JP3140127B2 - ３′−（２′）−アミノ−またはチオール−修飾された螢光色素結合ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、並びにその製造法および使用 - Google Patents
３′−（２′）−アミノ−またはチオール−修飾された螢光色素結合ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、並びにその製造法および使用Info
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Description
【０００１】標識されたオリゴヌクレオチドは、ハイブ
リダイゼーションプローブとして一般的に用いられてお
り且つ制限消化により天然の遺伝子物質から調製される
ＤＮＡプローブよりも扱いやすいので、遺伝子工学にお
いて極めて多数の用途が見出だされている。
リダイゼーションプローブとして一般的に用いられてお
り且つ制限消化により天然の遺伝子物質から調製される
ＤＮＡプローブよりも扱いやすいので、遺伝子工学にお
いて極めて多数の用途が見出だされている。
【０００２】いわゆるアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレ
オチドの形態で用いられる標識されたオリゴヌクレオチ
ドは調節するやり方で細胞の出来事に介入することがで
きるので、例えばタンパク質発現のインビボでの検討に
ついて重要性が増大してきている。現在の知識によれ
ば、この機構はＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよび
ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用によって起こるが、詳細は未だ
解明されていない。
オチドの形態で用いられる標識されたオリゴヌクレオチ
ドは調節するやり方で細胞の出来事に介入することがで
きるので、例えばタンパク質発現のインビボでの検討に
ついて重要性が増大してきている。現在の知識によれ
ば、この機構はＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよび
ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用によって起こるが、詳細は未だ
解明されていない。
【０００３】標識されたオリゴヌクレオチドは、インビ
トロでは例えばこの標識されたオリゴヌクレオチドを用
いることによって遺伝子バンク内の遺伝子フラグメント
の同定に用いて、遺伝子バンクのブロットした遺伝子プ
ローブの検査および同定を行う。
トロでは例えばこの標識されたオリゴヌクレオチドを用
いることによって遺伝子バンク内の遺伝子フラグメント
の同定に用いて、遺伝子バンクのブロットした遺伝子プ
ローブの検査および同定を行う。
【０００４】インビトロまたはインビボでこのような実
験を行うことができるようにするためには、オリゴヌク
レオチドは前記のように標識しなければならない。好適
な同位体による放射能標識の外に、既に用いられている
非放射性標識の一つの形態は、誘導体形成した螢光色素
であって、これはいっそう容易で危険性の少ない取扱い
を提供する。
験を行うことができるようにするためには、オリゴヌク
レオチドは前記のように標識しなければならない。好適
な同位体による放射能標識の外に、既に用いられている
非放射性標識の一つの形態は、誘導体形成した螢光色素
であって、これはいっそう容易で危険性の少ない取扱い
を提供する。
【０００５】今日まで、この種の技法は、既にＤＮＡの
非放射性配列決定に首尾よく用いられてきている。これ
に対する方法は本質的にはサンガーの方法に基づいてい
る（エフ・サンガー(F. Sanger) 、エス・ニックレン
(S. Nicklen)およびエス・クールソン(S. Coulson)、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977) ）。
非放射性配列決定に首尾よく用いられてきている。これ
に対する方法は本質的にはサンガーの方法に基づいてい
る（エフ・サンガー(F. Sanger) 、エス・ニックレン
(S. Nicklen)およびエス・クールソン(S. Coulson)、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977) ）。
【０００６】螢光標識は、オリゴヌクレオチドの５′末
端（エル・イー・フード(L.E. Hood) 、エル・エム・ス
ミス(L.M. Smith)およびシー・ハイナー(C. Heiner) 、
Nature, 321, 674 (1986) ）またはヌクレオベース(nuc
leobase)（ジェイ・エム・プローバー(J.M. Prober) 、
ジー・エル・トレイナー(G.L.Trainor)およびアール・
ジェイ・ダム(R.J. Dam)、Science 238, 336 (1987) ）
に付けられる(G.L. Trainor, Anal.Chem. 62,418(199
0))。一番最後に述べた方法の決定的な不都合は、螢光
標識が合成中、すなわち重合中およびこの場合には特に
酵素的重合中に導入されるという事実に由来する。前記
の方法でのこの段階では、結果として若干のポリメラー
ゼしか合成に用いることができず、このポリメラーゼに
よるトリホスフェートの受容は少なくなり、更に、大過
剰の基質を必要とする。
端（エル・イー・フード(L.E. Hood) 、エル・エム・ス
ミス(L.M. Smith)およびシー・ハイナー(C. Heiner) 、
Nature, 321, 674 (1986) ）またはヌクレオベース(nuc
leobase)（ジェイ・エム・プローバー(J.M. Prober) 、
ジー・エル・トレイナー(G.L.Trainor)およびアール・
ジェイ・ダム(R.J. Dam)、Science 238, 336 (1987) ）
に付けられる(G.L. Trainor, Anal.Chem. 62,418(199
0))。一番最後に述べた方法の決定的な不都合は、螢光
標識が合成中、すなわち重合中およびこの場合には特に
酵素的重合中に導入されるという事実に由来する。前記
の方法でのこの段階では、結果として若干のポリメラー
ゼしか合成に用いることができず、このポリメラーゼに
よるトリホスフェートの受容は少なくなり、更に、大過
剰の基質を必要とする。
【０００７】しかしながら、螢光標識の導入はサンガー
の配列決定に限定されない。螢光標識によるマクサム−
ギルバートの化学的配列決定も知られている（エイチ・
ボス(H. Voss) 、シー・シュヴァーガー(C. Schwager)
、ユー・ヴィルクナー(U. Wirkner)、ビー・シュプロ
ート(B. Sproat) 、ジェイ・ツィンマーマン(J. Zimmer
mann) 、エイ・ローゼンタール(A. Rosenthal)、エイチ
・エルフル(H. Erfle)、ジェイ・ステージマン(J. Steg
emann)およびダブリュ・アンソルグ(W. Ansorge)、Nuc
l. Acids Res., 17, 2517(1989) ）。
の配列決定に限定されない。螢光標識によるマクサム−
ギルバートの化学的配列決定も知られている（エイチ・
ボス(H. Voss) 、シー・シュヴァーガー(C. Schwager)
、ユー・ヴィルクナー(U. Wirkner)、ビー・シュプロ
ート(B. Sproat) 、ジェイ・ツィンマーマン(J. Zimmer
mann) 、エイ・ローゼンタール(A. Rosenthal)、エイチ
・エルフル(H. Erfle)、ジェイ・ステージマン(J. Steg
emann)およびダブリュ・アンソルグ(W. Ansorge)、Nuc
l. Acids Res., 17, 2517(1989) ）。
【０００８】これと同様に、螢光検出器による制限フラ
グメントのマッピングも記載されている（エイ・ヴィ・
カラノ(A.V. Carrano)、ジェイ・ラマディン(J. Lamerd
in）、エル・ケイ・アシュワース(L.K. Ashworth) 、ビ
ー・ワトキンス(B. Watkins)、イー・ブランスコム(E.
Branscomb)、ティー・スレザック(T. Slezak) 、エム・
ラフ(M. Raff) ピー・ジェイ・ドゥ・ジョング(P.J. de
Jong)、ディー・カイト(D. Keith)、エル・マックブラ
イド(L. McBride)、エス・マイスター(S. Meister)、エ
ム・クローニック(M. Kronick)、Genomics, 4, 129 (19
89））、およびエス・ブレンナー(S. Brenner)およびケ
イ・ジェイ・リヴァック(K.J. Livak)Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 86, 8902 (1989) ）。
グメントのマッピングも記載されている（エイ・ヴィ・
カラノ(A.V. Carrano)、ジェイ・ラマディン(J. Lamerd
in）、エル・ケイ・アシュワース(L.K. Ashworth) 、ビ
ー・ワトキンス(B. Watkins)、イー・ブランスコム(E.
Branscomb)、ティー・スレザック(T. Slezak) 、エム・
ラフ(M. Raff) ピー・ジェイ・ドゥ・ジョング(P.J. de
Jong)、ディー・カイト(D. Keith)、エル・マックブラ
イド(L. McBride)、エス・マイスター(S. Meister)、エ
ム・クローニック(M. Kronick)、Genomics, 4, 129 (19
89））、およびエス・ブレンナー(S. Brenner)およびケ
イ・ジェイ・リヴァック(K.J. Livak)Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 86, 8902 (1989) ）。
【０００９】螢光色素をヌクレオシド、ヌクレオチドま
たはオリゴヌクレオチドの３′−（２′）位（αまたは
β位）にアミノまたはチオール基を介して結合させるこ
とができ、この化合物は鋳型鎖またはオリゴヌクレオチ
ドの存在下にて相補鎖を合成することおよびインビボお
よびインビトロで遺伝子物質を検出するために好都合に
用いることができる。
たはオリゴヌクレオチドの３′−（２′）位（αまたは
β位）にアミノまたはチオール基を介して結合させるこ
とができ、この化合物は鋳型鎖またはオリゴヌクレオチ
ドの存在下にて相補鎖を合成することおよびインビボお
よびインビトロで遺伝子物質を検出するために好都合に
用いることができる。
【００１０】したがって、本発明は、 １． 式Ｉ
【化３】 （式中、Ｒ１はプリンまたはピリミジン塩基であり、基
Ｒ２およびＲ３の少なくとも一方はアミノまたはチオー
ル基を介して結合したαまたはβ位における螢光色素で
あり、他の基は所望によりαまたはβ位における水素、
ヒドロキシル、保護されたヒドロキシルまたはメトキシ
基であり、ｎは０またはそれより大きい数であり、Ｒ４
は５′保護基またはホスフェート、ピロホスフェートま
たはトリホスフェートであり、Ｒ５は酸素、フルオロメ
チレン、ジフルオロメチレンまたはメチレンであり、Ｒ
６はαまたはβ位におけるヒドロキシルまたはメトキシ
基または水素であり、但し、Ｒ１、Ｒ５およびＲ６はそ
れぞれの場合に同じまたは異なる意味を有することがで
き、ＹおよびＸは酸素、硫黄、ＮＨまたはメチレンであ
り、但し、ＸおよびＹはそれぞれの場合に同じまたは異
なることができる）を有する物質、 ２． ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチドの３′および／または２′位に位置するＯＨ基を
アミノまたはチオール基に誘導形成した後、螢光色素に
結合させることを特徴とする、１に記載の化合物の製造
法、 ３． ａ） 鋳型鎖の存在下における相補鎖の合成、 ｂ） 定義されたオリゴヌクレオチドの合成、 ｃ） インビボおよびインビトロにおけるその検出、お
よび ｄ） インビボおよびインビトロにおける核酸の検出、 における１に記載の化合物の使用、に関する。
Ｒ２およびＲ３の少なくとも一方はアミノまたはチオー
ル基を介して結合したαまたはβ位における螢光色素で
あり、他の基は所望によりαまたはβ位における水素、
ヒドロキシル、保護されたヒドロキシルまたはメトキシ
基であり、ｎは０またはそれより大きい数であり、Ｒ４
は５′保護基またはホスフェート、ピロホスフェートま
たはトリホスフェートであり、Ｒ５は酸素、フルオロメ
チレン、ジフルオロメチレンまたはメチレンであり、Ｒ
６はαまたはβ位におけるヒドロキシルまたはメトキシ
