CN101988110A - 一种Spink1基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种Spink1(serine peptidase inhibitor，Kazal type 1)基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种Spink1基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测前列腺癌疾病药物中的应用。本发明优点在于：本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

Description

一种Spink1基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

【技术领域】

本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种Spink1基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

【背景技术】

前列腺癌(prostatic carcinoma，prostatic cancer)是男性生殖系最常见的恶性肿瘤，发病随年龄而增长，其发病率有明显的地区差异，西欧和北美地区已高过肺癌，在男性是癌症死亡的第1位。我国以前发病率较低，但由于人口老龄化，近年来发病率有所增加，从1993年的每10万人的发病率1.7上升到2000年的10万分之4.55，到2005年上升到7.9。虽然这一发病率与其他肿瘤相比还相对较低，但对于城市男性来说，前列腺癌的发病率已在所有肿瘤中居第十位，应引起高度关注。前列腺癌的发病与年龄呈正相关：据国外统计，50岁以下男性很少发生，50～60岁发病占前列腺癌的1/3，70岁以上约占1/2，80岁以上约占3/4。前列腺癌的病因目前尚不完全清楚，大量临床研究提示，前列腺癌与性激素有关，特别是雄性激素与前列腺癌的发病存在非常明显的因果关系。雄性激素高的人群前列腺癌的发病，要比雄性激素低的人群高；而通过辠丸切除或各种药物减少雄性激素的合成，阻断雄性激素的作用可以达到治疗前列腺癌的目的。专家介绍说，前列腺癌与遗传有关，直系亲属中如果有前列腺癌的，其本人患前列腺癌的风险要比其他人高一倍。目前大家比较公认的是，前列腺癌与种族有关，前列腺癌在黑人中更为常见。也有研究提示，环境污染、淋球菌感染、前列腺增生、过量饮用咖啡和酒类等也与前列腺癌发生有关。此外，前列腺癌与饮食有关，长期高脂肪、高蛋白饮食与前列腺癌高度相关。专家介绍说，在2007年美国泌尿外科年会上，与会学者在讨论预防前列腺癌何种饮食最好时，大家得出的结论是中餐最好。传统中餐的特点是新鲜蔬菜多，肉食相对较少，还配有米饭和面条等主食，是一个合理的饮食结构。有专家认为，之所以欧美前列腺癌成为男性泌尿系统发病率最高的肿瘤，其中一个重要的原因就是与西餐的饮食结构有关。

由于前列腺癌在早期没有任何症状，患者往往容易错过最佳的治疗时机，导致诊疗难度加大。其实前列腺疾病是一种非常普通的男性疾病，发现得越早，治疗效果就越好。在大型义诊咨询活动中，北京大学第三医院为100位老年男性提供了免费的前列腺特异性抗原(PSA)检查。PSA是前列腺腺体和导管细胞分泌的一种蛋白质，正常时血中含量很少。一旦患有前列腺癌，PSA值将升高。PSA是目前公认有效的前列腺癌早期诊断方法，它可以敏感地确定前列腺癌的发生。由美国和瑞典科研人员进行的研究显示，男性在50岁之前进行PSA检测，可以提前25年预测前列腺癌的发生。与通常的直肠指诊、直肠超声检查比较，PSA具有测定结果客观、定量、无昼夜变化、不受检查者技术影响，以及测定方法更易为患者接受等优点。在多数情况下，PSA检测可以在前列腺发病初期就发现肿瘤，使更多的前列腺癌患者获得根治性手术的机会，提高肿瘤的治愈率。近来PSA的诊断准确率受到愈来愈多文献的探讨，以往人们一直用前列腺特异性抗原(PSA)作为前列腺癌(Pca)的标志物，但是PSA缺乏特异性，在良性前列腺增生(BPH)时PSA也会增高。尤其是PSA在4～10ng/L范围内，就很难区分BPH和Pca。因此，寻找更有临床意义的诊断指标非常迫切。

前列腺癌从癌前变到形成癌症，需要几年时间，如何做到早期检测、诊断、预后的检测及诊治后的复发、转移早期检出是降低发病率和死亡率的关键。

密西根州立大学的健康系统研究中心的病理学研究者发现在10％的前列腺癌症患者中有过度表达类型，聚焦于前列腺癌与基因融合的关系上，研究者在最近的研究中对1800例前列腺癌患者进行遗传性分析，寻找患者共同基因特征，他们发现一个叫Spink1(serine peptidase inhibitor，Kazal type 1)基因过度表达，或是未出现基因融合的前列腺癌中有大量基因拷贝.研究表明Spink1是亚型前列腺癌症的分子标记物，它是一种存在于体液、血液和组织中的分子物质，Spink1高表达病患比其它类型前列腺癌具有更大复发几率。Spink1基因序列号NM-003122mRNA，454bp cds：121……360bp。

