DE69920040T2

DE69920040T2 - Verfahren, reagentiensätze und zusammenstellungen zur erkennung von elektrostatisch an matrizen gebundene nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69920040T2
Application number: DE69920040T
Authority: DE
Inventors: T. Jack JOHANSEN; J. Jens HYLDIG-NIELSEN; J. Mark FIANDACA; M. James COULL
Original assignee: Boston Probes Inc
Current assignee: Boston Probes Inc
Priority date: 1998-12-08
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2019-12-09
Also published as: ATE275640T1; EP1137807B1; DK1536023T3; DE69938400T2; DK1137807T3; EP1137807A1; DE69938400D1; AU1751400A; EP1536023A1; ATE389732T1; DE69920040D1; EP1536023B1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der sondenbasierten Detektion, Analyse und Quantifizierung von Nucleinsäuren, die elektrostatisch auf Matrizes immobilisiert sind. Die Verfahren, Kits und Zusammensetzungen dieser Erfindung sind besonders gut geeignet für die Analyse und insbesondere für die Analyse einer einzelnen Punktmutation in einem Partikeltest, in einem Arraytest, in einem Nucleaseverdauungs-/Schutztest, in einem Linientest und/oder in einem selbstanzeigenden Testformat.
2. Beschreibung des verwandten Standes der Technik
Nucleinsäurehybridisierung ist ein fundamentaler Vorgang in der Molekularbiologie. Sondenbasierte Tests sind nützlich bei der Detektion, Quantifizierung und Analyse von Nucleinsäuren. Nucleinsäuresonden wurden schon lange genutzt, um Proben auf die Anwesenheit von Nucleinsäure aus Bakterien, Eukaryoten, Pilzen, Viren oder anderen Organismen zu analysieren, und sind auch nützlich bei der Untersuchung von auf Genetik basierenden Erkrankungszuständen oder klinischen Zuständen von Interesse in einzelnen Zellen ebenso wie in Geweben.
Probenzubereitungsverfahren, die das wiederholte Einfangen und Freisetzen von Zielsequenzen an und von Trägern (z. B. Magnetperlen) als ein Mittel beschreiben, um Nicht-Ziel-Polynucleotide, Trümmer und Verunreinigungen, die dazu neigen, einen Hintergrund in einen Hybridisierungstest einzuführen, zu entfernen, sind im Stand der Technik bekannt (siehe Collins et al., US 5,750,338 ). Allgemein können die Probenzubereitungsverfahren von Collins et al. in den meisten Ausführungsbeispielen traditioneller Hybridisierungstests verwendet werden, vorausgesetzt jedoch, dass die Zielnucleinsäure zuerst an einem Träger immobilisiert wird und danach von dem Träger so freigesetzt wird, dass sie, wenn sie freigesetzt worden ist, im Wesentlichen frei von Probenverunreinigungen, -trümmern und fremden Polynucleotiden ist. Die Erfindung von Collins et al. erfordert es jedoch, dass die Sonde oder Sonden assoziiert sein müssen oder in der Lage sein müssen, mit dem Untergrund unter Bindungsbedingungen zu assoziieren, um dadurch die Nucleinsäure von Interesse auf dem Untergrund zu immobilisieren (siehe Collins et al. in Spalte 4, Zeile 55 bis Spalte 5, Zeile 13).
Ein auf Sonden basiertes Probenzubereitungsverfahren für die Entfernung von Kontaminationen vor der PCR-Reaktion wurde beschrieben von Goldin et al. (siehe US 5,200,314 ). Dieses Vorgehen benötigt eine von einem Analyten eingefangene Sonde, die sowohl eine Analytenbindungsregion als auch einen ersten spezifischen Bindungspartner hat. Ähnlich wie die Erfindung von Collins et al. benötigt die Erfindung von Goldin et al., dass die vom Analyten eingefangene Sonde mit dem Träger in Wechselwirkung tritt, als das spezifische Mittel, durch welches die Zielsequenz immobilisiert wird.
Es wurden polykationische feste Träger für die Analyse und Reinigung von Nucleinsäuren, einschließlich der Reinigung von Polynucleotiden aus Lösungen, die Kontaminationen enthalten (siehe Arnold et al., US 5,599,667 ), verwendet. Arnold et al. beschreiben Tests, die feste Träger als ein Mittel benutzen, um Polynucleotide und mit einer Nucleotidsonde gebildete Hybride davon von unhybridisierter Sonde zu trennen (siehe Zusammenfassung der US 5,599,667 ). Die Erfindung wird postuliert als "... the discovery that polycationic solid supports can be used to selectively adsorb nucleotide multimers according to their size (emphasis added), larger multimers being more tightly bound to the support than smaller ones". [Übersetzung: „... der Entdeckung, dass polykationische feste Träger verwendet werden können, um selektiv Nucleotidmultimere nach ihrer Größe (Hervorhebung hinzugefügt) zu adsorbieren, wobei größere Multimere enger an den Untergrund gebunden werden als kleinere".] (siehe Spalte 4, Zeilen 39–44). Die Verfahren können auch verwendet werden, um die Nucleotidmultimere von Nicht-Nucleotid-Material zu trennen (siehe Spalte 5, Zeilen 25–28).
Eine wesentliche Beschränkung der Erfindung von Arnold et al. ist das Wechselspiel, welches zwischen der Zusammensetzung des kationischen festen Trägers und der Formulierung kontaktierender Lösungen besteht, ebenso wie das Wechselspiel zwischen zwei oder mehr der kontaktierenden Lösungen (siehe Spalte 7, Zeile 24, bis Spalte 8, Zeile 32), welche benötigt werden, um zwischen Nucleotidmultimeren zu unterscheiden (siehe Spalte 8, Zeilen 39–41). Ein Beispiel eines arbeitsaufwändigen Protokolls, um zu einer sauberen Kationendichte für einen festen Träger zu gelangen, kann in Spalte 9, Zeilen 36–52, gefunden werden und das Verfahren für die Bestimmung der Pufferkonzentration, die geeignet ist für die Auftrennung von Polynucleotiden und Nucleotidsonden, kann in Spalte 9, Zeilen 53–63, gefunden werden. Ähnlich muss die Auftrennungslösung vorsichtig gestaltet werden (siehe Spalte 10, Zeilen 9–12), vermutlich unter Verwendung des arbeitsaufwändigen Verfahrens des Versuchs und Irrtums, wie beschrieben für die Bestimmung der Kationendichte des festen Trägers. Dieses Erfordernis nach der substanziellen Optimierung der Testbedingungen innerhalb eines sehr engen Arbeitsbereiches resultiert daraus, dass die elektrostatische Immobilisierung von Nucleinsäure ein vergleichsweise unspezifischer Vorgang ist und es deswegen schwierig ist, eine negativ geladene Zielnucleinsäure auf einer kationischen Oberfläche elektrostatisch zu immobilisieren, ohne dass die positiv geladene Matrix auch eine starke Affinität für die negativ geladene Nucleinsäuresonde ausübt. Da die Auftrennung von Nucleotidmultimeren (Nucleotidsonde/Zielhybride aus überschüssiger Nucleotidsonde) innerhalb eines engen Bereichs von Bedingungen geschieht, die nicht notwendigerweise optimal für die Unterscheidung der Hybridisierung sein müssen, mögen die Hybride, die immer noch gemäß der Erfindung von Arnold et al. immobilisiert sind, nicht wirklich anzeigend sein für die Anwesenheit einer Zielsequenz. Folglich ist die Anwendbarkeit der Tests von Arnold et al. von begrenztem praktischem Nutzen.
Es wurde kürzlich eine Erfindung, die sich auf die Archivierung von Nucleinsäure bezog, beschrieben (siehe Gerdes et al., WO98/46797). Gerdes et al. verwenden hochelektropositive Festphasenmaterialien, um Nucleinsäuren für wiederholte Analysen einzufangen (siehe Seite 5, Zeile 24, bis Seite 6, Zeile 14). Eine wesentliche Begrenzung der Erfindung von Gerdes et al. liegt jedoch darin, dass die Nucleinsäure irreversibel an das hochelektropositive Festphasenmaterial gebunden werden muss.
Verfahren für das Hochdurchsatz-Screening für Sequenzen oder genetische Änderungen in Nucleinsäure wurden beschrieben (siehe A. P. Shuber, US 5,834,181 ). Shuber beschreibt die Analyse von Arrays immobilisierter Nucleinsäuren und schlägt die Immobilisierung der Nucleinsäure auf Nitrocellulose oder einer geladenen Nylonmembran vor (siehe Spalte 6, Zeilen 41–64). Die vorgeschlagenen Purin und Pyrimidin enthaltenden Polymere, welche für das Analysieren immobilisierter Nucleinsäure verwendet werden können, schließen Peptid-Nucleinsäure ein (siehe Spalte 5, Zeilen 15–20), die Polymere müssen jedoch notwendigerweise mit einem Anhang versehen oder markiert werden, da die Nachweisverfahren auf einem Anhang oder einer Markierung beruhen, die in das Polymer eingebaut wurde (siehe Spalte 6, Zeile 58, bis Spalte 9, Zeile 3). Die Tests von Shuber erfordern ein perfektes Komplement zwischen Sonde und Zielsequenz (siehe Spalte 8, Zeilen 52–58). Um eine saubere Unterscheidung zu erreichen, wird ein arbeitsaufwändiger empirischer Vorgang von Versuch und Irrtum für die Testoptimierung beschrieben (siehe Spalte 7, Zeile 16, bis Spalte 8). Bedingungen, die die Optimierung spezifischer und unspezifischer Hybridisierung erfordern, schließen die Konzentration des Polymers, die Temperatur der Hybridisierung, die Salzkonzentration und die Anwesenheit oder Abwesenheit nicht verwandter Nucleinsäure ein (siehe Spalte 8, Zeilen 15–18).
Shuber schlägt nicht ausdrücklich die Durchführung eines auf Sonden basierten Hybridisierungstests an einer elektrostatisch immobilisierten Nucleinsäure vor und besonders beschreibt er oder lehrt er nicht die Analyse elektrostatisch immobilisierter Nucleinsäure unter Verwendung einer Nicht-Nucleotidsonde wie einer Peptid-Nucleinsäure. Weiterhin schlägt Shuber nicht vor, offenbart oder lehrt irgendwelche Vorteile wie die Fähigkeit, innerhalb eines breiten Bereichs an Testbedingungen zu arbeiten, die Durchführung einer auf Peptid-Nucleinsäure basierten Analyse von Nucleinsäure, die elektrostatisch auf einer Matrix immobilisiert ist.
Pluskal et al. beschreiben einen Vergleich von einer auf DNA und Peptid-Nucleinsäure (PNA) basierenden Analyse von Nucleinsäure, die irreversibel mit geladener Nylonmembran vernetzt worden ist (siehe Pluskal et al., American Society for Biochemistry, 85th Annual Meeting, Washington, DC, Mai 1994). Pluskal et al. lehren, dass während PNA-Sonden verwendet werden können, um die irreversibel immobilisierte Nucleinsäure unter Standard-Hybridisierungsbedingungen nachzuweisen, PNA sehr gut unter hochstringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen arbeitet (siehe den Abschnitt, der überschrieben ist mit "Discussion"). Pluskal et al. lehren auch die Verwendung von 1% BSA als ein Blockierungsmittel, um die unspezifische Bindung der Sonde an die Membran zu reduzieren (siehe den Abschnitt, überschrieben mit "Discussion"). Da die Nucleinsäure von Pluskal et al. irreversibel mit der Nylonmembran vernetzt wurde, können hochstringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen an der Membran angewandt werden, ohne die Menge der auf dem Träger vorhandenen und für die Analyse zugänglichen Zielnucleinsäure zu reduzieren. Pluskal et al. demonstrieren deswegen ein Grundprinzip für das irreversible Verknüpfen der zu analysierenden Nucleinsäure mit dem Untergrund und der Verwendung eines Blockierungsmittels, wenn eine auf einer PNA-Sonde basierende Analyse unter Verwendung einer geladenen Nylonmembran durchgeführt wird.
Verfahren für den Schutz von Nucleinsäuresequenzen vor dem Nucleaseabbau/-verdauung durch Hybridisierung einer Nucleinsäure, die analog dazu ist, wurden beschrieben (siehe Stanley et al., US 5,861,250 ). Die in Stanley et al. beschriebenen Verfahren und Zubereitungen sind besonders gut geeignet für das „"cleaning up" a nucleic acid sample by degrading all nucleic acid present except the target sequence, ..." [Übersetzung: „"Aufräumen" einer Nucleinsäureprobe durch Abbauen sämtlicher, mit Ausnahme der Zielsequenz, vorhandener Nucleinsäure, ..."] (siehe Stanley et al. in Spalte 7, Zeilen 14–18). Stanley et al. beschreiben etliche Mittel für das Trennen eines hybridisierten Nucleinsäureanalogons von einem nicht hybridisierten Nucleinsäureanalogon, einschließlich Ionenaustauschchromatographie (siehe Spalte 6, Zeilen 62–64), sie beschreiben jedoch nicht die einfache elektrostatische Immobilisierung der Zielsequenz oder des Komplexes aus Nucleinsäureanalogon und Zielsequenz an eine Matrix als Mittel, um das hybridisierte Nucleinsäureanalogon von dem nicht hybridisierten Nucleinsäureanalogon zu trennen oder anderweitig den Komplex aus Nucleinsäureanalogon und Zielsequenz von den anderen Bestandteilen einer Probe zu trennen.
Verfahren und Geräte für den elektroaktiven Transport und die Fixierung von Nucleinsäuren für die Analyse wurden beschrieben (siehe Heller et al., US 5,849,486 ). Diese Erfindung benötigt jedoch hochausgetüftelte Instrumentierungen und Vorrichtungen, um eine Probe zu transportieren, zu fixieren und/oder zu analysieren.
Obwohl van den Engh den Nachweis von komplexen Makromolekülen wie Nucleinsäure nicht diskutieren, sind fluoreszierende Reporterperlen und Verfahren für das Nachweisen der Anwesenheit oder für die Bestimmung der Konzentration von fluiden Masseanalyten wie pH-Wert, Sauerstoffsättigung und Ionengehalt im Stand der Technik bekannt (siehe van den Engh et al., US 5,747,349 ). Nach van den Engh "Reporter beads are added to a fluid sample and the analyte concentration is determined by measuring fluorescence of individual beads, for example in a flow cytometer" [Übersetzung: "Reporterperlen werden zu einer flüssigen Probe hinzugefügt und die Analytenkonzentration wird bestimmt durch Messen der Fluoreszenz einzelner Perlen, z. B. in einem Durchflusszytometer"] (siehe Zusammenfassung von US 5,747,349 ). Die Perlen von van den Engh et al. umfassen eine Substratperle mit einer Vielzahl fluoreszierender Reportermoleküle, die darauf immobilisiert sind, worin die fluoreszierenden Reportermoleküle ein Fluoreszenzmolekül umfassen, dessen Fluoreszenzeigenschaften eine Funktion der Konzentration desjenigen Analyten sind, dessen Anwesenheit oder Konzentration bestimmt werden soll (siehe US 5,747,349 in Spalte 3, Zeilen 29–46). Folglich sind die Perlen von van den Engh schon an sich fluoreszierend und nicht die Analyten oder Derivate davon.
Kürzlich wurden Zubereitungen, die wenigstens eine Perle enthalten, welche mit einem festen Träger konjugiert sind und weiter mit wenigstens einem Makromolekül konjugiert sind, im Stand der Technik beschrieben (siehe Lough et al., PCT/US97/20194). Die beanspruchten Vorteile von Lough et al. schließen eine erhöhte Oberfläche für die Immobilisierung biologischer Partikel oder Makromoleküle im Vergleich zu flachen Trägern ein, ebenso wie die Fähigkeit, eine Chemie für die Immobilisierung der Makromoleküle an die Perle zu verwenden und eine davon unterschiedliche Chemie, um die Perle an den Untergrund anzuheften. Lough et al. definieren Makromoleküle als Nucleinsäuren einschließend (siehe Seite 7, Zeilen 10–17) und definieren weiter Peptid-Nucleinsäuren (PNA) als Analoga von Nucleinsäuren seiend (siehe Seite 8, Zeilen 4–9). Die Erfindung von Lough et al. ist primär auf die Analyse immobilisierter Makromoleküle gerichtet. Kurioserweise wird jedoch ein sondenbasierter Test nicht als ein Nachweisverfahren beschrieben, sondern Lough et al. sind eher auf die direkte Analyse des immobilisierten Makromoleküls durch Mittel wie die MALDI-TOF-Massenspektrometrie gerichtet. Abgesehen davon, dass sie von Lough et al. für ein Analogon einer Nucleinsäure erachtet wird, ist PNA nicht anderweitig in der Offenbarung erwähnt und keine Beispiele sind bereitgestellt, die zeigen, dass PNA für die Praxis der Erfindung geeignet ist.
Trotz seines Namens ist Peptid-Nucleinsäure (PNA) weder ein Peptid, eine Nucleinsäure noch ist sie eine Säure. Peptid-Nucleinsäure (PNA) ist ein natürlich nicht vorkommendes Polyamid, das mit Nucleinsäure (DNA und RNA) mit Sequenzspezifität hybridisieren kann (siehe US-Patente Nrn. 5,539,082, 5,527,675, 5,623,049, 5,714,331, 5,736,336, 5,773,571 oder 5,786,461, ebenso wie Egholm et al., Nature, 365: 566-568 (1993)). Da es ein natürlich nicht vorkommendes Molekül ist, ist unmodifizierte PNA nicht als ein Substrat für die Enzyme bekannt, von denen bekannt ist, dass sie Peptide oder Nucleinsäuren abbauen. Deswegen sollte PNA in biologischen Proben stabil sein, ebenso wie sie eine lange Lagerdauer haben sollten. Anders als die Nucleinsäure-Hybridisierung, die sehr abhängig von der Ionenstärke ist, ist die Hybridisierung einer PNA mit einer Nucleinsäure ziemlich unabhängig von der Ionenstärke und ist bei einer niedrigen Ionenstärke begünstigt; Bedingungen, die stark die Hybridisierung von Nucleinsäure mit Nucleinsäure benachteiligen (Egholm et al., Nature auf Seite 567). Die Wirkung der Ionenstärke auf die Stabilität und Konformation von PNA-Komplexen wurde ausgedehnt untersucht (Tomac et al., J. Am. Chem. Soc., 118: 5544-5552 (1996). Die Sequenzunterscheidung ist wirksamer für PNA, die DNA erkennt, als für DNA, die DNA erkennt (Egholm et al., Nature auf Seite 566). Die Vorteile in der Unterscheidung von Punktmutationen mit PNA-Sonden im Vergleich mit DNA-Sonden in einem Hybridisierungstest scheinen jedoch etwas sequenzabhängig zu sein (Nielsen et al., Anti-Cancer Drug Design, 8: 53-65, (1993), und Weiler et al., Nucl. Acids Res., 25: 279202799 (1997)).
Da die Nucleinsäuren einer komplexen Probe, wie ein Zelllysat oder eine PCR-Reaktionsmischung, konzentriert werden können und auch teilweise durch Immobilisierung auf Träger gereinigt werden können, könnten sondenbasierte Hybridisierungstests vereinfacht werden, falls die Anwesenheit einer Zielnucleinsäure spezifisch nachgewiesen werden könnte, während die Zielnucleinsäure trägergebunden bleibt; besonders, falls die Bedingungen für die Behandlung, Analyse und/oder Nachweis der Zielsequenz innerhalb eines breiten Bereiches funktionsfähig wären, so dass die Testbedingungen keine wesentliche und arbeitsaufwändige Optimierung benötigen. Die Fähigkeit, solche Analyse unter Verwendung eines Durchflusszytometers, eines Arrays, eines Nucleaseverdauungs/Schutztests, eines Linientests, eines selbstanzeigenden Tests oder in irgendeiner Kombination dieser Testformate, durchzuführen, wäre besonders günstig.
Die EP 0 411 186 A offenbart einen DNA-Sondentest unter Verwendung von neutral geladenen Sondensträngen. Die Sondenstränge sind Oligonucleotide.
Offenbarung der Erfindung
1. Zusammenfassung
Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren, Kits und Zusammensetzungen, die für die Detektion, die Identifizierung und/oder Quantifizierung von Nucleinsäuren, welche elektrostatisch auf Matrizes immobilisiert sind, geeignet sind, unter Verwendung von selbstanzeigenden Nicht-Nucleotidsonden, die sequenzspezifisch mit einer oder mehreren Zielsequenzen der Nucleinsäure hybridisieren, die jedoch nicht anderweitig wesentlich mit der Matrix in Wechselwirkung treten. Wenn die Nucleinsäure einmal immobilisiert ist, kann der nachweisbare Komplex aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz, der vor oder nach der Immobilisierung der Nucleinsäure gebildet wurde, unter einem breiten Bereich an Testbedingungen nachgewiesen, identifiziert oder quantifiziert werden, als ein Mittel, um die Zielsequenz in der Probe zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren. Da sie reversibel gebunden ist, kann die Nicht-Nucleotidsonde/Zielsequenz wahlweise von der Matrix für das Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren der Zielsequenz in der Probe entfernt werden. Da die Nicht-Nucleotidsonde/Zielsequenz gegen Abbau geschützt ist, liegt ein weiterer Vorteil dieser Erfindung darin, dass die Probe mit Enzymen behandelt werden kann, die Probenbestandteile abbauen, entweder bevor oder nachdem die Nucleinsäure an die Matrix gebunden wird, um die Probe (z. B. eine komplexe biologische Probe wie ein Zelllysat) "aufzuräumen" und dabei die Detektion, Identifikation oder Quantifikation der Zielsequenz in der Probe zu verbessern. Folglich haben die Verfahren, Kits und Zusammensetzungen dieser Erfindung wesentliche Vorteile gegenüber sämtlichen zuvor bekannten oder beschriebenen Verfahren, Kits oder Zusammensetzungen, da sie die einfache Verarbeitung und/oder Analyse von Proben und insbesondere von komplexen biologischen Proben unter einem breiten Bereich an Testbedingungen erleichtern.
In einem Ausführungsbeispiel bezieht sich diese Erfindung auf eine Zusammensetzung, umfassend:

a) eine Matrix;
b) mindestens ein Nucleinsäuremolekül, umfassend wenigstens eine Zielsequenz, das elektrostatisch an diese Matrix unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen gebunden ist; und
c) wenigstens eine markierte, selbstanzeigende Nicht-Nucleotidsonde, die nach der Hybridisierung mit einer Zielsequenz detektierbare Eigenschaften ändert und dadurch das Erfordernis für das Entfernen überschüssiger Sonde reduziert oder eliminiert, wobei diese markierte, selbstanzeigende Nicht-Nucleotidsonde eine Sondier-Nucleobasensequenz umfasst, die sequenzspezifisch mit wenigstens einem Teil der einen oder mehreren Zielsequenzen hybridisiert ist, um dabei einen Komplex aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz zu bilden, und worin das Rückgrat der selbstanzeigenden Nicht-Nucleotidsonde oder -sonden unter elektrostatischen Bindungsbedingungen ausreichend neutral oder positiv geladen ist oder sind, so dass es eine geringe oder gar keine Affinität für die Matrix zeigt.

Die Matrix kann ein Matrixarray sein und der Matrixarray kann weiterhin wenigstens ein weiteres Nucleinsäuremolekül umfassen.
In einem anderen Ausführungsbeispiel bezieht sich diese Erfindung auf ein Verfahren für die Detektion, Identifikation oder Quantifikation einer Zielsequenz eines Nucleinsäuremoleküls in einer Probe, wobei dieses Verfahren umfasst:

a) in Kontakt bringen der Probe mit einer Matrix und wenigstens einer markierten, selbstanzeigenden Nicht-Nucleotidsonde, welche detektierbare Eigenschaften nach der Hybridisierung mit einer Zielsequenz ändert und dabei das Erfordernis für die Entfernung überschüssiger Sonde reduziert oder eliminiert; i) worin dieses Nucleinsäuremolekül elektrostatisch an diese Matrix unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen binden wird; und ii) worin diese selbstanzeigende Nicht-Nucleotidsonde oder -sonden unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen mit wenigstens einem Teil der Zielsequenz hybridisieren wird, falls sie in der Probe vorhanden ist, um dadurch einen Komplex aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz zu bilden, und worin das Rückgrat der Nicht-Nucleotidsonde oder -sonden unter elektrostatischen Bindungsbedingungen ausreichend neutral oder positiv geladen ist oder sind, so dass es eine geringe oder gar keine Affinität für die Matrix zeigt; und
b) Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren der detektierbaren Änderung in dem Signal der selbstanzeigenden Nicht-Nucleotidsonde oder -sonden, das durch die Bildung des Komplexes aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz verursacht wird, als ein Mittel, um die Zielsequenz in einer Probe zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren.

In noch einem anderen Ausführungsbeispiel betrifft diese Erfindung ein wie oben beschriebenes Verfahren, worin das Verfahren auch ein Verfahren für die Detektion, Identifikation oder Quantifikation einer zweiten oder weiteren Zielsequenz eines zweiten oder weiteren Nucleinsäuremoleküls, das in einer Probe vorhanden sein kann, ist, wobei dieses Verfahren umfasst:

a) in Kontakt bringen der Probe mit einer Matrix und wenigstens zwei unabhängig voneinander detektierbaren, markierten, selbstanzeigenden Nicht-Nucleotidsonden, welche detektierbare Eigenschaften nach der Hybridisierung mit einer Zielsequenz ändern und dadurch das Erfordernis für die Entfernung überschüssiger Sonde reduzieren oder eliminieren; i) worin dieses Nucleinsäuremolekül oder -moleküle elektrostatisch an diese Matrix unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen binden wird; und ii) worin die zwei oder mehr unabhängig voneinander detektierbaren Nicht-Nucleotidsonden unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen mit wenigstens einem Teil der Zielsequenzen, mit welchen jede Sonde gestaltet ist, zu hybridisieren, falls sie in der Probe vorhanden sind, hybridisieren werden, um dadurch Komplexe aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz zu bilden, und worin das Rückgrat der Nicht-Nucleotidsonden unter elektrostatischen Bindungsbedingungen ausreichend neutral oder positiv geladen ist, so dass es eine geringe oder gar keine Affinität für die Matrix zeigt; und
b) Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren jedes einzelnen unabhängigen voneinander detektierbaren Komplexes aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz als ein Mittel, um jede einzelne Zielsequenz, die in einer Probe detektiert werden soll, zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren, worin die detektierbare Änderung in dem Signal von der selbstanzeigenden Nicht-Nucleotidsonde jedes einzelnen Komplexes aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz gemessen wird, um jede einzigartige Zielsequenz, die in der Probe detektiert werden soll, zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren.

Folglich wird, falls eine bestimmte Zielsequenz elektrostatisch auf der Matrix immobilisiert ist, die unabhängig detektierbare Nicht-Nucleotidsonde, die so gestaltet ist, dass sie mit jener bestimmten Zielsequenz hybridisiert, auf der Matrix konzentriert werden und für die Detektion zugänglich sein.
Wahlweise wird das einzigartige, unabhängig detektierbare Hybrid aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz von der Matrix durch Anpassen der Bedingungen außerhalb des Bereichs, der für die elektrostatische Bindung benötigt wird, freigesetzt werden, und erleichtert dadurch die Detektion des ungebundenen Hybrids aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz oder nur der nachweisbaren Sonde als das Mittel, um die Zielsequenz in der Probe zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren.
In noch einem weiteren Ausführungsbeispiel nutzt diese Erfindung den Vorteil der Stabilität der Komplexe aus Nucleinsäureanalogon und Nucleinsäure (siehe Stanley et al., US 5,861,250 ), um dadurch die Testerscheinung weiter zu verbessern und/oder anderweitig die Arbeit oder Komplexität der Probenzubereitung zu reduzieren.
Ein beispielhaftes Verfahren umfasst ein, wie oben beschriebenes Verfahren, weiterhin umfassend den folgenden Schritt:

c) in Kontakt bringen der Probe mit einem oder mehreren Enzymen, die in der Lage sind, Probenverunreinigungen, einschließlich dem Nucleinsäuremolekül, nicht jedoch den Komplex aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz zu einem Zeitpunkt abzubauen, nachdem die Probe mit der wenigstens einen Nicht-Nucleotidsonde in Kontakt gebracht worden ist, worin das Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren durchgeführt wird, nachdem die Probe mit einem oder mehreren Enzymen in Kontakt gebracht worden ist.

Wahlweise wird das detektierbare Hybrid aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz von der Matrix durch Anpassen der Bedingungen außerhalb des Bereichs, der für die elektrostatische Bindung benötigt wird, freigesetzt und dadurch wird der Nachweis des ungebundenen Hybrids aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz oder nur der nachweisbaren Sonde erleichtert, als ein Mittel, die Zielsequenz in der Probe zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren.
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel bezieht sich diese Erfindung auf ein Verfahren, wie es oben beschrieben ist, worin das Nucleinsäuremolekül elektrostatisch an einer Örtlichkeit auf einem Array immobilisiert ist, bestehend aus der Matrix, wobei dieser Array Nucleinsäuremoleküle umfasst, die an einzigartige Örtlichkeiten elektrostatisch gebunden sind.
Es ist ein Vorteil der Erfindung, dass eines oder mehrere Enzyme, die in der Lage sind, Probenverunreinigungen, einschließlich dem Nucleinsäure-Zielmolekül, nicht jedoch den Komplex aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz abzubauen, ebenfalls vor der Analyse des Arrays hinzugefügt werden können, um dadurch das Erscheinen des Arraytests durch Abbauen von Probenverunreinigungen zu verbessern, welche sonst zu falsch-positiven Ergebnissen führen könnten. Wahlweise können die nachweisbaren Hybride aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz von der Matrix durch Anpassen der Bedingungen außerhalb des Bereiches, der für die elektrostatische Bindung benötigt wird, freigesetzt werden und dadurch wird der Nachweis des ungebundenen Hybrids aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz oder nur der nachweisbaren Sonde erleichtert, als das Mittel, um Zielsequenz in der Probe zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren. Falls die Nicht-Nucleotidsonden unabhängig detektierbar sind, kann die Analyse der Matrix in einem Multiplexformat vonstatten gehen.
In noch einem weiteren Ausführungsbeispiel ist diese Erfindung auf ein Verfahren gerichtet, wie es oben beschrieben ist, worin das Verfahren auch ein Verfahren für die Detektion, Identifikation oder Quantifikation einer Zielsequenz eines Nucleinsäuremoleküls ist, das in einer zweiten oder nachfolgenden Probe von Interesse vorhanden sein kann, wobei dieses Verfahren umfasst:

a) Vermischen der zwei oder mehr Proben von Interesse mit wenigstens einer markierten, selbstanzeigenden Nicht-Nucleotidsonde, welche nach der Hybridisierung mit einer Zielsequenz detektierbare Eigenschaften ändert und dadurch das Erfordernis für das Entfernen überschüssiger Sonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen reduziert oder eliminiert;
b) in Kontakt bringen einer Matrix unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen mit wenigstens einem Teil von jeder der zwei oder mehr Proben, um dadurch die Nucleinsäurebestandteile jeder Probe auf der Matrix, jede an einer einzigartigen Örtlichkeit, elektrostatisch zu immobilisieren und dadurch eine Matrixanordnung aus Proben zu schaffen, worin das Rückgrat der Nicht-Nucleotidsonde oder -sonden unter elektrostatischen Bindungsbedingungen ausreichend neutral oder positiv geladen ist, das heißt es übt eine geringe oder gar keine Affinität für die Matrix aus; und
c) Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren des Komplexes aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz, der elektrostatisch an jede einzigartige Örtlichkeit der Matrixanordnung gebunden ist, als das Mittel um die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge der Zielsequenz in jeder der zwei oder mehr Proben zu bestimmen, worin die nachweisbare Änderung in dem Signal von der selbstanzeigenden Nicht-Nucleotidsonde oder -sonden gemessen wird, wobei die Zielsequenz, die an jeder einzigartigen Örtlichkeit bestimmt werden soll, identifiziert oder quantifiziert wird.

Es ist ein Vorteil der Erfindung, dass eines oder mehrere Enzyme, die in der Lage sind, Probenverunreinigungen, welche möglicherweise das Nucleinsäure-Zielmolekül nicht jedoch den Komplex aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz einschließen, abzubauen, auch vor der Analyse des Arrays hinzugefügt werden kann oder können, um dadurch die Durchführung des Arraytests durch Abbauen von Probenverunreinigungen, welche ansonsten zu falsch-positiven Ergebnissen führen könnten, zu verbessern. Wahlweise können die nachweisbaren Hybride aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz von der Matrix durch Anpassung der Bedingungen außerhalb des Bereichs, der für die elektrostatische Bindung benötigt wird, freigesetzt werden und dadurch wird der Nachweis des ungebundenen Hybrids aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz oder nur der nachweisbaren Sonde erleichtert, als das Mittel, um Zielsequenz in der Probe zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren. Falls die Nicht-Nucleotidsonden unabhängig voneinander nachweisbar sind, kann die Analyse der Matrix in einem Multiplexformat vonstatten gehen.
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel ist diese Erfindung auf einen Kit für die Analyse einer Probe gerichtet, die ein Nucleinsäuremolekül, welches eine Zielsequenz umfasst, enthält, wobei dieser Kit eine Matrix und wenigstens eine markierte, selbstanzeigende Nicht-Nucleotidsonde umfasst, welche nachweisbare Eigenschaften nach der Hybridisierung an eine Zielsequenz ändert und dadurch das Erfordernis für das Entfernen überschüssiger Sonde reduziert oder eliminiert, wobei diese markierte, selbstanzeigende Nicht-Nucleotidsonde eine Sondier-Nucleobasensequenz hat, welche sequenzspezifisch und unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen mit wenigstens einem Teil der Zielsequenz, die in dieser Probe detektiert werden soll, hybridisiert, um dadurch einen Komplex aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz zu bilden, und worin das Rückgrat der Nicht-Nucleotidsonde oder -sonden unter elektrostatischen Bindungsbedingungen ausreichend neutral oder positiv geladen ist oder sind, so dass es eine geringe oder gar keine Affinität für die Matrix zeigt.
Die Zusammensetzungen, Verfahren und Kits dieser Erfindung sind besonders nützlich für die Detektion, Identifikation und/oder das Zählen von Bakterien und Eukaryoten (z. B. Pathogenen) in Nahrungsmitteln, Getränken, Wasser, pharmazeutischen Produkten, Hygieneartikeln, Molkereiprodukten oder Umweltproben. Die Analyse bevorzugter, nicht beschränkter Getränke schließen Soda, Wasser in Flaschen, Fruchtsaft, Bier, Wein oder Likörprodukte ein. Geeignete Zusammensetzungen, Verfahren und Kits werden besonders nützlich sein für die Analyse von Rohmaterialien, Ausrüstung, Produkten oder Prozessen, die für die Herstellung oder die Lagerung von Nahrungsmitteln, Getränken, Wasser, pharmazeutischen Produkten, Hygieneartikeln oder Umweltproben verwendet werden.
Zusätzlich sind die Zusammensetzungen, Verfahren und Kits dieser Erfindung besonders nützlich für die Detektion von Bakterien und Eukaryoten (z. B. Pathogenen) in klinischen Proben und klinischen Umgebungen. Geeignete Zusammensetzungen, Verfahren und Kits werden besonders nützlich sein für die Analyse klinischer Muster, Ausrüstung, Anlagen oder Produkte, die verwendet werden, um Menschen oder Tiere zu behandeln.
2. Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele
I. Definitionen:

a. Wie hierin verwendet, soll der Begriff "Nucleobase" jede natürlich vorkommenden und jede natürlicherweise nicht vorkommenden heterocyclischen Einheiten einschließen, die gewöhnlich jenen bekannt sind, die Nucleinsäuretechnologie nutzen oder die Peptid-Nucleinsäuretechnologie nutzen, um dadurch Polymere zu erzeugen, die sequenzspezifisch mit Nucleinsäuren hybridisieren können.
b. Wie hierin verwendet, ist der Begriff "Nucleobasensequenz" irgendein Segment eines Polymers, welches Nucleobasen enthaltende Untereinheiten umfasst. Nicht begrenzende Beispiele geeigneter Polymere oder Polymersegmente schließen Oligonucleotide, Oligoribonucleotide, Peptid-Nucleinsäuren und Analoga oder Chimären davon ein.
c. Wie hierin verwendet, ist der Begriff "Zielsequenz" die Nucleobasensequenz eines Nucleinsäuremoleküls von Interesse, die in einem Test nachgewiesen werden soll und von der gewünscht wird, dass mit ihr wenigstens ein Teil der Sondier-Nucleobasensequenz der Nicht-Nucleotidsonde hybridisiert. Die Zielsequenz kann einen Untersatz des Nucleinsäuremoleküls umfassen oder sie kann das gesamte Nucleinsäuremolekül von Interesse sein.
d. Wie hierin verwendet, sollen die Begriffe "Markierung" und "detektierbare Einheit" austauschbar sein und sollen sich auf Einheiten beziehen, die an einer Nicht-Nucleotidsonde, einen Antikörper oder ein Antikörperfragment angeheftet werden können, um dadurch die Nicht-Nucleotidsonde, den Antikörper oder das Antikörperfragment durch ein Instrument oder Verfahren detektierbar zu machen.
e. Wie hierin verwendet, soll der Begriff "Nicht-Nucleotidsonde" ein Polymer bedeuten, welches nicht ein Polynucleotid ist, welches jedoch eine Sondier- Nucleobasensequenz umfasst, die so gestaltet ist, dass sie mit wenigstens einem Teil der Zielsequenz hybridisiert. Ein bevorzugtes, nicht begrenzendes Beispiel einer Nicht-Nucleotidsonde ist eine Peptid-Nucleinsäure- (PNA-)Sonde.
f. Wie hierin verwendet, soll der Begriff "Peptid-Nucleinsäure" oder "PNA" als ein Nicht-Nucleotidpolymer definiert werden, das zwei oder mehr PNA-Untereinheiten (-Reste) umfasst, einschließlich irgendeinem der Verbindungen, auf die Bezug genommen wird oder die als Peptid-Nucleinsäuren beansprucht werden in den US-Patenten Nrn. 5,539,082, 5,527,675, 5,623,049, 5,714,331, 5,736,336, 5,773,571 oder 5,786,461 (welche alle hierin durch Bezugnahme eingeschlossen werden). Der Begriff "Peptid-Nucleinsäure" oder "PNA" soll auch auf Polymere angewandt werden, die zwei oder mehr Untereinheiten jener Nachahmer von Nucleinsäuren umfassen, die in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben sind: Diderichsen et al., Tett. Lett., 37: 475–478 (1996); Fujii et al., Bioorg. Med. Chem. Lest., 7: 637–627 (1997); Jordan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 7: 687–690 (1997); Krotz et al., Tett. Lett., 36: 6941–6944 (1995); Lagriffoul et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 4: 1081–1082 (1994); Lowe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1, (1997) 1: 539–546; Lowe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans., 11: 547–554 (1997); Lowe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans., 11: 555–560 (1997); Petersen et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 6: 793–796 (1996); U. Diederichsen, Bioorganic & Med. Chem. Lett., 8: 165–168 (1998); Cantin et al., Tett. Lett., 38: 4211–4214 (1997); Ciapetti et al., Tetrahedron, 53: 1167–1176 (1997); Lagriffoule et al., Chem. Eur. J., 3: 912–919 (1997) und die WIPO-Patentanmeldung WO96/04000 durch Shah et al. und bezeichnet als "Peptide-based nucleic acid mimics (PENAMs)".

