DE69124921T2

DE69124921T2 - Verfahren und Verbindungen zum Markieren von DNS mit Xanthin und Niederalkyl substituierten Xathinderivaten und Reagentrien für die "in situ" Detektion von Chromosomen

Info

Publication number: DE69124921T2
Application number: DE69124921T
Authority: DE
Inventors: Kenneth Alexander Cruickshank; Douglas James Taron
Original assignee: BP Corp North America Inc
Current assignee: Abbott Molecular Inc
Priority date: 1990-11-08
Filing date: 1991-11-05
Publication date: 1997-10-16
Anticipated expiration: 2011-11-06
Also published as: EP0485156B1; JPH04287699A; EP0485156A1; ATE149512T1; DE69124921D1; US5512433A

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren und Verbindungen zur Markierung von DNA. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem den Nachweis und die Identifizierung von Chromosomen oder Chromosomenregionen durch Hybridisierung mit zahlreichen verschiedenen chromosomen- spezifischen Sonden. Insbesondere betrifft die Erfindung die in situ-Hybridisierung dieser chromosomenspezifischen Sonden mit Chromosomen aus aufgebrochenen Zellen, die so präpariert wurden, daß die native Chromosomenstruktur im wesentlichen intakt bleibt und daß die physikalischen Wechselbeziehungen zwischen verschiedenen Chromosomen, verschiedenen Abschnitten desselben Chromosoms oder zwischen Chromosomen und anderen zellulären Strukturen erhalten bleiben.

Zusammenfassung des Standes der Technik

Methoden der in situ-Hybridisierung sind im Stand der Technik bekannt und finden auf vielen Gebieten Anwendung zum Nachweis von Chromosomen oder Chromosomenregionen. Zu diesen Anwendungsgebieten zählen die pränatale Diagostik, die Genkartierung, die Hybridbildung von Somazellen und der Nachweis spezieller chromosomaler genetischer Marker für bosartige und andere Erkrankungen, ohne daß dies eine abschließende Aufzählung bedeutet. Die Hybridisierung erfolgt in situ zwischen den chromosomalen Ziel-DNA-Sequenzen und den Sondensequenzen, die so modifiziert wurden, daß sie nach der Hybridisierung mit verschiedenen physikalischen oder chemischen Mitteln nachweisbar sind. Die Präparation der chromosomalen Ziel- DNA erfolgt so, daß die chromosomalen und die zellulären Strukturen möglichst wenig beeinträchtigt werden und eine Hybridisierung mit der Sonde ermöglicht wird. Methoden zur Präparation von chromosomaler Ziel-DNA sind dem Fachmann bekannt. [Siehe beispielsweise Gall und Pardue, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 64:600 (1969), John et al., Nature (London) 223:582 (1969), Rudkin und Stollar, Nature (London) 265:472 (1977)].
Zahlreiche Hybridisierungssonden, die sich aus DNA- und RNA-Sequenzen zusammensetzen, sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Gall und Pardue, oben, offenbaren die Verwendung von mit Tritiumhaltigen Nukleotiden markierten komplementären RNA (cRNA)-Sonden zum Nachweis von bestimmten Sequenzen auf Lampenbürstenchromosomen.
John et al., oben, offenbaren die Verwendung von ¹²&sup5;I-markierten CRNA-Sonden zum Nachweis von DNA:RNA-Hybriden.
Landegent et al., Hum. Genet. 73:354-357 (1986), offenbaren den Nachweis eines bestimmten, genetisch mit dem Gen für die Huntington-Krankheit gekoppelten Abschnitts von menschlichem Chromosom 4 nach Hybridisierung mit einer klonierten genomischen DNA-Sonde.
van Dekken und Baumann, Cytogenet. Cell Genet. 48:188-9 (1988), offenbaren den spezifischen Nachweis von menschlichem Chromosom 1 nach Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten klonierten Sonden, die spezifisch für die repetitiven Sequenzen sind, die sich am Zentromer und Telomer finden.
Emmerich et al., Exp. Cell Res. 181:126-140 (1989), offenbaren den spezifischen Nachweis der menschlichen Chromosomen 1 und 15 nach Hybridisierung mit klonierten Sonden für repetitive menschliche DNA in Tandemanordnung.
Pieters et al., Cytogenet. Cell Genet. 53:15-19 (1990), offenbaren den Nachweis von menschlichen Chromosomen in individuellen Spermazellen nach Hybridisierung mit markierten, chromosomenspezifischen Sonden.
van Dekken et al., Cytometry 11:153-164 (1990), offenbaren den Nachweis der Chromosomen 1 und Y in Interphase- und Metaphasekernen von normalen menschlichen Blutzellen nach Hybridisierung mit markierten, chromosomenspezifischen Sonden mittels Durchflußzytometrie.
Kievits et al., Cytometry 11:105-109 (1990), offenbaren den Nachweis von speziellen Chromosomen oder Chromosomenabschnitten in menschlichen Lymphozytenpräparaten nach Hybridisierung mit markierter genomischer Gesamt-DNA aus Hybridzellen von Maus/Mensch- Somazellen und nach Vorbehandlung der markierten DNA mit unmarkierter gesamtgenomischer menschlicher DNA.
Verfahren zum Markieren von DNA- und RNA-Sonden sind dem Fachmann bekannt. Diese Verfahren umfassen den enzymatischen Einbau modifizierter Nukleotide, die chemische Synthese von Sonden, die modifizierte Nukleotide enthalten, und die direkte Modifikation von Nukleotiden. Die Modifikationen umfassen die Derivatisierung von Nukleotiden zur Anlagerung von Markern oder Haptenen und die direkte Anlagerung von Markern oder Haptenen. Herkömmliche Verfahren beinhalteten den Einbau von radioaktiven Isotopen wie ³H, ¹&sup4;C, ³&sup5;S, ³²P und ¹²&sup5;I. Die inhärente Instabilität und die entsprechend kurze nutzbare Lebensdauer von radioaktiv markierten Sonden sowie Gesundheits- und Entsorgungsprobleme führten zum Einsatz einer Reihe nichtradioaktiver Verbindungen zur Markierung von DNA- und RNA- Sonden.
Das US-Patent 4,833,251 offenbart eine direkte und synthetische Modifikation von DNA-Sonden und lehrt die Derivatisierung von DNA an N[4] (substituiertes Amino)-Cytosin. Diese Derivatisierung erfolgt durch Einbau derivatisierter Nukleotide in enzymatisch oder durch Festphasen-Chemie synthetisierte DNA. Die Derivatisierung kann auch durch direkte Modifikation einzelsträngiger DNA erfolgen, die mit Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, aus genomischer eukaryotischer DNA und aus in Prokaryoten klonierter DNA präpariert wurde.
Das US-Patent 4,626,501 lehrt die Derivatisierung von DNA- und RNA- Sequenzen an Adenosin- und Cytosinresten durch Konjugation dieser Reste an den Stickstoffpositionen N-6 bzw. N-4 mit der Verbindung 3-(4-Brom-3-oxobutan-1-sulfonyl)-propionat und einer Reihe verwandter Verbindungen.
Tchen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3466-3470 (1984), offenbaren die Anlagerung des Haptens 2-Acetylaminofluoren an einzeisträngige und doppeisträngige DNA- und RNA-Sonden spezifisch an Guanosinreste.
Draper, Nucleic Acids Res. 12:989-1002 (1984) lehrt die Derivatisierung von Polynukleotiden durch Bisulfit-katalysierte Transaminierung und offenbart die Markierung derivatisierter Polynukleotide mit einer fluoreszierenden Verbindung, Nitrobenzofurazan.
Zum Nachweis nichtradioaktiv markierter Sonden wurde eine Reihe dem Fachmann bekannter Methoden entwickelt. Zu diesen Methoden zählen der direkte Nachweis fluoreszenzmarkierter Verbindungen sowie indirekte Methoden, die auf der Bindung eines Reportermoleküls basieren, das dann entweder direkt oder indirekt nachgewiesen wird. Diese Methoden auf Basis eines Reporters umfassen immunologische Methoden, bei denen Antikörper entweder das aus Ziel und Sonde bestehende Hybridmolekül selbst oder das Hapten, mit der die Sonde derivatisiert wurde, erkennen, und Affinitätsmethoden, die auf den spezifischen Wechselwirkungen mit den Haptenmolekülen basieren, mit denen die Sonden derivatisiert wurden. Der Nachweis dieser Reportermoleküle gelang durch Anhängen eines Fluoreszenzmarkers, Konjugation an ein Enzym und anschließende enzymatische Umwandlung seines Substrats in ein nachweisbares Produkt oder durch Konjugation mit Atomen hoher Elektronendichte, beispielsweise Gold, Eisen oder Silber, und visuellen oder elektronenmikroskopischen Nachweis.
Rudkin und Stollar, Nature (London), 317:472-473, offenbaren den Nachweis einer in situ-Hybridisierung mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper gegen RNA:DNA-Hybride.
Landegent et al., Hum. Genet. 73:354-357 (1986), offenbaren die Verwendung von Meerrettichperoxidase-konjugierten Antikörpern, um die in situ-Hybridisierung einer 2-Acetylaminofluoren-konjugierten Cosmidsonde für ein Gen der Huntington-Krankheit nachzuweisen.
Garson et al., Nucleic Acids Res. 15:4761-4770 (1987), offenbaren die Verwendung von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Streptavidin zum Nachweis der Hybridisierung biotinylierter Sonden für die menschlichen N-myc- und γ-NGF-Gene.
Der Stand der Technik enthält Beispiele für eine Vielzahl enzymatischer und chemischer Methoden zur Markierung und Derivatisierung von Nukleinsäuresonden. Solche Sonden können mit einer ganzen Reihe von direkten und indirekten Nachweissystemen nachgewiesen werden. Diese Erfindung betrifft Verfahren und Verbindungen zur Markierung von DNA mit Xanthin und Niederalkyl-substituierten Xanthinderivaten, sowie Reagenzien, die zahlreiche verschiedene mit Xanthin und Niederalkyl-substituierten Xanthinderivaten markierte DNA-Sequenzen umfassen, die zu den DNA-Sequenzen eines Chromosoms oder eines Chromosomenabschnitts komplementär sind. Diese Reagenzien erlauben den in situ-Nachweis des Chromosoms. Die mit Xanthin oder den Niederalkyl-substituierten Xanthinderivaten markierte DNA, die an das Chromosom oder ein anderes Ziel gebunden ist, läßt sich mit immunologischen Methoden bequem nachweisen.

Zusammenfassung der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von: 1. Verfahren und Verbindungen zur Markierung von DNA mit Xanthin oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivaten, 2. Reagenzien für den in situ-Nachweis eines Chromosoms oder einer Chromosomenregion, 3. Verfahren zur Herstellung solcher Reagenzien und 4. Verfahren zur Verwendung solcher Reagenzien zum in situ-Nachweis eines Chromosoms oder einer Chromosomenregion.
Die Erfindung stellt Verfahren und Verbindungen zur kovalenten Bindung eines antigenen Markers an DNA bereit, sowie die mit dem Antigen markierte DNA, worin der antigene Teil der Markierung Xanthin oder ein Niederalkyl-substituiertes Xanthinderivat ist. Unter Xanthin- oder Niederalkyl-substituiertem Xanthinderivat- Marker sind Marker der Formel 1 zu verstehen:
worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen Niederalkylsubstituenten mit 1-6 Kohlenstoffatomen bedeuten, vorzugsweise Wasserstoff oder Methyl. Bevorzugte Marker sind Derivate von Xanthin (worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; Wasserstoff sind), 1-Methylxanthin, 3-Methylxanthin, 7-Methylxanthin, 1,3-Dimethylxanthin (Theophyllin), 1,7-Dimethylxanthin und 1,3,7-Trimethylxanthin (Koffein). Die am meisten bevorzugten Marker sind die Theophyllin- und Koffeinderivate.
Die Erfindung stellt ein Reagens zum in situ-Nachweis von Nukleinsäuresequenzen bereit, das ein oder mehrere DNA-Sequenzen umfaßt, die zu der nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär sind, worin die DNA-Sequenzen kovalent gebunden multiple Xanthin- oder Niederalkyl-substituierte Xanthinderivat-Marker aufweisen. Die bevorzugten Marker sind Theophyllin (1,3-Dimethylxanthin) und Koffein (1,3,7-Trimethylxanthin).
Die Erfindung umfaßt ein Reagens zum in situ-Nachweis eines Chromosoms oder einer Chromosomenregion, das unhybridisierte DNA-Sequenzen umfaßt, die zu verschiedenen Abschnitten des nachzuweisenden Chromosoms oder der nachzuweisenden Chromosomenregion im wesentlichen komplementäre Basensequenzen und zahlreiche transaminierte Cytosinbasen besitzen, wobei 1 bis 7% der gesamten Nukleotidreste transaminiert sind und 80 bis 100% der transaminierten Cytosinbasen einen kovalent gebundenen Xanthin- oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivat-Marker aufweisen, wobei die Anzahl der mit Xanthin oder den Niederalkyl-substituierten Xanthinderivaten markierten Cytosinbasen für einen Nachweis durch immunologische Verfahren ausreicht, während die spezifischen Bindungseigenschaften des Reagens gegenüber dem nachzuweisenden Chromosom oder der nachzuweisenden Chromosomenregion erhalten bleiben.
Die Erfindung umfaßt außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Reagens zum in situ-Nachweis eines Chromosoms, das umfaßt:
(a) Spalten von Plasmid-DNA, die DNA enthält, die zu dem nachzuweisenden Chromosom oder der nachzuweisenden Chromosomenregion komplementär ist,
(b) Transaminieren der DNA-Fragmente, und
(c) kovalentes Binden von Xanthin- oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivat-Markern an die transaminierten DNA-Fragmente.
Insbesondere umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Reagens zum in situ-Nachweis eines Chromosoms oder einer Chromosomenregion, das umfaßt:
(a) Transaminieren einer Anzahl von Cytosinbasen, die in unhybridisierten DNA-Sequenzen mit zu dem nachzuweisenden Chromosom oder der nachzuweisenden Chromosomenregion im wesentlichen komplementären Basensequenzen enthalten sind, wobei 1 bis 7% der gesamten Nukleotidreste transaminiert werden; und
(b) kovalentes Binden von Xanthin- oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivat-Markern an zwischen 80 and 100% der transaminierten Cytosinbasen, wobei der Anteil der Cytosinbasen mit kovalent gebundenen Xanthin- oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivat-Markern ausreicht, um ein nachweisbares Signal für das Xanthin oder das Niederalkyl-substituierte Xanthinderivat zu erzeugen, während die spezifischen Bindungseigenschaften des Reagens gegenüber dem nachzuweisenden Chromosom oder der nachzuweisenden Chromosomenregion im wesentlichen erhalten bleiben.
Außerdem stellt die Erfindung ein Verfahren zum in situ-Nachweis eines Chromosoms oder einer Chromosomenregion bereit, das umfaßt:
(a) Zugabe eines Überschusses blockierender DNA zu dem erfindungsgemäßen Reagens unter Hybridisierungsbedingungen zur Bindung mit unspezifisch bindender DNA in dem Reagens unter Bildung eines blockierten Reagens,
(b) In-Kontakt-bringen des blockierten Reagens mit dem nachzuweisenden Chromosom oder der nachzuweisenden Chromosomenregion unter Hybridisierungsbedingungen, und
(c) Nachweis der Bindung des blockierten Reagens an das nachzuweisende Chromosom oder die nachzuweisende Chromosomenregion mit immunologischen Methoden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, DNA als Reagens bereitzustellen, die mit Xanthin oder einem Niederalkyl substituierten Xanthinderivat markiert ist. Eine spezielle Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Reagens zum in situ- Nachweis eines Chromosoms oder einer Chromosomenregion bereitzustellen, worin das Reagens multiple DNA-Sequenzen enthält, die zu verschiedenen Abschnitten des nachzuweisenden Chromosoms oder der nachzuweisenden Chromosomenregion komplementär sind. Die multiplen DNA-Sequenzen in dem Reagens umfassen multiple Xanthin- oder Niederalkyl-substituierte Xanthinderivat-Marker, vorzugsweise Theophyllin- oder Koffeinmarker, die kovalent an die DNA-Sequenzen gebunden sind. Diese Xanthin- oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivat-Marker, vorzugsweise Theophyllin- oder Koffeinmarker, erlauben den Nachweis der DNA-Sequenzen, die mit dem interessierenden Chromosom oder der interesierenden Chromosomenregion hybridisieren, mit immunologischen Methoden. Die Xanthin- oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivat-Marker, vorzugsweise Theophyllin- oder Koffeinmarker, sind kovalent an irgendeine der Basen Adenin, Guanosin, Cytosin oder Thymidin gebunden, aus denen sich die DNA zusammensetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Xanthin- oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivat- Marker, vorzugsweise Theophyllin- oder Koffeinmarker, kovalent an eine Anzahl transaminierter Cytosinbasen in der DNA-Sequenz gebunden. Die Anzahl transaminierter Cytosinbasen mit Xanthin- oder Niederalkyl- substituierten Xanthinderivat -Markern, vorzugsweise Theophyllin- oder Koffeinmarkern, liefert eine Menge Xanthin- oder Niederalkyl-substituierte Xanthinderivat-Marker, vorzugsweise Theophyllin- oder Koffeinmarker, die zum Nachweis mit immunologischen Methoden ausreicht, wobei gleichzeitig die spezifischen Bindungseigenschaften der DNA-Sequenzen gegenüber dem interessierenden Chromosom oder der interesierenden Chromosomenregion im wesentlichen erhalten bleiben.
Eine weitere spezielle Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Verfahren zur Herstellung von Reagenzien zum in situ-Nachweis eines Chromosoms oder einer Chromosomenregion bereitzustellen. Die erste Stufe eines bevorzugten Verfahrens besteht darin, Plasmid-DNA, die aus einer Phagen-Chromosomengenbank stammt, in Fragmente zu spalten. Diese DNA-Fragmente werden transaminiert und dann werden funktionelles Xanthin oder funktionelle Niederalkyl-substituierte Xanthinderivate, vorzugsweise Theophyllin- oder Koffeinderivate, kovalent an die transaminierten DNA-Fragmente gebunden. In der vorliegenden Erfindung reicht die Zahl der transaminierten Cytosinbasen mit kovalent gebundenen Xanthin- oder Niederalkylsubstituierten Xanthinderivat-Markern, vorzugsweise Theophyllinoder Koffeinmarkern, zur Erzeugung einer immunologisch nachweisbaren Menge von Xanthin- oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivat-Markern, vorzugsweise Theophyllin- oder Koffeinmarkern, während gleichzeitig die spezifischen Bindungseigenschaften des Reagens gegenüber dem nachzuweisenden Chromosom oder der nachzuweisenden Chromosomenregion im wesentlichen erhalten bleiben.
Eine weitere spezielle Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Verfahren zum in situ-Nachweis eines Chromosoms oder einer Chromosomenregion bereitzustellen. Allgemein werden die bevorzugten Verfahren durchgeführt, indem man die Reagenzien der vorliegenden Erfindung mit dem nachzuweisenden Chromosom oder der nachzuweisenden Chromosomenregion unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt bringt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Verfahren zum Nachweis beliebiger Nukleinsäuresequenzen bereitzustellen, die zu DNA, die mit Xanthin oder mit Niederalkyl-substituierten Xanthinderivaten markiert ist, komplementär sind. Die Xanthin- oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivat-Marker erlauben den Einbau eines Reporter-Moleküls, beispielsweise eines fluoreszenz- oder enzymmarkierten Antikörpers, in einen Sonde-Zielsequenz-Komplex. Die Zielsequenz kann chromosomale DNA sein, aber auch RNA, beispielsweise Boten-RNA oder ribosomale RNA; extrachromosomale DNA, beispielsweise Mitochondrien-DNA; oder Prokaryoten- DNA, beispielsweise Bakterien- oder Virus-DNA. Der DNA-Sonden- Assay kann in situ-Hybridisierung, Hybridisierung in Lösung, Hybridisierung mit an einer festen Phase immobilisierten Nukleinsäuren oder Hybridisierung mit Nukleinsäure oder Protein-Blots beinhalten, die auf einem der zahlreichen Transfermedien immobilisiert sind, wozu, ohne darauf beschränkt zu sein, Nitrozellulose, Nylon und andere synthetische, dem Fachmann bekannte Derivate zählen.
Die Anwesenheit des Xanthin- oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivat-Markers, beispielsweise von Theophyllin oder Koffein, wird mit immunologischen Methoden nachgewiesen. Xanthin- oder Niederalkyl-substituierte Xanthinderivate sind Haptene, gegen die Antikörper gebildet werden können. Beispielsweise läßt man einen Anti-Theophyllin-Antikörper mit der Theophyllingruppe des an das Zielchromosom gebundenen Reagens reagieren. Dann läßt man einen zweiten, speziell gegenüber dem Anti-Theophyllin-Antikörper reaktiven Antikörper, der mit einem Enzym- oder Fluoreszenzmarker markiert ist, an den Anti-Theophyllin-Antikörper binden, um damit indirekt die Bindung der Theophyllin enthaltenden DNA an das Chromosom nachzuweisen. Dem Fachmann auf dem Gebiet der Immunologie sind zahlreiche Methoden bekannt, um die Anwesenheit von Haptenen wie Theophyllin oder Koffein nachzuweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform gibt man zu dem Reagens unter Hybridisierungsbedingungen einen Überschuß an blockierender DNA. Diese blockierende DNA bindet dann an beliebige unspezifisch bindende DNA in dem Reagens und bildet dadurch ein blockiertes Reagens. Dieses blockierte Reagens kann dann mit dem interessierenden Chromosom oder der interessierenden Chromosomenregion unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem ein Reagens, das DNA mit ein oder mehreren kovalent gebundenen Xanthin- oder Niederalkyl- substituierter Xanthingruppen umfaßt, worin der Xanthin- oder Niederalkyl-substituierte Xanthinderivat-Marker mittels immunobgischer Methoden nachweisbar ist und die DNA ihre Bindungseigenschaften beibehält.
Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem eine Verbindung, welche Theophyllin-8-N-(5-hydroxypentylamino)-O-succinoyl-O'-(N'-(3-sulfosuccinimidyl)ester ist.
Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem eine Verbindung, welche Koffein-8-N-(5-hydroxypentylamino)-O-succinoyl-O-(N'-(3-sulfosuccinimidyl) )ester ist.
Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem ein Reagens zum in situ- Nachweis von Nukleinsäuresequenzen, das eine oder mehrerer DNA- Sequenzen umfaßt, die zu der nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär sind, wobei die DNA-Sequenzen multiple kovalent gebundene Theophyllin- oder Koffeinmarkern aufweisen.
Weitere Aufgaben und bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und in den Ansprüchen diskutiert.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 erläutert die Herstellung von Theophyllin-8-N-(5-hydroxypentylamino)-O-succinoyl-O'-(N'-(3-sulfosuccinimidyl)ester.
Figur 2 erläutert die Reaktion von Theophyllin-8-N-(5-hydroxypentylamino)-O-succinoyl-O'-(N'-(3-sulfosuccinimidyl) ester mit DNA, die mit Ethylendiamin transaminiert wurde.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die Erfindung beinhaltet Verfahren und Verbindungen zur Markierung von DNA mit Xanthin oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivaten und Reagenzien und Verfahren zur in situ-Identifizierung von Chromosomen oder Chromosomenregionen. Die Erfindung beinhaltet ein Reagens, das eine Vielzahl an DNA-Sequenzen umfaßt, die zu den verschiedenen Abschnitten des nachzuweisenden Chromosoms oder der nachzuweisenden Chromosomenregion komplementär sind, worin die DNA- Sequenzen an multiplen Stellen aminiert sind und an den aminierten Stellen durch kovalente Bindung eines funktionalisierten Xanthinderivats oder eines Niederalkyl-substituierten Xanthinderivats mit Xanthin oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivaten markiert sind.
Die Quellen für die DNA-Sequenz, die in der Erfindung verwendet wird, umfassen DNA, die aus speziellen Chromosomen isoliert wurde, oder Genbanken solcher DNA, die in dem Fachmann bekannter Weise hergestellt wurden, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die individuellen Chromosomen, aus denen die DNA isoliert wird, können nach irgendeiner der zahlreichen Standardmethoden präpariert werden, beispielsweise mittels Durchflußzytometrie von Mikrozell- oder Somazellhybriden, oder durch direkte Isolierung aus individuellen Metaphase- oder Interphasezellen. Eine weitere Quelle für derartige DNAS sind Genbanken von spezieller chromosomaler DNA, die nach Standardmethoden hergestellt werden und von den üblichen, dem Fachmann bekannten Quellen bezogen werden können, beispielsweise der American Type Culture Collection (ATCC) und anderen Aufbewahrungsstellen für menschliches oder anderes kloniertes genetisches Material. Repräsentativ für die zahlreichen, von der ATCC erhältlichen Chromosomenbanken sind:
Die ATCC-Hinterlegungen sind von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, zu beziehen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung können solche DNA-Sequenzen auch mit Hilfe einer der zahlreichen, dem Fachmann bekannten enzymatischen Methoden in vitro synthetisiert werden. Siehe auch den Artikel mit dem Titel "Human Chromosome-Specific DNA Libraries, Biotechnology 4:537 (1986), der die Herstellung von Genbanken von menschlichen Chromosomen beschreibt.
Die in der Erfindung eingesetzte DNA wird aus diesen Quellen mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Methoden isoliert. Diese DNA wird dann mit irgendeiner der zahlreichen physikalischen, chemischen oder enzymatischen Behandlungsmethoden, zu denen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Ultraschallbehandlung, limitierter Verdau mit Dnasei, limitierter Verdau mit Mung-Bean-Nuklease und Scheren der DNA durch eine Nadel mit engem Kaliber gehören, zu einer heterogenen Mischung aus DNA-Fragmenten verschiedener Größen zerkleinert. Die Länge der DNA-Fragmente in der resultierenden Mischung liegt in einem Größenbereich von 100-500 Basenpaaren (bp), wobei die bevorzugte durchschnittliche Länge eines Fragments bei ungefähr 300bp liegt. Diese Verfahren liefern eine große Zahl von DNA-Sequenzen, die zu verschiedenen Abschnitten der nachzuweisenden Chromosomen komplementär sind. Tatsächlich werden tausende, wenn nicht sogar zehntausende DNA-Sequenzen erzeugt, die zu verschiedenen Abschnitten der Chromosomen-DNA komplementär sind.
Die DNA-Fragmente werden mit irgendeiner der zahlreichen, dem Fachmann bekannten chemischen Methoden derivatisiert, vorzugsweise durch Transaminierung der Aminogruppe am Kohlenstoffatom 4 (C4- Atom) der Nukleotidbase Cytosin. Die Derivatisierung führt zur Anlagerung einer Reihe von Diaminverbindungen an die C4-Position dieser Base, zu denen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Verbindungen wie Hydrazin und Alkylendiamine mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Ethylendiamin, zählen, sowie von Verbindungen, zu denen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Aminosäuren, Peptide, Etherderivate oder irgendwelche anderen organischen oder anorganischen Linkermoleküle zählen. In den DNA-Fragmenten sind ungefähr 5-50%, vorzugsweise 5-25% der in ihnen enthaltenen Cytosinreste transaminiert, wobei eine optimale Transaminierung bei 12-24% liegt. Von der Gesamtzahl der Nukleotidreste sind ungefähr 1-7% transaminiert, wobei im Optimalfall 2-5% der Gesamtzahl der Basen transaminiert sind.
