DE69938400T2

DE69938400T2 - Verfahren, Kits und Zusammensetzungen zur Identifizierung von elektrostatisch an Matrizen gebundenen Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69938400T2
Application number: DE69938400T
Authority: DE
Inventors: Jack T. Concord Johansen; Jens J. Holliston Hyldig-Nielsen; Mark J. Princeton Fiandaca; James M. Westford COULL
Original assignee: Boston Probes Inc
Current assignee: Boston Probes Inc
Priority date: 1998-12-08
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2009-04-23
Anticipated expiration: 2019-12-09
Also published as: EP1536023A1; DK1536023T3; EP1137807A1; EP1536023B1; DE69938400D1; ATE275640T1; DK1137807T3; ATE389732T1; AU1751400A; DE69920040T2; EP1137807B1; DE69920040D1

Description

Hintergrund der Erfindung:
1. Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft das Gebiet von auf Sonden basierender Detektion, Analyse und Quantifizierung von elektrostatisch an Matrizen immobilisierten Nukleinsäuren. Die Verfahren dieser Erfindung sind besonders gut für die Analyse und insbesondere die Analyse bezüglich einer einzelnen Punktmutation in einem Teilchentest, in einem Arraytest, in einem Nukleaseverdau/-schutztest, in einem Linientest und/oder in einem selbstanzeigenden Testformat geeignet.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Nukleinsäurehybridisierung ist ein fundamentaler Prozess in der Molekularbiologie. Auf Sonden basierende Tests sind bei der Detektion, Quantifizierung und Analyse von Nukleinsäuren nützlich. Nukleinsäuresonden werden seit langem zur Analyse von Proben auf die Anwesenheit von Nukleinsäure von Bakterien, Eukaryoten, Pilzen, Virus oder anderen Organismen verwendet und sind auch bei der Untersuchung von genetisch begründeten Erkrankungszuständen oder klinischen Zuständen von Interesse in einzelnen Zellen sowie in Geweben nützlich.
Probenvorbereitungsverfahren, welche das wiederholte Einfangen und Freisetzen von Zielsequenzen an und von Trägern (z. B. magnetischen Kügelchen) als ein Mittel zur Entfernung von Nicht-Zielpolynukleotiden, Bruchstücken und Verunreinigungen, welche zum Ein bringen von Hintergrund in einen Hybridisierungstest neigen, beschreiben, sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe: Collins et al., US 5,750,338 ). Im Allgemeinen können die Probenvorbereitungsverfahren von Collins et al. in den meisten Ausführungsformen von herkömmlichen Hybridisierungstests verwendet werden, jedoch mit der Maßgabe, dass die Zielnukleinsäure zunächst an einem Träger immobilisiert wird und danach von dem Träger so freigesetzt wird, dass sie, wenn freigesetzt, im Wesentlichen frei von Probenverunreinigungen, Bruchstücken und fremden Polynukleotiden ist. Die Erfindung von Collins et al. erfordert jedoch, dass die Sonde oder Sonden mit dem Träger unter Bindungsbedingungen assoziiert sein muss bzw. müssen oder assoziieren können muss bzw. müssen, wobei die Nukleinsäure von Interesse an dem Träger immobilisiert wird (siehe: Collins et al., in Spal. 4, Zeile 55 bis Spal. 5, Zeile 13).
Ein auf Sonden basierendes Probenvorbereitungsverfahren zur Entfernung von Kontaminanten vor einer PCR-Reaktion wurde von Goldin et al. beschrieben (siehe: US 5,200,314 ). Dieses Verfahren erfordert eine Analyten-Einfangsonde mit sowohl einer Analyten-Bindungsregion als auch einem ersten spezifischen Bindungspartner. Wie die Erfindung von Collins et al. erfordert die Erfindung von Goldin et al., dass die Analyten-Einfangsonde mit dem Träger als das spezifische Mittel, durch welches die Zielsequenz immobilisiert wird, wechselwirkt.
Polykationische feste Träger wurden zur Analyse und Reinigung von Nukleinsäuren, einschließlich die Reinigung von Polynukleotiden aus Lösungen, welche Kontaminanten enthalten, verwendet (siehe: Arnold et al.; US 5,599,667 ). Arnold et al. beschreiben Tests, welche feste Träger als ein Mittel zum Abtrennen von Polynukleotiden und Hybriden davon, welche mit einer Nukleotid-Sonde gebildet werden, von nicht hybridisierter Sonde verwenden (siehe: Zusammenfassung von US 5,599,667 ). Die Erfindung setzt „... die Entdeckung, dass polykationische feste Träger zur selektiven Adsorption von Nukleotidmultimeren gemäß ihrer Größe (Betonung hinzugefügt) verwendet werden können, wobei größere Multimere fester an den Träger gebunden sind als kleinere" voraus (siehe: Spal. 4, Zeilen 39–44). Die Verfahren können auch zur Abtrennung der Nukleotidmultimere von Nicht-Nukleotidmaterial verwendet werden (siehe: Spal. 5, Zeilen 25–28).
Eine wesentliche Einschränkung der Erfindung von Arnold et al. ist die Wechselwirkung, welche zwischen der Zusammensetzung des kationischen festen Trägers und der Formulierung der Kontaktlösungen vorliegt, sowie die Wechselwirkung zwischen zwei oder mehr der Kontaktlösungen (siehe: Spal. 7, Zeile 24 bis Spal. 8, Zeile 32), welche zur Unterscheidung zwischen Nukleotidmultimeren erforderlich sind (siehe: Spal. 8, Zeilen 39–41). Ein Beispiel eines arbeitsaufwändigen Protokolls zur Erlangung einer geeigneten Kationendichte für einen festen Träger kann in Spal. 9, Zeilen 36–52 gefunden werden und das Verfahren zur Bestimmung der Pufferkonzentration, welche zum Trennen von Polynuldeotiden und Nukleotid-Sonden geeignet ist, kann in Spal. 9, Zeilen 53–63 gefunden werden. Im ähnlicher Weise muss die Trennlösung sorgfältig designed werden (siehe: Spal. 10, Zeilen 9–12), vermutlich unter Verwendung des arbeitsaufwändigen Verfahrens von systematischem Ausprobieren, wie zur Bestimmung der Kationendichte des festen Trägers beschrieben. Diese Anforderung für eine wesentliche Optimierung der Testbedingungen innerhalb eines sehr engen Arbeitsbereichs resultiert, da elektrostatische Immobilisierung von Nukleinsäure ein relativ unspezifisches Verfahren ist und es deshalb schwierig ist, eine negativ geladene Zielnukleinsäure an einer kationischen Oberfläche ohne die positiv geladene Matrix, welche auch eine starke Affinität für die negativ geladene Nukleinsäuresonde aufweist, elektrostatisch zu immobilisieren. Da die Auftrennung von Nukleotidmultimeren (Hybride aus Nukleotid-Sonde/Ziel von überschüssiger Nukleotid-Sonde) innerhalb eines engen Bereichs von Bedingungen, die nicht notwendigerweise für die Unterscheidung von Hybridisierung optimal sein müssen, stattfindet, kann es sein, dass die Hybride, welche gemäß der Erfindung von Arnold et al. noch immobilisiert sind, nicht wirklich für die Anwesenheit einer Zielsequenz anzeigend sind. Folglich ist die Verwendbarkeit der Tests von Arnold et al. in der Anwendung praktisch eingeschränkt.
Eine Erfindung, welche das Erhalten von Nukleinsäure betrifft, wurde kürzlich beschrieben (siehe: Gerdes et al.; WO 98/46797 ). Gerdes et al. verwenden stark elektropositive Festphasenmaterialien zum Einfangen von Nukleinsäuren (siehe S. 5, Zeile 24 bis S. 6, Zeile 14) für Reihenanalysen. Jedoch ist eine wesentliche Einschränkung der Erfindung von Gerdes et al., dass die Nukleinsäure an das stark elektropositive Festphasenmaterial irreversibel gebunden sein muss.
Verfahren für das Hochdurchsatz-Screening von Sequenzen oder genetischen Veränderungen in Nukleinsäure wurden beschrieben (siehe: Shuber, A. P.; US 5,834,181 ). Shuber beschreibt die Analyse von Arrays von immobilisierten Nukleinsäuren und schlägt Immobilisierung der Nukleinsäure an Nitrocellulose oder einer geladenen Nylonmembran vor (siehe: Spal. 6, Zeilen 41–64). Vorgeschlagene Purin- und Pyrimidin-enthaltende Polymere, welche zum Analysieren von immobilisierter Nukleinsäure verwendet werden können, schließen Peptidnukleinsäure ein (siehe: Spal. 5, Zeilen 15–20), aber die Polymere müssen notwendigerweise mit einem Tag versehen oder markiert sein, da die Detektionsverfahren auf einem Tag oder einer Markierung, welche in das Polymer eingebracht sind, beruhen (siehe: Spal. 8, Zeile 58 bis Spal. 9, Zeile 3). Die Tests von Shuber erfordern ein perfektes Komplement zwischen Sonde und Zielsequenz (siehe: Spal. 8, Zeilen 52–57). Um eine geeignete Unterscheidung zu erreichen, wird ein arbeitsaufwändiges empirisches Verfahren von systematischem Ausprobieren für Testoptimierung beschrieben (siehe: Spal. 7, Zeile 16 bis Spal. 8). Bedingungen, welche Optimierung erfordern, von spezifischer und nicht spezifischer Hybridisierung schließen die Konzentration des Polymers, die Temperatur der Hybridisierung, die Salzkonzentration und die Anwesenheit oder Abwesenheit von nicht verwandter Nukleinsäure ein (siehe: Spal. 8, Zeilen 15–18).
Shuber schlägt nicht ausdrücklich das Durchführen eines auf Sonden basierenden Hybridisierungstests an einer elektrostatisch immobilisierten Nukleinsäure vor und beschreibt oder lehrt nicht speziell die Analyse einer elektrostatisch immobilisierten Nukleinsäure unter Verwendung einer Nicht-Nukleotid-Sonde wie einer Peptidnukleinsäure. Darüber hinaus schlägt Schuber nicht jedwede Vorteile vor, offenbart oder lehrt diese, wie das Vermögen innerhalb eines großen Bereichs von Testbedingungen zu arbeiten, eine auf Peptidnukleinsäuren basierende Analyse einer elektrostatisch an einer Matrix immobilisierten Nukleinsäure durchzuführen.
Pluskal et al. beschreiben einen Vergleich von auf DNA- und Peptidnukleinsäure (PNA)-Sonde basierender Analyse einer Nukleinsäure, welche irreversibel mit einer geladenen Nylonmembran vernetzt wurde (siehe: Pluskal et al., American Society for Biochemistry, 85^th Annual Meeting, Washington, DC, Mai 1994). Pluskal et al. lehren, dass, obwohl PNA-Sonden zur Detektion der irreversibel immobilisierten Nukleinsäure unter Standardhybridisierungsbedingungen verwendet werden können, PNA sehr gut unter sehr strengen Hybridisie rungs- und Waschbedingungen arbeitet (siehe: der Abschnitt mit dem Titel „Discussion"). Pluskal et al. lehren auch die Verwendung von 1% BSA als ein Blockiermittel zur Verringerung von nicht spezifischer Bindung der Sonde an der Membran (siehe: Abschnitt mit dem Titel „Discussion"). Da die Nukleinsäure von Pluskal et al. irreversibel mit der Nylonmembran vernetzt wurde, können sehr strenge Hybridisierungs- und Waschbedingungen an der Membran verwendet werden, ohne die Menge der Zielnukleinsäure, welche auf dem Träger vorhanden und zur Analyse verfügbar ist, zu verringern. Pluskal et al. zeigen deshalb einen vernünftigen Grund für irreversibles Binden der Nukleinsäure, welche analysiert wird, an den Träger und Verwenden eines Blockiermittels, wenn eine auf PNA-Sonden basierende Analyse unter Verwendung einer geladenen Nylonmembran durchgeführt wird.
Verfahren zum Schutz von Nukleinsäuresequenzen vor Nuldeaseabbau/-verdau durch Hybridisieren eines Nukleinsäureanalogons daran wurden beschrieben (siehe: Stanley et al.; US 5,861,250 ). Die Verfahren und Zusammensetzungen, welche in Stanley et al. beschrieben werden, sind besonders gut zum „„Aufreinigen" einer Nukleinsäureprobe durch Abbauen der gesamten vorhanden Nukleinsäure, außer der Zielsequenz, geeignet ..." (siehe: Stanley et al., in Spal. 7, Zeilen 14–18). Stanley et al. beschreiben mehrere Mittel zum Trennen von einem hybridisierten Nukleinsäureanalogon von einem nicht hybridisierten Nukleinsäureanalogon, einschließlich Ionenaustauschchromatographie (siehe: Spal. 6, Zeilen 62–64), aber sie beschreiben nicht die einfache elektrostatische Immobilisierung der Zielsequenz oder des Komplexes aus Nukleinsäureanalogon/Zielsequenz an einer Matrix als Mittel zum Abtrennen des hybridisierten Nukleinsäureanalogons von dem nicht hybridisierten Nukleinsäureanalogon oder ansonsten zum Abtrennen des Komplexes aus Nukleinsäureanalogon/Zielsequenz von den anderen Komponenten einer Probe.
Verfahren und ein Gerät zum elektroaktiven Transport und Fixierung von Nukleinsäuren zur Analyse wurden beschrieben (siehe: Heller et al., US 5,849,486 ). Jedoch erfordert diese Erfindung hoch ausgereifte Gerätschaften und Vorrichtungen, um eine Probe zu transportieren, fixieren und/oder analysieren.
Obwohl van den Engh nicht die Detektion von komplexen Makromolekülen wie Nukleinsauren erörtert, sind fluoreszente Reporterkügelchen und Verfahren zur Detektion der Anwesenheit oder Bestimmung der Konzentration von Fluidmasseanalyten, wie pH-Wert, Sauerstoffsättigung und Ionengehalt, auf dem Fachgebiet bekannt (siehe: van den Engh et al., US 5,747,349 ). Gemäß van den Engh „werden Reporterkügelchen zu einer Fluidprobe gegeben und die Analytenkonzentration wird durch Messen der Fluoreszenz von einzelnen Kugelchef, zum Beispiel in einem Durchflusszytometer, bestimmt" (siehe: Zusammenfassung von US 5,747,349 ). Die Kügelchen von van den Engh et al. umfassen ein Substratkügelchen mit einer Vielzahl von darauf immobilisierten fluoreszenten Reportermolekülen, wobei die fluoreszenten Reportermoleküle ein fluoreszentes Molekül umfassen, dessen fluoreszente Eigenschaften eine Funktion der Konzentration des besonderen Analyten sind, dessen Anwesenheit oder Konzentration bestimmt wird (siehe: US 5,747,349 , in Spal. 3, Zeil. 29–46). Folglich sind die Kügelchen von van den Engh inhärent fluoreszent und nicht die Analyten oder Derivate davon.
Kürzlich wurden Zusammensetzungen, welche mindestens ein Kügelchen enthalten, das an einen festen Träger konjugiert ist und ferner an mindestens ein Makromolekül konjugiert ist, auf dem Fachgebiet beschrieben (siehe: Lough et al., PCT/US97/20194 ). Die beanspruchten Vorteile von Lough et al. schließen eine vergrößerte Oberfläche für die Immobilisierung von biologischen Teilchen oder Makromolekülen im Vergleich zu flachen Oberflächen sowie das Vermögen, eine Chemie zur Immobilisierung des Makromoleküls auf dem Kügelchen und eine unterschiedliche Chemie zum Binden des Kügelchens an dem Träger zu verwenden, ein. Lough et al. definieren Makromoleküle derart, dass Nukleinsäuren eingeschlossen sind, (siehe: S. 7, Zeil. 10–17) und ferner definieren sie Peptidnukleinsäuren (PNA) als Analoga von Nukleinsäuren (siehe: S. 8, Zeil. 4–9). Die Erfindung von Lough et al. ist primär auf die Analyse von immobilisierten Makromolekülen gerichtet. Merkwürdigerweise jedoch wird ein auf Sonden basierender Test als ein Detektionsverfahren nicht beschrieben, vielmehr fokussieren sich Lough et al. auf direkte Analyse des immobilisierten Makromoleküls durch Mittel wie MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Außer dass sie anscheinend von Lough et al. als ein Analogon einer Nukleinsäure angesehen wird, wird PNA ansonsten nicht in der Offenbarung erwähnt und keine Beispiele werden bereitgestellt, welche zeigen, dass PNA für die Praxis der Erfindung geeignet ist.
Trotz ihres Namens ist Peptidnukleinsäure (PNA) weder ein Peptid, eine Nukleinsäure noch ist sie eine Säure. Peptidnukleinsäure (PNA) ist ein nicht natürlich vorkommendes Polyamid, welches an Nukleinsäure (DNA und RNA) mit Sequenzspezifität hybridisieren kann (siehe: Patent der Vereinigten Staaten Nr. 5,539,082, 5,527,675, 5,623,049, 5,714,331, 5,736,336, 5,773,571 oder 5,786,461 sowie Egholm et al., Nature 365: 566–568 (1993)). Da sie ein nicht natürlich vorkommendes Molekül ist, ist nicht bekannt, dass nicht modifizierte PNA ein Substrat für die Enzyme ist, für welche bekannt ist, ob sie Peptide oder Nukleinsäuren abbauen. Deshalb sollte PNA in biologischen Proben stabil sein sowie eine lange Lebensdauer aufweisen. Im Gegensatz zu Nukleinsäurehybridisierung, welche stark von Ionenstärke abhängig ist, ist die Hybridisierung einer PNA mit einer Nukleinsäure ziemlich unabhängig von Ionenstärke und wird bei niedriger Ionenstärke, Bedingungen, welche für die Hybridisierung von Nukleinsäure an Nukleinsäure äußerst ungünstig sind (Egholm et al., Nature, auf S. 567), begünstigt. Die Wirkung von Ionenstärke auf die Stabilität und Konformation von PNA-Komplexen wurde umfangreich untersucht (Tomac et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 5544–5552 (1996)). Sequenzunterscheidung ist wirksamer für PNA, welche DNA erkennt, als für DNA, welche DNA erkennt (Egholm et al., Nature, auf S. 566). Jedoch scheinen die Vorteile bei der Unterscheidung bezüglich einer Punktmutation mit PNA-Sonden im Vergleich zu DNA-Sonden in einem Hybridisierungstest etwas sequenzabhängig zu sein (Nielsen et al., Anti-Cancer Drug Design 8: 53–65 (1993) und Weiler et al., Nucl. Acids Res. 25: 2792–2799 (1997)).
Da die Nukleinsäuren einer komplexen Probe, wie eines Zelllysats oder PCR-Reaktionsgemisches, durch Immobilisierung an Trägern konzentriert und auch teilweise gereinigt werden können, könnten auf Sonden basierende Hybridisierungstests vereinfacht werden, wenn die Anwesenheit einer Zielnukleinsäure spezifisch detektiert werden könnte, während die Zielnukleinsäure trägergebunden bleibt; insbesondere wenn die Bedingungen für die Behandlung, Analyse und/oder Detektion der Zielsequenz innerhalb eines großen Bereichs arbeiten können, so dass Testbedingungen nicht eine wesentliche und arbeitsaufwändige Optimierung erfordern. Das Vermögen zur Durchführung von solchen Analysen unter Verwendung eines Durchflusszytometers, eines Arrays, eines Nukleaseverdau/-schutztests, eines Linientests, eines selbstanzeigenden Tests oder einer gewissen Kombination dieser Testformate wäre besonders vorteilhaft.
EP 0 411 186 beschreibt einen DNA-Sonden-Test unter Verwendung von neutral geladenen Sondensträngen.
WO 95/15974 beschreibt einen Test, wobei eine ausgewählte Region einer Nukleinsäure vor einem Angriff durch eine Nuklease durch Komplexieren eines Nuldeinsäureanalogons des PNA-Typs an der Nukleinsäure geschützt wird.
Offenbarung der Erfindung
1. Zusammenfassung
Diese Erfindung betrifft Verfahren, welche zur Detektion, Identifizierung und/oder Quantifizierung von Nukleinsäuren geeignet sind, die elektrostatisch an Matrizen immobilisiert werden, unter Verwendung von Nicht-Nukleotid-Sonden, deren Sequenz spezifisch an eine oder mehr Zielsequenzen der Nukleinsäure hybridisiert, aber ansonsten nicht wesentlich mit der Matrix wechselwirkt. Nachdem die Nukleinsäure immobilisiert wurde, kann der detektierbare Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz, der vor oder nach der Immobilisierung der Nukleinsäure gebildet wird, unter einem großen Bereich von Testbedingungen detektiert, identifiziert oder quantifiziert werden, als ein Mittel zum Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren der Zielsequenz in der Probe. Da sie reversibel gebunden ist, kann die Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz gegebenenfalls von der Matrix zum Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren der Zielsequenz in der Probe entfernt werden. Da die Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz gegen Abbau geschützt ist, ist es ein anderer Vorteil dieser Erfindung, dass die Probe mit Enzymen behandelt wird, welche Probenkomponenten abbauen, entweder bevor oder nachdem die Nukleinsäure an die Matrix gebunden wird, um die Probe (z. B. eine komplexe biologische Probe wie ein Zelllysat) „aufzureinigen" und dadurch die Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz in der Probe zu verbessern. Folglich haben die Verfahren dieser Erfindung wesentliche Vorteile gegenüber allen bisher bekannten oder beschriebenen Verfahren, Kits oder Zusammensetzungen, da sie die einfache Verarbeitung und/oder Analyse von Proben und insbesondere komplexen biologischen Proben unter einem großen Bereich von Testbedingungen ermöglichen.

1. Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung einer Zielsequenz eines Nukleinsäuremoleküls in einer Probe, das Verfahren umfassend: a) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit mindestens einer Nicht-Nukleotid-Sonde, worin die Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden unter geeigneten Hybridisierungsbedingun gen an mindestens einen Teil der Zielsequenz hybridisiert bzw. hybridisieren, wenn in der Probe vorhanden, um dadurch einen Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz zu bilden; b) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer Matrix, worin das Nukleinsäuremolekül unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen elektrostatisch an die Matrix bindet und worin das Rückrad der Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden unter elektrostatischen Bindungsbedingungen ausreichend neutral oder positiv geladen ist, so dass es nur geringe oder keine Affinität für die Matrix aufweist; c) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem oder mehreren Enzymen, die Probenkontaminanten abbauen können, einschließlich des Nukleinsäuremoleküls, nicht jedoch des Komplexes aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz, zu einer Zeit nach dem Durchführen von Schritt (a); und d) das Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren der Nicht-Nukelotid-Sonde oder des Komplexes aus Nicht-Nukelotid-Sonde/Zielsequenz zu einer Zeit nach dem Durchführen von Schritt (b) als ein Mittel zum Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren der Zielsequenz in der Probe.

Gegebenenfalls umfasst das Verfahren zusätzlich den Schritt

e) des Einstellens der Testbedingungen außerhalb des Bereichs der elektrostatischen Bindungsbedingungen, so dass der Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz von der Matrix freigesetzt wird, zu einer Zeit nach dem Durchführen der Schritte (a) bis (c) und vor dem Durchführen von Schritt (d).

Bevorzugt wird die Probe zunächst mit der oder den Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden in Kontakt gebracht oder die Probe wird zunächst mit der Matrix in Kontakt gebracht oder die Probe wird gleichzeitig mit der oder den Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden und der Matrix in Kontakt gebracht.
Bevorzugt wird die Unterscheidung hinsichtlich einer einzelnen Punktmutation erzielt, in dem man Schritt (c) bei einer Temperatur in einem fünfzehn Grad-Bereich durchführt, worin der Bereich als fünf Grad oberhalb und zehn Grad unterhalb der Schmelztemperatur des Hybrids definiert wird, das aus der Nicht-Nukleotid-Sonde und dem Nukleinsäuremolekül gebildet wird, das im Test unterschieden werden soll und das im Vergleich zur Zielsequenz eine einzelne Punktmutation aufweist.
Bevorzugt wird die Nicht-Nukleotid-Sonde der freigesetzten Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz bestimmt, um dadurch die Zielsequenz in der Probe zu detektieren, identifizieren oder quantifizieren.
Bevorzugt ist die Matrix aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus:

a) einem lösungsunlöslichen Polymeren;
b) einer Oberfläche;
c) einem kugelförmigen Träger;
d) einem porösen kugelförmigen Träger;
e) einem gegossenen Polymeren;
f) einem co-polymeren Material; und
g) einem Gel; und

Bevorzugt wird die Matrix zu einer Linie oder Form auf einem Träger solchermaßen formuliert, dass dann, wenn der Test für die Anwesenheit der Zielsequenz positiv ist, die Linie oder Form mit dem elektrostatisch immobilisierten Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz im Test detektiert wird und gegebenenfalls der Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz in einem Gerät für einen lateralen Durchflusstest gebildet wird.
Bevorzugt wird der Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz an einer oder mehreren Positionen auf einem Array gebildet.
Bevorzugt umfasst die Matrix einen kugelförmigen Träger, wodurch die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge an Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz auf der kugelförmigen Trägermatrix unter Anwendung eines Durchfluss- oder statischen Zytometers ermittelt wird.
Bevorzugt ist mindestens eine Nicht-Nukleotid-Sonde selbstanzeigend und dabei wird die detektierbare Änderung des Signals der selbstanzeigenden Nicht-Nukleotid-Sonde gemessen, um die Zielsequenz, welche in der Probe detektiert werden soll, zu detektieren, identifizieren oder quantifizieren. Stärker bevorzugt hybridisiert bzw. hybridisieren die selbstanzeigende(n) Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden an ein Nukleinsäuresyntheseprodukt oder Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionsprodukt, welche aus einer Synthese oder einem Amplifikationsprozess resultieren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Strangamplifikation (TMA), Rollzyklusamplifikation (RCA) und Q-beta-Replikase-Amplifikation. Bevorzugt wird in dieser Ausführungsform die Matrix temporär von einer oder mehreren Komponenten der Probe abgeschirmt. Zum Beispiel kann die Matrix temporär durch Zusatz von Glycerin zum Test abgeschirmt werden. Auch wird in dieser Ausführungsform bevorzugt die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge an Zielsequenz in der Probe in Echtzeit gemessen.
Bevorzugt ist die Nicht-Nukleotid-Sonde mit mindestens einer detektierbaren Einheit markiert. Stärker bevorzugt ist die detektierbare Einheit aus der Gruppe ausgewählt, welche aus einem Chromophor, einem Fluorochrom, einer Spin-Markierung, einem Radioisotop, einem Enzym, einem Hapten und einer chemilumineszenten Verbindung besteht. Stark bevorzugt ist das Enzym aus der Gruppe ausgewählt, welche aus alkalischer Phosphatase, Sojabohnenperoxidase und Meerrettichperoxidase besteht, oder das Hapten ist aus der Gruppe ausgewählt, welche aus Fluorescein, Biotin, 2,4-Dinitrophenyl und Digoxigenin besteht.
In einer alternativen Ausführungsform ist bzw. sind die Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden nicht markiert und das Verfahren umfasst ferner:

i) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem detektierbaren Antikörper zu dem Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz unter geeigneten Antikörperbindungsbedingungen, so dass der detektierbare Antikörper an den Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz bindet; und
ii) das Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren des detektierbaren Antikörpers als ein Mittel zum Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren der Zielsequenz in der Probe.

