CN101429555A - 一种胰腺癌症早期的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胰腺癌症早期的原位杂交检测试剂盒，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物、增效剂，其中所述的杂交探针序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了一种Palladin基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤：a.将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b.检测a步骤得到的杂交复合体。本发明另外还提供了试剂盒在制备检测胰腺癌症早期疾病药物中的应用。本发明优点在于：本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

Description

一种胰腺癌症早期的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

技术领域

本发明涉及一种基因诊断试剂盒，具体地说关于一种胰腺癌症早期的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用。

背景技术

胰腺癌是消化系统的恶性肿瘤，恶性程度很高，胰腺癌的发病率相对比较低，但致死率非常高，到目前为止，大多数胰腺癌患者都在确诊后一年内死亡。近年来，胰腺癌的发病率逐年上升，男女比例为1：7—2：1；40岁-70岁约占80％，胰腺癌发病在世界各地均有迅速增加，居全身恶性肿瘤的第七位。胰腺位于腹腔深部，且胰腺癌患者在早期没有明显的症状和体症，仅20％的胰腺癌患者有手术机会，术后复发率高，生存期短。国外一组100，313例胰腺癌患者的统计，5年存活率5％，中位生存时间小于20个月，国内报告8省2市14家三甲医院2340例胰腺癌患者术后5年生存期8.5％，中位生存时间为17.1月。在美国胰腺癌是肿瘤的第4位死因，国内是第8-10位死因。1989年美国有2.5万人死于胰腺癌，2005年死于胰腺癌的人数约10万，占肿瘤死亡第4位。我国每年死于胰腺癌患者达数十万人，胰腺癌的发病人数已占癌症发病率的第8位。

胰腺癌的早期症状不明显，目前的影像医学检测手段显示有胰腺占位性病变时，已属晚期，生存期超过一年的很少。目前临床上的诊断手段——通过X线、B超、CT、核磁共振等能分辨2CM以下的肿瘤已经不错。目前医学影像学的2CM以下的肿块属于早期癌症这一界限科学性不够严谨，从细胞学的角度，1CM肿块约有1亿个肿瘤细胞，2CM的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿瘤细胞。事实上，从单克隆癌细胞到2CM以下的肿块可能是相当长的病理演变过程，可能是一年或两年，从癌变前期到癌细胞形成和生成2CM肿块要经过相当长的病理演变过程，在这个病理演变过程中，难以证实早先形成癌细胞克隆肿块是唯一的癌块，可能在最早形成克隆肿块的同时，癌细胞通过不同的途径迁移到其它部位克隆生长。这在临床上已得到证实，一旦切除肿块后，其他地方复发或其它多发的肿块先后形成或转移。因此，依照传统的影像医学和其它生化指数的诊断认定的“早期诊断”这一概念值得认真讨论，在临床上以2CM以下的肿块大小来界分早期与否，不够严谨，这是导致癌症死亡率不降的真正理由。随着分子生物学技术日益完善，功能基因组学，疾病基因组学和癌症基因组学研究的深入开展。能够更早期在基因水平上做出诊断，在仅有少数几个癌细胞克隆生长或癌变前期、早期的迁移、肿瘤干细胞的存在和繁殖时就能检出，对于胰腺癌治愈率的提高有很大的临床意义。

Palladin基因取名自15世纪意大利的建筑师Palladin，这是一种细胞构架胶合蛋白，可以提供分子“胶水”来保持细胞的形态，并通过原生质膜把细胞相互连接起来，在这些细胞中Palladin在细胞分化形成特定形状时起着重要作用。美国的华盛顿大学和匹兹堡大学的研究人员在家族性胰腺癌的病患检测到Palladin基因的一个突变和过度表达，而散发性病例中亦发现Palladin基因的过度表达。进一步的研究证实，正常和癌变胰腺样品独立系(包括前述的家族成员样品)中定量分析Palladin RNA的表达，分析结果表明Palladin基因在零散的和家族遗传性的胰腺癌早期中都是过量表达。进而对Palladin基因测序，发现是这个家族成员中出现了Palladin的突变，将这个突变引入到一个人类细胞系中，证明这个突变增加了细胞迁移频率，破坏了细胞的细胞骨架。有关报道用基因芯片高通量的技术检查胰腺癌病人的4号染色体，发现4号染色体与胰腺癌密切相关，在已瞄定的243多个基因中发现唯独Palladin基因过度表达，在家族性胰腺癌的标本和散发性病例都证实Palladin基因在胰腺癌病例有一个突变和过度表达。以上的研究结果都说明突变的Palladin基因与这个家族胰腺癌发生密切相关，而且Palladin的过量表达也与许多其它胰腺癌患者有关联。Palladin基因是至今发现的与胰腺癌的致癌和致转移单一性有关的基因。

