JP5800817B2 - 前立腺癌における再発性遺伝子融合 - Google Patents
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Description
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたCA069568、CA111275、およびCA132874の下で政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、癌マーカーを含むがこれに限定されない癌の診断、研究、および療法のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、前立腺癌のための診断マーカーおよび臨床標的としての再発性遺伝子融合に関する。
本発明の理解を容易にするために、いくつかの語句を下記に定義する。
本発明は、前立腺癌における再発性遺伝子融合の発見に基づいている。本発明は、遺伝子融合を直接的にまたは間接的にのいずれかで検出しまたは標的とする診断方法、研究方法、治療方法を提供する。本発明は、診断、研究、および治療の目的のための組成物も提供する。
本発明は、前立腺癌を示す再発性遺伝子融合を同定する。いくつかの実施態様において、遺伝子融合は、第一の遺伝子(例えば、雄性ホルモンで調節された遺伝子または他の遺伝子)およびRASまたはRAFファミリーメンバー遺伝子の転写調節領域の染色体再配列の結果である。遺伝子融合は典型的には、第一の遺伝子(例えば、UBE2L3、またはSLC45A3など雄性ホルモンで調節された遺伝子)の転写調節領域由来の5’部分と、ETSファミリーメンバー遺伝子由来の3’部分とを含む。再発性遺伝子融合は、前立腺癌のための診断マーカーおよび臨床標的としての使用を有する。
雄性ホルモンによって調節された遺伝子は、ヒト前立腺の正常な生理学的機能にとって決定的に重要である。この遺伝子は、前立腺癌腫の発達および進行にも寄与する。認識されたARGには、TMPRSS2、SLC45A3、HERV−K_22q11.23、C15ORF21、FLJ35294、CANT1、PSA、PSMA、KLK2、SNRK、セラジン(Seladin)−1、およびFKBP51(Paoloni−Giacobino et al., Genomics 44: 309 (1997);Velasco et al., Endocrinology 145(8): 3913 (2004))が挙げられるが、これらに限定されない。
E2酵素としても公知のユビキチン抱合酵素は、プロテアソームを介する分解のためのタンパク質を標的とするユビキチン化反応における第二の工程を実施する。ユビキチン化加工は、76のアミノ酸からなる短いタンパク質であるユビキチンを、標的タンパク質におけるリシン残基に共有結合させる。一旦、タンパク質が1つのユビキチン分子でタグ付けされると、追加的なラウンドのユビキチン化は、プロテアソームの19S調節粒子によって認識されるポリユビキチン鎖を形成し、プロテアソームの20S中心粒子への通過を許容する標的タンパク質のATP依存性変性を惹起し、20S中心粒子において、プロテアーゼは、細胞による再利用のために、標的を短いペプチド断片へと分解する。
Rasは、細胞のシグナル伝達に関与する低分子GTPaseをコードする遺伝子のファミリーである。Rasシグナル伝達の活性化は、細胞の増殖、分化、および生存の原因となる。Rasは、構造においてすべてが関連しかつ多様な細胞挙動を調節するタンパク質のRasスーパーファミリーの原型メンバーである。Rasタンパク質は、細胞内シグナル伝達ネットワークを制御する二成分分子スイッチとして機能する。Rasで調節されたシグナル経路は、アクチン細胞骨格統合性、増殖、分化、細胞接着、アポトーシス、および細胞遊走のようなプロセスを制御する。Rasおよびras関連タンパク質はしばしば、癌において脱調節され、増大した浸潤および転移、ならびに低下したアポトーシスをもたらす。
本発明の遺伝子融合タンパク質は、その断片、誘導体、および類似体を含め、免疫原として用いられ、下記に説明される診断方法、研究方法、および治療方法における使用を有する抗体を産生し得る。抗体は、ポリクローナル、またはモノクローナル、キメラ、ヒト化、一本鎖、またはFab断片であり得る。当業者に公知の種々の手順は、このような抗体および断片の産生および標識に用いられ得る。例えば、Burns, ed., Immunochemical Protocols, 3rd ed., Humana Press (2005);Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988);Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983);Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)を参照されたい。短縮ETSファミリーメンバータンパク質またはキメラタンパク質とその個々の天然タンパク質との差を活用する抗体または断片は、特に好ましい。
本明細書で説明される遺伝子融合は、DNA、RNA、またはタンパク質として検出可能である。まず、遺伝子融合は、第一の遺伝子由来の5’部分とRASまたはRAFファミリーメンバー遺伝子由来の3’部分とを有するゲノムDNAの染色体再配列として検出可能である。一旦転写されると、遺伝子融合は、第一の遺伝子由来の5’部分とRASまたはRAFファミリーメンバー遺伝子由来の3’部分とを有するキメラmRNAとして検出可能である。一旦翻訳されると、遺伝子融合は、第一のタンパク質由来の5’部分およびRASもしくはRAFファミリーメンバータンパク質由来の3’部分の融合、または第一のタンパク質またはRASもしくはRAFファミリーメンバーの短縮バージョンとして検出可能である。短縮タンパク質または融合タンパク質は、アミノ酸配列、翻訳後加工、および/または二次構造、三次構造、もしくは四次構造におけるそれらの個々の天然タンパク質とは異なり得る。このような差は、存在する場合、遺伝子融合の存在を同定するために使用することができる。具体的な検出方法は、下記により詳細に説明される。
遺伝子融合を含むことが疑われる任意の患者の試料は、本発明の方法に従って試験され得る。非限定例として、試料は、組織(例えば、前立腺生検試料または前立腺摘除術によって得られた組織試料)、血液、尿、精液、前立腺分泌物、またはそれらの画分(例えば、血漿、血清、尿上清、尿細胞ペレット、または前立腺細胞)であり得る。尿試料は好ましくは、前立腺由来の前立腺細胞を尿路へと流させる入念な直腸指診(DRE)の直後に回収される。
本発明の遺伝子融合は、核酸配列決定、核酸ハイブリダイゼーション、および核酸増幅を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の種々の核酸技術を用いてゲノムDNAまたはキメラmRNAの染色体再配列として検出され得る。
核酸配列決定技術の実例となる非限定例には、連鎖終止(サンガー)配列決定および色素終止配列決定が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、RNAが細胞においてあまり安定ではなく、ヌクレアーゼ攻撃の傾向がより高いので、実験的にRNAは通常、配列決定の前にDNAへと逆転写されることを認識する。
