JPS60166695A - オリゴヌクレオチド誘導体およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

発明の背景 技術分野 本発明は、一般に、新規オリジ誘導体オチド訪導体に関
する。さらに具体的には、本発明は、ヌクレオチドの３
′−末端リン酸基延長上に適度な長さのスペーサーを介
して一級アミン基を導入してなるオリゴヌクレオチド誘
導体に関する。本発明は、また、このようなオリゴヌク
レオチド誘導体の製造法にも関する。 先行技術 近年、核酸の化学合成は新しい保護基の導入あるいはト
リエステル法、ホスファイト法等の新しい縮合法の開発
により飛緬的に進歩している。また、遺伝子工学の急速
な進歩とあいまって、核酸の化学合成がこの分野でも重
要な意義をもつようになってきた。例えば人工遺伝子を
合成し、遺伝子組換え操作を利用して有用物質の産生が
行なわれている（インターフェロン：　Ｎａｔｕｒｅ　
、　２８１．５４４（１９７９）、白血球由来インター
フェロン：　Ｎａｔｕｒａ。 ２８７．４１１（１９８０）　）。また、ハイブリッド
法のためのプローブとしての例（Ｎｕｅｌ、　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅａ、　９．８７９（１９８１）　’）、あるい
はｍＲＮＡ　あるいは一本鎖ＤＮＡから逆転写酵素ある
いはＤＮＡポリメラーゼによって、二本鎖ＤＮＡを合成
する際に必要な鋳型ＤＮＡに相補的なりＮＡ断片（プラ
イマー）として利用する例（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、　８．４（１５７（１９８０）　）　、等の応用
例もある。 （３） このように、核酸の有機化学的合成手段は、生体から単
離できない特殊な配列をもつオリゴヌクレオチドの合成
を可能にし、分子生物学、遺伝子工学等の研究に多大な
寄与をするものである。 本発明者らは現在まで、種々のオリジヌクレオチドの合
成を行なってその応用を検討してきたが、特にアフイニ
テイクロマトグラフイー用樹脂あるいは非放射性アフイ
ニテイゾローブ等を開発すべく鋭意努力を重ねた結果、
これまでにこれらの製造の際に有用な中間体であるオリ
ゴヌクレオチド誘導体を見出した（Ｉ￥ｊ願昭５７−１
３８１３６号、特願昭５８−２０４３０４号、％願昭５
８−２０４３０５号およびべく鋭意研究を行なった結果
、新たに有用な化合物である３−アミノアルキルオリゴ
ヌクレオチド誘導体を見出した。 要旨 本発明によるオリゴヌクレオチＦ鰺導体は、下式〔ｌで
示されるものであること、を特徴とする（４） ものである。 また、本発明による下式〔ｍ〕で示されるオリゴヌクレ
オチド誘導体の製造法は、下式［■′］で示される化合
物の３′−末端延長−ヒのＲ２，５′−末端のＲ３基、
塩基部分およびリン酸部分の保護基をすべて除去するこ
と、を特徴とするものである。 〔ただし、ｐは任意の自然数であり、Ｒｏはリン酸基の
保護基であり、Ｒ１は二価の直鎖または分岐鎖の炭化水
素残基であり、Ｒ２は水素またはアは）基の保護基であ
り、Ｒ３基は水素またはヌクレオチドの５′−水酸基の
保護基であり　Ｂ／はヌクレオチドを構成する塩基であ
って必要に応じて保護されたものであり、Ｂはヌクレオ
