JPS60197698A - アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成 - Google Patents
アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成Info
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- JPS60197698A JPS60197698A JP59266525A JP26652584A JPS60197698A JP S60197698 A JPS60197698 A JP S60197698A JP 59266525 A JP59266525 A JP 59266525A JP 26652584 A JP26652584 A JP 26652584A JP S60197698 A JPS60197698 A JP S60197698A
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- oligonucleotides
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、脂肪族アミノ基を有するオリゴヌクレオチド
を含有する組成物及びその製造方法に関するものである
。
を含有する組成物及びその製造方法に関するものである
。
従来の技術
オリゴヌクレオチドは、所定順序における4個のヌクレ
オチドの線状配列よりなる短鎖重合体である。ヌクレオ
チドのサブユニットはホスホジエステル結合により結合
されて、1個のヌクレオチドの5′ ヒドロキシル部分
を次のヌクレオチドの5′ヒドロキシ部分に結合させる
。オリゴヌクレオチドの例は5’ ApCpGpTpA
pTpGpGpCp31である。記号A、C,G及びT
aデオキシリボースの1−位置に結合されたプリン着し
くけピリミジン塩基の特性を意味する。すなわちAはア
デニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミジンで
ある。記号Pはホスホジエステル結合を示す。オリゴヌ
クレオチドの部分構造を第1図に示す。
オチドの線状配列よりなる短鎖重合体である。ヌクレオ
チドのサブユニットはホスホジエステル結合により結合
されて、1個のヌクレオチドの5′ ヒドロキシル部分
を次のヌクレオチドの5′ヒドロキシ部分に結合させる
。オリゴヌクレオチドの例は5’ ApCpGpTpA
pTpGpGpCp31である。記号A、C,G及びT
aデオキシリボースの1−位置に結合されたプリン着し
くけピリミジン塩基の特性を意味する。すなわちAはア
デニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミジンで
ある。記号Pはホスホジエステル結合を示す。オリゴヌ
クレオチドの部分構造を第1図に示す。
本発明の単一鎖オリゴヌクレオチドは、さらにヌクレオ
シドサブユニットの配列に関しホモジニアスであること
を特徴とし、さらに均一な分子量を有する。
シドサブユニットの配列に関しホモジニアスであること
を特徴とし、さらに均一な分子量を有する。
合成オリゴヌクレオチドは、最近の分子生物学及び組換
DNA技術における強力々武器である。
DNA技術における強力々武器である。
これらの分子に対する用途社多く、たとえば(a)遺伝
子の蛋白配列に基づく特性遺伝子の単離のための試料と
して、(b)所望の遺伝子の試験管内突然変異を指令す
るため、(e)単一鎖雛型に対するDNA合成のプライ
マーとして、(d)3R伝子の全合成における手順とし
てなど多くの用途が含まれ、これらについてはダプリュ
エム・アール・バール(W’m。
子の蛋白配列に基づく特性遺伝子の単離のための試料と
して、(b)所望の遺伝子の試験管内突然変異を指令す
るため、(e)単一鎖雛型に対するDNA合成のプライ
マーとして、(d)3R伝子の全合成における手順とし
てなど多くの用途が含まれ、これらについてはダプリュ
エム・アール・バール(W’m。
R,Bahl )等、プログレッシブ・ヌクレイツク・
アシッド・リサーチ・モレキュラ・バイオロジー、第2
1巻、第、101頁(197B)を参照するととができ
る。
アシッド・リサーチ・モレキュラ・バイオロジー、第2
1巻、第、101頁(197B)を参照するととができ
る。
したがって、この種のオリゴヌクレオチドの効率的な化
学合成法を開発するため極めて多くの努力が払われてい
る。現在まで開発されているこれら方法の簡単な説明は
ジー・シー・クロケラト(Crockett、 G、
C,)、アルドリヒミカ・アクタ、第16(31巻、第
47−55頁(1983)に見られる。現在使用し得る
最良の方法は、ヌクレオシ・ドのホスホルアミダイ)B
導体を同相合成法と組み合せて利用する〔マチラッチ尋
、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティー、
第103巻、第6185頁(1981)及びポーケージ
等、M、 H,テトラヘドロン・レター、第22 (2
0)巻、第1858−1862頁(1981))。30
個までの塩基の長さよりガるオリゴヌクレオチドはこの
ような常法にしたがって作成することができ、50個塩
基の程度の長さの分子も作成されている。
学合成法を開発するため極めて多くの努力が払われてい
る。現在まで開発されているこれら方法の簡単な説明は
ジー・シー・クロケラト(Crockett、 G、
C,)、アルドリヒミカ・アクタ、第16(31巻、第
47−55頁(1983)に見られる。現在使用し得る
最良の方法は、ヌクレオシ・ドのホスホルアミダイ)B
導体を同相合成法と組み合せて利用する〔マチラッチ尋
、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティー、
第103巻、第6185頁(1981)及びポーケージ
等、M、 H,テトラヘドロン・レター、第22 (2
0)巻、第1858−1862頁(1981))。30
