KR20130094337A - 개량형 이듀로네이트-2-설파타제 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연형 이듀로네이트-2-설파타제(IDS) 유전자 내에 서열번호 2의 뉴클레오타이드가 삽입되어 제조된 개량형 IDS 유전자에 관한 것으로서, 상기 유전자를 이용하여 제조된 개량형 IDS 효소는 종래 효소에 비해 혈액 내 잔류 시간이 길고, 음전하를 띠어 뼈를 표적으로 할 수 있으므로 보다 효과적으로 헌터증후군을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.

Description

개량형 이듀로네이트-2-설파타제 및 이의 용도{IMPROVED IDURONATE-2-SULFATASE AND USE THEREOF}

본 발명은 개량형 이듀로네이트-2-설파타제 및 이의 용도에 관한 것이다.

헌터증후군 또는 제2형 점액다당질증(mucosaccharidsosis type II)은 이듀로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase, 이하 IDS라 함)의 결핍으로 인해 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG)과 같은 뮤코다당체가 분해되지 못하여 리소좀 내에 축적되는 리소좀축적질환(lysosomal storage diseases, LSD) 중 하나이다. GAG는 신체의 모든 세포 내에 축적되어 여러 가지 증상을 초래하는데, 상기 증상에는 두드러진 얼굴 모습, 큰 머리, 간이나 비장의 비대로 인한 복부 팽만 등이 포함되며, 청력 상실, 심장판막질환, 폐쇄성 호흡기질환, 수면무호흡 등도 동반된다. 또한, 관절운동에도 제한이 올 수 있으며 중추신경계의 침범으로 신경계 증상과 발달 지연이 초래될 수 있다.

헌터 증후군은 162,000명당 1명꼴로 발생하는 것으로 알려져 있으며, X 염색체와 연관된 열성(X-linked recessive) 양식으로 유전되어 환자뿐만 아니라 가족에게 큰 고통을 주고 있다.

지금까지 헌터 증후군을 치료하기 위하여, 골수 이식방법, 효소 보충방법 및 유전자 요법 등이 다양하게 시도되어 왔다. 그러나 골수 이식방법의 경우 증상은 현저히 개선되지만 환자와 조직적합항체(HLA)가 맞는 대상을 구하기 어렵고, HLA 부적합 공여자의 수술 전후의 사망률이 높은 단점이 있다. 효소 보충방법은 투여방법이 간단한 장점이 있지만 지속적으로 효소를 투여해야 하므로 비용이 많이 드는 단점이 있다. 현재, 재조합 기술에 의해 인간 세포주에서 생산된 천연형 IDS로서, 미국 FDA에 의해 승인받은 엘라프라제(Elaprase®; Shire Pharmaceuticals Group)가 사용되고 있으나, 단가가 매우 비싸고, 체내 반감기가 짧아 뼈까지 도달하기 어려워 치료 효과가 간이나 비장 그리고 연부조직에 그치는 단점이 있다. 나아가, 정상적인 IDS 유전자를 아데노바이러스나 레트로바이러스를 통해 체내로 주입하는 유전자 치료도 연구중이나, 아직 실험적인 수준에 미치고 있다. 따라서, 헌터증후군의 새로운 치료제 및 치료 방법의 개발이 요구된다.

이에 본 발명자들은 종래 사용되어 온 엘라프라제의 단점을 개선하기 위해 노력하던 중, 천연형 IDS를 코딩하는 유전자를 변형시킴으로써 헌터 증후군 치료 효과가 뛰어난 효소를 얻을 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 종래 천연형 IDS에 비해 헌터 증후군 치료 효과가 뛰어난 개량형 IDS를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 개량형 IDS의 유전자를 포함하는 발현 벡터, 이를 포함하는 숙주 세포, 및 상기 개량형 IDS를 포함하는 헌터 증후군의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 개량형 IDS를 이용한 헌터 증후군의 치료 또는 예방 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천연형 이듀로네이트-2-설파타제(IDS) 유전자의 IDS 코딩 서열 내에 음전하를 띤 아미노산 5-7개를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드가 삽입된 유전자, 및 이에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 개량형 IDS 유전자를 포함하는 발현 벡터, 이를 포함하는 숙주 세포, 및 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 헌터 증후군의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 조성물을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 헌터 증후군의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

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도 1은 천연형 IDS 유전자의 리더 서열 다음에 서열번호 2의 6개의 아스파트산을 코딩하는 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 3의 링커를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드가 삽입된, 본 발명에 따른 개량형 IDS 유전자를 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 개량형 IDS(D6-IDS)를 얻기 위하여, pcR2.1-D6-IDS 벡터를 제한효소로 처리한 후 전기영동한 결과이다.
도 3은 개량형 IDS의 발현량이 높은 세포군을 선별하기 위한 닷 블롯(Dot blot) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 CHO 세포주에서 발현된 본 발명에 따른 개량형 IDS를 웨스턴 블롯에 의해 분석한 결과이다. 좌측 3개의 레인은 농도를 달리한 엘라프라제에 대한 결과를, 우측 4개의 레인은 본 발명에 따른 개량형 IDS로 형질감염된 CHO 세포주의 배양액에 대한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 개량형 IDS로 형질감염된 CHO 세포주의 배양액을 대상으로, 정제 단계별 용출액을 은 염색(silver staining)을 통해 분석한 결과이다. 상기 7번째 레인은 천연형 IDS인 엘라프라제를 이용하여 실험한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 개량형 IDS로 형질감염된 CHO 세포주의 배양액을 대상으로, 정제 단계별 용출액을 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과이다. 상기 7번째 레인은 천연형 IDS인 엘라프라제를 이용하여 실험한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 개량형 IDS로 형질감염된 CHO 세포주의 배양액을 정제하여 얻은 컬럼 D 용출액을 대상으로, IEF(isoelectric focusing)를 통해 분석한 결과이다. 상기 2번째 레인은 천연형 IDS인 엘라프라제를 이용하여 실험한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 개량형 IDS, 엘라프라제 및 GC1111의 투여에 따른 소변 내 GAG 함량을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 개량형 IDS, 엘라프라제 및 GC1111의 투여에 따른 간 조직 내 GAG 함량을 나타낸 것이다.

달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본 명세서에 사용된 용어 "이듀로네이트-2-설페이트" 또는 "IDS"는 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 및 데르마탄 설페이트(dermatan sulfate)의 분해에 관여하는 효소로서, 본 발명에서는 결핍시 헌터증후군 또는 제2형 점액다당질증(mucosaccharidsosis type II)을 유발할 수 있는 효소를 지칭한다.

또한, 상기 효소와 관련되어 사용된 용어 "천연형(natural type or wild type)"은 유기체, 바람직하게는 인간으로부터 얻어지거나, 또는 당업자에게 알려진 통상의 방법을 이용하여 숙주 세포로부터 생산된 것으로서, 어떠한 변형이 가해지지 않은 것을 의미하며, 반대로 "개량형"은 상기 천연형에 당업자에게 알려진 통상의 물리적, 화학적, 생물학적 또는 유전학적 처리를 가하여 제조된, 천연형에 비해 개선된 특성을 갖는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "IDS 코딩 서열"은 리더 서열(leader sequence)과 성숙(mature) IDS 코딩 서열로 이루어진, 시그날 펩타이드가 결합된 IDS 효소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "컨스트럭트"는 발현 벡터에 삽입하기 위해 구축된 핵산 서열을 의미하며, 용어 "벡터"는 유전자 전달을 위한 운반체(vehicle)를 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 천연형 이듀로네이트-2-설파타제(IDS) 유전자의 IDS 코딩 서열(CDS) 내에 음전하를 띠는 아미노산 5-7개를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드가 삽입된 유전자를 제공한다.

상기 천연형 IDS 유전자는, 예를 들어, Genbank accession No. NM_000202로 등록되어 있는 인간 천연형 IDS cDNA를 NheI/XhoI으로 처리하여 얻은, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 CDS 단편일 수 있다.

한편, 음전하를 띤 아미노산을 코딩하는 상기 올리고뉴클레오타이드는 천연형 IDS 효소에 음전하를 부여함으로써 뼈를 표적으로 하도록 함과 동시에 반감기를 늘려 혈액 내 잔류 시간을 증가시키는 역할을 하며, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 6개의 아스파트산(D6)을 코딩하는 올리고뉴클레오타이드를 예시할 수 있다. 상기 아스파트산 외에도 음전하를 띠는 글루탐산을 코딩하는 올리고뉴클레오타이드 또는 아스파트산과 글루탐산을 각각 코딩하는 뉴클레오타이드들이 임의의 순서로 나열된 올리고뉴클레오타이드가 사용될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 천연형 IDS 효소의 기본 구조를 변화시키지 않도록, IDS 코딩 서열의 N-말단 부위의 리더 서열과 성숙 IDS 코딩 서열 사이에 삽입되는 것이 바람직하다. 즉, 서열번호 1의 경우를 예로 들자면, 75번째와 76번째 염기 사이에 삽입되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 개량형 IDS 유전자에서, 상기 음전하를 띤 아미노산을 코딩하는 올리고뉴클레오타이드와 IDS 코딩 서열 사이에, 예를 들어, 상기 올리고뉴클레오타이드와 성숙 IDS 코딩 서열 사이에 링커가 추가로 삽입될 수 있다. 상기 링커로는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 또는 상기 서열번호 3의 염기서열의 일부가 변형된 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, GCG-GAA-GCT-GAA-ACT-GGC 서열(서열번호 6)을 갖는 올리고뉴클레오타이드가 사용될 수 있으나, IDS 효소의 기본 구조를 변화시키지 않는 한, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 바람직한 개량형 IDS 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 가질 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 개량형 IDS 유전자에 의해 코딩되는 개량형 IDS를 제공하며, 이는 서열번호 5의 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 개량형 IDS 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 상기 발현 벡터는 본 발명에 따른 개량형 IDS 유전자를 백본(backbone) 플라스미드의 MCS(multiple cloning site)에 삽입하여 제조할 수 있다. 상기 사용가능한 백본 플라스미드는 상업적으로 입수할 수 있는 임의의 포유동물 세포 발현용 플라스미드, 예를 들어, pcDNA3.1, pCI, pCMV, pHA-MEX, pMGS 등일 수 있으며, 이를 이용한 발현 벡터 제조 방법은 본 기술분야의 숙련자에게 널리 알려져 있다.

본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 본 발명에 따른 개량형 IDS 유전자를 포함하는 발현 벡터를 본 기술분야의 숙련자에게 알려진 통상의 방법을 이용하여 숙주 세포에 형질감염시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 숙주 세포의 종류에는 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 인간 세포주 또는 CHO(Chinese hamster ovary) 세포주가 사용될 수 있다.

본 발명은 개량형 IDS 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 헌터 증후군의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다. 상기 폴리펩타이드는 위에서 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 개량형 IDS 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포로부터 생산될 수 있다. 상기 생산방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 효소의 생산량이 최대치가 되는 기간, 예를 들어 10일 이상 동안 적절한 동물세포 배양용 배지에서 배양한 후, 배양액을 당업계에 알려진 통상의 정제 방법, 예를 들어, 이온교환 크로마토그래피, 컬럼 크로마토그래피, 여과 및 농축 등을 사용하여 정제할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 약학 조성물은 상기 폴리펩타이드 또는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화함으로써 제공될 수 있다. "약학적으로 허용되는" 담체란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 물질을 말한다.

한편, 본 발명에 따른 약학 조성물은 투여 경로에 따라 적합한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학 조성물은, 이에 한정되지는 않으나, 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.

본 발명의 약학 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다. 흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 약학 조성물을 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 안정화제(아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산) 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제(벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올)를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 상기와 같은 방법으로 제형화된 약학 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 진단 또는 치료 효과의 추적을 가능하게 하는 폴리펩타이드의 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 대상 질환 및 이의 중증정도, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 할 때 1회 투여시 10 ㎍ 내지 10 ㎎의 유효용량으로 하루에 수 차례 반복투여될 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 개량형 IDS 효소를 이용한 헌터 증후군의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 개량형 IDS 효소를 적절한 담체와 혼합하여 조성물을 제조한 후, 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 개량형 IDS 효소는 헌터 증후군 환자에게 부족한 IDS 효소를 보충하여 줌으로써, 헌터 증후군을 치료 또는 완화시키거나, 예방할 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 개량형 IDS 효소는 효소보충요법에 사용되던 천연형 IDS, 예를 들어 엘라프라제에 비해 혈액내 잔류 시간이 길며, 음전하를 띠어 뼈를 표적으로 할 수 있으므로, 헌터 증후군의 골이형성증 치료에 매우 효과적이다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 개량형 IDS 유전자 컨스트럭트 제작

기존 천연형 IDS 효소의 체내 반감기가 짧고, 뼈까지 도달하지 못하는 문제점을 해결하고자, 유전공학적 방법으로 천연형 IDS 유전자를 변형시켰다. 뼈를 구성하는 주성분이 양전하를 띠는 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)인 점에 착안하여, IDS 유전자가 음전하를 띠도록 음전하를 띠는 아미노산을 코딩하는 올리고뉴클레오타이드를 삽입하였다. 구체적으로, 인간 천연형 IDS cDNA(Genebank accession No. NM_000202)를 NheI/XhoI으로 처리하여 얻은 CDS 단편(~1.7kb, 서열번호 1)을 포함하고 있는 벡터(PCR2.1-IDS)를 삼성의료원으로부터 제공받아, 상기 서열 중 75번째 및 76번째 염기서열 사이에 아스파트산을 코딩하는 염기서열(GAT)이 6회 반복된 올리고뉴클레오타이드(D6, 서열번호 2) 및 링커 서열(서열번호 3)을 삽입하였다. 상기 D6 및 링커는 인간 IDS cDNA의 N-말단 부위의 리더 서열(leader sequence)과 IDS 유전자 사이에 삽입되므로, 제조된 개량형 IDS 단백질은 음전하를 띠면서도 기본 구조는 변화하지 않는다(도 1 참조). 상기 제조된 벡터를 pCR2.1-D6-IDS로 명명하였다. 염기서열 분석 결과, 서열번호 4의 염기서열로 나타낸 바와 같이, 서열번호 1의 천연형 IDS 유전자 내에 D6 및 링커가 순차적으로 삽입된 것을 확인하였다.

실시예 2: 개량형 IDS 단백질의 발현 및 확인

＜2-1＞ 개량형 IDS 발현 벡터의 제조

실시예 1에서 제조된 벡터를 NheI/XhoI으로 처리하여 개량형 IDS(D6-IDS) 유전자를 수득하였다(도 2). 상기 단편을 동일한 제한효소로 처리한 pMGS 벡터(대한민국 특허출원 제2000-43996호; PCT/KR01/01285호)에 서브클로닝하여, 개량형 IDS 발현 벡터 pMSG-D6-IDS를 제조하였다. 상기 벡터 내 도입 유전자는 염기서열 분석으로 확인하였다.

＜2-2＞ 개량형 IDS 발현벡터의 형질감염

상기 ＜2-1＞에서 제조된 pMGS-D6-IDS 벡터를 NdeI으로 선형화한 후 QIAQuick PCR 정제 키트로 정제하여 DNA 농도를 결정하고, 이를 형질감염에 사용하였다. 숙주세포는 CHO DG44(S)-EX (dhfr ^- / dhfr ^-, 콜롬비아대학) 세포 (RMCB #38)를 이용하였고, 상기 세포는 무혈청 배지(글루타민이 첨가된 EX-CELL CD CHO 배지, SAFC Bioscience)에서 5±1% CO₂, 37±1℃의 조건하에서 교반속도 140~150 rpm으로 배양하였다. 계대배양을 위해, 세포농도가 1 ~ 2 × 10⁶ 세포/mL에 도달하였을 때 2.5 × 10⁷ 개의 세포를 취하여 1,200 rpm 에서 5분간 원심분리 한 후, 다른 flask로 옮겨 현탁 배양하였다.

형질감염을 위하여, 전기천공법을 24-웰 규모로 수행하였다. 계대 배양 중인 세포로부터 1 × 10⁵ 세포/웰이 되도록 세포를 수획하여 원심분리로 배지를 제거한 후, 다시 1X DPBS로 1회 세척하였다. 여기에 R 완충액 (전기천공 용액 키트 내 포함), DNA (0.5 μg/well) 및 pDCH1P (dhfr)의 총 부피가 12 μL/웰이 되도록 준비하여 세포를 재현탁시켰다. HT supplement(Invitrogen사)가 첨가된 EX-CELL CD CHO 배지를 웰당 500 μL씩 분주하고, 10-μL 골드 팁(gold tip)을 이용하여 전기충격(1250 V, 20 msec, 2 회)을 가해 형질감염시킨 후, 웰에 미리 넣어둔 배지에 접종하였다. 형질감염된 세포를 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 6일간 배양한 후, 형질전환 된 세포들이 충분히 자랐을 때 96-웰 플레이트에 1,000 세포/웰로 접종하여 배양하였다. 세포의 상태와 콜로니 생성여부를 관찰하였고, 약 3주 후에 초기 적응된 379종의 세포주를 얻을 수 있었다.

＜2-3＞ 개량형 IDS 발현 세포군 선별

확보된 세포주 379종을 각각 균질기(homogenizer)로 분쇄한 후 원심분리기로 분획하여 세포 용해물(cell lysate)을 얻고, 닷 블롯(Dot blot, Protein Detector Microarray Dot Blot kit, AP Chemiluminescent, 제품번호 56-12-50, KPL사, USA)을 수행하여, IDS 발현량이 높은 상위 80종의 세포주를 일차 선별하였다(도 3 참조). 상기 일차 선별된 발현 세포주를 2 X 10⁵ 세포/웰의 농도로 2 mL의 상기 배지에 접종하고, 상기와 동일한 조건에서 4일간 배양한 후 배양액을 회수하였다. 상기 회수한 세포 배양액 시료에 대하여 닷 블롯과 웨스턴 블롯(Western blot, 항-인간 IDS 항체(R＆D사, AF2449)) 및 효소 활성 분석(Ya. V. Voznyi et al., J. Inherit . Metab. Dis . 24 (2001) 675-680)을 수행하였다. 분석 결과, IDS 발현량이 높게 측정된 세포주 총 20종을 선별하였다. 선별된 세포주 중 일부를 이용하여 웨스턴 블롯을 실시한 결과, 75~80 kDa의 크기의 개량형 IDS가 발현됨을 확인하였다(도 4 참조). 상기 세포주는 사용할 때까지 바이알에 냉동보관하였다.

실시예 3: 개량형 IDS 단백질의 생산 및 정제

＜3-1＞ 개량형 IDS 의 생산

실시예 2에서 수득한 동결 보관 중인 세포주 하나를 37℃에서 빠르게 녹인 후 무균 원심분리관에 넣고 원심분리를 통해 세포를 수집하였다. 상청액을 제거한 후, 회수된 세포침전물에 글루타민(0.8 g/L)이 첨가된 동물유래 성분이 없는 EX-CELL^® CD CHO 배지를 넣어 현탁시킨 후 플라스크에 넣고 5±1% CO₂, 37± 1℃의 조건하에서 배양하였다. 세포를 쉐이커 플라스크를 이용하여 2~3일 간격으로 계대배양을 실시하였다. 계대 배양으로 2L까지 배양 용량을 늘린 다음, 배양 중인 세포수가 생물배양기에 접종할 수 있는 충분한 양이 되면, 생물배양기에 접종하여 본 배양을 시작하였다. 배양 중 배양액을 채취하여 현미경으로 세포의 상태를 관찰하고 pH, 세포농도, 세포 생존율, 글루코스 농도, 글루타민 농도, 암모니아 농도를 분석하였다. 상기 정보에 따라 글루코스와 글루타민이 고갈되지 않도록 적정량을 첨가하고, 배양 중 가수분해물(TC Yeastolate, BD사)을 적정량 첨가하여 배양하였으며, 접종 후 10일 이상이 경과한 후 배양을 종료하고 배양액을 회수하였다.

＜3-2＞ 개량형 IDS 의 정제

상기 배양액으로부터 개량형 IDS를 효율적으로 정제하기 위하여, i) pI 값이 4 이하이며, ii) 당화(glycosylation)되어 있으며, iii) 만노스-6-포스페이트(mannose-6-phosphate)를 갖고 있는 IDS 단백질의 특성을 기초로 하여, IDS 정제공정을 확립하였다.

구체적으로, 실시예 ＜3-1＞에서 수득한 배양액을 20 mM 인산나트륨 완충액으로 평형화된 컬럼 A(Anion exchange resin, GE Healthcare)에 로딩하고 20 mM 인산나트륨과 0.3M 염화나트륨의 용출 완충액으로 용출시켜 배양액 내 색소와 여러 가지 불순물을 제거하였다. 그 후, 컬럼 A 용출액에 염화나트륨을 첨가하여 20 mM 인산나트륨 완충액으로 평형화된 컬럼 B(Hydrophobic Interaction resin, GE Healthcare)에 로딩하고 20mM 아세트산나트륨의 용출 완충액으로 용출시켜 컬럼 A 크로마토그래피에서 제거하지 못한 색소와 불순물들을 제거하였다. 이후, 컬럼 B 용출액을 20 mM 인산나트륨 완충액으로 평형화된 컬럼 C(Cation exchange resin, GE Healthcare)에 로딩하고 20 mM 아세트산나트륨의 용출 완충액으로 용출시켜, 이성질체 및 기타 불순물을 제거하였다. 마지막으로, 컬럼 C 용출액을 20 mM 아세트산나트륨 완충액으로 평형화된 컬럼 D(Affinity resin, GE Healthcare)에 로딩한 후, 20 mM 인산나트륨의 용출 완충액으로 용출시켜 컬럼 C 용출액의 부피를 줄였다. 상기 컬럼 D 용출액의 농도를 1 mg/mL 이상으로 조정하기 위하여, 한외여과(ultrafiltration) 막(컷오프 크기 10,000 MWCO)을 이용하여 농축하여 개량형 IDS 단백질을 수득하였다. 상기 수득된 개량형 IDS에 대하여 SDS-PAGE(은 염색 및 웨스턴 블롯)와 IEF(isoelectric focusing)를 수행하였고, 분석 결과를 도 5 내지 7에 나타내었다. 도 5 및 6에서 보는 바와 같이, 컬럼 A, B, C 및 D를 사용함에 따라 불순물이 감소하여 정제된 IDS 단백질을 얻을 수 있음을 확인할 수 있었다. 한편, 도 7에 나타난 IEF 결과로부터 개량형 IDS가 천연형 IDS에 비해 높은 pI를 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 1: 개량형 IDS 단백질의 효소 활성 측정

개량형 IDS 단백질의 효소 활성을 기존 천연형 효소인 엘라프라제(Elaprase, Genzyme사) 및 GC1111(녹십자; Otto P. van Diggelen. et. al., J. Inherit . Metab. Dis ., 2001)과 비교측정하였다. 실험방법은 상기 IDS 효소를 4MU-α-IdoA-2S (4-methylumbelliferyl-α-L-iduronide-2-sulfate·Na₂; 4-메틸움벨리프론 나트륨염) 기질과 농도별로 반응시킨 후, 엘라프라제 및 GC1111에 의해 기질이 절단되어 생성되는 4MU의 형광을 측정하였다. 이때 4MU 표준용액을 대조물질로써 넣어서 엘라프라제 및 GC1111에 의해 생성되는 4MU 양과 비교하여 효소 역가를 측정하였다.

＜1-1＞ 효소 활성 측정을 위한 시약의 제조

1) 시료 희석액: 50 mM 아세트산나트륨, 500 ug/mL BSA.

2) 반응정지액: 0.25 M 탄산나트륨/중탄산나트륨 (pH 10.7±0.2).

3) 4-MU 표준용액: 100 mM 농도의 4-메틸움벨리프론 나트륨염.

4) 기질 희석액: 0.1 M 아세트산나트륨/0.1 M 아세트산 완충액 (pH 5.0±0.2).

5) 기질 용액: 기질 희석액 8.33 mL에 5mg의 MU-αIdoA-2S (Moscerdam substrate사, 네덜란드) 용해.

6) LEBT (Lysosomal Enzyme purified from Bovine Testis; Moscerdam, M2) 용액: 바이알 당 증류수 2.2 mL씩 넣어 용해.

7) Pi/Ci 완충용액: 0.2 M 인산나트륨/0.1 M 구연산 완충액 (pH 4.5±0.2).

＜1-2＞ 효소 활성 측정

실시예 3에서 정제된 IDS 시료를 시료 희석액을 이용하여 10 ng/mL, 5 ng/mL, 2.5 ng/mL 및 1.25 ng/mL로 순차희석하였다. 추후 사용하게 될 4-MU 표준 용액용 웰은 비워 두고 블랙 96-웰 플레이트에 기질 용액을 20 μL씩 넣은 다음, 각 웰에 시료 희석액(blank) 10 μL와 상기 희석된 IDS 시료 10 μL를 첨가하여 혼합한 후, 빛을 차단한 상태로 37℃ 배양기에서 4시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 후, Pi/Ci 완충용액 20 μL와 LEBT 용액 10 μL를 첨가하여 잘 혼합한 다음, 빛을 차단한 상태로 37℃ 배양기에서 24시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기 웰에 반응정지액 200 μL를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 그리고 나서, 위에서 비워 두었던 표준용액용 웰에 반응 정지액에 농도별로 희석된 4-MU 표준용액을 260 μL씩 넣어주고 나서, 355nm/460nm에서 형광 리더기(Fluorescence reader: VICTOR X4, PerkinElmer사)를 이용하여 측정하였다. 실험은 각 농도마다 2웰씩 반복 실험하였다.

측정결과를 하기 표 1에 나타내었다.

＜표 1＞

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 개량형 IDS는 종래 시판중인 엘라프라제에 비해 활성이 매우 뛰어난 것으로 나타났다. 또한, CHO 세포주에서 생산되어 임상시험중인 GC1111에 비해 약간 우월한 활성을 나타내었다.

실험예 2: 개량형 IDS 의 약동학/ 약력학 측정

본 발명에 따른 개량형 IDS의 약동학적 특성을 종래 천연형 IDS인 엘라프라제 및 GC1111과 비교하였다.

구체적으로, 6~7주령의 암컷 ICR 마우스(25-30g)를 3마리씩 3개의 군으로 나눈 뒤, 상기 3가지 약물을 식염수를 이용하여 0.5mg/kg, 1.0mg/kg 및 4.5mg/kg의 농도로 희석하여 각각 100 μL를 마우스의 꼬리에 정맥주사하였다. 주사 후, 5, 15, 30, 60, 120 및 180분에 각 마우스를 전신 마취시켜 전혈(0.6 내지 0.8 mL)을 채취하고 혈청을 분리하였다. 상기 분리된 혈청은 분석 때까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다.

인간 특이적 항-이듀설파아제 항체(R＆D사, AF2449)를 이용한 샌드위치 ELISA 방법에 의하여, 혈청 내 IDS 농도(ng/mL)를 측정하였다. 상기 실험은 3회 반복하여 수행하였다. 상기 얻어진 시간-농도 곡선으로부터 비선형 혼합 효과 모형 분석에 많이 사용하는 NONMEM 소프트웨어 (version 7, ICON Development Solutions)를 이용하여 약동학 매개변수(PK parameter)를 분석하였다.

분석 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

＜표 2＞

상기 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 개량형 IDS는 천연형 IDS인 엘라프라제 및 GC1111에 비해 뛰어난 약동학 특성을 나타내었다. 특히, 본 발명에 따른 개량형 IDS는 실제 임상 적용 용량(0.5mg/kg)에서 혈액내 잔류량이 월등히 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 실제 약물 투여시 상기 개량형 IDS가 천연형 IDS에 비해 지속적인 효능을 나타낼 뿐만 아니라 뼈 표적 효과가 클 것임을 시사한다.

실험예 3: 개량형 IDS 의 단기 투여 효능 분석

본 발명에 따른 개량형 IDS의 단기 투여 효능을 분석하기 위하여, IDS 투여에 따른 GAG(glycosaminoglycan) 함량 변화를 검토하였다. 실험 방법은 IDS-넉아웃(knock-out) 마우스에 본 발명에 따른 개량형 IDS, 엘라프라제 및 GC1111을 주사한 후 소변 및 간 조직 내 GAG 함량을 측정함으로써 이루어졌다.

구체적으로, 총 35마리의 B6X129 마우스(8주령)를 7마리씩 1개의 야생형(WT) 군과 4개의 IDS-넉아웃(KO) 군으로 나눈 뒤, 자유롭게 물과 먹이를 먹도록 하였다. 1군은 야생형 마우스에 0.9% 식염수(100 μL)를 투여하였고, 2군은 IDS-넉아웃 마우스에 0.9% 식염수(100 μL)를 투여하였으며, 3군은 IDS-넉아웃 마우스에 엘라프라제 0.5 mg/kg(100 μL)을 투여하였고, 4군은 IDS-넉아웃 마우스에 GC1111 0.5 mg/kg(100 μL)을 투여하였으며, 5군은 IDS-넉아웃 마우스에 본 발명에 따른 개량형 IDS 0.5 mg/kg(100 μL)을 투여하였다. 상기 시험물질은 총 5회(0일, 7일, 14일, 21일 및 28일)에 걸쳐 마우스의 꼬리에 정맥 주사하였고, 소변은 투여 전과 투여 후 35일째에 회수하고, 간 조직은 투여 후 35일째에 회수하였다. 회수된 간 조직은 약 100 mg 정도를 PBS와 함께 튜브에 넣고 초음파분쇄기를 이용하여 분쇄한 다음, 원심분리하여 얻은 상층액을 GAG 분석에 사용하였다.

상기 회수한 소변 및 간 조직 내의 GAG 농도는 sGAG 분석 키트(Cat. No. BP-004, KAMIYA Biochemical사, USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다. 상기 sGAG 분석 키트는 음전하를 띠는 GAG와 양전하를 띠는 알시안 블루(Alcian blue) 염료간의 특이적 결합에 따른 색상 변화를 이용하여 GAG 함량을 측정할 수 있다. 간 조직의 경우, BCA 방법으로 단백질 함량을 측정하고 이를 이용하여 GAG 농도를 보정하였다. 측정된 소변 및 간 조직 내 GAG 함량을 각각 도 8 및 9에 나타내었다. 도 8 및 9에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 개량형 IDS는 기존의 약물(엘라프라제 및 GC1111)과 비슷한 수준으로 IDS-넉아웃 마우스에 비해 소변 및 간 조직 내 GAG 수치를 현저히 감소시키는 것으로 나타났다.

상기 실험 결과들은 본 발명에 따른 개량형 IDS가 기존 약물들에 비해 일반적인 효능면에서 뒤지지 않으며, 혈액 내 반감기가 뛰어나고, 음전하를 띠어 뼈 조직을 표적으로 할 수 있다는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명에 따른 개량형 IDS는 헌터증후군의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이상에서 본 발명은 특정 실시태양과 관련지어 설명되었으나, 첨부한 청구범위에 의해 정해지는 본 발명의 범주 내에서 당해 분야의 숙련자는 본 발명을 다양하게 변형 및 변화시킬 수 있다.

<110> GCBio Corp. <120> IMPROVED IDURONATE-2-SULFATASE AND USE THEREOF <130> PCB010037GCB <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1653 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(75) <400> 1 atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct gagctccgtc 60 tgcgtcgccc tcggatccga aacgcaggcc aactcgacca cagatgctct gaacgttctt 120 ctcatcatcg tggatgacct gcgcccctcc ctgggctgtt atggggataa gctggtgagg 180 tccccaaata ttgaccaact ggcatcccac agcctcctct tccagaatgc ctttgcgcag 240 caagcagtgt gcgccccgag ccgcgtttct ttcctcactg gcaggagacc tgacaccacc 300 cgcctgtacg acttcaactc ctactggagg gtgcacgctg gaaacttctc caccatcccc 360 cagtacttca aggagaatgg ctatgtgacc atgtcggtgg gaaaagtctt tcaccctggg 420 atatcttcta accataccga tgattctccg tatagctggt cttttccacc ttatcatcct 480 tcctctgaga agtatgaaaa cactaagaca tgtcgagggc cagatggaga actccatgcc 540 aacctgcttt gccctgtgga tgtgctggat gttcccgagg gcaccttgcc tgacaaacag 600 agcactgagc aagccataca gttgttggaa aagatgaaaa cgtcagccag tcctttcttc 660 ctggccgttg ggtatcataa gccacacatc cccttcagat accccaagga atttcagaag 720 ttgtatccct tggagaacat caccctggcc cccgatcccg aggtccctga tggcctaccc 780 cctgtggcct acaacccctg gatggacatc aggcaacggg aagacgtcca agccttaaac 840 atcagtgtgc cgtatggtcc aattcctgtg gactttcagc ggaaaatccg ccagagctac 900 tttgcctctg tgtcatattt ggatacacag gtcggccgcc tcttgagtgc tttggacgat 960 cttcagctgg ccaacagcac catcattgca tttacctcgg atcatgggtg ggctctaggt 1020 gaacatggag aatgggccaa atacagcaat tttgatgttg ctacccatgt tcccctgata 1080 ttctatgttc ctggaaggac ggcttcactt ccggaggcag gcgagaagct tttcccttac 1140 ctcgaccctt ttgattccgc ctcacagttg atggagccag gcaggcaatc catggacctt 1200 gtggaacttg tgtctctttt tcccacgctg gctggacttg caggactgca ggttccacct 1260 cgctgccccg ttccttcatt tcacgttgag ctgtgcagag aaggcaagaa ccttctgaag 1320 cattttcgat tccgtgactt ggaagaggat ccgtacctcc ctggtaatcc ccgtgaactg 1380 attgcctata gccagtatcc ccggccttca gacatccctc agtggaattc tgacaagccg 1440 agtttaaaag atataaagat catgggctat tccatacgca ccatagacta taggtatact 1500 gtgtgggttg gcttcaatcc tgatgaattt ctagctaact tttctgacat ccatgcaggg 1560 gaactgtatt ttgtggattc tgacccattg caggatcaca atatgtataa tgattcccaa 1620 ggtggagatc ttttccagtt gttgatgcct tga 1653 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide sequence coding for six aspartic acids (D6) <400> 2 gatgatgatg atgatgat 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 3 gccgaggcag aaaccgga 18 <210> 4 <211> 1689 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D6-IDS sequence <400> 4 atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct gagctccgtc 60 tgcgtcgccc tcggagatga tgatgatgat gatgccgagg cagaaaccgg atccgaaacg 120 caggccaact cgaccacaga tgctctgaac gttcttctca tcatcgtgga tgacctgcgc 180 ccctccctgg gctgttatgg ggataagctg gtgaggtccc caaatattga ccaactggca 240 tcccacagcc tcctcttcca gaatgccttt gcgcagcaag cagtgtgcgc cccgagccgc 300 gtttctttcc tcactggcag gagacctgac accacccgcc tgtacgactt caactcctac 360 tggagggtgc acgctggaaa cttctccacc atcccccagt acttcaagga 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Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys 85 90 95 Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr 100 105 110 Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe 115 120 125 Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser 130 135 140 Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp 145 150 155 160 Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys 165 170 175 Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala 180 185 190 Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu 195 200 205 Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met 210 215 220 Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro 225 230 235 240 His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu 245 250 255 Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro 260 265 270 Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val 275 280 285 Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe 290 295 300 Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp 305 310 315 320 Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala 325 330 335 Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly 340 345 350 Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His 355 360 365 Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu 370 375 380 Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser 385 390 395 400 Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val 405 410 415 Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro 420 425 430 Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys 435 440 445 Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr 450 455 460 Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg 465 470 475 480 Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp 485 490 495 Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr 500 505 510 Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp 515 520 525 Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp 530 535 540 His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu 545 550 555 560 Met Pro <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 6 gcggaagctg aaactggc 18

Claims (12)

1. 천연형 이듀로네이트-2-설파타제(IDS) 유전자의 IDS 코딩 서열 내에 음전하를 띠는 아미노산 5~7개를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드가 삽입된 유전자.
2. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드가 상기 IDS 유전자의 IDS 코딩 서열의 N-말단 부위의 리더 서열과 성숙 IDS 코딩 서열 사이에 삽입되는 것을 특징으로 하는 유전자.
3. 제 1항에 있어서, 상기 음전하를 띠는 아미노산이 아스파트산 또는 글루탐산인 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제 1항에 있어서, 상기 천연형 이듀로네이트-2-설파타제 유전자가 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열로 표시되고, 상기 올리고뉴클레오타이드가 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
5. 제 4항에 있어서, 상기 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드가 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 75번째와 76번째 염기 사이에 삽입되는 것을 특징으로 하는 유전자.
6. 제 2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드와 상기 성숙 IDS 코딩 서열 사이에 링커가 추가로 삽입된 것을 특징으로 하는 유전자.
7. 제 6항에 있어서, 상기 링커가 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
8. 제 1항의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드.
9. 제 1항의 유전자를 포함하는 발현 벡터.
10. 제 9항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
11. 제 8항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 헌터 증후군의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
12. 제 11항의 조성물을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 헌터 증후군의 치료 또는 예방 방법.

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