CN101328499B - 一种RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

一种RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种RhoGDI2(Rho GDP dissociation inhibitor beta)基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用。所述的试剂盒包括杂交探针、标记物、杂交液、增效剂，其中所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。一种RhoGDI2基因的原位杂交检测方法包括以下步骤：a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。所述的试剂盒在制备检测癌症早期转移、复发疾病药物中的应用。本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。同时，本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

Description

一种RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用。
背景技术
根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数170万，死亡人数近160万，患者600多万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400多万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。
2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家单位做了一个年度报告，“认为人类在抗癌大战中是失败”，也就是说癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是：1、肿瘤细胞异质性；2、肿瘤细胞耐药性；3、抗癌药物设计思路不完善等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。本发明人在研究中发现，导致癌症死亡率不降的另二个重要原因是：1、不能做到真正的早期诊断；2、转移的病理机制不清楚。依照传统的医学影像及和其它生化(如蛋白标记物)指标来诊断癌症，认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断(更小些有时无症状体征)，这一临床概念值得认真讨论。影像医学的2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度，1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是一年或两年、甚至三年以上，很难证实的是在这个过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶。临床上已证实：一旦形成肿块的同时，其他癌细胞通过不同途径迁移到其他部位克隆生长；一旦切除原发灶后，其他器官复发灶或多发癌块灶先后形成或转移。因此，在临床上以2公分以下的肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，这时已经是晚期了，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。
随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆)时或癌细胞突破血管壁早期转移时，就能做到早期预测诊断。
弗吉尼亚大学的泌尿学与分子生理学教授Dan Theodorescu博士领导的科学小组研究表明，RhoGDI2基因与膀胱癌细胞转移有关系，当RhoGDI2基因在癌细胞中有活性时，细胞就产生一种能够阻止癌细胞浸入到其他器官的蛋白。
目前对RhoGDI2基因的研究都采用高通量基因芯片技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，特别是个性化的应用在我国现阶段条件尚不成熟。
原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子)，探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。
根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA杂交。但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。
中国专利文献CN1556410公开了“一种鱼类病毒的检测试剂盒及其检测方法”。中国专利文献CN1680597公开了“一种用于定量检测丙型肝炎病毒(HCV)的荧光定量PCR试剂盒”。中国专利文献CN2918435，公开了“一种检测肥胖相关基因SNP的寡核苷酸芯片及试剂盒”。但是，关于RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测技术未见报道。
发明内容
本发明的目的在于：
(1)、提供一种RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒；
(2)、提供一种RhoGDI2基因的原位杂交检测方法；
(3)、提供一种RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒的应用。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的：本发明人在对大量样本：广泛性腺癌(肝、肺、肾、胃、子宫、卵巢、乳房、直肠等血液细胞)检测中观察到，癌症病人伴有转移者，RhoGDI2基因表达量降低或大部分是零表达，该指标有重要的临床价值。我们检测了近800例各种类型癌症患者(大部分已转移)血液标本，近800例正常对照组人群，经统计学分析，癌症患者体内RhoGDI2基因表达量为8％左右，正常人群表达量平均为50％，病例组中有600多例该基因是零表达。同时检测两个家族性癌症好发家属的直系亲属，该基因的表达量比正常人表达量都低。本发明提供的肿瘤转移抑制基因RhoGDI2是人类同源基因，位于染色体12P12.3的一个Rho家族基因，它们与GTP和GDP-1功能和细胞内移动有关。RhoGDI2在正常人体组织或器官中广泛表达，但在人类各种类型肿瘤及肿瘤转移患者中表达明显下降，甚至缺失。这是它与其它肿瘤转移抑制基因不同之处，具有广谱的癌症转移抑制作用。本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以RhoGDI2基因为检测对象，合成探针是RhoGDI2基因的DNA或RNA序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供RhoGDI2基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，癌症病人RhoGDI2基因表达低或不表达，即不显色，正常人有50％的表达量，显色深。本发明的核酸杂交基本过程包括下列几个步骤。(1)制备样品：首先需要从待检测组织样品提取RNA。RNA样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印并交联固定。(2)制备探针：探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸片段。在核酸杂交实验中，探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。这样，通过检疫与恩印膜上的核酸分子结合上的探针分子，既可知道被检测的核酸片段在膜上的位置，也就是在电泳凝胶上的位置，也就知道了它的分子大小。本试剂盒中探针用地高辛标记。(3)杂交：首先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，所以杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子即可。(4)检测：用相应的免疫组织化学的方法进行检测。具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：
1)、将待测标本放入反应槽中；
2)、仪器自动弃去液体，自动加消化液；
3)、仪器自动弃去液体，自动后固定；
4)、仪器自动弃去液体，自动预杂交(42℃)；
5)、仪器自动弃去液体，自动清洗；
6)、仪器自动弃去液体，自动杂交(42℃)；
7)、仪器自动弃去液体，自动清洗；
8)、仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；