核酸ハイブリダイゼーション技術の実例となる非限定例には、in situハイブリダイゼーション(ISH)、マイクロアレイ、およびサザンブロットまたはノザンブロットが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施態様において、融合配列は、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を用いて検出される。本発明に好ましいFISHアッセイは、細菌人工染色体(BAC)を利用する。これらは、ヒトゲノム配列決定プロジェクトにおいて広範に用いられており(Nature 409: 953−958 (2001)参照)、具体的なBACを含むクローンは、多くの源を通じて位置づけられる流通業者、例えばNCBIを通じて入手可能である。ヒトゲノム由来の各BACクローンは、明瞭に同定する引用名称が与えられている。これらの名称を用いて、相応のGenBank配列を見出し、流通業者からのクローンのコピーを注文することができる。
異なる種類の生物アッセイは、マイクロアレイと呼ばれ、これには、DNAマイクロアレイ(例えば、cDNAマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ)、タンパク質マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、形質移入または細胞マイクロアレイ、化合物マイクロアレイ、および抗体マイクロアレイを含むがこれらに限定されない。遺伝子チップ、DNAチップ、またはバイオチップとして一般的に公知のDNAマイクロアレイは、何千もの遺伝子についての発現プロファイリングの目的のために、または遺伝子についての発現レベルを同時にモニターするためにアレイを形成する固相表面(例えば、ガラス、プラスチック、またはシリコンのチップ)に付着した顕微鏡レベルのDNAスポットの集積物である。マイクロアレイを用いて、疾患細胞および正常細胞における遺伝子発現を比較することによって、疾患遺伝子を同定することができる。マイクロアレイは、ガラススライドへの細く尖ったピンによる刻印、事前作製したマスクを用いたフォトリソグラフィー、動的マイクロミラー装置を用いたフォトリソグラフィー、インクジェット刻印、または微小電極アレイにおける電気化学を含むがこれらに限定されない種々の技法を用いて作製することができる。
ゲノムDNAおよびキメラmRNAの染色体再配列は、検出の前にまたは検出と同時に増幅され得る。核酸増幅技術の実例となる非限定例には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、転写仲介性増幅(TMA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、および核酸配列ベースの増幅(NASBA)が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、ある増幅技術(例えば、PCR)が、RNAが増幅前にDNAに逆転写されることを必要とするのに対し、他の増幅技術が、RNAを直接増幅する(例えば、TMAおよびNASBA)ことを認識する。
増幅していないまたは増幅した遺伝子融合核酸は、任意の従来手段によって検出されることができる。例えば、遺伝子融合は、検出可能に標識されたプローブを用いたハイブリダイゼーションおよび結果として生じるハイブリッドの測定によって検出されることができる。検出方法の実例となる非限定例を下記に説明する。
1つの実例となる検出方法であるハイブリダイゼーション保護アッセイ(HPA)は、化学発光オリゴヌクレオチドプローブ(例えば、アクリジニウムエステル標識した(AE)プローブ)を標的配列とハイブリダイズさせること、ハイブリダイズしていないプローブに存在する化学発光標識を選択的に加水分解すること、およびルミノメーターにおける残存プローブから生じる化学発光を測定することを包含する。例えば、米国特許第5,283,174号およびNorman C. Nelson et al., Nonisotopic Probing, Blotting, and Sequencing, 第17章(それらのすべての内容が引用により本明細書に各々組み込まれるLarry J. Kricka ed., 2d ed. 1995)を参照されたい。
本発明の遺伝子融合は、タンパク質配列決定およびイムノアッセイを含むがこれらに限定されない当業者に公知の種々のタンパク質技術を用いて、短縮タンパク質またはキメラタンパク質として検出され得る。
タンパク質配列決定技術に関する実例となる非限定例には、質量分析およびエドマン分解が挙げられるが、これらに限定されない。
イムノアッセイの実例となる非限定例には、免疫沈降、ウェスタンブロット、ELISA、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、およびイムノPCRが挙げられるが、これらに限定されない。当業者に公知の種々の技術を用いて検出可能に標識された(例えば、比色、蛍光、化学発光、または放射能)ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、イムノアッセイにおける使用に好適である。
いくつかの実施態様において、コンピュータベースの分析プログラムを用いて、検出アッセイによって生じた生データ(例えば、所与の遺伝子融合または他のマーカーの存在、不在、または量)を臨床医用の推定値のデータへと翻訳する。臨床医は、任意の好適な手段を用いて推定データにアクセスできる。したがって、いくつかの好ましい実施態様において、本発明は、遺伝学または分子生物学で訓練されていないような臨床医が、生データを理解する必要がない更なる利点を提供する。データは、最も有用な形態で臨床医に直接呈される。臨床医は次に、対象のケアを最適化するために、情報を即時利用することができる。
本発明の遺伝子融合はまた、放射性核種画像、陽電子放射形断層撮影法(PET)、コンピュータ化した軸断層撮影法、X線または磁気共鳴画像法、蛍光検出、および化学発光検出を含むがこれらに限定されないインビボ撮像技術を用いて検出され得る。いくつかの実施態様において、インビボ撮像技術を用いて、動物(例えば、ヒト、または非ヒト哺乳類)における癌マーカーの存在または発現を可視化する。例えば、いくつかの実施態様において、癌マーカーmRNAまたはタンパク質は、癌マーカーに特異的な標識済み抗体を用いて標識される。特異的に結合しかつ標識された抗体は、放射線核種画像法、陽電子放射形断層撮影法、コンピュータ化軸断層撮影法、X線または磁気共鳴画像法、蛍光検出、および化学発光検出を含むがこれらに限定されないインビボ画像法を用いて個体において検出されることができる。本発明の癌マーカーに対する抗体を生じるための方法は、下記に説明される。
これらの任意の組成物は単独で、または本発明の他の組成物との組み合わせで、キットの形態で提供され得る。例えば、単一の標識済みプローブおよび対の増幅オリゴヌクレオチドは、本発明の遺伝子融合の増幅および検出のためのキットにおいて提供され得る。キットはさらに、適切な対照および/または検出試薬を含み得る。本発明のプローブおよび抗体組成物はアレイの形態でも提供され得る。
