JPS62244399A - 競合的均質検定法 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は標的分子の検出および定量分析において有用な
方法、試薬、組成物、キットおよび器具に関する。特に
本発明はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ま１こはリボ核酸
（ＲＮＡ）のハイブリダイゼーション検定を行うための
方法、試薬、組成物およびキットに関する。
方法、試薬、組成物、キットおよび器具に関する。特に
本発明はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ま１こはリボ核酸
（ＲＮＡ）のハイブリダイゼーション検定を行うための
方法、試薬、組成物およびキットに関する。
従来技術
本発明は係属中の米国特許出願第７３８５６０号（１９
８５年５月２８日付）および同第２８４４６９号（１９
８１年７月２１日付）の一部継続出願であり、これらは
ここに参照により引用される。
８５年５月２８日付）および同第２８４４６９号（１９
８１年７月２１日付）の一部継続出願であり、これらは
ここに参照により引用される。
次の定義は本発明の理解を促すために与えられる。本明
細書で用いる１生物学的結合対”という用語は、相互親
和性または結合ｎＢを示す分子対を意味する。“リガン
ドという用語は１不明ａ１書において、生物学的結合対
の一方の分子を意味し、そして“抗リガンドまたは”受
容体ｎは生物学的結合対の他方の分子を意味するだろう
。例えば、限定するものでないが、不発１男の実施態様
は生物学的結合対が２つの相補的なポリ核酸鎖を含む核
酸ハイブリダイゼーション検定に応用される。これらの
核酸鎖の一方がリガンドと呼ばれ、他方が抗リガンドと
呼ばれる。しかしながら、生物学的結合対は２，３０名
を挙げるならば、抗原および抗体、業物および薬物受容
部位、ならびに酵素および師素基買を含む。
細書で用いる１生物学的結合対”という用語は、相互親
和性または結合ｎＢを示す分子対を意味する。“リガン
ドという用語は１不明ａ１書において、生物学的結合対
の一方の分子を意味し、そして“抗リガンドまたは”受
容体ｎは生物学的結合対の他方の分子を意味するだろう
。例えば、限定するものでないが、不発１男の実施態様
は生物学的結合対が２つの相補的なポリ核酸鎖を含む核
酸ハイブリダイゼーション検定に応用される。これらの
核酸鎖の一方がリガンドと呼ばれ、他方が抗リガンドと
呼ばれる。しかしながら、生物学的結合対は２，３０名
を挙げるならば、抗原および抗体、業物および薬物受容
部位、ならびに酵素および師素基買を含む。
”プローブ”という用語は標的リガンドと選択的に結合
できる既知性状のリガンドを意味する。
できる既知性状のリガンドを意味する。
核酸に適用するとき、”プローブに標的核酸鎖に相補的
な塩基配列を有する核酸鎖を意味する。
な塩基配列を有する核酸鎖を意味する。
″′標識”という用語は例えば放射性同位体；酵素；発
光剤″または没殿剤；および色素を含む検出可能な分子
成分を意味する。”剤”という用語は検出口Ｊ北な応答
へ導く反応に関与する全ての分子成分を含めた広い意味
で使用される。”補助因子”という用語はその剤との反
応に関与する全ての分子成分を営めた広い意味で使用さ
れる。
光剤″または没殿剤；および色素を含む検出可能な分子
成分を意味する。”剤”という用語は検出口Ｊ北な応答
へ導く反応に関与する全ての分子成分を含めた広い意味
で使用される。”補助因子”という用語はその剤との反
応に関与する全ての分子成分を営めた広い意味で使用さ
れる。
遺伝情報は生細胞中に存在する糸状のＤＮＡ分子に蓄え
られている。ｉｎ ＶｉＶＯにおいてＤＮＡ分子は二重
らせんであり、二重らせんの各類はヌクレオチド鎖であ
る。各ヌクレオチドは４樵類の塩基：アデニン（Ａ）、
グアニン（Ｇｌ、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃｌの
１つによって特徴づけられる。塩基は官能基の向きによ
り一定の塩基対が互いに引きつけ合って水素結合により
結合するという意味で相補的である。−万のＤＮＡ鎖の
アデニンは他方の相補鎖のチミンと対合する。−万のＤ
ＮＡ 鎖のグアニンは他方の相補鎖のシトシンと対合す
る。
られている。ｉｎ ＶｉＶＯにおいてＤＮＡ分子は二重
らせんであり、二重らせんの各類はヌクレオチド鎖であ
る。各ヌクレオチドは４樵類の塩基：アデニン（Ａ）、
グアニン（Ｇｌ、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃｌの
１つによって特徴づけられる。塩基は官能基の向きによ
り一定の塩基対が互いに引きつけ合って水素結合により
結合するという意味で相補的である。−万のＤＮＡ鎖の
アデニンは他方の相補鎖のチミンと対合する。−万のＤ
ＮＡ 鎖のグアニンは他方の相補鎖のシトシンと対合す
る。
ＲＮＡ では、チミン塩基がウラシル（切で直き換えら
れ、ウラシルは相補鎖中のアデニンと対合する。
れ、ウラシルは相補鎖中のアデニンと対合する。
生物の遺伝暗号は４基対配列のＤＮＡ鎖により伝達され
る。ＤＮＡは共有結合さｔたデオキシリボヌクレオチド
鎖から成り、ＲＮＡは共有結合されたりボヌクレオデド
鎖から成る。それぞれの核酸は１つのヌクレオチドの糖
の５′−ヒドロキシル基と瞬接ヌクレオチドの糖の３′
−ヒドロキシル基との間のホスホジエステル紹会によっ
てｇ会される。自然界に存在するＤＮＡ１ｒ、：はＲＮ
Ａの各線状鎖は、遊離５′−ヒドロキシル基なもつ末端
と遊離３′−ヒドロキシル基をもつ末端とをＭ′″ｒる
。ポリヌクレオチドの各末端はそれぞれの遊離ヒドロキ
シル基に関連づけてしばしば５′木端′！！たは３′末
端と呼ばれている。自然界に存在するポリヌクレオチド
はその５′末端にホスフェート基をもち得る。ＤＮＡお
よびＲＮＡの相補鎖は、−万の鎮の３′末端が他方の餉
の５′末端と結合する逆平行複合体を形成する。
る。ＤＮＡは共有結合さｔたデオキシリボヌクレオチド
鎖から成り、ＲＮＡは共有結合されたりボヌクレオデド
鎖から成る。それぞれの核酸は１つのヌクレオチドの糖
の５′−ヒドロキシル基と瞬接ヌクレオチドの糖の３′
−ヒドロキシル基との間のホスホジエステル紹会によっ
てｇ会される。自然界に存在するＤＮＡ１ｒ、：はＲＮ
Ａの各線状鎖は、遊離５′−ヒドロキシル基なもつ末端
と遊離３′−ヒドロキシル基をもつ末端とをＭ′″ｒる
。ポリヌクレオチドの各末端はそれぞれの遊離ヒドロキ
シル基に関連づけてしばしば５′木端′！！たは３′末
端と呼ばれている。自然界に存在するポリヌクレオチド
はその５′末端にホスフェート基をもち得る。ＤＮＡお
よびＲＮＡの相補鎖は、−万の鎮の３′末端が他方の餉
の５′末端と結合する逆平行複合体を形成する。
核酸ハイブリダイゼーション検定は２本の核酸鎖がそれ
らの相補領域で対合する傾向に基づいている。現在、核
酸ハイブリダイゼーション検定は主に完全なりＮＡ分子
中の、まＬは核は湿分物中の、１定は核蛾フラグメ／ト
混合吻中の、特異なりＮＡ もしくはＲＮＡ塩基配列あ
るいに特定遺伝子を検出して回定するために使用されて
いる。
らの相補領域で対合する傾向に基づいている。現在、核
酸ハイブリダイゼーション検定は主に完全なりＮＡ分子
中の、まＬは核は湿分物中の、１定は核蛾フラグメ／ト
混合吻中の、特異なりＮＡ もしくはＲＮＡ塩基配列あ
るいに特定遺伝子を検出して回定するために使用されて
いる。
組織１Ｔこは培養物試料から抽出さｎｌこ全Ｄ Ｎ Ａ
またはＲＮＡ中の特異なりＮＡ’ＦたはＲＮＡ配列もし
くは特定遺伝子の同定は、生理学的または病理学的症状
の存在を示すかも知れない。特に、ヒトまたは動物組織
から抽出された全ＤＮＡ’！ｒ、ｍはＲＮＡ中の特異な
りＮＡ壕１こはＲＮＡｊ記列もしくは特定遺伝子の同定
は紐状赤血球貧血、組数適合性、癌および前癌状態、１
１こは細菌やウィルス感染などσつ症状もしくは遺伝病
の存在を示唆する。細菌培養物から抽出されに全ＤＮＡ
またはＲＮＡ中の特異なりＮＡまｒ、はＲＮＡ配列もし
くは特定遺伝子の同定は抗生物質耐性、毒物、ウィルス
またはグラスミドに関連した状態の存在を示し、また細
菌型の同定を可能にする。
またはＲＮＡ中の特異なりＮＡ’ＦたはＲＮＡ配列もし
くは特定遺伝子の同定は、生理学的または病理学的症状
の存在を示すかも知れない。特に、ヒトまたは動物組織
から抽出された全ＤＮＡ’！ｒ、ｍはＲＮＡ中の特異な
りＮＡ壕１こはＲＮＡｊ記列もしくは特定遺伝子の同定
は紐状赤血球貧血、組数適合性、癌および前癌状態、１
１こは細菌やウィルス感染などσつ症状もしくは遺伝病
の存在を示唆する。細菌培養物から抽出されに全ＤＮＡ
またはＲＮＡ中の特異なりＮＡまｒ、はＲＮＡ配列もし
くは特定遺伝子の同定は抗生物質耐性、毒物、ウィルス
またはグラスミドに関連した状態の存在を示し、また細
菌型の同定を可能にする。
従って、核酸）・イブリダイゼーション検定は病気の診
断および検出において大きな可能性を有している。さら
に、その可能性は植物の病因や毒物産生菌を検出するた
めに核酸ハイブリダイゼーション検定を使用する農業や
食品加工の分野にも存在する。
断および検出において大きな可能性を有している。さら
に、その可能性は植物の病因や毒物産生菌を検出するた
めに核酸ハイブリダイゼーション検定を使用する農業や
食品加工の分野にも存在する。
最も広く使用されているポリヌクレオチドノ・イブリダ
イゼーション検定法の１つは、サザ／プロットフィルタ
ーハイプリダイゼーンヨン法１には単にサブ／法として
知られているものである（ ５ｏｕｔｈｅｒｎ、 １．
、Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 、 ９８ 、５０３
。
イゼーション検定法の１つは、サザ／プロットフィルタ
ーハイプリダイゼーンヨン法１には単にサブ／法として
知られているものである（ ５ｏｕｔｈｅｒｎ、 １．
、Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 、 ９８ 、５０３
。
１９７５を参照）。サブ／法は標的ＤＮＡ またはＲＮ
Ａ配列を同定する１こめに用いられる。この方法は一般
に対象となる標的配列を保有する可能性がある生物から
単離しｊ、：ＲＮＡ またはＤＮＡ試料を制限エンドヌ
クレアーゼで消化して、ＤＮＡ フラグメントを形成す
ることによって実施される。
Ａ配列を同定する１こめに用いられる。この方法は一般
に対象となる標的配列を保有する可能性がある生物から
単離しｊ、：ＲＮＡ またはＤＮＡ試料を制限エンドヌ
クレアーゼで消化して、ＤＮＡ フラグメントを形成す
ることによって実施される。
その後、ＤＮＡフラグメント試料はアガロースやポリア
クリルアミドのようなゲルで電気泳動を行い、フラグメ
ント試料を鎖長により分類する。各フラグメント群は標
的配列の存在について試験される。、ＤＮＡ ｆニトロ
セルロースシートへ移行すせるためにゲル内部で変性す
る。ＤＮＡ フラグメント試料を含むゲルはニトロセル
ロースフィルターシートマ１こはジアゾ化紙（これにＤ
ＮＡフラグメントが移行して結合または固定される）と
接触させる。次いで、ＤＮＡフラグメント試料を含むニ
トロセルロースシートを約８５℃に、ｌ＞Ｏｍ してＤ
ＮＡを固定する。その後ニトロセルロースシートラ変性
した（一本領の９放射性標識ＤＮＡ プローブ？含む溶
液で処理する。放射性標識プローブは標的配列に相補的
な塩基配列と検出ｏＴ北な放射性成分を有するＤＮＡ鎖
を含む、 プローブとＤＮＡ フラグメントとのハイブリダイゼー
ションを行わせる。）・イブリダイゼーション工程の間
に固定化ＤＮＡ試料と標識ＤＮＡプローブとを結合させ
て、再び二本鎖構造を形成させる。
クリルアミドのようなゲルで電気泳動を行い、フラグメ
ント試料を鎖長により分類する。各フラグメント群は標
的配列の存在について試験される。、ＤＮＡ ｆニトロ
セルロースシートへ移行すせるためにゲル内部で変性す
る。ＤＮＡ フラグメント試料を含むゲルはニトロセル
ロースフィルターシートマ１こはジアゾ化紙（これにＤ
ＮＡフラグメントが移行して結合または固定される）と
接触させる。次いで、ＤＮＡフラグメント試料を含むニ
トロセルロースシートを約８５℃に、ｌ＞Ｏｍ してＤ
ＮＡを固定する。その後ニトロセルロースシートラ変性
した（一本領の９放射性標識ＤＮＡ プローブ？含む溶
液で処理する。放射性標識プローブは標的配列に相補的
な塩基配列と検出ｏＴ北な放射性成分を有するＤＮＡ鎖
を含む、 プローブとＤＮＡ フラグメントとのハイブリダイゼー
ションを行わせる。）・イブリダイゼーション工程の間
に固定化ＤＮＡ試料と標識ＤＮＡプローブとを結合させ
て、再び二本鎖構造を形成させる。
ハイブリダイゼーション法はきわめて特異的である。標
識プローブはもしも２つのＤＮＡ種が実質的に相補的な
塩基対機構を共有しないならばＤＮＡ試料と結合しない
であろう。ハイブリダイゼーションは所定の条件に応じ
て３〜４８時間を要する。
識プローブはもしも２つのＤＮＡ種が実質的に相補的な
塩基対機構を共有しないならばＤＮＡ試料と結合しない
であろう。ハイブリダイゼーションは所定の条件に応じ
て３〜４８時間を要する。
続いてハイブリダイズしなかったプローブを洗い落とす
。仄に、ニトロセルロースシート’ａ’Ｘ巌フィルムの
シート上にのせて感光させる。Ｘ線フィルムは感光部を
現像して、ＤＮＡプローブとハイブリダイズしたＤＮＡ
フラグメント（従って対象とする塩基対配列を含む）を
同定する。
。仄に、ニトロセルロースシート’ａ’Ｘ巌フィルムの
シート上にのせて感光させる。Ｘ線フィルムは感光部を
現像して、ＤＮＡプローブとハイブリダイズしたＤＮＡ
フラグメント（従って対象とする塩基対配列を含む）を
同定する。
核酸ハイブリダイゼーション検定の使用は、Ｘ独フィル
ム上にバンドを視覚化するための長い感光時間によって
幾分か妨げられている、一般的なブザ／法は感光のため
に１〜７日間欠１１８Ｌする。さらに、この技法の多く
は標識剤として放射性同位体を必要とする。放射性標識
剤を使用するには特別の実験手段とライセンスが必要で
ある。
ム上にバンドを視覚化するための長い感光時間によって
幾分か妨げられている、一般的なブザ／法は感光のため
に１〜７日間欠１１８Ｌする。さらに、この技法の多く
は標識剤として放射性同位体を必要とする。放射性標識
剤を使用するには特別の実験手段とライセンスが必要で
ある。
放射性標識を使用する検定法に関係した上記の諸問題は
、発光分子のような非放射性標識を使用する免疫検定法
の開発へと導いた。一般的にはス２５３−７４（１９８
１）を参照されたい。発光標識は外部エネルギー源によ
って励起された際に光を発し、励起エネルギー源の種類
に応じて、例えば高エネルギー粒子からエネルギーを誘
発する放射性発光標識；化学反応からエネルギーを得る
化学発光標識；励起エネルギーが生物学的糸に供給され
る生物発光標識；および赤外Ｋｄ、町税元巌または紫外
線の１！磁線（光子、フォトン）の単位によって励起さ
れる光ルミネツ七ンスまたは余光標識；に分類される。
、発光分子のような非放射性標識を使用する免疫検定法
の開発へと導いた。一般的にはス２５３−７４（１９８
１）を参照されたい。発光標識は外部エネルギー源によ
って励起された際に光を発し、励起エネルギー源の種類
に応じて、例えば高エネルギー粒子からエネルギーを誘
発する放射性発光標識；化学反応からエネルギーを得る
化学発光標識；励起エネルギーが生物学的糸に供給され
る生物発光標識；および赤外Ｋｄ、町税元巌または紫外
線の１！磁線（光子、フォトン）の単位によって励起さ
れる光ルミネツ七ンスまたは余光標識；に分類される。
上記文献の２５５頁を参照されたい。
非放射性エネルギー源によって励起される標識を使用す
る発光検定法は、放射性標識を使用する検定法に伴う健
康上の危険性やライセンスの問題を回避することができ
る。さらに、発光標識の使用は、ｔｌ ｔＲプローブが
検定試薬と結合したときに結合しなかったときとは異な
る発光特性を示し、その結果結合した標識プローブと結
合しなかった標識プローブとを分離する必要がないとい
う点で”均質な”検定法の開発を可能にする。没殿、酵
素、発光標識成分を使用１−る非放射性核酸型検定は信
頼できるとみなすに足る感度または特異性を与えていな
い。
る発光検定法は、放射性標識を使用する検定法に伴う健
康上の危険性やライセンスの問題を回避することができ
る。さらに、発光標識の使用は、ｔｌ ｔＲプローブが
検定試薬と結合したときに結合しなかったときとは異な
る発光特性を示し、その結果結合した標識プローブと結
合しなかった標識プローブとを分離する必要がないとい
う点で”均質な”検定法の開発を可能にする。没殿、酵
素、発光標識成分を使用１−る非放射性核酸型検定は信
頼できるとみなすに足る感度または特異性を与えていな
い。
発光検定法では、生物学的試料中のタンパク質や他の分
子の存在が励起光線の散乱（″レイリ＋散乱”）を引き
起こし、その結果励起光線の波長の約５ＯＪＩＩ以内の
波長で光を発する発光標識との干渉が生じる。内因性の
化合物はまた散乱分子に特徴的な比較的長い波長で励起
光線を散乱させ（”ラマン散乱”）、また発光標識の発
光スペクトル中の光線を吸収し、その結果発光プローブ
の消光をもたらす。
子の存在が励起光線の散乱（″レイリ＋散乱”）を引き
起こし、その結果励起光線の波長の約５ＯＪＩＩ以内の
波長で光を発する発光標識との干渉が生じる。内因性の
化合物はまた散乱分子に特徴的な比較的長い波長で励起
光線を散乱させ（”ラマン散乱”）、また発光標識の発
光スペクトル中の光線を吸収し、その結果発光プローブ
の消光をもたらす。
不均質な発光検定法の感度を改善する試みはいわゆる”
時間分解（ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ ） ”検定法
の開発へと導いた、ソニ（５ｏｎｉ ）らのＣ１１ｎ。
時間分解（ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ ） ”検定法
の開発へと導いた、ソニ（５ｏｎｉ ）らのＣ１１ｎ。
国特許第４１７６００７号を参照されたい。時間分解検
定法は一般に試料中に存在する物質の自然螢光の発光寿
命１〜２０ ｎ５ｅｃとは著しく異なる（通常はより長
い）発光寿命をもつ発光標識を使用することを含む。検
定の結合工程を行い、分離された結合標識物質または非
結合標識物質？キセノン放電管または他のパルス化エネ
ルギー源から発生する一連のエネルギーパルスにより励
起する。
定法は一般に試料中に存在する物質の自然螢光の発光寿
命１〜２０ ｎ５ｅｃとは著しく異なる（通常はより長
い）発光寿命をもつ発光標識を使用することを含む。検
定の結合工程を行い、分離された結合標識物質または非
結合標識物質？キセノン放電管または他のパルス化エネ
ルギー源から発生する一連のエネルギーパルスにより励
起する。
各パルスから生じる標識の発光は、試料中のバックグラ
ウンド物質の自然螢光の寿命よりも長い時間で測定する
。こうしてバックグラウンド散乱および短命の試料螢光
からの干渉が測定発光から排除される。
ウンド物質の自然螢光の寿命よりも長い時間で測定する
。こうしてバックグラウンド散乱および短命の試料螢光
からの干渉が測定発光から排除される。
プローブまたは試料ＤＮＡの分離や固定化を必要とする
この技法は非放射性検定の操作を煩雑にしている。発光
標識成分の発光は固体支持体によって低下される。支持
物質はバンクグラウンド螢光源であり得、また発生光線
ケ反射もしくは散乱させて検定を妨害する。／・イブリ
ダイゼーショ／工程に要する時間は、相補的ＤＮＡ鎖が
相補的対合関係にあるＤＮＡ鎖対の一方の固定化により
児全に遊離状態でない場合に増大する。標識プローブの
固体支持体への非特異的結合も検定の積度を低下させる
、 発明の要約 本発明の目的は、対象とする標的ポリヌクレオチド鎖の
検定を行うための方法、試薬、組成物、キットおよび器
具を提供することである。その他の目的は以後に示すで
あろう。
この技法は非放射性検定の操作を煩雑にしている。発光
標識成分の発光は固体支持体によって低下される。支持
物質はバンクグラウンド螢光源であり得、また発生光線
ケ反射もしくは散乱させて検定を妨害する。／・イブリ
ダイゼーショ／工程に要する時間は、相補的ＤＮＡ鎖が
相補的対合関係にあるＤＮＡ鎖対の一方の固定化により
児全に遊離状態でない場合に増大する。標識プローブの
固体支持体への非特異的結合も検定の積度を低下させる
、 発明の要約 本発明の目的は、対象とする標的ポリヌクレオチド鎖の
検定を行うための方法、試薬、組成物、キットおよび器
具を提供することである。その他の目的は以後に示すで
あろう。
要約すると、本発明の実施態様は生物学的結合対の構成
員である標的分子について試料を検定する方法馨包含す
る。本方法は試料とプローブ（プローブリガンドおよび
プローブ抗リガンドン含む）含有試薬とヲ結合条件下で
接触させることをきむ。
員である標的分子について試料を検定する方法馨包含す
る。本方法は試料とプローブ（プローブリガンドおよび
プローブ抗リガンドン含む）含有試薬とヲ結合条件下で
接触させることをきむ。
プローブリガンドおよびプローブ抗リガンドは互いに対
して第１の結合位置をとることかでさ、プローブ構成員
の少なくとも一方は標的分子に対して第２の結合位置を
とることができる。プローブ構成員はプローブリガ／ド
上に位置する第１標識成分およびプローブ抗リガンド上
に位置する′＃、２標識成分を含む。￥１および第２標
識成分はプローブリガンドおよび抗リガンドが第１結合
位置で存在するとき相互作用して、２つの位置の一方に
ある試薬リガンドおよび抗リガンドに特徴的な検出しつ
る信号を発することができる。試料は標的分子の存在と
関連した信号の存在について監視される。
して第１の結合位置をとることかでさ、プローブ構成員
の少なくとも一方は標的分子に対して第２の結合位置を
とることができる。プローブ構成員はプローブリガ／ド
上に位置する第１標識成分およびプローブ抗リガンド上
に位置する′＃、２標識成分を含む。￥１および第２標
識成分はプローブリガンドおよび抗リガンドが第１結合
位置で存在するとき相互作用して、２つの位置の一方に
ある試薬リガンドおよび抗リガンドに特徴的な検出しつ
る信号を発することができる。試料は標的分子の存在と
関連した信号の存在について監視される。
本発明の実施態様はさらに標的ポリヌクレオチド鎖につ
いて試料を検定する方法を包含する。本方法は試料と試
薬（第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポリヌク
レオチドプローブを含む）とを結合条件下で接触させる
ことを含む、第１および第２プローブはプローブ同士が
互いに結＠する位置をとることができ、プローブの少な
くとも一方はそのプローブが標的ポリヌクレオチド鎖と
結合する第２位置をとることができる。第１および第２
プローブは一方のプローブに位置する第１標識成分およ
び他方のプローブに位＊−ｒる第２標識成分を含む、第
１および第２標識成分は第１および第２プローブが互い
に結合したとき相互作用して、２つの位置の一方にある
試薬鎖に特徴的な検出しつる信号を発することができる
。試薬と接触させた試料は、試料中に標的ポリヌクレオ
チド鎖が存在することと関連する信号の存在について監
視する。本方法は固定化工程を必要とせずに、また放射
性標識技術を使用せずにポリヌクレオチド試料を検定す
ることができる。
いて試料を検定する方法を包含する。本方法は試料と試
薬（第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポリヌク
レオチドプローブを含む）とを結合条件下で接触させる
ことを含む、第１および第２プローブはプローブ同士が
互いに結＠する位置をとることができ、プローブの少な
くとも一方はそのプローブが標的ポリヌクレオチド鎖と
結合する第２位置をとることができる。第１および第２
プローブは一方のプローブに位置する第１標識成分およ
び他方のプローブに位＊−ｒる第２標識成分を含む、第
１および第２標識成分は第１および第２プローブが互い
に結合したとき相互作用して、２つの位置の一方にある
試薬鎖に特徴的な検出しつる信号を発することができる
。試薬と接触させた試料は、試料中に標的ポリヌクレオ
チド鎖が存在することと関連する信号の存在について監
視する。本方法は固定化工程を必要とせずに、また放射
性標識技術を使用せずにポリヌクレオチド試料を検定す
ることができる。
好ましくは、少なくとも１つの標識成分は一方のプロー
ブの３′末端に存在し、そして第２標識成分は北方のプ
ローブの５′宋肩に存在する。各プローブに対して複数
の標識成分を使用することができ、好ましくは２つの標
識成分（各末端に１つずつ）を使用する。例えば、第１
標識成分は３′位置で第１プローブと結付し、第２標識
成分は５′位置で結合する、類似の標識成分の構成（丁
なわち３′位置に第１標識成分および５′位置に第２標
識成分）をもつ第２プローブは、相対するプローブの第
１および第２標識成分がきわめて接近して相互作用する
ことができるように、第１プローブとハイブリダイズす
るであろう。
ブの３′末端に存在し、そして第２標識成分は北方のプ
ローブの５′宋肩に存在する。各プローブに対して複数
の標識成分を使用することができ、好ましくは２つの標
識成分（各末端に１つずつ）を使用する。例えば、第１
標識成分は３′位置で第１プローブと結付し、第２標識
成分は５′位置で結合する、類似の標識成分の構成（丁
なわち３′位置に第１標識成分および５′位置に第２標
識成分）をもつ第２プローブは、相対するプローブの第
１および第２標識成分がきわめて接近して相互作用する
ことができるように、第１プローブとハイブリダイズす
るであろう。
本発明方法の実施態様は、増幅手段中に標的配列と実質
的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドセグメン
トをスゲライジングして、試薬ポリヌクレオチドセグメ
ントの多数のコピーを形成させることによる追加のプロ
ーブ作製工程ケ含む。
的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドセグメン
トをスゲライジングして、試薬ポリヌクレオチドセグメ
ントの多数のコピーを形成させることによる追加のプロ
ーブ作製工程ケ含む。
好適には、増幅手段は細菌中に組み込んだときに増殖す
る高いコピー数のプラスミドまたはファージであるＪ標
的配列と実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオ
チドセグメントは細胞成分、および、望ましくない＃ｌ
菌、プラスミドまたはファージＤＮＡから単離し、制限
消化してセグメントとなす。その後、セグメントは標識
成分を付加してプローブを作製するために第１」用され
る。
る高いコピー数のプラスミドまたはファージであるＪ標
的配列と実質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオ
チドセグメントは細胞成分、および、望ましくない＃ｌ
菌、プラスミドまたはファージＤＮＡから単離し、制限
消化してセグメントとなす。その後、セグメントは標識
成分を付加してプローブを作製するために第１」用され
る。
さらに、各プラスミドまたはファージ誘４セクションは
制限＃素で消化して、標識成分を−まとめにして結合で
きる多数のサブセクションとする。
制限＃素で消化して、標識成分を−まとめにして結合で
きる多数のサブセクションとする。
各サブセクションは標的鎖の代表的部分とハイブリダイ
ズすることができるであろう。プラスミドまたはファー
ジ源由来の多数の試薬プローブはより優れた信号発生能
をもたらし、効率よくかつ比較的安価にプロープン提供
するであろう。
ズすることができるであろう。プラスミドまたはファー
ジ源由来の多数の試薬プローブはより優れた信号発生能
をもたらし、効率よくかつ比較的安価にプロープン提供
するであろう。
本発明の実施態様はさらに、ＤＮＡ鎖の３′末端を非放
射性標識するためびり方法およびその結果得られる組成
物を包含する。その組成物は核酸のアミノアルキル誘導
体を有するＤＮＡ鎖を含む。核酸のアミノ基はアミン反
応性標識成分と反応することができる。好ましくは、そ
のアミノアルキル誘導体は脂肪族の第１７ミノ基ン含む
。より詳細には、好適なアミノアルキル誘導体は赫索タ
ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（
ＴｄＴ ）によって試薬鎖にｆＩＦＸ曾し得るアミンへ
キシルアミノアプツシ／二リン酸のようなリボ核酸誘導
体を含む。
射性標識するためびり方法およびその結果得られる組成
物を包含する。その組成物は核酸のアミノアルキル誘導
体を有するＤＮＡ鎖を含む。核酸のアミノ基はアミン反
応性標識成分と反応することができる。好ましくは、そ
のアミノアルキル誘導体は脂肪族の第１７ミノ基ン含む
。より詳細には、好適なアミノアルキル誘導体は赫索タ
ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（
ＴｄＴ ）によって試薬鎖にｆＩＦＸ曾し得るアミンへ
キシルアミノアプツシ／二リン酸のようなリボ核酸誘導
体を含む。
ターミナルトランスフェラーゼは一本鎖ＤＮＡの末端に
１つまたは２つのリボ核酸誘導体を付加して、それによ
り信号強度を標準化するために大きさによって分類しな
ければならず且つ立体効果に寄与しうろデオキシ晶４体
の尾部に本来備わっている諸問題を取り除くであろう。
１つまたは２つのリボ核酸誘導体を付加して、それによ
り信号強度を標準化するために大きさによって分類しな
ければならず且つ立体効果に寄与しうろデオキシ晶４体
の尾部に本来備わっている諸問題を取り除くであろう。
尾部上の標識はエネルギー転移のための適当な立体関係
または衝突の相互作用をもはやもたない。しかしながら
、尾部は尾部上の標識成分が゛サイレント（ｓｉｌｅｎ
ｔ）”である場合に良好であり、例えば多くの消光剤は
消光剤のより大きな局部濃度ゆえにより大きな消光活性
をもたらし、しかも消光剤が非螢光性である場合には増
大したバックグラウンドを示さない。
または衝突の相互作用をもはやもたない。しかしながら
、尾部は尾部上の標識成分が゛サイレント（ｓｉｌｅｎ
ｔ）”である場合に良好であり、例えば多くの消光剤は
消光剤のより大きな局部濃度ゆえにより大きな消光活性
をもたらし、しかも消光剤が非螢光性である場合には増
大したバックグラウンドを示さない。
本発明の実施態様はさらに、生物学的結合対の一部であ
る標的分子の検定を行うためのキット？包含する。標的
分子が特定の塩基配列を有する核酸のセグメントである
場合に、キットは第１ポリヌクレオチドプローブおよび
第２ポリヌクレオチドプローブを含む試薬を包含する。
る標的分子の検定を行うためのキット？包含する。標的
分子が特定の塩基配列を有する核酸のセグメントである
場合に、キットは第１ポリヌクレオチドプローブおよび
第２ポリヌクレオチドプローブを含む試薬を包含する。
第１および第２プローブはそれらが精会条件下で互いに
結合する第１の位置をとることができ、これらのプロー
ブの少なくとも一部はそのプローブが標的と結合する第
２の位置馨とることができる。第１および第２プローブ
は一部のプローブと結合した少なくとも１つの標識成分
および他方の１０−ブと結合した第２標識成分を有する
。第１および第２標識成分は第１および第２プローブが
第１位置にあるとき相互作用して、２つの位置の一部に
あるプローブに特徴的な検出しつる信号を発することが
できる。
結合する第１の位置をとることができ、これらのプロー
ブの少なくとも一部はそのプローブが標的と結合する第
２の位置馨とることができる。第１および第２プローブ
は一部のプローブと結合した少なくとも１つの標識成分
および他方の１０−ブと結合した第２標識成分を有する
。第１および第２標識成分は第１および第２プローブが
第１位置にあるとき相互作用して、２つの位置の一部に
あるプローブに特徴的な検出しつる信号を発することが
できる。
本発明の実施態様はさらに、本方法に従って検定を行う
ための器具を包含する。標的がポリヌクレオチドセグメ
ントである場合、その器具は試薬と標的を実質的に混合
した均質状態で収容するのに適した反応室を含む。試薬
はｆ、１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポリヌク
レオチドプローブを含有する。ｇｌおよび第２プローブ
はそれらが結合条件下で互いに結合する第１０位遁ヲと
ることができ、これらのプローブの少なくとも一部はそ
のプローブが標的と結合する第２の位ｔｉｔをとること
ができる。第１および第２プローブはこれらのプローブ
の一部と結合した少なくとも１つの標識成分および他方
のプローブと結合した第２標識成分を有する。第１およ
び第２標識成分は第１および第２プローブが第１位置に
あるとき相互作用して、２つの位置の一部に特徴的な検
出しうる信号を発することができる。器具はさらに信号
を検出するための適当な検出手段（例えば発光剤の場合
には充電増倍管）を含む。
ための器具を包含する。標的がポリヌクレオチドセグメ
ントである場合、その器具は試薬と標的を実質的に混合
した均質状態で収容するのに適した反応室を含む。試薬
はｆ、１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポリヌク
レオチドプローブを含有する。ｇｌおよび第２プローブ
はそれらが結合条件下で互いに結合する第１０位遁ヲと
ることができ、これらのプローブの少なくとも一部はそ
のプローブが標的と結合する第２の位ｔｉｔをとること
ができる。第１および第２プローブはこれらのプローブ
の一部と結合した少なくとも１つの標識成分および他方
のプローブと結合した第２標識成分を有する。第１およ
び第２標識成分は第１および第２プローブが第１位置に
あるとき相互作用して、２つの位置の一部に特徴的な検
出しうる信号を発することができる。器具はさらに信号
を検出するための適当な検出手段（例えば発光剤の場合
には充電増倍管）を含む。
螢光検定において使用するのに適した本器具の態様は適
当な標識励起手段（適切な波長を定めろフィルターを備
えたレーザーまたは光−放射装置、または化学発光剤や
＃素剤の場合には補助因子を注入するための注入装置な
ど）を含む。
当な標識励起手段（適切な波長を定めろフィルターを備
えたレーザーまたは光−放射装置、または化学発光剤や
＃素剤の場合には補助因子を注入するための注入装置な
ど）を含む。
好適な器具は光を反応室へパルス化し、エネルギー転移
により生じた螢光の放出′ｆｆ：ｉＡ択的に読み取って
バックグラウンド螢光を減らすための時間分解制御（ｔ
ｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｃｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ）を営
むであろう。
により生じた螢光の放出′ｆｆ：ｉＡ択的に読み取って
バックグラウンド螢光を減らすための時間分解制御（ｔ
ｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｃｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ）を営
むであろう。
今や本発明の好適な態様を模式図によって示す図面乞診
照すると、特に第１図では、必要な試薬組成物と共に、
標的ポリヌクレオチド鎖の検定方法が模式的に示されて
いる。慣用の検定法において、１つ以上の標的鎖および
１つ以上のプローブ鎖を用いて検定が行われる。しかし
ながら、単純化して本発明ンより理解しやすぐするため
に、図面では単一の試薬セグメントと単一の標的セグメ
ントのみを示す。
照すると、特に第１図では、必要な試薬組成物と共に、
標的ポリヌクレオチド鎖の検定方法が模式的に示されて
いる。慣用の検定法において、１つ以上の標的鎖および
１つ以上のプローブ鎖を用いて検定が行われる。しかし
ながら、単純化して本発明ンより理解しやすぐするため
に、図面では単一の試薬セグメントと単一の標的セグメ
ントのみを示す。
第１図はハイブリダイズした又は相互に結合した第１位
置にある第１および第２ポリヌクンオチド鎖プローブ（
それぞれＰｌおよびＴ２）を示す。
置にある第１および第２ポリヌクンオチド鎖プローブ（
それぞれＰｌおよびＴ２）を示す。
また、対象とする２つの相補的な標的類から成る二本鎖
ＤＮＡ（それぞれＴ１およびＴ２）を示す。
ＤＮＡ（それぞれＴ１およびＴ２）を示す。
第１プローブ（Ｐｌ）は各末端に２つの標識成分（Ａｌ
およびＤＩ）を含む。第１標識成分（Ａ１）は第１プロ
ーブ（Ｐｌ）の５′末端に共有結合されており、そして
第２標識成分（ＤＬ）は第１プローブの３′末端に共有
結合されている。同様に、別の第１標識成分（Ａ２）が
＠２プローブ（Ｔ２）の５′末端に共有結付されており
、そして別の第２標識成分（Ｄ２）が第２プローブの３
′末端に共有結合されている。相対するプローブの第１
および第２標識成分（ＡｌとＤ２）および（Ａ２とＤＩ
）は第１および第２プローブか相互に結合した第１の位
置にあるとき相互作用することができる。
およびＤＩ）を含む。第１標識成分（Ａ１）は第１プロ
ーブ（Ｐｌ）の５′末端に共有結合されており、そして
第２標識成分（ＤＬ）は第１プローブの３′末端に共有
結合されている。同様に、別の第１標識成分（Ａ２）が
＠２プローブ（Ｔ２）の５′末端に共有結付されており
、そして別の第２標識成分（Ｄ２）が第２プローブの３
′末端に共有結合されている。相対するプローブの第１
および第２標識成分（ＡｌとＤ２）および（Ａ２とＤＩ
）は第１および第２プローブか相互に結合した第１の位
置にあるとき相互作用することができる。
当分野で通常の知識を有する者は、標識成分が共有結合
以外の方法、例えば限定するものではないが挿入（１ｎ
ｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ ）、キレート化、およびイオ
ン的、親水的または疎水的親和性によりＤＮＡ プロー
ブと結合または会合しうろことを認めるであろう。本明
細書で使用する”会曾″という用語は標識成分をプロー
ブに結合させる全ての手段を包含する。
以外の方法、例えば限定するものではないが挿入（１ｎ
ｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ ）、キレート化、およびイオ
ン的、親水的または疎水的親和性によりＤＮＡ プロー
ブと結合または会合しうろことを認めるであろう。本明
細書で使用する”会曾″という用語は標識成分をプロー
ブに結合させる全ての手段を包含する。
本発明の標識成分はそれらを相互作用させる方法で対合
または集合される。例えば、限定するものではないが、
標識群は第１および第２螢光団を含む標識成分の組合せ
、螢光団および化学発光成分の組合せ、化学発光成分お
よび補助因子の組合せ、没殿剤および可溶化剤の組合せ
、酵素および基質の組会せ、ならびに比色定量成分およ
び補助因子の組合せであり得る。
または集合される。例えば、限定するものではないが、
標識群は第１および第２螢光団を含む標識成分の組合せ
、螢光団および化学発光成分の組合せ、化学発光成分お
よび補助因子の組合せ、没殿剤および可溶化剤の組合せ
、酵素および基質の組会せ、ならびに比色定量成分およ
び補助因子の組合せであり得る。
第１図において、第１標識成分は特定波長（ｈｖ、 ）
のエネルギーまたは光乞受信し且つ第２波長（ｈｖ２）
でエネルギーまたは光乞発信し得る螢光団（Ａｌおよび
Ａ２）である。同様に、第２標識成分は特定波長（ｈｖ
、 ）のエネルギーまたは光を受信し且つ第２波長（ｈ
ｖ、 ）でエネルギーを発信もしくは転称し得る螢光団
（ＤＩおよびＤ２）である。相対するプローブの第１お
よび第２螢光団（ＡＩとＤ２）および（Ａ２とＤｉ）は
、第１および第２プローブが相互に結合した第１の位置
にあるとき相互作用することができ、こうして第２螢光
団から放射される光は消去される。さらに、通常第１螢
光団（ＡＩおよびＡ２）が受信できない波長ｈｖ３の光
は相互作用により波長ｈｖ、の発光χもたら丁。
のエネルギーまたは光乞受信し且つ第２波長（ｈｖ２）
でエネルギーまたは光乞発信し得る螢光団（Ａｌおよび
Ａ２）である。同様に、第２標識成分は特定波長（ｈｖ
、 ）のエネルギーまたは光を受信し且つ第２波長（ｈ
ｖ、 ）でエネルギーを発信もしくは転称し得る螢光団
（ＤＩおよびＤ２）である。相対するプローブの第１お
よび第２螢光団（ＡＩとＤ２）および（Ａ２とＤｉ）は
、第１および第２プローブが相互に結合した第１の位置
にあるとき相互作用することができ、こうして第２螢光
団から放射される光は消去される。さらに、通常第１螢
光団（ＡＩおよびＡ２）が受信できない波長ｈｖ３の光
は相互作用により波長ｈｖ、の発光χもたら丁。
ｍ１図に示すように、プローブ（ｐｌおよびＴ２）は標
的類（ＴｌおよびＴ２）に加えるかまたは組み合わされ
る。プローブおよび標的類は変性して分離させろ。次に
、プローブと標的をハイブリダイズさせ、さらにプロー
ブが標的と紹会してプローブ−標的ハイブリッド（ＰＴ
ｌおよびＰＴ ２ ）ゲ形成する第２位置へ結合させ
ろ。各プローブ鎖の標識成分は相対するプローブ鎖の標
識成分から分離されて相互作用することができない。
的類（ＴｌおよびＴ２）に加えるかまたは組み合わされ
る。プローブおよび標的類は変性して分離させろ。次に
、プローブと標的をハイブリダイズさせ、さらにプロー
ブが標的と紹会してプローブ−標的ハイブリッド（ＰＴ
ｌおよびＰＴ ２ ）ゲ形成する第２位置へ結合させ
ろ。各プローブ鎖の標識成分は相対するプローブ鎖の標
識成分から分離されて相互作用することができない。
プローブ鎖（ＰＩおよびＴ２）が相互に結合した第１の
位置では、第２螢光団（ＤｉおよびＤ２）を励起するの
に適した波長（ｈｖ、 ）の光エネルギーの放射が、初
期励起波長（ｈｖ３）またはｉ２螢光団（ＤＩおよびＤ
２）の通常の放出波長（ｈｖｔ）とは異なる波長（ｈｖ
ｔ ）の光エネルギーケ第１螢光団（ＡＩおよびＡ２）
から放出させる。プローブ（ＰＬおよびＴ２）と標的（
ＴｌおよびＴ２）との第２位置へのハイブリダイゼーシ
ョンは、相対するプローブ鎖（Ａ１とＤ２；およびＡ２
とＤｌ）の標識成分同士の相互作用の分裂をもたらし、
そして第１螢光団（ＡＩおよびｈ２）の放出波長（ｈｖ
２）での光の放出Ｘ減少させる。第１標識成分、すなわ
ち螢光団（ＡＩおよびＡ２）、の放出波長（ｈｖ２）の
光の放出減少は存在する標的の＃度と逆の関係にある。
位置では、第２螢光団（ＤｉおよびＤ２）を励起するの
に適した波長（ｈｖ、 ）の光エネルギーの放射が、初
期励起波長（ｈｖ３）またはｉ２螢光団（ＤＩおよびＤ
２）の通常の放出波長（ｈｖｔ）とは異なる波長（ｈｖ
ｔ ）の光エネルギーケ第１螢光団（ＡＩおよびＡ２）
から放出させる。プローブ（ＰＬおよびＴ２）と標的（
ＴｌおよびＴ２）との第２位置へのハイブリダイゼーシ
ョンは、相対するプローブ鎖（Ａ１とＤ２；およびＡ２
とＤｌ）の標識成分同士の相互作用の分裂をもたらし、
そして第１螢光団（ＡＩおよびｈ２）の放出波長（ｈｖ
２）での光の放出Ｘ減少させる。第１標識成分、すなわ
ち螢光団（ＡＩおよびＡ２）、の放出波長（ｈｖ２）の
光の放出減少は存在する標的の＃度と逆の関係にある。
第２螢光団（ＤＩおよびＤ２）の発光は通常第１８光団
（ＡｌおよびＡ２）の存在下で消滅され、その結果放出
波長（ｈｖ、）の光エネルギーはほとんど放出されない
か又は全く検出されない。しかしながら、プローブ鎖（
ＰＩおよびＴ２）と標的類（ＴｌおよびＴ２）がハイブ
リダイズしてプローブー標的ハイブリッド（ＰＴ ｌお
よびＰＴ ２ ） ’ｃ影形成ると、相対するプローブ
鎖（Ａｌとｐ２；およびＡ２とＤｉ）の標識成分同士の
相互作用がこわされて、第２螢光団（ＤｉおよびＤ２）
から波長（ｈｖ、）の検出可能な光エネルギーが放出さ
れ、これは桿的（ＴｌおよびＴ２）と結合した第２位置
をとるプローブ（ＰＩおよびＰ２）に特徴的である。第
２標識成分、すなわち蛍光団（ＤｉおよびＤ２）、り放
出波長（ｈｖ＋）の元の放出増加は標的鎖の濃度と関係
がある。
（ＡｌおよびＡ２）の存在下で消滅され、その結果放出
波長（ｈｖ、）の光エネルギーはほとんど放出されない
か又は全く検出されない。しかしながら、プローブ鎖（
ＰＩおよびＴ２）と標的類（ＴｌおよびＴ２）がハイブ
リダイズしてプローブー標的ハイブリッド（ＰＴ ｌお
よびＰＴ ２ ） ’ｃ影形成ると、相対するプローブ
鎖（Ａｌとｐ２；およびＡ２とＤｉ）の標識成分同士の
相互作用がこわされて、第２螢光団（ＤｉおよびＤ２）
から波長（ｈｖ、）の検出可能な光エネルギーが放出さ
れ、これは桿的（ＴｌおよびＴ２）と結合した第２位置
をとるプローブ（ＰＩおよびＰ２）に特徴的である。第
２標識成分、すなわち蛍光団（ＤｉおよびＤ２）、り放
出波長（ｈｖ＋）の元の放出増加は標的鎖の濃度と関係
がある。
２つの波長（ｈｖ、 ）および（ｈＶｖ ）での第１お
よび第２．標識成分、′ｆなわち蛍光団（ＡＩとＡ２；
およびＤｌとＤ２）、の発光値は分析的に組み合わされ
ていずれか一方の値のみよりも優れた感度および精度の
標的鎖の＃度に関する合計値ケ与えろことができる。と
ちらσ）信号も標旧鎖（ＴＩおよびＴ２）の存在につい
て監視される。
よび第２．標識成分、′ｆなわち蛍光団（ＡＩとＡ２；
およびＤｌとＤ２）、の発光値は分析的に組み合わされ
ていずれか一方の値のみよりも優れた感度および精度の
標的鎖の＃度に関する合計値ケ与えろことができる。と
ちらσ）信号も標旧鎖（ＴＩおよびＴ２）の存在につい
て監視される。
′Ｗ、１および第２螢光団の選択、光散乱、二次螢光、
および光を蛍光団に放射する励起装置または発光装置の
制御恨により、多重信号特にプローブ（ＰＬおよびＰ２
）が互いに結合した位置にあるときの第１螢光団（Ａｔ
およびＡ２）の信号を検出することは難しいかも知れな
い。さらに、光放出波長（ｈｖｚ）は第２螢光団（Ｄｌ
およびＤ２）の相互作用により必ずしも第１螢光団（Ａ
ｌおよびＡ２）の通常の放出波長ではない。光放出（ｈ
ｖ２）は第１螢光団（ＡＩおよびＡ２）または第２螢光
団（ＤＩおよびＤ２）牢獄とは全く異なる組合せもしく
は群としてＱ）標識成分に特徴的であり、あるいは消光
されるかも知れ７よい。
および光を蛍光団に放射する励起装置または発光装置の
制御恨により、多重信号特にプローブ（ＰＬおよびＰ２
）が互いに結合した位置にあるときの第１螢光団（Ａｔ
およびＡ２）の信号を検出することは難しいかも知れな
い。さらに、光放出波長（ｈｖｚ）は第２螢光団（Ｄｌ
およびＤ２）の相互作用により必ずしも第１螢光団（Ａ
ｌおよびＡ２）の通常の放出波長ではない。光放出（ｈ
ｖ２）は第１螢光団（ＡＩおよびＡ２）または第２螢光
団（ＤＩおよびＤ２）牢獄とは全く異なる組合せもしく
は群としてＱ）標識成分に特徴的であり、あるいは消光
されるかも知れ７よい。
変性および再アニーリング佐に、相対するプローブの標
識成分、丁なわち第１および第２螢光団（ＡおよびＤ）
は分離され、そして標的−プローブハイブリッド（ＰＴ
ｌおよびＰＴ ２ ）の形成により離れた状態にある
。標的−プローブハイブリッド（ＰＴ ｌおよびＰＴ
２ ）の形成は、第１標識成分ノ螢光ａＩ（Ａ １ オ
ＬＵ Ａ ２ ） カＷｇ ２！ｉｔ光団（ＤＩおよび
Ｄ２）からのエネルギー乞受は入れる又は消す口し力を
破壊する。エネルギーを受は入れる第１螢光団へエネル
ギーケ送る第２螢光団（ＤｉおよびＤ２）の信号発生能
は、一般に検出するのが比較的簡単である。第２螢光団
（ＤＩおよびＤ２）の信号強度の増加は試料中の標的の
濃度および存在を示す尺度である。特定試料中の標的の
量が多くなればなるｆｌど、第２螢光団の放出波長（ｈ
ｖ、 ）の信号強度は大きくなる。
識成分、丁なわち第１および第２螢光団（ＡおよびＤ）
は分離され、そして標的−プローブハイブリッド（ＰＴ
ｌおよびＰＴ ２ ）の形成により離れた状態にある
。標的−プローブハイブリッド（ＰＴ ｌおよびＰＴ
２ ）の形成は、第１標識成分ノ螢光ａＩ（Ａ １ オ
ＬＵ Ａ ２ ） カＷｇ ２！ｉｔ光団（ＤＩおよび
Ｄ２）からのエネルギー乞受は入れる又は消す口し力を
破壊する。エネルギーを受は入れる第１螢光団へエネル
ギーケ送る第２螢光団（ＤｉおよびＤ２）の信号発生能
は、一般に検出するのが比較的簡単である。第２螢光団
（ＤＩおよびＤ２）の信号強度の増加は試料中の標的の
濃度および存在を示す尺度である。特定試料中の標的の
量が多くなればなるｆｌど、第２螢光団の放出波長（ｈ
ｖ、 ）の信号強度は大きくなる。
本方法は第２図に示す装置を用いて実施される。
この装置は次の主な手段：すなわち励起手段または光源
、収納容器およびフォトンカウンター（Ｐりの形の信号
検出器を含む。
、収納容器およびフォトンカウンター（Ｐりの形の信号
検出器を含む。
収納容器は標的ポリヌクレオテドン詮む可能性がある試
料と試薬を収容するのに適している。必要ならば、試料
は当分野で知られた適当な標的捕獲／放出技法により標
的ポリヌクレオチド以外の全ての細胞成分を除くために
処理される。試料中のタンパク賀系物賀χ溶解するため
にはカオｌ−。
料と試薬を収容するのに適している。必要ならば、試料
は当分野で知られた適当な標的捕獲／放出技法により標
的ポリヌクレオチド以外の全ての細胞成分を除くために
処理される。試料中のタンパク賀系物賀χ溶解するため
にはカオｌ−。
ビック塩が使用されろ。
試料は第１プローブおよび第２プローブを営む試薬と混
合される。第１および第２プローブはこれらのプローブ
が互いに結合てる第１の位置、およびこれらのプローブ
の少なくとも一方が標的と結合しうる第２の位置をとる
ことができる。各プローブはそれと会合した第１および
第２標識成分（例えば蛍光団）を含み、第１および第２
標識成分はプローブが互いに結合した第１位置にあると
き相互作用する。試薬はハイブリダイゼーションを促進
する轟分野で知られた促進剤を含んでいてもよい。
合される。第１および第２プローブはこれらのプローブ
が互いに結合てる第１の位置、およびこれらのプローブ
の少なくとも一方が標的と結合しうる第２の位置をとる
ことができる。各プローブはそれと会合した第１および
第２標識成分（例えば蛍光団）を含み、第１および第２
標識成分はプローブが互いに結合した第１位置にあると
き相互作用する。試薬はハイブリダイゼーションを促進
する轟分野で知られた促進剤を含んでいてもよい。
自動分析用に設計された器具において、第２図に示す装
置は好ましくは複数の収納容器乞収めるための手段を含
むであろう。試料を含む収納器は順次分析される。試料
の精製、加熱、混合および再アニーリングは標識信号が
測定されるステーションから離れたステーションで行う
のが好ましい。
置は好ましくは複数の収納容器乞収めるための手段を含
むであろう。試料を含む収納器は順次分析される。試料
の精製、加熱、混合および再アニーリングは標識信号が
測定されるステーションから離れたステーションで行う
のが好ましい。
従って、収納容器は試料の精製、加熱および混合７行う
第１ステーシヨンまたは一連のステーショ／から、プロ
ーブおよび標的（存在するならば）を再アニーリングさ
せる第２ステーシヨンへ運ばれろ。その後、収納容器は
標識信号を監視てる第３ステーシヨンへ送うれろ。
第１ステーシヨンまたは一連のステーショ／から、プロ
ーブおよび標的（存在するならば）を再アニーリングさ
せる第２ステーシヨンへ運ばれろ。その後、収納容器は
標識信号を監視てる第３ステーシヨンへ送うれろ。
運搬手段は回転可能なターンテーブル、コンベヤーベル
トまたは他の手段？含む。病院の臨床設定においては、
運搬手段は手動による移動な宮む。
トまたは他の手段？含む。病院の臨床設定においては、
運搬手段は手動による移動な宮む。
従って、病院の医員は患者から組織試料′ｆｆ：採取し
、その試料を収納容器の中に入れることができろ。
、その試料を収納容器の中に入れることができろ。
試料の精製、加熱および試薬の混合はベッドサイドで開
始され、そして収納容器を信号監視用の第３ステーシヨ
ンに移しながら継続されるだろう。
始され、そして収納容器を信号監視用の第３ステーシヨ
ンに移しながら継続されるだろう。
今や第１ステーシヨン？参照でると、試料とプローブ乞
融Ｗ４温度に加熱するための加熱手段が収納容器にきわ
めて接近してｒｔ直されている。標的およびプローブは
プローブ同士が互いに結合する第１の位置、または標的
が存在する場合に少なくとも１つのプローブがその後の
冷却の際に標的と結合する第２の位置のいずれかをとる
ことができる。加熱手段は化学熱源、電気熱源または当
分野で知られた他の熱源を営めた多くの形をとることが
できる。収納容器は試料とプローブの混合を促すために
攪拌手段〉含む− 第１ステーシヨンから、プローブと標的（もし存在する
ならば）暑再アニーリングさせる第２ステー７ヨンヘ収
納容器を運ぶ。融屏ま１こは変性温度からの収納容器の
冷却を促進するために、第２ステーシヨンは冷却手段を
含む。冷却手段はもしも十分な時間が許されるならば必
要でＴｘ ＜、プローブとけ的ン再アニーリングさせる
ためには周囲温度でも十分に低い。
融Ｗ４温度に加熱するための加熱手段が収納容器にきわ
めて接近してｒｔ直されている。標的およびプローブは
プローブ同士が互いに結合する第１の位置、または標的
が存在する場合に少なくとも１つのプローブがその後の
冷却の際に標的と結合する第２の位置のいずれかをとる
ことができる。加熱手段は化学熱源、電気熱源または当
分野で知られた他の熱源を営めた多くの形をとることが
できる。収納容器は試料とプローブの混合を促すために
攪拌手段〉含む− 第１ステーシヨンから、プローブと標的（もし存在する
ならば）暑再アニーリングさせる第２ステー７ヨンヘ収
納容器を運ぶ。融屏ま１こは変性温度からの収納容器の
冷却を促進するために、第２ステーシヨンは冷却手段を
含む。冷却手段はもしも十分な時間が許されるならば必
要でＴｘ ＜、プローブとけ的ン再アニーリングさせる
ためには周囲温度でも十分に低い。
第２ステーシヨンを去って、収納容器は信号（２つの位
置の一部をとるプローブに特徴的である）を監視するｉ
＠３ステーションへ送られる。
置の一部をとるプローブに特徴的である）を監視するｉ
＠３ステーションへ送られる。
第３ステーシヨンは標識成分の１つを励起する手段？：
宮むＪｉ４１および第２標識成分が螢光団であるこの例
では、励起手段は第２螢光団の実質的励起ン生じさぜな
いように適当なフィルターを備えた光源を含む。また、
適当に挾い発光スペクトルをもつレーザーも使用し得る
。
宮むＪｉ４１および第２標識成分が螢光団であるこの例
では、励起手段は第２螢光団の実質的励起ン生じさぜな
いように適当なフィルターを備えた光源を含む。また、
適当に挾い発光スペクトルをもつレーザーも使用し得る
。
標識成分の１つが化学発光剤乞含む場合、その励起手段
は発光反応を生じさせるための適当な補助因子ケ収納容
器の中に注入する手段〉含むであろう。
は発光反応を生じさせるための適当な補助因子ケ収納容
器の中に注入する手段〉含むであろう。
第３の作業ステーションは収納容器からの螢光χ受ける
べく配置された信号検出器、フォト７カウンター（ＰＣ
）を含む。好ましくは２つのフォトカウンター（ＰＣ）
を使用する。１つのフォトンカウンターは第１標識成分
から発せられる信号χ受信し、そして第２のフォトンカ
ウンターはフィルターまたは時間分解法の使用により第
２標識成分から発せられろ信号乞受信する。
べく配置された信号検出器、フォト７カウンター（ＰＣ
）を含む。好ましくは２つのフォトカウンター（ＰＣ）
を使用する。１つのフォトンカウンターは第１標識成分
から発せられる信号χ受信し、そして第２のフォトンカ
ウンターはフィルターまたは時間分解法の使用により第
２標識成分から発せられろ信号乞受信する。
フォトンカウンターはアナライザーによって受信され、
増幅され、処理されるフォトン信号を発する。アナライ
ザーはその結果？オペレーターに送る他の装置に表示さ
せろように、フォトン信号乞処理して図式的に示すこと
ができる値に変える。
増幅され、処理されるフォトン信号を発する。アナライ
ザーはその結果？オペレーターに送る他の装置に表示さ
せろように、フォトン信号乞処理して図式的に示すこと
ができる値に変える。
本装置はパルス化光源またはシヌソイド変調光源と共に
アナログデフエクターχ便用することにより、寿命分解
法に適合させることができる。寿命分解法は本発明者の
係属中の米国特許出願第７３８５６０号（１９８５年５
月２８日付）に説明されており、これは参照によりここ
に引用される。
アナログデフエクターχ便用することにより、寿命分解
法に適合させることができる。寿命分解法は本発明者の
係属中の米国特許出願第７３８５６０号（１９８５年５
月２８日付）に説明されており、これは参照によりここ
に引用される。
本発明は合成オリゴヌクレオチドと共に使用するのに都
合がよい。しかしながら、本発明は経陽的な方法でプロ
ーブ（ＰＩおよびＰ２）’１作製する生物学的クローニ
ング法に容易に適合させることができる。
合がよい。しかしながら、本発明は経陽的な方法でプロ
ーブ（ＰＩおよびＰ２）’１作製する生物学的クローニ
ング法に容易に適合させることができる。
今や第３図を参照すると、標的配列に相補的であること
が知られている塩基配列を含むＤＮＡの二本鎖セグメン
ト（以後プローブセグメントと呼ぶ）が慣用組換えＤＮ
Ａ法によりプラスミドの甲に導入される。例えば、プラ
スミドはプラスミド環を開裂して一本鎖の突出部または
接着末端音生じさせる制限エンドヌクレアーゼで消化す
る。その接層末端はプローブセグメントの接層末端に相
補的であって、それと結合する。プローブセグメントは
その後のクローンの同定のための選択マーカーと共に挿
入される。
が知られている塩基配列を含むＤＮＡの二本鎖セグメン
ト（以後プローブセグメントと呼ぶ）が慣用組換えＤＮ
Ａ法によりプラスミドの甲に導入される。例えば、プラ
スミドはプラスミド環を開裂して一本鎖の突出部または
接着末端音生じさせる制限エンドヌクレアーゼで消化す
る。その接層末端はプローブセグメントの接層末端に相
補的であって、それと結合する。プローブセグメントは
その後のクローンの同定のための選択マーカーと共に挿
入される。
プラスミドはその後プラスミドが複製または増幅される
大腸菌（Ｋｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）のよう
な細菌の中に挿入される。細菌はプローブセグメントと
選択マーカーを首尾よく組み込んだ細菌以外の細菌に対
して有毒である培地上でコロニーへと増殖させる。
大腸菌（Ｋｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）のよう
な細菌の中に挿入される。細菌はプローブセグメントと
選択マーカーを首尾よく組み込んだ細菌以外の細菌に対
して有毒である培地上でコロニーへと増殖させる。
細菌コロニーを増殖させてプラスミドを高コピー数へと
複製させた後、細菌ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡは他
の細胞成分から分離し、そのＤＮＡを制限酵素で消化し
てプラスミドＤＮＡからプローブセグメントを切断する
。次いで、プローブセグメントは電気泳動ぞ含めた適当
な手段で単離する。そのプローブセグメントは末端標識
化してプローブを作＃するのに適している力）、あるい
はプローブとして価値があるサブセクションから成って
いる。従って、大きいプローブセグメントは制限酵素に
よる消化を数回行って、大きいプローブセグメントを小
さいプローブサブセグメント（その３′−および５′−
末端乞標識化するのに適している〕に切断しつる。
複製させた後、細菌ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡは他
の細胞成分から分離し、そのＤＮＡを制限酵素で消化し
てプラスミドＤＮＡからプローブセグメントを切断する
。次いで、プローブセグメントは電気泳動ぞ含めた適当
な手段で単離する。そのプローブセグメントは末端標識
化してプローブを作＃するのに適している力）、あるい
はプローブとして価値があるサブセクションから成って
いる。従って、大きいプローブセグメントは制限酵素に
よる消化を数回行って、大きいプローブセグメントを小
さいプローブサブセグメント（その３′−および５′−
末端乞標識化するのに適している〕に切断しつる。
プローブセグメントまたはサブセグメントの３′末端の
標識化は、活性化蛍光団との反応に利用し得る官能基を
もつヌクレオチドの使用により達成される。官能基をも
つヌクレオチドはターミナルデオキシル レオチジルト
ランスフエラーゼ（ＴｄＴ ）の使用によりプローブセ
グメントに付加される。ｒ＃ｇＴｄＴはリボヌクレオチ
ドの１＠または２個の塩基ンプローブセグメントに付加
させるだけであり、従ってプローブセグメントへのヌク
レオチドの尾部または伸長鎖の付加が回避されるだろう
。ヌクレオチドの大きい尾部または伸長鎖に、標識成分
間のエネルギー転移を変え、またプローブ鎖の標的鎖へ
のハイブリダイゼーショ／を変更もしくは損なう恐れの
ある立体効果ン有するだろう。プローブセグメントの５
′末端の標識化は、二官能性脂肪族基乞使用してプロー
ブセグメントに標識成分を結付させることにより達成さ
れる。好ましくはｌ忽識成分は脂肪族ジアミンによって
プローブセグメントに結合される。
標識化は、活性化蛍光団との反応に利用し得る官能基を
もつヌクレオチドの使用により達成される。官能基をも
つヌクレオチドはターミナルデオキシル レオチジルト
ランスフエラーゼ（ＴｄＴ ）の使用によりプローブセ
グメントに付加される。ｒ＃ｇＴｄＴはリボヌクレオチ
ドの１＠または２個の塩基ンプローブセグメントに付加
させるだけであり、従ってプローブセグメントへのヌク
レオチドの尾部または伸長鎖の付加が回避されるだろう
。ヌクレオチドの大きい尾部または伸長鎖に、標識成分
間のエネルギー転移を変え、またプローブ鎖の標的鎖へ
のハイブリダイゼーショ／を変更もしくは損なう恐れの
ある立体効果ン有するだろう。プローブセグメントの５
′末端の標識化は、二官能性脂肪族基乞使用してプロー
ブセグメントに標識成分を結付させることにより達成さ
れる。好ましくはｌ忽識成分は脂肪族ジアミンによって
プローブセグメントに結合される。
初めに一末鎖Ｄｋ（Ａの３′末端の標識化について見る
と、酵素ＴｄＴ（７Ｊ使用によりヌクレオチドをＤＮＡ
Ｓに付加させろ反応は次のように表わされる。
と、酵素ＴｄＴ（７Ｊ使用によりヌクレオチドをＤＮＡ
Ｓに付加させろ反応は次のように表わされる。
Ｍツ＋
ｎ（ＮＴＰ、） ＋ ｐ（ｄｘ）、→ ｐ（ｄｘ）ｍ
（ｄＮ）ｎ＋ｎＰＰ□ｄＴ 上記反応式において、ｐ（ｄｘ）Ｉｎは長さがｍ個の塩
基のオリゴデオキシヌクレオチドであり、Ｎはアデニン
、グアニン、シチジン、ウリジ／、チミ／ま１こはその
修飾体Ｑ）うちの１つでろる。ｎはＤＮＡ鎖に付加され
る単量体の数’！’表わ丁。
（ｄＮ）ｎ＋ｎＰＰ□ｄＴ 上記反応式において、ｐ（ｄｘ）Ｉｎは長さがｍ個の塩
基のオリゴデオキシヌクレオチドであり、Ｎはアデニン
、グアニン、シチジン、ウリジ／、チミ／ま１こはその
修飾体Ｑ）うちの１つでろる。ｎはＤＮＡ鎖に付加され
る単量体の数’！’表わ丁。
好ましくは単量体は核酸のアミノアルキル誘導体ン含む
だろう。アミノ基は多数の螢光剤と反応することかでき
る。より好ましくは、アミノアルキルご４体は第一脂肪
族アミノ基乞宮むａ岬基ＴｄＴおよびリボヌクレオチド
率量体の使用は、ＤＮＡ鎖への４１Ｌ量体塩基の付加を
１個または２個の塩基に制限する。Ｍ′＋ は金回イオ
ン補助因子乞表わ丁。好適なりポヌクレオチド誘専体の
例は８−（６−アミノヘキシル）−アミノアデノシン−
５′−三リン酸（ＡＨＡ −ＡＴＦ ）であり、その構
造を以下に示す。
だろう。アミノ基は多数の螢光剤と反応することかでき
る。より好ましくは、アミノアルキルご４体は第一脂肪
族アミノ基乞宮むａ岬基ＴｄＴおよびリボヌクレオチド
率量体の使用は、ＤＮＡ鎖への４１Ｌ量体塩基の付加を
１個または２個の塩基に制限する。Ｍ′＋ は金回イオ
ン補助因子乞表わ丁。好適なりポヌクレオチド誘専体の
例は８−（６−アミノヘキシル）−アミノアデノシン−
５′−三リン酸（ＡＨＡ −ＡＴＦ ）であり、その構
造を以下に示す。
化合物ＡＨＡ −ＡＴＰは多棟多様の螢光標識の付加を
ＯＴ能にてる棟Ａの化学反応を受けることができる第一
脂肪族アミノ基ぞ含Ｍする。
ＯＴ能にてる棟Ａの化学反応を受けることができる第一
脂肪族アミノ基ぞ含Ｍする。
従って、ＤＮＡ鎖の３′末端はＡＨＡ−ＡＴＰおよびタ
ーミナルトランスフェラーゼとｐＨ７において反応し、
その反応は仄のように表わされる。
ーミナルトランスフェラーゼとｐＨ７において反応し、
その反応は仄のように表わされる。
Ｍ９十
ｎＡＨＡ−ＡＴＰ ＋ ｐ（ｄｘ）ｒｎ−） ｐ（ｄ
ｘ）１１．（△）ＩＡ−Ａ）ｎ＋ ｎＰＰ１ｄＴ 得られる生成物知は没殿剤または可溶化剤、比色定蒙剤
、発光剤、酪系または細動因子のよりな標識成分と反応
し得るアミン官能基ぞ宮み、それにより標識成分ンもつ
プローブを製造することができる。例えば、蛍光団イン
ナオンアネートはｐＨ９，３でＡＨＡ −ＡＴＩ’のア
ミン官能基と反応してプローブ類を形成する。その他の
アミン反応性螢光団には例えばフルオレセインイソチオ
シアネート、スルホローダミン１０１スルホン飯クロリ
ド（テキサスレッド）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジ
ルピレンブタノエート、エオシンイソチオシアネートお
よびエリトロシンイソチオシアネートが含造れるが、こ
れらに限定されない。適当な化学発光剤および補助因子
にはアミン反応性ルミノール討導体、ミクロペルオキシ
ダーゼ、アクリジニウムエステル、ペルオキシダーゼお
よびそれらの誘導体が含まれる。当分野で通常の知ｉａ
乞有する者は、アミン反応性でない螢光剤および化学発
光剤をアミン反応性へと修飾して、本発明の標識成分と
して適するものにすることができること？認めるであろ
う。
ｘ）１１．（△）ＩＡ−Ａ）ｎ＋ ｎＰＰ１ｄＴ 得られる生成物知は没殿剤または可溶化剤、比色定蒙剤
、発光剤、酪系または細動因子のよりな標識成分と反応
し得るアミン官能基ぞ宮み、それにより標識成分ンもつ
プローブを製造することができる。例えば、蛍光団イン
ナオンアネートはｐＨ９，３でＡＨＡ −ＡＴＩ’のア
ミン官能基と反応してプローブ類を形成する。その他の
アミン反応性螢光団には例えばフルオレセインイソチオ
シアネート、スルホローダミン１０１スルホン飯クロリ
ド（テキサスレッド）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジ
ルピレンブタノエート、エオシンイソチオシアネートお
よびエリトロシンイソチオシアネートが含造れるが、こ
れらに限定されない。適当な化学発光剤および補助因子
にはアミン反応性ルミノール討導体、ミクロペルオキシ
ダーゼ、アクリジニウムエステル、ペルオキシダーゼお
よびそれらの誘導体が含まれる。当分野で通常の知ｉａ
乞有する者は、アミン反応性でない螢光剤および化学発
光剤をアミン反応性へと修飾して、本発明の標識成分と
して適するものにすることができること？認めるであろ
う。
ＤＮＡ鎖はまたそれらの３′末端に１− Ｎ１１−エテ
ノアデノシン−５′−三リン酸（ＥＡＴＰ ）のような
螢光ヌクレオチド誘導体乞ターミナルトランスフェラー
ゼ（ＴａＴ ）の媒介により付加して標識化することか
できろ。しかしながらＤＮＡ へのデオキシヌクレオチ
ドの付刀口は標準化するのが困難であり且つ立体効果を
生じやすい多くの付加ケ含む尾部または伸長鎖？もたら
すかも知れない。他の螢光ヌクレオチド誘導には例えば
３′−（ジメチルアミノナフトイル、）−ＡＴＰまたは
一〇ＴＰおよび／または螢光性複索環乞含むヌクＶオテ
ド三リン酸が含まれる。
ノアデノシン−５′−三リン酸（ＥＡＴＰ ）のような
螢光ヌクレオチド誘導体乞ターミナルトランスフェラー
ゼ（ＴａＴ ）の媒介により付加して標識化することか
できろ。しかしながらＤＮＡ へのデオキシヌクレオチ
ドの付刀口は標準化するのが困難であり且つ立体効果を
生じやすい多くの付加ケ含む尾部または伸長鎖？もたら
すかも知れない。他の螢光ヌクレオチド誘導には例えば
３′−（ジメチルアミノナフトイル、）−ＡＴＰまたは
一〇ＴＰおよび／または螢光性複索環乞含むヌクＶオテ
ド三リン酸が含まれる。
一本＠ＤＮＡの５′末端はそのＤＮＡ鎖の５′−リン酸
馨活性化螢光団に納会させろエチレンジアミンを使用す
ることによる２段階反応で標識化され、この反応は次の
ように表わされる。
馨活性化螢光団に納会させろエチレンジアミンを使用す
ることによる２段階反応で標識化され、この反応は次の
ように表わされる。
合成ポリヌクレオチドは５′−ヒドロキシル基？リン酸
化するだめの追加工程乞必要とするだろう。
化するだめの追加工程乞必要とするだろう。
リン酸化は工程（Ｔ）に先立ってＮ ＩＡ Ｔ４ キナ
ーゼン用いて行われる。
ーゼン用いて行われる。
好ましくは、カルボジイミドは水溶性でるり、例えば１
−エチル−３−〔３−ジメチルアミノプロビルクーカル
ボジイミド、１−シクロへキシル−３−（２−モルホリ
ノエチルツーカルボジイミドメト−ｐ−トルエン−サル
フェートおよびそれらの誘導体ン含む。
−エチル−３−〔３−ジメチルアミノプロビルクーカル
ボジイミド、１−シクロへキシル−３−（２−モルホリ
ノエチルツーカルボジイミドメト−ｐ−トルエン−サル
フェートおよびそれらの誘導体ン含む。
エチレンジアミンポリヌクレオチド誘導体は標識成分と
反応することができろ（工程Ｉｌ）反応性アミン官能基
２有する。反応性アミン官能基はｐＨ９，３でインチオ
シアネートと反応してプローブ類を形成するだろう。一
方の末端標識（例えば５′末端標識）のための適当な標
識成分は、他方の末端標識（３′末端標ｉａ）成分を補
足するように選択される。適当な螢光団には例えばフル
オレセインイソチオシアネート、スルホローダミン１０
１スルホン飯クロリド（テキサスレッド）、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミジルピレンブタノエート、エオシンイ
ソチオシアネート、エリトロシンインチオシアネートお
よびそれらの誘導体が含筐れるが、これらに限定されな
い。適当な化学発光剤および補助因子にはルミノール、
ミクロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ア
クリジニウムエステル、ルシゲニンおよびそれらの誘導
体が含まれる。
反応することができろ（工程Ｉｌ）反応性アミン官能基
２有する。反応性アミン官能基はｐＨ９，３でインチオ
シアネートと反応してプローブ類を形成するだろう。一
方の末端標識（例えば５′末端標識）のための適当な標
識成分は、他方の末端標識（３′末端標ｉａ）成分を補
足するように選択される。適当な螢光団には例えばフル
オレセインイソチオシアネート、スルホローダミン１０
１スルホン飯クロリド（テキサスレッド）、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミジルピレンブタノエート、エオシンイ
ソチオシアネート、エリトロシンインチオシアネートお
よびそれらの誘導体が含筐れるが、これらに限定されな
い。適当な化学発光剤および補助因子にはルミノール、
ミクロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ア
クリジニウムエステル、ルシゲニンおよびそれらの誘導
体が含まれる。
今や第４図を参照すると、−末鎖ＤＮＡに関して説明さ
れ１こ標識化法は、生物学的源から単離された二本鎖Ｄ
ＮＡ セグメントにも応用できる。こうして、図示する
ように、細菌プラスミドから単離された代表的ＤＮＡ
セグメントは２本の相補的なりＮＡ鎖（各ＤＮＡ鎖は３
′ヒドロキシル基と５′−リン酸基を有する）から成る
。二本鎖ＤＮＡセグメン）Ｕエチレンジアミンおよび活
性化螢光団と反応させて、両方のＤＮＡ鎖の５′−リン
市位置に第１蛍光団（ＡＪを同時に共有納会させること
ができる。
れ１こ標識化法は、生物学的源から単離された二本鎖Ｄ
ＮＡ セグメントにも応用できる。こうして、図示する
ように、細菌プラスミドから単離された代表的ＤＮＡ
セグメントは２本の相補的なりＮＡ鎖（各ＤＮＡ鎖は３
′ヒドロキシル基と５′−リン酸基を有する）から成る
。二本鎖ＤＮＡセグメン）Ｕエチレンジアミンおよび活
性化螢光団と反応させて、両方のＤＮＡ鎖の５′−リン
市位置に第１蛍光団（ＡＪを同時に共有納会させること
ができる。
次に、二本鎖ＤＮＡセグメントはＴｃ１Ｔの媒介により
ＡＨＡ−ＡＴＰと反応させ、そして各ＤＮＡ鎖の３′−
位置にｇ２螢光団（ＤＪを共有結合させる。
ＡＨＡ−ＡＴＰと反応させ、そして各ＤＮＡ鎖の３′−
位置にｇ２螢光団（ＤＪを共有結合させる。
従って、−万のプローブ鎖の第１螢光団（Ａ）はＤＮＡ
セグメントの両末端で他方のプローブ鎖の第２螢光団（
Ｄ）ｌと相互作用するように位置づけられる。標識成分
の第１螢光団（ＡＪおよび第２ｊｉ１！光団（Ｄｌｌは
相互作用して、プローブが標的とのハイブリダイゼーシ
ョンの際にとりつる２つの位置の一部に特徴的な信号を
発することができる。
セグメントの両末端で他方のプローブ鎖の第２螢光団（
Ｄ）ｌと相互作用するように位置づけられる。標識成分
の第１螢光団（ＡＪおよび第２ｊｉ１！光団（Ｄｌｌは
相互作用して、プローブが標的とのハイブリダイゼーシ
ョンの際にとりつる２つの位置の一部に特徴的な信号を
発することができる。
本発明は好適な実施態様の特徴を示す次の実施例により
さらに説明される。
さらに説明される。
実施例
Ａ、物質および方法
次の実施例において、１−Ｎ８−エテノアデノシン−５
′−三リン酸（ナトリウム塩）、２’−デオキシアデノ
シ７−５′−三リン酸（ナトリウム１、ＤＮＡオリゴマ
ー、およびセルロースニ固定され１こオリゴマーはニュ
ーシャーシー州ビス力タウエーのファーマシア・バイオ
ケミカルズ社から購入した。制限酵素はメリーランド州
ガイサースバーグのペセスダリサーチ研究所から購入し
た。
′−三リン酸（ナトリウム塩）、２’−デオキシアデノ
シ７−５′−三リン酸（ナトリウム１、ＤＮＡオリゴマ
ー、およびセルロースニ固定され１こオリゴマーはニュ
ーシャーシー州ビス力タウエーのファーマシア・バイオ
ケミカルズ社から購入した。制限酵素はメリーランド州
ガイサースバーグのペセスダリサーチ研究所から購入し
た。
低分子量形のターミナルデオキシヌクレオチジルトラン
スフエラーゼ（ＴｄＴ）はフロリダ州セントビータース
バーグのライフサイエンス社から購入した。８−（６−
アミノヘキシル）−アミノアデノシン−５′−三リン酸
（ＡＨＡ −ＡＴＰ ）はミズーリ州セントルイスのシ
グマケミカルズ社から購入した。プラスミド ５Ｐ６５
はウィスフンンン州マジソンのプロメガ・バイオチクか
ら購入した。
スフエラーゼ（ＴｄＴ）はフロリダ州セントビータース
バーグのライフサイエンス社から購入した。８−（６−
アミノヘキシル）−アミノアデノシン−５′−三リン酸
（ＡＨＡ −ＡＴＰ ）はミズーリ州セントルイスのシ
グマケミカルズ社から購入した。プラスミド ５Ｐ６５
はウィスフンンン州マジソンのプロメガ・バイオチクか
ら購入した。
アミン反応性蛍光団はオレゴン州ジャ／クショ／シティ
−のモレキュラープロープズ社から購入した。他の全て
の試薬は分析級またはそれ以上のものであった。合成り
ＮＡオリゴマーはいくつかの市販源（カリフォルニア州
エメリービルのアメリカン・バイオヌクレアーを含むう
からの試薬類および標準ホスホルアマダイト法を用いて
バイオサーチ・サム・ワン自ｆｉＤＮＡ合成機（カリフ
ォルニア州サンラフアニル〕で製造した。
−のモレキュラープロープズ社から購入した。他の全て
の試薬は分析級またはそれ以上のものであった。合成り
ＮＡオリゴマーはいくつかの市販源（カリフォルニア州
エメリービルのアメリカン・バイオヌクレアーを含むう
からの試薬類および標準ホスホルアマダイト法を用いて
バイオサーチ・サム・ワン自ｆｉＤＮＡ合成機（カリフ
ォルニア州サンラフアニル〕で製造した。
本実施例において、ＴｄＴ反応緩＠ｇ、（２Ｘ）はｐＨ
７、■で０．４Ｍカコジル酸、０．０（１２）Ｍジテオ
トレイトール、０．０１６Ｍ塩化マグネシウムを會む。
７、■で０．４Ｍカコジル酸、０．０（１２）Ｍジテオ
トレイトール、０．０１６Ｍ塩化マグネシウムを會む。
結合緩衝液はｐＨ７，５でＩＭ塩化ナトリクム、０．（
１２）Ｍリン酸カリウム、−塩基性（ＫＨ２ＰＯ４）を
含む、ホウ酸緩衝液は０．０５Ｍホウ酸を含むか、ある
いは塩酸または水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ９，
３にＡ整した０、０５Ｍホウホウ上リウム溶液を含む。
１２）Ｍリン酸カリウム、−塩基性（ＫＨ２ＰＯ４）を
含む、ホウ酸緩衝液は０．０５Ｍホウ酸を含むか、ある
いは塩酸または水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ９，
３にＡ整した０、０５Ｍホウホウ上リウム溶液を含む。
吸光夏測定はＤＮＡ プローブの組成、Ｄ Ｎ Ａおよ
びＤＮＡプローブの濃度、ならびにＤＮＡ融解実験（融
解曲線）における塩基対合度を測定するために行われた
。吸光スペクトルはキャリ＋１７Ｄ吸光度分光光匿計（
カリフォルニア州バロアルタのバリアンアソシエーツ社
）を便って記録した。温度の関数としてＤＮＡ の吸光
層の変化を測定するために、サーモスタット付きのキュ
ベツトホルダーの温度をハークモデルＡ８１冷却水浴に
ュージャージー州、サドル・ブロック）を用いて制御し
た。ホモポリマー濃度の測定において使用した吸光係数
は、ファーマシア・モレキュラー・バイオロジカルズの
カタログの付録に載っている吸光係数編集物から得た。
びＤＮＡプローブの濃度、ならびにＤＮＡ融解実験（融
解曲線）における塩基対合度を測定するために行われた
。吸光スペクトルはキャリ＋１７Ｄ吸光度分光光匿計（
カリフォルニア州バロアルタのバリアンアソシエーツ社
）を便って記録した。温度の関数としてＤＮＡ の吸光
層の変化を測定するために、サーモスタット付きのキュ
ベツトホルダーの温度をハークモデルＡ８１冷却水浴に
ュージャージー州、サドル・ブロック）を用いて制御し
た。ホモポリマー濃度の測定において使用した吸光係数
は、ファーマシア・モレキュラー・バイオロジカルズの
カタログの付録に載っている吸光係数編集物から得た。
同じ付録に載っているホモポリマーおよび交互ホモポリ
マーＤＮＡの吸光係数の平均は混合塩基配列の吸光係数
を概算するために使用され、−末鎖ＤＮＡについては８
．７ Ｘ １０” ｉｔ ／ ｍｏｌ ／塩基および二
本鎖ＤＮＡについては６．８ Ｘ １０’ Ｊｌ ／
［！１０１ ／塩基であった。
マーＤＮＡの吸光係数の平均は混合塩基配列の吸光係数
を概算するために使用され、−末鎖ＤＮＡについては８
．７ Ｘ １０” ｉｔ ／ ｍｏｌ ／塩基および二
本鎖ＤＮＡについては６．８ Ｘ １０’ Ｊｌ ／
［！１０１ ／塩基であった。
非結合螢光団の吸光係数は複合ＤＮＡ プローブ中に存
在する螢光団の量を測定するために使用した。
在する螢光団の量を測定するために使用した。
螢光スペクトルは８ＬＭモデル４８００アナログ分光螢
光計（イリンイ州アーバナ、ＳＬＭ−ＡＭＩＮＧＯイン
スッルメンツ社）を使って測定および記録した。より優
れた感度を得るために、アナログ分光蛍光計は螢光のフ
ォトン計数検出を行うように改良した。この改良は通常
の検出器の代わりに、周囲温度ハウジング内にハフマツ
モデル８９２８元電増倍管を、そして−３０℃付近に保
たれた熱電冷却ハウジング（リサーチモデルＴＥ−１７
７ＲＦ用の製品）内に同じ型の元′屯増倍管を含んでい
た。管のアノードの電流パルスが増幅され。
光計（イリンイ州アーバナ、ＳＬＭ−ＡＭＩＮＧＯイン
スッルメンツ社）を使って測定および記録した。より優
れた感度を得るために、アナログ分光蛍光計は螢光のフ
ォトン計数検出を行うように改良した。この改良は通常
の検出器の代わりに、周囲温度ハウジング内にハフマツ
モデル８９２８元電増倍管を、そして−３０℃付近に保
たれた熱電冷却ハウジング（リサーチモデルＴＥ−１７
７ＲＦ用の製品）内に同じ型の元′屯増倍管を含んでい
た。管のアノードの電流パルスが増幅され。
調整され、そしてＫ（）＆Ｇ ０ＲＴＥＣヌクレアー・
インスツルメンテーション・モジュール２使って計測さ
れた。このモジュールはモデル９３０１７アースト１ｌ
ｉｉＴｔ増幅器、モデル９３（１２）増幅器−弁別器、
およびモデル８７４クワドカウンター／タイマーを含ん
でいた。光電増幅管のダイノード・チェイン（Ｄｙｎｏ
ｄ、ｅ ｃｈａｉｎ）のための高血圧はＥＧ＆ＧＯＲＴ
ＫＣモデル４７８電力供給器によって供給した。
インスツルメンテーション・モジュール２使って計測さ
れた。このモジュールはモデル９３０１７アースト１ｌ
ｉｉＴｔ増幅器、モデル９３（１２）増幅器−弁別器、
およびモデル８７４クワドカウンター／タイマーを含ん
でいた。光電増幅管のダイノード・チェイン（Ｄｙｎｏ
ｄ、ｅ ｃｈａｉｎ）のための高血圧はＥＧ＆ＧＯＲＴ
ＫＣモデル４７８電力供給器によって供給した。
カウンターモジュールはヒユーレット・パラカード９８
２５コンピユータに工ＦＥＥ −４８８インタフエース
を介して接続した。コンピュータおよびインタフェース
は螢光光度計の非改良部分の基準検出器測定およびモノ
クロメータ−走査と同調させてフォトン！を側スペクト
ルを得られるように［７１こ。
２５コンピユータに工ＦＥＥ −４８８インタフエース
を介して接続した。コンピュータおよびインタフェース
は螢光光度計の非改良部分の基準検出器測定およびモノ
クロメータ−走査と同調させてフォトン！を側スペクト
ルを得られるように［７１こ。
温度制御はハークモデルＡ８１水浴と接続したＳＬＭサ
ーモスタット付きキュベツトホルダーを用いて維持した
。
ーモスタット付きキュベツトホルダーを用いて維持した
。
走査しない場合、試料の発光は一般にモノクロメータ−
の代わりにフィルターを使用した螢光光度計の第２開口
部を辿して測定された。フルオレセイン試料ＤＮＡ を
含む試料からの発光は、５２０ｎｍ （ＦＷＨＭ ＝
８．２ ｎｍ ）に集中したピーク透過率をもつティト
リック・オプチツクス３キャビティ干渉フィルターを兆
して濾光した。フルオレセイン試料は２ｎｍに設定され
たモノクロメータ−帯域幅で４９０ ｎｍにおいて励超
させ１こ。時１…の関数としてのフルオレセイン発光は
、データ蓄積および運動学的情報の処理が可能なヒユー
レット・パッカートモデル９８３６コンピユータにイン
タフェースで接続され１こカウンターモジュールヲ使っ
てｄ上鏝した。
の代わりにフィルターを使用した螢光光度計の第２開口
部を辿して測定された。フルオレセイン試料ＤＮＡ を
含む試料からの発光は、５２０ｎｍ （ＦＷＨＭ ＝
８．２ ｎｍ ）に集中したピーク透過率をもつティト
リック・オプチツクス３キャビティ干渉フィルターを兆
して濾光した。フルオレセイン試料は２ｎｍに設定され
たモノクロメータ−帯域幅で４９０ ｎｍにおいて励超
させ１こ。時１…の関数としてのフルオレセイン発光は
、データ蓄積および運動学的情報の処理が可能なヒユー
レット・パッカートモデル９８３６コンピユータにイン
タフェースで接続され１こカウンターモジュールヲ使っ
てｄ上鏝した。
いろいろな公知のハイブリダイゼーション条件が本方法
において夏用された。ハイブリダイゼーション条件のた
めの一般基準はメインコス（Ｍｅｉｎｋｏ℃ｈ）および
ワール（Ｗａｈｌ）、 ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃ
ｈｅｍｉｓ℃ｒｙ、 ｖｏＬ １３８ 、 Ｐ、 ２６
７−２８４（１９１３，ＬＪに開示されている。
において夏用された。ハイブリダイゼーション条件のた
めの一般基準はメインコス（Ｍｅｉｎｋｏ℃ｈ）および
ワール（Ｗａｈｌ）、 ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃ
ｈｅｍｉｓ℃ｒｙ、 ｖｏＬ １３８ 、 Ｐ、 ２６
７−２８４（１９１３，ＬＪに開示されている。
当分野で通常の知識を有する者は必要に応じて次の条件
を使用するであろう。ハイブリダイゼーションの最適速
度は一般に融解転移温度より約２０″〜２５℃低い温度
で得られる。より高いストリンジエンシー（Ｓｔｒｉｎ
ｇｅｎｃｙ ）のためには、ハイブリダイゼーションは
融解温度の５″−またけ１０℃以内の温度で行われる。
を使用するであろう。ハイブリダイゼーションの最適速
度は一般に融解転移温度より約２０″〜２５℃低い温度
で得られる。より高いストリンジエンシー（Ｓｔｒｉｎ
ｇｅｎｃｙ ）のためには、ハイブリダイゼーションは
融解温度の５″−またけ１０℃以内の温度で行われる。
ラムダＤＮＡの形のキャリアーＤＮＡの添加は、低濃度
でプローブの安定性を高めることが判明した。いくつか
の場合には、ＤＮＡの安定性を改善するためにＥＤＴＡ
も加えられた。濃縮剤や促進剤のような他の添加剤は
、これらがプローブの作製に使用されるサイズオリゴマ
ー（８ｉｚｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒ ）に効果的であり且
つこれらの添加によって螢光バックグラウンドが非常に
増加しない限り、ハイブリダイゼーション溶液中で使用
することができる。
でプローブの安定性を高めることが判明した。いくつか
の場合には、ＤＮＡの安定性を改善するためにＥＤＴＡ
も加えられた。濃縮剤や促進剤のような他の添加剤は
、これらがプローブの作製に使用されるサイズオリゴマ
ー（８ｉｚｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒ ）に効果的であり且
つこれらの添加によって螢光バックグラウンドが非常に
増加しない限り、ハイブリダイゼーション溶液中で使用
することができる。
実験で使用する一般方法は、まず初めに標的とプローブ
ＤＮＡを一本鎖の形にする８ｇ１工程を含む。これは標
的および試料ＤＮＡ を営む試料を水浴中で加熱するこ
とにより達成された。長いＤＮＡ標的の場合は、一般に
試料は沸騰水浴中で低塩緩衝液（または蒸留水」巾約１
０分聞方口熱される。
ＤＮＡを一本鎖の形にする８ｇ１工程を含む。これは標
的および試料ＤＮＡ を営む試料を水浴中で加熱するこ
とにより達成された。長いＤＮＡ標的の場合は、一般に
試料は沸騰水浴中で低塩緩衝液（または蒸留水」巾約１
０分聞方口熱される。
プローブは高温度への長期暴露を避けるために、しばし
ばデハイプリダイゼーショ７法の終り付近で標的ＤＮＡ
含有試料に加えられた。デハイプリダイゼーションの最
後に、ハイブリダイゼーションのための塩および緩衝剤
の所望濃度を達成すべく、濃厚塩緩衝液を加えた。比較
的小さいオリゴマー標的およびプローブは、より低い温
度においてより制い塩緩衝液中で融解（変性）される。
ばデハイプリダイゼーショ７法の終り付近で標的ＤＮＡ
含有試料に加えられた。デハイプリダイゼーションの最
後に、ハイブリダイゼーションのための塩および緩衝剤
の所望濃度を達成すべく、濃厚塩緩衝液を加えた。比較
的小さいオリゴマー標的およびプローブは、より低い温
度においてより制い塩緩衝液中で融解（変性）される。
通常のハイブリダイゼーションではＩＭのＮａＣ１が使
用されるが、ＤＮＡの融解温度を下げたい場合は１００
ｍＭのＮａＯ／ｌも使用できろ。その後、標的および
プローブの両方を宮む一本鎖試料はハイブリダイゼーシ
ョン＠度まで冷却させ、そして螢光団標識の相互作用の
程度を確かめるために螢光測定を行った。ハイブリダイ
ゼーション時間の長さは数分（高プローブＩａ夏の試料
の場合）から数時間（低濃度のプローブＤＮＡを含む試
料の場＠）まで変化した。
用されるが、ＤＮＡの融解温度を下げたい場合は１００
ｍＭのＮａＯ／ｌも使用できろ。その後、標的および
プローブの両方を宮む一本鎖試料はハイブリダイゼーシ
ョン＠度まで冷却させ、そして螢光団標識の相互作用の
程度を確かめるために螢光測定を行った。ハイブリダイ
ゼーション時間の長さは数分（高プローブＩａ夏の試料
の場合）から数時間（低濃度のプローブＤＮＡを含む試
料の場＠）まで変化した。
次の実施ｆ９１］は代表的な実験方法を説明するもので
あり、初めにプローブセグメントの３′末端標識化７示
し、次にプローブセグメントの５′末７８ Ｗ 識化を
示し、そして最後に末端標識生成物の競合的均質検定法
への応用について示す。
あり、初めにプローブセグメントの３′末端標識化７示
し、次にプローブセグメントの５′末７８ Ｗ 識化を
示し、そして最後に末端標識生成物の競合的均質検定法
への応用について示す。
−水銀ＤＮＡの３′末端は２工程反応で標識化した。第
１工程では、反応性官能基をもつ１個のヌクレオチドを
各ＤＮＡ ｇ７２の３′ヒドロキシル基に結合させるγ
こめに、ｒｙｒ素ＴｄＴ４使用した。第２工程は反応性
官能基との反応によって標識成分を各ＤＮＡ鎖に結合さ
せることを包含していた。
１工程では、反応性官能基をもつ１個のヌクレオチドを
各ＤＮＡ ｇ７２の３′ヒドロキシル基に結合させるγ
こめに、ｒｙｒ素ＴｄＴ４使用した。第２工程は反応性
官能基との反応によって標識成分を各ＤＮＡ鎖に結合さ
せることを包含していた。
仄の方法は１２塩基長のデオキシチミジン（ａ’ｒ、、
）の−重鎖ホモポリマー、それぞれ２０塩基長のホリ
テメキシアデノシンおよびポリデオキシチミジンの二本
鎖ホモポリマー（ｄＡ、ｏ−ａＴ、、） 。
）の−重鎖ホモポリマー、それぞれ２０塩基長のホリ
テメキシアデノシンおよびポリデオキシチミジンの二本
鎖ホモポリマー（ｄＡ、ｏ−ａＴ、、） 。
混合塩基合成オリゴマー、および酵素Ａ１ｕ Ｉお裏ヒ
ＨａθＩで消化されたネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子７ラグメントを貧むｐ ｓ ｐ ｂ ５の
プラスミドフラグメントを使用して行った。
ＨａθＩで消化されたネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子７ラグメントを貧むｐ ｓ ｐ ｂ ５の
プラスミドフラグメントを使用して行った。
今や第１工程をさらに詳しく見てみると、標準円錐形プ
ラスチック管の中で約１０ｎｍｏ１のＤＮＡを３．３
ｍＭ ＡＨＡ −ＡＴＰ水溶液２５．５μ２と混合し、
その試料を遠心Ｘ空装置（Ｓｐθｅｄ Ｖａｃ 、サバ
ント）で乾燥させた。ＤＮＡ／ＡＨＡ−ＡＴＰ浴故中の
ＡＨＡ −ＡＴＰ分子： ＤＮＡの３゛末端ヒドロキシ
ル基の比は約１０：１であつ１こ。ＤＮＡ、／ＡＨＡ−
ＡＴＰ溶液に、ＴｄＴ反応援′ｇＩｉ３０μ２、ウシ血
清アルブミン２０μｍ（水１ ｄ当たりウシ血清アルブ
ミン５００μｇ）、ＴａＴ ５００単泣、オヨび水を７
ｊｌｌえて７０μ２の反応混合物を得た。この反応湿分
物乞３７℃の水浴中で１８〜２４時間インキュベートさ
せた。
ラスチック管の中で約１０ｎｍｏ１のＤＮＡを３．３
ｍＭ ＡＨＡ −ＡＴＰ水溶液２５．５μ２と混合し、
その試料を遠心Ｘ空装置（Ｓｐθｅｄ Ｖａｃ 、サバ
ント）で乾燥させた。ＤＮＡ／ＡＨＡ−ＡＴＰ浴故中の
ＡＨＡ −ＡＴＰ分子： ＤＮＡの３゛末端ヒドロキシ
ル基の比は約１０：１であつ１こ。ＤＮＡ、／ＡＨＡ−
ＡＴＰ溶液に、ＴｄＴ反応援′ｇＩｉ３０μ２、ウシ血
清アルブミン２０μｍ（水１ ｄ当たりウシ血清アルブ
ミン５００μｇ）、ＴａＴ ５００単泣、オヨび水を７
ｊｌｌえて７０μ２の反応混合物を得た。この反応湿分
物乞３７℃の水浴中で１８〜２４時間インキュベートさ
せた。
セルロース粒子ＶＣ固定した相補的ホモポリマーに上記
ホモポリマーを１１）℃で結合させ、統いて結合緩衝液
を用いてそのセルロースを２０℃で洗浄することにより
、ｒｉｍ ｈのホモポリマー矧乞未反応のＡＨＡ−ＡＴ
Ｐから分離した。次に、生成物を溶離して、ｐＨ９，３
の０．０５ Ｍホウ敢緩価液中にセルロース粒子から分
離した。
ホモポリマーを１１）℃で結合させ、統いて結合緩衝液
を用いてそのセルロースを２０℃で洗浄することにより
、ｒｉｍ ｈのホモポリマー矧乞未反応のＡＨＡ−ＡＴ
Ｐから分離した。次に、生成物を溶離して、ｐＨ９，３
の０．０５ Ｍホウ敢緩価液中にセルロース粒子から分
離した。
ホモポリマー二本鎖、混合塩基オリゴマー、および ５
Ｐ６５二本鎖プラスミド制限フラグメ／トはセファデッ
クスＧ−２５クロマトグラフイー媒質および水またはホ
ウ酸緩衝液での溶離を使用するゲル透過クロマトグラフ
ィー、あるいはバイオ−ラッド研究所で製造したＮＡＣ
Ｂ イオン交換カラムのようなイオン変換カラムによ
り未反応のＡＨＡ −ＡＴＰから分離した。
Ｐ６５二本鎖プラスミド制限フラグメ／トはセファデッ
クスＧ−２５クロマトグラフイー媒質および水またはホ
ウ酸緩衝液での溶離を使用するゲル透過クロマトグラフ
ィー、あるいはバイオ−ラッド研究所で製造したＮＡＣ
Ｂ イオン交換カラムのようなイオン変換カラムによ
り未反応のＡＨＡ −ＡＴＰから分離した。
第２工程では、−重鎖ホモポリマー、湿分塩基オリゴマ
ー、二本鎖ホモポリマー、または二本鎖プラスミド７ラ
グメ／トを−まとめにして考えると、ＡＨＡ −ＡＴＰ
と各ＤＮＡ鎖の３′末端との反応により形成された末端
アミンペキンルアミノーアデノシンの第一脂肪族アミノ
基に、アミン反応性螢光−が共有結合された。アミン反
応性螢光−にはスルホローダミン１０１（テキプ°スレ
ッド）、ビンンブタノエート、フルオレセイン、ニオシ
ンおよびエリトロシン、インチオシアネート誘導体、ス
ルホン酸クロリド、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルが含まれる。アミン反応性螢光−は適当な非
反応性可溶化溶剤に溶解され、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミジルビレ／ブタノエートハアセトンに、スルホロー
ダミン１０１スルホン酸クロリドはジメチルホルムアミ
ドに、そしてフルオＶセインイソチオシアネートはジメ
チルスルホキシドにそれぞれ溶解した。０，０１モルの
蛍光団溶液を、ＡＨＡ−ＡＭＰ結合ＤＮＡ鎖な営む０．
０５モルのホウｒ！Ｒ／水酸化ナトリウム緩衝液（］）
Ｈ９，３）に絶えず攪拌しながら滴下した。
ー、二本鎖ホモポリマー、または二本鎖プラスミド７ラ
グメ／トを−まとめにして考えると、ＡＨＡ −ＡＴＰ
と各ＤＮＡ鎖の３′末端との反応により形成された末端
アミンペキンルアミノーアデノシンの第一脂肪族アミノ
基に、アミン反応性螢光−が共有結合された。アミン反
応性螢光−にはスルホローダミン１０１（テキプ°スレ
ッド）、ビンンブタノエート、フルオレセイン、ニオシ
ンおよびエリトロシン、インチオシアネート誘導体、ス
ルホン酸クロリド、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルが含まれる。アミン反応性螢光−は適当な非
反応性可溶化溶剤に溶解され、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミジルビレ／ブタノエートハアセトンに、スルホロー
ダミン１０１スルホン酸クロリドはジメチルホルムアミ
ドに、そしてフルオＶセインイソチオシアネートはジメ
チルスルホキシドにそれぞれ溶解した。０，０１モルの
蛍光団溶液を、ＡＨＡ−ＡＭＰ結合ＤＮＡ鎖な営む０．
０５モルのホウｒ！Ｒ／水酸化ナトリウム緩衝液（］）
Ｈ９，３）に絶えず攪拌しながら滴下した。
ＡＨＡ−ＡＭＰ結合ＤＮＡ鎖に対して２０倍〜２００倍
モル過剰の反応性官能基を使用して、この反応を目的生
成物へと至らしめに０反応は１６〜２４時間続けた。反
応時ＩＩＩの終りに、螢光団傾詭化−水銀ホモボリマー
をマフイニテイクロマトグラフイーにエリ単離した。蛍
光団標識化され１こ二本鎖ホモポリマー、混合塩基オリ
ゴマー、およびグラスミドｐＳＰ ６５の制限フラグメ
ントはＮＡＣＳカラムまたは上記のようなゲル透過クロ
マトグラフィーにより単離した。蛍光団標識化された一
水銀ホモポリマー、混合塩基オリゴマー、二本鎖ホモポ
リマー、および二本鎖プラスミドフラグメントは水もし
くは納会緩衝液中に単離した。長期貯蔵のために、俊光
団標識化ＤＮＡ溶液は遠心真空濃縮器で濃縮乾固させ、
−２０℃で貯蔵した。
モル過剰の反応性官能基を使用して、この反応を目的生
成物へと至らしめに０反応は１６〜２４時間続けた。反
応時ＩＩＩの終りに、螢光団傾詭化−水銀ホモボリマー
をマフイニテイクロマトグラフイーにエリ単離した。蛍
光団標識化され１こ二本鎖ホモポリマー、混合塩基オリ
ゴマー、およびグラスミドｐＳＰ ６５の制限フラグメ
ントはＮＡＣＳカラムまたは上記のようなゲル透過クロ
マトグラフィーにより単離した。蛍光団標識化された一
水銀ホモポリマー、混合塩基オリゴマー、二本鎖ホモポ
リマー、および二本鎖プラスミドフラグメントは水もし
くは納会緩衝液中に単離した。長期貯蔵のために、俊光
団標識化ＤＮＡ溶液は遠心真空濃縮器で濃縮乾固させ、
−２０℃で貯蔵した。
上記の２工程３′末端標識法の別法として、ポリヌクレ
オチドは酵素ＴａＴを用いて螢光ヌクレオチドにより直
接標識化することができる。例えば、−水銀ホモポリマ
ー鎖はＡＨＡ−ＡＴＰを一本鎖ＤＮＡの３′末端に付加
する方法と同じ方法を用いて、その３′末端が蛍光団、
１．Ｎ６−ニテノアテノシン三リン（［（ＥＡＴＰ〕、
修飾ヌクレオチドでｖｉ４識化され１こ。
オチドは酵素ＴａＴを用いて螢光ヌクレオチドにより直
接標識化することができる。例えば、−水銀ホモポリマ
ー鎖はＡＨＡ−ＡＴＰを一本鎖ＤＮＡの３′末端に付加
する方法と同じ方法を用いて、その３′末端が蛍光団、
１．Ｎ６−ニテノアテノシン三リン（［（ＥＡＴＰ〕、
修飾ヌクレオチドでｖｉ４識化され１こ。
上記方法は表１に示すように一本鎖および二本鎖オリゴ
マーの３′末喝に位置づけられた螢光標識成分をもたら
した。
マーの３′末喝に位置づけられた螢光標識成分をもたら
した。
表１３′末端標識化ＤＮＡオリゴマー
ｄＴ、２ フルオレセインインナオシアネート
ｏ、８８ｄＴｕ フルオレセインインチオ
シアネート０．７２ｄＴＩ２ １ 、 Ｎ１１−ｘ
テノアデ／シン０．９５ｄＴ１２ １ 、Ｎ’
ｉｆ／７ｆ／シフ １．０（ｉＴ、、
エオシンイソチオシア不一ト１．１ｄＴ、、
エリトロシンインチオシアネート２．６ｄＴ２
ｏ エオシンイソチオシア２−ト１．９０．５′
−末端標識化 ＤＮＡの一水銀ホモポリマー、ＤＮＡの二本鎖ホモポリ
マー、およびプラスミドＤＮＡの制限フラグメントの５
′末路は２工程反応で４１ＩＩｍ化した第１工程では、
ＤＮＡ鎖の末ｙ４５”）ン酸基と反応性の二官能性有機
分子（５′リン酸基を標識成分に結合しつる）とをチュ
ー（Ｂ、 Ｃ，Ｆ、 Ｃｈｕ ）、ワール（Ｇ、 Ｍ、
Ｗａｈｌ ）お工びオーゲル（Ｌ、 Ｏｒｇθ１）。
ｏ、８８ｄＴｕ フルオレセインインチオ
シアネート０．７２ｄＴＩ２ １ 、 Ｎ１１−ｘ
テノアデ／シン０．９５ｄＴ１２ １ 、Ｎ’
ｉｆ／７ｆ／シフ １．０（ｉＴ、、
エオシンイソチオシア不一ト１．１ｄＴ、、
エリトロシンインチオシアネート２．６ｄＴ２
ｏ エオシンイソチオシア２−ト１．９０．５′
−末端標識化 ＤＮＡの一水銀ホモポリマー、ＤＮＡの二本鎖ホモポリ
マー、およびプラスミドＤＮＡの制限フラグメントの５
′末路は２工程反応で４１ＩＩｍ化した第１工程では、
ＤＮＡ鎖の末ｙ４５”）ン酸基と反応性の二官能性有機
分子（５′リン酸基を標識成分に結合しつる）とをチュ
ー（Ｂ、 Ｃ，Ｆ、 Ｃｈｕ ）、ワール（Ｇ、 Ｍ、
Ｗａｈｌ ）お工びオーゲル（Ｌ、 Ｏｒｇθ１）。
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 、
１１ （１８） 。
１１ （１８） 。
６５１３−６５２９（１９８３Ｊに記載の方法に従って
縮合させた。第２工程はＤＮＡ鎖／反厄性有機分子を標
識成分と反応させてプローブ鎖を形成させることを包含
する。
縮合させた。第２工程はＤＮＡ鎖／反厄性有機分子を標
識成分と反応させてプローブ鎖を形成させることを包含
する。
当分野で習熟した者は、多くの形の天然に存在するＤＮ
Ａがその５′末端でリン酸化されることを認めるであろ
う。非リン酸化ＤＮＡは酵素Ｔ４キナーゼを用いる初期
リン酸化工程を必要とし、この方法は当分野でよく知ら
れている。５’−ＤＮＡ末端標識システムについてのペ
セスダ・リサーチ研究所の製品カタログを谷照されたい
（ここに参照により引用される）。
Ａがその５′末端でリン酸化されることを認めるであろ
う。非リン酸化ＤＮＡは酵素Ｔ４キナーゼを用いる初期
リン酸化工程を必要とし、この方法は当分野でよく知ら
れている。５’−ＤＮＡ末端標識システムについてのペ
セスダ・リサーチ研究所の製品カタログを谷照されたい
（ここに参照により引用される）。
例えば、第１工程を詳細に説明すると、水溶性カルボジ
イミドの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミドを用いて、エチレンジアミンと、
−水銀ＤＮＡ、二本鎖ホモポリマーお裏び ５Ｐ６５プ
ラスミドの二本鎖制限フラグメントの末端５′リン酸基
とを縮合させた。
イミドの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミドを用いて、エチレンジアミンと、
−水銀ＤＮＡ、二本鎖ホモポリマーお裏び ５Ｐ６５プ
ラスミドの二本鎖制限フラグメントの末端５′リン酸基
とを縮合させた。
反応混合物は５０ｎｍｏｌのＤＮＡを５００ ｔｚｌｌ
の水に溶解し、０．５Ｍエチレンジアミン、０．２Ｍカ
ルボジイミドおよび０．２Ｍ２−（Ｎ−モルホリノ）−
二タンスルホン酸を含有する５００μＵの反応溶液（ｐ
Ｈ６，０に調整）と混せすることにより調整した。この
反応混合物を室温で１６〜２４時間攪拌した。
の水に溶解し、０．５Ｍエチレンジアミン、０．２Ｍカ
ルボジイミドおよび０．２Ｍ２−（Ｎ−モルホリノ）−
二タンスルホン酸を含有する５００μＵの反応溶液（ｐ
Ｈ６，０に調整）と混せすることにより調整した。この
反応混合物を室温で１６〜２４時間攪拌した。
エチレンジアミンと反応したＤＮＡの一水銀ホモポリマ
ーは１反応混合物に塩化ナトリウムを１モル濃度になる
まで加え、次にその混仕物をセルロースに固定した相補
的ホモポリマーを含むカラムに１０℃で通すことにより
精製した。その後カラムはＦＡ付緩衝液を用いて１０℃
で、矢に２０℃で洗浄した。エチレンジアミンと反応し
たＤＮＡホモポリマーは５０〜６５℃の温度でぞのカラ
ムに０．０５ＭホウｒＰＩ緩衝液を通すことにより回収
した。
ーは１反応混合物に塩化ナトリウムを１モル濃度になる
まで加え、次にその混仕物をセルロースに固定した相補
的ホモポリマーを含むカラムに１０℃で通すことにより
精製した。その後カラムはＦＡ付緩衝液を用いて１０℃
で、矢に２０℃で洗浄した。エチレンジアミンと反応し
たＤＮＡホモポリマーは５０〜６５℃の温度でぞのカラ
ムに０．０５ＭホウｒＰＩ緩衝液を通すことにより回収
した。
二本鎖ホモポリマー、混合塩基オリゴマーおよびプラス
ミドＤＮＡの制限フラグメ／トは、エチレンジアミンと
反応したＤＮＡをセファデックスＧ−２５カラムに通し
、ホウ酸／水酸化ナトリウム緩＠液で溶離することによ
り精製した。別の精製法は低塩、緩衝液中でエチレンジ
アミン反応ＤＮＡをバイオ−ラッドＮ ｆｉ−Ｃ８カラ
ムに結合させ、高塩緩衝液１１こは２．０Ｍ酢酸アンモ
ニウムで溶離することを包含する。２．０Ｍ酢酸アンモ
ニウムで溶離した試料は、遠心真空装置または凍結乾燥
益を用いて塩緩衝液を除去すべく乾燥させた。
ミドＤＮＡの制限フラグメ／トは、エチレンジアミンと
反応したＤＮＡをセファデックスＧ−２５カラムに通し
、ホウ酸／水酸化ナトリウム緩＠液で溶離することによ
り精製した。別の精製法は低塩、緩衝液中でエチレンジ
アミン反応ＤＮＡをバイオ−ラッドＮ ｆｉ−Ｃ８カラ
ムに結合させ、高塩緩衝液１１こは２．０Ｍ酢酸アンモ
ニウムで溶離することを包含する。２．０Ｍ酢酸アンモ
ニウムで溶離した試料は、遠心真空装置または凍結乾燥
益を用いて塩緩衝液を除去すべく乾燥させた。
第２工程では、反応性Ｍ機成分のエチレンジアミンと結
合したＤＮＡ鎖を反応性蛍光団とさらに反応させてプロ
ーブ鎖を製造し７：４ より詳細には、アミン反応性蛍
光団（インチオシアネー）［導体ｔｔこはＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル）を適当な非反応性可溶化溶
剤にｆｉ解した。エチレンジアミン反応ＤＮＡを含む０
．０５Ｍホウ酸緩衝液にｐＨ９，３で絶えず攪拌しなが
ら０．ＯＩＭ螢光蛍光団を滴下した。反応性蛍光団はこ
の反応を目的生成物へと至らせるために２０倍〜２００
倍モル過剰に加えた。反応は攪拌下に１６〜２４時間継
続した。
合したＤＮＡ鎖を反応性蛍光団とさらに反応させてプロ
ーブ鎖を製造し７：４ より詳細には、アミン反応性蛍
光団（インチオシアネー）［導体ｔｔこはＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル）を適当な非反応性可溶化溶
剤にｆｉ解した。エチレンジアミン反応ＤＮＡを含む０
．０５Ｍホウ酸緩衝液にｐＨ９，３で絶えず攪拌しなが
ら０．ＯＩＭ螢光蛍光団を滴下した。反応性蛍光団はこ
の反応を目的生成物へと至らせるために２０倍〜２００
倍モル過剰に加えた。反応は攪拌下に１６〜２４時間継
続した。
反応時間の終りに、５′−蛍光団ｇ脆化ＤＮＡ ｆｊ！
：濾過した。５′−蛍光団標識化ホモポリマーー水銀Ｄ
ＮＡはアフイニテイクロマトグラフイーにより単離した
。５′−螢光団係ａｉに化された二本鎖ＤＮＡ、混合塩
基オリゴマー、ｆたは標識グラスミド制限フラグメント
はＮ Ａ ＣＢカラムもしくはゲル透過クロマトグラフ
ィーにより単離した。５′−螢光団標鐵化二水銀ホモポ
リマーまたけグラスミド制限フラグメント（１丁その抜
水もしくは結合緩衝液中に単離した。５′−螢光団標隷
化一水銀ＤＮＡは下肥の表２に示される。
：濾過した。５′−蛍光団標識化ホモポリマーー水銀Ｄ
ＮＡはアフイニテイクロマトグラフイーにより単離した
。５′−螢光団係ａｉに化された二本鎖ＤＮＡ、混合塩
基オリゴマー、ｆたは標識グラスミド制限フラグメント
はＮ Ａ ＣＢカラムもしくはゲル透過クロマトグラフ
ィーにより単離した。５′−螢光団標鐵化二水銀ホモポ
リマーまたけグラスミド制限フラグメント（１丁その抜
水もしくは結合緩衝液中に単離した。５′−螢光団標隷
化一水銀ＤＮＡは下肥の表２に示される。
表２５′−末端標識化Ｄ Ｎ ＡオリゴマーｄＡ、□
フルオレセインインチオシアネート０．８９ｄ
Ａ、２ フルオレセインインチオシアネートＵ、
９すａ Ａ ９０ フルオレセインインチオシ
アネート１．１ｄ（ＡＣ）、 フルオレセインイ
ンチオシアネート０．５９ｄ（ＡＣ，）、 フル
オＶセインイソチオシア坏−ト０．９０り ’ 末Ａｍ
４！ｇ４肺化ホモポリマープローブ鎖は相補的な３′
末緬ホモポリマー釧と結付して、二本＠（−万の鎖の３
′−標識成分が他方の鎖の５′−１票識成分と相互作用
する位置にめる）を杉成することができろ。５′−およ
び３′−ホモポリマー二本鎖およびプラスミド制限フラ
グメントに、２本の末端標識化相補的ポリヌクＶオチド
プローブ鎖を宮む。
フルオレセインインチオシアネート０．８９ｄ
Ａ、２ フルオレセインインチオシアネートＵ、
９すａ Ａ ９０ フルオレセインインチオシ
アネート１．１ｄ（ＡＣ）、 フルオレセインイ
ンチオシアネート０．５９ｄ（ＡＣ，）、 フル
オＶセインイソチオシア坏−ト０．９０り ’ 末Ａｍ
４！ｇ４肺化ホモポリマープローブ鎖は相補的な３′
末緬ホモポリマー釧と結付して、二本＠（−万の鎖の３
′−標識成分が他方の鎖の５′−１票識成分と相互作用
する位置にめる）を杉成することができろ。５′−およ
び３′−ホモポリマー二本鎖およびプラスミド制限フラ
グメントに、２本の末端標識化相補的ポリヌクＶオチド
プローブ鎖を宮む。
多数の二本鎖プローブ（ｄまた大腸菌エンテロトキノン
遺伝子の名成りＮＡから作ることができる。
遺伝子の名成りＮＡから作ることができる。
オリゴマーの相補対を合成して、その後［Ａ’ｔ＆した
。
。
大腸画工／テロトキシン／遺伝子のゲノム上の５つの異
なる領域に対応する塩基配列をもつ５対のオリゴマーを
製造した。４対は２１塩基長のオリゴマーを含み、１対
は２２塩基長のオリゴマーを含んでいた。１０の一水銀
オリゴマーは標識するために２群に分けた。１群はそれ
ぞれの相補対の一員を含み、他群は他の対質を含んでい
た。ターミナルトランスフェラーゼ反応混付物中にハイ
ブリダイズしたＤＮＡを避けるために、非相補鎖同士を
１つの群に集めた。末メ、櫨ヌクレオチドの酵素付加は
、平滑末瑣の二本鎖ＤＮＡ プライマー？：便用する場
合にあまり効率がよくない。この方法の標識効率は先の
二本鎖プローブ製造のときに得られたものほど高くなか
ったが、ハイプリダイセーションに関連する螢光の変化
は相当に低いプローブ濃度でそれを検出するのに士分な
ほど大きかった。
なる領域に対応する塩基配列をもつ５対のオリゴマーを
製造した。４対は２１塩基長のオリゴマーを含み、１対
は２２塩基長のオリゴマーを含んでいた。１０の一水銀
オリゴマーは標識するために２群に分けた。１群はそれ
ぞれの相補対の一員を含み、他群は他の対質を含んでい
た。ターミナルトランスフェラーゼ反応混付物中にハイ
ブリダイズしたＤＮＡを避けるために、非相補鎖同士を
１つの群に集めた。末メ、櫨ヌクレオチドの酵素付加は
、平滑末瑣の二本鎖ＤＮＡ プライマー？：便用する場
合にあまり効率がよくない。この方法の標識効率は先の
二本鎖プローブ製造のときに得られたものほど高くなか
ったが、ハイプリダイセーションに関連する螢光の変化
は相当に低いプローブ濃度でそれを検出するのに士分な
ほど大きかった。
二本鎖ホモポリマー、プラスミド制限フラグメントおよ
びトキシン遺伝子プローブは下記の表３に示される。
びトキシン遺伝子プローブは下記の表３に示される。
今や表３を参照すると、ホモポリマー二本鎖。
混合塩基オリゴマー、およびプラスミド制限フラグメン
トはそれぞれの各類の３′末端および５′末端の両方に
標識を含む。表１．２お工び３は二本鎖当たりの標識ま
たは一水銀当たりの標識を、標識化反応の効率の表示と
して含む。プローブ当たりの標識の数は吸光分光分析法
により測定した。
トはそれぞれの各類の３′末端および５′末端の両方に
標識を含む。表１．２お工び３は二本鎖当たりの標識ま
たは一水銀当たりの標識を、標識化反応の効率の表示と
して含む。プローブ当たりの標識の数は吸光分光分析法
により測定した。
相補的プローブ鎖の４ｆｉ識成分は、それらのプローブ
が互いに結付した位置にあるとき、第５白にグラフで示
すように相互作用することができる。
が互いに結付した位置にあるとき、第５白にグラフで示
すように相互作用することができる。
第５図は温度がハイブリダイズしたプローブの融解温度
に関して変化するときの温度に対する螢光放出の関係を
示している。プローブはそれぞれ１２塩基艮のデオキシ
アデノシンとデオキシチミジンのホモポリマー二本鎖で
あり、５′−フルオレセイン゛ト３′−スルホロ〜ダミ
ンのｇｍ群’を含む。
に関して変化するときの温度に対する螢光放出の関係を
示している。プローブはそれぞれ１２塩基艮のデオキシ
アデノシンとデオキシチミジンのホモポリマー二本鎖で
あり、５′−フルオレセイン゛ト３′−スルホロ〜ダミ
ンのｇｍ群’を含む。
図示するように、中実の円および三角形はプローブ含有
試料の温度が降下しつつあるときに得られた値を表わす
。中空の円および三角形はプローブ含有試料の温度が上
昇しつつあるときに得られπ値を示す。三角形によって
示された点は螢光放出の温度消光についての補正値を表
わす。円によって示された点は実際値を表わす。
試料の温度が降下しつつあるときに得られた値を表わす
。中空の円および三角形はプローブ含有試料の温度が上
昇しつつあるときに得られπ値を示す。三角形によって
示された点は螢光放出の温度消光についての補正値を表
わす。円によって示された点は実際値を表わす。
より詳細には、第５図の＠解曲線データは、ｌＮＮａＣ
１および０．（１２）Ｎす／酸カリウムからなる緩衝液
（ｐＨ７，５）中のＤＮＡ Ｅ料について記録したもの
である。第５図にプロットしたデータは等モル１ｌ（０
，１μＭ）の５′−フルオレセイ７− ｄＡ、。
１および０．（１２）Ｎす／酸カリウムからなる緩衝液
（ｐＨ７，５）中のＤＮＡ Ｅ料について記録したもの
である。第５図にプロットしたデータは等モル１ｌ（０
，１μＭ）の５′−フルオレセイ７− ｄＡ、。
おＪ、 ヒｄＴ、ｔ−スルホローダミ／−３′を混合し
、多くの試料温度での試料の平衡化の後に螢光放出を測
定することにより得た。また螢光放出に対する温度の影
響を調べるために、５′−フルオレセイン−ｄＡ、、単
独の螢光を同一温度で測定した。５′−フルオレセイン
−ｄＡ、！単独測定からのデータは２穐のプローブ試料
について記録されＦ融解曲線を補正するｋめに使用した
。補正データおよび未補正データの両方をプロットした
。
、多くの試料温度での試料の平衡化の後に螢光放出を測
定することにより得た。また螢光放出に対する温度の影
響を調べるために、５′−フルオレセイン−ｄＡ、、単
独の螢光を同一温度で測定した。５′−フルオレセイン
−ｄＡ、！単独測定からのデータは２穐のプローブ試料
について記録されＦ融解曲線を補正するｋめに使用した
。補正データおよび未補正データの両方をプロットした
。
プローブを冷却して再アニーリングするとき、螢光放出
が抑制されて螢光信号強度の減少が生じる。プローブを
融解温度または変性温度に加熱すろとき、プローブは分
離して標識成分同士の相互作用がなくなる。螢光放出は
もはや抑制されず、螢光放出が増大する。
が抑制されて螢光信号強度の減少が生じる。プローブを
融解温度または変性温度に加熱すろとき、プローブは分
離して標識成分同士の相互作用がなくなる。螢光放出は
もはや抑制されず、螢光放出が増大する。
第５図に示す標識成分の相互作用は、ＤＮＡハイブリダ
イゼーションを溶液中で測定するための慣用方法で測定
した”非ｖＡ識”プローブの融解温度データと一致する
。第６図は温度が非標識プローブの融解温度により変化
するときの温度と、２６０ ｎＭでの光エネルギーの吸
光度と、の関係をグラフによって示している。第６図に
示すプローブは１２塩基長のデオキシアデノシンおよび
デオキシチミジンのホモポリマーを含む。中実の円で示
したグラフの点は試料の温度が降下しつつあるときに読
み取ったものである。中空の円は試料の温度が上昇しつ
つあるときに読み取ったものである。プローブの温度が
プローブの融解温度により変化するにつれて、２６０
ｎＭでの吸光度は塩基対合の減少が原因で約０．１３５
から約０．ｊ８２まで増加した。吸光度測定によって得
られた非標識ＤＮＡの融解温度は、螢光団の相互作用に
より測定した標識ＤＮＡ の融解温度と１ｍ＋じであり
、このことはＤＮＡの標識化がハイブリダイゼーション
過程を妨害しないことを示している。
イゼーションを溶液中で測定するための慣用方法で測定
した”非ｖＡ識”プローブの融解温度データと一致する
。第６図は温度が非標識プローブの融解温度により変化
するときの温度と、２６０ ｎＭでの光エネルギーの吸
光度と、の関係をグラフによって示している。第６図に
示すプローブは１２塩基長のデオキシアデノシンおよび
デオキシチミジンのホモポリマーを含む。中実の円で示
したグラフの点は試料の温度が降下しつつあるときに読
み取ったものである。中空の円は試料の温度が上昇しつ
つあるときに読み取ったものである。プローブの温度が
プローブの融解温度により変化するにつれて、２６０
ｎＭでの吸光度は塩基対合の減少が原因で約０．１３５
から約０．ｊ８２まで増加した。吸光度測定によって得
られた非標識ＤＮＡの融解温度は、螢光団の相互作用に
より測定した標識ＤＮＡ の融解温度と１ｍ＋じであり
、このことはＤＮＡの標識化がハイブリダイゼーション
過程を妨害しないことを示している。
標識成分の相互作用はまた表３および表４に示される。
表３は非ハイブリッド形に対するハイブリッド形の標識
ホモポリマー複合体およびプラスミド制限７ラグメント
の螢光強度の比較を含む。
ホモポリマー複合体およびプラスミド制限７ラグメント
の螢光強度の比較を含む。
ハイブリダイズしたプローブの信号に対するハイブリダ
イズしなかったプローブの信号の比は４．１程度に高い
こともろり得ろ。
イズしなかったプローブの信号の比は４．１程度に高い
こともろり得ろ。
表４はハイブリダイズしたａ＆ｉｔプローブに対するハ
イブリダイズしなかっり標識プローブの螢光強度の比較
を示す。
イブリダイズしなかっり標識プローブの螢光強度の比較
を示す。
表３および表４において、螢光の変化はハイブリダイゼ
ーション条件下で観察された螢光に対する非ハイブリッ
ド状態の一部ま１こは両方の標識の蛍光の比として表わ
される。データはハイブリダイゼーション状態を選択す
るために温度を使用した実験；相補的プローブを一緒に
、その後単独で試験した実験；ま１こはプローブのハイ
ブリダイゼーションを大過剰（通常１０倍またはそれ以
上」の非疹飾相袖ＤＮＡの存在または不在下で行った実
験−のいずれかから得られた。後者の実験において、大
過剰の標的ＤＮＡは相補的ＤＮＡプローブ向士が互いに
ハイブリダイズすることを妨げる競脅的ハイプリダイゼ
ーショ／反応をもたラ−ｉ。
ーション条件下で観察された螢光に対する非ハイブリッ
ド状態の一部ま１こは両方の標識の蛍光の比として表わ
される。データはハイブリダイゼーション状態を選択す
るために温度を使用した実験；相補的プローブを一緒に
、その後単独で試験した実験；ま１こはプローブのハイ
ブリダイゼーションを大過剰（通常１０倍またはそれ以
上」の非疹飾相袖ＤＮＡの存在または不在下で行った実
験−のいずれかから得られた。後者の実験において、大
過剰の標的ＤＮＡは相補的ＤＮＡプローブ向士が互いに
ハイブリダイズすることを妨げる競脅的ハイプリダイゼ
ーショ／反応をもたラ−ｉ。
同じ標識オリゴマーの異なる製法を試験したプローブ対
については、螢光変化の複数の値が記入されている。表
４はオリゴマーの単一標識化によって作られ１こプロー
ブを便って得られたデータを含む、これらのプローブの
組成は表１および表２に載っている。表３のデータは第
１螢光団が各オリゴマーの５′末端にあり且つ第２螢光
団が３′末端にあるように標識さｎたプローブから誘導
される。ハイブリダイゼーション条件において、−万の
鎖の５′第１栄光団が相補鎖の３′第２螢元団ときわめ
て接近する。
については、螢光変化の複数の値が記入されている。表
４はオリゴマーの単一標識化によって作られ１こプロー
ブを便って得られたデータを含む、これらのプローブの
組成は表１および表２に載っている。表３のデータは第
１螢光団が各オリゴマーの５′末端にあり且つ第２螢光
団が３′末端にあるように標識さｎたプローブから誘導
される。ハイブリダイゼーション条件において、−万の
鎖の５′第１栄光団が相補鎖の３′第２螢元団ときわめ
て接近する。
表３および表４は２つの＋ｉ４識の少なくとも１つの螢
光に有意な変化が生じる数種の標識の組合せを示す。フ
ォルスター（Ｆｏｒｓｔｅｒ ） ｉ工事ルキー転移機
構では、比較的長い波長の光を吸収および放射する標識
は、その標識の励起の際に他の標識（エネルギー供与体
）からのエネルギーを受けとることが予期される。その
標識が螢光である＠台、これはエネルギー受容標識から
の発光の増加に伴って起こるエネルギー供与標識からの
発光の減少をもたらす。この機構に適合しつる挙動を示
す標識の組合せはフルオレセイン／スルホローダミン１
０１、アクリジン／スルホローダミン゛１ｏ１、フルオ
レセイン／エテノブテノシン、フルオレセイン／エオシ
ンおよびフルオレセイン／エリトロシンで必る。
光に有意な変化が生じる数種の標識の組合せを示す。フ
ォルスター（Ｆｏｒｓｔｅｒ ） ｉ工事ルキー転移機
構では、比較的長い波長の光を吸収および放射する標識
は、その標識の励起の際に他の標識（エネルギー供与体
）からのエネルギーを受けとることが予期される。その
標識が螢光である＠台、これはエネルギー受容標識から
の発光の増加に伴って起こるエネルギー供与標識からの
発光の減少をもたらす。この機構に適合しつる挙動を示
す標識の組合せはフルオレセイン／スルホローダミン１
０１、アクリジン／スルホローダミン゛１ｏ１、フルオ
レセイン／エテノブテノシン、フルオレセイン／エオシ
ンおよびフルオレセイン／エリトロシンで必る。
しかしながら、表３および表４はフォルスター型機構に
従って行動しないいくつかの相互作用ヲ示す。フォルス
ター型エネルギー転移機構と一致しない挙動を示す標識
の組合せはフルオレセイン／ピレンブタノエートおよび
フルオレセイン／アクリジンである。
従って行動しないいくつかの相互作用ヲ示す。フォルス
ター型エネルギー転移機構と一致しない挙動を示す標識
の組合せはフルオレセイン／ピレンブタノエートおよび
フルオレセイン／アクリジンである。
たとえいくつかの標識組合せが７オルスター型エネルギ
ー転移の典型的な行動を示すとしても、相互作用のメカ
ニズムは２つの＊ｍの一部だけから収集されたデータか
らは確認することができない。試験した標識組合せにお
いて、標識対の他方の一員はＤＮＡに結合したとき奉賀
的に非螢光性であるか、あるいはハイブリダイゼーショ
ンの状態にほとんど影響を受け“ない螢光を示した。標
識の相互作用の仕方の不確かさは、２つの標識分子を互
いの衝突距離内にもたらす能力の結果である。
ー転移の典型的な行動を示すとしても、相互作用のメカ
ニズムは２つの＊ｍの一部だけから収集されたデータか
らは確認することができない。試験した標識組合せにお
いて、標識対の他方の一員はＤＮＡに結合したとき奉賀
的に非螢光性であるか、あるいはハイブリダイゼーショ
ンの状態にほとんど影響を受け“ない螢光を示した。標
識の相互作用の仕方の不確かさは、２つの標識分子を互
いの衝突距離内にもたらす能力の結果である。
衝突による相互作用が可能である場合、動的消光のいろ
いろな機構が親会して、観察される相互作用を支配しつ
る。接近した範囲の動的相互作用はまた静的相互作用よ
りも実際上Ｗｊ著でるると思われる。
いろな機構が親会して、観察される相互作用を支配しつ
る。接近した範囲の動的相互作用はまた静的相互作用よ
りも実際上Ｗｊ著でるると思われる。
表３および表４に示したいくつかの螢光変化は、タンパ
ク質分子（すなわち抗体および／ま１こはタンパク質抗
原）のランダムｍ誠化を当てにして両方または一部の標
識物質を作らねばならない消光／エネルギー転位に基づ
くイムノアッセイにおいて観察されたものよりも大きい
。従って、抗原：抗体複合体では標識のほんの少しの画
分のみが互いとの静的または動的相互作用にとって適し
た位置にあるかも知れない。−万、ＤＮＡ末端の選択的
標識化は相対する標識の正確な位置づけｔ可能にし、そ
れ故にハイブリダイズしたプローブ鎖の全ての標識によ
って衝突の相互作用が可能となり、また静的な相互作用
が強められる。
ク質分子（すなわち抗体および／ま１こはタンパク質抗
原）のランダムｍ誠化を当てにして両方または一部の標
識物質を作らねばならない消光／エネルギー転位に基づ
くイムノアッセイにおいて観察されたものよりも大きい
。従って、抗原：抗体複合体では標識のほんの少しの画
分のみが互いとの静的または動的相互作用にとって適し
た位置にあるかも知れない。−万、ＤＮＡ末端の選択的
標識化は相対する標識の正確な位置づけｔ可能にし、そ
れ故にハイブリダイズしたプローブ鎖の全ての標識によ
って衝突の相互作用が可能となり、また静的な相互作用
が強められる。
表３および表４のデータはま１こ標識をＤＮＡに結合さ
せる方法を適切に選択することの必要性を指摘している
。フルオレセインが３′末端にあり且つピレンブタノエ
ートが５′末緬にある実施１利の場合は、標識の相互作
用がたとえめったとしてもほとんど観察されず、−万フ
ルオレセインが５′米綱にあり且つピレンが３′末錫に
ある場合は相当な相互作用が検出される。これは制限酵
素で消化したプラスミドＤＮＡばかりでなくホモポリマ
ーオリゴマーにも観察された。標識の配置の相違は２つ
の別々の末癩に標識を結合させる際に使用した異なる化
学に関係しており、３′−ｍ＋ＷＲはアミンへキシルア
ミノアデノシンリンカ−を介してｒ会されるが、５’−
ａｊｆ＆はエチレンジアミンリンカ−を介シて結付され
た、 本発明の試薬プローブは競合的ＤＮＡ検定に応用した。
せる方法を適切に選択することの必要性を指摘している
。フルオレセインが３′末端にあり且つピレンブタノエ
ートが５′末緬にある実施１利の場合は、標識の相互作
用がたとえめったとしてもほとんど観察されず、−万フ
ルオレセインが５′米綱にあり且つピレンが３′末錫に
ある場合は相当な相互作用が検出される。これは制限酵
素で消化したプラスミドＤＮＡばかりでなくホモポリマ
ーオリゴマーにも観察された。標識の配置の相違は２つ
の別々の末癩に標識を結合させる際に使用した異なる化
学に関係しており、３′−ｍ＋ＷＲはアミンへキシルア
ミノアデノシンリンカ−を介してｒ会されるが、５’−
ａｊｆ＆はエチレンジアミンリンカ−を介シて結付され
た、 本発明の試薬プローブは競合的ＤＮＡ検定に応用した。
このハイブリダイゼーション法は５′−フルオレセイン
−ｄＡ、、およびｄＴ Ｈ２−スルホローダミン−３′
ホモポリマーを含むプローブに特徴的である。
−ｄＡ、、およびｄＴ Ｈ２−スルホローダミン−３′
ホモポリマーを含むプローブに特徴的である。
第７図を参照されたい。ここではプローブと標的ＤＮＡ
の溶液が混合された。プローブの濃度は０．１μＭに定
め、標的濃度はゼロから０．５μＭの間で変えに０プロ
ーブは標的ＤＮＡ 、十分量の水２よび緩衝液（ｐＨ７
，５で１６０Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１〜０．（
１２）Ｍ−塩基性リン酸カリウムの最終濃度を与えろ）
と混合してハイブリダイゼーション溶液を調製した。こ
の溶液な水浴中６５℃で１５分間加熱して、標的とプロ
ーブＤＮＡの完全なデハイプリダイゼーションを行った
。
の溶液が混合された。プローブの濃度は０．１μＭに定
め、標的濃度はゼロから０．５μＭの間で変えに０プロ
ーブは標的ＤＮＡ 、十分量の水２よび緩衝液（ｐＨ７
，５で１６０Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１〜０．（
１２）Ｍ−塩基性リン酸カリウムの最終濃度を与えろ）
と混合してハイブリダイゼーション溶液を調製した。こ
の溶液な水浴中６５℃で１５分間加熱して、標的とプロ
ーブＤＮＡの完全なデハイプリダイゼーションを行った
。
次に試料を２時間かけて１０℃へと冷却させ、競合的ハ
イブリダイゼーションを起こさせた。
イブリダイゼーションを起こさせた。
第７図はフルオＶセインインチオシアネート（フルオン
セイ／）で標識化したデオキシアデノシンホモポリマー
およびスルホローダミン゛スルホン酸クロリド（スルホ
ローダミン）でａｌｉ＆化したデオキシテミジンホモポ
リマー（各々１２塩基長）からなる一定ａ度の１０″″
７モル二本船プローブン含むいろいろな濃度の標的鎖に
ついての、螢光強度（相対単位）対波長の関係をグラフ
により示している。全ての試料は３００ ｎｍの光エネ
ルギーを照射した。
セイ／）で標識化したデオキシアデノシンホモポリマー
およびスルホローダミン゛スルホン酸クロリド（スルホ
ローダミン）でａｌｉ＆化したデオキシテミジンホモポ
リマー（各々１２塩基長）からなる一定ａ度の１０″″
７モル二本船プローブン含むいろいろな濃度の標的鎖に
ついての、螢光強度（相対単位）対波長の関係をグラフ
により示している。全ての試料は３００ ｎｍの光エネ
ルギーを照射した。
約５２０ｎｍの波長でのピーク螢光強度は、１２塩基長
のデオキシアデノシンおよびデオキシチミジンの標的ホ
モポリマーのａ層変化にエリ変化する。
のデオキシアデノシンおよびデオキシチミジンの標的ホ
モポリマーのａ層変化にエリ変化する。
第８図は標的濃度に対する螢光放出の関係を示す。第８
図のグラフの点は一定濃度のプローブを使用した第７図
のグラフのピーク値である。標的濃度が増すにつれて、
スルホローダミンによる螢光消滅度が低下して螢光放出
が増大する。
図のグラフの点は一定濃度のプローブを使用した第７図
のグラフのピーク値である。標的濃度が増すにつれて、
スルホローダミンによる螢光消滅度が低下して螢光放出
が増大する。
５１−フルオレセインーｄＡ＋ｔ ／ ｄＴ＋ｔ−ピレ
ンブタノエート−３′系について先に示したハイブリダ
イゼーションデータは、相互作用する標識に基づいた競
合的ＤＮＡハイブリダイゼーション検定の概念を説明す
る上で役に立った。しかしながら、有用な検定系である
ためには、この方法が特異的であり且つ感度が浚れてい
ることを示さねばならない。
ンブタノエート−３′系について先に示したハイブリダ
イゼーションデータは、相互作用する標識に基づいた競
合的ＤＮＡハイブリダイゼーション検定の概念を説明す
る上で役に立った。しかしながら、有用な検定系である
ためには、この方法が特異的であり且つ感度が浚れてい
ることを示さねばならない。
第９〜１２図のデータは標識の相互作用に基づく検定法
のこれらの面を立証するのに役立つ。標識の特異性は表
３に示した最初のｃＬＡ２゜： ｄＴ、。
のこれらの面を立証するのに役立つ。標識の特異性は表
３に示した最初のｃＬＡ２゜： ｄＴ、。
誘導二本鎖プローブを使ってｐ、９図に示される。
この実験では、５０℃Ｍプローブ浴液といろいろな濃度
の３つの異なる標的ＤＮＡ とｔ水中で混合した。１つ
の標的は等モル債のｄＡ２ｏおよびｄＴ、ｏがら成って
おり、これはプローブとのハイブリダイゼーションにふ
されしい標的でめった。
の３つの異なる標的ＤＮＡ とｔ水中で混合した。１つ
の標的は等モル債のｄＡ２ｏおよびｄＴ、ｏがら成って
おり、これはプローブとのハイブリダイゼーションにふ
されしい標的でめった。
２つの非相補標的はクシ胸ＦＲＤＮＡとラムダファージ
ＤＮＡであった。試料は沸騰水浴中で６分間加熱し、そ
の後室温まで冷却させた。次いで試料を２１Ｍｍ結合緩
衝液で半分に希釈して、ｐＨ７，５においてそれぞれ１
００ ｍＭと１０ｍＭの最終Ｍａｉｌおよびリン酸カリ
ウムｍ度を得た。その直後に室温での螢光スペクトルを
各試料について記録した。
ＤＮＡであった。試料は沸騰水浴中で６分間加熱し、そ
の後室温まで冷却させた。次いで試料を２１Ｍｍ結合緩
衝液で半分に希釈して、ｐＨ７，５においてそれぞれ１
００ ｍＭと１０ｍＭの最終Ｍａｉｌおよびリン酸カリ
ウムｍ度を得た。その直後に室温での螢光スペクトルを
各試料について記録した。
第９図にプロットした螢光強度データは、正しい標的Ｄ
ＮＡ （ｄＡ２゜： ｄＴ、。）を使用した場合に、予
測された濃度依存性の競合的ハイブリダイゼーション挙
動を示す。標的ＤＮＡ濃度は異なる分子量の標的を使用
したので塩基対に換算してプロットした。各試料中に営
まれる標識二本鎖プローブの対応する環基対濃度は１μ
Ｍ （５０ｎＭ二本水銀ローブ〕でめった。約１．２μ
Ｍの（ＬＡ、、 ： ｄＴ、。
ＮＡ （ｄＡ２゜： ｄＴ、。）を使用した場合に、予
測された濃度依存性の競合的ハイブリダイゼーション挙
動を示す。標的ＤＮＡ濃度は異なる分子量の標的を使用
したので塩基対に換算してプロットした。各試料中に営
まれる標識二本鎖プローブの対応する環基対濃度は１μ
Ｍ （５０ｎＭ二本水銀ローブ〕でめった。約１．２μ
Ｍの（ＬＡ、、 ： ｄＴ、。
（１μＭの値に近い〕のところで生じた螢光変化の中間
点は、相補標的鎖が相補プローブ鎖に対してもつのと同
じ親和性を互いに対して有する競合的ハイブリダイゼー
ションを予期させた。非相補的標的ＤＮＡ （ウシ胸
腺ＤＮＡ とラムダＤＮＡ ）を使って集めたデータは
、過剰の非相補的ＤＮＡが相補的プローブ鎖同志のハイ
ブリダイゼーションを妨げなかつ尾ので、プローブがｄ
Ａｔｏ ：ｄＴ、。標的ＤＮＡに対して特異的であるこ
とを示した。
点は、相補標的鎖が相補プローブ鎖に対してもつのと同
じ親和性を互いに対して有する競合的ハイブリダイゼー
ションを予期させた。非相補的標的ＤＮＡ （ウシ胸
腺ＤＮＡ とラムダＤＮＡ ）を使って集めたデータは
、過剰の非相補的ＤＮＡが相補的プローブ鎖同志のハイ
ブリダイゼーションを妨げなかつ尾ので、プローブがｄ
Ａｔｏ ：ｄＴ、。標的ＤＮＡに対して特異的であるこ
とを示した。
ハイプリダイゼーショ／検定の感度は、比較的低いプロ
ーブ濃度で競合的ハイブリダイゼーションを行うことに
より証明した。５００ ｐＭ、５０ｐＭおよび５ ｐＭ
＃度の標識ｄＡ、。： ｄＴ、。プローブを用いり競合
的ハイプリグイゼーショ／から得られたデータを第１０
図に示す。これらの実施では、７”ｏ−プと標的ＤＮＡ
ト’？： ｐＨ７，５の１００ｍＭＮａｃ１および１
０ ｍＭリン酸カリウムを含む緩衝液中で湿分した。次
いで試料を８０℃で１０分間加熱し、その後５度／時間
の割合で２０℃まで低下させた。これはコンピュータ制
御水浴を使って行った。螢光放出は２０℃で各試料につ
いて測定した。標的濃度の関数としての螢光放出強度の
特徴的なＳ字状依存がそれぞれのプローブ濃度で観察さ
れ、そして螢光強度変化の中間点はより低いプローブ濃
度を使用する検定に対してより低い標的ａ度で生じた。
ーブ濃度で競合的ハイブリダイゼーションを行うことに
より証明した。５００ ｐＭ、５０ｐＭおよび５ ｐＭ
＃度の標識ｄＡ、。： ｄＴ、。プローブを用いり競合
的ハイプリグイゼーショ／から得られたデータを第１０
図に示す。これらの実施では、７”ｏ−プと標的ＤＮＡ
ト’？： ｐＨ７，５の１００ｍＭＮａｃ１および１
０ ｍＭリン酸カリウムを含む緩衝液中で湿分した。次
いで試料を８０℃で１０分間加熱し、その後５度／時間
の割合で２０℃まで低下させた。これはコンピュータ制
御水浴を使って行った。螢光放出は２０℃で各試料につ
いて測定した。標的濃度の関数としての螢光放出強度の
特徴的なＳ字状依存がそれぞれのプローブ濃度で観察さ
れ、そして螢光強度変化の中間点はより低いプローブ濃
度を使用する検定に対してより低い標的ａ度で生じた。
最も低いプローブ濃度（５ｐＭプローブ）を使用する検
定の場合は、螢光変化の中間点が約２０ ｐＭ標的だっ
た。これらの実験で使用した試料は、標準セミミクロ螢
光キュベツトを使用したので１−の容量でめった。これ
は”ｌ Ｑ ｆｎｎｏｌθの標的ＤＮＡに相当しＴこ。
定の場合は、螢光変化の中間点が約２０ ｐＭ標的だっ
た。これらの実験で使用した試料は、標準セミミクロ螢
光キュベツトを使用したので１−の容量でめった。これ
は”ｌ Ｑ ｆｎｎｏｌθの標的ＤＮＡに相当しＴこ。
他の技法によるＤＮＡハイブリグイゼーションはしばし
ば１０１ａｌｌ程度の容量を使用して行われる。同様の
容量の使用なＯＴ能にする螢光計のために試料用セルを
工夫することができ、その結果螢光変化の中間点につい
ては２００ ａｍｏｌｅへと約１００倍の感度の増加を
もたらすであろう。この実験では５ｐＭプローブを使用
する最大螢光変化が緩衝液の螢光とほぼ１ｎ゛」じ大き
さであるので、感度の大きい増加はプローブ濃度をこれ
以上低下させても期待されない。換言すれば、信号対ノ
イズの比は１に等しかった。緩衝液のバックグラウンド
は第１０図に示すデータから差し引かれる。
ば１０１ａｌｌ程度の容量を使用して行われる。同様の
容量の使用なＯＴ能にする螢光計のために試料用セルを
工夫することができ、その結果螢光変化の中間点につい
ては２００ ａｍｏｌｅへと約１００倍の感度の増加を
もたらすであろう。この実験では５ｐＭプローブを使用
する最大螢光変化が緩衝液の螢光とほぼ１ｎ゛」じ大き
さであるので、感度の大きい増加はプローブ濃度をこれ
以上低下させても期待されない。換言すれば、信号対ノ
イズの比は１に等しかった。緩衝液のバックグラウンド
は第１０図に示すデータから差し引かれる。
検定感度の増加を可能にする１つの方法は、対象とする
ゲノムの異なる領域とハイブリダイズする複数のプロー
ブを使用することである。これに関する２つの手法が試
験された第１の手法では、制限酵素の使用により天然Ｄ
ＮＡから複数の二本鎖プローブを作製した。ネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ遺伝子をｐｓＰ６５グラス
ミド（ウィスコンシン州マジソン、グロメガ・バイオチ
ク社〕に挿入して、このグラスミドを大腸菌内で増殖さ
せた。仄いで、数ミリグラムのプラスミドＤＮＡ Ｙ大
腸菌培養物から単離し、このプラスミドＤＮＡを２１１
類の制限酵素Ａ１ｕ ｌおよびＨａｅ鳳で処理した。こ
れは人ささが約６塩基対から６００塩基対（ＤＮＡ配列
分析による）までの範囲の約３７の平滑末端二本鎖をプ
ラスミド１つにつきもたらした。その後二本領の集団は
ｄＡ、。：ｄＴ、。プローブを標識するときに使用した
通菖の５′−お工び３′−標識化法により標識付けした
。
ゲノムの異なる領域とハイブリダイズする複数のプロー
ブを使用することである。これに関する２つの手法が試
験された第１の手法では、制限酵素の使用により天然Ｄ
ＮＡから複数の二本鎖プローブを作製した。ネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ遺伝子をｐｓＰ６５グラス
ミド（ウィスコンシン州マジソン、グロメガ・バイオチ
ク社〕に挿入して、このグラスミドを大腸菌内で増殖さ
せた。仄いで、数ミリグラムのプラスミドＤＮＡ Ｙ大
腸菌培養物から単離し、このプラスミドＤＮＡを２１１
類の制限酵素Ａ１ｕ ｌおよびＨａｅ鳳で処理した。こ
れは人ささが約６塩基対から６００塩基対（ＤＮＡ配列
分析による）までの範囲の約３７の平滑末端二本鎖をプ
ラスミド１つにつきもたらした。その後二本領の集団は
ｄＡ、。：ｄＴ、。プローブを標識するときに使用した
通菖の５′−お工び３′−標識化法により標識付けした
。
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子はこの初
期実験を単純化するために、一般には望まれることだが
、プラスミドｐＳＰ６５から遊離の状態で単離しなかっ
た。この制限酵素切断プラスミドの数種の標識化調製物
は表３に載っている。
期実験を単純化するために、一般には望まれることだが
、プラスミドｐＳＰ６５から遊離の状態で単離しなかっ
た。この制限酵素切断プラスミドの数種の標識化調製物
は表３に載っている。
第１１図はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝
子を宮む種々の濃度の未切断ｐｓＰ ６５プラスミドを
検索するために、表３に記載の第１のグラスミド調製物
を用いて行った競合的ハイブリダイゼーションからのデ
ータ？示す。プラスミドプローブは２．７ｐＭの完全グ
ラスミドに対応する濃度で存在していた（標識化二本鎖
の会計１０１００ｐ。水中のプローブおよび標的ＤＮＡ
は沸騰水浴中に１２分間置き、次にＮａＣ１とジノ哨カ
リウムの最終濃度をそれぞれＩＭおよびｌ ＯｍＭとす
るために２ｘ濃縮納会緩衝液を添加しながら室温まで冷
却させた。
子を宮む種々の濃度の未切断ｐｓＰ ６５プラスミドを
検索するために、表３に記載の第１のグラスミド調製物
を用いて行った競合的ハイブリダイゼーションからのデ
ータ？示す。プラスミドプローブは２．７ｐＭの完全グ
ラスミドに対応する濃度で存在していた（標識化二本鎖
の会計１０１００ｐ。水中のプローブおよび標的ＤＮＡ
は沸騰水浴中に１２分間置き、次にＮａＣ１とジノ哨カ
リウムの最終濃度をそれぞれＩＭおよびｌ ＯｍＭとす
るために２ｘ濃縮納会緩衝液を添加しながら室温まで冷
却させた。
フルオレセイン放出は各試料について異なった時間で記
録した。第１１図にプロットしたデータは１．５時間お
よび５時間で測定されたフルオレセインに相当する。両
方のフルオレセイン値は予測され１こように標的製置が
増加するにつれて減少することが示されている。
録した。第１１図にプロットしたデータは１．５時間お
よび５時間で測定されたフルオレセインに相当する。両
方のフルオレセイン値は予測され１こように標的製置が
増加するにつれて減少することが示されている。
試験した標的濃度範囲は温度に関する螢光変化の全範囲
を示すには十分大きくないが、検定は使用したプローブ
の対応濃度に相当する少なくとも数ピコモルの感度を示
す。仮説的な１０μ２試料では、畝ピコモル標的が約３
Ｑ ａｍｏｌｅに相当する。この案、験において、フ
ルオレセイン放出強度はバンクグラウンドフルオレセイ
／の大きさの程［エリも大きｐ）つＴこ ハイブリダイゼーションはプラスミドのランダム制限消
化から生ずるプローブの長さおよび広範囲の融解温度に
関するプローブの不均一集団のために困難であることが
予測される。それゆえに、出来るだけ均一な大きさのプ
ローブ集団を作るべく制限酵素乞注意深く選択すること
が有利であるだろう。クローン化ＤＮＡからこのエリな
均一集団を作るために、ゲノム内に新しい制限部位ケ遺
伝子操作により加えてもよい。
を示すには十分大きくないが、検定は使用したプローブ
の対応濃度に相当する少なくとも数ピコモルの感度を示
す。仮説的な１０μ２試料では、畝ピコモル標的が約３
Ｑ ａｍｏｌｅに相当する。この案、験において、フ
ルオレセイン放出強度はバンクグラウンドフルオレセイ
／の大きさの程［エリも大きｐ）つＴこ ハイブリダイゼーションはプラスミドのランダム制限消
化から生ずるプローブの長さおよび広範囲の融解温度に
関するプローブの不均一集団のために困難であることが
予測される。それゆえに、出来るだけ均一な大きさのプ
ローブ集団を作るべく制限酵素乞注意深く選択すること
が有利であるだろう。クローン化ＤＮＡからこのエリな
均一集団を作るために、ゲノム内に新しい制限部位ケ遺
伝子操作により加えてもよい。
大腸菌エンテロトキシン標的子の検定？示す第１２図を
今や参照すると、約１００塩基対の工／テロトキシ／遺
伝子７ラグメントから成る標的ＤＮＡがｐＨ７，５のｌ
ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ）リスヶ含む緩衝液７
００μ２中でラムダＤＮＡ （キャリアーＤＮＡ ）１
４μｇと混合された。この溶液を沸騰水浴中に１２分間
おき、その彼我３に”トキシン”として示した二本鎖プ
ローブＤＮＡを加え、この溶液を沸騰水浴に戻してさら
に２分間加熱した。
今や参照すると、約１００塩基対の工／テロトキシ／遺
伝子７ラグメントから成る標的ＤＮＡがｐＨ７，５のｌ
ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ）リスヶ含む緩衝液７
００μ２中でラムダＤＮＡ （キャリアーＤＮＡ ）１
４μｇと混合された。この溶液を沸騰水浴中に１２分間
おき、その彼我３に”トキシン”として示した二本鎖プ
ローブＤＮＡを加え、この溶液を沸騰水浴に戻してさら
に２分間加熱した。
次いで偏光計のサーモスタット付きキュベツトホルダー
内に収容され１こ螢光キュベツト中の２×ＮａＣ１／
ｌ）ン醍塩緩衝液７００μｍにこの浴液を加え、４２℃
（７゛ローブの融解温度より２５℃低い温度つに維持し
に０ラムダＤＮＡ 、塩化ナトリウムおよびリン酸カリ
ウムの最終試料ｔｎｗはそれぞれ１０μｇ／屑／、ＬＭ
およびＯ，ＵＩＭであった。
内に収容され１こ螢光キュベツト中の２×ＮａＣ１／
ｌ）ン醍塩緩衝液７００μｍにこの浴液を加え、４２℃
（７゛ローブの融解温度より２５℃低い温度つに維持し
に０ラムダＤＮＡ 、塩化ナトリウムおよびリン酸カリ
ウムの最終試料ｔｎｗはそれぞれ１０μｇ／屑／、ＬＭ
およびＯ，ＵＩＭであった。
螢光強度は前の実験とは異なる方法で測定しに０螢光値
は検出用エレクトロニクスにインタフェースで接続した
コンピュータの使用（物質および方法の部参照）により
時間と共に連続して記録した。
は検出用エレクトロニクスにインタフェースで接続した
コンピュータの使用（物質および方法の部参照）により
時間と共に連続して記録した。
この方法で集めたデータは異なる濃度のエンテロトキシ
ン標的を営む試料について第１２図にプロットした。初
期および最終螢光値を記録することによって、試料間で
変動するバックグラウンド螢光レベルから独立した螢光
変化が得らｌｒＬ′ｒＳ、第１２図のデータ記録は各組
のデータが同じ初期螢光値を含むように相殺した。この
効果は試料間で変動するバックグラウンドを取り去るこ
とである。
ン標的を営む試料について第１２図にプロットした。初
期および最終螢光値を記録することによって、試料間で
変動するバックグラウンド螢光レベルから独立した螢光
変化が得らｌｒＬ′ｒＳ、第１２図のデータ記録は各組
のデータが同じ初期螢光値を含むように相殺した。この
効果は試料間で変動するバックグラウンドを取り去るこ
とである。
各試料の螢光変化は存在する標的ＤＮＡの社に関係する
。検出可能な最も低い標的濃度は４ｐＭであることがわ
かった。従って、仮説的なｌＯμ！試料はこの温度で４
０ ａｍｏｌｅの標的欠富むだろう。
。検出可能な最も低い標的濃度は４ｐＭであることがわ
かった。従って、仮説的なｌＯμ！試料はこの温度で４
０ ａｍｏｌｅの標的欠富むだろう。
螢光強度を時間と共に連続して記録することの２番目の
利点は、螢光変化の時間依存が平衡値−＼のデータの外
挿をｉＪ龍にする運動学的方程式にろてはめることがで
きるので、より短いハイブリダイゼーション時間を使用
しイＯるということである。
利点は、螢光変化の時間依存が平衡値−＼のデータの外
挿をｉＪ龍にする運動学的方程式にろてはめることがで
きるので、より短いハイブリダイゼーション時間を使用
しイＯるということである。
螢光変化、の相対度はＭ１２図ＶＣ示す央１次について
２時間にわたって時々微分すればよい。
２時間にわたって時々微分すればよい。
前記実施例は荷定の螢光団を記録したものであるが、本
発明は他のアミン反応性蛍光団および化学発光剤にも応
用できる。アミン反応性蛍光団にＨ例えば前述のフルオ
レセイン、ピレン、アクリジン、スルホローダミン、エ
オシン、エリトロン／およびそれらの誘導体がｆまれる
。アミン反応性化学発光剤には例えばミクロペルオキシ
ダーゼ、ルミノール、イソルミノール、グルコースオキ
シダーゼ、アクリジニウムエステルおよびそれらのめ導
体が含まれる。
発明は他のアミン反応性蛍光団および化学発光剤にも応
用できる。アミン反応性蛍光団にＨ例えば前述のフルオ
レセイン、ピレン、アクリジン、スルホローダミン、エ
オシン、エリトロン／およびそれらの誘導体がｆまれる
。アミン反応性化学発光剤には例えばミクロペルオキシ
ダーゼ、ルミノール、イソルミノール、グルコースオキ
シダーゼ、アクリジニウムエステルおよびそれらのめ導
体が含まれる。
化学発光剤はプローブの化学発光像ｆａｇ分が第２相補
的プローブの螢光団と相互作用するように、螢光団と関
連して本検定に用いらｎる。螢光団はＪｅｌｊ４Ｉｉ１
１１！成分が離れるまで化学発光剤の発光を抑えるだろ
う。発光反応を開始させるために、試料媒体に適当な化
学発光補助因子も加えられるだろう。
的プローブの螢光団と相互作用するように、螢光団と関
連して本検定に用いらｎる。螢光団はＪｅｌｊ４Ｉｉ１
１１！成分が離れるまで化学発光剤の発光を抑えるだろ
う。発光反応を開始させるために、試料媒体に適当な化
学発光補助因子も加えられるだろう。
標的がプローブと結合部位について競合したとき、標識
成分は分離して化学発光剤または化学発光成分を発光さ
せ、そして検出可能な信号？発生することができる。
成分は分離して化学発光剤または化学発光成分を発光さ
せ、そして検出可能な信号？発生することができる。
化学発光剤はまた化学発光補助因子との組会せで本蛇明
に用いられる。こうして、第１プローブの化学発光’＄
Ｍｔ成分は第２相補プローブ上の化学発光補助因子標識
成分と相互作用するでろろう。
に用いられる。こうして、第１プローブの化学発光’＄
Ｍｔ成分は第２相補プローブ上の化学発光補助因子標識
成分と相互作用するでろろう。
この系は特定強度の光を発する。標的が存在する場会、
標的はプローブと競合し、それにより第１および第２プ
ローブおよび標識成分を分離し且つこの系の発光を抑制
するだろう。
標的はプローブと競合し、それにより第１および第２プ
ローブおよび標識成分を分離し且つこの系の発光を抑制
するだろう。
螢光団標識化プローブはバックグラウンド螢光を制限す
るために時間分解検定法において利用される。従って、
光パルスは第１螢光団を励起するのに十分な波長で導入
される。第１螢元団はそのエネルギーを第２螢光団に転
移する。ｆ、１螢元団から第２螢光団へのエネルギーの
転移および第２螢光団によるエネルギーの放出は、直！
１８螢光に比べてゆっくりした過程でろる。第１安光団
はエネルギー転位過程を引き延ばすために、艮い発覚寿
命を有するように選ばれる。試料はパルス後、そのパル
スによって開始された直接螢光活性が終了した後、およ
び転移したエネルギーがＭ２＊″／ｌ、団から発せられ
る付量に、第２螢元団からの元エネルギーについて監視
することができる。エネルギーを転移する位置にある螢
光群のみが監視される発光を生ずるだろう。相互作用す
る位置にある相補的プローブの標識成分のみが検出可能
な信号をもち、それによりバックグラウンド発光が抑え
られるだろう、 時間分解検定法の詳しい説明は本発明者の係属中の米国
特許出願第７３８５６０号に開示窟れており、これは参
照によりここに引用される。
るために時間分解検定法において利用される。従って、
光パルスは第１螢光団を励起するのに十分な波長で導入
される。第１螢元団はそのエネルギーを第２螢光団に転
移する。ｆ、１螢元団から第２螢光団へのエネルギーの
転移および第２螢光団によるエネルギーの放出は、直！
１８螢光に比べてゆっくりした過程でろる。第１安光団
はエネルギー転位過程を引き延ばすために、艮い発覚寿
命を有するように選ばれる。試料はパルス後、そのパル
スによって開始された直接螢光活性が終了した後、およ
び転移したエネルギーがＭ２＊″／ｌ、団から発せられ
る付量に、第２螢元団からの元エネルギーについて監視
することができる。エネルギーを転移する位置にある螢
光群のみが監視される発光を生ずるだろう。相互作用す
る位置にある相補的プローブの標識成分のみが検出可能
な信号をもち、それによりバックグラウンド発光が抑え
られるだろう、 時間分解検定法の詳しい説明は本発明者の係属中の米国
特許出願第７３８５６０号に開示窟れており、これは参
照によりここに引用される。
こうして、本発明は均質な非放射性検定を特徴とする。
本検定の均質性により、比較的短時間で検定を行うこと
ができろ。非放射性標識を使用すると、特別の許可がな
くても本検定乞行うことができ、１に検定技術および製
造技術が単純化される。
ができろ。非放射性標識を使用すると、特別の許可がな
くても本検定乞行うことができ、１に検定技術および製
造技術が単純化される。
本発明はその好適な実施態様について説明してさたが、
本発明は変更および修飾が可能であり、それゆえに先に
記載の細部に限定されるべきでなく、特許請求の範囲に
含まれる種々の変更および修正？加え得ることを理解す
べきである。
本発明は変更および修飾が可能であり、それゆえに先に
記載の細部に限定されるべきでなく、特許請求の範囲に
含まれる種々の変更および修正？加え得ることを理解す
べきである。
第１図は本発明の競合的ＤＮＡ検定を示す模式第２図は
本検定を行うための自動分析装置の略図でろり； 集３図はクローン化ＤＮＡ 由来の二本鎖プローブの作
製を示す模式図であり； 第４図は二本鎖プローブの末端標識化を示す模式図でめ
り； 第５図は相補プローブ鎖の標識成分が相互作用すると茜
の螢光放出と温度の関係ン示すグラフ（融、嘆曲＃りで
めり； 第６図は非標識プローブの融解曲線を示すグラフであり
； 第゛１図は一定製度の二本鎖プローブを含む異なる濃度
の標的鎖についての螢光強度と波長の関係を示すグラフ
でめり； 第８図は競合的エネルギー転移ＤＮＡハイブリダイゼー
ションにおける標的濃度と螢光放出の関係を示すグラフ
であり； 第９丙はフルオレセイン−ｄＡ、。： ｄＴ、。−ピレ
ンプローブ？用いた競合的検定における各Ｓ標的ＤＮＡ
の濃度とフルオレセイン発光強度の関係を示すグラフで
あり； 第１（〕図は異なる濃度のフルオレセイン−ｄＡ？。 ： ｄＴ、。−ピレンプローブを用いり競合的ｇａハイ
プリダイゼーショ／における標的ＤＮＡ ９度と螢光強
度の関係を示すグラフであり； 第１１図はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝
子を含むｐ８Ｆ６５グラスミドを検索するために、フル
オレ七インープラスミドーピレンプローブを用いて行っ
た競合的ハイブリダイゼーションからのデータを示し；
そして Ｗ１２図は大腸菌エンテロトキシン遺伝子の競合的検定
ン示す。 （外５名〕 １７に、３ クフーノ化ＤＮＡ歯釆の二本考負ブＤ−７’ＦＩｃ、ｔ
ｔ 二本値フ゛ロープの未Ｓ碑ＩＮ化 ！”／Ｇ、 １３ （：ｄＡ、・Ｊ４ｚ） Ｃ９ フル大しセイノ発太シ虱与 （■灯隼句°ノフルナレセ
インーブラスミドーピレノｉ−を火声マり灼し鋸杓穐、
疋ｙｉｃ−ｉｉ φ 九 強屋θｏＡ３ｒｎｉ）卜訃９ 手続補正内 昭和６２年特許願第３９０５号 ２、発明の名称 競合的均質検定法 ３、補正をする者 事件との関係 ９ｉ１許出願人 住所 名 称 アモコ・コーポレーション ４、代理人 住 所 東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手
町ビル ２０６号室 ５、補正の対象 タイプした明細山 手続補正内（方式） ％式％ ６、補正をする者 事件との関係 出 願 人 住所 名称アモコ・コーポレーション ４、代理人
本検定を行うための自動分析装置の略図でろり； 集３図はクローン化ＤＮＡ 由来の二本鎖プローブの作
製を示す模式図であり； 第４図は二本鎖プローブの末端標識化を示す模式図でめ
り； 第５図は相補プローブ鎖の標識成分が相互作用すると茜
の螢光放出と温度の関係ン示すグラフ（融、嘆曲＃りで
めり； 第６図は非標識プローブの融解曲線を示すグラフであり
； 第゛１図は一定製度の二本鎖プローブを含む異なる濃度
の標的鎖についての螢光強度と波長の関係を示すグラフ
でめり； 第８図は競合的エネルギー転移ＤＮＡハイブリダイゼー
ションにおける標的濃度と螢光放出の関係を示すグラフ
であり； 第９丙はフルオレセイン−ｄＡ、。： ｄＴ、。−ピレ
ンプローブ？用いた競合的検定における各Ｓ標的ＤＮＡ
の濃度とフルオレセイン発光強度の関係を示すグラフで
あり； 第１（〕図は異なる濃度のフルオレセイン−ｄＡ？。 ： ｄＴ、。−ピレンプローブを用いり競合的ｇａハイ
プリダイゼーショ／における標的ＤＮＡ ９度と螢光強
度の関係を示すグラフであり； 第１１図はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝
子を含むｐ８Ｆ６５グラスミドを検索するために、フル
オレ七インープラスミドーピレンプローブを用いて行っ
た競合的ハイブリダイゼーションからのデータを示し；
そして Ｗ１２図は大腸菌エンテロトキシン遺伝子の競合的検定
ン示す。 （外５名〕 １７に、３ クフーノ化ＤＮＡ歯釆の二本考負ブＤ−７’ＦＩｃ、ｔ
ｔ 二本値フ゛ロープの未Ｓ碑ＩＮ化 ！”／Ｇ、 １３ （：ｄＡ、・Ｊ４ｚ） Ｃ９ フル大しセイノ発太シ虱与 （■灯隼句°ノフルナレセ
インーブラスミドーピレノｉ−を火声マり灼し鋸杓穐、
疋ｙｉｃ−ｉｉ φ 九 強屋θｏＡ３ｒｎｉ）卜訃９ 手続補正内 昭和６２年特許願第３９０５号 ２、発明の名称 競合的均質検定法 ３、補正をする者 事件との関係 ９ｉ１許出願人 住所 名 称 アモコ・コーポレーション ４、代理人 住 所 東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手
町ビル ２０６号室 ５、補正の対象 タイプした明細山 手続補正内（方式） ％式％ ６、補正をする者 事件との関係 出 願 人 住所 名称アモコ・コーポレーション ４、代理人
Claims (29)
- （１）次の工程： （ａ）試料と試薬を結合条件下で接触させる工程、ここ
で上記試薬は第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２
ポリヌクレオチドプローブを含み、第１および第２ポリ
ヌクレオチドプローブはそれらが互いに結合する第１の
位置をとることができ且つ上記プローブの少なくとも１
つは該プローブ鎖が標的ポリヌクレオチドと結合する第
２の位置をとることができ、上記の第１プローブおよび
第２プローブはこれらのプローブの一方と会合した第１
標識成分および他方のプローブと会合した第２標識成分
を含み、該第１および第２標識成分は第１および第２プ
ローブが互いに結合するとき相互作用して上記２つの位
置の一方にあるプローブに特徴的な検出しうる信号を発
することができる；および （ｂ）該試料中の標的の存在と関連がある信号の存在に
ついて該試料を監視する工程； から成る標的ポリヌクレオチドについて試料を検定する
方法。 - （２）第１標識成分は上記プローブの一方の３′末端に
存在し、第２標識成分は他方のプローブの５′末端に存
在する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （３）各プローブは複数の標識成分を有する、特許請求
の範囲第１項記載の方法。 - （４）上記標識成分はそれぞれ上記プローブの末端に存
在する、特許請求の範囲第３項記載の方法。 - （５）第１標識成分は上記プローブの一方の３′末端に
あり、第２標識成分は他方のプローブの５′末端にある
、特許請求の範囲第３項記載の方法。 - （６）第１標識成分は核酸のアミノアルキル誘導体によ
り上記プローブと会合している、特許請求の範囲第２項
記載の方法。 - （７）上記誘導体はアデニンのアミノアルキル誘導体を
含む、特許請求の範囲第６項記載の方法。 - （８）上記誘導体はアデニンのアミノヘキシル誘導体を
含む、特許請求の範囲第６項記載の方法。 - （９）上記誘導体は８−（６−アミノヘキシル）−アミ
ノアデノシン−５′−モノホスフェートを含む、特許請
求の範囲第６項記載の方法。 - （１０）３′末端にある上記標識成分は核酸の螢光性誘
導体である、特許請求の範囲第５項記載の方法。 - （１１）該標識成分は１−Ｎ＾６−エテノアデノシン−
５′−モノホスフェートの誘導体を含む、特許請求の範
囲第１０項記載の方法。 - （１２）次の工程： （ａ）ポリヌクレオチドと核酸のアミノアルキル誘導体
とを反応条件下に酵素ターミナルトランスフェラーゼの
存在下で反応させる工程；および （ｂ）アミノアルキル誘導体のアミノ基をアミン反応性
成分と反応させる工程； から成るポリヌクレオチドの３′末端にアミン反応性成
分を会合させる方法。 - （１３）上記アミノアルキル誘導体はアデニンのアミノ
アルキル誘導体を含む、特許請求の範囲第１２項記載の
方法。 - （１４）上記アミノアルキル誘導体はリボヌクレオチド
である、特許請求の範囲第１２項記載の方法。 - （１５）アミノアルキル誘導体は８−（６−アミノヘキ
シル）−アミノアデノシン−５′−トリホスフェートを
含む、特許請求の範囲第１４項記載の方法。 - （１６）第１プローブおよび第２プローブを含み、該第
１および第２プローブは第１プローブが第２プローブと
結合する第１の位置、および上記プローブの少なくとも
１つが標的と結合する第２の位置をとることができるポ
リヌクレオチドプローブを作製する方法であって、 増幅手段中に標的配列と実質的に同一の塩基配列をもつ
ポリヌクレオチドセグメントをスプライシングして、該
ポリヌクレオチドセグメントの多数のコピーを形成し；
該セグメントを単離し；そして該セグメントの末端に標
識成分を会合させてプローブを作製することから成る上
記方法。 - （１７）増幅手段はプラスミドおよびファージ粒子を含
む、特許請求の範囲第１６項記載の方法。 - （１８）上記セグメントは単離した後に制限酵素で消化
してサブセグメントとなし、該サブセグメントを標識成
分と会合させてプローブを作る、特許請求の範囲第１６
項記載の方法。 - （１９）上記セグメントとヌクレオチドのアミノアルキ
ル誘導体とを反応条件下にターミナルトランスフェラー
ゼの存在下で反応させ、該アミノアルキル基を標識成分
と反応させることにより、第１標識成分を３′末端と会
合させる、特許請求の範囲第１６項記載の方法。 - （２０）上記セグメントと二官能性アルキルアミンとを
反応させてアミノアルキル基を含むセグメントを形成し
、次いで第２標識成分を該アミノアルキル基と反応させ
ることにより、第２標識成分を５′末端と会合させる、
特許請求の範囲第１９項記載の方法。 - （２１）標的ポリヌクレオチドについて試料を検定する
ための試薬を含むキットであって、 上記試薬は第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポ
リヌクレオチドプローブを含み、該第１および第２プロ
ーブはそれらが互いに結合する第１の位置をとることが
でき且つ上記プローブの少なくとも１つは該プローブ鎖
が標的と結合する第２の位置をとることができ、上記の
第１プローブおよび第２プローブはこれらのプローブの
一方と会合した第１標識成分および他方のプローブと会
合した第２標識成分を含み、該第１および第２標識成分
は上記第１および第２プローブが互いに結合するとき相
互作用して、上記２つの位置の一方にあるプローブに特
徴的な検出しうる信号を発することができる上記検定用
キット。 - （２２）第１標識成分は上記プローブの一方の３′末端
にあり、第２標識成分は他方のプローブの５′末端にあ
る、特許請求の範囲第２１項記載のキット。 - （２３）各プローブは複数の標識成分を有する、特許請
求の範囲第２２項記載のキット。 - （２４）上記標識成分はそれぞれ上記プローブの末端に
存在する、特許請求の範囲第２３項記載のキット。 - （２５）第１標識成分は３′末端にあり、第２標識成分
は５′末端にある、特許請求の範囲第２３項記載のキッ
ト。 - （２６）試料中のポリヌクレオチド標的について競合的
均質検定を行うための装置であって、 試薬および試料を収容するのに適した容器手段、ここで
該試薬は第１プローブおよび第２プローブを含み、該第
１および第２プローブは第１プローブが第２プローブと
結合する第１の位置およびこれらのプローブの少なくと
も１つが標的と結合する第２の位置をとることができ、
これらのプローブは一方のプローブと会合した少なくと
も１つの標識成分および他方のプローブと会合した第２
標識成分を有し、該第１および第２標識成分は上記プロ
ーブが第１の位置にあるとき相互作用して、該標識成分
の一方の励起の際に上記位置の一方に特徴的な信号を発
することができる； 上記標識成分の一方を励起する手段；および上記信号を
検出する手段； を含む上記装置。 - （２７）標識成分は螢光団であり、標識成分の一方を励
起する手段が光源を含む、特許請求の範囲第２６項記載
の装置。 - （２８）少なくとも１つの標識成分が化学発光剤であり
、標識成分の一方を励起する手段が上記容器に化学発光
補助因子を導入する手段を含む、特許請求の範囲第２６
項記載の装置。 - （２９）上記検出手段は光検出器を含む、特許請求の範
囲第２６項記載の装置。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US817841 | 1986-01-10 | ||
| US81784186A | 1986-01-19 | 1986-01-19 | |
| CA000535665A CA1296242C (en) | 1986-01-10 | 1987-04-27 | Competitive homogeneous assay |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62244399A true JPS62244399A (ja) | 1987-10-24 |
| JP2619866B2 JP2619866B2 (ja) | 1997-06-11 |
Family
ID=25671322
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62003905A Expired - Fee Related JP2619866B2 (ja) | 1986-01-10 | 1987-01-10 | 競合的均質検定法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5928862A (ja) |
| EP (1) | EP0232967B1 (ja) |
| JP (1) | JP2619866B2 (ja) |
| AT (1) | ATE88761T1 (ja) |
| CA (1) | CA1296242C (ja) |
| DE (1) | DE3785591T2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02245663A (ja) * | 1988-12-16 | 1990-10-01 | Ortho Diagnostic Syst Inc | 高度な特異的活性を有するヌクレオチドプローブの化学的製造方法 |
| JPH09504950A (ja) * | 1993-11-12 | 1997-05-20 | ザ パブリック ヘルス リサーチ インスティチュート オブ ザ シティー オブ ニューヨーク インク | 核酸検出用ハイブリダイゼーションプローブ、共通ステム、方法およびキット |
| JPH11506020A (ja) * | 1996-02-05 | 1999-06-02 | ザ パーキン―エルマー コーポレーション | 均質ｐｃｒハイブリダイゼーション系のための蛍光検出アッセイ |
| JP2006513701A (ja) * | 2002-10-11 | 2006-04-27 | アーラム バイオシステムズ インコーポレイテッド | 核酸ベースのシグナルトランスデューサーを含む立体構造的に敏感なプローブを有する標的検出システム |
| JP2009261334A (ja) * | 2008-04-25 | 2009-11-12 | Japan Science & Technology Agency | 核酸応答性ゲルおよびその製造方法ならびにその利用 |
| JP2010505440A (ja) * | 2006-10-12 | 2010-02-25 | ビオ−ラド・パストゥール | 核酸の蛍光検出のための二本鎖プローブ |
Families Citing this family (187)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA877772B (en) * | 1986-10-23 | 1988-04-20 | Amoco Corporation | Target and background capture methods and apparatus for affinity assays |
| EP0304184B1 (en) * | 1987-07-31 | 1994-10-12 | Gen-Probe Incorporated | Assay for polynucleotides employing oligonucleotides to eliminate undesirable cross reactions |
| DE68916671T2 (de) * | 1988-03-18 | 1995-03-02 | Baylor College Medicine | Mutationsnachweis durch kompetitiven Oligonukleotid-Priming. |
| GB8902689D0 (en) * | 1989-02-07 | 1989-03-30 | Ici Plc | Assay method |
| CA2049042A1 (en) * | 1989-03-10 | 1990-09-11 | Mark L. Collins | Preventing interference with affinity capture schemes |
| AU5269590A (en) | 1989-03-10 | 1990-10-09 | Gene-Trak Systems | Immobilized oligonucleotide probes and uses therefor |
| US5744101A (en) * | 1989-06-07 | 1998-04-28 | Affymax Technologies N.V. | Photolabile nucleoside protecting groups |
| US5800992A (en) | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
| US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| WO1992015708A1 (en) * | 1991-02-27 | 1992-09-17 | Amoco Corporation | Methods for improving the sensitivity of hybridization assays |
| US5578498A (en) | 1991-05-22 | 1996-11-26 | Behringwerke Ag | Metal chelate containing compositions for use in chemiluminescent assays |
| US5340716A (en) * | 1991-06-20 | 1994-08-23 | Snytex (U.S.A.) Inc. | Assay method utilizing photoactivated chemiluminescent label |
| US6251581B1 (en) | 1991-05-22 | 2001-06-26 | Dade Behring Marburg Gmbh | Assay method utilizing induced luminescence |
| GB9114525D0 (en) * | 1991-07-05 | 1991-08-21 | Delnatte Sabine | Homogeneous nucleic acids probe based tests and substances |
| DE69233391D1 (de) * | 1991-11-07 | 2004-09-02 | Nanotronics Inc | Hybridisierung von mit Chromophoren und Fluorophoren konjugierten Polynukleotiden zur Erzeugung eines Donor-Donor Energietransfersystems |
| DE69233331T3 (de) * | 1991-11-22 | 2007-08-30 | Affymetrix, Inc., Santa Clara | Kombinatorische Strategien zur Polymersynthese |
| WO1994003812A1 (en) * | 1992-07-31 | 1994-02-17 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Photoactivatable chemiluminescent matrices |
| DE69333991T2 (de) * | 1992-11-27 | 2006-12-14 | Canon K.K. | Verfahren und Sonde zum Nachweis von Nukleinsäuren |
| JPH06153997A (ja) * | 1992-11-27 | 1994-06-03 | Canon Inc | 検出信号増幅による標的核酸の検出方法 |
| EP0601889A2 (en) * | 1992-12-10 | 1994-06-15 | Maine Medical Center Research Institute | Nucleic acid probes |
| JP3247001B2 (ja) * | 1992-12-21 | 2002-01-15 | キヤノン株式会社 | ピリリウム化合物を用いた２本鎖核酸の検出方法、ピリリウム化合物を含有するプローブ及びそれを用いた標的核酸の検出方法、新規ピリリウム化合物 |
| WO1995002068A1 (fr) * | 1993-07-09 | 1995-01-19 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methode de discrimination des acides nucleiques et necessaire d'essai a cette fin |
| US5861124A (en) * | 1993-07-15 | 1999-01-19 | Hamamatsu Photonics Kk | Method and apparatus for detecting denaturation of nucleic acid |
| US5670315A (en) * | 1993-09-13 | 1997-09-23 | Canon Kabushiki Kaisha | Nucleic acid determination employing pyryilium dye |
| US5925517A (en) | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
| US6821727B1 (en) | 1993-11-15 | 2004-11-23 | Applera Corporation | Hybridization assay using self-quenching fluorescence probe |
| US5538848A (en) * | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| JPH07233065A (ja) | 1993-12-27 | 1995-09-05 | Canon Inc | ピリリウム塩又はピリリウム類似塩を含む光化学治療薬 |
| EP0763133B1 (en) * | 1994-05-23 | 2001-08-01 | Biotronics Corporation | Method for detecting a target nucleic acid |
| EP0684239B1 (en) * | 1994-05-26 | 2003-12-10 | Canon Kabushiki Kaisha | A method for detecting a target substance in a sample, utilizing pyrylium compound |
| WO1996034983A1 (en) | 1995-05-05 | 1996-11-07 | The Perkin-Elmer Corporation | Methods and reagents for combined pcr amplification and hybridization probing assay |
| WO1997023647A1 (en) * | 1995-12-22 | 1997-07-03 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Homogeneous amplification and detection of nucleic acids |
| EP0880598A4 (en) | 1996-01-23 | 2005-02-23 | Affymetrix Inc | RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM |
| DE69738687D1 (de) * | 1996-04-12 | 2008-06-26 | Phri Properties Inc | Sonden, kits und assays |
| WO1998010096A1 (en) * | 1996-04-12 | 1998-03-12 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detection probes, kits and assays |
| ATE295427T1 (de) * | 1996-06-04 | 2005-05-15 | Univ Utah Res Found | Überwachung der hybridisierung während pcr |
| US7070925B1 (en) | 1996-07-16 | 2006-07-04 | Gen-Probe Incorporated | Method for determining the presence of an RNA analyte in a sample using a modified oligonucleotide probe |
| AU726821B2 (en) * | 1996-07-16 | 2000-11-23 | Gen-Probe Incorporated | Methods for detecting and amplifying nucleic acid sequences using modified oligonucleotides having increased target specific Tm |
| US5853990A (en) | 1996-07-26 | 1998-12-29 | Edward E. Winger | Real time homogeneous nucleotide assay |
| DE69718268D1 (de) | 1996-10-03 | 2003-02-13 | Canon Kk | Verfahren zur Detektion von Zielnukleinsäure, Verfahren zu ihrer Quantifizierung und Pyrylium-Verbindungen zur Chemilumineszenz-Analyse |
| US6451530B1 (en) * | 1996-12-13 | 2002-09-17 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Fluorescent nucleotide analog hairpin formation for detection of nucleic acid hybridization |
| DE69814848T2 (de) * | 1997-02-27 | 2004-05-06 | Ingeneus Corp. | Untersuchung von nukleotiden in loesung mit hilfe von pna-sonden |
| US6060242A (en) * | 1997-02-27 | 2000-05-09 | Lorne Park Research, Inc. | PNA diagnostic methods |
| US5846729A (en) * | 1997-02-27 | 1998-12-08 | Lorne Park Research, Inc. | Assaying nucleotides in solution using a fluorescent intensity quenching effect |
| US6251591B1 (en) | 1997-02-27 | 2001-06-26 | Lorne Park Research, Inc. | Quantitative method for detecting nucleotide concentration |
| US6046004A (en) * | 1997-02-27 | 2000-04-04 | Lorne Park Research, Inc. | Solution hybridization of nucleic acids with antisense probes having modified backbones |
| US7803528B1 (en) | 1997-02-28 | 2010-09-28 | Quest Diagnostics Incorporated | Fluorescence energy transfer by competitive hybridization |
| US6103536A (en) * | 1997-05-02 | 2000-08-15 | Silver Lake Research Corporation | Internally referenced competitive assays |
| JPH1189598A (ja) * | 1997-09-18 | 1999-04-06 | Hitachi Software Eng Co Ltd | 蛍光標識プローブ及びハイブリダイゼーション検出方法 |
| US5935791A (en) | 1997-09-23 | 1999-08-10 | Becton, Dickinson And Company | Detection of nucleic acids by fluorescence quenching |
| US6080868A (en) | 1998-01-23 | 2000-06-27 | The Perkin-Elmer Corporation | Nitro-substituted non-fluorescent asymmetric cyanine dye compounds |
| WO1999042615A1 (en) * | 1998-02-18 | 1999-08-26 | Dade Behring Inc. | Methods for determining amounts of nucleic acids |
| US6255050B1 (en) | 1998-05-22 | 2001-07-03 | Lorne Park Research, Inc. | Dynamic hybridization system |
| GB9812768D0 (en) | 1998-06-13 | 1998-08-12 | Zeneca Ltd | Methods |
| AU762728B2 (en) * | 1998-07-02 | 2003-07-03 | Gen-Probe Incorporated | Molecular torches |
| US6037130A (en) * | 1998-07-28 | 2000-03-14 | The Public Health Institute Of The City Of New York, Inc. | Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits |
| US6441152B1 (en) * | 1998-12-08 | 2002-08-27 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions for the identification of nucleic acids electrostatically bound to matrices |
| WO2000073764A2 (en) | 1999-06-01 | 2000-12-07 | Baylor College Of Medicine | Composition and methods for the therapeutic use of an atonal-associated sequence |
| US6645733B1 (en) | 1999-06-25 | 2003-11-11 | Ingeneus Corporation | Fluorescent intensity method for assaying binding between proteins or peptides |
| AU7856600A (en) | 1999-10-04 | 2001-05-10 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Novel carbamates and ureas |
| US6376177B1 (en) * | 1999-10-06 | 2002-04-23 | Virtual Pro, Inc. | Apparatus and method for the analysis of nucleic acids hybridization on high density NA chips |
| DE19952568C2 (de) * | 1999-11-02 | 2003-05-22 | Noxxon Pharma Ag | Fluoreszenzmarkierte Nukleinsäure-Liganden |
| GB2359625B (en) * | 1999-12-10 | 2004-10-20 | Molecular Light Tech Res Ltd | Monitoring oligonucleotide binding process using chemiluminescence quenching |
| FI20000333A0 (fi) | 2000-02-16 | 2000-02-16 | Jussi Nurmi | Homogeeninen menetelmä polynukleotidin havaitsemiseksi |
| CN1348096A (zh) | 2000-10-10 | 2002-05-08 | 栾国彦 | 一种均相特异性检测核酸的探针及应用方法 |
| US20060073530A1 (en) * | 2001-08-15 | 2006-04-06 | Olaf Schneewind | Methods and compositions involving sortase B |
| US6593091B2 (en) | 2001-09-24 | 2003-07-15 | Beckman Coulter, Inc. | Oligonucleotide probes for detecting nucleic acids through changes in flourescence resonance energy transfer |
| US20030166282A1 (en) | 2002-02-01 | 2003-09-04 | David Brown | High potency siRNAS for reducing the expression of target genes |
| EP1470148B1 (en) | 2002-02-01 | 2012-07-18 | Life Technologies Corporation | Double-stranded oligonucleotides |
| US20060009409A1 (en) | 2002-02-01 | 2006-01-12 | Woolf Tod M | Double-stranded oligonucleotides |
| WO2003102239A2 (en) * | 2002-05-31 | 2003-12-11 | Secretary, Department Of Atomic Energy | Met/fret based method of target nucleic acid detection whereby the donor/acceptor moieties are on complementary strands |
| ATE519861T1 (de) * | 2002-06-14 | 2011-08-15 | Gen Probe Inc | Zusammensetzungen zum nachweis von hepatitis-b- virus |
| WO2004001074A1 (en) * | 2002-06-21 | 2003-12-31 | Lynx Therapeutics, Inc. | Method for detecting foreign dna in a host genome |
| KR20120002613A (ko) | 2002-08-12 | 2012-01-06 | 제네렉스, 인코포레이티드 | 폭스바이러스 및 암과 관련된 방법 및 조성물 |
| GB0303453D0 (en) * | 2003-02-14 | 2003-03-19 | Thermo Clinical Labsystems Oy | Automated sample analyzer and cuvette |
| EP1601955B1 (en) | 2003-03-07 | 2013-01-09 | Luxcel Biosciences Limited | An oxygen sensitive probe and method for measuring oxygen uptake |
| CA2525413C (en) | 2003-05-19 | 2010-08-17 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, methods and kits for determining the presence of trichomonas vaginalis in a test sample |
| US7202036B2 (en) * | 2003-06-12 | 2007-04-10 | Los Alamos National Security, Llc | Quenching methods for background reduction in luminescence-based probe-target binding assays |
| GB0320235D0 (en) * | 2003-08-29 | 2003-10-01 | Molecular Light Tech Res Ltd | Estimation of activity or inhibition of processes involved in nucleic acid modification using chemiluminescence quenching |
| ES2385485T3 (es) * | 2003-12-03 | 2012-07-25 | Abbott Laboratories | Sonda de ácido nucleico lineal de doble hebra y usos de la misma |
| DE602004026111D1 (de) | 2003-12-19 | 2010-04-29 | Nat Inst Of Advanced Ind Scien | Verfahren zum testen von nukleinsäuren unter verwendung davon sowie dafür zu verwendende nukleinsäuresonde |
| WO2006016978A1 (en) * | 2004-06-30 | 2006-02-16 | Applera Corporation | Analog probe complexes |
| AU2005280162B2 (en) | 2004-08-27 | 2012-04-26 | Gen-Probe Incorporated | Single-primer nucleic acid amplification methods |
| ATE469245T1 (de) | 2004-09-14 | 2010-06-15 | Univ Colorado | Auf genetischem targeting basierendes verfahren zur behandlung mit bucindolol |
| EP1909108B1 (en) | 2005-03-10 | 2019-05-29 | Gen-Probe Incorporated | Systems and methods to perform assays for detecting or quantifiying analytes |
| EP2322940B1 (en) | 2005-03-10 | 2014-10-29 | Gen-Probe Incorporated | Systems amd methods to perform assays for detecting or quantifing analytes within samples |
| US8980246B2 (en) | 2005-09-07 | 2015-03-17 | Sillajen Biotherapeutics, Inc. | Oncolytic vaccinia virus cancer therapy |
| CA2622295C (en) | 2005-09-12 | 2019-01-15 | The Regents Of The University Of Michigan | Recurrent gene fusions in prostate cancer |
| US9957569B2 (en) * | 2005-09-12 | 2018-05-01 | The Regents Of The University Of Michigan | Recurrent gene fusions in prostate cancer |
| RU2394915C2 (ru) * | 2006-03-24 | 2010-07-20 | Александр Борисович Четверин | Бесконтактные способы обнаружения молекулярных колоний, наборы реагентов и устройство для их осуществления |
| DK1945821T3 (da) | 2006-06-06 | 2011-03-07 | Gen Probe Inc | Mærkede oligonukleotider og anvendelse deraf i fremgangsmåder til amplifikation af nukleinsyrer |
| EP2038432B1 (en) * | 2006-06-30 | 2017-02-08 | Rosetta Genomics Ltd | Method for detecting and quantifying a target nucleic acid generated by rt-pcr of mirna |
| ES2741138T3 (es) | 2006-09-15 | 2020-02-10 | Childrens Hospital Of Eastern Ontario Res Institute Inc | Rhabdovirus oncolítico de Farmington |
| US9273345B2 (en) * | 2006-12-28 | 2016-03-01 | Conceptual Mindworks, Inc. | Methods and compositions for processes of rapid selection and production of nucleic acid aptamers |
| US8247171B2 (en) | 2007-02-01 | 2012-08-21 | Abacus Diagnostica Oy | Method for detection of presence of target polynucleotide in samples |
| WO2008119488A1 (en) * | 2007-03-30 | 2008-10-09 | Roche Diagnostics Gmbh | Alkyl amines improve detection of components of formaldehyde-fixed biological samples |
| AU2008269201B2 (en) | 2007-06-21 | 2011-08-18 | Gen-Probe Incorporated | Instrument and receptacles for use in performing processes |
| WO2009009432A2 (en) | 2007-07-06 | 2009-01-15 | The Regents Of The University Of Michigan | Recurrent gene fusions in prostate cancer |
| CA2692793C (en) | 2007-07-06 | 2014-05-20 | The Regents Of The University Of Michigan | Mipol1-etv1 gene rearrangements |
| US8790877B2 (en) * | 2007-07-12 | 2014-07-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force | Using DNA aptamers and quantum dots for the detection of proteins or other targets |
| JP2011518126A (ja) * | 2008-03-25 | 2011-06-23 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン | ＩＫＫｉ阻害剤の処置方法およびスクリーニング方法、ならびに関連するＩＫＫｉ診断方法 |
| US10316352B2 (en) | 2008-05-13 | 2019-06-11 | Gen-Probe Incorporated | Methods of capturing a target nucleic acid for amplification and detection using an inactivatable target capture oligomer |
| CA2725978A1 (en) | 2008-05-28 | 2009-12-03 | Genomedx Biosciences, Inc. | Systems and methods for expression-based discrimination of distinct clinical disease states in prostate cancer |
| US8034569B2 (en) * | 2008-06-06 | 2011-10-11 | Biotex, Inc. | Methods for molecular detection |
| GB0909333D0 (en) | 2009-06-01 | 2009-07-15 | Fu Guoliang | Multiplex amplification and detection |
| CA2738792C (en) | 2008-07-31 | 2016-11-22 | Oxitec Limited | Multiplex amplification and detection |
| WO2010030461A2 (en) * | 2008-09-12 | 2010-03-18 | Promega Corporation | Assessing expression of endogenous and exogenous genes |
| US20110300544A1 (en) | 2008-12-09 | 2011-12-08 | Guoliang Fu | Enhanced taqman probe based amplification |
| CN102639709A (zh) | 2009-01-09 | 2012-08-15 | 密歇根大学董事会 | 癌症中的复现性基因融合体 |
| JP5586631B2 (ja) | 2009-01-30 | 2014-09-10 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | 信号を検出し、信号伝送要素に熱エネルギーを加えるためのシステム及び方法 |
| JP2010178716A (ja) * | 2009-02-09 | 2010-08-19 | Olympus Corp | 標的核酸分子の定量方法及び標的核酸分子定量キット |
| US9393564B2 (en) | 2009-03-30 | 2016-07-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Bioagent detection systems, devices, and methods |
| EP2430187A2 (en) * | 2009-05-12 | 2012-03-21 | Abacus Diagnostica OY | Method for detecting nucleic acids |
| EP2449104B1 (en) | 2009-06-29 | 2014-06-04 | Luminex Corporation | Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same |
| US9409983B2 (en) | 2009-07-23 | 2016-08-09 | The Board Of Trustess Of The University Of Illinois | Methods and compositions involving PBEF inhibitors for lung inflammation conditions and diseases |
| US9512481B2 (en) | 2009-09-11 | 2016-12-06 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Polymorphisms in the PDE3A gene |
| ES2671570T3 (es) | 2009-09-14 | 2018-06-07 | Sillajen Biotherapeutics, Inc. | Terapia combinada contra el cáncer con virus oncolítico de vaccinia |
| JP5800817B2 (ja) | 2009-09-17 | 2015-10-28 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン | 前立腺癌における再発性遺伝子融合 |
| ES2533536T3 (es) | 2009-11-19 | 2015-04-10 | Solis Biodyne Oü | Composiciones para aumentar la estabilidad y actividad de polipéptidos, y métodos relacionados |
| US9045729B2 (en) | 2009-12-10 | 2015-06-02 | Ottawa Hospital Research Institute | Oncolytic rhabdovirus |
| CA2822747A1 (en) | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Arca Biopharma, Inc. | Use of s-(6-nitro-oxi-hexahydro-furo[3,2-b]thioacetate in the treatment of cardiovascular disorders associated with oxide synthase dysfunction |
| US8383793B2 (en) | 2010-04-15 | 2013-02-26 | St. Jude Children's Research Hospital | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of cancer resistant to anaplastic lymphoma kinase (ALK) kinase inhibitors |
| DE102010025161A1 (de) * | 2010-06-25 | 2011-12-29 | Qiagen Gmbh | Verfahren zum Nachweis von Ribonukleinsäuren |
| AU2011274789B2 (en) | 2010-07-07 | 2014-04-10 | The Regents Of The University Of Michigan | Diagnosis and treatment of breast cancer |
| EP2616555B1 (en) | 2010-09-16 | 2017-11-08 | Gen-Probe Incorporated | Capture probes immobilizable via l-nucleotide tail |
| US10233501B2 (en) | 2010-10-19 | 2019-03-19 | Northwestern University | Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment |
| US20150218639A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-08-06 | Northwestern University | Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment |
| US10093981B2 (en) | 2010-10-19 | 2018-10-09 | Northwestern University | Compositions and methods for identifying depressive disorders |
| US20150225792A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-08-13 | Northwestern University | Compositions and methods for identifying depressive disorders |
| GB201017978D0 (en) | 2010-10-25 | 2010-12-08 | Oxitec Ltd | Multiplex amplification and detection |
| EP2640854B1 (en) | 2010-11-19 | 2018-02-21 | The Regents Of The University Of Michigan | PCAT1 ncRNA AND USES THEREOF |
| US8945556B2 (en) | 2010-11-19 | 2015-02-03 | The Regents Of The University Of Michigan | RAF gene fusions |
| CA2824277C (en) | 2011-01-04 | 2021-08-31 | Jennerex, Inc. | Generation of antibodies to tumor antigens and generation of tumor specific complement dependent cytotoxicity by administration of oncolytic vaccinia virus |
| US10245255B2 (en) | 2011-02-14 | 2019-04-02 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for the treatment of obesity and related disorders |
| WO2012116308A1 (en) | 2011-02-24 | 2012-08-30 | Gen-Probe Incorporated | Systems and methods for distinguishing optical signals of different modulation frequencies in an optical signal detector |
| US20140057295A1 (en) | 2011-02-28 | 2014-02-27 | Barbara J. Stegmann | Anti-mullerian hormone changes in pregnancy and prediction of adverse pregnancy outcomes and gender |
| AU2012226530B2 (en) | 2011-03-08 | 2016-12-01 | King Abdullah University Of Science And Technology | Molecular biomarker set for early detection of ovarian cancer |
| US9364532B2 (en) | 2011-06-08 | 2016-06-14 | Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. | Compositions and methods for glioblastoma treatment |
| WO2013036799A2 (en) | 2011-09-09 | 2013-03-14 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods and compositions involving nkg2d inhibitors and cancer |
| EP2758547B1 (en) | 2011-09-21 | 2015-09-16 | Gen-Probe Incorporated | Methods for amplifying nucleic acid using tag-mediated displacement |
| CA2853760A1 (en) | 2011-11-04 | 2013-05-10 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer |
| US9863004B2 (en) | 2011-11-04 | 2018-01-09 | Gen-Probe Incorporated | Molecular assay reagents and methods |
| EP2795333A4 (en) | 2011-12-20 | 2016-02-17 | Univ Michigan | PSEUDOGENS AND USES THEREOF |
| WO2013096799A1 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems and methods for isolating nucleic acids from cellular samples |
| WO2013096838A2 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems and methods for isolating nucleic acids |
| US9970061B2 (en) | 2011-12-27 | 2018-05-15 | Ibis Biosciences, Inc. | Bioagent detection oligonucleotides |
| AU2013208757A1 (en) | 2012-01-09 | 2014-07-24 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer |
| CN114717296A (zh) | 2012-02-03 | 2022-07-08 | 加州理工学院 | 多路生化测定中信号的编码和解码 |
| US9506117B2 (en) | 2012-02-21 | 2016-11-29 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer |
| WO2013132354A2 (en) | 2012-03-06 | 2013-09-12 | Oslo Universitetssykehus Hf | Gene signatures associated with efficacy of postmastectomy radiotherapy in breast cancer |
| EP2834370B1 (en) | 2012-04-03 | 2019-01-02 | The Regents Of The University Of Michigan | Biomarker associated with irritable bowel syndrome and crohn's disease |
| WO2014005076A2 (en) | 2012-06-29 | 2014-01-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and biomarkers for detection of kidney disorders |
| IN2015DN01609A (ja) | 2012-08-03 | 2015-07-03 | California Inst Of Techn | |
| US11035005B2 (en) | 2012-08-16 | 2021-06-15 | Decipher Biosciences, Inc. | Cancer diagnostics using biomarkers |
| CN104838017B (zh) * | 2013-01-10 | 2017-07-21 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 高分辨率解链的改进校准 |
| US10125373B2 (en) | 2013-01-22 | 2018-11-13 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Geminiviral vector for expression of rituximab |
| CN105658790A (zh) | 2013-02-21 | 2016-06-08 | 东安大略研究所儿童医院有限公司 | 疫苗组合物 |
| US10640808B2 (en) | 2013-03-13 | 2020-05-05 | Abbott Molecular Inc. | Systems and methods for isolating nucleic acids |
| AU2013202805B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-07-16 | Gen-Probe Incorporated | System and method for extending the capabilities of a diagnostic analyzer |
| CN105378107A (zh) | 2013-03-14 | 2016-03-02 | 雅培分子公司 | 多重甲基化-特异性扩增系统和方法 |
| AU2013202788B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-10-01 | Gen-Probe Incorporated | Indexing signal detection module |
| WO2014179734A1 (en) | 2013-05-02 | 2014-11-06 | The Regents Of The University Of Michigan | Deuterated amlexanox |
| EP3000065A4 (en) | 2013-05-23 | 2017-01-18 | Iphenotype LLC | Phenotypic integrated social search database and method |
| MX2016004283A (es) | 2013-10-03 | 2016-10-12 | Oklahoma Med Res Found | Biomarcadores para la actividad, e intesidad y arrebato de la enfermedad lupus eritematoso sistemico. |
| WO2015089438A1 (en) | 2013-12-13 | 2015-06-18 | Northwestern University | Biomarkers for post-traumatic stress states |
| EP3151733B1 (en) | 2014-06-06 | 2020-04-15 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for characterizing and diagnosing periodontal disease |
| EP3224362A4 (en) | 2014-11-26 | 2018-06-06 | The Regents of The University of California | Therapeutic compositions comprising transcription factors and methods of making and using the same |
| WO2016196478A1 (en) | 2015-06-01 | 2016-12-08 | St. Jude Children's Research Hospital | Methods and compositions for prognostications and/or clinical management of graft-versus-host disease and transplant rejection |
| CA3012425C (en) | 2016-01-25 | 2023-09-12 | Bio-Rad Innovations | Digital microbiology |
| EP3407974A4 (en) | 2016-01-29 | 2019-08-28 | The Regents Of The University Of Michigan | ANALOGUES OF AMLEXANOX |
| CN116083543A (zh) | 2016-04-01 | 2023-05-09 | 克罗玛科德公司 | 用于工程化信号产生的竞争性探针 |
| CN109642252A (zh) | 2016-06-17 | 2019-04-16 | 加州理工学院 | 核酸反应及相关方法和组合物 |
| WO2018013509A1 (en) | 2016-07-11 | 2018-01-18 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Compositions and methods for diagnosing and treating arrhythmias |
| EP3504348B1 (en) | 2016-08-24 | 2022-12-14 | Decipher Biosciences, Inc. | Use of genomic signatures to predict responsiveness of patients with prostate cancer to post-operative radiation therapy |
| WO2018127786A1 (en) | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Oslo Universitetssykehus Hf | Compositions and methods for determining a treatment course of action |
| WO2018132916A1 (en) | 2017-01-20 | 2018-07-26 | Genomedx Biosciences, Inc. | Molecular subtyping, prognosis, and treatment of bladder cancer |
| EP3574114B1 (en) | 2017-01-26 | 2022-06-29 | Oklahoma Medical Research Foundation | Biomarkers for systemic lupus erythematosus disease activity, and intensity and flare |
| US11873532B2 (en) | 2017-03-09 | 2024-01-16 | Decipher Biosciences, Inc. | Subtyping prostate cancer to predict response to hormone therapy |
| WO2018205035A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | Genomedx Biosciences, Inc | Genetic signatures to predict prostate cancer metastasis and identify tumor agressiveness |
| EP3714043A4 (en) | 2017-11-22 | 2021-08-11 | The Regents of The University of Michigan | COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF CANCER |
| WO2019202536A1 (en) | 2018-04-18 | 2019-10-24 | St. Jude Children's Research Hospital | Genotyping assays to identify mutations in xaf1 |
| EP3788377A1 (en) | 2018-05-04 | 2021-03-10 | Abbott Laboratories | Hbv diagnostic, prognostic, and therapeutic methods and products |
| EP3867645B1 (en) | 2018-10-18 | 2024-06-05 | Oklahoma Medical Research Foundation | Biomarkers for a systemic lupus erythematosus (sle) disease activity immune index that characterizes disease activity |
| US11733242B2 (en) | 2018-10-31 | 2023-08-22 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Biomarkers and methods of use for radiation-induced lung injury |
| WO2023021330A1 (en) | 2021-08-16 | 2023-02-23 | University Of Oslo | Compositions and methods for determining a treatment course of action |
| WO2023023673A2 (en) | 2021-08-20 | 2023-02-23 | Kasa Bio, L.L.C. | Compositions and methods for multiplex detection of mirna and other polynucelotides |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5823795A (ja) * | 1981-07-17 | 1983-02-12 | アモコ・コ−ポレ−ション | ポリヌクレオチドの検定方法およびこの方法に用いる反応剤 |
| JPS60166695A (ja) * | 1984-02-09 | 1985-08-29 | Wakunaga Seiyaku Kk | オリゴヌクレオチド誘導体およびその製造法 |
| JPS60244300A (ja) * | 1984-05-07 | 1985-12-04 | アライド―シグナル・インコーポレーテッド | 組換えタンパク質を用いる置換ポリヌクレオチド検定および診断用キツド |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4407942A (en) * | 1981-01-29 | 1983-10-04 | Atomic Energy Of Canada Limited | Fluorescent detection of DNA damage |
| US4562159A (en) * | 1981-03-31 | 1985-12-31 | Albert Einstein College Of Medicine, A Division Of Yeshiva Univ. | Diagnostic test for hepatitis B virus |
| CA1180647A (en) * | 1981-07-17 | 1985-01-08 | Cavit Akin | Light-emitting polynucleotide hybridization diagnostic method |
| US4568649A (en) * | 1983-02-22 | 1986-02-04 | Immunex Corporation | Immediate ligand detection assay |
| GB8311905D0 (en) * | 1983-04-29 | 1983-06-02 | Cox R A | Isolation and detection of nucleotide sequence |
| US4626501A (en) * | 1983-09-02 | 1986-12-02 | Integrated Genetics, Inc. | Labeled DNA |
| US4670379A (en) * | 1984-12-19 | 1987-06-02 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Polynucleotide hydridization assays employing catalyzed luminescence |
| CA1273552A (en) * | 1985-12-23 | 1990-09-04 | Michael J. Heller | Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization assays |
| US4868103A (en) * | 1986-02-19 | 1989-09-19 | Enzo Biochem, Inc. | Analyte detection by means of energy transfer |
-
1987
- 1987-01-09 EP EP87300195A patent/EP0232967B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-09 AT AT87300195T patent/ATE88761T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-01-09 DE DE8787300195T patent/DE3785591T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-10 JP JP62003905A patent/JP2619866B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1987-04-27 CA CA000535665A patent/CA1296242C/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-07-30 US US07/559,315 patent/US5928862A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5823795A (ja) * | 1981-07-17 | 1983-02-12 | アモコ・コ−ポレ−ション | ポリヌクレオチドの検定方法およびこの方法に用いる反応剤 |
| JPS60166695A (ja) * | 1984-02-09 | 1985-08-29 | Wakunaga Seiyaku Kk | オリゴヌクレオチド誘導体およびその製造法 |
| JPS60244300A (ja) * | 1984-05-07 | 1985-12-04 | アライド―シグナル・インコーポレーテッド | 組換えタンパク質を用いる置換ポリヌクレオチド検定および診断用キツド |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02245663A (ja) * | 1988-12-16 | 1990-10-01 | Ortho Diagnostic Syst Inc | 高度な特異的活性を有するヌクレオチドプローブの化学的製造方法 |
| JPH09504950A (ja) * | 1993-11-12 | 1997-05-20 | ザ パブリック ヘルス リサーチ インスティチュート オブ ザ シティー オブ ニューヨーク インク | 核酸検出用ハイブリダイゼーションプローブ、共通ステム、方法およびキット |
| JPH11506020A (ja) * | 1996-02-05 | 1999-06-02 | ザ パーキン―エルマー コーポレーション | 均質ｐｃｒハイブリダイゼーション系のための蛍光検出アッセイ |
| JP2006513701A (ja) * | 2002-10-11 | 2006-04-27 | アーラム バイオシステムズ インコーポレイテッド | 核酸ベースのシグナルトランスデューサーを含む立体構造的に敏感なプローブを有する標的検出システム |
| JP2010505440A (ja) * | 2006-10-12 | 2010-02-25 | ビオ−ラド・パストゥール | 核酸の蛍光検出のための二本鎖プローブ |
| JP2009261334A (ja) * | 2008-04-25 | 2009-11-12 | Japan Science & Technology Agency | 核酸応答性ゲルおよびその製造方法ならびにその利用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| DE3785591D1 (de) | 1993-06-03 |
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| US5928862A (en) | 1999-07-27 |
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