EA010055B1 - ВЫДЕЛЕННАЯ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД Sp35, ПОЛИПЕПТИД Sp35 И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ПОЛИПЕПТИДА - Google Patents

ВЫДЕЛЕННАЯ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД Sp35, ПОЛИПЕПТИД Sp35 И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ПОЛИПЕПТИДА Download PDF

Info

Publication number
EA010055B1
EA010055B1 EA200501480A EA200501480A EA010055B1 EA 010055 B1 EA010055 B1 EA 010055B1 EA 200501480 A EA200501480 A EA 200501480A EA 200501480 A EA200501480 A EA 200501480A EA 010055 B1 EA010055 B1 EA 010055B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
vector
domain
neurons
sequence
Prior art date
Application number
EA200501480A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200501480A1 (ru
Inventor
Ша Май
Джон Маккой
Р. Блэйк Пепински
Дэниел Х. С. Ли
Алексей А. Луговской
Original Assignee
Байоджен Айдек Ма Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байоджен Айдек Ма Инк. filed Critical Байоджен Айдек Ма Инк.
Publication of EA200501480A1 publication Critical patent/EA200501480A1/ru
Publication of EA010055B1 publication Critical patent/EA010055B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к полипептидам Sp35 и их белкам слияния, антителам против Sp35 и их антигенсвязывающим фрагментам, а также к кодирующим указанные белки нуклеиновым кислотам. Изобретение также относится к композициям, содержащим такие антитела против Sp35, их антигенсвязывающие фрагменты, полипептиды Sp35 и их белки слияния, и к способам получения и применения указанных белков.