基または水素であり、但し、Ｒ１、Ｒ５およびＲ６はそ
れぞれの場合に同じまたは異なる意味を有することがで
き、ＹおよびＸは酸素、硫黄、ＮＨまたはメチレンであ
り、但し、ＸおよびＹはそれぞれの場合に同じまたは異
なることができる）を有する物質、 ２． ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチドの３′および／または２′位に位置するＯＨ基を
アミノまたはチオール基に誘導形成した後、螢光色素に
結合させることを特徴とする、１に記載の化合物の製造
法、 ３． ａ） 鋳型鎖の存在下における相補鎖の合成、 ｂ） 定義されたオリゴヌクレオチドの合成、 ｃ） インビボおよびインビトロにおけるその検出、お
よび ｄ） インビボおよびインビトロにおける核酸の検出、 における１に記載の化合物の使用、に関する。
【００１１】本発明を、以下において具体的に好ましい
態様について記載する。本発明は特許請求の範囲の内容
によって更に定義される。
態様について記載する。本発明は特許請求の範囲の内容
によって更に定義される。
【００１２】式Ｉの化合物は、本質的には文献既知の方
法によって合成される（エム・ガイト(M. Gait) 、オリ
ゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis) アイ
アールエル−プレス(IRL-Press) 、オックスフォード、
1984年）。
法によって合成される（エム・ガイト(M. Gait) 、オリ
ゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis) アイ
アールエル−プレス(IRL-Press) 、オックスフォード、
1984年）。
【００１３】色素の３′および／または２′位への結合
は、式ＩＩの化合物、好ましくはヌクレオシドから開始
する。
は、式ＩＩの化合物、好ましくはヌクレオシドから開始
する。
【化４】
【００１４】式ＩＩ（式中、Ｒ１〜Ｒ６、Ｘ、Ｙおよび
ｎは前記の意味を有し、これらの置換基については同じ
であることまたは異なるものであることが可能であり、
Ｒ７またはＲ８は水素、ヒドロキシルまたは保護された
ヒドロキシルまたはメチレン基である）の化合物を結合
に用いる。色素の結合は、アミンまたはチオールを導入
することによって３′および／または２′位におけるヒ
ドロキシル基を介して起こる。
ｎは前記の意味を有し、これらの置換基については同じ
であることまたは異なるものであることが可能であり、
Ｒ７またはＲ８は水素、ヒドロキシルまたは保護された
ヒドロキシルまたはメチレン基である）の化合物を結合
に用いる。色素の結合は、アミンまたはチオールを導入
することによって３′および／または２′位におけるヒ
ドロキシル基を介して起こる。
【００１５】アジドを導入するために脱離基は３′−
（２′）位に導入される。脱離基として好適なものは、
好ましくはトリフレートまたはメシレートまたはトシレ
ートである。アジドは、アジド好ましくはアジ化リチウ
ムによる求核攻撃によって導入される。チオレートまた
はＳ−保護チオレートの求核攻撃では、チオールまたは
保護されたチオールを生成する。ヌクレオシドの糖部分
において要求される立体化学は、ＳＮ２置換によって最
も良好に達成することができる。
（２′）位に導入される。脱離基として好適なものは、
好ましくはトリフレートまたはメシレートまたはトシレ
ートである。アジドは、アジド好ましくはアジ化リチウ
ムによる求核攻撃によって導入される。チオレートまた
はＳ−保護チオレートの求核攻撃では、チオールまたは
保護されたチオールを生成する。ヌクレオシドの糖部分
において要求される立体化学は、ＳＮ２置換によって最
も良好に達成することができる。
【００１６】アミノ基はアジドとその後のアミンへの還
元によって直接に得ることができる（文献：ダブリュ・
エス・マンガル(W.S. Mungall)およびアール・エル・レ
ットジンガー(R.L. Letsinger)、J. Org.Chem., 40巻,
11号, 1659 (1975) ）。トリフェニルホスフィンと水と
を用いるスタウジンガー反応がこの段階では好ましい
（文献：エム・メイ(M. May)およびジェイ・ダブリュ・
エンジェルス(J.W. Engels), Nucl. Acids Res., 17, 1
5, 5973 (1989)）。
元によって直接に得ることができる（文献：ダブリュ・
エス・マンガル(W.S. Mungall)およびアール・エル・レ
ットジンガー(R.L. Letsinger)、J. Org.Chem., 40巻,
11号, 1659 (1975) ）。トリフェニルホスフィンと水と
を用いるスタウジンガー反応がこの段階では好ましい
（文献：エム・メイ(M. May)およびジェイ・ダブリュ・
エンジェルス(J.W. Engels), Nucl. Acids Res., 17, 1
5, 5973 (1989)）。
【００１７】総ての化合物の構造および立体配置は、Ｎ
ＭＲ、元素分析、ＵＶ、ＩＲ等によって決定した。
ＭＲ、元素分析、ＵＶ、ＩＲ等によって決定した。
【００１８】重縮合が完了した後、ＤＮＡの３′末端の
糖部分の遊離の３′−（２′）−アミノまたはチオール
基を反応性の螢光色素と文献既知の方法によって反応さ
せることが可能である（フンカピラー(Hunkapiller) 、
Nucl. Acids Res., 13, 2399, 1985；ホッジス・アール
・アール(Hodges R.R.) ら、Biochemistry, 28巻,261
(1989)）。
糖部分の遊離の３′−（２′）−アミノまたはチオール
基を反応性の螢光色素と文献既知の方法によって反応さ
せることが可能である（フンカピラー(Hunkapiller) 、
Nucl. Acids Res., 13, 2399, 1985；ホッジス・アール
・アール(Hodges R.R.) ら、Biochemistry, 28巻,261
(1989)）。
【００１９】また、アミノ基はミツノブ反応（Synthesi
s, 1巻, 1981, 1 頁）およびヤマモトらによって記載さ
れた反応（J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1, 1, 306,198
0）によっても得られる。螢光色素のチオール基を介す
る結合は同様の方法で行われる。しかしながら、アジド
の代わりにチオールは保護されたまたは未保護の形態で
導入される。
s, 1巻, 1981, 1 頁）およびヤマモトらによって記載さ
れた反応（J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1, 1, 306,198
0）によっても得られる。螢光色素のチオール基を介す
る結合は同様の方法で行われる。しかしながら、アジド
の代わりにチオールは保護されたまたは未保護の形態で
導入される。
【００２０】螢光色素のヌクレオシド、ヌクレオチドま
たはオリゴヌクレオチドの遊離のアミノ基またはチオー
ル官能基(functionality) への結合は、代わりにそれら
を使用した後にのみ起こるようにすることもできる。例
えば、全混合物を螢光色素で標識することによるＤＮＡ
またはＲＮＡ配列決定反応の終了段階の後に螢光色素反
応を行うことが可能である。
たはオリゴヌクレオチドの遊離のアミノ基またはチオー
ル官能基(functionality) への結合は、代わりにそれら
を使用した後にのみ起こるようにすることもできる。例
えば、全混合物を螢光色素で標識することによるＤＮＡ
またはＲＮＡ配列決定反応の終了段階の後に螢光色素反
応を行うことが可能である。
【００２１】原則的には、螢光色素としてアミノまたは
チオール基と反応する総ての市販の色素、好ましくはフ
ルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ＮＢＤ
（シグマ(Sigma) 社製の４−フルオロ−７−ニトロベン
ゾフラザン）、クマリン、フルオレサミン、スクシニル
フルオレセインおよびダンシルを用いることが可能であ
る。
チオール基と反応する総ての市販の色素、好ましくはフ
ルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ＮＢＤ
（シグマ(Sigma) 社製の４−フルオロ−７−ニトロベン
ゾフラザン）、クマリン、フルオレサミン、スクシニル
フルオレセインおよびダンシルを用いることが可能であ
る。
【００２２】誘導体形成した反応混合物をゲル電気泳動
によって分別し、光度測定法またはレーザー分光分析法
によって検出することができる（エイチ・スワードロウ
(H. Swerdlow) およびアール・ゲスターランド(R. Gest
erland), Nucl. AcidsRes., 18, 1415 頁(1990)）。キ
ャピラリー電気泳動（エイ・エス・コーエン(A.S. Cohe
n)ら, P.N.A.S. US., 85, 9660 (1988) ）、例えばアク
リルアミドゲルを充填したものも十分利用出ることが判
った。この場合には、キャピラリーからの出口で検出を
行うのが好ましい（エイチ・スワードロウ(H. Swerdlo
w),エス・ヴー(S. Wu),エイチ・ハルケ(H. Harke), エ
ヌ・ドヴィチ(N. Dovichi)，Chromatography 516,61 (1
990)）。
によって分別し、光度測定法またはレーザー分光分析法
によって検出することができる（エイチ・スワードロウ
(H. Swerdlow) およびアール・ゲスターランド(R. Gest
erland), Nucl. AcidsRes., 18, 1415 頁(1990)）。キ
ャピラリー電気泳動（エイ・エス・コーエン(A.S. Cohe
n)ら, P.N.A.S. US., 85, 9660 (1988) ）、例えばアク
リルアミドゲルを充填したものも十分利用出ることが判
った。この場合には、キャピラリーからの出口で検出を
行うのが好ましい（エイチ・スワードロウ(H. Swerdlo
w),エス・ヴー(S. Wu),エイチ・ハルケ(H. Harke), エ
ヌ・ドヴィチ(N. Dovichi)，Chromatography 516,61 (1
990)）。
【００２３】５′位にトリホスフェートを有する式Ｉの
化合物から出発すると、任意の好適なプライマーと鋳型
鎖を用いてポリメラーゼ、すなわち好適な基質の存在下
で配列の真の相補コピーを４種類のヌクレオシドトリホ
スフェートの存在下で合成する酵素の助けによって、好
ましくはＴ７またはＴａｑポリメラーゼ、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩおよび逆転写酵素の助けによってＤＮＡ二本鎖
の合成を行うことが可能である。好適な５′保護基は、
トリチル、メトキシ−またはジメトキシトリチルである
（ガイト(Gait)、オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleo
tide Synthesis) アイアールエル−プレス(IRL-Press)
、オックスフォード、1984年）。
化合物から出発すると、任意の好適なプライマーと鋳型
鎖を用いてポリメラーゼ、すなわち好適な基質の存在下
で配列の真の相補コピーを４種類のヌクレオシドトリホ
スフェートの存在下で合成する酵素の助けによって、好
ましくはＴ７またはＴａｑポリメラーゼ、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩおよび逆転写酵素の助けによってＤＮＡ二本鎖
の合成を行うことが可能である。好適な５′保護基は、
トリチル、メトキシ−またはジメトキシトリチルである
（ガイト(Gait)、オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleo
tide Synthesis) アイアールエル−プレス(IRL-Press)
、オックスフォード、1984年）。
【００２４】合成の終結は、具体的にはそれぞれの場合
に式Ｉの３′−（２′）−アミノ−修飾Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ
ヌクレオチドを用いることによって決定することができ
る。これは、修飾ヌクレオチドの使用によって非常に塩
基特異的な反応の終結を確実に行うことができるので、
鋳型鎖の存在下でのＤＮＡ相補鎖の合成およびＤＮＡ鎖
の配列決定にも特に重要である。
に式Ｉの３′−（２′）−アミノ−修飾Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ
ヌクレオチドを用いることによって決定することができ
る。これは、修飾ヌクレオチドの使用によって非常に塩
基特異的な反応の終結を確実に行うことができるので、
鋳型鎖の存在下でのＤＮＡ相補鎖の合成およびＤＮＡ鎖
の配列決定にも特に重要である。
【００２５】ＲＮＡヌクレオシド、ヌクレオチドおよび
オリゴヌクレオチドの合成は、同様に行われる。
オリゴヌクレオチドの合成は、同様に行われる。
【００２６】３′−（２′）末端でアミノ−またはチオ
−修飾し、重合支持体上で固定化されたスターターヌク
レオチドの助けによって誘導体形成可能なオリゴヌクレ
オチドの合成を更に行うことが可能である。
−修飾し、重合支持体上で固定化されたスターターヌク
レオチドの助けによって誘導体形成可能なオリゴヌクレ
オチドの合成を更に行うことが可能である。
【００２７】好適なオリゴヌクレオチドは総て通常の方
法で調製したＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドである
が、好ましくは長さが２〜１００、特に好ましくは１２
〜５０ヌクレオチド（化学合成）であるかまたは長さが
用いたポリメラーゼの効率によって３，０００ヌクレオ
チド（酵素合成）までのものである。
法で調製したＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドである
が、好ましくは長さが２〜１００、特に好ましくは１２
〜５０ヌクレオチド（化学合成）であるかまたは長さが
用いたポリメラーゼの効率によって３，０００ヌクレオ
チド（酵素合成）までのものである。
【００２８】オリゴヌクレオチド合成は、通常の方法
で、すなわち３′および５′方向でスターターヌクレオ
チド−支持体複合体から出発して行い、定義された配列
のオリゴヌクレオチドを合成することを可能にする。
で、すなわち３′および５′方向でスターターヌクレオ
チド−支持体複合体から出発して行い、定義された配列
のオリゴヌクレオチドを合成することを可能にする。
【００２９】スターターヌクレオシドは、市販の支持体
上で合成の後に開裂することができる連結アーム（スペ
ーサー）を介して、例えば文献既知のコハク酸結合を介
してまたはウレタンによる結合（エフィモフ(Efimov)
ら、Nucl. Acids Res., 11,8369, 1983) ）を介して固
定化される。
上で合成の後に開裂することができる連結アーム（スペ
ーサー）を介して、例えば文献既知のコハク酸結合を介
してまたはウレタンによる結合（エフィモフ(Efimov)
ら、Nucl. Acids Res., 11,8369, 1983) ）を介して固
定化される。
【００３０】合成を行った後に、オリゴヌクレオチドは
好適な試薬を用いて支持体から開裂しなければならな
い。その後直ちに任意の好適な螢光色素による誘導体形
成を行う。
好適な試薬を用いて支持体から開裂しなければならな
い。その後直ちに任意の好適な螢光色素による誘導体形
成を行う。
【００３１】３′−（２′）末端で修飾され且つこの方
法で合成されたオリゴヌクレオチドを次に例えば相補オ
リゴヌクレオチドの検出に用いることができる。
法で合成されたオリゴヌクレオチドを次に例えば相補オ
リゴヌクレオチドの検出に用いることができる。
【００３２】本発明による使用は２つの利点を兼ね備え
ている。 １） 標識した相補鎖の調製において、末端３′−
（２′）−アミノ−またはチオール−修飾ヌクレオチド
によって同時に鎖が終結する。３′−（２′）位におけ
るその螢光色素の標識により更に危険のない検出が可能
になる。 ２） 厳密に定義されたオリゴヌクレオチドの調製で
は、支持体に結合し且つ同様に３′−（２′）−アミノ
−またはチオール−修飾されたスターターヌクレオチド
の標識により螢光標識および検出の可能性と連合した正
確なオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。
ている。 １） 標識した相補鎖の調製において、末端３′−
（２′）−アミノ−またはチオール−修飾ヌクレオチド
によって同時に鎖が終結する。３′−（２′）位におけ
るその螢光色素の標識により更に危険のない検出が可能
になる。 ２） 厳密に定義されたオリゴヌクレオチドの調製で
は、支持体に結合し且つ同様に３′−（２′）−アミノ
−またはチオール−修飾されたスターターヌクレオチド
の標識により螢光標識および検出の可能性と連合した正
確なオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。
【００３３】
【実施例】以下の例は本発明を更に詳しく説明するもの
である。 例 １． アノマー３′または２′−アミノ−またはアジド
−ヌクレオシド＝５′トリホスフェート 例１ ５′−トリホスフェート−３′−アミノ−３′−デオキ
シリボシド−チミジンの合成
である。 例 １． アノマー３′または２′−アミノ−またはアジド
−ヌクレオシド＝５′トリホスフェート 例１ ５′−トリホスフェート−３′−アミノ−３′−デオキ
シリボシド−チミジンの合成
【化５】 ５′−モノホスフェート−３′−アジド−３′−デオキ
シリボシド−チミジン ３′−アジドチミジン（シグマ）（１６０ｍｇ，０．６
ミリモル）をトリエチルホスフェート１０ｍｌに撹拌溶
解する。ＰＯＣｌ３の０．２ｍｌをトリエチルホスフェ
ート６ｍｌに溶解したものを、滴下漏斗から溶液に４℃
で加える。２４時間後に、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶
液５０ｍｌで中和し、トルエン６０ｍｌとエーテル１０
０ｍｌとでそれぞれ２回抽出する。水性相を蒸溜水５０
０ｍｌで希釈し、０．２モルＴＢＣ緩衝液（重炭酸トリ
エチルアンモニウム緩衝液；それ自身でｐＨ７．５に設
定した）２００ｍｌを通過させることによって逆イオン
(counter-ion) としてＨＣＯ３ −を入れた陰イオン交換
カラム（ＲセファデックスＡ−２５；５０×２．５ｃ
ｍ）に詰める。次いで、蒸溜水３００ｍｌを通過させる
ことによって精製を行い、最初に０．１モルＴＢＣ緩衝
液２００ｍｌで溶出し、次に直線状の０．１〜０．２モ
ルＴＢＣ緩衝液グラディエント（グラディエントの全容
積１３５０ｍｌ）で溶出を行う。一つのピークである生
成物ピークがクロマトグラムに現れる。生成物は０．１
２〜０．１５モルＴＢＣ緩衝液の緩衝液濃度で溶出し
た。ＴＬＣ陽性の２０ｍｌ画分を一緒にまとめ、凍結乾
燥によって濃縮する。重炭酸トリエチルアンモニウムを
エタノールを数回加えることによって除去する。生成物
は白色結晶トリエチルアンモニウム塩の形態である。 収率：２２０ｍｇ（５６．２％）；分子量６５１．８
１；Ｒｆ（アンモニア：イソプロパノール：水１０：７
０：２０）：０．４０；３００ＭＨｚ−１Ｈ−ＮＭＲ
（Ｄ２Ｏ）：１．３６（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３）；１．９０
（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）；２．５０（ｍ，４Ｈ，２′，
２″−Ｈ）；３．１８〜３．３０（ｄｄ，２Ｈ，Ｃ
Ｈ２）；４．１０（ｍ，１Ｈ，４′−Ｈ）；４．３
（ｍ，１Ｈ，３′−Ｈ）；６．３１（ｔ，１Ｈ，１′−
Ｈ）；７．７（ｓ，１Ｈ，６−Ｈ）；１１．５０（ｓ，
１Ｈ，ＮＨ），３００ＭＨｚ−31Ｐ−ＮＭＲ（８５％Ｈ
３ＰＯ４外部，Ｄ２Ｏ）：１．２３（ｓ，１Ｐ）。
シリボシド−チミジン ３′−アジドチミジン（シグマ）（１６０ｍｇ，０．６
ミリモル）をトリエチルホスフェート１０ｍｌに撹拌溶
解する。ＰＯＣｌ３の０．２ｍｌをトリエチルホスフェ
ート６ｍｌに溶解したものを、滴下漏斗から溶液に４℃
で加える。２４時間後に、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶
液５０ｍｌで中和し、トルエン６０ｍｌとエーテル１０
０ｍｌとでそれぞれ２回抽出する。水性相を蒸溜水５０
０ｍｌで希釈し、０．２モルＴＢＣ緩衝液（重炭酸トリ
エチルアンモニウム緩衝液；それ自身でｐＨ７．５に設
定した）２００ｍｌを通過させることによって逆イオン
(counter-ion) としてＨＣＯ３ −を入れた陰イオン交換
カラム（ＲセファデックスＡ−２５；５０×２．５ｃ
ｍ）に詰める。次いで、蒸溜水３００ｍｌを通過させる
ことによって精製を行い、最初に０．１モルＴＢＣ緩衝
液２００ｍｌで溶出し、次に直線状の０．１〜０．２モ
ルＴＢＣ緩衝液グラディエント（グラディエントの全容
積１３５０ｍｌ）で溶出を行う。一つのピークである生
成物ピークがクロマトグラムに現れる。生成物は０．１
２〜０．１５モルＴＢＣ緩衝液の緩衝液濃度で溶出し
た。ＴＬＣ陽性の２０ｍｌ画分を一緒にまとめ、凍結乾
燥によって濃縮する。重炭酸トリエチルアンモニウムを
エタノールを数回加えることによって除去する。生成物
は白色結晶トリエチルアンモニウム塩の形態である。 収率：２２０ｍｇ（５６．２％）；分子量６５１．８
１；Ｒｆ（アンモニア：イソプロパノール：水１０：７
０：２０）：０．４０；３００ＭＨｚ−１Ｈ−ＮＭＲ
（Ｄ２Ｏ）：１．３６（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３）；１．９０
（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）；２．５０（ｍ，４Ｈ，２′，
２″−Ｈ）；３．１８〜３．３０（ｄｄ，２Ｈ，Ｃ
Ｈ２）；４．１０（ｍ，１Ｈ，４′−Ｈ）；４．３
（ｍ，１Ｈ，３′−Ｈ）；６．３１（ｔ，１Ｈ，１′−
Ｈ）；７．７（ｓ，１Ｈ，６−Ｈ）；１１．５０（ｓ，
１Ｈ，ＮＨ），３００ＭＨｚ−31Ｐ−ＮＭＲ（８５％Ｈ
３ＰＯ４外部，Ｄ２Ｏ）：１．２３（ｓ，１Ｐ）。
【００３４】５′−トリホスフェート−３′−アジド−
３′−デオキシリボシド−チミジン トリエチルアンモニウム塩としての５′−モノホスフェ
ート−３′−アジド−３′，２′デオキシリボシド−チ
ミジン（１３０ｍｇ，０．２ミリモル）を無水ＤＭＦ
（ジメチルホルムアミド）６ｍｌに溶解させ、この溶液
に２５℃でＮ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾール（１６
２．１５ｍｇ，１ミリモル）を無水ＤＭＦ３ｍｌに溶解
したものを撹拌しながら加える。２時間の反応時間の後
に、無水メタノール１ｍｌを加え、混合物を更に１５分
間撹拌し、メタノールを留去する。残渣をトリ−ｎ−ブ
チルアンモニウムピロホスフェートをＤＭＦに溶解した
０．２モル溶液５ｍｌと混合し、室温で一晩撹拌する。
イミダゾールピロホスフェートから成る沈澱を濾別し、
ＤＭＦ２０ｍｌで洗浄し、濾液をロータリーエバポレー
ターで濃縮する。残渣を０．１モルＴＢＣ緩衝液２５０
ｍｌに溶解させ、溶液をＨＣＯ３ −を加えたセファデッ
クスＡ−２５陰イオン交換カラムに詰める。生成物を蒸
溜水２００ｍｌを通過させることによって精製し、０〜
０．５モルＴＢＣ緩衝液の直線状グラディエント（グラ
ディエントの全容積２，０００ｍｌ）で溶出させる。２
個のピークがクロマトグラムに現れ、最初のものはモノ
ホスフェートによって生じ、２番目のものは生成物によ
って生じる。生成物は、０．３０〜０．３５モルＴＢＣ
緩衝液の緩衝液濃度で溶出する。陽性の２０ｍｌ画分を
一緒にまとめ、凍結乾燥によって濃縮する。重炭酸トリ
エチルアンモニウムをエタノールを数回加えて除去す
る。生成物は白色結晶状のトリエチルアンモニウム塩の
形態である。 収率：９２ｍｇ（５０．４％）；分子量９１１．９５；
Ｒｆ（アンモニア：イソプロパノール：水１０：７０：
２０）：０．１４；３００ＭＨｚ−31Ｐ−ＮＭＲ（８５
％Ｈ３ＰＯ４外部，Ｄ２Ｏ）：−１０．７４（ｄ， 2Ｊ
PP＝２２．１Ｈｚ，１Ｐ，α−Ｐ原子）；−１１．４５
（ｄ， 2ＪPP＝２１．９Ｈｚ，１Ｐ，γ−Ｐ原子）；−
２２．９９（ｔ， 2ＪPP＝２０．３Ｈｚ，１Ｐ，β−Ｐ
原子）。
３′−デオキシリボシド−チミジン トリエチルアンモニウム塩としての５′−モノホスフェ
ート−３′−アジド−３′，２′デオキシリボシド−チ
ミジン（１３０ｍｇ，０．２ミリモル）を無水ＤＭＦ
（ジメチルホルムアミド）６ｍｌに溶解させ、この溶液
に２５℃でＮ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾール（１６
２．１５ｍｇ，１ミリモル）を無水ＤＭＦ３ｍｌに溶解
したものを撹拌しながら加える。２時間の反応時間の後
に、無水メタノール１ｍｌを加え、混合物を更に１５分
間撹拌し、メタノールを留去する。残渣をトリ−ｎ−ブ
チルアンモニウムピロホスフェートをＤＭＦに溶解した
０．２モル溶液５ｍｌと混合し、室温で一晩撹拌する。