In bevorzugten Ausführungsbeispielen ist eine PNA ein Polymer, das zwei oder mehr Untereinheiten der folgenden Formel umfasst:
worin jedes J dasselbe oder unterschiedlich ist und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, R¹, OR¹, SR¹, NHR¹, NR¹ ₂, F, Cl, Br und I. Jedes K ist dasselbe oder unterschiedlich und ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus O, S, NH und NR¹. Jedes R¹ ist dasselbe oder unterschiedlich und ist eine Alkylgruppe mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, die wahlweise ein Heteroatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe enthalten kann. Jedes A ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Einzelbindung, einer Gruppe der Formel -(CJ₂)_S- und einer Gruppe der Formel -(CJ₂)_SC(O)-, worin J definiert ist wie oben und jedes s eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist. Die ganze Zahl t ist 1 oder 2 und die ganze Zahl u ist 1 oder 2. Jedes L ist dasselbe oder unterschiedlich und ist unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus J, Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uridin, 5-Methylcytosin, 2-Aminopurin, 2-Amino-6-chlorpurin, 2,6-Diaminopurin, Hypoxanthin, Pseudoisocytosin, 2-Thiouracil, 2-Thiothymidin, anderen natürlich vorkommenden Nucleobasenanaloga, anderen natürlicherweise nicht vorkommenden Nucleobasen, substituierten und unsubstituierten aromatischen Einheiten, Biotin, Fluorescein und Dabcyl. In dem bevorzugtesten Ausführungsbeispiel besteht eine PNA-Untereinheit aus einer natürlich vorkommenden oder natürlicherweise nicht vorkommenden Nucleobase, die an dem Azastickstoff des N-[2-(Aminoethyl)]glycin-Rückgrats durch eine Methylen-Carbonyl-Verknüpfung angeheftet ist.
II. Beschreibung
A. Allgemeines:
Sonden:
Die für die Praxis dieser Erfindung verwendeten Sonden sind Nicht-Nucleotidsonden, die als ein Minimum eine Sondier-Nucleobasensequenz umfassen, die so gestaltet ist, dass sie mit wenigstens einem Teil einer Zielsequenz, die in einem sondenbasierten Hybridisierungstest detektiert werden soll, hybridisiert. Die Nicht-Nucleotidsonden umfassen ein ausreichend neutrales oder positiv geladenes Rückgrat, so dass sie eine geringe oder gar keine Affinität für die Matrix in einem breiten Bereich von Testbedingungen, einschließlich wesentlichen Variationen im pH-Wert, der Ionenstärke des Puffers, der Detergenzkonzentration und/oder der Konzentration chemischer Denaturierungsmittel, zeigen. Dieser breite Bereich an Bedingungen, unter denen nur geringe oder gar keine Wechselwirkungen zwischen der Nicht-Nucleotidsonde und der Matrix geschehen, ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber den früheren Verfahren wie jenen von Arnold et al. ( US 5,599,667 ), welche wesentliche Optimierung der Bedingungen erfordern, um eine Unterscheidung zu der unspezifischen Bindung der Nucleotidsonde und der Zielnucleinsäure (oder dem Komplex aus Nucleotidsonde und Zielnucleinsäure) an die Matrix zu erreichen.
Es ist immer noch ein weiterer Vorteil dieser Erfindung, dass wesentliche Änderungen in der Ionenstärke des Tests eine geringe Wirkung auf den Tm-Wert des Hybrids aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz haben (siehe (Egholm et al., Nature, 365: 566–568 (1993) und Tomac et al., J. Am. Chem. Soc., 118: 5544–5552 (1996)). Folglich erweitert dieses Fehlen an Sensitivität des Hybrids auf Änderungen in der Ionenstärke ebenfalls den Bereich möglicher Testbedingungen.
Die Nicht-Nucleotidsonden werden mit einer detektierbaren Einheit markiert. Die bevorzugten Nicht-Nucleotidsonden sind PNA-Sonden. Bevorzugte markierte Nicht-Nucleotidsonden sind Nicht-Nucleotid-"Beacon"-Sonden (siehe den Abschnitt, überschrieben mit "Nicht-Nucleotid-"Beacon"-Sonden" unten), da sie selbstanzeigend sind. Mit selbstanzeigend meinen wir, dass die Sonden detektierbare Eigenschaften nach der Hybridisierung mit einer Zielsequenz ändern und dadurch das Erfordernis für die Entfernung überschüssiger Sonde reduzieren oder eliminieren. In einem Ausführungsbeispiel werden die selbstanzeigenden Sonden dieser Erfindung auf einer Änderung in der Fluoreszenz beruhen, welche mit dem Auge beobachtet oder anderweitig mit einem Fluoreszenzgerät detektiert und/oder quantifiziert werden kann.
Da es eine wichtige Eigenschaft dieser Erfindung ist, dass die Nicht-Nucleotidsonden nicht wesentlich mit der Matrix in Wechselwirkung treten, können die Nicht-Nucleotidsonden dieser Erfindung durch geeignete Modifikation auch so gestaltet werden, dass sie eine bestimmte Nettoladung haben. Zum Beispiel können gewisse Auswahlen an Markierungen die Nicht-Nucleotidsonde dazu bringen, eine negative Nettoladung zu haben (siehe Beispiel 9). Die Nettoladung der Sonde kann jedoch durch Hinzufügen einer oder mehrerer positiv geladener Einheiten geändert werden, wie zum Beispiel durch Verknüpfen einer oder mehrerer der Verbindungen 7 oder 8, wie beschrieben von Gildea et al., Tett. Lett., 39: 7255–7258 (1998). Durch die Änderung der Nettoladung können die Sonden so gestaltet werden, dass sie irgendeine Kombination an gewünschten Markierungen haben und immer noch keine Affinität für die Matrix ausüben.
Sondier-Nucleotidsequenz:
Die Sondier-Nucleotidsequenz einer Nicht-Nucleotidsonde, die für die Praxis dieser Erfindung verwendet wird, ist der sequenzerkennende Teil des Konstruktes. Folglich ist die Sondier-Nucleobasensequenz so gestaltet, dass sie mit wenigstens einem Teil der Zielsequenz hybridisiert, da es bevorzugt sein kann, zwei oder mehr Sonden zu verwenden, die so gestaltet sind, dass sie mit der gesamten Zielsequenz hybridisieren (siehe z. B. europäische Patentanmeldung, bezeichnet als "Method of identifying a nucleic acid using triple helix formation of adjacently annealed probes"; EP-A-849-363, ebenso wie die WIPO-Patent-Anmeldung Nr. WO99/55916, bezeichnet als "Methods, Kits and Compositions for Detecting and Quantitating Target Sequences"). Vorzugsweise hybridisiert die Sondier-Nucleobasensequenz mit der gesamten Zielsequenz. Die Detektion der Hybridisierung der Nicht-Nucleotidsonde mit der Zielsequenz kann mit der Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge der in einer Probe vorhandenen Zielsequenz in Beziehung gesetzt werden.
Die Sondier-Nucleobasensequenz einer Nicht-Nucleotidsonde wird vorzugsweise genau komplementär mit der gesamten oder einem Teil der Zielsequenz sein. Alternativ könnte eine im Wesentlichen komplementäre Sondier-Nucleobasensequenz verwendet werden, da gezeigt worden ist, dass eine größere Sequenzunterscheidung erhalten werden kann, wenn Sonden genutzt werden, bei denen eine oder mehrere Punktmutationen (Basenfehlpaarung) zwischen der Sonde und der Zielsequenz bestehen (siehe Guo et al., Nature Biotechnology, 15: 331–335 (1997)).
Mit der gebührenden Berücksichtigung der Erfordernisse einer Nicht-Nucleotidsonde für das gewählte Testformat und die Zielsequenz, die detektiert werden soll, wird die Sondier-Nucleobasensequenz allgemein so gewählt werden, dass ein stabiler Komplex mit der gesamten oder einem Teil der Zielsequenz unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen gebildet wird. Allgemein jedoch werden die für die Praxis dieser Erfindung geeigneten Nicht-Nucleotidsonden eine Sondier-Nucleobasensequenz im Bereich von 5 bis 50 Untereinheiten haben. Bevorzugter wird die Sondier-Nucleobasensequenz im Bereich von 7 bis 25 Untereinheiten lang sein und noch bevorzugter im Bereich von 12 bis 20 Untereinheit in der Länge.
PNA-Synthese:
Verfahren für den chemischen Zusammenbau von PNAs sind wohl bekannt (siehe US-Patente Nrn. 5,539,082, 5,527,675, 5,623,049, 5,714,331, 5,736,336, 5,773,571 oder 5,786,571, hierin durch Bezugnahme eingeschlossen). Chemikalien und Instrumentierung für den automatisierten, trägergebundenen chemischen Zusammenbau von Peptid-Nucleinsäuren sind nun kommerziell zugänglich. Der chemische Zusammenbau einer PNA ist analog zu der Festphasenpeptidsynthese, worin bei jedem Zusammenbauzyklus das Oligomer einen reaktionsfähigen Alkylaminoterminus besitzt, welcher mit dem nächsten zu dem wachsenden Polymer hinzuzufügenden Synthon kondensiert wird. Da Standard-Peptid-Chemie genutzt wird, werden natürliche und nicht natürliche Aminosäuren routinemäßig in ein PNA-Oligomer eingebaut. Da PNA ein Polyamid ist, hat es einen C-Terminus (Carboxylterminus) und einen N-Terminus (Aminoterminus). Für die Zwecke der Gestaltung einer Hybridisierungssonde, die für das antiparallele Binden an die Zielsequenz (die bevorzugte Orientierung) geeignet ist, ist der N-Terminus der Sondier-Nucleobasensequenz der PNA-Sonde das Äquivalent des 5'-Hydroxylterminus eines äquivalenten DNA- oder RNA-Oligonucleotids.
PNA-Markierung:
Die Markierung von PNA erfolgt analog zu der Peptidmarkierung. Da die Synthesechemie des Zusammenbaus im Wesentlichen dieselbe ist, kann jedes Verfahren, das gewöhnlich verwendet wird, um ein Peptid zu markieren, üblicherweise für die Verwendung bei der Markierung einer PNA angepasst werden. Folglich können PNAs mit zahlreichen detektierbaren Einheiten markiert werden. Allgemein kann jede detektierbare Einheit, die mit einer Nucleinsäure oder einem Peptid verknüpft werden kann, mit einem PNA verknüpft werden.
Typischerweise wird der N-Terminus der PNA durch Reaktion mit einer Einheit markiert, die eine Carboxylsäuregruppe oder eine aktivierte Carboxylsäuregruppe hat. Eine oder mehrere Spacereinheiten können zwischen die markierte Einheit und das PNA-Oligomer eingefügt werden. Allgemein wird die Spacereinheit vor der Durchführung der Markierungsreaktion eingebaut. Der Spacer kann jedoch auch in die Markierung eingebettet werden und dadurch während der Markierungsreaktion eingebaut werden. Spezialisierte Reaktionsmittel können an die DNA angeheftet werden. Zum Beispiel kann eine terminale Arylamineinheit durch Kondensieren eines geeignet geschützten 4-Aminobenzoesäure-Derivates mit dem Aminoterminus des PNA-Oligomers erzeugt werden.
In einem Ausführungsbeispiel wird das C-terminale Ende der PNA markiert, indem zuerst eine markierte Einheit mit dem Träger kondensiert wird, auf welchem die markierte PNA zusammengebaut werden soll. Als Nächstes wird das erste Synthon der PNA mit der markierten Einheit kondensiert. Alternativ können eine oder mehrere Spacereinheiten zwischen die markierte Einheit und das PNA-Oligomer eingefügt werden (z. B. 8-Amino-3,6-dioxaoctansäure). Nachdem die PNA vollständig zusammengebaut und markiert ist, wird die PNA von dem Träger abgespalten, deprotektioniert und unter Verwendung von Standardmethodologien gereinigt.
Zum Beispiel könnte die markierte Einheit ein Lysinderivat sein, worin die ε-Aminogruppe mit einer detektierbaren Einheit wie 6-Carboxyfluorescein markiert ist. Alternativ könnte die markierte Einheit ein Lysinderivat sein, worin die ε-Aminogruppe mit einer 4-Aminobenzoesäureeinheit (z. B. 4-(N-(tert-Butyloxycarbonyl)-aminobenzamid) derivatisiert ist. Die Kondensation des Lysinderivates mit dem Untergrund würde unter Verwendung von Standardkondensations- (Peptid-)Chemie bewerkstelligt werden. Die α-Aminogruppe des Lysinderivates könnte dann deprotektioniert werden und der PNA-Zusammenbau könnte durch die Kondensation des ersten PNA-Synthons mit der α-Aminogruppe der Aminosäure Lysin gestartet werden. Nach dem vollständigen Zusammenbau würde das PNA-Oligomer dann von dem Träger unter Verwendung von wohl bekannten Methodologien abgespalten, deprotektioniert und gereinigt werden.
Alternativ wird eine funktionelle Gruppe des zusammengebauten oder teilweise zusammengebauten Polymers mit einer Donor- oder Akzeptoreinheit (z. B. ein PNA Molecular Beacon oder ein Linear Beacon) markiert, während es immer noch trägergebunden ist. Dieses Verfahren erfordert es, dass eine geeignete Schutzgruppe in das Oligomer eingebaut wird, um dadurch eine reaktive funktionelle Gruppe zu ergeben, mit welcher die Donor- oder Akzeptoreinheit verknüpft wird, es hat jedoch den Vorteil, dass die Markierung (z. B. ein Fluorophor) an irgendeiner Position innerhalb des Polymers, einschließlich innerhalb der Sondier-Nucleobasensequenz angeheftet werden kann. Zum Beispiel könnte die ε-Aminogruppe eines Lysins mit einer 4-Methyltriphenylmethyl- (Mtt-), einer 4-Methoxytriphenylmethyl- (MMT-) oder einer 4,4'-Dimethoxytriphenylmethyl- (DMT-) Schutzgruppe protektioniert werden. Die Mtt-, MMT- oder DMT-Gruppen können von PNA (zusammengebaut unter Verwendung von im Handel erhältlichen Fmoc-PNA-Monomeren und einem Polystyrolträger mit einem PAL-Linker; PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, MA) durch Behandlung des Harzes unter schwach sauren Bedingungen entfernt werden. Folglich kann die Donor- oder Akzeptoreinheit dann mit der ε-Aminogruppe der Aminosäure Lysin kondensiert werden. Nach vollständigem Zusammenbau und Markierung wird das Polymer dann von dem Untergrund abgespalten, deprotektioniert und unter Verwendung von wohl bekannten Methodologien gereinigt.
Alternativ wird eine Markierung (einschließlich einer der Donor- oder Akzeptoreinheiten, worin die andere Donor- oder Akzeptoreinheit mit der PNA während dem Zusammenbau verknüpft wird) an die PNA angeheftet, nachdem sie vollständig zusammengebaut, vom Untergrund abgespalten und wahlweise gereinigt worden ist. Dieses Verfahren ist zu bevorzugen, wo die Markierung mit den gewöhnlich für die Herstellung der PNA verwendeten Spaltungs-, Deprotektionierungs- oder Reinigungsregimes inkompatibel ist. Durch dieses Verfahren wird die PNA allgemein in Lösung durch die Reaktion einer funktionellen Gruppe der PNA und einer funktionellen Gruppe der Markierung markiert werden. Standardfachleute werden erkennen, dass die Zusammensetzung der Kopplungslösung von der Art der PNA und der Markierung abhängen wird. Die Lösung kann organisches Lösungsmittel, Wasser oder irgendeine Kombination davon umfassen. Allgemein wird das organische Lösungsmittel ein polares, nicht-nucleophiles Lösungsmittel sein. Nicht begrenzende Beispiel geeigneter organischer Lösungsmittel schließen Acetonitril, Tetrahydrofuran, Dioxan und N,N'-Dimethylformamid ein.
Allgemein wird die funktionelle Gruppe der PNA ein Amin sein und die funktionelle Gruppe der Markierung wird eine Carboxylsäure oder eine aktivierte Carboxylsäure sein. Nicht begrenzende Beispiele aktivierter funktioneller Gruppen in Form von Carboxylsäure schließen N-Hydroxysuccinimidylester ein. Falls die Markierung ein Enzym ist, wird das Amin auf der PNA vorzugsweise ein Arylamin sein. In wässrigen Lösungen kann die Carboxylsäuregruppe von entweder der PNA oder der Markierung (in Abhängigkeit von der Art der gewählten Bestandteile) mit einem wasserlöslichen Carbodiimid aktiviert werden. Das Reaktionsmittel 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) ist ein im Handel erhältliches Reaktionsmittel, das speziell für wässrige, Amid bildende Kondensierungsreaktionen verkauft wird.
Allgemein wird der pH-Wert wässriger Lösungen mit einem Puffer während der Kondensatorsreaktion moduliert werden. Vorzugsweise liegt der pH-Wert während der Kondensation im Bereich von 4–10. Wenn ein Arylamin mit der Carboxylsäure kondensiert wird, liegt der pH-Wert vorzugsweise im Bereich von 4–7. Wenn ein Alkylamin mit einer Carboxylsäure kondensiert wird, liegt der pH-Wert vorzugsweise im Bereich von 7–10. Allgemein wird die Basizität nicht-wässriger Reaktionen durch die Zugabe nichtnucleophiler organischer Basen moduliert werden. Nicht begrenzende Beispiele geeigneter Basen schließen N-Methylmorpholin, Triethylamin und N,N-Diisopropylethylamin ein. Alternativ wird der pH-Wert unter Verwendung von biologischen Puffern wie N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] (HEPES) oder 4-Morpholinthansulfonsäure (MES) oder anorganischen Puffern wie Natriumbikarbonat moduliert werden.
Beispielhafte Markierungen:
Es können zahlreiche detektierbare Einheiten für die Praxis dieser Erfindung verwendet werden. Geeignete detektierbare oder unabhängig detektierbare Einheiten werden so gewählt werden, dass sie mit dem durchzuführenden Test kompatibel sind. Allgemein werden die Markierungen so gewählt werden, dass das Markierungspaar neutral oder positiv geladen ist, so dass die nicht Nicht-Nucleotidsonde, wenn sie markiert ist, nicht eine wesentliche Affinität für die Matrix zeigt. Alternativ kann die Sonde so gestaltet werden, dass sie Ladungen (allgemein positive Ladungen) einschließt, so dass die markierte Sonde sogar dann, falls die Nettoladung der Markierungen negativ ist, neutral oder positiv geladen ist und deswegen eine geringe oder gar keine Affinität für die Matrix zeigt.
Nicht begrenzende Beispiele detektierbarer Einheiten (Markierungen), die für die Verwendung in der Praxis dieser Erfindung geeignet sind, würden Dextrankonjugate, ein verzweigtes Nucleinsäure-Detektionssystem, Chromophore, Fluorochrome, Spin-Markierungen, Radioisotope, Massemarkierungen, Enzyme, Haptene und chemolumineszierende Verbindungen einschließen. Bevorzugte Markierungsreagenzien werden als Carboxylsäuren oder als die N-Hydroxysuccinidylester von Carboxylsäuren geliefert werden. Zahlreiche mit Aminen reaktive Markierungsreagenzien sind im Handel erhältlich (wie z. B. von Molecular Probes, Eugene, Oregon). Bevorzugte Fluorochrome (Fluorophore) schließen 5(6)-Carboxyfluorescein (Flu), 6-((7-Amino-4-methylcoumarin-3-acetyl)amino)hexansäure (Cou), 5 (und 6)-Carboxy-X-Rhodamin (Rox), Cyanin-3-(Cy3-) Farbstoff, Cyanin-3,5-(Cy3,5-)Farbstoff, Cyanin-5-(Cy5-)Farbstoff, Cyanin-5,5-(Cy5.5-) Farbstoff, Cyanin-7-(Cy7-)Farbstoff, Cyanin-9-(Cy9-)Farbstoff (die Cyanin-Farbstoffe 3, 3,5, 5 und 5,5 sind als NHS-Ester von Amersham, Arlington Heights, IL erhältlich) oder die Alexa-Farbstoffreihen (Molecular Probes) ein. Bevorzugt Haptene schließen 5(6)-Carboxyfluorescein, 2,4-Dinitrophenyl, Digoxigenin und Biotin ein. Bevorzugte Enzyme schließen Sojabohnenperoxidase, alkalische Phosphatase und Meerrettichperoxidase ein. Andere geeignete Markierungsreagenzien und bevorzugte Verfahren des Anheftens würden von Durchschnittsfachleuten der PNA-Synthese erkannt werden.
Nicht-Nucleotid-"Beacon"-Sonden:
Die an die Nicht-Nucleotid-"Beacon"-Sonden angehefteten Markierungen umfassen einen Satz (hernach "Beacon-Satz (-Sätze)") an Energietransfereinheiten, umfassend wenigstens eine Energietransferdonor- und wenigstens eine Energietransferakzeptoreinheit.
Typischerweise wird der Beacon-Satz eine einzelne Donoreinheit und eine einzelne Akzeptoreinheit einschließen. Nichtsdestotrotz kann ein Beacon-Satz mehr als eine Donoreinheit und/oder mehr als eine Akzeptoreinheit enthalten. Die Donor- und Akzeptoreinheiten arbeiten dergestalt, dass eine oder mehrere Akzeptoreinheiten Energie aufnehmen, die von der einen oder den mehreren Donoreinheiten übertragen werden, oder löschen andersartig Signal von der Donoreinheit oder den -einheiten. Obwohl die kürzlich aufgelisteten Fluorophore (mit geeigneten spektralen Eigenschaften) auch als Energietransferakzeptoren tätig werden könnten, ist die Akzeptoreinheit vorzugsweise eine Löschereinheit. Vorzugsweise ist die Löschereinheit eine nicht-fluoreszierende aromatische oder heteroaromatische Einheit. Die bevorzugte Löschereinheit ist 4-((-4-(Dimethylamino)phenyl)azo)benzoesäure (Dabcyl).
Die Übertragung von Energie zwischen Donor- und Akzeptoreinheiten einer Nicht-Nucleotid-"Beacon"-Sonde kann durch Kollision der eng verbundenen Einheiten eines Beacon-Satzes oder durch einen nicht-strahlenden Vorgang wie Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) geschehen. Damit FRET geschehen kann, erfordert der Energietransfer zwischen Donor- und Akzeptoreinheiten eines Beacon-Satzes, dass die Einheiten eng benachbart im Raum liegen und dass das Emissionsspektrum von Donor(en) eine wesentliche Überlappung mit dem Absorptionsspektrum des (der) Akzeptors(en) hat (siehe Yaron et al., Analytical Biochemistry, 95: 228–235 (1979), und besonders auf Seite 232, Spalte 1, bis Seite 234, Spalte 1). Alternativ kann ein kollisionsvermittelter (strahlungsloser) Energietransfer zwischen sehr eng verknüpften Donor- und Akzeptoreinheiten geschehen, ob oder ob nicht das Emissionsspektrum der Donoreinheit(en) eine wesentliche Überlappung mit dem Absorptionsspektrum der Akzeptoreinheit(en) hat (siehe Yaron et al., Analytical Biochemistry, 95: 228–235 (1979), und besonders auf Seite 229, Spalte 1, bis Seite 232, Spalte 1). Auf diesen Vorgang wird als intramolekulare Kollision Bezug genommen, da angenommen wird, dass das Löschen durch den direkten Kontakt der Donor- und Akzeptoreinheiten verursacht wird (siehe Yaron et al.).
(i) Linear Beacons:
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Nicht-Nucleotid-"Beacon"-Sonde ein Linear Beacon, wie vollständig beschrieben in der ebenfalls anhängigen Patentanmeldung USSN 09/179,162 und der WIPO-Veröffentlichung WO99/22081, bezeichnet als "Methods, Kits And Compositions Pertaining To Linear Beacons", hierin durch Bezugnahme eingeschlossen.
(ii) PNA Molecular Beacons:
In einem bevorzugten Ausführungsform ist die Nicht-Nucleotid-"Beacon"-Sonde ein PNA Molecular Beacon, wie vollständig überschrieben in der ebenfalls anhängigen Patentanmeldung USSN 09/179,298 und der WIPO-Veröffentlichung WO99/21881, bezeichnet als "Methods, Kits And Compositions Pertaining To PNA Molecular Beacons", hierin durch Bezugnahme eingeschlossen.
Detektieren des Energietransfers:
Die Hybridbildung einer Nicht-Nucleotid-"Beacon"-Sonde mit einer Zielsequenz kann überwacht werden durch Messen wenigstens einer physikalischen Eigenschaft von wenigstens einem Mitglied des Beacon-Satzes, welcher detektierbar unterschiedlich ist, wenn der Hybridisierungskomplex gebildet wird, im Vergleich zu der Situation, wenn die Nicht-Nucleotid-"Beacon"-Sonde in der Abwesenheit einer Zielsequenz vorkommt. Wir nehmen auf dieses Phänomen als die selbstanzeigende Eigenschaft von Nicht-Nucleotid-"Beacon"-Sonden Bezug. Diese Änderung in detektierbarem Signal sollte aus der Änderung in der Effizienz des Energietransfers zwischen dem Donor und dem Akzeptor resultieren, welche aus der Hybridisierung der Nicht-Nucleotid-"Beacon"-Sonden resultiert. Vorzugsweise werden die Detektionsmittel das Messen der Fluoreszenz eines Donor- oder Akzeptorfluorophors eines Beacon-Satzes einschließen. Am bevorzugtesten wird der Beacon-Satz wenigstens ein Donorfluorophor und wenigstens einen Akzeptorlöscher umfassen, so dass die Fluoreszenz des Donorfluorophors verwendet werden wird, um Hybridisierung der Nicht-Nucleotidsonde mit der Zielsequenz zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren.
Andere selbstanzeigende Nicht-Nucleotidsonden:
In einem anderen Ausführungsbeispiel sind die Nicht-Nucleotidsonden dieser Erfindung selbstanzeigende Sonden des Typs, der in der WIPO-Patentanmeldung WO97/45539 beschrieben ist. Die in der WO97/45539 beschriebenen selbstanzeigenden Nicht-Nucleotidsonden unterscheiden sich im Vergleich von den Nicht-Nucleotid-"Beacon"-Sonden primär darin, dass keine Löscher- oder Akzeptoreinheit in den Sonden der WO97/45539 vorhanden ist. Vorzugsweise sind die Sonden der WO97/45539, wenn sie in dieser Erfindung verwendet werden, geeignet markierte Peptid-Nucleinsäuren.
Detektierbare und unabhängig detektierbare Einheiten/Multiplexanal
In bevorzugten Ausführungsbeispielen dieser Erfindung wird ein sondenbasierter Multiplex-Hybridisierungstest durchgeführt. In einem Multiplextest werden zahlreiche Bedingungen von Interesse gleichzeitig untersucht. Die Multiplexanalyse beruht auf der Fähigkeit, Probenbestandteile oder die damit in Beziehung stehenden Daten, während oder nachdem der Test abgeschlossen ist, zu sortieren. In bevorzugten Ausführungsbeispielen der Erfindung werden verschiedene unabhängig detektierbare Einheiten verwendet, um die unterschiedlichen Nicht-Nucleotidsonden eines Satzes zu markieren. Die Fähigkeit zwischen den unabhängig detektierbaren Einheiten zu differenzieren und/oder jede von ihnen zu quantifizieren, stellt die Mittel bereit, einen Hybridisierungstest in ein Multiplexformat zu bringen, da die Daten, welche mit der Hybridisierung jeder der unterschiedlich (unabhängig) markierten Nicht-Nucleotidsonden mit einer Zielsequenz in Beziehung stehen, mit der Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge der in einer Probe zu detektierenden Zielsequenz in Beziehung gesetzt werden können. Folglich können die sondenbasierten Multiplextests dieser Erfindung verwendet werden, um gleichzeitig die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge jeder von zwei oder mehr Zielsequenzen zu detektieren, die in derselben Probe und in demselben Test vorhanden sein könnten.
Spacer-/Linkereinheiten:
Allgemein werden Spacer verwendet, um die nachteiligen Wirkungen, die sperrige Markierungsreagenzien auf die Hybridisierungseigenschaften von Sonden haben könnten, zu minimieren. Linker induzieren typischerweise eine Flexibilität und Zufälligkeit in die Sonde oder verknüpfen anderweitig zwei oder mehr Nucleobasensequenzen einer Sonde. Bevorzugte Spacer-/Linkereinheiten für Nicht-Nucleotidsonden, die für die Praxis dieser Erfindung verwendet werden, bestehen aus einer oder mehreren Aminoalkylcarboxylsäuren (z. B. Aminocapronsäure), der Seitenkette einer Aminosäure (z. B. die Seitenkette von Lysin oder Ornithin), natürlichen Aminosäuren (z. B. Glycin), Aminooxyalkylsäuren (z. B. 8-Amino-3,6-dioxaoctansäure), Alkyldiacide (z. B. Bernsteinsäure) oder Alkyloxydiacide (z. B. Diglycolsäure). Spacer-/Linkereinheiten können auch zufällig oder absichtlich konstruiert werden, um die Wasserlöslichkeit der Sonde zu verbessern. Die Spacer-/Linkereinheiten können auch so gestaltet werden, dass sie die Löslichkeit des Oligomers erhöhen.
Vorzugsweise umfasst eine Spacer-/Linkereinheit eine oder mehrere verknüpfte Verbindungen, die die folgende Formel haben: -Y-(O_m)(CW₂)_n)_o-Z-. Die Gruppe Y hat die folgende Formel: eine Einzelbindung, -(CW₂)_p-, -C(O)(CW₂)_p-, -C(S)(CW₂)_p- und -S(O₂)(CW₂)_p-. Die Gruppe Z hat die Formel NH, NR², S oder O. Jedes W ist unabhängig voneinander H, R², -OR², F, Cl, Br oder I; worin jedes R² unabhängig ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: -CX₃, -CX₂CX₃, -CX₂CX₂CX₃, -CX₂CX(CX₃)₂ und -C(CX₃)₃. Jedes X ist unabhängig voneinander H, F, Cl, Br oder I. Jedes m ist unabhängig 0 oder 1. Jedes n, o und p sind unabhängig ganze Zahlen von 0 bis 10.
Verknüpftes Polymer:
Ein verknüpftes Polymer umfasst zwei oder mehr Nucleobasensequenzen, die durch einen Linker verknüpft werden. Die Sonden dieser Erfindung schließen verknüpfte Polymere ein, worin die Nucleobasensequenz mit einer oder mehreren zusätzlichen Peptid-Nucleinsäure-, Peptid- oder Enzymmolekülen verknüpft ist.
Hybridisierungsbedingungen/-stringenz:
Standardfachleute der Nucleinsäure-Hybridisierung werden erkennen, dass Faktoren, die gewöhnlich verwendet werden, um die Stringenz der Hybridisierung zu schaffen oder zu kontrollieren, die Formamidkonzentration (oder die eines anderen chemischen Denaturierungsreagens), die Salzkonzentration (das heißt die Ionenstärke), Hybridisierungstemperatur, Detergenskonzentration, pH-Wert und die Anwesenheit oder Abwesenheit von chaotropen Substanzen einschließen. Die optimale Stringenz für eine Sonden-/Zielkombination wird oftmals durch die wohl bekannte Technik der Festlegung von etlichen der zuvor genannten Stringenzfaktoren und der anschließenden Bestimmung der Wirkung des Variierens eines einzelnen Stringenzfaktors gefunden. Dieselben Stringenzfaktoren können moduliert werden, um dadurch die Stringenz der Hybridisierung von Nicht-Nucleotidsonden mit Zielsequenzen zu kontrollieren, mit der Ausnahme, dass die Hybridisierung einer PNA ziemlich unabhängig von der Ionenstärke ist. Die Ionenstärke wird wahrscheinlich kein wesentlicher Faktor in der Stringenz der meisten Nicht-Nucleotidsonden mit einem ausreichend neutralen oder positiv geladenen Rückgrat sein. Die optimale Stringenz für einen Test kann experimentell bestimmt werden durch Untersuchen jedes Stringenzfaktors, bis der gewünschte Grad der Unterscheidung erreicht ist.
Geeignete Hybridisierungsbedingungen:
Allgemein gilt, dass je enger verwandt die den Hintergrund verursachenden Nucleinsäure-Verunreinigungen mit der Zielsequenz sind, desto sorgfältiger muss die Stringenz kontrolliert werden. Sperrsonden können auch als ein Mittel verwendet werden, um die Diskriminierung über die möglichen Grenzen hinaus durch bloße Optimierung von Stringenzfaktoren zu verbessern. Geeignete Hybridisierungsbedingungen werden folglich Bedingungen umfassen, in welchen der gewünschte Diskriminierungsgrad erreicht wird, so dass ein Test ein genaues (innerhalb der für den Test gewünschten Toleranz) und reproduzierbares Ergebnis erzeugt. Unter Zuhilfenahme von nicht mehr als Routineexperimentierung werden Fachleute leicht in der Lage sein, geeignete Hybridisierungsbedingungen für die Durchführung eines Tests zu bestimmen.
Sperrsonden:
Sperrsonden sind Nicht-Nucleinsäure- oder Nucleinsäuresonden, die verwendet werden können, um das Binden der Sondier-Nucleobasensequenz einer Sonde an eine Hybridisierungsstelle, die nicht in Beziehung steht mit oder die eng in Beziehung steht mit der Zielsequenz, zu unterdrücken (siehe Coull et al., PCT/US97/21845, auch bekannt als WO98/24933). Allgemein unterdrücken die Sperrsonden das Binden der Sondier-Nucleobasensequenz an eng verwandte Nicht-Zielsequenzen, da die Sperrsonde mit der Nicht-Zielsequenz hybridisiert, um einen thermodynamisch stabileren Komplex zu bilden, als er durch die Hybridisierung zwischen der Sondier-Nucleobasensequenz und der Nicht-Zielsequenz gebildet wird. Folglich sind Sperrsonden typischerweise unmarkierte Sonden, die in einem Test verwendet werden, um dadurch ein unspezifisches Signal zu unterdrücken. Da sie gewöhnlich so gestaltet werden, dass sie mit eng verwandten Nicht-Zielsequenz-Sequenzen hybridisieren, wird typischerweise ein Satz aus zwei oder mehr Sperrsonden in einem Test verwendet werden, um dadurch ein unspezifisches Signal von Nicht-Zielsequenzen zu unterdrücken, welche vorhanden sein könnten und die Durchführung des Tests beeinflussen könnten.
Geeignete elektrostatische Bindungsbedingungen:
Es ist eine wichtige Eigenschaft der vorliegenden Erfindung, dass die elektrostatischen Bindungsbedingungen so gewählt werden, dass die Nicht-Nucleotidsonde eine geringe oder gar keine Affinität für die Matrix im Vergleich mit Nucleinsäurebestandteilen der Probe zeigt. Die elektrostatische Immobilisierung von Nucleinsäuren an Matrizes involviert primär die Bildung von Salzpaaren zwischen der Nucleinsäure und der Matrix. Ein Salzpaar umfasst eine geladene Spezies der Nucleinsäure, die mit einer geladenen Gegenspezies der Matrix in Wechselwirkung tritt, um eine Wechselwirkung zu bilden, die dazu neigt, die Assoziation der Nucleinsäure mit der Matrix zu stabilisieren. Variable Faktoren, die am meisten die elektrostatische Bindung beeinflussen werden, werden die Modulation von entweder dem pH-Wert und/oder der Ionenstärke oder von beidem einschließen. Der pH-Wert ist ein wichtiger Faktor, da er die Ladungsdichte auf der Matrix, ebenso wie die Nettoladung der Nucleinsäure beeinflussen kann. Ähnlich wird die Ionenstärke die Stabilität des Salzpaars beeinflussen, da es im Stand der Technik der Chromatographie wohl bekannt ist, dass eine steigende Ionenstärke die zwischen Nucleinsäuren und stationären Anionenaustauschphasen gebildeten Wechselwirkungen stabilisieren wird. Für die Zwecke dieser Erfindung sollen elektrostatische Bindungsbedingungen Bedingungen sein, die die reversible Bindung der Nucleinsäure von Interesse mit einer Matrix durch eine Salzpaarbildung ermöglichen.
Harmonisierung geeigneter Hybridisierungsbedingungen und geeigneter elektrostatischer Bindungsbedingungen:
Wenn die Verfahren, Kits und Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden, ist es wichtig, zwischen geeigneten Hybridisierungsbedingungen zu unterscheiden, worin die sequenzspezifische Hybridisierung einer Nicht-Nucleotidsonde mit einer Zielsequenz optimiert wird, im Vergleich zu elektrostatischen Bindungsbedingungen, die sich einfach auf Bedingungen beziehen, bei denen die Nucleinsäure an die Matrix bindet, die Nicht-Nucleotidsonde oder -sonden jedoch keine wesentliche Affinität für die Matrix zeigen. Typischerweise werden die elektrostatischen Bindungsbedingungen so gewählt werden, dass die Nicht-Nucleotidsonde ausreichend neutral oder positiv geladen ist. Wegen der Unterschiede in den Ladungen der Rückgrate von Nucleinsäure- und Nicht-Nucleotidsonden dieser Erfindung gibt es einen breiten Bereich an Bedingungen, innerhalb derer die Nucleinsäure von Interesse an die Matrix bindet, die Nicht-Nucleotidsonde oder -sonden jedoch nicht. Dieses Prinzip ist in Beispiel 13 ausgeübt, worin es klar ist, dass die Nicht-Nucleotidsonden nicht mit der Matrix bei irgendwelchen der untersuchten Bedingungen in Wechselwirkung treten, die am nächsten äquivalenten Nucleinsäuresonden können jedoch mit der Matrix unter vielen der getesteten Bedingungen in Wechselwirkung treten, unabhängig davon, ob die Zielsequenz in der Probe vorhanden ist oder nicht.
Da es eine wichtige Eigenschaft dieser Erfindung ist, dass die Nicht-Nucleotidsonde mit einer Nucleinsäure hybridisiert, welche elektrostatisch an eine Matrix gebunden ist, wird es von einem Fachmann geschätzt werden, dass Hybridisierungsbedingungen (Stringenzfaktoren) und elektrostatische Bindungsbedingungen innerhalb der Umgebung des durchzuführenden Tests harmonisiert werden sollten. Da pH-Wert und Ionenstärke Faktoren sind, die sowohl bei der Stringenz als auch bei der elektrostatischen Bindung berücksichtigt werden sollten, und da die elektrostatischen Bedingungen im Vergleich zu der optimierten Stringenz weit sind, sollte es immer möglich sein, die elektrostatischen Bindungsbedingungen einfach festzulegen und dann die Sondenunterscheidung durch Modulation von anderen Stringenzfaktoren zu optimieren. In diesem Zusammenhang sind die Verfahren dieser Erfindung den im Stand der Technik bekannten gegenwärtigen Verfahren (z. B. Arnold et al., US 5,599,667 ) weit überlegen. Unterstützt durch nicht mehr als Routineexperimentierung, werden Fachleute leicht in der Lage sein, die elektrostatischen Bindungsbedingungen und geeignete Hybridisierungsbedingungen zur Durchführung eines Tests leicht zu harmonisieren.
Matrizes:
Allgemein ist die Matrix nur ein Gerüst, das möglicherweise von der Masse der Flüssigkeit des Tests abtrennbar ist und das geladene funktionelle Gruppen umfasst, an welche die Nucleinsäure elektrostatisch reversibel bindet. Typischerweise geschieht die elektrostatische Bindung durch Salzpaarbildung zwischen geladenen Gruppen des Nucleinsäure-Rückgrats und geladenen Gruppen der Matrix. Für die Bindung von Nucleinsäuren werden die primären Wechselwirkungen am wahrscheinlichsten die Bildung eines Salzpaares zwischen den negativ geladenen Phosphatgruppen des Nucleinsäure-Phosphodiester-Rückgrats und den positiv geladenen funktionellen Gruppen der Matrix einschließen.
Nicht begrenzende Beispiele geeigneter Matrizes schließen die folgenden ein: Polymere, die in Wasser oder Wassermischungen unlöslich sind, und wasserlösliche organische Lösungsmittel; zwei- und dreidimensionale Oberflächen wie eine Wand eines Reagenzglases, einer Glasfritte oder eines Wafers; perlenförmige Untergründe wie Magnetperlen, chromatographische Füllträger, -medien und -harze; poröse perlenförmige Träger wie chromatographische Füllträger, -medien und -harze (z. B. Medien für die Anionenaustausch-Chromatographie), ein gegossenes Polymer wie eine Membran (z. B. Polyvinylidendifluorid, Teflon, Polyethylen, Polypropylen oder Polysulfon); Copolymermaterialien und Gele (z. B. Polyacrylamid oder Agarose). In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden im Handel erhältliche Ionenaustausch-Chromatographiemedien und insbesondere die perlenförmigen Medien als die Matrix verwendet werden.
Matrixabschirmung:
In gewissen bevorzugten Ausführungsbeispielen kann die Matrix zeitweise von den Testbestandteilen abgeschirmt werden, um dadurch die elektrostatische Bindung von Nucleinsäurebestandteilen des Tests an die Matrix zu verzögern. Zum Beispiel kann es bevorzugt sein, die Matrix teilweise oder vollständig von Testbestandteilen abzuschirmen, bis eine Nucleinsäuresynthese oder -amplifikationsreaktion teilweise oder vollständig abgeschlossen ist, um nicht die Synthese oder Amplifikation zu inhibieren (siehe z. B. Beispiel 12 dieser Spezifikation).
Fachleute werden erkennen, dass die Partitionierung von Reaktionsbestandteilen erhalten durch die Zubereitung eines Reaktionsgefäßes mit geeigneten Kompartimenten werden kann. Vorzugsweise wird jedoch die Matrix durch die Hilfe einer Flüssigkeit abgeschirmt, welche als eine zeitweilige Barriere dienen wird, bis die Reaktionsbestandteile vermischt sind. Folglich wird eine bevorzugte Flüssigkeit eine wassermischbare Flüssigkeit sein, die viskoser und/oder dichter im Vergleich zu Wasser ist, so dass sie nicht leicht mit wässrigen Lösungen vermischt wird, bis sie Erhitzen oder physikalischem Schütteln ausgesetzt ist. Es wird von Fachleuten geschätzt werden, dass ein nicht begrenzendes Beispiel solch einer Flüssigkeit Glycerol ist.
Beispielhafte Testformate:
Die Verfahren, Kits und Zusammensetzungen dieser Erfindung erleichtern wesentlich die Zubereitung und/oder Analyse von Nucleinsäuren von Interesse. Es ist auch ein Vorteil, dass sie allgemein auf sämtliche Probentypen und Testformate, die typischerweise für die Analyse von Nucleinsäuren verwendet werden, anwendbar sind. Etliche nicht begrenzende Beispiele bevorzugter Testformate, die getestet worden sind, werden unten beschrieben. Diese Beispiele zeigen die breite Anwendbarkeit der Verfahren, Kits und Zusammensetzungen dieser Erfindung. Allgemein schließen sich die unten beschriebenen Testformate nicht notwendigerweise gegenseitig aus und eines oder mehrere können für die Analyse einer bestimmten Probe kombiniert werden.
(i) Amplifikationstestformate
Diese Erfindung ist auf Proben anwendbar, worin die Nucleinsäure synthetisiert oder amplifiziert worden ist. Nicht begrenzende Beispiele bevorzugter Nucleinsäure-Synthese- oder Nucleinsäure-Amplifikationsreaktionen, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, schließen Polymerasekettenreaktion (PCR), Ligasekettenreaktion (LCR), Strangverdrängungsamplifikation (SDA), transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA), Rolling-Circle-Amplifikation (RCA) und Q-Beta-Replikase ein. Wenn sie mit Nicht-Nucleotid-"Beacon"-Sonden kombiniert werden, können diese Testformate in einem selbstanzeigenden Format durchgeführt werden, einschließlich Echtzeit- ebenso wie Endpunktbestimmung, wenn ein geeignetes Gerät wie ein Prism 7700 (PE Biosystems, Foster City, CA) verwendet wird. In einem selbstanzeigenden Test besteht, wenn einmal die Bestandteile des Tests miteinander kombiniert worden sind, kein Bedarf, die Bestandteile des Tests zu stören, um das Ergebnis zu bestimmen. Da die Testbestandteile nicht gestört werden brauchen, um das Ergebnis zu bestimmen, muss es eine gewisse nachweisbare oder messbare Änderung geben, die geschieht und die beobachtet oder quantifiziert werden kann, ohne die Bestandteile des Tests physikalisch zu manipulieren. Viele selbstanzeigende Tests beruhen auf einer Änderung in der Fluoreszenz, die mit dem Auge beobachtet werden kann oder die mit einem Fluoreszenzgerät anderweitig detektiert und/oder quantifiziert werden kann. Beispiel 12 dieser Spezifikation beschreibt selbstanzeigende PCR-Tests, geeignet für entweder Echtzeit- oder Endpunktanalyse.
(ii) Schutz-/Verdauungstests
Andere bevorzugte Tests dieser Erfindung sind auf die Detektion von Nucleinsäure-Zielsequenzen in Proben gerichtet; besonders in komplexen biologischen Proben, Komplexe biologische Proben wie Blut, Urin, Sputum und Zelllysate erfordern typischerweise ein beträchtliches Bearbeiten, um das Massematerial wie Protein, Lipide, Zelltrümmer etc. zu entfernen, welches ansonsten die Sensitivität und/oder Verlässlichkeit eines sondenbasierten Hybridisierungstests reduzieren würde. Es wurde kürzlich gezeigt dass Nucleinsäureanaloga wie PNA mit einer Zielsequenz hybridisieren können und dadurch die Nucleinsäure-Zielsequenz vor der Verdauung/dem Abbau durch Nucleasen schützt (siehe Stanley et al., US 5,861,250 ). In diesem bevorzugten Testformat werden eine oder mehrere nachweisbare Nicht-Nucleinsäuresonden, die das Nucleinsäureziel vor Verdauung/Abbau schützen können, mit einer oder mehreren Zielsequenzen unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert. Vorzugsweise kommt die Zielsequenz in einer komplexen biologischen Probe vor. Nachdem die Nicht-Nucleinsäuresonde mit der Nucleinsäure-Zielsequenz hybridisiert worden ist, wird die Probe mit einem oder mehreren Enzymen wie Proteasen und/oder Nucleasen behandelt, welche die Probenbestandteile abbauen, möglicherweise einschließlich dem Nucleinsäuremolekül von Interesse, nicht jedoch dem Komplex aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz. Da diese Behandlung kontaminierende Polymere und Trümmer verdaut/abbaut, reduziert oder eliminiert diese Behandlung die Komplexität der Probe und/oder die Bearbeitungserfordernisse, die normalerweise mit komplexen biologischen Proben verbunden sind. Da das eine oder die mehreren Hybride aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz, falls sie in der Probe vorhanden sind, nach der Enzymbehandlung intakt sind, können sie auf einer Matrix aufkonzentriert werden und als das Mittel, die Zielsequenz in der Probe von Interesse zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren, detektiert werden. Ein Beispiel dieses Testformates wird in Beispiel 14 dieser Spezifikation gefunden. Wahlweise wird das detektierbare Hybrid aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz von der Matrix durch Anpassung der Bedingungen außerhalb des Bereiches, der für die elektrostatische Bindung benötigt wird, freigesetzt und dadurch der Nachweis des ungebundenen Hybrids aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz erleichtert, oder es wird nur die detektierbare Sonde freigesetzt, als das Mittel, um die Zielsequenz in der Probe zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren.
Vorteilhafterweise ist die Anwesenheit der Matrix nicht für das Schützen der Zielsequenz vor Abbau erforderlich. Deswegen kann die Matrix entweder während der Enzymbehandlung anwesend sein oder sie kann nach der Enzymbehandlung hinzugefügt werden, um dadurch die Nicht-Nucleotidsonde/Zielsequenz elektrostatisch zu immobilisieren. In bevorzugten Ausführungsbeispielen ist das Nucleinsäureanalogon eine Nicht-Nucleotid-„Beacon"-Sonde und die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge des auf der Matrix detektierten selbstanzeigenden Signals wird verwendet, um die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge der in der Probe oder komplexen biologischen Probe vorhandenen Zielsequenz zu bestimmen.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel dieses Tests wird die Testtemperatur angepasst und/oder kontrolliert, so dass unperfekte Hybride vorzugsweise dissoziiert werden, um einen höheren Grad an Zielsequenzunterscheidung zu erreichen, einschließlich der Unterscheidung von einzelnen Punktmutationen. Allgemein erfordert dies das Anpassen der Temperatur des Tests auf einen Punkt unterhalb der Schmelztemperatur des Hybrids aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz, so dass die Hybride aus Nicht-Nucleotid-Sonde und Nicht-Zielsequenzen wenigstens zum Teil dissoziiert sind. Da die Hybride aus Nicht-Nucleotidsonde und Nicht-Zielsequenz allgemein weniger komplementär sind im Vergleich mit den Hybriden aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz, liegt die optimale Testtemperatur typischerweise innerhalb eines Bereiches von 15 Grad, worin dieser Bereich definiert wird als 5 Grad oberhalb und 10 Grad unterhalb der Schmelztemperatur des aus der Nicht-Nucleotidsonde und der Nicht-Zielsequenz gebildeten Hybrids. Zum Beispiel würde, falls Nicht-Nucleotidsonde/Nicht-Zielsequenz, das in dem Test unterschieden werden soll, eine Schmelztemperatur von 70 °C unter Testbedingungen hat, der bevorzugte Bereich für die Anpassung der Temperatur des Tests zwischen 75 °C (+ 5 °C) und 60 °C (–10 °C) liegen.
Die Dissoziierung von Nicht-Nucleotidsonde/Nicht-Zielsequenzen macht die Nicht-Zielsequenzen für den Enzymabbau zugänglich, da sie nicht länger geschützt sind. Obwohl die Hybridisierung, insbesondere in der Nähe des Tm-Wertes, ein Äquilibriumvorgang ist, verhindert die Zerstörung der Nicht-Zielsequenz die erneute Assoziierung des Hybrids aus Nicht-Nucleotidsonde und Nicht-Zielsequenz und die Bildung des damit verbundenen unspezifischen Signals.
Wie kürzlich festgestellt, sind die hierin beschriebenen Testformate nicht gegenseitig ausschließlich gegenüber anderen Testformaten. Es ist eine wichtige Eigenschaft dieser Erfindung, dass das Hybrid aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz reversibel an die Matrix gebunden wird. Deswegen kann das Hybrid aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz von der Matrix für nachfolgende Analysen freigesetzt werden. Folglich kann dieser Schutz-Nerdauungstest auch nur für die Probenzubereitung oder als ein bestätigender Vorläufertest für einen zweiten Test verwendet werden. Zum Beispiel können die Schutz-/Verdauungstests mit anderen Testformaten kombiniert werden, z. B. dem für die Analyse von Arrays, oder kann für die Probenzubereitung verwendet werden, bevor ein Linientest oder ein zytometrischer (Durchfluss- oder statischer) Test, wie unten beschrieben, durchgeführt wird.
(iii) Linientests:
Ein anderes bevorzugtes Testformat, das für die Praxis dieser Erfindung nützlich ist, ist der Linientest. Ein gewöhnlicher Linientest ist ein Querflusstest. Viele Verfahren und Vorrichtungen für Querflusstests sind bekannt (siehe US-Patente Nrn. 5,916,521, 5,798,273, 5,770,460, 5,710,005, 5,415,994, 4,956,302 und 4,943,522, welche alle hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind). Ein klassisches Beispiel eines Querflusstests ist ein kommerziell erhältlicher Schwangerschaftstest. In einem klassischen Schwangerschaftstest wird eine Urinprobe auf einen Fleck auf einer Querflusstestvorrichtung aufgetragen. Die Querflussvorrichtung umfasst eine Flüssigkeiten leitende Matrix, wie ein Filter oder eine Membrane, welche die Flüssigkeit (z. B. Urin) dazu bringt, passiv (allgemein durch Kapillarwirkung) von dem Fleck der Auftragung zum anderen Ende der leitenden Matrix zu fließen. Innerhalb der Querflussvorrichtung (oder anderweitig zu der Urinprobe vor der Auftragung auf die Vorrichtung hinzugefügt) befindet sich ein nachweisbarer Antikörper gegen das HCG-Hormon; besagtes HCG-Hormon ist in der Urinprobe nur vorhanden, falls die Patientin schwanger ist. Indem der Urin seitlich innerhalb der Vorrichtung fließt, wird der HCG/Antikörperkomplex gebildet, indem die Bestandteile in Wechselwirkung treten. Ebenfalls innerhalb der Vorrichtung befindet sich eine Linie (oder eine andere geometrische Form) einer Substanz (gewöhnlich ein anderer Antikörper), an welche der HCG/Antikörperkomplex binden wird und dadurch konzentriert wird, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen.
Folglich bedenkt ein anderes Ausführungsbeispiel dieser Erfindung einen Linien- oder Querflusstest für den Nachweis einer Nucleinsäure-Zielsequenz. In dem Linientest dieser Erfindung wird eine Linie, Linien oder eine andere geometrische Form der Matrix räumlich auf der Vorrichtung so fixiert, dass jegliche in einer Probe vorhandenen Komplexe aus Nicht-Nucleinsäuresonde und Zielsequenz auf der Linie (oder der anderen geometrischen Form) der Vorrichtung konzentriert werden können, wenn die Probe (oder Probenbestandteile) daran vorbeifließen. Vorzugsweise ist der Test ein Querflusstest. In dem Linientest dieser Erfindung kann die detektierbare Nicht-Nucleinsäuresonde zu der Probe hinzugefügt werden, bevor oder nachdem die Zielsequenz auf der Matrix der Linienvorrichtung konzentriert worden ist. Folglich wird die Zielsequenz in der Probe durch Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren des Komplexes aus Nicht-Nucleinsäuresonde und Zielsequenz, wie er auf der Linie, den Linien oder der anderen geometrischen Form konzentriert worden ist, bestimmt. Beispiel 16 dieser Spezifikation ist ein Beispiel eines Linientests. Wahlweise wird das Hybrid aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz von der Matrix durch Anpassung der Bedingungen außerhalb des Bereiches freigesetzt, der für die elektrostatische Bindung benötigt wird, und dadurch wird der Nachweis des Hybrids aus ungebundener Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz oder nur der detektierbaren Sonde erleichtert, als das Mittel, die Zielsequenz in der Probe zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren.
(iv) Arraytestformate:
In einem Ausführungsbeispiel sind Arrays Oberflächen, an welche zwei oder mehr Proben von Interesse immobilisiert worden sind, jede an einer einzigartigen Örtlichkeit. In der Literatur wurden Arrays, die Nucleinsäure umfassen, beschrieben. Es ist ein Vorteil dieser Erfindung, dass Nucleinsäure einer Probe elektrostatisch leicht auf einer Oberfläche in einem breiten Bereich an Bedingungen immobilisiert wird. Deswegen kann ein Array aus Proben leicht hergestellt werden, allgemein einfach durch Auftropfen (unter elektrostatischen Bindungsbedingungen) von zwei oder mehr Proben, die Nucleinsäure enthalten, an einzelnen Örtlichkeiten auf einer positiv geladenen Oberfläche. Da die Örtlichkeit jeder Probe bekannt ist, können Arrays elektrostatisch immobilisierter Nucleinsäure allgemein verwendet werden, um gleichzeitig eine oder mehrere Zielsequenzen in zwei oder mehr Proben von Interesse zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren. Folglich kann ein Array elektrostatisch immobilisierter Nucleinsäure bei diagnostischen Anwendungen oder in Screeningverbindungen für Leitsubstanzen, die einen therapeutischen Nutzen zeigen könnten, nützlich sein. Ein Beispiel eines Arraytests ist Beispiel 15 dieser Spezifikation. Wahlweise wird das Hybrid aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz von der Matrix durch Anpassung der Bedingungen außerhalb des Bereiches freigesetzt, der für die elektrostatische Bindung benötigt wird, und dadurch wird die Detektion des ungebundenen Hybrids aus Nicht- Nucleotidsonde und Zielsequenz oder nur der detektierbaren Sonde erleichtert, als ein Mittel, um die Zielsequenz in der Probe zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren.
Es ist ein Vorteil dieser Erfindung, dass die Nicht-Nucleotidsonde nicht notwendig ist für die Immobilisierung der Nucleinsäure an die Arraymatrix. Deswegen kann die Nicht-Nucleotidsonde zu einer oder mehreren Proben bevor oder nachdem sie elektrostatisch auf der Arraymatrix immobilisiert sind, hinzugefügt werden.
Arrays, die aus Hybriden aus Nicht-Nucleotidsonden und Zielsequenz bestehen, haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie hochstabil sind und nicht durch Enzyme, die Nucleinsäure abbauen, abgebaut werden sollten. Deswegen können diese Tests oder die Proben, die auf die Arraymatrix aufgetragen werden sollen, so behandelt werden, wie es oben in dem Abschnitt, der bezeichnet ist als "Verdauungs-/Schutztest", beschrieben ist, als ein Mittel, um die Testdurchführung durch den Abbau von Probenverunreinigungen zu verbessern. Unabhängig davon, ob die Probe mit Enzym vor oder nachdem sie auf die Arraymatrix aufgetragen wird behandelt wird, ist es wichtig, dass Nicht-Nucleotidsonde/Zielsequenz gebildet werden kann, so dass die Zielsequenz vor Abbau geschützt ist.
(v) Durchfluss- oder statische Zytometrietests:
Durchfluss- und statische Zytometrie sind sehr nützlich für die Analyse von ganzen Zellen, ebenso wie von Partikeln. Da die Matrizes dieser Erfindung in Perlenform oder partikulär sein können, ist diese Erfindung besonders gut geeignet für die statische oder Durchfluss-Zytometrie-Analyse von Partikeln, die Nucleinsäuren enthalten, welche darauf elektrostatisch immobilisiert sind. Gemäß dieser Erfindung ist die Nucleinsäure elektrostatisch an Partikeln oder Perlen immobilisiert. Eine Nicht-Nucleotidsonde wird verwendet, um eine Zielsequenz von Interesse, die auf den Partikeln oder Perlen anwesend ist, zu detektieren, und kann hinzugefügt werden, bevor oder nachdem die Nucleinsäure immobilisiert wird. Die Detektion, Identifikation oder Quantifikation des Komplexes aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz in dem statischen oder Durchflusszytometer wird als das Mittel verwendet, um die Zielsequenz in der Probe von Interesse zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren. Beispiel 13 dieser Spezifikation nutzt eine statische Quantifizierung der Fluoreszenz als das Mittel, um elektrostatisch auf Perlen immobilisierte Zielsequenz zu quantifizieren. Wahlweise wird das Hybrid aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz von der Matrix durch Anpassung der Bedingungen außerhalb des Bereiches freigesetzt, der für die elektrostatische Bindung benötigt wird, und dadurch wird der Nachweis des ungebundenen Hybrids aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz erleichtert, oder es wird nur die detektierbare Sonde freigesetzt, als das Mittel, die Zielsequenz in der Probe zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren.
Beispielhafte Anwendungen für die Verwendung dieser Erfindung
Da die Verfahren, Kits und Zusammensetzungen dieser Erfindung in einem sondenbasierten Hybridisierungstest verwendet werden können, wird diese Erfindung einen Nutzen bei der Verbesserung von Tests finden, die verwendet werden, um die Anwesenheit oder Menge eines Organismus oder Virus in einer Probe durch die Detektion von Zielsequenzen im Zusammenhang mit dem Organismus oder Virus zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren (siehe US-Patent Nr. 5,641,631, bezeichnet als "Method for detecting, identifying and quantitating organisms and viruses", hierin durch Bezugnahme eingeschlossen). Ähnlich wird diese Erfindung auch Nutzen finden in einem Test, der bei der Detektion, Identifikation oder Quantifikation einer oder mehrerer Arten eines Organismus in einer Probe verwendet wird (siehe US-Patent Nr. 5,288,611, bezeichnet als "Method for detecting, identifying and quantitating organisms and viruses", hierin durch Bezugnahme eingeschlossen). Diese Erfindung wird auch Nutzen finden in einem Test, der verwendet wird, um die Wirkung antimikrobieller Mittel auf das Wachstum eines oder mehrerer Organismen in einer Probe zu bestimmen (siehe US-Patent Nr. 5,612,183, bezeichnet als "Method for determining the effect of antimicrobial agents on growth using ribosomal nucleic acid subunit subsequence specific probes", hierin durch Bezugnahme eingeschlossen). Diese Erfindung wird auch einen Nutzen finden in einem Test, der verwendet wird, um die Anwesenheit oder Menge einer taxonomischen Gruppe an Organismen in einer Probe zu bestimmen (siehe US-Patent Nr. 5,601,984, bezeichnet als "Method for detecting the presence of amount of a taxonomic group of organisms using specific r-RNA subsequences as probes", hierin durch Bezugnahme eingeschlossen).
Die Verfahren, Kits und Zusammensetzungen dieser Erfindung sind besonders nützlich für die schnelle, empfindliche, zuverlässige und vielseitige Detektion von Zielsequenzen, die für Organismen besonders sind, welche in Nahrungsmitteln, Getränken, Wasser, pharmazeutischen Produkten, Hygieneprodukten, Molkereiprodukten oder Umweltproben gefunden werden könnten. Die Analyse bevorzugter Getränke schließt Soda, Wasser in Flaschen, Fruchtsaft, Bier, Wein oder Likörprodukte ein. Folglich werden die Verfahren, Kits und Zusammensetzungen dieser Erfindung besonders nützlich sein für die Analyse von Rohmaterialien, Ausrüstung, Produkten oder Vorgängen, die verwendet werden, um Nahrungsmittel, Getränke, Wasser, pharmazeutische Produkte, Hygieneprodukte, Milchprodukte oder Umweltproben herzustellen oder zu lagern.
