CN104145015A

CN104145015A - 靶向的溶酶体酶化合物

Info

Publication number: CN104145015A
Application number: CN201280068758.8A
Authority: CN
Inventors: 多米尼克·波依温; 让-保罗·卡斯泰恩; 米歇尔·德默勒; 萨斯米塔·塔里帕西; 让-克里斯托夫·柯里; 西蒙·洛德-杜富尔
Original assignee: Angiochem Inc
Current assignee: Angiochem Inc
Priority date: 2011-12-01
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2014-11-12
Also published as: HK1204002A1; RU2014126484A; WO2013078564A2; MX2014006594A; AU2012344702A1; EP2785838A4; EP2785838A2; BR112014013161A2; CA2857567A1; US20150037311A1; HK1200189A1; JP2015505824A; WO2013078564A3

Abstract

本发明涉及一种包含溶酶体酶和靶向部分的化合物，例如，其中化合物是包含艾杜糖-2-硫酸酯酶和血管肽素-2的融合蛋白。在某些实施方式中，由于靶向部分的存在，这些化合物能够比单独的酶更有效地穿过血脑屏障或积累于溶酶体中。本发明还特征在于使用这种化合物治疗溶酶体贮积症(例如，粘多糖病II型)的方法。

Description

靶向的溶酶体酶化合物

技术领域

本发明涉及包含溶酶体酶和靶向部分的化合物和这种结合物在由这类酶缺失所致的病况(disorder)的治疗中的应用。

背景技术

溶酶体贮积症是约50种罕见遗传病况的一组病况，其中受试者在正常代谢所需的溶酶体酶方面具有缺陷。这些疾病通常是由常染色体的或X-连锁的隐性基因造成的。作为一个组，这些病况的发病率为约1:5000到1:10,000。

亨特综合征(Hunter syndrome)或粘多糖病II型(MPS-II)是由缺乏艾杜糖-2-硫酸酯酶(艾杜糖-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase))(IDS；也称为艾杜硫酸酯酶)(其是肝素硫酸盐和硫酸皮肤素的溶酶体降解所需的酶)所致。因为这种疾病是X-连锁隐性的，它主要影响男性。那些患有这种病况的人无法分解和回收这些粘多糖(mucopolysaccharide)，其也称为糖胺聚糖(glycosaminoglycan)或GAG。这种缺乏导致遍及全身积累GAG，其对神经系统，关节，各器官系统包括心脏、肝脏和皮肤具有严重影响。也存在一些身体症状，包括粗拙的面部特征、肿大的头部和腹部以及皮损。在最严重的情况下，这种疾病可以在十几岁的年龄致命并伴有严重的智力发育迟滞。

还没有MPS-II的治愈之法。除了缓和的措施外，治疗方法已包括骨髓移植和酶替代疗法。已观察到骨髓移植会稳定MPS-II的周边症状，包括心血管异常、肝脾肿大(肥大的肝脏和脾脏)、关节僵硬。然而，这种方法并没有稳定或解决与这种疾病相关的神经心理症状(Guffon et al.,J.Pediatr.154:733-7,2009)。

酶替代疗法通过静脉给予IDS也被证明具有益处，包括在皮损(Marínet al.,[在印刷前在线公开]Pediatr.Dermatol.Oct.13,2011)、内脏器官大小胃肠道功能方面的改善，以及对治疗上呼吸道感染的抗生素的需求减少(Hoffman et al.,Pediatr.Neurol.45:181-4,2011)。像骨髓移植一样，这种方法并不能改善与MPS-II相关的中枢神经系统缺陷，因为该酶并未按照预期穿过血脑屏障(BBB；Wraith et al.，Eur.J.Pediatr.1676:267-7，2008)。

已经并正在进行研究用于增加IDS向大脑递送方法，包括鞘内递送(Felice et al.,Toxicol.Pathol.39:879-92，2011)。然而，鞘内递送是高创性技术。

除了其他症状外，解决神经性疾病症状的低创性并更有效的治疗MPS-II的方法因此将是高度期望的。

发明内容

本发明针对包含靶向部分和溶酶体酶的化合物。这些化合物以能够用于治疗MPS-II的IDS-血管肽素-2(Angiopep-2)结合物和融合蛋白为例。因为这些结合物和融合蛋白能够穿过BBB，因此它们不仅可以治疗外周疾病症状，而且还可以在治疗CNS症状中有效。此外，因为靶向部分如血管肽素-2能够靶向溶酶体的酶，预期这些结合物和融合蛋白会比酶自身更有效。

因此，在一个第一方面中，本发明特征在于包含以下的化合物：(a)靶向部分(例如，肽或肽靶向部分，其可以为少于200、150、125、100、80、60、50、40、35、30、25、24、23、22、21、20或19个氨基酸)和(b)溶酶体酶、其活性片段或其类似物，其中靶向部分和酶、片段或类似物通过接头连接。溶酶体酶可以是艾杜糖-2-硫酸酯酶(IDS)、具有IDS活性的IDS片段或IDS类似物。在某些实施方式中，IDS酶或IDS片段具有人IDS同种型(isoform)a或其片段的氨基酸序列(例如，同种型a的氨基酸26-550)或IDS类似物与人IDS同种型a、同种型b、同种型c的序列或与同种型a的氨基酸26-550基本相同(具有基本同一性，substantially identical)(例如，至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同)。在特定的实施方式中，IDS酶具有人IDS同种型a或同种型a的成熟形式(同种型a的氨基酸26-550)的序列。

在第一方面中，靶向部分可以包括与SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:107-SEQ ID NO:117(例如，血管肽素-2(SEQ ID NO:97))中的任一个基本相同的氨基酸序列。在其他实施方式中，靶向部分包含式Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys(式Ia)，其中X3是Asn或Gln；X4是Asn或Gln；而X5是Phe、Tyr或Trp，其中靶向部分可选地包含一个或多个列举于式Ia中的氨基酸的D-异构体。在其他实施方式中，靶向部分包含式Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2(式Ib)，其中X3是Asn或Gln；X4是Asn或Gln；X5是Phe、Tyr或Trp；Z1为不存在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly或Cys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly；并且Z2为不存在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr或Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys；并且其中靶向部分可选地包含一种或多种举于式Ib、Z1或Z2中的氨基酸的D-异构体。在其他实施方式中，靶向部分包含式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6(式IIa)，其中X1是Lys或D-Lys；X2是Arg或D-Arg；X5是Phe或D-Phe；并且X6是Lys或D-Lys；并且其中X1、X2、X5或X6中的至少一个是D-氨基酸。在其他实施方式中，靶向部分包含式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7(式IIb)，其中X1是Lys或D-Lys；X2是Arg或D-Arg；X5是Phe或D-Phe；X6是Lys或D-Lys；并且X7是Tyr或D-Tyr；并且其中X1、X2、X5、X6或X7中的至少一个是D-氨基酸。在其他实施方式中，靶向部分包含式Z1-X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7-Z2(式IIc)，其中X1是Lys或D-Lys；X2是Arg或D-Arg；X5是Phe或D-Phe；X6是Lys或D-Lys；X7是Tyr或D-Tyr；Z1为不存在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly或Cys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly；并且Z2为不存在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr或Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys；其中X1、X2、X5、X6或X7中的至少一个是D-氨基酸；并且其中多肽可选地包括一种或多种举于Z1或Z2中的氨基酸列的D-异构体。

在第一方面中，接头可以是共价键(例如，肽键)或一个或多个氨基酸。化合物可以是融合蛋白(例如，血管肽素-2-IDS、IDS-血管肽素-2或血管肽素-2-IDS-血管肽素-2，或者具有图1中所示的结构)。化合物可以进一步包含通过第二接头连接至化合物的第二靶向部分。

本发明还特征在于包含第一方面的化合物和药用载体的药物组合物。

在另一个方面中，本发明特征在于治疗或预防性治疗患有溶酶体贮积症(例如，MPS-II)的受试者的方法。方法包括向受试者给予第一方面的化合物或本文所描述的药物组合物。化合物中的溶酶体酶可以是IDS。受试者可能患有严重形式的MPS-II或减弱(attenuated)形式的MPS-II。受试者可能正在经历神经性症状(例如，智力发育迟滞)。方法可以可以实施于或开始于小于六个月龄或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15或18岁龄的受试者。受试者可以是婴儿(例如，不到1岁大)。

在某些实施方式中，靶向部分不是抗体(例如，对内源性(endogenous)BBB受体如胰岛素受体、转铁蛋白受体、瘦素受体、脂蛋白受体和IGF受体是特异性的抗体或免疫球蛋白)。

在任何上述方面中，靶向部分可以与表1的任意序列或其片段基本相同。在某些实施方式中，肽载体具有血管肽素-1(SEQ ID NO:67)、血管肽素-2(SEQ ID NO:97)(An2)、血管肽素-3(SEQ ID NO:107)、血管肽素-4a(SEQ ID NO:108)、血管肽素-4b(SEQ ID NO:109)、血管肽素-5(SEQID NO:110)、血管肽素-6(SEQ ID NO:111)、血管肽素-7(SEQ ID NO:112)或反向(reversed)血管肽素-2(SEQ ID NO:117)的序列。靶向部分或化合物可以被有效地运输到具体细胞类型(例如，肝、肺、肾、脾和肌肉中的任一种、两种、三种、四种或五种)中或可以有效穿过哺乳动物BBB(例如，血管肽素-1、-2、-3、-4a、-4b、-5和-6)。在另一个实施方式中，靶向部分或化合物能够进入具体的细胞类型(例如、肝、肺、肾、脾和肌肉中的任一种、两种、三种、四种或五种)但并不能有效穿过BBB(例如，包含血管肽素-7的结合物)。靶向部分可以有任何长度，例如，至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、35、50、75、100、200或500个氨基酸，或这些数量之间的任何范围。在某些实施方式中，靶向部分少于200、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7或6个氨基酸(例如，10至50个氨基酸的长度)。靶向部分可以通过重组遗传技术或化学合成而进行生产

表1：示例性靶向部分

多肽编号5、67、76和91，分别包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:91的序列，并且是C-端酰胺化的。

多肽编号107、109和110，分别包含SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的序列，并且是N-端乙酰化的。

在任何上述方面中，靶向部分可以包括具有以下式的氨基酸序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19

其中X1-X19中的每一个(例如，X1-X6、X8、X9、X11-X14和X16-X19)独立地是任何氨基酸(例如，天然氨基酸如Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)或不存在而X1，X10和X15中的至少一个(例如，2或3)是精氨酸。在一些实施方式中，X7是Ser或Cys；或X10和X15各自独立地是Arg或Lys。在一些实施方式中，X1至X19的残基，包括X1和X19，与SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:107-SEQ ID NO:116(例如，血管肽素-1、血管肽素-2、血管肽素-3、血管肽素-4a、血管肽素-4b、血管肽素-5、血管肽素-6和血管肽素-7)中的任一个的任一氨基酸序列基本相同。在一些实施方式中，至少一个(例如，2、3、4或5)氨基酸X1-X19是Arg。在一些实施方式中，多肽在多肽的N-端、多肽的C-端或这二者同时具有一个或多个另外的半胱氨酸残基。

在任何上述方面中，靶向部分可以包括氨基酸序列Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys(式Ia)，其中X3是Asn或Gln；X4是Asn或Gln；而X5是Phe、Tyr或Trp；其中多肽可选地长度少于200个氨基酸(例如，少于150、100、75、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、12、10、11、8或7个氨基酸，或这些数量之间的任何范围)；其中多肽可选地包括一种或多种列举于式Ia的氨基酸的D-异构体(例如，Lys、Arg、X3、X4、X5或Lys的D-异构体)；并且其中多肽不是表2中的肽。

在任何上述方面中，靶向部分可以包含氨基酸序列Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys(式Ia)，其中X3是Asn或Gln；X4是Asn或Gln；而X5是Phe、Tyr或Trp；其中多肽长度上少于19个氨基酸(例如，少于18、17、16、15、14、12、10、11、8或7个氨基酸或这些数量之间的任何范围)；而其中多肽可选地包含一种或多种列举于式Ia中的氨基酸的D-异构体(例如，Lys、Arg、X3、X4、X5或Lys的D-异构体)。

在任何上述方面中，靶向部分可以包含Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2(式Ib)的氨基酸序列，其中X3是Asn或Gln；X4是Asn或Gln；X5是Phe、Tyr或Trp；Z1为不存在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly或Cys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly；并且Z2为不存在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr或Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys；并且其中多肽可选地包含一种或多种列举于式Ib、Z1或Z2中的氨基酸的D-异构体。

在任何上述方面中，靶向部分可以包含氨基酸序列Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys。在其他实施方式中，靶向部分具有Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr的氨基酸序列。在其他实施方式中，靶向部分具有Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cys的氨基酸序列。

在任何上述方面中，靶向部分可以具有X1-X2-Asn-Asn-X5-X6(式IIa)的氨基酸序列，其中X1是Lys或D-Lys；X2是Arg或D-Arg；X5是Phe或D-Phe；并且X6是Lys或D-Lys；并且其中X1、X2、X5或X6中的至少一个(例如，至少两个，三个或四个)是D-氨基酸。

在任何上述方面中，靶向部分可以具有X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7(式IIb)的氨基酸序列，其中X1是Lys或D-Lys；X2是Arg或D-Arg；X5是Phe或D-Phe；X6是Lys或D-Lys；而X7是Tyr或D-Tyr；并且其中X1、X2、X5、X6或X7中的至少一个(例如，至少两个、三个、四个或五个)是D-氨基酸。

在任何上述方面中，靶向部分可以具有Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2(式IIc)的氨基酸序列，其中X3是Asn或Gln；X4是Asn或Gln；X5是Phe、Tyr或Trp；Z1为不存在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly或Cys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly；并且Z2为不存在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr或Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys；其中X1、X2、X5、X6或X7中至少一个是D-氨基酸；并且其中多肽可选地包含一种或多种列举于Z1或Z2中的氨基酸的D-异构体。

在任何上述方面中，靶向部分可以具有Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr(An2)的氨基酸序列，其中任何一个或多个氨基酸是D-异构体。例如，靶向部分可以具有1、2、3、4或5个是D-异构体的氨基酸。在优选的实施方式中，位置8、10和11中的一个或多个或全部可以是D-异构体。在另一个实施方式中，位置8、10、11和15中的一个或多个或全部可以具有D-异构体。

在任何上述方面中，靶向部分可以是Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr(3D-An2)；

Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P1)；

Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P1a)；

Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P1b)；

Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys(P1c)；

D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys(P1d)；

Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P2)；

Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P3)；

Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P4)；

Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P5)；

D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P5a)；

D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P5b)；

D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys(P5c)；

Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cys(P6)；

D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Tyr-Cys(P6a)；

D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Tyr-Cys(P6b)；

Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr；和D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-D-Tyr-Cys(P6c)；或它们的片段。在其他实施方式中，靶向部分含有具有0至5(例如、0至4、0至3、0至2、0至1、1至5、1至4、1至3、1至2、2至5、2至4、2至3、3至5、3至4或4至5)个氨基酸替换、缺失或插入的前述肽之一的序列。

在任何上述方面中，多肽可以是

Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；

Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；

Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；

Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；

Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；或Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys，或它们的片段。

在任何上述方面中，多肽可以是

Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr(3D-An2)；

Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys(P1)；

D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys(P1d)或它们的片段(例如，从P1、P1a、P1b、P1c或P1d的N-端缺失1至7个氨基酸；从P1、P1a、P1b、P1c或P1d的C-端缺失1至5个氨基酸；或从P1、P1a、P1b、P1c或P1d的N-端缺失1至7个氨基酸和从P1、P1a、P1b、P1c或P1d的C-端缺失1至5个氨基酸)。

在本文所描述的任何靶向部分中，该部分可以包含1、2、3、4或5个氨基酸(例如，1至3个氨基酸)的插入或缺失，可以由本文所描述的氨基酸序列(例如，由Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys)制成。

在本文所描述的任何靶向部分中，该部分可以在多肽的N-端、在多肽的C-端或这二者都具有一种或多种另外的半胱氨酸残基。在其他实施方式中，该靶向部分可以在多肽的N-端、在多肽的C-端或这二者都具有一种或多种另外的酪氨酸残基。在进一步的实施方式中，该靶向部分在多肽的N-端、在多肽的C-端或这二者都具有氨基酸序列Tyr-Cys和/或Cys-Tyr。

