CN101993944A - 一种aldh1基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种ALDH1(乙醛脱氢酶1)基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种ALDH1基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测乳腺癌或乳腺癌预后疾病药物中的应用。本发明优点在于：本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点；本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

Description

一种ALDH1基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

【技术领域】

本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种ALDH1基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用。

【背景技术】

根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数160万，死亡人数近160万，患者600万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。乳腺癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤，近年来发病率稳定上升且趋年轻化，发病率在女性肿瘤中居第三位。据世界范围统计，全球每年约有120多万人患乳腺癌，每年死于乳癌人数20万，工业发达国家乳腺癌进一步增加，根据美国癌症协会(ACS)的报告，美国每年超过20万人接受乳癌治疗，其中约四万人被夺去生命。从2006中国乳腺癌内分泌治疗高峰论坛上了解到，中国是乳腺癌发病率增长最快的国家之一，我国每年有约20万名妇女患乳腺癌，中国乳腺癌发病率每年约增长3％；在京、津、沪等大中城市，乳腺癌已跃居女性恶性肿瘤之首。研究显示，乳腺癌发病与家族遗传有密切关系，特别是犹太人妇女有一种特殊的BRCA1基因变异与家族性乳癌密切相关，家族遗传导致的乳癌大约占所有病例的5％-10，有乳癌家族史同时有BRCA1基因变异的妇女，她们一生中有85％机率患乳癌，而且有50％的机率患妊巢癌。同时发现，BRCA1基因无变异的大部分妇女患乳癌，而各国此类乳癌的发病率都在升高。近来的研究发现一种叫ALDH1(乙醛脱氢酶1)，与乳癌的预后密切相关，它是乳癌复发的根源，可用于乳癌的预后的观察指标。ALDH1基因标记总体上具有高度一致，活化水平可能预测乳癌的存活率，并且是有前景的预后工具。美国密歇根州州立大学综合癌症中心的Ginestier等人，发现了一个检测乳腺癌干细胞的新标志物——乙醛脱氢酶1(ALDH1)。利用此标志物，研究者首次在乳腺癌实体组织中发现了干细胞，(Cell Stem Cell 2007，1：555)。干细胞在肿瘤细胞中的比例一般不到5％，但却可能是癌症演进的关键细胞。研究者采用一种称为ALDEFLUOR的试剂，检测细胞内的ALDH1活性。ALDH1活性高的细胞能被荧光标记，从而可以被检测和分选出来。结果表明，在乳腺组织的正常细胞以及癌细胞中，ALDEFLUOR阳性的细胞具有类似于干细胞的特性，而阴性细胞则不然。另外，对577份患者乳腺癌组织标本的研究显示，19％～30％的肿瘤表达ALDH1。表达ALDH1阳性肿瘤患者的预后最差，其总体生存率较低，发生转移的可能性是ALDH1阴性肿瘤患者的1.76倍。同时，研究者还对分选的细胞能否形成乳腺肿瘤进行了实验。结果显示，仅ALDH1阳性细胞可形成肿瘤，即使只用500个阳性细胞也会形成肿瘤；但5万个ALDH1阴性细胞也不会形成肿瘤。该研究发现一种重要的可应用于检测恶性乳腺癌干细胞的新标志物，用这种简单的标志物可评估患者预后。本发明采用核酸原位杂交技术检测ALDH1基因，观察细胞内ALDH1基因的表达程度，来分析癌症干细胞存在和存在的量，进一步研究表明ALDH1基因标记总体上具有高度一致，活化水平和高表达可能预测乳癌的预后，并且是有前景的预后工具。

乳腺癌从癌前变到形成癌症，需要几年时间，如何做到早期检测、诊断、预后的检测及诊治后的复发、转移早期检出是降低发病率和死亡率的关键。常规的影像医学检查只能诊断是否有占位的癌肿块，也就是说发现已属于癌症晚期，往往病人的生存期不长。如何在更早期发现(癌变前期)它有非常重要的临床意义，也就是说如何从单细胞水平和基因水平做到早期诊断和转移复发的早期检测是我们要实现治愈乳癌的关键。现在临床上有一个错误概念，依照传统的影像医学和结合其它生化检测指标，判定占位性的癌症在二公分以下是属于早期癌症，这一概念值得认真讨论。医学影像学的2CM以下的肿块属于早期癌症这一界限科学性是不够严谨的，从细胞学的角度，1CM肿块约有1亿个肿瘤细胞，2CM的肿块其三维空间的细胞叠加数目，远不止2亿个肿瘤细胞。由于目前临床上的诊断手段比较缺乏，通过X线、B超、CT、核磁共振等的手段能分辨在1-2CM以下的肿瘤已经不错。而事实上是，从单克隆癌细胞到2CM以下的肿块可能是相当长的病理演变过程，可能是一年或两年及三年以上，从癌变前期到癌细胞形成及生成2CM肿块要经过相当长的病理演变过程，在这个病理演变过程中，难以证实早先形成癌细胞克隆肿块是唯一的癌块，可能在最早形成克隆肿块的同时，癌细胞通过不同的途径迁移到其它部位克隆生长。这在临床上已得到证实，一旦切除肿块后，其他地方会出现复发或其它多发的肿块先后形成或转移。因此，在临床上以2CM以下大小的肿块来界分早期与否，不够严谨，事实上这时的癌变已属于晚期，这导致癌症死亡率不降的真正理由。美国所有的主要健康组织都认为对癌症的早期检测是挽救生命，降低晚期治疗费用的关键。

