CN111110849B - 丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型在制备细胞衰老及肿瘤诊断或调控制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子(SPINK1)在制备细胞衰老及肿瘤的诊断或调控制剂中的应用。首次揭示了SPINK1在SASP表型以及肿瘤微环境中发挥重要的生物学作用，其与化疗治疗后的预后密切相关。因此，SPINK1可作为SASP表型调控研究以及基于肿瘤微环境的抗肿瘤研究的靶点，作为肿瘤经化疗治疗后的预后评估以及分级的标志物，以及作为靶点开发抑制肿瘤的药物。

Description

丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型在制备细胞衰老及肿瘤诊 断或调控制剂中的应用

技术领域

本发明属于疾病诊断及调控领域，更具体地，本发明涉及丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子(SPINK1)在制备细胞衰老及肿瘤的诊断或调控制剂中的应用。

背景技术

细胞衰老表现为核膜内折，染色质固缩，脂褐质积累，细胞体积增大，细胞核变大，β-半乳糖苷酶活性上升以及分泌多种因子等。细胞衰老由一种或多种因素触发，激活下游包括p53、p16^INK4A/Rb、PI3K/Akt、FoxO转录因子和线粒体SIRT1等在内的多条信号通路。除了进入永久性增殖停滞，衰老细胞常关系到许多病理学特征，包括局部炎症。细胞衰老发生于受损细胞，并防止其在生物体内增殖。在各种外界刺激和内部因素影响下，细胞损伤可以导致明显的细胞衰老迹象；当损伤累积和达到一定的限度，组织中呈现各种肉眼可辨的组织退行变化和生理上的衰老表型。

尤其值得注意的是，衰老细胞中炎症性细胞因子的表达水平显著升高，这一现象被称为衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)。SASP这一概念是由Coppe等人在2008年首次提出。他们发现衰老细胞能通过分泌胞外基质蛋白、炎症相关因子及癌细胞生长因子促进邻近癌前细胞发生癌变或恶性增强，并称这些蛋白为SASP因子。

衰老细胞产生的外泌蛋白功能，往往取决于衰老肿瘤细胞的基因背景。尽管 SASP对肿瘤生物学具有重要的意义，但是它如何调控肿瘤仍然不甚明确。近年来已有研究将抗衰老着眼于靶向干预SASP的上游信号通路，药物或遗传特异性抑制衰老细胞中IKK/NF-κB、mTOR、p38MAPK、JAK/STAT等，能钝化SASP引起的旁分泌效应，从而改善细胞及机体的衰老状态。

目前，如何靶向杀死衰老细胞而不损伤邻近健康细胞，如何在阻断SASP负性因子的同时保留正性因子的作用，如何将动物实验的研究结果推广及临床等诸多问题都有待进一步的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子在制备细胞衰老及肿瘤的诊断或调控制剂中的应用。

在本发明的第一方面，提供一种用于抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的药物组合物，所述药物组合物中包括：特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体，以及化疗药物。

在一个优选例中，所述的化疗药物是基因毒药物；较佳地，所述的化疗药物包括：米托蒽醌，阿霉素，博莱霉素，沙铂，顺铂，卡铂，道诺霉素，诺加霉素，阿柔比星，表柔比星，多柔比星，阿糖胞苷，卡培他滨，吉西他滨，5-氟尿嘧啶。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括：特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体和米托蒽醌，且两者质量比为1:0.005～1:2.；较佳地为 1:0.01～1:1.0；更佳地为1:0.02～1:0.6，如1:0.2。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括：特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体和阿霉素，且两者质量比为1:0.02～1:1.5；较佳地为1:0.05～1:0.8；更佳地为1:0.06～1:0.3，如1:0.1。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括：特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体和博来霉素，且两者质量比为1:0.02～1.5；较佳地为1:0.05～1:0.8；更佳地为1:0.06～1:0.3，如1:0.1。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括：特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体和选自沙铂、顺铂、卡铂的一种或多种，且抗体与后者的质量比为1:0.02～1.5；较佳地为1:0.05～1:0.8；更佳地为1:0.06～1:0.3，如1:0.1。

在另一优选例中，所述的特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体是由杂交瘤细胞系CCTCC NO:C2018213分泌。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的药物组合物的用途，用于制备抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的药盒。

在一个优选例中，所述的药物组合物中，特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体通过抑制肿瘤微环境中基质细胞表达的丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子，从而降低肿瘤耐药性。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括：前列腺癌，乳腺癌，结直肠癌，胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、肺癌。

在另一优选例中，所述的肿瘤耐药性是肿瘤对化疗药物产生的耐药性。

在本发明的另一方面，提供特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体，其由杂交瘤细胞系CCTCC NO:C2018213分泌。

在本发明的另一方面，提供特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体在制备抗体药物中的应用，所述抗体药物与化疗药物联合应用，抑制肿瘤或消除肿瘤耐药性；或用于消除肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。

在本发明的另一方面，提供一种杂交瘤细胞株SP2/0-01-SPINK1-SUN，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCC NO:C2018213。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的药盒，包括：特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体，或产生该抗体的细胞株。

在一个优选例中，所述的药物组合物包括：所述的药盒中还包括：化疗药物；较佳地所述化疗药物是基因毒药物；较佳地，所述的化疗药物包括：米托蒽醌，阿霉素，博莱霉素，沙铂，顺铂，卡铂，道诺霉素，诺加霉素，阿柔比星，表柔比星，多柔比星，阿糖胞苷，卡培他滨，吉西他滨，5-氟尿嘧啶。

在本发明的另一方面，提供丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子在制备用于肿瘤化疗预后评估的诊断试剂中的用途，其中，所述的丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1 型因子为肿瘤微环境中基质细胞产生的丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子。

在一个优选例中，所述的肿瘤微环境中基质细胞产生的丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子可以通过常规分离手段从样本组织分离获得。

在本发明的另一方面，提供特异性识别丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的试剂在制备用于肿瘤化疗预后评估或病理分级的诊断试剂中的用途，其中，所述的丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子为肿瘤微环境中基质细胞产生的丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子。

在一个优选例中，所述的特异性识别丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的试剂包括：抗体试剂，引物，探针。

在本发明的另一方面，提供一种筛选抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达NF-κB以及丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子，且该丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子编码基因上游存在NF-κB结合位点；和(2)检测所述体系中NF-κB对于丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的调控作用；若所述候选物质在统计学上抑制NF-κB对于丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的转录调控，则表明该候选物质是抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的潜在物质。

在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或步骤(2)包括：检测测试组的体系中NF-κB对于丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的转录调控，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；如果测试组中NF-κB对于丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的转录调控显著被抑制(如抑制20％以上，较佳的抑制50％以上；更佳的抑制80％以上)，则表明该候选物质是抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的潜在物质。

在另一优选例中，所述的NF-κB结合位点包括：丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1 型因子编码基因上游-3902，-1851，-1763，-362，+51位。

在本发明的另一方面，提供一种筛选抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达EGFR介导的信号通路以及丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子；和(2)检测所述体系中丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子对于EGFR介导的信号通路的激活作用；若所述候选物质在统计学上抑制该激活作用，则表明该候选物质是抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的潜在物质。

在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或步骤(2)包括：检测测试组的体系中丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子对于EGFR介导的信号通路的激活作用，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；如果测试组中丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子对于 EGFR介导的信号通路的激活作用显著被抑制(如抑制20％以上，较佳的抑制50％以上；更佳的抑制80％以上)，则表明该候选物质是抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的潜在物质。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、人源前列腺原代基质细胞系PSC27经过化疗药物和放射处理之后的基因表达谱热图。CTRL，control。BLEO，bleomycin。HP，hydrogen peroxide。RAD，radiation。红色箭头，SPINK1。

图2、PSC27细胞经过各种条件处理之后的DNA损伤反应(DDR)。A，免疫荧光检测后的代表性图片，红色荧光为γH2AX，蓝色为DAPI。B，DDR foci统计对比分析。MIT，mitoxantrone。SAT，satraplatin。RAD，radiation。DOX，doxorubicin。 BLEO，bleomycin。

图3、PSC27经过图2中各种条件处理之后的衰老检测。A，经过SA-B-Gal染色后的明场显微镜代表图。B，SA-B-Gal染色阳性细胞统计学对比分析。

图4、PSC27经过图2中各种条件处理之后细胞中DNA嵌入速率分析。A，BrdU 染色之后的代表图，绿色荧光为BrdU。B，各种药物处理之后的BrdU统计学分析。

图5、基质细胞中SPINK1的表达情况。A，经过各种条件处理之后SPINK1在 PSC27细胞中的转录本表达水平。B，Western blot分析SPINK1蛋白表达。

图6、在博来霉素处理之后的PSC27基质细胞表达几种SASP典型因子的时间规律。在药物损伤之后的第1(“2”)，3(“3”)，5(“4”)，7(“5”)，10(“6”)和15(“7”)天分别收集基质细胞并获取其总RNA，进行RT-PCR检测。各时间点数据同对照(未加药组，“1”)规范化之后的数值用于作图。

图7、经过几种药物处理之后的前列腺基质细胞和癌细胞中SPINK1的转录本表达水平对比分析。

图8、图7中使用的各细胞系经过博来霉素处理之后的蛋白样本以Western blot分析确定SPINK1表达变化。IC，intracellular protein。CM，conditioned media。GAPDH，loading control。

图9、人源乳腺基质细胞系HBF1203经过化疗药物处理之后的DNA损伤情况。 A，免疫荧光染色结果代表图，红色荧光为γH2AX，蓝色为DAPI。B，DDR信号统计学对比分析。CIS：顺铂(Cisplatin)；CARB：卡铂(Carboplatin)。

图10、HBF1203经过图9中各种条件处理之后的衰老细胞分析检测。A，经过 SA-B-Gal染色后的明场显微镜代表图。B，SA-B-Gal染色阳性细胞统计学对比分析。

图11、HBF1203经过各种药物处理之后细胞中DNA嵌入分析。A，BrdU染色之后的代表图，绿色荧光为BrdU。B，各种药物处理之后的BrdU统计学分析。

图12、HBF1203中SPINK1的表达情况。经过各种条件处理之后SPINK1在细胞中的转录本表达水平。

图13、经过几种药物处理之后的乳腺基质细胞和癌细胞中SPINK1的转录本表达水平对比分析。

图14、图13中使用的各细胞系经过阿霉素处理之后的蛋白样本以Western blot分析确定SPINK1表达情况变化。IC，intracellular protein。CM，conditioned media。GAPDH，loading control。

图15、分别基于PSC27和HBF1203建立的稳转系经过Western blot确定其 SPINK1蛋白表达水平。Native，original stroma cell line。Vector，subline transduced withcontrol vector。SPINK1，subline overexpressing exogenous SPINK1。GAPDH，loadingcontrol。EGF，epidermal growth factor。

图16、PSC27和HBF1203的subline在DNA损伤性化疗药物处理之后的各种表型分析。A，DDR foci统计。B，基于BrdU染色的DNA合成分析。C，基于SA-B-gal 染色的细胞衰老分析。DMSO，control。

图17、基质细胞在药物处理之后的增殖潜力分析。A，PSC27细胞各subline的时间增长曲线。B，HBF1203增长曲线。药物处理(Drug treatment)，分别为博来霉素和阿霉素加药时间点。

图18、前列腺癌患者化疗前后原发病灶组织病理学对比分析。左侧，组化染色代表性图片。右侧，H&E染色代表性图片。

图19、基于前列腺癌患者肿瘤组织中SPINK1的组化染色结果进行病理分级之后的统计学对比分析。A，统计学图，未经化疗的患者和经历过化疗的患者人数分别为42和48。B，病理分级代表性图片。EL，expression level。

图20、经过激光俘获显微切割(LCM)分离之后的基质细胞和上皮细胞，其SPINK1转录本表达对比分析。

图21、基于单个患者的基质细胞与癌细胞中SPINK1转录本表达分析。每组患者数目10。左，基质细胞。右，上皮细胞。

图22、化疗后阶段前列腺癌患者肿瘤基质细胞中的SPINK1，IL-8和WNT16B 蛋白表达对比分析。每个因子病理分数来自各因子的组化染色，每一读数为3次病理盲读的平均值。

图23、基于SPINK1，IL-8和WNT16B的组化染色代表图。三种因子的组化病理染色系列来自某患者疗后阶段的连续3张切片。

图24、在化疗后患者体内分析SPINK1与IL-8之间、SPINK1与WNT16B之间的蛋白表达关系。各个因子的数值来自三次病理盲读。其中r，R²，slope和P值，均来自Pearson关联分析。左，SPINK1-IL-8。右，SPINK1-WNT16B。

图25、基于化疗后阶段患者病灶中SPINK1的表达水平进行的生存曲线(KaplanMeier)分析。SPINK1低表达组患者数目，20，绿色曲线。SPINK1高表达组患者，28，红色曲线。

图26、乳腺癌患者化疗前后原发病灶组织病理学对比分析。左侧，组化染色代表性图片。右侧，H&E染色代表性图片。

图27、基于乳腺癌患者肿瘤组织中SPINK1的组化染色结果进行病理分级之后的统计学对比分析图，未经化疗的患者和经历过化疗的患者人数分别为68和62。

图28、不同类型细胞之间的SPINK1表达对比分析。A，经过激光俘获显微切割(LCM)分离之后的基质细胞和上皮细胞，其SPINK1转录本表达对比分析。B，基于单个患者的基质细胞SPINK1转录本表达分析，每组患者数目为10。C，基于癌细胞的一组类似分析，每组患者数目为10。

图29、基于化疗后阶段乳腺癌患者病灶中SPINK1的表达水平进行的生存曲线(Kaplan Meier)分析。SPINK1低表达组患者数目，26，绿色曲线。SPINK1高表达组患者，36，红色曲线。

图30、结直肠癌患者化疗前后原发病灶组织病理学对比分析。左侧，组化染色代表性图片。右侧，H&E染色代表性图片。

图31、基于结直肠癌患者肿瘤组织中SPINK1的组化染色结果进行病理分级之后的统计学对比分析图，未经化疗的患者和经历过化疗的患者人数均为40。

图32、不同类型细胞之间的SPINK1表达对比分析。左，经过激光俘获显微切割(LCM)分离之后的结直肠癌基质细胞和上皮细胞，其SPINK1转录本表达对比分析。中，基于单个患者的基质细胞SPINK1转录本表达分析，每组患者数目为10。右，基于癌细胞的一组类似分析，每组患者数目为10。

图33、基于化疗后阶段结直肠癌患者病灶中SPINK1的表达水平进行的生存曲线(Kaplan Meier)分析。SPINK1低表达组患者数目，14，蓝色曲线。SPINK1高表达组患者，26，紫色曲线。

图34、生信分析SPINK1启动子上游4000bp范围内的NF-kB结合位点。A，哺乳动物NF-kB亚基p65典型结合位点的序列示意图。B，根据SPINK1启动子区域内推测性NF-kB结合位点构建的一组表达载体示意图。

图35、将图34B中的4个报告性表达载体分别转入293细胞后经TNFα刺激，检测其荧光素酶活性。NAT11-Luc2CP，阳性对照载体。

图36、将图35中使用的4个载体转入PSC27基质细胞后经过50μg/ml博来霉素处理，分别对比分析其荧光素酶信号强度。

图37、ChIP-PCR分析经过NF-kB特异性抗体沉降下来的组分中SPINK1启动子上4个推测性NF-kB结合位点的PCR信号强度。IL-6-p1和IL-8-p1均为序列已知的 NF-kB位点，此处用作阳性对照。

图38、NF-kB入核突变细胞亚系PSC27^IkBα经过三种化疗药物处理之后，SPINK1 和IL-8的表达水平。

图39、将GL-SPINK1-P04转入PSC27细胞中后，再经博来霉素分别和NF-kB、 c/EBP和AP-1抑制剂处理，获得的荧光素酶信号对比。BAY，NF-kB抑制剂。BA， c/EBP抑制剂。T5224和SR，AP-1抑制剂。

图40、在PSC27细胞经过博来霉素分别和NF-kB、c/EBP和AP-1抑制剂处理之后，几种SASP组分的转录本表达情况。A，SPINK1。B，IL-6。C，IL-8。

图41、PSC27的SPINK1过表达亚系和敲除亚系中SPINK1的蛋白表达和对细胞本身影响的分析。A，Western blot检测SPINK1表达。GAPDH，loading control。 B，SA-β-Gal染色统计学分析。C，代表性图片。

图42、分别经过PSC27的SPINK1过表达组和敲除组产生的CM处理之后前列腺癌细胞的增殖率分析。

图43、图42中各组前列腺癌细胞的迁移率分析，Hela细胞为阳性对照。

图44、图42中各组前列腺癌细胞的侵袭率分析，Hela细胞为阳性对照。

图45、图42中各组前列腺癌细胞在米托蒽醌作用下的耐药性分析。米托蒽醌药物浓度设定在各个癌细胞系的IC50值附近。

图46、前列腺癌细胞系DU145在SPINK1存在和/或化疗药物使用的情况下，caspase 3的完整形式及其切割形式的表达情况分析。

图47、前列腺癌细胞系PC3在米托蒽醌以及apoptosis抑制剂(QVD-OPH， ZVAD/FMK)或激活剂(PAC1，GA)作用下，细胞凋亡情况对比分析。A，紫杉醇(DOC)。 B，米托蒽醌(MIT)。

图48、前列腺癌细胞系PC3和DU145在基质细胞衍生的SPINK1作用下，EGFR 及其下游分子的活化情况分析。EGF，作为检测性的癌细胞一内源生长因子。底部数值，SPINK1在基质细胞CM中的相对计算浓度(ELISA读值)。

图49、前列腺癌细胞系PC3和DU145在基质细胞衍生的SPINK1作用下，图 48中各分子表达情况的再次Western blot分析。

图50、基于SPINK1特异性抗体的IP和Western blot分析。IgG，对照抗体。S，SPINK1单抗。

图51、基质细胞中SPINK1敲除对于细胞本身衰老的影响。A，SA-B-Gal染色后的统计学分析。B，代表性细胞染色图片。

图52、博来霉素处理之后的PSC27(PSC27-BLEO)产生的CM用于处理前列腺癌细胞，SPINK1敲除与否情况下癌细胞的增殖率分析。

图53、图52中各处理条件下前列腺癌细胞的迁移率和侵袭率分析。A，迁移率。 B，侵袭率。每组数据上方为统计学分析，下方为代表性细胞图片。

图54、图52中各处理条件下癌细胞对于米托蒽醌的耐药性分析。药物使用浓度为各细胞系的IC50值。

图55、同图54中的实验条件类似，但使用了EGFR抑制剂AG-1478(2μM)， Cetuximab(50μg/ml)和SPINK1 mAb(1μg/ml)，检测细胞的耐药性。