Description

Изобретение относится к неврологии, нейробиологии и молекулярной биологии. Более конкретно, изобретение относится к молекулам и способам для лечения неврологических заболеваний, нарушений и повреждений, таких как повреждение спинного мозга.
Уровень техники изобретения
Аксоны и дендриты тянутся от нейронов. Дистальный конец вытянутого аксона или нейтрита включает в себя специализированную область, известную как конус роста. Конусы роста чувствительны к локальным условиям среды и направляют рост аксонов в сторону клетки-мишени нейрона. Конусы роста отвечают на окружающие сигналы, например, на адгезию поверхности, факторы роста, неиротрансмиттеры и электрические поля. Конусы роста в основном продвигаются со скоростью от 1 до 2 мм/сутки. Конус роста исследует область впереди себя и по обе стороны посредством вытяжений, классифицируемых как ламеллоподии и филоподии. Когда вытяжение контактирует с неблагоприятной поверхностью, оно отстраняется. Когда вытяжение контактирует с благоприятной поверхностью роста, оно продолжает удлиняться и направляет конус роста в данном направлении. Когда конус роста достигает подходящей клетки-мишени, создается синаптическое соединение.
Функция нервной клетки подлежит влиянию контакта между нейронами и другими клетками в их непосредственном окружении (Рибкйаикег, с1 а1., 1988, Р11уыо1. Реу. 68:819). Данные клетки включают в себя специализированные глиальные клетки, олигодендроциты в центральной нервной системе (ЦНС), и шванновские клетки в периферической нервной системе (ПНС), которые заключают нейрональный аксон в миелиновую оболочку (Бетке, 1992, ίη Ап 1п1гобис1юп ίο Мо1еси1аг №игоЬю1оду, Ζ. На11, Еб., р. 281, 8шаиег).
Нейронам ЦНС присуща способность регенерировать после повреждения, но она подавляется ингибиторными белками, присутствующими в миелине (Βτίίίίδ е1 а1., 2001, Ыеигоп 30:11-14; 1опе§ е1 а1, 2002, 1. №иго8С1. 22:2792-2803; Оптре е1 а1, 2002, 1. №иго8С1.:22:3144-3160).
Охарактеризованы некоторые ингибиторные белки миелина, находящиеся в олигодендроглиоцитах. Известные примеры ингибиторных белков миелина включают в себя ЫодоА (Сйеп е1 а1., Ма1иге, 2000, 403, 434-439; Огапбрге е1 а1., Ма1иге 2000, 403, 439-444), ассоциированный с миелином гликопротеин (МАО) (МсКеггасйег е1 а1., 1994, Ыеигоп 13:805-811; Микйорабйуау е1 а1., 1994, Ыеигоп 13:757-767) и олигодендроглиоцитарный гликопротеин (ОМ-др) (М1ко1 е1 а1., 1988, 1. Се11. Вю1.106:1273-1279). Как было показано отдельно, каждый из этих белков является лигандом нейронального Ν§Κ1 (^апд е1 а1., №11иге 2002, 417, 941-944; Огапбрге е1 а1., Уинге 2000, 403, 439-444; Сйеп е1 а1., №1иге, 2000, 403, 434-439; Потешсош е1 а1., №игоп 2002, опубликовано он-лайн 28 июня 2002 г.).
Рецептор №до 1 (Ν§Ρ1) представляет собой ΟΡΙ-заякоренный мембранный белок, который содержит 8 богатых лейцином повторов (Еоигшег е1 а1., 2001, №1иге 409:341-346). После взаимодействия с ингибиторными белками (например, №доА. МАО и ОМ-др), комплекс ^Р1 передает сигналы, которые приводят к коллапсу конуса роста и ингибированию разрастания нейрита.
Имеется неудовлетворенная потребность в молекулах и способах для ингибирования опосредованного НдР1 коллапса конуса роста и полученного в результате ингибирования разрастания нейрита.
Сущность изобретения
Авторами изобретения сделаны различные открытия, касающиеся полипептида, обозначенного «8р35» (обозначение авторов изобретения). Альтернативные обозначения 8р35 включают в себя «ΌΙΝΟΟ» и «ΌΙΝΟΟ-1». Открытия авторов изобретения включают в себя следующее. 8р35 связывается с ^Р1. 8р35 связывается сам с собой в гомотипическом взаимодействии. Белок слияния 8р35-Ес индуцирует или способствует разрастанию отростков гранулярных нейронов. Белок слияния 8р35-Ес способствует выживанию нейронов в модели повреждения путем гемисекции руброспинального тракта и в модели рассечения глазного нерва. Инфицированные 8р35-ретровирусом первичные клетки коры при доставке их крысам с повреждением спинного мозга обеспечивают повышенное выживание нейронов, усиление окрашивания тубулина βΙΙΙ аксонов и повышенное содержание миелина.
Изобретение, частично основанное на данных открытиях, относится к выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, в котором:
(a) полипептид включает в себя:
(ί) БРР-домен 8р35, (и) основную область 8р35, располагающуюся с С-конца относительно БРР-домена, и (ш) иммуноглобулиновый Од) домен 8р35, располагающийся с С-конца относительно основной области;
(b) полипептид не имеет трансмембранного домена.
БРР-Домен 8р35 может содержать С-концевой БРР (БРРСТ), Ν-концевой БРР (БРРЭТ) или оба варианта. В некоторых вариантах осуществления изобретения кодируемый полипептид 8р35 не имеет цитоплазматического домена. В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид 8р35 включает в себя аминокислотные остатки 34-532 8Εβ ΙΌ ΝΟ: 2 и не имеет аминокислотных остатков 533-614.
Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, где полипептид
- 1 010055 включает в себя 1д-домен 8р35 и не имеет ЬКК-домена 8р35, основной области 8р35, трансмембранного домена и цитоплазматического домена.
Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, где полипептид включает в себя ЬКК-домен 8р35 и не имеет 1д-домена 8р35, основной области 8р35, трансмембранного домена и цитоплазматического домена.
Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, не имеющий функционального цитоплазматического домена, но включающий в себя все другие домены 8р35. Например, кодируемый полипептид может включать в себя аминокислоты 1-576 8ЕЦ Ш N0: 2 (перед процессингом сигнальной последовательности).
В некоторых вариантах осуществления изобретения кодируемый полипептид представляет собой полипептид слияния, содержащий не относящийся к 8р35 фрагмент. Не относящийся к 8р35 фрагмент может представлять собой, например, фрагмент 1д, фрагмент сывороточного альбумина, фрагмент направленного действия, репортерный фрагмент, или фрагмент, облегчающий очистку. Предпочтительный не относящийся к 8р35 фрагмент представляет собой фрагмент 1д, например, фрагмент Ес.
Нуклеотидная последовательность может быть функционально связана с последовательностью контроля экспрессии, например, с экспрессирующим вектором. Изобретение также относится к клетке хозяина, трансформированной вектором, который экспрессирует полипептид 8р35 по изобретению.
Изобретение также относится к полипептиду 8р35, кодируемому любой из описанных выше нуклеиновых кислот.
Изобретение также относится к полипептиду 8р35, конъюгированному с полимером, например, с полиалкиленгликолем, с сахарным полимером и с полипептидом. Предпочтительным полимером является полиалкиленгликоль, например полиэтиленгликоль (ПЭГ). Полипептид может конъюгироваться с 1, 2, 3 или 4 полимерами. Предпочтительно, общая молекулярная масса конъюгированных полимеров составляет от 20000 до 40000 Да на полипептид 8р35.
Изобретение также включает в себя способ ингибирования трансдукции сигнала, осуществляемой посредством Ν§Κ1. Способ охватывает контакт Ν§Κ1 с эффективным количеством полипептида 8р35. Предпочтительные полипептиды для применения по данному способу включают в себя следующее:
(a) полипептид 8р35, где (а) полипептид включает в себя (1) ЬКК-домен 8р35, (и) основную область 8р35, располагающуюся с С-конца относительно ЬКК-домена, и (ш) иммуноглобулиновый (1д) домен 8р35, располагающийся с С-конца относительно основной области; и (Ь) полипептид не имеет трансмембранного домена; и (b) полипептид 8р35, который включает в себя 1д-домен 8р35 и не содержит ЬКК-домена 8р35, основной области 8р35, трансмембранного домена и цитоплазматического домена.
Изобретение также относится к способу снижения ингибирования аксонального роста нейрона центральной нервной системы (ЦНС). Способ охватывает контакт данного нейрона с эффективным количеством полипептида, такого как полипептид 8р35, антитело против 8р35 или антигенсвязывающий фрагмент антитела против 8р35.
Изобретение также включает в себя способ ингибирования коллапса конуса роста нейрона ЦНС. Способ охватывает контакт данного нейрона с эффективным количеством полипептида, такого как полипептид 8р35, антитело против 8р35 или антигенсвязывающий фрагмент антитела против 8р35.
Изобретение также относится к способу лечения заболевания, нарушения или повреждения ЦНС у млекопитающего. Способ охватывает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида, такого как полипептид 8р35, антитело против 8р35 или антигенсвязывающий фрагмент антитела против 8р35. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание, нарушение или повреждение ЦНС представляет собой повреждение спинного мозга. Полипептид 8р35 может вводиться местно. В некоторых осуществлениях способа полипептид 8р35 впервые вводится в течение 48 ч с момента повреждения спинного мозга. Для местного введения терапевтически эффективное количество полипептида предпочтительно составляет от 10 мкг/кг до 10 мг/кг. Для системного введения терапевтически эффективное количество полипептида предпочтительно составляет от 1 до 20 мг/кг.
Изобретение также относится к способу генной терапии ех νίνο для лечения заболевания, нарушения или повреждения ЦНС у млекопитающего. Способ охватывает (а) предоставление культивируемой клетки хозяина, экспрессирующей рекомбинантный полипептид 8р35; и (Ь) введение указанной клетки хозяина млекопитающему в участок заболевания, нарушения или повреждения ЦНС, например, повреждения спинного мозга. Культивируемая клетка хозяина может происходить из подлежащего лечению млекопитающего. В данном способе генной терапии ех νίνο рекомбинантный полипептид 8р35 может представлять собой полноразмерный полипептид 8р35.
Изобретение также относится к способу стимуляции миелинизации в участке заболевания, нарушения или повреждения ЦНС. Способ охватывает контакт участка заболевания, нарушения или повреждения ЦНС с эффективным количеством полипептида 8р35, например полипептида, содержащего ЬККдомен 8р35 и не имеющего 1д-домена 8р35, основной области 8р35, трансмембранного домена и цитоплазматического домена.
Изобретение также относится к способу генной терапии ίη νίνο для лечения заболевания, наруше
- 2 010055 ния или повреждения ЦНС посредством генной терапии ίη νίνο. Способ включает в себя стадии введения млекопитающему в участок заболевания, нарушения или повреждения, или вблизи от него вирусного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид 8р35, так что полипептид 8р35 экспрессируется с нуклеотидной последовательностью млекопитающего в количестве, достаточном для снижения ингибирования аксонального вытяжения нейронов, в участке повреждения или вблизи от него. Вирусный вектор, например, может представлять собой аденовирусный вектор, лентивирусный вектор, вектор на основе вируса Эпштейна-Барр, паповавирусный вектор, вектор на основе вируса коровьей оспы и вектор на основе вируса простого герпеса. Заболевание, нарушение или повреждение, например, может представлять собой повреждение спинного мозга или повреждение глазного нерва. Вирусный вектор может вводиться, например, путем местного введения, внутриглазного введения, парентерального введения, интратекального введения, субдурального введения и подкожного введения.
Изобретение также относится к способу стимуляции выживания нейрона при риске его гибели. Способ включает в себя контакт нейрона с эффективным количеством полипептида 8р35. Полипептид 8р35 может представлять собой растворимую форму 8р35, например, белок слияния 8р35-Ес. Нейрон также может находиться ίη νίίτο или ίη νίνο, например, в организме млекопитающего с нейродегенеративным заболеванием, нарушением или повреждением, например, с рассеянным склерозом, АЬ8, болезнью Гентингтона, болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, диабетической невропатией, инсультом, травматическими повреждениями головного мозга и повреждением спинного мозга. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид 8р35 вводят непрямым образом: путем (а) предоставления культивируемой клетки хозяина, экспрессирующей рекомбинантный полипептид 8р35; и путем (Ь) введения данной клетки хозяина млекопитающему в участке нейронов. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид вводят непрямым образом посредством генной терапии ίη νίνο. В таком варианте осуществления способ включает в себя введение в участок нейрона или вблизи него вирусного вектора, включающего в себя нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид 8р35, так что полипептид 8р35 экспрессируется с нуклеотидной последовательности в организме млекопитающего в количестве, достаточном для стимуляции выживания нейрона.
Используемый здесь термин «полноразмерный человеческий полипептид 8р35» означает полипептид, аминокислотная последовательность которого представляет собой аминокислоты 34-614 8 ЕС ГО N0: 2.
Используемый здесь термин «гетерологичная группа» означает аминокислотную последовательность, не присутствующую в полноразмерном полипептиде 8р35.
Используемый здесь термин «рецептор ηο§ο 1» означает полипептид, последовательность которого доступна под инвентарным номером СснЬанк ААС53612.
Используемый здесь термин «полипептидный антагонист 8р35» означает полипептид 8р35, который блокирует, ингибирует или препятствует биологической активности встречающегося в природе 8р35.
Используемый здесь термин «основная область 8р35» означает следующий аминокислотный мотив:
К К А К I К ϋ К К (8ЕО ГО N0: 4)
К К V К V К Е К В (8ЕО ГО N0: 5)
В В Ь В Ь В Ό В К (8ЕО ГО N0: 6)
В В 6 В 6 В Ό В К (8ЕО ГО N0: 7) В В I В А В Ό В К (8ЕО ГО N0: 8)
Верхняя строка аминокислот (жирным шрифтом; 8Еф ГО N0: 4) является предпочтительной последовательностью основной области 8р35, с приведенными ниже вариантами, в которых показаны необязательные замены (8Еф ГО N0: 5, 6, 7 и 8).
Используемый здесь термин «белок слияния 8р35» означает белок слияния, который включает в себя фрагмент 8р35, слитый с гетерологичным фрагментом.
Используемый здесь термин «1д-домен 8р35» означает аминокислоты 433-493 8Еф ГО N0: 2, при обеспечении того, что данная последовательность может содержать до пяти индивидуальных аминокислотных вставок, делеций или консервативных аминокислотных замен. Следующие замены (нумерация по 8ЕС ГО N0: 2) введены специально: V на М в положении 6; 8 на С в положении 294; V на А в положении 348; и В на Н в положении 419.
Используемый здесь термин «ЬВВ-домен 8р35» означает домен, который содержит от 10 до 14 последовательностей - богатых лейцином повторов, включая ЬВВКГ и ЬВВСТ, перечисленные в табл. 1, при обеспечении того, что до пяти аминокислотных вставок, делеций или консервативных аминокислотных замен могут происходить в суммарных 10-14 богатых лейцином повторах.
Используемый здесь термин «фрагмент 8р35» означает биологически активный фрагмент полноразмерного полипептида 8р35.
Используемый здесь термин «полипептид 8р35» означает фрагмент 8р35 или белок слияния, который содержит фрагмент 8р35.
Кроме указанных иначе случаев, все используемые здесь технические или научные термины имеют
- 3 010055 значение, обычно подразумеваемое под этими терминами специалистом в области, к которой относится изобретение. В случае конфликта для контроля будет служить настоящая спецификация, включая определения. Все указанные здесь публикации, патенты и другие ссылки включены в качестве ссылки.
Хотя способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным здесь, могут использоваться в воплощении или тестировании изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны ниже. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не подразумеваются как ограничивающие. Другие характеристики и преимущества изобретения будут понятны из подробного описания и из формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой нуклеотидную последовательность кДНК полноразмерного человеческого 8р35 (8ЕО ГО N0:1).
Фиг. 2 представляет собой аминокислотную последовательность полноразмерного человеческого полипептида 8р35 (8Е0 ГО N0: 2).
Фиг. 3 представляет собой схематичную иллюстрацию доменной структуры 8р35 и карты делеций для идентификации последовательности(ей) 8р35, которые связываются с Ν§Κ1.
Фиг. 4 представляет собой гистограмму, на которой суммированы данные по связыванию 8р35 с 0087-клетками, трансфицированными экспрессирующим вектором, кодирующим крысиный р75, или векторным контролем. Через 48 ч с клетками инкубировали АР-8р35 или АР. Связанный АР выявляли с использованием хромогенного реагента детекции АР.
Фиг. 5 представляет собой гистограмму, суммирующую данные по связыванию АР-0тдр и АРΝοβθ-66 с клетками С087, трансфицированными экспрессирующим вектором, кодирующим Ν§Κ1; Ν§Κ1 и р75; Ν§Κ.1, р75, и 8р35, или векторным контролем. Через 48 ч с клетками инкубировали АР-0тдр, АРΝοβθ-66 или АР. Связанный АР выявляли с использованием хромогенного реагента для выявления АР.
Фиг. 6 представляет собой гистограмму, на которой суммированы данные по стимуляции ингибиторной активности миелиновых ингибиторов в отношении разрастания нейрита ίη νίίτο. Длину нейрита измеряли на гранулярных нейронах мозжечка 7-суточной новорожденной крысы, экспрессирующих ΌΝ8р35, полноразмерный 8р35 или контроль, культивируемых на иммобилизованном субстрате с 0тдр, миелином и Νοβθ-66. Трансфицированные Э^8р35 клетки проявляли сниженную реакцию на ингибиторные субстраты. Длину нейрита вычисляли от 1000 нейронов на группу лечения в двух независимых экспериментах (р<0,01).
Фиг. 7 представляет собой гистограмму, на которой суммированы данные по обращению ингибиторной активности миелиновых ингибиторов за счет 8р35-Ес. Длина нейрита на гранулярных нейронах мозжечка 7-суточной новорожденной крысы (1000 нейронов), культивируемых на иммобилизованном субстрате с 0тдр, миелином или Νοβθ-66. в присутствии или отсутствие 8р35-Ес. 8р35-Ес снижал ингибирование разрастания нейритов, вызванное 0тдр, Νοβθ-66 и МАО. Длину нейрита вычисляли от 1000 нейронов на группу лечения в двух независимых экспериментах (р<0,01).
Фиг. 8 представляет собой график, в котором суммированы данные эксперимента, показывающего, что введенный интратекально 8р35-Ес улучшает функциональное восстановление после дорзальной гемисекции у крысы. Локомоторный коэффициент ВВВ, измеряемый как функция времени после дорзальной гемисекции у контрольных (1дО) или обработанных 8р35-Ес крыс (8 животных на группу). Лечение инициировали во время повреждения спинного мозга.
Фиг. 9 представляет собой график, на котором показаны коэффициенты ВВВ индивидуальных животных на четвертую неделю в эксперименте, суммированном на фиг. 8.
Подробное описание изобретения
Встречающийся в природе человеческий 8р35 представляет собой гликозилированный специфичный в отношении ЦНС белок, содержащий 614 аминокислот (фиг. 2; 8Е0 ГО Ν0: 2). Человеческий полноразмерный полипептид 8р35 дикого типа содержит ЬКВ-домен, состоящий из 14 богатых лейцином повторов (включая Ν- и С-концевые части), 1д-домен, трансмембранную область и цитоплазматический домен (фиг. 3). Цитоплазматический домен содержит канонический участок фосфорилирования тирозина. Кроме того, встречающийся в природе белок 8р35 содержит сигнальную последовательность, короткую основную область между ЬКВСТ и 1д-доменом и трансмембранную область между 1д-доменом и цитоплазматическим доменом (фиг. 3). Человеческий ген 8р35 содержит стартовые кодоны альтернативной трансляции, так что шесть дополнительных аминокислот, т.е. М0У8КР (8Е0 ГО Ν0: 9), могут присутствовать или отсутствовать на Ν-конце сигнальной последовательности 8р35. В табл. 1 перечислены 8р35-домены и другие области по номерам аминокислотных остатков, на основе последовательности, показанной на фиг. 2 (8Е0 ГО Ν0: 2).
- 4 010055
Таблица 1
Распределение в тканях и экспрессия 8р35 во время развития исследованы у людей и крыс. Биологию 8р35 исследовали в экспериментальной модели на животных (крысах). Экспрессия крысиного 8р35 локализована в нейронах ЦНС и олигодендроцитах головного мозга, что определено путем нозернблоттинга и иммуногистохимического окрашивания. Уровень экспрессии мРНК 8р35 регулируется в процессе развития, с коротким пиком после рождения, т.е. примерно на первые сутки после рождения. В модели повреждения путем рассечения спинного мозга 8р35 регулируется позитивно в участке повреждения, как это определено посредством ОТ-ПЦР.
Авторами изобретения открыто, что полноразмерный 8р35 дикого типа связывается с Ν§Κ1. Растворимые производные 8р35 функционируют в качестве полипептидов-антагонистов 8р35 путем связывания с Ν§Κ1 и блокирования, ингибирования или противодействия его функции, препятствуя таким образом опосредованному Ν§Κ1 ингибированию аксонального вытяжения, которое обычно имеет место в нейронах ЦНС. Это предпочтительно в ситуациях, где аксональное вытяжение или разрастание нейрита необходимо в головном мозге или спинном мозге. Повреждение спинного мозга, включающее в себя частичное или полное раздробление или разрыв, является примером ситуации, когда необходимо это вытяжение аксонов, но в норме ингибируется путем действия пути Νομο. Примеры заболеваний или нарушений, в которых будет предпочтительным аксональное вытяжение и/или разрастание нейритов в головном мозге, включают в себя инсульт, рассеянный склероз и другие нейродегенеративные заболевания или нарушения.
В способах согласно настоящему изобретению полипептид 8р35 или блокирующее 8р35 антитело (или антигенсвязывающий фрагмент антитела) может вводиться непосредственно в виде ранее образованного полипептида или посредством вектора на основе нуклеиновой кислоты, для противодействия функции Ν§Κ1 и обеспечения предпочтительного разрастания аксонов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения растворимый полипептид-антагонист 8р35 вводят способом лечения, который охватывает:
(1) трансформацию или трансфекцию имплантируемой клетки хозяина нуклеиновой кислотой, например, вектором, который экспрессирует полипептид 8р35; и (2) имплантацию трансформированной клетки хозяина млекопитающему, в участок заболевания, нарушения или повреждения.
Например, трансформированная клетка хозяина может имплантироваться в участок повреждения
- 5 010055 спинного мозга. В некоторых вариантах осуществления изобретения имплантируемую клетку хозяина изымают из млекопитающего, временно культивируют, трансформируют или трансфицируют выделенной нуклеиновой кислотой, кодирующую растворимый полипептид 8р35, и имплантируют обратно тому же млекопитающему, из которого ее изъяли. Клетка может быть изъята из того же участка, куда она имплантируется, но это необязательно. Такие осуществления, иногда называемые генной терапией ех νίνο, могут предоставлять длительную подачу полипептида 8р35, локализованную в участке действия, в течение ограниченного периода времени.
Изобретение относится к олигопептидам, которые могут использоваться в качестве модуляторов взаимодействия 8р35 с Ν§Β1 и гомотипических взаимодействий 8р35. Олигопептиды включают в себя следующий аминокислотный мотив:
Ь 8 Р К К Η (8ЕО ГО N0: 10)
I Т Р К В В (8ЕО ГО N0: 11)
А С Р Η Н К (8ЕО ГО N0: 12)
V 8 Р В К Н (8ЕО ГО N0: 13)
Верхняя строка аминокислот (жирным; 8Е0 ГО N0: 10) представляет собой предпочтительную последовательность, с вариантами, содержащими необязательные замены, показанные ниже (8Е0 ГО N0: 11, 12 и 13).
Различные типовые полипептиды 8р35, антитела против 8р35 и фрагменты антител, и способы и материалы для получения данных молекул для воплощения настоящего изобретения описаны ниже.
Белки слияния и конъюгированные полипептиды.
Некоторые осуществления изобретения включают в себя применение полипептида 8р35, например, полипептида-антагониста 8р35, в котором фрагмент 8р35 слит с гетерологичным полипептидным фрагментом с образованием белка слияния 8р35. Белки слияния 8р35 могут использоваться для достижения различных целей, например, для повышения времени полужизни в сыворотке, улучшения биологической доступности, направленного на конкретный орган или клеточный тип действия ίη νίνο, улучшения эффективности рекомбинантной экспрессии, повышенной секреции клеткой хозяина, упрощения очистки и более высокой авидности. В зависимости от достигаемой(ых) цели(ей) гетерологичный фрагмент может быть инертным или биологически активным. Также можно выбирать, будет ли он стабильно слит с фрагментом 8р35, или же сможет отщепляться ίη νίίτο или ίη νίνο. Гетерологичные фрагменты для достижения различных целей известны в данной области.
В качестве альтернативы экспрессии белка слияния 8р35 выбранный гетерологичный фрагмент может быть предварительно образован и химически конъюгирован с фрагментом 8р35. В большинстве случаев выбранный гетерологичный фрагмент действует одинаково, слит он или конъюгирован с фрагментом 8р35. Поэтому в следующем обсуждении гетерологичных аминокислотных последовательностей, если не отмечено иначе, следует понимать, что гетерологичная последовательность может объединяться с фрагментом 8р35 в виде белка слияния или химического конъюгата.
Фармакологически активные полипептиды, такие как 8р35, часто характеризуются быстрым клиренсом ίη νίνο, что приводит к необходимости больших доз для достижения терапевтически эффективных концентраций в организме. Кроме того, полипептиды, меньшие чем примерно 60 кДа, потенциально проходят гломерулярную фильтрацию, что иногда ведет к нефротоксичности. Слияние или конъюгация относительно малых полипептидов, таких как фрагменты 8р35, может быть использовано для снижения или предотвращения риска такой нефротоксичности. Известны различные гетерологичные аминокислотные последовательности, т.е. полипептидные фрагменты или «носители» для увеличения стабильности терапевтических полипептидов ίη νίνο, т.е. их периода полужизни в сыворотке.
Вследствие его длительного периода полужизни, широкого распространения ίη νίνο, отсутствия ферментативной или иммунологической функции, по существу, полноразмерный человеческий сывороточный альбумин (Н8А) или фрагмент НА8 является предпочтительным гетерологичным фрагментом. Путем применения способов и материалов, таких как описанные у Υеη е1 а1., 1992, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А, 89:1904-1908 и 8уеб е1 а1., 1997, Β1οο6 89:3243-3252, Н8А может быть использован для образования белка слияния 8р35 или конъюгата, который проявляет фармакологическую активность за счет фрагмента 8р35, при этом характеризуясь значительно повышенной, например, в 10-100 раз, стабильностью ίη νίνο. Предпочтительно, С-конец Н8А слит с ^концом фрагмента 8р35. Поскольку Н8А представляет собой в природе секретируемый белок, сигнальная последовательность Н8А может использоваться для достижения секреции белка слияния 8р35 в клеточную культуральную среду, когда белок слияния продуцируется в эукариотической экспрессирующей системе, например, относящейся к млекопитающему.
В некоторых вариантах осуществления изобретения используется полипептид 8р35, в котором фрагмент 8р35 слит с Гс-областью, т.е. С-концевой частью константной области тяжелой цепи 1д. Потенциальные преимущества слияния 8р35-Гс охватывают растворимость, стабильность ίη νίνο и мультивалентность, например, димеризацию. Используемая Гс-область может представлять собой Гс-область 1дА, Ι§Ό или 1дС Гс (шарнир-СН2-СН3). Альтернативно, она может представлять собой Гс-область 1дЕ или 1дМ (шарнир-СН2-СН3-СН4). Гс-область 1дС является предпочтительной, например, Гс-область 1дС1 или Гс-область 1дС4. Материалы и способы для конструирования и экспрессии ДНК, кодирующей
- 6 010055 белки слияния с Ес, известны в данной области и могут применяться для получения белков слияния Зр35 без излишнего экспериментирования. Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к белку слияния Зр35, такому как описанный у Сароп с1 а1., патенты США № 5428130 и 5565335.
Сигнальная последовательность представляет собой полинуклеотид, который кодирует аминокислотную последовательность, инициирующую транспорт белка через мембрану эндоплазматического ретикулума. Сигнальные последовательности, которые могут быть использованы для конструирования иммунофузина, включают в себя сигнальные последовательности легкой цепи антитела, например, антитела 14.18 (С1Ше8 е1.а1., 1989, 1. 1ттипо1. Ме1й., 125:191-202), сигнальные последовательности тяжелой цепи антитела, например, сигнальная последовательность тяжелой цепи антитела МОРС141 (Закапо е1 а1., 1980, №Ц.1ге 286:5774). Альтернативно, могут быть использованы другие сигнальные последовательности. См., например, ^а1§оп, 1984, Ыискк Лс1Й5 Кекеагсй 12:5145. Сигнальный пептид обычно отщепляется в просвете эндоплазматического ретикулума пептидазами сигнального пептида. Это приводит к секреции белка-иммунофузина, содержащего Ес-область и фрагмент Зр35.
В некоторых вариантах осуществления последовательность ДНК кодирует участок протеолитического расщепления между кассетой секреции и фрагментом Зр35. Участок расщепления предоставляет протеолитическое расщепление кодируемого белка слияния, таким образом, Ес-домен отделяется от белка-мишени. Подходящие участки протеолитического расщепления включают в себя аминокислотные последовательности, распознаваемые протеолитическими ферментами, такими как трипсин, плазмин, тромбин, фактор Ха или энтерокиназа К.
Кассета секреции может входить в состав реплицируемого экспрессирующего вектора. Подходящие векторы включают в себя линейные нуклеиновые кислоты, плазмиды, фагемиды, космиды и тому подобное. Типовым экспрессирующим вектором является рйС, в котором транскрипция ДНК иммунофузина помещена под контроль энхансера и промотора человеческого цитомегаловируса. См., например, Ьо е1 а1., 1991, ВюсЫт. Вюрйук. Ас1а 1088:712; и Ьо е1 а1., 1998, Рго1еш Епдшеегшд 11:495-500. Подходящая клетка хозяина может трансформироваться или трансфицироваться ДНК, кодирующей полипептид Зр35, и применяется для экспрессии и секреции полипептида Зр35. Предпочтительные клетки хозяина включают в себя иммортализованные гибридомные клетки, миеломные клетки, клетки 293, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки Не1а и клетки СОЗ.
Полностью интактные Ес-области дикого типа проявляют эффекторные функции, которые обычно не являются необходимыми и не требуются для белка слияния с Ес согласно изобретению. Поэтому некоторые участки связывания предпочтительно удаляются из Ес-области во время конструирования кассеты секреции. Например, поскольку совместная экспрессия с легкой цепью не является необходимой, участок связывания белка, связывающего тяжелую цепь, В1р (НепйеШю! е1 а1., 1987, 1ттипо1. Тойау 8:111114), удаляют из СН2-домена Ес-области 1дЕ, так что данный участок не мешает эффективной секреции иммунофузина. Сходным образом, остатки цистеина, присутствующие в Ес-областях, которые отвечают за связывание легкой цепи иммуноглобулина, следует удалять или замещать другой аминокислотой, так что данные цистеиновые остатки не мешают надлежащей пространственной упаковке Ес-области при его продукции в виде иммунофузина. Следует подвергать делеции последовательности трансмембранных доменов, такие как присутствующие в 1дМ.
Предпочтительной является Ес-область 1дС1. Альтернативно, Ес-область других подклассов иммуноглобулина гамма (гамма-2, гамма-3 и гамма-4) можно использовать в кассете секреции. Ес-область 1дО1 иммуноглобулина гамма-1, предпочтительно используемая в кассете секреции, включает в себя шарнирную область (по меньшей мере ее часть), СН2-область и СН3-область. В некоторых вариантах осуществления Ес-область иммуноглобулина гамма-1 представляет собой Ес с делецией СН2, которая включает в себя часть шарнирной области и СН3-область, но не СН2-область. Ес с делецией СН2 описана Сй11С5 е1 а1., 1990, Нит. АпйЬой. НуЬпйотак, 1: 47. В некоторых вариантах осуществления применяют Ес-области 1дА, Ι§Ό, 1дЕ или 1дМ.
Белки слияния Зр35-Ес могут конструироваться в нескольких различных конфигурациях. В одной конфигурации С-конец фрагмента Зр35 сливают непосредственно с Ν-концом фрагмента Ес. В слегка отличной конфигурации короткий полипептид, например 2-10 аминокислот, вводят в состав белка слияния между Ν-концом фрагмента Зр35 и С-концом фрагмента Ес. Такой линкер предоставляет конформационную гибкость, что в некоторых случаях может увеличивать биологическую активность. Если в фрагменте Ес остается достаточная часть шарнирной области, белок слияния Зр35-Ес будет димеризоваться, образуя таким образом дивалентную молекулу. Гомогенная популяция мономерных белков слияния Ес дает моноспецифичные, бивалентные димеры. Смесь двух мономерных белков слияния Ес, где каждый имеет свою специфичность, дает биспецифичные, бивалентные димеры.
Любое число перекрестных линкеров, содержащих соответствующие группы, способные взаимодействовать с аминогруппой, и группы, способные взаимодействовать с группой тиола, может быть использовано для связывания Зр35 с сывороточным альбумином. Примеры подходящих линкеров включают в себя группы, способные взаимодействовать с аминогруппой, перекрестные линкеры, которые встраивают способный взаимодействовать с группой тиола малеимид, например, ЗМСС, АМАЗ, ВМРЗ, МВЗ, ЕМСЗ, ЗМРВ, ЗМРН, КМИЗ, и ОМВЗ. Другие подходящие линкеры встраивают способную взаи
- 7 010055 модействовать с тиолом галогенацетатную группу, например, 8ВАР, 8ΙΆ, 8ΙΆΒ. Линкеры, которые предоставляют защищенный или незащищенный тиол для взаимодействия с сульфгидрильными группами с продукцией восстанавливаемой связи, включают в себя 8РЭР. 8МРТ, 8ЛТЛ и 8АТР. Такие реагенты коммерчески доступны (например, Р1егсе СйеткаН).
Конъюгация не должна задействовать Ν-конец полипептида 8р35 или тиоловый фрагмент сывороточного альбумина. Например, белки слияния 8р35-альбумин могут быть получены с использованием способов генной инженерии, где фрагмент 8р35 слит с геном сывороточного альбумина на его Ν-конце, С-конце или на обоих концах.
Полипептиды 8р35 могут быть слиты с гетерологичными пептидами для облегчения очистки фрагмента 8р35. Например, гистидиновая метка может быть слита с полипептидом 8р35 для ослабления очистки с использованием коммерчески доступных хроматографических сред.
