DE3446635A1 - Synthese von aminoderivaten von oligonukleotiden - Google Patents

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Synthese von Aminoderivaten von Oligonukleotiden

Beschreibung

Ein Oligonukleotid ist ein kurzes Polymer, bestehend aus einer geraden Sequenz von vier Nukleotiden in einer definierten Ordnung. Die Nukleotiduntereinheiten sind verbunden durch Phosphodiesterbindungen, die die 3¹-Hydroxylgruppe des einen Nukleotids mit der 5'-Hydroxylgruppe des nächsten Nukleotids verbinden. Ein Beispiel eines Oligonukleotids ist 5' ApCpGpTpApTpGpGpCp 3¹. Die Buchstaben A, C, G und T beziehen sich auf die Art der Purin- oder Pyrimidinbase, die an der 1-Position der Desoxyribose gebunden ist. A, Adenin; C, Cytosin; G, Guanin; T Thymidin. P steht für die Phosphodiesterbindung. Die Struktur eines Teils eines Oligonukleotids ist in Fig. 1 gezeigt.

Die einsträngigen Oligonukleotide dieser Erfindung sind weiter dadurch gekennzeichnet, daß sie homogen sind im Hinblick auf die Sequenz der Nukleosiduntereinheiten und ein einheitliches Molekulargewicht haben.

Synthetische Oligonukleotide sind leistungsfähige Hilfsmittel in der modernen Molekularbiologie und bei der rekombinierenden DNA-Arbeit. Es gibt verschiedene Anwendungen für diese Moleküle, eingeschlossen a) als Sonden für die Isolierung spezifischer Gen·, basierend auf der Proteinsequenz des Genprodukts, b) um die in vitro Mutagenese eines gewünschten Gens zu lenken, c) als Primer für die DNA-Synthese einer einsträngigen Schablone, d) als Schritte in der Totalsynthese von Genen und viele mehr, die in Wm. R. Bahl et al, Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol., 21, 101 (1978) zusammengefaßt sind.

Sehr beträchtliche Anstrengungen wurden deshalb der Entwicklung wirkungsvoller chemischer Methoden für die Synthese dieser Oligonukleotide gewidmet. Eine kurze Übersicht dieser Methoden, wie sie entwickelt wurden bis zur Gegenwart, ist zu finden bei Crocket, G.C., Aldrichimica Acta 16(3), 47-55 (1983). Die beste Methodenlehre, die derzeit erhältlich ist, verwendet Phosphoramididderivate der Nukleoside in kombination mit einem Festphasensyntheseverfahren, Matteucci et al, J. Am. Chem. Soc., 103, 3185 (1981); und Beaucage et al, M. H. Tet. Lett., 22(20), 1858-1862 (1981). Oligonukleotide mit einer Länge von bis zu 30 Basen können routinemäßig hergestellt werden in dieser Hinsicht und Moleküle mit bis zu 50 Basen wurden schon hergestellt. Apparate, die diese Technologie anwenden, sind nun im Handel erhältlich.

Es gibt andere Berichte in der Literatur der Derivatisierung der DNA. Ein modifiziertes Nukleosidtriphosphat wurde entwickelt, worin eine Biotingruppe konjugiert ist an eine aliphatische Aminogruppe an der 5-Position von Uracil, Langer et al, Proc. Nat. Acad. Sei., U.S.A., 78, 6633-6637 (1981). Dieses Nukleosidderivat wurde tatsächlich in eine doppelsträngige DNA eingebracht. Wenn es einmal in der DNA ist, kann es durch Antibiotin-Antikörper gebunden werden, die dann verwendet werden können für die Detektion durch Fluoreszenz oder enzymatische Methoden. Die DNA, die das Biotin-konjugierte Nukleosid inkorporiert hatte durch die Methode von Langer et al wurde fragmentiert in kleinere Einzel- und Doppelstrangstücke, die heterogen sind im Hinblick auf die Sequenz der Nukleosiduntereinheiten und verschieden im Molekulargewicht. Draper und Gold, Biochemistry, 19, 1774-1781 (1980) berichteten über die Einführung von

