Krchnak, et ai., Tetrahedron
Lett., 1987, 4469).
• · • · ··· 1 2
Vaikka PNA-synteesissä käytetäänkin tällä hetkellä edullisesti 2 .*. : kiinteään faasiin perustuvaa tekniikkaa, niin käyttökelpoisia • · 34 118424 ovat kuitenkin myös muut menettelytavat tai niiden yhdistelmät, esimerkiksi yhdistettynä tähän kiinteään faasiin perustuvaan tekniikkaan: (1) perinteiset liuosfaasissa toteutetut menetelmät peptidisynteesiä varten (esim. Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, Berlin-New York 1984), jossa synteesissä toteutetaan vaiheittainen kokoaminen tai lohko/kappale-kondensaatio, ovat erityisen käyttökelpoisia tuotettaessa PNA-yhdisteitä etenkin suuressa mittakaavassa (grammoja, kilogrammoja ja jopa tonneja); (2) niinkutsuttu " nestefaasi"strategia, jossa käytetään hyväksi liukoisia poly-meerikantajia kuten lineaarista polystyreeniä (Shemyakin, et ai., Tetrahedron Lett., 1965, 2323) sekä polyeteeniglykolia (PEG) (Mutter ja Bayer, Angev. Chem. Int. Ed. Engl. , 1974, 13, 88), on käyttökelpoinen; (3) satunnaispolymerointi (katso esim. Odian, "Principles of Polymerization", McGraw-Hill, New York (1970), josta saadaan molekyylipainoltaan hyvin erilaisten ("polydisperssien") peptidi- tai PNA-molekyylien seoksia, on erityisen käyttökelpoinen esimerkiksi sellaisiin tarkoituksiin kuten anti-virusvaikutusten seulontaan; (4) tekniikkaan, joka perustuu polymeerin kannattamien aminohappojen aktiivisten estereiden käyttöön (Fridkin, et ai. , J. Aro. Chem. Soc. , 1965, 87, 4646), ja jota kutsutaan joskus "käänteiseksi Merri-field-synteesiksi" tai "polymeerireagenssisynteesiksi", liittyy etuna välituotteiden eristäminen ja puhdistaminen, ja näin ollen sitä voidaan käyttää erityisen sopivana menetelmänä * · ;··1 keksikokoisten, valinnaisesti suojattujen PNA-molekyylien *. 1ί syntetisoimiseksi, joita PNA-molekyylejä voidaan käyttää myö-* 1 · hemmin kappaleiden kondensaatiossa suurempien PNA-molekyylien ·· · t 1#i saamiseksi; (5) mahdollista on se, että PNA-molekyylejä voi-:T: daan koota entsymaattisesti käyttäen entsyymejä kuten proteaa- seja tai niiden johdannaisia, joiden spesifisyydet ovat uusia (joita on saatu esimerkiksi keinotekoisesti esimerkiksi prote-.···, iini muokkauksen a). Mahdollista on myös kehittää "PNA-ligaa- i i · *. ^ seja" lukuisten PNA-kappaleiden kondensoimiseksi hyvin suurik- 1 si PNA-molekyyleiksi; (6) koska vasta-aineita voidaan kehittää * · · lähes mille tahansa mielenkiintoiselle molekyylille, niin PNA-molekyylien kokoamiseen sopiviksi mahdollisiksi kandidaa- ,·, · teiksi tulisi katsoa myös jokin aika sitten kehitetyt katalyyt-• · · • · 35 118424 tiset vasta-aineet (abtsyymit), jotka Lerner: in ryhmä (Traman-tano, et al. , Science, 1986, 234, 1566) ja Schultz: in ryhmä (Pollack, et al., Science, 1986, 234, 1570) havaitsivat samanaikaisesti. Niinpä, alalla on koettu huomattavaa onnistumista asyylisiirtoreaktioita katalysoivien abtsyymien tuotannossa (katso esim. Shokat, et al. , Nature, 1989, 338, 269; sekä siinä esitetyt viittaukset). Lopuksi täysin keinotekoisia entsyymejä, joita Stewart: in ryhmä (Hahn, et al., Science, 1990, 248, 1544) on saanut aikaan aivan viimeaikoina, voidaan kehittää siten, että ne soveltuvat PNA-synteesiin. Yleisesti käyttökelpoisten entsyymien, ligaasien ja katalyyttisten vasta-aineiden, jotka kykenevät välittämään spesifisiä kytkentäreaktiöitä, suunnittelun tulisi olla helpompaa PNA-synteesin tapauksessa kuin "normaalin” peptidisynteesin tapauksessa, koska PNA-molekyylit koostuvat usein vain neljästä erilaisesta aminohaposta (yksi kutakin neljää luonnollista nukleoemästä kohden) verrattuna kahteenkymmeneen luonnolliseen (proteinogeeniseen) aminohappoon, joista peptidin muodostuvat. Yhteenvetona voidaan esittää, ettei vain yksi strategia ole ehkä täysin sopiva spesifisen PNA-molekyylin syntetisoimiseksi, ja tästä syystä menetelmien yhdistelmä saattaa toimia parhaiten.
(a) Monomeeristen rakennelohkojen synteesiin liittyvät kokeet
Monomeerit syntetisoidaan edullisesti kuviossa 8 esitetyllä .*.· yleisellä tavalla. Tähän liittyy joko (Boc-aminoetyyli)glysii-··· nin metyyli- tai etyyliesterin valmistus esimerkeissä 21-23 kuvattua suojaavan ryhmän liittämis/poistamistoimenpidettä • käyttäen. Tymiinimonomeerin synteesi on kuvattu esimerkeissä • ·« · 24-25 ja suojatun sytosiinimonomeerin synteesi on kuvattu • · esimerkissä 26.
• · * \ . Suojatun adeniinimonomeerln synteesiin (kuvio 14) liittyi etyylibromiasetaatin alkylointi (esimerkki 27) sekä substi- • · · *\ * tuoitumisaseman varmistaminen röntgensädekristallografisesti, ·;·*: 9-aseman ollessa haluttu. Sitten Ne-aminoryhmä suojattiin sitten bentsyylioksikarbonyyliryhmällä käyttämällä reagenssina ··« \t N-etyyli-bentsyylioksikarbonyyli-imidatsoli-tetrafluoriboraat-**”, tia (esimerkki 28). Tuote-esterin yksinkertainen hydrolyysi • t · · · · 36 118424 (esimerkki 29) tuotti N*-bentsyylioksikarbonyyli-9-karboksime-tyyliadeniinia, jota käytettiin sitten standarditoimenpiteissä (esimerkit 10-11, kuvio 8). Adeniinimonomeeri on sijoitettu kahteen erilaiseen PNA-oligomeeriin (esimerkit 30 ja 31).
Suojatun G-monomeerin synteesiä havainnollistetaan kuviossa 15. Lähtömateriaali eli 2-amino-6-klooripuriini alkyloitiin bromietikkahapolla (esimerkki 32) ja klooriatomi substatuoitiin sitten bentsyylioksiryhmällä (esimerkki 36). Tuloksena ollut happo kytkettiin sitten (Boc-aminoetyyli)glysiini-metyy-liesteriin (esimerkki 33) reagenssilla PyBrop*"», ja tuloksena ollut esteri hydrolysoitiin (esimerkki 23). O*-bentsyyliryhmä poistettiin lopullisessa HF-pilkkomisvaiheessa PNA-oligomeerin synteesissä. Pilkkoutuminen varmistettiin toteamalla lopullisen PNA-oligomeerin odotettu massa sisällytettynä PNA-oligomeeriin käyttäen kondensointiaineena di-isopropyylikarbodi-imidiä (esimerkki 52).
Koe-esimerkeissä on käytetty seuraavia lyhenteitä: DFM N, N-dimetyyliformamidi; DCC N,N-disykloheksyyli-karbodi-imidi; DCU N, N-disykloheksyyliurea; THF tetrahydrofuraani; aeg N-asetyy- 11- (2-aminoetyyli)glysiini; pfp pentafluorifenyyli; Boc tert. -butoksikarbonyyli; Z bentsyylioksikarbonyyli; NMR ydinmagneet-tinen resonanssi; s singletti; d dubletti; dd dublettien dub-letti; t tripletti; q kvartetti; m multipletti; b leveä; δ i · ;··[ kemiallinen siirtymä.
i t · • * • * • m : NMR-spektrit määritettiin joko JEOL FX 90Q-spektrometrillä tai • · · * V Bruker 250 MHz-laitteella, käyttäen sisäisenä standardina **·
ϊ#! ϊ tetrametyylisilaania. Massaspektrit määritettiin MassLab VG
12- 250 kvadrupoli-instrumentilla, joka käsitti VG FAB-lähteen ja koettimen. Sulamispisteet määritettiin Buchi-sulamispiste- 1*«· laitteella ja niitä ei ole korjattu. N, N-dimetyyliformamidi • t kuivattiin 4 k molekyyliseuloilla, tislattiin ja säilytettiin | * 4 Ä-molekyyliseulojen läsnäollessa. Pyridiini (HPLC-laatu) *...· kuivattiin ja sitä säilytettiin 4 k molekyyli seulojen läsnäol- * ··· lessa. Muut käytetyt liuottimet olivat joko parhainta saata-«··· ,·. : villa olevaa laatua tai ne tislattiin ennen käyttöä. Dioksaani m m 37 118424 johdettiin emäksisen alumiinioksidin läpi ennen käyttöä. Boc-anhydridia, 4-nitrofenolia, metyylibromiasetaattia, bentsyyli-oksikarbonyylikloridia ja pentafluorifenolia saatiin yhtiöstä Aldrich Chemical Company. Tymiiniä, sytosiinia ja adeniinia saatiin yhtiöstä Sigma.
Ohutkerroskromatografiset määritykset (tie) toteutettiin käyttäen seuraavia liuotinjärjestelmiä: (1) kloroformi: trietyyli-amiini: met anoi i 7:1:2; (2) metyleenikloridi: metanoli 9:1; (3) kloroformi: metanoli: etikkahappo 85:10:5. Täplät saatiin näkyviin UV-valolla (254 nm) ja/tai sumuttamalla niihin ninhydrii-niliuosta (3 g ninhydriiniä 1000 ml: ssa 1-butanolia ja 30 ml: ssa etikkahappoa), sen jälkeen, kun levyjä oli kuumennettu 120 *C:ssa 5 minuutin ajan, ja levyjä kuumennettiin jälleen sumuttamisen jälkeen.
Jatketut rungot
Ryhmissä A, C ja D esiintyviä vaihteluja (kuvio 16) havainnollistetaan monomeeristen rakennelohkojen synteesillä ja sisällyttämisellä FNA-oligomeereihin.
Eräässä esimerkissä C-ryhmä oli CH(CH3)-ryhmä. Vastaavan mono-meerin synteesi on kuvattu kuviossa 17. Siihen kuuluu Boc-, suojatun l-amino-2,3-propaanidiolin valmistus (esimerkki 35), joka l-amino-2, 3-propaani di oli pilkotaan perjodaatilla boc-aminoasetaldehydiksi, jota käytetään suoraan seuraavassa reak- • · *. ·: tiossa. Tämä boc-aminoasetaldehydi voidaan kondensoida eri- • · :,· · laisten amiinien kanssa; esimerkissä 36 käytettiin alaniinie-| V tyyliesteriä. Esimerkeissä 17-19 valmistettiin vastaavia ty- ϊΤϊ miinimonomeereja. Tämä monomeeri on sisällytetty 8-meeriin DCC-kytkemismenetelmällä (esimerkit 30 ja 31).
* e·· »»*· ,···, Eräässä toisessa esimerkissä D-ryhmä on (CHe)3-ryhmä. Vastaa- vt· van monomeerin synteesiä on havainnollistettu kuviossa 18A ja ’"*· se on kuvattu esimerkeissä 40 ja 46.
e·· e · • e
»M
Eräässä toisessa esimerkissä A-ryhmä on (CHa) 2CO-ryhmä. vas- *··· .·, : taavan tyrniini monomeeri n synteesiä on havainnollistettu kuvi- s • · 38 1 1 8 4 2 4 ossa 18b ja se on kuvattu esimerkeissä 42-45.
Edelleen eräässä muussa esimerkissä C-ryhmä on (CHa)a-ryhmä. Tymiinin ja suojatun sytosiinimonomeerin synteesiä on havainnollistettu kuviossa 19 ja se on kuvattu esimerkeissä 46-51, Hybridisointikokeet yhden yksikön käsittävällä PNA-oligomee-rillä on kuvattu esimerkissä 61, josta nähdään affiniteetin merkittävä pieneneminen mutta spesifisyyden säilyminen.
Esimerkki 1
Tert. -butyyli-4-nitrofenyylikarbonaatti
Natriumkarbonaattia (29,14 g; 0, 275 mol) ja 4-nitrofenolia (12,75 g; 91,6 mmol) sekoitettiin dioksaaniin (250 ml). Boc-anhydridi (20,0 g; 91,6 mmol) siirrettiin tähän seokseen diok-saanin (50 ml) avulla. Seosta palautusjäähdytettiin 1 tunnin ajan, se jäähdytettiin 0 ’ C: n lämpötilaan, suodatettiin ja väkevöitiin 1/3, minkä jälkeen se kaadettiin veteen (350 ml), jonka lämpötila oli 0 *C. Puolen tunnin sekoittamisen jälkeen tuote otettiin talteen suodattamalla, se pestiin vedellä ja kuivattiin sitten vakuumissa sikapentillä. Saanto 21, 3 g (97%). Sp. 73, 0-74, 5 *C (kirjallisuudesta 78, 5-79, 5 *C).
Analyysi yhdisteelle CnHisNOs: todettu (laskettu): C 55, 20 (55, 23) H 5,61 (5,48) N 5,82 (5,85).
• · • e*
Esimerkki 2 ; Γϊ (Ν' -Boc-2' -aminoetyyli)glysiini (2) ··♦ ·
If I
i · : * ·
Otsikon mukainen yhdiste valmistettiin muokkaamalla Heimer: in e et ai. menetelmää. N-(2-aminoetyyli)glysiiniä (1, 3,00 g; 25,4 . mmol) liuotettiin veteen (50 ml), liuokseen lisättiin dioksaa-*1** nia (50 ml) ja pH asetettiin arvoon 11,2 2 N natriumhydroksi- i i f *\ * dilla. Tert.-butyyli-4-nitrofenyylikarbonaattia (7,29 g; 30,5 mmol) liuotettiin dioksaaniin (40 ml) ja liuos lisättiin pisa-
{*": roittain 2 tunnin aikana, pitäen pH samalla arvossa 11,2 2N
• * * natriumhydroksidilla. pH asetettiin aika-ajoin arvoon 11,2 ’1. vielä kolmen tunnin aikana ja sitten liuos jätettiin rauhaan • « · • *· • · 39 118424 yön ajaksi. Liuos jäähdytettiin 0 ' C: n lämpötilaan ja pH asetettiin huolella arvoon 3, 5 0, 5 M kloorivetyhapolla. Vesiliuos pestiin kloroformilla (3x200 ml), pH asetettiin arvoon 9,5 2N natriumhydroksidillä ja liuos haihdutettiin kuiviin vakuumissa (14 mmHg). Jäännös uutettiin DMF: llä (25 + 2x10 ml) ja uutteet suodatettiin liiallisen suolan poistamiseksi. Tällä tavalla saatiin otsikon mukaista yhdistettä sisältävä liuos, saannon ollessa 60 %, ja puhtauden ollessa enemmän kuin 95 % tlc-mää-rityksellä (järjestelmä 1, täplät saatu näkyviin ninhydriinil-lä, Rf 0,3). Liuosta käytettiin Boc-aeg-johdannaisten seursavissa valmistuksissa sitä tämän enempää puhdistamatta.
Esimerkki 3 N-l-karboksimetyylitymiini (4) Tämä menettelytapa eroaa kirjallisuuden mukaisesta synteesistä, mutta se on helpompi, sillä päästään suurempiin saantoihin ja siinä tuotteeseen ei jää reagoimatta jäänyttä tymiiniä. Suspensioon, joka sisälsi tymiiniä (3, 40,0 g; 0,317 mol) ja kaliumkarbonaattia (87,7 g; 0, 634 mmol) DMF: ssä (900 ml), lisättiin metyylibromiasetaattia (30, 00 ml; 0,317 mmol). Tätä seosta sekoitettiin voimakkaasti yön yli typpi-ilmakehässä. Seos suodatettiin ja haihdutettiin vakuumissa kuiviin. Kiinteätä jäännöstä käsiteltiin vedellä (300 ml) ja 4 N kloorivetyhapol-*,· la (12 ml), sitä sekoitettiin 15 minuuttia 0 * C: ssa, se suoda- ·’**: tettiin ja pestiin vedellä (2x75 ml). Sakkaa käsiteltiin vedel- ♦ *» ·*·.· lä (120 ml) ja 2N natriumhydroksidilla (60 ml) ja sitä keitet- • e J tiin 10 minuuttia. Seos jäähdytettiin 0 * C: n lämpötilaan, se •V. suodatettiin ja puhdas otsikon mukainen yhdiste saostettiin *·»·. lisäämällä 4N kloorivetyhappoa (70 ml). Saanto sen jälkeen, • e • kun tuote oli kuivattu vakuumissa sikapentin läsnäollessa: . 37,1 g (64 %). 1H-NMR: (90 MHz; DSMO-de): 11,33 ppm (s, 1H, \*:Γ Nä); 7'49 <d' J=0, 92 Hz, 1H, ArH); 4,38 (s, 2H, CHa); 1,76 (d, V* J-0,92 Hz, T-CH·).
* e • 4 e·» t : e*· 1 »♦·· t · • f I ft *· e * 40 118424
Esimerkki 4 N-l-karboksimetyylitymiini-pentafluorifenyyliesteri (5) N- 1-karboksi metyyli tyrni iniä (4/ 10/0 g; 54/3 mmol) ja penta- fluorifenolia (10/0 g; 54/3 mmol) liuotettiin DMF: ään (100 ml) ja jäähdytettiin 5 *C:n lämpötilaan jäävedessä. Sitten lisättiin yhdistettä DCC (13,45 g; 65,2 mmol). Kun lämpötila oli laskenut alemmaksi kuin 5 *C, jäähaude poistettiin ja seosta sekoitettiin 3 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Saostunut DCU poistettiin suodattamalla ja se pestiin kahdesti DMF: llä (2x10 ml). Yhdistetty suodos kaadettiin eetteriin (1400 ml) ja jäähdytettiin 0 *C: n lämpötilaan. Petrolieetteriä (1400 ml) lisättiin ja seos jätettiin rauhaan yön ajaksi. Otsikon mukainen yhdiste eristettiin suodattamalla ja se pestiin huolellisesti petrolieetterillä. Saanto: 14,8 g (78 %). Tuote oli riittävän puhdasta seuraavan reaktion toteuttamiseen, mutta analyyttinen näyte saatiin kiteyttämällä uudestaan 2-propano-lista. Sp. 200, 5-206 * C. Analyysi yhdisteelle CisH^FsNaCU: todettu (laskettu): C 44, 79 (44, 59); H 2,14 (2,01) N 8,13 (8,00). FAB-MS: 443 (M+l+glyseroli), 351 (M+l). 1H-NMR (90 MHz; DMSO-de): 11,52 ppm (s, 1H, NH); 7,64 (s, 1H, ArH); 4,99 (s, 2H, CH2); 1,76 (s, 3H, CH3).
. Esimerkki 5 * l-(Boc-aeg)tyrniini (6) * · » · · • f • · » *· Edellä saatuun DMF-liuokseen lisättiin tri etyyli amiini a (7,08 : ml; 50,8 mmol) ja sitten N-l-karboksimetyylitymiini-pentafluo- • · · : *.· rifenyyliesteriä (5, 4,45 g; 12,7 mmol). Tuloksena ollutta V · liuosta sekoitettiin 1 tunnin ajan. Liuos jäähdytettiin 0 * C: n lämpötilaan ja sitä käsiteltiin kationinvaihtomateriaalilla .:. ("Dowex 50W X-8", 40 g) 20 minuutin ajan. Kationinvaihtomate- ···· riaali poistettiin suodattamalla, se pestiin dikloorimetaanil- • la (2x15 ml) ja dikloorimetaania (150 ml) lisättiin. Tuloksena * * · · · » ollut liuos pestiin kylläisellä natriumkloridilla, kuivattiin • « · magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin vakuumissa kuiviin, ensin vesi-imun ja sitten öljypumpun avulla. Jäännöstä ravis- *··» : teltiin yhdessä veden (50 ml) kanssa ja sitten se haihdutet- • · 41 118424 tiin kuiviin. Tämä toimenpide toistettiin yhden kerran. Sitten jäännös liuotettiin metanoliin (75 ml) ja kaadettiin eetteriin (600 ml) ja petroolieetteriin (1,4 1). Koko yön kestäneen
sekoittamisen jälkeen valkoinen kiintoaine eristettiin suodat-tamalla ja se pestiin petrolieetterillä. Kuivaaminen sikapen-tin läsnäollessa vakuumissa, tuotti 3,50 g (71,7 %). Sp. 142-147 * C. Analyysi yhdisteelle CxeHa^N^Ov: todettu (laskettu) C 49, 59 (50,00) H 6, 34 (6, 29) N 14, 58 (14, 58). lH-NMR
(250 MHz, OMSO-de): Johtuen siitä, että pyöriminen sekundäärisen amidisidoksen ympäri oli rajoittunut, useat signaalit olivat kaksinkertaisia suhteessa 2: 1 (ilmoitettu luettelossa lyhenteellä mj, joka tarkoittaa suuri (major), ja mi, joka tarkoittaa pieni (minor). 12,73 ppm (b, 1H, -COaH); 11,27 ppm (s, mj., imidi); 11,25 ppm (s, mi., imidi); 7,30 ppm (s, mj., ArH); 7,26 ppm (s, mi., ArH); 6,92 ppm (ei erott. t, mj., BoocNH); 6,73 ppm (ei erott. t; mi., BocNH); 4,64 ppm (s, mj., T-CHa-CO-); 4,47 ppm (s, mi., T-CHa-CO-); 4,19 ppm (s, mi., CONRCHaCOaH); 3,97 ppm (s, mj., CONRCHaCOaH); 3, 41-2, 89 ppm (ei erott. m, -CHaCHa- ja vesi); 1,75 ppm (s, 3H, T-CHa); 1,38 ppm (s, 9H, t-Bu). l3C-NMR: 170, 68 ppm (CO); 170, 34 (CO); 167, 47 (CO); 167, 08 (CO); 164, 29 (CO); 150,9 (C5n); 141,92 (C6“ ); 108,04 (C2' ); 77, 95 ja 77, 68 (Thy-CHaCO); 48, 96, 47, 45 ja 46, 70 (-CHaCHa- jaNCHaH); 37, 98 (Thy-CHs); 28, 07 (t-Bu).
FAB-MS: 407 (M+Na*); 385 (M+H~).
t · • · · * · * · · : Esimerkki 6 • · * : l-(Boc-aeg)tymiini-pentafluorifenyyliesteri (7, Boc-Taeg. OPfp) • · · ··♦ * · • · · \.Γ 1-(Boc-ag)tymiiniä (6) (2,00 g; 5,20 mmol) liuotettiin DMF: ään ’ (5 ml) ja liuokseen lisättiin metyleenikloridia (15 ml). Pen- tafluorifenolla (1,05 g; 5,72 mmol) lisättiin ja liuos jäähdy- • · · ··.: tettiin 0 * C: n lämpötilaan j äähauteessa. Sitten lisättiin • · · V : yhdistettä DDC (1,29 g; 6,24 mmol) ja jäähaude poistettiin 2 ....; minuutin kuluttua. Seosta sekoitettiin 3 tunnin ajan ympäris- .···. tön lämpötilassa, minkä jälkeen saostunut DCU poistettiin • · ’♦* suodattamalla ja pestiin metyleenikloridilla. Yhdistetty suo- ...:* dos pestiin kahdesti natriumvetykarbonaatin vesiliuoksella ja • · kertaalleen kylläisellä natriumkloridilla, kuivattiin magne- 42 1 1 8424 siumsulfaatilla ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Kiinteä jäännös liuotettiin dioksaaniin (150 ml) ja liuos kaadettiin veteen (200 ml), jonka lämpötila oli 0 *C. Otsikon mukainen yhdiste eristettiin suodattamalla, pestiin vedellä ja kuivat-* tiin sikapentin läsnäollessa, vakuumissa. Saanto: 2,20 g (77 %). Analyyttinen näyte saatiin kiteyttämällä uudestaan 2-pro-panolista. Sp. 174-175, 5 * C. Analyysi yhdisteelle
CaaHaaBUO-rFs, todettu (laskettu): C 48, 22 (48, 01); H 4,64 (4,21); N 9,67 (10,18). lH-NMR (250 MHz, CDCla): Johtuen sii tä, että pyöriminen sekundäärisen amidisidoksen ympäri oli rajoittunutta, useat signaalit olivat kaksinkertaisia suhteessa 6: 1 [esitetty luettelossa lyhenteellä mj, joka tarkoittaa suurta (major), ja mi., joka tarkoittaa pientä (minor)]. 7,01 ppm (s, mi., ArH); 6,99 ppm (s, mj., ArH); 5,27 ppm (ei erott. t, BocNH); 4,67 ppm (s, mj., T-CHa-CO-); 4,60 ppm (s, mi., T-CHa-CO-); 4,45 ppm (s, mj,, CONRCHaCOaPfp); 4,42 ppm (s, mi., CONRCHaCOaPfp); 3,64 ppm (t, 2H, BocNHCHaCHa-); 3, 87 ppm ("q", 2H, BocNHCHaCHa -); 1,44 (s, 9H, t-Bu). FAB-MS: 551 (10; M+1); 495 (10; M+l-tBu); 451 (80; -Boc).
Esimerkki 7 N^-bentsyylioksikarbonyyli-sytosiini (9)
Bentsyylioksikarbonyylikloridia (52 ml; 0,36 mol) lisättiin * pisaroitta!n noin 1 tunnin aikana suspensioon, joka sisälsi ··« *...*' sytosiinia (8, 20,0 g; 0,18 mol) kuivassa pyridiinissä (1000 • · !,*·· ml), jonka lämpötila oli 0 * C, typpi-ilmakehässä, uunissa kui- jt:': vatussa laitteistossa. Sitten liuosta sekoitettiin yön yli, •V. minkä jälkeen pyridiinisuspensio haihdutettiin kuiviin vakuu-• * missä. Vettä (200 ml) ja 4N kloorivetyhappoa lisättiin siten, * että pH-arvoksi saatiin noin 1. Tuloksena ollut valkoinen sak-ka suodatettiin, pestiin vedellä ja kuivattiin osittain ilma-imulla. Yhä märkää sakkaa keitettiin absoluuttisessa etanolis- • · · *·,'* sa (500 ml) 10 minuutin ajan, se jäähdytettiin 0 * C: n lämpö- *:·*: tilaan, pestiin huolllisesti eetterillä ja kuivattiin vakuumis- sa. Saanto 24,7 g (54 %). Sp. >250 * C. Analyysi yhdisteelle • # · \ CiaHiiN303 todettu (laskettu): C 58, 59 (58, 77); H 4, 55 (4,52); N 17,17 (17,13). NMR-spektrejä ei määritetty, koska tuotetta » · · • ** • · 43 118424 ei saatu liukenemaan.
Esimerkki 8 N4-bentsyylioksikarbonyyli-Nl-karboksimetyylisytosiini (10)
Kolmikaulaiseen pyöreäpohjaiseen pulloon/ joka oli varustettu mekaanisella sekoituksella ja typpi-ilmakehällä/ laitettiin metyyli bromi as etaatti a (7,82 ml; 82,6 mmol) sekä suspensio, joka sisälsi N*-bentsyylioksikarbonyyli-sytosiinia (9, 21,0 g; 82,6 mmol) ja kaliumkarbonaattia (11,4 g; 82,6 mmol) kuivassa DMF: ssä (900 ml). Seosta sekoitettiin voimakkaasti yön yli, se suodatettiin ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Siihen lisättiin vettä (300 ml) ja 4N kloorivetyhappoa (10 ml), seosta sekoitettiin 15 minuuttia 0 *C:ssa, se suodatettiin ja pestiin vedellä (2 x 75 ml). Eristettyä sakkaa käsiteltiin vedellä (120 ml), 2N natriumhydroksidillä (60 ml), sitä sekoitettiin 30 minuuttia, se suodatettiin, jäähdytettiin 0 *C:n lämpötilaan ja siihen lisättiin 4N kloorivetyhappoa (35 ml). Otsikon mukainen yhdiste eristettiin suodattamalla, pestiin huolellisesti vedellä, kiteytettiin uudestaan metanolista (1000 ml) ja pestiin huolellisesti eetterillä. Tällä tavalla saatiin 7, 70 g (31 %) puhdasta yhdistettä. Uudelleenkiteytyksestä saadun emä-liuoksen tilavuus pienennettiin 200 ml: ksi ja se jäähdytettiin 0 * C: n lämpötilaan. Tällä tavalla saatiin vielä 2,30 g materi- aalia, joka oli puhdasta tie-määrityksen perusteella, mutta joka oli väriltään punertavaa. Sp. 266-274 * C. Analyysi yhdis- • · : teelle CmHxsNsOs: todettu (laskettu): C 55, 41 (55, 45); H 4,23 (4,32); N 14, 04 (13, 86). lH-NMR (90 MHz; DMSO-de). 8,02 ppm (d, J=7, 32 Hz, 1H, H-6); 7,39 (s, 5H, Ph); 7,01 (d, J=7,32 Hz, • · * 1H, H-5); 5,19 (s, 2H, PhCHa-); 4,52 (s, 2H).
• · ·
Esimerkki 9 • * · V · N‘*-bentsyylioksikarbonyyli-N1-karboksimetyyli-sytosiini-penta- *:·*; fluori f enyyliesteri (11) • · * • · • * * * * *. N<-bentsyylioksikarbonyyli-N1-karboksimetyyli-sytosiinia (10, ··· ***\ 4,00 g; 13,2 mmol) ja pentafluorifenolia (2,67 g; 14,5 mmol) *· *: sekoitettiin DMF: ään (70 ml), jäähdytettiin 0 * C: n lämpötilaan 44 1 1 8 4 2 4 jäävedellä, ja siihen lisättiin yhdistettä DCC (3,27 g; 15,8 mmol). Jäähaude poistettiin 3 minuutin kuluttua ja seosta sekoitettiin 3 tuntia huoneen lämpötilassa. Saostunut DCU poistettiin suodattamalla, pestiin DMF: llä ja suodos haihdutettiin kuiviin vakuumissa (0,2 mmHg). Kiinteätä jäännöstä käsiteltiin metyleenikloridilla (250 ml), sekoitettiin voimakkaasti 15 minuutin ajan, suodatettiin, pestiin kahdesti laimealla natriumvetykarbonaatilla ja kertaalleen kylläisellä nat-riumkloridilla, kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Kiinteä jäännös kiteytettiin uudelleen 2-propanolista (150 ml) ja kiteet pestiin huolellisesti eetterillä. Saanto 3,40 g (55 %). Sp. 241-245 * C. Analyysi yhdisteelle CaoHiaNsFsOs: todettu (laskettu) C 51,56 (51,18); H 2, 77 (2, 58); N 9, 24 (8, 95). 1H-NMR (90 MHz; CDCls); 7,66 ppm (d, J=7, 63 Hz, 1H, H-6); 7,37 (s, 5H, Ph); 7,31 (d, J=7, 63 Hz, 1H, H-5); 5,21 (s, 2H, PhCHa-); 4,97 (s, 2H, NCHa-). FAB-MS: 470 (M+l).
Esimerkki 10 N-^-bentsyylioksikarbonyyli-l-Boc-aeg-sytosiini (12)
Edellä kuvatulla tavalla valmistettuun liuokseen, joka sisälsi (N-Boc-2-aminoetyyli)glysiiniä (2) DMF: ssä, lisättiin trietyy-liamiinia (7,00 ml; 50,8 mmol) ja N*-bentsyylioksikarbonyy- # .*.· li-N^-karboksimetyylisytosiinipentafluorifenyyllesteriä (11, *,"* 2,70 g; 5,75 mmol). Liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan, minkä jälkeen siihen lisättiin metyleeniklori- • .*. dia (150 ml), kylläistä natriumkloridia (250 ml) ja 4N kloori-··« · vetyhappoa siten, että pH-arvoksi saatiin noin 1. Orgaaninen kerros erotettiin ja pestiin kahdesti kylläisellä natriumklo- • · » ridilla, kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin . kuiviin vakuumissa, käyttäen ensin vesi-imua ja sitten öljy- *::: pumppua. Öljymäistä jäännöstä käsiteltiin vedellä (25 ml) ja • · * *·] * se haihdutettiin jälleen kuiviin vakuumissa. Sitten tämä toi- ···*: menpide toistettiin. Sitten öljymäinen jäännös (2,80 g) liuo- tettiin metyleeni kloridi in (100 ml), siihen lisättiin petroo- • · · *. lieetteriä (250 ml) ja seosta sekoitettiin yön yli. Otsikon ··· ···'· mukainen yhdiste eristettiin suodattamalla ja pestiin petrooli- • · · * ·· • e 45 118424 eetterillä. (Tlc-määritys (järjestelmä 1) osoitti/ että läsnä oli olennaisia määriä pentafluorifenolia# mutta sitä ei yritettykään poistaa. Saanto: 1# 72 g (59 %). Sp. 156 *C (hajoaa).
1H-NMR (250 MHz# CDCls): johtuen siitä# että pyöriminen sekun däärisen amidisidoksen ympäri oli rajoittunut# useat signaalit olivat kaksinkertaisia suhteessa 2: 1 (mainittu luettelossa lyhenteellä mj.# joka tarkoittaa suurta (major)# ja lyhenteellä mi.# joka tarkoittaa pientä (minor)]. 7,88 ppm (dd, 1H, H-6); 7# 39 (m, 5H, Ph); 7# 00 (dd# 1H# H-5); 6# 92 (b, 1H, BocNH); 6,74 (b# 1H# ZNH) -?; 5,19 (S, 2H, Ph-CHa); 4,81 ppm (s# mj., Cyt-CHa-CO-); 4#62 ppm (s# mi.# Cyt-CHa-CO-); 4,23 (s# mi.# CONRCHaCOaH); 3,98 ppm (s# mj.# CONRCHaCOaH); 3, 42-3, 02 (ei erottu, m# -CHaCHa- ja vesi); 1# 37 (s# 9H# tBu). FAB-MS: 504 (M+l); 448 (M+l-tBu).
Esimerkki 11 ΝΛ-bentsyylioksikarbonyyli-1-Boc-aeg-sytosiini-pentafluori-fenyyliesteri (13) N^-bentsyylioksikarbonyyli-l-Boc-aeg-sytosiinia (12# 1,50 g; 2,98 mmol) ja pentafluori fenolia (548 mg; 2,98 mmol) liuotettiin DMF: ään (10 ml). Liuokseen lisättiin metyleenikloridia (10 ml)# reaktioseos jäähdytettiin 0 *C: n lämpötilaan jäähau-teessa, ja siihen lisättiin yhdistettä DCC (676 mg; 3,28 .···, mmol). Jäähaude poistettiin 3 minuutin kuluttua ja seosta e 'Γ*. sekoitettiin 3 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Sakka eris- #· .* .* tettiin suodattamalla ja se pestiin kertaalleen metyleeniklori- · · !**/ dilla. Sakka liuotettiin kiehuvaan dioksaaniin (150 ml) ja • « · ! .* liuos jäähdytettiin 15 * C: n lämpötilaan# jolloin DCU saostui.
··· V : DCU poistettiin suodattamalla ja tuloksena ollut suodos kaadet tiin veteen (250 ml), jonka lämpötila oli 0 *C. Otsikon mukaili* nen yhdiste eristettiin suodattamalla, se pestiin vedellä ja ·*·*: kuivattiin sikapentin läsnäollessa vakuumissa. Saanto 1# 30 g | . (65 %). Analyysi yhdisteelle Ca»HaeNsO«F:>: todettu (laskettu): I..* C 52, 63 (52, 02); H 4,41 (4,22); N 10, 55 (10, 46). 1H-NMR (250 · *···* MHz; DMSO-de): tässä nähtiin olennaisesti edellä mainitun #t*j* hapon spektri, johtuen todennäköisimmin esterin hydrolyysistä.
FAB-MS: 670 (M+l); 614 (M+l-tBu).
• · 46 118424
Esimerkki 12 4-kloorikarboksi-9-klooriakridiini 4-karboksiakridonia (6/25 g; 26/1 mmol)/ tionyylikloridia (25 ml) ja 4 pisaraa yhdistettä DMF kuumennettiin varovaisesti typpivirran alla niin kauan, kunnes kaikki kiinteä materiaali oli liuennut. Sitten liuosta palautusjäähdytettiin 40 minuuttia. Liuos jäähdytettiin ja liika tionyylikloridi poistettiin vakuumissa. Viimeisetkin tionyylikloridijäämät poistettiin haihduttamalla yhdessä kuivan bentseenin (kuivattu Na-Pb: 11ä) kanssa kahdesti. Jäljelle jäänyttä keltaista jauhetta käytettiin suoraan seuraavassa reaktiossa.
Esimerkki 13 4- (5-metoksikarbonyylipentyyliamidokarbonyyli) -9-klooriakri-diini
Metyyli-6-aminoheksanoaatti-hydrokloridia (4,70 g; 25,9 mmol) liuotettiin metyleenikloridiin (90 ml), jäähdytettiin 0 *C: n lämpötilaan, liuokseen lisättiin trietyyliamiinia (IS ml), ja tuloksena oleva liuos lisättiin sitten välittömästi edellä saatuun happokloridiin. Happokloridin sisältävä pyöreäpohjainen . pullo jäähdytettiin 0 *C: n lämpötilaan jäähauteessa. Seosta ' ·* sekoitettiin voimakkaasti 30 minuuttia 0 * C: ssa ja 3 tunnin • i* * * * ajan huoneen lämpötilassa. Tuloksena ollut seos suodatettiin • * \**i jäljelle jääneen kiintoaineen poistamiseksi/ joka kiintoaine •. · :.· : pestiin metyleenikloridilla (20 ml). Punaruskea metyleeniklo- | Λ ridisuodos pestiin tämän jälkeen kahdesti kylläisellä natrium- iT: vetykarbonaatilla, kertaalleen kylläisellä natriumkloridilla/ kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin kuiviin va- .:» kuumissa. Tuloksena saatuun öljymäiseen jäännökseen lisättiin [···, kuivaa bentseeniä (35 ml) ja ligroiinia (60-80 * C, kuivattu * * *
Na-Pb: llä). Seosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen. Aktiivi- * ***** hiiltä ja seliittiä lisättiin ja seosta palautusjäähdytettiin • e· 5,.,5 3 minuuttia. Suodattamisen jälkeen otsikon mukainen yhdiste kiteytyi jäähdytettäessä ja magneettisekoittimella sekoitetta- .·",· essa. Se eristettiin suodattamalla ja pestiin petroolieette- • · · • · 47 118424 rillä. Tuotetta säilytettiin kiinteän kaiiumhydroksidin läsnäollessa. Saanto 5/ 0 g (50 %).