Ähnlich sind die Verfahren, Kits und Zusammensetzungen dieser Erfindung besonders nützlich für die schnelle, empfindliche, zuverlässige und vielseitige Detektion von Zielsequenzen, die besonders sind für Organismen, welche in klinischen Umgebungen gefunden werden könnten. Folglich werden die Verfahren, Kits und Zusammensetzungen dieser Erfindung besonders nützlich sein für die Analyse von klinischen Mustern oder Ausrüstung, Anlagen oder Produkten, die verwendet werden, um Menschen oder Tiere zu behandeln. Zum Beispiel kann der Test verwendet werden, um eine Zielsequenz zu detektieren, welche für eine auf Genetik basierende Erkrankung spezifisch ist, oder welche spezifisch ist für eine Veranlagung für eine auf Genetik basierende Erkrankung. Nicht begrenzende Beispiele an Erkrankungen schließen β-Thalassämie, Sichelzellanämie, Faktor-V Leiden, cystische Fibrose und mit Krebs in Beziehung stehende Ziele wie p53, p10, BRC-1 und BRC-2.
III. Bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung:
Zusammensetzungen:
In einem Ausführungsbeispiel bezieht sich diese Erfindung auf Zusammensetzungen, die geeignet sind, um die Anwesenheit einer Zielsequenz in einer Probe zu detektieren. Eine bevorzugte Zusammensetzung umfasst ein Nucleinsäure mit einer Zielsequenz, welche elektrostatisch an eine Matrix unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen gebunden ist. Die Zusammensetzung umfasst weiter eine Nicht-Nucleotidsonde mit einer Sondier-Nucleobasensequenz, die mit wenigstens einem Teil der Zielsequenz sequenzspezifisch hybridisiert ist, vorausgesetzt jedoch, dass die Nicht-Nucleotidsonde nicht wesentlich an die Matrix unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen bindet, wenn nicht die Zielsequenz auf der Matrix vorhanden ist. Deswegen wird die elektrostatische Immobilisierung des Komplexes aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz primär durch die Wechselwirkung der Nucleinsäure mit der Matrix bestimmt und ist nicht signifikant abhängig von irgendwelchen Wechselwirkungen der Nicht-Nucleotidsonde und der Matrix.
Solche Zusammensetzungen sind gut geeignet für den Nachweis der Anwesenheit von Zielsequenzen in Proben, da die Nucleinsäurebestandteile der Probe auf der Matrix konzentriert werden. Weiterhin wird die hybridisierte detektierbare Nicht-Nucleotidsonde auf der Matrix konzentriert, so dass die Nachweisgrenze des Tests verbessert werden kann, da die Anwesenheit der Markierung lokalisiert wird und dadurch leichter nachgewiesen wird, im Vergleich mit der Situation, wenn sie in der Masse der Flüssigkeit verteilt ist (siehe Beispiel 12).
Verfahren:
In einem anderen Ausführungsbeispiel bezieht sich diese Erfindung auf Verfahren für die Detektion, Identifikation oder Quantifikation einer Zielsequenz in einer Probe, die eine Nucleinsäure enthält. Ein beispielhaftes Verfahren umfasst das in Kontakt bringen einer Probe mit einer Matrix und wenigstens einer Nicht-Nucleotidsonde, worin die Nucleinsäure in der Probe elektrostatisch an die Matrix unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen binden wird. Zusätzlich wird die Nicht-Nucleotidsonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen mit wenigstens einem Teil der Zielsequenz, falls sie in der Probe anwesend ist, hybridisieren. Das Verfahren umfasst weiter das Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren des Hybrids aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz als ein Mittel, um die Zielsequenz in der Probe zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren.
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel bezieht sich diese Erfindung auf Multiplexverfahren für die Detektion, Identifikation oder Quantifikation von zwei oder mehr Zielsequenzen von zwei oder mehr Nucleinsäuremolekülen, die in derselben Probe anwesend sein könnten. Ein beispielhaftes Verfahren umfasst das in Kontakt bringen einer Probe mit einer Matrix und zwei oder mehr unabhängig detektierbaren Nicht-Nucleotidsonden, worin die in der Probe vorhandene Nucleinsäure elektrostatisch an die Matrix unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen binden wird. Zusätzlich werden die zwei oder mehr unabhängig detektierbaren Nicht-Nucleotidsonden unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen mit wenigstens einem Teil der Zielsequenzen, mit denen die Sonde durch ihre Konstruktion hybridisieren soll, falls sie in der Nucleinsäure der Probe vorhanden sind, hybridisieren. Folglich wird, falls eine bestimmt Zielsequenz elektrostatisch auf der Matrix immobilisiert wird, die unabhängig detektierbare Nicht-Nucleotidsonde, die gestaltet ist, um mit jener bestimmten Zielsequenz zu hybridisieren, auf der Matrix konzentriert werden und für die Detektion zugänglich werden. Deswegen umfasst das Verfahren weiter das Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren jedes einzelnen unabhängig detektierbaren Hybrids aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz, welches elektrostatisch an diese Matrix als ein Mittel gebunden wird, um jede einzelne Zielsequenz, die in der Probe und in demselben Test detektiert werden soll, zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren. Wahlweise werden die einzelnen unabhängig detektierbaren Hybride aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz von der Matrix freigesetzt durch Anpassen der Bedingungen außerhalb des Bereichs, der für die elektrostatische Bindung benötigt wird, und dadurch wird der Nachweis des ungebundenen Hybrids aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz oder nur der detektierbaren Sonde erleichtert, als das Mittel, um die Zielsequenz in der Probe zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren.
In noch einem weiteren Ausführungsbeispiel nutzt diese Erfindung den Vorteil der Stabilität der Komplexe aus Nucleinsäureanalogon und Nucleinsäure (siehe Stanley et al., US5,861,250), um dadurch weiter die Durchführung des Tests zu verbessern und/oder anderweitig den Arbeitsaufwand oder die Komplexität der Probenzubereitung zu reduzieren.
Ein Beispielverfahren umfasst das Kontaktieren der Probe mit wenigstens einer Nicht-Nucleotidsonde, worin die Nicht-Nucleotidsonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen mit wenigstens einem Teil der Zielsequenz hybridisieren wird, falls sie in der Probe vorhanden ist. Die Probe wird auch auf einer Matrix konzentriert, worin das Nucleinsäuremolekül elektrostatisch an eine Matrix unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen binden wird. Entweder vor oder nach der Immobilisierung an die Matrix wird die Probe, die den Komplex aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz enthält, mit einem oder mehreren Enzymen in Kontakt gebracht, die in der Lage sind, Proben-Verunreinigungen abzubauen, einschließlich dem Nucleinsäuremolekül, nicht jedoch den Komplex aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz. Das Verfahren umfasst weiter das Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren des Hybrids aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz als ein Mittel, die Zielsequenz in der Probe zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren, vorausgesetzt, dass die Nicht-Nucleotidsonde/Zielsequenz zuerst auf der Matrix immobilisiert wird. Wahlweise wird das detektierbare Hybrid aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz von der Matrix durch Anpassen der Bedingungen außerhalb des Bereiches, der für die elektrostatische Bedingung benötigt wird, freigesetzt und dadurch wird die Detektion des ungebundenen Hybrids aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz oder nur der detektierbaren Sonde erleichtert, als das Mittel, die Zielsequenz in der Probe zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren.
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel bezieht sich diese Erfindung auf ein Verfahren für die Detektion, Identifikation oder Quantifikation einer Zielsequenz eines Nucleinsäuremoleküls, das an einer Örtlichkeit auf einem Array elektrostatisch immobilisiert ist, worin der Array Nucleinsäuremoleküle umfasst, die elektrostatisch an einzigartigen Örtlichkeiten gebunden sind. Ein beispielhaftes Verfahren umfasst das in Kontakt bringen des Arrays mit wenigstens einer Nicht-Nucleotidsonde, worin die Nicht-Nucleotidsonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen mit wenigstens einem Teil der Zielsequenz, falls sie auf dem Array vorhanden ist, hybridisieren wird. Der an eine Örtlichkeit auf diesem Array elektrostatisch gebundene Komplex aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz wird dann detektiert, identifiziert oder quantifiziert als das Mittel, um die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge der an dieser Arrayörtlichkeit vorhandenen Zielsequenz zu bestimmen. Es ist ein Vorteil der Erfindung, dass eines oder mehrere Enzyme, die in der Lage sind, Probenverunreinigungen, einschließlich des Nucleinsäure-Zielmoleküls, nicht jedoch den Komplex aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz, abzubauen, auch vor der Analyse des Arrays hinzugefügt werden kann, um dadurch die Durchführung des Arraytests zu verbessern, indem Proben-Verunreinigungen abgebaut werden, welche ansonsten zu falsch-positiven Ergebnissen führen könnten. Wahlweise können die detektierbaren Hybride aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz von der Matrix durch Anpassung der Bedingungen außerhalb des Bereiches, der für die elektrostatische Bindung erforderlich ist, freigesetzt werden, und dadurch wird der Nachweis des Hybrids aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz oder nur der detektierbaren Sonde erleichtert, als das Mittel, die Zielsequenz in der Probe zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren. Falls die Nicht-Nucleotidsonden unabhängig detektierbar sind, kann die Analyse der Matrix in einem Multiplexformat erfolgen.
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel ist diese Erfindung auf ein Verfahren für die Detektion, Identifikation oder Quantifikation einer Zielsequenz eines Nucleinsäuremoleküls gerichtet, welches in irgendeiner von zwei oder mehr Proben von Interesse vorhanden sein könnte. Das Verfahren umfasst das Vermischen jeder der beiden oder mehr Proben von Interesse mit wenigstens einer Nicht-Nucleotidsonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen. Als Nächstes wird eine Matrix unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen mit wenigstens einem Teil von jeder der zwei oder mehr Proben in Kontakt gebracht, um dadurch die Nucleinsäurebestandteile jeder Probe an die Matrix elektrostatisch zu immobilisieren, jede an einer einzigen Örtlichkeit, und um dadurch eine Matrixanordnung von Proben zu schaffen. Der an eine Örtlichkeit auf diesem Array elektrostatisch gebundene Komplex aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz wird dann detektiert, identifiziert oder quantifiziert als das Mittel, um die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge der an dieser Arrayörtlichkeit vorhandenen Zielsequenz zu bestimmen. Es ist ein Vorteil der Erfindung, dass eines oder mehrere Enzyme, die in der Lage sind Proben-Verunreinigungen abzubauen, einschließlich des Nucleinsäure-Zielmoleküls, nicht jedoch den Komplex aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz, auch vor der Analyse des Arrays hinzugefügt werden können, um dadurch die Durchführung des Arraytests durch Abbauen von Proben-Verunreinigungen, welche ansonsten zu falschpositiven Ergebnissen führen könnten, zu verbessern. Wahlweise können die detektierbaren Hybride aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz von der Matrix durch Anpassung von Bedingungen außerhalb des Bereiches, der für die elektrostatische Bindung benötigt wird, freigesetzt werden, und dadurch wird die Detektion des ungebundenen Hybrids aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz oder nur der detektierbaren Sonde erleichtert, als das Mittel, um die Zielsequenz in der Probe zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren. Falls die Nicht-Nucleotidsonden unabhängig detektierbar sind, kann die Analyse der Matrix in einem Multiplexformat erfolgen.
Kits:
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel ist diese Erfindung auf Kits gerichtet, die für die Durchführung eines Tests, wie er hierin beschrieben ist, geeignet ist, welcher die Anwesenheit, Abwesenheit oder Anzahl von Zielsequenzen in einer Probe detektiert. Die Kits dieser Erfindung umfassen eine Matrix und eine oder mehrere Nicht-Nucleotidsonden und andere Reagenzien oder Zusammensetzungen, die ausgewählt werden, um einen Test durchzuführen oder um anderweitig die Durchführung eines Tests zu vereinfachen, der verwendet wird, um eine Zielsequenz in einer Probe zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren. Geeignete Nicht-Nucleotidsonden, Matrizes und Verfahren wurden kürzlich hierin beschrieben. Typischerweise wird der Kit eine Nicht-Nucleotidsonde, eine Matrix und eines oder mehrere Reagenzien oder Puffer für die Festlegung der elektrostatischen Bindungsbedingungen und/oder Hybridisierungsbedingungen umfassen.
Ein Ausführungsbeispiel eines bevorzugten Kits wird wenigstens zwei unabhängig detektierbare Nicht-Nucleotidsonden umfassen, dergestalt, dass die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge jeder unabhängig detektierbaren Einheit verwendet werden kann, um jede von wenigstens zwei Zielsequenzen, die in einer Probe in demselben Test (ein Multiplextest) vorhanden sein könnten, unterscheidbar zu identifizieren oder zu quantifizieren. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird der Kit zwei oder mehr Nicht-Nucleotid-"Beacon"-Sonden umfassen. Vorzugsweise wird der Kit nützlich sein, um einen selbstanzeigenden Multiplextest wie einen selbstanzeigenden PCR-Test durchzuführen.
3. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A und 1B sind mit dem Computer erzeugte Negative der Abbildungen einer Fotografie von Röhrchen eines Experimentes, in der PCR verwendet wird, um eine Nucleinsäure, die eine Zielsequenz umfasst, zu amplifizieren, mit welcher ein Linear Beacon hybridisiert, um ein detektierbares Signal zu erzeugen.
2A und 2B sind mit dem Computererzeugte Negative der Abbildungen einer Fotografie desselben Polyacrylamidgels, das verwendet wurde, um den Inhalt der in den 1A und 1B vor (2A) und nach (2B) der Färbung mit Ethidiumbromid zu analysieren.
3 ist ein mit dem Computer erzeugtes Negativ einer Abbildung einer Fotografie von Röhrchen aus einem Experiment, bei dem PCR verwendet worden ist, um unterschiedliche Amplicons mit einer Punktmutation einer Zielsequenz zu erzeugen, mit welcher ein Linear Beacon hybridisiert, um ein detektierbares Signal zu erzeugen.
4A und 4B sind mit dem Computer erzeugte Negative einer Abbildung einer Fotografie desselben Polyacrylamidgels, das verwendet worden ist, um den Inhalt der in 3 gezeigten Röhrchen vor (4A) und nach (4B) der Färbung mit Ethidiumbromid zu analysieren.
5 ist ein mit dem Computer erzeugtes Negativ einer Abbildung einer Fotografie von Röhrchen aus einem Experiment, das verwendet wurde, um den Bereich der Ionenstärke, der für die elektrostatische Immobilisierung von Sonden, Zielnucleinsäuren und Komplexen aus Sonde und Zielnucleinsäure geeignet ist, zu bestimmen.
6A und 6B sind Abbildungen derselben mit GAPS-überzogenem Mikroskopobjektträger, die aufgetropfte Proben enthalten, vor (6A) und nach (6B) dem Waschen, um Material zu entfernen, das nicht anderweitig elektrostatisch immobilisiert worden ist.
Methoden für die Durchführung der Erfindung
Diese Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele erläutert, von denen nicht beabsichtigt ist, dass sie in irgendeiner Weise begrenzend sind.
Beispiel 1: Synthese von DNA-Oligonucleotiden für die Untersuchung
Für diese Untersuchung wurden markierte und unmarkierte DNA-Oligonucleotide, die als Sonden oder als Nucleinsäuren geeignet sind, umfassend eine Zielsequenz, entweder unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reagenzien und Geräten synthetisiert oder von kommerziellen Lieferanten bezogen. Sämtliche DNAs wurden in gereinigter Form erhalten oder unter Verwendung von gewöhnlichen Verfahren gereinigt. Die Sequenzen der zubereiteten DNA-Oligonucleotide sind in Tabelle 1 unten dargestellt. Verfahren und Zusammensetzungen für die Synthese und Reinigung synthetischer DNAs sind Fachleuten wohl bekannt.
Beispiel 2: Synthese von N-α-(Fmoc)-ε-(NH₂)-L-ysin-OH
Zu 20 mmol N-α-(Fmoc)-N-ε-(t-boc)-L-Lysin-OH wurden 60 ml 2/1 Dichlormethan (DCM)/Trifluoressigsäure (TFA) hinzugefügt. Der Lösung wurde ermöglicht, zu rühren, bis die tert-Butyloxycarbonyl-(t-boc)-Gruppe vollständig von dem N-α-(Fmoc)-N-ε-(t-boc)-L-Lysin-OH entfernt worden war. Die Lösung wurde dann bis zur Trockne verdampft und der Rückstand wurde erneut in 15 ml DCM gelöst. Es wurde dann ein Versuch gemacht, das Produkt durch die tropfenweise Zugabe der Lösung zu 350 ml Ethylether zu fällen. Da das Produkt ausölte, wurde der Ethylether dekantiert und das Öl wurde einem Hochvakuum ausgesetzt, um einen weißen Schaum zu ergeben. Der weiße Schaum wurde in 250 ml Wasser gelöst und die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 4 durch die Zugabe von gesättigtem Natriumphosphat (dibasisch) neutralisiert. Es wurde ein weißer Feststoff gebildet und durch Vakuumfiltration gesammelt. Das Produkt wurde in einem Vakuumofen bei 35–40 °C über Nacht getrocknet. Ausbeute: 17,6 mmol, 88 %.
Beispiel 3: Synthese von N-α-(Fmoc)-N-ε-(dabcyl)-L-Lysin-OH
Zu 1 mmol N-α-(Fmoc)-N-ε-(NH₂)-L-Lysin-OH (Beispiel 2) wurden 5 ml N,N'-Dimethylformamid (DMF) und 1,1 mmol TFA hinzugefügt. Dieser Lösung wurde ermöglicht, zu rühren, bis sich die Aminosäure vollständig gelöst hatte.
Zu 1,1 mmol 4-((4-Dimethylamin)phenyl)azo)benzosäure-Succinimidylester (Dabcyl-NHS; Molecular Probes, P/N D-2245) wurden 4 ml DMF und 5 mmol Diisopropylethylamin (DIEA) hinzugefügt. Zu dieser Rührlösung wurde tropfenweise die wie oben beschrieben zubereitete N-α-(Fmoc)-N-ε-(NH₂)-L-Lysin-OH-Lösung hinzugefügt. Der Reaktion wurde ermöglicht, über Nacht zu rühren, und sie wurde dann aufgearbeitet.
Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in 50 ml DCM und 50 ml 10 % wässriger Zitronensäure partitioniert. Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht wurde mit wässrigem Natriumbicarbonat gewaschen und wiederum mit 10 % wässriger Zitronensäure gewaschen. Die organische Schicht wurde dann mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem orangen Schaum verdampft. Der Schaum wurde aus Acetonitril (ACN) kristallisiert und die Kristalle wurden durch Vakuumfiltration gesammelt. Ausbeute: 0,52 mmol, 52 %.
Beispiel 4: Synthese eines N-α-(Fmoc)-N-ε-(dabcyl)-L-Lysin-PAL-PEG/PS-Syntheseträgers
Das N-α-(Fmoc)-N-ε-(dabcyl)-L-Lysin-OH (Beispiel 2) wurde verwendet, um einen Syntheseträger zuzubereiten, der für die Zubereitung C-terminal dabcylierter PNAs nützlich ist. Die Fluorenylmethoxycarbonyl-(Fmoc)-Gruppe von 0,824 g im Handel erhältlichem Fmoc-PAL-Peg-PS-Syntheseträger (PerSeptive Biosystems, Inc.; P/N GEN913384) wurde durch Behandlung in einem Durchflussgefäß mit 20 % Piperidin in DCM für 30 Minuten entfernt. Der Träger wurde dann mit DCM gewaschen. Schließlich wurde der Träger mit DMF gewaschen und mit einem Spülstrom aus Argon getrocknet.
Eine Lösung, die 0,302 g N-α-(Fmoc)-N-ε-(dabcyl)-L-Lysin-OH, 3,25 ml DMF, 0,173 g [O-(7-Azabenzotriaol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphate (HATU), 0,101 ml DIEA und 0,068 ml 2,6-Lutidin enthielt, wurde durch die aufeinander folgende Kombination der Reagenzien zubereitet. Diese Lösung wurde dann zu dem gewaschenen Syntheseträger hinzugefügt und es wurde ihr ermöglicht, für 2 Stunden zu reagieren. Die Lösung wurde dann durch das Gefäß mit einem Argonstrom gespült und der Träger wurde nacheinander mit DMF, DCM und DMF gewaschen. Das Harz wurde dann mit einem Argonstrom getrocknet.
Der Träger wurde mit 5 ml im Handel erhältlichem Standard-PNA-Kappen-Reagens (PerSeptive Biosystems, Inc., P/N GEN063102) behandelt. Das Kappen-Reagens wurde dann von dem Gefäß abgespült und der Träger wurde mit DMF und DCM gewaschen. Der Träger wurde dann mit einem Argonstrom getrocknet. Schließlich wurde der Syntheseträger unter Hochvakuum getrocknet.
Die Endbeladung des Trägers wurde durch die Analyse der Fmoc-Beladung von drei Proben von annähernd 6–8 mg bestimmt. Die Analyse bestimmte die Beladung auf annähernd 0,145 mmol/g.
Dieser Syntheseträger wurde in eine leere PNA-Synthesesäule, sofern benötigt, gepackt und verwendet, um PNA-Oligomere mit einer C-terminalen Dabcyl-Löschereinheit, angeheftet an das PNA-Oligomer durch die ε-Aminogruppe der C-terminalen Aminosäure L-Lysin, zuzubereiten.
Beispiel 5: Synthese von PNA
PNAs wurden unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reagenzien und Geräten, erhalten von PerSeptive Biosystems, Inc., synthetisiert. Doppelkupplungen wurden oftmals durchgeführt, um sicherzustellen, dass das Rohprodukt von einer annehmbaren Reinheit war. Die Reinheit der End-PNAs wurde durch Standardumkehrphasen-Chromatographieverfahren bestimmt und die Identität der PNA wurde durch Vergleich theoretisch berechneter Massen mit den Ergebnissen der Massenanalyse unter Verwendung eines MALDI-TOF-Massenspektrometers betätigt.
Es wurden PNAs, die eine C-terminale Dabcyleinheit besaßen, zubereitet durch Durchführen der Synthese unter Verwendung eines, wie im Beispiel 4 beschrieben, zubereiteten, mit Dabcyl-Lysin modifizierten Syntheseträgers. PNAs, die eine N-terminale Fluoresceineinheit besaßen, wurden mit den geeigneten Markierungsreagenzien und Linkern (falls nötig) vor der Abspaltung von dem Syntheseträger behandelt (siehe Beispiel 6). Etliche Verfahren sind für das Markieren eines PNA-Oligomers mit Fluorescein erhältlich, das von den Anmeldern bevorzugte Verfahren ist aber in Beispiel 6 beschrieben. PNAs, umfassend eine Cy3-Markierung (Amersham), wurden von dem Syntheseträger abgespalten und mit HPLC unter Verwendung gewöhnlicher Verfahren vor der Cy3-Markierung gereinigt, wie in Beispiel 7 beschrieben.
Beispiel 6: Bevorzugtes Vorgehen für die Markierung trägergebundener PNA mit 5(6)-Carboxyfluorescein
Nach der sauberen Reaktion mit Linkern und dem Entfernen der endständigen Aminschutzgruppe wurde das Harz mit 250 μl einer Lösung, enthaltend 0,5 M 5(6)-Carboxyfluorescein, 0,5 M N,N'-Diisopropylcarbodiimid, 0,5 M 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol (HOAt) in DMF (siehe Weber et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 8: 597–600 (1998)) behandelt. Nach der Behandlung wurde der Syntheseträger gewaschen und unter Hochvakuum getrocknet. Das PNA-Oligomer wurde dann abgespalten, deprotektioniert und gereinigt.
Beispiel 7: Allgemeines Vorgehen für die Cy3-Markierung von PNAs
Das gereinigte, PNA enthaltende Amin wurde in 1/1 DMF/Wasser in einer Konzentration von annähernd 0,05 OD/μl gelöst, um eine PNA-Stammlösung zuzubereiten. Aus der Stammlösung wurden annähernd 30 nmol PNA zu einem Röhrchen hinzugefügt. Zu diesem Röhrchen wurden dann 125 μl 0,1 M HEPES (pH 8,5) und ausreichend 1/1 DMF/Wasser, um das Gesamtvolumen auf 250 μl zu bringen, hinzugefügt. Diese Lösung wurde gründlich vermischt. Zu einem vorgepackten Röhrchen aus Cy3-Farbstoff (Amersham) wurden die gesamten 250 μl der wie oben beschrieben zubereiteten Lösung hinzugefügt. Das Röhrchen wurde gut vermischt und es wurde ihm dann ermöglicht, für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur zu reagieren.
Nach der Reaktion wurde das Lösungsmittel durch Verdampfung in einem Speed-Vac entfernt. Das Pellet wurde dann in 400 μl einer Lösung, enthaltend 3:1 1 % wässriges TFA/ACN, gelöst. Wahlweise wurde die Lösung dann in 5000 MW Ultrafree (Millipore, P/N UFC3LCC25) oder 3000 MW (Amicon, P/N 42404) übertragen und filtriert, um Farbstoff im Überschuss zu entfernen. Das wiedergewonnene Produkt wurde dann erneut unter Verwendung gewöhnlicher Umkehrphasen-Chromatographieverfahren gereinigt.
Allgemeine Diskussion der Beispiel 8 bis 12:
Die folgenden Beispiele wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob die Anwesenheit von Zielnucleinsäuren, welche elektrostatisch an mit Polyethylenimin (PEI) derivatisierte Perlen gebunden worden sind, spezifisch unter Verwendung von markierten PNA-Sonden detektiert werden könnte, worin die markierte (neutrale) PNA nicht an die Perlen in der Abwesenheit von Zielnucleinsäure immobilisiert werden würde, jedoch hybridisieren würde und deswegen auf den Perlen immobilisiert werden würde, falls die Zielnucleinsäure vorhanden ist. Diese Experimente zeigen eine Anwendung, welche einzigartig geeignet ist für PNA-Sonden, da sie ein neutrales Rückgrat besitzen, aber nichtsdestotrotz mit Nucleinsäuren mit Sequenzspezifität hybridisieren.
Unterstützt durch die Diskussion und die hierin beschriebenen Beispiele werden Fachleute schätzen, dass andere als jene mit PEI überzogenen, positiv geladenen Matrizes für die Praxis der hierin beschriebenen Erfindung geeignet sind. Ähnlich werden Fachleute schätzen, dass sämtliche Matrixarten oder Trägerarten, andere als Perlen, für die Praxis dieser Erfindung geeignet sind. Schließlich werden Fachleute auch schätzen, dass die Nicht-Nucleotidsonden, die für die Praxis dieser Erfindung geeignet sind, gegenwärtige (z. B. PNA) und zukünftige Konstrukte einschließen, welche sequenzspezifisch mit Nucleinsäure in Wechselwirkung treten und welche entweder neutral oder positiv geladen sind unter Bedingungen, bei denen eine Nucleinsäure elektrostatisch an eine geladene Matrix binden wird.
Tabelle 1: Oligodesoxynucleotidsonden und Konstrukte
Sämtliche Oligodesoxynucleotide sind von dem 5'- in Richtung zu dem 3'-Ende dargestellt. Stammlösungen der Oligodesoxynucleotide wurden allgemein zubereitet durch Lösen des trockenen Pulvers in TE-Puffer (TE-Puffer: 10 mM Tris, pH 8,3, 1 mM EDTA).
Materialien:
Im Handel erhältliche mit PEI derivatisierte Perlen wurden für diese Experimente ausgewählt, da sie leicht erhältlich sind als gut charakterisierte, kommerzielle Anionenaustauch-Chromatographie-Packmaterialien mit einer hohen Dichte positiv geladener funktioneller Gruppen pro Flächeneinheit bei einem neutralen pH-Wert (pH 7). Da sie eine hohe Dichte positiv geladener funktioneller Gruppen bei einem neutralen pH-Wert besaßen, besaßen sie eine günstige Bindungskapazität für Oligonucleotide, die bei neutralem pH-Wert negativ geladen sind (da jeder Phosphodiester eine einzelne negative Ladung umfasst, ist die Ladung jeder Nucleinsäure längenabhängig).
PEI-Kieselsäure- und Q-Sepharose-Perlen wurden als im Wesentlichen austauschbar in sämtlichen durchgeführten Experimenten festgestellt. Die PEI-Kieselsäure-Perlen wurden jedoch als eine innere (natürliche) Fluoreszenz aufweisend befunden, wenn sie auf dem UV-Transilluminator beleuchtet wurden, und aus diesem Grund können sie in einigen Anwendungen weniger geeignet sein.
Tabelle 2: PNA-Sonden
Sämtliche PNA-Sequenzen sind von dem Amin- zum Carboxylende geschrieben. Abkürzungen sind: Ac = Acetyl; Flu = 5(6)-Carboxyfluorescein; Dabcyl = 4-((4-(Dimethylamino)phenyl)azo)benzoesäure; Bio = Biotin; O = 8-Amino-3,6-dioxaoctansäure; K = die Aminosäure L-Lysin; E = der Löslichkeitsverstärker "4", wie er in Gildea et al., Tett. Lett. 39 (1998), 7255-7258, wiedergegeben ist; Ce = die Gruppe, erhalten durch Kappen der PNA mit der geladenen Einheit "7", wie in Gildea et al., Tett. Lett. 39 (1998), 7255-7258, wiedergegeben, and Cy3 = der Cyanin-3-Farbstoff von Amersham. Stammlösungen von PNAs werden allgemein durch Lösen der gereinigten Sonde in einer Lösung zubereitet, enthaltend 1/1 N,N'-Dimethylformamid (DMF)/Wasser, in einer Konzentration von annähernd 0,05 OD (260 nm) pro μl.
DNA-Plasmid-Matrizen
Die Plasmide pKRASMU und pKRASWT wurden als Matrizen in PCR-Amplifikationsreaktionen verwendet und wurden durch Klonieren eines PCR-Amplicons aus menschlicher DNA in das pCR2.1-Plasmid (Invitrogen) erzeugt. Die mutierte menschliche DNA wurde aus einer Zelllinie, Calu-1, zubereitet, welche eine Punktmutation an der Base 129 des K-ras-Gens enthält. Die menschliche Wildtyp-DNA wurde aus einer Zelllinie, NCI, zubereitet, welche zwei Kopien des K-ras-Wildtyp-Gens enthält. Klone wurden durch Restriktionsfragmentanalyse und Sequenzanalyse gescreent. Große Zubereitungen des Plasmids wurden erzeugt und wurden unter Verwendung von Standardtechniken quantifiziert. Die amplifizierte Region flankiert die K-ras-Mutation und war 111 bp lang.
dsDNA-Matrize (nur amplifizierter Bereich)
Die Position und Sequenz der Punktmutation der Amplicons ist in Klammern erläutert.

Das Plasmid PBR322 wurde von New England BioLabs, P/N 300-35, erhalten. Tabelle 3: Salzpuffer

Elektrophoreseartikel:

10–20% Polyacrylamidgel:	ESA, Katalog # 80-0015
10X Gelpuffer:	ESA, Katalog # 80-0132
4X Beladungsfarbstoff:	50 % Glycerol, 0,1 M Bromphenol-Blau, 0,01 M Xylencyanol, 4X ESA-Gelpuffer (verdünnt aus ESA # 80-0132)

Beispiel 8: Allgemeine Eigenschaften der Polyethylenimin- (PEI-)Perlen
Polyethylenimin- (PEI-)Perlen wurden untersucht, um die physikalischen Eigenschaften wie Partikelgröße und Form, ebenso wie chemische Eigenschaften wie die Bindungskapazität von Nucleinsäure zu bestimmen. Partikelgröße und die Konzentration der pro Volumeneinheit suspendierten Perlen wurden unter Verwendung eines Hemazytometers (Hausser Scientific; Horsham, PA; Modell # 3900) bestimmt.
Unter Verwendung des Hemazytometers wurden die Sepharoseperlen als allgemein kugelig in der Form und mit einem Durchmesser im Bereich von annähernd 20–50 μm mit einem geschätzten durchschnittlichen Durchmesser von 30 μm befunden. Die Konzentration der suspendierten Sepharoseperlen wurde auf annähernd 50.000 Perlen/μl geschätzt, nachdem sie gewaschen (gemäß den Instruktionen des Herstellers) und in deionisiertem Wasser erneut gelöst worden sind.
Unter Verwendung des Hemazytometers wurden die Kieselsäureperlen ebenfalls als allgemein in der Form kugelig und mit einem Durchmesser im Bereich von annähernd 5–15 μm mit einem geschätzten durchschnittlichen Durchmesser von annähernd 10 μm befunden. Die Konzentration der suspendierten Kieselsäureperlen wurde auf annähernd 150.000 bis 200.000 Perlen/μl geschätzt, nachdem sie gewaschen (gemäß den Anweisungen des Herstellers) und erneut in deionisiertem Wasser gelöst worden waren.
Die Fähigkeit der Kieselsäure- und Sepharoseperlen, Nucleinsäure zu binden, wurde in 100 mM TRIS-HCI, pH 7,5, untersucht. Die Kapazität der Sepharoseperlen wurde gemittelt auf ungefähr 0,75 OD₂₆₀ Nucleinsäure pro μl Perlen oder annähernd 1,1 E-5 OD₂₆₀ Nucleinsäure pro Perle. Die Kapazität der Kieselsäureperlen wurde durch den Anmelder angenähert auf ungefähr 0,4 OD₂₆₀ Nucleinsäure pro μl Perle oder annähernd 0,8 E-6 OD₂₆₀ Nucleinsäure pro Perle. Für sämtliche durchgeführten Experimente waren diese Bindungskapazitäten hoch genug, so dass von der gesamten Nucleinsäure der Probe erwartet wurde, dass sie unter der gegebenen Menge an in dem Test vorhandener Matrix und unter den verwendeten elektrostatischen Bindungsbedingungen elektrostatisch an den Untergrund gebunden werden würde.
Beispiel 9: Vorläufige Studien über [Salz] und pH-Wert
Wie oben diskutiert, sind die Kieselsäure- und Sepharoseperlen kommerziell erhältliche Anionenaustausch-Chromatographiemedien. Da die Anionenaustausch-Chromatographie oftmals einen Salzgradienten oder einen pH-Gradienten nutzt, um Materialien, die elektrostatisch daran gebunden sind, zu eluieren, wurde die Wirkung der Modulation in der Salzkonzentration und der pH-Variation auf die Bindung von PNA- und/oder DNA-Sonden an Sepharoseperlen untersucht, um geeignete elektrostatische Bindungsbedingungen für die nachfolgende Experimentierung zu bestimmen.
i. [Salz]
Zu einzelnen Röhrchen, die 5 μl Sepharoseperlen und 94 μl jeweils einer von sechs Salzlösungen (Salzpuffer A-F; siehe Tabelle 3 oben) enthielten, wurden 5 pmol (in 1 μl eines geeigneten Lösungsmittels) von entweder DNA-WT-15Flu- (Tabelle 1) oder PNA-WT-15Flu-Sonde (Tabelle 2) hinzugefügt. Die Röhrchen wurden verwirbelt, kurz zentrifugiert und dann unter UV-Licht untersucht, um zu bestimmen, ob die fluoreszierend markierten Proben immer noch in der Lösung vorherrschend waren oder ob sie an die Oberfläche der Perlen adsorbiert hatten.
Die PNA-Sonde (PNA WT-15FLu; Tabelle 2) wurde als vorwiegend an die Perlen adsorbiert gefunden, wenn sie sich in den Salzpuffern A und B befand, jedoch vorwiegend in Lösung, wenn alle die Puffer mit der höheren Salzkonzentration verwendet worden waren. Diese Ergebnisse zeigten, dass die mit Fluorescein markierte PNA-Sonde nur an die Perlen bei einer niedrigen Ionenstärke (annähernd 200 mM NaCl oder darunter) binden würde.
Im Vergleich dazu wurde die mit Fluorescein markierte DNA-Sonde (DNA WT-15F1u; Tabelle 1) mit identischer Länge an Untereinheiten und mit identischer Nucleobasensequenz als im Wesentlichen an die Perlen adsorbiert gefunden, mit der Ausnahme, wenn Puffer F anwesend war. In Puffer F wurde etliches der Sonde in der Lösung beobachtet. Diese Daten zeigten, dass wenigstens 500 mM NaCl nötig waren, um die elektrostatischen Wechselwirkungen der 15-mer DNA-Sonde und des PEI auf der Oberfläche zu unterbrechen, um dadurch die Sonde von der Matrix freizusetzen.
Obwohl der Unterschied von 200 mM NaCl, um das PNA-15-mer freizusetzen, im Vergleich mit 500 mM für die Freisetzung des DNA-15-mers signifikant genug war, um für die Praxis vieler Ausführungsbeispiele dieser Erfindung nützlich zu sein, war das Erfordernis nach 200 mM NaCl, um PNA-Sonde von der PEI-Oberfläche freizusetzen, überraschend und veranlasste deswegen Folgeuntersuchungen. Nach der weiteren Analyse wurde die Anwesenheit der Fluorescein-Markierung (5(6)-Carboxyfluorescein), welche zwei negative Ladungen bei neutralem pH-Wert besitzt, als der primäre Grund für die starken elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen der PNA-Sonde und den PEI-derivatisierten Perlen bestimmt.
Im Wege dieses Beispiels wurde ein Cy3-markiertes PNA-15-mer (UQ-Cy3; Tabelle 2), welches eine positive geladene Kappengruppe umfasste, in den in Tabelle 3 oben aufgelisteten Salzpuffern untersucht. Es wurde herausgefunden, dass die Cy3-markierte PNA nicht an die Perlen band, sogar in Salzpuffer A. Weiterhin wurde herausgefunden, dass freies Fluorescein im Wesentlichen an die Perlen in Salzpuffer A adsorbiert war, wohingegen der Cy3-Farbstoff dies nicht tat. Schließlich wurde festgestellt, dass 1 μl der Sepharoseperlen sogar 5 pmol 5(6)-Carboxyfluorescein adsorbieren konnten, wenn sie in Salzpuffer A waren. Folglich legen diese Daten nahe, dass es die Fluorescein-Markierung und nicht der PNA-Teil des Oligomers war, welche die starke Wechselwirkung zwischen den PEI-derivatisierten Perlen in den Salzpuffern A und B zeigten. Folglich wird angenommen, dass native PNA nicht wesentlich an PEI elektrostatisch bindet, sogar unter niedrigen Salzbedingungen (z. B. Salzpuffer A). Dies steht in Übereinstimmung mit den Erwartungen, da PNA neutral ist, und deswegen sollte nicht erwartet werden, dass sie an die PEI-derivatisierten Perlen elektrostatisch bindet.
ii. pH-Wirkungen:
Da sich die Nettoladung auf dem PNA-Rückgrat nicht dramatisch bei einem pH-Wert im Bereich von 5–10 ändern sollte, wurde die Wirkung der Modulation im pH-Wert nach der Bindung von PNA an PEI-derivatisierte Perlen nicht untersucht. Es wurde jedoch die pH-Abhängigkeit der DNA-Bindung an PEI-derivatisierte Kieselsäureperlen untersucht, um Arbeitsparameter für die nachfolgende Experimentierung zu bestimmen. Die Ergebnisse der Experimente können wie folgt zusammengefasst werden: Bei einem pH-Wert von 7,3 blieb die WT-15Flu-DNA-Sonde auf den Kieselsäureperlen bis zu einer Konzentration von 0,8 M NaCl gebunden, wohingegen bei einem pH-Wert von 8,3 dieselbe Sonde an die Perlen bei NaCl-Konzentrationen im Überschuss von 0,1 M nicht band.
Diese Ergebnisse können mit der Anzahl erwarteter positiv geladener funktioneller Gruppen auf dem PEI-Träger in Beziehung gesetzt werden. Die höhere Kapazität bei einem pH-Wert von 7,3 zeigt, dass der Träger unter diesen Bedingungen stärker geladen ist (höhere Ladungsdichte). Bei einem pH-Wert von 8,3 nähert sich der pH-Wert der Lösung dem pK-Wert des sekundären Amins von PEI an und deswegen beginnt der Träger damit, neutralisiert zu werden (weniger positive Ladungen pro Flächeneinheit). Mit weniger positiven Ladungen hat jede Perle eine niedrigere Affinität für die negativ geladenen Oligodesoxynucleotide. Deswegen wird weniger Salz benötigt, um die elektrostatischen Wechselwirkungen zu unterbrechen und dadurch die DNA in die Lösung freizusetzen.
Beispiel 10: Vorläufige Untersuchung der Hybridbildung immobilisierter DNA
Es wurde eine Studie durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Hybridisierung der DNA-Sonden mit Nucleinsäure geschehen würde, die elektrostatisch an der Oberfläche der Sepharoseperlen immobilisiert ist. Für dieses Experiment wurde 1 pmol der MU-15Flu-PNA-Sonde ermöglicht, mit 0,5 pmol des KRASMU(31)-DNA-Ziels zu hybridisieren, welches entweder frei in Lösung war oder elektrostatisch an Sepharoseperlen gebunden war (1 μl einer 1:10-Verdünnung einer Perlenstammlösung in Puffer E). Es wurden Kontrollen in der Form von "nur PNA" (Sonde) und "nur DNA" (Zielsequenz) ebenfalls untersucht. Den Hybridisierungsreaktionen wurde ermöglicht, für annähernd 2 Minuten fortzuschreiten, wonach 1 μl der 1:10-Verdünnung der Perlenstammlösung zu der Probe hinzugefügt wurde, welche anfänglich keine Sepharoseperlen enthielt.
Die Hybridisierungsreaktionsbestandteile wurden dann in einzelne Kapillarpipetten eingesaugt, aus welchen die Flüssigkeit herausgesaugt wurde, wodurch die Perlen und jegliche gebundenen und fluoreszierend markierten PNA/DNA-Hybride zurückgelassen wurden. Die Kontrollen "nur PNA" und "nur DNA" wurden als nicht-fluoreszierend unter UV-Licht befunden. Durch die optische Inspektion waren jedoch beide der PNA/DNA-Hybridisierungsreaktionen gleich fluoreszierend. Folglich zeigen diese Daten, dass die PNA mit annähernd äquivalenter Effizienz an sowohl die DNA hybridisieren kann, die auf Sepharoseperlen immobilisiert ist, ebenso wie sie mit der DNA hybridisieren kann, die frei in Lösung ist.
Beispiel 11: Effizienz von elektrostatischem Einfangen und Freisetzen
Es wurde eine Studie durchgeführt, um die Effizienz des elektrostatischen Einfangens und Freisetzens von Nucleinsäure bei sehr niedrigen Nucleinsäurekonzentrationen zu bestimmen. Da die Menge an Nucleinsäure extrem gering war, wurde die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet, um die eingefangene und wiedergewonnene Nucleinsäure zu quantifizieren. Das Plasmid pBR322 (New England BioLabs; PN/P/N 300-35) wurde in Konzentrationen im Bereich von 5 E+11 bis 5 E+5 Molekülen (annähernd 1 attomol) pro Mikroliter verwendet.
Plasmid-DNA wurde über einen Zeitraum von 5 Minuten unter Verwendung von 1 μl PEI-Kieselsäureperlen in 20 μl 100 mM TRIS-HCl, pH 7,6, eingefangen. Nach dem Einfangen wurden die Proben durch Zentrifugation pelletiert, die Überstände wurden entfernt und die Perlen wurden mit 1000 μl 100 mM TRIS-HCl, pH 7,6, gewaschen, um unspezifisch gebundenes Material zu entfernen. Die Plasmid-DNA wurde dann von den Perlen durch Behandlung mit 10 μl Hochsalzpuffer, enthaltend 2 M NaCl und 100 mM TRIS-HCl, pH 7,6, freigesetzt. Ein Mikroliter jedes Perleneluates wurde dann zu 99 μl 100 mM TRIS-HCl, pH 7,6, hinzugefügt, um die NaCl-Konzentration auf ein Maß, das für PCR annehmbar ist, herunter zu verdünnen. Zwei Mikroliter jeder verdünnten Probe wurden dann zu einer 50μl-PCR-Reaktion hinzugefügt.
Zusätzlich enthielt jede PCR-Reaktion ebenfalls 5 pmol pBR322-5'-Primer, 5 pmol pBR322-3'-Primer, 3 mM MgCl₂, 250 μM NTPs, 2,0 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase, 50 mM KCl und 10 mM Tris-HCl, pH 8,3 (PCR-Reagenzien, einschließlich 10X Puffer, Magnesiumchloridlösung, AmpliTaq-DNA-Polymerase und Nucleotidtriphosphate, wurden von Perkin-Elmer, Foster City, CA, bezogen). Die Reaktionen wurden in Mini-Eppendorf-Röhrchen unter Verwendung eines Perkin-Elmer-2400-Thermocycler-Gerätes durchgeführt. Das PCR-Protokoll schloss 20 Sekunden Aufwärmen auf 95 °C (nur in der ersten Runde), gefolgt von der Denaturierung bei 95 °C für 20 Sekunden, Annealing bei 56 °C für 20 Sekunden und Verlängerung bei 74 °C für 20 Sekunden, ein. Der Zyklus aus Denaturierung, Annealing und Verlängerung wurde für 30 Zyklen wiederholt, gefolgt von einem abschließenden Verlängerungsschritt bei 74 °C für 5 Minuten.
Sämtliche Proben wurden auf einem Polyacrylamidgel nach der PCR laufen gelassen und alle enthielten nachweisbare Spiegel des Amplicons mit der korrekten Größe, obwohl die am meisten verdünnte Probe (5 E+5 Eingangsmoleküle) kaum detektierbar war. Die Menge an DNA in der PCR-Reaktion war tatsächlich 500-fach weniger (1 E+3 Moleküle) wegen der Verdünnung, die notwendig war, um Salz zu entfernen, wie oben beschrieben. In einem Kontrollexperiment, das zur selben Zeit laufen gelassen wurde, waren 1 E+3 Moleküle die Detektionsgrenze von pBR322 durch 30 Zyklen PCR. Diese Ergebnisse legen nahe, dass bei 5 E+5 Molekülen Eingangsmatrize die Mehrheit der anfänglich zu der Matrix hinzugefügten Plasmid-DNA eingefangen und freigesetzt wurde.
Beispiel 12: Selbstanzeigende PCR-Tests
Selbstanzeigende und Closed-Tube-Tests werden zunehmend populär wegen ihrer Fähigkeit, Nucleinsäure-Routineanalysetests zu rationalisieren, zu vereinfachen und möglicherweise zu automatisieren. Weiterhin verhindern Closed-Tube-Tests das Herübertragen von Verunreinigungen zwischen Proben, welches eine Hauptquelle falschpositiver Ergebnisse bei Nucleinsäurediagnosen ist. Da die Konzentration nachweisbarer Einheiten ein Vorteil ist, verbunden mit der elektrostatischen Bindung von Nucleinsäuren an Matrizes, stellte man sich vor, dass es möglich sein könnte, einen selbstanzeigenden PCR-Test zu schaffen, worin die Fluoreszenz der in der Reaktion eingeschlossenen Matrix zu dem Zeitpunkt, zu dem die Reaktionsbestandteile vermischt werden, verwendet werden könnte, um das Ergebnis einer PCR-Amplifikation durch die bloße Überwachung mit dem Auge oder durch Geräteüberwachung des Röhrchens während und/oder nachdem die PCR abgeschlossen war, zu bestimmen.
Die Punktmutationsanalyse ist ein weiteres wichtiges Ziel eines diagnostischen Nucleinsäuretests, da die genaue Bestimmung einer spezifischen Punktmutation genetischen Materials in einer Probe oftmals ein entscheidender Faktor bei der genauen Identifizierung genetischer Störungen und anderer Krankheitszustände ist. Wie in der Spezifikation diskutiert, können Sperrsonden verwendet werden, um die Punktmutationsanalyse eines auf Sonden basierten Tests über die Grenzen hinaus, die durch die präzise Optimierung oder Kontrolle der Stringenz möglich sind, zu verbessern. Folglich stellte man sich vor, dass die Verwendung von PNA-Sperrsonden in Verbindung mit Linear Beacons die Entwicklung eines auf selbstanzeigenden Sonden basierten Tests, der zur Punktmutationsunterscheidung fähig ist, erleichtern würde, der ein Ergebnis erzeugen würde, welches durch die optische Inspektion oder durch die instrumentelle Analyse während und/oder nachdem die PCR abgeschlossen ist, interpretiert werden könnte.
Für die Beispiele A und B wurde asymmetrische PCR genutzt, da asymmetrische PCR einen signifikanten Überschuss an einzelsträngiger Nucleinsäure ergibt. Weil es durch die wohl überlegte Anpassung des Verhältnisses der 5'- und 3'-Primer möglich ist, zu wählen, welche Stränge des Amplicons bevorzugt amplifiziert werden, war es möglich, den Test so zu gestalten, dass die Zielsequenz, mit welcher die Nicht-Nucleotidsonde hybridisiert, in der überproduzierten einzelsträngigen Nucleinsäure des asymmetrischen PCR-Tests enthalten war.
Für die Beispiele A und B wurde ein Linear Beacon als die Nicht-Nucleotidsonde gewählt, da Linear Beacons selbst nicht fluoreszierend (oder nur sehr gering fluoreszierend) sind, bis sie mit der Zielsequenz hybridisiert haben. Dieser Ansatz war vorteilhaft, da der Reaktionscocktail, der das Linear Beacon enthält, vergleichsweise nicht-fluoreszierend während des Tests bleiben würde, und in Theorie würden nur die Perlen fluoreszierend werden, vorausgesetzt, die Zielsequenz wurde erzeugt und elektrostatisch an die Matrix (Perlen) gebunden. Folglich wurde das Linear Beacon (BK.RAS-Cy3; siehe Tabelle 2 oben) so gestaltet, dass es mit dem überproduzierten Strang eines Bereichs an dsDNA (siehe Illustration auf Seite 28), der amplifiziert werden soll, hybridisiert und wurde zu dem PCR-Cocktail vor dem Thermocycling hinzugefügt. Das PNA Linear Beacon wurde mit Cy3 markiert, da vorangegangene Experimente gezeigt hatten, dass die negative geladene Fluorescein-Markierung eine Affinität für die mit PEI überzogenen Perlen bei Salzkonzentrationen von weniger als 200 mM zeigten.
Obwohl Linear Beacons mit der Zielsequenz während dem Thermocycling hybridisieren könnten, wurde eine signifikante Hemmung des Amplifikationsvorgangs nicht beobachtet. Folglich wurde die PCR-Amplifikation erfolgreich unter Verwendung des detektierbaren fluoreszierenden Signals des Linear Beacons überwacht, welches auf der Oberfläche der Perlen in Antwort auf die Aktivität der PCR-Reaktion erzeugt wurde. Die vorgestellten Daten zeigen schlüssig die Machbarkeit der Verwendung von Linear Beacons für den Nachweis oder die Punktmutationsanalyse von an eine Matrix elektrostatisch gebundene Nucleinsäure, welche durch Amplifikation in einem Closed-Tube-Test erzeugt worden war. Wie durch die 1 und 3 belegt, kann das Ergebnis durch die bloße optische Inspektion der endgültigen Testprobe, die immer noch in dem Röhrchen ist, bestimmt werden. Da Fluoreszenz mit dem bloßen Auge sichtbar ist, würde ein empfindliches Instrument wie ein Prism 7700 für die automatisierte Echtzeit- oder Endpunktprobenanalyse geeignet sein. Die Figuren zeigen weiter, dass es die Konzentration der Proben auf der Matrix ermöglicht, die Nachweisgrenzen des Tests zu verbessern, da die Signalintensität auf den Perlen weit intensiver ist als das Signal, das durch die Masse Flüssigkeit erzeugt wird, wenn das Linear Beacon frei in Lösung ist.
A. Asymmetrische PCR mit Linear Beacons
PCR-Materialien und -Verfahren
Dieses Experiment umfasste fünf einzelne PCR-Reaktionen. Variable Faktoren, die innerhalb des Satzes an fünf Reaktionen untersucht wurden, schlossen die Anwesenheit oder Abwesenheit von mit PEI derivatisierten Sepharoseperlen (annähernd 25.000 Q-Sepharoseperlen), die Anwesenheit oder Abwesenheit von Plasmidmatrize (pKRASWT bei 20 fmol pro 50 μl Reaktion (0,4 nM)) und die Anwesenheit oder Abwesenheit von Thermocycling (TMC) ein. Tabelle 4 unten fasst die Zusammensetzung verschiedener Röhrchen hinsichtlich dieser variablen Faktoren zusammen. Zusätzlich enthielt jede PCR-Reaktion 1,5 μl 100 % Glycerol, 0,5 μl Wasser (Kontrolle) oder Sepharoseperlen, 45 pmol KRAS-5'-Primer, 5 pmol KRAS-3'-Primer, 3 mM MgCl₂, 250 μM NTPs, 2,0 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase, 50 mM KCl, 10 mM TRIS-HCl, pH 8,3, und 50 pmol BK.RAS-Cy3-Nicht-Nucleotidsonde (Linear Beacon) in einem Gesamtvolumen von 50 μl. Während der Zubereitung und vor der PCR wurden die Röhrchen vorsichtig gehandhabt, um ein Vermischen der Bestandteile zu vermeiden.
Das PCR-Protokoll schloss 20 Sekunden Aufwärmen auf 95 °C (nur die erste Runde), gefolgt von Denaturieren bei 95 °C für 5 Sekunden, Annealing bei 55 °C für 30 Sekunden und Verlängerung bei 74 °C für 20 Sekunden ein. Der Zyklus aus Denaturierung, Annealing und Verlängerung wurde für 50 Zyklen wiederholt, gefolgt von einem abschließenden Verlängerungsschritt bei 74 °C für 5 Minuten.
Nach dem Thermocycling wurden die Röhrchen auf einem Transilluminator platziert und die Fluoreszenz wurde mit dem Auge untersucht. Danach wurden die Röhrchen verwirbelt und dann für 2 Minuten zentrifugiert, um die Perlen auf dem Röhrchenboden zu konzentrieren. Es wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet, ob die Röhrchen vor der Betrachtung verwirbelt und zentrifugiert wurden oder nicht. Dies zeigte, dass Glycerol das Endpunktergebnis nicht beeinflusste.
Bemerkungen:

1. Glycerol wurde hinzugefügt, um die Perlen vorübergehend von den Reaktionsbestandteilen in den frühen Stadien der PCR abzuschirmen, so dass der Vorgang nicht wesentlich durch die elektrostatische Bindung der Primer an die Matrix (Perlen) während der kritischen frühen Thermozyklen gehemmt sein würde. Nachfolgende Untersuchungen zeigten, dass die Anwesenheit eines vorübergehenden Schildes nicht wesentlich ist, um ein genaues Ergebnis zu erreichen, aber nichtsdestotrotz bevorzugt ist.

Tabelle 4: Variable Faktoren
Aufarbeitung/Analyse nach der PCR
Nach der PCR wurden die Röhrchen 1 bis 5 auf einem Transilluminator platziert, um die Fluoreszenz sichtbar zu machen, und dann fotografiert. 1A ist ein Negativ des eingescannten Bildes der Fotografie, die von den fünf Mini-Eppendorf-Röhrchen unmittelbar nach der PCR (die Röhrchen sind mit 1 bis 5 beschriftet) aufgenommen worden war. Nachdem die Fotografie aufgenommen worden war, wurden 0,5 μl der Q-Sepharoseperlen-Stammlösung zu den Röhrchen 1 bis 3 hinzugefügt. Die fünf Röhrchen wurden dann verwirbelt, zentrifugiert und wiederum auf dem Transilluminator platziert und wiederum fotografiert. 1B ist ein Negativ der eingescannten Aufnahme der zweiten Fotografie der fünf Mini-Eppendorf-Röhrchen.
Nach dem erneuten Fotografieren der Röhrchen wurden die Überstände dekantiert und die Perlen wurden mit 100 μl einer Lösung gewaschen, die 50 mM NaCl und 100 mM TRIS-HCl, pH 7,6, enthielt. Das Waschen schloss das Hinzufügen des Waschpuffers, das kurze Verwirbeln, Zentrifugieren und anschließende Dekantieren ein. Die elektrostatisch gebundenen Nucleinsäuren wurden von den Perlen für die Analyse durch Verwirbeln in einer Lösung, die 10 μl 0,05 % Ammoniumhydroxid und 2,0 M NaCl enthielt, freigesetzt. Überstände wurden entfernt und auf eine Mikrowellenplatte übertragen, wo sie mit 1 μl 0,1 N Salzsäure neutralisiert wurden. Zu jeder Vertiefung wurden 4 μl 4X Ladungsfarbstoff hinzugefügt. Schließlich wurden 15 μl jeder Probe auf einem Gel mit einem Gradienten von 10 bis 20 % laufen gelassen, um die Nucleinsäure-Amplifikation zu bestätigen und die Produktgröße zu bestimmen.
Die 2A und 2B sind die Negative von Aufnahmen von Fotografien desselben Polyacrylamidgels mit einem Gradienten von 10 bis 20 %, beleuchtet auf einem UV-Transilluminator, welche vor bzw. nach dem Färben mit Ethidiumbromid aufgenommen worden waren.
Ergebnisse:
Röhrchenaufnahmen/Fotografien
Hinsichtlich der Analyse der Aufnahmen der Fotografien wird gebeten, zu bemerken, dass obwohl Schwarz-Weiß-Fotografien aufgenommen wurden, die Inspektion der Röhrchen mit dem Auge mit dem in den Aufnahmen zu sehenden Hell-Dunkel-Kontrast übereinstimmte, mit der Ausnahme, dass der Cy3-Farbstoff für das Auge unter dem Transilluminator orange erschien. Ferner wird das Negativ (elektronisch erzeugt) der eingescannten Aufnahme gezeigt, da angenommen wird, dass die Kontraste der Negativaufnahme für die Illustration überlegen sind und durch Fotokopieren genauer reproduziert werden.
Mit Bezugnahme auf 1A sind die Ergebnisse wie erwartet. Röhrchen 1 war eine Kontrolle, die dem Thermocycling nicht ausgesetzt worden war und deswegen wurde eine geringe oder gar keine Fluoreszenz beobachtet (die Inhalte des Röhrchens erscheinen in Kontrast zu dem Hintergrund klar). Ähnlich enthielten die Röhrchen 2 und 4 keine Matrize und deswegen wurde eine geringe oder gar keine Fluoreszenz in Lösung (Röhrchen 2) oder auf den Perlen (Röhrchen 4) beobachtet, da keine Amplifikation stattgefunden haben sollte. Röhrchen 3 war jedoch fluoreszierend, wie erwartet, da die Amplifikation der Matrize das 111 bp lange Amplicon produziert haben sollte, mit welchem das Linear Beacon hybridisierte, um ein detektierbares Signal zu erzeugen. Nichtsdestotrotz war die Lösung, da keine Sepharose vorhanden war, sichtbar orange im Vergleich mit Röhrchen 1, 2 und 4. Ähnlich enthielt Röhrchen 5 hochfluoreszierende (orange für das Auge; dunkel im Negativ der Aufnahme) Perlen, wie erwartet, da die Amplifikation der Matrize das 111 bp lange Amplicon produziert haben sollte (elektrostatisch an die Perlenmatrix gebunden); mit welchem das Linear Beacon hybridisierte, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen.
Mit Bezugnahme auf 1B sind die Ergebnisse ebenfalls wie erwartet. Genauer, beeinflusste die Zugabe der Sepharoseperlen zu den Röhrchen 1 bis 3 nur die Fluoreszenz von Röhrchen 3. Insbesondere wurde die orangefarbene Fluoreszenz, die vor der Zugabe der Sepharoseperlen als in der Lösung befindlich beobachtet wurde, nach der Perlenzugabe auf der Perlenoberfläche (dunkel in dem Negativ der Aufnahme) konzentriert. Weiterhin war die Intensität der Fluoreszenz von Röhrchen 3, was optisch festgestellt werden konnte, vergleichbar mit der Fluoreszenzintensität der Perlen in Röhrchen 5. Folglich scheint im Ergebnis kein Unterschied vorzuliegen, ob die Matrix vor oder nachdem die PCR-Reaktion durchgeführt wird hinzugefügt wird oder nicht
Zusammenfassend zeigen die in den 1A und 1B vorgestellten Daten, dass es möglich ist, selbstanzeigende Amplifikationstests durchzuführen, worin das Signal einer Sonde auf einer Matrix konzentriert werden kann, auf welcher eine amplifizierte Zielnucleinsäure elektrostatisch immobilisiert ist.
Gel-Fotografien/Aufnahmen:
Die Analyse der PCR-Reaktionen durch Gel wurde durchgeführt, um die Anwesenheit und Größe von Amplicons zu bestimmen, um dadurch zu bestätigen, dass die optische Analyse der Röhrchen in Übereinstimmung mit den erwarteten Produkten der PCR-Amplifikation stand.
Mit Bezugnahme auf die 2A und 2B befinden sich die Vertiefungen des Gels auf der Oberseite der Fotografien. Aliquoten jedes Röhrchens wurden in der Nähe der Oberkante des Gels hinzugefügt und elektrophoretisch in Richtung zur Unterkante des Gels gelenkt. Die Spuren 2 und 8 enthalten zwei unterschiedliche doppelsträngige DNA-Größenmarker; Spur 2 ist ∅X174/HaeIII (New England BioLabs Nr. 303-1 S) und Spur 8 ist eine 100bp-Leiter (New England BioLabs Nr. 323-1L). Bandengrößen sind in 2B gezeigt. Die Spuren 3 bis 6 enthalten Proben freigesetzter Nucleinsäure, jeweils isoliert aus den Perlen in Röhrchen 2 bis 5, und die Spur 7 enthält Material, freigesetzt aus den Perlen in Röhrchen 1.
Mit Bezugnahme auf 2A kann die Anwesenheit selbstfluoreszierender Banden in den Spuren 4 und 6 (von den Röhrchen 3 bzw. 5) in Richtung der Unterkante der Aufnahme gesehen werden. Die fluoreszierenden Banden können der Anwesenheit des Linear Beacons zugeschrieben werden, das immer noch mit dem Nucleinsäure-Amplicon hybridisiert ist, sogar nachdem es in dem Gel gewandert ist. Dieses Ergebnis steht in Übereinstimmung mit der Amplifikation in den Röhrchen 3 und 5, wie gezeigt durch die optische Analyse der Röhrchen. Im Vergleich dazu gibt es keine sichtbar fluoreszierenden Banden in irgendeiner der Spuren 3, 5 und 7. Dieses Ergebnis steht in Übereinstimmung mit dem Fehlen der Amplifikation, wie angezeigt durch die optische Analyse der Röhrchen.
Mit Bezugnahme auf 2B, ist sämtliche Nucleinsäure fluoreszierend, da sie mit Ethidiumbromid gefärbt ist. Deswegen sind die Größenmarker in den Spuren 2 und 8 nun sichtbar. Stark fluoreszierende Banden mit einer Größe in Übereinstimmung mit dem erwarteten 100 bp großen Produkt sind in den Spuren 4 und 6 sichtbar, fehlen jedoch in den Spuren 3, 5 und 7. Diese Daten bestätigen die Produktion des beabsichtigten Amplicons ausschließlich in den Röhrchen 3 und 5 und bestätigen weiterhin, dass die Nucleinsäure aus dem Material wiedergewonnen wurde, das ursprünglich an die Sepharoseperlen elektrostatisch gebunden war.
Zusammenfassend zeigen die in den 1 A und 1B gezeigten Daten, wenn sie mit den in den 2A und 2B vorgestellten Daten berücksichtigt werden, schlüssig, dass es möglich ist, selbstanzeigende Amplifikationstests durchzuführen, worin das Signal einer Sonde auf einer Matrix konzentriert werden kann, an welcher eine amplifizierte Zielnucleinsäure elektrostatisch immobilisiert ist.
Analyse einzelner Punktmutationen
Dieses Experiment wurde verwendet, um zu untersuchen, ob es möglich war, eine Punktmutationsunterscheidung in dem selbstanzeigenden, auf Sonden basierten Test zu erreichen oder ob nicht. Wenn nicht anderweitig festgestellt, wurde dieses Experiment durchgeführt, im Wesentlichen wie beschrieben in Teil A oben, mit der Ausnahme, dass ein nicht markiertes PNS-Oligomer (Sperrsonde) hinzugefügt wurde, um eine Unterscheidung einer einzelnen Punktmutation zu erreichen. Da Kontrollreaktionen, die die Sperrsonde nicht enthielten, durchgeführt wurden, zeigt ein Vergleich der in der Anwesenheit oder Abwesenheit der Sperrsonde erhaltenen Ergebnisse klar die merkliche Verbesserung in der Identifikation der Zielsequenz, die aus der Anwesenheit der Sperrsonde resultiert.
PCR-Materialien und -Verfahren:
Dieses Experiment umfasste neun einzelne PCR-Reaktionen. Die innerhalb des Satzes aus neun Reaktionen untersuchten variablen Faktoren schlossen die Anwesenheit oder Abwesenheit von Sepharoseperlen (annähernd 25.000 PEI-Sepharoseperlen), die Anwesenheit oder Abwesenheit von Plasmidmatrize (pKRASWT oder pKRASMU in einer Konzentration von 100 fmol pro 50 μl Reaktion (0,4 nM)) und die Anwesenheit oder Abwesenheit von 400 pmol PNA-Sperrsonde (MU-15Blocker; siehe Tabelle 2) ein. Das Gesamtvolumen der PCR-Reaktionen, einschließlich Glycerol und Perlen, betrug 50 μl.
Tabelle 5 unten fasst die Zusammensetzungen zahlreicher Röhrchen bezüglich dieser variablen Faktoren zusammen. Zusätzlich enthielt jede PCR-Reaktion 45 pmol des KRAS-5'-Primers, 5 pmol des KRAS-3'-Primers (siehe Tabelle 1), 3 mM MgCl₂, 250 μM NTPs, 2,0 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase, 50 mM KCl, 10 mM TRIS-HCl, pH 8,3, 50 pmol BK.RAS-Cy3- (siehe Tabelle 2) -Nicht-Nucleotidsonde (Linear Beacon), 1,5 μl Glycerol und 0,5 μl Sepharoseperlen oder Wasser (Kontrolle). Das Glycerol überlagerte die Perlen, um sie vorübergehend von den Reaktionsbestandteilen in den frühen Phasen der PCR abzuschirmen, so dass der Vorgang nicht wesentlich durch die elektrostatische Bindung der Primer an die Matrix (Perlen) während der kritischen frühen Thermozyklen inhibiert würde. Während der Zubereitung und vor der PCR wurden die Röhrchen vorsichtig gehandhabt, um das Mischen der Bestandteile zu verhindern.
Tabelle 5: Variable Faktoren
Das PCR-Protokoll schloss 20 Sekunden Aufwärmen auf 95 °C (nur die erste Runde), gefolgt von Denaturieren bei 95 °C für 5 Sekunden, Annealing bei 55 °C für 30 Sekunden und Verlängerung bei 74 °C für 30 Sekunden ein. Der Zyklus aus Denaturierung, Annealing und Verlängerung wurde für 30 Zyklen wiederholt.
Aufarbeitung/Analyse nach der PCR
Nach der PCR wurden die Röhrchen 1 bis 9 auf einem Transilluminator platziert, um die Fluoreszenz sichtbar zu machen, und dann fotografiert. 3 ist ein Negativ der eingescannten Aufnahme der Fotografie, die von den neun Mini-Eppendorf-Röhrchen unmittelbar nach der PCR aufgenommen wurde (die Röhrchen sind mit 1 bis 9 bezeichnet).
Nach dem Fotografieren wurden die Röhrchen kurz verwirbelt, dann kurz zentrifugiert, um die Perlen zu konzentrieren. Die Überstände wurden entfernt und die Röhrchen wurden mit 100 μl 50 mM NaCl, 100 mM TRIS-HCl, pH 7,6, gewaschen. Die elektrostatisch gebundenen Nucleinsäuren wurden dann von den Perlen für die Analyse durch Verwirbeln in 10 μl einer Lösung, enthaltend 100 mM CAPSO, pH 10,7, und 2 M NaCl, freigesetzt. Die Lösung wurde dann von den Perlen abgetrennt und 9 μl jeder der wiedergewonnenen Lösungen wurde mit 3 μl 4X Ladungsfarbstoff kombiniert. Eine Probe aus jedem Röhrchen wurde dann auf einem Gel mit einem Gradienten von 10 bis 20 % laufen gelassen, um die Nucleinsäure-Amplifikation zu bestätigen und die Produktgröße zu identifizieren. Die 4A und 4B sind die Negative der Aufnahmen von Fotografien desselben Polyacrylamidgels mit einem Gradienten von 10 bis 20 %, beleuchtet auf einem UV-Transilluminator, welche vor (4A) und nach (4B) der Färbung mit Ethidiumbromid gemacht wurden.
Ergebnisse:
Röhrchenaufnahmen/Fotografien
Mit Bezugnahme auf 3, war Röhrchen 1 eine Negativkontrolle, die keine Matrize enthielt, und ist, wie erwartet, nicht-fluoreszierend nach der PCR (die Röhrcheninhalte gleichen dem Hintergrund in dem Negativ der Aufnahme). Die Inhalte der Röhrchen 2 und 3 waren jedoch sichtbar fluoreszierend unter dem Transilluminator (dunkler als Röhrchen 1 in dem Negativ der Aufnahme). Dies war das erwartete Ergebnis für Röhrchen 2, da die Amplifikation der Matrize das 111 bp lange Amplicon, das eine Zielsequenz enthält, zu welchem das Linear Beacon perfekt komplementär ist, erzeugt haben sollte. Das in Röhrchen 3 erzeugte Amplicon enthielt jedoch eine Sequenz, die eine Punktmutation des Wildtyp-Amplicons enthielt. In der Abwesenheit der Sperrsonde wird das Linear Beacon jedoch wenigstens teilweise mit dem mutierten Amplicon, das von dem Plasmid pKRASMU(31) unter den vorhandenen Hybridisierungsbedingungen erzeugt wurde, hybridisieren, da die mutierten und die Wildtyp-Amplicons so nah verwandt sind. Teilhybridisierung bewirkt eine ausreichende Bildung von Fluoreszenzsignal, um mit dem Auge unter dem Transilluminator sichtbar zu sein. Da in den Röhrchen 2 und 3 keine Sepharoseperlen vorhanden waren, ist die orange Farbe (Dunkelheit der Negativaufnahme) der hybridisierten Linear Beacons gleichmäßig über die Lösung verteilt. Da das Signal nicht konzentriert war, erzeugte es kein starkes Signal in der Figur.
Die Reagenzien-Zusammensetzungen der Röhrchen 4 bis 6 sind identisch mit den jeweiligen Zusammensetzungen der Röhrchen 1 bis 3, mit der Ausnahme, dass PEI-Sepharoseperlen während der PCR-Reaktion anwesend waren. Mit Bezugnahme auf 3 war Röhrchen 4 eine Negativkontrolle, die keine Matrize enthielt, und wie erwartet, sind die Lösung und die Sepharoseperlen nach der PCR nicht-fluoreszierend im Vergleich mit den Röhrchen 5 und 6 (die Röhrcheninhalte und Perlen gleichen dem Hintergrund in dem Negativ der Aufnahme). Mit Bezugnahme auf die Röhrchen 5 und 6 wurden die Sepharoseperlen an dem Boden der Röhrchen hochfluoreszierend, wobei die Intensität von Röhrchen 5 etwas intensiver ist im Vergleich mit Röhrchen 6. Dieses Ergebnis ist wie erwartet, da die Amplifikation der Matrize das 111 bp große Amplicon (elektrostatisch an die Perlenmatrix gebunden) erzeugt haben sollte, mit welchem das Linear Beacon hybridisierte, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Die Fluoreszenzintensität von Röhrchen 6 ist niedriger, da das Linear Beacon nicht perfekt komplementär zu dem Amplicon ist, aber wenigstens teilweise hybridisieren kann, um ein detektierbares Signal unter den vorhandenen Hybridisierungsbedingungen zu erzeugen. Da es einen geringen Unterschied zwischen den Röhrchen gab, erlaubte die optische Inspektion der Röhrchen es jedoch einem nicht, zu bestätigen, ob die Probe mutierte oder Wildtyp-Zielsequenz enthielt oder nicht, und ist deswegen nicht notwendigerweise geeignet für die Analyse einer einzelnen Punktmutation.
Nach dem Vergleich der Röhrchen 2 und 3 mit der Intensität an Signal von den Röhrchen 5 und 6 wird es deutlich, dass es die Konzentration des nachweisbaren Fluoreszenzsignals auf den Perlen einem erlaubt, deutlicher ein positives Ergebnis zu detektieren, da die Perlen in den Röhrchen 5 und 6 deutlicher positiv im Vergleich zu den Lösungen in den Röhrchen 2 und 3 sind.
Die Reagenzien-Zusammensetzungen der Röhrchen 7 bis 9 sind identisch mit den jeweiligen Zusammensetzungen der Röhrchen 4 bis 6, mit der Ausnahme, dass in den Röhrchen 7 bis 9 400 pmol MU15Blocker-Sonde vor der PCR-Amplifikation hinzugefügt wurden. Mit Bezugnahme auf 3 war Röhrchen 7 eine Negativkontrolle, die keine Matrize enthielt, und wie erwartet, sind die Sepharoseperlen nicht-fluoreszierend nach der PCR im Vergleich mit den Röhrchen 8 und 9 (die Röhrcheninhalte und Perlen gleichen dem Hintergrund in dem Negativ der Aufnahme). Da die Sperrsonde anwesend ist, sind nur die Perlen in Röhrchen 8 deutlich fluoreszierend im Vergleich mit den Inhalten der Röhrchen 7 und 9. Folglich wird es einem die optische Inspektion der Röhrchen ermöglichen, zu bestätigen, ob die Probe mutierte oder Wildtyp-Zielsequenz enthielt oder nicht. Deswegen ist dieser selbstanzeigende Test für die Einzelpunktmutations/Unterscheidungsanalyse geeignet. Es wird von Durchschnittsfachleuten geschätzt werden, dass die Quantifizierung des nachweisbaren Signals unter Verwendung eines Gerätes wie eines Durchflusszytometers und durch nicht mehr als Routineexperimentierung erreicht werden kann.
Zusammenfassend zeigen die in 3 vorgestellten Daten, dass es möglich ist, homogene oder Closed-Tube-Amplifikationstests durchzuführen, worin das Signal einer Sonde auf einer Matrix konzentriert werden kann, auf welcher eine amplifizierte Zielnucleinsäure elektrostatisch immobilisiert ist. Weiterhin kann der Test für die Einzelpunktmutationsanalyse verwendet werden, wenn Sperrsonden genutzt werden.
Gel-Fotografien/Aufnahmen:
Die Analyse der PCR-Reaktionen durch Gel wurde durchgeführt, um die Anwesenheit und Größe von Amplicons zu bestimmen und um dadurch zu bestätigen, dass die optische Analyse der Röhrchen mit den erwarteten Produkten der PCR-Amplifikation korrelierte.
Mit Bezugnahme auf die 4A und 4B, befinden sich die Vertiefungen in dem Gel oben auf den Fotografien. Die Aufnahmen in den 4A und 4B sind nicht direkt vergleichbar, da die Fotografien unter Verwendung von unterschiedlichen Aussetzungsparametern gemacht worden sind. Aliquoten jedes Röhrchens wurden in der Nähe der Oberkante des Gels hinzugefügt und elektrophoretisch in Richtung der Unterkante des Gels gelenkt. Die Spuren 1 und 12 enthalten zwei unterschiedliche doppelsträngige DNA-Größenmarker; Spur 1 ist eine 100-bp-Leiter (New England BioLabs #323-1L) und Spur 12 ist eine 1000-bp-Leiter (New England BioLabs #323-25). Die Bandengrößen sind in 4B gezeigt. Die Spuren 2 bis 4 enthalten jeweils 9 μl der Proben 1 bis 3, die Spuren 5 bis 10 enthalten Proben freigesetzter Nucleinsäure, jeweils isoliert aus den Perlen in den Röhrchen 4 bis 9, und Spur 11 ist leer.
Mit Bezugnahme auf 4A kann die Anwesenheit selbstfluoreszierender Banden in den Spuren 3, 4, 6, 7 und 9 (aus den Proben 2, 3, 5, 6 bzw. 8) in Richtung zum Boden und in der Mitte der Aufnahme gesehen werden. Die Fluoreszenzbanden an der Unterkante der Aufnahme sind am wahrscheinlichsten Sondenmoleküle, welche in dem Gel gewandert sind. Die Fluoreszenzbanden in der Mitte der Aufnahme können der Anwesenheit des Linear Beacons zugeschrieben werden, das immer noch mit dem Nucleinsäure-Amplicon hybridisiert ist, sogar nachdem es in dem Gel gewandert ist. Dieses Ergebnis steht in Übereinstimmung mit der Amplifikation in den Röhrchen 2, 3, 5, 6 und 8, wie es durch die optische Analyse und das Fotografieren der Röhrchen angedeutet worden war. Im Vergleich dazu gibt es keine sichtbar fluoreszierenden Banden in irgendeiner der Spuren 2, 5, 8 und 10 (Röhrchen 1, 4, 7 und 9). Dieses Ergebnis steht in Übereinstimmung mit dem Fehlen von Fluoreszenz, das bei diesen Röhrchen beobachtet worden war.
Mit Bezugnahme auf 4B, ist sämtliche Nucleinsäure fluoreszierend, da sie mit Ethidiumbromid gefärbt ist. Deswegen sind die Größenmarker in den Spuren 1 und 12 nun sichtbar. Stark fluoreszierende Banden mit einer Größe in Übereinstimmung mit dem erwarteten 111-bp-Produkt sind in den Spuren 3, 4, 6, 7, 9 und 10 (Röhrchen 2, 3, 5, 6, 8 und 9) sichtbar, fehlen jedoch in den Spuren 2, 5 und 8 (Röhrchen 1, 4 und 7). Diese Daten bestätigen die Produktion der beabsichtigten Amplicons in den Röhrchen 2, 3, 5, 6, 8 und 9 und bestätigen weiter, dass die Nucleinsäure von dem Material wiedergewonnen worden war, das ursprünglich elektrostatisch an die Sepharoseperlen gebunden war. Am bemerkenswertesten ist die Anwesenheit von Banden in sowohl der Spur 8 als auch der Spur 10 (Röhrchen 7 und 9). Diese Banden bestätigen, dass Amplifikation in diesen Proben geschah. Deswegen kann das Fehlen an Signal in Röhrchen 9 im Vergleich mit Röhrchen 7 nur der Anwesenheit der Sperrsonde zugeschrieben werden, welche es einem ermöglicht, eine Punktmutationsunterscheidung des Amplicons zu erzielen.
Zusammenfassend zeigen die in 4A und 4B vorgestellten Daten schlüssig, wenn sie mit den in 3 vorgestellten Daten berücksichtigt werden, dass es möglich ist, selbstanzeigende, auf Sonden basierte Tests durchzuführen, die für die Unterscheidung einzelner Basen (Unterscheidung einzelner Punktmutationen) geeignet sind, worin das Signal einer Sonde auf einer Matrix konzentriert werden kann, an welche eine amplifizierte Zielnucleinsäure elektrostatisch immobilisiert ist.
Beispiel 13: Vergleich des Testarbeitsbereichs für PNA:DNA- und DNA:DNA-Hybride
Dieses Beispiel ist gestaltet, um den Arbeitsbereich für die elektrostatische Bindung der Nicht-Nucleotidsonden (z. B. PNA) mit jenem der nächst äquivalenten Nucleinsäuresonden in einem elektrostatischen Bindungstest für ein Nucleinsäure-Zielmolekül, das am nächsten äquivalent ist in der Größe mit der Sonde, zu vergleichen. Das Ziel ist deswegen, einen Bereich an Ionenstärke zu bestimmen, in welchem die Nicht-Nucleotid- und Polynucleotidsonden an die Matrix nur binden werden, falls das Nucleinsäureziel vorhanden ist. Für dieses Beispiel wurdn eine PNA-Sonde (WT-15F1u PNA; siehe Tabelle 2) und eine DNA-Sonde (WT-15F1u; siehe Tabelle 1) in Wasser auf eine Konzentration von 5 μM verdünnt. Das Nucleinsäureziel (KRAS WT(21); siehe Tabelle 1) wurde in Wasser ebenfalls auf eine Konzentration von 50 μM verdünnt.
Als Nächstes wurden vier Sätze mit acht Eppendorf-Röhrchen mit 100 μl von jedem der acht in Tabelle 6 beschriebenen Salzpuffern zubereitet. Die vier Sätze an Röhrchen umfassten die folgenden experimentellen Bedingungen. Zu Satz I wurde die PNA-Sonde hinzugefügt, jedoch kein Nucleinsäureziel (KRASWT(21)). Dies ist die Kontrolle "ohne Ziel". Zu Satz II wurden die PNA-Sonde und das Nucleinsäureziel (KRASWT(21)) hinzugefügt. Zu Satz III wurde die DNA-Sonde, jedoch kein Nucleinsäureziel (KRASWT(21)) hinzugefügt. Dies ist die Kontrolle "ohne Ziel". Zu Satz IV wurde die DNA-Sonde und das Nucleinsäureziel (KRASWT(21)) hinzugefügt.
Tabelle 6: Salzpuffer
Diese Proben wurden zubereitet, indem ein Mikroliter der geeigneten Stammlösung an PNA-Sonde oder DNA-Sonde zu jedem Röhrchen in den Sätzen I, II, III und IV hinzugefügt wurde, um dadurch eine Endkonzentration von 250 nM Sonde zu erreichen. Zu jedem Röhrchen in den Sätzen II und IV wurde auch ein Mikroliter der Nucleinsäure-Zielstammlösung (KRASWT(21)) hinzugefügt, um dadurch eine Probe zu schaffen mit einer Endkonzentration von 2,5 μM Ziel. Zu den "ohne-Ziel"-Kontrollsätzen I und III wurde ein Mikroliter Wasser hinzugefügt.
Alle Röhrchen wurden kurz verwirbelt, um die Bestandteile zu mischen, und wurden bei Raumtemperatur für annähernd 5 Minuten gehalten, um die Hybridisierung der Sonden und Ziele zu ermöglichen. Zu jedem Röhrchen wurden dann 1 μl Q-Sepharosepartikel, suspendiert in Wasser, hinzugefügt. Die Röhrchen wurden kurz verwirbelt, es wurde ihnen ermöglicht, bei Raumtemperatur für annähernd 5 Minuten zu stehen, dann wurden sie für 30 Sekunden zentrifugiert, um die Partikel auf dem Boden zu konzentrieren.
Die Röhrchen wurden dann über einer UV-Lichtquelle (Transilluminator) angeordnet und fotografiert. Die Negativaufnahme der Fotografie ist als 5 vorgestellt. Überstände wurden dann entfernt und verworfen. Als Nächstes wurden 100 μl des geeigneten Salzpuffers den passenden Röhrchen zurückgegeben. Die PEI-Partikel wurden in dem Hybridisierungspuffer durch kräftiges Verwirbeln resuspendiert und dann wurde jede suspendierte Partikelprobe auf eine einzelne Vertiefung in einer Mikrotiterplatte übertragen. Die Proben in der Mikrotiterplatte wurden sofort analysiert (Wallac, Victor, 1420 Multilabel Counter, Gaithersburg, MD). Die Ergebnisse der Analyse der Fluoreszenz auf den Perlen sind in Tabelle 7 vorgestellt.
Ergebnisse:
Röhrchenaufnahmen/Fotografien
Mit Bezugnahme auf 5, sind die vier Röhrchensätze in der Reihenfolge von oben nach unten angeordnet. Innerhalb jedes Satzes sind die Röhrchen in der Ordnung steigender Salzkonzentration von links nach rechts angeordnet. Zum Beispiel ist das zu der oberen linken Ecke der Figur nächste Röhrchen Satz I, Puffer G (0,0 M NaCl) und das zur unteren rechten Ecke nächste Röhrchen ist Satz IV, Puffer N (0,7 M NaCl).
Mit Bezugnahme auf 5, Satz I, zeigt das Fehlen des Fluoreszenzsignals auf dem Boden des Röhrchens, dass die PNA-Sonde eine sehr geringe Affinität für die Partikel in der Abwesenheit des Nucleinsäureziels (KRASWT(21)) hat. In Satz II ist die PNA-Sonde im Vergleich dazu auf der Matrix zu einer Salzkonzentration von annähernd 300 mM (siehe Salzpuffer J) konzentriert. Dieses Ergebnis steht in Übereinstimmung mit der Hybridisierung der Sonde mit der Zielsequenz, die elektrostatisch an die Matrix gebunden ist. Das Fehlen an auf der Matrix konzentrierter Sonde bei Salzkonzentrationen über 300 mM liegt wahrscheinlich am Fehlen der Bindung des kurzen Nucleinsäureziels . (KRASWT(21)) bei jenen Salzkonzentrationen. Insgesamt genommen, zeigen die Daten, dass die PNA-Sonde nicht mit der Matrix unter irgendwelchen Bedingungen untersuchter Ionenstärke in Wechselwirkung tritt. Folglich ist der anwendbare Bereich für den Test, der diese PNA-Sonde nutzt, wenigstens 0 bis 700 mM Salz.
Mit Bezugnahme auf 5, Satz III, ist die DNA-Sonde im Wesentlichen konzentriert auf der Matrix bis zu einer Salzkonzentration von annähernd 300 mM (siehe Salzpuffer J) und schwach bis zu einer Salzkonzentration von 400 mM (siehe Salzpuffer K). Diese Daten zeigen, dass die natürliche DNA-Sonde eine wesentliche Eigen-Affinität für die Matrix hat. Im Vergleich dazu zeigt Satz IV, dass das Hybrid aus Sonde und Zielsequenz die Anwesenheit von auf der Matrix konzentrierter Sonde stark bis zu einer Salzkonzentration von annähernd 400 mM (siehe Salzpuffer K) und schwach bis zu einer Salzkonzentration von 500 mM (siehe Salzpuffer L) erhöht. Deswegen beträgt der Arbeitsbereich für die unterscheidende Sonde des Komplexes aus Sonde und Zielsequenz, wenn dieses Gesamt-DNA-System verwendet wird, annähernd 300 bis 500 mM Salz. Dies ist ein sehr enger Arbeitsbereich im Vergleich mit der PNA-Sonde.
Bemerkung: Der anscheinende Konflikt zwischen den Ergebnissen von Experiment 9 und den oben beschriebenen Ergebnissen, worin die PNA-Sonde WT-15F1u nachweisbar an die Matrix bis zu 100 mM Salz bindet (Experiment 9), jedoch nicht in Wechselwirkung tritt mit dem Untergrund, sogar bei 0 mM Salz, wurde als bedingungsabhängig bestätigt. Der Puffer in Experiment 9 enthält Tween-20, welches die Wechselwirkung der PNA-Sonde mit dem Untergrund zu fördern scheint. Zusätzlich wurde die PNA-Sonde in diesem Experiment zu Wasser zuerst aus der konzentrierten Stammlösung aus 1/1 DMF:Wasser hinzugefügt, was die Wechselwirkung der PNA-Sonde mit dem Träger zu reduzieren scheint. Um Zweifel zu vermeiden, stehen alle Daten in Übereinstimmung mit der Fluorescein-Markierung als die primäre Quelle der Wechselwirkung mit der Matrix, was ein augenscheinliches Ergebnis in Experiment 9 war.
Quantifizierung der partikelgebundenen Fluoreszenz
Der optische Vergleich der Röhrchen wurde auch durch die quantitative Analyse der Fluoreszenz der resuspendierten Perlen bestätigt. Die quantitativen Fluoreszenzmessungen, ebenso wie die daraus abgeleiteten Daten für die Perlen sind in Tabelle 7 vorgestellt.
Mit Bezugnahme auf Tabelle 7 sind die Fluoreszenz-Rohablesewerte jeder Probe (Sätze I–IV; jeweils Reihen B-E) suspendierter Partikel bei jedem der Salzpuffer (Puffer G-N; jeweils Spalten 2–9) vorgestellt. Aus diesen Daten werden die Signal-Rausch-Daten für PNA-Sonde (Reihe F) und DNA-Sonde (Reihe G) mathematisch aus den Fluoreszenz-Rohdaten abgeleitet. Zum Beispiel wurde der Fluoreszenz-Rohwert, erhalten für Puffer G in Satz II (Spalte 2, Reihe C = 12.736 rlu) durch den Fluoreszenz-Rohwert, erhalten für Puffer G in Satz I (Spalte 2, Reihe B = 738 rlu), geteilt, um den S/N-Wert für die PNA-Sonde in Puffer 0 von 17,3 rlu (12.736 + 738 = 17,3 (Spalte 2, Reihe F)) zu erhalten.
Tabelle 7: Perlen-Fluoreszenzdaten
Das aus den quantitativen Fluoreszenz-Rohdaten für die PNA-Sonde berechnete Signal-Rausch-Verhältnis steht in Übereinstimmung mit der optischen Analyse. Ein starkes Signal kann über dem Hintergrund von 0 bis 300 mM Salz nachgewiesen werden (siehe Reihe F, Spalten 2–5). Im Vergleich dazu wird nur ein schwaches Signal für die DNA-Sonde bei Salzkonzentrationen zwischen 300 und 500 mM detektiert (siehe Reihe G, Spalten 5–7).
Insgesamt genommen, zeigen die optischen Daten der 5 und die quantitativen Daten der Tabelle 7 deutlich, dass die Nicht-Nucleotid-PNA-Sonden innerhalb eines wesentlich größeren Bereichs an Salzkonzentrationen arbeiten, im Vergleich zu den nächst äquivalenten DNA-Sonden, wenn sie in einem elektrostatischen Immobilisierungstest verwendet werden. Die PNA-Sonden stellen auch ein wesentlich größeres Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu den DNA-Sonden bereit. Folglich zeigen diese Daten etliche Vorteile, die den DNA-Sonden zur überlegenen Wahl für die Durchführung sondenbasierter Analyse von Nucleinsäure, die elektrostatisch auf einer Matrix immobilisiert ist, machen.
Beispiel 14: Einzelpunktmutationsunterscheidung unter Verwendung eines Schutz/Verdauungstests
Dieses Experiment wurde gestaltet als ein Schutz-/Verdauungstest, geeignet für die Unterscheidung einzelner Punktmutationen. So wie er gestaltet ist, weist der Test auch ein Mittel für die Verbesserung des Tests nach, bewirkt durch Anpassen der Temperatur des Tests bis zu einem Punkt, wo unspezifische Hybride zu schmelzen beginnen, und die Nucleinsäure, welche das unspezifische Signal bewirkt, wird nun als ein Substrat für das Enzym zugänglich. Die Verdauung der störenden Nicht-Zielsequenz resultiert in einer wesentlichen Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses des Tests. Der Test wurde auch wesentlich vereinfacht durch die Verwendung eines selbstanzeigenden Linear Beacon (BK.RAS-Cy3; siehe Tabelle 2) und die elektrostatische Immobilisierung des Hybrids aus Linear Beacon und Zielsequenz auf Sepharosepartikeln, was das schnelle elektrostatische Einfangen und die Quantifizierung des Hybrids aus Linear Beacon und Zielsequenz erlaubte.
Materialien:
Mungobohnen-Nuclease und 10X Puffer wurden von New England BioLabs erhalten. Das Enzym wird in 10 Einheiten pro Mikroliter vertrieben. Wenn der 10X Puffer gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnt wird, enthält der Puffer 50 mM Natriumacetat, 30 mM Natriumchlorid, 1 mM Zinkchlorid und hat einen pH-Wert von 5,0 bei 25 °C.
Experimente:

Dieses Experiment umfasste 6 Proben, in welchen die PNA-Sonde an entweder das KRASWT(24)-Ziel (siehe Tabelle 1) oder mit dem KRASMU(24)-Ziel (siehe Tabelle 1) mit der Einzelbasenfehlpaarung hybridisiert war. Eine Kontrolle ohne Ziel und Kontrollproben ohne Enzym wurden ebenfalls durchgeführt. Der Test wurde bei 65 °C durchgeführt. Diese Temperatur liegt unterhalb dem Tm-Wert des perfekten Komplements (BK.RAS-Cy3/KRASWT(24)), welcher als annähernd 81 °C gemessen worden war, und liegt sehr nahe beim Tm-Wert des imperfekten Komplements (BK.RAS-Cy3/KRASMU(24)), welcher als annähernd 67 °C unter identischen Bedingungen gemessen worden war. Diese Temperatur liegt innerhalb des Bereichs von 5 Grad über und 10 Grad unter der Schmelztemperatur des imperfekten Komplements, welches in dem Test unterschieden wird und welches eine einzelne Punktmutation im Vergleich mit der Zielsequenz KRASWT(24) hat. Die Zusammensetzung der 6 Proben ist unten zusammengefasst:

Probe 1:	KRASWT(24)-Ziel + Enzym
Probe 2:	KRASMU(24)-Ziel + Enzym
Probe 3:	kein Ziel + Enzym
Probe 4:	KRASWT(24)-Ziel, kein Enzym
Probe 5:	KRASMU(24)-Ziel, kein Enzym
Probe 6:	kein Ziel, kein Enzym

Für dieses Experiment wurden PNA-Sonden und DNA-Ziele in einer Endkonzentration von 0,33 μM in einem Volumen von 100 μl eines 1X Mungobohnen-Nucleasepuffers hinzugefügt. Die Proben wurden auf 95 °C für 5 Minuten erhitzt, um Hybride zu denaturieren, und dann auf 65 °C abgekühlt. Nach 5 Minuten der Äquilibrierung bei 65 °C wurden die Proben 1–3 mit 0,3 μl Mungobohnen-Nuclease behandelt. Die Proben 4, 5 und 6 wurden nicht mit Nuclease behandelt. Alle Proben wurden kurz verwirbelt, dann wurde ihnen ermöglicht, für 10 Minuten bei 65 °C zu inkubieren. Nach der Inkubation wurden sämtliche Proben mit 1 μl PEI-Sepharosepartikeln behandelt, kräftig verwirbelt, dann für 30 Sekunden zentrifugiert, um die Partikel zu pelletieren. Überstände wurden entfernt und die Partikel wurden in 100 μl 1X Mungobohnen-Nucleasepuffer resuspendiert. Die gesamten Inhalte jedes Röhrchens wurden auf eine Mikrotiterplatte übertragen und für die Fluoreszenz unter Verwendung eines Wallac, Victor, 1420 Multilabel Counter, analysiert. Fluoreszenzwerte sind in relativen Lichteinheiten (rlu) beschrieben.
Ergebnisse:
Fluoreszenzmessungen der zwei Kontrollen "ohne Ziel", Probe Nr. 3 und Probe Nr. 6, ergaben ähnliche Werte, wie erwartet werden würde (400 bzw. 466 rlu). Die Werte der Kontrollen "ohne Ziel" wurden von den Roh-Fluoreszenzwerten der anderen Proben abgezogen, um Werte ohne Hintergrundsignal zu erhalten. Die Werte ohne Hintergrundsignal für die übrigen Proben waren wie folgt: Probe Nr. 1 (4.926 rlu), Probe Nr. 2 (338 rlu), Probe Nr. 4 (8.896 rlu) und Probe Nr. 5 (2.532 rlu).
Ein Vergleich der enzymbehandelten und unbehandelten Proben offenbart den relativen Nutzen der Nucleasebehandlung. Ein Vergleich der Probe Nr. 1 und Probe Nr. 4 zeigt einen 45%igen Signalverlust des komplementären Ziels KRASWT(24), wenn es mit der Nuclease behandelt wird ((8.896-4.929) + 8.896 = 45 %). Im Gegensatz dazu zeigt der Vergleich der Probe Nr. 2 mit der Probe Nr. 5 einen 87%igen Signalverlust des Ziels mit der Einzelbasenfehlpaarung KRASMU(24) von der Enzymbehandlung ((2.532-338) + 2.532 = 87 %). Als ein Ergebnis des abweichenden Signalverlusts des imperfekten Komplements im Vergleich mit dem perfekten Komplement, was der enzymatischen Verdauung zugeschrieben werden kann, gibt es einen entsprechenden Anstieg im Signal-Rausch-Verhältnis (vollständig komplementäres Signal geteilt durch das Basenfehlpaarungssignal, S/N) für den Test. Der S/N-Wert für die Probe, die nicht mit Enzym behandelt worden war, betrug 3,5 (8.896 + 2.532 = 3,5) und der S/N-Wert für die Probe, die mit Enzym behandelt worden war, war 14,6 (4.926 + 338 = 14,6). Obwohl ein Verlust an spezifischem Signal in den enzymbehandelten Proben beobachtet wurde (vgl. die Roh-Fluoreszenz für die Proben Nrn. 1 und 2 mit 4 bzw. 5), war der Nettogewinn an Signal im Verhältnis zum Rauschen sehr günstig für das Gesamterscheinen des Tests.
Insgesamt genommen, zeigen diese Daten, dass der Schutz-/Verdauungstest mit der elektrostatischen Immobilisierung des Komplexes aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz kombiniert werden kann, um ein schnelles Ergebnis bereitzustellen. Die Nicht-Nucleotidsonde kann ein Linear Beacon sein und der Test kann selbstanzeigend sein. Zusätzlich kann das Ergebnis des Tests wesentlich durch die wohl überlegte Modulierung der Testtemperatur erhöht werden, um dadurch die Nucleinsäure zu schmelzen und zu verdauen, welche die falsch-positiven Ergebnisse verursachte.
Beispiel 15: Arraytest
Für diesen Test wurde ein kommerziell erhältlicher Mikroskopobjektträger mit einer kationischen Oberfläche verwendet, um vorgemischte Proben, die Nucleinsäure und Sonde enthielten, und die auf dem Objektträger in einer Reihe an Flecken abgelagert worden sind, elektrostatisch zu immobilisieren. Der Mikroskopobjektträger wurde dann gewaschen, um unhybridisierte Sonde zu entfernen und um die Zielsequenz, falls sie auf dem Mikroskopobjektträger vorhanden war, zu detektieren.
Zubereitung der Sonde, Ziele und Partikel
Das mit Cyanin-3 (Cy3) markierte PNA-15-mer (RASWT-Cy3) in einer Lösung aus 50 % wässrigem N,N-Dimethylformamid in einer Konzentration von 570 pmol/μl wurde auf eine Konzentration von 20 pmol/μl in Hybridisierungspuffer (12 % wässriges Formamid, 5 mM Tris-Hydrochlorid, 25 mM Natriumchlorid und 0,05 % SDS bei einem pH-Wert von 7,5) verdünnt. Das DNA-Oligonucleotid-31-mer (KRASMU(31)), das zu RASWT-Cy3 komplementär war, wurde in Wasser bei einer Konzentration von 20 pmol/μl 221-fach auf eine Konzentration von 1 pmol/μl in Hybridisierungspuffer verdünnt. Das DNA-Oligonucleotid-60-mer (CompDNA), das zu RASWT-Cy3 nicht komplementär war, lag im Wasser in einer Konzentration von 90 pmol/μl vor und wurde 90-fach auf eine Konzentration von 1 pmol/μl in Hybridisierungspuffer verdünnt.
Hybridisierung, Auftüpfeln und Datenerwerb:
Röhrchen A: In einem Mikrozentrifugenröhrchen wurde 1 μl Wasser mit 1 μl RASWT-Cy3 und 18 μl Hybridisierungspuffer kombiniert.
Röhrchen B: In einem Mikrozentrifugenröhrchen wurde 1 μl KRASMU(31) mit 1 μl RASWT-Cy3 und 18 μl Hybridisierungspuffer kombiniert.
Röhrchen C: In einem Mikrozentrifugenröhrchen wurde 1 μl CompDNA mit 1 μl RASWT-Cy3 und 18 μl Hybridisierungspuffer kombiniert.
Die Röhrchen A, B und C wurden für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann wurden 0,2 μl der Lösung aus jedem Röhrchen als eine Reihe an Tropfen auf mit GAPS überzogene Objektträger (Corning, Corning NY) aufgetragen. Der Objektträger hat eine mit Gamma-Aminopropylsilan überzogene Oberfläche. Der Objektträger wurde für einen Zeitraum von annähernd 20 Minuten in einen Ofen, der bei 50 °C gehalten wurde, gegeben, bis die Flecken getrocknet waren. Der Objektträger wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und abgebildet, um die Örtlichkeit der Flecken auf dem Objektträger zu verifizieren. Ein Array-Mikrobildgeber von Genetic Microsystems (GMS 318, Woburn, MA) wurde verwendet, um unter Verwendung des grünen Lasers gemäß den Anweisungen des Herstellers Objektträgerbilder zu erhalten. Der Objektträger wurde dann aus dem Bildgeber entfernt und mit Hybridisierungspuffer in einem kleinen Träger unter sanftem Schütteln für 5 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Der Objektträger wurde dann mit deionisiertem Wasser gespült, geschüttelt, um überschüssiges Wasser zu entfernen, und es wurde ihm ermöglicht, auf der Laborbank zu trocknen. Das Bild des gewaschenen Objektträgers wurde wiederum aufgenommen.
Ergebnisse:
Die 6A und 6B sind die Bilder des Objektträgers, aufgenommen vor bzw. nach dem Waschschritt. Vor dem Waschen gab es drei sichtbare Flecken, markiert mit A, B und C, jeweils entsprechend den Reaktionen der Röhrchen A, B und C. Nach dem Waschschritt (6B) war Fleck A jedoch nicht länger für das Gerät sichtbar. Dies zeigt, dass die PNA-Sonde in der Abwesenheit jeglicher Nucleinsäure von der Objektträgeroberfläche durch den Waschschritt entfernt worden war. Wenn das komplementäre Ziel KRASMU(31) vorhanden war, wurde das sichtbare Signal an der Arrayörtlichkeit bewahrt (Fleck B), wahrscheinlich wegen der Hybridisierung der Sonde mit dem elektrostatisch immobilisierten Ziel. Wenn eine nicht komplementäre Nucleinsäure verwendet wurde, war das meiste der PNA-Sonde weggewaschen (Fleck C). Insgesamt genommen zeigen die Daten, dass es möglich ist, eine Matrixarray elektrostatisch immobilisierter Nucleinsäure zuzubereiten und leicht auf die Anwesenheit einer darauf lokalisierten Zielsequenz unter Verwendung einer Nicht-Nucleotidsonde zu testen.
Beispiel 16: Linientest
In dem Beispiel wird ein Linientest durchgeführt, worin ein Komplex aus Nicht-Nucleotidsonde und Zielsequenz unter Verwendung einer Linie aus einem polykationischen Polymer auf einem im Handel erhältlichen Membranmaterial eingefangen wird, worin den Reagenzien ermöglicht wird, in die Membran einzuziehen, wie es typisch ist für einen Querflusstest.
Zubereitung der Membran:
Streifen (2,5 cm × 20 cm) aus Millipore-Membran (P/N WOPP, Bedford, MA) wurden in einer Lösung aus 0,5 % Glutaraldehyd in Ethanol befeuchtet. Die feuchten Streifen wurden auf einem Stück Whatman-3MM-Papier unter einer Abzugshaube platziert. Nach 3 Minuten, wenn die Filterstreifen trocken erschienen, wurden sie aus dem Abzug entfernt und auf der Platte eines Ivek-Microstripers (Ivek Corp., Springfield, VT) platziert. Eine 3 mm breite Linie einer Polyethylenamin- (PEI-)Lösung wurde dann entlang dem Mittelpunkt jedes Membranstreifens aufgetragen. Die PEI-Lösung wurde zuvor durch Lösen von PEI mit einem Molekulargewicht von 750.000 (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) in Wasser und Anpassen des pH-Wertes auf 8,5 mit verdünnter Salzsäure zubereitet. Die PEI-Lösung wurde dann auf eine Konzentration von 1 mg PEI pro Milliliter verdünnt.
Wenn die Filterstreifen mit der PEI-Lösung gestreift worden waren, wurde es ihnen ermöglicht, über Nacht auf der Laborbank zu trocken. Am nächsten Tag wurden die Streifen mit verdünnter Salzsäure, pH-Wert ungefähr 3, für 45 Minuten gewaschen. Die Streifen wurden dann mit Wasser gewaschen und auf Whatman-3MM-Papier gegeben, um für 24 Stunden zu trocknen. Die Streifen wurden in kleinere Stücke mit einer Breite von 1 cm auf eine Länge von 2,5 cm geschnitten, so dass jeder Streifen eine PEI-Linie über seinen Mittelpunkt hatte. An einem Ende wurden 5 mm von jedem Stück zwischen zwei Stücke Whatman-3MM-Papier (2 × 1 cm) unter Verwendung einer kleinen Bulldog-Metallklammer eingeklemmt.
Zubereitung der Sonde, Ziele und Partikel
Ein biotinyliertes PNA-15-mer (BioP-15) in einer Lösung aus 50%igem wässrigen N,N-Dimethylformamid in einer Konzentration von 333 pmol/μl wurde 333-fach auf eine Endkonzentration 1 pmol/μl in Hybridisierungspuffer (50 % wässriges Formamid, 20 mM Tris-Hydrochlorid, 100 mM Natriumchlorid und 0,1 % SDS, pH-Wert 7,5) verdünnt. Das DNA-Oligonucleotid-60-mer (CompDNA; siehe Tabelle 1), komplementär zu BioP-15, in Wasser mit einer Konzentration von 90 pmol/μl, wurde 90-fach auf eine Konzentration von 1 pmol/μl in Hybridisierungspuffer verdünnt. Ein DNA-Oligonucleotid-60-mer (NonCompDNA; siehe Tabelle 1), nicht komplementär zu BioP-15, in Wasser mit einer Konzentration von 221 pmol/μl , wurde 221-fach auf eine Konzentration von 1 pmol/μl in Hybridisierungspuffer verdünnt. Eine Suspension aus Streptavidin-Gold-Partikeln (Arista Biologicals, Inc. Bethlehem, PA)) mit einem Durchmesser von 40 nm, wurde 20-fach mit Hybridisierungspuffer verdünnt.
Hybridisierung:
Röhrchen A: In einem Mikrozentrifugenröhrchen wurden 2,5 μl CompDNA mit 2,5 μl BioP-15 kombiniert. Die Reaktion wurde dann für 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und 20 μl 40 nM Streptavidin-Goldpartikel in Hybridisierungslösung wurden hinzugefügt.
Röhrchen B: In einem Mikrozentrifugenröhrchen wurden 2,5 μl NonCompDNA mit 2,5 μl BioP-15 kombiniert. Die Reaktion wurde dann für 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und es wurden 20 μl 40 nM Streptavidin-Goldpartikel in Hybridisierungspuffer hinzugefügt.
Linientest:
Die Röhrchen A und B wurden dann für 15 Minuten bei Raumtemperatur nach der Zugabe der Goldpartikel inkubiert. Die Inhalte der Röhrchen wurden auf ein kleines Stück Parafilm-Laborfilm (American Can Company) übertragen. Auf unterschiedliche Stücke aus Parafilm wurden zwei 20 μl Tröpfchen aus Hybridisierungspuffer aufgetüpfelt. In jeden Tropfen wurde das Ende eines Membranstreifens eingetaucht, so dass der Puffer in Richtung des durch die Bulldog-Klammer gehaltenen Endes gesaugt wurde. Die Filterstreifen wurden mit der Flüssigkeit in Kontakt gehalten bis der gesamte Tropfen auf die Membran aufgezogen war. Die Enden der beiden Streifen wurden dann getrennt in die Inhalte von Röhrchen A oder Röhrchen B, die zuvor auf saubere Abschnitte des Laborfilms übertragen worden waren, eingetaucht. Wenn die gesamten A- und B-Tröpfchen in ihre jeweiligen Filterstreifen eingezogen waren, wurden die Filterenden dann gesondert in 10 μl Tröpfchen aus Hybridisierungspuffer getaucht.
Ergebnisse:
In dem Fall von Röhrchen A, das BioP-15 und dessen DNA-Komplement CompDNA enthielt, bildete sich eine rote Linie über den Filterstreifen während des Aufsaugens der Inhalte des Röhrchens A auf den Filterstreifen. In dem Fall von Röhrchen B wurde keine Linie gesehen. Die Ergebnisse zeigen die Machbarkeit eines einfachen Linientests für den Nachweis von Nucleinsäuren unter Verwendung eines kationischen Polymers als eine Einfangzone auf dem Membranfilter.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Zusammensetzung, umfassend: (a) eine Matrix; (b) mindestens ein Nukleinsäuremolekül, umfassend mindestens eine Zielsequenz, das elektrostatisch unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen an die Matrix gebunden ist, und (c) mindestens eine markierte, selbstanzeigende Nicht-Nukleotid-Sonde, die detektierbare Eigenschaften bei Hybridisieren an eine Zielsequenz ändert und dadurch das Erfordernis, überschüssige Sonde zu entfernen, verringert oder eliminiert, wobei die markierte, selbstanzeigende Nicht-Nukleotid-Sonde eine sondierende Nukleobasensequenz umfasst, die sequenzspezifisch an mindestens einen Teil der einen oder mehreren Zielsequenzen hybridisiert, um dadurch einen Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde und Zielsequenz zu bilden, worin das Rückrad der selbstanzeigenden Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden unter elektrostatischen Bindungsbedingungen ausreichend neutral oder positiv geladen ist, dass es wenig oder keine Affinität für die Matrix aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Matrix ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem lösungsunlöslichen Polymer; (b) einer Oberfläche; (c) einem kugelförmigen Träger; (d) einem porösen kugelförmigen Träger; (e) einem gegossenen Polymeren; (f) einem co-polymeren Material; und (g) einem Gel; und worin die Matrix geladene funktionale Gruppen umfasst, die für die Bindung von Nukleinsäure unter elektrostatischen Bindungsbedingungen geeignet sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Matrix in eine Linie oder Form eines Trägers formuliert wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin die Zusammensetzung zu einem lateralen Strömungstest als Vorrichtung geformt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung an einer oder mehreren Positionen auf einem Array geformt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Matrix eine Matrixanordnung oder ein Matrixarray ist und der Matrixarray zusätzlich mindestens ein weiteres Nukleinsäuremolekül umfasst.
Zusammensetzung, wie in einem der vorstehenden Ansprüche beansprucht, worin die Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden unter elektrostatischem Bindungsbedingungen ein vollständig neutrales Rückrad umfasst bzw. umfassen.
Zusammensetzung, wie in einem der vorstehenden Ansprüche beansprucht, worin die Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden Peptidnukleinsäuren sind.
Zusammensetzung, wie in einem der vorstehenden Ansprüche beansprucht, worin die sondierende Nukleobasensequenz im Wesentlichen komplementär zur Zielsequenz ist.
Zusammensetzung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 beansprucht, worin die sondierende Nukleobasensequenz der Zielsequenz exakt komplementär ist.
Zusammensetzung, wie in einem der vorstehenden Ansprüche beansprucht, worin das oder die Nukleinsäuremolekül(e) mit Ausnahme des Teils des Moleküls oder der Moleküle abgedaut ist bzw. sind, der vor dem Abdauen mittels Hybridisierung an die Nicht-Nukleotid-Sonde geschützt ist.
Verfahren zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung einer Zielsequenz eines Nukleinsäuremoleküls in einer Probe, das Verfahren umfassend: (a) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer und Matrix und mindestens einer markierten, selbstanzeigenden Nicht-Nukleotid-Sonde, die detektierbare Eigenschaften bei Hybridisierung an eine Zielsequenz ändert und dadurch das Erfordernis, überschüssige Probe zu entfernen, verringert oder eliminiert; i) worin das Nukleinsäuremolekül elektrostatisch unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen an die Matrix binden wird, und ii) worin die selbstanzeigende Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen an mindestens einen Teil der Zielsequenz hybridisiert bzw. hybridisieren, wenn in der Probe vorhanden, um dadurch einen Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde und Zielsequenz zu bilden, und worin das Rückrad der Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden unter elektrostatischen Bindungsbedingungen ausreichend neutral oder positiv geladen ist, so dass es wenig oder keine Affinität für die Matrix aufweist, und (b) das Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren der detektierbaren Signaländerung aus der selbstanzeigenden Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden, verursacht durch Bildung des Komplexes aus Nicht-Nukleotid-Sonde und Zielsequenz als Mittel zum Detektieren, Identifizieren, oder Quantifizieren der Zielsequenz in der Probe.
Verfahren gemäß Anspruch 12, worin das Verfahren auch ein Verfahren zur Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung einer zweiten oder weiteren Zielsequenz eines zweiten oder weiteren Nukleinsäuremoleküls ist, das in einer Probe vorhanden sein kann, das Verfahren umfassend: (a) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer Matrix und mindestens zwei unabhängig detektierbaren, markierten, selbstanzeigenden Nicht-Nukleotid-Sonden, die detektierbare Eigenschaften bei Hybridisierung an eine Zielsequenz ändern und dadurch das Erfordernis, überschüssige Sonde zu entfernen, verringern oder eliminieren; i) worin das oder die Nukleinsäuremolekül(e) unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen elektrostatisch an die Matrix binden; und ii) worin die zwei oder mehr unabhängig detektierbaren Nicht-Nukleotid-Sonden unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen an mindestens einen Teil der Zielsequenzen hybridisieren, an die jede Sonde zu hybridisieren ausgelegt ist, falls in der Probe vorhanden, um dadurch Komplexe aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz zu bilden, und worin das Rückrad der Nicht-Nukleotid- Sonden unter elektrostatischen Bindungsbedingungen ausreichend neutral oder positiv geladen ist, sodass es nur geringe oder keine Affinität für die Matrix aufweist, und (b) das Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren jedes einzelnen, unabhängigen detektierbaren Komplexes aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz als Mittel zum Detektieren, Identifizieren und Quantifizieren jeder einzelnen Zielsequenz, die in der Probe detektiert werden soll, worin die detektierbare Änderung des Signals aus der selbstanzeigenden Nicht-Nukleotid-Sonde jedes einzelnen Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz-Komplexes gemessen wird, um jede einzelne Zielsequenz, die in der Probe detektiert werden soll, zu detektieren, identifizieren oder quantifizieren.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13, zusätzlich umfassend das Einstellen der Testbedingungen außerhalb des Bereichs der elektrostatischen Bindungsbedingungen zu einem Zeitpunkt vor der Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung, so dass der Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz von der Matrix zur Detektion, Identifizierung oder Quantifikation freigesetzt wird.
Verfahren, wie in Anspruch 12 beansprucht, zusätzlich umfassend den Schritt: (c) des In-Kontakt-Bringens der Probe mit einem oder mehreren Enzymen, die Probenkontaminanten abdauen können, einschließlich des Nukleinsäuremoleküls, nicht jedoch des Komplexes aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz, zu einer Zeit nach dem In-Kontakt-Bringen der Probe mit mindestens einer Nicht-Nukleotid-Sonde, worin das Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren nach dem In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem einen oder mehreren Enzymen erfolgt.
Verfahren, wie in Anspruch 15 beansprucht, zusätzlich umfassend den Schritt: (d) des Einstellens der Testbedingungen außerhalb des Bereichs der elektrostatischen Bindungsbedingungen, so dass der Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz von der Matrix freigesetzt wird.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 15 oder 16 beansprucht, worin die Probe zunächst mit der oder den Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden in Kontakt gebracht wird.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 15 oder 16 beansprucht, worin die Probe zunächst mit der Matrix in Kontakt gebracht wird.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 15 oder 16 beansprucht, worin die Probe gleichzeitig mit der oder den Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden und der Matrix in Kontakt gebracht wird.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 15 oder 16 beansprucht, worin die Unterscheidung hinsichtlich einer einzelnen Punktmutation erzielt wird, in dem man Schritt (c) bei einer Temperatur in einem fünfzehn Grad-Bereich durchführt, worin der Bereich als fünf Grad oberhalb und zehn Grad unterhalb der Schmelztemperatur des Hybrids definiert wird, das aus der Nicht-Nukleotid-Sonde und dem Nukleinsäuremolekül gebildet wird, das im Test unterschieden werden soll und das im Vergleich zur Zielsequenz eine einzelne Punktmutation aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 16, worin die Nicht-Nukleotid-Sonde der freigesetzten Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz bestimmt wird, um dadurch die Zielsequenz in der Probe zu bestimmen, identifizieren oder quantifizieren.
Verfahren, wie einem der Ansprüche 12 bis 21 beansprucht, worin die Matrix ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem lösungsunlöslichen Polymeren; (b) einer Oberfläche; (c) einem kugelförmigen Träger; (d) einem porösen kugelförmigen Träger; (e) einem gegossenen Polymeren; (f) einem co-polymeren Material; und (g) einem Gel; und worin die Matrix geladene funktionale Gruppen enthält, die für die Bindung von Nukleinsäure unter elektrostatischen Bindungsbedingungen geeignet sind.
Verfahren, wie einem der Ansprüche 12 bis 21 beansprucht, worin die Matrix zu einer Linie oder Form auf einem Träger solchermaßen formuliert wird, dass dann, wenn der Test für die Anwesenheit der Zielsequenz positiv ist, die Linie oder Form mit dem elektrostatisch immobilisierten Komplex aus Nicht-Nukleoid-Sonde-Zielsequenz im Test detektiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 23, worin der Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz einem Gerät für eine lateralen Durchflusstest gebildet wird.
Verfahren, wie einem der Ansprüche 12 bis 21 beansprucht, worin der Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz an einer oder mehreren Positionen auf einem Array gebildet wird.
Verfahren, wie einem der Ansprüche 12 bis 21 beansprucht, worin die Matrix einen kugelförmigen Träger umfasst, wodurch die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge an Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz auf der kugelförmigen Support-Matrix unter Anwendung eines Durchfluss- oder statischen Zytometers ermittelt wird.
Verfahren, wie in Anspruch 12 beansprucht, worin das Nukleinsäuremolekül elektrostatisch an einer Stelle auf einem Array aus der Matrix immobilisiert wird, worin der Array Nukleinsäuremoleküle umfasst, die elektrostatisch an einzelnen Stellen gebunden sind.
Verfahren, wie in Anspruch 12 beansprucht, worin das Verfahren auch ein Verfahren für die Detektion, Identifizierung oder Quantifizierung einer Zielsequenz eines Nukleinsäuremoleküls ist, das in einer zweiten oder folgenden interessierenden Probe vorhanden sein kann, das Verfahren umfassend: (a) das Mischen von jeder der zwei oder mehr interessierenden Proben mit mindestens einer markierten, selbstanzeigenden Nicht-Nukleotid-Sonde, die detektierbare Eigenschaften bei Hybridisierung an eine Zielsequenz ändert und dadurch das Erfordernis, überschüssige Sonde zu entfernen, verringert, unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen; (b) das In-Kontakt-Bringen einer Matrix unter geeigneten elektrostatischen Bindungsbedingungen mit mindestens einem Teil von jeder der zwei oder mehr Proben, um dadurch die Nukleinsäurekomponenten jeder Probe an die Matrix jeweils an einer einzelnen Stelle zu immobilisieren, und einen Matrix-Array von Proben zu erzeugen, worin das Rückrad der Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden unter elektrostatischen Bindungsbedingungen ausreichrnd neutral oder positiv geladen ist, dass es keine oder nur geringe Affinität für die Matrix aufweist, und (c) das Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren des Komplexes aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz, der elektrostatisch an einer einzelnen Stelle auf dem Matrix-Array gebunden ist, als Mittel zur Bestimmung der Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge der Zielsequenz in jeder der zwei oder mehr Proben, worin die detektierbare Änderung des Signals der selbstanzeigenden Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden gemessen wird, um die zu bestimmende Zielsequenz an jeder einzelnen Stelle zu detektieren, identifizieren oder quantifizieren.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 12, 13, 15 bis 21, 27 oder 28 beansprucht, worin die selbstanzeigende(n) Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden an ein Nukleinsäuresyntheseprodukt oder Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionsprodukt hybridisiert bzw. hybridisieren, dass aus einer Synthese oder einem Amplifikationsprozess resultiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Strangverdrängungsamplifikation (SDA), der transkriptionsvermittelten Amplifikation (TMA), Rollzyklusamplifikation (RCA) und Q-beta-Replikase-Amplifikation.
Verfahren gemäß Anspruch 29, worin die Matrix temporär von einer oder mehreren Komponenten der Probe abgeschirmt wird.
Verfahren nach Anspruch 30, worin die Matrix temporär durch Zusatz von Glycerin zum Test abgeschirmt wird.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 12, 13, 15 bis 21 oder 27 bis 31 beansprucht, worin die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge an Zielsequenz in der Probe in Echtzeit gemessen wird.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 12 bis 32 beansprucht, worin die selbstanzeigende Nicht-Nukleotid-Sonde mit einem Fluorochrom markiert ist.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 12 bis 33 beansprucht, worin die Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden ein unter elektrostatischen Bindungsbedingungen vollständig neutrales Rückrad umfasst bzw. umfassen.
Verfahren, wie in den Ansprüchen 12 bis 34 beansprucht, worin die Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden Peptidnukleinsäuren sind.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 12 bis 35 beansprucht, worin die sondierende Nukleobasensequenz der Zielsequenz im Wesentlichen komplementär ist.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 12 bis 35 beansprucht, worin die sondierende Nukleobasensequenz der Zielsequenz exakt komplementär ist.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 12 bis 37 beansprucht, worin die Zielsequenz für die Detektion eines Organismus, Virus, Pilz oder Pathogens, dass in einem Test detektiert werden soll, charakteristisch ist.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 12 bis 37 beansprucht, worin die Zielsequenz für die Detektion einer genetisch begründeten Erkrankung charakteristisch ist oder für die Detektion einer Predisposition für eine genetisch begründete Erkrankung charakteristisch ist.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 12 bis 39 beansprucht, worin eine oder mehrere Nicht-Ziel-Sonden zum Test zugesetzt werden, um dadurch die Unterscheidung des Test hinsichtlich einer einzelnen Punktmutation zu verbessern.
Kit zur Analyse einer Probe, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Zielsequenz, der Kit umfassend eine Matrix und mindestens eine markierte, selbstanzeigende Nicht-Nukleotid-Sonde, die detektierbare Eigenschaften bei Hybridisierung an eine Zielsequenz ändert und dadurch das Erfordernis der Entfernung überschüssiger Sonde verringert oder eliminiert, wobei die markierte, selbstanzeigende Nicht-Nukleotid-Sonde eine sondierende Nukleobasensequenz aufweist, welche Sequenz unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen spezifisch an mindestens einen Teil der zu detektierenden Zielsequenz in der Probe hybridisiert, um dadurch einen Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz zu bilden, worin das Rückrad der Nicht-Nukleotid-Sonde oder -Sonden unter elektrostatischen Bindungsbedingungen ausreichend neutral oder positiv geladen ist, damit dieses geringe oder keine Affinität für die Matrix aufweist.
Kit nach Anspruch 41, zusätzlich umfassend eines oder mehrere Reagenzien, geeignet für die Modulierung der elektrostatischen Bindungsbedingungen des Tests.
Kit nach Anspruch 41, zusätzlich umfassend Enzyme, die Probenkontaminanten, nicht jedoch einen Komplex aus Nicht-Nukleotid-Sonde/Zielsequenz abdauen.
Kit nach Anspruch 41, worin der Kit zwei oder mehr unabhängig detektierbare Nicht-Nukleotid-Sonden umfasst und zur Durchführung eines Multiplextests ausgelegt ist.