PL168874B1 - Sposób wytwarzania 3’amino-albo tiolomodyfikowanych, sprzegnietych z barwnikiem fluorescencyjnym nukleozydów, nukleotydów i oligonukieotydów PL PL - Google Patents

Sposób wytwarzania 3’amino-albo tiolomodyfikowanych, sprzegnietych z barwnikiem fluorescencyjnym nukleozydów, nukleotydów i oligonukieotydów PL PL

Info

Publication number
PL168874B1
PL168874B1 PL91292701A PL29270191A PL168874B1 PL 168874 B1 PL168874 B1 PL 168874B1 PL 91292701 A PL91292701 A PL 91292701A PL 29270191 A PL29270191 A PL 29270191A PL 168874 B1 PL168874 B1 PL 168874B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
amino
group
thiol
hydroxyl
fluorescent dye
Prior art date
Application number
PL91292701A
Other languages
English (en)
Other versions
PL292701A1 (en
Inventor
Joachim Engels
Mathias Herrlein
Renate Konrad
Matthias Mag
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of PL292701A1 publication Critical patent/PL292701A1/xx
Publication of PL168874B1 publication Critical patent/PL168874B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

1. Sposób wytwarzania zwiazku o wzorze 1, w którym R oznacza zasade purynowa albo pirymidy- nowa, R oznacza przylaczony przez grupe aminowa albo tiolowa barwnik fluorescencyjny w pozycji a albo P, a R oznacza atom wodoru, grupe hydroksy- lowa, zabezpieczona grupe hydroksylowa albo meto ksylowa w pozycji a albo ß , n oznacza liczbe 0 , R oznacza grupe 5 ’-zabezpieczajaca albo fosfo- ran, pirofosforan albo trifosforan, R oznacza atom tlenu, fluorometylen, difluorometylen albo metylen, R6 oznacza grupe hydroksylowa albo metoksylowy albo atom wodoru w pozycji a albo ß , przy czym R , R5 i R6 kazdorazowo ewentualnie maja jednakowe albo rózne znaczenia, Y oraz X oznaczaja atom tlenu, atom siarki, NH albo metylen, przy czym X i Y kazdorazowo sa ewentualnie jednakowe albo rózne, znamienny tym, ze znajdujaca sie w pozycji 3’ grupe hydroksylowa nukleozydu, nukleotydu albo oligonu- kleotydu przeprowadza sie w pochodna grupy amino- wej albo tiolowej i nastepnie sprzega z barwnikiem fluorescencyjnym. WZOR 1 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 3’-amino albo tiolomodyfikowanych, sprzęgniętych z barwnikiem fluorescencyjnym nukleozydów, nukleotydów i oligonukleotydów.
zwyczaj wiele zastosowań w technologii genów,
Zna czone oligonukleotydy znalazły ponieważ manipulowanie nimi jest łatwiejsze niż manipulowanie stosowanymi tradycyjnie jako próby hybrydyzacji sondami DNA, które wytwarza się przez trawienie restrykcyjne z natywnego materiału genowego.
Znaczone oligonukleotydy, które stosuje się w postaci tak zwanych antysensownych oligonukleotydów DNS, mogą regulująco wkraczać w akcję komórek i dlatego zyskują coraz większe znaczenie np. dla badania in vivo ekspresji protein. Mechanizm przebiega według obecnego rozpoznania przez wzajemne oddziaływanie DNA-DNA, DNA-RNA i RNA-RNA, ale szczegółowo nie jest jeszcze wyjaśniony.
168 874
Znaczone oligonukleotydy służą in vitro np. do identyfikacji fragmentów genów banku genów, przy czym za pomocą znaczonego oligonukleotydu sonduje się i identyfikuje blotowane próbki genów banku genów.
Aby móc przeprowadzić takie badania in vitro albo in vivo, należy oligonukleotydy znakować, jak już wspomniano. Obok radioaktywnego znakowania przez odpowiednie izotopy jako postać nieradioaktywnego znakowania stosuje się już pochodne barwników fluorescencyjnych, które stwarzają możliwość łatwiejszego i bardziej bezpiecznego manipulowania.
Dotychczas taką technikę stosowano również już skutecznie do nieradioaktywnego sekwencjonowania DNA. Tu były przeprowadzane przedłużacze bazujące w zasadzie na metodzie Sanger’a (F. Sanger, S. Nicklen i S. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)).
Znacznik fluorescencyjny lokuje się albo przy końcu 5’ oligonukleotydu (L.E. Hood, L.
M. Smith i C. Heiner. Nature 321, 674 (1986)), albo przy nukleozasadzie (J. M. Prober, G. L. Trainor i R. J. Dam, Science 238, 336 (1987)) (G. L. Trainor, Anal. Chem. 62, 418 (1990)). Zdecydowana niedogodność przytoczonego na końcu sposobu polega na tym, że znacznik fluorescencyjny jest wprowadzany podczas syntezy, to znaczy podczas polimeryzacji i tu specjalnie podczas enzymatycznej polimeryzacji. Konsekwencją tego etapu sposobu jest, że można stosować tylkojeszcze niektóre polimerazy dla syntezy, że akceptacja trifosforanów przez polimerazy spada i że poza tym potrzebny jest silny nadmiar substrato.
Wprowadzenie znacznika fluorescencyjnego nie jest jednak ograniczone do sekwencjonowania Sanger’a. Znane jest również chemiczne sekwencjonowanie za pomocą znacznika fluorescencyjnego według Maxam-Gilbegt’a (H. Voss, C. Schwager, U. Wirkner, B. Sproat J. Zimmermann, A. Rosenthal, H. Erfle, J. Stegemann i W. Ansorge, Nuci. Acids
Res. 17, 2517 (1989)).
Analogicznie do tego opisane jest także przenoszenie fragmentów restrykcyjnych za pomocą detektorów fluorescencyjnych (A.V. Carrano, J. Lamerdin, L.K. Ashworth, B. Watkins, E. Branscomb, T. Slezak, M. Raff, P.J. de Jong, D. Keith, L. McBride, S. Meister, M. Kronic, Genomics , 129 (1989) i S. Brenner oraz K.J. Livak, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86,8902 (1989)).
Obecnie stwierdzono, że barwnik fluorescencyjny może być przyłączony przez grupę aminową albo tiolową w pozycji 3’ (w miejscu a albo β) nukleozydu, nukleotydu lub oligonukleotydu i ten związek można korzystnie stosować do syntezy przeciwległych nici w obecności nici-matrycy albo oligonukleotydów oraz do detekcji genetycznego materiału in vivo oraz in vitro.
Przedmiotem wynalazku jest zatem sposób wytwarzania związku o wzorze 1, w którym R1 oznacza zasadę purynową albo pirymidynową, R3 oznacza przyłączony przez grupę aminową albo tiolową barwnik fluorescencyjny w pozycji a albo (3, a Rz oznacza atom wodoru, grupę hydroksylową, zabezpieczoną grupę hydroksylową lub metoksylową w pozycji a albo β, n oznacza liczbę > 0, R oznacza grupę zabezpieczającą 5’ albo fosforan, pirofosforan, trifosforan, R5 oznacza atom tlenu, fluorometylen, difluorometylen albo metylen, R6 oznacza grupę hydroksylową albo metoksylową lub atom wodoru w pozycji a albo β, przy czym R\ R5 i R6 każdorazowo mogą mieć jednakowe lub różne znaczenie, Y oraz X oznaczają atom tlenu, siarki, NH albo metylen, przy czym X i Y każdorazowo mogą być jednakowe albo różne, który to sposób charakteryzuje się tym, że znajdującą się w pozycji 3’ grupę OH nukleozydu, nukleotydu albo oligonukleotydu przeprowadza się w pochodną aminową albo tiolową i następnie sprzęga z barwnikiem fluorescencyjnym.
Poniżej wynalazek opisany jest szczegółowo, zwłaszcza w jego korzystnych . postaciach wykonania, poza tym wynalazek jest określony przez zawartość zastrzeżeń.