個までの塩基の長さよりガるオリゴヌクレオチドはこの
ような常法にしたがって作成することができ、50個塩
基の程度の長さの分子も作成されている。
この技術を使用する装置も現在市販されている。
DNAの誘導体化に関する他の報告も文献に見られる。
改変ヌクレオシド三燐酸が開発されており、ここでビオ
チン基はウラシルの5位置における脂肪族アミノ基に結
合されている[ランガー等、グロシーデイング・ナショ
ナル・アカデミ−・サイエンス、U、 S、 A、第7
8巻、第6655−6657頁(1981)]。このヌ
クレオチド訪導体は二重鎖DNA中に効果的に組み込ま
れる。DNAに組み込まれると、゛これは抗ビオチン抗
体により結合され、次いでこれを螢光法又は酵素法によ
り検出するために使用することができる。ランガー等の
方法により組み込まれたピオチン結合ヌクレオシドを有
するDNAはより小さい単−鎖及び二重鎖のものに断片
化され、これらは又クレオシドサブユニットの配列に対
しヘテロジニアスであって、分子量が異なっている。ト
レーパー及びゴールド〔バイオケミストリー、第19巻
、第1774−1781頁(1980)は、重亜硫酸塩
で触媒されたアミン変換反応及びその後の螢光性標識と
の反応による脂肪族アミノ基の導入を報告している。
チン基はウラシルの5位置における脂肪族アミノ基に結
合されている[ランガー等、グロシーデイング・ナショ
ナル・アカデミ−・サイエンス、U、 S、 A、第7
8巻、第6655−6657頁(1981)]。このヌ
クレオチド訪導体は二重鎖DNA中に効果的に組み込ま
れる。DNAに組み込まれると、゛これは抗ビオチン抗
体により結合され、次いでこれを螢光法又は酵素法によ
り検出するために使用することができる。ランガー等の
方法により組み込まれたピオチン結合ヌクレオシドを有
するDNAはより小さい単−鎖及び二重鎖のものに断片
化され、これらは又クレオシドサブユニットの配列に対
しヘテロジニアスであって、分子量が異なっている。ト
レーパー及びゴールド〔バイオケミストリー、第19巻
、第1774−1781頁(1980)は、重亜硫酸塩
で触媒されたアミン変換反応及びその後の螢光性標識と
の反応による脂肪族アミノ基の導入を報告している。
トレーパー及びゴールドの報告においては、アミノ基を
ピリミジン塩基に直接結合させる。このように結合した
アミノ基は水素結合を抑制し、この理由でこれら物質は
ハイブリッド化などに有用でない。チュー等〔ヌクレイ
ツク・アシッド・リサーチ、第11 (18)巻、第6
515−6529頁、(1983)〕は、アミンをオリ
ゴヌクレオチド又唸核酸の末端51燐酸塩に結合させる
方法を報告している。
ピリミジン塩基に直接結合させる。このように結合した
アミノ基は水素結合を抑制し、この理由でこれら物質は
ハイブリッド化などに有用でない。チュー等〔ヌクレイ
ツク・アシッド・リサーチ、第11 (18)巻、第6
515−6529頁、(1983)〕は、アミンをオリ
ゴヌクレオチド又唸核酸の末端51燐酸塩に結合させる
方法を報告している。
多くの理由で他の化学物質を合成オリゴヌクレオチドに
共有結合させる方法が望まれている。オリゴヌクレオチ
ドに結合された螢光染料は、放射性同位元素をこれらが
使用される研究、診断及び臨床法から排除することを可
能にし、かつ使用寿命及び入手性を向上させる。DNA
配列決定装置のための本出願人による特許出MK記賊し
たように、螢光標識したオリゴヌクレオチドの合成はD
NA配列決定法の自動化を可能にする。適当な技術の開
発及び螢光標識したオリゴヌクレオチドの検出及び使用
に対する装置化は、現在&Thlな他の実験的及び臨床
的技術の自動化を可能にする。
共有結合させる方法が望まれている。オリゴヌクレオチ
ドに結合された螢光染料は、放射性同位元素をこれらが
使用される研究、診断及び臨床法から排除することを可
能にし、かつ使用寿命及び入手性を向上させる。DNA
配列決定装置のための本出願人による特許出MK記賊し
たように、螢光標識したオリゴヌクレオチドの合成はD
NA配列決定法の自動化を可能にする。適当な技術の開
発及び螢光標識したオリゴヌクレオチドの検出及び使用
に対する装置化は、現在&Thlな他の実験的及び臨床
的技術の自動化を可能にする。
たとえばシュルツ(5chultz )等によりジャー
ナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティー、第104
巻、第6861頁(1982)に開示されたもの及びヘ
ルツベルク(Hertzberg )等によりジャナル
−アメリカン・ケミカル・ソサエティー、第104巻、
第313頁(“L982 )に開示されたようなりNA
開製薬器の結合は合成制限酵素の作成を可能にし、その
特異性はオリゴヌクレオチド配列により指令される。
ナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティー、第104
巻、第6861頁(1982)に開示されたもの及びヘ
ルツベルク(Hertzberg )等によりジャナル
−アメリカン・ケミカル・ソサエティー、第104巻、
第313頁(“L982 )に開示されたようなりNA
開製薬器の結合は合成制限酵素の作成を可能にし、その
特異性はオリゴヌクレオチド配列により指令される。
発明が解決しようとする問題点
本発明は、遊離脂肪族アミノ基を合成オリゴヌクレオチ
ドに導入する一般的方法を提供する。このアミノ基は各
種のアミノ反応性官能基と容易かつ特異的に反応し、そ
れKより広範な種類の化学物質の共有結合を可能にする
。
ドに導入する一般的方法を提供する。このアミノ基は各
種のアミノ反応性官能基と容易かつ特異的に反応し、そ
れKより広範な種類の化学物質の共有結合を可能にする
。
問題点を解決するための手段
要するに、本発明は、検出可能な成分に結合された新規
な脂肪族アミノ誘導化単一鎖オリゴヌクレオチドからな
り、検出可能な成分は発色団、振光剤、蛋白質、酵素な
どの「標識」である。
な脂肪族アミノ誘導化単一鎖オリゴヌクレオチドからな
り、検出可能な成分は発色団、振光剤、蛋白質、酵素な
