JPH11512617A

JPH11512617A - ペプチド核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション分析のための方法、装置及びキット

Info

Publication number: JPH11512617A
Application number: JP9514448A
Authority: JP
Inventors: フユークス，マーテイン; エゴルム，マイケル; オキーフ，ヘザー; ヤオ，シアン・ダブリユー
Original assignee: パーセプテイブ・バイオシステムズ・インコーポレイテツド
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1996-10-04
Publication date: 1999-11-02
Also published as: EP0854937B9; EP0854937A1; US20020012902A1; WO1997012995A1; DE69634696D1; US20050053944A1; DE69634696T2; EP0854937B1

Abstract

(57)【要約】一本鎖核酸の試料を標的配列に相補的な配列を有する検出可能なＰＮＡプローブと接触させ、それにより標的配列が存在する場合にはそれが検出可能なプローブとハイブリダイズして検出可能な二重鎖を形成し、次いでその二重鎖を変性媒体中において未結合試料成分から電気泳動によって分離することにより、試料中の所望の標的配列を有する分子をハイブリダイズ及び分離するための方法、組成物及び装置。また、本発明は、試料を検出可能なＰＮＡプローブと接触させることによる、一本鎖核酸及びそれらの相補鎖の混合試料中の所望の標的配列を有する分子をハイブリダイズ及び分離するための方法、組成物及び装置にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】ペプチド核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション分析のための方法、装置及びキット発明の分野本発明は、一般にはハイブリダイゼーション分析の分野に関し、より具体的には、ペプチド核酸をＤＮＡ又はＲＮＡ標的配列のプローブとして用いるハイブリダイゼーション分析に関する。発明の背景混合物の分離及び分析のための十分に確立されている技術である電気泳動は、電場における分子の移動及び移動度の差に基づくそれらの分離を含む。多くの異なる形態の電気泳動が開発されており、これにはフリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動、等電点電気泳動及び等速電気泳動が含まれる。伝統的に、電気泳動は、ポリアクリルアミド又はアガロースから板又は棒状に成型されたゲル中にて行われている。ＤＮＡ又はＲＮＡのようなポリヌクレオチドの分離及び分析には板状ゲルが広く用いられている。関心のあるポリヌクレオチド標的におけるヌクレオチドの配列を決定するため、電気泳動を他の分析技術と組み合わせることができる。サザンブロッティングとして知られる技術においては、ＤＮＡ試料が関心のある“標的”ヌクレオチド配列について分析される。ＤＮＡ試料を典型的には加熱することにより変性させ、変性された一本鎖ＤＮＡを板状ゲルにおいて電気泳動により分離する。電気泳動分離の後、ＤＮＡを断片化し、ゲルからニトロセルロース膜のような膜に移し、もしくはブロットする。次に、この一本鎖断片化ＤＮＡを、関心のある標的ヌクレオチド配列と相補的な配列を有する標識ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴマーで探索する。このＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴマー、すなわち、標的配列に相補的なプローブは、標的配列が存在する場合、それとハイブリダイズする。その後、あらゆる未結合ＤＮＡ断片及び過剰のプローブを厳密に洗浄することにより除去する。洗浄後、特異的に結合したオリゴヌクレオチドプローブの標識が膜上に止まり、これを検出する。標的配列の有無及びその大きさを容易に決定することができる。ノーザンブロッティングと呼ばれる類似の技術が、ＲＮＡもしくはＤＮＡプローブのいずれかを用いるＲＮＡ試料の分析に用いられる。信頼がおける再現性のある結果を得るには、しばしば、個々の系の各々について実験上の最適化が必要となる。加えて、最も重要な工程は、しばしば、測定に必要な特異的に結合したプローブを除去することなく（背景カウントの増大につながり得る）あらゆる非特異的に結合したプローブを有効に脱着させることを必要とする厳密な洗浄の工程である。さらに、ブロッティング技術は、電気泳動の前に関心のある標的ヌクレオチド配列を変性させ、ブロッティングが行われるまでプローブを添加しないことを必要とする複雑な手順である。したがって、上述のブロッティング技術は、４時間ないし数日を要する手順全体の各々が複雑で、時間がかかり、かつ労働集約的なものである。ペプチド核酸、すなわちＰＮＡは、通常のノーザン及びサザンブロット分析における有用なプローブ代替物であることが決定されている。Ｐｌｕｓｋａｌ，Ｍ．ら，ＰｅｐｔｉｄｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓａｎｄＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＤＮＡａｎｄＲＮＡＢｌｏｔＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓ，ＴｈｅＦＡＳＥＢＪｏｕｒｎａｌＰｏｓｔｅｒ＃３５（１９９４年）を参照のこと。ＰＮＡは、核酸塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシルが結合しているアミノ酸の繰り返し単位を含んでなる合成オリゴアミドである。Ｅｇｈｏｌｍら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６５，５６６−５６８；Ｏｅｒｕｍら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．（１９９３年）２３５３３２−３６；ＰｒａｃｔｉｃａｌＰＮＡ：ＩｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇＰｏｉｎｔＭｕｔａｔｉｏｎｓｂｙＰＮＡＤｉｒｅｃｔｅｄＰＣＲＣｌａｍｐｉｎｇ（１９９５年）ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＶｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ１を参照のこと。ＰＮＡシントン及びオリゴマーはＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、フラミンガム、ＭＡから購入することができ、当該技術分野において公知の方法によって作製することが可能である。例えば、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ９２／０１２１９号、ＰＣＴ／ＥＰ９２／０１２２０号、ＰＣＴ／ＵＳ９２／１０９２１号を参照のこと。多くの用途において、ＰＮＡプローブは核酸プローブよりも好ましい。これは、低塩の条件下で不安定化する核酸／核酸二重鎖とは異なり、非常に低い塩の条件下でＰＮＡ／核酸二重鎖が形成され、安定のままであるためである。Ｅｇｈｏｌｍら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３年）３６５，５６６−５６８；ＰｒａｃｔｉｃａｌＰＮＡ：ＰＮＡＯｌｉｇｏｍｅｒｓａｓＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＰｒｏｂｅｓ（１９９５年）ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ２を参照のこと。加えて、ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体は類似の核酸／核酸複合体よりも熱溶融点が高いため、ＰＮＡプローブを使用することによりブロッティング検定の再現性を改善することができる。ＰｌｕｓｋａｌＭ．らを参照のこと。しかしながら、ＰＮＡプローブを用いても、これらの検定は複雑で、時間がかかり、かつ労働集約的なままである。ゲル充填毛管における非標識ＰＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチド複合体の電気分離が記述されている。Ｒｏｓｅ，Ｄ．Ｊ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３年）６５：３５４５−３５４９。この技術はＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの安定性故に有利ではあるが、このＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体の形成においてＰＮＡと競合する相補的ＤＮＡ鎖がない非競合環境において形成される。この実験は、二本鎖ＤＮＡを用いて開始して、ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体を形成させることが可能であるのかどうかを示さなかった。このような二本鎖核酸試料は、ハイブリダイゼーション分析を行う際、特定の問題を呈する。二本鎖試料の各々の鎖がその相補鎖に対して非常に高い親和性を有するため、低塩の条件下でさえ、関心のある標的ＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖の存在下における結合に、オリゴヌクレオチドプローブが効率的に競合することができない。したがって、二本鎖ＤＮＡの分析は、典型的には、相補鎖が存在しない条件下において一本鎖核酸試料を探査することを必要とし、さもなければプローブとの競合に利用することはできない。例えば、伝統的なブロッティング技術においては、断片をゲルから膜にブロットして競合する相補的断片を固定化する。したがって、このような技術は、さらなる複雑性及びＤＮＡ配列を分析するための時間を付け加える。二本鎖ＤＮＡはゲノム試料中の核酸の最も普通の形態であるため、これらの利用可能な技術は完全に満足できるものではない。核酸を検出及び分析するための、迅速で、再現性があり、容易で、かつコストの上で効果的な方法に対する需要が存在する。本発明はこれらの需要に取り組む。発明の要約したがって、本発明は、関心のある標的配列を有するポリヌクレオチド試料を分離及び検出するためのものであって、従来技術の制限及び不都合による１以上の問題を実質的に排除する方法、組成物、装置、及びキットを指向する。一態様において、本発明は、一本鎖ポリヌクレオチド配列及びそれらの相補鎖の混合試料溶液の成分を分離し、かつそこに選択された標的配列を検出するための方法に関する。この方法を実施するためには、まず、二本鎖ポリヌクレオチドを、典型的には加熱により、相補的な一本鎖ポリヌクレオチド対に変性させる。次に、一本鎖ポリヌクレオチド対の試料を選択された標的配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するＰＮＡプローブと混合し、それにより一本鎖ポリヌクレオチド配列をＰＮＡとハイブリダイズさせて検出可能なＰＮＡ／ポリヌクレオチド二重鎖を形成する。その後、試料中の様々なポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド／ＰＮＡ種を電気泳動によって分離し、検出可能なＰＮＡ／ポリヌクレオチド二重鎖を検出する。ＰＮＡプローブは、酵素、蛍光体、ビオチン、発色基、放射性同位体、着色粒子、電気化学もしくは化学発光基のような検出可能な基で標識することができる。様々な態様において、様々な種が、篩分け媒体中に電気泳動、より具体的には毛管電気泳動によって分離される。篩分け媒体は、それが用いられる場合には、ポリアクリルアミド、アガロース、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリジン及びメチルセルロースからなる群より選択することができる。別の態様においては、篩分け媒体は用いられない。別の態様において、請求される発明は、選択された標的配列を含むポリヌクレオチドの試料における検出のための装置に関する。本発明の装置は、試料注入区域、該注入区域と連通する電気泳動篩分け媒体、及び該注入区域に導入される試料と混合するように配置されるＰＮＡプローブを有する。このＰＮＡプローブは選択される標的配列の少なくとも一部と相補的な配列を有し、標的配列が存在する場合にはそれとハイブリダイズして検出可能な複合体を形成する。このプローブは標識することが可能であり、あらゆる適切な篩分け媒体を用いることができる。好ましい態様において、本発明の装置は少なくとも１つの毛管又は通路を有する。