Die transaminierten DNA-Sequenzen werden kovalent an eine der zahlreichen Xanthin- oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivat- Verbindungen gebunden, die eine reaktive funktionelle Gruppe aufweisen, die in der Lage ist, mit der transaminierten DNA-Sequenz eine kovalente Bindung einzugehen. Bevorzugte Verbindungen, die verwendet werden können, um die transaminierten DNA-Sequenzen mit Theophyllin bzw. Koffein zu markieren, sind Theophyllin-8-N-(5- hydroxypentylamino)-O-succinoyl-O'-(N'-(3-sulfosuccinimidyl))ester oderKoffein-8-N-(5-hydroxypentylamino)-O-succinoyl-O'-(N'-(3- sulfosuccinimidyl))ester. Die transaminierten DNA-Sequenzen werden mit einem 100-300fachen molaren Überschuß der funktionalisierten Theophyllin- oder Koffeinverbindung umgesetzt, vorzugsweise mit einem ungefähr lsofachen molaren Überschuß. Ungefähr 80-100% der transaminierten Stellen werden Theophyllin- oder Koffein-markiert.
Die mit Xanthin oder mit Niederalkyl-substituierten Xanthinderivaten markierten DNA-Sequenzen werden zur in situ-Hybridisierung mit den Zielchromosomen eingesetzt. Im Sinne dieser Erfindung bedeutet "in situ", daß die Chromosomen aus dem Zellkern ohne wesentliche Zerstörung oder Umlagerung der Chromosomen relativ zueinander exponiert werden und die Chromosomen für die mit Xanthin oder mit den Niederalkyl-substituierten Xanthinderivaten, vorzugsweise mit Theophyllin oder Koffein markierten DNA-Sonden zugänglich sind. Zu den Zielsequenzen für diese Hybridisierung zählen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Chromosomen oder Chromosomenregionen von normalen, kranken oder bösartigen menschlichen oder sonstigen Tier- oder Pflanzenzellen, die sich entweder in der Interphase oder irgendeinem anderen Stadium der Meiose oder Mitose befinden, und die entweder aus lebenden oder abgestorbenen Geweben, Organen oder aus Flüssigkeiten stammen oder daraus extrahiert wurden; Keimzellen einschließliche Spermien und Eizellen, Samenzellen, Pollen, oder Zygoten, Embryos, Chorion- oder Amnionzellen, oder Zellen aus irgendwelchen anderen keimenden Körpern; in vitro gezüchtete Zellen, entweder aus Langzeit- oder Kurzzeitkulturen und entweder normal, immortalisiert oder transformiert; inter- oder intraspezifische Hybride verschiedener Zelltypen oder verschiedener Differenzierungsstadien dieser Zellen; individuelle Chromosomen oder Chromosomenabschnitte oder translozierte, deletierte oder anderweitig geschädigte Chromosomen, die mit irgendeiner der zahlreichen bekannten fachmännischen Methoden isoliert wurden, zu denen Genbanken von derartigen in prokaryotische oder andere Vektoren klonierten und darin vermehrten Chromosomen gehören, oder die in vitro mittels bekannter fachmännischer Methoden amplifiziert wurden; oder forensisches Material einschließlich Spermien, Blut, Haaren oder anderen Proben, wobei diese Aufzählung nicht abschließend ist.
Vor der Hybridisierung werden die markierten DNA-Sequenzen mit einem Überschuß einer entsprechenden unmarkierten DNA oder einer reassozuerten Fraktion unmarkierter DNA umgesetzt, um an unspezifisch bindende DNA in der Probe zu binden, wodurch die unspezifische DNA blockiert und ein blockiertes Reagens geschaffen wird. Diese blockierende DNA wird in einer Konzentration von 1-10 µg pro 10 µl gesamter genomischer DNA eingesetzt, wobei ein bevorzugter Bereich abhängig vom hybridisierten Chromosom zwischen 2,25 und 6,75 µg pro 10 µl oder zwischen 1 und 4 µg pro 10 µl, vorzugsweise bei ungefähr 1,3 µg pro 10 µl liegt. Die blockierende DNA kann menschliche Plazenta-DNA sein oder man präpariert Cot1-DNA (Cot1- DNA von Life Technologies, Gaithersburg, MD, Kat.-Nr. 52795A) durch mechanisches Scheren von gesamtgenomischer menschlicher DNA auf eine durchschnittliche Länge von weniger als 400 Basenpaaren. Dieses Material wird denaturiert und dann über einen genügend langen Zeitraum rehybridisiert, so daß ein erheblicher Bruchteil der hochrepetitiven DNA-Sequenzen Doppelstränge bildet. Die Mischung aus doppel- und einzelstrangigen DNA-Spezies wird mit Nuklease S1 behandelt, einer Nuklease, die spezifisch einzelsträngige DNA zu Mono- und Oligonukleotiden abbaut. Aus dieser Mischung wird unverdaute, doppelsträngige Cot1-DNA gewonnen.
Die Chromosomen werden vorzugsweise zur Sichtbarmachung mit irgendeinem der zahlreichen Gegenfärbemittel, zu denen in nicht einschränkender Aufzählung Propioliumiodid, Chinacrin oder Distamycin/4,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI) gehören, oder mit einem nichtfluoreszierenden Farbstoff wie Giemsa gefärbt. Diese Gegenfärbemittel erlauben die Sichtbarmachung aller Chromosomen.
Die Erfindung stellt also eine Mischung aus einer großen Anzahl von mit Xanthin oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivaten markierten DNA-Sequenzen, vorzugsweise mit Theophyllin- oder Koffeinmarkern markierte DNA-Sequenzen bereit, die zu verschiedenen Abschnitten der nachzuweisenden Chromosomen komplementär sind. Die Verfahren dieser Erfindung liefern tausende, wenn nicht zehntausende verschiedene DNA-Sequenzen, die zu dem nachzuweisenden Chromosom komplementär und mit Xanthin oder mit Niederalkyl-substituierten Xanthinderivaten, ganz besonders bevorzugt mit Theophyllin oder Koffein, markiert sind. Die Hybridisierung dieser großen Zahl von verschiedenen markierten DNA-Sequenzen mit einem wesentlichen Abschnitt der Chromosomen erlaubt den Nachweis des Chromosoms, indem man die hybridisierte, markierte DNA mit einem gegen den Marker gerichteten Antikörper reagieren läßt und dann wiederum den an den Marker gebundenen Antikörper mit einem Antikörper bindet, der mit einem Enzym- oder Fluoreszenzmarker markiert ist und für den an den Marker gebundenen Antikörper spezifisch ist. Dem Fachmann auf dem Gebiet der Immunologie sind zahlreiche immunologische Methoden bekannt, mit denen Xanthin- oder Niederalkyl-substituierte Xanthin- Marker wie Theophyllin oder Koffein nachgewiesen werden können. Xanthin- oder Niederalkyl-substituierte Xanthinderivate, wie beispielsweise Theophyllin oder Koffein, sind Haptene, gegen die mit Hilfe allgemein bekannter Methoden Antikörper gebildet werden können. Methoden zur Markierung von Antikörpern mit Fluoreszenzmarkern wie Fluorescein, Rhodamin u.a. sind allgemein bekannt. Ebenso ist es bekannt, Antikörper mit Enzymen wie Meerrettichperoxidase und alkalischer Phosphatase zu markieren. Beispielsweise könnten die Xanthin- oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivat-Marker, beispielsweise der Theophyllinmarker, auf den an das Zielchromosom hybridisierten DNA-Sequenzen direkt durch Reaktion mit einem fluoreszenz- oder enzymmarkierten Anti-Theophyllin-Antikörper nachgewiesen werden. Der Komplex läßt sich wie folgt darstellen:
Chromosoinen -DNA/komplementäre DNA - Theophyllin-markiert/Anti- Theophyllin-Antikörper (Fluoreszenz- oder Enzymmarker)
In einer anderen Anordnung läßt man den Theophyllinmarker mit einem Anti-Theophyllin-Antikörper reagieren, der wiederum an einen gegen den Anti-Theophyllin-Antikörper gerichteten Antikörper gebunden ist, der einen Fluoreszenz- oder Enzymmarker trägt. Beispielsweise wird Anti-Theophyllin-Antikörper aus Kaninchen zuerst an den Theophyllinmarker gebunden, gefolgt von einem Anti-Kaninchen-Antikörper aus Ziegen, der einen Fluoreszenz- oder Enzymmarker trägt. Diese Anordnung läßt sich wie folgt darstellen:
Chromosomen -DNA/komplementäre DNA - Theophyllin-markiert/Anti- Theophyllin-Antikörper aus Kaninchen/Anti-Kaninchen-Antikörper aus Ziegen mit einem Fluoreszenz- oder Enzymmarker.
Die Fluoreszenz- oder Enzymmarker werden mittels Standardmethoden nachgewiesen. Dem Fachmann auf dem Gebiet der Immunologie sind zahlreiche Testanordnungen, Fluoreszenzmarker und Enzymmarker zum Nachweis von Haptenen wie beispielsweise Xanthin- oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivaten, insbesondere Theophyllin- oder Koffeinmarkern, bekannt. Auch andere spezifisch bindende Substanzen wie Avidin/Biotin können vorteilhaft in Testanordnungen für Xanthin- oder Niederalkyl-substituierte Xanthinderivate, insbesondere Theophyllin- oder Koffeinmarker, eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. Auch zahlreiche Ausführungsformen, die hier nicht speziell beschrieben werden, fallen jedoch unter das Prinzip und den Umfang der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1

Isolierung von für menschliche Chromosomen spezifische DNA-Sonden

Für menschliche Chromosomen spezifische DNA-Sonden wurden von den Lawrence Livermore National Laboratories (LLNL) als rekombinante Phagen-Genbanken erhalten, die wie bei Van Dilla, M.A. et al.
(Biotechnology 4:537-552, 1986) beschrieben konstruiert worden waren. Diese Genbanken wurden durch Wachstum auf einem E. Coli- Wirtsstamm amplifiziert. Die amplifizierten Phagen wurden gereinigt, ihre DNA wurde extrahiert und diese DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Hind III verdaut. Die Insert-DNA wurde von der DNA des Lambda-Vektors gereinigt und in die Hind III-Stelle des Plasmidvektors pBS (Stratagene, La Jolla, CA) kloniert. Die resultierenden Plasmide wurden in einen E. Coli-Stamm, DH5α (Bethesda Research Libraries, Gaithersburg, Maryland), transformiert.
Bei den hier erläuterten Plasmid-Genbanken handelt es sich um die ATCC-Nummern 57738, 57753 und 57754 (Chromosom 1); die ATCC-Nummern 57749, 57748 und 57751 (Chromosom 3); die ATCC-Nummern 57723 und 57702 (Chromosom 8); und die ATCC-Nummern 57727 und 57736 (Chromosom 12). Die Genbanken werden in 1ml-Aliquoten als eingefrorene Zellen aufbewahrt. Diese Fläschchen wurden als Primärquelle für die Produktion von Stammkulturen für die Fermentation verwendet.
Die Bakterien wurden durch Fermentation gezüchtet. Die von der ATCC erhaltene Stammkultur wurde 24 Stunden bei 37ºC auf 1,6%igen Agarplatten mit Ampicillin (200 µg/ml) und YT-Nährmedium kultiviert, das 8 Gramm pro Liter (g/l) Bacto Tryptone (Difco), 5 g/l Bacto Yeast Extract (Difco), 15 g/l Bacto Agar und 5 g/l Natriumchlorid enthielt. Die kultivierten Zellen wurden mit 4 ml geerntet, die 16 g/l Bacto Tryptone (Difco), 10 g/l Bacto Yeast Extract (Difco) und 5 g/l Natriumchlorid enthielten, und zu jeder Ernte wurden 4 ml 20%iges Glycerin zugegeben. Die E. Coli-Zellkultur wurde durch Eintauchen der Glasfläschchen in flüssigen Stickstoff in 0,5ml-Aliquoten schockgefroren und bis zur Verwendung bei -80ºC aufbewahrt.
Das Inokulum für den Fermenter wurde in 350 ml hergestellt, indem man die Impfkultur in einem Casamino Acid-Medium mit 13,2 g/l Na&sub2;HPO&sub4; 7H&sub2;O, 3,0 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,05 g/l NaCl, 1,0 g/l NH&sub4;Cl, 10,0 g/l Casamino Acids (Difco), 0,03 g/l MgSO&sub4;, 0,004 g/l CaCl&sub2; 2H&sub2;O, 3,0 g/l Glucose, 0,025 g/l Thiamin-HCl, 0,0054 g/l FeCl&sub3;, 0,0004 g/l ZnSO&sub4;, 0,0007 g/l CoCl&sub2;, 0,0007 g/l Na&sub2;MoO&sub4;, 0,0008 g/l CuSO&sub4;, 0,0002 g/l H&sub2;BO&sub3; und 0,0005 g/l MnSO&sub4; in einem 21-Nasenschüttelkolben bei pH 7 und 37ºC kultivierte. Die 350ml-Kultur wurde zum Beimpfen von 4,2 Litern Fermentationsmedium verwendet, das 1% Glucose, 13,2 g/l Na&sub2;HPO&sub4; 7H&sub2;O, 3,0 g/l KH&sub2;P0&sub4;, 0,05 g/l NaCl, 1,0 g/l NH&sub4;Cl, 10,0 g/l Casamino Acids (Difco), 0,03 g/l MgSO&sub4;, 0,004 g/l CaCl&sub2; 2H&sub2;O, 0,025 g/l Thiamin-HCl, 0,0054 g/l FeCl&sub3;, 0,0004 g/l ZnSO&sub4;, 0,0007 g/l CoCl&sub2;, 0,0007 g/l Na&sub2;MoO&sub4;, 0,0008 g/l CUSO&sub4;, 0,0002 g/l H&sub2;BO&sub3; und 0,0005 g/l MnSO&sub4; enthielt.
Die Bakterienzellen wurden unmittelbar nach Ende der Fermentation mit einem Membran-Zellanreicherer und einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge geerntet. Das fermentierte Zellmedium wurde mit einem 0,45-Mikron(µm)-Membranfilter (2 Quadratfuß) von 5 Litern auf ungefähr 800 ml konzentriert. Das Zellkonzentrat wurde dann 10 Minuten bei 7000 x g in einer Kühlzentrifuge abzentrifugiert. Die Pellets der Bakterienzellen werden nach Verwerfen des Überstandes wiedergewonnen.
Aus den Pellets der Bakterienzellen wurde die Plasmid-DNA extrahiert. Die Zellen wurden gründlich in einer Lösung mit 50 mM Glucose (sterilfiltriert), 10 mM NAEDTA (pH 7,5-8,0) und 25 mM Tris- HCL (pH 8,0) resuspendiert, und zwar in einer Menge, die der dreifachen Masse des Zellpellets (M) (in Millilitern) entsprach. Die Zellen wurden nach Zugabe von 6xM (in Millilitern) einer Lösung mit 0,2 M NaOH und 1% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) unter kräftgem Wirbeln lysiert. Nach Aufklaren der Lösung wurden 4,5xM (in Millilitern) einer Lösung mit 55,5 ml Eisessig und 147,5 g Kaliumacetat in einem Endvolumen von 500 ml gründlich zugemischt, was zur Bildung eines flockigen Präzipitats führte. Der Überstand wurde von dem flockigen Präzipitat abgetrennt und dieser Überstand wurde zur Entfernung von restlichem Präzipitat 15 Minuten bei 7000 x g zentrifugiert.
Die Nukleinsäure wurde aus dem Überstand mit einem Volumenteil Ethanol gefällt und anschließend wurde 10 Minuten bei 7000 x g zentrifugiert und die Nukleinsäurepellets wurden in insgesamt 0,54xM (in Millilitern) resuspendiert. Die Nukleinsäure wurde dann mit einem halben (1/2) Volumenteil neutralisiertem Phenol und 1/2 Volumenteil Chloroform extrahiert und mit 2 Volumenteilen Ethanol gefällt. Die Nukleinsäure wurde in 0,3xM (in Millilitern) einer Lösung mit 50 mM Tris-HCL (pH 7,0) und 100 mM Natriumacetat resuspendiert. Dann wurden 0,77xM (in Mikrolitern) 10mg/ml Rnase (hitzebehandelt) zugegeben und man ließ 30 Minuten bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4ºC verdauen. Dann wurden 0,615xM (in Mikrolitern) einer Proteinase K-Lösung (20mg/ml) zugegeben und es wurde drei Stunden bei 55ºC inkubiert. Die DNA wurde dann mit 1/2 Volumenteil neutralisiertem Phenol und 1/2 Volumenteil Chloroform extrahiert und mit 2 Volumenteilen Ethanol gefällt.
Die DNA wurde in 0,415xM (in Milliliter) Wasser resuspendiert, es wurden 0,05xM Milliliter 5 M NaCl und 0,155xM Milliliter 50%iges (w/v) Polyethylenglycol (PEG) (Molekulargewicht 6000-8000) zugegeben, und es wurde eine Stunde in Eiswasser inkubiert und durch 15- minütige Zentrifugation bei 7000 x g gefällt. Die DNA wurde in 0,04xM Millilitern Wasser und 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat resuspendiert und mit 1/2 Volumenteil neutralisiertem Phenol und 1/2 Volumenteil Chloroform extrahiert und mit 2 Volumenteilen Ethanol gefällt. Die gereinigte DNA wurde in 0,0476xM Millilitern deionisiertem H&sub2;O resuspendiert. Die DNA-Konzentration wurde durch Fluorometrie bestimmt.
Schließlich wurde die gereinigte DNA durch Beschallen mit einem Branson Sonifier 450 (Danbury, Connecticut) in kleine Fragmente mit einer Länge von ungefähr 300 Basenpaaren gespalten. Diese Fragmentgröße erwies sich empirisch als das Optimum für die zur in situ- Hybridisierung verwendeten DNA-Sonden. 4 mg der oben präparierten gereinigten Plasmid-DNA wurden in 2 ml Wasser resuspendiert und in ein Trockeneis/Ethanol-Bad getaucht, um ein Kochen während der Beschallung zu verhindern. Die Mikrospitze des Beschallungsgeräts wurde in diese Lösung getaucht, bis sich die Spitze 2-5 mm über dem Boden des Röhrchens befand. Die Beschallung erfolgte bei einer Ausgangsleistung von 25-30 Watt diskontinuierlich mit einer 80%igen relativen Einschaltdauer (80% der Zeit an, 20% der Zeit aus) über einen Zeitraum von 5 Minuten. Nach der Beschallung wurde die DNA durch Zugabe von 0,2 ml 3M Natriumacetat (pH 5,5) und 4 ml Ethanol gefällt. Das Präzipitat wurde durch 5-minütige Zentrifugation bei 8000 x g wiedergewonnen und unter Vakuum getrocknet.

Beispiel 2

Bisulfit-katalysierte Transaminierung von DNA

Die DNA wurde durch Anlagerung von Ethylendiamin an das C4-Kohlenstoffatom der Cytosinbase transaminiert. Diese Reaktion wird durch Natriumbisulfit katalysiert. Ungefähr 8 bis 24% der verfügbaren Desoxycytidinnukleotidstellen werden zur Markierung mit Xanthin oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivaten, insbesondere Theophyllin oder Koffein, aminiert.
Zur Herstellung des Bisulfitpuffers wurden 1,7 ml rauchende HCl langsam zu 1 ml deionisiertem H&sub2;O auf Eis gegeben. Dann wurde langsam 1 ml frisches Ethylendiamin (Sigma-Kat.-Nr. E-4379) auf Eis zugegeben. Nach Lösen des Ethylendiamins wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und es wurden 0,475 g Natriummetabisulfit (Aldrich-Kat.-Nr. 25555-6) zugegeben. Dann wurde zu der Bisulfitmischung langsam rauchende HCl zugegeben&sub1; bis ein pH von 7,0 erreicht war. Dann wurde deionisiertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 5,0 ml zugegeben.
Zur Transaminierung der DNA wurde 1 mg beschallte DNA in 0,3 ml H&sub2;O resuspendiert. Die DNA wurde durch 5-minütiges Kochen bei 100ºC und anschließendes schnelles Abkühlen in einem Eiswasserbad denaturiert. Die Transaminierungsreaktion wurde durch Zugabe von 0,3 ml dieser DNA-Lösung zu 2,7 ml Bisulfitpuffer eingeleitet und die Reaktionsmischung wurde 2 Tage bei 37ºC inkubiert. Die DNA-Lösung wurde mittels Standarddialyse gegen 5-10 mM Natriumborat (pH 8,0) entsalzt. Nach der Dialyse wurden 0,3 ml 3 M Natriumacetat (pH 5,5) zu dem Dialysat gegeben. Die aminierte DNA wurde mit 2,5 Volumenteilen Ethanol gefällt und nach 10-minütiger Zentrifugation bei 8000 x g wiedergewonnen. Die Pellets wurden unter Vakuum getrocknet und auf eine Konzentration von 3 mg/ml DNA rehydratisiert. Diese Lösung wurde bis zur Verwendung bei -80ºC aufbewahrt.

Beispiel 3

Herstellung von Theophyllin-8-N- (5-hvdroxypentylamino)-O-succinoyl O'-(N'-(3-sulfosuccinimidyl))ester

Eine Lösung aus 5,16 g 8-Bromtheophyllin und 5,15 g 5-Amino-1pentanol in 18 ml p-Xylol wurde 18 Stunden unter Rückfluß gekocht. Die Reaktionslösung wurde abkühlen gelassen und bildete nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur eine Fest/Flüssig-Mischung. Das Xylol wurde dekantiert und der Feststoff wurde mit Pentan gewaschen (3x40 ml). Der resultierende Feststoff wurde 30 Minuten in 20 ml Wasser gerührt und zum Sammeln des festen Materials abfiltriert. Das gesammelte feste Material wurde mit Wasser gewaschen (3x20 ml) und getrocknet; es wurden 3,73 g 8-(5-Hydroxypentylamino)theophyllin erhalten. Zu einer Lösung von 1,12 g 8-(5-Hydroxypentylamino)theophyllin in 15 ml wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (DMF) wurden 0,516 g Succinsäureanhydrid und 0,2 g 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) gegeben. Die Mischung wurde mit einem Magnetrührer über Nacht bei Raumtemperatur unter wasserfreien Bedingungen gerührt. Der farblose Feststoff, der ausfiel, wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Dichlormethan gewaschen und an der Luft getrocknet; man erhielt 1,20 g Theophyllin-8-N-(5-hydroxypentylamino)-O-succinsäureester. Dieser Feststoff wurde aus einer kochenden 1:1-Mischung aus Propanol/Wasser umkristallisiert und über Calciumsulfat getrocknet; es wurde ein farbloser Feststoff erhalten.
Zu einer Lösung von 0,725 g Theophyllin-8-N-(5-hydroxypentylamino)- O-succinsäureester in 15 ml wasserfreiem Dimethylformamid wurden 0,414 g 3-Sulfo-N-hydroxysuccinimid (Sulfo-NHS) gegeben.
Zu der obigen Lösung wurde eine Lösung von 0,488 g Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 2 ml wasserfreiem DMF gegeben. Die resultierende Mischung wurde mit einem Magnetrührer 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in einem Eisbad eine Stunde gekühlt und dann zur Entfernung von Dicyclohexylharnstoff unter Vakuum filtriert. Das Filtrat wurde unter Vakuum (2 Torr, 30ºC) eingedampft; es wurde ein viskoses, farbloses Öl erhalten. Dieses Öl wurde mit 40 ml wasserfreiem Ethanol behandelt und ein festes Material ausgefällt. Das ausgefällte Material wurde durch Filtration gesammelt und über wasserfreiem Calciumsulfat getrocknet; es wurden 0,450 g Theophyllin-8-N-(5-hydroxypentylamino)-O-succinoyl- O'-(N'-(3-sulfosuccinimidyl) )ester (NHS-Theophyllin) erhalten. Dieses Reaktionsschema ist in Figur 1 erläutert. Die Markierung der aminierten DNA mit NHS-Theophyllin ist in Figur 2 dargestellt.

Beispiel 4

Herstellung von 8- (5-Hydroxypentylamino)koffein, Koffein-8-N-(5- hvdroxypentylamino)-O-succinsäureester und Koffein-8-N-(5-hydroxy- Dentylamino)-O-succinoyl-O'-(N'-(3-sulfosuccinimidyl) )ester (NHS- Koffein)

Ausgehend von 8-(5-Hydroxypentylamino)theophyllin in Beispiel 3 wurden 1,0 ml Dimethylsulfat (DMS) zu 1,40 g 8-(5-Hydroxypentylamino)theophyllin in 20 ml Wasser mit 0,3 g Natriumhydroxid gegeben. Die 1,0 ml DMS wurden in Einzelportionen von 0,1 ml über einen Zeitraum von 1 Stunde bei Raumtemperatur zugegeben. Es schied sich ein farbloser kristalliner Feststoff ab, der durch Filtration gesammelt wurde. Dieser Feststoff wurde getrocknet und es wurden 0,850 g 8-(5-Hydroxypentylamino)koffein erhalten.
Entsprechend dem Verfahren in Beispiel 3 und unter Verwendung äquivalenter Mengen wurde das 8-(5-Hydroxypentylamino)koffein in Koffein-8-N-(5-hydroxypentylamino)-O-succinsäureester und in Koffein-8-N-(5-hydroxy-pentylamino)-O-succinoyl-O'-(N'-(3-sulfosuccinimidyl) )ester (NHS-Koffein) überführt.

Beispiel 5

DNA-Markierung - Theophyllin

Die gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 erhaltenen, für menschliches Chromosom 8 spezifischen DNA-Sonden mit einer durchschnittlichen Länge von ungefähr 300 bp wurden durch Bisulfit-katalysierte Transaminierung mit Ethylendiamin wie in Beispiel 2 beschrieben derivatisiert. Ungefähr 5% der Basen wurden aminiert. Eine Lösung der aminierten DNA (100 µg Gesamt-DNA) in einem 1,5 ml-Plastikzentrifugenröhrchen wurde unter Vakuum eingedampft. Zu dem Rückstand wurden 0,5 ml 0,2 M 3-propansulfonsäure (MOPS)-Puffer und anschließend 100 µl NHS-Theophyllin (26 mg/ml N,N-Dimethylformamid) gegeben und die Mischung wurde über Nacht bei 25ºC inkubiert. Es wurden 50 µl 3 M Natriumacetat (pH 5,5) und anschließend 1,5 ml eiskaltes Ethanol zugegeben und die Mischung wurde mindestens 2 Stunden bei -20ºC inkubiert. Die Lösung wurde 10 Minuten bei 10000 x g zentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit 0,6 ml eiskaltem Ethanol gewaschen und dann in 100 µl sterilem Wasser gelöst. Es wurden zwei Sephadex G-50 Select D-Chromatographiesäulen (5 Prime T 3 Prime, Inc.) mit einem Bettvolumen von 0,8 ml präpariert. Auf jede Säule wurden 50 µl des gelösten Pellets aufgebracht und es wurde 4 Minuten bei 10000 x g zentrifugiert. 10 µl der gereinigten DNA wurden mit 490 µl 20 mM NaOH verdünnt und zur Abschätzung der DNA-Konzentration wurde die optische Dichte bei 260 nm bestimmt. Die gereinigte DNA wurde mit Wasser auf eine DNA-Arbeitskonzentration von 100 µg/ml verdünnt.

In situ-Hybridisierungsverfahren

Die Theophyllin-markierte DNA-Sonde wurde durch in situ-Hybridisierung getestet. Die Ziel-DNA bestand aus kultivierten normalen weißen Blutzellen, die in Metaphase stehengeblieben waren. Die Zellen wurden aus einem Abstand von ungefähr drei Fuß auf einen Mikroskopobjektträger fallengelassen, um die Kerne aufzubrechen. Vor der Hybridisierung wurde der Träger bei 70ºC in eine Denatunerungslösung aus 70% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) gegeben. Dann wurde der Träger dehydratisiert, indem er durch 70%ige, 85%ige und 100%ige Ethanollösungen geführt wurde (jeweils 2 min).
Die Hybridisierungsmischung, die auf jeden Träger gegeben wurde, bestand aus 50% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7). Menschliche Plazenta-DNA (2,25 µg/10 µl) wurde als blockierende DNA verwendet. Die Theophyllin-markierte DNA wurde in einer Konzentration von 10 ng/µl zugegeben. 10 µl der kompletten Hybridisierungsmischung wurden durch 10-minütiges Erhitzen auf 70ºC denaturiert. Die Sonde und die blockierende DNA wurden 60 Minuten bei 37ºC vorhybridisiert. Die Mischung wurde dann auf den Träger aufgebracht, mit einem Abdeckstreifen abgedeckt und mit Kautschukzement versiegelt. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 37ºC in einer Feuchtekammer.
Am nächsten Tag wurde die überschüssige Sonde durch dreimaliges 15-minütiges Waschen des Trägers bei 45ºC in 50% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) und durch jeweils 15-minütiges Waschen in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) und anschließend in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1% NP40-Detergens (Octylphenoxypolyethoxyethanol, ein nichtionisches Tensid, das von Calbiochem, La Jolla, California, vertrieben wird) (PN-Puffer) entfernt. Der Träger wurde zweimal jeweils 2 Minuten bei 25ºC in PN-Puffer gewaschen. Der Träger wurde 1 Stunde in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1% NP4O-Detergens/ 5% fettfreie Trockenmilch (PNM-Puffer) blockiert. Der Träger wurde 1 Stunde bei 25ºC in mit PNM-Puffer 1:250 verdünntem Anti-Theophyllin von Kaninchen (Sigma) inkubiert. Der Träger wurde dreimal jeweils 5 Minuten bei 25ºC in PN-Puffer gewaschen. Dann wurde der Träger 1 Stunde mit alkalischer Phosphatase-Anti-Kaninchen-Immunglobulin G (Sigma), 1:250 verdünnt mit PNM-Puffer, inkubiert. Der Träger wurde dreimal jeweils 5 Minuten bei 25ºC in PN-Puffer gewaschen. Dann wurde der Träger 30 Minuten bei 37ºC in 17 ml BCIP/NBT [eine Lösung enthaltend 4 µg/ml Nitroblau-Tetrazolium (NBT) und 3 µg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP, wie von Chemprobe erhältlich)] inkubiert. Der Träger wurde mit destilliertem Wasser gespült, an der Luft getrocknet und unter einem Mikroskop betrachtet.

Ergebnisse der in situ-Hybridisierung

Der alkalische Phosphatase-Marker katalysiert die Umwandlung des BCIP/NBT-Substrats in einen dunkelblauen Farbstoff, der unter dem Mikroskop schwarz erscheint. Nicht-Zielchromosomen erscheinen entweder farblos oder können mit einem Giemsa-Farbstoffpräparat blau gegengefärbt werden.
Entsprechend im wesentlichen dem obigen Verfahren wurden auch die Ergebnisse für die Chromosomen 1, 3 und 12 erhalten. Optische Beschreibung
Code:
Spezifität: (-) nicht erkennbar, (+) leicht erhöhte Färbung in den Zielchromosomen, (++) vernünftige Spezifität, (+++) gute Spezifität.
Intensität: (-) nicht sichtbar&sub1; (+) nur unter Phase sichtbar, (++) dunkle Färbung, sichtbar bei Durchstrahlung, (+++) sehr dunkle Färbung, lichtbrechend unter Phase.

Beispiel 6

DNA-Markierung - Koffein

Die gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 erhaltenen, für menschliches Chromosom 4 spezifischen DNA-Sonden mit einer durchschnittlichen Länge von ungefähr 300 bp wurden durch Bisulfit-katalysierte Transaminierung mit Ethylendiamin wie in Beispiel 2 beschrieben derivatisiert. Ungefähr 4,3% der Basen wurden aminiert. Eine Lösung der aminierten DNA (100 µg Gesamt-DNA) in einem 1,5 ml-Plastikzentrifugenröhrchen wurde unter Vakuum eingedampft. Zu dem Rückstand wurden 0,5 ml 3-propansulfonsäure (MOPS)-Puffer und anschließend 100 µl NHS-Koffein (3 mg/ml N,N-Dimethylformamid) gegeben und die Mischung wurde über Nacht bei 25ºC inkubiert. Es wurden 50 µl 3 M Natriumacetat (pH 5,5) und anschließend 1,5 ml eiskaltes Ethanol zugegeben und die Mischung wurde mindestens 2 Stunden bei -20ºC inkubiert. Die Lösung wurde 10 Minuten bei 10000 x g zentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit 0,6 ml eiskaltem Ethanol gewaschen und dann in 100 µl sterilem Wasser gelöst. Es wurden zwei Sephadex G-50 Select D-Chromatographiesäulen (5 Prime T 3 Prime, Inc.) mit einem Bettvolumen von 0,8 ml präpariert. Auf jede Säule wurden 50 µl des gelösten Pellets aufgebracht und es wurde 4 Minuten bei 10000 x g zentrifugiert. 10 µl der gereinigten DNA wurden mit 490 µl 20 mM NaOH verdünnt und zur Abschätzung der DNA-Konzentration wurde die optische Dichte bei 260 nm bestimmt. Die gereinigte DNA wurde mit Wasser auf eine DNA-Arbeitskonzentration von 100 µg/ml verdünnt.

In situ-Hybridisierungsverfahren

Die Koffein-markierte DNA-Sonde wurde durch in situ-Hybridisierung getestet. Die Ziel-DNA bestand aus kultivierten normalen weißen Blutzellen, die in Metaphase stehengeblieben waren. Die Zellen wurden aus einem Abstand von ungefähr drei Fuß auf einen Mikroskopobjektträger fallengelassen, um die Kerne aufzubrechen. Vor der Hybridisierung wurde der Träger bei 70ºC in eine Denaturierungslösung aus 70% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) gegeben. Dann wurde der Träger dehydratisiert, indem er durch 70%ige, 85%ige und 100%ige Ethanollösungen geführt wurde (jeweils 2 min).
Die Hybridisierungsmischung, die auf jeden Träger gegeben wurde, bestand aus 50% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7). Menschliche Plazenta-DNA (2,25 µg/10 µl) wurde als blockierende DNA verwendet. Die Koffein-markierte DNA wurde in einer Konzentration von 10 ng/µl zugegeben. 10 µl der kompletten Hybridisierungsmischung wurden durch 10-minütiges Erhitzen auf 70ºC denaturiert. Die Sonde und die blockierende DNA wurden 60 Minuten bei 37ºC vorhybridisiert. Die Mischung wurde dann auf den Träger aufgebracht, mit einem Abdeckstreifen abgedeckt und mit Kautschukzement versiegelt. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 37ºC in einer Feuchtekammer.
Am nächsten Tag wurde die überschüssige Sonde durch dreimaliges 15- minütiges Waschen des Trägers bei 45ºC in 50% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) und dann durch jeweils 15-minütiges Waschen bei 45ºC in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) und anschließend in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1% NP40-Detergens (Octylphenoxypolyethoxyethanol, ein nichtionisches Tensid, das von Calbiochem, La Jolla, California, vertrieben wird) (PN-Puffer) entfernt. Der Träger wurde zweimal jeweils 2 Minuten bei 25ºC in PN-Puffer gewaschen. Der Träger wurde 20 Minuten bei 25ºC in mit PNM-Puffer 1:250 verdünntem Kaninchen-Anti-Koffein (Western Chemical Research Corporation, Ft. Collins, Co) inkubiert. Der Träger wurde dreimal jeweils 2 Minuten bei 25ºC mit PN-Puffer gewaschen. Dann wurde der Träger 20 Minuten in Meerrettichperoxidase-Anti- Kaninchen-Immunglobulin G (Sigma), 1:250 verdünnt mit PNM-Puffer, inkubiert. Der Träger wurde dreimal jeweils 2 Minuten bei 25ºC mit PN-Puffer gewaschen. Dann wurde der Träger 30 Minuten bei 37ºC in Tetramethylbenzidin (TMB) inkubiert. Der Träger wurde mit destilliertem Wasser gespült, an der Luft getrocknet und unter einem Mikroskop betrachtet.

Ergebnisse der in situ-Hybridisierung

Der Merrettichperoxidase-Marker katalysiert die Umwandlung des TMB- Substrats in einen leuchtend blauen Farbstoff, der unter dem Mikroskop blau-grün erscheint. Nicht-Zielchromosomen erscheinen entweder farblos oder können mit einem Safranin 0-Präparat (Sigma, 0,5% wäßrig) rot gegengefärbt werden. Optische Beschreibung
Code: Spezifität (-) nicht erkennbar, (+) leicht erhöhte Färbung in den Zielchromosomen, (++) vernünftige Spezifität, (+++) gute Spezifität
Intensität: (-) nicht sichtbar, (+) nur unter Phase sichtbar, (++) dunkle Färbung, sichtbar bei Durchstrahlung, (+++) sehr dunkle Färbung, lichtbrechend unter Phase.

Beispiel 7

DNA-Markierung - Theophyllin an Zentromersonde

Die gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 erhaltenen, für menschliches Chromosom 8 spezifischen DNA-Sonden mit einer durchschnittlichen Länge von ungefähr 300 bp wurden durch Bisulfit-katalysierte Transaminierung mit Ethylendiamin wie in Beispiel 2 beschrieben derivatisiert. Ungefähr 3,5% der Basen wurden aminiert. Eine Lösung der aminierten DNA (100 µg Gesamt-DNA) in einem 1,5 ml-Plastikzentrifugenröhrchen wurde unter Vakuum eingedampft. Zu dem Rückstand wurden 0,5 ml 0,2 M 3-propansulfonsäure (MOPS)-Puffer und anschließend 100 µl NHS-Theophyllin (30 mg/ml N,N-Dimethylformamid) gegeben und die Mischung wurde über Nacht bei 25ºC inkubiert. Es wurden 50 µl 3 M Natriumacetat (pH 5,5) und anschließend 1,5 ml eiskaltes Ethanol zugegeben und die Mischung wurde mindestens 2 Stunden bei -20ºC inkubiert. Die Lösung wurde 10 Minuten bei 10000 x g zentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit 0,6 ml eiskaltem Ethanol gewaschen und dann in 100 µl sterilem Wasser gelöst. Es wurden zwei Sephadex G-50 Select D-Chromatographiesäulen (5 Prime 3 Prime, Inc.) mit einem Bettvolumen von 0,8 ml präpariert. Auf jede Säule wurden 50 µl des gelösten Pellets aufgebracht und es wurde 4 Minuten bei 10000 x g zentrifugiert. 10 µl der gereinigten DNA wurden mit 490 µl 20 mM NaOH verdünnt und zur Abschätzung der DNA-Konzentration wurde die optische Dichte bei 260 nm bestimmt. Die gereinigte DNA wurde mit Wasser auf eine DNA-Arbeitskonzentration von 100 µg/ml verdünnt.

In situ-Hybridisierungsverfahren

Die Theophyllin-markierte DNA-Sonde wurde durch in situ-Hybridisierung getestet. Die Ziel-DNA bestand aus kultivierten normalen weißen Blutzellen, die in Metaphase stehengeblieben waren. Die Zellen wurden aus einem Abstand von ungefähr drei Fuß auf einen Mikroskopobjektträger fallengelassen, um die Kerne aufzubrechen. Vor der Hybridisierung wurde der Trager in eine Denaturierungslösung aus 70% Formamid/0,3 M NaCl/30 TNM Natriumcitrat (pH 7) bei 70ºC gegeben. Dann wurde der Träger dehydratisiert, indem er durch 70%ige, 85%ige und 100%ige Ethanollösungen geführt wurde (jeweils 2 min).
Die Hybridisierungsmischung, die auf jeden Träger gegeben wurde, bestand aus 50% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7). Menschliche Plazenta-DNA (2,25 µg/10 µl) wurde als blockierende DNA verwendet. Die Theophyllin-markierte DNA wurde in einer Konzentration von 30 ng/µl zugegeben. 10 µl der kompletten Hybridisierungsmischung wurden durch 10-minütiges Erhitzen bei 70ºC denaturiert. Die Mischung wurde dann auf den Träger aufgebracht, mit einem Abdeckstreifen abgedeckt und mit Kautschukzement versiegelt. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 37ºC in einer Feuchtekammer.
Am nächsten Tag wurde die überschüssige Sonde durch dreimaliges 15- minütiges Waschen des Trägers bei 45ºC in 50% Formamid/0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) und dann durch jeweils 15-minütiges Waschen bei 45ºC in 0,3 M NaCl/30 mM Natriumcitrat (pH 7) und anschließend in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7)/0,1% NP40-Detergens (Octylphenoxypolyethoxyethanol, ein nichtionisches Tensid, das von Calbiochem, La Jolla, California, vertrieben wird) (PN-Puffer) entfernt. Der Träger wurde zweimal jeweils 2 Minuten bei 25ºC in PN-Puffer gewaschen. Der Träger wurde 20 Minuten bei 25ºC in mit PNM-Puffer 1:250 verdünntem Anti-Theophyllin von Kaninchen (Sigma) inkubiert. Der Träger wurde dreimal jeweils 2 Minuten bei 25ºC mit PN-Puffer gewaschen. Dann wurde der Träger 20 Minuten in Meerrettichperoxidase-Anti-Kaninchen-Immunglobulin G (Sigma), 1:250 verdünnt mit PNM-Puffer, inkubiert. Der Träger wurde dreimal jeweils 2 Minuten bei 25ºC mit PN-Puffer gewaschen. Dann wurde der Träger 5 Minuten entsprechend den Herstellerangaben in Tetramethylbenzidin (TMB, Vector Laboratories) inkubiert. Der Träger wurde mit destilliertem Wasser gespült, an der Luft getrocknet und 5 Minuten bei 25ºC in wäßrigem Safranin (0,5% w/v) gegengefärbt.

