JP5850898B2 - 前立腺癌マーカーとしてのspink1およびその使用 - Google Patents
前立腺癌マーカーとしてのspink1およびその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5850898B2 JP5850898B2 JP2013218134A JP2013218134A JP5850898B2 JP 5850898 B2 JP5850898 B2 JP 5850898B2 JP 2013218134 A JP2013218134 A JP 2013218134A JP 2013218134 A JP2013218134 A JP 2013218134A JP 5850898 B2 JP5850898 B2 JP 5850898B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- spink1
- prostate
- cancer
- expression
- erg
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/81—Protease inhibitors
- G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- G01N2333/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- G01N2333/8135—Kazal type inhibitors, e.g. pancreatic secretory inhibitor or ovomucoid
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
癌マーカーを含むがこれに限定されない、癌の研究、診断、および治療のための組成物および方法を提供する。特に、SPINK1および前立腺癌のための他のマーカーを提供する。
[1]
(a)患者由来の前立腺細胞を含有する試料を提供する工程;
(b)前立腺細胞を含有する試料において、SPINK1の正常発現と比較したSPINK1の過剰発現を検出する工程;および
(c)前立腺細胞を含有する試料において、ERGおよび/またはETV1の正常発現を検出する工程
を含む、患者における前立腺癌を同定するための方法であって、
前立腺細胞を含有する試料において、ERGおよび/またはETV1の正常発現と比較したSPINK1の相互排他的な過剰発現を検出する工程により、患者における前立腺癌を同定する、方法。
[2]
工程(b)が、SPINK1のRNAの過剰発現を検出することを含む、[1]記載の方法。
[3]
工程(b)が、SPINK1のタンパク質の過剰発現を検出することを含む、[1]記載の方法。
[4]
前立腺細胞を含有する試料が、前立腺組織、血液、尿、精液、前立腺分泌物、または単離された前立腺細胞である、[1]記載の方法。
[5]
前立腺細胞を含有する試料において、SPINK1の過剰発現を検出する工程により、患者における浸潤性前立腺癌を同定する、[1]記載の方法。
[6]
前立腺細胞を含有する試料が、根治的前立腺切除術後の患者に由来し、かつSPINK1の過剰発現により、根治的前立腺切除術後の患者における前立腺癌の再発を同定する、[1]記載の方法。
[7]
(a)患者由来の前立腺細胞を含有する試料を提供する工程;ならびに
(b)前立腺細胞を含有する試料において、
(i)SPINK1の正常発現と比較したSPINK1の過剰発現、およびPCA3の正常発現と比較したPCA3の過剰発現、
(ii)SPINK1の正常発現と比較したSPINK1の過剰発現、およびGOLPH2の正常発現と比較したGOLPH2の過剰発現、
(iii)SPINK1の正常発現と比較したSPINK1の過剰発現、およびTMPRSS2:ERGの存在、
(iv)SPINK1の正常発現と比較したSPINK1の過剰発現、PCA3の正常発現と比較したPCA3の過剰発現、およびGOLPH2の正常発現と比較したGOLPH2の過剰発現、
(v)SPINK1の正常発現と比較したSPINK1の過剰発現、PCA3の正常発現と比較したPCA3の過剰発現、およびTMPRSS2:ERGの存在、
(vi)SPINK1の正常発現と比較したSPINK1の過剰発現、GOLPH2の正常発現と比較したGOLPH2の過剰発現、およびTMPRSS2:ERGの存在、または
(vii)SPINK1の正常発現と比較したSPINK1の過剰発現、PCA3の正常発現と比較したPCA3の過剰発現、GOLPH2の正常発現と比較したGOLPH2の過剰発現、およびTMPRSS2:ERGの存在
を検出する工程
を含む、患者における前立腺癌を同定するための方法であって、
前立腺細胞を含有する試料において、SPINK1の過剰発現を検出する工程により、患者における前立腺癌を同定する、方法。
[8]
工程(b)が、SPINK1のRNAの過剰発現を検出することを含む、[7]記載の方法。
[9]
工程(b)が、SPINK1のタンパク質の過剰発現を検出することを含む、[7]記載の方法。
[10]
前立腺細胞を含有する試料が、前立腺組織、血液、尿、精液、前立腺分泌物、または単離された前立腺細胞である、[7]記載の方法。
[11]
(a)患者由来の前立腺細胞を含有する試料を提供する工程;ならびに
(b)前立腺細胞を含有する試料において、
(i)SPINK1の正常発現と比較したSPINK1の過剰発現、
(ii)PCA3の正常発現と比較したPCA3の過剰発現、
(iii)GOLPH2の正常発現と比較したGOLPH2の過剰発現、および
(iv)TMPRSS2:ERGの存在
を検出する工程
を含む、患者における前立腺癌を同定するための方法であって、
前立腺細胞を含有する試料において、SPINK1の過剰発現を検出する工程により、患者における前立腺癌を同定する、方法。
[12]
以下のうちの少なくとも1つを含む、組成物:
(a)SPINK1のRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする配列を含む第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ERGのRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする配列を含む第2のオリゴヌクレオチドプローブ、およびETV1のRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする配列を含む第3のオリゴヌクレオチドプローブ;
(b)第1の対のそれぞれの増幅オリゴヌクレオチドが、SPINK1のRNAもしくはcDNAに特異的にハイブリダイズする配列を含む、第1の増幅オリゴヌクレオチド対、第2の対のそれぞれの増幅オリゴヌクレオチドが、ERGのRNAもしくはcDNAに特異的にハイブリダイズする配列を含む、第2の増幅オリゴヌクレオチド対、およびそれぞれの増幅オリゴヌクレオチドが、ETV1のRNAもしくはcDNAに特異的にハイブリダイズする配列を含む、第3の増幅オリゴヌクレオチド対;または、
(c)SPINK1のタンパク質に特異的に結合する第1の抗体、ERGのタンパク質に特異的に結合する第2の抗体、およびETV1のタンパク質に特異的に結合する第3の抗体。
[13]
以下のうちの少なくとも1つを含む、組成物:
(a)
(i)SPINK1のRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ、および
(ii)
(A)PCA3のRNAもしくはcDNA、
(B)GOLPH2のRNAもしくはcDNA、または
(C)キメラRNAの5’部分がTMPRSS2遺伝子から転写され、かつキメラRNAの3’部分がERG遺伝子から転写される、キメラRNAもしくはcDNAの接合部
に特異的にハイブリダイズする配列を含む、少なくとももう1つのオリゴヌクレオチドプローブ
を含む、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプローブ;
(b)
(i)それぞれの増幅オリゴヌクレオチドが、SPINK1のRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする配列を含む、1対の増幅オリゴヌクレオチド、および
(ii)
(A)それぞれの増幅オリゴヌクレオチドが、PCA3のRNAもしくはcDNAに特異的にハイブリダイズする配列を含むか、
(B)それぞれの増幅オリゴヌクレオチドが、GOLPH2のRNAもしくはcDNAに特異的にハイブリダイズする配列を含むか、または
(C)TMPRSS2遺伝子もしくはその対応するcDNAから転写されたキメラRNAの5’部分に特異的にハイブリダイズする配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、およびERG遺伝子もしくはその対応するcDNAから転写されたキメラRNAの3’部分に特異的にハイブリダイズする配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチドを含む、
少なくとももう1対の増幅オリゴヌクレオチド
を含む、少なくとも2対の増幅オリゴヌクレオチド;または
(c)
(i)SPINK1のタンパク質に特異的に結合する抗体、および
(ii)
(A)GOLPH2のタンパク質、
(B)ネイティブERGタンパク質、
(C)TMPRSS2遺伝子とERG遺伝子との融合体によってコードされる、アミノ末端が切断されたERGのタンパク質、または
(D)TMPRSS2遺伝子によってコードされたアミノ末端部と、ERG遺伝子によってコードされたカルボキシ末端部とを有するキメラタンパク質
に特異的に結合する、少なくとも2つの抗体
を含む、少なくとももう1つの抗体。
さらなる態様を以下に記載する。