随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆时)就能做到基因水平的早期预测诊断。本发明采用核酸原位杂交技术检测Spink1基因，对前列腺癌的早期基因水平的预测有临床价值。

本发明的原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种Spink1基因的原位杂交检测试剂盒的用途。

本发明的再一的目的是，提供一种Spink1基因的原位杂交检测试剂盒。

本发明的另一的目的是，提供一种Spink1基因的原位杂交检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种Spink1基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测前列腺癌疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

所述的非放射性标记物优选自地高辛。

所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种Spink1基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种Spink1基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤：

a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

所述的a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：

仪器操作：

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42℃)；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42℃)；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本发明优点在于：

1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。

2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

3、本发明能及早做到Spink1基因表达异常的信息采集，给临床前列腺癌病患一个真正的预后早期诊断。这样才有可能实施前列腺癌的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治前列腺癌恶疾。

【附图说明】

图1是本发明实施例中癌症病人Spink1过量表达图片。

图2是本发明实施例中正常人Spink1表达图片。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明具体实施方式作详细说明。

实施例1

一种Spink1基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下：

消化液        100μl/管  1管/盒    无色透明液体

保护液        100μl/管  1管/盒    无色透明液体

预杂交液      1300μl/管 2管/盒    无色透明液体

正义杂交液    10μl/管   1管/盒    无色透明液体

反义杂交液    10μl/管   1管/盒    无色透明液体

封闭液        1000μl/管 1管/盒    无色透明液体

碱性磷酸酶抗体1μl/管    1管/盒    无色透明液体

显色剂A       175μl/管  1管/盒    黄色液体

显色剂B       320μl/管  1管/盒    无色透明液体

缓冲液I 10x   90ml/瓶    1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液II 10x  80ml/瓶    1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液III 10x 20m/瓶     3瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液IV 10x  90ml/瓶    1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

固定液        90ml/瓶    1瓶/盒    无色透明液体

阳性对照标本  6片/盒

上述试剂成分说明：(所有试剂购自SIGMA)

1、消化液：20mg/ml蛋白酶K，100mg蛋白酶K，加DEPC-H₂O 5ml；

2、保护液：0.2g的glycine加入1ml的1×缓冲液I；

3、预杂交液：1×缓冲液II 7.5ml

50×D 3ml

10mg/ml yest t-RNA 750ul

11mg/ml SALMON TESTES DNA 682ul

0.04M EDTA 3ml

50％formamide 15ml

4、封闭液：0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入1ml 1×缓冲液III；

5、10x缓冲液I：(PH7.1-7.4)

NaCl 80g

Na₂HPO₄.12H₂O  360g

KCl    2g

KH₂PO₄ 2g

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

6、10x缓冲液II：(PH7.0)

NaCl  175.3g

柠檬酸钠88.2g

HCl几滴

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

7、缓冲液III：(PH7.9)

Tris    121.1g

NaCl  87.66g

HCl  60ml左右

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

8、缓冲液IV：

1M Tris-HCl(PH9.5)：Tirs 121.1g加HCl 3ml左右，加水900ml，调PH至9.5，加水至1l，并高压灭菌；

1M NaCl：NaCl 58.44加水至1l，并高压灭菌；

0.5M MgCl₂：101.65g MgCl₂.6H₂O加水至1l，并高压灭菌；

9、固定液：多聚甲醛40g加1×缓冲液I至1l，稍加热(约50-60度)搅拌至溶解；

10、显色剂A：NBT 1g加70％DMF11.44ml；

11、显色剂B：BCIP 1g加100％DMF30ml。

本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

实施例2

一种Spink1基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用

一、标本处理

1、用10ml的离心管，装4.5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋巴细胞分离液(血∶淋巴细胞分离液＝1∶1.5)的离心管中，2000r/min离心10min；

2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

3、弃上清.沉淀加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；

5、用40ml 4％固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1×缓冲液I洗5min。每缸可以放16片；