В некоторых осуществлениях изобретения конструкция слияния 8р35 используется для усиления продукции фрагмента 8р35 в бактериях. В таких конструкциях бактериальный белок, обычно экспрессируемый и/или секретируемый на высоком уровне, используется в качестве Ν-концевого партнера слияния полипептида 8р35. См., например, 8тйй е1 а1., 1988 Сепе 67:31; Норр е1 а1., 1988, Вю1есйпо1оду 6:1204; Ьа УаШе е1. а1., 1993, Вю1есйпо1оду 11:187.
В некоторых вариантах осуществления изобретения конструкция слияния включает в себя фрагмент 8р35 и второй связывающий человеческий Ν§Β1 фрагмент, например, фрагмент гликопротеина миелина олигодендроглиоцитов (ОМдр), фрагмент ассоциированного с миелином гликопротеина (МАС) или фрагмент Нодо66. Преимущества таких конструкций включают в себя усиленное сродство связывания Ν§ΚΤ.
Полноразмерная аминокислотная последовательность ОМдр известна в данной области (инвентарный номер СепЬапк Р23515). Конкретные примеры белков слияния 8р35-ОМдр включают следующее:
8р35 (а.к. 34-532) + Рс 1дС1 + ОМдр (аминокислотные остатки 25-400); и
8р35 (а. к. 34-532) + Н8А + ОМдр (аминокислотные остатки 25-400).
Полноразмерная аминокислотная последовательность МАС известна в данной области (инвентарный номер СепЬапк А61084). Конкретные примеры белков слияния 8р35-МАС включают следующее:
8р35 (а.к. 34-532) + Рс 1дС1 + МАС (аминокислотные остатки 12-500); и
8р35 (а.к. 34-532) + Н8А + МАС (аминокислотные остатки 12-500).
Полноразмерная аминокислотная последовательность №до известна в данной области (инвентарный номер СепЬапк №доА АУ102279). Конкретные примеры белков слияния 8р35-№до включают в себя следующее:
8р35 (а.к. 34-532) + Рс 1дС1 + №до66 (аминокислотные остатки №доА 1056-1122);
8р35 (а.к. 34-532) + Н8А + №до66 (аминокислотные остатки №доА 1056-1122);
8р35 (а. к. 34-532) + Рс 1дС1 + амино-Нодо (аминокислотные остатки НодоА 1-949); и
8р35 (а.к. 34-532) + Н8А + амино-Лодо (аминокислотные остатки №доА 1-949).
Путем слияния фрагмента 8р35 с Ν- и С-концами подходящего для слияния партнера могут быть получены бивалентные или тетравалентные формы полипептида 8р35. Например, группа 8р35 может быть слита с Ν- и С-концами 1д-фрагмента, с продукцией бивалентного мономерного полипептида, содержащего два фрагмента 8р35. После димеризации двух из этих мономеров за счет фрагмента 1д получают тетравалентную форму белка 8р35. Такие мультивалентные формы могут быть получены для достижения повышенного сродства связывания с мишенью. Мультивалентные формы 8р35 также могут быть получены путем размещения фрагментов 8р35 в тандеме, с образованием конкатамеров, которые могут быть использованы отдельно или в слиянии с партнерами слияния, такими как 1д или Н8А.
Конъюгированные полимеры (отличные от полипептидов).
Некоторые варианты осуществления включают в себя полипептид 8р35, в котором один или несколько полимеров конъюгированы (ковалентно связаны) с полипептидом 8р35. Примеры полимеров, подходящих для такой конъюгации, включают в себя полипептиды (обсуждаемые выше), сахаридные полимеры и цепи полиалкиленгликолей. Обычно, но не обязательно, полимер конъюгируют с полипептидом 8р35 с целью улучшения одной или нескольких из следующих характеристик: растворимость, стабильность или биодоступность.
Предпочтительным классом полимера для конъюгирования с полипептидом 8р35 является полиалкиленгликоль.
Полиэтиленгликоль (ПЭГ) является особенно предпочтительным. Фрагменты ПЭГ, например 1, 2, 3, 4 или 5 полимеров ПЭГ, могут быть конъюгированы с каждым полипептидом 8р35 для повышения времени полужизни в сыворотке по сравнению с отдельным полипептидом 8р35. Фрагменты ПЭГ не являются антигенными и, по существу, инертны биологически. Фрагменты ПЭГ, используемые при воплощении изобретения, могут быть разветвленными или неразветвленными.
Число фрагментов ПЭГ, присоединенных к полипептиду 8р35, и молекулярная масса индивидуальных цепей ПЭГ может варьировать. В общем, чем выше молекулярная масса полимера, тем меньше полимерных цепей присоединяют к полипептиду. Предпочтительно, чтобы общая масса полимера, присоединенного к полипептиду 8р35, составляла от 20 до 40 кДа. Таким образом, если присоединяется одна
- 8 010055 полимерная цепь, предпочтительная молекулярная масса цепи составляет 20-40 кДа. Если присоединены две цепи, предпочтительная молекулярная масса каждой цепи составляет 10-20 кДа. Если присоединены три цепи, предпочтительная молекулярная масса составляет 7-14 кДа.
Полимер, например ПЭГ, может быть присоединен к полипептиду 8р35 посредством любой подходящей экспонированной реакционноспособной группы полипептида. Экспонированная(ые) реакционноспособная(ые) группа(ы) может(могут) представлять собой, например, Ν-концевую аминогруппу или эпсилон-аминогруппу внутреннего остатка лизина или обе такие группы. Активированный полимер может взаимодействовать и ковалентно связываться с любой свободной аминогруппой полипептида 8р35. Свободные карбоксильные группы, подходящим образом активированные карбонильные группы, гидроксил, гуанидил, имидазол, окисленные углеводные фрагменты и меркаптогруппы 8р35 (если они доступные) также могут использоваться в качестве реакционноспособных групп для присоединения полимера.
Предпочтительно, в реакции конъюгации используется примерно 1,0-10 моль активированного полимера на моль полипептида, в зависимости от концентрации полипептида. Обычно выбранное отношение представляет собой баланс между максимализацией взаимодействия при минимизации побочных реакций (часто неспецифических), которые могут ослаблять требуемую фармакологическую активность фрагмента 8р35. Предпочтительно, чтобы сохранялось по меньшей мере 50% биологической активности (что демонстрируется, например, в любом из описанных здесь и известных в данной области анализов) полипептида 8р35, и более предпочтительно, если сохраняется примерно 100% активности.
Полимер может быть конъюгирован с полипептидом 8р35 с использованием общепринятой химии. Например, фрагмент полиалкиленгликоля может быть присоединен к эпсилон-аминогруппе лизина полипептида 8р35. Связывание с боковой цепью лизина можно проводить с использованием активного сложного эфира Ν-гидроксилсукцинимида (ΝΗ8) в виде сукцинимидилсукцината ПЭГ (СС-ПЭГ) и сукцинимидилпропионата ПЭГ (СПА-ПЭГ). Подходящие полиалкиленгликолевые фрагменты включают в себя, например, карбоксиметил-ΝΗδ, норлейцин-ΝΗδ, 8С-РЕС, тресилат, альдегид, эпоксид, карбонилимидазол и ΡΝΡ-карбонат. Данные реагенты коммерчески доступны. Дополнительные взаимодействующие с аминогруппой линкеры ПЭГ могут быть замещены сукцинимидильным фрагментом. Они включают в себя, например, изотиоцианаты, нитрофенилкарбонаты, эпоксиды и бензотриазолкарбонаты.
Предпочтительно, выбирают условия для максимизации избирательности и выхода взаимодействия. Такая оптимизация условий взаимодействия доступна обычному специалисту в данной области.
Модификацию ПЭГ можно проводить в любой из реакций модификации ПЭГ, известных в данной области. См., например, Гост оп Сго\\111 Гас1ог§, 3: 4-10, 1992; опубликованные заявки на выдачу Европейского патента ЕР 0154316 и ЕР 0401384. Модификация ПЭГ может проводиться с использованием реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой полиэтиленгликоля (или аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером).
Модификация ПЭГ путем ацилирования в основном охватывает взаимодействие активного сложноэфирного производного полиэтиленгликоля. Любая реакционноспособная молекула ПЭГ может использоваться при модификации ПЭГ. Предпочтительный активированный сложный эфир ПЭГ эстерифицируется до Ν-гидроксисукцинимида (ΝΗ8). Используемый здесь термин «ацилирование» включает без ограничения следующие типы связей между терапевтическим белком и водорастворимым полимером, таким как ПЭГ: амидная, карбаматная, уретановая и т.п. См., Вюсопщда1е 011ст. 5: 133-140, 1994. Следует выбирать параметры взаимодействия во избежание условий температуры, растворителей и рН, которые будут повреждать или инактивировать полипептид 8р35.
Предпочтительно, соединяющая связь является амидной. Предпочтительно по меньшей мере 95% полученного в результате продукта модифицировано одним, двумя или тремя фрагментами ПЭГ. Однако могут образовываться некоторые виды молекул с более высокой степенью модификации ПЭГ в количествах, зависящих от конкретных используемых условий взаимодействия. Очищенные модифицированные ПЭГ виды молекул могут быть отделены от смеси, в частности, от непрореагировавших видов молекул, общепринятыми способами очистки, включая, например, диализ, высаливание, ультрафильтрацию, ионообменную хроматографию, хроматографию путем гель-фильтрации и электрофорез.
Модификация ПЭГ путем алкилирования в основном включает в себя взаимодействие концевого альдегидного производного ПЭГ с 8р35 в присутствии восстанавливающего средства. Кроме того, можно манипулировать условия взаимодействия для предпочтительной модификации ПЭГ только на Νконцевой аминогруппе 8р35 (т.е. модифицированным одним ПЭГ белком). В случае модификации одним ПЭГ или несколькими ПЭГ фрагменты ПЭГ предпочтительно присоединяются к белку посредством группы -0Ή2-ΝΗ-. С конкретной ссылкой на группу -СН2- данный тип связи известен как «алкильная» связь.
В дериватизации путем восстановительного алкилирования для получения модифицированного одной молекулой ПЭГ продукта используется различная реакционная способность различных типов первичных аминогрупп (лизиновых по сравнению с Ν-концевой), доступных для дериватизации. Взаимодействие производят при рН, которая обеспечивает преимущество различия по рКа между эпсилонаминогруппами остатков лизина и Ν-концевой аминогруппы белка. За счет такой селективной дериватизации контролируется присоединение водорастворимого полимера, который содержит реакционноспо
- 9 010055 собную группу, такую как альдегид, к белку: конъюгация с полимером имеет место преимущественно с Ν-конца белка, и не происходит значительной модификации других реакционноспособных групп, таких как аминогруппы боковых цепей лизина.
Полимерные молекулы, используемые в подходах ацилирования и алкилирования, выбирают из водорастворимых полимеров. Выбранные полимеры следует модифицировать так, что они будут иметь единичную реакционноспособную группу, такую как активный сложный эфир для ацилирования или альдегид для алкилирования, предпочтительно, так что степень полимеризации может контролироваться в соответствии с настоящими способами. Типовой реакционноспособный альдегид ПЭГ представляет собой пропионовый альдегид полиэтиленгликоля, который стабилен в воде, или его моно-С1-Сюалкокси- или арилоксипроизводные (см., патент США № 5252714). Полимер может быть разветвлен или неразветвлен. Для реакций ацилирования выбранный(ые) полимер(ы) должен(ны) иметь единственную реакционноспособную сложноэфирную группу. Для восстановительного алкилирования выбранный(ые) полимер(ы) должен(ны) иметь единственную реакционноспособную альдегидную группу. В общем, водорастворимые полимеры не выбирают из встречающихся в природе гликозильных остатков, поскольку их удобнее получить в системах рекомбинантной экспрессии млекопитающих.
Способ получения модифицированного ПЭГ 8р35. в основном, охватывает стадии (а) взаимодействия белка или полипептида 8р35 с полиэтиленгликолем (таким как реакционноспособный сложный эфир или альдегидное производное ПЭГ) в условиях, в которых молекула становится присоединенной к одной или нескольким группам ПЭГ, и (Ь) получения продукта(ов) взаимодействия. В общем, оптимальные условия взаимодействия для реакций ацилирования определяются от случая к случаю на основе известных параметров и требуемого результата. Например, чем больше отношение ПЭГ :белок, тем больше процентная доля модифицированного ПЭГ продукта.
Восстановительное алкилирование с продукцией, по существу, однородной популяции молекул монополимер/8р35, в основном, охватывает следующие стадии:
(a) взаимодействие белка 8р35 или полипептида с реакционноспособной молекулой ПЭГ в условиях восстановительного алкилирования, при рН, подходящем для реп-πίΐ избирательной модификации Νконцевой аминогруппы 8р35; и (b) получения продукта(ов) взаимодействия.
Для получения, по существу, однородной популяции молекул монополимер/8р35, условия реакции восстановительного алкилирования являются теми, которые позволяют селективное присоединение водорастворимого полимерного фрагмента к Ν-концу 8р35. Такие условия взаимодействия, в основном, обеспечивают различие рКа между аминогруппами боковой цепи лизина и Ν-концевой аминогруппы. Для целей настоящего изобретения предпочтительный рН находится в интервале 3-9, предпочтительно 3-6.
Полипептиды 8р35 могут включать в себя метку, например, фрагмент, который может впоследствии высвобождаться путем протеолиза. Таким образом, лизиновый фрагмент может избирательно модифицироваться вначале путем взаимодействия с Нщ-меткой, модифицированной низкомолекулярным линкером, таким как реагент Траута (Р1егее), который будет реагировать с лизином и Ν-концом, и затем путем высвобождения Нй-метки. После этого полипептид будет содержать свободную 8Н-группу, которая будет избирательно модифицироваться ПЭГ, содержащим способную к взаимодействию с тиолом группу, такую как малеимидная группа, винилсульфоновая группа, галогенацетатная группа или свободный или защищенный 8Н.
Реагент Траута может замещаться любым линкером, который будет создавать специфичный участок для присоединения ПЭГ. Например, реагент Траута может замещаться 8РЭР. 8МРТ, 8АТА или 8АТР (Р1егее). Сходным образом можно проводить взаимодействие белка с способным взаимодействовать с аминогруппой линкером, который встраивает малеимид (например, 8МСС, АМА8, ВМР8, МВ8, ЕМС8, 8МРВ, 8МРН, КМП8 или 6МВ8), галогенацетатную группу (8ВАР, 81А, 81АВ) или винилсульфоновую группу, и проводить взаимодействие полученного в результате продукта с ПЭГ, который содержит свободную 8Н.
В некоторых вариантах осуществления фрагмент полиалкиленгликоля присоединяют к группе цистеина полипептида 8р35. Присоединение может осуществляться, например, с использованием малеимидной группы, винилсульфоновой группы, галогенацетатной группы или тиольной группы.
Полипептид 8р35 необязательно конъюгируют с фрагментом полиэтиленгликоля посредством лабильной связи. Лабильную связь можно отщеплять, например, путем биохимического гидролиза, протеолиза или расщепления сульфгидрильной связи. Например, связь может отщепляться в условиях ίπ νίνο (физиологических).
Взаимодействия могут проводиться любым подходящим способом, используемым для взаимодействия биологически активных материалов с инертными полимерами, предпочтительно, при рН, примерно равном 5-8, например рН 5, 6, 7 или 8, если реакционноспособные группы находятся на альфааминогруппе с Ν-конца. В общем, в способе используется получение активированного полимера и последующее взаимодействие белка с активированным полимером для продукции растворимого белка, подходящего для получения препарата.
Векторы.
- 10 010055
Изобретение относится к векторам, включающим в себя нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид 8р35. Выбор вектора и последовательностей контроля экспрессии, с которыми функционально связаны нуклеиновые кислоты согласно изобретению, зависит от требуемых функциональных свойств, например, экспрессии белка и подлежащей трансформации клетки хозяина.
Элементы контроля экспрессии, которые могут использоваться для регуляции экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности, известны в данной области. Неограничивающие примеры включают в себя индуцируемые промоторы, конститутивные промоторы, сигналы секреции и другие регуляторные элементы. Когда используется индуцируемый промотор, он может контролироваться, например, путем изменения статуса питательных веществ или изменения температуры в среде клетки хозяина.
Вектор может включать в себя прокариотический репликон, т.е. последовательность ДНК, обладающую способностью направлять автономную репликацию и поддерживать молекулу рекомбинантной ДНК в бактериальной клетке хозяина вне хромосомы. Такие репликоны хорошо известны в данной области. Кроме того, векторы, содержащие прокариотический репликон также могут включать в себя ген, экспрессия которого обеспечивает детектируемый маркер, такой как устойчивость к лекарственному средству. Примеры генов бактериальной устойчивости к лекарственным средствам включают в себя гены, обеспечивающие устойчивость к ампициллину или тетрациклину.
Векторы, которые включают в себя прокариотический репликон, также могут включать в себя прокариотический или относящийся к бактериофагу промотор для управления экспрессией кодирующих генных последовательностей в бактериальной клетке хозяина. Промоторные последовательности, совместимые с бактериальными хозяевами, обычно предоставляются в плазмидных векторах, содержащих удобные участки рестрикции для встраивания сегмента ДНК, подлежащего экспрессии. Примерами таких плазмидных векторов являются рИС8, рИС9, рВК.322 и рВК.329 (ВюВаб), рРЬ и рКК223 (Рйагшаша). Любой подходящий прокариотический хозяин может использоваться для экспрессии молекулы рекомбинантной ДНК, кодирующей белок по изобретению.
Векторы для экспрессии в эукариотических клетках известны в данной области и коммерчески доступны. Обычно такие векторы содержат подходящие участки рестрикции для встраивания требуемого сегмента ДНК. Типовые векторы включают в себя р8УЪ и рК8У-10 (Рйагтааа), рВРУ-1, рМЬ2б (1п1сгпаΙίοηαΐ В1о1есйпо1од1е8), рТЭТ1 (АТСС 31255), ретровирусный экспрессирующий вектор рМЮ, аденовирусный челночный вектор рЭС'315 и векторы ААУ.
Векторы для экспрессии в эукариотических клетках могут содержать маркер селекции, например, гены устойчивости к лекарственным средствам. Примером такого гена является ген неомицинфосфотрансферазы (пео) (8ои111егп е! а1., 1982, 1. Мо1. Апа1. Сепе1. 1:327-341).
Для экспрессии антител или фрагментов антител ДНК, кодирующие частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, встраивают в экспрессирующие векторы, такие как плазмиды, ретровирусы, космиды, УАС, происходящие из ЕВУ эписомы, и тому подобное. Экспрессирующий вектор и последовательности контроля экспрессии выбирают так, что они совместимы с используемой для экспрессии клеткой хозяина. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут встраиваться в отдельный вектор. В некоторых осуществлениях оба гена встраивают в один и тот же экспрессирующий вектор.
Подходящим вектором является тот, который кодирует функционально полноценную последовательность человеческого иммуноглобулина Сн или Сь. Предпочтительно, участки рестрикции конструируют так, что любая последовательность Ун или Уь может легко встраиваться и экспрессироваться. В таких векторах обычно происходит сплайсинг между донорным участком сплайсинга во встроенной 1области и акцепторным участком сплайсинга, предшествующим человеческой С-области, и также в областях сплайсинга, которые встречаются внутри человеческих Сн-экзонов. Полиаденилирование и терминация транскрипции происходит в нативных хромосомных участках ниже кодирующей области. Рекомбинантный экспрессирующий вектор может также кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки хозяина.
Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетке хозяинамлекопитающего включают в себя вирусные элементы, которые направляют высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, например, промоторы и энхансеры, происходящие из ретровирусных ЬТК, из цитомегаловируса (СМУ) (например, промотор/энхансер СМУ), из обезьяньего вируса 40 (8У40) (например, промотор/энхансер 8У40), из аденовируса (например, большой поздний промотор аденовируса (АбМЬР)), из вируса полиомы, и сильные промоторы млекопитающих, такие как промотор нативного иммуноглобулина и актина. Для дальнейшего описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей см., например, 8бп5кг патент США № 5168062; Ве11, патент США № 4510245; и 8сйайиег, патент США № 4968615.
Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут нести последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках хозяина (например, точки начала репликации) и подлежащие селекции маркерные гены. Подлежащий селекции маркерный ген способствует селекции клеток хозяина, в которые был введен вектор (см., например, Ахе1, патенты США № 4399216; 4634665 и 5179017). Например, обычно подлежащий селекции маркерный ген придает устойчивость клетке хозяина, в которую был вве
- 11 010055 ден вектор, к лекарственным средствам, таким как 0418, гидромицин или метотрексат. Предпочтительные избирательные маркерные гены включают в себя ген дигидрофолатредуктазы (ΌΗΕΚ) (для применения в дй1г клетках хозяина с селекцией/амплификацией, основанной на метотрексате) и ген пео (для селекции, основанной на 0418).
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды 8р35 и антитела против 8р35, и векторы, содержащие данные молекулы нуклеиновой кислоты, могут применяться для трансформации подходящей клетки хозяина. Трансформация может осуществляться любым подходящим способом. Способы введения экзогенной ДНК в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают в себя опосредованную декстраном трансфекцию, преципитацию фосфатом кальция, опосредованную полибреном трансфекцию, слияние протопласта, электропорацию, инкапсуляцию полинуклеотида(ов) в липосомы, и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. Кроме того, молекулы нуклеиновой кислоты могут вводиться в клетки млекопитающих вирусными векторами.
Трансформация клеток хозяина может выполняться общепринятыми способами, подходящими для используемого вектора и клетки хозяина. Для трансформации прокариотических клеток хозяина могут применяться электропорация и способы обработки солью (Сойеп е! а1., 1972, Ргос. №111. Асай. 8с1. И8А 69:2110-2114). Для трансформации клеток позвоночных может использоваться электропорация, способы обработки солями и катионными липидами. См., например, Огайат е! а1., 1973, У1го1оду 52:456-467; №1д1ет е! а1., 1979, Ргос. ЫаЙ. Асай. 8с1. И8А 76:1373-13761.
Клеточные линии млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии, известны в данной области и включают в себя много иммортализованных клеточных линий из Атепсап Туре СиЙите Со11есОоп (АТСС). Они включают в себя, среди прочих, клетки яичника китайского хомячка (СНО), N80, клетки 8Р2, клетки НеЬа, клетки почки сирийского хомячка (ВНК), клетки почки обезьяны (СО8), клетки человеческой гепатоцеллюлярной карциномы (например, Нер 02), клетки А549 и некоторое количество других клеточных линий.
Экспрессия полипептидов из продуцирующих клеточных линий может быть усилена с использованием известных способов. Например, система глутаминсинтетазы (08) обычно используется для усиления экспрессии в конкретных условиях. См., например, Европейский патент № 0216846, 0256055 и 0323997 и заявку на выдачу Европейского патента № 89303964.4.
Клетки хозяина.
Клетки хозяина могут быть прокариотическими или эукариотическими. Предпочтительные эукариотические клетки хозяина включают в себя в качестве неограничивающих примеров клетки дрожжей и млекопитающих, например, клетки яичника китайского хомячка (СНО) (инвентарный № АТСС ССЬ61), клетки эмбриона мыши 8\νίδ5 из МН МН-3Т3 (инвентарный № АТСС СРБ1658). и клетки почки сирийского хомячка (ВНК). Другие подходящие эукариотические клетки хозяина включают в себя клетки насекомых и растительные клетки. Типовыми прокариотическими клетками хозяина являются Е. сой и 81тер!отусе8.
Препараты.
Композиции, содержащие полипептиды 8р35, антитела против 8р35 или антигенсвязывающие фрагменты антител против 8р35 могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители. Например, они могут содержать наполнители и/или вспомогательные вещества, которые облегчают переработку активных соединений в препараты, созданные для доставки в участок действия. Подходящие препараты для парентерального введения включают в себя водные растворы активных соединений в водорастворимой форме, например, растворы водорастворимых солей. Кроме того, могут вводиться суспензии активных соединений в виде подходящих масляных суспензий для инъекции. Подходящие липофильные растворители или носители включают в себя жирные масла, например кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, например этилолеат или триглицериды. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, и включают в себя, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и декстран.
Необязательно, суспензия может также содержать стабилизаторы. Липосомы также могут использоваться для инкапсуляции молекул по изобретению для доставки в клетки или интерстициальные пространства. Типовые фармацевтически приемлемые носители представляют собой физиологически совместимые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие всасывание средства, воду, солевой раствор, фосфатно-солевой буфер, декстрозу, глицерин, этанол и тому подобное. В некоторых вариантах осуществления композиция включает в себя изотонические средства, например сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. В некоторых вариантах осуществления композиции включают в себя фармацевтически приемлемые вещества, такие как увлажняющие средства, или малые количества добавочных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие средства, консерванты или буферы, которые усиливают время хранения или эффективность активных ингредиентов.
Композиции по изобретению могут быть в различных формах, включая, например, жидкие (например, растворы для инъекций и инфузий), дисперсии, суспензии, полутвердые и твердые дозированные формы. Предпочтительная форма зависит от способа введения и терапевтических применений.
- 12 010055
Композиция может быть получена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Стерильные инъецируемые растворы могут быть получены путем введения активного ингредиента в требуемом количестве в подходящем растворе с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, как это требуется, с последующей стерилизацией фильтрованием. В общем, дисперсии получают путем включения активного ингредиента в состав стерильного носителя, который содержит основную среду дисперсии и другие требуемые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекции предпочтительные способы получения представляют собой сушку в вакууме и сушку вымораживанием, с получением в результате порошка активного ингредиента и любого дополнительного требуемого ингредиента из предварительно стерилизованного фильтрованием раствора. Надлежащая текучесть раствора может поддерживаться, например, применением такого покрытия, как лецитин, поддержанием требуемого размера частиц в случае дисперсии и применением поверхностно-активных веществ. Длительное всасывание инъецированных композиций может проводиться путем введения в композицию средства, которое замедляет всасывание, например, солей моностеарата и желатина.
Активный ингредиент можно поместить в препарат или устройство с контролируемым высвобождением. Примеры таких препаратов и устройств включают в себя имплантаты, трансдермальные пластыри и системы доставки посредством микрокапсул. Могут использоваться деградирующие в биологических условиях, биологически совместимые полимеры, например, этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы получения таких препаратов и устройств известны в данной области. См., например, 8и51атсб апб Соп1го11сб Яс1са5с Эгид Эсйусгу ЗуЧспъ. 1. Я. ЯоЬшкоп, сб., Магсс1 Эекксг. 1пс., Ναν Уогк, 1978.
Препараты-депо для инъекций могут быть получены путем образования микроинкапсулированных матриксов лекарственного средства в деградирующих в биологических условиях полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от отношения лекарственное средство-полимер и природы используемого полимера, скорость высвобождения лекарственного средства может контролироваться. Другие типовые деградирующие в биологических условиях представляют собой полиортоэфиры и полиангидриды. Препараты-депо для инъекций также могут быть получены путем захвата лекарственного средства в липосомы или микроэмульсии.
Дополнительные активные соединения могут включаться в состав композиций. В некоторых вариантах осуществления полипептид 8р35, антитело против 8р35 или его фрагмент вводится совместно с антителом против ЫдЯ1 или с его антигенсвязывающими фрагментами, или с растворимыми полипептидами ЫдЯ1 или с белками слияния с ЫдЯ1.
Режимы дозировки могут настраиваться для обеспечения оптимального требуемого ответа. Например, может вводиться единственный болюс, несколько отдельных доз могут вводиться с течением времени, или доза может пропорционально снижаться или повышаться, по указаниям необходимости терапевтической ситуации. Предпочтительно составлять парентеральные композиции в единичных дозированных формах для простоты введения и однородности дозировки. См., например, ЯсштдХоп'к Рйагтасси11са1 8с1спсс5 (Маск РиЬ. Со., ЕаДоп, РА 1980).
В дополнение к активному веществу жидкая дозированная форма может содержать инертные ингредиенты, такие как вода, этиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сорбитановые эфиры жирных кислот.
Генная терапия.
Полипептид 8р35 может продуцироваться в млекопитающем ίη у1уо, например, у пациентачеловека, с использованием подхода генной терапии для лечения заболевания ЦНС, нарушения или повреждения, при котором будет терапевтически предпочтительным снижение ингибирования вытяжения аксонов. Это включает в себя введение подходящей кодирующей полипептид 8р35 нуклеиновой кислоты, функционально связанной с подходящими последовательностями контроля экспрессии. Предпочтительно, данные последовательности включены в вирусный вектор. Подходящие для такой генной терапии вирусные векторы включают в себя аденовирусные векторы, лентивирусные векторы, бакуловирусные векторы, векторы на основе вируса Эпштейна-Барр, паповавирусные векторы, векторы на основе вируса коровьей оспы, векторы на основе вируса простого герпеса и векторы на основе аденоассоциированного вируса (ААУ). Вирусные векторы могут быть вирусными векторами, дефицитными по репликации.
Предпочтительный аденовирусный вектор имеет делецию в своем гене Е1 или гене Е3. При использовании аденовирусного вектора млекопитающее предпочтительно не подвергают воздействию нуклеиновой кислоты, кодирующей ген маркера селекции.
Примеры
Изобретение далее иллюстрируется следующими экспериментальными примерами. Примеры предоставляются только для иллюстративных целей, и никоим образом не предназначены для ограничения объема или содержания изобретения.
- 13 010055
Пример 1. Профиль экспрессии 8р35.
Экспрессию 8р35 в тканях человека оценивали путем нозерн-блот-анализа. Многочисленные блоты тканей, содержащие 12 основных тканей человека или 14 тканей человеческой ЦНС гибридизовали в течение ночи при 68°С с меченным Р32 зондом на 8р35 (нуклеотиды 150-450 последовательности кДНК 8р35). Блоты промывали 3 раза 2х 88С, 0,5% 8Ό8, затем 3 раза 0,5х 88С, 0,1% 8Ό8. Затем блот экспонировали на рентгеновскую пленку, и визуализировали уровень мРНК авторадиографией.
8р35 был высокоэкспрессирован в головном мозге человека, но отсутствовал в сердце, скелетной мышце, толстом кишечнике, тимусе, селезенке, почке, печени, тонком кишечнике, плаценте, легком и в лейкоцитах периферической крови. 8р35 экспрессировался во всех тестируемых тканях головного мозга, включая ткани, выделенные из передней коры, задней коры, энторинальной области коры, гиппокампа, обонятельной луковицы, полосатого тела, таламуса, мозжечка, среднего мозга, моста, продолговатого мозга и спинного мозга. Для 8р35 наблюдался градиент генной экспрессии по ростральной/спинномозговой оси при наивысших уровнях в коре мозга и наименьших в спинном мозге.
Иммуногистохимическое (1НС) окрашивание использовали для определения того, экспрессируется ли 8р35 в конкретных клетках головного мозга. Препараты головного мозга крысы, фиксированные в 4% параформальдегиде, срезы спинного мозга или первичные культуры гранулярных нейронов инкубировали с первичными антителами против 8р35, как указано, с последующим применением вторичных антител, конъюгированных с А1еха 480 или 590 (Мо1еси1аг РгоЬек 1пс.). Затем срезы устанавливали в Уес1а51нс1б и визуализировали путем флуоресцентной микроскопии. Специфические антитела против 8р35, используемые для 1НС, получали из библиотеки фагового дисплея ЕаЬ с использованием технологии МогРйокук.
8р35 специфично экспрессируется в нейронах и олигодендроцитах, но не в астроцитах. Это определяли в экспериментах, где срезы ткани головного мозга крысы окрашивали различными средствами, включая антитело против маркера астроцитов ПЕАР, антитело против маркера олигодендроглиоцитов (04), и антитело против маркера нейронов тубулина βΙΙΙ, причем все срезы также окрашивали антителом против 8р35. Олигодендроциты и нейроны интенсивно окрашивались антителом против 8р35. Не наблюдалось окрашивание астроцитов.
В качестве независимого подтверждения профиля экспрессии 8р35 авторы изобретения проводили полуколичественную ОТ-ПЦР с использованием мРНК, выделенной (набор АшЬюп) из крысиных первичных клеточных культур очищенных астроцитов, олигодендроцитов и гранулярных нейронов мозжечка. Использовали прямой праймер АА06СССА6СА66Т6ТТТ6Т60А (8ЕО ΙΌ N0: 14) и обратный праймер ТАСТС6АТСТС6АТ0ТТ6Т0СТТТ (8ЕО ΙΌ N0: 15). После 26 циклов наблюдали мощный пик в мРНК из нейронов, различимый, но более слабый сигнал наблюдали в мРНК олигодендроцитов, и не наблюдали полосы в астроцитах.
Пример 2. Белок слияния 8р35-Ес.
Для исследования биологической функции 8р35 получали конструкцию, в которой внеклеточная часть человеческого 8р35 (остатки 1-531) слита с шарниром и Ес-областью человеческого Ι§Ο1. Частичную кодирующую последовательность для человеческого 8р35 получали путем ПЦР из клона 227.2 (Тпсу1е) с использованием прямого праймера
5'СА6СА66ТС6АС6С66СС6САТ6СТ66С666666С0Т3' (8ЕО ΙΌ N0: 16) и обратного праймера 5'СА6СА66ТС6АССТС6ССС66СТ66ТТ603' (8ЕО ΙΌ N0: 17).
Продукт ПЦР с тупыми концами субклонировали в участок 8гЯ вектора РСК 8СШРТ АМР (81га1адепе) с получением РСК 8СШРТ АМР-§р35. Фрагмент 8аИ выделяли из РСК 8СШРТ АМР-§р35 и субклонировали в вектор РСКСАМР Ι§ (производное вектора 81га1адепе РСК 8СШРТ АМР, в котором последовательность Ес-гамма субклонирована в фрагмент от 8аИ(5') до N04(3')), объединяя сигнальную последовательность и последовательность эктодомена 8р35 (кодоны 1-531) в одну рамку с последовательностями, кодирующими шарнир и Ес-область человеческого Ι§1. Идентифицировали правильные изоляты, и фрагмент N04, содержащий фрагмент 8р35-Ес, субклонировали в единичный участок клонирования N01 Ι экспрессирующего вектора СН274 для 293Е, производного коммерческого экспрессирующего вектора КЕР4 ([пуЦгодеп). Белок слияния 8р35-Ес, кодируемый новым вектором СН274/§р35-Ес, подтверждали путем секвенирования ДНК, под названием плазмиды ОТ123.
Стабильные клеточные линии, экспрессирующие белок слияния 8р35-Ес, генерировали путем электропорации клеток хозяина СН0 ΌΟ44 с плазмидой ОТ123. Трансфицированные клетки СН0 культивировали в альфа-минус-МЕМ в присутствии 10% диализованной сыворотки и 4 мМ глутамина для отбора на предмет независимого от нуклеозидов роста. Через четырнадцать суток после трансфекции клетки подпитывали свежей средой. Для скрининга на предмет клеток, экспрессирующих 8р35-Ес, клетки СН0 метили меченным фикоэритрином (РЕ) антителом козы против человеческого Ι§0 (1аск§оп ЬаЬк) и подвергали сортировке путем высокоскоростной проточной цитометрии в ЕАС8 Мо-Е1о (Су1оша1юп). Отбирали клетки, которые экспрессировали самый высокий уровень БрЛ.эЭд. Данные клетки размножали в культуре в течение 7 суток, затем метили повторно и опять сортировали. Клетки, экспрессирующие наивысший уровень БрЛ.эЭд выделяли в виде отдельных клонов в 96-луночных планшетах. Данные клоны выращивали в течение двух недель и затем подпитывали свежей средой за сутки до ЕАС8-анализа для
- 14 010055 проверки уровня экспрессии. Клоны, которые экспрессировали самый высокий уровень 8р35-Ес, размножали и создавали банки замороженных клеток. Клеточные линии адаптировали к росту в суспензионной культуре в бессывороточной среде ВСМ16. Титр 8р35-Ес, продуцированного данными клонами, определяли путем выращивания клеточных линий при 37°С в течение 4-5 пассажей, с последующим выращиванием клеток до 50% максимальной плотности клеток и их культивирования в течение 10-15 суток при 28°С до возрастания плотности жизнеспособных клеток до 75%. В этот момент собирали культуральную среду, очищали от клеток и дебриса центрифугированием, и титровали образцы культуральной надосадочной жидкости на уровни 8р35-Ес посредством вестерн-блот анализа с использованием антитела против человеческого 1д (Таеквои ЬаЬ) в качестве зонда.
Белок слияния 8р35-Ес очищали из осветленной культуральной среды следующим образом: 9 мл 1М НЕРЕ8, рН 7,5, добавляли к 900 мл подготовленной среды. Среду загружали в течение 3 ч при 4°С на 3 мл белок А-сефарозы (Рйагтааа) в режиме погружения. Смолу собирали в колонке с внутренним диаметром 1,5 см, и промывали четыре раза 3 мл РВ8, два раза 4 мл РВ8, содержащего 800 мМ ЫаС1, и затем опять 3 мл РВЗ. 8р35-Ес элюировали с колонки 25 мМ ЫаН2РО4, рН 2,8, 100 мМ ЫаС1 фракциями по 1,5 мл и нейтрализовали добавлением 75 мкл 0,5 М ЫаН2РО4, рН 8,6. Фракции, содержащие пики белка, идентифицировали путем измерения поглощения при 280 нм, объединяли и подвергали дальнейшей очистке на колонке объемом 1 мл с белком А. Перед загрузкой добавляли №1С1 до 600 мМ и НЕРЕ8, рН 7,5, до 50 мМ. Колонку дважды промывали 600 мкл 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,5, 1 М ЫаС1, и затем 1 мл РВ8. 8р35Ес элюировали из колонки 25 мМ ЫаН2РО4, рН 2,8, 100 мМ ЫаС1, собирая фракции объемом 0,5 мл, и нейтрализовали добавлением 25 мкл 0,5 М №1Н2РО4. рН 8,6. Фракции, содержащие пики белка, идентифицировали путем измерения поглощения при 280 нм и объединяли. При БОЗ-РАСЕ в восстановительных условиях 3р35-1д мигрировал в виде единичной полосы (>95% чистоты) с различной массой 90 кДа. В невосстановительных условиях белок проходил как димер с примерной массой 180 кДа. Очищенный 8р35-Ес разделяли на аликвоты и хранили при -70°С. Фрагмент ΝοΐΙ СТ123, который содержал аминокислоты 8р35 1-531 и Ес человеческого 1дС1, субклонировали в участок ΝοΐΙ вектора РУ90 для создания 0В002.
Пример 3. Белок слияния Н18-АР-8р35.
Для исследования и выделения рецептора 8р35 белок экспрессировали в клетках СО87 и СНО в виде белка слияния с щелочной фосфатазой с гистидиновой меткой (НЕ-АР). Плазмиду конструировали следующим образом: внеклеточный домен 8р35 (а.к. 34-532) амплифицировали в ПЦР с использованием праймеров (прямого) 5'-ААТТААСААТТСАСССССТСССССССССССТСССАСТ-3' (8ЕС) ГО 18), содержащего участок расщепления Есо К! (подчеркнуто), и (обратного) 5'-ТАТАТТТСТАСАТСАСТССССССССТССТТССАСАТСАААСССа-3' (8ЕС) ГО ^: 19), содержащего участок расщепления ХЬа I (подчеркнуто). Продукт ПЦР расщепляли ХЬа I, полученные в результате липкие концы заполняли ДНК полимеразой Т4 ΏΝΑ, затем расщепляли Есо ΚΙ и очищали в геле. Расщепленный продукт лигировали в Ншб ΙΙΙ-заполненный/ЕсоК I фрагмент Нщ-АР из вектора Н^8-ΑР-рс^NΑ 1.1 (ΙηνίΙΐΌβοη). Фрагмент Н18-АР-8р35 расщепляли Ншб ΙΙΙ и Есо ΚΙ, заполняли концы, затем лигировали в участок №1 Ι с заполненными концами в вектор рУ90. Последовательность ДНК вставки подтверждали путем секвенирования ДНК.
Клетки СО87 пересевали за сутки до трансфекции. ДНК вектора Нщ-АР-8р35 (8 мкг) использовали для трансфекции 5х106 клеток с использованием липофектамина (ΙηνίΙΐΌβοη).
Подготовленную среду собирали через 48 ч после трансфекции.
Авторы изобретения разработали клеточную линию СНО, экспрессирующую белок слияния НщАР-8р35 с использованием плазмиды рУ90. Клетки хозяина СНО ΏΟ44 (2х106 клеток) трансфицировали 100 мкг плазмиды путем электропорации. Клетки культивировали в альфа-минус-МЕМ в присутствии 10% диализованной сыворотки и 4 мМ глутамина для селекции независимого от нуклеозидов роста. Через 14 суток после трансфекции клетки загружали свежей средой перед скринингом посредством сортировки на ЕАС8 Мо-Е1о (СуЮтаОоп). Трансфицированные клетки СНО метили мышиным моноклональным антителом 8В6, направленным против человеческой плацентарной щелочной фосфатазы (81дта). Вторичное антитело, меченное РЕ антитело козы против мышиных Ι§Ο, использовали для продукции сигнала, специфичного для трансфицированных клеток. После мечения РЕ клетки подвергали сортировке путем высокоскоростной проточной цитометрии и отбирали верхние 5%.
Для продукции подготовленной среды с Нщ-АР-8р35 отбирали клетки, экспрессирующие наивысший уровень Ш8-Ар8р35. Клеточные линии адаптировали к росту в культуре суспензии в бессывороточной среде (ВСМ16). Титр Нщ-АР-8р35, продуцируемого данными клонами, определяли путем выращивания клеточных линий при 37°С в течение 4-5 пассажей, затем клетки выращивали до 50% от максимальной плотности клеток и культивировали их в течение 10-15 суток при 28°С до повышения плотности жизнеспособных клеток до 75%. Отбирали культуральную среду, очищали ее от клеток и дебриса путем центрифугирования, и титровали образцы культуральной надосадочной жидкости на предмет уровня НщАР-8р35 путем вестерн-блот-анализа с использованием антитела против человеческой АР (1аск§оп ЬаЬк) в качестве зонда.
- 15 010055
Н18-АР-8р35 очищали от подготовленной среды следующим образом: 400 мл кондиционированной среды от клеток СНО, экспрессирующих Н18-АР-8р35 разбавляли 400 мл воды. Триэтаноламин, рН 8,5, добавляли до 25 мМ из 0,5 М маточного раствора, и образец загружали в течение 2 ч при 4°С на 6 мл анионообменной смолы ЕгасЮдеЕТМАЕ (ЕМ 1пби51пс5) в режиме погружения. Смолу собирали в колонку с внутренним диаметром 1,5 см, и промывали дважды 6 мл 10 мМ НЕРЕ8 рН 7,5, 50 мМ №С1. АР8р35 элюировали с колонки 10 мМ НЕРЕ8 рН 7,5, 200 мМ №1С1 во фракциях объемом 2 мл. Пиковые фракции идентифицировали путем мониторинга активности АР и посредством δΌδ-РАСЕ. Прошедшую через колонку ТМАЕ фракцию далее разводили 300 мл воды и загружали в режиме погружения в течение ночи при 4°С на 6 мл смолы ТМАЕ. Смолу собирали и промывали, как описано выше и элюировали 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,5, 150 мМ №С1. Пиковые фракции опять идентифицировали путем мониторинга активности АР и посредством δΌδ-РАСЕ. Н18-АР-8р35 с первой колонки был чистым на 50%, а АР-8р35 со второй колонки был чистым на 90%. В восстановительных условиях Н1к-АР-8р35 мигрировал на гелях 8Э8-РАСЕ как различимая масса 130 кДа. Хотя материал 90%-ной чистоты подходил для большей части исследований, для некоторых исследований Н18-АР-8р35 далее очищали на агарозной смоле №-№ГА (01адсп). №1С1 добавляли к элюированным фракциям с колонки ТМАЕ до 800 мМ, и 0,5 М триэтаноламин, рН 8,5, и 1М имидазол, рН 7,0, добавляли до 25 мМ и 15 мМ, соответственно. 4,5 мл образца нагружали на колонку N^NТА объемом 4 00 мкл. Колонку промывали трижды 25 мМ триэтаноламином, рН 8,5, 800 мМ №С1, 15 мМ имидазолом, и элюировали с колонки Н18-АР-8р35 200 мМ имидазолом рН 7,0, 350 мМ №С1, собирая фракции объемом 200 мкл. Пиковые, содержащие АР фракции объединяли и диализовали в течение ночи против 250 объемов 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,5, 200 мМ №С1. МдС12 и ΖπΕ’Ε добавляли к остатку до 2 и 0,25 мМ, соответственно. Конечный продукт был более чем на 95% чистым, как показано посредством δΌδ-РАСЕ, и двигался в виде единичной полосы массой примерно 140 кДа в восстановительных условиях.
Конструкции 8р35 также конструировали в виде белков слияния с Ес. Конструкцию 8р-35 ЬРК-Ес получали путем ПЦР с использованием праймеров (прямого) 5'СТТСАСАССССАТССССССССССАТССТСССССССССССТСАСС3' (8ЕО ΙΌ N0:20) и (обратного) 5'ССАСССССССССССАСССССТСССССАСССТСАСАССАСТСАССС3' (8ЕО ГО N0: 21).
Продукт ПЦР встраивали в участок ΝοΐΙ вектора РУ90. Конструкцию 8р35 Ю-Ес получали путем ПЦР с использованием праймеров (прямого) 5'СТТСАСАССССАТССССССССССАТССТСССССССССССТСАСС3' (8ЕО ΙΌ Ν0:22) и (обратного) 5'СТСССССАТССССССССССССССАСССТСАСАССАСТСАССССАС3' (8ЕО ГО Ν0: 23).
Продукт ПЦР встраивали в участок ΝοΐΙ вектора РУ90. Белки экспрессировали в клетках СНО и очищали с использованием колонки с белок А-сефарозой.
Пример 4. Связывание 8р35 с экспрессирующими Ν§Ρ1 клетками.
Для того чтобы показать связывание 8р35 с Ν§Κ1, использовали четыре разных способа. Вначале авторы изобретения выявляли взаимодействие в прямом анализе связывания, в котором конъюгат щелочная фосфатаза-8р35 (АР-8р35) инкубировали с экспрессирующими Ν§Κ1 клетками и оценивали связывание с использованием хромогенного реагента для выявления АР. Клетки СО87 с 90%-ной сомкнутостью выращивали на чашках для культуры ткани диаметром 100 мм, и трансфицировали их экспрессирующими Ν§Ρ1 плазмидами с использованием реагентов Ецдепе 6 (РнсЬе). Через 48 ч трансфицированные клетки промывали один раз НВН (сбалансированный солевой буфер Хэнкса, 1 мг/мл В8А, 20 мМ НЕРЕ8, рН 7,0), и затем инкубировали в течение 1,5 ч при 23°С с 4 мкг/мл белка слияния АР-8р35 в НВН. Клетки промывали ледяным буфером НВН 3 раза каждый раз в течение 3 мин, затем фиксировали 3,7% формальдегидом в 20 мМ НЕРЕ8, рН 7,0, 150 мМ №1С1 в течение 15 мин, и переносили обратно в буфер НВН. Эндогенную термолабильную АР инактивировали нагреванием в течение 2 ч при 67°С. Связанный АР-8р35 выявляли путем инкубации в нитро-голубом тетразолии NВТ (РнсЬе). Ар-8р35 связывался с клетками СО87, экспрессирующими человеческий рецептор Ν§Ρ1. но не с контрольными клетками СО87, трансфицированными только вектором. Наблюдали точечный профиль окрашивания Ν§Κ1, отражающий то, что только часть клеток, вероятно 50% из них, трансфицировалось Ν§Κ1.
Для лучшего количественного анализа связывания авторы изобретения проводили такой же эксперимент, но параллельные образцы клеток обрабатывали 8, 4, 2, 1, 0,5, 0,125, 0,06 мкг/мл АР-8р35. Связанную АР инкубировали с 4-нитрофенилфосфатом, и активность АР оценивали в устройстве для считывания 96-луночных планшетов ^ο^^ατ Эеу1се5). Из этих данных авторы изобретения выясняли, что ЕС50 связывания Ар-8р35 с человеческим Ν§Κ1 составляет примерно 6 нМ.
Во-вторых, авторы изобретения выявляли связывание 8р35 с Ν§Κ1 подходом ЕМ8А. Планшеты для ЕЫ8А (ί.’ο5ΐ;π) покрывали 10 мкг/мл растворимых рецепторов ^Р1-Ес (δΝ§Κ310-Ес, содержащий пептид крысиного Ν§Κ1 35-310, слитый с шарниром и Ес крысиного Ι§Ο1, и ^дК344-Ес, содержащий пептид крысиного Ν§Κ1 35-344, слитый с крысиным Ι§Ο1) в 0,1М NаНСОз, рН 9,0, в течение 1 ч при 37°С. Планшеты блокировали и промывали 25 мМ Нерек, рН 7,0, содержащим 0,1% В8А, 0,1% овальбумина, 0,1% обезжиренного сухого молока и 0,001% ΝαΝ3. Белок АР-8р35, 4 мкг/мл, добавляли к планшету и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты затем промывали 10 мМ Тгщ, рН 7,5, 150 мМ №С1, и выявляли связанную АР с использованием 10 мкг/мл хромогенного субстрата 4-нитрофенилфосфата,
- 16 010055 растворенного в 0,1 М глицине, 1 мМ МдС12, 1 мМ Ζη0’12. рН 10,5. ΟΌ4ι0 определяли на устройстве для считывания результатов ЕЫ8А (Мо1еси1аг ^еν^се8), оборудованном программой 8ойшах. АР-8р35 связывался с иммобилизованным ^дК-344-Ес, но не с белком ^дК-310-Ес, указывая на то, что для связывания 8р35 требуется более протяженный вариант молекулы Ν§Κ1. Авторы смогли обеспечить конкурентное ингибирование связывания АР-8р35 с ^дК344-Ес из Ν§Κ1 на 80% путем предварительной инкубации АР 8р35 со 100-кратным избытком ^дК344-Ес. Не обнаруживали конкурентного связывания при использовании белка слияния 1д1 ежа и крысы в качестве контроля белка слияния с крысиным 1д.
В-третьих, авторы изобретения выявляли связывание 8р35 с Ν§Κ1 посредством совместной иммунопреципитации 8р35 с Ν§Κ1. Для данного исследования сомкнутые на 80% клетки С087, выращенные на чашках для культуры ткани диаметром 100 мм, трансфицировали плазмидами, кодирующими 8р35гемагглютинин (8р35-НА) и Ν§Κ-ΕΈΑ6, с использованием реагентов Еидепе 6 (КосЕе). Через 48 ч после трансфекции клетки собирали и лизировали в 1 мл лизирующего буфера (50 мМ НЕРЕ8, рН 7,5, 150 мМ №С1, 1,5 мМ МдС12, 1 мМ ЕСТА, 1% Ττίΐοη Х-100 и 10% глицерин) при 4°С в течение 30 мин. Затем лизат центрифугировали при 14000хд в течение 15 мин, и надосадочную жидкость собирали и инкубировали при 4°С в течение ночи при перемешивании, с использованием аффинного матрикса против НА (Ε^ΐβ). Образцы промывали 3 раза 1 мл лизирующего буфера, затем кипятили в течение 3 мин в буфере для образца по Лэммли, подвергали 4-15% δΌδ-РАСЕ, и анализировали посредством иммуноблоттинга с антителом против ЕЬАС М2 (81дта). Аффинная смола против метки НА накапливала комплекс, содержащий 8р35-НА и ЕЬАС^дК, что было очевидно за счет присутствия. Этот комплекс не наблюдался в лизатах из контрольных трансфекций, в которых клетки обрабатывали только плазмидой 8р35-НА или плазмидой ЕЬАС^дКТ, или клетки совместно трансфицировали Е1ад^дК1 и меченным НА контрольным белком, не связывающим Ν^ΕΤ.
8р35-НА получали следующим образом. Сигнальную последовательность и внеклеточный домен 8р35 (аминокислоты 1-531) амплифицировали путем ПЦР с использованием праймеров 5'АТАТТСТАСААТССТСССССССССССТСАС3' (81Т) ΙΌ Ν0: 24) и 5'АТАТАСТАСТСТССТТССССССССССТТСС3' (8 ЕС) ГО Ν0: 25), содержащих участки ХЬа1 и 8ре1 (подчеркнуто). Продукт ПЦР расщепляли ХЬа1 и 8ре1 и встраивали в вектор рСССНА между участками ХЬа Ι и 8ре Ι. Последовательность вставки подтверждали посредством секвенирования ДНК. Конструкция ЕЬАС ^К1 была получена от д-ра ΖЫдаηд Не (№!ите, νο1 420, Νον 7, 2002).
В-четвертых, авторы изобретения показали, что Ар-8р35 связывался с гранулярными нейронами мозжечка крысы (ССЦ), которые экспрессируют Ν^ΕΤ. Для данного эксперимента сомкнутые на 90% клетки СС^ выделенные через 8 суток после рождения, выращивали на чашках для культуры ткани диаметром 100 мм. Через 48 ч клетки промывали один раз буфером НВН, и затем инкубировали с 4 мкг/мл АР-8р35 в буфере НВН в течение 1,5 ч при 23°С. Затем клетки промывали ледяным НВН 3 раза каждый раз по 3 мин, затем фиксировали 3,7% формальдегидом в 20 мМ НЕРЕ8, рН 7,0, и 150 мМ №1С1 в течение 15 мин и переносили обратно в НВН. Эндогенную термолабильную АР инактивировали нагреванием в течение 2 ч при 67°С. Связанный АР-8р35 выявляли путем инкубации с нитро-голубым тетразолием Ν^ (ΡοΟκ). АР-8р35 связывался с гранулярными нейронами мозжечка, выделенными на 8 сутки после рождения, которые экспрессируют Ν^ΕΤ Связывание АР-8р35 с нейронами ингибировалось обработкой ССN с использованием РГРЬС (5 ед./мл), который расщепляет большинство заякоренных СР1 белков с поверхности мембраны. Поскольку ^К1 представляет собой СР1-связанный белок, данный результат далее поддерживает утверждение, что 8р35 связывается с ^К1 на клетках ί,ΌΝ.
Пример 5. Совместная локализация 8р35 и ^К1.
Для определения того, экспрессированы ли 8р35 и ^К1 на одних и тех же нейронах, авторы изобретения проводили исследование по совместной локализации. Фиксированные 4% параформальдегидом первичные культуры гранулярных нейронов крысы р8 инкубировали с антителами против 8р35 и NдΕ1 (8ап!а Сги/), и затем с подходящими меченными А1еха вторичными антителами ^ο^υΠτ РгоЬек 1пс.). Клетки визуализировали посредством конфокальной микроскопии. Нейроны интенсивно окрашивались антителами против 8р35 и ^К1. Оба белка экспрессировались в телах и аксонах нейронов. Для обеспечения анализа совместной локализации для 2 типов антител использовались различно окрашенные зонды. Когда красители (красная для ^К-положительных клеток и зеленая для 8р35-положительных клеток) накладывались один на другой, авторы изобретения видели желтый цвет в пределах клетки, что указывало на совместную локализацию двух белков в данных нейронах.
Пример 6. Участки связывания ^К1 в молекуле 8р35.
Авторы изобретения использовали картирование, основанное на делециях, для определения конкретных доменов 8р35, вовлеченных во взаимодействия с ^К1. Следующие конструкции с делециями получали с использованием набора для мутагенеза 8!та!адепе ОшксНапде. Авторы проверяли все векторные конструкции посредством секвенирования ДНК модифицированных вставок.
Н18-АР-8р35Ь, который содержит домен богатых лейцином повторов 8р35 плюс его основную область (а.к. 34-432), клонировали из вектора НЦ-АР-8р35 (а.к. 34-532) путем ПЦР. Использованные праймеры представляли собой
5'СССАССАССТСТТТСТССАССАСТСАТСТАСССССССССАТСССТС-3' (8ЕС) ГО Ν0: 26) и
- 17 010055
5'-САСССАТСССССССССТАС АТСАСТССТССАСАААСАССТССТССС-3' (8ЕО ΙΌ N0: 27).
Н18-АР-8р35б, который кодирует 1д домен 8р35 плюс его основную область (а.к. 417-531), клонировали из вектора Н1§-АР-8р35а (а.к. 37-531) путем ПЦР. Использованные праймеры представляли собой
5'ССССССССАССССССТСААТТССССССССССАТСССССАСССС-3' (8ЕО ΙΌ N0: 28) и 5'-ССССТСССССАТССССССССССААТТСАССССССТСССССССС-3' (8ЕО ΙΌ N0: 29).
Н18-АР-8р35е, который кодирует только 1д-домен (а.к. 425-531), клонировали из вектора Н18-ЛР8р35 (а.к. 34-532) путем ПЦР. Использованные праймеры представляли собой
5'-ССССССССАССССССТСААТТСССССАССАССТСТТТСТССАС-3' (8ЕО ΙΌ N0: 30) и 5'-СТССАСАААСАССТССТСССССААТТСАССССССТСССССССС-3' (8ЕО ΙΌ N0: 31).
Коммерческий набор для мутагенеза и протокол (81га1аёепе ОшксНамде) использовали для мутации аминокислоты 456 (аргинин на глутаминовую кислоту) и аминокислоты 458 (гистидин на валин) 8р35 в векторе ^$^£-81335 (34-532). Использованные праймеры представляли собой
5'-САТССТСТСССТСТСАССССААААССТАСТССТСТСАСССААСАСС-3' (8ЕО ΙΌ N0: 32) и 5'-ССТСТТСССТСАСАССАСТАССТТТТССССТСАСАСССАСАССАТС-3' (8ЕО ΙΌ N0: 33).
Конструкции с делециями на основе Н18-АР-8р35 (фиг. 3) помещали в экспрессирующие векторы рV90 и экспрессировали в клетках 293. Подготовленную среду собирали, и аддукты АР очищали посредством последовательных стадий хроматографии на смоле Егас1сде1 ТМАЕ и №№ГА-агарозе. Очищенные белки тестировали на предмет связывания с КдВ1, экспрессированным на клетках С087. Все три конструкции слабо связывались с 8р35. Эти результаты указывают на то, что ЬКВ-повторы 1-14 8р35 (аминокислоты с 34 по 417) и Ιβ-домен 8р35 (аминокислоты 425-531) вносят вклад в связывание 8р35 с N§^1. Ιβ-домен характеризовался более высоким сродством, чем домен ЬКВ.
Структурную модель Ι^-домена 8р35 генерировали с использованием кристаллической структуры NСЛМ в качестве рамки (Рашпилем е1 а1., 2000, №11. 81гнс1. ΒίοΙ. 7:389-393). Из этой модели авторы изобретения наблюдали петлю (номера остатков 454-458, аминокислоты: 8РВКН; 8Е0 ΙΌ N0: 34), которые могут вовлекаться в связывание. Для проверки данной гипотезы авторы изобретения конструировали конструкцию 8р35, в которой остатки В в 456 и Н в 458 изменяли на Е и V, соответственно. Когда данную конструкцию тестировали на связывание КдВ1, авторы изобретения обнаруживали >10-кратное повышение сигнала. В качестве альтернативного подхода для тестирования вклада данной петлевой области в связывание, авторы изобретения синтезировали пептид, соответствующий последовательности Ь8РККН (8Е0 ΙΌ N0: 10), который авторы циклизовали путем добавления цистеинов с N и С-концов пептида. После связывания с N§^1 данный пептид блокируется, ингибирует или препятствует функции ЫдВ1.
Пример 7. 8р35 индуцирует разрастание отростков ССN р8.
Для определения биологической функции 8р35 в нейронах авторы изобретения инкубировали 8р35Ес с гранулярными нейронами, выделенными через 8 суток после рождения, для обнаружения того, может ли 8р35 регулировать разрастание нейрита. Культуральные слайды ЬаЫек (8 лунок) покрывали поли-Э-лизином (81дта) в концентрации 0,1 мг/мл до раскапывания белка 8р35-Ес (16 мкг/лунку белка). Слайды сушили в течение ночи, затем ополаскивали и покрывали ламинином (6ί^ο) в концентрации 10 мкг/мл. Мозжечковые гранулярные нейроны, выделенные через 8 суток после рождения, диссоциировали и высевали на предварительно покрытые слайды. Культуры на слайдах инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 24 ч. Затем слайды фиксировали в 4% параформальдегиде, содержащем 20% сахарозу, и окрашивали антителом против тубулина βΙΙΙ (Сονаηсе ТИП). Через 24 ч ССN характеризовались явственной пучкообразной морфологией, что подтверждалось ветвлением отростков нейронов. Разрастание отростков не наблюдалось в необработанных клетках или контрольных образцах, покрытых белком Ес.
Пример 8. Действие 8р35 на активацию/инактивацию В^А.
8р35-Ес индуцировал разрастание отростков в постнатальных гранулярных нейронах мозжечка. Поскольку, как известно, сигнальная молекула В1юА вовлечена в разрастание отростков, авторы изобретения определяли, может ли 8р35-Ес регулировать функции МщА в нейронах. Авторы изобретения проводили эксперименты по активации МщА следующим образом: клетки 293 или клетки С087 трансфицировали экспрессирующими векторами, содержащими комбинации В1юА, 8р35 или N§^1 с использованием реагентов Еидеме 6 (Вοсйе). Через 48 ч после трансфекции клетки подвергали сывороточному голоданию в течение ночи, затем лизировали в 50 мМ Тгщ, рН 7,5, содержащем 1% ТоЩи Х-100, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% 8Ό8, 500 мМ №С1, 10 мМ МдС12, плюс коктейль ингибиторов протеаз. Клеточные лизаты осветляли путем центрифугирования при 13000хд и 4°С в течение 5 мин, и 95% образцов надосадочной жидкости инкубировали с 20 мкг иммобилизованного аффинного матрикса, содержащего связывающий домен С8Т-В1ю (гранулы В^ект, ирЧа1е ВОЮсНгю^ду) при 4°С в течение 45 мин. Гранулы промывали 3 раза промывочным буфером (50 мМ Тгщ, рН 7,5, 1% ТоЩи Х-100, 150 мМ №С1, 10 мМ МдС12, с протеазными ингибиторами). Связанный с СТР В1ю элюировали с гранул путем нагревания при 95°С в течение 5 мин в буфере для образца 8П8-РАСЕ. Связанный и общий белок В1ю выявляли путем вестернблота с использованием моноклонального антитела против В^А (8аШа Сгнх). Клетки С087 и НЕК293, трансфицированные 8р35, индуцировали активацию В^А, что подтверждалось увеличением количества
- 18 010055
КйоА-СТР, выявленного на блоте после трансфекции геном 8р35. Дальнейшее увеличение уровня КйоАСТР наблюдали после обработки 8р35-Ес. В отличие от увеличения уровня КЪоА-СТР после трансфекции одним 8р35, при трансфекции клеток 8р35 и ΝβΚ.1. КйоА частично инактивировался. Обработка данных клеток 8р35-Ес приводила к дальнейшей инактивации КйоА.
Авторы изобретения подтверждали сигнальный ответ на 8р35 с использованием анализа ЕЫРК (Мо1еси1аг Оет1се5) для определения воздействия обработки 8р35 на ток Са. Авторы наблюдали значительный ток Са44 в клетках, экспрессирующих 8р35, при обработке 8р35-Ес, но не в контрольных клетках, обработанных 8р35-Ес. Ток Са++ снижался, когда клетки, которые совместно трансфицировали ΝβΚ.1 и 8р35, обрабатывали белком слияния 8р35-Ес.
Пример 9. Взаимодействие белка 8р35 с самим собой.
Поскольку домены ЬКК часто участвуют в гомотипических взаимодействиях, и авторы изобретения наблюдали, что добавление растворимого 8р35 к трансфицированным 8р35 клеткам вызывает повышение КйоА-СТР по сравнению с наблюдаемым при трансфекции одним 8р35, авторы тестировали связывание 8р35 с самим собой. Для проведения данного теста авторы изобретения использовали совместную иммунопреципитацию. Клетки СО87, сомкнутые на 80%, выращенные на чашках для культуры ткани диаметром 100 мм, трансфицировали плазмидами 8р35 НА или 8р35-ЕЬАС, или обеими, с использованием реагентов Еидепе 6 (Косйе). Через 48 ч после трансфекции клетки собирали и лизировали в 1 мл лизирующего буфера (50 мМ НЕРЕ8, рН 7,5, 150 мМ №С1, 1,5 мМ МдС12, 1 мМ ЕСТА, 1% Тгйоп Х-100 и 10% глицерин) при 4°С в течение 30 мин. Лизат центрифугировали при 14000/д в течение 15 мин, и образцы надосадочной жидкости собирали и инкубировали, при 4°С в течение ночи при перемешивании с аффинным матриксом против НА (Косйе). Затем образцы промывали 3 раза 1 мл лизирующего буфера, промывали в буфере Лэммли для образца, подвергали 4-15% δΌδ-РАСЕ, и анализировали путем иммуноблота с антителами против ЕЬАС. Смола с антителами против НА захватывала комплекс, который содержал 8р35-ЕЬАС, что определено путем вестерн-блота. Это указывало на прямое взаимодействие 8р35 с самим собой. Авторы изобретения также обрабатывали клетки, трансфицированные НА-8р35, 8р35-Ес, и использовали сходный подход иммунопреципитации для того, чтобы показать, что НА-8р35 связывается с 8р35-Ес.
8р35-ЕЬАС получали следующим образом. Внеклеточный домен гена 8р35 (а.к. 1-531) амплифицировали путем ПЦР с использованием праймеров
5'ААТТААССССССССАТССТСССССССССССТ3' (8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 35) и
5'ААТТААССССССССТТТСТСАТСТ'3 (8ЕО ГО ΝΟ: 36), содержащих участки №0 (подчеркнуто). Продукт ПЦР расщепляли №11 и встраивали в участок №0 вектора рУ90. Последовательность ДНК вставки подтверждали путем секвенирования ДНК.
Пример 10. Трансплантация трансформированных 8р35 клеток ίπ νί\Ό.
Для определения биологической функции 8р35 у крыс с повреждением спинного мозга авторы изобретения инфицировали корковые клетки в первичной культуре (смешанные культуры) ретровирусом, экспрессирующим полноразмерный 8р35 или ретровирусным контролем, для доставки в эпицентр повреждения спинного мозга крысы. Вводили 2/106 клеток, и крыс фиксировали на 10 сутки. Образцы спинного мозга фиксировали в течение ночи в 4% параформальдегиде, затем дегидрировали в 70% Е1ОН, и затем в 95% Е(ОН. Образцы ткани пропитывали парафином. Срезы (толщиной 10 мкм) использовали для иммуногистохимического окрашивания. Крысы, которые получали клетки, экспрессирующие 8р35, по сравнению с контролем характеризовались меньшим сокращением аксонов и большим окрашиванием тубулина βΙΙΙ вблизи эпицентра. У крыс с повреждением, получавших 8р35, наблюдали повышенное выживание нейронов.
Ретровирусную конструкцию 8р35 получали следующим образом: ген 8р35 амплифицировали путем ПЦР с использованием праймеров
5'-САТТАСТССАСАТССТСССССССССССТСАСС-3' (8 ЕС) ГО ΝΟ: 37), содержащего участок Х1о1 (подчеркнуто), и
5'ССССССААТТСТСАТАТСАТСТТСАТСТТСААСТТС-3' (8ЕС) ГО ΝΟ: 38), содержащего участок ЕсоШ (подчеркнуто). Продукт ПЦР расщепляли Х1о1 и ЕсоШ, затем лигировали в ретровирусный вектор рМ1С (который содержит 1КЕ8-СЕР), который ранее расщепляли Х1о1 и ЕсоШ. Новый вектор называли рММС078. Все изоляты рММС078 содержали незапланированные точечные мутации, так что два изолята рММС078 лигировали вместе. рММС078.6 расщепляли Х1ю1 и Асс1, и рММС078.7 расщепляли Х1о1 и Асс1. Эти два фрагмента лигировали вместе с получением конечной правильной плазмиды рММС089. Последовательность ДНК вставки подтверждали путем секвенирования ДНК. Ретровирус 8р35 получали, как описано. Клетки 293С пересевали за сутки до трансфекции. 8 мкг 8р35-ретровирусной ДНК использовали для трансфекции 5/106 клеток с применением липофектамина (1птЦгодеп). Подготовленную среду собирали через 92 ч после трансфекции. Подготовленную среду центрифугировали при 5000/д в течение 10 мин, и надосадочную жидкость использовали в качестве маточного раствора ретровируса 8р35. Данный маточный раствор хранили при 4°С в течение 1 недели или при -80°С в течение 6 месяцев.
Пример 11. Модель повреждения спинного мозга на животных.
- 19 010055
Все хирургические процедуры проводят с использованием асептического способа. В течение 1 недели до любой хирургической манипуляции животных приучают к рукам. Перед и после операции для профилактики вводят ампициллин 100 мг/кг п./к. для снижения риска инфекционного повреждения мочевого пузыря.
Животных подвергают анестезии с использованием мидазолама в дозе 2,5 мг/кг в./бр. в сочетании с 2-3% изофлураном в 02 для глубокого наркоза, который оценивают пощипыванием пальца. В течение операции и восстановления от нее животных держат на нагреваемой подушке с циркулирующей водой. Глазную смазку используют для предотвращения высыхания глаза, и атропин в дозе 0,05 мг/кг п./к. вводят для снижения избыточного слюноотделения. На коже делают маленький разрез, и отводят мышцу, чтобы открыть позвонки. Проводят дорзальную ламинэктомию на уровне позвонка Ь6 (и Ь7, если необходимо помещение интратекального катетера, см. ниже), Ь6/Ь7, и прилегающие остистые отростки прочно фиксируют в спинальной рамке (Ωανίά КорГ 1п51гитсп15). Проводят дорзальную гемисекцию на уровне Ь6 тонкими ножницами для иридэктомии, полностью прерывая главный дорзомедиальный и малый дорзолатеральный компоненты кортикоспинального тракта (С8Т). После операции участок ламинэктомии покрывают защитным материалом, таким как ОцгаГИт, и сшивают надлежащие мышцы хромовой нитью 4,0 для защиты открытого позвоночника. Кожу сшивают и протирают раствором бетадина.
Функциональное восстановление животных оценивают с использованием способа коэффициента Ва§8о ВсаШс апб ВгекпеЕап (ВВВ), который обычно применяется для оценки крыс после повреждения спинного мозга. В данном способе проводится количественный анализ функции задних конечностей крыс путем подробного анализа подвижности в суставах и способности переносить вес. Крыс оценивают через сутки после повреждения спинного мозга, после этого - еженедельно.
Непосредственно после пересечения С8Т в участок пересечения и непосредственно в каудальном и ростральном направлении от участка повреждения вводят инъекцией аденовирус, экспрессирующий 8р35 или СЕР, или контрольный вирус (1010 частиц). Всего 10 мкл аденовируса вводят в 5 различных участков (4 мкл/участок). Для интратекального введения белка 8р35 в твердой оболочке спинного мозга делают маленькое отверстие в 2 мм каудально от повреждения Ь7, и встраивают интратекальный катетер в субарахноидальное пространство в области Ь7. Катетер медленно и аккуратно ведут вдоль спинного мозга примерно на 1 мм каудальнее повреждения. Часть катетера, лежащую вне интратекального пространства, плотно пришивают к окружающей ткани. Подготовленный миниосмотический насос (А1ха согр.), содержащий тестируемый материал (белок 8р35 или контрольный белок), присоединяют к экспонированному концу направляющей канюли и помещают в подкожное пространство. После хирургического вмешательства участки ламинэктомии покрывают протективным материалом, таким как ОцгаШт, и сшивают надлежащие мышцы хромовой нитью 4,0 для защиты открытого позвоночника. Кожу сшивают и протирают раствором бетадина.
Гистологический анализ. Операцию по мечению трактов проводят во время операции по индукции повреждения спинного мозга. Кожу головы бреют и протирают бетадином и 70%-ным спиртом. Животное помещают в рамку стереотаксиса. Скальп рассекают продольно и соскабливают периост со свода черепа. В черепе просверливают отверстие примерно 1-2 мм в диаметре и вставляют стеклянную микролитровую иглу вертикально в 8 мест моторной коры (координаты определяют по атласу мозга крысы Рах1по8 апб ХУаЧоп, 1997). Примерно 5 мкл материала для мечения трактов (например, биотин-декстранамин, мол. масса 10000) вводят путем инъекции, и иглу оставляют на месте еще на 5 мин для обеспечения диффузии раствора. После удаления иглы отверстие в черепе заклеивают гелевой пеной, и скальп скрепляют, закрывая участок повреждения. Животным позволяют восстановиться и получить послеоперационный уход (описанный выше). Через четыре-десять недель животных подвергают глубокому наркозу (инактин 100-110 мг/кг в.бр.) и перфузируют для изучения гистологии, как описано выше. Материал для мечения тракта переносится механизмами антеградного транспорта вниз по кортикоспинальному тракту в направлении каудального конца спинного мозга и предоставляет способ количественного анализа анатомической целостности в пределах кортикоспинального тракта. Для экспериментов по иммуногистохимии животных подвергают глубокому наркозу инактином (100-110 мг/кг в.бр.) через 2-8 недели после операции по индукции повреждения. Грудную полость открывают и вынимают сердце для обеспечения перфузии. В левый желудочек вставляют канюлю, через которую медленно нагнетают 100сс ледяной РВ8 (в правом желудочке прорезают отверстие для обеспечения выхода жидкости). За этим следует медленное, но равномерное прокапывание 4% параформальдегида (50-100 мл) до явной фиксации глаз/ушей/пальцев. Удаляют спинной мозг, заботясь о минимальном изменении участка повреждения, замораживают в ОСТ, делают срезы и подготавливают их для иммуногистохимии. Также необязательно собирают другие ткани для дальнейшего анализа. Животные, получавшие аденовирус с 8р35, характеризовались повышенным ветвлением аксонов, что определено окрашиванием тубулина βΙΙΙ в аксонах нейронов.
Пример 12. Конструкции вирусного вектора 8р-35.
Происходящий из рМ1С вирусный вектор 8р-35 получали следующим образом. Полноразмерную кодирующую 8р35 последовательность амплифицировали путем ПЦР с использованием праймера
5'-САТТАСТССАСАТССТСССССССССССТСАСС-3' (8ЕО ΙΌ Ν0: 37), содержащего участок
- 20 010055
ХМ, и праймера 5' ССССССААТТСТСАТАТСАТСТТСАТСТТСААСТТС-3' (8ЕО ΙΌ N0: 38), содержащего участок ЕотВЕ Продукт ПЦР расщепляли Х1ю1 и ЕтоК!, затем лигировали в ретровирусный вектор рМЮ (СНеид е1 а1, 1996, №11. Вю1есЬМ. 145:576), который расщепляли Х1ю1 и ЕтоВГ Данный вектор обозначали рММС078. Все изоляты рММС078 содержали точечные мутации, так что два изолята рММС078 лигировали вместе. Вектор рММС078.6 расщепляли ΧΗοΙ и Асс1, и рММС078.7 расщепляли ΧΗοΙ и Асс1. Эти два фрагмента лигировали с получением плазмиды рММС089.
Происходящий от рМЮ вирусный вектор 8р35-НА получали следующим образом. Фрагмент, кодирующий аминокислоты 8р35 326-614, в рамке считывания с последовательностью НА, получали с использованием ПЦР с праймером
5'-СССТТССССССССТСААСТАССТСССССТССТС-3' (8 ЕС) ΙΌ N0: 39), содержащим участок 8ас11, и
5'-ССССААТТСТСААСССТААТСАССААССТССТААСССТАТАТСАТСТТСАТСТТСААСТТ ССССССССССТСССС-3' (8Е0 ГО N0: 40), где рММС089 служила матрицей. Более длинный праймер включает в себя кодирующую НА последовательность (курсив) после кодона 614 8р35 и перед участком ЕотВ I. Затем продукт ПЦР расщепляли 8ас II и ЕотВ I, и использовали для замены фрагмента 8ас П-ЕстаВ I, содержащего кодоны 326-614 8р35 дикого типа, в происходящем от рМЮ ретровирусном векторе.
Бакуловирусный вектор 8р35 НА получали следующим образом. Кодирующую 8р35-НА последовательность из ретровирусного вектора 8р35-НА расщепляли Χίο I и ЕтоВ I, затупляли концы и клонировали посредством Β§12-Π11-ίη в участок бакуловирусного челночного вектора рΒV-СΖРС (патенты США № 6190887 и 6338953), замещая ген Ьас2 под промотором СМV.
Аденовирусный вектор 8р35 получали следующим образом. Последовательность 8р35-ШЕ8-СГР из ретровируса 8р35 расщепляли ΧΗο I-Γ^11-^η и Ме I, затем клонировали в участки ЕсοВ1-Γ^11-^η/NНе I аденовирусного челночного вектора рЭС315. под минимальный промотор СМV.
Пример 13. Модель ремиелинизации на животных.
Во всех исследованиях использовали крыс-самок Εοηβ Егаиз. Крыс подвергали наркозу с использованием изофлурана, и извлекали Т3/4 и проводили дорзальную гемиламинэктомию. Затем вводили путем инъекции химическое демиелинизирующее средство, лизолецитин (3 мкл 1% лизолецитина в 0,9% солевом растворе) в правую сторону дорзальных столбов спинного мозга в 0,5-1 мм ниже поверхности мозга). До и после операции проводили подходящую обезболивающую обработку.
Через трое суток участок инъекции повторно извлекают (под изофлурановым наркозом с подходящей обезболивающей обработкой), и вводят путем инъекции в поврежденный спинной мозг следующие средства: в участок повреждения вводят аденовирусный вектор, кодирующий белок 8р35/контрольный белок. 1010 частиц аденовируса, кодирующего 8р35 или контроль ОГР в объеме 10 мкл, вводят путем инъекции в поврежденный спинной мозг крысы в различные участки, числом до 5, в участок индуцированной лизолецитином демиелинизации и вокруг него. В каждый из 5 участков инъекции вводят объем, не превышающий 2 мкл. Для гистологического анализа демиелинизации/ремиелинизации спинного мозга через 2, 3, 4 или 6 недель после операции, животных подвергают глубокому наркозу посредством инактина (100-110 мг/кг в.бр.) и проводят перфузию фиксирующего раствора через сердце. Затем вынимают спинной мозг и подготавливают к анализу. Животные, получавшие лечение 8р35, характеризовались повышенной миелинизацией аксона, что определено ГНС с использованием антитела против МВР или быстрым луксолом голубым.
Пример 14. РНК1 8р35.
Для определения роли 8р35 в функции мозга авторы изобретения вводили лентивирусную РНК1 8р35 в клетки СЮН выделенные на 8 сутки после рождения. Инфицированные РНК1 8р35 клетки имели более короткие нейриты и более высокую скорость пролиферации, чем контрольные клетки. Данные результаты указывают на роль 8р35 в регуляции активации В1юА.
Последовательности ДНК 8р35 мыши и крысы сравнивали на предмет поиска областей гомологии для применения кандидатных РНКзН. СН324 конструировали путем отжига олигонуклеотидов Εν1-035 и Εν1-036 и лигирования с рЬЬ3.7, расщепленной Нра1 и Х1юЕ Олигонуклеотиды получали от МАС. Последовательности представляют собой:
Εν1-035 (смысловой олигонуклеотид)
5'ТСАТССТСАТССТССТАСАСТТСААСАСАСТСТАССАССАТСАССАТСТТТТТТС (8ЕС) ГО N0: 41)
Εν1-036 (антисмысловой олигонуклеотид)
5'ТССАСААААААСАТССТСАТССТССТАСАСТСТСТТСААСТСТАССАССАТСАССАТСА (8ЕС) ГО N0: 42).
Перед продукцией вируса ДНК из рЬЬ3.7 или кандидатной зНРНК в рЬЬ3.7 одновременно трансфицировали с мышиной плазмидой, меченной 8р35-НА, в отношении 5 к 1, в клетки СН0 в 6-луночном формате. Нокдаун анализировали детекцией путем вестерн-блота метки 8р35-НА из трансфицированных лизатов клеток СН0, и путем нозерн-блота общей ДНК, полученной из параллельных лунок. Блот зондировали фрагментом т8р35 размером 0,7 тыс.н.п. Анализы проводили через 48 ч после трансфекции
- 21 010055 (данные не показаны). Вирусы продуцировали из лучшего кандидата на применение в культурах нейронов крысы. Вектор, дополнительная методология и продукция вируса соответствовали описанным в КнЬнъоп с1 а1. А кпйупик-Ьакей куккт 1о Гипс11опа11у Шепсе депек ίη рпшагу таттаНап се11ь, Цет сеШ апб капкдешс тке Ьу ΚΝΑ ткгГегепсе. Ν;·ιΙ. Сепе1. 33, 401-6 (2003).
Пример 15. Активация ВНоА.
Клетки СО87, одновременной экспрессирующие Ν§Κ1 и 8р35, не характеризовались изменениями уровня КНоА/СТР в ответ на ОМдр. Это указывает на то, что образования комплекса 8р35/ЫдК1 не достаточно для обеспечения трансдукции сигнала посредством миелинового ингибитора.
Авторы изобретения исследовали возможность того, что передачу сигнала опосредует тройной комплекс 8ρ35/Ν§Κ.1/ρ75. Для оценки взаимодействия между 8р35, Ν§Κ1 и р75 использовали два подхода. Во-первых, связывание оценивали прямым анализом связывания с использованием конъюгата АР8р35. Конъюгат АР-8р35 слабо связывался с экспрессирующими р75 клетками. АР-Р75 связывался с экспрессирующими Ν§Κ,1 клетками. Связывание АР-8р35 с Ν§Κ,1 и р75 измеряли посредством ЕЫ8А (фиг. 4). Во-вторых, связывание 8р35 с Ν§Κ1 и р75 оценивали посредством совместной иммунопреципитации из клеток СО87, одновременно экспрессирующих 8р35, Ν§Κ1 и р75. Антитело против Ν§Κ1 иммунопреципитировало комплекс, содержащий 8р35 и р75. Антитело против 8р35 также иммунопреципитирует комплекс, содержащий р75. Данные по взаимодействию и совместной иммунопреципитации предоставляли доказательства прямого взаимодействия между 8р35, Ν§Κ1 и р75. Авторы изобретения применяли конфокальную микроскопию и антитела против 8р35, р75 и Ν§Κ1 для того, чтобы показать, что 8р35, Ν§Κ1 и р75 совместно локализуются в телах клеток и аксонах нейронов р7 СО из крыс.
Далее авторами изобретения показано, что сочетания 8р35, Ν§Κ1 и р75 достаточно для активности миелинового ингибитора. Не нейронные клетки СО87 конструировали так, чтобы они экспрессировали все три компонента. С использованием данных клеток авторы изобретения показали, что уровень КНоА/СТР позитивно регулируется ОМдр. Обработка ОМдр-Гс повышала уровень КНоА/СТР в клетках, одновременно экспрессирующих 8р35/р75/ЫдК1, по сравнению с другими комбинациями трех этих компонентов. Авторы изобретения подтверждали экспрессию белков посредством вестерн-блота лизатов клеток СО 87. Сродство миелиновых ингибиторов, связывающихся с ИдК!, не подвергалось влиянию присутствия р75 или р75 и 8р35. Объединение результатов поддерживает модель, согласно которой тройной комплекс Ν§Κ1. 8р35 и р75 требуется для регуляции КНоА в присутствии лигандов ЫдК1 (фиг. 5).
8р35 содержит цитоплазматический домен, который потенциально прямо или косвенно вовлечен в передачу сигнала. Для определения роли цитоплазматического домена авторы изобретения продуцировали 8р35, укороченный по цитоплазматическому домену (аминокислоты от 34 до 576 8ЕЦ ΙΌ ΝΌ: 2), для функционирования доминантно-негативным образом посредством образования непродуктивного тройного комплекса, не способного к передаче. Авторы обозначили данную молекулу с укорочением по цитоплазматическому домену «ΌΝ-8ρ35» (по боттаШ педаИуе 8р35). Авторы изобретения трансфицировали полноразмерным 8р35 или ΌΝ-8ρ35 нейроны СС, выделенные на 7 сутки после рождения (р7), и затем анализировали их ответ на ингибиторные компоненты миелина (Отдр, миелин и Ыодо66). Как показано на фиг. 6, трансфицированные ΌΝ-8ρ35 клетки не отвечали на ингибиторные компоненты миелина и характеризовались более длинными нейритами по сравнению с контролем. Клетки, трансфицированные полноразмерной конструкцией 8р35, наоборот, характеризовались повышенным ответом на ингибиторные субстраты, и характеризовались более короткими нейритами по сравнению с контролем. Это демонстрирует, что ΌΝ-8ρ35 действует как конкурентный ингибитор подавления разрастания нейритов, вызванных компонентами миелина. Авторы изобретения ожидали, что экзогенный, растворимый 8р35-Гс также связывает ЫдК1 и блокирует действие ингибиторных веществ. Как показано на фиг. 7, 8р35-Гс снижает ингибирование разрастания нейритов за счет Отдр, Ыодо66 и МАС.
Пример 16. Нейропротекторная активность.
Равные количества крысиных гранулярных нейронов мозжечка р6 помещали в каждую лунку 12луночного планшета для культуры клеток в присутствии или отсутствие 50 нМ белка кр35-Гс. Данные поли-Э-лизиновые планшеты предварительно покрывали [позволяли высохнуть в них] 10 мкг миелина ЦНС, или 200 нг Ыодо66, МАС и ОМдр или контролем-Гс. Культуры нейронов поддерживали в течение 1-7 суток при 37°С и 5% СО2. Нейроны были здоровыми и хорошо росли в контрольных лунках с РВ8, с полным вытяжением нейритов независимо от обработки кр35-Гс [определено с помощью специфичного нейронального маркера, тубулина βΙΙΙ], по оценке после 3 суток. В отсутствие кр35-Гс нейроны не росли хорошо в лунках, покрытых миелином, Ыодо66, МАС и ОМдр. Имелось минимальное разрастание нейритов [коротких и искривленных], и нейроны оказывались нездоровыми, с округлым телом клетки и конденсированным ядерным веществом. Окрашивание ЭАР1 продемонстрировало, что число нейронов, выявляемых в данных лунках, было меньшим, чем в контрольных лунках с РВ8, что указывало на утрату нейронов. В присутствие кр35-Гс присутствовали длинные нейриты, и нейроны оказывались здоровыми. Окрашивание ЭАР1 демонстрировало большее число нейронов в данных лунках по сравнению с теми, куда не вводили кр35-Гс. Данные суммированы ниже в табл. 2.
- 22 010055 в
высушенный субстрат: вытяжение нейритов морфология тела клетки ядерное вещество число нейронов в конце эксперимента отсутствие зр35-Ес
ОМдр/Ыодо/МАС/миелин короткие искривленные округлая конденсированное снижено
Таблица 2 контроль Ес длинные вытянутые распростертая прозрачное то же, что в контроле Ес присутствии зр35-Ес высушенный субстрат:
ОМдр/Иодо/МАС/миелин контроль Ес вытяжение нейритов длинные вытянутые длинные вытянутые морфология тела распростертая распростертая клетки ядерное вещество прозрачное прозрачное число нейронов в снижено меньше, чем то же, что в конце эксперимента в контроле ЕС контроле Ес
Эти данные указывают на то, что растворимая форма 8р35, например, 8р35-Рс, обладает нейропротекторной активностью.
В спинном мозге крыс с гемитрансекцией (Т9, 8СТ) окрашивание тубулина β-ΙΙΙ срезов спинного мозга выявляло существенную потерю нейронов в участке повреждения. Рекомбинантный вирус, экспрессирующий 8р35, использовали для инфицирования животных 8СТ в участке повреждения.
Гистологическое окрашивание данных образцов спинного мозга выявляло повышенное число нейронов вокруг участка повреждения по сравнению с контрольной группой, которую инфицировали векторным вирусом. Это соотносится с экспериментальными находками т νίΐΐΌ, описанными выше, и указывает на дальнейшие нейропротективные свойства, ассоциированные с 8р35.
Пример 17. 8р35 в модели повреждения спинного мозга на животных.
Поскольку 8р35-Рс снижал разрастание нейритов, вызванное ОМдр, ^до-66 и МАС т νίΐΐΌ, авторы изобретения ожидали, что данная молекула способствует функциональному восстановлению повреждений ЦНС т νί\·Ό. Для подтверждения этого авторы вводили 8р35-Рс в спинной мозг подвергнутых гемисекции крыс, т.е. модели острой травмы ЦНС на животных. Как показано на фиг. 8 и 9, обработанные 8р35-Рс крысы демонстрировали значительно улучшенное функциональное восстановление по сравнению с контрольными крысами, обработанными ^С.
Повреждение спинного мозга и анализ поведения проводили следующим образом. Все хирургические процедуры проводили согласно руководству Вюдеп Ι п^111и!1'опа1 Ашта1 Изе апб Саге СотпвИее. Крыс-самок Ьопд Ενапз (190-210 г, СЬаг1ез КАег, АИттд1оп, Массачусетс) подвергали наркозу с использованием 2,5 мг/кг мидазолама в.бр. и 2-3% флуотана в О2. Дорзальную ламинэктомию проводили на уровне позвонков Т6 и Т7. Осуществляли дорзальную гемисекцию, полностью прерывая главный дорзомедиальный и малый дорзолатеральный компоненты кортикоспинального тракта (С8Т). Немедленно после трансекции С8Т в субарахноидальное пространство встраивают интратекальный катетер на уровне Т7 и соединяют его с подготовленным миниосмотическим насосом (Аке1, модель 2004), встроенным в подкожное пространство. Миниосмотические насосы доставляли контрольный человеческий белок изотипа Ни ЕС (5 мг/мл, п=5, РЬагттдеп), РВ8 (п=3), растворимый белок слияния Ни 8р35-!д (4,3 мг/мл, п=8) со скоростью 0,25 мкл/ч. После операции участок ламинэктомии сшивали и скрепляли рану в коже. Послеоперационный уход включал в себя анальгезию (бупренорфин, 0,05 мг/кг п.к.) в течение 3 суток и обработку антибиотиком (ампициллин 100 мг/кг п.к. два раза в сутки) в течение 7 суток после операции. Мочевой пузырь опустошали вручную два раза в сутки в течение исследования (28 суток) или до возвращения функции (этот момент отмечали). Всех животных вслепую оценивали с помощью системы тестов «открытого поля» ВВВ (Ваззо е! а1., 1995, I. №иго!гаита 12:1-21; Опо е! а1., 2003, I. №игозс1. 23:58875896). Крыс оценивали на сутки после трансекции С8Т (сутки 2) и после этого еженедельно в течение 4 недель с использованием рейтинговой шкалы локомоции Ваззо-ВеаШе-ВгезпаЬап (ВВВ). Исследователи работали с разными группами обработки вслепую в течение исследования.
Пример 18. Выживаемость нейронов и регенерация аксонов в модели гемисекции руброспинального тракта (К8Т).
- 23 010055
Авторы изобретения также исследовали действие обработки 8р35 на регенерацию нейронов в руброспинальном тракте, который непосредственно участвует в локомоции.
Взрослых крыс 8ргацие-[)а\у1еу в возрасте 9 недель (200-250 г) подвергали анестезии путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (80 мг/кг) и ксилазина (8 мг/кг). С использованием операционного микроскопа проводили ламинэктомию и выявляли седьмой грудной позвонок (С7). После открытия твердой оболочки проводили правостороннюю гемисекцию на уровне спинного мозга С7 с использованием пары пружинных ножниц. После гемисекции спинного мозга животные получали кусок гелевой пены, смешанной с 10 мкл 2 мкг/мл раствора 8р35-Рс, или с 10 мкл 2 мкг/мл раствора человеческого 1д, или с 10 мкл РВ8, который помещали сверху участка повреждения. После операций животных в каждой группе подразделяли для отслеживания пути аксонов и анализа поведения. Животным, предназначенным для отслеживания пути аксонов (п=5 в каждой группе) и анализа поведения (п=7 в каждой группе), обеспечивали выживание в течение 1 месяца.
Р1иого-Оо1б (РО, 6% мас./об., Р1иогосйготе) использовали для мечения нейронов К8Т, аксоны которых регенерировали, пересекая рубец повреждения, и повторно вошли в каудальный спинной мозг. За двое суток до окончания периода выживания после повреждения (1 месяц), животных подвергали наркозу внутрибрюшинной инъекцией кетамина (80 мг/кг) и ксилазина (8 мг/кг). Проводили дорзальную ламинэктомию, и идентифицировали сегмент позвоночника Т2. РО в объеме 0,5 мл вводили вручную в правую часть спинного мозга Т2 с использованием шприца Гамильтона. Через двое суток животных подвергали анестезии и фиксировали летальной дозой кетамина (150 мг/кг) и ксилазина (8 мг/кг), и их перфузировали внутрисердечно физраствором и далее 400 мл фиксирующего раствора, содержащего 4% параформальдегида в 0,1хРВ8. Удаляли головной и спинной мозг, фиксировали их после изъятия в течение ночи и затем помещали в 30% раствор сахарозы в фосфатном буфере. Из тканей головного и спинного мозга получали срезы толщиной 30 мм на криостате и монтировали их в покрытые желатином слайды. Число меченных РО нейронов К8Т на слайде, относящемся к очагу повреждения, выражали в виде процентной доли от общего числа меченных РО нейронов на контралатеральной интактной стороне. Данную процентную долю в группах сравнивали статистически с использованием одностороннего дисперсионного анализа с последующим расчетом теста множественных сравнений Тикеу-Кгатег. Как показано в табл. 3, 8р35-Рс в концентрации 2 мкг/мл способствовал выживанию нейронов руброспинального тракта (К8Т).
Таблица 3
Обработка Процент выживания нейронов В.ЗТ (± ст.ош.ср.)
РВЗ 17,1+2
Зр35-Гс 31,9+1,5
Контроль-Ес 14,5±2,1
Для анализа поведения оценивали применение передних конечностей во время спонтанного исследования в вертикальном направлении через месяц после различных способов обработки, как описано (Ι,ίιι е! а1., 1999) с небольшими модификациями. Крыс помещали в чистый плексигласовый цилиндр (15 см в диаметре и 30 см в высоту), где допускали применение передних конечностей для исследования в вертикальном направлении в течение 5 мин. Проводили подсчет следующих типов поведения: (1) независимое использование левых (неповрежденных) или правых (неповрежденных) передних конечностей для контакта со стенкой цилиндра; и (2) одновременное использование обоих передних конечностей для контакта со стенкой цилиндра. Поведение по исследованию в вертикальном направлении выражали в плане (1) процентной доли использования левой (неповрежденной) передней конечности по отношению к общему числу применения поврежденной, неповрежденной и обеих конечностей; (2) процентной доли использования правой (поврежденной) передней конечности по отношению к общему числу применения поврежденной, неповрежденной и обеих конечностей; и (3) процентной доли использования обеих конечностей по отношению к общему числу применения поврежденной, неповрежденной и обеих конечностей. Различия между группами тестировали посредством одностороннего дисперсионного анализа с последующим «роз! йос»-анализом Бонферрони. Обработанные 8р35-Рс животными характеризовались значительно улучшенной подвижностью передних конечностей: 30% использования обеих передних конечностей у обработанных 8р35-1-Рс животных по сравнению с 10% использования обоих передних конечностей у обработанных контролем-Рс или РВ8 животных; 55% использования левой (неповрежденной) конечности по сравнению с 80% использования у обработанных контролем-Рс или РВ8 животных; и 29% использования правой (поврежденной) конечности по сравнению примерно с 15% у обработанных контролем-Рс или РВ8 животных.
Пример 19. 8р35-Рс способствует выживанию клеток ганглия сетчатки (КОС) в модели пересечения зрительного нерва.
- 24 010055
Авторы изобретения далее подтверждали активность Зр35 с использованием модели пересечения зрительного нерва, в которой исследуются факторы, воздействующие на функцию нейронов. В данном исследовании использовались молодые половозрелые самки крыс Зргадие Эач1еу (ЗЭ). Правый зрительный нерв каждого животного пересекали интраорбитально в 1,5 мм от оптического диска. Кусочек гелевой губки, пропитанной 6% Е1иого-Оо1й (ЕС), наносили на только что пересеченный участок справа сзади от птического диска для мечения выживающих клеток ганглия сетчатки (КОС). Животные, подразделенные на 6 групп (п=6 в каждой группе), получали Зр35-Ес, человеческий 1дО1, или просто РВЗ, путем инъекции в желтое пятно. Объем каждой инъекции в желтое пятно составлял 4 мл, причем дозировка каждой инъекции равнялась 2 мг. Инъекции в желтое пятно проводили непосредственно после пересечения зрительного нерва.
Всем животным обеспечивали выживание в течение 1 недели. За два дня до фиксации животных пересекали левый зрительный нерв каждого животного, и применяли 6% ЕС для мечения выживших КОС, которые служат внутренним контролем. Животных фиксировали передозировкой нембутала, и препарировали сетчатку в 4% параформальдегиде. Для разделения сетчатки на четыре квадранта (верхний, нижний, носовой и височный) делали четыре радиальных разреза. Затем сетчатку фиксировали после препарирования в том же фиксирующем растворе в течение 1 ч, после чего ее препараты монтировали в слайды с использованием специальной среды (Иако). Слайды оценивали в флуоресцентном микроскопе с использованием ультрафиолетового фильтра (длина волны возбуждения=330-380 нм). Меченые КОС подсчитывали по средней линии каждого квадранта, начиная с оптического диска и до периферического края сетчатки с интервалами 500 мм, с использованием окулярной сетки 200x200 мм. Процентную долю выживших в результате каждого вида обработки КОС выражали путем сравнения числа выживших КОС в поврежденному глазу с таковым в противоположном глазу. Все данные выражали в виде среднего значения±стандартная ошибка среднего. Статистическую значимость оценивали посредством одностороннего дисперсионного анализа с последующим «рок! йос»-тестом Тикеу-Кгатег. Различия считали значимыми для р<0,05. Обработанные Зр35-Ес животные характеризовались значимым выживанием нейронов (83%) по сравнению с животными, обработанными контролем-Ес или РВЗ, которые характеризовались выживанием нейронов, примерно равным лишь 50%.
Другие варианты осуществления.
Другие варианты осуществления входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
- 25 010055
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ΒΙΟΟΕΝ ЮЕС МА, ΙΝ0.
ΜΙ, ЗНА мссоу, σοΗΝ
ΡΕΡΙΝ3ΚΥ, К. ВЬАКЕ
ЬЕЕ, ΟΑΝΙΕΙ, Н. 3.
<120> БЕЛОК, СВЯЗЫВАЮЩИЙ РЕЦЕПТОР ΝΟΟΟ <130> А183 РСТ <140> РСТ/и304/008323 <141> 2004-03-17 <150> 60/455,756 <151> 2003-03-19 <150> 60/480,241 <151> 2003-06-20 <150> 60/492,057 <151> 2003-08-01 <160> 41 <170> Рагепг1п Уег. 3.2 <210> 1 <211> 2882 <212> ДНК <213> Ното заргепз <220>
<221> модифицированное_основание <222> (2361) <223> а, Г, с или д <220>
<221> модифицированное_основание <222> (2366) <223> а, Р, с или д
- 26 010055 <220>
<221> модифицированное_основание <222> (2844) <223> а, к, с или д <220>
<221> модифицированное_основание <222> (2846) <223> а, к, с или д <220>
<221> модифицированное_основание <222> (2856) <223> а, к, с или д <220>
<221> модифицированное_основание <222> (2862) <223> а, к, с или д <220>
<221> модифицированное_основание <222> (2865) <223> а, к, с или д <400> 1
ддададаса-Ь дсдаЩддкд ассдадссда дсддассдаа ддсдсдсссд адакдсаддк 60
дадсаададд акдскддсдд ддддсд-Ьдад дадсакдссс адсссссксс кддсскдскд 120
дсадсссакс сЪсскдскдд кдскдддскс адкдсЕдкса ддсксддсса сдддскдссс 180
дссссдсЕдс дадЕдскссд сссаддассд сдскдЕдскд Едссассдса адсдсЩ+дк 240
ддсадЪсссс дадддсаксс ссассдадас дсдссГдскд дасскаддса адаассдсак 300
саааасдскс аассаддасд ад+Ьсдссад скксссдсас сЪддаддадс ЕддадсЕсаа 360
сдадаасакс дЕдадсдссд Еддадсссдд сдссЕЕсаас аассЪсккса асскссддас 420
дсЕдддРскс сдсадсаасс дсскдаадсЕ саксссдска ддсдксЩса скддссксад 480
саасскдасс аадскддаса ксадсдадаа саадаФФдМ: аксскаскдд ас+асакдЫ 540
Есаддасскд Еасаасскса адксаскдда дд+кддсдас аакдассксд ЕскасаЕскс 600
ксассдсдсс Ексадсддсс ксаасадсск ддадсадскд асдскддада аакдсаасск 660
дасскссакс сссассдадд сдсЕдРссса скдсасддсс ГсаЕсдЕсск даддскссдд 720
сассксааса ЕсааЕдссас сдддаскаск сскксаадад дсксЕассда сксааддЕск 780
Еддадакссс сасЕддссск асЕЕддасас саЕдасассс ааскдсскск асддссксаа 840
сскдасдксс сЕдкссакса сасаскдсаа ЕсЕдассдсЪ дкдсссЕсск ддссдкссдс 900
сассЕадЕск аЕсЕссдскк ссксаасскс ЕссЕасассс саксадсасс а££дадддс± 960
ссакдккдса ГдадскдсЕс сддсксадда дакссадскд дкдддсдддс адскддссдк 1020
- 27 010055
ддкддадссс ЬаЬдсБЬссд сддссБсаас БассЬдсдсд ЬдсЬсааЬдЬ сксЬддсаас 1080
садкдассас аскддаддаа БсадЬсЬЬсс асЬсддкддд саасскддад асасксаЬсс 1140
ЬддасЬссаа сссдскддсс ЬдсдасЬдкс ддсЬссЬдкд дддЫссддс дссдскддсд 1200
дсЬсаасЬЬс аассддсадс адсссасдкд сссасдсссд адЬккдЬсса дддсааддад 12 60
ЫсааддасБ ЬсссЬдакдЬ скасЬдссса аскасЫсас сЬдссдссдс дсссдсаЬсс 1320
дддассдсад дсссадсадд ЬдШдЬдда сдадддссас асддкдсадЬ ЬЬдЬдЬдсдд 1380
дссдаЬддсд асссдссдсс сдссаЬсскс ЬддсЬсЬсас сссдааасас скддЬсЬсад 1440
ссаададсаа ЬдддсддсЬс асадксЬЬсс сЬдакдсасд сЬддаддкдс дскасдссса 1500
ддЬасаддас аасддсасдк ассЬдЬдсак сдсддссаас дсдддсддса асдаскссаЬ 1560
дсссдсссас сЬдсакдЬдс дсадскасЬс дсссдаскдд ссссаксадс ссаасаадас 1620
сЬЬсдсЬЬЬс акскссаасс адссдддсда дддададдсс аасадсассс дсдссаскдЬ 1680
дссШсссс БЬсдасаЬса адасссЬсаЬ саЬсдссасс ассакдддсБ БсаБсБсБББ 1740
сскдддсдЬс дЬссЬсЬЬск дссЬддкдсЬ дсЬдЬЬЬсЬс Ьддадссддд дсаадддсаа 1800
сасааадсас аасаксдада ЬсдадкаЬдЬ дссссдааад Ьсддасдсад дсаксадсЬс 1860
сдссдасдсд ссссдсаадЬ ссаасаЬдаа даЬдаиасда ддссддддсд дддддсаддд 1920
асссссдддс ддссдддсад дддааддддс скддссдсса ссЬдсЬсасЬ сЪссадЬсск 1980
ЬсссассЬсс ЬсссЬасссЬ ЬсЬасасасд ЬЬсЬсЬЬБсЬ сссксссдсс ЬссдЬссссЬ 2040
дсЬдсссссс дссадссскс ассасскдсс сЬссЬЪсЬас саддасскса даадсссада 2100
сскддддасс ссасскасас аддддсаЬЬд асадаскдда дЬЬдааадсс дасдаассда 2160
сасдсддсад адЬсааЬаак ЬсааЬааааа адЫасдаас БББсБсБдБа асЬЬдддЬЬЬ 2220
сааЬааЬЬаЬ дда-ЬЬккЬаЬ даааасЬЬда аакаакаааа ададаааааа асЬаЬЬкссЬ 2280
акадскадкс ддааЬдсааа сПЫдасдк ссЬдаЬЬдск ссадддсссЬ сЬЬссаасЬс 2340
адЫБсЫдБ ШШсШ пЬссЬпсЬсс БсЫсББссБ ссЫБсБсББ сБсББссссс 2400
адкддддадд даЬсасксад даааасадда ааддаддЫс садссссасс сасскдссса 2460
ссссдсссса ддсассакса ддадсаддск адддддсадд сскдддссса дсЬссдддск 2520
ддсЫБЫдс адддсдсадд Ьддаддддас аддкскдссд акдддддЬдд дадссЬдксЬ 2580
дскдддсЬдс саддсддсас саскдсаадд ддЬдддадсс БддсЬсдддЬ дкддсЬдада 2640
сЬскддасад аддскддддЬ ссЬссЪдддд дасадсасад ЬсадЬддада дадссадддд 2700
скддаддЬдд ддсссасссс адссЬсЬддЬ сссадсксЬд сЬдсЬсасЬЬ дскдЬдЬддс 2760
ссксаадсад дкссасЬддс сЬсксЬдддс сБсадЬсЬсс асаЬскдЬас ааакдддаас 2820
аЬЬасссссЬ дссскдссЬа ссЬпападдд сЬдкЬпкдад дпакпдаЬда даЬдаЬдЬаЬ 2880
дк 2882
<210> 2 <211> 614 <212> БЕЛОК <213> Ното зараепз <400> 2
Мек Беи А1а С1у 61у Уа1 Агд Зег Мек Рго Зег Рго Ьеи Ьеи А1а Суз
10 15
- 28 010055
Тгр 61η Рго Не Ьеи 20 Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи 61у 25 Зег Уа1 Ьеи Зег 30 61у Зег
А1а ТЬг 61у Суз Рго Рго Агд Суз С1и Суз Зег А1а 61п Азр Агд А1а
35 40 45
Уа1 Теи Суз Н1з Агд Ьуз Агд Рке 7а1 А1а Уа1 Рго 61и С1у Не Рго
50 55 60
ТЬг С1и Ткг Агд Ьеи Ьеи Азр Ьеи С1у Ьуз Азп Агд Не Ьуз Ткг Ьеи
65 70 75 80
Азп С1п Азр 61и РЬе А1а Зег Рке Рго Н13 Ьеи С1и 61и Ьеи 61и Ьеи
85 90 95
Азп С1и Азп Не Уа1 Зег А1а Уа1 С1и Рго С1у А1а Рке Азп Азп Ьеи
100 105 110
РЬе Азп Ьеи Агд Ткг Ьеи 61у Ьеи Агд Зег Азп Агд Ьеи Ьуз Ьеи Не
115 120 125
Рго Ьеи 61у Уа1 Рке Ткг 61у Ьеи Зег Азп Ьеи Ткг Ьуз Ьеи Азр Не
130 135 140
Зег 61и Азп Ьуз Не Уа1 Не Ьеи Ьеи Азр Туг Мек Рке 61п Азр Ьеи
145 150 155 160
Туг Азп Ьеи Ьуз Зег Ьеи 61и Уа1 С1у Азр Азп Азр Ьеи Уа1 Туг Не
165 170 175
Зег Н13 Агд А1а Рке Зег 61у Ьеи Азп Зег Ьеи 61и 61п Ьеи Ткг Ьеи
180 185 190
61и Ьуз Суз Азп Ьеи Ткг Зег Не Рго Ткг 61и А1а Ьеи Зег Н1з Ьеи
195 200 205
Н13 С1у Ьеи Не Уа1 Ьеи Агд Ьеи Агд ΗΪ3 Ьеи Азп Не Азп А1а 11е
210 215 220
Агд Азр Туг Зег Рке Ьуз Агд Ьеи Туг Агд Ьеи Ьуз Уа1 Ьеи 61и Не
225 230 235 240
- 29 010055
Зег ΗΪ3 Тгр Рго Туг Ьеи Азр ТЬг МеЬ ТЬг Рго Азп Суз 250 Ьеи Туг 255 С1у
245
Ьеи Азп Ьеи ТЬг Зег Ьеи Зег Ые ТЬг ΗΪ3 Суз Азп Ьеи ТЬг А1а Уа1
260 265 270
Рго Туг Ьеи А1а Уа1 Агд Низ Ьеи Уа1 Туг Ьеи Агд РЬе Ьеи Азп Ьеи
275 280 285
Зег Туг Азп Рго Ые Зег ТЬг Ые С1и С1у Зег Мек Ьеи ΗΪ3 С1и Ьеи
290 295 300
Ьеи Агд Ьеи С1п С1и Ые С1п Ьеи Уа1 С1у С1у С1п Ьеи А1а Уа1 Уа1
305 310 315 320
С1и Рго Туг А1а РЬе Агд С1у Ьеи Азп Туг Ьеи Агд Уа1 Ьеи Азп Уа1
325 330 335
Зег С1у Азп С1п Ьеи ТЬг ТЬг Ьеи С1и С1и Зег Уа1 РЬе ΗΪ3 Зег Уа1
340 345 350
С1у Азп Ьеи С1и ТЬг Ьеи Ые Ьеи Азр Зег Азп Рго Ьеи А1а Суз Азр
355 360 365
Суз Агд Ьеи Ьеи Тгр Уа1 РЬе Агд Агд Агд Тгр Агд Ьеи Азп РЬе Азп
370 375 380
Агд С1п С1п Рго ТЬг Суз А1а ТЬг Рго С1и РЬе Уа1 С1п С1у Ьуз С1и
385 390 395 400
РЬе Ьуз Азр РЬе Рго Азр Уа1 Ьеи Ьеи Рго Азп Туг РЬе ТЬг Суз Агд
405 410 415
Агд А1а Агд Не Агд Азр Агд Ьуз А1а С1п С1п Уа1 РЬе Уа1 Азр С1и
420 425 430
С1у Н13 ТЬг Уа1 С1п РЬе Уа1 Суз Агд А1а Азр С1у Азр Рго Рго Рго
435 440 445
А1а Не Ьеи Тгр Ьеи Зег Рго Агд Ьуз ΗΪ3 Ьеи Уа1 Зег А1а Ьуз Зег
450 455 460
- 30 010055
АЗП 465 С1у Агд Ьеи ТЬг Уа1 470 РЬе Рго Азр С1у ТЪг Ьеи С1и Уа1 475 Агд Туг 480
А1а С1п Уа1 С1п Азр Азп С1у ТЬг Туг Ьеи Суз 11е А1а А1а Азп А1а
485 490 495
С1у С1у Азп Азр Зег МеЬ Рго А1а Н1з Ьеи ΗΪ3 Уа1 Агд Зег Туг Зег
500 505 510
Рго Азр Тгр Рго ΗΪ3 С1п Рго Азп Ьуз ТНг РЬе А1а РНе 11е Зег Азп
515 520 525
С1п Рго С1у 61и С1у С1и А1а Азп Зег ТЬг Агд А1а ТЬг Уа1 Рго РЪе
530 535 540
Рго РНе Азр 11е Ьуз ТЬг Ьеи 11е 11е А1а ТЬг ТЬг Мек С1у РНе Не
545 550 555 560
Зег РИе Ьеи С1у Уа1 Уа1 Ьеи РНе Суз Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи РНе Ьеи Тгр
565 570 575
Зег Агд 61у Ьуз С1у Азп ТИг Ьуз Н13 Азп 11е С1и 11е С1и Туг Уа1
580 585 590
Рго Агд Ьуз Зег Азр А1а С1у 11е Зег Зег А1а Азр А1а Рго Агд Ьуз
595 600 605
РНе Азп Мек Ьуз Мек Не
610 <210> 3 <211> 59 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 3
Ьсдадааааа адаЬсдЬсаЬ ссЬдсТадас ЬсЬсЬЬдаад ЬсЬадсадда ЬдасдаЬса 59
- 31 010055 <210> 4 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 4
Агд Агд А1а Агд 11е Агд Азр Агд Ьуз
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Ното зарЬепз
<400> 5
Луз Ьуз Уа1 Ьуз Уа1 Ьуз С1и Ьуз Агд
1 5
<210> 6 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> б Агд Агд Ьеи Агд Ьеи Агд Азр Агд Ьуз
1 5
<210> 7 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 7 Агд Агд С1у Агд С1у Агд Азр Агд Ьуз
5 <210> 8 <211> 9
- 32 010055
<212> БЕЛОК
<213> Ното зарЬепз
<400> 8
Агд Агд Не Агд А1а Агд Азр Агд Ьуз
5
<210> 9
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Ното зарЬепз
<400> 9
Мер О1п Уа1 Зег Ьуз Агд
5
<210> 10
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Ното зарЬепз
<400> 10
Ьеи Зег Рго Агд Ьуз Н±з
1 5
<210> 11
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Ното зарЬепз
<400> 11
11е ТЬг Рго Ьуз Агд Агд
1 5
<210> 12
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Ното зарЬепз
- 33 010055 <400> 12
А1а Суз Рго Н13 ΗΪ3 Ьуз
5 <210> 13 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Ното зар1епз <400> 13
Уа1 Бег Рго Агд Ьуз ΗΪ3
5 <210> 14 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 14 ааддсссадс аддЬдЬЬЬдЬ дда 23 <210> 15 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 15
БасЬсдаксЬ сдаЬдЬЬдЬд сЬЬЬ 24 <210> 16 <211> 37 <212> ДНК
- 34 010055 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер
<400> 16
садсаддЕсд асдсддссдс аЕдсЕддсдд ддддсд! 37
<210> 17
<211> 29
<212> ДНК
<213> Ното зартепз
<400> 17
садсадд+сд ассЕсдсссд дсЪддР+дд 29
<210> 18
<211> 37
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер
<400> 18
ааккаадаа! 1сасдддс1д сссдссссдс Едсдад! 37
<210> 19
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер
<400> 19
ГаЕаЕГГсЕа даксасЕсдс ссддскддИ ддадаЕдааа деда 44
<210> 20
- 35 010055 <211> 44 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 20 с£1дасасдд даЕссдсддс сдсаЕдсЪдд сддддддсд! дадд 44 <210> 21 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 21 дсадсддддс дддсадсссд Рддссдадсс ЕдасадсасЕ дадсс 45 <210> 22 <211> 44 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 22 сЕРдасасдд даЕссдсддс сдсаЕдсЕдд сддддддсдЕ дадд 44 <210> 23 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер
- 36 010055 <400> 23 дксссддаЬд сдддсдсддд ссдадсскда садсаскдад ссса1д 45 <210> 24 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности! праймер <400> 24 аЬаЬЕсЕада аЕдсЬддсдд ддддсдЬдад 30 <210> 25 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 25 акаЕасЕадЕ дЕсдЬЕдссд сссдсдЕЕдд 30
<210> 26
<211> 46
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательностЦ: праймер
<400>
<210> 27
<211> 46
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
- 37 010055 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 27 садддаЕссд сддсссРада РсасЕсдЕсс асааасассЕ дсбддд 46 <210> 28 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 28 сдссдсдсас ссдддЕдаа1: Рссдсдсссд саЕссдддас сдс 43 <210> 29 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 29 дсддБсссдд аЕдсдддсдс ддааББсасс сдддЕдсдсд дед 43 <210> 30 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 30 сдссдсдсас ссдддЕдааБ Бсдсссадса ддбдШдГд дас 43 <210> 31
- 38 010055 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 31 дЬссасааас ассЬдсЬддд сдааЬЬсасс сдддЬдсдсд дед 43 <210> 32 <211> 46 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 32 саЬссЬсЬдд сЬсЬсасссд ааааддЬасЬ ддЬсЬсадсс аададс 46 <210> 33 <211> 46 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 33 дсЬсЬЬддсЬ дадассадЬа ссЬЬЬЬсддд Ьдададссад аддаЬд 46 <210> 34 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 34
Бег Рго Агд Ьуз Нтз
5
- 39 010055 <210> 35 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 35 ааРЕаадсдд ссдсаЕдсГд дсддддддсд ΐ 31 <210> 36 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 36 ааЕЕаадсдд ссдсЕЕЪдЕс аЕдЕ <210> 37 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 37 даРЕасЕсда даЕдсЕддсд дддддсдрда дд 32 <210> 38 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 40 010055 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 38 сдсдддаайй οΕσβίΒ^ΟΒΐ сШса±дМ:д аасШд 36 <210> 39 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 39 дссЕЕссдсд дссГсаасйа ссЕдсдсдЕд сйс 33 <210> 40 <211> 75 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 40 ссддааййсй саадсдйаай саддаасдЕс дйаадддЕай айсаЪсййса ЕдПдаасЕЕ 60 дсддддсдсд Есддс 75 <210> 41 <211> 55 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 41
ЕдаЕсдЕсаЕ ссйдсЕадас Псаададад ЕсЕадсадда ЕдасдаЕсЕЕ ЬШс 55

Claims (37)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид Зр35, выбранный из группы, состоящей из:
    (a) полипептида, содержащего аминокислоты 34-532 последовательности ЗЕО ΙΌ N0: 2;
    (b) полипептида, содержащего аминокислоты 34-417 последовательности ЗЕО ΙΌ N0: 2;
    (c) полипептида, содержащего аминокислоты 34-432 последовательности ЗЕО ΙΌ N0: 2;
    (й) полипептида, содержащего аминокислоты 417-531 последовательности ЗЕО ΙΌ N0: 2;
    (е) полипептида, содержащего аминокислоты 425-531 последовательности ЗЕО ΙΌ N0: 2;
    (ί) полипептида, содержащего аминокислоты 1-531 последовательности ЗЕО ΙΌ N0: 2;
    (д) полипептида, содержащего аминокислоты 433-493 последовательности ЗЕО ΙΌ N0: 2;
    (к) полипептида, содержащего ЬКК-домен Зр35, основную область Зр35, расположенную с С-конца относительно ЬКК-домена, иммуноглобулиновый (Ιβ) домен Зр35, расположенный с С-конца относительно основной области, и, необязательно, функциональный цитоплазматический домен, но лишенного трансмембранного домена;
    (ί) полипептида, содержащего Ιβ-домен Зр35, но лишенного ЬКК-домена Зр35, основной области Зр35, трансмембранного домена и функционального цитоплазматического домена;
    (ί) полипептида, содержащего ЬКК-домен Зр35, но лишенного Ιβ-домена Зр35, основной области Зр35, трансмембранного домена и функционального цитоплазматического домена;
    (k) полипептида, содержащего ЬКК-домен Зр35, основную область, Ιβ-домен, соединяющую последовательность и трансмембранный домен, но лишенного функционального цитоплазматического домена;
    (l) полипептида, такого как указано в (к), не содержащего функционального цитоплазматического домена;
    (т) полипептида, содержащего аминокислоты 417-424 последовательности ЗЕО ΙΌ N0: 2;
    (п) полипептида, содержащего аминокислоты 494-551 последовательности ЗЕО ΙΌ N0: 2;
    (о) полипептида, содержащего аминокислоты 1-576 последовательности ЗЕО ΙΌ N0: 2;
    причем полипептид, кодируемый указанной нуклеиновой кислотой, снижает ингибирование аксонального роста нейронов центральной нервной системы.
  2. 2. Выделенная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, в основном состоящий из области Зр35, выбранной из группы, включающей:
    (Ι) ЗРККН (ЗЕО ΙΌ N0: 34);
    (ΙΙ) ЬЗРККН (ЗЕО ΙΌ N0: 10);
    (ΙΙΙ) ПТККК (ЗЕО ΙΌ N0: 11);
    (Ιν) АСРННК (ЗЕЦ ΙΌ N0: 12) и (V) VЗРККН (ЗЕО ΙΌ N0: 13), причем полипептид, кодируемый указанной нуклеиновой кислотой, снижает ингибирование аксонального роста нейронов центральной нервной системы.
  3. 3. Нуклеиновая кислота по п.2, где указанный полипептид циклизован.
  4. 4. Нуклеиновая кислота по п.1 или 2, дополнительно содержащая полинуклеотид, кодирующий гетерологичный пептид, слитый с указанным полипептидом Зр35.
  5. 5. Нуклеиновая кислота по п.4, где гетерологичный пептид выбран из группы, состоящей из пептида Ιβ, сывороточного альбумина, направляющего пептида, маркерного пептида и пептида, облегчающего очистку.
  6. 6. Нуклеиновая кислота по п.5, где пептид Ιβ представляет собой пептид Ес.
  7. 7. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.1 или 2.
  8. 8. Вектор по п.7, где указанная нуклеиновая кислота функционально связана с последовательностью, контролирующей экспрессию.
  9. 9. Вектор по любому из пп.7 или 8, являющийся вирусным вектором.
  10. 10. Клетка хозяина, содержащая вектор по любому из пп.7-9.
  11. 11. Клетка хозяина по п.10, которая экспрессирует полипептид Зр35.
  12. 12. Выделенный полипептид Зр35, кодируемый нуклеиновой кислотой по любому из пп.1-6, снижающий ингибирование аксонального роста нейронов центральной нервной системы.
  13. 13. Полипептид по п.12, конъюгированный с полимером.
  14. 14. Полипептид по п.13, где полимер выбран из группы, состоящей из полиалкиленгликоля, сахарного полимера и полипептида.
  15. 15. Полипептид по п.14, где полиалкиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ).
  16. 16. Полипептид по п.15, где полипептид конъюгирован с одним, двумя или четырьмя полимерами.
  17. 17. Полипептид по п.16, где общая молекулярная масса полимеров составляет от 20000 до 40000 Да.
  18. 18. Антитело, которое специфически связывается с полипептидом по любому из пп.12-17, или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, причем указанные антитело или антиген-связывающий фрагмент снижают ингибирование аксонального роста нейронов центральной нервной системы (ЦНС).
    - 42 010055
  19. 19. Молекула интерферирующей РНК (РНК1), которая специфически связывается с полинуклеотидом по п.1 или 2 и снижает ингибирование роста аксонов нейронов центральной нервной системы.
  20. 20. Молекула РНК1 по п.19, где указанная молекула РНК1 представляет собой малую шпилечную РНК (зБРНК) и кодируется молекулой ДНК, содержащей последовательность 8ЕЦ ΙΌ NО: 41 или 8ЕЦ ΙΌ
    42.
  21. 21. Способ ш νίΙΐΌ ингибирования трансдукции сигнала за счет ^Κ1, включающий обеспечение контакта ХдК.1 -экспрессирующей клетки с эффективным количеством полипептида 8р35 по любому из пп.12-17, или антитела, или его фрагмента по п.18.
  22. 22. Способ ш νΐΐΐΌ снижения ингибирования роста аксонов нейронов центральной нервной системы (ЦНС), включающий обеспечение контакта указанных нейронов с эффективным количеством полипептида 8р35 по любому из пп.12-17, или антитела, или его фрагмента по п.18.
  23. 23. Способ 1п νίΙΐΌ ингибирования разрушения конуса роста нейронов ЦНС, включающий обеспечение контакта указанных нейронов с эффективным количеством полипептида 8р35 по любому из пп.1217, или антитела, или его фрагмента по п.18.
  24. 24. Способ 1п νίΙΐΌ стимуляции выживания нейронов при риске их гибели, включающий обеспечение контакта указанных нейронов с эффективным количеством полипептида 8р35 по любому из пп.1217, или антитела, или его фрагмента по п.18.
  25. 25. Применение вектора по любому из пп.7-9 для получения лекарственного средства для лечения заболевания, нарушения или повреждения ЦНС у млекопитающего, где полипептид 8р35, кодируемый нуклеотидной последовательностью, в указанном векторе экспрессируется в клетках млекопитающего в количестве, достаточном для снижения ингибирования аксонального роста нейронов в участке повреждения или вблизи него.
  26. 26. Применение по п.25, где указанный вектор представляет собой вирусный вектор, который выбран из группы, состоящей из аденовирусного вектора, лентивирусного вектора, бакуловирусного вектора, вектора на основе вируса Эпштейна-Барр, паповавирусного вектора, вектора на основе вируса коровьей оспы и вектора на основе вируса простого герпеса.
  27. 27. Применение по п.25, где указанный вектор представляет собой вирусный вектор, который вводят путем, выбранным из группы, состоящей из местного введения, внутриглазного введения, парентерального введения, интратекального введения, субдурального введения и подкожного введения.
  28. 28. Применение клетки-хозяина по п.10 или 11 для получения лекарственного средства для лечения заболевания, нарушения или повреждения ЦНС у млекопитающего.
  29. 29. Применение по п.23, где клетка-хозяин происходит из клеток млекопитающего, подлежащего лечению.
  30. 30. Применение полипептида 8р35 по любому из пп.12-17 для получения лекарственного средства для лечения заболевания, нарушения или повреждения ЦНС у млекопитающего.
  31. 31. Применение по любому из пп.25-27 или 30, где указанный полипептид 8р35 стимулирует миелинизацию.
  32. 32. Применение антитела или его фрагмента по п.18 для получения лекарственного средства для лечения заболевания, нарушения или повреждения ЦНС у млекопитающего.
  33. 33. Применение молекулы РНК1 по п.19 или 20 для получения лекарственного средства для лечения заболевания, нарушения или повреждения ЦНС.
  34. 34. Применение по любому из пп.25-33, где заболевание, нарушение или повреждение ЦНС представляет собой повреждение спинного мозга или повреждение зрительного нерва.
  35. 35. Применение по любому из пп.25-34, где указанное лекарственное средство является подходящим для стимуляции выживания нейронов при риске их гибели у млекопитающего с нейродегенеративным заболеванием, нарушением или повреждением.
  36. 36. Применение по любому из пп.25-35, где указанное лекарственное средство вводят в участок заболевания, нарушения или повреждения ЦНС или вблизи него.
  37. 37. Применение по любому из пп.25-36, где заболевание, нарушение или повреждение ЦНС выбрано из группы, состоящей из рассеянного склероза, бокового амиотрофического склероза (АЬ8), болезни Гентингтона, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, диабетической невропатии, инсульта, травматического повреждения головного мозга и повреждения спинного мозга.
EA200501480A 2003-03-19 2004-03-17 ВЫДЕЛЕННАЯ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД Sp35, ПОЛИПЕПТИД Sp35 И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ПОЛИПЕПТИДА EA010055B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US45575603P 2003-03-19 2003-03-19
US48024103P 2003-06-20 2003-06-20
US49205703P 2003-08-01 2003-08-01
PCT/US2004/008323 WO2004085648A2 (en) 2003-03-19 2004-03-17 Nogo receptor binding protein

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200501480A1 EA200501480A1 (ru) 2006-02-24
EA010055B1 true EA010055B1 (ru) 2008-06-30

Family

ID=33102167

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200501480A EA010055B1 (ru) 2003-03-19 2004-03-17 ВЫДЕЛЕННАЯ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД Sp35, ПОЛИПЕПТИД Sp35 И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ПОЛИПЕПТИДА

Country Status (27)

Country Link
US (5) US7785829B2 (ru)
EP (3) EP2248899B8 (ru)
JP (3) JP5341311B2 (ru)
KR (1) KR101106441B1 (ru)
AT (1) ATE479754T1 (ru)
AU (2) AU2004223464C1 (ru)
BR (1) BRPI0408501A (ru)
CA (1) CA2519227C (ru)
CY (2) CY1111097T1 (ru)
DE (1) DE602004028916D1 (ru)
DK (2) DK2248899T3 (ru)
EA (1) EA010055B1 (ru)
ES (1) ES2537015T3 (ru)
GE (1) GEP20094629B (ru)
HK (3) HK1085764A1 (ru)
HU (1) HUE025347T2 (ru)
IL (1) IL170721A (ru)
IS (1) IS2786B (ru)
MX (1) MXPA05009913A (ru)
NO (1) NO336530B1 (ru)
NZ (1) NZ607886A (ru)
PL (3) PL1606409T3 (ru)
PT (2) PT2248899E (ru)
RS (1) RS54160B1 (ru)
SI (2) SI2248899T1 (ru)
UA (1) UA87106C2 (ru)
WO (1) WO2004085648A2 (ru)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA05009913A (es) 2003-03-19 2005-11-04 Biogen Idec Inc Proteina enlazadora del receptor nogo.
RS52593B (en) * 2004-06-24 2013-04-30 Biogen Idec Ma Inc. TREATMENT OF THE CONDITIONS CONCERNING DEMYELINIZATION
JP5060293B2 (ja) 2004-08-03 2012-10-31 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 神経機能におけるｔａｊ
EP1681565B1 (de) * 2005-01-14 2011-07-06 Abbott GmbH & Co. KG Zellulärer RhoGTPase Aktivierungs-Assay
SG10201508322SA (en) 2005-07-08 2015-11-27 Biogen Ma Inc Sp35 antibodies and uses thereof
US20090175846A1 (en) * 2005-10-27 2009-07-09 Biogen Idec Ma Inc Oligodendrocyte-Myelin Glycoprotein Compositions and Methods of Use Thereof
EP1959979A4 (en) * 2005-11-04 2010-01-27 Biogen Idec Inc METHODS FOR PROMOTING NEURITY GROWTH AND SURVIVAL OF DOPAMINERGIC NEURONS
JP5312039B2 (ja) * 2005-12-02 2013-10-09 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 脱髄の関与する状態の処置
JP2009544703A (ja) * 2006-07-24 2009-12-17 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストの投与により髄鞘形成、ニューロンの生存および希乏突起膠細胞の分化を促進するための方法
CN103351437A (zh) 2006-11-17 2013-10-16 诺瓦提斯公司 Lingo结合分子及其制药用途
SG177966A1 (en) * 2007-01-09 2012-02-28 Biogen Idec Inc Sp35 antibodies and uses thereof
US8128926B2 (en) 2007-01-09 2012-03-06 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
US20100297121A1 (en) * 2007-10-11 2010-11-25 Biogen Idec Ma Inc. Methods for Treating Pressure Induced Optic Neuropathy, Preventing Neuronal Degeneration and Promoting Neuronal Cell Survival Via Administration of LINGO-1 Antagonists and TrkB Agonists
AU2008325107B2 (en) * 2007-11-08 2015-04-23 Biogen Ma Inc. Use of LINGO-4 antagonists in the treatment of conditions involving demyelination
AU2009269099B2 (en) 2008-07-09 2016-03-10 Biogen Ma Inc. Compositions comprising antibodies to LINGO or fragments thereof
US20130231464A1 (en) * 2010-04-28 2013-09-05 Oncolmmune, Inc. Methods of use of soluble cd24 for therapy of rheumatoid arthritis
JP2012048656A (ja) * 2010-08-30 2012-03-08 Canon Inc 画像処理装置、画像処理方法
JP2015518829A (ja) 2012-05-14 2015-07-06 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 運動ニューロンに関する状態の処置のためのｌｉｎｇｏ−２アンタゴニスト
CA2887682A1 (en) 2012-10-09 2014-04-17 Biogen Idec Ma Inc. Combination therapies and uses for treatment of demyelinating disorders
MX2017009038A (es) 2015-01-08 2017-10-25 Biogen Ma Inc Antagonistas de proteina 1 de interacción con el receptor de nogo que contiene el dominio de inmunoglobulina y repeticiones ricas en leucina (lingo-1) y usos para el tratamiento de trastornos desmielinizantes.
CA2988306A1 (en) 2015-06-05 2016-12-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Triazoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018013714A1 (en) 2016-07-13 2018-01-18 Biogen Ma Inc. Dosage regimens of lingo-1 antagonists and uses for treatment of demyelinating disorders
WO2018106646A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Aminotriazoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018106641A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pyrazoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018106643A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Heterocyclic azoles for the treatment of demyelinating diseases
BR112021017644A2 (pt) 2019-03-11 2021-11-16 Biogen Ma Inc Composições farmacêuticas contendo anticorpos anti-lingo-1

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001012662A2 (en) * 1999-08-17 2001-02-22 Incyte Genomics, Inc. Membrane associated proteins

Family Cites Families (218)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US6054561A (en) 1984-02-08 2000-04-25 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4694778A (en) 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
WO1986005807A1 (en) 1985-04-01 1986-10-09 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
AU631802B2 (en) 1988-06-14 1992-12-10 Cetus Oncology Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
EP0768377A1 (en) 1988-09-02 1997-04-16 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
ZA902949B (en) 1989-05-05 1992-02-26 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
DE69031120T2 (de) 1989-05-19 1998-01-15 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Her2 extrazellulare domäne
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5180820A (en) 1989-08-30 1993-01-19 Barde Yves Alain Brain-derived neurotrophic factor
US5605690A (en) 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
WO1991014438A1 (en) 1990-03-20 1991-10-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5219837A (en) 1990-06-21 1993-06-15 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of stimulating myelination of cells
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5532351A (en) 1990-07-12 1996-07-02 Arch Development Corporation Nucleic acid sequences encoding OMGP
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) * 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) * 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
CA2095836C (en) 1990-11-09 1999-04-06 Stephen D. Gillies Cytokine immunoconjugates
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
CA2108147C (en) 1991-04-10 2009-01-06 Angray Kang Heterodimeric receptor libraries using phagemids
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
EP0590067A1 (en) 1991-06-14 1994-04-06 Xoma Corporation Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
US5756096A (en) 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
JP3571337B2 (ja) * 1992-02-11 2004-09-29 セル ジェネシス，インコーポレーテッド 遺伝子標的現象による同型遺伝子接合
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
WO1994009817A1 (en) 1992-11-04 1994-05-11 City Of Hope Novel antibody construct
DK0669986T3 (da) 1992-11-13 2003-07-28 Idec Pharma Corp Fuldstændigt inaktiverede kozac-sekvenser til ekspression i pattedyr
US5468872A (en) 1993-09-16 1995-11-21 Cephalon, Inc. K-252a functional derivatives potentiate neurotrophin-3 for the treatment of neurological disorders
JP3442784B2 (ja) 1993-11-23 2003-09-02 ジェネンテク，インコーポレイテッド キナーゼ受容体活性化検定法
US5753225A (en) 1993-12-03 1998-05-19 The Regents Of The University Of California Antibodies that mimic actions of neurotrophins
JPH09506262A (ja) 1993-12-08 1997-06-24 ジェンザイム・コーポレイション 特異的抗体の製造方法
PT744958E (pt) 1994-01-31 2003-11-28 Univ Boston Bancos de anticorpos policlonais
GB9402331D0 (en) 1994-02-07 1994-03-30 Univ Mcgill Nerve growth factor structural analogs and their uses
US5877016A (en) 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
DE4447588C2 (de) 1994-05-03 1997-11-20 Omer Osama Dr Dr Med Pflanzliches Arzneimittel zur Behandlung von chronischen und allergischen Rhino-Sino-Bronchitiden
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
WO2001004311A1 (en) 1999-07-07 2001-01-18 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
DE69531877T2 (de) 1994-10-25 2004-07-29 Toyama Chemical Co. Ltd. Ein Wirkstoff für die Forderung von Nervwachstumfaktor Aktivität, der ein 1,2-Ethandiol-Derivat oder ein Salz davon enthält
US5770577A (en) 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6280964B1 (en) 1995-04-14 2001-08-28 The Regents Of The University Of California Binding sites for phosphotyrosine binding domains
ATE390933T1 (de) 1995-04-27 2008-04-15 Amgen Fremont Inc Aus immunisierten xenomäusen stammende menschliche antikörper gegen il-8
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
DE69638269D1 (de) 1995-06-14 2010-11-18 Univ California Hochaffine humane antikörper gegen tumorantigene
US5707829A (en) * 1995-08-11 1998-01-13 Genetics Institute, Inc. DNA sequences and secreted proteins encoded thereby
IT235676Y1 (it) 1995-07-27 2000-07-12 Felice Gaudioso Allestimenti per lo svolgimento del gioco wormhole action match.
GB9525180D0 (en) 1995-12-08 1996-02-07 Univ Mcgill Design of hormone-like antibodies with agonistic and antagonistic fuctions
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US6455277B1 (en) 1996-04-22 2002-09-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding human glial cell line-derived neurotrophic factor receptor polypeptides
JP2000501416A (ja) 1996-04-26 2000-02-08 ユニバーシティー オブ オタワ ニューロン病を治療し予防するための、治療法および薬物のスクリーニング法
US5611016A (en) * 1996-06-07 1997-03-11 Lucent Technologies Inc. Dispersion-balanced optical cable
EP0912184B1 (en) 1996-06-25 2002-09-25 Cephalon, Inc. Use of k-252a derivative for the treatment of peripheral or central nerve disorders, and cytokine overproduction
DE69740038D1 (ru) 1996-07-12 2010-12-16 Genentech Inc
EP0938499A1 (en) 1996-07-19 1999-09-01 Amgen Inc. Analogs of cationic proteins
BR9712978A (pt) 1996-09-11 2000-04-18 Gen Hospital Corp Vìrus de dna de não-mamìferos possuindo uma proteìna de revestimento alterada
US6261545B1 (en) 1996-09-13 2001-07-17 Advanced Medicine Research Institute Ophthalmic compositions of neurotrophic factors, remedies for optic nerve function disorders and method for treating optic nerve function disorders
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6420140B1 (en) 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
US20070213290A1 (en) 1996-10-17 2007-09-13 Kingsman Alan J Neurite regeneration
US6156728A (en) 1996-11-01 2000-12-05 Genentech, Inc. Treatment of inner ear hair cells
US6593290B1 (en) 1996-11-01 2003-07-15 Genentech, Inc. Treatment of inner ear hair cells
EP0942968B1 (en) 1996-12-03 2008-02-27 Amgen Fremont Inc. Fully human antibodies that bind EGFR
EP0981637B1 (en) 1997-03-14 2005-05-25 Biogen Idec Inc. Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
US20020137890A1 (en) 1997-03-31 2002-09-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
PT970126E (pt) 1997-04-14 2001-10-30 Micromet Ag Novo metodo para a producao de receptores de antigenios anti-humanos e suas utilizacoes
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
ES2258817T3 (es) 1997-05-21 2006-09-01 Biovation Limited Metodo para la produccion de proteinas no inmunogenas.
US20020112251A1 (en) 1997-08-04 2002-08-15 Mccarthy Sean A. Novel genes encoding proteins having prognostic, diagnostic, preventive, therapeutic and other uses
AU8768798A (en) 1997-08-04 1999-02-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Tango-78, tango-79, and tango-81 nucleic acid molecules and polypeptides
KR100502596B1 (ko) 1997-09-17 2005-07-22 제넨테크, 인크. 분비 폴리펩티드와 막횡단 폴리펩티드 및 이들을 코딩하는핵산
US6974689B1 (en) 1997-09-18 2005-12-13 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding PRO211 polypeptides
EP1205546B1 (en) 1997-10-24 2005-11-23 Genentech, Inc. Polypeptide and nucleic acids encoding the same
FR2776661B1 (fr) 1998-03-26 2002-04-05 Centre Nat Rech Scient Polypeptide immunoreactif du recepteur trka du ngf et utilisations
US7282482B2 (en) 1998-04-08 2007-10-16 The Regents Of The University Of California NGF for the prevention of demyelination in the nervous system
AU5922999A (en) 1998-09-16 2000-04-03 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
CN1354755B (zh) 1998-11-06 2010-06-02 苏黎世大学 Nogo基因的核苷酸序列和蛋白序列以及基于其的方法
DE69934967T2 (de) 1998-12-08 2007-12-06 Biovation Ltd. Verfahren zur verminderung der immunogenität von proteinen
EP1165784A2 (en) 1999-03-31 2002-01-02 Curagen Corporation Nucleic acids including open reading frames encoding polypeptides; "orfx"
US7034132B2 (en) 2001-06-04 2006-04-25 Anderson David W Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US20040067490A1 (en) 2001-09-07 2004-04-08 Mei Zhong Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
JP4387625B2 (ja) 1999-07-02 2009-12-16 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｈｅｒ２に結合する化合物
EP1074617A3 (en) 1999-07-29 2004-04-21 Research Association for Biotechnology Primers for synthesising full-length cDNA and their use
AU6181300A (en) 1999-07-29 2001-02-19 Helix Research Institute Liver cancer-associated genes
US6461414B1 (en) 1999-10-29 2002-10-08 Baker Hughes Incorporated Foam monitoring and control system
JP2004522404A (ja) 1999-12-01 2004-07-29 ジェネンテック・インコーポレーテッド 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードしている核酸
US6680209B1 (en) 1999-12-06 2004-01-20 Biosite, Incorporated Human antibodies as diagnostic reagents
US7119165B2 (en) 2000-01-12 2006-10-10 Yale University Nogo receptor-mediated blockade of axonal growth
YU53502A (sh) 2000-01-12 2005-11-28 Yale University Blokada aksonalnog rasta posredstvom nogo receptora
DK1265605T3 (da) 2000-01-18 2007-02-12 Univ Mcgill Farmaceutiske sammensætninger omfattende peptidmimetisk, cyklisk beta-drejningsforbindelse
AU2001232969A1 (en) 2000-01-25 2001-08-07 Nuvelo, Inc. Methods and materials relating to transforming growth factor alpha-like polypeptides and polynucleotides
WO2001055203A1 (en) * 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
CA2393616A1 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001059063A2 (en) 2000-01-31 2001-08-16 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
EP1574520A3 (en) 2000-02-03 2005-12-21 Nuvelo, Inc. Methods and materials relating to neuronal guidance molecule-like (NGM-like) polypeptides and polynucleotides
US6800607B2 (en) 2000-02-29 2004-10-05 Ltt Bio-Pharma Co., Ltd. Modified BDNF
ES2637801T3 (es) 2000-04-11 2017-10-17 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
AU2001266787A1 (en) 2000-06-07 2002-01-08 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US6430914B1 (en) 2000-06-29 2002-08-13 Foster Wheeler Energy Corporation Combined cycle power generation plant and method of operating such a plant
US20040010118A1 (en) 2000-08-16 2004-01-15 Zerhusen Bryan D. Novel proteins and nucleic acids encoding same
CN1680441A (zh) 2000-09-13 2005-10-12 史密丝克莱恩比彻姆公司 新型化合物
US20040048245A1 (en) 2000-10-05 2004-03-11 Shimkets Richard A. Novel human proteins, polynucleotides encoding them and methods of using the same
NZ525422A (en) * 2000-10-06 2006-09-29 Biogen Idec Inc Isolated polynucleotides comprising a nucleic acid which encodes a polypeptide which modulates axonal growth in CNS neurons
CA2429544C (en) 2000-11-17 2010-10-19 University Of Rochester In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells
US20030216558A1 (en) 2000-12-22 2003-11-20 Morris David W. Novel compositions and methods for cancer
AU2002255478A1 (en) 2001-01-10 2002-09-12 Pe Corporation (Ny) Kits, such as nucleic acid arrays, comprising a majority of human exons or transcripts, for detecting expression and other uses thereof
WO2002060955A2 (en) 2001-01-29 2002-08-08 Idec Pharmaceuticals Corporation Modified antibodies and methods of use
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
WO2003008583A2 (en) 2001-03-02 2003-01-30 Sagres Discovery Novel compositions and methods for cancer
FI111522B (fi) * 2001-05-07 2003-08-15 Marioff Corp Oy Palontorjuntalaitteisto ja palontorjuntalaitteiston käyttölähde
EP1401858A4 (en) 2001-06-04 2005-12-21 Curagen Corp THERAPEUTIC POLYPEPTIDES, NUCLEIC ACIDS COATING THEREOF AND METHOD OF USE
US20030162734A1 (en) 2001-06-28 2003-08-28 Miller Carol A. Modulation of DENN-MADD expression and interactions for treating neurological disorders
US7223558B2 (en) 2001-07-11 2007-05-29 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding three novel human cell surface proteins with leucine rich repeats and immunologobulin folds, BGS2, 3, and 4 and variants thereof
US20030226155A1 (en) 2001-08-30 2003-12-04 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin-antibody fusion proteins
US20040142325A1 (en) 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
US20050123990A1 (en) 2001-09-26 2005-06-09 Incyte Corporation Membrane associated proteins
US7098302B2 (en) 2001-10-12 2006-08-29 University Of Vermont And State Agricultural College Binding peptides specific for the extracellular domain of ErbB2 and uses therefor
WO2003035833A2 (en) 2001-10-22 2003-05-01 Exelixis, Inc. Modifier of the p53 pathway and methods of use
US7309485B2 (en) 2001-12-03 2007-12-18 Children's Medical Center Corporation Reducing myelin-mediated inhibition of axon regeneration
WO2003054152A2 (en) 2001-12-10 2003-07-03 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
AU2003224638A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Exelixis, Inc. PDPK1s AS MODIFIERS OF THE p53 PATHWAY AND METHODS OF USE
EP2314316A1 (en) 2002-04-05 2011-04-27 Amgen, Inc Human anti-OPGL neutralizing antibodies as selective OPGL pathway inhibitors
PT1534736E (pt) 2002-08-10 2010-09-07 Univ Yale Antagonistas do receptor nogo
CN101628939B (zh) 2002-09-06 2014-06-25 安姆根有限公司 治疗性人抗-il-1r1单克隆抗体
US6919426B2 (en) 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
US7816497B2 (en) 2002-10-30 2010-10-19 University Of Kentucky Compositions and methods for inhibiting drusen complement components C3a and C5a for the treatment of age-related macular degeneration
US20040186044A1 (en) 2002-11-06 2004-09-23 Cosgaya Jose Miguel Modulation of myelination by interaction with P75 and TRK receptors
US7388079B2 (en) 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
MXPA05009913A (es) 2003-03-19 2005-11-04 Biogen Idec Inc Proteina enlazadora del receptor nogo.
CN1926147A (zh) 2003-08-07 2007-03-07 比奥根艾迪克Ma公司 Nogo受体拮抗剂
AU2004266159A1 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
JP2007512001A (ja) 2003-08-28 2007-05-17 バイオレクシス ファーマシューティカル コーポレイション Ｅｐｏミメティックペプチドおよび融合タンパク質
US7205387B2 (en) 2003-08-28 2007-04-17 Agency For Science, Technology And Research Recombinant polypeptide useful for neurotrophin receptor mediated gene delivery and as neurotrophin agonist
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
WO2005063819A2 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Crucell Holland B.V. Human binding molecule against cd1a
ZA200606461B (en) 2004-02-12 2008-02-27 Lexicon Pharmaceuticals Inc Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
WO2005097184A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against nogo receptor
US20050214288A1 (en) 2004-03-26 2005-09-29 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against Nogo receptor
AU2005232657B2 (en) 2004-04-08 2010-12-16 David B. Agus ErbB antagonists for pain therapy
RS52593B (en) 2004-06-24 2013-04-30 Biogen Idec Ma Inc. TREATMENT OF THE CONDITIONS CONCERNING DEMYELINIZATION
US20060009288A1 (en) 2004-07-07 2006-01-12 Devos John A Conveying information to an interrogator using resonant and parasitic radio frequency circuits
JP5060293B2 (ja) 2004-08-03 2012-10-31 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 神経機能におけるｔａｊ
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AR054260A1 (es) 2005-04-26 2007-06-13 Rinat Neuroscience Corp Metodos de tratamiento de enfermedades de la neurona motora inferior y composiciones utilizadas en los mismos
JP2008540339A (ja) 2005-04-29 2008-11-20 ワイス Ｎｏｇｏレセプター機能モチーフおよびそれに関するペプチド模倣物、ならびにそれらを使用する方法
WO2006136006A1 (en) 2005-05-16 2006-12-28 Mcgill University Lgi, lingo and p75ntr family members: novel modulators of neuronal growth
RU2007144678A (ru) 2005-06-06 2009-07-20 Вайет (Us) МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИ-TrkB АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
EP2581440B1 (en) 2005-06-08 2016-03-16 The University of North Carolina At Chapel Hill Methods of facilitating neural cell survival using non-peptide and peptide BDNF neurotrophin mimetics
AU2005332949A1 (en) 2005-06-16 2006-12-21 University Technologies International Inc. A treatment for short bowel syndrome
SG10201508322SA (en) 2005-07-08 2015-11-27 Biogen Ma Inc Sp35 antibodies and uses thereof
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US20090175846A1 (en) 2005-10-27 2009-07-09 Biogen Idec Ma Inc Oligodendrocyte-Myelin Glycoprotein Compositions and Methods of Use Thereof
EP1959979A4 (en) 2005-11-04 2010-01-27 Biogen Idec Inc METHODS FOR PROMOTING NEURITY GROWTH AND SURVIVAL OF DOPAMINERGIC NEURONS
JP5312039B2 (ja) 2005-12-02 2013-10-09 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 脱髄の関与する状態の処置
WO2007092777A2 (en) 2006-02-02 2007-08-16 Wyeth Cloning, characterization, and application of tnfrsf19 in neurological disorders
US7693698B2 (en) 2006-02-03 2010-04-06 Wyeth Llc Method for identifying or designing a candidate agent that interacts with LINGO-1 polypeptide using a LINGO-1 three-dimensional structure
WO2007098283A2 (en) 2006-02-27 2007-08-30 Biogen Idec Ma Inc. Use of antagonists of maif receptor complex molecules and neurotrophic factors for treatment of neurological diseases and disorders
JP2009544703A (ja) * 2006-07-24 2009-12-17 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストの投与により髄鞘形成、ニューロンの生存および希乏突起膠細胞の分化を促進するための方法
CN103351437A (zh) 2006-11-17 2013-10-16 诺瓦提斯公司 Lingo结合分子及其制药用途
SG177966A1 (en) 2007-01-09 2012-02-28 Biogen Idec Inc Sp35 antibodies and uses thereof
US8128926B2 (en) 2007-01-09 2012-03-06 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
US20100297121A1 (en) * 2007-10-11 2010-11-25 Biogen Idec Ma Inc. Methods for Treating Pressure Induced Optic Neuropathy, Preventing Neuronal Degeneration and Promoting Neuronal Cell Survival Via Administration of LINGO-1 Antagonists and TrkB Agonists
AU2008325107B2 (en) 2007-11-08 2015-04-23 Biogen Ma Inc. Use of LINGO-4 antagonists in the treatment of conditions involving demyelination
DK2307042T3 (da) 2008-06-25 2014-05-12 Lundbeck & Co As H Modulering af trpv: vps10p-domænereceptorsystem til behandlingen af smerte
CN102171247A (zh) 2008-07-02 2011-08-31 特鲁比昂药品公司 TNF-α拮抗剂多靶点结合蛋白
AU2009269099B2 (en) 2008-07-09 2016-03-10 Biogen Ma Inc. Compositions comprising antibodies to LINGO or fragments thereof
EP3831954A3 (en) 2008-11-17 2021-10-13 Veracyte, Inc. Methods and compositions of molecular profiling for disease diagnostics
FR2958293B1 (fr) 2010-04-01 2014-09-26 Centre Nat Rech Scient Outils pour l'identification de ligands de lingo-1,lingo-2, lingo-3 et lingo-4, et utilisations
JP2015518829A (ja) 2012-05-14 2015-07-06 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 運動ニューロンに関する状態の処置のためのｌｉｎｇｏ−２アンタゴニスト

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001012662A2 (en) * 1999-08-17 2001-02-22 Incyte Genomics, Inc. Membrane associated proteins

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI W. ET AL.: "NEUTRALIZATION OF MYELIN - ASSOCIATED NOGO - A BY A NOGO RECEPTOR - Fc FUSION PROTEIN", SOCIETY FOR NEUROSCIENCE ABSTRACTS, SOCIETY FOR NEUROSCIENCE, US, 2002, page ABS3332, XP001199824, ISSN: 0190-5295, the whole document *
MI S. ET AL.: "A novel CNS ÔÇô specific protein promotes axonal elongation by modulating RhoA signaling", 2003, SOCIETY FOR NEUROSCIENCE ABSTRACT VIEWER AND ITINERARY PLANNER, VOL. 2003, PAGE(S) ABSTRACT NO. 891.5 URL - HTTP://SFN.SCHOLARONE.COM, 33RD ANNUAL MEETING OF THE SOCIETY OF NEUROSCIENCE; NEW ORLEANS, LA, USA; NOVEMBER 08-12, 2003, XP001183276, sentences 1-13 *
MI SHA ET AL.: "LINGO-1 is a component of the Nogo-66 receptor/p75 signaling complex", March 2004 (2004-03), NATURE NEUROSCIENCE, VOL. 7, NR. 3, PAGE(S), 221-228, XP001183275, ISSN: 1097-6256, figures 1, 5, 6 *

Also Published As

Publication number Publication date
US8153580B2 (en) 2012-04-10
PT1606409E (pt) 2010-12-20
US20070059793A1 (en) 2007-03-15
RS54160B1 (sr) 2015-12-31
IL170721A (en) 2011-07-31
EP2248899B8 (en) 2015-07-15
EP2902491A1 (en) 2015-08-05
JP2007524370A (ja) 2007-08-30
BRPI0408501A (pt) 2006-03-14
DK1606409T3 (da) 2011-01-03
DK2248899T3 (en) 2015-06-29
EP2248899B1 (en) 2015-05-06
CY1111097T1 (el) 2015-06-11
IS2786B (is) 2012-05-15
PL378582A1 (pl) 2006-05-02
UA87106C2 (ru) 2009-06-25
JP5341311B2 (ja) 2013-11-13
NO20054836L (no) 2005-10-19
AU2004223464A2 (en) 2004-10-07
ATE479754T1 (de) 2010-09-15
US7785829B2 (en) 2010-08-31
NZ607886A (en) 2014-09-26
PT2248899E (pt) 2015-09-23
US20130287693A1 (en) 2013-10-31
WO2004085648A2 (en) 2004-10-07
WO2004085648A3 (en) 2004-11-18
US8765662B2 (en) 2014-07-01
NO336530B1 (no) 2015-09-21
HK1146297A1 (en) 2011-05-20
EP2248899A1 (en) 2010-11-10
AU2004223464B2 (en) 2010-04-01
JP2013138688A (ja) 2013-07-18
HK1211618A1 (en) 2016-05-27
IS8016A (is) 2005-09-08
HUE025347T2 (en) 2016-02-29
US8932821B2 (en) 2015-01-13
AU2004223464A1 (en) 2004-10-07
CY1116863T1 (el) 2017-04-05
AU2010202636A1 (en) 2010-07-15
HK1085764A1 (en) 2006-09-01
US20120230979A1 (en) 2012-09-13
MXPA05009913A (es) 2005-11-04
EP1606409A2 (en) 2005-12-21
KR20050110012A (ko) 2005-11-22
AU2004223464C1 (en) 2010-09-23
RS20050709A (en) 2007-11-15
EP1606409B1 (en) 2010-09-01
DE602004028916D1 (de) 2010-10-14
CA2519227A1 (en) 2004-10-07
US20150177240A1 (en) 2015-06-25
PL1606409T3 (pl) 2011-02-28
PL2248899T3 (pl) 2015-10-30
US20100204304A1 (en) 2010-08-12
JP2010154861A (ja) 2010-07-15
GEP20094629B (en) 2009-03-10
ES2537015T3 (es) 2015-06-01
SI2248899T1 (sl) 2015-07-31
SI1606409T1 (sl) 2011-01-31
EA200501480A1 (ru) 2006-02-24
KR101106441B1 (ko) 2012-01-18
CA2519227C (en) 2013-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8765662B2 (en) NOGO receptor binding protein
RU2734678C2 (ru) Генетическая конструкция
JPH11513883A (ja) ヒト血管内皮増殖因子２
JPH11500128A (ja) 抗トランスフォーミング増殖因子β遺伝子治療
JP2011500075A (ja) Ｇｄｎｆのスプライスバリアントおよびその用途
JP2022554267A (ja) 組換えｃｄｋｌ５タンパク質、遺伝子療法、及び製造方法
AU2003288434B2 (en) Peptides, antibodies thereto, and their use in the treatment of central nervous system damage
WO2006129867A2 (en) ENHANCED EXPRESSION OF LACTOFERRIN mRNA BY LACRITIN
ZA200507501B (en) Nogo receptor binding protein
US7893032B2 (en) NgR variants and compositions thereof for suppressing axonal growth inhibition
KR19990007806A (ko) 전환 성장 인자 α ＨＩＩ
NZ575052A (en) NOGO Receptor Binding Protein

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

TK4A Corrections in published eurasian patents
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU