JPH0678353B2 - アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成 - Google Patents

アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成

Info

Publication number
JPH0678353B2
JPH0678353B2 JP11959792A JP11959792A JPH0678353B2 JP H0678353 B2 JPH0678353 B2 JP H0678353B2 JP 11959792 A JP11959792 A JP 11959792A JP 11959792 A JP11959792 A JP 11959792A JP H0678353 B2 JPH0678353 B2 JP H0678353B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
oligonucleotide
amino
amino group
nucleoside
oligonucleotides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP11959792A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH06145192A (ja
Inventor
ロイド・エム・スミス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KARIFUORUNIA INST OBU TEKUNOROJII
Original Assignee
KARIFUORUNIA INST OBU TEKUNOROJII
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by KARIFUORUNIA INST OBU TEKUNOROJII filed Critical KARIFUORUNIA INST OBU TEKUNOROJII
Publication of JPH06145192A publication Critical patent/JPH06145192A/ja
Publication of JPH0678353B2 publication Critical patent/JPH0678353B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、脂肪族アミノ基を有す
るオリゴヌクレオチドを含有する組成物及びその製造方
法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】オリゴヌクレオチドは、所定順序におけ
る４種類のヌクレオチドの線状配列よりなる短鎖重合体
である。ヌクレオチドのサブユニットはホスホジエステ
ル結合により結合されて、１個のヌクレオチドの３’ヒ
ドロキシル部分を次のヌクレオチドの５’ヒドロキシ部
分に結合させる。オリゴヌクレオチドの例は５’ｐＣｐ
ＧｐＴｐＡｐＴｐＧｐＧｐＣｐ３’である。記号Ａ、
Ｃ、Ｇ及びＴはデオキシリボースの１−位置に結合され
たプリン若しくはピリミジン塩基の特性を意味する。す
なわちＡはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔ
はチミジンである。記号ｐはホスホジエステル結合を示
す。オリゴヌクレオチドの部分構造を第１図に示す。本
発明の単一鎖オリゴヌクレオチドは、さらにヌクレオシ
ドサブユニットの配列に関しホモジニアスであることを
特徴とし、さらに均一な分子量を有する。
【０００３】合成オリゴヌクレオチドは、最近の分子生
物学及び組換ＤＮＡ技術における強力な武器である。こ
れらの分子に対する用途は多く、たとえば（ａ）遺伝子
産物の蛋白配列に基づく特定の遺伝子の単離のためのプ
ローブとして、（ｂ）所望の遺伝子の試験管内突然変異
を指令するため、（ｃ）単一鎖鋳型上におけるＤＮＡ合
成のプライマーとして、（ｄ）遺伝子の全合成における
手順としてなど多くの用途が含まれ、これらについては
ダブリュエム・アール・バール（Ｗｍ．Ｒ．Ｂａｈｌ）
等、プログレッシブ・ヌクレイック・アシッド・リサー
チ・モレキュラ・バイオロジー、第２１巻、第１０１頁
（１９７８）を参照することができる。
【０００４】したがって、この種のオリゴヌクレオチド
の効率的な化学合成法を開発するため極めて多くの努力
が払われている。現在まで開発されているこれら方法の