別の態様においては、この装置は複数の通路を有する。さらに別の好ましい態様においては、この装置は多通路マイクロチップである。さらに別の態様において、請求される発明は、少なくとも２種類のＰＮＡプローブが標識され、その各々が、存在するのであれば異なる標的配列とハイブリダイズして検出可能な複合体を形成する、上記方法、組成物及び装置に関する。標的配列は同じＤＮＡセグメントにあっても別々のＤＮＡセグメントにあってもよく、同じ遺伝子の異なる座位から生じるものであっても異なる遺伝子から生じるものであってもよい。前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両者は例示的かつ説明的なものであり、請求される発明のさらなる説明を提供することを目的とするものであることが理解される。添付の図面は本発明のさらなる理解を提供するために含まれるものであって、本明細書に組込まれ、かつその一部を構成するものであり、本発明の幾つかの態様を説明し、本明細書の記述と共に本発明の原理を説明する役目を果たす。図面の説明図１は、本発明の“ブロット無し”法の一態様の流れ図を伴う、伝統的なサザンブロッティング技術の流れ図である。図２Ａ及び２Ｂは、化学発光によって発色させた、様々な温度及び濃度でのＤＮＡ／ＤＮＡ及びＤＮＡ／ＰＮＡハイブリダイゼーション実験の結果を、アガロースゲルの２つのセグメントで示す。図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、ｐＢＲ３２２の２種類の制限消化物と３種類の異なる電気泳動ゲル系：非変性４−２０％アクリルアミド（３Ａ）；７Ｍ尿素６％アクリルアミド（３Ｂ）；及び１％アガロース（３Ｃ）で分離された標識ＰＮＡとのハイブリダイゼーション実験の結果を示す。図４は、二本鎖ＤＮＡｐＢＲ３２２と標識ＰＮＡプローブとのハイブリダイゼーション実験における温度の効果を示す。図４Ａ及び４Ｂは、影響を受けていない個人（Ｈ）、レーン１、２及び５、並びにキャリア（Ｃ）、レーン３及び４、によって提供された嚢胞性線維症遺伝子Ｗ１２８２と野性型（ＷＴ）遺伝子、レーン１及び３、又は変異体（Ｍ）遺伝子、レーン２及び４、の標識ＰＮＡプローブ及び過剰の変異体プローブ（レーン５）との１．５％ＴＢＥアガロースゲル：ＤＮＡでの予備ゲルハイブリダイゼーション検定の結果を示す。図５は、変性媒体中における様々な温度での相補的(曲線Ａ：◆)、１塩基ミスマッチ（曲線Ｂ：■）及び２塩基ミスマッチ（曲線Ｃ：●）ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の安定性を比較するプロットである。図６は、様々な温度での相補的（曲線Ａ：■）及び２塩基ミスマッチ（曲線Ｂ：■）ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の安定性を比較するプロットである。図７は、ｐＢＲ３２２のＢｓｔＮＩ及びＭｓｐＩ消化に由来するＤＮＡ断片の毛管ゲル電気泳動の電気泳動図である。図８は、毛管電気泳動によるｐＢＲ３２２の消化断片のサイズ分離のためのサイズ較正曲線である。図９は、標識ＰＮＡプローブ及びｐＢＲ３２２のＢｓｔＮＩ消化の断片を含む、ハイブリダイゼーション検定の構成要素の電気泳動分離の電気泳動図である。図１０は、標識ＰＮＡプローブ及びｐＢＲ３２２のＭｓｐＩ消化の断片を含む、ハイブリダイゼーション検定の構成要素の電気泳動分離の電気泳動図である。図１１は、標識ＰＮＡプローブ並びにｐＢＲ３２２のＢｓｔＮＩ消化及びｐＢＲ３２２のＭｓｐＩ消化の両者の断片を含む、ハイブリダイゼーション検定の構成要素の電気泳動分離の電気泳動図である。図１２は、本発明の装置の態様の毛管の面での断面透視図を模式的に示すものである。図１３Ａは、食違いはさみインジェクタを用いる試料導入プロセスを模式的に示すものである。図１３Ｂは、食違いはさみインジェクタを用いる電気泳動分離プロセスを模式的に示すものである。図１４は、多通路毛管マイクロチップウェハの毛管の面での断面透視図を模式的に示すものである。図１５は、毛管ゲル電気泳動を用いるハイブリダイゼーション分析のための一体型装置を模式的に示すものである。図１６は、標識ＰＮＡプローブ（フレーム６００の影像）並びにｐＢＲ３２２のＢｓｔＮＩ及びＭｓｐＩ消化の両者の断片（フレーム３００−４００の影像）を含む、ハイブリダイゼーション検定の電気泳動分離の電気泳動図である。図１７Ａは、野性型嚢胞性線維症Ｆ５０８遺伝子の標識ＰＮＡプローブを（ａ）影響を受けていない個人；（ｂ）キャリア；及び（ｃ）影響を受けている患者から提供されたＤＮＡ試料と共に含む、ハイブリダイゼーション検定の構成要素の電気泳動分離の電気泳動図を示す。図１７Ｂは、変異嚢胞性線維症Ｆ５０８遺伝子（ΔＦ５０８）の標識ＰＮＡプローブを（ａ）影響を受けていない個人；（ｂ）キャリア；及び（ｃ）影響を受けている患者から提供されたＤＮＡ試料と共に含む、ハイブリダイゼーション検定の構成要素の電気泳動分離の電気泳動図を示す。図１８Ａは、影響を受けていない個人から提供された野性型ＤＮＡ試料の野性型嚢胞性線維症Ｗ１２８２遺伝子についてのハイブリダイゼーション検定の構成要素の電気泳動分離の電気泳動図を示す：（ａ）野性型標識ＰＮＡプローブ；（ｂ）変異標識ＰＮＡプローブ；及び（ｃ）ＤＮＡ試料は含まないが変異プローブは含む対照。図１８Ｂは、健常キャリアから提供されたＤＮＡ試料の変異嚢胞性線維症Ｗ１２８２Ｘ遺伝子についてのハイブリダイゼーションの構成要素の電気泳動分離の電気泳動図を示す：（ａ）野性型標識ＰＮＡプローブ；（ｂ）変異標識ＰＮＡプローブ。図１９は、野性型嚢胞性線維症Ｗ１２８２及びＦ５０８遺伝子の２種類の標識ＰＮＡプローブを含む、多ハイブリダイゼーション検定の構成要素の電気泳動分離の電気泳動図である。発明の詳細な説明本発明者らは、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドにとって通常の変性条件下において、ＰＮＡが標的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列とハイブリダイズしたままであることを見出している。したがって、実施者は、試料成分を篩分け媒体で電気泳動により分離することに加えて、プローブとハイブリダイズして複合体を形成することに基づいて標的配列の存在を同時に検出することが可能である。ここで用いられる“プローブ”は、標的配列内の核酸塩基の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド塩基の配列を指す。従来、相補的ＤＮＡ標的とＤＮＡプローブとの競合を防ぐため、プローブとハイブリダイズさせる前に、相補的核酸鎖をそのパートナーとの結合に利用できないようにする必要があった。このため、標的ヌクレオチド配列とＰＮＡプローブとのハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ／ＤＮＡプローブがハイブリダイズしない条件下で行うことができる。ここで用いられる “標的配列”という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列のような、技術者が検出することを望み、ＰＮＡプローブとハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基のあらゆる配列を指す。付け加えられる利点として、ＰＮＡは従来のヌクレオチドプローブとは異なって電荷を持たず、したがって、過剰のプローブからのハイブリッドの電気泳動分離を簡素化する。これらのＰＮＡプローブを用いる検定は少なくとも通常用いられるオリゴヌクレオチドプローブと同程度の感度及び識別能力を有するものであり、それらの標的とより迅速にハイブリダイズする。さらに、本発明の検定は迅速な１工程ハイブリダイゼーションとそれに続くサイズ分離を提供し、したがって、当該技術分野において公知の方法より時間の消費、複雑性及び労働集約性が少ない。ここで用いられるＰＮＡ（ペプチド核酸）という用語は、中性ポリアミド主鎖を有するＤＮＡ模倣体であって、この中性ポリアミド主鎖には核酸塩基がＤＮＡのリン酸主鎖に結合するのと同じ様式で結合するＤＮＡ模倣体を指す。ＰＮＡは、標準的なペプチド化学により定型的に合成することが可能であり、固相合成のいずれかの一部として、又は樹脂からの開裂に続いて、ビオチン又は様々な他の標識で標識することができる。例えば、Ｃｈｏｌｌｅｔら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．５，ｐｐ．１５２９−１５４１（１９８５年）を参照のこと。単量体シントンからＰＮＡを作製する方法は当該技術分野で公知である。ここで用いられる“検出可能な基”は請求される発明における使用に適する基であり、これには酵素、蛍光体、ビオチン、発色基、放射性同位体、電気化学基及び化学発光基が含まれるがこれらに限定されるものではない。このような基は、当該技術分野において認知されている技術を用いて、容易にプローブに結合させることができる。請求される発明の全ての側面を十分に理解するため、本発明の組成物、キット及び方法をもたらすＰＮＡ／核酸二重鎖の２つの重要な特性を出願人が発見していることが認められるべきである。第１に、出願人は、驚くべきことに、標的配列に相補的な配列を有する標識ＰＮＡプローブを変性されている二本鎖核酸試料に添加すると、ＰＮＡプローブが標的配列と迅速にハイブリダイズし、それにより相補的核酸鎖の存在下において二重鎖を形成することを観察している。より長い相補的核酸鎖は低塩の条件下であっても非常に短いＰＮＡプローブと競合するため、ＰＮＡプローブが容易にもしくは迅速に置換して、より安定な二本鎖核酸出発物質を形成することがないことは驚くべきことである。これは、５０ヌクレオチドサブユニットを超える長さの二本鎖区域を有する試料のような長い核酸断片を含む試料にとって非常に驚くべきことである。第２に、ＰＮＡ／核酸二重鎖は、ＤＮＡ二次構造が崩壊する変性条件下において安定である。したがって、試料の成分を変性条件下において分離し、それにより二次構造の形成及び相補的断片の結合を防ぐことが可能である。このようなことは、伝統的なＤＮＡ又はＲＮＡプローブを用いては、変性条件が所望の断片化、すなわち二次構造の形成に影響を及ぼすだけではなく、プローブとの所望のハイブリダイゼーションをも崩壊させるため、不可能である。ホルムアミドのような変性剤の存在は、標的に対するプローブ配列の単一の塩基対の区別の達成に必要な温度を低下させる。このため、ハイブリダイゼーション検定のアニーリング工程を周囲温度もしくはその近辺で行うことができる。その結果、本発明のハイブリダイゼーション検定は、関連技術の検定よりも高い識別能力を持つことが可能である。従来技術の用途において、ＤＮＡの２つの独立の鎖を分離する前にはプローブのハイブリダイゼーションは行われない。伝統的な技術においては、標識プローブが電場の中を移動し、これが大過剰で用いられる。したがって、過剰のプローブが非常に強い信号として現れ、これが幾つかの標的の正確な検出を妨げる可能性がある。加えて、ポリヌクレオチド／プローブ複合体が容易に解離するため、解離の程度に応じて、検出に利用することができる信号はほとんど、もしくは全くない。分離媒体が変性剤を含んでいた場合、全ての複合体は急速に解離して何も検出されない。標識ＤＮＡ及びＲＮＡプローブとは異なり、本発明の標識ＰＮＡプローブは、相補的ヌクレオチド鎖の存在下においてさえ、ヌクレオチド試料中の標的配列とハイブリダイズしたままであり得る。形成されるＰＮＡ／核酸複合体は低塩の条件下において非常に安定であり、変性剤の存在下において分離及び検出を可能とするのに十分な程度に安定である。加えて、ＰＮＡは荷電しておらず、かつ電気泳動分離において実質的に移動しないため、成分のより良好な分離が得られる。一本鎖核酸はいかなる天然もしくは合成源からも得ることができる。例えば、所望の配列を検出しようと望むＤＮＡ又はＲＮＡのいかなる試料をも、当該技術分野において公知のいかなる方法によっても断片化及び変性させることができる。したがって、例えば、特定の診断用途において、少なくともヒトゲノムの一部を消化し、それを変性させ、それを本発明の方法における試料として用いることにより、特定の配列の存在を検出することができる。一態様において、低イオン強度緩衝剤を用い、温度を約６５℃以上に約５分間上昇させることにより、二本鎖ヌクレオチドの断片を変性させ、それらのヌクレオチド断片が再アニールする前にそれらのうちの１つにＰＮＡプローブをハイブリダイズさせることが可能である。この態様において、変性したヌクレオチド断片及びＰＮＡプローブを含む試料をゲルに直接導入し、電場に置く。ＰＮＡプローブ及び相補的ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を含むハイブリダイズした複合体は、未結合プローブ及び一本鎖ヌクレオチドとは異なる電気泳動移動度を示す。ＰＮＡプローブは中性であるため、ハイブリダイズしていないプローブは電場の下ではゲル中を移動することはない。時には、プローブに結合している標識がプローブに幾らかの電荷を付け加えることもあるが、その標識プローブの電気泳動移動度は一般に小さく、迅速で完全な分離を可能にするのに十分な程度ハイブリダイズしたＰＮＡ／ヌクレオチド二重鎖とは異なる。このため、一本鎖核酸断片及びハイブリダイズした複合体だけがゲル中に侵入して移動する。したがって、標的配列を含む断片を、その断片とハイブリダイズしているプローブ上の標識を検出することにより検出することが可能である。この技術に関しては、ＰＮＡプローブとの競合を防ぐための相補的ヌクレオチド鎖を分離するさらなる工程は必要ないことに注目されたい。簡単な概要において、本発明の方法は、まず関心のある標的配列の少なくとも一部と相補的であり、かつそれとハイブリダイズすることが可能なＰＮＡプローブを設計することにより実施することができる。標的配列は、試料中に検出しようとする核酸配列のあらゆる既知の配列である。標的配列は、様々な態様において、関心のある遺伝子をコードする配列であり得る。標的配列の例には、プロモーター配列、遺伝子座、病原体に特異的な配列、癌遺伝子に特異的な配列、遺伝的に変更された植物及び生物に特異的な配列、遺伝的欠損に特異的な配列、ＰＣＲのような方法で増幅された配列、及びＺｎフィンガーのような共通構造モチーフをコードする配列が含まれるがこれらに限定されるものではない。より詳細には、ＰＮＡはペプチドの合成に用いられるものに類似する方法によって合成することが可能である。単量体シントンからＰＮＡを作製する方法は当該技術分野において公知である。本発明のＰＮＡプローブは、好ましくは、標的配列とのハイブリダイゼーションの際に標識ＰＮＡ／核酸複合体を形成するように、検出可能な基で標識される。フルオレセイン又はビオチン標識ＰＮＡプローブは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のＥｘｐｅｄｉｔｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍで合成することができる。ビオチン（Ｂｉｏ）又はフルオレセイン(Ｆｌｕ)の活性化エステル、例えば１−(４’−ニトロフェニル)ピラゾリン−５−オン（ＤＭＴｒ−Ｂｉｏ−ＨＰＰ）のジメトキシトリチルビオチンエステル又は５，６−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを反応させる前に、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノン酸(−ｏｏ−)のスペーサー単位を樹脂結合ＰＮＡに添加する。その後、標識ＰＮＡを樹脂から切り離し、保護基を除去して本発明において用いられる標識ＰＮＡプローブを得る。ＰＮＡを蛍光染料で標識する方法も当該技術分野における熟練者に公知である。次に、関心のある標的配列に対応するＰＮＡプローブを試験しようとするポリヌクレオチドの試料中に導入する。この試料はＤＮＡを含んでいてもＲＮＡを含んでいてもよく、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。試料が当初二本鎖である場合、ＰＮＡプローブを添加する前に変性させると、試料は一本鎖ポリヌクレオチドとそれらの相補鎖の溶液を含む。プローブはＤＮＡの相補鎖と競合し、標的配列が存在する場合には少なくともその一部と優先的に結合して検出可能な二重鎖を形成する。ＰＮＡ及びＤＮＡプローブの性能の差は分子のオン及びオフ速度の差によるものであることが部分的には信じられる。ＰＮＡのより速いオン速度はそのハイブリダイゼーション時間をより短いものにする。ＰＮＡのより遅いオフ速度は、ＤＮＡプローブで使用可能なものよりも広範な温度範囲全体にわたってハイブリダイズし、かつ洗浄に耐えるＰＮＡの能力により、ミスマッチをより容易に識別することを可能にする。加えて、ＤＮＡプローブとＰＮＡプローブとのオフ速度の差は、プローブの長さが減少するにしたがって大きくなる。実際、従来技術において１３残基未満の長さのオリゴヌクレオチドはプローブとして使用することができず、これに対してＰＮＡは１０残基という短さでも検出に十分な信号を出す。このため、本発明に従って、僅かに４残基のタンパク質配列の情報に基づいてＰＮＡプローブを設計することができる。したがって、ＰＮＡは様々なハイブリダイゼーションベースのＤＮＡ／ＲＮＡ用途に有用であり、この用途には点変異の直接検出、固相親和性捕獲及び反復配列を含むＤＮＡのＰＣＲの改善が含まれるがこれらに限定されるものではない。ＤＮＡ及びＲＮＡへのＰＮＡの結合の塩依存性は請求される発明のとりわけ魅力的な特徴である。ＰＮＡは低塩条件下、例えば約１０ｍＭ未満の濃度で、緊密に結合することが可能である。これらの条件の下では、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の形成（すなわち、二次及び三次構造）は非常に不首尾になり、又は妨げられる。したがって、低イオン強度の条件下で核酸試料をＰＮＡプローブと混合することが好ましいことがある。これらの条件は、塩濃度によって比較的影響を受けることがないＰＮＡプローブ／核酸のハイブリダイゼーションに好都合であり、これに対して核酸／核酸相互作用は高イオン強度の条件において好都合である。好ましくは、混合物のイオン強度は約１ないし約５０ミリモル濃度の範囲である。特定の態様においては、篩分け媒体に導入する前に、試料及びプローブを特定の期間、すなわち約１分ないし３０分間インキュベートし、成分が相互作用して複合体を形成するためのより長期間の機会を与えることが好ましいことがある。熟練技術者は、定型の実験を用いるインキュベート工程を含めるのに適切であり、及び／又はそれが必要である時期を決定することができる。標識プローブをヌクレオチド試料と混合した後、ハイブリダイズしたＰＮＡ／核酸二重鎖を過剰の標識プローブから分離しなければならない。好ましくは、これらの二重鎖を、標的配列を含まない相補的ヌクレオチド鎖及び他の未結合成分のような試料中の他の種からも分離する。多くの分離技術が当該技術分野において公知であり、本発明の方法において有用である。例えば、電気泳動、クロマトグラフィ、質量分析及び他の方法により試料中の種を分離することができる。好ましくは、篩分け媒体を用い、もしくは用いない電気泳動により成分を分離する。しかしながら、クロマトグラフィ媒体、例えば灌流クロマトグラフィ媒体、すなわちＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，好ましいものであり得る。特定の態様においては、篩分け媒体はポリアクリルアミド又はアガロースを含むスラブゲルに形成する。ここで用いられる場合、篩分け媒体は試料中の種をサイズに基づいて分離することが可能ないかなる媒体であってもよい。当該技術分野における熟練者は、所望する特定のサイズ分離に基づいて適切な媒体を容易に選択することができる。篩分け媒体は、例えば、ポリアクリルアミド、アガロース、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリジン及びメチルセルロースからなる群より選択することができる。媒体は溶液であってもよく、液状であってもゲル状であってもよく、かつ板状形態であっても毛管の形態であってもよい。化学成分の電気泳動速度は電場におけるその電気泳動移動度及び電気浸透流によって決定される。成分の電気移動度は電気泳動媒体の性質、例えば、ｐＨ、イオン強度及び粘度の影響を受け得る。電気泳動媒体は、その系の特定の成分の電気泳動移動度を選択的に妨げる物理的特性について選択することが可能である。例えば、媒体に添加される篩分け剤の量によって種の分子移動を変更し、したがって、電気泳動移動度を変更することが可能である。特定の態様においては、篩分け媒体は必要ではなく、緩衝剤が成分の分離に十分な電気泳動媒体である。別の態様においては、媒体は変性性であっていてもよい。当業者は、当該技術分野において公知のあらゆる手段、例えば温度の上昇又は変性剤の添加、によって媒体を変性性にさせることができることを理解するであろう。電気泳動での移動を付与するのに必要な電位は、典型的には、一般にセンチメートル当り１００ボルトないしセンチメートル当り数千ボルトの範囲の電場強度で作動する高電圧源によって媒体を横切って印加される。好ましくは、電場はセンチメートル当り約１００ないし５００ボルトである。例えば、米国特許第４，８６５，７０６号及び第４，８６５，７０７号を参照のこと。ＰＮＡはポリアミド主鎖を有するため、これらは本質的に荷電していない。したがって、過剰のプローブからのＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの分離は、高度に荷電したハイブリッドが電場の中を迅速に移動し、これに対して本質的に中性のプローブはゆっくりと移動するか、もしくは全く移動しないため、比較的容易である。上述のように、標識が小電荷をプローブに付与することがあるが、ＤＮＡもしくはＲＮＡプローブと同様に、ＰＮＡ／ヌクレオチド複合体の分離に大きく影響することはない。一態様において、篩分け媒体は電気分離通路内に配置され、そこに試料及びプローブが添加される。電気泳動は、毛管又は通路における毛管電気泳動により、篩分け媒体を用いて、もしくは用いずに、有利に行うことができる。毛管又は通路はいかなるサイズであってもよいが、毛管又は通路の断面積を小さくすることにより高速及び高解像度のために用いられる非常に高い電場が可能となる。通路は、好ましくは、深さが約０．１μｍないし約１０００μｍであり、幅が約１０ μｍないし１０００μｍである。毛管は、好ましくは、約２５μｍないし１００ μｍ径である。このような形態により、蛍光又はＵＶ吸収による標識の定量的検出が容易になる。これは自動化に非常に都合が良い。特定の態様においては、複数の検定を平行して行うことによる高い処理量を可能にするために多通路マイクロチップを用いることができる。マイクロチップは１００までの通路を有することが可能である。次に、通路内に収容される電導性篩分け媒体に電位を印加し、ハイブリダイズした二重鎖及び試料の他の成分を移動させる。電気浸透流、電気泳動移動度、電気泳動媒体の化学、ｐＨ、温度、イオン強度、粘度、試料の容量、電位、毛管の長さ、篩分け媒体の性質及び量、検出法等を含むがこれらに限定されるものではない、請求される発明の多くの実験パラメータは変動し得る。これらのパラメータは実施される電気分離分析のいかなるものについても最適化することができる。これらのパラメータの１つ以上を変更することにより、当業者が定型の実験を用いて本発明を利用することが可能になり、請求される方法に万能性が付与される。分離工程の後、請求される方法はハイブリダイズした複合体の検出に備える。検出は、紫外線の吸収、可視光線の吸収、蛍光、化学発光、屈折率、ラマン分光分析、質量分析、電気化学及び伝導率を含むがこれらに限定されるものではない方法によって達成することができる。幾つかの態様においては、タンパク質、炭水化物及び核酸の検出又は位置決定に利用されているビオチンでＰＮＡプローブを標識することが好ましいことがある。Ｃｈｏｌｌｅｔら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．５，ｐｐ．１５２９−１５４１（１９８５）を参照のこと。熟練した実施者は、他の基を試料配列と組み合わせて用いて分離の解像度を増大させることができる。例えば、電荷変更基を混合物に添加して、電場の下でＰＮＡ／核酸複合体が受ける力を増大させることが可能である。簡単に述べると、そのような混合物を電気分離分析するそのような方法は、通路内で、（１）試料；（２）分析物の第１結合部位に結合する第１結合パートナー；及び（３）分析物の第２結合部位に結合する第２結合パートナーを含む混合物を電気的に分離する工程を包含する。第１結合パートナーは検出可能な基を含み、第２結合パートナーは電荷変更基を含むことが可能であり、したがって、未結合試料及び成分とは異なる電気泳動移動度を有するものと考えられる。特定の態様においては、特定の試料中の１を上回る標的配列を探索することが有用であり得る。このような多元的分析は様々な方法で行うことができる。例えば、分離がサイズに基づくものである場合には、そのような検定において検出される断片のパターンは独自のものであり、したがって分析の基礎である可能性がある。同様に、電気泳動により分離する場合にはこのパターンは電気泳動図として現われ、別の態様においてはこのパターンは写真フィルム上のスポットもしくはバンドとして現われ得る。当業者は、試料を１種類を上回る標的配列に向けられた１種類を上回る標識ＰＮＡプローブと接触させることにより、このような多元的検定を容易に行うことができる。様々なプローブ上の標識は同じであっても異なっていてもよい。検出の際、信号のパターンを標的配列について分析することができる。これらの多元的方法は、例えば、特定の遺伝子の同定、遺伝子多形、親子鑑定、又は診断用途において有用であり得る。好ましい態様においては、標識が独立に検出可能な異なる蛍光標識を有していてもよい。例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｍ．ら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１３：２３９９−２４１２（１９８５年）；及びＳｍｉｔｈ，Ｌ．Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：６７４−６７９（１９８６年）を参照のこと。特定の検定においては、複数の標識を用いることにより、標的配列が特定の断片と会合しているかどうかの絶対的な同定を容易にすることができる。加えて、単一の試料の分析の実施に用いられるプローブ（１種もしくは複数）が全て共通の標識を有するものの、その標識は異なる試料に対しては異なるものである１回の分離で、複数の試料を処理することができる。このため、一態様においては、標識は蛍光標識であってもよく、分離は電気泳動により行うことができる。したがって、全ての試料をプールし、１回の分離で分離することが可能である。全ての試料の全ての情報をハイブリダイゼーションの際に利用することが可能であり、異なる標識を識別することが可能な検出系を用いて獲得することができる。適切なデータ解析ツールを用いて、個々の試料の各々のデータを所望のときに個別に示して報告することが可能である。このように、請求される発明は、標的配列を有する分子のハイブリダイゼーション、分離及び検出の方法を提供する。伝統的な技術とは異なり、ハイブリダイゼーションは分離及び検出と同時に、又はそれ以前に生じさせることが可能である。ＤＮＡ又はＲＮＡプローブを用いる通常のブロット法は時間がかｋり、かつ労働集約的である多工程手順を包含し、これは、（１）変性した試料の篩分け媒体への導入；(２)電気泳動による分離；（３）膜への移行；（５）プローブとのハイブリダイゼーション；（６）厳密な洗浄；及び、最後に、（７）検出のための標識の発色を必要とする。対照的に、請求される方法は、プローブとのハイブリダイゼーション、篩分け媒体又は毛管の注入区域への試料の導入、及び検出に先立つ電気泳動による分離のみを必要とする。図１に関しては、従来技術のプロセスの流れ図及び本発明のプロセスの流れ図がそれらのそれぞれの工程を直接比較するために示されている。結果として、請求される方法は当該技術分野において公知の方法より迅速であり、かつ労働集約的なものではない。以下の例は、ＰＮＡプローブ／ヌクレオチド分析の有用性を従来のＤＮＡプローブ／ＤＮＡ分析と比較して明らかにする。実施例１予備ゲルハイブリダイゼーションＡ．実験の設計：表１Ａ及び１Ｂに関して、５種類の異なる融解／アニーリング（ハイブリダイゼーション）温度をビオチンで標識したＰＮＡ及びＤＮＡプローブ（試料Ａ−Ｅ）を用いて試験した。実験的対照は９４℃でのみ加熱したＤＮＡ／ＰＮＡ試料；及び５５℃のみで加熱したＤＮＡ／ＰＮＡ試料を含んでいた（試料Ｆ１及びＦ２）。各温度で、標的ＤＮＡの連続希釈（すなわち、２ｎｇ、０．２ｎｇ及び０．０２ｎｇ）を用いた（表１Ａ）。全ての試料には１ピコモル（ｐｍｏｌ）のプローブを含めた。混合物の最終塩濃度は１ｍＭトリス（７．５）、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であった。（ＴＥはトリスとＥＤＴＡとの混合物を指す。）各反応の総容量は１０μＬであった。ハイブリダイズした試料を１×ＴＢＥ（０．１３４Ｍトリス、４４．５ｍＭホウ酸、２．７ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡ）１％アガロースゲルに流した。ゲルに流した直後に、非荷電ナイロン膜への毛管移行を開始した。移行緩衝剤は２０×ＳＳＣ（３ＭＮａＣｌ、３００ｍＭクエン酸ナトリウム）であった。翌日、その膜を乾燥させてＵＶ（紫外光、その源は総エネルギー３３，０００μジュール／ｃｍ²の露光をもたらす）で架橋した。これらの膜を加熱密封バッグに入れ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから購入した化学発光キット（＃７００６）を用いてビオチン標識を検出した。この検出については製造者の指示に従った。膜をＸ線フィルムに露出させ、画像を得るために現像した。第１の温度は融解温度として、第２のものはアニーリング温度として働くように設計された。Ｂ．結果：図２Ａ及び２Ｂに関して、ＰはＰＮＡオリゴマープローブがアニール（ハイブリダイズ）していたことを示し、ＤはＤＮＡオリゴマープローブが核酸二重鎖にアニール（ハイブリダイズ）していたことを示す。Ｍはマーカーのレーンを示す。レーンＡ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１及びＥ１は、ゲル内バンドを示し、ゲル内に移動し、検出されているＰＮＡプローブ／核酸二重鎖を表す。各試料はハイブリダイゼーションの間に異なる温度条件に晒されていたため、この実験はアニーリング現象がまさに温度依存性であることを示す。同一の条件下においては、レーンＡ２、Ｂ２、Ｃ２、Ｄ２及びＥ２に示されるように、類似のＤＮＡプローブ／核酸二重鎖はほとんど検出されない。これらのレーンの各々において、標識ＤＮＡプローブは各レーンの底部の大きな環状の染みとして観察される。この染みは、過剰のＤＮＡオリゴマーが荷電しており、したがってゲル中を移動するため視認可能である。この染みは、それが小さく（１５ヌクレオチド）、ゲル内を非常に迅速に移動するためゲルの底部に存在する。反対に、ＰＮＡプローブに関するレーンは、これらのプローブが主に受動拡散によってゲル中を移動するため、導入ウェル近辺にのみバックグラウンドを示す。全ての試料のうちのレーン３及び５におけるＰＮＡ／核酸二重鎖の検出には、バンドを観察するためにより長いフィルムの露光時間を要した。したがって、検出の限界が標的ＤＮＡの出発量及び標的配列への結合に利用可能なプローブの量に依存する濃度依存性が存在する。対照は、試料ＤＮＡ／ＤＮＡが、ＤＮＡ／ＰＮＡ二重鎖の適切なアニーリング温度でもある５５℃でさえ融解することを示す。さらに、対照Ｆ１で二重鎖が形成されるため、アニーリング温度を得る必要はない。実施例２．異なるゲル系での予備ゲルハイブリダイゼーション実験Ａ．実験の設計：この実験においては、各々の試料を３つ調製した。二本鎖プラスミドＤＮＡの２種類の異なる制限消化物、１）制限酵素ＢｓｔＮＩで消化したｐＢＲ３２２（１２ｎｇを３つに分割）、及び２）制限酵素ＭｓｐＩで消化したｐＢＲ３２２、をこの実験に用いるために購入した。２種類の別々の出発濃度を消化したプラスミドの各々の試料に用いた（すなわち、５０ｎｇ及び１２ｎｇの出発プラスミド）。プラスミド消化物の各々の試料をエッペンドルフ管に入れ、この管に４ピコモル（ｐｍｏｌ）のビオチニル化ＰＮＡプローブ（５’−Ｂｉｏ−ｏｏ−ＡＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＣＡＴ−３’）、１／１０容量のトリス−ＥＤＴＡ緩衝剤及び脱イオン化濾過水（ｄＨ₂Ｏ）を添加して容量を３０ｍＬとした。これらの反応物を２０分間７０℃にした。次に、それらを３つに分割して適切な装着染料を添加し、４−２０％非変性アクリルアミドゲル（図３Ａ）、７Ｍ尿素−６％アクリルアミドゲル（図３Ｂ）又は１％アガロースゲル（図３Ｃ）のいずれかで分離した。次いで、各ゲル中の成分を毛管作用により非荷電ナイロン膜上に移行させた。この膜を乾燥させ、ＵＶ（紫外光、その源は総エネルギー３３，０００μジュール／ｃｍ² の露光をもたらす）で架橋させた。この膜を加熱密封バッグに入れ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌｏｂｓ．から購入した化学発光キット（＃７００６）を用いてビオチン標識を検出した。この検出については製造者の指示に従った。膜をＸ線フィルムに露出させ、画像を得るために現像した。Ｂ．結果：図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃに関して、試料は数字１、２、又は３で指示された場所にのみゲル上に導入した。すべての数字１はＢｓｔＮＩで消化したｐＢＲ３２２の４ｎｇであった。全ての数字２は、１６ｎｇという高い濃度のＭｓｐＩで消化したｐＢＲ３２２を表す。同様に、全ての３という数字は４ｎｇという濃度の低い、ＭｓｐＩで消化されたｐＢＲ３２２を表す。文字Ｍは、そのレーンにサイズマーカーを流したことを示す。予想通りに、異なるゲル条件に対して、成分の移動度はゲルからゲルで実質的に変化する。図３Ａに関して、レーン１は９３９塩基対（ｂｐ）の長さの一本鎖ＤＮＡ断片を含む。同じバンドが図３Ｃのレーン１に出現する。しかしながら、これは図３Ｂには見られない。これは、この断片が６％アクリルアミドを通してうまく電気泳動させるには大きすぎるためである。図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃのレーン２に見出されるＰＮＡ／断片複合体に関して、目視可能である約９７ｂｐのバンドの１断片がある。もう一度述べるが、異なるゲルは、同じ長さの断片において、異なる移動度を付与することは明らかである。図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃに見出されるレーン３は、レーン２に見られる断片／ＰＮＡ複合体のより薄い溶液であるが、これはそれぞれのゲル系の各々の同じ部分を流れる。この実験の組は、ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体が７Ｍ尿素−６％アクリルアミドゲル中及び装着染料に用いられるホルムアミド中で元のままに維持され／その状態を保つことを示す。そうでなければ、ＰＮＡが坦持するビオチン標識に検出が依存しているので、別個のバンドは目視できないはずである。６％アクリルアミドゲルで目視可能な唯一のバンドが約９７ｂｐのｐＢＲ３２２ＭｓｐＩバンドであることに注目されたい。このバンドはＢｓｔＮＩ標的（９３９ｂｐ）よりも非常に短い。このバンドは、６％アクリルアミドゲルが５００ｂｐよりも短い断片を分離するために、視認することができる。より大きな断片はゲルに入ることも、実質的に膜に移行されることもない。実施例３．制限酵素消化／予備ゲルハイブリダイゼーションＡ．実験の設計：６組の反応を２回行った。４ｎｇの直線化二本鎖ｐＢＲ３２２を反応の各々に用いた。ｐＢＲ３２２に２ｐｍｏｌのビオチニル化ＰＮＡ、１／１０容量のＴＥ緩衝液及びｄＨ₂Ｏを添加して反応容積を１０μＬにした。試料の組を指示される温度で１０分間インキュベートした後、徐々に（３０分を超えて）室温に冷却した。（試料２Ｂは最初に９４℃に加熱し、試料３Ｂ及びＤは８５℃に加熱し、試料４Ｂ及びＤは−７５℃に、試料５Ｂ及びＤは−６５℃に、試料６Ｂ及びＤは −５５℃に、及び試料７Ｂ及びＤは室温に放置した。）全ての試料を徐々に室温まで冷却した後、各試料にｄＨ₂Ｏ、１／１０容量の中程度の塩（ＮＥＢ２−１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭジチオスレイトール）及び１ｍｌのＰｓｔＩ制限酵素を添加した。これらを３７℃で２０分間インキュベートした後、一晩周囲温度で放置した。翌日、各々の管にさらに０．５μＬの制限酵素を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。図４に関して、１組の試料（Ｂ）に装着染料を添加し、アガロースゲルに導入する用意を整えた。別の組（Ｄ）は９４℃で１０分間インキュベートした。次いで、装着染料をＤ組に添加して試料を導入した。全ての試料を１％アガロースゲルを通して電気泳動させた。その後、各ゲル中の成分を毛管作用により非荷電ナイロン膜上に移行させた。翌日、この膜を乾燥させ、ＵＶ（紫外光、その源は総エネルギー３３，０００μジュール／ｃｍ²の露光をもたらす）で架橋させた。この膜を加熱密封バッグに入れ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ．から購入した化学発光キット（＃７００６）を用いてビオチン標識を検出した。この検出については製造者の指示に従った。膜をＸ線フィルムに露出させ、画像を得るために現像した。Ｂ．結果：図４に関して、目視し得る消化されたＤＮＡ（すなわち、短い断片が目視可能である）が存在する唯一のレーンが各試料のＤレーンに観察される。これは、ＤＮＡが消化されるためには、それが二本鎖となるように最初に再アニールされなければならないことを示す。再アニールが生じる際、ＰＮＡプローブは複合体から脱離する。Ｂレーンは消化されたＤＮＡ断片を含む。そのＤＮＡ断片はＰＮＡプローブが複合体から脱離するので、ＤＮＡがもはや標識されないために検出されない。Ｄレーンは、消化の後９４℃で１０分の処理によって二本鎖ＤＮＡが融解し、それによりＰＮＡがもう一度結合することが可能であったことから、ＰＮＡプローブに再アニールの機会があったため、目視可能である。図４はＰＮＡプローブ及び二本鎖ＤＮＡの幾つかの特徴を示す。第１に、融解温度が増大するに従って再アニーリングが実質的に長期間となるゆえに、ＤＮＡを高温で融解することが好ましい。第２に、ＰＮＡを一本鎖ＤＮＡに再アニールさせる機会を得たＤＮＡだけが消化されるように見える。６５、７５、８５及び９５℃については、ＰＮＡが結合したままの一本鎖ＤＮＡが幾らか存在する。これは５５℃又は室温のいずれかでは起こらない。第３に、ＰＮＡの存在下に消化の後に試料を再加熱することはしなかったため、我々は、切断されたＤＮＡは存在するものの、それは検出されないものと結論付けた。我々の全体的な結論は、我々がこれらのゲル上に可視化されたＤＮＡは一本鎖であり、このＤＮＡがゆっくりとしたプロセスで復元する際にＰＮＡを置換するというものである。実施例４．嚢胞性線維症遺伝子Ｗ１２８２の予備ゲルハイブリダイゼーションＡ．実験の設計：嚢胞性線維症キャリアにおけるＷ１２８２Ｘ変異を、毛管関連検定において１塩基変異を検出する方法の臨床検査における有用性の試験に用いた。図４Ａに関して、２つの野性型対立遺伝子Ｗ１２８２を含む影響を受けていない個人から提供されたＤＮＡ試料をレーン１及び２に、野性型対立遺伝子Ｗ１２８２及び変異体対立遺伝子Ｗ１２８２Ｘを含むキャリアから提供されたＤＮＡ試料をレーン３及び４に用い、野性型に対するフルオレセイン標識ＰＮＡ、Ｆｌｕ−ｏｏ−ＣＴＴＴＣＣＴＣＣＡＣＴＧＴＴ−ＮＨ₂、をレーン１及び３に、変異体に対するフルオレセイン標識ＰＮＡ、Ｆｌｕ−ｏｏ−ＣＴＴＴＣＣＴＴＣＡＣＴＧＴＴ−ＮＨ₂、をレーン２及び４に用いる、４種類のハイブリダイゼーション検定を平行して実施した。ＰＣＲ反応からの標的ＤＮＡ試料の各々（０．５−１．０μＬ）をフルオレセイン化ＰＮＡプローブ（０．５−１．０ｐｍｏｌ）及び１μＬの２５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）と混合し、ｄＨ₂Ｏで総容積を１０μＬとした。各混合物を９５℃で１０分間加熱した後、１０分間周囲温度に冷却した。装着染料を添加し、各混合物を１．５％ＴＢＥアガロースゲルに導入して２５分間電気泳動した。このゲルに対してナイロン膜へのサザン移行の準備を整えた。検出の前に、膜を乾燥させて２５４ｎｍで架橋させた。架橋した膜をアルカリホスファターゼＤＡＫＯ（＃Ｋ０４６、コペンハーゲン、デンマーク）に直接結合する抗フルオレセイン抗体と共に加熱密封バッグに入れることにより、フルオレセイン化ＰＮＡプローブ及びＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの化学発光の検出を行った。膜を５容量のＴＭＳ（１０ｍＭトリス、ｐＨ９．５、１０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ₂）で２分間及びルミゲン（Ｌｕｍｉｇｅｎ）（Ｐｒｏｔｏｔｐｅ＃７００６、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ．）溶液ですすいだ。この膜を富士ＲＸフィルムに露出した。Ｂ．結果図４Ａに関して、制御された温度により緊密な条件が適用されなかったが、非常に効率的な識別が観察された。レーン３及び４のキャリアから提供された試料に由来するバンドの強度は、レーン１の野性型ＰＮＡ／ＤＮＡプローブから生じるバンドの強度のほぼ半分であった。変異体ＰＮＡプローブはレーン２の野性型ＤＮＡ試料とはハイブリダイズせず、これは試料ＤＮＡの１塩基対の識別に適用された場合のこの方法の高い特異性を示す。全てのレーンにおいて過剰の標識ＰＮＡプローブが様々な強度で観察され、最も強度が高いのは、変異体ＰＮＡプローブが検出可能な量の野性型ＤＮＡ試料とのハイブリッドを形成しなかったレーン２において観察されたものであった。観察された１塩基対の識別の効率は、１）標識ＰＮＡプローブは本質的に非常に特異的であり、かつ２）比較的長さが短いＰＮＡプローブ、及び最も重要なことは小過剰のプローブのみが検定に用いられるという、２つの因子によるものである。これは、大過剰の（ＤＮＡ）プローブが通常用いられる伝統的なサザンブロッティングとは対照的である。過剰の変異体ＰＮＡプローブを野性型ＤＮＡ試料と共に用いた場合、偽陽性が観察された(図４Ｂのレーン５)。実施例５毛管電気泳動によるサザンブロットデータの迅速な取得Ａ．毛管電気泳動（ＣＥ）装置ＬａｓｅｒＭｏｄｕｌｅ４８８アルゴンイオンレーザーを備えるＰ／ＡＣＥ２０５０毛管電気泳動装置ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、フラートン、ＣＡ、ＵＳＡ）を５２０ナノメートル（ｎｍ）バンドパスフィルターと共に、レーザー誘発蛍光（ＬＩＦ）検出に用いた。紫外（ＵＶ）吸収検出は２６０ｎｍで行った。分離は、注入側のカソードを用いて陰極性モードで行った。毛管は、長さ３５センチメートル(ｃｍ)（検出器に２８ｃｍ）、内径（ｉ．ｄ．）７５ μｍの未処理毛管（長さ３５ｃｍで検出器まで２８ｃｍ）（Ｐ／Ｎ２００００１７、ＰｏｌｙｍｉｃｒｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フェニックス、ＡＺ、ＵＳＡ）であった。Ｂ．材料市販プラスミド（Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ）並びにＢｓｔＮＩ（Ｐ／Ｎ＃３０３ −１Ｓ）及びＭｓｐＩ（Ｐ／Ｎ＃３０３−２Ｌ）制限酵素消化プラスミドｐＢＲ３２２をＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓビバリー、ＭＡ、ＵＳＡから入手した。これらは、関心のある既知標的配列を有する核酸試料として役立った。トリス−ホウ酸 −エチレンジアミン四酢酸（ＴＢＥ）緩衝剤粉末をＳｉｇｍａ（セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）から入手し、１×ＴＢＥ（ｐＨ８．３）を調製した。１％ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）（ＭＷ４，０００，０００ダルトン）ポリマー緩衝液を１×ＴＢＥ緩衝液を用いて調製した。標的に対して完全に相補的な配列及び塩基対ミスマッチの両者を有するフルオレセインもしくはビオチン標識ＰＮＡプローブを、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フラミンガム、ＭＡ、ＵＳＡ）からの促進核酸合成システムで合成した。ビオチン（Ｂｉｏ）又はフルオレセイン（Ｆｌｕ）の活性化エステル（例えば１−（４’−ニトロフェニル）ピラゾリン−５−オン（ＤＭＴｒ− ｂｉｏ−ＨＰＰ）のジメトキシトリチルビオチンエステル又は５，６−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を反応させる前に、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノン酸（−ｏ−）のスペーサー単位を樹脂結合ＰＮＡに添加した。その後、標識ＰＮＡを樹脂から切り離し、ＴＦＭＳＡ／ＴＦＡ／ｍ−クレゾール／チオアニソール（２：６：１：１）混合物を室温で２時間用いて保護基を除去した。この標識ＰＮＡを、無水エーテルを添加することにより濾液から沈殿させた。この粗製ＰＮＡ沈殿を、ＤｅｌｔａｐａｃｋＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）でのＨＰＬＣ及びＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５で蛍光性不純物を除去することにより精製した。以下の実験において用いられる様々な標識ＰＮＡプローブの配列を表２に列挙する。Ｃ．実験の設計（プローブハイブリダイゼーション）関心のあるＤＮＡ標的（１０^-7−１０^-8Ｍ核酸試料）を含む１０マイクロリットル（μｌ）の溶液及び標識ＰＮＡプローブ（１０^-6−１０^-7Ｍ）を含む１０μ ｌの試料をマイクロバイアルに加えた。この混合物を９５℃で１０分間加熱してＤＮＡのあらゆる二本鎖伸展物（二次構造）を融解した後、周囲温度に冷却した。次いで、この試料を毛管電気泳動装置に導入し、分離を実行した。検出能力は上記の装置に組込まれている。Ｄ．結果実験１．ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションの温度制御フルオレセイン標識ＰＮＡプローブと、Ｍ１３ｍｐ１８プラスミドに対して相補的なＦｌｕ−ｏｏ−ＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡ−ＮＨ₂、１塩基ミスマッチのＦｌｕ−ｏｏ−ＴＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣＡＣＧＡ−ＮＨ₂、及び２塩基ミスマッチのＦｌｕ−ｏｏ−ＴＴＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＣＧＡ−ＮＨ₂配列とのハイブリダイゼーションに対する温度制御実験を行った。上述の通りに試料を調製し、上述の装置で分析した。この実験については、サーモスタットで調節され、それにより分離の間の温度制御が容易なカートリッジ内に毛管を配置した。一連のＣＥ分離を、２０キロボルト（ＫＶ）の電位の下、１０℃ないし５０℃の範囲の温度で行った。分析は、１×ＴＢＥ緩衝液（ｐＨ８．３）中の３０％ホルムアミドの存在下（図５）及び非存在下（図６）において行った。ＬＩＦ検出は、励起については４８８ｎｍ、発光については５２０ｎｍで行った。一般的には、塩基対ミスマッチの数が増加するに従ってハイブリッドの融解点が減少することが観察されたが、これは予想された結果である。ホルムアミドの非存在下において得られたデータを図６に示す。図６に関しては、曲線Ｂが２塩基ミスマッチについて得られたデータを表し、曲線Ａが相補的ＰＮＡプローブについて得られたデータを表す。曲線Ａが比較的平坦であり、相補的プローブから形成される二重鎖が記録された全ての温度で安定であることを示す。曲線ＢのＳ字形状は熱融解プロフィールに典型的なものであり、２塩基対のミスマッチを有するプローブが３０℃未満の温度で標的と実質的にアニールし、かつＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の融解点が約３３℃であることを示す。ランニング緩衝液中３０％のホルムアミド（変性剤）の存在下において得られたデータを図５に示す。ここに示されるのは、相補的ＰＮＡプローブ（曲線Ａ）、１塩基ミスマッチＰＮＡプローブ（曲線Ｂ）及び２塩基ミスマッチＰＮＡプローブ（曲線Ｃ）を含む試料についての温度制御曲線である。曲線Ｃの低い信号レベル及び勾配の欠如は、２塩基ミスマッチを有するプローブが実験で用いられた温度範囲内では標的とアニールしないことを示す。曲線Ｂの勾配は、１塩基ミスマッチを有するプローブが標的とアニールするものの、その複合体が２５℃を上回る温度で完全に解離することを示す。曲線Ａは、これらの条件下で相補的ＰＮＡプローブで形成された複合体の融解温度（Ｔｍ）が３５ないし３８℃であることを示す。これは、蛍光信号が３５℃で急激に低下し始めるためである。このＰＮＡプローブ検定は、検定の特異性を高めるため、より高い温度及び変性条件下で行なうことが可能である。実験２．ＤＮＡのサイズ分離のための毛管ゲル電気泳動架橋していないポリマー（ＰＥＯ）をＤＮＡ分離のための毛管ゲル電気泳動（ＣＧＥ）における篩分け媒体として利用した。毛管電気泳動においては、未被覆毛管表面上のシラノールのイオン化により緩衝剤陽イオンの電気的“二重層”が表面を横切って形成されるという現象が起こる。毛管を横切って電圧を印加すると、陽イオンの二重層の移動が毛管内を陰極に向かうバルク流体の流れを生じる。この流れは電気浸透の結果であり、電気浸透流（ＥＯＦ）と呼ばれる。ＤＮＡ分離のための毛管電気泳動においてはＥＯＦを最小にすることが望ましい。ポリマーゲル充填未処理毛管の利点は、ＥＯＦが最小化され、低粘度ポリマー溶液を圧力の下で毛管の外に押出して容易に置き換えることができることである。様々な分子量のＰＥＯポリマーを試験した。０．５％ＰＥＯ（ＭＷ８，０００，０００ダルトン）充填未被覆毛管で電気浸透流が非常に少なかった。結果として、このモデル系を用いて、ＢｓｔＮＩ及びＭｓｐＩ消化物をＰＥＯゲル充填毛管によって分離した（図７）。全ての分離について１０ＫＶの電位を用いた。試料成分の検出は２６０ｎｍでのＵＶ検出により行った。ピークを、同じ試料のアガローススラブゲル電気泳動分離から得られたバンドと比較した。これらの２つの分離の分析及び製造者から提供される既知の分子量の基づいて既知のピークを割り当てた。図８はＢｓｔＮＩ及びＭｓｐＩ消化試料の較正曲線を表す。移動時間を核酸断片の長さに対してプロットした。このデータは３００塩基から１２００塩基まで極めて直線状である。変動係数（ＣＶ）（平均で割った標準偏差）は、ＭｓｐＩ断片の分離の６回繰り返した実行について、０．６５％未満であった。このデータは、この毛管が断片の適切なサイズ分離を行うことを示す。実験３．プローブハイブリダイゼーション及びＣＥ分析によるサイズ決定ｐＢＲ３２２ＤＮＡ試料の標的配列に相補的な配列を有するフルオレセイン標識ＰＮＡ７.５１０^-7Ｍプローブを上述の通り調製した。ｐＢＲ３２２ＤＮＡ（１０００μｇ／ｍＬ）のＭｓｐＩ（１０００μｇ／ｍＬ）及びＢｓｔＮＩ消化物の両者を標的として用いた。標的配列及びＰＮＡプローブの配列を以下に示す。ｐＢＲ３２２ＤＮＡ：５’−−−−−ＡＴＧＣＧＡＣＴＣＣＴＧＣＡＴ−−− −−３’ ＰＮＡプローブ：Ｈ₂Ｎ−ＴＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＴＡ−ｏｏ− Ｆｌｕフルオレセイン標識ＰＮＡ（過剰）をｐＢＲ３２２ＤＮＡ消化物と混合することにより、均質溶液ハイブリダイゼーションを行った。次いで、この混合物を９０℃に５分間加熱して二本鎖ＤＮＡを変性させた。次に、これらの試料を周囲温度に冷却した。その後、この混合物を、上述の毛管及び装置を用いるＬＩＦ検出を伴う毛管ゲル電気泳動により分離した。図９に関して、標識ＰＮＡプローブ及び標的配列を有するＢｓｔＮＩ消化の核酸断片（９２９塩基）から形成されたＰＮＡ／核酸二重鎖を検出することができる（ピーク１）。標識ＰＮＡプローブのフルオレセイン標識が負電荷を坦持するため、標識ＰＮＡプローブがゲル中に移動して同様に検出される（ピーク２）。図１０に関して、標識ＰＮＡプローブ及び標的配列を有するＭｓｐＩ消化の核酸断片（９７塩基）から形成されたＰＮＡ／核酸二重鎖を検出することができる（ピーク１）。標識ＰＮＡプローブのフルオレセイン標識が負電荷を坦持するため、標識ＰＮＡプローブがゲル中に移動して同様に検出される（ピーク２）。図１１に関して、図５及び７において引用の試料の比較分離が、標的配列を有する断片の比較サイズ分離を行うことが可能であることを示す。したがって、ピーク１は標的配列を有するＭｓｐＩ断片（９７塩基）と標識ＰＮＡプローブとから形成された二重鎖である。ピーク２は標的配列を有するＢｓｔＮＩ断片（９２９塩基）と標識ＰＮＡプローブとから形成された二重鎖である。ピーク３は、再び、過剰のフルオレセイン標識ＰＮＡプローブである。相補的配列を有する断片は、ＣＧＥ−ＬＩＦにより、３０分以内に分離されて特異的に検出される。その結果、３０分の実験１回で、試料についてのサイズ及び配列の両者の情報が得られる。分析を固体基板に形成された通路において行われるマイクロチップの形態を用いて行うことにより、高処理量を達成することができる。このような装置は、多くの分析実験を平行して行うことを可能にする複数の通路を設けて作製することが可能である。ＳｔｕＢｏｒｍａｎ，ＤｅｖｅｌｏｐｅｒｓｏｆＮｏｖｅｌＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｓＣｌａｉｍＭａｊｏｒＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＡｄｖａｎｃｅｓ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＮｅｗｓ，Ｊｕｌｙ２４，１９９５，ｐｐ．３７−３９を参照のこと。別の態様において、請求される発明は、試料中の分析物の存在、非存在又は濃度を検出するための装置を提供する。この装置は、様々な態様において、例えば、試料注入区域、該注入区域に導入された試料と混合するように配置されるＰＮＡプローブ、及び分離区域を具備するができる。幾つかの態様においては、この装置は試料インキュベーション区域を具備していてもよい。図１２に関して、特定の態様において、装置１０は試料注入区域２４を具備する。１以上のＰＮＡプローブ２８が、試料注入区域２４内に、試料が区域２４に導入された際にプローブ２８がこの試料と接触するように、配置されている。標的が存在する場合、プローブは該標的とハイブリダイズする。この装置は、その内部に分離媒体３６が配置されている毛管又は通路２０をさらに具備し、この通路は試料注入区域２４、緩衝液貯留所１６、注入物／廃棄物貯留所２６、及び廃棄物貯留所３０と連通している。特定の態様において、試料注入区域２４と毛管２０との合流点は注入物／廃棄物貯留所２６と毛管２０との合流点より上流である。この食違い設計は注入容積をより大きくすることを可能にする。その操作について、図１３Ａに関して、試料を注入区域２４に添加し、標的が存在する場合にはそれがプローブ２８とハイブリダイズする。区域２６に適用されているグランド(ＧＮＤ)に対して高電圧（ＨＶ）を区域１６、２４及び３０に印加し、流動する試料の流れをはさむように制御し、サンプリング時間の影響を受けない注入容積を与える、分離通路２０への試料２２の拡散を妨げる。その後、区域１６、２４、３０と２６との間の電位を遮断し、区域１６と区域３０との間に電位を付与してサイズ及び電気泳動移動度により試料の成分、例えば図１３Ｂに示される成分３４及び３８を分離する。好ましい態様においては、この装置を温度制御手段３２（図１２）と接触させて配置することができる。温度制御手段３２は、分離媒体３２を変性させることに加えて、注入区域内の二本鎖試料を融解もしくは変性させるように活性化させることが可能である。幾つかの態様においては、試料を試料区域２４に添加し、その試料を変性させるように温度制御手段を調整し、かつプローブ２８とのハイブリダイゼーションが生じ得るように再度温度制御手段３２を調整することができる。幾つかの場合には、分離媒体３６を変性させるように再度温度制御手段３２を調整することが望ましいことがある。別の態様においては、この装置は固体基板に形成された複数の平行な通路を有するマイクロチップである。このような装置は多くの別々の分析を平行して行うことを可能にし、それにより高処理量を達成する。簡単な概要において、図１４に関して、装置１１は、各々が注入区域２４、緩衝剤貯留所１６、注入物／廃棄物貯留所２６、及び廃棄物貯留所３０を有する複数の毛管通路２０を具備する。好ましい態様においては、この装置は温度制御手段３２と接触して配置される。あらゆる検出手段を本発明の装置において利用することが可能であり、それは当業者が容易に選択することができる。本発明の方法及び組成物に従って用いられる場合、この装置は試料中の分析物の定性的及び定量的検出を許容する。このようなマイクロチップ分離装置は、溶融シリカウェハに通路構造を作製するのに写真平板術及び化学エッチング剤を用いることにより、製造する。アクセス孔は、通路の末端に、エッチングしたウェハを通してレーザー穿孔する。第２の溶融シリカウェハをエッチングしたウェハに接着させて取り囲まれた通路を作製する。接着の後、ウェハを個々の分離チップに切断する。より詳細には、この微小作製を行うため、クロムのフィルム（４００Å）を溶融シリカ基板（７５ｍｍ径×０．４ｍｍ；ホヤ、東京、日本）上にスパッタリングする。Ｐｈｏｔｏｒｅｓｉｓｔ（Ｓｈｉｐｌｅｙ１８１１、ニュートン、ＭＡ）をウェハ１１上にスピンコートし、９０℃で２５分間焼付ける。この樹脂を、密着整列Ｐｈｏｔｏｍａｓｋ(ＡｄｖａｎｃｅｄＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓ、ウィルミントン、ＭＡ)を通してＵＶ（３６５ｎｍ）照射に晒し、Ｍｉｃｒｏｐｏｓｉｔ現像液（シップレー）で現像することによりパターン形成する。Ｋ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆／ＮａＯＨ（ＣｈｒｏｍｅＥｔｃｈ、シップレー）を用いてクロムを除去する。ウェハ１１をＮＨ₄Ｆ／ＨＦ（１：１）エッチング剤に５０℃で浸漬することにより、得られたマスクパターンを溶融シリカにエッチングする。エッチングの深さはエッチング時間を監視することにより制御し、プロフィロメーター（ミツトヨ）で測定する。この研究で利用されるマイクロチップは２８μｍの深さにエッチングされ、これは等方性エッチング条件のために通路の上部で６６μｍの通路幅２０を生じる。通路２０の断面積は内径４４μｍの円筒状毛管と同等である。Ｐｈｏｔｏｒｅｓｉｓｔをアセトンで除去し、残留クロムをＫ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆／ＮａＯＨを用いて溶解する。通路の末端へのアクセス手段はエッチングしたウェハ１１を貫通するレーザー穿孔による孔によって与えられる。第２の溶融シリカウェハをエッチングしたウェハに接着させて通路を取り囲む。両ウェハを５０℃のＮＨ₄ＯＨ／Ｈ₂Ｏに浸漬し、Ｈ₂Ｏですすぐ。その後、それらを接触させた状態で置き、熱的に接着した。最初の接着を２００℃（２時間）で行った後、１０００℃（一晩）で最終的な接着を形成させた。ガラス管から切り出した個々の貯留所１６、２４、２６及び３０をシリコーン接着剤（ＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇ）で取り付ける。図１５に関して、そのような溶融シリカマイクロチップを電源及びチップベースの検定のための蛍光光学系に連結する。高電圧をＳｐｅｌｌｍａｎＣＺＥ１０００Ｒ電源（プレインビュー、ＮＹ）又は他の適切な電源によりスイッチング回路又はレジスタネットワークを介して加える。焦点距離１０ｃｍのレンズを用いて５３°の入射角で通路に焦点が合わされている、４８８ｎｍでの〜３ｍＷの励起で作動するＯｍｎｉｃｈｒｏｍｅ（チノ、ＣＡ）アルゴンイオンレーザー又は他の適切な装置を用いて、レーザー誘導蛍光検出を行う。２０×顕微鏡対物レンズ（ＥｄｍｕｎｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、バーリントン、ＮＪ）により蛍光放射が集められる。集められた光はイメージプレーンの内径２ｍｍの開口によって空間的に濾過され、２つの５２０ｎｍバンドパスフィルター（５２０ＤＦ３０）ＯｍｅｇａＯｐｔｉｃａｌ（バトルボロ、ＶＴ）によって光学的に濾過される。電位計（例えばＫｅｉｔｈｌｅｙ６１４、クリーブランド、ＯＨ）に接続された光電子増倍管（例えば、ＨａｍａｍａｔｓｕＲ９２８、ブリッジウォーター、ＮＪ）が蛍光信号を検出する。この信号をＰＣ制御２０ビットデータ取得システム（例えば、ＤａｔａＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ２８０４、マールバロー、ＭＡ）でデジタル化し、適切なソフトウェア（例えば、ＡＤＩ、アラメダ、ＣＡからのＣａｅｓａｒソフトウェア）を用いて分析する。従来のいかなる検出方法をも本発明の装置において用いることが可能であり、これにはより一般的な電気泳動法において用いられるものが含まれる。特定の種のいかなる適切に検出可能な物理的特性の検出をも可能にする検出方法が選択される。これらの検出システムには、紫外線又は可視光の吸収、蛍光、屈折率、ラマン、質量分析、化学発光、電気化学、及び伝導率が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに別の側面においては、請求される発明は、電気分離分析を用いて標的配列の存在、非存在又は濃度を検出するためのキットを提供する。キットの好ましい態様は、様々な試料に含まれる予め選択された標的配列を検出するように構成されている。詳細には、本発明のキットは、予め選択された変性篩分け媒体及び本発明のＰＮＡプローブを収容する容器ハウジングを含むことができる。本発明のキットは、幾つかの態様においては、核酸試料中の関心のある遺伝的特徴に独特の１種以上の異なる標的配列にアニールすることが可能な２種以上の標識プローブを含んでいてもよい。プローブ上の標識は同じであっても異なっていてもよく、独立に検出することができるものであってもよい。特定の態様においては、本発明のキットは、１つの通路もしくは複数の通路を具備する電気分離装置をさらに提供する。本発明のキットは、ここで定義される１つの毛管もしくは複数の毛管を具備する使い捨て装置を任意に提供することが意図されている。このような微小通路装置の利点は以下の実験から理解される。実施例６マイクロチップでのＰＮＡ／ＤＮＡ検定Ａ．実験の設計フルオレセイン標識ＰＮＡプローブを上述の通り調製した。標識ＰＮＡプローブはｐＢＲ３２２ＤＮＡに相補的な配列を有する１５量体（質量分析による測定でＭＷ４７７４）である。ｐＢＲ３２２ＤＮＡの２種類の制限酵素消化物、ＢｓｔＮＩ及びＭｓｐＩ、の混合物を標的として用いた。ｐＢＲ３２２ＤＮＡ：５’−−−−−ＡＴＧＣＧＡＣＴＣＣＴＧＣＡＴ−− −−−３’ ＰＮＡプローブ：Ｈ₂Ｎ−ＴＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＴＡ−ｏｏ−Ｆｌｕフルオレセイン標識ＰＮＡ（過剰）をｐＢＲ３２２ＤＮＡ消化物と混合し、９０℃で５分間加熱して二本鎖ＤＮＡを変性させ、室温に冷却することにより均質溶液ハイブリダイゼーションを行った。この実験手順は上記実施例４の第３小区分に説明されている。この混合物を、ＬＩＦ検出を備えるマイクロチップゲル電気泳動により、７０４ｖ／ｃｍの電圧を印加して分離した。通路の幅は２２ｍｍであり、通路の断面は約１００μｍ×５０μｍであった。Ｂ．結果図１６に関して、フルオレセイン標識ＰＮＡと標的ＤＮＡ断片とのハイブリッドのサイズを検出することができる。ＰＮＡがフルオレセインで標識されているため、ＰＮＡプローブは負に荷電するフルオレセインに由来する負電荷を坦持する。結果として、フルオレセイン標識ＰＮＡは、それが陰極から注入された場合、電場の中を陽極に向かって毛管内を移動するが、ＤＮＡ又はＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドほどは速くはない。図１６は、ｐＢＲ３２２ＤＮＡＭｓｐＩ及びＢｓｔＮＩ消化物のＰＮＡプローブハイブリダイゼーション測定の電気泳動図を示す。ハイブリッドＰＮＡ／ＭｓｐＩ及びＰＮＡ／ＢｓｔＮＩ並びにＰＮＡプローブは、７０４Ｖ／ｃｍの下、検出器まで２２ｍｍの距離で分離する。ＰＮＡ／ＭｓｐＩ断片(９７塩基)ハイブリッド二重鎖及びＰＮＡ／ＢｓｔＮＩ断片（９２９塩基）ハイブリッド二重鎖の形成は３０秒以内に検出される。過剰のＰＮＡは４０秒後に検出される。３０秒以内に相補的配列を有する断片が分離し、ＬＩＦにより特異的に検出された。実施例７嚢胞性線維症Ｆ５０８遺伝子Ａ．実験の設計嚢胞性線維症（ＣＦ）は一般的で致死的なリセッシブ（ｒｅｓｓｅｓｓｉｖｅ）障害である。この疾患を引き起こす主な変異（ΔＦ５０８）がＣＦ染色体の７０％で見出されている。実験手順は上記実施例５に説明されている。このΔＦ５０８変異は３塩基の欠失である。野性型（Ｆ５０８）及び変異体遺伝子（ΔＦ５０８）に対する以下のプローブを調製した。Ｆ５０８Ｆｌｕ−ｏｏ−ＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴ−ＮＨ₂ ΔＦ５０８Ｆｌｕ−ｏｏ−ＡＣＡＣＣＡＡＴＧＡＴＡＴ−ＮＨ₂ Ｂ．結果野性型嚢胞性線維症Ｆ５０８遺伝子に対する標識ＰＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション検定を、（ａ）影響を受けていない個人；(ｂ)影響を受けていないキャリア；及び(ｃ)影響を受けている患者から提供された３種類のＤＮＡ試料を用いる毛管電気泳動により行った。これらの結果を図１７Ａに示す。図１７Ａは、全てのものを等しくし、３つの検定を同時に平行して実行したものであるが、以下の事項を示している。最大の信号が影響を受けていない個人によって提供された試料から集められ、これは両遺伝子が野性型標識ＰＮＡプローブにアニールすることを示し；これより強度の劣る信号が健常キャリアによって提供された試料から集められ、これは２種類の遺伝子のうちの一方、野性型のもののみが野性型標識ＰＮＡプローブとアニールして変異体ΔＦ５０８遺伝子がアニールしないことを示し、かつ影響を受けている患者によって提供された試料からは有意の信号は検出されず、これはその試料から利用可能な野性型遺伝子が存在しないことを示す。第２ハイブリダイゼーション検定においては、変異体ΔＦ５０８に対する標識ＰＮＡプローブを用いて変異体遺伝子ΔＦ５０８の直接検出及び同定を可能にした。この検定は、（ａ）影響を受けていない個人；（ｂ）影響を受けていないΔ Ｆ５０８変異体のキャリア；及び（ｃ）影響を受けているΔＦ５０８変異を有する患者から提供された３種類のＤＮＡ試料を用いて毛管電気泳動により行った。これらの結果を図１７Ｂに示す。図１７Ｂは、全てのものを等しくし、３つの検定を同時に平行して実行したものであるが、以下の事項を示す。今回は、最大の信号が影響を受けている患者によって提供された試料から集められ、これは両ＤＮＡ遺伝子がΔＦ５０８標識ＰＮＡプローブとアニールして患者の試料から変異 ΔＦ５０８の存在の肯定的な同定を許容することを示し；これより強度の劣る信号が影響を受けていないキャリアによって提供された試料から集められ、これは遺伝子のうちの一方がΔＦ５０８標識ＰＮＡプローブにアニールし、これに対して第２の遺伝子はアニールせず、同様に変異ΔＦ５０８遺伝子の存在の肯定的な同定を許容することを示し；影響を受けていない個人によって提供された試料からは有意の信号は集められず、これはΔＦ５０８標識ＰＮＡプローブとのアニールに利用可能な試料からの変異ΔＦ５０８遺伝子が存在しないことを示す。これらの２つの検定の結果を表３に示す。この表は、２種類の型のＰＮＡプローブを用いた様々なＤＮＡ試料からの信号応答のパターンを示すものである。実施例８嚢胞性線維症Ｗ１２８２遺伝子Ａ．実験の設計上記と類似の実験を嚢胞性線維症遺伝子Ｗ１２８２について行った。嚢胞性線維症遺伝子Ｗ１２８２は点変異を１つ有する。実験手順は上記実施例５に説明されている。以下の野性型（Ｗ１２８２）及び変異体遺伝子（１２８２Ｘ）に対するＰＮＡプローブを調製した。Ｗ１２８２（ＷＴプローブ）Ｆｌｕ−ｏｏ−ＣＴＴＴＣＣＴＣＣＡＣＴＧＴＴ−ＮＨ₂ Ｗ１２８２Ｘ（Ｍプローブ）Ｆｌｕ−ｏｏ−ＣＴＴＴＣＣＴＴＣＡＣＴＧＴＴ−ＮＨ₂ Ｂ．結果野性型嚢胞性線維症Ｗ１２８２遺伝子に対するハイブリダイゼーション検定を、毛管電気泳動によって２種類の標識ＰＮＡプローブを用いて行った：（ａ）ＷＴプローブ及び（ｂ）Ｍプローブ（ｃ）ＤＮＡ試料を含まずにＭプローブのみを含む対照。これらの結果を図１８Ａに示す。図１８Ａは、全てのものを等しくし、３つの検定を同時に平行して実行したものであるが、以下の事項を示す。ライン（ａ）において、ＷＴプローブを用いた場合に強い信号が検出され、これは両遺伝子が野性型標識ＰＮＡプローブにアニールしたことを示し；僅かに１塩基のミスマッチで、毛管電気泳動条件下で行うライン（ｂ）において、Ｍプローブを用いた場合には有意の信号は検出されず、これはＭプローブが野性型遺伝子にアニールしなかったことを示し、かつ対照実行（ｃ）においては有意の信号は検出されなかった。野性型嚢胞性線維症Ｗ１２８２遺伝子に対する第２のハイブリダイゼーション実験を、毛管電気泳動により、２種類の標識ＰＮＡプローブ：（ａ）ＷＴプローブ及び（ｂ）Ｍプローブを用いて行った。これらの結果を図１８Ｂに示す。図１８Ｂは、全てのものを等しくし、３つの検定を同時に平行して実行したものであるが、以下の事項を示す。今回は、ＷＴもしくはＭプローブのいずれかを用いた場合、比較的強度は劣るがそれでも強い信号が集められ、これは両プローブがキャリアから提供された試料ＤＮＡにアニールし、試料中の変異Ｗ１２８２Ｘ遺伝子の存在の肯定的な同定を許容することを示す。これらの２つの検定の結果を表４に示す。この表は、２種類の型のＰＮＡプローブを用いた様々なＤＮＡ試料からの信号応答のパターンを示すものである。実施例９多遺伝子検出のための多ＰＮＡプローブＡ．実験の設計ＣＦｗ１２８２遺伝子（野性型ＰＣＲ産物）及びＣＦＦ５０８遺伝子（野性型ＰＣＲ産物）をモデル系として用いた。この２つの遺伝子の混合物に、正常ｗ１２８２遺伝子及び正常Ｆ５０８遺伝子に対するフルオレセイン標識正常ＰＮＡプローブを添加した。ハイブリダイゼーションの後、この混合物をＨＥＣ（ヒドロキシエチルセルロース）ゲル充填毛管に注入した。この毛管の長さは合計で２７ｃｍであり、検出器に対する２０ｃｍの分離長さを有していた。この未被覆毛管の内径は７５μｍであった。ＴＢＳ（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ）緩衝液中で２Ｍ尿素の存在下において分離を行った。これらの２つの遺伝子はサイズが異なるため（ＣＦｗ１２８２については１９７ｂｐ、ＣＦＦ５０８については３８４ｂｐ）、ハイブリッドの分離は５分で完了した。Ｂ．結果図１９に関しては、より短い遺伝子との二重鎖ＣＦＷ１２８２／ＰＮＡが最初に検出されてピーク１として示され、より長い遺伝子との二重鎖Ｆ５０８／ＰＮＡが次に検出されてピーク２として示される。この実験は、ＣＥにおける多遺伝子探索のための多ＰＮＡプローブを多遺伝子探索のための多ＰＮＡプローブに拡張できることを示す。さらに、異なる色もしくは酵素標識でタグが付けられたＰＮＡプローブを、同じ遺伝子の異なる変異又は異なる遺伝子の複数の変異を同じ分析において同時に検出するのに用いることができる。本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、本発明の方法、キット及び装置に様々な修正及び変形を加えることができることは当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、本発明の修正および変形を、それらが添付の請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内に入るという条件の下で、その範囲内に含めることが意図されている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年８月８日【補正内容】信頼がおける再現性のある結果を得るには、しばしば、個々の系の各々について実験上の最適化が必要となる。加えて、最も重要な工程は、しばしば、測定に必要な特異的に結合したプローブを除去することなく（背景カウントの増大につながり得る）あらゆる非特異的に結合したプローブを有効に脱着させることを必要とする厳密な洗浄の工程である。さらに、ブロッティング技術は、電気泳動の前に関心のある標的ヌクレオチド配列を変性させ、ブロッティングが行われるまでプローブを添加しないことを必要とする複雑な手順である。したがって、上述のブロッティング技術は、４時間ないし数日を要する手順全体の各々が複雑で、時間がかかり、かつ労働集約的なものである。ペプチド核酸、すなわちＰＮＡは、通常のノーザン及びサザンブロット分析における有用なプローブ代替物であることが決定されている。Ｐｌｕｓｋａｌ，Ｍ．ら，ＰｅｐｔｉｄｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓａｎｄＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＤＮＡａｎｄＲＮＡＢｌｏｔＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓ，ＴｈｅＦＡＳＥＢＪｏｕｒｎａｌＰｏｓｔｅｒ＃３５（１９９４年）を参照のこと。ＰＮＡは、核酸塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシルが結合しているアミノ酸の繰り返し単位を含んでなる合成オリゴアミドである。Ｅｇｈｏｌｍら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３年）３６５，５６６−５６８；Ｏｅｒｕｍら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．（１９９３年）２３５３３２−３６；ＰｒａｃｔｉｃａｌＰＮＡ：ＩｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇＰｏｉｎｔＭｕｔａｔｉｏｎｓｂｙＰＮＡＤｉｒｅｃｔｅｄＰＣＲＣｌａｍｐｉｎｇ（１９９５年）ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＶｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ１を参照のこと。ＰＮＡシントン及びオリゴマーはＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、フラミンガム、ＭＡから購入することができ、当該技術分野において公知の方法によって作製することが可能である。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／０１３７０号、ＷＯ９２／２０７０３号、ＷＯ９３／１２１２９号を参照のこと。多くの用途において、ＰＮＡプローブは核酸プローブよりも好ましい。これは、低塩の条件下で不安定化する核酸／核酸二重鎖とは異なり、非常に低い塩の条件下でＰＮＡ／核酸二重鎖が形成され、安定のままであるためである。Ｅｇｈｏｌｍら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３年）３６５，５６６−５６８；ＰｒａｃｔｉｃａｌＰＮＡ：ＰＮＡＯｌｉｇｏｍｅｒｓａｓＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＰｒｏｂｅｓ（１９９５年）ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ２を参照のこと。加えて、ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体は類似の核酸／核酸複合体よりも熱溶融点が高いため、ＰＮＡプローブを使用することによりブロッティング検定の再現性を改善することができる。ＰｌｕｓｋａｌＭ．らを参照のこと。しかしながら、ＰＮＡプローブを用いても、これらの検定は複雑で、時間がかかり、かつ労働集約的なままである。ゲル充填毛管における非標識ＰＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチド複合体の電気分離が記述されている。Ｒｏｓｅ，Ｄ．Ｊ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３年）６５：３５４５−３５４９。この技術はＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの安定性故に有利ではあるが、請求の範囲１．ポリヌクレオチドにおける選択された標的配列を検出する方法であって、ａ）少なくとも１つの核酸鎖及びその相補鎖を含み、該核酸の１つの鎖及びその相補鎖の一方が該選択された標的配列を有することが疑われる試料を提供する工程；ｂ）該試料を、検出可能な基で標識されている、該選択された標的配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するＰＮＡプローブと、該選択された標的配列が存在する場合にＰＮＡ／核酸複合体の形成を許容する少なくとも１つの核酸／核酸変性剤の存在下において混合する工程であって、該形成が該少なくとも１つの核酸／核酸変性剤の存在下において生じる工程；ｃ）該ＰＮＡ／核酸複合体を工程ｂ）から得られる混合物の他の成分から分離する工程；及びｄ）該ＰＮＡ／核酸複合体を検出する工程、を包含する方法。２．削除３．検出可能な基が、酵素、着色粒子、蛍光体、ビオチン、発色基、放射性同位体、電気化学及び化学発光基からなる群より選択される、請求の範囲第１項の方法。４．工程ｃ）を篩分け媒体中で行う、請求の範囲第１項の方法。５．篩分け媒体が、ポリアクリルアミド、アガロース、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリジン及びメチルセルロースからなる群より選択される、請求の範囲第４項の方法。６．工程ｃ）を電気泳動によって行う、請求の範囲第１項の方法。７．工程ｃ）を毛管電気泳動によって行う、請求の範囲第６項の方法。８．削除。９．削除。１０．削除。１１．変性剤が尿素、ホルムアミド、及び有機溶媒からなる群より選択される化合物を含む、請求の範囲第１項の方法。１２．工程ｂから得られる混合物の温度を該混合物が変性性になるように調整する、請求の範囲第１項の方法。１３．削除。１４．削除。１５．削除。１６．削除。１７．削除。１８．削除。１９．削除。２０．削除。２１．削除。２２．削除。２３．少なくとも１つのポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つの選択された標的配列を検出するための装置であって、ａ）試料導入区域；ｂ）該導入区域に導入される、少なくとも１つの二本鎖ポリヌクレオチドを含む試料と混合するように配置され、該少なくとも１つの二本鎖ポリヌクレオチドに存在することが疑われる該選択された標的配列に相補的な配列を有する少なくとも１つのＰＮＡプローブ；ｃ）該選択された標的配列が存在する場合にＰＮＡ／核酸複合体の形成を許容するように配置される核酸／核酸変性剤であって、該形成は該少なくとも１つの核酸／核酸変性剤の存在下において生じる核酸／核酸変性剤；及びｄ）該導入区域と連通する分離区域であって、該ＰＮＡ／核酸複合体を該導入区域及び該分離区域に存在する他の成分から分離する分離区域、を具備する装置。２４．分離区域が篩分け媒体を含む、請求の範囲第２３項の装置。２５．削除。２６．削除。２７．削除。２８．削除。２９．試料導入区域及び分離区域と連通して配置される試料インキュベーション区域を具備する、請求の範囲第２３項の装置。３０．分離区域が毛管通路である、請求の範囲第２３項の装置。３１．複数の毛管通路を具備するマイクロチップ装置であって、該毛管通路の各々がさらにａ）試料導入区域；ｂ）該導入区域の各々に導入される試料と混合するように配置される少なくとも１つのＰＮＡプローブであって、該試料は少なくとも１つの二本鎖ポリヌクレオチドを含み、かつ該少なくとも１つのＰＮＡプローブは該少なくとも１つの二本鎖ポリヌクレオチドに存在することが疑われる選択された標的配列に相補的な配列を有する少なくとも１つのＰＮＡプローブ；ｃ）該選択された標的配列が存在する場合にＰＮＡ／核酸複合体の形成を許容する核酸／核酸変性剤であって、該形成は該少なくとも１つの核酸／核酸変性剤の存在下において生じる核酸／核酸変性剤；ｄ）検出区域；及びｅ）該導入区域及び該検出区域と連通する分離区域、を具備するマイクロチップ装置。３２．前記核酸がＤＮＡである、請求の範囲第１項の方法。３３．前記変性剤が、工程ｂ）から得られる混合物を低塩濃度に調製することを許容する低イオン強度緩衝剤を含む、請求の範囲第１項の方法。３４．ＰＮＡプローブが粒子と会合する、請求の範囲第１項の方法。３５．ＰＮＡプローブが電荷変更基を含む、請求の範囲第１項の方法。３６．工程ｂ）が、前記試料を、各々が前記少なくとも１つの核酸鎖及びその相補鎖のうちの１つのそれぞれの選択された標的配列の少なくとも一部に相補的な配列を有する複数のＰＮＡプローブと、該それぞれの選択された標的配列が存在する場合に少なくとも１つのＰＮＡ／核酸複合体の形成を許容する条件下において混合すること、を包含する、請求の範囲第１項の方法。３７．ポリヌクレオチド中の複数の選択された標的配列を検出するための方法であって、ａ）少なくとも１つの一本鎖核酸配列及びその相補鎖を含み、該少なくとも１つの一本鎖核酸配列及びその相補鎖が複数の選択された標的配列を有することが疑われる試料を提供する工程；ｂ）該試料を、各々が該少なくとも１つの一本鎖核酸配列及びその相補鎖の該選択された標的配列のそれぞれのうちの１つの少なくとも一部と相補的な配列を有する複数のＰＮＡプローブと、該選択された標的配列のそれぞれのうちの１つが存在する場合に少なくとも１つのＰＮＡ／核酸複合体の形成を許容する条件下において混合する工程であって、該形成が該少なくとも１つの核酸／核酸変性剤の存在下において生じる工程；ｃ）該少なくとも１つのＰＮＡ／核酸複合体を工程ｂ）からの混合物の他の成分から分離する工程；及びｄ）該少なくとも１つのＰＮＡ／核酸複合体を検出する工程、を包含する方法。３８．篩分け媒体がポリアクリルアミド、アガロース、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリジン及びメチルセルロースからなる群より選択される、請求の範囲第２４項の装置。３９．前記変性剤が尿素、ホルムアミド、及び有機溶媒からなる群より選択される、請求の範囲第２３項の装置。４０．前記変性剤が、工程ｃ）から得られる混合物を低塩濃度に調整することを許容する低イオン強度緩衝液を含む、請求の範囲第３９項の装置。４１．前記少なくとも１つのＰＮＡプローブのうちの少なくとも１つが検出可能な基で標識されている、請求の範囲第２３項の装置。４２．検出可能な基が酵素、着色粒子、蛍光体、ビオチン、発色基、放射性同位体、電気化学及び化学発光基からなる群より選択される、請求の範囲第４１項の装置。４３．前記少なくとも１つのＰＮＡプローブのうちの少なくとも１つが粒子と会合している、請求の範囲第２３項の装置。４４．前記少なくとも１つのＰＮＡプローブのうちの少なくとも１つが電荷変更基を有する、請求の範囲第２３項の装置。４５．前記分離区域と連通する検出区域をさらに具備する、請求の範囲第２３項の装置。４６．前記毛管通路のうちの少なくとも１つの分離区域が篩分け媒体を具備する、請求の範囲第３１項のマイクロチップ装置。４７．篩分け媒体がポリアクリルアミド、アガロース、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリジン及びメチルセルロースからなる群より選択される、請求の範囲第４６項のマイクロチップ装置。４８．前記変性剤が尿素、ホルムアミド、及び有機溶媒からなる群より選択される、請求の範囲第３１項のマイクロチップ装置。４９．前記変性剤が、工程ｃ）から得られる混合物を低塩濃度に調整することを許容する低イオン強度緩衝液を含む、請求の範囲第３１項のマイクロチップ装置。５０．前記少なくとも１つのＰＮＡプローブのうちの少なくとも１つが検出可能な基で標識されている、請求の範囲第３１項のマイクロチップ装置。５１．前記少なくとも１つのＰＮＡプローブのうちの少なくとも１つが電荷変更基を有する、請求の範囲第３１項のマイクロチップ装置。５２．検出可能な基が酵素、着色粒子、蛍光体、ビオチン、発色基、放射性同位体、電気化学及び化学発光基からなる群より選択される、請求の範囲第３１項のマイクロチップ装置。５３．前記少なくとも１つのＰＮＡプローブが粒子と会合している、請求の範囲第３１項のマイクロチップ装置。５４．前記毛管通路の各々が前記試料注入区域及び前記分離区域と連通して配置される試料インキュベーション区域をさらに具備する、請求の範囲第３１項のマイクロチップ装置。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者エゴルム，マイケルアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02173、レキシントン、レキシントン・リツジ・ドライブ・1231 (72)発明者オキーフ，ヘザーアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02173、レキシントン・マレツト・ロード・248 (72)発明者ヤオ，シアン・ダブリユーアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01701、フラミンガム、エドマンズ・ロード・11、アパートメント・76

Claims

【特許請求の範囲】１．一本鎖核酸及びそれらの相補的鎖の混合試料溶液の成分を分離し、かつそれらの中に選択された標的配列を検出するための方法であって、ａ）試料を該標的配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するＰＮＡプローブと混合し、それにより検出可能なＰＮＡ／核酸二重鎖を形成させる工程；及び、その後、ｂ）試料中の種を分離する工程；及びｃ）該検出可能な二重鎖を検出する工程を包含する方法。２．ＰＮＡプローブが検出可能な基で標識されている、請求の範囲第１項の方法。３．検出可能な基が、酵素、着色粒子、蛍光体、ビオチン、発色基、放射性同位体、電気化学及び化学発光基からなる群より選択される、請求の範囲第２項の方法。４．種を篩分け媒体中で分離する、請求の範囲第６項の方法。５．篩分け媒体が、ポリアクリルアミド、アガロース、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリジン及びメチルセルロースからなる群より選択される、請求の範囲第４項の方法。６．種を電気泳動により分離する、請求の範囲第１項の方法。７．種を毛管電気泳動により分離する、請求の範囲第６項の方法。８．工程（ｂ）を核酸／核酸ハイブリッドの変性に適する条件下で行う、請求の範囲第１項の方法。９．核酸試料が５０ヌクレオチドを上回る長さの鎖を含む、請求の範囲第１項の方法。１０．工程ｂ）を変性媒体中で行う、請求の範囲第１項の方法。１１．変性媒体試薬が尿素、ホルムアミド、及び有機溶媒からなる群より選択されるものを含む、請求の範囲第１０項の方法。１２．媒体の温度を該媒体が変性性になるように調整する、請求の範囲第１０項の方法。１３．一本鎖核酸の混合試料溶液の成分を分離し、かつそれらの中に選択された標的配列を検出するための方法であって、ａ）試料を該標的配列の少なくとも一部に相補的な配列を有するＰＮＡプローブと混合し、それが存在する場合には、それにより検出可能なＰＮＡ／核酸二重鎖を形成する工程；ｂ）工程ａ）の後、試料中の成分を分離する工程；ｃ）該二重鎖を検出する工程、を包含する方法。１４．工程ｂ）を変性媒体中で行う、請求の範囲第１３項の方法。１５．変性媒体が篩分け媒体である、請求の範囲第１５項の方法。１６．ＰＮＡプローブが標識されている、請求の範囲第１４項の方法。１７．篩分け媒体が、ポリアクリルアミド、アガロース、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリジン及びメチルセルロースからなる群より選択される、請求の範囲第１６項の方法。１８．標識が、酵素、蛍光体、ビオチン、発色基、放射性同位体、着色粒子、電気化学及び化学発光基からなる群より選択される、請求の範囲第１７項の方法。１９．種を電気泳動により分離する、請求の範囲第１４項の方法。２０．種を毛管電気泳動により分離する、請求の範囲第１９項の方法。２１．変性培地が変性剤を含む、請求の範囲第１４項の方法。２２．媒体が、該媒体の温度を調整することにより変性性にされている、請求の範囲第１４項の方法。２３．選択された標的配列を含むポリ核酸の試料における検出のための装置であって、ａ）試料注入区域；ｂ）該注入区域に導入される試料と混合するように配置され、該選択された標的配列に相補的な配列を有し、かつ該標的配列が存在する場合にはそれとハイブリダイズして検出可能な複合体を形成するＰＮＡプローブ；及びｃ）該注入区域と連通する分離区域を具備する装置。２４．分離区域が篩分け媒体を含む、請求の範囲第２３項の装置。２５．一本鎖核酸及びそれらの相補鎖の混合試料溶液の成分を分離し、かつそれらの中に選択された標的配列を検出するためのキットであって、ａ）電気泳動媒体中の、該標的配列の少なくとも一部に相補的な配列を有する検出可能なＰＮＡプローブ、及び；ｂ）変性篩分け媒体、を具備するキット。２６．電気泳動媒体が毛管又は通路内に配置される、請求の範囲第２５項のキット。２７．少なくとも２種類のＰＮＡプローブを含み、その各々が異なる該標的配列に相補的な配列を有する、請求の範囲第２６項のキット。２８．温度を制御するための手段をさらに具備する、請求の範囲第２３項の装置。２９．試料注入手段と関連付けて配置される試料インキュベーション手段を具備する、請求の範囲第２３項の装置。３０．分離区域が毛管通路である、請求の範囲第２３項の装置。３１．１００までの毛管通路を具備し、その各々がさらにａ）試料注入区域；ｂ）検出区域；ｃ）該注入区域及び該検出区域と連通し、かつ接続する分離区域、を具備するマイクロチップ装置。