aliphatischen Aminogruppen durch eine bisulfitkatalysierte Transaminierungsreaktion und die nachfolgende Reaktion mit einem Fluoreszenzmarker. Bei Draper und Gold ist die Aminogruppe direkt an eine Pyrimidinbase gebunden. Die Aminogruppe, die so angebracht ist, inhibiert Wasserstoffbrücken und aus diesem Grunde sind diese Materialien nicht geeignet für Hybridisierung und ähnliches. Chu et al, Nucleic Acid Res. 11(18), 6513-6529 (1983) haben eine Methode berichtet für die Bindung eines Amins an das terminale 5'-Phosphat der Oligonukleotide oder Nukleinsäuren.

Es gibt viele Gründe, eine Methode wünschenswert erscheinen zu lassen, für die kovalente Bindung anderer chemischer Gattungen an synthetische Oligonukleotide. Fluoreszenzfarben, die an Oligonukleotide gebunden sind, erlauben es, Radioisotope aus der Forschung und diagnostischen und klinischen Verfahren zu eliminieren, in denen sie verwendet werden und verbessern die Lebensdauer und die Verfügbarkeit. Wie in der Parallelanmeldung für eine DNA-Sequenzierungsvorrichtung erlaubt die Synthese von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden die Automatisierung des DNA-Sequenzierungsverfahrens. Die Entwicklung geeigneter Techniken und Instrumente für die Detektion und die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden erlaubt die Automation anderer, jetzt schwieriger Labor- und klinischer Techniken. Die Bindung von DNA-Spaltungschemikalien wie die, die bei Schultz et al, J. Am. Chem. Soc, 104, 6861 (1982; und Hertzberg et al, J. Am. Chem. Soc, 104, 313 (1982) offenbart sind, erlauben die Bildung von synthetischen Restriktionsenzymen, deren Spezifität durch die Oligonukleotidsequenz gelenkt wird.

Die vorliegende Erfindung offenbart eine allgemeine Methode für die Einführung einer freien aliphatischen Aminogruppe(n) in synthetische Oligonukleotide. Diese Aminogruppe reagiert schnell und spezifisch mit einer Vielzahl von aminoreaktiven Funktionen und erlaubt dadurch die kovalente Bindung einer weiten Vielzahl von chemischen Gattungen.

Die vorliegende Erfindung umfaßt neue aliphatische aminoderivatisierte einsträngige Oligonukleotide, die konjugiert sind mit einem detektierbaren Anteil, der ein Chromophor, ein fluoreszierendes Mittel, ein Protein, ein Enzym oder ein anderer Marker ist.

Diese Erfindung schließt weiterhin neue Oligonukleotide ein, die mindestens ein aminoderivatisiertes Nukleosid über einen Phosphoramidit-Vorläufer eingesetzt haben.

In anderer Hinsicht umfaßt diese Erfindung die Synthese von Oligonukleotiden auf einem Festphasenträger, wobei das Oligonukleotid umgesetzt wird mit einem geschützten aminoderivatisierten Nukleosxdphosphoramidit.

Die Erfindung ist in einer bestimmten Hinsicht das synthetisierte Molekül 5'-Trifluoracetamido 5'-Desoxy 3'-N,N-Diisopropylphosphoramidothymidin (Figur 2) und seine Addition an das 5'-Ende als letzter Addition der Festphasenoligonukleotidsynthese. Während der Spaltung und der Schutzgruppenabspaltung des Oligonukleotids wird die Trifluoracetylgruppe hydrolysiert, wobei eine freie aliphatische Aminogruppe am 5'-Ende des Oligonukleotids zurückbleibt. Dieses aminoderivatisierte Oligonukleotid kann dann umgesetzt werden mit einer

Vielzahl von arainoreaktiven Molekülen, um die entsprechenden Oligonukleotidderivate zu ergeben. Dies ist ein Spezialfall der allgemeineneren Lösung, ein modifiziertes Nukleotid zu verwenden, das eine geschützte aliphatische Aminogruppe an dem Basenanteil eher als an dem 5'-Kohlenstoff hat. Ein derartiges Molekül erlaubt es, verschiedene freie Aminogruppen in dem Oligonukleotid anzubringen und an jeder gewünschten Position in der Oligonukleotidsequenz.

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, neue Reagenzien und Techniken zu schaffen, die anwendbar sind für die DNA-' Sequenzierung.

Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung, Verbesserungen bei der DNA-Hybridisierung für die Detektion von genetischen Krankheiten und für andere Zwecke zu schaffen.

Diese und andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden durch die folgende Beschreibung offenbart werden.

Die Strategie, die verwendet wird, um aliphatische Aminogruppen in ein Oligonukleotid einzuführen ist, ein 3 -Phosphoramidxtderivat eines Nukleosidanalogen zu synthetisieren, das eine geschützte aliphatische Aminogruppe enthält. Dieser Phosphoramidit kann dann umgesetzt werden mit dem Oligonukleotid, das synthetisiert wird auf einem festen Träger in einer Art, die analog ist zu der Reaktion des underivatisierten Nukleosidphosphoramitids. Die Spaltung von der festen Phase und die Abspaltung der Schutzgruppe der Basenanteile und der aliphatischen Aminogruppe ergibt das aminoderivatisierte Oligonukleotid.

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Beispiel

Synthese von VI. In Figur 3 wird die Synthese der Verbindung VI aus der im Handel erhältlichen Verbindung I (Thymidin) gezeigt. Die Synthese der Verbindungen II bis IV ist offenbart in Horowit et al, J. Org. Chem., 27, 3045-3048 (1962); und Gibbs and Orgel, J. Carbohydrates-Nucleosides and Nucleotides, 3(5 und 6), 315-334 (1976). Die Synthese der Verbindungen V und VI ist die folgende.

Beispiel 2

5'-Trifluoracetamido-S'-Desoxythymidin (V): 1,25 g (5 mmol) 5'-Amino 5'Desoxythymidin wurden aufgelöst in 25 ml trockenem Dimethylformamid. Dazu wurden 1,3 ml (10 mmol) S-Ethyltrifluorthioacetat (Aldrich) gegeben. Die Reaktion wurde leicht bei Raumtemperatur gerührt. TLC der Reaktionsmischung auf Silica Gel F-254 Platten in MeOH:Aceton 1:1 zeigte einen einzigen Punkt des Produkts, detektiert durch Kurzwellen-UV. Das Produkt hatte eine hohe Mobilität in diesem Lösungsmittelsystem im Gegensatz zu der Ausgangsverbindung VI, die tatsächlich immobil ist.

Die Reaktionsmischung wurde rotationsabgedampft zur Trockene unter reduziertem Druck, in einen Erlenmeyer Kolben in 30 ml Isopropanol überführt und rekristallisiert aus kochendem Isopropanol:MeOH. Ausbeute = 1,315 g (3,9 mmol, 80 % Ausbeute), Schmelzpunkt 261° bis 262° (dec), Analyse berechnet: C, 42,7 %, H, 4,18 %; N 12,5 %; gefunden: C 42,7 %, H 4,16 %; N 12,4 %. Die Struktur von V wurde weiter bestätigt durch ¹H NMR.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung eines geschützten aminoderivatisierten Nukleotidphosphoraraidits.

5'Trifluoracetamido 5·-Desoxy 3'-N,N-diisopropyl-phosphoramidothymidin (VI): Alle Glaswaren, Spritzen und Kapillarröhrchen, die bei dieser Reaktion verwendet wurden, wurden über Nacht in einem Trockenofen getrocknet. Dimethylformamid (DMF) wurde über einem 4-X-MoIekularsieb (Linde) aufbewahrt. Diisopropylethylamin (DIPEA) wurde aus Natriumhydroxid destilliert, dann aus Kalziumhydrid und über einem 4-A-Molekularsieb aufbewahrt .

Zu einem trockenen 50-ml-Dreihals-Rundkolben mit Rührfisch wurden 63 mg (0,19 mmol) V zugegeben. Die Dreihälse wurden mit Gummiserumstopfen verstopft und Nadeln wurden in die Stopfen eingeführt. Der Kolben wurde für mehrere Stunden in einem Dessikkator über trockenem CaCIp ausgepumpt. Der Kolben wurde unter einem leichten Strom von trockenem Stickstoffgas gehalten und 2ml trockenes DMF wurden durch eine Spritze zugegeben. 60 μΐ DIPEA (0,34 mmol) wurden zugegeben in einem trockenen 100 μΐ Kapillarröhrchen. 40 μΐ Chlor-N,N-diisopropylamino-methoxyphosphin (American Bionuclear, Emeryville, CA) wurden zugegeben (in einem trockenen 100 μΐ Kapillarröhrchen). Die Reaktion wurde leicht gerührt, bis alle Ausgangsmaterialien gelöst waren und dann absetzen gelassen bei Raumtemperatur (immer unter N₂). Ein TLC nach einer Stunde auf Silikagel F-254 Platten in HCCl₃IEtOHrEt₃N 88:10:2 zeigte einen einzigen Punkt des Produkts von weitaus größerer Mobilität

als das Ausgangsmaterial V. Versuche, dieses Produkt zu reinigen in einer Art ähnlich der, beschrieben für das Nukleosidphosphoramidit (4) waren nicht erfolgreich wegen des Abbaues des Produkts. Deshalb wurde die rohe Reaktionsmischung direkt verwendet für das Ankuppeln an das synthetische Oligonukleotid an dem Festphasenträger. Die Struktur von VI wird entnommen aus der Reaktivität dieses Produkts in der Addition des Oligonukleotids und aus dem erwarteten Produkt der Reaktion, basierend auf den Literaturergebnissen.

Beispiel 4

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung eines Oligonukleotids, das am 5'-Ende über eine Phosphodiesterbindung an die 3 *-Hydroxylgruppe des 5'-Amino 5'-Desoxythymidins gebunden ist.

Addition von VI an das 5'-Ende eines Oligonukleotids; Ein basengeschütztes synthetisches Oligonukleotid der Sequenz 5¹OH-AGC ACT TTT AGA GT 3¹ gebunden an die Festphase an dem 3'-Ende wurde hergestellt durch Verfahren, die im Detail beschrieben sind in dem Protokoll mit dem Titel "A Procedure for the Manual Synthesis of Deoxyolxgonucleotides using dimethoxytrityl nucleoside phosphoramidites on a Solid Support", herausgegeben von Applied Biosystems, Inc., Foster City, California. Die Unterschiede für die Reaktion des Oligonukleotids mit VI waren a) statt der Schritte 4.22 und 4.23 wird 1 ml der frisch hergestellten Reaktionsmischung, die VI enthält, mit 1 ml 0,5 M Tetrazol in Acetonitril kombiniert und zugegeben zu dem Reaktionsgefäß; b) nach dem

At

Schritt 4.33 gibt es zwei 30 Sekunden Waschschritte mit Acetonitril; und c) die VerschlußSektion 5 wird ausgelassen (um für den Versuch unreagierte Hydroxylgruppen in einer folgenden Addition zu lassen).

Die Wirksamkeit der Kupplungsreaktion wird leicht überwacht durch nachfolgendes Kuppeln mit einem "normalen" Phosphoramidit und Spaltung der Dimethoxytritylgruppe, um einen Farbnachweis zu ergeben. Wenn die 5'-Hydroxylgruppen des Oligonukleotids bei dem ersten Kuppeln mit VI reagierten, sind sie nicht mehr erhältlich für die Reaktion beim nachfolgenden Kuppeln und daher wird wenig Farbe frei bei der DCA-Behandlung, die der zweiten Kupplung folgt. Bei diesem Beispiel wurden OD₄₅₀=I.12 (nach Verdünnung) für die DMT-Gruppe frei aus dem Oligonukleotid vor der Reaktion mit VI. OD₄₅₀=O.026 (nach Verdünnung) für das DMT wurden aus einem G-Rest frei, der nachfolgend zu der Reaktion mit VI zugegeben wurde. Daher wurden 98 % der 5'OH-Gruppen durch die Reaktion mit VI blockiert. Bei dem Oligonukleotid wurden die Schutzgruppen abgespalten und es wurde von der Festphase gespalten durch Behandlung mit Thiophenol und konzentriertem NH₄OH in üblicher Art und Weise und das NH₄OH wurde unter vermindertem Druck entfernt. Das Oligonukleotid wurde aufgelöst in 1 ml destilliertem H₂O. Das OD96O ^{war 12}^ ^von dieser Lösung, was anzeigte, daß die Konzentration an DNA 4,5 mg/ml war. 50 μΐ dieser Lösung wurden verdünnt auf 1 ml mit H„O und 15 Minuten gemischt mit 100 mg AG50W-X4 (Natriumform) Ionenaustauscherharz, um das DNA von dem Ammoniumsalz in das Natriumsalz umzuwandeln (die Ammoniumionen stören den nachfolgenden Ninhydrintest). Das Harz wurde durch Zentrifugation entfernt, und der überstand wurde in einem Savant-Rotationskonzentrator getrocknet. Der

quantitative Ninhydrinnachweis (Sarin, V. K., et al, Anal. Biochem. JLT7, 147-157 (1981)) ergab ungefähr 1 Mol Aminogruppe pro Mol Oligonukleotid (die molare Konzentration an Oligonukleotid wurde bestimmt aus einem berechneten Extinktionskoeffizienten E~_cn = 1.55 χ 10 , bezogen auf die Nukleotidzusammensetzung). Ein Ninhydrinnachweis derselben molaren Menge eines Kontrolloligonukleotids, mit dem kein VI konjugiert worden war, ergab keine aminopositive Reaktion.

Beispiel 5

Konjugation mit dem Farbstoff: Zu 100 μΐ der obigen Lösung des Aminooligonukleotids wurden 200 μΐ H₂O, 50 μΐ IM Carbonat/Bicarbonatpuffer mit pH 9,0 und 25 μΐ frisch hergestelltes 10 mg/ml Fluoresceinisothiocyanat (FITC) (Molekularsonden, Inc., Junction City, Oregon) in Dimethylsulfoxid zugegeben. Die Mischung wurde mehrere Stunden bei Raumtemperatur belassen und gereinigt durch Chromatographie auf einer Säule (1 cm χ 9 cm) Sephadex G-25 in Wasser. Das gelbe Produkt wurde eluiert in das ausgeschiedene Volumen und wurde sauber getrennt von unreagiertem Farbstoff. Eine Kontrollreaktion mit Oligonukleotid, mit dem kein VI umgesetzt worden war, ergab wenig oder keine Farbe in dem ausgeschiedenen Volumen der Säule, was anzeigte, daß der Farbstoff tatsächlich mit der zugegebenen Aminogruppe reagiert hatte. Das Farbstoff-Oligonukleotid-Konjugat hatte OD₂₆₀ =2,3, OD₄₉₅ = 0,54. Bezogen auf E₄₉₅ 7 χ 10 für FITC ergibt dies eine 7,7 μΜ Lösung des Farbstoffs. Bezogen auf E₃₆₀ = 1,55 χ 10⁵ ist das DNA 12,8 μΜ. Daher waren ungefähr 60 % der DNA-Moleküle mit Farbstoff markiert. Dies ist eine grobe Schätzung, die nicht