在任何上述方面的某些实施方式中，靶向部分可以在长度上少于15个氨基酸(例如，长度上少于10个氨基酸)。

在任何上述方面的某些实施方式中，靶向部分可以具有酰胺化的C-端。在其他实施方式中，靶向部分被有效地转运(运送，transport)通过BBB(例如，比血管肽素-2更加有效地转运通过BBB)。

在任何上述方面的某些实施方式中，融合蛋白、靶向部分或溶酶体酶(例如，IDS)、片段或类似物是修饰的(例如，如本文所描述的)。融合蛋白、靶向部分或溶酶体酶、片段或类似物可以是酰胺化的、乙酰化的或这二者均有。这种修饰可以是在多肽的氨基端或羧基端。融合蛋白、靶向部分或溶酶体酶、片段或类似物也可以包括或者是本文所描述的任何多肽的拟肽(例如，本文所描述的那些)。融合蛋白、靶向部分或溶酶体酶、片段或类似物可以是多聚体形式，例如，二聚体形式(例如，通过半胱氨酸残基成键的二硫键形成)。

在某些实施方式中，靶向部分、溶酶体酶(例如，IDS)、酶片段或酶类似物具有本文所描述的具有至少一个氨基酸替换(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个替换)、插入或缺失的氨基酸序列。多肽可以含有，例如，1至12、1至10、1至5或1至3个氨基酸替换，例如，1至10个(例如，至9、8、7、6、5、4、3、2)个氨基酸替换。一个或多个氨基酸替换可以是保守的或非保守的。例如，靶向部分可以在对应于SEQ ID NO:1、血管肽素-1、血管肽素-2、血管肽素-3、血管肽素-4a、血管肽素-4b、血管肽素-5、血管肽素-6和血管肽素-7中的任何氨基酸序列的位置1、10和15的位置中的一个、两个或三个位置处具有精氨酸。

在任何上述方面中，化合物可以专门排除包含或由任何SEQ IDNO:1-SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:107-SEQ ID NO:117(例如，血管肽素-1、血管肽素-2、血管肽素-3、血管肽素-4a、血管肽素-4b、血管肽素-5、血管肽素-6和血管肽素-7)组成的多肽。在一些实施方式中，本发明的多肽和结合物排除SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104和SEQID NO:105的多肽。

在任何上述方面中，接头(X)可以是本领域内已知的或本文所描述的任何接头。在具体实施方式中，接头是共价键(例如，肽键)、化学连接剂(例如本文所描述的那些)、氨基酸或肽(例如、2、3、4、5、8、10或多个氨基酸)。

在某些实施方式中，接头具有式：

其中n是2至15之间的整数(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)；且Y是A上的巯基而Z是B上的伯胺或Y是B上的巯基而Z是A上的伯胺。在某些实施方式中，接头是N-琥珀酰亚胺基(乙酰硫代)乙酸酯(N-Succinimidyl(acetylthio)acetate，SATA)接头或肼接头。接头可以通过游离胺、半胱氨酸侧链(例如，血管肽素-2-Cys或Cys-血管肽素-2的)，或通过糖基化位点结合结合至酶(例如，IDS)或靶向部分(例如，血管肽素-2)。

在某些实施方式中，化合物具有式

其中“Lys-NH”基团表示存在于酶中的赖氨酸或N-端或C-端的赖氨酸。在另一实例中，化合物具有结构：

或

其中每一－NH－基团分别表示存在于靶向部分和酶上的伯氨基。在具体实施方式中，酶可以是IDS或者靶向部分可以是血管肽素-2。

在某些实施方式中，化合物是包含靶向部分(例如，血管肽素-2)和溶酶体酶(例如，IDS)、酶片段或酶类似物的融合蛋白。

在某些实施方式中，接头包括选自由以下组成的组中的点击化学(链接化学，click-chemistry)反应对：炔基基团和叠氮基基团之间形成含三唑的接头的惠斯更(Huisgen)1,3-偶极环加成反应；具有4π电子体系的二烯(例如，可选取代的1,3-不饱和化合物，如可选取代的1,3-丁二烯、1-甲氧基-3-三甲基硅氧基-1,3-丁二烯、环戊二烯、环己二烯或呋喃)和具有2π电子体系的亲二烯体(dienophile)或亲杂二烯体(heterodienophile)(例如，可选取代的链烯基或可选取代的炔基基团)之间的狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应；用亲核剂和环张力杂环基亲电体(strained heterocyclylelectrophile)的开环反应；和用硫代磷酸酯基团和碘代基基团的夹板连接反应(splint ligation reaction)；和用醛基团和氨基基团的还原性氨化反应。在本发明的一个方面中，接头选自由以下组成的组：单氟环辛炔(MFCO)、二氟环辛炔(DFCO)、环辛炔(OCT)、二苯并环辛炔(DIBO)、二芳基氮杂环辛炔(BARAC)、二氟苯并环辛炔(DIFBO)和双环[6.1.0]壬炔(BCN)。在另一个方面中，接头是马来酰亚胺基团或S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)基团。肽靶向部分经由N-端叠氮基基团或C-端叠氮基基团连接至接头。

在一个实施方式中，化合物包括经由BCN接头连接至IDS的血管肽素-2。这种化合物可以具有通用结构

其中n是经由接头连接至IDS的血管肽素-2部分的数量并在1至6之间，An₂是血管肽素-2，连接至An2的NH基团是血管肽素-2的N-端氨基基团，并且连接至IDS的NH基团表示来自IDS中赖氨酸的侧链伯氨基基团。化合物也可以具有结构

化合物也可以具有结构

在每一上述式中，An₂是血管肽素-2，连接至An2的NH基团是血管肽素-2的N-端氨基基团，并且连接至IDS的NH基团表示来自IDS中赖氨酸的侧链伯氨基基团。

在本发明的化合物的任何方面中，血管肽素-2可以用叠氮基团在多肽的N-或C-端进行衍生化，而使叠氮基团可以在点击化学反应中与炔烃衍生接头反应，以将血管肽素-2连接至接头。本发明还特征在于包含式III的化合物的组合物，其中n的平均值在1至6之间(例如，1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6)。

具有BCN接头的化合物也可以具有结构

其中n是经由接头连接至IDS的血管肽素-2部分的数量并在1至6之间，An₂是血管肽素-2并经由血管肽素-2的C-端的赖氨酸的侧链伯氨基基团连接至接头，并且连接至IDS的NH基团表示来自IDS中赖氨酸的侧链伯氨基基团。

本发明特征在于包含式VI的化合物的组合物，其中n的平均值在1至6之间(例如，1、1.5、2、2.3、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6)。

在一个实施方式中，化合物包含经由MFCO接头连接至IDS的血管肽素-2。血管肽素-2可以经由血管肽素-2的N-端氨基基团连接至MFCO接头。化合物可以具有结构

其中n是经由接头连接至IDS的血管肽素-2部分的数量并在1至6之间，An₂是血管肽素-2，连接至An2的NH基团是血管肽素-2的N-端氨基基团，并且连接至IDS的NH基团表示来自IDS中赖氨酸的侧链伯氨基基团。

本发明还特征在于包含式VII的化合物的组合物，其中n的平均值在1至6之间(例如，1、1.5、2、2.5、2.6、3、3.5、4、4.4、4.5、5、5.3、5.5或6)。

在本发明的一个方面中，血管肽素-2经由血管肽素-2的C-端的氨基酸(例如，赖氨酸)的侧链伯氨基基团连接至MFCO接头并且化合物具有结构

其中n是经由接头连接至IDS的血管肽素-2部分的数量并且在1至6之间，An₂是血管肽素-2并且经由血管肽素-2的C-端的赖氨酸的侧链伯氨基基团连接至接头，并且连接至IDS的NH基团表示来自IDS中赖氨酸的侧链伯氨基基团。本发明特征在于包含式VIII的化合物的组合物，其中n的平均值在1至6之间(例如，1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、4.9、5、5.5或6)。

在本发明的另一个实施方式中，化合物包含经由DBCO接头连接至IDS的血管肽素-2并且具有结构

其中n是经由接头连接至IDS的血管肽素-2部分的数量并且在1至6之间，An₂是血管肽素-2，连接至An2的NH基团是血管肽素-2的N-端氨基基团，并且连接至IDS的NH基团表示来自IDS中赖氨酸的侧链伯氨基基团。本发明特征在于包含式IX的化合物的组合物，其中n的平均值在1至6之间(例如，1、1.3、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6)。

本发明还特征在于一种化合物，其中血管肽素-2-Cys经由马来酰亚胺基团连接至IDS并且具有结构

其中n是经由接头连接至IDS的血管肽素-2部分的数量并且在1至6之间，其中An₂Cys，连接至An₂Cys的S部分表示血管肽素-2-Cys中的半胱氨酸上的侧链硫化物，并且连接至IDS的NH基团表示来自IDS中赖氨酸的侧链伯氨基基团。本发明特征在于包含式X的化合物的组合物，其中n的平均值在0.5至6之间(例如，0.5、0.8、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6)。

在一个替代实施方式中，Cys-血管肽素-2经由马来酰亚胺基团连接至IDS并且具有结构

其中n是经由接头连接至IDS的血管肽素-2部分的数量并且在1至6之间，其中Cys-An₂是Cys-血管肽素-2，连接至Cys-An₂的S部分表示Cys-血管肽素-2中的半胱氨酸上的侧链硫化物，并且连接至IDS的NH基团表示来自IDS中赖氨酸的侧链伯氨基基团。本发明特征在于包含式XI的化合物的组合物，其中n的平均值在0.5至6之间(例如，0.5、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6)。

在上述实施方式的一个方面中，接头可以是用选自由单氟环辛炔(MFCO)、二氟环辛炔(DFCO)、环辛炔(OCT)、二苯并环辛炔(DIBO)、二芳基氮杂环辛炔(BARAC)、二氟苯并环辛炔(DIFBO)和双环[6.1.0]壬炔(BCN)组成的组中的炔烃基团官能化的马来酰亚胺基团并且炔烃-官能化的马来酰亚胺经由连接至血管肽素-2的叠氮基基团连接至血管肽素-2。

在本发明的一个实施方式中，化合物包含经由S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)基团连接至IDS的血管肽素-2并且具有结构

其中n是经由接头连接至IDS的血管肽素-2部分的数量并且在1至6之间，An₂是血管肽素-2，连接至An2的NH基团是血管肽素-2的N-端氨基基团，并且连接至IDS的NH基团表示来自IDS中赖氨酸的侧链伯氨基基团。本发明特征在于包含式XII的化合物的组合物，其中n的平均值在1至6之间(例如，1、1.5、2、2.5、2.6、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6)。

以上所描述的化合物可以具有1、2、3、4、5或多个经由接头连接至酶的肽靶向部分，其中靶向部分是血管肽素-2并且酶是溶酶体酶，例如，IDS。

本发明还特征在于包含由以上各式表示的化合物的组合物，其中连接至每一IDS的血管肽素-2部分的平均数在1至6之间(例如，1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6)，优选1.5-5，更优选2-4。在以上组合物的一些方面中，连接至每一IDS的血管肽素-2部分的平均数可以为2(例如，1、1.5、2、2.5或3)。更优选连接至每一IDS的血管肽素-2部分的平均数可以为约4(例如，2、2.5、3、3.5、4、4.5或5)。另外，连接至每一IDS的血管肽素-2部分的平均数可以为约6(例如，3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7)。

本发明特征在于包含结合至任何以上所描述的化合物的纳米粒子的组合物。本发明还特征在于任何以上的特征化合物的脂质体制剂。

本发明特征在于包含任何一种以上所描述的化合物和药用载体的药物组合物。本发明还特征在于治疗或预防性治疗患有溶酶体贮积症的受试者的方法，其中方法包括向受试者给予任何以上所描述的化合物或组合物。在方法的一个方面中，溶酶体贮积症是粘多糖病II型(MPS-II)并且溶酶体酶是IDS。在方法的另一个方面中，受试者具有MPS-II的严重形式或MPS-II的减弱形式。在方法的另一方面中，受试者具有神经性症状。受试者可以在五岁之龄下、优选在三岁之龄下开始治疗。受试者可以是婴儿。本发明的方法也包括胃肠外给予本发明的化合物和组合物。

“受试者”是指人或非人动物(例如，哺乳动物)。

“溶酶体酶”是指在溶酶体中发现的、其中该酶的缺失可以导致溶酶体贮积症的任何酶。

“溶酶体贮积症”是指由溶酶体酶的缺失引起的任何疾病。已经确定大约50种这样的病况。

“靶向部分”是指化合物或分子，如可以转运进入特定细胞类型(例如，肝、肺、肾、脾或肌肉)、进入特定的细胞部分(compartment)(例如，溶酶体)或穿过BBB的多肽或拟肽。在某些实施方式中，靶向部分可以结合至存在于脑血管内皮细胞上的受体并由此通过胞转作用(穿胞吞排作用，transcytosis)转运穿过BBB。靶向部分可以是对其可以获得高水平的经内皮转运而不影响细胞或BBB完整性的分子。靶向部分可以是多肽或拟肽，并可以是天然存在的或通过化学合成或基因重组技术生产。

“治疗”受试者中的疾病、病症(disorder)或病况(condition)是指通过向受试者给予治疗剂而减少疾病、病症或病况的至少一种症状。

“预防性治疗”受试者中的疾病、病症或病况是指在疾病症状发作之前通过向受试者给予治疗剂而降低疾病、病症或病况的发病频率或减少严重度。

其被“有效地转运穿过BBB”的多肽是指能够至少与血管肽素-6一样有效穿过BBB(即，超过在2007年5月29日提交的美国专利申请号US11/807,597中的原位脑灌注检测分析中的血管肽-1(250nM)的38.5％，该专利申请通过引用结合于此)的多肽。因此，“非有效转运穿过BBB”的多肽以较低水平转运到大脑(例如，转运效率低于血管肽素-6)。

其被“有效转运至特定细胞类型”的多肽或化合物是指：与对照质相比，或在结合物的情况下与未结合的试剂相比，能够在该细胞类型中积累(例如，由于向细胞内转运增加、从细胞的外排降低或它们的组合)超过至少10％(例如，25％、50％、100％、200％、500％、1000％、5000％或10,000％)的程度的多肽或化合物。这类行为详细描述于国际申请公开号WO 2007/009229中，通过引用结合于此。

“基本相同(基本同一性，substantially identity)”或“基本相同的”是指分别与参照序列具有相同的多肽或多核苷酸序列或当两个序列最佳对齐时在参照序列内对应位置分别具有规定的百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的多肽或多核苷酸序列。例如，与参照序列“基本相同的”氨基酸序列与参照氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。对于多肽，对比序列的长度将一般为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、90、100、150、200、250、300或350个邻接(contiguous)氨基酸(例如，全长序列)。对于核酸，对比序列的长度一般为至少5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个邻接核苷酸(例如，全长核苷酸序列)。可以使用序列分析软件(例如，Sequence Analysis Software Package of the Genetics ComputerGroup，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710UniversityAvenue，Madison，WI53705)在默认设置下测定序列同一性。这样的软件可以通过将同源程度分配于各种替换、缺失和其他修饰而匹配相似序列。

根据以下详细说明、附图和权利要求书本发明的其他特征和优点将是显而易见的。

附图说明

图1是示出所产生的IDS构建体的示意图。

图2是示出使用抗IDS抗体、由用所示构建体转染的CHO-S细胞的细胞培养基进行的蛋白质免疫印迹分析的图像。

图3是示出以下所描述的实施例中用于检测IDS活性的荧光检测分析法的示意图。

图4是示出用所示构建体转染的CHO-S细胞的细胞培养基中IDS活性的曲线图。

图5A是示出用所示构建体转染CHO-S细胞之后七天时间内的IDS活性的曲线图。

图5B是示出CHO-S细胞中七天时间内IDS-His或IDS-An2-His的表达的一组免疫印迹图像。

图6A是示出用表达所示构建体的CHO-S细胞的培养基处理之后，在MPS-II成纤维细胞中³⁵S-GAG积累的降低的曲线图。

图6B是示出用纯化的IDS-An2-His处理之后，在MPS-II成纤维细胞中GAG积累的降低的曲线图。

图7A-图7C是IDS同种型(同种型a，图7A；同种型b，图7B；同种型c，图7C)的序列。

图8是示出IDS(JR-032)和IDS-血管肽素-2结合物的考马斯亮蓝染色和免疫印迹检测的一组图像。

图9是示出IDS-血管肽素-2结合物与JR-032相比的酶活性的曲线图。酶活性表示为％JCR-032对照。对于结合物，测定的数量在4至8之间，对于JR-032，每个条形图(bar)是15次测定的平均值。