どの「標識」である。
さらに、本発明はホスホルアミダイト先駆体を介して少
なくとも1釉のアミノ誘導化ヌクレオシドを挿入した新
規なオリゴヌクレオチドをも包含する。
なくとも1釉のアミノ誘導化ヌクレオシドを挿入した新
規なオリゴヌクレオチドをも包含する。
他の面において、本発明は固相支持体上のオリゴヌクレ
オチドの合成方法をも包含し、ここでオリゴヌクレオチ
ドは保護されたアミン94化ヌクレオシドホスホルアミ
ダイトと反応させる。
オチドの合成方法をも包含し、ここでオリゴヌクレオチ
ドは保護されたアミン94化ヌクレオシドホスホルアミ
ダイトと反応させる。
本発明は、−面において、合成された分子51−トリフ
ルオロアセタミド−51−デオキシ−31−N、N−ジ
イソプロピルホスホルアミドチミジン(第2図)及び内
相オリゴヌクレオチド合成における最後の付加としての
51末端に対するその付加である。オリゴヌクレオチド
の開裂及び保護解除の際、トリフ/I/オロアセチル基
は加水分解されて遊離の脂肪族アミノ基をオリゴヌクレ
オチドの5′末端に放出する。このアミノ誘導化された
オリゴヌクレオチドは次いで広範カ穐類のアミン反応性
分子のいずれかと反応して、対応のオリゴヌクレオチド
誘導体を生成することができる。これは、5′炭素では
なく塩基部分に保護脂肪族アミノ基を有する改変ヌクレ
オシドを使用する一般的方法の特殊な例である。この種
の分子は、数個、の遊離アミノ基をオリゴヌクレオチド
の内部にかつオリゴヌクレオチド配列における所望位置
に組み込むことを可能にする。
ルオロアセタミド−51−デオキシ−31−N、N−ジ
イソプロピルホスホルアミドチミジン(第2図)及び内
相オリゴヌクレオチド合成における最後の付加としての
51末端に対するその付加である。オリゴヌクレオチド
の開裂及び保護解除の際、トリフ/I/オロアセチル基
は加水分解されて遊離の脂肪族アミノ基をオリゴヌクレ
オチドの5′末端に放出する。このアミノ誘導化された
オリゴヌクレオチドは次いで広範カ穐類のアミン反応性
分子のいずれかと反応して、対応のオリゴヌクレオチド
誘導体を生成することができる。これは、5′炭素では
なく塩基部分に保護脂肪族アミノ基を有する改変ヌクレ
オシドを使用する一般的方法の特殊な例である。この種
の分子は、数個、の遊離アミノ基をオリゴヌクレオチド
の内部にかつオリゴヌクレオチド配列における所望位置
に組み込むことを可能にする。
本発明の目的は、DNA配列決定に使用しうる新規な試
薬及び技術を提供することである。
薬及び技術を提供することである。
さらに本発明の目的は、ナ伝病の検出及び他の目的に対
するDNAハイブリット化の改良を提供することである
。
するDNAハイブリット化の改良を提供することである
。
本発明のこれら及びその他の目的及び利点は、以下の記
載から当業者には明らかとなるであろう。
載から当業者には明らかとなるであろう。
脂肪族アミノ基をオリゴヌクレオチド中へ導入するため
に使用する方法は、保−された脂肪族アミノ基を含有す
るヌクレオシド同族体の3′ホスホルアミダイト誘導体
を合成することである。次いで、このホスホルアミダイ
トを、非誘導化ヌクレオシドホスホルアミダイトの反応
と同様な方法で、固体支持体上で合成されるオリゴヌク
レオチドと反応させることができる。同相からの開裂及
び塩基成分と脂肪族アミン基との保論解除はアミノ導溝
化オリゴヌクレオチドを与える。
に使用する方法は、保−された脂肪族アミノ基を含有す
るヌクレオシド同族体の3′ホスホルアミダイト誘導体
を合成することである。次いで、このホスホルアミダイ
トを、非誘導化ヌクレオシドホスホルアミダイトの反応
と同様な方法で、固体支持体上で合成されるオリゴヌク
レオチドと反応させることができる。同相からの開裂及
び塩基成分と脂肪族アミン基との保論解除はアミノ導溝
化オリゴヌクレオチドを与える。
例 ■
■の合成:第3図には、市販化合物I(チミジン)から
の化合物■の合成を示す。化合物■〜■の合成はホaヒ
ッッ(Horowit )等、ジャーナル・オーガニッ
ク・ケミストリー、第27巻、第3045−3048頁
(1962)に開示され、さらにギブx (Gibbs
)及びオルゲル(Orgel )、ジャーナル・カー
ボハイドレーツーヌクレオシズ・アンド・ヌクレオシド
、第3(5及び6)巻、第315−354頁(1976
)に開示されている。化合物■及び■の合成社次の通り
である。
の化合物■の合成を示す。化合物■〜■の合成はホaヒ
ッッ(Horowit )等、ジャーナル・オーガニッ
ク・ケミストリー、第27巻、第3045−3048頁
(1962)に開示され、さらにギブx (Gibbs
)及びオルゲル(Orgel )、ジャーナル・カー
ボハイドレーツーヌクレオシズ・アンド・ヌクレオシド
、第3(5及び6)巻、第315−354頁(1976
)に開示されている。化合物■及び■の合成社次の通り
である。
例田
アミノ−51−デオキシチミジンを25mの乾燥ジメチ
ルホルムアミドに溶解させた。これに13m(10ミリ
モル)のS−二チルトリアルオロチオアセテート(アル
ドリッチ社)を加えた。反応物を室温で静かに攪拌した
。MeOH:アセトン1:1で行なったシリカゲルF−
254プレートにおける前記反応混合物のTLCは、短
波長UVKより検出される生成物の単一スポットを示す
。この生成物は、殆んど移動しない出5発化合物■に対
比してこの溶剤系において高移動性を有する。
ルホルムアミドに溶解させた。これに13m(10ミリ
モル)のS−二チルトリアルオロチオアセテート(アル
ドリッチ社)を加えた。反応物を室温で静かに攪拌した
。MeOH:アセトン1:1で行なったシリカゲルF−
254プレートにおける前記反応混合物のTLCは、短
波長UVKより検出される生成物の単一スポットを示す
。この生成物は、殆んど移動しない出5発化合物■に対
比してこの溶剤系において高移動性を有する。
反応混合物を減圧下で回転式に蒸発させ、30艷のイソ
プロパツールの三角フラスコに移し、沸とうインプロパ
ツール: M e OHから再結晶化させた。収率=t
315g(五9ミリモル、8oチ収率)、融点261°