イミダゾールピロホスフェートから成る沈澱を濾別し、
ＤＭＦ２０ｍｌで洗浄し、濾液をロータリーエバポレー
ターで濃縮する。残渣を０．１モルＴＢＣ緩衝液２５０
ｍｌに溶解させ、溶液をＨＣＯ３ −を加えたセファデッ
クスＡ−２５陰イオン交換カラムに詰める。生成物を蒸
溜水２００ｍｌを通過させることによって精製し、０〜
０．５モルＴＢＣ緩衝液の直線状グラディエント（グラ
ディエントの全容積２，０００ｍｌ）で溶出させる。２
個のピークがクロマトグラムに現れ、最初のものはモノ
ホスフェートによって生じ、２番目のものは生成物によ
って生じる。生成物は、０．３０〜０．３５モルＴＢＣ
緩衝液の緩衝液濃度で溶出する。陽性の２０ｍｌ画分を
一緒にまとめ、凍結乾燥によって濃縮する。重炭酸トリ
エチルアンモニウムをエタノールを数回加えて除去す
る。生成物は白色結晶状のトリエチルアンモニウム塩の
形態である。 収率：９２ｍｇ（５０．４％）；分子量９１１．９５；
Ｒｆ（アンモニア：イソプロパノール：水１０：７０：
２０）：０．１４；３００ＭＨｚ−31Ｐ−ＮＭＲ（８５
％Ｈ３ＰＯ４外部，Ｄ２Ｏ）：−１０．７４（ｄ， 2Ｊ
PP＝２２．１Ｈｚ，１Ｐ，α−Ｐ原子）；−１１．４５
（ｄ， 2ＪPP＝２１．９Ｈｚ，１Ｐ，γ−Ｐ原子）；−
２２．９９（ｔ， 2ＪPP＝２０．３Ｈｚ，１Ｐ，β−Ｐ
原子）。
【００３５】５′−トリホスフェート−３′−アミノ−
３′−デオキシリボシド−チミジン ５′−トリホスフェート−３′−アジド−３′，２′−
デオキシリボシド−チミジン（６８ｍｇ，０．０７５ミ
リモル）をジオキサン／蒸溜水（２：１）５ｍｌに溶解
し、撹拌しながら室温でトリフェニルホスフィン（２０
０ｍｇ，０．７５ミリモル）を加える。反応混合物を２
５℃で３０時間撹拌した後、溶媒を除去する。残渣を蒸
溜水３０ｍｌに溶解させ、それぞれエーテル３０ｍｌで
３回抽出する。水性相を１５０ｍｌに希釈し、溶液をＨ
ＣＯ３ −を加えたセファデックスＡ−２５陰イオン交換
カラムに詰める。生成物を蒸溜水２００ｍｌを通過させ
ることによって精製し、０〜０．５モルＴＢＣ緩衝液の
直線状グラディエント（グラディエントの全容積２，０
００ｍｌ）で溶出させる。クロマトグラムには３個のピ
ークが現れ、最初はモノホスフェート化合物６を表わ
し、第二のものは生成物ピークを第三のものは前駆体ピ
ーク７を表わす。生成物は０．４０〜０．４２モルＴＢ
Ｃ緩衝液の緩衝液濃度で溶出した。陽性の２５ｍｌ画分
を一緒に纏めて、凍結乾燥によって濃縮する。重炭酸ト
リエチルアンモニウムを、エタノールを加えて除去す
る。生成物は無定形の白色トリエチルアンモニウム塩の
形態である。 収率：５７ｍｇ（８５．７％）；分子量８８５．９０；
Ｒｆ（アンモニア：イソプロパノール：水１０：７０：
２０）：０．０８；３００ＭＨｚ−１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２
Ｏ）：１．３０（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３）；１．９２（ｓ，
３Ｈ，ＣＨ３）；２．６４（ｍ，４Ｈ，２′，２″−
Ｈ）；３．１９〜３．２１（ｄｄ，２Ｈ，ＣＨ２）；
４．２６（ｍ，１Ｈ，４′−Ｈ）；４．４１（ｍ，１
Ｈ，３′−Ｈ）；６．３４（ｔ， 3ＪHH＝６．７４Ｈ
ｚ，１Ｈ，１′−Ｈ）；７．６９（ｓ，１Ｈ，６−
Ｈ）；１１．５０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）。３００ＭＨｚ−
31Ｐ−ＮＭＲ（８５％Ｈ３ＰＯ４外部，Ｄ２Ｏ）：−１
０．７５（ｄ， 2ＪPP＝２２Ｈｚ，１Ｐ；α−Ｐ原
子）；−１１．４５（ｄ， 2ＪPP＝２１．９Ｈｚ，１
Ｐ，γ−Ｐ原子）；−２２．０５（ｔ， 3ＪPP＝２０．
４Ｈｚ，１Ｐ，β−Ｐ原子）。
３′−デオキシリボシド−チミジン ５′−トリホスフェート−３′−アジド−３′，２′−
デオキシリボシド−チミジン（６８ｍｇ，０．０７５ミ
リモル）をジオキサン／蒸溜水（２：１）５ｍｌに溶解
し、撹拌しながら室温でトリフェニルホスフィン（２０
０ｍｇ，０．７５ミリモル）を加える。反応混合物を２
５℃で３０時間撹拌した後、溶媒を除去する。残渣を蒸
溜水３０ｍｌに溶解させ、それぞれエーテル３０ｍｌで
３回抽出する。水性相を１５０ｍｌに希釈し、溶液をＨ
ＣＯ３ −を加えたセファデックスＡ−２５陰イオン交換
カラムに詰める。生成物を蒸溜水２００ｍｌを通過させ
ることによって精製し、０〜０．５モルＴＢＣ緩衝液の
直線状グラディエント（グラディエントの全容積２，０
００ｍｌ）で溶出させる。クロマトグラムには３個のピ
ークが現れ、最初はモノホスフェート化合物６を表わ
し、第二のものは生成物ピークを第三のものは前駆体ピ
ーク７を表わす。生成物は０．４０〜０．４２モルＴＢ
Ｃ緩衝液の緩衝液濃度で溶出した。陽性の２５ｍｌ画分
を一緒に纏めて、凍結乾燥によって濃縮する。重炭酸ト
リエチルアンモニウムを、エタノールを加えて除去す
る。生成物は無定形の白色トリエチルアンモニウム塩の
形態である。 収率：５７ｍｇ（８５．７％）；分子量８８５．９０；
Ｒｆ（アンモニア：イソプロパノール：水１０：７０：
２０）：０．０８；３００ＭＨｚ−１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２
Ｏ）：１．３０（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３）；１．９２（ｓ，
３Ｈ，ＣＨ３）；２．６４（ｍ，４Ｈ，２′，２″−
Ｈ）；３．１９〜３．２１（ｄｄ，２Ｈ，ＣＨ２）；
４．２６（ｍ，１Ｈ，４′−Ｈ）；４．４１（ｍ，１
Ｈ，３′−Ｈ）；６．３４（ｔ， 3ＪHH＝６．７４Ｈ
ｚ，１Ｈ，１′−Ｈ）；７．６９（ｓ，１Ｈ，６−
Ｈ）；１１．５０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）。３００ＭＨｚ−
31Ｐ−ＮＭＲ（８５％Ｈ３ＰＯ４外部，Ｄ２Ｏ）：−１
０．７５（ｄ， 2ＪPP＝２２Ｈｚ，１Ｐ；α−Ｐ原
子）；−１１．４５（ｄ， 2ＪPP＝２１．９Ｈｚ，１
Ｐ，γ−Ｐ原子）；−２２．０５（ｔ， 3ＪPP＝２０．
４Ｈｚ，１Ｐ，β−Ｐ原子）。
【００３６】例２ １−（３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−５′−
トリホスフェート−β−Ｄ−スレオペントフラノシル）
チミンの合成
トリホスフェート−β−Ｄ−スレオペントフラノシル）
チミンの合成
【化６】 １−（３′−アジド−２′，３′−ジデオキシ−５′−
Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−スレオペントフラノ
シル）チミン 四臭化炭素（１１．９１ミリモル、４．１０ｇ）を５′
−ジメトキシトリチルチミジン（調製については、エム
・ガイト(M. Gait) 、オリゴヌクレオチド合成(Oligonu
cleotide Synthesis) アイアールエル−プレス(IRL-Pre
ss) 、(1984)，27頁を参照されたい）（５．９８ｇ，１
１ミリモル）、トリフェニルホスフィン（３．０７６
ｇ，１１．７３ミリモル）およびアジ化リチウム（３．
１ｇ，５５ミリモル）を乾燥ＤＭＦ３７ｍｌに溶解した
撹拌溶液に加える。混合物を室温（ＲＴ）で５６時間撹
拌した後、メタノール１５ｍｌを加える。生成物を次に
氷冷蒸溜水８００ｍｌ中で沈澱させる。沈澱をクロロホ
ルムに溶解させ、フラッシュクロマトグラフィ（酢酸エ
チル：ｎ−ヘキサン＝３：１）によって精製する。クロ
ロホルム：メタノール９：１中のＲｆ＝０．５２。ＩＲ
（ｃｍ−１）：２１００アジド、収率８０％、４．９５
ｇ。
Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−スレオペントフラノ
シル）チミン 四臭化炭素（１１．９１ミリモル、４．１０ｇ）を５′
−ジメトキシトリチルチミジン（調製については、エム
・ガイト(M. Gait) 、オリゴヌクレオチド合成(Oligonu
cleotide Synthesis) アイアールエル−プレス(IRL-Pre
ss) 、(1984)，27頁を参照されたい）（５．９８ｇ，１
１ミリモル）、トリフェニルホスフィン（３．０７６
ｇ，１１．７３ミリモル）およびアジ化リチウム（３．
１ｇ，５５ミリモル）を乾燥ＤＭＦ３７ｍｌに溶解した
撹拌溶液に加える。混合物を室温（ＲＴ）で５６時間撹
拌した後、メタノール１５ｍｌを加える。生成物を次に
氷冷蒸溜水８００ｍｌ中で沈澱させる。沈澱をクロロホ
ルムに溶解させ、フラッシュクロマトグラフィ（酢酸エ
チル：ｎ−ヘキサン＝３：１）によって精製する。クロ
ロホルム：メタノール９：１中のＲｆ＝０．５２。ＩＲ
（ｃｍ−１）：２１００アジド、収率８０％、４．９５
ｇ。
【００３７】１−（３′−アミノ−２′，３′−ジデオ
キシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−スレオ
ペントフラノシル）チミン トリフェニルホスフィン（１．３ｇ，４．９４ミリモ
ル）を１−（３′−アジド−２′，３′−ジデオキシ−
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−スレオペント
フラノシル）チミン（０．５ｇ，０．８ミリモル）の撹
拌溶液に加え、４時間反応させる。ホスフィンイミン
を、蒸溜水３ｍｌを加えて加水分解し、更に３時間撹拌
する。ロータリーエバポレーター中で溶媒を除去した
後、残留オイルをフラッシュクロマトグラフィ（クロロ
ホルム：メタノール９９：１＋１％トリエチルアミン）
によって精製する。同じ溶媒中でのＲｆ＝０．２７。こ
のアミンは、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）でニンヒ
ドリンで処理することによって紫色に染色することがで
きる。収率８７．５％，０．４２ｇ。生成物は特有の 1
Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。
キシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−スレオ
ペントフラノシル）チミン トリフェニルホスフィン（１．３ｇ，４．９４ミリモ
ル）を１−（３′−アジド−２′，３′−ジデオキシ−
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−スレオペント
フラノシル）チミン（０．５ｇ，０．８ミリモル）の撹
拌溶液に加え、４時間反応させる。ホスフィンイミン
を、蒸溜水３ｍｌを加えて加水分解し、更に３時間撹拌
する。ロータリーエバポレーター中で溶媒を除去した
後、残留オイルをフラッシュクロマトグラフィ（クロロ
ホルム：メタノール９９：１＋１％トリエチルアミン）
によって精製する。同じ溶媒中でのＲｆ＝０．２７。こ
のアミンは、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）でニンヒ
ドリンで処理することによって紫色に染色することがで
きる。収率８７．５％，０．４２ｇ。生成物は特有の 1
Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。
【００３８】１−（３′−アミノ−２′，３′−ジデオ
キシ−５′−トリホスフェート−β−Ｄ−スレオペント
フラノシル）チミンへの転換 続いて５′−トリホスフェートへ転換するために、ジメ
トキシトリチル基をエム・ガイト(M. Gait) 、オリゴヌ
クレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis）アイアー
ルエル−プレス(IRL-Press) 、49頁、(1984)の記載と同
様の方法で除去し、例１に記載したのと同様にしてトリ
ホスフェートを５′位へ結合させる。
キシ−５′−トリホスフェート−β−Ｄ−スレオペント
フラノシル）チミンへの転換 続いて５′−トリホスフェートへ転換するために、ジメ
トキシトリチル基をエム・ガイト(M. Gait) 、オリゴヌ
クレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis）アイアー
ルエル−プレス(IRL-Press) 、49頁、(1984)の記載と同
様の方法で除去し、例１に記載したのと同様にしてトリ
ホスフェートを５′位へ結合させる。
【００３９】例３ ２′−アミノ−２′−デオキシ−５′−トリホスフェー
ト−ウリジンの調製
ト−ウリジンの調製
【化７】 （２，２′−アンヒドロ−１−β−アラビノフラノシ
ル）−ウラシル 重炭酸ナトリウム０．５ｇ（５．９３ミリモル）を、ウ