图56、图55中各种处理条件下PC3细胞系的生存曲线分析。MIT药物浓度设计为接近临床给药条件下前列腺癌患者血浆中的MIT实际浓度。

图57、人源乳腺癌细胞MDA-MB-231和基质细胞HBF1203进行类似图56中的各种处理之后的细胞耐药曲线图。DOX，doxorubicin。

图58、免疫缺陷型小鼠皮下接种PC3/PSC27之后，第8周结束时小鼠肿瘤终端体积的测量值。左侧，5组样本的统计学对比分析。右侧，代表性肿瘤图片。

图59、小鼠体内肿瘤生长、给药和检测流程示意图。在PC3/PSC27皮下注射之后的第三周，开始使用单药或多药处理。

图60、预临床条件下小鼠治疗模式示意图。上方为各处理方式，下方为各时间点分布。

图61、小鼠接种PC3/PSC27之后在连续8周的MIT预临床给药之后的肿瘤终端体积统计学分析。左侧，统计学对比。右侧，代表性肿瘤图片。

图62、化疗结束后小鼠肿瘤经过激光俘获显微切割，将基质细胞和癌细胞予以特异性分离之后的SASP代表性因子和细胞衰老标志性因子的表达分析。A-H分别为 IL-8，WNT16B，SPINK1，MMP2，AREG，ANGPTL4，p16和p21

图63、分别经过安慰剂(placebo)和米托蒽醌处理的小鼠肿瘤组织中SPINK1的表达情况。

图64、经过米托蒽醌和治疗性抗体Cetuximab或SPINK1 mAb单药或多药治疗之后，小鼠肿瘤终端体积的统计学分析。

图65、基于PC3-luc/PSC27皮下接种之后的小鼠，体内荧光素酶表达检测分析。

图66、预临床给药7天之后小鼠肿瘤内部癌细胞的DNA损伤和凋亡情况对比分析。左侧，统计学对比。右侧，代表性组化染色图片(cleaved caspase 3)。

图67、几种治疗条件下小鼠血浆中SPINK1蛋白水平分析。检测结果来自ELISA。

图68、免疫缺陷型小鼠接种LNCaP/PSC27之后第8周米托蒽醌治疗结束时的小鼠肿瘤终端体积统计学分析。

图69、免疫缺陷型小鼠接种乳腺癌细胞系MDA-MB-231和/或HBF1203之后第 8周紫杉醇治疗结束时的小鼠肿瘤终端体积统计学分析。

图70、PC3小鼠在预临床结束时体重(A)和外周血中肌氨酸酐(B)，尿素(C)， ALP(D)和ALT(E)水平对比分析。

图71、MDA-MB-231小鼠在MIT预临床治疗结束时体重(A)和外周血中肌氨酸酐(B)，尿素(C)，ALP(D)和ALT(E)水平对比分析。

图72、免疫完整型小鼠(C57BL/6)在DOX预临床治疗结束时体重(A)和外周血中肌氨酸酐(B)，尿素(C)，ALP(D)和ALT(E)水平对比分析。同时检测其血浆中血球红蛋白(F)，白细胞(G)，淋巴细胞(H)和血小板(I)的单位体积数量。

图73、前列腺临床患者血浆中SPINK1和IL-8蛋白水平及其相互关系分析。A，ELISA检测获得的SPINK1水平读值(化疗前后各20名患者)。B，ELISA检测获得的 SPINK1水平读值(化疗前后各20名患者)。C，Pearson分析SPINK1和IL-8之间的统计学关系。

图74、A-C，类似于图73的临床数据分析，乳腺癌患者样本。

图75、A-C，类似于图72和图73的临床数据分析，结直肠癌患者样本。

图76、化疗前后前列腺癌患者血浆中SPINK1和IL-8含量的Western blot检测。化疗前后各6名患者。Albumin，血浆loading control。

图77、化疗后阶段患者原发病灶组织和外周血中的SPINK1和IL-8的表达水平关联性分析。共20名患者。

图78、基于图77中的20名前列腺癌患者病灶组织中基质细胞的多个SASP因子表达分析。IL-2/3/5/12为SASP非相关性白细胞介素(或促炎症因子)，均为实验对照。

图79、化疗后阶段20名前列腺癌患者血浆中SPINK1水平同其无病生存期的关联。SPINK1低水平患者，10名，青色曲线。SPINK1高水平患者，紫色曲线。

图80、卵巢癌患者中SPINK1过表达统计图。每一红点代表一名卵巢癌患者，每一黑点代表一名健康志愿者。

图81、TCGA数据库有关SPINK1在乳腺癌患者中突变，扩增，缺失的统计学对比分析。

图82、TCGA数据库有关SPINK1在前列腺癌患者中突变，扩增，缺失的统计学对比分析。

图83、临床治疗过程中肿瘤微环境中SPINK1在基质细胞中表达与外泌，对于周边癌细胞的病理影响，以及进入外周血参与循环的工作模式图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示了丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1 型因子(SPINK1)在SASP表型以及肿瘤微环境中发挥重要的生物学作用，其与化疗治疗后的预后密切相关。因此，SPINK1可作为SASP表型调控研究以及基于肿瘤微环境的抗肿瘤研究的靶点，作为肿瘤经化疗治疗后的预后评估以及分级的标志物，以及作为靶点开发抑制肿瘤的药物。

SPINK1

丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型(SPINK1)的因子，又被称为胰腺分泌性胰酶抑制因子(PSTI)或肿瘤相关性胰酶抑制因子(TATI)，是一种由56个氨基酸残基组成的分泌性多肽，主要作用是抑制胰蛋白酶原等多种丝氨酸蛋白酶原活性。SPINK家族与慢性胰腺炎、Netherton综合征、食管癌等疾病关系密切。人SPINK1氨基酸序列如下：MKVTGIFLLSALALLSLSGNTGADSLGREAKCYNELNGCTKIYDPVCGTD GNTYPNECVLCFENRKRQTSILIQKSGPC(SEQ ID NO:1)。

已有的一些研究提示，SPINK1的过表达与前列腺癌患者的临床不良预后呈正相关。此外，与正常的肝脏组织相比，肝癌组织中SPINK1的基因表达显著上调，这可能是由于肿瘤浸润引起的组织破坏诱发急性期反应，在白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素1(IL-1)的作用下诱导了SPINK1的高表达。SPINK1在肝细胞癌组织中的高表达显示了其具有作为肝细胞癌肿瘤标志物的潜能。进一步研究发现，血浆 SPINK1具有作为肝细胞癌血清肿瘤标志物的潜能，而血浆SPINK1表达量的高低与肝细胞癌患者的肿瘤分期明显相关。

然而，在基质细胞因化疗药物或辐射处理而形成SASP的过程中出现SPINK1 表达异常及其分子机制，以及该因子释放至胞外后对于临近癌细胞表型的影响、对于疾病的恶性进展的意义，至今并无相关报道。在抗癌治疗过程中，SASP的典型外泌因子如SPINK1，如否会对癌细胞获得性耐药造成显著影响，以及治疗过程中癌细胞是否出现跟基质细胞类似的药物诱导性SPINK1表达，均是亟需回答的重要科学问题。

以往有关SPINK1在癌症研究中的报道曾涉及膀胱癌，结直肠癌，肝癌和前列腺癌，并且主要是关于该基因的突变或过表达。然而，大多数的数据均集中在癌细胞自身的研究上，相比之下患者基质组织的情况却基本被忽略了。而本发明中，首次揭示了SPINK1在SASP表型以及肿瘤微环境中发挥重要的生物学作用，其与化疗治疗后的预后密切相关。

药物组合及其应用

本发明人发现，特异性抑制SPINK1的抗体与化疗药物联合用药，能够极其显著地增强肿瘤抑制效果。特异性抑制SPINK1的抗体与化疗药物的协同作用藉由以下作用方式：特异性抑制SPINK1的抗体通过结合肿瘤微环境(尤其是其中的基质细胞)的SPINK1，抑制其活性，逆转肿瘤对于化疗药物的耐药性，从而化疗药物的用药效果更为理想。

基于本发明人的新发现，本发明提供了用于抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的药物组合或组合物，所述药物组合或组合物中包括：特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子 Kazal 1型因子的抗体，以及化疗药物。

如本文所用，所述的“肿瘤”可以是原位肿瘤或转移肿瘤，其包括存在耐药性的难治性肿瘤，特别是对基因毒化疗药物具有耐药性的肿瘤。较佳地，所述的肿瘤是实体瘤。例如，所述的肿瘤包括：前列腺癌，乳腺癌，结直肠癌，胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、肺癌等。

作为本发明的优选方式，提供一种对于抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性特别有效的抗SPINK1单抗，所述抗SPINK1单抗对于SPINK1具有很高的特异性，不结合于 SPINK1以外的其它蛋白。并且，当用于与化疗药物联合以抑制肿瘤时，其效果极为优异。

本发明的抗SPINK1单抗利用杂交瘤技术来制备，该杂交瘤细胞株在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCC NO:C2018213。在获得了所述杂交瘤的情况下，可按照常规的动物细胞培养方法，体外培养扩增所述的杂交瘤细胞，从而使之分泌所述的抗SPINK1单抗。作为一种实施方式，所述的抗SPINK1单抗可以由下列制备方法制备：(1)提供佐剂预处理的小鼠；(2)在小鼠腹腔内接种所述的杂交瘤细胞并分泌单克隆抗体；(3)抽取腹水，分离获得所述的单克隆抗体。从腹水中分离单克隆抗体经过进一步纯化，从而可获得高纯度的抗体。本发明的单克隆抗体还可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。本领域人员均了解，在得到了所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系或通过测序等手段得知所述的单克隆抗体后，本领域人员可以方便地获得所述的抗体。

特异性抑制SPINK1的抗体与化疗药物可以被制成药物组合物的方式给药，或者两者可以分离地存在于一个药盒中。其中所述的特异性抑制SPINK1的抗体以及化疗药物均为有效量的。在用作药物时，通常所述的特异性抑制SPINK1的抗体还与药学上可接受的载体相混合。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的如本文所用。

本发明的具体实施例中，给出了一些针对动物如鼠的给药方案。从动物如鼠的给药剂量换算为适用于人类的给药剂量是本领域技术人员易于作出的，例如可根据 Meeh-Rubner公式来进行计算：Meeh-Rubner公式：A＝k×(W^2/3)/10,000。

式中A为体表面积，以m²计算；W为体重，以g计算；K为常数，随动物种类而不同，一般而言，小鼠和大鼠9.1，豚鼠9.8，兔10.1，猫9.9，狗11.2，猴11.8，人10.6。应理解，根据药物以及临床情形的不同，根据有经验的药师的评估，给药剂量的换算是可以变化的。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明提供了一种用于抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的药盒，所述的药盒中包括特异性抑制SPINK1的抗体和化疗药物(如米托蒽醌，阿霉素，博莱霉素，沙铂，紫杉醇)。更优选地，所述药盒中还包括：使用说明书，以指导临床医师以正确合理的方式用药。

为了方便给药，所述的特异性抑制SPINK1的抗体与化疗药物(如米托蒽醌，阿霉素，博莱霉素，沙铂，紫杉醇)的组合物或彼此独立存在的抗体或化疗药物(如米托蒽醌，阿霉素，博莱霉素，沙铂，紫杉醇)可以被制成单元剂型的形式，置于试剂盒中。“单元剂型”是指为了服用方便，将药物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

肿瘤化疗后预后评估的应用

基于本发明人的上述新发现，可以将SPINK1作为肿瘤化疗后的预后评估的标志物：(i)进行肿瘤化疗后的疾病分型、鉴别诊断、和/或无病生存率分析；(ii)评估相关人群的肿瘤治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法。比如，可分离出肿瘤微环境中、特别是基质细胞中SPINK1基因表达异常的人群，从而可进行更有针对性地治疗。

可以通过判断待评估样本(基质细胞)中SPINK1的表达情况或活性情况，来预测提供该待评估样本的受试者的肿瘤预后情况，选择合适的药物实施治疗。通常，可以规定一个SPINK1的阈值，当SPINK1的表达情况高于所规定的阈值时，考虑采用抑制SPINK1的方案进行治疗。所述的阈值对于本领域技术人员而言是易于确定的，例如可以通过将正常人组织微环境中的SPINK1的表达情况与肿瘤患者微环境中的SPINK1的表达情况进行比较后，获得SPINK1表达异常的阈值。

因此，本发明提供了SPINK1基因或蛋白的用途，用于制备肿瘤预后评估的试剂或试剂盒。可采用各种本领域已知的技术来检测SPINK1基因的存在与否以及表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、 Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。本发明还提供了用于在分析物中检测SPINK1基因的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增SPINK1的引物；或特异性识别SPINK1 的探针来确定SPINK1基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合SPINK1编码的蛋白的抗体或配体来确定SPINK1蛋白的表达情况。

所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。

筛选药物的应用

在得知了SPINK1在基质细胞中的表达受到NF-κB调控后，可以基于该特征来筛选抑制NF-κB对于SPINK1的转录调控(NF-κB促进SPINK1转录)的物质。可从所述的物质中找到对于抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性真正有用的药物。

因此，本发明提供一种筛选抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理表达NF-κB以及SPINK1的体系，且该SPINK1编码基因上游存在NF-κB结合位点；以及检测所述体系中NF-κB对于SPINK1的调控作用；若所述候选物质在统计学上抑制NF-κB对于SPINK1的转录调控，则表明该候选物质是抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到NF-κB对于SPINK1的转录调控以及SPINK1的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达体系。

在得知了肿瘤微环境(特别是基质细胞)中的SPINK1对肿瘤细胞的功能性影响主要由EGFR及其下游的信号通路所控制后，可以基于该特征来筛选抑制SPINK1对 EGFR介导的信号通路的激活的物质。可从所述的物质中找到对于抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性真正有用的药物。

因此，本发明提供一种筛选抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理一表达体系，该体系表达EGFR介导的信号通路以及 SPINK1；以及检测所述体系中SPINK1对于EGFR介导的信号通路的激活作用；若所述候选物质在统计学上抑制该激活作用，则表明该候选物质是抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到 SPINK1对于EGFR介导的信号通路的激活作用以及SPINK1的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达体系。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性真正有用的物质。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社， 2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1.细胞培养

(1)细胞系维持

正常人源前列腺原代基质细胞系PSC27和人源乳腺原代基质细胞系HBF1203(均获自美国弗雷德哈青森癌症研究中心)于PSCC完全培养液中增殖和传代。前列腺良性上皮细胞系BPH1，前列腺癌上皮细胞系M12，DU145，PC3，LNCaP和VCaP，乳腺癌上皮细胞系MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-468，T47D和BT474(购自ATCC) 均在5％FBS的RPMI-1640完全培养液中、于37℃、5％CO₂条件的培养箱中培养。

(2)细胞冻存与复苏

a细胞冻存

以0.25％胰蛋白酶收集对数生长期细胞，1000rpm离心2min，弃去上清，重新悬浮细胞于新鲜配置的冻存液中。分装细胞于已标示的无菌冻存管中。然后经梯度降温(4℃10min，-20℃30min，-80℃16～8h)，最后转入液氮中长期储存。

b细胞复苏

取出液氮中冻存的细胞，立即放入37℃水浴，使其快速融化。直接加入2ml细胞培养液，使细胞均匀悬浮。待细胞贴壁后，更换新的培养液。

(3)体外实验处理

为造成细胞损伤，PSC27细胞生长至80％(简称PSC27-Pre)时培养液中加入100 nM紫杉萜(docetaxel，DTX)，100nM紫杉醇(paclitaxel，PTX)，200nM长春新碱 (vincristine，VCR)，50μg/ml博来霉素(bleomycin，BLEO)，1μM米托蒽醌 (mitoxantrone，MIT)，10uM沙铂(satraplatin，SAT)或10Gy ¹³⁷Cs电离辐射(γ-radiation at 743rad/min，RAD)。药物处理6小时后，细胞被PBS简单洗过3次，留置于培养液中7～10天，然后进行后续实验。

2.质粒制备和慢病毒转染

全长人源SPINK1克隆在慢病毒表达载体pLenti-CMV/To-Puro-DEST2(Invitrogen) 酶切位点BamHI和XbaI之间。包装系293FT被用于细胞转染和慢病毒制造。

用于敲除SPINK1的small hairpin RNAs(shRNAs)sense strand序列分别为 GAAGAGAGGCCAAATGTTATTCAAGAGATAACATTTGGCCTCTCTTCTTT(SEQ ID NO:2)和CCAAGATATATGACCCTGTTTCAAGAGAACAGGGTCATATATCTT GGTTTTT(SEQ ID NO:3)。

3.免疫荧光和组化分析

小鼠单克隆抗体anti-phospho-Histone H2A.X(Ser139)(clone JBW301，Millipore) 和鼠单抗anti-SPINK1(Cat#H00006690-M01(clone 4D4)，Abnova)，及二级抗体Alexa

488(或594)-conjugated F(ab’)₂按顺序加入到覆有固定细胞的载玻片上。细胞核用2μg/ml of 4’，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)进行复染。从3个观察视野中选取最具代表性的一张图像进行数据分析和结果展示。FV1000激光扫描共聚焦显微镜(Olympus)用于获取细胞共聚焦荧光图像。

临床前列腺癌、乳腺癌和结直肠癌患者组织IHC染色所用SPINK1抗体同上，购自Abnova。具体步骤如下：常规脱蜡，用0.6％H2O2甲醇在37℃孵育30min，然后用0.01M pH6.0的柠檬酸缓冲液修复20min，室温冷却30min。用正常羊血清封闭 20min，用SPINK1一抗(1:200)在37℃孵育1h，移至4℃冰箱过夜。第二天用TBS洗三次，以二抗(HRP偶联的羊抗兔)在37℃孵育45min，再用TBS洗3次，最后用 DAB显色。

4.基质-上皮共培养和体外实验

用DMEM+0.5％FBS的培养液培养PSC27细胞3天，然后以1倍PBS清洗满丰度的细胞群。简单离心后收集上清作为条件性培养基存放–80℃或直接使用。前列腺上皮细胞在这种条件性培养基中连续培养3天的时间里开展体外实验。对于化疗抗性，上皮细胞系在低血清DMEM(0.5％FBS)(简称“DMEM”)中，或条件性培养基中培养，同时米托蒽醌(MIT)用于处理细胞1至3天，浓度接近各个细胞系的IC₅₀数值，随后在亮场显微镜下进行观察。

5.全基因组范围表达芯片分析(Agilent expression microarray)