Oncomineデータベース(Rhodes et al.,Proc Natl Acad Sci USA 101,9309[2004];Rhodes et al.,Neoplasia 6,1[2004])に申請する際に、癌異常値のプロファイル解析(cancer outlier profile analysis(COPA))と称される方法論は、白血病におけるPBX1および多発性骨髄腫におけるCCND1を含むいくつかの既知の癌遺伝子を正確に同定した(Tomlins et al.,Science 310,644[2005])。加えて、COPAは、前立腺癌における候補癌遺伝子としてETSファミリー遺伝子を指定し、ERGまたはETV1およびアンドロゲンによって調節された遺伝子TMPRSS2に関与する反復性の染色体再構築の発見を促した(Tomlins et al.,[2005]、上記参照)。
本明細書に記載される開示および添付の特許請求の範囲に関する理解を深めるために、多数の用語およびフレーズを以下に定義する。
癌マーカーを含むがこれに限定されない、癌の研究、診断、および治療のための組成物および方法を記載する。特に、SPINK1および前立腺癌のための他のマーカーを提供する。したがって、マーカーの検出のための方法およびキット、ならびに薬剤スクリーニング、治療への応用を提供する。
癌性前立腺組織において、発現が特異的に変化するマーカーを提供する。このようなマーカーは、前立腺癌の診断および特性化に使用を見出す。例えば、本明細書に記載される実験では、前立腺癌において過剰発現するSPINK1を同定した。加えて、SPINK1、ERGおよびETV1は、相互排他的な異常値発現を示した。さらなる実験では、SPINK1、PCA3、GOLPH2およびTMPRSS2:ERG融合を含む前立腺癌に関連する遺伝子発現の検出のための多重パネルアッセイを同定した。
SPINK1(セリンペプチダーゼ阻害剤、Kazal型1)のcDNA配列は、Genbankアクセッション番号NM_003122.2に提供される。PSTIまたはTATIとしても知られている、SPINK1によってコードされるペプチドは、本来は、ウシ膵臓およびヒト膵液から単離され、その正常機能は、膵臓におけるトリプシンの阻害であると考えられる(Haverback et al.,Am J Med 29,421−33(1960);Kazal et al.,Journal of the American Chemical Society 70,3034−3040(1948);Paju et al.,Crit Rev Clin Lab Sci 43,103−42(2006);Greene et al.,Methods Enzymol 45,813−25(1976))。SPINK1 mRNAおよびタンパク質は、様々な良性および癌組織において検出されているが、前立腺におけるその発現は記載されていない(Paju and Stenman,Crit Rev Clin Lab Sci 43,103−42(2006),Stenman,Clin Chem 48,1206−9(2002)にて概説)。SPINK1は、23のアミノ酸シグナルペプチドを有する79のアミノ酸ペプチドをコード化し、健常な個体の尿および血清において検出可能である(Paju and Stenman、上記参照)。重度の炎症および膵臓炎中、大いに上昇するのに加えて、SPINK1の血中濃度は、膵臓、胃、肝臓、肺、乳癌、膀胱、腎、頭頸部、結腸直腸、腎臓および卵巣癌を含む、多数の癌において異常調整され得る(Paju and Stenman(上記参照)、Stenman(上記参照)にて概説)。結論として、バイオインフォマティクス的アプローチを用いて、本試験は、TMPRSS2−ETSの陰性前立腺癌のサブセットにおけるSPINK1の著しい過剰発現を同定し、qPCRを用いてこれらの結果を確認した。これらの結果は、総合してSPINK1の過剰発現が、前立腺癌増殖に関与する、ならびに前立腺癌の分子サブタイプのためのバイオマーカーとして役立つことが示される。
ERG(NM_004449)は、他の正常ヒト組織に対して前立腺上皮において高度に発現することが実証されている。ERG遺伝子は、染色体21に位置している。この遺伝子は、短腕の末端から38,675,671〜38,955,488の塩基対に位置している。ERG遺伝子は、279,817の全塩基対(マイナス鎖配向)である。対応するERG cDNAおよびタンパク質配列は、それぞれ、GenBankアクセッション番号M17254およびGenBankアクセッション番号NP04440(Swissタンパク質アクセッション番号P11308)で示される。
ETV1遺伝子は、染色体7(GenBankアクセッション番号 NC_000007.11、NC_086703.11、およびNT_007819.15)に位置している。この遺伝子は、短腕の末端から13,708330〜13,803,555の塩基対に位置している。ETV1遺伝子は、95,225の全塩基対(マイナス鎖配向)である。対応するETV1 cDNAおよびタンパク質配列は、それぞれ、GenBankアクセッション番号 NM_004956およびNP_004947(Swissタンパク質アクセッション番号P50549)で示される。
DD3(Bussemakers、国際公開第WO 98/45420号、Schalken,Eur.Urol.34(suppl.3):3−6(1998),Bussemakers et al.,Cancer Res. 59:5975−5979(1999)、およびBussemakers,Eur.Urol.35:408−412(1999))としても知られている、PCA3のための遺伝子は、染色体9、さらに正確には、領域9q21−22に位置している。これは4つのエクソンからなり、選択的スプライシングと選択的ポリアデニル化の両方によって、大きさが異なる転写を生じる。RT−PCRによって、PCA3dd3発現は、前立腺組織に限定され、睾丸、精嚢、卵巣、胎盤、および膀胱を含む、試験したすべての他の組織には存在しないことが認められた。加えて、ノーザンブロット分析では、PCA3dd3は、検査した前立腺癌の大部分(50のうち47)に高度に発現したのに対し、同一の患者からのBPHまたは正常な前立腺細胞において、全くない、または非常に低い発現を検出したことを示した。正常またはBPH組織と比較して、前立腺癌においては、PCA3dd3の少なくとも20倍の過剰発現がある。PCA3dd3発現は、腫瘍悪性度とともに増加すると考えられ、転移病巣において検出される。
GOLPH2(GP73)は、肝臓癌に関連するB型肝炎の糖タンパク質マーカーである(Block et al.,(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,102,779−784)。GP73は、ウイルス性肝炎に罹患した患者の肝細胞において高いレベルで発現されるII型ゴルジ膜貫通タンパク質である(Kladney,et al.,2000,Gene249,53−65)。GP73は、胆管上皮細胞に構成的に発現され、正常な肝細胞に最小限に発現される。対照的に、巨細胞性肝炎に罹患した患者の肝臓は、多核化肝細胞において、GP73に強い免疫活性を示す。GP73 mRNAおよびタンパク質は、アデノウイルスを含む、ウイルスで感染した後、高度に分化したHepG2ヘパトーマ細胞に発現される。GP73は、ゴルジ膜貫通タンパク質であるため、損傷または病的肝臓を有する対象であっても、血清中に有意な量で存在することは期待されない。
TMPRSS2:ERGおよび前立腺癌の他の遺伝子融合マーカーは、米国公開第US20070212702 A1号に記載される(その全体において参照することにより本明細書に組み込まれる)。TMPRSS2(NM_005656)は、他の正常ヒト組織に対して前立腺上皮において高度に発現することが実証されている(Lin et al.,Cancer Research 59:4180(1999))。TMPRSS2遺伝子は、染色体21に位置している。この遺伝子は、短腕の末端から41,750,797〜41,801,948の塩基対に位置している(51,151の全塩基対(マイナス鎖配向))。ヒトTMPRSS2タンパク質配列は、GenBankアクセッション番号AAC51784(Swissタンパク質アクセッション番号O15393)及びGenBankアクセッション番号U75329で対応するcDNAに見ることができる(Paoloni−Giacobino,et al.,Genomics 44:309(1997)も参照されたい)。
SPINK1、またはその断片、誘導体、および類似体を含む、他の癌マーカーポリペプチドは、診断および治療への応用に有用な抗体を産生するための免疫原として使用され得る。このような抗体は、ポリクローナル、またはモノクローナル、キメラ、ヒト化、一本鎖またはFab断片であり得、標識または非標識され得、これらのすべては、既知の手順および標準的な実験室規範を用いて産生され得る。例えば、Burns, ed., Immunochemical Protocols,3rd ed.,Humana Press (2005)、 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、Kozbor et al.,Immunology Today 4: 72(1983)、Ko¨hler and Milstein,Nature 256:495(1975)を参照されたい。
一部の態様においては、癌マーカー(例えば、SPINK1)の発現の検出するための方法を提供する。一部の態様においては、検出方法は、(例えば、正常前立腺組織における癌マーカーの値と比較して)検出された癌マーカーの値を測定する。
癌マーカーを含む疑いのあるいかなる患者の試料も、本明細書に記載される方法に従い、試験され得る。非限定例として、該試料は、組織(例えば、前立腺生検試料または前立腺切除術によって得られた組織試料)、血液、尿、精液、前立腺分泌物、またはその部分(例えば、血漿、血清、尿上清、尿細胞ペレットまたは前立腺細胞)であり得る。尿試料は、前立腺からの前立腺細胞を尿路に流す、細心の直腸診(DRE)の直後に採取されることが好ましい。
本明細書に記載される癌マーカーは、核酸配列分析、核酸ハイブリダイゼーション、および核酸増幅を含むが、これらに限定されない、当業者に既知の様々な核酸手法を使用して、RNAとして検出され得る。
