CN113045651A - 靶向Palladin蛋白Pal-11-15区段的抗体及在制备神经再生药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

一种靶向骨架蛋白palladin分子中Pal‑11‑15(即PalΔ11‑15)区段的抗体及在制备调节神经再生药物中的应用，属于药学技术领域。本发明基于神经胶质细胞的特性，以及骨架蛋白palladin分子的功能结构域，开发出可调节神经生长与再生的靶向骨架蛋白palladin分子中PalΔ11‑15区段的抗体。使用本发明的靶向骨架蛋白palladin分子中PalΔ11‑15区段的抗体，能够通过与PalΔ11‑15的可逆结合，调节palladin分子的亚细胞分布与生物功能，起到了调节神经生长与再生的作用。本发明提供的靶向骨架蛋白palladin分子中PalΔ11‑15区段的抗体可以在制备调节神经修复与再生药物中得到广泛的应用。

Description

靶向Palladin蛋白Pal-11-15区段的抗体及在制备神经再生 药物中的应用
技术领域
本发明属于药学技术领域，具体涉及一种靶向骨架蛋白palladin分子中Pal-11-15(即PalΔ11-15)区段的抗体及在制备调节神经再生药物中的应用。
背景技术
神经细胞骨架系统的分解和再组建的动力学过程，对调节神经修复与再生的进程是十分必要的。神经细胞最突出的结构特点是拥有众多的突起，它们是神经细胞体延伸出来的细长部分，包括树突和轴突，它们也是传递神经冲动的重要部位。神经的生长和发育，以及神经损伤的修复与再生等都与树突和轴突的发生与伸展相关，而树突和轴突的发生与伸展等方面都与神经细胞骨架有关。中枢神经系统中的神经元，因其具有很长的轴突，才可以将神经传导信号进行远距离间的传输，从而行使神经传导的功能。因此，神经细胞的骨架系统在调节神经修复与再生方面起着重要的作用。
Palladin是细胞中一种骨架蛋白，在多种细胞中，它与富含肌动蛋白等的细胞骨架结构有共定位[1]。最近的研究显示：palladin分子是一种独特的功能蛋白，因为它不仅是多种细胞骨架结合蛋白的分子支架，它本身还是一种细胞骨架的交联蛋白[2-4]。因此palladin分子通过直接和间接的分子机制，在组织细胞内骨架结构的组装矩阵中起着重要的调节作用。
在生物体中，palladin存在多种分子大小不同的亚型，它们的表达定位存在一定的组织特异性和不同的分布。Palladin分子最普遍的亚型是90kDa，它在多种动物组织如大脑、心脏和胃中均有表达[5]。Palladin分子的140kDa亚型广泛表达在新生组织中，例如大脑、心脏、肺、胃、肠、肾、骨头和皮肤，并且在上皮衍生细胞系中也有大量表达。在发育后期，140kDa亚型在很多组织中的表达量都有所下降。Palladin分子的200kDa亚型的表达只在心脏和骨骼中能检测到[6]，而在新生组织中，可以在横纹肌和骨骼中检测到200kDa亚型[7]。与成年组织中不同，在胚胎发育过程中，从始至终都有90kDa、140kDa和200kDa亚型的表达。90kDa、140kDa和200kDa亚型中均存在PalΔ11-15区段，对PalΔ11-15区段的靶向调节，可以正向或负向调节细胞的生长与分化，以及调节神经的生长、修复与再生。
有机体的组织包含不同的细胞类型，我们利用培养细胞系确定在发育过程中组织表达的palladin亚型是否分布在不同类型的细胞中。在原代培养的成纤维细胞、血管平滑肌细胞和上皮细胞系中进行对比，可以看出，90kDa的亚型在成纤维和平滑肌细胞中可以检测到，而140kDa的亚型只表达在成纤维细胞中。在上皮细胞中，90kDa和140kDa亚型均能检测到。这些结果表明：palladin的90kDa和140kDa亚型的形成分别与成纤维类型和上皮细胞类型的细胞结构相关[6]。
[1]Boukhelifa M,Parast MM,Valtschanoff JG,LaMantia AS,Meeker RB,OteyCA.A role for the cytoskeleton-associated protein palladin in neuriteoutgrowth.Mol Biol Cell.2001；12(9):2721-2729.
[2]Wall ME,Rachlin A,Otey CA,Loboa EG.Human adipose-derived adultstem cells upregulate palladin during osteogenesis and in response to cyclictensile strain.Am J Physiol Cell Physiol.2007；293(5):C1532-C1538.
[3]Goicoechea SM,Bednarski B,Stack C,et al.Isoform-specificupregulation of paladin in human and murine pancreas tumors.PLoS One.2010；5(4):e10347.
[4]Salaria SN,Illei P,Sharma R,et al.Palladin is overexpressed in thenon-neoplastic stroma of infiltrating ductal adenocarcinomas of the pancreas,but is only rarely overexpressed in neoplastic cells.Cancer Biol Ther.2007；6(3):324-328.
[5]Parast MM,Otey CA.Characterization of palladin,a novel proteinlocalized to stress fibers and cell adhesions.J Cell Biol.2000；150(3):643-656.
[6]Wang HV,Moser M.Comparative expression analysis of the murinepaladin isoforms.Dev Dyn.2008；237(11):3342-3351.
[7]Rachlin AS,Otey CA.Identification of palladin isoforms andcharacterization of an isoform-specific interaction between Lasp-1andpalladin.J Cell Sci.2006；119(Pt6):995-1004.
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向骨架蛋白palladin分子中PalΔ11-15区段的抗体及在制备调节神经再生药物中的应用，该靶向骨架蛋白palladin分子中PalΔ11-15区段的抗体可以调节神经修复与再生。靶向骨架蛋白palladin分子中PalΔ11-15区段的抗体通过与PalΔ11-15区段结合，调节palladin分子的亚细胞分布与生物功能，起到调节神经生长与再生的作用。本发明提供的靶向骨架蛋白palladin分子中PalΔ11-15区段的抗体可以在制备调节神经修复与再生药物中得到广泛的应用。
本发明基于神经胶质细胞的特性，以及骨架蛋白palladin分子的结构与功能，开发出可调节神经生长与再生的靶向骨架蛋白palladin分子中PalΔ11-15区段的抗体。使用本发明的靶向骨架蛋白palladin分子中PalΔ11-15区段的抗体，能够通过调节骨架蛋白palladin特定亚型分子的功能，正向或负向调控神经的修复与再生。
迄今为止国内外尚未报道过本发明所述的靶向骨架蛋白palladin分子中PalΔ11-15区段的抗体，尚未见应用这种靶向骨架蛋白palladin分子中PalΔ11-15区段的抗体在神经的修复与再生中应用的报道。
本发明所述的一种靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体，其中所述的PalΔ11-15区段具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
进一步，前面所述的一种靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体，该抗体可为单克隆抗体、多克隆抗体或单链抗体。
进一步，前面所述的一种靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体，该抗体可由人体或动物体免疫产生，或为基因工程表达产物。
进一步，前面所述的一种靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体，该抗体可与PalΔ11-15区段的全部肽段或部分肽段可逆结合。
进一步，前面所述的一种靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体是由如下步骤制备得到：
(1)合成编码PalΔ11-15的基因及构建其表达载体
依据由本发明中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，利用DNA合成仪合成编码PalΔ11-15的基因片段，并与表达载体pET28a或pMA5重组，获得重组表达载体pET28a-PalΔ11-15或pMA5-PalΔ11-15，转化E.coli BL21(DE3)或BS168感受态细胞，获得表达PalΔ11-15的阳性菌株；
(2)PalΔ11-15蛋白的制备
将步骤(1)得到的表达PalΔ11-15的阳性菌株用LB培养基(Thermo Fisher公司，货号：12780052)(50μg/mL Kana)扩大培养后，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导菌体表达出PalΔ11-15；破碎菌体，使用Ni2+亲和层析柱(上海生工，货号：BSP079)纯化得到本发明所述的PalΔ11-15蛋白；
(3)抗体的制备
用步骤(2)得到的PalΔ11-15蛋白免疫新西兰大白兔(购自吉林大学实验动物中心)6次(1mg/次)后，处死免疫兔，获得抗血清；抗血清经Protein A柱子(Roche公司，货号：11719408001)纯化后，获得靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体(anti-PalΔ11-15AB)，即抗PalΔ11-15抗体。
前面所述的一种靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体在制备神经再生药物中具有广泛的应用。
附图说明
图1：纯化的PalΔ11-15的SDS-PAGE图谱；其中M：蛋白质Marker；A：PalΔ11-15。如图所示，纯化得到的PalΔ11-15蛋白的分子量为24.6kDa。
图2：抗PalΔ11-15的抗体(anti-PalΔ11-15AB)检测靶细胞中palladin的免疫荧光图，其中图(a)为DAPI染色的部位显示出细胞核的区域；图(b)为抗PalΔ11-15的抗体(anti-PalΔ11-15AB)检测靶细胞中palladin的区域；图(c)为(a)和(b)Merge图，抗PalΔ11-15的抗体与细胞核显色区的重叠。如图所示，抗PalΔ11-15的抗体能够特异性识别靶细胞中的palladin。
图3：抗PalΔ11-15的抗体(anti-PalΔ11-15AB)加入SH-SY5Y细胞中孵育48小时后的细胞明场图，其中图(a)为对照组SH-SY5Y细胞；图(b)为加入抗PalΔ11-15的抗体组SH-SY5Y细胞。如图所示，图(b)中加入了抗PalΔ11-15的抗体组中，SH-SY5Y细胞的聚集明显降低，但突起明显增长。
具体实施方式
实施例1制备抗PalΔ11-15的抗体(anti-PalΔ11-15AB)，包括以下步骤：
(1)合成编码PalΔ11-15的基因及构建其表达载体
依据本发明所述的palladin分子中PalΔ11-15区段的氨基酸序列，设计并利用DNA合成仪人工合成了编码PalΔ11-15区段的基因片段，其序列如下：
5’-ggaattccatatggaccccctgaagctgcagcagctgcagaaccagatcaggctggagcaggaggccggcgccaggcagcccccccccgcccccaggagcgccccccccagcccccccttcccccccccccccgccttccccgagctggccgcctgcaccccccccgccagccccgagcccatgagcgccctggccagcaggagcgcccccgccatgcagagcagcggcagcttcaactacgccaggcccaagcagttcatcgccgcccagaacctgggccccgccagcggccacggcacccccgccagcagccccagcagcagcagcctgcccagccccatgagccccacccccaggcagttcggcagggcccccgtgccccccttcgcccagcccttcggcgccgagcccgaggccccctggggcagcagcagccccagccccccccccccccccccccccgtgttcagccccaccgccgccttccccgtgcccgacgtgttccccctgccccccccccccccccccctgcccagccccggccaggccagccactgcagcagccccgccaccaggttcggccacagccagacccccgccgccttcctgagcgccctgctgcccagccagcccccccccgccgccgtgaacgccctgggcctgcccaagggcgtgacccccgcctaaggatcc-3’
其中5’端有下划线的catatg序列是内切酶NdeI识别位点，3’端有下划线的ggatcc序列是内切酶BamHI识别位点，所设计的此二酶切位点与表达本发明所述的PalΔ11-15区段的载体pET28a或pMA5(通用的大肠杆菌或枯草杆菌表达载体，含有硫酸卡那霉素抗性基因，Novagen等公司)的NdeI和BamHI相匹配，适合于在大肠杆菌或枯草杆菌中高效表达。利用NdeI和BamHI切割位点将此人工合成的编码PalΔ11-15的基因片段克隆进表达载体pET28a或pMA5中NdeI和BamHI酶切位点之间，连接得到重组表达载体pET28a-PalΔ11-15或pMA5-PalΔ11-15，其中编码PalΔ11-15的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
上述表达载体的构建步骤具体如下：
双酶切反应：将1.0μg pET28a或pMA5载体和5.0ug上述用DNA合成仪人工合成的编码PalΔ11-15区段的基因片段分别与适量去离子水混匀，使其总体积分别为16μL，再各加入2单位限制性内切酶NdeI和BamHI及2μL相应的10X K缓冲液，混匀后置于37℃水浴保温2小时；最后分别采用常规琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海生工公司，货号：BS413)回收目的DNA，分别获得载体pET28a或pMA5片段和编码PalΔ11-15区段的基因片段。
编码PalΔ11-15的基因片段与载体pET28a或pMA5的连接：取0.5μg上述步骤回收的载体pET28a或pMA5片段，加入4ug编码PalΔ11-15区段的基因片段、2μL 10X T4 DNA连接酶缓冲液，加去离子水定容至20μL，最后加入1单位的T4 DNA连接酶，混匀并瞬间离心以使液滴聚集管底，置于16℃水浴过夜，得到连接好的重组表达载体pET28a-PalΔ11-15或pMA5-PalΔ11-15。
重组表达载体pET28a-PalΔ11-15或pMA5-PalΔ11-15转化E.coli DH5α：取10μL重组表达载体pET28a-PalΔ11-15或pMA5-PalΔ11-15加入100μL E.coli DH5α感受态细胞(E.coli DH5α感受态细胞的制备方法参照“分子克隆实验指南”第二版，科学出版社，49页)中，冰浴30分钟后置于42℃水浴中保温1分钟，立即取出并置于冰浴中冷却2分钟。加入200μL、37℃预热的SOC液体培养基，37℃、150rpm振摇培养60分钟后，取出100μL培养液涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂培养平板上，37℃培养16小时后，出现转化菌落。挑取上述转化菌落进行核酸序列分析，结果证明获得了重组表达载体pET28a-PalΔ11-15或pMA5-PalΔ11-15。
(2)PalΔ11-15的表达与制备：
在本实施例中使用E.coli BL21(DE3)或BS168为宿主菌细胞，重组表达载体pET28a-PalΔ11-15或pMA5-PalΔ11-15可转化E.coli BL21(DE3)或BS168细胞，并使用硫酸卡那霉素筛选出能高效稳定表达的单克隆细胞株，获得表达的PalΔ11-15。具体操作：
将3.5μg的重组表达载体pET28a-PalΔ11-15或pMA5-PalΔ11-15加入到0.5mLE.coli BL21(DE3)或BS168感受态细胞中，37℃、250r/min培养90min，取菌液涂布筛选平板。37℃培养16小时后，获得转化的单菌落。
挑取转化的单菌落，接种于2mL LB培养基(Thermo Fisher公司，货号：12780052)中，37℃振摇培养过夜。以1:100(体积比)的比例接种10mL LB培养基(50μg/mL Kana)，37℃、200rpm振荡培养12小时后，4℃、5000rpm离心5分钟收集菌体。用1/10培养液体积的10mMTris-Cl缓冲液(pH8.0)重悬菌体，置于冰浴中超声波破碎菌体。破碎菌体于4℃、5000rpm离心15分钟，获得上清液。最后，使用Ni2+亲和层析柱(上海生工，货号：BSP079)纯化得到本发明所述的PalΔ11-15蛋白。
图1示出了所制备的PalΔ11-15蛋白的SDS-PAGE鉴定结果，纯化得到的PalΔ11-15蛋白的分子量为24.6kDa。
(3)动物免疫
免疫动物为6月龄、体重2～3kg雄性新西兰大白兔(购自吉林大学实验动物中心)，免疫抗原为上述表达纯化的PalΔ11-15蛋白。
将PalΔ11-15蛋白用无菌的PBS缓冲液(pH 7.4)稀释至质量浓度为2μg/μL，再用等体积的弗氏完全佐剂(购自鼎国公司)与得到的PalΔ11-15蛋白溶液混合、乳化得到弗氏完全佐剂乳化后的PalΔ11-15抗原蛋白，使PalΔ11-15的终浓度为1μg/μL。选用注射器混匀法进行乳化，约0.5h后乳化完全，乳化完全的标准为乳化后的抗原滴在水面上5min内不扩散。取6月龄、体重2～3kg的雄性新西兰大白兔，初次免疫采用腿部肌肉注射弗氏完全佐剂乳化后的PalΔ11-15抗原蛋白，剂量为1mg。加强免疫采用耳缘静脉注射PalΔ11-15抗原蛋白(不加佐剂)，剂量为1mg。初次免疫与第一次加强免疫的时间间隔为三周，以后每隔两周进行加强免疫。经过6次免疫，最后一次免疫后7天，分离抗血清。
(4)抗血清的制备
将上述免疫的雄性新西兰大白兔处死，取血，并将血液装入三角烧瓶中。将盛有血液的三角瓶置于37℃温箱1小时，再置于4℃冰箱3.5小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细管吸取血清于3000rpm离心15分钟，取上清液加入防腐剂(质量分数为0.01％的硫柳汞或质量分数为0.02％的叠氮钠)，分装后置4℃冰箱中保存备用。
(5)抗PalΔ11-15的抗体的纯化
取Protein A柱子(Roche公司，货号：11719408001)，先用体积分数为50％的乙醇消毒，再用50mL无菌PBS洗柱子，最后用10个体积20mM的Tris溶液(pH8.0)平衡柱子。将步骤(4)制备的抗血清离心10000g 10分钟，取上清。用1.0M Tris(pH 8.0)调抗血清的pH值至7.6。将抗血清缓慢加到Protein A柱子中，然后用6个柱体积的20mM的Tris溶液(pH 8.0)洗柱子，再用10个柱体积的20mM氨基乙酸(pH 5.0)洗柱子，最后用5个柱体积的0.1M的氨基乙酸(pH 2.5)洗脱抗体，获得纯化的靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体(anti-PalΔ11-15AB)，即抗PalΔ11-15抗体。
实施例2抗PalΔ11-15抗体对palladin的免疫荧光检测，包括以下步骤：
将生长良好的1X104靶细胞(SH-SY5Y细胞)接种于24孔细胞培养板上，使细胞均匀贴壁生长于24孔板底部的玻璃片上后，将爬片的靶细胞用PBS冲洗3次，直接加入固定液(Solarbio公司，货号：P1110)，室温固定30min。PBS冲洗3次、每次5min，晾干后加入封闭液(Solarbio公司，货号：SW3015)室温封闭2小时或者4℃过夜。用PBS冲洗5min，加入实施例1制备的抗PalΔ11-15抗体(1:800，体积比)，室温放置2.5小时。用PBS洗三次，每次5min。加入FITC标记的山羊抗兔IgG(1：200，体积比)(北京中衫金桥生物技术有限公司)，避光室温反应2.5小时。再用PBS洗三次，每次10min，注意避光。最后用含有80％甘油的PBS封片，进行荧光观察，结果如图2所示。免疫荧光结果显示，实施例1制备的抗PalΔ11-15的抗体(即本发明所述的一种靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体)能够特异性识别靶细胞中的palladin。
实施例3抗PalΔ11-15的抗体调节SH-SY5Y细胞的聚集与突起的生长，包括以下步骤：
将生长良好的1X1 04SH-SY5Y细胞分为二组，培养12小时使细胞均匀贴壁生长后，其中一组为对照组，另一组中加入用0.22μm过滤膜(millipore公司，货号：SLGP033RB)过滤除菌的抗PalΔ11-15的抗体(anti-PalΔ11-15AB)。二组SH-SY5Y细胞继续培养48小时后，在倒置显微镜下观察、照相，结果如图3所示。图3结果显示出，抗PalΔ11-15的抗体可调节SH-SY5Y细胞的聚集与突起的生长，在加入了抗PalΔ11-15的抗体组中，SH-SY5Y细胞的聚集明显降低，但突起明显增长。这些结果显示出，抗PalΔ11-15的抗体与骨架蛋白palladin分子中PalΔ11-15区段的特异性结合影响了靶细胞的迁移、聚集与突起的生长。神经细胞的迁移、聚集与突起的生长均与细胞骨架蛋白的动态组装有关，而靶向骨架蛋白palladin分子中PalΔ11-15区段的抗体能够调节神经细胞的迁移、聚集与突起的生长，显示出在制备调节神经修复与再生药物中的广泛应用价值。
<110> 吉林大学
<120> 靶向Palladin蛋白Pal-11-15区段的抗体及在制备神经再生药物中的应用
<160> 2
<210> 1
<211> 225
<212> PRT
<213> 人
<400> 1
Met Asp Pro Leu Lys Leu Gln Gln Leu Gln Asn Gln Ile Arg Leu Glu
1 5 10 15
Gln Glu Ala Gly Ala Arg Gln Pro Pro Pro Ala Pro Arg Ser Ala Pro
20 25 30
Pro Ser Pro Pro Phe Pro Pro Pro Pro Ala Phe Pro Glu Leu Ala Ala
35 40 45
Cys Thr Pro Pro Ala Ser Pro Glu Pro Met Ser Ala Leu Ala Ser Arg
50 55 60
Ser Ala Pro Ala Met Gln Ser Ser Gly Ser Phe Asn Tyr Ala Arg Pro
65 70 75 80
Lys Gln Phe Ile Ala Ala Gln Asn Leu Gly Pro Ala Ser Gly His Gly
85 90 95
Thr Pro Ala Ser Ser Pro Ser Ser Ser Ser Leu Pro Ser Pro Met Ser
100 105 110
Pro Thr Pro Arg Gln Phe Gly Arg Ala Pro Val Pro Pro Phe Ala Gln
115 120 125
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Ser Gln Thr Pro Ala Ala Phe Leu Ser Ala Leu Leu Pro Ser Gln Pro
195 200 205
Pro Pro Ala Ala Val Asn Ala Leu Gly Leu Pro Lys Gly Val Thr Pro
210 215 220
Ala
225
<210> 2
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ATG GAC CCC CTG AAG CTG CAG CAG CTG CAG AAC CAG ATC AGG CTG GAG
Met Asp Pro Leu Lys Leu Gln Gln Leu Gln Asn Gln Ile Arg Leu Glu
1 5 10 15
CAG GAG GCC GGC GCC AGG CAG CCC CCC CCC GCC CCC AGG AGC GCC CCC
Gln Glu Ala Gly Ala Arg Gln Pro Pro Pro Ala Pro Arg Ser Ala Pro
20 25 30
CCC AGC CCC CCC TTC CCC CCC CCC CCC GCC TTC CCC GAG CTG GCC GCC
Pro Ser Pro Pro Phe Pro Pro Pro Pro Ala Phe Pro Glu Leu Ala Ala
35 40 45
TGC ACC CCC CCC GCC AGC CCC GAG CCC ATG AGC GCC CTG GCC AGC AGG
Cys Thr Pro Pro Ala Ser Pro Glu Pro Met Ser Ala Leu Ala Ser Arg
50 55 60
AGC GCC CCC GCC ATG CAG AGC AGC GGC AGC TTC AAC TAC GCC AGG CCC
Ser Ala Pro Ala Met Gln Ser Ser Gly Ser Phe Asn Tyr Ala Arg Pro
65 70 75 80
AAG CAG TTC ATC GCC GCC CAG AAC CTG GGC CCC GCC AGC GGC CAC GGC
Lys Gln Phe Ile Ala Ala Gln Asn Leu Gly Pro Ala Ser Gly His Gly
85 90 95
ACC CCC GCC AGC AGC CCC AGC AGC AGC AGC CTG CCC AGC CCC ATG AGC
Thr Pro Ala Ser Ser Pro Ser Ser Ser Ser Leu Pro Ser Pro Met Ser
100 105 110
CCC ACC CCC AGG CAG TTC GGC AGG GCC CCC GTG CCC CCC TTC GCC CAG
Pro Thr Pro Arg Gln Phe Gly Arg Ala Pro Val Pro Pro Phe Ala Gln
115 120 125
CCC TTC GGC GCC GAG CCC GAG GCC CCC TGG GGC AGC AGC AGC CCC AGC
Pro Phe Gly Ala Glu Pro Glu Ala Pro Trp Gly Ser Ser Ser Pro Ser
130 135 140
CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC GTG TTC AGC CCC ACC GCC GCC TTC CCC
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Val Phe Ser Pro Thr Ala Ala Phe Pro
145 150 155 160
GTG CCC GAC GTG TTC CCC CTG CCC CCC CCC CCC CCC CCC CTG CCC AGC
Val Pro Asp Val Phe Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Ser
165 170 175
CCC GGC CAG GCC AGC CAC TGC AGC AGC CCC GCC ACC AGG TTC GGC CAC
Pro Gly Gln Ala Ser His Cys Ser Ser Pro Ala Thr Arg Phe Gly His
180 185 190
AGC CAG ACC CCC GCC GCC TTC CTG AGC GCC CTG CTG CCC AGC CAG CCC
Ser Gln Thr Pro Ala Ala Phe Leu Ser Ala Leu Leu Pro Ser Gln Pro
195 200 205
CCC CCC GCC GCC GTG AAC GCC CTG GGC CTG CCC AAG GGC GTG ACC CCC
Prp Pro Ala Ala Val Asn Ala Leu Gly Leu Pro Lys Gly Val Thr Pro
210 215 220
GCC TAA
Ala *
225
2

Claims (8)

1.一种靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体，其特征在于：PalΔ11-15区段具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的一种靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体，其特征在于：该抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或单链抗体。
3.如权利要求2所述的一种靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体，其特征在于：该抗体由人体或动物体免疫产生。
4.如权利要求2所述的一种靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体，其特征在于：该抗体为基因工程表达产物。
5.如权利要求2、3和4所述的一种靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体，其特征在于：该抗体可与权利要求1中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的全部或部分肽段相结合。
6.如权利要求5所述的一种靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体，其特征在于：该抗体可与权利要求1中所述的PalΔ11-15区段可逆结合。
7.如权利要求6所述的一种靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体，其特征在于：该抗体由如下步骤制备得到：
(1)合成编码PalΔ11-15的基因及构建其表达载体
依据SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，利用DNA合成仪合成编码PalΔ11-15的基因片段，并与表达载体pET28a或pMA5重组，获得重组表达载体pET28a-PalΔ11-15或pMA5-PalΔ11-15，转化E.coli BL21(DE3)或BS168感受态细胞，获得表达PalΔ11-15的阳性菌株；
(2)PalΔ11-15蛋白的制备
将步骤(1)得到的表达PalΔ11-15的阳性菌株用含50μg/mL Kana的LB培养基扩大培养后，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导菌体表达出PalΔ11-15；破碎菌体，使用Ni2+亲和层析柱纯化得到PalΔ11-15蛋白；
(3)抗体的制备
用步骤(2)得到的PalΔ11-15蛋白免疫新西兰大白兔6次后，处死免疫兔，获得抗血清；抗血清经Protein A柱子纯化后，获得靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体，即抗PalΔ11-15抗体。
8.权利要求1～7任何一项所述的一种靶向palladin蛋白PalΔ11-15区段的抗体在制备神经再生药物中的应用。
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