いくつかの実施態様において、本発明は、(例えば抗癌薬をスクリーニングするための)薬物スクリーニングアッセイを提供する。本発明のスクリーニング方法は、本発明の方法を用いて同定された癌マーカーを利用する(例えば、本発明の遺伝子融合を含むがこれに限定されない)。例えば、いくつかの実施態様において、本発明は、遺伝子融合の発現を変化させる(例えば、低下させる)化合物をスクリーニングする方法を提供する。化合物または薬剤は、例えば、プロモーター領域と相互作用することによって、転写に干渉し得る。化合物または薬剤は融合によって(例えば、RNA干渉またはアンチセンス技術などによって)生産されたmRNAに干渉し得る。化合物または薬剤は、融合の生物活性の上流または下流である経路に干渉し得る。いくつかの実施態様において、候補化合物は、癌マーカーに対して向けられるアンチセンスまたは干渉RNA薬(例えば、オリゴヌクレオチド)である。他の実施態様において、候補化合物は、本発明の癌マーカー調節因子または発現産物に特異的に結合しかつその生物機能を阻害する抗体または低分子である。
本発明は、本発明の外生の癌マーカー遺伝子(例えば、遺伝子融合)またはその突然変異体およびバリアント(例えば、トランケーションまたは単一ヌクレオチド多型)を含むトランスジェニック動物の作出を熟慮する。好ましい実施態様において、トランスジェニック動物は、野生型動物と比較して変化した表現型(例えば、マーカーの増大したまたは低下した存在)を示す。このような表現型の存在または不在を分析するための方法には、本明細書に開示されたものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの好ましい実施態様において、トランスジェニック動物はさらに、腫瘍の亢進したもしくは低下した発達、または癌の証拠を示す。
以下の実施例は、本発明のある好ましい実施形態および態様を示しかつさらに説明するために提供されるものであり、その範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
(材料および方法)
(全長融合転写産物のクローニング)
全長の融合転写産物SLC45A3−BRAFおよびRAF−ESRP1をpCR8/GW/TOPOエントリーベクター(Invitrogen, USA)へと、製造元の説明書にしたがってTAクローニング法によってクローン化した。融合転写産物を後に、Gateway pcDNADEST40哺乳類発現ベクター(Invitrogen, USA)およびpAd/CMV/V5−DEESTアデノウイルス発現系(Invitrogen, USA)へと、製造元の説明書にしたがってLRクロナーゼII酵素反応によって組換えた。
ESRP1−RAF1融合陽性前立腺癌組織および融合陰性組織をNP溶解緩衝液(50 mM Tris−HCl, 1%NP40, pH 7.4, Sigma, St. Louis, MO)、および完全プロテアーゼ阻害薬混合物(Roche, Indianapolis, IN)、およびホスファターゼ阻害剤(EMD bioscience, San Diego. CA)において均質化した。融合陽性組織における融合タンパク質の発現を試験し、分子量を評価するために、HEK293細胞にESRP1−RAF1融合コンストラクト(pDEST40発現ベクターにおいてクローン化−Invitrogen, Carlsbad CA)およびベクター対照を形質移入し、プロテアーゼ阻害剤を有するNP40溶解緩衝液において溶解した。15マイクログラムの各タンパク質抽出物を試料緩衝液中で煮沸し、SDS−PAGEによって分離し、ポリビニリデンジフルオリドメンブレンへと転写した(GE Healthcare, Piscatawa, NJ)。メンブレンをブロッキング緩衝液(トリス緩衝塩類溶液、0.1%トゥイーン(TBS−T)、5%無脂肪乾燥乳)において1時間インキュベートし、抗RAF1マウスモノクローナル抗体(ブロッキング緩衝液中で1:1000、BD bioscience, San Jose, CA, カタログ番号610151)とともに4℃で一晩インキュベートした。TBS−Tによる3回の洗浄後、ブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合二次抗体とともにインキュベートし、シグナルを製造元(GE Healthcare)によって説明されるように高感度化学発光系によって可視化した。ブロットを抗ベータアクチンマウスモノクローナル(1:5000、Sigmaカタログ番号A5441)抗体で再度プローブした。
製造元のプロトコール(Roche Applied Sciences)にしたがって、Fugene 6を用いて形質移入を実施した。35mmプラスチック皿におけるNIH3T3細胞(1.5×105)に目的の2μgのプラスミドDNAを形質移入した。融合転写産物SLC45A3−Braf、エクソン8−Braf、エクソン10−Braf、および突然変異体V600Eについてのプラスミドを、対照プラスミド(それぞれpDEST40およびpBABE)とともに用いた。形質移入の3日後、細胞を5%CS入りのDMEM(Life Technologies)を含む140mmの皿へと分けた。培養物に3〜4日間ごとに養分を与えた。3週間後、5%CS入りのDMEMにおいて培養した細胞を遺伝子座の可視化のために70%エタノールにおける0.2%クリスタルバイオレットで染色し、コロニー計数装置で計数した(Oxford Optronix Ltd., Oxford UK, ソフトウェアv4.1, 2003)。遺伝子座の計数を手動でさらに確認した。
各処理について、等量の細胞を96ウェルプレートへとWST−1アッセイのために、Boyden浸潤チャンバーへと浸潤アッセイのために蒔種した。WST−1増殖アッセイを製造元のプロトコール(Roche, Indianapolis, IN, USA)を用いて実施した。浸潤アッセイを、すでに説明されたとおりに実施した(Kleer et al. PNAS 2003、Cao et al. Oncogene 2008)。
新鮮凍結限局性前立腺癌(n=42)、転移性前立腺癌(n=21)、および良性前立腺(n=5)の組織試料から単離された1〜2μgの全RNA、ならびに黒色腫(11)、膵癌(8)、および乳癌(8)の細胞株のパネルを、製造元の説明書にしたがって、Superscript II逆転写酵素(Invitrogen)を用いてcDNAへと変換した。ビオチン化した配列決定テンプレートを、製造元の説明書にしたがって、PyroMark Q24 BRAFキット(Biotage−Qiagen)からプライマーを用いてBRAF遺伝子のコドン600における突然変異(V600E、エクソン15)に及ぶ375bp断片のPCR増幅によって生じた。10マイクロリットルのビオチン化PCR産物をストレプトアビジン被覆したセファロースビーズ(高性能ストレプトアビジンセファロース、GE Healthcare)において、Pyromark Q24真空プレップワークステーションを用いて固定した後、水酸化ナトリウム変性によってビオチン化していない鎖を除去した後、中和緩衝液および70%エタノールにおいて洗浄した。次に、一本鎖ビオチン化テンプレートを0.3mM配列決定プライマーと混合し、「合成による配列決定」を、先に説明したように、PyroMark Q24プラットフォームを用いて問題のヌクレオチド配列の配剤を通じて実施した(Edlundh−Rose, Egyhazi et al. Melanoma Res. 16:471 2006;Spittle, Ward et al. J. Mol. Diagn. 9:464 2007)。コドン600についてのヌクレオチド配列ACAGA/TGAAA(配列番号4)を分析し、Pyromark Q24 1.0.10ソフトウェアによって可視化した。公知の突然変異状態を有する9個の黒色腫細胞株のパネル(sk−mel−2、sk−mel−5、sk−mel−19、sk−mel−28、sk−mel−29、sk−mel−103、G−361、Malme−3M、mel−1)を用いて、アッセイ標準物質として供した。