9)、仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；
10)、取出封片镜检。
本发明的技术方案如下：
一种RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、杂交液、增效剂，其中，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。
所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P中的一种。
所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。
所述的非放射性标记物优选自地高辛。
所述的杂交液增效剂是碱性磷酸酶抗体。
一种RhoGDI2基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤：
a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；
b、检测a步骤得到的杂交复合体。
a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液单核细胞标本。
一种RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症早期转移、复发疾病药物中的应用。
所述的癌症是肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫癌或胰腺癌。
本发明所公开一种RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用，其优点表现在：本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。同时，本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。克服了目前对RhoGDI2基因的研究都采用高通量基因芯片方法，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用的缺陷。本发明的临床意义是更早期跟踪检测癌症发生和病理演变过程中癌细胞发生转移的情况。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上检测RhoGDI2基因异常表达，在影像医学检查未发现占位性癌病灶复发之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿瘤之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床癌症病患一个真正的早期诊断以及治疗后转移复发及早预测。这样才有可能实施癌症的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治癌症恶疾。
附图说明
图1：正常人血液RhoGDI2原位杂交结果。
图2：癌症病人血液RhoGDI2原位杂交结果。
图3：正常人及各年龄段的RhoGDI2基因表达量方块图(统计学分析)。
图4：正常人及各年龄段的RhoGDI2基因表达量曲线图(统计学分析)。
图5：各类癌症患者及各年龄段的RhoGDI2基因表达量方块图(统计学分析)。
图6：各类癌症患者及各年龄段的RhoGDI2基因表达量曲线图(统计学分析)。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应该理解，下面的实施例用于说明而非限定本发明内容，任何形式上的改变或变通将落入本发明的保护范围。
实施例1
一种RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒
一种RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、杂交液、增效剂，其中，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下：
消化液     100μl/管    1管/盒    无色透明液体
保护液     100μl/管    1管/盒    无色透明液体
预杂交液   1300μl/管   2管/盒    无色透明液体
正义杂交液 10μl/管     1管/盒    无色透明液体
反义杂交液 10μl/管     1管/盒    无色透明液体
封闭液            1000μl/管    1管/盒    无色透明液体
碱性磷酸酶抗体    1μl/管       1管/盒    无色透明液体
显色剂A           175μl/管     1管/盒    黄色液体
显色剂B           320μl/管     1管/盒    无色透明液体
缓冲液I 10x       90ml/瓶       1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体
缓冲液II 10x      80ml/瓶       1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体
缓冲液III 10x     20ml/瓶       3瓶/盒    浅黄色或无色透明液体
缓冲液IV 10x      90ml/瓶       1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体
固定液            90ml/瓶       1瓶/盒    无色透明液体
阳性对照标本      6片/盒
上述试剂成分说明：(所有试剂购自SIGMA)
1、消化液：20mg/ml蛋白酶K，100mg蛋白酶K，加DEPC-H2O 5ml；
2、保护液：0.2g的glycine加入1ml的1×缓冲液I；
3、预杂交液：1×缓冲液II 7.5ml
50×D 3ml
10mg/ml yest t-RNA 750ul
11mg/ml SALMON TESTES DNA 682ul
0.04M EDTA 3ml
50％ formamide 15ml；
4、封闭液：0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入1ml 1×缓冲液III；
5、10x缓冲液I：(PH7.1-7.4)
NaCl     80g
Na2HPO4.12H2O   360g
KCl      2g
KH2PO4   2g
加三蒸水至11，并高压灭菌；
6、10x缓冲液II：(PH7.0)
NaCl  175.3g
柠檬酸钠  88.2g
HCl 几滴
加三蒸水至11，并高压灭菌；
7、缓冲液III：(PH7.9)
Tris      121.1g
NaCl      87.66g
HCl       60ml左右
加三蒸水至11，并高压灭菌；
8、缓冲液IV：
1M Tris-HCl(PH9.5)：Tirs 121.1g加HCl 3ml左右，加水900ml，调PH至9.5，加水至11，并高压灭菌；
1M NaCl：NaCl 58.44加水至11，并高压灭菌；
0.5M MgCl2：101.65g MgC12.6H2O加水至11，并高压灭菌；
9、固定液：多聚甲醛40g加1×缓冲液I至11，稍加热(约50-60度)搅拌至溶解；
10、显色剂A：NBT 1g加70％DMF11.44ml；
11、显色剂B：BCIP 1g加100％DMF30ml。
本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。
实施例2
一种RhoGDI2基因的原位杂交检测方法
一、标本处理：
1、用10ml的离心管，装4.5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋巴细胞分离液(血∶淋巴细胞分离液＝1∶1.5)的离心管中，2000r/min离心10min；
2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；
3、弃上清.沉淀加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；
4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；
5、用40ml 4％固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1×缓冲液I洗5min。每缸可以放16片；
6、标本可保存在-20℃，或继续做实验。
二、将实施例1制得的试剂盒中试剂配制成使用浓度
1、将10×缓冲液I用三蒸水按1∶10稀释成1×缓冲液I；
2、将20×缓冲液II用三蒸水按1∶10稀释成2×缓冲液II；按1∶100稀释成0.2×缓冲液II；按1∶200稀释成0.1×缓冲液II；
3、将10×缓冲液III用三蒸水按1∶10稀释成1×缓冲液III；