核酸配列分析法の例示的な非限定例は、チェーンターミネーター(chain terminator)(Sanger)配列分析およびダイターミネーター(dye terminator)配列分析を含むが、これらに限定されない。当業者は、RNAが細胞中で不安定であり、実験的にさらにヌクレアーゼ攻撃される傾向があるため、RNAは、通常、配列分析される前に、DNAに逆転写されることを理解されるであろう。
核酸ハイブリダイゼーションの例示的な非限定例は、インサイツハイブリダイゼーション法(ISH)、マイクロアレイ、およびサザンブロットまたはノーザンブロットを含むが、これらに限定されない。
一部の態様においては、癌マーカー配列は、蛍光インサイツハイブリダイゼーション法(FISH)を用いて検出される。好ましいFISHアッセイは、細胞人工染色体(BAC)を利用する。これらは、ヒトゲノム配列決定において広範に使用されている(Nature 409:953−958(2001)を参照)、特定のBACを含むクローンは、販売業者を通して入手でき、多くの供給源、例えば、NCBIを通して位置され得る。ヒトゲノムからのそれぞれのBACクローンは、それを疑いなく同定する参照名を与えられている。これらの名を使用して、対応するGenBank配列を見つけ、販売業者からクローンの複製を注文することができる。
異なる種類の生物学的アッセイは、マイクロアレイと称され、DNAマイクロアレイ(例えば、cDNAマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ)、タンパク質マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、トランスフェクションまたは細胞マイクロアレイ、化合物マイクロアレイ、および抗体マイクロアレイを含むが、これらに限定されない。遺伝子チップ、DNAチップ、またはバイオチップとして一般に知られている、DNAマイクロアレイは、発現プロファイリングまたは何千もの遺伝子の発現量を同時に観察するために、アレイを形成する固体表面(例えば、ガラス、プラスチック、またはシリコンチップ)に付着させる顕微鏡的DNAスポットの集合である。付加されたDNAセグメントは、プローブとして知られ、何千ものプローブを、単一DNAマイクロアレイに使用することができる。マイクロアレイを、疾患細胞および正常細胞において遺伝子発現と比較することによって、疾患遺伝子を同定するために使用することができる。マイクロアレイは、ガラス板に極細ピンを用いた印刷、既製マスクを用いたフォトリソグラフィー、動的マイクロミラーデバイスを用いたフォトリソグラフィー、インクジェット印刷、または微小電極アレイにおける電気化学を含むが、これらに限定されない、様々な手法を用いて製造することができる。
癌マーカーゲノムDNAおよびmRNAは、検出前または検出と同時に増幅され得る。核酸増幅法の例示的な非限定例は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、転写媒介増幅法(TMA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換型増幅法(SDA)、および核酸配列増幅法(NASBA)を含むが、これらに限定されない。当業者は、ある種の増幅法(例えば、PCR)は、増幅前に、RNAが、DNAに逆転写されること(例えば、RT−PCR)を必要とするのに対し、他の増幅法は、RNAを直接増幅する(例えば、TMAおよびNASBA)ことを理解するであろう。
非増幅または増幅された核酸を任意の従来の手段によって検出することができる。例えば、癌マーカー核酸を、検出可能な標識されたプローブを用いたハイブリダイゼーションおよび得られるハイブリッドの測定によって検出することができる。検出方法の例示的な非限定例は、下に記載される。
癌マーカーは、タンパク質配列分析、およびイムノアッセイを含むが、これらに限定されない、当業者に既知の様々なタンパク質手法を用いて、タンパク質として検出され得る。
タンパク質配列分析法の例示的な非限定例は、質量分析法およびエドマン分解法を含むが、これらに限定されない。
イムノアッセイの例示的な非限定例は、免疫沈降、ウエスタンブロット法、ELISA、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、およびイムノPCR法を含むが、これらに限定されない。当業者に既知の様々な手法(例えば、比色分析、蛍光、化学蛍光、または放射能)を用いて検出可能に標識されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、イムノアッセイにおける使用に適している。
一部の態様においては、コンピュータベースの分析プログラムは、検出分析によって生成された原データ(例えば、所与のマーカーの存在、不在、またはその量)を、臨床医用の予測値のデータに変換するために使用される。臨床医は、任意の好適な手段を用いて予測データにアクセスすることができる。したがって、好適な態様においては、遺伝学または分子生物学において訓練されていない可能性が高い臨床医は、原データを理解する必要がない。該データは、その最も有用な形式で臨床医に直接示される。該臨床医は、その後、対象のケアを最適化するために、その情報を直ちに利用することができる。
一部の態様においては、インビボイメージング法は、動物(例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳類)における癌マーカーの発現を視覚化するために使用される。例えば、一部の態様においては、癌マーカーのmRNAまたはタンパク質は、癌マーカーに対して特異的な標識された抗体を用いて標識される。特異的に結合および標識された抗体は、放射性核種イメージング、ポジトロン断層法、コンピュータ断層撮影、X線、また磁気共鳴映像法、蛍光検出、および化学蛍光検出を含むが、これらに限定されないインビボイメージング法を用いて、個体において検出され得る。癌マーカーに抗体を発生させる方法を、上に記載する。
さらに他の態様において、前立腺癌の検出および特性のためのキットが提供される。一部の態様においては、該キットは、検出試薬および緩衝液に加えて、癌マーカーに対して特異的な抗体(例えば、SPINK1)を含む。他の態様においては、該キットは、mRNAまたはcDNAのレベル、または染色体欠失の存在もしくは不在(例えば、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー)の検出に対して特異的な試薬を含む。好適な態様においては、該キットは、すべての対照、アッセイ法を実施するための指示、および分析および結果の提示のための任意の必須のソフトウェアを含む、検出分析を実施するために必要な、または十分な構成要素のすべてを含む。
一部の態様においては、薬剤スクリーニングアッセイ(例えば、抗癌剤のためのスクリーニング)を提供する。スクリーニング法は、本明細書で同定される癌マーカーを利用する(例えば、SPINK1を含むが、これに限定されない)。例えば、一部の態様においては、癌マーカー遺伝子の発現を変化する(例えば、減少または増加)、発現もしくは発現しない、または特定の癌マーカーを所有する個体の健康を変化させる化合物をスクリーニングする方法を提供する。一部の態様においては、候補化合物は、癌マーカーに対して方向付けられるアンチセンス剤(例えば、オリゴヌクレオチド)である。アンチセンス療法の考察のための下のIV章を参照されたい。他の態様においては、候補化合物は、癌マーカーに特異結合し、その生物学的機能を阻害する抗体または小分子である。
一部の態様においては、癌(例えば、前立腺癌)に対する療法を提供する。一部の態様においては、療法は、癌マーカー(例えば、SPINK1を含むが、これに限定されない)を標的にする。例えば、一部の態様においては、SPINK1の発現を標的にするアンチセンスまたはRNAi療法を利用する。追加の治療剤を、例えば、本明細書に記載される、薬剤スクリーニング法を用いて同定する。
以下の実施例は、ある好適な態様および態様を示し、さらに例示するために提供され、その範囲を限定されるものと解釈されるべきではない。
本実施例は、前立腺癌におけるSPINK1発現の特性化を記載する。
癌異常値のプロファイル解析(COPA)
COPA解析は、(Tomlins et al.Science 310,644−8(2005))に記載される、Oncomine3.0において、7つの前立腺癌遺伝子発現データセット(Yu et al.,J Clin Oncol 22,2790−9(2004);Lapointe et al.,Proc Natl Acad Sci USA 101,811−6(2004);Glinsky et al.,J Clin Invest 113,913−23(2004);Vanaja et al.,Cancer Res 63,3877−82(2003),Dhanasekaran et al.,Nature 412,822−6(2001),LaTulippe et al.,Cancer Res 62,4499−506(2002);Welsh et al.,Cancer Res 61,5974−8(2001))上において実施された。COPAは、3つの工程を有する。まず、遺伝子発現値は、中央値を中央とし、それぞれの遺伝子の中央発現値を0に設定する。第2に、中央絶対偏差値(MAD)を算出し、それぞれの遺伝子発現値をそのMADで除算することによって、1まで縮尺する。注目すべきは、異常発現値が、分布推定値に過度に影響を及ぼさず、したがって、正規化後も維持されるように、平均偏差および標準偏差ではなく、中央値およびMADを、変換のために使用したことである。第3に、転換した発現値の75番目、90番目、および95番目のパーセンタイルは、それぞれの遺伝子に対して一覧にされた後、遺伝子は、パーセンタイルのスコアによって順位付けられ、異常値のプロファイルの優先順位をつけた表を提供する。3つのパーセンタイルのカットオフ値のいずれかで上位100位以内の異常値を記録した遺伝子を、異常値と称した。同一番号の試験における異常値として同定された遺伝子は、これらの異常値試験におけるそれらの平均異常値順位によってさらに順位付けされた。SPINK1発現も、2つのマルチ癌プロファイリング試験からの前立腺癌の検体において調べた(Bittner et al.,Nat Biotechnol 23,183−4(2005),Su et al.,Cancer Res 61,7388−93(2001))。
定量PCRに使用された組織は、ミシガン大学(University of Michigan)で根治的前立腺切除術シリーズおよび迅速な検視プログラム(Rapid Autopsy Program)からのものであり、それらはともに、ミシガン大学(University of Michigan)前立腺癌重点研究特別助成金(Specialized Program of Research Excellence(S.P.O.R.E.))組織コアの一部である。組み合わせた蛍光インサイツハイブリダイゼーション法(FISH)および免疫組織化学(IHC)評価に関しては、ミシガン大学(University of Michigan(UM))コホートは、根治的前立腺切除術シリーズからの試料からなる。スウェーディッシュウォッチフルウェイティング(Swedish Watchful Waiting(SWW))コホートは、記載されるように、症候性良性前立腺過形成のための経尿道的前立腺切除術によって付随的に診断された局在型前立腺癌に罹患した男性のスウェーディッシュ集団に基づくコホートからの試料からなる(Andren et al.,J Urol 175,1337−40(2006)、Johansson et al.,JAMA 291,2713−9(2004))。メモリアルスローンケタリング癌センター(Memorial Sloan Kettering Cancer Center(MSKCC))コホートは、1985年から2003年の間に、根治的前立腺切除術によってMSKCCで処置された局在型または局所進行性前立腺癌に罹患した患者からなる。すべての試料は、各機関からIRB承認書と共に得られた。前立腺癌細胞株22RV1は、Jill Macoska(ミシガン大学(University of Michigan))によって提供された。
定量PCR(qPCR)は、本質的に記載されるように、Applied Biosystems 7300リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems,Foster City,CA))におけるSYBR Green染料を用いて、実施された(Tomlins et al., Science 310,644−8(2005)、Tomlins et al., Cancer Res 66,3396−400(2006))。略説すると、全RNAは、Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA)を用いて、組織から単離された。RNAは、ND−1000分光光度計(Nanodrop Technologies,Wilmington,DE)を用いて定量化し、3〜5μgの全RNAは、ランダムプライマーの存在下で、SuperScript III(Invitrogen)を用いて、cDNAに逆転写された。すべてのqPCR反応は、製造業者の推奨した熱サイクル条件を用いて、Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)、および25ngの前方プライマーおよび逆のプライマーの双方で実施した。それぞれに実験に関しては、閾値は、配列検出ソフトウェアバージョン1.2.2(Applied Biosystems)を用いて、qPCR反応の対数期中、設定された。それぞれの試料のためのハウスキーピング遺伝子GAPDHおよびHMBSの平均と比較してERG、ETV1、およびSPINK1の量は、比較閾値サイクル(Ct値)法(Applied Biosystems User Bulletin #2に従う)を用いて決定した。それぞれの試料のためのERG、ETV1、およびSPINK1の相対量は、それぞれの遺伝子のためのすべての試料からの平均量に較正された。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、Integrated DNA Technologies(Coralville,IA)によって合成された。GAPDHおよびHMBS、ならびにERG(エクソン5_6)およびETV1(エクソン6_7)プライマーは、記載される通りであった(Tomlins et al.,2005、上記参照)。SPINK1の配列を以下に示す。
ミシガン大学(University of Michigan、(UM))およびスウェーディッシュウォッチフルウェイティング(Swedish Watchful Waiting(SWW))コホートのためのIHCは、局在型前立腺癌の75(UM)と312(SWW)の評価可能な症例からのコアを含む、組織マイクロアレイにおけるSPINK1(H00006690−M01、Abnova,Taipei City,Taiwan)に対するマウスモノクローナル抗体を用いて、実施された。1%を超える癌性上皮細胞の染色は、陽性であると見なした。以前に、前述に記載されるように、別々のERGアッセイを用いて、FISHによってTMRPSS2−ERG融合の状態のためのこれらの組織マイクロアレイ上で評価された症例がある(Tomlins et al.,2005、上記参照)。これらの試験をSPINK1発現と融合の状態の間で逆相関関係があったことを事前の仮説で実施した際、片側フィッシャーの正確確率検定をSPINK1と融合の状態の間の関係を評価するために使用した。
MSKCCコホートのためのIHCは、局在型前立腺癌の817の評価可能な症例から3重のコアを含む組織マイクロアレイ上のSPINK1(コード6E832)に対して自家マウスモノクローナル抗体を用いて、実施された。それぞれのコアにおける陽性の腫瘍細胞のパーセンテージは、0%、5%の値、または10%の倍数を予測し、割り当てられた。発現の強度は、0、1、2、または3の値を割り当てられた。それぞれの検体からの3重コアは、別々に記録され、少なくとも2つの解釈可能なコアにおいて、腫瘍性組織の存在は、分析の症例を含むために必要とされた。症例は、3つのコアのうちのいずれかが80%を超える、陽性のSPINK1免疫活性(強度1〜3)を示す腫瘍細胞を示した場合、SPINK1陽性として記録された。
Glinskyらのカプランマイヤー分析およびUMデータセットに関しては、生化学的制御は、生化学的再発情報を利用できない場合、0.2ng/mlのPSA増加、または転移癌の発生等の前立腺切除術後の疾患の再発として定義された。MSKCCコホートに関しては、臨床的異常者はすべて、生化学的再発を以前に有していたため、第2次確認PSA測定が>0.2ng/mlを有し、切除術後PSA>0.2ng/mlとして定義される、生化学的再発のみ検討した。Glinskyらからのデータセットからの予後解析に関しては、SPINK1の異常値発現に陽性である試料は、(図1Aに示すように)正規化発現単位(normalized expression units)が0.5より大きくなるものとして定義された。UMおよびMSKCCコホートのIHC解析に関しては、陽性症例は、上に記載されるように定義された。カプランマイヤー分析および多変量Cox比例ハザード回帰は、その後、生化学的PSA再発を伴うSPINK1の会合を分析するために使用される。疾病の再発の可能性を予測するために、Kattanの7年の術後ノモグラム(Kattan et al.,J Clin Oncol 17,1499−507(1999))を使用し、ノモグラムおよびノモグラムプラスSPINK1状態(status)のコンコーダンスインデックス(concordance index)は、記載されるように1000倍のブートストラッピングを用いて評価された(Kattan et al.,J Clin Oncol 21,3573−9(2003))。
尿の採取、RNAの単離、RNA増幅および前立腺癌に罹患した男性からのTMRPSS2−ERGのqPCRは、記載される通りであった(Laxman,B. et al.Noninvasive detection of TMPRSS2:ERG fusion transcripts in the urine of men with prostate cancer.Neoplasia 8,885−8(2006))。略説すると、25ngの単離されたRNAを、製造業者の取扱説明書に従い、TransPlex Whole Transcriptome Amplification(WTA)キット(Rubicon Genomics、ミシガン州アナーバー(Ann Arbor、MI))を用いて増幅した。それぞれのqPCR反応に関しては、10ngのWTA増幅されたcDNAを鋳型として使用した。2×Power SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems,Foster City,CA)および25ngの前方および逆のプライマーの双方を、SPINK1、ERG(上に記載されるようなプライマー)およびPSA(Laxman et al.,2006、上記参照)のために使用した。すべての実験に関しては、同一の閾値および基線は、配列検出ソフトウェアバージョン1.2.2(Applied Biosystems)を用いて設定された。PSAに対して26より大きい閾値サイクル(Ct)値を有するすべての試料を排除し、不十分な前立腺細胞回復を有する試料を除去した。試料は、ERGおよびTMRPSS2−ERGアッセイがともに、37未満のCt値を示した場合、TMRPSS2−ERG陽性であると見なされた。PSAと比較してSPINK1の量は、比較Ct法を用いてそれぞれの試料に対して決定され、それぞれの試料のための相対量は、すべての試料の平均に正規化された。SPINK1過剰発現試料のうちの上位11%(本試験において評価された他の5つのコホートからSPINK1陽性試料の平均パーセント(表3参照))が、SPINK1陽性として同定された。この試験をSPINK1発現と融合の状態の間で逆相関関係があったことを事前の仮説で行なったので、片側フィッシャーの正確確率検定をSPINK1とTMPRSS2:ERG状態の間の関係を評価するために使用した。
前立腺癌検体過剰発現SPINK1に存在する際、SPINK1のcDNA(NM_003122.2)はコンセンサスKozak配列(下線を引いた部分の開始および終止コドン)を含む、前方プライマーと共に、以下のプライマーを用いて、RT−PCRによって増幅された。
cDNA産物は、GatewayエントリーベクターpCR8/GW/TOPO(Invitrogen)にクローニングされたTOPOであり、pCR8−SPINK1を得た。アデノウイルス構成物を生成するために、pCR8−SPINK1を、LRクロナーゼII(Invitrogen)を用いて、pAD/CMV/V5(Invitrogen)と再結合した。対照pAD/CMV/LACZクローンは、Invitrogenから得られた。アデノウイルスは、ミシガン大学(University of Michigan)Vector Coreによって生成された。良性の不死化前立腺細胞株RWPEをSPINK1またはLACZアデノウイルスに感染させ、一時的過剰発現のためのRWPE−SPINK1およびRWPE−LACZを生成した。
RWPE−LACZおよびRWPE−SPINK1細胞の増殖は、指定された時点において、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ(細胞増殖試薬WST1,Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)によるテトラゾリウム塩WST−1の開裂に基づく比色分析アッセイによって3回測定された。22RV1細胞の細胞計数は、72時間において、トリプシン処理細胞、およびCoulter counter(Beckman Coulter,Fullerton,CA)によって、3回の分析によって見積もられた。
浸潤アッセイに関しては、RWPE−SPINK1およびRWPE−LACZ細胞(アデノウイルスで感染してから48時間後)、または22RV1細胞を使用した。同数の指示された細胞を、化学誘引物質として下方室に加えられたウシ胎仔血清を用いて、24ウェル培養プレートの挿入物に存在している基底膜マトリックス(EC matrix,Chemicon,Temecula,CA)上に播種した。48時間後、非浸潤細胞およびECマトリックスを綿棒から除去した。浸潤細胞をクリスタルバイオレットで染色し、撮影した。挿入部分を10%酢酸で処置し、吸光度を560nmで測定した。
22RV1細胞内のSPINK1のsiRNAノックダウンに関しては、SPINK1(LQ−019724−00,Chicago,IL)に対するDharmacon SMARTpoolを含む個々のsiRNAを、qPCRによるSPINK1ノックダウンのために試験され、最も有効な単一siRNA(J−019724−07)をさらに実験のために使用した。SiCONTROL非標的siRNA #1(D−001210−01)またはSPINK1に対するsiRNAは、Oligofectamine(Invitrogen)を用いて、22RV1細胞にトランスフェクトした。24時間後、第2の同一トランスフェクションを実行し、上に記載されるように、細胞をRNA単離、浸潤アッセイ、または増殖アッセイのために24時間後採取した。
発現プロファイリングをアジレント(Agilent)のWhole Human Genomeオリゴマイクロアレイ,Santa Clara,CA)を用いて実施した。Trizolを用いて単離された全RNAをQiagen RNAeasy Microキット,Valencia,CA)を用いて精製した。1μgの全RNAをcRNAに変換し、製造業者のプロトコル(アジレント(Agilent))に従い標識化した。ハイブリダイゼーションを、65℃で16時間実施し、アレイをアジレント(Agilent)DNAマイクロアレイスキャナー上でスキャンした。画像を解析し、データは、それぞれのアレイに対し実施された、線形およびLowess(locally weighted scatterplot smoother)正規化とともに、アジレント(Agilent)Feature Extraction Software 9.1.3.1を用いてデータを抽出した。22RV1−siSPINK1ハイブリダイゼーションに関して、参照は、非標的siRNAで感染した22RV1細胞であった。二重ハイブリダイゼーションは、合計4つのアレイのために、複製染料フリップと共に実施された。過剰発現および低発現されたシグニチャー(signature)は、すべてのハイブリダイゼーションにおいて有意な差異を示す発現(PValueLogRatio<0.01)、およびすべてのハイブリダイゼーションにおいてCy5/Cy3比>もしくは<1を有する特性のみを含むようにフィルタリングすることによって、生成された。
上に記載されるように、2位に位置付けられたメタ異常値であるSPINK1(セリンペプチダーゼ阻害剤、Kazal型1)は、複数の試験にわたって、ERGおよびETV1を有する良性の前立腺組織および相互排他的な過剰発現と比較して、前立腺癌において過剰発現を示すことが決定された。SPINK1が上位100位の異常値として同定された2つの試験からの、SPINK1発現ならびにERGおよびETV1を有する散布図のプロファイル(Glinsky et al.,J Clin Invest 113,913−23(2004);Yu et al.,J Clin Oncol 22,2790−9(2004))を図1bに示し、SPINK1発現を測定する7つの追加試験からのプロットを共に図5に示す(Dhanasekaran et al.,Nature 412,822−6(2001),LaTulippe et al.,Cancer Res 62,4499−506(2002),Vanaja et al.,Cancer Res 63,3877−82(2003),Welsh et al.,Cancer Res 61,5974−8(2001),Su et al.,Cancer Res 61,7388−93(2001)、GSE2109およびGSE8218)。全体で、これらの試験からのSPINK1は、127のうち2のみ(1.6%)の良性の前立腺組織試料および387のうち64(16.5%)の前立腺癌(両側フィッシャーの正確確率検定、p=9.5E−7)において異常値発現を示した。387のうち384のプロファイルされた前立腺癌(99.2%)は、図1bおよび5に示されるように、SPINK1、ERG、およびETV1の相互排他的な過剰発現を示した。
遺伝子は、所定の3つのパーセンタイルのカットオフ値(75、90、95)のうちのいずれかで上位100位以内の異常値(COPAにより順位付けられる)を記録した試験の数によって順位付けされた。上位100位に位置付けされた場合、遺伝子は試験におけるそれらの平均COPA順位(平均順位)によってさらに順位付けされた。
本試験で評価される6つのコホートに関しては、分析された全前立腺癌試料、SPINK1陽性試料数およびそのパーセンテージ(それぞれのアッセイ法のための方法に定義されるように)、および試料のパーセンテージは、SPINK1およびERG、ETV1またはTMPRSS2:ERGの相互排他的な過剰発現を示した(測定される場合)。その6つのコホートは、インシリコのマイクロアレイデータ、組織試料における定量PCR(qPCR)、ミシガン大学(University of Michigan、UM)免疫組織化学(IHC)/蛍光インサイツハイブリダイゼーション法(FISH)、スウェーディッシュウォッチフルウェイティング(Swedish Watchful Waiting(SWW))IHC/FISH、メモリアルスローンケタリング癌センター(Memorial Sloan Kettering Cancer Center(MSKCC))IHC、および尿試料におけるqPCRである。
*非尿ベースのコホートからの個々のパーセントは、平均がとられた。qPCR尿コホートからのSPINK1陽性試料を定義するために、他のコホートからの11%平均のSPINK1正値性を使用した。
22RV1細胞を、SPINK1(siRNA SPINK1)または非標的制御siRNA(NT siRNA)に対してsiRNAでトランスフェクトした。全RNAを単離し、発現プロファイリングをAgilent Whole Human Genome Oligo Microarray(GPL4133)を用いて実施した。ハイブリダイゼーション(siRNA SPINK1/NT siRNA)は、複製染料フリップと共に二重に実施された。染色フリップ(siRNA SPINK1/NT siRNA)用に補正されプローブ名、遺伝子名および代表的配列、4つのハイブリダイゼーションにわたる平均倍率変化を含む、特異的に発現された特性(方法参照)を示す。
本実施例は、前立腺癌に関連するマーカーのための試料の評価で用いる多重尿アッセイを記載する。
尿採取、RNA単離、増幅、および定量PCR
本試験は、ミシガン大学(University of Michigan)医学部の施設内治験審査委員会(IRB)によって承認され、試料は、ミシガン大学医療システム(University of Michigan Health System、UMHS)で、針生検(n=216)あるいは根治的前立腺切除術(n=60)のいずれかを行う前の直腸診に続いて、インフォームド・コンセントの上で276人の患者から得られた。尿は、DNA/RNA保存料を含む尿採取カップに(Sierra Diagnostics LLC、Sonora,CA)、排泄された。尿からのRNAの単離および全トランスクリプトーム増幅(whole transcriptome amplification(WTA))は、(Laxman et al.,Neoplasia 2006;8:885−8)に記載される通りであった。定量PCR(qPCR)を使用し、7個の前立腺癌バイオマーカー(AMACR、ERG、GOLPH2、PCA3、SPINK1、TFF3、およびTMPRSS2:ERG融合)、および(Laxman et al.,2006、上記参照、Tomlins et al.,Neoplasia 2006;8:153−62)に本質的に記載される、WTA増幅されたcDNAからの対照転写物PSAおよびGAPDHを検出した。ERG(エクソン5_6)(Tomlins et al., Science 2005;310:644−8)、GAPDH(Vandesompele et al.,Genome Biol 2002;3:RESEARCH0034)、AMACR(Kumar−Sinha et al.,Am J Pathol 2004;164:787−93)、およびPSA(Specht et al.,Am J Pathol 2001;158:419−29)に対するプライマー配列は、以前に記載されており、他のバイオマーカーに関しては、以下のように示す。
TMPRSS2:ERG融合は、Taqmanプライマー/プローブを用いて、以下の配列と共に検出された。
閾値は、配列検出ソフトウェアバージョン1.2.2(Applied Biosystems,Foster City,CA)を用いて、qPCR反応の対数期中、それぞれのプレートに対して同一の基線および閾値セットと共に、設定され、それぞれの試料のためにすべての遺伝子のために、閾値サイクル(Ct)値を生成した。
qPCRは、111人の生検陰性の患者および前立腺癌に罹患した165人の患者(105人の生検陽性の患者および60人の前立腺切除術を受けた患者)から採取された尿からのWTAのcDNAにおいて実施された。27を超えるPSA Ct値を有する試料は、試料内の前立腺細胞の十分な量を確保するために除外し、分析における、105人の生検陽性および前立腺癌に罹患した患者からの152の試料をもたらした。qPCR分析に関しては、対照(2-ΔCt)に対する試験マーカーではなく、未加工の−ΔCを(試験変数の分散を安定するために)使用した。TMPRSS2:ERGは、陽性試料を37未満のCt値を有するものとして定義して、組織試料において観察された融合陽性または陰性状態に反映するための2値変数として二分された(Tomlins et al.,2005、上記参照、Perner et al.,Am J Surg Pathol 2007;31:882−8)。PCA3が、前立腺組織特定のマーカーであることを報告されているので(de Kok et al.,Cancer Res 2002;62:2695−8)、それは、尿PSA(CtPSA−CtPCA3)に対して正規化された。すべての他の試験変数は、尿PSAとGAPDH値の平均((CtPSA+CtGAPDH)/2−Ct変数)に対して調整された。異常値を示す22の試料は、それらの試料における少なくとも1つの試験変数が、その試料平均から標準偏差3を下回る調整値を示し、qPCRの失敗を示唆したため、除外された。これにより、前立腺癌に罹患した138人の患者(86人の針生検陽性の患者および52人の根治的前立腺切除術を受けた患者)および96人の生検陰性の患者からの試料の採集データセットを得た。
一変量および多変量ロジスティック回帰を、前立腺癌の診断状態と試験変数との間の関連性を分析するために使用した。多変量ロジスティック回帰に関しては、赤池情報量基準(AIC)ベースの逆方向選択を使用し、重要度の低い条件を除外した(Venables WNaR,B.D Modern Applied Statistics with S,4th edition.:New York:Springer,2002)。すべての試験マーカーが、初期回帰モデルに含まれ、該モデルは、AICベースの逆方向選択によってさらに改良された。最終モデルを決定した後、それぞれの試料のための予測信頼度を、受信者動作特性(ROC)曲線を生成するための入力として使用し、濃度曲線下面積(AUC)を算出した。すべての試料を回帰モデル生成のために使用したので、予測されたAUCは過剰最適化された可能性がある。この偏りを修正するために、leave−one−out交差検定法を実施した。略説すると、1つの試料を除外する一方、該回帰モデルは、最適マーカーを選択し、係数を予測するために、残りの試料に対して照準された。その後、除外した試料のためのモデル予測に基づいて、予測信頼度を算出した。すべての試料が1度ずつ除外されるまで、これを繰り返し、生成された予測信頼度を、その後、ROC分析として使用した。同様に、PCA3は、AUCを生成するためにロジスティック回帰モデルにフィットさせた。AUCの差異は、前に記載されるように、分析された(DeLong et al.,Biometrics 1988;44:837−45)。すべての分析は、Rにおいて実施され、ROC曲線はSPSS11.5でプロットした(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)。
臨床情報は、臨床ステージ、グリーソンスコア、および生検結果および病理的データに基づくリスク分類等の臨床学的因子との関連を決定するために、カルテから同定された(D’Amico et al.,JAMA 1998;280:969−74)。臨床的ノモグラムを使用し、無増悪生存率および病理学的病期分類のリスクを算出した(Kattan et al.,J Natl Cancer Inst 1998;90:766−71、Kattan et al.,Cancer 1997;79:528−37)。新規のリスク階層化分類(高リスク対低リスク)はまた、すべてのグリーソン6腫瘍、臨床的T1cステージを有する任意のグリーソン7腫瘍、またはグリーソン3+4腫瘍を低リスク腫瘍として、およびグリーソン8+、ステージT2グリーソン7腫瘍またはグリーソン4+3の階層化を有する腫瘍を高リスク腫瘍として分類することによって評価された。すべての変数は、それぞれの臨床的リスク群と一変量関連のために試験された。
前立腺癌に対する多重qPCRベースの試験を開発するために、既刊された報告書に基づく7個の推定前立腺癌バイオマーカー、ならびに前立腺癌に罹患した138人の患者(86人の針生検陽性の患者および52人の根治的前立腺切除術を受けた患者)および針生検陰性を有する96人の患者の最終コホートにおける我々の群からの分析を評価した。バイオマーカーは、PCA3、AMACRおよびGOLPH2等の前立腺癌において、一般に、過剰発現されるもの(Rubin et al.,JAMA 2002;287:1662−70;de Kok et al.、上記参照)、ならびにERGおよびTMPRSS2:ERG、ならびにTFF3およびSPINK1(Tomlins et al,2005、上記参照;Faith et al.,Prostate 2004;61:215−27;Garraway et al.,Prostate 2004;61:209−14)等の前立腺癌のサブセットにおいて過剰発現されるものを含んだ。
Claims (6)
- 患者から得られた試料において前立腺癌細胞を検出するための方法であって、該試料は、前立腺細胞または前立腺分泌物もしくはその画分を含有し、該方法は、
(a)患者試料におけるSPINK1の発現レベルを検出し、検出されたSPINK1発現レベルを、SPINK1の正常な発現と比較する工程と、
(b)試料において、存在する場合、ERGおよび/またはETV1の発現レベルを検出する工程と、
を含み、ここで、SPINK1の過剰発現を検出し、ならびにERGおよび/またはETV1の正常な発現または欠如を検出することにより、試料において前立腺癌細胞を同定する、方法。 - SPINK1の正常な発現と比較した試料におけるSPINK1の過剰発現を検出し、ならびに試料におけるERGおよび/またはETV1の正常な発現を検出する工程をさらに含む、請求項1記載の方法であって、SPINK1の過剰発現を検出し、ならびにERGおよび/またはETV1の正常な発現を検出することにより、試料において前立腺癌細胞を同定する、方法。
- 工程(a)が、SPINK1のRNAを検出することを含む、請求項1または2記載の方法。
- 工程(a)が、SPINK1のタンパク質を検出することを含む、請求項1または2記載の方法。
- 試料が、前立腺組織、血液、尿、精液、前立腺分泌物、または単離された前立腺細胞を含む、請求項1または2記載の方法。
- 試料においてSPINK1の過剰発現を検出することにより、試料において浸潤性前立腺癌細胞または進行性ETS陰性前立腺癌細胞を同定する、請求項1または2記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US85775806P | 2006-11-08 | 2006-11-08 | |
US60/857,758 | 2006-11-08 | ||
US90687607P | 2007-03-14 | 2007-03-14 | |
US60/906,876 | 2007-03-14 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009536481A Division JP2010508855A (ja) | 2006-11-08 | 2007-11-08 | 前立腺癌マーカーとしてのspink1およびその使用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014087335A JP2014087335A (ja) | 2014-05-15 |
JP5850898B2 true JP5850898B2 (ja) | 2016-02-03 |
Family
ID=39365376
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009536481A Pending JP2010508855A (ja) | 2006-11-08 | 2007-11-08 | 前立腺癌マーカーとしてのspink1およびその使用 |
JP2013218134A Expired - Fee Related JP5850898B2 (ja) | 2006-11-08 | 2013-10-21 | 前立腺癌マーカーとしてのspink1およびその使用 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009536481A Pending JP2010508855A (ja) | 2006-11-08 | 2007-11-08 | 前立腺癌マーカーとしてのspink1およびその使用 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20100129804A1 (ja) |
EP (1) | EP2079851B1 (ja) |
JP (2) | JP2010508855A (ja) |
CN (2) | CN101652484B (ja) |
AU (1) | AU2007317306B2 (ja) |
CA (1) | CA2668961A1 (ja) |
IL (2) | IL198526A (ja) |
WO (1) | WO2008058239A2 (ja) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011102999A2 (en) * | 2010-02-19 | 2011-08-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Spink1 targeted therapy |
MX2012011481A (es) * | 2010-04-02 | 2012-11-16 | Veridex Llc | Pronostico basado en los genes de la recurrencia del antigeno especifico de prostata para pacientes con cancer de prostata clinicamente localizado. |
US20140308657A1 (en) * | 2010-12-09 | 2014-10-16 | Philadelphia Health & Education Corporation D/B/A Drexel University College Of Medicine | Serine protease inhibitor kazal antibodies |
EP3348652B1 (en) * | 2011-05-12 | 2023-07-26 | MDxHealth Research B.V. | Molecular markers in prostate cancer |
WO2013028788A1 (en) * | 2011-08-22 | 2013-02-28 | Exosome Diagnostics, Inc. | Urine biomarkers |
WO2013036755A1 (en) * | 2011-09-09 | 2013-03-14 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Etv1 antibodies and uses thereof |
US20130143237A1 (en) * | 2011-11-29 | 2013-06-06 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for prostate cancer analysis |
CN103436594A (zh) * | 2012-10-16 | 2013-12-11 | 科蒂亚(新乡)生物技术有限公司 | 一种bdna在尿液中检测pca3的应用 |
CN102968558B (zh) * | 2012-11-14 | 2015-11-18 | 叶定伟 | 一种预测初诊前列腺癌骨转移风险的装置 |
US20170362662A1 (en) * | 2014-12-01 | 2017-12-21 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Novel rna-biomarker signature for diagnosis of prostate cancer |
CN104531878B (zh) * | 2015-01-04 | 2017-11-10 | 上海市同济医院 | 一种联合lncRNA和AR3检测试剂盒及应用 |
CN105717082A (zh) * | 2016-02-02 | 2016-06-29 | 管晓翔 | 一种用于检测三阴性乳腺癌瘤内异质性的方法 |
KR101948385B1 (ko) * | 2016-09-01 | 2019-05-13 | 충북대학교 산학협력단 | 전립선암 예후 분석용 신규 바이오마커 및 그의 용도 |
CN109521457B (zh) * | 2018-09-25 | 2022-10-21 | 中国辐射防护研究院 | 一种基于信息准则的γ辐射源项划分方法及系统 |
CN111110849B (zh) * | 2018-10-11 | 2021-09-10 | 中国科学院上海营养与健康研究所 | 丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型在制备细胞衰老及肿瘤诊断或调控制剂中的应用 |
CN109776679B (zh) * | 2019-01-08 | 2022-06-17 | 灏灵赛奥(天津)生物科技有限公司 | 一种丝氨酸蛋白酶抑制因子spink1的抗体、其制备方法和应用 |
CN109678950B (zh) * | 2019-01-08 | 2022-05-10 | 灏灵赛奥(天津)生物科技有限公司 | spink1抗原、能够特异性结合spink1的抗体及其功能片段及其应用和产品 |
US11788091B2 (en) | 2019-08-21 | 2023-10-17 | University Of Virginia Patent Foundation | Methods and compositions for diagnosing and treating prostate cancer based on long noncoding RNA overlapping the LCK gene that regulates prostate cancer cell growth |
WO2022103988A2 (en) * | 2020-11-11 | 2022-05-19 | University Of Virginia Patent Foundation | Methods and compositions for diagnosing and treating prostate cancer based on long noncoding rna overlapping the lck gene that regulates prostate cancer cell growth |
CN111308095A (zh) * | 2020-03-04 | 2020-06-19 | 北京师范大学 | 用于诊断前列腺癌的尿液蛋白标记物 |
US20240295567A1 (en) * | 2021-06-29 | 2024-09-05 | Kyoto University | Hypoxia biomarker and use thereof |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4323546A (en) * | 1978-05-22 | 1982-04-06 | Nuc Med Inc. | Method and composition for cancer detection in humans |
JP3448090B2 (ja) * | 1994-02-16 | 2003-09-16 | 浜松ホトニクス株式会社 | エネルギー移動検出法およびその装置 |
US20050214309A1 (en) * | 1994-03-18 | 2005-09-29 | Hinrichs Steven H | Methods and compositions for modulating transcription factor activity |
US5854206A (en) * | 1995-08-25 | 1998-12-29 | Corixa Corporation | Compounds and methods for treatment and diagnosis of prostate cancer |
CO4600637A1 (es) * | 1996-03-15 | 1998-05-08 | Corixa Corp | Compuestos para inmunoterapia e inmunodiagnosis del cancer de prostata |
US20030185830A1 (en) * | 1997-02-25 | 2003-10-02 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer |
BR9808881A (pt) * | 1997-02-25 | 2001-09-11 | Corixa Corp | Compostos para imunoterapia de câncer de próstata e métodos para seu uso |
ES2324503T3 (es) * | 1997-04-10 | 2009-08-07 | Stichting Katholieke Universiteit University Medical Centre Nijmegen | Pca3, genes pca3 y metodos de uso. |
US6187799B1 (en) * | 1997-05-23 | 2001-02-13 | Onyx Pharmaceuticals | Inhibition of raf kinase activity using aryl ureas |
US6828429B1 (en) * | 1999-03-26 | 2004-12-07 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Prostate-specific gene, PCGEM1, and the methods of using PCGEM1 to detect, treat, and prevent prostate cancer |
PL361397A1 (en) * | 2000-09-21 | 2004-10-04 | Smithkline Beecham P.L.C. | Imidazole derivatives as raf kinase inhibitors |
US6897024B2 (en) * | 2001-05-31 | 2005-05-24 | Stichting Katholieke Universiteit More Particularly The University Medical Centre Nijmegen | Nucleic acid molecules comprising the promoter for PCA3, and uses thereof |
US7229774B2 (en) * | 2001-08-02 | 2007-06-12 | Regents Of The University Of Michigan | Expression profile of prostate cancer |
US7790867B2 (en) * | 2002-12-05 | 2010-09-07 | Rosetta Genomics Inc. | Vaccinia virus-related nucleic acids and microRNA |
WO2005005601A2 (en) * | 2003-06-09 | 2005-01-20 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating and diagnosing cancer |
EP1664718B1 (en) * | 2003-09-05 | 2009-12-09 | Thomas Jefferson University | Diagnosis and monitoring of hepatocellular carcinoma |
EP1784511A4 (en) * | 2004-08-13 | 2009-03-11 | Millennium Pharm Inc | GENES, COMPOSITIONS, KITS AND METHODS FOR IDENTIFICATION, ASSESSMENT, PREVENTION AND THERAPY OF PROSTATE CANCER |
US20060275794A1 (en) * | 2005-03-07 | 2006-12-07 | Invitrogen Corporation | Collections of matched biological reagents and methods for identifying matched reagents |
US7718369B2 (en) * | 2005-09-12 | 2010-05-18 | The Regents Of The University Of Michigan | Recurrent gene fusions in prostate cancer |
WO2008063769A2 (en) * | 2006-10-10 | 2008-05-29 | The Henry M.Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Prostate cancer-specific alterations in erg gene expression and detection and treatment methods based on those alterations |
JPWO2009044899A1 (ja) * | 2007-10-03 | 2011-02-17 | 協和発酵キリン株式会社 | 細胞の増殖を制御する核酸 |
-
2007
- 2007-11-08 CA CA 2668961 patent/CA2668961A1/en not_active Abandoned
- 2007-11-08 CN CN2007800495248A patent/CN101652484B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2007-11-08 AU AU2007317306A patent/AU2007317306B2/en not_active Ceased
- 2007-11-08 EP EP20070864115 patent/EP2079851B1/en active Active
- 2007-11-08 JP JP2009536481A patent/JP2010508855A/ja active Pending
- 2007-11-08 WO PCT/US2007/084090 patent/WO2008058239A2/en active Application Filing
- 2007-11-08 US US12/513,637 patent/US20100129804A1/en not_active Abandoned
- 2007-11-08 CN CN2013100513934A patent/CN103233063A/zh active Pending
-
2009
- 2009-05-03 IL IL198526A patent/IL198526A/en not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-09-25 IL IL21537311A patent/IL215373A/en not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-10-21 JP JP2013218134A patent/JP5850898B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2079851A4 (en) | 2010-09-01 |
CN101652484A (zh) | 2010-02-17 |
EP2079851A2 (en) | 2009-07-22 |
CN103233063A (zh) | 2013-08-07 |
CA2668961A1 (en) | 2008-05-15 |
JP2010508855A (ja) | 2010-03-25 |
EP2079851B1 (en) | 2015-01-07 |
US20100129804A1 (en) | 2010-05-27 |
IL215373A0 (en) | 2011-11-30 |
IL198526A (en) | 2012-10-31 |
WO2008058239A2 (en) | 2008-05-15 |
AU2007317306A1 (en) | 2008-05-15 |
CN101652484B (zh) | 2013-03-20 |
WO2008058239A3 (en) | 2008-11-06 |
IL215373A (en) | 2013-07-31 |
IL198526A0 (en) | 2010-02-17 |
WO2008058239A9 (en) | 2009-12-23 |
JP2014087335A (ja) | 2014-05-15 |
AU2007317306B2 (en) | 2012-06-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5850898B2 (ja) | 前立腺癌マーカーとしてのspink1およびその使用 | |
EP3018216B1 (en) | Recurrent gene fusions in prostate cancer | |
JP5512125B2 (ja) | 前立腺癌における再発性遺伝子融合 | |
US9926602B2 (en) | Recurrent gene fusions in prostate cancer | |
ES2700877T3 (es) | Fosfodiesterasa 4D7 como marcador de cáncer de próstata | |
US11015224B2 (en) | RAF gene fusions | |
KR100767878B1 (ko) | 간세포암 진단용 조성물, 이를 포함하는 간세포암 진단키트 및 간세포암 진단방법 | |
KR101007576B1 (ko) | 대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커 | |
KR101065027B1 (ko) | 대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커 | |
KR20100018026A (ko) | 대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150212 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150305 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20150519 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150603 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150710 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20151102 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20151201 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5850898 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |