CN102712953A - 前列腺癌中的复发性基因融合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于癌症诊断、研究和治疗的组合物及方法，包括但不限于癌症标志。具体地，本发明涉及作为前列腺癌的诊断标志和临床靶的复发性基因融合物。

Description

前列腺癌中的复发性基因融合物

政府资助

本发明是在由国立卫生研究院授予的CA069568、CA111275和CA132874下由政府资助进行的。政府在本发明中具有一定的权利。

发明领域

本发明涉及用于癌症诊断、研究和治疗的组合物和方法，包括但不限于癌症标志。具体地，本发明涉及作为前列腺癌的诊断标志和临床靶的复发性基因融合物(recurrent gene fusion)。

发明背景

癌症研究的中心目标是鉴定因果性地牵涉肿瘤发生的改变的基因。已鉴定了几种类型的体细胞突变，包括碱基置换、插入、缺失、易位(translocation)和染色体的获得和丢失，其全都导致癌基因或肿瘤抑制基因的活性改变。首先在1900年代早期有人假设，现在又有染色体重排事件在癌症中具有因果作用的可靠证据(Rowley，Nat Rev Cancer 1:245(2001))。复发性染色体畸变被认为是白血病、淋巴瘤和肉瘤的主要特征。更常见并且促成相对大部分的与人癌症相关的发病率和死亡率的上皮肿瘤(癌)包括低于1%的已知疾病特异性染色体重排(Mitelman，Mutat Res 462:247(2000))。虽然恶性血液病的特征通常在于平衡的疾病特异性染色体重排，但大多数实体瘤具有许多非特异性染色体畸变。实体瘤的核型复杂性据认为归因于癌症演化或进展过程中获得的二次改变。

已描述了染色体重排的两个主要机制。在一个机制中，一个基因的启动子/增强子元件被重排至邻近原癌基因，从而引起改变的致癌蛋白的表达。该类型的易位通过将免疫球蛋白(IG)和T细胞受体(TCR)基因与MYC并列从而导致该癌基因分别在B-细胞和T-细胞恶性肿瘤中的激活来举例说明(Rabbitts，Nature 372:143(1994))。在第二机制中，重排导致两个基因的融合，这产生可具有新功能或改变的活性的融合蛋白。该易位的原型实例为慢性髓性白血病(CML)中的BCR-ABL基因融合(Rowley，Nature 243:290(1973)；deKlein等人，Nature 300:765(1982))。重要地，该发现导致甲磺酸伊马替尼(Gleevec)的合理开发，所述药物成功地靶向BCR-ABL激酶(Deininger等人，Blood 105:2640(2005))。因此，鉴定常见上皮肿瘤中的复发性基因重排可对癌症药物发现努力以及患者的治疗具有重大意义。

发明概述

本发明涉及用于癌症诊断、研究和治疗的组合物和方法，包括但不限于癌症标志。具体地，本发明涉及作为前列腺癌的诊断标志和临床靶的复发性基因融合物。

例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于鉴定患者的前列腺癌的方法，包括：提供来自所述患者的样品；和检测基因融合物在样品中的存在或不存在，所述基因融合物具有来自SLC45A3基因的转录调控区的5’部分和来自RAF家族基因(例如，RAF1或BRAF)的3’部分，其中在样品中检测到基因融合物的存在鉴定了患者的前列腺癌。在某些实施方案中，SLC45A3基因的转录调控区包含SLC45A3基因的启动子区域。在某些实施方案中，检测步骤包括检测具有来自SLC45A3基因的转录调控区的5’DNA部分和来自RAF家族基因的3’DNA部分的基因组DNA的染色体重排。在某些实施方案中，检测步骤包括检测具有从SLC45A3基因的转录调控区转录的5’RNA部分和从RAF家族基因转录的3’RNA部分的嵌合mRNA转录物。在某些实施方案中，样品是组织、血液、血浆、血清、尿、尿上清液、尿细胞沉淀、精液、前列腺分泌物或前列腺细胞。

本发明的其它实施方案提供了用于鉴定患者的前列腺癌的方法，包括：提供来自所述患者的样品；和检测具有来自UBE2L3基因的转录调控区的5’部分和来自RAS家族基因(例如，KRAS)的3’部分的基因融合物在样品中的存在或不存在，其中在样品中检测到所述基因融合物的存在鉴定了患者的前列腺癌。在某些实施方案中，UBE2L3基因的转录调控区包含UBE2L3基因的启动子区域。在某些实施方案中，检测步骤包括检测具有来自UBE2L3基因的转录调控区的5’DNA部分和来自RAS家族基因的3’DNA部分的基因组DNA的染色体重排。在某些实施方案中，检测步骤包括检测具有从UBE2L3基因的转录调控区转录的5’RNA部分和从RAS家族基因转录的3’RNA部分的嵌合mRNA转录物。在某些实施方案中，样品是组织、血液、血浆、血清、尿、尿上清液、尿细胞沉淀、精液、前列腺分泌物或前列腺细胞。

在其它实施方案中，本发明提供了包含如下的至少一种的组合物：(a)包含与嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的接头(junction)杂交的序列的寡核苷酸探针，其中所述嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的5’部分来自SLC45A3基因的转录调控区并且所述嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的3’部分来自RAF家族成员基因；(b)包含与来自SLC45A3基因的转录调控区的嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的5’部分杂交的序列的第一寡核苷酸探针，和包含与来自RAF家族成员基因的嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的3’部分杂交的序列的第二寡核苷酸探针；(c)包含与来自SLC45A3基因的调控区的嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的5’部分杂交的序列的第一扩增寡核苷酸，和包含与来自RAF家族成员基因的嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的3’部分杂交的序列的第二扩增寡核苷酸；(d)包含与嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的接头杂交的序列的寡核苷酸探针，其中所述嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的5’部分来自UBE2L3基因的转录调控区并且所述嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的3’部分来自RAS家族成员基因；(e)包含与来自UBE2L3基因的转录调控区的嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的5’部分杂交的序列的第一寡核苷酸探针，和包含与来自RAS家族成员基因的嵌合基因组DNA或嵌合的3’部分杂交的序列的第二寡核苷酸探针；(f)包含与来自UBE2L3基因的转录调控区的嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的5’部分杂交的序列的第一扩增寡核苷酸，和包含与来自RAS家族成员基因的嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的3’部分杂交的序列的第二扩增寡核苷酸；和(g)针对具有由UBE2L3基因编码的氨基末端部分和由RAS家族成员基因编码的羧基末端部分的嵌合蛋白的抗体。在某些实施方案中，RAF家族成员基因为BRAF或RAF1。在某些实施方案中，RAS家族成员基因为KRAS。

在下面的说明和实施例中提供了本发明的其它实施方案。

附图简述

图1显示SLC45A3-BRAF和ESRP1-RAF1以及RAF1-ESRP1基因融合物在ETS阴性前列腺癌中的发现。(a)分别具有FLJ35294-ETV1(上)、TMPRSS2-ERG(中)、SLC45A3-BRAF(左下)以及ESRP1-RAF1和RAF1-ESRP1(右下)的临床局限性前列腺肿瘤(clinically localized prostatetumor)样品PCA1、PCA2、PCA3和PCA17的基因融合提名评分(nominationscore)的直方图。(b)支持SLC45A3与BRAF之间的染色体间基因融合的双端读取(paired-end read)的图示。(c和d)支持ESRP1与RAF1之间的染色体间基因融合(导致交互融合基因ESRP1-RAF1和RAF1-ESRP1)的双端读取的图示。

图2显示SLC45A3-BRAF、ESRP1-RAF1和RAF1-ESRP1基因融合物的表达的验证。(a)PCA3中SLC45A3-BRAF基因融合物的qRT-PCR验证和(b)使用外显子跨越引物的外显子特异性PCR显示BRAF外显子8-18相对于外显子1-7的高水平表达。(c)PCA17中的ESRP1-RAF1和RAF1-ESRP1交互基因融合物的qRT-PCR验证。(d)分别在PCA3和PCA17中的SLC45A3-BRAF(左)和ESRP1-RAF1(右)基因融合物的FISH验证。(e)蛋白印迹分析显示120kDa ESRP1-RAF1融合蛋白在用从PCA17克隆的ESRP1-RAF1全长融合构建体转染的PCA17和HEK293中的表达。

图3显示利用SLC45A3-BRAF融合转录物对NIH3T3细胞的转化。a)通过融合构建体SLC45A3-BRAF、BRAF EX8-stop、BRAF EX10-stop、RAF突变体V600E和载体对照(用于融合转录物的pDEST40和用于突变体V600E的pBABE)在NIH3T3细胞中产生的集落诱导(Foci induction)。对于每一个样品所示的代表性板和集落形成的定量示于来自两个独立实验的条形图(b)中。(c)SLC45A3-BRAF融合物促进细胞增殖和侵袭。(d)用0.25uM索拉非尼(Sorafenib)或DMSO对照处理RWPE稳定细胞，在指定的时间点进行WST-1测定。

图4显示BRAF(A)和RAF1(B)的正常和融合转录物的外显子结构。

图5显示BRAF和RAF1基因重排的基因组组织和FISH验证。(a)和(b)的上图中的示意图分别显示SLC45A3和BRAF以及ESRP1和RAF1基因的基因组定位。

图6显示正常样品(NOR9)和先证者(index case)(PCA3)的BRAF的RNA-seq外显子覆盖度(exon coverage)。

图7显示ETV1和BRAF RNA-Seq异常表达谱(outlier expression profile)。

图8显示表达融合转录物SLC45A3-Braf、BRAF Ex8-stop和BRAFEx10-stop以及pDEST40载体的NIH3T3细胞的集落频率的比较。

图9显示展示BRAF V600E突变状态的代表性热解图(pyrogram)。

图10显示截短的BRAF和BRAF融合转录物。

图11显示SLC45A3-BRAF融合物的示意图。

图12显示由癌症产生的BRAF融合转录物。

图13显示SLC45A3、AKAP9、FCHSD1和KIAA1549的表达图。

图14显示SLC45A3的雄激素调控。

图15显示将KRAS提名为DU145前列腺癌细胞的候选基因融合物的DNA拷贝数数据的整体性分析(integrative analyses)。(A)显示了在患者亚组中伴随特征性病灶扩增(focal amplification)的已知复发性基因融合物的表。(B)左图，来自36个白血病细胞系的3‘扩增的基因的扩增断点分级和装配(ABRA)分析以及ConSig评分将ABL1鉴定为与3’扩增相关的融合基因。(C)左图，如(B)中一样，除使用来自一小组前列腺癌细胞系的数据外。

图16显示DU145细胞和前列腺癌组织中UBE2L3-KRAS嵌合体的表征。(A)显示DU145和融合阳性PCA上UBE2L3与KRAS的融合的来自5’RACE的测序结果的示意图。(B)使用融合引物通过SYBR测定分析一连串小组的前列腺癌细胞系、良性前列腺组织、局限性(PCA)和转移性(MET)前列癌组织的UBE2L3-KRAS mRNA表达。(C)利用来自UBE2L3的第一外显子和KRAS的最后一个外显子的融合引物的常规RT-PCR验证。还显示了UBE2L3、KRAS和GAPDH mRNA的RT-PCR。(D)突出显示了复发性基因融合物TMPRSS2-ERG、BCR-ABL1、UBE2L3-KRAS与它们各自细胞系内的二次基因融合物(secondary gene fusion)之间的差异的来自K562、VCaP和DU145的配对读取(mate pair read)支持的嵌合体提名的直方图。(E)U145中的UBE2L3与KRAS之间的融合物的双端测序覆盖度的示意图。(F)左图，UBE2L3和KRAS基因座的基因组组织示于示意图中，棒表示BAC克隆的位置。右图，对DU145的间期FISH分析显示3个拷贝的融合物信号，如箭头所指示的。

图17显示UBE2L3-KRAS融合蛋白的表征。(A)UBE2L3、KRA和预测的UBE2L3-KRAS融合蛋白的图示。(B)UBE2L3-KRAS融合蛋白在DU145细胞中的表达。(C)在一小组前列腺癌细胞系中观察UBE2L3-KRAS融合蛋白，利用蛋白酶体抑制剂硼替佐米稳定蛋白质表达。(D)用于检测DU145细胞中的UBE2L3-KRAS蛋白的质谱测定法。

图18显示UBE2L3-KRAS融合物的致癌潜能。(A)UBE2L3-KRAS在NIH3T3细胞中的过表达增加细胞增殖。(B)UBE2L3-KRAS的过表达诱导NIH3T3细胞的集落形成。(C)由UBE2L3-KRAS融合物参与的下游信号转导途径的观察。(D)UBE2L3-KRAS转染的NIH3T3细胞在裸小鼠中形成肿瘤。(E)UBE2L3-KRAS融合物在RWPE良性前列腺上皮细胞中的表达导致增加的细胞增殖。(F)表达UBE2L3-KRAS融合物的RWPE稳定细胞显示增加的细胞侵袭潜能。(G)UBE2L3-KRAS感染的RWPE细胞在小鼠中形成短暂肿瘤(transient tumor)。

图19显示扩增断点分级和装配(ABRA)分析的生物信息学工作流程。

图20显示描述手工精选(manual curation)标准的代表性5’和3’融合伴侣候选者(具有5’和3’扩增的基因)的SNP阵列和阵列CGH数据。(A)具有不可接受的断点的白血病和前列腺癌细胞系的代表性候选3’伴侣的相对DNA拷贝数数据。(B)通过对K-562以及其它白血病细胞系进行扩增断点装配分析鉴定的ABL1的候选5’融合伴侣的阵列CGH数据。(C)DU145(两个重复杂交)和其它前列腺癌细胞系上的KRAS的候选5’融合伴侣的阵列CGH数据。

图21显示SYBR与Taqman融合qPCR测定法的比较。

图22显示DU145和融合阳性PCA组织中5’cDNA末端的RNA连接酶-介导的快速扩增(RLM-5‘RACE)。(A)描述基因特异性引物(黑色箭头)在用于RLM-5’RACE的融合物的KRAS部分上的位置的示意图。(B)DU145和3个融合阳性病例的RLM-5’RACE结果的代表性凝胶照片。

图23显示来自DU145和3个融合阳性病例的融合序列的分析未显示KRAS融合等位基因的典型突变(canonical mutation)。

图24显示DU145和UBE2L3-KRAS阳性前列腺癌组织的代表性FISH结果。(A)用作用于间期FISH的探针的BAC的示意图。(B)对DU145的FISH分析确认了KRAS基因座上的重排以及UBE2L3与KRAS的融合。(C)突出显示阴性发现的UBE2L3-KRAS阳性组织的代表性FISH结果。

图25显示UBE2L3-KRAS融合物的siRNA敲低和异位表达的qPCR确认。(A)DU145中被针对融合接头、野生型UBE2L3和野生型KRAS的siRNA敲低的UBE2L3-KRAS的qPCR确认。(B-C)，表达UBE2L3-KRAS融合物的NIH3T3和RWPE细胞的qPCR确认。使用空白pDEST40载体或UBE2L3-KRAS融合物转染NIH 3T3细胞(B)。用具有空白pLenti-6载体或UBE2L3-KRAS融合物的慢病毒颗粒转染RWPE细胞(C)。

图26显示表达UBE2L3-KRAS融合物的NIH3T3成纤维细胞与pDEST40载体对照相反丧失正常的成纤维细胞的形态学。

图27显示表达UBE2L3-KRAS融合物或pDEST40载体的NIH3T3细胞的集落密度的比较。

图28显示表达UBE2L3-KRAS融合物的NIH3T3细胞显示S期的增加。

图29显示Ras信号转导途径的示意图。

图30显示NIH 3T3异种移植物模型的照片和病理学。(A)具有表达UBE2L3-KRAS融合物(上)和pDEST40载体(下)的NIH3T3异种移植物肿瘤的小鼠的照片。(B)NIH3T3异种移植物组织的病理学。左图，使用苏木精和伊红(HE)对从具有表达NIH3T3融合物的肿瘤的小鼠切取的异种移植物组织进行染色。右图，显示98%的肿瘤细胞核(上)对17%的对照组织细胞核(下)的异种移植物组织的Ki-67免疫组织化学(IHC)染色对于Ki-67是阳性的。

定义

为了有利于理解本发明，下面定义许多术语和短语：

如本文中所使用的，术语“基因融合物”是指因第一基因的至少一部分与第二基因的至少一部分融合而产生的嵌合基因组DNA、嵌合信使RNA、截短的蛋白质和嵌合蛋白质。基因融合物不一定包括完整的基因或基因的外显子。

如本文中所使用的，术语“癌症中上调的基因”是指在癌症(例如，前列腺癌)中相对于在其它组织中的水平以更高的水平表达(例如，mRNA或蛋白质表达)的基因。在某些实施方案中，癌症中上调的基因以比在其它组织中的表达水平高至少10%，优选至少25%，更优选至少50%，更优选至少100%，更优选至少200%，最优选至少300%的水平表达。在某些实施方案中，前列腺癌中上调的基因为“雄激素调控的基因”。

如本文中所使用的，术语“前列腺组织中上调的基因”是指在前列腺组织中相对于在其它组织中的水平以更高水平表达(例如，mRNA或蛋白质表达)的基因。在某些实施方案中，前列腺组织中上调的基因以比在其它组织中的表达水平高至少10%，优选至少25%，更优选至少50%，更优选至少100%，更优选至少200%，最优选至少300%的水平表达。在某些实施方案中，前列腺组织中上调的基因只在前列腺组织中表达。

如本文中所使用的，术语“转录调控区”是指包括调节(例如，上调或下调)基因的表达的序列的基因的区域。在某些实施方案中，基因的转录调控区包括也称为5’非翻译区(5’UTR)的基因的非编码上游序列。在其它实施方案，转录调控区包括位于基因的编码区内或内含子(例如，增强子)内的序列。

如本文中所使用的，术语“雄激素调控的基因”是指其表达被雄激素(例如，睾酮)诱导或抑制的基因或基因的部分。雄激素调控的基因的启动子区域可包含与雄激素或雄激素信号分子(例如，下游信号分子)相互作用的“雄激素应答元件”。

如本文中所使用的，术语“检测”、“探测”或“测定”可描述发现或辨别的一般动作或可检测地标记的组合物的具体观察。

如本文中所使用的，术语“癌症的分期”是指癌症的进展水平的定性或定量评估。用于确定癌症的分期的标准包括但不限于肿瘤的大小和转移的程度(例如，局限性的或远距离的)。

如本文中所使用的，术语“核酸分子”是指任何包含核酸的分子，包括但不限于DNA或RNA。术语包括包含DNA或RNA的任何已知碱基类似物的序列，所述类似物包括但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(queosine)、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。

术语“基因”是指包含产生多肽、前体或RNA(例如，rRNA、tRNA)所必需的编码序列的核酸(例如，DNA)序列。多肽可由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码，只要全长或片段的期望的活性或功能性质(例如，酶促活性、配体结合、信号转导、免疫原性等)得到保持。术语还包括结构基因的编码区以及位于与在5'和3'端上的编码区相邻且离任一端的距离达约1kb或更多的序列，以便基因相应于全长mRNA的长度。位于编码区的5'并且存在于mRNA上的序列被称为5'非翻译序列。位于编码区的3'或下游并且存在于mRNA上的序列被称为3′非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式。基因的基因形式或克隆包含被称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列间断的编码区。内含子是被转录至核RNA(hnRNA)中的基因的区段；内含子可包含调控元件例如增强子。内含子被除去或从核转录物或初级转录物“剪接掉”；内含子因而不存在于信使RNA(mRNA)转录物中。mRNA在翻译过程中用于指定新生多肽的氨基酸的序列或顺序。

如本文中所使用的，术语“寡核苷酸”是指长度较短的单链多核苷酸链。寡核苷酸的长度通常少于200个残基(例如，15至100个残基)，然而，如本文中所使用的，术语也意欲包括更长的多核苷酸链。寡核苷酸通常根据它们的长度来称呼。例如，24个残基的寡核苷酸被称为“24聚体”。寡核苷酸可通过自我杂交(self-hybridizing)或通过与其它多核苷酸杂交来形成二级和三级结构。此类结构可包括但不限于双链体、发夹、十字形结构、弯曲(bend)和三链体。

如本文中所使用的，术语“探针”是指能够与另一个目的寡核苷酸的至少一部分杂交的寡核苷酸(即，核苷酸的序列)，无论是天然存在的(如在纯化的限制酶切消化物中)还是合成、重组或通过PCR扩增产生的。探针可以是单链或双链的。探针用于特定基因序列的检测、鉴定和分离。预期用于本发明的任何探针将用任何“报告分子”来标记，以便在任何检测系统(包括但不限于酶(例如，ELISA以及基于酶的组织化学测定法)、荧光、放射性和发光系统)中可被检测。本发明无意限定于任何特定的检测系统或标记。

术语“分离的”，当与核酸结合使用时，如在“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”中，是指被鉴定并且与在其天然来源中通常与其结合的至少一种组分或污染物分离的核酸序列。分离的核酸是以与其被天然发现时所存在的形式或环境不同的形式或环境存在的核酸。相反地，非分离的核酸为以它们天然存在时的状态被发现的核酸例如DNA或RNA。例如，发现给定的DNA序列(例如，基因)在宿主细胞染色体上与相邻基因靠近；RNA序列例如编码特定蛋白质的特定mRNA序列在细胞中被发现为与编码许多蛋白质的许多其它mRNA的混合物。然而，编码给定的蛋白质的分离的核酸，举例来说，包括在通常表达给定的蛋白质的细胞中的这样的核酸，其中所述核酸存在于与天然细胞的染色体位置不同的染色体位置上，或另外侧翼连接与天然发现的核酸序列不同的核酸序列。分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以以单链或双链形式存在。当分离的核酸、寡核苷酸或多肽将被用于表达蛋白质时，寡核苷酸或多核苷酸将最低限度地包含有义或编码链(即，寡核苷酸或多核苷酸可以是单链的)，但可包含有义链和反义链(即，寡核苷酸或多核苷酸可以是双链的)。

如本文中所使用的，术语“纯化的”或“纯化”是指从样品除去组分(例如，污染物)。例如，通过除去污染性非免疫球蛋白蛋白质来纯化抗体；还可通过除去不结合靶分子的免疫球蛋白来纯化它们。非免疫球蛋白蛋白质的除去和/或不结合靶分子的免疫球蛋白的除去导致样品中靶反应性免疫球蛋白的百分比的增加。在另一个实施方案中，在细菌宿主细胞中表达重组多肽，通过除去宿主细胞蛋白质来纯化所述多肽；重组多肽在样品中的百分比从而得到增加。

发明详述

本发明基于前列腺癌中复发性基因融合的发现。本发明提供了直接或间接检测或靶向基因融合物的诊断、研究和治疗方法。本发明还提供了用于诊断、研究和治疗目的的组合物。

I.基因融合物

本发明鉴定了表示前列腺癌的复发性基因融合物。在某些实施方案中，基因融合物是第一基因(例如，雄激素调控基因或其它基因)和RAS或RAF家族成员基因的转录调控区的染色体重排的结果。基因融合物通常包括来自第一基因(例如，UBE2L3或雄激素调控的基因例如SLC45A3)的转录调控区的5’部分和来自ETS家族成员基因的3’部分。复发性基因融合物已用作前列腺癌的诊断标志和临床靶。

A.雄激素调控的基因

受雄激素调控的基因对于人前列腺的正常生理功能是至关重要的。它们还促成前列腺癌的发生和进展。公认的ARG包括但不限于：TMPRSS2；SLC45A3；HERV-K_22q11.23；C15ORF21；FLJ35294；CANT1；PSA；PSMA；KLK2；SNRK；Seladin-1；和FKBP51(Paoloni-Giacobino等人，Genomics 44:309(1997)；Velasco等人，Endocrinology 145(8):3913(2004))。

已证明TMPRSS2(NM 005656)在前列腺上皮中相对于其它人组织高度表达(Lin等人，Cancer Research 59:4180(1999))。TMPRSS2基因位于染色21上。该基因位于来自pter的41,750,797-41,801,948bp(总共51,151bp；负链取向)。人TMPRSS2蛋白序列可见于GenBank登录号AAC51784(Swiss Protein登录号O15393)并且相应的cDNA见于GenBank登录号U75329(也参见，Paoloni-Giacobino等人，Genomics 44:309(1997))。

已显示SLC45A3(也称为prostein或P501S)在转录物和蛋白质水平上只在正常前列腺和前列腺癌中表达(Kalos等人，Prostate 60，246-56(2004)；Xu等人，Cancer Res 61，1563-8(2001))。

通过EST分析和大量平行测序，发现HERV-K 22q11.23是人内源逆转录病毒元件的HERV-K家族的第二强表达的成员并且在前列腺中相对于其它正常组织最高地表达(Stauffer等人，Cancer Immun 4，2(2004))。虽然未曾描述HERV-K元件的雄激素调控，但已显示内源逆转录病毒元件赋予对小鼠性连锁蛋白质基因C4A的雄激素应答性(Stavenhagen等人，Cell 55，247-54(1988))。已显示其它HERV-K家族成员在乳腺癌和乳腺癌细胞系中高度表达并且受雄激素调控(Ono等人，J Virol 61，2059-62(1987)；Patience等人，J Virol 70，2654-7(1996)；Wang-Johanning等人，Oncogene 22，1528-35(2003))，并且在具有t(8；19)(p12；q13.3)的干细胞骨髓增生障碍的情况下来自染色体19上的HERV-K3元件的序列被融合至FGFR1(Guasch等人，Blood 101，286-8(2003))。

C15ORF21(也称为D–PCA-2)最初基于其在正常前列腺和前列腺癌中的独有过表达而分离(Weigle等人，Int J Cancer 109，882-92(2004))。

FLJ35294被鉴定为已测序的人cDNA的“全长长日本(full-length longJapan)”(FLJ)集合的成员(Nat Genet.2004Jan；36(1):40-5.Epub 2003Dec 21)。

CANT1(也称为sSCAN1)是钙激活核苷酸酶(Arch Biochem Biophys.2002Oct 1；406(1):105-15)。CANT1为371个氨基酸的蛋白质。可切割的信号肽产生333个残基的分泌性蛋白质，预测的核心分子为37,193Da。Northern分析在许多人组织(包括睾丸、胎盘、前列腺和肺)鉴定中鉴定了所述转录物。在该人酶中未鉴定出常规腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)-保守区域或核苷酸结合结构域，这表明细胞外核苷酸酶的新家族的成员资格。

在某些实施方案中，本发明的基因融合物包括ARG的转录调控区。ARG的转录调控区可包含ARG的编码区或非编码区，包括启动子区域。ARG的启动子区域还可包括ARG的雄激素应答元件(ARE)。

B.遍在蛋白缀合酶(Uubiquitin Conjugating Enzyme)

遍在蛋白缀合酶，也称为E2酶，进行通过蛋白酶体将蛋白质靶向降解的遍在蛋白化反应的第二步骤。遍在蛋白化过程将遍在蛋白(76个氨基酸的短的蛋白质)共价连接于靶蛋白上的赖氨酸残基。一旦蛋白质被一个遍在蛋白分子标记，其它轮的遍在蛋白化就形成多聚遍在蛋白链，该蛋白链被蛋白酶体的19S调节颗粒识别，从而促发靶蛋白的ATP依赖性解折叠，这允许其通过进入蛋白酶体的20S核心颗粒，在所述核心颗粒中蛋白酶将靶降解成短肽片段以被细胞再循环。

UBE2L3是人E2酶的一个实例。UBE2L3的mRNA序列由Genbank登录号NR_028437描述。

C.RAS/RAF家族

Ras是编码参与细胞信号转导的小GTP酶的基因的家族。Ras信号转导的激活引起细胞生长、分化和存活。Ras是全都在结构上相关并且调节不同细胞行为的蛋白质的Ras超家族的典型成员。Ras蛋白用作控制细胞内信号转导网络的二元分子开关(binary molecular switche)。Ras调节的信号途径控制这类过程如肌动蛋白细胞骨架完整性、增殖、分化、细胞粘附、细胞凋亡和细胞迁移。Ras和ras相关蛋白在癌细胞中通常失调，从而导致增加的侵袭和转移，并且减小细胞凋亡。

由于Ras将信号从细胞外部传送至细胞核，因此ras基因的突变可持久地激活其并且即使在细胞外信号不存在的情况下也在细胞内引起不适当的传导。因为这些信号导致细胞生长和分裂，因此失调的Ras信号转导最终可以导致肿瘤发生和癌症(Goodsell DS(1999).Oncologist 4(3):263-4)。在20-25%的所有人肿瘤(在特定的肿瘤类型中达到90%)中发现Ras的激活突变(Downward J(2003年1月).Nat.Rev.Cancer 3(1):1122)。

Ras超家族具有100多种蛋白质(Wennerberg等人，(March 2005).J.Cell.Sci.118(Pt 5):843-6)。基于结构、序列和功能，可将Ras超家族分成8个主要家族，每一个所述家族被进一步分成亚家族：Ras、Rho、Rab、Rap、Arf、Ran、Rheb、Rad和Rit。

每一个亚家族共有共同的核心G结构域，其提供必须的GTP酶和核苷酸交换活性。周围序列帮助确定小GTP酶的功能特异性，例如Rho亚家族共有的'插入环(Insert Loop)'特异性地促成对效应蛋白例如IQGAP和WASP的结合。

Ras家族通常负责细胞增殖，Rho负责细胞形态学，Ran负责核转运，Rab和Arf负责囊泡运输(Munemitsu等人，(1990).Mol Cell Biol10(11):597782)。V-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1，也称为BRAF，是在人中由BRAF基因编码的蛋白质(Sithanandam等人(December 1990)Oncogene 5(12):1775-80；Sithanandam等人(1992年4月).Oncogene 7(4):795–9)。

人KRAS DNA具有由GenBank登录号NG 007524描述的核苷酸序列。人KRAS mRNA具有由GenBank登录号NM 004985描述的核苷酸序列。

BRAF基因产生称为B-RAF的蛋白质，所述蛋白质在细胞中和在细胞生长中参与发送信号。该基因在许多类型的癌症中可被突变(Davies等人，(2002).Nature 417(6892):949-54)，所述突变引起B-RAF蛋白的改变。这可增加癌细胞的生长和扩散。

该基因编码属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的raf/mil家族的蛋白质。该蛋白质在调节MAP激酶/ERK信号转导途径中起作用，其影响细胞分裂、分化和分泌。

该基因的突变与心包膜综合征(特征在于心脏缺陷的疾病)、精神发育迟滞和独特面容(distinctive facial appearance)相关。该基因的突变还与多种癌症相关，包括非何杰金淋巴瘤、结直肠癌、恶性黑素瘤、甲状腺癌、肺的非小细胞肺癌和肺腺癌。

c-raf是编码此处称为“Raf-1”的蛋白激酶的基因。Raf-1蛋白在MAPK/ERK信号转导途径中用作蛋白激酶级联的部分。Raf-1为丝氨酸/苏氨酸特异性激酶。Raf-1为MAP激酶激酶激酶(MAP3K)，其在与其直接结合的膜结合GTP酶的Ras家族的下游起作用。一旦被激活，Raf-1就可磷酸化以激活双特异性蛋白激酶MEK1和MEK2，所述激酶依次磷酸化以激活丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶ERK1和ERK2。激活的ERK是细胞生理学的多效性效应子并且在参与细胞分裂周期、细胞凋亡、细胞分化和细胞迁移的基因表达的控制中起着重要作用。

被发现的第一raf基因是癌基因v-raf(Mark等人，(1984年4月).Science224(4646):285-9)。不久发现v-raf的正常(非致癌的)细胞同源物是真核基因组的保守组分并且显示它们可突变并且变成癌基因(Shimizu等人，(1986).Int.symp.Princess Takamatsu Cancer Res.Fund 17:8591)。A-Raf和B-Raf是与Raf-1具有相似序列的两种蛋白激酶。在几种类型的癌症中发现B-Raf基因的突变。Raf激酶是抗癌药物开发的靶(Sridhar等人，(2005年4月).Mol.CancerTher.4(4):677-85)。存在几个可用于检测Raf激酶抑制性药物的定量免疫化学法(Olive(2004年10月).Expert Rev Proteomics 1(3):32741)。

人BRAF DNA具有由GenBank登录号NG 007873描述的核苷酸序列。人BRAF mRNA具有由GenBank登录号NM_004333描述的核苷酸序列。

人RAF1DNA具有由GenBank登录号NG_007467描述的核苷酸序列。人RAF1mRNA具有由GenBank登录号NM_002880描述的核苷酸序列。

II.抗体

本发明的基因融合蛋白，包括其片段、衍生物和类似物，可用作免疫原来产生在下面描述的诊断、研究和治疗方法中具有用途的抗体。所述抗体可以是多克隆或单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链推磨或Fab片段。对于本领域技术人员来说是已知的不同方法可用于产生和标记此类抗体和片段。参见，例如，Burns编，Immunochemical Protocols，第3版，HumanaPress(2005)；Harlow和Lane，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory(1988)；Kozbor等人，Immunology Today 4:72(1983)；和Milstein，Nature 256:495(1975)。利用截短的ETS家族成员蛋白或嵌合蛋白与它们各自的天然蛋白质之间的差异的抗体或片段是特别优选的。

III.诊断应用

本文中描述的基因融合物可被检测为DNA、RNA或蛋白质。最初，基因融合物可被检测为具有来自第一基因的5’部分和来自RAS或RAF家族成员基因的3’部分的基因组DNA的染色体重排。当转录时，基因融合物可被检测为具有来自第一基因的5’部分和来自RAS或RAF家族成员基因的3’部分的嵌合mRNA。当翻译时，基因融合可被检测为来自第一蛋白质的5’部分和来自RAS或RAF家族成员蛋白质的3’部分的融合蛋白或第一蛋白质或RAS或RAF家族成员的截短形式。截短或融合蛋白可与它们各自的天然蛋白质相异在于氨基酸序列、翻译后加工和/或二级、三级或四级结构。这样的差异(如果存在的话)可用于鉴定基因融合物的存在。下面更详细地描述检测的具体方法。

本发明提供了基于DNA、RNA和蛋白质的直接或间接检测基因融合物的诊断方法。本发明还提供了用于诊断目的组合物和试剂盒。

本发明的诊断方法可以是定性的或定量的。定量诊断法可以用于例如通过截止值或阈值水平区分惰性与攻击性癌症。在可适用的情况下，定性或定量诊断法还可包括靶、信号或媒介物(intermediary)(例如，通用引物)的扩增。

初始测定可确认基因融合物的存在但不能鉴定具体的融合物。如果需要，随后进行二次测定以确定特定融合物的身份。二次测定可使用与初始测定法不同的检测技术。

可以以多重或小组形式检测本发明的基因融合物以及其它标志。单独地或与基因融合物组合地选择标志的预测值。示例性前列腺癌标志包括但不限于：AMACR/P504S(美国专利No.6,262,245)；PCA3(美国专利No.7,008,765)；PCGEM1(美国专利No.6,828,429)；蛋白质/P501S、P503S、P504S、P509S、P510S、prostase/P703P、P710P(第20030185830号美国公布)；以及美国专利No.5,854,206和6,034,218以及第20030175736号美国公布(将每一个所述专利和公布通过引用整体并入本文)中公开的标志。其它癌症、疾病、感染和代谢状况的标志也预期包括在多重或小组形式中。

本发明的诊断法还可参考使特定基因融合物与疾病的分期、侵袭性或进展或转移的存在或风险相关的数据来进行改进。最后，由本发明的方法提供的信息将帮助医生选择对于特定患者的最佳疗程。

A.样品

可按照本发明的方法测试怀疑包含基因融合物的任何患者样品。以非限定性实例为例，样品可以是组织(例如，前列腺活检样品或通过前列腺切除术获得的组织样品)、血液、尿、精液、前列腺分泌物或其级分(例如，血浆、血清、尿上清液、尿细胞沉淀或前列腺细胞)。优选在仔细的直肠指诊(DRE)之后立即收集尿样品，所述直肠指诊使前列原的前列腺细胞脱落至泌尿道中。

