JP6433424B2 - 脱リン酸化されたリソソーム蓄積症タンパク質およびその使用方法 - Google Patents

脱リン酸化されたリソソーム蓄積症タンパク質およびその使用方法 Download PDF

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Description

関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法１１９（ｅ）の下、２０１２年７月３１日に出願された米国仮出願第６１／６７７，９５９号（これは、その全体が参考として援用される）に対する優先権を主張する。
配列表に関する記述
本出願に関連する配列表を、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供し、この配列表は、本明細書中で参考として援用される。配列表を含むテキストファイル名は、ＢＩＯＳ＿０６＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは約２５ＫＢであり、２０１３年７月３１日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出した。
背景
技術分野
本発明は、一般に、タンパク質のリン酸化形態と比較して血液脳関門（ＢＢＢ）を横断するか透過する能力が高いリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）タンパク質の脱リン酸化形態（イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ、またはＩ２Ｄ）の脱リン酸化形態が含まれる）およびそのｐ９７結合体に関する。かかる脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質およびｐ９７結合体を含む組成物および、例えば、任意の１つ以上のリソソーム蓄積症（ハンター症候群（すなわち、ＭＰＳ ＩＩ型）など）を処置するためのその使用方法も含まれる。
関連技術の記載
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、細胞のリソソーム内の特異的な酵素またはタンパク質の活性の不在または減少に起因する。細胞内で、喪失酵素の影響は、細胞内リソソーム内の未分解「貯蔵物質」の蓄積として認められる。この集積物により、リソソームが膨潤して機能不全を引き起こし、それにより、細胞および組織が損傷する。リソソーム蓄積症が典型的には遺伝的病因を有するので、多数の組織は問題の酵素を欠くであろう。しかし、組織が異なれば同一酵素の不在の程度も異なる。どのように組織が悪影響を受けるかは、組織が喪失酵素の基質を生成する程度によっていくらか決定される。貯蔵の負荷をもっとも受ける組織の型が、どのようにして薬物を患者に投与すべきかを決定づける。
多数のリソソーム蓄積症の酵素が同定され、その各疾患と関連付けられている。一旦喪失酵素または欠損酵素が同定されると、補充酵素を患者の罹患組織に有効に送達させるという問題に処置を集中させることができる。
静脈内酵素代償療法（ＥＲＴ）はＬＳＤ（例えば、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ、ＭＰＳ ＩＩＩ）に有利であり得るが、かかる疾患におけるリソソームへの治療酵素の送達の増強手段は、費用の削減および治療有効性の増加に関して有益であろう。
１つの問題として、血液脳関門（ＢＢＢ）は、血流から脳への多数の薬剤の自由な輸送を遮断する。このため、神経学的側面が有意に認められるＬＳＤは、静脈内ＥＲＴに応答すると期待されない。かかる疾患について、ＢＢＢを通過して罹患細胞に入るリソソーム内への酵素送達の改善方法が非常に望まれるであろう。
発明の概要
本発明の実施形態は、哺乳動物細胞（ヒト細胞など）中に発現された（または産生された）対応するコントロールＬＳＤタンパク質と比較して実質的に脱リン酸化された単離リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）ポリペプチドを含む。一定の実施形態では、ＬＳＤポリペプチドは、対応するＬＳＤタンパク質と比較して少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％脱リン酸化されている。
特定の実施形態では、ＬＳＤポリペプチドは、１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを含む。例えば、一定のＬＳＤポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個またはそれを超えるＮ結合型オリゴマンノースグリカンを含む。いくつかの実施形態では、ＬＳＤポリペプチドは、対応するＬＳＤタンパク質として少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の数または量のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを有する。特定の実施形態では、ＬＳＤポリペプチドは、哺乳動物細胞中に発現された（または産生された）対応するＬＳＤタンパク質と比較して、Ｎ結合型オリゴマンノースグリカンのマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を実質的に含まない。いくつかの態様では、ＬＳＤポリペプチドは、酸性ホスファターゼまたはアルカリホスファターゼでの酵素消化によって脱リン酸化される。
一定の実施形態では、ＬＳＤポリペプチドは、１つ以上のイズロン酸−２−スルファターゼ、Ｌ−イズロニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、酸性リパーゼ、システイン輸送体、Ｌａｍｐ−２、α−ガラクトシダーゼＡ、酸性セラミダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、ＧＭ２−ガングリオシドアクチベーター（ＧＭ２Ａ）、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、サポシンＢ、ノイラミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼホスホトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼγ−サブユニット、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ：Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、ガラクトース６−スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、スルファターゼ、パルミトイルプロテインチオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、カテプシンＡ、カテプシンＫ、α−ガラクトシダーゼＢ、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、シアリン（ｓｉａｌｉｎ）、およびシアル酸輸送体（その活性フラグメントおよび改変体が含まれる）から選択される。いくつかの実施形態では、ＬＳＤポリペプチドはヒトポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、ＬＳＤポリペプチドは、ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、またはその活性フラグメントもしくは改変体である。いくつかの態様では、ヒトＩＤＳが、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、配列番号２を含むか、配列番号２から本質的になるか、配列番号２からなるアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、ヒトＩＤＳは、１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを含む。特定の態様では、ヒトＩＤＳは、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを含む。いくつかの態様では、ヒトＩＤＳは、ヒト細胞（例えば、ＨＴ−１０８０細胞）などの哺乳動物細胞中に産生された（発現された）対応する野生型ヒトイズロン酸−２−スルファターゼとして少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の数または量のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンは、ヒト細胞などの哺乳動物細胞中に産生された（発現された）対応するヒトＩＤＳのＮ結合型オリゴマンノースグリカンと比較して実質的に脱リン酸化されている。いくつかの態様では、１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンは、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％脱リン酸化されている。
いくつかの実施形態では、ヒトＩＤＳは、哺乳動物細胞中に産生された対応するＩＤＳと比較してマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を実質的に含まない。特定の態様では、ヒトＩＤＳは、Ｍ６Ｐ含有量が約１．２ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質未満である。一定の態様では、ヒトＩＤＳは、Ｍ６Ｐ含有量が約０．５ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質未満である。特定の態様では、ヒトＩＤＳは、Ｍ６Ｐ含有量が約０．１５ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質または約０．１５ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質未満である。
いくつかの実施形態では、ＬＳＤポリペプチドは、ヒトα−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵ）またはその活性フラグメントもしくは改変体である。いくつかの態様では、ヒトＩＤＵは、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、配列番号３を含むか、配列番号３から本質的になるか、配列番号３からなるアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、ヒトＩＤＵは１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを含む。特定の態様では、ヒトＩＤＵは、１、２、３、４、５、または６個のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩＤＵは、哺乳動物細胞、任意選択的にヒト細胞中に産生された（発現された）対応するヒトＩＤＵとして少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の数または量のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを有する。特定の態様では、１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンは、哺乳動物細胞、任意選択的にヒト細胞中に産生された（発現された）対応するヒトＩＤＵのＮ結合型オリゴマンノースグリカンと比較して、実質的に脱リン酸化されている。特定の態様では、１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％脱リン酸化されている。いくつかの態様では、ヒトＩＤＵは、哺乳動物細胞中に産生された対応するＩＤＵと比較して、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を実質的に含まない。
一定の実施形態では、対応するタンパク質は、野生型タンパク質（ヒト野生型ＩＤＳまたはＩＤＳタンパク質など）である。特定の実施形態では、実質的に脱リン酸化されたＩＤＳの対応するタンパク質は、ヒト細胞株、任意選択的にＨＴ−１０８０線維肉腫細胞株中に産生されたイデュルスルファーゼである。
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＨＴ−１０８０線維肉腫細胞から選択される。
ｐ９７結合体を形成するために本明細書中に記載の実質的に脱リン酸化されたＬＳＤポリペプチドに共有結合性に連結されたか作動可能に連結されたｐ９７ポリペプチドを含む結合体も含まれる。
組成物（本明細書中に記載の単離リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）ポリペプチドまたはｐ９７結合体を含む薬学的組成物が含まれる）も含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は薬学的に許容され得るキャリアを含む。
一定の実施形態は、本明細書中に記載の組成物（例えば、薬学的組成物）、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質、または結合体を被験体に投与する工程を含む、処置を必要とする被験体におけるリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）の処置方法を含む。
一定の方法では、ＬＳＤは、１つ以上のムコ多糖体沈着症ＩＩ型（ハンター症候群）、ムコ多糖体沈着症Ｉ型（ハーラー症候群）、アスパルチルグルコサミン尿、コレステロールエステル蓄積症、ウォルマン病、シスチン蓄積症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ファーバー病、フコース蓄積症、ガラクトシアリドーシスＩ型／ＩＩ型、ゴーシェ病Ｉ型／ＩＩ型／ＩＩＩ型、ゴーシェ病、グロボイド細胞白質ジストロフィ（ｇｌｏｂｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｅｕｃｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、クラッベ病、糖原貯蔵障害ＩＩ、ポンぺ病、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ型／ＩＩ型／ＩＩＩ型、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩ型、テイ・サックス病、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩＩ型、サンドホフ病、ＧＭ２−ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシスＩ型／ＩＩ型、β−マンノシドーシス、異染性白質ジストロフィ（ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｃｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ムコリピドーシスＩ型、シアリドーシスＩ型／ＩＩ型ムコリピドーシスＩＩ型／ＩＩＩ型Ｉ細胞病、ムコリピドーシスＩＩＩＣ型偽性ハーラーポリジストロフィ、ムコ多糖体沈着症ＩＩＩＡ型、サンフィリッポ症候群、ムコ多糖体沈着症ＩＩＩＢ型、ムコ多糖体沈着症ＩＩＩＣ型、ムコ多糖体沈着症ＩＩＩＤ型、ムコ多糖体沈着症ＩＶＡ型、モルキオ症候群、ムコ多糖体沈着症ＩＶＢ型、ムコ多糖体沈着症ＶＩ型、ムコ多糖体沈着症ＶＩＩ型、スライ症候群、ムコ多糖体沈着症ＩＸ型、多発性スルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチノーシス、ＣＬＮ１バッテン病、ニーマン・ピック病ＮＢ型、ニーマン・ピック病、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、濃化異骨症、シンドラー病Ｉ型／ＩＩ型、シンドラー病、およびシアル酸蓄積症から選択される。
特定の実施形態では、ＬＳＤはムコ多糖体沈着症ＩＩ型（ハンター症候群）であり、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質はヒトイズロン酸−２−スルファターゼである。
他の実施形態では、ＬＳＤはムコ多糖体沈着症Ｉ型（ハーラー症候群）であり、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質はヒトＬ−イズロニダーゼである。
いくつかの実施形態では、ＬＳＤが中枢神経系（ＣＮＳ）合併症を有するか、被験体がＬＳＤのＣＮＳ合併症を発症するリスクがある。
実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質（ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）など）を産生する方法であって、哺乳動物細胞株、任意選択的にヒト細胞株中でＬＳＤタンパク質を組換え的に産生する工程、および組換え的に産生されたＬＳＤタンパク質を、同一の細胞株中で産生された未処置ＬＳＤタンパク質と比較してＬＳＤタンパク質のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）含有量が少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％減少するのに十分な時間ホスファターゼで処理する工程を含む、方法も含まれる。特定の実施形態では、ＬＳＤタンパク質はヒトＩＤＳまたはヒトＩＤＵである。
特定の実施形態では、ヒト細胞株はＨＴ−１０８０線維肉腫細胞株であり、タンパク質はヒトＩＤＳである。いくつかの態様では、ヒトＩＤＳは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、配列番号２のアミノ酸配列からなる。特定の態様では、ホスファターゼは仔牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）である。特定の態様では、ＣＩＰはアクリルビーズに結合している。
いくつかの実施形態では、ＬＳＤタンパク質（ヒトＩＤＳなど）は、ヒトｐ９７配列に融合している。一定の方法は、ＬＳＤタンパク質（ヒトＩＤＳなど）をヒトｐ９７ポリペプチドに結合体化する工程をさらに含む。
特定の実施形態は、ヒトＩＤＳポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列またはその改変体を含むか配列番号２のアミノ酸配列またはその改変体からなり、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）含有量が約１．２ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質未満である、単離ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）ポリペプチドを含む。特定の態様では、Ｍ６Ｐ含有量は、約０．５ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質未満である。いくつかの態様では、Ｍ６Ｐ含有量は、約０．１５ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質または約０．１５ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質未満である。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照した際に明らかとなるであろう。本明細書中に開示の全ての文献は、それぞれが個別に援用されたかのように、その全体が本明細書中で参考として援用される。
特定の実施形態では、本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
哺乳動物細胞中に発現された（または産生された）対応するＬＳＤタンパク質と比較して実質的に脱リン酸化された単離リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）ポリペプチド。
（項目２）
前記ＬＳＤポリペプチドが少なくとも約７５％脱リン酸化されている、項目１に記載の単離ポリペプチド。
（項目３）
前記ＬＳＤポリペプチドが少なくとも約８０％脱リン酸化されている、項目１に記載の単離ポリペプチド。
（項目４）
前記ＬＳＤポリペプチドが１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを含む、前記項目のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
（項目５）
前記ＬＳＤポリペプチドが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを含む、項目１に記載の単離ポリペプチド。
（項目６）
前記ＬＳＤポリペプチドが、対応するＬＳＤタンパク質として少なくとも約７５％の数または量のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを有する、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記ＬＳＤポリペプチドが、哺乳動物細胞中に発現された（または産生された）対応するＬＳＤタンパク質と比較して、Ｎ結合型オリゴマンノースグリカンのマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を実質的に含まない、項目４〜６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
（項目８）
前記ＬＳＤポリペプチドが、酸性ホスファターゼまたはアルカリホスファターゼでの酵素消化によって脱リン酸化される、前記項目のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
（項目９）
前記ＬＳＤポリペプチドが、以下のものの活性フラグメントおよび改変体を含む、イズロン酸−２−スルファターゼ、Ｌ−イズロニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、酸性リパーゼ、システイン輸送体、Ｌａｍｐ−２、α−ガラクトシダーゼＡ、酸性セラミダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、ＧＭ２−ガングリオシドアクチベーター（ＧＭ２Ａ）、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、サポシンＢ、ノイラミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼホスホトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼγ−サブユニット、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ：Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、ガラクトース６−スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、スルファターゼ、パルミトイルプロテインチオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、カテプシンＡ、カテプシンＫ、α−ガラクトシダーゼＢ、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、シアリン、およびシアル酸輸送体のうちの１つ以上から選択される、前記項目のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
（項目１０）
前記ＬＳＤポリペプチドがヒトポリペプチドである、前記項目のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
（項目１１）
前記ＬＳＤポリペプチドが、ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、またはその活性フラグメントもしくは改変体である、前記項目のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
（項目１２）
前記ヒトＩＤＳが配列番号２と少なくとも９０％同一である、項目１１に記載の単離ポリペプチド。
（項目１３）
前記ヒトＩＤＳが１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを含む、項目１２に記載の単離ポリペプチド。
（項目１４）
前記ヒトＩＤＳが、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを含む、項目１３に記載の単離ポリペプチド。
（項目１５）
前記ヒトＩＤＳが、哺乳動物細胞、任意選択的にヒト細胞中に産生された（発現された）対応する野生型ヒトイズロン酸−２−スルファターゼとして少なくとも約７５％の数または量のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを有する、項目１３または１４に記載の単離ポリペプチド。
（項目１６）
前記１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンが、哺乳動物細胞、任意選択的にヒト細胞中に産生された（発現された）対応するヒトＩＤＳのＮ結合型オリゴマンノースグリカンと比較して実質的に脱リン酸化されている、項目１３〜１５のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
（項目１７）
前記１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンが少なくとも７５％脱リン酸化されている、項目１６に記載の単離ポリペプチド。
（項目１８）
前記ヒトＩＤＳが、哺乳動物細胞中で産生された対応するＩＤＳと比較してマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を実質的に含まない、項目１６または１７に記載の単離ポリペプチド。
（項目１９）
Ｍ６Ｐ含有量が約１．２ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質未満である、項目１８に記載の単離ポリペプチド。
（項目２０）
Ｍ６Ｐ含有量が約０．５ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質未満である、項目１９に記載の単離ポリペプチド。
（項目２１）
Ｍ６Ｐ含有量が約０．１５ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質未満である、項目２０に記載の単離ポリペプチド。
（項目２２）
前記ＬＳＤポリペプチドが、ヒトα−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵ）またはその活性フラグメントもしくは改変体である、項目１〜１０のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
（項目２３）
前記ヒトＩＤＵが配列番号３と少なくとも９０％同一である、項目２２に記載の単離ポリペプチド。
（項目２４）
前記ヒトＩＤＵが１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを含む、項目２２または２３に記載の単離ポリペプチド。
（項目２５）
前記ヒトＩＤＵが、１、２、３、４、５、または６個のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを含む、項目２４に記載の単離ポリペプチド。
（項目２６）
前記ヒトＩＤＵが、哺乳動物細胞、任意選択的にヒト細胞中に産生された（発現された）対応するヒトＩＤＵとして少なくとも約７５％の数または量のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを有する、項目２４または２５に記載の単離ポリペプチド。
（項目２７）
前記１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンが、哺乳動物細胞、任意選択的にヒト細胞中に産生された（発現された）対応するヒトＩＤＵのＮ結合型オリゴマンノースグリカンと比較して、実質的に脱リン酸化されている、項目２４〜２６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
（項目２８）
前記１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンが少なくとも７５％脱リン酸化されている、項目２７に記載の単離ポリペプチド。
（項目２９）
前記ヒトＩＤＵが、哺乳動物細胞中に産生された対応するＩＤＵと比較して、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を実質的に含まない、項目２８に記載の単離ポリペプチド。
（項目３０）
前記対応するタンパク質が野生型タンパク質である、前記項目のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
（項目３１）
前記対応するタンパク質がヒト細胞株中に産生されたイデュルスルファーゼである、前記項目のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
（項目３２）
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＨＴ−１０８０線維肉腫細胞から選択される、前記項目のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
（項目３３）
ｐ９７結合体を形成するために前記項目のいずれか１項に記載の実質的に脱リン酸化されたＬＳＤポリペプチドに共有結合性に連結されたか作動可能に連結されたｐ９７ポリペプチドを含む結合体。
（項目３４）
前記項目のいずれか１項に記載の単離リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）ポリペプチドまたはｐ９７結合体を含む組成物。
（項目３５）
薬学的に許容され得るキャリアを含む、項目３４に記載の組成物。
（項目３６）
項目３４または３５に記載の組成物を被験体に投与する工程を含む、処置を必要とする被験体におけるリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を処置する方法。
（項目３７）
前記ＬＳＤが、１つ以上のムコ多糖体沈着症ＩＩ型（ハンター症候群）、ムコ多糖体沈着症Ｉ型（ハーラー症候群）、アスパルチルグルコサミン尿、コレステロールエステル蓄積症、ウォルマン病、シスチン蓄積症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ファーバー病、フコース蓄積症、ガラクトシアリドーシスＩ型／ＩＩ型、ゴーシェ病Ｉ型／ＩＩ型／ＩＩＩ型、ゴーシェ病、グロボイド細胞白質ジストロフィ（ｇｌｏｂｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｅｕｃｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、クラッベ病、糖原貯蔵障害ＩＩ、ポンぺ病、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ型／ＩＩ型／ＩＩＩ型、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩ型、テイ・サックス病、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩＩ型、サンドホフ病、ＧＭ２−ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシスＩ型／ＩＩ型、β−マンノシドーシス、異染性白質ジストロフィ（ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｃｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ムコリピドーシスＩ型、シアリドーシスＩ型／ＩＩ型ムコリピドーシスＩＩ型／ＩＩＩ型Ｉ細胞病、ムコリピドーシスＩＩＩＣ型偽性ハーラーポリジストロフィ、ムコ多糖体沈着症ＩＩＩＡ型、サンフィリッポ症候群、ムコ多糖体沈着症ＩＩＩＢ型、ムコ多糖体沈着症ＩＩＩＣ型、ムコ多糖体沈着症ＩＩＩＤ型、ムコ多糖体沈着症ＩＶＡ型、モルキオ症候群、ムコ多糖体沈着症ＩＶＢ型、ムコ多糖体沈着症ＶＩ型、ムコ多糖体沈着症ＶＩＩ型、スライ症候群、ムコ多糖体沈着症ＩＸ型、多発性スルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチノーシス、ＣＬＮ１バッテン病、ニーマン・ピック病ＮＢ型、ニーマン・ピック病、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、濃化異骨症、シンドラー病Ｉ型／ＩＩ型、シンドラー病、およびシアル酸蓄積症から選択される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記ＬＳＤがムコ多糖体沈着症ＩＩ型（ハンター症候群）であり、前記実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質がヒトイズロン酸−２−スルファターゼである、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記ＬＳＤがムコ多糖体沈着症Ｉ型（ハーラー症候群）であり、前記実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質がヒトＬ−イズロニダーゼである、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記ＬＳＤが中枢神経系（ＣＮＳ）合併症を有するか、前記被験体が前記ＬＳＤのＣＮＳ合併症を発症するリスクがある、項目３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
実質的に脱リン酸化されたヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）を産生する方法であって、ヒト細胞株中で前記ヒトＩＤＳを組換え的に産生する工程、組換え的に産生された前記ヒトＩＤＳを、同一のヒト細胞株中で産生された非処理ヒトＩＤＳと比較して前記ヒトＩＤＳのマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）含有量が少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％減少するのに十分な時間ホスファターゼで処理する工程を含む、方法。
（項目４２）
前記ヒト細胞株がＨＴ−１０８０線維肉腫細胞株である、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記ＩＤＳが、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、配列番号２のアミノ酸配列からなる、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記ホスファターゼが仔牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）である、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
前記ＣＩＰがアクリルビーズに結合している、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記ヒトＩＤＳをヒトｐ９７配列に融合する、項目４１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
前記ＩＤＳをヒトｐ９７ポリペプチドに結合体化する工程をさらに含む、項目４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４８）
単離ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）ポリペプチドであって、前記ヒトＩＤＳポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列またはその改変体を含むか配列番号２のアミノ酸配列またはその改変体からなり、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）含有量が約１．２ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質未満である、単離ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）ポリペプチド。
（項目４９）
前記Ｍ６Ｐ含有量が約０．５ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質未満である、項目４８に記載の単離ポリペプチド。
（項目５０）
前記Ｍ６Ｐ含有量が約０．１５ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質または約０．１５ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質未満である、項目４８に記載の単離ポリペプチド。
図１は、静脈内注射後のマウスの脳実質中の試験タンパク質の蓄積レベルを示す（ＩＤＳ、イズロン酸−２−スルファターゼ；ｄｐＩＤＳ、脱リン酸化イズロン酸−２−スルファターゼ；ＭＴｆ−ＩＤＳ、ｐ９７−ＩＤＳ結合体；ＭＴｆ−ｄｐＩＤＳ、ｐ９７−ｄｐＩＤＳ結合体）。 図２は、静脈内感染後のマウスの脳実質（ＢＢＢの内側）と脳毛細血管（ＢＢＢの外側）との間の試験タンパク質の分布を示す。 図３は、以下の３つのＮ結合型グリカンを示す：マンノース残基のみがコアに付着したオリゴマンノースグリカン；Ｎ−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃＴ）がコアに付着した複合グリカン；およびマンノース残基のみがコアのＭａｎα１−６アームに付着し、１つまたは２つのアンテナがＭａｎα１−３アーム上に存在するハイブリッドグリカン。 図４は、シス・ゴルジ内のオリゴマンノースＮ−グリカン上のマンノース残基のＣ−６にＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐを獲得するリソソームタンパク質の産生を示す。Ｎ−アセチル−グルコサミンを、トランス・ゴルジ内でグリコシダーゼによって除去してリン酸残基を露呈させる。 図５は、ｐ９７（ＭＴｆ）への結合体化を含むか含まない（ｗｉｔｈｏｕｔ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ）脳実質内のＩＤＳおよびｄｐＩＤＳの分布を示す。 図６は、イデュルスルファーゼ（ヒトＩＤＳ）のアミノ酸配列（配列番号２）を示し、Ｎ結合型グリコシル化部位を示す。
発明の詳細な説明
本発明の実施形態は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）タンパク質（イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）など）の脱リン酸化形態が、通常のリン酸化タンパク質と比較して血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して中枢神経系（ＣＮＳ）組織内に移行する能力が有意に増加させたという発見に一部基づく。ｐ９７（メラノトランスフェリン）ポリペプチド配列への結合体化により、ＢＢＢを通過したＣＮＳ組織内への脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質の移行をさらに改善することができる。
多数のリソソーム酵素は、リン酸化Ｎ−グリカンの生成を含む特殊な輸送経路によってリソソームを標的にする。リン酸化工程は、典型的には、シス・ゴルジで起こり、オリゴマンノースＮ結合型グリカンのマンノース残基のＣ−６へのＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐの移行を含む。トランス・ゴルジ内のグリコシダーゼがＮ−アセチルグルコサミンを除去してマンノース−６−リン酸残基を生成する。かかる残基がレクチン受容体（マンノース−６−リン酸受容体）によって認識されてリソソーム酵素を酸性化区画内に輸送し、この区画でこの酵素が受容体から放出され、最終的にリソソームに移行する。ここで、例えば酸性ホスファターゼとのインキュベーションによるオリゴマンノースＮ結合型グリカンからのリン酸基の除去により、ＢＢＢを通過する移行が増加するが依然として中枢神経系細胞内のリソソーム区画に十分に輸送される方法でＬＳＤタンパク質（イズロン酸−２−スルファターゼなど）の薬物動態学的性質が変化するということを予想外に見出した。
したがって、本明細書中に記載の脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質および関連するｐ９７結合体は、酵素代償療法（ＥＲＴ）によるリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）（神経系またはＣＮＳ区画を有するか有するリスクの有るＬＳＤが含まれるが、これらに限定されない）の処置の改善で種々の用途を見出すことができる。特定の実施形態では、ＬＳＤタンパク質は、ヒトｐ９７ポリペプチドに任意選択的に結合体化されたＩＤＳの実質的に脱リン酸化されたバージョンであり、このバージョンは、通常のリン酸化されたタンパク質を使用するＥＲＴと比較して、例えば、ハンター症候群の処置を改善するために使用することができる。他の実施形態では、ＬＳＤタンパク質は、ヒトｐ９７ポリペプチドに任意選択的に結合体化されたＩＤＵの実質的に脱リン酸化されたバージョンであり、このバージョンは、通常のリン酸化されたタンパク質を使用するＥＲＴと比較して、例えば、ハーラー症候群の処置を改善するために使用することができる。
他の利点および利益は、当業者に明らかであろう。
定義
他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する当業者によって一般に理解される意味を有する。本明細書中に記載の方法および材料と類似するか等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。本発明の目的のために、以下の用語を以下のように定義する。
冠詞「ａ」および「ａｎ」を、本明細書中で、冠詞の文法上の目的語が１つまたは１つを超える（すなわち、少なくとも１つ）をいうために使用する。例として、「要素」は、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
「約」は、基準の量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、含量、重量、または長さの３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％まで変化する量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、含量、重量、または長さを意味する。
本明細書中で使用する場合、用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸の両方ならびにアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を意味することを意図する。天然に存在するアミノ酸には、タンパク質生合成中に利用される２０（Ｌ）−アミノ酸ならびに例えば４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、デスモシン、イソデスモシン、ホモシステイン、シトルリン、およびオルニチンなどの他のアミノ酸が含まれる。天然に存在しないアミノ酸には、例えば、当業者に公知の（Ｄ）−アミノ酸、ノルロイシン、ノルバリン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、およびエチオニンなどが含まれる。アミノ酸アナログには、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸の修飾形態が含まれる。かかる修飾物には、例えば、アミノ酸上の化学基および化学部分の置換もしくは交換またはアミノ酸の誘導体化による修飾物が含まれ得る。アミノ酸模倣物には、例えば、基準アミノ酸の電荷および電荷間隔の特徴などの機能的に類似の性質を示す有機構造が含まれる。例えば、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）を模倣する有機構造は、類似の分子空間内に存在する正電荷部分を有し、天然に存在するＡｒｇアミノ酸の側鎖のｅ−アミノ基と同一の可動度を有するであろう。模倣物には、アミノ酸またはアミノ酸官能基の最適な間隔および電荷相互作用を維持するための制限された構造物も含まれる。当業者は、どの構造が機能的に等価なアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を構成するのかを承知しているか決定することができる。
本明細書を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、言及した工程もしくは要素または工程もしくは要素の群を含むが、任意の他の工程もしくは要素または工程もしくは要素の群を排除しないことを意味すると理解されるであろう。「〜からなる」は、句「〜からなる」に続くあらゆる用語を含み、且つそれに制限されることを意味する。したがって、句「〜からなる」は、列挙した要素が必要または必須であり、他の要素が存在できないことを示す。「〜本質的になる」は、この句の後に列挙された任意の要素を含み、且つ、列挙した要素の開示で特定された活性または作用に干渉も寄与もしない他の要素に制限されることを意味する。したがって、句「〜本質的になる」は、列挙した要素が必要とされるか必須であるが、他の要素が任意選択的であり、他の要素が列挙した要素の活性または作用に実質的に影響を及ぼすかどうかに依存して存在しても存在しなくても良いことを示す。
用語「結合体」は、薬剤または他の分子（例えば、生物学的に活性な分子）のｐ９７ポリペプチドへの共有結合的または非共有結合的な付着または連結の結果として形成された物質をいうことを意図する。結合体ポリペプチドの一例は、「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」（すなわち、元は個別のポリペプチドをコードする２つ以上のコード配列の連結によって作製されたポリペプチド）であり、連結されたコード配列の翻訳によって典型的には各々の個別のポリペプチド由来の機能的性質を有する単一の融合ポリペプチドが得られる。
本明細書中で使用する場合、用語「機能」および「機能的な」などは、生物学的、酵素的、または治療的な機能をいう。
用語「グリカン」は、通常はモノサッカリドのＯ−グリコシド連結を含むポリサッカリドまたはオリゴサッカリドをいう。グリカンはモノサッカリド残基のホモポリマーまたはヘテロポリマーであり得、そして／または直鎖または分岐鎖であり得る。グリコシル化は、グリカンがタンパク質の官能基に付着される同時翻訳反応または翻訳後反応を含む。タンパク質会合グリカンの例には、Ｎ結合型グリカン、Ｏ結合型グリカン、ホスホグリカン、Ｃ結合型グリカン、およびグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アンカーが含まれる。Ｎ結合型グリカンはアスパラギン側鎖またはアルギニン側鎖の窒素に付着し、Ｏ結合型グリカンはセリン側鎖、トレオニン側鎖、チロシン側鎖、ヒドロキシリジン側鎖、またはヒドロキシプロリン側鎖のヒドロキシ酸素に付着する。Ｎ結合型グリカンは共通のコア糖配列Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを共有し、以下の３つの型に分類される：（１）マンノース残基のみがコアに付着しているオリゴマンノース；（２）Ｎ−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃＴ）から始まる「アンテナ」がコアに付着している複合体；および（３）マンノース残基のみがコアのＭａｎα１−６アームに付着し、且つ１つまたは２つのアンテナがＭａｎα１−３アーム上に存在するハイブリッド（図３を参照のこと）。図４は、シス・ゴルジ内のオリゴマンノースＮ−グリカン上のマンノース残基のＣ−６にＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐを獲得するリソソームタンパク質（例えば、ＬＳＤタンパク質）の産生を示し；Ｎ−アセチル−グルコサミンを、トランス・ゴルジ内でグリコシダーゼによって除去し、それにより、マンノース−６−リン酸残基が露呈され、これがマンノース−６−リン酸受容体によって認識されて酸性化プレリソソーム区画に進行する。
「相同性」は、同一であるか、保存的置換を構成するアミノ酸数の百分率をいう。相同性を、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒａｕｘら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１２，３８７−３９５，１９８４）（本明細書中で参考として援用される）などの配列比較プログラムを使用して決定することができる。この方法では、本明細書中に引用したものと類似するか実質的に異なる長さの配列を、例えば、ＧＡＰによって使用される比較アルゴリズムによるアラインメントへのギャップ（かかるギャップは決定されている）の挿入によって比較することができる。
「単離された」は、未変性の状態で通常は材料に付随する成分を実質的または本質的に含まない材料を意味する。例えば、「単離ペプチド」または「単離ポリペプチド」などは、本明細書中で使用する場合、その天然の細胞環境および他の細胞成分との会合（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏ基質と有意に会合していない）からのペプチド分子またはポリペプチド分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ単離および／または精製を含む。
用語「連結」、「リンカー」、「リンカー部分」、または「Ｌ」を、目的の薬剤からｐ９７ポリペプチドフラグメントを分離するためか、第１の薬剤を別の薬剤から分離するために（例えば、２つ以上の薬剤が連結してｐ９７結合体を形成する場合）使用することができるリンカーをいうために本明細書中で使用する。リンカーは、生理学的に安定であり得るか、酵素分解性リンカー（例えば、タンパク質分解性リンカー）などの放出可能なリンカーを含むことができる。一定の態様では、リンカーは、例えば、ｐ９７融合タンパク質の一部としてのペプチドリンカーであり得る。いくつかの態様では、リンカーは、非ペプチドリンカーまたは非タンパク質リンカーであり得る。いくつかの態様では、リンカーは、ナノ粒子などの粒子であり得る。
用語「調整」および「変化」には、コントロールと比較して統計的に有意なまたは生理学的に有意な量または程度の「増加」、「増強」、または「刺激」および「減少」または「軽減」が含まれる。「増加」量、「刺激」量、または「増強」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、組成物の非存在下（例えば、本発明の結合体のポリペプチドの非存在下）またはコントロールの組成物、サンプル、もしくは試験被験体による産生量の１．１倍、１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、またはそれを超える（例えば、５００倍、１０００倍）（その間の全ての整数および小数点ならびに１超（例えば、１．５、１．６、１．７．１．８など）が含まれる）増加が含まれ得る。「減少」量または「軽減」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、組成物の非存在下またはコントロール組成物による産生量の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少（その間の全ての整数が含まれる）が含まれ得る。１つの非限定的な例として、コントロールは、リソソーム貯蔵タンパク質の通常のリン酸化バージョンに対する本明細書中に記載の実質的に脱リン酸化された（ｄｐ）リソソーム貯蔵タンパク質またはポリペプチドのみに対するｐ９７−ポリペプチド結合体の活性（血液脳関門を通過する輸送／送達の量もしくは速度、中枢神経系組織への分布の速度および／もしくはレベル、ならびに／または血漿、中枢神経系組織、もしくは任意の他の全身または末梢の非中枢神経系組織のＣｍａｘなど）を比較することができる。比較および「統計的に有意な」量の他の例を、本明細書中に記載している。
一定の実施形態では、組成物中の任意の所与のポリペプチド（例えば、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質、ｐ９７結合体）の「純度」を、具体的に定義することができる。例えば、一定の組成物は、例えば、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）（化合物を分離、同定、および定量するために生化学および分析化学で頻繁に使用されるカラムクロマトグラフィの周知の形態）（決して制限されない）で測定した場合に純度が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（その間の全ての小数が含まれる）であるポリペプチドを含むことができる。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」および「酵素」を、アミノ酸残基のポリマーならびにその改変体および合成アナログをいうために本明細書中で交換可能に使用する。したがって、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が合成の天然に存在しないアミノ酸（対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログなど）であるアミノ酸ポリマーおよび天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用する。本明細書中に記載のポリペプチドは、産物の特定の長さに制限されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質はポリペプチドの定義内に含まれ、他で具体的に示さない限り、かかる用語を、本明細書中で交換可能に使用することができる。本明細書中に記載のポリペプチドはまた、発現後修飾（グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化など）ならびに天然に存在するおよび天然に存在しない当該分野で公知の他の修飾を含むことができる。ポリペプチドは、タンパク質全体またはそのサブシーケンス、フラグメント、改変体、または誘導体であり得る。
「生理学的に切断可能な」または「加水分解可能な」または「分解可能な」結合は、生理学的条件下で水と反応する（すなわち、加水分解される）結合である。結合が水中で加水分解する傾向は、２つの中心原子を結びつける一般的な連結型だけでなく、これらの中心原子に付着する置換基にも依存するであろう。適切な加水分解的に不安定か弱い連結には、以下が含まれるが、これらに限定されない：カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、チオエステル、チオールエステル、カルボナート、ならびにヒドラゾン、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド。
「放出可能なリンカー」には、生理学的に切断可能なリンカーおよび酵素分解性リンカーが含まれるが、これらに限定されない。したがって、「放出可能なリンカー」は、自発性加水分解または生理学的条件下でのいくつかの他の機構（例えば、酵素触媒、酸触媒、塩基触媒など）による切断のいずれかを経得るリンカーである。例えば、「放出可能なリンカー」は、駆動力として塩基でプロトン（例えば、イオン化水素原子、Ｈα）が引き抜かれる脱離反応に関与し得る。本明細書中の目的のために、「放出可能なリンカー」は、「分解性リンカー」と同義である。「酵素分解性連結」は、連結（例えば、１つ以上の酵素酵素（例えば、ペプチダーゼまたはプロテアーゼ）による分解に供されるアミノ酸配列）を含む。特定の実施形態では、放出可能なリンカーのｐＨ７．４、２５℃（例えば、生理学的ｐＨ、ヒトの体温（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ）での半減期は、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、または約９６時間またはそれ未満である。
用語「基準配列」は、一般に、別の配列と比較される核酸コード配列（すなわち、アミノ酸配列）をいう。本明細書中に記載の全てのポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列（名称によって記載されている配列および配列表中に記載の配列が含まれる）が基準配列として含まれる。
用語「配列同一性」（例えば、「〜と５０％同一の配列」を含む）は、本明細書中で使用する場合、配列が比較ウィンドウにわたってヌクレオチド対ヌクレオチドを基本とするかアミノ酸対アミノ酸を基本として同一である程度をいう。したがって、「配列同一率」を、比較ウィンドウにわたる最適にアラインメントした２つの配列の比較、両方の配列中に同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が生じる位置の数を決定して適合位置数を得ること、適合位置数を比較ウィンドウ中の総位置数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割ること、および結果に１００を掛けて配列同一率を得ることによって計算することができる。典型的にはポリペプチド改変体が基準ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する、本明細書中に記載の任意の基準配列（例えば、配列表を参照のこと）と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列が同一のヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。
２つ以上のポリヌクレオチド間またはポリペプチド間の配列の関係を説明するために使用される用語には、「基準配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一率」および「実質的な同一性」が含まれる。「基準配列」は、少なくとも１２個であるが、頻繁には１５〜１８個、しばしば少なくとも２５個の長さのモノマー単位（ヌクレオチドおよびアミノ酸残基が含まれる）である。２つのポリヌクレオチドが、それぞれ、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で相違する配列を含むことができるので、２つ（またはそれを超える）ポリヌクレオチドの間の配列比較を、典型的には、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較して配列が類似する局所領域を同定および比較することによって行う。「比較ウィンドウ」は、２配列を最適にアラインメントした後にある配列を同数の連続する位置の基準配列と比較する少なくとも６個（通常は約５０個〜約１００個、より通常には約１００個〜約１５０個）の連続する位置の概念的セグメントをいう。比較ウィンドウは、基準配列（付加や欠失を含まない）と比較した場合に２配列の最適なアラインメントのために約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較ウィンドウのアラインメントに最適な配列アラインメントを、コンピュータ化されたアルゴリズムの実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）または観察および選択した任意の種々の方法によって作成された最良のアラインメント（すなわち、結果として比較ウィンドウにわたって最高の相同率が得られる）によって行うことができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９，１９９７に開示のプログラムのＢＬＡＳＴファミリーも参照することができる。配列分析の詳細な考察を、Ａｕｓｕｂｅｌら、 “Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，” Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，１９９４−１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ １５のＵｎｉｔ １９．３に見出すことができる。
「統計的に有意な」は、結果が偶然に起こった見込みが無いことを意味する。統計的有意性を、当該分野で公知の任意の方法によって決定することができる。一般的に使用されている有意性の基準には、ｐ値が含まれ、これは、帰無仮説が真実である場合に認められた事象が起こる頻度または確率である。得られたｐ値が有意水準より小さい場合、帰無仮説は棄却される。単純事例では、有意水準を０．０５以下のｐ値で定義する。
用語「溶解性」は、ポリペプチドなどの薬剤が液体溶媒に溶解して均一な溶液を形成する性質をいう。溶解性を、典型的には、溶媒の単位体積あたりの溶質の質量（溶媒１ｋｇあたりの溶質のｇ数、ｇ／ｄＬ（１００ｍＬ）、ｍｇ／ｍｌなど）、容積モル濃度、重量モル濃度、モル分率、または濃度の他の類似の記載のいずれかによる濃度として示す。１溶媒量あたりの溶解することができる溶質の最大平衡量は、特定の条件下（温度、圧力、ｐＨ、および溶媒の性質が含まれる）でのその溶媒への溶質の溶解性である。一定の実施形態では、溶解性を、生理学的ｐＨまたは他のｐＨ（例えば、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、またはｐＨ７．４）で測定する。一定の実施形態では、溶解性を、水またはＰＢＳもしくはＮａＣｌ（ＮａＰを含むか含まない）などの生理学的緩衝液中で測定する。特定の実施形態では、溶解性を、相対的により低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．０）および相対的により高い塩（例えば、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＮａＰ）で測定する。一定の実施形態では、溶解性を、血液または血清などの体液（溶媒）中で測定する。一定の実施形態では、温度はおよそ室温（例えば、約２０、２１、２２、２３、２４、２５℃）またはおよそ体温（約３７℃）であり得る。一定の実施形態では、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質またはｐ９７結合体の室温または約３７℃での溶解度は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、または３０ｍｇ／ｍｌである。
「被験体」には、本明細書中で使用する場合、本発明の実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質またはｐ９７結合体で処置または診断することができる症状を示すか、症状を示すリスクがある任意の動物が含まれる。適切な被験体（患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、家畜、および飼育動物またはペット（ネコまたはイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類、好ましくはヒト患者が含まれる。特定の実施形態では、被験体は、ハンター症候群などのリソソーム貯蔵障害を有する。
「実質的に」または「本質的に」は、ほぼ完全または十分であることを意味する（例えば、いくつかの所与の量の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）。いくつかの態様では、リソソーム貯蔵障害タンパク質は、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）中に産生された対応する野生型タンパク質と比較して実質的に脱リン酸化されている。
「実質的に含まない」は、所与の量がほぼ完全にまたは完全に存在しないことをいう（例えば、いくつかの所与の量の約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％未満）。例えば、一定の組成物は、細胞タンパク質、膜、核酸、内毒素、または他の夾雑物を「実質的に含まない」可能性がある。いくつかの態様では、リソソーム貯蔵障害タンパク質は、リン酸基を「実質的に含まない」。
「処置」または「処置すること」には、本明細書中で使用する場合、疾患または容態の症状または病態に及ぼす任意の所望の影響が含まれ、処置される疾患または容態の１つ以上の測定可能なマーカーの最小の変化または改善でさえ含まれ得る。「処置」または「処置すること」は、疾患もしくは容態またはその関連する症状の完全な根絶または治癒を必ずしも示さない。この処置を受ける被験体は、処置を必要とする任意の被験体である。臨床的改善の例示的なマーカーは、当業者に明らかであろう。
用語「野生型」は、天然に存在する供給源から単離した場合に遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物をいう。野生型の遺伝子または遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）は、集団中で最も頻繁に認められるものであり、したがって、遺伝子の「正常」形態または「野生型」形態が任意にデザインされる。
実質的に脱リン酸化されたリソソーム貯蔵障害タンパク質
上述の通り、本発明の実施形態は、実質的に脱リン酸化されたリソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）タンパク質または１つ以上のリソソーム蓄積症に関連するリソソームタンパク質を含む。例には、リソソームヒドロラーゼならびに老廃物および細胞デブリ（脂質、糖タンパク質、およびムコ多糖など）、膜貫通タンパク質、可溶性非酵素タンパク質、膜輸送タンパク質、ならびに酵素を翻訳後に修飾するタンパク質を代謝する他のリソソーム酵素が含まれる。
例示的なリソソームタンパク質またはＬＳＤタンパク質には、イズロン酸−２−スルファターゼ、Ｌ−イズロニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、酸性リパーゼ、システイン輸送体、Ｌａｍｐ−２、α−ガラクトシダーゼＡ、酸性セラミダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、ＧＭ２−ガングリオシドアクチベーター（ＧＭ２Ａ）、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、サポシンＢ、ノイラミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼホスホトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼγ−サブユニット、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ：Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、ガラクトース６−スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、スルファターゼ、パルミトイルプロテインチオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、カテプシンＡ、カテプシンＫ、α−ガラクトシダーゼＢ、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、シアリン、およびシアル酸輸送体が含まれる。特定の実施形態では、ＬＳＤタンパク質はヒトタンパク質である。
一定の実施形態では、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質は、対応するコントロールＬＳＤタンパク質と比較して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％（すなわち、完全に）脱リン酸化されている。
いくつかの実施形態では、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質は、リン酸基を実質的に含まない（例えば、ＬＳＤタンパク質は、対応するコントロールＬＳＤタンパク質の約１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％未満のリン酸基を有する）。タンパク質リン酸化の変化を、当該分野の日常的な技術（全分子量を測定するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、同位体標識、および質量分析（Ｂｏｎｅｎｆａｎｔら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．１００：８８０−８８５，２００３を参照のこと）；リンタンパク質特異的抗体を使用したウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡ；ならびに蛍光リン酸化センサー色素を使用したタンパク質リン酸化状態の定量分析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰｒｏｂｅｓのＰｒｏ−Ｑ Ｄｉａｍｏｎｄ（登録商標）色素を参照のこと）など）にしたがって測定することができる。
対応する「コントロール」タンパク質には、通常または野生型のグリコシル化機構およびリン酸化機構を有する哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞）中で組換え的に産生され、好ましくは例えばグリコシダーゼまたはホスファターゼなどの酵素で処置されていない同型のタンパク質（例えば、同一の属および／または種由来の同一のタンパク質名、同一またはほぼ同一のアミノ酸配列）が含まれる。いくつかの態様では、対応するコントロールタンパク質は、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質の野生型バージョンである。特定の実施形態では、例えば、ＬＳＤタンパク質がイズロン酸−２−スルファターゼである場合、対応するコントロールタンパク質は、ヒト細胞（ＨＴ−１０８０ヒト線維肉腫細胞株など）中で産生されたイデュルスルファーゼ（Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標））である（Ｇａｒｃｉａら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．９１：１８３−９０，２００７；および図５を参照のこと）。
脱リン酸化ＬＳＤタンパク質を、当該分野の種々の技術にしたがって調製することができる。例えば、多数のリン酸基がＮ結合型オリゴマンノースグリカン上のマンノース−６−リン酸残基に会合するので、ＬＳＤタンパク質上のグリカン数またはグリコシル化度の減少は、リン酸基数またはリン酸化度を同様に減少させ得る。したがって、グリカン会合リン酸化レベルの減少を、例えば、潜在的なグリコシル化部位に会合する１つ以上の残基（例えば、Ｎ結合型グリコシル化部位中の残基（Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）など）の変異、酵素的脱グリコシル化（例えば、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）、マンノシダーゼでの処置）、Ｎ−グリカンプロセシングを阻害するための細胞培養培地または細胞培養条件の操作、および／またはグリコシル化能力が変化したか、減少したか、持たない哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または他の細胞型中でのＬＳＤタンパク質の組換え産生によって行うことができる（例えば、Ｈｏｓｓｌｅｒら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９：９３６−９４９，２００９；およびＣｕｍｍｉｎｇｓ ａｎｄ Ｅｓｋｏら，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００９（第８章、第４６章、および第５０章を含む）を参照のこと）。グリコシル化能力が有意に減少した細胞の例には、大腸菌などの多数の細菌が含まれる。
しかし、一定の例では、そのグリコシル化状態を有意に減少させることなく（すなわち、グリカン（Ｎ結合型オリゴマンノースグリカンが含まれる）の数または量を有意に減少させることなく）ＬＳＤタンパク質のリン酸化を減少させることが好ましい。それ故、一定の実施形態では、ＬＳＤタンパク質は、対応するコントロールタンパク質と比較して実質的に脱リン酸化されているが、コントロールタンパク質と同一または実質的に同一のグリカン数またはグリコシル化度を有する。特定の実施形態では、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質は、対応するコントロールタンパク質と同一または実質的に同一のＮ結合型オリゴマンノースグリカンの数または程度を有する。例には、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質が対応するコントロールタンパク質として少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％のグリカン（例えば、Ｎ結合型オリゴマンノースグリカン）の数またはグリコシル化度を有することが含まれる。グリコシル化状態を、当該分野の種々の技術（全分子量を測定するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ＰＮＧアーゼＦ（ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ）でのタンパク質の酵素前処理および蛍光二次元ゲルまたは二次元ゲルウェスタンブロッティングを組み合わせた蛍光二次元ベースの方法（Ｇｒａｈａｍら，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．８：４９１９−３０，２００８を参照のこと）、ならびにＮ結合型糖タンパク質の質量分析ベースの定量方法（Ｒｅｂｅｃｃｈｉら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．８：２６９−２７７（９），２０１１を参照のこと）など）にしたがって測定することができる。
これらおよび関連する実施形態では、特定のグリカン（例えば、Ｎ結合型オリゴマンノースグリカン；図４を参照のこと）を、対応するコントロールタンパク質のグリカンと比較して実質的に脱リン酸化することができる。例えば、一定の実施形態では、ＬＳＤタンパク質のグリカン（例えば、Ｎ結合型オリゴマンノースグリカン）は、対応するコントロールＬＳＤタンパク質のグリカンと比較して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％（すなわち、完全に）脱リン酸化されている。いくつかの態様では、ＬＳＤタンパク質のグリカン（例えば、Ｎ結合型オリゴマンノースグリカン）は、リン酸基を実質的に含まない（例えば、対応するコントロールＬＳＤタンパク質のグリカンの約１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％未満のリン酸基を有する）。一定の実施形態では、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質は、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を実質的に含まない（例えば、対応するコントロールＬＳＤタンパク質の約１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％未満のＭ６Ｐ残基を有する）。
いくつかの実施形態では、グリコシル化およびリン酸化されたＬＳＤタンパク質を、哺乳動物細胞または他の細胞中で産生し、次いで、１つ以上のホスファターゼにてｉｎ ｖｉｔｒｏで処置して任意選択的にグリカン数またはグリコシル化度を有意に減少させることなくリン酸基（例えば、Ｎ結合型オリゴマンノースグリカンに会合したマンノース−６−リン酸残基）の数を減少させることができる（実施例１を参照のこと）。ホスファターゼの一般例には、酸性ホスファターゼおよびアルカリホスファターゼが含まれる。酸性ホスファターゼの例には、前立腺酸性ホスファターゼ、リソソーム酸性ホスファターゼ、赤血球酸性ホスファターゼ、マクロファージ酸性ホスファターゼ、破骨細胞酸性ホスファターゼ（ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、およびジャガイモ酸性ホスファターゼが含まれる。一般的に使用されているアルカリホスファターゼの例には、エビアルカリホスファターゼ、仔牛腸アルカリホスファターゼ、胎盤アルカリホスファターゼ、および分泌型アルカリホスファターゼ（すなわち、胎盤アルカリホスファターゼのＣ末端短縮物）が含まれる。
いくつかの態様では、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質は、ヒトイズロニダーゼ（α−Ｌ−イズロニダーゼ；ＩＤＵ）、またはその活性フラグメントもしくは改変体である。イズロニダーゼは、グリコサミノグリカン（デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸など）の生成に関与するリソソーム酵素であり、その欠損はＭＰＳ Ｉ（すわなち、ハーラー症候群）に関連する。配列番号３は、ヒトイズロニダーゼの一次アミノ酸配列を提供する。
ヒトＩＤＵは、６つの潜在的なＮ結合型グリコシル化部位（主に、「複合型」オリゴサッカリド）を有し、そのうちの少なくとも２つがマンノース−６−リン酸化されていることが示されている（Ｂｒｏｏｋｓら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．１１：７４１−７５０，２００１；およびＺｈａｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２７５８−２２７６５：１９９７を参照のこと）。いくつかの実施形態では、実質的に脱リン酸化されたヒトＩＤＵは、これらのグリコシル化部位のうちの１つ以上がＮ結合型グリカンおよびその会合するマンノース−６−リン酸残基を減少させるために変異している。それ故、これらおよび関連する実施形態では、ヒトＩＤＵタンパク質は、野生型ヒトＩＤＵタンパク質と比較して実質的に脱グリコシル化されており（例えば、Ｎ結合型オリゴマンノースグリカン）且つ実質的に脱リン酸化されている。
特定の態様では、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質は、ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、またはその活性フラグメントもしくは改変体である。ＩＤＳ（イズロン酸−２−スルファターゼ；ＥＣ ３．１．６．１３）は、グリコサミノグリカンであるヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸の分解に関与するリソソームエキソスルファターゼである。ＩＤＳ欠損により、リソソーム貯蔵障害ＭＰＳ ＩＩ（ムコ多糖体沈着症ＩＩ型）が生じる。配列番号２は、ヒトＩＤＳ（イデュルスルファーゼ）の一次アミノ酸配列を提供する。本明細書中に記載のように、実質的に脱リン酸化されたヒトＩＤＳのグリコシル化改変体も含まれる（米国特許第５，７９８，２３９号および同第５，９３２，２１１号を参照のこと）。
ヒトＩＤＳ配列は、３１、１１５、１４４、２４６、２８０、３２５、５１３、および５３７の各位置に８つの潜在的なＮ結合型グリコシル化部位（すなわち、ＮＸＳ／Ｔモチーフ）を含む（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ−Ｌａｗｒｅｎｃｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３８６：３９５−４００，２００５；および配列番号２中の対応するＮ結合型グリコシル化部位については図６を参照のこと）。いくつかの実施形態では、実質的に脱リン酸化されたヒトＩＤＳは、これらのグリコシル化部位のうちの１つ以上がＮ結合型グリカンおよびその会合するマンノース−６−リン酸残基を減少させるために変異している。それ故、これらおよび関連する実施形態では、ヒトＩＤＳタンパク質は、野生型ヒトＩＤＳタンパク質と比較して実質的に脱グリコシル化されており（例えば、Ｎ結合型オリゴマンノースグリカン）且つ実質的に脱リン酸化されている。
他の態様では、実質的に脱リン酸化されたヒトＩＤＵタンパク質またはＩＤＳタンパク質は、対応するコントロールヒトＩＤＳタンパク質またはＩＤＵタンパク質（例えば、野生型タンパク質）と同一または実質的に同一のグリカン数またはグリコシル化度を有する。例えば、実質的に脱リン酸化されたヒトＩＤＵタンパク質またはＩＤＳタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、または８つの潜在的なＮ結合型グリコシル化部位にＮ結合型グリカン（例えば、オリゴマンノースグリカン）を有し得る。したがって、ヒトＩＤＵタンパク質またはＩＤＳタンパク質は、哺乳動物細胞、任意選択的にヒト細胞中に産生された（発現された）対応する野生型ヒトＩＤＵまたはＩＤＳとして少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の数または量のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを有し得る。特定の態様では、ヒトＩＤＵまたはＩＤＳの１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンは、対応するコントロールヒトＩＤＵタンパク質またはＩＤＳタンパク質のＮ結合型オリゴマンノースグリカンと比較して実質的に脱リン酸化されている。例えば、ヒトＩＤＵまたはＩＤＳの１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンは、対応するコントロールヒトＩＤＳタンパク質と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％（すなわち、完全に）脱リン酸化され得る。いくつかの態様では、ヒトＩＤＵまたはＩＤＳの１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンは、リン酸基を実質的に含まない。例えば、脱リン酸化されたＩＤＵタンパク質またはＩＤＳタンパク質のグリカンは、対応するコントロールヒトＩＤＵタンパク質またはＩＤＳタンパク質のグリカンの約１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％未満のリン酸基を有する。一定の実施形態では、実質的に脱リン酸化されたＩＤＵタンパク質またはＩＤＳタンパク質は、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を実質的に含まない（例えば、対応するコントロールＩＤＵタンパク質またはＩＤＳタンパク質の約１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％未満のＭ６Ｐ残基を有する）。特定の実施形態では、実質的に脱リン酸化されたＩＤＳタンパク質のＭ６Ｐ含有量は、約０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、または１．５ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質またはおよそそれ未満（その間の全ての範囲および整数が含まれる）である。
特定の実施形態では、ヒトＩＤＳタンパク質は、前記タンパク質上のリン酸基またはＭ６Ｐ残基の数を減少させるために１つ以上のホスファターゼ（例えば、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ）で処置したヒト細胞（例えば、ＨＴ−１０８０細胞）中に産生されたイデュルスルファーゼ（Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標））の実質的に脱リン酸化された形態である。
ｐ９７ポリペプチド配列およびその結合体
本発明の実施形態はまた、本明細書中に記載の脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質にカップリングしたか、連結したか、そうでなければ付着したヒトｐ９７（メラノトランスフェリン；ＭＴｆ）ポリペプチドを含む結合体、かかる結合体を含む組成物、およびその関連する使用方法を含む。
特定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチドは、脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質に共有結合性、非共有結合性、または作動可能にカップリングされてｐ９７−薬剤結合体を形成する。いくつかの態様では、ｐ９７結合体を、１つ以上のさらなる目的の薬剤（小分子および／または検出可能な物質など）にカップリングすることができる。例示的なｐ９７ポリペプチド配列および薬剤を以下に記載する。ｐ９７ポリペプチドの脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質または目的の他の薬剤へのカップリングのための例示的な方法および成分（リンカー基など）も記載する。
ｐ９７配列。一定の実施形態では、本発明の組成物および／または結合体中で使用されるｐ９７ポリペプチド配列は、配列番号１に記載のヒトｐ９７配列を含むか、配列番号１に記載のヒトｐ９７配列から本質的になるか、配列番号１に記載のヒトｐ９７配列からなる。その改変体およびフラグメントも含まれる。
いくつかの実施形態では、ｐ９７ポリペプチド配列は、配列番号１に記載のヒトｐ９７配列またはその一部とその長さに沿って少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一または相同な配列を含む。
特定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチド配列は、配列番号１に記載のヒトｐ９７配列のフラグメントを含む。一定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチドフラグメントは、およそ、少なくともおよそ、またはおよそ以下の数値まで：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７００、７１０、７２０、７３０、またはそれを超えるアミノ酸長（その間の全ての整数および範囲が含まれる）であり、配列番号１などの基準ｐ９７配列の全てまたは配列の一部を含むことができる。
一定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチドフラグメントは、約５〜７００、５〜６００、５〜５００、５〜４００、５〜３００、５〜２００、５〜１００、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１０〜７００、１０〜６００、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００、１０〜１００、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１５、２０〜７００、２０〜６００、２０〜５００、２０〜４００、２０〜３００、２０〜２００、２０〜１００、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０、２０〜２５、３０〜７００、３０〜６００、３０〜５００、３０〜４００、３０〜３００、３０〜２００、３０〜１００、３０〜５０、３０〜４０、４０〜７００、４０〜６００、４０〜５００、４０〜４００、４０〜３００、４０〜２００、４０〜１００、４０〜５０、５０〜７００、５０〜６００、５０〜５００、５０〜４００、５０〜３００、５０〜２００、５０〜１００、６０〜７００、６０〜６００、６０〜５００、６０〜４００、６０〜３００、６０〜２００、６０〜１００、６０〜７０、７０〜７００、７０〜６００、７０〜５００、７０〜４００、７０〜３００、７０〜２００、７０〜１００、７０〜８０、８０〜７００、８０〜６００、８０〜５００、８０〜４００、８０〜３００、８０〜２００、８０〜１００、８０〜９０、９０〜７００、９０〜６００、９０〜５００、９０〜４００、９０〜３００、９０〜２００、９０〜１００、１００〜７００、１００〜６００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜２５０、１００〜２００、１００〜１５０、２００〜７００、２００〜６００、２００〜５００、２００〜４００、２００〜３００、または２００〜２５０アミノ酸長であり、配列番号１などの基準ｐ９７配列の全てまたは一部を含む。
一定の実施形態では、目的のｐ９７ポリペプチド配列は、目的の薬剤を血液脳関門を通過して中枢神経系（ＣＮＳ）内に輸送するのに有効なｐ９７アミノ酸配列、ｐ９７のサブシーケンス、および／または改変体を含む。特定の実施形態では、改変体またはフラグメントは、ヒトｐ９７のＮ−ローブ（配列番号１の残基２０〜３６１）を含む。特定の態様では、改変体またはフラグメントは、インタクト且つ機能的なＦｅ３＋結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、ｐ９７ポリペプチド配列は、ｐ９７ポリペプチドの可溶性形態（Ｙａｎｇら，Ｐｒｏｔ Ｅｘｐ Ｐｕｒｉｆ．３４：２８−４８，２００４を参照のこと）、またはそのフラグメントまたは改変体である。いくつかの態様では、可溶性ｐ９７ポリペプチドは、疎水性ドメイン（配列番号１の残基７１０〜７３８）の全てまたは一部の欠失のみまたはシグナルペプチド（配列番号１の残基１〜１９）の全てまたは一部の欠失との組み合わせを有する。特定の態様では、可溶性ｐ９７ポリペプチドは、配列番号１の残基２０〜７１１（その改変体およびフラグメントが含まれる）を含むか、これらからなる。
一定の実施形態では、例えば、リポソームを使用する場合、ｐ９７ポリペプチド配列はｐ９７ポリペプチドの脂溶性形態である。例えば、一定のこれらおよび関連する実施形態は、任意選択的にシグナルペプチドを伴うか伴わずに疎水性ドメインの全てまたは一部を含むｐ９７ポリペプチドを含む。
一定の他の実施形態では、ｐ９７フラグメントまたは改変体は、ｐ９７受容体（ＬＲＰ１受容体および／またはＬＲＰ１Ｂ受容体）に特異的に結合することができる。
基準ｐ９７ポリペプチドおよび他の基準ポリペプチドの改変体およびフラグメントを、以下にさらに詳述している。
ｐ９７結合体。上述の通り、一定の実施形態は、脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質もしくは目的の他の薬剤（例えば、小分子または検出可能な物質）またはその任意の組み合わせに連結したｐ９７ポリペプチドを含む。１つを超える脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質および目的の薬剤を含む結合体（例えば、１つ以上の脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質および小分子に結合体化したｐ９７フラグメント）も含まれる。
共有結合性の連結が好ましいが、非共有結合性の連結（比較的強力な非共有結合性のタンパク質−リガンド相互作用（ビオチンとアビジンとの間の相互作用など）を利用する連結が含まれる）も使用することができる。ｐ９７ポリペプチドと脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質または目的の薬剤との間の直接的な共有結合性または非共有結合性の相互作用を必ずしも必要としない作動可能な連結も含まれ、かかる連結の例には、ｐ９７ポリペプチドおよび脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質ならびに任意選択的なさらなる目的の薬剤を含むリポソーム混合物が含まれる。例示的なタンパク質結合体の生成方法を本明細書中に記載しており、他の方法が当該分野で周知である。
小分子。特定の実施形態では、ｐ９７結合体を、小分子にさらに付着または連結する。「小分子」は、合成または生物学的起源（生体分子）であるが、典型的にはポリマーではない有機化合物をいう。有機化合物は、その分子が炭素を含む化学物質の巨大なクラスをいい、典型的には炭酸塩のみを含むもの、炭素の単純酸化物、またはシアニドが除外される。「生体分子」は、一般に、生物によって産生される有機分子（高分子（バイオポリマー）（ペプチド、ポリサッカリド、および核酸なども）および小分子（一次、二次代謝産物、脂質、リン脂質、糖脂質、ステロール、グリセロ脂質、ビタミン、およびホルモンなど）が含まれる）をいう。「ポリマー」は、一般に、典型的には共有結合性の化学結合によって連結された反復構造単位から構成される大分子または高分子をいう。
一定の実施形態では、小分子の分子量は、約１０００〜２０００ダルトン未満、典型的には約３００と７００ダルトンとの間であり、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、５００、６５０、６００、７５０、７００、８５０、８００、９５０、１０００、または２０００ダルトンが含まれる。
リソソーム貯蔵障害の処置のために、例示的な小分子クラスには、基質還元治療および薬理学的シャペロン治療に使用される小分子、未成熟のナンセンス変異サプレッサー、およびタンパク質恒常性制御因子が含まれる（Ｓｍｉｄら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ．１９：１３６７−７９、２０１０；ａｎｄ Ｂｅｃｋ、ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ．６２：３３−４０、２０１０を参照のこと）。
いくつかの態様では、小分子は、抗炎症分子である。例には、ステロイドおよび糖質コルチコイド（例えば、ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）（アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬、シクロホスファミド、およびミコフェノラートなど）が含まれる。
検出可能な物質。いくつかの実施形態では、ｐ９７結合体を、「検出可能な物質」にさらに付着または連結させる。例示的な検出可能な物質には、ヨウ素ベースの標識、放射性同位体、フルオロフォア／蛍光色素、およびナノ粒子が含まれるが、これらに限定されない。
例示的なヨウ素ベースの標識には、ジアトリゾ酸（Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびそのアニオン型ジアトリゾアートが含まれる。ジアトリゾ酸は、ＣＴスキャンなどの先進Ｘ線技術で使用される放射線造影剤である。下記のヨウ素放射性同位体も含まれる。
検出可能な物質として使用することができる例示的な放射性同位体には、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１１１Ｉｎ、１６９Ｙｂ、９９ｍＴＣ、５５Ｆｅ、およびヨウ素同位体（１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、および１３１Ｉなど）が含まれる。これらの放射性同位体は、特定のプロトコールのニーズに適合するように調整することができる異なる半減期、減衰型、およびエネルギーレベルを有する。これらの一定の放射性同位体を、例えば、かかる組織の医学的画像化を改善するためにｐ９７ポリペプチドに結合体化することによってＣＮＳ組織を選択的に標的するかより良好に標的にすることができる。
直接検出可能な物質として使用することができるフルオロフォアまたは蛍光色素の例には、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、およびオレゴングリーン（登録商標）などが含まれる（例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ−９ｔｈ Ｅｄ．，２００２，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−１０ｔｈ Ｅｄ．，２００５，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。発光色素または他の検出可能な色素も含まれる。色素による発光は、可視光または不可視光（紫外線または赤外線など）であり得る。例示的な実施形態では、色素は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）色素；キサンテン色素（フルオレセインおよびローダミンなど）；α位またはβ位にアミノ基を有する色素（ナフチルアミン色素、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホナート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホナート（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｄｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、および２−ｐ−トルイジニル（ｔｏｕｉｄｉｎｙｌ）−６−ナフタレンスルホナートなど）；３−フェニル−７−イソシアナトクマリンを有する色素；アクリジン（９−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジなど）；ピレン、ベンゾオキサジアゾール（ｂｅｎｓｏｘａｄｉａｚｏｌｅ）、およびスチルベン；３−（ε−カルボキシペンチル）−３’−エチル−５，５’−ジメチルオキサカルボシアニン（ＣＹＡ）を有する色素；６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）；５および６−カルボキシローダミン−１１０（Ｒ１１０）；６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）；６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）；ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（商標）；Ｃｙ２；テキサスレッドおよびローダミンレッド；６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）；６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）；５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＺＯＥ）；ＮＡＮ；ＮＥＤ；Ｃｙ３；Ｃｙ３．５；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；およびＣｙ７．５；ＩＲ８００ＣＷ、ＩＣＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０であり得る。一定の実施形態は、検出可能な物質（フルオロフォア（例えば、オレゴングリーン（登録商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８）など）で標識した化学療法薬（例えば、パクリタキセル、アドリアマイシン）への結合体化を含む。
ナノ粒子は、通常、約１〜１０００ｎｍの範囲のサイズであり、金粒子、銀粒子、および量子ドットなどの多様な化学構造が含まれる。白色光をある入射角で照射した場合、約４０〜１２０ｎｍの範囲の銀または金のナノ粒子は高強度で単色光を散乱するであろう。散乱光の波長は、粒子サイズに依存する。ごく近接した４〜５種の異なる粒子は各々単色光を散乱し、これらが重ね合わされた場合に特異的な固有の色が得られるであろう。銀粒子または金粒子などの誘導体化ナノ粒子を、広範囲の分子（タンパク質、抗体、小分子、受容体リガンド、および核酸が含まれる）に付着させることができる。ナノ粒子の具体例には、金属ナノ粒子および金属ナノシェル（金粒子、銀粒子、銅粒子、白金粒子、カルシウム粒子、複合粒子、金中空球、金コーティングしたシリカナノシェル、およびシリカコーティングした金シェルなど）が含まれる。シリカ、ラテックス、ポリスチレン、ポリカルボナート、ポリアクリラート、ＰＶＤＦナノ粒子、およびこれらの任意の材料の着色粒子も含まれる。
量子ドットは、広範な波長にわたる光によって励起可能な直径約１〜５ｎｍの蛍光結晶である。適切な波長の光による励起の際、これらの結晶は単色光などを発光し、波長はその化学組成およびサイズに依存する。ＣｄＳｅ、ＺｎＳｅ、ＩｎＰ、またはＩｎＡｓなどの量子ドットは固有の光学的性質を有し、これらおよび類似の量子ドットは多数の商業的供給元（例えば、ＮＮ−Ｌａｂｓ，Ｆａｙｅｔｔｅｖｉｌｌｅ，ＡＲ；Ｏｃｅａｎ Ｎａｎｏｔｅｃｈ，Ｆａｙｅｔｔｅｖｉｌｌｅ，ＡＲ；Ｎａｎｏｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から利用可能である。
ポリペプチド改変体およびフラグメント。一定の実施形態は、名称によるか配列識別子を参照して記載される本明細書中に記載の基準ポリペプチド（ｐ９７ポリペプチドおよびＬＳＤタンパク質が含まれる）の改変体および／またはフラグメントを含む。これらのポリペプチドの野生型配列または最も一般的な配列は当該分野で周知であり、本明細書中に記載の改変体およびフラグメントとの比較のために使用することができる。
ポリペプチド「改変体」は、この用語を本明細書中で使用する場合、１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入によって本明細書中に具体的に開示のポリペプチドと典型的に異なるポリペプチドである。改変体ポリペプチドは生物学的に活性である。すなわち、これらは基準ポリペプチドの酵素活性または結合活性を保有し続ける。かかる改変体は、例えば、遺伝子多型および／または人為的操作に起因し得る。
多くの場合、生物学的に活性な改変体は、１つ以上の保存的置換を含むであろう。「保存的置換」は、あるアミノ酸を、ペプチド化学分野の当業者がポリペプチドの二次構造およびハイドロパシー特性が実質的に不変であると予想されるような類似の性質を有する別のアミノ酸と置換することである。上記のように、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造を修飾し、所望の特徴を有する改変体ポリペプチドまたは誘導ポリペプチドをコードする機能的分子を依然として得ることができる。本発明のポリペプチドの等価であるかさらに改良された改変体または一部を作製するためにポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが望ましい場合、当業者は、典型的には、以下の表Ａにしたがって、コードＤＮＡ配列の１つ以上のコドンを変化させるであろう。
例えば、一定のアミノ酸を、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位などの構造との相互作用的結合能力を相当に喪失することなく、タンパク質構造中の他のアミノ酸と置換することができる。タンパク質の生物学的機能活性を定義するのはタンパク質の相互作用能力および相互作用性であるので、タンパク質配列、そして勿論その根底にあるＤＮＡコード配列中で一定のアミノ酸配列置換を行うことができ、それにもかかわらず、類似の性質を有するタンパク質が得られる。したがって、開示の組成物のペプチド配列または前記ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列においてその有用性を大きく喪失することなく種々の変更を行うことができることが期待される。
かかる変化の作製において、アミノ酸のハイドロパシー指標を考慮することができる。タンパク質に相互作用性の生物学的機能を付与する際のアミノ酸ハイドロパシー指標の重要性は、当該分野で一般に理解されている（Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２（本明細書中で参考として援用される））。アミノ酸の相対的なハイドロパシーは、得られたタンパク質の二次構造に依存し、一方でタンパク質の他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、および抗原など）との相互作用を定義することを認めている。各アミノ酸は、疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシー指標が割り当てられている（Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。これらの値は以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。一定のアミノ酸を類似のハイドロパシーの指標またはスコアを有する他のアミノ酸と置換することができ、それにより、依然として類似の生物学的活性を有するタンパク質が得られる（すなわち、依然として生物学的機能が等価のタンパク質が得られる）ことが当該分野で公知である。かかる変化の作製において、そのハイドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸との置換が好ましく、±１以内が特に好ましく、±０．５以内がさらに特に好ましい。
類似のアミノ酸の置換を親水性に基いて有効に行うことができることも当該分野で理解される。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が本明細書中で参考として特に援用される）は、タンパク質の最も高い局所平均親水性は、その隣接アミノ酸の親水性に支配されるので、そのタンパク質の生物学的性質と相関すると述べている。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述のように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。あるアミノ酸を類似の親水性値を有する別のアミノ酸と置換することができ、それにより、依然として生物学的に等価な、特に免疫学的に等価なタンパク質が得られると理解される。かかる変化において、その親水性値が±２以内のアミノ酸置換が好ましく、±１以内が特に好ましく、±０．５以内がさらに特に好ましい。
したがって、上記で概説のように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、およびサイズなど）に基づく。種々の上記特徴を考慮した例示的な置換は当業者に周知であり、以下が含まれる：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
アミノ酸置換を、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいてさらに行うことができる。例えば、負電荷アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；正電荷アミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ；類似の親水性値を有する無電荷極性頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、およびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。保存的変化を示し得る他のアミノ酸群には、以下が含まれる：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；ａｎｄ（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。
改変体は、非保存的変化も含み得るか、その代わりに含み得る。１つの好ましい実施形態では、改変体ポリペプチドは、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２アミノ酸未満、またはさらに１アミノ酸の置換、欠失、または付加が未変性の配列と異なる。改変体を、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造、酵素活性、および／またはハイドロパシーへの影響が最小のアミノ酸の欠失または付加によって改変することも（その代わりに行うことも）できる。
一定の実施形態では、ポリペプチド配列は、およそ、少なくともおよそ、またはおよそ以下の数値まで：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、またはそれを超える連続アミノ酸長（その間の全ての整数が含まれる）であり、基準配列の全てまたは一部を含むことができる（例えば、配列表を参照のこと）。
他の特定の実施形態では、ポリペプチド配列は、約またはわずか約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、またはそれを超える連続アミノ酸（その間の全ての範囲が含まれる）からなり、基準配列の全てまたは一部を含むことができる（例えば、配列表を参照のこと）。
さらに他の特定の実施形態では、ポリペプチド配列は、約１０〜１０００、１０〜９００、１０〜８００、１０〜７００、１０〜６００、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００、１０〜１００、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２０〜１０００、２０〜９００、２０〜８００、２０〜７００、２０〜６００、２０〜５００、２０〜４００、２０〜３００、２０〜２００、２０〜１００、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０、５０〜１０００、５０〜９００、５０〜８００、５０〜７００、５０〜６００、５０〜５００、５０〜４００、５０〜３００、５０〜２００、５０〜１００、１００〜１０００、１００〜９００、１００〜８００、１００〜７００、１００〜６００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜２００、２００〜１０００、２００〜９００、２００〜８００、２００〜７００、２００〜６００、２００〜５００、２００〜４００、または２００〜３００の連続アミノ酸（その間の全ての範囲が含まれる）であり、基準配列の全てまたは一部を含む。一定の実施形態では、短縮ポリペプチドが基準ポリペプチドの結合特性および／または活性を保持する限り、任意の基準ポリペプチドのＣ末端領域またはＮ末端領域を、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、または８００、またはそれを超えるアミノ酸、または約１０〜５０、２０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００、またはそれを超えるアミノ酸（その間の全ての整数および範囲（例えば、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５）が含まれる）を短縮することができる。典型的には、生物学的に活性なフラグメントは、由来する生物学的に活性な基準ポリペプチドの活性の約１％、約５％、約１０％、約２５％、または約５０％も有する。
一般に、改変体は、基準ポリペプチド配列に対して少なくとも約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性または配列同一性または配列相同性を示すであろう。さらに、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれを超えるアミノ酸の付加（例えば、Ｃ末端付加、Ｎ末端付加、両方）、欠失、短縮、挿入、または置換によって未変性配列または親配列と異なるが、親または基準のポリペプチド配列の性質または活性を保持する配列が意図される。
いくつかの実施形態では、改変体ポリペプチドは、基準配列と少なくとも１つであるが、５０、４０、３０、２０、１５、１０、８、６、５、４、３、または２アミノ酸残基未満が異なる。他の実施形態では、改変体ポリペプチドは、基準配列と少なくとも１％であるが、２０％、１５％、１０％、または５％未満の残基が異なる。（この比較にアラインメントが必要である場合、配列を類似性が最大になるようにアラインメントしなければならない。欠失または挿入によって「除外された」配列（すなわち、ミスマッチ）を相違と見なす）
配列間の配列類似性および配列同一性（これらの用語を本明細書中で交換可能に使用する）の計算を以下のように行う。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一率を決定するために、配列を最適に比較されるようにアラインメントする（例えば、第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列内の一方または両方にアラインメントを最適にするためのギャップを挿入することができ、比較のために非相同配列を無視することができる）。一定の実施形態では、比較のためにアラインメントした基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、分子はその位置で同一である。
２配列間の同一率は、２配列の最適なアライメントのために挿入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、これらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
配列の比較および２配列間の同一率の決定を、数学アルゴリズムを使用して行うことができる。１つの好ましい実施形態では、２アミノ酸配列間の同一率を、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラム内に組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３，１９７０）アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ならびにギャップの重み１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さの重み１、２、３、４、５、または６を使用して決定する。さらに別の好ましい実施形態では、２ヌクレオチド配列間の同一率を、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列ならびにギャップの重み４０、５０、６０、７０、または８０および長さの重み１、２、３、４、５、または６を使用して決定する。特に好ましいパラメータセット（および他で特定しない限り使用すべきセット）は、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５を使用したＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリング行列である。
２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列間の同一率を、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃａｂｉｏｓ．４：１１−１７，１９８９）を使用し、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長さペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用して決定することができる。
本明細書中に記載の核酸配列およびタンパク質配列を、公的データベースを検索するための「問い合わせ配列」として使用して、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定することができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−１０）のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用してかかる検索を行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワードレングス＝１２を使用して行い、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を使用して行い、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためのギャップ挿入アラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載のようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。
１つの実施形態では、上述の通り、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを、ＢＬＡＳＴアラインメントツールを使用して評価することができる。局所アラインメントは単純に配列セグメント対からなり、各配列由来の１つを比較する。Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムまたはＳｅｌｌｅｒｓアルゴリズムの修正により、伸長またはトリミングによってそのスコアを改善することができない全てのセグメント対（高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）と呼ばれる）が見出されるであろう。ＢＬＡＳＴアラインメントの結果は、偶然のみからＢＬＡＳＴスコアを予想することができる見込みを示すための統計的尺度を含む。
生スコアＳを各アラインメントした配列に関連するギャップ数および置換数から計算し、類似性スコアが高いほどアラインメントの有意性が高くなる。置換スコアは参照表から得られる（ＰＡＭ、ＢＬＯＳＵＭを参照のこと）。
ギャップスコアを、典型的には、Ｇ（ギャップ開始ペナルティ）およびＬ（ギャップ伸長ペナルティ）の和として計算する。ギャップの長さｎについて、ギャップコストはＧ＋Ｌｎであろう。ギャップコスト（ＧおよびＬ）の選択は経験によるが、通例ではＧについては高値（１０〜１５）（例えば、１１）およびＬについては低値（１〜２）（例えば、１）を選択する。
ビットスコアＳ’は生アラインメントスコアＳに由来し、これは使用したスコアリングシステムの統計的特性が考慮されている。ビットスコアをスコアリングシステムに関して正規化し、したがって、このスコアを使用して異なる検索由来のアラインメントスコアを比較することができる。用語「ビットスコア」および「類似度スコア」を、交換可能に使用する。ビットスコアから、アラインメントの優良度が示され、このスコアが高いほどアラインメントが優良である。
Ｅ値（すなわち期待値）は、類似スコアを有する配列がデータベース中に偶然に生じる見込みを示す。これは、データベース中に偶然起こると期待されるＳと等しいかより良好なスコアを有する異なるアラインメント数の予想である。Ｅ値が小さいほどアラインメントは有意である。例えば、Ｅ値がｅ−１１７のアラインメントは、類似のスコアを有する配列が単純に偶然に起こる可能性が極めて低いことを意味する。さらに、アミノ酸のランダム対をアラインメントするための期待スコアは負である必要があり、そうでなければ長いアラインメントはアラインメントしたセグメントが関連するかどうかとは無関係に高スコアを有する傾向があるであろう。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、適切な置換行列、ヌクレオチド、またはアミノ酸を使用し、ギャップ挿入アラインメントについてはギャップ作製ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティを使用する。例えば、ＢＬＡＳＴアラインメントおよびポリペプチド配列の比較を、典型的には、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、ギャップ伸長ペナルティ１１、およびギャップ伸長ペナルティ１を使用して行う。
１つの実施形態では、配列類似度スコアを、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、ギャップ伸長ペナルティ１１、およびギャップ伸長ペナルティ１を使用して行ったＢＬＡＳＴ分析から報告する。
特定の実施形態では、本明細書中に提供した配列同一性／類似度スコアは、以下のパラメータを使用したＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０（ＧＣＧ，Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を使用して得た値をいう：ＧＡＰ重み５０および長さ重み３、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリング行列を使用したヌクレオチド配列についての同一率および類似率；ＧＡＰ重み８および長さ重み２、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用したアミノ酸配列についての同一率および類似率（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）。ＧＡＰは、マッチ数を最大にし、且つギャップ数を最小にする２つの完全配列のアラインメントを見出すためにＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３、１９７０）を使用する。
１つの特定の実施形態では、改変体ポリペプチドは、基準ポリペプチド配列（例えば、配列表を参照のこと）と任意選択的にアラインメントして少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、またはそれを超える（その間の全ての整数および範囲が含まれる）ＢＬＡＳＴビットスコアまたは配列類似度スコアを生成することができるアミノ酸配列を含み、ここで、ＢＬＡＳＴアラインメントにはＢＬＯＳＵＭ６２行列、ギャップ伸長ペナルティ１１、およびギャップ伸長ペナルティ１を使用した。
上述の通り、基準ポリペプチドを、種々の方法（アミノ酸の置換、欠失、短縮、付加、および挿入が含まれる）で変化させることができる。かかる操作方法は、一般に、当該分野で公知である。例えば、基準ポリペプチドのアミノ酸配列改変体を、ＤＮＡの操作によって調製することができる。変異誘発およびヌクレオチド配列の変更の方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（ＰＮＡＳ ＵＳＡ．８２：４８８−４９２，１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら，（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２，１９８７）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら，（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，” Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）、およびこれらの引用文献を参照のこと。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスを、Ｄａｙｈｏｆｆら，（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルで見出すことができる。
かかる改変によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする方法および選択された性質を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法は、当該分野で公知である。かかる方法を、基準ポリペプチドの組み合わせ変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合させることが可能である。一例として、反復アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）（ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大させる技術）をスクリーニングアッセイと組み合わせて使用してポリペプチド改変体を同定することができる（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５，１９９２；Ｄｅｌｇｒａｖｅら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．６：３２７−３３１，１９９３）。
例示的な結合体化方法。ｐ９７ポリペプチド配列のリソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）タンパク質または目的の他の薬剤への結合体化またはカップリングを、標準的な化学的技術、生化学的技術、および／または分子技術を使用して行うことができる。実際に、利用可能な当該分野で認識されている方法論を使用して本開示を考慮したｐ９７結合体の作製方法は明らかであろう。勿論、本発明のｐ９７結合体の一次成分をカップリングした場合に使用した技術および得られた連結の化学的性質が結合体の各成分の所望の機能性または活性を実質的に妨害しないことが一般に好ましいであろう。
使用した特定のカップリングの化学的性質は、生物学的に活性な薬剤（例えば、小分子、ポリペプチド）の構造、生物学的に活性な薬剤内に複数の官能基が存在する可能性、保護／脱保護工程の必要性、および薬剤の化学的安定性などに依存し、当業者はこの化学的性質を容易に決定するであろう。本発明のｐ９７結合体の調製に有用な例示的なカップリングの化学的性質を、例えば、Ｗｏｎｇ（１９９１），“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ”，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．；およびＢｒｉｎｋｌｅｙ “Ａ Ｂｒｉｅｆ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｄｙｅｓ，Ｈａｐｔｅｎｓ，ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，” ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，３：２０１３，１９９２に見出すことができる。好ましくは、結合体の結合能力および／または結合活性は、使用した結合体化技術の結果として、例えば、結合体化されていないＬＳＤポリペプチドもしくは薬剤または結合体化されていないｐ９７ポリペプチドと比較して実質的に減少しない。
一定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチド配列を、ＬＳＤポリペプチドまたは目的の他の薬剤に直接または間接的にカップリングすることができる。ｐ９７ポリペプチド配列とＬＳＤポリペプチドまたは目的の他の薬剤との間の直接反応は、それぞれが相互反応可能な置換基を保有する場合に可能である。例えば、一方に存在する求核性基（アミノ基またはスルフヒドリル基など）は、他方に存在するカルボニル含有基（無水物または酸ハライドなど）または良好な脱離基（例えば、ハライド）を含むアルキル基と反応することができる。
あるいは、リンカー基（非ペプチドリンカーおよびペプチドリンカーが含まれる）を介してｐ９７ポリペプチド配列およびＬＳＤポリペプチドまたは目的の他の薬剤を間接的にカップリングすることが望ましいかもしれない。リンカー基はまた、結合能力、ターゲティング能力、または他の機能性の妨害を回避するために目的の薬剤をｐ９７ポリペプチド配列から遠ざけるためのスペーサーとして機能することができる。リンカー基はまた、薬剤上の置換基の化学反応性を増大させ、したがって、カップリング効率を増大させる働きをし得る。化学反応性の増大はまた、他の場合には増大しなければ不可能と考えられる薬剤または薬剤上の官能基の使用を容易にすることができる。放出可能または安定なリンカーを選択して、ｐ９７結合体および付着した抗体または目的の他の薬剤の薬物動態学的を変化せることもできる。例示的な連結基には、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光解離性基、ペプチダーゼ不安定基、およびエステラーゼ不安定基が含まれる。他の例示的な実施形態では、結合体は、米国特許第５，２０８，０２０号または欧州特許第０ ４２５ ２３５ Ｂ１号、およびＣｈａｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５２：１２７−１３１，１９９２に開示の連結基などの連結基を含む。さらなる例示的なリンカーを以下に記載する。
いくつかの実施形態では、１つを超えるｐ９７ポリペプチド配列をＬＳＤポリペプチドまたは他の薬剤にカップリングする（またはその逆）ことが望ましいかも知れない。例えば、一定の実施形態では、複数のｐ９７ポリペプチド配列を１つのＬＳＤポリペプチドまたは他の薬剤にカップリングするか、あるいは、１つ以上のｐ９７ポリペプチドを複数のＬＳＤポリペプチドまたは他の薬剤に結合体化する。ｐ９７ポリペプチド配列は、同一でも異なっていてもよい。特定の実施形態と無関係に、複数のｐ９７ポリペプチド配列を含む結合体を、種々の方法で調製することができる。例えば、１つを超えるポリペプチドを薬剤に直接カップリングすることができるか、複数の付着部位を提供するリンカーを使用することができる。種々の公知のヘテロ二官能性架橋ストラテジーのうちのいずれかを、本発明の結合体の作製のために使用することができる。結合体化／架橋手順中に使用した材料の化学量論の調節によって多数のこれらの実施形態を行うことができると理解されるであろう。
一定の例示的な実施形態では、スクシンイミジルエステル官能基を含む薬剤とアミノ基を含むｐ９７ポリペプチドとの間の反応によりアミド連結が形成され、オキシカルボニルイミダゾール（ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｉｍｉｄｉｚａｏｌｅ）官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応によりカルバマート連結が形成され、ｐ−ニトロフェニルカルボナート官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応によりカルバマート連結が形成され、トリクロロフェニルカルボナート官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応によりカルバマート連結が形成され、チオエステル官能基を含む薬剤とＮ末端アミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応によりアミド連結が形成され、プロピオンアルデヒド（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ）官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により第二級アミン連結が形成される。
いくつかの例示的な実施形態では、ブチルアルデヒド官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により第二級アミン連結が形成され、アセタール官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により第二級アミン連結が形成され、ピペリドン官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により第二級アミン連結が形成され、メチルケトン官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により第二級アミン連結が形成され、トレシラート官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により第二級アミン連結が形成され、マレイミド官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により第二級アミン連結が形成され、アルデヒド官能基を含む薬剤とアミノ基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により第二級アミン連結が形成され、ヒドラジン官能基を含む薬剤とカルボン酸基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応により第二級アミン連結が形成される。
特定の例示的な実施形態では、マレイミド官能基を含む薬剤とチオール基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応によりチオエーテル連結を形成し、ビニルスルホン官能基を含む薬剤とチオール基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応によりチオエーテル連結を形成し、チオール官能基を含む薬剤とチオール基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応によりジスルフィド連結を形成し、オルソピリジルジスルフィド官能基を含む薬剤とチオール基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応によりジスルフィド連結を形成し、ヨードアセトアミド官能基を含む薬剤とチオール基を含むＰ９７ポリペプチドとの間の反応によりチオエーテル連結を形成する。
特定の実施形態では、アミン−スルフヒドリル架橋剤を、結合体の調製のために使用する。１つの好ましい実施形態では、例えば、架橋剤はスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であり、この架橋剤は、中程度の長さのシクロヘキサン安定化スペーサーアーム（８．３オングストローム）の反対側の末端にＮＨＳ−エステルおよびマレイミド反応基を含むスルフヒドリル架橋剤である。ＳＭＣＣは、その後のｐ９７ポリペプチド配列との反応のためのスルフヒドリル反応性のマレイミド活性化された薬剤（例えば、ポリペプチド、抗体）を作製するために使用することができる非切断性の膜透過性架橋剤である。ＮＨＳエステルは、ｐＨ７〜９で第一級アミンと反応して安定なアミド結合を形成する。マレイミドは、ｐＨ６．５〜７．５でスルフヒドリル基と反応して安定なチオエーテル結合を形成する。したがって、ＳＭＣＣのアミン反応性ＮＨＳエステルが薬剤の第一級アミンと迅速に架橋し、次いで、得られたスルフヒドリル反応性マレイミド基がｐ９７のシステイン残基との反応に利用されて目的の特定の結合体を得ることができる。
一定の特定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチド配列を、架橋を容易にするために（例えば、マレイミド活性化された薬剤への架橋を容易にするために）露呈したスルフヒドリル基を含むように改変する。より特定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチド配列を、保護されたチオールスルフヒドリル基を付加するために第一級アミンを修飾する試薬で修飾する。さらにより特定の実施形態では、試薬Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、チオール化ｐ９７ポリペプチドを生成する。
他の特定の実施形態では、マレイミド活性化された薬剤を、適切な条件下でチオール化ｐ９７ポリペプチドと反応させて本発明の結合体を生成する。これらの反応物中でのＳＭＣＣ、ＳＡＴＡ、薬剤、およびｐ９７ポリペプチドの比を操作することによって異なる化学量論、分子量、および性質を有する結合体を生成することが可能であると理解されるであろう。
さらに他の例示的な実施形態では、結合体を、二官能性タンパク質カップリング剤（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジピミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トルエン２，６−ジイソシアナートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）など）を使用して作製する。特定のカップリング剤には、ジスルフィド連結を得るためのＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７［１９７８］）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）が含まれる。
本明細書中で考察した特定の架橋ストラテジーは、本発明の結合体の生成で使用することができる適切な結合体化ストラテジーの多数の例のほんの一部である。種々の他の二官能性または多官能性の試薬（ホモ官能性およびヘテロ官能性の両方）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログ中に記載の試薬など）をリンカー基として使用することができることが当業者に明らかであろう。例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化炭水化物残基によってカップリングすることができる。かかる方法論を記載した文献が多数存在する（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらの米国特許第４，６７１，９５８号）。
特定の実施形態は、ｐ９７ポリペプチドとＬＳＤポリペプチドまたは他の薬剤との間の結合体化を容易にするための１つ以上のアルデヒドタグを使用することができる（米国特許第８，０９７，７０１号および同第７，９８５，７８３号（参考として援用される）を参照のこと）。ここで、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の作用によるアルデヒドタグのスルファターゼモチーフでの酵素修飾により、ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基が生成される。次いで、ＦＧｌｙ残基のアルデヒド部分を、目的の部分のポリペプチドへの部位特異的付着のための化学的ハンドルとして利用することができる。いくつかの態様では、目的の部分は、小分子、ペプトイド、アプタマー、またはペプチド模倣物である。いくつかの態様では、目的の部分は、別のポリペプチド（抗体など）である。
したがって、特定の実施形態は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える異種スルファターゼモチーフを含むｐ９７ポリペプチドまたはＬＳＤポリペプチドまたは他のポリペプチド薬剤を含み、ここで、モチーフは、以下の構造：
Ｘ１Ｚ１Ｘ２Ｚ２Ｘ３（配列番号４）
（式中、Ｚ１はシステインまたはセリンであり；Ｚ２はプロリン残基またはアラニン残基であり；Ｘ１は存在しても不在でもよく、存在する場合、任意のアミノ酸であり、Ｘ１は、異種スルファターゼモチーフがアルデヒドタグ化ポリペプチドのＮ末端に存在する場合に存在することが好ましく；Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である）を含む。
上記モチーフを有するポリペプチドを、ＦＧＥ酵素によって修飾してＦＧｌｙ残基を有するモチーフを生成することができ、上述の通り、次いで、このモチーフを例えば、リンカー部分を介した薬剤（第２のポリペプチドなど）の部位特異的付着のために使用することができる。かかる修飾を、例えば、ＦＧＥ酵素を発現する哺乳動物細胞、酵母細胞、または細菌細胞中のスルファターゼモチーフ含有ポリペプチド（例えば、ｐ９７、ＬＳＤポリペプチド）の発現または単離ＦＧＥ酵素での単離ポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾によって行うことができる（Ｗｕら，ＰＮＡＳ．１０６：３０００−３００５，２００９；Ｒｕｓｈ ａｎｄ Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１３０：１２２４０−１，２００８；およびＣａｒｌｓｏｎら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８３：２０１１７−２５，２００８を参照のこと）。
それ故、いくつかの実施形態は、ホルミルグリシン残基を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える異種スルファターゼモチーフを含むｐ９７ポリペプチドまたはポリペプチド薬剤（例えば、ＬＳＤポリペプチド）を含み、ここで、モチーフは、以下の構造：
Ｘ１（ＦＧｌｙ）Ｘ２Ｚ２Ｘ３（配列番号５）
（式中、ＦＧｌｙはホルミルグリシン残基であり；Ｚ２はプロリン残基またはアラニン残基であり；Ｘ１は存在しても不在でもよく、存在する場合、任意のアミノ酸であり、Ｘ１は、異種スルファターゼモチーフがアルデヒドタグ化ポリペプチドのＮ末端に存在する場合に存在することが好ましく；Ｘ２およびＸ３は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である）を含む。
特定の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は、それぞれ独立して、脂肪族アミノ酸、硫黄含有アミノ酸、または極性の無電荷アミノ酸である。例えば、Ｘ１は、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｓ、またはＴであり得；Ｘ２および／またはＸ３は、独立して、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｇ、またはＣであり得る。
いくつかの実施形態では、異種スルファターゼモチーフは、（ａ）１６アミノ酸残基長未満（約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５残基長が含まれる）であり得るか、（ｂ）ポリペプチドのＮ末端に位置し得るか、（ｃ）ポリペプチドのＣ末端に位置し得るか、（ｄ）ポリペプチド起源のアミノ酸配列の内部部位に位置し得るか、（ｅ）ポリペプチドの末端ループ中に位置し得るか、（ｆ）ポリペプチドの翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）に位置し得るか、その任意の組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態は、（ｉ）スルファターゼモチーフ（またはアルデヒドタグ）含有ｐ９７ポリペプチド、および（ｉｉ）薬剤（Ａ）（アルデヒド反応基で官能化された小分子など）の結合体に関し、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、スルファターゼモチーフのＦＧｌｙ残基およびアルデヒド反応基を介して共有結合性に連結している。かかる結合体は、以下の一般的構造：
ｐ９７（ＦＧｌｙ）−Ｒ１−Ａ
（式中、Ｒ１は少なくとも１つのアルデヒド反応性連結であり；ＦＧｌｙは異種スルファターゼモチーフ内のホルミルグリシン残基である）のうちの１つを有することができる。
いくつかの実施形態は、（ｉ）スルファターゼモチーフ（またはアルデヒドタグ）含有ｐ９７ポリペプチド、および（ｉｉ）アルデヒド反応基で官能化されたポリペプチド薬剤（ｐＡ）（逆も同じ）の結合体に関し、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、スルファターゼモチーフのＦＧｌｙ残基およびアルデヒド反応基を介して共有結合性に連結している。かかる結合体は、以下の一般的構造：
ｐ９７（ＦＧｌｙ）−Ｒ１−ｐＡまたはｐ９７−Ｒ１−（ＦＧｌｙ）ｐＡ
（式中、Ｒ１は少なくとも１つのアルデヒド反応性連結であり；ＦＧｌｙは異種スルファターゼモチーフ内のホルミルグリシン残基である）のうちの１つを有することができる。
薬剤または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド（例えば、ｐ９７ポリペプチド、ＬＳＤポリペプチド）を、１つ以上のアルデヒド反応基（アミノオキシ、ヒドラジド、およびチオセミカルバジドなど）で官能化し、次いで、少なくとも１つのＦＧｌｙ残基を介してアルデヒドタグ含有ポリペプチドに共有結合性に連結してアルデヒド反応性連結を形成することができる。アミノオキシ官能化薬剤（または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）の付着によりＦＧｌｙ残基と官能化薬剤（または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）との間にオキシム連結が作製され；ヒドラジド官能化薬剤（または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）の付着によりＦＧｌｙ残基と官能化薬剤（または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）との間にヒドラジン連結が作製され；チオセミカルバジド官能化薬剤（または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）の付着によりＦＧｌｙ残基と官能化薬剤（または非アルデヒドタグ含有ポリペプチド）との間にヒドラジンカルボチアミド連結が作製される。それ故、これらおよび関連する実施形態では、Ｒ１は、シッフ塩基を含む連結（オキシム連結、ヒドラジン連結、またはヒドラジンカルボチアミド連結など）であり得る。
一定の実施形態は、（ｉ）スルファターゼモチーフ（またはアルデヒドタグ）含有ｐ９７ポリペプチドおよび（ｉｉ）スルファターゼモチーフ（またはアルデヒドタグ）含有ＬＳＤポリペプチド薬剤（Ａ）の結合体を含み、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）は、各ＦＧｌｙ残基を介して、任意選択的に二官能性のリンカー部分またはリンカー基を介して共有結合性に連結している。例えば、一定のｐ９７結合体は、以下の構造：
ｐ９７（ＦＧｌｙ）−Ｒ１−Ｌ−Ｒ２−（ＦＧｌｙ）Ａ
（式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なるアルデヒド反応性連結であり；Ｌはリンカー部分であり、ｐ９７（ＦＧｌｙ）はアルデヒドタグ含有ｐ９７ポリペプチドであり、（ＦＧｌｙ）Ａはアルデヒドタグ含有薬剤（ＬＳＤポリペプチド薬剤など）である）を含むことができる。
単なる例として、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフは、ｐ９７ポリペプチドのＣ末端およびポリペプチドベースの薬剤（例えば、ＬＳＤポリペプチド）のＮ末端に存在し得る。他の実施形態では、少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフは、ｐ９７ポリペプチドのＮ末端およびポリペプチドベースの薬剤のＣ末端に存在し得る。さらなる他の実施形態では、少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフは、ｐ９７ポリペプチドのＮ末端およびポリペプチドベースの薬剤のＮ末端に存在し得る。さらなる実施形態では、少なくとも１つの異種スルファターゼモチーフは、ｐ９７ポリペプチドのＣ末端およびポリペプチドベースの薬剤のＣ末端に存在し得る。上述の通り、少なくとも１つの異種モチーフは、ｐ９７ポリペプチドおよび／またはポリペプチドベースの薬剤中の内部位置に存在し得る。当業者は、他の組み合わせが可能であると認識するであろう。
Ｒ１およびＲ２のアルデヒド反応性連結を、（ｉ）アルデヒドタグのホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基と（ｉｉ）前記アルデヒド反応基で官能化されたリンカー部分（例えば、２つのアルデヒド反応基（同一でも異なっていてもよい）を有する二官能化リンカー）との間の共有結合を形成する任意のアルデヒド反応基によって独立して形成することができる。アルデヒド反応基の例には、アミノオキシ基、ヒドラジド基、およびチオセミカルバジド基が含まれ、これらは、ＦＧｌｙ残基を有するシッフ塩基含有連結（それぞれ、オキシム連結、ヒドラジン連結、およびヒドラジンカルボチアミド連結が含まれる）を形成するであろう。それ故、Ｒ１およびＲ２は、独立して、シッフ塩基を含む連結（オキシム連結、ヒドラジン連結、またはヒドラジンカルボチアミド連結など）であり得る。
いくつかの実施形態では、アルデヒドタグ含有ｐ９７ポリペプチドおよびアルデヒドタグ含有ＬＳＤポリペプチドまたは他の薬剤を、多官能化リンカー（例えば、二官能化リンカー）を介して連結し（例えば、共有結合的に連結し）、後者を同一または異なるアルデヒド反応基で官能化する。これらおよび関連する実施形態では、アルデヒド反応基は、リンカーによりｐ９７ポリペプチドとＬＳＤポリペプチドまたは他の薬剤との間にその各ＦＧｌｙ残基を介して共有結合性の架橋を形成可能である。リンカー部分には、１つ以上のアルデヒド反応基で官能化することができ、好ましくは二官能化または多官能化することができる任意の部分または化学的部分が含まれる。特定の例には、ペプチド、水溶性ポリマー、検出可能な物質、他の治療化合物（例えば、細胞傷害性化合物）、ビオチン／ストレプトアビジン部分、およびグリカンが含まれる（Ｈｕｄａｋら，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１３３：１６１２７−３５，２０１１を参照のこと）。グリカン（またはグリコシド）の具体例には、アミノオキシグリカン（グリコシルＮ−ペンテノイルヒドロキサマート中間体から構成される高次グリカンなど）が含まれる（前出）。例示的なリンカーを本明細書中に記載し、これらのリンカーを当該分野の日常的技術にしたがってアルデヒド反応基で官能化することができる（例えば、Ｃａｒｒｉｃｏら，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．３：３２１−３２２，２００７；および米国特許第８，０９７，７０１号および同第７，９８５，７８３号を参照のこと）。
ｐ９７結合体を、種々の「クリック化学」技術（モジュール式であり、広範で収率が非常に高く、非クロマトグラフ法によって除去することができ、且つ立体特異的であり得るが必ずしもエナンチオ選択性ではない主に無害の副生成物を生成する反応が含まれる）によって調製することもできる（Ｋｏｌｂら，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．４０：２００４−２０２１，２００１を参照のこと）。特定の例には、アジドとアルキンのヒュスゲン１，３−双極子付加環化を使用する結合体化技術（「アジド−アルキン付加環化」反応とも呼ばれる）が含まれる（Ｈｅｉｎら，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２５：２２１６−２２３０，２００８を参照のこと）。アジド−アルキン付加環化反応の非限定的な例には、銅触媒アジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）反応およびルテニウム触媒アジド−アルキン付加環化（ＲｕＡＡＣ）反応が含まれる。
ＣｕＡＡＣは、広範な温度で作用し、水性条件およびｐＨ４〜１２の範囲で影響を受けず、広範な官能基を許容する（Ｈｉｍｏら，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１２７：２１０−２１６，２００５を参照のこと）。活性Ｃｕ（Ｉ）触媒を、例えば、還元剤としてアスコルビン酸ナトリウムを使用してＣｕ（Ｉ）塩またはＣｕ（ＩＩ）塩から生成することができる。この反応によって１，４置換生成物が形成され、領域特異性となる（Ｈｅｉｎら，前出を参照のこと）。
ＲｕＡＡＣは、アジドの末端アルキンへの付加環化を触媒することができるペンタメチルシクロペンタジエニルルテニウムクロリド［Ｃｐ＊ＲｕＣｌ］複合体を利用し、それにより、位置選択的に１，５二置換１，２，３−トリアゾールが得られる（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．９：５３３７−５３３９，２００７を参照のこと）。さらに、ＣｕＡＡＣと対照的に、ＲｕＡＡＣを内部アルキンと共に使用して、全置換１，２，３−トリアゾールを得ることもできる。
したがって、一定の実施形態は、アジド側鎖またはアルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸（内部および末端（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端）の非天然アミノ酸が含まれる）を含むｐ９７ポリペプチドを含む。一定のこれらのｐ９７ポリペプチドを、アジド側鎖またはアルキン側鎖を含む非天然アミノ酸のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、無細胞系）組込みによって形成することができる。例示的なｉｎ ｖｉｖｏ技術には、例えば改変大腸菌を使用した細胞培養技術（Ｔｒａｖｉｓ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２８５：１１０３９−４４，２０１０；およびＤｅｉｔｅｒｓ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ．１５：１５２１−１５２４，２００５を参照のこと）が含まれ、例示的なｉｎ ｖｉｔｒｏ技術には無細胞系（Ｂｕｎｄｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２１：２５５−６３，２０１０を参照のこと）が含まれる。
いくつかの実施形態では、アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを、少なくとも１つのアルキン基を含む薬剤（またはリンカー）（アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む抗体または他のポリペプチド薬剤など）へのアジド−アルキン付加環化によって結合体化する。他の実施形態では、アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを、少なくとも１つのアジド基を含む抗体または他のポリペプチド薬剤（またはリンカー）（アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むポリペプチド薬剤など）へのアジド−アルキン付加環化によって結合体化する。それ故、一定の実施形態は、１，２，３−トリアゾール連結を介して薬剤に共有結合性に連結したｐ９７ポリペプチドを含む結合体を含む。
特異的ｐ９７結合体を、以下のそれぞれの構造（Ｉ）または（ＩＩ）：
（式中、Ｒはｐ９７ポリペプチドであり、Ｒｌは目的の薬剤（またはリンカー）であるか、Ｒは目的の薬剤（またはリンカー）であり、Ｒｌはｐ９７ポリペプチドである）を含めるための以下のＣｕＡＡＣベースの反応またはＲｕＡＡＣベースの反応によって形成することができる。
一定の実施形態では、アジド側鎖を有する非天然アミノ酸および／またはアルキン側鎖を有する非天然アミノ酸は、末端アミノ酸（Ｎ末端、Ｃ末端）である。一定の実施形態では、１つ以上の非天然アミノ酸は内部非天然アミノ酸である。
例えば、一定の実施形態は、アルキン基を含む薬剤に結合体化したアジド側鎖を有するＮ末端非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態は、アルキン基を含む薬剤に結合体化したアジド側鎖を有するＣ末端非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。特定の実施形態は、アジド側鎖を含む薬剤に結合体化したアルキン側鎖を有するＮ末端非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。さらなる実施形態は、アジド側鎖を含む薬剤に結合体化したアルキン側鎖を有するＣ末端非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態は、アルキン基を含む薬剤に結合体化したアジド側鎖を有する少なくとも１つの内部非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。さらなる実施形態は、アジド側鎖を含む薬剤に結合体化したアルキン側鎖を有する少なくとも１つの内部非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。
特定の実施形態は、アルキン側鎖を有するＮ末端非天然アミノ酸を含むポリペプチド薬剤に結合体化したアジド側鎖を有するＮ末端非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。他の実施形態は、アルキン側鎖を有するＣ末端非天然アミノ酸を含むポリペプチド薬剤に結合体化したアジド側鎖を有するＣ末端非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。さらに他の実施形態は、アルキン側鎖を有するＣ末端非天然アミノ酸を含むポリペプチド薬剤に結合体化したアジド側鎖を有するＮ末端非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。さらなる実施形態は、アルキン側鎖を有するＮ末端非天然アミノ酸を含むポリペプチド薬剤に結合体化したアジド側鎖を有するＣ末端非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。
他の実施形態は、アジド側鎖を有するＮ末端非天然アミノ酸を含むポリペプチド薬剤に結合体化したアルキン側鎖を有するＮ末端非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。なおさらなる実施形態は、アジド側鎖を有するＣ末端非天然アミノ酸を含むポリペプチド薬剤に結合体化したアルキン側鎖を有するＣ末端非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。さらなる実施形態は、アジド側鎖を有するＣ末端非天然アミノ酸を含むポリペプチド薬剤に結合体化したアルキン側鎖を有するＮ末端非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。なおさらなる実施形態は、アジド側鎖を有するＮ末端非天然アミノ酸を含むポリペプチド薬剤に結合体化したアルキン側鎖を有するＣ末端非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドを含む。
（ａ）（ｉ）アジド側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドと少なくとも１つのアルキン基を含む薬剤（例えば、アルキン側鎖を有する非天然アミノ酸）との間；または（ｉｉ）アルキン側鎖を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むｐ９７ポリペプチドと少なくとも１つのアジド基を含む薬剤（例えば、アジド側鎖を有する非天然アミノ酸）との間のアジド−アルキン付加環化反応を行う工程；および（ｂ）反応物からｐ９７結合体を単離し、それにより、ｐ９７結合体を生成する工程を含む、ｐ９７結合体の生成方法も含む。
ｐ９７結合体が融合ポリペプチドである場合、融合ポリペプチドを、一般に、標準的な技術を使用して調製することができる。しかし、好ましくは、融合ポリペプチドを、本明細書中に記載され、且つ当該分野で公知の発現系での組換えポリペプチドとして発現する。本発明の融合ポリペプチドは、ｐ９７ポリペプチド配列の１つまたは複数のコピーを含むことができ、且つ目的のポリペプチドベースの薬剤（例えば、ＬＳＤポリペプチド）の１つまたは複数のコピーを含むことができる（任意の所望の配置で存在する）。
融合タンパク質について、ｐ９７ポリペプチド、ポリペプチド薬剤（例えば、ＬＳＤポリペプチド）、および任意選択的なペプチドリンカー成分をコードするＤＮＡ配列を個別にアセンブリし、次いで、適切な発現ベクターにライゲートすることができる。一方のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端を、ペプチドリンカーを使用するか使用しないで他方のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に配列の読み枠がインフレームであるようにライゲートする。ライゲートしたＤＮＡ配列を、適切な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに作動可能に連結する。ＤＮＡ発現を担う調節エレメントを、第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して５’方向のみで位置づける。同様に、翻訳終止シグナルおよび転写終止シグナルを終了させるのに必要な終止コドンは、ほとんどのＣ末端ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して３’の方向にのみ存在する。これにより、両成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合ポリペプチドに翻訳される。
類似の技術（主に、プロモーター、終止コドン、および転写終止シグナルなどの調節エレメントの配置）を、非融合結合体の産生のための非融合タンパク質（例えば、ｐ９７ポリペプチド）およびポリペプチド薬剤（例えば、抗体剤）の組換え産生に適用することができる。
本発明のポリヌクレオチドおよび融合ポリヌクレオチドは、ｐ９７ポリペプチド配列をコードする核酸の１つまたは複数のコピーを含むことができ、そして／またはＬＳＤポリペプチドなどのポリペプチド薬剤をコードする核酸の１つまたは複数のコピーを含むことができる。
いくつかの実施形態では、対象とされるｐ９７ポリペプチド、抗体、もしくは他のポリペプチド薬剤、および／またはｐ９７−ポリペプチド融合物をコードする核酸を宿主細胞に直接移入し、細胞を、コードされたポリペプチドの発現を誘導するのに十分な条件下でインキュベートする。本開示のポリペプチド配列を、当業者に周知の標準的な技術を使用して本明細書中に提供したポリペプチド配列および核酸配列と組み合わせて調製することができる。
したがって、一定の関連する実施形態によれば、本明細書中に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは融合ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を提供する。宿主細胞中でのｐ９７ポリペプチド、ＬＳＤポリペプチド、またはｐ９７−ＬＳＤポリペプチド融合物の発現を、適切な条件下でのポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞の培養によって都合よく行うことができる。発現による産生後、ポリペプチドを、任意の適切な技術を使用して単離および／または精製し、次いで、必要に応じて使用することができる。
種々の異なる宿主細胞中でのポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は周知である。適切な宿主細胞には、細菌系、哺乳動物細胞系、酵母系、およびバキュロウイルス系が含まれる。当該分野で利用可能な異種ポリペプチド発現のための哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、およびＮＳＯマウス黒色腫細胞などが含まれる。一般的な好ましい細菌宿主は大腸菌である。大腸菌などの原核細胞中でのポリペプチドの発現は、当該分野で十分に確立されている。概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．９：５４５−５５１（１９９１）を参照のこと。培養における真核細胞中での発現もまた、ポリペプチドの組換え産生の選択肢として当業者が利用可能である（Ｒｅｆ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３−５７６，１９９３；およびＴｒｉｌｌら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：５５３−５６０，１９９５を参照のこと）。
適切な調節配列（プロモーター配列、終結配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および必要に応じた他の配列が含まれる）を含む適切なベクターを選択するか構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス（例えば、ファージ、すなわちファージミド）であり得る。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。例えば、核酸構築物の調製における核酸の操作、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの移入および遺伝子発現、ならびにタンパク質分析のための多数の公知の技術およびプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２またはその後の最新情報に詳述されている。
用語「宿主細胞」を、１つ以上の本明細書中に記載のポリペプチドをコードする核酸配列が導入されているか導入することができ、選択された目的の遺伝子（任意の本明細書中に記載のポリペプチドをコードする遺伝子など）をさらに発現するか発現することができる細胞をいうために使用する。この用語は、選択した遺伝子が存在する限り、子孫が元の親と同一の形態学的性質または遺伝子構造であるかどうか無関係な親細胞の子孫を含む。宿主細胞を、一定の特徴、例えば、スルファターゼモチーフ内のシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基に変換するためのホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の発現、または非天然アミノ酸（結合体化を容易にするためのアジド側鎖、アルキン側鎖、または他の所望の側鎖を有する非天然アミノ酸が含まれる）をポリペプチドに組み込むことができるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの発現について選択することができる。
したがって、かかる核酸を宿主細胞に導入する工程を含む方法も意図される。核酸の導入は、任意の利用可能な技術を使用することができる。真核細胞について、適切な技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス（例えば、ワクシニア、または昆虫細胞用のバキュロウイルス）を使用した形質導入が含まれ得る。細菌細胞について、適切な技術には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを使用したトランスフェクションが含まれ得る。導入後、例えば、遺伝子発現条件下での宿主細胞の培養によって核酸から発現させるか発現を可能にすることができる。１つの実施形態では、核酸を、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に取り込む。標準的な技術にしたがってゲノムを使用した組換えを促進する配列を含めることによって取り込みを促進することができる。
本発明はまた、一定の実施形態では、特定のポリペプチド（本明細書中に記載のｐ９７ポリペプチド、ＬＳＤポリペプチド、またはｐ９７−ＬＳＤポリペプチド融合タンパク質など）を発現するために発現系中で本明細書中に記載の核酸構築物を使用する工程を含む方法を提供する。
上述の通り、一定のｐ９７結合体（融合タンパク質など）は、１つ以上のリンカー基（非ペプチドリンカー（例えば、非タンパク質リンカー）およびペプチドリンカーが含まれる）を使用することができる。かかるリンカーは安定なリンカーまたは放出可能なリンカーであり得る。
例示的な非ペプチドの安定性連結には、スクシンイミド、プロピオン酸、カルボキシメチラート連結、エステル、カルバマート、アミド、アミン、カルバミド、イミン、脂肪族Ｃ−Ｃ結合、チオエーテル連結、チオカルバマート、およびチオカルバミドなどが含まれる。一般に、加水分解的に安定な連結は、生理学的条件下で約１〜２％から５％／日未満の加水分解率を示す連結である。
例示的な非ペプチドの放出性連結には、カルボン酸エステル連結、リン酸エステル連結、無水物連結、アセタール連結、ケタール連結、アシルオキシアルキルエーテル連結、イミン連結、オルトエステル連結、チオエステル連結、チオールエステル連結、カルボナート連結、およびヒドラゾン連結が含まれる。加水分解的に不安定なまたは弱い連結のさらなる例示的な実施形態には、以下が含まれるが、これらに限定されない：−Ｏ２Ｃ−（ＣＨ２）ｂ−Ｏ−（式中、ｂは１〜５である）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２−（ＣＨ２）ｃ−（式中、ｂは１〜５であり、ｃは２〜５である）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２−（ＣＨ２）ｃ−Ｏ−（式中、ｂは１〜５であり、ｃは２〜５である）、−（ＣＨ２）ｂ−ＯＰＯ３−（ＣＨ２）ｂ’−（式中、ｂは１〜５であり、ｂ’は１〜５である）、−Ｃ（Ｏ）−（ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ）ａ−ＮＨ−ＣＨＲ−（式中、ａは２〜２０であり、Ｒは、α−アミノ酸上に見いだされる置換基である）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯ２−ＣＨＣＨ２−ＣＨ２−（式中、ｂは１〜５である）、−Ｏ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ＝Ｎ−（ＣＨ２）ｂ−Ｏ−（式中、ｂは１〜５である）、および−Ｏ−（ＣＨ２）ｂ−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−（ＣＨ２）ｂ−Ｏ−（式中、各ｂは、独立して、１〜５である）。
放出可能なリンカーの他の例は、ベンジル脱離ベースのリンカー、トリアルキルロックベースのリンカー（またはトリアルキルロックラクトン化ベースのリンカー）、ビシンベースのリンカー、および酸不安定性リンカーであり得る。その内で、酸不安定性リンカーは、ジスルフィド結合、ヒドラゾン含有リンカー、およびチオプロピオナート含有リンカーであり得る。
細胞への内在化中または内在化の際に放出可能なまたは切断可能なリンカーも含まれる。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出機構には、ジスルフィド結合の還元による切断（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒの米国特許第４，４８９，７１０号）、光解離性結合の照射による切断（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化アミノ酸側鎖の加水分解による切断（例えば、Ｋｏｈｎらの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介加水分解による切断（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらの米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解による切断（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらの米国特許第４，５６９，７８９号）が含まれる。１つの実施形態では、酸不安定性リンカーを使用することができる（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１，１９９２；および米国特許第５，２０８，０２０号）。
一定の実施形態では、「水溶性ポリマー」を、ｐ９７ポリペプチド配列の目的の薬剤へのカップリングのためのリンカーにおいて使用する。「水溶性ポリマー」は、水溶性であり、通常は実質的に非免疫原性であり、通常は原子分子量が約１，０００ダルトンを超えるポリマーをいう。水溶性ポリマーを介した２つのポリペプチドの付着は、かかる修飾が血清半減期の増加（例えば、タンパク質分解安定性の増加および／または腎臓クリアランスの減少）によって治療指数を増加させることができるので、望ましい可能性がある。さらに、１つ以上のポリマーの付着により、タンパク質医薬品の免疫原性が減少し得る。水溶性ポリマーの特定の例には、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーなどが含まれる。
いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーの有効流体学的分子量は、約１０，０００Ｄａ超、約２０，０００〜５００，０００Ｄａ超、約４０，０００Ｄａ〜３００，０００Ｄａ超、約５０，０００Ｄａ〜７０，０００Ｄａ超、通常は約６０，０００Ｄａ超である。「有効流体学的分子量」は、水ベースのサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって決定した場合のポリマー鎖の有効な水溶媒和サイズをいう。水溶性ポリマーがポリアルキレンオキシド反復単位（エチレンオキシド反復単位など）を有するポリマー鎖を含む場合、各鎖の原子分子量は、約２００Ｄａと約８０，０００Ｄａとの間または約１，５００Ｄａと約４２，０００Ｄａとの間であり得、２，０００〜約２０，０００Ｄａが特に興味深い。直鎖、分枝鎖、および末端荷電水溶性ポリマーも含まれる。
アルデヒドタグ化ポリペプチド間のリンカーとして有用なポリマーは、広範な分子量およびポリマーサブユニットを有することができる。これらのサブユニットは、生物学的ポリマー、合成ポリマー、またはその組み合わせを含むことができる。かかる水溶性ポリマーの例には、以下が含まれる：デキストランおよびデキストラン誘導体（硫酸デキストラン、Ｐ−アミノ架橋デキストリン、およびカルボキシメチルデキストリンが含まれる）、セルロースおよびセルロース誘導体（メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースが含まれる）、デンプンおよびデキストリン、ならびにデンプンの誘導体および加水分解物（ｈｙｄｒｏｙｌａｃｔｅ）、ポリアルキレングリコール（ｐｏｌｙａｌｋｌｙｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）およびその誘導体（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールのプロピレングリコールとのコポリマー（ここで、前記ホモポリマーおよびコポリマーは非置換であるか、１つの末端がアルキル基、ヘパリンおよびヘパリンのフラグメント、ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル、ポリビニルピロリドン、アスパルトアミド、およびポリオキシエチル化ポリオール、デキストランおよびデキストラン誘導体、デキストリンおよびデキストリン誘導体と置換されている）が含まれる）。具体的に記載した水溶性ポリマーの種々の誘導体も含まれると認識されるであろう。
水溶性ポリマー、特に、ポリエチレングリコール「ＰＥＧ」などのポリアルキレンオキシドベースのポリマーが当該分野で公知である（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；およびＰｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｅｄｓ．，ＡＣＳ（１９９７）；ならびに国際特許出願：ＷＯ９０／１３５４０号、ＷＯ９２／００７４８号、ＷＯ９２／１６５５５号、ＷＯ９４／０４１９３号、ＷＯ９４／１４７５８号、ＷＯ９４／１７０３９号、ＷＯ９４／１８２４７号、ＷＯ９４／２８９３７号、ＷＯ９５／１１９２４号、ＷＯ９６／０００８０号、ＷＯ９６／２３７９４号、ＷＯ９８／０７７１３号、ＷＯ９８／４１５６２号、ＷＯ９８／４８８３７号、ＷＯ９９／３０７２７号、ＷＯ９９／３２１３４号、ＷＯ９９／３３４８３号、ＷＯ９９／５３９５１号、ＷＯ０１／２６６９２号、ＷＯ９５／１３３１２号、ＷＯ９６／２１４６９号、ＷＯ９７／０３１０６号、ＷＯ９９／４５９６４号、および米国特許第４，１７９，３３７号；同第５，０７５，０４６号；同第５，０８９，２６１号；同第５，１００，９９２号；同第５，１３４，１９２号；同第５，１６６，３０９号；同第５，１７１，２６４号；同第５，２１３，８９１号；同第５，２１９，５６４号；同第５，２７５，８３８号；同第５，２８１，６９８号；同第５，２９８，６４３号；同第５，３１２，８０８号；同第５，３２１，０９５号；同第５，３２４，８４４号；同第５，３４９，００１号；同第５，３５２，７５６号；同第５，４０５，８７７号；同第５，４５５，０２７号；同第５，４４６，０９０号；同第５，４７０，８２９号；同第５，４７８，８０５号；同第５，５６７，４２２号；同第５，６０５，９７６号；同第５，６１２，４６０号；同第５，６１４，５４９号；同第５，６１８，５２８号；同第５，６７２，６６２号；同第５，６３７，７４９号；同第５，６４３，５７５号；同第５，６５０，３８８号；同第５，６８１，５６７号；同第５，６８６，１１０号；同第５，７３０，９９０号；同第５，７３９，２０８号；同第５，７５６，５９３号；同第５，８０８，０９６号；同第５，８２４，７７８号；同第５，８２４，７８４号；同第５，８４０，９００号；同第５，８７４，５００号；同第５，８８０，１３１号；同第５，９００，４６１号；同第５，９０２，５８８号；同第５，９１９，４４２号；同第５，９１９，４５５号；同第５，９３２，４６２号；同第５，９６５，１１９号；同第５，９６５，５６６号；同第５，９８５，２６３号；同第５，９９０，２３７号；同第６，０１１，０４２号；同第６，０１３，２８３号；同第６，０７７，９３９号；同第６，１１３，９０６号；同第６，１２７，３５５号；同第６，１７７，０８７号；同第６，１８０，０９５号；同第６，１９４，５８０号；同第６，２１４，９６６号（参考として援用される）を参照のこと）。
例示的な目的のポリマーには、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシド、またはその誘導体（式−−（ＣＨ２−−ＣＨ２−−Ｏ）−−のエチレンオキシド反復単位を含むポリアルキレンオキシドおよびポリアミドアルキレンオキシドが含まれる）を含むポリマーが含まれる。さらなる例示的な目的のポリマーには、分子量が約１，０００ダルトンを超える式−−［Ｃ（Ｏ）−−Ｘ−−Ｃ（Ｏ）−−ＮＨ−−Ｙ−−ＮＨ］ｎ−または−−［ＮＨ−−Ｙ−−ＮＨ−−Ｃ（Ｏ）−−Ｘ−−Ｃ（Ｏ）］ｎ−−（式中、ＸおよびＹは、同一でも異なっていてもよく、分枝鎖または直鎖であり得る２価のラジカルであり、ｎは２〜１００、通常は２〜５０の個別の整数であり、ＸおよびＹのいずれかまたは両方が直鎖または分枝鎖であり得る生体適合性の実質的に非抗原性の水溶性反復単位を含む）のポリアミドが含まれる。
さらなる例示的な水溶性反復単位は、式−−（ＣＨ２−−ＣＨ２−−Ｏ）−−または−−（ＣＨ２−−ＣＨ２−−Ｏ）−−のエチレンオキシドを含む。かかる水溶性反復単位数は有意に変化することができ、かかる単位の通常の数は２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、最も通常には２〜５０である。例示的な実施形態は、ＸおよびＹの一方または両方が以下から選択される水溶性反復単位である：−−（（ＣＨ２）ｎ１−−（ＣＨ２−−ＣＨ２−−Ｏ）ｎ２−−（ＣＨ２）−−または−−（（ＣＨ２）ｎ１−−（Ｏ−−ＣＨ２−−ＣＨ２）ｎ２−−（ＣＨ２）ｎ１−−）（式中、ｎ１は１〜６、１〜５、１〜４、最も通常には１〜３であり、ｎ２は、２〜５０、２〜２５、２〜１５、２〜１０、２〜８、最も通常には２〜５である）。さらなる例示的な実施形態は、いくつかあるバリエーションのうちで、Ｘが−−（ＣＨ２−−ＣＨ２）−−であり、Ｙが−−（ＣＨ２−−（ＣＨ２−−ＣＨ２−−Ｏ）３−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−ＣＨ２）−−−または−−（ＣＨ２−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−（Ｏ−−ＣＨ２−−ＣＨ２）３−−ＣＨ２）−−である水溶性反復単位である。
一定の実施形態では、ペプチドリンカー配列を使用して、ｐ９７結合体の成分を分離またはカップリングすることができる。例えば、ポリペプチド−ポリペプチド結合体について、ペプチドリンカーは、確実に各ポリペプチドがその二次構造および三次構造に折りたたまれるのに十分な距離で成分を分離することができる。かかるペプチドリンカー配列を、本明細書中に記載されており、且つ当該分野で周知の標準的な技術を使用して、結合体（例えば、融合タンパク質）に組み込むことができる。適切なペプチドリンカー配列を、以下の要因に基いて選択することができる：（１）可動性の伸長高次構造を採用する能力；（２）第１および第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用することができる二次構造を採用できないこと；および（３）ポリペプチド機能性エピトープと反応し得る疎水性残基または荷電残基の欠如。リンカーとして有用に使用することができるアミノ酸配列には、Ｍａｒａｔｅａら，Ｇｅｎｅ ４０：３９−４６，１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８−８２６２，１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号、および米国特許第４，７５１，１８０号に開示のアミノ酸配列が含まれる。
一定の例示的な実施形態では、ペプチドリンカーは、約１〜５アミノ酸、５〜１０アミノ酸、５〜２５アミノ酸、５〜５０アミノ酸、１０〜２５アミノ酸、１０〜５０アミノ酸、１０〜１００アミノ酸、または任意のその間の範囲のアミノ酸である。他の例示的な実施形態では、ペプチドリンカーは、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれを超えるアミノ酸長を含む。特定のリンカーは、約１〜２００アミノ酸、１〜１５０アミノ酸、１〜１００アミノ酸、１〜９０アミノ酸、１〜８０アミノ酸、１〜７０アミノ酸、１〜６０アミノ酸、１〜５０アミノ酸、１〜４０アミノ酸、１〜３０アミノ酸、１〜２０アミノ酸、１〜１０アミノ酸、１〜５アミノ酸、１〜４アミノ酸、１〜３アミノ酸の全アミノ酸長、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくはそれを超えるアミノ酸を有することができる。
ペプチドリンカーは、本明細書中の他の場所に記載されており、且つ当該分野で公知の任意の１つ以上の天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、アミノ酸アナログ、および／またはアミノ酸模倣物を使用することができる。リンカーとして有用に使用することができる一定のアミノ酸配列には、Ｍａｒａｔｅａら，Ｇｅｎｅ ４０：３９−４６，１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．８３：８２５８−８２６２，１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号、および米国特許第４，７５１，１８０号に開示のアミノ酸配列が含まれる。特定のペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ｓｅｒ残基、および／またはＡｓｎ残基を含む。他の中性に近いアミノ酸（ＴｈｒおよびＡｌａなど）も、必要に応じてペプチドリンカー配列中で使用することができる。
一定の例示的なリンカーには、以下のＧｌｙ、Ｓｅｒ、および／またはＡｓｎ含有リンカーが含まれる：［Ｇ］ｘ、［Ｓ］ｘ、［Ｎ］ｘ、［ＧＳ］ｘ、［ＧＧＳ］ｘ、［ＧＳＳ］ｘ、［ＧＳＧＳ］ｘ（配列番号６）、［ＧＧＳＧ］ｘ（配列番号７）、［ＧＧＧＳ］ｘ（配列番号８）、［ＧＧＧＧＳ］ｘ（配列番号９）、［ＧＮ］ｘ、［ＧＧＮ］ｘ、［ＧＮＮ］ｘ、［ＧＮＧＮ］ｘ（配列番号１０）、［ＧＧＮＧ］ｘ（配列番号１１）、［ＧＧＧＮ］ｘ（配列番号１２）、［ＧＧＧＧＮ］ｘ（配列番号１３）リンカー（式中、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、またはそれを超える数である）。これらのアミノ酸および関連するアミノ酸の他の組み合わせが当業者に明らかであろう。
特定の実施形態では、リンカー配列は、３つのグリシン残基を含むＧｌｙ３リンカー配列を含む。特定の実施形態では、可動性リンカーを、ＤＮＡ結合部位およびペプチド自体の両方をモデリングすることができるコンピュータプログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ．９０：２２５６−２２６０，１９９３；およびＰＮＡＳ．９１：１１０９９−１１１０３，１９９４）を使用するかファージディスプレイ法によって合理的にデザインすることができる。
ペプチドリンカーは、生理学的に安定であり得るか、放出可能なリンカー（生理学的分解性リンカーまたは酵素分解性リンカー（例えば、タンパク質分解性リンカー）など）が含まれ得る。一定の実施形態では、１つ以上の放出可能なリンカーにより、結合体の半減期がより短くなり、且つクリアランスがより迅速になり得る。これらおよび関連する実施形態を使用して、例えば、血流中のｐ９７結合体の溶解性および血液循環寿命を向上させることができる一方で、薬剤を血流中に（またはＢＢＢを通過して）送達させることもでき、リンカーの分解後、ｐ９７配列を実質的に含まない。これらの態様は、ポリペプチドまたは他の薬剤が、ｐ９７配列に持続的に結合体化した時に活性の減少が認められる場合に特に有用である。本明細書中に提供したリンカーの使用により、かかる抗体は、結合体化形態である場合にその治療活性を維持することができる。これらおよび他の方法では、ｐ９７結合体の性質を、長期間にわたって抗体の生物活性および循環半減期のバランスをとるようにより有効に調整することができる。
本発明の特定の実施形態での使用に適切な酵素分解性連結には、以下が含まれるが、これらに限定されない：セリンプロテアーゼ（トロンビン、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カリクレイン、またはサブチリシン（ｓｕｂｓｔｉｌｉｓｉｎ）など）によって切断されるアミノ酸配列。トロンビン切断性アミノ酸配列の実例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−（配列番号１４）、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−、−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−（配列番号１５）、−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−（配列番号１６）、−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−（配列番号１７）、−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−、−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−、および−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−。エラスターゼ切断性アミノ酸配列の実例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−（配列番号１８）、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−（配列番号１９）、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−（配列番号２０）、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−（配列番号２１）、および−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−（配列番号２２）。
本発明の特定の実施形態での使用に適切な酵素分解性連結には、マトリックスメタロプロテイナーゼ（コラゲナーゼ、ストロメライシン、およびゼラチナーゼなど）によって切断することができるアミノ酸配列も含まれる。マトリックスメタロプロテイナーゼ切断性アミノ酸配列の実例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｚ−（配列番号２３）、−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｚ−（配列番号２４）、−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｚ−（配列番号２５）、および−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｚ−（配列番号２６）（式中、ＹおよびＺはアミノ酸である）。コラゲナーゼ切断性アミノ酸配列の実例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｚ−（配列番号２７）、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｚ−（配列番号２８）、−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−（配列番号２９）、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−（配列番号３０）、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−（配列番号３１）、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−（配列番号３２）、および−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−（配列番号３３）（式中、Ｚはアミノ酸である）。ストロメライシン切断性アミノ酸配列の実例は、−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−（配列番号３４）であり、ゼラチナーゼ切断性アミノ酸配列の例は、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−（配列番号３５）である。
本発明の特定の実施形態での使用に適切な酵素分解性連結には、アンギオテンシン変換酵素によって切断することができるアミノ酸配列（例えば、−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−、−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（配列番号３６）および−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（配列番号３７）など）も含まれる。
本発明の特定の実施形態での使用に適切な酵素分解性連結には、カテプシンＢによって切断することができるアミノ酸配列（例えば、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（配列番号３８）、−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−（配列番号３９）、および−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−など）も含まれる。
しかし、一定の実施形態では、１つ以上の非ペプチドリンカーまたはペプチドリンカーのいずれかは任意である。例えば、第１および第２のポリペプチドが機能的ドメインを分離し、且つ立体障害を防止するために使用することができる非必須Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸領域を有する融合タンパク質ではリンカー配列は必要ないかもしれない。
本明細書中に記載のｐ９７ポリペプチドおよびｐ９７ポリペプチド結合体の機能的性質を、当業者に公知の種々の方法（例えば、親和性／結合アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴、競合阻害アッセイ）が含まれる）を使用して評価することができる。例えば、本明細書中に記載の結合体を、受容体内在化に及ぼす影響、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの有効性など（血液脳関門を通過する輸送速度が含まれる）について試験することができる。かかるアッセイを、当業者に公知の十分に確立されているプロトコール（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ ２００１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）を参照のこと）または市販のキットを使用して行うことができる。
使用方法および薬学的組成物
本発明の一定の実施形態は、本明細書中に記載の脱リン酸化されたリソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）タンパク質および関連するｐ９７結合体の組成物の使用方法に関する。かかる方法の例には、例えば、一定の器官／組織（神経系の器官／組織など）の医用画像のための脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質または関連するｐ９７結合体の使用を含む処置方法および診断方法が含まれる。いくつかの実施形態は、中枢神経系（ＣＮＳ）の障害もしくは容態またはＣＮＳ成分を有する障害もしくは容態の診断および／または処置方法を含む。特定の態様は、リソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）（ＣＮＳ成分を含む前記障害が含まれる）の処置方法を含む。
したがって、一定の実施形態は、本明細書中に記載の実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質またはそのｐ９７結合体を含む組成物を投与する工程を含む、処置を必要とする被験体の処置方法を含む。本明細書中に記載の実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質またはそのｐ９７結合体を含む組成物を投与する工程を含む、被験体の神経系（例えば、中枢神経系組織）への薬剤の送達方法も含まれる。一定のこれらおよび関連する実施形態では、本方法により、例えば、比較的または通常のリン酸化ＬＳＤタンパク質または結合体化されていないＬＳＤタンパク質を含む組成物による送達と比較して中枢神経系組織への薬剤の送達速度が増大する。
いくつかの例では、被験体は、リソソーム蓄積症を有するか有するリスクがある。したがって、一定の方法は、処置を必要とする被験体のリソソーム蓄積症（任意選択的に中枢神経系に関連するかＣＮＳ合併症（ＣＮＳ ｉｎｖｏｌｖｍｅｎｔ）を有するリソソーム蓄積症）の処置に関する。例示的なリソソーム蓄積症には、ムコ多糖体沈着症ＩＩ型（ハンター症候群）、ムコ多糖体沈着症Ｉ型（ハーラー症候群）、アスパルチルグルコサミン尿、コレステロールエステル蓄積症、ウォルマン病、シスチン蓄積症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ファーバー病、フコース蓄積症、ガラクトシアリドーシスＩ型／ＩＩ型、ゴーシェ病Ｉ型／ＩＩ型／ＩＩＩ型、ゴーシェ病、グロボイド細胞白質ジストロフィ（ｇｌｏｂｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｅｕｃｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、クラッベ病、糖原貯蔵障害ＩＩ、ポンぺ病、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ型／ＩＩ型／ＩＩＩ型、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩ型、テイ・サックス病、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩＩ型、サンドホフ病、ＧＭ２−ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシスＩ型／ＩＩ型、β−マンノシドーシス、異染性白質ジストロフィ（ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｃｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ムコリピドーシスＩ型、シアリドーシスＩ型／ＩＩ型ムコリピドーシスＩＩ型／ＩＩＩ型Ｉ細胞病、ムコリピドーシスＩＩＩＣ型偽性ハーラーポリジストロフィ、ムコ多糖体沈着症ＩＩＩＡ型、サンフィリッポ症候群、ムコ多糖体沈着症ＩＩＩＢ型、ムコ多糖体沈着症ＩＩＩＣ型、ムコ多糖体沈着症ＩＩＩＤ型、ムコ多糖体沈着症ＩＶＡ型、モルキオ症候群、ムコ多糖体沈着症ＩＶＢ型、モルキオ症候群、ムコ多糖体沈着症ＶＩ型、ムコ多糖体沈着症ＶＩＩ型、スライ症候群、ムコ多糖体沈着症ＩＸ型、多発性スルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチノーシス、ＣＬＮ１バッテン病、ニーマン・ピック病ＮＢ型、ニーマン・ピック病、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、濃化異骨症、シンドラー病Ｉ型／ＩＩ型、シンドラー病、およびシアル酸蓄積症が含まれる。これらおよび関連する実施形態では、本明細書中に記載のように、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質を、単独および／またはｐ９７結合体として投与することができる。
特定の態様では、リソソーム蓄積症はムコ多糖体沈着症ＩＩ型（ＭＰＳ ＩＩ；またはハンター症候群）であり、ＬＳＤタンパク質はヒトＩＤＳの実質的に脱リン酸化された形態である。ハンター症候群は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）蓄積によって特徴付けられるＸ連鎖多系統障害である。罹患個体の大多数は男性であり、稀に女性キャリアが所見を示す。発症年齢、疾患重症度、および進行速度は、大きく異なり得る。
重症疾患患者において、ＣＮＳ合併症（主に進行性の認知衰退を発症する）、進行性気道疾患、および心疾患により、通常、最初の１０年または次の１０年で死亡する。したがって、一定の実施形態は、ＣＮＳ合併症を有するハンター症候群の処置を含む。
軽症型疾患患者では、他の器官系に及ぼすＧＡＧ蓄積の影響は進行性認知低下患者と同程度の重症度であり得るにもかかわらず、ＣＮＳは罹患していない（または最小に罹患している）。正常な知能を有する若年青年期への生存は、軽症型形態の疾患で共通である。しかし、軽症型疾患を有する被験体は、ＣＮＳ組織への透過が改善される脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質（例えば、ＩＤＳ）の投与から依然として恩恵を受け得る（例えば、軽症型ハンター症候群からＣＮＳ合併症を有するハンター症候群への進行リスクを軽減する）。
ハンター症候群の両形態におけるさらなる所見には、以下が含まれる：低身長；交通性水頭症を伴うか伴わない大頭症；巨舌症；嗄声；伝音性および感音性の聴力損失；肝腫大および／または脾腫；多発性骨形成不全および関節拘縮（顎関節の強直症が含まれる）；脊柱管狭窄症；および手根管症候群。したがって、本明細書中に記載のＬＳＤタンパク質を使用した処置を受ける患者は、ハンター症候群のこれらの所見のうちの１つ以上を有し得る。
尿中ＧＡＧおよび骨検索は、ＭＰＳ容態の存在を証明することができるがＭＰＳ ＩＩに特異的ではない。男性発端者におけるＭＰＳ ＩＩ診断の客観的基準は、少なくとも１つの他のスルファターゼの正常な活性の存在下での白血球、線維芽細胞、または血漿中のイズロン酸スルファターゼ（ＩＤＳ）酵素活性の欠損である。ＩＤＳ（その変異がハンター症候群に関連することが知られている唯一の遺伝子）の分子遺伝子検査を使用して、通常でない表現型またはＧＡＧ試験結果に適合しない表現型を有する男性発端者における診断を確認することができる。
ハンター症候群の一般的な処置には、発達療法、作業療法、および理学療法；水頭症シャント術；扁桃摘出術およびアデノイド切除術；陽圧換気（ＣＰＡＰまたは気管切開術）；手根管開放術；心臓弁置換；鼠径ヘルニア修復が含まれる。それ故、一定の態様では、本明細書中に記載のＬＳＤタンパク質によって処置する被験体は、１つ以上のこれらの処置を受ける可能性があるか、受けているか、受けていた。
疾患モニタリングは、器官系合併症および疾患重症度に依存し得、通常、年１回の心機能評価および心エコー図；肺機能評価（肺機能検査が含まれる）；オーディオグラム；眼の検査；発達評価；および神経学的検査が含まれる。さらなる研究には、閉塞性無呼吸についての睡眠検査；手根管症候群を評価するための神経伝導速度（ＮＣＶ）；水頭症の評価；股疾患をモニタリングするための整形外科評価が含まれ得る。したがって、いくつかの態様では、本明細書中に記載のＬＳＤタンパク質による処置のための被験体は、１つ以上のこれらの疾患モニタリングプロトコールを受ける可能性があるか、受けているか、受けていた。
他の態様では、ＬＳＤはムコ多糖体沈着症Ｉ型（ハーラー症候群）であり、ＬＳＤタンパク質はヒトＬ−イズロニダーゼの実質的に脱リン酸化された形態である。ムコ多糖体沈着症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）は、一連の重症度に及ぶ特徴を有する進行性の多系統障害である。罹患個体は、伝統的には、３つのＭＰＳ Ｉ症候群（ハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群、またはシャイエ症候群）のうちの１つを有すると分類されるが、生化学的相違は同定されておらず、臨床所見は重複している。したがって、罹患個体は、ほとんどの場合、重症または軽症のＭＰＳ Ｉ（治療選択肢に影響を及ぼす特質）のいずれかを有すると説明される。
重症ＭＰＳ Ｉでは、乳児は出生時に正常に見え、典型的には、早期徴候は非特異的である（例えば、臍ヘルニアまたは鼠径ヘルニア、１歳未満の高頻度上気道の感染）。１歳を超えるまで粗大化顔貌は明らかになり得ない。下部脊椎の亀背が一般的である。全ての骨に関与する進行性骨格異形成（多発性骨形成不全）は汎発性である。３歳までに、線形の成長が停止する。知的障害が進行し、深刻になる。聴力損失が一般的である。典型的な心肺不全による死亡は、通常、１０歳以下で起こる。一定の態様では、本明細書中に記載のＬＳＤタンパク質での処置を受ける被験体は、任意選択的にＣＮＳ合併症を伴う重症ＭＰＳ Ｉを有し得る。
軽症型ＭＰＳ Ｉでは、疾患の重症度および疾患の進行速度は、２０〜３０年で死に至る重症の生命を脅かす合併症から進行性の関節疾患の顕在化に起因する有意な障害を伴う通常の寿命までの範囲である。個体によっては神経学的合併症を発症せず、学齢前期に精神運動発達が正常であり得るが、学習障害が存在し得る。臨床的発症は、通常、３歳と１０歳との間である。聴力損失および心臓弁疾患が一般的である。一定の態様では、本明細書中に記載のＬＳＤタンパク質での処置を受ける被験体は、任意選択的にＣＮＳ合併症を伴う軽症型ＭＰＳ Ｉを有し得る。
ＭＰＳ Ｉの診断は、典型的には、末梢血白血球、培養線維芽細胞、または血漿中のリソソーム酵素α−Ｌ−イズロニダーゼ活性の欠損が示されるかどうかに依存する。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（例えば、ヘパランおよびデルマタン硫酸）の尿中排泄の増加もまた、有用な予備試験である。ＩＤＵＡ（その変異がＭＰＳ Ｉを引き起こすことが現在知られている唯一の遺伝子）の分子遺伝子試験が臨床的に利用可能である。配列分析により、ほとんどのＭＰＳ Ｉ個体における両方のＩＤＵＡ変異が同定されると期待される。したがって、本明細書中に記載のＬＳＤタンパク質での処置を受ける被験体は、１つ以上のこれらのＭＰＳ Ｉの特徴を有し得る。
ＭＰＳＩの一般的な徴候の処置には、乳児学習プログラム／発達遅延のための特殊教育；グレアを軽減するための日除け付き帽子／サングラス；必要に応じた心臓弁置換；理学療法、必要に応じた整形外科（関節置換、環椎後頭骨安定化、手根管症候群のための正中神経減圧術）；水頭症のための脳脊髄液（ＣＳＦ）シャント術；耳管機能障害および／または上気道閉塞のための扁桃摘出術およびアデノイド切除術；睡眠時無呼吸、肺高血圧症、右心不全のための気管切開術；ＰＥチューブ；および頚髄症のための外科的介入が含まれる。それ故、一定の態様では、本明細書中に記載のＬＳＤタンパク質による処置のための被験体は、１つ以上のこれらの処置を受ける可能性があるか、受けているか、受けていた。
ＭＰＳ Ｉの初期の徴候の処置または防止には、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）が含まれ、これにより、２歳未満の重症ＭＰＳ Ｉの選択された小児の生存率を増加させ、顔貌粗大および肝脾腫を軽減し、聴覚を改善し、正常な心機能を維持することができる。ＨＳＣＴは、通常、骨の徴候や角膜混濁を改善しない。ＨＳＣＴは、小児において移植時に軽度であるが有意な認知障害を伴う一連の認知低下を遅延することができる。したがって、いくつかの態様では、本明細書中に記載のＬＳＤタンパク質による処置のための被験体は、少なくとも１つのＨＳＣＴを受ける可能性があるか、受けているか、受けていた。
ＭＰＳ Ｉのための疾患のモニタリングは、種々の要因に依存し得るが、乳児および小児における頭部成長の早期および継続的なモニタリング；日常的な正中神経伝導速度検査；および小学校入学前の軽症型疾患患児の教育評価が含まれ得る。整形外科医、神経科医（脊髄合併症）、眼科医、心臓病専門医（心エコー図が含まれる）、オージオロジスト、および耳鼻咽喉科医によって年１回の評価を行うことができる。したがって、いくつかの態様では、本明細書中に記載のＬＳＤタンパク質による処置のための被験体は、１つ以上のこれらの疾患モニタリングプロトコールを受ける可能性があるか、受けているか、受けていた。
ｉｎ ｖｉｖｏでの使用（例えば、ヒト疾患の処置、医用画像、または試験）のために、本明細書中に記載の実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質およびｐ９７結合体を、一般に、投与前に薬学的組成物に組み込む。薬学的組成物は、生理学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤と組み合わせた１つ以上の本明細書中に記載の実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質またはｐ９７結合体を含む。
薬学的組成物を調製するために、有効量または所望の量の１つ以上の実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質またはｐ９７結合体を、特定の投与様式に適切であることが当業者に公知の任意の薬学的キャリアまたは賦形剤と混合する。薬学的キャリアは、液体、半液体、または固体であり得る。非経口、皮内、皮下、または局所への適用のために使用される溶液または懸濁液には、例えば、滅菌希釈剤（水など）、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水；ＰＢＳ）、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌薬（ベンジルアルコールおよびメチルパラベンなど）；抗酸化剤（アスコルビン酸および亜硫酸水素ナトリウムなど）およびキレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；緩衝液（酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、およびリン酸緩衝液など）が含まれ得る。静脈内投与する場合、適切なキャリアには、生理的食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ならびに増粘剤および溶解補助剤（グルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびその混合物など）を含む溶液が含まれる。
本明細書中に記載のポリペプチドおよび結合体を、純粋な形態または適切な薬学的組成物の形態で、類似の用途の薬剤の許容された任意の投与様式によって投与することができる。薬学的組成物を、ポリペプチドまたは結合体または結合体含有組成物を生理学的に許容され得るキャリア、希釈剤、または賦形剤と組み合わせることによって調製することができ、これを固体、半固体、液体、または気体の調製物（錠剤、カプセル、散剤、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射液、吸入剤、ゲル、ミクロスフィア、およびエアロゾルなど）に処方することができる。さらに、他の薬学的に有効な成分（本明細書中の他の場所に記載の他の抗癌剤が含まれる）および／または適切な賦形剤（塩、緩衝液、および安定剤など）は、組成物内に存在し得るが、必須ではない。
種々の異なる経路（経口、非経口、鼻、静脈内、皮内、皮下、または局所が含まれる）によって投与することができる。好ましい投与様式は、処置または防止される容態の性質に依存する。
キャリアは、例えば、使用される投薬量および濃度で曝露される細胞または哺乳動物に無毒の薬学的に許容され得るキャリア、賦形剤、または安定剤が含まれ得る。しばしば、生理学的に許容され得るキャリアは、ｐＨ緩衝化水溶液である。生理学的に許容され得るキャリアの例には、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；抗酸化剤（アスコルビン酸が含まれる）；低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなど）；モノサッカリド、ジサッカリド、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンが含まれる）；キレート剤（ＥＤＴＡなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；および／または非イオン性界面活性剤（ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（商標））ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびポロキサマー（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標））など）が含まれる。
一定の実施形態では、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質および／またはｐ９７ポリペプチド配列を、各々か、個別にか、または依存の結合体としてか、粒子（例えば、ナノ粒子、ビーズ、脂質処方物、脂質粒子、またはリポソーム（例えば、免疫リポソーム））に結合するか、粒子内にカプセル化する。例えば、特定の実施形態では、ｐ９７ポリペプチド配列を粒子表面に結合させ、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質を粒子表面に結合させ、そして／または粒子内にカプセル化する。いくつかのこれらおよび関連する実施形態では、ｐ９７ポリペプチドおよび実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質を、粒子自体（例えば、ナノ粒子、リポソーム）のみを介して相互に共有結合性にまたは作動可能に連結させ、且つ任意の別の方法では相互に共有結合性に結合させない（すなわち、これらを同一粒子に個別に結合させる）。他の実施形態では、ｐ９７ポリペプチドおよび実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質を、最初に本明細書中に記載のように（例えば、リンカー分子を介して）相互に共有結合性または非共有結合性に結合体化し、次いで、粒子（例えば、免疫リポソーム、ナノ粒子）に結合させるか粒子内にカプセル化する。特定の実施形態では、粒子はリポソームであり、組成物は、１つ以上のｐ９７ポリペプチド、１つ以上の実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質、およびリポソームを形成するための脂質混合物（例えば、リン脂質（界面活性を有する混合脂質鎖））を含む。いくつかの態様では、リポソーム構造の形成によって共有結合性の結合体化を必要とすることなくｐ９７ポリペプチドおよび実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質が作動可能に連結されるように、ｐ９７ポリペプチドおよび実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質を脂質／リポソーム混合物と個別に混合する。他の態様では、ｐ９７ポリペプチドおよび実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質を、本明細書中に記載のように最初に共有結合性または非共有結合性に相互に結合体化し、次いで、脂質と混合してリポソームを形成する。他の実施形態では、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質を、いかなるｐ９７ポリペプチドも使用せずに粒子（例えば、ナノ粒子、ビーズ、脂質処方物、脂質粒子、またはリポソーム（例えば、免疫リポソーム））に結合するか粒子内にカプセル化する。ｐ９７ポリペプチド、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質、および／またはｐ９７−薬剤結合体を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリラート）マイクロカプセル）によって調製したマイクロカプセル中、コロイド薬物送達系中（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中に捕捉することができる。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０）に開示されている。粒子またはリポソームは、他の治療薬または診断薬（細胞毒性薬など）をさらに含むことができる。
正確な投薬量および処置の持続時間は、処置される疾患の関数であり、公知の試験プロトコールを使用するか、当該分野で公知のモデル系において組成物を試験し、それから外挿することによって経験的に決定することができる。比較臨床試験も行うことができる。投薬量はまた、緩和すべき容態の重症度によって異なり得る。薬学的組成物を、一般に、望ましくない副作用を最小にしながら治療的に有用な効果が発揮されるように処方および投与する。組成物を１回投与することができるか、間隔をあけて投与すべきいくつかのより小さな用量に分割することができる。任意の特定の被験体のために、特定の投薬レジメンを各必要性に応じて長期間にわたって調整することができる。
したがって、これらおよび関連する薬学的組成物の典型的な投与経路には、経口、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、口内、直腸、膣、および鼻腔内が含まれるが、これらに限定されない。用語「非経口」には、本明細書中で使用する場合、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内への注射または注入技術が含まれる。本発明の一定の実施形態の薬学的組成物を、患者への組成物の投与の際に組成物中に含まれる有効成分が生物学的に利用可能なように処方する。被験体または患者に投与される組成物は、例えば、錠剤が単回投薬単位であり得る場合に１つ以上の投薬単位の形態を取ることができ、エアロゾル形態の本明細書中に記載のポリペプチドまたは結合体の容器は複数の投薬単位を保持することができる。かかる投薬形態の実際の調製方法は公知であり、当業者に明らかであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００）を参照のこと。投与すべき組成物は、任意の事象において、目的の疾患または容態の処置のための治療有効量の実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質（すなわち、本明細書中に記載の結合体）を含むであろう。
薬学的組成物は、固体または液体であり得る。１つの実施形態では、組成物が、例えば、錠剤または散剤の形態であるように、キャリアは粒子である。組成物が、例えば、経口用油、注射液、またはエアロゾル（例えば、吸入投与に有用）である場合、キャリアは液体であり得る。経口投与を意図する場合、薬学的組成物は固体または液体のいずれかが好ましく、本明細書中で固体または液体と見なされる範囲内に半固体、半液体、懸濁液、およびゲル形態が含まれる。
経口投与のための固体組成物として、薬学的組成物を、散剤、顆粒、圧縮錠、丸薬、カプセル、チューインガム、またはウェハなどに処方することができる。かかる固体組成物は、典型的には、１つ以上の不活性希釈剤または食用キャリアを含むであろう。さらに、１つ以上の以下が存在することができる：結合剤（カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンなど）；賦形剤（デンプン、ラクトース、またはデキストリンなど）、崩壊剤（アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル、およびトウモロコシデンプンなど）；潤滑剤（ステアリン酸マグネシウムまたはステロテックスなど）；流動促進剤（コロイド状二酸化ケイ素など）；甘味剤（スクロースまたはサッカリンなど）；香味物質（ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバーなど）；および着色剤。薬学的組成物がカプセル形態（例えば、ゼラチンカプセル）である場合、薬学的組成物は、上記タイプの材料に加えて、液体キャリア（ポリエチレングリコールまたは油など）を含むことができる。
薬学的組成物は、液体、例えば、エリキシル、シロップ、溶液、乳濁液、または懸濁液の形態であり得る。液体は、２つの例を挙げると、経口投与用または注射による送達用であり得る。経口投与と意図する場合、好ましい組成物は、本発明の化合物に加えて、１つ以上の甘味剤、防腐剤、色素／着色剤、および香味増強剤を含む。注射による投与を意図する組成物では、１つ以上の界面活性剤、防腐剤、湿潤薬、分散剤、懸濁剤、緩衝液、安定剤、および等張剤を含めることができる。
溶液、懸濁液、または他の類似の形態である液体薬学的組成物は、１つ以上の以下のアジュバントを含むことができる：滅菌希釈剤（注射用蒸留水、生理食塩水（好ましくは生理的食塩水）、リンゲル液、等張塩化ナトリウム、固定油（合成モノグリセリドまたはジグリセリド（溶剤または懸濁媒質としての役割を果たし得る）、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶剤など）；抗菌薬（ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど）；抗酸化剤（アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸など）；緩衝液（酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはリン酸緩衝液など）、および張度を調整するための薬剤（塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）。非経口調製物を、アンプル、使い捨てのシリンジ、またはガラス製またはプラスチック製の多用量バイアル中に封入することができる。生理的食塩水は好ましいアジュバントである。注射用薬学的組成物は無菌であることが好ましい。
非経口または経口投与のいずれかを意図する液体薬学的組成物は、適切な投薬量が得られるような量の本明細書中に開示の実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質または結合体を含むべきである。典型的には、目的の薬剤のこの量は、組成物中において少なくとも０．０１％である。経口投与を意図する場合、この量は、組成物の０．１重量％と約７０重量％との間で変化し得る。一定の経口薬学的組成物は、約４％と約７５％との間の目的の薬剤を含む。一定の実施形態では、本発明の薬学的組成物および薬学的調製物を、希釈前に非経口投薬単位が０．０１重量％〜１０重量％の目的の薬剤を含むように調製する。
キャリアが溶液、乳濁液、軟膏、またはゲル基剤を適切に含むことができる場合、薬学的組成物は、局所投与を意図することができる。基剤は、例えば、１つ以上の以下を含むことができる：ペトロラタム、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、希釈剤（水およびアルコールなど）、ならびに乳化剤および安定剤。増粘剤は、局所投与用の薬学的組成物中に存在することができる。経皮投与を意図する場合、組成物は、経皮貼布またはイオン導入デバイスを含むことができる。
薬学的組成物は、例えば、直腸内で融解して薬物を放出する坐剤の形態で、直腸投与を意図し得る。直腸投与用組成物は、適切な非刺激性賦形剤として油脂性基剤を含むことができる。かかる基剤には、ラノリン、カカオバター、およびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。
薬学的組成物は、固体または液体の投薬単位の物理的形態を改変する種々の材料を含むことができる。例えば、組成物は、有効成分周囲にコーティングシェルを形成する材料を含むことができる。コーティングシェルを形成する材料は、典型的には不活性であり、例えば、糖、シェラック、および他の腸溶コーティング剤から選択することができる。あるいは、有効成分を、ゼラチンカプセルにカプセル化することができる。固体または液体の薬学的組成物は、結合体または薬剤に結合し、それにより、化合物の送達を補助する薬剤を含むことができる。この能力で作用することができる適切な薬剤には、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、１つ以上のタンパク質またはリポソームが含まれる。
薬学的組成物は、エアロゾルとして投与することができる投薬単位から本質的になり得る。用語「エアロゾル」を、コロイド性の系から圧縮パッケージからなる系までの範囲の種々の系を示すために使用する。液化ガスまたは圧縮ガスによるか、有効成分を分注する適切なポンプシステムによって送達することができる。エアロゾルを、有効成分を送達するための単相系、二相系、または三相系で送達することができる。エアロゾルの送達には、必要な容器、アクチベーター、バルブ、およびサブコンテナなどを含み、これらが共にキットを形成し得る。当業者は、過度に実験を行うことなく、好ましいエアロゾルを決定することができる。
本明細書中に記載の実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質または結合体を含む組成物を、身体からの急速な排出からタンパク質を防御するキャリア（持続放出性の処方物またはコーティングなど）を使用して調製することができる。かかるキャリアには、制御放出処方物（挿入物およびマイクロカプセル化送達系）および生分解性の生体適合性ポリマー（エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリオルソエステル、ポリ乳酸、および当業者に公知の他のポリマーなど）などが含まれるが、これらに限定されない。
薬学的組成物を、薬学分野で周知の方法論によって調製することができる。例えば、注射による投与を意図する薬学的組成物を、本明細書中に記載の実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質または結合体、および、任意選択的に１つ以上の塩、緩衝液、および／または安定剤を含む組成物を、滅菌蒸留水と組み合わせて溶液を形成することによって調製することができる。均一な溶液または懸濁液の形成を容易にするために、界面活性剤を添加することができる。界面活性剤は、水性送達系中でのタンパク質の溶解または均一な懸濁を容易にするためにタンパク質と非共有結合性に相互作用する化合物である。
組成物を治療有効量で投与することができ、治療有効量は、種々の要因（使用した特定の化合物（例えば、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質、結合体）の活性；化合物の代謝安定性および作用期間；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、および食事；投与の様式および時間；排出速度；薬物の組み合わせ；特定の障害または容態の重症度；および治療を受ける被験体が含まれる）に応じて変化するであろう。一般に、治療有効１日量は（７０ｋｇの哺乳動物について）、約０．００１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約０．０７ｍｇ）〜約１００ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約７．０ｇ）であり、好ましくは、治療有効用量は（７０ｋｇの哺乳動物について）は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約０．７ｍｇ）〜約５０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約３．５ｇ）であり、より好ましくは、治療有効用量（７０ｋｇの哺乳動物について）は、約１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約７０ｍｇ）〜約２５ｍｇ／ｋｇ（すなわち、約１．７５ｇ）である。
本明細書中に記載の実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質または結合体を含む組成物を、本明細書中に記載のように、１つ以上の他の治療薬の投与と同時、投与前、または投与後に投与することもできる。例えば、１つの実施形態では、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質または結合体を、抗炎症剤と共に投与する。抗炎症剤または抗炎症薬には、ステロイドおよび糖質コルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンが含まれる）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）（アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬、シクロホスファミド、およびミコフェノラートが含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。
かかる併用療法は、本発明の化合物および１つ以上のさらなる活性薬剤を含む単一の薬学的投薬形態の投与、ならびに本発明の結合体および各活性薬剤をその個別の薬学的投薬処方物中に含む組成物の投与を含むことができる。例えば、本明細書中に記載の結合体および他の活性薬剤を、患者に錠剤またはカプセルなどの単一の経口投薬組成物中で共に投与することができるか、各薬剤を個別の経口投薬処方物で投与することができる。同様に、本明細書中に記載の結合体および他の活性薬剤を、単一の非経口投薬組成物中で（生理食塩水または他の生理学的に許容され得る溶液中など）共に患者に投与することができるか、各薬剤を個別の非経口投薬処方物で投与することができる。個別の投薬処方物を使用する場合、実質的に脱リン酸化されたＬＳＤタンパク質または結合体および１つ以上のさらなる活性薬剤を含む組成物を、本質的に同時に（すなわち、一斉に）または個別にずらした時間で（すなわち、連続的および任意の順序で）投与することができ、併用療法は全てのこれらのレジメンが含まれると理解される。
以下の実施例を例示のために示すが、本発明を制限するものではない。
実施例１
脱リン酸化されたイズロニダーゼ（ＤＰＩＤＵ）の調製
イズロニダーゼを、リン酸基を除去するためにＡｆｆｉｇｅｌ固定ジャガイモ酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）で処理した。
Ａｆｆｉｇｅｌ固定ＰＡＰの調製。タンパク質のＡｆｆｉｇｅｌへの固定についてＢｉｏＲａｄによって提供されたプロトコールにしたがって、２０ｍｌの新鮮なＡｆｆｉｇｅｌ懸濁液を５０ｍｌポリプロピレンスクリュートップチューブに入れ、ＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏで５回洗浄した。３ｍｌの水および０．８３ｍｌの３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を、およそ２５ｍｌの最終体積まで添加した。３６０ｍｇのＰＡＰを１０ｍｌの０．１Ｍ ＮａＯＡｃに溶解し、０．５ｍｌを、開始ＯＤ２８０をチェックするために保持した。ＰＡＰ溶液をＡｆｆｉｇｅｌ溶液に添加し、混合し、ロッカー上に置いて４℃で一晩インキュベートした。
翌朝、ゲルをゆっくり沈殿させた（例えば、ベンチトップ遠心分離器にて４００ｒｐｍで１〜２秒間、または静置によるゲルの沈殿）。上清を除去し、最終ＯＤ２８０をチェックするために（連結効率をチェックするために）保持した。２０ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ／グリシン（ｐＨ５．６）の添加およびロッカー上での４℃で３時間のインキュベーションによって、未連結部位をゲル上でブロッキングした。ブロッキング溶液をゲルから除去し、ゲルを０．１Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）＋０．０１％ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）で４回洗浄した。ゲルを、０．０２％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）＋０．０１％ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）中にて４℃で保存した。
固定化ＰＡＰを使用したＩＤＵからのリン酸基の除去。緩衝液を調整済みのＡｆｆｉｇｅｌ−ＰＡＰゲルからデカントした。アジ化ナトリウムを除去するために、ゲルを、１５ｍｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）で４回洗浄した。ここで、洗浄の間にベンチトップ遠心分離器にて４００ｒｐｍまでで１秒間のスピンによってゲルを穏やかに充填した。
全実験で使用したイズロニダーゼは、ＯＤ２８０によって０．６６ｍｇ／ｍｌのＰａｕｌ ＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋのＰＤバッチ０００４１４に由来する。Ａｆｆｉｇｅｌ−ＰＡＰとのインキュベーションの前に、イズロニダーゼを０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）に完全に緩衝液交換して酸性ＰＢＳ保存緩衝液からリン酸塩を除去した。除去しなければ、脱リン酸化を阻害するであろう。全脱リン酸化反応のための緩衝液交換を、１Ｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を使用した１２ｍｌのＩＤＵ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｌｉｄｅ−ａｌｙｚｅｒ ｓｙｓｔｅｍ，１０Ｋ ＭＷカットオフ）（０．６６ｍｇ／ｍｌ）の一晩の透析によって行った。透析緩衝液を、２４時間で２回交換した。
脱リン酸化反応のために、１２ｍｌのイズロニダーゼ（０．６６ｍｇ／ｍｌ）を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および１０ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（０．０１％ポリソルベート８０を含む）を、５０ｍｌスクリュートップのポリプロピレンチューブ中の１５ｍｌの調製したＡｆｆｉｇｅｌ−ＰＡＰに添加した。混合物を、ロータリーインキュベーター上にて２５℃で約２１〜２４時間インキュベートし、ゲルをベンチトップ遠心分離器にて４００ｒｐｍで１〜２秒間軽くスピンした。
脱リン酸化ＩＤＵを含む上清を取り出し、０．００１％ポリソルベート８０を含む１５ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）でゲルを４回洗浄し、全上清を回収した。上清（約７０〜７５ｍｌ）をプールし、セントリコン（１０Ｋカットオフ）で濃縮した。ＩＤＳ処方物緩衝液（酸性ＰＢＳ）に緩衝液を交換して、最終体積を約４〜５ｍｌにした。ポリソルベート８０を、最終濃度０．００１％まで添加した。次いで、０．２２μＭフィルターを使用して組成物を濾過滅菌した。
実施例２
Ｐ９７脱リン酸化イズロン酸−２−スルファターゼ（ＤＰＩＤＳ）結合体の調製
標識された試験タンパク質および結合体を調製するために、ｄｐＩＤＳを、リン酸基数を減少させるためのアクリルビーズ結合仔牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）での処置によって組換えＩＤＳから調製した。
組換えＩＤＳ（１．５ｍｇ／ｍｌで４．５ｍｌ；ヒトＨＴ−１０８０細胞中で産生）を、予め平衡化したＣＩＰ−アクリルビーズを使用して穏やかに混合しながら３７℃で一晩処理した。ＣＩＰビーズをカラムに移し、通過画分（ＦＴ）を回収し、ビーズをおよそ２５ｍｌのＰＢＳで洗浄した。全ＦＴおよび洗浄画分を回収し、４．５ｍｌに濃縮した。次いで、ＣＩＰビーズを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２（ｐＨ８．０）で再度平衡化し、ＩＤＳの他のサブバッチのために再利用した。結合体化のために使用した最初のバッチ中で２９ｍｇのＣＩＰ処理ｄｐＩＤＳ（脱リン酸化ＩＤＳ）が生成された。ｄｐＩＤＳについて比活性の減少は認められなかった（表１を参照のこと）。しかし、プレート結合アッセイおよびＢｉａｃｏｒｅ分析によって測定した場合に可溶性マンノース−６−リン酸受容体（ｓＭ６ＰＲ）への結合の減少が認められた（ＫＤ２の結合親和性の１／７への減少および全応答（Ｒｍａｘ）の１／２への減少を示す表２を参照のこと）。ＰＡＤ−ＨＰＬＣによって測定した場合にマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）含有量の減少も認められた（ＭＰ６含有量の１／１７への減少または約９４〜９５％減少を示す表３を参照のこと）。
結合体化のために、約２８ｍｇ（１．４５ｍｇ／ｍｌで１９．６ｍｌ）のｄｐＩＤＳを、２．６×３３ｃｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５Ｆカラム上にて６．０ｍｌ／分で０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に緩衝液交換し、次いで、２つのＶｉｖａｓｐｉｎ ２０（１０ｋＤａ）フィルターを使用して濃縮した。このプロセスにより、２８０ｎｍでの紫外可視分光光度法によって示した場合に１６．５ｍｌのｄｐＩＤＳ溶液（１．６７ｍｇ／ｍｌ）が得られ、この波長での１ｍｇ／ｍｌ溶液のｄｐＩＤＳについての吸光度は１．３３（表示収量＝２８ｍｇ）と推測された。最初のＩＤＳ溶液を調製するために類似のプロトコール（通常のリン酸化）を行って、２２ｍｌのＩＤＳ溶液（１．４５ｍｇ／ｍｌ）を得た。次いで、下記のように、これらのタンパク質をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（ＡＦ６４７）、ヒトｐ９７（メラノトランスフェリン；ＭＴｆ）、またはその両方に結合体化した。
ｄｐＩＤＳへのＡＦ６４７の組込み。ｄｐＩＤＳの１１．６ｍｇ（６．９６ｍｌ）溶液（上記）に、２．０ｍｇ（４００μｌ）の５．０ｍｇ／ｍｌ溶液のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７スクシンイミドエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ２０００６）を含むＤＭＳＯを、ＡＦ６４７：ｄｐＩＤＳ比が１０：１に相当するように添加した。活性化反応を２０℃で３５分間進行させて、粗ＡＦ６４７標識ｄｐＩＤＳを得た。１．０８ｍｌの粗反応混合物（１．８ｍｇのｄｐＩＤＳを含む）を取り出し、単一のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５Ｍ ＰＤ−１０カラム上で５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液＋１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ６．７）に精製した。このプロセスにより、２．５ｍｌのＡＦ６４７活性化ｄｐＩＤＳ溶液を得た。
溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ６フィルターを使用して濾液の着色が認められなくなるまでダイアフィルトレーションを行い、次いで、濃縮して１．３１ｍｌのｄｐＩＤＳ−ＡＦ６４７溶液を濃度１．１５ｍｇ／ｍｌで得た。これは、１ｍｇ／ｍｌ溶液ｄｐＩＤＳについてこの波長で吸光度１．３３と推定され（収量＝１．５ｍｇ）、ＡＦ６４７：ＩＤＳ比２．０８から、６５０ｎｍでのＡＦ６４７のモル吸光係数は２３９，０００Ｌｍｏｌ−１ｃｍ−１と推定された。この溶液を０．２μｍに対して濾過した。このプロトコールを、通常のリン酸化ＩＤＳへのＡＦ６４７の組み込みにも使用した。
ｄｐＩＤＳ−ＡＦ６４７へのマレイミドの組込み。粗ＡＦ６４７標識ｄｐＩＤＳの一部（９．８ｍｇ）に、０．２３ｍｇ（１１３μｌ）の２．０ｍｇ／ｍｌの４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ、Ｔｈｅｒｍｏ ２２３６０）を含むＤＭＳＯ溶液を、ＳＭＣＣ：ｄｐＩＤＳ比が５：１に相当するように添加した。ｄｐＩＤＳ−ＡＦ６４７活性化反応を２０℃で６０分間進行させ、次いで、１２６μｌの１０ｍｇ／ｍｌグリシン水溶液にて２０℃で１５分間反応停止させた。
粗マレイミド活性化ｄｐＩＤＳ−ＡＦ６４７を、２．６×２３ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０Ｍカラム上にて溶離液として５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．０）を使用して、６．０ｍｌ／分で精製した。このプロセスにより、１４．０ｍｌのマレイミド活性化ｄｐＩＤＳ−ＡＦ６４７溶液を濃度０．６９ｍｇ／ｍｌで得た。これは、１ｍｇ／ｍｌのｄｐＩＤＳ溶液についてのこの波長で吸光度１．３３と推定され（収量＝９．７１ｍｇ）、ＡＦ６４７：ｄｐＩＤＳ比２．０１から、６５０ｎｍでのＡＦ６４７のモル吸光係数は２３９，０００Ｌｍｏｌ−１ｃｍ−１と推定された。ＳＡＭＳＡ−フルオレセインを使用してサンプルをマレイミド収量についてアッセイし、１．０４マレイミド基／ｄｐＩＤＳ分子の組込みが示された。このプロトコールを、通常のリン酸化ＩＤＳ−ＡＦ６４７へのマレイミドの組込みにも使用した。
ｐ９７（ＭＴｆ）−ｄｐＩＤＳ−ＡＦ６４７結合体化。２２０ｍｇの可溶性ｐ９７（ＭＴｆ）を、６．０ｍｇ／ｍｌで２．６×３４ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５Ｍカラム上にて０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に緩衝液交換し、次いで、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０（１０ｋＤａフィルター）を使用して濃縮して、２８０ｎｍでの紫外可視分光光度法によって示した場合に１５．０ｍｌのｐ９７溶液（１３．９１ｍｇ／ｍｌ）が得られ、この波長での１ｍｇ／ｍｌ溶液のｐ９７についての吸光度は１．１９（表示収量＝２０９ｍｇ）と推定された。
ｐ９７のチオール化のために、４６ｍｇ（３．３１ｍｌ）のｐ９７を解凍し、室温に平衡化し、６６μｌ（０．３３ｍｇ）の５．０ｍｇ／ｍｌのＳ−アセチルチオ酢酸およびスクシンイミジルエステル（ＳＡＴＡ、Ｔｈｅｒｍｏ ２６１０２）を含むＤＭＳＯ溶液を、ＳＡＴＡ：ｐ９７比が２．５：１に相当するように添加した。Ｓ−アセチルチオール化反応を、２０℃で６０分間進行させた。０．０５Ｍ ＥＤＴＡ二ナトリウム塩および２．５Ｍヒドロキシルアミンヒドロクロリドの水溶液（０．３３ｍｌ）（ｐＨ７．０）を添加してチオールを脱保護し、脱保護反応を２０℃で１５分間進行させた。
粗チオール化ｐ９７を、溶離液として５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．０）を使用して２つの使い捨てＰＣ−１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５Ｍカラムにて精製して低分子量副生成物を除去した。このプロセスにより、２８０ｎｍでの紫外可視分光光度法によって示した場合に６．０ｍｌの濃度７．４８ｍｇ／ｍｌのチオール化ｐ９７溶液が得られ、６．０ｍｌのチオール化ｐ９７溶液が得られ、この波長での１ｍｇ／ｍｌ溶液のｐ９７についての吸光度は１．１９（表示収量＝４５ｍｇ）と推定された。サンプルを、エルマン試薬を使用してチオール含有量についてアッセイし、ｐ９７分子あたり０．９チオール基の組込みを示した。
ｄｐＩＤＳ−ＡＦ６４７へのｐ９７の結合体化のために、９．２ｍｇのマレイミド活性化ｄｐＩＤＳ−ＡＦ６４７および１７．８ｍｇのチオール化ｐ９７（ｐ９７：ｄｐＩＤＳ比１．８：１に相当する）を共に２０℃で１８時間反応させた。５０μｌの２．０ｍｇ／ｍｌ ２−メルカプトエタノール水溶液（２０℃で１５分間のインキュベーション）および３２μｌの１０．０ｍｇ／ｍｌのＮ−エチルマレイミド水溶液（２０℃で１５分間のインキュベーション）の添加によって結合体化反応を停止させた。
粗結合体（約１６ｍｌ）を０．２μｍに対して濾過し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２０（１０ｋＤａフィルター）を使用して４．０ｍｌまで濃縮した。濃縮した粗結合体を、溶離液として５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液＝１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ６．７）を４．０ｍｌ／分で使用して２．６×６２ｃｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２０ＰＧカラムを使用した高分解能サイズ排除クロマトグラフィによって精製した。このプロトコールを、通常のリン酸化ＩＤＳ−ＡＦ６４７へのｐ９７の結合体化のためにも使用した。
実施例３
脱リン酸化イズロン酸−２−スルファターゼ（ＤＰＩＤＳ）およびＰ９７−ＤＰＩＤＵ結合体の脳組織内での分布
ＡＦ６４７標識ＩＤＳ、ｄｐＩＤＳ、ｐ９７（ＭＴｆ）−ＩＤＳ結合体、およびｐ９７（ＭＴｆ）−ｄｐＩＤＳ結合体の脳組織区画内の分布を評価するための実験を行った。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７（ＡＦ６４７）標識タンパク質を、以下の表にしたがって、マウスに静脈内注射した。
標識試験タンパク質注射の約２時間後、心臓内脳灌流を行って血液脳関門を損傷することなく脳脈管構造から血液を洗い出した。この手順を、組織学的研究および生体内分布研究のための脳切開および脳組織の調製の前に行った。ここで、トマトレクチン（１００μｇ）を、最初に安楽死の約１０分前にマウスに注射した（尾静脈注射）。マウスを、ケタミンおよびキシラジン（それぞれの用量１００ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射を用いて麻酔した。次いで、約４０μＬの１００単位／ｍＬのヘパリンを腹腔内投与した。マウスの意識消失後、マウスをエタノールで湿らせ、胸郭を除去して拍動している心臓を露呈させた。マウスを、２５ゲージ針を取り付けた１ｍｌシリンジを使用して右心室から失血させた。大静脈および／または右心房を切開して循環灌流液を排出させた。マウスを、肝臓から血液が除去されるまで２５ゲージ針および注入ポンプ（４ｍｌ／分で２〜５分間）を使用して左心室を介して灌流した。頭皮を、小刀を用いて眼の間から頸部まで開裂して頭蓋骨を露呈させた。脊髄を、小刀を用いて大後頭孔直下で切断した。鋏を使用して大後頭孔から眼に側方に向かって頭蓋骨を切断し、頭蓋骨の上部を除去した。弯曲鉗子を使用して、組織を損傷することなく脳を掻き出した。
次いで、脳を矢状面に沿って半分に切断し、各半球を秤量した。一方の半球を冷凍のためにＯＣＴコンパウンド中に包埋し、他方の半球を均質化および組織ホモジネートにおける蛍光の測定のために調製した。
結果を図１、２、および５に示す。図１は、静脈内注射後のマウスの脳実質中の試験タンパク質の蓄積レベルを示す（ＩＤＳ、イズロン酸−２−スルファターゼ；ｄｐＩＤＳ、脱リン酸化イズロン酸−２−スルファターゼ；ＭＴｆ−ＩＤＳ、ｐ９７−ＩＤＳ結合体；ＭＴｆ−ｄｐＩＤＳ、ｐ９７−ｄｐＩＤＳ結合体）。図２は、静脈内感染後のマウスの脳実質（ＢＢＢの内側）と脳毛細血管（ＢＢＢの外側）との間の試験タンパク質の分布を示す。図５は、ｐ９７（ＭＴｆ）への結合体化を含むか含まない脳実質内のＩＤＳおよびｄｐＩＤＳのレベルを示す。
これらのデータを使用して二元配置ＡＮＯＶＡ分析も行った。結果を以下の表に示す。
ｐ９７（ＭＴｆ）結合体化は結果に影響を及ぼすか？ＭＴｆ結合体化は全分散の約５３．１０％を占める。Ｆ＝７５．５２。ＤＦｎ＝１。ＤＦｄ＝３７。Ｐ値は＜０．０００１である。ＭＴｆ結合体化が全く影響を及ぼさない場合、このサイズの実験でこの大きな（またはより大きな）影響が無作為に認められる偶然は０．０１％未満である。この影響は非常に有意と見なされる。
Ｍ６Ｐ脱リン酸化は結果に影響を及ぼすか？Ｍ６Ｐ脱リン酸化は全分散の約１９．７５％を占める。Ｆ＝２８．０９。ＤＦｎ＝１。ＤＦｄ＝３７。Ｐ値は＜０．０００１である。Ｍ６Ｐ脱リン酸化が全く影響を及ぼさない場合、このサイズの実験でこの大きな（またはより大きな）影響が無作為に認められる偶然は０．０１％未満である。影響は非常に有意と見なされる。
これらのデータおよび分析によれば、脱リン酸化ＩＤＳは、通常のリン酸化ＩＤＳと比較して脳実質内への透過が有意に増加した。同様に、ｐ９７−ｄｐＩＤＳ結合体は、ｐ９７と通常のリン酸化ＩＤＳとの間の結合体と比較して脳実質内への透過が有意に増加した。それ故、リン酸基の除去は、単独またはｐ９７結合体としてのいずれの投与においてもＢＢＢを通過するＩＤＳの移行を有意に増加させた。
本明細書中に記載の種々の実施形態を組み合わせてさらなる実施形態を提供することができる。本明細書中で言及され、そして／または出願データシートに列挙された全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、その全体が本明細書中で参考として援用される。実施形態の態様を、必要に応じて種々の特許、出願、および刊行物の概念を使用して修正してなおさらなる実施形態を得ることができる。
上記の詳細な説明を考慮して実施形態に対するこれらのおよび他の変更形態を得ることができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用用語を、明細書および特許請求の範囲中に開示の特定の実施形態に特許請求の範囲を制限すると解釈すべきではなく、かかる特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲と共に全ての可能な実施形態が含まれると解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は開示によって制限されない。

Claims (6)

  1. ムコ多糖体沈着症ＩＩ型（ハンター症候群）の処置のための医薬の調製におけるヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）ポリペプチドを含む組成物の使用：
    ここで、前記ヒトＩＤＳポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列若しくは配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２のアミノ酸配列若しくは配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなり、且つ前記ＩＤＳポリペプチドのマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）含有量が約０．５ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質未満である。
  2. 前記ハンター症候群が、中枢神経系（ＣＮＳ）合併症を有するか、またはＣＮＳ合併症を発症するリスクがある、請求項１に記載の使用。
  3. 前記Ｍ６Ｐ含有量が、約０．１５ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質または約０．１５ｐｍｏｌ Ｍ６Ｐ／ｐｍｏｌ ＩＤＳタンパク質未満である、請求項１または２に記載の使用。
  4. 前記ヒトＩＤＳポリペプチドが、１つ以上のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
  5. 前記ヒトＩＤＳポリペプチドが、７個または８個のＮ結合型オリゴマンノースグリカンを含む、請求項４に記載の使用。
  6. 前記ヒトＩＤＳポリペプチドが、ｐ９７ポリペプチドに共有結合性に連結されるか、または作動可能に連結され、ｐ９７結合体を形成している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003222568B2 (en) 2002-01-11 2009-05-07 Bioasis Technologies, Inc. Use of P97 as an enzyme delivery system for the delivery of therapeutic lysosomal enzymes
BR112014002219A2 (pt) 2011-07-05 2018-08-07 Bioasis Technologies Inc conjugados anticorpo p97 e métodos de sua utilização
PT2739649T (pt) 2011-08-05 2018-01-03 Bioasis Technologies Inc Fragmentos de p97 com atividade de transferência
US9932565B2 (en) 2012-07-31 2018-04-03 Bioasis Technologies, Inc. Dephosphorylated lysosomal storage disease proteins and methods of use thereof
ES2774549T3 (es) 2013-03-13 2020-07-21 Bioasis Technologies Inc Fragmentos de P97 y usos de los mismos
US20160347821A1 (en) 2014-02-03 2016-12-01 Bioasis Technologies, Inc. P97 fusion proteins
DK3107562T3 (da) * 2014-02-19 2019-12-16 Bioasis Technologies Inc P97-ids-fusionsproteiner
CN106413757B (zh) 2014-05-01 2022-01-14 比奥阿赛斯技术有限公司 p97-多核苷酸结合物
GB201508025D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Fabry disease gene therapy
RU2673038C2 (ru) * 2016-01-18 2018-11-21 ООО "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" Лекарственное средство на основе бифункционального антитела для лечения мукополисахаридоза II типа
CN106282231B (zh) * 2016-09-06 2020-01-03 陕西慧康生物科技有限责任公司 粘多糖贮积症ii型动物模型的构建方法及应用
JP2019535396A (ja) 2016-11-10 2019-12-12 ザ リサーチ ファウンデーション フォー ザ ステート ユニバーシティ オブ ニューヨーク 気道閉塞に関するシステム、方法、及びバイオマーカ
JP7252211B2 (ja) * 2017-09-08 2023-04-04 ザ ヌムール ファウンデーション リソソーム蓄積症を治療するための薬剤、デバイス、および血液循環システム、ならびにリソソーム蓄積症を治療するための方法
CR20200129A (es) 2017-10-02 2020-08-22 Denali Therapeutics Inc Proteínas de fusión que comprenden enzimas de terapia de reemplazo de enzimas
WO2020077114A2 (en) * 2018-10-10 2020-04-16 Amicus Therapeutics, Inc. Disulfide bond stabilized polypeptide compositions and methods of use
US20220023434A1 (en) 2018-12-19 2022-01-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Bifunctional Molecules for Lysosomal Targeting and Related Compositions and Methods
CN110609078B (zh) * 2019-09-20 2022-03-11 南京谱利健生物技术有限公司 一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法
EP4229192A1 (en) 2020-10-14 2023-08-23 Denali Therapeutics Inc. Fusion proteins comprising sulfoglucosamine sulfohydrolase enzymes and methods thereof
CN118019768A (zh) * 2021-08-18 2024-05-10 吉尼瑞姆股份公司 治疗酶的靶向递送
CN114181318B (zh) * 2021-11-08 2023-08-01 四川大学 一种组织特异性表达穿透血脑屏障的idua融合蛋白的重组腺相关病毒及应用
WO2023204202A1 (ja) * 2022-04-19 2023-10-26 Ｊｃｒファーマ株式会社 マンノース－６－リン酸の数を減少させた糖蛋白質
WO2023207574A1 (zh) * 2022-04-28 2023-11-02 领诺(上海)医药科技有限公司 一种穿越血脑屏障的重组hARSA

Family Cites Families (163)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
US4394448A (en) 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
US4391904A (en) 1979-12-26 1983-07-05 Syva Company Test strip kits in immunoassays and compositions therein
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4489710A (en) 1981-06-23 1984-12-25 Xoma Corporation Composition and method for transplantation therapy
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4766075A (en) 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US5186941A (en) 1983-05-06 1993-02-16 Vestar, Inc. Vesicle formulation for the controlled release of therapeutic agents
US4625014A (en) 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4801542A (en) 1984-10-12 1989-01-31 Zymogenetics, Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
US4638045A (en) 1985-02-19 1987-01-20 Massachusetts Institute Of Technology Non-peptide polyamino acid bioerodible polymers
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US4935349A (en) 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
GB2188637B (en) 1986-02-07 1990-11-14 Oncogen Vaccines against melanoma
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4866042A (en) 1987-11-18 1989-09-12 Neuwelt Edward A Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier
US5720937A (en) 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
DE3815826A1 (de) 1988-05-09 1989-11-23 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von vicinal diacyloxysubstituierten verbindungen
US5470829A (en) 1988-11-17 1995-11-28 Prisell; Per Pharmaceutical preparation
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
DE69033192T3 (de) 1989-04-19 2004-05-19 Enzon, Inc. Aktive karbonate von polyalkylenoxyden zur modifizierung von polypeptiden
IL90193A (en) 1989-05-04 1993-02-21 Biomedical Polymers Int Polurethane-based polymeric materials and biomedical articles and pharmaceutical compositions utilizing the same
US5672683A (en) 1989-09-07 1997-09-30 Alkermes, Inc. Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein
US6018031A (en) 1989-10-20 2000-01-25 Trustees Of Dartmouth College Binding agents specific for IgA receptor
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5650388A (en) 1989-11-22 1997-07-22 Enzon, Inc. Fractionated polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
US5312808A (en) 1989-11-22 1994-05-17 Enzon, Inc. Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
NL194941C (nl) 1990-02-15 2003-08-04 Cordis Corp Werkwijze voor het aanbrengen van een fysiologisch actieve verbinding op een substraatoppervlak.
US5275838A (en) 1990-02-28 1994-01-04 Massachusetts Institute Of Technology Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
US5171264A (en) 1990-02-28 1992-12-15 Massachusetts Institute Of Technology Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
US5219564A (en) 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
WO1992000748A1 (en) 1990-07-06 1992-01-23 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
FR2672053B1 (fr) 1991-01-30 1993-04-23 Atochem Polyether bloc amides, leur procede de synthese.
FR2673946B1 (fr) 1991-03-15 1993-05-28 Atochem Polyether bloc amides, leur procede de synthese.
EP0576589A4 (en) 1991-03-18 1994-07-27 Enzon Inc Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5932211A (en) 1991-11-12 1999-08-03 Women's And Children's Hospital Glycosylation variants of iduronate 2-sulfatase
ES2241710T3 (es) 1991-11-25 2005-11-01 Enzon, Inc. Procedimiento para producir proteinas multivalentes de union a antigeno.
CA2129442C (en) 1992-02-13 2003-05-27 Morten P. Meldal Polyethylene or polypropylene glycol containing polymer
US5981194A (en) 1992-07-10 1999-11-09 University Of British Columbia Use of p97 and iron binding proteins as diagnostic and therapeutic agents
CA2139862C (en) 1992-07-10 2007-06-26 Wilfred A. Jefferies Use of p97 and iron binding proteins as diagnostic and therapeutic agents
US20020119095A1 (en) 1992-07-10 2002-08-29 Reinhard Gabathuler Chemotherapeutic agents conjugated to p97 and their methods of use in treating neurological tumours
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
WO1994004193A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5614549A (en) 1992-08-21 1997-03-25 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
CA2150262C (en) 1992-12-04 2008-07-08 Kaspar-Philipp Holliger Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
US5298643A (en) 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
US5349001A (en) 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
US6838254B1 (en) 1993-04-29 2005-01-04 Conopco, Inc. Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of camelidae
AU7109494A (en) 1993-06-16 1995-01-03 Enzon, Inc. Conjugated biodhesives
US5840900A (en) 1993-10-20 1998-11-24 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5880131A (en) 1993-10-20 1999-03-09 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5965566A (en) 1993-10-20 1999-10-12 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5605976A (en) 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5618528A (en) 1994-02-28 1997-04-08 Sterling Winthrop Inc. Biologically compatible linear block copolymers of polyalkylene oxide and peptide units
UA41929C2 (uk) 1994-03-17 2001-10-15 Мерк Патент Гмбх Анти-ефрр одноланцюжковий fv,молекула днк,яка його кодує, анти-ефрр антитіло,спосіб одержання анти-ефрр одноланцюжкового fv,спосіб одержання повного анти-ефрр антитіла та фармацевтична композиція (варіанти)
WO1995033490A1 (en) 1994-06-02 1995-12-14 Enzon, Inc. Method of solubilizing substantially water insoluble materials
US5730990A (en) 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5756593A (en) 1995-05-15 1998-05-26 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkyene oxide carboxylic acids
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
CA2226299A1 (en) 1995-08-11 1997-02-27 Dendritech, Inc. Hyper comb-branched polymer conjugates
DE69636289T2 (de) 1995-12-18 2007-05-10 Angiodevice International Gmbh Vernetzten polymerisatmassen und verfahren für ihre verwendung
ATE341344T1 (de) 1996-08-02 2006-10-15 Ortho Mcneil Pharm Inc Polypeptide mit einzelnem kovalent gebundenen n- terminalen wasserlöslichen polymer
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
WO1998048837A1 (en) 1997-04-30 1998-11-05 Enzon, Inc. Polyalkylene oxide-modified single chain polypeptides
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
US6011042A (en) 1997-10-10 2000-01-04 Enzon, Inc. Acyl polymeric derivatives of aromatic hydroxyl-containing compounds
US6111107A (en) 1997-11-20 2000-08-29 Enzon, Inc. High yield method for stereoselective acylation of tertiary alcohols
TW492882B (en) 1997-11-28 2002-07-01 Caleb Pharmaceuticals Inc Cholinergic antagonist plaster composition
AU1825299A (en) 1997-12-17 1999-07-05 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US6180095B1 (en) 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5965119A (en) 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
JP4078032B2 (ja) 1998-03-12 2008-04-23 ネクター セラピューティックス エイエル，コーポレイション 近位の反応性基を持つポリ（エチレングリコール）誘導体
US6153655A (en) 1998-04-17 2000-11-28 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
US6419934B1 (en) 1999-02-24 2002-07-16 Edward L. Tobinick TNF modulators for treating neurological disorders associated with viral infection
US6537549B2 (en) 1999-02-24 2003-03-25 Edward L. Tobinick Cytokine antagonists for the treatment of localized disorders
US6177077B1 (en) 1999-02-24 2001-01-23 Edward L. Tobinick TNT inhibitors for the treatment of neurological disorders
US6015557A (en) 1999-02-24 2000-01-18 Tobinick; Edward L. Tumor necrosis factor antagonists for the treatment of neurological disorders
US6982089B2 (en) 1999-02-24 2006-01-03 Tact Ip, Llc Cytokine antagonists for neurological and neuropsychiatric disorders
US7214658B2 (en) 2004-07-06 2007-05-08 Tact Ip, Llc Method of delivering a TNF antagonist to the brain of a human by perispinal administration without direct intrathecal injection
US6419944B2 (en) 1999-02-24 2002-07-16 Edward L. Tobinick Cytokine antagonists for the treatment of localized disorders
US6507788B1 (en) 1999-02-25 2003-01-14 Société de Conseils de Recherches et D'Applications Scientifiques (S.C.R.A.S.) Rational selection of putative peptides from identified nucleotide, or peptide sequences, of unknown function
US6642038B1 (en) * 1999-09-14 2003-11-04 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. GlcNAc phosphotransferase of the lysosomal targeting pathway
BR9917517A (pt) 1999-10-08 2002-07-30 Shearwater Corp Derivados poliméricos heterobifuncionais e processo para a preparação dos mesmos
WO2001059459A2 (en) 2000-02-08 2001-08-16 University Of British Columbia Compositions and methods for screening therapeutic agents
US6261595B1 (en) 2000-02-29 2001-07-17 Zars, Inc. Transdermal drug patch with attached pocket for controlled heating device
CA2443555C (en) 2000-05-01 2016-07-19 Christopher M. Starr Enzymes useful for treating and methods for treating mps-vi and cells lines for producing such enzymes recombinantly
AU2001285020A1 (en) 2000-08-17 2002-02-25 Synapse Technologies, Inc. P97-active agent conjugates and their methods of use
AU2001283740A1 (en) 2000-08-17 2002-02-25 University Of British Columbia Chemotherapeutic agents conjugated to p97 and their methods of use in treating neurological tumours
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
KR20030074839A (ko) 2001-02-19 2003-09-19 메르크 파텐트 게엠베하 감소된 면역원성을 갖는 개질 항-ｅｇｆｒ 항체
BRPI0210405B8 (pt) 2001-06-13 2021-05-25 Genmab As anticorpo monoclonal humano, molécula biespecífica, método in vitro para inibir o crescimento de uma célula expressando egfr, para induzir a citólise de uma célula expressando egfr, e para detectar a presença de antígeno egfr ou uma célula expressando egfr em uma amostra, e, vetor de expressão
US7595378B2 (en) 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
DE60234057D1 (de) 2001-07-25 2009-11-26 Raptor Pharmaceutical Inc Zusammensetzungen und verfahren zur modulation des transports durch die blut-hirn-schranke
CN101724075B (zh) 2001-10-10 2014-04-30 诺和诺德公司 肽的重构和糖缀合
US7179617B2 (en) 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US20030072761A1 (en) 2001-10-16 2003-04-17 Lebowitz Jonathan Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier
AU2003222568B2 (en) 2002-01-11 2009-05-07 Bioasis Technologies, Inc. Use of P97 as an enzyme delivery system for the delivery of therapeutic lysosomal enzymes
US7244592B2 (en) 2002-03-07 2007-07-17 Dyax Corp. Ligand screening and discovery
WO2004078215A2 (en) 2003-02-28 2004-09-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Use of antibody conjugated deoxycytidine kinase for adept
US20050026823A1 (en) 2003-06-20 2005-02-03 Biomarin Pharmaceutical Inc. Use of the chaperone receptor-associated protein (RAP) for the delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
US7442372B2 (en) * 2003-08-29 2008-10-28 Biomarin Pharmaceutical Inc. Delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
JP2007509040A (ja) 2003-10-11 2007-04-12 イネックス ファーマシューティカルズ コーポレイション 先天性免疫及び抗体依存性細胞傷害を強化するための方法及び組成物
DE10355904A1 (de) 2003-11-29 2005-06-30 Merck Patent Gmbh Feste Formen von anti-EGFR-Antikörpern
EP1720405A4 (en) 2004-02-06 2008-08-27 Biomarin Pharm Inc MANUFACTURE OF HIGHLY PHOSPHORYLATED LYSOSOMAL ENZYMES AND USES THEREOF
US20050208090A1 (en) * 2004-03-18 2005-09-22 Medtronic, Inc. Methods and systems for treatment of neurological diseases of the central nervous system
US7462697B2 (en) 2004-11-08 2008-12-09 Epitomics, Inc. Methods for antibody engineering
US8236306B2 (en) 2004-12-18 2012-08-07 Edward Lewis Tobinick Methods to facilitate transmission of large molecules across the blood-brain, blood-eye, and blood-nerve barriers
CA2595682A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
US7842467B1 (en) 2005-05-12 2010-11-30 Celera Corporation Breast disease targets and uses thereof
ES2340205T3 (es) 2005-11-12 2010-05-31 Eli Lilly And Company Anticuerpos anti-egfr.
CA2631184A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
US7498142B2 (en) 2006-01-31 2009-03-03 Yeda Research And Development Co., Ltd. Methods of identifying combinations of antibodies with an improved anti-tumor activity and compositions and methods using the antibodies
WO2008022349A2 (en) 2006-08-18 2008-02-21 Armagen Technologies, Inc. Agents for blood-brain barrier delivery
US7985783B2 (en) 2006-09-21 2011-07-26 The Regents Of The University Of California Aldehyde tags, uses thereof in site-specific protein modification
PL2308514T3 (pl) 2007-03-23 2013-11-29 To Bbb Holding B V Koniugaty do ukierunkowanego dostarczania leku poprzez barierę krew-mózg
US9365634B2 (en) 2007-05-29 2016-06-14 Angiochem Inc. Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues
US20110124576A1 (en) 2007-08-08 2011-05-26 Novozymes A/S Transferrin Variants and Conjugates
EP3692988A3 (en) 2008-03-18 2020-10-14 Genentech, Inc. Combinations of an anti-her2 antibody-drug conjugate and 5-fu, anti-vegf antibody, carboplatin or abt-869 and methods of use
DK2485761T3 (da) * 2009-10-09 2019-05-06 Armagen Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til øgning af iduronat-2-sulfatase-aktivitet i CNS
ES2638309T3 (es) 2010-04-19 2017-10-19 Nlife Therapeutics S.L. Composiciones y métodos para la distribución selectiva de moléculas de oligonucleótidos a tipos específicos de neuronas
FR2959229B1 (fr) 2010-04-21 2013-01-18 Vect Horus Derives peptidiques, leur preparation et leurs utilisations
RU2012154576A (ru) * 2010-06-25 2014-07-27 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Способы и композиции для доставки к цнс гепаран-n-сульфатазы
US8545837B2 (en) * 2010-06-25 2013-10-01 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods and compositions for CNS delivery of iduronate-2-sulfatase
PE20230169A1 (es) * 2010-06-25 2023-02-01 Shire Human Genetic Therapies Suministro al sistema nervioso central de agentes terapeuticos
US20130236442A1 (en) 2010-11-12 2013-09-12 Green Cross Corporation Iduronate-2-sulfatase and use thereof
BR112014002219A2 (pt) 2011-07-05 2018-08-07 Bioasis Technologies Inc conjugados anticorpo p97 e métodos de sua utilização
PT2739649T (pt) 2011-08-05 2018-01-03 Bioasis Technologies Inc Fragmentos de p97 com atividade de transferência
CA2872226A1 (en) 2012-05-02 2013-11-07 Symphogen A/S Humanized pan-her antibody compositions
US20140004097A1 (en) * 2012-06-29 2014-01-02 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Method of producing recombinant iduronate-2-sulfatase
US9932565B2 (en) 2012-07-31 2018-04-03 Bioasis Technologies, Inc. Dephosphorylated lysosomal storage disease proteins and methods of use thereof
US8753426B2 (en) 2012-08-03 2014-06-17 Air Products And Chemicals, Inc. Polymers, polymer membranes and methods of producing the same
US9938525B2 (en) 2012-10-26 2018-04-10 Nlife Therapeutics, S.L. Compositions and methods for selective delivery of oligonucleotide molecules to cell types
GB201303308D0 (en) 2013-02-25 2013-04-10 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
ES2774549T3 (es) 2013-03-13 2020-07-21 Bioasis Technologies Inc Fragmentos de P97 y usos de los mismos
US20150093399A1 (en) 2013-08-28 2015-04-02 Bioasis Technologies, Inc. Cns-targeted conjugates having modified fc regions and methods of use thereof
US20160347821A1 (en) 2014-02-03 2016-12-01 Bioasis Technologies, Inc. P97 fusion proteins
DK3107562T3 (da) 2014-02-19 2019-12-16 Bioasis Technologies Inc P97-ids-fusionsproteiner
CN106413757B (zh) 2014-05-01 2022-01-14 比奥阿赛斯技术有限公司 p97-多核苷酸结合物
WO2017123928A1 (en) 2016-01-13 2017-07-20 Bioasis Technologies, Inc. Blood-brain barrier vector compounds and conjugates thereof

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