WO2007108378A1 - シグナルプローブポリマーの形成方法 - Google Patents

シグナルプローブポリマーの形成方法 Download PDF

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nucleic acid
polymer
oligonucleotide
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Chikako Hakii
Mitsugu Usui
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Eisai R & D Management Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method for forming a signal probe polymer capable of effectively forming a self-assembly (polymer) of an oligonucleotide 'probe and improving the stability and sensitivity of detection of a target analyte
  • the present invention relates to a polymer formed by the method, a method for detecting a target analyte using the method, and a pair of probes used in the method.
  • Patent Documents 1 to 4 are schematic illustrations of the method described in Patent Document 1.
  • FIG. 1 the method described in Patent Document 1 is a method using a pair of oligonucleotide probes 18 (HoneyComb Probes, hereinafter referred to as HCPs) composed of three regions as shown in FIG. lHCP18a (X region, Y region and Z region) and 2nd HCP 18b (X 'region, Y' region and Z 'region) each have three complementary nucleotide sequences, and they are reacted with each other.
  • HCPs oligonucleotide probes 18
  • the base sequence of each region is devised so as to hybridize with only one region (Fig. 2).
  • a method of forming a polymer by means of a probe alternation link self-assembly reaction of these oligonucleotides is called a pulsar method (PALSAR method).
  • Patent Document 2 the method described in Patent Document 2 is such that guanine or cytosine is arranged at the end of each region of the pair of HCPs, and a CG bond is formed at the end of each region when the pair of HCPs are hybridized.
  • the number of bases in each region is 20, and an HCP in which G or C is arranged at the end of each region is used. It is disclosed.
  • Figure 4 shows the use of the pulsar method An example of a signal amplification method in the microplate is shown. As shown in Fig. 4 (a)
  • probe probe 14 capture probe
  • the reaction equipment such as the microplate 10 and then capture the target nucleic acid 12 as shown in Fig. 4 (b).
  • the self-assembly reaction can form a self-assembly 20 and amplify the signal.
  • the signal probe polymer (also simply referred to as polymer) is HC.
  • the assist probe refers to a probe that can specifically bind to the target analyte to be detected and has the same base sequence as a part or all of one oligonucleotide / probe of the pair of oligonucleotides' probes. It serves to connect the target analyte and the signal probe polymer.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 3267576
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 3310662
  • Patent Document 3 International Publication No.02Z31192
  • Patent Document 4 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2002-355081
  • Patent Document 5 International Publication No. 03Z029441
  • the present invention relates to a method for forming a signal probe polymer capable of efficiently and quantitatively forming a polymer, a signal probe polymer formed by the method, an oligonucleotide probe used in the method, and
  • the object is to provide a method for detecting a target analyte with high sensitivity and excellent quantification.
  • the present inventors have conducted extensive research to improve detection sensitivity in the detection of a target analyte using the Noresa method.
  • the bases of each region of HCP In some cases, the base at the end of each nucleic acid region is guanine or cytosine, so that a polymer can be formed very efficiently compared to the case where each region has 20 bases. And significantly improve the stability and sensitivity of target analyte detection The present invention has been found out.
  • nucleic acid regions X, Y and Z are provided in order from the 5 'end, and from three nucleic acid regions having the structure of the following chemical formula (1).
  • Nucleic acid regions X ′, Y ′, and Z ′ are provided in order from the 5 ′ end, and have a structure of the following chemical formula (2), a second probe that also has three nucleic acid region forces,
  • the length of each region of the oligonucleotide probe is preferably 14 or 15, and the length of each region of the oligonucleotide probe is all 14 bases. It is more preferable that
  • each nucleic acid region is guanine or cytosine.
  • the oligonucleotide 'probe is labeled with a labeling substance.
  • the labeling substance is ataridium ester, a radioisotope, piotin, digoxigenin, a fluorescent substance, a luminescent substance or a dye.
  • the signal probe polymer of the present invention is formed by the method for forming a signal probe polymer of the present invention.
  • the target analyte detection method of the present invention is a method for detecting the presence of a target analyte in a sample, wherein the polymer is formed by the signal probe polymer formation method of the present invention. And detecting the target analyte by detecting the polymer.
  • the target It is preferable to form a complex containing the analyte, the assist probe, and the polymer, and detect the target analyte by analyzing the complex.
  • target analyte examples include at least one selected from the group force of nucleic acid, antigen, antibody, receptor, hapten, enzyme, protein, peptide, polymer, and carbohydrate.
  • the target analyte is a nucleic acid
  • one of the pair of oligonucleotide probes has a sequence complementary to a part of the target nucleic acid (target gene).
  • an assist probe having a region complementary to the base sequence of the target gene and the base sequence of the oligonucleotide probe.
  • the pair of oligonucleotides 'probes of the present invention is provided with nucleic acid regions X, Y and Z in the order of 5' end force, and comprising three nucleic acid regions having the structure of the following chemical formula (1).
  • Nucleic acid regions X ′, Y ′, and Z ′ are provided in order from the 5 ′ end, and have a structure of the following chemical formula (2), a second probe that also has three nucleic acid region forces,
  • a pair of powerful oligonucleotides 'probes, said oligonucleotides' pro The length of each region of the base is 13 to 15 bases.
  • the length of each region of the oligonucleotide probe is preferably 14 or 15, and the length of each region of the oligonucleotide probe is all More preferably, it is 14 bases.
  • each nucleic acid region is guanine or cytosine.
  • the oligonucleotide 'probe is labeled with a labeling substance.
  • the labeling substance is ataridium ester, a radioisotope, piotin, digoxigenin, a fluorescent substance, a luminescent substance or a dye.
  • the detection sensitivity of a target analyte can be significantly improved easily.
  • FIG. 1 is a schematic explanatory diagram showing a pair of HCPs.
  • FIG. 2 is a schematic explanatory diagram showing the binding mode of a pair of HCPs.
  • FIG. 3 is a schematic explanatory view showing a polymer formed by a plurality of pairs of HCPs.
  • FIG. 4 is a schematic explanatory diagram showing an example of a method for detecting a target nucleic acid using the Noresa method.
  • FIG. 5 is a schematic explanatory diagram showing an example of a method for detecting a target antigen using a pulsar method
  • FIG. 6 is a schematic explanatory view showing an example of a method for detecting a target antigen using the pulsar method, showing a complex comprising an antibody bound to a support, a target antigen and an assist probe bound to the antibody.
  • FIG. 7 is a schematic explanatory view showing an example of a method for detecting a target antigen using a pulsar method, and shows a polymer formed on the complex of FIG.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of absorbance measurement in Examples 1 to 7 and Experimental Examples 1 to 6.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of electrophoresis in Examples 1 to 3 and Experimental Examples 1 to 6.
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of electrophoresis in Examples 4 to 7.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of Example 8 to: L 1 and Experimental Examples 7 to 12.
  • FIG. 1 is a schematic explanatory diagram showing a pair of oligonucleotide probes (a pair of HCPs).
  • FIG. 2 is a schematic explanatory view showing the binding mode of the HCP in FIG.
  • FIG. 3 is a schematic explanatory view showing a self-assembly formed by a plurality of pairs of HCPs of FIG.
  • the pair of oligonucleotide probes according to the present invention includes a nucleic acid region consisting of three nucleic acid regions having a nucleic acid region X, a nucleic acid region Y, and a nucleic acid region Z in that order from the 5 'end as shown in FIG.
  • nucleic acid region X and the nucleic acid region X ', the nucleic acid region Y and the nucleic acid region Y, and the nucleic acid region ⁇ and the nucleic acid region Z' are complementary nucleic acid regions that can be hybridized. As shown in FIG. 2, nucleic acid region X and nucleic acid region X ′ are combined, nucleic acid region ⁇ and nucleic acid region Y ′ are combined, and nucleic acid region ⁇ and nucleic acid region Z ′ are combined.
  • guanine (G) or cytosine (C) is arranged at both ends of each region, and when a pair of HCPs are hybridized, a CG bond is formed at the end of each region. It is preferable.
  • the length of each region of the HCP is set to a base number of 13 to 15, preferably 14 or 15, and the lengths of the three regions in one probe are the same or different. May be. More preferably, the length of each region of the HCP is all 14 or all 15.
  • the oligonucleotide 'probe is usually a force composed of DNA or RNA. It may be an analog.
  • nucleic acid analogues include peptide nucleic acids (PNA, see WO 92/20702) and Locked Nucleic Acid (LNA, Koshkin AA et al. Tetra hedron 1998.54, 3607-3630., Koshkin AA et al. J Am. Chem. Soc. 1998.120, 13252-13253., Wahlestedt C et al. PNAS. 2000.97,5633- 5638., etc.).
  • PNA peptide nucleic acids
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • a pair of oligonucleotide probes is usually composed of the same type of nucleic acid, but for example, a pair of a DNA probe and an RNA probe may be used. That is, the type of probe nucleic acid can be selected from DNA, RNA, or nucleic acid analogs (eg, PNA, LNA, etc.). In addition, the nucleic acid composition in one probe does not need to be composed of only one type, for example, DNA. For example, an oligonucleotide probe (chimeric probe) composed of DNA and RNA can be used. It can also be used and is included in this invention.
  • probes can be synthesized by a known method.
  • a DNA probe it can be synthesized by the phosphoramidide method using a DNA synthesizer type 394 of Applied Biosystems Inc.
  • a DNA synthesizer type 394 of Applied Biosystems Inc.
  • phosphate triester method the H-phosphonate method
  • thiophosphonate method the thiophosphonate method
  • the method for forming a signal probe polymer of the present invention comprises forming a signal probe polymer by reacting multiple pairs of the pair of HCPs of the present invention. As shown in FIG. 3, a signal probe polymer 20 that is a self-assembly of HCP is efficiently formed in accordance with the concentration of the probe by performing a hybridization reaction with a plurality of pairs of the HCPs. be able to.
  • the number of HCPs used is not particularly limited, but is used in the range of 10 2 to 10 15 .
  • the composition and concentration of the reaction buffer are not particularly limited, and ordinary buffers commonly used for nucleic acid amplification can be suitably used.
  • the pH is also suitable within the normal range, and preferably a pH in the range of 7.0 to 9.0 can be used.
  • the temperature condition of the hybridization reaction is not particularly limited and may be a normal temperature condition, but the reaction temperature is preferably 40 to 80 ° C, more preferably 55 to 65 ° C. Furthermore, it is preferable that a reaction temperature region is partially formed in the reaction solution so that the self-assembly reaction is performed in the reaction temperature region. 005Z106031).
  • the reaction temperature applied to the partial reaction temperature region is preferably 40-80 ° C, more preferably 55-65 ° C.
  • the stability and sensitivity of detection of the target analyte can be improved.
  • the target analyte detection method of the present invention detects the presence of a target analyte in a sample by forming a polymer using the signal probe polymer formation method of the present invention and detecting the polymer. is there.
  • a method for detecting the target analyte specifically, a method of detecting a target analyte by detecting a polymer by forming a complex of the target analyte and a polymer (for example, Patent Document 5), and a target A method in which a polymer is formed using a method in which the polymer is formed only in the presence of the analyte, and the target analyte is detected by detecting the polymer (e.g., WO 02Z18642, WO 2004 Z074480). , International Publication No. 2004Z072302;)
  • any sample that may contain the target analyte can be applied.
  • blood, serum, urine, feces, cerebrospinal fluid, tissue fluid, sputum examples include biological samples such as cell cultures, samples that may contain or be infected with viruses, bacteria, molds, and the like.
  • the target analyte examples include nucleic acids, antigens, antibodies, receptors, haptens, enzymes, proteins, peptides, polymers, carbohydrates, and those having a combination force.
  • the target analyte may be appropriately prepared or isolated from a sample.
  • a nucleic acid such as DNA or RNA obtained by amplifying a target nucleic acid in a sample by a known method can be used.
  • target nucleic acid target gene
  • single-stranded DNA and Z or RNA, and double-stranded DNA and Z or RNA can be used.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • the target analyte has the same nucleic acid region as part or all of one of the pair of HCPs of the present invention (ie, the first probe or the second probe). It is preferable to use an assist probe that can be specifically bonded. Using the assist probe, a complex containing a target analyte, an assist probe and a polymer is formed, and the target analyte is detected by analyzing the complex, thereby making target analysis easier. An object can be detected.
  • the assist probe can be appropriately selected depending on the target analyte.
  • the target analyte is a nucleic acid
  • an assist probe in which an antibody is bound by chemical binding, for example, an antibody that has been previously conjugated to an antibody by a bond such as an amino group and a carboxyl group.
  • an assist probe in which a pyotinylated antibody is bound using streptavidin.
  • the target analyte is a nucleic acid
  • one of the pair of HCPs is configured to have a sequence complementary to a part of the target nucleic acid, and the target nucleic acid and the polymer are synthesized using the pair of HCPs.
  • the target nucleic acid can be detected by forming a complex and detecting the polymer.
  • the detection method of the present invention preferably includes a step of capturing the target analyte with a reaction material for detecting the target analyte.
  • the present invention is applicable to various reaction equipment for target analyte detection.
  • DNA chips or DNA microarrays Marshall, A.'Hodgson J. DNA chips: an array of possibilities. Nat Biotechnol. 27- «3 ⁇ , 1998., etc.
  • microplates magnetic particles and the like.
  • the method for capturing the target analyte with the reaction equipment is not particularly limited, but the capture equipment and the target analyte are used using a reaction equipment in which a capture substance that can specifically bind to the target analyte is bound. It is preferable to bind the reaction equipment and the target analyte by binding.
  • the capture substance is not particularly limited as long as it is appropriately selected according to the target analyte.
  • the target analyte is a nucleic acid
  • the target analyte is an antigen or an antibody
  • an antibody or antigen that specifically binds to the target analyte is preferably used as the capture substance.
  • the target analyte is a carbohydrate
  • FIG. 4 is a schematic explanatory diagram showing an example of a method for detecting a target nucleic acid using the pulsar method.
  • 10 is a microplate as a reaction equipment
  • 12 is a target nucleic acid
  • 14 is a capillary probe having a base sequence complementary to the target nucleic acid
  • 18 is a pair of HCPs [first HCP (nucleic acid region XYZ) , And the second HCP (nucleic acid regions X, Y, Z,)], 16 are assist probes having the same nucleic acid region ( ⁇ ) as the first HCP and having a nucleic acid region ⁇ ⁇ complementary to the target nucleic acid 12.
  • the captive probe 14 and the assist probe 16 immobilized on the microplate 10 are bound to the target nucleic acid 12, and the assist probe 16 is placed on the microplate 10.
  • a plurality of pairs of HCP18 were added [Fig. 4 (e)]
  • the assist probe 16 and the plurality of pairs of HCP18 were added.
  • polymer 20 and bind target nucleic acid 12 and polymer 20 via assist probe 16 [Fig. 4 (f)] and analyze the polymer to determine the presence of target nucleic acid in the sample be able to.
  • the target nucleic acid and the assist probe were reacted [FIG. 4 (d)].
  • the order of the reaction with the nucleic acid and the reaction between the target nucleic acid and the assist probe is not particularly limited, either of which may be performed first or simultaneously.
  • FIG. 5 to FIG. 7 are schematic explanatory views showing an example of a method for detecting a target antigen using the pulsar method, and an antibody is used to specifically bind to the target antigen.
  • 30 is a support
  • 32 is a target antigen
  • 34 is an antibody specific for the target antigen
  • 36 has the same nucleic acid region (XYZ) as the first HCP, and is specific for the target antigen.
  • the support 30 to which the antibody 34 has been immobilized in advance and the antibody 35 contained in the assist probe 36 capture the target antigen 32 to form a complex 38. Is done. Thereafter, a plurality of pairs of HCPs [first HCP (symbol 18a) and second HCP (symbol 18b)] are added, and the assist probe 36 and the plurality of pairs of HCPs are reacted as shown in FIG.
  • the presence of the target nucleic acid in the sample can be determined by forming a polymer 40 on the complex 38 and analyzing the polymer.
  • the detection method of the signal probe polymer is not particularly limited!
  • one or both of the pair of oligonucleotide probes is previously labeled with a labeling substance and detected using the labeling substance.
  • the labeling substance is attalizium-umester, a radioisotope, piotin, digoxigenin, a fluorescent substance, a luminescent substance or a dye.
  • one or both of a pair of oligonucleotide probes can be labeled with a fluorescent substance, and the presence of the polymer can be detected by a photochemical change of the fluorescent substance.
  • one or both of a pair of oligonucleotide probes can be labeled with a chromogenic enzyme or a luminescent enzyme in advance, and the presence of the polymer can be detected by photochemical change.
  • one or both of a pair of oligonucleotide probes can be labeled with a radioisotope, and the presence of the polymer can be detected with the radioisotope.
  • the presence of the polymer can be detected by hybridizing a labeled probe to the formed polymer.
  • a labeled probe those labeled with a chromogenic enzyme, a luminescent enzyme, or a radioisotope can be used.
  • a fluorescent substance having a property of binding to nucleic acid can be added to the formed polymer, and the presence of the polymer can be detected by a photochemical change of the fluorescent substance.
  • a fluorescent substance having a property of being inserted into a double-stranded base pair is preferable.
  • fluorescent substances examples include SYBR Green I stain, SYBR Green II stain, S YBR Green Gold stain, Vistra Green stain, Gelstar stain, Radiant Red stain ⁇ PicoGreen, RiboGreen, 01iGreen, Hoechst33258 (Bis-Benzimide), Propidium lodide YO-PRO-1 Iodide ⁇ YO-PRO-3 Iodide (Molecular Probes), bromide chijimu, Di stamycin A, TOTO, Psoralen, ataridimumuester, atridine orange, AO AO (homodimer) and the like are preferable.
  • the polymer of the present invention exhibits an extremely light color effect such as "noisy mouth opening" in which the intensity of the absorption band in the ultraviolet region at 260 nm is reduced. Therefore, the absorption in the ultraviolet region at a wavelength of 260 nm is achieved. By measuring, the state of the polymer can be confirmed.
  • Example [0043] (Examples 1 to 7 and experimental examples:! To 6)
  • Table 1 use a pair of HCPs (first probe and second probe) with different numbers of bases in each region, so that the absorbance at 260 nm at the start of the reaction is 1.2 to 1.5.
  • the concentration of each HCP was adjusted and the pair of HCP was dissolved in the reaction solution [4XSSC, 0.2% SDS] to prepare an HCP solution.
  • Table 1 is a table showing the number of bases in each region (X—Y—Z) of HCP (first probe and second probe) used in Examples 1 to 7 and the sequence number of each probe base sequence.
  • Table 2 is a table showing the number of bases in each region (X—Y—Z) of HCP (first probe and second probe) used in Experimental Examples 1 to 6 and the sequence number of each probe base sequence.
  • the prepared HCP solution was dispensed at 100 / zL into a 2 mL tube, heated at 94 ° C for 1 minute, and immediately cooled on ice. Next, make sure that the HCP solution cooled on ice does not go through the higher temperature range than the set temperature [previously, each reaction temperature [55.0, 56.2, 57.5, 59.2, 61.4, 6 3. 9, 66. 1, 67. 7, 68. 9 or 70.0 ° C], the tube was set and allowed to react for 2 hours. After the reaction, in order to prevent white turbidity due to SDS in the HCP solution, it was stored at 28 ° C and analyzed as follows. In addition, the experiment was performed on the prepared control solution in the same manner as the HCP solution.
  • the absorbance at a wavelength of 260 nm was measured for the HCP solution and the control solution after the reaction.
  • the absorbance ratio of each reaction temperature of the HCP solution relative to the control was calculated.
  • Tables 3 and 4 show the absorbance ratio of each reaction temperature of the HCP solution to the control.
  • Figure 8 shows the graph of absorbance ratio for each reaction temperature.
  • Examples 1 to 7 were used in which the number of bases in each region was 13 HCPs, 14 HCPs, 15 HCPs, and 14 and 15 HCPs. Compared with Experimental Examples 1 to 6 using HCPs with 12, 16, 17, 18, 19 or 20 all bases in each region, the absorbance ratio with respect to the control was small, and in particular, 14 HCPs were used. The case was minimal.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of electrophoresis in Example 13 and Experimental Examples 1-6.
  • the lane number is the number of bases in each region
  • lanes 13 to 15 are the samples of Examples 1 to 3
  • lanes 1 and 16 to 20 are the samples of Experimental Examples 1 to 6,
  • lane M is the molecular size. It is a marker.
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of electrophoresis of Examples 4 to 7, lanes 1 to 4 are the samples of Examples 6, 7, 4 and 5, respectively
  • lane M is a molecular size marker.
  • the polymer band is A.
  • the band of the unreacted probe is indicated by B.
  • a capillary probe (SEQ ID NO: 28) having a sequence complementary to a target oligo DNA (SEQ ID NO: 27) having the same base sequence as the rRNA of Staphylococcus aureus was respectively connected to a 96-well microphone port of strip well type. It was fixed on a plate and used for experiments.
  • Assist probes shown in Tables 5 and 6 in the first hybridization solution [4XSSC, 0.2% SDS, l% Blocking reagent (Roche), 20% formamide, Salmon sperm DNA (10 ⁇ g / mL)] was dissolved to 24 pmol ZmL, and this was used as the first hybridization 'probe solution used for the hybridization of the target rRNA and the capillary probe.
  • Each of the assist probes used has the same base sequence as that of the first probe and a base sequence complementary to the target oligo DNA.

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Abstract

　ポリマーを効率的且つ定量的に形成することができるシグナルプローブポリマーの形成方法、該方法で形成されるシグナルプローブポリマー、該方法で用いられるオリゴヌクレオチド・プローブ、及び高感度で定量性に優れた標的分析物の検出方法を提供する。５’端部から順に核酸領域Ｘ、Ｙ及びＺが設けられた３箇所の核酸領域からなる第１プローブと、５’端部から順に核酸領域Ｘ’、Ｙ’及びＺ’が設けられた３箇所の核酸領域からなる第２プローブと、からなる一対のオリゴヌクレオチド・プローブの複数対を反応させてポリマーを形成させる方法であって、前記オリゴヌクレオチド・プローブの各領域の長さが１３～１５塩基であるようにした。

Description

明 細 書
シグナルプローブポリマーの形成方法
技術分野
[0001] 本発明は、効果的にオリゴヌクレオチド 'プローブの自己集合体 (ポリマー）を形成さ せ、標的分析物の検出の安定性と感度を向上させることができるシグナルプローブポ リマーの形成方法、該方法により形成されるポリマー、該方法を利用した標的分析物 の検出方法、及び該方法に用いられる一対のプローブに関する。
背景技術
[0002] 本発明者らは酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法 (プローブ自己集合体の形 成方法)を提案した (特許文献 1〜4)。図 1〜図 3は特許文献 1記載の方法の概略説 明図である。例えば、特許文献 1記載の方法は、図 1に示したように 3個所の領域から 構成される一対のオリゴヌクレオチド 'プローブ 18 (HoneyComb Probe,以下、 HCPと 称する。）を用いる方法であり、第 lHCP18a (X領域， Y領域及び Z領域)と第 2HCP 18b (X'領域， Y'領域及び Z'領域)の各々の 3個所の領域は互いに相補的な塩基 配列を有し、両者を反応させた場合、領域の 1個所のみとハイブリダィズする様に各 領域の塩基配列を工夫したものである（図 2)。この工夫により、複数の一対の HCPを 反応させた場合、互いにハイブリダィズしてプローブの自己集合体 20 (ポリマー）を 形成させることができる（図 3)。本明細書において、これらオリゴヌクレオチド 'プロ一 ブの自己集合汉 (Probe alternation link self-assembly reaction)によるポリマーの 形成法を、パルサー法 (PALSAR法）と称する。
[0003] また、特許文献 2記載の方法は、前記一対の HCPの各領域の末端にグァニン又は シトシンを配置し、一対の HCPがハイブリダィズした際に C— G結合を各領域の端部 に形成することにより、より安定したポリマーを効率的に形成させる方法であり、特許 文献 2の実施例では各領域の塩基数が 20であり各領域の端部に G又は Cを配置さ せた HCPが開示されている。
[0004] また、本発明者らは、パルサー法を利用することにより、ターゲット遺伝子の検出感 度を向上させることができることを見出した (特許文献 5)。図 4に、パルサー法を利用 したマイクロプレートにおけるシグナル増幅方法の一例を示す。図 4 (a)に示した如く
、マイクロプレート 10等の反応機材に標的核酸 12を捕捉可能なキヤプチヤープロ一 ブ 14 (捕捉用プローブ)を結合させ、次に図 4 (b)に示した如ぐ標的核酸 12を捕捉 した後、図 4 (c)に示した如ぐ HCPと標的核酸に相補的な領域を持つアシストプロ ーブ 16をカ卩え、更に、図 4 (e)に示した如ぐ複数対の HCP18をカ卩えて、自己集合 反応により自己集合体 20を形成させ、シグナルを増幅させることができるものである。
[0005] なお、本明細書中でシグナルプローブポリマー（単にポリマーとも称する）とは、 HC
Pにより形成される前記自己集合体を言う。またアシストプローブとは、検出する標的 分析物と特異的に結合可能であり、前記一対のオリゴヌクレオチド 'プローブの一方 のオリゴヌクレオチド ·プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有するプローブを 言 、、標的分析物とシグナルプローブポリマーをつなぐ働きをする。
特許文献 1：特許第 3267576号公報
特許文献 2：特許第 3310662号公報
特許文献 3 :国際公開第 02Z31192号公報
特許文献 4:特開 2002— 355081号公報
特許文献 5：国際公開第 03Z029441号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、ポリマーを効率的且つ定量的に形成することができるシグナルプローブ ポリマーの形成方法、該方法で形成されるシグナルプローブポリマー、該方法で用 V、られるオリゴヌクレオチド ·プローブ、及び高感度で定量性に優れた標的分析物の 検出方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、上記課題を解決するために、ノ レサ一法を利用した標的分析物の 検出における検出感度を向上させるベく鋭意研究を重ねた結果、 HCPの各領域の 塩基の長さを工夫し、場合によっては各核酸領域の端部の塩基をグァニン又はシト シンとすることにより、各領域が 20塩基である場合と比較して極めて効率的にポリマ 一を形成することができ、更に標的分析物の検出の安定性と感度を著しく向上させる ことができることを見出し、本発明に到達したものである。
[0008] 即ち、本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法は、 5'端部から順に核酸領 域 X、 Y及び Zが設けられ、下記化学式（1)の構造を有する、 3箇所の核酸領域から なる第 1プローブと、
[化 1]
X Y Z
5'端部から順に核酸領域 X'、 Y'及び Z'が設けられ、下記化学式 (2)の構造を有す る、 3箇所の核酸領域力もなる第 2プローブと、
[化 2]
Z， Y' X，
(前記化学式（1)及び（2)において、 Xと X，、 Yと Y，、 Ζと Z'はそれぞれハイブリダィ ズ可能な相補的領域である）
力もなる一対のオリゴヌクレオチド 'プローブの複数対を反応させてポリマーを形成さ せる方法であって、前記オリゴヌクレオチド 'プローブの各領域の長さが 13〜 15塩基 であることを特徴とする。
[0009] 本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法において、前記オリゴヌクレオチド' プローブの各領域の長さが 14又は 15であることが好ましく、前記オリゴヌクレオチド · プローブの各領域の長さが全て 14塩基であることがより好ましい。
前記各核酸領域の端部全ての塩基がグァニン又はシトシンであることが好ましい。
[0010] 前記オリゴヌクレオチド 'プローブが、標識物質で標識されていることが好適である。
前記標識物質が、アタリジ-ゥムエステル、放射性同位元素、ピオチン、ジゴキシゲ ニン、蛍光物質、発光物質又は色素であることが好ましい。
[0011] 本発明のシグナルプローブポリマーは、前記本発明のシグナルプローブポリマーの 形成方法で形成されることを特徴とする。
[0012] 本発明の標的分析物の検出方法は、試料内の標的分析物の存在を検出する方法 であって、前記本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法によりポリマーを形成 させ、該ポリマーを検出することにより標的分析物を検出することを特徴とする。
[0013] 前記標的分析物と特異的に結合可能であり、前記一対のオリゴヌクレオチド 'プロ ーブの一方のオリゴヌクレオチド 'プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有する アシストプローブを用い、前記標的分析物と前記アシストプローブと前記ポリマーとを 含む複合体を形成し、該複合体を分析することにより前記標的分析物を検出すること が好ましい。
前記標的分析物としては、例えば、核酸、抗原、抗体、レセプター、ハプテン、酵素 、たんぱく質、ペプチド、ポリマー及び糖質力 なる群力 選択される少なくとも 1種が 挙げられる。
[0014] 前記標的分析物が核酸の場合、前記一対のオリゴヌクレオチド 'プローブの一方が 、前記標的核酸 (ターゲット遺伝子）の一部に相補的な配列を有することが好ま 、。 また、前記ターゲット遺伝子と前記ポリマーを繋ぐために、ターゲット遺伝子の塩基配 列と前記オリゴヌクレオチド 'プローブの塩基配列に対して、それぞれに相補的な領 域を持つアシストプローブを用いることが好適である。
[0015] 本発明の一対のオリゴヌクレオチド 'プローブは、 5 '端部力 順に核酸領域 X、 Y及 び Zが設けられ、下記化学式（1)の構造を有する、 3箇所の核酸領域からなる第 1プ ローブと、
[化 3]
X Y z
5'端部から順に核酸領域 X'、 Y'及び Z'が設けられ、下記化学式 (2)の構造を有す る、 3箇所の核酸領域力もなる第 2プローブと、
[化 4]
Z' Y' X'
(前記化学式（1)及び（2)において、 Xと X，、 Υと Υ，、 Ζと Z'はそれぞれハイブリダィ ズ可能な相補的領域である）
力 なる一対のオリゴヌクレオチド 'プローブであって、前記オリゴヌクレオチド 'プロ一 ブの各領域の長さが 13〜 15塩基であることを特徴とする。
[0016] 本発明の一対のオリゴヌクレオチド 'プローブにおいて、前記オリゴヌクレオチド'プ ローブの各領域の長さが 14又は 15であることが好ましく、前記オリゴヌクレオチド ·プ ローブの各領域の長さが全て 14塩基であることがより好ましい。
前記各核酸領域の端部全ての塩基がグァニン又はシトシンであることが好ましい。
[0017] 前記オリゴヌクレオチド 'プローブが、標識物質で標識されていることが好適である。
前記標識物質が、アタリジ-ゥムエステル、放射性同位元素、ピオチン、ジゴキシゲ ニン、蛍光物質、発光物質又は色素であることが好ましい。
発明の効果
[0018] 本発明によれば、簡便に標的分析物の検出感度を著しく向上することができる。
図面の簡単な説明
[0019] [図 1]一対の HCPを示す概略説明図である。
[図 2]—対の HCPの結合様式を示す概略説明図である。
[図 3]複数対の HCPにより形成されたポリマーを示す概略説明図である。
[図 4]ノ レサ一法を利用した標的核酸の検出方法の一例を示す概略説明図である。
[図 5]パルサー法を利用した標的抗原の検出方法の一例を示す概略説明図であり、
(a)は支持体に結合された抗体、（b)は標的抗原、（c)は抗体を結合させたアシスト プローブを示す。
[図 6]パルサー法を利用した標的抗原の検出方法の一例を示す概略説明図であり、 支持体に結合された抗体と標的抗原と抗体を結合させたアシストプローブとを含む複 合体を示す。
[図 7]パルサー法を利用した標的抗原の検出方法の一例を示す概略説明図であり、 図 6の複合体上に形成されたポリマーを示す。
[図 8]実施例 1〜7及び実験例 1〜6の吸光度測定の結果を示すグラフである。
[図 9]実施例 1〜3及び実験例 1〜6の電気泳動法の結果を示す写真である。
[図 10]実施例 4〜7の電気泳動法の結果を示す写真である。
[図 11]実施例 8〜： L 1及び実験例 7〜 12の結果を示すグラフである。
符号の説明 [0020] 10 :マイクロプレート、 12 :標的核酸、 14 :キヤプチヤープローブ、 16 :アシストプロ ーブ、 18 :—対のオリゴヌクレオチド 'プローブ（一対の HCP)、 18a:第 1プローブ（第 1HCP)、 18b :第 2プローブ（第 2HCP)、 20 :自己集合体、シグナルプローブポリマ 一、 30 :支持体、 32 :標的抗原、 34、 35 :抗体、 36 :アシストプローブ、 38 :複合体、 40 :ポリマー。
発明を実施するための最良の形態
[0021] 以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的 に示されるもので、本発明の技術思想力 逸脱しない限り種々の変形が可能なことは いうまでもない。
[0022] 図 1は、一対のオリゴヌクレオチド 'プローブ (一対の HCP)を示す概略説明図であ る。図 2は、図 1の HCPの結合態様を示す概略説明図である。図 3は、図 1の HCPの 複数対により形成された自己集合体を示す概略説明図である。
[0023] 本発明の一対のオリゴヌクレオチド 'プローブは、図 1に示した如ぐ 5'端部から順 に核酸領域 X、核酸領域 Y及び核酸領域 Zを有する、 3箇所の核酸領域からなる第 1 プローブ (第 1HCP) 18aと、 5'端部から順に核酸領域 X'、核酸領域 Y'及び核酸領 域 Z'を有する、 3箇所の核酸領域力もなる第 2プローブ (第 2HCP) 18bと、からなる 一対のオリゴヌクレオチド 'プローブ（一対の HCP)であって、前記オリゴヌクレオチド' プローブの各領域の長さが 13〜 15塩基であることを特徴とする。
[0024] 前記一対の HCPにお ヽて、核酸領域 Xと核酸領域 X'、核酸領域 Yと核酸領域 Y， 、核酸領域 Ζと核酸領域 Z'はそれぞれハイブリダィズ可能な相補的核酸領域であり、 図 2に示した如ぐ核酸領域 Xと核酸領域 X'が結合し、核酸領域 Υと核酸領域 Y'が 結合し、核酸領域 Ζと核酸領域 Z'が結合する。本発明の一対の HCPは、各領域の 両末端部にグァニン (G)又はシトシン (C)が配置されており、一対の HCPがハイプリ ダイズした際に各領域の端部に C G結合が形成されることが好ましい。
[0025] 前記 HCPの各領域の長さは、それぞれ塩基数 13〜15、好ましくは 14又は 15に設 定されるものであり、 1プローブ中の 3領域の長さは同じであっても異なっていてもよ い。前記 HCPの各領域の長さが全て 14又は全て 15であることがより好ましい。
[0026] 上記オリゴヌクレオチド 'プローブは、通常 DNA又は RNAで構成される力 核酸類 似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸 (PNA、国際公開第 92/20702号公報等参照）や Locked Nucleic Acid (LNA、 Koshkin AA et al. Tetra hedron 1998.54,3607—3630., Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998.120,13252 -13253., Wahlestedt C et al. PNAS. 2000.97,5633- 5638.等参照）が挙げられる。ま た、一対のオリゴヌクレオチド 'プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、 たとえば DNAプローブと RNAプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プロ ーブの核酸の種類は DNA、 RNAまたは核酸類似体（たとえば PNAや LNA等）から 選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえば DN Aのみから構成される必要はなぐ必要に応じて、たとえば、 DNAと RNAカゝら構成さ れるオリゴヌクレオチド 'プローブ (キメラプローブ)を使用することも可能であり、本発 明に含まれる。
[0027] これらプローブは公知の方法により合成することができる。たとえば DNAプローブ の場合、アプライドバイオシステムズ社 (Applied Biosystem Inc.)の DNAシンセサイ ザ一 394型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法とし てリン酸トリエステル法、 H—ホスホネート法、チォホスホネート法等があるが、いかな る方法で合成されたものであってもょ 、。
[0028] 本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法は、前記本発明の一対の HCPの 複数対を反応させてシグナルプローブポリマーを形成させるものである。図 3に示し た如ぐ前記一対の HCPの複数対をハイブリダィゼーシヨン反応させることにより、プ ローブの濃度に応じて効率的に HCPの自己集合体であるシグナルプローブポリマ 一 20を形成させることができる。
[0029] 使用する HCPの本数は特に限定されないが、 102〜1015本の範囲で用いられる。
反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液 が好適に使用できる。 pHも常用の範囲で好適であり、好ましくは pH7. 0〜9. 0の範 囲のものが使用できる。ノ、イブリダィゼーシヨン反応の温度条件も特に限定されず、 通常の温度条件でよいが、反応温度は好ましくは 40〜80°Cであり、より好ましくは 55 〜65°Cである。更に、反応溶液中に反応温度領域を部分的に形成させ、当該反応 温度領域にぉ 、て自己集合反応を行わせるようにすることが好ま U、（国際公開第 2 005Z106031号公報)。部分的な反応温度領域に適用される反応温度は 40〜80 °Cが好ましぐより好ましくは 55〜65°Cである。
[0030] 本発明のシグナルポリマーの形成方法を利用して標的分析物を検出することにより 、標的分析物の検出の安定性と感度を向上させることができる。
本発明の標的分析物の検出方法は、前記本発明のシグナルプローブポリマーの 形成方法を利用してポリマーを形成させ、該ポリマーを検出することにより試料中の 標的分析物の存在を検出するものである。前記標的分析物の検出方法としては、具 体的には、標的分析物とポリマーの複合体を形成させ、ポリマーの検出により標的分 析物を検出する方法 (例えば、特許文献 5)、及び標的分析物が存在する場合にの みポリマーが形成される方法を用いてポリマーを形成させ、ポリマーの検出により標 的分析物を検出する方法 (例えば、国際公開第 02Z18642号、国際公開第 2004 Z074480号、国際公開第 2004Z072302号;)力挙げられる。
[0031] 本発明における標的分析物測定用試料は、該標的分析物を含む可能性のあるあ らゆる試料が適用でき、例えば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織液、喀痰、 細胞培養物等の生体由来試料、ウィルス、細菌、カビ等の含有または感染した可能 性のある試料等が挙げられる。
前記標的分析物としては、例えば、核酸、抗原、抗体、レセプター、ハプテン、酵素 、たんぱく質、ペプチド、ポリマー、糖質及びそれらの組み合わせ力もなるものが挙げ られる。該標的分析物は試料より適宜調製または単離したものでもよい。また、試料 中の標的核酸を公知の方法で増幅した DNAまたは RNA等の核酸も使用できる。前 記標的核酸 (ターゲット遺伝子）として、一本鎖の DNA及び Z又は RNA、並びに二 本鎖の DNA及び Z又は RNAを用いることができる。また、前記標的核酸に SNPs ( 一塩基多形)を用いることができる。
[0032] 本発明の検出方法において、前記本発明の一対の HCPの一方 (即ち、第 1プロ一 ブ又は第 2プローブ)の一部又は全てと同じ核酸領域を有し、且つ標的分析物に特 異的に結合可能なアシストプローブを用いることが好ま U、。前記アシストプローブを 用いて、標的分析物とアシストプローブとポリマーとを含む複合体を形成し、該複合 体を分析することにより前記標的分析物を検出することにより、より簡便に標的分析 物を検出することができる。
[0033] 前記アシストプローブは、標的分析物に応じて適宜選択可能である。例えば、標的 分析物が核酸の場合、該標的核酸の 1領域に相補的な配列を有するアシストプロ一 ブを用い、ハイブリダィゼーシヨンにより結合させることが好ましい。
標的分析物が抗原の場合、化学的結合により抗体を結合させたアシストプローブ、 例えば、予め抗体にァミノ基とカルボキシル基等の結合によりコンジュゲートさせたも のを用いることが好ましい。また、ピオチン化した抗体を、ストレプトアビジンを用いて 結合させたアシストプローブを用いてもょ 、。
[0034] また、標的分析物が核酸の場合、前記一対の HCPの一方を前記標的核酸の一部 に相補的な配列を有するように構成し、該一対の HCPを用いて標的核酸とポリマー の複合体を形成させ、ポリマーの検出により、標的核酸を検出することができる。
[0035] また、本発明の検出方法において、標的分析物検出用の反応機材で標的分析物 を捕捉する工程を含むことが好ましい。本発明は、標的分析物検出の為の種々の反 応機材に適用可能である力 特に、 DNAチップ又は DNAマイクロアレイ（Marshall, A.'HodgsonJ.DNA chips: an array of possibilities. Nat Biotechnol.lり, 27— «3丄, 1998.等 参照）、マイクロプレート、及び磁性体粒子等に好適に用いられる。
[0036] 標的分析物を反応機材で捕捉する方法は特に限定されないが、標的分析物に特 異的に結合可能な捕捉用物質を結合させた反応機材を用い、該捕捉用物質と標的 分析物の結合により反応機材と標的分析物を結合させることが好ましい。
該捕捉用物質は標的分析物に応じて適宜選択すればよく特に限定されない。標的 分析物が核酸の場合、捕捉用物質として、該標的核酸の 1領域 (アシストプローブに 相補的な領域を除く）に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド (キヤプチヤー プローブ)を用いることが好ましい。標的分析物が抗原又は抗体の場合、捕捉用物質 として標的分析物に特異的に結合する抗体又は抗原を用いることが好ましい。また、 標的分析物が糖質の場合、捕捉用物質として標的分析物に特異的に結合するレク チンを用いることが好ましい。
[0037] 以下、標的分析物 (標的物質)として核酸又は抗原を検出する場合を例に、本発明 の標的分析物の検出方法をより具体的に説明する。 図 4は、パルサー法を利用した標的核酸の検出方法の一例を示す概略説明図であ る。図 4において、 10は反応機材としてのマイクロプレート、 12は標的核酸、 14は標 的核酸に相補的な塩基配列を有するキヤプチヤープローブ、 18は一対の HCP [第 1 HCP (核酸領域 XYZ)、及び第 2HCP (核酸領域 X，Y，Z，）]、 16は第 1HCPと同じ 核酸領域 (ΧΥΖ)を有し且つ標的核酸 12に相補的な核酸領域 Τを有するアシストプ ローブである。
[0038] 図 4 (a)〜（d)に示した如ぐマイクロプレート 10に固定化されたキヤプチヤープロ一 ブ 14及びアシストプローブ 16を標的核酸 12に結合させ、マイクロプレート 10上に、 アシストプローブ 16、標的核酸 12及びキヤプチヤープローブ 14からなる複合体を形 成した後、一対の HCP18の複数対を添カ卩し [図 4 (e) ]、該アシストプローブ 16と前 記複数対の HCPを反応させてポリマー 20を形成させ、アシストプローブ 16を介して 標的核酸 12とポリマー 20を結合させ [図 4 (f) ]、該ポリマーを分析することにより試料 中の標的核酸の存在を確定することができる。なお、図 4においては、キヤプチヤー プローブと標的核酸を反応させた後 [図 4 (b) ]、標的核酸とアシストプローブを反応さ せたが [図 4 (d) ]、キヤプチヤープローブと標的核酸との反応、及び標的核酸とァシ ストプローブとの反応の順序は特に限定されず、いずれを先に行ってもよぐまた同 時に行ってもよい。
[0039] 図 5〜図 7は、パルサー法を利用した標的抗原の検出方法の一例を示す概略説明 図であり、該標的抗原と特異的に結合させる為に抗体を用いる。図 5〜7中、 30は支 持体、 32は標的抗原、 34は標的抗原に特異的な抗体、 36は第 1HCPと同じ核酸領 域 (XYZ)を有し、且つ標的抗原に特異的な抗体 35を結合させたアシストプローブで ある。
図 5及び図 6に示した如ぐサンドイッチィムノアッセィ法により、予め抗体 34を固定 した支持体 30、及びアシストプローブ 36に含まれる抗体 35が、標的抗原 32を捕捉 し複合体 38が形成される。その後、一対の HCP [第 1HCP (符号 18a)及び第 2HC P (符号 18b) ]の複数対を添加し、図 7に示した如ぐ該アシストプローブ 36と前記複 数対の HCPを反応させて前記複合体 38上にポリマー 40を形成させ、該ポリマーを 分析することにより試料中の標的核酸の存在を確定することができる。 [0040] 本発明にお!/、て、シグナルプローブポリマーの検出方法としては、特に限定はな！/ヽ 力 前記一対のオリゴヌクレオチド 'プローブ (第 1及び第 2プローブ）の一方、又は両 方を予め標識物質で標識し、該標識物質を利用して検出することが好ましい。前記 標識物質が、アタリジ-ゥムエステル、放射性同位元素、ピオチン、ジゴキシゲニン、 蛍光物質、発光物質又は色素であることが好ましぐ操作性、定量性及び感度の点 力 アタリジ -ゥムエステルが特に好ましい。具体的には、あら力じめ一対のオリゴヌ クレオチド 'プローブの一方又は両方を蛍光物質で標識し、ポリマーの存在を蛍光物 質の光化学的な変化により検出することが可能である。また、あらかじめ一対のオリゴ ヌクレオチド 'プローブの一方又は両方を発色系酵素又は発光系酵素で標識し、ポリ マーの存在を光化学的な変化により検出することが可能である。さらにまた、あらかじ め一対のオリゴヌクレオチド 'プローブの一方又は両方をラジオアイソトープで標識し 、ポリマーの存在をラジオアイソトープにより検出することが可能である。
[0041] また、前記形成されたポリマーに対して、標識プローブをハイブリダィゼーシヨンさ せてポリマーの存在を検出することが可能である。標識プローブとしては、発色系酵 素、発光系酵素、又はラジオアイソトープ等で標識したものを用いることができる。ま た、前記形成されたポリマーに対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え 、その蛍光物質の光化学的な変化により上記ポリマーの存在を検出することが可能 である。蛍光物質としては、 2本鎖の塩基対の中に挿入する性質を持った蛍光物質 が好ましい。蛍光物質としては、例えば、 SYBR Green I stain, SYBR Green II stain, S YBR Green Gold stain、 Vistra Green stain、 Gelstar stain、 Radiant Red stain ^ PicoGr een、 RiboGreen、 01iGreen、 Hoechst33258(Bis— Benzimide)、 Propidium lodide、 YO— P RO-1 Iodideゝ YO- PRO- 3 Iodide (以上、 Molecular Probes社製）、臭化工チジゥム、 Di stamycin A、 TOTO、 Psoralen,アタリジ-ゥムエステル、アタリ-ジゥムオレンジ（Acrid ine Orange)、 AO AO (homodimer)等が好ましい。
[0042] また、本発明のポリマーは、 260nmにおける紫外部の吸収帯の強度が減じる「ノヽィ ポク口ミズム」と 、う淡色効果の発現が極めて大き 、為、波長 260nmにおける紫外部 吸収を測定することにより、ポリマーの状態を確認することが可能である。
実施例 [0043] (実施例 1〜7及び実験例:!〜 6)
1. 目的
HCPによるポリマーの形成において、 HCPの各領域の塩基数の違いによるポリマ 一の形成効率を、様々な塩基数の HCPを用いて比較した。
[0044] 2.各溶液の調製方法
(2— 1) HCP溶液の調製
表 1又は表 2に示した如く各領域の塩基数が異なる一対の HCP (第 1プローブ及び 第 2プローブ）をそれぞれ用い、反応開始時の 260nmにおける吸光度が 1. 2〜1. 5 になるように各 HCPの濃度を調整して、反応溶液 [4XSSC、 0.2%SDS]に該一対の H CPを溶解し、 HCP溶液を調製した。表 1は実施例 1〜7で用いた HCP (第 1プロ一 ブ及び第 2プローブ）の各領域 (X— Y— Z)の塩基数及び各プローブの塩基配列の 配列番号を示す表であり、表 2は実験例 1〜6で用いた HCP (第 1プローブ及び第 2 プローブ)の各領域 (X— Y— Z)の塩基数及び各プローブの塩基配列の配列番号を 示す表である。
[0045] [表 1] 実施例 1〜 7で用いた H C P
Figure imgf000014_0001
[0046] [表 2] 実験例 1〜 7で用いた H C P
Figure imgf000014_0002
(2— 2)対照溶液の調製
ポリマーの形成効率を比較する為に、第 1プローブのみを添加した溶液 (第 1プロ ーブの濃度：前記 HCP溶液に添加した第 1プローブの 2倍量）をそれぞれ調製し、対 照とした。
[0048] 3.反応
0. 2mLチューブに前記調製した HCP溶液を 100 /z Lずつ分注し、 94°Cで 1分力口 熱後、直ちに氷上で冷却した。次に、氷上で冷却した HCP溶液が設定温度より高温 度域を経由しな ヽよう【こ、予め各反応温度 [55. 0、 56. 2、 57. 5、 59. 2、 61. 4、 6 3. 9、 66. 1、 67. 7、 68. 9又は 70. 0°C]に到達した状態でチューブをセットし、 2時 間反応させた。反応後、 HCP溶液中の SDSによる白濁を防ぐ為、 28°Cで保存し、下 記分析を行った。また、前記調製した対照溶液に対しても、 HCP溶液と同様に実験 を行った。
[0049] 4.分析
(4 1)吸光度測定
前記反応後の HCP溶液及び対照溶液に対して波長 260nmにおける吸光度を測 定した。対照に対する HCP溶液の各反応温度の吸光度比を計算した。対照に対す る HCP溶液の各反応温度の吸光度比を表 3及び 4に示す。各反応温度に対する吸 光度比のグラフを図 8に示す。
[0050] [表 3]
Figure imgf000015_0001
*1 ：電気泳動法に使用したサンプル
*2：各実施例において比率が最小のサンプル
[0051] [表 4] 温度 (°c) 実験例 1 実験例 2 実験例 3 実験例 4 実験例 5 実験例 6
55.0 0.942 0.985 1.021 1.042 1.059 1.024
56.2 0.921 0.984 1.031 1.045 1.077 1.014
57.5 0.900*1 0.997 1.065 1.069 1.085 1.030
59.2 0.822 1.043*1 1.066*1 1.063 1.109*1 1.079
61.4 0.778*2 1.030 1.002 1.071*1 1.042 1.035*1
63.9 0.929 0.942 0.939*2 0.990 0.918*2 0.945
66.1 0.963 0.935*2 0.946 0.973*2 0.971 0.936*2
67.7 0.981 0.977 1.024 0.981 0.976 0.952
68.9 0.978 0.982 0.997 1.019 1.046 1.001
70.0 0.963 0.966 0.993 1.047 1.000 1.013
*1 ：電気泳動法に使用したサンプル
*2：各実験例において比率が最小のサンプル
[0052] 表 3及び表 4に示したように各領域の塩基数が全て 13の HCP、全て 14の HCP、全 て 15の HCP及び 14と 15からなる HCPを用 、た実施例 1〜7は、各領域の塩基数が 全て 12、 16、 17、 18、 19又は 20の HCPを用いた実験例 1〜6に比べて対照に対 する吸光度比が小さくなり、特に 14の HCPを用いた場合に最小であった。
核酸は規則的な高次構造をとることにより、吸収強度が減少する「淡色効果」という 現象を示す。すなわち、吸光度比の変化を淡色効果として比較することは、ポリマー の形成効率やその構造の規則性の高さの指標となる。このことより、各領域の塩基数 が全て 13の HCP、全て 14の HCP、全て 15の HCP及び 14と 15からなる HCPはポリ マーの形成効率が高ぐ中でも淡色効果が顕著である各領域の塩基数が全て 14の HCPは、規則正しレ、ポリマーの形成効率が特に高 、ことがわ力つた。
[0053] (4 2)電気泳動法
淡色効果がおきて 、る温度のサンプル (表 3及び表 4に示したサンプル)を 6%ポリ アクリルアミドゲル電気泳動で確認した。図 9は実施例 1 3及び実験例 1〜6の電気 泳動法の結果を示す写真である。図 9において、レーン番号は各領域の塩基数であ り、レーン 13〜15は実施例 1〜3のサンプル、レーン 1、 16〜20は実験例 1〜6のサ ンプル、レーン Mは分子サイズマーカーである。図 10は実施例 4〜7の電気泳動法 の結果を示す写真であり、レーン 1〜4はそれぞれ実施例 6, 7, 4及び 5のサンプル、 レーン Mは分子サイズマーカーである。また、図 9及び図 10中、ポリマーのバンドを A で示し、未反応プローブのバンドを Bで示した。
[0054] 図 9及び図 10に示した如ぐ各領域の塩基数が全て 13の HCP、全て 14の HCP、 全て 15の HCP及び 14と 15からなる HCPを用 、た実施例 1〜7は、各領域の塩基数 が全て 12、 16、 17、 18、 19又は 20の HCPを用いた実験例 1〜6に比べてレーン上 のラダーバンドやレーン下部の未反応プローブ（図中の B)が少なぐポリマーの形成 効率が高いことがわ力つた。特に各領域の塩基数が全て 14の HCPを用いた場合は ラダーバンドや未反応プローブが最も少ないことから反応に供した HCPのほとんどが 効率よく自己集合反応に関与していると考えられ、規則正しいポリマーの形成効率が 特に高いことがわ力つた。
[0055] (実施例 8〜： L 1及び実験例 7〜12)
1. 目的
HCPによるポリマー形成を利用したターゲット遺伝子の検出において、 HCPの塩 基数の違いによるターゲット遺伝子の検出効率を、様々な塩基数の HCPを用いて比 較した。
[0056] 2.マイクロプレートの調製
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus)の rRNAと同じ塩基配列を有するターゲッ トオリゴ DNA (配列番号 27)に相補的な配列を有するキヤプチヤープローブ (配列番 号 28)を各々ストリップウェルタイブの 96ウェルマイク口プレート上に固定し、実験に 用いた。
[0057] 3.各溶液の調製方法
(3— 1)第 1ハイブリダィゼーシヨン'プローブ溶液の調製
第 1ハイブリダィゼーシヨン溶液 [4XSSC、 0.2%SDS、 l%Blocking reagent (Roche製）、 20%ホルムアミド、 Salmon sperm DNA(10 μ g/mL)]に表 5及び 6に示すアシストプロ ーブを 24pmolZmLになるように溶解し、これをターゲット rRNAとキヤプチヤープロ ーブのハイブリダィゼーシヨンに使用する第 1ハイブリダィゼーシヨン'プローブ溶液と した。なお、用いたアシストプローブは、それぞれ第 1プローブと同じ塩基配列及びタ 一ゲットオリゴ DNAに相補的な塩基配列を有する。
[0058] (3— 2)第 2ハイブリダィゼーシヨン 'HCP溶液の調製 第 2ハイブリダィゼーシヨン溶液 [4XSSC、 0.2%SDS、 l%Blocking reagent (Roche製) ]に表 5及び 6に示した如く各領域の塩基数が異なる 5'末端が DIGラベルされた一対 の HCP (第 1プローブ及び第 2プローブ）を 500pmol/mLになるように溶解し、これ を第 2ハイブリダィゼーシヨン 'HCP溶液とした。表 5は実施例 8〜： 11で用いた HCP ( 第 1プローブ及び第 2プローブ）の各領域 (X— Y— Z)の塩基数及び各プローブの塩 基配列の配列番号を示す表であり、表 6は実験例 7〜12で用いた HCP (第 1プロ一 ブ及び第 2プローブ）の各領域 (X— Y— Z)の塩基数及び各プローブの塩基配列の 配列番号を示す表である。
[0059] [表 5] 実施例 8 ~ 1 1で用いた H C P及びアシス トプローブ
[0060] [表
Figure imgf000018_0001
4.反応
(4 1)第 1ハイブリダィゼーシヨン
前記調製したストリップウェルタイブの 96ウェルマイク口プレートに各濃度のターノ トオリゴ DNA (配列番号 27) (0. 05, 0. 1, 0. 5, 1又は lOfmolZmL)を 50 L 第 1ハイブリダィゼーシヨン'プローブ溶液を 50 Lずつ分注し、プレートシ一ラー しつ力りとシールし、マイクロプレートの上部 20°C、下部 45°Cに設定した条件下で 1 時間反応させた。反応後、洗浄液 [50mM- Tris, 0.3M- NaCl, 0.01 %-TritonX- 100, p H 7.6]で洗浄した。
[0062] (4— 2)第 2ハイブリダィゼーシヨン (HCPのポリマー形成反応）
洗浄後、洗浄液をよくきった 96ウェルマイク口プレートへ第 2ハイブリダィゼーシヨン •HCP溶液を 100 Lずつ分注し、プレートシ一ラーでしつ力りとシールした。マイク 口プレートの上部 20°C、下部 55°Cに設定した条件下で 30分間反応させた。
[0063] 5.検出
マイクロプレートウエルを洗浄後、 15mU/mLの ALP標識抗ジゴキシゲニン (lOOmM T ris, pH 7.5)を 100 L加え、 37°Cのインキュベーターで反応させた。洗浄液で洗浄 後、発光基質液 (CDP- Star、 TROPIX製）を ΙΟΟ μ Lカロえ、暗所で 20分反応後、ルミ ノメーター（Centro LB960、 Berthold製)で発光強度（RLU)を測定した。結果を表 7及 び図 11に示す。
[0064] [表 7]
Figure imgf000019_0001
[0065] 表 7及び図 11に示したように、各領域の塩基数が全て 13の HCP、全て 14の HCP 、全て 15の HCP及び 14と 15からなる HCPを用いた実施例 8〜： L 1は、各領域の塩 基数が全て 12、 16、 17、 18、 19又は 20の HCPを用いた実験例 7〜12に比べて高 い測定値が得られた。

Claims

請求の範囲 5'端部から順に核酸領域 X、 Y及び Zが設けられ、下記化学式（1)の構造を有する 、 3箇所の核酸領域力 なる第 1プローブと、 [化 1] ；：：；；：；：：：：：：；： ！！；；；：：；：；；： ( 1 ) X Y Z 5'端部から順に核酸領域 X'、 Y'及び Z'が設けられ、下記化学式 (2)の構造を有す る、 3箇所の核酸領域力もなる第 2プローブと、 [化 2] 5， ■ ■ ■ ( 2 ) Ζ' Υ， Χ'
(前記化学式（1)及び（2)において、 Xと X，、 Υと Υ，、 Ζと Z'はそれぞれハイブリダィ ズ可能な相補的領域である）
力もなる一対のオリゴヌクレオチド 'プローブの複数対を反応させてポリマーを形成さ せる方法であって、前記オリゴヌクレオチド 'プローブの各領域の長さが 13〜 15塩基 であることを特徴とするシグナルプローブポリマーの形成方法。
[2] 前記オリゴヌクレオチド ·プローブの各領域の長さが 14又は 15塩基であることを特 徴とする請求項 1記載のシグナルプローブポリマーの形成方法。
[3] 前記オリゴヌクレオチド 'プローブの各領域の長さが全て 14塩基であることを特徴と する請求項 1記載のシグナルプローブポリマーの形成方法。
[4] 前記各核酸領域の端部全ての塩基がグァニン又はシトシンであることを特徴とする 請求項 1〜3のいずれ力 1項記載のシグナルプローブポリマーの形成方法。
[5] 前記オリゴヌクレオチド 'プローブが、標識物質で標識されていることを特徴とする 請求項 1〜4のいずれ力 1項記載のシグナルプローブポリマーの形成方法。
[6] 前記標識物質が、アタリジ -ゥムエステル、放射性同位元素、ピオチン、ジゴキシゲ ニン、蛍光物質、発光物質又は色素であることを特徴とする請求項 5記載のシグナル プローブポリマーの形成方法。
[7] 請求項 1〜6の!、ずれか 1項記載の方法で形成されることを特徴とするシグナルプ ローブポリマー。
[8] 試料内の標的分析物の存在を検出する方法であって、請求項 1〜6のいずれか 1 項記載の方法によりポリマーを形成させ、該ポリマーを検出することにより標的分析 物を検出することを特徴とする標的分析物の検出方法。
[9] 前記標的分析物と特異的に結合可能であり、前記一対のオリゴヌクレオチド 'プロ ーブの一方のオリゴヌクレオチド 'プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有する アシストプローブを用い、前記標的分析物と前記アシストプローブと前記ポリマーとを 含む複合体を形成し、該複合体を分析することにより前記標的分析物を検出すること を特徴とする請求項 8記載の標的分析物の検出方法。
[10] 前記標的分析物が核酸であり、前記一対のオリゴヌクレオチド 'プローブの一方が、 前記標的核酸の一部に相補的な配列を有することを特徴とする請求項 8記載の標的 分析物の検出方法。
[11] 前記標的分析物が、核酸、抗原、抗体、レセプター、ハプテン、酵素、たんぱく質、 ペプチド、ポリマー及び糖質力 なる群力 選択される少なくとも 1種であることを特徴 とする請求項 8又は 9記載の標的分析物の検出方法。
[12] 5'端部から順に核酸領域 X、 Y及び Zが設けられ、下記化学式（1)の構造を有する
、 3箇所の核酸領域力 なる第 1プローブと、
[化 3]
Figure imgf000021_0001
5'端部から順に核酸領域 X'、 Y'及び Z'が設けられ、下記化学式 (2)の構造を有す る、 3箇所の核酸領域力もなる第 2プローブと、
[化 4]
Ζ' Υ， Χ' (前記化学式（1)及び（2)において、 Xと X，、 Yと Y，、 Ζと Z'はそれぞれハイブリダィ ズ可能な相補的領域である）
力 なる一対のオリゴヌクレオチド 'プローブであって、前記オリゴヌクレオチド 'プロ一 ブの各領域の長さが 13〜 15塩基であることを特徴とする一対のオリゴヌクレオチド · プローブ。
[13] 前記オリゴヌクレオチド ·プローブの各領域の長さが 14又は 15塩基であることを特 徴とする請求項 12記載の一対のオリゴヌクレオチド 'プローブ。
[14] 前記オリゴヌクレオチド 'プローブの各領域の長さが全て 14塩基であることを特徴と する請求項 12記載の一対のオリゴヌクレオチド ·プローブ。
[15] 前記各核酸領域の端部全ての塩基がグァニン又はシトシンであることを特徴とする 請求項 12〜 14のいずれ力 1項記載の一対のオリゴヌクレオチド 'プローブ。
[16] 前記オリゴヌクレオチド 'プローブが、標識物質で標識されていることを特徴とする 請求項 12〜 15のいずれ力 1項記載の一対のオリゴヌクレオチド 'プローブ。
[17] 前記標識物質が、アタリジ -ゥムエステル、放射性同位元素、ピオチン、ジゴキシゲ ニン、蛍光物質、発光物質又は色素であることを特徴とする請求項 16記載の一対の オリゴヌクレオチド.プローブ。
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