患者样品通常需要经设计用以分离或富集基因融合物或包含基因融合物的细胞的样品的预处理。多种对于本领域技术人员来说是已知的技术可用于该目的，包括但不限于：离心；免疫捕获；细胞裂解；和核酸靶向捕获(参见，例如，欧洲专利No.1409727，通过引用整体并入本文)。

B.DNA和RNA检测

可使用多种对于本领域技术人员来说是已知的核酸技术(包括但不限于：核酸测序；核酸杂交；和核酸扩增)将本发明的基因融合物检测为基因组DNA的染色体重排或嵌合mRNA。

1.测序

核酸测序技术的说明性非限定性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域技术人员承认，因为RNA在细胞中不太稳定并且更易于被核酸酶攻击，因此在实验中在测序之前通常将RNA逆转录成DNA。

链终止子测序使用利用经修饰的核苷酸底物进行的DNA合成反应的序列特异性终止。通过使用短的放射性或其它物质标记的寡核苷酸引物在模板DNA的特定位点上起始延伸，所述引物与该区域上的模板互补。使用DNA聚合酶、标准的4种脱氧核苷酸碱基和低浓度的一种链终止核苷酸(最常见地双脱氧核苷酸)延伸寡核苷酸引物。在4个分开的管中重复该反应，每一种碱基轮流作为双脱氧核苷酸。链终止核苷酸通过DNA聚合酶的有限掺入导致一系列相关DNA片段，所述DNA片段只在其中使用特定双脱氧核苷酸的位置上被终止。对于每一个反应管，在平板聚丙烯酰胺凝胶或充满粘稠聚合物的毛细管中通过电泳分离片段。通过当你从凝胶的顶部扫视至底部时读取哪个泳道产生来自标记引物的可见标记来测定序列。

染料终止子测序可选地标记终止剂。可通过利用分开的荧光染料(所述探针在不同波长上发荧光)标记每一种双脱氧核苷酸链终止剂来在单个反应中进行完全测序。

2.杂交

核酸杂交技术的说明性非限定性实例包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern印迹或Northern印迹。

原位杂交(ISH)是一种类型的杂交，其使用标记的互补DNA或RNA链作为探针来将特定DNA或RNA序列定位在组织的部分或切片(原位)中，或如果组织足够小，则定位在整个组织(整体ISH)中。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于在组织切片或整体内测量和定位mRNA以及其它转录物。通常处理样品细胞和组织以原位固定靶转录物和增加探针的进入。将探针在升高的温度下与靶序列杂交，随后洗去过量探针。分别使用放射自显影术、荧光显微镜术或免疫组织化学定位和定量组织中的用放射性、荧光或抗原标记的碱基标记探针。ISH还可使用两种或多种用放射性或其它非放射性标记物标记的探针来同时检测两种或多种转录物。

a.FISH

在某些实施方案中，使用荧光原位杂交(FISH)检测融合序列。用于本发明的优选FISH测定法利用细菌人工染色体(BAC)。这类细菌人工染色体已被广泛用于人基因组测序计划(参见Nature 409:953-958(2001))，并且包含特定BAC的克隆可通过分配者(可通过位于许多来源例如NCBI)获得。来自人基因组的每一个BAC克隆被赋予明确标识其的参考名称。这些名称可用于发现相应GenBank序列和从分配者订购克隆的拷贝。

本发明还提供了对人前列腺细胞、人前列腺组织或对围绕所述人前列腺细胞或人前列腺组织的液体进行FISH测定的方法。

b.微阵列

不同种类的生物测定法称为微阵列，包括但不限于：DNA微阵列(例如，cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列)；蛋白质微阵列；组织微阵列；转染或细胞微阵列；化合物微阵列；以及抗体微阵列。DNA微阵列，通常称为基因芯片或生物芯片，是附着至固体表面(例如，玻璃、塑料或硅芯片)形成用于同时表征数千个基因的表达和监控其表达水平的微小DNA点的集合。附着的DNA片段称为探针，可将数千种所述探针用于单个DNA阵列。微阵列可用于通过比较患病和正常细胞的基因表达来鉴定疾病。可使用多种技术来制备微阵列，包括但不限于：利用尖头针打印在载波片上；使用预制掩模的光刻法；使用动态微镜装置的光刻法；墨水喷射打印；或微电极阵列上的电化学。

Southern印迹和Northern印迹分别用于检测特定的DNA或RNA序列。将从样品提取的DNA或RNA片段化，在基质凝胶上电泳分离，然后转移至滤膜。将滤膜结合的DNA或RNA经历与与目的序列互补的标记探针杂交。检测与滤膜结合的杂交的探针。该方法的变型是反向Northern印迹，其中被附着于膜上的底物核酸是分离的DNA片段的集合并且探针是从组织提取的且被标记的RNA。

3.扩增

可在检测之前或与之同时扩增基因组DNA和嵌合mRNA的染色体重排。核酸扩增技术的说明性非限定性实例包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域技术人员将承认某些扩增技术(例如，PCR)需要RNA在扩增之前被逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，然而其它扩增技术直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

聚合酶链式反应(美国专利No.4,683,195、4,683,202、4,800,159和4,965,188，将所述每一个专利通过引用整体并入本文)，通常称为PCR，使用多个循环的变性、引物对相反链的退火以及引物延伸来指数式增加靶核酸序列的拷贝数。在称为RT-PCR的变型中，逆转录酶(RT)被用于从mRNA产生互补DNA(cDNA)，随后通过PCR扩增cDNA以产生多拷贝的DNA。关于PCR的其它不同变换，参见，例如，美国专利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159；Mullis等人，Meth.Enzymol.155:335(1987)；以及Murakawa等人，DNA 7:287(1988)，将所述每一篇专利和文献通过引用整体并入本文。

通常称为TMA的转录介导的扩增(美国专利No.5,480,784和5,399,491，将所述每一篇专利通过引用整体并入本文)在大体上恒定的温度、离子强度和pH的条件(其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地产生另外的拷贝)下自身催化地合成多拷贝的靶核酸序列。参见，例如，美国专利No.5,399,491和5,824,518，将每一个所述专利通过引用整体并入本文。在第20060046265号美国公布(通过引用整体并入本文)描述的变型中，TMA任选地包括使用封闭部分、终止部分和其它修饰部分来提高TMA法的灵敏度和精确度。

连接酶链式反应(Weiss，R.，Science 254:1292(1991)，通过引用整体并入本文)，通常称为LCR，使用两组与靶核酸的相邻区域杂交的互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复循环中被DNA连接酶共价连接以产生可检测的双链连接的寡核苷酸产物。

链置换扩增技术(Walker，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:392-396(1992)；美国专利No.5,270,184和5,455,166，将所述每一篇文献和专利通过引用整体并入本文)，通常称为SDA，使用以下循环：使引物序列与靶序列的相反链退火配对，在dNTPαS存在的情况下进行引物延伸以产生双链体半硫代磷酸酯化的引物延伸产物，对半修饰的限制性核酸内切酶识别位点进行内切酶介导的切口产生，然后从切口的3'末端进行聚合酶介导的引物延伸以置换现有链并且产生用于下一轮引物退火、切口产生和链置换的链，从而导致产物的几何扩增。嗜热SDA(tSDA)在基本上相同的方法中在更高的温度下使用嗜热核酸内切酶和聚合酶(欧洲专利No.0684315)。

其它扩增方法包括例如：基于核酸序列的扩增(美国专利No.5,130,238，通过引用整体并入本文)，通常称为NASBA；使用通常称为Qβ复制酶的RNA复制酶扩增探针分子本身的扩增法(Lizardi等人，BioTechnol.6:1197(1988)，通过引用整体并入本文)；基于转录的扩增法(Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173(1989))；和自主序列复制(Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874(1990)，将所述每一篇文献通过引用整体并入本文)。关于已知扩增方法的进一步论述参见Persing，David H.，“In Vitro Nucleic Acid AmplifcationTechniques”in Diagnostic Medical Microbiology:Principles andApplications(Persing等人编著)，pp.51-87(American Society for Microbiology，Washington，DC(1993))。

4.检测方法

可通过任何常规方法检测非扩增的或扩增的基因融合核酸。例如，可通过与可检测地标记的探针杂交和测量所得的杂交物来检测基因融合物。下面描述检测法的说明性非限定性实例。

一个说明性检测法杂交保护测定(Hybridization ProtectionAssay)(HPA)包括将化学发光寡核苷酸探针(例如，吖啶酯标记的(AE)探针)与靶序列杂交，选择性水解存在于未杂交的探针上的化学发光标记物，然后在光度计中测量从剩余探针产生的化学发光。参见，例如，美国专利No.5,283,174和NormanC.Nelson等人，Nonisotopic Probing，Blotting，and Sequencing，第17章(LarryJ.Kricka编著，第2版.1995，将所述每一篇文献通过引用整体并入本文)。

另一个说明性检测法提供了扩增过程的实时定量评估。扩增过程的“实时”评估包括在扩增反应过程连续地或定期地测定反应混合物中扩增子的量，和使用测定的值计算最初存在于样品中的靶序列的量。多种用于基于实时扩增测定存在于样品中的初始靶序列的量的方法在本领域是公知的。此类方法包括美国专利No.6,303,305和6,541,205(将每一个所述专利通过引用整体并入本文)中公开的方法。用于测定最初存在于样品中的靶序列的量的但不基于实时扩增的另一个方法公开于美国专利No.5,710,029(通过引用整体并入本文)中。

可通过使用多种自我杂交探针(其大部分具有茎-环结构)实时检测扩增产物。取决于探针是以自我杂交的状态存在还是通过与靶序列杂交以改变的状态存在，标记此类自我杂交探针以便它们发射不同的可检测信号。以非限定性实例为例，“分子火炬(molecular torche)”是一种自我杂交探针，其包括通过连接区(例如，非核苷酸连接体)连接的并且在预定的杂交测定条件下彼此杂交的自我互补的独特区域(称为“靶结合结构域”和“靶闭合结构域(targetclosing domain)”)。在优选实施方案中，分子火炬在靶结合结构域中包含单链碱基区域，其在长度上为约1至约20个碱基并且易于接近以在链置换条件下与存在于扩增反应中的靶序列杂交。在链置换条件下，分子火炬的可完全或部分互补的两个互补区域的杂交是有利的，除了在靶序列存在的情况下，所述靶序列将结合存在于靶结合结构域中的单链区域并且置换靶闭合结构域的全部或部分。分子火炬的靶结合结构域和靶闭合结构域包括这样放置的可检测的标记或一对相互作用的标记(例如，发光剂/猝灭剂)，以便当分子火炬自我杂交时与当与靶序列杂交时相比较产生不同的信号，从而允许在未杂交的分子火炬存在的情况下检测测试样品中的探针:靶双链体。分子火炬和多种类型的相互作用标记物对描述于美国专利No.6,534,274(通过引用整体并入本文)中。

具有自我互补性的检测探针的另一个实例是“分子信标”。分子信标包括核酸分子，所述核酸分子具有靶互补序列、在靶序列不存在于扩增反应中的情况下使探针保持闭合构象的亲和力对(affinity pair)(或核酸臂)以及当探针处于闭合构象时相互作用的标记物对。靶序列与靶互补序列的杂交将亲和力对的成员分开，从而将探针转换成开放构象。至开放构象的转换因标记物对的减小的相互作用而可被检测，所述标记物对可以是例如荧光基团和猝灭剂(例如，DABCYL和EDANS)。分子信标公开于美国专利No.5,925,517和6,150,097(通过引用整体并入本文)中。

其它自我杂交探针对于本领域技术人员来说是公知的。以非限定性实例为例，具有相互作用的标记物的探针结合对，例如美国专利No.5,928,862(通过引用整体并入本文)中公开的探针结合对，可经改造以适用于本发明。用于检测单核苷酸多态性(SNP)的探针系统也可用于本发明。另外的检测系统包括“分子开关”，如第20050042638号美国公布(通过引用整体并入本文)中公开的。其它探针例如包括嵌入染料和/或荧光基团的探针也用于在本发明中检测扩增产物。参见，例如，美国专利No.5,814,447(通过引用整体并入本文)。

C.蛋白质检测

可使用本领域技术人员已知的多种蛋白质技术(包括但不限于：蛋白质测序；和免疫测定法)将本发明的基因融合物检测为截短或嵌合蛋白质。

1.测序

蛋白质测序技术的说明性非限定性实例包括但不限于质谱法和埃德曼降解法。

质谱法原则上可对任何大小的蛋白质测序，但随着大小增加计算机化变得更加困难。利用内切蛋白酶降解蛋白质，将所得的溶液通过高压液相色谱柱。在该柱的末端，溶液从狭窄喷口喷出(带电荷至高正电位)，进入质谱仪。微滴上的电荷使它们破碎化直至只保留单个离子。随后肽被片段化，测量片段的质荷比。利用计算机分析质谱，将所述质谱与先前测序的蛋白质的数据库相比较以测定片段的序列。然后用不同的降解酶来重复该过程，序列的交叠用于构建蛋白质的序列。

在埃德曼降解反应中，将待测序的肽吸附至固体表面(例如，包被有聚凝胺的玻璃纤维)上。向吸附的肽中加入埃德曼试剂异硫氰酸苯酯(PTC)和12%的三甲胺的适度碱性缓冲液，埃德曼试剂与N末端氨基酸的胺基反应。随后可通过加入无水酸来选择性分离末端氨基酸衍生物。衍生物异构化以提供取代的苯硫乙内酰脲，可洗去其，利用色谱法进行鉴定，然后可重复该循环。每一步的效率为约98%，这允许可靠地测定约50个氨基酸。

2.免疫测定法

免疫测定法的说明性非限定性实例包括但不限于：免疫沉淀；蛋白质印迹；ELISA；免疫组织化学；免疫细胞化学；流式细胞术；和免疫-PCR。使用本领域技术人员已知的多种技术(例如，比色法、荧光法、化学发光法或放射性法)可检测地标记的多克隆或单克隆抗体适合用于免疫测定法。

免疫沉淀是使用特异于抗原的抗体将该抗原沉淀出溶液的技术。该方法可用于通过靶向被认为存在于复合物中的蛋白质来鉴定存在于细胞提取物中的所述蛋白质。利用最初从细菌分离的不溶性抗体-结合蛋白例如蛋白A和蛋白G将复合物从溶液取出。还可将抗体偶联至可容易地从溶液分离出来的琼脂糖珠粒。在洗涤后，可使用质谱法、蛋白质印迹或用于鉴定复合物的成分的许多其它方法来分析沉淀。

蛋白质印迹或免疫印迹是检测给定的组织匀浆或提取物样品中的蛋白质的方法。其使用凝胶电泳根据质量分离变性的蛋白质。随后将蛋白质转移出凝胶并且转移至膜(通常聚二氟乙烯或硝酸纤维素)上，在所述膜上使用特异于目的蛋白质的抗体探测它们。作为结果，研究者可检查给定的样品中蛋白质的量和比较几个组之间的水平。

ELISA(酶联免疫吸附测定法的缩写)是检测抗体或抗原在样品中的存在的生物化学技术。其利用最少两种抗体，其中之一特异于抗原并且另一个被偶联至酶。第二抗体将引起生色或荧光底物产生信号。ELISA的变型包括夹心ELISA、竞争性ELISA和ELISPOT。因为可进行ELISA来估计抗原或抗体在样品中的存在，因此其为用于测定血清抗体浓度以及用于检测抗原的存在的有用工具。

免疫组织化学和免疫细胞化学是指通过组织或细胞中的抗原结合它们各自的抗体的原理分别将蛋白质定位在组织切片或细胞中的方法。可视化能够通过用生色或荧光标记物标记抗体来实现。有色标记物的常见实例包括但不限于辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。荧光基团标记物的常见实例包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)。

流式细胞术是用于计数、检查和分选悬浮在液流中的微观粒子的技术。其允许流过光学/电子检测仪器的单个细胞的物理和/或化学特征的同时多参数分析。单频率或颜色的光束(例如，激光)指向水动力聚焦的液流上。许多检测器瞄准其中液流通过光束的点；一个检测器与光束对成直线(前向散射或FSC)并且几个检测器与其垂直(侧向散射(SSC)或一个或多个荧光检测器)。每一个通过光束的悬浮颗粒以某种方式散射光线，颗粒中的荧光化学药品可被激发，从而以比光源更低的频率发射光。散射光与荧光的组合被检测器拣出，通过分析每一个检测器(一个检测器针对一个荧光发射峰值)上的亮度的波动，可能推断出关于每一个单个颗粒的物理和化学结构的多个事实。FSC与细胞体积相关，SSC与颗粒的密度或内部复杂性(例如，细胞核的形状、细胞质颗粒的量和类型或膜粗糙度)相关。

免疫-聚合酶链式反应(IPCR)利用核酸扩增技术在基于抗体的免疫测定中增加信号的产生。因为不存在PCR的蛋白质等同物，即蛋白质不能以与核酸在PCR过程中复制的方式相同的方式复制，因此增加检测灵敏度的唯一方法是通过信号放大。将靶蛋白与被直接或间接缀合于寡核苷酸的抗体结合。洗去未结合的抗体，剩下的结合的抗体具有它们的扩增的寡核苷酸。蛋白质检测通过使用标准核酸检测法(包括实时法)检测扩增的寡核苷酸来进行。

D.数据分析

在某些实施方案中，将基于计算机的分析程序用于将由检测测定法产生的原始数据(例如，给定的基因融合物或其它标志的存在、不存在或量)翻译成临床医生使用的预测值的数据。临床医生可使用任何适当的方法获得预测数据。因此，在某些优选实施方案中，本发明提供了其它益处：不可能在遗传学或分子生物学上得到训练的临床医生不必理解原始数据。以其最有用的形式直接将数据呈递给临床医生。临床医生从而能够立即利用信息以最优化受试者的护理。

本发明涉及能够在进行测定的实验室、信息提供者、医务人员和受试者之间来回接收、处理和传递信息的任何方法。例如，在本发明的某些实施方案中，从受试者获得样品(例如，活检组织或血清或尿样品)，将其提供给位于世界任何部分(例如，在与其中受试者居住的国家或其中最终使用信息的国家不同的国家中)的表征服务机构(profiling service)(例如，医疗机构的临床实验室、基因组表征商业机构等)以产生原始数据。当样品包括组织或其它生物样品时，受试者可拜访处方医疗中心以获取样品并且将其送至表征中心，或受试者可收集他们自己的样品(例如，尿样品)并且直接将其送至表征中心。当样品包括先前测定的生物信息时，受试者可将信息直接送至表征服务机构(例如，可通过计算机扫描含有信息的信息卡，然后使用电子通讯系统将数据传递至表征中心的计算机)。当样品被表征中心接收后，样品被处理并且产生特异于对于受试者是期望的诊断或预后信息的特征(即，表达数据)。

随后以适合于由治疗医生解释的格式产生特征数据。例如，不是提供原始表达数据，而是产生的格式可代表对于受试者的诊断或风险评估(例如，癌症存在的可能性)以及对于具体治疗选择的推荐。可通过任何适当的方法将数据展示给临床医生。例如，在某些实施方案中，表征服务机构产生可为临床医生打印的(例如，在重点照护检验时)或在计算机监视器上展示给临床医生的报告。

在某些实施方案中，首先可在医疗点或在地区机构分析信息。随后将原始数据送至中央处理设施以进一步分析和/或将原始数据转化成用于临床医生或患者的信息。中央处理设施提供了数据分析的私密性(所有数据根据统一安全协议被存储在中央设施)、速度和一致性的有利方面。中央处理设施可在受试者的治疗后控制数据的命运。例如，通过使用电子通讯系统，中央设施可给临床医生、受试者或研究者提供数据。

在某些实施方案中，受试者能够直接使用电子通讯系统访问数据。受试者可基于结果选择其它干预或咨询。在某些实施方案中，数据被用于研究用途。例如，可将数据用于进一步最优化作为疾病的具体状况或分期的有用指标的标志的包括或清除。

E.体内成像

还可使用体内成像技术选择本发明的基因融合物，所述技术包括但不限于：放射性核素成像；正电子发射断层摄影术(PET)；计算机轴位体层摄影术、X-射线或磁共振成像法、荧光检测法和化学发光检测法。在某些实施方案中，体内成像技术被用于使动物(例如人或非人哺乳动物)中癌症标志的表达的存在可见。例如，在某些实施方案中，使用特异于癌症标志的标记抗体标记癌症标志mRNA或蛋白质。可使用体内成像法检测个体中的特异性结合和标记的抗体，所述方法包括但不限于放射性核素成像、正电子发射断层摄影术、计算机轴位体层摄影术、X-射线或磁共振成像法、荧光检测法和化学发光检测法。下面描述用于产生针对本发明的癌症标志的抗体的方法。

本发明的体内成像法在表达本发明的癌症标志的癌症(例如，前列腺癌)的诊断中是有用的。体内成像被用于使表示癌症的标志的存在可见。此类技术允许诊断而无需使用令人不快的活组织检查。本发明的体内成像法对于给癌症患者提供预后也是有用的。例如，可检测表示癌症可能转移的标志的存在。本发明的体内成像法还可用于检测身体的其它部位中的转移癌。

在某些实施方案中，对特异于本发明的癌症标志的试剂(例如，抗体)进行荧光标记。使用任何适当的方法(例如，使用美国专利No.6,198,107(通过引用并入本文)中描述的仪器)检测荧光标记的抗体。

在其它实施方案中，对放射性标记抗体。抗体用于体内诊断的用途在本领域是公知的。Sumerdon等人，(Nucl.Med.Biol 17:247-254[1990])已描述了用于使用铟-111作为标记物对肿瘤进行放射免疫闪烁成像的最优化抗体-螯合剂。Griffin等人，(J Clin Onc 9:631-640[1991])已描述了该试剂在检测怀疑患有复发性结直肠癌的患者的肿瘤中的用途。具有顺磁性离子的类似试剂作为用于磁共振成像的标记物的用途在本领域是已知的(Lauffer，MagneticResonance in Medicine 22:339-342[1991])。使用的标记物将取决于所选择的成像模式。放射性标记物例如铟-111、锝-99m或碘-131可用于平面扫描或单光子发射计算体层摄影术(SPECT)。正电子发射标记物例如氟-19也可用于正电子发射断层摄影术(PET)。对于MRI，可使用顺磁性离子例如钆(III)或锰(II)。

具有半衰期在1小时至3.5天之间的放射性金属可用以缀合抗体，例如钪-47(3.5天)、镓-67(2.8天)、镓-68(68分钟)、锝-99m(6小时)和铟-111(3.2天)，其中镓-67、锝-99m和铟-111对于γ照相显像术是优选的，镓-68对于正电子发射断层摄影术是优选的。

用此类放射性金属标记抗体的有用方法是利用双功能螯合剂例如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)，如例如由Khaw等人(Science 209:295[1980])(对于In-111和Tc-99m而言)所描述的，以及如由Scheinberg等人(Science215:1511[1982])所描述的。也可使用其它螯合剂，但1-(对-羧基甲氧基苄基)EDTA和DTPA的羧基碳酸酐是有利的，因为它们的使用允许缀合而不显著影响抗体的免疫反应性。

用于将DPTA偶联于蛋白质的另一个方法是使用DTPA的环酐，如由Hnatowich等人(Int.J.Appl.Radiat.Isot.33:327[1982])对于利用In-111标记白蛋白所描述的，但所述方法可适合于抗体的标记。用Tc-99m标记抗体的适当方法(所述方法不使用利用DPTA的螯合作用)是Crockford等人，(美国专利No.4,323,546，通过引用并入本文)的相关方法。

用Tc-99m标记免疫球蛋白的优选方法是由Wong等人(Int.J.Appl.Radiat.Isot.，29:251[1978])对于血浆蛋白所描述的方法，并且最近被Wong等人(J.Nucl.Med.，23:229[1981])成功地用于标记抗体的方法。

在缀合于特定抗体的放射性金属的情况下，同样也期望向抗体分子引入尽可能高比例的放射性标记而不破坏其免疫原性。其它改进可通过在本发明的特定癌症标志存在的情况下实施放射性标记以确保抗体上的抗原结合位点得到保护来实现。抗原在标记后被分离。

在其它实施方案中，体内生物光子成像(Xenogen，Almeda，CA)用于体内成像。该实时体内成像利用荧光素酶。荧光素酶基因被整合入细胞、微生物和动物(例如，作为与本发明的癌症标志的融合蛋白)。当被激活时，其导致发射光的反应。将CCD照相机和软件用于捕获图像并且分析其。

F.组合物和试剂盒

可以以试剂盒的形式提供单独的或与本发明的其它组合物组合的任何此类组合物。例如，可在试剂盒中提供用于扩增和检测本发明的基因融合物的单个标记探针和成对的扩增寡核苷酸。试剂盒还可包括适当的对照和/或检测试剂。本发明的探针和抗体组合物还可以以阵列的形式提供。

用于本发明的诊断方法的组合物包括但不限于探针、扩增寡核苷酸和抗体。特别优选的组合物只有当第一基因融合至RAS或RAF家族成员基因时才可检测产物。此类组合物包括：包含序列的单个标记探针，所述序列与来自第一基因的5’部分与来自RAS或RAF家族成员基因的3’融合的接头杂交(即，跨越基因融合接头)；一对扩增寡核苷酸，其中第一扩增寡核苷酸包含与来自第一基因融合物的5’部分至来自RAS或RAF家族成员基因的3’部分的转录调控区杂交的序列；针对因第一蛋白与RAS或RAF家族成员基因的融合而产生的氨基末端截短的蛋白质的抗体；或针对具有来自第一基因的氨基末端部分和来自RAS或RAF家族成员基因的羧基末端部分的嵌合蛋白质的抗体。然而，其它有用的组合物包括：一对标记探针，其中第一标记探针包含与第一基因的转录调控区杂交的序列并且第二标记探针包含与RAS或RAF家族成员基因杂交的序列。

IV.药物筛选应用

在某些实施方案中，本发明提供了药物筛选测定法(例如，以筛选抗癌药物)。本发明的筛选法利用使用本发明的方法鉴定的癌症标志(例如，包括但不限于本发明的基因融合物)。在某些实施方案中，本发明提供了筛选改变(例如，减少)基因融合物的表达的化合物的方法。化合物或试剂可通过例如与启动子区域相互作用来干扰转录。化合物或试剂干扰由融合物产生的mRNA(例如，通过RNA干扰、反义技术等)。化合物或试剂可干扰为融合物的生物活性的上游或下游的途径。在某些实施方案中，候选化合物是针对癌症标志的反义或干扰RNA试剂(例如，寡核苷酸)。在其它实施方案中，候选化合物是特异性结合本发明的癌症标志调节剂或表达产物并且抑制其生物功能的抗体或小分子。

在一个筛选方法中，通过将化合物与表达癌症标志的细胞接触来评估候选化合物的改变癌症标志表达的能力，随后测定所述候选化合物对表达的作用。在某些实施方案中，可通过检测由细胞表达的癌症标志mRNA的水平来评估候选化合物对癌症标志基因的表达的作用。可通过任何适当的方法检测mRNA表达。

在其它实施方案中，可通过测量由癌症标志编码的多肽的水平来评估候选化合物对癌症标志基因的表达的作用。可使用任何适当的方法(包括但不限于本文中公开的方法)来测量表达的多肽的水平。

具体地，本发明提供了用于鉴定调节剂，即结合本发明的的癌症标志，对例如癌症标志表达或癌症标志活性具有抑制(或刺激)作用，或对例如癌症标志底物的表达或活性具有刺激或抑制作用的候选或测试化合物或试剂(例如，蛋白质、肽、肽模拟物、类肽、小分子或其它药物)的筛选方法。由此鉴定的化合物可用于在治疗方案中直接或间接调节靶基因产物(例如，癌症标志基因)的活性，以发挥靶基因产物的生物功能，或鉴定破坏正常靶基因相互作用的化合物。抑制癌症标志的活性或表达的化合物在治疗增生性障碍例如癌症(特别地前列腺癌)中是有用的。

在一个实施方案中，本发明提供了用于筛选作为癌症标志蛋白或多肽或其生物活性部分的底物的候选或测试化合物的测定法。在另一个实施方案中，本发明提供了用于筛选结合或调节癌症标志蛋白或多肽或其生物活性部分的活性的候选或测试化合物的测定法。

本发明的测试化合物可在本领域已知的组合文库法中使用许多方法的任一方法获得，所述组合文库法包括生物文库；类肽文库(具有肽的功能性但具有新型非肽主链的分子的文库，所述分子抗酶促降解但仍然保持生物活性；参见，例如，Zuckennann等人，J.Med.Chem.37:2678-85[1994])；空间可寻址平行固相(spatially addressable parallel solid phase)或液相文库；需要解叠合(deconvolution)的合成文库法；'一株一化合物'文库法；和使用亲和层析选择的合成文库法。生物文库和类肽文库法优选用于肽文库，然而其它4种方法也适用于化合物的肽、非肽寡聚物或小分子文库(Lam(1997)AnticancerDrug Des.12:145)。

用于分子文库的合成的方法的实例可见于本领域，例如见于：DeWitt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909[1993]；Erb等人，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 91:11422[1994]；Zuckermann等人，J.Med.Chem.37:2678[1994]；Cho等人，Science 261：1303[1993]；Carrell等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33.2059[1994]；Carell等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061[1994]；和Gallop等人，J.Med.Chem.37:1233[1994]。

化合物的文库可提供于溶液中(例如，Houghten，Biotechniques13:412-421[1992])，或提供于珠粒(Lam，Nature 354:82-84[1991])、芯片(Fodor，Nature 364:555-556[1993])、细菌或孢子(美国专利No.5,223,409；通过引用并入本文)、质粒(Cull等人，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 89:18651869[1992])或噬菌体(Scott和Smith，Science  249:386-390[1990]；Devlin  Science249:404-406[1990]；Cwirla等人，Proc.NatI.Acad.Sci.87:6378-6382[1990]；Felici，J.Mol.Biol.222:301[1991])上。

在一个实施方案中，测定法是基于细胞的测定法，其中将表达癌症标志mRNA或蛋白质或其生物活性部分的细胞与测试化合物接触，并且测定所述测试化合物调节癌症标志的活性的能力。可通过监控例如酶促活性、破坏或mRNA等的变化来测定测试化合物调节癌症标志活性的能力。

还可评估测试化合物调节癌症标志对化合物例如癌症标志底物或调节剂的结合的能力。这可以例如通过用放射性同位素或酶促标记物偶联化合物例如底物(以便可通过检测复合物中的标记的化合物例如底物来测定化合物例如底物对癌症标志的结合)来实现。

可选择地，用放射性同位素或酶促标记物偶联癌症标志以监控测试化合物调节癌症标志对复合物中的癌症标志底物的结合的能力。例如用¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³H直接或间接标记化合物(例如，底物)，通过射电发射(radioemmission)的直接计数或通过闪烁计数来检测放射性同位素。可选择地，可用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶酶促标记化合物，通过测定适当的底物至产物的转化来检测酶促标记。

可在标记或不标记任何相互作用物的情况下评估化合物(例如，癌症标志底物)与癌症标志相互作用的能力。例如，可使用微生理计(microphysiometer)检测化合物与癌症标志的相互作用而无需标记所述化合物或癌症标志(McConnell等人Science 257:1906-1912[1992])。如本文中所使用的，“微生理计”(例如，细胞传感器(Cytosensor))是使用光寻址电位传感器(LAPS)测量细胞酸化其环境的速率的分析仪。该酸化速率的变化可用作化合物与癌症标志之间的相互作用的指标。

在另一个实施方案中，提供无细胞测定法，其中将癌症标志蛋白或其生物活性部分与测试化合物接触，评估所述测试化合物结合癌症标志蛋白、mRNA或其生物活性部分的能力。待用于本发明的测定法的癌症标志蛋白或mRNA的优选生物活性部分包括参与与底物或其它蛋白质的相互作用的片段，例如具有高表面概率评分(surface probability score)的片段。

无细胞测定法包括在足以允许两种化合物相互作用和结合(从而形成可被除去和/或检测的复合物)的条件和时间下制备靶基因蛋白与测试化合物的反应混合物。

还可例如使用荧光能量转移(FRET)(参见，例如，Lakowicz等人，美国专利No.5,631,169；Stavrianopoulos等人，美国专利No.4,968,103；将每一个所述专利通过引用并入本文)检测两个分子之间的相互作用。选择荧光基团标记物以便第一供体分子发射的荧光能量可被第二′受体′分子上的荧光标记物吸收，所述荧光标记物反过来能够因吸收的能力而发荧光。

可选择地，'供体'蛋白分子可只利用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同波长的光的标记物，以便′受体′分子标记物可与′供体′的标记物相区别。由于标记物之间的能力转移的效率与分开分子的距离相关，因此可评估分子之间的空间关系。在其中结合在分子之间发生的情况下，′受体′分子标记物的荧光发射应当最大。FRET结合事件可通过本领域公知的标准荧光检测方法(例如，使用荧光计)来方便地测量。

在另一个实施方案中，可使用实时生物分子相互作用分析法(BIA)(参见，例如，Sjolander和Urbaniczky，Anal.Chem.63:2338-2345[1991]和Szabo等人Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705[1995])来测定癌症标志蛋白或mRNA结合靶分子的能力。“表面等离子共振技术”或“BIA”实时检测生物特异性相互作用，而无需标记任何相互作用物(例如，BlAcore)。结合表面上质量的变化(表示结合事件)导致表面附近光的折射率的改变(表面等离子共振(SPR)的光学现象)，从而导致可用作生物分子之间实时反应的指示的可检测信号。

在一个实施方案中，将靶基因产物或测试物质锚定至固相上。可在反应结束时检测锚定在固相上的靶基因产物/测试化合物复合物。优选，可将靶基因产物锚定在固相上，可利用本文中论述的可检测标记物直接或间接标记测试化合物(其未被锚定)。

可能期望固定癌症标志、抗癌症标志抗体或其靶分子以有利于将蛋白质的复合形式与一种或两种蛋白质的非复合形式分离，以及有利于提供测定的自动化。可在适合于盛装反应物的任何容器中实现测试化合物对癌症标志蛋白的结合，或在候选化合物存在或不存在的情况下癌症标志蛋白与靶分子的相互作用。此类容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可提供添加了允许一种或两种蛋白质与基质结合的结构域的融合蛋白。例如，可将谷胱甘肽S-转移酶-癌症标志融合蛋白或谷胱甘肽S-转移酶/靶融合蛋白吸附至谷胱甘肽琼脂糖珠粒(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，随后将其与测试化合物、或与测试化合物和非吸附的靶蛋白或癌症标志蛋白组合，然后将混合物在有助于复合物形成的条件下(例如，就盐和pH而言在生理条件下)进行温育。温育后，洗涤珠粒或微量滴定板孔以除去任何未结合的组分(在珠粒的情况下为固定的基质)，然后例如如上所述直接或间接地测定复合物。

可选择地，可将复合物与基质分离，使用标准技术测定癌症标志结合或活性的水平。用于将癌症标志蛋白或靶分子固定在基质上的其它技术包括使用生物素与链霉抗生物素蛋白的缀合。可使用本领域已知的技术(例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，EL)从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化的癌症标志蛋白或靶分子，然后将其固定在链霉抗生物素蛋白包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。

为了进行所述测定，向含有锚定的组分的包被的表面加入非固定的组分。在反应完成后，在以便所形成的任何复合物仍然固定在固相上的条件下除去(例如，通过洗涤)未反应的组分。可以以许多方式检测锚定在固体表面上的复合物。在预标记先前未固定的组分的情况下，固定在表面上的标记物的检测表示复合物形成。在未预标记先前未固定的组分的情况下，可使用间接标记物来检测锚定在表面上的复合物，例如使用特异于固定的组分的标记抗体(所述抗体，反过来，可利用例如标记的抗IgG抗体直接标记或间接标记)来检测。

利用与癌症标志蛋白或靶分子反应但不干扰所述癌症标志蛋白对其靶分子的结合的抗体来进行该测定。可将此类抗体衍生至板的孔，通过抗体缀合将未结合的靶或癌症标志蛋白捕获在孔中。除了上述用于GST固定的复合物的方法外，用于检测此类复合物方法还包括使用与癌症标志蛋白或靶分子反应的抗体进行的复合物的免疫检测法以及依赖于检测与癌症标志蛋白或靶分子相关的酶促活性的酶联测定法。

可选择地，可在液相中进行无细胞测定法。在这样的测定中，通过许多标准技术将反应产物与未反应的组分分离，所述标准技术包括但不限于：差速离心(参见，例如，Rivas和Minton，Trends Biochem Sci 18:284-7[1993])；层析(凝胶过滤层析、离子交换层析)；电泳(参见人，例如，Ausubel等人编著Current Protocols in Molecular Biology 1999，J.Wiley:New York.)；和免疫沉淀(参见，例如，Ausubel等人编著Current Protocols in Molecular Biology1999，J.Wiley:New York)。此类树脂和层析技术对于本领域技术人员来说是已知的(参见例如，Heegaard J.Mol.Recognit 11:141-8[1998]；Hageand TweedJ.Chromatogr.Biomed.Sci.App 1699:499-525[1997])。此外，还可如上所述方便地使用荧光能量转移技术来检测结合而无需进一步从溶液纯化复合物。

测定可包括将癌症标志蛋白、mRNA或其生物活性部分与已知的化合物(所述化合物结合癌症标志)接触以形成测定混合物，然后将所述测定混合物与测试化合物接触，并且测定测试化合物与癌症标志蛋白或mRNA相互作用的能力，其中测定测试化合物与癌症标志蛋白或mRNA相互作用的能力包括测定测试化合物与已知的化合物相比较优先结合癌症标志或其生物活性部分，或调节靶分子的活性的能力。

就癌症标志可在体内与一种或多种细胞或细胞外大分子例如蛋白质相互作用而言，这样的相互作用的抑制剂是有用的。可使用均相测定法(homogeneous assay)来鉴定抑制剂。

例如，制备靶基因产物与具有相互反应性(interactive)的细胞或细胞外结合伴侣产物的预形成的复合物，以便标记靶基因产物或它们的结合伴侣，但通过标记物产生的信号因复合物形成而被猝灭(参见，例如，美国专利No.4,109,496，通过引用并入本文，利用该方法进行免疫测定)。与来自预形成的复合物的种类之间竞争并且置换其的测试物质的添加将导致高于本底的信号产生。这样，可鉴定破坏靶基因产物-结合伴侣相互作用的测试物质。可选择地，癌症标志蛋白在双杂交测定或三杂交测定中可用作“诱饵蛋白”(参见，例如，美国专利No.5,283,317；Zervos等人，Cell 72:223-232[1993]；Madura等人，J.Biol.Chem.268.12046-12054[1993]；Bartel等人，Biotechniques14:920-924[1993]；Iwabuchi等人，Oncogene 8:1693-1696[1993]；和Brent W094/10300；将所述每一篇文献通过引用并入本文)，以鉴定与癌症标志(″癌症标志-结合蛋白"或"癌症标志-bp")结合或相互作用并且牵涉癌症标志活性的其它蛋白质。此类癌症标志-bp可以是由癌症标志蛋白或靶(如例如癌症标志介导的信号转导途径的下游组件)产生的信号的激活剂或抑制剂。

还可鉴定癌症标志表达的调节剂。例如，将细胞或无细胞混合物与候选化合物接触，评估癌症标志mRNA或蛋白质相对于在所述候选化合物不存在的情况下癌症标志mRNA或蛋白质的表达水平的表达。当在候选化合物存在的情况下癌症标志mRNA或蛋白质的表达高于在所述候选化合物不存在的情况下的表达时，所述候选化合物被鉴定为癌症标志mRNA或蛋白质表达的刺激物。可选择地，当在候选化合物存在的情况下癌症标志mRNA或蛋白质的表达低于(即，统计上显著地低于)在所述候选化合物不存在的情况下的表达时，所述候选化合物被鉴定为癌症标志mRNA或蛋白质表达的抑制剂。可利用本文中描述的用于检测癌症标志mRNA或蛋白质的方法测定癌症标志mRNA或蛋白质表达的水平。

可使用基于细胞的测定法或无细胞测定法来鉴定调节剂，并且可在体内，例如在动物例如疾病的动物模型(例如，患有前列腺癌或转移性前列腺癌的动物；或具有来自动物(例如，人)的前列腺癌的异种移植物或来自因前列腺癌的转移(例如，至淋巴结、骨或肝)而引起的癌症的细胞，或来自前列腺癌细胞系的细胞的动物)中确认所述试剂调节癌症标志蛋白的活性的能力。

本发明还涉及通过上述筛选测定法(参见，例如，下面癌症治疗的描述)鉴定的新型试剂。因此，在适当的动物模型(例如本文中描述的动物模型)中进一步使用如本文中所述鉴定的试剂(例如，癌症标志调节剂、反义癌症标志核酸分子、siRNA分子、癌症标志特异性抗体或癌症标记结合伴侣)来测定使用这样的试剂的治疗的功效、毒性、副作用或作用机制在本发明的范围之内。此外，通过上述筛选测定法鉴定的新型试剂可以例如用于本文中描述的治疗。

V.转基因动物

本发明涉及包含本发明的外源癌症标志基因(例如，基因融合物)或其突变体或变体(例如，截短或单核苷酸多态性)的转基因动物的产生。在优选实施方案中，转基因动物展示与野生型动物相比较改变的表型(例如，增加的或减少的标志的存在)。用于分析此类表型的存在或不存在的方法包括但不限于本文中公开的方法。在某些优选实施方案中，转基因动物还展示增加的或减少的肿瘤的生长或癌症的证据。

本发明的转基因动物用于药物(例如，癌症治疗)筛选。在某些实施方案中，给转基因动物和对照动物施用测试化合物(例如，怀疑对于治疗癌症是有用的药物)和对照化合物(例如，安慰剂)，然后评估作用。

可通过多种方法产生转基因动物。在某些实施方案中，将处于不同发育期的胚性细胞用于引入转基因以产生转基因动物。取决于胚性细胞的发育期，使用不同方法。受精卵是显微注射的最好的靶。在小鼠中，雄原核达到直径约20微米的大小(该尺寸允许1-2皮升(pl)DNA溶液的重现性注射)。受精卵用作基因转移的靶的用途具有重大的有利方面，因为在大多数情况下，被注射的DNA将在第一次卵裂之前被整合入宿主基因组(Brinster等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:4438-4442[1985])。因此，转基因非人动物的所有细胞都将具有整合的转基因。这通常也反映在建立者(founder)的转基因至后代的高效传递上，因为50%的精细胞将具有所述转基因。美国专利No.4,873,191描述了用于受精卵的显微注射的方法；将该专利的公开内容通过引用整体并入本文。

在其它实施方案中，将逆转录病毒感染用于将转基因引入非人动物。在某些实施方案中，通过将逆转录病毒载体注射入卵母细胞的卵周隙来将逆转录病毒载体用于转染卵母细胞(美国专利No.6,080,912，通过引用并入本文)。在其它实施方案中，可在体外将发育中的非人胚胎培养至胚泡期。在该时间中，可靶向分裂球以进行逆转录病毒感染(Janenich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA73:1260[1976])。通过酶促处理以除去透明带来获得分裂球的高效感染(Hogan等人，in Manipulating the Mouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.[1986])。用于引入转基因的病毒载体系统通常是具有转基因的复制缺陷型逆转录病毒(Jahner等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA82:6927[1985])。转染非常容易并且通过在单层病毒产生性细胞上培养分裂球来高效地获得(Stewart等人，EMBO J.，6:383[1987])。可选择地，可在更晚时期进行感染。可将病毒或病毒产生性细胞注射入分裂球(Jahner等人，Nature298:623[1982])。大多数建立者对于转基因来说将是嵌合体，因为整合只在一小组形成转基因动物的细胞中发生。此外，建立者可包含转基因在基因组的不同位置上的各种逆转录病毒插入，所述插入将通常在后代中分离。此外，还可能通过妊娠中期胚胎的子宫内逆转录病毒感染(Jahner等人，同上[1982])来将转基因引入种系，虽然效率较低。本领域已知的使用逆转录病毒或逆转录病毒载体产生转基因动物的其它方法包括将逆转录病毒颗粒或产生逆转录病毒的丝裂霉素C-处理的细胞显微注射入受精卵的卵周隙或早期胚胎(第WO 90/08832号PCT国际申请[1990]，以及Haskell和Bowen，Mol.Reprod.Dev.，40:386[1995])。

在其它实施方案中，将转基因引入胚胎干细胞，然后利用所述转染的干细胞形成胚胎。通过在适当的条件下体外培养植入前胚胎来获得ES细胞(Evans等人，Nature 292:154[1981]；Bradley等人，Nature 309:255[1984]；Gossler等人，Proc.Acad.Sci.USA 83:9065[1986]；和Robertson等人，Nature322:445[1986])。可利用本领域已知的多种方法，通过DNA转染高效地将转基因引入ES细胞，所述方法包括磷酸钙共沉淀、原生质体或原生质球融合、脂质感染和DEAE-葡聚糖-介导的转染。还可通过逆转录病毒介导的转导或通过显微注射将转基因引入ES细胞。在将它们引入胚泡期胚胎的囊胚腔后，此类转染的ES细胞此后可定殖在胚胎中并且贡献所得的嵌合体动物的种系(关于综述，参见，Jaenisch，Science 240:1468[1988])。在将转染的ES细胞引入囊胚腔之前，可将转染的ES细胞经历不同选择方案以富集已整合了转基因的ES细胞，假定转基因提供用于这样的选择的手段。可选择地，聚合物链式反应可用于筛选已整合了转基因的ES细胞。该技术排除了对在转染入囊胚腔之前在适当的选择条件下培养转染的ES细胞的需要。

在其它实施方案中，利用同源重组来敲除基因功能或产生缺失突变体(例如，截短突变体)。用于同源重组的方法描述于美国专利No.5,614,396(通过引用并入本文)中。

实验

下列实施例被提供用以显示和进一步举例说明本发明的某些优选实施方案和方面，并且不被解释为限定其范围。

实施例1:RAF基因融合

材料和方法

全长融合转录物的克隆

按照制造商的说明书利用TA克隆法将全长融合转录物SLC45A3-BRAF和RAF1-ESRP1克隆入pCR8/GW/TOPO进入载体(Invitrogen，USA)。随后按照造商的说明书利用LR ClonaseII系统反应将融合转录物重组入GatewaypcDNADEST40哺乳动物表达载体(Invitrogen，USA)和pAd/CMV/V5-DEST腺病毒表达系统(Invitrogen，USA)。

蛋白质印迹

将ESRP1-RAF1融合阳性前列腺癌组织和融合阴性组织在NP40裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，1%NP40，pH7.4，Sigma，St.Louis，MO)和完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Indianapolis，IN)以及磷酸酶抑制剂(EMDbioscience，San Diego.CA)中匀浆。为了在融合阳性组织中测试表达和评估融合蛋白的分子量，用ESRP1-RAF1融合构建体(于pDEST40表达载体-Invitrogen，Carlsbad CA中克隆的)和载体对照转染HEK293细胞，将细胞在具有蛋白酶抑制剂的NP40裂解缓冲液中裂解。在样品缓冲液中煮沸15微克的每一种蛋白质提取物，通过SDS-PAGE分离，将其转移至聚偏氟乙烯膜(GEHealthcare，Piscataway，NJ)上。将膜在封闭缓冲液(Tris-缓冲盐溶液，0.1%Tween(TBS-T)，5%脱脂奶粉)中温育1小时，然后在4℃与抗-RAF1小鼠单克隆抗体(1:1000于封闭缓冲液中，BD bioscience，San Jose，CA，Cat#:610151)一起温育过夜。在用TBS-T洗涤3次后，用缀合有辣根过氧化物酶的二抗温育印迹，如由制造商(GE Healthcare)所描述的，利用增强化学发光系统使信号可见。用抗-β肌动蛋白小鼠单克隆(1:5000，Sigma Cat#:A5441)抗体再探测印迹。

集落形成测定

按照制造商的方案(Roche Applied Sciences)使用Fugene 6进行转染。用2μg目的质粒的DNA转染35-mm塑料皿中的NIH3T3细胞(1.5X10⁵)。将用于融合转录物SLC45A3-Braf、外显子8-Braf、外显子10-Braf和突变体V600E的质粒与对照质粒(分别地pDEST40和pBABE)一起使用。转染后3天，将细胞分入装有具有5%CS(Life Technologies)的DMEM的140-mm培养皿。每隔3-4天给培养物进料。3周后，用0.2%的70%乙醇中的结晶紫对培养在具有5%CS的DMEM中的细胞进行染色以使集落可见，在菌落计数器(Oxford Optronix Ltd.，Oxford UK，软件v4.1，2003)上计数集落。通过手工进一步确认集落计数。

WST-1测定

对于每一个处理，将等量的细胞涂铺入96孔板(以进行WST-1测定)、Boyden侵袭小室(以进行侵袭测定)。使用制造商的方案(Roche，Indianapolis，IN，USA)进行WST-1增殖测定。如先前所述(Kleer等人PNAS 2003，Cao等人Oncogene 2008)进行侵袭测定。

利用焦磷酸测序进行BRAF密码子V600E突变检测

按照制造商的说明书，使用Superscript II逆转录酶(Invitrogen)将1-2μg总RNA(从新鲜冷冻的局限性前列腺癌(n=42)、转移性前列腺癌(n=21)和良性前列腺(n=5)组织样品以及一小组黑素瘤(11)、胰腺癌(8)和乳腺癌(8)细胞系分离的)转变成cDNA。按照制造商的说明书，使用来自PyroMark Q24BRAF试剂盒(Biotage-Qiagen)的引物，通过PCR扩增跨越BRAF基因的密码子600(V600E，外显子15)的突变的375bp片段产生生物素化测序模板。使用Pyromark Q24Vacuum Prep Workstation将10微升生物素化的PCR产物固定在链霉抗生物素包被的琼脂糖珠粒(Streptavidin Sepharose High Performance，GE Healthcare)上，然后通过氢氧化钠变性除去非生物素化的链，随后在中和缓冲液和70%乙醇中进行洗涤。随后将单链生物素化的模板与0.3mM测序引物混合，如先前所述(Edlundh-Rose，Egyhazi等人Melanoma Res.16:4712006；Spittle，Ward等人J.Mol.Diagn.9:4642007)，使用PyroMark Q24平台，通过分配查询核苷酸序列来进行‘边合成边测序(sequencing bysynthesis)’。利用Pyromark Q241.0.10软件分析和显现密码子600的核苷酸序列ACAGA/TGAAA(SEQ Id NO:4)。将一组9个具有已知突变状态的黑素瘤细胞系(sk-mel-2、sk-mel-5、sk-mel-19、sk-mel-28、sk-mel-29、sk-mel-103、G-361、Malme-3M、mel-1)用于用作测定标准。

实时PCR验证

在Applied Biosystems Step One Plus Real Time PCR系统上，使用PowerSYBR Green Mastermix(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行定量PCR(QPCR)。所有寡核苷酸引物获自Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)并且列于表3中。GAPDH引物用作对照。进行所有测定，重复2次，将结果以相对于GAPDH的平均倍数变化作图。

荧光原位杂交(FISH)

使用前列腺癌组织微阵列(TMA)和个体切片对肿瘤细胞进行FISH杂交。BAC克隆选自UCSC基因组浏览器并且通过BACPAC资源(Children’sHospital，Oakland，CA)购买。在集落纯化后，使用QiagenTips-100(Qiagen，USA)制备中量制备DNA。使用生物素-16-dUTP和地高辛配基-11-dUTP(Roche，USA)，通过切口平移法标记DNA。沉淀探针DNA，将其溶解在含有50%甲酰胺、2XSSC、10%硫酸葡聚糖和1%Denhardts溶液的杂交混合物中。将约200ng的标记探针与正常人染色体杂交以确认每一个BAC克隆的图位。使用抗地高辛配基-荧光素和alexa fluor594缀合物(以分别获得绿色和红色)来获得FISH信号。使用由ISIS图像处理软件(Metasystems，Germany)控制的高分辨率CCD照相机捕获荧光图像。

结果

预测SLC45A3-BRAF融合转录物向前转录外显子8(图10中突出显示的)，从而也包含BRAF的激酶结构域。图11显示染色体内基因融合转录物SLC45A 1-BRAF的双端转录组(paired end transcriptome)发现。图12显示由癌症产生的BRAF融合转录物。图13显示几个基因的表达水平的箱线图。图14显示SLC45A3的雄激素调控。左上图显示证明SLC45A3响应雄激素治疗的RNA-Seq基因表达。右上图显示SLC45A3的AR调控的qRT-PCR确认。右下图显示突出显示代表SLC45A3的ERG和AR调控的ChIP-Seq峰值的UCSC屏幕截图(screenshot)。

图1显示在ETS阴性前列腺癌中发现SLC45A3-BRAF和ESRP1-RAF1以及RAF1-ESRP1基因融合物。图1(a)显示分别具有FLJ35294-ETV1(上)、TMPRSS2-ERG(中)、SLC45A3-BRAF(左下)和ESRP1-RAF1以及RAF1-ESRP1(右下)的临床局限性前列腺肿瘤样品PCA1、PCA2、PCA3和PCA17中基因融合物提名评分的直方图。图1(b)显示支持SLC45A3与BRAF之间的染色体间基因融合的双端读取的图示。BRAF基因中的蛋白质激酶样结构域在融合事件后仍然保持完整。(c和d)支持ESRP1与RAF1之间的染色体间基因融合(导致交互融合基因ESRP1-RAF1和RAF1-ESRP1)的双端读取的图示。

图2显示SLC45A3-BRAF、ESRP1-RAF1和RAF1-ESRP1基因融合物的表达的验证。图2(a)PCA3中SLC45A3-BRAF基因融合物的qRT-PCR验证和(b)使用外显子跨越引物的外显子特异性PCR，其显示BRAF外显子8-18相对于外显子1-7的高水平表达。图2(c)显示PCA17中的ESRP1-RAF1和RAF1-ESRP1交互基因融合物的qRT-PCR验证。图2(d)显示分别在PCA3和PCA17中的SLC45A3-BRAF(左)和ESRP1-RAF1(右)基因融合物的FISH验证。单独的信号表示PCA3的正常染色体1和7(SLC45A3和BRAF)以及PCA17的染色体8和3(ESRP1和RAF1)。共定位信号(箭头)表示使用分别来自5’和3’伴侣基因的5’和3’末端的BAC克隆检测的融合事件。图2(e)显示蛋白印迹分析，其显示120kDa ESRP1-RAF1融合蛋白在用从PCA17克隆的ESRP1-RAF1全长融合构建体转染的PCA17和HEK293中的表达。

图3显示利用SLC45A3-BRAF融合转录物对NIH3T3细胞的转化。图3a)显示利用融合构建体SLC45A3-BRAF、BRAF EX8-stop、BRAF EX10-stop、RAF突变体V600E和载体对照(用于融合转录物的pDEST40和用于突变体V600E的pBABE)在NIH3T3细胞中进行的集落诱导。评估用指定的构建体转染的NIH3T3细胞的集落形成能力。对于每一个样品显示的代表性板和集落形成的定量示于来自两个独立实验的条形图中(b)。图3c显示SLC45A3-BRAF融合物促进细胞增殖和侵袭。在指定的时间点进行WST-1测定，测量450nm处的吸光度。误差棒代表标准误差均值(s.e.m)。利用t-检验计算与pDEST40对照稳定细胞相比较的P-值。图3(d)显示用0.25uM索拉非尼或DMSO对照处理RWPE稳定细胞，且在指定的时间点进行WST-1测定。误差棒代表标准误差均值。利用t-检验计算与DMSO处理的细胞相比较的P-值。

图4显示BRAF(A)和RAF1(B)的正常和融合转录物的外显子结构。激酶结构域保留在BRAF和RAF1融合基因中。SLC45A3-BRAF融合导致保留完整激酶结构域的截短BRAF基因的表达。表达ESRP1-RAF1融合物(具有1060aa的开放阅读框架的4.2kb融合转录物)，从而导致120kDa融合物的形成。

图5显示BRAF和RAF1基因重排的基因组组织和FISH验证。(a)和(b)的上图中的示意图分别显示SLC45A3和BRAF以及ESRP1和RAF1基因的基因组定位。具有BAC克隆识别号码的矩形表示用于FISH研究的5’和3’BAC克隆。(a)和(b)中的下图显示正常细胞和肿瘤细胞的FISH分析。BRAF分裂探针(split probe)显示两个拷贝的重排的染色体(箭头)，SLC45A35’-BRAF 3’融合探针显示两个拷贝的融合信号。RAF1分裂探针显示正常细胞中的两个共定位信号和肿瘤细胞中的重排信号模式。ESRP1分裂探针显示肿瘤细胞中的重排。5’ESRP1探针和3’RAF1探针显示正常细胞中的分开的信号以及肿瘤细胞中的一个融合信号。

图6显示正常样品(NOR9)和先证者(PCA3)的BRAF的RNA-seq外显子覆盖度。外显子在下面以交替的灰色阴影显示。棒突出显示外显子间的核苷酸覆盖度。

图7显示ETV1和BRAF RNA-Seq异常表达谱。样品被分类为良性或肿瘤前列腺样品。将肿瘤样品进一步分类为ETS-样品和ETV1+样品。

图8显示表达融合转录物SLC45A3-Braf、BRAF Ex8-stop和BRAFEx10-stop以及pDEST40载体的NIH3T3细胞的集落频率的比较。使用菌落计数器(Oxford Optronix Ltd.，Oxford UK，软件v4.1，2003)评估表达融合转录物SLC45A3-Braf、BRAF Ex8-stop、BRAF Ex10-stop表达和载体对照(pDEST40)的NIH3T3细胞的集落密度。最小集落半径和最大集落半径的值分别设置在0.10mm和2.75mm，然而将最小集落密度固定在0.15光密度(OD)。条形图显示落在x-轴上的光密度的范围(0.01至0.65OD)内的y-轴上的集落频率。

图9显示展示BRAF V600E突变状态(灰色阴影)的代表性热解图。BRAF基因的密码子600中的可变位置A/T的核苷酸分配顺序ACAGA/TGAAA(SEQ ID NO:5)测定法。上方的热解图代表野生型(T/T)、中间代表突变体/野生型(A/T)以及下方代表(A/A)基因型。

表1显示前列腺癌中BRAF和RAF1基因重排的发生率的FISH评估。

表2显示焦磷酸测序测定的BRAF突变V600E基因型

表3显示用于克隆和验证的引物序列。

实施例2:RAS基因融合物

A.材料和方法

急性淋巴母细胞白血病和前列腺癌的阵列CGH/SNP数据集的分析

关于Affymetrix SNP阵列，使用完全匹配/错配(PM/MM)模型进行基于模型的表达以概括每一个探针组的信号强度。为了进行拷贝数推断，通过将每一个SNP探针组的概括的信号强度与样品的二倍体参照组相比较来计算每一个肿瘤样品的原始拷贝数。在Agilent双通道阵列CGH数据集中，计算经处理的测试通道信号与经处理的参照通道信号之间的差分比(differential ratio)。将所有所得的相对DNA拷贝数数据进行log2转化，其反映了测试样品与参照样品之间的DNA拷贝数差异。为了提高拷贝数估计的精确性，利用参照组标准化方法。对于每一个样品，将非性染色体分成30Mb区域单位。计算来自每一个区域的探针的相对DNA拷贝数数据的绝对平均值，将其与其它区域比较。在每一个样品中挑出来自具有最小绝对平均值的两个区域的探针作为内部参照组，其代表具有最小DNA拷贝数偏差的染色体区域。对于每一个样品，在针对参照探针组的无效模型(null model)假定下，将对数比率转化成平均值为0的正态分布。利用perl程序执行归一化法(normalization method)。

扩增断点分级和装配(ABRA)

ABRA分析具有3个步骤。首先，利用环状二元分割(CBS)算法(Karnoub等人，Nat Rev MolCell Biol 9，517(2008年7月))分割来自阵列CGH或阵列SNP数据集的拷贝数数据。通过将扩增的相对拷贝数数据与邻近区段相比较来测定扩增的水平，选择具有等于或大于2个拷贝数获得的断点(≥0.75)。跨越超过500kb的扩增包括在分析中。利用所有人基因的基因组区域定位每一个扩增断点的基因组位置。每一个人基因的基因组区域指定为最接近基因的5’的转录物变体的起点至最接近基因的3’的变体的终点。基于扩增断点与基因放置的关联性将部分扩增的基因被分类成候选5’和3’伴侣。5’扩增的基因被当作5’伴侣，3’扩增的基因被当作3’伴侣。第二，将部分扩增的“癌症基因”鉴定为驱动者融合基因候选者。这通过将3’扩增的基因对应至通过癌症基因普查鉴定的已知癌症基因来实现。为了评估部分扩增的基因与潜在癌症的相关性，使用“概念签名技术(concept signature technology)”(ConSig)法(Moul等人，Prostate 20，327(1992))，该方法可基于它们与在已知的癌症基因中频繁发现的“分子概念”的关联性优先鉴定具有生物意义的基因。该评分尤其用于3’融合基因的判别(Moul等人，同上)。根据它们的径向概念签名评分(radialconcept signature score)(简称ConSig评分)给具有可接受的断点(参见下面标准，图20A)的3’扩增的基因分级。最高评分的3’扩增的癌症基因被当作驱动者融合基因候选者。第三，将选择的3’扩增的基因的扩增水平与来自相同细胞系的5’扩增的基因相匹配以提名假定的5’伴侣。利用DNA拷贝数数据的未分割的相对定量手工精选断点的实际位置和质量。当扩增断点是不可接受时的情形是(图20)：

(1)多个基因内断点；

(2)候选者不是离扩增断点最近的基因；

(3)来自现有拷贝数的扩增开始增加并且断点不明显；

(4)断点位于染色体的着丝粒或末端；

(5)断点是扩增内的小缺失的结果；和

(6)断点发现于大部分样品中。

分割处理可能具有与实际位置略微不同的断点的估计。这与断点装配相关。为了克服该问题，在断点分级过程中，将基因的10kb上游区域和1kb下游区域以内的DNA断点赋予该基因；以及在断点装配过程中，将基因的20kb上游区域和20kb下游区域内的DNA断点赋予该基因。实际上，可调整该窗口以提高ABRA分析的性能。

总之，在K-562上发现6个5’扩增的基因，4个匹配ABL1的3’扩增水平。在精选后，只有2个基因BCR和NUP214具有可接受的断点。在DU145上，分别从两个重复杂交发现8个和6个5’扩增的基因(表4)。在精选后，选择UBE2L3-KRAS、SOX5-KRAS和C14orf166-KRAS用以实验验证。然后根据候选5’伴侣的第1个外显子和候选3’伴侣的最后一个外显子以及紧接断点之后的外显子设计引物，以测试假定的融合。

细胞系和组织

从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)获得良性永生化前列腺细胞系RWPE、RWPE、前列腺癌细胞系DU145、PC3、Ca-HPV-10、WPE1-NB26和NCI-H660、成纤维细胞系NIH 3T3以及人胚胎肾细胞系HEK。从CambrexBio Science(Walkersville，MD)获得原代良性前列腺上皮细胞(PrEC)。VCaP源自患有激素难治性转移性前列腺癌的患者的脊椎转移灶(Seeburg等人，Nature 312，71(1984年11月1-7日))。组织来自University ofMichigan的根治性前列腺切除术系列和来自快速尸检方案(Rapid Autopsy Program)，它们都是University of Michigan Prostate  Cancer Specialized Program of ResearchExcellence(S.P.O.R.E.)Tissue Core的部分。组织也获自University HospitalUlm(Ulm，Germany)的根治性前列腺切除术系列。在每一种情况下在获得患者的知情同意和现有机构审查委员会的批准后收集所有样品。一批良性前列腺组织总RNA获自Clontech实验室(Mountain View，CA)。按照制造商的说明书利用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)分离来自所有样品的总RNA。利用Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)验证RNA完整性。

微阵列比较基因组杂交(阵列CGH)

为了提名前列腺癌细胞系中的潜在驱者基因融合物，在Agilent-014698Human Genome CGH Microarray 105A(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)上表征10个前列腺癌细胞系，包括22RV1、C4-2B、CA-hpv-10、DU145、LAPC4、MDAPCa-2b、NCI660、PC3、VCaP和WPE 1-NB26。按照分配者的说明书将所有细胞系生长在完全血清中。按照制造商的方案，将从这些细胞系提取的基因组DNA针对参照人男性基因组DNA(6个正常个体，Promega，#G1471)与打印在阵列版式中的寡核苷酸杂交。对每一个探针的荧光强度的分析检测癌症细胞系相对于正常参照基因组的拷贝数变化(Genome build2004)。进行DU145的Replicate阵列CGH杂交以提名KRAS的5’伴侣。

双端转录组测序(Paired-end transcriptome sequencing)和分析

按照制造商的方案使用mRNA-seq样品制备试剂盒(Illumina)制备用于测序的DU145 mRNA样品。利用Illumina分析管道分析原始测序图像数据，使用ELAND软件(Illumina)将其与暴露人参照基因组(unmasked human referencegenome)(NCBI v36，hg18)对齐。随后如先前所描述的分析成对读取以提名配对嵌合体(Schubbert，K.Shannon，G.Bollag，Nat Rev Cancer 7，295(Apr，2007))。

逆转录PCR(RT-PCR)和测序

在随机引物存在的情况下使用SuperScript III(Invitrogen，Carlsbad，CA)从1微克的总RNA合成互补DNA。在50℃下进行反应60分钟，按照制造商的说明书使用microcon YM-30(Millipore Corp，Bedford，MA，USA)纯化cDNA，将其在PCR中用作模板。使用Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)合成用于本研究的所有寡核苷酸引物，所述引物列于表10中。使用Platinum TaqHigh Fidelity和融合特异性引物进行聚合酶链式反应，进行35个循环。通过在1.5%琼脂糖凝胶上电泳来分辨产物，切取条带，将其纯化，然后TOPO TA克隆入pCR 4-TOPO TA载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在University ofMichigan DNA Sequencing Core的ABI Model 3730自动测序仪上使用M13反向引物和M13正向引物对来自至少4个集落的纯化的质粒DNA进行双向测序。

定量PCR(qPCR)

使用StepOne Real Time PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行定量PCR(qPCR)。简而言之，使用制造商推荐的热循环条件，利用SYBRGreen Master Mix(Applied Biosystems)、cDNA模板和25ng的正向和反应融合引物进行反应。对于每一个实验，使用StepOne软件在QPCR反应的指数期过程中设置阈值水平。使用比较阈值法循环(comparative threshold cycle)(Ct)法(Applied Biosystems User Bulletin#2)测定每一个靶基因相对于每一个样品的持家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的量。对于图16b显示的实验，将靶基因的相对量针对来自良性前列腺的相对量进行标准化。对于一个亚组的细胞系和组织样品，使用Taqman探针CAGCAACCAAAACC(SEQ ID NO:40)进行qPCR。根据融合qPCR具有≥10的RQ值的样品被认为是融合阳性的。

RNA连接酶介导的cDNA末端的快速扩增(RLM-RACE)

按照制造商的说明书，使用GeneRacer RLM-RACE试剂盒(Invitrogen)进行RNA连接酶介导的cDNA末端的快速扩增。选择前列腺癌细胞系DU145以及通过qPCR测定具有高UBE2L3-KRAS表达的组织样品PCA1-3和MET10用以进行5’RACE。简而言之，牛肠磷酸酶处理2微克的总RNA以从截短的mRNA和非mRNA除去5’磷酸并且用烟草酸性焦磷酸酶去帽。将GeneRacerRNA Oligo连接于全长转录物并且使用SuperScript III进行逆转录。为了获得5’末端，使用GeneRacer 5’和KRAS R2引物对，利用Platinum Taq HighFidelity(Invitrogen)扩增第一链cDNA。随后利用GeneRacer 5’套式引物和KRAS R3或R4引物进行巢式PCR。通过在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳来分辨产物，切取条带，纯化，然后如上所述进行测序。

荧光原位杂交(FISH)

为了评估UBE2L3与KRAS的融合，利用跨越各自基因座的探针，应用双色双信号FISH策略。地高辛-dUTP标记的BAC克隆RP11-317J15用于UBE2L3基因座，生物素-14-dCTP BAC克隆RP11-608F13用于KRAS基因座。为了检测KRAS基因座上的可能的易位，利用跨越KRAS基因座的两个探针(地高辛-dUTP标记的BAC克隆RP11-68I23(5’KRAS)和生物素-14-dCTP标记的BAC克隆RP11-157L6(3’KRAS))，使用断点FISH策略。从Children’s Hospital ofOakland Research Institute(CHORI)获得所有BAC克隆。在FISH分析之前，通过与正常外周淋巴细胞的中期染色体涂片杂交来验证所有探针的完整性和纯度。

为了对DU145细胞进行中期FISH，使用标准细胞遗传学技术制备中期染色体涂片。为了对一系列前列腺癌组织微阵列上进行中期FISH，如所描述的(Tomlins等人，Science 310，644(2005年10月28日)；Kumar-Sinha等人，Nat RevCancer 8，497(2008年7月))进行组织杂交、洗涤和颜色检测。总的可评估案例包括78个PCA和29个MET(就KRAS分裂探针而言)以及67个PCA和18个MET(就UBE2L3/KRAS融合探针而言)。为了评估TMA上的中期FISH，评估每案例平均50-100个细胞以评估KRAS重排和UBE2L3/KRAS融合。此外，将来自5个融合阳性案例的福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织切片用于确认阴性FISH结果。

蛋白质印迹

使用oligofectamine(Invitrogen)，利用针对UBE2L3(5’-CCACCGAAGATCACATTTA-3’；SEQ    ID    NO:1)、KRAS(5’-GAAGTTATGGAATTCCTTT-3’；SEQ ID NO:2)或融合接头(5’-CCGACCAAGGCCTGCTGAA-3’；SEQ  ID NO:3)的siRNA双链体(Dharmacon，Lafayette，CO，USA)转染前列腺癌细胞系DU145。将用非靶向性siRNA和RWPE细胞转染的DU145用作阴性对照。转染后48小时，将细胞在NP40裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，1%NP40，pH 7.4，Sigma，St.Louis，MO)和完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Indianapolis，IN)中匀浆。将10微克的每一种蛋白质提取物在样品缓冲液中煮沸，通过SDS-PAGE分离，将其转移至聚偏氟乙烯膜(GE Healthcare，Piscataway，NJ)上。将膜在封闭缓冲液[Tris-缓冲盐溶液，0.1%Tween(TBS-T)，5%脱脂奶粉]中温育1小时，然后用下列抗体：抗-RAS小鼠单克隆(1:1000于封闭缓冲液中，Millipore Cat#:05-516)、抗-KRAS兔多克隆(1:1000，Proteintech Group Inc.，Cat#:12063-1-AP)和抗-β肌动蛋白小鼠单克隆(1:5000，Sigma Cat#:A5441)抗体于4℃温育过夜。在用TBS-T洗涤3次后，用缀合有辣根过氧化物酶的二抗温育印迹，然后如制造商所述(GE Healthcare)利用增强化学发光系统使信号可见。为了测试融合蛋白在多个前列腺来源的细胞系中的表达，使用来自用或未用500nM硼替佐米处理12小时的DU145、PrEC、RWPE、22RV1、VCaP、PC3的裂解物。将过表达UBE2L3-KRAS融合蛋白的硼替佐米处理的HEK细胞用作阳性对照。为了探究MAPK信号转导途径的激活，用phospho MEK1/2、phospho p38MAPK、phospho Akt探测来自表达UBE2L3-KRAS、V600E突变型BRAF、G12V突变型KRAS和载体对照的NIH 3T3稳定细胞系的蛋白质裂解物，通过各自总蛋白质和β肌动蛋白的探测显示相等的载量。为了进行ERK激活分析，在利用phospho erk1/2抗体进行免疫印迹分析之前，使NIH 3T3细胞饥饿12小时。MAPK信号转导蛋白的所有抗体购自Cell Signaling Technologies。

多重反应监测质谱(Multiple Reactions Monitoring Mass Spectrometry)

将Du145和LnCaP细胞生长至70%的汇合，用硼替佐米进行处理。24小时后，收获细胞，在加入蛋白酶抑制剂完全mini混合物(Roche，Indianapolis，IN，USA)的RIPA缓冲液(Pierce Biotechnology，Rockford，IL，USA)中制备全细胞蛋白质裂解物。通过离心澄清裂解物，通过SDS PAGE(Novex，18%Tris-甘氨酸，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)分离裂解物。切取12个相同大小的来自15-40kDa区域的条带以用于胶内胰蛋白酶消化。将来自各凝胶片的冻干的肽重悬浮于3%乙腈、0.1%甲酸(含有25fmol的各稳定同位素标记的肽内部标准(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO，USA))中。随后分离肽，利用CHIP HPLC-多重反应监测质谱(MRM-MS)进行测量。测量每一个稳定同位素标记的内部标准的3个瞬态(transition)和内源肽的3个瞬态。保留时间内每一种肽的所有6个瞬态的交叠表示阳性测量。

UBE2L3-KRAS嵌合体的体外过表达

利用pDEST40(具有或不具有5’FLAG)和pLenti-6载体(无5’FLAG)产生UBE2L3-KRAS的表达质粒。将NIH 3T3细胞维持在含有10%FBS的DMEM中，使用Fugene 6转染剂(Invitrogen)，用pDEST40载体质粒或包含UBE2L3-KRAS开放阅读框架的pDEST40转染所述细胞。3天后，使用500μg/ml遗传霉素选择转染的细胞。在3周的选择后，建立载体和UBE2L3-KRAS融合物的稳定细胞系，将其用于进一步分析。G12V突变型KRAS(Addgene质粒9052)、V600E突变型BRAF(Addgene质粒15269)和它们各自的pBABE–puro载体(Addgene质粒1764)的构建体获自Addgene(Cambridge，MA，USA)。将这些质粒构建体转染进维持在10%牛血清中的NIH 3T3细胞，使用嘌呤霉素1μg/ml产生稳定细胞系以用于选择。将这些稳定细胞系用作对照以进行RAS-MAPK信号转导途径的免疫印迹分析。

为了在前列腺来源的正常细胞系中过表达UBE2L3-KRAS融合物，用表达UBE2L3-KRAS开放阅读框架或pLenti-6载体的慢病毒颗粒转染RWPE细胞。感染后3天，将细胞经历3μg/ml灭瘟素选择。在3周的选择后，挑出单个的克隆，进行扩增以用于进一步分析。通过qPCR(图25B,C)和蛋白质印迹测试NIH 3T3和RWPE过表达模型的UBE2L3-KRAS融合物。

细胞增殖测定

为了进行细胞增殖分析，以一式两份将10,000个表达UBE2L3-KRAS融合物或载体的NIH 3T3细胞涂铺在24孔板的孔中，在指定的时间上使用库耳特计数器(Beckman Coulter，Fullerton，CA)进行细胞计数。使用表达UBE2L3-KRAS融合物或载体的RWPE稳定克隆进行类似的测定。进行两个细胞增殖测定2次，提供来自代表性测定的数据。

基膜基质侵袭测定

将100,000个细胞的表达UBE2L3-KRAS融合物或pLenti-6载体的RWPE克隆接种在基质胶预包被的板(BD Biosciences)上，按照制造商的推荐进行处理。48小时后，用结晶紫对插入物进行染色。使用10%醋酸进行脱染色，通过比较560nm处的吸光度定量侵袭。将DU145用作侵袭测定的阳性对照。

集落形成测定

按照制造商的方案(Roche Applied Sciences)使用Fugene 6进行转染。用2μg目的质粒的DNA转染35-mm塑料皿中的NIH 3T3细胞(1.5×10⁵)。将融合转录物UBE2L3-KRAS和致癌KRAS G12V的质粒与对照质粒(分别地pDEST40和pBABE)一起使用。转染后3天，将细胞分入一个装有含有5%小牛血清(Colorado Serum Company)的DMEM的140-mm培养皿中。每隔3-4天给培养物进料。3周后，用0.2%的70%乙醇中的结晶紫对细胞进行染色以使集落可见，在菌落计数器(Oxford Optronix Ltd.，Oxford UK，软件v4.1，2003)上进行计数。通过手工进一步确认计数。

FACS细胞周期分析

在LSR II流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA)running FACSDivia上分析表达UBE2L3-KRAS融合物或载体的碘化丙啶染色的稳定NIH 3T3细胞，使用ModFit LT(Verity Software House，Topsham，ME)计算细胞周期相。

NIH 3T3和RWPE-UBE2L3-KRAS异种移植模型

4周龄雄性Balb C nu/nu小鼠购自Charles River，Inc.(Charles RiverLaboratory，Wilmington，MA)。将过表达融合转录物UBE2L3-KRAS或NIH3T3-载体(2×10⁶个细胞)的稳定NIH 3T3和RWPE细胞重悬浮于100μl具有20%基质胶(BD Biosciences，Becton Drive，NJ)的盐水中，然后将其皮下植入小鼠的左胁腹或左和右胁腹区。使用赛拉嗪(80-120mg/kg IP)和氯胺酮(10mg/kgIP)的混合物麻醉小鼠以在植入前进行化学约束。每一组包括8只小鼠。通过使用数显卡尺每天记录肿瘤体积的增加，使用公式(π/6)(L×W2)计算肿瘤体积，其中L=肿瘤的长度，W=宽度。所有涉及小鼠的方法都经Universityof Michigan的大学实验动物使用与关爱委员会(UCUCA)批准并且符合它们的相关监管标准。

结果

通过使用称为扩增断点分级和装配(ABRA)分析的整合基因组方法(integrative genomics approach)，将KRAS提名为DU145前列腺癌细胞中的与遍在蛋白缀合酶UBE2L3的基因融合物。UBE2L3-KRAS嵌合转录物的表达在DU145细胞和112个前列腺癌组织的42个组织(38%)中得到验证。UBE2L3-KRAS融合蛋白相对不太稳定并且需要蛋白解体抑制才可被容易地观察到。UBE2L3-KRAS融合物的过表达在体外和体内诱导NIH 3T3成纤维细胞和RWPE前列腺上皮细胞的致癌表型。与标准的KRAS G12V突变相反，UBE2L3-KRAS融合物减弱NIH 3T3细胞中的MEK和ERK信号转导，相反导致AKT和p38MAP激酶的激活，所述两个酶牵涉前列腺癌的进展。

RAS蛋白在细胞生理学、发育和肿瘤发生中起着至关重要的作用(Karnoub等人，Nat Rev Mol Cell Biol 9，517(2008年7月)；Rodriguez-Viciana等人，Cold Spring Harb Symp Quant Biol 70，461(2005))。已在广泛的癌症(Karnoub等人，同上)中但极少在前列腺癌(Moul等人，Prostate 20，327(1992))中鉴定了RAS的突变。迄今为止，RAS途径的致癌改变只限制于激活点突变，包括研究最多的HRAS的Gly-至-Val置换(Seeburg等人，Nature 312，71(1984年11月1-7日))和KRAS的密码子12、13或61的置换(Karnoub等人，同上；Schubbert，K.Shannon，G.Bollag，Nat Rev Cancer 7，295(2007年4月))。RAS基因的嵌合转录物已被描述为一类癌症相关突变。在先前的研究中，特征在于融合至转录因子的ETS家族的成员的5’基因组调控元件(最常见地受雄激素调控的)的复发性基因融合物已被鉴定并且经发现存在于60-70%以上的前列腺癌中(Tomlins等人，Science 310，644(2005年10月28日)；Kumar-Sinha等人，Nat Rev Cancer 8，497(2008年7月))。在该研究中，整合生物信息学法被用于研究癌症的基因融合物的基因组模式特征。这导致融合至KRAS的UBE2L3的复发性嵌合转录物在一个亚组的人前列腺癌中的表征。

为了理解癌症中复发性基因融合物的特征特性，进行与人癌症相关的多维基因组数据的大规模整体分析。该分析显示在许多情况下，一小亚组的具有复发性基因融合物的肿瘤或癌细胞系通常在基因组重排的位置上展示特征性扩增(Mullighan等人，Nature 453，110(2008年5月1日)；Graux等人，NatGenet 36，1084(2004年10月)；Barr等人，Hum Mol Genet 5，15(1996年1月)；Ferreira等人，Oncogene 27，2084(2008年3月27日)；Koivunen等人，Clin CancerRes 14，4275(2008年7月1日))(图15A)。扩增通常影响一部分融合基因，并且通常被认为是与疾病进展、抗药性和不良预后相关的二次遗传损伤(Mullighan等人，同上；Barr等人，同上；Ferreira等人，同上；Koivunen等人，同上；Stergianou等人，Leukemia 19，1680(2005年9月)；Attard等人，Oncogene 27，253(2008年1月10日))。相反地，导致癌基因的显著过表达的高水平拷贝数变化通常包括在一小组肿瘤样品间处于重叠扩增中央的靶基因。因此，“部分”扩增的癌基因可表示该基因参与在癌症进展中非常重要的基因组融合事件。此外，基于进行的整合分析，与基因融合相关的扩增通常包括5’伴侣的5’区和3’伴侣的3’区。

该观察为通过匹配候选5’和3’伴侣的扩增水平来从扩增断点装配假定的基因融合物提供了理论基础。为了从基因组数据系统性地提名部分扩增的基因融合物，对整个来自癌症细胞系的数据概要应用ABRA(工作流程描述于图19中)。最初在癌症细胞系上进行实验，因为断点分析在均一的细胞群体中更可靠，与由多种细胞类型(其中有许多不是恶性的)组成的肿瘤相反。最早在从36个白血病细胞系产生的公布的单多态性微阵列(aSNP)数据集(Mullighan等人，同上)上测试ABRA法，所述细胞系包括已知具有扩增的BCR-ABL1融合物的K-562慢性髓样白血病细胞系(Wu等人，Leukemia 9，858(1995年5月))。测定相对DNA拷贝数数据，鉴定来自36个细胞系的所有5’和3’扩增的基因(≥2个拷贝)。在该数据集中，ABL1是具有3’拷贝数增加的最高等级的基因(图15B，左图，表4)。随后将所有5’扩增的基因在K-562中的扩增水平与ABL1匹配以提名潜在5’伴侣。在K-562中发总共现6个5’扩增的基因，5个匹配ABL13’扩增的水平。在精选扩增断点后，BCR和NUP214被提名为ABL1融合伴侣候选者(图15B，右图)。关于候选者选择的标准，参见方法和图20A，B。该分析证明该方法在从基因组数据集提名驱动者基因融合物中是可行的。

为了在前列腺癌中提名新型基因融合物，将该方法用于10个前列腺癌细胞系(表5)的比较基因组杂交(aCGH)的阵列。DU145前列腺癌细胞系中提名的最靠前的候选者为展示伴随KRAS的3’扩增的明显断点的KRAS(图15C，左)。通过许多研究已在前列腺癌中观察到RAS-MAPK途径的下游信号转导媒介物的激活(Graff等人，J Biol Chem275，24500(2000年8月11日)；Xu等人，Oncogene 25，2987(2006年5月18日))。

为了装配KRAS基因中的扩增断点，对DU145进行重复阵列CGH杂交。将KRAS的扩增水平与来自DU145细胞的5’扩增的基因匹配鉴定了10个由两个阵列CGH杂交之任一指示的5’潜在伴侣。在精选后，基于图20C中详述的标准，C14orf166、SOX5和UBE2L3被留下作为KRAS的最靠前的5’伴侣候选者(图15C，右)。

为了实验性验证预测的C14orf166-KRAS、SOX5-KRAS和UBE2L3-KRAS的融合，根据候选5’伴侣的第1个外显子和KRAS的最后1个外显子以及紧接断点后的外显子设计引物对。DU145细胞的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析鉴定了UBE2L3-KRAS的但非其它的特异性融合条带。RT-PCR产物的随后测序确认了UBE2L3外显子3至KRAS外显子2的融合，这示意性描述于图16A中。

为了评估UBE2L3-KRAS嵌合体的表达模式，通过SYBR green定量PCR(QPCR)以及Taqman QPCR分析一小组前列腺细胞系和组织。在细胞系的上下文中，UBE2L3-KRAS表达被限定于DU145细胞并且在被测试的其它5个前列腺细胞系中不表达(图16B，图21)。在一小组来自University ofMichiganProstate SPORE方案和University of Ulm的前列腺组织中，通过使用SYBRgreen测定，36个前列腺癌(PCA)中有14个，16个转移性前列腺癌(MET)中有10个展示升高的UBE2L3-KRAS的表达(图16B)。良性相邻前列腺没有一个展示该嵌合体的表达。通过对一个亚组的样品使用独立设计的Taqman测定(图21)，这些结果得到进一步证实。

未观察到与早期描述的ETS基因融合(表7)的互斥性，这表明UBE2L3-KRAS嵌合体可与具有ETS基因融合的肿瘤共存。使用来自UBE2L3的第1个外显子和KRAS的最后1个外显子的引物的常规RT-PCR在被QRT-PCR确定为UBE2L3-KRAS阳性的前列腺癌样品中产生预期大小的产物(图16C)。野生型UBE2L3和KRAS在组群中等量表达(图16C)。从3个整合阳性组织克隆的RT-PCR产物的随后测序显示与从U145细胞分离的相同的融合转录物(图23)。此外，这些序列的突变分析未显示KRAS的融合等位基因的改变(图23)。在来自Weill Cornell Medical College的前列腺癌的第二独立组群中测试到UBE2L3-KRAS嵌合体的普遍性，在60个样品的18个样品中检测到融合转录物(表8)。对产物进行测序以进行确认。与其它检查的组群类似，表达UBE2L3-KRAS嵌合体的前列腺癌与ETS基因融合物的存在不相互排斥。为了阐明UBE2L3-KRAS融合物的组织特异性，检查一组非前列腺来源的癌症。通过qPCR对36个乳腺癌组织和9个黑素瘤细胞系的分析没有检测到嵌合转录物，这强调了UBE2L3-KRAS的前列腺癌特异性(表7)。

为了表征融合转录物的5’末端，使用DU145细胞和4个UBE2L3-KRAS阳性前列腺癌组织，从KRAS的外显子2引发进行5’RNA连接酶介导的cDNA末端的快速扩增(RLM-RACE)(图22)。这确认了在DU145和3个前列腺癌样品中UBE2L3存在于融合转录物的5’末端。序列分析显示了从UBE2L3延伸至KRAS的296个氨基酸的开放阅读框架(ORF)(图16A)。

为了比较UBE2L3-KRAS转录物与其它假定的嵌合体的相对表达水平，对DU145细胞进行双端转录组测序。与K-562细胞中的BCR-ABL和VCaP细胞中的TMPRSS2-ERG类似(图16D)(Maher等人，Proc Natl Acad Sci USA(2009年7月10日))，UBE2L3-KRAS嵌合体在DU145细胞中是最靠前的嵌合序列之一，这证明了生物相关性(图16D-E)。转录组测序还将C14orf166-SLC25A1鉴定为在DU145细胞中发现的最靠前的嵌合体(图16D，右图)，所述两个嵌合体分别被ABRA提名为假定的5’和3’融合基因(表5-6)。此外，来自K-562细胞的转录组测序数据不仅检测到BCR-ABL嵌合而且还检测到该细胞系中第二丰富的嵌合体为NUP214-XKR3(图16D，左图)。NUP214也被ABRA法提名为K562细胞中的5’融合伴侣(图15B，右图)。

为了确定UBE2L3-KRAS嵌合体是否可归因于基于DNA的重排，进行荧光原位杂交(FISH)分析。通过KRAS分裂探针和UBE2L3-KRAS融合探针FISH分析，DU145明确地显示在KRAS基因组基因座上的重排和与UBE2L3的融合(图16F，图24B)。此外，观察到UBE2L3-KRAS融合物的低水平扩增(3个拷贝)，与其通过ABRA法的提名一致。为了将这些发现扩展至前列腺组织，进行一系列前列腺癌组织微阵列(其包括67个PAC和18个MET)的FISH分析。在KRAS基因座上未观察到基因重排；也未观察到UBE2L3至KRAS的融合(表11，图24C)。利用KRAS分裂探针，通过FISH测定来自Weill Cornell Medical College的3个先证者，并且未发现重排(表8)。该结果(其与DU145细胞中观察到的结果不一致)表明前列腺肿瘤表达UBE2L3-KRAS转录物，所述转录物不归因于类似于在前列腺癌中发现的SLC45A3-ELK4嵌合转录物的基于DNA的融合(Rickman等人，Cancer Res 69，2734(2009年4月1日)；Maher等人，Nature 458，97(2009年3月5日))。类似地，Sklar及同事鉴定了在子宫内膜间质细胞中在mRNA水平上表达的复发性JJAZ1-SUZ12嵌合体，所述嵌合体似乎被“锁定”为子宫内膜间质瘤中的基于DNA的基因融合(Wang等人，Science 321，1357(2008年9月5日))。因此，DU145前列腺癌细胞应该来源于表达UBE2L3-KRAS转录物的前列腺癌，其中嵌合体的表达被在细胞培养物中挑出的基因组重排锁定到位。

接着检查UBE2L3-KRAS蛋白的表达。预测的296个氨基酸融合蛋白从UBE2L3的C端修剪掉17个氨基酸(图17A)。全长KRAS蛋白质得到保留，UBE2L3与KRAS之间存在4个氨基酸插入。通过使用针对RAS产生的单克隆抗体和针对KRAS产生的多克隆抗体，除了对应于野生型KRAS的21kDa条带外，还检测到33kDa的融合蛋白(图17B，C)。通过使用针对KRAS、UBE2L3和UBE2L3-KRAS的嵌合接头的RNA干扰敲低表达，显示归因于UBE2L3-KRAS蛋白的条带的特异性(图17B，图25A)。在DU145细胞中明确地发现了UBE2L3-KRAS蛋白，但在一小组其它前列腺细胞系中未发现其(图17C)。还使用多重反应监测(MRM)测定法通过DU145细胞的质谱评估独立地确认了所述蛋白质的特异性表达(图17D)。虽然在DU145、VCaP和LNCaP细胞中检测到野生型KRAS和UBE2L3，但只在DU145细胞中检测到UBE2L3-KRAS。HEK293细胞中编码UBE2L3-KRAS的表达构建体的过表达未显示蛋白质表达(图17C)。在蛋白酶体抑制剂硼替佐米存在的情况下，所述融合蛋白的表达清晰地显现，表明降低的融合蛋白的稳定性。用硼替佐米温育DU145细胞也升高了UBE2L3-KRAS蛋白表达的水平(图17C)。

为了测定UBE2L3-KRAS蛋白的功能，将其在NIH 3T3细胞中过表达(图25B)，经典地用于研究RAS生物学的系统(Seeburg等人，同上；Der等人，ProcNatl Acad Sci USA79，3637(1982年1月))。增强的UBE2L3-KRAS的表达诱导了成纤维细胞形态学的丢失(图26)和增加的细胞增殖(图18A)以及集落形成(图18B，图27)。细胞周期分析显示细胞的S期级分增加(图28)。为了查询NIH 3T3细胞中通过UBE2L3-KRAS进行的潜在RAS-相关信号转导途径，对至关重要的信号转导媒介物进行一系列免疫印迹分析(图29)。如关于NIH3T3细胞的文献中所报导的，KRAS是更强的MEK/ERK级联的诱导剂；然而HRAS是更强的PI3K/AKT途径的激活物(Zhu等人，J Biol Chem 279，37398(2004年9月3日))。UBE2L3-KRAS过表达减弱了内源MEK和ERK磷酸化，表明嵌合产物对RAS信号转导的潜在显性负效应(图18C)。此外，不仅存在UBE2L3-KRAS融合物对MEK-ERK信号转导的减弱作用，而且还观察到至AKT和p38MAP激酶激活的偏移(已被许多研究表明牵涉前列腺癌的途径)(Graff等人，同上；Xu等人，同上)。

为了测定UBE2L3-KRAS表达对肿瘤生长的体内效应，将稳定NIH3T3载体对照细胞或表达NIH 3T3 UBE2L3-KRAS嵌合体的细胞植入裸小鼠。在表达UBE2L3-KRAS的细胞但非载体转染的细胞中观察到肿瘤形成(图18D，图30)。

为了研究UBE2L3-KRAS嵌合体在前列腺背景中的作用，在RWPE前列腺上皮细胞中过表达融合物(图25C)。为了观察融合蛋白的表达，需要利用硼替佐米的蛋白酶体抑制(图18E，插图)，这表明所述融合蛋白高度不稳定。

UBE2L3-KRAS嵌合体在RWPE细胞中的过表达导致裸小鼠中增加的细胞增殖、细胞侵袭和肿瘤生长的短暂增加(图18E-G)。与NIH 3T3异种移植物不同，过表达UBE2L3-KRAS的RWPE异种移植物在数周时间内展示肿瘤进展，表明在RWPE系统中，需要其它改变来维持更长期的肿瘤生长。

概括而言，本实施例描述了使用与基因重排数据匹配的已公布的基因组数据集的汇集理解癌症中复发性基因融合物的共同特征的整合生物信息学法。这导致DU145前列腺癌细胞系中UBE2L3-KRAS嵌合体的提名。通过实验确认了该基因组融合物以RNA和DNA水平存在于DU145细胞。在前列腺肿瘤中，发现UBE2L3-KRAS嵌合转录物在30-40%的前列腺癌(来自3个独立组群，表9)中高度表达，但在良性相邻组织或其它癌症类型中未被检测到或以低水平表达。在负责该嵌合体的产生的前列腺癌组织中未检测到基于DNA的改变，这表明改变的剪接机制可能是基因组融合产生的前提条件。这与针对子宫内膜间质组织(Wang等人，同上)的JJAZ1-SUZ12嵌合体所描述的改变的剪接机制类似。已确定在前列腺癌中UBE2L3-KRAS嵌合体可与ETS基因融合物共存。

UBE2L3-KRAS嵌合体编码其中N端包含UBE2L3蛋白的大部分和与全长KRAS在框内的小截短的蛋白质。该融合蛋白不稳定并且需要蛋白酶体抑制才可被容易地观察到。UBE2L3是遍在蛋白缀合酶(E2)(Moynihan等人，Genomics51，124(1998年7月1日))。此外，也有相当多的证据表明遍在蛋白途径在肿瘤发生中是非常重要的(Hoeller等人，Nature 458，438(2009年3月26日))。

虽然已鉴定了KRAS的许多致癌激活点突变，但这是具有致癌性的KRAS的突变型嵌合体形式的第一次描述，从而代表了新型种类的癌症相关改变。由于KRAS中的激活点突变在前列腺癌中非常罕见，因此UBE2L3-KRAS嵌合体也代表了特异于前列腺癌的KRAS改变，同样地有许多研究支持KRAS和MAPK途径在前列腺癌进展中的作用(Graff等人，同上；Chen等人，同上)。KRAS G12V和UBE2L3-KRAS都在体外和体内展示致癌表型，UBE2L3-KRAS过表达导致MEK-ERK途径的减弱而非激活。相反地，KRAS融合物指导AKT和p38MAPK途径下游的信号转导。

表4.一个小组的36个白血病细胞系的ABRA分级分析的结果。未显示不具有部分扩增的基因的细胞。

*扩增的水平显示扩增断点上DNA拷贝数数据的相对定量的差异

#当断点不可接受时的情形

(1)多个基因内断点；

(2)候选者不是离扩增断点最近的基因；

(3)来自现有拷贝数的扩增开始增加并且断点不明显；

(4)断点位于染色体的着丝粒或末端；

(5)断点是扩增内的小缺失的结果；和

(6)断点发现于大部分样品中。

$癌症基因通过癌症基因普查有确定。

表5.一个小组的10个前列腺癌细胞系的ABRA分级分析的结果。未显示不具有部分扩增的基因的细胞系。

表6：将5'扩增的基因的扩增水平与K-562和DU145上的ABL1和KRAS匹配分别提名了它们的候选5'伴侣。播种断点装配分析的3'基因用粗体突出显示。

表7：跨一小组的良性前列腺、前列腺癌细胞系和组织以及其它肿瘤(UM和ULM组群)中的临床病毒学数据和UBE2L3-KRAS表达

表8：来自Cornell组群的60个局限性前列腺癌样品中的UBE2L3-KRAS表达

#患者特异性格里森和

*聚集特异性格里森评分

&利用KRAS分裂探针进行FISH

表9：前列腺癌组织上UBE2L3-KRAS融合物状态的概述

表10：用于RT-PCR、qPCR、5'RLM-RACE和克隆的寡核苷酸引物

表11.通过对一系列前列腺癌组织微阵列的FISH分析概述KRAS重排和UBE2L3-KRAS融合状态。表显示阳性案例的数目除以可评估案例的总数。

上述说明书中提及的所有公布、专利、专利申请和登录号通过引用整体并入本文。虽然已结合具体的实施方案描述了本发明，但应理解，要求保护的本发明应当不过度地限定于这样的具体实施方案。事实上，本发明的所述组合物和方法的各种变动和变化对于本领域技术人员来说是显然的并且意欲包括在下列权利要求的范围内。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种用于鉴定或表征患者的前列腺癌的方法，所述方法包括在获自所述患者的样品中检测，如果存在的话，具有来自SLC45A3基因的转录调控区的5’部分和来自RAF家族基因的3’部分之间的融合、重排或基因组缺失或由所述融合、重排或基因组缺失产生的基因融合物，其中在所述样品中检测到基因融合物的存在鉴定或表征了所述患者的前列腺癌。

2.权利要求1所述的方法，其中所述SLC45A3基因的转录调控区包含SLC45A3基因的启动子区域。

3.权利要求1所述的方法，包括检测包含来自SLC45A3基因的转录调控区的5’DNA部分和来自RAF家族基因的3’DNA部分的基因组DNA的染色体重排。

4.权利要求1所述的方法，包括检测包含从SLC45A3基因的转录调控区转录的5’RNA部分和从RAF家族基因转录的3’RNA部分的嵌合mRNA转录物。

5.权利要求1所述的方法，其中所述样品选自组织、血液、血浆、血清、尿、尿上清液、尿细胞沉淀、精液、前列腺分泌物或前列腺细胞。

6.权利要求1所述的方法，其中所述RAF家族基因选自BRAF和RAF1。

7.一种用于鉴定或表征患者的前列腺癌的方法，所述方法包括在获自所述患者的样品中检测，如果存在的话，具有来自UBE2L3基因的转录调控区的5’部分和来自RAS家族基因的3’部分之间的融合、重排或基因组缺失或由所述融合、重排或基因组缺失产生的基因融合物在所述样品中的存在或不存在，其中在所述样品中检测到所述基因融合物的存在鉴定或表征了所述患者的前列腺癌。

8.权利要求7所述的方法，其中所述UBE2L3基因的转录调控区包含UBE2L3基因的启动子区域。

9.权利要求7所述的方法，包括检测包含来自UBE2L3基因的转录调控区的5’DNA部分和来自RAS家族基因的3’DNA部分的基因组DNA的染色体重排。

10.权利要求7所述的方法，包括检测包含从UBE2L3基因的转录调控区转录的5’RNA部分和从RAS家族基因转录的3’RNA部分的嵌合mRNA转录物。

11.权利要求7所述的方法，其中所述样品选自组织、血液、血浆、血清、尿、尿上清液、尿细胞沉淀、精液、前列腺分泌物或前列腺细胞。

12.权利要求7所述的方法，其中所述RAS家族基因为KRAS。

13.一种组合物，其包含如下的至少一种：

(a)包含与嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的接头杂交的序列的寡核苷酸探针，其中所述嵌合基因组DNA或所述嵌合mRNA的5’部分来自SLC45A3基因的转录调控区并且所述嵌合基因组DNA或所述嵌合mRNA的3’部分来自RAF家族基因；

(b)包含与来自SLC45A3基因的转录调控区的嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的5’部分杂交的序列的第一寡核苷酸探针，和包含与来自RAF家族基因的所述嵌合基因组DNA或所述嵌合mRNA的3’部分杂交的序列的第二寡核苷酸探针；

(c)包含与来自SLC45A3基因的调控区的嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的5’部分杂交的序列的第一扩增寡核苷酸，和包含与来自RAF家族基因的所述嵌合基因组DNA或所述嵌合mRNA的3’部分杂交的序列的第二扩增寡核苷酸；

(d)包含与嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的接头杂交的序列的寡核苷酸探针，其中所述嵌合基因组DNA或所述嵌合mRNA的5’部分来自UBE2L3基因的转录调控区并且所述嵌合基因组DNA或所述嵌合mRNA的3’部分来自RAS家族基因；

(e)包含与来自UBE2L3基因的转录调控区的嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的5’部分杂交的序列的第一寡核苷酸探针，和包含与来自RAS家族基因的所述嵌合基因组DNA或所述嵌合mRNA的3’部分杂交的序列的第二寡核苷酸探针；

(f)包含与来自UBE2L3基因的转录调控区的嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的5’部分杂交的序列的第一扩增寡核苷酸，和包含与来自RAS家族基因的所述嵌合基因组DNA或所述嵌合mRNA的3’部分杂交的序列的第二扩增寡核苷酸；和

(g)针对具有由UBE2L3基因编码的氨基末端部分和由RAS家族基因编码的羧基末端部分的嵌合蛋白的抗体。

14.权利要求13所述的组合物，其中所述RAF家族基因选自BRAF和RAF1。

15.权利要求13所述的组合物，其中所述RAS家族基因为KRAS。

16.SLC45A3-RAF家族基因融合物检测剂用于鉴定或表征患者的前列腺癌的用途。

17.SLC45A3-RAF家族基因融合物检测剂用于鉴定SLC45A3-RAF家族基因融合物在生物样品中的存在的用途，其中所述SLC45A3-RAF家族基因融合物包括具有来自SLC45A3基因的转录调控区的5’部分与来自RAF家族基因的3’部分之间的融合、重排或基因组缺失或因所述融合、重排或基因组缺失产生的基因融合物。

18.UBE2L3-RAS家族基因融合物检测剂用于鉴定或表征患者的前列腺癌的用途。

19.UBE2L3-RAS家族基因融合物检测剂用于鉴定UBE2L3-RAS家族基因融合物在生物样品中的存在的用途，其中所述UBE2L3-RAS家族基因融合物包括具有来自UBE2L3基因的转录调控区的5’部分与来自RAS家族基因的3’部分之间的融合、重排或基因组缺失或因所述融合、重排或基因组缺失产生的基因融合物。

20.一种用于测定前列腺癌患者的对利用RAF抑制剂或MAPK/ER途径抑制剂的治疗的反应的可能性的方法，所述方法包括在获自前列腺癌患者的样品中检测，如果存在的话，具有来自SLC45A3基因的转录调控区的5’部分与来自RAF家族基因的3’部分之间的融合、重排或基因组缺失或因所述融合、重排或基因组缺失产生的基因融合物，其中检测到所述融合物的存在表明所述前列腺癌患者可能对利用所述RAF抑制剂或所述MAPK/ER途径抑制剂的治疗起反应。

21.一种用于测定前列腺癌患者的对利用AKT抑制剂或p38MAP激酶途径抑制剂的治疗的反应的可能性的方法，所述方法包括在获自前列腺癌患者的样品中检测，如果存在的话，具有来自UBE2L3基因的转录调控区的5’部分与来自RAS家族基因的3’部分之间的融合、重排或基因组缺失或因所述融合、重排或基因组缺失产生的基因融合物，其中检测到所述融合物的存在表明所述前列腺癌患者可能对利用所述AKT抑制剂或所述p38MAP激酶途径抑制剂的治疗起反应。

Claims (15)

1.一种用于鉴定患者的前列腺癌的方法，包括：

(a)提供来自所述患者的样品；和

(b)检测具有来自SLC45A3基因的转录调控区的5’部分和来自RAF家族基因的3’部分的基因融合物在所述样品中的存在或不存在，

其中在所述样品中检测到基因融合物的存在鉴定了所述患者的前列腺癌。

2.权利要求1所述的方法，其中所述SLC45A3基因的转录调控区包含SLC45A3基因的启动子区域。

3.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括检测具有来自SLC45A3基因的转录调控区的5’DNA部分和来自RAF家族基因的3’DNA部分的基因组DNA的染色体重排。

4.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括检测具有从SLC45A3基因的转录调控区转录的5’RNA部分和从RAF家族基因转录的3’RNA部分的嵌合mRNA转录物。

5.权利要求1所述的方法，其中所述样品选自组织、血液、血浆、血清、尿、尿上清液、尿细胞沉淀、精液、前列腺分泌物或前列腺细胞。

6.权利要求1所述的方法，其中所述RAF家族成员基因选自BRAF和RAF1。

7.一种用于鉴定患者的前列腺癌的方法，包括：

(a)提供来自所述患者的样品；和

(b)检测具有来自UBE2L3基因的转录调控区的5’部分和来自RAS家族基因的3’部分的基因融合物在所述样品中的存在或不存在，

其中在所述样品中检测到所述基因融合物的存在鉴定了所述患者的前列腺癌。

8.权利要求7所述的方法，其中所述UBE2L3基因的转录调控区包含UBE2L3基因的启动子区域。

9.权利要求7所述的方法，其中步骤(b)包括检测具有来自UBE2L3基因的转录调控区的5’DNA部分和来自RAS家族基因的3’DNA部分的基因组DNA的染色体重排。

10.权利要求7所述的方法，其中步骤(b)包括检测具有从UBE2L3基因的转录调控区转录的5’RNA部分和从RAS家族基因转录的3’RNA部分的嵌合mRNA转录物。

11.权利要求7所述的方法，其中所述样品选自组织、血液、血浆、血清、尿、尿上清液、尿细胞沉淀、精液、前列腺分泌物或前列腺细胞。

12.权利要求7所述的方法，其中所述RAS家族成员基因为KRAS。

13.一种组合物，其包含如下的至少一种：

(a)包含与嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的接头杂交的序列的寡核苷酸探针，其中所述嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的5’部分来自SLC45A3基因的转录调控区并且所述嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的3’部分来自RAF家族成员基因；

(b)包含与来自SLC45A3基因的转录调控区的嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的5’部分杂交的序列的第一寡核苷酸探针，和包含与来自RAF家族成员基因的所述嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的3’部分杂交的序列的第二寡核苷酸探针；

(c)包含与来自SLC45A3基因的调控区的嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的5’部分杂交的序列的第一扩增寡核苷酸，和包含与来自RAF家族成员基因的所述嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的3’部分杂交的序列的第二扩增寡核苷酸；

(d)包含与嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的接头杂交的序列的寡核苷酸探针，其中所述嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的5’部分来自UBE2L3基因的转录调控区并且所述嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的3’部分来自RAS家族成员基因；

(e)包含与来自UBE2L3基因的转录调控区的嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的5’部分杂交的序列的第一寡核苷酸探针，和包含与来自RAS家族成员基因的所述嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的3’部分杂交的序列的第二寡核苷酸探针；

(f)包含与来自UBE2L3基因的转录调控区的嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的5’部分杂交的序列的第一扩增寡核苷酸，和包含与来自RAS家族成员基因的所述嵌合基因组DNA或嵌合mRNA的3’部分杂交的序列的第二扩增寡核苷酸；和

(g)针对具有由UBE2L3基因编码的氨基末端部分和由RAS家族成员基因编码的羧基末端部分的嵌合蛋白的抗体。

14.权利要求13所述的组合物，其中所述RAF家族成员基因选自BRAF和RAF1。

15.权利要求13所述的组合物，其中所述RAS家族成员基因为KRAS。

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