Quantitative Ergebnisse der in situ-Hybridisierung

Der Merrettichperoxidase-Marker katalysiert die Umwandlung des TMB- Substrats in einen leuchtend blauen Farbstoff. Metaphasechromosomen, die mit der Zentromersonde für Chromosom 8 markiert sind, erscheinen als ein Paar von Chromosomen, die im Zentrum dunkel gefärbt sind. In Interphase-Kernen erscheint die Färbung der Chromosom 8-Zentromeren in Form von diskreten Spots, dunkelblau gegen einen roten Hintergrund. Es ist auch möglich, die "Dots" pro Kern auszuzählen. Zur Demonstration der Genauigkeit und der Spezifität dieses Verfahrens wurden 100 Kerne ausgezählt; für die Spotzahlen wurde die folgende Häufigkeitsverteilung gefunden:

Claims

1. Reagens zum in situ-Nachweis von Nukleinsäuresequenzen, das eine oder mehrerer DNA-Sequenzen umfaßt, die zu der nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär sind, wobei die DNA- Sequenzen kovalent gebunden multiple Xanthin- oder Niederalkyl-substituierte Xanthinderivat-Marker aufweisen.

2. Reagens nach Anspruch 1 zum in situ-Nachweis eines Chromosoms oder einer Chromosomenregion, das multiple DNA-Sequenzen umfaßt, die zu verschiedenen Teilen des nachzuweisenden Chromosoms oder der nachzuweisenden Chromosomenregion komplementär sind, wobei die Marker aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Xanthin, 1-Methylxanthin, 3-Methylxanthin, 7-Methylxanthin, Theophyllin, 1,7-Dimethylxanthin und Koffeinderivaten besteht.

3. Reagens nach Anspruch 1 zum in situ-Nachweis eines Chromosoms oder einer Chromosomenregion, das multiple DNA-Sequenzen umfaßt, die zu verschiedenen Teilen des nachzuweisenden Chromosoms oder der nachzuweisenden Chromosomenregion komplementär sind, wobei die DNA-Sequenzen multiple, kovalent gebundene Marker aufweisen und die Marker eine Theophyllin-8-N-(5-hydroxypentylamino)-O-succinimoyl-Einheit oder eine Koffein-8-N-(5-hydroxypentylamino)-O-succinimoyl-Einheit umfassen, wobei die Anzahl der Marker für einen Nachweis durch immunologische Verfahren ausreicht, während die spezifischen Bindungseigenschaften der DNA gegenüber der oder den nachzuweisenden komplementären Targetsequenz (en) erhalten bleiben.

4. Reagens zum in situ-Nachweis eines Chromosoms oder einer Chromosomenregion, das unhybridisierte DNA-Sequenzen mit zu verschiedenen Teilen des nachzuweisenden Chromosoms oder der nachzuweisenden Chromosomenregion im wesentlichen komplementären Basensequenzen und mit zahlreichen transaminierten Cytosinbasen umfaßt, wobei 1 bis 7% der gesamten Nukleotidreste transaminiert sind und 80 bis 100% der transaminierten Cytosinbasen kovalent gebunden einen Xanthin- oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivat-Marker aufweisen&sub1; wobei die Anzahl der markierten Cytosinbasen für einen Nachweis durch immunologische Verfahren ausreicht, während die spezifischen Bindungseigenschaften des Reagens gegenüber dem nachzuweisenden Chromosom oder der nachzuweisenden Chromosomenregion im wesentlichen erhalten bleiben.

5. Reagens nach den Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, worin die DNA- Sequenzen vor der Markierung aus einer rekombinanten Phagen- Genbank des nachzuweisenden Chromosoms oder der nachzuweisenden Chromosomenregion erhalten sind und diese DNA-Sequenzen eine durchschnittliche Länge von etwa 300 bp haben.

6. Reagens nach den Ansprüchen 1, 2, 3, 4 oder 5, worin etwa 5- 50% der Cytosinstellen in den DNA-Sequenzen durch Bisulfit- katalysierte Transaminierung mit Alkylendiaminen, die 2 bis 10 Kohlenstoffatome besitzen, aminiert sind und worin die Marker kovalent an aminierten Cytosinstellen gebunden sind.

7. Reagens, das DNA umfaßt, in der ein oder mehrere Cytosinbasen durch Bisulfit-katalysierte Transaminierung mit einem Alkylendiamin, das 2 bis 10 Kohlenstoffatome besitzt, vorzugsweise mit Ethylendiamin, transaminiert sind, wobei 1 bis 7% der gesamten Nukleotidreste transaminiert sind und 80 bis 100% der transaminierten Stellen mit einer oder mehreren Theophyllin- oder Koffein-Gruppen umgesetzt sind, vorzugsweise mit Theophyllin-8-N-(5-hydroxypentylamino)-O-succinoyl-O'-(N'-(3-sulfosuccinimidyl))ester oder Koffein-8-N-(5- hydroxypentylamino)-O-succinoyl-O'-(N'-(3-sulfosuccinimidyl))ester, wobei dieses Theophyllin oder Koffein durch immunologische Verfahren nachweisbar ist und die DNA ihre Bindungseigenschaften beibehält.

8. Verfahren zur Herstellung eines Reagens zum in situ-Nachweis eines Chromosoms, das umfaßt:

(a) Spalten von Plasmid-DNA, die DNA enthält, die zu dem nachzuweisenden Chromosom oder der nachzuweisenden Chromosomenregion komplementär ist, in Fragmente mit einer durchschnittlichen Länge von etwa 300 bp,

(b) Transaminieren der DNA-Fragmente durch Bilsulfit-katalysierte Transaminierung mit Ethylendiamin, und

(c) kovalentes Binden eines Xanthin- oder Niederalkylsubstituierten Xanthinderivat-Markers an die transaminierten DNA-Fragmente, wobei die Markierung durch Umsetzung der DNA mit Theophyllin-8-N-(5-hydroxypentylamino)- O-succinoyl-O'-(N'-(3-sulfosuccinimidyl))ester oder Koffein-8-N-(5-hydroxypentylamino)-O-succinoyl-O'-(N'- (3-sulfosuccinimidyl))ester gebildet wird.

9. Verfahren zum in situ-Nachweis eines Chromosoms oder einer Chromosomenregion, das die folgenden Schritte in Kombination umfaßt:

(a) In-Kontakt-bringen des Reagens nach den Ansprüchen 6 oder 7 mit dem nachzuweisenden Chromosom oder der nachzuweisenden Chromosomenregion unter Hybridisierungsbedingungen, und

(b) Nachweis der An- oder Abwesenheit des Xanthin- oder Niederalkyl-substituierten Xanthinderivat-Markers, der von dem mit dem nachzuweisenden Chromosom oder der nachzuweisenden Chromosomenregion hybridisierten Reagens stammt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Reagens durch Zugabe, unter Hybridisierungsbedingungen, eines Überschusses an blockierender DNA zu dem Reagens blockiert wird.

11. Verfahren zur Herstellung eines Reagens zum in situ-Nachweis eines Chromosoms oder einer Chromosomenregion, das umfaßt:

(a) Transaminieren, durch Bisulfit-katalysierte Transaminierung mit Ethylendiamin, einer Anzahl von Cytosinbasen, die in unhybridisierten DNA-Sequenzen mit zu dem nachzuweisenden Chromosom oder der nachzuweisenden Chromosomenregion im wesentlichen komplementären Basensequenzen enthalten sind; und

(b) kovalentes Binden eines Xanthin- oder Niederalkylsubstituierten Xanthinderivat-Markers an wenigstens einen Teil der transaminierten Cytosinbasen, wobei der Anteil der Cytosinbasen mit kovalent gebundenen Markern für einen Nachweis durch immunologische Verfahren ausreicht, während die spezifischen Bindungseigenschaften des Reagens gegenüber dem nachzuweisenden Chromosom oder der nachzuweisenden Chromosomenregion im wesentlichen erhalten bleiben.

12. Verfahren zum Markieren von DNA, das umfaßt: Transaminieren eines oder mehrerer Cytosinreste in der DNA mit einem Alkylendiamin, das 2 bis 9 Kohlenstoffatome besitzt, und Umsetzen der transaminierten DNA mit Theophyllin-8-N- (5-hydroxypentyl- amino)-O-succinoyl-O'-(N'-3-sulfosuccinimidyl))ester oder Koffein-8-N-(5-hydroxypentylamino)-O-succinoyl-O'-(N'-(3- sulfosuccinimidyl))ester.

13. Verbindungen, nämlich Theophyllin-8-N-(5-hydroxypentylamino)- O-succinoyl-O'-(N'-(3-sulfosuccinimidyl))ester und Koffein-8-N-(5-hydroxypentylamino)-O-succinoyl-O'-(N'-(3-sulfosuccinimidyl))ester. FIGUR 1 FIGUR 2 MARKER IM ÜBERSCHUSS; PH 7,4 MOPS-Puffer/über Nacht/RT DURCH TRANSAMINIERUNG MIT ETHYLENDIAMIN MODIFIZIERTE DNA ("AMINIERTE DNA")