Esimerkki 14 4-(5-metoksikarbonyylipentyyli)amidokarbonyyli-9-[6' -(4" -nit-r obent s ami do) heks yyl i ami no ] - ami noakri di i ni 4-(5-metoksikarbonyylipentyyliamidokarbonyyli)-9-klooriakri-diinia (1,30 g; 3,38 mmol) ja fenolia (5 g) kuumennettiin 80 * C: n lämpötilaan 30 minuutiksi typpi virran alla, minkä jälkeen lisättiin 6-(4' nitrobentsamido)-1-heksyyliamiinia (897 mg; 3,38 mmol). Lämpötila nostettiin arvoon 120 *C 2 tunniksi. Reaktioseos jäähdytettiin ja siihen lisättiin metyleenikloridia (80 ml). Tuloksena saatu liuos pestiin kolmeen kertaan 2N natriumhydroksidillä (60 ml annoksina) ja kertaalleen vedellä, se kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Tuloksena ollut punainen öljy (1,8 g) liuotettiin metyleenikloridiin (40 ml), joka oli jäähdytetty 0 *C: n lämpötilaan. Eetteriä (120 ml) lisättiin ja tuloksena ollutta liuosta sekoitettiin yön yli. Tällöin saatiin kiinteän materiaalin ja öljyn seos. Kiintoaine eristettiin suodattamalla. Kiintoaine ja öljy liuotettiin uudelleen metyleenikloridiin (80 ml) ja lisättiin pisaroittain kylmään eetteriin (150 ml). 20 minuuttia kestäneen sekoittamisen jälkeen otsikon mukainen • · .··*; yhdiste eristettiin suodattamalla oranssina kiteinä. Tämä *·» ,·, ; tuote pestiin eetterillä ja kuivattiin vakuumissa kaliumhyd- • ·» .*,/ roksidilla. Saanto 1,60 g (77 %). Sp. 145-147 * C.
• · · ·«· i ** · : * : *.„· Esimerkki 15 | · · ·* * 4-(5-karboksipentyyli)amidokarbonyyli-9-[6' - (4" -nitrobentsami do) -heksyyliamino]-aminoakridiini ·· * * ···· !,i ί 4-(5~metoksikarbonyylipentyyli)amidokarbonyyli-9~[6, -(4"-nit- robentsamido)heksyyliamino]aminoakridiinia (503 mg; 0,82 mmol) • i ..... liuotettiin yhdisteeseen DMF (30 ml), ja liuokseen lisättiin *:** 2N natriumhydroksidia (30 ml). 15 minuutin pituisen sekoitta- misen jälkeen lisättiin 2N kloorivetyhappoa (35 ml) ja vettä ».**: (50 ml) 0 *C:ssa. 30 minuutin pituisen sekoittamisen jälkeen 48 118424 liuos dekantoitiin, jolloin jäljelle jäi Öljymäistä ainetta, joka liuotettiin kiehuvaan metanoliin (150 ml), suodatettiin ja väkevöitiin 1/3: aan tilavuudesta. Tähän metanoliliuokseen lisättiin eetteriä (125 ml) ja 5-6 pisaraa HCl:ia etanolissa. Liuos dekantoitiin sen jälkeen, kun sitä oli sekoitettu 1 tunnin ajan 0 *C:ssa. öljy maine n materiaali liuotettiin uudelleen metanoliin (25 ml) ja se saostettiin eetterillä (150 ml). Otsikon mukainen yhdiste eristettiin keltaisina kiteinä koko yön kestäneen sekoittamisen jälkeen. Saanto 417 mg (80 %). Sp. 173 *C (hajoaa).
Esimerkki 16 (a) 4-(5-pentafluorifenyylioksikarbonyylipentyyli)-amidokarbo-nyyli-9-(6' -(4"-nitrobentsamido)-heksyyliamino]-aminoakri-diini(Acr1Opfp)
Edellä saatu happo (300 mg; 0,480 mmol) liuotettiin yhdisteeseen DMF (2 ml) ja metyleenikloridia (8 ml) lisättiin. Sitten lisättiin pentafluorifenolia (97 mg; 0,53 mmol), joka siirrettiin 2x2 ml: 11a metyleenikloridia. Tuloksena ollut liuos jäähdytettiin 0 *C:n lämpötilaan, minkä jälkeen lisättiin yhdistettä DCC (124 mg; 0,60 mmol). Jäähaude poistettiin 5 minuutin kuluttua ja seos jätettiin seisomaan yön ajaksi. ·'·* Saostunut DCU poistettiin sentrifugoimalla ja sentrifugaatti *.♦.* haihdutettiin kuiviin vakuumissa, käyttäen ensin vesi-imua ja • · \*·; sitten öljypumppua. Jäännös liuotettiin metyleeni kloridi in (20 ·,· : ml), suodatettiin ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Jäännös Γ·[: liuotettiin jälleen metyleenikloridiin ja petrooli eetteri in (150 ml). 1 ml: n suuruinen annos 5M HCl: n eetteri liuos ta li- * sättiin. Liuotin poistettiin dekantoimalla sen jälkeen, kun „·, seosta oli sekoitettu 30 minuuttia 0 *C:ssa. Jäännöksenä saatu ♦ öljymäinen aine liuotettiin metyleenikloridiin (100 ml). Pet- f 4 · roolieetteriä (150 ml) lisättiin ja seosta sekoitettiin yön ***** yli. Seuraavana päivänä keltainen saostunut kiteinen materiaa- li eristettiin suodattamalla ja se pestiin runsailla määrillä petroolieetteriä. Saanto kuivaamisen jälkeen 300 mg (78 %).
|I|*. Sp. 97,5 * C (hajoaa). Kaikkien näytteiden alkuaineanalyysi, • * « 49 118424 lH- ja 13C-NMR- ja massaspektrit olivat tyydyttävät.
(b) PNA-yhdisteiden synteesin liittyvät kokeet; vrt. kuvio 8
Materiaalit; Βοσ-Lys (C1Z)# bentshydryyliamiini-sekapoly(styreeni -1%-di vinyyli bent s eeni )hartsi (BHA-hartsi) ja p-metyyli-bentshydryyliamiini-sekapoly(styreeni-1%-divinyylibentseeni)-hartsi (MBHA-hartsi) oli hankittu yhtiöstä Peninsula Laboratories. Muut reagenssit ja liuottimet olivat: Biograde tri fluori -etikkahappo yhtiöstä Halocarbon Products; di-isopropyylietyyli-amiini (99 %; sitä ei tislattu tämän enempää) ja N-asetyyli-imidatsoli (98 %) yhtiöstä Aldrich; HaO tislattiin kahdesti; vedetön HF yhtiöstä Union Carbide; synteesilaatuinen N, N-dime-tyyliformamidi ja analyysilaatuinen metyleenikloridi (jota ei tislattu tämän enempää) yhtiöstä Merck; HPLC-laatuinen aseto-nitriili yhtiöstä Lab-Scan; purum-laatuinen anisoli, Ν,Ν'-di-sykloheksyylikarbodi-imidi ja puri s s.-laatuinen 2, 2, 2-tri fluori etanoli yhtiöstä Fluka.
(c) Yleiset menetelmät ja huomautuksia
Seuraava pätee, mikäli toisin ei ole mainittu. PNA-yhdisteet syntetisoitiin vaiheittain tapahtuvalla, kiinteään faasiin perustuvalla menetelmällä (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. , 1963, 85, 2149), jossa käytettiin tavanomaista peptidikemiaa sekä TFA-pysymätöntä tert. -butyylioksikarbonyyliryhmää (Boc- ryhmää) "tilapäiseen" N-suojaukseen (Merrifield, J. Am. Chem. ·♦* " !**.: Soc, , 1964, 86, 304) ja happostabiilimpaa bentsyylioksikarbo- * f 5 nyyli- (Z) ja 2-klooribentsyylioksikarbonyyli- (ClZ)-ryhmää *»* · ··,·, sivuketjun "pysyvään" suojaamiseen. C-päätteen amidien saarni-• · seksi PNA-yhdisteet koottiin HF-pysymättömien BHA- tai MBHA- t i * hartsien pinnalle (MBHA-hartsi on herkempää lopullisen HF-pilkkomisen suhteen verrattuna substituoitumattomaan BHA-hart-siin (Matsueda, et ai., Peptides. 1981, 2, 45)]. Kaikki reakti- «f* V ! ot (HF-reaktioita lukuunottamatta) toteutettiin käsikäyttÖisis-» sä tavanomaisissa kiinteän faasin reaktioastioissa, jotka oli .···. varustettu karkealla lasisintterillä (Merrifield, et ai. , ϊ · •t Biochemistry, 1982, 21, 5020). "Normaaleja" aminohappoja si- M· .»•ϊ sältäviä peptidejä varten tarkoitettua kvantitatiivista ninhyd- riinireaktiota (Kaiser: in koe), jonka ovat alunperin kehittä- • - * - · - · · < 1 · · * '···.* ....... . ΐ.-.si...s^miii'^v.
118424 50 neet Merrifield ja hänen työtoverinsa (Sarin, et ai., Anal. Biochem., 1981, 117, 147), voitiin soveltaa onnistuneesti (katso taulukot I-III) käyttäen "normaalisti" käytettyä tehollista ekstinktiokerrointa € 15000 kaikkien jäännös ten tapauksessa yksittäisten kytkeytymisten täydellisyyden määrittämiseen sekä kasvavien peptidiketjujen lukumäärän mittaamiseen. Teoreettinen substituoituminen S«-i jäännöksen numero n kytkeytyessä (olettaen sekä suojauksen täydellinen poistuminen että täydellinen kytkeytyminen, ja olettaen, ettei ketju pääty eikä PNA-ketjuja häviä synteesijakson aikana) voidaan laskea yhtälöstä:
Sn = Sn-1 x [1 + (Sn-i x ÄMW x 10"3 mmol/mol)]-1 missä ΔMW on molekyylipainon kasvu ([ AMW] * g/mol) ja SÄ-i on teoreettinen substituoituminen edeltävän jäännöksen n-1 kytkeytyessä ([S] * mmol/g). Yksittäisen kytkeytymisasteen arvioitu arvo (%) lasketaan mitatun substitution suhteen (mikäli S*, ää ei ole määritetty) ja se sisältää korjauksen, joka on tehty jäljellä olevien vapaiden aminoryhmien lukumäärään edellisen jakson jälkeen. HF-reaktiot toteutettiin Diaflon HF-laitteessa, joka oli saatu yhtiöstä Toho Kasei (Osaka, Japani). Käänteisfaasilla täytettyjä Vydac Cie-kolonneja (5 * nm, 0, 46 x 25 cm ja 5 nm, 1,0 x 25 cm) käytettiin vastaavasti « ·* analyyttisissä ja puoli-preparatiivisissa HPLC-määrityksissä, jotka toteutettiin SP8000-instrumentilla. Puskuri A oli 5 9 9 ; ·*· til. -% asetonitriiliä vedessä, joka sisälsi 445 nl trifluori-*·» · JV. etikkahappoa litrassa, ja puskuri B oli 60 til. -% asetonitrii- » » .··», liä vedessä, joka sisälsi 390 nl tri fluori etikkahappoa litras- f * * * sa. Lineaarinen gradientti oli 0-100 % puskuria B 30 minuutin . aikana, virtausnopeuksien ollessa 1,2 ml/min (analyyttinen ie» määritys) ja 5 ml/min (puolipreparatiivinen määritys). Eluent-** * teja seurattiin aallonpituudella 215 nm (analyyttinen määri- tys) ja 230 nm (puolipreparatiivinen määritys). PNA-yhdistei-·**'; den molekyylipa!not määritettiin aaaCf plasmadesorptiolla "ti- • * e me-of-flight" massaspektrometrisesti runsaimpien isotooppien ··· keskiarvosta.
e e * · · * e* t · 51 118424
Esimerkki 17
Acr1-[Teag]χβ-NHa: n ja lyhyempien johdannaisten kiinteään faasiin perustuva synteesi (a) Boc-[Taeg]ιβ-ΒΗΑ-hartsin vaiheittainen kokoaminen Synteesi käynnistettiin edeltäkäsin turvotetun ja neutraloidun BHA-hartsin (100 mg) pinnalla (jonka hartsin määritettiin sisältävän 0,57 mmol NHa/g ninhydriini reaktion a) käyttäen yksinkertaisia kytkentöjä (" synteesimenettely 1") sekä 3,2 ekvivalenttia yhdistettä BocTaeg-OPfp seoksessa, jonka koostumus oli 33 % DMF/CHaCla. Yksittäiset kytkentäreaktiot toteu tettiin ravistelemalla vähintään 12 tunnin ajan käsikäyttöisessä 6 ml: n tavanomaisessa, kiinteätä faasia varten tarkoitetussa reaktioastiassa, ja reagoimatta jääneet aminoryhmät suojattiin asetyloimalla synteesin valituissa vaiheissa. Ketjun pitenemistapahtumaa seurattiin useissa vaiheissa kvantitatiivisella ninhydriini reaktion a (katso taulukko I). Osa suojatuista Boc-[Taeg]s-BHA-, Boc-[Taeg]io-ΒΗΑ- ja Boc-[Taeg]is-BHA-hartseista poistettiin vastaavasti 5, 10 ja 15 jäännöksen kokoamisen jälkeen.
• · • t · · * · · * · • · · * · * • · • · • · * • · · * * · · • * · * · · • · • * • ·*
• * I
• * · • · * • · ·· • · · • * · * · · # * • m * · · • · • · • · · * * · · • · » · • * • · * • * · • · 52 118424 Jäljellä olevat ami- Arvioitu
Synteesi- Kytketty Substitutio suojaavan noryhmät (pmol/g) sen kytkeyty- vaihe jäännös ryhmän poistamisen jälkeen, kun on misaste jälkeen toteutettu ___(mmol/g)____
Yksinker- Asetyloi- .
Mitattu Teoreetti- täinen kyt- minen ' ' I nen keminen "O· 0.57_____ 1 BocTaeg ND__0.50 1.30 <99.7 2 BocTaeg ND 0.44 1.43 <99.9 3 __BocTaeg 0.29__039__033___99.3 4 BocTaeg 0.27__035__13.30 96.3 . 5 BocTaeg 0.26 0.32 8.33 >99.9 6 BocTaeg ND 0.30 7.78 >99.9 7 BocaTeg ND__028__13.81__722__<97.8 8 BocTaeg ND__026__14.00___<99.9 9 BocTaeg ND__0.24 30.33 93.2 10 __BocTaeg 0,16 0.23__11.67__067__>99.9 • ·* 11 BocTaeg ND 0.21 4.58 >99.9 • ΦΦ * * * 12 BocTaeg ND 0.20 5.87 <99.4 • *· n""·^™111" ' M··-»"1 111111 1 1 " l—i !'! ' • · : 13 BocTaeg ND 0.19 1.67 >99.9 « ·· · • 9 · : ·* 14 BocTaeg ND 0.18 14.02 <93.1 • ·· • · · * * * 15 ' BocTaeg 0.07 0.17 4.20 3.33 >99.9
*;* ND - EI MÄÄRITETTY
MM • · · • * * * * * * • f • · · • * • · • · · ♦ • I» • · · · • · • * · • · · • · 53 118424 (b) Acr1-[Taeg]i»-BHA-hartsin synteesi
Sen jälkeen, kun suojaavat ryhmät oli poistettu jäljellä olleesta Boc-[Taeg]ιβ-ΒΗΑ-hartsista (arvioitu kuivapaino on noin 30 mg; -0,002 mmol kasvavia ketjuja), H-[Taeg]i»-BHA-hartsi saatettiin reagoimaan Acr1-OPfp: n noin 50 ekvivalentin (80 mg; 0,11 mmol) kanssa 1 ml: ssa noin 66 % DMF/CHaCl» (eli pentafluo-rifenyyliesterin 0,11 M liuos) kiinteätä faasia varten tarkoitetussa 3 ml: n reaktioastiassa. Kvalitatiivisella ninhydriini-reaktiolla todettiin, että akridiiniosan kytkeytyminen oli lähes kvantitatiivinen.
(c) H-[Taeg]s-NHa: n pilkkominen, puhdistus ja tunnistus
Osa suojatusta Boc-[Taeg]»-BHA-hartsista käsiteltiin trifluo-rietikkahapon 50 % metyleeni kloridi liuoksen a N-päätteessä sijaitsevan Boc-ryhmän (joka on mahdollisesti haitallisen tert. -butyylikationin esiaste) poistamiseksi ennen HF-pilkko-mista. Neutraloinnin ja pesun (jotka toteutettiin samankaltaisella tavalla kuin "synteesitoimenpiteen 1" vaiheet 2-4) ja kaksi tuntia vakuumissa kestäneen kuivaamisen jälkeen tuloksena saatu 67,1 mg (kuivapaino) H-[Taeg]s-BHA-hartsi pilkottiin 5 ml: 11a HF: anisoli-seosta (9:1; til./til. ), sekoittaen 0 *C:ssa 60 minuutin ajan. HF: n poistamisen jälkeen jäännöstä sekoitettiin kuivan dietyylieetterin kanssa (4 x 15 ml, kul-, loinkin 15 min. ) anisolin poistamiseksi, seos suodatettiin pai- « novoimaan perustuen lasisintterisuppilon läpi ja kuivattiin.
* s ··.' Tämän jälkeen PNA uutettiin 60 ml: aan (4 x 15 ml, sekoittaen • · :.*·! kulloinkin 15 minuuttia) etikkahapon 10 % vesiliuosta. Tästä • * ;.· j liuoksesta otetut näytteet analysoitiin analyyttisellä, kään- j*\: teisfaasiin perustuvalla HPLC-määrityksellä raa'an PNA: n puh- :T: tauden toteamiseksi. 13,0 minuutin kohdalla todettu suurin • piikki vastasi noin 93 % kokonaisabsorbanssista. Jäljelle jäänyt liuos pakastettiin ja lyofilisoitiin, jolloin raakamate-.···. riaalia saatiin noin 22,9 mg. Lopulta 19,0 mg raakatuotetta • * e puhdistettiin viidestä erästä, joista kukin sisälsi 3,8 mg 1 *:**: ml: ssa vettä. Tämä suurin piikki otettiin talteen puoliprepara- • * * tiivisella käänteis f aasipyl väällä. Asetonitriili poistettiin nopealla vakuumilaitteella ja jäännösliuos pakastettiin (hiili- !*!*: happojäätä käyttäen) ja se lyofilisoitiin lopulta, jolloin · * • · 54 118424 saatiin 13,1 mg yli 99-prosenttisesti puhdasta H-[Taeg]s-NHa-yhdistettä. Tämä PNA-molekyyli liukeni vaivattomasti veteen ja sillä oli oikea molekyylipaino massaspektrimäärityksen perusteella. (M+H)*:n tapauksessa laskettu m/z-arvo oli 1349, 3 ja mitattu m/z-arvo oli 1347, 8.
(d) H-[Taeg] j.o-NH3: n pilkkominen, puhdistus ja tunnistus Osa suojatusta Boc-[Taeg]*o-BHA-hartsista käsiteltiin kohdassa (c) kuvatulla tavalla, jolloin saatiin 11,0 mg raakamateriaa-lia, kun 18,9 mg kuivaa H-[Taeg]10-BHA-hartsia pilkottiin HF: 11a. 15, 5 minuutin kohdalla esiintyvä suurin piikki vastasi noin 53 % kokonaisabsorbanssista. Noin 1 mg raakatuotetta puhdistettiin toistaen (jäljempänä kuvattavista syistä), jolloin saatiin noin 0,1 mg vähintään 80-prosenttisesti mutta oletettavasti yli 99-prosenttisesti puhdasta H-[Taeg]10-NHa-yhdis-tettä. Kohdepiikin jälkeen eluoitunutta, suhteellisen leveää häntää, joka vastasi noin 20 % kokona!sabsorbanssista, ei kyetty poistamaan (vain vähentämään jonkin verran) toistuvilla puhdistuksilla. Massaspektrin, joka vain vahvistaa molekyyli-painoltaan oikean H-[Taeg]10-NHa: n läsnäolon, perusteella tämän häntäilmiön voidaan katsoa johtuvan kohdemolekyylin paremmin tai huonommin määritellyistä aggregaatio/konformaa-tio-tiloista. Tästä syystä raakatuote sisältää kohdemolekyyliä todennäköisesti enemmän kuin edellä mainitut 53 %. H-[Taeg]10-NHa liukenee helposti veteen. (M+H)"·: n tapauksessa laskettu ·'**: m/z-arvo oli 2679, 6 ja mitattu m/z-arvo oli 2681, 5.
*·· • ♦ • * * • ·· • e : (e) H-[Taeg] is-NHa: n pilkkominen, puhdistus ja tunnistus ·«« ♦ jV, Osa suojatusta Boc-[Taeg]is-BHA-hartsista käsiteltiin kohdassa (c) kuvatulla tavalla, jolloin saatiin 3,2 mg raakamateriaa- • · · • lia, kun 13,9 mg kuivaa H-[Taeg]is-BHA-hartsia pilkottiin . HF: llä. Kohdassa 22,6 min. todettu suurin piikki sijaitsi ·· · ·*·*· leveässä pullistumassa, joka vastasi noin 60 % kokonais abs or- ·*· · *.* * banssista (kuvio 12a). Nytkin (katso edellinen kohta) tämän ·:**: pullistuman katsotaan johtuvan kohdemolekyylin H-[Taeg] is-NHa .*·*. aggregaatio/konformaatio-tiloista, koska talteen otetun "pui- • · ·. listuman" massaspektrianalyysi ei osoittanut merkittävällä • · * ···'· tavalla muiden molekyylien läsnäoloa. Kaikki raakatuote puh- ·*· · • *♦ • · 55 118424 distettiin ottamalla “pullistuma" talteen, jolloin saatiin noin 2,8 mg materiaalia. (M+Na)*:n tapauksessa laskettu m/z-arvo oli 4033, 9 ja laskettu m/z-arvo oli 4032, 9.
(f) Acr1-[Taeg]is-NHa:n pilkkominen, puhdistus ja tunnistus
Osa suojatusta Acr1-[Taeg]is-BHA-hartsista käsiteltiin kohdassa (b) kuvatulla tavalla, jolloin saatiin 14,3 mg raakamateri-aalia, kun 29,7 mg kuivaa Acr1-[Taeg]i»-BHA-hartsia pilkottiin HF: llä. 23,7 minuutin kohdalla esiintyvä suuri piikki ja 29,2 minuutin kohdalla todettu "dimeeri" (katso jäljempänä) vastasivat yhdessä noin 40 % kokonaisabsorbanssista (kuvio 12b).
Raakatuotetta puhdistettiin toistaen siten, että saatiin noin 1 mg oletettavasti yli 99-prosenttisesti puhdasta Acr1-[Taeg] is-NHä:ta, joka oli "kontaminoitunut" itsestään kasautuneilla molekyyleillä, jotka eluoltuivat kohdissa 27,4 min., 29,2 min. ja lopulta suurena leveänä "pullistumana", joia eluoitui 100 % puskurilla B (kuvio 12c). Tämä tulkinta on yhtäpitävä sen havainnon kanssa, että nämä piikit kasvavat seisotettaessa (tuntien ajan) etikkahapon vesiliuoksessa, ja lopulta ne saostuvat kvantitatiivisesti. (M+H)*:n tapauksessa laskettu m/z-arvo oli 4593, 6 ja mitattu m/z-arvo oli 4588, 7.
(g) Synteesitoimenpide 1 . (1) Suojaavien Boc-ryhmien poistaminen seoksella TFA/CHaCla • ·* (1:1, til. /til. ), 3 ml, 3x1 min ja 1x30 min; (2) pesu yhdis- teellä CHaCla, 3 ml, 6x1 min; (3) neutralointi seoksella DIEA/-*·.’·· CHaCla (1:19, til. /til. ), 3 ml, 3x2 min.; (4) pesu CHaCla: 11a, it; 3 ml, 6x1 min., ja kuiviin valutus 1 minuutin ajan; (5) PNA- :*·*: hartsista voidaan ottaa 2-5 mg: n näyte ja se voidaan kuivata • · huolellisesti kvantitatiivista ninhydriini analyysiä varten « substitution määrittämiseksi; (6) BocTaeg-OPfp: n 3,2 ekvivalen-tin (0,18 mmol; 100 mg) lisäys liuotettuna 1 ml: aan CHaCla: ta, minkä jälkeen lisätään 0,5 ml DMF: ää (pentafluorifenyylieste- • · · *. rin lopullinen pitoisuus noin 0,12 M); kytkeytymi s reaktion » annettiin edetä yhteensä 12-24 tunnin ajan huoneen lämpötilas-sa ravistellen; (7) pesu DMF: llä, 3 ml, 1x2 min; (8) pesu *·, CHaCla: 11a, 3 ml, 4x1 min.; (9) neutralointi seoksella DIEA/-T*. CHaCla (1:19, til. /til. ), 3 ml, 2x2 min; (10) pesu yhdisteellä e ·· • · 56 118424 CHaCla, 3 ml, 6x1 min; (11) suojatusta PNA-hartsista otettiin 2-5 mg: n näyte nopeata kvalitatiivista ninhydriinimääritystä varten ja edelleen 2-5 mg kuivataan huolellisesti kvantitatiivista ninhydriinianalyysiä varten, jolla analyysillä määritetään kytkeytymisaste (jaksojen 7, 10 ja 15 jälkeen reagoimatta jääneet aminoryhmät suojattiin asetyloimalla N-asetyyli-imidat-solilla metyleenikloridissa).
Esimerkki 18
Acr1-(Taeglis-Lys-NHa:n ja lyhyempien johdannaisten synteesi kiinteän faasin avulla (a) Boc-[Taeg]is-Lys(ClZ)-BHA-hartsin kokoaminen vaiheittain Synteesi käynnistettiin kiinnittämällä Boc-Lys(ClZ)-yhdistettä (tavanomainen in situ DCC-kytkeminen puhtaassa CHaCla: ssa) kvantitatiivisesti edeltäkäsin turvotetun ja neutraloidun BHA-hartsin (100 mg; 0,57 mmol NHa/g) pinnalle. Suojattua PNA-ketjua jatkettiin edelleen käyttäen yksinkertaisia kytkentöjä ("synteesitoimenpide 2") jaksoissa 1-5 ja jaksoissa 10-15 käyttäen 3,2 ekvivalenttia yhdistettä BocTaeg-OPfp noin 33 % DMF/CHaCla-seoksessa. Jaksoissa 5-10 käytettiin vapaan hapon BocTaeg-OH erityistä suoraa DCC- (eli in situ) kytkemistä noin 33 % DMF/CHaCla-seoksessa. Kaikki kytkemisreaktiot toteutettiin ravistelemalla vähintään 12 tuntia käsikäyttöisessä 6 .* ml: n suuruisessa, tavanomaisessa, kiinteätä faasia varten (···( tarkoitetussa reaktioastiassa. Reagoimatta jääneet aminoryhmät 'Γ*. suojattiin asetyloimalla synteesin samoissa vaiheissa kuin // esimerkissä 17. Osa suojatusta Boc-[Taeg]»-Lys(C1Z)-BHA-hart- * · · j;· * sista ja Boc-[Taeg]xo-Lys(ClZ)-BHA-hartsista otettiin talteen e · · • ·* 5 ja 10 PNA-jäännöksen kokoamisen jälkeen, vastaavasti. Boc- ·♦· V: [Taeg] xo-Lys (ClZ)-BHA-hartsista saadun raa'an pilkkomi s tuot teen analyyttisestä HPLC-kromatogrammista [katso kohta (e)] *:* pääteltiin, ettei PNA-j äännösten 5-10 ylimääräisen "vapaan ·'·*; hapon" kytkeminen parantanut merkittävästi synteesin saantoa, e * , verrattuna esimerkissä 17 vain yksinkertaisesti kytkettyihin jäännöksiin.
• · · • · e ♦ e·· * e ci» e • ••e • e ♦ · · * *· e · 57 118424 (b) Acr1-[Taeg]io-Lys(C1Z)-BHA-hartsin synteesi
Sen jälkeen, kun suojaavat ryhmät oli poistettu osasta Boc-[Taeg]io-Lys(C1Z)-BHA-hartsia (arvioitu kuivapaino on noin 90 mg; noin 0,01 mmol kasvavia ketjuja), H- [Taeg] is-BHA-hartsi saatettiin reagoimaan Acr1-OPfp: n noin 20 ekvivalentin (141 mg; 0,19 mmol) kanssa 1 ml: ssa noin 66 % DMF/CHaCla-seosta 3 ml: n suuruisessa, kiinteätä faasia varten tarkoitetussa reak-tioastiassa. Kvalitatiivisen ninhydriinireaktion perusteella akridiiniosan kytkeytyminen oli lähes kvantitatiivinen.
(c) Acr1-[Taeg]is-Lys(C1Z)-BHA-hartsin synteesi
Sen jälkeen, kun suojaavat ryhmät oli poistettu jäljelle jääneestä Boc-[Taeg]is-Lys(C1Z)-BHA-hartsista (arvioitu kuivapaino noin 70 mg; noin 0, 005 mmol kasvavia ketjuja), H-[Taeg]is-Lys(Clz)-BHA-hartsi saatettiin reagoimaan Acr^-OPfp: n noin 25 ekvivalentin kanssa (91 mg; 0,12 mmol) 1 ml: ssa noin 66 % DMF/CHaCla-seosta 3 ml:n suuruisessa, kiinteätä faasia varten tarkoitetussa reaktioastiassa. Kvalitatiivisen ninhydriinireaktion perusteella voitiin päätellä, että akridiiniosan kytkeytyminen oli lähes kvantitatiivinen.
(d) H-[Taeg]s-Lys-NHa:n pilkkominen, puhdistus ja tunnistus Osa suojatusta Boc-[Taeg]s-Lys(C1Z)-BHA-hartsista käsiteltiin esimerkissä 17c kuvatulla tavalla, jolloin saatiin 8,9 mg * /,· raakaa materiaalia, kun 19,0 mg kuivaa H- [Taeg] s-Lys (C1Z)-BHA-»*· 4<! hartsia pilkottiin HF: llä. 12,2 minuutin kohdalla eluoitunut i\: suurin piikki (joka eluoitui vasta 14,2 minuutin kohdalla, j ·*· mikäli se injektoitiin vesiliuoksesta eikä etikkahapon 10 % av» · vesiliuoksesta) vastasi noin 90 % kokonais absorbanssi s ta. Noin e * /;·, 2,2 mg raakatuotetta puhdistettiin, jolloin saatiin noin 1,5 # · · mg 99-prosenttisesti puhdasta yhdistettä H-[Taeg]a-Lys-NHa.
(e) H-[Taeg] io-Lys-NHa: n pilkkominen, puhdistus ja tunnistus V - * *%* Osa suojatusta Boc-[Taeg]io-Lys(C1Z)-BHA-hartsista käsiteltiin ·:**: esimerkissä 17C kuvatulla tavalla, jolloin saatiin 1,7 mg ·’**· raakaa materiaalia, kun 7,0 mg kuivaa H-[Taeg]io-Lys(ClZ)-BHA-··· *, hartsia pilkottiin HF: llä. 15, 1 minuutin kohdalla saatu suurin ·#· piikki (joka eluoitui 17,0 minuutin kohdalla, mikäli se injek- V · · • ·# e · 58 118424 toitiin. vesiliuoksesta eikä etikkahapon 10 % vesiliuoksesta) vastasi noin 50 % kokonais abs orbanssi s ta. Noin 1, 2 mg raaka-* tuotetta puhdistettiin, jolloin saatiin noin 0,2 mg yli 95-pro-senttisesti puhdasta H-[Taeg]ao-Lys-NHa: ta. Kuvio 13a. (M+H)*:n tapauksessa laskettu m/z-arvo oli 2807,8 ja laskettu m/z-arvo oli 2808,2.
(f) Acr1-[Taeg]io-Lys-NHa: n pilkkominen, puhdistus ja tunnistus 99,1 mg suojattua Acr1-[Taeg]*o-Lys(C1Z)-BHA-hartsia (kuiva-paino) pilkottiin esimerkissä 17c kuvatulla tavalla, jolloin saatiin 42,2 mg raakaa materiaalia. Kohdalla 25,3 minuuttia saatu suurin piikki (joka eluoitui 23,5 minuutin kuluttua, mikäli se injektoitiin vesiliuoksesta eikä etikkahapon 10 % vesiliuoksesta) vastasi noin 45 % kokonaisabsorbanssista. 8,87 mg: n osa raakatuotteesta puhdistettiin, jolloin saatiin noin 5,3 mg yli 97-prosenttisesti puhdasta H-[Taeg]io-Lys-NHa: ta. (M+H)-:n tapauksessa laskettu m/z-arvo oli 2850, 8 ja mitattu m/z-arvo oli 2849, 8.
(g) Acr1-[Taeg]is-Lys-NHa: n pilkkominen ja puhdistus 78,7 mg: n osa suojatusta Acr1-[Taeg]ia-Lys(ClZ)-BHA-hartsista (kuivapaino) pilkottiin esimerkin I kohdassa (c) kuvatulla tavalla, jolloin saatiin 34,8 mg raakaa materiaalia. 23,5 * minuutin kohdalla saatu suurin piikki (joka eluoitui noin samassa ajassa, jos se injektoitiin vesiliuoksesta eikä etik-kahapon 10 % vesiliuoksesta) sekä 28,2 minuutin kohdalla saatu • e * ,·, "dimeeri" vastasivat noin 35 % kokonais abs orbanssis ta. Noin I I » 4,5 mg raakatuotetta puhdistettiin, jolloin saatiin noin 1,6 • · mg oletettavasti yli 9 5-prosentti s es ti puhdasta H-[Taeg]io-Ly- • s-NHa: ta. Tätä yhdistettä ei kyetty vapauttamaan "dimeeri"piikistä, joka kasvoi seisotettaessa etikkahapon vesiliuoksessa.
» *«·· • · 9 V : (h) Synteesitoimenpide 2 « (1) Suojaavien Boc-ryhmien poisto seoksella TFA/CHaCla (1:1, til. /til. ), 3 ml, 3x1 min ja 1x30 min; (2) pesu yhdisteellä *'] CHaCla, 3 ml, 6x1 min; (3) neutralointi seoksella DIEA/CHaCla (1:19, til./til. ), 3 ml 3x2 min; (4) pesu yhdisteellä CHaCla, • s f » · « f« e * 59 118424 3 ml, 6x1 min., ja kuiviin valutus 1 minuutin ajan; (5) PNA-hartsista voidaan ottaa 2-5 mg: n näyte, joka kuivataan huolellisesti kvalitatiivista ninhydriinianalyysiä varten; (6) jaksoissa 1-5 ja jaksoissa 10-15 kytkentäreaktio toteutettiin lisäämällä 3,2 ekvivalenttia (0,18 mmol; 100 mg) yhdistettä BocTaeg-OPfp liuotettuna 1 ml: aan yhdistettä CHaCla, minkä jälkeen lisättiin 0,5 ml DMF: ää (pentafluorifenyyliesterin lopullinen pitoisuus oli noin 0, 12 M); kytkentäreaktion annettiin edetä yhteensä 12-24 tuntia samalla ravistellen; jaksoissa 5-10 käytettiin lisäksi 0,12 M BocTaeg-OH: n 0,12 M DCC-kytkemistä 1,5 ml: ssa seosta DMF/CHaCla (1:2, til./til. ); (7) pesu DMF: llä, 3 ml, 1x2 min; (8) pesu CHaCla: 11a, 3 min, 4x1 min; (9) neutralointi seoksella DIEA/CHaCla(1: 19, til./til.), 3 ml, 2x2 min; (10) pesu CHaCla: 11a, 3 ml, 6x1 min; (11) suojatusta PNA-hartsista otetaan 2-5 mg: n näyte kvalitatiivista ninhydriini määritystä varten (jaksojen 7, 10 ja 15 jälkeen reagoimatta jääneet aminoryhmät suojattiin asetyloimalla N-asetyyli-imidatsolilla metyleenikloridissa).
Esimerkki 19 H-[Taeg]io-Lys-NHa: n parannettu kiinteään faasiin perustuva synteesi
Suojattu PNA koottiin MBHA-hartsin pinnalle, käyttäen suurin • · · piirtein puolta BHA-hartsin siitä kuormituksesta, jota käytet- :/.: tiin edeltävissä esimerkeissä. Edelleen, kaikkia jaksoja yhtä ;/*; lukuunottamatta seurasi kytkeytymättä jääneiden aminoryhmien ·*.*; asetylointi. Synteesi on kuvattu seuraavassa kaikkine yksityis-• * kohtineen: • · · * . (a) Boc-Lys(ClZ)~NH-CH(p-CH3-CeH*)-C«H4-hartsin (MBHA-hartsi) • · · # *.*" valmistus, hartsin alustavan substitutioasteen ollessa 0, 3 * · · '·[ ' mmol/g * • ·
Boc-Lys (ClZ)-MBHA-hartsin toivottu substitutioaste oli 0,25- * · · 0, 30 mmol/g. Tähän arvoon pääsemiseksi 1, 5 mmol yhdistettä */*. Boc-Lys (C1Z) kytkettiin 5,0 g: aan neutraloitua ja edeltäkäsin * · * *· " turvotettua MBHA-hartsia (joka sisältää 0,64 mmol NHa/g kvanti- 60 118424 tatiivisella ninhydriinireaktiona määritettynä) käyttäen yksinkertaista 11 in situ11-kytkemistä (1/5 mmol DCC) 60 ml: ssa yhdistettä CHaCla. Tämä reaktio toteutettiin ravistelemalla 3 tunnin ajan käsikäyttöisessä, 225 ml: n suuruisessa, tavanomaisessa, kiinteätä faasia varten tarkoitetussa reaktioastiassa. Sitten reagoimatta jääneet aminoryhmät suojattiin asetyloimal-la seoksella asetanhydridi/pyridiini/CHaCla (1:1:2, til. /til. /-til. ) 18 tunnin ajan. Neutraloidun hartsin kvantitatiivinen ninhydriinireaktio osoitti, että jäljellä oli vain 0,00093 mmol/g vapaata amiinia (katso taulukko I), eli 0,15 % alkupe räisistä aminoryhmistä. Substitutioaste arvioitiin poistamalla suojaavat ryhmät ja ninhydriinianalyysillä, ja sen todettiin olevan 0,32 mmol/g neutraloidun H-Lys(C1Z)-MBHA-hartsin tapauksessa. Tämä arvo on hyvin verrannollinen 0,28 mmol/g olevaan suurimpaan arvoon, joka on saatu kytkettäessä kvantitatiivisesti 0,30 mmol Boo-Lys(C1Z)/g hartsia (katso taulukko II).
(b) Boc-[Taeg]a-Lys(C1Z)-MBHA-hartsin vaiheittainen kokoaminen Kohdassa (a) valmistetun H-Lys(ClZ)-MBHA-hartsin koko erää käytettin suoraan (samassa reaktioastiassa) Boc-[Taeg]3-Lys-(ClZ)-MBHA-hartsin kokoamiseksi yksinkertaisilla kytkennöillä ("synteesitoimenpide 3") käyttäen 2,5 ekvivalenttia yhdistettä ,*,· BocTaeg-OPfp puhtaassa CHaCla: ssa. Kvantitatiivista ninhyd- riinireaktiota käytettiin koko synteesin ajan (katso taulukko .*. : ii).
• * • · • · · • · · • · · · (c) Boc-[Taeg] β-Lys (ClZ)-MBHA-hartsin vaiheittainen kokoaminen • · ]·.*, Noin 4, 5 g märkää Boc-[Taeg] s-Lys (C1Z)-MBHA-hartsia [noin 0,36 • · · * mmol kasvavia ketjuja; saatu yhteensä noin 19 grammasta märkää . hartsia, joka on valmistettu kohdassa (b)] laitettiin 55 ml: n • · SPPS-reaktioastiaan. Boc-[Taeg]e-Lys(C1Z)-MBHA-hartsi koottiin *·· V * yksinkertaisin kytkennöin ("synteesitoimenpide 4") käyttäen *:··· 2, 5 ekvivalenttia yhdistettä BocTaeg-OPfp noin 30 % .·*·. DMF/CHaCla-seoksessa. Synteesin etenemistä sen kaikissa vai- ·. heissä seurattiin kvantitatiivisella ninhydriini reaktion a • tf (katso taulukko II).
• · • · · • · · • · ei 118424 (d) Boc-[Taeg]ιο-Lys(CLz)-MBHA-hartsin vaiheittainen kokoaminen
Noin 1 g märkää Boc-[Taeg]e-Lys(C1Z)-MBHA-hartsia [noin 0,09 mmol kasvavia ketjuja; saatu yhteensä noin 4 grammasta märkää hartsia, joka on valmistettu kohdassa (c)] laitettiin 20 ml:n SPPS-reaktioastiaan. Boc-[Taeg]io-Lys(C1Z)-MBHA-hartsi koottiin yksinkertaisin kytkennöin, joita käytettiin edellisessä kohdassa, käyttäen 2, 5 ekvivalenttia yhdistettä BocTaeg-OPfp noin 30 % DMF/CH»Cla-seoksessa. Reaktiotilavuus oli 3 ml (voimakas ravistelu). Synteesiä seurattiin kvantitatiivisella ninhydriinireaktiolla (katso taulukko XX).
Synteesi- Kytketty Substitutio suojaa- Jäljellä olevat amino- Arvioitu vaihe jäännös . van ryhmän poista- ryhmät (|umol/g) sen kytkeytymisen jälkeen jälkeen, kun on misaste (mmol/g) toteutettu
Mitattu Teoreet- Vksinker- Asetyloi- ^ tinen täinen kyt minen keminen____ "0"__BocLys(CIZ) 0.32__028__0.93 1__BocTaeg 0.23 0.26 0.97 0.54 >99.9 .1 2 BocTaeg 0.21 0.24 0.92 0.46 99.8 *”.·1 3 BocTaeg 0.19 0.23 1.00 0.57 99.7 • · ' 11 1111'' • · · / 4 BocTaeg 0.18 0.21 1.85 99.3 • · · ^' 1 - ........... " 4 · 1 • ·· · 5 BocTaeg 0.17 0.20 2.01 0.19 99.9 • · ^ • f ί.ί'ϊ 6__BocTaeg 0.15 0,19__1.69 0.10 99.0 7 BocaTeg . 0.11 0.18 1.11 0.66 99.1 ··« —^ .···. 8 BocTaeg 0.12 0.17 1.82 0.44 99.0 9 BocTaeg__OIO 0.17 5.63 0.56 94.8 10 BocTaeg 0.11 0.16 1.54 0.67 99.1 • ^ il IU tm r i sass^ssa= ··· * • t»· · • · 1 • ♦ · · 62 118424 (e) Ac-[Taeg]ιο-Lys(C1Z)-MBHA-hartsin synteesi
Sen jälkeen, kun suojaavat ryhmät oli poistettu osasta Boc-[Taeg]ιο-Lys(C1Z)-MBHA-hartsia (arvioitu kuivapaino on noin 45 mg), hartsi asetyloitiin kvantitatiivisesti 2 ml: 11a etikka-happo /pyri di i ni /CH * Cl a -s eos t a (1:1.2, til. /til. /til. ) 2 tunnin aikana 3 ml:n suuruisessa, kiinteätä faasia varten tarkoitetussa reaktioastiassa.
(f) H-[Taeg]ιο-Lys-NHa: n pilkkominen, puhdistus ja tunnistus
Osa suojatusta Boc-[Taeg]ιο-Lys(C1Z)-BHA-hartsista käsiteltiin esimerkissä 17c kuvatulla tavalla, jolloin saatiin noin 24 mg raakaa materiaalia, kun 76 mg kuivaa H-[Taeg]s-Lys(C1Z)-BHA-hartsia pilkottiin HP: llä. Suurin piikki kohdassa 15,2 min. (joka sisältää epäpuhtauksia, kuten häviämäpeptidejä ja erilaisia sivutuotteita) vastasi noin 78 % kokonaisabsorbanssis-ta. Tämä suurin piikki vastasi myös noin 88 % "suurimman piikin plus häviämäpiikkien" absorbanssista, ollen hyvin yhtäpitävä 90, 1 % olevan arvioidun kokonaiskytkeytyrnissaannon kans sa, joka saanto on saatu laskemalla yhteen yksittäiset kytkey-tymissaannot taulukosta IX. 7,2 mg: n osa raakatuotteesta puhdistettiin kahdesta erästä käyttämällä puolipreparatiivista käänteisfaasikolonnia (keräten suurin piikki dekantteriin, , jota jäähdytettiin hiilihappojään ja 2-propanolin seoksella). Kukin sisälsi 3, 6 mg 1 ml: ssa vettä. Pakastettu liuos lyofili- f · soitiin suoraan (ennen asetonitriilin poistamista nopealla *! vakuumilla), jolloin saatiin 4,2 mg 8 2-prosentti s es ti puhdasta * · : H- [Taeg] io~Lys-NHa-tuotetta.
·· · * · · « · • · :T: (g) Ac-[Taeg]io-Lys-NHa: n pilkkominen, puhdistus ja tunnistus 400, 0 mg: n annos suojattua Ac-[Taeg]ιο-Lys(C1Z)-BHA-hartsia (kuivapaino) pilkottiin esimerkissä 17c kuvatulla tavalla, TFA-käsittelyä lukuunottamatta, jolloin saatiin 11,9 mg raaka- • » · materiaalia. 15,8 minuutin kohdalla saatu suurin piikki vasta- :**· si noin 75 % kokonaisabsorbanssista. 4, 8 mg: n annos raakatuot-··« teestä puhdistettiin, jolloin saatiin arviolta 3,5 mg yli * 95-prosenttisesti puhdasta yhdistettä Ac-[Taeg] io-Lys-NHa. /!*: (M+H)*:n tapauksessa laskettu m/z-arvo oli 2849, 8 ja mitattu e ·« m/z-arvo oli 2848, 8.
* ' ’ · ’ '· I .-..'.SVVV..
118424 63 (h) Synteesitoimenpide 3 (1) Suojaavien Βοσ-ryhmien poistaminen seoksella TFA/CHaCla (1: 1, til. /til. ), 100 ml/ 3x1 min ja 1x30 min; (2) pesu CHaCla: 11a/ 100 ml/ 6x1 min; (3) neutralointi seoksella DIEA/CHaCla (1:19, til. /til. ), 100 ml, 3x2 min; (4) pesu CHaCla: 11a, 100 ml, 6x1 min, ja kuiviin valutus 1 minuutin aikana; (5) PNA-hartsista otettiin 2-5 mg: n näyte ja se kuivattiin huolella kvantitatiivista ninhydriinianalyysiä varten substitutioasteen määrittämiseksi; (6) sitten lisättiin 2,5 ekvivalenttia (3,75 mmol; 2,064 g) yhdistettä BocTaeg-OPfp liuotettuna 35 ml: aan yhdistettä CHaCla (pentafluorifenyylies-terin lopullinen pitoisuus noin 0, 1 M); kytkentäreaktion annettiin edetä yhteensä 20-24 tuntia samalla ravistellen; (7) pesu DMF:llä, 100 ml, 1x2 min. (BocTaeg-OH-sakan poistamiseksi); (8) pesu CHaCla: 11a, 100 ml, 4x1 min; (9) neutralointi seoksella DI EA/CHaCla (1:19, til. /til. ) 100 ml, 2x2 min; (10) pesu CHaCla: 11a, 100 ml, 6x1 min; (11) PNA-hartsista otetaan 2-5 mg: n näyte nopeata kvalitatiivista ninhydriinimääritystä varten, ja lisäksi 2-5 mg kuivataan huolellisesti kvantitatiivista ninhydriinianalyysiä varten kytkeytymisasteen määrittämiseksi; (12) reagoimatta jääneet aminoryhmät suojataan asety-,· loimella 100 ml: 11a asetanhydridi/pyridiini/CHaCla-seosta J.! (1:1:2; til./til./til. ) 2 tunnin ajan; (13) pesu CHaCla: 11a, * · **, 100 ml, 6x1 min; (14) suojatusta PNA-hartsista otetaan 2 x 2-5 e * · ’· / mg: n näytteet ja ne neutraloidaan DI EA/CHaCla: 11a (1:19, i.: : til./til. ) ja pestään CHaCla: 11a kvalitatiivista ja kvantita- e* φ Ϊ *.! tiivistä ninhydriini analyysiä varten.
«♦· e e e f · e r (i) Synteesitoimenpide 4 ·;» (1) Suojaavien Boc-ryhmien poistaminen seoksella TFA/CHaCla . (1:1, til. /til. ), 25 ml, 3x1 min. ja 1x30 min; (2) pesu CHaCla: 11a, 25 ml, 6x1 min; (3) neutralointi seoksella DIE-A/CHaCla (1:19, til./til. ), 25 ml, 3x2 min; (4) pesu CHaCla: 11a, 25 ml, 6x1 min, ja kuiviin valutus 1 minuutin e ··· ajan; (5) PNA-hartsista otetaan 2-5 mg: n näyte ja se kuivat- see* ,*.j tiin huolellisesti kvantitatiivista ninhydriinianalyysia var- • e ten substitution määrittämiseksi; (6) sitten lisättiin 2,5 64 118424 ekvivalenttia (0,92 mmol; 0,506 g) yhdistettä BocTaeg-OPfp liuotettuna 6 ml: aan CHaCla: ta, minkä jälkeen lisättiin 3 ml DMP: ää (pentafluorifenyyliesterin lopullinen pitoisuus noin 0,1 M); kytkentäreaktion annettiin edetä yhteensä 20-24 tuntia samalla ravistellen; (7) pesu DMF: llä, 25 ml, 1x2 min; (8) pesu CHaCla: 11a, 25 ml, 4x1 min; (9) neutralointi seoksella DIEA/CHaCla (1:19, til./til. ), 25 ml, 2x2 min; (10) pesu CHaCla: 11a, 25 ml, 6x1 min; (11) suojatusta PNA-hartsista otettiin 2-5 mg:n näyte nopaeata kvalitatiivista ninhydriini-määritystä varten ja vielä 2-5 mg kuivataan huolellisesti kvantitatiivista ninhydriinianalyysiä varten kytkeytymisasteen määrittämiseksi; (12) reagoimatta jääneet aminoryhmät suojataan asetyloimalla 25 ml: 11a asetanhydridi/pyridiini/CHaCla-seosta (1:1:2, til. /til. /til. ) 2 tunnin ajan (paitsi ensimmäisen jakson jälkeen); (13) pesu CHaCla: 11a, 25 ml, 6x1 min; (14) suojatusta PNA-hartsista otettiin 2 x 2-5 mg: n näytettä, jotka neutraloitiin DIEA/CHaCla-seoksella (1:19, til./til.) ja pestiin CHaCla: 11a kvalitatiivista ja kvantitatiivista ninhyd,-riinianalyysiä varten.
Esimerkki 20
Yhdisteen H-[Taeg]s-Caeg-[Taeg]^-Lys-NHa synteesi kiinteätä faasia käyttäen e#· ;**, (a) Boc-[ Taeg] s-Caeg- (Taeg ].*-Lys (Cl Z)-MBHA-harts in vaiheittai- ♦ ♦ i '· ” nen kokoaminen • * :.i : Noin 2,5 g märkää Boc-[Taeg]3-Lys (C1Z)-MBHA-hartsia (noin 1/6 ti · ; V yhteensä jäljellä olevasta noin 16 grammasta märkää hartsia; ««· V 5 noin 0,75 g kuivaa hartsia, noin 0,15 mmol kasvavia ketjuja) laitettiin 6 ml:n SFPS-reaktioastiaan. Boc-[Taeg]e-Caeg-··· [Taeg]*-Lys (C1Z)-MBHA-hartsia koottiin kaikkien Taeg-jäännös- ten kaksinkertaisella kytkennällä käyttäen tavanomaisesti 2,5 f • # ekvivalenttia yhdistettä BocTaeg-OPfp 2,5 ml: ssa noin 30 % | * DMF/CHaCla-seosta, paitsi että ensimmäinen jäännös oli kytket- ty yksinkertaisesti. C(Z)aeg-jäännöksen sisällyttäminen toteu-··· tettiin kytkemällä 2,0 ekvivalenttia yhdistettä BocC(Z)aeg
Ml* .·.: seoksessa TFE/CHaCla (1:2, til./til.). Synteesin etenemistä • · 65 118424 kaikissa vaiheissa seurattiin kvantitatiivisella ninhydriini-reaktiolla (katso taulukko III).
cun(.„.: i/wfUeffw Substitutio suojaa Jäljellä olevat amino- Arvioitu 3y.. e ” ^ van ryhmän poista- ryhmät (pmol/g) sen kytkeyty- va;Lhe jäännös miSen jälkeen jälkeen, kun on misaste toteutettu ___(mmol/g)_
Mitattu Teoreet- 1. 2. asety- tinen kytken-· kytken-loiminer ________tä tä___ _3_ 0.19 0.23 1.00 0.57 _4__BocTaeg 0.17 0.21 4.88 97.3 97.3 _5__BocC(Z)aeg 0.11__0.20 70.20 27.98 1.33 78.4(46) _8__BocTaeg__OIO__0.19 24.79 4.58 2.40 95.4 (75) _7__BocTaeg__009__0.18 8.55 1.61 0.20 >99.9 (93) _8__BocTaeg 0.08__0.17 6.53 0.80 0.45 99.0 (91) _β__BocTaeg__007__0.16 9.26 3.66 0.61 94.8 (86)
BocTaeg 0.07 0.15 5.32 1.48 0.60 98.8 (93) (b) H-[Taeg]5-Caeg-[Taeg]«-Lys-NHa: n pilkkominen, puhdistus ja tunnistus · .*··. Osa suojatusta Boc-[Taeg]s-Caeg-(Taeg]*-Lys(C1Z)-BHA-hartsista .·. ; käsiteltiin esimerkin I kohdassa (c) kuvatulla tavalla, joi-• * * .*_/ loin saatiin noin 14,4 mg raakamateriaalia, kun 66,9 mg kuivaa V,y H-[Taeg] s-Caeg-[Taeg] A-Lys (ClZ)-BHA-hartsia pilkottiin HF: llä.
14,5 minuutin kohdalla sijaitseva suurin piikki vastasi yli 50 • * · *·’ * % kokonaisabsorbanssista. 100,0 mg: n suuruinen annos raakatuo- tetta puhdistettiin (8 erää; kukin liuotettiin 1 ml: aan vet-..*·* tä), jolloin saatiin noin 9, 1 mg 9 6-prosentti s es ti puhdasta V : H-[Taeg]s-Caeg-tTaegl^-Lys-NHa: ta (kuvio 13b). (M+H)-:n ta- pauksessa laskettu m/z-arvo » 2793, 8 ja mitattu m/z-arvo * 2790, 6.
• · • · ··« * ··· ···# • · • · · • e· • · 66 1 1 8424
Esimerkki 21 N-bents yy1i oks i karbonyyli-N' -(Boc-ami noetyyli)glys i i ni
Aminoetyyliglysiiniä (52, 86 g; 0, 447 mol) liuotettiin veteen (900 ml) ja dioksaania (900 ml) lisättiin. pH asetettiin arvoon 11,2 2N NaOH: 11a. pH: ta arvossa 11,2 pitäen tert.-butyy-li-p-nitrofenyylikarbonaattia (128,4 g; 0,537 mol) liuotettiin dioksaaniin (720 ml) ja liuos lisättiin pisaroittain 2 tunnin aikana. pH pidettiin arvossa 11,2 vielä vähintään kolmen tunnin ajan ja sitten seosta sekoitettiin yön yli. Keltainen liuos jäähdytettiin 0 *C:n lämpötilaan ja pH asetettiin arvoon 3,5 2N HC1: llä. Seos pestiin kloroformilla (4x100 ml) ja vesi-faasin pH asetettiin arvoon 9,5 2N NaOH: 11a 0 *C:ssa. Bentsyy-1 i oks i karbonyyl iki ori di a (73,5 ml; 0,515 mol) lisättiin puolen tunnin aikana, pitäen pH arvossa 9, 5 2N NaOH: 11a. pH: ta säädettiin usein seuraavien 4 tunnin aikana ja liuosta sekoitettiin yön yli. Seuraavana päivänä liuos pestiin eetterillä (3x600 ml) ja liuoksen pH säädettiin jälkeenpäin arvoon 1,5 2N HC1: llä 0 *C:ssa. Otsikon mukainen yhdiste eristettiin uuttamalla etyyliasetaatilla (5x1000 ml). Etyyliasetaattiliuos kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin kuiviin va-kuumissa. Tällöin saatiin 138 g, jotka liuotettiin eetteriin (300 ml) ja saostettiin lisäämällä petroolieetteriä (1800 ml). Saanto 124, 7 (79 %). Sp. 64, 5-85 * C. Analyysi yhdisteelle ·"*: Ci^HaiNaOs: todettu (laskettu) C 58, 40 (57, 94); H 7, 02 (6, 86); N 7, 94 (7, 95). ^H-NMR (250 MHz, CDCla) 7,33 & 7,32 (5H, Ph); :*.·! 5,15 & 5,12 (2H, PhCHa); 4,03 & 4,01 (2H, NCHaCOaH); 3,46 (b, j*v 2H, BooNHCHaCHa); 3,28 (b, 2H, BocNHCHaCHa); 1,43 & 1,40 (9H, «Bu). HPLC (260 nm) 20,71 min (80,2 %) ja 21,57 min (19,8 %).
• * UV-spektrit (200 nm - 300 nm) ovat identtiset, mikä osoittaa, että pieni piikki koostuu yhdisteestä Bis-Z-AEG.
··· ···· • · e V ** Esimerkki 22 * N' -Boc-aminoetyyli-glysiini-etyyliesteri • · · • · • · *" N-bentsyylioksikarbonyyli-N' -Boc-aminoetyyliJglysiiniä (60,0 * · s ···: g; 0,170 mol) ja N, N-dimetyyli-4-aminopyridiiniä (6,00 g) liuotettiin absoluuttiseen etanoliin (500 ml) ja jäähdytettiin 67 118424 O * C: n lämpötilaan ennen yhdisteen DCC (42,2 g; 0, 204 mol) lisäämistä. Jäähaude poistettiin 5 minuutin kuluttua ja sekoittamista jatkettiin vielä 2 tuntia. Saostunut DCU (32,5 g kuivattuna) poistettiin suodattamalla ja pestiin eetterillä (3x100 ml). Yhdistetty suodos pestiin peräkkäin laimealla kaliumvetysulfaatilla (2x400 ml), laimealla natriumvetykarbo-naatilla (2x400 ml) ja kylläisellä natriumkloridilla (1x400 ml). Orgaaninen faasi suodatettiin, kuivattiin sitten magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin 66, 1 g öljymäistä ainetta, joka sisälsi jonkin verran yhdistettä DCU.
Öljy liuotettiin absoluuttiseen etanoliin (600 ml) ja siihen lisättiin 6,6 g hiileen sidottua palladiumia (10 %). Liuosta hydrattiin ilmakehän paineessa, säiliön täyttyessä 2N natrium-hydroksidilla. Neljän tunnin kuluttua teoreettisesta 4,2 litrasta oli kulunut 3,3 litraa. Reaktioseos suodatettiin selii-tin läpi ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin 39,5 g (94 %) öljymäistä ainetta. 13 g tätä öljymäistä ainetta puhdistettiin kromatografisesti silikageelillä (600 g SiOa). Eluointi toteutettiin 300 ml: 11a 20 % petroolieetteriä mety- leenikloridissa, minkä jälkeen otsikon mukainen yhdiste eluoi-tiin 1700 ml:lla 5 % metanolia metyleenikloridissa. Liuotin * poistettiin fraktioista vakuumissa siten, että päästiin tyydyt-tävään puhtauteen, ja saanto oli 8,49 g.
• · · • »i * · • · ϊ.ϊ 1 Vaihtoehtoisesti 10 g raakamateriaalia puhdistettiin Kugel • · · ί Rohr-tisisuksella. ^H-NMR (250 MHz, CDaOD); 4,77 (b. s, NH); :T: 4,18 (q, 2H, MeCHa-); 3,38 (s, 2H, NCHaCOaEt); 3,16 (t, 2H,
BocNHCHaCHa); 2,68 (t, 2H, BocNHCHaCHa); 1,43 (s, 9H, ^Bu) ja ·;· 1,26 (t, 3H, CH3) 13C-NMR 171,4 (COEt); 156,6 (CO); 78,3 • t*« ^ [(CHs)eCj; 59,9 (CHa); 49,0 (CHa); 48,1 (CHa); 39,0 (CHa); 26, 9 (CHa) ja 12, 6 (CHa).
• · • * · • · • a • a a a a ··· a • •aa a a • · a • ·· • a 68 118424
Eelmerkki 23 Ν' -Boc-aminoetyyli-glysiini-metyyliesteri Tässä meneteltiin edellä kuvatulla tavalla, korvaten etanoli metanolilla. Lopullinen tuote puhdistettiin pylvään avulla puhdistamalla.
Esimerkki 24 l-(Boc-aeg)tymiini-etyyliesteri N' -Boc-aminoetyyli-glysiinietyyliesteriä (13,5 g; 54,8 mmol), DhbtOH (9,84 g; 60,3 mmol) ja 1-karboksimetyylitymiiniä (11,1 g; 60,3 mmol) liuotettiin DMF: ään (210 ml). Sitten lisättiin metyleenikloridia (210 ml). Liuos jäähdytettiin 0 ' C: n lämpö tilaan etanoli/jää-hauteessa ja yhdistettä DCC (13,6 g; 65,8 mmol) lisättiin. Jäähaude poistettiin 1 tunnin kuluttua ja sekoittamista jatkettiin vielä 2 tuntia ympäristön lämpötilassa. Saostunut DCU poistettiin suodattamalla ja pestiin kahdesti metyleenikloridilla (2x75 ml). Yhdistettyyn suodokseen lisättiin enemmän metyleenikloridia (650 ml). Tämä liuos pestiin peräkkäin laimealla natriumvetykarbonaatilla (3x500 ml), laimealla kaliumvetysulfaatilla (2x500 ml) ja kylläisellä natriumkloridilla (1x500 ml). Jonkin verran sakkaa poistettiin •V orgaanisesta faasista suodattamalla. Orgaaninen faasi kuivat-* ·· tiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa.
:/.· Öljymäinen jäännös liuotettiin metyleenikloridiin (150 ml), : suodatettiin ja otsikon mukainen yhdiste saostettiin lisäämäl- • · · · t1·*. lä petroolieetteriä (350 ml) 0 ’C:ssa. Metyleenikloridi/pet- • e roolieetteri-käsittely toistettiin kerran. Tällä tavalla saatiin 16,0 g (71 %) materiaalia, jonka puhtaus oli enemmän kuin 99 % HPLC-määrityksen perusteella.
·1«· * · « • · ·
Esimerkki 25 » » » :***: 1-(Boc-aeg) tyrniini * · ♦ * * 1 ·
Edellä saatu materiaali suspendoitiin THF: iin (194 ml, jolloin • » »
1 saatiin 0,2 M liuos), ja siihen lisättiin litiumhydroksidin IM
69 118424 vesiliuosta (116 ml). Seosta sekoitettiin 45 minuuttia ympäristön lämpötilassa ja sitten se suodatettiin jäljelle jääneen DCU: n poistamiseksi. Liuokseen lisättiin vettä (40 ml), minkä jälkeen liuos pestiin metyleenikloridilla (300 ml). Vettä (30 ml) lisättiin edelleen ja tämä alkalinen liuos pestiin vielä kerran metyleenikloridilla (150 ml). Vesiliuos jäähdytettiin 0 *C: n lämpötilaan ja pH asetettiin arvoon 2 lisäämällä pisaroit-tain IN HC1 (noin 110 ml). Otsikon mukainen yhdiste uutettiin etyyliasetaatilla (9x200 ml), yhdistetyt uutteet kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja ne haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Jäännös haihdutettiin kertaalleen metanolista, ja sitä kuivattiin yön yli, jolloin saatiin väritöntä lasimaista kiintoainetta. Saanto: 9,57 g (64 %). HPLC > 98 % R* = 14,8 min. Analyysi yhdisteelle C16H24N4O7O,25 HaO: Todettu (laskettu) C 49,29 (49, 42); H 6, 52 (6, 35); N 14,11 (14,41). Koska pyöriminen sekundäärisen amidin ympäri oli rajoittunut, useat signaalit olivat kaksinkertaisia suhteessa 2: 1 [mikä on esitetty luettelossa lyhenteellä mj., joka tarkoittaa "suurta”, ja mi., joka tarkoittaa "pientä" ). 1H-NMR (250 MHz, DMSO-de): 12,75 (b. s., 1H, COaH); 11,28 (s, "1H", mj., imidi-NH); 11,26 (s, "1H", mi., imidi-NH); 7,30 (s, "1H", mj., T H-6); 7,26 (s, "1H", mi., H-6); 6,92 (b. t. , "1H", mj., BocNH); 6,73 (b. t. , " 1H", .·, mi., BocNH); 4,64 (s, " 2H", mj., CHaCON); 4,46 (s, " 2H", mj., CHaCON); 4,19 (s, " 2H", mi., CHaCOaH); 3,97 (s, " 2H" , mj., CHaCOaH); 3,63-3,01 (ei erottunut m, sisältäen vettä, CHaCHa); !V 1,75 (s, 3H, CH 3) ja 1,38 (s, 9H, eBu).
• · · ·»· * t* ♦ • ·* Esimerkki 26 • ·· *.* * N4-bentsyylioksikarbonyyli-l-(Boc-aeg)sytosiini ,.*·* N' -Boc-aminoetyyli-glysiini-etyyli es teriä (5,00 g; 20,3 mmol), ϊ^:: DhbtOH (3,64 g; 22,3 mmol) ja N^-bentsyylioksikarbonyyli-l- karboksi metyyli s ytosiini (6,77 g; 22,3 mmol) suspendoitiin v · ... DMF; ään (10 ml). Sitten lisättiin metyleeni kloridi a (100 ml).
a · **:** Liuos jäähdytettiin 0 * C: n lämpötilaan ja yhdistettä DCC (5,03 ♦ g; 24,4 mmol) lisättiin. Jäähaude poistettiin 2 tunnin kulut-tua ja sekoittamista jatkettiin vielä tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Sitten reaktioseos haihdutettiin kuiviin vakuu- 70 118424 riaali eristettiin suodattamalla/ se pestiin vedellä ja kuivattiin. HPLC-määrityksen mukaan (ilmaiseminen tapahtui aallonpituudella 260 nm) tämän materiaalin puhtaus oli enemmän kuin 99 %, DCO: n ohella. Sitten tämä esteri suspendoitiin THF: iin (100 ml), jäähdytettiin 0 *C:n lämpötilaan ja seokseen lisättiin IN LiOH: ta (61 ml). 15 minuuttia kestäneen sekoittamisen jälkeen seos suodatettiin ja suodos pestiin metyleenikloridil-la (2x150 ml). Sitten alkalinen liuos jäähdytettiin 0 * C: n
lämpötilaan ja pH asetettiin arvoon 2,0 IN HCl-liuoksella. Otsikon mukainen yhdiste eristettiin suodattamalla ja se pestiin kerran vedellä, jolloin kuivaamisen jälkeen saatiin 11,3 g valkoista jauhetta. Tämä materiaali suspendoitiin metyleeni-kloridiin (300 ml) ja petroolieetteriä (300 ml) lisättiin. Suodatuksen, pesun ja kuivaamisen jälkeen saatiin 7, 1 g (69 %). HPLC-määrityksen perusteella puhtaus oli 99 % Rt = 19,5 min., ja 12,6 minuutin kohdalla todettiin vähäistä epäpuhtautta (noin 1 %), joka oli mitä todennäköisemmin Z-de-suojattu monomeeri. Analyysi yhdisteelle Ca3HaeN»Oe (todettu (laskettu): C 54, 16 (54, 87); H 5,76 (5,81) ja N 13,65 (13,91). *H-NMR
(250 MHz, DMSO-de). 10,78 (b. s, 1H, COaH); 7,88 (2 päällekkäin menevää dublettia, 1H, Cyt H-5); 7,41-7,32 (m, 5H, Ph); 7,01 (2 päällekkäin menevää dublettia, 1H, Cyt H-6); 6,94 & 6,78 (erottum. tripletit, 1H, BocNH); 5,19 (s, 2H, PhCHa); 4,81 & M* 4,62 (s, 2H, CHaCON); 4,17 & 3,98 (s, 2H, CHaCOaH); 3,42-3,03 (m, sisältäen vettä, CHaCHa) ja 1,38 & 1,37 (s, 9H, *Bu).
·.*·: i3C-NMR: 150, 88; 128, 52; 128,18; 127, 96; 93, 90; 66, 53; 49,58 S ja 28, 22. IR: taajuus yksiköissä cm-1 (intensiteetti): 3423 ! V (26, 4), 3035 (53, 2), 2978 (41, 4), 1736 (17, 3), 1658 (3, 8), 1563 (23, 0), 1501 (6, 8) ja 1456 (26, 4).
·:· Esimerkki 27 e··· . *: *. 9-karboks i metyyli-adenii ni-etyyli es teri e
Adeniinia (10,0 g, 74 mmol) ja kaliumkarbonaattia (10,29 g, 74,0 mmol) suspendoitiin DMF: ään ja etyylibromiasetaattia ··· (8,24 ml, 74 mmol) lisättiin. Suspensiota sekoitettiin 2,5 t · e e : tuntia typpi-ilmakehässä, huoneen lämpötilassa, ja sitten se suodatettiin. Kiinteä jäännös pestiin kolmeen kertaan DMF; llä 71 118424 (10 ml). Yhdistetty suodos haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Kellanoranssi kiintoaine kaadettiin veteen (200 ml) ja 4N HC1-liuosta lisättiin siten, että pH-arvoksi saatiin noin 6. Seosta sekoitettiin 0 'C: n lämpötilassa 10 minuuttia, kiintoaine suodatettiin, pestiin vedellä ja kiteytettiin uudestaan 96 % etanolista (150 ml). Otsikon mukainen yhdiste eristettiin suodattamalla ja pestiin huolellisesti eetterillä. Saanto 3,4 g (20 %). Sp. 215, 5-220 * C. Analyysi yhdisteelle CsHnNsOa todettu (laskettu): C 48, 86 (48, 65); H 5,01 (4,91); N 31,66 (31,42). *H-NMR (250 MHz; DMSO-de): (s, 2H, H-2 &H-8), 7,25 (b. s., 2H, NHa), 5,06 (s, 2H, NCHa), 4,17 (q, 2H, J=7, 11 Hz, OCHa) ja 1,21 (t, 3H, J=7, 13 Hz, NCHa). *»C-NMR: 152, 70; 141,30; 61,41; 43, 97 ja 14,07. FAB-MS: 222 (MH+). IR: taajuus yksikössä cm-1 (intensiteetti): 3855 (54, 3), 3274(10, 4), 3246(14, 0), 3117(5, 3), 2989(22, 3), 2940(33, 9), 2876(43, 4), 2753(49, 0), 2346(56, 1), 2106(57, 1), 1899(55, 7), 1762(14, 2), 1742(14, 2), 1742(1, 0), 1671(1, 8), 1644(10, 9), 1606(0, 6), 1582(7, 1), 1522(43, 8), 1477(7, 2), 1445(35, 8) ja 1422(8, 6).
Alkyloitumisasema varmistettiin röntgensädekristallografisesti kiteillä, jotka oli saatu kiteyttämällä uudelleen 96 % etanolista.
.· Esimerkki 28
Ne-bentsyylioksikarbonyyli-9-karboksimetyyli -adoniini -etyyli -Γ*. esteri e · · • ·♦ • e e · • · i i.li 9-karboksimetyyliadeniini-etyyliesteriä (3,40 g, 15,4 mmol) • liuotettiin kuivaan DMF: ään (50 ml) varovasti kuumentaen, : jäähdytettiin 20 * C: hen ja lisättiin liuokseen, joka sisälsi 1 N-etyyli-bentsyylioksikarbonyyli-imidatsoli-tetrafluoriboraat- "*j* tia (62 mmol) metyleenikloridissa (50 ml), 15 minuutin aikana, ·*·*: samalla jäissä jäähdyttäen. Tällöin todettiin vähäistä saostu- * , mistä. Jäähaude poistettiin ja liuosta sekoitettiin yön yli.
Reaktioseosta käsiteltiin kylläisellä natriumvetykarbonaatilla e · *...* (100 ml). 10 minuuttia kestäneen sekoittamisen jälkeen faasit #>*:· erotettiin ja orgaaninen faasi pestiin peräkkäin yhdellä tila- ·*·,» vuudella vettä, laimeata kaliumvetysulfaattia (kahdesti) ja • · kylläistä natriumkloridia. Liuos kuivattiin magnesiumsuifaa- 72 118424 tiliä ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin 11 g öljymäistä materiaalia. Tämä materiaali liuotettiin metylee-nikloridiin (25 ml)/ jäähdytettiin 0 * C: hen ja saostettiin petroolieetteristä (50 ml). Tämä toimenpide toistettin kerran, jolloin saatiin 3,45 g (63 %) otsikon mukaista yhdistettä. Sp.
132-135 * C. Analyysi yhdisteelle CitIU-tNsCU, todettu (laskettu): C 56, 95 (57, 46); H 4,71 (4,82); N 19,35 (19, 71). ^H-NMR
(250 MHz; CDCla); 8,77 (s, 1H, H-2 tai H-8); 7,99 (s, 1H, H-2 tai H-8); 7, 45-7, 26 (m, 5H, Ph); 5,31 (s, 2H, N-CHa); 4,96 (s, 2H, Ph-CHa); 4,27 (q, 2H, J*7, 15 Hz, CHaCHa) ja 1,30 (t, 3H, J=7, 15 Hz, CHaCHs). 13C-NMR: 153,09; 143,11; 128, 66; 67, 84; 62,51; 44, 24 ja 14,09. FAB-MS: 356 (MH+) ja 312 (MH+-COa). IR: taajuus yksikössä cm-1 (intensiteetti): 3423 (52, 1); 3182 (52.8) ; 3115 (52,1); 3031 (47, 9); 2981 (38, 6); 1747 (1,1); 1617 (4,8); 15,87 (8,4); 1552 (25, 2); 1511 (45,2); 1492 (37.9) ; 1465 (14, 0) ja 1413 (37,3).
Esimerkki 29 N «-bents yy1i oks i karbonyy1i-9-karboks imetyyli adeniini
Ne-bentsyylioksikarbonyyli-9-karboksimetyyliadeniini-etyylies- teriä (3,20 g; 9,01 mmol) sekoitettiin metanoliin (50 ml), •\ joka oli jäähdytetty 0 * C: hen. Natriumhydroksidiliuosta (50 * · .···, ml; 2N) lisättiin, jolloin materiaali liukeni nopeasti. Sen t***j jälkeen, kun tätä alkalista liuosta oli pidetty 30 minuuttia 0 t ·« / / *C:ssa, se pestiin metyleenikloridilla (2x50 ml). Vesiliuoksen “*,* pH asetettiin arvoon 1,0 4N HC1-liuoksella 0 *C:ssa, jolloin J * · otsikon mukainen yhdiste saostui. Saanto suodattamisen, vedel- • * · * lä pesun ja kuivaamisen jälkeen oli 3,08 g (104 %). Tuote
sisälsi suolaa ja se näkyi alkuaineanalyysissa. Analyysi yh-disteelle CisHiaNaO* todettu (laskettu): C 46, 32 (55, 05); H
:T: 4, 24 (4, 00); N 18,10 (21,40) jaC/N: 2, 57 (2, 56). 1H-NMR (250 MHz; DMSO-de): 8,70 (s, 2H, H-2 ja H-8); 7, 50-7, 35 (m, 5H, * * t...t Ph); 5,27 (s, 2H, N-CHa); ja 5,15 (s, 2H, Ph-CHa). 13C-NMR: ’·:** 168, 77, 152, 54, 151, 36, 148, 75, 145, 13, 128, 51, 128, 17, 127, 98, 66, 76 ja 44, 67. IR (KBr): 3484 (18, 3); 3109 (15,9); 3087 (15, 0); 2966 (17, 1); 2927 (19, 9); 2383 (53, 8); 1960 (62,7); 1739 (2, 5); 1688 (5, 2); 1655 (0, 9); 1594 (11, 7); 1560 73 118424 (12,3); 1530 (26, 3); 1499 (30, 5); 1475 (10, 4); 1455 (14, 0); 1429 (24, 5) ja 1411 (23,6). FAB-MS: 328 (MH+) ja 284 (MH+-CO»)- HPLC (215 nm, 260 nm) järjestelmässä 1: 15,18 minuuttia, vähäisiä epäpuhtauksia, yhteensä vähemmän kuin 2 %.
Esimerkki 30 N*-bentsyylioksikarbonyyli-l-(Boc-aeg)adeniini-etyyliesteri
Yhdisteitä N' -Boc-aminoetyyli-glysiini-etyyliesteriä (2,00 g; 8,12 mmol), DhbtOH (1,46 g; 8,93 mmol) ja Ne-bentsyylioksikar-bonyyli-9-karboksimetyyli-adeniini (2,92 g; 8,93 mmol) liuotettiin DMF: ään (15 ml). Sitten lisättiin metyleenikloridia (15 ml). Liuos jäähdytettiin 0 *C: n lämpötilaan etanoli/jää-hauteessa. Yhdistettä DCC (2,01 g; 9,74 mmol) lisättiin. Jää-haude poistettiin 2,5 tunnin kuluttua ja sekoittamista jatkettiin vielä 1, 5 tuntia ympäristön lämpötilassa. Saostunut DCU poistettiin suodattamalla ja se pestiin kertaalleen DMF: llä (15 ml) ja kahdesti metyleenikloridilla (2x15 ml). Yhdistettyyn suodokseen lisättiin enemmän metyleenikloridia (100 ml). Liuos pestiin peräkkäin laimealla natriumvetykarbonaatilla (2x100 ml), laimealla kaliumvetysulfaatilla (2x100 ml) ja kylläisellä natriumkloridilla (1x100 ml). Orgaaninen faasi , haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin 3,28 g (73 %) kellertävää öljymäistä ainetta. Raakatuotteen HPLC osoitti ...* puhtaudeksi vain 66 % sekä useita epäpuhtauksia, jotka olivat « · V'i sekä enemmän että vähemmän polaarisia kuin varsinainen piikki, ·.· ϊ öljy liuotettiin absoluuttiseen etanoliin (50 ml) ja siihen ί * : lisättiin aktiivihiiltä. Viisi minuuttia kestäneen sekoittami- • · .*·*; sen jälkeen liuos suodatettiin. Suodos sekoitettiin veteen (30 ml) ja sitä sekoitettiin yön yli. Seuraavana päivänä valkoinen sakka poistettiin suodattamalla, pestiin vedellä ja kuivatti·, tiin, jolloin saatiin 1, 16 g (26 %) materiaalia, jonka puhtaus • « · *, oli enemmän kuin 98 % HPCL-analyysin perusteella. Veden lisää- **" minen emäliuokseen tuotti vielä 0,53 g, jonka puhtaus oli noin 95 %. Analyysi yhdisteelle CaeHssN-rOvHaO todettu (laskettu): C 55, 01 (54, 44); H 6,85 (6,15) ja N 16, 47 (17, 09). *H-NMR (250 T\ MHz, CDC13) 8,74 (s, 1H, Ade H-2); 8,18 (b. S, 1H, ZNH); 8,10 & 8,04 (s, 1H, H-8); 7, 46-7, 34 (m, 5H, Ph); 5,63 (ei erott. t, ..... . .'tl.fcb·.**', 74 118424 4,29 & 4,06 (s, 2H, CHaCOaH); 4,20 (q, 2H, OCHaCHa); 3,67-3,29 (m, 4H, CHaCHa); 1,42 (s, 9H, *Bu) ja 1,27 (t, 3H, OCHaCHa). Spektrissä nähdään jäämiä etanolista ja DCU: sta.
Esimerkki 31
Ne-bentsyylioksikarbonyyli~l-(Boc-aeg)adeniini N*-bentsyylioksikarbonyyli-l-(Boc-aeg)adeniini-etyyliesteriä (1,48 g; 2,66 mmol) suspendoitiin THF: iin (13 ml) ja seos jäähdytettiin 0 *C:n lämpötilaan. Litiumhydroksidia (8 ml; IN) lisättiin. 15 minuuttia kestäneen sekoittamisen jälkeen reak-tioseos suodatettiin, siihen lisättiin ylimääräistä vettä (25 ml) ja liuos pestiin metyleenikloridilla (2x25 ml). Vesiliuoksen pH asetettiin arvoon 2,0 IN HClsllä. Sakka eristettiin suodattamalla, pestiin vedellä ja kuivattiin, jolloin saatiin 0,82 g (58 %). Tuote seostettiin uudelleen kahdesti metylee
ni kloridin/petroolieetterin seoksella, ja kuivaamisen jälkeen saatiin 0,77 g (55 %). Sp. 119 *C (hajoaa). Analyysi yhdisteelle Ca-HaaNyOvHaO todettu (löydetty): C 53, 32 (52, 84); H
5,71 (5,73); N 17, 68 (17, 97). FAB-MS: 528, 5 (MH+). 1H-NMR (250 MHz, DMSO-de): 12,75 (hyvin b, 1H, COaH); 10,65 (b. s, 1H, ZNH); 8,59 (d, 1H, J=2, 14 Hz, Ade H-2); 8,31 (s, 1H, Ade H-8); ,· 7,49-7,31 (m, 5H, Ph); 7,03 & 6,75 (ei erott. t, 1H, BocNH); 5,33 & 5,16 (S, 2H, CHaCON); 5,22 (s, 2H, PhCHa); 4,34-3,99 ;*V (s, 2H, CHaCOaH); 3, 54-3, 03 (m: t, sisältäen vettä, CHaCHa) ja I t I *“ *“ // 1,39 & 1,37 (s, 9H, ^Bu). 13C-NMR: 170,4; 166,6; 152,3; 151,5; j;V 149,5; 145,2; 128,5; 128,0; 127,9; 66, 32; 47, 63; 47, 03; 43,87 : V ja 28, 24.
Il» Ϊ* I • · 9
Esimerkki 32 •; * 2-amino-6-kloori-9-karboksi me t y y 1 i puri i ni
• »M
V *· « · · 9 · · 9
Suspensioon, joka sisälsi 2-amino-6-klooripuriinia (5,02 g;
.|»M
29,6 mmol) ja kaliumkarbonaattia (12,91 g; 93,5 mmol) DMF; ssä t e *··* (50 ml), lisättiin bromietikkahappoa (4,70 g; 22,8 mmol).
·:· Seosta sekoitettiin voimakkaasti 20 tuntia typpi-ilmakehässä.
•tee
Vettä (150 ml) lisättiin ja liuos suodatettiin Celite: n läpi, e · ,* ...... ·.·_·.-.'»VW». ·- - 118424 75 jolloin saatiin kirkkaan keltainen liuos. Tämä liuos tehtiin happamaksi pH-arvoon 3 4N kloorivetyhapolla. Sakka suodatettiin ja kuivattiin vakuumissa sikapentin läsnäollessa. Saanto (3,02 g; 44,8 %). lH-NMR (DMSO-d6): d = 4, 88 ppm (s, 2H); 6,95 (S, 2H); 8, 10 (s, 1H).
Esimerkki 33 2-ami no-6-bents yyli oks i-9-karboks imetyylipuri i ni
Natriumia (2,0 g; 87,0 mmol) liuotettiin bentsyylialkoholiin (20 ml) ja liuos kuumennettiin 130 *C: n lämpötilaan 2 tunniksi. Sen jälkeen, kun liuos oli jäähdytetty 0 ' C: hen, siihen lisättiin hitaasti liuos, joka sisälsi 2-amino-6-kloori-9-karboks ime tyyli puri ini a (4,05 g; 18,0 mmol) DMF: ssä (85 ml), ja tuloksena saatua suspensiota sekoitettiin yön yli 20 *C: ssa. Natriumhydroksidiliuosta (IN, 100 ml) lisättiin ja kirkas liuos pestiin etyyliasetaatilla (3x100 ml). Sitten vesifaasi tehtiin happamaksi pH-arvoon 3 4N kloorivetyhapolla. Sakka liuotettiin etyyliasetaattiin (200 ml) ja vesifaasi uutettiin etyyliasetaatilla (2x100 ml). Yhdistetyt orgaaniset faasit pestiin kylläisellä natriumkl ori di liuoksen a (2x75 ml), kuivattiin vedettömällä natriumsulfaatilla ja haihdutettiin kui-.· viin vakuumissa. Jäännös kiteytettiin uudestaan etanolista l.'.' (300 ml). Saanto vakuumissa, sikapentin läsnäollessa kuivaami- I”. sen jälkeen: 2,76 g (52 %). Sp. 159-165 * C. Analyysi (lasket- * · · !* " tu; todettu): C (56,18; 55, 97), H (4,38; 4,32), N (23,4; f;:/ 23,10). *H-NMR (DMSO-de): 4, 82 ppm (s, 2H); 5,51 (s, 2H); 6,45 : (s, 2H); 7,45 (m, 5H); 7,82 (s, 1H).
♦ · ♦ » · ·
Esimerkki 34 N~ (f 2-amino-6-bentsyylioksi-puriini-9-yyli ] -asetyyli) -N- (2-Boc-aminoetyyli)-glysiini (BocGaeg-OH-monomeeri ] j..‘ 2-amino-6-bentsyylioksi-9-karboksimetyyli-puriinia (0,50 g; • · ‘•••* 1,67 mmol), metyyli-N- (2 - [ tert. -butoksikarbonyyli amino ] etyy- tt'l· li)-glysinaattia (0,65 g; 2,80 mmol), di-is opropyyli etyyli- amiinia (0,54 g; 4,19 mmol) ja bromi-tris-pyrrolidino-fosfo- • · nium-heksafluori fosfaattia (PyBroP®) (0, 798 g; 1,71 mmol) 76 118424 sekoitettiin DMF: ssä (2 ml) 4 tunnin ajan. Tämä kirkas liuos kaadettiin jäissä jäähdytettyyn natriumvetykarbonaattiliuok-seen (IN; 40 ml) ja uutettiin etyyliasetaatilla (3x40 ml). Orgaaninen kerros pestiin kaiiumvetysuifaattiliuoksella (IN; 2x40 ml), natriumvetykarbonaatilla (IN; 1x40 ml) ja kylläisellä natriumkloridiliuoksella (60 ml). Vedettömällä natriumsul-faatilla kuivaamisen ja vakuumissa haihduttamisen jälkeen kiinteä jäännös kiteytettiin uudestaan etyyliasetaatin ja heksaanin seoksesta (20 ml; 2: 1), jolloin saatiin metyylieste-riä 63 % saannolla (MS-FAB 514 (M+l)). Hydrolyysi toteutettiin liuottamalla esteri etanoli/vesi-seokseen (30 ml (1:2)), joka sisälsi väkevää natriumhydroksidia (1 ml). Kaksi tuntia kestäneen sekoittamisen jälkeen liuos suodatettin ja tehtiin happamaksi pH-arvoon 3 lisäämällä 4N kloorivetyhappoa. Otsikon mukainen yhdiste saatiin suodattamalla. Saanto: 370 mg (72 % hydrolyysin tapauksessa). Puhtaus HPLC-määrityksen perusteella oli enemmän kuin 99 %. Koska pyöriminen sekundäärisen amidisi- doksen ympäri oli rajoittunut, niin useat signaaleista olivat kaksinkertaisia suhteessa 2: 1 (mikä on esitetty luettelossa lyhenteellä mj, joka tarkoittaa "suurta", ja mi., joka tarkoittaa "pientä"). 1H-NMR (250 MHz, DMSO-de): d * 1,4 ppm.
(s, 9H); 3/2 (m, 2H); 3/6 (m, 2H); 4/1 (s, mj., CONRCHaCOOH); 4,4 .. (s, mi., CONRCHaCOOH); 5,0 (s, mi., Gua-CHaCO-); 5,2 (s, mj., :.lt Gua-CHaCO); 5,6 (s, 2H); 6,5 (s, 2H); 6/9 (m, mi./ BocNH); 7/1 ;|V (»/ mj./ BocNH); 7,5 (m./ 3H); 7,8 (s, 1H); 12,8 (s;lH). l3C- ;·*;*· NMR: 170, 95; 170, 52; 167, 29; 166, 85; 160, 03; 159/ 78; 155, 84; iJj 154, 87; 140, 63; 136, 76; 128,49; 128,10; 113,04; 78,19; 77, 86; : 7 66,95; 49, 22; 47,70; 46, 94; 45, 96; 43, 62; 43,31 ja 28, 25.
* ·· • · · • · ·
Esimerkki 35 .·· 3-Boc-amino-l, 2-propaani di oli *··» * · · • · · *·* * ·, 3-amino-1, 2-propaani di oi ia (40, 00 g, 0, 440 mol, 1,0 ekvival. ) ] liuotettin veteen (1000 ml) ja liuos jäähdytettiin 0 * C: n lämpötilaan. Di-tert. -butyyli-di karbonaatti a (115,0 g, 0,526 mol, 1,2 ekvival. ) lisättiin yhtenä annoksena. Reaktioseos ··♦· .·. j lämmitettiin huoneen lämpötilaan vesihauteessa samalla sekoittaen. pH pidettiin arvossa 10,5 liuoksella, joka sisälsi nat- 77 118424 riumhydroksidia (17#56 g, 0, 440 mol, 1,0 ekvival. ) vedessä (120 ml). Kun natriumhydroksidin vesiliuos oli lisätty, reak-tioseosta sekoitettiin yön yli huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen etyyliasetaattia (750 ml) lisättiin reaktioseokseen, joka jäähdytettiin sitten 0 * C: n lämpötilaan. pH asetettiin arvoon 2,5 4N rikkihapolla samalla voimakkaasti sekoittaen. Faasit erotettiin ja vesifaasi pestiin lisäännöksellä etyyliasetaattia (6x350 ml). Orgaanisen faasin tilavuus pienennettiin 900 ml: ksi haihduttamalla alennetussa paineessa. Tämän jälkeen orgaaninen faasi pestiin kaliumvetysulfaatin kylläisellä vesiliuoksella, joka oli laimennettu tilavuudeltaan kaksinkertaiseksi (1x1000 ml) ja natriumkloridin kylläisellä vesiliuoksella (1x500 ml). Orgaaninen faasi kuivattiin (MgSO«) ja haihdutettiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin 50, 12 g (60 %) otsikon mukaista yhdistettä. Tuote voitiin muuttaa kiinteäksi haihduttamalla metyleeniklorldista ja pakastamalla tämän jälkeen. *H-NMR (CDCla/TMS): d = 1,43 (s, 9H, Me3C), 3,25 (m, 2H, CHa), 3,57 (m, 2H, CHa), 3,73 (m, 1H, CH). *3C-NMR (CDCla/TMS): d- 28,2 (Me3C), 42,6 (CHa), 63,5, 71,1 (CHaOH, CHOH), 79,5 (Me3C), 157,0 (C*0).
Esimerkki 36 ·'. 2- (Boc-amino)etyyli-L-alaniini-metyyliesteri * · ' · ·· • · .·. : 3-Boc-amino-l, 2-propaanidiolia (20,76 g, 0,109 mol, 1 ekvi- ·*.·] vai. ) suspendoitiin veteen (150 ml). Kalium-m-perjodaattia II*.* (24, 97 g, 0,109 mol, 1 ekvival.) lisättiin ja reaktioseosta : * : *..I sekoitettiin 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa typpi-ilmake- • · · ** ’ hässä. Reaktioseos suodatettiin ja vesifaasi uutettiin kloroformilla (6x250 ml). Orgaaninen faasi kuivattiin (MgSO«) ja ..M* haihdutettiin, jolloin saatiin lähes kvantitatiivisena saanto-
• M
: na Boc-aminoasetaldehydiä värittömänä Öljynä, jota käytettiin tämän enempää puhdistamatta seuraavassa toimenpiteessä.
• * ··· « · • · ‘I* Metanoliin (250 ml) lisättiin hiileen sidottua palladiumia ..li* (10 %; 0,8 g) typpi-ilmakehässä samalla jäähdyttäen (0 *C) ja voimakkaasti sekoittaen. Vedetöntä natriumasetaattia (4,49 g, 54,7 mmol, 2 ekvival.) ja L-alaniini-metyyliesteri-hydroklori- 78 118424 dia (3,82 g, 27,4 mmol, 1 ekvival. ) lisättiin. Boc-aminoase-taldehydiä (4,79 g, 30,1 mmol, 1,1 ekvival.) liuotettiin meta-noliin (150 ml) ja lisättiin reaktioseokseen. Reaktioseosta hydrattiin ilmakehän paineessa ja huoneen lämpötilassa, kunnes vedyn kulutus oli päättynyt. Reaktioseos suodatettiin Celite:n läpi, joka Celite pestiin vielä lisämäärällä MeOH: ta. MeOH poistettiin alennetussa paineessa. Jäännös suspendoitiin veteen (150 ml) ja pH asetettiin arvoon 8,0 lisäämällä pisaroit-tain 0, 5 N NaOH-liuosta samalla voimakkaasti sekoittaen. Vesi-faasi uutettiin metyleenikloridilla (4x250 ml). Orgaaninen faasi kuivattiin (MgSO«), suodatettiin Celite: n läpi ja haihdutettiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin 6,36 g (94 %) otsikon mukaista yhdistettä kirkkaana, hieman keltaisena öljynä. MS (FAB-MS): m/z (%) * 247 (100, M+l, 191 (90), 147 (18). *H-NMR (250 MHz, CDCla). 1,18 (d, J=7,0 Hz, 3H, Me), 1,36 (s, 9H, Me3C), 1,89 (h, 1H, NH), 2,51 (m, 1H, CHa), 2,66 (m, 1H, CHa), 3,10 (m, 2H, CHa), 3,27 (q, J»7,0 Hz, 1H, CH), 3,64 (s, 3H, OMe), 5,06 (b, 1H, karbamaatti-NH). 13C-NMR: d=18, 8 (Me), 28,2 (MesC), 40, 1, 47,0 (CHa), 51,6 (OMe), 56,0 (CH), 155,8 (karbamaatti C=0), 175,8 (esteri CsO).
Esimerkki 37 ·*, N- (Boo-aminoetyyli) -N- (1-tyminyyliasetyyli) -L-alaniini-metyy-* · .*··. liesteri * ·· • » * * · • ·« .* / Liuokseen, joka sisälsi Boc-aminoetyyli-(L)-alaniini-metyyli-f;*.1 esteriä (1,23 g, 5,0 mmol) DMF: ssä (10 ml), lisättiin yhdistät-tä Dhbt-OH (0,90 g, 5,52 mmol) ja 1 -tyrni nyylietikkahappoa • · * ’·’ * (1/01 g, 5,48 mmol). Kun l-tyminyylietikkahappo oli liuennut, dikloorimetaania (10 ml) lisättiin ja liuosta jäähdytettiin jäähauteessa. Sen jälkeen, kun reaktioseos oli saavuttanut 0 :j*: * C: n lämpötilan, siihen lisättiin yhdistettä DCC (1,24 g, 6,01 mmol). Viiden minuutin kuluessa tästä lisäyksestä todettiin • · DCU-sakka. Edelleen 5 minuutin kuluessa jäähaude poistettiin.
*;** Kahden tunnin kuluttua tlc-analyysi osoitti reaktion päätty- * neen. Seos suodatettiin ja sakka pestiin di kloori metaani 11 a (100 ml). Tuloksena ollut liuos uutettiin kahdesti 5 % natrium-vetykarbonaatilla (150 ml) ja kahdesti kylläisellä kaliumvety- 1 ' ' ' ... ...... ......... ι.-·ι.ύί3ν.ι 118424 79 sulfaatilla (25 ml) vedessä (100 ml). Sen jälkeen, kun liuos oli uutettu viimeisen kerran kylläisellä natriumkloridilla (150 ml), se kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin, jolloin saatiin valkoista vaahtoa. Vaahto puhdistettiin pyl-väskromatografisesti silikageelillä käyttäen dikloorimetaania ja metanoiigradienttia eluenttina. Tällä tavalla saatiin puhdas yhdiste (>99 % HPLC-määrityksellä) (1,08 g, 52,4 %).
FAB-MS: 413 (M+l) ja 431 (M+l + vesi). 1H-NMR (CDCla): 4,52 (S, 2H, CH'a); 3,73 (s, 3H, OMe); 3,2-3,6 (m, 4H, etyyli CHa: t); 1,90 (s, 3H, MeTissä); 1,49 (ά, 3H, He Ala: ssa, J=7, 3 Hz); 1,44 (s, 9H, Boc).
Esimerkki 38 N-(Boc-aminoetyyli)-N-(1-tyminyyliasetyyli)-L-alaniini
Otsikon mukaisen yhdisteen metyyliesteriä (2,07 g, 5,02 mmol) liuotettiin metanoliin (100 ml) ja liuosta jäähdytettiin jää-hauteessa. 2M natriumhydroksidia (100 ml) lisättiin. 10 minuutin pituisen sekoittamisen jälkeen seoksen pH asetettiin arvoon 3 4M kloorivedyllä. Sitten liuos uutettiin etyyliasetaatilla (3x100 ml). Yhdistetyt orgaaniset uutteet kuivattiin magnesiumsulfaatilla. Haihduttamisen jälkeen tuloksena ollut vaahto liuotettiin etyyliasetaattiin (400 ml) ja muutamaan t · .*··. ml: aan metanolia kiintoaineen liuottamiseksi. Sitten lisättiin .*!*: petrooli eetteriä niin paljon, että saostuminen alkoi. Seoksen • · * annettiin seisoa yön yli -20 * C:ssa, minkä jälkeen sakka pois-·**.* tattiin suodattamalla. Tällöin saatiin 1,01 g (50,5 %) puhdas- •tt·' ta yhdistettä (>99 % HPLC-määrityksen perusteella). Tämä yh- V * diste voidaan kiteyttää uudestaan 2-propanolista. FAB-MS: 399 (M+l). 1H-NMR (DMSO-de): 11,35 (s, 1H, COO); 7,42 (s, 1H, H' e); 4,69 (s, 2H, CH'a); 1,83 (s, 3H, Me T: ssä); 1,50-1,40 (m, 12H, Me Ala + Boc: ssa).
»•»M • · ... Esimerkki 39 4 1 • · • · « » (a) N-(Boc-aminoetyyli)-N-(l-tyminyyliasetyyli)-D-alaniini-i*.: metyyliesteri
Liuokseen, joka sisälsi Boc-aminoetyyli-alaniinimetyyliesteriä ...... ..... - · ... ·'··>··*···.....
118424 80 (2/48 g, 10/1 mmol) DMF: ssä (20 ml)/ lisättiin yhdistettä Dhbt-OH (1/80 g, 11,0 mmol) ja tyrninyylietikkahappoa (2,14 g, 11/6 mmol). 1-tyrninyylietikkahapon liukenemisen jälkeen mety-leenikloridia (20 ml) lisättiin ja liuosta jäähdytettiin jää-hauteessa. Kun reaktioseos oli saavuttanut 0 *C:n lämpötilan, siihen lisättiin yhdistettä DCC (2,88 g, 14,0 mmol). Viisi minuuttia lisäyksen jälkeen todettiin DCU-sakka. 35 minuutin kuluttua jäähaude poistettiin. Reaktioseos suodatettiin 3,5 tuntia myöhemmin ja sakka pestiin metyleenikloridilla (200 ml). Tuloksena ollut liuos uutettiin kahdesti 5 % natriumvety-karbonaatilla (200 ml) ja kahdesti kylläisellä kaliumvetysul-faatilla vedessä (100 ml). Lopuksi liuos uutettiin kylläisellä natriumkloridilla (250 ml), minkä jälkeen se kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin, jolloin saatiin öljyä. Tämä öljy puhdistettiin kromatografisesti lyhyellä silikageeliko-lonnilla käyttäen eluenttina metyleenikloridia ja metanoligra-dienttia. Tällöin saatiin yhdiste, jonka puhtaus oli >96 % HPLC-määrityksen perusteella (1,05 g, 25,3 %) petroolieette-rillä saostamisen jälkeen. FAB-MS: 413 (M+l). +H-NMR (CDC13): 5.64 (t, 1H, BocNH, J=5, 89 Hz); 4,56 (d, 2H, CH'a); 4,35 (q, 1H, CH Ala: ssa, J=7, 25 Hz); 3,74 (s, 3H, OMe); 3, 64-3, 27 (m, 4H, etyyli H':t); 1,90 (s, 3H, Me T: ssä); 1, 52-1, 44 (t, 12H, .· Boc+Me Ala: ssa).
* · ' • ·· * * ;**, (b) N- (Boc-aminoetyyli) -N- (1-tyrni nyyli as etyyli) -D-al aniini 1 t * // Otsikon mukaisen yhdisteen metyyli es teriä (1,57 g, 3,81 mmol) * » t liuotettiin metanoliin (100 ml) ja jäähdytettiin jäähauteessa.
ί \: Natriumhydroksidia (100 ml; 2M) lisättiin. 10 minuutin pitui- »*4
V : sen sekoittamisen jälkeen seoksen pH asetettiin arvoon 3 4M
kloorivedyllä. Sitten liuos uutettiin etyyliasetaatilla (3x100 4>*|· ml). Yhdistetyt orgaaniset uutteet kuivattiin magnesiumsulfaa- .·*; tiliä. Haihduttamisen jälkeen öljy liuotettiin etyyli as etaat- • *. tiin (200 ml). Petroolieetteriä lisättiin (600 ml: n kokonais-tilavuudeksi) kunnes saostuminen alkoi. Seosta seisotettiin » · yön yli -20 *C:ssa, minkä jälkeen sakka poistettiin suodatta- ·* maila. Tällöin saatiin 1,02 g (67,3 %) otsikon mukaista yhdis- • * · · * ·*·,· tettä, joka oli 9 4-prosentti s es ti puhdasta HPLC-määrityksen perusteella. FAB-MS: 399 (M+l). lH-NMR: 11,34 (s, 1H, COOH); 81 1 1 8424 7,42 (s, 1H, H' e); 4,69 (s, 2H, CH'a); 4,40 (q, 1H, CH Ala: s- sa, J=7, 20 Hz); 1,83 (s, 3H, Me T:ssa); 1, 52-1, 40 (m, 12H,
Boc+Me Ala:ssa).
Esimerkki 40 N-(N' -Boc-3' -aminopropyyli)-N-[(l-tyminyyli)asetyyliJglysii-ni-metyyliesteri N-(Ν' -Boc-3' -aminopropyyliJglysiini-metyyliesteriä (2,84 g, 0,0115 mol) liuotettiin DMF: ään (35 ml), minkä jälkeen lisättiin yhdistettä DhbtOH (2,07 g, 0,0127 mol) ja 1-tyminyylie-tikkahappoa (2,34 g, 0,0127 mol). Metyleeni kloridi a (35 ml) lisättiin ja seos jäähdytettiin 0 *C: n lämpötilaan jäähautees-sa. DCC: n (2,85 g, 0,0138 mol) lisäämisen jälkeen seosta sekoitettiin 0 *C:ssa 2 tuntia, ja sitten yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Saostunut DCU poistettiin suodattamalla, pestiin metyleenikloridilla (25 ml) ja suodokseen lisättiin vielä metyleenikloridia (150 ml). Orgaaninen faasi uutettiin natriumvetykarbonaatilla (1 tilavuus kylläistä liuosta, joka oli laimennettu 1 tilavuudella vettä, 6x250 ml), kaliumsulfaa-tilla (1 tilavuus kylläistä liuosta, joka oli laimennettu 4 tilavuudella vettä, 3x250 ml) sekä natriumkloridin kylläisellä vesiliuoksella (1x250 ml), kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Kiinteä jäännös suspendoi-***· tiin metyleeni kloridi in (35 ml) ja suspensiota sekoitettiin 1 f ·* j\j tunnin ajan. Saostunut DCU poistettiin suodattamalla ja pes- t e j .·, tiin metyleenikloridilla (25 ml). Suodos haihdutettiin kuiviin ••V vakuumissa ja jäännös puhdistettiin pylväskromatografisesti ψ * *».I silikageelillä, jota eluoitiin metanolin ja metyleeni kloridi n I I » * seoksella (3->7 % metanoligradientti metyleenikloridissa).
Tällöin saatiin otsikon mukaista yhdistettä valkoisena kiinto-
···· jauheena (3,05 g, 64 %). Sp. 76-79 *C (hajoaa). Analyysi yh-'V : disteelle CieHaeN^O?, todettu (laskettu): C 52,03 (52, 42); H
·:♦·: 6, 90 (6, 84); N 13,21 (13,58). Yhdisteen 1H- ja 13C-NMR-spekt- .*··, rit todettiin tyydyttäviksi.
s e See • tee e *Mf e t * · .9 te 0 Ψ ¢2 118424
Esimerkki 41 N-(N' -Boc-3' -aminopropyyli)-N-[(1-tyrninyyli)asetyyliJglysiini
N-(Ν' -Boc-3' -aminopropyyli)-N-((1-tyminyyli)asetyyli]glysii-ni-metyyliesteriä (3,02 g, 0,00732 mol) liuotettiin metanoliin (25 ml) ja liuosta sekoitettiin 1,5 tunnin ajan yhdessä 2M natriumhydroksidin (25 ml) kanssa. Metanoli poistettiin haihduttamalla vakuumissa ja pH asetettiin arvoon 2 4M kloorivety-hapolla 0 ’ C:ssa. Tuote eristettiin valkoisina kiteinä suodattamalla, pestiin vedellä (3x10 ml) ja kuivattiin sikapentin läsnäollessa vakuumissa. Saanto 2, 19 g (75 %). Analyysi yhdisteelle Ci7H26N4O7 ·HaO: todettu (laskettu): C 49, 95 (49, 03); H
6, 47 (6, 29); N 13, 43 (13, 45). Yhdisteen 1H- ja 13C-NMR-spekt- rit todettiin tyydyttäviksi.
Esimerkki 42 3-(1-tyminyyli)-propaanihapon metyyliesteri
Tymiiniä (14,0 g, 0,11 mol) suspendoitiin metanoliin. Metyyli-akrylaattia (39,6 ml, 0,44 mol) lisättiin yhdessä natriumhydroksidin katalyyttisten määrien kanssa. Liuosta palautusjääh-dytettiin pimeässä 45 tuntia, se haihdutettiin kuiviin vakuumissa ja jäännös liuotettiin metanoliin (8 ml) samalla lämmittäen. Jäähauteessa jäähdyttämisen jälkeen tuote saostettiin • ·* lisäämällä eetteriä (20 ml), se eristettiin suodattamalla, • ** pestiin eetterillä (3x15 ml) ja kuivattiin vakuumissa sikapen-tiliä. Saanto 11,23 g (48 %). Sp. 112-119 * C. Analyysi yhdis- • teelle CeHiaNaO^, todettu (laskettu): C 51, 14 (50, 94); H 5,78 • · * :***: (5,70); N 11, 52 (13,20). Yhdisteen lH- ja **C-NMR-spektrit * m todettiin tyydyttäviksi.
Esimerkki 43 "" 3-(1-tyminyyli)-propaanihappo • * · • · · ·:·*: 3-(1-tyminyyli)-propaanihapon metyyliesteriä (1,0 g, 0, 0047 mol) suspendoitiin 2M natriumhydroksidiin (15 ml), ja keitet-*·. tiin 10 minuutin ajan. pH asetettiin arvoon 0,3 väkevällä kloo-rivetyhapolla. Liuos uutettiin etyyliasetaatilla (10x25 ml).
* · · • · * • · S3 118424
Orgaaninen faasi uutettiin natriumkloridin kylläisellä vesi-liuoksella, se kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin otsikon mukaista yhdistettä saatiin valkoisena kiintoaineena (0,66 g, 71 %). Sp. 118-121 *C. Analyysi yhdisteelle CeHioNaO*, todettu (laskettu): C
48, 38 (48, 49); H 5, 09 (5, 09); N 13,93 (14,14). Yhdisteen *H- ja 13C-NMR-spektrit todettiin tyydyttäviksi.
Esimerkki 44 N-(Ν' -Boc-aminoetyyli)-N-((1-tyminyyli)propanoyyliIglysiini-etyyliesteri N- (Ν' -Boc-aminoetyyli) glysiini-etyyli es teriä (1,0 g, 0,0041 mol) liuotettiin DMF: ään (12 ml). Yhdistettä DhbtOH (0,73 g, 0, 0045 mol) ja 3-(1-tyminyyli)-propaanihappoa (0,89 g, 0, 0045 mol) lisättiin. Sitten lisättiin metyleenikloridia (12 ml) ja seos jäähdytettiin 0 *C:n lämpötilaan jäähauteessa. Yhdisteen DCC (1,01 g, 0,0049 mol) lisäämisen jälkeen seosta sekoitettiin 0 * C: ssa 2 tuntia, sitten 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Saostunut DCU poistettiin suodattamalla, pestiin mety-leenikloridilla (25 ml) ja lisämäärä metyleenikloridia (50 ml) lisättiin suodokseen. Orgaaninen faasi uutettiin natriumvety-karbonaatilla (1 tilavuus kylläistä liuosta, joka oli laimen-.. nettu 1 tilavuudella vettä, 6x100 ml), kaliumsulfaatilla (1 tilavuus kylläistä liuosta, joka oli laimennettu 4 tilavuudel- ;·*. la vettä, 3x100 ml) sekä natriumkloridin kylläisellä vesiliuok-• · · ]· sella (1x100 ml), se kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdu-: tettiin kuiviin vakuumissa. Kiinteä jäännös suspendoitiin • e · : V metyleenikloridiin (15 ml) ja seosta sekoitettiin 1 tunnin ·· V: ajan. Saostunut DCU poistettiin suodattamalla ja pestiin mety- leenikloridilla. Suodos haihdutettiin kuiviin vakuumissa, ja ··· jäännös puhdistettiin kromatografisesti silikageelipylväällä, ·*·* jota eluoitiin metanolin ja metyleenikloridin seoksella (1 — >6 % metanoligradientti metyleenikloridissa). Tällöin otsi- ] * kon mukaista yhdistettä saatiin valkoisena jauheena (1,02 g,
59 %). Analyysi yhdisteelle CieHsoN^O·?-, todettu (laskettu): C
·:· 53, 15 (53, 51); H 6, 90 (7, 09); N 12,76 (13,13). Yhdisteen *H- ··*« :*·.· ja ^C-NMR-spektrit todettiin tyydyttäviksi.
• e ¢4 118424
Esimerkki 45 N-(Ν' -Boc-aminoetyyli)—N—[(l-tyminyyli)propanoyyli]glysiini N-(Ν' -Boc-aminoetyyli)-N-1(l-tyminyyli)propanoyyli]glysiini-etyyliesteriä (0,83 g, 0, 00195 mol) liuotettiin metanoliin (25 ml). Natriumhydroksidia (25 ml; 2M) lisättiin. Liuosta sekoitettiin 1 tunnin ajan. Metanoli poistettiin haihduttamalla vakuumissa ja pH asetettiin arvoon 2 4M kloorivetyhappoon 0 *C:ssa. Tuote eristettiin suodattamalla, pestiin eetterillä (3x15 ml) ja kuivattiin sikapentillä vakuumissa. Saanto 0, 769 g, 99 %). Sp. 213 *C (hajoaa).
Esimerkki 46
Mono-Boc-etyleenidiamiini (2)
Tert.-butyyli-4-nitrofenyylikarbonaattia (1) (10,0 g; 0,0418 mol) liuotettiin DMF: ään (50 ml) ja tätä liuosta lisättiin pisaroittain 30 minuutin aikana liuokseen, joka sisälsi ety-leenidiamiinia (27,9 ml; 0,418 mol) ja DMF: ää (50 ml), ja seosta sekoitettiin yön yli. Seos haihdutettiin kuiviin vakuumissa ja tuloksena saatu öljy liuotettiin veteen (250 ml). 0 *C: n lämpötilaan jäähdyttämisen jälkeen pH alennettiin arvoon , 3,5 4M kloorivetyhapolla. Sitten liuos suodatettiin ja uutet- * tiin kloroformilla (3x250 ml). pH asetettiin arvoon 12 ♦ · ·· 0 *C:ssa 2M natriumhydroksidillä ja vesiliuos uutettiin mety- *. *: leenikloridilla (3x300 ml). Natriumkloridin kylläisellä vesi- • · · liuoksella (250 ml) käsittelyn jälkeen metyleenikloridiliuos i \· kuivattiin magnesiumsulfaatilla, Suodattamisen jälkeen liuos :*·*: haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin 4,22 g • (63 %) tuotetta (Öljy). lH-NMR (90 MHz; CDCls): 81,44 (s, 9H); 2,87 (t, 2H); 3,1 (q, 2H); 5,62 (s, leveä).
• « ** • · t · * • · ·
Esimerkki 47 (N-Boc-aminoetyyli)-6-alaniini-metyyliesteri, HC1 ♦ •e * · • · e··
Mono-Boc-etyleenidiamiinia (2) (16,28 g; 0,102 mol) liuotet- *"/: tiin asetonitriiliin (400 ml) ja metyyliakrylaattia (91,50 ml; * ·· • · 85 118424 1,02 mol) siirrettiin seokseen asetonitriilillä (200 ml). Liuosta palautusjäähdytettiin yön yli typpi-ilmakehässä/ pimeässä metyyliakrylaatin polymeroitumisen välttämiseksi. Sen jälkeen, kun seos oli haihdutettu kuiviin vakuumissa, siihen lisättiin veden ja eetterin seos (200 + 200 ml) ja liuos suodatettiin ja sitä sekoitettiin voimakkaasti. Vesifaasi uutettiin vielä kertaalleen eetterillä ja sitten se pakastekuivat-tiin, jolloin saatiin keltaista kiintoainetta. Uudelleenkitey-tys etyyliasetaatista tuotti 13,09 g (46%) otsikon mukaista yhdistettä. Sp. 138-140 * C. Analyysi yhdisteelle CnHaaNaO^Cl, todettu (laskettu): C 46, 49 (46, 72); H 8, 38 (8, 20); N 9,83 (9,91); Cl 12, 45 (12, 54). 1H-NMR (90 MHz; DMSO-de): 8 1,39 (s, 9H); 2,9 (m, 8H); 3,64 (s, 3H).
Esimerkki 48 N-[(1-tyminyyli)asetyyli]-N' -Boc-aminoetyyli-B-alaniini-metyy-liesteri
Yhdistettä (N-Boc-amino-etyyli)-B-alaniini-metyyliesteri, HC1 (3) (2,0 g; 0,0071 mol) ja 1-tyminyylietikkahappo-pentafluori- fenyyliesteriä (5) (2, 828 g; 0, 00812 mol) liuotettiin DMF: ään (50 ml). Tri etyyli amiini a (1,12 ml; 0, 00812 mol) lisättiin ja seosta sekoitettiin yön yli. Metyleenikloridin (200 ml) lisäämisen jälkeen orgaaninen faasi uutettiin natriumvetykarbonaa-tin vesiliuoksella (3x250 ml), kaliumvetysulfaatin puolikyl- • e .·*·. Iäisellä vesiliuoksella (3x250 ml) ja natriumkloridin kylläi- • · · .·. j sellä vesiliuoksella (250 ml), ja se kuivattiin magnesiumsul- ·*.·. faatilla. Suodatus ja haihdutus kuiviin vakuumissa johtivat :.:V 2,9 g: n (99 %) saantoon (öljy). *H-NMR (250 MHz; CDCla): Koska pyöriminen sekundäärisen amidin ympäri oli rajoittunut, niin • · · *** * useat signaalit olivat kaksinkertaistuneet; 8 1/43 (s, 9H); 1,88 (s, 3H); 2,63 (t, 1H); 2,74 (t/ 1H); 3, 25-3, 55 (4xt, 8H); 3,65 (2xt, 2H); 3,66 (s, 1,5); 3,72 (s, 1,5); 4,61 (s, 1H); : 4/72 (s, 2H); 5,59 (s, 0,5 H); 5,96 (s, 0, 5H); 7,11 (s, 1H); 10,33 (s, 1H).
• i ··· • ♦ • • « · ··· • M· • · I » · • f* • · 86 118424
Esimerkki 49 N-((1-tyminyyli)asetyyli]-N' -Boc-aminoetyyli-P-alaniini N-[(1-tyminyyli)asetyyli]-N' -Boc-aminoetyyli-3-alaniini-metyyli esteriä (3,0 g; 0/0073 mol) liuotettiin 2M natriumhydroksidia (30 ml), pH asetettiin arvoon 2 0 *C:ssa 4M kloorivety- hapolla ja liuosta sekoitettiin 2 tuntia. Sakka eristettiin suodattamalla/ pestiin kolmeen kertaan kylmällä vedellä ja kuivattiin sikapentillä vakuumissa. Saanto 2,23 g (77 %). Sp. 170-176 * C. Analyysi yhdisteelle Ci-rHaeN.O^'HaO, todettu (laskettu): C 49/ 49 (49/ 03); H 6,31 (6,78); N 13, 84 (13, 45).
1H-NMT (90 MHz; DMSO-de): 5 1,38 (s, 9H); 1,76 (s, 3H); 2,44 ja 3,29 (m, 8H); 4,55 (s, 2H); 7,3 (s, 1H); 11,23 (s, 1H).
PAB-MS: 399 (M+l).
Esimerkki 50 N-[(1-(N*-Z)-sytosyyli)asetyyli]-N' -Boc-aminoetyyli-8-alanii-ni-metyyliesteri
Yhdistettä (N-Boc-amino-etyyli)-3-alaniini-metyyliesteri, HC1 (3) (2,0 g; 0,0071 mol) ja 1-(N-4-Z)-sytosyylietikkahappo- pentafluorifenyyliesteriä (5) (3,319 g; 0,0071 mol) liuotettiin DMF: ään (50 ml). Tri etyyli amiini a (0,99 ml; 0,0071 mol) lisättiin ja seosta sekoitettiin yön yli. Metyleenikloridin . (200 ml) lisäämisen jälkeen orgaaninen faasi uutettiin nat- • · · riumvetykarbonaatin vesiliuoksella (3x250 ml), kaliumvetysul- ’·/*: faatin puoli kylläisellä vesiliuoksella (3x250 ml) ja natrium- i kloridin kylläisellä vesiliuoksella (250 ml) ja kuivattiin ;*·*: magnesiumsulfaatilla. Suodatus ja haihdutus kuiviin vakuumissa • · | tuotti 3, 36 g kiinteätä yhdistettä, joka kiteytettiin uudes- * taan metanolista. Saanto 2,42 g (64 %). Sp. 158-161 * C. Ana- lyysi yhdisteelle CasHaaNsOe, todettu (laskettu): C 55,19 (56, 49); H 6,19 (6,26); N 12,86 (13,18). *H-NMR (250 MHz; • · · *. CDCI3): Koska pyöriminen sekundäärisen amidin ympäri oli ra-*:*·: joittunut, niin useat signaalit olivat kaksinkertaisia; δ 1,43 (s, 9H); 2,57 (t, 1H); 3, 60-3, 23 (m: t, 6H); 3,60 (s, 1,5 H);
Is. 3'66 (s' H>J 4,8° (S, 1H); 4,88 (s, 1H); 5,20 (s, 2H); 7, 80-7, 25 (m: t, 7H). FAB-MS: 532 (M+l).
* ·♦ • · 87 118424
Esimerkki 51 N-[(1-(ΝΛ-Ζ)-sytosyyli)asetyyli]-Ν' -Boc-aminoetyyli-β-aianiini N-[(l-(N-4-Z)-sytosyyli)asetyyli]-N' -Boc-aminoetyyli-β-alanii-ni-metyyli es teriä (0,621 g; 0,0012 mol) liuotettiin 2M nat-riumhydroksidiin (8,5 ml) ja liuosta sekoitettiin 2 tuntia. Tämän jälkeen pH asetettiin arvoon 2 0 *C:ssa 4M kloorivetyha-polla ja liuosta sekoitettiin 2 tuntia. Sakka eristettiin suodattamalla, se pestiin kolmeen kertaan kylmällä vedellä ja kuivattiin vakuumissa sikapentillä. Saanto 0,326 g (54 %).
Valkoinen kiintoaine kiteytettiin uudestaan 2-propanolista ja pestiin petroolieetterillä. Sp. 163 "C (hajoaa). Analyysi yhdisteelle Ca^HaiNaO*, todettu (laskettu): C 49, 49 (49, 03); H 6,31 (6,78); N 13, 84 (13, 45). lH-NMR (250 MHz; CDCls): Koska pyöriminen sekundäärisen amidin ympäri oli rajoittunut, niin useat signaalit olivat kaksinkertaisia; δ 1,40 (s, 9H); 2,57 (t, 1H); 2,65 (t, 1H); 3, 60-3, 32 (m: t, 6H); 4,85 (s, 1H); 4,98 (s, 1H); 5,21 (s, 2H); 5,71 (s, 1H, leveä); 7, 99-7, 25 (m: t, 7H). FAB-MS: 518 (M+l).
Esimerkki 52
Esimerkki guaniinijäännöksen käsittävästä PNA-oligomeerista (a) H-[Taeg]s-[Gaeg]-[Taeg]*-Lys-NHa: n kiinteään faasiin pe- t · · rustuva synteesi « » «et • · · • · : Suojattu PNA koottiin Boc-Lys (ClZ)-muokatun MBHA-hartsin pin- ΓΛ nalle, substitution ollessa noin 0, 15 mmol/g (määritetty kvan-• » .**. titatiivisella ninhydriinireaktiolla). Kytkeytymättömien ami- noryhmien suojaus toteutettiin ainoastaan ennen BocGaeg-OH-r'm monomeerin sisällyttämistä.
• 4*4 * * * • 4 · (b) H-[Taeg]s-[Gaeg]-[Taeg]4-Lys-NHa: n vaiheittainen kokoami- * nen (synteesitoimenpide) « »e • e e · ft*
Synteesi käynnistettiin edeltäkäsin turvotetun (yön yli "**. DCM: ssä) ja neutraloidun Boc-Lys (ClZ)-MBHA-hartsin (102 mg) a · · « M e e 88 118424 pinnalla. Toteutetut vaiheet olivat seuraavat: (1) suojaavien Boc-ryhmien poisto FA/DCM: llä (1:1, til./til. ), 1x2 min ja lxl/2 tuntia, 3 ml; (2) pesu DCM: llä, 4x20 sekuntia, 3 ml; pesu DMF: llä, 2x20 sekuntia, 3 ml; pesu DCM: llä, 2x20 sekuntia, 3 ml, sekä kuiviin valutus 30 sekunnin ajan; (3) neutralointi DIEA/DCM-seoksella (1:19 til./til.), 2x3 min., 3 ml; (4) pesu DCM: llä, 4x20 sek., 3 ml, ja valutus kuiviin 1 minuutin ajan; (5) di-isopropyyli-karbodi-imidin 4 ekvivalentin lisäys (0,06 mmol; 9,7 μΐ) ja yhdisteen BocTaeg-OH 4 ekvivalentin (0,06 mmol; 24 mg) tai yhdisteen BocGaeg-OH (0,06 mmol; 30 mg) lisäys 0,6 ml: ssa DCM/DMF-seosta (1: 1, til./til. ) (mo-nomeerin lopullinen pitoisuus 0,1 M), kytkentäreaktion annettiin edetä 1/2 tuntia huoneen lämpötilassa ravistellen; (6) imua käytettiin 20 sekuntia; (7) pesu DMF: llä, 2x20 sek. ja 1x2 min., 3 ml; pesu DCM: llä 4x20 sek., 3 ml; (8) neutralointi DI EA/DCM (1:19 til./til.), 2x3 min., 3 ml; (9) pesu DCM: llä 4x20 sek., 3 ml ja kuiviin valutus 1 min.; (19) kvalitatiivinen Kaiser: in testi; (11) reagoimatta jääneiden aminoryhmien suojaaminen asetyloimalla AcaO/pyridiini/DCM: llä (1:1:2, til./til.), lxl/2 tuntia, 3 ml; ja (12) pesu DCM: llä, 4x20 sek., 2x2 min ja 2x20 sek., 3 ml. Vaiheet 1-12 toistettiin, kunnes saatiin toivottu sekvenssi. Kaikki kvalitatiiviset Kaiser: in testit olivat negatiivisia (oijenkeltäinen väri, helmien ollessa värittömiä), mikä osoitti lähes 100 % kytkey-. .* tymissaannon. PNA-oligomeeri pilkottiin ja puhdistettiin nor- maalilla toimenpiteellä. FAB-MS: 2832, 11 [M*+l] (laskettu /·.! 2832, 15).
Ϊ • · · •te · {*·*· Esimerkki 53 e ψ H-Taeg-Aaeg-(Taeg]β-Lys-NHa: n kiinteän faasin synteesi e .·. (a) Boc-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]e-Lys (Cl Z)-MBHA-hartsin kiinteän « faasin vaiheittainen kokoaminen ; « · • · · e * ‘J**: Noin 0, 3 g märkää Boc-[Taeg] «-Lys (ClZ)-MBHA-hartsia laitettiin t"*i 3 ml: n SPPS-reaktioastiaan. Boc-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]e-Lys(C1Z)-MBHA-hartsi koottiin in situ A(Z)aeg-jäännöksen DCC-kytken-nällä (yksinkertainen) käyttäen 0,19 M yhdistettä BocA(Z)-aeg- * *·· 89 118424 OH sekä 0,15 M DCC 2,5 ml: ssa 50 % DMF/CHaCla-seosta sekä yksinkertaisella kytkennällä 0, 15 M BocTaeg-OPfp: n kanssa puhtaassa CHaCla:ssa ("synteesitoimenpide 5"). Synteesiä seurattiin kvantitatiivisella ninhydriinireaktiolla, joka osoitti A(Z)aeg:n noin 50 % sisältymisen sekä Tae g: n noin 96 % sisältymisen.
(b) H-Taeg-Aaeg-[Taeg]»-Lys-NHa: n pilkkominen, puhdistus ja tunnistus
Suojattua Boc-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]e-Lys(C1Z)-BAH-hartsia käsiteltiin esimerkissä 40c kuvatulla tavalla, jolloin saatiin noin 15, 6 mg raakamateriaalia, kun 53, 1 mg kuivaa H-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]β-Lys (C1Z)-BHA-:hartsia pilkottiin HF: llä. 14, 4 minuutin kohdalla saatu suurin piikki vastasi alle 50 % kokonaisabsorbanssista. 0,5 mg: n annos raakatuotteesta puhdistettiin, jolloin saatiin noin 0,1 mg yhdistettä H-Taeg-Aaeg-[Taeg]β-Lys-NHa. (MH+)~:lle laskettu m/z-arvo oli 2816,16 ja mitattu m/z-arvo oli 2816,28.
(c) Synteesitoimenpide 5 (1) Suojaavien Βοσ-ryhmien poisto seoksella TFA/CHaCla (1:1, til./til. ), 2,5 ml, 3x1 min. ja 1x30 min; (2) pesu CHaCla: 11a, • 1’ 2,5 ml, 6x1 min.; (3) neutralointi DIEA/CHaCla: 11a (1:19, • · · til. /til. ), 2,5 ml, 3x2 min.; (4) pesu CHaCla: 11a, 2,5 ml, 6x1 • · *·.*·; min, ja kuiviin valutus 1 minuutin ajan; (5) PNA-hartsista • · ·,· · otettiin 2-5 mg: n näyte ja se kuivattiin huolellisesti kvanti- :***: tatiivista ninhydriinianalyysiä varten substitution määrittä- « 1 miseksi; (6) yhdisteen BocA(Z)aeg-OH 0,47 mmol (0,25 g) lisää- minen liuotettuna 1,25 ml: aan DMF: ää, minkä jälkeen lisättiin .·. 0,47 mmol (0,1 g) yhdistettä DCC 1,25 ml: ssa CHaCla: ta tai “1^ 0,36 mmol (0,20 g) yhdistettä BocTaeg-OPfp 2,5 ml: ssa CHaCla; * · · *. kytkentäreaktion annettiin edetä yhteensä 20-24 tuntia samalla ""· ravistellen; (7) pesu DMF: llä, 2,5 ml, 1x2 min; (8) pesu :1]1ϊ CHaCla: 11a, 2,5 ml, 4x1 min; (9) neutralointi seoksella DIEA/- CHaCla (1:19, til. /til. ), 2,5 ml, 2x2 min; (10) pesu CHaCla: 11a, 2,5 ml, 6x1 min; (11) suojatusta PNA-hartsista • · · • · · 1 otettiin 2-5 mg:n näyte, joka kuivattiin huolellisesti kvanti- 90 118424 tatiivista ninhydriinianalyysiä varten kytkeytymisasteen määrittämiseksi; (12) reagoimatta jääneiden aminoryhmien suojaaminen asetyloimalla 25 ml: 11a seosta asetanhydridi/pyridii-ni/CHaCla (1:1:2, til./til./til. ) 2 tunnin ajan (paitsi vii meisen jakson jälkeen); sekä (13) pesu CHaCla:lla, 2,5 ml, 6x1 min; (14) suojatusta PNA-hartsista otettiin 2x2-5 mg; n näytteet, jotka neutraloitiin seoksella DIEA/CHaCla (1:19, til/. -til. ) ja pestiin CHaCla: 11a ninhydriinianalyysejä varten.
Esimerkki 54 H-[Taeg]a-Aaeg-[Taeg]s-Lys-NHa: n kiinteään faasiin perustuva synteesi (a) Boc-[Taeg]a-A(Z)aeg-[Taeg]s-Lys(C1Z)-MBHA-hartsin vaiheittainen kokoaminen
Noin 0, 5 g märkää Boc-[Taeg]s-Lys(ClZ)-MBHA-hartsia laitettiin 5 ml: n SPPS-reaktioastiaan. Boc-[Taeg]a-A(Z)aeg-[Taeg]s-Lys-(C1Z)-MBHA-hartsi koottiin in situ sekä A(Z)aeg- että Taeg-jäännösten DCC-kytkennällä käyttäen 0,15 M-0,2 M suojattua PNA-monomeeria (vapaa happo) yhdessä DCC: n ekvivalentin määrän kanssa 2 ml: ssa puhdasta CHaCla: ta (" synteesi toimenpide 6")· Synteesiä seurattiin kvantitatiivisella ninhydriinireaktiolla, joka osoitti A(Z)aeg:n yhteensä noin 82 % sisältymisen kolmeen kertaan toteutetun kytkennän jälkeen (ensimmäinen kytkentä tuotti noin 50 % sisältymisen; neljäs HOBt-välitteinen kytkemi- * · ♦ ;*·,· nen 50 % DMF/CHaCla-seoksessa ei nostanut kytkennän kokonais- : saantoa merkittävästi) sekä Taeg-jäännösten kvantitatiivisen ·**·. sisältymisen (yksinkertaiset kytkennät).
e · • · *·» * · * * (b) H-[Taeg]a-Aaeg-[Taeg]s-Lys-NHa: n pilkkominen, puhdistus ja tunnistus a · · ··*· Suojattua Boc - [Taeg] a-A(Z)aeg-[Taeg] s-Lys (ClZ)-BHA-hartsia V * käsiteltiin esimerkissä 40c kuvatulla tavalla, jolloin saatiin ····: noin 16,2 mg raakamateriaalia, kun 102,5 mg kuivaa H-[Taeg]a- ,··*. A( Z)aeg-[Taeg] s-Lys (ClZ)-BHA-hartsia pilkottiin HF: llä. Pieni •# määrä raaka tuotteesta puhdistettiin. (MH+)*:n tapauksessa ...i laskettu m/z-arvo oli 2050, 85 ja mitattu m/z-arvo oli 2050, 90.
• · • * · • ·· • * 91 118424 (c) Synteesitoimenpide 6 (I) Suojaavien Boc-ryhmien poistaminen TFA/CHaCla-seoksella (1:1/ til. /til. )/ 2 ml, 3x1 min. ja 1x30 min; (2) pesu CHaCla: 11a, 2 ml, 6x1 min; (3) neutralointi DIEA/CHaCla: 11a (1:19, til. /til. ), 2 ml, 3x2 min; (4) pesu CHaCla: 11a, 2 ml, 6x1 min, ja kuiviin valutus 1 minuutin ajan; (5) PNA-hartsista otettiin 2-5 mg:n näyte ja se kuivattiin huolella kvantitatiivista ninhydriinianalyysiä varten susbtitution määrittämiseksi; (6) sitten lisättiin 0,44 mmol (0,23 g) BocA(Z)aeg-OH: ta liuotettuna 1,5 ml: aan CHaCla, minkä jälkeen lisättiin 0,44 mmol (0,09 g) DCC: tä 0,5 ml: ssa CHaCla tai 0,33 mmol (0,13 g) BocTaeg-OH: ta 1,5 ml: ssa CHaCla, minkä jälkeen lisättiin 0,33 mmol (0,07 g) DCC: tä 0,5 ml: ssa CHaCla; kytkentäreaktion annettiin edetä yhteensä 20-24 tunnin ajan samalla ravistellen; (7) pesu DMF: llä, 2 ml, 1x2 min; (8) pesu CHaCla: 11a, 2 ml, 4x1 min; (9) neutralointi seoksella DIEA/CHaCla (1:19, til./-til. ), 2 ml, 2x2 min; (10} pesu CHaCla: 11a, 2 ml, 6x1 min; (II) suojatusta PNA-hartsista otettiin 2-5 mg: n näyte, joka kuivattiin huolella kvantitatiivista ninhydriinianalyysiä varten kytkeytymisasteen määrittämiseksi; (12) reagoimalla jääneet eminoryhmät suojattiin asetyloimalla 25 ml: 11a seosta asetanhydridi/pyridiini/CHaCla (1:1:2, til./til./til. ) 2 tun- . nin ajan (paitsi viimeisen jakson jälkeen); (13) pesu . ;.** CHaCla: 11a, 2 ml, 6x1 min; ja (14) suojatusta PNA-hartsista . · · * *··* otettiin 2x2-5 mg: n näytteet, ne neutraloitiin DIEA/CHaCla-se- \**: oksella (1:19, til./til. ) ja pestiin CHaCla: 11a ninhydriini- • · analyyseja varten.
·· · • · · e ' · e ·
Esimerkki 55
Esimerkki "ilman emäs subs ti tuti ota".
• · · L
♦ · J | T s Ύ s
. H N
·;· H H
«•M
... : eli L=H
e »· • ♦ 92 118424
PNA DNA T
m
H-T1Q-LysNH2 (dA)1Q 73*C
H-T4(Ac)T5-LysNH2 (dA)io 49*C
H-T4(Ac)Tg-LysNH2 (dA)4(dG)(dA)g 37*C H-T4(Ac)T5-LysNH2 (dA)4(dC)(dA)g 41*C H-T4(Ac)T5-LysNH2 (dA)4(dT)(dA)g 41*C H-T4(Ac)Tg-LysNH2 (dA)5(dG)(dA)4 36*C H-T4(Ac)Tg-LysNH2 (dA)5(dC)(dA)4 40'C
H-T4(Ac)Tg-LysNH2 (dA)g(dT)(dA)4 40*C
Näin ollen voidaan nähdä, että H-Tio-LysNHa: een verrattuna yhden tymiiniligandin korvautuminen Hilla johtaa siiten, että Tm putoaa arvosta 48 * C arvoon 73 * C. Samoin nähdään myös yhden yhteensopimattoman emäksen sisällyttämisen vaikutus.
Seuraavat kokeet havainnollistavat PNA-oligomeerien tiettyjä biokemiallisia/biologisia ominaisuuksia.
e • ·* 1. Sekvenssi erottelu (diskriminaatio) dsDNA-tasolla (esimerkki ***· 63/ kuvio 20) e · - \*·: Si-nukleaasiin perustuvaa koetintekniikkaa käyttäen analysoi- ·.· · tiin se diskriminaatio/ jolta liittyy Tio, TsCT« (TeC) &
TaCTaCT* (TeCa) PNA: n sitoutumiseen plasmidin pUC19 BamHI-, Sali- tai PstI -kohtaan kloonattuihin tunnistussekvensseihin *
Aio, AsGA« (AeG) & AaGAaGA* (A»Ga). Tuloksista kuvio (20) näh-dään, että kolme PNA: ta sitoutuu vastaaviin tunnistussekvens-seihin, suhteellisen tehokkuuden ollessa tällöin seuraava; PNA
• e · *, — Tio: Aio > AeG >> AeGa, PNA — TeC: AeG > Aio >> AeGa, PNA — *:**: TaCa: AeGa k A»G >> Aio. Näin ollen 37 * C: ssa yksi yhteensopi- mattomuus kymmenestä johtaa vähentyneeseen tehokkuuteen (arviolta 5-10-kertainen), kun taas kahta yhteensopimattomuutta ei ’I’’; hyväksytä.
• ·· • ♦ ,3 1 1 8424 2. Yksi juos tel s en DNA: n syrjäyttäminen ds DNA: s ta PNA-yhdistei-den Tio/TeC/TeCa hybridisaatioila (kuvio 20) - Esimerkki 63.
3. PNA-Tio - dsDNA-juosteen s yrjäy tyrni s kompleksi n muodostumisen kinetiikka (esimerkki 64, kuvio 21).
Koettimena kompleksin muodostuksessa käytettiin Si-nukleaasia eri aj anhetkillä, mitä seurasi PNA: n ja päästään 3aP-leimatun dsDNA-kappaleen sekoittaminen (kuvio 21).
4. PNA-dsDNA-kompleksin stabiilisuus (esimerkki 65, kuvio 22) PNA-T»: n ja 3aP-dsDNA (Aio/Tio)-kohteen väliset kompleksit muodostettiin (60 minuuttia, 37 *C). Sitten näitä komplekseja inkuboitiin toivotussa lämpötilassa oligo-dAio: n läsnäollessa 10 minuutin ajan, jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja määritettiin KMnO-α: ää käyttäen. Tulokset (kuvio 22) osoittavat, että PNA-dsDNA-kompleksien lämpöstabiilisuus heijastaa PNA-oli-gonukleotidikompleksien lämpöstabiilisuutta arvon "Tm" suhteen.
5. PNA: n kyky inhiboida pilkkoutumista restriktioentsyymeillä (esimerkki 64, kuvio 23)
Plasmidimuodoste pTIO sisältää dAio/dTio-alueen pUC19: n Bam- *a· HI-kohtaan kloonattuna. Niinpä pTIO: n pilkkominen BamHI:llä ja ·*'*: PvuII: 11a johtaa kahteen pieneen, vastaavasti 211 ja 111 emäs- * · · parin DNA-kappaleeseen. PNA-Tio: n läsnäollessa saadaan 336 * · : .*. emäsparin kappale, joka vastaa pilkkomista pelkällä PvuII: 11a ··,·. (kuvio 23). Näin ollen PNA, joka on sitoutunut restriktioent- syymikohdan läheisyyteen, estää BamHI-pilkkoutumisen. Tulok- • · · ' sista nähdään myös, että PNA-dsDNA-kompleksi voidaan muodostaa 100 %: n saannolla. Samankaltaisia tuloksia saatiin käytettäes- · ..·*· sä pT8C2-plasmidia ja PNA-T8C2: ta.
·** • · * * * * ·..·· 6. la*I-leimatun PNA: n sitoutuminen oligonukleotideihin (esi- ,···. merkki 63, kuvio 24) • · *·’ Tyr-PNA-Tio-Lys-NHa leimattiin iasI:llä käyttäen yhdistettä ···· NaiaeI ja kloramiini-T: tä ja puhdistettiin HPLC-tekniikalla.
• · :,"*ί iasI-PNA-Tio: n todettiin sitoutuvan oligo-dAio: een PAGE-tek- 94 118424 nilkalla ja autoradiografialla (kuvio 24). Sitoutuminen voitiin viedä päätökseen ylimäärällä vasikan kateenkorvan denaturoitua DNA: ta.
Edellä esitettyyn kohtaan (1) palaten, dsDNA: n sekvenssispesifistä tunnistamista havainnollistetaan PNA: n, joka koostuu 10 tyrniinisubstituoituneesta 2-aminotyyliglysyyliyksiköstä, ja jonka C-päätteessä on lysiiniamidi ja N-päätteessä on kompleksinen 9-aminoakridiiniligandi [9-Acr1-(Taeg)lo-Lys-NH*, kuviot 11a ja b] sitoutumisella dAio/dTio-kohdesekvenssiin. Tämä kohde sisältyy 248 emäsparin suuruiseen, päästään 33P-leimattuun DNA-kappal ees een.
Juosteen syrjäytyminen varmistettiin seuraavan tyyppisillä kokeilla: 1) 9-Acr1-ligandin (kuvio 5), joka käsittää 4-nitrobentsamido-ryhmän DNA: n pilkkoutumisen takaamiseksi sitä säteilytettäes-sä, odotetaan pilkkovan DNA: ta vain hyvin lähellä sen sitoutumiskohtaa. Kun edellä mainitun 248 emäsparin DNA-kappaleen käsittävää PNA: ta säteilytetään, niin tällöin todetaan selektiivinen pilkkoutuminen dAio/dTio-sekvenssissä (kuvio 3a).
2) Niinkutsutussa valojalanjälkeen perustuvassa määrityksessä, » · /**· jossa synteettinen diatso-kytketty akridiini pilkkoo säteily- • · : tettäessä DNA: ta vuorovaikutteessaan DNA: n kanssa (paitsi • ·· silloin, kun mainittu sitova aine suojaa DNA: ta).
« « · ··* · • · · * * : \.lt Tällainen koe toteutettiin edellä kuvatulla 248 emäsparin dsDNA-kappaleella, joka osoitti selvää suojausta PNA-sitoutu-miskohdan valopilkkoutumista vastaan (kuvio 3b).
t*i ·»·· tl· V * 3) Samantyyppisessä kokeessa DNA: ta pilkkova entsyymi, miero- coccus-nukleaasi, jonka vaikutuksen useimmat DNA: ta sitovat ..... reagenssit estävät, osoitti voimakkaampaa pilkkomista Ti0-koh- e · "* teessä (kuvio 3c).
··· ···· • · • 4 · • · · • · 95 118424 4) Edelleen eräässä toisentyyppisessä kokeessa käytettiin hyväksi yksijuosteisten tymiiniligandien hyvin tunnettua suurta herkkyyttä (kaksijuosteisiin tymiiniligandeihin verrattuna) kaliumpermanganattihapetukselle. 248 emäsparin hapettuminen reagenssin läsnäollessa osoitti ainoastaan kohteen Txo-juos-teen hapettuvan (kuvio 3b).
5) Samantyyppisessä demonstraatiossa Sx-nukleaasin spesifisyys yksinkertaiseen juosteeseen osoitti selvästi, että hyökkäys kohdistui vain kohteen Tio-juosteeseen (kuvio 3d).
(Taeg)io:n, (Taeg) ιο-Lys-NHa: n ja Acr*-(Taeg) ιο-Lys-NHa: n (kuvio 5) hyvin tehokasta sitoutumista vastaavaan dAio: een havainnollistettiin edelleen kahdella tavalla: 1. Kuten jäljempänä esimerkissä 56 esitetään, PNA-oligonukleo- tidikompleksit liikkuvat hitaammin kuin yksijuosteinen oligo- nukleotidi polyakryyliamidigeeleillä elektroforeesin aikana.
Näin ollen tällaisia kokeita suoritettiin Acr1-(Taeg)io-Lys- NHa: 11a ja päästään 33P-leimatulla dAio: llä. Tällöin todettiin hidastunutta liikkumista olosuhteissa, joissa normaali dAio/dTio-dupleksi on stabiili, sekä olosuhteissa, joissa tällainen dupleksi on epästabiili (denaturoiva geeli). vertai- ·', lukoe suoritettiin Acr1-(Taeg)xo-Lys-NHa: n ja päästään 3aP- • · .*·*; leimatun dTio: n seoksella, jonka ei todettu hidastuneen edellä .·*.*; mainituissa olosuhteissa.
* *· • · • · • · · * · · II*,* 2. DNA-dupleksien (dsDNA: n) muodostuessa yksijuosteisesta t · : *"! DNA: sta ekstrinktiokerroin pienenee (hypokromisuus). Täten • · · '·* DNA: n denaturoitumista voidaan seurata mittaamalla absorbans- sin muutokset esimerkiksi T»: n funktiona, T»: n ollessa se t lämpötila, jossa 50 % dupleksi s ta on kadonnut yksinkertaisia :*:V juosteita muodostaen.
• e··· • ·
Duplekseja muodostettiin seuraavassa luetelluista yksijuostei- ’*!* sista oligodeoksiribonukleotideistä ja PNA-molekyyleistä.
Tyypillisesti 0,3 ODaeo T-rikasta juostetta hybridi s oi ti in 1 ·**.! ekvivalenttiin toista juostetta kuumentamalla 90 *C:ssa 5 * · 96 118424 minuuttia, jäähdyttämällä huoneen lämpötilaan ja pitämällä 30 minuuttia, ja lopulta säilyttämällä jääkaapissa 5 *C:ssa vähintään 30 minuutin ajan. Kaikki käytetyt puskurit olivat 10 mM fosfaatin suhteen ja 1 mM EDTA: n suhteen. Niukkasuolainen puskuri ei sisältänyt lainkaan natriumkloridia, kun taas kes-ki suolainen puskuri sisälsi 140 mM NaCl: ia ja runs as suolaina n puskuri sisälsi 500 mM NaCl: ia. Näiden kaikkien puskureiden pH oli 7, 2. Hybridien suiamislämpötila määritettii Gilford Res-ponse-laitteella. Seuraavia ekstinktiokertoimia käytettiin: A: 15,4 ml/umol*cm; T: 8,8; G: 11,7 ja C: 7,3 sekä normaaleille nukleotideille että PNA: lie. Sulamiskäyrät määritettiin 0,5 *C/min. olevin askelein. T»-arvot määritettiin käyrän, jossa Aaeo esitettiin lämpötilan funktiona, 1. derivaatan maksimista.
01 igodeoksiribonukleoti di luettelo:
1. 5'-AAA-AAA-AA
2. 5'-AAA-AAA-AAA-A
3. 5'-TTT-TTT-TTT-T
4. 5 ' -AAA-AAG-AAA-A
5. 5 ' -AAG-AAG-AAA-A
6. 5'-AAA-AGA-AAA-A
7. 5 *-AAA-AGA-AGA-A
• ·* 8. 5 * -TTT-TCT-TTT-T
...* 9. 5'-TTT-TCT-TCT-T
• a
ίο. 5 » -TTT-TTC-TTT-T \X: 11. 5'-TTT-TTC-TTC-T
X***: 12. 5'-TTC-TTC-TTT-T
k a
.*:·; 13. 5»-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT
14. 5 1 -AAA-AAA-AAA-AAA-AAA
"·* PNA-luettelo • e· V : a. TTT-TTT-TTT-T-Lys-NH2 ····· b. TTT-TTT-TT-Lys-NH2 ,··*. C. TTT-TTC-TTT-T-Lys-NH2 d. TTC-TTC-TTT-T-Lys-NH2 • t· **·*· e. Acr-TTT-TTT-TTT-T-Lys-NH2 \*·: f. Ac-TTT-TTT-TTT-t-Lys-NH2 'T--· Ψ *·*·*· · "F · ' ·" F-^'» . VW * » - - F . . ' · * * ^ »l-J» » » '•F·'.'... w 97 118424
Keskinkertaisesti Runsaasti Ollgo/PNA Vähän suolaa suolaa_suolaa 1+b 56/ 0 51/ 5 50/0 2+a 73/0 72/ 5 73/0 2+c 41/ 5 ja 52/ 0* 2+e 84/ 5 86/ 0 -90 2+f 74 4+a 60,0 59/ 0 61,5 4+c 74, 5 72,0 72,5 4+f 62,0 5+a 47,0 5+c 57, 5 5+f 46,5 7+a 46,0 7+c 58,0 7 + f 43,5 7 + 12 23,0 13 + 14_39, 0_ * Kaksi erisuuruista suiamislämpötilaa todetaan, mikä osoittaa paikallista sulamista ennen täydellistä denaturoitumista.
RNA-A: n (poly rA) ja PNA-Tio-Lys-NHa: n välille muodostunut hybridi sulaa niin suuressa lämpötilassa, ettei sitä kyetä mittaamaan (>90 *C). Mutta spesifinen hybridisoituminen tode taan Aaeo-arvon voimakkaasta pienenemisestä RNA-A: hän sekoitettaessa, muttei G; hen, C: hen eikä U: hun sekoitettaessa. Koe suoritetaan sekoittamalla 1 ml PNA-liuosta ja 1 ml RNA-liuosta, joiden kummankin Aaeo = 0,6, minkä jälkeen absorbanssi mitä-taan aallonpituudella 260 nm. Tämän jälkeen näyte kuumennetaan ··* 90 * C: n lämpötilaan 5 minuutiksi, jäähdytetään huoneen lämpö- Λ » tilaan ja pidetään tässä lämpötilassa 30 minuuttia, ja säily- :,· · tetään lopulta 5 * C: n lämpötilassa 30 minuuttia.
«· · * · : e * <··, Αΐβο Aaeo Aaeo - ‘ ennen sekoit- sekoittamisen RNA PNA sekoit- tamisen ja kuumentamisen tamista jälkeen jälkeen te* ♦ “ — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — ]*;·, RNA-A PNA-Tio-lys -NHa 0, 600 0, 389 0, 360 RNA-U PNA-Tio-lys-NHa 0, 600 0, 538 0, 528 ’ί"1 RNA-G PNA-Tio-lys-NHa 0, 600 0, 514 0, 517 :**,*: RNA-C PNA-Tio-lys -NHa 0, 600 0, 540 0, 532 ··· ,*f* • · te· • «· • · 98 118424
Edellä suoritetuista mittauksesta voidaan vetää seuraavat johtopäätökset. Emästen pinoutumista esiintyy, koska todetaan sulamiskäyrä. PNA-DNA-hybridi on stabiilimpi kuin normaali DNA-DNA-hybridi, ja PNA-RNA on vieläkin stabiilimpi. Yhteensopimattomuudet aiheuttavat Tm-arvon merkittävää pienenemistä riippumatta siitä, onko väärään pariin liittynyt emäs DNA- tai PNA-juosteessa. Tm-arvo riippuu vain vähän ionivahvuudesta toisin kuin normaaleiden oligonukleotidien tapauksessa.
Esimerkki 56
Acr1-(Taeg)lo-Lys-NHa: n sitominen dAio: een (kuvio 11a)
Yhdistettä Acr1-(Taeg)io-Lys (100 ng) ja 50 cps 5'-[33P]-päästä leimattua oligonukleotidiä (d(GATCCAioG)] inkuboitiin 15 minuuttia huoneen lämpötilassa 20 μΐ: ssa TE-puskuria (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4). Näyte jäähdytettiin jäissä (15 minuuttia) ja analysoitiin geelielektroforeettisesti polyak-ryyliamidissa (PAGE). 10 μΐ:aan näytettä lisättiin 2 μΐ 50 % glyserolia, 5 μΐ TBE: tä (TBE = 90 mM Tris-boraatti, 1 mM EDTA, pH 8,3) ja näyte analysoitiin PAGE-määrityksellä (15 % akryy- liamidia, 0,5 % bi s akryyli amidi a) TBE-pus kurissa 4 *C:ssa. 10 μΐ; n annos tästä näytteestä lyofilisoitiin ja liuotettiin uudestaan 10 μΐ: aan 80 % formamidia, 1 TBE, kuumennettiin 90 * C: n lämpötilaan (5 min.) ja analysoitiin urea/PAGE: 11a (15 % \"t akryyli amidi a, 0,5 % bi s akryyli amidi a, 7M ureaa) TBE: ssa.
•\j [*aP]-pitoisen DNA: n vyöhykkeet saatiin näkyviin autoradiogra- ; ·’· fisesti käyttäen voimistavia varjostimia ja Agfa Curix RPI- M· * röntgensädefilmejä, joiden annettiin valottua -80 *C:ssa 2 • · tunnin ajan.
• * · «
Oligonukleotidit syntetisoitiin Biosearch 7500 DNA-synteti- *"1 saattorilla, ne leimattiin gammataaP]-ATP: llä (Amersham, 5000 * · « '·' Ci/mmol) ja polynukleotidikinaasilla ja puhdistettiin PAGE: 11a
standardi tekniikoita käyttäen (Maniatis et ai., (1986): A
.'1· laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories).
·· · « »«·
Kuvioissa 11a ja lib tämä 5'-*aP-leimattu oligonukleotidi 1 on 1 5'-GATCCAioG. Sitä inkuboitiin joko Acr-Tio-Lys-NHa: n puuttu- 99 118424 essa (urat 1 ja 4) tai Acr-Tio-Lys-NHa: n läsnäollessa (urissa 2 ja 5, 25 pmol; urissa 3 ja 6, 75 pmol) sekä myöskin "oli- go-2: n" , joka oli 5' -GATCCTioG, puuttuessa (urat 1-3) tai sen läsnäollessa (urat 4-6). 5'-3aP-leimattua oligo 2: ta inkuboi-tiin saman PNA: n puuttuessa (ura 7) tai läsnäollessa (urassa 8 25 pmol; urassa 9 75 pmol) ja analysoitiin PAGE: 11a edellä yksityiskohtaisesti kuvatulla tavalla.
Kuvion 11a tulokset osoittavat ssDNA: n viivästyvän, kun PNA on hybridisoinut sen (urat 1-3), ja PNA: n kyvyn kilpailla DNA-oii-gonukleotidin kanssa leimatusta täydentävästä vastinoligonuk-leotidistä (urat 4-6). dsDNA: hän liittyvän vyöhykkeen intensiteetti voimistuu nopeammin PNA-pitoisuuden kasvaessa, ja se korvautuu hitaasti liikkuvaa PNA-DNA-hybridiä edustavalla vyöhykkeellä. Urat 7-9 osoittavat, ettei PNA: 11a ole mitään vaikutusta Tio-oligo-DNA: hän, jota se ei täydennä.
Kuviossa 11b, joka on ajettu DNA: ta denaturoivissa olosuhteissa, PNA-DNA-dupleksit pysyvät denaturoitumattomina.
Esimerkki 57
Juosteen syrjäyttävän kompleksin muodostaminen P1 as mi di n DNA-sekvenssin sisältämä dAio-dTio-kohdesekvenssi • · .·**. muodostettiin kloonaamalla kaksi oligonukleotidiä : [d(GATCCAioG) + d(GATCCTioG)) pUC19: n BamHI-restriktioentsyymi- • ·· ,\·\ kohtaan käyttäen Eschericia coli JM101-kantaa ja standarditek- *.!*.’ niikoita (Maniat!s et ai., 1986). Toivottu plasmidi (josta • · · käytetään merkintää pTIO) eristettiin yhdestä tuloksena oi- • · · *·* * leesta kloonista ja puhdistettiin alkalisella uuttotoimenpi- teellä ja CsCl-sentrifugoinnilla (Maniatis et ai., 1986). 248 emäsparin pituinen, 3'-(3aP]-päästään leimattu DNA-kappale, · joka sisälsi dAio/dTio-kohdesekvenssin, saatiin pilkkomalla pTIO DNA restriktioentsyymelllä EcoRI ja PvuII, leimaamalla • · ...4 pilkottu DNA a[3aP]-dATP: llä (4000 Ci/mmol, Amersham) käyttäen • * *" E. coli DNA-polymeraasin Klenow-kappaletta (Boehringer Mann- * heim) ja puhdistamalla tämä 248 emäsparin DNA-kappale PAGE: 11a • · *·/·* (5 % akryyliamidi, 0,06 % bi s akryyli amidi, TBE-puskuri). Tämä 100 118424 DNA-kappale saatiin leimaamalla pää (3aP]:llä 5' -päästä siten, että EcoRI:lla pilkottua pT10-plasmidia käsiteltiin bakteeriperäisellä alkalisella fosfataasilla (Boehringer Mannheim), plasmidi-DNA puhdistettiin geelielektroforeesilla alhaisessa lämpötilassa sulavalla agaroosilla, ja se leimattiin gamma-[3aP] ATP: llä ja polynukleotidikinaasilla. PvuII:lla käsittelyn jälkeen tämä 248 emäsparin DNA-kappale puhdistettiin edellä kuvatulla tavalla.
Acr1-(Taeg)ιο-Lys-NHa:n ja tämän 248 emäsparin DNA-kappaleen välinen kompleksi muodostettiin inkuboimalla 50 ng Acrl-(Ta-eg)ιο-Lys-NHa:ta ja 500 cps 3aP-leimattua 248 emäsparin kappaletta sekä 0,5 μg vasikan kateenkorvasta saatua DNA: ta 100 μΐ: ssa 25 mM Tris-HCl, 1 mM MgCla, 0,1 mM CaCla, pH 7,4, 60 minuuttia 37 *C:ssa jäljempänä kuvatulla tavalla.
Esimerkki 58
Juosteen syrjäyttävän kompleksin koettaminen: (a) Staphylococcus-nukleaasilla (kuvio 12b, urat 8-10)
Juosteen syrjäyttävä kompleksi muodostettiin edellä kuvatulla tavalla. Tätä kompleksia käsiteltiin Staphylococcus-nukleaasilla (Boehringer Mannheim), jota käytettiin 750 U/ml, 5 minuuttia 20 *C:ssa ja reaktio pysäytettiin lisäämällä EDTA: ta • ·* pitoisuudeksi 25 mM. DNA saostettiin lisäämällä 2 tilavuutta • · etanolia, 2 % kaliumasetaattia, joka oli liuotettu uudestaan • · *·.'·· 80 % formamidia, TBE, kuumennettiin 90 * C: n lämpötilaan (5 · :.· ; min. ) ja analysoitiin suuren erotuskyvyn PAGE: 11a (10 % akryy- :*·*: liamidia, 0, 3 % bi s akryyli amidi a, 7 M ureaa) ja autoradiogra- • · ·*·*; fisesti. Ura 8 ei sisällä lainkaan PNA: ta, ura 9 40 pmol ja ura 10 120 pmol. Kun PNA: ta on läsnä, nähdään jalanjäljen ilmaantuminen, mikä osoittaa, että taipumus pilkkoutua Staphy- « lococcus-nukleaasin vaikutuksesta on suurentunut ja että näin • * * • · · *. ollen s s DNA: n syrjäytyminen ds DNA: s ta on lisääntynyt.
• · (b) Affiniteettiin perustuvalla valopilkkomisella (kuviot 12a *·. + 12b; urat 1-3 kussakin tapauksessa)
Kompleksi muodostettiin TE-puskuriin. Eppendorf-putkessa ole- * ·· • « 101 118424 vaa näytettä säteilytettiin ylhäältäpäin aallonpituudella 300 nm (Philips TL 20 W/12-fluoresenssivaloputki, 24 Jm-3s-1) 30 minuutin ajan. DNA seostettiin edellä kuvatulla tavalla, se sekoitettiin IM piperidiiniin ja sitä kuumennettiin 90 *C:ssa 20 minuuttia. Lyofilisoinnin jälkeen DNA analysoitiin PAGE: 11a edellä kuvatulla tavalla. Jälleen, kussakin tapauksessa ura 1 ei sisällä PNA: ta ja urat 2 ja 3 sisältävät 40 pmol ja 120 pmol PNA: ta, vastaavasti. PNA: hän sitoutunut DNA-juoste (Aio-juoste) pilkkotuu akridiiniesterin kohdalta (kuviossa 12a urat 1-3) uuden vyöhykkeen tuottaen (merkitty nuolella), kun taas PNA: n syrjäyttämä juoste (Tio-juoste) pilkkoutuu satunnaisesti tuottaen jalanjäljen.
(c) Kaliumpermanganaatilla (kuviossa 12b urat 4-6)
Kompleksi muodostettiin 100 μΐ:ssa TE: tä ja 5 μΐ 20 mM KMnO« lisättiin. Reaktioseosta pidettiin 15 s 20 * C: ssa, minkä jälkeen reaktio pysäytettiin lisäämällä 50 μΐ 1, 5 M natriumase-taattia, pH 7,0, IM 2-merkaptoetanolia. DNA saostettiin, käsiteltiin piperidiinillä ja analysoitiin edellä kuvatulla tavalla. Samoja PNA-pitoisuuksia on käytetty urissa 4-6 kuin urissa 1-3. Jälleen todetaan jalanjäljen ilmaantuminen, mikä osoittaa syrjäytyneen ssDNA: n pilkkoutuneen permanganaatin vaikutuksesta.
(d) Vaiojalanjälkien muodostuksella (kuvio 12a, urat 5-6) • * · "...* Kompleksi muodostettiin 100 μΐ: ssa TE: tä ja diatso-kytkettyä *·.'·· akridiinia (0,1 μg/μl) (DHA, Nielsen et ai., (1988) Nucl.
jti J Acids Res. , 16, 3877-88) lisättiin. Näytettä säteilytettiin aallonpituudella 365 nm (Philips TL 20 W/09N, 22 Jm“3s-*) 30 • · minuutin ajan ja sitä käsiteltiin tavalla, joka on kuvattu e "affiniteettiin perustuvan valopilkkomisen" yhteydessä. PNA: n .5. läsnäollessa (ura 6) DNA on suojattu ja vyöhykkeet, jotka e *!*.*.t vastaavat pilkkoutumista suojatussa alueessa, katoavat.
• » · « e *:**· (e) Si-nukleaasilla (kuvio 12c, urat 1-3)
Kompleksi muodostettiin liuoksessa, joka sisälsi 50 mM natrium-asetaattia, 200 mM NaCl, 0,5 % glyserolia, 1 mM ZnCla, pH 4, 5, ♦ ja käsiteltiin nukleaasilla Si (Boehringer Mannheim), jonka
• M
102 118424 pitoisuus oli 0/ 5 U/ml, 5 minuutin ajan 20 *C:ssa. Reaktio pysäytettiin ja seosta käsiteltiin edelleen tavalla, joka on kuvattu kohdassa "Staphylococcus-nukleaasi". PNA: n käytetty määrä oli nolla (urat 1-3) tai 120 pmol (urat 4-6), urasta 7 nähdään kokostandardit. Jälleen todetaan PNA: n syrjäyttämän Ti oDNA-juos teen pilkkoutuminen.
Esimerkki 59
Hybridisaation herkkyys (1) suuntautumiselle (2) pH: lie ja (3) sekvenssien yhteensopimattomuudelle PNA-oligomeeri H-T4C2TCTC-LysNHa valmistettiin synteesitoimenpiteellä 6, se puhdistettiin käänteisfaasiin perustuvalla HPLC-menetelmällä ja tunnistettiin FAB-massaspektrometrialla; todettu (laskettu) 2746, 8 (2447, 15). Tällä sekvenssillä toteu tetut hybridisaatiokokeet ratkaisevat suuntautumiakysymyksen, koska se on aidosti epäsymmetrinen. Tällaiset kokeet ratkaisevat myös Tm-arvon pH-riippuvuuden sekä muodostuneiden kompleksien stokiometrian.
Hybridi saatiokokeet PNA-oligomeerilla H-T^CaTCTC-LysNHa toteutettiin seuraavasti: t • · • *· * * » « · · • » · · • · · • · • · • · · • · · M* * • · · t · • · » « ··· • * · • * * « »*· • · · · • ·» * « » • · · • · *·· • · * ♦ • ·· e »i· m • 9·· 9 9 • 99 9 99 9 9 1 1 8424 103
Rivi Hybridisoitu sekvenssiin pH Tm # 1 5'-(dA)4(dG)2(dA)(dG)(dA)(dG) 7.2 55.5 2:1 2 5'-(dA)4(dG)2(dA)(dG)(dA)(dG) 9.0 26.0 2:1 3 5'-(dA)4(dG)2(dA)(dG)(dA)(dG) 5.0 88.5 2:1 4 5'-(dG)(dA)(dG)(dA)(dG)2(dA)4 7.2 38.0 2:1 5 5'-(dG)(dA)(dG)(dA)(dG)2(dA)4 9.0 31.5 6 5'-(dG)(dA)(dG)(dA)(dG)2(dA)4 5.0 52.5 61.0 7 5'-(dA)4(dG)(dT)(dA)(dG)(dA)(dG) 7.2 39.0 8 5'-(dA)4(dG)(dT)(dA)(dG)(dA)(dG) 9.0 <20 9 5'-(dA)4(dG)(dT)(dA)(dG)(dA)(dG) 5.0 51.5 10 5'-(dA)4(dG)2(dT)(dG)(dA)(dG) 7.2 31.5 11 5'-(dA)4(dG)2(dT)(dG)(dA)(dG) 5.0 50.5 12 5'-(dG)(dA)(dG)(dA)(dT)(dG)(dA)4 7.2 24.5 13 5'-(dG)(dA)(dG)(dA)(dT)(dG)(dA)4 9.0 <20 14 5'-(dG)(dA)(dG)(dA)(dT)(dG)(dA)4 5.0 57.0 15 5'-(dO)(dA)(dG)(dT)(dG)2(dA)4 7.2 25.0 16 5'-(dG)(dA)(dG)(dT)(dG)2(dA)4 5.0 39.5 52.0 # = Stökiometria UV-sekoituskäyrillä määritettynä = ei määritetty » Nämä tulokset osoittavat, että aidosti sekoittunut sekvenssi • e .·*' tuotti hyvin määritellyt s ui amis käyrät. PNA-oligomeerit voivat • * · *, *: todellisuudessa sitoutua kummallakin tavalla suuntautuneina • · ;.· : (vertaa riviä 1 ja 4), vaikka N-pääte/5' -suuntautuminen onkin • · · \ edullinen. Yhden yhteensopimattomuuden aikaansaaminen joko T: tä tai C: tä vastapäätä johti Tm-arvon pienenemiseen enemmän kuin 16 *C pH-arvossa 7,2; pH-arvossa 5,0 Tm-arvo pieneni enemmän kuin 27 * C. Tämä osoittaa, että sekvenssi-selektiivi- • ·· · syyden aste on hyvin suuri.
* · ♦ ** e ] * Kuten edellä on esitetty, Tm-arvo riippuu erittäin voimakkaas- 5...· ti pH-arvosta, mikä osoittaa, että Hoogsteen-emäsparinmuodos- tus on tärkeätä hybridien muodostumiselle. Tästä syystä ei ole .*·,· yllättävää, että s töki ome tri aksi todettiin 2: 1.
• · 104 118424
Symmetrian puuttuminen sekvenssistä ja Tm-arvon voimakas pieneneminen yhteensopimattomuuksien läsnäollessa osoittavat, että Watson-Crick-juoste ja Hoogsteen-juoste ovat yhdensuuntaisia täydentävään vastin-DNA: hän sitoutuneina. Tämä pätee kummankin suuntautumisen eli 5' /N-pääte- ja 3' /N-pääte-suun-tautumisen tapauksessa.
Esimerkki 60
Sekvenssin diskriminointi hybridisäätiössä
Hybridisaatiokokeissa, joissa H-TsGT-«-LysNHa hybridi s oi ti in alla esitettyihin deoksioligonukleotideihin, saatiin seuraavat tulokset:
Rivi_Deoksioligonukleotidi_Tm 1 5'-(dA)5(dA) (dA)4-3' 55,0 2 5'-(dA)5(dG) (dA)4-3' 47,0 3 5' -(dA)5(dC) (dA)4-3' 56,5 4 5' - (dA) 5 (dT) (dA) 4-3' 46,5 5 5' -(dA)4(dG) (dA)5-3' 48,5 6 5' -(dA)4(dC) (dA)5-3' 55,5 7 5'-(dA)4(dT) (dA)5-3' 47,0 « ,*.* Kuten todetaan vertaamalla rivejä 1, 3 ja 6 riveihin 2, 4, 5 **#4S ja 7, tässä mallissa G voi diskriminoida C/A: n ja G/T: n välil- la DNA-juosteessa, eli sekvenssin diskriminointia todetaan.
♦ · : Edelleen määritettiin UV-sekoituskäyrien perusteella, että ·*· · **.*. rivin 3 kompleksi on 2 PNA: 1 DNA-kompleksi.
• · ··· s · · « · f
Esimerkki 61 . Sekvenssispesifisyys hybridisäätiössä muokattua runkoa käyt- ··· ··“ täen «*· • * ; • * · ·:*·; Hybridisaatiotiedot, jotka liittyvät PNA-oligomeeriin ja jat- ketun rungon (β-ai aniini muokkaus) käsittävään yhteen yksik- • e· *. köön, ovat seuraavat: e·* ···· • · ♦ · * f ·* • · 105 118424 PNA_DNA_Tm
H-Tio-LysNHa (dA)10 73 *C
Η-Τλ(0T)Ts-LysNHa (dA)io 57 *C
H~T« (BT)Ts-LysNHa (dA) (dG) (dA) s 47 *C
H-T*(0T)Ts-LysNHa (dA)* (dC)(dA)s 49 *C
H-T*(0T)Ts-LysNHa (dA)<(dT)(dA)s 47 *C
Vaikka suiamislämpötila laskee, niin kuitenkin näistä tuloksista nähdään, että emässpesifinen tunnistaminen säilyy.
Esimerkki 62
Jodaustoimenpide - Radioaktiivinen leimaaminen 5 n annos Tyr-PNA-Tio-Lys-NHa: ta liuotetaan 40 μΐ: aan 100 mM Na-fosfaattia, pH 7,0, ja 1 mCi NaiasI:tä ja 2 μΐ kl o rämiini-T: tä (50 mM CHsCN: ssä) lisätään. Liuos jätetään 20 * C: hen 10 minuutiksi ja sitten se johdetaan 0,5 + 5 cm: n Sephadex-
GlO-pylvään läpi. Ensimmäiset kaksi radioaktiivisuutta sisältävää fraktiota (kumpikin 100 μΐ) otetaan talteen ja puhdistetaan HPLC-menetelmällä: käänteisfaasi C-18, käyttäen 0-60 %
CHaCN-gradienttia CF3COOH: n 0,1 % vesiliuoksessa. iasI-PNA
eluoituu heti PNA-piikin jälkeen. Liuotin poistetaan alenne-.* tussa paineessa.
• e • ·· '-4 e .**. Esimerkki 63 • · } // PNA: iden-Tio/TeC/TeCa sitoutuminen kaksijuosteisiin DNA-koh- ·;· · teisiin Aio/AeG/AsGa (kuvio 20) • · • »f \ Seosta, joka sisälsi 200 cps mainitun plasmidin kaksi juos teista 3aP-leimattua EcoRI-PvuII-kappaletta (suuri kappale, jossa .«li* EcoRI-kohdan 3'-pää on leimattu), 0,5 ug kantajana toimivaa ·’·*: vasikan kateenkorvan DNA: ta ja 300 ng mainittua PNA: ta 100 e μΐ: ssa puskuria (200 mM NaCl, 50 mM Na-asetaattia, pH 4,5, 1 mM ZnSO*), inkuboitiin 37 *C:ssa 120 minuuttia. 50 yksikköä **;*' nukleaasia Si lisättiin ja inkuboitiin 20 * C: ssa 5 minuuttia.
Reaktio pysäytettiin lisäämällä 3 μΐ 0,5 M EDTA ja DNA saos- ·,*·.; tettiin lisäämällä 250 μΐ 2 % kaliumasetaattia etanolissa. DNA # · 106 118424 analysoitiin elektroforeettisesti sekvenssin määritykseen sopivilla 10 % polyakryyliamidigeeleillä ja radioaktiivisesti leimatut DNA-vyöhykkeet saatiin näkyviin autoradiografisesti. Muodostuneet täydelliset vyöhykekuviot osoittivat yksijuostei-sen DNA-juosteen syrjäytymisen, johon juosteeseen nukleaasi vaikuttaa lyhyempiä oligonukleotidejä sisältävän seoksen tuottaen. Kussakin tapauksessa kolmella PNA: 11a saatujen tulosten vertaaminen osoittaa selektiivisyyden kunkin saadun kohteen suhteen.
Kohdeplasmidi valmistettiin kloonaamalla asianmukaiset oligo-nukleotidit plasmidiin pUC19. Kohde Aio: oligonukleotidit GATCCAioG & GATCCTioG kloonattiin BamHI-kohtaan (Plasmidista käytettiin merkintää pTIO). Kohde ASGA«: oligonukleotidit TCGACT«*CTsG & TCGACAsGA^G kloonattu Sali-kohtaan (plasmidi pT9C). Kohde AaGAaGA*: oligonukleotidit GAaGAaGA^TGCA & GT«CTaCTaCTGCA kloonattu PstI-kohtaan (plasmidi pT8C2). Näiden kohteiden asemat geelissä on merkitty vasemmalla olevilla pylväillä. A/G tarkoittaa kohteen P10 A+G-sekvenssitikkaita.
Esimerkki 64 PNA: n kyky inhiboida pilkkoutumista restriktioentsyymillä (kuvio 23) a t"( 2 ng: n annokseen plasmidia pTIO sekoitettiin esitetty määrä e PNA-Tio: tä 20 μΐ: ssa TE-puskuria (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, M j pH 7,4) ja inkuboitiin 37 *C:ssa 120 minuutin ajan. Seokseen « I »
lisättiin 2 μΐ lOx väkevöityä puskuria (10 mM Tris-HCl, pH
S V 7,5, 10 mM, MgCla, 50 mM NaCl, 1 mM DTT) sekä PvuII: tä (2 ··» : yksikköä) ja BamHI: tä (2 yksikköä) ja inkubointia jatkettiin 60 minuuttia. DNA analysoitiin geeli-elektroforeettisesti M* käyttäen 5 % polyakryyliamidia ja DNA saatiin näkyviin eti- '·'· di umbromi di-värjäyksellä.
• I
a a····
Merkittävän PNA-osuuden läsnäollessa (0,2, 0,6) entsyymin * * · ’»· BamHI pilkkomiskuvio muuttui, mikä osoittaa, että PNA: n läsnä- •i* olo pilkkomi s kohdan vieressä inhiboi tätä entsyymiä.
• · r · f a ·♦ a · 107 118424
Esimerkki 65 PNA-Tio - dsDNA-juosteen syrjäytymiskompleksin muodostumisen kinetiikka (kuvio 21)
Seosta/ joka sisälsi 200 cps plasmidin pTIO kaksijuosteista 32P-leimattua EcoRI-PvuII-kappaletta (suuri kappale/ joka oli leimattu EcoRI-kohdan 3' -päästä)/ 0,5 g kantajana toimivaa vasikan kateenkorvan DNA: ta ja 300 ng PNA-Tio-LysNHa: ta 100 Ulissa puskuria (200 mM NaCl, 50 mM Na-asetaattia, pH 4,5, 1 mM ZnS0«), inkuboitiin 37 1C:ssa. Mainittuina aikoina kuhunkin 7 näytteeseen lisättiin 50 U Si-nukleaasia ja inkubointia jatkettiin 5 minuuttia 20 1C:ssa. Nukleaasi pilkkoo jokaisen yksijuosteisen DNA: n, joka on syntynyt juosteen syrjäytymisen seurauksena. Sitten DNA saostettiin lisäämällä 250 ui 2 % kaliumasetaattia etanolissa ja se analysoitiin elektroforeet-tisesti käyttäen sekvenssin määritykseen sopivaa 10 % polyak- ryyliamidigeeliä. Juosteen syrjäytymiskompleksin määrä laskettiin mielivaltaisina yksikköinä kohdesekvenssissä tapahtuneen Si-pilkkoutumisen voimakkuudesta, autoradiogrammien densito-metrisellä skannauksella mitaten. Tällöin voidaan nähdä kompleksin muodostuminen ajan kuluessa.
Esimerkki 66 FNA-dsDNA-kompleksien stabiilisuus (kuvio 22) a • · · » • ·» • · ···’ Seosta, joka sisälsi 200 cps 3aP-pT10-kappaletta (kuten esi-• · · *· ’· merkissä 65), 0,5 ug vasikan kateenkorvan DNA: ta ja 300 ng : toivottua PNA: ta (joko Tio-LysNHa, Te-LysNHa tai Te-LysNHa), • aa : inkuboitiin 100 ulissa puskuria, joka sisälsi 200 mM NaCl, 50 : mM Na-asetaattia, pH 4, 5, 1 mM ZnSO1, 60 minuuttia 37 1 C: ssa.
2 ug: n määrä oligonukleotidiä GATCCAioG lisättiin kilpailemaan ··· PNA: n kanssa leimatusta oligonukleotidistä ja kutakin näytettä *··1 kuumennettiin 10 minuuttia esitetyssä lämpötilassa, jäähdytet- • ^ tiin jäissä 10 min. ja lämmitettiin 20 1 C: hen. 50 U Si-nukle- aasia lisättiin ja yhtenä nnukleotidinä vapautuneen radioak-tiivisuuden määrä mitattiin.
* ··· * • II1 · • 1 · • · · • · 108 118424
Odotettu Tm-arvo Tio DNA-dupleksin tapauksessa on 20 *C, Te -16 *C ja Te - 12 *C. Vastaavien PNA/DNA-arvojen on osoitettu olevan Tio > 70 * C, Te - 60 *C ja Te - 37 * C.
Esimerkki 67 PNA: n immobilisoiminen
PNA-Sepharose-hartsin valmistamiseksi 10 mg syanogeenibromidil-la aktivoitua Sepharose-hartsia (Sigma) ja 10 μg PNA: ta inku-boitiin 100 μΐ: ssa 50 mM Na-fosfaattia, pH 7, 5, 60 minuutin ajan 37 *C:ssa. Sepharose eristettiin sentrifugoimalla ja pestiin kolmeen kertaan 250 μΐ: 11a 50 mM Na-fosfaattia, pH
7, 5.
Esimerkki 68 5' -päästä 32P-leimatun oligonukleotidin sitoutuminen PNA- -Sepharos e-harts ii n 1 mg PNA-Sepharose-hartsia (esimerkki 67) 100 μΐ:ssa TE-puskuri a ja 50 ops (noin 100 ng) 1 2 33P-leimattua oligonukleotidiä inkuboitiin yhdessä 16 tunnin ajan 20 *C:ssa. Sepharose eristettiin sentrifugoimalla ja se pestiin kahteen kertaan 500 μΐ: Ha TE-puskuria. Sitoutunut oligonukleotidi määritettiin nestetuikelaskennalla, käyttäen " Cerenkov: in" menetelmää.
• k .···, Tulokset on esitetty alla olevassa taulukossa kolmen erilaisen PNA-Sepharos e: n ja neljän oli go-DNA: n tapauksessa. Immobili- • · * .*/ soitujen PNA-molekyylien vangitsemisen spesifisyys nähdään * « * selvästi, vain yhden yhteensopimattoman emäsparin ollessa • * * * ·’ sallittu.
• *· • · · • · · P-oligon % sitoutuminen PNA-Sepharose-hartsiin • · · • · · ·
: : : Kiinteän kantajan (CNBr-Sepharose) pinnalla oleva PNA
2 _T10_T9C_T8C2_puuttuu
DNA
3 AIO 51 45 15 8 ·. A9G 11 50 52 8 A8G2 11 45 42 4 .·. : seos 11 13 14 15 • * 109 118424 Tässä taulukossa AIO on 5'-GATCCAAAAAAAAAAG, A9G on 5' -TCGA-CAAAAAGAAAAG, A8G2 on 5' -GAAGAAGAAACTGAC ja seos on 5' -GAT-CACGCGTATACGCGT. PNA: t ovat: T10: H-TioLysNHa, T9C: H-TSCT*-
LysNHa, T8C2: H-TaCTaCT.*-LysNHa, puuttuu: etanoliamiini.
Esimerkki 69 (Kuvio 25a/ To & o) 3aP-oligonukleotidin ja PNA-Sepharose: n välisen sitoutumisen s tabi i1isuuden 1ämpöti1ari ippuvuus
Oligonukleotidit sidottiin PNA-Sepharose-hartsiin esimerkeissä 67 ja 68 kuvatulla tavalla. Kussakin tapauksessa 3aP-oligonuk-leotidi-PNA-Sepharose pestiin tämän jälkeen kasvavissa lämpötiloissa. Sepharose eristettiin sentrifugoimalla/ radioaktiivisuus määritettiin “Cerenkov"-laskennalla ja Sepharose siirrettiin jälleen 500 μΐ: aan TE-puskuria, sitä inkuboitiin seu-raavaksi toivotussa lämpötilassa/ sentrifugoitiin, jne. Kuvio esittää tulokset/ jotka on normalisoitu alkuperäisen sitoutumisen suhteen. Oligonukleotidi ja PNA-Sepharose olivat esimerkissä 68 esitetyn taulukon mukaisia. Käyrien väliset siirtymät osoittavat oligonukleotidisitoutumisen pienentyneen stabiili-suuden, kun läsnä on yksi yhteensopimattomuus.
.· Esimerkki 70 PNA: n kyky inhiboida transkriptiota (kuvio 26) • * * * * • · * * * ;· / Seosta, joka sisälsi 100 ng pl as mi di-DNA: ta (pilkottu restrik- i · « ί·γ tioentsyymillä PvuII; katso jäljempänä) ja 100 ng PNA: ta 15
i *.* μΐ: ssa puskuria, joka sisälsi 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH
» · · : 7,4, inkuboitiin 37 *C:ssa 60 minuuttia. Sitten 4 μΐ: aan 5x väkevöityä puskuria (0,2 M Tris-HCl (pH 8,0), 40 mM MgCla, 10 ··· mM spermidiiniä, 125 mM NaCl) sekoitettiin 1 μΐ NTP-seosta (10 • · · · mM ATP, 10 mM CTP, 10 mM GTP, 1 mM UTP, 0, 1 μ01/μ1 3aP-UTP, 5 mM DTT, 2 μg/ml tRNA, 1 μg/ml hepariini) ja 3 yksikköä RNA-polymeraasia. Inkubointia jatkettiin 10 min. 37 *C:ssa. Sitten • · *···' RNA saostettiin lisäämällä 60 μΐ 2 % kaliumasetaattia 96 % « ·;· etanolissa -20 *C:ssa ja analysoitiin elektroforeettisesti * · ♦ · :*.φϊ sekvenssin määritykseen sopivilla 8 % polyakryyliamidigeeleil-• * no 118424 lä. RNA-kopiot saatiin näkyviin autoradiografisesti. Seuraavia plasmideja käytettiin: urat 1-5; pAlOKS (Αιο-kohde sijaitsee kopioituneessa juosteessa). Urat 6-10: pTIQKS (Αιο-kohde sijaitsee kopioitumattomassa juosteessa). Plasmidia käsiteltiin seuraavilla restriktioentsyymeillä ennen koetta: urat 1/ 4, 6 ja 9: PyuII; urat 2, 5, 7 ja 10; Xha I; urat 3 ja 8: BamHI.
Urien 4, 5, 9 ja 10 näytteet sisälsivät PNA: ta, kun taas PNA puuttui muualta. Geelistä nähdään, että kun PNA Tio on sitoutunut plasmidin kopioituun juosteeseen, niin RNA: n kopioituminen pysähtyy PNA-sitoutumiskohtaan. Mikäli PNA on sitoutunut plasmidin kopioitumattomaan juosteeseen, niin kopioituminen ei pysähdy.
Esimerkki 71
Affiniteetti-PNA-Sepharose (kuvio 27) 1 mg: aa PNA-Tio Sepharose-hartsia (katso esimerkki 67) 100 μΐ:ssa TE-puskuria inkuboitiin seuraavien 5' -päästään 3aP-lei-mattujen oligonukleotidien (noin 50 cps) kanssa 16 tuntia 20 * C: ssa:
1: 5'-GAT CCG GCA AAT CGG CAA TAC GGC ATA ACG GCT AAA
CGG CTT TAC GGC TTA TCG GCT ATT CGG CAT TTC GGC
··. AAT TCG, • ·
.**·. 2: 5' -GAT CCG GCT TAA CGG CAA TTC GCT TAT ACG GCA TAT
.·**: CGG CTA ATC GGC ATT ACG GCT TTT CGG G, • ··
3: 5' -GAC AAA CAT ACA ATT TCA ACA GAA CCA AAA AAA AAA
e · · ::v aaa a, j · · 4: 5' -ACT GAC TAC CTA GGT TTA CCG TGC CAG TCA,
S·* ' 5: 5'-GAA ACG GAT AGC TGC A
·»« • ··· ··· • · · • · ·
Sepharose eristettiin sentrifugoimalla ja se pestiin 3 kertaa TE-puskurilla. Tämän jälkeen oligonukleotidit pestiin pois 500 μΐ: 11a TE-puskuria suurenevissa lämpötiloissa, ne saostettiin *j. 1 mlrlla etanolia, 2 % kaliumasetaattia ja analysoitiin elek- troforeettisesti 20 % polyakryyliamidi, 7M urea-gelissä, joka * · * • · m 118424 kehitettiin TBE-puskurissa ja ilmaistiin autoradiografisesti (-70 1C, 16 tuntia, voimistava varjostin). Tulokset on esitet ty kuviossa 26. Urat olivat seuraavat: ura 1: oligonukleotidit, jotka eivät olleet sitoutuneet Sepha- dex-hartsiin; ura 2: oligonukleotidit, jotka huuhtoutuivat pois 40 1C:ssa; ura 3: oligonukleotidit, jotka huuhtoutuivat pois 60 1C:ssa; ura 4: oligonukleotidit, jotka huuhtoutuivat pois 80 1C:ssa;
Vain plasmidi 3 täydentää PNA: ta. Voidaan nähdä, että pestäessä korkeintaan 80 1C:ssa olennaisesti vain täydentävä vastin-plasmidi pysyy PNA-Sepharose-hartsissa. Tämä esimerkki havainnollistaa oligonukleotidin poistamista sen seoksesta affiniteettiin perustuvalla vangitsemisella PNA: ta käyttäen.
Esimerkki 72
Ds-plasmidissa läsnäolevan DNA-sekvenssin kvantitatiivinen määritys pNA-juosteen syrjäytyksellä 3 pg plasmidi-DNA: ta, joka oli pilkottu jäljempänä mainituilla vastaavilla restriktioentsyymeillä 10 μΐ: ssa puskuria, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, ja 5000 cpm (noin 10 ng) iasI-PNA-Tio~Tyr ja alla esitettyjen kokonais-PNA-mää- t ;,1 rien osoittama määrä kylmää PNA TioTyr inkuboitiin yhdessä 60 * ; minuuttia 37 1C:ssa. DNA seostettiin 25 μΐ: 11a etanolia, 2 % • · *. 1ϊ kaliumasetaatilla ja analysoitiin sitten elektroforeesilla 6 % • · : polyakryyliamidissa, TBE-pus kuri s s a. Geeli värjättiin etidium- # · · J bromidilla ja se alistettiin autoradiografiaan (-70 1 C, 16 tuntia, voimistava varjostin). Tulokset nähdään kuviosta 28.
"A" on etidiumilla värjätty geeli ja "b" on vastaava autoradi- ... ogrammi. Käytetyt plasmidit olivat: .2,·. urat 1-3: pTio + Haelll; • · · urat 4-6: pTio x Hinfl; * urat 7-9: pTa.o x PvuII.
• · f e ♦ • 1 • · 1 2 ··· * 1 · · « · * · · • f I t · 112 118424 PNA-Tio-Tyr: n kokonaismäärä kussakin näytteessä oli: urat 1, 4 ja 7: noin 10 ng; urat 2, 5 ja 8: 25 ng; urat 3/ 6 ja 9: 250 ng.
Etidiumbromidigeeli (a) osoittaa syntyneiden DNA-kappaleiden koon (DNA-PNA-hybridit mukaan lukien). Autoradiografi (b) osoittaa/ mikä geelin (a) vyöhyke sisältää PNA: ta. Juosteen syrjäytymiskompleksin läsnäolo voidaan nähdä urasta 1, samoin urissa 2 ja 3 kylmän PNA: n osuuden suurentamisen vaikutus tämän vyöhykkeen intensiteettiin. Samankaltaiset tulokset voidaan nähdä kummankin muun kahden plasmidin tapauksessa urissa 4-6 ja 7-9. PNA-DNA-vyöhykkeen sijaintia kussakin tapauksessa voidaan käyttää plasmidin tunnistamiseen/ ja perus-intensiteettiä voidaan käyttää läsnäolevan plasmidin määrän kvantitoimiseen.
Alan asiantuntijoille on selvää/ että keksinnön näihin edullisiin suoritusmuotoihin voidaan tehdä lukuisia muutoksia ja muokkauksia keksinnön hengestä tällöin kuitenkaan poikkeamatta. Tarkoituksena on näin ollen, että liitteenä olevat patenttivaatimukset kattavat kaikki tällaiset ekvivalenttiset muunnokset, jotka ovat keksinnön hengen ja tavoitteiden mukaisia.
m % • •f M* * · ♦ * · • *· • « I * * * · I * · ·»' · j * : 4 * I * ♦ # · ·
P
* I· * + *·· «t» t » « « * · * • e • •f ψ e • · ··« ·*· e»·» • * ψ e * « M • *

Claims (36)

113 118424
1. Nukleiinihappoanalogi käytettäväksi yhden tai useamman kemiallisen tai mikrobiologisen kokonaisuuden vangitsemiseen, toteamiseen, havaitsemiseen, eristämiseen, tunnistamiseen tai määrittämiseen, tunnettu siitä, että analogi on peptidinukleiinihappo (PNA), jonka käsittämässä polyamidirungossa on lukuisia ligandeja vastaavissa, mainittua runkoa pitkin ja toisistaan jollakin etäisyydellä sijaitsevissa asemissa, kunkin ligandin ollessa toisistaan riippumatta luonnossa esiintyviä nukleoemäksiä, luonnossa esiintymättömiä nukleoemäksiä tai nukleoemäksiä sitovia ryhmiä, ja kunkin ligandin ollessa sitoutunut suoraan tai epäsuoraan rungossa läsnäolevaan typpiatomiin ja pääasiassa vähintään 4-8 väliatomin erottaessa näitä typpiatomeja, joissa mainittu ligandi on kiinni, toisistaan tässä rungossa, mainitun analogin käsittäessä havaittavan leiman tai siihen ollessa konjugoituna havaittava leima.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen nukleiinihappoanalogi, tunnettu siitä, että typpiatomit, joissa ligandit ovat kiinni mainitussa rungossa, ovat kukin atsa-typpiatomeja.
3. Nukleiinihappoanalogi käytettäväksi yhden tai useamman kemiallisen tai mikrobiologisen kokonaisuuden vangitsemiseen, toteamiseen, havaitsemiseen, eristämiseen, tunnistamiseen tai määrittämiseen, tunnettu siitä, että analogi on sellainen nukleiinihappoanalogi, joka kykenee hybridisoitumaan täydentävän . , vastinsekvenssin käsittävään nukleiinihappoon siten, että muodostuu hybridi, tt · · *t* joka on stabiilimpi lämmön vaikutuksesta tapahtuvaa denaturoitumista vastaan e « *···* kuin sellainen hybridi, joka on muodostunut mainittua analogia vastaavasta • · ·,*·· tavanomaisesta deoksiribonukleotidistä ja mainitusta nukleiinihaposta, mainitun t · ί^ί : analogin käsittäessä havaittavan leiman tai siihen ollessa konjugoituna havaittava leima. « · • · « • · · • · *
4. Nukleiinihappoanalogi käytettäväksi yhden tai useamman kemiallisen tai mikrobiologisen kokonaisuuden vangitsemiseen, toteamiseen, havaitsemiseen, • · • ** eristämiseen, tunnistamiseen tai määrittämiseen, tunnettu siitä, että analogi *...· on sellainen nukleiinihappoanalogi, joka kykenee hybridisoitumaan kaksijuosteiseen nukleiinihappoon, jonka yhden juosteen sekvenssi on mainittua • · I • f m···# analogia täydentävä vastine, siten, että toinen juoste syrjäytyy mainitusta • · *** yhdestä juosteesta, mainitun analogin käsittäessä havaittavan leiman tai siihen • · il i ollessa konjugoituna havaittava leima. • · • · · • *· • · 114 118424
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen leimattu nukleiinihappoanalogi, tunnettu siitä, että se käsittää nukleiinihapon, jolla on yleinen kaava: l' l2 L" I, I, L A1 A2 An •l 1 1 2 2 'n Q\ t'G 2'B „'B\ 1 "D XC2 XD2 "'-C Dn missä: n on vähintään 2, kukin I^-L" on valittu toisistaan riippumatta vedyn, hydroksin, < Ci—C4) — alkanoyylin, luonnossa esiintyvien nukleoemästen, luonnossa esiintymättömien nukleoemästen, aromaattisten ryhmien, DNA-väliryhmien, nukleoemäksiä sitovien ryhmien ja reportteriligandien joukosta siten, että vähintään yksi symboleista L1-!/1 tarkoittaa luonnossa esiintyvää nukleoemästä, luonnossa esiintymätöntä nukleoemästä, DNÄ-väliryhmää tai nukleoemäksiä sitovaa ryhmää; kukin A1-A" on yksinkertainen sidos, metyleeniryhmä tai ryhmä, jolla on kaava: Rl Rl ^ Rl Rl L I>2 r2 I2 L Jp U Jq L Jr L Jg . . missä:, • « « *·*·* X on O, S, Se, NR3, CH2 tai C(CH3)2; ·· *,,,· Y on yksinkertainen sidos, 0, S tai NR4; ;*·.· sekä p että q ovat alueella 1-5 oleva kokonaisluku, summan ρ+q ollessa • · ; korkeintaan 10; • · ♦ ***** sekä r että s ovat nolla tai alueella 1^5 oleva kokonaisluku, summan r+s ollessa • · · • ·* korkeintaan 10; ··· ·.· · sekä R1 että R2 on valittu toisistaan riippumatta vedyn, mahdollisesti hydroksilla tai alkoksilla tai alkyylitiolla substituoituneen (Ci-C4)-alkyylin, ; m*m hydroksin, alkoksin, alkyylition, aminon ja halogeenin joukosta; ja ♦ · * ***,* sekä R3 että R4 on valittu toisistaan riippumatta vedyn, (C1-C4)-alkyylin, t · *··.* hydroksilla tai alkoksilla tai alkyylitiolla substituoituneen (Ci—)-alkyylin, Ϊ hydroksin, alkoksin, alkyylition ja aminon joukosta; • · · ί kukin Bl-Bn on N tai R3N*, missä R3 on edellä esitetyn määritelmän mukainen; kukin Cl-C" on CR6R7, CHR6CHR7 tai CR6R7CH2, missä Rs on vety ja R7 on valittu •*j*· luonnossa esiintyvien alfa-aminohappojen sivuketjujen joukosta tai R6 ja R7 on • · >···> valittu toisistaan riippumatta vedyn, (C2~C6)-alkyylin, aryylin, aralkyylin, • · ·«· 115 1 1 8424 heteroaryylin, hydroksin, (C^Cg) -alkoksin, (CVCg) -alkyylition, NR3R4:n ja SR5:n joukosta, joissa kaavoissa R3 ja R4 ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaisia, ja R5 on vety, (Ci-C6)-alkyyli, hydroksilla, alkoksilla tai alkyylitiolla substituoitunut (Cx-C6)-alkyyli tai R6 ja R7 täydentävät yhdessä alisyklisen tai heterosyklisen järjestelmän; kukin D1-Dn on CR6R7, CH2CR6R7 tai CHR6CHR7, missä R6 ja R7 ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaisia; kukin G^G”'1 on -CONR3-, -CSNR3-, -SONR3- tai -S02NR3- suuntautuneena kummalla tavalla tahansa, ja joissa kaavoissa R3 on edellä esitetyn määritelmän mukainen; Q on -C02H, -CONR'R", -S03H tai -S02NR'R" tai ryhmän -C02H tai -S03H aktivoitu johdannainen; ja I on -NHR'"R"" tai -NR'"C(O)R"", joissa kaavoissa R', R", R'" ja R"" on valittu toisistaan riippumatta vedyn, alkyylin, aminoa suojaavien ryhmien, reportteriligandien, väliryhmien, kelaatinmuodostajien, peptidien, proteiinien, hiilihydraattien, lipidien, steroidien, oligonukleotidien sekä liukoisten ja liukenemattomien polymeerien joukosta, mainitun analogin käsittäessä havaittavan leiman tai siihen ollessa konjugoituna havaittavissa oleva leima.