定量的PCR(QPCR)を、Applied Biosystems Step One Plus Real Time PCR SystemにおけるPower SYBR Green Mastermix(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて実施した。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーをIntegrated DNA Technologies (Coralville, IA)から得ており、表3に列挙する。GAPDHプライマーを対照として用いた。すべてのアッセイを2回反復して実施し、結果をGAPDHに対する平均倍数変化としてプロットした。
FISHハイブリダイゼーションを、前立腺癌組織マイクロアレイ(TMA)および個々の切片を用いて、腫瘍細胞に関して実施した。BACクローンをUCSCゲノムブラウザから選択し、BACPAC源(Children’s Hospital, Oakland, CA)を通じて購入した。コロニー精製の後、中間量の調製DNAをQiagenTips−100(Qiagen, USA)を用いて調製した。DNAをビオチン−16−dUTPおよびジゴキシゲニン−11−dUTPを用いるニック翻訳法(Roche, USA)によって標識した。プローブDNAを沈殿させ、50%ホルムアミド、2×SSC、10%硫酸デキストラン、および1%デンハルト溶液を含むハイブリダイゼーション混合物において溶解した。約200ngの標識済みプローブを正常ヒト染色体とハイブリダイズさせ、各BACクローンのマップ位置を確認した。FISHシグナルを、抗ジゴキシゲニン−フルオレセインおよびアレクサフルオル594抱合体を用いて得、緑色および赤色をそれぞれ得た。蛍光画像を、ISIS画像処理ソフトウェア(Metasystems, Germany)によって制御された高解像度CCDカメラを用いて捕捉した。
SLC45A3−BRAF融合転写産物は、エクソン8を先へ転写すると推定され(図10に強調)、それゆえ、BRAFのキナーゼドメインも含む。図11は、染色体間遺伝子融合転写産物SLC45A1−BRAFの対形成した末端トランスクリプトーム発見を示す。図12は、癌によるBRAF融合転写産物を示す。図13は、いくつかの遺伝子の発現レベルの箱プロットを示す。図14は、SLC45A3の雄性ホルモン調節を示す。左上のパネルは、SLC45A3が雄性ホルモン処理に応答することを示すRNA−Seq遺伝子発現を示す。右上のパネルは、SLC45A3のAR調節の定量的RT−PCR確認を示す。右下のパネルは、SLC45A3のERGおよびAR調節を表すChIP−Seqピークを強調するUCSCスクリーンショットを示す。
(A.材料および方法)
(急性リンパ芽球性白血病および前立腺癌についてのアレイCGH/SNPデータセットの分析)
Affymetrix SNPアレイについて、モデルベースの発現を実施して、各プローブセットについてのシグナル強度を、完全マッチ/ミスマッチ(PM/MM)モデルを用いて要約した。コピー数の干渉について、各SNPプローブセットの要約されたシグナル強度を、複相体基準セットの試料と比較することによって、試料の生コピー数を各腫瘍試料について算出した。Agilent2チャネルアレイCGHデータセットにおいて、処理された試験チャネルシグナルと処理された基準チャネルシグナルとの差次的な比を算出した。結果として生じる相対的なDNAコピー数データすべてをlog2変換し、それは、試験試料と基準試料の間のDNAコピー数を反映する。コピー数の概算の正確性を改良するために、基準セットの標準化方法を採用した。各試料について、非性染色体を30Mb領域単位に分けた。各領域由来のプローブについての相対的なDNAコピー数データの絶対平均を算出し、他の領域と比較した。各試料において最小の絶対平均を有する2つの領域由来のプローブを、最小のDNAコピー数異常を有する染色体領域を表す内部基準セットとして拾い上げた。各試料について、ログ比を基準プローブセットについて0モデル仮定の下で0の平均で正常分布に変換した。標準化方法をパールプログラミングによって実施した。
ABRA分析は3工程を有する。第一に、アレイCGHまたはアレイSNPデータセット由来のコピー数データを環状二進法セグメント化(CBS)アルゴリズムによってセグメント化した(Karnoub et al., Nat Rev Mol Cell Biol 9, 517 (Jul, 2008))。増幅レベルを、増幅の相対的コピー数データを隣接するセグメントと比較することによって決定し、2コピー数以上の増加を有する不連続点を選択した(≧0.75)。500kb超にわたる増幅は、分析に含まれる。各増幅不連続点のゲノム位置を、すべてのヒト遺伝子のゲノム領域でマッピングした。各ヒト遺伝子のゲノム領域を、遺伝子の5’に最も接近する転写産物バリアントの開始、および遺伝子の3’に最も接近するバリアントの終了として指定した。部分的に増幅された遺伝子を増幅の不連続点と遺伝子配置との関係に基づいて、候補5’および3’パートナーへと分類した。5’増幅した遺伝子は、5’パートナーとして考えられ、3’増幅した遺伝子は、3’パートナーとして考えられる。第二に、部分的に増幅した「癌遺伝子」を駆動融合遺伝子候補物として同定した。このことは、癌遺伝子人口調査によって規定された公知の癌遺伝子に3’増幅した遺伝子をマッピングすることによって達成された。癌の根底にある部分的に増幅された遺伝子の関連性を評価するために、公知の癌遺伝子において頻繁に見出される「分子概念」との関係に基づいて生物学的に意味のある遺伝子を優先的に同定することのできる「概念署名技術」(ConSig)法(Moul et al., Prostate 20, 327 (1992))を用いた。このスコアは、3’融合遺伝子とは特に区別される(Moul et al., 上述)。許容し得る不連続点(下記の基準、図20A参照)を有する3’増幅した遺伝子を、(簡潔なConSigスコアにおける)それらの放射状概念署名スコアによって階級分けした。上位にスコア化された3’増幅した癌遺伝子は、駆動融合遺伝子候補物として考えられた。第三に、選択された3’増幅された遺伝子についての増幅レベルを、推定5’パートナーを指名するための同じ細胞株から5’増幅した遺伝子とマッチさせた。不連続点の実際の位置および質を、DNAコピー数データのセグメント化されていない相対的な定量で手動で管理した。増幅不連続点が許容し得ない場合の状況は、(図20)である:
(1)複数の遺伝子内不連続点;
(2)候補は、増幅不連続点に最も近い遺伝子ではなく;
(3)増幅は、既存のコピー数の増加から開始し、不連続点は鋭くはなく;
(4)不連続点は、染色体の動原体または末端に位置し;
(5)不連続点は、増幅内の小さな欠失の結果であり;
(6)不連続点は、大部分の試料において見出される。
良性不死化前立腺細胞株RWPE、前立腺癌細胞株DU145、PC3、Ca−HPV−10、WPE1−NB26、およびNCI−H660、線維芽細胞株NIH3T3、ならびにヒト胚性腎臓細胞株HEKをアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関,(Manassas, VA)から得た。初代良性前立腺上皮細胞(PrEC)をCambrex Bio Science(Walkersville, MD)から得た。VCaPは、ホルモン難治性転移性前立腺癌を有する患者からの脊椎転移に由来した(Seeburg et al., Nature 312, 71 (Nov 1−7, 1984))。組織は、両方ともミシガン大学前立腺癌専門優良研究(University of Michigan Prostate Cancer Specialized Program of Research Excellence)(S.P.O.R.E.)組織コアの一部であるミシガン大学(University of Michigan)における前立腺全摘除術および迅速剖検材料からであった。組織は、ウルム大学病院(University Hospital Ulm)(Ulm, Germany)において前立腺全摘除術からも得た。患者にインフォームドコンセントとともに、各施設において事前に施設内治験審査委員会の認可をうけ、すべての試料を回収した。良性前立腺組織全RNAのプールをClontech実験室(Mountain View, CA)から得た。すべての試料由来の全RNAを製造元のプロトコールに従ってトリゾール(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて単離した。RNAの完全性をAgilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)によって確認した。
前立腺癌細胞株における潜在的な駆動遺伝子融合を指名するために、22RV1、C4−2B、CA−hpv−10、DU145、LAPC4、MDAPCa−2b、NCI660、PC3、VCaP、およびWPE1−NB26を含む10の前立腺癌細胞株をAgilent−014698 Human Genome CGH Microarray 105A(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)に関して表した。すべての細胞株を、流通業者の説明書に従って、全血清において増殖させた。細胞株から抽出されたゲノムDNAを、製造元のプロトコールに従って、アレイフォーマットにおいて印字されたオリゴヌクレオチドに対する基準ヒト雄性ゲノムDNA(6個の正常個体、Promega, #G1471)に対してハイブリダイズした。各プローブについての蛍光強度分析は、正常基準ゲノムに対する癌細胞株のコピー数変化を検出した(2004年に構築されたゲノム)。DU145の複製アレイCGHハイブリダイゼーションを実施して、KRASの5’パートナーを指名した。
DU145 mRNA試料を、製造元のプロトコールに従ってmRNA−seq試料調製キット(Illumina)を用いて配列決定するために調製した。生の配列決定画像データを、非マスクヒト基準ゲノム(NCBI v36, hg18)に対して整列したIllumina分析パイプラインによって、ELANDソフトウェア(Illumina)を用いて分析した。次に、対形成した読み取りを、すでに説明したように分析して、符合対キメラを指名した(Schubbert, K. Shannon, G. Bollag, Nat Rev Cancer 7, 295 (Apr, 2007))。
相補的DNAを1マイクログラムの全RNAから、SuperScript III(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、ランダムプライマーの存在下で合成した。反応は、50℃で60分間実施し、製造元の説明書に従ってミクロコンYM−30(Millipore Corp, Bedford, MA, USA)を用いてcDNAを精製し、PCRにおいてテンプレートとして用いた。本研究において用いられるすべてのオリゴヌクレオチドプライマーを、集積DNA技術(Coralville, IA)によって合成し、表10に列挙する。ポリメラーゼ連鎖反応を、白金Taq高忠実度および融合特異的プライマーを用いて35周期の間実施した。生成物を1.5%アガロースゲルにおける電気泳動によって分離し、バンドを切り出し、精製し、pCR 4−TOPO TAベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)へとTOPO TAクローン化した。少なくとも4つのコロニー由来の精製済みプラスミドDNAを、ミシガン大学(University of Michigan)DNA Sequenccing CoreにおいてABI Model 3730自動配列決定装置においてM13逆方向プライマーおよびM13順方向プライマーを用いて二方向的に配列決定した。
定量的PCR(qPCR)を、StepOne Real Time PCRシステム(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて実施した。簡潔には、反応を、SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)cDNAテンプレートならびに25ngの順方向および逆方向の両融合プライマーとともに、製造元の推奨した温熱周期条件を用いて実施した。各実験において、閾値レベルを、StepOneソフトウェアを用いたQPCR反応の指数関数的位相の間に設定した。各試料についてのハウスキーピング遺伝子であるグリセロアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素(GAPDH)に対する各標的遺伝子の量を、比較閾値周期(Ct)法を用いて決定した(Applied Biosystems User Bulletin #2)。図16のbに呈される実験については、標的遺伝子の相対量を、良性前立腺由来の相対量に対して較正した。細胞株および組織試料のサブセットについては、TaqmanプローブCAGCAACCAAAACC(配列番号40)を用いてqPCRを実施した。融合qPCRによる≧10のRQ値を有する試料を融合陽性と考えた。
cDNA末端のRNAリガーゼ仲介性急速増幅を、製造元の説明書に従ってGeneRacer RLM−RACEキット(Invitrogen)を用いて実施した。qPCRによって高いUBE2L3−KRAS発現レベルを有する前立腺細胞株DU145ならびに組織試料PCA1−3およびMET10を5’RACEのために選択した。簡潔には、2マイクログラムの全RNAをウシ小腸ホスファターゼで処理し、短縮mRNAおよび非mRNAから5’リン酸を除去し、タバコ酸性ピロホスファターゼでキャップを外した。GeneRacer RNA Oligoを全長の転写産物に連結し、SuperScript IIIを用いて逆転写した。5’末端を得るために、第一の鎖のcDNAを、GeneRacer5’およびKRAS R2プライマー対を用いて白金Taq高忠実度(Invitrogen)で増幅した。次に、ネステッドPCRをGeneRacer5’でネステッドプライマーおよびKRAS R3またはR4プライマーを用いて実施した。先に説明した通り、産物を1.5%アガロースゲルにおける電気泳動によって分解し、バンドを切り出し、精製し、および配列決定した。
UBE2L3とKRASとの融合を評価するために、2色2シグナルのFISH戦略を採用し、プローブは個々の遺伝子座に及んだ。ジゴキシン−dUTP標識したBACクローンRP11−317J15をUBE2L3遺伝子座に用い、ビオチン−14−dCTP BACクローンRP11−608F13をKRAS遺伝子座に用いた。KRAS遺伝子座における起こり得る転位を検出するために、不連続分離したFISH戦略を用い、2つのプローブはKRAS遺伝子座に及んだ(ジゴキシン−dUTP標識済みBACクローンRP11−68I23、(5’ KRAS)およびビオチン−14−dCTP標識済みBACクローンRP11−157L6(3’ KRAS))。すべてのBACクローンをChildren’s Hospital of Oakland Research Institute(CHORI)から得た。FISH分析の前に、すべてのプローブの完全性および純度を、正常末梢リンパ球の中期拡延に対するハイブリダイゼーションによって検証した。
前立腺癌細胞株DU145にUBE2L3(5’−CCACCGAAGATCACATTTA−3’;配列番号1)、KRAS(5’−GAAGTTATGGAATTCCTTT−3’;配列番号2)、または融合接合部(5’−CCGACCAAGGCCTGCTGAA−3’;配列番号3)に対するsiRNA二本鎖(Dharmacon, Lafayette, CO, USA)を、オリゴフェクタミン(Invitrogen)によって形質移入した。DU145に非標的siRNAを形質移入し、RWPE細胞を陰性対照として用いた。形質移入の48時間後、細胞をNP40溶解緩衝液(50 mMトリス−HCl, 1%NP40, pH 7.4, Sigma, St. Louis, MO)および完全プロテイナーゼ阻害薬混合物(Roche, Indianapolis, IN)において均質化した。拡タンパク質抽出物10マイクログラムを試料緩衝液中で煮沸しSDS−PAGEによって分離し、ポリビニリデンジフルオリドメンブレン(GE Healthcare, Piscataway, NJ)に転写した。メンブレンをブロッキング緩衝液[トリス緩衝塩類溶液, 0.1%トゥイーン(TBS−T), 5%無脂肪乾燥乳]中で1時間インキュベートし、以下の抗体とともに4℃で一晩インキュベートした:抗RASマウスモノクローナル抗体(ブロッキング緩衝液における1:1000、Milliporeカタログ番号05−516)、抗KRASウサギポリクローナル(1:1000、Proteintech Group Inc., カタログ番号12063−1−AP)、および抗ベータアクチンマウスモノクローナル(1:5000、Sigmaカタログ番号A5441)抗体。TBS−Tによる3回の洗浄の後、ブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合型二次抗体とともにインキュベートし、製造元(GE Healthcare)によって説明されるように、高感度化学発光系によってシグナルを可視化した。複数の前立腺由来細胞株における融合タンパク質発現を試験するために、未処理のまたは500nMのボルテゾミブで処理したかのいずれかであるDU145、PrEC、RWPE、22RV1、VCaP、PC3由来の可溶化液を用いた。UBE2L3−KRAS融合タンパク質を過剰発現するボルテゾミブ処理したHEK細胞を陽性対照として用いた。MAPKシグナル伝達経路の活性化を探索するために、UBE2L3−KRAS、V600E突然変異体BRAF、G12V突然変異体KRAS、およびベクター対照を発現するNIH3T3安定細胞株由来のタンパク質可溶化液をホスホMEK1/2、ホスホp38MAPK、ホスホAktを用いてプローブし、等量の負荷量を、個々の全タンパク質およびベータアクチンについてプローブすることによって示した。ERK活性化分析のために、NIH3T3細胞を、ホスホerk1/2抗体を用いたイムノブロット分析の12時間前に飢餓状態にした。MAPKシグナル伝達タンパク質についてのすべての抗体を、Cell Signaling Technologies から購入した。
Du145およびLnCaP細胞を70%培養密度まで増殖させ、ボルテゾミブで処理した。24時間後、細胞を収穫し、全細胞タンパク質可溶化液を、プロテアーゼ阻害薬完全ミニカクテル(Roche, Indianapolis, IN, USA)の添加を伴うRIPA緩衝液(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)において調製した。可溶化液を遠心分離によって清澄化し、SDS PAGE(Novex, 18%トリス−グリシン, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)によって分離した。15〜40kDa領域由来の12の等しい大きさのバンドをゲル中トリプシン消化のために切り出した。各ゲルの切片由来の凍結乾燥したペプチドを、各々安定して放射性標識した25fmolのペプチド内部標準物質(Sigma−Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA)を含む3%アセトニトリル、0.1%ギ酸において再懸濁した。次に、ペプチドを分離し、CHIP HPLC多重反応モニタリング質量分析(MRM−MS)によって分離および測定した。安定して放射性標識した各内部標準物質についての3回の移行および内在性ペプチドについての3回の移行を測定した。保持時間における各ペプチドについての6回の移行すべての重複は、陽性の測定結果を示した。
UBE2L3−KRASについての発現プラスミドをpDEST40(5’FLAGありまたはなし)およびpLenti−6ベクター(5’FLAGなし)を用いて作製した。NIH3T3細胞を10%FBSを有するDMEMにおいて維持し、pDEST40ベクタープラスミドまたはUBE2L3−KRASオープンリーディングフレームを含むpDEST40のいずれかを、Fugene 6形質移入試薬(Invitrogen)を用いて形質移入した。3日後、形質移入した細胞を500μg/mLゲネティシンを用いて選択した。選択の3週間後、安定した細胞株をベクターおよびUBE2L3−KRAS融合の両方について確立し、さらなる分析のために用いた。G12V突然変異体KRAS(Addgeneプラスミド9052)、V600E突然変異体BRAF(Addgeneプラスミド15269)、およびそれらの個々のpBABE−puroベクター(Addgeneプラスミド1764)についてのコンストラクトをAddgene(Cambridge, MA, USA)から得た。これらのプラスミドコンストラクトを10%仔ウシ血清において維持したNIH3T3細胞において形質移入し、安定した株をピューロマイシン1μg/mLを選択のために用いて作製した。これらの安定した細胞株を、RAS−MAPKシグナル伝達経路のイムノブロット分析のための対照として用いた。
細胞増殖分析について、UBE2L3−KRAS融合またはベクターを発現する10,000個のNIH3T3を24ウェルプレートに2つ組のウェルで蒔種し、細胞計数をCoulter Counter(Beckman Coulter, Fullerton, CA)を用いて、示された時間に実施した。類似のアッセイを、UBE2L3−KRAS融合またはベクターを発現するRWPE安定クローンを用いて実施した。両細胞増殖アッセイを2回実施し、代表的なアッセイからのデータを呈する。
UBE2L3−KRAS融合またはpLenti−6ベクターを発現する100,000個のRWPEクローンをマトリゲルであらかじめ被覆したプレート(BD Biosciences)へと蒔種し、製造元の推奨として処理した。48時間後、インサートをクリスタルバイオレットで染色した。脱染色を10%酢酸を用いて実施し、浸潤を560nmにおける吸光度を比較することによって定量した。DU145を浸潤アッセイのための陽性対照として用いた。
製造元のプロトコール(Roche Applied Sciences)に従って、Fugene 6を用いて形質移入を実施した。35mmのプラスチック皿におけるNIH3T3細胞(1.5×105)に2μgの目的のプラスミドDNAを形質移入した。融合転写産物UBE2L3−KRASおよび癌遺伝子KRAS G12Vについてのプラスミドを、対照プラスミド(それぞれpDEST40およびpBABE)とともに用いた。形質移入の3日間後、細胞を、5%仔ウシ血清(Colorado Serum Company)を有するDMEMを含む1枚の140mmの皿へと分けた。培養物に3〜4日間ごとに養分を与えた。3週間後、細胞を70%エタノールにおける0.2%クリスタルバイオレットで遺伝子座の可視化のために染色し、コロニー計数装置で計数した(Oxford Optronix Ltd., Oxford UK, software v4.1, 2003)。計数を手動でさらに確認した。
UBE2L3−KRAS融合またはベクターを発現するヨウ化プロピジウム染色した安定したNIH3T3細胞を、FACSDiviaを実行するLSR IIフローサイトメーター(BD Biosciences, San Jose, CA)において分析し、細胞周期相をModFit LT(Verity Software House, Topsham, ME)を用いて算出した。
4週齢の雄性Balb C nu/nuマウスをCharles River, Inc.(Charles River Laboratory, Wilmington, MA)から購入した。融合転写産物UBE2L3−KRASまたはNIH3T3−ベクター(2×106個)を過剰発現する安定したNIH3T3およびRWPE細胞を、20%マトリゲル(BD Biosciences, Becton Drive, NJ)を有する100μLの塩類溶液中で再懸濁し、マウスの左または左右両方の側腹領域へと皮下的に植え込んだ。キシラジン(80〜120mg/kg腹腔内)およびケタミン(10mg/kg腹腔内)のカクテルを用いて、植え込みの前の化学的拘束のためにマウスを麻酔した。8個体のマウスが各群に含まれた。腫瘍体積の発達を毎日、デジタルキャリパーを用いることによって記録し、腫瘍の体積を式(π/6)(L×W2)を用いて算出し、式中、L=腫瘍の長さ、およびW=幅であった。マウスに関するすべての手順は、ミシガン大学(University of Michigan)における動物の使用および取り扱いに関する大学委員会(UCUCA)によって認可され、それらの関連する調節標準に従う。
増幅不連続点階級分けおよび集合(ABRA)と呼ばれる集積ゲノムアプローチを用いて、KRASをDU145前立腺癌細胞におけるユビキチン抱合酵素UBE2L3との遺伝子融合として指名した。UBE2L3−KRASキメラ転写産物の発現をDU145細胞および112の前立腺癌組織のうちの42(38%)において検証した。UBE2L3−KRAS融合タンパク質は、比較的不安定であり、プロテオソーム阻害が容易に観察されることを必要とする。UBE2L3−KRAS融合の過剰発現は、NIH3T3線維芽細胞およびRWPE前立腺上皮細胞におけるインビトロおよびインビボでの癌遺伝子表現型を誘導する。正準のKRAS G12V突然変異とは対照的に、UBE2L3−KRAS融合は、NIH3T3細胞におけるMEKおよびERKシグナル伝達を減弱させ、代わりに、AKTおよびp38MAPキナーゼの活性化をもたらし、これらの療法は、前立腺癌の進行に関与する。
(a)患者由来の試料を提供すること、および
(b)SLC45A3遺伝子の転写調節領域由来の5’部分とRAFファミリー遺伝子由来の3’部分とを有する遺伝子融合の試料における存在または不在を検出すること
を含み、前記試料における遺伝子融合の存在を検出することは、患者における前立腺癌を同定する、患者における前立腺癌を同定するための方法。
(項目2)
前記SLC45A3遺伝子の転写調節領域は、SLC45A3遺伝子のプロモーター領域を含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
工程(b)は、前記SLC45A3遺伝子の転写調節領域由来の5’DNA部分と、前記RAFファミリー遺伝子由来の3’DNA部分とを有するゲノムDNAの染色体再配列を検出することを含む、項目1に記載の方法。
(項目4)
工程(b)は、前記SLC45A3遺伝子の転写調節領域から転写された5’RNA部分と、RAFファミリー遺伝子から転写された3’RNA部分とを有するキメラmRNA転写産物を検出することを含む、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記試料は、組織、血液、血漿、血清、尿、尿上清、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物、および前立腺細胞からなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記RAFファミリーメンバー遺伝子は、BRAFおよびRAF1からなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目7)
(a)患者由来の試料を提供すること、および
(b)UBE2L3遺伝子の転写調節領域由来の5’部分とRASファミリー遺伝子由来の3’部分とを有する遺伝子融合の試料における存在または不在を検出すること
を含み、この中で、試料における遺伝子融合の存在を検出することは、患者における前立腺癌を同定する、患者における前立腺癌を同定するための方法。
(項目8)
前記UBE2L3遺伝子の転写調節領域は、前記UBE2L3遺伝子のプロモーター領域を含む、項目7に記載の方法。
(項目9)
工程(b)は、前記UBE2L3遺伝子の転写調節領域由来の5’DNA部分と前記RASファミリー遺伝子由来の3’DNA部分とを有するゲノムDNAの染色体再配列を検出することを含む、項目7に記載の方法。
(項目10)
工程(b)は、前記UBE2L3遺伝子の転写調節領域から転写された5’RNA部分とRASファミリー遺伝子から転写された3’RNA部分とを有するキメラmRNA転写産物を検出することを含む、項目7に記載の方法。
(項目11)
前記試料は、組織、血液、血漿、血清、尿、尿上清、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物、および前立腺細胞からなる群から選択される、項目7に記載の方法。
(項目12)
前記RASファミリーメンバー遺伝子は、KRASである、項目7に記載の方法。
(項目13)
以下の少なくとも1つを含む組成物:
(a)キメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの5’部分は、SLC45A3遺伝子の転写調節領域由来でありかつキメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの3’部分は、RAFファミリーメンバー遺伝子由来である、キメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの接合部とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ;
(b)SLC45A3遺伝子の転写調節領域由来のキメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの5’部分とハイブリダイズする配列を含む第一のオリゴヌクレオチドプローブ、およびRAFファミリーメンバー遺伝子由来のキメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの3’部分とハイブリダイズする配列を含む第二のオリゴヌクレオチドプローブ;
(c)SLC45A3遺伝子の転写調節領域由来のキメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの5’部分とハイブリダイズする配列を含む第一の増幅オリゴヌクレオチド、およびRAFファミリーメンバー遺伝子由来のキメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの3’部分とハイブリダイズする配列を含む第二の増幅オリゴヌクレオチド;
(d)キメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの5’部分は、UBE2L3遺伝子の転写調節領域由来でありかつキメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの3’部分は、RASファミリーメンバー遺伝子由来である、キメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの接合部とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ;
(e)UBE2L3遺伝子の転写調節領域由来のキメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの5’部分とハイブリダイズする配列を含む第一のオリゴヌクレオチドプローブ、およびRASファミリーメンバー遺伝子由来のキメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの3’部分とハイブリダイズする配列を含む第二のオリゴヌクレオチドプローブ;
(f)UBE2L3遺伝子の転写調節領域由来のキメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの5’部分とハイブリダイズする配列を含む第一の増幅オリゴヌクレオチド、およびRASファミリーメンバー遺伝子由来のキメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの3’部分とハイブリダイズする配列を含む第二の増幅オリゴヌクレオチド;ならびに
(g)UBE2L3遺伝子によってコードされるアミノ末端部分とRASファミリーメンバー遺伝子によってコードされるカルボキシ末端部分とを有するキメラタンパク質に対する抗体。
(項目14)
前記RAFファミリーメンバー遺伝子は、BRAFおよびRAF1からなる群から選択される、項目13に記載の組成物。
(項目15)
前記RASファミリーメンバー遺伝子は、KRASである、項目13に記載の組成物。
Claims (7)
- 遺伝子融合を、患者における前立腺癌を同定するための指標とする方法であって、前記遺伝子融合は、融合接合部において3’部分に融合した5’部分を含み、前記5’部分は、SLC45A3遺伝子の転写調節領域由来の配列を含み、前記3’部分は、BRAF遺伝子由来の配列を含み、前記方法は、存在する場合、前記患者から得られた試料において、前記遺伝子融合を検出することを含み、前記試料において前記遺伝子融合の存在を検出することが、前記患者における前立腺癌を同定する、方法。
- 前記SLC45A3遺伝子の転写調節領域は、SLC45A3遺伝子のプロモーター領域を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記SLC45A3遺伝子から転写された5’RNA部分と、BRAF遺伝子から転写された3’RNA部分とを含むキメラmRNA転写産物を検出することを含む、請求項1に記載の方法。
- 以下のうちの少なくとも1つを含む組成物:
(a)キメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの融合接合部とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、前記融合接合部において、前記キメラゲノムDNAもしくは前記キメラmRNAの5’部分が、前記キメラゲノムDNAもしくは前記キメラmRNAの3’部分に融合し、前記5’部分はSLC45A3遺伝子由来の配列を含み、そして、前記キメラゲノムDNAもしくは前記キメラmRNAの前記3’部分は、BRAF遺伝子由来の配列を含む、オリゴヌクレオチドプローブ;
(b)SLC45A3遺伝子由来のキメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの5’部分とハイブリダイズする配列を含む第一のオリゴヌクレオチドプローブ、およびBRAF遺伝子由来のキメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの3’部分とハイブリダイズする配列を含む第二のオリゴヌクレオチドプローブ;ならびに/または
(c)SLC45A3遺伝子由来のキメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの5’部分とハイブリダイズする配列を含む第一の増幅オリゴヌクレオチド、およびBRAF遺伝子由来のキメラゲノムDNAもしくはキメラmRNAの3’部分とハイブリダイズする配列を含む第二の増幅オリゴヌクレオチド。 - 患者における前立腺癌を同定するための、請求項4に記載の組成物。
- 前記SLC45A3 BRAF遺伝子融合物をさらに含む、請求項4に記載の組成物であって、前記SLC45A3 BRAF遺伝子融合物は、融合接合部において3’部分に融合した5’部分を含み、前記5’部分は、SLC45A3遺伝子の転写調節領域由来の配列を含み、前記3’部分は、BRAF遺伝子由来の配列を含む、組成物。
- 遺伝子融合を、前立腺癌患者におけるRAF阻害薬またはMAPK/ER経路阻害薬による治療に対する応答の見込みを決定するための指標とする方法であって、前記遺伝子融合は、融合接合部において3’部分に融合した5’部分を含み、前記5’部分は、SLC45A3遺伝子の転写調節領域由来の配列を含み、前記3’部分は、BRAF遺伝子由来の配列を含み、前記方法は、存在する場合、前記前立腺癌患者から得られた試料における、前記遺伝子融合を検出することを含み、前記遺伝子融合の存在を検出することは、前記前立腺癌患者が前記RAF阻害薬または前記MAPK/ER経路阻害薬による前記治療に応答する見込みがあることを示す方法。
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