目前对Palldin基因的研究都采用高通量基因芯片技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床推广应用，特别是个性化的应用在我国现阶段条件尚未见介绍。根据现有的文献资料Palladin基因的检测技术未见报道。

原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

中国专利文献CN1556221公开了“IC53基因及其相关产物诊断和治疗结肠癌的用途及一种诊断结肠癌的试剂盒”。中国专利文献CN1769485公开了“栉孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法及其试剂盒”。中国专利文献CN1556410公开了“一种鱼类病毒的检测试剂盒及其检测方法”。中国专利文献CN1680597公开了“一种用于定量检测丙型肝炎病毒(HCV)的荧光定量PCR试剂盒”。中国专利文献CN2918435，公开了“一种检测肥胖相关基因SNP的寡核苷酸芯片及试剂盒”。但是，关于Palladin基因的原位杂交检测试剂盒及其检测技术未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种胰腺癌症早期的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用，能够检测早期胰腺癌，或者在治疗后能及早地预测转移复发状况。

为了解决上述问题，本发明提供了，一种胰腺癌症早期的原位杂交检测试剂盒，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针序列如SEQ ID NO：1所示，其长度为5773bp，位于4号染色体4q23”.3。

作为可选的技术方案，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO：1所示的RNA序列。

作为可选的技术方案，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

作为可选的技术方案，所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

作为可选的技术方案，所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

作为可选的技术方案，所述的非放射性标记物优选自地高辛。

作为可选的技术方案，还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

本发明还提供了一种Palladin基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤：

a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

作为可选的技术方案，所述a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16—24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

本发明还提供了试剂盒在制备检测胰腺癌症早期疾病药物中的应用。

本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以Palladin基因为检测对象，合成探针是Palladin基因的DNA或RNA序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供Palladin基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，正常人Palladin基因不表达，即不显色，Palladin基因在胰腺癌病人高表达。

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：

仪器操作：

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42℃)；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42℃)；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本发明优点在于：

1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。

2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。克服了目前对Palladin基因的研究都采用高通量基因芯片方法，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用的缺陷。

3、本发明的临床意义是更早期检测胰腺癌症发生，本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上(癌变前期或癌细胞增殖)检测Palladin基因异常表达，在影像医学检查未发现占位性癌病灶之前，及早于其它胰腺癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿瘤之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床胰腺癌症病患一个真正的早期诊断以及治疗后转移复发及早预测。这样才有可能实施胰腺癌的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治癌症恶疾。

4、用Palladin基因试剂盒检测胰腺癌症比用其它试剂盒及影像医学诊断技术检测胰腺癌症更早期、敏感性更好。本发明采用核酸原位杂交技术检测Palladin的mRNA或DNA比蛋白诊断方法更早期、敏感性更好。

附图说明

图1是本发明实施例中胰腺癌症病人Palladin过量表达图。

图2是本发明实施例中正常人Palladin图。

具体实施方式

下面结合图对本发明提供的一种胰腺癌症早期的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用的具体实施方式做详细说明。

实施例1

一种胰腺癌症早期的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO：1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下：

消化液          100μl/管    1管/盒       无色透明液体

保护液          100μl/管    1管/盒       无色透明液体

预杂交液        1300μl/管   2管/盒       无色透明液体

正义杂交液      10μl/管     1管/盒       无色透明液体

反义杂交液      10μl/管     1管/盒       无色透明液体

封闭液          1000μl/管   1管/盒       无色透明液体

碱性磷酸酶抗体   1μl/管      1管/盒      无色透明液体

显色剂A          175μl/管    1管/盒      黄色液体

显色剂B          320μl/管    1管/盒      无色透明液体

缓冲液I 10x      90ml/瓶     1瓶/盒      浅黄色或无色透明液体

缓冲液II 10x     80ml/瓶     1瓶/盒      浅黄色或无色透明液体

缓冲液III 10x    20m/瓶      3瓶/盒      浅黄色或无色透明液体

缓冲液IV 10x     90ml/瓶     1瓶/盒      浅黄色或无色透明液体

固定液           90ml/瓶     1瓶/盒      无色透明液体

阳性对照标本     6片/盒

上述试剂成分说明：(所有试剂购自SIGMA)

1、消化液：20mg/ml蛋白酶K，100mg蛋白酶K，加DEPC-H₂O 5ml；

2、保护液：0.2g的glycine加入1ml的1×缓冲液I；

3、预杂交液：1×缓冲液II7.5ml

50×D 3ml

10mg/ml yest t-RNA 750ul

11mg/ml SALMON TESTES DNA 682ul

0.04M EDTA 3ml

50％ formamide 15ml

4、封闭液：0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入1ml 1×缓冲液III；

5、10x缓冲液I：(PH7.1-7.4)

NaCl 80g

Na₂HPO_4·12H₂O 360g

KCl 2g

KH₂PO₄ 2g

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

6、10x缓冲液II：(PH7.0)

NaCl 175.3g

柠檬酸钠 88.2g

HCl 几滴

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

7、缓冲液III：(PH7.9)

Tris 121.1g

NaCl 87.66g

HCl 60ml左右

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

8、缓冲液IV：

1M Tris-HCl(PH9.5)：Tirs 121.1g加HCl 3ml左右，加水900ml，调PH至9.5，加水至1l，并高压灭菌；

1M NaCl：NaCl 58.44加水至1l，并高压灭菌；

0.5M MgCl₂：101.65g MgCl_2·6H₂O加水至1l，并高压灭菌；

9、固定液：多聚甲醛40g加1×缓冲液I至1l，稍加热(约50-60度)搅拌至溶解；

10、显色剂A：NBT 1g加70％DMF11.44ml；

11、显色剂B：BCIP 1g加100％DMF30ml。

本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

实施例2

一种胰腺癌症早期的原位杂交检测方法

一、标本处理

1、用10ml的离心管，装4.5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋巴细胞分离液(血:淋巴细胞分离液＝1:1.5)的离心管中，2000r/min离心10min；

2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

3、弃上清.沉淀加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；

5、用40ml4％固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1×缓冲液I洗5min。每缸可以放16片；

6、标本可保存在-20℃，或继续做实验。

二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度

1、将10×缓冲液I用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液I；

2、将20×缓冲液II用三蒸水按1:10稀释成2×缓冲液II；

按1:100稀释成0.2×缓冲液II；按1:200稀释成0.1×缓冲液II；

3、将10×缓冲液III用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液III；

4、10×缓冲液IV用三蒸水按1:10稀释成×缓冲液IV(取1#，2#，3#各10ml，加水至100ml既可)。

三、实验步骤：

1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次实验做一对阳性对照)；

2、在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1×缓冲液199.9ml，即为使用浓度)20ml。37℃水浴预热10分钟。放进16张玻片，37℃处理12min，再用1×缓冲液I洗5min；

3、用0.2％的保护液(保护液1ml加1×缓冲液I99ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；

4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70％，90％，95％的乙醇各洗2min，自然干燥；

6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张加反义杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内

在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液II洗两次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液II洗一次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液II洗两次，每次15min；

8、用1×缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；

9、将玻片放入保湿盒内，加0.5％l封闭液(1ml封闭液加5ml1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min；

10、取出玻片，用1×缓冲液III洗30s，自然干燥；

11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min；

12、取出玻片，用1×缓冲液III洗3次，每次15min；

13、1×缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73.3ul，显色剂B157.5ul加到30ml1×缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上；

14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10％的1×缓冲液I混匀)封片镜检。

四、结果判断

在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。

阳性对照标本加反义杂交液的应该80％以上染上紫色。

所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。

胰腺癌症病人Palladin过量表达图见图1。正常人Palladin图见图2。

地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的Palladin基因表达量，用来确定胰腺癌是否发生，临床研究表明，Palladin基因是胰腺癌的特异性基因，Palladin基因在正常人中不表达，唯独在胰腺癌病人中表达，一旦Palladin基因表达，说明胰腺癌症已经发生，从而获得胰腺癌的诊断信息。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>芮屈生物技术(上海)有限公司

<120>一种胰腺癌症早期的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

<130>/

<150>200710171741.6

<151>2007-11-30

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>3321

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

Claims (10)

1.一种胰腺癌症早期的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于：所述的杂交探针序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的杂交探针序列如SEQ ID NO：1所示的RNA序列。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述的非放射性标记物优选自地高辛。

7.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

8.一种胰腺癌症早期的原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a、将权利要求1或2所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16—24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

10.根据权利要求1或2所述的试剂盒在制备检测胰腺癌症早期疾病药物中的应用。

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