Bevorzugt umfasst bzw. umfassen die Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden ein unter elektrostatischen Bindungsbedingungen vollständig neutrales Rückgrad.
Bevorzugt ist bzw. sind die Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden Peptidnukleinsäuren.
Bevorzugt ist die sondierende Nukleobasensequenz zur Zielsequenz im Wesentlichen komplementär.
Bevorzugt ist die sondierende Nukleobasensequenz zur Zielsequenz exakt komplementär.
Bevorzugt ist die Zielsequenz für die Detektion eines Organismus, Virus, Pilzes oder Pathogens, welche in einem Test detektiert werden sollen, charakteristisch und die Zielsequenz ist für die Detektion einer genetisch begründeten Erkrankung charakteristisch oder ist für die Detektion einer Prädisposition für eine genetisch begründete Erkrankung charakteristisch.
Bevorzugt werden eine oder mehrere Nicht-Ziel-Sonden zum Test zugesetzt, um dadurch die Unterscheidung des Tests hinsichtlich einer einzelnen Punktmutation zu verbessern.
Die Verfahren dieser Erfindung sind besonders zur Detektion, Identifizierung und/oder Zählung von Bakterien und Eukaryoten (z. B. Pathogenen) in Nahrungsmitteln, Getränken, Wasser, pharmazeutischen Produkten, Körperpflegeprodukten, Molkereiprodukten oder Umweltproben nützlich. Die Analyse von bevorzugten nicht-einschränkenden Getränken schließen Selters, Wasser in Flaschen, Fruchtsaft, Bier, Wein oder Likörprodukte ein. Geeignete Verfahren werden besonders zur Analyse von Rohmaterialien, Ausrüstung, Produkten oder Verfahren, welche zur Herstellung oder Lagerung von Nahrungsmitteln, Getränken, Wasser, pharmazeutischen Produkten, Körperpflegeprodukten, Molkereiprodukten oder Umweltproben verwendet werden, nützlich sein.
Zusätzlich sind die Verfahren dieser Erfindung besonders zur Detektion von Bakterien und Eukaryoten (z. B. Pathogenen) in klinischen Proben und klinischen Umgebungen nützlich.
Geeignete Verfahren werden besonders zur Analyse von klinischen Prüfkörpern, Ausrüstung, Fixiervorrichtungen oder Produkten, welche zur Behandlung von Menschen oder Tieren verwendet werden, nützlich sein.
2. Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
I. Definitionen:

a. Wie hier verwendet, soll der Ausdruck „Nukleobase" jene natürlich vorkommenden und jene nicht natürlich vorkommenden heterozyklischen Einheiten einschließen, welche im Allgemeinen jenen bekannt sind, die Nukleinsäuretechnologie verwenden oder Peptidnukleinsäuretechnologie verwenden, um damit Polymere zu erzeugen, welche sequenzspezifisch an Nukleinsäuren hybridisieren können.
b. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „Nukleobasensequenz" jedwedes Segment eines Polymers, welches Nukleobase-enthaltende Untereinheiten umfasst. Nichteinschränkende Beispiele von geeigneten Polymeren oder Polymersegmenten schließen Oligonukleotide, Oligoribonukleotide, Peptidnukleinsäuren und Analoga oder Chimäre davon ein.
c. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „Zielsequenz" die Nukleobasensequenz eines Nukleinsäuremoleküls von Interesse, welches in einem Test detektiert werden soll und von welchem man annimmt, dass daran mindestens ein Teil der sondierenden Nukleobasensequenz der Nicht-Nukleotid-Sonde hybridisiert. Die Zielsequenz kann einen Teilbereich des Nukleinsäuremoleküls umfassen oder kann das gesamte Nukleinsäuremolekül von Interesse sein.
d. Wie hier verwendet, sollen die Ausdrücke „Markierung" und „detektierbare Einheit" austauschbar sein und sollen Einheiten betreffen, welche an eine Nicht-Nukleotid-Sonde, Antikörper oder Antikörperfragment gebunden werden können, um dadurch die Nicht-Nukleotid-Sonde, Antikörper oder Antikörperfragment durch ein Instrument oder Verfahren detektierbar zu machen.
e. Wie hier verwendet, soll der Ausdruck „Nicht-Nukleotid-Sonde" ein Polymer bedeuten, welches kein Polynukleotid ist, welches aber eine sondierende Nukleobasense quenz umfasst, welche designed ist, um an mindestens einen Teil der Zielsequenz zu hybridisieren. Ein bevorzugtes nicht-einschränkendes Beispiel einer Nicht-Nukleotid-Sonde ist eine Peptidnukleinsäure (PNA)-Sonde.
f. Wie hier verwendet, soll der Ausdruck „Peptidnukleinsäure" oder „PNA" als ein Nicht-Nukleotid-Polymer definiert sein, welches zwei oder mehr PNA-Untereinheiten (Reste) umfasst, einschließlich jedwede der Verbindungen, auf welche in den Patenten der Vereinigten Staaten Nr. 5,539,082, 5,527,675, 5,623,049, 5,714,331, 5,736,336, 5,773,571 oder 5,786,461 (welche hier alle durch Bezugnahme aufgenommen sind) als Peptidnukleinsäuren Bezug genommen wird oder welche darin beansprucht werden. Der Ausdruck „Peptidnukleinsäure" oder „PNA" soll auch für Polymere verwendet werden, welche zwei oder mehr Untereinheiten von jenen Nukleinsäuremimetika umfassen, die in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben werden: Diderichsen et al., Tett. Lett. 37: 475–478 (1996); Fujii et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 7: 637–627 (1997); Jordan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 7: 687–690 (1997); Krotz et al., Tett. Lett. 36: 6941–6944 (1995); Lagriffoul et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 1081–1082 (1994); Lowe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, (1997) 1: 539–546; Lowe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 11: 547–554 (1997); Lowe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 11: 555–560 (1997); Petersen et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6: 793–796 (1996); Diederichsen, U., Bioorganic & Med. Chem. Lett., 8: 165–168 (1998); Cantin et al., Tett. Lett., 38: 4211–4214 (1997); Ciapetti et al., Tetrahedron, 53: 1167–1176 (1997); Lagriffoule et al., Chem. Eur. J., 3: 912–919 (1997) und WIPO-Patentanmeldung WO 96/04000 von Shah et al. und mit dem Titel „Peptide-based nucleic acid mimics (PENAMs)".

