CN109234400B - 一种用于检测kiaa1549-braf融合基因的荧光原位杂交探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测KIAA1549‑BRAF融合基因的荧光原位杂交探针及其制备方法和应用。所述荧光原位杂交探针包含两个探针库，KIAA1549基因杂交探针库：探针的起始位置设计在KIAA1549基因断裂点左右各200Kb范围内，探针向着丝粒方向延伸，探针的长度为300～1000Kb；BRAF基因杂交探针库：探针的起始位置设计在BRAF基因断裂点左右各200Kb范围内，探针向端粒方向延伸，探针的长度为300～1000Kb。本发明在两个融合基因外区域分别设计探针，实现了在同一条染色体上两个距离比较近的融合基因检测，能够在细胞水平上很直观的反应两个基因的融合状态。

Description

一种用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针 及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针及其制备方法和应用。
背景技术
毛细胞星形细胞瘤(PA)是一种WHO分级为Ⅰ级的颅内原发肿瘤，在儿童神经外科中是最为常见的神经胶质瘤，统计其约占脑部肿瘤的25％。KIAA1549基因和BRAF基因均位于7号染色体q34区域，BRAF基因的串联重复导致了KIAA1549/BRAF基因融合，在毛细胞型星形细胞瘤中高发(60％～80％)。根据KIAA1549及BRAF基因互相融合的位置不同，日前已报道5种不同融合变体，分别为：KIAA1549ex16-BRAF ex9，KIAA1549ex15-BRAF ex9，andKIAA1549ex16-BRAF ex11，KIAA1549ex18-BRAF ex10和KIAA1549ex19-BRAF ex9；前三种依次占全部变异数目的45％，28％和5％，后两种相对较少。尽管产生上述融合的内在机制目前仍不十分清楚，但不同类型的KIAA1549-BRAF融合突变被认为具有相同的功能。
目前为止，对于PA发生发展中的分子机制仍未有非常明确的结论，在PA患者的染色体7q34中检测到异常的基因拷贝，全基因组的高通量测序技术显示丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路异常，该通路的异常与KIAA1549基因和BRAF基因互相融合相关。越来越到的文献报道，KIAA1549:BRAF融合基因已被用作毛细胞星形细胞瘤的诊断标志物。此外2015年度“中国中枢神经系统胶质瘤诊断与治疗指南”中推荐KIAA1549:BRAF融合基因检测作为毛细胞星形细胞瘤的诊断标志物。
该融合基因的检测方法目前有4种，全基因组测序(WGS)、转录组测序(RNA-seq)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和荧光原位杂交(FISH)，由于前两种方法成本高、对样本要求高使其在大多数实验室难以广泛推行；后两种方法也是“中国中枢神经系统胶质瘤诊断与治疗指南”中推荐的检测方法，由于KIAA1549:BRAF基因融合有多种形式，PCR技术检测相对比较困难且无法检测出未报道的融合方式。荧光原位杂交(FISH)技术对于融合基因的检测可以非常直观的反应两种基因的融合状态，对于已报道不同融合类型和未报道的融合方式均可以检出，克服了PCR技术的不足。FISH技术对于KIAA1549:BRAF基因融合的检测应该是首选，但由于两个基因均位于7号染色体q34区域，且染色体位置距离较近，因此常规FISH荧光探针很难检测该融合基因。目前针对该融合基因主要有两种检测探针：BRAF断裂探针和KIAA1549/BRAF融合基因探针。由于已有BRAF断裂探针设计区域分别在BRAF基因断裂区域左右各550Kb范围，当BRAF基因断裂后，信号点之间距离为1.4Mb区域，该距离比较近，无法区分开断裂信号点；而KIAA1549/BRAF融合基因探针设计区域(图2)分别两个基因发生融合区域，断裂融合后在两个信号点中间多出一个融合信号，但三个信号点间距离约为1.0Mb区域，同样无法区分开断裂信号点。因此，目前常规BRAF断裂探针和KIAA1549/BRAF融合基因探针均不能完全区分阳性和阴性样本。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针及其制备方法和应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针，所述荧光原位杂交探针包含两个探针库，KIAA1549基因杂交探针库：探针的起始位置设计在KIAA1549基因断裂点左右各200Kb范围内，探针向着丝粒方向延伸，探针的长度为300～1000Kb；BRAF基因杂交探针库：探针的起始位置设计在BRAF基因断裂点左右各200Kb范围内，探针向端粒方向延伸，探针的长度为300～1000Kb。
上述方案中，KIAA1549基因杂交探针库中所述探针的起始位置为KIAA1549基因16号外显子；BRAF基因杂交探针库中所述探针的起始位置为BRAF基因9号外显子。
上述方案中，所述荧光原位杂交探针的两个探针库标记了两种不同颜色的荧光染料。
上述方案中，所述荧光染料选自：CY3、CY5、TAMRA、Texas Red、Rhodamine、FITC、Biotin-aha和FAM。
包含上述用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针的试剂盒。
用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)从UCSC Genome Browser下载KIAA1549基因和BRAF基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列，其中KIAA1549基因探针覆盖区域为：起始位置设计在KIAA1549基因断裂点左右各200Kb范围内，向着丝粒方向延伸300～1000Kb，BRAF基因探针覆盖区域为：起始位置设计在BRAF基因断裂点左右各200Kb范围内，向端粒方向延伸长度为300～1000Kb；
(2)将步骤(1)获得的KIAA1549基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，筛选出的探针导出到EXCEL表格中，得到一系列KIAA1549基因探针序列；
(3)将步骤(1)获得的BRAF基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，筛选出的探针导出到EXCEL表格中，得到一系列BRAF基因探针序列；
(4)使用DNA合成仪对步骤(2)所得一系列KIAA1549基因探针进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到KIAA1549基因探针库；同理，使用DNA合成仪对步骤(3)所得一系列BRAF基因探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到BRAF基因探针库；
(5)使用带有不同荧光基团的通用引物分别对KIAA1549基因探针库和BRAF基因探针库进行扩增标记反应，得到荧光标记的KIAA1549基因杂交探针库和BRAF基因杂交探针库，所述荧光标记的KIAA1549基因杂交探针库和BRAF基因杂交探针库构成了用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针。
上述方案中，步骤(2)和步骤(3)中所述探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85～99℃，GC比40～80％，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针最小间隔5bp。
上述方案中，在步骤(2)所得一系列KIAA1549基因探针序列的每条探针5’端和3’端加上18bp的标签序列；在步骤(3)所得一系列BRAF基因探针序列的每条探针5’端和3’端加上18bp的标签序列。
上述方案中，所述标签序列的碱基序列如下所示：
5’端标签序列为：TGTAAAACGACGGCCAG(SEQ ID NO.1)
3’端标签序列为：GGTCATAGCTGTTTCCTG(SEQ ID NO.2)。
上述方案中，所述通用引物的序列如下所示：
M13-F TGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO.3)
M13-R CAGGAAACAGCTATGACC(SEQ ID NO.4)。
上述方案中，步骤(5)所述扩增标记反应的PCR反应体系如下：
上述方案中，步骤(5)所述扩增标记反应的PCR反应条件如下：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共进行35个循环；72℃10min。
上述试剂盒在制备用于检测KIAA1549-BRAF融合基因产品中的应用，具体应用方法包括如下步骤：
(1)样本处理：取已烤片的厚度在4～5微米的石蜡切片样本，浸入预热的65℃脱蜡剂I中10～15分钟；取出玻片后浸入预热的65℃脱蜡剂II中10～15分钟；取出玻片后在室温下依次浸入100％乙醇、85％乙醇、70％乙醇中各2～3分钟；取出玻片后浸入预热的65℃去离子水中3～5分钟；取出玻片后浸入95℃去离子水中30～40分钟，冷水预冷玻片1min；取出玻片后浸入预热的37℃蛋白酶工作液中20～40分钟；取出玻片后浸泡于洗脱液中漂洗两次，每次5分钟；取出玻片后分别浸入70％、85％和100％梯度酒精各2～3min；取出玻片后室温晾干，备用；
(2)KIAA1549-BRAF融合基因快速检测探针杂交混合物的制备：将荧光标记的KIAA1549探针库、荧光标记的BRAF探针库和杂交缓冲液按照1:1:9的体积比混合；
(3)探针样本共変性：每例样本使用步骤(2)混合所得KIAA1549-BRAF融合基因快速检测探针杂交混合物进行杂交，使用22X22mm盖玻片盖片，使用橡皮胶封片，封片后将玻片置于杂交仪中85℃变性5min，42℃杂交2h；
(4)杂交后洗涤：待杂交完成后揭去盖玻片，将玻片置于68℃预热的洗液中洗涤去除未结合探针；
(5)复染及镜检：将晾干的玻片滴加抗淬灭封片剂封片，然后在荧光显微镜下观察杂交结果。
上述方案中，步骤(2)中所述杂交缓冲液的组分为：10wt％去离子甲酰胺、10wt％硫酸葡聚糖、1ugRNaseA、0.3M氯化钠、10mM柠檬酸缓冲液。
上述方案中，步骤(3)中所述洗液为：含0.3M氯化钠、0.03M柠檬酸钠和0.1％Tween-20。
本发明的有益效果如下：1)本发明分别在KIAA1549断裂点附近向着丝粒方向区域设计探针，在BRAF断裂点附近向端粒方向区域设计探针，由于KIAA1549和BRAF两个基因在同一条染色体上且距离比较近，未发生融合时两种荧光信号相邻，当发生融合时两个基因中间插入一段2Mb片段后两种荧光信号分离，能够很清楚的区分融合基因类型；本发明打破固有思维，在两个融合基因外区域分别设计探针，实现了在同一条染色体上两个距离比较近的融合基因检测，能够在细胞水平上很直观的反应两个基因的融合状态；2)本发明两个融合基因区域可以标记使用与FISH检测相关的所有荧光染料，选择范围广泛；3)本发明所述荧光原位杂交探针杂交时间短，具有极高的信噪比，并且具有很高的特异性和样本检出率。
附图说明
图1为KIAA1549-BRAF基因融合方式。
图2为普通KIAA1549-BRAF基因融合探针工作原理。
图3为本发明所述用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针的设计思路及工作原理。
图4为采用本发明所述荧光原位杂交探针检测KIAA1549-BRAF融合基因的结果判读。
图5为本发明所述荧光原位杂交探针和普通KIAA1549-BRAF基因融合探针检测
KIAA1549-BRAF融合基因的检测结果比较。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1 KIAA1549-BRAF融合基因快速检测探针的制备
本发明所述KIAA1549-BRAF融合基因快速检测探针的制备，包括如下步骤：
(1)从UCSC Genome Browser下载KIAA1549和BRAF基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列，其中KIAA1549探针覆盖区域为：chr7 138,361,140-138,861,139(起始位置为KIAA1549基因16号外显子向着丝粒方向500Kb区域)；BRAF基因探针覆盖区域为：chr7 140,787,547-141,287,546(起位置为BRAF基因9号外显子向端粒方向500kb区域)；所获取的序列保存为fasta格式，基因组中重复序列区域替换为N；
(2)将步骤(1)获得的KIAA1549基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85～99℃，GC比40-80％，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针间最小间隔5bp；然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列；标签序列的碱基序列如下：5端标签序列为：TGTAAAACGACGGCCAG(M13上游序列)，3端标签序列为：GGTCATAGCTGTTTCCTG(M13下游序列)；得到一系列带标签序列的KIAA1549探针；
(3)将步骤(1)获得的BRAF基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85～99℃，GC比40-80％，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针间最小间隔5bp；然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列；标签序列的碱基序列同步骤(2)；得到一系列带标签序列的BRAF探针；
(4)使用DNA合成仪对步骤(2)所得带有标签序列的KIAA1549探针进行合成，将合成的探针进行混合，制备得到KIAA1549基因探针库，所述KIAA1549基因探针库包含7451条带有标签序列的探针；同理，使用DNA合成仪对步骤(3)所得带有标签序列的BRAF探针进行合成，将合成的探针进行混合，制备得到BRAF基因探针库，所述BRAF基因探针库包含8225条带有标签序列的探针；
(5)分别合成5’端带有绿色荧光基团和橘红色荧光基团的M13通用引物，通用引物序列为：M13-F TGTAAAACGACGGCCAGT，M13-R CAGGAAACAGCTATGACC；使用5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物对BRAF基因探针库进行扩增标记反应；使用5’端带有橘红的荧光基团的M13通用引物对KIAA1549基因探针库进行扩增标记反应；所述扩增标记反应的PCR反应体系如下：
所述扩增标记反应的PCR反应条件如下：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共进行35个循环；72℃10min；
(6)使用乙醇醋酸钠法分别对步骤(5)所得KIAA1549基因探针库的扩增标记产物和BRAF基因探针库的扩增标记产物进行纯化，纯化后再经稀释得到浓度为20ng/ul的荧光杂交KIAA1549探针库，浓度为20ng/ul的荧光杂交BRAF探针库。
实施例2 KIAA1549-BRAF融合基因快速检测探针的使用方法
实施例1制备所得KIAA1549-BRAF融合基因快速检测探针在检测KIAA1549-BRAF融合基因时的使用方法，具体包括如下步骤：
(1)样本处理：取已烤片的厚度在4～5微米的石蜡切片样本，浸入预热的65℃脱蜡剂I中10～15分钟；取出玻片后浸入预热的65℃脱蜡剂II中10～15分钟；取出玻片后在室温下依次浸入100％乙醇、85％乙醇、70％乙醇中各2～3分钟；取出玻片后浸入预热的65℃去离子水中3～5分钟；取出玻片后浸入95℃去离子水中30～40分钟，冷水预冷玻片1min；取出玻片后浸入预热的37℃蛋白酶工作液中20～40分钟；取出玻片后浸泡于洗脱液中漂洗两次，每次5分钟；取出玻片后分别浸入70％、85％和100％梯度酒精各2-3min；取出玻片后室温晾干，备用；
(2)KIAA1549-BRAF融合基因快速检测探针杂交混合物的制备：将实施例1制备所得浓度为20ng/ul的KIAA1549探针库、浓度为20ng/ul的BRAF探针库和杂交缓冲液按照1:1:9的体积比混合；所述杂交缓冲液的组分为：50wt％去离子甲酰胺、10wt％硫酸葡聚糖、1ugRNaseA、0.4M氯化钠、10mM柠檬酸缓冲液；
(3)探针样本共変性：每例样本使用10ul步骤(2)混合所得KIAA1549-BRAF融合基因快速检测探针杂交混合物，使用22X22mm盖玻片盖片，使用橡皮胶封片，封片后将玻片置于杂交仪中85℃变性5min，42℃杂交2h；
(4)杂交后洗涤：待杂交完成后揭去盖玻片，将玻片置于68℃预热的洗液(含0.3M氯化钠、0.03M柠檬酸钠和0.1％Tween-20)中洗涤去除未结合探针；
(5)复染及镜检：将晾干的玻片滴加10ul抗淬灭封片剂封片，然后在荧光显微镜下观察杂交结果。
采用实施例1制备的KIAA1549-BRAF融合基因快速检测探针及实施例2所述检测方法，设置杂交的时间为2h；同时采用普通的探针(普通探针设计原理：两个基因分别标记不同颜色，当两个基因发生融合时，两个不同颜色的信号点融合在一起即两个基因发生融合)检测KIAA1549-BRAF融合基因，杂交时间设置为16h。检测结果如图5所示，从图5看出：由于KIAA1549和BRAF两个基因在同一条染色体上且距离比较近，未发生融合时两种荧光信号相邻，当发生融合后两个基因中间插入一段2Mb片段后两种荧光信号分离；本发明所制备的KIAA1549-BRAF融合基因快速检测探针在比较短的杂交时间可以非常清楚的区分阳性和阴性样本，阳性样本(三个信号点，等位基因一个黄色信号点，插入片段后红绿信号点分离；即阳性样本一红一绿一黄三个信号点)，阴性样本(两个信号点，未插入片段，红绿信号点仍然在一起为两个黄色信号点；即阴性样本为两个黄色信号点)。而作为对比例的普通探针因为两个基因相邻太近无法区分阳性和阴性样本，说明了本发明所述KIAA1549-BRAF融合基因荧光杂交探针设计合理，不仅杂交时间短，而且具有极高的信噪比，极高的特异性和样本检出率。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉康录生物技术股份有限公司
<120>一种用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针及其制备方法和应用
<160> 4
<210> 1
<211> 17bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞1
tgtaaaacga cggccag 17
<210> 2
<211> 18bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞2
ggtcatagct gtttcctg 18
<210> 3
<211> 18bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞3
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 4
<211> 18bp
<212> DNA
<213>人工序列
＜400＞4
caggaaacag ctatgacc 18

Claims (9)

1.一种用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针，其特征在于，所述荧光原位杂交探针包含两个探针库，KIAA1549基因杂交探针库：探针的起始位置设计在KIAA1549基因断裂点左右各200Kb范围内，探针向着丝粒方向延伸，延伸的长度为300~1000Kb；BRAF基因杂交探针库：探针的起始位置设计在BRAF基因断裂点左右各200Kb范围内，探针向端粒方向延伸，延伸的长度为300~1000Kb。
2.根据权利要求1所述的用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针，其特征在于，KIAA1549基因杂交探针库中所述探针的起始位置为KIAA1549基因16号外显子；BRAF基因杂交探针库中所述探针的起始位置为BRAF基因9号外显子。
3.根据权利要求1所述的用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针，其特征在于，所述荧光原位杂交探针的两个探针库标记了两种不同颜色的荧光染料。
4.包含权利要求1~3任一所述用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针的试剂盒。
5.权利要求1~3任一所述用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）从UCSC Genome Browser下载KIAA1549基因和BRAF基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列，其中KIAA1549基因探针覆盖区域为：起始位置设计在KIAA1549基因断裂点左右各200Kb范围内，向着丝粒方向延伸300~1000Kb，BRAF基因探针覆盖区域为：起始位置设计在BRAF基因断裂点左右各200Kb范围内，向端粒方向延伸长度为300~1000Kb；
（2）将步骤（1）获得的KIAA1549基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，筛选出的探针导出到EXCEL表格中，得到一系列KIAA1549基因探针序列；所述探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85~99℃，GC比40~80%，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针最小间隔5bp；
（3）将步骤（1）获得的BRAF基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，筛选出的探针导出到EXCEL表格中，得到一系列BRAF基因探针序列；所述探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85~99℃，GC比40~80%，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针最小间隔5bp；
（4）使用DNA合成仪对步骤（2）所得一系列KIAA1549基因探针进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到KIAA1549基因探针库；同理，使用DNA合成仪对步骤（3）所得一系列BRAF基因探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到BRAF基因探针库；
（5）使用带有不同荧光基团的通用引物分别对KIAA1549基因探针库和BRAF基因探针库进行扩增标记反应，得到荧光标记的KIAA1549基因杂交探针库和BRAF基因杂交探针库，所述荧光标记的KIAA1549基因杂交探针库和BRAF基因杂交探针库构成了用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤（2）所得一系列KIAA1549基因探针序列的每条探针5’端加上17bp的标签序列、3’端加上18bp的标签序列；在步骤（3）所得一系列BRAF基因探针序列的每条探针5’端加上17bp的标签序列、3’端加上18bp的标签序列；所述标签序列的碱基序列如下所示：
5’端标签序列为：TGTAAAACGACGGCCAG；3’端标签序列为：GGTCATAGCTGTTTCCTG。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述通用引物的序列如下所示：M13-FTGTAAAACGACGGCCAGT；M13-R CAGGAAACAGCTATGACC。
8.权利要求4所述试剂盒在制备用于检测KIAA1549-BRAF融合基因产品中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，具体的应用包括如下步骤：
（1）从UCSC Genome Browser下载KIAA1549基因和BRAF基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列，其中KIAA1549基因探针覆盖区域为：起始位置设计在KIAA1549基因断裂点左右各200Kb范围内，向着丝粒方向延伸300~1000Kb，BRAF基因探针覆盖区域为：起始位置设计在BRAF基因断裂点左右各200Kb范围内，向端粒方向延伸长度为300~1000Kb；
（2）将步骤（1）获得的KIAA1549基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，筛选出的探针导出到EXCEL表格中，得到一系列KIAA1549基因探针序列；
（3）将步骤（1）获得的BRAF基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，筛选出的探针导出到EXCEL表格中，得到一系列BRAF基因探针序列；
（4）使用DNA合成仪对步骤（2）所得一系列KIAA1549基因探针进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到KIAA1549基因探针库；同理，使用DNA合成仪对步骤（3）所得一系列BRAF基因探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到BRAF基因探针库；
（5）使用带有不同荧光基团的通用引物分别对KIAA1549基因探针库和BRAF基因探针库进行扩增标记反应，得到荧光标记的KIAA1549基因杂交探针库和BRAF基因杂交探针库，所述荧光标记的KIAA1549基因杂交探针库和BRAF基因杂交探针库构成了用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针。
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