4、10×缓冲液IV用三蒸水按1∶10稀释成×缓冲液IV(取1#，2#，3#各10ml，加水至100ml既可)。
三、实验步骤
1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次实验做一对阳性对照)；
2、在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1×缓冲液199.9ml，即为使用浓度)20ml。37℃水浴预热10分钟。放进16张玻片，37℃处理12min，再用1×缓冲液I洗5min；
3、用0.2％的保护液(保护液1ml加1×缓冲液I 99ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；
4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；
5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70％，90％，95％的乙醇各洗2min，自然干燥；
6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张加反义杂交液20ul/片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；
7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，
在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液II洗两次，每次15min，
在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液II洗一次，每次15min，
在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液II洗两次，每次15min，
8、用1×缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；
9、将玻片放入保湿盒内，加0.5％1封闭液(1ml封闭液加5ml1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min；
10、取出玻片，用1×缓冲液III洗30s，自然干燥；
11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min；
12、取出玻片，用1×缓冲液III洗3次，每次15min；
13、1×缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73.3ul，显色剂B157.5ul加到30ml 1×缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上；
14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10％的1×缓冲液I混匀)封片镜检。
四、结果判断
在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。阳性对照标本加反义杂交液的应该80％以上染上紫色。所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的RhoGDI2基因表达量，用来确定癌症是否发生和/或转移。临床研究表明，RhoGDI2基因并具有广谱性，因为RhoGDI2基因在正常人中高表达(正常人血液RhoGDI2原位杂交结果见图1，正常人及各年龄段的RhoGDI2基因表达量见图3，图4)。如果RhoGDI2基因表达低或零表达(癌症病人血液RhoGDI2原位杂交结果见图2，各类癌症患者及各年龄段的RhoGDI2基因表达量见图5，图6)，说明癌症已经复发、转移、扩散，从而获得癌症的诊断信息。当检测到RhoGDI2基因的表达低于正常对照时，则可预测受试者为癌症早期转移或癌症转移易感者，这些癌症包括肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫癌、胰腺癌。
SEQUENCE LISTING
<110>芮屈生物技术(上海)有限公司
<120>一种RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用
<130>/
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1216
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
ctcattgact tccttcctgt tctaactgcc agtactcaga agtcagagtt gagagacaga    60
ggcaccccgg acagagacgt gaagcactga ataaatagat cagaatgact gaaaaagccc   120
cagagccaca tgtggaggag gatgatgatg atgagctgga cagcaagctc aattataagc   180
ctccaccaca gaagtccctg aaagagctgc aggaaatgga caaagatgat gagagtctaa   240
ttaagtacaa gaaaacgctg ctgggagatg gtcctgtggt gacagatccg aaagccccca   300
atgtcgttgt cacccggctc accctggttt gtgagagtgc cccgggacca atcaccatgg   360
accttactgg agatctggaa gccctcaaaa aggaaaccat tgtgttaaag gaaggttctg   420
aatatagagt caaaattcac ttcaaagtga acagggatat tgtgtcaggc ctgaaatacg   480
ttcagcacac ctacaggact ggggtgaaag tggataaagc aacatttatg gttggcagct   540
atggacctcg gcctgaggag tatgagttcc tcactccagt tgaggaggct cccaagggca   600
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acctcagctg ggagtggaac ctgtcgatta agaaggagtg gacagaatga atgcatccac   720
ccctttcccc acccttgcca cctggaagaa ttctctcagg cgtgttcagc accctgtccc   780
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ttttcccacc ctgtcactca acgtggtccc tagaacaaga ggcttaaaac cgggctttca   900
cccaacctgc tccctctgat cctccatcag ggccagatct tccacgtctc catctcagta   960
cacaatcatt taatatttcc ctgtcttacc cctattcaag caactagagg ccagaaaatg  1020
ggcaaattat cactaacagg tctttgactc aggttccagt agttcattct aatgcctaga    1080
ttcttttgtg gttgttgctg gcccaatgag tccctagtca catcccctgc cagagggagt    1140
tcttcttttg tgagagacac tgtaaacgac acaagagaac aagaataaaa caataactgt    1200
gtgtgttctg gctgag                                                    1216

Claims (1)

1.一种RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、杂交液、增效剂，其特征在于：所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示；所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物；所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P中的一种；所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种；所述的杂交液增效剂是碱性磷酸酶抗体。
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