对正常人源前列腺原代基质细胞系PSC27进行全基因组范围表达芯片(4x44k) 分析的程序和方法参见Sun，Y.等，Nat.Med.18:1359-1368)。

6.定量PCR(RT-PCR)测定基因表达

以Trizol试剂抽提生长期细胞总RNA，进行逆转录反应。将逆转录反应产物 cDNA稀释50倍作为模板，进行RT-PCR。

反应完成后，经软件分析查看每个基因的扩增情况，导出相应的域值循环数，采用2-ΔΔCt方法，计算每个基因的相对表达量。对融解曲线(melting surve)的波峰和波形进行分析以确定得到的扩增产物是否为特异性单一目的片段。

7.NF-κB调控分析

含有编码IκBα蛋白序列上两个IKK磷酸化突变位点S32A和S34A的反病毒载体pBabe-Puro-IκBα-Mut(super repressor)，被用于转染慢病毒包装细胞系PHOENIX。慢病毒随后用于侵染PSC27基质细胞系，而1μg/ml嘌呤霉素(puromycin)则被用于筛选阳性克隆。作为另外一种方法，5μM的小分子抑制剂Bay 11-7082(购自Selleck)被用于NF-κB活性控制。基质细胞随后被暴露于几种不同形式的细胞毒，及时记录由此产生的表型，分析相关基因表达情况。经过这种方式处理过的细胞，产生出来的条件性培养液被收集起来，用于针对上皮细胞的各种检测。

8.SPINK1启动子分析和染色体免疫沉降(ChIP)检测

针对人SPINK1基因(Gene ID 6690，Genbank accession NM_001354966.1)使用软件CONSITE进行分析，以发现潜在的核心NF-κB结合位点。ChIP-PCR实验中设计4对PCR引物来扩增SPINK1启动子内部NF-κB结合区附近core sequence：primer set#1(-482～-259)：正向5’-CTACTGAAATCACAGTGAAGTATAG-3’(SEQ ID NO: 4)，反向5’-CTGTTCATTGCATCCTGCTAT-3’(SEQ ID NO:5)；primer set#2(-1870～ -1625)：正向5’-GACCAGTCTGGCCAACATGG-3’(SEQ ID NO:6)，反向5’- CCTCATGCTGTATGTTAGATATTCAGAC-3’(SEQ ID NO:7)；primer set#3(-1917～ -1773)：正向5’-TACTTTGGGAGGCCGAGGCAG-3’(SEQID NO:8)，反向 5’-CTCCCGAGTAGCTGGGATTACAGG-3’(SEQ ID NO:9)；primer set#4(-4000～ -3798)：正向5’-TTTAAGAACCTACTATGTGTTTGG-3’(SEQ ID NO:10)，反向 5’-GAAACTCTTGGACACTTTG AG-3’(SEQ ID NO:11)。同时，设计另外2对引物用于分别扩增IL-6：正向5’-AAATGCCCAACAGAGGTCA-3’(SEQ ID NO:12)，反向 5’-CACGGCTCTAGGCTCTGAAT-3’(SEQ ID NO:13)和IL8：正向5’- ACAGTTGAAAACTATAGGAGCTACATT-3’(SEQ ID NO:14)，反向5’-TCGCTTC TGGGCAAGTACA-3’(SEQ ID NO:15)的启动子序列(均为已知的阳性对照)。针对早期代数的PSC27细胞(如p8)和经过博来霉素(50ug/ml)处理的PSC27细胞进行ChIP 分析。体外固定的染色体，使用小鼠单抗anti-p65antibody(F-6，Santa Cruz)进行沉降处理，提取DNA用以扩增。载有多个NF-κB结合位点突变的报告表达载体系通过 site-directedmutagenesis(Strategene)方法设计和产生。此外，涵盖多个NF-κB结合位点和经过优化的IL-2最小启动子作为NF-κB激活转基因系统(NAT system)的报告载体NAT11-Luc2CP-IRES-nEGFP(日本Hokkaido大学Dr.Hatakeyama友情提供)，在实验中用作阳性对照。每一报告载体均由pRL-TK vector(Addgene)共转染以进行信号标准化处理。

9.临床前列腺癌、乳腺癌和结直肠癌患者组织样本获取和分析

化疗药物方案是根据去势抵抗性前列腺癌患者(临床试验注册号NCT03258320)、渗透性导管型乳腺癌患者(临床试验注册号NCT02897700)及非转移性结直肠癌患者 (临床试验注册号NCT00643877)的病理学特征指定的。临床分期为原发癌在I subtype A(IA)(T1a，N0，M0)以上但没有明显远端转移病灶的患者被招募至临床队列中。同时，年龄40-75岁经临床确诊为PCa，或者年龄大于18岁在组织上被证实有渗透性 BCa的患者、年龄小于75岁经临床确诊为CRC的患者方被招募。所有患者均被提供知情同意书并签字确认。有关肿瘤大小，组织类型，肿瘤渗透，淋巴结转移和病理 TNM疾病阶段的数据从病理记录系统获取。肿瘤加工为FFPE样本并处理成组织学切片以供评估。OCT冰冻切片经LCM选择性分离，用于基因表达分析。特别地，化疗前后的腺体相关基质细胞经LCM分离。免疫活性评分(IRS)根据每一组织样本的组化染色呈色深浅分别归类于0-1(阴性)，1-2(若)，2-3(中)，3-4(强)四类(Fedchenko and Reifenrath，2014)。随机对照试验(RCT)方案和所有实验程序均经上海交通大学医学院IRB批准和授权，并根据权威指导原则逐步开展。

10.小鼠移植瘤试验和预临床化疗程序

年龄6周左右的免疫缺陷型小鼠ICR/SCID mice(体重约25g)用于本发明相关动物实验。基质细胞PSC27和上皮细胞以1:4的比例混合，而每一移植体包含1.25×10⁶细胞，用于组织重构。移植瘤通过皮下移植方式植入小鼠体内，移植手术结束之后8 周末动物被执行安乐死。肿瘤体积按照如下公式计算：V＝(π/6)x((l+w)/2)³(V，体积；l，长度；w，宽度)。类似地，乳腺癌移植瘤分别由MDA-MB-231(三阴性、高恶性乳腺癌细胞系)和HBF1203(乳腺成纤维细胞系)，通过组织重构形成。

在预临床化疗试验中，经过皮下移植的小鼠被供给标准实验食谱，2周之后实施化疗药物米托蒽醌(0.2mg/kg剂量)或阿霉素(1.0mg/kg剂量)腹腔给药。同时，FDA 批准的治疗性抗体Cetuximab(10.0mg/kg的剂量，200μl/剂)或经过严格纯化之后的 SPINK1 mAb(10.0mg/kg的剂量，200μl/剂)进行单药或双药静脉注射。时间点为第3、 5、7周的第一天，整个疗程共进行3次循环给药，每个循环为2周。疗程结束后，小鼠肾脏被收集用于肿瘤测量和组织学分析。每只小鼠累积性共接受米托蒽醌0.6 mg/kg体重，或阿霉素3.0mg/kg体重。化疗试验进行到第8周末结束，小鼠处死之后立即解剖，其移植瘤被收集并用于病理系统分析。给药7天之后的部分小鼠用于组化评估其组织水平的caspase 3活性。

化疗进行过程中，每周称取一次小鼠体重；化疗整体结束之后，再次称量小鼠体重并将其血液以心脏穿刺法收集起来置于冰浴45分钟。外周血随即在4℃予以8000 rpm离心10分钟之后，约50μl被VetTest pipette tip吸取，用于IDEXX VetTest 8008 化学分析器检测。肝功测量项目包括肌氨酸酐，尿素，碱性磷酸酶和谷丙转氨酶。

11.生物统计学方法

本发明申请中所有涉及细胞增殖率，迁移性，侵袭性和存活性等的体外实验和小鼠移植瘤及化疗处理的体内试验均重复3次以上，数据以均值±标准误的形式呈现。统计学分析建立在原始数据的基础上，通过two-tailed Student’s t test，one-or two-wayANOVA，Pearson’s correlation coefficients test，Kruskal-Wallis，log-rank test，Wilcoxon-Mann-Whitney test or Fisher’s exact test进行计算，而P<0.05的结果认作具有显著性差异。

实施例1、基因毒药物可以在人源基质细胞中诱导SPINK1的高度表达

近期本发明人注意到人源前列腺基质细胞系PSC27(主要是成纤维细胞组成)在被细胞毒尤其是基因毒化疗药物或电离辐射处理之后，会生成大量SASP因子，并且 SPINK1出现在上调表达幅度最高的一组蛋白中(图1)。为了验证这一现象并扩大研究范围，本发明人随后使用了一套DNA损伤性药物，包括米托蒽醌(MIT)，沙铂(SAT)， gamma射线(RAD)，阿霉素(DOX)和博来霉素(BLEO)处理基质细胞。体外实验表明细胞呈现出明显增多的DNA损伤焦点(γH2AX)，上升的半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性和降低的DNA合成(BrdU嵌入)(图2，3，4)，暗示着典型的细胞周期阻滞和细胞衰老的发生。随后的检测证明了作为对于多种基因毒的反应，转录本和蛋白水平的SPINK1 均有显著上升(图5)。有趣的是，SPINK1在基质细胞中的表达模式，同另外几种SASP 标志性因子如MMP1，WNT16B，SFRP2和MMP12非常相似，即在细胞被药物损伤之后的时间里出现表达水平的逐渐上升，直到细胞在7-10天之后达到一个平台期并长期保持一种分泌状态(图6)。