−262℃(分解)、分析予測値C42,7チ、H4
,18チ Ni2.5チ;実験値C42,7%、l(4
,16%、N12.4チ。■の補遺をさらにHNMRに
より確認した。
プロパツールの三角フラスコに移し、沸とうインプロパ
ツール: M e OHから再結晶化させた。収率=t
315g(五9ミリモル、8oチ収率)、融点261°
−262℃(分解)、分析予測値C42,7チ、H4
,18チ Ni2.5チ;実験値C42,7%、l(4
,16%、N12.4チ。■の補遺をさらにHNMRに
より確認した。
例■
この例は、保睡されたアミノ誘導化ヌクレオシドホスホ
ルアミダイトの製造を示している。
ルアミダイトの製造を示している。
使用した注射器及び毛細管線、乾燥オープン内で1晩焼
成した。ジメチルホルムアミド(DMF)は、4人のモ
レキュラシーブ(リンデ社)で貯蔵した。ジイソプロピ
ルエチルアミン(DIPEA)は、水酸化カリウムから
、次いで水素化カルシウムから蒸留し、そして4にのモ
レキュラシーブで貯蔵した。
成した。ジメチルホルムアミド(DMF)は、4人のモ
レキュラシーブ(リンデ社)で貯蔵した。ジイソプロピ
ルエチルアミン(DIPEA)は、水酸化カリウムから
、次いで水素化カルシウムから蒸留し、そして4にのモ
レキュラシーブで貯蔵した。
撹拌棒を備える乾燥した5首の50−丸底、?ラスコに
63tq(a、1pミリモル)の化合物■を加えた。5
首にはそれぞれゴム栓を施こし、これら栓に針を挿入し
た。このフラスコを、乾燥CaC1,のデシケータにお
いて数時間減圧した。フラスコを乾f#窒素ガスの静か
な流れの下に保ち、2−の乾燥DMFを注射器で加えた
。60μlのDIPEA(cL54ミリモル)を乾燥1
00μ!毛細管で加えた。
63tq(a、1pミリモル)の化合物■を加えた。5
首にはそれぞれゴム栓を施こし、これら栓に針を挿入し
た。このフラスコを、乾燥CaC1,のデシケータにお
いて数時間減圧した。フラスコを乾f#窒素ガスの静か
な流れの下に保ち、2−の乾燥DMFを注射器で加えた
。60μlのDIPEA(cL54ミリモル)を乾燥1
00μ!毛細管で加えた。
40μlのクロル−N、N−ジイソプロピルアミノメト
キシホスフィン(アメリカン・ビオヌクレア社、カリホ
ルニア州、エメルビル在)を加えた(乾燥100μ!毛
細管による)。反応物を全出発物質が溶解するまで静か
に攪拌し、次いで室温に静櫨した(常にN、の下で)。
キシホスフィン(アメリカン・ビオヌクレア社、カリホ
ルニア州、エメルビル在)を加えた(乾燥100μ!毛
細管による)。反応物を全出発物質が溶解するまで静か
に攪拌し、次いで室温に静櫨した(常にN、の下で)。
1時間後、HCCIs :EtOH:EtsN=88
: 10 : 2におりるシリカゲルF−254プレー
ト上のTLCは、出発物 □質Vよりもずっと移動度の
高い生成物の単一スポットを示した。ヌクレオシドホス
ホルアミダイト(4)につき記載したと同様な方法で、
この生成物を生成する試みは、生成物の分解により不成
功に終った。したがって、粗製反応混合物を、同相支持
体上の合成オリゴヌクレオチドに対する結合のために直
接使用した。■の構造は、オリゴヌクレオチドへの付加
におけるこの生成物の反応性及び文 □献の結果に基づ
く反応の予想生成物から推定される。
: 10 : 2におりるシリカゲルF−254プレー
ト上のTLCは、出発物 □質Vよりもずっと移動度の
高い生成物の単一スポットを示した。ヌクレオシドホス
ホルアミダイト(4)につき記載したと同様な方法で、
この生成物を生成する試みは、生成物の分解により不成
功に終った。したがって、粗製反応混合物を、同相支持
体上の合成オリゴヌクレオチドに対する結合のために直
接使用した。■の構造は、オリゴヌクレオチドへの付加
におけるこの生成物の反応性及び文 □献の結果に基づ
く反応の予想生成物から推定される。
例■
この例は、ホスホジエステル結合を介して51−アミノ
−51−デオキシチミジンの31−ヒドロキシル忙対し
51末端で結合されたオリゴヌクレオチドの製造を示し
ている。
−51−デオキシチミジンの31−ヒドロキシル忙対し
51末端で結合されたオリゴヌクレオチドの製造を示し
ている。
付加:5′末端にて固相に結合された配列5゜0H−A
GCACT TTT AGA GT 3’ の塩基保験
された合成オリゴヌクレオチドを、カリフォルニア州・
フォスターシティ−在、アプライド・バイオシステムス
・インコーポレーション社により発行された「固体支持
体上のジメトキシトリチルヌクレオシドホスホルアミダ
イトを用いるデオキシオリゴヌクレオチドの合成法」と
題する論文に詳細に記載された方法により作成した。オ
リゴヌクレオチドと■との反応の相違点は、(a)工程
4.22及び4.23の代りに■を含有する新たに調製
された反応混合物1−をアセトニトリル中の[15Mテ
トラゾール11ntと混合し、これを反応容器に加える
こと、(b)工程4,33の後にアセトニトリルで30
秒間にわたり2回洗渉すること、及び(e)キャッピン
グ工程5を省略すること(後の付加における未反応ヒド
ロキシル基の分析を可能にする)である。
GCACT TTT AGA GT 3’ の塩基保験
された合成オリゴヌクレオチドを、カリフォルニア州・
フォスターシティ−在、アプライド・バイオシステムス
・インコーポレーション社により発行された「固体支持
体上のジメトキシトリチルヌクレオシドホスホルアミダ
イトを用いるデオキシオリゴヌクレオチドの合成法」と
題する論文に詳細に記載された方法により作成した。オ
リゴヌクレオチドと■との反応の相違点は、(a)工程
4.22及び4.23の代りに■を含有する新たに調製
された反応混合物1−をアセトニトリル中の[15Mテ
トラゾール11ntと混合し、これを反応容器に加える
こと、(b)工程4,33の後にアセトニトリルで30
秒間にわたり2回洗渉すること、及び(e)キャッピン
グ工程5を省略すること(後の付加における未反応ヒド
ロキシル基の分析を可能にする)である。
結合反応の効率は、比色分析を可能にする「正常」なホ
スホルアミダイトとの結合及びジメトキシトリチル基の
開裂により容易に監視される゛。オリゴヌクレオチドの
51−ヒドロキシル基が■と最初の結合で反応すれば、
これはもはや後の結合において反応に利用されず、第2
結合の後のDCA処理に際し殆んど発色しない。この例
において、DMT基に対するOD4m6 = 112
(希釈後)が、■と反応する前のオリゴヌクレオチドか
ら発生した。DMTに対するOD、、。=0026(希
釈後)が、■との反応後に加えられたG残基から発生し
た。したがって、5’ −OH基の98優が■との反応
により保護された。このオリゴヌクレオチドを保霞解除
し、かつチオフェノールと濃厚NH,OHとによる常法
での処理によって固相がも開裂させ、そしてNH,OH
を減圧下で除去した。
スホルアミダイトとの結合及びジメトキシトリチル基の
開裂により容易に監視される゛。オリゴヌクレオチドの
51−ヒドロキシル基が■と最初の結合で反応すれば、
これはもはや後の結合において反応に利用されず、第2
結合の後のDCA処理に際し殆んど発色しない。この例
において、DMT基に対するOD4m6 = 112
(希釈後)が、■と反応する前のオリゴヌクレオチドか
ら発生した。DMTに対するOD、、。=0026(希
釈後)が、■との反応後に加えられたG残基から発生し
た。したがって、5’ −OH基の98優が■との反応
により保護された。このオリゴヌクレオチドを保霞解除
し、かつチオフェノールと濃厚NH,OHとによる常法
での処理によって固相がも開裂させ、そしてNH,OH
を減圧下で除去した。
オリゴヌクレオチドを1−の蒸留水に溶解させた。
OD、6゜はとの溶液につき128であり、これはDN
Aの濃度が4.5W/−であることを示す。この溶液5
0μノを水で1−まで希釈し、そして数百(1o O〜
200)119のAC30W−X4 (ナトリウム型)
イオy交換樹脂と15分間混合して、DNAをアンモニ
ウム塩からナトリウム塩に変換させた(アンモニウムイ
オンは後のニンヒドリン分析を#l筈する)。この樹脂
を遠心分離により除去し、上澄液をサバント型回転濃縮
機で乾燥した。定量ニンヒドリン分析〔ヴイ・ター・サ
リン(5arin*V、に、)等、アナリチカル・バイ
オケミストリー、第117巻、第147−157頁(1
981))はオリゴヌクレオチド1モル当り約1モルの
アミ−ノ基を与えた(オリゴヌクレオチドのそル濃度紘
計算吸光係数E、6゜=tssxio’ からヌクレオ
チド組成に基づいて決定した)。■が結合されてない比
較オリゴヌクレオチドの同モル量に対するニンヒドリン
分析は、アミノ陽性反応を示さなかった。
Aの濃度が4.5W/−であることを示す。この溶液5
0μノを水で1−まで希釈し、そして数百(1o O〜
200)119のAC30W−X4 (ナトリウム型)
イオy交換樹脂と15分間混合して、DNAをアンモニ
ウム塩からナトリウム塩に変換させた(アンモニウムイ
オンは後のニンヒドリン分析を#l筈する)。この樹脂
を遠心分離により除去し、上澄液をサバント型回転濃縮
機で乾燥した。定量ニンヒドリン分析〔ヴイ・ター・サ
リン(5arin*V、に、)等、アナリチカル・バイ
オケミストリー、第117巻、第147−157頁(1
981))はオリゴヌクレオチド1モル当り約1モルの
アミ−ノ基を与えた(オリゴヌクレオチドのそル濃度紘
計算吸光係数E、6゜=tssxio’ からヌクレオ
チド組成に基づいて決定した)。■が結合されてない比
較オリゴヌクレオチドの同モル量に対するニンヒドリン
分析は、アミノ陽性反応を示さなかった。
例 5
染料との結合:100μノのアミノオリゴヌクレオチド
の上記溶液へ、200μlのH,0と50μ101モル
炭酸塩/X炭酸緩衝液(pH9,0)と25μ!の新た
に調製した10η/−のフルオレシンインチオシアネー
ト(FITC)(オレゴン州、ジャンクションシティ−
在、モレキュラー・ブローブス・インコーポレーション
社)とのジメチルスルホキシドにおける溶液を加えた。
の上記溶液へ、200μlのH,0と50μ101モル
炭酸塩/X炭酸緩衝液(pH9,0)と25μ!の新た
に調製した10η/−のフルオレシンインチオシアネー
ト(FITC)(オレゴン州、ジャンクションシティ−
在、モレキュラー・ブローブス・インコーポレーション
社)とのジメチルスルホキシドにおける溶液を加えた。
この混合物を室温に数時間放置し、そしてat O中の
セファデックスG−25媒体のカラム(1cILX9c
!IL)に対するクロマトグラフィーにより精製した。
セファデックスG−25媒体のカラム(1cILX9c
!IL)に対するクロマトグラフィーにより精製した。
黄色生成物が溶出容量に溶出され、これを未反応染料か
ら綺麗に分離した。■が反応していないオリゴヌクレオ
チドとの比較反応は、カラムの溶出容量に殆んど全く着
色を与えず、これはこの染料が全く添加アミン基と反応
しなかったことを示している。染料−オリゴヌクレチド
結合物はOD*eo = 2.3、OD、、、 = Q
、 54を有した。FITCにつきE41111 =7
X10’ K基づいて、これは17μmE:/I/の染
料溶液を与える。E、6゜=t55×10s に基づき
、DNAは12.8μモルである。
ら綺麗に分離した。■が反応していないオリゴヌクレオ
チドとの比較反応は、カラムの溶出容量に殆んど全く着
色を与えず、これはこの染料が全く添加アミン基と反応
しなかったことを示している。染料−オリゴヌクレチド
結合物はOD*eo = 2.3、OD、、、 = Q
、 54を有した。FITCにつきE41111 =7
X10’ K基づいて、これは17μmE:/I/の染
料溶液を与える。E、6゜=t55×10s に基づき
、DNAは12.8μモルである。
したがって、60%までの(〜60%)DNA分子が染
料により標識された。これは大兄の推定であって、未結
合に対する結合フルオレフィン吸収における変化を示さ
ず、またより短い汚染性オリゴヌクレオチド及び非反応
オリゴヌクレオチドの変化も示さない。この着色DNA
の1部を20%ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動に
かけ、この長さのオリゴヌクレオチドに適切な移動度の
単一の着色(及び螢光性)バンドとして明らかに見られ
た。
料により標識された。これは大兄の推定であって、未結
合に対する結合フルオレフィン吸収における変化を示さ
ず、またより短い汚染性オリゴヌクレオチド及び非反応
オリゴヌクレオチドの変化も示さない。この着色DNA
の1部を20%ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動に
かけ、この長さのオリゴヌクレオチドに適切な移動度の
単一の着色(及び螢光性)バンドとして明らかに見られ
た。
染料結合したオリゴヌクレオチドは、高性能液体クロマ
トグラフィー(HPLC)により逆転相C1aカラム(
ウォーターズ社)で溶出用としてアセトニトリル:0.
IM)リエチルアンモニウムアセテー)(pH7,0)
勾配を用いて容易に精製された。
トグラフィー(HPLC)により逆転相C1aカラム(
ウォーターズ社)で溶出用としてアセトニトリル:0.
IM)リエチルアンモニウムアセテー)(pH7,0)
勾配を用いて容易に精製された。
上記した新規なアミノ誘導化オリゴヌクレオチドには多
くの用途が可能である。脂肪族アミノ基社容易かつ%異
的に多数の官能基と反応する。これは、実質的に任意の
所望の分子が上記のように作成されたオリゴヌクレオチ
ドに結合しうろことを意味する。これは酵素、他の蛋白
質、螢光標瞳、生物発光性標識、発色Nなどを包含する
。オリゴヌクレオチドは、多くの分野にしはしは放射性
標識と組み合せて広く使用されている。非放射性試料分
子を放射性標の代に使用することもできる。
くの用途が可能である。脂肪族アミノ基社容易かつ%異
的に多数の官能基と反応する。これは、実質的に任意の
所望の分子が上記のように作成されたオリゴヌクレオチ
ドに結合しうろことを意味する。これは酵素、他の蛋白
質、螢光標瞳、生物発光性標識、発色Nなどを包含する
。オリゴヌクレオチドは、多くの分野にしはしは放射性
標識と組み合せて広く使用されている。非放射性試料分
子を放射性標の代に使用することもできる。
これは、オリゴヌクレオチドを使用する方法をより安価
にし、かつ使用を容易とがし、さらに臨床用途に適合さ
せる。放射性標識は大して好適でないが、この新規がア
ミノ誘導化オリゴヌクレオチドを、たとえば11!+1
のように放射性標識することもできる。新規なアミン誘
導化オリゴヌクレオチドの用途に関する次の3つの特定
例のみを例示する。: 1 自動化DNA配列決定、 2、DNAハイブリッド化による遺伝子病の検出、 3、 ハイブリッド化の検出のための螢光の一般的使用
。
にし、かつ使用を容易とがし、さらに臨床用途に適合さ
せる。放射性標識は大して好適でないが、この新規がア
ミノ誘導化オリゴヌクレオチドを、たとえば11!+1
のように放射性標識することもできる。新規なアミン誘
導化オリゴヌクレオチドの用途に関する次の3つの特定
例のみを例示する。: 1 自動化DNA配列決定、 2、DNAハイブリッド化による遺伝子病の検出、 3、 ハイブリッド化の検出のための螢光の一般的使用
。
遺伝子異常の検出:オリゴヌクレオチドを使用して個人
の遺伝子型を決定することができる。これは、アミニオ
センチシスにより胎児から得られたDNA試料につき行
なわれる。このtFiNは、6桓の遺伝子病に対する危
険において大姉の遺伝子カウンセリングに対し不変であ
る。成人の遺伝子型をも決定して、効果的診断及び早期
の処置を可能にする。この技術の顕著な1例は、錐状赤
血球貧血症の検出である〔コナー(Connor )等
、プルシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエ
ンス、U、 S、 A、第80巻、第278頁(198
3))。19個の塩基対長さの合成オリゴヌクレオチド
を合成し、一方は正常カヒトβ−グロビン遺伝子(βA
)に対し補完的であり、かつ一方は錐状赤血球β−グロ
ビン遺伝子(βS)に対し補完的である。これらの分子
を放射能標識し、DNAハイブリッド化における試料と
して使用した。適当なハイブリット化条件の下で、これ
ら試料を使用してβA遺伝子をβS対立遺伝子から区別
することができる。これは錐状赤血球貧血症の診断を可
能にする。より一般的には、コナー等の文献に指摘され
たように、「オリゴヌクレオチドの対立遺伝子特異性の
ハイブリッド化特性は、単一コピー遺伝子のDNA配列
におけるポイント突然変異を含む任意の遺伝子病の一般
的診断方法を与える」。本発明はこの技術に直接使用す
ることができる。アミノ基を有するオリゴヌクレオチド
試料を作成し、これに螢光標識をラベルする。
の遺伝子型を決定することができる。これは、アミニオ
センチシスにより胎児から得られたDNA試料につき行
なわれる。このtFiNは、6桓の遺伝子病に対する危
険において大姉の遺伝子カウンセリングに対し不変であ
る。成人の遺伝子型をも決定して、効果的診断及び早期
の処置を可能にする。この技術の顕著な1例は、錐状赤
血球貧血症の検出である〔コナー(Connor )等
、プルシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエ
ンス、U、 S、 A、第80巻、第278頁(198
3))。19個の塩基対長さの合成オリゴヌクレオチド
を合成し、一方は正常カヒトβ−グロビン遺伝子(βA
)に対し補完的であり、かつ一方は錐状赤血球β−グロ
ビン遺伝子(βS)に対し補完的である。これらの分子
を放射能標識し、DNAハイブリッド化における試料と
して使用した。適当なハイブリット化条件の下で、これ
ら試料を使用してβA遺伝子をβS対立遺伝子から区別
することができる。これは錐状赤血球貧血症の診断を可
能にする。より一般的には、コナー等の文献に指摘され
たように、「オリゴヌクレオチドの対立遺伝子特異性の
ハイブリッド化特性は、単一コピー遺伝子のDNA配列
におけるポイント突然変異を含む任意の遺伝子病の一般
的診断方法を与える」。本発明はこの技術に直接使用す
ることができる。アミノ基を有するオリゴヌクレオチド
試料を作成し、これに螢光標識をラベルする。
螢光性試料分子は放射性試料の短い寿命と比べて無限に
安定であり、使用又は取り扱いに関し特殊の注意を必要
としない。このことは、臨床用途においてこの方法を極
めて好適となし、これが事実上使用しうる主たる領域で
ある。
安定であり、使用又は取り扱いに関し特殊の注意を必要
としない。このことは、臨床用途においてこの方法を極
めて好適となし、これが事実上使用しうる主たる領域で
ある。
オリゴヌクレオチド試料は、研究並びに臨床用途に広く
使用される。これらは、「ライブラリー」すなわちプラ
スミド又はファージベクター中にクローン化されて生物
の全ゲノム(または発現RNA)を含む配列を有するD
NA断片のコレクションにおいて、DNA片及び所望配
列を検出するために一般的に使用される。さらに、これ
らは、特定DNA片の制限分解物の「プロット」におけ
る所定配列のDNAにハイブリッド化させるためにも使
用される。これら全ての例或いはその他の例において、
オリゴヌクレオチドには一般に5′末端にPlを標識し
、かつ分子をオートラジオグラフィーにより検出する。
使用される。これらは、「ライブラリー」すなわちプラ
スミド又はファージベクター中にクローン化されて生物
の全ゲノム(または発現RNA)を含む配列を有するD
NA断片のコレクションにおいて、DNA片及び所望配
列を検出するために一般的に使用される。さらに、これ
らは、特定DNA片の制限分解物の「プロット」におけ
る所定配列のDNAにハイブリッド化させるためにも使
用される。これら全ての例或いはその他の例において、
オリゴヌクレオチドには一般に5′末端にPlを標識し
、かつ分子をオートラジオグラフィーにより検出する。
本発明社、螢光染料によるオリゴヌクレオチドの標識を
開示する。したがって、螢光を使用して、放射能が従来
使用されている任意の技術で分子を検出することができ
る。これは、たとえば試料の安定性、使用のコズト及び
容易さ並びに廃棄のような放射能に対する多くの利点を
有する。
開示する。したがって、螢光を使用して、放射能が従来
使用されている任意の技術で分子を検出することができ
る。これは、たとえば試料の安定性、使用のコズト及び
容易さ並びに廃棄のような放射能に対する多くの利点を
有する。
以上、本発明を説明したが、本発明はこれらのみに限定
されない。
されない。
手続補正書
昭和60年2月20日
特許庁長官 専 買 手 殿
事件の表示 昭和59年特 願第266525号発明の
名称 アミン騎尋化されたオリゴヌクレオチドの合成補
正をする者 事件との関係 特許出願人 補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄 図面 1通 補正の内容 別紙の通り t 明細書2S頁を別紙と差し換えろ。
名称 アミン騎尋化されたオリゴヌクレオチドの合成補
正をする者 事件との関係 特許出願人 補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄 図面 1通 補正の内容 別紙の通り t 明細書2S頁を別紙と差し換えろ。
2 図面筒1〜5glを加える。
オリゴヌクレオチドの標識を開示する。したがって、螢
光ご使用して、放射能が従来使用されている任意の技術
で分子を検出することができる。これは、たとえば試料
の安定性、使用のコスト及び容易さ並びに廃棄のような
放射能に対する多くの利点を有する。
光ご使用して、放射能が従来使用されている任意の技術
で分子を検出することができる。これは、たとえば試料
の安定性、使用のコスト及び容易さ並びに廃棄のような
放射能に対する多くの利点を有する。
以上、本発明を説明したが、本発明はこれらのみに限定
されない。
されない。
(客」し先頭J)し岐j4
第1f;!Jはオリゴヌクレオチドの1部を示す構造図
であり、 第2図は合成された5′ −トリフルオロアセタミド5
′−チオキシ5’−N、N−ジイソプロピルホスホルア
ミドチミジンの構造図であり、第3図は市販のチミジン
からの5’)リフルオロアセタミド5′−デオキシ5
’ −N t N−シイツブ四ビルホスホルアミドチミ
ジンの合成を示す略図である。
であり、 第2図は合成された5′ −トリフルオロアセタミド5
′−チオキシ5’−N、N−ジイソプロピルホスホルア
ミドチミジンの構造図であり、第3図は市販のチミジン
からの5’)リフルオロアセタミド5′−デオキシ5
’ −N t N−シイツブ四ビルホスホルアミドチミ
ジンの合成を示す略図である。
−0−P−OFIG、I FIG、2
人
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)脂肪族アミン誘導化された単一鎖オリゴヌクレオ
チドを検出可能な成分に結合してなる組成物。 (2)検出可能な成分が螢光性である特許請求の範囲第
1項記載の組成物。 (3)検は可能な成分が光吸収性又は着色されたもので
ある特許請求の範囲第1項記載の組成物。 (4)検出可能な成分が蛋白質である特許請求の範囲第
1項記載の組成物。 (5)検出可能な成分が酵率である特許請求の範囲第1
項記載の組成物。 (6)検出1」能な成分が放射性(+tsである特許請
求の範囲第1項記載の組成物。 をホスホルアミダイト先駆体を介して挿入したオリゴヌ
クレオチドからなる新規な組成物。 (8)オリゴヌクレオチドを保護されたアミノ誘導化ヌ
クレオシドホスホルアミダイトと反応させることを特徴
とする同相支持体上のオリゴヌクレオチドの合成方法。 (9) ホスホジエステル結合を介して5′ −アミノ
−51−デオキシチミジンの3′ −ヒドロキシルに5
′末端で結合されたオリゴヌクレオチドからなる新規な
組成物。 QI5’ −アミノ−51−デオキシチミジンを保睦剤
と反応させて51−トリフルオロアセタミド−51−デ
オキシチミジンを生成させ、次いでこれをホスフィンと
反応させて対応のホスホルアミダイトを生成させ、この
ホスホルアミダイトを次いで固相支持体に結合された塩
基性保賎オリゴヌクレオチドと反応させることを特徴と
する特許請求の範囲第9項記載の組成物の製造方法。 aυ 保護されたアミン誘導化ヌクレオシドホスホ(l
a5’ −トリフルオロアセタミド−5′ −デオキシ
チミジンをホスフィンと反応させて得られるホスホルア
ミダイト。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US56501083A | 1983-12-20 | 1983-12-20 | |
US565010 | 1990-08-09 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP25102888A Division JPH01250393A (ja) | 1983-12-20 | 1988-10-06 | アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60197698A true JPS60197698A (ja) | 1985-10-07 |
JPH0157119B2 JPH0157119B2 (ja) | 1989-12-04 |
Family
ID=24256835
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59266525A Granted JPS60197698A (ja) | 1983-12-20 | 1984-12-19 | アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成 |
JP25102888A Granted JPH01250393A (ja) | 1983-12-20 | 1988-10-06 | アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成 |
JP11959792A Expired - Lifetime JPH0678353B2 (ja) | 1983-12-20 | 1992-04-14 | アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP25102888A Granted JPH01250393A (ja) | 1983-12-20 | 1988-10-06 | アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成 |
JP11959792A Expired - Lifetime JPH0678353B2 (ja) | 1983-12-20 | 1992-04-14 | アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
JP (3) | JPS60197698A (ja) |
CA (1) | CA1244786A (ja) |
DE (1) | DE3446635C2 (ja) |
FR (1) | FR2556726B1 (ja) |
GB (1) | GB2153356B (ja) |
SE (1) | SE466208B (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01501149A (ja) * | 1986-06-24 | 1989-04-20 | カリフオルニア インステイテユート オブ テクノロジー | 新規なデオキシリボヌクレオシドホスホルアミダイト及びオリゴヌクレオチドを製造するためのそれらの使用 |
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US5015733A (en) * | 1983-12-20 | 1991-05-14 | California Institute Of Technology | Nucleosides possessing blocked aliphatic amino groups |
USRE43096E1 (en) | 1984-01-16 | 2012-01-10 | California Institute Of Technology | Tagged extendable primers and extension products |
US5821058A (en) | 1984-01-16 | 1998-10-13 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
GB8509880D0 (en) * | 1985-04-17 | 1985-05-22 | Ici Plc | Testing device |
US4762779A (en) * | 1985-06-13 | 1988-08-09 | Amgen Inc. | Compositions and methods for functionalizing nucleic acids |
US4757141A (en) * | 1985-08-26 | 1988-07-12 | Applied Biosystems, Incorporated | Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof |
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US4855225A (en) * | 1986-02-07 | 1989-08-08 | Applied Biosystems, Inc. | Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides |
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KR930703340A (ko) * | 1990-12-11 | 1993-11-29 | 챨스 엠. 브록 | 올리고뉴클레오타이드 표지 방법 |
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