6. Patenttivaatimuksen l mukainen leimattu nukleiinihappoanalogi, tunnettu siitä, että se käsittää nukleiinihappoanalogin, jolla on yleinen kaava: L' L2 L" I . I, I A1 A2 A" I I I Q\ .-b' ,g' ,.b2 ..G2--,. .B" .1 ^C1 'D> vc2 vd2 ——c" ''D" • · « * * • · • * • · · *·· · missä: ·· · • · · . ; *" kukin A -A on yksinkertainen sidos tai ryhmä, jolla on kaava: ··· • · • · · " f1! Γ ϋ1] I" f1! f1] •t*;* __L -γ--ί--tai--C--Y--C--C— r2 j>2 lh R2 : : : L Jp L Jq L Jr L Js • · • · e • · • · • · · ,*, n, kukin L1-!,”, X, Y, p, q, r ja s ovat kuten määritelty patenttivaatimuksessa * * * ·*·* 5, sekä R1 että R2 on valittu toisistaan riippumatta vedyn, mahdollisesti • · • · · *. *: hydroksilla tai alkoksilla substituoituneen (Ci-C4)-alkyylin, hydroksin, alkoksin, aminon ja halogeenin joukosta; ja 116 118424 sekä R3 että R4 on valittu toisistaan riippumatta vedyn, (Ci-C4) -alkyylin, hydroksilla tai alkoksilla substituoituneen (Cj-C-i)-alkyylin, hydroksin, alkoksin ja aminon joukosta; kukin B1-Bn on N tai R3N+, missä R3 on edellä esitetyn määritelmän mukainen; kukin C1-Cn on CR6R7, CHReCHR7 tai CR6R7CH2, missä R6 on vety ja R7 on valittu luonnossa esiintyvien alfa-aminohappojen sivuketjujen joukosta, tai R6 ja R7 on valittu toisistaan riippumatta vedyn, (C2-C6)-alkyylin, aryylin, aralkyylin, heteroaryylin, hydroksin, metoksin NR3R4:n ja SR5:n joukosta, joissa kaavoissa R3 ja R4 ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaisia, ja R5 on vety, (Ci-C6)-alkyyli, hydroksilla tai alkoksilla substituoitunut (Ci~C6)-alkyyli tai R6 ja R7 täydentävät yhdessä alisyklisen järjestelmän; kukin DJ-Dn on CH3CR6R7 tai CHR6CHR7, missä R6 ja R7 ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaisia; kukin G'-G"'1 on kuten määritelty patenttivaatimuksessa 5, joka käsittää havaittavissa olevan leiman tai johon on konjugoitu havaittava leima.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen leimattu nukleiinihappoanalogi, tunnettu siitä, että se käsittää nukleiinihappoanalogin, jolla on yleinen kaava: Ϊ 1 Ϊ o^^(CH2), 0^/(CH2)i • · RV ,(CH2)k .N. ^(CH2)m J1--(CHz)k .n ^(CH2)m^ :··; T K T • o R7' R7’ • m • · · • · · n ··· · I _I ** ·· * • · · • · • · *·· ·,· · missä: kukin L on valittu toisistaan riippumatta vedyn, fenyylin, luonnossa esiintyvien ; t· nukleoemästen ja luonnossa esiintymättömien nukleoemästen joukosta; '**t* kukin R7' on valittu toisistaan riippumatta vedyn ja luonnossa esiintyvien alfa- • · *·*·* aminohappojen sivuketjujen joukosta; .*. ; n on alueella 1-60 oleva kokonaisluku; * Il * sekä k että m ovat toisistaan riippumatta nolla tai yksi; ja kukin 1 on • 1··« • · toisistaan riipppumatta alueella 0-5; Rn on OH, NHz tai -NHLysNH2; ja • « .···. R1 on H tai COCH3, • · ··· 117 1 1 8424 joka käsittää havaittavissa olevan leiman tai johon on konjugoitu havaittava leima.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen leimattu nukleiinihappoanalogi, tunnettu siitä, että se käsittää nukleiinihappoanalogin, jolla on yleinen kaava: I— —i L L o o « H-R 1 I7' H R7' J n missä: L, R7' ja n ovat kuten määritelty patenttivaatimuksessa 7, joka käsittää havaittavissa olevan leiman tai johon on konjugoitu havaittava leima.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen leimattu nukleiinihappoanalogi, tunnettu siitä, että kukin L on valittu toisistaan riippumatta ryhmästä, joka koostuu nukleoemäksistä tyrniini, adeniini, sytosiini, guaniini ja urasiili; ·*·*· kukin R7' on vety; ja • · ,···. n on alueella 1-30 oleva kokonaisluku. • e ··· • * • · · • ·· .* .* 10. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen leimattu • · · j·· · nukleiinihappoanalogi, tunnettu siitä, että leima on radioisotooppileima, ί .· entsyymileima, biotiini, fluorofori, kemiluminesenssileima, antigeeni, vasta- ··· lml ! aine tai spin-leima. Ϊ*. il· Patenttivaatimuksen 1, 2 tai jonkin patenttivaatimuksen 5-10 mukainen ,···# leimattu nukleiinihappoanalogi, tunnettu siitä, että mainitut ligandit ovat • · *;* tyrniini ja/tai sytosiini. • · • * » • » · • * ; **; 12. Nukleiinihappoanalogin in vitro käyttö yhden tai useamman kemiallisen tai ··· ,*. mikrobiologisen kokonaisuuden vangitsemiseen, toteamiseen, havaitsemiseen, S * * ·*·' eristämiseen, tunnistamiseen tai määrittämiseen, tunnettu siitä, että • * ·. *J nukleiinihappoanalogi on peptidinukleiinihappo (PNA), jonka käsittämässä polyamidirungossa on lukuisia ligandeja vastaavissa, mainittua runkoa pitkin ja 118 118424 toisistaan jollakin etäisyydellä sijaitsevissa asemissa, kunkin ligandin ollessa toisistaan riippumatta luonnossa esiintyviä nukleoemäksiä, luonnossa esiintymättömiä nukleoemäksiä tai nukleoemäksiä sitovia ryhmiä, ja kunkin ligandin ollessa sitoutunut suoraan tai epäsuoraan rungossa läsnäolevaan typpiatomiin ja pääasiassa vähintään 4-8 väliatomin erottaessa näitä typpiatomeja, joissa mainittu ligandi on kiinni, toisistaan tässä rungossa.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että typpiatomit, joissa ligandit ovat kiinni mainitussa rungossa, ovat kukin atsa-typpiatomeja.
14. Nukleiinihappoanalogin in vitro käyttö yhden tai useamman kemiallisen tai mikrobiologisen kokonaisuuden vangitsemiseen, toteamiseen, havaitsemiseen, eristämiseen, tunnistamiseen tai määrittämiseen, tunnettu siitä, että nukleiinihappoanalogi on sellainen nukleiinihappoanalogi, joka kykenee hybridisoitumaan täydentävän vastinsekvenssin käsittävään nukleiinihappoon siten, että muodostuu hybridi, joka on stabiilimpi lämmön vaikutuksesta tapahtuvaa denaturoitumista vastaan kuin sellainen hybridi, joka on muodostunut mainittua analogia vastaavasta tavanomaisesta deoksiribonukleotidistä ja mainitusta nukleiinihaposta.
15. Nukleiinihappoanalogin in vitro käyttö yhden tai useamman kemiallisen tai mikrobiologisen kokonaisuuden vangitsemiseen, toteamiseen, havaitsemiseen, eristämiseen, tunnistamiseen tai määrittämiseen, tunnettu siitä, että nukleiinihappoanalogi on sellainen nukleiinihappoanalogi, joka kykenee , , hybridisoitumaan kaksijuosteiseen nukleiinihappoon, jonka yhden juosteen * · · ·*·* sekvenssi on mainittua analogia täydentävä vastine, siten, että toinen juoste • ·· syrjäytyy mainitusta yhdestä juosteesta. • · • · · • *· • · • ,·, 16. Jonkin patenttivaatimuksen 12-15 mukainen nukleiinihappoanalogin käyttö, • · * tunnettu siitä/ että nukleiinihapolla on yleinen kaava: • · · • · • · ··· ♦ · · • I · * l' L2 L" U! I 2 'n s : A' A2 An ‘"Il I ^c' V vc2 '•d2 .....c" o" • · missä: • · n on vähintään 2, • · ·*· 119 118424 kukin L1-Ln on valittu toisistaan riippumatta vedyn, hydroksin, (Ci-C4)-alkanoyylin, luonnossa esiintyvien nukleoemästen, luonnossa esiintymättömien nukleoemästen, aromaattisten ryhmien, DNA-väliryhmien, nukleoemäksiä sitovien ryhmien ja reportteriligandien joukosta siten, että vähintään yksi symboleista L'-L" tarkoittaa luonnossa esiintyvää nukleoemästä, luonnossa esiintymätöntä nukleoemästä, DNA-väliryhmää tai nukleoemäksiä.sitovaa ryhmää; kukin Al-An on yksinkertainen sidos, metyleeniryhmä tai ryhmä, jolla on kaava: Rl f1 f1 f1 X --c--Y--C--tai--C--Y--Q--C i2 R2 *2 *2 s L Jp L Jq Jr s missä: X on 0, S, Se, NR3, CH2 tai C(CH3)2; Y on yksinkertainen sidos, 0, S tai NR4; sekä p että q ovat alueella 1-5 oleva kokonaisluku, summan p+q ollessa korkeintaan 10; sekä r että s ovat nolla tai alueella 1-5 oleva kokonaisluku, summan r+s ollessa korkeintaan 10; sekä R1 että R2 on valittu toisistaan riippumatta vedyn, mahdollisesti hydroksilla tai alkoksilla tai alkyylitiolla substituoituneen (Ci-C<)-alkyylin, hydroksin, alkoksin, alkyylition, aminon ja halogeenin joukosta; ja sekä R3 että R4 on valittu toisistaan riippumatta vedyn, (C1-C4)-alkyylin, , t hydroksilla tai alkoksilla tai alkyylitiollasubstituoituneen (Ci-C4)-alkyylin, • t · *.*.* hydroksin, alkoksin, alkyylition ja aminon joukosta; ·»· ·φββ« kukin B1-B" on N tai R3N*, missä R3 on edellä esitetyn määritelmän mukainen; ·*·4· kukin C^-C" on CR6R7, CHR6CHR7 tai CR6R7CH2, missä R6 on vety ja R7 on valittu • luonnossa esiintyvien alfa-aminohappojen sivuketjujen joukosta tai R6 ja R7 on • · · »!*.* valittu toisistaan riippumatta vedyn, (C2-Ce)-alkyylin, aryylin, aralkyylin, • · · • .* heteroaryylin, hydroksin, (Ca—C6) -alkoksin, (Ci-C«)-alkyylition, NR3R4:n ja SR5:n ··· •ti * joukosta, joissa kaavoissa R3 ja R4 ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaisia, ja R5 on vety, (Ci-Ce)-alkyyli, hydroksilla, alkoksilla tai • · alkyylitiolla substituoitunut (C3—C6)-alkyyli tai R6 ja R7 täydentävät yhdessä • ' I *·* · alisyklisen tai heterosyklisen järjestelmän; kukin D'-D" on CRSR7, CH2CR6R7 tai CHR6CHR7, missä R6 ja R7 ovat edellä esitettyjen .·. · määritelmien mukaisia; • ·· * kukin Gl-G"'3 on -C0NR3-, -CSNR3-, -SONR3- tai -S02NR3- suuntautuneena kummalla * tavalla tahansa, ja joissa kaavoissa R3 on edellä esitetyn määritelmän mukainen; Q on -C02H, -CONR'R", -S03H tai -S02NR'R" tai ryhmän -C02H tai -S03H aktivoitu • · 4··· johdannainen; ja • · ··· 120 1 1 8424 I on -NHR1"R"" tai -NR1"C(O)R"", joissa kaavoissa R', R" , R'" ja Rn" on valittu toisistaan riippumatta vedyn, alkyylin, aminoa suojaavien ryhmien, reportteriligandien, väliryhmien, kelaatinmuodostajien, peptidien, proteiinien, hiilihydraattien, lipidien, steroidien, oligonukleotidien sekä liukoisten ja liukenemattomien polymeerien joukosta.
17. Jonkin patenttivaatimuksen 12-15 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että nukleiinihappoanalogilla on yleinen kaava: L' L2 L" I, I, I a' aj a" 1, .1, , I Q\ ,'B ,'C 2'B -- „'B" n'1 T1 VD1 C2 2 "~cn ^Dn missä: kukin A1-An on yksinkertainen sidos, tai ryhmä, jolla on kaava: Γ" J1" Rl | p2 ft2 R2 R2 L Jp L Jq L Jr L Js ·*.*. n, kukin ΐΛ-Ι/1, X, Y, p, q, r ja s ovat kuten määritelty patenttivaatimuksessa • * ,···, 5, sekä R1 että R2 on valittu toisistaan riippumatta vedyn, mahdollisesti • · I**, hydroksilla tai alkoksilla substituoituneen (Ci-C4)-alkyylin, hydroksin, • · · « «· * * alkoksin, aminon 3a halogeenin joukosta; ja I « » !·ί : sekä R3 että R4 on valittu toisistaan riippumatta vedyn, (Ci-CJ -alkyylin, ·· I • *,· hydroksilla tai alkoksilla substituoituneen (¢^-04)-alkyylin, hydroksin, • · · ; alkoksin ja aminon joukosta; kukin B1-Bn on N tai R3N*, missä R3 on edellä esitetyn määritelmän mukainen; ··, kukin C^-C" on CR6R7, CHR6CHR7 tai CR6R7CH2, missä R6 on vety ja R7 on valittu • *· ... luonnossa esiintyvien alfa-aminohappojen sivuketjujen joukosta tai R6 ja R7 on • · e · ··· valittu toisistaan riippumatta vedyn, (C2-C6)-alkyylin, aryylin, aralkyylin, : : : heteroaryylin, hydroksin, metoksin NR3R4:n ja SRs:n joukosta, joissa kaavoissa R3 .***. ja R4 ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaisia, ja Rs on vety, (Cj-Ce)- ··· alkyyli, hydroksilla tai alkoksilla substituoitunut (C2-C6)-alkyyli tai R6 ja R7 • · · *.*.* täydentävät yhdessä alisyklisen järjestelmän; • · ·,**: kukin D^D" on CH2CR6R7 tai CHR6CHR7, missä R6 ja R7 ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaisia; 121 118424 kukin g'-G"'1 on kuten määritelty patenttivaatimuksessa 5.
18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen nukleiinihappoanalogin käyttö, tunnettu siitä, että nukleiinihappoanalogilla on yleinen kaava: L L --(CH2)k N (CH2)m^ I h I OR7' R7' _ _J n missä: kukin L on valittu toisistaan riippumatta vedyn, fenyylin, luonnossa esiintyvien nukleoemästen ja luonnossa esiintymättömien nukleoemästen joukosta; kukin R7' on valittu toisistaan riippumatta vedyn ja luonnossa esiintyvien alfa- aminohappojen sivuketjujen joukosta; n on alueella 1-60 oleva kokonaisluku; sekä k että m ovat toisistaan riippumatta nolla tai yksi; ja kukin 1 on toisistaan riipppumatta alueella 0-5; Rh on OH, NH2 tai -NHLysNH2; ja , t R1 on H tai COCH3. • · · I « t • · ··· ί ί 19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen nukleiinihappoanalogin käyttö, tunnettu ·*· I siitä, että nukleiinihappoanalogilla on yleinen kaava: • * • * • · # • · · *·· i I I v: o o : Rh^ Y Y ^NH-R 1 !:··! R7' H R7’ • f n ··· . L _ n » · · • ·· * missä: L, R7' ja n ovat kuten määritelty patenttivaatimuksessa 7, • · * · · • * · • · ι··« 20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että • · *·· 122 118424 kukin L on valittu toisistaan riippumatta ryhmästä, joka koostuu nukleoemäksistä tyrniini, adeniini, sytosiini, guaniini ja urasiili; kukin R7' on vety; ja n on alueella 1-30 oleva kokonaisluku,
21. Patenttivaatimuksen 12, 13 tai jonkin patenttivaatimuksen 16-20 mukainen nukleiinihappoanalogin käyttö, tunnettu siitä, että mainitut ligandit ovat tyrniini ja/tai sytosiini.
22. Jonkin patenttivaatimuksen 12-21 mukainen nukleiinihappoanalogin käyttö, tunnettu siitä, että nukleiinihappoanalogi käsittää havaittavissa olevan leiman tai siihen on konjugoitu havaittavissa oleva leima.
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen nukleiinihappoanalogin käyttö, tunnettu siitä, että leima on radioisotooppileima, entsyymileima, biotiini, fluorofori, kemiluminesenssileima, antigeeni, vasta-aine tai spin-leima.
24. In vitro menetelmä nukleiinihapon vangitsemiseksi, tunnettu siitä, että nukleiinihappo saatetaan kosketukseen hybridisoivissa olosuhteissa jonkin patenttivaatimuksen 12-23 mukaisen, kiinteään kantajaan immobilisoidun nukleiinihappoanalogin kanssa, joka nukleiinihappoanalogi käsittää ligandien sekvenssin, joka on sopiva hybridisoitumaan mainittuun nukleiinihappoon.
25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vangittu t t nukleiinihappo havaitaan, todetaan, määritetään tai tunnistetaan käsittelemällä • · · *.1 2 3.1 sitä nukleiinihapon tunnistavalla aineella sen ollessa sitoutuneena ··· • · immobilisoituun nukleiinihappoanalogiin. · • · 1 I ·· 2 • f • · 26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vangittu • 1 I 3 1 nukleiinihappo käsittää ensimmäisen alueen, joka on hybridisoitunut • » I Ϊ .1 immobilisoituun nukleiinihappoanalogiin, sekä toisen alueen, joka ei ole niin • · · ! hybridisoitunut ja jota käsitellään leimatulla nukleiinihapolla tai leimatulla nukleiinihappoanalogilla, joka on sovitettu hybridisoitumaan tämän toisen alueen • · vähintään johonkin osaan ja mainittu leima havaitaan. • · ♦ • · 1 ··· 1 • t1 *...1 27. Patenttivaatimuksen 24 mukainen menetelmä mRNA:n vangitsemiseksi, tunnettu ψ .·, ; siitä, että immobilisoitu nukleiinihappoanalogi käsittää peräkkäiset ligandit, * 1· * jotka voivat hybridisoitua tämän mRNA:n poly-A-häntiin mRNA:n vangitsemiseksi. • · t * .1»1. 28. Patenttivaatimuksen 24 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peräkkäiset • · ... ligandit ovat tymiiniä. • » • ft1 ,,, 1 18424 123
29. Jonkin patenttivaatimuksen 24 tai 27 tai 28 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että jo vangittu nukleiinihappo vapautetaan immobilisoidusta nukleiinihappoanalogista alistamalla immobilisoitu nukleiinihappoanalogi ja vangittu nukleiinihappo dehybridisoiviin olosuhteisiin.
30. Jokin patenttivaatimuksissa 12-23 määritelty nukleiinihappoanalogi, tunnettu siitä, että se on immobilisoitu kiinteään kantajaan.
31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen immobilisoitu nukleiinihappoanalogi, tunnettu siitä, että se on sisällytetty affiniteettiin perustuvaan vangitsemispylvääseen.
32. In vitro menetelmä kohdenukleiinihapon toteamiseksi, havaitsemiseksi tai määrittämiseksi, tunnettu siitä, että kohdenukleiinihappo hybridisoidaan patenttivaatimuksen 1-11 mukaiseen leimattuun nukleiinihappoanalogiin, jolla on riittävästi täydentävä vastinsekvenssi hybridisoituakseen kohdenukleiinihappoon hybridisoivissa olosuhteissa, minkä jälkeen kohdenukleiinihappoon tällä tavalla hybridisoituneessanukleiinihappoanalogissa oleva leima havaitaan ja määritetään.
33. Patenttivaatimuksen 32 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdenukleiinihappo on immobilisoitu substraattiin ennen hybridisointia.
34. Patenttivaatimuksen 33 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdenukleiinihappo on immobilisoitu substraattiin hybridisoimalla siihen • · · ·,·,· kuuluva ensimmäinen alue vangitsevaan nukleiinihappoon tai ··· ; ; nukleiinihappoanalogiin, jolla on riittävästi tätä ensimmäistä aluetta Ml .·, ; täydentävä vastinsekvenssi hybridisoituakseen siihen, ja joka itse on puolestaan • ·· , . immobilisoitu tähän substraattiin, ja että tämä leimattu nukleiinihappoanalogi • 1 1 ··· · hybridisoituu kohdenukleiinihapon toiseen alueeseen. ·· · • · · • ♦ • · :1♦1· 35. In vitro menetelmä yhden juosteen syrjäyttämiseksi kaksinkertaisesta ♦ nukleiinihaposta, tunnettu siitä, että tähän kaksinkertaiseen nukleiinihappoon . , hybridisoidaan sellainen patenttivaatimuksen 3 nukleiinihappoanalogi, jolla on • · · ··· 5 tämän kaksinkertaisen nukleiinihapon toisen juosteen suhteen riittävää • ·· affiniteettia kyetäkseen syrjäyttämään siitä yhden juosteen. 9 • · · • ·· * 1 36. In vitro menetelmä kaksijuosteisen kohdenukleiinihapon havaitsemiseksi, * 1 tunnistamiseksi tai määrittämiseksi, tunnettu siitä, että siihen hybridisoidaan .V. sellainen patenttivaatimuksen 3 syrjäyttävä nukleiinihappoanalogi, joka kykenee !.! syrjäyttämään yhden juosteen kaksijuosteisesta kohdenukleiinihaposta, jonka • · ··♦ 1 1 8424 124 toisella juosteella on tätä syrjäyttävää nukleiinihappoanalogia täydentävä vastinsekvenssi, jolloin syrjäyttävä nukleiinihappoanalogi käsittää kaksijuosteisen kohdenukleiinihapon toista juostetta riittävästi täydentävän vastinsekvenssin hybridisoituakseen siihen siten, että kohdenukleiinihapon mainittu yksi juoste syrjäytyy siitä yksijuosteisessa muodossa, minkä jälkeen tämän yhden syrjäytyneen juosteen läsnäolo havaitaan tai määritetään.
37. Patenttivaatimuksen 36 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syrjäytetty juoste pilkotaan kappaleiksi, joiden läsnäolo havaitaan.
38. Patenttivaatimuksen 37 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syrjäytetty juoste pilkotaan käsittelemällä sitä nukleaasilla.
39. Oligonukleotidihappoanalogin käyttö spesifisen nukleiinihapon in vitro havaitsemiseen tai eristämiseen, tunnettu siitä, että oligonukleotidianalogi sitoutuu voimakkaammin sen vastin-ssDNA- tai -RNA-juosteisiin kuin vastaaviin DNA:hän tai RNA:hän vastaavasti.
40. Diagnostisissa toimenpiteissä käyttökelpoinen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää vähintään yhden, patenttivaatimuksen 1-11 mukaisen leimatun nukleiinihappoanalogin sekä vähintään yhden havaittavissa olevan reagenssin tämän leimatun nukleiinihappoanalogin havaitsemiseksi.
41. Patenttivaatimuksen 40 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi jonkin patenttivaatimuksen 12-20 mukaisen • · • · * nukleiinihappoanalogin, joka on immobilisoitu kiinteään kantajaan. mm * • * • « ··* • · 42. Reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 30 / / mukaisen immobilisoidun nukleiinihappoanalogin yhdistettynä vähintään yhteen mmm ί·ί S nukleiinihapon tunnistavaan aineeseen nukleiinihappoanalogia käyttäen vangitun ·· · • * : nukleiinihapon läsnäolon havaitsemiseksi. *·· * * ♦ ♦ · ·
43. Patenttivaatimuksen 42 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että . 9 nukleiinihapon tunnistava aine on leimattu nukleiinihappo tai leimattu J · · •·ί * nukleiinihappoanalogi. ··· • · • · ··* • « • m m • mm • m m m m m m m • ♦ · • · • m mmm • m m m mmm 125 118424
FI935208A 1991-05-24 1993-11-23 Nukleiinihappoanalogit ja niiden käyttö diagnostisissa ja analyyttisissä toimenpiteissä FI118424B (fi)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK98691A DK98691D0 (da) 1991-05-24 1991-05-24 Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
DK98791A DK98791D0 (da) 1991-05-24 1991-05-24 Fremgangsmaade til sekvensspecifik genkendelse af et dobbeltstrenget polynucleotid
DK98691 1991-05-24
DK98791 1991-05-24
DK92510A DK51092D0 (da) 1991-05-24 1992-04-15 Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
DK51092 1992-04-15
PCT/EP1992/001220 WO1992020703A1 (en) 1991-05-24 1992-05-22 The use of nucleic acid analogues in diagnostics and analytical procedures
EP9201220 1992-05-22

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI935208A0 FI935208A0 (fi) 1993-11-23
FI935208A FI935208A (fi) 1993-11-23
FI118424B true FI118424B (fi) 2007-11-15

Family

ID=27220741

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI935208A FI118424B (fi) 1991-05-24 1993-11-23 Nukleiinihappoanalogit ja niiden käyttö diagnostisissa ja analyyttisissä toimenpiteissä

Country Status (16)

Country Link
US (11) US6395474B1 (fi)
EP (5) EP0586618B1 (fi)
JP (6) JP2758988B2 (fi)
KR (1) KR0133131B1 (fi)
AT (3) ATE155483T1 (fi)
AU (2) AU666480B2 (fi)
BR (1) BR9206049A (fi)
CA (2) CA2109805A1 (fi)
DE (2) DE69220946T2 (fi)
DK (3) DK51092D0 (fi)
ES (2) ES2164052T3 (fi)
FI (1) FI118424B (fi)
GR (1) GR3025018T3 (fi)
HU (1) HU221003B1 (fi)
NO (2) NO312516B1 (fi)
WO (2) WO1992020702A1 (fi)

Families Citing this family (359)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5852182A (en) * 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals Inc. Thiol-derivatized oligonucleosides
US5783682A (en) * 1990-07-27 1998-07-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide mimics having nitrogen-containing linkages
US5719262A (en) * 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5766855A (en) * 1991-05-24 1998-06-16 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity and sequence specificity
US6713602B1 (en) 1991-05-24 2004-03-30 Ole Buchardt Synthetic procedures for peptide nucleic acids
US6414112B1 (en) 1991-05-24 2002-07-02 Ole Buchardt Peptide nucleic acids having 2,6-diaminopurine nucleobases
US7223833B1 (en) 1991-05-24 2007-05-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid conjugates
DK51092D0 (da) * 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
US6228982B1 (en) * 1992-05-22 2001-05-08 Benget Norden Double-stranded peptide nucleic acids
US6441130B1 (en) 1991-05-24 2002-08-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Linked peptide nucleic acids
US5641625A (en) * 1992-05-22 1997-06-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cleaving double-stranded DNA with peptide nucleic acids
US6451968B1 (en) * 1991-05-24 2002-09-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acids
US5539082A (en) * 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) * 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
EP0616612A4 (en) 1991-12-12 1995-01-11 Gilead Sciences Inc NUCLEASE-STABLE OLIGOMERS SUITABLE FOR BINDING AND METHODS OF USE.
MX9207334A (es) * 1991-12-18 1993-08-01 Glaxo Inc Acidos nucleicos peptidicos y formulacion farma- ceutica que los contiene
ATE515510T1 (de) * 1991-12-24 2011-07-15 Isis Pharmaceuticals Inc Durch dna-abschnitte unterbrochene modifizierte oligonukleotide
US5700922A (en) * 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US6033884A (en) * 1992-03-20 2000-03-07 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporter systems and methods of use
US6770738B1 (en) 1992-05-22 2004-08-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Higher order structure and binding of peptide nucleic acids
GB9211979D0 (en) * 1992-06-05 1992-07-15 Buchard Ole Uses of nucleic acid analogues
US6350853B1 (en) 1993-04-26 2002-02-26 Peter E. Nielsen Conjugated peptide nucleic acids having enhanced cellular uptake
US7825215B1 (en) * 1993-04-26 2010-11-02 Peter E. Nielsen Substituted nucleic acid mimics
GB9311386D0 (en) * 1993-06-02 1993-07-21 Pna Diagnostics As Nucleic acid analogue assay procedures
AU7206794A (en) * 1993-06-11 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers for modulating ras oncogene
WO1995004748A1 (en) * 1993-08-09 1995-02-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers for modulating viral processes
US5527675A (en) * 1993-08-20 1996-06-18 Millipore Corporation Method for degradation and sequencing of polymers which sequentially eliminate terminal residues
DE4331011A1 (de) * 1993-09-13 1995-03-16 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit C-Verzweigung für Therapie und Diagnostik
DE4331012A1 (de) * 1993-09-13 1995-03-16 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit N-Verzweigung für Therapie und Diagnostik
EP0720615B1 (en) * 1993-09-21 2000-07-26 Amersham Pharmacia Biotech UK Limited Elongation, amplification and sequence determination using a chimeric oligonucleotide
US6710164B1 (en) * 1993-11-22 2004-03-23 Peter E. Nielsen Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
GB2284209A (en) 1993-11-25 1995-05-31 Ole Buchardt Nucleic acid analogue-induced transcription of RNA from a double-stranded DNA template
GB2284208A (en) * 1993-11-25 1995-05-31 Pna Diagnostics As Nucleic acid analogues with a chelating functionality for metal ions
GB2285445A (en) * 1993-12-06 1995-07-12 Pna Diagnostics As Protecting nucleic acids and methods of analysis
GB2289677A (en) * 1993-12-06 1995-11-29 Pna Diagnostics As Labelling of nucleic acid analogue-peptide chimerae
JPH11503713A (ja) * 1993-12-22 1999-03-30 パーセプティブ・バイオシステムズ・インコーポレーテッド ペプチド核酸合成用のグアニンシントンと、その調製方法
US6133444A (en) 1993-12-22 2000-10-17 Perseptive Biosystems, Inc. Synthons for the synthesis and deprotection of peptide nucleic acids under mild conditions
DK145493D0 (da) * 1993-12-23 1993-12-23 Dako As Antistof
US5539083A (en) * 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
DE4408534A1 (de) * 1994-03-14 1995-09-28 Hoechst Ag Substituierte N-Ethyl-Glycinderivate zur Herstellung von PNA und PNA-/DNA-Hybriden
US6919441B2 (en) 1994-03-14 2005-07-19 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Polyamide-oligonucleotide derivatives, their preparation and use
DE4408528A1 (de) * 1994-03-14 1995-09-28 Hoechst Ag Peptid-Oligonucleotid-Derivate, deren Herstellung und Verwendung
DE4408533A1 (de) 1994-03-14 1995-09-28 Hoechst Ag PNA-Synthese unter Verwendung einer basenlabilen Amino-Schutzgruppe
DE4408531A1 (de) * 1994-03-14 1995-09-28 Hoechst Ag PNA-Synthese unter Verwendung einer gegen schwache Säuren labilen Amino-Schutzgruppe
AU2369895A (en) * 1994-04-29 1995-11-29 Perseptive Biosystems, Inc. Activated esters of 1-phenylpyrazolin-5-one for labelling amine-functionalized molecules
EP0760008A1 (en) 1994-05-19 1997-03-05 Dako A/S Pna probes for detection of neisseria gonorrhoeae and chlamydia trachomatis
US5629152A (en) * 1994-08-01 1997-05-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Trisubstituted β-lactams and oligo β-lactamamides
DE4427980A1 (de) * 1994-08-08 1996-02-15 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere für Therapie und Diagnostik
US6558633B1 (en) 1994-09-21 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chemical reaction apparatus and methods
PT804456E (pt) * 1994-10-06 2003-01-31 Peter Eigil Nielsen Conjugados de acidos nucleicos dos peptidos
US5629178A (en) * 1994-10-28 1997-05-13 Genetics & Ivf Institute Method for enhancing amplification in the polymerase chain reaction employing peptide nucleic acid (PNA)
UA48150C2 (uk) * 1994-11-02 2002-08-15 Ай-Сі-Ен Фармасьютикалз Похідні амінокислот або аміноспиртів, олігонуклеотид
WO1996015143A1 (en) * 1994-11-14 1996-05-23 Chiron Corporation SYNTHESIS OF PEPTIDE NUCLEIC ACIDS (PNAs) AND ANALOGUES VIA SUBMONOMER APPROACH
CA2207629A1 (en) * 1994-12-22 1996-06-27 Abbott Laboratories Methods of immobilizing oligonucleotides to solid support materials and methods of using support bound oligonucleotides
ES2157426T3 (es) * 1995-03-04 2001-08-16 Pna Diagnostics As Modulacion de las propiedades de union de coparticipes de union de un acido nucleico.
US6475721B2 (en) * 1995-03-04 2002-11-05 Boston Probes, Inc. Sequence specific detection of nucleic acids using a solid carrier bound with nucleic acid analog probes
US6465650B1 (en) 1995-03-13 2002-10-15 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Substituted N-ethylglycine derivatives for preparing PNA and PNA/DNA hybrids
JP2001518054A (ja) 1995-06-07 2001-10-09 パーセプティブ バイオシステムズ，インコーポレーテッド Ｐｎａ−ｄｎａキメラと、このキメラ合成用のｐｎａシントン
JPH11507352A (ja) 1995-06-07 1999-06-29 ジンタ・インコーポレイテッド 新規カルバメート基本カチオン性脂質
AU4327296A (en) * 1995-06-22 1996-05-15 Dako A/S Recombinant antibody capable of binding to pna/nucleic acid complexes
EP0840751A1 (en) * 1995-06-22 1998-05-13 Dako A/S Monoclonal antibody capable of binding to pna/nucleic acid complexes
GB9519299D0 (en) * 1995-09-21 1995-11-22 Farrar Gwyneth J Genetic strategy
JPH11512617A (ja) * 1995-10-06 1999-11-02 パーセプテイブ・バイオシステムズ・インコーポレイテツド ペプチド核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション分析のための方法、装置及びキット
EP1477572A3 (en) * 1995-10-06 2006-02-15 Perseptive Biosystems, Inc. Methods and kit for hybridization analysis using peptide nucleic acid probes
ATE362546T1 (de) 1995-10-12 2007-06-15 Lansdorp Peter M Verfahren zum nachweis von mehrfachkopien einer wiederholungssequenz in einem nukleinsäuremolekül
US6001966A (en) * 1995-10-19 1999-12-14 Proligo Llc Method for solution phase synthesis of oligonucleotides and peptides
US5874532A (en) * 1997-01-08 1999-02-23 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for solution phase synthesis of oligonucleotides and peptides
AU7016096A (en) * 1995-10-20 1997-05-07 Trustees Of Boston University Nucleic acid clamps
AU7210196A (en) * 1995-11-16 1997-06-05 Dako A/S In situ hybridization to detect specific nucleic acid sequences in eucaryotic samples
US5888733A (en) * 1995-11-16 1999-03-30 Dako A/S In situ hybridization to detect specific nucleic acid sequences in eucaryotic samples
CA2190430A1 (en) * 1995-12-12 1997-06-13 Margret Barbara Basinski Method for measuring genetic messages
US6180767B1 (en) 1996-01-11 2001-01-30 Thomas Jefferson University Peptide nucleic acid conjugates
US20030069195A1 (en) * 1996-03-01 2003-04-10 Farrar Gwenyth Jane Suppression of polymorphic alleles
US6020126A (en) * 1996-03-21 2000-02-01 Hsc, Reasearch And Development Limited Partnership Rapid genetic screening method
AU2542097A (en) * 1996-03-26 1997-10-17 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide treatments and compositions for human melanoma
GB9606961D0 (en) 1996-04-02 1996-06-05 Farrar Gwyneth J Genetic strategy III
US8551970B2 (en) * 1996-04-02 2013-10-08 Optigen Patents Limited Genetic suppression and replacement
US20040234999A1 (en) * 1996-04-02 2004-11-25 Farrar Gwenyth Jane Genetic suppression and replacement
GB9608803D0 (en) * 1996-04-27 1996-07-03 Univ Newcastle Mitochondrial dna defects
SE506700C2 (sv) * 1996-05-31 1998-02-02 Mikael Kubista Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra
US20040266706A1 (en) * 2002-11-05 2004-12-30 Muthiah Manoharan Cross-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US9096636B2 (en) * 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20050032068A1 (en) * 2002-11-05 2005-02-10 Prakash Thazha P. Sugar and backbone-surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US20040171030A1 (en) * 1996-06-06 2004-09-02 Baker Brenda F. Oligomeric compounds having modified bases for binding to cytosine and uracil or thymine and their use in gene modulation
US7812149B2 (en) 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US20050042647A1 (en) * 1996-06-06 2005-02-24 Baker Brenda F. Phosphorous-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US20050118605A9 (en) * 1996-06-06 2005-06-02 Baker Brenda F. Oligomeric compounds having modified bases for binding to adenine and guanine and their use in gene modulation
ATE311402T1 (de) * 1996-07-24 2005-12-15 Buchardt Dorte Peptidnukleinsäuren mit erhöhter bindungsaffinität, sequenzspezifität und löslichkeit
US5858683A (en) * 1996-08-30 1999-01-12 Matritech, Inc. Methods and compositions for the detection of cervical cancer
DE19637339A1 (de) * 1996-09-13 1998-03-19 Hoechst Ag Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren
US5919638A (en) * 1996-10-08 1999-07-06 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting prostate tumors
US5908845A (en) * 1996-10-30 1999-06-01 Segev; David Polyether nucleic acids
US20050202499A1 (en) 1996-10-31 2005-09-15 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US6444202B1 (en) 1996-11-25 2002-09-03 Bundesrepublic Deutschland, Vertreten Durch Den Bundesminister Fur Gesundheit Processed polypeptides with IL-16 activity, processes for their production and their use
AU6822598A (en) * 1997-02-24 1998-09-09 Georgia Tech Research Corporation Method for determining a nucleic acid
US6117973A (en) 1997-02-24 2000-09-12 Georgia Tech Research Corp. PNA monomers with electron donor or acceptor
US5932711A (en) * 1997-03-05 1999-08-03 Mosaic Technologies, Inc. Nucleic acid-containing polymerizable complex
US6692912B1 (en) * 1997-03-05 2004-02-17 Matrix Technologies Corporation Nucleic acid-containing polymerizable complex
US6015887A (en) * 1997-04-11 2000-01-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chiral peptide nucleic acids and methods for preparing same
SE522077C2 (sv) * 1997-09-05 2004-01-13 Lightup Technologies Ab Förfarande att välja sekvens hos sond för nukleinsyrahybridisering
US6617422B1 (en) 1997-05-23 2003-09-09 Peter Nielsen Peptide nucleic acid monomers and oligomers
JP2001501975A (ja) * 1997-05-28 2001-02-13 ペーター・エー・ニールセン 亢進した細胞取り込みを有する結合ペプチド核酸
ATE301669T1 (de) * 1997-05-30 2005-08-15 Pna Diagnostics As 2- oder 3-dimensionale geometrische struktur aus peptidnukleinsäuren
WO1998058256A1 (en) * 1997-06-16 1998-12-23 The University Of North Carolina At Chapel Hill PEPTIDO OLIGONUCLEOTIDES (PONs) AND THEIR COMBINATORIAL LIBRARIES
US5962665A (en) 1997-06-16 1999-10-05 Abbott Laboratories Nucleic acid primers and probes for detecting HIV-1 and HIV-2
JPH11332595A (ja) * 1997-07-09 1999-12-07 Masao Karube プローブｐｎａによるｄｎａの検出方法
EP0897991B1 (en) * 1997-08-22 2004-12-08 PNA Diagnostics ApS Small Triplex Forming PNA Oligos
US6300318B1 (en) 1997-09-16 2001-10-09 Peter E. Nielsen Antibacterial and antibiotic methods using peptide nucleic acids and pharmaceutical compositions therefor
DE19741739B4 (de) * 1997-09-22 2006-04-27 Nanogen Recognomics Gmbh Supramolekulares Paarungssystem, dessen Herstellung und Verwendung
US6989270B1 (en) 1997-10-17 2006-01-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Using polyamide nucleic acid oligomers to engender a biological response
US6723560B2 (en) 1998-10-08 2004-04-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Using polyamide nucleic acid oligomers to engender a biological response
US6007992A (en) * 1997-11-10 1999-12-28 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US6028183A (en) 1997-11-07 2000-02-22 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives and oligonucleotides containing same
DE19816550A1 (de) 1997-12-24 1999-06-24 Roche Diagnostics Gmbh Universell verwendbarer Aufbau eines Analysenelements und dessen Einsatz zur Analytbestimmung
US6030997A (en) * 1998-01-21 2000-02-29 Eilat; Eran Acid labile prodrugs
US6326479B1 (en) * 1998-01-27 2001-12-04 Boston Probes, Inc. Synthetic polymers and methods, kits or compositions for modulating the solubility of same
US6361942B1 (en) * 1998-03-24 2002-03-26 Boston Probes, Inc. Method, kits and compositions pertaining to detection complexes
US20040063618A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Muthiah Manoharan Peptide nucleic acids having improved uptake and tissue distribution
US20040186071A1 (en) * 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
DE19824900B4 (de) 1998-06-04 2006-05-04 Roche Diagnostics Gmbh DNA-Nachweis über einen Strangreassoziationskomplex
US6664045B1 (en) * 1998-06-18 2003-12-16 Boston Probes, Inc. PNA probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection of microorganisms
EP1095054B1 (en) 1998-07-09 2006-10-25 Biocept, Inc. Method of using an improved peptide nucleic acid universal library to optimize dna sequence hybridation
US6548651B1 (en) * 1998-11-11 2003-04-15 Pantheco A/S Modified peptide nucleic acid (PNA) molecules
KR20020007332A (ko) * 1999-03-18 2002-01-26 추후제출 일 단계 샘플 제조 및 복합적인 생물학적 샘플에서 핵산의검출
US20020049173A1 (en) * 1999-03-26 2002-04-25 Bennett C. Frank Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
US6824866B1 (en) 1999-04-08 2004-11-30 Affymetrix, Inc. Porous silica substrates for polymer synthesis and assays
DE19927783A1 (de) 1999-06-18 2000-12-21 Roche Diagnostics Gmbh Element zur Bestimmung eines Analyts in einer Flüssigkeit, entsprechendes Bestimmungsverfahren unter Verwendung des Elementes sowie Kit zur Bestimmugn eines Analyts
AU6629200A (en) * 1999-08-25 2001-03-19 Philip P Garner Alpha-helical peptide nucleic acid alpha-pna
US6348583B1 (en) * 1999-08-30 2002-02-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Poly(ether-thioether), poly(ether-sulfoxide) and poly(ether-sulfone) nucleic acids
US7169553B1 (en) 1999-08-30 2007-01-30 Roche Diagnostics, Gmbh 2-Azapurine compounds and their use
CA2317179A1 (en) 1999-09-01 2001-03-01 Affymetrix, Inc. Macromolecular arrays on polymeric brushes and methods for preparing the same
US6660845B1 (en) 1999-11-23 2003-12-09 Epoch Biosciences, Inc. Non-aggregating, non-quenching oligomers comprising nucleotide analogues; methods of synthesis and use thereof
ATE406914T1 (de) 2000-02-10 2008-09-15 Massachusetts Eye & Ear Infirm Photodynamische therapie zur behandlung von augenerkrankungen
EP1263773A4 (en) * 2000-03-14 2005-08-31 Active Motif OLIGONUCLEOTIDE ANALOGUES, METHODS OF SYNTHESIS AND METHODS OF IMPLEMENTATION
US6962906B2 (en) 2000-03-14 2005-11-08 Active Motif Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use
US20040014644A1 (en) * 2000-03-14 2004-01-22 Vladimir Efimov Oligonucleotide analogues and methods of use for modulating gene expression
AU2001256976A1 (en) 2000-04-03 2001-10-15 Cytyc Corporation Detection and typing of human papillomavirus using pna probes
US6936443B2 (en) 2000-04-03 2005-08-30 Cytyc Corporation Detection and typing of human papillomavirus using PNA probes
US7211381B1 (en) 2000-04-04 2007-05-01 Abbott Laboratories β2 andrenergic polymorphism detection
US6593092B2 (en) 2000-04-04 2003-07-15 Abbott Laboratories Beta 2 adrenergic polymorphism detection
DE10019135A1 (de) 2000-04-18 2001-10-31 Aventis Pharma Gmbh Polyamidnukleinsäure-Derivate, Mittel und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE10019136A1 (de) * 2000-04-18 2001-10-31 Aventis Pharma Gmbh Polyamidnukleinsäure-Derivate, Mittel und Verfahren zu ihrer Herstellung
US6887664B2 (en) 2000-06-06 2005-05-03 Applera Corporation Asynchronous primed PCR
WO2002012263A1 (en) 2000-08-03 2002-02-14 Roche Diagnostics Gmbh Nucleic acid binding compounds containing pyrazolo[3,4-d]pyrimidine analogues of purin-2,6-diamine and their uses
US20030114410A1 (en) 2000-08-08 2003-06-19 Technion Research And Development Foundation Ltd. Pharmaceutical compositions and methods useful for modulating angiogenesis and inhibiting metastasis and tumor fibrosis
PT2078531E (pt) 2000-08-08 2012-08-06 Technion Res & Dev Foundation Composições farmacêuticas e métodos úteis para modular a angiogénese
US7183394B1 (en) * 2000-08-11 2007-02-27 Garner Philip P Helical nucleopeptides
ATE544473T1 (de) * 2000-11-09 2012-02-15 Cold Spring Harbor Lab Chimäre moleküle zur modulation der genexpression
WO2002051797A1 (fr) * 2000-12-26 2002-07-04 Applied Biosystems Japan Ltd Nouveau monomere d'acide nucleique peptidique fonctionnel et procede de production correspondant
CA2436665C (en) 2001-01-29 2012-01-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid derivatives
GB0102388D0 (en) * 2001-01-31 2001-03-14 Secr Defence Polymers
EP1236804A1 (en) 2001-03-02 2002-09-04 Boehringer Mannheim Gmbh A method for determination of a nucleic acid using a control
DE60239020D1 (de) 2001-03-09 2011-03-03 Boston Probes Inc Kombinationsoligomere betreffende Verfahren, Kits und Zusammensetzungen
MXPA03009415A (es) 2001-04-16 2004-01-29 Wyeth Corp ESTRUCTURAS NOVEDOSAS DE LECTURA ABIERTA DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE QUE CODIFICAN ANTIGENOS DE POLIPePTIDOS Y USOS DE LAS MISMAS.
US8026051B2 (en) 2001-05-18 2011-09-27 Boston Probes, Inc. PNA probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection of Candida
US20030207804A1 (en) * 2001-05-25 2003-11-06 Muthiah Manoharan Modified peptide nucleic acids
US7053195B1 (en) 2001-06-12 2006-05-30 Syngenta Participatious Ag Locked nucleic acid containing heteropolymers and related methods
EP1925672A1 (en) 2001-06-22 2008-05-28 Syngeta Participations AG Abiotic stress responsive polynucleotides and polypeptides
US6921812B1 (en) 2001-07-03 2005-07-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of modulating pharmacokinetics of oligonucleotides
US6852491B2 (en) 2001-09-04 2005-02-08 Abbott Laboratories Amplification and detection reagents for HIV-1
EP1432826B1 (en) 2001-09-24 2012-12-12 Life Technologies Corporation Methods, kits and compositions pertaining to the suppression of detectable probe binding to randomly distributed repeat sequences in genomic nucleic acid
WO2003040395A2 (en) 2001-11-07 2003-05-15 Applera Corporation Universal nucleotides for nucleic acid analysis
US20050118589A1 (en) 2001-11-21 2005-06-02 Vann Charles S. Digital array
KR100464261B1 (ko) 2002-01-24 2005-01-03 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
US20040063109A2 (en) 2002-01-25 2004-04-01 Applera Corporation Single-tube, ready-to-use assay kits, and methods using same
US8017758B2 (en) * 2002-03-21 2011-09-13 Boston Probes, Inc. PNA oligomers, oligomer sets, methods and kits pertaining to the detection of Bacillus anthracis
US20030211509A1 (en) * 2002-03-26 2003-11-13 Wiley Steven R. TNF-delta ligand and uses thereof
US7052840B2 (en) 2002-04-03 2006-05-30 Capitol Genomix, Inc. Reversible association of nucleic acid with a carboxylated substrate
US7026120B2 (en) 2002-04-15 2006-04-11 Abbott Laboratories Probes for detecting tumor cells
KR20030084444A (ko) 2002-04-26 2003-11-01 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
US7015317B2 (en) 2002-05-02 2006-03-21 Abbott Laboratories Polynucleotides for the detection and quantification of hepatitis B virus nucleic acids
WO2003100076A2 (en) * 2002-05-17 2003-12-04 Applera Corporation Pna probes, probe sets, method and kits pertaining to the determination of listeria
US20030220844A1 (en) * 2002-05-24 2003-11-27 Marnellos Georgios E. Method and system for purchasing genetic data
EP1575990B1 (en) 2002-09-08 2009-11-18 Applera Corporation Solid phase bound PNA-dimers and their synthesis
EP1572978A4 (en) * 2002-10-16 2006-05-24 Univ Texas COMBINATORIAL BANKS OF APTAMERS WITH OLIGONUCLEOTIDE OLIGONUCLEOTIDE PHOSPHOROTHIOATE AND PHOSPHORODITHIOATE GROUPS RELATED TO BALLS
US20060183106A1 (en) * 2002-10-18 2006-08-17 Adam Siddiqui-Jain Processes for identifying quadruplex-targeted antiviral molecules
WO2004044139A2 (en) * 2002-11-05 2004-05-27 Isis Parmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
US9150605B2 (en) * 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation
AU2003291753B2 (en) * 2002-11-05 2010-07-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US9150606B2 (en) * 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
US7807802B2 (en) 2002-11-12 2010-10-05 Abbott Lab Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae
CN1849142A (zh) 2002-11-15 2006-10-18 埃迪尼克斯(开曼)有限公司 2′－支链核苷和黄病毒突变
AU2003294447A1 (en) * 2002-11-21 2004-06-18 Epicentre Technologies Preparation and use of single-stranded transcription substrates for synthesis of transcription products corresponding to target sequences
US20040259132A1 (en) * 2002-11-22 2004-12-23 Henrik Stender Peptide nucleic acid probes for analysis of pseudomonas (sensu stricto)
EP2112229A3 (en) 2002-11-25 2009-12-02 Sequenom, Inc. Methods for identifying risk of breast cancer and treatments thereof
US7736909B2 (en) 2003-01-09 2010-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising capture agents
ATE515702T1 (de) * 2003-01-30 2011-07-15 Life Technologies Corp Verfahren, mixturen, kits und zusammensetzungen bezüglich der analytbestimmung
US20040171149A1 (en) * 2003-02-11 2004-09-02 Wraight Christopher J. Modulation of insulin like growth factor I receptor expression
NZ541637A (en) * 2003-02-11 2008-07-31 Antisense Therapeutics Pty Ltd Modulation of insulin like growth factor I receptor
CN100532550C (zh) 2003-02-21 2009-08-26 卫材R&D管理有限公司 用于变异基因检测的信号扩增方法
WO2005017181A2 (en) * 2003-05-20 2005-02-24 Investigen, Inc. System for detecting polynucleotides
WO2005012546A2 (en) * 2003-07-25 2005-02-10 Andreas Braun Methods for isolating and identifying novel target-specific structuremers for use in the biological sciences
JPWO2005010181A1 (ja) * 2003-07-25 2007-09-27 株式会社クレディアジャパン 核酸検出方法
US20050063932A1 (en) * 2003-08-14 2005-03-24 Natalie Dilallo Skin care compositions including hexapeptide complexes and methods of their manufacture
US20060198800A1 (en) * 2003-08-14 2006-09-07 Natalie Dilallo Skin care compositions including hexapeptide complexes and methods of their manufacture
WO2005074417A2 (en) * 2003-09-03 2005-08-18 Salk Institute For Biological Studies Multiple antigen detection assays and reagents
US20050148087A1 (en) 2004-01-05 2005-07-07 Applera Corporation Isobarically labeled analytes and fragment ions derived therefrom
WO2005067646A2 (en) 2004-01-07 2005-07-28 Hitachi Chemical Research Center, Inc. Primers and probes for the detection of hiv
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
ATE399884T1 (de) 2004-03-24 2008-07-15 Applera Corp Codierungs- und decodierungsreaktionen zur bestimmung von target-polynukleotiden
ATE478158T1 (de) 2004-04-28 2010-09-15 Eisai R&D Man Co Ltd Hybridisierungsverfahren
WO2005111235A2 (en) * 2004-05-04 2005-11-24 Dak Denmark A/S Methods for detecting chromosome aberrations
AU2005252662B2 (en) * 2004-06-03 2011-08-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
WO2006085964A2 (en) 2004-06-30 2006-08-17 Applera Corporation Log-linear amplification
US7884086B2 (en) 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
US7306785B2 (en) * 2004-09-23 2007-12-11 General Electric Company Multifunctional cross-bridged tetraaza macrocyclic compounds and methods of making and using
US20060223084A1 (en) * 2004-12-06 2006-10-05 Bioveris Corporation Methods and compositions for detecting Bacillus anthracis
BRPI0515777A (pt) * 2004-12-11 2008-08-05 Cytogenix Inc biossìntese isenta de células de ácido nucléico de alta qualidade e usos dos mesmos
EP2813581B1 (en) 2005-01-06 2018-06-27 Applied Biosystems, LLC Use of polypeptides having nucleic acid binding activity in methods for fast nucleic acid amplification
US7229769B2 (en) * 2005-03-25 2007-06-12 Illumina, Inc. Compositions and methods for detecting protease activity
WO2006110314A2 (en) 2005-03-25 2006-10-19 Ambion, Inc. Methods and compositions for depleting abundant rna transcripts
DK2236616T3 (da) 2005-06-02 2014-01-13 Advandx Inc Peptid-nukleinsyreprober til analyse af mikroorganismer
CA2919210C (en) 2005-06-07 2019-03-05 Luminex Corporation Methods for detection and typing of nucleic acids
WO2007015168A2 (en) * 2005-07-01 2007-02-08 Dako Denmark A/S Monomeric and polymeric linkers useful for conjugating biological molecules and other substances
US20070059713A1 (en) 2005-09-09 2007-03-15 Lee Jun E SSB-DNA polymerase fusion proteins
US20090291437A1 (en) * 2005-11-02 2009-11-26 O'brien Sean Methods for targeting quadruplex sequences
WO2007073149A1 (en) 2005-12-22 2007-06-28 Keygene N.V. Alternative nucleotides for improved targeted nucleotide exchange
EP2010677A4 (en) * 2006-02-24 2010-04-14 Investigen Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTION OF POLYNUCLEOTIDES
WO2007108378A1 (ja) 2006-03-15 2007-09-27 Eisai R & D Management Co., Ltd. シグナルプローブポリマーの形成方法
CA2651815A1 (en) 2006-05-10 2007-11-22 Dxterity Diagnostics Detection of nucleic acid targets using chemically reactive oligonucleotide probes
US20100196336A1 (en) 2006-05-23 2010-08-05 Dongsu Park Modified dendritic cells having enhanced survival and immunogenicity and related compositions and methods
US20080050752A1 (en) 2006-06-30 2008-02-28 Applera Corporation Methods of analyzing binding interactions
AU2007281535A1 (en) 2006-08-01 2008-02-07 Applied Biosystems, Llc. Detection of analytes and nucleic acids
US20080096193A1 (en) * 2006-10-24 2008-04-24 Charles Robert Bupp Methods and compositions for detecting polynucleotides
US20080131880A1 (en) * 2006-11-22 2008-06-05 Bortolin Laura T PNA-DNA oligomers and methods of use thereof
US8324359B1 (en) 2006-12-04 2012-12-04 Luminex Corporation Oxocarbonamide peptide nucleic acids and methods of using same
EP2857526B1 (en) 2006-12-13 2016-08-17 Luminex Corporation Systems and methods for multiplex analysis of PCR in real time
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
AU2007339793A1 (en) * 2006-12-29 2008-07-10 Applied Biosystems, Llc Systems and methods for detecting nucleic acids
US20080241838A1 (en) * 2006-12-29 2008-10-02 Applera Corporation, Applied Biosystems Group Methods and systems for detecting nucleic acids
US7803543B2 (en) 2007-01-19 2010-09-28 Chang Gung University Methods and kits for the detection of nucleotide mutations using peptide nucleic acid as both PCR clamp and sensor probe
WO2008103702A2 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 Investigen, Inc. Methods and compositions for rapid light-activated isolation and detection of analytes
US9260476B2 (en) 2007-02-23 2016-02-16 The Research Foundation For The State University Of New York RNA targeting compounds and methods for making and using same
US9150612B2 (en) * 2007-02-23 2015-10-06 The Research Foundation Of State University Of New York RNA targeting compounds and methods for making and using same
EP2514838B1 (en) 2007-04-13 2017-12-06 Abbott Molecular Inc. Primer and probe sequences for detecting chlamydia trachomatis
US8097422B2 (en) 2007-06-20 2012-01-17 Salk Institute For Biological Studies Kir channel modulators
EP3023436A1 (en) 2007-07-03 2016-05-25 Dako Denmark A/S Improved methods for generation, labeling and use of mhc multimers
IL184627A0 (en) 2007-07-15 2008-12-29 Technion Res & Dev Foundation Agents for diagnosing and modulating metastasis and fibrosis as well as inflammation in a mammalian tissue
JP5659014B2 (ja) 2007-08-02 2015-01-28 ジリード バイオロジクス，インク． 線維症、腫瘍浸潤、血管新生及び転移の治療及び診断のための方法及び組成物
EP2202319A4 (en) 2007-10-24 2010-10-20 Eisai R&D Man Co Ltd NUCLEIC ACID PROBE AND PROCESS FOR PRODUCING POLYMER FOR PROBE
EP2213751A1 (en) 2007-10-31 2010-08-04 Eisai R&D Management Co., Ltd. Polymer for detection of target substance, and method for detection of target substance
ES2641290T3 (es) 2007-11-20 2017-11-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc Modulación de la expresión de CD40
US8017338B2 (en) 2007-11-20 2011-09-13 Life Technologies Corporation Reversible di-nucleotide terminator sequencing
CA2711499C (en) 2008-01-10 2018-09-25 Research Development Foundation Vaccines and diagnostics for the ehrlichioses
EP3699291A1 (en) 2008-01-17 2020-08-26 Sequenom, Inc. Single molecule nucleic acid sequence analysis processes and compositions
KR101072899B1 (ko) * 2008-01-21 2011-10-17 주식회사 파나진 아미노산 스페이서가 결합된 펩티드 핵산의 합성 및 그의응용
EP2271772B1 (en) 2008-03-11 2014-07-16 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
KR20090098710A (ko) 2008-03-14 2009-09-17 주식회사 씨티아이바이오 세포투과성과 핵산 결합력이 좋은 펩타이드 핵산 유도체
EP3733871A1 (en) 2008-05-27 2020-11-04 Dako Denmark A/S Compositions and methods for detection of chromosomal aberrations with novel hybridization buffers
CA2726850C (en) 2008-06-13 2015-06-02 Codexis, Inc. Method of synthesizing polynucleotide variants
US20090312196A1 (en) 2008-06-13 2009-12-17 Codexis, Inc. Method of synthesizing polynucleotide variants
KR20110059743A (ko) 2008-09-03 2011-06-03 난양 테크놀러지컬 유니버시티 펩티드 핵산 단량체 및 올리고머
US8962247B2 (en) 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US10138485B2 (en) 2008-09-22 2018-11-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Neutral nanotransporters
US9290556B2 (en) 2008-09-29 2016-03-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tumor vascular marker-targeted vaccines
ES2794401T3 (es) 2008-10-15 2020-11-18 Axolabs Gmbh Método de detección de oligonucleótidos
CA2743057C (en) 2008-11-07 2019-11-26 Research Development Foundation Compositions and methods for the inhibition of cripto/grp78 complex formation and signaling
US8715732B2 (en) * 2009-01-05 2014-05-06 Cornell University Nucleic acid hydrogel via rolling circle amplification
US9107935B2 (en) 2009-01-06 2015-08-18 Gilead Biologics, Inc. Chemotherapeutic methods and compositions
WO2010087994A2 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
US9745574B2 (en) 2009-02-04 2017-08-29 Rxi Pharmaceuticals Corporation RNA duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
US7964355B2 (en) 2009-02-17 2011-06-21 Investigen, Inc. Assays based on detection of photobleaching reaction products from dye catalytic complex
WO2010097655A1 (en) 2009-02-26 2010-09-02 Dako Denmark A/S Compositions and methods for rna hybridization applications
US8063193B2 (en) 2009-03-27 2011-11-22 Abbott Laboratories Nucleotide and amino acid sequences encoding an exported protein 1 derived from Plasmodium vivax and uses thereof
WO2010114599A1 (en) 2009-04-01 2010-10-07 Dx Terity Diagnostics Inc. Chemical ligation dependent probe amplification (clpa)
WO2010118243A2 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Genentech, Inc. Use of il-27 antagonists to treat lupus
AU2010256880B2 (en) 2009-06-02 2015-01-22 Opko Health, Inc. Identification of small molecules recognized by antibodies in subjects with neurodegenerative diseases
JP5785942B2 (ja) 2009-06-29 2015-09-30 ルミネックス コーポレーション ヘアピンコンフォメーションを有するキメラプライマーおよびその使用法
WO2011011630A2 (en) 2009-07-23 2011-01-27 Codexis, Inc. Nitrilase biocatalysts
EP2462230B1 (en) * 2009-08-03 2015-07-15 Recombinetics, Inc. Methods and compositions for targeted gene modification
SG2014004816A (en) 2009-08-21 2014-03-28 Gilead Biologics Inc Catalytic domains from lysyl oxidase and loxl2
WO2011047257A1 (en) 2009-10-16 2011-04-21 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for producing cyclic peptoid libraries
CA2781907C (en) 2009-12-02 2019-07-16 Dako Denmark A/S Compositions and methods for performing hybridizations with no denaturation
WO2011087760A2 (en) 2009-12-22 2011-07-21 Sequenom, Inc. Processes and kits for identifying aneuploidy
US9404160B2 (en) 2009-12-22 2016-08-02 Becton, Dickinson And Company Methods for the detection of microorganisms
RU2615143C2 (ru) 2010-03-24 2017-04-04 Адвирна Самодоставляющие PHKi соединения уменьшенного размера
WO2011133931A1 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Genentech, Inc. Use of il-27 antagonists for treating inflammatory bowel disease
MX2017015093A (es) 2011-01-11 2023-03-10 Seegene Inc Detección de secuencias de ácido nucleico objetivo mediante ensayo de escisión y extensión del pto.
WO2012134195A2 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension-dependent cleavage
WO2012138955A2 (en) 2011-04-08 2012-10-11 Ly Danith H CONFORMATIONALLY-PREORGANIZED, MiniPEG-CONTAINING GAMMA-PEPTIDE NUCLEIC ACIDS
EP3378954B1 (en) 2011-04-29 2021-02-17 Sequenom, Inc. Quantification of a minority nucleic acid species
WO2012150749A1 (en) 2011-05-04 2012-11-08 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences by po cleavage and hybridization
EP2710145B1 (en) 2011-05-17 2015-12-09 Dxterity Diagnostics Incorporated Methods and compositions for detecting target nucleic acids
US10662465B2 (en) 2011-09-30 2020-05-26 Agilent Technologies, Inc. Hybridization compositions and methods using formamide
GB201117482D0 (en) 2011-10-11 2011-11-23 Univ Dundee Targetiing of miRNA precursors
EP2768974B1 (en) 2011-10-21 2017-07-19 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods
EP2594942A1 (en) 2011-11-16 2013-05-22 Koninklijke Philips Electronics N.V. Long rigid spacers to enhance binding kinetics in immunoassays
EP2789688A4 (en) 2011-12-09 2015-07-15 Eisai R&D Man Co Ltd METHOD FOR DETECTING NUCLEOTIDE MUTATION AND DETECTION KIT
EP4155401A1 (en) 2012-03-02 2023-03-29 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
AU2013228226B2 (en) 2012-03-05 2016-06-02 Seegene, Inc. Detection of nucleotide variation on target nucleic acid sequence by PTO cleavage and extension assay
WO2013172305A1 (ja) 2012-05-15 2013-11-21 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 Ｒｎａの検出方法及び検出用キット
US9359616B2 (en) 2012-05-21 2016-06-07 The Scripps Research Institute Ribosomal polynucleotides and related expression systems
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
US10077474B2 (en) 2012-05-29 2018-09-18 Abbott Molecular, Inc. Method of designing primers, method of detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs), method of distinguishing SNPs, and related primers, detectable oligonucleotides, and kits
CA2878979C (en) 2012-07-13 2021-09-14 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
WO2014033314A1 (en) 2012-09-03 2014-03-06 Uab Bioseka Antisense oligonucleotide targeting bacterial glucosyltransferases
US10006909B2 (en) 2012-09-28 2018-06-26 Vibrant Holdings, Llc Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis
US10260089B2 (en) 2012-10-29 2019-04-16 The Research Foundation Of The State University Of New York Compositions and methods for recognition of RNA using triple helical peptide nucleic acids
WO2014093291A1 (en) 2012-12-10 2014-06-19 Advandx, Inc. Use of probes for mass spectrometric identification of microorganisms or cells and associated conditions of interest
EP2770065B1 (en) 2013-02-25 2017-12-13 Seegene, Inc. Detection of nucleotide variation on target nucleic acid sequence
US9289502B2 (en) 2013-03-08 2016-03-22 Emerald Therapeutics, Inc. Preparation of oligo conjugates
EP2971115B1 (en) 2013-03-13 2022-07-27 Seegene, Inc. Quantification of target nucleic acid using melting peak analysis
WO2014168711A1 (en) 2013-03-13 2014-10-16 Sequenom, Inc. Primers for dna methylation analysis
CA2901293A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Abbott Molecular Inc. Detection of bisulfite converted nucleotide sequences
WO2014152054A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays for mutation detection
US10221216B2 (en) 2013-04-11 2019-03-05 Carnegie Mellon University Template-directed γPNA synthesis process and γPNA targeting compounds
US10370415B2 (en) 2013-04-11 2019-08-06 Carnegie Mellon University Divalent nucleobase compounds and uses therefor
US9910041B2 (en) 2013-07-12 2018-03-06 Emd Millipore Corporation Method of determining virus removal from a sample containing a target protein using activated carbon
US20160244816A1 (en) 2013-07-15 2016-08-25 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension-dependent immobilized oligonucleotide hybridization
LT6214B (lt) 2013-10-07 2015-08-25 Uab "Bioseka" Priešprasminiai oligonukleotidai aterosklerozės ir kardiovaskulinių infekcijų prevencijai
KR20160068855A (ko) 2013-10-11 2016-06-15 제넨테크, 인크. Nsp4 억제제 및 사용 방법
WO2015057998A1 (en) 2013-10-16 2015-04-23 The University Of British Columbia Device for formulating particles at small volumes
US11447814B2 (en) 2013-10-18 2022-09-20 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence on solid phase by PTO cleavage and extension using HCTO assay
WO2015070050A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Baylor Research Institute Nuclear loclization of glp-1 stimulates myocardial regeneration and reverses heart failure
DK3099799T3 (da) 2014-01-28 2019-07-01 Dice Molecules Sv Llc Arrays af monolitter med bundne genkendelsesforbindelser
EP3117011B1 (en) 2014-03-13 2020-05-06 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10851407B2 (en) 2014-05-08 2020-12-01 Carnegie Mellon University Left-handed gamma-peptide nucleic acids, methods of synthesis and uses therefor
AU2015274660B2 (en) 2014-06-10 2020-07-16 Dxterity Diagnostics Incorporated Devices and methods for collecting and stabilizing biological samples
EP3161151A1 (en) 2014-06-24 2017-05-03 Abbott Molecular Inc. Detection of single nucleotide polymorphisms in human kras
RU2697502C2 (ru) 2014-07-24 2019-08-14 Эбботт Молекьюлар Инк. Композиции и способы обнаружения и анализа микобактерии туберкулеза (mycobacterium tuberculosis)
WO2016028887A1 (en) 2014-08-19 2016-02-25 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for enrichment of nucleic acids
EP3259346A4 (en) 2015-02-20 2018-07-11 Baylor College of Medicine P63 inactivation for the treatment of heart failure
JP7376977B2 (ja) 2015-06-12 2023-11-09 アレクトル エルエルシー 抗ｃｄ３３抗体及びその使用方法
EP3307779A2 (en) 2015-06-12 2018-04-18 Alector LLC Anti-cd33 antibodies and methods of use thereof
CN108184327A (zh) 2015-07-14 2018-06-19 雅培分子公司 用于鉴定耐药性结核的组合物和方法
CA2996059A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Alector Llc Anti-siglec-7 antibodies and methods of use thereof
CA2998886C (en) 2015-09-16 2023-05-16 PetaOmics, Inc. Methods and compositions for genomic target enrichment and selective dna sequencing
WO2017066643A1 (en) 2015-10-14 2017-04-20 Bio-Path Holding, Inc. P-ethoxy nucleic acids for liposomal formulation
KR20180084782A (ko) 2015-10-14 2018-07-25 엑스-써마 인코포레이티드 얼음 결정 형성을 감소시키기 위한 조성물 및 방법
JP7060502B2 (ja) 2015-10-29 2022-04-26 アレクトル エルエルシー 抗Ｓｉｇｌｅｃ－９抗体及びその使用方法
JP7349788B2 (ja) 2016-01-06 2023-09-25 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア 分岐ミキサー並びにその使用及び製造方法
EP3436049B1 (en) 2016-03-31 2022-01-12 Baylor Research Institute Angiopoietin-like protein 8 (angptl8)
US10400274B2 (en) 2016-06-18 2019-09-03 Jan Biotech, Inc. Fluorogenic probes and their use in quantitative detection of target RNA sequences
US10300145B2 (en) 2016-07-15 2019-05-28 Massachusetts Institute Of Technology Synthetic nanoparticles for delivery of immunomodulatory compounds
KR20190053905A (ko) 2016-09-16 2019-05-20 바이오-패쓰 홀딩스 인크. 리포솜 안티센스 올리고뉴클레오타이드와의 병용 요법
WO2018058091A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Carnegie Mellon University Divalent nucleobase compounds and uses therefor
US11147249B2 (en) 2016-12-08 2021-10-19 Alector Llc Siglec transgenic mice and methods of use thereof
US11359014B2 (en) 2017-05-16 2022-06-14 Alector Llc Anti-siglec-5 antibodies and methods of use thereof
WO2018218250A2 (en) 2017-05-26 2018-11-29 Vibrant Holdings, Llc Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing
CN117700548A (zh) 2017-08-03 2024-03-15 艾利妥 抗cd33抗体及其使用方法
WO2019045532A2 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Seegene, Inc. EVALUATION OF COMPONENT PERFORMANCE USING A PAIR OF DIMER FORMER PRIMERS
WO2019066461A2 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Seegene, Inc. DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCES BY CLEAVAGE ANALYSIS AND EXTENSION OF PTO
US11470827B2 (en) 2017-12-12 2022-10-18 Alector Llc Transgenic mice expressing human TREM proteins and methods of use thereof
EP3728206A4 (en) 2017-12-21 2021-11-24 Carnegie Mellon University COMPOUNDS TARGETING NUCLEIC ACID DIRECTED TO THE MATRIX
WO2020023920A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 Alector Llc Anti-siglec-5 antibodies and methods of use thereof
US20210308215A1 (en) 2018-09-21 2021-10-07 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating diabetes, and methods for enriching mrna coding for secreted proteins
WO2021005223A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of epilepsy
EP4061943A1 (en) 2019-11-19 2022-09-28 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of cancer
US20210381039A1 (en) 2020-05-29 2021-12-09 Front Range Biosciences, Inc. Methods and compositions for pathogen detection in plants
WO2022006019A1 (en) 2020-06-29 2022-01-06 Front Range Biosciences, Inc. Characterization of cannabis cultivars based on terpene synthase gene profiles
JP2023540429A (ja) 2020-07-10 2023-09-25 アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル） てんかんを治療するための方法及び組成物
WO2022241007A1 (en) * 2021-05-11 2022-11-17 Mccurdy Russell Lewis Replaceable floating attractant accessories for fishing line
WO2023043280A1 (ko) 2021-09-17 2023-03-23 주식회사 씨젠 합성 비자연 염기를 포함하는 태그 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출
CN114409890A (zh) * 2022-02-28 2022-04-29 中国科学院长春应用化学研究所 一种氨基功能化的聚乙二醇衍生物及其制备方法
WO2024017990A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating chronic pain disorders

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2910130A1 (de) 1979-03-15 1980-09-25 Franz Rossmoeller Verbesserte befestigungsvorrichtung zum aufhaengen von paneelen und moebelelementen
DE2910129C2 (de) 1979-03-15 1986-01-23 Oskar 4354 Datteln Fleck Leiste zum Abdichten des Zwischenraums zwischen der Trauflatte eines Daches und den darüberliegenden traufseitigen Dacheindeckungsplatten
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
EP0215942B1 (en) 1985-03-15 1995-07-12 Antivirals Inc. Polynucleotide assay reagent and method
US5166315A (en) * 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) * 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
EP0972779A3 (en) 1987-10-28 2004-10-20 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
EP0433345B1 (en) 1988-09-01 1994-04-20 Forskningscenter Riso Peptide synthesis method and solid support for use in the method
JPH02156895A (ja) * 1988-12-08 1990-06-15 Sumitomo Heavy Ind Ltd 好塩菌による５’‐ヌクレオチド類の製造法
JPH0635469B2 (ja) * 1989-09-13 1994-05-11 信 高橋 ジエチレントリアミン三酢酸化合物及びその製造中間体並びにそれらの製造法
US5340716A (en) * 1991-06-20 1994-08-23 Snytex (U.S.A.) Inc. Assay method utilizing photoactivated chemiluminescent label
US5719262A (en) * 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) * 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US6414112B1 (en) * 1991-05-24 2002-07-02 Ole Buchardt Peptide nucleic acids having 2,6-diaminopurine nucleobases
US6451968B1 (en) * 1991-05-24 2002-09-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acids
US6228982B1 (en) * 1992-05-22 2001-05-08 Benget Norden Double-stranded peptide nucleic acids
DK51092D0 (da) 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
MX9207334A (es) 1991-12-18 1993-08-01 Glaxo Inc Acidos nucleicos peptidicos y formulacion farma- ceutica que los contiene
US6770738B1 (en) * 1992-05-22 2004-08-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Higher order structure and binding of peptide nucleic acids
AU4525093A (en) * 1992-05-28 1993-12-30 Gilead Sciences, Inc. Conformationally restrained oligomers containing amide or carbamate linkages for sequence-specific binding
US5705333A (en) * 1994-08-05 1998-01-06 The Regents Of The University Of California Peptide-based nucleic acid mimics(PENAMS)
US6472209B1 (en) * 1997-10-17 2002-10-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Using polyamide nucleic acid oligomers to engender a biological response

Also Published As

Publication number Publication date
EP0586474B1 (en) 2001-09-12
JP2007306926A (ja) 2007-11-29
NO934122L (no) 1994-01-11
HU9303023D0 (en) 1994-01-28
US20040059087A1 (en) 2004-03-25
US6357163B1 (en) 2002-03-19
US7378485B2 (en) 2008-05-27
NO313201B1 (no) 2002-08-26
AU1880692A (en) 1992-12-30
US20020160383A1 (en) 2002-10-31
NO934235D0 (no) 1993-11-23
EP1411063A1 (en) 2004-04-21
AU666480B2 (en) 1996-02-15
DK0586618T3 (da) 1998-02-09
EP0586618B1 (en) 1997-07-16
NO934235L (no) 1994-01-20
ES2164052T3 (es) 2002-02-16
US20060160731A1 (en) 2006-07-20
ATE515569T1 (de) 2011-07-15
BR9206049A (pt) 1994-12-27
US20120115136A1 (en) 2012-05-10
AU1884392A (en) 1992-12-30
FI935208A0 (fi) 1993-11-23
DK0586474T3 (da) 2001-12-31
JP3982828B2 (ja) 2007-09-26
CA2109805A1 (en) 1992-11-26
US6201103B1 (en) 2001-03-13
GR3025018T3 (en) 1998-01-30
CA2109320A1 (en) 1992-11-25
DE69232055T2 (de) 2002-06-06
EP1411063B1 (en) 2006-07-19
WO1992020703A1 (en) 1992-11-26
NO312516B1 (no) 2002-05-21
US20060046255A1 (en) 2006-03-02
DK51092D0 (da) 1992-04-15
EP1162206A2 (en) 2001-12-12
FI935208A (fi) 1993-11-23
HU221003B1 (hu) 2002-07-29
JPH06506945A (ja) 1994-08-04
HUT66597A (en) 1994-12-28
EP1074559B1 (en) 2011-07-06
CA2109320C (en) 2003-07-22
KR0133131B1 (en) 1998-04-14
DE69220946D1 (de) 1997-08-21
EP0586618A1 (en) 1994-03-16
ATE205504T1 (de) 2001-09-15
US6395474B1 (en) 2002-05-28
DE69232055D1 (de) 2001-10-18
WO1992020702A1 (en) 1992-11-26
EP1074559A1 (en) 2001-02-07
JP2008253251A (ja) 2008-10-23
JP2758988B2 (ja) 1998-05-28
JP2009069158A (ja) 2009-04-02
NO934122D0 (no) 1993-11-15
JP2003235590A (ja) 2003-08-26
ES2107552T3 (es) 1997-12-01
US20030180734A1 (en) 2003-09-25
EP1162206A3 (en) 2004-04-14
US5977296A (en) 1999-11-02
DE69220946T2 (de) 1998-01-15
EP0586474A1 (en) 1994-03-16
JPH06509063A (ja) 1994-10-13
US6710163B1 (en) 2004-03-23
ATE155483T1 (de) 1997-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI118424B (fi) Nukleiinihappoanalogit ja niiden käyttö diagnostisissa ja analyyttisissä toimenpiteissä
US6228982B1 (en) Double-stranded peptide nucleic acids
EP0773950B1 (en) Linked peptide nucleic acids
US5786461A (en) Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) Peptide nucleic acids
US5736336A (en) Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US6414112B1 (en) Peptide nucleic acids having 2,6-diaminopurine nucleobases
JP3306073B2 (ja) 増加した結合親和性、配列特異性および溶解性を有するペプチド核酸
US6713602B1 (en) Synthetic procedures for peptide nucleic acids
US6710164B1 (en) Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US20030105286A1 (en) Linked peptide nucleic acids

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 118424

Country of ref document: FI