In bevorzugten Ausführungsformen ist eine PNA ein Polymer, welches zwei oder mehr Untereinheiten der folgenden Formel umfasst:
wobei jedes J gleich oder unterschiedlich ist und aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus H, R¹, OR¹, SR¹, NHR¹, NR¹ ₂, F, Cl, Br und I besteht. Jedes K ist gleich oder unterschiedlich und ist aus der Gruppe ausgewählt, welche aus O, S, NH und NR¹ besteht. Jedes R¹ ist gleich oder unterschiedlich und ist ein Alkylrest mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls ein Heteroatom oder einen substituierten oder nicht substituierten Arylrest enthalten kann. Jedes A ist aus der Gruppe ausgewählt, welche aus einer Einfachbindung, einem Rest der Formel -(CJ₂)_S- und einem Rest der Formel -(CJ₂)_SCO)-, wobei J vorstehend definiert ist und jedes s eine ganze Zahl von eins bis fünf ist, besteht. Die ganze Zahl t ist 1 oder 2 und die ganze Zahl u ist 1 oder 2. Jedes L ist gleich oder unterschiedlich und ist unabhängig aus der Gruppe ausgewählt, welche aus J, Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uridin, 5-Methylcytosin, 2-Aminopurin, 2-Amino-6-chlorpurin, 2,6-Diaminopurin, Hypoxanthin, Pseudoisocytosin, 2-Thiouracil, 2-Thiothymidin, anderen natürlich vorkommenden Nukleobasenanaloga, anderen nicht natürlich vorkommenden Nukleobasen, substituierten und nicht substituierten aromatischen Einheiten, Biotin, Fluorescein und dabcyl besteht. In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform besteht eine PNA-Untereinheit aus einer natürlich vorkommenden oder nicht natürlich vorkommenden Nukleobase, welche an den Aza-Stickstoff des N-[2-(Aminoethyl)]glycin-Rückgrads durch eine Methylencarbonylbindung gebunden ist.
II. Beschreibung
A. Allgemein:
Sonden:
Die Sonden, welche für die Praxis dieser Erfindung verwendet werden, sind Nicht-Nukleotid-Sonden, welche im Minimalfall eine sondierende Nukleobasensequenz umfassen, die zur Hybridisierung an mindestens einen Teil einer Zielsequenz designed ist, welche in einem auf Sonden basierenden Hybridisierungstest detektiert werden soll. Die Nicht-Nukleotid-Sonden umfassen ein ausreichend neutrales oder positiv geladenes Rückgrad, so dass sie nur geringe oder keine Affinität für die Matrix über einen großen Bereich von Testbedingungen, einschließlich wesentliche Variationen beim pH-Wert, der Puffer-Ionenstärke, Detergenzkonzentration und/oder Konzentration eines chemischen Denaturierungsmittels, aufweisen. Dieser große Bereich von Bedingungen, unter welchen nur geringe oder keine Wechselwirkung zwischen der Nicht-Nukleotid-Sonde und der Matrix auftreten, ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber den früheren Verfahren wie jenen von Arnold et al. ( US 5,599,667 ), welche eine wesentliche Bedingungsoptimierung erfordern, um eine Unterscheidung zwischen der nicht spezifischen Bindung der Nukleotid-Sonde und der Zielnukleinsäure (oder Komplex aus Nukleotid-Sonde/Zielnukleinsäure) an der Matrix zu erreichen.
Es ist noch ein anderer Vorteil dieser Erfindung, dass wesentliche Änderungen bei der Ionenstärke des Tests eine geringe Wirkung auf die Tm des Hybrids aus Nicht-Nuldeotid-Sonde/Zielsequenz haben (siehe: Egholm et al. Nature 365: 566–568 (1993) und Tomac et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 5544–5552 (1996)). Folglich erweitert dieser Mangel an Empfindlichkeit des Hybrids für Änderungen bei der Ionenstärke auch den Bereich von möglichen Testbedingungen.
Die Nicht-Nukleotid-Sonden können mit einer detektierbaren Einheit markiert werden oder können nicht markiert bereitgestellt werden, jedoch mit der Maßgabe, dass das Hybrid aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz detektierbar ist, wenn die Sonde nicht markiert ist. Die bevorzugten Nicht-Nukleotid-Sonden sind PNA-Sonden. Bevorzugte markierte Nicht-Nukleotid-Sonden sind Nicht-Nukleotid-„Beacon"-Sonden (siehe: der Abschnitt mit dem Titel „Non-Nucleotide „Beacon” Probes", nachstehend), da sie selbstanzeigend sind. Mit selbstanzeigend meinen wir, dass die Sonden detektierbare Eigenschaften durch Hybridisieren an eine Zielsequenz ändern und dabei die Erfordernis für die Entfernung von überschüssiger Sonde verringern oder beseitigen. In einer Ausführungsform werden die selbstanzeigenden Sonden dieser Erfindung auf einer Änderung der Fluoreszenz, welche mit dem Auge beobachtet oder anderweitig mit einem Fluoreszenzinstrument detektiert und/oder quantifiziert werden kann, beruhen.
Da es ein wichtiges Merkmal dieser Erfindung ist, dass die Nicht-Nukleotid-Sonden nicht wesentlich mit der Matrix Wechselwirken, können die Nicht-Nukleotid-Sonden dieser Erfindung auch durch eine geeignete Modifizierung designed werden, so dass sie eine besondere Nettoladung aufweisen. Zum Beispiel könnte eine bestimmte Auswahl von Markierungen verursachen, dass die Nicht-Nukleotid-Sonde eine negative Nettoladung aufweist (siehe: Beispiel 9). Jedoch kann die Nettoladung der Sonde durch Hinzufügen von einer oder mehr positiv geladenen Einheiten verändert werden, wie durch Binden von einer oder mehr der Verbindungen 7 oder 8, wie von Gildea et al., Tett. Lett. 39: 7255–7258 (1998) beschrieben. Durch die Änderung der Nettoladung können die Sonden derart designed werden, dass sie jedwede Kombination von gewünschten Markierungen aufweisen und noch keine Affinität für die Matrix aufweisen.
Nicht markierte Nicht-Nukleotid-Sonden:
Die Nicht-Nukleotid-Sonden, welche für die Praxis dieser Erfindung verwendet werden, müssen nicht mit einer detektierbaren Einheit, die in den Verfahren dieser Erfindung arbeiten kann, markiert sein. Wenn die Nicht-Nukleotid-Sonden verwendet werden, ist es möglich, den Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Nukleinsäure, der durch Hybridisieren der sondierenden Nukleobasensequenz der Sonde an der Zielsequenz gebildet wird, unter Verwendung eines Antikörpers zu dem Hybrid aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Nukleinsäure (Komplex) zu detektieren. Als ein nicht-einschränkendes Beispiel könnte ein Komplex aus PNA/Nukleinsäure unter Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch mit dem Komplex unter geeigneten Antikörperbindungsbedingungen wechselwirkt, detektiert werden. Geeignete Antikörper zu den Komplexen aus PNA/Nukleinsäure und Verfahren für ihre Herstellung und Verwendung werden in der WIPO-Patentanmeldung WO 95/17430 sowie US 5,612,458 , welche hier durch Bezugnahme aufgenommen sind, beschrieben.
Der Komplex aus Antikörper/PNA/Nukleinsäure, der durch Wechselwirkung des α-PNA/Nukleinsäure-Antikörpers mit dem Komplex aus PNA/Nukleinsäure gebildet wird, kann durch mehrere Verfahren detektiert werden. Zum Beispiel könnte der α-PNA/Nukleinsäure-Antikörper mit einer detektierbaren Einheit markiert werden. Geeignete detektierbare Einheiten (Markierungen) werden hier beschrieben. So korreliert die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge der detektierbaren Einheit mit der Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge des Komplexes aus Antikörper/PNA/Nukleinsäure und der Zielsequenz, welche identifiziert werden soll. Alternativ wird der Komplex aus Antikörper/PNA/Nukleinsäure unter Verwendung eines sekundären Antikörpers, der mit einer detektierbaren Einheit markiert ist, detektiert. Typischerweise bindet der sekundäre Antikörper spezifisch an den α-PNA/Nukleinsäure-Antikörper unter geeigneten Antikörperbindungsbedingungen. So korreliert die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge der detektierbaren Einheit mit der Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge des Komplexes aus Antikörper/Antikörper/PNA/Nukleinsäure und der Zielsequenz, welche identifiziert werden soll. Wie hier verwendet, soll der Ausdruck Antikörper Antikörperfragmente, welche spezifisch an andere Antikörper oder andere Antikörperfragmente binden, einschließen.
Sondierende Nukleobasensequenz:
Die sondierende Nukleobasensequenz einer Nicht-Nukleotid-Sonde, welche für die Praxis dieser Erfindung verwendet wird, ist der Sequenzerkennungsteil des Konstrukts. Deshalb ist die sondierende Nukleobasensequenz derart designed, dass sie an mindestens einen Teil der Zielsequenz hybridisiert, da es bevorzugt sein kann, zwei oder mehr Sonden zu verwenden, welche designed sind, an die gesamte Zielsequenz zu hybridisieren (siehe zum Beispiel: Europäische Patentanmeldung mit dem Titel „Method of identifying a nucleic acid using triele helix formation of adjacently annealed probes"; EP-A-0 849 363 sowie die WIPO-Patentanmeldung Nr. WO 99/55916 mit dem Titel „Methods, Kits and Compositions for Detecting and Quantitating Target Sequences". Bevorzugt hybridisiert die sondierende Nukleobasensequenz an der gesamten Zielsequenz. Detektion von Nicht-Nuldeotid-Sonden-Hybridisierung an der Zielsequenz kann mit der Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge von Zielsequenz, welche in einer Probe vorhanden ist, korreliert werden.
Die sondierende Nukleobasensequenz einer Nicht-Nukleotid-Sonde wird bevorzugt exakt komplementär zur gesamten oder einem Teil der Zielsequenz sein. Alternativ könnte eine im Wesentlichen komplementäre sondierende Nukleobasensequenz verwendet werden, da gezeigt wurde, dass eine stärkere Sequenzunterscheidung erhalten werden kann, wenn Sonden verwendet werden, wobei eine oder mehr Punktmutationen (Basenfehlpaarung) zwischen der Sonde und der Zielsequenz vorliegen (siehe: Guo et al., Nature Biotechnology 15: 331–335 (1997)).
Nach reiflicher Überlegung in Bezug auf die Anforderungen einer Nicht-Nukleotid-Sonde für das gewählte Testformat und die Zielsequenz, welche detektiert werden soll, wird die sondierende Nukleobasensequenz im Allgemeinen derart gewählt, dass ein stabiler Komplex mit der gesamten oder einem Teil der Zielsequenz unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen gebildet wird. Im Allgemeinen jedoch werden die Nicht-Nukleotid-Sonden, welche für die Praxis dieser Erfindung geeignet sind, im Allgemeinen eine sondierende Nukleo basensequenz im Bereich von 5 bis 50 Untereinheiten aufweisen. Stärker bevorzugt wird die sondierende Nukleobasensequenz im Bereich von 7 bis 25 Untereinheiten in der Länge und stärker bevorzugt im Bereich von 12 bis 20 Untereinheiten in der Länge liegen.
PNA-Synthese:
Verfahren zum chemischen Aufbau von PNAs sind bekannt (siehe: Patente der Vereinigten Staaten Nr. 5,539,082, 5,527,675, 5,623,049, 5,714,331, 5,736,336, 5,773,571 oder 5,786,571, welche hier durch Bezugnahme aufgenommen sind). Chemikalien und die Gerätschaften für den trägergebundenen automatisierten chemischen Aufbau von Peptidnuldeinsäuren sind nun kommerziell erhältlich. Der chemische Aufbau einer PNA ist analog zu Festphasen-Peptidsynthese, wobei in jedem Aufbauzyklus das Oligomer einen reaktiven Alkylaminoterminus aufweist, der mit dem nächsten Synthon, das zu dem wachsenden Polymer hinzugefügt wird, kondensiert wird. Da Peptid-Standardchemie verwendet wird, werden natürliche und nicht natürliche Aminosäuren routinemäßig in ein PNA-Oligomer eingebracht. Da eine PNA ein Polyamid ist, weist sie einen C-Terminus (Carboxylterminus) und einen N-Terminus (Aminoterminus) auf. Für die Zwecke des Designs einer Hybridisierungssonde, welche für Antiparallelbindung an die Zielsequenz geeignet ist (die bevorzugte Orientierung), ist der N-Terminus der sondierenden Nukleobasensequenz der PNA-Sonde das Äquivalent des 5'-Hydroxylterminus eines äquivalenten DNA- oder RNA-Oligonukleotids.
PNA-Markierung:
Markieren einer PNA ist analog zu Peptidmarkieren. Da die Synthesechemie des Aufbaus im Wesentlichen gleich ist, kann jedwedes Verfahren, welches im Allgemeinen zum Markieren eines Peptids verwendet wird, normalerweise zur Verwendung beim Markieren einer PNA angepasst werden. So können PNAs mit zahlreichen detektierbaren Einheiten markiert werden. Im Allgemeinen kann jedwede detektierbare Einheit, welche an eine Nukleinsäure oder ein Peptid gebunden werden kann, an eine PNA gebunden werden.
Typischerweise wird der N-Terminus der PNA durch Umsetzung mit einer Einheit mit einer Carbonsäuregruppe oder aktivierten Carbonsäuregruppe markiert. Eine oder mehr Spacereinheiten können zwischen die markierte Einheit und das PNA-Oligomer eingebracht werden. Im Allgemeinen wird die Spacereinheit vor der Durchführung der Markierungsreaktion eingebracht. Jedoch kann der Spacer in der Markierung eingebettet sein und dadurch während der Markierungsreaktion eingebracht werden. Spezialisierte Reagenzien können an die PNA gebunden werden. Zum Beispiel kann eine terminale Arylamineinheit durch Kondensieren eines geeignet geschützten 4-Aminobenzoesäurederivats mit dem Aminoterminus des PNA-Oligomers erzeugt werden.
In einer Ausführungsform wird das C-terminale Ende der PNA durch zunächst Kondensieren einer markierten Einheit mit dem Träger, auf welchem die markierte PNA aufgebaut wird, markiert. Dann wird das erste Synthon der PNA mit der markierten Einheit kondensiert. Alternativ können eine oder mehr Spacereinheiten zwischen die markierte Einheit und das PNA-Oligomer eingebracht werden (z. B. 8-Amino-3,6-dioxaoctansäure). Nachdem die PNA vollständig aufgebaut und markiert wurde, wird die PNA unter Verwendung von Standardmethodiken von dem Träger abgespalten, entschützt und gereinigt.
Zum Beispiel könnte die markierte Einheit ein Lysinderivat sein, wobei die ε-Aminogruppe mit einer detektierbaren Einheit wie 5(6)-Carboxyfluorescein markiert ist. Alternativ könnte die markierte Einheit ein Lysinderivat sein, wobei die ε-Aminogruppe mit einer 4-Aminobenzoesäureeinheit derivatisiert ist (z. B. 4-(N-(tert-Butyloxycarbonyl)-aminobenzamid). Kondensation des Lysinderivats mit dem Träger würde unter Verwendung von Kondensations-(Peptid)-Standardchemie erreicht. Die α-Aminogruppe des Lysinderivats könnte dann entschützt werden und der PNA-Aufbau durch Kondensation des ersten PNA-Synthons mit der α-Aminogruppe der Lysinaminosäure initiiert werden. Nach einem vollständigen Aufbau würde das PNA-Oligomer dann unter Verwendung von bekannten Methodiken von dem Träger abgespalten, entschützt und gereinigt.
Alternativ wird eine funktionelle Gruppe an dem aufgebauten oder teilweise aufgebauten Polymer mit einer Donor- oder Akzeptoreinheit markiert (z. B. eine PNA-Molekül-Beacon oder eine lineare Beacon), während es noch trägergebunden ist. Dieses Verfahren erfordert, dass eine geeignete Schutzgruppe in das Oligomer eingebracht wird, wodurch eine reaktive Funktion erhalten wird, an welche die Donor- oder Akzeptoreinheit gebunden wird, weist aber den Vorteil auf, dass die Markierung (z. B. ein Fluorophor) an jedwede Position in dem Polymer, einschließlich innerhalb der sondierenden Nukleobasensequenz, gebunden werden kann. Zum Beispiel könnte die ε-Aminogruppe eines Lysins mit einer 4-Methyltriphenylmethyl (Mtt)-, einer 4-Methoxytriphenylmethyl (MMT)- oder einer 4,4'-Dimethoxytriphenylmethyl(DMT)-Schutzgruppe geschützt werden. Die Ma-, MMT- oder DMT-Gruppen können von der PNA (aufgebaut unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Fmoc-PNA-Monomeren und Polystyrolträger mit einem PAL-Linker; PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, MA) durch Behandlung des Harzes unter milden sauren Bedingungen entfernt werden. Anschließend kann die Donor- oder Akzeptoreinheit dann mit der ε-Aminogruppe der Lysinaminosäure kondensiert werden. Nach dem vollständigen Aufbau und Markieren wird das Polymer dann unter Verwendung von bekannten Methodiken von dem Träger abgespalten, entschützt und gereinigt.
Alternativ wird eine Markierung (einschließlich eine der Donor- oder Akzeptoreinheit, wobei die andere der Donor- oder Akzeptoreinheit an die PNA während dem Aufbau gebunden wird) an die PNA gebunden, nachdem sie vollständig aufgebaut, vom Träger abgespalten und gegebenenfalls gereinigt wurde. Dieses Verfahren ist bevorzugt, wo die Markierung mit den Abspaltungs-, Entschützungs- oder Reinigungsschemata, welche im Allgemeinen zur Herstellung von PNA verwendet werden, inkompatibel ist. Bei diesem Verfahren wird die PNA im Allgemeinen in Lösung durch die Umsetzung einer funktionellen Gruppe an der PNA und einer funktionellen Gruppe an der Markierung markiert. Der Fachmann wird erkennen, dass die Zusammensetzung der Kupplungslösung von der Natur der PNA und der Markierung abhängen wird. Die Lösung kann organisches Lösungsmittel, Wasser oder jedwede Kombination davon umfassen. Im Allgemeinen wird das organische Lösungsmittel ein polares nicht-nukleophiles Lösungsmittel sein. Nicht-einschränkende Beispiele von geeigneten organischen Lösungsmitteln schließen Acetonitril, Tetrahydrofuran, Dioxan und N,N'-Dimethylformamid ein.
Im Allgemeinen wird die funktionelle Gruppe an der PNA ein Amin sein und die funktionelle Gruppe an der Markierung wird eine Carbonsäure oder aktivierte Carbonsäure sein. Nicht-einschränkende Beispiele von funktionellen aktivierten Carbonsäuregruppen schließen N-Hydroxysuccinimidylester ein. Wenn die Markierung ein Enzym ist, wird das Amin an der PNA bevorzugt ein Arylamin sein. In wässrigen Lösungen kann die Carbonsäuregruppe von entweder der PNA oder der Markierung (abhängig von der Natur der gewählten Komponenten) mit einem wasserlöslichen Carbodiimid aktiviert werden. Das Reagenz 1-(3- Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC) ist ein kommerziell erhältliches Reagenz, welches speziell für wässrige Amid-bildende Kondensationsreaktionen verkauft wird.
Im Allgemeinen wird der pH-Wert von wässrigen Lösungen mit einem Puffer während der Kondensationsreaktion moduliert. Bevorzugt liegt der pH-Wert während der Kondensation im Bereich von 4 bis 10. Wenn ein Arylamin mit der Carbonsäure kondensiert wird, liegt der pH-Wert bevorzugt im Bereich von 4 bis 7. Wenn ein Alkylamin mit einer Carbonsäure kondensiert wird, liegt der pH-Wert bevorzugt im Bereich von 7 bis 10. Im Allgemeinen wird die Basizität von nicht-wässrigen Umsetzungen durch die Zugabe von nicht-nukleophilen organischen Basen moduliert. Nicht-einschränkende Beispiele von geeigneten Basen schließen N-Methylmorpholin, Triethylamin und N,N-Diisopropylethylamin ein. Alternativ wird der pH-Wert unter Verwendung von biologischen Puffer wie (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure) (HEPES) oder 4-Morpholinethansulfonsäure (MES) oder anorganischen Puffer wie Natriumbicarbonat moduliert.
Beispielhafte Markierungen:
Zahlreiche detektierbare Einheiten können für die Praxis dieser Erfindung verwendet werden. Geeignete detektierbare oder unabhängig detektierbare Einheiten werden derart gewählt, dass sie mit dem Test, der durchgeführt wird, kompatibel sind. Im Allgemeinen werden die Markierungen so gewählt, dass das Markierungspaar neutral oder positiv geladen ist, so dass die Nicht-Nukleotid-Sonde, wenn markiert, keine wesentliche Affinität für die Matrix aufweist. Alternativ kann die Sonde derart designed werden, dass Ladungen eingebracht werden (im Allgemeinen positive Ladungen), so dass, sogar wenn die Nettoladung der Markierungen negativ ist, die markierte Sonde neutral oder positiv geladen ist und deshalb nur geringe oder keine Affinität für die Matrix aufweist.
Nicht-einschränkende Beispiele von detektierbaren Einheiten (Markierungen), welche zur Verwendung in der Praxis dieser Erfindung geeignet sind, werden Dextrankonjugate, ein verzweigtes Nukleinsäuredetektionssystem, Chromophore, Fluorochrome, Spin-Markierungen, Radioisotope, Massemarkierungen, Enzyme, Haptene und chemilumineszente Verbindungen einschließen. Bevorzugte Markierungsreagenzien werden als Carbonsäuren oder als die N-Hydroxysuccinidylester von Carbonsäuren bereitgestellt. Zahlreiche Aminreaktive Markierungsreagenzien sind kommerziell erhältlich (wie zum Beispiel von Molecular Probes, Eugene, Oregon). Bevorzugte Fluorochrome (Fluorophore) schließen 5(6)-Carboxyfluorescein (Flu), 6-((7-Amino-4-methylcoumarin-3-acetyl)amino)hexansäure (Cou), 5(und 6)-Carboxy-X-rhodamin (Rox), Cyanin 3 (Cy3)-Farbstoff, Cyanin 3.5 (Cy3.5)-Farbstoff, Cyanin 5 (Cy5)-Farbstoff, Cyanin 5.5 (Cy5.5)-Farbstoff, Cyanin 7 (Cy7)-Farbstoff, Cyanin 9 (Cy9)-Farbstoff (die Cyanin-Farbstoffe 3, 3.5, 5 und 5.5 sind als NHS-Ester von Amersham, Arlington Heights, IL erhältlich) oder die Alexa-Farbstoffreihe (Molecular Probes) ein. Bevorzugte Haptene schließen 5(6)-Carboxyfluorescein, 2,4-Dinitrophenyl, Digoxigenin und Biotin ein. Bevorzugte Enzyme schließen Sojabohnenperoxidase, alkalische Phosphatase und Meerrettichperoxidase ein. Andere geeignete Markierungsreagenzien und bevorzugte Verfahren zum Binden werden vom Fachmann auf dem Gebiet der PNA-Synthese erkannt.
Nicht-Nukleotid-„Beacon"-Sonden:
Die Markierungen, welche an die Nicht-Nukleotid-„Beacon"-Sonden gebunden sind, umfassen einen Satz (hier nachstehend „Beacon-Satz bzw. -Sätze") von Energietransfereinheiten, welche mindestens eine Energietransferdonor- und mindestens eine Energietransferakzeptoreinheit umfassen. Typischerweise wird der Beacon-Satz eine einzelne Donoreinheit und eine einzelne Akzeptoreinheit einschließen. Nichtsdestoweniger kann ein Beacon-Satz mehr als eine Donoreinheit und/oder mehr als eine Akzeptoreinheit enthalten. Die Donor- und Akzeptoreinheiten arbeiten derart, dass eine oder mehr Akzeptoreinheiten Energie aufnehmen, welche von der einen oder mehr Donoreinheiten transferiert wird, oder ansonsten ein Signal von der Donoreinheit oder -einheiten quenchen. Obwohl die vorstehend aufgelisteten Fluorophore (mit geeigneten spektralen Eigenschaften) auch als Energietransferakzeptoren arbeiten könnten, ist die Akzeptoreinheit bevorzugt eine Quenchereinheit. Bevorzugt ist die Quenchereinheit eine nicht fluoreszente aromatische oder heteroaromatische Einheit. Die bevorzugte Quenchereinheit ist 4-((4-(Dimethylamino)phenyl)azo)benzoesäure (dabcyl).
Transfer von Energie zwischen Donor- und Akzeptoreinheiten einer Nicht-Nukleotid„Beacon"-Sonde kann durch Kollision der eng assoziierten Einheiten eines Beacon-Satzes oder durch einen Nicht-Strahlungsprozess wie Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) stattfinden. Damit FREI stattfindet, erfordert ein Transfer von Energie zwischen Donor- und Akzeptoreinheiten von einem Beacon-Satz, dass die Einheiten eng im Raum stehen und dass das Emissionsspektrum eines Donor(s/en) eine wesentliche Überlappung mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptors/en) aufweist (siehe: Yaron et al. Analytical Biochemistry, 95: 228–235 (1979) und insbesondere Seite 232, Spal. 1 bis Seite 234, Spal. 1). Alternativ kann ein Kollisions-vermittelter (strahlungsloser) Energietransfer zwischen sehr eng assoziierten Donor- und Akzeptoreinheiten stattfinden, ob das Emissionsspektrum einer Donoreinheit(en) eine wesentliche Überlappung mit dem Absorptionsspektrum der Akzeptoreinheit(en) aufweist oder nicht (siehe: Yaron et al., Analytical Biochemistry, 95: 228–235 (1979) und insbesondere Seite 229, Spal. 1 bis Seite 232, Spal. 1). Dieser Prozess wird als intramolekulare Kollision bezeichnet, da man annimmt, dass das Quenchen durch den direkten Kontakt der Donor- und Akzeptoreinheiten verursacht wird (siehe: Yaron et al.).
(i) Lineare Beacon:
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nicht-Nukleotid-„Beacon”-Sonde eine lineare Beacon, wie vollständiger in der auch anhängigen Patentanmeldung USSN 09/179,162 und WIPO-Veröffentlichung WO 99/22018 mit dem Titel „Methods, Kits And Compositions Pertaining To Linear Beacons", welche hier durch Bezugnahme aufgenommen sind, beschrieben.
(ii) PNA-Molekül-Beacons:
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nicht-Nukleotid-„Beacon”-Sonde eine PNA-Molekül-Beacon, wie vollständiger in der auch anhängigen Patentanmeldung USSN 09/179,298 und WIPO-Veröffentlichung WO 99/21881 mit dem Titel „Methods, Kits And Compositions Pertaining To PNA Molecular Beacons", welche hier durch Bezugnahme aufgenommen sind, beschrieben.
Detektieren von Energietransfer:
Hybridbildung einer Nicht-Nukleotid-„Beacon”-Sonde mit einer Zielsequenz kann durch Messen von mindestens einer physikalischen Eigenschaft von mindestens einem Be standteil des Beacon-Satzes beobachtet werden, welche detektierbar unterschiedlich ist, wenn der Hybridisierungskomplex gebildet ist, im Vergleich damit, wenn die Nicht-Nukleotid-„Beacon"-Sonde in der Abwesenheit der Zielsequenz vorliegt. Wir bezeichnen dieses Phänomen als die selbstanzeigende Eigenschaft von Nicht-Nukleotid-„Beacon"-Sonden. Diese Änderung des detektierbaren Signals soll von der Änderung des Wirkungsgrads des Energietransfers zwischen dem Donor und Akzeptor resultieren, welche von der Hybridisierung der Nicht-Nukleotid-„Beacon"-Sonden resultiert. Bevorzugt wird das Mittel zur Detektion das Messen von Fluoreszenz eines Donor- oder Akzeptorfluorophors eines Beacon-Satzes einbeziehen. Am stärksten bevorzugt wird der Beacon-Satz mindestens ein Donorfluorophor und mindestens einen Akzeptorquencher umfassen, so dass die Fluoreszenz des Donorfluorophors zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung einer Hybridisierung der Nicht-Nukleotid-Sonde an der Zielsequenz verwendet wird.
Andere selbstanzeigende Nicht-Nukleotid-Sonden:
In einer anderen Ausführungsform sind die Nicht-Nukleotid-Sonden dieser Erfindung selbstanzeigende Sonden des Typs, der in der WIPO-Patentanmeldung WO 97/45539 beschrieben wird. Die selbstanzeigenden Nicht-Nukleotid-Sonden, welche in WO 97/45539 beschrieben werden, unterscheiden sich im Vergleich mit den Nicht-Nukleotid-„Beacon"-Sonden primär dadurch, dass keine Quencher- oder Akzeptoreinheit in den Sonden von WO 97/45539 vorhanden sind. Bevorzugt sind die Sonden von WO 97/45539 , wie in dieser Erfindung verwendet, geeignet markierte Peptidnukleinsäuren.
Detektierbare und unabhängig detektierbare Einheiten/Multiplex-Analyse:
In bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung wird ein auf Sonden basierender Hybridisierungs-Multiplextest durchgeführt. In einem Multiplextest werden zahlreiche Bedingungen von Interesse gleichzeitig untersucht. Multiplexanalyse beruht auf der Fähigkeit, Probenkomponenten oder die damit in Zusammenhang stehenden Daten, während oder nachdem der Test vollendet wurde, zu sortieren. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden bestimmte unabhängig detektierbare Einheiten zum Markieren der unterschiedlichen Nicht-Nukleotid-Sonden eines Satzes verwendet. Die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen und/oder Quantifizierung von jeder der unabhängig detektierbaren Einheiten stellt das Mittel bereit, einen Hybridisierungstest in Multiplexweise durchzuführen, da die Daten, welche mit der Hybridisierung von jeder der in bestimmter Weise (unabhängig) markierten Nicht-Nukleotid-Sonden an einer Zielsequenz korrelieren, mit der Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge der Zielsequenz, welche in einer Probe detektiert werden soll, korreliert werden können. Folglich können die auf Sonden basierenden Multiplextests dieser Erfindung zur gleichzeitigen Detektion der Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge von jeder von zwei oder mehr Zielsequenzen, welche in der selben Probe und im selben Test vorhanden sein können, verwendet werden.
Spacer-/Linkereinheiten:
Im Allgemeinen werden Spacer zur Minimierung der Nebenwirkungen, welche voluminöse Markierungsreagenzien auf die Hybridisierungseigenschaften von Sonden haben könnten, verwendet. Linker induzieren typischerweise Flexibilität und Unordnung in der Sonde oder verbinden ansonsten zwei oder mehr Nukleobasensequenzen einer Sonde. Bevorzugte Spacer-/Linkereinheiten für Nicht-Nukleotid-Sonden, welche für die Praxis dieser Erfindung verwendet werden, bestehen aus einer oder mehr Aminoalkylcarbonsäuren (z. B. Aminocapronsäure), der Seitenkette einer Aminosäure (z. B. der Seitenkette von Lysin oder Ornithin), natürlichen Aminosäuren (z. B. Glycin), Aminooxyalkylsäuren (z. B. 8-Amino-3,6-dioxaoctansäure), Alkyldisäuren (z. B. Bernsteinsäure) oder Alkyloxydisäuren (z. B. Diglykolsäure). Spacer-/Linkereinheiten können auch zufällig oder absichtlich aufgebaut werden, um die Wasserlöslichkeit der Sonde zu verbessern. Die Spacer-/Linkereinheiten können auch derart designed werden, dass die Löslichkeit des Oligomers gesteigert wird.
Bevorzugt umfasst eine Spacer-/Linkereinheit eine oder mehr verbundene Verbindungen mit der Formel: -Y-(O_m-(CW₂)_n)_o-Z-. Der Rest Y weist die Formel auf: eine Einfachbindung, -(CW₂)_p-, -C(O)(CW₂)_p-, -C(S)(CW₂)_p- und -S(O₂)(CW₂)_P. Der Rest Z hat die Formel NH, NR², S oder O. Jedes W ist unabhängig H, R², -OR², F, Cl, Br oder I; wobei jedes R² unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: -CX₃, -CX₂CX₃, -CX₂CX₂CX₃, -CX₂CX(CX₃)₂ und -C(CX₃)₃. Jedes X ist unabhängig H, F, Cl, Br oder I. Jedes m ist unabhängig 0 oder 1. Jedes n, 0 und p ist unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 10.
Gebundenes Polymer:
Ein gebundenes Polymer umfasst zwei oder mehr Nukleobasensequenzen, welche durch einen Linker verbunden sind. Die Sonden dieser Erfindung schließen gebundene Polymere ein, wobei die sondierende Nukleobasensequenz an ein oder mehr zusätzliche Peptidnukleinsäure-, Peptid- oder Enzymmoleküle gebunden ist.
Hybridisierungsbedingungen/Strenge:
Der Fachmann auf dem Gebiet der Nukleinsäurehybridisierung wird erkennen, dass Faktoren, welche im Allgemeinen zur Auferlegung oder Steuerung von Strenge der Hybridisierung verwendet werden, Formamidkonzentration (oder ein anderes chemisches Denaturierungsreagenz), Salzkonzentration (d. h. Ionenstärke), Hybridisierungstemperatur, Detergenzkonzentration, pH-Wert und die Anwesenheit oder Abwesenheit von chaotropen Mitteln einschließen. Die optimale Strenge für eine Sonde/Ziel-Kombination wird oft durch die bekannte Technik von Stabilhalten von mehreren der vorstehend erwähnten Faktoren der Strenge und dann Bestimmen der Wirkung einer Variation eines einzelnen Faktors der Strenge gefunden. Die gleichen Faktoren der Strenge können moduliert werden, um dabei die Strenge der Hybridisierung von Nicht-Nukleotid-Sonden an Zielsequenzen zu steuern, außer dass die Hybridisierung einer PNA ziemlich unabhängig von der Ionenstärke ist. Es ist wahrscheinlich, dass die Ionenstärke kein wesentlicher Faktor bei der Strenge der meisten Nicht-Nukleotid-Sonden mit einem ausreichend neutralen oder positiv geladenen Rückgrad ist. Die optimale Strenge für einen Test kann experimentell durch Untersuchung von jedem Faktor der Strenge, bis der gewünschte Unterscheidungsgrad erreicht ist, bestimmt werden.
Geeignete Hybridisierungsbedingungen:
Im Allgemeinen, je stärker verwandt die Hintergrund-verursachenden Nukleinsäurekontaminanten zur Zielsequenz sind, desto sorgfältiger muss die Strenge gesteuert werden. Blockierende Sonden können auch als ein Mittel zur Verbesserung der Unterscheidung über die Grenzen hinaus, welche durch bloße Optimierung der Faktoren der Strenge möglich sind, verwendet werden. Geeignete Hybridisierungsbedingungen werden so Bedingungen umfassen, unter welchen der gewünschte Unterscheidungsgrad erreicht wird, so dass ein Test ein genaues (innerhalb der Toleranz, welche für den Test gewünscht ist) und reproduzierbares Ergebnis erzeugt. Mit der Hilfe von nicht mehr als Routineexperimentieren wird der Fachmann leicht in der Lage sein, geeignete Hybridisierungsbedingungen zur Durchführung eines Tests zu bestimmen.
Blockiersonden:
Blockiersonden sind Nicht-Nukleinsäure- oder Nukleinsäure-Sonden, welche zur Unterdrückung der Bindung der sondierenden Nukleobasensequenz einer Sonde an einer Hybridisierungsstelle, welche nicht verwandt oder eng verwandt mit der Zielsequenz ist, verwendet werden können (siehe: Coull et al., PCT/US97/21845 , alias WO 98/24933 ). Im Allgemeinen unterdrücken die Blockiersonden das Binden der sondierenden Nuldeobasensequenz an eng verwandte Nicht-Zielsequenzen, da die Blockiersonde an die Nicht-Zielsequenz hybridisiert, wobei ein thermodynamisch stabilerer Komplex gebildet wird als durch Hybridisierung zwischen der sondierenden Nukleobasensequenz und der Nicht-Zielsequenz gebildet wird. Folglich sind Blockiersonden typischerweise nicht markierte Sonden, welche in einem Test verwendet werden, um dabei ein nicht spezifisches Signal zu unterdrücken. Da sie normalerweise zur Hybridisierung an eng verwandten Nicht-Zielsequenz-Sequenzen designed sind, wird typischerweise ein Satz von zwei oder mehr Blockiersonden in einem Test verwendet, um damit ein nicht spezifisches Signal von Nicht-Zielsequenzen, welche vorhanden sind und die Leistung des Tests beeinflussen könnten, zu unterdrücken.
Geeignete elektrostatische Bindungsbedingungen:
Es ist ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass die elektrostatischen Bindungsbedingungen so gewählt werden, dass die Nicht-Nukleotid-Sonde nur wenig oder keine Affinität für die Matrix im Vergleich mit Nukleinsäurekomponenten der Probe aufweist. Die elektrostatische Immobilisierung von Nukleinsäuren an Matrizen bezieht primär die Bildung von Salzpaaren zwischen der Nukleinsäure und der Matrix ein. Ein Salzpaar umfasst eine geladene Spezies der Nukleinsäure, welche mit einer entgegengesetzt geladenen Spezies der Matrix wechselwirkt, wobei eine Wechselwirkung gebildet wird, die zur Stabilisierung der Assoziation der Nukleinsäure mit der Matrix neigt. Variable Faktoren, welche die elektrostatische Bindung am stärksten beeinflussen werden, werden eine Modulierung von einem oder beiden von pH-Wert und/oder Ionenstärke einbeziehen. Der pH-Wert ist ein wichtiger Faktor, da er die Ladungsdichte an der Matrix sowie die Nettoladung der Nukleinsäure beeinflussen kann. In ähnlicher Weise wird Ionenstärke die Salzpaarstabilität beeinflussen, da es auf dem Fachgebiet der Chromatographie bekannt ist, dass steigende Ionenstärke die Wechselwirkungen, welche zwischen Nukleinsäuren und stationären Anionenaustauschphasen gebildet werden, destabilisiert. Für die Zwecke dieser Erfindung sollen elektrostatische Bindungsbedingungen Bedingungen sein, welche die reversible Bindung der Nukleinsäure von Interesse an einer Matrix durch Salzpaarbildung ermöglichen.
Harmonisierung von geeigneten Hybridisierungsbedingungen und geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen:
Wenn die Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, ist es wichtig, zwischen geeigneten Hybridisierungsbedingungen, wobei sequenzspezifische Hybridisierung einer Nicht-Nukleotid-Sonde an einer Zielsequenz optimiert wird, im Vergleich zu elektrostatischen Bindungsbedingungen, welche einfach die Bedingungen betreffen, unter welchen die Nukleinsäure an die Matrix bindet, aber die Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden keine wesentliche Affinität für die Matrix aufweist bzw. aufweisen, zu unterscheiden. Typischerweise werden die elektrostatischen Bindungsbedingungen derart gewählt, dass die Nicht-Nuklein-Sonde ausreichend neutral oder positiv geladen ist. Wegen der Unterschiede bei den Ladungen der Rückgrade der Nukleinsäure und Nicht-Nukleotid-Sonden dieser Erfindung gibt es einen großen Bereich von Bedingungen, in welchem die Nukleinsäure von Interesse an die Matrix bindet, dies aber die Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden nicht tut bzw. tun. Dieses Prinzip ist in Beispiel 13 beispielhaft dargestellt, wobei es klar ist, dass die Nicht-Nukleotid-Sonden unter jedweden untersuchten Bedingungen nicht mit der Matrix Wechselwirken, aber die am nächsten äquivalenten Nukleinsäure-Sonden mit der Matrix unter vielen der getesteten Bedingungen Wechselwirken können, ob die Zielsequenz in der Probe vorhanden ist oder nicht.
Da es ein wichtiges Merkmal dieser Erfindung ist, dass die Nicht-Nukleotid-Sonde mit einer Nukleinsäure hybridisiert, welche elektrostatisch an eine Matrix gebunden ist, wird der Fachmann erkennen, dass die Hybridisierungsbedingungen (Faktoren der Strenge) und elektrostatischen Bindungsbedingungen im Kontext des Tests, der durchgeführt wird, harmonisiert werden sollten. Da pH-Wert und Ionenstärke Faktoren sind, welche sowohl bei der Strenge als auch der elektrostatischen Bindung berücksichtigt werden müssen, und da die elektrostatischen Bindungsbedingungen breit im Vergleich mit der optimierten Strenge sind, sollte es immer möglich sein, einfach die elektrostatischen Bindungsbedingungen festzulegen und dann die Sondenunterscheidung durch Modulierung von anderen Faktoren der Strenge zu optimieren. In dieser Hinsicht sind die Verfahren dieser Erfindung viel besser als momentane auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren (z. B. Arnold et al., US 5,599,667 ). Mit der Hilfe von nicht mehr als Routineexperimentieren wird der Fachmann leicht in der Lage sein, die elektrostatischen Bindungsbedingungen und geeigneten Hybridisierungsbedingungen zur Durchführung eines Tests zu harmonisieren.
Matrizen:
Im Allgemeinen ist die Matrix nur ein Gerüst, welches möglicherweise vom Massefluid des Tests abgetrennt werden kann und welches geladene funktionelle Gruppen umfasst, an welche die Nukleinsäure reversibel elektrostatisch bindet. Typischerweise findet elektrostatisches Binden durch Salzpaarbildung zwischen geladenen Resten des Nukleinsäure-Rückgrads und geladenen Resten der Matrix statt. Zum Binden von Nukleinsäuren werden die primären Wechselwirkungen am stärksten wahrscheinlich die Bildung eines Salzpaares zwischen den negativ geladenen Phosphatgruppen des Nukleinsäurephosphodiester-Rückgrads und positiv geladenen funktionellen Gruppen der Matrix einbeziehen.
Nicht-einschränkende Beispiele von geeigneten Matrizen schließen ein: Polymere, welche in Wasser oder Gemischen von Wasser und wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln unlöslich sind; zwei- und dreidimensionale Oberflächen wie eine Wand eines Röhrchens, eine Glasfritte oder ein Wafer; kugelförmige Träger wie magnetische Kügelchen, Chromatographiepackungsträger, -medien und -harze; poröse kugelförmige Träger wie Chromatographiepackungsträger, -medien und -harze (z. B. Anionenaustausch-chromatographiemedien), ein gegossenes Polymer wie eine Membran (z. B. Polyvinylidendifluorid, Teflon, Polyethylen, Polypropylen oder Polysulfon); co-polymere Materialien und Gele (z. B. Polyacrylamid oder Agarose). In einer bevorzugten Ausführungsform werden kommerziell erhältliche Ionenaustauschchromatographiemedien und insbesondere die kugelförmigen Medien als die Matrix verwendet.
Matrixabschirmung:
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen kann die Matrix temporär von den Testkomponenten abgeschirmt werden, um dadurch temporär die elektrostatische Bindung von Nukleinsäurekomponenten des Tests an der Matrix zu verzögern. Zum Beispiel kann es bevorzugt sein, die Matrix teilweise oder vollständig von Testkomponenten abzuschirmen, bis eine Nukleinsäuresynthese oder -Amplifikationsreaktion teilweise oder im Wesentlichen vollendet ist, um so die Synthese oder Amplifikation nicht zu inhibieren (siehe zum Beispiel: Beispiel 12 dieser Beschreibung).
Der Fachmann wird erkennen, dass das Trennen von Reaktionskomponenten durch Herstellen eines Reaktionsgefäßes mit geeigneten Abteilungen erhalten werden kann. Bevorzugt wird die Matrix jedoch mit der Hilfe eines Fluids abgeschirmt, welches als eine temporare Barriere dienen wird, bis die Reaktionskomponenten gemischt sind. So wird ein bevorzugtes Fluid ein wassermischbares Fluid sein, welches im Vergleich mit Wasser viskos und/oder dicht ist, so dass es sich nicht leicht mit wässrigen Lösungen mischt, bis es Erwärmen oder physikalischer Bewegung ausgesetzt wird. Ein Fachmann wird erkennen, dass ein nichteinschränkendes Beispiel eines solchen Fluids Glycerin ist.
Beispielhafte Testformate:
Die Verfahren dieser Erfindung vereinfachen die Herstellung und/oder Analyse von Nukleinsäuren von Interesse wesentlich. Es ist auch ein Vorteil, dass sie im Allgemeinen bei allen Typen von Proben und Testformaten, welche typischerweise für die Analyse von Nukleinsauren verwendet werden, verwendet werden können. Mehrere Beispiele von bevorzugten Testformaten, welche getestet wurden, sind nachstehend beschrieben. Diese Beispiele zeigen die breite Verwendbarkeit der Verfahren dieser Erfindung. Im Allgemeinen schließen sich die nachstehend beschriebenen Testformate nicht notwendigerweise gegenseitig aus und eines oder mehr können für die Analyse einer besonderen Probe kombiniert werden.
(i) Amplifikationstestformate:
Diese Erfindung kann für Proben, wobei die Nuldeinsäure synthetisiert oder amplifiziert wurde, verwendet werden. Nicht-einschränkende Beispiele von bevorzugter Nukleinsäuresynthese oder Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, schließen Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Strangverdrängungsamplifikation (SDA), transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA), Rollzyklusamplifikation (RCA) und Q-beta-Replikase ein. Wenn mit Nicht-Nukleotid-„Beacon"-Sonden kombiniert, können diese Testformate in einem selbstanzeigenden Format, einschließlich Echtzeit- sowie Endpunkt-Bestimmung, durchgeführt werden, wenn ein geeignetes Instrument wie ein Prism 7700 (PE Biosystems, Foster City, CA) verwendet wird. In einem selbstanzeigenden Test, nachdem die Komponenten des Tests kombiniert wurden, gibt es keinen Bedarf, Inhalte des Tests zu stören, um das Ergebnis zu bestimmen. Da die Testinhalte nicht gestört werden müssen, um das Ergebnis zu bestimmen, muss es eine gewisse detektierbare oder messbare Änderung geben, welche auftritt und welche beobachtet oder quantifiziert werden kann, ohne physikalisch die Inhalte des Tests zu manipulieren. Viele selbstanzeigende Tests beruhen auf einer Änderung der Fluoreszenz, welche mit dem Auge beobachtet oder ansonsten mit einem Fluoreszenzinstrument detektiert und/oder quantifiziert werden kann. Beispiel 12 dieser Beschreibung beschreibt selbstanzeigende PCR-Tests, welche für entweder Echtzeit- oder Endpunkt-Analyse geeignet sind.
(ii) Schutz-/Verdautests:
Andere bevorzugte Tests dieser Erfindung sind auf die Detektion von Nukleinsäurezielsequenzen in Proben, insbesondere in komplexen biologischen Proben, gerichtet. Komplexe biologische Proben wie Blut, Urin, Auswurf und Zelllysate erfordern typischerweise ein wesentliches Verarbeiten, um das Massematerial, wie Protein, Lipide, Zelltrümmer, usw., welche ansonsten die Empfindlichkeit und/oder Zuverlässigkeit eines auf Sonden basierenden Hybridisierungstests verringern, zu entfernen. Es wurde früher gezeigt, dass Nukleinsäureanaloga, wie PNA, an eine Zielsequenz hybridisieren und dabei die Nukleinsäurezielsequenz vor Verdau/Abbau durch Nukleasen schützen können (siehe: Stanley et al.; US 5,861,250 ). Im Testformat der Erfindung werden eine oder mehr detektierbare Nicht-Nukleinsäure-Sonden, welche das Nukleinsäureziel vor Verdau/Abbau schützen können, an die eine oder mehr Zielsequenzen unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert. Bevorzugt liegt die Zielsequenz in einer komplexen biologischen Probe vor. Nachdem die Nicht-Nukleinsäure-Sonde an die Nukleinsäurezielsequenz hybridisiert hat, wird die Probe mit einem oder mehr Enzymen wie Proteasen und/oder Nukleasen, welche die Probenkomponenten abbauen, möglicherweise einschließlich dem Nukleinsäuremolekül von Interesse, aber nicht den Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz, behandelt. Da diese Behandlung kontaminierende Polymere und Bruchstücke verdaut/abbaut, verringert oder beseitigt diese Behandlung die Probenkomplexität und/oder Verarbeitungsanforderungen, welche normalerweise mit komplexen biologischen Proben in Zusammenhang stehen. Da das eine oder mehr Hybride aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz, falls in der Probe vorhanden, nach der Enzymbehandlung intakt sind, können sie an einer Matrix konzentriert und als das Mittel zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz in der Probe von Interesse detektiert werden. Ein Beispiel dieses Testformats wird in Beispiel 14 dieser Beschreibung gefunden. Gegebenenfalls wird das detektierbare Hybrid aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz von der Matrix durch Einstellen der Bedingungen außerhalb des Bereichs, der für elektrostatisches Binden erforderlich ist, freigesetzt und dabei eine Detektion des nicht gebundenen Hybrids aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz oder nur der detektierbaren Sonde als ein Mittel zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz in der Probe ermöglicht.
Vorteilhafterweise ist die Anwesenheit der Matrix zum Schützen der Zielsequenz vor Abbau nicht erforderlich. Deshalb kann die Matrix entweder während der Enzymbehandlung vorhanden sein oder nach der Enzymbehandlung zugegeben werden, um damit die Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz elektrostatisch zu immobilisieren. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Nukleinsäureanalogon eine Nicht-Nukleotid-„Beacon”-Sonde und die Anwesenheit, Abwesenheit oder der Umfang eines selbstanzeigenden Signals, welches an der Matrix detektiert wird, wird zur Bestimmung der Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge einer Zielsequenz, welche in der Probe oder komplexen biologischen Probe vorhanden ist, verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Tests wird die Testtemperatur so eingestellt und/oder gesteuert, dass nicht perfekte Hybride bevorzugt dissoziieren, um einen höheren Grad von Zielsequenzunterscheidung, einschließlich Unterscheidung bezüglich einer ein zelnen Punktmutation, zu erreichen. Im Allgemeinen bezieht dies das Einstellen der Temperatur des Tests auf einen Punkt unter der Schmelztemperatur des Hybrids aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz ein, so dass Nicht-Nukleotid-Sonde/Nicht-Zielsequenzen zumindest teilweise dissoziiert sind. Da die Hybride aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Nicht-Zielsequenz im Allgemeinen im Vergleich mit den Hybriden aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz weniger komplementär sind, liegt die optimale Testtemperatur typischerweise in einem fünfzehn Grad-Bereich, wobei dieser Bereich als fünf Grad oberhalb und zehn Grad unterhalb der Schmelztemperatur des Hybrids, welches aus der Nicht-Nukleotid-Sonde und der Nicht-Zielsequenz gebildet wird, definiert ist. Wenn zum Beispiel die Nicht-Nukleotid-Sonde/Nicht-Zielsequenz, welche in dem Test unterschieden werden soll, eine Schmelztemperatur von 70°C unter Testbedingungen aufweist, würde der bevorzugte Bereich zum Einstellen der Temperatur des Tests zwischen 75°C (+5°C) und 60°C (–10°C) liegen.
Dissoziation der Nicht-Nukleotid-Sonde/Nicht-Zielsequenzen macht die Nicht-Zielsequenzen für Enzymabbau zugänglich, da sie nicht länger geschützt sind. Obwohl Hybridisierung, insbesondere nahe der Tm, ein Gleichgewichtsprozess ist, verhindert eine Zerstörung der Nicht-Zielsequenz eine erneute Assoziation des Hybrids aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Nicht-Zielsequenz und die damit in Zusammenhang stehende Erzeugung des nicht spezifischen Signals.
Wie vorstehend angegeben, schließen sich die hier beschriebenen Testformate in Bezug auf andere Testformate nicht gegenseitig aus. Es ist ein wichtiges Merkmal dieser Erfindung, dass das Hybrid aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz reversibel an die Matrix gebunden ist. Deshalb kann das Hybrid aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz von der Matrix für anschließende Analyse freigesetzt werden. Folglich kann dieser Schutz-/Verdautest auch nur für Probenvorbereitung oder als ein Vorläufernachweistest für einen zweiten Test verwendet werden. Zum Beispiel können die Schutz-/Verdautests mit anderen Testformaten kombiniert werden, wie für die Analyse von Arrays oder für Probenvorbereitung, bevor ein Linientest oder (Durchfluss- oder statischer) Zytometrietest wie nachstehend beschrieben durchgeführt werden.
(iii) Linientests:
Ein anderes bevorzugtes Testformat, welches für die Praxis dieser Erfindung nützlich ist, ist der Linientest. Ein allgemeiner Linientest ist ein lateraler Durchflusstest. Viele Verfahren und Geräte für laterale Durchflusstests sind bekannt (siehe: US Pat. Nr. 5,916,521 , 5,798,273 , 5,770,460 , 5,710,005 , 5,415,994 , 4,956,302 und 4,943,522 , welche alle hier aufgenommen sind). Ein klassisches Beispiel eines lateralen Durchflusstests ist ein kommerziell erhältlicher Schwangerschaftstest. In einem klassischen Schwangerschaftstest wird eine Urinprobe auf einen Punkt auf einem Gerät für einen lateralen Durchflusstest aufgebracht. Das Gerät für einen lateralen Durchfluss umfasst eine Fluid-leitende Matrix, wie einen Filter oder eine Membran, welche verursacht, dass das Fluid (z. B. Urin) passiv vom Aufbringungspunkt zum anderen Ende der leitenden Matrix (im Allgemeinen durch Kapillarwirkung) fließt. In dem Gerät für einen lateralen Durchfluss ist ein detektierbarer Antikörper gegen das HCG-Hormon vorhanden (oder wird ansonsten zu der Urinprobe vor der Aufbringung auf das Gerät gegeben), wobei das HCG-Hormon in der Urinprobe nur vorhanden ist, wenn die Untersuchte schwanger ist. Wenn der Urin lateral in dem Gerät fließt, bildet sich der HCG/Antikörper-Komplex, wenn die Komponenten Wechselwirken. In dem Gerät ist auch eine Linie (oder andere geometrische Form) einer Substanz (normalerweise ein anderer Antikörper), an welcher der HCG/Antikörper-Komplex binden und dabei aufkonzentrieren wird, wobei ein detektierbares Signal erzeugt wird.
Folglich zieht eine andere Ausführungsform dieser Erfindung einen Linientest oder Test für einen lateralen Durchfluss für die Detektion einer Nukleinsäurezielsequenz in Betracht. Im Linientest dieser Erfindung wird eine Linie, Linien oder andere geometrische Form einer Matrix räumlich auf dem Gerät fixiert, so dass jedwede Komplexe aus Nicht-Nukleinsäure-Sonde/Zielsequenz, welche in einer Probe vorhanden sind, an der Linie (oder anderen geometrischen Form) des Geräts konzentriert werden können, wenn die Probe (oder Probekomponenten) vorüberfließt. Bevorzugt ist der Test ein Test für einen lateralen Durchfluss. Im Linientest dieser Erfindung kann die detektierbare Nicht-Nukleinsäure-Sonde zu der Probe gegeben werden, bevor oder nachdem die Zielsequenz auf der Matrix des Liniengeräts konzentriert ist. Folglich wird die Zielsequenz in der Probe durch Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren des Komplexes aus Nicht-Nukleinsäure-Sonde/Zielsequenz bestimmt, wenn er an der Linie, Linien oder anderen geometrischen Form konzentriert ist. Beispiel 16 dieser Beschreibung ist ein Beispiel eines Linientests. Gegebenenfalls wird das Hybrid aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz von der Matrix durch Einstellen der Bedingungen außerhalb des Bereichs, der für elektrostatisches Binden erforderlich ist, freigesetzt und dabei eine Detektion des nicht gebundenen Hybrids aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz oder nur der detektierbaren Sonde als ein Mittel zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz in der Probe ermöglicht.
(iv) Arraytestformate:
In einer Ausführungsform sind Arrays Oberflächen, an welchen zwei oder mehr Proben von Interesse jeweils an einem einmaligen Ort immobilisiert wurden. Arrays, welche Nukleinsäure umfassen, wurden in der Literatur beschrieben. Es ist ein Vorteil dieser Erfindung, dass Nukleinsäure einer Probe leicht an einer Oberfläche unter einem großen Bereich von Bedingungen elektrostatisch immobilisiert wird. Deshalb kann ein Array von Proben leicht hergestellt werden, im Allgemeinen durch nur punktförmig Auftragen (unter elektrostatischen Bindungsbedingungen) von zwei oder mehr Proben, welche Nukleinsäure enthalten, an einmaligen Orten auf einer positiv geladenen Oberfläche. Da der Ort von jeder Probe bekannt ist, können Arrays von elektrostatisch immobilisierter Nukleinsäure im Allgemeinen verwendet werden, um gleichzeitig eine oder mehr Zielsequenzen in zwei oder mehr Proben von Interesse zu detektieren, identifizieren oder quantifizieren. So kann ein Array von elektrostatisch immobilisierter Nukleinsäure in diagnostischen Verwendungen oder beim Screenen von Verbindungen nach Leitstrukturen, welche therapeutische Verwendbarkeit aufweisen könnten, nützlich sein. Ein Beispiel eines Arraytests ist Beispiel 15 dieser Beschreibung. Gegebenenfalls wird das Hybrid aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz von der Matrix durch Einstellen der Bedingungen außerhalb des Bereichs, der für elektrostatisches Binden erforderlich ist, freigesetzt und dabei eine Detektion des nicht gebundenen Hybrids aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz oder nur der detektierbaren Sonde als ein Mittel zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz in der Probe ermöglicht.
Es ist ein Vorteil dieser Erfindung, dass die Nicht-Nukleotid-Sonde nicht zur Immobilisierung der Nukleinsäure an der Arraymatrix notwendig ist. Deshalb kann die Nicht-Nukleotid-Sonde zu der einen oder mehr Proben gegeben werden, bevor oder nachdem sie elektrostatisch an der Arraymatrix immobilisiert werden.
Arrays, welche Hybride aus Nicht-Nukleotid-Sonden/Zielsequenz umfassen, weisen den zusätzlichen Vorteil auf, dass sie hoch stabil sind und nicht durch Enzyme, welche Nukleinsaure abbauen, abgebaut werden sollten. Deshalb können diese Arrays oder die Proben, welche auf die Arraymatrix aufgebracht werden, wie vorstehend im Abschnitt mit dem Titel „Verdau-/Schutztests" beschrieben behandelt werden, als ein Mittel, die Testleistung durch den Abbau von Probenkontaminanten zu verbessern. Ungeachtet dessen, ob die Probe mit dem Enzym, bevor oder nachdem sie auf die Arraymatrix aufgebracht wird, behandelt wird, ist es wichtig, dass die Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz gebildet wird, so dass die Zielsequenz gegen Abbau geschützt ist.
(v) Durchfluss- oder statische Zytometrietests:
Durchfluss- und statische Zytometrie sind für die Analyse von ganzen Zellen sowie Teilchen sehr nützlich. Da die Matrizen dieser Erfindung kugelförmig oder teilchenförmig sein können, ist diese Erfindung besonders gut für die statische oder Durchflusszytometrieanalyse von Teilchen, welche daran elektrostatisch immobilisiert Nukleinsäuren enthalten, geeignet. Gemäß dieser Erfindung wird die Nukleinsäure elektrostatisch an Teilchen oder Kügelchen immobilisiert. Eine Nicht-Nukleotid-Sonde wird zur Detektion einer Zielsequenz von Interesse, welche auf den Teilchen oder Kügelchen vorhanden ist, verwendet und kann zugegeben werden, bevor oder nachdem die Nukleinsäure immobilisiert wird. Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung des Komplexes aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz im statischen oder Durchflusszytometer wird als das Mittel zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz in der Probe von Interesse verwendet. Beispiel 13 dieser Beschreibung verwendet eine statische Quantifizierung von Fluoreszenz als das Mittel zur Quantifizierung einer Zielsequenz, welche elektrostatisch an Kügelchen immobilisiert ist. Gegebenenfalls wird das Hybrid aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz von der Matrix durch Einstellen der Bedingungen außerhalb des Bereichs, der für elektrostatisches Binden erforderlich ist, freigesetzt und dabei eine Detektion des nicht gebundenen Hybrids aus Nicht-Nukleotid- Sonde/Zielsequenz oder nur der detektierbaren Sonde als ein Mittel zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz in der Probe ermöglicht.
Beispielhafte Anwendungen unter Verwendung der Erfindung:
Da die Verfahren dieser Erfindung in einem auf Sonden basierenden Hybridisierungstest verwendet werden können, wird diese Erfindung beim Verbessern von Tests Verwendung finden, welche zum Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren der Anwesenheit oder Menge eines Organismus oder Virus in einer Probe durch die Detektion von Zielsequenzen, welche mit dem Organismus oder Virus in Zusammenhang stehen, verwendet werden (siehe: Patent der Vereinigten Staaten Nr. 5,641,631 mit dem Titel „Method for detecting, identifying and quantitating organisms and viruses", hier durch Bezugnahme aufgenommen). In ähnlicher Weise wird diese Erfindung auch in einem Test Verwendung finden, der bei der Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung von einer oder mehr Spezies eines Organismus in einer Probe verwendet wird (siehe: Patent der Vereinigten Staaten Nr. 5,288,611 mit dem Titel „Method for detecting, identifying and quantitating organisms and viruses", hier durch Bezugnahme aufgenommen). Diese Erfindung wird auch in einem Test Verwendung finden, der zur Bestimmung der Wirkung von antimikrobiellen Mitteln auf das Wachstum von einem oder mehr Mikroorganismen in einer Probe verwendet wird (siehe: Patent der Vereinigten Staaten Nr. 5,612,183 mit dem Titel „Method for determining the effect of antimicrobial agents an growth using ribosomal nucleic acid subunit subsequence specific grobes", hier durch Bezugnahme aufgenommen). Diese Erfindung wird auch in einem Test Verwendung finden, der zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge einer taxonomen Gruppe von Organismen in einer Probe verwendet wird (siehe: Patent der Vereinigten Staaten Nr. 5,601,984 mit dem Titel „Method for detecting the presence or amount of a taxonomic group of organisms using specific r-RNA subsequences as grobes", hier durch Bezugnahme aufgenommen).
Die Verfahren dieser Erfindung sind besonders für die schnelle, empfindliche, zuverlässige und vielseitige Detektion von Zielsequenzen nützlich, welche für Organismen besonders sind, die in Nahrungsmitteln, Getränken, Wasser, pharmazeutischen Produkten, Körperpflegeprodukten, Molkereiprodukten oder Umweltproben gefunden werden könnten. Die Analyse von bevorzugten Getränken schließen Selters, Wasser in Flaschen, Fruchtsaft, Bier, Wein oder Likörprodukte ein. Folglich werden die Verfahren dieser Erfindung besonders zur Analyse von Rohmaterialien, Ausrüstung, Produkten oder Verfahren, welche zur Herstellung oder Lagerung von Nahrungsmitteln, Getränken, Wasser, pharmazeutischen Produkten, Körperpflegeprodukten, Molkereiprodukten oder Umweltproben verwendet werden, nützlich sein.
Ebenso sind die Verfahren dieser Erfindung besonders für die schnelle, empfindliche, zuverlässige und vielseitige Detektion von Zielsequenzen nützlich, welche für Organismen besonders sind, die in klinischen Umgebungen gefunden werden könnten. Folglich werden die Verfahren dieser Erfindung besonders zur Analyse von klinischen Prüfkörpern oder Ausrüstung, Fixiervorrichtungen oder Produkten, welche zur Behandlung von Menschen oder Tieren verwendet werden, nützlich sein. Zum Beispiel kann der Test zur Detektion einer Zielsequenz, welche spezifisch für eine genetisch begründete Erkrankung ist oder spezifisch für eine Prädisposition für eine genetisch begründete Erkrankung ist, verwendet werden. Nichteinschränkende Beispiele von Erkrankungen schließen β-Thalassämie, Sichelzellanämie, Faktor V-Leiden, zystische Fibrose und mit Krebs in Beziehung stehende Ziele wie p53, p10, BRC-1 und BRC-2 ein.
III. Elemente der Erfindung:
Zusammensetzungen:
Eine bevorzugte Zusammensetzung, welche zur Detektion der Gegenwart einer Zielsequenz in einer Probe geeignet ist, umfasst eine Nukleinsäure mit einer Zielsequenz, welche unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen elektrostatisch an eine Matrix gebunden ist. Die Zusammensetzung umfasst ferner eine Nicht-Nukleotid-Sonde mit einer sondierenden Nukleobasensequenz, welche sequenzspezifisch an mindestens einen Teil der Zielsequenz hybridisiert ist, jedoch mit der Maßgabe, dass die Nicht-Nukleotid-Sonde nicht wesentlich an die Matrix unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen bindet, wenn die Zielsequenz an der Matrix nicht vorhanden ist. Deshalb wird die elektrostatische Immobilisierung des Komplexes aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz an der Matrix primär durch die Wechselwirkung der Nukleinsäure mit der Matrix und nicht im Wesentlichen abhängig von jedweden Wechselwirkungen der Nicht-Nukleotid-Sonde und der Matrix bestimmt.
Solche Zusammensetzungen sind für die Detektion der Anwesenheit von Zielsequenzen in Proben gut geeignet, da die Nukleinsäurekomponenten der Probe an der Matrix konzentriert werden. Darüber hinaus wird die hybridisierte detektierbare Nicht-Nukleotid-Sonde an der Matrix konzentriert, so dass die Nachweisgrenze des Tests verbessert werden kann, da die Anwesenheit der Markierung örtlich konzentriert wird und dabei im Vergleich damit, wenn sie im Massefluid verteilt ist, einfacher detektiert wird (siehe: Beispiel 12).
Verfahren:
Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung einer Zielsequenz in einer Probe, welche Nukleinsäure enthält. Ein beispielhaftes Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen einer Probe mit einer Matrix und mindestens einer Nicht-Nukleotid-Sonde, wobei die Nukleinsäure in der Probe elektrostatisch an die Matrix unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen binden wird. Zusätzlich wird die Nicht-Nukleotid-Sonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen an mindestens einen Teil der Zielsequenz, falls in der Probe vorhanden, hybridisieren. Das Verfahren umfasst ferner das Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren des Hybrids aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz als ein Mittel zum Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren der Zielsequenz in der Probe.
In noch einer anderen Ausführungsform betrifft diese Erfindung Multiplexverfahren zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung von zwei oder mehr Zielsequenzen von einem oder mehr Nukleinsäuremolekülen, welche in der selben Probe vorhanden sein können. Ein beispielhaftes Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen einer Probe mit einer Matrix und zwei oder mehr unabhängig detektierbaren Nicht-Nukleotid-Sonden, wobei die Nukleinsäure, welche in der Probe vorhanden ist, unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen an die Matrix elektrostatisch binden wird. Zusätzlich werden die zwei oder mehr unabhängig detektierbaren Nicht-Nukleotid-Sonden unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen an mindestens einen Teil der Zielsequenzen hybridisieren, wobei jede Sonde für Hybridisierung designed ist, falls in der Nukleinsäure der Probe vorhanden. Wenn eine besondere Zielsequenz elektrostatisch an der Matrix immobilisiert wird, wird folglich die unabhängig detektierbare Nicht-Nukleotid-Sonde, welche zur Hybridisierung mit dieser besonderen Zielsequenz designed ist, an der Matrix konzentriert werden und für Detektion zugänglich sein.
Deshalb umfasst das Verfahren ferner das Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren von jedem einmaligen unabhängig detektierbaren Hybrid aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz, welches elektrostatisch an die Matrix gebunden ist, als ein Mittel zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung von jeder einmaligen Zielsequenz, welche in der Probe und im selben Test detektiert werden soll. Gegebenenfalls werden die einmaligen unabhängig detektierbaren Hybride aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz von der Matrix durch Einstellen der Bedingungen außerhalb des Bereichs, der für elektrostatisches Binden erforderlich ist, freigesetzt und wird dabei eine Detektion des nicht gebundenen Hybrids aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz oder nur der detektierbaren Sonde als ein Mittel zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz in der Probe ermöglicht.
In noch einer weiteren Ausführungsform zieht diese Erfindung einen Vorteil aus der Stabilität der Komplexe aus Nukleinsäureanalogon/Nukleinsäure (siehe: Stanley et al.; US 5,861,250 ), wodurch ferner die Testleistung verbessert wird und/oder ansonsten die Arbeit oder Komplexität der Probenvorbereitung verringert werden.
Ein beispielhaftes Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen der Probe mit mindestens einer Nicht-Nukleotid-Sonde, wobei die Nicht-Nukleotid-Sonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen an mindestens einen Teil der Zielsequenz, falls in der Probe vorhanden, hybridisieren wird. Die Probe wird auch mit einer Matrix in Kontakt gebracht, wobei das Nukleinsäuremolekül unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen elektrostatisch an die Matrix binden wird. Entweder vor oder nach der Immobilisierung an der Matrix wird die Probe, welche den Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz enthält, mit einem oder mehr Enzymen in Kontakt gebracht, welche Probenkontaminanten, einschließlich das Nukleinsäuremolekül, aber nicht den Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz, abbauen können. Das Verfahren umfasst ferner das Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren des Hybrids aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz als ein Mittel zum Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren der Zielsequenz in der Probe, mit der Maßgabe, dass die Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz zunächst an der Matrix immobilisiert wird. Gegebenenfalls wird das detektierbare Hybrid aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz von der Matrix durch Einstellen der Bedingungen außerhalb des Bereichs, der für elektrostatisches Binden erforderlich ist, freigesetzt und dabei eine Detektion des nicht gebundenen Hybrids aus Nicht- Nukleotid-Sonde/Zielsequenz oder nur der detektierbaren Sonde als ein Mittel zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz in der Probe ermöglicht.
In noch einer anderen Ausführungsform betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung einer Zielsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, welches elektrostatisch an einem Ort auf einem Array immobilisiert ist, wobei der Array Nukleinsäuremoleküle, welche an einmaligen Orten elektrostatisch gebunden sind, umfasst. Ein beispielhaftes Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen des Arrays mit mindestens einer Nicht-Nukleotid-Sonde, wobei die Nicht-Nukleotid-Sonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen an mindestens einen Teil der Zielsequenz, falls auf dem Array vorhanden, hybridisieren wird. Der Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz, der elektrostatisch an einem Ort auf dem Array gebunden ist, wird dann als das Mittel zur Bestimmung der Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge der Zielsequenz, welche an dem Arrayort vorhanden ist, detektiert, identifiziert oder quantifiziert. Es ist ein Vorteil der Erfindung, dass ein oder mehr Enzyme, welche Probenkontaminanten, einschließlich das Nukleinsäurezielmolekül, aber nicht den Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz, abbauen können, auch vor der Analyse des Arrays zugegeben werden können, um dadurch die Leistung des Arraytests durch Abbau von Probenkontaminanten, welche ansonsten zu falschen positiven Ergebnissen führen könnten, zu verbessern. Gegebenenfalls können die detektierbaren Hybride aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz von der Matrix durch Einstellen der Bedingungen außerhalb des Bereichs, der für elektrostatisches Binden erforderlich ist, freigesetzt werden und wird dadurch eine Detektion des nicht gebundenen Hybrids aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz oder nur der detektierbaren Sonde als das Mittel zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz in der Probe ermöglicht. Wenn die Nicht-Nukleotid-Sonden unabhängig detektiert werden, kann die Analyse der Matrix in einem Multiplexformat ablaufen.
In noch einer weiteren Ausführungsform ist diese Erfindung auf ein Verfahren zur Detektion, Identifzierung oder Quantifizierung einer Zielsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, welches in jedweder von zwei oder mehr Proben von Interesse vorhanden sein kann, gerichtet. Das Verfahren umfasst das Mischen von jeder der zwei oder mehr Proben von Interesse mit mindestens einer Nicht-Nukleotid-Sonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen. Dann wird die Matrix unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen mit mindestens einem Teil von jeder der zwei oder mehr Proben in Kontakt gebracht, um dabei die Nukleinsäurekomponenten von jeder Probe an der Matrix jeweils an einem einmaligen Ort elektrostatisch zu immobilisieren und dabei einen Matrixarray von Proben zu erzeugen. Der Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz, der elektrostatisch an einem Ort auf dem Array gebunden ist, wird dann als das Mittel zur Bestimmung der Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge der Zielsequenz, welche an dem Arrayort vorhanden ist, detektiert, identifiziert oder quantifiziert. Es ist ein Vorteil der Erfindung, dass ein oder mehr Enzyme, welche Probenkontaminanten, einschließlich das Nukleinsäurezielmolekül, aber nicht den Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz, abbauen können, auch vor der Analyse des Arrays zugegeben werden können, um dadurch die Leistung des Arraytests durch Abbau von Probenkontaminanten, welche ansonsten zu falschen positiven Ergebnissen führen könnten, zu verbessern. Gegebenenfalls können die detektierbaren Hybride aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz von der Matrix durch Einstellen der Bedingungen außerhalb des Bereichs, der für elektrostatisches Binden erforderlich ist, freigesetzt werden und wird dadurch eine Detektion des nicht gebundenen Hybrids aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz oder nur der detektierbaren Sonde als das Mittel zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz in der Probe ermöglicht. Wenn die Nicht-Nukleotid-Sonden unabhängig detektiert werden, kann die Analyse der Matrix in einem Multiplexformat ablaufen.
Kits:
Kits, welche zur Durchführung eines Tests geeignet sind, wie hier beschrieben, welche die Anwesenheit, Abwesenheit oder Anzahl von Zielsequenzen in einer Probe detektieren, umfassen eine Matrix und eine oder mehr Nicht-Nukleotid-Sonden und andere Reagenzien oder Zusammensetzungen, welche ausgewählt sind, um einen Test durchzuführen oder um anderweitig die Durchführung eines Tests zu vereinfachen, der zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung einer Zielsequenz in einer Probe verwendet wird. Geeignete Nicht-Nukleotid-Sonden, Matrizen und Verfahren wurden hier vorstehend beschrieben. Typischerweise wird der Kit eine Nicht-Nukleotid-Sonde, eine Matrix und ein oder mehr Reagenzien oder Puffer zum Festlegen der elektrostatischen Bindungsbedingungen und/oder Hybridisierungsbedingungen umfassen.
Ein bevorzugter Kit wird mindestens zwei unabhängig detektierbare Nicht-Nukleotid-Sonden umfassen, so dass die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge von jeder unabhängig detektierbaren Einheit zur eindeutigen Identifizierung oder Quantifizierung von jeder der mindestens zwei Zielsequenzen, welche in einer Probe vorhanden sein können, im selben Test (ein Multiplextest) verwendet werden kann. In einem bevorzugten Beispiel wird der Kit zwei oder mehr Nicht-Nukleotid-„Beacon"-Sonden umfassen. Bevorzugt wird der Kit zur Durchführung eines selbstanzeigenden Multiplextests wie eines selbstanzeigenden PCR-Tests nützlich sein.
3. Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
Die 1A und 1B sind von einem Computer erzeugte Negative des Bildes einer Fotografie von Röhrchen eines Experiments unter Verwendung von PCR zur Amplifizierung einer Nukleinsäure, welche eine Zielsequenz umfasst, an welche eine lineare Beacon hybridisiert, wobei ein detektierbares Signal erzeugt wird.
Die 2A und 2B sind von einem Computer erzeugte Negative des Bildes einer Fotografie des selben Polyacrylamidgels, welches zur Analyse des Inhalts der Röhrchen verwendet wurde, die in den 1A und 1B gezeigt sind, vor (2A) und nach (2B) Ethidiumbromid-Anfärbung.
3 ist ein von einem Computer erzeugtes Negativ eines Bildes einer Fotografie von Röhrchen eines Experiments unter Verwendung von PCR zur Erzeugung von unterschiedlichen Amplikonen mit einer Punktmutation einer Zielsequenz, an welche eine lineare Beacon hybridisiert, wobei ein detektierbares Signal erzeugt wird.
Die 4A und 4B sind von einem Computer erzeugte Negative eines Bildes einer Fotografie des selben Polyacrylamidgels, welches zur Analyse des Inhalts der Röhrchen verwendet wurde, die in der 3 gezeigt sind, vor (4A) und nach (4B) Ethidiumbromid-Anfärbung.
5 ist ein von einem Computer erzeugtes Negativ eines Bildes einer Fotografie von Röhrchen eines Experiments, welches zur Bestimmung des Bereichs der Ionenstärke, die für elektrostatische Immobilisierung von Sonden, Zielnukleinsäuren und Komplexen aus Sonde/Zielnukleinsäure geeignet ist, verwendet wurde.
Die 6A und 6B sind Bilder des selben GAPS-überzogenen Objektträgers, der punktförmige Proben enthält, vor (6A) und nach (6B) dem Waschen, um Material zu entfernen, welches ansonsten nicht elektrostatisch immobilisiert ist.
Durch das Beschreiben der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird nun für den Fachmann ersichtlich werden, dass andere Ausführungsformen, welche die hier beschriebenen Konzepte berücksichtigen, verwendet werden können. Es gilt deshalb als vereinbart, dass diese Ausführungsformen nicht auf offenbarte Ausführungsformen eingeschränkt sein sollen, sondern vielmehr nur durch den Geist und Umfang der folgenden Patentansprüche eingeschränkt sein sollen.
Arten zur Durchführung der Erfindung:
Diese Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, mit welchen nicht beabsichtigt ist, in irgendeiner Weise einschränkend zu sein.
Beispiel 1: Synthese von DNA-Oligonukleotiden zur Untersuchung;
Für diese Untersuchung wurden markierte oder markierte DNA-Oligonukleotide, welche als Sonden oder als Nukleinsäuren geeignet sind, die eine Zielsequenz umfassen, entweder unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Reagenzien und Gerätschaften synthetisiert oder von kommerziellen Anbietern erhalten. Alle DNAs wurden in gereinigter Form erhalten oder unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren gereinigt. Die Sequenzen der hergestellten DNA-Oligonukleotide sind in Tabelle 1 nachstehend gezeigt. Verfahren und Zusammensetzungen für die Synthese und Reinigung von synthetischen DNAs sind dem Fachmann bekannt.
Beispiel 2: Synthese von N-α-(Fmoc)-N-ε-(NH₂)-L-Lysin-OH
Zu 20 mMol N-α-(Fmoc)-N-ε-(t-boc)-L-Lysin-OH wurden 60 ml 2/1 Dichlormethan (DCM)/Trifluoressigsäure (TFA) gegeben. Man ließ die Lösung rühren, bis die tert-Butyloxycarbonyl (t-boc)-Gruppe vollständig von dem N-α-(Fmoc)-N-ε-(t-boc)-L-Lysin-OH entfernt worden war. Die Lösung wurde dann zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde wieder in 15 ml DCM gelöst. Dann wurde ein Versuch zur Fällung des Produkts durch tropfenweise Zugabe der Lösung zu 350 ml Ethylether durchgeführt. Da das Produkt als Öl anfiel, wurde der Ethylether abdekantiert und das Öl wurde unter hohes Vakuum gesetzt, wobei ein weißer Schaum erhalten wurde. Der weiße Schaum wurde in 250 ml Wasser gelöst und die Lösung wurde durch Zugabe von gesättigter Natriumphosphat (zweibasisch) auf einen pH-Wert von 4 neutralisiert. Ein weißer Feststoff wurde gebildet und durch Vakuumfiltration gesammelt. Das Produkt wurde in einem Vakuumofen bei 35 bis 40°C über Nacht getrocknet. Ausbeute 17,6 mMol, 88%.
Beispiel 3: Synthese von N-α-(Fmoc)-N-ε-(dabcyl)-L-Lysin-OH
Zu 1 mMol N-α-(Fmoc)-N-ε-(NH₂)-L-Lysin-OH (Beispiel 2) wurden 5 ml N,N'-Dimethylformamid (DMF) und 1,1 mMol TFA gegeben. Diese Lösung ließ man rühren, bis sich die Aminosäure vollständig gelöst hatte.
Zu 1,1 mMol 4-((4-(Dimethylamino)phenyl)azo)benzoesäuresuccinimidylester (Dabcyl-NHS, Molecular Probes, P/N D-2245) wurden 4 ml DMF und 5 mMol Diisopropylethylamin (DIEA) gegeben. Zu dieser gerührten Lösung wurde tropfenweise die N-α-(Fmoc)-N-ε-(NH₂)-L-Lysin-OH-Lösung, welche wie vorstehend beschrieben hergestellt worden war, gegeben. Man ließ die Umsetzung über Nacht rühren und wurde dann aufgearbeitet.
Das Lösungsmittel wurde vakuumabgedampft und der Rückstand wurde in 50 ml DCM und 50 ml 10%iger wässriger Zitronensäure aufgeteilt. Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht wurde mit wässriger Natriumbicarbonat und wieder mit 10%iger wässriger Zitronensäure gewaschen. Die organische Schicht wurde dann mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem orangefarbenen Schaum eingedampft. Der Schaum wurde in Acetonitril (ACN) kristallisiert und die Kristalle wurden durch Vakuumfiltration gesammelt. Ausbeute 0,52 mMol, 52%.
Beispiel 4: Synthese des N-α-(Fmoc)-N-ε-(dabcyl)-L-Lysin-PAL-Peg/PS-Syntheseträgers
Das N-α-(Fmoc)-N-ε-(dabcyl)-L-Lysin-OH (Beispiel 2) wurde zur Herstellung eines Syntheseträgers, der zur Herstellung von C-terminalen dabcylierten PNAs nützlich ist, ver wendet. Die Fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)-Gruppe von 0,824 g des kommerziell erhältlichen Fmoc-PAL-Peg-PS-Syntheseträgers (PerSeptive Biosystems, Inc.; P/N GEN913384) wurde durch Behandlung mit 20% Piperidin in DCM für 30 Minuten in einem Durchflussgefäß entfernt. Der Träger wurde dann mit DCM gewaschen. Schließlich wurde der Träger mit DMF gewaschen und mit einem Argon-Spülstrom getrocknet.
Eine Lösung, welche 0,302 g N-α-(Fmoc)-N-ε-(dabcyl)-L-Lysin-OH, 3,25 ml DMF, 0,173 g [O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HATU), 0,101 ml DIEA und 0,068 ml 2,6-Lutidin enthielt, wurde durch aufeinanderfolgende Kombination der Reagenzien hergestellt. Diese Lösung wurde dann zu dem gewaschenen Syntheseträger gegeben und man ließ für 2 Stunden umsetzen. Die Lösung wurde dann durch das Gefäß mit einem Argon-Strom gespült und der Träger wurde aufeinanderfolgend mit DMF, DCM und DMF gewaschen. Das Harz wurde dann mit einem Argon-Strom getrocknet.
Der Träger wurde dann mit 5 ml kommerziell erhältlichem PNA-Standardcappingreagenz (PerSeptive Biosystems, Inc., P/N GEN063102) behandelt. Das Cappingreagenz wurde dann aus dem Gefäß gespült und der Träger wurde mit DMF und DCM gewaschen. Der Träger wurde dann mit einem Argon-Strom getrocknet. Schließlich wurde der Syntheseträger unter hohem Vakuum getrocknet.
Die Endbeladung des Trägers wurde durch Analyse der Fmoc-Beladung von drei Proben von ungefähr 6 bis 8 mg bestimmt. Die Analyse bestimmte die Beladung als ungefähr 0,145 mMol/g.
Dieser Syntheseträger wurde in eine leere PNA-Synthesesäule gepackt, wenn notwendig, und zur Herstellung von PNA-Oligomeren mit einer C-terminalen dabcyl-Quencheinheit, welche an das PNA-Oligomer durch die ε-Aminogruppe der C-terminalen L-Lysin-Aminosäure gebunden ist, verwendet.
Beispiel 5: Synthese von PNA
PNAs wurden unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Reagenzien und Gerätschaften, welche von PerSeptive Biosystems, Inc. erhalten worden waren, hergestellt. Dop pelkupplungen wurden oft durchgeführt, um sicher zu stellen, dass das Rohprodukt eine akzeptable Reinheit aufwies. Die Reinheit der fertigen PNAs wurde durch Umkehrphasenchromatographie-Standardverfahren bestimmt und die Identität der PNA wurde durch Vergleich von theoretischen berechneten Massen mit Ergebnissen einer Masseanalyse unter Verwendung eines MALDI-TOF-Massenspektrometers bestätigt.
PNAs, welche eine C-terminale dabcyl-Einheit aufweisen, wurden durch Durchführen der Synthese unter Verwendung des dabcyl-Lysin-modifizierten Syntheseträgers, der wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt worden war, hergestellt. PNAs, welche eine N-terminale Fluorescein-Einheit aufweisen, wurden mit den geeigneten Markierungsreagenzien und Linkern (wenn erforderlich) vor der Abspaltung von dem Syntheseträger behandelt (siehe: Beispiel 6). Mehrere Verfahren sind zum Markieren eines PNA-Oligomers mit Fluorescein verfügbar, aber das vom Anmelder bevorzugte Verfahren wird in Beispiel 6 beschrieben. PNAs, welche eine Cy3-Markierung (Amersham) umfassen, wurden von dem Syntheseträger abgespalten und unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren vor dem Cy3-Markieren, wie in Beispiel 7 beschrieben, HPLC-gereinigt.
Beispiel 6: Bevorzugtes Verfahren zum Markieren von trägergebundener PNA mit 5(6)-Carboxyfluorescein
Nach einer geeigneten Umsetzung mit Linkem und einer Entfernung der terminalen Amin-Schutzgruppe wurde das Harz mit 250 μl einer Lösung, welche 0,5 M 5(6)-Carboxyfluorescein, 0,5 M N,N'-Diisopropylcarbodiimid, 0,5 M 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol (HOAt) in DMF enthielt, behandelt (siehe: Weber et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 8: 597–600 (1998)). Nach der Behandlung wurde der Syntheseträger gewaschen und unter hohem Vakuum getrocknet. Das PNA-Oligomer wurde dann abgespalten, entschützt und gereinigt.
Beispiel 7: Allgemeines Verfahren zum Cy3-Markieren von PNAs
Die gereinigte Amin-enthaltende PNA wurde in 1/1 DMF/Wasser bei einer Konzentration von ungefähr 0,05 OD/μl gelöst, um eine PNA-Vorratslösung herzustellen. Von dem Vorrat wurden ungefähr 30 nMol PNA in ein Röhrchen gegeben. In dieses Röhrchen wurden dann 125 μl 0,1 M HEPES (pH-Wert 8,5) und ausreichend 1/1 DMF/Wasser gegeben, um das Gesamtvolumen auf 250 μl zu bringen. Diese Lösung wurde gründlich gemischt. Zu einem abgepackten Röhrchen mit Cy3-Farbstoff (Amersham) wurde die gesamte 250 μl-Lösung, welche wie vorstehend beschrieben hergestellt worden war, gegeben. Das Röhrchen wurde gut gemischt und dann ließ man für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur umsetzen.
Nach der Umsetzung wurde das Lösungsmittel in einer Speed-vac durch Abdampfen entfernt. Das Pellet wurde dann in 400 μl einer Lösung, welche 3:1 1%ige wässrige TFA/ACN enthielt, gelöst. Gegebenenfalls wurde die Lösung dann in eine 5000 MW-Ultrafree (Millipore, P/N UFC3LCC25) oder eine 3000 MW (Amicon, P/N 42404) überführt und filtriert, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Das gewonnene Produkt wurde dann unter Verwendung von herkömmlichen Umkehrphasenchromatographieverfahren wieder gereinigt.
Allgemeine Erörterung der Beispiele 8 bis 12:
Die folgenden Beispiele wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob die Anwesenheit von Zielnukleinsäuren, welche an Polyethylenimin(PEI)-derivatisierten Kügelchen elektrostatisch gebunden wurden, spezifisch unter Verwendung von markierten PNA-Sonden detektiert werden kann, wobei die markierte (neutrale) PNA in der Abwesenheit der Zielnukleinsäure nicht an den Kügelchen immobilisiert wird, aber hybridisiert und deshalb an den Kugelchef immobilisiert wird, wenn die Zielnukleinsäure vorhanden ist. Diese Experimente zeigen eine Verwendung, welche in einzigartiger Weise für PNA-Sonden geeignet ist, da sie ein neutrales Rückgrad aufweisen, aber nichtsdestoweniger an Nukleinsäuren mit Sequenzspezifität hybridisieren.
Mit Hilfe der Erörterung und Beispiele, welche hier beschrieben werden, wird der Fachmann erkennen, dass positiv geladene Matrizen, welche verschieden von jenen sind, die mit PEI überzogen sind, für die Praxis der hier beschriebenen Erfindung geeignet sind. In ähnlicher Weise wird der Fachmann erkennen, dass alle Arten von Matrizen oder Trägern, welche verschieden von Kügelchen sind, für die Praxis dieser Erfindung geeignet sind. Schließlich wird der Fachmann auch erkennen, dass die Nicht-Nukleotid-Sonden, welche für die Praxis dieser Erfindung geeignet sind, momentane (z. B. PNA) und zukünftige Konstrukte, welche sequenzspezifisch mit Nukleinsäure Wechselwirken und welche unter Bedingungen, wobei eine Nukleinsäure elektrostatisch an eine geladene Matrix binden wird, entweder neutral oder positiv geladen sind, einschließen.
Alle Oligodeoxynukleotide sind vom 5' zum 3' gezeigt. Vorratslösungen der Oligodeoxynukleotide wurden im Allgemeinen durch Lösen des trockenen Pulvers in TE-Puffer (TE-Puffer: 10 mM TRIS pH-Wert 8,3, 1 mM EDTA) hergestellt.
Materialien:
PEI-Kieselgel-Kügelchen (Gel) Amicon P/N PAE-300-15
HP-Sepharose Q-Kügelchen Pharmacia Biotech P/N 17-1014-03
Kommerziell erhältliche PEI-derivatisierte Kügelchen wurden für diese Experimente gewählt, da sie leicht verfügbar waren, als gut charakterisierte kommerzielle Anionenaustauschchromatographie-Packungsmaterialien mit einer hohen Dichte an positiv geladenen funktionellen Gruppen pro Flächeneinheit bei neutralem pH-Wert (pH-Wert 7). Da sie eine hohe Dichte an positiv geladenen funktionellen Gruppen bei neutralem pH-Wert aufweisen, weisen sie ein vorteilhaftes Bindungsvermögen für Oligonukleotide, welche bei neutralem pH-Wert negativ geladen sind, auf (da jeder Phosphodiester eine einzelne negative Ladung umfasst, ist die Ladung von jeder Nukleinsäure längenabhängig).