リジン１９ｇ（７７．８ミリモル）およびジフェニルカ
ーボネート２２．２ｇ（１０３．６ミリモル）を無水ジ
メチルホルムアミド７５ｍｌに溶解したものに加えた。
溶解が完了した後、透明な無色液体を１５０℃の温度に
３０分間加熱する。冷却した後、冷溶液を無水エーテル
に注入する。エーテルを傾瀉によって生成する沈澱から
除去し、粗生成物をメタノール１６５０ｍｌから再結晶
させる。乾燥すると白色結晶性粉末を生じる。 融点：２３９℃；ＭＳ：２２７；Ｒｆ：０．３１ 塩化
メチレン／メタノール８：２；収率９．２２ｇ（５２．
３％）。 1Ｈ−ＮＭＲ ６０ＭＨｚは文献値に対応す
る。
ル）−ウラシル 重炭酸ナトリウム０．５ｇ（５．９３ミリモル）を、ウ
リジン１９ｇ（７７．８ミリモル）およびジフェニルカ
ーボネート２２．２ｇ（１０３．６ミリモル）を無水ジ
メチルホルムアミド７５ｍｌに溶解したものに加えた。
溶解が完了した後、透明な無色液体を１５０℃の温度に
３０分間加熱する。冷却した後、冷溶液を無水エーテル
に注入する。エーテルを傾瀉によって生成する沈澱から
除去し、粗生成物をメタノール１６５０ｍｌから再結晶
させる。乾燥すると白色結晶性粉末を生じる。 融点：２３９℃；ＭＳ：２２７；Ｒｆ：０．３１ 塩化
メチレン／メタノール８：２；収率９．２２ｇ（５２．
３％）。 1Ｈ−ＮＭＲ ６０ＭＨｚは文献値に対応す
る。
【００４０】２′−アジド−２′−デオキシウリジン （２，２′−アンヒドロ−１−β−アラビノフラノシ
ル）−ウラシル１．１６ｇ（１０ミリモル）およびアジ
化リチウム３．５ｇ（７１．７ミリモル）を撹拌しなが
ら無水ＤＭＰＵ（１，３−ジメチル−３，４，５，６−
テトラヒドロ−２−１−Ｈ）−ピリミジノール）２５ｍ
ｌに導入する。懸濁液を１２０℃まで加熱すると、反応
溶液は黒くなる。３日後に、黒色溶液を水８０ｍｌで希
釈し、塩化メチレン１００ｍｌで２回抽出する。次い
で、一緒にまとめた有機相を水で更に４回洗浄し、ロー
タリーエバポレーターで濃縮する。固形のタール状残渣
をシリカゲル上でカラムクロマトグラフィ（塩化メチレ
ン／メタノール８：２）で精製する。黒色油状残渣をロ
ータリーエバポレーターで濃縮した後、これをシリカゲ
ルベースで更に２回精製する（アセトン：メタノール
８：３およびアセトン：酢酸エチル１：１）。ＴＬＣで
純粋な無色ガラス状物質（Ｒｆ塩化メチレン／メタノー
ル８：１＝０．６１）が得られる。収率２．０３５ｇ
（３０％）。ＩＲ（クロロホルムフィルム）：２１２０
ｃｍ−１。ＭＳ（ＦＡＢ）：２７０。生成物は予想した
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。２′−アミノ−２′
−デオキシ−５′−トリホスフェート−ウリジンを、ヒ
ドロキシル官能基の選択的３′−アシル化によって調製
する。次に、５′−トリホスフェート基の導入を例１と
同様の方法で行う。３′位で脱アシル化を行った後、ア
ジドをトリフェニルホスフィンと反応させて（例２と同
様にして）アミンへ還元する。
ル）−ウラシル１．１６ｇ（１０ミリモル）およびアジ
化リチウム３．５ｇ（７１．７ミリモル）を撹拌しなが
ら無水ＤＭＰＵ（１，３−ジメチル−３，４，５，６−
テトラヒドロ−２−１−Ｈ）−ピリミジノール）２５ｍ
ｌに導入する。懸濁液を１２０℃まで加熱すると、反応
溶液は黒くなる。３日後に、黒色溶液を水８０ｍｌで希
釈し、塩化メチレン１００ｍｌで２回抽出する。次い
で、一緒にまとめた有機相を水で更に４回洗浄し、ロー
タリーエバポレーターで濃縮する。固形のタール状残渣
をシリカゲル上でカラムクロマトグラフィ（塩化メチレ
ン／メタノール８：２）で精製する。黒色油状残渣をロ
ータリーエバポレーターで濃縮した後、これをシリカゲ
ルベースで更に２回精製する（アセトン：メタノール
８：３およびアセトン：酢酸エチル１：１）。ＴＬＣで
純粋な無色ガラス状物質（Ｒｆ塩化メチレン／メタノー
ル８：１＝０．６１）が得られる。収率２．０３５ｇ
（３０％）。ＩＲ（クロロホルムフィルム）：２１２０
ｃｍ−１。ＭＳ（ＦＡＢ）：２７０。生成物は予想した
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する。２′−アミノ−２′
−デオキシ−５′−トリホスフェート−ウリジンを、ヒ
ドロキシル官能基の選択的３′−アシル化によって調製
する。次に、５′−トリホスフェート基の導入を例１と
同様の方法で行う。３′位で脱アシル化を行った後、ア
ジドをトリフェニルホスフィンと反応させて（例２と同
様にして）アミンへ還元する。
【００４１】例４ ３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−５′−トリホ
スフェート−アデノシンの合成
スフェート−アデノシンの合成
【化８】 Ｎ６−ベンゾイル−９−（５−Ｏ−ベンゾイル−２−デ
オキシ−β−Ｄ−スレオ−ペントフラノシル）アデニン （ニシノ(Nishino) ら、Nucleosides & Nucleotides, 1
986, 5,159によって記載された方法により調製した）Ｎ
６，５′−Ｏ−ジベンゾイル−２′−デオキシアデノシ
ン９２０ｍｇ（２ミリモル）を（ピリジン２ｍｌを含有
する）無水ジクロロメタン３０ｍｌに懸濁したものを−
３０℃に冷却し、無水トリフルオロメタンスルホン酸を
ジクロロメタンに溶解したもの（１０容積％）５ｍｌを
ゆっくりと滴下して加える。冷却槽を取り外した後、溶
液を放置して暖め、水１ｍｌを加える。３時間後に、水
を更に５ｍｌを加え、有機相を洗浄する。溶媒を除去し
た後、残留する残渣をメタノール５０ｍｌに溶解し、重
炭酸ナトリウム１００ｍｇを加える。混合物を室温で更
に２時間撹拌し、１０％強度の酢酸で中和し、溶媒を除
去し、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィ（ク
ロロホルム：メタノール９７：３）で精製する。収率７
１０ｍｇ（１．４８ミリモル）７５％。Ｒｆクロロホル
ム：メタノール９７：３＝０．４９。ＭＳ＝４５９。
オキシ−β−Ｄ−スレオ−ペントフラノシル）アデニン （ニシノ(Nishino) ら、Nucleosides & Nucleotides, 1
986, 5,159によって記載された方法により調製した）Ｎ
６，５′−Ｏ−ジベンゾイル−２′−デオキシアデノシ
ン９２０ｍｇ（２ミリモル）を（ピリジン２ｍｌを含有
する）無水ジクロロメタン３０ｍｌに懸濁したものを−
３０℃に冷却し、無水トリフルオロメタンスルホン酸を
ジクロロメタンに溶解したもの（１０容積％）５ｍｌを
ゆっくりと滴下して加える。冷却槽を取り外した後、溶
液を放置して暖め、水１ｍｌを加える。３時間後に、水
を更に５ｍｌを加え、有機相を洗浄する。溶媒を除去し
た後、残留する残渣をメタノール５０ｍｌに溶解し、重
炭酸ナトリウム１００ｍｇを加える。混合物を室温で更
に２時間撹拌し、１０％強度の酢酸で中和し、溶媒を除
去し、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィ（ク
ロロホルム：メタノール９７：３）で精製する。収率７
１０ｍｇ（１．４８ミリモル）７５％。Ｒｆクロロホル
ム：メタノール９７：３＝０．４９。ＭＳ＝４５９。
【００４２】３′−アジド−２′，３′−ジデオキシア
デノシン Ｎ６−ベンゾイル−９−（５−Ｏ−ベンゾイル−２−デ
オキシ−β−Ｄ−スレオペントフラノシル）−アデニン
９２０ｍｇ（２ミリモル）を無水ジクロロメタン２０ｍ
ｌ（およびピリジン２ｍｌ）に溶解したものを−３０℃
に冷却する。次いで、無水トリフルオロメタンスルホン
酸を無水ジクロロメタンに溶解したもの５ｍｌ（３ミリ
モル）を滴下して加える。冷却槽を取り外し、混合物を
更に２０分間撹拌し、アジ化リチウム９８０ｍｇ（２０
ミリモル）をＤＭＦ２０ｍｌに溶解したものを溶液に加
える。ＲＴで更に２時間撹拌した後、水５０ｍｌおよび
クロロホルム１５０ｍｌを加え、有機相を吸収させ、蒸
溜水で洗浄する。溶媒を、Ｒロータヴェイパー(Rotavap
or) で除去し、生成物をアンモニア性メタノール溶液で
一晩処理して塩基保護基を除去する。溶媒を再度除去し
てからシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィ（ク
ロロホルム：メタノール９５：５）で精製を行う。収
率：４３０ｍｇ（１．６ミリモル，７９％）白色結晶性
粉末。ＩＲ：２，１００ｃｍ−１アジド基。
デノシン Ｎ６−ベンゾイル−９−（５−Ｏ−ベンゾイル−２−デ
オキシ−β−Ｄ−スレオペントフラノシル）−アデニン
９２０ｍｇ（２ミリモル）を無水ジクロロメタン２０ｍ
ｌ（およびピリジン２ｍｌ）に溶解したものを−３０℃
に冷却する。次いで、無水トリフルオロメタンスルホン
酸を無水ジクロロメタンに溶解したもの５ｍｌ（３ミリ
モル）を滴下して加える。冷却槽を取り外し、混合物を
更に２０分間撹拌し、アジ化リチウム９８０ｍｇ（２０
ミリモル）をＤＭＦ２０ｍｌに溶解したものを溶液に加
える。ＲＴで更に２時間撹拌した後、水５０ｍｌおよび
クロロホルム１５０ｍｌを加え、有機相を吸収させ、蒸
溜水で洗浄する。溶媒を、Ｒロータヴェイパー(Rotavap
or) で除去し、生成物をアンモニア性メタノール溶液で
一晩処理して塩基保護基を除去する。溶媒を再度除去し
てからシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィ（ク
ロロホルム：メタノール９５：５）で精製を行う。収
率：４３０ｍｇ（１．６ミリモル，７９％）白色結晶性
粉末。ＩＲ：２，１００ｃｍ−１アジド基。
【００４３】３′−アミノ−２，′，３′−ジデオキシ
−５′−トリホスフェート−アデノシン ５′−トリホスフェートは、例１と同様にして調製す
る。次いで、アジドを例２と同様の方法でアミンまで還
元する。
−５′−トリホスフェート−アデノシン ５′−トリホスフェートは、例１と同様にして調製す
る。次いで、アジドを例２と同様の方法でアミンまで還
元する。
【００４４】例５ ３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−５′−トリホ
スフェート−グアノシンの合成
スフェート−グアノシンの合成
【化９】 ３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−５′−トリホ
スフェート−グアノシンは、ニシノ(Nishino) ら（Nucl
eosides & Nucleotides, 5, 159, 1986 ）の方法によっ
て調製することができるＮ２−イソブチリル−５′−Ｏ
−ベンゾイル−２′−デオキシグアノシンから出発して
調製される。ヌクレオシドを例４における調製と同様に
して３′−アジドに転換する。この場合にイソブチリル
保護基はトリホスフェート基の導入の後でかつアジドの
アミンへの還元の前にのみ除去されるので、アンモニア
性メタノール溶液での処理は行われないことに留意すべ
きである。グアノシンの場合にもトリホスフェートへ転
換するために例１に記載の方法を用いる。アミンへの還
元は例２に記載されている。
スフェート−グアノシンは、ニシノ(Nishino) ら（Nucl
eosides & Nucleotides, 5, 159, 1986 ）の方法によっ
て調製することができるＮ２−イソブチリル−５′−Ｏ
−ベンゾイル−２′−デオキシグアノシンから出発して
調製される。ヌクレオシドを例４における調製と同様に
して３′−アジドに転換する。この場合にイソブチリル
保護基はトリホスフェート基の導入の後でかつアジドの
アミンへの還元の前にのみ除去されるので、アンモニア
性メタノール溶液での処理は行われないことに留意すべ
きである。グアノシンの場合にもトリホスフェートへ転
換するために例１に記載の方法を用いる。アミンへの還
元は例２に記載されている。
【００４５】２． ３′−アミノオリゴマーの合成およ
びその後の３′−螢光標識 例６ ２０個のヌクレオチドのオリゴマー ３′−Ｈ２Ｎ−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴ−５′の合成は、５′−ジメトキシトリチルで保護
された３′−アミノ−３′−デオキシチミジンから出発
する。この化合物は例１に記載した方法で調製される。
この場合に、出発物質は、エム・ガイト(M. Gait) （オ
リゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis) ア
イアールエル−プレス(IRL-Press) 、1984年、27頁）の
方法によってＡＺＴとジメトキシトリチルクロリドとか
ら調製することができる５′−ジメトキシトリチル保護
ＡＺＴ（アジド−３′−デオキシリボシド−チミジン）
である。
びその後の３′−螢光標識 例６ ２０個のヌクレオチドのオリゴマー ３′−Ｈ２Ｎ−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴ−５′の合成は、５′−ジメトキシトリチルで保護
された３′−アミノ−３′−デオキシチミジンから出発
する。この化合物は例１に記載した方法で調製される。
この場合に、出発物質は、エム・ガイト(M. Gait) （オ
リゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis) ア
イアールエル−プレス(IRL-Press) 、1984年、27頁）の
方法によってＡＺＴとジメトキシトリチルクロリドとか
ら調製することができる５′−ジメトキシトリチル保護
ＡＺＴ（アジド−３′−デオキシリボシド−チミジン）
である。
【００４６】この化合物を次に、例１に記載の方法でト
リフェニルホスフィンで還元する。次の段階は支持体物
質の調製である。このために、５′−Ｏ−（４，４′−
ジメトキシトリチル）−３′−アミノ−３′−デオキシ
チミジン２００ｍｇを無水ピリジン７００μｌに導入す
る。この溶液に、ＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン）
４５ｍｇ、引き続いて無水コハク酸４０ｍｇを加える。
混合物を一晩放置した後、残っている無水コハク酸を水
１０μｌを加えることによって加水分解する。トルエン
との共蒸発を３回行い、残渣を塩化メチレン１２ｍｌに
吸収させ、冷クエン酸（１０％強度）４ｍｌで洗浄し、
水４ｍｌで２回洗浄する。有機相を硫酸ナトリウム上で
乾燥させ、溶媒量を濃縮させ、物質を塩化メチレン１ｍ
ｌに溶解させる。この溶液をｎ−ヘキサン３０ｍｌに撹
拌しながら徐々に滴下して加える。分離した沈澱を吸引
濾別して、４０℃でオイルポンプ真空下で乾燥させる。
更に、標準的方法によってＣＰＧをベースとした支持体
物質を調製し、次に、ホスホルアミダイト法によるＡＢ
Ｉ３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザー上での標準的サイク
ル(ABI 380A User Bulletin,発刊番号36，7 月，1986）
を用いて12個のヌクレオチドのオリゴマーを調製する。
支持体の３′−アミノオリゴヌクレオチドの脱保護およ
び開裂の後、精製および特性決定を標準的方法によって
行う。この場合に、一層塩基に不安定な結合法を用いて
支持体に結合させることによって一層良好な結果を得る
ことができる。エフィモフ(Efimov)（Nucl. Acids Re
s., 11,8369，1983）によって記載されたのと同様にし
てウレタン官能基によって開裂される酸アミドを置換す
るのが有利である。
リフェニルホスフィンで還元する。次の段階は支持体物
質の調製である。このために、５′−Ｏ−（４，４′−
ジメトキシトリチル）−３′−アミノ−３′−デオキシ
チミジン２００ｍｇを無水ピリジン７００μｌに導入す
る。この溶液に、ＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン）
４５ｍｇ、引き続いて無水コハク酸４０ｍｇを加える。
混合物を一晩放置した後、残っている無水コハク酸を水
１０μｌを加えることによって加水分解する。トルエン
との共蒸発を３回行い、残渣を塩化メチレン１２ｍｌに
吸収させ、冷クエン酸（１０％強度）４ｍｌで洗浄し、
水４ｍｌで２回洗浄する。有機相を硫酸ナトリウム上で
乾燥させ、溶媒量を濃縮させ、物質を塩化メチレン１ｍ
ｌに溶解させる。この溶液をｎ−ヘキサン３０ｍｌに撹
拌しながら徐々に滴下して加える。分離した沈澱を吸引
濾別して、４０℃でオイルポンプ真空下で乾燥させる。
更に、標準的方法によってＣＰＧをベースとした支持体
物質を調製し、次に、ホスホルアミダイト法によるＡＢ
Ｉ３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザー上での標準的サイク
ル(ABI 380A User Bulletin,発刊番号36，7 月，1986）
を用いて12個のヌクレオチドのオリゴマーを調製する。
支持体の３′−アミノオリゴヌクレオチドの脱保護およ
び開裂の後、精製および特性決定を標準的方法によって
行う。この場合に、一層塩基に不安定な結合法を用いて
支持体に結合させることによって一層良好な結果を得る
ことができる。エフィモフ(Efimov)（Nucl. Acids Re
s., 11,8369，1983）によって記載されたのと同様にし
てウレタン官能基によって開裂される酸アミドを置換す
るのが有利である。
【００４７】例７ ３′−アミノ末端を有する２３ヌクレオチドのオリゴマ
ー ３′−Ｈ２Ｎ−ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴ
ＧＧＡＴ−５′の合成は、例１に記載したのと同様に行
う。精製および特性決定は標準的方法による。
ー ３′−Ｈ２Ｎ−ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴ
ＧＧＡＴ−５′の合成は、例１に記載したのと同様に行
う。精製および特性決定は標準的方法による。
【００４８】例８ 引き続く３′−アミノ末端でのオリゴマーの誘導体形成
は、フルオレセインイソチオシアネートで行う。３′−
アミノオリゴヌクレオチド５０ナノモルをエッペンドル
フチューブ中の５００ミリモル重炭酸ナトリウム溶液２
５μｌに溶解させる。３００ミリモルＦＩＴＣ（シグ
マ）のＤＭＳＯ溶液２０μｌを加える。室温で６時間反
応させた後、反応混合物を２０ミリモル酢酸アンモニウ
ム溶液中でセファデックスＧ−２５カラムを通過させる
ことによって精製する。３′−ＦＩＴＣオリゴマーを螢
光検出およびＵＶ検出の両者により分析的ＨＰＬＣを行
うことによって分析した。ＨＰＬＣの結果は、キャピラ
リーゲル電気泳動（ディオネックス(Dionex)から入手）
上で分析することによっても確かめられた。フルオレセ
インイソチオシアネートの式：
は、フルオレセインイソチオシアネートで行う。３′−
アミノオリゴヌクレオチド５０ナノモルをエッペンドル
フチューブ中の５００ミリモル重炭酸ナトリウム溶液２
５μｌに溶解させる。３００ミリモルＦＩＴＣ（シグ
マ）のＤＭＳＯ溶液２０μｌを加える。室温で６時間反
応させた後、反応混合物を２０ミリモル酢酸アンモニウ
ム溶液中でセファデックスＧ−２５カラムを通過させる
ことによって精製する。３′−ＦＩＴＣオリゴマーを螢
光検出およびＵＶ検出の両者により分析的ＨＰＬＣを行
うことによって分析した。ＨＰＬＣの結果は、キャピラ
リーゲル電気泳動（ディオネックス(Dionex)から入手）
上で分析することによっても確かめられた。フルオレセ
インイソチオシアネートの式：
【化１０】
【００４９】例９ 例１および２からの３′−アミノオリゴマーを、例３に
記載の方法によって、ローダミンイソチオシアネートお
よびテトラメチルローダミンイソチオシアネートと反応
させる。３′−螢光標識したオリゴマーを、螢光検出お
よびＵＶ検出の両者により分析的ＨＰＬＣを行うことに
よって分析した。ＨＰＬＣの結果は、キャピラリーゲル
電気泳動（ディオネックス(Dionex)から入手）上で分析
することによっても確かめられた。色素ローダミンイソ
チオシアネートおよびテトラメチルローダミンイソチオ
シアネートの式：
記載の方法によって、ローダミンイソチオシアネートお
よびテトラメチルローダミンイソチオシアネートと反応
させる。３′−螢光標識したオリゴマーを、螢光検出お
よびＵＶ検出の両者により分析的ＨＰＬＣを行うことに
よって分析した。ＨＰＬＣの結果は、キャピラリーゲル
電気泳動（ディオネックス(Dionex)から入手）上で分析
することによっても確かめられた。色素ローダミンイソ
チオシアネートおよびテトラメチルローダミンイソチオ
シアネートの式：
【化１１】
【００５０】例１０ 例１および２からの３′−アミノオリゴマーを、例３に
記載の方法によって下記のクマリン誘導体と反応させ
る。３′−螢光標識したオリゴマーを、螢光検出および
ＵＶ検出の両者により分析的ＨＰＬＣを行うことによっ
て分析する。ＨＰＬＣの結果は、キャピラリーゲル電気
泳動（ディオネックス(Dionex)から入手）上で分析する
ことによっても確かめられる。 クマリン色素分子の式：
記載の方法によって下記のクマリン誘導体と反応させ
る。３′−螢光標識したオリゴマーを、螢光検出および
ＵＶ検出の両者により分析的ＨＰＬＣを行うことによっ
て分析する。ＨＰＬＣの結果は、キャピラリーゲル電気
泳動（ディオネックス(Dionex)から入手）上で分析する
ことによっても確かめられる。 クマリン色素分子の式：
【化１２】
【００５１】３． ＤＮＡポリメラーゼによる修飾ヌク
レオチドの結合および配列決定実験の分析 通常の配列決定酵素によるアミノトリホスフェートの受
容をチェックするために、適当な終結溶液を調製し、ポ
リメラーゼ（クレノウ，ベーリンガー(Boehringer)；Ｔ
ａｑ，アメルシャム(Amersham)；Ｔ７，ファルマシア(P
harmacia) ；シークエナーゼ(Sequenase) ，ＵＳＢ）を
試験した。これにより、トリホスフェートの結合速度お
よび終結特性の古典的および螢光色素を用いる標識によ
る分析を行った。
レオチドの結合および配列決定実験の分析 通常の配列決定酵素によるアミノトリホスフェートの受
容をチェックするために、適当な終結溶液を調製し、ポ
リメラーゼ（クレノウ，ベーリンガー(Boehringer)；Ｔ
ａｑ，アメルシャム(Amersham)；Ｔ７，ファルマシア(P
harmacia) ；シークエナーゼ(Sequenase) ，ＵＳＢ）を
試験した。これにより、トリホスフェートの結合速度お
よび終結特性の古典的および螢光色素を用いる標識によ
る分析を行った。
【００５２】例１１ 例１と同様な方法で調製した５′−トリホスフェート−
３′−アミノ−３′−デオキシリボシド−チミジンを
２′，３′−ジデオキシ−５′−トリホスフェート−チ
ミジンに代えた。これは、前記の総てのポリメラーゼの
終結溶液で行った。それぞれの場合に、等モル、１０倍
および１０分の１のｄＮＴＰ／ターミネーターの比率を
試験した。配列決定は、標準的方法で行った。これらの
検討におけるオートラジオグラフィ検出は、α−35Ｓ−
ｄＡＴＰの結合によるものであった。ａ） ３′−アミ
ノ−ヌクレオチドは用いた酵素に対して終結作用を有
し、ｂ） Ｔ７、Ｔａｑおよびシクエナーゼの場合の結
合速度は通常のジデオキシターミネーターと同じであ
り、ｃ）最終的には、アミノ−ヌクレオチドを用いて問
題なく配列決定が可能であるということが明らかになっ
た。
３′−アミノ−３′−デオキシリボシド−チミジンを
２′，３′−ジデオキシ−５′−トリホスフェート−チ
ミジンに代えた。これは、前記の総てのポリメラーゼの
終結溶液で行った。それぞれの場合に、等モル、１０倍
および１０分の１のｄＮＴＰ／ターミネーターの比率を
試験した。配列決定は、標準的方法で行った。これらの
検討におけるオートラジオグラフィ検出は、α−35Ｓ−
ｄＡＴＰの結合によるものであった。ａ） ３′−アミ
ノ−ヌクレオチドは用いた酵素に対して終結作用を有
し、ｂ） Ｔ７、Ｔａｑおよびシクエナーゼの場合の結
合速度は通常のジデオキシターミネーターと同じであ
り、ｃ）最終的には、アミノ−ヌクレオチドを用いて問
題なく配列決定が可能であるということが明らかになっ
た。
【００５３】例１２ 化合物５′−トリホスフェート−３′−アミノ−３′−
デオキシリボシド−チミジンをフルオレセインイソチオ
シアネートと反応させて５′−トリホスフェート−３′
−アミノ−３′−デオキシリボシド−３′−Ｎ−フルオ
レセインイソチオシアネート−チミジンを得た。５′−
トリホスフェート−３′−アミノ−３′，２′−デオキ
シリボシド−チミン（２．５ｍｇ，２．８マイクロモ
ル）をエッペンドルフキャップ中の蒸溜水２００μｌに
溶解し、１モルＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐ
Ｈ９）２００μｌを加える。反応混合物をアルミニウム
箔に包んで日光から保護し、フルオレセインイソチオシ
アネート溶液（ＤＭＦ１ｍｌ中１０ｍｇ）８０μｌを１
００μｌピペットで加える。室温で１０分間反応させた
後、ＴＬＣでは前駆体が定量的に転換する。精製はゲル
濾過によって行う。セファデックスＧ−１０カラムをア
ルミニウム箔に包んで光から保護した後、完全な反応混
合物をカラム物質に詰め、１ｍｌ／分の流速で水で溶出
する。クロマトグラムは２個のピークを示す。第一のピ