チドを構成する塩基である（　ＢｌまたはＢおよびＲｏ
が複数個存在するときは、それらは同一でも異なっても
よい）。ただし、式［璽′］で示される化合物は、Ｒｏ
、Ｒ２、Ｒ３およびＢ′に関してその少なくとも一つに
おいて保護されたものであるとする。］ 効果 本発明者らの合成した３′−アミノアルキル−オリゴデ
オキシリボヌクレオチドは、下記（１）〜（３）の５′
−アミノアルキルオリゴヌクレオチド（特願昭５８−２
０４３０６号）の特徴に加えて、さらに（４）〜（力の
特徴および利用価値を有するものである。 （１）　いかなる塩基配列を有するアフィニティークロ
マトグラフ用オリゴクヌレオチド樹脂や非放射性ハイブ
リダイゼイションプローブも製造スることができる。 （２）合成が非常に簡単であって、大量合成が可能であ
る。 （３）該オリゴヌクレオチドはその中に存在する他の官
能基（水酸基、リン酸基および塩基部分のアミン基など
）よりも反応性が高い一級アミノ基を有するので、反応
条件等の設定により他の化合物を選択的にアミン基部分
と結合させることが可能である。 （４）本発明者らのさきに提案した５′−アはノアルキ
ルーオリゴヌクレオチドと対をなす化合物として、研究
上および応用上型費である。 （５）　５’−末端側が普通のオリゴヌクレオチドと同
様に利用でき、たとえば〔３２Ｐ〕によりラベル化が可
能である。 （６）　３’−アミノアルキルオリゴヌクレオチドと５
′−アミノアルキル−オリゴヌクレオチドを組み合せて
使用することができる。たとえば標識物質（たとえばビ
オチン、２，４−ジニトロフェニル基など）をそれぞれ
のアミノ誘導体に付加後、リンカ−として天然のＩ）Ｎ
Ａに結合させ、それぞれの標識物質の性質を利用して特
定のＤＮＡを分離または検出する。 （力　前記の本発明者らの提案した５′−アミノアルキ
ルオリゴヌクレオチドの合成方法を組み合せることによ
り、本発明オリゴヌクレオチドの（７） ５′−末端にもアミノアルキル基を導入することができ
る。このビス−アミノ誘導体は、標識物質を２倍付加で
きるので、その標識物質による検出感度を倍に高めたり
、異なる標識物質を導入して２つの検出方法を利用でき
るようにすることが可能である。 本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、前記の式［
１１１で示されるものである（以下、化合物〔膠〕とい
う）。 式中、記号上は、２′−デオキシリＩヌクレオシドの３
′−および５′−水酸基を除いたデオキシリ２ヌクレオ
シド残基を示すのに慣用されているものであって、具体
的には下記の構造のものである。 置換基Ｂはヌクレオチドを構成する塩基を示し、通常は
アデニン、チミン、シトシ／またはグアニンである。化
合物〔ｌ中にＢが複数個存在すると（８） ぎは、それらは同一でも異なってもよい。 ｐは、自然数を示し、化合物［ＩＩＩ］の重合度を示す
ものである。その場合のｐは合成及び精製が可能ならば
、いかなる数でもよいが、実用的には１〜４０程度、特
に１〜４）程度、である。 基Ｒ１は化合物〔ｌのヌクレオチ１部分の３′−末端リ
ン酸基とアミン部分とを連結する二価の直鎖または分岐
鎖の炭化水素残基である。この部分はヌクレオチド鎖の
延長および脱保穫に影響を及ぼさずかつその条件で安定
であればいかなるものでもよい。特に、炭素数２〜２０
程度の直鎖または分岐鎖のアルキレン基が適当である。 化合物［１１１の合成 一般的説明 化合物〔ｌ、すなわち本発明による３′−アミノアルキ
ルオリゴヌクレオチド、は合目的的な任意の方法によっ
て合成することができる。 一つの好ましい方法は、前記の式〔璽′〕のオリゴヌク
レオチド誘導体、すなわちオリ１ゴデオキシヌクレオチ
ドの３′−末端リン酸基に基Ｒ１を介して−級アミノ基
を有し、この−級アミン基、ヌクレオチドの塩基部分お
よびリン酸基部分ならびに５′−末端水酸基のうちの少
な（とも一つが保護されたものであるもの、のすべての
保護基を除去することからなるものである。 一方、式〔■′〕の化合物は、たとえば、３′−末端水
酸基以外が保護されたヌクレオチドとアミノ基が保護さ
れたアミノアルキルアルコールとをリン酸基を介して縮
合させ、必要に応じて鎖長な伸ばす方法によって合成す
ることができる。 第１図は、この好ましい合成法の一例を示すフローチャ
ートである。フローチャート中の記号は、下記の意味を
持つ（その意義ないし詳細は、後記した通りである）。 Ｒ０リン酸基を保−する置換基である。 Ｒ１二価の直鎮または分岐鎖の炭化水素残基である。 Ｒ２水素またはアミノ基の保護基である。 Ｒ３水素または５−末端水酸基の保護基である。 ｍＸｎ、ｐ　任意の自然数 Ｂ　塩基 Ｂ′　必要に応じて保護された塩基。通常はＲ６−ベン
ゾイルアデニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、φ−ベン
ゾイルシトシンおよびチミン（すなわち保護不要）より
選択される。 ｘ−ｐ−ｘ　二価のリン酸化剤 ■ ＲＯ なお、デオキシオリゴリゼヌクレオチドの合成法は既に
各種のものが公知であって、保護基の種類およびその導
入ないし除去ならびに縮合その他について上記以外の詳
細は核酸の化学合成に関する放置や総説、たとえは「ヌ
クレオシＰ・ヌクレオチドの合成」（丸善１９７７年）
、［核酸有機化学−１（化学同人１９７９年）、「核酸
」（朝食書店１９７９年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、
　３４　、３１（１９７８）　、有合化、当−、７２３
（１９７８）および化学の領域、旦、　５６６（１９７
９）等、を８照されたい。 その合成 （１１） これらの各式で示される化合物（以下、それぞれ化合物

〔０〕、〔０′〕、ｒＢ、［１１１、および〔田′〕と
いう）は、前記の式で示されるものである。Ｒ１は前記
した通りに定義されるものであり、ＲＯ１Ｒ２およびＲ
３は、それぞれ水素あるいはリン酸基、−級アミノ基ま
たは３７−末端水酸基の保護基であり　Ｂ／はヌクレオ
チドを構成する塩基であって、必要に応じて保護された
ものである。本発明化合物［１１１は化合物〔■′〕の
保護基をすべて除去することからなる方法で製造するこ
とが好ましいから、化合物〔ｙ′〕はＲｏ、Ｒ２、Ｒ３
およびＢの少なくとも一つが保護されたものでなければ
ならない。 リン酸基を保護するＲｏは、オルトクロロフェニル基が
代表的である。−級アミン基を保護するＲ２は、トリフ
ルオロアセチル基または０−クロロフェニルスルフェニ
ル基が代表的である。５′−末端水酸基を保護するＲ３