簡単な説明はジー・シー・クロケット（Ｃｒｏｃｋｅｔ
ｔ，Ｇ．Ｃ．）、アルドリヒミカ・アクタ、第１６
（３）巻、第４７−５５頁（１９８３）に見られる。現
在使用し得る最良の方法は、ヌクレオシドのホスホルア
ミダイト誘導体を固相合成法と組み合わせて利用する
［マテウッチ等、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・
ソサエティー、第１０３巻、第３１８５頁（１９８１）
及びポーケージ等、Ｍ．Ｈ．テトラヘドロン・レター、
第２２（２０）巻、第１８５８−１８６２頁（１９８
１）］。３０個までの塩基の長さよりなるオリゴヌクレ
オチドはこのような常法にしたがって作成することがで
き、５０個塩基の程度の長さの分子も作成されている。
この技術を使用する装置も現在市販されている。
【０００５】ＤＮＡの誘導体化に関するほかの報告も文
献に見られる。修飾ヌクレオシド三燐酸が開発されてお
り、ここでビオチン基はウラシルの５位置における脂肪
族アミノ基に結合されている［ランガー等、ブロシーデ
ィング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、Ｕ．
Ｓ．Ａ．第７８巻、第６６３３−６６３７頁（１９８
１）］。このヌクレオチド誘導体は二重鎖ＤＮＡ中に効
果的に組み込まれる。ＤＮＡに組み込まれると、これは
抗ビオチン抗体により結合され、次でこれを蛍光法又は
酸素法により検出するために使用することができる。ラ
ンガー等の方法により組み込まれたビオチン結合ヌクレ
オシドを有するＤＮＡはより小さい単一鎖及び二重鎖の
ものに断片化され、これらはヌクレオシドサブユニット
の配列についてヘテロジニアスであって、分子量が異な
っている。ドレーパー及びゴールド［バイオケミストリ
ー、第１９巻、第１７７４−１７８１頁（１９８０）］
は、重亜硫酸塩で触媒されたアミノ交換反応及びその後
の蛍光性標識との反応による脂肪族アミノ基の導入を報
告している。ドレーパー及びゴールドの報告において
は、アミノ基をピリミジン塩基に直接結合させる。この
ように結合したアミノ基は水素結合を抑制し、この理由
でこれら物質はハイブリッド化などに有用でない。チュ
ー等［ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第１１（１
８）巻、第６５１３−６５２９頁、（１９８３）］は、
アミンをオリゴヌクレオチド又は核酸の末端５’燐酸塩
に結合させる方法を報告している。
【０００６】多くの理由でほかの化学物質を合成オリゴ
ヌクレオチドに共有結合させる方法が望まれている。オ
リゴヌクレオチドに結合された蛍光染料は、放射性同位
元素をこれらが使用される研究、診断及び臨床法から排
除することを可能にし、かつ使用寿命及び入手性を向上
させる。ＤＮＡ配列決定装置のための本出願人による特
許出願に記載したように、蛍光標識したオリゴヌクレオ
チドの合成はＤＮＡ配列決定法の自動化を可能にする。
適当な技術の開発及び蛍光標識したオリゴヌクレオチド
の検出及び使用に対する装置化は、現在面倒なほかの実
験的及び臨床的技術の自動化を可能にする。たとえばシ
ュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）等によりジャーナル・アメリ
カン・ケミカル・ソサエティー、第１０４巻、第６８６
１頁（１９８２）に開示されたもの及びヘルツベルク
（Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ）等によりジャーナル・アメリカ
ン・ケミカル・ソサエティー、第１０４巻、第３１３頁
（１９８２）に開示されたようなＤＮＡ開裂薬品の結合
は合成制限酵素の作成を可能にし、その特異性はオリゴ
ヌクレオチド配列により指令される。
【０００７】
【発明が解決しようとする問題点】本発明は、遊離脂肪
族アミノ基を合成オリゴヌクレオチドに導入する一般的
方法を提供する。このアミノ基は各種のアミノ反応性官
能基と容易かつ特異的に反応し、それにより広範な種類
の化学物質の共有結合を可能にする。
【０００８】
【問題点を解決するための手段】要するに、本発明は、
検出可能な成分に結合された新規な脂肪族アミノ誘導化
単一鎖オリゴヌクレオチドからなり、検出可能な成分は
発色団、蛍光剤、蛋白質、酵素などの「標識」である。
【０００９】さらに、本発明はホスホルアミダイト先駆
体を介して少なくとも１種のアミノ誘導化ヌクレオシド
を挿入した新規なオリゴヌクレオチドをも包含する。
【００１０】ほかの面において、本発明は固相支持体上
のオリゴヌクレオチドの合成方法をも包含し、ここでオ
リゴヌクレオチドは保護されたアミノ誘導化ヌクレオシ
ドホスホルアミダイトと反応させる。
【００１１】本発明は、一面において、合成された分子
５’−トリフルオロアセトアミド−５’−デオキシ−
３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミドチミジン
（第２図）及び固相オリゴヌクレオチド合成における最
後の付加としての５’末端に対するその付加である。オ
リゴヌクレオチドの開裂及び保護解除の際、トリフルオ
ロアセチル基は加水分解されて遊離の脂肪族アミノ基を
オリゴヌクレオチドの５’末端に残す。このアミノ誘導
化されたオリゴヌクレオチドは次いで広範な種類のアミ
ノ反応性分子のいずれかと反応して、対応するオリゴヌ
クレオチド誘導体を生成することができる。これは、
５’炭素ではなく塩基部分に保護脂肪族アミノ基を有す
る修飾ヌクレオシドを使用する一般的方法の特殊な例で
ある。この種の分子は、数個の遊離アミノ基をオリゴヌ
クレオチドの内部にかつオリゴヌクレオチド配列におけ
る所望位置に組み込むことを可能にする。
【００１２】本発明の目的は、ＤＮＡ配列決定に使用し
うる新規な試薬及び技術を提供することである。
【００１３】さらに本発明の目的は、遺伝病の検出及び
他の目的に対するＤＮＡハイブッリット化の改良を提供
することである。
【００１４】本発明のこれら及びその他の目的及び利点
は、以下の記載から当業者には明らかとなるであろう。
【００１５】脂肪族アミノ基をオリゴヌクレオチド中へ
導入するために使用する方法は、保護された脂肪族アミ
ノ基を含有するヌクレオシド同族体の３’ホスホルアミ
ダイト誘導体を合成することである。次いで、このホス
ホルアミダイトを、非誘導化ヌクレオシドホスホルアミ
ダイトの反応と同様な方法で、固体支持体上で合成され
るオリゴヌクレオチドと反応させることができる。固相
からの開裂及び塩基成分と脂肪族アミノ基との保護解除
はアミノ誘導化オリゴヌクレオチドを与える。
【００１６】
【実施例】例 Ｉ ＶＩの合成 ：第３図には、市販化合物Ｉ（チミジン）か
らの化合物ＶＩの合成を示す。化合物ＩＩ〜ＩＶの合成
はホロヒッツ（Ｈｏｒｏｗｉｔ）等、ジャーナル・オー
ガニック・ケミストリー、第２７巻、第３０４５−３０
４８頁（１９６２）に開示され、さらにギブス（Ｇｉｂ
ｂｓ）及びオルゲル（Ｏｒｇｅｌ）、ジャーナル・カー
ボハイドレーツ−ヌクレオシズ・アンド・ヌクレオチ
ズ、第３（５及び６）巻、第３１５−３３４頁（１９７
６）に開示されている。化合物Ｖ及びＶＩの合成は次の
通りである。
【００１７】例 ＩＩ ５’−トリフルオロアセタミド−５’−デオキシチミジ
ン（Ｖ） ：１．２５ｇ（５ミリモル）の５’−アミノ−
５’−デオキシチミジンを２５ｍｌの乾燥ジメチルホル
ムアミドに溶解させた。これに１．３ｍｌ（１０ミリモ
ル）のＳ−エチルトリフルオロチオアセテート（アルド
リッチ社）を加えた。反応物を室温で静かに撹拌した。
ＭｅＯＨ：アセトン１：１で行ったシリカゲルＦ−２５
４プレートにおける前記反応混合物のＴＬＣは、短波長
>ＵＶにより検出される生成物の単一スポットを示す。
この生成物は殆んど移動しない出発化合物ＶＩに対比し
てこの溶剤系において高移動性を有する。
【００１８】反応混合物は減圧下で回転式に蒸発させ、
３０ｍｌのイソプロパノールの三角フラスコに移し、沸
とうイソプロパノール：ＭｅＯＨから再結晶化させた。
収率＝１．３１５ｇ（３．９ミリモル、８０％収率）、
融点２６１°−２６２℃（分解）、分析予測値Ｃ ４
２．７％、Ｈ ４．１８％ Ｎ １２．５％；実験値Ｃ
４２．７％、Ｈ ４．１６％、Ｎ １２．４％。Ｖの構
造をさらにＨ ＮＭＲにより確認した。
【００１９】例 ＩＩＩ この例は、保護されたアミノ誘導化ヌクレオシドホスホ
ルアミダイトの製造を示している。
【００２０】５’トリフルオロアセタミド−５’−デオ
キシ−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミドチ
ミジン（ＶＩ）：全てガラス製品であるこの反応に使用
した注射器及び毛細管は、乾燥オーブン内で１晩焼成し
た。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は４Åのモレキュ
ラシーブ（リンデ社）で貯蔵した。ジイソプロピルエチ
ルアミン（ＤＩＰＥＡ）は、水酸化カリウムから、次い
で水素化カルシウムから蒸留し、そして４Åのモレキュ