经过分析几种前列腺来源的细胞系中SPINK1的表达情况，本发明人发现基质细胞比上皮细胞具有更为显著的可诱导性(图7，8)，暗示着基质细胞可能存在着一种驱动SPINK1在DNA损伤背景下高表达的分子机制。这一基质细胞-上皮细胞显著差异的分子特征，随后被一组人乳腺来源的细胞系所证实，包括基质细胞系HBF1203和几个恶性程度并不相同的上皮癌细胞系，表明SPINK1表达具有组织和器官类型的非特异性(图9-14)。

接下来，本发明人研究SPINK1在基质细胞中的表达是否会对其机制细胞本身造成衰老等方面的影响。评估了经过慢病毒转染而过表达SPINK1的前列腺和乳腺来源的基质细胞系(PSC27^SPINK1和HBF1203^SPINK1)，但发现无论DNA损伤反应，溶酶体活性，DNA合成率，以及细胞增殖潜力，均没有发生改变，且呈现器官来源非特异性(图 15-17)。值得注意的是，与SPINK1同家族的一种蛋白，即人表皮生长因子EGF，在 SPINK1过表达之后并没有发生蛋白水平的显著改变(图15)。以上数据表明，SPINK1 表达是细胞衰老的结果之一，而非造成细胞衰老的刺激因素。

实施例2、SPINK1在肿瘤微环境中的表达同化疗之后患者生存呈显著负相关

体外实验结果促使着本发明人继续思考，肿瘤微环境中是否也会出现SPINK1 表达。本发明人研究了一个因被诊断出罹患前列腺癌而经过临床化疗的患者队列，惊奇地发现这些患者普遍在治疗之后，而非在此之前，出现肿瘤组织中SPINK1的显著上调(图18)。同体外实验数据相一致，SPINK1在组织中的表达，集中体现于腺体周边的基质细胞而非腺体内的上皮细胞(图18)。

相比于化疗前，SPINK1在化疗后肿瘤中的高度表达这一特征，被一种预先建立起来的可以根据特定蛋白的组化染色强度定量评估其在组织内的表达水平的病理检测系统的深入分析和进一步确定(图19)。经过激光俘获显微切割这一微观技术，本发明人又发现组织中的SPINK1更加倾向于在基质细胞群而非上皮细胞群中出现诱导性表达(图20)。为确认SPINK1的药物诱导性，本发明人选取了一组在化疗前后的组织样本都被获取并保存下来的患者，发现在他们当中的任何一人，均出现SPINK1在化疗之后的基质细胞而非上皮细胞中高度表达(图21)。本发明人进一步注意到，SPINK1 在被药物破坏的微环境中的表达，同基质细胞SASP特征性因子IL-8和WNT16B基本呈现平行关系(图22)。在受损的肿瘤微环境中，SPINK1同IL-8及WNT16B之间的关系，被化疗之后患者体内这些因子的病理评估所证实(图23-24)。更为重要的，根据患者体内肿瘤基质中SPINK1进行的病理分级所获得的大数据，表明基质组织中 SPINK1的表达水平同疗后阶段患者的无病生存期呈现显著的负相关(图25)。

作为支持性证据，SPINK1的这一系列病理特征在随后的一组涵盖了乳腺癌患者和结直肠癌患者的扩大化研究中，得以重复和确认(图26-33)。本发明人的研究数据提示，SPINK1在肿瘤基质组织中的表达，可以作为一个SASP相关的独立预测指标，用于疗后时期疾病复发和临床死亡率相关的风险系数进行患者分层；同时，SPINK1 在基质中的生成可能具有重要的病理意义。

实施例3、SPINK1在基质细胞中的表达为NF-kB等转录因子所调控

继而，本发明人研究SPINK1在受损基质细胞中的表达机制。作为哺乳动物细胞中调控SASP表达的关键转录机器，NF-κB复合物在癌基因诱导或治疗性损伤导致的细胞衰老过程中均发挥重要作用。首先考虑NF-κB是否介导SPINK1在DNA损伤之后的基质细胞中表达。分析发现在SPINK1上游4000bp区域存在几个NF-κB结合位点(图34)，随后基于报告载体的荧光检测证实了这几个位点的重要性。

相比于对照组293T或PSC27细胞，TNF-α刺激或BLEO处理过的实验组呈现出显著提高的SPINK1启动子转录活性(图35，36)。接下来的ChIP-PCR结果证实了四个位点均为DNA损伤之后真正的NF-κB结合位点(图37)。基于NF-κB功能性缺陷细胞系(PSC27^IκBα)的实验表明，失去NF-κB的细胞核转位活性可以导致SPINK1转录水平大幅减低(图38)。

转录因子被报道参与到SASP因子的表达过程中，如C/EBP和AP-1，然而它们在SPINK1表达中的作用尚不明确。为此，本发明人使用了betulinic acid(BA)，即 C/EBP家族抑制剂，和T-5224，即AP-1选择性抑制剂，分别处理经过预先转导SPINK1 启动子报告载体的PSC27细胞。DNA损伤性处理之后报告载体的荧光信号明显上升，而Bay 11-7082，一种NF-κB抑制剂，则可以基本废除这些信号的产生(图39)。尽管 BA或T-5224的处理可以降低报告载体的荧光信号，它们的降低幅度显著低于Bay 11-7082所造成的影响(图39)。进一步实验结果表明，NF-κB抑制，而非C/EBP或 AP-1阻断，可以造成SPINK1转录水平显著下降(图40)。SPINK1的这一表达特征，同SASP的两个特征性因子IL-6和IL-8相接近，尽管后两者的转录主要为NF-κB和 C/EBP所介导，而非AP-1(图40)。

总体而言，SPINK1在基因毒背景下的基质细胞中表达主要受NF-κB的调控。同时，可以基于NF-κB对于SPINK1的调控作用，来筛选通过影响两者的相互作用而抑制肿瘤的药物，一些能够抑制或阻止两者相互作用的药物，潜在的可能有利于肿瘤的治疗。

实施例4、SPINK1对癌细胞的功能性影响主要由EGFR及其下游的信号通路所控制

相比于以往有关SPINK1在前列腺癌等疾病中的研究主要集中于该因子的自分泌作用方式，本发明人随后关注基质细胞衍生的SPINK1是否通过旁分泌途径对受体细胞发挥影响。首先，在基质细胞中敲除SPINK1之后对于EGF等可溶因子的表达和基质细胞自身衰老的发生并没有造成显著改变(图41)。相比之下，过表达SPINK1 的PSC27细胞(PSC27^SPINK1)产生的条件性培养基(CM)，却可以对一系列前列腺上皮癌细胞如PC3，DU145，LNCaP和M12造成显著影响，包括上调的增殖率，迁移率和侵袭性(图42-44)。然而，这一系列恶性特征却在SPINK1被从基质细胞中敲除之后，发生显著逆转(图42-44)。更重要的是，SPINK1显著提高了前列腺癌细胞对于临床化疗药物米托蒽醌(MIT)的耐药性(图45)。进一步研究发现，MIT是通过导致细胞中 caspase 3的切割来诱导细胞凋亡的，但这一过程可被SPINK1所显著削弱，而从基质细胞中敲除SPINK1之后又可以恢复MIT的这一效果(图46)。为证实这一发现，本发明人随后使用了QVD-OPH和ZVAD-FMK，两种广谱caspase 3抑制剂，以及PAC1 和gambogic acid(GA)，两种caspase激活剂，分别在MIT处理细胞之前用于细胞培养。本发明人发现，细胞凋亡程度在QVD-OPH或VAD-FMK存在条件下显著降低，即便使用了SPINK1培养癌细胞(图47)。而当PAC1或GA被分别加入细胞培养液时，凋亡指数却大幅上升，基本抵消了SPINK1的抗凋亡作用(图47)。这一发现随后被另一化疗药物紫杉醇(DOC)所证实，尽管后者主要通过干扰细胞微管解聚发挥诱导细胞凋亡的作用。因此，SPINK1主要是通过抑制caspase所介导的细胞凋亡，造成癌细胞对于各种化疗药物的抵抗性。

因SPINK1同EGF分享约50％的序列同源性，本发明人首先确定了SPINK1作为一种EGF类似物生长因子对于癌细胞信号通路的影响。在使用SPINK1高表达基质细胞(PSC27^SPINK1)产生的CM培养癌细胞之后，本发明人发现后者出现多个蛋白分子的变化，主要包括EGFR(Y845)，Akt(S473)和mTOR(S2448)等位点的磷酸化，暗示SPINK1所介导的PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活(图48)。进而，Erk(T202/Y204) 和Stat3(S727)的磷酸化，表明这些细胞中MAPK通络的活化。值得注意的是，EGF 在癌细胞中的表达水平并没有发生显著改变，即便在有SPINK1存在时，故而可以排除癌细胞通过EGF自分泌的调整发生信号通路的变化(图48)。为确定EGFR是否在 SPINK1影响癌细胞活化的过程中起到主要介导作用，本发明人使用了AG-1478，一种RTK抑制剂，处理受体癌细胞。有趣的是，在AG-1478存在的条件下，SPINK1 所诱导的EGFR及其下游多个分子的磷酸化均被废除，包括Akt/mTOR和Erk/Stat3信号轴。因而，SPINK1引起的癌细胞表型改变主要通过EGFR介导的信号通路活化来实现，尽管不能排除这一过程中有其它受体分子的参与。作为支持性证据，SPINK1 被从基质细胞中敲除之后，癌细胞的这一系列信号通路活化基本消失(图49)，进一步证实SPINK1是通过EGFR受体引起多个下游信号通路的激活。为确定SPINK1和 EGFR之间的相互作用，本发明人使用SPINK1特异性抗体进行了IP实验。结果表明， SPINK1同EGFR两个分子间存在物理性直接作用，而IP信号可以在PSC27^SPINK1而非PSC27^Vector CM处理过的癌细胞样本中被轻易发现(图50)。

接下来，本发明人要问另一个关键问题，即SPINK1在SASP驱动癌细胞恶性进展过程中是否发挥核心作用。为此目的，本发明人构建了PSC27-shRNA^SPINK1稳定性亚系并在DNA损伤处理之后收集其CM。本发明人注意到，在SPINK1被敲除之后， PSC27原本在DNA损伤条件下出现的细胞衰老既没有延迟也未加速，SA-β-Gal阳性率不变(图51)。在PSC27-BLEO所产生的CM培养癌细胞时，后者的增殖率，迁移率和侵袭性均出现显著上调，而SPINK1从基质细胞中的敲除则可以大幅降低这一系列恶性表型的增幅(图52，53)。

本发明人发现，在SPINK1被敲除之后，PSC27-BLEO所赋予的前列腺癌细胞对于米托蒽醌的获得性耐药性，出现大幅下降(图54)。同样，在PSC27-BLEO CM培养条件下，被EGFR抑制剂AG-1478所作用过的癌细胞的耐药性也显著降低(图55)。为证实SPINK1在SASP广谱因子中所起的关键作用，本发明人使用了Cetuximab，一种FDA批准使用的临床中特异性抑制EGFR的单抗。本发明人发现Cetuximab能够显著下调基质细胞赋予癌细胞的耐药性，效果接近AG-1478(图54)。既然Cetuximab 和AG-1478的靶向分子均为EGFR，本发明人推理直接靶向控制微环境中的SPINK1 是否可以获得更加的效果。经过大量的分析和筛选，本发明人通过杂交瘤筛选的方法获得一种小鼠单抗SPINK1 mAb(保藏号是CCTCC NO:C2018213)，可以在癌细胞耐药性控制实验中取得十分理想的效果，癌细胞清除效率甚至高于AG-1478或Cetuximab(图55)。进而，本发明人同时使用了SPINK1 mAb和Cetuximab处理培养条件下的癌细胞，发现其结果跟SPINK1 mAb单独使用时相同(图55)，说明将 Cetuximab跟SPINK1mAb协同使用并不能获得比SPINK1 mAb单独使用更高的抗癌效率。尽管PSC27-BLEO CM可以使得PC3在一系列的体外实验中表现为对于 MIT(剂量范围0.1～1.0μM)的获得性耐药，该SPINK1 mAb介导的SPINK1清除使得这种耐药性显著弱化，效果跟SPINK1 mAb和Cetuximab联用时接近(图56)。在随后的乳腺癌体外实验中，本发明人观察到了本质上类似的现象(图57)。因而，通过靶向癌细胞表面受体之一的EGFR，和直接控制基质细胞来源的SPINK1，均可达到降低癌细胞获得性耐药的实际目的。

实施例5、体内靶向SPINK1可以延缓肿瘤进程并提高肿瘤对于化疗药物的敏感性

临床抗癌过程中微环境SASP的广谱表达可以加速许多恶性事件，包括肿瘤发生，局部炎症和治疗性抵抗。然而，这种向恶性进展的趋势是否可以通过特异性控制微环境中SASP的核心因子得以控制，以及如何有效抑制抗癌疗法所激活的体内微环境中的SASP，一直是科学界的难题。为了尽可能模拟临床条件，本发明人向免疫缺陷型小鼠皮下部位接种了PSC27和PC3混合细胞群，8周之后本发明人停止实验并进行分析。结果发现，基质细胞表达外源因子SPINK1的情况下，肿瘤终端体积大幅上升，但在SPINK1从基质细胞敲除之后却显著降低(图58)。此外，本发明人设计了一套用于模拟临床抗癌治疗方案的预临床治疗策略，即对荷瘤小鼠进行一个为期8周的化疗方案，后者包括根据一系列预实验数据确定的3次单药或双药治疗(图59，图60)。相比于对照组，接种有PSC27^SPINK1的小鼠肿瘤体积明显上升，但在化疗药物米托蒽醌腹腔给药造成的筛选压下形成的肿瘤体积显著缩小，证明化疗本身可以有效阻滞肿瘤发展(图61)。然而，与对照组(PSC27^Vector小鼠)的肿瘤相比，PSC27^SPINK1残存小鼠肿瘤仍然显著上升，暗示微环境在在整个化疗过程中的病理作用。

通过激光俘获显微切割技术将基质细胞和癌细胞单独分离出来之后，本发明人发现微环境中的这两个细胞在表达SASP典型外泌因子方面呈现较大差异性。包括IL-8，WNT16B，SPINK1，MMP3，AREG和ANGPTL4在内的一组SASP经典因子，在基质细胞中广泛上调，尽管癌细胞也出现AREG和ANGPTL4表达增强；同时，p16/p21 等细胞衰老象征性CDK抑制因子，则在上皮细胞和基质细胞中均呈显著上升(图62)，暗示体内条件下细胞衰老和SASP发生发展这一趋势。

本发明人通过组化染色，确认了预临床治疗条件下肿瘤组织中出现SPINK1的明显表达(图63)。为了验证体外实验结果，本发明人继而使用了Cetuximab或SPINK1 mAb与米托蒽醌联合使用。在仅接种有PC3细胞的小鼠这一组，尽管米托蒽醌单独使用可以显著降低肿瘤体积(40.5％)，Cetuximab治疗性抗体的同时给药并未进一步缩小肿块(图64)，暗示PC3肿瘤基本在EGF/EGFR信号轴非依赖性的微环境中进展。当基质细胞PSC27跟癌细胞PC3共同接种至小鼠体内时，肿瘤终端体积则上升为 149.0％，再次印证基质细胞的促瘤潜力。当PC3/PSC27小鼠经过米托蒽醌治疗之后，肿瘤体积降低了44.9％；经过Cetuximab或SPINK1mAb跟米托蒽醌的联合治疗，肿瘤体积则进一步下降了34.6％和46.3％(图64)；Cetuximab作为一种治疗性单抗其功效已被了解，而SPINK1 mAb比Cetuximab显著更理想的效果尤为出乎意料。

同时，本发明人使用了表达荧光素酶的PC3细胞系(PC3-luc)，发现小鼠体内条件下检测到的生物荧光信号在各组动物之间的相对强度，跟以上检测到的肿瘤终端体积基本对应，且排除了癌细胞体内发生异位器官转移这一可能(图65)。这一系列数据，表明相比于传统的化疗本身，SPINK1单抗介导的靶向治疗结合基因毒化疗，可以引起更加显著的肿瘤反应；特异性靶向SPINK1的单抗，甚至可以达到显著高于 Cetuximab这一RTK靶向制剂的效率，尽管后者在临床中用于治疗EGFR⁺癌症患者并多年来已经取得良好的效果。

为进一步解析SPINK1在体内条件下造成的癌细胞耐药的机制，本发明人解剖了用药7天之后的小鼠并获得其肿瘤，用于病理分析。尽管Cetuximab本身并不引起 DNA损伤反应(DDR)，PC3肿瘤却表现为明显的凋亡，可能跟Cetuximab与EGFR之间的高度亲和力有关，后者可以降低癌细胞生存率(图66)。然而，跟米托蒽醌结合之后的Cetuximab，并没有进一步提高癌细胞的凋亡率，暗示跟米托蒽醌协同时 Cetuximab的细胞毒有所限制。重要的在于，相比于Cetuximab，SPINK1 mAb产生了更加显著的治疗效果(图66)。组化染色结果表明，在SPINK1 mAb被使用的条件下，caspase 3呈现更为明显的切割。此外，ELISA检测结果表明，米托蒽醌治疗过程中可以造成小鼠血浆中SPINK1蛋白水平大幅上升，但在SPINK1 mAb同时给药时却可以被显著控制(图67)。

为进一步验证以上发现，本发明人进而使用了LNCaP，即另外一种经典前列腺上皮癌细胞系，跟PSC27同时接种于小鼠皮下形成肿瘤。不同于PC3，LNCaP本身表达雄激素受体AR并呈雄激素依赖性生长。为形成AR信号通路的原初状态，本发明人没有采取去势治疗，而是遵循了PC3小鼠预临床实验的一系列步骤。重要的是， LNCaP/PSC27小鼠肿瘤终端体积在化疗药物跟治疗性抗体结合之后出现大幅降低 (36.7％，cetuximb；50.7％，SPINK1 mAb)(图68)。本发明人的这些结果表明，从SASP 广谱因子中特异性去除SPINK1可以有效增强肿瘤对于化疗的敏感性，而这一过程并不依赖于雄激素或AR信号轴。

考虑到实体瘤本身的特性，本发明人继而将研究扩大到人类乳腺癌。经过在小鼠皮下接种MDA-MB-231癌细胞和HBF1203乳腺来源基质细胞，本发明人发现 MDA-MB-231/HBF1203肿瘤呈现出跟前列腺癌小鼠数据十分类似的趋势，在单用阿霉素的基础上，联用cetuximb进一步抑制肿瘤体积26.6％，联用SPINK1 mAb进一步抑制肿瘤体积39.5％)(图69)。因此，靶向SPINK1造成的耐药拮抗性数据表明，控制微环境中的SPINK1对于肿瘤治疗的效果是器官非依赖性的、在多种实体瘤中均适用的一种手段。

为确定这一治疗策略的安全性和可行性，本发明人接下来对实验小鼠进行了病理生理学评估。结果表明，无论单药还是多药治疗，小鼠的体重和其它多种指标，包括血浆水平的肌氨酸酐、尿素、ALP和ALT均保持不变(图70)。同时，在乳腺癌荷瘤小鼠中，本发明人验证了这一效果(图71)。更为重要的，在免疫完整型小鼠中 (C57BL/6)，本发明人除了观测到以上类似的数据，还发现动物的血细胞数量也未发生显著改变(图72)。这一系列预临床研究结果，表明靶向SPINK1的抗体治疗和传统化疗相结合，不只是可以造成更显著的抑制肿瘤效果，同时具有较高的用药安全性，不会引起明显的体内毒性。

实施例6、SPINK1是一个用于判断临床条件下患者体内SASP发生发展的新型生物标志物

随后本发明人要确定SPINK1是否可以在临床化疗之后的癌症外周血中，得以使用常规技术检测出来。为此，本发明人收集了两组前列腺癌患者的血浆样本，包括一组经历过化疗处理的和另一组未经任何治疗的患者。经过基于ELISA的蛋白检测，本发明人发现化疗之后时期患者血液中的SPINK1水平显著高于未经化疗的患者(图 73)。有趣的是，这一趋势跟SASP的一个典型因子IL-8十分相似。为确定这两个因子之间的关系，本发明人选取了化疗前后均有血液样本提供的一组患者，发现这些患者血浆中SPINK1同IL-8之间存在显著关联(r＝0.9443，P<0.0001)(图73)。在另外的一组乳腺癌临床患者和一组结直肠癌患者样本中，本发明人注意到均存在这一现象 (图74，75)。

为了获得进一步的认识，本发明人又进行了基于患者临床标本的纵向分析。在一组前列腺癌患者的原发病灶组织和外周血样本中，本发明人惊奇地注意到SPINK1和 IL-8这两个SASP相关因子可以在Western blot上清晰地显示出来，并且仅在化疗后患者的血浆样本中出现信号(图76)。此外，无论在实体组织还是血浆水平，这两个因子彼此之间均存在明显的相关性(图77)。为明晰SPINK1和IL-8作为检测体内SASP 状态的标志物，本发明人使用激光俘获显微切割技术分离了前列腺癌患者病灶组织中的基质细胞，并对其进行了转录本水平的分析。结果表明，包括MMP1，CXCL3，IL-1β， WNT16B，IL-6和GM-CSF在内的多个SASP相关因子均同SPINK1和IL-8在每一患者组织中呈现密切相关(图78)。相比之下，IL-2/3/5/12等同SASP无关的因子则不具有这一特征。本发明人的研究数据表明，SPINK1可以作为反映临床患者体内条件下 SASP发生发展的一个标志性因子，用于评估化疗后阶段癌症患者SASP的发展状态及其动态特征。此外，在血浆中的SPINK1蛋白水平同临床患者疗后阶段的生存期之间存在显著的负相关(图79)，暗示SPINK1作为患者肿瘤微环境经过不可修复的损伤之后释放出来的一个外泌因子，可以用作分析、判断传统化疗之后患者生存的一个独立指标(图80-82)，将SPINK1作为一种常规的、非侵袭性的液体活检标志物，可以为将来的临床医学提供一项精确、便捷和高效的新型诊断和预防技术(图83)。

生物材料保藏

本发明的杂交瘤细胞株SP2/0-01-SPINK1-SUN保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)，保藏号为CCTCC NO:C2018213，保藏日2018年10月10 日。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型在制备细胞衰老及肿瘤诊断或调控制剂中的应用

<130> 187310

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 79

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Lys Val Thr Gly Ile Phe Leu Leu Ser Ala Leu Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ala Asp Ser Leu Gly Arg Glu Ala Lys Cys

20 25 30

Tyr Asn Glu Leu Asn Gly Cys Thr Lys Ile Tyr Asp Pro Val Cys Gly

35 40 45

Thr Asp Gly Asn Thr Tyr Pro Asn Glu Cys Val Leu Cys Phe Glu Asn

50 55 60

Arg Lys Arg Gln Thr Ser Ile Leu Ile Gln Lys Ser Gly Pro Cys

65 70 75

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 干扰分子(small hairpin RNA)

<400> 2

gaagagaggc caaatgttat tcaagagata acatttggcc tctcttcttt 50

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 干扰分子(small hairpin RNA)

<400> 3

ccaagatata tgaccctgtt tcaagagaac agggtcatat atcttggttt tt 52

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

ctactgaaat cacagtgaag tatag 25

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

ctgttcattg catcctgcta t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

gaccagtctg gccaacatgg 20

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

cctcatgctg tatgttagat attcagac 28

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

tactttggga ggccgaggca g 21

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

ctcccgagta gctgggatta cagg 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

tttaagaacc tactatgtgt ttgg 24

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

gaaactcttg gacactttga g 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

aaatgcccaa cagaggtca 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

cacggctcta ggctctgaat 20

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

acagttgaaa actataggag ctacatt 27

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

tcgcttctgg gcaagtaca 19

Claims (22)

1.一种用于抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包括：特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体，以及化疗药物；所述特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体由杂交瘤细胞系CCTCC NO:C2018213分泌。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的化疗药物是基因毒药物。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的化疗药物包括：米托蒽醌，阿霉素，博莱霉素，沙铂，顺铂，卡铂，道诺霉素，诺加霉素，阿柔比星，表柔比星，多柔比星，阿糖胞苷，卡培他滨，吉西他滨，5-氟尿嘧啶。

4. 如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，其包括:

特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体和米托蒽醌，且两者质量比为1:0.005~1:2.0；或

特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体和阿霉素，且两者质量比为1:0.02~1:1.5；或

特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体和博来霉素，且两者质量比为1:0.02~1.5；或

特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体和选自沙铂、顺铂、卡铂的一种或多种，且抗体与后者的质量比为1:0.02~1.5。

5.权利要求1～4任一所述的药物组合物的用途，用于制备抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的药盒。

6. 如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物中，特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体通过抑制肿瘤微环境中基质细胞表达的丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子，从而降低肿瘤耐药性。

7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括：前列腺癌，乳腺癌，结直肠癌，胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、肺癌。

8. 特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体，其是由杂交瘤细胞系CCTCC NO: C2018213分泌。

9. 特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体在制备抗体药物中的应用，所述抗体药物与化疗药物联合应用，抑制肿瘤或消除肿瘤耐药性；或用于消除肿瘤细胞对化疗药物的耐药性；所述特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体由杂交瘤细胞系CCTCC NO: C2018213分泌。

10. 一种杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCC NO:C2018213。

11. 一种用于抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的药盒，其特征在于，所述药盒包括：特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体，或产生该抗体的细胞株；所述特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体由杂交瘤细胞系CCTCC NO: C2018213分泌。

12.如权利要求11所述的药盒，其特征在于，所述的药盒中还包括：化疗药物。

13.如权利要求12所述的药盒，其特征在于，所述化疗药物是基因毒药物。

14.如权利要求12所述的药盒，其特征在于，所述的化疗药物包括：米托蒽醌，阿霉素，博莱霉素，沙铂，顺铂，卡铂，道诺霉素，诺加霉素，阿柔比星，表柔比星，多柔比星，阿糖胞苷，卡培他滨，吉西他滨，5-氟尿嘧啶。

15. 丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子在制备用于肿瘤化疗预后评估的诊断试剂中的用途，其中，所述的丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子为肿瘤微环境中基质细胞产生的丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子；所述诊断试剂为特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体，由杂交瘤细胞系CCTCC NO: C2018213分泌。

16. 特异性识别丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的试剂在制备用于肿瘤化疗预后评估或病理分级的诊断试剂中的用途，其中，所述的丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子为肿瘤微环境中基质细胞产生的丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子；所述特异性抑制丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的抗体由杂交瘤细胞系CCTCC NO: C2018213分泌。

17.如权利要求15或16所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括：前列腺癌，乳腺癌，结直肠癌，胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、肺癌。

18. 一种筛选抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1) 用候选物质处理一表达体系，该体系表达NF-κB以及丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型因子，且该丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子编码基因上游存在NF-kB结合位点；和

(2) 检测所述体系中NF-kB对于丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的调控作用；若所述候选物质在统计学上抑制NF-κB对于丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的转录调控，则表明该候选物质是抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的潜在物质。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或

步骤(2)包括：检测测试组的体系中NF-κB对于丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的转录调控，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；

如果测试组中NF-κB对于丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子的转录调控显著被抑制，则表明该候选物质是抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的潜在物质。

20. 如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的NF-kB结合位点包括：丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子编码基因上游-3902，-1851，-1763，-362，+51位。

21. 一种筛选抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1) 用候选物质处理一表达体系，该体系表达EGFR介导的信号通路以及丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子；和

(2) 检测所述体系中丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子对于EGFR介导的信号通路的激活作用；若所述候选物质在统计学上抑制该激活作用，则表明该候选物质是抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的潜在物质。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或

步骤(2)包括：检测测试组的体系中丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子对于EGFR介导的信号通路的激活作用，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；

如果测试组中丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型因子对于EGFR介导的信号通路的激活作用显著被抑制，则表明该候选物质是抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的潜在物质。

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