はジメトキシ）　ＩＪチル基が代表的である。 ｍおよびｎは合成および精製が可能であるならばいかな
る数でもよいが、実用的には１〜４０程度、（１２） 特に１〜４）程度、である。ｍ＋ｎは前記したｐの定義
を充足するものでなければならない。 なお、二価のリン酸化剤の基Ｘは、トリアゾールまたは
ベンゾトリアゾールであることが好ましい。 式［■′］で示されている化合物は、式［１１〕（ｍ−
１）から出発し、通常用いられる保護ヌクレオチド（化
合物〔０′〕）を順次縮合させることによって合成する
ことができる。 化合物〔■′〕の合成法をその一実施態様（第１図）に
ついて示せば、下記の通りである。まず、第１図におい
て、３′−水酸基化合物［’：Ｏ］　（ｍ＝１　）に二
価のリン酸化剤（たとえば、ホスホジトリアゾリド、ホ
スホジクロリドまたはホスホペンシトリアゾリド等）を
作用させてリン酸化し、ついでアミノ基が保護されてい
るアミノアルコール化合物ｍ（この化合物はアミノアル
キレンアルコール（ＮＨ２Ｒ１０Ｈ）のアミン基をＲ２
で保護することにより得ることができる）を縮合させる
ことにより化合物［１〕（ｍ＝１）を得る。 なお、化合物［０］はｍ　〉１でもありうるが（この化
合物も通常のオリゴヌクレオチド合成法で製造可能）、
所望重合度ｐを実現するには化合物

〔０〕としてｍ　＞
　１のものを用いるよりもｍ　＝　１の化合物〔ＩＩ）
に化合物〔０′〕を１回フ５ｒいし数回縮合させること
による（詳細後記）方が好ましい。 次に、化合物（１１１（ｍ＝１）に任意の通常の合成に
使用される保循ヌクレオチド（化合物〔０′］）を適当
な回数縮合させることにより、目的の鎖長ｐの化合物〔
■′〕を得ることができる。縮合は縮合剤を用いること
がふつうであって、好ましい縮合剤としてはトリインプ
ロピルベンゼンスルホニルテトラゾリド、メシチレンス
ルホニルテトラゾリドおよびメシチレンスルホニルニト
ロトリアシリｒ等がある。また縮合はモノマー（ｎ＝１
）を順次縮合するよりも実施例に示すように、ブロック
同士の縮合を行なうのが好ましい。これは縮合、回数が
少なくてすむこと、精製が容易なことなどによるもので
ある。なお、反応条件等の詳細は後記実験例を参照され
たい。また、化合物〔■′１の他の合成法をも含めた合
成法の詳細については、同時出願の特許ａ（１）の明細
書の記載を参照された（１゜ 化合物〔Ｉ〕の合成 化合物［１１１１は、上記化合物〔■′〕の保護基をす
べて除去することによって得ることができる。各保護基
の除去は、所与の保護基の種類および反応１〆１・に応
じて、適当な試薬を用いて適当な順序で行なうことがで
きる。 好ましい方法の一つは、下記の通りである。すなわち、
先ず、リン酸トリエステル中のオルトクロロフェニル基
（ＲＯ）および塩基部分のアシル基（Ｒ２）は、（１，
５Ｍのテトラメチルグアニ・クン−ピリジン−２−カル
ボアルドキシムのジオキサン−水（９：　１　（ｖ／ｖ
）　）浴液で処理後、アルカリ処理（濃アンモニア水）
を行なうことより除去される。 Ｒ２がトリフルオロアセチル基の場合は、これはアンモ
ニア処理によってＲ２と同時に脱離されるカ、オルトニ
トロフェニルスルフェニル基テアル場合はメルカプトエ
タノール処理が必要である。 （１５） Ｒ２として他の保護基を用いた場合は、オリげヌクレオ
チド部分が安定な条件で、さらに別の処理を加えること
も可能である。 次に、Ｒ３が未だ残った状態の化合物〔■′１をセファ
デックスＧ−５０を用いて一度粗精製する。 これは、Ｒ３（・ジメトキシトリチル基）を利用した精
製法を用いるためである。すなわち、逆相カラムによる
ＨＰＬＣでまずＲ３をもつオリ♂ヌクレオチドを分離し
、次に８０％酢酸によってＲ３を除去する。これを再度
逆相カラムによるＨＰＬＣで精製して、目的の３′−ア
ミノアルキルオリゴヌクレグルミ気泳動などにより精製
することも可能である。 第１図のフローチャートに従って、本発明の化合物〔画
〕を合成した。 第１図で、記号は次の意味をもつ。 （１６） Ｂ′　ベンゾイル化アデニンまたはチミジンＢ　アデニ
ンまたはチミジン ＲＯオルトクロロフェニル Ｒ１ヘキセン Ｒ２トリフルオロアセチル Ｒ３ジメトキシトリチル Ｒ４シアノエチル ＭＳＮＴ　メシチレンスルホニルニトロトリアシリ　ド １ ｘ−ｐ−ｘ　ｘはトリアゾールまたはベンゾトリア０Ｒ
Ｏゾール 実施例１−１ ピリジン共沸により無水にした化合物［０１（Ｂ’＝Ｎ
−ベンゾイルアデニン、ｍ＝＝１　）　（１，３１ｇ。 ２ｍＭ）にｏ−クロロフェニルホスホジトリアゾリドの
ジオキサン溶液（７ｍｌ、４選、２．８　ｍＭ　）を加
えて２時間反応させる。薄層クロマトグラフィーにより
反応の完了を確認した後、ピリジン共沸、トルエン共沸
により無水にした化合物［１〕（）！Ｊフルオロアセ、
チル−６−アミンヘキサノール）（６４０ｍｇ　、　３
　ｍＭ　’）及び１−メチル−イミダゾール（５００ｍ
ｇ、６　ｍＭ　）を加えて一夜反応させる。 反応終了後、溶媒を留去し、クロロホルムで抽出し、水
、０．５Ｍリン酸二水素ナトリウム水溶液、飽和炭酸水
素す）　ＩＪウム水溶液、および水で順次洗浄し、無水
硫酸ナトリウムで乾燥する。クロロホルムな留去後、シ
リカゲルショートカラム（クロロホルムのメタノール溶
液、０→４％）で精製して、目的の化合物［＋１］（ｍ
＝１）を得る。 収率１，５０ｇ、７０％ この化合物（１１１（Ｂ’＝Ｎ−ベンゾイルアデニン、
ｍ　＝　１　）　（５００ｍｇ　、　０．４８　ｍＭ　
）を取り、２係−ベンゼンスルホン酸のクロロホルム−
メタノール７　：　３　ｖ／ｖ　）溶ｆｉ、　（１０ｍ
ｌ　）中で、室温にて３分間で脱トリチル化する。飽和
炭酸水素ナトリウムおよび水で洗浄後、クロロホルムを
留去する。これに、化合物［：　Ｏ’ＴＩ　（Ｂ’＝Ｎ
−ベンゾイルアデニン、ｎ　＝　２　）　（１，０３ｇ
　、　０．７２　ｍＭ　）　をピリジン−トリエチルア
ミン−水（３：　１　：　１　ｖ／ｖ　）　２０ｍ１で
室温で１１分処理してＲ３を除去しかつ溶媒を完全に留
去した化合物を加え、共沸させて無水とする。これに無
水ピリジン（５ｍｌ）　およびメシチレンスルホニルニ
トロトリアゾリド（以下ＭＳＮＴと記す）（４３０ｍｇ
　、１．４４　ｍＭ　’）　を加えて、２時間反応させ
る。薄層クロマトグラフィーで反応の完了を確認した後
、濃縮する。トルエン共沸によりピリジンを除去したの
ち、２％ベンゼンスルホン酸のクロロホルム−メタノー
ル（７：　３　ｖ／ｖ　）溶液処理（６ｍｌ、室温、５
分間）して、脱トリチル化する。常法により抽出を行な
い、シリカゲルで精製して、目的の化合物［１１”］　