随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆时)就能做到早期预测诊断。将ALDH1基因的检测技术用来筛选和预后检测临床妇科乳腺癌的资料未见报道。本发明采用核酸原位杂交技术对乳腺癌细胞进行检测，结果表明ALDH1基因表达与其它研究报道一致。该基因可以乳腺癌预后病理演变的重要标志物。

鉴于目前有些生化指标(癌胚蛋白，糖蛋白、癌症标志物)敏感性不够高，例如，AFP(甲胎蛋白)在癌块直径2公分以上或2公分以下的肝癌阳性率分别是50％和20％。目前的一些生化诊断指标只是对晚期癌症检测比较灵敏，如何做到影像医学手段无法判定癌症，标志物检测不够灵敏时，就能发现癌症已发生及已转移，或者在治疗后能及早地预测转移复发状况，特别是作为临床妇科乳腺癌普查筛选的硬指标，及早发现乳腺癌，降低乳腺癌的发病率和死亡率，这就是本发明初衷。

本发明的原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

中国专利文献CN1556221公开了“IC53基因及其相关产物诊断和治疗结肠癌的用途及一种诊断结肠癌的试剂盒”。中国专利文献CN1769485公开了“栉孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法及其试剂盒”。但是，关于ALDH1基因的原位杂交检测试剂盒及其检测技术未见报道。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种ALDH1基因的原位杂交检测试剂盒的用途。

本发明的再一的目的是，提供一种ALDH1基因的原位杂交检测试剂盒。

本发明的另一的目的是，提供一种ALDH1基因的原位杂交检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种ALDH1基因的原位杂交检测试剂盒，在制备检测乳腺癌或乳腺癌预后疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。ALDH1基因的核苷酸序列长度是2116bp，CDS是54..1559，位于染色体9q21.13.1″位点上。

所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

所述的非放射性标记物优选自地高辛。

所述，还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种ALDH1基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种ALDH1基因原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤：

a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

作为可选的技术方案，所述a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以ALDH1基因为检测对象，合成探针是ALDH1基因的DNA或RNA序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或乳腺组织细胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供ALDH1基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，正常乳腺组织ALDH1基因低表达，即浅显色或不显色，在乳腺癌病人高表达，深显色，临床意义非常重大。

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：

仪器操作：

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42℃)；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42℃)；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本发明优点在于：

1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。

2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

3、本发明的临床意义是更早期跟踪检测乳腺癌发生动态过程，以及用于乳腺癌预防医学的检测和筛选工具。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上检测ALDH1异常表达，在影像医学检查及乳腺检查未发现占位性乳腺癌病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿块之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床乳腺癌病患一个真正的预后早期诊断。这样才有可能实施乳腺癌的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根乳腺癌恶疾。

【附图说明】

图1是本发明实施例中乳腺癌症病人ALDH1基因表达图片。

图2是正常乳腺ALDH1基因表达图片。

【具体实施方式】

下面结合图对本发明提供的一种ALDH1基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用的具体实施方式做详细说明。

实施例1

一种ALDH1基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下：

消化液          100μl/管  1管/盒    无色透明液体

保护液          100μl/管  1管/盒    无色透明液体

预杂交液        1300μl/管 2管/盒    无色透明液体

正义杂交液      10μl/管   1管/盒    无色透明液体

反义杂交液      10μl/管   1管/盒    无色透明液体

封闭液          1000μl/管 1管/盒    无色透明液体

碱性磷酸酶抗体  1μl/管    1管/盒    无色透明液体

显色剂A         175μl/管  1管/盒    黄色液体

显色剂B         320μl/管  1管/盒    无色透明液体

缓冲液I   10x   90ml/瓶    1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液II  10x   80ml/瓶    1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液III 10x   20m/瓶     3瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液IV  10x   90ml/瓶    1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

固定液          90ml/瓶    1瓶/盒    无色透明液体

阳性对照标本    6片/盒

上述试剂成分说明：(所有试剂购自SIGMA)

1、消化液：20mg/ml蛋白酶K，100mg蛋白酶K，加DEPC-H₂O 5ml；

2、保护液：0.2g的glycine加入1ml的1×缓冲液I；

3、预杂交液：1×缓冲液II 7.5ml

50×D 3ml

10mg/ml yest t-RNA 750ul

11mg/ml SALMON TESTES DNA 682ul

0.04M EDTA 3ml

50％formamide 15ml

4、封闭液：0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入1ml 1×缓冲液III；

5、10x缓冲液I：(PH7.1-7.4)

NaCl 80g

Na₂HPO₄.12H₂O  360g

KCl  2g

KH₂PO₄2g

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

6、10x缓冲液II：(PH7.0)

NaCl  175.3g

柠檬酸钠88.2g

HCl  几滴

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

7、缓冲液III：(PH7.9)

Tris   121.1g

NaCl   87.66g

HCl    60ml左右

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

8、缓冲液IV：

1M Tris-HCl(PH9.5)：Tirs 121.1g加HCl 3ml左右，加水900ml，调PH至9.5，加水至1l，并高压灭菌；

1M NaCl：NaCl 58.44加水至1l，并高压灭菌；

0.5M MgCl₂：101.65g MgCl₂.6H₂O加水至1l，并高压灭菌；

9、固定液：多聚甲醛40g加1×缓冲液I至1l，稍加热(约50-60度)搅拌至溶解；

10、显色剂A：NBT 1g加70％DMF11.44ml；

11、显色剂B：BCIP 1g加100％DMF30ml。

本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

实施例2

一种ALDH1基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用

一、标本处理

1、用10ml的离心管，装4.5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋巴细胞分离液(血∶淋巴细胞分离液＝1∶1.5)的离心管中，2000r/min离心10min；

2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

3、弃上清.沉淀加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；

5、用40ml 4％固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1×缓冲液I洗5min。每缸可以放16片；

6、标本可保存在-20℃，或继续做实验。

二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度

1、将10×缓冲液I用三蒸水按1∶10稀释成1×缓冲液I；

2、将20×缓冲液II用三蒸水按1∶10稀释成2×缓冲液II；

按1∶100稀释成0.2×缓冲液II；按1∶200稀释成0.1×缓冲液II；

3、将10×缓冲液III用三蒸水按1∶10稀释成1×缓冲液III；

4、10×缓冲液IV用三蒸水按1∶10稀释成×缓冲液IV(取1#，2#，3#各10ml，加水至100ml既可)。

三、实验步骤：

1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次实验做一对阳性对照)；

2、在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1×缓冲液199.9ml，即为使用浓度)20ml。37℃水浴预热10分钟。放进16张玻片，37℃处理12min，再用1×缓冲液I洗5min；

3、用0.2％的保护液(保护液1ml加1×缓冲液I99ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；

4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70％，90％，95％的乙醇各洗2min，自然干燥；

6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张加反义杂交液20ul/片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内

在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液II洗两次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液II洗一次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液II洗两次，每次15min；

8、用1×缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；

9、将玻片放入保湿盒内，加0.5％l封闭液(1ml封闭液加5ml1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min；

10、取出玻片，用1×缓冲液III洗30s，自然干燥；

11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml 1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min；

12、取出玻片，用1×缓冲液III洗3次，每次15mi n；

13、1×缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73.3ul，显色剂B157.5ul加到30ml 1×缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上；

14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10％的1×缓冲液I混匀)封片镜检。

四、结果判断

在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。

阳性对照标本加反义杂交液的应该80％以上染上紫色。

所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。

地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的ALDH1基因表达量，用来确定乳腺癌的预后。临床研究表明，ALDH1基因在乳腺癌中高表达，因为ALDH1基因在正常人低表达，ALDH1基因的高表达说明乳癌预后差，ALDH1基因的表达程度与乳癌的预后有关，属正相关，表达越高预后越差。从而获得乳腺癌的诊断信息。具体结果请见图1和图2。

实施例3

用ALDH1基因试剂盒检测乳腺癌疾病与用ERK基因试剂盒检测乳腺癌疾病之间平行实验。

为了科学评价上述基因各自在乳腺癌疾病的特异性、敏感性、准确性。我们用平行试验的方法，同时检测上述基因的mRNA，检测技术采用核酸原位杂交技术，用同一例乳腺癌疾病患者的外周血，同时检测ALDH1基因和ERK基因的mRNA(进行核酸原位杂交、免疫组化染色、镜下记数、结果报告等均采用实施例1和实施例2的原位杂交技术的相同方法和步骤及试剂)。发现ALDH1基因在乳腺癌疾病病人中表达量比ERK基因在同一疾病病人的表达量要高。结果表明，ALDH1基因对乳腺癌疾病诊断的特异性、敏感性、准确性比ERK基因更好，原位杂交基因表达图显示，ALDH1基因的表达量是70％，ERK基因的表达量是50％。本发明的试剂盒作于乳腺癌疾病诊断的指标有非常重要的临床意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>芮屈生物技术(上海)有限公司

<120>一种ALDH1基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

<130>/

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2116

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

atcagaacca aattgctgag ccagtcacct gtgttccagg agccgaatca gaaatgtcat    60

cctcaggcac gccagactta cctgtcctac tcaccgattt gaagattcaa tatactaaga   120

tcttcataaa caatgaatgg catgattcag tgagtggcaa gaaatttcct gtctttaatc   180

ctgcaactga ggaggagctc tgccaggtag aagaaggaga taaggaggat gttgacaagg   240

cagtgaaggc cgcaagacag gcttttcaga ttggatcccc gtggcgtact atggatgctt   300

ccgagagggg gcgactatta tacaagttgg ctgatttaat cgaaagagat cgtctgctgc   360

tggcgacaat ggagtcaatg aatggtggaa aactctattc caatgcatat ctgaatgatt   420

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gtacaatacc aattgatgga aattttttta catatacaag acatgaacct attggtgtat   540

gtggccaaat cattccttgg aatttcccgt tggttatgct catttggaag atagggcctg   600

cactgagctg tggaaacaca gtggttgtca aaccagcaga gcaaactcct ctcactgctc   660

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ctggttatgg gcctacagca ggggcagcca tttcttctca catggatata gacaaagtag   780

ccttcacagg atcaacagag gttggcaagt tgatcaaaga agctgccggg aaaagcaatc   840

tgaagagggt gaccctggag cttggaggaa agagcccttg cattgtgtta gctgatgccg   900

acttggacaa tgctgttgaa tttgcacacc atggggtatt ctaccaccag ggccagtgtt   960

gtatagccgc atccaggatt tttgtggaag aatcaattta tgatgagttt gttcgaagga  1020

gtgttgagcg ggctaagaag tatatccttg gaaatcctct gaccccagga gtcactcaag  1080

gccctcagat tgacaaggaa caatatgata aaatacttga cctcattgag agtgggaaga  1140

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agcccacagt gttctctaat gttacagatg agatgcgcat tgccaaagag gagatttttg  1260

gaccagtgca gcaaatcatg aagtttaaat ctttagatga cgtgatcaaa agagcaaaca  1320

atactttcta tggcttatca gcaggagtgt ttaccaaaga cattgataaa gccataacaa  1380

tctcctctgc tctgcaggca ggaacagtgt gggtgaattg ctatggcgtg gtaagtgccc  1440

agtgcccctt tggtggattc aagatgtctg gaaatggaag agaactggga gagtacggtt  1500

tccatgaata tacagaggtc aaaacagtca cagtgaaaat ctctcagaag aactcataaa  1560

gaaaatacaa gagtggagag aagctcttca atagctaagc atctccttac agtcactaat  1620

atagtagatt ttaaagacaa aatttttctt ttcttgattt ttttaaacat aagctaaatc  1680

atattagtat taatactacc catagaaaac ttgacatgta gcttcttctg aaagaattat  1740

ttgccttctg aaatgtgacc cccaagtcct atcctaaata aaaaaagaca aattcggatg  1800

tatgatctct ctagctttgt catagttatg tgattttcct ttgtagctac ttttgcagga  1860

taataatttt atagaaaagg aacagttgca tttagcttct ttcccttagt gactcttgaa  1920

gtacttaaca tacacgttaa ctgcagagta aattgctctg ttcccagtag ttataaagtc  1980

cttggactgt tttgaaaagt ttcctaggat gtcatgtctg cttgtcaaaa gaaataatcc  2040

ctgtaatatt tagctgtaaa ctgaatataa agcttaataa aaacaacctt gcatgaaaaa  2100

aaaaaaaaaa aaaaaa                                                  2116

Claims (10)

1.一种ALDH1基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测乳腺癌或乳腺癌预后疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物优选自地高辛。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

8.一种ALDH1基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

9.一种ALDH1基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a、将权利要求8所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

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