图10是示出在用未结合的JR-032或各个结合物(4ng/mL)处理的MPSII患者成纤维细胞中测定的GAG浓度的曲线图。GAG水平表示为％健康患者成纤维细胞中测定的GAG。

图11是示出血管肽素-2-IDS结合物降低MPSII成纤维细胞中GAG浓度与未结合的JR-032具有类似的效力。GAG浓度在用各种浓度的JR-032三种结合物处理的MPSII患者成纤维细胞中测定。GAG的水平表示为％健康患者成纤维细胞中测定的GAG。

图12A-12B是一组示出JR-032在大脑不同部位的分布的曲线图。

图13是分别示出在单个时间点(2分钟)时未结合JR-032和15种结合物的大脑分布的曲线图。除非指定C-端，否则所有接头都是通过N-端连接而连接到An2。

图14A-图14D是示出70-56-1B、70-56-2B、68-32-2和70-66-1B结合物的MALDI-TOF分析的一组曲线图。

图15A示出68-32-2、70-56-1B、70-56-2B和70-66-1B的SEC分析。

图15B示出68-32-2、70-56-1B、70-56-2B和70-66-1B的SP分析。

图16A-图16B是示出分别在1h和16h内由U87细胞摄取的Alexa488-IDS和Alexa488-An2-IDS(70-56-2B)的一组曲线图。

图17是示出使用共聚焦显微镜测定Alexa488标记的结合物的细胞内转运的示意图。

图18是一组共聚焦显微照片，示出Alexa标记的IDS(上栏)和Alexa标记的血管肽素-2-IDS(70-56-2B，下栏)在U87细胞中与lysotracker染料相比较的定位。在第四栏(合并)中示出16小时摄取后的共定位。酶以50nM的浓度在37℃下孵育16小时。放大倍率为100×。

图19是一组共聚焦显微照片，示出Alexa标记的IDS(上栏)和Alexa标记的血管肽素-2-IDS(70-56-2B，下栏)在U87细胞中与lysotracker染料相比较的定位。在第四栏(合并)中示出没有共定位。酶以100nM的浓度在37℃下孵育1小时。放大倍率为100×。

图20是一组共聚焦显微照片，示出Alexa标记的IDS(上图)和Alexa标记的血管肽素-2-IDS(70-56-2B，下图)在U87细胞中与lysotracker染料相比的定位。在第四栏(合并)中以黄色示出共定位。酶以100nM的浓度在37℃下孵育16小时。放大倍率为100×。

图21是示出Alexa标记的IDS和Alexa标记的血管肽素-2-IDS(70-56-1B)在U87细胞中与lysotracker染料相比的定位的共聚焦显微照片。酶以50nM的浓度在37℃下孵育过夜。放大倍率为100×。右栏是左栏的缩放版。

图22是一组共聚焦显微照片，示出Alexa-标记IDS和Alexa488标记An2-IDS结合物：#68-32-2，70-66-1B，70-56-2B和68-27-3在U-87细胞中的摄取和定位。

图23是比较JR-032和菊粉的脑摄取和分布的曲线图。

图24A-图24B是比较An2-IDS结合物与未结合的JR-032的K_in和脑分布的曲线图。

图25A-图25B是示出血管肽素-2-IDS结合物显示出进入U87细胞中的摄取增加以及提高血管肽素-2-IDS结合物引入率与向这些细胞内摄取增加相关的曲线图。

图26是IDUA酶前体的氨基酸序列。成熟酶包括该序列的氨基酸27-653。

图27是编码融合至血管肽素-2(An2)的IDUA的、并且有或没有组氨酸(His)-标签的cDNA构建体的质粒图谱。这些构建体被亚克隆至合适的表达载体如pcDNA3.1中。

图28是八个IDUA和EPiC-IDUA融合蛋白的示意图。

图29是使用抗-IDUA、抗血管肽素-2或抗-六聚组氨酸抗体的蛋白免疫印迹，示出IDUA和EPiC-IDUA融合蛋白的表达水平，如在CHO-S细胞培养基中检测的。

图30A是示出从CHO-S培养基纯化的IDUA和EPiC-IDUA融合蛋白的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶的图像。图30B是示出去除或未去除His标签的IDUA-His和An2-IDUA-His蛋白的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶的图像。下面是用抗-His或抗-An2抗体检测His标签的存在或不存在(以确证去除了His标签)和An2标记的存在的蛋白免疫印迹。

图31是示出用于纯化在CHO细胞中的重组IDUA的方案的表格。

图32A是示出最后步骤中使用SP-琼脂糖凝胶(强阳离子交换树脂)的IDUA的纯化曲线的曲线图。插图是示出洗脱期间IDUA在各个级分中的水平的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶的图像。图32B是示出来自不同批次的有或没有His标签的IDUA和An2-IDUA的可重复纯化的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。图32C是示出足以体外脑灌注和体外检测分析的IDUA和An2-IDUA的量的纯化的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。

图33是示出IDUA酶在底物4-甲基伞形基-α-L-艾杜糖苷(4-methylumbelliferyl-α-L-iduronide)上反应的示意图。底物由IDUA水解成4-甲基伞形酮(4-MU)，这是用法兰德(Farrand)过滤荧光计使用450nm发射波长和365nm激发波长进行荧光分光检测的。

图34是示出IDUA-His₈、IDUA、An2-IDUA-His₈以及商业IDUA-His₁₀具有相似酶活性的表格。

图35是示出MPS-I成纤维细胞中由IDUA、IDUA-His和An2-IDUA-His降低GAG的曲线图。

图36是示出在暴露于细胞培养基中浓度增加的IDUA或An2-IDUA酶之后，MPS-I成纤维细胞中IDUA胞内活性的一组曲线图。

图37是示出在过量M6P、RAP或An2的存在下由MPS-I成纤维细胞摄取IDUA蛋白的曲线图。

图38A-图38C是示出随着An2(图13A)和M6P(图13B)的量的增加，由MPS-I成纤维细胞M6P受体依赖性摄取IDUA蛋白的曲线图。图13C示出在用量增加的LRP1抑制剂RAP的存在下的IDUA和An2-IDUA的摄取。

图39A是示出在An2肽(1mM)、M6P(5mM)和RAP(1μm)肽(LRP1抑制剂)的存在下由U-87成胶质细胞瘤细胞摄取IDUA和AN2-IDUA(曝光2小时或24小时)的一组曲线图。图39B是示出证明An2-IDUA与LRP1相互作用的An2-IDUA与LRP1的免疫共沉淀的一组蛋白免疫印迹。

图40A是示出IDUA融合蛋白中PNG酶F切割位点的示意图。图40B是示出未变性或变性的An2-IDUA的去糖基化的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶的图像。图40C是示出用PNG酶F处理之前和之后的IDUA/或An2-IDUA的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶的图像。图40D是示出去糖基化对U87细胞内IDUA和An2-IDUA摄取的影响的曲线图。

图41是示出健康成纤维细胞和MPS-I成纤维细胞中溶酶体摄取An2的一组荧光共聚焦显微照片。

图42是示出由U87细胞摄取IDUA、An2-IDUA、Alexa-488-IDUA和Alexa488-An2-IDUA的曲线图。

图43是示出原位转运IDUA和An2-IDUA穿过BBB的一组曲线图。

图44是示出由牛脑毛细血管内皮细胞与新生大鼠星形胶质细胞(astrocyte)的共培养物组成的体外BBB模型(CELLIAL technologies)的示意图。该模型用于评价穿过BBB的转运。

图45是示出使用在图19中所示出的体外BBB模型评价An2-IDUA和IDUA通过脑毛细血管内皮细胞的胞转作用的曲线图。

图46是示出在RAP或An2的存在下使用体外BBB模型评价An2-IDUA和IDUA通过脑毛细血管内皮细胞的胞转作用的曲线图。

图47是示出在MPS-I患者成纤维细胞中An2-IDUA的剂量响应的曲线图。

图48是示出MPS-I基因敲除小鼠的脑匀浆物中IDUA酶活性的曲线图。匀浆物是在IV注射An2-IDUA至基因敲除小鼠60min之后制备的。

具体实施方式

本发明涉及包含通过接头(例如，肽键)结合的溶酶体酶(例如，IDS)和靶向部分(例如，血管肽素-2)的化合物。靶向部分能够将酶转运至溶酶体和/或穿过BBB。这种化合物典型实例有血管肽素-2-IDS结合物和融合蛋白。这些蛋白无论是在酶学测定中还是在MPS-II的细胞模型中都维持IDS酶活性。因为靶向部分如血管肽素-2能够将蛋白转运穿过BBB，因此预期这些结合物不仅具有外周活性，而且在中枢神经系统(CNS)内也具有活性。另外，靶向部分如血管肽素-2被细胞摄取通过受体介导的转运机制(如LRP-1)进入溶酶体内。因此，发明人认为，这些靶向部分可以增加溶酶体中酶的浓度，从而特别是在表达LRP-1受体的组织和器官如肝、肾和脾中产生更有效的疗法。

这些特点克服目前治疗方法的一些最大的缺点，因为IDS本身的静脉给予并不能治疗CNS疾病的症状。与绕过血脑屏障的物理方法形成对比，这种鞘内或颅内给予，是高度创伤性的并因此通常对于CNS递送问题不是具有吸引力的解决方案，而本发明允许无创脑部递送。另外，与标准酶替代疗法相比，治疗剂向溶酶体的改进的转运可以允许降低给予剂量或频率。

溶酶体贮积症

溶酶体贮积症是其中脂质、糖蛋白或粘多糖的代谢基于酶功能紊乱而被打乱的一类病症。这种功能紊乱导致不能正确代谢的物质的胞内积累。症状根据疾病的不同而不同，但在许多这些疾病中，器官系统(肝脏、心脏、肺、脾)、骨骼以及神经系统中的问题都是存在的。典型地，这些疾病是由相关酶中罕见的遗传缺陷引起的。大多数这些疾病都是以常染色体隐性遗传方式遗传的，但有些，如MPS-II，则是X连锁隐性遗传疾病。

溶酶体酶

本发明可以使用本领域内已知的适用于治疗溶酶体贮积症的任何溶酶体酶。本发明的化合物典型实例有艾杜糖-2-硫酸酯酶(IDS；也称为艾杜硫酸酯酶)。化合物可以包含IDS、保留酶活性的IDS片段或IDS类似物，其可以包含与人IDS序列基本上具有同一性(例如，至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％的同一性)并保留酶活性的氨基酸序列。

已知IDS的三种同种型，同种型a、b和c。同种型a是550个氨基酸的蛋白并且如图7A所示。同种型b(图7B)是343个氨基酸的蛋白，与较长的同种型a相比，其具有不同的C-端区。同种型c(图7C)由于使用下游起始密码子而在N-端具有变化。任何这些同种型都可以用在本发明的化合物中。

为了测试特定的片段或类似物是否具有酶活性，熟练的技术人员可以使用任何合适的检测分析方法。用于测定IDS活性的检测分析法，例如，在本领域内是已知的，包括描述于文献Hopwood,Carbohydr.Res.69:203-16,1979,Bielicki et al.,Biochem.J.271:75-86,1990，和Dean et al.,Clin.Chem.52:643-9,2006中的那些。类似的荧光测定法也描述如下。使用任何这些分析测定方法，本领域技术人员将可以确定特定的IDS片段或类似物是否具有酶活性。

在某些实施方式中，使用了酶片段(例如，IDS片段)。IDS片段可以为至少50、100、150、200、250、300、350、400、450或500个氨基酸的长度。在某些实施方式中，例如，可以使用本文所描述的任何多肽修饰进行修饰酶。

靶向部分

本发明的化合物可以特征在于本文所描述的任何靶向部分，例如，表1中描述的任何多肽(例如，血管肽素-1、血管肽素-2或反向血管肽素-2)或其片段或类似物。在某些实施方式中，多肽可以具有与本文所描述的多肽至少35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或甚至100％的同一性。多肽相对于本文所描述的序列之一可以具有一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)替换。以下更详细地描述其他修饰。

本发明还特征在于这些多肽的片段(例如，功能性片段)。在某些实施方式中，片段能够被有效地转运到或积累于特定的细胞类型(例如，肝、眼、肺、肾或脾)中或有效地转运穿过BBB。多肽的短截可以是来自多肽的N-端、多肽的C-端或二者的组合的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或多个氨基酸。其他片段包括其中多肽的内部部分缺失的序列。

可以通过使用或本文的检测分析法或方法进行识别其他多肽。例如，候选多肽可以通过常规的肽合成方法生产、与紫杉醇结合并给予至实验室动物。生物活性的多肽结合物可以，例如，基于其提高注射肿瘤细胞并用结合物治疗的动物相对于未用结合物治疗(例如，用未结合的试剂治疗)的对照的存活率的能力进行识别。例如，可以基于其在原位脑灌注法中的软组织上的位置而识别生物活性的多肽。

也可以实施确定在其他组织中的积累的检测分析方法。标记的多肽结合物可以给予至动物，并可以测定在不同器官中的积累。例如，结合至可检测的标记(标签，label)(例如，近IR荧光光谱标记如Cy5.5)的多肽容许活体内可视化。这样的多肽可以给予至动物，并可以检测该多肽在器官的存在，从而容许测定多肽在所需的器官中积累的速率和量。在其他实施方式中，可以用放射同位素(例如，¹²⁵I)标记多肽。多肽随后给予至动物。经过一段时间后，将动物处死并提取器官。随后可以使用本领域中已知的任何方法测定在每个器官中的放射性同位素的量。通过在具体器官中相对于标记的对照多肽的量比较标记的候选多肽的量，可以确定候选多肽进入和积累于具体组织中的能力。合适的阴性对照包括任何已知不能有效转运进入特定细胞类型的肽或多肽(例如，相对于血管肽素不能穿过BBB的肽或任何其他肽)。

其他序列描述于美国专利号US 5,807,980(例如，本文所描述的SEQID NO:102)、US 5,780,265(例如，SEQ ID NO:103)、US 5,118,668(例如，SEQ ID NO:105)中。编码抑酶肽类似物的示例性核苷酸序列atgagaccagatttctgcct cgagccgccg tacactgggc cctgcaaagc tcgtatcatc cgttacttct acaatgcaaaggcaggcctg tgtcagacct tcgtatacgg cggctgcaga gctaagcgta acaacttcaa atccgcggaagactgcatgc gtacttgcgg tggtgcttag；SEQ ID NO:106；基因库登录号(Genbankaccession)No.X04666)。抑酶肽类似物的其他实例可以通过使用公开于国际专利申请号PCT/CA2004/000011中的合成抑酶肽序列(或其部分)进行蛋白BLAST(基因库：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)找到。示例性抑酶肽类似物也发现于登录号CAA37967(GI:58005)和1405218C(GI:3604747)之下。

修饰多肽

本发明中所用的融合蛋白、靶向部分和溶酶体酶、片段或类似物可以具有修饰的氨基酸序列。在某些实施方式中，修饰并不会显著毁坏所需的生物活性(例如，穿越BBB的能力或酶促活性)。修饰可以降低(例如，至少5％、10％、20％、25％、35％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％)；可以不影响或可以提高(例如，至少5％、10％、25％、50％、100％、200％、500％或1000％)原始多肽的生物活性。修饰肽载体或多肽治疗剂可以具有或可以最优化多肽的特性，如体内稳定性、生物利用度、毒性、免疫活性、免疫学特性(免疫一致性，immunological identity)和结合性质。

修饰包括通过天然过程的那些，如翻译后加工，或通过本领域中已知的化学修饰技术。修饰可以发生于多肽中的任何位置，包括多肽骨架、氨基酸侧链和氨基-端或羧基-端。同一类型的修饰可以以相同或不同的程度存在于给定多肽中的几个位点，并且多肽可以包含不只一种类型的修饰。多肽可以由于泛素化而分枝化，并且它们可以是环状的，有或没有枝化。环状的、枝化的以及枝化的环状多肽可以由翻译后天然过程所致或者可以是合成制得的。其他修饰包括聚乙二醇化、乙酰化、酰基化、乙酰氨基甲基(acetomidomethyl，Acm)基团的加成、ADP-核糖基化、烷基化、酰胺化、生物素化、氨甲酰化、羧乙基化、酯化、共价结合至核黄素、共价结合至血红素部分、共价结合核苷酸或核苷酸衍生物、共价结合药物、共价结合标志物(例如，荧光或放射性的)、共价结合脂质或脂质衍生物、共价结合磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、转运RNA介导的将氨基酸添加至蛋白如精氨酰化和泛素化。

修饰的多肽也可以包括多肽序列中的氨基酸插入、缺失或替换，无论是保守或非保守的(例如，D-氨基酸、脱氨基氨基酸(desamino acid))(例如，其中这种变化基本上不改变多肽的生物活性)。特别地，将一个或多个半胱氨酸残基添加到本发明的任何多肽的氨基端或羧基端可以促进这些多肽通过，例如，二硫键的结合。例如，血管肽素-1(SEQ ID NO:67)、血管肽素-2(SEQ ID NO:97)或血管肽素-7(SEQ ID NO:112)可以经过修饰而在氨基-端(分别是SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:113和SEQ IDNO:115)包含单个半胱氨酸残基或在羧基-端(分别是SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:116)包含单个半胱氨酸残基。氨基酸替换可以是保守的(即，其中残基由相同一般类型或组的另一个取代)或非保守的(即，其中一个残基被另一种类型的氨基酸取代)。另外，非天然氨基酸可以替换天然氨基酸(即，非天然的保守性氨基酸替换或非天然的非保守性氨基酸替换)。

合成制备的多肽可以包含非DNA天然编码的氨基酸的替换(例如，非天然的或人工(unnatural)氨基酸)。非天然氨基酸的实例包括D-氨基酸、具有连接至半胱氨酸的硫原子的乙酰基氨基甲基基团的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、式NH₂(CH₂)_nCOOH的ω-氨基酸其中n为2-6、中性非极性氨基酸如肌氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸和正亮氨酸。苯基甘氨酸可替换Trp、Tyr或Phe；瓜氨酸和甲硫氨酸亚砜是中性非极性的，半胱酸是酸性的，并且鸟氨酸是碱性的。脯氨酸可以用羟脯氨酸替换并保留构象赋予性质。

类似物可以通过替换诱变(substitutional mutagenesis)产生并保留原始多肽的生物活性。确定为“保守替换”的替换实例如表2所示。如果这种替换会导致不期望的变化，则引入其他类型的替换(在表2中命名为“示例性替换”，或按照本文所描述的参照氨基酸类别进一步的描述)并筛选产物。

通过选择在其影响维持(a)多肽骨架在替换区域内的结构，例如作为折叠或螺旋构象、(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性或(c)侧链的主体(bulk)方面显著不同的替换而完成在功能或免疫一致性中的实质性修饰。基于共同的侧链特性，将天然存在的残基分成不同组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、甲硫氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)；

(2)中性亲水性的：半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)；

(3)酸性/带负电荷的：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)；

(4)碱性的：天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)；

(5)影响链取向的残基：甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)；

(6)芳香族：色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)；

(7)极性的：Ser、Thr、Asn、Gln；

(8)碱性带正电的：Arg、Lys、His；和

(9)带电荷的：Asp、Glu、Arg、Lys、His。

其他氨基酸替换列于表2中。

表2：氨基酸替换

多肽衍生物和拟肽

除了由天然氨基酸构成的多肽之外，拟肽或多肽类似物也涵盖于本发明内，并可以形成本发明的化合物中使用的融合蛋白，靶向基团或溶酶体酶、酶片段或酶类似物。多肽类似物常用于药物工业作为具有类似于模板多肽性质的非肽药物。非肽化合物称为“肽模拟物”或拟肽(Fauchere et al.，Infect.Immun.54:283-287,1986和Evans et al.，J.Med.Chem.30:1229-1239，1987)。结构上与治疗有用的肽或多肽相关的肽模拟物可以用于产生等效或增强治疗或预防效果。通常，拟肽在结构上类似于范例多肽(即，具有生物或药理活性的多肽)如天然存在的受体结合的多肽，但具有一种或多种通过本领域公知的方法可选地被键如–CH₂NH–、–CH₂S–、–CH₂–CH₂–、–CH＝CH–(顺(cis)和反(trans))、–CH₂SO–、–CH(OH)CH₂–、–COCH₂–等取代的肽键(Spatola,Peptide Backbone Modifications,VegaData,1:267,1983；Spatola et al.,Life Sci.38:1243-1249,1986；Hudson etal.,Int.J.Pept.Res.14:177-185,1979；和Weinstein,1983,Chemistry andBiochemistry,of Amino Acids,Peptides and Proteins,Weinstein eds,MarcelDekker,New York)。这种多肽模拟物可以具有比天然多肽更显著的优势，包括生产更经济、化学稳定性更高、药理特性增强(例如、半衰期、吸收、效力、效率)、抗原性降低等。

尽管本文所描述的靶向部分可以有效地穿过BBB或靶向特定的细胞类型(例如，本文所描述的那些)，但可以通过蛋白酶的存在而降低其有效性。同样，本发明的化合物中所用的溶酶体酶、酶片段或酶类似物的效力可能会类似降低。血清蛋白酶具有特异性底物要求，包括用于酶切的L-氨基酸和肽键。而且，外肽酶，其代表血清中蛋白酶活性的最重要的组分，通常作用于多肽的第一肽键并需要游离的N-端(Powell et al.,Pharm.Res.10:1268-1273,1993)。鉴于此，往往有利的是使用多肽修饰的版本。修饰的多肽保留了原始L-氨基酸多肽的结构特性，但有利的是易于被蛋白酶和/或外肽酶切割。

用相同类型的D-氨基酸(例如，对映体，代替L-赖氨酸的D-赖氨酸)系统性替换共有序列(consensus sequence)一个或多个氨基酸，可用于产生更稳定的多肽。因此，本文所描述的多肽衍生物或拟肽可以是全L-，全D-或混合的D、L-多肽。N-端或C-端D-氨基酸的存在增加多肽的体内稳定性，因为肽酶不能利用D-氨基酸作为底物(Powell et al.,Pharm.Res.10:1268-1273,1993)。反向-D多肽是含D-氨基酸、以相对于含L-氨基酸的多肽的反向序列排布的多肽。因而，L-氨基酸多肽的C-端残基变成D-氨基酸多肽的N-端，等等。反向D-多肽保留与L-氨基酸多肽相同的三级构象，并因此保留相同活性，但是对体外和体内酶促降解更稳定，并因此比原始多肽具有更强的治疗功效(Brady和Dodson，Nature368:692-693,1994和Jameson et al.,Nature368:744-746,1994)。除了反向D-多肽，包含共有序列或基本上相同的共有序列变体的约束多肽(constrainedpolypeptide)可以通过本领域熟知的方法产生(Rizo et al.，Ann.Rev.Biochem.61:387-418，1992)。例如，可以通过加入能够形成二硫键桥的半胱氨酸残基，并由此产生环状多肽而产生约束多肽。环状多肽没有游离N-或C-末端。因此，它们不容易受到外肽酶的蛋白酶解作用，但是它们当然易受不在多肽端处切割的内肽酶作用。具有N-端或C-端D-氨基酸的多肽的氨基酸序列和环状多肽的氨基酸序列通常分别与除了存在N-端或C-端D-氨基酸残基或其环形结构之外它们对应的多肽的序列具有同一性。

含有分子内二硫键的环状衍生物可以通过常规的固相合成制备，同时在选择用于环化的位置如氨基和羧基端处引入合适的S-保护的半胱氨酸或同源半胱氨酸残基(Sah et al.,J.Pharm.Pharmacol.48:197,1996)。继完成链组装后，可以(1)通过采取对应的两个游离SH-官能团的后续负载(on-support)氧化而选择性除去S-保护基团，来形成S-S键，接着从负载载体上按传统移出产物和进行合适的纯化过程或(2)通过从载体上连同完整侧链脱保护一起移出多肽，随后在高度稀水溶液中氧化游离SH功能团，而进行环化。

可以通过常规的固相合成制备含有分子内酰胺键的环状衍生物，而同时在选择用于环化的位置处引入合适的氨基和羧基侧链保护的氨基酸衍生物。含有分子内-S-烷基键的环状衍生物可以通过常规的固相化学制备，而同时在选择用于环化的位置处引入具有合适的氨基保护侧链的氨基酸残基，和合适的S-保护的半胱氨酸或高半胱氨酸(homocysteine)残基。

赋予对作用于多肽N-端或C-端残基的肽酶的抗性的另一种有效方法是在多肽的端部添加化学基团，而使得修饰的多肽不再是肽酶的底物。一种这样的化学修饰是多肽在任一端或两端进行糖基化。某些化学修饰，特别是N-端糖基化，已证明可以提高多肽在人血清中的稳定性(Powell et al.,Pharm.Res.10:1268-1273,1993)。可以增强血清稳定性的其他化学修饰包括，但不限于，添加N-端烷基基团，由1至20个碳原子的低级烷基组成，如乙酰基基团，和/或添加C-端酰胺或取代的酰胺基团。具体而言，本发明包括由带有N-端乙酰基基团和/或C-端酰胺基团的多肽构成的修饰多肽。

本发明还包括含有其他非多肽的通常部分的化学部分的其他类型的多肽衍生物，条件是衍生物保留所需的多肽的功能活性。这种衍生物的实例包括(1)氨基端或另一游离氨基基团的N-酰基衍生物，其中酰基基团可以是烷酰基基团(例如，乙酰基、己酰基、辛酰基)、芳酰基基团(例如，苯甲酰基)或阻断基团如F-moc(芴甲基-O-CO-)；(2)羧基端或另一个游离羧基或羟基基团的酯；(3)羧基端或另一个游离羧基基团通过与氨基或与合适胺反应而产生的酰胺；(4)磷酸化衍生物；(5)结合至抗体或其他生物配体的衍生物和其他类型的衍生物。

由向本文所描述的多肽添加另外的氨基酸残基所产生的更长多肽序列也涵盖在本发明中。这种更长的多肽序列可以预期具有与本文以上所描述的多肽相同的生物学活性和特异性(例如，细胞趋化性(tropism))。尽管并不排除具有大量另外氨基酸的多肽，但人们已经认识到一些巨型多肽可能呈现(assume)掩蔽有效序列的构型，从而妨碍结合至靶(例如，LRP受体家族的成员)。这些衍生物可以充当竞争性拮抗剂作用。因此，尽管本发明涵盖本文所描述的具有扩展的多肽或多肽的衍生物，但是合乎需要的是扩展不会破坏化合物的细胞靶向活性或酶活性。

本发明中所包括的其他衍生物是由本文所描述的、直接或通过间隔子如通过一短延伸(stretch)的丙氨酸残基或通过蛋白水解的假定位点(例如，通过组织蛋白酶，参见例如，美国专利号US 5,126,249和欧洲专利号EP 495 049)共价相互连接的两个相同或不同的多肽构成的双重多肽。本文所描述的多肽的多聚体由相同或不同的多肽或其衍生物形成的分子的聚合物构成。

本发明还涵盖为包含本文所描述的多肽的嵌合或融合蛋白的多肽衍生物或其片段，在其氨基-或羧基端末端或这两端连接至不同蛋白的氨基酸序列。这样的嵌合或融合蛋白可以通过编码蛋白的核酸的重组表达而产生。例如，嵌合或融合蛋白可以包含至少6个与所描述的理想地产生具有等效或更强功能活性的嵌合或融合蛋白的多肽之一共享的氨基酸。

识别拟肽的检测分析法

如上所描述的，产生来复制本文所描述的多肽的骨架几何结构和药效团呈现的非肽基(non-peptidyl)化合物(拟肽)常常具有更好的代谢稳定性、更高效力、更长的作用持续时间和更好的生物利用度的属性。

可以使用本领域中已知的组合库方法中的许多方法中的任何方法，包括生物库、空间可寻址平行固相或溶液相库、需要去卷积的合成库方法、“一珠一化合物”库方法、以及使用亲和色谱选择的合成库方法获得拟肽化合物。生物库方法仅限于肽库，而其他四种方法都适用于肽、非肽低聚物或化合物的小分子库(Lam,Anticancer Drug Des.12:145,1997)。分子库合成方法的实例可以在本领域内找到，例如，查阅：DeWitt et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909,1993)；Erb et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11422,1994)；Zuckermann et al.(J.Med.Chem.37:2678,1994)；Cho etal.(Science261:1303,1993)；Carell et al.(Angew.Chem,Int.Ed.Engl.33:2059,1994和ibid2061)；和查阅Gallop et al.(Med.Chem.37:1233,1994)。化合物的库可以存在于溶液中(例如，Houghten,Biotechniques13:412-421,1992)或珠上(Lam,Nature354:82-84,1991)、晶片上(Fodor,Nature364:555-556,1993)、细菌或孢子上(美国专利号US 5,223,409)、质粒上(Cull et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1865-1869,1992)或噬粒上(Scott和Smith，Science249:386-390,1990)或荧光素酶上、以及通过测定合适底物向产物转化的转化率而检测的酶标签上。

一旦识别如本文所描述的多肽，其可以通过许多标准方法，包括但不限于，差示溶解度(例如，沉淀)法、离心法、色谱法(例如，亲和、离子交换和尺寸排阻)中的任何方法，或通过用于纯化肽、拟肽或蛋白的任何其他标准技术分离和纯化。可以使用本领域中已知的任何功能检测分析法评价感兴趣的经过识别的多肽的功能特性。理想的是，使用用于评价胞内信号传导中的下游受体功能的检测分析法(例如，细胞增殖)。

例如，可以使用下面三阶段法获得本发明的拟肽化合物：(1)扫描本文所描述的多肽以识别对于靶向本文所描述的细胞类型所必需的二级结构区域；(2)使用构象约束的二肽替代物(surrogate)来改善(refine)骨架几何结构并提供对应于这些替代物的有机平台；和(3)使用最佳有机平台来展示设计用于模拟天然多肽的所需活性的候选库中的有机药效团。三阶段法更详细地介绍如下。在第1阶段中，先导候选多肽被扫描并省略(abridge)其结构以识别其活性的要求。合成一系列原始多肽的多肽类似物。在第2阶段中，使用构象约束二肽替代物研究最好的多肽类似物。吲哚里西啶-2-酮(indolizidin-2-one)，吲哚里西啶-9-酮和喹诺里西啶酮(quinolizidinone)氨基酸(分别为I²aa，I⁹aa和Qaa)被用作用于研究最佳候选肽的主链几何结构的平台。可以在多肽的具体区域处引入这些和相关的平台(综述于文献Halab et al.,Biopolymers55:101-122,2000和Hanessian et al.,Tetrahedron53:12789-12854,1997中)以在不同方向上定向药效团。这些类似物的生物学评价识别出模拟活性几何结构要求的改进先导多肽。在第3阶段中，来自最具活性的先导多肽的平台被用于展示负责天然肽活性的药效团的有机替代物。按照平行合成格式组合药效团和支架。可以通过使用本领域中已知的方法的其他手段实现多肽的衍生和上述阶段。

由本文的多肽、多肽衍生物、拟肽或其他小分子测定的结构功能关系可以用于完善和制备具有类似或更好性能的类似分子结构。因此，本发明的化合物也包括共享如本文所描述的多肽的结构、极性、电荷特性和侧链性质的分子。

总之，基于本文的公开内容，本领域的技术人员可以开发出适用于识别将试剂靶向特定细胞类型的化合物(例如，本文描述的那些)的肽和拟肽筛选检测分析法。可以开发本发明的检测分析法用于低通量、高通量或超高通量筛选格式。本发明的检测分析法包括易于自动化的检测分析法。接头

溶酶体酶(例如，IDS)、酶片段或酶类似物可以直接地(例如，通过共价键如肽键)结合至靶向部分或可以通过接头结合。接头包括化学连接剂(例如，可酶切的接头)和肽。

在一些实施方式中，接头是化学连接剂。溶酶体酶(例如，IDS)、酶片段或酶类似物和靶向部分可以通过巯基基团、氨基基团(胺)和/或糖或任何合适的反应性基团进行结合。同源双功能和异源双功能交联剂(结合剂)可获自许多商业源。在本发明的多肽上可以找到可用于交联的区域。交联剂可以包含柔性臂，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碳原子。示例性交联剂包括BS3([双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯]；BS3是靶向可接近伯胺的同源双功能N-羟基琥珀酰亚胺酯)，NHS/EDC(N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-'(二甲基氨丙基)碳二酰亚胺；NHS/EDC允许伯胺基团与羧基基团结合)，磺基-EMCS([N-e-马来酰亚胺基己酸]肼，磺基-EMCS是对巯基反应和氨基基团有活性的异源双功能反应活性基团(马来酰亚胺和NHS-酯)，肼(大多数蛋白含有暴露的糖而肼是用于将羧基基团连接至伯胺的有用试剂)，和SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯；SATA是对胺有活性的，并添加了保护的巯基基团)。

为了形成共价键，可以用作化学反应活性的基团是各种各样的活性羧基基团(例如，酯)，其中羟基部分是在修饰肽所要求的水平上生理可接受的。具体的试剂包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、马来酰亚胺-苯甲酰基-琥珀酰亚胺(MBS)、γ-马来酰亚胺-丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、马来酰亚胺基丙酸(MPA)、马来酰亚胺基己酸(MHA)和马来酰亚胺基十一烷酸(MUA)。

伯胺是NHS酯的主要靶。可接近的α-胺基团存在于蛋白N-端而赖氨酸的ε-胺与NHS酯反应。当NHS酯结合反应与伯胺反应释放N-羟基琥珀酰亚胺之时形成酰胺键。这些含有反应活性基团的琥珀酰亚胺在本文中称为琥珀酰亚胺基基团。在本发明的某些实施方式中，蛋白上的官能团将是巯基基团而化学反应性基团将是含马来酰亚胺基的基团如γ-马来酰亚胺-丁酰胺(GMBA或MPA)。这种含马来酰亚胺的基团在本文中称为马来酰亚胺基团。

当反应混合物的pH值为6.5-7.4时，马来酰亚胺基团对肽上的巯基基团最具选择性。在pH值为7.0时，马来酰亚胺基团与巯基反应的速率(例如，蛋白如血清白蛋白或IgG上的硫羟基基团)比与胺反应快1000倍。因此，马来酰亚胺基团和巯基之间可以形成稳定的硫醚连接。

在其他实施方式中，接头包括至少一个氨基酸(例如，至少2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、40或50个氨基酸的肽)。在某些实施方式中，接头是单个氨基酸(例如，任何天然存在的氨基酸如Cys)。在其他实施方式中，使用了富含甘氨酸的肽如具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_n其中n是1、2、3、4、5或6的肽，如在美国专利号US 7271149中所描述的。在其他实施方式中，使用了富含丝氨酸的肽接头，如在美国专利号US5,525,491中所描述的。富含丝氨酸的肽接头包括式[X-X-X-X-Gly]_y的那些，其中上达至两个的X是Thr，而其余X是Ser，并且y为1～5(例如，Ser-Ser-Ser-Ser-Gly，其中y大于1)。在一些情况下，接头是单个氨基酸(例如，任何氨基酸，如Gly或Cys)。其他接头包括刚性接头(例如，PAPAP和(PT)_nP，其中n为2、3、4、5、6或7)和α-螺旋接头(例如，A(EAAAK)_nA，其中n为1、2、3、4或5)。

合适的接头的实例是琥珀酸、Lys、Glu和Asp，或二肽如Gly-Lys。当接头是琥珀酸时，其一个羧基基团可以与氨基酸残基的氨基基团形成酰胺键，而其另一个羧基基团可以，例如，与肽或取代基的氨基基团形成酰胺键。当接头是Lys、Glu或Asp时，其羧基基团可以与氨基酸残基的氨基基团形成酰胺键，而其氨基基团可以，例如，与取代基的羧基基团形成酰胺键。当Lys用作接头时，另外的接头可以插入于Lys的ε-氨基基团和取代基之间。在一个特定实施方式中，另外的接头是琥珀酸，例如，其与Lys的ε-氨基基团和取代基中存在的氨基基团形成酰胺键。在一个实施方式中，另外的接头是Glu或Asp(例如，其与Lys的ε-氨基基团形成的酰胺键而与取代基中存在的羧基基团形成另一个酰胺键)，即，取代基是N^ε-酰化的赖氨酸残基。

点击化学接头

在特定的实施方式中，通过点击化学反应对之间的反应形成接头。点击化学反应对是指高产率和高动力学增益参与模块化反应，由此产生点击化学接头的一对反应活性基团。在这个实施方式中，反应活性基团之一连接至酶部分而另一个反应活性基团连接至多肽。示例性反应和点击化学对包括炔基基团和叠氮基基团之间形成含三唑的接头的惠斯更(Huisgen)1,3-偶极环加成反应；具有4π电子体系的二烯(例如，可选取代的1,3-不饱和化合物，如可选取代的1,3-丁二烯、1-甲氧基-3-三甲基硅氧基-1,3-丁二烯、环戊二烯、环己二烯或呋喃)和具有2π电子体系的亲二烯体或亲杂二烯体(例如，可选取代的链烯基或可选取代的炔基基团)之间的狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应；用亲核剂和环张力杂环基亲电剂的开环反应；用硫代磷酸酯基团和碘代基基团的夹板连接反应；和用醛基团和氨基基团的还原性氨化反应(Kolb et al.,Angew.Chem.Int.Ed.,40:2004-2021(2001)；Van der Eycken et al.,QSAR Comb.Sci.,26:1115-1326(2007))。

在本发明的特定实施方式中，多肽通过炔基基团和叠氮基基团点击化学对之间的反应形成的含三唑接头连接至酶部分。在这种情况中，叠氮基基团可以连接至多肽而炔基基团可以连接至酶部分。可替代地，叠氮基基团可以连接至酶部分而炔基基团可以连接至多肽。在某些实施方式中，叠氮基基团和炔基基团之间的反应是未催化的，而在其他实施方式中，由铜(I)催化剂(例如，碘化亚铜(I))，铜(II)催化剂在还原剂存在下(例如，含抗坏血酸钠的硫酸铜(II)或乙酸铜(II))，或由含钌催化剂(例如，Cp*RuCl(PPh₃)₂或Cp*RuCl(COD))催化反应。

示例性接头包括单氟环辛炔(MFCO)、二氟环辛炔(DFCO)、环辛炔(OCT)、二苯并环辛炔(DIBO)、二芳基氮杂环辛炔(BARAC)、二氟苯并环辛炔(DIFBO)和双环[6.1.0]壬炔(BCN)。

溶酶体贮积症的治疗

本发明还特征在于用于治疗溶酶体贮积症如MPS-II的方法。MPS-II的特征在于糖胺聚糖(GAG)的细胞积累，这是由个体不能降解(breakdown)这些产物所致。

在某些实施方式中，在诊断患有IDS基因突变，但还没有疾病的症状的受试者(例如，婴儿或2岁以下的受试者)上进行治疗。在其他实施方式中，治疗在具有至少1种MPS-II症状(例如，任何本文的那些)的个体上进行。

MPS-II一般分为两大类，重症疾病和减弱疾病。本发明可以涉及治疗患有这两种类型的疾病任一种的受试者。重症疾病的特征在于涉及CNS。在重症疾病中，认知能力下降，加之呼吸道和心脏疾病，通常导致成年之前死亡。这种病的减弱形式一般只轻微涉及或不涉及CNS。在重症疾病和减弱疾病二者之中，非CNS症状可能与具有“严重”形式的那些一样严重。

最初的MPS-II症状从约18月至约四岁的时候开始自己表现出来并包括腹部疝气、耳部感染、流鼻涕和感冒。症状包括五官粗陋(例如，前额突出、扁平桥梁鼻、大舌头)、大脑袋(大头畸形)、肿大腹部、包括肿大肝(大畸形肝(heptaomegaly))和脾脏肿大(大畸形脾脏(slenomegaly))、以及听力损失。本发明的方法可以涉及治疗具有任何本文所描述的症状的受试者。MPS-II还导致关节异常，涉及骨质增厚。

可以在任何年龄(从婴儿至成年)的受试者上开始治疗。受试者可以在出生、6月龄或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15或18岁龄时开始治疗。

给予和剂量

本发明还特征在于含有治疗有效剂量的本发明的化合物的药物组合物。组合物可以经过配制而适用于各种药物递送系统。一种或多种生理上可接受的赋形剂或载体也可以包括于组合物中进行适当的配制。适用于本发明的合适制剂请查阅Remington’s Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Company,Philadelphia,PA,17th ed.,1985。对于药物递送方法的简要综述，参见，例如，Langer(Science249:1527-1533,1990)。

药物组合物意在用于肠胃外、鼻内、局部、口服或局部给予，如通过透皮方式，用于预防性和/或治疗性治疗。药物组合物可以肠胃外给予(例如，通过静脉内、肌内或皮下注射)，或通过口服摄取，或在受血管或癌症病症影响的区域处通过局部施用或关节内注射。其他给予途径包括血管内、动脉内、瘤内、腹膜内、心室内、上皮内(intraepidural)，以及鼻、眼、巩膜内、眶内、直肠、局部或气雾吸入给予。通过如以长效注射剂或易蚀植入物或组件的方式，缓释给予也专门涵盖于本发明中。因此，本发明提供了胃肠外给予的组合物，包含溶解或悬浮于可接受的载体，优选水性载体，例如水、缓冲水、盐水、PBS等中的上面提到的药物。组合物可以含有接近生理条件所需的药用辅助物质，如pH值调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等。本发明还提供了口服递送的组合物，其可以包含惰性组分如用于配制片剂、胶囊等的粘结剂或填料。另外，本发明提供了局部给予的组合物，其可以不含惰性成分，如配制霜剂、软膏等的溶剂或乳化剂。

这些组合物可以通过常规灭菌技术灭菌或可以无菌过滤。所得到的水溶液可以原样包装使用或冻干，冻干制剂在给予之前与无菌水性载体组合。制剂的pH值一般为3至11，更优选5至9或6至8，而最优选7至8，如7至7.5。所得的固体形式的组合物可以分多个单剂量单位包装，每个都包含固定量的上述一种或多种试剂，如在片剂或胶囊的密封包装中。固体形式的组合物也可以包装于一个灵活量的容器中，如设计用于局部可涂施的霜剂或软膏的可挤压管中。

含有有效量的组合物可以给予用于预防性或治疗性治疗。在预防性应用中，组合物可以给予至诊断具有溶酶体贮积症相关的突变(例如，在IDS基因中的突变)的受试者。可以以足以延迟、减少或优选防止病况发作的足够量将本发明的组合物给予至受试者(例如，人)。在治疗性应用中，按照足以治愈或至少部分阻止这种疾病的症状及其并发症的用量将组合物给予至已经遭受溶酶体贮积症(例如，MPS-II)的受试者(例如，人类)。足以实现此目的量定义为“治疗有效量”，足以基本上改善与疾病或医学病况相关的至少一种症状的化合物量。例如，在溶酶体贮积症的治疗中，减少、预防、延迟、抑制或阻止疾病或病况的任何症状的药剂或化合物将会是治疗有效的。不要求治疗有效量的药剂或化合物治愈疾病或病况，但将提供对疾病或病况的治疗，而使这种疾病或病况的发作受到延迟、阻滞或预防，或疾病或病况症状得到缓解，或疾病或病况的期限改变或，例如，在个体中不太严重或加速恢复。

这种应用的有效用量可以取决于疾病或病况的严重程度和受试者的体重和一般状态。推荐每周静脉内给予艾杜硫酸酯酶0.5mg/kg。本发明的化合物可以，例如，按照等效剂量(即，看作相对于艾杜硫酸酯酶的融合蛋白的另外分子量)和频率进行给予。化合物可以按照艾杜硫酸酯酶等效剂量，例如、0.01、0.05、0.1、0.5、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0或5mg/kg每周一次、每周两次、每隔一天、每天或每天两次进行给予。本发明的组合物和在本发明的方法中所用给予至哺乳动物(例如，人类)的治疗有效量可以通过普通技术人员结合考虑哺乳动物在年龄、体重和状况上的个体差异而确定。因为本发明的某些化合物表现出穿过BBB并进入溶酶体中的能力增强，本发明化合物的剂量可以低于(例如，低于或等于约90％、75％、50％、40％、30％、20％、15％、12％、10％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的)未结合药剂治疗效果所需的等效剂量。以有效量将本发明的试剂给予至受试者(例如，哺乳动物，如人类)，有效量是在所治疗的受试者中产生所希望的结果(例如，GAG积累减少)的量。还可以通过本领域那些技术人员根据经验确定治疗有效量。

可以用由治疗医师所选的剂量水平和模式实施本发明的包含有效量的组合物的单次或多次给予。可以基于疾病或病况在受试者中的严重度确定和调整剂量和给予方案，这种严重度可以在整个治疗过程中根据由临床医师普遍实行的或本文所描述的方法进行监测。

本发明的化合物可以与常规治疗或疗法的方法组合使用，或可以独立于常规治疗或疗法的方法使用。

当以组合疗法与其他药物一起给予本发明的化合物时，它们可以顺序或同时向个体给予。另外，根据本发明的药物组合物可以由本发明的化合物的组合联合本文所描述的药用赋形剂，以及本领域中已知的另一种治疗或预防药物而构成。

以下实施例预想举例说明本发明，而非进行限制。

实施例1

IDS-血管肽素-2融合蛋白的设计

设计了一系列的IDS-血管肽素-2构建体。IDS cDNA获自Origene(目录号RC219187)。使用了三种基本构型：N-端融合(An2-IDS和An2-IDS-His)，C-端融合(IDS-An2和IDS-An2-His)和N-和C-端融合(An2-IDS-An2和An2-IDS-An2-His)，既有含8x His标记的，又有不含8x His标记的(图1)。也产生无血管肽素-2的对照(IDS和IDS-His)。

实施例2

重组hIDS蛋白在CHO-S细胞中的表达和活性

随后在悬浮生长(grown in suspension)的CHO-S细胞中表达这些构建体。使用线性25kDa聚乙烯亚胺(PEI，Polyscience)作为转染试剂通过瞬时转染在FreeStyle CHO-S细胞(Invitrogen)中表达IDS构建体。在一个实施例中，DNA(1mg)与70mL的FreeStyle CHO表达培养基(Invitrogen)混合，并且在室温下孵育15min。PEI(2mg)单独在70mL培养基中孵育15分钟，并随后将DNA和PEI溶液混合并另外孵育15分钟。DNA/PEI络合物混合物添加到360mL含1×10⁹CHO-S细胞的培养基。在37℃、8％CO₂和用中度搅拌孵育四个小时后，加入500mL温暖的培养基。在收获前，在相同条件下进一步孵育CHO-S细胞5天。

为了确定细胞是否表达和分泌IDS或IDS融合蛋白，对培养基实施使用抗-IDS抗体的蛋白免疫印迹分析。如图2中所见，IDS-His、An2-IDS-His和DS-An2-His的表达水平相似。因此，细胞可以表达这些蛋白。

发明人还表征了IDS在培养基中的活性。这种检测分析方法使用两步酶促检测分析法进行实施(图3)。这种检测分析法涉及在水中用IDS处理4-甲基伞形基-α-L-艾杜糖苷-2-硫酸酯长达4小时以产生4-甲基伞形基-α-L-艾杜糖苷和硫酸酯。在第二步骤中，用过量的α-L-艾杜糖苷酸酶(IDUA)处理这些产物24小时以产生α-L-艾杜糖醛酸和4-甲基伞形酮。活性通过测定4-甲基伞形酮(365nm激发；450nm发射)的荧光而确定。

在一个具体实施例中，如下进行这种检测分析法。10μL的CHO-S转染细胞的培养基与20μL的1.25mM4-甲基伞形基-α-L-艾杜糖苷-2-硫酸酯(IDS底物，获自Moscerdam Substrates)在乙酸盐缓冲液，pH5.0中混合，并且在37℃下孵育4h。随后通过加入20μL0.2M Na₂HPO₄/0.11M柠檬酸缓冲液(pH4.5)和10μL由牛睾丸纯化的溶酶体酶(LEBT)开始这种检测分析法的第二步骤。在37℃下24小时之后，用200μL含0.025％TritonX-100的0.5M NaHCO₃/Na₂CO₃缓冲液(pH10.7)终止反应。通过测定4-甲基伞形酮(365nm激发；450nm发射)的荧光而确定活性。

IDS在悬浮生长的CHO-S细胞中的活性测定如图4所示，并且所有三种蛋白(IDS-His、An2-IDS-His和IDS-AN2-His)均表现出具有IDS活性。

实施例3

表达的表征和优化

为了进一步表征表达，对IDS-His和IDS-An2-His融合蛋白测定了IDS在悬浮生长的CHO-S细胞中的表达和活性的时间过程评价，如图5A和图5B中所示。根据这些数据，在转染之后五天观察到最大IDS表达和活性。在这些实验中没有观察到由CHO-S细胞对IDS-An2-His的再捕获(recapture)。

为了进一步优化转染条件，使用两种不同数量的细胞(1.25×10⁷个细胞或2.5×10⁷个细胞)进行转染。使用了三各不同的DNA与聚乙烯亚胺(PEI)比值(1:1、1:2、1:3和1:4)。

根据这些实验，如通过IDS活性(图5A)和通过表达分析(图5B)所示，使用1:2的DNA:PEI比值获得了最佳结果。

实施例4

IDS在MPS-II成纤维细胞中的活性

为了确定所表达的蛋白是否能够降低细胞中的GAG积累，使用了取自MPS-II患者的成纤维细胞。在第一组实验中，来自上文所描述的用不同IDS和IDS融合蛋白转染的CHO-S细胞的细胞培养基与成纤维细胞一起孵育。基于35S-GAG的存在测定GAG积累量。如图6A中所示，使用融合蛋白降低的GAG与IDS本身降低的GAG类似。

如下进行这些检测分析法。MPS II(Coriell institute，GM00298)或健康人成纤维细胞(GM05659)在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中按照250,000个细胞/孔接种于6-孔培养皿中，并且在37℃下5％CO₂中生长。4天后，细胞用PBS洗涤一次，用低硫酸盐F-12培养基(Invitrogen，目录#11765-054)洗涤一次。1mL含10％透析过的FBS(Sigma，目录#F0392)的低硫酸盐F-12培养基和10μCi³⁵S-硫酸钠添加至存在或不存在重组IDS蛋白的细胞中。在5％CO₂中于37℃下孵育成纤维细胞。48小时后，除去培养基并且用PBS洗涤细胞5次。细胞溶解于0.4mL/孔的1NNaOH中并加热至60℃维持60分钟以溶解蛋白。取出等分试样进行μBCA蛋白检测分析。用液体闪烁计数器计数放射活性。数据表示为³⁵S CPM/μg蛋白。

用纯化的IDS-AN2-His获得了更加有前景的结果，相比于在正常人体成纤维细胞中测定的标准对照值，该纯化的IDS-AN2-His能够降低GAG-积累(图6B)。这些结果表明，发明人的纯化的融合蛋白是有活性的。总之，对于MPS-II成纤维细胞的这些数据表明，融合蛋白是有活性的，并且它们到达了它们可以切割葡糖胺基葡聚糖(glycoaminoglycan)的溶酶体中。

最后，蛋白免疫印迹表明，LRP-1在正常和MPS-II成纤维细胞中以相同水平表达(数据未显示)。

实施例5

点击化学接头

在一个实施例中，靶向部分通过点击化学接头连接至溶酶体酶。这种化学的一个实施例如下所示。

这种方法的优点在于，它是非常具有选择性的，因为反应仅发生于叠氮和炔烃组分之间。反应也发生于水溶液中并是生物相容的因此可以在活体细胞中进行。另外，反应是快速并定量的，容许在稀溶液中制备纳摩尔级的结合物。最后，因为反应是pH-不敏感性的，因此它可以在pH4至11的任何地方进行，在实施例8和9中讨论本发明中使用的特异性点击化学接头。

实施例6

SATA化学连接

在另一实施例中，靶向部分通过SATA化学接头连接至溶酶体酶。用于产生这种结合物的示例性方案如下所示。

实施例7

其他化学结合策略

在另一个实施例中，通过肼接头实现化学结合。用于产生这种结合物的示例性方案如下所示。

在另一实施例中，使用过碘酸-氧化的酶与肼衍生物通过糖部分(例如，糖基化位点)实现化学结合。这种方法的实施例如下用保护丙酰基的肼所示。

这种方法的另一个实施例如下所示。

实施例8

IDS与An2通过点击化学结合的方法

艾杜糖-2-硫酸酯酶的氨基酸序列，其中可能的结合位点，即赖氨酸和N-端残基被加亮强调。

化合物结构

血管肽素2序列

H₂N-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asp-Asp-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-COOH

叠氮基-An2(N-端)

具有N-端叠氮基团的叠氮基丁酰基-An2(叠氮基-An2)的结构如下所示。这种化合物通过标准固相合成法制备。

An2-叠氮基(C-端)

具有C-端叠氮基团的An₂-[Lys²⁰-N₃](AN2-叠氮基)的结构如下所示。这种化合物通过标准固相合成方法进行制备。

示意性结构：

显示在叠氮基丁酰基-血管肽素-2的N-端上使用BCN接头和点击化学结合的IDS-BCN-丁酰基-An₂(70-56-1B和70-56-2B)的结构如下所示。

显示在血管肽素-2-Lys²⁰的C-端上使用MFCO接头和点击化学结合的An₂-[Lys²⁰]-MFCO-IDS(70-66-1B)的结构如下所示。

显示在血管肽素-2Lys²⁰的C-端上使用BCN接头结合的An₂-[Lys²⁰]-BCN-IDS(68-32-2)的结构如下所示。

70-56-1B和70-56-2B的合成方案

步骤：1-修饰IDS赖氨酸

BCN：双环[6.1.0]壬炔

合成70-56-1A

在室温下、在5h内伴随偶尔手动振荡，向在磷酸盐缓冲液20mMpH～7.6中的(7.24mg，95nmol)的IDS(1)中加入380nmol(4当量)的BCN-N-羟基琥珀酰亚胺酯(2)(获自如下制备的原液：5.82mg溶解于1000μL无水DMSO中)。通过用HiPrep26/10脱盐柱以5mL/min用磷酸盐缓冲液20mM pH7.6凝胶过滤，从过量试剂纯化修饰的IDS3a，70-56-1A。所收集的级分通过Amicon超离心过滤器(限值10kDa，3000rpm)浓缩至3.8mL(6.5mg，收率90％)。回收修饰的IDS70-56-1A(3a)并用于与叠氮基An2(N-端)(4)的下一结合步骤。

步骤：2-修饰的IDS与叠氮基An2(N端)的结合

合成(70-56-1B)

向修饰的IDS衍生物(3a)(6.5mg，85.2nmole)中加入8当量的叠氮基An2(N-端)(4)。手动振荡溶液，包裹于铝箔上并在室温下保持过夜。随后通过Q琼脂糖1mL柱使用20mM TRIS pH7作为结合缓冲剂而同时使用20mM TRIS和500mM NaCl pH7.0作为洗脱缓冲剂纯化结合物(5)。结合物经过分离并用IDS缓冲液(1X：137mM NaCl，17mMNaH₂PO₄，3mM Na₂HPO₄，pH～6)通过用Amicon超滤过滤器(10kDa截止值，3000rpm)5×15mL冲洗进行交换并浓缩至2.5mL而获得70-56-1B(6mg，收率83％)。

合成70-56-2A

室温下在5h内伴随着偶尔手动振荡，向在磷酸盐缓冲液20mMpH～7.6中的7.24mg(95nmol)的IDS(1)中加入570nmol(6当量)的BCN-N-羟基琥珀酰亚胺酯(2)。由通过用HiPrep26/10脱盐柱以5mL/min用磷酸盐缓冲液20mM pH7.6凝胶过滤从过量的试剂纯化活化的IDS70-56-2B(3b)。所收集的级分通过Amicon超离心过滤器(10kDa，3000rpm)浓缩至3.5mL(6.5mg，收率90％)。回收修饰的IDS3b，70-66-2A，用于与叠氮基An2(N-端)(4)的下一结合步骤中。

合成(70-56-2B)

向修饰的IDS 3b，70-56-2A(6.5mg，85.2nmole)中加入12当量的叠氮基An2(N-端)(4)。手动振荡溶液并包裹于铝箔上并在室温下保持过夜。通过Q琼脂糖1mL柱使用20mM TRIS pH7作为结合缓冲剂而使用20mM TRIS和500mM NaCl pH7.0作为洗脱缓冲剂纯化结合物(5)随后。分离结合物并用IDS缓冲液(1X：137mM NaCl，17mM NaH₂PO₄，3mM Na₂HPO₄，pH～6)通过用Amicon超滤过滤器(10kDa限值，3000rpm)5×15mL冲洗进行交换并浓缩至3mL以获得70-56-1B(6mg，83％)。

70-66-1B的合成方案

以下所示合成方案示出MFCO接头与IDS的连接以及经由血管肽素-2的末端赖氨酸的氨基基团的An₂-[Lys²⁰-N₃](叠氮基An2)与MFCO接头的连接。

步骤：1-修饰IDS赖氨酸

6，MFCO：单氟环辛炔

合成70-66-1A

向在磷酸盐缓冲液20mM pH～7.6中的(10.6mg，139nmol)的IDS(1)中加入1112nmol(8当量)的MFCO-N-羟基琥珀酰亚胺酯(6)(获自如下制备的原液：7.6mg溶解于1000μL无水DMSO中)，并且置于室温下持续5h，其中偶尔手动振荡。通过用HiPrep26/10脱盐柱以5mL/min用磷酸盐缓冲液20mM pH7.6凝胶过滤从过量的试剂纯化修饰的IDS70-66-1A(7)。所收集的级分通过Amicon超离心过滤器(10kDa限值，3000rpm)浓缩至3mL(9.4mg，收率89％)。修饰的IDS70-56-1A(3a)用于与叠氮基An2(C-端)(8)的下一结合步骤。

步骤：2-修饰的IDS与叠氮基An2(C端)(An₂-[Lys²⁰-N₃])的结合

合成(70-66-1B)

向修饰的IDS衍生物(7)(6.1mg，80nmol)中加入16当量的叠氮基An2(C-端)(8)。手动振荡溶液并包裹于铝箔上并在室温下保持过夜。通过Q琼脂糖1mL柱使用20mM TRIS pH7作为结合缓冲剂而同时使用20mM TRIS和500mM NaCl pH7.0作为洗脱缓冲剂纯化结合物(5)。结合物经过分离并用IDS缓冲液(1X：137mM NaCl，17mM NaH₂PO₄，3mMNa₂HPO₄，pH～6)通过用Amicon超滤过滤器(10K mW，3000rpm)5×15mL冲洗进行交换并浓缩至2.5mL以获得70-66-1B(6.1mg，100％)。

68-32-2的合成方案

BCN:双环[6.1.0]壬炔

步骤：1-修饰IDS赖氨酸

合成68-31-2

向在磷酸盐缓冲液20mM pH～7.6中的(14.5mg，190nmol)的IDS(1)中加入1520nmol(8当量)的BCN-N-羟基琥珀酰亚胺酯(2)(获自如下制备的原液：5.82mg溶解于1000μL的无水DMSO中)，放置在室温下持续5h，其中偶尔手动振荡。通过用HiPrep26/10脱盐柱以5mL/min用磷酸盐缓冲液20mM pH7凝胶过滤从过量试剂纯化修饰的IDS(10)。所收集的级分通过Amicon超离心过滤器(限值10kDa，3000rpm)浓缩至4mL(14.5mg，收率100％)。回收修饰的IDS用于与叠氮基An2(C-端)的下一结合步骤。

步骤：2-修饰的IDS与An2(C端)(An₂-[Lys²⁰-N₃])的结合

合成68-32-2

向修饰的IDS衍生物(10)(11mg，144.2nmol)中加入16当量的叠氮基An2(C-端)。溶液手动振荡并包裹于铝箔上并在室温下保持过夜。随后通过Q琼脂糖1mL柱使用20mM TRIS pH7作为结合缓冲剂而同时使用20mM TRIS和500mM NaCl pH7.0作为洗脱缓冲剂纯化结合物(11)。分离结合物并用IDS缓冲液(1X：137mM NaCl，17mM NaH₂PO₄，3mM Na₂HPO₄，pH～6)通过用Amicon超滤过滤器(10K mW，3000rpm)5×15mL冲洗进行交换并浓缩至2.5mL以获得68-32-2(10mg，91％)。

IDS酶特异性活性的方案(由B-JR032-010-04进行修饰)

1)通过microBCA测定标准物质JR-032和结合物中蛋白的浓度。

2)制备测试溶液：

将JR-032和结合物1/200稀释于含Triton-X100的稀释缓冲液中。

3)通过将1mL4-MU原液稀释于11.5mL的含Triton-X100的缓冲液中(终浓度为800μmol/L)制备标准溶液。

4)通过将500μL的800μmol/L稀释于500μL含TritonX100的缓冲液中制成400μmol/L标准溶液来制备系列稀释液。重复该过程以获得以下稀释液：800、400、200、100、50、25、12.5和6.25μmol/L。

5)分别将10μL的每一空白溶液(含Triton-X100稀释缓冲液)分配于微孔板的2个孔(n＝2)中，将标准溶液(6.25μmol/L至800μmol/L)分配于2个孔(n＝2)中而将各样品溶液分配于4个孔中(n＝4)。

6)向每一孔中加入100μL的底物溶液(4-MUS)并轻轻混匀。

7)盖上微孔板并置于调节至37℃的孵育箱中。

8)在60分钟后向每一孔中精确加入190μL的终止溶液并混合以终止反应。

9)在荧光板读数器上设置微孔板，并且在355nm的激发波长和460nm的检测波长下测定荧光强度。

10)如果在这些测试中需要进行对比，则用参比物质进行相同的测定。

计算方法：

11)从样品溶液中产生4-MU的浓度

使用以下公式确定从样品溶液中产生4-MU的浓度，Cu浓度(μmol/L)。

Cs = \frac{w}{176.17} \times \frac{10^{6}}{50 \times 100}

w：4-MU的用量(mg)(176.17：4-MU的分子量)

Cs：在标准溶液中的浓度(μmol/L)

Cu = Cs (\frac{Au}{As})

Au：样品溶液的荧光强度

As：标准溶液的荧光强度

12)样品溶液的特异性活性：使用以下公式确定样品溶液的特异性活性，B(mU/mg)。

B = \frac{\frac{Cu}{60} \times C \times \frac{50}{0.1}}{P}

C：脱盐测试物质的稀释系数

B：特异性活性(mU/mg)

P：脱盐测试物质中蛋白的浓度(mg/mL)

用于糖胺聚糖(GAG)积累检测分析的方案

材料：

·II型MPS Hunter成纤维细胞(Coriell institute，GM00298)

·健康人成纤维细胞(Coriell institute，GM00298)

·DMEM，胎牛血清(FBS)

·低硫酸盐哈姆氏(Ham's)F-12培养基(Invitrogen，目录#11765-054)

·对0.15M氯化钠透析的FBS，10000Da MWCO(Sigma，目录#F0392)

·³⁵S-硫酸钠(Perkin-Elmer，目录#NEX041H002MC)

方法：

1.MPS II(GM00298)或健康人成纤维细胞(GM05659)在6孔培养皿中以25万个细胞/孔在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中。

-生长4天。

2.-弃去培养基，用温暖并且无菌的PBS洗涤细胞。

-加入1mL/孔含10％透析FBS和1010μCi³⁵S-硫酸钠的低硫酸盐F-12培养基。

-加入重组IDS蛋白。在37℃、5％CO₂中孵育48小时

3.-弃去培养基，用冷PBS(1mL，5次洗涤)洗涤细胞。

-将细胞溶解于0.4mL/孔的1N NaOH中。

-60℃下加热60分钟以溶解蛋白。

-移除并等份试样进行μBCA蛋白检测分析。

4.用液体闪烁计数器计数放射性。

5.μBCA蛋白检测分析。

6.数据表示为³⁵S CPM/μg蛋白。

原位脑灌注的方案

根据在Dagenais et al.,2000中所描述的方案在实验室内建立原位小鼠脑灌注方法。简而言之，在用氯胺酮/赛拉嗪(140/8mg/kg)腹膜内(i.p.)注射的麻醉小鼠上进行手术。暴露出右颈总动脉，并且在分叉水平(levelof the bifurcation)处进行连接。随后用填充有生理盐水/肝素(25U/mL)溶液并安装在26号针头上的聚乙烯管(0.30mm内径×0.70mm外径)吻侧(rostrally)插管颈总动脉。在实验前数天中使用Pierce的碘-珠来125I放射标记所研究的分子。在凝胶过滤柱上去除游离碘，之后进行大量(extensive)透析(截止值10kDa)。使用Bradford检测分析法并用JR-032作为标准进行剂量给予放射标记的蛋白。

在手术前，制备由KREBS-碳酸氢盐缓冲液-9mm葡萄糖构成的灌注缓冲液并且在37℃，pH7.4下孵育，用95％O₂:5％CO₂稳定。将含有加入到灌注缓冲液的放射性标记化合物的注射器放置于灌注泵(Harvard pumpPHD2000；Harvard apparatus)上并连接到导管上。在即将灌注之前立即切断心脏并以2.5mL/min的流量脑灌注2min。IDS和An2-IDS结合物的所有灌注都以5nM的浓度进行。灌注后，简单地用无示踪剂溶液灌注脑30秒以洗出血管。在灌注结束后，通过断头术将小鼠立即处死并将右脑半球分离到冰上并且在Ringer/Hepes缓冲液中匀浆后进行毛细血管清除。

毛细血管清除

毛细血管清除方法允许通过消除示踪剂与毛细血管的结合来测定灌注的分子进入脑软组织中的积累。毛细血管清除方案改编自由Triguero etal.,1990所描述的方法。将葡聚糖(35％)的溶液加入到脑匀浆中以获得17.5％的最终浓度。在手动彻底混合后，将混合物离心(在10000rpm下10分钟)，所得到的沉淀主要含有毛细血管而上清液对应于脑软组织。

示踪剂信号的测定

取出匀浆物、上清液、沉淀和灌流液的等分试样测定其放射标记的分子的含量。[¹²⁵I]-样品在Wizard1470自动γ计数器(Perkin-Elmer Inc,Woodbridge,ON)上计数。所有的等分试样用TCA沉淀以获得放射标记的沉淀蛋白级分。以对不同脑区室的体积分布(mL/100g/2min)表示结果。

实施例9

化合物的筛选和表征

筛选

重组艾杜糖-2-硫酸酯酶(IDS)(JCR-032)经由赖氨酸连接结合到An2。具有标记的潜在附着位点的IDS氨基酸序列呈现于上述实施例8中。这些结合物代表不同AN2:与IDS的接头的不同比率。在这种结合策略中测试的接头是点击化学接头，包括MFCO(单氟环辛炔)、BCN(双环壬炔)、SATA(S-乙酰基硫代乙酸酯)、DBCO(二苄基环辛炔)和马来酰亚胺。在所有情况下，An2:加入到反应中的接头材料之比为2:1，其中An2过量IDS4-、6-或8-倍。从反应产物中通过Q-琼脂糖柱色谱除去An2，并且MALDI-TOF分析用于确定引入到每一IDS上的An2平均数。SP-HPLC分析用于确定未结合的IDS是否存在于产物中。SEC分析用于检测结合之后蛋白的质量。使用这种方法，发现第一系列的9种结合物具有聚集体形成的证据，而结合反应被优化和重复以消除这一问题。另外，使用其他接头产生5种新结合物。选择用于酶活性、GAG降低和原位脑灌注测试的赖氨酸结合物列于下表3中。注意，引入的An2数量是平均值，因为多个物种可以存在于结合反应产物中。通过MALDI TOF的JR-032质量为76,320Da(11次测定)。在图8中呈现这些结合物的蛋白免疫印迹。

表3：选择用于进一步分析的An2-IDS赖氨酸结合物。

¹＝两个值的平均。

²＝三个值的平均。

评价这些结合物以确定：

1.An2引入(范围为1～5个An2/IDS)

2.没有由SEC聚集的证据

3.通过SP-分析不超过两个主峰

半胱氨酸策略还应用于尝试限制(和标准化)引入到每个IDS(one perIDS)的AN2数量，然而，使用包括上达至20当量的An2的条件范围获得与An2的IDS结合物不超过50％。此外，结合反应产物显示出50％的酶活性损失，提示结合的物质是非活性的。因此，赖氨酸方法受到青睐。概要分析(Profiling)

用JR-032作为对照，赖氨酸结合物经历体外酶检测分析。实验细节如上。所有的结合物保留酶活性(参见图9)。在某些情况下，所测得的活性超过了天然IDS的活性。这可能是由于蛋白定量检测分析中的干扰所致，从而导致较低的蛋白计算浓度和较高的活性/蛋白。为了确证具有功能端点的酶促活性，对其在降低MPSII患者成纤维细胞中GAG水平的效力分析结合物。在4ng/mL(50pM)的浓度下，GAG水平降低到非疾病成纤维细胞中观察到的水平，类似于用JR-032观察到的水平(参见图10和11)。

为了确定结合是否赋予关于脑渗透的优势，结合物被放射性碘化并且在小鼠原位脑灌注检测分析法中进行检测。在这种实验中，经由颈动脉递送酶(5nM)，从而使选择性传递到大脑的量最大化。在两分钟的暴露之后，用生理盐水灌注脑以除去循环酶。一旦去除大脑，使用毛细血管清除以分离毛细血管相关的和软组织的级分。计数放射活性以定量测试品分布的体积。在所有实验中JR-032用作对照，而其结果汇集起来以产生单一的对照值。由于关于酶活性和GAG降低没有观察到结合物之间的决定性(决策驱动性，decision-driving)差异，因此这种体内BBB渗透评估的结果是用于化合物选择的主要驱动力。图12和13示出JR-032和15种结合物分别在单时间点(2min)时的脑分布。JR-032相对于菊粉的脑分布比较提供于图23中。

图14A、图14B、图14C和图14D分别示出70-56-1B、70-56-2B、68-32-2和70-66-1B的MALDI-TOF分析。图15A和图15B示出68-32-2、70-56-1B、70-56-2B和70-66-1B的SEC和SP分析。这些结合物的结构和合成方案的总结如上提供。引入到68-32-2、70-66-1B、70-56-2B和70-56-1B的An2平均数分别为2.3、4.9、2.4和1.2。在这些分析中没有检测到未结合的JR-032。两个峰(代表An2-IDS的两个群体)对于每种结合物都是可见的，一种在4-5min时洗脱，而第二种在10min时洗脱。对于不同An2-IDS结合物的类似间隔峰的纯化已经得到证明。

用Alexa488染料标记结合产物并用于U87细胞中的运输研究(trafficking study)以将其定位与lysotracker染料相对比。显微镜实验的示意图提供于图17中并且标记有Alexa488染料的68-32-2、70-56-1B、70-56-2B和70-66-1B的结合物的共聚焦显微镜实验结果(示出它们相对于lysotracker染料的定位)如图18-图22所示。结合物与lysotracker染料的共定位作用表明该结合物在酸性溶酶体中的存在。图16示出定量数据表明，孵育1个小时或16小时(图16)之后观察到结合的和天然的JR-032两者的进入。对于两种酶，摄取EC₅₀为约10nM，而对于70-56-2B证实具有较高的最大吸收。以上提供了这个实验的方案。在图24和25中示出支持摄取An2-IDS进入U-87细胞和大脑的进一步的数据。

实施例10

合成具有可酶切接头的IDS-血管肽素-2结合物

通过如下所示两种方案，An2经由含二硫键的可酶切接头结合至IDS。在第一方案中，IDS的赖氨酸侧链与SPDP接头反应以产生修饰的IDS。将修饰的IDS与An₂-Cys-SH反应以经由An₂-Cys的C-端半胱氨酸的S部分连接An2以产生IDS-An₂结合物。

在第二方案中，将IDS与SATA接头反应接着与羟胺反应以产生修饰的IDS。使An₂的N-端赖氨酸与SPDP反应以产生修饰的An₂。使修饰的IDS与修饰的An₂反应以经由An₂的N-端氨基基团将An₂连接至IDS以产生IDS-An₂结合物。

方案1

方案2

实施例11

IDUA融合蛋白构建体和在哺乳动物细胞内的表达

全长人IDUA cDNA克隆(NM_000203.2)获自OriGene。通过PCR产生血管肽素-2(An2)的编码序列和TEV可切割组氨酸标签(histidine-tag)的编码序列。有和没有His-标签的cDNA构建体亚克隆于合适的表达载体如pcDNA3.1(Qiagen GigaPrep)中，在CMV启动子的控制下(图27)。所有研究的候选物(有/没有可切割组氨酸标签)的IDUA和EPiC-IDUA质粒都使用聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂和Freestyle CHO表达培养基(无血清培养基，Invitrogen)转染到市售CHO-S表达系统(FreeStyle^TM Max表达系统，Invitrogen)中。在这些系统中，细胞悬浮生长，并且在转染表达质粒之后，融合蛋白分泌于培养基中。培养和转染参数对于最大表达在小规模实验(30mL)中进行优化。通过使用发荧光底物4-甲基伞形基-α-L-艾杜糖苷和使用抗-IDUA、抗-血管肽素-2或抗-六聚组氨酸抗体的蛋白免疫印迹测定IDUA酶活性监控重组融合蛋白在细胞培养基中的表达。如图28中所示，设计了八种IDUA和EPiC-IDUA融合蛋白，并表达于CHO-S细胞中，如通过蛋白免疫印迹(图29)在细胞培养基中检测到的表达水平所示。除了下面的构建体，观察到良好的表达水平：IDUA-An2-His、An2-IDUA-An2和An2-IDUA-An2。

实施例12

IDUA融合构建体的表达和纯化

下面的步骤描述了用于转染、表达和纯化IDUA融合蛋白的优化条件。

如下进行转染。转染前一天，将分离的(split)CHO-S细胞(5×10⁸细胞/360mL培养基)用Gibco FreeStyle CHO表达培养基+8mM L-谷氨酰胺作为培养基分离于3-L无菌烧瓶中。第二天，进行细胞计数，并且总细胞数应为约1×10⁹个细胞。制备两个T-75无菌培养基烧瓶并分别标记“DNA”和“PEI”。将70mL的培养基加入到每根管中。2mL的1mg/mL PEI(2mg)加入到标记“PEI”的管中，并将1mg的DNA加入到标记“DNA”的管中(DNA:PEI比率＝1:2)。两个烧瓶都轻轻混合，并允许在室温下静置15分钟。将PEI溶液随后加入到DNA溶液(不能逆向实施)。然后将该管轻轻混合，并允许在室温下静置恰好15分钟。将DNA/PEI复合物(140mL)加入到3-L烧瓶中的360mL的悬浮液培养物中，并在设定为37℃、8％CO₂的培养箱中的定轨摇床平台(130rpm)上培养该烧瓶。4小时培养后，加入500mL的培养基并将培养温度降低到31℃。将烧瓶在31℃、130rpm、8％CO₂下培养5天。然后通过离心(2000rpm，5min)收获细胞，滤出经调整的培养基(0.22μm)并保存于4℃下。

用包括由TEV蛋白酶(在烟草蚀纹病毒中发现的高位点特异性半胱氨酸蛋白酶)消化可切割位点的两步色谱法进行含组氨酸标签的融合蛋白纯化。纯化顺序如下。通过离心或使用澄清过滤器(5-0.6μm)，接着是用0.2μm截止过滤器的无菌过滤来进行细胞培养物上清液的澄清。使用镍亲和色谱使用Ni-NTA(Nickel²⁺-氨三乙酸(nitrilotriacetic acid))Superflow树脂(QIAGEN)如下进行聚组氨酸标记的蛋白的捕获。首先，用50mMNa₂HPO₄pH8.0、200mM氯化钠、10％甘油、25mM咪唑平衡柱。随后加载经澄清的上清液，接着是使用平衡缓冲液冲洗直至UV₂₈₀吸光度稳定。用50mM Na₂HPO₄pH8.0、200mM氯化钠、10％甘油、25mM咪唑从柱上洗脱蛋白。最后，使用0.5M NaOH清洗30分钟接触时间，接着是使用平衡缓冲液再生清洁柱准备就绪(in place)。

如下进行组氨酸标签去除。用TEV蛋白酶缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0、0.5mmol EDTA和1mM DTT)透析含有高含量蛋白质的级分。随后用TEV蛋白酶在+4℃下培养融合蛋白16h。最后，用Ni-NTA平衡缓冲液(50mM的Na₂HPO₄pH8.0、200mM氯化钠、10％甘油、25mM咪唑)透析融合蛋白。

通过镍亲和色谱使用Ni-NTA Superflow树脂(QIAGEN)按照流穿(Flowthrough)模式如下进行聚组氨酸标标签、TEV-His-标记的并且未切割的蛋白质的捕获。首先，用50mM Na₂HPO₄ pH8.0、200mM NaCl、10％甘油、25mM咪唑平衡柱。消化后的蛋白质加载到柱上，然后使用平衡缓冲液洗涤直到UV₂₈₀吸光度稳定。融合蛋白收集于穿流中。用50mMNa₂HPO₄ pH8.0、200mM NaCl、10％甘油、250mM咪唑洗脱不需要的物质。最后，通过含有融合蛋白的穿流级分与PBS缓冲液的缓冲液交换进行配制。

第一Ni-NTA色谱步骤之后，洗脱的His-标签蛋白显示出良好的纯度(图30A)。此外，可以通过TEV酶切去除His标签提供纯化的IDUA或An2-IDUA(图30B)。

也纯化了无组氨酸的蛋白质。使用组氨酸标签的目的是为了便于在几个步骤中纯化蛋白，但它也需要通过用TEV蛋白酶消化去除标签。所有的标签，无论是大或小，都具有干扰蛋白生物活性的潜势并影响其行为。此外，为了将TEV酶切位点引入构建体中，需要另外的氨基酸，其在酶切之后留在C-端。这可能也影响到蛋白行为。最后，使用市售TEV蛋白酶即使是小规模也会是很麻烦(onerous)的，并可能贡献最高达～10％的生产成本。为了克服这个问题，设计了无His标签的构建体(图27)，并开发出纯化方法以达到高纯度。图31中描述的方案用于纯化无His标签的IDUA。在最终步骤期间使用SP-琼脂糖凝胶(强阳离子交换树脂)的IDUA纯化曲线如图32A所示。如通过洗脱期间这些级分的SDS-PAGE/考马斯(插图32A)所示出的，能够获得高纯度。此外，图32B和32C表明，能够以足以进行体内脑灌和体外实验的量由多个批次可重复地纯化IDUA和An2-IDUA。

实施例13

EPiC-IDUA活性测试

在体外通过使用未纯化的蛋白(仍然在培养基中)用4-甲基伞形基-α-L-艾杜糖苷(4-MUBI)作为底物通过荧光分光法测定EPiC-IDUA酶活性(图33)。底物由IDUA水解成4-甲基伞形酮(4-MU)，其使用法兰德(Farrand)过滤荧光计使用450nm发射波长和365nm激发波长进行荧光分光检测。采用已知用量的4-MU的标准曲线用于确定检测分析法中的4-MU浓度，这与IDUA活性成正比。

预期酶活性会保留在融合蛋白中并且荧光计量单位应该与加入到底物中的EPiC-IDUA融合蛋白的质量成正比。

检查内部(in-house)表达于细胞培养基的细胞培养上清液中的3种不同蛋白的酶活性并与市售的IDUA-10xHis比较。内部产生酶的酶活性表现出与IDUA-10xHis类似的水平(图34)，表明与An2融合后保留了酶活性。

为了确定所表达的蛋白是否能够降低细胞中GAG累积，使用了取自MPS-I患者的成纤维细胞。MPS-I或健康人成纤维细胞(Coriell Institute)以25万个细胞/孔在含10％胎牛血清(FBS)的达尔伯克氏(Dulbecco’s)改良的伊格尔(Eagle)培养基(DMEM)中接种于6孔培养皿上，并在37℃5％CO₂下生长。4天后，细胞用磷酸盐牛血清(PBS)洗涤一次并用低硫酸盐F-12培养基(Invitrogen，目录#11765-054)洗涤一次。在重组IDUA和EPiC-IDUA蛋白的存在或不存在下，将1mL的含10％透析FBS(Sigma，目录#F0392)和10μCi³⁵S-硫酸钠的低硫酸盐F-12培养基加入到细胞中。成纤维细胞在37℃在5％CO₂下培养。48小时后，除去培养基并用PBS洗涤细胞5次。然后细胞裂解于0.4mL/孔的1N NaOH中并在60℃下加热60min以溶解蛋白质。移出等分试样用于μBCA蛋白分析。用液体闪烁计数器进行放射计数。数据表示为³⁵S CPM/μg蛋白。

在第一个实验中，只测试了IDUA(有或无His标签)和一种EPiC-IDUA衍生物。第一融合蛋白的结果表明，酶的酶活性在与血管肽素-2融合后保留下来。随着与健康成纤维细胞中测定的可比的MPS-I成纤维细胞中GAG的降低(图35)，观察到剂量响应。用An2-IDUA也观察到类似的结果，如图47所示。

实施例14

体外评价MPS-I成纤维细胞内胞内摄取

为了(a)确定重组IDUA蛋白是否被细胞摄取和(b)比较天然和融合IDUA之间的摄取水平，MPS-I成纤维细胞以100,000个细胞/孔在含10％胎牛血清(FBS)的达尔伯克氏改良的伊格尔培养基(DMEM)中接种于12孔培养皿上，并在37℃、5％CO₂下生长。4天后，更换培养基，并如下体外评价IDUA和An2-IDUA融合蛋白的摄取。浓度增加的纯化IDUA和An2-IDUA充分加入到各MPS-I纤维细胞。细胞在37℃下进一步生长最长24小时。细胞在24小时暴露时间间隔内的不同时间点用PBS彻底洗涤以移除培养基。细胞最后裂解于0.4M甲酸钠，pH3.5、0.2％Triton X-100中。对每一条件都进行酶活性测定。结果如图36所示。

基于这些结果，An2-IDUA对于作为天然酶IDUA的成纤维细胞具有类似的亲和常数，表明An2肽不影响IDUA的摄取和胞吞作用。据发现最高达24小时摄取都是时间依赖性的和线性的。此外，摄取机制看起来是具有高亲和力的可饱和机制(saturable mechanism)。

实施例15

在M6P、An2和RAP的存在下，由MPS-成纤维细胞的体外摄取

如上一节中所描述的，在过量的M6P、RAP或An2的存在下用2.4nM的IDUA或An2-IDUA培养MPS-I成纤维细胞24h。如图37中所示，An2-IDUA和天然IDUA摄取进入MPS-I成纤维细胞中主要是M6P受体依赖性的。

在LRP1抑制剂RAP存在下用增加量的M6P、An2，以及用增加量的天然和EPIC酶进一步研究了酶的M6P受体依赖性摄取。结果如图38A-图38C所示。这些实验证实，在MPS-I成纤维细胞中，通过与游离M6P共培养而以剂量依赖性的方式阻止(prevent)An2-IDUA和天然IDUA的摄取。此外，即使在高酶浓度下，An2和LRP1抑制剂RAP对通过MPSI成纤维细胞的An2-IDUA和天然IDUA摄取也没有影响。

实施例16

由LRP1高表达U87胶质母细胞瘤细胞的体外摄取

在已知具有高表达的LRP1受体的U87胶质母细胞瘤的细胞中评价了IDUA和An2-IDUA的摄取。进行这个实验以进一步理解IDUA和An2-IDUA通过细胞的摄取机制，并且特别是确定EPIC化合物是否能够通过LRP1受体在摄取中起到作用。在AN2肽(1mM)、M6P(5mM)和RAP(1μm)肽(LRP1抑制剂)的存在下，U87细胞生长并暴露于IDUA&An2-IDUA持续2小时和24小时。图39A中所示的结果表明：1)U-87中An2-IDUA和天然IDUA的摄取水平类似于MPSI成纤维细胞；和2)在U-87中，An2-IDUA和天然IDUA的吸收主要都是M6PR依赖性的。

接着LRP1RAW264.7细胞表达细胞用IDUA或An2-IDUA进行培养。用抗IDUA的抗体进行免疫沉淀，然后进行LRP1的蛋白免疫印迹。LRP1被拉下(pull down)(图39B)，表明An2-IDUA与LRP1相互作用。

实施例17

由U87胶质母细胞瘤细胞体外摄取去糖基化的IDUA/An2-IDUA

在使用PNG酶F去糖基化之后，在U87胶质母细胞瘤细胞中评价了IDUA和An2-IDUA的摄取。实施这个实验以验证IDUA和An2-IDUA由细胞的M6P受体依赖性摄取机制。通过将IDUA/An2-IDUA暴露于N-糖苷酶F，亦称为PNG酶F(在最内层GlcNAc和高甘露糖的天冬酰胺残基之间的切割的酰胺酶)进行糖基化(包括甘露糖-6-磷酸残基(M6P))的去除(图40A)。An2-IDUA在去糖基化之前或被变性或处于天然状态(图40B)。

在验证U87细胞中的酶活性之前，通过SDS-Page/考马斯分析酶(图40C)。用48nM的酶浓度将U87细胞暴露于糖基化的/去糖基化的IDUA/An2-IDUA持续24h。这些结果(图40D)表明糖基化作用在IDUA/An2-IDUA的摄取机制中起到关键作用，证实了以上的所有结果，这些结果证明由表达高比例的LRP1受体的MPS1成纤维细胞和U87细胞的摄取主要是甘露糖6磷酸(M6P)受体依赖性。U87细胞中测得的低水平的酶活性可能与PGN酶F处理之后酶的去糖基化不完全有关，如以上考马斯凝胶中糖基化/非糖基化形式之间的条带拖尾(smear)所图示说明的。

实施例18

An2-IDUA在溶酶体中的体外摄取和定位

为了确定An2-IDUA融合蛋白是否到达溶酶体，使用不同的实验方法进行共定位研究。为了使这种体外方法符合要求，用荧光染料AlexaFluor488(绿色探针)标记An2。在MPS-I患者的成纤维细胞中摄取荧光蛋白后，用lysotracker(红色探针)染色溶酶体。共聚焦显微镜显示出lysotracker和Alexa488-An2共定位良好(图41)。

在U87胶质母细胞瘤中通过比较非标记IDUA/An2-IDUA与绿色荧光Alexa Fluor488标记物质的酶活性而进行评价IDUA和AN2-IDUA的摄取。进行这个实验是为了验证标记对摄取的不利影响。在细胞暴露于0、100ng和1000ng标记的/未标记的酶后，评价U87细胞中的酶活性。这些结果表明，用Alexa Fluor488染料标记IDUA和An2-IDUA不影响酶活性和MPSI成纤维细胞中的摄取(图42)。

实施例19

体外运输(trafficking)研究(胞转作用)-BBB转运

为了测定和表征IDUA和EPiC-IDUA衍生物的转运，使用Pierce(Rockford，IL，USA)的碘珠试剂盒和D-盐葡聚糖脱盐柱、用标准步骤进行放射标记纯化的蛋白。通过使用跨孔板(trans-well plate)测定穿过(crossing)模型的放射性标记分子的量进行定量。此外，通过SDS-PAGE或通过LS/MS分析融合蛋白的完整性，容许确定分子量而确保胞转作用期间没有发生降解。

在小鼠内通过体内脑摄取模型(也称为原位脑灌注)完成对这些融合蛋白的脑摄取的测试。这种技术允许去除血液成分，并将脑暴直接露于放射标记的分子。简要地说，使用适于发明人实验室用于进行小鼠脑的药物摄取研究的原位脑灌注方法测定[¹²⁵I]-蛋白从小鼠脑毛细血管的腔侧的摄取(Cisternino et al.,Pharm.Res.18:183-90,2001；Dagenais et al.,J.Cereb.Blood Flow Metab.20:381-6,2000)。以1.15mL/min的流量在37℃用放射标记的化合物灌注脑2-10min。在灌注放射标记分子后，进一步用Krebs缓冲液灌注脑60秒以洗去过量的[¹²⁵I]-蛋白。随后处死小鼠以终止灌注并将右半球隔离于冰上，按照先前的描述(Banks et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.302:1062-9,2002)在葡聚糖-70垫上用冰冷溶液立即进行毛细血管清除。收集匀浆物、上清液、沉淀和灌注液的等分式样以测定它们的含量并评价分配的表观体积(Vd)。能够由此测定BBB初始转运速率常数(K_in)和放射活性化合物的区域性分布，这允许评价化合物穿过BBB而无血清蛋白相互作用的能力。EPiC-IDUA在脑软组织中摄取的靶向速率(K_in)应至少为10^-4mL/g/s。作为比较，所报告的葡萄糖K_in为9.5×10^-3(Mandulaet al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.317:667-75,2006)，醇的K_in为1.8×10^-4(Gratton et al.,J.Pharm.Pharmacol.49:1211-6,1997)而吗啡的K_in为1.6×10^-4(Seelbach et al.,J.Neurochem.102:1677-90,2007)。

对于IDUA和EPiC-IDUA，采用以下参数进行BBB传送评价：50nM的放射标记物质浓度、在37℃、1.15mL/min持续2分钟的灌注时间和30s的冲洗时间。结果(图43)表明，单独IDUA可以结合或可以截留于大脑的毛细血管内并且少量会到达脑软组织。一种解释可能是IDUA具有大约9的等电点的事实。因此，蛋白在中性pH下带正电。在An2-IDUA的情况下，发明人观察到整个脑中分布体积增加。有趣的是，与天然酶相比，在脑软组织中发现了更高的含量(约7倍)。总之，这些结果表明，加入An2会提高IDUA穿过BBB的转运。

实施例20

使用BBB模型(CELLIAL technologies)的体外BBB评价

还使用由与新生大鼠星形胶质细胞共培养的牛脑毛细血管内皮细胞构成的体外BBB模型(图44)评价EPiC-衍生物穿过BBB的转运。为了测定和表征IDUA和An2-IDUA衍生物的转运，用标准方法放射性标记纯化的蛋白。通过使用跨孔孔板测定穿过模型的放射标记的分子的量进行定量。此外，通过SDS-PAGE或通过LS/MS进行分析融合蛋白的完整性，容许确定分子量，确保胞转作用期间没有发生降解。使用体外BBB方案对比An2-IDUA和IDUA酶的转运。如图45所示，结果表明与仅有酶的情况相比，EPiC-IDUA穿过BBB的转运提高了～2倍。

也在如RAP和An2的LRP1受体竞争物的存在下评价了EPiC-IDUA和IDUA通过BBB内皮细胞的转运。提供于图46中的结果表明，IDUA穿过BBB内皮细胞的通道是An2-转运依赖性的。

实施例21

在MPS-I基因敲除鼠中An2-IDUA的酶活性

在由静脉注射An2-IDUA后1小时的MPS-I基因敲除小鼠制备的小鼠脑匀浆中测定IDUA活性。图48表明单次注射An2-IDUA在MPS-I基因敲除小鼠脑匀浆中恢复了35％IDUA酶活性。

实施例22

IDUA与肽的化学结合

肽靶向部分，如血管肽素-2，可以通过化学接头连接至IDUA。在一个实施例中，这使用SATA接头实现，这在上面已经描述。可以使用以下方案实现化学结合。

在这个方案中，四当量的SATA在pH8磷酸盐缓冲液中与酶反应，从而将接头结合至酶。酶-接头随后用羟胺脱保护以获得IDUA的游离巯基中间体。然后将该化合物结合至6当量的MHA-血管肽素-2，以生成酶-肽结合物。

在另一个实施例中，酶与特劳特(Traut’s)试剂(2-亚氨基四氢噻吩，2-iminothialone)反应，然后将其结合至6当量的MHA-血管肽素-2，如下所示。

其他实施方式

在本说明书中提到的所有专利、专利申请和出版物，包括2011年12月1日提交的美国临时专利申请号US 61/565,764和2012年6月15日提交的美国临时专利申请号US 61/660,564，以如同每一独立的专利、专利申请或出版物具体地和单独地指出的那样通过引用结合于此的相同程度通过引用结合于此。

Claims

1.一种化合物，包含(a)少于150个氨基酸的肽或肽靶向部分和(b)溶酶体酶、其活性片段或其类似物，其中，所述靶向部分和所述酶、片段或类似物通过接头连接。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述靶向部分包含与SEQ IDNO:1-SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:107-SEQ ID NO:117中任一项至少70％同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的化合物，其中，所述靶向部分包含血管肽素-2的序列(SEQ ID NO:97)。

4.根据权利要求3所述的化合物，其中，所述靶向部分可选地包含在SEQ ID NO:97中记载的氨基酸的一种或多种D-异构体。

5.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述靶向部分包含式Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys(式Ia)，

其中：

X3是Asn或Gln；

X4是Asn或Gln；和

X5是Phe、Tyr或Trp；

其中，所述靶向部分可选地包含在式Ia中记载的氨基酸的一种或多种D-异构体。

6.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述靶向部分包含式Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2(式Ib)，

其中：

X3是Asn或Gln；

X4是Asn或Gln；

X5是Phe、Tyr或Trp；

Z1为不存在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly或Cys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly；和

Z2为不存在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr或Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys；并且

其中，所述靶向部分可选地包含在式Ib、Z1或Z2中记载的氨基酸的一种或多种D-异构体。

7.根据权利要求6所述的化合物，其中，所述靶向部分包含在式Ib、Z1或Z2中记载的氨基酸的至少3种D-异构体。

8.根据权利要求7所述的化合物，其中，所述靶向部分具有式Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr。

9.根据权利要求7所述的化合物，其中，所述靶向部分具有式Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr。

10.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述靶向部分包含式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6(式IIa)，

其中，

X1是Lys或D-Lys；

X2是Arg或D-Arg；

X5是Phe或D-Phe；和

X6是Lys或D-Lys；并且

其中，X1、X2、X5或X6中的至少一个是D-氨基酸。

11.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述靶向部分包含式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7(式IIb)，

其中：

X1是Lys或D-Lys；

X2是Arg或D-Arg；

X5是Phe或D-Phe；

X6是Lys或D-Lys；和

X7是Tyr或D-Tyr；并且

其中，X1、X2、X5、X6或X7中的至少一个是D-氨基酸。

12.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述靶向部分包含式Z1-X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7-Z2(式IIc)，

其中：

X1是Lys或D-Lys；

X2是Arg或D-Arg；

X5是Phe或D-Phe；

X6是Lys或D-Lys；

X7是Tyr或D-Tyr；

Z2为不存在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr或Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys；

其中，X1、X2、X5、X6或X7中的至少一个是D-氨基酸；并且

其中，所述靶向部分可选地包含在Z1或Z2中记载的氨基酸的一种或多种D-异构体。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的化合物，其中，所述接头是共价键或一个或多个氨基酸。

14.根据权利要求13所述的化合物，其中，所述共价键是肽键。

15.根据权利要求14所述的化合物，其中，所述化合物是融合蛋白。

16.根据权利要求1-12中任一项所述的化合物，其中，所述接头是化学结合物。

17.根据权利要求16所述的化合物，其中，所述化合物具有结构：

其中，所述“Lys-NH”基团表示存在于所述酶中的赖氨酸或者N-端或C-端赖氨酸。

18.根据权利要求17所述的化合物，其中，所述化合物具有结构：

19.根据权利要求16所述的化合物，其中，所述化合物具有结构：

或

其中，每个-NH-基团分别表示存在于所述靶向部分和所述酶上的伯氨基。

20.根据权利要求19所述的化合物，其中，所述化合物具有结构：

或

21.根据权利要求16所述的化合物，其中，所述接头通过糖基化位点进行结合。

22.根据权利要求21所述的化合物，其中，所述接头是肼或肼衍生物。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的化合物，其中，所述化合物进一步包含第二靶向部分，所述第二靶向部分通过第二接头连接至所述化合物。

24.一种包含一种或多种纳米粒子的组合物，其中，所述纳米粒子结合至权利要求1-23所述的化合物中的任一种。

25.一种包含权利要求1-23所述的化合物中的任一种的脂质体制剂的组合物。

26.一种包含权利要求1-23中任一项所述的化合物和药用载体的药物组合物。

27.一种治疗或预防性治疗患有溶酶体贮积症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予权利要求1-26中任一项所述的化合物。

28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述受试者具有神经性症状。

29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述受试者在五岁龄之下开始治疗。

30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述受试者在三岁龄之下开始治疗。

31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述受试者是婴儿。

32.根据权利要求27所述的方法，其中，所述给予包括胃肠外给予。