（］Ｂ’＝Ｎ−ベンゾイルアデニンｐ＝３、Ｒ３＝Ｈ）
を得る。 収線４１０　ｍｇ　（０，２３ｍＭ　）、４８％実施例
１−２ 化合物（０１（Ｂ’＝チミン、ｍ：１．１．１０ｇ２　
ｍＭ　）、　ジトリアゾリド浴液（７ｍｌ／ｍＭ、２．
８ｍＭ）、化合物［１］（）リフルオロアセチル−６−
アミンヘキサノール、６４０　ｍｇ　３　ｍＭ　）およ
び１〜メチルイミダゾール（５００ｍｇ、　６　ｍＭ　
）を加え（１９） て以下実施例１−１と同様に反応させ、精製して、化合
物口１］　（Ｂ’＝チミン、ｍ　＝　１　）、１．１３
ｇ　（６０％）を得る。 この化合物［Ｈ］　（２７０ｍｇ、０，３　ｒｒＭ　）
を同様に脱トリチル化後、脱シアンエチル化した化合物
（０’）　（Ｂ’＝チミン、ｎ＝２ｐ、Ｒ４＝　Ｈ、５
３０ｍｇ。 ０．４４　ｍＭ　）と無水ピリジン（２ｍｌ）中ＭＳＮ
Ｔ（２６０ｍｇ　、　０．８８　ｍＭ　）　を用いて縮
合させる。２チベンゼンスルホン酸により脱トリチル化
後、抽出精製して、目的の化合物〔■′〕（Ｂ′＝チミ
ン、ｐ＝３、Ｒ３＝Ｈ）、２３０　ｍｇ、５２％を得る
。 実施例１−３ 実施例１−１で合成した化合物［１１’）　（Ｂ’＝Ｎ
　−ベンゾイルアデニン、ｍ　＝　３　）　（２１０ｍ
ｇ　、　０．１２ｍＭ）　および脱シアンエチル化した
化合物〔０′〕（Ｂ’＝Ｎ−ベンゾイル−アデニン、ｎ
＝３、Ｒ’＝Ｈ、３００ｍｇ　１０．１５　ｍＭ　）　
を無水ピリジン２ｍｌ中ＭＳＮＴ　（２２０ｍｇ　、　
０，７５　ｒｒＭ　）を用いて縮合させる。２チベンゼ
ンスルホン酸処理後、精製して、目的のヘキサマー［１
’］（Ｂ’＝Ｎ−ぺ／シイルア（２０） デニン、ｐ＝５、Ｒ３＝Ｈ）　２４０　ｍｇ　（５９％
）を得る。 実施例１−４ 実施例１−２で合成した化合物［１１１（Ｂ’−チミン
、ｍ　＝　３、Ｒ３＝　Ｈ、１１０ｍｇ　、０．０７５
　ｍＭ　）　および脱シアンエチル化した化合物［ｏ’
）　（Ｂ’＝チミン、ｎ　＝　３、Ｒ３＝Ｈ，１５５ｍ
ｇ　、　０，１０　ｒｒＭ　）を無水ピリジン（２ｍｌ
）中ＭＳＮＴ　（１３０ｍｇ　、　０．４５ｍＭ　）　
を用いて縮合させる。脱トリチル化後精製して、目的の
ヘキサマー［Ｉｔ’）　（Ｂ’＝チミン、ｐ＝（ｉ、Ｒ
３＝Ｈ）　１２０　ｍｇ　（５２％　）を得る。 実施例１−５ ５Ａ施例１−３で合成した化合物［ｎ］　（Ｂ’＝Ｎ　
−ベンゾイルアデニン、ｐ＝５、Ｒ”　＝　Ｈ１２２０
ｍｇ、（１，（１６５ｍＭ　）　および脱シアンエチル
化した化合物［０’］（Ｂ’＝Ｎ−ベンゾイルアデニン
、ｎ＝６、Ｒ４＝Ｈ１２５０ｍｇ、０．５　ｍＭ　）　
を室温−夜装置して縮合させる。反応波濃縮し、シリカ
ゲルショートカラムで精製して、目的のドデカマー〔■
′〕（Ｂ’＝Ｎ−ベンゾイルアデニン、ｐ＝１２、Ｒ３
＝ＤＭＴｒ　）　２００　ｍｇ　（４５％　）を得る。 実施例１−６ 実施例１−４で合成した化合物ｒｕ］（Ｂ’＝チξン、
ｎ　＝　６、Ｒ３−Ｈ２ＳＯｍｇ、０．０２　ｍＭ　’
）および脱シアノエチル化した化合物［０’）（Ｂ’＝
チミン、ｎ　−６、Ｒ４＝Ｈ１１７０ｍｇ、０．（１６
ｍＭ　）を無水ピリジン２ｍｌ中ＭＳＮＴ　（１００ｍ
ｇ　、０．３３　ｍＶ　）と共に一夜放置して縮合させ
る。反応後濃縮し、シリカゲルショートカラムで精製し
て、目的のドデカマー　［１”］　（Ｂ’＝チミン、ｐ
＝１２、Ｒ３＝　ＤＭＴｒ）５０　ｍｇ　（５４チ）を
得る。 実施例２−１ 実施例１−５で合成した化合物［１１’ｌ　（Ｂ’＝Ｎ
　−ベンゾイルアデニン、Ｐ”’１２）を約２０　ｍ　
ｇ取り、０．５Ｍテトラメチルグアニジン−ピリジン−
２−カルＩアルｒキシムのピリジン−水（９：　１　ｖ
／ｖ）浴液（０，５Ｍ　ＴＭＧ　−Ｏｘｌｍｅと略す）
　２００　μｍを加えて室温で１６時間処理する。これ
に濃アンモニア水２．５　ｍｌ　を加えて、５０’Ｃで
６時間処理する。濃縮後、５０ｍＭ重炭酸トリエチルア
ンモニウム緩両液（ＴＥＡＢ緩衝液ｐＨ７，５）　１　
ｍｌを溶かし、エーテル１ｍｌ　で３回洗浄する。水層
を取り、セファデックスＧ−５０（１，５ａｍ　Ｘ　１
２０　ｅｍ、　５　ｍＭ　ＴＥＡＢ緩衝液）で分離する
。最初に溶出される分画を集め（第２図）、さらに逆相
カラム（ｌｔ　ＢｏｎｄａｐａｋＣ１８，１０−＋３０
％アセトニトリル１５０ｍＭＴＥＡＡ緩衝液、ｐＨ７，
２）を用いた高速液体クロマトグラフィーでＭＷする（
第３図）。トリチル基をもつメインビーク（２５係アセ
トニトリル付近に溶出する。）を分取し、８０％酢酸中
ＩＯ分間処坤して脱トリチル化し、再度逆相カラム（０
→ｆｆ）％アセトニトリル）で精製する（第４図）。目
的の３′−アミンへキシル−Ｐデカアデニル酸Ｃｍ〕Ｃ
Ｂ＝アデニン、ｐ＝１２）は１５係アセトニトリル付近
に溶出される。 また、３′−アミノへキシルドデカチミジル酸〔団１　
（Ｂ’＝チミン、ｐ＝１２）は、実施例１−６で得た化
合物［１１〕（Ｂ’＝チミン、ｐ＝１２、Ｒ３＝ＤＭＴ
ｒ　）を用いて実施例２−１と同様の方法で脱保護、精
製することにより得られる。 （２３） 実施例２−２ 実施例１−３で合成した化合物［＋１］（Ｂ’−Ｎ　−
ベンゾイルアデニン、ｐ＝（３、Ｒ３＝Ｈ）約Δ１ｍｇ
をとり、０　、５　Ｍ　ＴＭＧ　−Ｏｘｉｍｅ溶液２（
１０μｌを加支て処理、続いて濃アンモニア水で処理す
る。セファデックスＧ　５０　（１，５ｃｍ　Ｘ　１２
０　ａｍ　、５０ｍＭＴＥＡＡ緩衝液ｐＨ７，５）　に
より粗精製した後（図５）、逆相カラム（１１Ｒｏｎｄ
ａｐａｋ　Ｃ１８，０→２（１％アセトニトリル／　５
０　ｍＭ　ＴＥＡＡ緩ｍｉ、ｐｉ（７，１）を用いた高
速液体クロマトグラフィーで精製する（第６図）、化合
物［１１１）　（Ｂ　＝アデニン、ｐ＝６）がメインビ
ークとして得られた。 この場合、反応中間体であるためあらかじめトリチル基
が除去されていたが、純度が高かったため良好な分離Ｍ
製ができた。 確認 実施例２−１および２−２で得られた化合物［１’ｌ　
（Ｂ　＝アデニン、ｐ＝１２）および（Ｂ＝アデニン％
Ｐ＝６）とマーカーとしてトリデカアデニル酸（Ａｌ１
）およびトリデカチミジル酸（ＴＩ３）（２４） を０，０２０Ｄずつとり、〔γ３２−　Ｐ　１　ＡＴＰ
およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、５′水
酸基を５２ｐでリン酸化する。これを２０％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（７Ｍ尿素）により分析し、目的
物の確認および純度の検定を行なった。その電気泳動ノ
ミターンのオートラジオグラフを第７図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の化合物を合成する方法の一例を示す
フローチャートである。 第２図は、実施例２−１の脱保瞳中間体のセファデック
スＧ−Ｅ５ｆ）での溶出パターンを示したものである。 第３図および第４図は、実施例２−１におけるＲ１（ｏ
ｎｄａｐａｋ　Ｃ１８を用いた高速液体クロマトグラフ
ィーの溶出パターンを示したものであって、第３図がト
リチル体、第４図が化合物［１１１］（Ｂ　＝アデニン
、ｐ＝１２、Ｒ３＝Ｈ）のノにターンである。 第５図および第６図は、中間体である実施例１＝３の化
合物を脱保護精製（実施例２−２）１．たもののセファ
デックスＧ５０のノぐターンおよびμＢｏｎｄａｐａｋ
　Ｃ１８による高速液体クロマトグラフィーの溶出パタ
ーンである。 第７図は２０係ポリアクリルアミＰゲル電気泳動（７Ｍ
尿素）パターンのオートラジオグラフである。 なお、第３〜７図は、いずれも模写したものである。 ｔＡｌ　Ａｌ１、（Ｂ）　化合物ＣＮ〕（Ｂ−アデニン
、ｐ＝１２）、（Ｃ）化合物［１１］（Ｂ　＝アデニン
、ｐ＝６　）、　の）　Ｔ１３゜ 出願人代理人　猪　股　清 寥　永　鰹　田Ｕシ９どＶ ｔｅｌｓ　Ｖ　・奨Ｌｕ’ｔＦ’ｌ；２Ｖす ｇ　＋！％　ＬＬ＋ｕｔ９；＝ｖ す ｒ般　軌　山Ｕセ９２Ｖ イ′＋！峻　肌セ９シＶ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下式［１１１１で示されるものであることを特徴と
   する、オリゴヌクレオチド誘導体。 ０す 〔ただし、ｐは任意の自然数であり、Ｒ１は二価の直鎖
   または分岐鎖の炭化水素残基であり、Ｂはヌクレオチド
   を構成する塩基である（Ｂが複数個存在するときは、そ
   れらは同一でも異なってもよい）。〕 ２、塩基Ｂがアデニン、チミン、シトシンおよびグアニ
   ンからなる群より選ばれたものである、特許請求の範囲
   第１項記載のオリゴヌクレオチド誘導体。 ３、Ｒ１が炭素数２〜加の直鎖または分岐鎖のアルキレ
   ン基である、％許精求の範囲第１項才たは第２項記載の
   オリゴヌクレオチド誘導体。 ４、９が４０寸での自然数である、特許請求の範囲第１
   〜３項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド誘導
   体。 ５６下式〔■′〕で示される化合物の３′−末端延長上
   のＲ２，５′−末端のＲ３基、塩基部分およびリン酸部
   分の保護基をすべて除去することを特徴とする、下式［
   １１１１でボされるオリゴヌクレオチド誘導体の製造法
   。 〔ただし、ｐは任意の自然数であり、Ｒはリン酸基の保
   護基であり、Ｒは二価の直鎖または分枝鎖の炭化水素残
   基であり、Ｒ２は水素またはアミノ基の保贈基であり、
   Ｒ３基は水素またはヌクレオチドの５′−水酸基の保護
   基であり　Ｂ／はヌクレオチドを構成する塩基であって
   必要に応じて保護されたものであり、Ｂはヌクレオチド
   を構成する塩基である（Ｂ′またはＢおよびＲｏが複数
   個存在するときは、それらは同一でも異なってもよい）
   。ただし、式〔■′〕で示される化合物は、Ｒｏ、Ｒ２
   、Ｒ３およびＢ′に関してその少な（とも一つにおいて
   保護されたものであるとする。〕