Związki o wzorze ogólnym 1 syntetyzuje się w zasadzie według metod znanych z. literatury (M. Gait, Oligonucleotide Synthesis, JRL-Press, Oxford 1984).
W celu przyłączenia barwnika do pozycji 3’ wychodzi się ze związku o wzorze 2, zwłaszcza nukleozydu. Do przyłączenia stosuje się związek o wzorze 2, w którym R1 do r6, X, Y oraz n mają podane znaczenia, przy czym podstawniki są ewentualnie jednakowe albo różne, a R7 lub R8 oznacza atom wodoru, grupę hydroksylową, zabezpieczoną grupę hydroksylową albo metoksylową. Przyłączenie barwnika prowadzi się przez wprowadzenie aminy albo tiolu poprzez stojącą w pozycji 3’ grupę hydroksylową.
168 874
W celu wprowadzenia grupy azydowej w pozycję 3’ wprowadza się grupę opuszczającą. Jako grupa opuszczająca służą przeważnie triflat (kwas trifluorometanosulfonowy), mesylat lub tosylat. Przez nukleofilowe działanie azydkiem, przeważnie azydkiem litu, następuje wprowadzenie ra™' azydowej. Nukleofilowe atakowanie tiolanu albo S-zabezpieczonego tiolanu daje tiol albo zabezpieczony tiol.
Pożądaną stereochemię przy części cukrowej nukleozydu można uzyskać najlepiej przez podstawienia S N
Grupę aminową można otrzymać prosto przez grupę azydową i następnie redukcją do aminy (lit.: W.S. Mungall i R.L. Letsinger, J. Org. Chem., tom 40, nr 11, 1659 (1975). W tym etapie wyróżnia się reakcja Staudinger’a z trifenylofosfiną i wodą (lit.: M. May i J.W. Engels, Nuci. Acids Res. 17, 15, 5973 (1989)).
Wszystkie związki odnośnie ich budowy i konfiguracji oznaczano przez NMR, analizę elementarną, UV, IR itd.
Po zakończeniu polikondensacji wolna grupa 3’-aminowa albo tiolowa części cukrowej na końcu 3’ DNA może reagować z reaktywnym barwnikiem fluorescencyjnym według sposobów znanych z literatury (Kunkapiller, Nuci. Acids, Res. 13, 2399, 1985; Rodges R.R. i współpracownicy Biochemistry, tom 28, 261 (1989).
Alternatywnie grupę aminową otrzymuje się także przez reakcję Mitsunobu (Synthesie, tom 11981, strona 1) i odpowiednie do reakcji opisanej przez Yamamoto i współpracowników (J. Chem. soc. Perk. Trans. I. 1, 306, 1980).
Przyłączenie barwnika fluorescencyjnego poprzez grupę tiolową następuje w analogiczny sposób i analogiczną drogą. Jednak zamiast grupy azydowej wprowadza się grupę tiolową w zabezpieczonej albo niezabezpieczonej postaci.
Przyłączenie barwnika fluorescencyjnego do wolnej grupy aminowej albo funkcji tiolowej nukleozydu, nukleotydu albo oligonukleotydu może następować alternatywnie także dopiero po ich zastosowaniu. Możliwy jest na przykład taki sposób postępowania, że reakcję barwnika fluorescencyjnego przeprowadza się po etapie terminacji reakcji sekwencjonowania DNA albo RNA, przy czym cały przedłużacz znakuje się barwnikiem fluorescencyjnym.
Jako barwniki fluorescencyjne można stosować zasadniczo wszystkie dostępne w handlu barwniki, które reagują z grupą aminową albo tiolową, przeważnie fluoresceinę, rodaminę, czerwień Texas, NBD (4-fluoro-7-nitrobenzofurazan Sigma), kumarynę, fluoreskaminę, sukcynylofluorescynę i dansyl (1-(dimetyloamino)-naftaleno-5-sulfonyl).
Przeprowadzoną w pochodne mieszaninę reakcyjną można rozdzielić przez elektroforezę żelową i poddać detekcji przez fotometrię albo spektroskopię laserową (H. Swerdlow i R. Gesterland, Nuci. Acids Res. 18. strona 1415 (1990)). Jako dobrze nadająca się do stosowania okazała się również elektroforeza kapilarna (A.S. Cohen i współpracownicy, P.N.A.S. US. 85, 9660 (1988)), np. wypełniona żelami akryloamidowymi. Detekcja następuje wtedy przeważnie przy wyjściu kapilary (H. Swerdlow, S. Wu, H. Harke, N. Dovichi, Chromatography 516, 61 (1990)).
Wychodząc ze związku o wzorze 1, który posiada w pozycji 5’ trifosforan, stosując dowolny primer i nić-matrycę, za pomocą polimerazy, to znaczy enzymu, który w obecności odpowiednich substratów syntetyzuje wierną, komplementarną kopię sekwencji, można w obecności czterech nukleozydotrifosforanów przeprowadzić syntezę dwuniciowego DNA, przeważnie za pomocą T7-albo Taqpolimerazy, DNA-polimerazy I i odwrotnej transkryptazy. Jako grupy zabezpieczające w pozycji 5’ służą trifenylometyl, metoksy-albo dimetoksytrifenylornety! (Gait, Oligonucleotide Synthesis, JRL-Press, Oxford 1984).
Terminację syntezy można specyficznie oznaczyć każdorazowo przez użycie 3’-aminomodyfikowanego nukleotydu A, C, G, T o wzorze 1. To ma szczególne znaczenie dla syntezy przeciwległych nici DNA w obecności nici-matrycy, a zatem również dla sekwencjonowania nici DNA, ponieważ użycie modyfikowanego nukleotydu zapewnia bardzo specyficzną zasadową terminację reakcji.
Synteza RNA-nukleozydów, nukleotydów i oligonukleotydów następuje w analogiczny sposób i analogiczną drogą.
168 874
Poza tym możliwajest synteza dających się przeprowadzić w pochodne oligonukleotydów za pomocą nukleotydu starterowego, który zmodyfikowano amino albo tio na końcu 3’ i utrwalono na oligomerycznym nośniku.
Jako oligonukleotydy mają znaczenie wszystkie w tradycyjnym sensie wytwarzane nukleotydy DNA i RNA, przeważnie jednak o długości 2 do 100, szczególnie korzystnie 12 do 50 nukleotydów (chemiczna synteza) lub o długości do około 3000 nukleotydów (enzymatyczna synteza), zależnie od skuteczności zastosowanej polimerazy.
Synteza oligonukleotydu następuje wychodząc z kompleksu nukleotyd starterowy-nośnik w tradycyjnym sensie, to znaczy w kierunku 3’ i 5’ i umożliwia syntezę oligonukleotydu o określonej sekwencji.
Utrwalanie nukleozydu starterowego na znajdujących się w handlu nośnikach następuje przez ramię związku (Spacer), które można odszczepić po syntezie; na przykład przez znane z literatury połączenie kwasu bursztynowego albo przez połączenie z uretanem (Efimov i współpracownicy, Nuci. acids. Res. ll, 8369,1983).
Po syntezie oligonukleotyd trzeba odszczepić od nośnika odpowiednimi odczynnikami. Potem następuje wprost przeprowadzenie w pochodne dowolnym barwnikiem fluorescencyjnym.
Tak zsyntetyzowane i zmodyfikowane na końcu 3’-oligonukleotydy mogą potem być zastosowane do detekcji np. komplementarnych oligonukleotydów.
Sposób według wynalazku łączy dwie korzyści, a mianowicie po pierwsze przy wytwarzaniu znaczonej przeciwległej nici następuje jednocześnie zakończenie nici przez stojący na końcu 3’-amIno albo tiolomodyfikowany nukleotyd. Przez znakowanie jego barwnikiem fluorescencyjnym w pozycji 3’ możliwa jest poza tym bezpieczna detekcja. Druga korzyść polega na tym, że przy wytwarzaniu dokładnie określonych oligonukleotydów przez znakowanie przyłączonego do nośnika i również 3’-amino- albo tiolomodyfikownego nukleotydu starterowego możllwia jest dokładna synteza oligonukleotydu połączona z możliwością znakowania fluorescencyjnego i zatem detekcji.
Przedstawione niżej przykłady służą do dalszego objaśnienia wynalazku.
Przykłady
1. Anomeryczne 3’-amino- albo -azydo-nukleozydo-5’-trifosforany
Przykład I. Wytwarzanie 5’-trifosforano-3’-amino-3’-dezoksyrybozydo-tymidyny według schematu l, 5’-monofosforano-3’ -azydo-3’-dezoksyrybozydo-tymidyna.
160 mg (0,6 mmoli) 3’azydotymidyny (Sigma) rozpuszcza się podczas mieszania w 10 ml fosforanu trietylowego. Przez wkraplacz dodaje się do roztworu w temperaturze 4°C 0,2 ml POCI3 w 6 ml fosforanu trietylowego. Po 24 godzinach zobojętnia się przy użyciu 50 ml nasyconego roztworu NaHCO3 i wytrząsa po dwa razy z 60 ml toluenu i 100 ml teru. Fazę wodną rozcieńcza się destylowaną wodą do 500 ml i podaje na kolumnę anionitową (®Sephadex A-25; 50 x 2,5 cm) która przez przepuszczanie 200 ml 0,2 M buforu TBK (bufor wodorowęglan trietyloamoniowy; pH 7,5 ustawiło się samo) jest obciążone HCO3 jako przeciwjonem. Potem oczyszcza się przez przepuszczanie 300 ml wody destylowanej i eluuje najpierw przy użyciu 200 ml 0,1 M buforu TBK i potem liniowym gradientem 0,1 - 0,2 M buforu TBK (całkowita objętość gradientowa 1350 ml). W chromatogramie pokazuje się pik, pik produktu. Produkt eluował przy stężeniu buforu 0,12 do 0,15 M buforu TBK. Frakcje 20 ml pozytywne według DC łączy się i zatęża przez liofilizację. Wodorowęglan trietyloamoniowy usuwa się przez wielokrotne dodanie etanolu. Produkt występuje jako biała, krystaliczna sól trletyloumomowu. Wydajność: 220 mg (56,2%); ciężar cząsteczkowy: 651,81; Rf (amoniak: izopropanol: woda = 10:70:20): 0,40 300 MHz-’H-NMR (D20): 1,36 (t, 3H, CH3); 1,90 (s, 3H, CH3); 2,50 (m, 4H, 2’, 2”-H); 3,18-3,30 (dd, 2H, CH2); 4,10 (m, 1H, 4’-H); 4,3 (m, 1H, 3’-H); 6,31 (t, 1H, 1’-H); 7,7 (s, 1H, 6-H); 11,50 (s, 1H, NH) 300MHz-31P-NMR (85% H3P04extem, D20): 1,23 (s, 1P).
’-trifosforano-3 ’ -azydo-3 ’ -dezoksyrybozydo-tymidyna
130 mg (0,2 mmoli) 5’-monofosforano-3’-azydo-3’, 2’-dezoksyrybozydotyminy jako soli trietyloamoniowej rozpuszcza się w 6 ml absolutnego DMF (dimetyloformamidu) i do roztworu dodaje w temperaturze 25°C 162,15 mg (1 mmol) N’,N’-karbonylodiimidazolu w 3 ml absolut6
168 874 nego DMF podczas mieszania. Po czasie reakcji trwającym 2 godziny dodaje się 1 ml absolutnego metanolu, miesza przez dalsze 15 minut i oddestylowuje metanol. Pozostałość zadaje się 5 ml 0,2 M roztworu pirofosforanu tri-n-butyloamoniowego w DMF i miesza przez noc w temperaturze pokojowej. Odsącza się osad powstały z pirofosforanu imidazolu, przemywa 20 ml DMF i przesącz zatęża w wyparce obrotowej. Pozostałość rozpuszcza się w 250 ml 0,1 M buforu TBK i roztwór poddaje na kolumnę anionitową Sephadex A-25 obciążoną HCO3'. Produkt oczyszcza się przez przepuszczenie 200 ml destylowanej wody i eluuje liniowym gradientem 0 do 0,5 M buforu TBK (całkowita objętość gradientowa 2000 ml). W chromatogramie pojawiają się dwa piki, z których pierwszy wytworzony jest przez monofosforan, a drugi przez produkt. Produkt eluował przy stężeniu buforu 0,30 do 0,35 M buforu TBK. Pozytywne 20 ml frakcje łączy się i zatęża przez liofilizację. Wodorowęglan trietyloamoniowy usuwa się przez wielokrotne dodanie etanolu. Produkt występuje jako biała, krystaliczna sól trietyloamoniowa. Wydajność: 92 mg (50,4%): ciężar cząsteczkowy: 911,95; Rf (amoniak: izopropanol: woda = 10:70:20): 0,14 300 MHz-T-NMR (85% H3PO4 extem, D20): -10,74 (d, 2Jpp = 22,1 Hz, 1P, alfa-P-atom): -11,45 (d, 2jpp= 21,9 Hz, 1P, gamma-P-atom); -22,99 (t, 3Jpp = 20,3Hz, 1P, beta-P-atom).
’ -trifosforano-3 ’ -amino-3 ’ -dezoksyrybozydo-tymidyna mg (0,075 mmoli) 5’-trifosforano-3’-azydo-3’, 2’-dezoksyrybozydotyminyrozpuszcza się w 5 ml mieszaniny dioksan-woda destylowana (2:1) i przy mieszaniu w temperaturze pokojowej dodaje się 200 mg (0,75 mmoli) trifenylofosfiny. Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze 25°C przez 30 godzin i potem odciąga rozpuszczalnik. Pozostałość rozpuszcza się w 30 ml destylowanej wody i ekstrahuje trzykrotnie stosując po 30 ml eteru. Fazę wodną rozcieńcza się do 150 ml i roztwór podaje na kolumnę anionitową Sephadex A-25 obciążoną HCO3’. Produkt oczyszcza się przez przepuszczenie 200 ml destylowanej wody i eluuje liniowym gradientem 0 do 0,5 M buforu TBK (objętość gradientowa 2000 ml). Chromatogram pokazuje trzy piki, z których pierwszy wytwarza monofosforanowy związek 6, drugi pik produktu, a trzeci przedstawia pik eduktu 7. Produkt eluował przy stężeniu buforu 0,40 do 0,42 M buforu TBK. Łączy się pozytywne 25 ml frakcje i zatęża je przez liofilizację. Wodorowęglan trietyloamoniowy usuwa się przez dodanie etanolu. Produkt występuje jako biało-bezpostaciowa sól trietyloamoniowa. Wydajność: 57 mg (85,7%); ciężar cząsteczkowy: 885,90; Rf(amoniak:izopropanol: woda = 10:70:20): 0,08; 300 MHz-1H-NMR (D2O): 1,30 (t, 3H, CH3); 1,92 (s, 3H, CH3); 2,64 (m, 4H, 2’, 2”-H); 3,19-3,21 (dd,2H, CH2);4,26(m, 1H,4’-H):4,41 (m, 1H, 3’-H); 6,34 (t, 3jhh = 6,74 Hz, 1H, 1’-H); 7,69 (s, 1H, 6-H); 11,50 (s, 1H, NH). 300 MHz^P-NMR (85% H3PO4 extem, D20); -10,75 (d, 2jpp = 22 Hz, 1P; alfa-P-atom); -11,45 (d, 2jpp = 21,9 Hz, 1P, gamma-P-atom); -22,05 (t, 3jpp = 20,4 Hz, 1P, beta-P-atom).
Przykład II. Wytwarzanie 1-(3’-am^no-2’,3’-didezoksy-5’-trifosforano-3-D-treopentofuranozylo)-tyminy według schematu 2 1-(3’-azydo-2’, 3’-didezoksy-5’,0-dimetoksytrifenylometyIo-3-D-treopentofuranozylo)-tymina
Do roztworu 5,98 g (11 mmoli) 5 ’ -dimetoksytrifenylometylotymidyny (wytwarzanie patrz M. Gait, Oligonucleotide synthesis, IRL Press (1984), strona 27), trifenylofosfiny (3,076 g, 11,73 mmoli) i 3,1 g (55 mmoli) azydku litu w 37 ml suchego DMF dodaje się podczas mieszania 4,10 g (11,91 mmoli) czterobromku węgla. Całość miesza się przez 56 godzin w temperaturze pokojowej i potem dodaje 15 ml metanolu. Następnie produkt wytrąca się w 800 ml lodowato zimnej wody destylowanej. Osad przenosi się do chloroformu i oczyszcza przez chromatografię rzutową (octan etylu: n-heksan = 3:1).
Wydajność: 4,95 g (80%); Rf (chloroform:metanol = 9:1): 0,52 IR (cm'1): 2100 azyd.
-(3’ -amino-2’ ,3’-didezoksy-5’-0-dimetoksytrifenylometylo-e-D-treopentofuranoksylo)-tymina
Do mieszanego roztworu 0,5 g (0,8 mmoli) 1-(3’-azydo-2’,3 -didezoksy-5’-0-dimetoksytrifenylometylo-e-D-tropentofuranozylo)-tyminy dodaje się 0,15 g trifenylofosfiny (1,3 g, 4,94 mmoli) i pozostawia na 4 godziny do przereagowania. W celu zhydrolizowania fosfinoiminy dodaje się 3 ml destylowanej wody i miesza przez dalsze 3 godziny. Pozostały po usunięciu rozpuszczalnika w wyparce obrotowej olej oczyszcza się przez chromatografię rzutową (chloroform: metanol = 99:1+1% trietyloaminy). Wartość Rt w takim samym eluencie = 0,27. Przez
168 874 potraktowanie ninhydryną w chromatografii cienkowarstwowej (DC) można zabarwić aminę na fioletowo. Wydajność: 0,42 g (87,5%). Produkt wykazuje odpowiednie widmo ‘H-NMR.
Reakcja do 1-(3 ’ -amino-2’ ,3 ’ -didezoksy-5 '-trifosforano-3-D-treopentofuranozylo)-tyminy
Dla dalszej reakcii do 5-trifosforanu, analogicznie iak onisa.no u M. Gait’ a Oligonuc-leotide synthesis, IRL Press, strona 49 (1984), usuwa się grupą dimetoksytrifenylometylową i przeprowadza przyłączenie trifosforanu w pozycję 5’, jak wzmiankowane w przykładzie I.
Przykład III. Wytwarzanie 3’-amino-2’,3’-didezoksy-5 ’-trifosforano-adenozyny według schematu 4.
N^-benzoilo^-^-O-benzoilo^-dezoksy-p-D-treopentofuranozylohadenina.
Zawiesinę 920 mg (2 mmoli)N6,5’-0-dibenzoilo-2’-dezoksyadenozyny (wytworzonej metodą opisaną przez Nishino i współpracowników, Nucleosides & Nucleotides 1986, 5, 159) w 30 ml absolutnego dichlorometanu (zawierającego 2 ml pirydyny) ochładza się do temperatury -30°C i wkrapla powoli 5 ml roztworu bezwodnika kwasu trifluorometanosulfonowego w dichlorometanie (10%-obj.). Po usunięciu łaźni chłodzącej pozwala się roztworowi ogrzać i dodaje doń 1 ml wody. Po 3 godzinach dodaje się dalsze 5 ml wody i przemywa fazę organiczną. Po usunięciu rozpuszczalnika otrzymaną pozostałość rozpuszcza się w 50 ml metanolu i dodaje 100 mg wodorowęglanu sodu. Miesza się dalsze 2 godziny w temperaturze pokojowej, zobojętnia 10% kwasem octowym, oddestylowuje rozpuszczalnik i oczyszcza przez chromatografię rzutową na żelu krzemionkowym (chloroform: metanol = 97:3).
Wydajność: 710 mg (1,48 mmoli) 75%.
Wartość Rf (chloroform: metanol = 97:3): 0,49.
MS = 459 ’ -azydo-2 ’ ,3 ’ -didezoksyadenozyna
Roztwór 920 mg (2 mmoli) N6-benzoilo-9-(5-0-bfnzoilo-2-dezoksy-β-D-tteopentofuranozylo)-adeniny w 20 ml absolutnego dichlorometanu (i 2 ml pirydyny) ochładza się do temperatury -30°C. Potem wkrapla się 5 ml (3 mmole) roztworu bezwodnika kwasu trifluorometanosulfonowego w absolutnym dichlorometanie. Usuwa się łaźnię chłodzącą, miesza przez dalsze 20 minut i do roztworu dodaje 980 mg (20 mmoli) azydku litu w 20 ml DMF. Miesza się przez dalsze 2 godziny w temperaturze pokojowej, po czym dodaje 50 ml wody i 150 ml chloroformu, fazę organiczną wytrząsa się i przemywa destylowaną wodą. Usuwa się rozpuszczalnik w wyparce obrotowej (®Rotyvapor) i w celu usunięcia zasadowej grupy zabezpieczającej traktuje się przez noc amoniakalnym roztworem metanolu. Po ponownym usunięciu rozpuszczalnika oczyszcza się przez chromatografię rzutową (chloroform: metanol = 95:5) na żelu krzemionkowym.
Wydajność: 430 mg (1,6 mmoli, 79%) białego, krystalicznego proszku.
IR: 2100 cm1 grupa azydowa ’ -amino-2 ’ ,3 ’ -didezoksy-5 ' -trifosforano-adenozyna
Wytwarzanie 5 ’ -trifosforanu prowadzi się analogicznie do przykładu I. Następnie redukuje się grupę azydową do aminowej, jak w przykładzie II.
Przykład IV. Wytwarzanie 3’-amino-2’,3’-didezoksy-5’-trifosforano-guanozyny według schematu 5.
Wytwarzanie 3’-amino-2’, 3’-didezoksy-5’-trifosforano-guanozyny prowadzi się wychodząc z N2-izobutyyto-5’-0-bfnzoilo-2’-dezoksy guanozyny, którą można wytwarzać metodą Nishino i współpracowników (Nucleosides & Nucleotides 5, 159, 1986). Reakcja nukleozydu do 3 ’ -azydu następuje analogicznie do wytwarzania podanego w przykładzie m. Przy tym należy zauważyć, że traktowanie amoniakalnym roztworem metanolu nie dochodzi do skutku, ponieważ usunięcie zabezpieczającej grupy izobutyrylowej następuje dopiero po wprowadzeniu grupy trifosforanowej, a przed redukcją azydu do aminy. Reakcja do trifosforanu następuje także w przypadku guanozyny według metody wymienionej w przykładzie I. Redukcja do aminy opisana jest w przykładzie II.
2. Wytwarzanie 3’-amino-oligomerów i następne znakowanie 3’-fluorescencyjne.
Przykład V. Synteza oligomeru z 20 nukleotydów 3’-H2N-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-5 ’ następuje wychodząc z 3’amino-3’-dezoksy-tymidyny zabezpieczonej 5’-dimetoksytrifenylometylem. Wytwarzanie tego związku przebiega według opisu przykładu I. Przy tym wychodzi
168 874 się z zabezpieczonej 5’-dimetoksytrifenylometylem AZT (azydo-3’-dezoksyrybozydo-tymidyny), którą można wytworzyć z AZT i chlorku dimetoksytrifenylometylu według metody M. Gait’a (Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, strona 27).
Następnie związek redukuje się, jak opisano w przykładzie I, trifenylofosfiną. Następnym etapemjest wytworzenie nośnika. W tym celu 200 mg 5’-0-(4,4’-dimetoksytrifenylometylo)-3’amino-3-dezoksy-tymidyny umieszcza się w 700 (il absolutnej pirydyny. Do tego roztworu dodaje się 45 mg DMAP (dimetyloaminopirydyny) i następnie 40 mg bezwodnika kwasu bursztynowego. Po staniu przez noc hydrolizuje się pozostały bezwodnik kwasu bursztynowego przez dodanie 10 gl wody. Trzykrotnie współodparowuje się z toluenem i pozostałość przenosi do 12 ml chlorku metylenu, przemywa 4 ml zimnego kwasu cytrynowego (10%) i dwukrotnie 4 ml wody. Fazę organiczną suszy się nad siarczanem sodu, zatęża objętość rozpuszczalnika i substancję rozpuszcza w 1 ml chlorku metylenu. Roztwór ten wkrapla się powoli podczas mieszania do 30 ml n-heksanu. Wytrącony osad odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy go w temperaturze 40°C pod zmniejszonym ciśnieniem wytworzonym przy użyciu pompy olejowej. Dalsze wytwarzanie nośnika na bazie CPG następuje według znormalizowanych protokołow, a dla wytworzenia oligomeru z 12 nukcotydów pracuje się dalej ze znormalizowanym cyklem (ABI 380A User Bulletin, Issue nr 36, lipiec 1986) na syntetyzerze AB1 380 A DNA według sposobu fosforoamidiiu. Po usunięciu grupy zabezpieczającej i odszczepieniu 3’-aminooligonukleotydu od nośnika zgodnie z normą oczyszcza się i charakteryzuje. Lepsze wyniki można przy tym uzyskać przez bardziej labilne wobec zasad metody sprzęgania dla przyłączenia do nośnika. Korzystne jest podstawienie przeznaczonego do odszczepienia amidu kwasowego przez funkcję uretanową, jak to zostało opisane u Efimov’a (Nucleic Acid Res. 11, 8369, 1983).
Przykład VI. Synteza oligomeru z 23 nukleotydów z końcem 3 ’ -amino 3 ’ -H2N-ACACCCAATTCTGAAAATGGAT-5’ następuje według opisu w przykładzie I. Oczyszczenie i charakteryzacja następuje metodami standardowymi.
Przykład VII. Następne utworzenie pochodnych oligomerów przy terminalnym 3’-amino następuje przy użyciu izotiocyjanianu fluoresceiny. W naczyniu Eppendorf’ a 50, nmoli 3’-aminooligonukleotydu rozpuszcza się w 25 gl 500 mM roztworu wodorowęglanu sodu. Dodaje się 20 gl 300 mM roztworu FITC (Sigma) w DMSO. Po czasie reakcji trwającym 6 godzin w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną oczyszcza się przez przepuszczanie w 20 mM roztworze octanu amonu przez kolumnę Sephadex G-25.3’-FITC-oligomer analizowano poprzez analityczny przebieg HPLC zarówno przez detekcję fluoresceinową jak też przez detekcję UV. Wyniki HPLC weryfikowano również przez analizy na żelowej elektroforezie kapilarnej (firma Dionex). Izotiocyjanian fluoresceiny przedstawiony jest wzorem 3.
Przykład VIII. Obydwa 3’-aminooligomery z przykładu I i II poddaje się metodą opisaną w przykładzie III reakcji z izotiocyjanianem rodaminy o wzorze 4 i tetrametylorodaminy o wzorze 5. Oligomery znaczone 3’-fluorescencyjnie są analizowane poprzez analityczny przebieg HPLC zarówno przez detekcję fluoresceinową jak też przez detekcję UV. Wyniki HPLC weryfikowano także przez analizy na żelowej elektroforezie kapilarnej (firma Dionex).
Przykład IX. Obydwa 3 ’ -aminooligomery z przykładu I i II poddaje się reakcji metodą opisaną z przykładzie III z odtworzoną pochodną kumaryny. 3’-fluorescencyjnie znaczony oligomer analizuje się poprzez analityczny przebieg HPLC zarówno przez detekcję fluoresceinową jak też przez detekcję UV. Wyniki HPLC weryfikowano także przez analizy na żelowej elektroforezie kapilarnej (firma Dionex). Cząsteczka barwnika kumarynowego jest przedstawiona wzorem 6.
3. Budowa modyfikowanych nukleotydów przez polimerazy DNA oraz analiza eksperymentów sekwencjonowania.
W celu ponownego zbadania akceptacji aminotrifosforanów przez dostępne enzymy sekwencjonowania wytworzono odpowiednie roztwory terminacji i testowano polimerazy (Klenow, Boehringer; Taq, Amearsham; T7, Pharmacia; Sequenaste®, USB). Przy tym etapy budowy 1 właściwości terminacji trifosforanów analizowano zarówno klasycznie jak też przez znakowanie barwnikami fluorescencyjnymi.
168 874
Przykład X. Wytworzony według przykładu I 5’-trifosforano-3’-amino-3’-dezoksyrybozydowo-tymidynę wymieniono na 2’,3-didezoksy-5’-trifosforano-tymidynę. To następowało przy roztworach terminacji wszystkich podanych wyżej polimeraz. Każdor wnywp w%/r>rbHoii/w pia ndwo^nmielnu/p H71 Amprinkrnrnie wz^liQ7p i i 7imęierin1imtnie mnieic7p
X * » > -*> Tł V VT J V V» V » » <*A « K* Λ- \-f » ▼ Λ Λ V A V ·· S··.** « Αηρ Α —-Α. ** ΑΑΑΑ V . > Λ ΑΑΑΆΜ V Α »Α V W Λ. V Λ. V ΑΧΑ kŁAXV AA AAAA«^J WMW stosunki dNTP/terminator. Sekwencjonowaniaprzeprowadzano według znormalizowanych protokołów. W tych badaniach detekcji następowała autoradiograficznie przez wbudowanie alfa35S-dATP. Okazuje się, że a) 3’-amino-nuldeotyd działa terminacyjnie na zastosowane enzymy, b) etapy budowy w przypadku T7, Taq i sekwenazy są identyczne ze zwykłymi didezoksy-terminatorami i c) wreszcie aminonukleotydem można przeprowadzić bezproblemowo sekwencjonowanie.
Przykład XI. Związek 5’-trifosforano-3’-amino-3’-dezoksyrybozydowo-tymidynę poddano reakcji z izotiocyjanianem fluoresceiny do 5’-trifosforano-3’-amino-3’-dezoksyrybozydo-3’-Ń-fluoresceinoizotiocyjaniano-tymidyny.
2,5 mg (2,8 gmoli) 5’-trifosforano-3’-amino-3’,2’-dezoksyrybozydotyminy rozpuszcza się w naczyniu Eppendorf a w 200 gl destylowanej wody i dodaje 200 μ1 1 M bufom Na2CC^3/NaHCC^3 (pH 9). Mieszaninę reakcyjną chroni się przed dziennym światłem osłoną z aluminiowej folii i dodaje się przy użyciu 100 μΐ pipety 80 μl roztworu izotiocyjanianu fluoresceiny (10 mg w 1 ml DMF). Po czasie reakcji trwającym 10 minut w temperaturze pokojowej stwierdza się według DC ilościowe przereagowanie eduktu. Oczyszczanie prowadzi się przez chromatografię żelową. Kolumna Sephadex G-10 jest chroniona przed światłem za pomocą osłony z folii aluminiowej, następnie całą mieszaninę reakcyjną wprowadza się na materiał kolumny i eluuje strumieniem wody 1 ml/minutę. Chromatogram pokazuje dwa piki. Pierwszy pik wytworzonyjest przez produkt, a drugi przez nieprzereagowany barwnik. Wielkość frakcji wynosi 5 ml, łącznie otrzymuje się 24 frakcje. Na podstawie chromatogramu 4 frakcje okazują się jako pozytywne. To potwierdza DC. Usuwa się rozpuszczalnik przez liofilizację i substancję składuje w temperaturze -80°C.
Wydajność: 3,32 mg (93%); ciężar cząsteczkowy: 1,274,32;
Wartość Rf (amoniak: izopropanol: woda = 10:70:60): 0,62;
Fluorescencyjne widmo emisyjne: długość fali wypromieniowanego światła wynosi 420 nm. Maksimum emisji związku wynosi 514,8 nm. Mierzono 2,5 mM roztwór w destylowanej wodzie. Maksimum emisji 2,5 mM roztworu barwnika nie przeprowadzonego w pochodne w wodzie destylowanej leży przy długości fali 519,4 nm.