6、标本可保存在-20℃，或继续做实验。

二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度

1、将10×缓冲液I用三蒸水按1∶10稀释成1×缓冲液I；

2、将20×缓冲液II用三蒸水按1∶10稀释成2×缓冲液II；

按1∶100稀释成0.2×缓冲液II；按1∶200稀释成0.1×缓冲液II；

3、将10×缓冲液III用三蒸水按1∶10稀释成1×缓冲液III；

4、10×缓冲液IV用三蒸水按1∶10稀释成×缓冲液IV(取1#，2#，3#各10ml，加水至100ml既可)。

三、实验步骤：

1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次实验做一对阳性对照)；

2、在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1×缓冲液199.9ml，即为使用浓度)20ml。37℃水浴预热10分钟。放进16张玻片，37℃处理12min，再用1×缓冲液I洗5min；

3、用0.2％的保护液(保护液1ml加1×缓冲液I99ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；

4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70％，90％，95％的乙醇各洗2min，自然干燥；

6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张加反义杂交液20ul/片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内

在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液II洗两次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液II洗一次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液II洗两次，每次15min；

8、用1×缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；

9、将玻片放入保湿盒内，加0.5％l封闭液(1ml封闭液加5ml 1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min；

10、取出玻片，用1×缓冲液III洗30s，自然干燥；

11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml 1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min；

12、取出玻片，用1×缓冲液III洗3次，每次15min；

13、1×缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73.3ul，显色剂B157.5ul加到30ml 1×缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上；

14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10％的1×缓冲液I混匀)封片镜检。

四、结果判断

在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。

阳性对照标本加反义杂交液的应该80％以上染上紫色。

所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。

地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的Spink1基因表达量，用来确定前列腺癌是否发生。临床研究表明，Spink1基因是前列腺癌的特异基因，因为Spink1基因在正常人中不表达，唯独在前列腺癌边细胞中表达，说明前列腺癌已经发生，用来确定前列腺癌是否发生，或是正常。从而获得前列腺癌的早期诊断信息。

本发明实施例采样为：前列腺癌病人5名，正常对照组5名。抽所有待检人的外周血3-5毫升(分离白细胞)做原位杂交。结果表示，所有前列腺癌患者Spink1基因有过度表达，细胞染色；正常对照组Spink1基因不表达，细胞无染色。具体结果请见图1和图2。

实施例3

用Spink1基因试剂盒检测前列腺癌疾病与用ACP1基因试剂盒检测前列腺癌疾病之间平行实验。

为了科学评价上述基因各自在前列腺癌疾病的特异性、敏感性、准确性。我们用平行试验的方法，同时检测上述基因的mRNA，检测技术采用核酸原位杂交技术，用同一例前列腺癌疾病患者的外周血，同时检测Spink1基因和ACP1(ACP1(酸性磷酸酶1)，NR_024080)基因的mRNA(进行核酸原位杂交、免疫组化染色、镜下记数、结果报告等均采用实施例1和实施例2的原位杂交技术的相同方法和步骤及试剂)。发现Spink1基因在前列腺癌疾病病人中表达量比ACP1基因在同一疾病病人的表达量要高。结果表明，Spink1基因对前列腺癌疾病诊断的特异性、敏感性、准确性比ACP1基因更好，原位杂交基因表达图显示，Spink1基因的表达量是70％，ACP1基因的表达量是50％。本发明的试剂盒作于前列腺癌疾病诊断的指标有非常重要的临床意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>芮屈生物技术(上海)有限公司

<120>一种Spink1基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

<130>/

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>454

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

agcccagtag gtggggcctt gctgccatct gccatatgac ccttccagtc ccaggcttct  60

gaagagacgt ggtaagtgcg gtgcagtttt caactgacct ctggacgcag aacttcagcc 120

atgaaggtaa caggcatctt tcttctcagt gccttggccc tgttgagtct atctggtaac 180

actggagctg actccctggg aagagaggcc aaatgttaca atgaacttaa tggatgcacc 240

aagatatatg accctgtctg tgggactgat ggaaatactt atcccaatga atgcgtgtta 300

tgttttgaaa atcggaaacg ccagacttct atcctcattc aaaaatctgg gccttgctga 360

gaaccaaggt tttgaaatcc catcaggtca ccgcgaggcc tgactggcct tattgttgaa 420

taaatgtatc  tgaatatccc caaaaaaaaa aaaa                            454

Claims (10)

1.一种Spink1基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测前列腺癌疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物优选自地高辛。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

8.一种Spink1基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

9.一种Spink1基因的原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a、将权利要求8所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

Images