Es wurde bestimmt, dass PEI-Kieselgel- und PEI-Sepharose-Kügelchen in allen durchgeführten Experimenten im Wesentlichen austauschbar waren. Jedoch wurde gefunden, dass die PEI-Kieselgel-Kügelchen eine intrinsische (native) Fluoreszenz aufweisen, wenn sie auf dem UV-Transilluminator beleuchtet werden, und dass sie aus diesem Grund in manchen Anwendungen weniger geeignet sein können. Tabelle 2: PNA-Sonden

Beschreibung	PNA-Sequenz
WT-15Flu	Flu-OO-ACG-CCA-CCA-GCT-CCA-NH₂
MU-15Flu	Flu-OO-ACG-CCA-CAA-GCT-CCA-NH₂
MU-15-Blocker	H₂N-OO-ACG-CCA-CAA-GCT-CCA-NH₂
BK.RAS-Cy3	Cy3-O-ACG-CCA-CCA-GCT-CCA-K(dabcyl)-NH₂
UQ-Cy3	Ce-OO-TGqA-TTG-CGA-ATG-K(Cy3)-NH₂
RASWT-Cy3	Cy3-OOE-ACG-CCA-CCA-GCT-CCA-E-NH₂
BioP-15	Ac-OE-TTA-TAC-TGC-TAG-CCT-EO-K(Bio)-NH₂

Alle PNA-Sequenzen sind vom Amin- zum Carboxylterminus geschrieben. Abkürzungen sind: Ac = Acetyl; Flu = 5(6)-Carboxyfluorescein; dabcyl = 4-((4-(Dimethylamino)phenyl)azo)benzoesäure; Bio = Biotin; O = 8-Amino-3,6-dioxaoctansäure; K = die Aminosäure L-Lysin; E = das Löslichkeitsverbesserungsmittel „4" wie in Gildea et al., Tett. Lett. 39 (1998) 7255–7258 dargestellt; Ce = die Gruppe, welche durch Capping der PNA mit der geladenen Einheit „7" wie in Gildea et al., Tett. Lett. 39 (1998) 7255–7258 dargestellt erhalten wird und Cy3 = der Cyanin 3-Farbstoff von Amersham. Vorratslösungen von PNAs werden im Allgemeinen durch Lösen der gereinigten Sonde in einer Lösung, welche 1/1 N,N'-Dimethylformamid (DMF)/Wasser in einer Konzentration von ungefähr 0,05 OD (260 nm) pro μl enthält, hergestellt.
DNA-Plasmid-Template:
Die Plasmide, pKRASMU(31) und pKRASWT, wurden als Template in PCR-Amplifikationsreaktionen verwendet und wurden durch Klonieren eines PCR-Amplikons von humaner DNA in das pCR2.1-Plasmid (Invitrogen) erzeugt. Die mutante humane DNA wurde aus einer Zelllinie, Calu-1, welche eine Punktmutation bei der Base 129 des K-ras-Gens enthält, hergestellt. Die humane Wildtyp-DNA wurde aus einer Zelllinie, NCI, welche zwei Kopien des K-ras-Wildtypgens enthält, hergestellt. Klone wurden durch Restriktionsfragmentanalyse und Sequenzanalyse gescreent. Große Zubereitungen des Plasmids wurden unter Verwendung von Standardtechniken erzeugt und quantifiziert. Die amplifizierte Region flankiert die K-ras-Mutation und wies eine Länge von 111 bp auf.
Die Position und Sequenz der Punktmutation der Amplikone sind in Klammern gezeigt.

Plasmid pBR322 wurde von New England BioLabs, P/N 300-3S erhalten. Tabelle 3: Salzpuffer:

Puffer-ID	Pufferkomponenten:
A	0 mM NaCl, 10 mM TRIS-Cl pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA, 0,1% Tween-20.
B	100 mM NaCl, 10 mM TRIS-Cl pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA, 0,1% Tween-20.
C	200 mM NaCl, 10 mM TRIS-Cl pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA, 0,1% Tween-20.
D	300 mM NaCl, 10 mM TRIS-Cl pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA, 0,1% Tween-20.
E	400 mM NaCl, 10 mM TRIS-C1 pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA, 0,1% Tween-20.
F	500 mM NaCl, 10 mM TRIS-Cl pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA, 0,1% Tween-20.

Elektrophoresezuführungen:

10 bis 20% Polyacrylamidgel:	ESA, Katalog Nr. 80-0015
10X Gelpuffer:	ESA, Katalog Nr. 80-0132
4X Beladungsfarbstoff:	50% Glycerin, 0,1 M Bromphenolblau, 0,01 M Xylencyanol, 4X ESA Gelpuffer (verdünnt von ESA Nr. 80-0132)

Beispiel 8: Allgemeine Eigenschaften von Polyethylenimin(PEI)-Kügelchen
Polyethvlenimin(PEI)-Kügelchen wurden untersucht, um physikalische Charakteristika wie Teilchengröße und -gestalt sowie chemische Eigenschaften wie Nukleinsäure-Bindungskapazität zu bestimmen. Teilchengröße und -konzentration der Kügelchen, suspendiert pro Volumeneinheit, wurden unter Verwendung einer Zählkammer (Hausser Scientific; Horsham, PA; Modell Nr. 3900) bestimmt.
Es wurde unter Verwendung der Zählkammer gefunden, dass die Sepharose-Kügelchen im Allgemeinen eine kugelförmige Gestalt aufweisen und einen Durchmesser im Bereich von ungefähr 20 bis 50 um mit einem abgeschätzten mittleren Durchmesser von 30 um haben. Die Konzentration der suspendierten Sepharose-Kügelchen wurde als ungefähr 50.000 Kügelchen/μl, nachdem gewaschen (nach den Anweisungen des Herstellers) und in deionisiertem Wasser wieder gelöst worden war, abgeschätzt.
Es wurde unter Verwendung der Zählkammer gefunden, dass die Kieselgel-Kügelchen im Allgemeinen auch eine kugelförmige Gestalt aufweisen und einen Durchmesser im Bereich von ungefähr 5 bis 15 μm mit einem abgeschätzten mittleren Durchmesser von ungefähr 10 μm haben. Die Konzentration der suspendierten Kieselgel-Kügelchen wurde als ungefähr 150.000 bis 200.000 Kügelchen/μl, nachdem gewaschen (nach den Anweisungen des Herstellers) und in deionisiertem Wasser wieder gelöst worden war, abgeschätzt.
Das Vermögen der Kiesegel- und Sepharose-Kügelchen zum Binden von Nuldeinsäure wurde in 100 mM TRIS-HCl pH-Wert 7,5 untersucht. Die Kapazität der Sepharose-Kügelchen wurde als etwa 0,75 OD₂₆₀ Nukleinsäure pro μl Kügelchen oder ungefähr 1,1 E-5 OD₂₆₀ Nukleinsäure pro Kügelchen angenähert. Die Kapazität der Kieselgel-Kügelchen wurde durch den Anmelder als etwa 0,4 OD₂₆₀ Nukleinsäure pro μl Kügelchen oder ungefähr 0,8 E-6 OD₂₆₀ Nukleinsäure pro Kügelchen angenähert. Für alle durchgeführten Experimente waren diese Bindungskapazitäten hoch genug, so dass erwartet wurde, dass die gesamte Nukleinsäure der Probe an den Träger elektrostatisch gebunden war, der durch die Menge der in dem Test vorhanden Matrix und die verwendeten elektrostatischen Bindungsbedingungen gegeben war.
Beispiel 9: Voruntersuchungen über [Salz] und pH-Wert:
Wie vorstehend erörtert, sind die Kieselgel- und Sepharose-Kügelchen kommerziell erhältliche Anionenaustauschchromatographiemedien. Da Anionenaustauschchromatographie oft einen Salzgradienten oder pH-Wert-Gradienten verwendet, um Materialien zu eluieren, welche elektrostatisch daran gebunden sind, wurde die Wirkung einer Modulierung der Salzkonzentration und einer pH-Wert-Variation auf die Bindung von PNA- und/oder DNA-Sonden an Sepharose-Kügelchen untersucht, um geeignete elektrostatische Bindungsbedingungen für anschließendes Experimentieren zu bestimmen.
i. [Salz]
Zu einzelnen Röhrchen, welche 5 μl Sepharose-Kügelchen und 94 μl von einer von jeder von sechs Salzlösungen (Salzpuffer A bis F, siehe: Tabelle 3, vorstehend) enthielten, wurden 5 pMol (in 1 μl eines geeigneten Lösungsmittels) von entweder DNA WT-15Flu (Tabelle 1)- oder PNA WT-15Flu (Tabelle 2)-Sonde gegeben. Die Röhrchen wurden gevortext, kurz zentrifugiert und dann unter UV-Licht untersucht, um zu bestimmen, ob die fluoreszent markierten Sonden noch überwiegend in Lösung waren oder ob sie auf der Oberfläche der Kügelchen adsorbiert worden waren.
Es wurde gefunden, dass die PNA-Sonde (PNA WT-15Flu, Tabelle 2) überwiegend an den Kügelchen adsorbiert war, als sie in den Salzpuffern A und B war, aber überwiegend in Lösung war, als alle Puffer mit höherer Salzkonzentration verwendet wurden. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Fluorescein-markierte PNA-Sonde nur bei niedriger Ionenstärke (ungefähr 200 mM NaCl oder niedriger) an die Kügelchen binden wird.
Es wurde durch Vergleich gefunden, dass die Fluorescein-markierte DNA-Sonde (DNA WT-15Flu, Tabelle 1) mit identischer Untereinheitlänge und Nukleobasensequenz im Wesentlichen an den Kügelchen adsorbiert war, außer als Puffer F verwendet wurde. In Puffer F wurde ein Teil der Sonde in der Lösung beobachtet. Diese Daten zeigten, dass mindestens 500 mM NaCl erforderlich waren, um die elektrostatischen Wechselwirkungen der 15-mer DNA-Sonde und des PEI auf der Oberfläche zu stören, um dabei die Sonde von der Matrix freizusetzen.
Obwohl der Unterschied von 200 mM NaCl zur Freisetzung des PNA 15-mers im Vergleich mit 500 mM für die Freisetzung des DNA 15-mers im Wesentlichen ausreichend war, um für die Praxis von vielen Ausführungsformen dieser Erfindung nützlich zu sein, war die Anforderung von 200 mM NaCl zur Freisetzung der PNA-Sonde von der PEI-Oberfläche überraschend und forderte deshalb zu einer anschließenden Untersuchung auf. Durch weitere Analyse wurde bestimmt, dass die Anwesenheit der Fluorescein-Markierung (5(6)-Carboxyfluorescein), welche zwei negative Ladungen bei einem neutralen pH-Wert aufweist, der Hauptgrund für die starken elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen der PNA-Sonde und den PEI-derivatisierten Kügelchen ist.
Als Beispiel wurde ein Cy3-markiertes PNA 15-mer (UQ-Cy3, Tabelle 2), welches eine positiv geladene Cappinggruppe umfasste, in den in Tabelle 3 vorstehend aufgelisteten Salzpuffern untersucht. Es wurde gefunden, dass die Cy3-markierte PNA sogar in Salzpuffer A nicht an die Kügelchen band. Darüber hinaus wurde gefunden, dass freies Fluorescein in Salzpuffer A im Wesentlichen an den Kügelchen adsorbiert war, wogegen dies der Cy3-Farbstoff nicht tat. Schließlich wurde bestimmt, dass 1 μl der Sepharose-Kügelchen bis zu 5 pMol 5(6)-Carboxyfluorescein adsorbieren konnten, wenn in Salzpuffer A. Folglich schlagen diese Daten vor, dass es die Fluorescein-Markierung und nicht der PNA-Teil des Oligomers war, welche die stärkere Wechselwirkung mit den PEI-derivatsierten Kügelchen in den Salzpuffern A und B zeigte. So nimmt man an, dass natives PNA im Wesentlichen nicht elektrostatisch an das PEI, sogar unter niedrigen Salzkonzentrationen (z. B. Salzpuffer A), bindet. Dies steht mit den Erwartungen im Einklang, da PNA neutral ist und deshalb nicht erwartet werden sollte, dass es elektrostatisch an die PEI-derivatisierten Kügelchen bindet.
ii. pH-Wert-Wirkungen;
Da die Nettoladung des PNA-Rückgrads bei einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 10 sich nicht stark verändern sollte, wurde die Wirkung einer Modulierung des pH-Werts auf die Bindung von PNA an PEI-derivatisierten Kügelchen nicht untersucht. Jedoch wurde die pH-Wert-Abhängigkeit der DNA-Bindung an PEI-derivatisierten Kieselgel-Kügelchen untersucht, um Arbeitsparameter für anschließendes Experimentieren zu bestimmen. Die Ergebnisse der Experimente können wie folgt zusammengefasst werden: bei einem pH-Wert von 7,3 blieb die WT-15Flu DNA-Sonde an den Kieselgel-Kügelchen bis zu 0,8 M NaCl gebunden, wogegen bei einem pH-Wert von 8,3 die gleiche Sonde nicht an die Kügelchen bei NaCl-Konzentrationen von über 0,1 M band.
Diese Ergebnisse können mit der Anzahl der erwarteten positiv geladenen funktionellen Gruppen des PEI-Trägers korreliert werden. Die höhere Kapazität bei einem pH-Wert von 7,3 zeigt, dass der Träger unter diesen Bedingungen stärker geladen ist (höhere Ladungsdichte). Jedoch nähert sich bei einem pH-Wert von 8,3 der pH-Wert der Lösung dem pK-Wert des sekundären Amins des PEI an und deshalb beginnt das Neutralisiertwerden des Trägers (we niger positive Ladungen pro Flächeneinheit). Mit weniger positiven Ladungen weist jedes Kügelchen eine niedrigere Affinität für die negativ geladenen Oligodeoxynuldeotide auf. Deshalb ist weniger Salz erforderlich, um die elektrostatischen Wechselwirkungen zu stören und dadurch die DNA in die Lösung freizusetzen.
Beispiel 10: Voruntersuchung von Hvbridbildung von immobilisierter DNA
Eine Untersuchung wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob eine Hybridisierung der PNA-Sonden mit Nukleinsäure, welche auf der Oberfläche der Sepharose-Kügelchen elektrostatisch immobilisiert wurde, stattfindet. Für dieses Experiment ließ man 1 pMol der MU-15Flu PNA-Sonde mit 0,5 pMol der KRASMU(31)-Ziel-DNA, welche entweder frei in Lösung oder an Sepharose-Kügelchen elektrostatisch gebunden war (1 μl einer 1:10-Verdünnung des Kügelchenvorrats in Puffer E), hybridisieren. „nur PNA" (Sonde)- und „nur DNA" (Zielsequenz)-Kontrollen wurden auch untersucht. Die Hybridisierungsreaktionen ließ man für ungefähr 2 Minuten ablaufen, worauf 1 μl der 1:10-Verdünnung des Kügelchenvorrats zu der Probe, welche anfänglich keine Sepharose-Kügelchen enthielt, gegeben wurde.
Die Hybridisierungsreaktionsinhalte wurden dann in einzelne Kapillarpipetten aufgesaugt, von welchen die Flüssigkeit abgesaugt wurde, wobei die Kügelchen und jedwede gebundenen und fluoreszent markierten Hybride aus PNA/DNA zurückgelassen wurden. Es wurde gefunden, dass die „nur PNA"- und „nur DNA"-Kontrollen unter UV-Licht nicht fluoreszent waren. Jedoch waren nach visueller Untersuchung beide der PNA/DNA-Hybridisierungsreaktionen gleich fluoreszent. Folglich zeigen diese Daten, dass die PNA mit nahezu äquivalenter Wirksamkeit an sowohl die DNA, welche elektrostatisch an Sepharose-Kügelchen immobilisiert ist, als auch an die DNA, welche frei in Lösung ist, hybridisieren kann.
Beispiel 11: Wirksamkeit des elektrostatischen Einfangens und Freisetzens
Eine Untersuchung wurde durchgeführt, um die Wirksamkeit des elektrostatischen Einfangens und Freisetzens von Nukleinsäure bei sehr niedrigen Nukleinsäurekonzentrationen zu bestimmen. Da die Menge an Nukleinsäure sehr niedrig war, wurde die Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Quantifizierung der eingefangenen und gewonnenen Nukleinsäure verwendet. Das Plasmid pBR322 (New England Biolabs; PN/P/N 300-3S) wurde in Konzentrati onen im Bereich von 5 E + 11 bis 5 E + 5 Molekülen (ungefähr 1 Attomol) pro Mikroliter verwendet.
Plasmid-DNA wurde über einen Zeitraum von 5 Minuten unter Verwendung von 1 μl PEI-Kieselgel-Kügelchen in 20 μl 100 mM TRIS-HCl pH-Wert 7,6 eingefangen. Nach dem Einfangen wurden die Proben durch Zentrifugation pelletiert, die Überstände wurden entfernt und die Kügelchen wurden mit 1000 μl 100 mM TRIS-HCl pH-Wert 7,6 gewaschen, um nicht spezifisch gebundenes Material zu entfernen. Die Plasmid-DNA wurde dann von den Kügelchen durch Behandlung mit 10 μl eines Puffers mit viel Salz, der 2 M NaCl und 100 mM IRIS-HCl pH-Wert 7,6 enthielt, freigesetzt. Ein Mikroliter von jedem Kügelcheneluat wurde dann zu 99 μl 100 mM TRIS-HCl pH-Wert 7,6 gegeben, um die NaCl-Konzentration auf einen Level, welcher für PCR akzeptabel ist, zu verdünnen. Zwei Mikroliter von jeder verdünnten Probe wurden dann zu einer 50 μl-PCR-Reaktion gegeben.
Zusätzlich enthielt jede PCR-Reaktion auch 5 pMol pBR322-5'-Primer, 5 pMol pBR322-3'-Primer, 3 mM MgCl₂, 250 μM NTPs, 2,0 Einheiten AmpliTaq DNA-Polymerase, 50 mM KCl und 10 mM Tris-HCl pH-Wert 8,3 (PCR-Reagenzien, welche 10X Puffer, Magnesiumchlorid-Lösung, AmpliTaq DNA-Polymerase und Nukleotidtriphosphate einschlossen, wurden von Perkin-Elmer, Foster City, CA erhalten). Die Umsetzungen wurden in Eppendorf-Miniröhrchen unter Verwendung eines 2400 Thermocyclers von Perkin-Elmer durchgeführt. Das PCR-Protokoll bezog eine 20 Sekunden-Aufwärmung auf 95°C (nur 1. Runde), gefolgt von Denaturieren bei 95°C für 20 Sekunden, Annealing bei 56°C für 20 Sekunden und Extension bei 74°C für 20 Sekunden ein. Der Denaturierungs-Annealing-Extensions-Zyklus wurde 30 Zyklen wiederholt, gefolgt von einem Extensionsendschritt bei 74°C für 5 Minuten.
Man ließ alle Proben nach der PCR auf einem Polyacrylamidgel laufen und alle enthielten detektierbare Levels des Amplikons mit korrekter Größe, obwohl die am stärksten verdünnte Probe (5 E + 5 eingebrachte Moleküle) kaum detektierbar war. Die Menge an DNA in der PCR-Reaktion war tatsächlich aufgrund der Verdünnung, welche zur Entfernung von Salz notwendig war, wie vorstehend beschrieben, 500-fach niedriger (1 E + 3 Moleküle). In einem Kontrollexperimentlauf zur selben Zeit waren 1 E + 3 Moleküle die Nachweisgrenze von pBR322 durch 30 PCR-Zyklen. Diese Ergebnisse schlagen vor, dass bei 5 E + 5 Molekülen eingebrachtes Templat die Hauptmenge der Plasmid-DNA, welche anfänglich zur Matrix gegeben wurde, eingefangen und freigesetzt wurde.
Beispiel 12: Selbstanzeigende PCR-Tests
Selbstanzeigende Tests und Tests in geschlossenen Röhrchen werden aufgrund ihrer Fähigkeit zur Verallgemeinerung, Vereinfachung und möglicherweise Automatisierung von Nukleinsäureanalyseroutinetests zunehmend populärer. Auch verhindern Tests in geschlossenen Röhrchen eine Übertragungskontamination zwischen Proben, was eine Hauptquelle von falschen positiven Ergebnissen bei Nukleinsäurediagnostika ist. Da die Konzentration an detektierbaren Einheiten ein Vorteil ist, der mit dem elektrostatischen Binden von Nukleinsäuren an Matrizen in Zusammenhang steht, wurde in Betracht gezogen, dass es möglich sein könnte, einen selbstanzeigenden PCR-Test aufzubauen, wobei die Fluoreszenz der Matrix, welche in der Umsetzung eingeschlossen ist, zu der Zeit, bei welcher die Reaktionskomponenten gemischt werden, verwendet werden könnte, um das Ergebnis einer PCR-Amplifikation durch nur visuelle oder instrumentelle Beobachtung des Röhrchens während der und/oder nachdem die PCR vollendet ist, zu bestimmen.
Punktmutationsanalyse ist eine andere wichtige Aufgabe eines Nukleinsäure-Diagnostiktests, da eine genaue Bestimmung einer speziellen Punktmutation eines genetischen Materials in einer Probe oft ein entscheidender Faktor bei der geeigneten Identifizierung von genetischen Störungen und anderen Erkrankungszuständen ist. Wie in der Beschreibung erörtert, können Blockiersonden zur Verbesserung einer Analyse bezüglich einer einzelnen Punktmutation eines auf Sonden basierenden Tests über die Grenzen, welche durch die genaue Optimierung oder Steuerung von Strenge möglich sind, verwendet werden. So wurde in Betracht gezogen, dass die Verwendung von PNA-Blockiersonden in Verbindung mit linearen Beacons die Entwicklung eines selbstanzeigenden auf Sonden basierenden Tests ermöglichen könnte, der zur Unterscheidung bezüglich einer Punktmutation in der Lage ist, was ein Ergebnis erzeugen würde, das durch visuelle Untersuchung oder durch instrumentelle Analyse, während der und/oder nachdem die PCR vollendet ist, interpretiert werden kann.
Für die Beispiele A und B wurde asymmetrische PCR verwendet, da asymmetrische PCR zu einem signifikanten Überschuss an einsträngiger Nukleinsäure führt. Da es durch vernünftiges Einstellen des Verhältnisses der 5'- und 3'-Primer möglich ist, auszuwählen, welcher der Stränge des Amplikons bevorzugt amplifiziert wird, ist es möglich, den Test derart zu designen, dass die Zielsequenz, an welche die Nicht-Nukleotid-Sonde hybridisiert, in der im Überschuss hergestellten einsträngigen Nukleinsäure des asymmetrischen PCR-Tests enthalten ist.
Für die Beispiele A und B wurde eine lineare Beacon als die Nicht-Nukleotid-Sonde gewählt, da lineare Beacons inhärent nicht fluoreszent (oder sehr wenig fluoreszent) sind, bis sie an die Zielsequenz hybridisiert sind. Diese Vorgehensweise war vorteilhaft, da das Reaktionsgemisch, welches die lineare Beacon enthält, während dem Test und in der Theorie relativ nicht fluoreszent bleibt, nur die Kügelchen würden fluoreszent werden, mit der Maßgabe, dass die Zielsequenz erzeugt wird und elektrostatisch an die Matrix (Kügelchen) gebunden wird. So wurde die lineare Beacon (BK.RAS-Cy3; siehe Tabelle 2, vorstehend) derart designed, dass sie an den im Überschuss hergestellten Strang einer Region der dsDNA (siehe: Veranschaulichung auf S. 28), welche amplifiziert werden soll, hybridisiert, und wurde vor dem Thermocycling zu dem PCR-Gemisch gegeben. Die lineare PNA-Beacon wurde mit Cy3 markiert, da frühere Experimente gezeigt haben, dass die negativ geladene Fluorescein-Markierung eine Affinität für die PEI-überzogenen Kügelchen bei Salzkonzentrationen von niedriger als 200 mM zeigt.
Obwohl lineare Beacons während dem Thermocycling an die Zielsequenz hybridisieren können, wurde eine signifikante Inhibierung des Amplifikationsprozesses nicht beobachtet. Folglich wurde die PCR-Amplifikation erfolgreich unter Verwendung des detektierbaren fluoreszenten Signals der linearen Beacon, welches auf der Oberfläche der Kügelchen als Antwort auf die Aktivität der PCR-Reaktion erzeugt wurde, beobachtet. Die präsentierten Daten zeigen in schlüssiger Weise die Durchführbarkeit der Verwendung von linearen Beacons für die Detektion oder Punktmutationsanalyse von elektrostatisch an eine Matrix gebundener Nukleinsäure, die durch Amplifikation in einem Test in geschlossenen Röhrchen erzeugt wurde. Wie durch die 1 und 3 nachgewiesen wird, kann das Ergebnis durch bloße visuelle Untersuchung der fertigen Testprobe, welche noch im Röhrchen ist, bestimmt werden. Da Fluoreszenz für das bloße Auge sichtbar ist, wird ein empfindliches Instrument, wie ein Prism 7700, für Echtzeit- oder automatisierte Endpunkt-Probeanalysen geeignet sein. Die Figuren zeigen ferner, dass es die Konzentration der Proben an der Matrix möglich macht, die Nachweisgrenzen des Tests zu verbessern, da die Signalintensität an den Kügelchen viel intensiver ist als das Signal, welches durch das Massefluid erzeugt wird, wenn die lineare Beacon frei in Lösung ist.
A. Asymmetrische PCR mit linearen Beacons PCR-Materialien und -Verfahren:
Dieses Experiment umfasste fünf einzelne PCR-Reaktionen. Variable Faktoren, welche innerhalb des Satzes von fünf Umsetzungen untersucht wurden, schlossen die Anwesenheit oder Abwesenheit von PEI-derivatisierten Sepharose-Kügelchen (ungefähr 25.000 PEI-Sepharose-Kügelchen), die Anwesenheit oder Abwesenheit von Plasmidtemplat (pKRASWT bei 20 fMol pro 50 μl Umsetzung (0,4 nM)) und die Anwesenheit oder Abwesenheit von Thermocycling (TMC) ein. Tabelle 4 nachstehend fasst die Zusammensetzung von verschiedenen Röhrchen bezüglich dieser variablen Faktoren zusammen. Zusätzlich enthielt jede PCR-Reaktion 1,5 μl 100% Glycerin, 0,5 μl Wasser (Kontrolle) oder Sepharose-Kügelchen, 45 pMol KRAS-5'-Primer, 5 pMol des KRAS-3'-Primers, 3 mM MgCl₂, 250 μM NTPs, 2,0 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase, 50 mM KCl, 10 mM TRIS-Cl pH-Wert 8,3 und 50 pMol BK.RAS-Cy3-Nicht-Nukleotid-Sonde (lineare Beacon) in einem Gesamtvolumen von 50 μl. Während der Herstellung und nach der PCR wurden die Röhrchen vorsichtig gehandhabt, um das Mischen der Komponenten zu vermeiden.
Das PCR-Protokoll bezog eine 20 Sekunden-Aufwärmung auf 95°C (nur 1. Runde), gefolgt von Denaturieren bei 95°C für 5 Sekunden, Annealing bei 55°C für 30 Sekunden und Extension bei 74°C für 30 Sekunden ein. Der Denaturierungs-Annealing-Extensions-Zyklus wurde 50 Zyklen wiederholt, gefolgt von einem Extensionsendschritt bei 74°C für 5 Minuten.
Nach dem Thermocycling wurden die Röhrchen auf einem Transilluminator platziert und die Fluoreszenz wurde durch Augenschein untersucht. Danach wurden die Röhrchen gevortext und dann für 2 Minuten zentrifugiert, um die Kügelchen am Röhrchenboden zu konzentrieren. Es wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet, ob die Röhrchen vor dem Betrachten gevortext und zentrifugiert wurden oder nicht. Dies zeigte, dass das Glycerin das Endpunktergebnis nicht beeinflusste.
Anmerkungen:

1. Das Glycerin wurde zugegeben, um temporär die Kügelchen von den Reaktionskomponenten in den frühen Stufen der PCR abzuschirmen, so dass das Verfahren nicht wesentlich durch elektrostatisches Binden der Primer an der Matrix (Kügelchen) während der kritischen frühen Thermozylden inhibiert wurde. Anschließende Untersuchungen zeigten, dass die Anwesenheit einer temporären Abschirmung nicht wesentlich ist, um ein genaues Ergebnis zu erreichen, aber nichtsdestoweniger bevorzugt ist.

Tabelle 4: Variable Faktoren

Röhrchen Nr. PEI-Kügelchen Templat TMC

1 - pKRASWT nein

2 - - ja

3 - pKRASWT ja

4 Sepharose - ja

5 Sepharose pKRASWT ja
Nach-PCR-Aufarbeitung/Analyse:
Nach der PCR wurden die Röhrchen 1 bis 5 auf einem Transilluminator platziert, um Fluoreszenz zu visualisieren, und dann fotografiert. 1A ist ein Negativ des gescannten Bildes der Fotografie, welche von den fünf Eppendorf-Miniröhrchen unmittelbar nach der PCR aufgenommen wurde (Röhrchen sind mit 1 bis 5 markiert). Nachdem die Fotografie aufgenommen worden war, wurden 0,5 μl des PEI-Sepharose-Kügelchen-Vorrats zu den Röhrchen 1 bis 3 gegeben. Die fünf Röhrchen wurden dann gevortext, zentrifugiert und wieder auf dem Transilluminator platziert und wieder fotografiert. 1B ist ein Negativ des gescannten Bildes der zweiten Fotografie der fünf Eppendorf-Miniröhrchen.
Nach dem erneuten Fotografieren der Röhrchen wurden die Überstände abdekantiert und die Kügelchen wurden mit 100 μl einer Lösung, welche 50 mM NaCl und 100 mM TRIS-HCl pH-Wert 7,6 enthielt, gewaschen. Das Waschen bezog das Zugeben des Waschpuffers, kurz Vortexen, Zentrifugieren und dann Dekantieren ein. Die elektrostatisch gebundenen Nukleinsäuren wurden dann von den Kügelchen zur Analyse durch Vortexen in einer Lösung, welche 10 μl 0,05% Ammoniumhydroxid und 2,0 M NaCl enthielt, freigesetzt. Die Überstände wurden entfernt und in eine Mikrovertiefungsplatte überführt, wobei sie mit 1 μl 0,1 N Salzsäure neutralisiert wurden. Zu jeder Vertiefung wurden 4 μl 4X Beladungsfarbstoff gegeben. Schließlich ließ man dann 15 μl von jeder Probe auf einem 10 bis 20%-Gradientengel laufen, um die Nukleinsäureamplifikation zu bestätigen und die Produktgröße zu identifizieren.
Die 2A und 2B sind das Negativ von Bildern von Fotografien des selben 10 bis 20%-Gradienten-Polyacrylamidgels, beleuchtet auf einem UV-Transilluminator, welche vor beziehungsweise nach dem Ethidiumbromid-Anfärben aufgenommen wurden.
Ergebnisse:
Röhrchenbilder/-fotografien
Bezüglich der Analyse der Bilder der Fotografien nehmen Sie bitte zur Kenntnis, dass, obwohl Schwarz-Weiß-Fotografien aufgenommen wurden, die visuelle Untersuchung der Röhrchen mit dem Hell-Dunkel-Kontrast, der in den Bildern gesehen wird, im Einklang stand, außer dass der Cy3-Farbstoff als orangefarben für das Auge unter dem Transilluminator erschien. Darüber hinaus ist das Negativ (elektronisch erzeugt) des gescannten Bildes gezeigt, da man annimmt, dass die Kontraste des Negativbildes für eine Veranschaulichung hervorragend sind und durch Fotokopieren genauer reproduziert werden.
Mit Bezug auf 1A sind die Ergebnisse wie erwartet. Röhrchen 1 war eine Kontrolle, welche nicht Thermocycling unterworfen worden war, und deshalb wurde wenig oder keine Fluoreszenz beobachtet (die Röhrcheninhalte erscheinen im Kontrast zum Hintergrund klar). Ebenso enthielten die Röhrchen 2 und 4 kein Templat und deshalb wurde wenig oder keine Fluoreszenz in Lösung (Röhrchen 2) oder an den Kügelchen (Röhrchen 4) beobachtet, da keine Amplifikation stattgefunden haben sollte. Röhrchen 3 war jedoch wie erwartet fluoreszent, da eine Amplifizierung des Templats das 111 bp-Amplikon, an welches die lineare Beacon hybridisierte, wobei ein detektierbares Signal erzeugt wurde, hergestellt haben sollte. Da keine Sepharose vorhanden war, war die Lösung nichtsdestoweniger sichtbar orangefar ben im Vergleich mit den Röhrchen 1, 2 und 4. Ebenso enthielt Röhrchen 5 Kügelchen hoher Fluoreszenz (orangefarben durch Augenschein; dunkel im Negativ des Bildes) wie erwartet, da eine Amplifizierung des Templats das 111 bp-Amplikon (elektrostatisch an die Kügelchenmatrix gebunden), an welches die lineare Beacon hybridisierte, wobei ein detektierbares Signal erzeugt wurde, hergestellt haben sollte.
Mit Bezug auf 1B sind die Ergebnisse auch wie erwartet. Speziell beeinflusste die Zugabe der Sepharose-Kügelchen zu den Röhrchen 1 bis 3 nur die Fluoreszenz von Röhrchen 3. Insbesondere war die orangefarbene Fluoreszenz, wobei beobachtet wurde, dass sie vor der Zugabe der Sepharose-Kügelchen in Lösung war, nach der Kügelchen-Zugabe auf der Kügelchenoberfläche konzentriert (dunkel im Negativ des Bildes). Darüber hinaus war die Intensität der Fluoreszenz von Röhrchen 3, welche visuell bestimmt werden konnte, vergleichbar mit der Fluoreszenzintensität der Kügelchen in Röhrchen 5. Folglich scheint beim Ergebnis kein Unterschied zu sein, ob die Matrix zugegeben wird oder nicht, bevor oder nachdem die PCR-Reaktion durchgeführt wird.
Zusammengefasst zeigen die in den 1A und 1B präsentierten Daten, dass es möglich ist, selbstanzeigende Amplifizierungstests durchzuführen, wobei ein Signal einer Sonde auf einer Matrix, an welcher eine amplifizierte Zielnukleinsäure elektrostatisch immobilisiert ist, konzentriert werden kann.
Gelfotografien/-bilder:
Eine Analyse der PCR-Reaktionen durch Gel wurde durchgeführt, um die Anwesenheit und Größe der Amplikone zu bestimmen, um dabei zu bestätigen, dass die visuelle Analyse der Röhrchen mit den erwarteten Produkten der PCR-Amplifikation korrelierte.
Mit Bezug auf die 2A und 2B sind die Vertiefungen des Gels im oberen Bereich der Fotografien. Aliquote von jedem Röhrchen wurden nahe dem oberen Bereich des Gels zugegeben und zum unteren Bereich des Gels elektrophoretisch geführt. Die Spuren 2 und 8 enthalten zwei unterschiedliche doppelsträngige DNA-Größenmarker; Spur 2 ist ∅X174/HaeIII (New England BioLabs Nr. 303-1S) und Spur 8 ist eine 100 bp-Leiter (New England BioLabs Nr. 323-1L). Bandengrößen sind in 2B gezeigt. Die Spuren 3 bis 6 enthalten Proben von freigesetzter Nukleinsäure, welche jeweils von den Kügelchen in den Röhrchen 2 bis 5 isoliert wurden, und Spur 7 enthält Material, welches von den Kügelchen in Röhrchen 1 freigesetzt wurde.
Mit Bezug auf 2A kann die Anwesenheit von inhärent fluoreszenten Banden in den Spuren 4 und 6 (von den Röhrchen 3 beziehungsweise 5) zum unteren Bereich des Bildes hin gesehen werden. Die fluoreszenten Banden können der Anwesenheit der linearen Beacon zugeschrieben werden, welche noch an dem Nukleinsäure-Amplikon hybridisiert ist, sogar nachdem es in das Gel migriert ist. Dieses Ergebnis steht mit der Amplifizierung in den Röhrchen 3 und 5 im Einklang, wie durch die visuelle Analyse der Röhrchen gezeigt. Bei Vergleich gibt es keine sichtbaren fluoreszenten Banden in jedweder der Spuren 3, 5 und 7. Dieses Ergebnis steht mit dem Fehlen von Amplifizierung im Einklang, wie durch visuelle Analyse der Röhrchen gezeigt.
Mit Bezug auf 2B ist die gesamte Nukleinsäure fluoreszent, da sie mit Ethidiumbromid angefärbt ist. Deshalb sind die Größenmarker in den Spuren 2 und 8 nun sichtbar. Starke fluoreszente Banden mit einer Größe, welche mit dem erwarteten 111 bp-Produkt im Einklang steht, sind in den Spuren 4 und 6 sichtbar, sind aber in den Spuren 3, 5 und 7 abwesend. Diese Daten bestätigen die Herstellung des beabsichtigten Amplikons nur in den Röhrchen 3 und 5 und bestätigen ferner, dass die Nukleinsäure von Material gewonnen wurde, welches ursprünglich an den Sepharose-Kügelchen elektrostatisch gebunden war.
Zusammengefasst zeigen die in den 1A und 1B präsentierten Daten, wenn sie mit den in den 2A und 2B präsentierten Daten betrachtet werden, als Ergebnis, dass es möglich ist, selbstanzeigende Amplifizierungstests durchzuführen, wobei ein Signal einer Sonde auf einer Matrix, an welcher eine amplifizierte Zielnukleinsäure elektrostatisch immobilisiert wird, konzentriert werden kann.
Analyse bezüglich einer einzelnen Punktmutation

Dieses Experiment wurde verwendet, um zu untersuchen, ob es möglich ist oder nicht, in dem selbstanzeigenden auf Sonden basierenden Test eine Unterscheidung bezüglich einer Punktmutation zu erreichen. Wenn nicht Anderweitiges angegeben ist, wurde dieses Experiment im Wesentlichen wie in Teil A vorstehend beschrieben durchgeführt, außer dass ein nicht markiertes PNA-Oliogmer (Blockiersonde) zugegeben wurde, um eine Unterscheidung bezüglich einer einzelnen Punktmutation zu erreichen. Da Kontrollreaktionen, welche die Blockiersonde nicht enthielten, durchgeführt wurden, zeigt ein Vergleich der Ergebnisse, welche in der Gegenwart und Abwesenheit der Blockiersonde erhalten wurden, klar die beträchtliche Verbesserung bei der Zielsequenz-Identifizierung, welche aus der Anwesenheit der Blockiersonde resultiert. Tabelle 5: Variable Faktoren

Röhrchen Nr.	PEI-Kügelchen	Templat	Blockiersonde
1	-	-	-
2	-	pKRASWT	-
3	-	pKRASMU(31)	-
4	Sepharose	-	-
5	Sepharose	pKRASWT	-
6	Sepharose	pKRASMU(31)	-
7	Sepharose	-	MU-15Blocker
8	Sepharose	pKRASWT	MU-15Blocker
9	Sepharose	pKRASMU(31)	MU-15Blocker

PCR-Materialien und -Verfahren:
Dieses Experiment umfasste neun einzelne PCR-Reaktionen. Variable Faktoren, welche in dem Satz von neun Umsetzungen untersucht wurden, schlossen die Anwesenheit oder Abwesenheit von PEI-derivatisierten Sepharose-Kügelchen (ungefähr 25.000 PEI-Sepharose-Kügelchen), die Anwesenheit oder Abwesenheit von Plasmidtemplat (pKRASWT oder pKRASMU(31) in 100 fMol pro 50 μl Umsetzung (0,4 nM)) und die Anwesenheit oder Abwesenheit von 400 pMol PNA-Blockiersonde (MU-15Blocker, siehe: Tabelle 2) ein. Das Gesamtvolumen der PCR-Umsetzungen, einschließlich Glycerin und Kügelchen, war 50 μl.
Tabelle 5 nachstehend fasst die Zusammensetzung von verschiedenen Röhrchen bezüglich dieser variablen Faktoren zusammen. Zusätzlich enthielt jede PCR-Reaktion 45 pMol des KRAS-5'-Primers, 5 pMol des KRAS-3'-Primers (siehe: Tabelle 1), 3 mM MgCl₂, 250 μM NTPs, 2,0 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase, 50 mM KCl, 10 mM TRIS-HCl pH-Wert 8,3, 50 pMol BK.RAS-Cy3 (siehe: Tabelle 2)-Nicht-Nukleotid-Sonde (lineare Beacon), 1,5 μl Glycerin und 0,5 μl Sepharose-Kügelchen oder Wasser (Kontrolle). Das Glycerin über lagert die Kügelchen, um sie von den Reaktionskomponenten in den frühen Stufen der PCR abzuschirmen, so dass das Verfahren nicht wesentlich durch das elektrostatische Binden der Primer an die Matrix (Kügelchen) während den kritischen frühen Thermozyklen inhibiert wird. Während der Herstellung und vor der PCR wurden die Röhrchen vorsichtig gehandhabt, um das Mischen der Komponenten zu vermeiden.
Das PCR-Protokoll bezog eine 20 Sekunden-Aufwärmung auf 95°C (nur 1. Runde), gefolgt von Denaturieren bei 95°C für 5 Sekunden, Annealing bei 55°C für 30 Sekunden und Extension bei 74°C für 30 Sekunden ein. Der Denaturierungs-Annealing-Extensions-Zyklus wurde 30 Zyklen wiederholt.
Nach-PCR-Aufarbeitung/-Analyse:
Nach der PCR wurden die Röhrchen 1 bis 9 auf einem Transilluminator platziert, um Fluoreszenz zu visualisieren, und dann fotografiert. 3 ist ein Negativ des gescannten Bildes der Fotografie, welche von den neun Eppendorf-Miniröhrchen unmittelbar nach der PCR aufgenommen wurde (Röhrchen sind mit 1 bis 9 markiert).
Nach dem Fotografieren wurden die Röhrchen kurz gevortext, dann kurz zentrifugiert, um die Kügelchen zu konzentrieren. Die Überstände wurden entfernt und die Kügelchen wurden mit 100 μl 50 mM NaCl, 100 mM TRIS-Cl pH-Wert 7,6 gewaschen. Die elektrostatisch gebundenen Nukleinsäuren wurden dann von den Kügelchen zur Analyse durch Vortexen in 10 μl einer Lösung, welche 100 mM CAPSO pH-Wert 10,7 und 2 M NaCl enthielt, freigesetzt. Die Lösung wurde dann von den Kügelchen abgetrennt und 9 μl von jeder der gewonnenen Lösungen wurden mit 3 μl von 4X Beladungsfarbstoff kombiniert. Eine Probe von jedem Röhrchen ließ man dann auf einem 10 bis 20%-Gradientengel laufen, um die Nukleinsäureamplifikation zu bestätigen und die Produktgröße zu identifizieren. Die 4A und 4B sind das Negativ der Bilder der Fotografien des selben 10 bis 20%-Gradienten-Polyacrylamidgels, erleuchtet auf einem UV-Transilluminator, welche vor (4A) und nach (4B) Ethidiumbromid-Anfärbung aufgenommen wurden.
Ergebnisse:
Röhrchenbilder/-fotografien
Mit Bezug auf 3 war Röhrchen 1 eine Negativkontrolle, welche kein Templat enthielt, und ist wie erwartet nach PCR nicht fluoreszent (die Röhrcheninhalte ähneln dem Hintergrund im Negativ des Bildes). Jedoch waren die Inhalte der Röhrchen 2 und 3 unter dem Transilluminator sichtbar fluoreszent (dunkler als Röhrchen 1 im Negativ des Bildes). Dies war das erwartete Ergebnis für Röhrchen 2, da die Amplifizierung des Templats das 111 bp-Amplikon, welches eine Zielsequenz enthält, zu welcher die lineare Beacon perfekt komplementär ist, hergestellt haben sollte. Jedoch enthielt das Amplikon, welches in Röhrchen 3 erzeugt wurde, eine Punktmutation enthaltende Sequenz des Wildtyp-Amplikons. Jedoch wird in der Abwesenheit der Blockiersonde die lineare Beacon-Sonde zumindest teilweise an das mutante Amplikon, welches aus dem Plasmid pKRASMU(31) unter den vorliegenden Hybridisierungsbedingungen erzeugt wurde, hybridisieren, da die mutanten und Wildtyp-Amplikons so eng verwandt sind. Eine teilweise Hybridisierung verursacht eine Erzeugung eines ausreichenden fluoreszenten Signals, welches unter dem Transilluminator für das Auge sichtbar ist. Da keine Sepharose-Kügelchen in den Röhrchen 2 und 3 vorhanden waren, ist die orange Farbe (Dunkelheit des Negativbildes) der hybridisierten linearen Beacon überall gleich in der Lösung verteilt. Da das Signal nicht konzentriert war, erzeugte es kein starkes Signal in der Figur.
Die Reagenzzusammensetzung der Röhrchen 4 bis 6 ist jeweils identisch zu den Röhrchen 1 bis 3, außer dass PEI-Sepharose-Kügelchen während der PCR-Reaktion vorhanden waren. Mit Bezug auf 3 war Röhrchen 4 eine Negativkontrolle, welche kein Templat enthielt, und wie erwartet sind die Lösung und Sepharose-Kügelchen nach der PCR im Vergleich mit den Röhrchen 5 und 6 (die Röhrcheninhalte und -Kügelchen ähneln dem Hintergrund im Negativ des Bildes) nicht fluoreszent. Mit Bezug auf die Röhrchen 5 und 6 wurden die Sepharose-Kügelchen im unteren Bereich der Röhrchen hoch fluoreszent, wobei die Intensität von Röhrchen 5 verglichen mit Röhrchen 6 etwas stärker intensiv ist. Dieses Ergebnis ist wie erwartet, da die Amplifikation des Templats das 111 bp-Amplikon (elektrostatisch an die Kügelchenmatrix gebunden), an welches die lineare Beacon hybridisiert, wobei ein detektierbares Signal erzeugt wird, hergestellt haben sollte. Die Fluoreszenzintensität des Röhrchens 6 ist niedriger, da die lineare Beacon nicht perfekt zu dem Amplikon komplementär ist, aber mindestens teilweise unter den vorliegenden Hybridisierungsbedingungen hybridieren kann, wobei ein detektierbares Signal erzeugt wird. Da wenig Unterschied zwischen den Röhrchen 5 und 6 besteht, ermöglicht jedoch eine visuelle Untersuchung der Röhrchen nicht, zu bestätigen, ob die Probe eine mutante oder Wildtyp-Zielsequenz enthielt oder nicht, und ist deshalb nicht notwendigerweise für eine Analyse bezüglich einer einzelnen Punktmutation geeignet.
Durch Vergleich der Röhrchen 2 und 3 mit der Intensität des Signals der Röhren 5 und 6 wurde klar, dass die Konzentration des detektierbaren fluoreszenten Signals an den Kügelchen ermöglicht, ein positives Ergebnis klarer zu detektieren, da die Kügelchen in den Röhrchen 5 und 6 verglichen mit den Lösungen in den Röhrchen 2 und 3 klarer positiv sind.
Die Reagenzzusammensetzung der Röhrchen 7 bis 9 war jeweils identisch zu den Röhrchen 4 bis 6, außer dass in den Röhrchen 7 bis 9 vor der PCR-Amplifikation 400 pMol MU-15Blocker-Sonde zugegeben wurden. Mit Bezug auf 3 war Röhrchen 7 eine Negativkontrolle, welche kein Templat enthielt, und wie erwartet sind die Sepharose-Kügelchen nach der PCR verglichen mit den Röhrchen 8 und 9 (die Röhrcheninhalte und Kügelchen ähneln dem Hintergrund im Negativ des Bildes) nicht fluoreszent. Da die Blockiersonde vorhanden ist, sind nur die Kügelchen in Röhrchen 8 verglichen mit den Inhalten in den Röhrchen 7 und 9 klar fluoreszent. So ermöglicht eine visuelle Untersuchung der Röhrchen, zu bestätigen, ob die Probe eine mutante oder Wildtyp-Zielsequenz enthielt oder nicht. Deshalb ist dieser selbstanzeigende Test für eine Analyse bezüglich einer einzelnen Punktmutation/Unterscheidung geeignet. Der Fachmann wird erkennen, dass eine Quanitifizierung eines detektierbaren Signals unter Verwendung eines Instruments, wie eines Durchflusszytometers, und nicht mehr als Routineexperimentieren erreicht werden kann.
Zusammengefasst zeigen die in 3 präsentierten Daten, dass es möglich ist, homogene Amplifizierungstests oder Amplifizierungstests in geschlossenen Röhrchen durchzuführen, wobei ein Signal einer Sonde auf einer Matrix, an welcher eine amplifizierte Zielnukleinsäure elektrostatisch immobilisiert ist, konzentriert werden kann. Darüber hinaus kann der Test, wenn Blockiersonden verwendet werden, für eine Analyse bezüglich einer einzelnen Punktmutation verwendet werden.
Gelfotografien/-bilder:
Eine Analyse der PCR-Reaktionen durch Gel wurde zur Bestimmung der Anwesenheit und Größe von Amplikonen durchgeführt, um dabei zu bestätigen, dass die visuelle Analyse der Röhrchen mit den erwarteten Produkten der PCR-Amplifikation korrelierte.
Mit Bezug auf die 4A und 4B sind die Vertiefungen des Gels im oberen Bereich der Fotografien. Die Bilder in den 4A und 4B sind nicht direkt vergleichbar, da die Fotografien unter Verwendung von unterschiedlichen Einwirkungsparametern gemacht wurden. Aliquote von jedem Röhrchen wurden nahe dem oberen Bereich des Gels zugegeben und zum unteren Bereich des Gels elektrophoretisch geführt. Die Spuren 1 und 12 enthalten zwei unterschiedliche doppelsträngige DNA-Größenmarker; Spur 1 ist eine 100 bp-Leiter (New England BioLabs Nr. 323-1L) und Spur 12 ist eine 1000 bp-Leiter (New England BioLabs Nr. 323-2S). Bandengrößen sind in 4B gezeigt. Die Spuren 2 bis 4 enthalten jeweils 9 μl der Proben 1 bis 3, die Spuren 5 bis 10 enthalten Proben von freigesetzter Nukleinsäure, welche jeweils von den Kügelchen in den Röhrchen 4 bis 9 isoliert wurden, und Spur 11 ist ein Blindwert.
Mit Bezug auf 4A kann die Anwesenheit von inhärent fluoreszenten Banden in den Spuren 3, 4, 6, 7 und 9 (von den Proben 2, 3, 5, 6 beziehungsweise 8) zum unteren Bereich des Bildes hin und in der Mitte davon gesehen werden. Die fluoreszenten Banden im unteren Bereich des Bildes sind am stärksten wahrscheinlich Sondenmoleküle, welche in das Gel migriert sind. Die fluoreszenten Banden in der Mitte des Bildes können der Anwesenheit der linearen Beacon zugeschrieben werden, welche noch an dem Nukleinsäure-Amplikon hybridisiert ist, sogar nachdem es in das Gel migriert ist. Dieses Ergebnis steht mit der Amplifizierung in den Röhrchen 2, 3, 5, 6 und 8 im Einklang, wie durch die visuelle Analyse und das Fotografieren der Röhrchen gezeigt. Bei Vergleich gibt es keine sichtbaren fluoreszenten Banden in jedweder der Spuren 2, 5, 8 und 10 (Röhrchen 1, 4, 7 und 9). Dieses Ergebnis steht mit dem Fehlen von Fluoreszenz, welches in diesen Röhrchen beobachtet wurde, im Einklang.
Mit Bezug auf 4B ist die gesamte Nukleinsäure fluoreszent, da sie mit Ethidiumbromid angefärbt ist. Deshalb sind die Größenmarker in den Spuren 1 und 12 nun sichtbar. Starke fluoreszente Banden mit einer Größe, welche mit dem erwarteten 111 bp-Produkt im Einklang steht, sind in den Spuren 3, 4, 6, 7, 9 und 10 (Röhrchen 2, 3, 5, 6, 8 und 9) sichtbar, sind aber in den Spuren 2, 5 und 8 (Röhrchen 1, 4 und 7) abwesend. Diese Daten bestätigen die Herstellung des beabsichtigten Amplikons in den Röhrchen 2, 3, 5, 6, 8 und 9 und bestätigen ferner, dass die Nukleinsäure von Material gewonnen wurde, welches ursprünglich an den Sepharose-Kügelchen elektrostatisch gebunden war. Am stärksten bemerkenswert ist die Anwesenheit einer Bande in beiden Spuren 8 und 10 (Röhrchen 7 und 9). Diese Banden bestätigen, dass Amplifizierung in diesen Proben stattfand. Deshalb kann das Fehlen eines Signals in Röhrchen 9 verglichen mit Röhrchen 7 nur der Anwesenheit der Blockiersonde zugeschrieben werden, was ermöglicht, eine Unterscheidung bezüglich einer Punktmutation des Amplikons zu erreichen.
Zusammengefasst zeigen die in den 4A und 4B präsentierten Daten, wenn sie mit den in der 3 präsentierten Daten betrachtet werden, als Ergebnis, dass es möglich ist, selbstanzeigende auf Sonden basierende Tests, welche zur Unterscheidung bezüglich einer einzelnen Base (Unterscheidung bezüglich einer einzelnen Punktmutation) geeignet sind, durchzuführen, wobei ein Signal einer Sonde auf einer Matrix, an welcher eine amplifizierte Zielnukleinsäure elektrostatisch immobilisiert ist, konzentriert werden kann.
Beispiel 13: Vergleich des Testarbeitsbereichs für PNA:DNA- und DNA:DNA-Hybride
Dieses Beispiel ist zum Vergleich des Arbeitsbereichs für elektrostatisches Binden von Nicht-Nukleotid-Sonden (z. B. PNA) mit dem der am nähesten äquivalenten Nukleinsäure-Sonden in einem elektrostatischen Bindungstest für ein Nukleinsäure-Zielmolekül, welches in der Größe zur Sonde nahe äquivalent ist, designed. Das Ziel ist deshalb, einen Bereich von Ionenstärke zu bestimmen, in welchem die Nicht-Nukleotid- und Polynukleotid-Sonden an die Matrix binden werden, nur wenn das Nukleinsäureziel vorhanden ist. Für dieses Beispiel wurde eine PNA-Sonde (WT-15Flu PNA; siehe Tabelle 2) und eine DNA-Sonde (WT-15Flu; siehe Tabelle 1) in Wasser auf eine Konzentration von 5 μM verdünnt. Das Nukleinsäureziel (KRASWT(21); siehe Tabelle 1) wurde auch in Wasser auf eine Konzentration von 50 μM verdünnt.

Dann wurden vier Sätze von acht Eppendorf-Röhrchen mit 100 μl von jedem der acht in Tabelle 6 beschriebenen Salzpuffer hergestellt. Die vier Sätze der Röhrchen umfassten die folgenden experimentellen Bedingungen: In Satz I wurde die PNA-Sonde aber kein Nuklein säureziel (KRASWT(21)) gegeben. Dies ist die „kein Ziel"-Kontrolle. In Satz II wurden die PNA-Sonde und das Nukleinsäureziel (KRASWT(21)) gegeben. In Satz III wurde die DNA-Sonde aber kein Nukleinsäureziel (KRASWT(21)) gegeben. Dies ist die „kein Ziel"-Kontrolle. In Satz IV wurden die DNA-Sonde und das Nukleinsäureziel (KRASWT(21)) gegeben. Tabelle 6: Salzpuffer:

Puffer ID	Pufferkomponenten:
G	0 mM NaCl, 10 mM TRIS-Cl pH-Wert 8,0
H	100 mM NaCl, 10 mM TRIS-Cl pH-Wert 8,0
I	200 mM NaCl, 10 mM TRIS-Cl pH-Wert 8,0
J	300 mM NaCl, 10 mM TRIS-Cl pH-Wert 8,0
K	400 mM NaCl, 10 mM TRIS-Cl pH-Wert 8,0
L	500 mM NaCl, 10 mM TRIS-Cl pH-Wert 8,0
M	600 mM NaCl, 10 mM TRIS-Cl pH-Wert 8,0
N	700 mM NaCl, 10 mM TRIS-Cl pH-Wert 8,0

Diese Proben wurden durch Geben von einem Mikroliter des geeigneten Vorrats der PNA-Sonde oder DNA-Sonde zu jedem Röhrchen in den Sätzen I, II, III und IV, wobei eine Endkonzentration von 250 nM Sonde erreicht wurde, hergestellt. Zu jedem Röhrchen in den Sätzen II und IV wurde auch ein Mikroliter des Vorrats an Nukleinsäureziel (KRASWT(21)) gegeben, wobei eine Probe mit einer Endkonzentration von 2,5 μM Ziel erzeugt wurde. Zu den „kein Ziel"-Kontroll-Sätzen I und III wurde ein Mikroliter Wasser gegeben.
Alle Röhrchen wurden kurz gevortext, um die Bestandteile zu mischen, und bei Raumtemperatur für ungefähr 5 Minuten gehalten, um eine Hybridisierung der Sonden und Ziele zu ermöglichen. Zu jedem Röhrchen wurde dann ein Mikroliter PEI-Sepharose-Teilchen, suspendiert in Wasser, gegeben. Die Röhrchen wurden kurz gevortext, man ließ bei Raumtemperatur für ungeführ 5 Minuten stehen, zentrifugierte dann für 30 Sekunden, um die Teilchen am Boden zu konzentrieren.
Die Röhrchen wurden dann über einer UV-Lichtquelle (Transilluminator) angeordnet und fotografiert. Das Negativbild der Fotografie ist in 5 präsentiert. Die Überstände wurden dann entfernt und verworfen. Dann wurden 100 μl des geeigneten Salzpuffers zurück in die geeigneten Röhrchen gegeben. Die PEI-Teilchen wurden wieder im Hybridisierungspuffer durch starkes Vortexen suspendiert und dann wurde jede suspendierte Teilchenprobe in eine einzelne Vertiefung in einer Mikrotiterplatte überführt. Die Proben in der Mikrotiterplatte wurden unmittelbar analysiert (Wallac, Victor, 1420 Multilabel Counter, Gaithersburg, MD). Die Ergebnisse der Fluoreszenzanalyse an den Kügelchen sind in Tabelle 7 präsentiert.
Ergebnisse:
Röhrchenbilder/-fotografien
Mit Bezug auf 5 sind die vier Sätze der Röhrchen in der Reihenfolge von oben nach unten angeordnet. Innerhalb jedem Satz sind die Röhrchen in der Reihenfolge von aufsteigender Salzkonzentration von links nach rechts angeordnet. Zum Beispiel ist das Röhrchen, welches am nächsten zur oberen linken Ecke der Figur ist, Satz I, Puffer G (0,0 M NaCl) und das Röhrchen, welches am nächsten zur unteren rechten Ecke ist, ist Satz IV, Puffer N (0,7 M NaCl).
Mit Bezug auf 5, Satz I zeigt das Fehlen eines fluoreszenten Signals am Boden des Röhrchens, dass die PNA-Sonde eine sehr geringe Affinität für die Teilchen in der Abwesenheit des Nukleinsäureziels (KRASWT(21)) aufweist. Zum Vergleich ist in Satz II die PNA-Sonde bis zu einer Salzkonzentration von ungefähr 300 mM an der Matrix konzentriert (siehe Salzpuffer J). Dieses Ergebnis steht mit der Hybridisierung der Sonde an der elektrostatisch an der Matrix gebundenen Zielsequenz im Einklang. Das Fehlen der Sonde, welche an der Matrix konzentriert ist, bei Salzkonzentrationen von über 300 mM ist wahrscheinlich aufgrund dem Mangel an Bindung des kurzen Nukleinsäureziels (KRASWT(21)) bei jenen Salzkonzentrationen. Insgesamt zeigen die Daten, dass die PNA-Sonde unter jedweden untersuchten Bedingungen von Ionenstärke nicht mit der Matrix wechselwirkt. Folglich ist der verwendbare Bereich für den Test, welcher diese PNA-Sonde verwendet, mindestens 0 bis 700 mM Salz.
Mit Bezug auf 5, Satz III ist die DNA-Sonde an der Matrix wesentlich bis zu einer Salzkonzentration von ungefähr 300 mM (siehe Salzpuffer J) und schwach bis zu einer Salzkonzentration von 400 mM (siehe Salzpuffer K) konzentriert. Diese Daten zeigen, dass die native DNA-Sonde eine wesentliche inhärente Affinität für die Matrix aufweist. Durch Vergleich zeigt Satz IV, dass das Hybrid aus Sonde/Zielsequenz die Anwesenheit der Sonde, welche an der Matrix konzentriert ist, stark bis zu einer Salzkonzentration von ungefähr 400 mM (siehe Salzpuffer K) und schwach bis zu einer Salzkonzentration von 500 mM (siehe Salzpuffer L) erhöht. Deshalb ist der Arbeitsbereich zum Unterscheiden von Sonde von einem Komplex aus Sonde/Zielsequenz, wenn dieses gesamte DNA-System verwendet wird, ungefähr 300 bis 500 mM Salz. Dies ist ein sehr enger Arbeitsbereich im Vergleich zur PNA-Sonde. Anmerkung: Es wurde bestätigt, dass der anscheinende Konflikt zwischen den Ergebnissen von Experiment 9 und den vorstehend beschriebenen Ergebnissen, wobei die PNA-Sonde WT-15Flu detektierbar an die Matrix bis zu 100 mM Salz (Bsp. 9) bindet, aber nicht mit dem Träger sogar bei 0 mM Salz wechselwirkt, bedingungsabhängig ist. Der Puffer in Experiment 9 enthält Tween-20, wobei es scheint, dass dies die Wechselwirkung der PNA-Sonde mit dem Träger fördert. Zusätzlich wurde die PNA-Sonde in diesem Experiment zunächst zu Wasser von dem konzentrierten Vorrat von 1/1 DMF:Wasser gegeben, wobei es scheint, dass dies die Wechselwirkung der PNA-Sonde mit dem Träger erniedrigt. Um Zweifel zu vermeiden, alle Daten sind mit der Fluorescein-Markierung, welche die primäre Quelle der Wechselwirkung mit der Matrix ist, im Einklang, was ein offensichtliches Ergebnis von Experiment 9 war.
Quantifizierung von Teilchen-assoziierter Fluoreszenz
Der visuelle Vergleich des Röhrchens wurde auch durch quantitative Analyse der Fluoreszenz der wieder suspendierten Kügelchen bestätigt. Die quantitativen Fluoreszenzmessungen sowie abgeleitete Daten für die Kügelchen sind in Tabelle 7 präsentiert.

Mit Bezug auf Tabelle 7 ist das Rohfluoreszenz-Ausleseergebnis von jeder Probe (Sätze I bis IV; jeweils Reihen B bis E) der suspendierten Teilchen bei jedem der Salzpuffer (Puffer G bis N; jeweils Spalten 2 bis 9) präsentiert. Von diesen Daten wurden die Signal-Rausch-Daten für die PNA-Sonde (Reihe F) und DNA-Sonde (Reihe G) mathematisch von den Rohfluoreszenzdaten abgeleitet. Zum Beispiel wurde der Rohfluoreszenzwert, der für Puffer G in Satz I erhalten wurde (Spalte 2, Reihe B = 738 rlu), in dem Rohfluoreszenzwert von Puffer G in Satz II (Spalte 2, Reihe C = 12736 rlu) geteilt, um den S/N-Wert für die PNA-Sonde in Puffer 0 von 17,3 rlu (12736:738 = 17,3 (Spalte 2, Reihe F)) zu erhalten. Tabelle 7: Kügelchen-Fluoreszenzdaten

	1	2	3	4	5	6	7	8	9
A	Puffer. Nr.	G	H	I	J	K	L	M	N
B	Satz I	738	652	618	956	696	1052	992	1124
C	Satz II	12736	12052	11212	8610	1726	830	420	660
D	Satz III	36422	39807	33577	28001	7572	5750	5286	4640
E	Satz IV	36170	47133	46570	43731	43495	13020	2284	1710
F	PNA S/N	17,3	18,5	18,1	9,0	2,5	0,8	0,4	0,6
I G	DNA S/N	1,0	1,2	1,4	1,6	5,7	2,3	0,4	0,4

Das Signal-Rausch-Verhältnis, welches aus den quantitativen Rohfluoreszenzdaten für die PNA-Sonde berechnet wurde, stimmt mit der visuellen Analyse überein. Ein starkes Signal kann über dem Hintergrund von 0 bis 300 mM Salz detektiert werden (siehe: Reihe F, Spalten 2 bis 5). Im Vergleich wird nur ein schwaches Signal für die DNA-Sonde bei Salzkonzentrationen von zwischen 300 und 500 mM detektiert (siehe: Reihe G, Spalten 5 bis 7).
Insgesamt zeigen die visuellen Daten von 5 und die quantitativen Daten von Tabelle 7 klar, dass die Nicht-Nukleotid-PNA-Sonden in einem wesentlich größeren Bereich von Salzkonzentrationen verglichen mit den am nähesten liegenden äquivalenten DNA-Sonden, wenn in einem elektrostatischen Immobilisierungstest verwendet, arbeiten. Die PNA-Sonden stellen auch ein wesentlich höheres Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich mit den DNA-Sonden bereit. Folglich zeigen die Daten mehrere Vorteile, welche die PNA-Sonden die hervorragende Wahl zur Durchführung von auf Sonden basierender Analyse von an einer Matrix elektrostatisch immobilisierter Nukleinsäure machen.
Beispiel 14: Unterscheidung bezüglich einer einzelnen Punktmutation unter Verwendung eines Schutz-/Verdautests (erfindungsgemäßes Beispiel)
Dieses Experiment wurde als ein Schutz-/Verdautest, der zur Unterscheidung bezüglich einer einzelnen Punktmutation geeignet ist, designed. Wie designed stellt der Test auch ein Mittel zum Verbessern des Tests bereit, verursacht durch Einstellen der Temperatur des Tests auf einen Punkt, bei welchem nicht spezifische Hybride beginnen zu schmelzen und die Nukleinsäure, welche dabei das nicht spezifische Signal erzeugt, nun als ein Substrat für das Enzym verfügbar wird. Ein Verdau der beeinflussenden Nicht-Zielsequenz resultiert in einer wesentlichen Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses des Tests. Der Test wird auch wesentlich durch die Verwendung einer selbstanzeigenden linearen Beacon (BK.RAS-Cy3; siehe Tabelle 2) und elektrostatischer Immobilisierung des Hybrids aus lineare Beacon/Zielsequenz an Sepharose-Teilchen, was das schnelle elektrostatische Einfangen und Quantifizieren des Hybrids aus linearer Beacon/Zielsequenz ermöglicht, vereinfacht.
Materialien:
Mungbohnennuklease und 10X Puffer wurden von New England BioLabs erhalten. Das Enzym wird in 10 Einheiten pro Mikroliter bereitgestellt. Wenn der 10X Puffer gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnt wird, enthält der Puffer 50 mM Natriumacetat, 30 mM Natriumchlorid, 1 mM Zinkchlorid und weist einen pH-Wert von 5,0 bis 25°C auf.
Experimentelles:
Dieses Experiment umfasst 6 Proben, in welchen die PNA-Sonde an entweder das KRASWT(24)-Ziel (siehe: Tabelle 1) oder die einzelne Base-Fehlpaarung, KRASMU(24)-Ziel (siehe: Tabelle 1) hybridiert wurde. Eine kein Ziel-Kontrolle und Kontrollproben ohne Enzym wurden auch durchgeführt. Der Test wurde bei 65°C durchgeführt. Diese Temperatur liegt unter der Tm des perfekten Komplements (BK.RAS-Cy3/KRASWT(24)), welche als ungefähr 81°C gemessen wurde, und sehr nahe der Tm des nicht perfekten Komplements (BK.RAS-Cy3/KRASMU(24)), welche als ungefähr 67°C gemessen wurde, unter identischen Bedingungen. Diese Temperatur liegt innerhalb des Bereichs von fünf Grad über und zehn Grad unter der Schmelztemperatur des nicht perfekten Komplements, welches in dem Test unterschieden wird und welches eine einzelne Punktmutation im Vergleich mit der Zielsequenz KRASWT(24) aufweist. Die Zusammensetzung der sechs Proben ist nachstehend zusammengefasst:

Probe 1. KRASWT(24)-Ziel + Enzym
Probe 2. KRASMU(24)-Ziel + Enzym
Probe 3. Kein Ziel + Enzym
Probe 4. KRASWT(24)-Ziel, kein Enzym
Probe 5. KRASMU(24)-Ziel, kein Enzym
Probe 6. Kein Ziel, kein Enzym

Für dieses Experiment wurden PNA-Sonden und DNA-Ziele in einer Endkonzentration von 0,33 μM in ein 100 μl-Volumen von 1X Mungbohnennuklease-Puffer gegeben. Die Proben wurden auf 95°C für 5 Minuten erwärmt, um Hybride zu denaturieren, und dann auf 65°C abgekühlt. Nach 5 Minuten Äquilibrierung bei 65°C wurden die Proben 1 bis 3 mit 0,3 μl Mungbohnennuklease behandelt. Die Proben 4, 5 und 6 wurden nicht mit Nuklease behandelt. Alle Proben wurden kurz gevortext, dann ließ man für 10 Minuten bei 65°C inkubieren. Nach der Inkubation wurden alle Proben mit 1 μl PEI-Sepharose-Teilchen behandelt, stark gevortext, dann für 30 Sekunden zentrifugiert, um die Teilchen zu pelletieren. Die Überstände wurden entfernt und die Teilchen wurden wieder in 100 μl 1X Mungbohnennuklease-Puffer suspendiert. Die gesamten Inhalte von jedem Röhrchen wurden in eine Mikrotiterplatte überführt und auf Fluoreszenz unter Verwendung eines Wallac, Victor, 1420 Multilabel Counter analysiert. Die Fluoreszenzwerte sind in relativen Lichteinheiten (rlu) beschrieben.
Ergebnisse:
Die Fluoreszenzmessungen der zwei „kein Ziel"-Kontrollen, Probe Nr. 3 und Probe Nr. 6, ergaben ähnliche Wert wie erwartet wurden (400 beziehungsweise 466 rlu). Die „kein Ziel"-Werte wurden von den Rohfluoreszenz-Werten der anderen Proben subtrahiert, um Werte minus Hintergrundsignal zu erhalten. Die Werte minus Hintergrundsignal für die verbleibenden Proben waren wie folgt: Probe Nr. 1 (4926 rlu); Probe Nr. 2 (338 rlu); Probe Nr. 4 (8896 rlu) und Probe Nr. 5 (2532 rlu).
Ein Vergleich von Enzym-behandelten und -unbehandelten Proben enthüllt die relativen Vorteile einer Nukleasebehandlung. Ein Vergleich von Probe Nr. 1 und Probe Nr. 4 zeigt einen 45%igen Verlust des Signals von dem komplementären Ziel, KRASWT(24), wenn mit der Nuklease behandelt wird ((8896–4929):8896 = 45%). Im Gegensatz zeigt ein Vergleich von Probe Nr. 2 mit Probe Nr. 5 einen 87%igen Verlust des Signals von dem einzelne Base-Fehlpaarungsziel, KRASMU(24), bei Enyzmbehandlung (((2532–338):2532) = 87%). Als ein Ergebnis des unterschiedlichen Verlusts des Signals von dem nicht perfekten Komplement verglichen mit dem perfekten Komplement, was enzymatischer Verdauung zugeschrieben werden kann, gibt es einen entsprechenden Anstieg des Signal-Rausch-Verhältnisses (vollständig komplementäres Signal dividiert durch Fehlpaarungs-Signal, S/N) für den Test. Der S/N-Wert für die Probe, welche nicht mit Enzym behandelt worden war, war 3,5 (8896:2532 = 3,5) und der S/N-Wert für die Probe, welche mit Enzym behandelt worden war, war 14,6 (4926:338 = 14,6). Obwohl ein Verlust von spezifischem Signal in den Enzym-behandelten Proben beobachtet wurde (vergleiche Rohfluoreszenz für die Probear. 1 und 2 mit 4 beziehungsweise 5), war der Nettogewinn von Signal zu Rauschen für die Gesamtleistung des Tests sehr vorteilhaft.
Insgesamt zeigen diese Daten, dass der Schutz-/Verdautest mit elektrostatischer Immobilisierung des Komplexes aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz kombiniert werden kann, um ein schnelles Ergebnis bereit zu stellen. Die Nicht-Nukleotid-Sonde kann eine lineare Beacon und der Test selbstanzeigend sein. Zusätzlich kann das Ergebnis des Tests wesentlich durch vernünftige Modulierung der Testtemperatur, um dabei Nukleinsäure zu schmelzen und zu verdauen, welche falsche positive Ergebnisse erzeugt, verbessert werden.
Beispiel 15: Arraytest
Für diesen Test wurde ein kommerziell erhältlicher Objektträger mit einer kationischen Oberfläche zur elektrostatischen Immobilisierung von vorgemischten Nuldeinsäure und Sonde enthaltenden Proben, welche auf den Objektträger in einem Array von Punkten abgeschieden wurden, verwendet. Der Objektträger wurde dann zur Entfernung von nicht hybridisierter Sonde gewaschen und die Zielsequenz, wenn auf dem Objektträger vorhanden, wurde detektiert.
Herstellung von Sonde, Zielen und Teilchen:
Das Cyanin-3 (Cy3)-markierte PNA 15-mer (RASWT-Cy3) in einer Lösung von 50%igem wässrigem N,N-Dimethylformamid in einer Konzentration von 570 pMol/μl wurde auf eine Konzentration von 20 pMol/μl in Hybridisierungspuffer (12% wässriges Formamid, 5 mM Tris-Hydrochlorid, 25 mM Natriumchlorid und 0,05% SDS bei einem pH-Wert von 7,5) verdünnt. Das DNA-Oligonukleotid 31-mer (KRASMU(31)), welches zu RASWT-Cy3 komplementär war, in Wasser in einer Konzentration von 20 pMol/μl wurde 221-fach auf eine Konzentration von 1 pMol/μl in Hybridisierungspuffer verdünnt. Das DNA-Oligonukleotid 60-mer (CompDNA), welches zu RASWT-Cy3 nicht komplementär war, in Wasser in einer Konzentration von 90 pMol/μl wurde 90-fach auf eine Konzentration von 1 pMol/μl in Hybridisierungspuffer verdünnt.
Hybridisierung, punktförmiges Auftragen und Datenaufnahme:

Röhrchen A: In einem Mikrofuge-Röhrchen wurden 1 μl Wasser mit 1 μl RASWT-Cy3 und 18 μl Hybridisierungspuffer kombiniert.
Röhrchen B: In einem Mikrofuge-Röhrchen wurden 1 μl KRASMU(31) mit 1 μl RASWT-Cy3 und 18 c Hybridisierungspuffer kombiniert.
Röhrchen C: In einem Mikrofuge-Röhrchen wurden 1 μl CompDNA mit 1 μl RASWT-Cy3 und 18 μl Hybridisierungspuffer kombiniert.

Die Röhrchen A, B und C wurden für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann wurden 0,2 μl der Lösung von jedem Röhrchen als eine Reihe von Tropfen auf einen GAPS-überzogenen Objektträger (Corning, Corning NY) aufgebracht. Der Objektträger hatte eine gamma-Aminopropylsilan-überzogene Oberfläche. Der Objektträger wurde für einen Zeitraum von ungefähr 20 min in einem Ofen, welcher bei 50°C gehalten wurde, bis die Punkte getrocknet waren, platziert. Der Objektträger wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und es wurde ein Bild davon gemacht, um den Ort der Punkte auf dem Objektträger zu verifizieren. Eine Genetic Microsystems-Arraymikrobildgebungsvorrichtung (GMS 318, Wobum, MA) wurde zum Aufnehmen von Objektträgerbildern unter Verwendung des grünen Lasers gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Der Objektträger wurde dann von der Bildgebungsvorrichtung entfernt und mit Hybridisierungspuffer in einem kleinen Trog mit sanfter Bewegung für 5 min bei Raumtemperatur gewaschen. Der Objektträger wurde dann mit deionisiertem Wasser gespült, geschüttelt, um überschüssiges Wasser zu entfernen, und man ließ ihn auf dem Labortisch trocknen. Das Bild des gewaschenen Objektträgers wurde wieder aufgenommen.
Ergebnisse:
Die 6A und 6B sind die Bilder des Objektträger, welche vor beziehungsweise nach dem Waschschritt gemacht wurden. Vor dem Waschen waren drei sichtbare Punkte, welche als A, B und C markiert sind, entsprechend den Umsetzungen der Röhrchen A, B und C, vorhanden. Jedoch nach dem Waschschritt (6B) war Punkt A nicht länger für das Instrument sichtbar. Dies zeigt, dass die PNA-Sonde in der Abwesenheit von jedweder Nuk leinsäure von der Objektträgeroberfläche durch den Waschschritt entfernt wurde. Als das komplementäre Ziel KKRASMU(31) vorhanden war, wurde das sichtbare Signal an dem Arrayort erhalten (Punkt B), vermutlich aufgrund der Hybridisierung der Sonde an dem elektrostatisch immobilisierten Ziel. Als eine nicht-komplementäre Nukleinsäure verwendet wurde, wurde ein Großteil der PNA-Sonde abgewaschen (Punkt C). Insgesamt zeigen die Daten, dass es möglich ist, einen Matrixarray von elektrostatisch immobilisierter Nukleinsäure herzustellen und einfach auf die Anwesenheit einer darauf örtlich konzentrierten Zielsequenz unter Verwendung einer Nicht-Nukleotid-Sonde zu testen.
Beispiel 16: Linientest
In dem Beispiel wird ein Linientest durchgeführt, wobei ein Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz unter Verwendung einer Linie von polykationischem Polymer auf einem kommerziell erhältlichen Membranmaterial eingefangen wird, wobei Reagenzien ein Aufsaugen in die Membran ermöglicht wird, wie es für einen lateralen Durchflusstest typisch ist.
Herstellung einer Membran:
Streifen (2,5 cm × 20 cm) einer Millipore-Membran (P/N WOPP, Bedford, MA) wurden in einer Lösung von 0,5% Glutaraldehyd in Ethanol befeuchtet. Die feuchten Streifen wurden auf einem Stück Whatman 3MM-Papier in einem Rauchabzug platziert. Nach 3 Minuten, als die Filterstreifen trocken erschienen, wurden sie aus dem Abzug genommen und auf einer Platte eines Ivek-Mikroabscheiders (Ivek Corp., Springfield, VT) platziert. Eine 3 mm breite Linie einer Polyethylenamin(PEI)-Lösung wurde dann entlang des Mittelpunkts von jedem Membranstreifen aufgebracht. Die PEI-Lösung wurde vorher durch Lösen von PEI mit einem Molekulargewicht von 750.000 (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) in Wasser und Einstellen des pH-Werts auf 8,5 mit verdünnter Salzsäure hergestellt. Die PEI-Lösung wurde dann auf eine Endkonzentration von 1 mg PEI pro Milliliter verdünnt.
Nachdem auf die Filterstreifen die PEI-Lösung abgeschieden worden war, ließ man sie über Nacht auf dem Labortisch trocknen. Am nächsten Tag wurden die Streifen mit verdünnter Salzsäure, pH-Wert ~ 3, für 45 Minuten gewaschen. Die Streifen wurden dann mit Wasser gewaschen und auf einem Whatman 3MM-Papier zum Trocknen für 24 Stunden platziert. Die Streifen wurden in kleinere Stücke mit 1 cm Breite mal 2,5 cm Länge geschnitten, so dass jeder Streifen eine PEI-Linie durch seinen Mittelpunkt aufwies. An einem Ende wurden 5 mm von jedem Stück zwischen zwei Stücke Whatman 3MM-Papier (2 × 1 cm) unter Verwendung einer kleinen Bulldog-Metallklammer in Sandwich-Art eingeklemmt.
Herstellung von Sonde, Zielen und Teilchen
Ein biotinyliertes PNA 15-mer (BioP-15) in einer Lösung von 50%igem wässrigen N,N-Dimethylformamid in einer Konzentration von 333 pMol/μl wurde 333-fach auf eine Endkonzentration von 1 pMol/μl in Hybridisierungspuffer (50% wässriges Formamid, 20 mM Tris-Hydrochlorid, 100 mM Natriumchlorid und 0,1% SDS, pH-Wert 7,5) verdünnt. Das DNA-Oligonukleotid 60-mer (Corp-DNA; siehe Tabelle 1), komplementär zu BioP-15, in Wasser in einer Konzentration von 90 pMol/μl wurde 90-fach auf eine Konzentration von 1 pMol/μl in Hybridisierungspuffer verdünnt. Ein DNA-Oligonukleotid 60-mer (NonCompDNA; siehe Tabelle 1), welche nicht komplementär zu BioP-15 war, in Wasser in einer Konzentration von 221 pMol/μl wurde 221-fach auf eine Konzentration von 1 pMol/μl in Hybridisierungspuffer verdünnt. Eine Suspension von Streptavidin-Gold-Teilchen (Arista Biologicals, Inc., Bethlehem, PA), 40 Reihendurchmesser, wurde 20-fach mit Hybridisierungspuffer verdünnt.
Hybridisierung:

Röhrchen A: In einem Mikrofuge-Röhrchen wurden 2,5 μl CompDNA mit 2,5 μl BioP-15 kombiniert. Die Umsetzung wurde dann für 2 min bei Raumtemperatur inkubiert und 20 μl 40 nm Streptavidin-Gold-Teilchen in Hybridisierungslösung wurden zugegeben.
Röhrchen B: In einem Mikrofuge-Röhrchen wurden 2,5 μl NonCompDNA mit 2,5 μl BioP-15 kombiniert. Die Umsetzung wurde dann für 2 min bei Raumtemperatur inkubiert und 20 μl 40 nm Streptavidin-Gold-Teilchen in Hybridisierungslösung wurden zugegeben.

Linientest:
Die Röhrchen A und B wurden dann nach der Zugabe der Gold-Teilchen für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inhalte der Röhrchen wurden auf ein kleines Stück Parafilm-Laborfilm (American Can Company) überführt. Auf unterschiedliche Teile des Parafilms wurden zwei 20 μl-Tropfen Hybridisierungspuffer punktförmig aufgebracht. In jeden Tropfen wurde das Ende eines Membranstreifens getaucht, so dass sich der Puffer zum durch die Bulldog-Klammer gehaltenen Ende aufsaugte. Die Filterstreifen wurden mit der Flüssigkeit in Kontakt gehalten, bis sich der gesamte Tropfen in die Membran aufgesaugt hatte. Die Enden der zwei Streifen wurden dann getrennt in die Inhalte von Röhrchen A oder Röhrchen B, welche vorher auf saubere Bereiche des Laborfilms überführt worden waren, getaucht. Als die gesamten Tropfen A und B in ihre jeweiligen Filterstreifen aufgesaugt worden waren, wurden die Filterenden dann getrennt in 10 μl-Tropfen von Hybridisierungspuffer getaucht.
Ergebnisse:
Im Falle des Röhrchens A, welches das BioP-15 und sein DNA-Komplement CompDNA enthielt, bildete sich eine rote Linie quer über den Filterstreifen während dem Aufsaugen der Röhrchen A-Inhalte in den Filterstreifen. Im Fall des Röhrchens B wurde keine Linie gesehen. Die Ergebnisse zeigen die Durchführbarkeit eines einfachen Linientests zum Detektieren von Nukleinsäuren unter Verwendung eines kationischen Polymers als eine Einfangzone auf dem Membranfilter.
ÄQUIVALENTE
Obwohl diese Erfindung insbesondere mit Bezugnahmen auf bevorzugte Ausführungsformen davon gezeigt und beschrieben wurde, wird der Fachmann erkennen, dass verschiedene Änderungen in Form und Details darin vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der Erfindung wie durch die angefügten Patentansprüchen definiert abzuweichen.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verfahren zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung einer Zielsequenz eines Nukleinsäuremoleküls in einer Probe, das Verfahren umfasst: e) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit mindestens einer Nicht-Nukleotid-Sonde, worin die Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen an mindestens einen Teil der Zielsequenz hybridisiert bzw. hybridisieren, wenn in der Probe vorhanden, um dadurch einen Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz zu bilden; f) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer Matrix, worin das Nukleinsäuremolekül unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen elektrostatisch an die Matrix bindet und worin das Rückgrat der Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden unter elektrostatischen Bindungsbedingungen ausreichend neutral oder positiv geladen ist, so dass es nur geringe oder keine Affinität für die Matrix aufweist; g) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem oder mehreren Enzymen, die Probenkontaminanten abbauen können, einschließlich des Nukleinsäuremoleküls, nicht jedoch des Komplexes aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz, zu einer Zeit nach dem Durchführen von Schritt (a); und h) das Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren der Nicht-Nukelotid-Sonde oder des Komplexes aus Nicht-Nukelotid-Sonde/Zielsequenz zu einer Zeit nach dem Durchführen von Schritt (b) als ein Mittel zum Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren der Zielsequenz in der Probe.
Verfahren, wie in Anspruch 1 beansprucht, zusätzlich umfassend den Schritt: i) des Einsteilens der Testbedingungen außerhalb des Bereichs der elektrostatischen Bindungsbedingungen, so dass der Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz von der Matrix freigesetzt wird, zu einer Zeit nach dem Durchführen der Schritte (a) bis (c) und vor dem Durchführen von Schritt (d).
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 beansprucht, worin die Probe zunächst mit der oder den Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden in Kontakt gebracht wird oder die Probe zunächst mit der Matrix in Kontakt gebracht wird oder die Probe gleichzeitig mit der oder den Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden und der Matrix in Kontakt gebracht wird.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 beansprucht, worin die Unterscheidung hinsichtlich einer einzelnen Punktmutation erzielt wird, in dem man Schritt (c) bei einer Temperatur in einem fünfzehn Grad-Bereich durchführt, worin der Bereich als fünf Grad oberhalb und zehn Grad unterhalb der Schmelztemperatur des Hybrids definiert wird, das aus der Nicht-Nukleotid-Sonde und dem Nukleinsäuremolekül gebildet wird, das im Test unterschieden werden soll und das im Vergleich zur Zielsequenz eine einzelne Punktmutation aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die Nicht-Nukleotid-Sonde der freigesetzten Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz bestimmt wird, um dadurch die Zielsequenz in der Probe zu detektieren, identifizieren oder quantifizieren.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, worin die Matrix ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem lösungsunlöslichen Polymeren; (b) einer Oberfläche; (c) einem kugelförmigen Träger; (d) einem porösen kugelförmigen Träger; (e) einem gegossenen Polymeren; (f) einem co-polymeren Material; und (g) einem Gel; und worin die Matrix geladene funktionelle Gruppen enthält, die für die Bindung von Nukleinsäure unter elektrostatischen Bindungsbedingungen geeignet sind.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, worin die Matrix zu einer Linie oder Form auf einem Träger solchermaßen formuliert wird, dass dann, wenn der Test für die Anwesenheit der Zielsequenz positiv ist, die Linie oder Form mit dem elektrostatisch immobilisierten Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz im Test de tektiert wird und gegebenenfalls der Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz in einem Gerät für einen lateralen Durchflusstest gebildet wird.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, worin der Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz an einer oder mehreren Positionen auf einem Array gebildet wird.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 oder 5 beansprucht, worin die Matrix einen kugelförmigen Träger umfasst, wodurch die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge an Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz auf der kugelförmigen Trägermatrix unter Anwendung eines Durchfluss- oder statischen Zytometers ermittelt wird.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, worin mindestens eine Nicht-Nukleotid-Sonde selbstanzeigend ist und worin die detektierbare Änderung des Signals der selbstanzeigenden Nicht-Nukleotid-Sonde gemessen wird, um die Zielsequenz, welche in der Probe detektiert werden soll, zu detektieren, identifizieren oder quantifizieren.
Verfahren, wie in Anspruch 10 beansprucht, worin die selbstanzeigende(n) Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden an ein Nukleinsäuresyntheseprodukt oder Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionsprodukt hybridisiert bzw. hybridisieren, welche aus einer Synthese oder einem Amplifikationsprozess resultieren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Strangverdrängungsamplifikation (SDA), der transkriptionsvermittelten Amplifikation (TMA), Rollzyklusamplifikation (RCA) und Q-beta-Replikase-Amplifikation.
Verfahren gemäß Anspruch 11, worin die Matrix temporär von einer oder mehreren Komponenten der Probe abgeschirmt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die Matrix temporär durch Zusatz von Glycerin zum Test abgeschirmt wird.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 11 bis 13 beansprucht, worin die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge an Zielsequenz in der Probe in Echtzeit gemessen wird.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht, worin die Nicht-Nukleotid-Sonde mit mindestens einer detektierbaren Einheit markiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, worin die detektierbare Einheit aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus einem Chromophor, einem Fluorochrom, einer Spin-Markierung, einem Radioisotop, einem Enzym, einem Hapten und einer chemilumineszenten Verbindung besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 16, worin das Enzym aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus alkalischer Phosphatase, Sojabohnenperoxidase und Meerrettichperoxidase besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 16, worin das Hapten aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Fluorescein, Biotin, 2,4-Dinitrophenyl und Digoxigenin besteht.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht, worin die Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden nicht markiert ist bzw. sind und das Verfahren ferner umfasst: iii) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem detektierbaren Antikörper zu dem Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz unter geeigneten Antikörperbindungsbedingungen, so dass der detektierbare Antikörper an den Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz bindet; und iv) das Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren des detektierbaren Antikörpers als ein Mittel zum Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren der Zielsequenz in der Probe.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 19 beansprucht, worin die Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden ein unter elektrostatischen Bindungsbedingungen vollständig neutrales Rückgrat umfasst bzw. umfassen.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 20 beansprucht, worin die Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden Peptidnukleinsäuren sind.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 21 beansprucht, worin die sondierende Nukleobasensequenz zur Zielsequenz im Wesentlichen komplementär ist.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 22 beansprucht, worin die sondierende Nukleobasensequenz zur Zielsequenz exakt komplementär ist.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 23 beansprucht, worin die Zielsequenz für die Detektion eines Organismus, Virus, Pilzes oder Pathogens, welche in einem Test detektiert werden sollen, charakteristisch ist.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 23 beansprucht, worin die Zielsequenz für die Detektion einer genetisch begründeten Erkrankung charakteristisch ist oder für die Detektion einer Prädisposition für eine genetisch begründete Erkrankung charakteristisch ist.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 1 bis 25 beansprucht, worin eine oder mehrere Nicht-Ziel-Sonden zum Test zugesetzt werden, um dadurch die Unterscheidung des Tests hinsichtlich einer einzelnen Punktmutation zu verbessern.