ークは生成物により、第二のピークは未反応の色素によ
って生じる。画分の大きさは５ｍｌであり、全部で２４
画分を得る。クロマトグラムに基づき、画分４が陽性で
あることが判る。これはＴＬＣによって確かめられる。
溶媒を凍結乾燥により除去し、物質を−８０℃に保存す
る。収率３．３２ｍｇ（９３％）；分子量：１，２７
４．３２；Ｒｆ（アンモニア：イソプロパノール：水１
０：７０：６０）＝０．６２；螢光発光スペクトル：入
射光線の波長は４２０ｎｍである。化合物の発光最大値
は５１４．８ｎｍにおいてである。蒸留水中の２．５ミ
リモル溶液を測定した。誘導体形成しない色素の２．５
ミリモル蒸留水溶液の発光最大値は、５１９．４ｎｍの
波長においてである。
デオキシリボシド−チミジンをフルオレセインイソチオ
シアネートと反応させて５′−トリホスフェート−３′
−アミノ−３′−デオキシリボシド−３′−Ｎ−フルオ
レセインイソチオシアネート−チミジンを得た。５′−
トリホスフェート−３′−アミノ−３′，２′−デオキ
シリボシド−チミン（２．５ｍｇ，２．８マイクロモ
ル）をエッペンドルフキャップ中の蒸溜水２００μｌに
溶解し、１モルＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐ
Ｈ９）２００μｌを加える。反応混合物をアルミニウム
箔に包んで日光から保護し、フルオレセインイソチオシ
アネート溶液（ＤＭＦ１ｍｌ中１０ｍｇ）８０μｌを１
００μｌピペットで加える。室温で１０分間反応させた
後、ＴＬＣでは前駆体が定量的に転換する。精製はゲル
濾過によって行う。セファデックスＧ−１０カラムをア
ルミニウム箔に包んで光から保護した後、完全な反応混
合物をカラム物質に詰め、１ｍｌ／分の流速で水で溶出
する。クロマトグラムは２個のピークを示す。第一のピ
ークは生成物により、第二のピークは未反応の色素によ
って生じる。画分の大きさは５ｍｌであり、全部で２４
画分を得る。クロマトグラムに基づき、画分４が陽性で
あることが判る。これはＴＬＣによって確かめられる。
溶媒を凍結乾燥により除去し、物質を−８０℃に保存す
る。収率３．３２ｍｇ（９３％）；分子量：１，２７
４．３２；Ｒｆ（アンモニア：イソプロパノール：水１
０：７０：６０）＝０．６２；螢光発光スペクトル：入
射光線の波長は４２０ｎｍである。化合物の発光最大値
は５１４．８ｎｍにおいてである。蒸留水中の２．５ミ
リモル溶液を測定した。誘導体形成しない色素の２．５
ミリモル蒸留水溶液の発光最大値は、５１９．４ｎｍの
波長においてである。
【００５４】調製した５′−トリホスフェート−３′−
アミノ−３′−デオキシリボシド−３′−Ｎ−フルオレ
セイン−イソチオシアネート−チミジンを２′，３′−
ジデオキシ−５′−トリホスフェート−チミジンに代え
た。これは、前記した総てのポリメラーゼの終結溶液で
行った。それぞれの場合に、等モル、１０倍および１０
分の１のｄＮＴＰ／ターミネーターの比率を試験した。
配列決定は標準的方法で行った。これらの検討における
オートラジオグラフィ検出はα−35Ｓ−ｄＡＴＰの結合
によった。ａ） ３′−螢光標識したヌクレオチドは用
いた酵素について終結作用を有し、ｂ） Ｔ７、Ｔａｑ
およびシクエナーゼの場合における結合速度は、立体的
に要求する色素残基のために従来のジデオキシターミネ
ーターの１０倍の濃度に等しく、ｃ） 配列決定は３′
−螢光標識したターミネーターを用いて困難無く行うこ
とができるということがわかる。
アミノ−３′−デオキシリボシド−３′−Ｎ−フルオレ
セイン−イソチオシアネート−チミジンを２′，３′−
ジデオキシ−５′−トリホスフェート−チミジンに代え
た。これは、前記した総てのポリメラーゼの終結溶液で
行った。それぞれの場合に、等モル、１０倍および１０
分の１のｄＮＴＰ／ターミネーターの比率を試験した。
配列決定は標準的方法で行った。これらの検討における
オートラジオグラフィ検出はα−35Ｓ−ｄＡＴＰの結合
によった。ａ） ３′−螢光標識したヌクレオチドは用
いた酵素について終結作用を有し、ｂ） Ｔ７、Ｔａｑ
およびシクエナーゼの場合における結合速度は、立体的
に要求する色素残基のために従来のジデオキシターミネ
ーターの１０倍の濃度に等しく、ｃ） 配列決定は３′
−螢光標識したターミネーターを用いて困難無く行うこ
とができるということがわかる。
【００５５】例１３ 調製した５′−トリホスフェート−３′−アミノ−３′
−デオキシリボシド−３′−Ｎ−フルオレセイン−イソ
チオシアネート−チミジンを２′，３′−ジデオキシ−
５′−トリホスフェート−チミジンに代えた。これは、
Ｔ７およびＴａｑポリメラーゼの終結溶液で行った。基
本として１０倍のｄＮＴＰ／ターミネーターの比率を用
いた。配列決定は標準的方法で行った。α−35Ｓ−ｄＡ
ＴＰの結合は、これらの検討では行わなず、配列分析は
市販のＤＮＡシークエンサーで３′−螢光標識ターミネ
ーターで首尾よく行った。
−デオキシリボシド−３′−Ｎ−フルオレセイン−イソ
チオシアネート−チミジンを２′，３′−ジデオキシ−
５′−トリホスフェート−チミジンに代えた。これは、
Ｔ７およびＴａｑポリメラーゼの終結溶液で行った。基
本として１０倍のｄＮＴＰ／ターミネーターの比率を用
いた。配列決定は標準的方法で行った。α−35Ｓ−ｄＡ
ＴＰの結合は、これらの検討では行わなず、配列分析は
市販のＤＮＡシークエンサーで３′−螢光標識ターミネ
ーターで首尾よく行った。
【００５６】例１４ ５′−トリホスフェート−３′−チオ−３′−デオキシ
リボシド−チミジンの合成
リボシド−チミジンの合成
【化１３】 ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｓ−ベンゾイル
−チオチミジン ３′位における硫黄の導入は脱離基（メシレート）をナ
トリウムチオベンゾエートで置き換えることによって行
う。ナトリウムチオベンゾエートはチオ安息香酸（１０
ｇ）の水１５ｍｌの氷冷溶液に１０モルＮａＯＨ溶液を
加えて溶液をアルカリ性にすることによって合成する。
次いで、ｐＨを水性チオ安息香酸で７に調整し、溶液を
−５℃に冷却し、濾過して、固形の残渣を除去する。水
をロータリーエバポレーターでエタノールと共に除去し
た後、黄色塩を五酸化リン上で真空で乾燥する。５′−
Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｏ−メタンスルホニル
−２′−デオキシキシロ−チミジン（８．４５ミリモ
ル）（メシレートの合成：ミラー(Miller)，フォックス
(Fox）(1964), J. Org. Chem., 29, 1772 ）およびチオ
安息香酸ナトリウム（３３ミリモル）のＤＭＦ（３０ｍ
ｌ）溶液を１００℃で４時間撹拌する。混合物をジクロ
ロメタンで抽出し、有機相を飽和ＮａＨＣＯ３溶液およ
び飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄する。硫酸ナトリウム上で有
機相を乾燥した後、トルエンと共に共蒸発させ、油性粗
生成物をフラッシュクロマトグラフィ（シリカゲル６０
Ｈ、クロロホルム／メタノール０〜１０％）によって精
製する。 収率：６０％、生成物は予想された 1Ｈ−ＮＭＲスペク
トルを有する。
−チオチミジン ３′位における硫黄の導入は脱離基（メシレート）をナ
トリウムチオベンゾエートで置き換えることによって行
う。ナトリウムチオベンゾエートはチオ安息香酸（１０
ｇ）の水１５ｍｌの氷冷溶液に１０モルＮａＯＨ溶液を
加えて溶液をアルカリ性にすることによって合成する。
次いで、ｐＨを水性チオ安息香酸で７に調整し、溶液を
−５℃に冷却し、濾過して、固形の残渣を除去する。水
をロータリーエバポレーターでエタノールと共に除去し
た後、黄色塩を五酸化リン上で真空で乾燥する。５′−
Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｏ−メタンスルホニル
−２′−デオキシキシロ−チミジン（８．４５ミリモ
ル）（メシレートの合成：ミラー(Miller)，フォックス
(Fox）(1964), J. Org. Chem., 29, 1772 ）およびチオ
安息香酸ナトリウム（３３ミリモル）のＤＭＦ（３０ｍ
ｌ）溶液を１００℃で４時間撹拌する。混合物をジクロ
ロメタンで抽出し、有機相を飽和ＮａＨＣＯ３溶液およ
び飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄する。硫酸ナトリウム上で有
機相を乾燥した後、トルエンと共に共蒸発させ、油性粗
生成物をフラッシュクロマトグラフィ（シリカゲル６０
Ｈ、クロロホルム／メタノール０〜１０％）によって精
製する。 収率：６０％、生成物は予想された 1Ｈ−ＮＭＲスペク
トルを有する。
【００５７】５′−ジメトキシトリチル保護基を、文献
既知の方法（エム・ガイト(M. Gait) 、オリゴヌクレオ
チド合成(Oligonucleotide Synthesis) アイアールエル
−プレス(IRL-Press) 、オックスフォード、1984年）に
よって開裂して５′位をホスフィチル化する。次に、
５′−トリホスフェートを、エクシュタイン(Eckstein)
とルードヴィッヒ(Ludwig)の方法（J.Org. Chem., 198
9, 54 巻，3 号，631 ）によってサリチルホスホクロリ
ダイト（アルドリッチ(Aldrich) ）を用い、ピロホスフ
ェートで処理することによって調製する。チオールは、
アルゴンを飽和したエタノール中１０モルＮａＯＨと反
応させることによって遊離する（アール・コスチック
(R. Cosstick) 、Nucleic Acids Research, 18, 4,82
9）。３′−チオ−５′−トリホスフェート−チミジン
を例８における方法によってヨードアセタミドフルオレ
セイン（モレキュラー・プローブス(Molecular Probe
s)）と結合させ、８０％の収率の螢光標識したチオヌク
レオチドがこの工程で得られる。
既知の方法（エム・ガイト(M. Gait) 、オリゴヌクレオ
チド合成(Oligonucleotide Synthesis) アイアールエル
−プレス(IRL-Press) 、オックスフォード、1984年）に
よって開裂して５′位をホスフィチル化する。次に、
５′−トリホスフェートを、エクシュタイン(Eckstein)
とルードヴィッヒ(Ludwig)の方法（J.Org. Chem., 198
9, 54 巻，3 号，631 ）によってサリチルホスホクロリ
ダイト（アルドリッチ(Aldrich) ）を用い、ピロホスフ
ェートで処理することによって調製する。チオールは、
アルゴンを飽和したエタノール中１０モルＮａＯＨと反
応させることによって遊離する（アール・コスチック
(R. Cosstick) 、Nucleic Acids Research, 18, 4,82
9）。３′−チオ−５′−トリホスフェート−チミジン
を例８における方法によってヨードアセタミドフルオレ
セイン（モレキュラー・プローブス(Molecular Probe
s)）と結合させ、８０％の収率の螢光標識したチオヌク
レオチドがこの工程で得られる。
【００５８】例１５ １−（３′−チオ−２′−，３′−ジデオキシ−５′−
トリホスフェート−β−Ｄ−スレオペントフラノシル）
チミジンの合成
トリホスフェート−β−Ｄ−スレオペントフラノシル）
チミジンの合成
【化１４】 ナトリウムチオベンゾエートでの置換は５′−ＤＭＴｒ
−Ｏ−，３′−Ｏ−メシル−チミジンから出発して例１
４に記載の方法で行う。この後に、５′保護基を開裂さ
せ、５′−トリホスフェートを導入し、チオールを遊離
させ、ヨードアセタミドフルオレセインを例１４の方法
と同様にして結合させる。
−Ｏ−，３′−Ｏ−メシル−チミジンから出発して例１
４に記載の方法で行う。この後に、５′保護基を開裂さ
せ、５′−トリホスフェートを導入し、チオールを遊離
させ、ヨードアセタミドフルオレセインを例１４の方法
と同様にして結合させる。
【００５９】例１６ １０個のヌクレオチド３′−β−Ｈ２Ｎ−ＴＴＴ ＴＴ
Ｔ ＴＴＴ Ｔ−５′のオリゴマーの合成 オリゴマー３′−β−Ｈ２Ｎ−ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ
Ｔ−５′の合成は１−（３′−アミノ−２′−，３′
−ジデオキシ−５′−ＤＭＴｒ−β−Ｄ−スレオペント
フラノシル）−チミジンから出発し、これを例６に記載
の方法で反応させてホスホルアミダイト法の支持体物質
を得る。次の、フルオレセインイソチオシアネートによ
る３′−β−アミノ−オリゴヌクレオチドの螢光標識は
例８と同様に行う。
Ｔ ＴＴＴ Ｔ−５′のオリゴマーの合成 オリゴマー３′−β−Ｈ２Ｎ−ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ
Ｔ−５′の合成は１−（３′−アミノ−２′−，３′
−ジデオキシ−５′−ＤＭＴｒ−β−Ｄ−スレオペント
フラノシル）−チミジンから出発し、これを例６に記載
の方法で反応させてホスホルアミダイト法の支持体物質
を得る。次の、フルオレセインイソチオシアネートによ
る３′−β−アミノ−オリゴヌクレオチドの螢光標識は
例８と同様に行う。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レナーテ、コンラド ドイツ連邦共和国ズルツバッハ／タウヌ ス、ハウプトシュトラーセ、127ベー (72)発明者 マティアス、マグ ドイツ連邦共和国オーベルルセル、ア ン、デル、フリーデンスリンデ、６ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 21/02 C07H 21/04 C12Q 1/68 G01N 33/58 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (7)
- 【請求項１】式Ｉ 【化１】 （式中、Ｒ１はプリンまたはピリミジン塩基であり、 基Ｒ２およびＲ３の少なくとも一方はアミノまたはチオ
ール基を介して結合したα−またはβ位における螢光色
素であり、他の基は所望によりαまたはβ位における水
素、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシルまたはメト
キシ基であり、 ｎは０またはそれより大きい数であり、 Ｒ４は５′保護基またはホスフェート、ピロホスフェー
トまたはトリホスフェートであり、 Ｒ５は酸素、フルオロメチレン、ジフルオロメチレンま
たはメチレンであり、 Ｒ６はαまたはβ位におけるヒドロキシルまたはメトキ
シ基または水素であり、 但し、Ｒ１、Ｒ５およびＲ６はそれぞれの場合に同じま
たは異なる意味を有することができ、 ＹおよびＸは酸素、硫黄、ＮＨまたはメチレンであり、
但し、ＸおよびＹはそれぞれの場合に同じまたは異なる
ことができる）を有する３′−および／または２′−ア
ミノ−およびチオール修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド
またはオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチドの３′および／または２′位に位置するＯ
Ｈ基をアミノまたはチオール基に誘導形成した後、螢光
色素に結合させることを特徴とする、請求項１に記載の
式Ｉの化合物の製造法。 - 【請求項３】式ＩＩ 【化２】 （式中、Ｒ１〜Ｒ６、Ｘ、Ｙおよびｎは請求項１に記載
の意味を有し、但し、Ｒ１、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ
の場合に同一または異なる意味を有することができ、Ｒ
７またはＲ８は水素、ヒドロキシルまたは保護されたヒ
ドロキシルまたはメトキシ基である）の化合物におい
て、 ａ） 求核攻撃によって３′および／または２′位に保
護されたまたは保護されていない形でアジドまたはチオ
ールを導入し、但し、適切であればアジドをアミンに還
元し、 ｂ） アミノ基を介してまたはチオール基を介して螢光
色素を結合させること、を特徴とする、請求項１に記載
の式Ｉの化合物の製造法。 - 【請求項４】フルオレセイン、ローダミン、テキサスレ
ッド、ＮＢＤ、クマリン、フルオレサミン、スクシニル
フルオレセインおよびダンシルを螢光色素として用い
る、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシド、ヌクレ
オチドおよびオリゴヌクレオチドの合成のための、請求
項１に記載の式Ｉの化合物の使用方法。 - 【請求項６】請求項１に記載の式Ｉの化合物を含んでな
る、インビボおよびインビトロでの顕微鏡的および肉眼
的螢光検出のための試薬。 - 【請求項７】ａ） 鋳型鎖の存在下での相補鎖の合成の
ための、 ｂ） オリゴヌクレオチドの合成のための、 請求項５に記載の式Ｉの化合物の使用方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4039488 | 1990-12-11 | ||
| DE4039488.3 | 1990-12-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04290896A JPH04290896A (ja) | 1992-10-15 |
| JP3140127B2 true JP3140127B2 (ja) | 2001-03-05 |
Family
ID=6420050
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03350821A Expired - Fee Related JP3140127B2 (ja) | 1990-12-11 | 1991-12-11 | ３′−（２′）−アミノ−またはチオール−修飾された螢光色素結合ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、並びにその製造法および使用 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0490281B1 (ja) |
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| AT (1) | ATE142222T1 (ja) |
| AU (1) | AU643856B2 (ja) |
| BG (1) | BG61484B1 (ja) |
| BR (1) | BR9105335A (ja) |
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| CS (1) | CS374391A3 (ja) |
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| DK (1) | DK0490281T3 (ja) |
| ES (1) | ES2093671T3 (ja) |
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| NZ (1) | NZ240900A (ja) |
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| PT (1) | PT99747A (ja) |
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| US5599922A (en) * | 1994-03-18 | 1997-02-04 | Lynx Therapeutics, Inc. | Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties |
| CA2184375C (en) * | 1994-03-18 | 2006-05-02 | Sergei M. Gryaznov | Oligonucleotide n3'-p5' phosphoramidates: synthesis and compounds; hybridization and nuclease resistance properties |
| US5726297A (en) * | 1994-03-18 | 1998-03-10 | Lynx Therapeutics, Inc. | Oligodeoxyribonucleotide N3' P5' phosphoramidates |
| DE4418691A1 (de) * | 1994-05-28 | 1996-02-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | 3'-(4'-) nicht-radioaktiv markierte Nukleoside und Nukleotide mit Aminocarbonsäure-, Peptid- oder Carbonsäure-Spacer |
| US5962271A (en) * | 1996-01-03 | 1999-10-05 | Cloutech Laboratories, Inc. | Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end |
| US5859233A (en) * | 1996-02-21 | 1999-01-12 | Lynx Therapeutics, Inc. | Synthons for synthesis of oligonucleotide N3-P5 phosphoramidates |
| US5684143A (en) * | 1996-02-21 | 1997-11-04 | Lynx Therapeutics, Inc. | Oligo-2'-fluoronucleotide N3'->P5' phosphoramidates |
| US6017702A (en) * | 1996-12-05 | 2000-01-25 | The Perkin-Elmer Corporation | Chain-termination type nucleic acid sequencing method including 2'-deoxyuridine-5'-triphosphate |
| DE19741084A1 (de) * | 1997-09-18 | 1999-03-25 | Knoell Hans Forschung Ev | Hochaffine Nukleinsäuremoleküle mit funktionellen Gruppen zur spezifischen Erkennung von Zielmolekülen, ihre Herstellung und Verwendung |
| US6289229B1 (en) | 1998-01-20 | 2001-09-11 | Scimed Life Systems, Inc. | Readable probe array for in vivo use |
| US6184347B1 (en) | 1998-11-19 | 2001-02-06 | Agilent Technologies Inc. | Minimization of blooming in high-density arrays by using reactive wash reagents |
| US6761877B2 (en) * | 2000-02-18 | 2004-07-13 | Biocrystal, Ltd. | Functionalized encapsulated fluorescent nanocrystals |
| ATE352586T2 (de) * | 2000-09-29 | 2007-02-15 | Molecular Probes Inc | Modifizierte carbocyaninfarbstoffe und deren konjugate |
| US7563618B2 (en) | 2001-03-23 | 2009-07-21 | Geron Corporation | Oligonucleotide conjugates |
| KR100762261B1 (ko) | 2001-04-27 | 2007-10-04 | (주)바이오니아 | 전장 상보 디옥시리보핵산 제조 방법과 이에 사용되는앵커와 프라이머 |
| US7214428B2 (en) * | 2001-09-17 | 2007-05-08 | Invitrogen Corporation | Highly luminescent functionalized semiconductor nanocrystals for biological and physical applications |
| US7205048B2 (en) | 2001-09-17 | 2007-04-17 | Invitrogen Corporation | Functionalized fluorescent nanocrystal compositions and methods of making |
| WO2003054507A2 (en) * | 2001-09-17 | 2003-07-03 | Biocrystal, Ltd. | Nanocrystals |
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