Wytworzoną 5’-trifosUorano-3’-amino-3’-dezoksyrybozydo-3’-Ń-fluoresceinoizotiocyjaniano-tymidę wymieniono na2’,3’-didezoksy-5’-trifosforano-tymidynę. Nastąpiło to w roztworach terminacji wszystkich podanych wyżej polimeraz. Każdorazowo wypróbowano równomolowe, dziesięciokrotnie większe i dziesięciokrotnie mniejsze stosunki dNTP/terminator. Sekwencjonowanie przeprowadzono według znormalizowanych protokółów. Przy tych badaniach detekcja następowała audioradiograficznie przez wbudowanie alfa^S-dATP. Okazuje się że a) 3’-fluorescencyjnie znaczony nukleotyd działa terminacyjnie na stosowane enzymy, b) etapy budowy w przypadku T7, Taq i sekwenazy na podstawie sterycznie wymagającej reszty barwnika przy dziesięciokrotnie wyższych stężeniach są identyczne ze zwykłymi didezoksyterminatorami i c) 3 ’ -fluorescencyjnie znakowanym terminatorem można przeprowadzić bezproblemowe sekwencjonowanie.
Przykład XII. Wytworzoną 5 ’ -triUosUoranf-3’ -amino-3’ dezoksyrybozydf-3’-Ń-fluoresceinoizotiocyjaniano-tymidynę wymieniono na 2’, 3’-didezoksy-5’-triUosUorar^o->'midynę. Następowało to przy roztworach terminacji polimeraz T7 i Taq. Za podstawę były dziesięciokrotnie większe stosunki dNTP/terminator. Sekwencjonowanie przeprowadzano według znormalizowanych protokółów. Przy tych badaniach zrezygnowano z budowy alfa^S-dATP i analizę sekwencyjną przeprowadzono skutecznie 3 ’ -fluorescencyjnie znaczonym terminatorem na dostępnym w handlu urządzeniu do sekwencjonowania DNA.
Przykład XIII. Wytwarzanie 5 ’-trifosforano-3 ’-tio-3 ’ -dezoksyrybozydo-tymidyny według schematu 6.
5’-0-dimetoksytrifenylometylo-3’-S-benzoilo-tiotymidyna
168 874
Wprowadzenie siarki w pozycję 3’ następuje przez podstawienie grupy wyjściowej (mesyiatu) tiobenzoesanem sodu.
Wytwarzanie tiobenzoesanu sodu prowadzi się przez dodanie 10 M NaOH do lodowato zimnego roztworu kwasu tiobenzoesowego (10 g) w 15 ml wody aż roztwór stanie się alkaliczny. Następnie ustawia sięiwartość pH na 7 wodnym roztworem kwasu tiobenzoesowego, ochładza do temperatury -5°C i roztwór sączy w celu usunięcia stałych pozostałości. Po usunięciu wody w wyparce obrotowej z etanolem suszy się żółtą sól pod zmniejszonym ciśnieniem nad pięciotlenkiem fosforu.
Roztwór 5 ’ -0-dimetoksytrifenylometylo-3 ’ -0-metanosulfonylo-2’-dezoksyksylo-tymidyny (8,45 mmoli) (synteza mesylatu: Miller, Fox (1964) J. Org. Chem. 29, 1772) i 33 mmoli tiobenzoesanu sodu w 30 ml DMF miesza się przez 4 godziny w temperaturze 100°C. Całość wytrząsa się z dichlorometanem i fazę organiczną przemywa nasyconym roztworem NaHCOs i nasyconymroztworemNaCL Po wysuszeniu fazy organicznej nad siarczanem sodu współodparowuje się dwukrotnie z toluenem i oleisty produkt oczyszcza przez chromatografię rzutową (żel krzemionkowy 60 H, chloroform/metanol 0 - 10%).
Wydajność; 60%; produkt posiada oczekiwane widmo 1H-NMR.
Zabezpieczającą grupę 5’-dimetoksytrifenylometylową w pozycji 5’ dla fosforylacji odszczepia się metodami znanymi z literatury (M. Gait, Oligonucleotide Synthesis, JRL-Press, Oxford 1984). Następnie metodą Eckstein’a i Ludwig’a (J. Org. Chem., 1989, tom 54, nr 3, 631) wytwarza się 5’trifosforan z chlorkiem salicylofosforowym (Aldrich) i przez traktowanie pirofosforanem. Tiol uwalnia się przez reakcję z 10 M NaOH w etanolu nasyconym argonem (R. Cosstick, Nucleic Acids Research 18,4, 829).
3’-tio-5’-trifosforano-tymidynę sprzęga się według metody przykładu VIII z jodoacetamidofluoresceiną (próby cząsteczkowe) i w tym etapie otrzymuje się z 80% wydajnością tionukleotyd znaczony fluoresceiną.
Przykład XIV. Wytwarzanie l-(3’-tio-2’,3’-didezoksy-5’-trifosforano-P-D-treopentofuranozylo)-tyminy według schematu 7.
Wychodząc z 5’-DMTr-O-, 3’-0-mesylo-tymidynę, jak opisano w przykładzie XIII, podstawia się tiobenzoesanem sodu. Potem następuje odszczepienie grupy 5’-zabezpieczającej, wprowadzenie 5’-trifosforanu, uwolnienie tiolu i przyłączenie jodoacetamidofluoresceiny analogicznie do sposobu przykładu XIII.
Przykład XV. Wytwarzanie oligomeru z 10 nukleotydów 3’-3-HzN-T’TT TTT TTT T-5’.
Wytwarzanie oligomeru 3’-P-H2N-TTT TTT TTT T-5’ następuje wychodząc z l-(3’-amino-2’,3’-didezoksy-5’-DMTr-3-treopentofuranozylo)-tyiminy, którą według metody opisanej w przykładzie.V poddaje się reakcji do nośnika dla procesu fosforoamidytu. Następne znakowanie 3’-3-amino-oligonukleotydu izotiocyjanianem fluoresceiny następuje według przykładu VII.
WZÓR 2
168 874
WZÓR 3 WZÓR 5
WZÓR 4
WZÓR 6
168 874
168 874
OH
°9P3~V °4U
OH N3
SCHEMAT 3
SCHEMAT 4
DMTrO—kOj
W
SCHEMAT 7
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims (4)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania związku o wzorze 1, w którym R1 oznacza zasadę purynową albo pirymidynową, R3 oznacza przyłączony przez grupę aminową albo tiolową barwnik fluorescencyjny w pozycji α albo β, a R2 oznacza atom wodoru, grupę hydroksylową, zabezpieczoną grupę hydroksylową albo metoksylową w pozycji a albo β, n oznacza liczbę > 0, R4 oznacza grupę 5’-zabezpieczającą albo fosforan, pirofosforan albo trifosforan, R5 oznacza atom tlenu, fluorometylen, difluorometylen albo metylen, R6 oznacza grupę hydroksylową albo metoksylową albo atom wodoru w pozycji a albo β, przy czym R , r5 i r6 każdorazowo ewentualnie mają jednakowe albo różne znaczenia, Y oraz X oznaczają atom tlenu, atom siarki, NH albo metylen, przy czym X i Y każdorazowo są ewentualnie jednakowe albo różne, znamienny tym, że znajdującą się w pozycji 3' grupę hydroksylową nukleozydu, nukleotydu albo oligonukleotydu przeprowadza się w pochodną grupy aminowej albo tiolowej i następnie sprzęga z barwnikiem fluorescencyjnym.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że znajdującą się w pozycji 3’ grupę hydroksylową nukleozydu, nukleotydu albo oligonukleotydu przeprowadza się w pochodną grupy aminowej albo tiolowej tak, że najpierw do grupy 3’-hydroksylowej wprowadza się grupę opuszczającą, potem przez nukleofilowe działanie azydkiem wytwarza się azyd lub przez nukleofilowe działanie tiolanem albo S-zabezpieczonym tiolanem tworzy się tiol albo S-zabezpieczony tiol i następnie wolną grupę 3’-aminową albo tiolową części cukrowej na końcu 3’ kwasu nukleinowego poddaje się reakcji z reaktywnym barwnikiem fluorescencyjnym.
  3. 3. Sposób wytwarzania związku o wzorze 1, znamienny tym, że w związku o wzorze 2, w którym R1 do R6, X, Y oraz n mają wyżej podane znaczenia, przy czym r1, r5 , r6 każdorazowo mają ewentualnie jednakowe albo różne znaczenia, a R7 albo R8 oznaczają atom wodoru, grupę hydroksylową albo zabezpieczoną grupę hydroksylową lub metoksylową,
    a) w pozycji 3’ przez nukleofilowe działanie wprowadza się grupę azydową lub tiolową w zabezpieczonej albo niezabezpieczonej postaci i grupę azydową redukuje się do grupy aminowej i
    b) przez grupę aminową albo przez grupę tiolową przyłącza się barwniki fluorescencyjny.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1do 3, znamienny tym, że jako barwniki fluorescencyjne stosuje się fluoresceinę, rodaminę, czerwień Texas, NBD, kumarynę, fluoreskaminę, sukcynylofluorescynę i dansyl.
PL91292701A 1990-12-11 1991-12-10 Sposób wytwarzania 3’amino-albo tiolomodyfikowanych, sprzegnietych z barwnikiem fluorescencyjnym nukleozydów, nukleotydów i oligonukieotydów PL PL PL168874B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4039488 1990-12-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL292701A1 PL292701A1 (en) 1992-09-21
PL168874B1 true PL168874B1 (pl) 1996-04-30

Family

ID=6420050

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL91292701A PL168874B1 (pl) 1990-12-11 1991-12-10 Sposób wytwarzania 3’amino-albo tiolomodyfikowanych, sprzegnietych z barwnikiem fluorescencyjnym nukleozydów, nukleotydów i oligonukieotydów PL PL

Country Status (27)

Country Link
US (3) US5679785A (pl)
EP (1) EP0490281B1 (pl)
JP (1) JP3140127B2 (pl)
KR (1) KR920012107A (pl)
AT (1) ATE142222T1 (pl)
AU (1) AU643856B2 (pl)
BG (1) BG61484B1 (pl)
BR (1) BR9105335A (pl)
CA (1) CA2057475A1 (pl)
CS (1) CS374391A3 (pl)
DE (1) DE59108143D1 (pl)
DK (1) DK0490281T3 (pl)
ES (1) ES2093671T3 (pl)
FI (1) FI915779A (pl)
GR (1) GR3021041T3 (pl)
HU (1) HUT60505A (pl)
IE (1) IE75726B1 (pl)
IL (1) IL100298A (pl)
MX (1) MX9102468A (pl)
NO (1) NO914859L (pl)
NZ (1) NZ240900A (pl)
PL (1) PL168874B1 (pl)
PT (1) PT99747A (pl)
RO (1) RO111575B1 (pl)
RU (1) RU2073682C1 (pl)
TR (1) TR27715A (pl)
YU (1) YU187991A (pl)

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5476925A (en) * 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US5726297A (en) * 1994-03-18 1998-03-10 Lynx Therapeutics, Inc. Oligodeoxyribonucleotide N3' P5' phosphoramidates
US5599922A (en) * 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
AU704549B2 (en) * 1994-03-18 1999-04-29 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: synthesis and compounds; hybridization and nuclease resistance properties
DE4418691A1 (de) * 1994-05-28 1996-02-22 Boehringer Mannheim Gmbh 3'-(4'-) nicht-radioaktiv markierte Nukleoside und Nukleotide mit Aminocarbonsäure-, Peptid- oder Carbonsäure-Spacer
US5962271A (en) * 1996-01-03 1999-10-05 Cloutech Laboratories, Inc. Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end
US5859233A (en) * 1996-02-21 1999-01-12 Lynx Therapeutics, Inc. Synthons for synthesis of oligonucleotide N3-P5 phosphoramidates
US5684143A (en) * 1996-02-21 1997-11-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligo-2'-fluoronucleotide N3'->P5' phosphoramidates
US6017702A (en) * 1996-12-05 2000-01-25 The Perkin-Elmer Corporation Chain-termination type nucleic acid sequencing method including 2'-deoxyuridine-5'-triphosphate
DE19741084A1 (de) * 1997-09-18 1999-03-25 Knoell Hans Forschung Ev Hochaffine Nukleinsäuremoleküle mit funktionellen Gruppen zur spezifischen Erkennung von Zielmolekülen, ihre Herstellung und Verwendung
US6289229B1 (en) 1998-01-20 2001-09-11 Scimed Life Systems, Inc. Readable probe array for in vivo use
US6184347B1 (en) 1998-11-19 2001-02-06 Agilent Technologies Inc. Minimization of blooming in high-density arrays by using reactive wash reagents
US6761877B2 (en) * 2000-02-18 2004-07-13 Biocrystal, Ltd. Functionalized encapsulated fluorescent nanocrystals
EP1322710B2 (en) 2000-09-29 2015-02-18 Life Technologies Corporation Modified carbocyanine dyes and their conjugates
US7563618B2 (en) 2001-03-23 2009-07-21 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
KR100762261B1 (ko) 2001-04-27 2007-10-04 (주)바이오니아 전장 상보 디옥시리보핵산 제조 방법과 이에 사용되는앵커와 프라이머
US7205048B2 (en) * 2001-09-17 2007-04-17 Invitrogen Corporation Functionalized fluorescent nanocrystal compositions and methods of making
US7214428B2 (en) * 2001-09-17 2007-05-08 Invitrogen Corporation Highly luminescent functionalized semiconductor nanocrystals for biological and physical applications
EP2159044B1 (en) 2001-09-17 2012-05-16 Life Technologies Corporation Nanocrystals
WO2004055160A2 (en) * 2002-12-13 2004-07-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Biomolecular coupling methods using 1,3-dipolar cycloaddition chemistry
JP4177123B2 (ja) * 2003-01-10 2008-11-05 富士通株式会社 配線図形検証方法、プログラム及び装置
ES2524048T3 (es) 2003-03-31 2014-12-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Composiciones y métodos para la detección de ciertos flavivirus, incluidos los miembros del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa
US20050131224A1 (en) * 2003-12-15 2005-06-16 Cti Pet Systems, Inc. Method for preparing radiolabeled thymidine
US7160537B2 (en) * 2003-12-15 2007-01-09 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Method for preparing radiolabeled thymidine having low chromophoric byproducts
US7939251B2 (en) 2004-05-06 2011-05-10 Roche Molecular Systems, Inc. SENP1 as a marker for cancer
JP2008510852A (ja) * 2004-08-17 2008-04-10 インヴィトロジェン コーポレーション 高発光性コロイド粒子の合成
EP1809720B1 (en) * 2004-10-29 2012-05-02 Life Technologies Corporation Functionalized fluorescent nanocrystals, and methods for their preparation and use
WO2006048262A2 (en) * 2004-11-04 2006-05-11 Roche Diagnostics Gmbh Classification of acute myeloid leukemia
US7541144B2 (en) * 2005-01-31 2009-06-02 Agilent Technologies, Inc. RNA labeling method
EP2272983A1 (en) * 2005-02-01 2011-01-12 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Reagents, methods and libraries for bead-based sequencing
US7544471B2 (en) * 2005-07-30 2009-06-09 Agilent Technologies, Inc. Preparing RNA from a wax-embedded tissue specimen
US7700289B2 (en) * 2006-04-03 2010-04-20 Agilent Technologies, Inc. Method for labeling RNA
CN101495654A (zh) * 2006-04-19 2009-07-29 阿普里拉股份有限公司 无凝胶珠基测序的试剂、方法和文库
US7572585B2 (en) * 2006-07-31 2009-08-11 Agilent Technologies, Inc. Enzymatic labeling of RNA
MX338089B (es) * 2006-12-05 2016-04-01 Lasergen Inc Nucleotidos y necleosidos marcados de foto-escision y necleotidos y necleosidos marcados y metodos para su uso en secuenciacion de adn.
JP5777340B2 (ja) 2007-08-06 2015-09-09 オリオン ゲノミクス エルエルシー Ｉｇｆ２遺伝子の対立遺伝子特異的な発現を判定するための一塩基多型ならびに新規および公知の多型の組み合わせ
CA2639416C (en) 2007-09-11 2019-12-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Diagnostic test for susceptibility to b-raf kinase inhibitors
JP2010539982A (ja) * 2007-10-01 2010-12-24 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー チェイスライゲーション配列決定法
US20100086914A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Roche Molecular Systems, Inc. High resolution, high throughput hla genotyping by clonal sequencing
JP5748672B2 (ja) 2009-02-11 2015-07-15 オリオン ゲノミクス エルエルシー Ｉｇｆ２の対立遺伝子特異的な発現を判定するための多型の組み合わせ
US8431416B2 (en) 2009-04-01 2013-04-30 Becton, Dickinson And Company Reactive heterocycle-substituted 7-hydroxycoumarins and their conjugates
US8309059B2 (en) * 2009-08-31 2012-11-13 Promega Corporation Reactive cyanine compounds
WO2011128096A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Roche Diagnostics Gmbh Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment
CA2801468C (en) 2010-06-04 2018-09-04 Chronix Biomedical Prostate cancer associated circulating nucleic acid biomarkers
US8623324B2 (en) 2010-07-21 2014-01-07 Aat Bioquest Inc. Luminescent dyes with a water-soluble intramolecular bridge and their biological conjugates
ES2729554T3 (es) 2011-10-21 2019-11-04 Chronix Biomedical Biomarcadores de ácidos nucleicos en circulación asociados al cáncer colorrectal
ES2413566B1 (es) 2011-12-14 2014-05-20 Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y pronóstico de la hipoacusia neurosensorial.
CN104619894B (zh) 2012-06-18 2017-06-06 纽亘技术公司 用于非期望核酸序列的阴性选择的组合物和方法
WO2014093825A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Chronix Biomedical Personalized biomarkers for cancer
SI3004388T2 (sl) 2013-05-29 2023-11-30 Chronix Biomedical Odkrivanje in kvantifikacija donorjeve brezcelične DNK v cirkulaciji prejemnikov presajenih organov
LT3201361T (lt) 2014-10-01 2020-06-10 Chronix Biomedical Laisvai cirkuliuojančios dnr kiekybinio įvertinimo būdai
KR20180136436A (ko) 2016-03-28 2018-12-24 에이에이티 바이오퀘스트, 인코포레이티드 폴리플루오레노[4,5-cde]옥세핀 접합체 및 피분석물 검출 방법에서의 이의 용도
US11220628B2 (en) 2019-02-20 2022-01-11 Aat Bioquest, Inc. Condensed polycyclic conjugated polymers and their use for biological detection
WO2021154933A1 (en) 2020-01-30 2021-08-05 Aat Bioquest, Inc. Uv excitable polyfluorene based conjugates and their use in methods of analyte detection
WO2023147355A2 (en) * 2022-01-25 2023-08-03 Oregon Health & Science University Methods and systems for increasing capture potential of a spatial array

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5015733A (en) * 1983-12-20 1991-05-14 California Institute Of Technology Nucleosides possessing blocked aliphatic amino groups
US4849513A (en) * 1983-12-20 1989-07-18 California Institute Of Technology Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups
EP0267996A1 (en) * 1986-11-20 1988-05-25 Tamir Biotechnology Ltd. New nucleotide derivatives
GB2236852B (en) * 1989-09-25 1994-04-06 Scotgen Ltd DNA probe based assays and intermediates useful in the synthesis of cleavable nucleic acids for use in such assays
US5227487A (en) * 1990-04-16 1993-07-13 Molecular Probes, Inc. Certain tricyclic and pentacyclic-hetero nitrogen rhodol dyes
US5541307A (en) * 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof

Also Published As

Publication number Publication date
RU2073682C1 (ru) 1997-02-20
PL292701A1 (en) 1992-09-21
ATE142222T1 (de) 1996-09-15
NZ240900A (en) 1994-07-26
US5668269A (en) 1997-09-16
IE75726B1 (en) 1997-09-24
CA2057475A1 (en) 1992-06-12
EP0490281A1 (de) 1992-06-17
DK0490281T3 (pl) 1997-02-10
AU8892791A (en) 1992-06-18
JP3140127B2 (ja) 2001-03-05
NO914859L (no) 1992-06-12
IL100298A0 (en) 1992-09-06
HU913885D0 (en) 1992-02-28
DE59108143D1 (de) 1996-10-10
RO111575B1 (ro) 1996-11-29
AU643856B2 (en) 1993-11-25
PT99747A (pt) 1992-11-30
NO914859D0 (no) 1991-12-10
IL100298A (en) 1997-03-18
YU187991A (sh) 1994-09-09
JPH04290896A (ja) 1992-10-15
CS374391A3 (en) 1992-06-17
BG61484B1 (bg) 1997-09-30
FI915779A0 (fi) 1991-12-09
EP0490281B1 (de) 1996-09-04
US5659025A (en) 1997-08-19
GR3021041T3 (en) 1996-12-31
FI915779A (fi) 1992-06-12
IE914301A1 (en) 1992-06-17
TR27715A (tr) 1995-06-22
US5679785A (en) 1997-10-21
MX9102468A (es) 1992-06-01
KR920012107A (ko) 1992-07-25
HUT60505A (en) 1992-09-28
BR9105335A (pt) 1992-08-25
ES2093671T3 (es) 1997-01-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL168874B1 (pl) Sposób wytwarzania 3’amino-albo tiolomodyfikowanych, sprzegnietych z barwnikiem fluorescencyjnym nukleozydów, nukleotydów i oligonukieotydów PL PL
US6573374B1 (en) Nucleotides labelled with an infrared dye and their use in nucleic acid detection
EP2089343B1 (en) Click chemistry for the production of reporter molecules
RU2699993C2 (ru) Модифицированные нуклеотидные линкеры
EP2125856B1 (en) Photocleavable labeled nucleotides and nucleosides and labeled nucleotides and nucleosides and methods for their use in dna sequencing
EP0543913B1 (en) Oligo(alpha-arabinofuranosyl nucleotides) and alpha-arabinofuranosyl precursors thereof
JP2542453B2 (ja) 検出可能な１本鎖オリゴヌクレオチドの化学的合成に有用な化合物
EP3356381A1 (en) Design and synthesis of novel disulfide linker based nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis
US20090081686A1 (en) Photocleavable labeled nucleotides and nucleosides and methods for their use in dna sequencing
EP2130835A1 (en) Compound having structure derived from mononucleoside or mononucleotide, nucleic acid, labeling substance, and method and kit for detection of nucleic acid
JPH10158530A (ja) 蛍光染料およびその製造方法
Christopherson et al. Synthesis of oligonucleotides containing 2′-deoxy-6-thioguanosine at a predetermined site
JPH03505209A (ja) 標的付与されたオリゴヌクレオチド類の合成に使用できるヌクレオシド誘導体類、これ等誘導体類から得たオリゴヌクレオチド類及びそれ等の合成
JPS63130599A (ja) 修飾ヌクレオチド
Stolze et al. Synthesis of 3′‐Sugar‐and Base‐Modified Nucleotides and Their Application as Potent Chain Terminators in DNA Sequencing
JPS60166695A (ja) オリゴヌクレオチド誘導体およびその製造法
WO2007105623A1 (ja) オリゴヌクレオチド固定化固相担体
JPS6299392A (ja) 新規リボヌクレオシド誘導体およびその用途
JPWO2004058793A1 (ja) ヌクレオチド誘導体とｄｎａマイクロアレイ