ラシーブで貯蔵した。
【００２１】撹拌棒を備える乾燥した三首の５０ｍｌ丸
底フラスコに６３ｍｇ（０．１９ミリモル）の化合物Ｖ
を加えた。三首にはそれぞれゴム栓を施こし、これら栓
に針を挿入した。このフラスコを、乾燥ＣａＣｌ2 のデ
シケータにおいて数時間減圧した。フラスコを乾燥窒素
ガスの静かな流れの下に保ち、２ｍｌの乾燥ＤＭＦを注
射器で加えた。６０μｌのＤＩＰＥＡ（０．３４ミリモ
ル）を乾燥１００μｌ毛細管で加えた。４０μｌのクロ
ル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィン
（アメリカン・ビオヌクレア社、カリホルニア州、エメ
ルビル在）を加えた（乾燥１００μｌ毛細管による）。
反応物を全出発物質が溶解するまで静かに撹拌し、次い
で室温に静置した（常にＮ2 の下で）。１時間後、ＨＣ
Ｃｌ3 ：ＥｔＯＨ：Ｅｔ3 Ｎ＝８８：１０：２における
シリカゲルＦ−２５４プレート上のＴＬＣは、出発物質
Ｖよりもずっと移動度の高い生成物の単一スポットを示
した。ヌクレオシドホスホルアミダイト（４）につき記
載したと同様な方法で、この生成物を精製する試みは、
生成物の分解により不成功に終わった。したがって、粗
製反応混合物を、固相支持体上の合成オリゴヌクレオチ
ドに対する結合のために直接使用した。ＶＩの構造は、
オリゴヌクレオチドへの付加におけるこの生成物の反応
性及び文献の結果に基づく反応の予想生成物から推定さ
れる。
【００２２】例 ＩＶ この例は、ホスホジエステル結合を介して５’−アミノ
−５’−デオキシチミジンの３’−ヒドロキシルに対し
５’末端で結合されたオリゴヌクレオチドの製造を示し
ている。
【００２３】オリゴヌクレオチドの５’−末端に対する
ＶＩの付加：３’末端にて固相に結合された配列５’Ｏ
Ｈ−ＡＧＣ ＡＣＴ ＴＴＴ ＡＧＡ ＧＴ ３’の塩
基保護された合成オリゴヌクレオチドを、カリフォルニ
ア州・フォスターシティー在、アプライド・バイオシス
テムス・インコーポレーション社により発行された「固
体支持体上のジメトキシトリチルヌクレオシドホスホル
アミダイトを用いるデオキシオリゴヌクレオチドの合成
法」と題する論文に詳細に記載された方法により作成し
た。オリゴヌクレオチドとＶＩとの反応の相違点は、
(a) 工程４．２２及び４．２３の代りにＶＩを含有する
新たに調製された反応混合物１ｍｌをアセトニトリル中
の０．５Ｍテトラゾール１ｍｌと混合し、これを反応容
器に加えること、(b) 工程４．３３の後にアセトニトリ
ルで３０秒間にわたり２回洗浄すること、及び(c) キャ
ッピング工程５を省略すること（後の付加における未反
応ヒドロキシル基の分析を可能にする）である。
【００２４】結合反応の効率は、比色分析を可能にする
「正常」なホスホルアミダイトとの結合及びジメトキシ
トリチル基の開裂により容易に監視される。オリゴヌク
レオチドの５’−ヒドロキシル基がＶＩと最初の結合で
反応すれば、これはもはや後の結合において反応に利用
されず、第２結合の後のＤＣＡ処理に際し殆んど発色し
ない。この例において、ＤＭＴ基に対するＯＤ450 ＝
１．１２（希釈後）が、ＶＩと反応する前のオリゴヌク
レオチドから発生した。ＤＭＴに対するＯＤ450＝０．
０２６（希釈後）が、ＶＩとの反応後に加えられたＧ残
基から発生した。したがって、５’−ＯＨ基の９８％が
ＶＩとの反応により保護された。このオリゴヌクレオチ
ドを保護解除し、かつチオフェノールと濃厚ＮＨ4 ＯＨ
とによる常法での処理によって固相から開裂させ、そし
てＮＨ4 ＯＨを減圧下で除去した。オリゴヌクレオチド
を１ｍｌの蒸留水に溶解させた。ＯＤ260 はこの溶液に
つき１２８であり、これはＤＮＡの濃度が４．５ｍｇ／
ｍｌであることを示す。この溶液５０μｌを水で１ｍｌ
まで希釈し、そして数百（１００〜２００）ｍｇのＡＧ
５０Ｗ−Ｘ４（ナトリウム型）イオン交換樹脂と１５分
間混合して、ＤＮＡをアンモニウム塩からナトリム塩に
変換させた（アンモニウムイオンは後のニンヒドリン分
析を阻害する）。この樹脂を遠心分離により除去し、上
澄液をサバント型回転濃縮機で乾燥した。定量ニンヒド
リン分析［ヴイ・ケー・サリン（Sarin,V.K.) 等、アナ
リチカル・バイオケミストリー、第１１７巻、第１４７
−１５７頁（１９８１）］はオリゴヌクレオチド１モル
当たり約１モルのアミノ基を与えた（オリゴヌクレオチ
ドのモル濃度は計算吸光係数Ｅ260 ＝１．５５×１０5
からヌクレオチド組成に基づいて決定した）。ＶＩが結
合されてない比較オリゴヌクレオチドの同モル量に対す
