DE69634696T2

DE69634696T2 - Verfahren und testsystem zur hybridisierungsanalyse unter verwendung von peptidnukleinsäure-sonden

Info

Publication number: DE69634696T2
Application number: DE69634696T
Authority: DE
Inventors: Martin Fuchs; Michael Egholm; Heather O'keefe; Xian W. Yao
Original assignee: PerSeptive Biosystems Inc
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1996-10-04
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2016-10-05
Also published as: WO1997012995A1; EP0854937B1; US20020012902A1; DE69634696D1; EP0854937A1; JPH11512617A; EP0854937B9; US20050053944A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Hybridisierungsanalyse und insbesondere die Hybridisierungsanalyse unter Verwendung von Peptidnukleinsäuren als Sonden für DNA- oder RNA-Zielsequenzen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine Elektrophorese, eine gut etablierte Technik zur Auftrennung und Analyse von Gemischen, beinhaltet die Migration (Wanderung) von Molekülen in einem elektrischen Feld und deren Auftrennung basierend auf Mobilitätsunterschieden. Es wurden viele unterschiedliche Arten von Elektrophoresen entwickelt, einschließlich Freizonenelektrophorese, Gel-Elektrophorese, isoelektrische Fokussierung und Isotachophorese. Traditionell wurde eine Elektrophorese in Gelen durchgeführt, die aus Polyacrylamid oder Agarose in Form von Platten oder Stangen gegossen waren. Plattengele wurden weitläufig zur Auftrennung und Analyse von Polynukleotiden wie DNA oder RNA verwendet.
Eine Elektrophorese kann mit anderen analytischen Techniken kombiniert werden, um die Sequenz von Nukleotiden in einem Polynukleotid-Ziel von Interesse zu bestimmen. In einer Technik, die als Southern-Blotting bekannt ist, wird eine DNA-Probe auf eine "Ziel"-Nukleotidsequenz von Interesse analysiert. Die DNA-Probe wird denaturiert, typischerweise durch Erhitzen, und die denaturierte einzelsträngige DNA wird elektrophoretisch in einer Gel-Platte aufgetrennt. Nach der elektrophoretischen Auftrennung wird die DNA fragmentiert und von dem Gel auf eine Membran, wie eine Nitrocellulosemembran, transferiert oder geblottet. Eine einzelsträngige fragmentierte DNA wird dann mit einem markierten DNA- oder RNA-Oligomer mit einer Sequenz, die komplementär ist zu der Zielnukleotidsequenz von Interesse, als Sonde untersucht. Das DNA- oder RNA-Oligomer oder Sonde, die komplementär ist zu der Zielsequenz wird an die Zielsequenz, wenn sie vorhanden ist, hybridisieren. Nicht-gebundene DNA-Fragmente und überschüssige Sonde wird dann durch stringentes Waschen entfernt. Die Markierung auf der spezifisch gebundenen Oligonukleotidsonde verbleibt auf der Membran nach dem Waschen und wird nachgewiesen. Das Vorliegen oder das Fehlen der Zielsequenz und dessen Größe kann leicht bestimmt werden. Eine ähnliche Technik, die als Northern-Blotting bezeichnet wird, wird verwendet, um RNA-Proben, entweder mit RNA- oder DNA-Sonden, zu analysieren.
Zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse erfordern oft eine experimentelle Optimierung für jedes einzelne System. Zusätzlich ist der am meisten kritische Schritt oft der stringente Waschschritt, der erforderlich ist, um eine nicht-spezifisch gebundene Sonde (die zu einem Anstieg bei der Zählerzahl des Hintergrunds führen kann) abzulösen, ohne die spezifisch gebundene Sonde, die zur Durchführung einer Messung erforderlich ist, zu entfernen. Weiterhin sind Blotting-Techniken komplexe Verfahren, bei denen es erforderlich ist, dass die Zielnukleotidsequenz von Interesse vor der Elektrophorese denaturiert wird und dass die Sonde nicht zugegeben wird, bis das Blotten stattgefunden hat. Daher sind die oben beschriebenen Blotting-Techniken komplex, zeitaufwändig und laborintensiv, wobei jede Gesamtprozedur zwischen 4 Stunden und mehreren Tagen benötigt.
Es wurde festgestellt, dass Peptidnukleinsäuren oder PNAs als Sondensubstituenten in konventionellen Northern- und Southern-Blot-Analysen einsetzbar sind (siehe Pluskal, M. et al., Peptide Nucleic Acid Probes and Their Application in DNA and RNA Blot Hybridization Analysis. The FASEB Journal. Poster #35 (1994)). PNAs sind synthetische Oligoamide, die aus wiederholenden Einheiten von Aminosäuren bestehen, an die die Nukleobasen Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin und Uracil gebunden sind. (Siehe Egholm et al., Nature (1993) 365, 566–568; Oerum et al. Nucl. Acids Res. (1993) 23 5332–36; Practical PNA: Identifying Point Mutations by PNA Directed PCR Clamping (1995) PerSeptive Biosystems, Band 1, Ausgabe 1). PNA-Synthone und Oligomere sind kommerziell erhältlich von PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, MA, und können durch bekannte Verfahren auf dem Gebiet hergestellt werden (siehe z.B. PCT-Publikationen WO95/01370, WO92/20703, WO93/12129).
In vielen Anwendungen sind PNA-Sonden gegenüber Nukleinsäuresonden bevorzugt, da sie im Gegensatz zu Nukleinsäure/Nukleinsäure-Duplexen, die unter niedrigen Salzbedingungen destabilisiert werden, PNA/Nukleinsäure-Duplexe gebildet werden und unter sehr niedrigen Salzbedingungen stabil bleiben. (Siehe Egholm et al., Nature (1993) 365, 566–568: Practical PNA: PNA Oligomers as Hybridization Probes (1995) PerSeptive Biosystems, Band 1, Ausgabe 2). Zusätzlich kann die Verwendung von PNA-Sonden die Reproduzierbarkeit von Blotting-Assays verbessern, da PNA/DNA-Komplexe einen höheren thermalen Schmelzpunkt besitzen als die analogen Nukleinsäure/Nukleinsäurekomplexe (siehe Pluskal M. et al.). Jedoch bleiben selbst mit den PNA-Sonden die Assays komplex und sowohl zeitaufwändig als auch laborintensiv.
Die elektrophoretische Auftrennung von PNA/DNA-Oligonukleotidkomplexen in einer Gel-gefüllten Kapillare ist beschrieben worden (Rose, D. J. Anal. Chem. (1993) 65; 3545–3549). Obwohl die Technik aufgrund der Stabilität des PNA/DNA-Hybrids vorteilhaft ist, werden die PNA/DNA-Hybride in einer nicht-kompetitiven Umgebung gebildet, wo komplementäre DNA-Stränge nicht verfügbar sind, um mit der PNA bei der Bildung des PNA/DNA-Komplexes zu kompetitieren. Dieses Experiment zeigte nicht, ob es möglich ist, PNA/DNA-Komplexe zu bilden, wenn von doppelsträngiger DNA ausgegangen wird.
Solche doppelsträngigen Nukleinsäureproben weisen spezifische Probleme auf, wenn Hybridisierungsanalysen durchgeführt werden. Da jeder Strang einer doppelsträngigen Probe eine sehr hohe Affinität für dessen komplementären Strang besitzt, selbst unter niedrigen Salzbedingungen, können Oligonukleotidsonden nicht effizient hinsichtlich einer Bindung beim Vorliegen eines DNA-Stranges, der komplementär ist zu dem Ziel-DNA-Strang von Interesse, kompetitieren. Daher erfordert die Analyse einer doppelsträngigen DNA typischerweise die Untersuchung einer einzelsträngigen Nukleinsäureprobe unter Bedingungen, bei denen der komplementäre Strang nicht vorhanden ist oder nicht zur Kompetition mit der Sonde verfügbar ist. Zum Beispiel blottet man in traditionellen Blotting-Techniken die Fragmente von einem Gel auf eine Membran, um die kompetitierenden komplementären Fragmente zu immobilisieren. Daher tragen solche Techniken zu einer zusätzlichen Komplexität und Zeitaufwand für die Analyse von DNA-Sequenzen bei.
Da doppelsträngige DNA die am meisten übliche Form einer Nukleinsäure in einer genomischen Probe ist, sind die verfügbaren Techniken daher nicht vollständig zufriedenstellend. Es besteht daher ein Bedarf für ein schnelles, reproduzierbares, leichtes und kosteneffizientes Verfahren für die Detektion und Analyse von Nukleinsäuren. Die vorliegende Erfindung geht auf diese Bedürfnisse ein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Detektion von Polynukleotidproben mit einer Zielsequenz von Interesse, welche ein oder mehrere der Probleme, die auf die Beschränkungen und Nachteile des Stands der Technik zurückzuführen sind, überwindet.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer ausgewählten Zielsequenz in einem Polynukleotid. Um das Verfahren durchzuführen, denaturiert man zuerst ein doppelsträngiges Polynukleotid, typischerweise durch Erhitzen, in komplementäre einzelsträngige Polynukleotidpaare. Als nächstes wird die Probe aus einzelsträngigen Polynukleotidpaaren mit einer PNA-Sonde gemischt, die eine Sequenz aufweist, die komplementär ist zu mindestens einem Teil der ausgewählten Zielsequenz, um dadurch die einzelsträngige Polynukleotidsequenz mit PNA unter denaturierenden Bedingungen zu hybridisieren, um eine detektierbare PNA/Polynukleotid-Duplex zu bilden. Die verschiedenen Polynukleotid- und Polynukleotid/PNA-Spezies in der Probe werden dann elektrophoretisch aufgetrennt und die detektierbare PNA/Polynukleotid-Duplex wird nachgewiesen. Die PNA-Sonde kann mit einem detektierbaren Rest, wie Enzymen, Fluorophoren, Biotin, Chromophoren, Radioisotopen, gefärbten Partikeln, elektrochemischen oder chemilumineszierenden Resten markiert werden. In verschiedenen Ausführungsformen werden die verschiedenen Spezies in einem Siebmedium elektrophoretisch oder, spezifischer, durch Kapillarelektrophorese aufgetrennt. Das Siebmedium ist, falls verwendet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyacrylamid, Agarose, Polyethyloxid, Polyvinylpyrolidin und Methylcellulose. In anderen Ausführungsformen wird kein Siebmedium verwendet.
Insbesondere umfasst das Verfahren die Schritte:

a) Bereitstellen einer Probe, die mindestens einen Nukleinsäure-Strang, z.B. eine DNA und dessen Komplementär-Strang umfasst, wobei einer des mindestens einen Nukleinsäure-Strangs und dessen Komplementär-Strangs in Verdacht steht, die ausgewählte Zielsequenz zu enthalten;
b) Mischen der Probe mit einer PNA-Sonde, die mit einem detektierbaren Rest markiert ist, wobei die PNA-Sonde eine Sequenz hat, die komplementär ist zu mindestens einem Teil der ausgewählten Zielsequenz, in der Gegenwart von mindestens einem Nukleinsäure/Nukleinsäure-denaturierenden Reagens unter denaturierenden Bedingungen, was die Bildung eines PNA/Nukleinsäure- Komplexes ermöglicht, wenn die ausgewählte Zielsequenz vorhanden ist, wobei die Bildung in der Gegenwart von mindestens einer/einem Nukleinsäure/Nukleinsäure-denaturierenden Reagens stattfindet;
c) Auftrennen des PNA/Nukleinsäure-Komplexes von anderen Bestandteilen des aus Schritt b) hervorgehenden Gemisches, denaturierenden Bedingungen; und
d) Detektieren des PNA/Nukleinsäure-Komplexes, der unter denaturierenden Bedingungen stabil ist.

Die vorhergehende allgemeine Beschreibung und die folgende detaillierte Beschreibung sollen beispielhaft und erklärend sein und sollen die beanspruchte Erfindung weiter erklären. Die beigefügten Zeichnungen sind hierbei miteingeschlossen, um zu einem tieferen Verständnis der Erfindung beizutragen und sind in der Patentschrift eingeschlossen und bilden einen Teil von dieser, veranschaulichen mehrere Ausführungsformen der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung zur Erläuterung der Prinzipien der Erfindung.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Flussdiagramm von traditionellen Southern-Blotting-Techniken mit einem Flussdiagramm von einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen "Nicht-blot"-Verfahrens.
2A und 2B zeigen, auf zwei Abschnitten eines Agarose-Gels, die Ergebnisse von DNA/DNA- und DNA/PNA-Hybridisierungsexperimenten bei verschiedenen Temperaturen und Konzentrationen, die durch Chemilumineszenz zustande kommen.
3A, 3B und 3C zeigen die Ergebnisse von einem Hybridisierungsexperiment zwischen zwei Restriktionsverdaus von pBR322 mit einer markierten PNA-Sonde, die auf drei unterschiedlichen elektrophoretischen Gel-Systemen aufgetrennt wurde: nicht-denaturierendes 4–20% Acrylamid (3A); 7 M Harnstoff 6% Acrylamid (3B) und 1% Agarose (3C).
4 zeigt die Wirkung der Temperatur in einem Hybridisierungsexperiment zwischen doppelsträngiger DNA pBR322 und markierter PNA-Sonde.
4A und 4B zeigen die Ergebnisse von Prä-Gel-Hybridisierungs-Assays für das Gen der zystischen Fibrose W1282, das von einem nicht-betroffenen Individuum stammt (H), Spuren 1, 2 und 5 und einem Träger (C), Spuren 3 und 4, mit einer markierten PNA-Sonde für das Wildtyp(WT)-Gen, Spuren 1 und 3 oder dem Mutanten(M)-Gen, Spuren 2 und 4 und einen Überschuss der Mutanten-Sonde (Spur 5) auf einem 1,5%igen TBE-Agarose-Gel: DNA.
5 ist eine grafische Darstellung, die die Stabilität von komplementären (Kurve A: ♦), Einbasen-Mismatch (Kurve B:
) und Zweibasen-Mismatch (Kurve C: •) PNA/DNA-Duplexen in einem denaturierenden Medium bei verschiedenen Temperaturen vergleicht.
6 ist eine grafische Darstellung, die die Stabilität von komplementären (Kurve A: ♦) und Zweibasen-Mismatch (Kurve B:
)-PNA/DNA-Duplexen bei verschiedenen Temperaturen vergleicht.
7 ist ein Elektropherogramm einer Kapillar-Gel-Elektrophorese von DNA-Fragmenten aus dem BstN1- und Msp1-Verdau von pBR322.
8 ist eine Größenkalibrierungskurve für die Größenauftrennung von Fragmenten des Verdaus von pBR322 durch Kapillar-Elektrophorese.
9 ist eine Elektropherogramm einer elektrophoretischen Auftrennung der Bestandteile eines Hybridisierungs-Assays, der eine markierte PNA-Sonde und die Fragmente eines Verdaus mit BstN1 von pBR322 enthält.
10 ist ein Elektropherogramm einer elektrophoretischen Auftrennung der Bestandteile eines Hybridisierungs-Assays, der eine markierte PNA-Sonde und die Fragmente eines Verdaus mit Msp1 von pBR322 enthält.
11 ist ein Elektropherogramm einer elektrophoretischen Auftrennung der Bestandteile eines Hybridisierungs-Assays, der eine markierte PNA-Sonde und die Fragmente sowohl von dem Verdau mit BstN1 von pBR322 und dem Verdau mit MspI von pBR322 enthält.
12 ist eine schematische Darstellung eines Profils von einer Aufsicht in der Ebene der Kapillare von einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Apparates.
13A ist eine schematische Darstellung des Probenladeprozesses (Abschnitt A) mit einem versetzten angeklemmten Injektor.
13B ist eine schematische Darstellung des Elektrophorese-Auftrennungsprozesses (Abschnitt B) mit einem versetzten angeklemmten Injektor.
14 ist eine schematische Darstellung eines Profils von einer Aufsicht in der Ebene der Kapillaren von einer Multikanal-Kapillar-Mikrochip-Scheibe.
15 ist eine schematische Darstellung des integrierten Apparates zur Hybridisierungsanalyse unter Verwendung von Kapillar-Gel-Elektrophorese.
16 ist ein Elektropherogramm einer elektrophoretischen Auftrennung von einem Hybridisierungs-Assay, der eine markierte PNA-Sonde (Bild bei Rahmen 600) und die Fragmente der Verdaus mit BstN1 und Msp1 von pBR322 (Bilder bei Rahmen 300–600) unter Verwendung eines Multikanalmikrochips enthält.
17A zeigt Elektropherogramme von elektrophoretischen Auftrennungen der Bestandteile von Hybridisierungs-Assays, die eine markierte PNA-Sonde für das Bildtyp-Gen der zystischen Fibrose F508 enthält mit den zur Verfügung gestellten DNA-Proben aus: (a) einem nicht-betroffenen Individuum; (b) einem Träger und (c) einem betroffenen Patienten.
17B zeigt Elektropherogramme von elektrophoretischen Auftrennungen der Bestandteile eines Hybridisierungs-Assays, der eine markierte PNA-Sonde für das mutante zystische Fibrose-Gen F508 (ΔF508) enthält mit den zur Verfügung gestellten DNA-Proben aus: (a) einem nicht-betroffenen Individuum; (b) einem Träger und (c) einem betroffenen Patienten.
18A zeigt Elektropherogramme von elektrophoretischen Auftrennungen der Bestandteile von Hybridisierungs-Assays für das Wildtyp-Gen der zystischen Fibrose W1282 mit Proben von Wildtyp-DNA, die von einem nicht-betroffenen Individuum stammen: (a) markierte Wildtyp-PNA-Sonde; (b) eine markierte Mutanten-PNA-Sonde und (c) Kontrolle ohne DNA-Probe, aber mit Mutanten-Sonde.
18B zeigt Elektropherogramme von elektrophoretischen Auftrennungen der Bestandteile der Hybridisierung für das mutante zystische Fibrose-Gen W1282X auf DNA-Proben, die von einem gesunden Träger stammen: markierte Wildtyp-PNA-Sonde, (b) eine markierte Mutanten-PNA-Sonde.
19 ist ein Elektropherogramm einer elektrophoretischen Auftrennung der Bestandteile eines Multiplex-Hybridisierungs-Assay, der zwei markierte PNA-Sonden für die Wildtyp-Gene der zystischen Fibrose W1282 und F508 enthält.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben festgestellt, dass PNA an einer Ziel-DNA- oder -RNA-Sequenz unter normalen denaturierenden Bedingungen für ein DNA/DNA-, RNA/DNA- oder RNA/RNA-Hybrid hybridisiert bleibt. Daher ist der Fachmann in der Lage das Vorliegen einer Zielsequenz basierend auf einer Hybridisierung mit der Sonde zur Bildung eines Komplexes gleichzeitig nachzuweisen und Bestandteile auf einem Siebmedium elektrophoretisch aufzutrennen. Eine "Sonde", wie hier verwendet, bezeichnet eine Sequenz von Nukleotidbasen, die komplementär sind zu mindestens einem Teil der Nukleobasen in der Zielsequenz. Zwar war es notwendig, den komplementären Nukleinsäurestrang für eine Bindung an dessen Partner vor einer Hybridisierung mit einer Sonde nicht mehr verfügbar zu machen, so dass eine Kompetition zwischen dem komplementären DNA-Ziel und der DNA-Sonde vermieden wurde. Daher kann eine Hybridisierung zwischen der Ziel-Nukleotidsequenz und der PNA-Sonde unter Bedingungen durchgeführt werden, bei denen die DNA/DNA-Sonde nicht hybridisieren würde. Der Ausdruck "Zielsequenz", wie hier verwendet, bezeichnet eine beliebige Sequenz von Nukleotidbasen, die der Fachmann nachweisen möchte, beispielsweise eine DNA- oder RNA-Sequenz und die in der Lage ist, mit einer PNA-Sonde zu hybridisieren. Als ein weiterer Vorteil besitzen PNAs im Gegensatz zu konventionellen Nukleotidsonden keine Ladung und vereinfachen deshalb die elektrophoretische Abtrennung des Hybrids von der überschüssigen Sonde. Assays unter Verwendung von diesen PNA-Sonden sind mindestens genauso empfindlich und selektiv als üblicherweise verwendete Oligonukleotidsonden und hybridisieren schneller an deren Ziele. Weiter stellen die erfindungsgemäßen Assays eine schnelle, einstufige Hybridisierung bereit, gefolgt von einer Größenauftrennung und sind daher weniger zeitaufwändig, komplex und laborintensiv als bekannte Verfahren des Stands der Technik.
Der Ausdruck PNA (Peptidnukleinsäure), wie hier verwendet, bezeichnet eine Nachahmung einer DNA mit einem neutralen Polyamid-Rückgrat, an dem die Nukleinsäurebasen auf die selbe Art und Weise verknüpft sind, wie sie es bei dem Phosphat-Rückgrat von DNA sind.
PNAs können routinemäßig durch Standardpeptidchemieverfahren synthetisiert werden und können mit Biotin oder verschiedenen anderen Markierungen entweder als Teil der Festphasensynthese oder nach einer Spaltung von dem Harz markiert werden (siehe z.B. Chollet et al., Nucleic Acids Research, Band 13, Nr. 5, Seiten 1529–1541 (1985). Verfahren zur Herstellung von PNA aus Monomersynthonen sind auf dem Gebiet bekannt.
"Detektierbare Reste", wie hier verwendet, sind Reste, die zur Verwendung in der beanspruchten Erfindung geeignet sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Enzyme, Fluorophore, Biotin, Chromophore, Radioisotope, elektrochemische Reste und chemilumineszierende Reste. Solche Reste können leicht mit der Sonde unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannten Techniken konjugiert werden.
Zur Würdigung von allen Aspekten der beanspruchten Erfindung sollte festgestellt werden, dass die Anmelder zwei wichtige Eigenschaften von PNA/Nukleinsäure-Duplexen entdeckt haben, welche zu den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, Kits und Verfahren führten. Als erstes haben die Anmelder überraschender Weise festgestellt, dass die PNA-Sonde schnell mit der Zielsequenz hybridisieren wird, um dadurch eine Duplex in der Gegenwart des komplementären Nukleinsäurestrangs zu bilden, wenn eine markierte PNA-Sonde mit einer Sequenz, die komplementär ist zu einer Zielsequenz, zu einer doppelsträngigen Nukleinsäureprobe, die denaturiert worden ist, zugegeben wird. Da der längere komplementäre Nukleinsäurestrang mit der viel kürzeren PNA-Sonde auf eine Bindung kompetitieren wird, selbst unter niedrigen Salzbedingungen, ist es überraschend, dass die PNA-Sonde nicht leicht oder schnell entfernt wird, um dadurch das stabilere doppelsträngige Nukleinsäureausgangsmaterial zu bilden. Dies ist sehr überraschend für Proben, die lange Nukleinsäurefragmente enthalten, beispielsweise Proben mit doppelsträngigen Abschnitten von mehr als 50 Nukleotiduntereinheiten in der Länge.
Zweitens ist die PNA/Nukleinsäure-Duplex unter solchen denaturierenden Bedingungen stabil, bei denen sich eine DNA-Sekundärstruktur auflöst. Dadurch ist es möglich, getrennte Bestandteile einer Probe unter denaturierenden Bedingungen aufzutrennen, um dadurch eine Sekundärstrukturbildung und -Bindung von komplementären Fragmenten zu verhindern. Dies ist nicht möglich, wenn traditionelle DNA- oder RNA-Sonden verwendet werden, da die denaturierenden Bedingungen nicht nur eine gewünschte Fragmentierung beeinflussen würden, d.h. eine Sekundärstrukturbildung, sondern auch die gewünschte Hybridisierung mit der Sonde auflösen würden. Das Vorliegen von denaturierenden Reagenzien, wie Formamid, wird die Temperatur erniedrigen, die notwendig ist, um eine Einzelbasenpaarunterscheidung von Sondensequenzen für Ziele zu erreichen. Daher kann der Anlagerungsschritt von Hybridisierungs-Assays bei oder nahe der Raumtemperatur durchgeführt werden. Folglich sind die erfindungsgemäßen Hybridisierungs-Assays wesentlich selektiver als Assays des Stands der Technik.
In Anwendungen des Stands der Technik wird eine Hybridisierung der Sonde nicht vor der Auftrennung der zwei unabhängigen DNA-Stränge durchgeführt. Bei herkömmlichen Techniken wandern markierte Sonden in dem elektrischen Feld und werden in großem Überschuss eingesetzt. Daher ergibt eine überschüssige Sonde als ein sehr kräftiges Signal, welches mit einer genauen Detektion von einigen Zielen interferieren kann. Darüber hinaus kann, da der Polynukleotid/Sondenkomplex leicht dissoziiert, kein oder nur ein geringes Signal für eine Detektion zur Verfügung stehen, was von dem Dissoziationsgrad abhängt. Wenn das Auftrennungsmedium ein denaturierendes Reagens einschließt, würden alle Komplexe leicht dissoziieren und es würde keiner nachgewiesen werden.
In Gegensatz zu markierten DNA- und RNA-Sonden bleiben die erfindungsgemäßen markierten PNA-Sonden an die Zielsequenzen bei den Nukleotidproben selbst dann hybridisiert, wenn ein komplementärer Nukleotidstrang vorliegt. Der PNA/Nuklein säurekomplex wird unter niedrigen Salzbedingungen sehr stabil gebildet und ist in denaturierenden Reagenzien ausreichend stabil, um eine Auftrennung und Detektion zu ermöglichen. Zusätzlich wird eine bessere Auftrennung von Bestandteilen erreicht, da die PNAs nicht geladen sind und während einer elektrophoretischen Auftrennung nicht wesentlich migrieren.
Die einzelsträngigen Nukleinsäuren können von einer natürlichen oder synthetischen Quelle erhalten werden. Beispielsweise kann eine beliebige DNA- oder RNA-Probe, in der die gewünschte Sequenz nachgewiesen werden soll, durch bekannte Verfahren auf dem Gebiet fragmentiert und denaturiert werden. Daher kann beispielsweise in bestimmten diagnostischen Anwendungen das Vorliegen einer bestimmten Sequenz detektiert werden, indem zumindest ein Teil des menschlichen Genoms verdaut wird, denaturiert wird und als eine Probe in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird.
In einer Ausführungsform kann man doppelsträngige Nukleotidfragmente denaturieren und eine PNA-Sonde an einen von ihnen hybridisieren, bevor die Nukleotidfragmente sich erneut anlagern, indem ein Puffer mit niedriger Ionenstärke verwendet wird und indem die Temperatur bis auf ungefähr 65°C oder höher für ungefähr 5 Minuten erhöht wird. Bei dieser Ausführungsform wird die Probe, die die denaturierten Nukleotidfragmente und die PNA-Sonde umfasst, nun direkt auf das Gel geladen und einem elektrischen Feld ausgesetzt. Ein hybridisierter Komplex, der eine PNA-Sonde und eine komplementäre DNA- oder RNA-Sequenz umfasst, wird eine elektrophoretische Mobilität aufweisen, die sich von der der nicht-gebundenen Sonde unterscheidet und sich von der der einzelsträngigen Nukleotiden unterscheidet. Da die PNA-Sonde neutral ist, werden nicht-hybridisierte Sonden nicht in dem Gel unter einem elektrischen Feld migrieren. In einigen Fällen kann die Markierung, die an die Sonde gebunden ist, zu einer Ladung der Sonde beitragen, jedoch ist die elektrophoretische Mobilität der markierten Sonde im Allgemeinen niedrig und unterscheidet sich hinreichend von der des hybridisierten PNA/Nukleotid-Duplex, um eine schnelle, vollständige Auftrennung zu ermöglichen. Daher werden lediglich die einzelsträngigen Nukleinsäurefragmente und die hybridisierten Komplexe in das Gel gelangen und migrieren. Fragmente, welche die Zielsequenzen enthalten, können daher nachgewiesen werden, indem die Markierung auf der Sonde, die an das Fragment hybridisiert ist, detektiert wird. Es ist hierbei anzumerken, dass bei dieser Technik kein zusätzlicher Schritt erforderlich ist, um die komple mentären Nukleotidstränge aufzutrennen, um dadurch eine Kompetition mit der PNA-Sonde zu verhindern.
Zur kurzen Übersicht werden die erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt, indem zuerst eine PNA-Sonde mit einer Sequenz entworfen wird, die komplementär ist zu mindestens einem Teil einer Zielsequenz von Interesse und in der Lage ist, daran zu hybridisieren. Eine Zielsequenz ist eine beliebige bekannte Sequenz von Nukleotidbasen, die man in einer Probe nachweisen möchte. Zielsequenzen können, in verschiedenen Ausführungsformen, Sequenzen sein, die für ein Gen von Interesse kodieren. Beispiele von Zielsequenzen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Promotor-Sequenzen, Loci, Sequenzen, die spezifisch für Pathogene sind, Sequenzen, die spezifisch für Onkogene sind, Sequenzen, die spezifisch für genetisch veränderte Pflanzen und Organismen sind, Sequenzen, die spezifisch für genetische Defekte sind, Sequenzen, die durch Verfahren amplifiziert worden sind, wie PCR und Sequenzen, die für übliche Strukturmotive, wie Zinkfinger, kodieren, etc.
Insbesondere können PNAs durch Verfahren synthetisiert werden, die analog denen sind, wie sie für die Synthese von Peptiden verwendet werden. Verfahren zur Herstellung von PNAs aus Monomersynthone sind auf dem Gebiet bekannt. Die erfindungsgemäßen PNA-Sonden werden vorzugsweise mit einem detektierbaren Rest markiert, sodass nach einer Hybridisierung an eine Zielsequenz ein markierter PNA/Nukleinsäurekomplex gebildet wird. Fluorescein oder Biotin-markierte PNA-Sonden können auf ein Expedite-Nukleinsäuresynthesesystem von PerSeptive Biosystems (Framingham, MA, USA) synthetisiert werden. Spacer-Einheiten aus 8-Amino-3,6-dioxaoctansäure (-oo-) werden zu den Harz-gebundenen PNAs vor der Reaktion von aktivierten Estern von Biotin (Bio) oder Fluorescein (Flu), wie Dimethoxytritylbiotinester von 1-(4'-Nitrophenyl)pyrazolin-5-on (DMTr-bio-HPP) oder 5,6-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimid zugegeben. Die markierten PNAs werden dann von dem Harz abgespalten und Schutzgruppen werden entfernt, um die erfindungsgemäßen markierten PNA-Sonden zu ergeben. Verfahren zur Markierung von PNAs mit fluoreszierenden Farbstoffen sind auch für den Fachmann bekannt.
Die PNA-Sonde, die der Zielsequenz von Interesse entspricht, wird dann in eine Probe von Polynukleotiden, die getestet werden sollen, eingeführt. Die Probe kann DNA oder RNA umfassen und kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Wenn die Probe ursprünglich doppelsträngig ist, wird die Probe, wenn sie vor dem Zusatz der PNA-Sonde denaturiert wird, eine Lösung von einzelsträngigen Polynukleotiden und deren komplementären Stränge umfassen. Die Sonde wird mit dem komplementären DNA-Strang kompetitieren und vorzugsweise mit mindestens einem Teil der Zielsequenz binden, soweit vorhanden, um eine detektierbare Duplex zu bilden. Es wird angenommen, dass zumindest zum Teil die Unterschiede bei der Leistungsfähigkeit von PNA- und DNA-Sonden auf die Unterschiede der Anlagerungs- und Abtrennungsraten des Moleküls zurückzuführen sind. Die schnellere Anlagerungsrate von PNA ermöglicht kürzere zu verwendende Hybridisierungszeiten. Die langsamere Abtrennungsrate von PNA ermöglicht es Mismatches aufgrund der Fähigkeit von PNA zu hybridisieren und einem Waschen über einen breiteren Temperaturbereich zu widerstehen, leichter zu erkennen, als es für DNA-Sonden der Fall ist. Zusätzlich werden die Unterschiede bei der Abtrennungsrate zwischen der DNA- und PNA-Sonden größer, wenn die Länge der Sonde abnimmt. Tatsächlich könnten Oligonukleotide des Stands der Technik, die weniger als 13 Reste lang sind, nicht als Sonden verwendet werden, wohingegen PNA mit nur 10 Resten ein kräftiges Signal für eine Detektion hervorbringt. Daher kann man entsprechend der vorliegenden Erfindung PNA-Sonden entwerfen, die auf lediglich vier Reste einer Proteinsequenzinformation basieren. PNA ist daher für eine Vielzahl von Hybridisierungen verwendbar, die auf DNA/RNA-Anwendungen basieren, einschließlich aber nicht beschränkt auf einen direkten Nachweis von Punktmutation, Festphasenaffinitätsbindung und Verbesserung von PCR für DNA, die Wiederholungssequenzen enthält.
Die Salzunabhängigkeit einer PNA-Bindung an DNA und RNA ist ein besonders wichtiges Merkmal der beanspruchten Erfindung. PNA kann fest unter niedrigen Salzbedingungen binden, z.B. bei Konzentrationen von weniger als ungefähr 10 mM. Unter diesen Bedingungen wird eine Duplex-Bildung von DNA/DNA, DNA/RNA oder RNA/RNA (d.h. eine Sekundär- und Tertiär-Struktur) in hohem Maße vermieden oder verhindert. Daher kann es bevorzugt sein, die Nukleinsäuresonde mit der PNA-Sonde unter Bedingungen mit niedriger Ionenstärke zu mischen. Diese Bedingungen werden die PNA-Sonden-/Nukleinsäure-Hybridisierung begünstigen, welche durch die Salzkonzentration relativ unbeeinflusst ist, wohingegen Nukleinsäure/Nukleinsäureinteraktion bei Bedingungen mit höherer Ionenstärke begünstigt werden. Vorzugsweise ist die Ionenstärke des Gemisches in dem Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 50 mM.
In bestimmten Ausführungsformen kann es bevorzugt sein, die Probe und Sonde für einen Zeitraum von beispielsweise ungefähr einer Minute bis 30 Minuten zu inkubieren, um den Bestandteilen länger die Möglichkeit zu geben zu interagieren und einen Komplex vor dem Beladen auf dem Siebmedium zu bilden. Der Fachmann wird in der Lage sein, zu bestimmen, wann es zweckmäßig ist und/oder notwendig ist, den Inkubationsschritt einzuschließen, indem Routineexperimente durchgeführt werden.
Nach dem Mischen der markierten Sonde mit der Nukleotidprobe müssen die hybridisierten PNA/Nukleinsäure-Duplexe von der überschüssigen markierten Sonde aufgetrennt werden. Vorzugsweise werden die Duplexe auch von anderen Spezies in der Probe, wie die komplementären Nukleotidstränge, die nicht die Zielsequenz besitzen, und anderen nicht gebundenen Bestandteilen aufgetrennt. Zahlreiche Auftrennungstechniken sind auf dem Gebiet bekannt und in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar. Zum Beispiel können Spezies in einer Probe durch Elektrophorese, Chromatographie, Massenspektrometrie und anderen Verfahren aufgetrennt werden. Vorzugsweise werden die Bestandteile durch Elektrophorese mit oder ohne einem Siebmedium aufgetrennt. Jedoch ist es auch bevorzugt die Bestandteile auf einem chromatographischen Medium aufzutrennen, wie z.B. einem Perfusions-Chromatographiemedium, d.h. POROS^®, erhältlich von PerSeptive Biosystems, Inc.
In bestimmten Ausführungsformen wird ein Siebmedium in ein Plattengel gebildet, das Polyacrylamid oder Agarose umfasst. Wie hier verwendet, kann ein Siebmedium ein beliebiges Medium sein, das in der Lage ist Spezies in einer Probe, basierend auf deren Größe, aufzutrennen. Der Fachmann kann leicht ein geeignetes Medium, basierend auf der gewünschten spezifischen Auftrennungsgröße auswählen. Das Siebmedium kann z.B. ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Polyacrylamid, Agarose, Polyethylenoxid, Polyvinylpyrolidin und Methylcellulose. Das Medium kann eine Lösung sein oder in Flüssig- oder Gelform vorliegen und kann in einer Platte oder Kapillare vorliegen. Die elektrophoretische Geschwindigkeit von einem chemischen Bestandteil wird durch dessen elektrophoretische Mobilität in einem elektrischen Feld und dem elektroosmotischen Fluss bestimmt. Die elektrophoretische Mobilität des Bestandteils kann durch die Art des Elektrophoresemediums beeinflusst werden, z.B. pH, Ionenstärke und Viskosität. Ein Elektrophoresemedium kann aufgrund von physikalischen Eigenschaften ausgewählt werden, die die elektrophoretischen Mobilitäten von bestimmten Bestandteilen des Systems in selektiver Weise behindern. Zum Beispiel kann die Menge an Sieb-Mittel, das zu dem Medium zugesetzt wird, den molekularen Widerstand der Spezies verändern und auf diese Weise deren elektrophoretische Mobilität. In bestimmten Ausführungsfor men wird kein Siebmedium benötigt, da der Puffer ein ausreichendes Elektrophoresemedium für die Auftrennung der Bestandteile darstellt. In anderen Ausführungsformen kann das Medium denaturierend sein. Der Fachmann wird erkennen, dass ein Medium denaturiert gemacht werden kann, indem auf dem Gebiet bekannte Mittel eingesetzt werden, wie z.B. erhöhte Temperatur oder der Zusatz von denaturierenden Reagenzien.
Das elektrische Potential, das für eine elektrophoretische Bewegung erforderlich ist, wird typischerweise über das Medium durch eine Hochspannungsquelle angelegt, wobei der Betrieb bei elektrischen Feldstärken im Allgemeinen im Bereich von 100 Volt pro Zentimeter bis mehrere 1000 Volt pro Zentimeter stattfindet. Vorzugsweise beträgt das elektrische Feld ungefähr 100 bis ungefähr 500 Volt pro Zentimeter (siehe z.B. US-Patente Nrn. 4,865,706 und 4,865,707). Da PNAs ein Polyamidrückgrat haben, sind sie im Wesentlichen nicht geladen. Daher ist die Auftrennung des PNA/DNA-Hybrids von einer überschüssigen Sonde relativ leicht, da das hochgeladene Hybrid schnell in dem elektrischen Feld migrieren wird, während die im Wesentlichen neutrale Sonde langsam oder überhaupt nicht migrieren wird. Wie oben diskutiert, kann eine Markierung eine kleine Ladung zu der Sonde hinzufügen, beeinflusst diese jedoch nicht in signifikanter Weise die Auftrennung des PNA/Nukleotidkomplexes als es für eine DNA- oder RNA-Sonde der Fall sein würde.
In einer Ausführungsform wird das Siebmedium innerhalb eines elektrischen Auftrennungskanals angeordnet und die Probe und Sonde wird hierzu zugegeben. Die Elektrophorese kann vorteilhafter Weise durch eine Kapillarelektrophorese in Kapillaren oder Kanälen durchgeführt werden, mit oder ohne Siebmedium. Obwohl die Kapillaren oder Kanäle von einer beliebigen Größe sein können, ermöglichen Kapillaren oder Kanäle mit einer kleinen Querschnittsfläche sehr hohe elektrische Felder, die für eine hohe Geschwindigkeit und eine hohe Auflösung verwendet werden können. Ein Kanal hat vorzugsweise eine Tiefe von ungefähr 0,1 μm bis ungefähr 1000 μm und eine Breite von ungefähr 10 μm bis 1000 μm. Eine Kapillare hat einen Durchmesser von vorzugsweise zwischen ungefähr 25 m bis 100 μm. Eine solche Ausführung ermöglicht es leicht die Detektion der Markierung durch Fluoreszenz oder UV-Absorption zu quantifizieren. Es ist für eine Automatisierung gut geeignet. In bestimmten Ausführungsformen kann ein Multikanalmikrochip verwendet werden, um einen hohen Durchsatz durch Durchführung von mehreren Assays parallel zu ermöglichen. Ein Mikrochip kann bis zu 100 Kanäle enthalten.
Ein elektrisches Potential wird dann an das elektrisch leitende Siebmedium angelegt, das innerhalb des Kanals angeordnet ist, um eine Migration der hybridisierten Duplex und andere Bestandteile der Probe zu bewirken. Viele experimentelle Parameter der beanspruchten Erfindung können variieren, einschließlich aber nicht beschränkt auf elektroosmotischer Fluss, elektrophoretische Mobilität, Chemie des elektrophoretischen Mediums, pH, Temperatur, Ionenstärke, Viskosität, Probenvolumen, elektrisches Potential, Kapillarlänge, Art und Menge des Siebmediums, Detektionsverfahren etc. Diese Parameter können für eine beliebige durchzuführende elektrische Auftrennungsanalyse optimiert werden. Das Variieren von einem oder mehreren dieser Parameter ermöglicht es dem Fachmann unter Verwendung von Routineexperimenten die Erfindung einzusetzen und verleiht den beanspruchten Verfahren eine gewisse Vielfältigkeit.
Nach dem Auftrennungsschritt kann mit dem beanspruchten Verfahren der hybridisierte Komplex nachgewiesen werden. Der Nachweis kann durch Verfahrensweisen erreicht werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf Absorption von ultravioletter Strahlung, Absorption von sichtbarer Strahlung, Fluoreszenz, Chemilumineszenz, Refraktionsindex, Raman-Spektroskopie, Massenspektrometrie, Elektrochemie und Leitfähigkeit. In einigen Ausführungsformen kann es bevorzugt sein die DNA-Sonde mit Biotin zu markieren, das für die Detektion oder Lokalisierung von Proteinen, Kohlenhydraten und Nukleinsäuren verwendet wird (siehe Chollet et al., Nucleic Acids Res., Band 13, Nr. 5, Seiten 1529–1541 (1985)).
Der Fachmann wird andere Reste in Kombination mit den Probensequenzen einsetzen, um die Auflösung der Auftrennung zu erhöhen. Zum Beispiel können ladungsmodifizierende Reste zu dem Gemisch zugegeben werden, um die auf den PNA/Nukleotidkomplex einwirkende Kraft unter dem elektrischen Feld zu erhöhen. Kurz zusammengefasst umfasst ein Verfahren für die elektrische Auftrennungsanalyse von einem solchen Gemisch den Schritt des elektrischen Auftrennens eines Gemisches in einem Kanal, das (1) eine Probe; (2) einen ersten Bindungspartner, der an eine erste Bindungsstelle auf einem Analyten bindet, und (3) einen zweiten Bindungspartner, der an eine zweite Bindungsstelle auf den Analyten bindet, enthält. Der erste Bindungspartner kann einen detektierbaren Rest umfassen, der zweite Bindungspartner kann einen ladungsmodifizierenden Rest umfassen und daher zu einer unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilität einer nicht-gebundenen Probe und den Bestandteilen beitragen.
In bestimmten Ausführungsformen kann es nützlich sein, mehr als eine Zielsequenz in einer bestimmten Probe mit einer Sonde zu untersuchen. Solche multidimensionalen Analysen können auf verschiedene Arten durchgeführt werden. Zum Beispiel kann, wenn die Auftrennung auf der Größe basiert, das Muster von Fragmenten, die in einem solchen Assay nachgewiesen werden, einzigartig sein und daher die Basis für einen Assay bilden. In gleicher Weise kann das Muster als ein Elektropherogramm in Erscheinung treten, wenn die Auftrennung durch Elektrophorese erfolgt, und in anderen Ausführungsformen erscheint das Muster als Punkte oder Banden auf einem fotografischen Film. Der Fachmann kann leicht solche multidimensionalen Assays durchführen, indem eine Probe mit mehr als einer markierten PNA-Sonde, die auf mehr als eine Zielsequenz gerichtet ist, in Kontakt gebracht wird. Die Markierungen auf den verschiedenen Sonden können die selben oder unterschiedlich sein. Nach der Detektion können die Signalmuster auf die Zielsequenzen hin analysiert werden. Diese multidimensionalen Verfahren können z.B. bei der Identifizierung von spezifischen Genen, Genpolymorphismus, Vaterschaftstest oder diagnostischen Anwendungen Verwendung finden.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Markierungen unterschiedliche fluoreszierende Markierungen umfassen, die unabhängig detektierbar sind (siehe z.B. Smith, L. M. et al., Nucleic Acids Research, 13: 2399–2412 (1985) und Smith, L. M. et al., Nature, 321: 674–679 (1986)). In bestimmten Assays kann die Verwendung von mehreren Markierungen die absolute Identifizierung ermöglichen, um zu bestimmen, ob eine Zielsequenz mit einem bestimmten Fragment assoziiert ist.
Zusätzlich können mehrere Proben in einer einzelnen Auftrennung verarbeitet werden, wobei die Sonde oder die Sonden, die zur Durchführung der Analyse von einer einzelnen Probe verwendet werden, alle eine gemeinsame Markierung aufweisen, die Markierungen sich jedoch für die unterschiedlichen Proben unterscheiden. Daher können in einer Ausführungsform die Markierungen fluoreszierende Markierungen sein und die Auftrennung kann durch Elektrophorese durchgeführt werden. Danach können alle Proben gepoolt werden und in einer einzelnen Auftrennung aufgetrennt werden. Es sind alle Informationen bezüglich allen Proben nach einer Hybridisierung verfügbar und können unter Verwendung eines Detektionssystems abgerufen werden, das die unterschiedlichen Markierungen unterscheiden kann. Unter Verwendung von geeigneten Datenauswertungswerkzeugen können die Daten für jede einzelne Probe dargestellt und, wenn gewünscht, angezeigt werden.
Daher stellt die beanspruchte Erfindung ein Verfahren zur Hybridisierung, Auftrennung und Detektion von Molekülen mit einer Zielsequenz bereit. Im Gegensatz zu herkömmlichen Techniken, kann eine Hybridisierung gleichzeitig oder vor einer Auftrennung und Detektion erfolgen. Ein konventionelles Blotten mit DNA- oder RNA-Sonden beinhaltet ein mehrstufiges Verfahren, das sowohl zeitaufwändig als auch laborintensiv ist und (1) Beladen einer denaturierten Probe auf einem Siebmedium; (2) Auftrennung durch Elektrophorese; (3) Transfer auf eine Membran; (5) Hybridisierung mit einer Sonde; (6) stringente Waschschritte und schließlich (7) Entwicklung der Markierung zur Detektion benötigt. Im Gegensatz dazu erfordern die beanspruchten Verfahren lediglich eine Hybridisierung mit einer Sonde, das Beladen einer Probe auf einem Siebmedium oder in den Injektionsbereich einer Kapillare und das Auftrennen durch Elektrophorese vor der Detektion. Unter Bezugnahme auf 1 sind ein Chart-Diagramm des Verfahrens des Stands der Technik und ein Flussdiagramm des Verfahrens der vorliegenden Erfindung für einen direkten Vergleich von deren jeweiligen Schritten gezeigt. Folglich sind die beanspruchten Verfahren schneller und weniger laborintensiv als die auf dem Gebiet bekannten Verfahren.
Die folgenden Experimente verdeutlichen die Einsetzbarkeit der DNA-Sonden/Nukleotidanalyse im Vergleich zu konventionellen DNA-Sonden/DNA-Analysen.
Beispiel 1. Prä-Gel-Hybridisierung
A. Experimentelles Design:
Unter Bezugnahme auf die Tabellen 1A und 1B wurden fünf verschiedene Schmelz-/Anlagerungs-(Hybridisierungs-)temperaturen unter Verwendung von PNA- und DNA-Sonden getestet, die mit Biotin markiert waren (Proben A–E). Die experimentellen Kontrollen umfassten eine DNA/PNA-Probe, die lediglich auf 94°C erhitzt worden ist und eine DNA/PNA-Probe, die lediglich auf 55°C erhitzt worden ist (Proben F1 und F2). Bei jeder Temperatur wurden serielle Verdünnungen der Ziel-DNA durchgeführt (d.h. 2 ng, 0,2 ng und 0,02 ng; Tabelle 1A). Alle Proben enthielten 1 Picomol (pmol) der Sonde. Die endgültige Salzkonzentration des Gemisches betrug 1 mM Tris (7,5), 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; TE bezeichnet das Gemisch von Tris und EDTA). Das Gesamtvolumen von jeder Reaktion betrug 10 μl.
Hybridisierte Proben wurden auf einem 1%igen Agarose-Gel aus 1 × TBE (0,134 M Tris, 44,5 mM Borsäure, 2,7 mM Na₂EDTA) laufen gelassen. Die Kapillarübertragung auf eine nicht-geladene Nylonmembran wurde unmittelbar nach dem Gel-Lauf durchgeführt. Der Transferpuffer war 20 × SSC (3 M NaCl, 300 mM Natriumcitrat). Am nächsten Tag wurde die Membran getrocknet und mit UV kreuzvernetzt (ultraviolettes Licht, bei dem die Quelle eine Gesamtenergiemenge von 33000 μJoule/cm² abgibt). Die Membranen wurden in einer verschließbaren Heißklebetasche eingeschlossen und die Biotinmarkierung wurde unter Verwendung eines chemilumineszierenden Kits (#7006), bezogen von New England Biolabs, nachgewiesen. Der Nachweis erfolgte entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Die Membran wurde einem Röntgenfilm ausgesetzt und entwickelt, um das Bild zu erhalten.
Tabelle 1A. Probenbestandteile
Tabelle 1B. Experimentelle Bedingungen

A) 94°C, 10 Min.; 45°C, 15 Min.
B) 94°C, 10 Min.; 55°C, 15 Min.
C) 94°C, 10 Min.; 75°C, 15 Min.
D) 94°C, 10 Min.; 45°C, 5 Min.
E) 94°C, 10 Min.; 75°C, 5 Min.
F1) 94°C, 10 Min.
F2) 55°C, 10 Min.

Die erste Temperatur wurde so gewählt, dass sie als Schmelztemperatur und die zweite als Anlagerungstemperatur wirkt.
B. Ergebnisse:
Unter Bezugnahme auf die 2A und 2B bezeichnet ein P, dass eine PNA-Oligomersonde angelagert (hybridisiert) wurde und ein D bezeichnet, dass eine DNA-Oligomersonde an die Nukleinsäure-Duplex angelagert (hybridisiert) wurde. M bezeichnet eine Markerspur. Spuren A1, B1, C1, D1 und E1 enthalten Banden innerhalb des Gels, welche der PNA-Sonden/Nukleinsäure-Duplex, die in das Gel migriert und nachgewiesen worden ist, entsprechen. Da jede Probe unterschiedlichen Temperaturbedingungen während der Hybridisierung ausgesetzt war, zeigt das Experiment, dass das Anlagerungsphänomen weitgehend temperaturunabhängig ist. Unter identischen Bedingungen ist die analoge DNA-Sonden/Nukleinsäure-Duplex kaum nachweisbar, was durch die Spuren A2, B2, C2, D2 und E2 gezeigt ist. In jeder dieser Spuren wird die markierte DNA-Sonde als ein großer runder Klumpen am Boden jeder Spur nachgewiesen. Dieser Klumpen ist sichtbar, da überschüssiges DNA-Oligomer geladen ist und daher in dem Gel migriert. Der Klumpen befindet sich am Boden des Gels, da er klein ist (15 Nukleotide) und sich sehr schnell durch das Gel bewegt. Umgekehrt, Spuren mit PNA-Sonde weisen nur in der Nähe der Ladetasche einen Hintergrund auf, da die Sonden in das Gel primär durch passive Diffusion migrieren. Der Nachweis der PNA/Nukleinsäure-Duplex in den Spuren 3 und 5 von allen Proben erforderte eine längere Belichtungszeit für den Film, damit die Bande nachweisbar wird. Daher gibt es eine Konzentrationsabhängigkeit, wodurch die Nachweisgrenzen von der Ausgangsmenge der Ziel-DNA und der Sondenmenge, die zur Bindung an die Zielsequenz verfügbar ist, abhängt. Die Kontrollen zeigen, dass die Probe DNA/DNA selbst bei 55°C schmilzt, was auch eine geeignete Anlagerungstemperatur für DNA/PNA-Duplexe ist. Darüber hinaus muss keine Anlagerungstemperatur erreicht werden, da eine Duplex zur Kontrolle F1 gebildet wird.
Beispiel 2. Prä-Gel-Hybridisierungslauf auf unterschiedlichen Gelsystemen
A. Experimentelles Design
Bei diesem Experiment wurde jede Probe dreifach hergestellt. Es wurden drei unterschiedliche Restriktionsverdaus auf doppelsträngiger Plasmid-DNA durchgeführt, die in diesem Experiment zum Einsatz kamen: 1) pBR322, das mit dem Restriktionsenzym BstNI, 12 ng, verdaut wurde, um dreifach gespalten zu werden und 2) pBR322, das mit dem Restriktionsenzym MspI verdaut wurde. Es wurden zwei ge trennte Ausgangskonzentrationen für jede Probe des verdauten Plasmids verwendet (d.h. 50 ng und 12 ng des Ausgangsplasmids). Jede Probe des Plasmidverdaus wurde in ein Eppendorf-Gefäß überführt und zu dem Gefäß wurde zugegeben: 4 Picomol (pmol) der biotinilierten PNA-Sonde (5'-Bio-oo-ATGCAGGAGT CGCAT-3'), ein Zehntel des Volumens von Tris-EDTA-Puffer und deionisiertes und filtriertes Wasser (dH₂O), um das Volumen auf 30 ml zu bringen. Diese Reaktionen wurden bei 70°C für 20 Minuten gestellt. Sie wurden dann in drei Teile aufgeteilt, der geeignete Ladefarbstoff wurde zugegeben und sie wurden entweder auf einem 4–20%igen denaturierten Acrylamid-Gel (3A), 7 M Harnstoff-6% Acrylamid-Gel (3B) oder 1%-Agarose-Gel (3C) aufgetrennt. Die Bestandteile in jedem Gel wurden dann durch Kapillarwirkung auf eine nicht-geladene Nylonmembran überführt. Die Membran wurde getrocknet und mit UV kreuzvernetzt (ultraviolettes Licht, bei dem die Quelle eine Gesamtenergiemenge von 33000 μJoule/cm² abgibt). Die Membranen wurden in einer verschließbaren Heißklebetasche verschlossen und die Biotin-Markierung wurde unter Verwendung eines chemilumineszierenden Kits (#7006), der von New England Biolabs bezogen wurde, nachgewiesen. Die Empfehlungen des Herstellers wurden für diesen Nachweis verwendet. Die Membran wurde einem Röntgenfilm ausgesetzt und entwickelt, um das Bild zu ergeben.
B. Ergebnisse:
Unter Bezugnahme auf die 3A, 3B und 3C wurden die Proben nur dann auf die Gele geladen, wenn dies durch eine Ziffer 1, 2 oder 3 gekennzeichnet wurde. Die Ziffer 1 entspricht jeweils 4 ng pBR322, das mit BstNI verdaut wurde. Die Ziffer 2 stellt jeweils die höhere Konzentration von 16 ng pBR322 dar, das mit MspI verdaut wurde. Gleichermaßen entspricht die Ziffer 3 dem weniger konzentrierten 4 ng pBR322, das mit MspI verdaut wurde. Der Buchstabe M zeigt an, dass ein Größenmarker in solchen Spuren laufen gelassen wurde. Wie erwartet, variiert die Mobilität der Bestandteile wesentlich von Gel zu Gel bei den unterschiedlichen Gel-Bedingungen. Unter Bezugnahme auf 3A enthält Spur 1 eine einzelsträngiges DNA-Fragment, das 939 Basenpaare (bp) lang ist. Die selbe Bande tritt in Spur 1 von 3C auf. Sie ist jedoch nicht in 3B feststellbar. Dies liegt daran, weil das Fragment zu groß ist, um erfolgreich über 6% Acrylamid einer Elektrophorese unterzogen zu werden. Hinsichtlich des PNA-Fragment-Komplexes, das in Spur 2 der 3A, 3B und 3C festgestellt wurde, gibt es ein Fragment mit einer Bande von ungefähr 97 bp, die sichtbar ist. Es wird wieder deutlich, dass verschiedene Gele unterschiedliche Mobilitäten von Fragmenten der selben Länge übermitteln. Spur 3, die in den 3A, 3B und 3C festgestellt wurde, welche einer verdünnteren Lösung des Fragments-/PNA-Komplexes entspricht, der in Spur 2 festgestellt wird, läuft in dem selben Teil von dem entsprechenden Gel-System.
Dieser Satz von Experimenten zeigt, dass der PNA/DNA-Komplex erhalten bleibt/intakt bleibt in einem 7 M Harnstoff-6% Acrylamid-Gel und in dem in dem Ladefarbstoff verwendeten Formamid. Wenn dies nicht der Fall wäre, würde dann keine unterscheidungskräftige Bande sichtbar sein, da die Detektion von der Biotin-Markierung abhängt, die das PNA trägt. Es ist anzumerken, dass die einzig sichtbare Bande auf dem 6%igen Acrylamid-Gel die pBR322-MspI-Bande ist, die ungefähr 97 bp lang ist. Die Bande ist wesentlich kürzer als das BstNI-Ziel (939 bp). Diese Bande ist sichtbar, da das 6%ige Acrylamid-Gel Fragmente, die kleiner als 500 Basenpaare sind, auftrennt. Größere Fragmente gelangen nicht in das Gel hinein und werden auch nicht wesentlich auf eine Membran überführt.
Beispiel 3. Restriktionsenzymverdau/Prä-Gel-Hybridisierung
A. Experimentelles Design:
Sechs Reaktionssätze wurden zweifach angesetzt. Es wurde 4 ng linearisierte doppelsträngige pBR322 für jede Reaktion verwendet. Es wurden 2 pmol einer biotinilierten PNA, 1/10tel Volumen von TE-Puffer und dH₂O, um das Reaktionsvolumen auf 10 μl zu bringen, zu dem pBR322 zugegeben. Die Probensätze wurden bei der angezeigten Temperatur für 10 Minuten inkubiert und dann langsam (über 30 Minuten) auf Raumtemperatur abgekühlt (Probe 2B wurde anfangs auf 94°C erhitzt, Probe 3B und D wurden bei 85°C erhitzt, Probe 4B und D bei –75°C, Probe 5B und D bei –65°C, Probe 6B und D bei –55°C und Probe 7B und D wurden bei Raumtemperatur gelassen). Nachdem alle Proben langsam auf Raumtemperatur abgekühlt worden sind, wurden dH₂O, 1/10tel Volumen des Mediumsalzes (NEB 2–10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 1 mM Dithiotheritol) und 1 ml PstI-Restriktionsenzym zu jeder Probe zugegeben. Diese wurden bei 37°C für 20 Minuten inkubiert und dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Am nächsten Tag wurde zu jedem Gefäß zusätzliche 0,5 ml Restriktionsenzym zugegeben und bei 37°C für 15 Minuten inkubiert. Unter Bezugnahme auf 4 hatte ein Probensatz (B) zugegebenen Ladepuffer enthalten und war bereit, um auf das Agarose-Gel geladen zu werden. Der andere Satz (D) wurde bei 94°C für 10 Minuten inkubiert. Dann wurde Ladefarbstoff zu dem Satz D zugegeben und die Proben wurden gela den. Alle Proben wurden über ein 1%iges Agarose-Gel einer Elektrophorese unterzogen. Die Bestandteile in jedem Gel wurden dann durch Kapillarwirkung auf eine nicht-geladene Nylonmembran überführt. Am nächsten Tag wurde die Membran getrocknet und mit UV kreuzvernetzt (ultraviolettes Licht, bei dem die Quelle eine Gesamtenergiemenge von 33000 μJoule/cm² abgibt). Die Membranen wurden in eine verschließbaren Heißklebetasche verschlossen und die Biotin-Markierung wurde unter Verwendung eines chemilumineszierenden Kits (#7006), der von New England Biolabs bezogen wurde, nachgewiesen. Der Nachweis erfolgte entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Die Membran wurde einem Röntgenfilm ausgesetzt und entwickelt, um das Bild zu ergeben.
B. Ergebnisse:
Unter Bezugnahme auf 4 werden die einzigen Spuren, in denen verdaute DNA sichtbar ist (d.h. ein kürzeres Fragment sichtbar ist), in den D-Spuren von jeder Probe feststellbar. Dies zeigt, dass zum Verdau der DNA diese zuerst neu angelagert werden muss, so dass sie doppelsträngig vorliegt. Wenn eine erneute Anlagerung stattfindet, löst sich die PNA-Sonde von dem Komplex ab. Die B-Spuren enthalten verdaute DNA-Fragmente, die nicht detektiert werden, da sich die PNA-Sonde von dem Komplex ablöst, so dass die DNA nicht länger markiert ist. Die D-Spuren sind sichtbar, da nach dem Verdau die PNA-Sonde die Möglichkeit hatte, sich erneut anzulagern, da die 10 Minuten-Behandlung bei 94°C die doppelte Standard-DNA schmolz, so dass die PNA noch einmal binden konnte. 4 zeigt mehrere Eigenschaften der PNA-Sonden und von doppelsträngiger DNA. Erstens ist es bevorzugt, die DNA bei hohen Temperaturen zu schmelzen, so dass eine erneute Anlagerung wesentlich länger braucht als das Erhöhen der Schmelztemperatur. Zweitens wird DNA, welche die Möglichkeit hatte, dass sich ein PNA an die einzelsträngige DNA erneut anlagert, wird als verdaut festgestellt. Bei 65, 75, 85 und 95°C gibt es einige einzelsträngige DNA, die mit einer an ihr gebundenen PNA zurückbleibt. Dies ist jedoch nicht der Fall für eine Probe bei 55°C oder Raumtemperatur. Drittens schlossen wir, da die Proben nach einem Verdau in der Gegenwart von PNAs nicht erneut erhitzt wurden, dass es gespaltene DNA gibt, die jedoch nicht nachgewiesen wird. Unsere Gesamtschlussfolgerung ist, dass die DNA, die wir auf diesen Gelen sichtbar machen, einzelsträngig ist und dass sie die PNA ablöst, wenn die DNA renaturiert, was ein langsamer Prozess ist.
Beispiel 4. Prä-Gel-Hybridisierungs-Assay für das zystische Fibrose-Gen W1282
A. Experimentelles Design:
Die W1282X-Mutation in Trägern der zystischen Fibrose wurde verwendet, um die Einsetzbarkeit des Verfahrens zur Detektion einer Einzel-Basenmutation in einem klinisch relevanten Assay zu testen. Unter Bezugnahme auf 4A wurden 4 Hybridisierungs-Assays parallel laufen gelassen unter Verwendung einer DNA-Probe, die von einem nicht-betroffenen Individuum stammt, das zwei Wildtyp-Allele W1282, Spuren 1 und 2, enthält, und einer DNA-Probe, die von einem Träger zur Verfügung gestellt wurde, der ein Wildtyp-Allel W1282 und das Mutanten-Allel W1282X trägt, Spuren 3 und 4, unter Verwendung einer Fluoreszenz-markierten PNA-Sonde für den Wildtyp, Flu-oo-CTTTCCTCCA CTGTT-NH₂, Spuren 1 und 3 und einer Fluoreszenz-markierten PNA-Sonde für die Mutante, Flu-oo-CTTTCCTTCA CTGTT-NH₂, Spuren 2 und 4. Jede Ziel-DNA-Sonde (0,5–1,0 μl) aus einer PCR-Reaktion wurde mit der fluoreszierenden PNA-Sonde (0,5–1,0 pmol) und 1 μl 250 mM Tris (pH 8,0) gemischt und das Gesamtvolumen wurde auf 10 μl mit dH₂O gebracht. Jedes Gemisch wurde bei 95°C für 10 Minuten erhitzt und dann auf Raumtemperatur für 10 Minuten abgekühlt. Der Ladefarbstoff wurde zugegeben und jedes Gemisch wurde auf einem 1,5%-TBE-Agarose-Gel geladen und für 25 Minuten einer Elektrophorese unterzogen. Das Gel wurde für einen Southern-Transfer auf einer Nylonmembran vorbereitet. Die Membran wurde getrocknet und bei 254 nm vor der Detektion kreuzvernetzt. Die Detektion der Chemilumineszenz der fluoreszierenden PNA-Sonden und PNA/DNA-Hybriden wurde durchgeführt, indem die kreuzvernetzte Membran in eine Heißklebetasche zusammen mit einem Anti-Fluorescein-Antikörper, der mit alkaliner Phosphatase DAKO (#K046, Koppenhagen, Dänemark) direkt konjugiert ist, gegeben wurde. Die Membran wurde in 5 Volumen-TMS (10 mM Tris, pH 9,5, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl₂) für zwei Minuten und Lumigen-Lösung (Prototyp #7006, New England Biolabs) gespült. Die Membran wurde auf einen Fuji RX-Film gelegt.
B. Ergebnisse:
Unter Bezugnahme auf 4A wurde eine sehr wirksame Unterscheidung erreicht, obwohl stringente Bedingungen nicht über eine Kontrolle der Temperatur angewendet werden konnten. Die Intensitäten der Banden von den Proben, die von dem Träger erhalten wurden, Spuren 3 und 4, wiesen eine ungefähr halb so große Intensität der Bande auf, die von dem Wildtyp PNA/DNA-Hybrid, Spur 1, resultiert. Die Mutanten-PNA-Sonden hybridisieren mit der Wildtyp-DNA-Probe, Spur 2, was die hohe Spezifität des Verfahrens zeigt, wenn es zur Einzelbasenpaarunterscheidung der Proben-DNA eingesetzt wird. In allen Spuren wurde überschüssige markierte PNA-Sonde mit verschiedener Intensität festgestellt, wobei die intensivste in Spur 2 festgestellt wurde, in der die Mutanten-PNA-Sonde keine detektierbare Mengen des Hybrids mit der Wildtyp-DNA-Probe bildete. Die beobachtete Wirksamkeit einer Einzelbasenpaarunterscheidung ist auf zwei Faktoren zurückzuführen: 1) die markierten PNA-Sonden sind intrinsisch hochspezifisch und 2) die relativ kurze Länge der PNA-Sonden und insbesondere wird nur ein kleiner Überschuss der Sonde in dem Assay verwendet. Dies ist im Gegensatz zu dem traditionellen Southern-Blot, bei dem ein hoher Überschuss an (DNA-)Sonde normalerweise verwendet wird. Wenn ein Überschuss der Mutant-PNA-Sonde mit der Wildtyp-DNA-Probe verwendet wurde, wurde eine Falsch-Positive festgestellt, Spur 5, 4B.
Beispiel 5. Schnelle Erfassung von Southern-Blot-Daten durch Kapillarelektrophorese
A. Kapillarelektrophorese(CE)-Aufbau:
Es wurde ein P/ACE 2050-Kapillarelektrophoreseapparat mit einem Argonionenlaser, Lasermodul 488 (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA) mit einem 520 Nanometer (nm) Bandpass-Filter für eine Laser-induzierte Fluoreszenz(LIF)-Detektion verwendet. Es wurde eine Ultraviolett(UV)-Absorptionsdetektion bei 260 nm durchgeführt. Die Auftrennungen erfolgen in einem Modus mit negativer Polarität, wobei sich die Kathode auf der Injektionsseite befand. Die Kapillare war eine unbehandelte Kapillare mit einem inneren Durchmesser (i.d.) von 75 μm (35 cm in der Länge und 28 cm zum Detektor) (P/N 2000017, Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, USA) und einer Länge von 35 Zentimeter (cm) (28 cm zum Detektor).
B. Materialien:
Ein kommerziell erhältliches Plasmid (M13mp18-DNA) und das mit BstN1(P/N #303-1S) und Msp1(P/N #303-2L)-Restriktionsenzym-verdaute Plasmid pBR322 wurden von New England Biolabs, Beverly, MA, USA, erhalten. Diese dienten als Nukleinsäureproben mit bekannten Zielsequenzen von Interesse. Trisboratethylendiamintetraessigsäure(TBE)-Pufferpulver wurde erhalten von Sigma (St. Louis, MO, USA) und 1 × TBE (pH 8,3) wurde hergestellt. 1%ige Poly(ethylenoxid)(PEO)-Polymerpufferlösung (MW = 4 Millionen Dalton) wurde mit 1 × TBE-Puffer hergestellt.
Fluorescein- oder Biotion-markierte PNA-Sonden, die sowohl vollständig komplementäre Sequenzen als auch Basenpaar-Mismatches gegenüber den Zielen enthalten, wurden auf einem Expedite Nukleinsäuresynthesesystem von PerSeptive Biosystems (Framingham, MA, USA) synthetisiert. Die Spacer-Einheiten von 8-Amino-3,6-dioxaoctansäure (-o-) wurden zu der Harz-gebundenen PNA vor der Reaktion von aktivierten Estern von Biotin (Bio) oder Fluorescein (Flu) wie Dimethoxytritylbiotinester von 1-(4'-Nitrophenyl)pyrazolin-5-on (DMTr-bio-HPP) oder 5,6-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimid zugegeben. Die markierte PNA wurde dann von dem Harz gespalten und Schutzgruppen wurden unter Verwendung von einem TFMSA/TFA/m-Creso/Thioanisol-Gemisch (2:6:1:1) für zwei Stunden bei Raumtemperatur entfernt. Die markierte PNA wurde von dem Filtrat durch Zusatz von wasserfreiem Ether präzipitiert. Das rohe PNA-Präzipitat wurde durch HPLC auf einer Deltapack-C18-Säule (Waters) und durch eine Sephadex G-25 gereinigt, um fluoreszierende Unreinheiten zu entfernen. Die Sequenzen der verschiedenen markierten PNA-Sonden, die in den folgenden Experimenten verwendet wurden, sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2: Markierte PNA-Sonden
C. Experimentelles Design (Sondenhybridisierung)
10 Mikroliter (μl) einer Lösung, die das DNA-Ziel von Interesse (10^–7–10^–8 M Nukleinsäureprobe) enthält und 10 μl einer Probe, die die markierte PNA-Sonde (10^–6–10^–7 M) enthält, wurde in ein Mikrogefäß zugegeben. Das Gemisch wurde bei 90°C für 10 Minuten erhitzt, um irgendwelche doppelsträngigen Abschnitte von DNA (Sekundärstruktur) zu schmelzen und wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Probe wurde dann auf den Kapillarelektrophoreseapparat geladen und die Auftrennung wurde laufen gelassen. Die Fähigkeit zur Detektion ist in den oben beschriebenen Apparat integriert.
D. Ergebnisse:
Experiment 1. Temperaturkontrolle zur PNA/DNA-Hybridisierung
Es wurden Experimente zur Temperaturkontrolle zur Hybridisierung von Fluorescein-markierten PNA-Sonden mit komplementären Sequenzen von Flu-oo-TTTTCCCAGT CACGA-NH₂, Einbasen-Mismatch Flu-oo-TTTTCCCAGG CACGA-NH₂ und Zweibasen-Mismatch Flu-oo-TTTTCACAGG CACGA-NH₂ an das M13mp18-Plasmid durchgeführt. Die Proben wurden wie oben beschrieben hergestellt und auf dem oben beschriebenen Apparat analysiert. Bei diesem Experiment wurde die Kapillare in eine Kassette platziert, die temperaturreguliert war, um so die Temperaturkontrolle während der Auftrennung zu ermöglichen. Eine Reihe von CE-Auftrennungen wurden bei einer Spannung von 20 Kilovolt (KV) bei Temperaturen im Bereich von 10°C bis 50°C durchgeführt. Die Analyse wurde in der Gegenwart (5) und Abwesenheit (6) von 30% Formamid in 1 × TBE-Puffer (pH 8,3) durchgeführt. Die LIF-Detektion wurde bei einer Anregung bei 488 nm und einer Emission bei 520 nm durchgeführt. Im Allgemeinen wurde beobachtet, dass die Schmelzpunkte der Hybride mit der zunehmenden Anzahl von Basenpaar-Mismatches abnimmt, wobei es sich dabei um ein erwartetes Ergebnis handelt.
Daten, die in der Abwesenheit von Formamid erhalten wurden, sind in 6 dargestellt. Unter Bezugnahme auf 6 stellt die Kurve B Daten dar, die für das Zweibasen-Mismatch erhalten wurden und Kurve A stellt die Daten dar, die für die komplementäre PNA-Sonde erhalten wurden. Da die Kurve A relativ flach ist, weisen die Daten darauf hin, dass die aus der komplementären Sonde gebildete Duplex bei allen aufgezeichneten Temperaturen stabil ist. Die S-förmige Form der Kurve B ist typisch für ein thermales Schmelzprofil und deutet darauf hin, dass sich die Sonde mit zwei Basenpaar-Mismatches im Wesentlichen an das Ziel bei Temperaturen unterhalb von 30°C anlagert und der Schmelzpunkt der DNA/PNA-Duplex ungefähr bei 33°C ist.
Die Daten, die in der Gegenwart von 30% Formamid in dem Laufpuffer (ein denaturierendes Reagens) erhalten wurden, sind in 5 dargestellt. Wiedergegeben sind die Kurven der Temperaturkontrolle für die Proben, die eine komplementäre DNA-Sonde (Kurve A), Einbasen-Mismatch-PNA-Sonde (Kurve B) und Zweibasen-Mismatch-PNA-Sonde (Kurve C) enthalten. Der niedrige Signalspiegel und die fehlende Steigung der Kurve C deutet darauf hin, dass sich die Sonde mit einem Zweibasen-Mismatch nicht an das Ziel innerhalb des in dem Experiment verwendeten Temperaturbereichs anlagert. Die Steigung von Kurve B deutet darauf hin, dass sich die Sonde mit einem Einzelbasenpaar-Mismatch an das Ziel anlagert, der Komplex sich jedoch vollständig oberhalb von 25°C dissoziiert. Kurve A deutet darauf hin, dass die Schmelztemperatur (Tm) des gebildeten Komplexes unter diesen Bedingungen mit der komplementären DNA-Sonde zwischen 35 bis 38°C beträgt, da das Fluoreszenz-Signal bei 35°C stark abzufallen begann. Der PNA-Sonden-Assay kann bei einer höheren Temperatur und bei denaturierenden Bedingungen durchgeführt werden, um die Spezifität des Assays zu erhöhen.
Beispiel 2. Kapillar-Gel-Elektrophorese für DNA-Größenauftrennungen
Ein unvernetztes Polymer (PEO) wurde als Siebmedium bei der Kapillar-Gel-Elektrophorese (CGE) für DNA-Auftrennungen eingesetzt. Es gibt ein Phänomen bei der Kapillar-Elektrophorese, bei dem eine Ionisierung des Silanols auf einer unbeschichteten Kapillaroberfläche eine elektrische Doppelschicht von Puffer-Kationen über die Oberfläche erzeugt. Wenn eine Spannung über die Kapillare angelegt wird, verursacht eine Migration der Doppelschicht von Kationen einen Fluss von einer Flüssigkeitsmasse in die Kapillare in Richtung der Kathode. Dieser Fluss ist das Ergebnis einer Elektroendoosmose und wird als elektroosmotischer Fluss (EOF) bezeichnet. Es ist wünschenswert, den EOF bei einer Kapillar-Gel-Elektrophorese zur DNA-Auftrennung möglichst gering zu halten. Der Vorteil der unbehandelten Polymer-Gel-gefüllten Kapillare ist, dass EOF gering gehalten wurde und dass die Polymer-Lösung mit geringer Viskosität aus der Kapillare unter Druck herausgepresst werden kann und dann leicht ersetzt werden kann.
Es wurden verschiedene Molekulargewichte von PEO-Polymer getestet. Der elektroosmotische Fluss war bei einer mit 0,5% PEO (MW = 8 Millionen Dalton) gefüllten unbeschichteten Kapillare sehr niedrig. Folglich wurden unter Verwendung dieses Modellsystems die BstNI- und MspI-Verdaus durch die PEO-Gel-gefüllte Kapillare aufgetrennt (7). Eine Spannung von 10 KV wurde für alle Auftrennungen ver wendet. Der Nachweis der Probenbestandteile wurde durch UV-Detektion bei 260 nm durchgeführt.
Die Spitzen wurden mit den Banden verglichen, die von einer elektrophoretischen Auftrennung der selben Probe auf einem Agarose-Säulengel erhalten wurden. Bekannte Spitzen wurden basierend auf einer Analyse der beiden Auftrennungen und den bekannten Molekulargewichten, wie sie von dem Hersteller angegeben werden, gekennzeichnet. 8 stellt die Kalibrierungskurve der Proben des BstNI- und MspI-Verdaus dar. Die Migrationszeit wurde gegen die Länge der Nukleinsäureragmente aufgetragen. Die Daten waren von 300 Basen bis 1200 Basen weitgehend linear. Der Variationskoeffizient (CV), die Standardabweichung geteilt durch den Durchschnitt, betrug weniger als 0,65% für sechs doppelte Läufe von Auftrennungen des MspI-Fragments. Die Daten zeigten, dass die Kapillare eine angemessene Größenauftrennung der Fragmente ermöglichen würde.
Beispiel 3. Sondenhybridisierung und Größenbestimmung durch CE-Analyse
Eine Fluorescein-markierte PNA-Sonde (7,5 × 10^–7 M) mit einer Sequenz, die komplementär ist zu einer Zielsequenz der pBR322-DNA-Probe, wurde, wie oben beschrieben, hergestellt. Es wurden sowohl der MspI- (1000 μg/ml) als auch der BstNI-Verdau von pBR322-DNA (1000 μg/ml) als Ziele verwendet. Die Zielsequenz und die Sequenz der PNA-Sonde sind unten gezeigt.
Eine homogene Hybridisierung in Lösung wurde durchgeführt, indem die Fluorescein-markierte PNA (im Überschuss) mit den pBR322-DNA-Verdaus gemischt wurde. Das Gemisch wurde dann auf 90°C für 5 Minuten erhitzt, um die doppelsträngige DNA zu denaturieren. Die Proben wurden dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Das Gemisch wurde dann durch Kapillar-Gel-Elektrophorese mit einer LIF-Detektion unter Verwendung der oben beschriebenen Kapillare und Apparats aufgetrennt.
Unter Bezugnahme auf 9 kann die PNA/Nukleinsäure-Duplex, die aus der markierten PNA-Sonde und dem Nukleinsäurefragment (929 Basen) des BstNI-Verdaus gebildet ist und die Zielsequenz trägt, nachgewiesen werden (Peak 1). Da die Fluorescein-Markierung der markierten PNA-Sonde eine Negativladung trägt, migriert die markierte PNA-Sonde in das Gel und wird auch nachgewiesen (Peak 2).
Unter Bezugnahme auf 10 kann die PNA/Nukleinsäure-Duplex, die aus der markierten PNA-Sonde und dem Nukleinsäurefragment (97 Basen) des MspI-Verdaus gebildet ist und die Zielsequenz trägt, nachgewiesen werden (Peak 1). Da die Fluorescein-Markierung der markierten PNA-Sonde eine Negativladung trägt, migriert die markierte PNA-Sonde in das Gel und wird nachgewiesen (Peak 2).
Unter Bezugnahme auf 11 zeigt eine vergleichende Auftrennung von Proben, auf die in den 5 und 7 Bezug genommen wurde, dass eine vergleichende Größenauftrennung der Fragmente, die die Zielsequenzen tragen, durchführbar ist. Daher ist Peak 1 eine Duplex, die aus dem MspI-Fragment (97 Basen), das die Zielsequenz trägt und der markierten PNA-Sonde gebildet wurde. Peak 2 ist eine Duplex, die aus dem BstNI-Fragment (929 Basen), das die Zielsequenz trägt, und der markierten PNA-Sonde gebildet wurde. Peak 3 wiederum ist die überschüssige Fluorescein-markierte PNA-Sonde. Die Fragmente, die die komplementäre Sequenz enthalten, wurden aufgetrennt und spezifisch durch CGE-LIF innerhalb von 30 Minuten detektiert. Folglich wird sowohl eine Größen- als auch eine Sequenzinformation für die Proben innerhalb eines 30minütigen Laufs erhalten. Ein hoher Durchsatz kann erreicht werden, indem ein Mikrochip-Format verwendet wird, bei dem die Analysen in Kanälen durchgeführt werden, die in einem Festsubstrat gebildet werden. Solche Vorrichtungen können mit mehreren Kanälen hergestellt werden, die viele getrennte Analysen, die parallel durchgeführt werden können, ermöglichen (siehe Stu Borman, Developers of Novel DNA Sequences Claim Major Performance Advances, Chemical & Engineering News, July 24, 1995, Seiten 37–39).
In einem anderen Aspekt stellt die beanspruchte Erfindung eine Apparatur zum Nachweis des Vorliegens, Fehlens oder Konzentration eines Analyten in einer Probe bereit. Die Apparatur kann, in verschiedenen Ausführungsformen, beispielsweise ein Probeninjektionsbereich, eine PNA-Sonde, die so angeordnet ist, dass sie mit einer Probe, die in diesem Injektionsbereich eingeführt wird, vermischt wird und einen Auftrennungsbereich umfassen. In einigen Ausführungsformen kann die Apparatur einen Probeninkubationsbereich umfassen. Unter Bezugnahme auf 12 umfasst die Apparatur 10 in bestimmten Ausführungsformen einen Probeninjektionsbereich 24. Eine oder mehrere PNA-Sonden 28 werden innerhalb des Probeninjektionsbereiches 24 so angeordnet, dass nach der Einführung der Probe in dem Bereich 24 die Sonde 28 mit der Probe in Kontakt kommt. Wenn das Ziel vorhanden ist, wird die Sonde dann an das Ziel hybridisieren. Die Apparatur umfasst weiter eine Kapillare und einen Kanal 20, in dem ein Auftrennungsmedium 36 darin angeordnet ist, wobei der Kanal eine Verbindung mit dem Probeninjektionsbereich 24, einem Pufferreservoir 16, einem Injektions-/Abfallreservoir 26 und einem Abfallreservoir 30 hat. In bestimmten Ausführungsformen befindet sich die Abzweigung des Probeninjektionsbereiches 24 und der Kapillare 20 oberhalb der Abzweigung des Injektions-/Abfallreservoirs 26 und der Kapillare 20. Diese räumliche Anordnung ermöglicht es ein größeres Injektionsvolumen festzulegen.
Während des Betriebs und unter Bezugnahme auf 13A wird eine Probe in den Injektionsbereich 24 eingeführt und ein Ziel wird, wenn vorhanden, mit der Sonde 28 hybridisieren. Es wird eine Hochspannung (HV) an die Bereiche 16, 24 und 30 relativ zur Erde (GND), die an dem Bereich 26 angelegt wird, angelegt und wird kontrolliert, um den fließenden Probenstrom abzuklemmen, die Diffusion der Probe 22 in den Auftrennungskanal 20 zu verhindern und ein Injektionsvolumen bereitzustellen, das unabhängig von der Probenverarbeitungszeit ist. Das elektrische Potential zwischen den Bereichen 16, 24, 30 und 26 wird dann abgeschalten und es wird eine Spannung zwischen dem Bereich 16 und dem Bereich 30 angelegt und die Bestandteile der Probe anhand der Größe und elektrophoretischen Mobilität aufzutrennen, z.B. die Bestandteile 34 bis 38, die in 13B gezeigt sind.
In bevorzugten Ausführungsformen kann die Apparatur in Kontakt mit einem Temperaturkontrollmittel 32 gebracht werden (12). Das Temperaturkontrollmittel 32 kann aktiviert werden, um doppelsträngige Proben in dem Injektionsbereich zu schmelzen oder zu denaturieren und um das Auftrennungsmedium 36 denaturierend zu machen. In einigen Ausführungsformen kann man eine Probe in dem Probebereich 24 hinzugeben, das Temperaturkontrollmittel so einstellen, dass die Probe denaturiert wird und das Temperaturkontrollmittel 32 wiederum so einstellen, dass eine Hybridisierung mit der Sonde 28 stattfindet. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, das Temperaturkontrollmittel 32 wiederum so einzustellen, dass das Auftrennungsmedium 36 denaturierend gemacht wird.
In anderen Ausführungsformen ist die Apparatur ein Mikrochip mit mehreren parallelen Kanälen, die in festen Substraten ausgebildet sind. Solche Vorrichtungen ermöglichen viele getrennte Analysen, die parallel durchgeführt werden können, um dadurch einen hohen Durchsatz zu erzielen. Zur Übersicht und unter Bezugnahme auf 14 umfasst die Apparatur 11 mehrere Kapillarkanäle 20, wobei jeder einen Probeninjektionsbereich 24, ein Pufferreservoir 16, ein Injektions-/Abfallreservoir 26 und ein Abfallreservoir 30 besitzt. In bevorzugten Ausführungsformen kann die Apparatur in Kontakt mit einem Temperaturkontrollmittel 32 gebracht werden. Es können beliebige bekannte Detektionsmittel in der erfindungsgemäßen Apparatur eingesetzt werden und leicht von dem Fachmann ausgewählt werden. Bei einem Einsatz in den erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen ermöglicht die Apparatur eine qualitative und quantitative Detektion eines Analyten in einer Probe. Solche Mikrochipauftrennungsvorrichtungen werden hergestellt unter Verwendung von fotolithographischen und chemischen Ätzmitteln, um Kanalstrukturen in einer fusionierten Siliziumscheibe herzustellen. Es werden Zugangslöcher an den Kanalenden mit einem Laser durch die geätzte Scheibe gebohrt. Eine zweite fusionierte Siliziumscheibe wird an die geätzte Scheibe gebunden, um eingekapselte Kanäle zu erzeugen. Nach der Verbindung wird die Scheibe in einzelne Auftrennungschips geschnitten.
Genauer gesagt, wird zur Durchführung einer Mikrofabrikation ein Chromfilm (400 Å) auf das fusionierte Siliziumsubstrat aufgesprüht (75 mm Durchmesser × 0,4 mm; Hoya, Tokyo, Japan). Fotolack (Shipley 1811, Newton, MA) wird auf die Scheibe 11 spritzbeschichtet und bei 90°C für 25 Minuten gebacken. Der Fotolack wird gemustert, indem er einer UV-Strahlung (365 nm) ausgesetzt wird über eine kontaktverbundene Fotomaske (Advanced Reproductions, Wilmington, MA) und indem er in einem Microposit-Entwickler (Shipley) entwickelt wird. Das Chrom wird unter Verwendung von K₃Fe(CN)₆/NaOH entfernt (Chrome Etch, Shipley). Das resultierende Maskenmuster wird in das fusionierte Silizum geätzt, indem die Scheibe 11 in NH₄F/HF (1:1) Ätzmittel bei 50°C eingetaucht wird. Die Tiefe der Ätzung wird durch Überwachung der Ätzzeit gemessen und mit einem Profilometer gemessen (Mitutoyo). Der in dieser Untersuchung eingesetzte Mikrochip wird bis zu einer Tiefe von 28 μm geätzt, was eine Kanalbreite 20 von 66 μm am oberen Ende des Kanals aufgrund der isotropen Ätzbedingungen ergibt. Die Querschnittsfläche des Kanals 20 entspricht der einer zylindrischen Kapillare mit einem inneren Durchmesser von 44 μm. Der Fotolack wird mit Aceton entfernt und das verbleibende Chrom wird durch Verwendung von K₃Fe(CH)₆/NaOH gelöst.
Ein Zugang zu den Kanalenden wird durch Laser-gebohrte Löcher über die geätzte Scheibe 11 gewährt. Eine zweite fusionierte Siliziumscheibe ist mit der geätzten Scheibe verbunden, um die Kanäle einzuschließen. Beide Scheiben werden in 50°C NH₄OH/H₂O₂ eingetaucht und in H₂O gespült. Sie werden dann in Kontakt gebracht und thermisch verbunden. Die anfängliche Verbindung fand bei 200°C (2 Stunden) statt, gefolgt von der Herbeiführung einer Endverbindung bei 1000°C (über Nacht). Die einzelnen Reservoirs 16, 24, 26 und 30, die aus Röhrenglas geschnitten werden, wurden mit Silikonklebemittel verbunden (Dow Corning).
Unter Bezugnahme auf 15 wird ein fusionierter Siliziummikrochip mit einer Energiequelle und Fluoreszenzoptiken für den chipbasierenden Assay gekuppelt. Die Hochspannung wird von einem Netzteil Spellman CZE 1000R (Plainview, NY) oder einer anderen geeigneten Quelle über einen Schaltkreis und einem Verbund von Widerständen bereitgestellt. Eine Laser-induzierte Fluoreszenzdetektion wird unter Verwendung eines Argon-Ionenlasers Omnichrom (Chino, CA), der bei ungefähr 3 mW Anregung bei 488 nm betrieben wird oder einer anderen geeigneten Vorrichtung durchgeführt, der in dem Kanal bei einem Einfallswinkel von 53° mit einer Linse mit 10 cm Brennweite fokussiert wird. Ein 20 × Mikroskopobjektiv (Edmund Scientific, Barrington, NJ) sammelt die Fluoreszenzemission. Das gesammelte Licht wird räumlich gefiltert durch eine Apparatur mit einem inneren Durchmesser von 2 mm in der Bildebene und durch zwei Bandpassfilter mit 520 nm (520DF30) (Omega Optical, Brattleboro, VT) optisch filtriert. Eine Fotovervielfacherröhre (wie Hamamatsu R928, Bridgewater, NJ), die an Elektrometer (wie ein Keithley 614, Cleveland, OH) verbunden ist, detektiert das Fluoreszenzsignal. Das Signal wird mit einem computergesteuerten 20 Bit Datenerfassungssystem digitalisiert (wie ein Data Translation 2804, Marlborough, MA) und unter Verwendung einer geeigneten Software analysiert (wie Caesar Software von ADI, Alameda, CA).
Es kann ein beliebiges konventionelles Verfahren zum Nachweis in der erfindungsgemäßen Apparatur verwendet werden, einschließlich solchen, die in konventionelleren Elektrophoreseverfahren verwendet werden. Ein Detektionsverfahren wird ausgewählt, das eine Detektion einer beliebig detektierbaren physikalischen Eigenschaft einer Spezies ermöglicht. Diese Detektionssysteme umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Absorption von ultravioletter oder sichtbarer Strahlung, Fluoreszenz, Refraktionsindex, Raman, Massenspektrometrie, Chemilumineszenz, Elektrochemie und Leitfähigkeit.
In einem anderen Aspekt stellt die beanspruchte Erfindung Kits zum Nachweis des Vorliegens, Fehlens oder Konzentration einer Zielsequenz unter Verwendung einer elektrischen Auftrennungsanalyse bereit. Bevorzugte Ausführungsformen von Kits sind so konfiguriert, dass sie vorgewählte Zielsequenzen bei verschiedenen vorliegenden Proben nachweisen. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Kits Behältergehäuse einschließen, die ein vorausgewähltes denaturierendes Siebmedium und eine erfindungsgemäße PNA-Sonde enthalten. Die erfindungsgemäßen Kits können in einigen Ausführungsformen mehr als eine markierte Sonde enthalten, die sich an eine oder mehrere unterschiedliche Zielsequenzen anlagern kann, die in einer genetischen Eigenschaft von Interesse in einer Nukleinsäureprobe einzigartig ist. Die Markierungen auf den Sonden können die selben oder unterschiedlich sein und können unabhängig detektierbar sein. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die erfindungsgemäßen Kits eine Elektroseparationsapparatur, die einen Kanal oder eine Vielzahl von Kanälen umfasst. Es ist beabsichtigt, dass die erfindungsgemäßen Kits gegebenenfalls eine verwerfbare Apparatur bereitstellen, die eine Kapillare oder eine Vielzahl von Kapillaren, wie sie hier definiert sind, umfasst. Die Vorteile einer solchen Mikrokanalapparatur sind aus den folgenden Experimenten ersichtlich.
Beispiel 6 PNA/DNA-Assay auf einem Mikrochip
A. Experimentelles Design
Eine Fluorescein-markierte PNA-Sonde wurde, wie oben beschrieben, hergestellt. Die markierte PNA-Sonde ist ein 15mer mit einer komplementären Sequenz zu PBR322-DNA (MW 4774, bestimmt durch Massenspektrometrie). Das Gemisch der zwei Restriktionsenzymverdaus mit BstNI und MspI von der pBR322-DNA, wurde als Ziel verwendet.
Eine homogene Hybridisierung in Lösung wurde durchgeführt, indem die Fluorescein-markierte PNA (in Überschuss) mit den pBR322-DNA-Verdaus gemischt wurde, bei 90°C für 5 Minuten erhitzt wurde und die doppelsträngige DNA denaturiert wurde und auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Das experimentelle Verfahren ist oben in Beispiel 4, Unterabschnitt 3, beschrieben. Das Gemisch wurde eine Mikrochip-Gel-Elektrophorese mit einer LIF-Detektion bei Anlegen einer Spannung von 704 V/cm aufgetrennt. Die Länge der Kanäle betrug 22 mm und der Querschnitt der Kanäle betrug ungefähr 100 μm × 50 μm.
B. Ergebnisse
Unter Bezugnahme auf 16 kann die Größe des Hybrids der Fluorescein-markierten PNA und das Ziel-DNA-Fragment nachgewiesen werden. Da die PNA mit Fluorescein markiert ist, trägt die PNA-Sonde eine negative Ladung, die von dem negativ geladenen Fluorescein stammt. Als ein Ergebnis wird sich die Fluorescein-markierte PNA in die Kapillare bewegen, jedoch nicht so schnell wie DNA oder PNA/DNA-Hybride, in Richtung der Anode in einem elektrischen Feld, wenn sie von der Kathode injiziert wird. 16 zeigt ein Elektropherogramm einer Bestimmung der PNA-Sondenhybridisierung von pBR322-DNA-MspI- und -BstNI-Verdaus. Die Bildung einer PNA/MspI-Fragment-Duplex (97 Basen) und einer PNA/BstN1-Fragment-Hybrid-Duplex (929 Basen) wird innerhalb von 30 Sekunden nachgewiesen. Die PNA im Überschuss wird nach 40 Sekunden nachgewiesen. Die Fragmente, die die komplementäre Sequenz enthalten, wurden aufgetrennt und spezifisch durch LIF innerhalb von 30 Sekunden nachgewiesen.
Beispiel 7 F508-Gene der zystischen Fibrose
A. Experimentelles Design
Zystische Fibrose (CF) ist eine häufig vorkommende letale rezessive Erkrankung. Es wurde eine Hauptmutation, welche die Krankheit auslöst, in 70% der CF-Chromosomen gefunden (ΔF508). Das experimentelle Verfahren ist oben on Beispiel 5 beschrieben. Die ΔF508-Mutation ist eine Dreibasendeletion. Die folgenden PNA-Sonden für den Wildtyp (F508) und das Mutantengen (ΔF508) wurden hergestellt:
B. Ergebnisse
Ein Hybridisierungs-Assay mit einer markierten PNA-Sonde für das zystische Fibrose F508-Wildtyp-Gen wurde durch Kapillar-Elektrophorese mit drei DNA-Proben durchgeführt, die zur Verfügung gestellt wurden von: (a) einem nicht-betroffenen Individuum; (b) einem nicht-betroffenen Träger und (c) einem betroffenen Patienten. Die Ergebnisse sind in 17A gezeigt. Wenn alle Einstellungen gleich sind und die drei Assays gleichzeitig parallel durchgeführt werden, zeigt 17A, dass das maximale Signal von der Probe von dem nicht-betroffenen Individuum stammt, was darauf hinweist, dass beide Gene an die markierte PNA-Sonde des Wildtyps anlagerten; ein schwächeres Signal stammt von der Probe, die von dem gesunden Träger stammt, was darauf hinweist, dass nur eines der beiden Gene, der Wildtyp, sich an die markierte PNA-Sonde des Wildtyps anlagerte, während dies nicht der Fall war für das Mutanten ΔF508-Gen und es wurden keine signifikanten Signale von der Probe nachgewiesen, die von dem betroffenen Patienten stammt, was darauf hinweist, dass keine Wildtyp-Gene in der Probe verfügbar waren. In einem zweiten Hybridisierungs-Assay wurde eine markierte PNA-Sonde für die Mutante ΔF508 verwendet, um eine direkte Detektion und die Identifizierung des Mutantengens ΔF508 zu ermöglichen. Der Assay wurde durch Kapillar-Elektrophorese mit drei Proben durchgeführt, die zur Verfügung gestellt wurden von: (a) einem nicht-betroffenen Individuum; (b) einem nicht-betroffenen Träger der ΔF508-Mutation; und (c) einem betroffenen Patienten, der die ΔF508-Mutation trägt. Die Ergebnisse sind in 17B gezeigt. Wenn alle Einstellungen gleich sind und die drei Assays gleichzeitig parallel durchgeführt werden, zeigt 17, dass dieses Mal das maximale Signal von der Probe erfasst wurde, die von dem betroffenen Patienten stammt, was darauf hinweist, dass beide DNA-Gene sich an die ΔF508-markierte PNA-Sonde anlagerten und eine positive Identifikation des Vorliegens von mutiertem ΔF508 aus der Probe des Patienten ermöglichten; ein schwächeres Signal wird von der Probe erfasst, die von dem nicht-betroffenen Träger stammt, was darauf hinweist, dass eines der Gene sich an die ΔF508-markierte PNA-Sonde anlagerte, während dies nicht der Fall war für das zweite Gen und dass auch eine positive Identifikation des Vorliegens eines mutierten ΔF508-Gens möglich war; kein signifikantes Signal wurde von der Probe umfasst, die von dem nicht-betroffenen Individuum stammt, was darauf hinweist, dass keine mutierten ΔF508-Gene in der Probe verfügbar waren, um sich an die ΔF508-markierte PNA-Sonde anzulagern.
Die Ergebnisse dieser beiden Assays sind in Tabelle 3 wiedergegeben, welche das Muster der Signalantwort von den verschiedenen DNA-Proben mit den zwei Arten der PNA-Sonden zeigt.
Tabelle 3: ΔF508-Mutationsdetektion
Beispiel 8 Das W1282-Gen der zystischen Fibrose
A. Experimentelles Design
Ein ähnliches Experiment wie oben wurde für das zystische Fibrose-Gen W1282 durchgeführt. Das zystische Fibrose-Gen W1282 hat eine einzelne Punktmutation. Das experimentelle Verfahren ist oben in Beispiel 5 beschrieben. Die folgenden PNA-Sonden für den Wildtyp (W1282) und das Mutantengen (W1282X) wurden hergestellt:
B. Ergebnisse
Ein Hybridisierungs-Assay für das zystische Fibrose W1282 Wildtyp-Gen wurde durch Kapillar-Elektrophorese mit den zwei markierten PNA-Sonden durchgeführt: (a) die WT-Sonde und (b) die M-Sonde (c) Kontrolle ohne DNA-Probe, aber nur mit M-Sonde. Die Ergebnisse sind in 18A gezeigt. Wenn alle Einstellungen gleich sind und die drei Assays gleichzeitig parallel durchgeführt werden, zeigt 18A, dass bei der Kurve (a) ein starkes Signal nachgewiesen wird, wenn die WT-Probe verwendet wird, was darauf hinweist, dass beide Gene sich an die markierte PNA-Sonde des Wildtyps anlagerten; keine signifikanten Signale wurden nachgewiesen, wenn die M-Sonde verwendet wurde, was darauf hinweist, dass die M-Sonde sich nicht an das Wildtyp-Gen bei der Kurve (b) anlagerte, selbst wenn nur ein Basen-Mismatch vorlag und unter den Kapillar-Elektrophoresebedingungen und kein signifikantes Signal in dem Kontrolllauf (c) nachgewiesen wurde.
Ein zweiter Hybridisierungs-Assay für das zystische Fibrose W1282 Wildtyp-Gen wurde durch Kapillar-Elektrophorese mit den zwei markierten PNA-Sonden durchgeführt: (a) die WT-Sonde und (b) die M-Sonde. Die Ergebnisse sind in 18B gezeigt. Wenn alle Einstellungen gleich sind und die drei Assays gleichzeitig parallel durchgeführt werden, zeigt 18B, dass dieses Mal ein im Verhältnis schwächeres aber immer noch starkes Signal erfasst wird, wenn entweder WT- oder M-Sonden verwendet werden, was darauf hinweist, dass beide Sonden sich an die Proben-DNA, die von einem Träger stammt, anlagern und eine positive Identifikation des Vorliegens eines mutierten W1282-Gens in der Probe ermöglichen. Die Ergebnisse dieser beiden Assays sind in Tabelle 4 dargestellt, die das Muster der Signalantwort von den verschiedenen DNA-Proben mit den zwei Arten der PNA-Sonden zeigen.
Tabelle 4: W1282-Mutationsdetektion
Beispiel 9 Multi-PNA-Sonden für eine Multi-Gendetektion
A. Experimentelles Design
Das CF W1282-Gen (Wildtyp PCR-Produkt) und das CF F508-Gen (Wildtyp PCR-Produkt) wurden als ein Modellsystem verwendet. Fluorescein-markierte normale PNA-Sonden für das normale W1282-Gen und das normale F508-Gen wurden zu dem Gemisch der beiden Gene zugegeben. Nach Hybridisierung wurde das Gemisch in die HEC(Hydroxyethylcellulose)-Gel-gefüllte Kapillare injiziert. Die Länge der Kapillare betrug insgesamt 27 cm mit einem Abstand von 20 cm zu dem Detektor. Der interne Durchmesser der unbeschichteten Kapillare betrug 75 μm. Die Auftrennung wurde in der Gegenwart von 2 M Harnstoff in TBE(Tris-Borat-EDTA)-Puffer durchgeführt. Da sich die beiden Gene in der Größe unterscheiden (197 bp für CF W1282 und 384 bp für CF F508), war die Auftrennung der Hybride innerhalb von 5 Minuten fertig.
B. Ergebnisse
Unter Bezugnahme auf 19 wird die Duplex mit dem kürzeren Gen CF W1282/PNA zuerst nachgewiesen und ist als Peak 1 gezeigt, die Duplex mit dem längeren Gen F508/PNA wird als zweites nachgewiesen und ist als Peak 2 gezeigt.
Dieses Experiment zeigt, dass Multi-PNA-Sonden für eine Multi-Gen-Untersuchung in CE auf Multi-PNA-Sonden für eine Multi-Gen-Untersuchung ausgeweitet werden können. Weiter könnten PNA-Sonden, die mit unterschiedlichen Farb- oder Enzymmarkierungen markiert sind, verwendet werden, um unterschiedliche Mutationen des selben Gens oder Mutationen von unterschiedlichen Genen gleichzeitig in der selben Analyse nachzuweisen.
Es wird für den Fachmann ersichtlich werden, dass verschiedene Modifikationen und Variationen in den erfindungsgemäßen Verfahren, Kits und der Apparatur gemacht werden können, ohne den Grundgedanken oder den Umfang der Erfindung zu verlassen. Es ist daher beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung die Modifikationen und Variationen dieser Erfindung abdeckt, soweit diese in den Umfang der anhängen Patentansprüche fallen.

Claims

Verfahren zum Nachweis einer ausgewählten Zielsequenz in einem Polynukleotid, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer Probe, die mindestens einen NukleinsäureStrang, z.B. eine DNA und dessen Komplementär-Strang umfasst, wobei einer des mindestens einen Nukleinsäure-Strangs und dessen Komplementär-Strangs in Verdacht steht, die ausgewählte Zielsequenz zu enthalten; b) Mischen der Probe mit einer PNA-Sonde, die mit einem detektierbaren Rest markiert ist, wobei die PNA-Sonde eine Sequenz hat, die komplementär ist zu mindestens einem Teil der ausgewählten Zielsequenz, in der Gegenwart von mindestens einem Nukleinsäure/Nukleinsäure-denaturierendes Reagenz unter denaturierenden Bedingungen, was die Bildung eines PNA/Nukleinsäure-Komplexes ermöglicht, wenn die ausgewählte Zielsequenz vorhanden ist, wobei die Bildung in der Gegenwart von mindestens einer/einem Nukleinsäure/Nukleinsäure-denaturierenden Reagens stattfindet. c) Auftrennen des PNA/Nukleinsäure-Komplexes von anderen Bestandteilen des aus Schritt b) hervorgehenden Gemisches, denaturierenden Bedingungen; und d) Detektieren des PNA/Nukleinsäure-Komplexes, der unter denaturierenden Bedingungen stabil ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt c) entweder durch Elektrophorese oder wahlweise durch Kapillarelektrophorese; oder in einem Siebe-Medium durchgeführt wird und wahlweise ist das Siebe-Medium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyacrylamid, Agarose, Polyethylenoxid, Polyvinylpyrolidin und Methylcellulose.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die PNA-Sonde einen Ladungsmodifizierenden Rest umfasst oder mit einem Teilchen assoziiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der detektierbare Rest ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Enzymen, farbigen Teilchen, Fluorophoren, Biotin, Chromophoren, Radioisotopen, elektrochemischen und chemilumineszierenden Resten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das denaturierende Reagens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Harnstoff, Formamid, organische Lösungsmittel, einem Puffer mit geringer Ionenstärke, der die Anpassung des aus Schritt b) hervorgehenden Gemisches zu niedrigen Salz-Konzentrationen gestattet und wobei die Temperatur des aus Schritt b) hervorgehenden Gemisches angepasst wird um das Medium denaturierend zu machen.