Änderungen in der Absorption von gebundenem Fluoreszein relativ zu ungebundenem berücksichtigt, noch kontaminierende kürzere und nichtreaktive Oligonukleotide. Ein Aliquot dieser gefärbten DNA wurde einer Elektrophorese auf einem 20 % Polyacrylamidgel unterzogen und war leicht sichtbar als einzelne gefärbte (und fluoreszieren de) Bande einer Mobilität, die für ein Oligonukleotid dieser Länge angemessen war.

Das farbstoffkonjugierte Oligonukleotid wurde leicht gereinigt durch Hochdruckflüssig-Chromatographie (HPLC) auf einer Reverse-phase-C. _o Säule (Waters) unter Verwendung eines Acetonitril:0,1 M Triethylammoniumacetat pH 7 Gradienten für die Elution.

Es gibt viele mögliche Anwendungen der neuen aminoderivatisierten Oligonukleotide, die oben offenbart worden sind. Die aliphatische Aminogruppe reagiert leicht und spezifisch mit einer großen Anzahl von funktionellen Gruppen. Dies bedeutet, daß tatsächlich jedes gewünschte Molekül an ein Oligonukleotid, das hergestellt ist, wie oben beschrieben, gebunden werden kann. Dies schließt Enzyme, andere Proteine, Fluoreszenzmarker, Biolumineszenzmarker, Chromophore usw. ein. Oligonukleotide wurden weithin benutzt in einer Vielzahl von Gebieten, oft in Verbindung mit Radiomarkern. Es wird nun möglich sein, nicht radioaktive Testmoleküle gegen radioaktive Marker auszutauschen. Dies macht Verfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden billiger und leichter verwendbar und kompatibel mit der klinischen Ausstattung. Obwohl Radiomarker weniger bevorzugt sind, können die neuen aminoderivatisierten Oligonukleotide auch radio-

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markiert werden, z. B. mit J . Die folgenden drei speziellen Beispiele für Verwendungen der neuen aminoderivatisierten Oligonukleotide sind nur beispielhaft:

1. Automatisierte DNA-Sequenzierung.

2. Detektion genetischer Krankheit durch DNA-Hybridisierung.

3. Allgemeine Verwendung der Fluoreszenz für die Detektion der Hybridisierung.

Detektion genetischer Abnormalitäten: Oligonukleotide können verwendet werden, um den Genotyp von Individuen zu bestimmen. Dies wird bei DNA-Proben durchgeführt, die vom Fötus durch Amniozentese erhalten werden. Diese Information ist unschätzbar für die genetische Beratung von Paaren mit einem Risiko für eine Vielzahl von genetischen Krankheiten. Der Genotypus von Erwachsenen kann auch bestimmt werden und erlaubt eine effektive Diagnose und Behandlung in einem frühen Stadium. Ein treffendes Beispiel dieser Technologie ist für die Detektion von Sichelzellenanämie, Connor et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 278 (1983). 19 Basenpaare lange synthetische Oligonukleotide wurden synthetisiert, eines komplementär zu dem normalen Human-ß-Globingen (ß ) und eines

komplementär zu dem Sichelzellen-ß-Globingen (ß ). Diese Moleküle werden radioaktiv markiert und verwendet als Tests bei der DNA-Hybridisierung. Unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen können diese Proben verwendet

A S

werden, um das β -Gen von dem β -Allel zu unterscheiden.

Dies erlaubt die Diagnose der Sichelzellenkrankheit. Allgemeiner, wie in Connor et al ausgeführt, "schafft dieses allelspezifische Hybridisierungsverhalten der Oligonukleotide eine allgemeine Methode für die Diagnose jeglicher genetischer Krankheit, die eine Punktmutation in der DNA-Sequenz eines single-copy-Gens enthält." Die vorliegende Erfindung ist direkt anwendbar für diese Technik. Die Oligonukleotidproben werden hergestellt

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mit einer Aminogruppe und markiert mit einem Fluoreszenzmarker. Das Fluoreszenzprobenmolekül ist unbegrenzt stabil im Gegensatz zu der kurzen Lebensdauer radioaktiver Proben und erfordert keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen für die Verwendung oder Behandlung. Dies bedeutet eine Methode, die äußerst bevorzugt ist für die Verwendung im klinischen Einsatz, der das Hauptgebiet ist, in dem die Technologie verwendet werden wird.

Oligonukleotidproben werden weithin verwendet in der Forschungsarbeit ebenso wie bei der klinischen Arbeit. Sie werden allgemein verwendet, um ein Stück DNA zu ermitteln und eine gewünschte Sequenz in einer "Bibliothek", einer Sammlung von DNA-Fragmenten, die in ein Plasmid oder einen Farbenvektor geklont werden, der Sequenzen enthält, die das gesamte Genom (oder expressed RNA) oder eines Organismus enthalten. Sie werden auch verwendet, um DNA einer gegebenen Sequenz in einem "Fleck" einer Restriktionsauswahl eines bestimmten Stückes DNA zu hybridisieren. In all diesen Beispielen, ebenso wie in anderen, wird das Oligonukleotid markiert mit ³²P, gewöhnlich am 5'-Ende, und die Moleküle werden durch Autoradiographie detektiert. Die vorliegende Erfindung beschreibt die Markierung von Oligonukleotiden mit Fluoreszenzfarbstoffen. Deshalb kann die Fluoreszenz verwendet werden für die Detektion der Moleküle in jeder der Techniken, in denen Radioaktivität in üblicher Weise verwendet wurde. Dies bietet verschiedene Vorteile gegenüber der Radioaktivität wie Stabilität der Testproben, Kosten und Leichtigkeit der Verwendung und Beseitigung.

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Claims (1)

1. Pate ntansprüche

   1. Zusammensetzung umfassend aliphatische aminoderivatisierte einsträngige Oligonukleotide, konjugiert an einen detektierbaren Anteil.

   2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der detektierbare Anteil fluoreszierend ist. .

   3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der detektierbare Anteil absorbierend oder gefärbt ist.

   4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der detektierbare Anteil ein Protein ist.

   5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der detektierbare Anteil ein Enzym ist.

   6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch

   gekennzeichnet , daß der detek-

   125 tierbare Anteil radioaktives -J ist.

   7. Neue Zusammensetzung, bei der ein Oligonukleotid mindestens ein aminoderivatisiertes Nukleosid über einen Phosphoramidit-Vorläufer eingesetzt hat.

   ( 8J Synthese von Oligonukleotiden auf einem Festphasenträger, dadurch gekennzeichnet , daß das Oligonukleotid umgesetzt wird mit einem geschützten aminoderivatisierten Nukleosidphosphoramidit.

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   9. Oligonukleotid, gekuppelt am 5'-Ende über eine Phosphodiesterbindung an die 3'-Hydroxylgruppe von 5'-Amino 5'-Desoxythymidin.

   10. Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung von Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß 5'-Amino 5'-Desoxythymidin mit einer Schutzgruppe umgesetzt wird, um 5'-Trifluoracetamido-5'-Desoxythymidin zu ergeben, das dann mit einem Phosphin umgesetzt wird, um das entsprechende Phosphoramidit zu ergeben, und daß das Phosphoramidit anschließend mit einem basegeschützten Oligonukleotid, das an einen Festphasenträger gebunden ist, umgesetzt wird.

   11. Geschützte, aminoderivatisierte Nukleosidphosphoramidite.

   12. Phosphoramidit, erhalten durch Reaktion des 5¹-Trifluoracetamido-5'-desoxythymidin mit einem Phosphin.