るニンヒドリン分析は、アミノ陽性反応を示さなかっ
た。
【００２５】例 ５ 染料との結合 ：１００μｌのアミノオリゴヌクレオチド
の上記溶液へ、２００μｌのＨ2 Ｏと５０μｌの１モル
炭酸塩／重炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）と２５μｌの新た
に調製した１０ｍｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシ
アネート（ＦＩＴＣ）（オレゴン州、ジャンクションシ
ティー在、モレキュラー・プローブス・インコーポレー
ション社）とのジメチルスルホキシドにおける溶液を加
えた。この混合物を室温に数時間放置し、そしてＨ2 Ｏ
中のセファデックスＧ−２５媒体のカラム（１ｃｍ×９
ｃｍ）に対するクロマトグラフィーにより精製した。黄
色生成物が溶出容量に溶出され、これを未反応染料から
綺麗に分離した。ＶＩが反応していないオリゴヌクレオ
チドとの比較反応は、カラムの溶出容量に殆んど全く着
色を与えず、これはこの染料が実際に添加されたアミノ
基と反応したことを示している。染料−オリゴヌクレオ
チド結合物はＯＤ260 ＝２．３、ＯＤ495 ＝０．５４を
有した。ＦＩＴＣにつきＥ495 ＝７×１０4 に基づい
て、これは７．７μモルの染料溶液を与える。Ｅ260 ＝
１．５５×１０5 に基づき、ＤＮＡは１２．８μモルで
ある。したがって、およそ６０％の（〜６０％）ＤＮＡ
分子が染料により標識された。これは大凡の推定であっ
て、未結合に対する結合フルオレセイン吸収における変
動を考慮せず、またより短い混入オリゴヌクレオチド及
び非反応オリゴヌクレオチドの変動も考慮していない。
この着色ＤＮＡのアリコートを２０％ポリアクリルアミ
ドゲルにて電気泳動にかけ、この長さのオリゴヌクレオ
チドに適切な移動度の単一の着色（及び蛍光性）バンド
として明らかに見られた。
【００２６】染料結合したオリゴヌクレオチドは、高性
能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により逆転相Ｃ
18カラム（ウォーターズ社）で溶出用としてアセトニト
リル：０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（ｐ
Ｈ７．０）勾配を用いて容易に精製された。
【００２７】上記した新規なアミノ誘導化オリゴヌクレ
オチドには多くの用途が可能である。脂肪族アミノ基は
容易かつ特異的に多数の官能基と反応する。これは、実
質的に任意の所望の分子が上記のように作成されたオリ
ゴヌクレオチドに結合しうることを意味する。これは酵
素、他の蛋白質、蛍光標識、生物発光性標識、発色団な
どを包含する。オリゴヌクレオチドは、多くの分野にし
ばしば放射性標識と組み合せて広く使用されている。非
放射性試料分子を放射性標識の代りに使用することもで
きる。これは、オリゴヌクレオチドを使用する方法をよ
り安価にし、かつ使用を容易となし、さらに臨床用途に
適合させる。放射性標識は大して好適でないが、この新
規なアミノ誘導化オリゴヌクレオチドを、例えばＩ125
のように放射性標識することもできる。新規なアミノ誘
導化オリゴヌクレオチドの用途に関する次の３つの特定
例のみを例示する： １．自動化ＤＮＡ配列決定、 ２．ＤＮＡハイブリッド化による遺伝子病の検出、 ３．ハイブリッド化の検出のための蛍光の一般的使用。
【００２８】遺伝子異常の検出：オリゴヌクレオチドを
使用して個人の遺伝子型を決定することができる。これ
は、アミニオセンテシスにより胎児から得られたＤＮＡ
試料につき行なわれる。この情報は、各種の遺伝子病に
対する危険において夫婦の遺伝子カウンセリングに対し
不変である。成人の遺伝子型をも決定して、効果的診断
及び早期の処置を可能にする。この技術の顕著な１例
は、鎌状赤血球貧血症の検出である［コナー(Connor)
等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイ
エンス、Ｕ．Ｓ．Ａ．第８０巻、第２７８頁（１９８
３）］。１９個の塩基対長さの合成オリゴヌクレオチド
を合成し、一方は正常なヒトβ−グロビン遺伝子（β
A ）に対し補完的であり、かつ一方は鎌状赤血球β−グ
ロビン遺伝子（βS ）に対し補完的である。これらの分
子を放射能標識し、ＤＮＡハイブリッド化における試料
として使用した。適当なハイブリッド化条件の下で、こ
れら試料を使用してβA 遺伝子をβS 対立遺伝子から区
別することができる。これは鎌状赤血球貧血症の診断を
可能にする。より一般的には、コナー等の文献に指摘さ
れたように、「オリゴヌクレオチドの対立遺伝子特異性
のハイブリッド化特性は、単一コピー遺伝子のＤＮＡ配
列におけるポイント突然変異を含む任意の遺伝子病の一
般的診断方法を与える」。本発明はこの技術に直接使用
することができる。アミノ基を有するオリゴヌクレオチ
ド試料を作成し、これに蛍光標識をラベルする。蛍光性
試料分子は放射性試料の短い寿命と比べて無限に安定で
あり、使用又は取り扱いに関し特殊の注意を必要としな
い。このことは、臨床用途においてこの方法を極めて好
適となし、これが事実上使用しうる主たる領域である。
【００２９】オリゴヌクレオチド試料は、研究並びに臨
床用途に広く使用される。これらは、「ライブラリー」
すなわちプラスミド又はファージベクター中にクローン
化されて生物の全ゲノム（または発現ＲＮＡ）を含む配
列を有するＤＮＡ断片のコレクションにおいて、ＤＮＡ
片及び所望配列を検出するために一般的に使用される。
さらに、これらは、特定ＤＮＡ片の制限分解物の「ブロ
ット」における所定配列のＤＮＡにハイブリッド化させ
るためにも使用される。これら全ての例或いはその他の
例において、オリゴヌクレオチドには一般に５’末端に
Ｐ32を標識し、かつ分子をオートラジオグラフィーによ
り検出する。本発明は、蛍光染料によるオリゴヌクレオ
チドの標識を開示する。したがって、蛍光を使用して、
放射能が従来使用されている任意の技術で分子を検出す
ることができる。これは、たとえば試料の安定性、使用
のコスト及び容易さ並びに廃棄のような放射能に対する
多くの利点を有する。以上、本発明を説明したが、本発
明はこれらのみに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】オリゴヌクレオチドの部分構造である。
【図２】５’−トリフルオロアセタミド−５’−デオキ
シ−３’Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミドチミジ
ンである。
【図３】市販化合物Ｉ（チミジン）からの化合物ＶＩ
（５’−トリフルオロアセタミド−５’−デオキシ−
３’−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミドチミジ
ン）の合成経路である。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ５’末端ヌクレオシドの５’炭素原子の
    アミノ基に結合した検出可能な発蛍光団又は発色団を有
    する単一鎖のオリゴヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 前記のオリゴヌクレオチドが５’末端
    ５’−アミノ−５’デオキシチミジンヌクレオシド部分
    を含む、請求項１に記載の化合物。
  3. 【請求項３】 ５’末端ヌクレオシドの５’炭素原子の
    アミノ基に結合した検出可能な発蛍光団又は発色団を有
    する単一鎖のオリゴヌクレオチドの製造方法であって、
    アミノヌクレオシドホスホルアミダイトを固相支持体上
    におけるオリゴヌクレオチド合成の最終のカップリング
    段階で反応させることによってアミノ基を導入し、そし
    て検出可能な発蛍光団又は発色団を前記のアミノ基に結
    合する、前記の製造方法。
  4. 【請求項４】 保護された５’−アミノ−５’−デオキ
    シ−３’−ホスホルアミドチミジンを反応させることに
    よってアミノ基を導入する、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 ホスホルアミダイト化合物が下記の一般
    式： 【化１】 （式中、Ｂはヌクレオシド塩基或はヌクレオシド塩基ア
    ナログであり、Ｒ1 及びＲ2 は低級アルキルである）を
    有する改良された請求項３に記載の方法。
  6. 【請求項６】 オリゴヌクレオチドを次いで支持体から
    開裂する、請求項５に記載の方法。
JP11959792A 1983-12-20 1992-04-14 アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成 Expired - Lifetime JPH0678353B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56501083A 1983-12-20 1983-12-20
US565010 1990-08-09

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP25102888A Division JPH01250393A (ja) 1983-12-20 1988-10-06 アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH06145192A JPH06145192A (ja) 1994-05-24
JPH0678353B2 true JPH0678353B2 (ja) 1994-10-05

Family

ID=24256835

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP59266525A Granted JPS60197698A (ja) 1983-12-20 1984-12-19 アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成
JP25102888A Granted JPH01250393A (ja) 1983-12-20 1988-10-06 アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成
JP11959792A Expired - Lifetime JPH0678353B2 (ja) 1983-12-20 1992-04-14 アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP59266525A Granted JPS60197698A (ja) 1983-12-20 1984-12-19 アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成
JP25102888A Granted JPH01250393A (ja) 1983-12-20 1988-10-06 アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成

Country Status (6)

Country Link
JP (3) JPS60197698A (ja)
CA (1) CA1244786A (ja)
DE (1) DE3446635C2 (ja)
FR (1) FR2556726B1 (ja)
GB (1) GB2153356B (ja)
SE (1) SE466208B (ja)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1223831A (en) 1982-06-23 1987-07-07 Dean Engelhardt Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same
US4849513A (en) * 1983-12-20 1989-07-18 California Institute Of Technology Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups
US5118800A (en) * 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5015733A (en) * 1983-12-20 1991-05-14 California Institute Of Technology Nucleosides possessing blocked aliphatic amino groups
USRE43096E1 (en) 1984-01-16 2012-01-10 California Institute Of Technology Tagged extendable primers and extension products
US5821058A (en) * 1984-01-16 1998-10-13 California Institute Of Technology Automated DNA sequencing technique
GB8509880D0 (en) * 1985-04-17 1985-05-22 Ici Plc Testing device
US4762779A (en) * 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US4757141A (en) * 1985-08-26 1988-07-12 Applied Biosystems, Incorporated Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof
US4959463A (en) * 1985-10-15 1990-09-25 Genentech, Inc. Intermediates
US4855225A (en) * 1986-02-07 1989-08-08 Applied Biosystems, Inc. Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides
DE3642939A1 (de) * 1986-06-03 1987-12-10 Europ Lab Molekularbiolog Verfahren zur dna-markierung
CA1340806C (en) * 1986-07-02 1999-11-02 James Merrill Prober Method, system and reagents for dna sequencing
US5242796A (en) * 1986-07-02 1993-09-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method, system and reagents for DNA sequencing
US4904582A (en) * 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US4833332A (en) * 1987-06-12 1989-05-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Scanning fluorescent detection system
US4965349A (en) * 1987-12-24 1990-10-23 Applied Biosystems, Inc. Method of synthesizing oligonucleotides labeled with ammonia-labile groups on solid phase supports
US5262536A (en) * 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US4997928A (en) * 1988-09-15 1991-03-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fluorescent reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
GB8822228D0 (en) * 1988-09-21 1988-10-26 Southern E M Support-bound oligonucleotides
JPH05509110A (ja) * 1990-12-11 1993-12-16 アボツト・ラボラトリーズ オリゴヌクレオチドの標識方法
US5643722A (en) * 1994-05-11 1997-07-01 Trustees Of Boston University Methods for the detection and isolation of proteins
US6020481A (en) * 1996-04-01 2000-02-01 The Perkin-Elmer Corporation Asymmetric benzoxanthene dyes
SE522077C2 (sv) * 1997-09-05 2004-01-13 Lightup Technologies Ab Förfarande att välja sekvens hos sond för nukleinsyrahybridisering
DE19815864A1 (de) * 1998-04-08 1999-10-14 Europ Lab Molekularbiolog 5'-modifizierte Nukleotide und ihre Anwendung in der Molekularbiologie und Medizin
US6965041B1 (en) 1999-03-24 2005-11-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services N-acylphosphoramidites and their use in oligonucleotide synthesis
US7355037B2 (en) 2001-12-03 2008-04-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Thermolabile hydroxyl protecting groups and methods of use
US9809824B2 (en) 2004-12-13 2017-11-07 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services CpG oligonucleotide prodrugs, compositions thereof and associated therapeutic methods

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3284440A (en) * 1964-06-12 1966-11-08 Merck & Co Inc Phosphate esters of cytosine arabinoide and process for preparing same
US3847898A (en) * 1969-05-27 1974-11-12 Upjohn Co N4-trihaloethoxy carbonyl arabino-furanosyl cytosine 5'-esters
DE2924332A1 (de) * 1978-06-22 1980-01-03 Miles Lab Flavin-adenin-dinukleotid-markiertes konjugat und dessen verwendung in spezifischen bindungsversuchen
DE2924249C2 (de) * 1978-06-22 1989-04-27 Miles, Inc., Elkhart, Ind., Us Spezifische bindungs-untersuchungsmethode zur bestimmung eines liganden in einem fluessigen medium und reagentien zur durchfuehrung dieser methode
US4415732A (en) * 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
FR2519005B1 (fr) * 1981-12-29 1985-10-25 Pasteur Institut Fragments d'adn marques a l'une au moins de leurs extremites par des ribonucleotides modifies reconnaissables par des molecules affines et procede pour realiser une analyse de tels fragments d'adn

Also Published As

Publication number Publication date
SE8406484L (sv) 1985-06-21
GB2153356A (en) 1985-08-21
JPH06145192A (ja) 1994-05-24
JPH0460600B2 (ja) 1992-09-28
GB8432205D0 (en) 1985-01-30
JPS60197698A (ja) 1985-10-07
JPH01250393A (ja) 1989-10-05
SE466208B (sv) 1992-01-13
CA1244786A (en) 1988-11-15
SE8406484D0 (sv) 1984-12-19
JPH0157119B2 (ja) 1989-12-04
FR2556726B1 (fr) 1987-02-20
GB2153356B (en) 1987-07-22
FR2556726A1 (fr) 1985-06-21
DE3446635A1 (de) 1985-06-27
DE3446635C2 (de) 1997-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH0678353B2 (ja) アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成
US5817786A (en) Single-stranded labelled oligonucleotides of preselected sequences
US5015733A (en) Nucleosides possessing blocked aliphatic amino groups
US4849513A (en) Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups
US5118800A (en) Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5118802A (en) DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
JP3140127B2 (ja) ３′−（２′）−アミノ−またはチオール−修飾された螢光色素結合ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、並びにその製造法および使用
EP0227459B1 (en) Arabinonucleic acid probes for dna/rna assays
JP4714320B2 (ja) アミノ基転移による固相核酸標識化
EP1877415B1 (en) New labelling strategies for the sensitive detection of analytes
US6040439A (en) Method for chemical synthesis of oligonucleotides
JPH10511691A (ja) 新規な保護基及びオリゴヌクレオチド合成のための改良方法における核新規な保護基の使用
WO2008037568A2 (en) Reversible terminators for efficient sequencing by synthesis
US6013434A (en) Oligonucleotide-polyamide conjugates
US7098326B2 (en) Methods for the integrated synthesis and purification of oligonucleotides
WO1993024511A1 (en) Oligonucleotide-polyamide conjugates
US5631361A (en) Method of synthesizing radioisotopically labeled oligonucleotides by direct solid-phase 5' phosphitylation
EP0302881A1 (en) Polynucleotide probes on solid support through photo-labile linkage
JPH064670B2 (ja) 酵素標識化されたポリヌクレオチドおよびその製法
JP4467930B2 (ja) ヌクレオチド標識試薬およびそれが導入されたオリゴヌクレオチド誘導体
JP2723360B2 (ja) オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲート
McGuire Synthesis and studies of modified nucleotides and oligonucleotides
AU4054693A (en) Oligonucleotide-polyamide conjugates
WO2007105623A1 (ja) オリゴヌクレオチド固定化固相担体

Legal Events

Date Code Title Description
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 19950328

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term