CN1354755B - Nogo基因的核苷酸序列和蛋白序列以及基于其的方法 - Google Patents

Nogo基因的核苷酸序列和蛋白序列以及基于其的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1354755B
CN1354755B CN998153486A CN99815348A CN1354755B CN 1354755 B CN1354755 B CN 1354755B CN 998153486 A CN998153486 A CN 998153486A CN 99815348 A CN99815348 A CN 99815348A CN 1354755 B CN1354755 B CN 1354755B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nogo
leu
ser
glu
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN998153486A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1354755A (zh
Inventor
马丁E·施瓦布
马伊奥S·陈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Zuerich
Original Assignee
Universitaet Zuerich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22316666&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN1354755(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Universitaet Zuerich filed Critical Universitaet Zuerich
Publication of CN1354755A publication Critical patent/CN1354755A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1354755B publication Critical patent/CN1354755B/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

本发明涉及基因Nogo、其编码的蛋白产物以及其衍生物和类似物。也提供Nogo蛋白、衍生物和抗体的产生。本发明还涉及治疗组合物以及诊断和治疗方法。

Description

Nogo基因的核苷酸序列和蛋白序列以及基于其的方法
该申请要求1998年11月6日申请的美国临时申请第60/107,446号的权益，该申请通过引用全部结合到本文中。
1.介绍
本发明涉及基因Nogo，具体涉及其编码的蛋白产物Nogo以及其衍生物和类似物。也提供Nogo蛋白、衍生物和抗体的产物。本发明还涉及治疗组合物以及诊断和治疗方法。
2.发明背景
在高等脊椎动物的中枢神经系统(CNS)中，损伤后轴突的再生几乎没有，并且结构可塑性也有限。与CNS髓磷脂相关的生长抑制剂可能起重要作用。单克隆抗体(mAb)-IN-1证明了这一点，IL-1中和有效神经突生长抑制性髓磷脂蛋白，因此在成年大鼠脊髓损伤或脑损伤后促进长距离轴突再生并增强代偿可塑性。
许多体外和体内观察已经揭示出神经突生长调节的一个新方面，即是存在排斥性和抑制性信号和因子(Keynes和Cook，1995，Curr.Opin.Neurosci.5：75-82)。这些信号中的大多数看来是蛋白质或糖蛋白。在鉴定所述因子方面的第一个突破是鸡脑源生长锥衰弱诱导分子-脑衰蛋白-1的纯化和cDNA克隆，该分子现在称为Semaphorin 3A。
最近纯化和克隆的第二组排斥性指导信号现在命名为Ephrin。它们是Eph受体酪蛋白激酶家族的配体。Ephrin-A5和Ephrin-A2在鸡胚视顶盖中以梯度表达，其异位表达或缺失引起向内生长视网膜轴突(retinal axon)的指导错误。与Semaphorin一样，Ephrin家族有15-20个成员，每个成员均在神经系统中和神经系统外有复杂且动态的表达。这些分子中的大多数的功能仍有待分析。
可以排斥生长轴突并在发育的神经系统中表达的第三组指导信号是Netrin。Netrin同其C.elegans直向同源物(ortholog)unc-6一样，已经作为早期脊髓连合轴突的底板源化学引诱物纯化出。Netrin-1证明，根据靶神经元生长锥是存在的受体类型，对于某些类型的神经元具有排斥效应(Tessier-Lavigne等，1996，Science 274：1123-33)。
先前，Canoni和Schwab报道了与成年CNS少突胶质细胞和髓磷脂有关的有效神经突生长抑制活性(1988，J.Cell Biol.106：1281-1288)。一种主要组分是高分子量的膜蛋白(在大鼠中为NI-250，有一较小组分NI-35)，最近将其纯化，它与本发明的主题相关，并且被中和性mAb IN-1结合(Canoni和Schwab，1988，J.Cell Biol.106：1281-1288；美国专利第5,684,133、5,250,414号；PCT公布号WO93/00427)。
髓磷脂相关神经突生长抑制剂在防止受损伤CNS轴突的再生中起关键性作用。当在鸡或大鼠中阻断少突胶质细胞的发育和髓磷脂形成时，CNS损伤后的再生许可期延长。事实上，髓磷脂的形成与CNS表现出高都结构可塑性和高再生潜力的发育期结束同时发生。
将IN-1体内应用于脊髓损害的成年大鼠，诱导长距离范围内的皮质脊髓轴突再生，并且允许运动和行为功能的恢复，尤其是与行进有关的功能恢复，这证明NI-250和NI-35有可能是髓磷脂相关生长抑制的主要组分。关于视神经和胆碱能隔-海马(cholinergic septo-hippocampal)途径的相似实验也证明，IN-1识别的抗原NI-35/250的体内相关性(Schnell和Schwab，1990，Nature 343：269-272；Bregman等，1995，Nature 378：498-501)。
未损伤的纤维系统也对IN-1中和神经突生长抑制剂应答。最近的实验总结性地表明，在选择性皮质脊髓束损伤(锥体束切断术)后，在完整的纤维生长跨过脊髓和脑干中线，并在NI-1存在中的建立双侧神经分布型，伴随有精细运动几乎完全的行为恢复(Z’Graggen等，1998，J.Neuroscience 18(12)：4744-4757)。
编码神经突生长抑制蛋白的基因的分离，提供了多个机会来开发可用于神经元再生以及用于治疗各种神经学疾病包括CNS肿瘤的制品。
上文对参考文献的引用不应解释为承认这种参考文献作为本发明现有技术而得到。
3.发明概述
本发明涉及Nogo基因(人、大鼠和牛Nogo和其它物种的Nogo同源物)的核苷酸序列以及它们的编码蛋白的氨基酸序列及其衍生物(例如片段)和类似物。也提供可与前述核苷酸序列杂交或互补的核酸。在具体实施方案中，所述Nogo蛋白是大鼠、牛或人蛋白。
本发明也涉及与Nogo相互作用的基因的鉴定方法。
Nogo是本发明提供的、通过本发明的方法鉴定的基因，它既编码神经生长调节蛋白，又与神经生长调节蛋白相互作用。
本发明也涉及有功能活性的本发明的Nogo衍生物和类似物，即它们能够表现出一种或多种已知的与天然存在的Nogo蛋白相关的功能活性。例如，已经鉴定出氨基酸542-722之间的一个主要抑制区。这种功能活性包括但不限于对神经细胞的神经突生长抑制、成纤维细胞的散布和迁移或表现出肿瘤生长的任何细胞、与神经生长调节蛋白相互作用或与所述相互作用竞争的能力、与抗Nogo抗体结合(或与Nogo竞争结合)的能力-抗原性、产生与Nogo结合的抗体的能力-免疫原性。涉及有潜力诱导神经突向外生长或通过抑制Nogo功能而防止背根神经节生长锥衰弱的这些抗体、有能力抑制神经突向外生长的Nogo功能片段或衍生物。
本发明还涉及Nogo的片段(和其衍生物和类似物)，所述片段包含一个或多个Nogo蛋白结构域，例如酸性和富脯氨酸氨基末端(例如SEQ ID NO：2的氨基酸31-58)、高度保守的羧基末端和大鼠Nogo中、也在羧基末端中的35个氨基酸和36个氨基酸长度的2段疏水序列(例如SEQ ID NO：2的氨基酸988-1023和1090-1125)。
另外提供抗各种Nogo的抗体以及Nogo衍生物和类似物。特别是，例如，已经衍生出两种抗体，衍生名为AS 472的第一种抗体，用作免疫原，是对应于SEQ ID NO：2的氨基酸623-640的合成肽；产生了针对Nogo羧基末端-SEQ ID NO：2的氨基酸762-1163的第二种抗体，名为AS Bruna。
也提供了Nogo蛋白、衍生物和类似物的产生方法，例如重组方法。
本发明也涉及基于Nogo蛋白和核酸的治疗和诊断方法和组合物。本发明的治疗化合物包括但不限于Nogo蛋白及其类似物和衍生物(包括片段)；其抗体；编码Nogo蛋白的核酸、类似物或衍生物；和Nogo核酶或Nogo反义核酸。
本发明也涉及基于Nogo蛋白和核酸以及抗Nogo抗体的治疗和诊断方法和组合物。本发明可供用于通过给予促进Nogo活性的化合物(例如Nogo蛋白和功能活性类似物和衍生物包括其片段；编码Nogo蛋白的核酸、类似物或衍生物、Nogo激动剂)治疗CNS和神经衍生肿瘤。
本发明也可供用于通过给予干扰Nogo活性的化合物(例如显性阴性Nogo衍生物；抗Nogo抗体；Nogo的反义核酸；Nogo核酶或结合Nogo活性位点的化学基团)治疗最终导致神经系统损害的疾病、紊乱或损害；例如包括但不限于以下的疾病、紊乱或损害：中枢神经系统(CNS)创伤(例如脊髓或脑损伤)、梗塞、感染、恶性肿瘤、暴露于毒性药物、营养缺乏、副肿瘤性综合征和退行性神经病(包括但不限于早老性痴呆、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化和进行性supra-nuclear palsy)。
本发明也提供疾病诱因的动物模型、诊断方法和筛选方法以及鉴定和评价Nogo激动剂和拮抗剂的方法。
3.1定义
本文中所用的，以下划线或斜体标注基因名称应该是指基因，相反，其编码的蛋白产物以无下划线或斜体的基因名称表示。例如，“Nogo”应该是指Nogo基因，而“Nogo”应该是指Nogo基因的蛋白产物。
4.附图描述
图1a-1b：(a)Nogo cDNA克隆：CWP1-3是通过用简并寡核苷酸MSC5-8(混合的)和MSC9筛选牛脊髓白质cDNA文库分离的牛cDNA克隆。由该克隆衍生的互补RNA用于随后的大鼠cDNA文库筛选。Oli3和Oli18是从寡聚d(T)引发的大鼠少突胶质细胞文库中分离的。R103U21、RO18U1和RO18U37-3是从六核苷酸引发的大鼠脑干/脊髓文库(Stratagene)中分离的。在CWP1-3和R13U21上显示了6种牛NI220(bNI220)肽序列的位置。不同外显子的接点序列在每个克隆顶部标注。RO18U1上显示的问号鉴别该克隆上与任何其它Nogo克隆的序列不匹配的序列。RO18U37-3仅从5’端测序，以虚线表示未测序的部分。(b)证明产生三种Nogo转录物的假定机制的简图。P1和P2代表可变启动子(alternative promoter)的推定位置。需要最少数目的三种外显子来产生如图所示的三种转录物，尽管每种外显子可能潜在地被剪接成多个外显子。
图2a-2b：(a)Nogo转录物A的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和氨基酸序列(SEQ ID NO：2)(通过将RO18U37-3、Oli18和R1-3U21cDNA序列连接产生的序列)。椭圆框：假定的起始密码子；以虚线下划线：酸性序列段；□：潜在的PKC位点；△：潜在的酪蛋白激酶II位点；粗下划线：羧基末端疏水区和潜在的跨膜结构域；细下划线：潜在的N-糖基化位点。(b)从大鼠和牛cDNA翻译的已测序、纯化的牛NI220(bNI220；SEQ ID NO：3-8)和相应的牛(SEQ ID NO：9-14)和大鼠(SEQID NO：15-20)序列之间的肽序列比较。与bNI220肽序列不匹配的大鼠和牛氨基酸序列为小写。
图3a-3b：(a)NSP(人；SEQ ID NO：21)、S-REX(大鼠)(SEQ IDNO：22)、CHS-REX(鸡；SEQ ID NO：23)、NOGOBOV(牛；SEQID NO：24)、NOGORAT(大鼠；SEQ ID NO：25)、C.elegans EST克隆(W06A7A；SEQ ID NO：26)和黑尾果蝇(D.melanogaster)EST克隆(US51048；SEQ ID NO：27)的羧基末端180个氨基酸共同区的氨基酸序列比较。(b)两个疏水区的进化保守性。显示了共同疏水区内和所述共同疏水区物种间的相似性百分比。细线框注字母：保守氨基酸。
图4a-4c：(a)Nogo共同探针对各种组织的RNA杂交。所述共同探针含有转录物A序列的核苷酸2583-4678。ON，视神经；SC，脊髓；C，脑皮质；DRG，背根神经节；SN，坐骨神经；PC12，PC12细胞系。(b)采用外显子1特异性探针的脊髓和PC12细胞RNA的RNA印迹杂交(左图)以及采用外显子2特异性探针的后脑(HB)和骨骼肌(M RNA的RNA印迹杂交(右图)。(c)采用Nogo共同探针的RNA印迹杂交。K，肾；B，软骨(来自胸骨)；Sk，皮肤；M，骨骼肌；Lu，肺；Li，肝；Sp，脾。标记了所述三种主要转录物(4.6千碱基(kb)，2.6kb和1.7kb)。△：扩散但一致的大小约1.3kb条带。
图5a-5f：成年大鼠脊髓和小脑切片的原位杂交。(a，d)可以观察到用Nogo反义“共同”核糖核酸探针(riboprobe)标记的分别在脊髓和小脑白质中的多排少突胶质细胞(OL)。这非常类似于在连续脊髓切片与反义plop核糖核酸探针杂交时检测到的信号(b)。(c)也用Nogo反义“共同”核糖核酸探针标记灰质(GM)中的神经元。WM：白质。分别为用Nogo反义“共同”核糖核酸探针(e)和抗GFAP抗体(f)双重标记的小脑切片的亮视野和荧光图象。浦肯野细胞(双箭头)用Nogo探针强标记，而星形胶质细胞(黑色和白色箭头)为阴性。也用Nogo探针标记了粒细胞层(Gr)中的少数细胞，m：分子层。标度条：a，b，d-f：50p.m；c：280p.m。
图6a-6i：在出生后不同天数的视神经用或者Nogo或plp(反义或有义)探针的原位杂交(a，f：P0；b，g：P3；c，h：P7；d，e，i：P22)。(a-d)Nogo反义探针；(e)Nogo有义探针；(g-i)plp反义探针；(f)plp有义探针。可以在早至P0在少突胶质细胞前体中检测到Nogo表达，而plp表达仅在接近视神经交叉(g)的P3视神经中开始可检测到。
图7：AS Bruna和AS 472均识别约200kD的髓磷脂蛋白。按照Spillmann等，1998，J.Biol.Chem.，273(30)：19283-19293的方法制备大鼠髓磷脂提取物和牛q库。AS Bruna和AS 472各自识别牛髓磷脂中的200kD条带以及几条较小的条带，它们可能是bNI220的降解产物。AS Bruna使大鼠髓磷脂中的200kD条带染色。I：AS Bruna；P：AS Bruna，免疫前血清；E：亲和纯化的AS 472。
图8a-8i：采用IN-1(a-e)、AS Bruna(d-f)和AS 472(g-i)进行的大鼠脊髓和小脑的免疫组织化学，如各图的左侧所示。当冷冻切片用乙醇/乙酸固定时，用所有三种抗体在两个组织中均观察到强髓磷脂染色(a，b，d，e，g，h)。除少突胶质细胞胞体外，用甲醇处理切片消除了髓磷脂染色(箭头；c，f，i)。箭头：浦肯野细胞，WM，白质；GM，灰质，DR：背根；Gr，粒细胞层；m，分子层。标度条：a，d，g：415μm；b，c，e，f，h，i：143μm。
图9a-9d：在不同生物测定中AS 472和AS Bruna的中和活性。(a)将NIH 3T3成纤维细胞接种到用q库包被并用IN-1、AS Bruna、AS 472或相应的免疫前血清预处理的细胞培养平皿上。两种多克隆血清甚至显示出比IN-1略好的对抑制性底物的中和。免疫前血清对NIH3T3细胞的散布没有显著影响。过量的用来产生AS 472的肽(P472)的加入竞争所述中和活性，而非特异性肽(Px)没有效应。(b)用AS Bruna或AS 472预处理所述抑制性底物，导致DRG神经突外向生长与可以在层粘连蛋白底物上观察到的向外生长相当。在用PBS预处理(c；计分＝0)和用AS Bruna预处理(d；计分＝4)的q库上的从DRG神经突向外生长的实例。
图10a-10d：用AS 472注射视神经外植体导致轴突向内生长。(a)解剖多对成年大鼠视神经，用AS 472或免疫前血清注射，并置于室培养物中，以使所述神经的一端与解离的P0大鼠DRG神经元接触。(b)体外2周后，在距切割位点(箭头A)3.5mm处取所述神经的EM切片并系统筛选完整的轴突(3个实验)。(c)再生的轴突束(箭头)通过使AS472注射的视神经退化而生长。(d)再生的轴突与髓磷脂接触。放大倍数：c，12,000x；d，35,000x。
图11a-11c：转染COS细胞中重组Nogo A的表达。(a)蛋白质印迹，显示AS Bruna对重组Nogo A(2道)和得自原代培养大鼠少突胶质细胞的内源Nogo A(3道)的免疫反应性。在5％变性SDS凝胶上，这两种蛋白的迁移率实际上是相同的，为约200kD。对照LacZ构成物转染样品(1道)显示出与AS Bruna没有免疫反应性。同一印迹也用抗myc抗体9E10探测，如图所示。与AS Bruna反应的条带也与抗myc标记抗体9E10反应(5道)，而内源Nogo A不与9E10反应(6道)。LacZ对照转染样品显示出约118kD的预期条带(4道)。用Nogo A构成物瞬时转染的COS细胞用AS Bruna(b)和IN-1(c)双重染色。用ASBruna阳性染色的细胞用IN-1染色也是阳性。
图12：牛Nogo cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：28)。
图13：与人Nogo的理论氨基酸序列(SEQ ID NO：29)序列对比的大鼠Nogo A的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。人Nogo氨基酸序列得自已表达序列标志(EST)与大鼠Nogo序列的序列对比以及采用大鼠Nogo作为指导模板翻译序列对比的人EST。
图14：大鼠Nogo C核酸(SEQ ID NO：31)序列及其相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)。
图15a-15e：Nogo A存在于少突胶质细胞质膜上，通过免疫细胞化学和培养物中少突胶质细胞的细胞表面生物素化证明。
免疫细胞化学(a-d)：解离得自P10大鼠视神经的少突胶质细胞并将其培养2天。肝细胞用mAb IN-1(a)或AS 472(c)染色表明少突胶质细胞胞体和过程上的免疫反应性。在竞争肽P472存在下，AS 472仅表现背景标记(所有细胞类型)(d)。当去除第一抗体时(b)，观察到相似的非特异性染色。评估：将编号的平皿随机混合并由3个独立的观察者分类。8/10的平皿被所有三个观察者正确分类为AS 472阳性、mAb IN-1阳性或对照。
生物素化(e)：富含少突胶质细胞的大鼠P4全脑培养物在培养7天后，用膜不透性试剂进行细胞表面生物素化。随后，细胞匀浆用链霉抗生物素-Dynabead处理。沉淀(Ppt)和上清液(sup)用AS472印迹；它们表现出不同的蛋白图型：在沉淀中发现的细胞表面Nogo A表现出比胞内Nogo A更大的表观分子量。这种变化可能是因糖基化引起的。腔ER蛋白BiP和大部分的β-微管蛋白可能仅在胞内部分发现。
图16a-16j：功能测定表明在少突胶质细胞细胞膜上存在NogoA。将视神经培养物与AS 472预温育(a，b)，使得NIH 3T3成纤维细胞散布至GalC(01抗体)免疫荧光染色描绘的高度分支的少突胶质细胞上(a)。相应的相差图象(b)中的箭头指明NIH 3T3成纤维细胞散布到所述少突胶质细胞顶部上。(c，d)：当AS 472与P472一起加入时，NIH 3T3成纤维细胞严格避开GalC阳性少突胶质细胞区域(箭头)(Caroni和Schwab，1988，Neuron 1：85-96)。(e，f)：在AS 472存在下，P0大鼠解离的DRG神经元能够将神经突延伸到高度分支的少突胶质细胞区域上(f中的箭头)。(g，h)：肽P472有效地竞争AS 472的中和活性：神经突完全避开少突胶质细胞。用于这些实验中的AS 472是针对大鼠472肽序列产生的。(i，j)：这些结果的定量分析(如方法中所述)证明AS 472在两种类型的测定中的强中和活性。标度条：40μm。
图17a-17e：重组Nogo A是一种抑制性底物，其抑制活性被mAbIN-1中和。对于NIH 3T3成纤维细胞散布和DRG神经突向外生长测定，包被得自稳定的CHO-Nogo A细胞系的富RecNogo A提取物或从稳定的CHO-LacZ细胞系中平行分离的β-半乳糖苷酶。(a)myc-his-标记的recLacZ(1道)和recNogo A(2道)的银凝胶表现出180kD的NogoA条带。该Nogo A条带的身份通过与AS Bruna(3道)和抗myc抗体9E10(4道)温育的蛋白质印迹而证实。(b)RecNogo A包被的平皿明显抑制NIH 3T3的散布。与mAb IN-1或AS Bruna预温育导致对抑制活性的高度显著(p＜0.01)的中和。对照1gM mAb O1和免疫前血清无效。CHO-LacZ提取物对NIH 3T3细胞具有部分抑制效应，可能是因内源CHO蛋白引起的。这种抑制活性不受与抗体预温育的影响。
(c)对于DRG神经突向外生长测定，将与(b)中相同的蛋白物质与层粘连蛋白混合并包被。RecNogo A以依赖于剂量的方式对解离的DRG神经突向外生长具有非常有效的抑制效应。该活性被mAb IN-1中和(p＜0.001)，但不被对照mAb 01中和。从CHO-LacZ细胞中分离的蛋白物质在所使用的任何浓度下均没有抑制效应，与抗体温育对神经突向外生长也没有任何影响。计分实例示于(d)中：1μg recNogoA，无神经突计分或短神经突(箭头)计分：2，计分实例还示于(e)中：1μg CHO-LacZ，长的分支神经突(箭头)计分：5-6。用双尾Student t检验进行统计学分析。标度条：280μm。
图18：Nogo缺失突变体的功能分析。如下文6.2.7一节中所述，产生编码含Nogo片段或Nogo截短部分(如以下所列)的融合蛋白的以下缺失构成物。
Nogo-A：    His标记/T7标记/载体/Nogo-A seq.aa1-1162
Nogo-B：    His标记/T7标记/载体/Nogo-A seq.aa1-171+975-1162
Nogo-C：    His标记/T7标记/Nogo-CN末端(11aa)+Nogo-A seq.aa975-1162
NiAext：    His标记/T7标记/载体/Nogo-A seq.aa1-974/T7标记
NiR：       His标记/T7标记/载体/Nogo-A seq.aa1-171/载体
NiG：       His标记/T7标记/Nogo-A seq.aa 172-974/His标记
EST：       His标记/T7标记/Nogo-A seq.aa 760-1162
NiG-D1：    His标记/T7标记/Nogo-A seq.aa172-908/载体
NiG-D2：    His标记/T7标记/Nogo-A seq.aa 172-866/His标记
NiG-D3：    His标记/T7标记/Nogo-A seq.aa 172-723/His标记
NiG-D4：     His标记/T7标记/Nogo-A seq.aa 172-646/His载体
NiG-D5：     His标记/T7标记/Nogo-A seq.aa 291-646/His标记
NiG-D7：     His标记/T7标记/Nogo-A seq.aa 172-234+292-974/His标记
NiG-D8：     His标记/T7标记/Nogo-A seq.aa 172-628
NiG-D9：     His标记/T7标记/Nogo-A seq.aa 172-259+646-974/His标记
NiG-D10：    His标记/T7标记/Nogo-A seq.aa 291-974/His标记
NiG-D 14：   His标记/T7标记/Nogo-A seq.aa 172-259
NiG-D15：    His标记/T7标记/Nogo-A seq.aa 172-189+491-974/His标记
NiG-D16：    His标记/T7标记/Nogo-A seq.aa 172-189+619-974/His标记
NiG-D17：    His标记/T7标记/Nogo-A seq.aa 172-189+257-974/His标记
NiG-D18：    His标记/T7标记/Nogo-A seq.aa 172-189+261-974/His标记
NiG-D20：    His标记/T7标记/Nogo-A seq.aa 542-722/His标记
所述氨基酸(aa)编号基于以第一个甲硫氨酸开始的大鼠Nogo A氨基酸序列编号(SEQ ID NO：2)。His标记和T7标记由34个氨基酸组成。
所述N末端和C末端载体序列衍生自表达载体pET28。
5.发明详述
本发明涉及Nogo基因的核苷酸序列及其编码的蛋白的氨基酸序列。本发明还涉及Nogo蛋白的片段以及其它衍生物和类似物。编码这种片段或衍生物的核酸也在本发明范围内。本发明提供多种不同物种的Nogo基因及其所编码的蛋白。本发明的Nogo基因包括人、大鼠和牛Nogo以及其它物种中的相关基因(同源物)。Spillman等，1998，J.Biol.Chem.273：19283-19293中公开的牛亚序列不是本发明要求保护的部分。在具体实施方案中，所述Nogo基因和蛋白得自脊椎动物，或更具体地讲得自哺乳动物。在本发明的一个优选实施方案中，所述Nogo基因和蛋白来源于人类。提供了上述蛋白和衍生物的产生，例如通过重组方法产生。
本发明提供的Nogo基因包括编码Nogo三种同种型的核酸分子，所述三种同种型即Nogo A、Nogo B和Nogo C。提及基因“Nogo”应该包括编码所有三种同种型的核酸分子，除非另有说明。同样，提及Nogo蛋白应该包括所有三种Nogo同种型，除非另有说明。本发明的Nogo蛋白可以阻止脊髓或脑中神经元的再生(即非许可底物特性)，抑制背根神经节神经突向外生长，诱导背根神经节生长锥衰弱，阻断NIH 3T3细胞散布，阻断PC12神经突向外生长等。
所述Nogo蛋白及其片段和衍生物不含所有中枢神经系统髓磷脂物质；特别是，它们不含与所述Nogo蛋白天然连接的所有中枢神经系统髓磷脂物质。这种物质可以包括其它CNS髓磷脂蛋白、脂质和糖类。本发明的Nogo蛋白、其片段和衍生物也最好不含从生物标本中纯化所用的试剂，例如去垢剂。
在一个具体实施方案，本发明提供通过本领域已知的方法制备的重组Nogo蛋白、其片段和衍生物，所述已知方法例如在遗传工程细胞中表达所述Nogo基因。
本发明也涉及有功能活性的本发明的Nogo衍生物和类似物，即它们能够表现出一个或多个与全长(野生型)Nogo蛋白相关的已知功能活性。这种功能活性包括但不限于能够与神经生长调节蛋白相互作用(或竞争结合)的能力；抗原性[与抗Nogo抗体结合(或与Nogo竞争结合)的能力]；免疫原性(产生与Nogo结合的抗体的能力)；防止脊髓或脑中神经元的再生、赋予底物限制神经细胞以及肿瘤细胞生长、散布和迁移的特性；抑制背根神经节神经突向外生长；诱导背根神经节生长锥衰弱；阻断NIH 3T3细胞的体外散布；阻断PC12神经突向外生长；限制神经可塑性等。
本发明还涉及包含一个或多个所述Nogo蛋白结构域的Nogo片段(及其衍生物和类似物)。
另外提供抗Nogo抗体、其衍生物和类似物。
本发明也涉及基于Nogo蛋白和核酸和抗Nogo抗体的治疗和诊断方法和组合物。本发明可供用于通过给予促进Nogo活性的化合物(例如Nogo蛋白及其功能活性类似物和衍生物(包括片段)；编码所述Nogo蛋白的核酸、类似物或衍生物、Nogo激动剂)治疗生长调节细胞和器官的疾病。
本发明也提供通过给予拮抗或抑制Nogo功能的化合物(例如抗体、Nogo反义核酸、Nogo拮抗剂衍生物)治疗神经系统损害或疾病的方法。
本发明也提供疾病诱因的动物模型、诊断方法和筛选方法。
为了清楚地公开并且不作为限制，将本发明的详述分为以下几个小节。
5.1  Nogo基因的分离
本发明涉及Nogo基因或核酸的核苷酸序列。在一个实施方案中，Nogo核酸包含被鉴定为图1b中描述的Nogo A的、图2a的大鼠cDNA序列(SEQ ID NO：1)、或其编码区、或编码长度为1163个氨基酸的Nogo蛋白或其任何功能片段或衍生物(例如具有SEQ ID NO：2序列的蛋白，如图2a中所示)的核苷酸序列。
在另一实施方案中，Nogo核酸包含编码Nogo B的核苷酸序列，而Nogo B蛋白是Nogo A的氨基末端172个氨基酸与羧基末端188个氨基酸融合，产生截短的360个氨基酸蛋白的等同物。由于去除间插核苷酸编码序列的可变剪接，产生Nogo B的转录物。
在本发明的再一实施方案中，Nogo核酸包含编码Nogo C的核苷酸序列，而Nogo C蛋白在其氨基末端含有Nogo A中不存在的11个氨基酸，并含有Nogo A和B的羧基末端188个氨基酸。Nogo C蛋白具有199个氨基酸。编码Nogo C的转录物是从可变Nogo启动子转录的结果。
在再一具体实施方案中，本发明提供牛Nogo核酸序列(SEQ IDNO：28)。
在再一具体实施方案中，本发明提供编码人Nogo、人Nogo蛋白片段的核苷酸序列，所述人Nogo包括大鼠Nogo A、Nogo B和Nogo C的人等同物。用大鼠Nogo A转录物作为模板，并将人已表达序列标志(EST)一起剪接，以揭示连续的核苷酸序列，来阐述人Nogo核酸序列。Nogo的大鼠和牛氨基酸序列也提供了关于正确转录读框的信息，使得推断出人Nogo的氨基酸序列。本发明也提供人Nogo基因片段的氨基酸序列。
本发明也提供至少由Nogo序列的8个核苷酸组成(即可杂交部分)的纯化核酸；在其它实施方案中，所述核酸由Nogo序列的至少25个(连续)核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、150个核苷酸、20个核苷酸、500个核苷酸、700个核苷酸或800个核苷酸或全长Nogo编码序列组成。在另一实施方案中，所述核酸的长度小于35、200或500个核苷酸。核酸可以是单链或是双链。本发明也涉及与上述序列可杂交或互补的核酸。在具体方面，提供包含与Nogo基因的至少10、25、50、100或200个核苷酸或完整编码区互补的序列的核酸。
在一个具体实施方案中，提供在低严格性条件下可与Nogo核酸(例如具有SEQ ID NO：2；图2a序列)或编码Nogo衍生物的核酸杂交的核酸。作为实例且不是限制性的，采用这种低严格性条件的方法如下(也参见Shilo和Weinberg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：6789-6792)：含DNA的滤膜在含以下物质的溶液中于40℃预处理6小时：35％甲酰胺、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mMEDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、0.1％BSA和500μg/ml变性鲑精DNA。在具有以下修改的同一溶液中进行杂交：0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/ml鲑精DNA、10％(wt/vol)硫酸葡聚糖，并使用5-20X106cpm 32P标记的探针。将滤膜在杂交混合物中于40℃下保温18-20小时，然后于55℃在含有2X SSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中洗涤1.5小时。用新鲜溶液取代洗涤溶液，再于60℃保温1.5小时。将滤膜吸干并曝光进行放射自显影。如有必要，将滤膜于65-68℃洗涤第三次并对胶片再曝光。可以使用的其它低严格性条件是本领域众所周知的(例如与用于交叉物种杂交一样，如6.1.1一节中的实施例中证明)。
在另一具体实施方案中，提供在高严格性条件下可与Nogo核酸杂交的核酸。作为实例并且不是限制性的，采用这种高严格性条件的方法如下：含DNA的滤膜在由以下物质构成的缓冲液中于65℃预杂交8小时至过夜：6X SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mMEDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500μg/ml变性鲑精DNA。滤膜在含有100μg/ml变性鲑精DNA和5-20X106cpm 32P标记的探针的预杂交混合物中于65℃杂交48小时。于37℃在含有2X SSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll和0.01％BSA的溶液中进行1小时的洗涤滤膜。接着于50℃下在0.1X SSC中洗涤45分钟，然后进行放射自显影。可以使用的其它高严格性条件是本领域众所周知的。
在另一具体实施方案中，提供在中等严格性条件下可与Nogo核酸杂交的核酸。例如但不限于，采用这种中等严格性条件的方法如下：含DNA的滤膜于55℃在含有6X SSC、5X Denhart溶液、0.05％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA的溶液中预处理6小时。在同一溶液中进行杂交并使用5-20X106cpm32P标记的探针。滤膜在杂交混合物中于55℃保温18-20小时，然后于60℃下在含有1X SSC和0.1％SDS的溶液中洗涤两次，每次30分钟。将滤膜吸干并曝光进行放射自显影。可以使用的其它中等严格性条件是本领域众所周知的。于37℃在含有2X SSC、0.1％SDS的溶液中洗涤滤膜1小时。这种严格性条件适合于在另一物种中分离包含Nogo基因序列的核酸分子，例如采用大鼠或牛Nogo cDNA克隆作为探针以分离人Nogo cDNA。
当与本发明的Nogo基因序列区段比较时，在公布的核酸序列数据库中报道的许多人已表达序列标志(EST)表现出高度序列同一性。采用ENTREZ核苷酸查询，鉴定出以下初步列出的人EST，并以其Genbank登录号列出：AA158636(SEQ ID NO：35)、AA333267(SEQID NO：36)、AA081783(SEQ ID NO：37)、AA167765(SEQ ID NO：38)、AA322918(SEQ ID NO：39)、AA092565(SEQ ID NO：40)、AA081525(SEQ ID NO：41)和AA081840(SEQ ID NO：42)。在本发明之前，没有一个上述鉴定的EST在这些EST在体内可以编码的氨基酸序列方面进行特征鉴定。对于包含所述人EST的预测氨基酸序列的蛋白的功能一无所知。此外，与大鼠Nogo cDNA的5’端序列对齐(align)的一种EST例如AA158636和与大鼠cDNA 3’端序列对齐的另一EST例如AA081840不重叠，认为可能不是同一人cDNA序列的部分。
根据本发明的Nogo基因序列，认为这些人EST代表在获得所述EST的组织中表达的人Nogo基因的部分。因此，本发明包括包含两种或两种以上的以上鉴定的人EST的核酸分子。所述EST可能在同一人组织中表述，或可能在不同的人组织中表达。最好是，本发明的核酸分子包含至少两种相互不重叠、或不与第三或更多人EST重叠的人EST的核苷酸序列。
因为由于克隆了牛和大鼠Nogo核酸，以上鉴定的人EST现在被签定为人Nogo基因的片段，所以设想人EST具有相对于本发明各种方法中其它Nogo核酸分子的相似功能，所述方法例如但不限于例如，表达人Nogo多肽、杂交测定和作为反义核酸分子抑制Nogo表达等。
此外，本发明提供并包括人Nogo蛋白的预测氨基酸序列及其片段。如图13所示，大鼠Nogo蛋白的氨基酸序列(图2a；SEQ ID NO：2)与人Nogo蛋白的预测氨基酸序列(图13；SEQ ID NO：29)进行序列对比。因此，本发明包括包含以下序列的人Nogo蛋白：人Nogo预测的氨基酸序列，图13和SEQ ID NO：29；或人Nogo的预测氨基酸序列中由至少6个氨基酸残基组成的亚序列；或一个或多个人Nogo片段的以下预测氨基酸序列：MEDLDQSPLVSSS(人Nogo，相应于SEQID NO：43的氨基酸1-13)、KIMDLKEQPGNTISAG(人Nogo，相应于SEQ ID NO：44的氨基酸187-203)、KEDEVVSSEKAKDSFNEKR(人Nogo，相应于SEQ ID NO：45的氨基酸340-358)、QESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASVIQPSS(人Nogo，相应于SEQ ID NO：46的氨基酸570-619)。天然存在的的人Nogo和重组人Nogo以及氨基酸序列基本上类似于上述氨基酸序列并且能够被针对Nogo蛋白的抗体结合的其片段在本发明范围内。
本发明还提供编码氨基酸序列基本类似于图13所示氨基酸序列(图13；SEQ ID NO：29)的人Nogo蛋白的核酸分子。在具体实施方案中，也设想了编码氨基酸序列基本类似于图13所示氨基酸序列(SEQID NO：29)的人Nogo蛋白片段的核酸分子，前提是这种核酸分子不包含以上鉴定的人EST的核苷酸序列。
在使用采用本领域已知的计算机同源性程序例如BLAST计算机检索(Altschul等，1994，Nature Genet.6：119-129)进行序列对比的计算机算法时，如果在一种氨基酸序列和人Nogo蛋白的预测氨基酸序列这两种分子中超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％的氨基酸残基是相同的，则认为所述氨基酸序列基本上类似于人Nogo蛋白的预测氨基酸序列。
例如但不限于，有用的计算机同源性程序包括以下：基本局部序列对比检索工具(BLAST)(www.ncbi.nlm.nih.gov)(Altschul等，1990，J.of Molec.Biol.，215：403-410，“BLAST算法；Altschul等，1997，Nuc.Acids Res.25：3389-3402)，这是一种适用于检索序列相似性的启发性检索算法，它采用Karlin和Altschul的统计学方法(1990，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA，87：2264-68；1993，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 90：5873-77)确定显著性。5种具体的BLAST程序执行以下任务：
1)BLASTP程序将氨基酸查询序列对蛋白序列数据库进行比较。
2)BLASTN程序将核苷酸查询序列对核苷酸序列数据库进行比较。
3)BLASTX程序将核苷酸查询序列(两条链)的6种读框概念翻译产物(six-frame conceptual translation product)对蛋白序列数据库进行比较。
4)TBLASTN程序将蛋白查询序列对以所有6种读框(两条链)翻译的核苷酸序列数据库进行比较。
5)TBLASTX程序将核苷酸查询序列的6种读框翻译物对核苷酸序列数据库的6种读框翻译物进行比较。
正如本领域技术人员所理解的，对于鉴定具有所需同一性百分比的核酸TBLASTN程序特别有用，而对于鉴定具有所需同一性百分比的氨基酸序列BLASTP程序特别有用。
Smith-Waterman(数据库：欧洲生物信息研究所wwwz.ebi.ac.uk/bic_sw/)(Smith-Waterman，1981，J.of Molec.Biol.，147：195-197)是用于序列对比的一种数学上严格的算法。
FASTA(参见Pearson等，1988，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA，85：2444-2448)是Smith-Waterman算法的直观推断近似法。关于BLAST、Smith-Waterman和FASTA算法的方法和益处的总体讨论，请参见Nicholas等，1998，“检索序列数据库和序列计分法教程(ATutorial on Searching Sequence Databases and Sequence ScoringMethods)”(www.psc.edu)和其中引用的参考文献。
应用人Nogo的预测氨基酸序列或人EST核苷酸序列包括编码人Nogo预测氨基酸序列的简并序列，来分离或鉴定人Nogo基因、片段、其天然存在的突变体和变异体，属于本发明范围。本领域技术人员已知的这种应用包括但不限于使用所述信息制备核酸探针，以用于DNA文库筛选、DNA扩增、人群的基因筛选；以及制备合成肽，以制备抗体。在本文下面的小节中提供这种应用的某些应用的详细描述。
另外提供编码Nogo蛋白的衍生物和类似物的核酸、以及Nogo反义核酸。正如显而易见的，本文所用的“编码Nogo蛋白片段或部分的核酸”应该解释为是指仅编码所述Nogo蛋白所列举片段或部分、而没有所述Nogo蛋白的其它连续部分作为连续序列的核酸。在这方面，一部分是指一个或多个氨基酸。
也提供包含在相同物种或不同物种的其它Nogo核酸之间保守(与所述其它Nogo核酸同源)的区域的Nogo核酸片段。图2a中提供了编码一个或多个Nogo结构域的核酸，例如，大鼠Nogo的保守羧基末端结构域，它具有约180个氨基酸，并且由终止密码子之前的编码序列的最后540个核苷酸编码。也提供了在大鼠Nogo A中保守羧基末端结构域内的两个疏水结构域(即氨基酸988-1023和氨基酸1090-1125)的核苷酸序列和氨基酸序列。也提供了大鼠Nogo A残基31-58的氨基末端酸性结构域的核苷酸序列和氨基酸序列。
为了进行Nogo各个区的功能分析，已经产生了Nogo基因中的一系列缺失，并将其通过重组DNA技术克隆到表达载体中，并作为融合蛋白表达。提供了编码Nogo蛋白片段的核酸，例如编码SEQ ID NO：2的以下氨基酸残基的核酸：氨基酸残基1-171、172-974、259-542、542-722、172-259、722-974或975-1162或它们的组合；或编码SEQID NO：29的以下氨基酸残基的核酸：1-131、132-939、206-501、501-680、132-206、680-939和940-1127或它们的组合。某些缺失构成物包含截短的Nogo部分和编码六组氨酸标记和/或T7标记的额外核苷酸序列。提供了核酸，所述核酸编码缺乏SEQ ID NO：2的氨基酸残基172-259、氨基酸残基974-1162或氨基酸残基172-259和974-1162、而在其它部分包含SEQ ID NO：2其余部分的截短Nogo蛋白；或编码缺乏SEQ ID NO：29的氨基酸残基132-206、氨基酸残基939-1127或氨基酸残基132-206和939-1127、但在其它部分包含SEQID NO：29其余部分的截短Nogo蛋白。典型的缺失构成物的结构示于图18中。缺失构成物当引入细胞中时，产生Nogo片段或截短部分。在6.2.7一节的表2描述的各种功能测定中，测试了这些突变体的生物活性。
克隆Nogo基因的具体实施方案作为一个具体实施例介绍，但不是限制性的，如下所述：
为了表达克隆(本领域通常已知的技术)，通过本领域已知的方法构建一个表达文库。例如，分离mRNA(例如人)，制备cDNA，并将其连接到表达载体(例如噬菌体衍生物)中，以使它能够被随后所引入的宿主细胞表达。然后可以采用各种筛选测定来选择表达的Nogo产物。在一个实施方案中，可以用抗Nogo抗体来选择。
在另一实施方案中，采用聚合酶链式反应(PCR)在基因组文库或cDNA文库中扩增所需序列，然后进行选择。代表已知的Nogo序列的寡核苷酸引物可以用作PCR中的引物。在一个优选方面，所述寡核苷酸引物代表不同物种的Nogo之间强同源性的Nogo保守区段的至少一部分。所述合成寡核苷酸可以用作引物，来通过PCR从一种潜在目标来源(RNA或DNA)、最好是cDNA文库中扩增序列。例如可以利用Perkin-Elmer Cetus热循环仪和Taq聚合酶(Gene AmpTM)进行PCR。扩增的DNA可以包括得自任何真核生物物种的mRNA或cDNA或基因组DNA。人们可以选择来合成几种不同的简并引物，以用于PCR反应。也可以改变引发PCR反应中所用的杂交条件的严格性，以在已知Nogo核苷酸序列和分离的核酸同源物之间提供更高或更低程度的核苷酸序列相似性。对于杂交物种的杂交，最好使用低严格性条件。对于同一物种的杂交，最好使用中等严格性条件。
在成功扩增Nogo同源物区段后，可以对该区段进行分子克隆和测序并且用作探针以分离完整的cDNA或基因组克隆。这进而又允许确定该基因的完整核苷酸序列、其表达分析和产生其蛋白产物以进行功能分析，如下文所述。以这种方式，可以鉴定出编码Nogo蛋白和Nogo类似物的另外的基因。
上述方法不意味着限制以下可以获得Nogo克隆的方法的一般描述。
任何真核细胞均可以潜在地用作分子克隆所述Nogo基因的核酸源。可以从脊椎动物、哺乳动物、人、猪、鼠、牛、猫、鸟类、马、犬以及其它灵长类来源、昆虫等中分离编码Nogo的核酸序列。可以采用本领域已知的标准方法，从克隆的DNA(例如DNA“文库”)中获得所述DNA，或通过化学合成、cDNA克隆或通过从所需细胞中纯化的基因组DNA或其片段的克隆，获得所述DNA。(参见例如Sambrook等，1989，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Glover，D.M.(主编)，1985，DNA Cloning：A Practical Approach，MRLPress，Ltd.，Oxford，U.K.第I、II卷)。得自基因组DNA的克隆除含有编码区外，还可能含有调节区和内含子DNA区；得自cDNA的克隆将仅含外显子序列。无论何种来源，均应该将所述基因分子克隆到合适的载体中，用于基因的繁殖。
在得自基因组DNA的基因的分子克隆中，产生DNA片段，其中某些片段将编码所需基因。可以采用各种限制酶于特定位点切割所述DNA。或者，人们可以在镁存在下使用DNA酶，以将所述DNA片段化，或可以将所述DNA进行物理剪切，如例如通过超声处理。然后通过标准技术，包括但不限于琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳和柱层析，可以根据大小分离所述线性DNA片段。
一旦产生所述DNA片段后，可以以多种方式完成含所需基因的特定DNA片段的鉴定。例如，如果可以得到一定量的Nogo(或任何物种的)基因的一部分或其特定RNA或其片段(参见6.1.1一节)，并可以将其纯化和标记，则可以通过与所述标记探针进行核酸杂交来筛选所产生的DNA片段(Benton，W.和Davis，R.，1977，Science 196：180；Grunstein，M.和Hogness，D.，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72：3961)。与所述探针具有相当大同源性的那些DNA片段将杂交。也可以通过限制酶消化和将片段大小与按照已知限制图谱(如果可得到)预测的片段大小进行比较，来鉴定合适的片段。根据该基因的特性可以进行进一步选择。
或者，通过基于其表达产物的物理、化学或免疫学特性的测定，可以检测基因的存在。例如，可以选择杂交选择正确mRNA的cDNA克隆或DNA克隆，这将产生例如电泳迁移率、等电聚焦行为、蛋白水解消化图谱、翻译后修饰、酸性或碱性特性或抗原性特性与Nogo已知特性相似或相同的蛋白。可得到抗Nogo抗体，例如IN-1和IN-2(美国专利5,684,133)、AS Bruna和AS 472。AS Bruna和AS 472的制备在6.1.7一节中描述。可以通过在ELISA(酶联免疫吸附测定)型方法中标记抗体与推定的Nogo合成克隆结合，或通过纯化的或全细胞提取物的蛋白质印迹，鉴定所述Nogo蛋白。
也可以通过核酸杂交然后进行体外翻译进行mRNA选择，鉴定出所述Nogo基因。在该方法中，片段用来通过杂交分离互补mRNA。这种DNA片段可以代表其它物种(例如小鼠、人类)的可得到的、纯化的Nogo DNA。所分离mRNA的分离产物的体外翻译产物的免疫沉淀分析或功能测定(例如体外聚集能力；与受体结合；参见下文)鉴定所述mRNA，并因此鉴定含有所需序列的互补DNA片段。另外，通过将分离自细胞的多核糖体吸附至特异性针对Nogo蛋白的固定化抗体，可以选择特异性mRNA。可以采用所选择的mRNA(得自吸附的多核糖体)作为模板，合成放射标记的Nogo cDNA。然后，放射标记的mRNA或cDNA可以用作探针，来从其它基因组DNA片段中鉴定Nogo DNA片段。
分离Nogo基因组DNA的替代方法包括但不限于根据已知序列化学合成该基因序列本身，或制备编码Nogo蛋白的mRNA的cDNA。例如，可以从表达Nogo的细胞中分离用于Nogo基因cDNA克隆的RNA。其它方法也是可能的，并且在本发明范围内。
然后将所鉴定和分离的基因插入合适的克隆载体中。可以使用本领域已知的多种载体-宿主系统。可能的载体包括但不限于质粒或修饰病毒，但所述载体系统必须与所用的宿主细胞相匹配。这种载体包括但不限于噬菌体例如λ衍生物、或质粒例如pBR322或pUC质粒衍生物或Bluescript载体(Stratagene)。在一个具体实施例中，将Nogo克隆到具有附加表位以简化蛋白表达分析的pcDNA3中(6.1.10一节)。
例如通过将所述DNA片段连接到具有互补粘性末端的克隆载体中，可以完成插入到克隆载体中。然而，如果在克隆载体中不存在用来将所述DNA片段化的互补限制位点，则可以酶促修饰所述DNA分子的末端。或者，通过将核苷酸序列(接头)连接到所述DNA末端上，可以产生所需的任何位点；这些连接接头可以包含特异性化学合成的、编码限制性内切核酸酶识别序列的寡核苷酸。在一个替代方法中，所切割的载体和Nogo基因可以通过同聚物加尾修饰。可以将重组分子通过转化、转染、感染、电穿孔等引入宿主细胞，以使产生许多拷贝的所述基因序列。
在一个替代方法中，所述所需基因可以在以“鸟枪”法插入合适的克隆载体中后进行鉴定和分离。在插入克隆载体之前，可以通过例如大小分级来富集所述所需基因。
在具体实施方案中，用掺入分离的Nogo基因的重组DNA分子、cDNA或合成DNA序列转化宿主细胞，能够产生多拷贝的该基因。因此，通过培养转化体，从所述转化体中分离重组DNA分子，必要时从所分离的重组DNA中挽回所插入的基因，可以大量获得所述基因。
本发明提供的Nogo序列包括所编码的氨基酸序列基本上与天然Nogo蛋白相同的那些核苷酸序列、以及具有功能等同氨基酸的那些编码的氨基酸序列、以及编码其它Nogo衍生物或类似物的那些序列，如以下6.2.1和6.2.2小节中关于Nogo衍生物和类似物描述。
5.2Nogo基因的表达
可以将编码Nogo蛋白或其功能活性类似物或片段或其它衍生物的核苷酸序列(参见图1b和2a；6.2.1和6.2.2小节)插入合适的表达载体中，即含有所插入蛋白编码序列转录和翻译的必需元件的载体。必需转录和翻译信号也可以由天然Nogo基因和/或其侧翼区提供。也可以用充分描述的抗原或具有与结合配偶体(例如myc附加表位、组氨酸标记、T7附加表位等，参见6.2.6一节和图11a-11c)的已知结合特性的生物分子的编码序列标记编码序列。然后可以利用这种额外的序列，利用结合基团与连接到固相基质的其相应的伴侣的相互作用，来纯化Nogo蛋白、蛋白片段或衍生物。
可以使用多种宿主-载体系统，来表达蛋白编码序列。这些系统包括但不限于用病毒(痘苗病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物，例如含酵母载体的酵母，或用噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件在其强度和特异性方面不同。根据所用的宿主-载体系统，可以使用多种合适转录和翻译元件中的任一种。在具体实施方案中，表达人Nogo基因或编码人Nogo功能活性部分的序列，作为一个具体实例，或者表达Nogo A、Nogo B或Nogo C(图1b)。在再一实施方案中，表达包含所述Nogo蛋白一个结构域的Nogo片段。
如本文所用，如果在通过例如转染、电穿孔、转导等将细胞中天然不存在的核酸引入细胞或其祖先中后，这种细胞含有所述核酸，则所述细胞被所述核酸“转化”。
也提供了编码人Nogo A片段的核苷酸序列，所述片段包含选自SEQ ID NO：29的氨基酸残基1-131、132-939、206-501、501-680、132-206、680-939和940-1127的氨基酸序列。也提供了编码人Nogo A截短部分的核苷酸序列；所述截短蛋白缺乏SEQ ID NO：29的氨基酸残基132-206、氨基酸残基939-1127或氨基酸残基132-206和939-1127，但在其它部分包含SEQ ID NO：29的其余部分。
先前描述的将DNA片段插入载体中的任何方法均可以用来构建含嵌合基因的表达载体，所述嵌合基因包含合适的转录/翻译控制信号和蛋白编码序列。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组体(遗传重组)。编码Nogo蛋白或肽片段的核酸序列的表达，可以通过第二核酸序列来调节，以使所述Nogo蛋白或肽在用所述重组DNA分子转化的宿主中表达。例如Nogo蛋白的表达可以由本领域已知的任何启动子/增强子元件控制。典型的实施方案是应用6.2.1一节中讨论的Nogo天然启动子之一，或者是P1或者是P2。也可以使用非天然启动子。可以用来控制Nogo表达的启动子包括但不限于SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290：304-310)、劳斯肉瘤病毒3’长末端重复序列中含有的启动子(Yamamoto等，1980，Cell 22：787-799)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，1982，Nature 296：39-42)；原核生物表达载体，例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)或tac启动子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)；也参见在于Scientific American，1980，242：74-94的“得自重组细菌的有用蛋白”；包含胭脂碱合成酶启动子区(Herrera-Estrella等，Nature 303：209-213)或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner等，1981，Nucl.Acids Res.9：2871)和光合酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrella等，1984，Nature 310：115-120)的植物表达载体；得自酵母或其它真菌的启动子元件，例如Gal 4启动子、ADC(乙醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子的启动子，以及表现出组织特异性并已经用于转基因动物的以下动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等，1984，Cell 38：639-646；Ornitz等，1986，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7：425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature 315：115-122)、在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等，1984，Cell 38：647-658；Adames等，1985，Nature318：533-538；Alexander等，1987，Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)、在睾丸细胞、乳腺细胞、淋巴样细胞和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制区(Leder等，1986，Cell 45：485-495)、在肝脏中有活性的清蛋白基因控制区(Pinkert等，1987，Genes and Devel.1：268-276)、在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等，1985，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等，1987，Science 235：53-58)；在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，1987，Genes and Devel.1：161-171)、在髓样细胞中有活性的β-球蛋白基因控制区(Mogram等，1985，Nature315：338-340；Kollias等，1986，Cell 46：89-94)；在大脑少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等，1987，Cell 48：703-712)；在骨骼肌中有活性的髓磷脂轻链-2基因控制区(Sani，1985，Nature 314：283-286)和在下丘脑中有活性的促性腺素释放素基因控制区(Mason等，1986，Science 234：1372-1378)。
在一个具体实施方案中，使用的载体包含一个启动子，所述启动子有效连接于Nogo编码核酸、一个或多个复制起点和任选的一个或多个选择标记(例如抗生素抗性基因)。
在一个具体实施方案中，通过将Nogo编码序列亚克隆到三种pGEX载体(谷胱甘肽S-转移酶表达载体；Smith和Johnson，1988，Gene 7：31-40)的每一种EcoRI限制位点中，制备表达构成物。这便于从所述亚克隆中以正确的读框表达所述Nogo蛋白产物。
通过以下三种通用方法可以鉴定含有Nogo基因插入片段的表达载体：(a)核酸杂交，(b)“标记”基因功能的存在与否，和(c)所插入序列的表达。在第一种方法中，采用包含与所插入的Nogo基因同源的序列的探针，通过核酸杂交可以检测出插入表达载体中的Nogo基因的存在。在第二种方法中，根据因Nogo基因插入载体中而引起的某些“标记”基因功能(例如胸苷激酶活性、抗生素抗性、转化表型、在杆状病毒中形成包含体等)的存在与否，可以鉴定和选择所述重组载体/宿主系统。例如，如果Nogo基因插入该载体的标记基因序列中，则根据标记基因功能的缺乏可以鉴定出含所述Nogo插入片段的重组体。在第三种方法中，通过分析所述重组体表达的Nogo产物，可以鉴定重组表达载体。这种测定可以基于例如体外测定系统中Nogo蛋白的物理特性或功能特性，例如与抗Nogo抗体的结合。
一旦鉴定并分离出特定的重组DNA分子，则可以用本领域已知的几种方法来繁殖所述DNA分子。一旦确立了合适的宿主系统和生长条件，则可以繁殖重组表达载体和大量制备。如前所解释，可以使用的表达载体包括但不限于以下载体或其衍生物：人或动物病毒，例如痘苗病毒或腺病毒；昆虫病毒，例如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(例如λ)以及质粒和粘粒DNA载体，这仅例举少数实例。
另外，可以选择调节所插入序列表达、或以所需特定方式修饰和加工所述基因产物的宿主细胞株。来自某些启动子的表达在某些诱导物存在的可以增加；因此，可以控制遗传工程Nogo蛋白的表达。此外，不同的宿主细胞具有用于转录和翻译后加工和修饰(例如蛋白的糖基化、磷酸化)的特征性和特异性的机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统，以确保所表达的外源蛋白的所需修饰和加工。例如，在细菌系统中的表达可以用来产生未糖基化的核心蛋白产物。在酵母中的表达将产生糖基化产物。在哺乳动物细胞中的表达可以用来确保异源蛋白的“天然”糖基化。此外，不同的载体/宿主表达系统可以在不同程度上影响加工反应。
在其它具体实施方案中，所述Nogo蛋白、片段、类似物或衍生物可以作为融合物、或嵌合蛋白产物(包含通过肽键连接于异源蛋白序列(不同蛋白的)的所述蛋白、片段、类似物或衍生物)来表达。通过采用本领域已知的方法，将编码所需氨基酸序列的合适核酸序列在正确的编码框内相互连接，并通过本领域通常已知的方法表达所述嵌合产物，可以制备这种嵌合产物。或者，通过蛋白合成技术，例如利用肽合成仪，可以制备这种嵌合产物。
可以克隆并表达cDNA序列和基因组序列。
5.3  Nogo基因产物的鉴定和纯化
在特定方面，本发明提供Nogo、特别是人Nogo、包含抗原决定簇(即可以被抗体识别的)或有其它功能活性的其片段和衍生物的氨基酸序列、以及编码上述氨基酸序列的核酸序列。本文所用的“功能活性”Nogo物质是指表现出一种或多种与全长(野生型)Nogo A蛋白相关的已知功能活性，例如非许可底物特性、背根神经节生长锥衰弱、NIH 3T3散布抑制、神经突向外生长抑制、与Nogo底物或Nogo结合配偶体的结合、抗原性(与抗Nogo抗体的结合)、免疫原性等。
在具体实施方案中，本发明提供Nogo蛋白的片段，所述片段包含至少6个氨基酸、10个氨基酸、17个氨基酸、50个氨基酸、100个氨基酸或至少220个氨基酸。在其它实施方案中，所述蛋白包含或高度保守的Nogo羧基末端结构域(Nogo A的羧基末端188个氨基酸)或基本上由所述结构域组成。也提供片段或包含片段的蛋白，所述片段缺乏Nogo蛋白的保守羧基末端结构域或疏水羧基末端序列段、或氨基末端酸性结构域、或氨基末端聚脯氨酸区或其任何组合。提供编码上述片段或蛋白的核酸。
一旦鉴定出表达Nogo基因序列的重组体，则可以分析所述基因产物。通过根据所述产物的物理或功能特性的测定，包括将所述产物放射性标记，然后通过凝胶电泳、免疫测定等进行分析，可以完成这一步。
一旦鉴定出Nogo蛋白，可以通过标准方法将其分离和纯化，所述标准方法包括层析(例如离子交换层析、亲和层析和大小柱层析)、离心、差别溶解度或蛋白纯化的其它任何标准技术。采用任何合适的测定，包括背根神经节生长锥衰弱、NIH 3T3散布抑制、抑制视神经中的神经突再生(参见6.2.4-6.2.5小节)，可以评估功能特性。
或者，一旦鉴定出由重组体产生的Nogo蛋白，则可以根据所述重组体中包含的嵌合基因的核苷酸序列推导出所述蛋白的氨基酸序列。因此，可以采用本领域已知的标准化学方法(例如参见Hunkapiller，M.等，1984，Nature 310：105-111)合成所述蛋白。
在另一替代实施方案中，采用标准方法例如上述方法(例如免疫亲和纯化)，从天然来源中纯化天然Nogo C。
在本发明的一个具体实施方案中，无论是通过重组DNA技术产生的，还是通过化学合成方法或纯化天然蛋白产生的这种Nogo蛋白，包括但不限于含有作为第一氨基酸的基本上如图2a(SEQ ID NO：2)中所示、图12(SEQ ID NO：28)中的牛、或图13(SEQ ID NO：29)中的人的氨基酸序列的全部或部分、以及片段和其它衍生物(例如但不限于图18中所示的)和其类似物的那些蛋白，包括与其同源的蛋白。最好是，本发明的Nogo蛋白不含与所述Nogo蛋白天然连接的所有CNS髓磷脂物质。
5.4  Nogo基因和蛋白的结构
通过本领域已知的各种方法和以下小节中描述的这些方法中的几种方法，可以分析Nogo基因和蛋白的结构。
5.4.1遗传分析
采用包括但不限于DNA印迹杂交(Southern，E.M.，1975，J.Mol.Biol.98：503-517)、RNA印迹杂交(参见例如Freeman等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：4094-4098)、限制性内切核酸酶图谱(Maniatis，T.，1982，Molecular Cloning，A Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork)和DNA序列分析的方法，可以分析相应于Nogo基因的克隆的DNA或cDNA。聚合酶链式反应(PCR；美国专利第4,683,202、4,683,195和4,889,818号；Gyllenstein等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：7652-7656；Ochman等，1988，Genetics 120：621-623；Loh等，1989，Science 243：217-220)，然后用Nogo特异性探针进行DNA印迹杂交，可以允许检测出得自各种细胞类型的DNA中的Nogo基因。非PCR的扩增方法是通常已知的，也可以使用。在一个实施方案中，可以用DNA印迹杂交来测定Nogo的遗传连锁。可以用RNA印迹杂交分析来确定Nogo基因的表达。可以测试不同发育状态和活性状态的各种细胞类型的Nogo表达。可以控制DNA和RNA印迹杂交的杂交条件的严格性，以确保具有所需程度的与所用的特异性Nogo探针相关性的核酸的检测。可以使用本领域通常已知的这些方法和其它方法的修改方法。
可以用限制性内切核酸酶图谱来大致确定Nogo基因的基因结构。通过限制性内切核酸酶酶切得到的限制性图谱可以通过DNA序列分析来证实。
可以采用本领域已知的任何技术，包括但不限于Maxam和Gilbert的方法(1980，Meth.Enzymol.65：499-560)、Sanger双脱氧法(Sanger，F.等，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74：5463)、应用T7DNA聚合酶(Tabor和Richardson，美国专利第4,795,699号)或应用自动DNA测序仪(例如Applied Biosystems，Foster City，CA)，进行DNA序列分析。
5.4.2蛋白分析
通过从DNA序列推导，或者通过蛋白直接测序例如用自动氨基酸测序仪，可以得到Nogo蛋白的氨基酸序列。
通过亲水性分析(Hopp，T.和Woods，K.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824)，可以进一步特征鉴定Nogo蛋白序列。可以用亲水性分布型来鉴定Nogo蛋白的疏水区和亲水区以及编码这些区的基因序列的相应区。
其次，也可以进行结构分析(Chou，P.和Fasman，G.，1974，Biochemistry 13：222)，以鉴定Nogo的采取特定二级结构的区域。
采用本领域可利用的计算机软件程序，也可以完成序列同源物的操作、翻译、和二级结构预测、可读框预测和作图以及测定。
也可以利用其它结构分析方法。这些包括但不限于X射线晶体学(Engstom，A.，1974，Biochem.Exp.Biol.11：7-13)和计算机制作模型(Fletterick，R.和Zoller，M.(主编)，1986，Computer Graphics andMolecular Modeling，载于Current Communications in MolecularBiology，Dold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork)。
5.5  抗Nogo蛋白的抗体及其衍生物的产生
按照本发明，所述Nogo蛋白、其片段或其它衍生物或其类似物可以用作免疫原，以产生免疫特异性地结合这种免疫原的抗体。这种抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库。产生针对大鼠和牛Nogo重组片段的抗体(6.1.7一节)，这些抗体也与其它种类的表位交叉反应。在另一实施方案中，鉴定为亲水性的Nogo蛋白片段用作免疫原，以用于抗体产生。
本领域已知的各种方法可以用以产生抗Nogo蛋白或衍生物或类似物的多克隆抗体。在一个特定的实施方案中，可以获得针对图2a中SEQ ID NO：2、图12中SEQ ID NO：28、图14中SEQ ID NO：32或图13中SEQ ID NO：29(分别为大鼠Nogo A、牛Nogo、大鼠Nogo C或人Nogo)的序列或其亚序列编码的Nogo蛋白表位的兔多克隆抗体。为了产生抗体，可以通过用所述天然Nogo蛋白或合成形式的Nogo蛋白或其衍生物(例如片段)注射，可以免疫各种宿主动物，所述动物包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。可以根据宿主物种使用各种佐剂来增加免疫应答，所述佐剂包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐剂、无机凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔
Figure G998153486D00311
血蓝蛋白、二硝基酚和可能有用的人用佐剂例如BCG(卡介菌)和小棒杆菌。
对于针对Nogo蛋白序列或其类似物的单克隆抗体的制备，可以使用提供用于由培养的连续细胞系生产抗体分子的任何技术。例如，最初由Kohler和Milstein开发的杂交瘤技术(1975，Nature 256：495-497)以及trioma技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，ImmunologyToday 4：72)和EBV-杂交瘤技术，以产生人单克隆抗体(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan.R.Liss，Inc.，第77-96页)。可以利用当前的技术(PCT/US90/02545)，在无菌动物中生产单克隆抗体。按照本发明，可以使用人抗体，并且可以采用人杂交瘤(Cote等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：2026-2030)或通过用EBV病毒体外转化人B细胞(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，第77-96页)获得人抗体。事实上，按照本发明，可以使用开发用于生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851-6855；Neuberger等，1984，Nature312：604-608；Takeda等，1985，Nature 314：452-454)，即通过将得自Nogo特异性小鼠抗体分子的基因与得自具有合适生物活性的人抗体分子的基因剪接在一起；这种抗体在本发明范围内。
按照本发明，描述用于生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)可以用来生产Nogo特异性单链抗体。描述用于构建Fab表达文库的技术也可以利用(Huse等，1989，Science 246：1275-1281)，以提供快速且容易鉴定对Nogo蛋白、衍生物或类似物具有所需特异性的单克隆Fab片段。
可以采用已知技术产生含有独特型所述分子的抗体片段。例如，这种片段包括但不限于：F(ab’)2片段，可以通过胃蛋白酶消化所述抗体分子产生；Fab’片段，可以通过还原F(ab’)2片段的二硫桥产生；Fab片段，可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生；和Fv片段。
在抗体生产中，可以采用本领域已知的技术，例如ELISA(酶联免疫吸附测定)，完成所需抗体的筛选。例如，为了选择识别Nogo蛋白特定结构域的抗体，人们可以测定所产生杂交瘤的与含这种结构域的Nogo片段结合的产物。对于特异性结合第一Nogo同源物、但不特异性地结合不同Nogo同源物的抗体的选择，人们可以在与所述第一Nogo同源物结合但缺乏与所述第二Nogo同源物结合的基础上进行选择。
也提供对Nogo蛋白一个结构域特异性的抗体。
上述抗体可以用于本领域中已知的方法中，所述方法涉及本发明Nogo蛋白序列的定位和活性，例如用于这些蛋白的成象、在合适生理样品中、在诊断方法中测定Nogo蛋白的水平等。
抗Nogo抗体以及含所述结合结构域的其片段是治疗剂。
5.6  Nogo蛋白、衍生物和类似物
本发明还涉及Nogo蛋白以及Nogo蛋白的衍生物(包括但不限于片段)和类似物。也提供编码Nogo蛋白衍生物和蛋白类似物的核酸。在一个实施方案中，所述Nogo蛋白由上文5.1一节中描述的Nogo核酸编码。在特定方面，动物例如小鼠、大鼠、猪、牛、狗、猴子人、蝇或青蛙的Nogo A、Nogo B或Nogo C蛋白以及衍生物或类似物在本发明范围内。
与Nogo相关的衍生物和类似物的生产和应用也在本发明范围内。在一个具体实施方案中，所述衍生物或类似物是有功能活性的，即能够表现出与全长野生型Nogo蛋白相关的一种或多种功能活性。作为一个实例，具有所需免疫原性或抗原性的这种衍生物或类似物可以用于例如免疫测定、用于免疫、用于抑制Nogo活性等。保留或者缺乏或者抑制所需目的Nogo特性(例如与Nogo结合配偶体结合)的衍生物或类似物，可以分别用作这种特性及其生理相关特性的诱导物或抑制剂。一个具体实施方案涉及可以被抗Nogo抗体结合的Nogo片段。可以通过本领域已知的方法，包括但不限于6.1.10-6.1.12节中描述的测定，测试Nogo的衍生物或类似物的所需活性。
为了将Nogo的活性区作图，可以通过如6.2.7中描述的重组DNA技术，制备一系列Nogo缺失突变体。缺失突变体中存在的Nogo部分示于图18中。在一个具体实施方案中，本发明提供Nogo片段，例如包含Nogo A(SEQ ID NO：2)的氨基酸1-171、172-974、259-542、542-722、722-974、172-259或975-1162或上述的组合(或者由上述氨基酸或它们的组合组成)的片段。也提供缺乏SEQ ID NO：2的氨基酸172-259和/或975-1162的Nogo的截短突变体，因为这些区看来是非必需的，并且可以从Nogo中除去而不影响生物活性。也提供包含SEQ ID NO：29的氨基酸1-131、132-939、206-501、501-680、132-206、680-939或940-1127(或者由上述氨基酸)的人Nogo A相应的片段。也提供缺乏SEQ ID NO：29的氨基酸残基132-206、氨基酸残基939-1127或氨基酸残基132-206和939-1127的人Nogo A的截短突变体。
在一个具体实施方案中，所述片段不含所有CNS髓磷脂物质和/或表现出对Nogo的抑制活性。也提供包含与非Nogo序列融合的一种或多种上述片段的融合蛋白。
通过提供功能等同分子的置换、添加或缺失而改变Nogo序列，可以制备Nogo基因衍生物。由于核苷酸编码序列的简并性，编码基本上与Nogo基因相同的氨基酸序列的其它DNA序列可以用于实施本发明。这些包括但不限于包含Nogo基因的全部或部分的核苷酸序列，其中所述Nogo基因通过置换编码该序列内功能等同氨基酸残基的不同密码子而改变，由此产生沉默改变。同样，本发明的Nogo衍生物包括但不限于：含有作为第一氨基酸序列的Nogo蛋白氨基酸的全部或部分，其中所述Nogo蛋白的氨基酸包括改变的序列，其中功能等同氨基酸残基取代了该序列内的残基，导致沉默改变。例如，该序列内的一个或多个氨基酸残基可以被具有相似极性的另一氨基酸保守性取代，这可用作功能等同物，导致沉默改变。该序列内氨基酸的置换可以选自所述氨基酸所属类别的其它成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
在本发明的一个具体实施方案中，提供了由Nogo蛋白片段组成或包含所述片段的蛋白，所述片段由Nogo蛋白的至少10个(连续的)氨基酸组成。在其它实施方案中，所述片段由所述Nogo蛋白的至少17个或50个氨基酸组成。在具体实施方案中，这种片段不大于35、100或200个氨基酸。Nogo的衍生物或类似物包括但不限于包含以下区的那些分子：基本上与Nogo或其片段同源的区(例如在不同实施方案中，在相同大小的氨基酸序列内或当同其中由本领域已知的计算机同源性程序序列对比的序列对比序列进行比较时，同一性至少为60％或70％或80％或90％或95％，所述计算机同源性程序例如BLAST计算机检索(Altschul等，1994，Nature Genet.6：119-129))；或其编码核酸在严格条件、中等严格条件或非严格条件下能够与Nogo编码序列杂交的那些区。
也提供包含Nogo片段的分子，例如含有与其它部分(包括标记或生物活性部分)碳氢键合的分子。
可以采用各种本领域已知的方法产生本发明的Nogo衍生物和类似物。导致其产生的操作可以发生在基因水平或蛋白水平上。例如，可以通过本领域已知的多种策略中的任一种(Maniatis，T.，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York)，修饰所克隆的Nogo基因序列。可以将该序列在合适的位点用限制性内切核酸酶切割，然后如有需要进行进一步的酶促修饰、分离和体外连接。在编码Nogo衍生物或类似物的基因的产生中，应该小心确保所修饰的基因保留在与Nogo相同的翻译读框内，在编码所需Nogo活性的基因区域内不被翻译终止信号中断。
另外，所述Nogo编码核酸序列可以在体外或体内突变，以产生和/或破坏翻译、起始和/或终止序列，或在编码区中产生变异和/或形式新的限制性内切核酸酶位点或破坏现有的限制性内切核酸酶位点，以促进进一步的体外修饰。可以使用本领域已知的任何诱变技术，包括但不限于化学诱变、体外定点诱变(Hutchinson，C.等，1978，J.Biol.Chem 253：6551)、应用接头(Pharmacia)等。
也可以在蛋白水平进行Nogo序列的操作。本发明范围内包括在翻译期间或翻译后例如通过以下方法差别修饰的Nogo蛋白片段或其它衍生物或类似物，所述方法例如糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、用已知的保护基团/封闭基团衍生、蛋白水解酶切、与抗体分子或其它细胞配体连接等。可以用已知技术，包括但不限于采用溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4的特异性切割；乙酰化、甲酰化、氧化、还原；在衣霉素存在下的代谢合成等进行多种化学修饰的任一种。
另外，可以化学合成Nogo的类似物和衍生物。例如，可以利用肽合成仪，合成对应于Nogo蛋白含有所需结构域或介导体外所需活性的部分的肽。此外，如有需要，可以将非典型氨基酸或化学氨基酸类似物作为置换或添加引入到Nogo序列中。非典型氨基酸一般包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸Abu、2-氨基丁酸γ-Abu、ε-Ahx 6-氨基己酸、Aib 2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟氨基酸、设计者氨基酸(designer amino acid)例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和氨基酸类似物。此外，所述氨基酸可以是D型(右旋)或L型(左旋)。
在一个具体实施方案中，所述Nogo衍生物是嵌合蛋白或融合蛋白，包含一种Nogo蛋白或其片段(最好由至少一个Nogo蛋白结构域或基序、或Nogo蛋白的至少10个氨基酸组成)，所述Nogo蛋白或其片段在其氨基末端或羧基末端通过肽键连接于一种不同蛋白的氨基酸序列。在一个实施方案中，通过重组表达编码该蛋白的核酸(包含与不同蛋白的编码序列符合读框地连接的Nogo编码序列)产生这种嵌合蛋白。通过将编码所需氨基酸序列的合适的核酸序列通过本领域已知的方法在正确的读框中相互连接，并通过本领域通常已知的方法表达所述嵌合产物，可以制备这种嵌合产物。或者，通过蛋白合成技术，例如利用肽合成仪，可以制备这种嵌合产物。可以构建包含与任何异源蛋白编码序列融合的Nogo部分的嵌合基因。这种异源蛋白编码序列包括例如六组氨酸标记和T7标记。一个具体实施方案涉及包含Nogo的至少6个氨基酸的片段的嵌合蛋白。
在另一具体实施方案中，所述Nogo衍生物是包含一个与Nogo蛋白同源的区的分子。
在一个优选实施方案中，所述Nogo衍生物(例如片段)是非天然存在的蛋白。
衍生物和类似物的其它具体实施方案在以下小节和下文的实施例一节中描述。
5.6.1含有一个或多个Nogo蛋白结构域的Nogo衍生物
在一个具体实施方案中，本发明涉及Nogo衍生物和类似物，特别涉及包含一个或多个Nogo蛋白结构域或者由所述结构域组成的Nogo片段和这种片段的衍生物，所述片段包括但不限于：保守的羧基末端和疏水结构域或氨基末端酸性或富聚脯氨酸结构域、上述任一种的功能(例如结合)片段、或上述的任何组合。
一个具体实施方案涉及包含Nogo特定片段的分子，所述特定片段是在各种Nogo蛋白中与大鼠或牛Nogo蛋白的特定片段同源性最强的那些片段。包含Nogo同源物的一个结构域的片段可以通过如6.1.2、6.1.8、6.1.9、6.1.10、6.1.11或6.1.12中描述的蛋白分析方法来鉴定。
在另一具体实施方案中，提供包含Nogo蛋白的一个或多个结构域(或其功能部分)、但也缺乏Nogo蛋白的一个或多个结构域(或其功能部分)的分子。在另一实施方案中，提供包含Nogo蛋白的一个或多个结构域(或其功能部分)并具有Nogo蛋白的一个或多个突变(例如由缺失或点突变引起的)结构域(例如以使所述突变结构域功能降低了)的分子。
5.7  Nogo蛋白、衍生物和类似物的分析
Nogo蛋白、衍生物和类似物的功能活性可以通过各种方法分析。在以下部分中描述功能测定不是意味着限制性的，可以包括本领域技术人员已知的其它测定。
5.7.1  Nogo体外神经突生长抑制的测定
在一个具体实施方案中，可以采用体外组织培养(6.1.10一节)分析Nogo蛋白、衍生物和类似物对NIH 3T3散布的抑制或对PC12神经突向外生长的抑制。
在一个替代实施方案中，可以用Nogo蛋白、衍生物和类似物来分析由于Nogo存在而诱导的外植鸡背根神经节生长锥衰弱。同样，可以根据对外植鸡背根神经节的神经突向外生长的抑制，分析Nogo的功能(Spillman等，1998，J.Biol.Chem.273：19283-19293)。
5.7.2  Nogo体内功能特性的分析
在一个实施例中，Nogo蛋白、衍生物和类似物的拮抗剂可以用于采用在长距离内皮质脊髓束(CST)再生和行为恢复的动物模型的体内功能测定中。
在一个优选实施方案中，通过外科切除术或脊髓挫伤损伤啮齿动物皮质脊髓束，然后给予所述动物Nogo的拮抗剂。关于结构可塑性或再生，通过解剖学技术，主要通过标记限定的神经束，监测与未处理对照动物或对照抗体处理的动物相比的神经可塑性、再生和功能恢复。通过用啮齿动物进行的行动和通过电生理学杀伤试验(例如粘性纸试验(sticky paper test)、足弹丸达到任务(food pellet reaching task)等)(Thallmair等，1998，Nat.Neuroscience 1(2)：124-131)，测定功能的恢复。
5.7.3  Nogo配体结合抑制及其测定
在分析与野生型Nogo结合或与野生型Nogo竞争与抗Nogo抗体结合能力的一个实施方案中，可以使用本领域已知的各种免疫测定方法，包括但不限于采用诸如以下技术的竞争性测定系统和非竞争性测定系统：放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹层”免疫测定、免疫放射分析、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定(采用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测定(例如凝胶凝集测定、血凝测定)、补体结合测定、免疫荧光测定、A蛋白测定和免疫电泳测定等。在一个实施方案中，通过检测第一抗体上的标记来检测抗体结合。在另一实施方案中，通过检测第二抗体或试剂与第一抗体的结合，检测第一抗体。在再一实施方案中，标记第二抗体。本领域已知用于在免疫测定中检测结合的许多方法，这些方法在本发明范围内。
在鉴定Nogo结合蛋白的另一实施方案中，可以例如通过本领域众所周知的方法分析结合。在另一实施方案中，可以分析Nogo与其底物结合的生理相关物。
其它方法是本领域技术人员已知的，并且在本发明范围内。
5.8治疗应用
本发明可供用于通过给予治疗化合物(本文称为“治疗剂”)治疗或预防各种疾病和紊乱。这种“治疗剂”包括但不限于：Nogo蛋白及其类似物和衍生物(包括片段)(例如如上所述的)；其抗体(如上所述)；编码所述Nogo蛋白、类似物或衍生物的核酸(例如如上所述的)；Nogo反义核酸以及Nogo激动剂和拮抗剂。通过给予促进Nogo功能的治疗剂，治疗或预防涉及使细胞生长去调节的疾病例如CNS肿瘤。通过给予拮抗(抑制)Nogo功能的治疗剂，治疗神经突生长、再生或维持缺陷或希望神经突生长、再生或维持缺陷的疾病。上述内容在以下小节中详细描述。
一般而言，最好是给予物种来源或物种反应性(在抗体的情况下)与患者相同的制品。因此，在一个优选实施方案中，将人Nogo蛋白、衍生物、或类似物、或核酸、或抗人Nogo蛋白的抗体治疗性或预防性地给予病人。
5.8.1涉及去调节的细胞生长的疾病的治疗和预防
通过给予促进(即增加或供应)Nogo功能的治疗剂，治疗或预防涉及去调节的细胞生长的疾病或紊乱。这种治疗剂的实例包括但不限于Nogo蛋白、衍生物或有功能活性的、特别是在抑制神经突延伸或细胞生长抑制方面有活性(例如在体外测定或动物模型中证明的)的片段；和编码Nogo蛋白或其功能活性衍生物或片段的核酸(例如用于基因治疗)。最好是，所述Nogo蛋白、衍生物或其片段不含与其天然连接的所有CNS髓磷脂物质。采用体外测定或动物模型(其实例在下文描述)，可以鉴定出可以使用的其它治疗剂，例如Nogo激动剂。
在具体实施方案中，在以下疾病或紊乱中治疗性(包括预防性)给予促进Nogo功能的治疗剂：(1)涉及Nogo蛋白或功能缺乏或水平降低(相对于正常或所需的)的疾病或紊乱，例如在Nogo蛋白缺乏、遗传缺陷、无生物活性或活性不足或表达不足的患者中；或(2)其中体外(或体内)测定(参见下文)表明Nogo激动剂给予效用的疾病或紊乱。例如通过获得患者组织样品(例如得自活检组织)并体外分析其RNA或蛋白水平、所表达的RNA或蛋白的结构和/或活性，可以容易地检测到Nogo蛋白或功能缺乏或水平降低。因此可以使用本领域的许多标准方法，包括但不限于激酶测定、检测和/或显现Nogo蛋白的免疫测定(例如蛋白质印迹、免疫沉淀，然后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫细胞化学等)和/或通过检测和/或显现Nogo mRNA检测Nogo表达的杂交测定(例如RNA印迹测定、斑点印迹、原位杂交等)等。
可以治疗或预防涉及去调节的细胞生长的疾病或紊乱包括但不限于增生性疾病、恶性肿瘤、神经系统肿瘤等。以下详细描述这些疾病或紊乱的实例。
5.8.1.1肿瘤生长
可以通过给予促进Nogo功能的治疗剂治疗或预防的肿瘤生长和相关疾病，包括但不限于表1所列的(关于这类疾病的综述，请参见Fishman等，1985，Medicine，第二版，J.B.Lippincott Co.，Philadelphoa)：
表1
肿瘤生长和相关疾病
实体瘤
肉瘤和癌
神经胶质瘤、成胶质细胞瘤
星形细胞瘤
成神经细胞瘤
颅咽管瘤
室管膜瘤
松果体瘤
成血管细胞瘤
听神经瘤
少突胶质细胞瘤
menangioma
成神经细胞瘤
成视网膜细胞瘤
在具体实施方案中，在中枢神经系统、脊髓或任何神经组织中治疗或预防恶性肿瘤或增殖障碍(dysproliferative)变化(例如组织转化和发育异常)或高增生性(hyperproliferative)疾病。
5.8.1.2恶化前病症
也可以给予促进Nogo活性的本发明治疗剂，以治疗恶化前病症和防止进行至肿瘤或恶性肿瘤状态，包括但不限于表1所列的疾病。这种预防或治疗应用适用于已知或怀疑在肿瘤状态或癌症之前的进程的病症，特别是，其中已经发生非肿瘤细胞生长包括增生、组织转化，或最特别是已经发生发育异常(关于这种异常生长病症的综述，请参见Robbins和Angell，1976，Basic Pathology，第二版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，第68-79页)。增生是一种形式的受控细胞增殖，涉及在组织或器官中细胞数目增加，而其结构或功能没有显著改变。组织转化是一种形式的受控细胞生长，其中一种类型的成熟或全分化的细胞取代另一种类型的成熟细胞。组织转化可以发生在表皮细胞或结缔组织细胞中。非典型组织转化涉及略微无序的(disorderly)组织转化表皮。发育异常通常是癌的前兆，并且主要发现于表皮中；它是非肿瘤细胞生长的最无序的形式，涉及单个细胞一致性的降低和细胞构筑定向的降低。发育异常的细胞通常具有异常大的、深染色的细胞核，表现出复型现象。发育异常特征性地发生在存在慢性刺激或炎症的地方。
或者或除存在特征为增生、组织转化或发育异常的异常细胞生长外，得自患者的细胞样品体内表现出或体外表现出的存在一种或多种转化表型或恶性肿瘤表型特征，可能表明预防性/治疗性给予促进Nogo功能的治疗剂是合乎需要的。如上所述，这种转化表型特征包括形态改变、基质粘附更松散、接触抑制丧失、贴壁依赖性丧失、蛋白酶释放、糖转运增加、血清需求减少、胎儿抗原表达、250,000道尔顿细胞表面蛋白消失等。(关于与转化表型或恶性肿瘤表型相关的特征，也参见文献同上，第84-90页)。
在其它实施方案中，通过给予有效量的治疗剂治疗表现出一种或多种以下恶性肿瘤的诱因因素的患者：Von Recklinghausen或成视网膜细胞瘤的神经纤维瘤病；参见Robbins和Angell，1976，BasicPathology，第二版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，第112-113页)等)。
在另一具体实施方案中，将本发明的治疗剂给予病人以防止进行至肾、软骨(胸骨的)、皮肤、骨骼肌、肺或脾的癌症、黑素瘤或肉瘤。
5.8.1.3高增生性疾病和增殖障碍性疾病
在本发明的另一实施方案中，促进Nogo活性的治疗剂用来治疗或预防高增生性疾病或良性增殖障碍性疾病。具体实施方案涉及治疗或预防肝硬化(瘢痕形成已经超过正常肝再生过程的病症)、治疗瘢痕瘤(肥大性瘢痕)形成(在瘢痕形成过程干扰正常更新的皮肤毁损)、银屑病(一种常见皮肤病，特征为皮肤过度增生和正确细胞命运决定延迟)、良性肿瘤、纤维性囊肿病和组织肥大(例如前列腺增生)。
5.8.1.4基因治疗
在一个具体实施方案中，给予包含编码Nogo蛋白或其功能衍生物的序列的核酸，通过基因治疗促进Nogo功能。基因治疗是指通过给予受治疗者核酸进行的治疗。在本发明的该实施方案中，所述核酸产生其编码蛋白，所述蛋白通过促进Nogo功能介导治疗效应。
本领域中任何可利用的基因治疗方法均可以按照本发明使用。以下描述典型的方法。
关于基因治疗方法的一般综述，请参见Goldspiel等，1993，ClinicalPharmacy 12：488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann，Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，1993，Science 260：926-932；和Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62：191-217；1993年5月，TIBTECH 11(5)：155-215)。在Ausubel等(编码)，1993，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY；和Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression，A LaboratoryManual，Stockton Press，NY中，描述了可以使用的重组DNA技术的本领域通常已知的方法。
在一个优选方面，所述治疗剂包括作为表达载体部分的Nogo核酸，所述表达载体在合适宿主中表达Nogo蛋白或其片段或嵌合蛋白。特别是，这种核酸具有有效连接于Nogo编码区的启动子，所述启动子为诱导型或组成型，以及任选地可以为组织特异性的启动子。在另一具体实施方案中，在使用的核酸分子中Nogo编码序列和任何其它所需序列邻接促进于基因组中所需位点进行同源重组的区域，因此可供用于染色体内表达Nogo核酸(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935；Zijlstra等，1989，Nature 342：435-438)。
将所核酸传递至患者可以或者是直接的，或者是间接的，在直接传递的情况下，所述患者直接暴露于所述核酸或携带核酸的载体，在间接传递的情况下，细胞首先用所述核酸体外转化，然后移植到所述患者中。这两种方法是分别称为活体内或活体外基因治疗。
在一个具体实施方案中，将所述核酸直接体内给予，其中所述核酸表达产生所编码产物。这可以通过本领域已知的多种方法中的任一种完成，例如通过将其作为合适核酸表达载体的部分来构建，并将其给予以使其称为细胞内的，例如通过采用缺陷型或减毒反转录病毒载体或其它病毒载体进行感染(参见美国专利第4,980,286号)；或通过直接注射裸露DNA或利用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)；或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被、在脂质体、微粒或微胶囊中包胶囊；或通过给予其连接已知进入细胞核的肽的形式，通过给予其连接经受受体介导的胞吞作用的配体的形式(参见例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)(它可以用来导向特异性表达所述受体的细胞类型)等。在另一实施方案中，可以形成核酸-配体复合物，其中所述配体包含基因融合病毒肽，以破坏核内体，使得所述核酸能够避免溶酶体的降解作用。在再一实施方案中，所述核酸通过导向特异性受体，可以在体内定向，以进行细胞特异性吸收和表达(参见例如PCT公告WO 92/06180，公告日为1992年4月16日(Wu等)；WO 92/22635，公告日为1992年12月23日(Wilson等)；WO92/20316，公告日为1992年11月26日(Findeis等)；WO93/14188，公告日为1993年7月22日(Clarke等)；WO 93/20221，公告日为1993年10月14日(Young))。或者，可以将所述核酸细胞内引入，并通过同源重组掺入到宿主细胞DNA中以进行表达(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：8932-8935；Zijlstra等，1989，Nature 342：435-438)。
在一个具体实施方案中，使用含有Nogo核酸的病毒载体。例如，可以使用反转录病毒载体(参见Miller等，1993，Meth.Enzymol.217：581-599)。这些反转录病毒载体已经经过修饰，以缺失病毒基因组包装和整合到宿主细胞DNA中不需要的反转录病毒序列。将待用于基因治疗的Nogo核酸克隆到该载体中，这有利于将所述基因传递到患者体内。在Boesen等，1994，Biotherapy 6：291-302中可以找到关于反转录病毒载体的更详细的资料，所述文献描述了利用反转录病毒载体将mdr1基因传递至造血干细胞，以便产生对化疗更具抗性的干细胞。描述在基因治疗中应用反转录病毒载体的其它参考文献是：Clowes等，1994，J.Clin.Invest.93：644-651；Kierm等，1994，Blood83：1467-1473；Salmons和Gunzberg，1993，Human Gene Therapy 4：129-141；和Grossman和Wilson，1993，Curr.Opin.in Genetics and Devel.3：110-114。
腺病毒是可以用于基因治疗的其它病毒载体。腺病毒是用于将基因传递至中枢神经系统的尤其有吸引力的载体。腺病毒天然感染呼吸上皮，在此它们引起轻度疾病。基于腺病毒的传递系统的其它靶是肝、呼吸上皮、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。Kozarsky和Wilson，1993，Current Opinion in Genetics and Development3：499-503介绍了基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout等，1994，Human Gene Therapy 5：3-10证明了应用腺病毒载体将基因转移至恒河猴的呼吸上皮。在Rosenfeld等，1991，Science 252：431-434；Rosenfeld等，1992，Cell 68：143-155；和Mastrangeli等，1993，J.Clin.Invest.91：225-234中，可以找到在基因治疗中应用腺病毒的其它情况。
除腺病毒外，也已经提出将腺伴随病毒(AAV)用于基因治疗(Walsh等，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300)。
基因治疗的另一途径涉及通过诸如电穿孔、脂质转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染的方法，将基因转移至组织培养物的细胞中。通常，转移方法包括将选择标记转移至所述细胞。然后将所述细胞置于选择之下，以分离已经摄入并正表达所转移基因的那些细胞。然后将那些细胞传递至患者。
在该实施方案中，将所述核酸引入细胞中，然后体内给予所产生的重组细胞。这样的引入可以通过本领域已知的任何方法进行，所述方法包括但不限于转染、电穿孔、微注射、用含有所述核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。本领域已知用于将外源基因引入细胞的多种技术(参见例如Loeffler和Behr，1993，Meth.Enzymol.217：599-618；Cohen等，1993，Meth.Enzymol.217：618-644；Cline，1985，Pharmac.Ther.29：69-92)，所述多种技术可以按照本发明使用，前提是不破坏所述受体细胞必需的发育功能和生理功能。所述技术应该可供用于将所述核酸稳定转移至所述细胞，以使所述核酸可由所述细胞表达，而且最好是可遗传的并且可由其细胞后代表达。
可以将所产生的重组细胞通过本领域已知的各种方法传递至患者。在一个优选实施方案中，例如皮下注射上皮细胞。在另一实施方案中，可以将重组皮肤细胞用作所述患者的皮肤移植物。最好是静脉内给予重组血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)。设想的细胞用量取决于所需的效应、患者状态等，并且可以由本领域技术人员确定。
可以引入核酸用于基因治疗的细胞包括任何所需的、可利用的细胞类型，包括但不限于：上皮细胞、内皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如得自骨髓、脐带血、外周血、胎肝的造血干细胞或祖细胞等等。
在一个优选实施方案中，用于基因治疗的细胞是所述患者自体的。
在一个将重组细胞用于基因治疗的实施方案中，将一种Nogo核酸引入所述细胞，以使所述核酸可由所述细胞或其后代表达，然后体内给予所述重组细胞以产生治疗效应。在一个具体实施方案中，使用干细胞或祖细胞。可以分离并在体外维持的任何干细胞和/或祖细胞均可以潜在地按照本发明的该实施方案使用。这样的干细胞包括但不限于神经干细胞(Stemple和Anderson，1992，Cell 71：973-985)。
在一个具体实施方案中，待引入用于基因治疗的核酸包含一个有效连接于所述编码区的诱导型启动子，以致于通过控制转录的合适诱导物的存在或不存在可控制所述核酸的表达。
可以使用其它方法以用于传递编码Nogo蛋白或功能衍生物的核酸。
5.8.2  其中Nogo阻断再生的疾病的治疗和预防
通过给予拮抗(抑制)Nogo功能的治疗剂，治疗其中需要神经突延伸、生长或再生的疾病或障碍。最终导致神经系统损害的疾病、障碍或损害包括但不限于中枢神经系统(CNS)创伤(例如脊髓损伤或脑损伤)、梗塞、感染、恶性肿瘤、暴露于毒性因子、营养缺乏、副肿瘤性综合征和退行性神经病(包括但不限于早老性痴呆、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化和进行性supra-nuclearpalsy)；通过给予干扰Nogo活性的化合物(例如显性阴性Nogo衍生物；抗Nogo抗体；编码Nogo的反义核酸；Nogo核酶或结合Nogo活性位点的化学基团)。
可以使用的治疗剂包括但不限于Nogo反义核酸和功能障碍的(例如因异源(非Nogo序列)插入Nogo编码序列中引起的)、可以通过同源重组用来“剔除”内源的Nogo功能(参见例如Capecchi，1989，Science244：1288-1292)的Nogo核酸。抗Nogo抗体(以及含有其结合区的其片段和衍生物)可以用作Nogo的拮抗剂。在本发明的一个具体实施方案中，将含有Nogo基因的一部分、其中Nogo序列连接(位于其5’和3’)不同基因序列的核酸用作Nogo拮抗剂，以通过同源重组促进Nogo失活(也参见Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：8932-8935；Zijlstra等，1989，Nature 342：435-438)。利用已知的便利的体外测定，例如根据其抑制Nogo结合另一蛋白或抑制任何已知Nogo功能的能力，最好是在体外或细胞培养物中进行分析，可以鉴定出抑制Nogo功能的其它治疗剂，尽管也可以使用基因测定。最好利用合适的体外或体内测定，来测定特定治疗剂的效应以及是否其给予指示出受影响组织的治疗。
在具体实施方案中，在下述疾病中治疗性地(包括预防性地)给予抑制Nogo功能的治疗剂：(1)涉及Nogo蛋白水平或功能提高(相对于正常或所需的)的疾病或障碍，例如在Nogo蛋白活性过多或超量表达的患者中；或(2)在体外(或体内)测定(参见下文)表明给予Nogo拮抗剂效用的疾病或障碍。例如通过定量测定蛋白和/或RNA，通过获得患者组织样品(例如得自活组织检查组织)并体外分析其RNA或蛋白水平、所表达的Nogo RNA或蛋白的结构和/或活性，可以容易地检测出Nogo蛋白或功能水平的提高。因而可以使用本领域的许多标准方法，包括但不限于激酶测定、免疫测定，以检测和/或显现Nogo蛋白(例如蛋白质印迹、免疫沉淀继之以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫细胞化学等)和/或杂交测定，分别通过检测和/或显现Nogo mRNA(例如RNA印迹测定、斑点印迹、原位杂交等)检测Nogo的表达等。
5.8.2.1  Nogo表达的反义调节
在一个具体实施方案中，利用Nogo反义核酸抑制Nogo功能。本发明提供下述核酸的治疗或预防应用，所述核酸具有至少6个与编码Nogo的基因或cDNA或其部分反义的核苷酸。本文使用的Nogo“反义”核酸是指借助某些序列互补性能够与Nogo RNA(最好是mRNA)的部分杂交的核酸。所述反义核酸可以与Nogo mRNA的编码区和/或非编码区互补。这样的反义核酸具有作为抑制Nogo功能的治疗剂的用途，并且可以用于上文描述的疾病的治疗或预防。
本发明的反义核酸可以是双链或单链的RNA或DNA或其修饰物或衍生物的寡核苷酸，可以将它们直接给予细胞，或可以通过外源的所引入序列的转录，在细胞内产生所述寡核苷酸。
在一个具体实施方案中，由本发明提供的Nogo反义核酸可以用来促进中枢神经系统的神经元再生，特别是包括皮质脊髓束的再生、恢复期间的可塑性、神经元的再生长以及创伤性损伤相关性损伤、中风和神经变性性疾病的治愈。
本发明还提供药用组合物，所述药用组合物包含有效量的药学上可接受载体中的本发明Nogo反义核酸，如下文所述。
在另一实施方案中，本发明涉及抑制原核细胞或真核细胞中Nogo核酸序列表达的方法，所述方法包括为所述细胞提供有效量包含本发明Nogo反义核酸的组合物。
下面详细描述Nogo反义核酸及其应用。
5.8.2.1.1  Nogo反义核酸
所述Nogo反义核酸至少有6个核苷酸，最好是寡核苷酸(范围是6个至约50个寡核苷酸)。在具体方面，所述寡核苷酸至少为10个寡核苷酸、至少15个寡核苷酸、至少100个寡核苷酸或至少200个寡核苷酸。所述寡核苷酸可以是DNA或RNA或嵌合混合物或其衍生物或修饰形式，可以是单链或双链。可以在碱基部分、糖部分或磷酸酯骨架修饰所述寡核苷酸。所述寡核苷酸可以包括其它附加基团，例如肽、或促进跨越细胞膜的转运的因子(参见例如Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：6553-6556；Lemaitre等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.84：648-652；PCT公布号WO 88/09810，公布于1988年12月15日)或血脑屏障(参见例如PCT公布号WO 89/10134，公布于1988年4月25日)、杂交触发的切割因子(参见例如Krol等，1988，BioTechniques 6：958-976)或嵌入剂(参见例如Zon，1988，Pharm.Res.5：539-549)。
在本发明的一个优选方面，提供一种Nogo反义寡核苷酸，最好是单链DNA。在一个最优选方面，这样一种寡核苷酸包含所述Nogo基因的两个启动子序列之一的附近序列的反义序列、或编码所述Nogo基因的羧基末端部分的序列的反义序列。可能最好选择性地抑制其中一种Nogo同种型的表达。可以用本领域一般已知的取代基在所述寡核苷酸结构上的任何位置进行修饰所述寡核苷酸。
所述Nogo反义寡核苷酸可以包含至少一个修饰的碱基部分，所述部分选自但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w以及2，6-二氨基嘌呤。
在另一实施方案中，所述寡核苷酸包含至少一个选自以下组的经修饰的糖部分，所述组包括但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
在再一实施方案中，所述寡核苷酸包括至少一种选自下述组的修饰的磷酸酯主链，所述组包括但不限于：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、酰胺基硫代磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯(phosphordiamidate)、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯(alkylphosphotriester)、以及其formacetal或其类似物。
在再一实施方案中，所述寡核苷酸是α-端基异构寡核苷酸。α-端基异构寡核苷酸与互补RNA形成特异性双链杂交体，在所述双链杂交体中，与通常的β-单位相反，链相互之间平行(参见Gautier等，1987，Nucl.Acids Res.15：6625-6641)。
可以将所述寡核苷酸与另一分子缀合，所述另一分子例如为肽、杂交触发的交联剂、转运因子、杂交触发的切割因子等。
可以使用本领域已知的标准方法来合成本发明的寡核苷酸；例如，通过用自动化DNA合成仪(例如商业上可从Biosearch、AppliedBiosystems等公司买到的DNA合成仪)来合成。作为实例，可以用Stein等的方法(1988，Nucl.Acids Res.16：3209)合成硫代磷酸寡核苷酸；通过用控制孔的玻璃聚合物载体(Sarin等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：7448-7451)，可以制备甲基膦酸寡核苷酸，等等。
在一个具体实施方案中，所述Nogo反义寡核苷酸包含催化性RNA或核酶(参见例如PCT国际公布WO 90/11364，公布于1990年10月4日；Sarver等，1990，Science 247：1222-1225)。在另一实施方案中，所述寡核苷酸是2’-0-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，Nucl.Acids Res.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBS Lett.215：327-330)。
在一个可选择的实施方案中，本发明的Nogo反义核酸通过从外源序列转录而在胞内产生。例如，可以将载体体内引入，以使所述载体被细胞摄入，在所述细胞中所述载体或其部分被转录，产生本发明的反义核酸(RNA)。这样一种载体应该含有编码所述Nogo反义核酸的序列。这种载体可以保持为附加型，或变为整合入染色体，只要它可以被转录以产生所需的反义RNA。这样的载体可以通过本领域的标准重组DNA技术方法来构建。载体可以是质粒、病毒或本领域已知的用于在哺乳动物细胞中复制和表达的其它载体。
由本领域已知在哺乳动物(最好是人类)细胞中起作用的任何启动子进行编码Nogo反义RNA的序列的表达。这样的启动子可以是诱导型或组成型的。这样的启动子包括但不限于：SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290：304-310)、劳斯肉瘤病毒3’长末端重复序列中含有的启动子(Yamamoto等，1980，Cell 22：787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，1982，Nature296：39-42)等。
本发明的反义核酸包含与Nogo基因、最好是人Nogo基因的RNA转录物的至少一部分的互补的序列。然而，不需要绝对互补，尽管最好是绝对互补。本文涉及的“与RNA的至少一部分互补”的序列是指具有足够的互补性以能够与所述RNA杂交形成稳定双链体的序列；在双链Nogo反义核酸的情况下，可以因此测试所述双链体DNA的一条单链，或可以分析三链体形成。杂交能力将取决于所述反义核酸的互补性的程度和长度。一般而言，杂交核酸越长，则它可以含有越多的与Nogo RNA错配的碱基，但仍可形成稳定的双链体(或当情况可以时形成三链体)。本领域技术人员可以利用测定杂交复合物的解链温度的标准方法，来确定可耐受的错配程度。
5.8.2.1.2  Nogo反义核酸的治疗应用
可以用所述Nogo反义核酸来治疗(或预防)表达或最好是超量表达Nogo的细胞类型的疾病。在一个具体实施方案中，这样的疾病是生长增生性疾病。在一个优选实施方案中，使用单链DNA反义Nogo寡核苷酸。
采用本领域已知的各种方法，可以鉴定出表达或超量表达NogoRNA的细胞类型。这样的方法包括但不限于：与Nogo特异性核酸杂交(例如通过RNA印迹杂交、斑点印迹杂交、原位杂交)，观察来自所述细胞类型的RNA在体外翻译为Nogo的能力；免疫测定等。在一个优选方面，例如通过免疫细胞化学或原位杂交，在治疗之前可以分析来自患者的原代组织的Nogo表达。
可以将包含有效量药学上可接受载体中的Nogo反义核酸的本发明药用组合物，给予具有表达或超量表达Nogo RNA或蛋白的类型的疾病或障碍的患者。
治疗特定疾病或病症的Nogo反义核酸的有效量将取决于所述疾病或病症的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。可能时，在测试并用于人类之前，最好体外测定所述反义物对待治疗肿瘤类型的细胞毒性，然后在有用的动物模型系统中测定所述细胞毒性。
在一个具体实施方案中，包含Nogo反义核酸的药用组合物通过脂质体、微粒或微胶囊给予。在本发明的不同实施方案中，采用这样的组合物来达到持续释放所述Nogo反义核酸可能是有用的。在一个具体实施方案中，可能最好利用通过抗特定可鉴定肿瘤抗原的抗体定向的脂质体(Leonetti等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：2448-2451；Renneisen等，1990，J.Biol.Chem.265：16337-16342)。
5.9治疗用途或预防用途的证明
在用于人类之前，最好在体外，然后在体内，测试本发明治疗剂的所需治疗活性或预防活性。例如，可以用来确定给予特定治疗剂是否适合的体外测定中，包括体外细胞培养物测定，其中患者组织样品在培养物中培养并暴露于治疗剂或者给予其治疗剂，并且观察这种治疗剂对所述组织样品的效应。例如，通过测定所述患者中神经突再生长或运动控制的功能恢复，可以分析作为Nogo功能抑制剂的治疗剂。
在不同的具体实施方案中，可以用涉及患者疾病的细胞类型的典型细胞来进行体外测定，以确定治疗剂是否具有对这种细胞类型的所需效应。
在人类中测试之前，可以在合适的动物模型系统中测试用于治疗的化合物，所述动物模型系统包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等。对于体内测试，在给予人类之前，可以使用本领域已知的任何动物模型系统。
5.10治疗性/预防性给予和组合物
本发明提供通过给予受治疗者有效量的本发明治疗剂进行治疗(和预防)的方法。在一个优选方面，所述治疗剂是基本上纯化的。所述受治疗者最好是动物，包括但不限于牛、猪、马、鸡、猫、狗等，最好是哺乳动物，最优选是人类。在一个具体实施方案中，非人类哺乳动物是所述受治疗者。
当所述治疗剂包含核酸时，可以使用的制剂和给药方法是上述制剂和方法；可以从下文描述中选择另外合适的制剂和给药途径。
各种传递系统是已知的，并且可以用来给予本发明的治疗剂，例如在脂质体、微粒、微胶囊中包胶囊、能够表达所述治疗剂的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)、构建作为反转录病毒载体或其它载体一部分的治疗核酸等。引入方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口途径。所述化合物可以通过任何方便的途径给予，例如通过输注或大剂量注射、通过经上皮或粘膜内衬(例如口腔粘膜、直肠粘膜和肠粘膜等)吸收，并且可以与其它生物活性剂一起给予。可以系统给予或局部给予。另外，可能最好将本发明的药用组合物通过合适的途径引入中枢神经系统，所述合适的途径包括心室内和鞘内注射；用心室内导管，例如连接于贮液器(例如Ommaya贮液器)的心室内导管，可以促进心室内注射。也可以利用肺部给药，例如使用吸入器或喷雾器和具有雾化剂的制剂。
在一个具体实施方案中，可能最好将本发明的药用组合物局部给予需要治疗的区域；通过例如但不限于手术期间局部输注、表面应用例如结合手术后的伤口敷剂、通过注射、利用导管或利用植入物，所述植入物是多孔、非多孔或胶状材料，包括膜例如sialastic膜，或纤维，可以达到这种给药。在一个实施方案中，可以在恶性肿瘤或肿瘤性或前肿瘤性组织部位(或形成者部位)直接注射进行给药。
在另一实施方案中，所述治疗剂可以在小泡中、特别是在脂质体中传递(参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat等，Liposomesin the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein andFidler(编辑)，Liss，New York，第353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同上，第317-327页，一般参见同上的文献)。
在再一实施方案中，所述治疗剂在控释系统中传递。在一个实施方案中，可以使用一个泵(参见Langer，参见上文；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald等，Surgery 88：507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321：574(1989))。在另一实施方案中，可以使用聚合材料(参见Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise(编辑)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled DrugBioavaibility，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(编辑)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61(1983)；也参见Levy等，Science 228：190(1985)；During等，Ann.Neurol.25：351(1989)；Howard等，J.Neurosurg.71：105(1989))。在再一实施方案中，可以将控释系统置于治疗靶附近，即脑附近，因此仅需要系统剂量的一部分(参见例如Goodson，MedicalApplications of Controlled Release，同上，第2卷，第115-138页(1984))。
在Langer的综述(Science 249：1527-1533(1990))中讨论了其它控释系统。
在所述治疗剂是编码蛋白治疗剂的核酸的具体实施方案中，可以通过以下方式体内给予所述核酸，以促进其编码蛋白的表达，所述方式为通过将其作为合适核酸表达载体的一部分构建，并将其例如利用反转录病毒载体给予，以使它成为胞内的(参见美国专利第4,980,286号)，或通过直接注射，或利用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或通过用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或通过给予其连接已知进入细胞核的同源框样肽的形式(参见例如Joliot等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868)等。或者，可以将核酸治疗剂在胞内引入并通过同源重组掺入到宿主细胞DNA中进行表达。
本发明也提供药用组合物。这样的组合物包含治疗有效量的治疗剂和药学上可接受的载体。在一个具体实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由联邦政府或州政府管理局批准或列于美国药典中或其它普遍接受的药典用于动物，更特别是用于人类的。术语“载体”是指与所述治疗剂一起给予的稀释剂、辅助剂、赋形剂或载体。这种药用载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油醚、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内给予所述药用组合物时，水是优选的载体。盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油一硬脂酸酯、滑石粉、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙醇、甘醇、水、乙醇等。如有需要，所述组合物也可以含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂形式等等。口服制剂可以包括标准载体，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药用载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”。这样的组合物将含有治疗有效量的所述治疗剂与适量的载体，最好是纯化形式的治疗剂，以便提供用于适合给予所述患者的形式。所述制剂应该适合所述给药途径。
在一个优选实施方案中，按照常规方法，将所述组合物配制为适合于静脉内给予人类的药用组合物。通常，用于静脉内给药的组合物是无菌等渗水性缓冲液形式的溶液。必要时，所述组合物也可以包含增溶剂和局部麻醉药例如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。一般而言，所述组分或者分别供应，或者一起混合为单位剂型，例如作为密封容器(例如安瓿或指示活性剂量的sachette)中的冻干粉或无水浓缩物。当所述组合物将通过输注给予时，可以将其用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶配药。当通过注射给予所述组合物时，可以提供一个安瓿的无菌注射用水或盐水，以使在给予前可以将所述组分混合。
本发明的治疗剂可以配制为中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离氨基形成的盐，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐；以及与游离羧基形成的盐，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
将在治疗特定疾病或病症方面是有效的本发明的治疗剂的量，将取决于所述疾病或病症的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。另外，任选地利用体外测定来帮助鉴定最适剂量范围。所述制剂中使用的准确的剂量也将取决于给药途径以及所述疾病或障碍的严重程度，并且应该根据医师和每个患者的情况而定。然而，用于静脉内给药的合适剂量范围一般为约20-500微克活性化合物/公斤体重。用于鼻内给药的合适剂量范围一般为约0.01pg/kg体重至1mg/kg体重。可以根据得自体外或动物模型试验系统的剂量反应曲线来外推有效剂量。
本发明也提供药用包装或试剂盒，其包含一个或多个装有本发明药用组合物的一个或多个组分的容器。这样的容器任选地附有由管理药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构开具的通知，所述通知反映出所述机构批准生产、使用或销售用于人类给药。
5.11  诊断和筛选
Nogo蛋白、其类似物、衍生物和亚序列、Nogo核酸(和其互补序列)、抗Nogo抗体已经用于诊断。这类分析可以用于分子，例如免疫测定，以检测、预测、诊断或监测影响Nogo表达的各种病症、疾病和障碍，或监测其治疗。特别是，采用包括下述步骤的方法进行这样的免疫测定：在使得免疫特异性结合可以发生的条件下使得自患者的样品与抗Nogo抗体接触，并且检测或测定所述抗体的任何免疫特异性结合的量。在一个具体方面，在组织切片中这种抗体结合可以用来检测异常的Nogo定位或异常(例如低水平或没有)的Nogo水平。在一个具体实施方案中，当Nogo的异常水平是病症的指示时，抗Nogo抗体可以用来分析患者组织或血清样品中Nogo的存在。所谓“异常水平”是指相对于得自没有所述疾病的机体的一部分或受治疗者类似样品中存在的水平、或代表存在的标准水平而言，升高或降低的水平。
可以使用的免疫测定包括但不限于：采用免疫组织化学的技术的竞争性和非竞争性测定系统、病理学、蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹层”免疫测定、免疫沉淀分析、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射分析、荧光免疫测定、免疫组织化学测定、A蛋白免疫测定，这仅是少数实例。
Nogo基因和相关核酸序列和亚序列包括互补序列也可以用于杂交测定。Nogo核酸序列或其包含至少约8个核苷酸的亚序列可以用作杂交探针。杂交测定可以用来检测、预测、诊断或监测与Nogo表达和/或活性的异常改变相关的病症、障碍或疾病状态，如上文所述。特别是，通过包括以下步骤的方法：在使得杂交可以发生的条件下使含核酸的样品与能够与Nogo DNA或RNA杂交的核酸探针接触，并检测或测定任何所产生的杂交，进行这样的杂交测定。
在具体实施方案中，通过检测证明生长抑制的Nogo蛋白、NogoRNA或Nogo功能活性水平的降低，或通过检测引起Nogo表达或活性降低的Nogo RNA、DNA或蛋白中的突变(例如Nogo核酸中的易位、Nogo基因或蛋白的截短、相对于野生型Nogo核苷酸序列或氨基酸序列的改变)，可以诊断涉及细胞生长和发育障碍的疾病和障碍，或可以筛选其可疑的存在，或可以检测发生这种障碍的诱因。这样的疾病和障碍包括但不限于第3节和第5.8.1.1节中描述的那些疾病和障碍。作为实例，通过免疫测定可以检测Nogo蛋白的水平，通过杂交分析(例如RNA印迹、斑点印迹)可以检测出Nogo RNA的水平，通过本领域通常已知的结合测定可以进行Nogo与细胞生长抑制剂蛋白受体的结合，通过DNA印迹、RFLP分析、采用最好产生跨越至少Nogo基因大部分的片段的引物进行PCR、对得自所述患者的Nogo基因组DNA或cDNA测序等，可以检测出Nogo核酸中的易位和点突变。
也提供于诊断用途的试剂盒，所述试剂盒在一个或多个容器中包含一种抗Nogo抗体和任选的一种所述抗体的标记结合配偶体。或者，可以标记(用可检测标记，例如化学发光部分、酶部分、荧光部分或放射性部分)所述抗Nogo抗体。也提供在一个或多个容器中包含能够与Nogo RNA杂交的核酸的试剂盒。在一个具体实施方案中，试剂盒可以在一个或多个容器中包含一种引物对(例如每种引物在大小范围为6-30个核苷酸)，所述引物对在合适的反应条件下能够引发Nogo核酸的至少一部分扩增[例如通过聚合酶链式反应(参见例如Innis等，1990，PCR Protocols，Academic Press，Inc.，San Diego，CA)、连接酶链式反应(参见EP 320,308)、应用Qβ复制酶、环状探针反应或本领域已知的其它方法]。试剂盒可以任选地还包括在一个容器中的预定量的纯化Nogo蛋白或核酸，例如用作标准或对照。
5.12筛选Nogo激动剂和拮抗剂
Nogo核酸、蛋白和衍生物也已经用于筛选测定，以检测与Nogo核酸、蛋白或衍生物特异性结合的分子，因此具有作为Nogo的激动剂或拮抗剂的潜在用途，特别是因此影响细胞生长调节的分子。在一个具体实施方案中，进行这样的测定，以筛选具有作为神经生长促进剂的潜在用途的分子，以用于药物开发。本发明因此提供一些测定，以检测与Nogo核酸、蛋白或衍生物特异性结合的分子。例如，可以用表达Nogo核酸的重组细胞，重组产生这些测定中的Nogo蛋白，以筛选与Nogo蛋白结合的分子。在有助于结合的条件下使分子(例如推定的Nogo结合配偶体)与所述Nogo蛋白(或其片段)接触，然后鉴定出与所述Nogo蛋白特异性结合的分子。可以用相似的方法来筛选结合Nogo衍生物或核酸的分子。可以用来进行上述测定的方法是本领域通常已知的。
作为实例，可以对多样性的文库例如随机或组合肽或非肽文库，筛选特异性结合Nogo的分子。可以使用的许多文库是本领域已知的，例如化学合成文库、重组(例如噬菌体呈现文库)和体外基于翻译的文库。
化学合成文库的实例描述于Fodor等，1991，Science 251：767-773；Houghten等，1991，Nature 354：84-86；Lam等，1991，Nature 354：82-84；Medynski，1994，Bio/Technology 12：709-710；Gallop等，1994，J.Medicinal Chemistry 37(9)：1233-1251；Ohlmeyer等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10922-10926；Erb等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422-11426；Houghten等，1992，Biotechniques 13：412；Jayawickreme等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：1614-1618；Salmon等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11708-11712；PCT公布号WO 93/20242；和Brenner和Lerner，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5381-5383。
噬菌体呈现文库的实例描述于Scott和Smith，1990，Science249：386-390；Devlin等，1990，Science 249：404-406；Christian，R.B.等，1992，J.Mol.Biol.227：711-718)；Lenstra，1992，J.Immunol.Meth.152：149-157；Kay等，1993，Gene 128：59-65；和PCT公布号WO94/18318，公布日为1994年8月18日。
体外基于翻译的文库包括但不限于描述于以下文献的文库：PCT公布号WO 91/05058，公布日为1991年4月18日；和Mattheakis等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9022-9026。
作为非肽文库的实例，苯并二氮杂卓文库(参见例如Bunin等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：4708-4712)可以适合于使用。类肽(peptoid)文库(Simon等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：9367-9371)也可以使用。Ostresh等(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11138-11142)描述了可以使用的文库的另一实例，其中已经将肽中的酰胺官能全甲基化，以产生化学转化的组合文库。
采用通常已知的多种方法中的任一种，可以完成文库的筛选。参见例如以下参考文献，所述参考文献公开了肽文库的筛选：Parmley和Smith，1989，Adv.Exp.Med.Biol.251：215-218；Scott和Smith，1990，Science 249：386-390；Fowlkes等，1992；BioTechniques 13：422-427；Oldenburg等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5393-5397；Yu等，1994，Cell 76：933-945；Staudt等，1988，Science 241：577-580；Bock等，1992，Nature 355：564-566；Tuerk等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6988-6992；Ellington等，1992，Nature 355：850-852；Ladner等的美国专利第5,096,815号、美国专利第5,223,409号和美国专利第5,198,346号；Rebar和Pabo，1993，Science 263：671-673；和PCT公布号WO94/18318。
在一个具体实施方案中，通过使文库成员与在固相上固定化的Nogo蛋白(或核酸或衍生物)接触，并且收获结合所述蛋白(或核酸或衍生物)的文库成员，可以进行筛选。称为“淘选”技术的这类筛选方法的实例例如描述于Parmley和Smith，1988，Gene 73：305-318；Fowlkes等，1992，BioTechniques 13：422-427；PCT公布号WO 94/18318；和上文引用的参考文献。
在另一实施方案中，在酵母中选择相互作用蛋白的双杂种系统(Fields和Song，1989，Nature 340：245-246；Chien等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9578-9582)可以用来鉴定特异性结合Nogo蛋白或衍生物的分子。
5.13动物模型
本发明也提供动物模型，包括但不限于小鼠、仓鼠、羊、猪、牛，最好是非人类哺乳动物中的模型。
在一个实施方案中，提供用于涉及神经突延伸、生长和再生的疾病和障碍的动物模型。通过促进染色体中的Nogo基因和已经使得无生物活性(最好通过插入异源序列，例如抗生素抗性基因)的外源Nogo基因之间的同源重组，可以最初产生这样的动物。在一个优选方面，通过用含有所述插入失活的Nogo基因的载体转化胚衍生干(ES)细胞，使得发生同源重组，然后将所述ES细胞注射到胚泡中，并将所述胚泡植入到养母体内，然后其中Nogo基因已被失活的所述嵌合动物(“剔除动物”)(参见Capecchi，1989，Science 244：1288-1292)出生，进行这种同源重组。可以繁殖嵌合动物，以产生另外的剔除动物。这种动物可以是小鼠、仓鼠、羊、猪、牛等，最好是非人类哺乳动物。在一个具体实施方案中，产生剔除小鼠。
预期这种剔除动物发生或预先处置使其发生涉及中枢神经系统的疾病或障碍，因此可能具有作为这种疾病和障碍的动物模型的用途，例如以筛选或测试分子(例如潜在的神经系统障碍治疗剂)抑制神经组织肿瘤以及因此治疗或预防这类疾病或障碍的能力。
本发明不限于保藏的微生物或本文描述的具体实施方案的范围。实际上，除本文描述的以外，根据以上描述和附图，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。这样的修改计划在所附的权利要求书的范围内。
本文引用的各种参考文献，它们的公开内容通过引用全部结合到本文中。
6.实施例：Nogo基因的核苷酸和蛋白产物的特征鉴定
本文描述的实例证明：所克隆的基因Nogo编码一种蛋白，该蛋白为有效神经细胞生长抑制剂，并且也为Schwab等的美国专利第5,684,133号中描述的单克隆抗体所识别。
6.1材料和方法
以下小节描述用于本发明的材料和方法。本领域技术人员会认识到，这些材料和方法仅仅说明现在要求保护的发明，本发明人设想了各种修改。这些修改计划属于所附权利要求书的范围内。
6.1.1从髓磷脂中纯化牛Nogo
所有纯化步骤均于4℃进行，通过NIH 3T3散布和PC12神经突向外生长测定(6.1.10一节)常规测定所获得部分的抑制底物活性。通过剔除脑脊膜并切成小块，小心地清洗牛脊髓组织。然后在提取缓冲液(60mM CHAPS，100mM Tris-Cl，pH 8.0，10mM EDTA缓冲液pH 8.0，2.5mM碘代乙酰胺，1mM苯基甲磺酰氟，0.1μg/ml抑肽酶，1μg/ml亮抑酶肽、1μg/ml抑胃酶肽A)中提取髓磷脂。
为了获得脊髓提取物，直接在CHAPS提取缓冲液中以(1∶1；w∶v)的比率将所述组织匀浆。将匀浆于4℃以100,000×g离心1小时，离心两次(Kontron K50.13型，固定角度)。将澄清的上清液(提取物)立即加样于在缓冲液A(20mM Tris-Cl，pH 8.0，0.5％(w/v)CHAPS)中平衡的Q-Sepharose柱(2.6×11.5cm)。用5倍床体积的0-1M NaCl的缓冲液A的线性梯度(在50分钟内100ml梯度)洗脱结合蛋白。含有牛NI220的活性部分在约0.4M NaCl下洗脱，将其合并(q-库1)，用于随后加样于在缓冲液B(150mM NaCl，20mM Tris-Cl，pH 8.0，0.5％(w/v)CHAPS)中平衡的Superdex 200(2.6×60cm)柱。
在凝胶过滤(s-库1)后，通过6％SDS-PAGE在还原条件下和总共2500伏特-小时的低恒定功率(2瓦特/凝胶)下分离活性部分。在考马斯蓝染色(0.1％w/v R250的50％甲醇和10％乙酸溶液)后鉴定条带和凝胶区域，将其切出，并于4℃在800μl凝胶洗脱缓冲液(0.5％(w/v)CHAPS，20mM Tris-Cl，pH 8.0，10mM EDTA，pH 8.0，2.5mM碘代乙酰胺，1mM苯基甲磺酰氟，0.1μg/ml抑肽酶，1μg/ml亮抑酶肽、1μg/ml抑胃酶肽A)中提取至少48小时。
6.1.2纯化Nogo的微量测序
将几个凝胶的IN-1可中和活性凝胶洗脱材料在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上在还原条件下再电泳，并用0.1％(w/v)考马斯蓝R250的50％甲醇和10％乙酸溶液染色。切下220KDa的条带，在凝胶中直接进行内切蛋白酶Lys-C消化(1∶50摩尔比)。将样品酸化并加样于反向高效液相层析柱，用0.04％三氟乙酸和80％乙腈的线性梯度(0-100％)分离肽，将含单一肽种类的部分进行自动化Edman降解。
6.1.3纯化Nogo的电泳
采用6％(w/v)SDS-聚丙烯酰胺凝胶(10×24×0.01cm)，在还原条件(100mM二硫苏糖醇)下进行高分辨SDS-PAGE。在20mM Tris碱，192mM甘氨酸pH 8.3，0.037％(w/v)SDS，20％甲醇中，用半干转移装置(Bio-Rad，Trans Blot SD)转移至Immobilon-P膜(Millipore)上。转移时间于0.8mA/cm2下为2小时。封闭试剂(于室温下1小时)为3％明胶的PBS(磷酸缓冲盐溶液，pH 7.2，8g NaCl，0.2g KH2PO4，2.8gNa2HPO4·12H2O和0.2g KCl，溶于1升水中)溶液，而洗涤液含有20mM Tris-Cl，pH 7.5，150mM NaCl和0.4％吐温(3×10分钟，于室温下)。第一抗体(对于用1％明胶的PBS溶液稀释)的温育时间通常是于4℃过夜。辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG第二抗体(1∶2000)于室温下温育1小时。ECL化学发光系统用于检测(Amersham PharmaciaBiotech)。
6.1.4cDNA文库的探测
从牛脊髓中新鲜解剖出白质，并用FastTrack试剂盒(Invitrogen)提取poly(a)+RNA。用Uni-ZAP试剂盒(Stratagene)，按照生产商的说明进行cDNA文库的构建。所述文库的复杂性高于总共4×106噬菌斑形成单位，插入片段的平均大小约为1.8千碱基。
根据bNI220肽1序列设计了简并寡核苷酸MSC5-8(MSC5：
TCIGTIGGYAAIACIGCIGGYAARTC(SEQ ID NO：47)；MSC6：
TCIGTIGGIAGIACIGCIGGYAAYTC(SEQ ID NO：48)；MSC7：
TCIGTIGGYAAIACIGCIGGIAGRTC(SEQ ID NO：49)；MSC8：
TCIGTIGGIAGIACIGCIGGIAGRTC(SEQ ID NO：50)，而根据bNI220肽2序列设计了MSC9(GARATHGCIGAIATHCARGAYGGIGA(SEQIDNO：51))。寡核苷酸由MWG Biotech(Munchenstein，瑞士)合成，并用DIG DNA 3’端标记试剂盒标记。采用DIG RNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim)合成核糖核酸探针(Riboprobe)。
探针杂交和洗涤条件如生产商所述(MSC5-8和MSC9于57℃的杂交和洗涤温度下使用)。采用CDP-star系统(Boehringer Mannheim)进行探针检测。cDNA文库标记和筛选按照λZap cDNA文库(Stratagene)的方案进行。Genescreen(DuPont)尼龙膜用于噬菌斑复印。
6.1.5DNA测序
用Microsynth(Balgach，瑞士)的Perkin Elmer AB1377系统对CWP1-3、Oli18、Oli3和R1-3U21的两条链测序。通过DNASIS程序(Hitachi)分析DNA序列。用BLAST程序(NCBI)进行数据库检索。
6.1.6RNA分析
采用RNAgent(Promega)或FastTrack试剂盒(Invitrogen)，分别从组织中提取总RNA和poly(A)+RNA。通过在1％甲醛凝胶上电泳分离RNA，并将其转移至Genescreen膜上。将印迹与用DIG RNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim)从相关质粒产生的反义核糖核酸探针杂交。印迹杂交、洗涤和CDP star检测条件如生产商所描述。“共同”探针EST111410(TIGR，ATCC，Rockville，MD，USA)含有核苷酸2535-4678之间的转录物A序列，外显子1特异性探针含有核苷酸65-769之间的转录物A序列，而外显子2特异性探针含有核苷酸815-3183之间的转录物A序列。
6.1.7抗血清的产生
抗血清472(AS 472)由Research Genetics，Inc.(Huntsville AL；USA)针对合成肽P472-SYDSIKLEPENPPPYEEA(牛序列；SEQ IDNO：33)而产生，所述合成肽对应于SEQ ID NO：2的大鼠Nogo氨基酸序列623-640，具有3个错配。
抗血清Bruna(AS Bruna)针对在大肠杆菌中作为融合蛋白表达的重组Nogo蛋白的片段而产生。具体地说，SEQ ID NO：2的大鼠NogoA核苷酸序列编码氨基酸762-1,163的羧基末端(采用Novagen pET系统在大肠杆菌中表达)用来产生AS Bruna抗Nogo抗血清。
6.1.8电泳和蛋白质印迹
采用本领域技术人员熟知的标准方法进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。抗体如下稀释：AS Bruna 1∶7,500；AS 4721∶2,000；抗myc(9E10)1∶5,000(Invitrogen)；抗BiP 2μg/ml(Stressgen)；mAb IN-1杂交瘤上清液未稀释而使用。第二抗体是：HRP缀合的抗兔(Pierce；1∶20,000)；抗小鼠IgM(1∶50,000)；和碱性磷酸酶缀合的抗小鼠(MilanAnalytica AG，La Roche，瑞士；1∶5,000)。
6.1.9免疫组织化学
快速解剖成年大鼠脊髓或小脑，将其包埋在OTC化合物中并于-40℃冷冻。切20个死后切片，并于40℃在乙醇/乙酸中固定。如Rubin等，1994，J.Neurocytol.23：209-217中所述进行免疫染色，只是不用猝灭步骤。或者，组织切片用甲醇固定(于-20℃下2分钟)，而免疫染色按照Rubin等的上述文献进行。所用的第一抗体是(抗体：(稀释度))：IN-1的杂交瘤上清液：(未稀释)；AS Bruna(1∶5000)；或亲和纯化的AS472(1∶50)。
6.1.10NIH 3T3成纤维细胞散布测定
将NIH 3T3成纤维细胞接种到用5μg/孔(＝1cm2)q-库预包被的培养皿上。q-库是在Q sepharose柱上分离的牛脊髓提取物的合并活性部分。IN-1作为未稀释的培养上清液使用(1-10μg/ml)，AS Bruna和免疫前血清在PBS中稀释1∶1000，而AS 472和免疫前血清在PBS以1∶500稀释。为了补偿不同q-库制剂中的活性变异，将接种到q-库上的受抑制的圆形细胞数相对于接种到缓冲液对照上标准化至100％和至0％(Spillman等，1998，J.Biol.Chem.273：19283-93)。
6.1.11DRG神经突向外生长测定
在Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中从E16胚鸡中解剖出背根神经节(DRG)，将其分为两个部分，并置于用q-库预包被的培养皿上的具有10％(FCS)和1％甲基纤维素的100μl F12培养基中。在37℃温育24小时后，采用0(无向外生长)至4(最大向外生长)的范围，以半定量方式记录来自单个DRG的神经突向外生长。
6.1.12DRG/视神经共同培养测定
从用5500Gray辐射并注射或者AS 472或者相应的免疫前血清(1∶10稀释度)的成年大鼠中解剖出视神经。在3室培养物中培养多对神经，以使每个神经的一端通过硅润滑油/塔夫纶阻挡层达到中间室，在中间室放置来自P0大鼠的解离的培养原代DRG神经元。培养2周后，采用本领域已知的标准技术固定神经，将其包埋用于电镜分析(EM)，从DRG暴露的残干以约3.5mm距离取超薄切片。采用Zeiss EM902，系统分析切片中再生长轴突的存在。
6.1.13COS细胞中的Nogo A表达
采用本领域已知的标准克隆技术，将Nogo A可读框亚克隆到pcDNA3.1mychis载体(Invitrogen)中。所产生的质粒(Nogo-myc19)产生含有融合于myc-his标记(21个氨基酸)的Nogo A序列的重组蛋白。采用superfect(Qiagen)按照生产商的方案将Nogo-myc19(2μg DNA/35mm平皿)，或对照质粒(pcDNAmychisLacZ)转染到COS细胞中。转染后36-48小时收获转染的细胞。根据用抗myc抗体的免疫荧光染色和酶促β-半乳糖苷酶颜色反应，估计平均转染率约为20％。转染的COS细胞用95％乙醇/5％乙酸固定(4℃，25分钟)，在PBS/10％FCS中封闭，并与AS Bruna(1∶200)或IN-1(1∶2)一起在PBS/1％FCS中于室温下温育2小时。用PBS洗涤细胞，并与荧光第二抗体(对于AS Bruna检测为羊抗兔-FITC，而对于IN-1检测为羊抗小鼠-TRITC，JacksonImmuno Research Lab.Inc.，West Grove，PA)反应。
6.1.14少突胶质细胞培养物
将从新生大鼠脑中分离的少突胶质细胞接种至75cm2聚赖氨酸烧瓶(Sigma，St.Louis，MO)中，在补充5％FCS的DMEM中培养10-12天。通过在定轨摇床上以210rpm震摇过夜，从星形胶质细胞单层释放出少突胶质细胞及其祖细胞(progenitor)的富集混合群体。将细胞以1-2×106细胞的密度接种到聚赖氨酸包被的35cm2平皿上。让祖细胞在化学成分已知的培养基(CDM)中分化3-4天。
6.1.15细胞表面生物素化
如van der Haar等(1998，J.Neurosci.Res.51：371-81)中所述，制备P4大鼠全脑培养物。在体外第7天，用细胞不透性EZ-LINK-Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce)如所述的方法对其进行生物素化，只是所有步骤均于15℃下进行，将细胞在1ml裂解缓冲液(0.05M NaH2PO4 pH 8.0，0.15M NaCl，0.5％CHAPS(Sigma)，2.5mM碘代乙酰胺，1mM苯基甲磺酰氟，0.1μg/ml抑肽酶，1μg/ml亮抑酶肽、1μg/ml抑胃酶肽A)中裂解。生物素化蛋白用Dynabeads M-280链霉抗生物素(Dynal)免疫沉淀，经过SDS-PAGE，并转移至硝化纤维素膜上，用AS 472、α-BiP和α-β-微管蛋白探测。所述膜用Re-Blot蛋白质印迹再循环试剂盒(Chemicon)提取(strip)。
6.1.16免疫细胞化学
按照Schwab和Caroni所述(1988，J.Neurosci.8：2381-2393)，制备视神经少突胶质细胞。2日龄的培养物与AS 472(1∶200)或mAb IN-1(1∶3)在培养基中于室温(rt)下温育25分钟。洗涤培养物，用4％低聚甲醛/5％蔗糖的PBS溶液固定，并在0.1M马来酸/2％封闭试剂(Boehringer Mannheim)中封闭1小时。第二碱性磷酸酶缀合抗体(MilanAnalytica)以1∶7,500的0.1M马来酸/1％封闭试剂溶液使用(1小时，rt)。转染的COS细胞用95％乙醇/5％乙酸固定(4℃，25分钟)，封闭，并与AS Bruna(1∶200)或mAb IN-1一起于室温下温育2小时。细胞与羊抗兔-FITC以及羊抗小鼠TRITC(Jackson Immuno Research Lab)反应。
6.1.17视神经室
按照Schwab等所述(1988，J.Neurosci.8：2381-2393)，在三室培养系统中培养多对视神经，注射并暴露于或者AS 472或者相应的免疫前血清(1∶10)。将视神经包埋进行电镜分析(EM)，从DRG暴露的残干以约3.5mm距离取超薄切片。采用Zeiss EM 902显微镜，系统分析切片中再生长轴突的存在。
6.2实验结果
以下一节公开了得自6.1及其小节叙述的方法的实验结果。
6.2.1Nogo cDNA的分离
纯化大鼠NI-250的牛同系物bNI220，通过蛋白酶消化产生所纯化蛋白的肽。按照6个不同的bNI220肽序列，设计多种洋地黄毒苷标记的简并寡核苷酸。根据用这些寡核苷酸筛选牛白质文库，分离出几个cDNA文库。用最大克隆的插入片段(CWP1-3，图1a)合成探针，用于随后大鼠cDNA文库的筛选。来自这种筛选的所选择的克隆示于图1a。这些cDNA克隆的DNA序列分析表明，三种不同的转录物起源于一个基因，将该基因命名为Nogo。所述不同的转录物可能既产生于可变启动子用法又产生于可变剪接(Nogo A、Nogo B和Nogo C；图1b)。从图1A所示的克隆编译DNA序列，以产生转录物A，其DNA序列示于图2a。
这三种转录物的概念翻译(conceptual translation)产生命名为Nogo A(1163个氨基酸)、Nogo B(360个氨基酸)和Nogo C(199个氨基酸)的蛋白产物。由于Nogo A含有得自纯化bNI220的所有6种肽序列(图2b)，因此它可能等同于纯化的蛋白大鼠NI-250。Nogo A、B和C具有共同的188个氨基酸的羧基末端(共同结构域)，Nogo A和B共享172氨基酸的氨基末端。由于可变剪接，Nogo A比Nogo B长803个氨基酸。
Nogo同种型中没有一个在N末端具有疏水氨基酸序列段，所述序列段可以用作常规信号肽。然而，已经描述了缺乏常规信号肽、但仍通过膜转运的蛋白，例如成纤维细胞生长因子(Florkiewicz等，1995，J.Cell.Physiology 162：388-399)、睫状神经营养因子(Sendtner等，1994，J.Neurobiology 25：1436-1353)和白介素-1(Rubartelli等，1990，EMBO J.9：1503-1510)。例如commissureless(Tear等，1996，Neuron 16：501-514)的膜蛋白也缺乏常规信号肽，但仍插入膜。
尽管在推定5’非翻译区没有符合读框的终止密码子，这可能明确限定起始密码子，但以下证据提示，图2a中指出的甲硫氨酸是Nogo A和Nogo B的起始密码子：(1)该假定起始密码子周围的序列证明符合翻译起始位点的共有序列(GCCGCC A/G CCATGG；SEQ ID NO：39)；(2)进行了大量的研究以通过文库筛选以及5’-RAGE寻找更上游的序列。这些寻找中没有一个已经导致鉴定出更上游的序列；和(3)从上述甲硫氨酸表达真核重组Nogo A的表观分子量约为200kD，正如通过SDS-PACE所估计的，这不可与来自大鼠少突胶质细胞的内源Nogo A区别(图11a)。
6.2.2Nogo序列分析
Nogo A含有7个潜在的N-糖基化位点，然后生物化学证据表明，Nogo A不具有主要的多糖组分。Nogo A也具有19个PKC识别位点和7个酪蛋白激酶II识别位点(图2a)。所有三种Nogo均分别具有35个氨基酸和36个氨基酸的两个共同羧基末端疏水结构域。它们中的任一种或两种可以用作跨膜结构域或膜内结构域，这与bNI220鉴定为膜内在蛋白质一致。Nogo A(以及Nogo B和C)不含有任何已知的细胞粘着分子、胞外基质蛋白或其它引导分子的基序。
Nogo序列用来在不同数据库中检索同源基因，所述三种Nogo产物的羧基末端共同结构域与鉴定的人基因nsp(大鼠中的cl13和s-rex，以及鸡中的chs-rex)相似(62.5％)(图3)。来自C.elegans的EST和黑尾果蝇(Drosophila melanogaster)EST在该同一区与Nogo和nsp也具有显著的相似性(分别为16.6％和13.6％)。Nogo和Nsp的180个氨基酸羧基末端结构域在哺乳动物物种中均高度保守(分别为98.3％和97.3％)，这表明它们可以执行相似和必需的功能。在该区之外，不同物种中特定蛋白的相似性也高(在大鼠和牛Nogo A之间为73％；在NSP-A和S-rexb之间为76.2％；在Chs-rexb和NSP-A或S-rexb之间为50％)。然而，NSP和Nogo之间的相似性限于其羧基末端疏水共同结构域(图3a)，以及限于所述蛋白该保守区之外的酸性性质。NSP(NSP-A、NSP-B和NSP-C)先前被描述为功能未知的神经内分泌(neuro-endocrine)特异性产物。原位杂交和免疫组织学显示出神经系统中NSP的神经元定位。最近鉴定出另一人基因nsp样-1，它也具有与Nsp和Nogo具有50％相似性的一个羧基末端疏水区。
6.2.3.Nogo的组织表达
通过RNA印迹和原位杂交检查Nogo表达型式。当使用“共同”探针(6.1.6一节)时，在视神经、脊髓和脑皮质中检测到三种主要的Nogo转录物(命名为：A，4.6kb；B，2.6kb；和C，1.7kb)(图4a)。在背根神经节中，仅检测到两种较大的转录物。在PC12细胞中检测到一种2.6kb的主要转录物，而在长时间暴露后仅可以检测到4.6kb条带(图4a)。在坐骨神经中，检测到较低水平的转录物，2.6kb条带是主要的转录物。当脊髓和PC 12细胞poly(A)+RNA与外显子1特异性探针杂交时，仅检测到4.6kb和2.6kb转录物；当后脑和骨骼肌poly(A)+RNA与外显子2特异性探针杂交时，在后脑中仅检测到4.6kb转录物(图4b)。这些结果证实了图1B中显示的转录物图谱。然而，RNA印迹分析结果也证明，Nogo的表达不限于神经系统(图4c)；在骨骼肌(1.7kb)、肾(2.6kb和1.7kb)、软骨(来自胸骨，1.7kb)、皮肤(1.7kb)、肺(2.6kb)和脾(2.6kb)中也检测到Nogo转录物。除骨骼肌表达高水平的Nogo C转录物外，神经系统之外的Nogo转录物水平低于神经系统的水平。迄今为止，4.6kb Nogo A转录物看来只在神经系统中转录。
采用所述共同探针在成年大鼠CNS组织切片上进行的原位杂交，表明在大脑和脊髓不同部分的白质中多排胞体的中等标记。这种排列是典型的束间少突胶质细胞(图5a，d)。除少突胶质细胞外，几种类型的神经元也表达高水平的Nogo转录物(图5c，e)。在小脑中，用抗GFAP抗体双重染色切片和原位杂交清楚地表明，由所述Nogo探针将浦肯野细胞强染色，而星形胶质细胞不被标记(图5e，f)。在发育中的视神经中，早至出生后当天(P0)，即在可以检测出主要髓磷脂蛋白蛋白磷脂蛋白(PLP)和髓磷脂碱性蛋白(MBP)的mRNA之前数天，检测到Nogo转录物(图6)。这种定时与第一个半乳糖脑苷脂阳性少突胶质细胞的出现和神经突生长抑制活性的表达一致，神经突生长抑制活性可以被IN-1中和。
针对基于牛Nogo A特异性序列的合成肽产生抗血清(AS 472)，而针对45kD重组的部分大鼠Nogo A(6.1.7一节)产生抗血清(ASBruna)。在蛋白质印迹上，AS 472和AS Bruna每个都识别牛髓磷脂中的一种约200kD的蛋白，而AS Bruna还识别一种200kD大鼠髓磷脂蛋白(图7)。成年大鼠脊髓和小脑的切片用AS 472、AS Bruna和IN-1染色。当切片用乙醇/乙酸固定时(较早时表明是IN-1抗原的保藏和可及性所需的步骤)，所有三种抗体观察到白质/髓磷脂的强染色(图8)。用AS Bruna的少突胶质细胞胞体的染色特别清楚。新鲜冷冻的切片用甲醇处理，而不用乙醇/乙酸处理，消除了除少突胶质细胞胞体外的髓磷脂染色。
AS Bruna和AS 472也将某些类型的神经元包括脊髓中的运动神经元以及小脑中的粒层和分子层染色。浦肯野细胞用AS 472和ASBruna强染色，但用IN-1没有可检测的染色。
6.2.4  Nogo抗体在体外抑制Nogo诱导的生长抑制
半纯化牛脊髓NI-220制剂(q-库)可以防止NIH 3T3成纤维细胞散布和神经突向外生长。在存在Nogo抗血清AS Bruna、AS 472或IN-1中任一种时，q-库抑制活性降低，即NIH 3T3成纤维细胞经历散布和胚鸡背根神经节(DRG)在包被q-库的平皿上延伸神经突(图9)。通过加入用来产生AS 472的肽P472(6.1.7一节)证明了特异性。P472成功地阻断AS 472的抑制效应，而对照肽对所述抑制没有效应。
此外，采用AS 472，在免疫细胞化学上、功能和生物化学上，证明了在少突胶质细胞的细胞表面上存在Nogo A。当细胞为活细胞时，原代培养的少突胶质细胞用或者mAb IN-1或者AS 472染色，在分化的少突胶质细胞上观察到相对弱(与半乳糖脑苷脂的免疫细胞化学相比)但清楚的表面染色(图15a，c)。加入AS 472的竞争肽(P472)或不加入第一抗体，消除了特异性染色(图15b，d)。细胞表面生物素化和随后用链霉抗生物素沉淀进一步证明在少突胶质细胞质膜上存在Nogo A。在沉淀物中，AS 472检测到在所述胞内可能的非加工和非糖基化AS 472免疫阳性条带之上约40kD的条带。在生物素化部分中不能检测出ER蛋白BiP(图15e)。
也在功能上分析Nogo A作为少突胶质细胞细胞表面分子。少突胶质细胞和NIH 3T3成纤维细胞或者少突胶质细胞和DRG神经元的共同培养，清楚地表明成熟少突胶质细胞的抑制特性。这些测定证明，NIH 3T3成纤维细胞和DRG神经突强烈地避开少突胶质细胞的区域，这种效应被mAb IN-1中和。在存在AS 472的情况下，这种抑制同样降低(图16a、b和e、f)，而AS 472与P472预温育恢复了少突胶质细胞介导的抑制(图16c、d和g、h)。定量分析揭示出在两种类型的测定中mAb IN-1和AS 472的高度显著的中和能力(图16i和j)。
测试由稳定转染的CHO细胞系产生的RecNogo-A(图17a)对NIH3T3成纤维细胞散布和DRG神经突向外生长的活性。从稳定的CHO细胞系(CHO-LacZ)分离的重组产生的β-半乳糖苷酶与recNogo-A平行富集，将其用作两个测定中内源CHO蛋白抑制活性的对照。在NIH3T3成纤维细胞散布测定中，含recNogo-A的CHO提取物(Nogo-A：约1-5％总蛋白；图9a)在10μg/cm2下表现出对细胞散布的明显抑制效应(图17b)。这种效应是剂量依赖性的：在20μg/cm2下抑制活性较高，而5μg/cm2没有抑制性(数据未显示)。通过所述包被蛋白与mAb IN-1或AS Bruna预温育，可以将所述抑制活性中和至背景水平，而针对半乳糖脑苷脂的对照抗体(mAb O1)或AS Bruna免疫前血清没有效应(图17b)。
除了对NIH 3T3成纤维细胞散布的强效应外，含recNogo-A的CHO提取物而不是CHO-LacZ提取物，对来自原代培养神经元的神经突向外生长具有有效抑制效应：解离的DRG神经元以剂量依赖形式被recNogo-A抑制(图17c)。这种抑制活性可以被mAb IN-1中和，但不被对照mAb O1中和(图17c-e)。分离自CHO-LacZ的重组蛋白在1μg和5μg下没有抑制性，加入mAb O1或IN-1对神经突向外生长没有效应。
6.2.5神经突在体外的再生长
研究了新生大鼠DRG神经突再生和通过成年CNS组织生长的能力。从成年大鼠解剖出多对视神经，在特殊室培养系统中培养，以使DRG神经突可及每根神经的一端(图10a)。在每个培养物中，给两根神经之一注射并暴露于免疫前兔血清，给第二根神经注射AS 472，AS 472也存在于该神经周围的侧室中。在NGF存在下在体外2周后，固定所述培养物，将其拆开并包埋用于电镜分析(EM)。从所述神经接触DRG神经元的一端取3.5mm的EM切片。注射免疫前血清的神经不含或仅含有少数轴突(图10b)。后者仅发现与基膜和所述神经表面上的星形胶质细胞相连。相反，注射AS 472的大多数视神经含有相当大数目的轴突，通常多达数百个。可以常常观察到与髓磷脂接触(图10c，d)。
6.2.6  IN-1识别重组Nogo A
当Nogo A作为转染的COS细胞中的羧基末端myc-his标记的重组蛋白表达时，采用抗myc抗体和AS Bruna这两者的蛋白质印迹证明，重组Nogo A在变性SDS凝胶上的表观分子量约为200kD(图11a)。在同一印迹上，As Bruna在大鼠原代培养少突胶质细胞中检测到相似迁移率的条带，提示重组Nogo A的分子量与来自少突胶质细胞的内源Nogo A的分子量几乎相同(图1a)。当转染的COS细胞用IN-1和As Bruna免疫荧光染色时，IN-1和AS Bruna识别相同的转染细胞(图11b，c)。大多数所述免疫反应性位于细胞内，并且仅在透化后可及。
6.2.7对Nogo活性区作图
产生一系列Nogo的缺失突变体，以便对Nogo的抑制结构域或区作图。通过采用内部限制位点、绿豆内切核酸酶III消化和聚合酶链式反应，产生所述Nogo基因的缺失构成物。在图18及其简述中提供了所述突变体的描述。所述大多数构成物具有N末端T7标记，以用抗T7单克隆抗体进行鉴定；具有N末端或C末端六组氨酸标记(“His标记”)，用于采用固定化Co(II)-亲和层析纯化。Nogo缺失突变体NiG-D1、NiG-D2直至NiG-D20全都采用NIH 3T3成纤维细胞散布测定测试，以测定抑制活性。在PC12神经突向外生长、解离的大鼠DRG神经突向外生长或视网膜神经节剥离测定中测试某些突变体。结果示于以下表2中。
表2.Nogo缺失突变体的功能活性
当成纤维细胞或PC12细胞被抑制以不能在包被得自缺失突变体的Nogo制剂的平板上散布时，记录NIH 3T3成纤维细胞测定(3T3)或PC12测定中的阳性结果。胚鸡背根神经节神经突向外生长测定(DRG)或神经节生长锥衰弱测定(RGC)中的阳性结果表明，在得自缺失突变体的Nogo制剂存在下，神经突向外生长受抑制，或引起生长锥衰弱。
该数据表明，在来自氨基酸172-974、特别是氨基酸542-722的Nogo-A特异性区中鉴定出一个主要抑制结构域。另外，Nogo-A和Nogo-B的N末端序列(氨基酸1-171)也抑制3T3散布。根据所述结果，来自氨基酸172-259的Nogo区和来自975-1162的Nogo区看来是非必需的，并且可以除去而不损失抑制活性。
7.实施例：人Nogo核酸和蛋白、衍生物和片段
本发明提供编码人Nogo蛋白以及人Nogo蛋白片段的核苷酸序列，所述人Nogo蛋白片段包括与大鼠Nogo A、Nogo B和部分NogoC的人等同物。人Nogo氨基酸序列描述于图13，并且已经命名为SEQID NO：29。
本发明也提供人Nogo基因片段的核苷酸序列。采用大鼠Nogo A转录物作为辅助，以对同源于所述大鼠或牛cDNA序列的人已表达序列标志(EST)的人Nogo核苷酸序列进行序列对比并将其剪接在一起，可以确定人Nogo核苷酸序列.
例如，EST AA 081783和AA333267(5.1一节)互相重叠，并且对应于大鼠Nogo A(图2a；SEQ ID NO：1)核酸位置765-1272.ESTAA322592、AA092565和AA081525(5.1一节)也互相重叠，并且所述重叠序列对应于大鼠Nogo核酸1642-2131。不采用与本发明的大鼠或牛Nogo核苷酸序列进行直接计算机比较，可能不能对这两组独立的重叠EST进行序列对比，以得到所述人序列。对于原始计算机序列对比，最好使用ENTREZ Nucleotide QUERY。其它计算机序列对比程序列于5.1一节，作为替代实施例，不意味着限制可以使用的计算机程序的范围。
8.讨论
8.1神经突生长抑制剂Nogo的克隆
Nogo A具有许多特性，支持它是先前所描述的大鼠NI-250，这是一种CNS髓磷脂的主要神经突向外生长抑制蛋白和IN-1的抗原。在分子水平上，Nogo A含有最初通过对bNI-220测序获得的所有6种肽，bNI-220是牛脊髓髓磷脂的最具抑制性的组分。在表达水平上，少突胶质细胞是成年CNS中的Nogo A表达的主要细胞类型，Nogo表达在视神经中定时的符合先前对IN-1中和的对神经突生长的髓磷脂抑制活性的描述。此外，蛋白质印迹揭示在活性q-库部分中存在Nogo A，来自不同CNS区的白质被AS Bruna以及AS 472(对NogoA为特异性的)染色，其染色型式与IN-1的型式相同。这些事实均与Nogo A是NI-250的解释一致。
针对Nogo A序列产生的两种抗血清AS Bruna和AS 472大大降低了部分纯化的牛脊髓制剂(q-库)的抑制活性。AS 472也使得数毫米范围内的许多背根神经节轴突向内生长至成年视神经外植体中，非常类似于NI-1。
尽管Nogo A的计算分子量为约140kD，但在变性SDS凝胶上其表观分子量为约200kD，这在预先估计的约250kD的范围内。Nogo A在SDS凝胶中的异常迁移率可能是由其酸性性质引起，而不是因为翻译后修饰引起的。对于其它高度酸性的蛋白例如生长相关蛋白GAP-43以及NSP-A，已经假定蛋白在SDS-PAGE上异常迁移率。另外，细菌表达的重组Nogo A的表观分子量与大鼠少突胶质细胞表达的内源Nogo A的表观分子量相同。这反对通过例如糖基化的机制对Nogo A进行主要修饰。
8.2  Nogo防止成年CNS的再生并限制其可塑性
Nogo在来自P0的大鼠视神经少突胶质细胞中的表达与较早的IN-1可中和性神经突生长抑制活性的发现非常一致。有趣的是，这种表达比主要髓磷脂蛋白表达和致密髓磷脂形成早数天。Nogo的出现可能是对轴突信号的反应，可以防止相应的纤维束中的进一步轴突生长(在大鼠视神经中轴突数目在E20为高峰)。Nogo也可能抑制侧突形成，并由此稳定分化CNS的一般结构。在分化CNS区的灰质中，髓磷脂含量和IN-1的免疫反应性与GAP-43和所述特定区的可塑性的潜力负相关。事实上，应用于成年CNS的IN-1抗体允许在脑干和脊髓中发生萌发和可塑性至先前已知的仅新生CNS的程度。与这种可塑性平行的大的功能恢复表明，萌发轴突能够形成功能适当的连接。
先前已经证明，神经元对抑制性Nogo的反应在不同年龄的神经元之间不同。推定，这是由于受体的差别表达，所述受体将有希望很快被鉴定出。同Netrins和许多生长因子一样，仍有可能存在触发不同反应的不同Nogo受体。Nogo也在某些类型的神经元中表达，这一事实表明在相同和/或不同Nogo同种型之间可能的相互作用。
8.3Nogo属于一个新的神经突调节分子家族
对Nogo的序列分析揭示，没有已知的细胞表面蛋白或基质蛋白的基序涉及轴突引导(排斥或吸引)；即不能鉴定出免疫球蛋白、纤连蛋白III型或EGF的结构域。与所描述的神经生长抑制剂Semaphorins、Netrins或Ephrins也没有同源性。
Nogo形成一个新家族，根据其羧基末端180个氨基酸的相似性，所述家族具有一组新近描述的蛋白-NSP/s-rex和NSP-样1蛋白。同Nogo的情况一样，可变启动子用法(Nsp和Nsp-样1基因)和可变剪接(仅Nsp)均负责具有共同羧基末端的可变蛋白产物的产生，所述共同羧基末端含有两个疏水氨基酸序列段。正如名称所表示，NSP(神经内分泌同特异性蛋白)主要在神经元和几种内分泌细胞类型中表达。它们主要位于细胞内，与内质网相连。NSP-样1基因主要在脑和肌肉中表达。NSP家族和Nsp-样1家族的功能均是未知的。潜在C.elegans和黑尾果蝇中均存在潜在的直向同源物，这一事实表明，Nogo与其神经再生和萌发抑制活性，可能是新近进化的，并因此是NSP家族的未描述过的成员。
8.4非神经元组织中的Nogo
Nogo C转录物在骨骼肌中的表达水平与神经系统中的表达水平相当。肌肉Nogo C的一个可想象的功能是排斥运动轴突，并将其限于运动终板区。低水平的Nogo表达也可以在其它非神经组织中检测到。观察到的髓磷脂提取物和NI-250对成纤维细胞和星形胶质细胞散布的抑制暗示在这些细胞中存在Nogo蛋白受体和反应机制。这提示Nogo在细胞运动的接触抑制方面的可能的一般功能。
本发明不限于本文描述的具体实施方案的范围。实际上，根据上述描述和附图，除本文描述的实施方案之外的本发明的各种修改，对于本领域技术人员而言将是显而易见的。这样的修改计划属于所附的权利要求书范围内。
本文引用了各种参考文献，其公开内容通过引用全部结合到本文中。
序列表
SEQ ID NO.1
<211>3741
<212>DNA
<213>Rattus sp.
<220>
<221>CDS
<222>(253)...(3741)
<400>1
attgctcgtc tgggcggcgg cggcggctgc agcctgggac agggcgggtg gcacatctcg    60
atcgcgaagg cagcagaagc agtctcattg ttccgggagc cgtcgcctct gcaggttctt   120
cggctcggct cggcacgact cggcctgcct ggcccctgcc agtcttgccc aacccccaca   180
accgcccgcg actctgagga gaagcggccc tgcggcggct gtagctgcag catcgtcggc   240
gacccgccag cc atg gaa gac ata gac cag tcg tcg ctg gtc tcc tcg tcc   291
              Met Glu Asp Ile Asp Gln Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser
               1               5                   10
acg gac agc ccg ccc cgg cct ccg ccc gcc ttc aag tac cag ttc gtg     339
Thr Asp Ser Pro Pro Arg Pro Pro Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val
     15                  20                  25
acg gag ccc gag gac gag gag gac gag gag gag gag gag gac gag gag     387
Thr Glu Pro Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu
 30                  35                  40                  45
gag gac gac gag gac cta gag gaa ctg gag gtg ctg gag agg aag ccc     435
Glu Asp Asp Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro
                 50                  55                  60
gca gcc ggg ctg tcc gca gct gcg gtg ccg ccc gcc gcc gcc gcg ccg     483
Ala Ala Gly Leu Ser Ala Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro
             65                  70                  75
ctg ctg gac ttc agc agc gac tcg gtg ccc ccc gcg ccc cgc ggg ccg    531
Leu Leu Asp Phe Ser Ser Asp Ser Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro
         80                  85                  90
ctg ccg gcc gcg ccc cct gcc gct cct gag agg cag cca tcc tgg gaa    579
Leu Pro Ala Ala Pro Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Glu
     95                 100                 105
cgc agc ccc gcg gcg ccc gcg cca tcc ctg ccg ccc gct gcc gca gtc    627
Arg Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val
110                 115                 120                 125
ctg ccc tcc aag ctc cca gag gac gac gag cct ccg gcg agg ccc ccg    675
Leu Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro
                130                 135                 140
cct ccg ccg cca gcc ggc gcg agc ccc ctg gcg gag ccc gcc gcg ccc    723
Pro Pro Pro Pro Ala Gly Ala Ser Pro Leu Ala Glu Pro Ala Ala Pro
            145                 150                 155
cct tcc acg ccg gcc gcg ccc aag cgc agg ggc tcc ggc tca gtg gat    771
Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ser Val Asp
        160                 165                 170
gag acc ctt ttt gct ctt cct gct gcatct gag cct gtg ata ccc tcc     819
Glu Thr Leu Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Pro Ser
    175                 180                 185
tct gca gaa aaa att atg gat ttg atg gag cag cca ggt aac act gtt    867
Ser Ala Glu Lys Ile Met Asp Leu Met Glu Gln Pro Gly Asn Thr Val
190                 195                 200                 205
tcg tct ggt caa gag gat ttc cca tct gtc ctg ctt gaa act gct gcc    915
Ser Ser Gly Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala
                210                 215                 220
tct ctt cct tct cta tct cct ctc tca act gtt tct ttt aaa gaa cat     963
Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro Leu Ser Thr Val Ser Phe Lys Glu His
            225                 230                 235
gga tac ctt ggt aac tta tca gca gtg tca tcc tca gaa gga aca att    1011
Gly Tyr Leu Gly Asn Leu Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ile
        240                 245                 250
gaa gaa act tta aat gaa gct tct aaa gag ttg cca gag agg gca aca    1059
Glu Glu Thr Leu Asn Glu Ala Ser Lys Glu Leu Pro Glu Arg Ala Thr
    255                 260                 265
aat cca ttt gta aat aga gat tta gca gaa ttt tca gaa tta gaa tat    1107
Asn Pro Phe Val Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr
270                 275                 280                 285
tca gaa atg gga tca tct ttt aaa ggc tcc cca aaa gga gag tca gcc    1155
Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe Lys Gly Ser Pro Lys Gly Glu Ser Ala
                290                 295                 300
ata tta gta gaa aac act aag gaa gaa gta att gtg agg agt aaa gac    1203
Ile Leu Val Glu Asn Thr Lys Glu Glu Val Ile Val Arg Ser Lys Asp
            305                 310                 315
aaa gag gat tta gtt tgt agt gca gcc ctt cac agt cca caa gaa tca    1251
Lys Glu Asp Leu Val Cys Ser Ala Ala Leu His Ser Pro Gln Glu Ser
        320                 325                 330
cct gtg ggt aaa gaa gac aga gtt gtg tct cca gaa aag aca atg gac    1299
Pro Val Gly Lys Glu Asp Arg Val Val Ser Pro Glu Lys Thr Met Asp
    335                 340                 345
att ttt aat gaa atg cag atg tca gta gta gca cct gtg agg gaa gag    1347
Ile Phe Asn Glu Met Gln Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu
350                 355                 360                 365
tat gca gac ttt aag cca ttt gaa caa gca tgg gaa gtg aaa gat act    1395
Tyr Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Gln Ala Trp Glu Val Lys Asp Thr
                370                 375                 380
tat gag gga agt agg gat gtg ctg gct gct aga gct aat gtg gaa agt    1443
Tyr Glu Gly Ser Arg Asp Val Leu Ala Ala Arg Ala Asn Val Glu Ser
            385                 390                 395
aaa gtg gac aga aaa tgc ttg gaa gat agc ctg gag caa aaa agt ctt    1491
Lys Val Asp Arg Lys Cys Leu Glu Asp Ser Leu Glu Gln Lys Ser Leu
        400                 405                 410
ggg aag gat agt gaa ggc aga aat gag gat gct tct ttc ccc agt acc    1539
Gly Lys Asp Ser Glu Gly Arg Asn Glu Asp Ala Ser Phe Pro Ser Thr
    415                 420                 425
cca gaa cct gtg aag gac agc tcc aga gca tat att acc tgt gct tcc    1587
Pro Glu Pro Val Lys Asp Ser Ser Arg Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Ser
430                 435                 440                 445
ttt acc tca gca acc gaa agc acc aca gca aac act ttc cct ttg tta    1635
Phe Thr Ser Ala Thr Glu Ser Thr Thr Ala Asn Thr Phe Pro Leu Leu
                450                 455                 460
gaa gat cat act tca gaa aat aaa aca gat gaa aaa aaa ata gaa gaa    1683
Glu Asp His Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu
            465                 470                 475
agg aag gcc caa att ata aca gag aag act agc ccc aaa acg tca aat    1731
Arg Lys Ala Gln Ile Ile Thr Glu Lys Thr Ser Pro Lys Thr Ser Asn
        480                 485                 490
cct ttc ctt gta gca gta cag gat tct gag gca gat tat gtt aca aca    1779
Pro Phe Leu Val Ala Val Gln Asp Ser Glu Ala Asp Tyr Val Thr Thr
    495                 500                 505
gat acc tta tca aag gtg act gag gca gca gtg tca aac atg cct gaa    1827
Asp Thr Leu Ser Lys Val Thr Glu Ala Ala Val Ser Asn Met Pro Glu
510                 515                 520                 525
ggt ctg acg cca gat tta gtt cag gaa gca tgt gaa agt gaa ctg aat    1875
Gly Leu Thr Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn
                530                 535                 540
gaa gcc aca ggt aca aag att gct tat gaa aca aaa gtg gac ttg gtc    1923
Glu Ala Thr Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Val Asp Leu Val
            545                 550                 555
caa aca tca gaa gct ata caa gaa tca ctt tac ccc aca gca cag ctt    1971
Gln Thr Ser Glu Ala Ile Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Thr Ala Gln Leu
        560                 565                 570
tgc cca tca ttt gag gaa gct gaa gca act ccg tca cca gtt ttg cct    2019
Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro
    575                 580                 585
gat att gtt atg gaa gca cca tta aat tct ctc ctt cca agc gct ggt    2067
Asp Ile Val Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Leu Leu Pro Ser Ala Gly
590                 595                 600                 605
gct tct gta gtg cag ccc agt gta tcc cca ctg gaa gca cct cct cca    2115
Ala Ser Val Val Gln Pro Ser Val Ser Pro Leu Glu Ala Pro Pro Pro
                610                 615                 620
gtt agt tat gac agt ata aag ctt gag cct gaa aac ccc cca cca tat    2163
Val Ser Tyr Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr
            625                 630                 635
gaa gaa gcc atg aat gta gca cta aaa gct ttg gga aca aag gaa gga    2211
Glu Glu Ala Met Asn Val Ala Leu Lys Ala Leu Gly Thr Lys Glu Gly
        640                 645                 650
ata aaa gag cct gaa agt ttt aat gca gct gtt cag gaa aca gaa gct    2259
Ile Lys Glu Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala Val Gln Glu Thr Glu Ala
    655                 660                 665
cct tat ata tcc att gcg tgt gat tta att aaa gaa aca aag ctc tcc    2307
Pro Tyr Ile Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser
670                 675                 680                 685
act gag cca agt cca gat ttc tct aat tat tca gaa ata gca aaa ttc    2355
Thr Glu Pro Ser Pro Asp Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Ile Ala Lys Phe
                690                 695                 700
gag aag tcg gtg ccc gaa cac gct gag cta gtg gag gat tcc tca cct    2403
Glu Lys Ser Val Pro Glu His Ala Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro
            705                 710                 715
gaa tct gaa cca gtt gac tta ttt agt gat gat tcg att cct gaa gtc    2451
Glu Ser Glu Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Glu Val
        720                 725                 730
cca caa aca caa gag gag gct gtg atg ctc atg aag gag agt ctc act    2499
Pro Gln Thr Gln Glu Glu Ala Val Met Leu Met Lys Glu Ser Leu Thr
    735                 740                 745
gaa gtg tct gag aca gta gcc cag cac aaa gag gag aga ctt agt gcc    2547
Glu Val Ser Glu Thr Val Ala Gln His Lys Glu Glu Arg Leu Ser Ala
750                 755                 760                 765
tca cct cag gag cta gga aag cca tat tta gag tct ttt cag ccc aat    2595
Ser Pro Gln Glu Leu Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gln Pro Asn
                770                 775                 780
tta cat agt aca aaa gat gct gca tct aat gac att cca aca ttg acc    2643
Leu His Ser Thr Lys Asp Ala Ala Ser Asn Asp Ile Pro Thr Leu Thr
            785                 790                 795
aaa aag gag aaa att tct ttg caa atg gaa gag ttt aat act gca att    2691
Lys Lys Glu Lys Ile Ser Leu Gln Met Glu Glu Phe Asn Thr Ala Ile
        800                 805                 810
tat tca aat gat gac tta ctt tct tct aag gaa gac aaa ata aaa gaa    2739
Tyr Ser Asn Asp Asp Leu Leu Ser Ser Lys Glu Asp Lys Ile Lys Glu
    815                 820                 825
agt gaa aca ttt tca gat tca tct ccg att gag ata ata gat gaa ttt    2787
Ser Glu Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe
830                 835                 840                 845
ccc acg ttt gtc agt gct aaa gat gat tct cct aaa tta gcc aag gag    2835
Pro Thr Phe Val Ser Ala Lys Asp Asp Ser Pro Lys Leu Ala Lys Glu
                850                 855                 860
tac act gat cta gaa gta tcc gac aaa agt gaa att gct aat atc caa    2883
Tyr Thr Asp Leu Glu Val Ser Asp Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ile Gln
            865                 870                 875
agc ggg gca gat tca ttg cct tgc tta gaa ttg ccc tgt gac ctt tct    2931
Ser Gly Ala Asp Ser Leu Pro Cys Leu Glu Leu Pro Cys Asp Leu Ser
        880                 885                 890
ttc aag aat ata tat cct aaa gat gaa gta cat gtt tca gat gaa ttc    2979
Phe Lys Asn Ile Tyr Pro Lys Asp Glu Val His Val Ser Asp Glu Phe
    895                 900                 905
tcc gaa aat agg tcc agt gta tct aag gca tcc ata tcg cct tca aat    3027
Ser Glu Asn Arg Ser Ser Val Ser Lys Ala Ser Ile Ser Pro Ser Asn
910                 915                 920                 925
gtc tct gct ttg gaa cct cag aca gaa atg ggc agc ata gtt aaa tcc    3075
Val Ser Ala Leu Glu Pro Gln Thr Glu Met Gly Ser Ile Val Lys Ser
                930                 935                 940
aaa tca ctt acg aaa gaa gca gag aaa aaa ctt cct tct gac aca gag    3123
Lys Ser Leu Thr Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu
            945                 950                 955
aaa gag gac aga tcc ctg tca gct gta ttg tca gca gag ctg agt aaa    3171
Lys Glu Asp Arg Ser Leu Ser Ala Val Leu Ser Ala Glu Leu Ser Lys
        960                 965                 970
act tca gtt gtt gac ctc ctc tac tgg aga gac att aag aag act gga    3219
Thr Ser Val Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly
    975                 980                 985
gtg gtg ttt ggt gcc agc tta ttc ctg ctg ctg tct ctg aca gtg ttc    3267
Val Val Phe Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe
990                 995                 1000                1005
agc att gtc agt gta acg gcc tac att gcc ttg gcc ctg ctc tcg gtg    3315
Ser Ile Val Ser Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val
                1010                1015                1020
act atc agc ttt agg ata tat aag ggc gtg atc cag gct atc cag aaa    3363
Thr Ile Ser Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys
            1025                1030                1035
tca gat gaa ggc cac cca ttc agg gca tat tta gaa tct gaa gtt gct    341l
Ser Asp Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala
        1040                1045                1050
ata tca gag gaa ttg gtt cag aaa tac agt aat tct gct ctt ggt cat    3459
Ile Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His
    1055                1060                1065
gtg aac agc aca ata aaa gaa ctg agg cgg ctt ttc tta gtt gat gat    3507
Val Asn Ser Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp
1070                1075                1080                1085
tta gtt gat tcc ctg aag ttt gca gtg ttg atg tgg gtg ttt act tat    3555
Leu Val Asp Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr
                1090                1095                1100
gtt ggt gcc ttg ttc aat ggt ctg aca cta ctg att tta gct ctg atc    3603
Val Gly Ala Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile
            1105                1110                1115
tca ctc ttc agt att cct gtt att tat gaa cgg cat cag gtg cag ata    3651
Ser Leu Phe Ser Ile Pro Val Ile Tyr Glu Arg His Gln Val Gln Ile
        1120                1125                1130
gat cat tat cta gga ctt gca aac aag agt gtt aag gat gcc atg gcc    3699
Asp His Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Ser Val Lys Asp Ala Met Ala
    1135                1140                1145
aaa atc caa gca aaa atc cct gga ttg aag cgc aaa gca gat            3741
Lys Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Asp
1150                1155                1160
SEQ ID NO.2
<211>1163
<212>PRT
<213>Rattus sp.
<400>2
Met Glu Asp Ile Asp Gln Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser Thr Asp Ser
 1               5                  10                  15
Pro Pro Arg Pro Pro Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Thr Glu Pro
            20                  25                  30
Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp
        35                  40                  45
Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly
    50                  55                  60
Leu Ser Ala Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp
65                  70                  75                  80
Phe Ser Ser Asp Ser Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala
                85                  90                  95
Ala Pro Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Glu Arg Ser Pro
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val Leu Pro Ser
        115                 120                 125
Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro
    130                 135                 140
Pro Ala Gly Ala Ser Pro Leu Ala Glu Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu
                165                 170                 175
Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Pro Ser Ser Ala Glu
            180                 185                 190
Lys Ile Met Asp Leu Met Glu Gln Pro Gly Asn Thr Val Ser Ser Gly
        195                 200                 205
Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Pro Leu Ser Thr Val Ser Phe Lys Glu His Gly Tyr Leu
225                 230                 235                 240
Gly Asn Leu Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ile Glu Glu Thr
                245                 250                 255
Leu Asn Glu Ala Ser Lys Glu Leu Pro Glu Arg Ala Thr Asn Pro Phe
            260                 265                 270
Val Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met
        275                 280                 285
Gly Ser Ser Phe Lys Gly Ser Pro Lys Gly Glu Ser Ala Ile Leu Val
    290                 295                 300
Glu Asn Thr Lys Glu Glu Val Ile Val Arg Ser Lys Asp Lys Glu Asp
305                 310                 315                 320
Leu Val Cys Ser Ala Ala Leu His Ser Pro Gln Glu Ser Pro Val Gly
                325                 330                 335
Lys Glu Asp Arg Val Val Ser Pro Glu Lys Thr Met Asp Ile Phe Asn
            340                 345                 350
Glu Met Gln Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu Tyr Ala Asp
        355                 360                 365
Phe Lys Pro Phe Glu Gln Ala Trp Glu Val Lys Asp Thr Tyr Glu Gly
    370                 375                 380
Ser Arg Asp Val Leu Ala Ala Arg Ala Asn Val Glu Ser Lys Val Asp
385                 390                 395                 400
Arg Lys Cys Leu Glu Asp Ser Leu Glu Gln Lys Ser Leu Gly Lys Asp
                405                 410                 415
Ser Glu Gly Arg Asn Glu Asp Ala Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Pro
            420                 425                 430
Val Lys Asp Ser Ser Arg Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Ser Phe Thr Ser
        435                 440                 445
Ala Thr Glu Ser Thr Thr Ala Asn Thr Phe Pro Leu Leu Glu Asp His
    450                 455                 460
Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Arg Lys Ala
465                 470                 475                 480
Gln Ile Ile Thr Glu Lys Thr Ser Pro Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu
                485                 490                 495
Val Ala Val Gln Asp Ser Glu Ala Asp Tyr Val Thr Thr Asp Thr Leu
            500                 505                 510
Ser Lys Val Thr Glu Ala Ala Val Ser Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr
        515                 520                 525
Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Thr
    530                 535                 540
Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Val Asp Leu Val Gln Thr Ser
545                 550                 555                 560
Glu Ala Ile Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Thr Ala Gln Leu Cys Pro Ser
                565                 570                 575
Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val
            580                 585                590
Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Leu Leu Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val
        595                 600                 605
Val Gln Pro Ser Val Ser Pro Leu Glu Ala Pro Pro Pro Val Ser Tyr
    610                 615                 620
Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala
625                 630                 635                 640
Met Asn Val Ala Leu Lys Ala Leu Gly Thr Lys Glu Gly Ile Lys Glu
                645                650                655
Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala Val Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile
            660                 665                 670
Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Thr Glu Pro
        675                 680                 685
Ser Pro Asp Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Ile Ala Lys Phe Glu Lys Ser
    690                 695                 700
Val Pro Glu His Ala Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Glu Ser Glu
705                 710                 715                 720
Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Glu Val Pro Gln Thr
                725                 730                 735
Gln Glu Glu Ala Val Met Leu Met Lys Glu Ser Leu Thr Glu Val Ser
            740                 745                 750
Glu Thr Val Ala Gln His Lys Glu Glu Arg Leu Ser Ala Ser Pro Gln
        755                 760                 765
Glu Leu Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gln Pro Asn Leu His Ser
    770                 775                 780
Thr Lys Asp Ala Ala Ser Asn Asp Ile Pro Thr Leu Thr Lys Lys Glu
785                 790                 795                 800
Lys Ile Ser Leu Gln Met Glu Glu Phe Asn Thr Ala Ile Tyr Ser Asn
                805                 810                 815
Asp Asp Leu Leu Ser Ser Lys Glu Asp Lys Ile Lys Glu Ser Glu Thr
            820                 825                 830
Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Phe
        835                 840                 845
Val Ser Ala Lys Asp Asp Ser Pro Lys Leu Ala Lys Glu Tyr Thr Asp
    850                 855                 860
Leu Glu Val Ser Asp Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ile Gln Ser Gly Ala
865                 870                 875                 880
Asp Ser Leu Pro Cys Leu Glu Leu Pro Cys Asp Leu Ser Phe Lys Asn
                885                 890                 895
Ile Tyr Pro Lys Asp Glu Val His Val Ser Asp Glu Phe Ser Glu Asn
            900                 905                 910
Arg Ser Ser Val Ser Lys Ala Ser Ile Ser Pro Ser Asn Val Ser Ala
        915                 920                 925
Leu Glu Pro Gln Thr Glu Met Gly Ser Ile Val Lys Ser Lys Ser Leu
    930                 935                 940
Thr Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp
945                 950                 955                 960
Arg Ser Leu Ser Ala Val Leu Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val
                965                970                975
Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe
            980                985                990
Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val
        995                 1000                1005
Ser Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser
    1010                1015                1020
Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu
1025                1030                1035                1040
Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu
                1045                1050                1055
Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Ser
            1060                1065                1070
Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp
        1075                1080                1085
Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr Val Gly Ala
    1090                1095                1100
Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser Leu  Phe
1105                1110                1115                1120
Ser Ile Pro Val Ile Tyr Glu Arg His Gln Val Gln Ile Asp His Tyr
                1125                1130                1135
Leu Gly Leu Ala Asn Lys Ser Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln
            1140                1145                1150
Ala Lys Ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Asp
        1155                1160
SEQ ID NO.3
<211>13
<212>PRT
<213>Bos sp.
<400>3
Glu Tyr Leu Gly Asp Leu Pro Ala Val Leu Pro Thr Glu
 1               5                  10
SEQ ID NO.4
<211>11
<212>PRT
<213>Bos sp.
<400>4
Glu Ile Ala Glu Ile Gln Asp Gly Glu Ser Leu
 1               5                  10
SEQ ID NO.5
<211>15
<212>PRT
<213>Bos sp.
<220>
<221>VARIANT
<222>(2)...(2)
<223>Xaa＝any amino acid
<400>5
Lys Xaa Tyr Leu Glu Ser Ile Gln Pro Ser Leu Gly Ile Thr Lys
1                5                  10                  15
SEQ ID NO.6
<211>9
<212>PRT
<213>Bos sp.
<220>
<221>VARIANT
<222>2，5
<223>Xaa＝any amino acid
<400>6
Lys Xaa Phe Glu Xaa Val Trp Glu Val
 1               5
SEQ ID NO.7
<211>11
<212>PRT
<213>Bos sp.
<400>7
Val Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys
1                5                  10
SEQ ID NO.8
<211>16
<212>PRT
<213>Bos sp.
<400>8
Lys Ala Val Ala Ala Glu Ala Ser Met Arg Glu Glu Tyr Ala Asp Phe
 1               5                  10                  15
SEQ ID NO.9
<211>13
<212>PRT
<213>Bos sp.
<400>9
Glu Tyr Leu Gly Asp Leu Pro Ala Val Leu Pro Thr Glu
 1               5                  10
SEQ ID NO.10
<211>12
<212>PRT
<213>Bos sp.
<400>10
Glu Ile Ala Asp Ile Gln Asp Gly Ala Gly Ser Leu
 1               5                  10
SEQ ID NO.11
<211>15
<212>PRT
<213>Bos sp.
<400>11
Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gln Pro Ser Leu Gly Ile Thr Lys
 1               5                  10                  15
SEQ ID NO.12
<211>9
<212>PRT
<213>Bos sp.
<400>12
Lys Pro Phe Glu Arg Val Trp Glu Val
 1               5
SEQ ID NO.13
<211>11
<212>PRT
<213>Bos sp.
<400>13
Val Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys
 1               5                  10
SEQ ID NO.14
<211>16
<212>PRT
<213>Bos sp.
<400>14
Lys Gly Val Ala Ala Glu Ala Ser Met Gly Glu Glu Tyr Ala Asp Phe
 1               5                  10                  15
SEQ ID NO.15
<211>13
<212>PRT
<213>Rattus sp.
<400>15
Gly Tyr Leu Gly Asn Leu Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu
 1               5                  10
SEQ ID NO.16
<211>12
<212>PRT
<213>Rattus sp.
<400>16
Glu Ile Ala Asn Ile Gln Ser Gly Ala Asp Ser Leu
 1               5                  10
SEQ ID NO.17
<211>15
<212>PRT
<213>Rattus sp.
<400>17
Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gln Pro Asn Leu His Ser Thr Lys
 1               5                  10                 15
SEQ ID NO.18
<211>9
<212>PRT
<213>Rattus sp.
<400>l8
Lys Pro Phe Glu Gln Ala Trp Glu Val
 1               5
SEQ ID NO.19
<211>11
<212>PRT
<213>Rattus sp.
<400>19
Val Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys
 1               5                  10
SEQ ID NO.20
<211>16
<212>PRT
<213>Rattus sp.
<400>20
Met Gln Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu Tyr Ala Asp Phe
 1               5                  10                  15
SEQ ID NO.21
<211>186
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>21
Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Gln Thr Gly Ile Val Phe Gly
 1               5                  10                  15
Ser Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ser Leu Thr Gln Phe Ser Val Val Ser
            20                  25                  30
Val Val Ala Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Thr Ile Ser Phe
        35                  40                  45
Arg Ile Tyr Lys Ser Val Leu Gln Ala Val Gln Lys Thr Asp Glu Gly
    50                  55                  60
His Pro Phe Lys Ala Tyr Leu Glu Leu Glu Ile Thr Leu Ser Gln Glu
65                  70                  75                  80
Gln Ile Gln Lys Tyr Thr Asp Cys Leu Gln Phe Tyr Val Asn Ser Thr
                85                  90                  95
Leu Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Gln Asp Leu Val Asp Ser
            100                 105                 110
Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Leu Leu Thr Tyr Val Gly Ala Leu
        115                 120                 125
Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Leu Met Ala Val Val Ser Met Phe Thr
    130                 135                 140
Leu Pro Val Val Tyr Val Lys His Gln Ala Gln Ile Asp Gln Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Gly Leu Val Arg Thr His Ile Asn Ala Val Val Ala Lys Ile Gln Ala
                165                 170                 175
Lys Ile Pro Gly Ala Lys Arg His Ala Glu
            180                 185
SEQ ID NO.22
<211>186
<212>PRT
<213>Rattus sp.
<400>22
Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Gln Thr Gly Ile Val Phe Gly
 1               5                  10                  15
Ser Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ser Leu Thr Gln Phe Ser Val Val Ser
            20                  25                  30
Val Val Ala Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Thr Ile Ser Phe
        35                  40                  45
Arg Ile Tyr Lys Ser Val Leu Gln Ala Val Gln Lys Thr Asp Glu Gly
    50                  55                  60
His Pro Phe Lys Ala Tyr Leu Glu Leu Glu Ile Thr Leu Ser Gln Glu
65                  70                  75                  80
Gln Ile Gln Lys Tyr Thr Asp Cys Leu Gln Leu Tyr Val Asn Ser Thr
                85                  90                  95
Leu Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Gln Asp Leu Val Asp Ser
            100                 105                 110
Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Leu Leu Thr Tyr Val Gly Ala Leu
        115                 120                 125
Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Leu Met Ala Val Val Ser Met Phe Thr
    130                 135                 140
Leu Pro Val Val Tyr Val Lys His Gln Ala Gln Val Asp Gln Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Gly Leu Val Arg Thr His Ile Asn Thr Val Val Ala Lys Ile Gln Ala
                165                 170                 175
Lys Ile Pro Gly Ala Lys Arg His Ala Glu
            180                 185
SEQ ID NO.23
<211>186
<212>PRT
<213>Gallus gallus
<400>23
Asn Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Gln Thr Gly Ile Val Phe Gly
 1               5                  10                  15
Ser Leu Leu Leu Leu Leu Phe Ser Leu Thr Gln Phe Ser Val Val Ser
            20                  25                  30
Val Val Ala Tyr Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ser Ala Thr Ile Ser Phe
        35                  40                  45
Arg Ile Tyr Lys Ser Val Leu Gln Ala Val Gln Lys Thr Asp Glu Gly
    50                  55                  60
His Pro Phe Lys Ala Tyr Leu Asp Met Glu Met Asn Leu Ser Gln Asp
65                  70                  75                  80
Gln Ile Gln Lys Tyr Thr Asp Cys Leu Gln Leu Tyr Val Asn Ser Thr
                85                  90                  95
Val Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Gln Asp Leu Val Asp Ser
            100                 105                 110
Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Leu Leu Thr Tyr Val Gly Ala Leu
        115                 120                 125
Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Met Ala Val Val Ser Met Phe Thr
    130                 135                 140
Leu Pro Val Val Tyr Asp Lys Tyr Gln Ala Gln Ile Asp Gln Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Gly Leu Val Arg Thr His Ile Asn Thr Val Val Ala Lys Ile Gln Ala
                165                 170                 175
Lys Ile Pro Gly Ala Lys Arg Lys Ala Glu
            180                 185
SEQ ID NO.24
<211>186
<212>PRT
<213>Bos sp.
<400>24
Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe Gly
 1               5                  10                  15
Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser
            20                  25                  30
Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser Phe
        35                  40                  45
Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu Gly
    50                  55                  60
His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu
65                  70                  75                  80
Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Cys Thr
                85                  90                  95
Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp Ser
            100                 105                 110
Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu
        115                 120                 125
Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser
    130                 135                 140
Val Pro Val Ile Tyr Glu Arg His Gln Ala Gln Ile Asp His Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Gly Leu Ala Asn Lys Asn Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala
                165                 170                 175
Lys Ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Glu
            180                 185
SEQ ID NO.25
<211>186
<212>PRT
<213>Rattus sp.
<400>25
Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe Gly
 1               5                  10                  15
Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser
            20                  25                  30
Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser Phe
        35                  40                  45
Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu Gly
    50                  55                  60
His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu
65                  70                  75                  80
Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Ser Thr
                85                  90                  95
Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp Ser
            100                 105                 110
Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu
        115                 120                 125
Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser
    130                 135                 140
Ile Pro Val Ile Tyr Glu Arg His GIn Val Gln Ile Asp His Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Gly Leu Ala Asn Lys Ser Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala
                165                 170                 175
Lys Ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Asp
            180                 185
SEQ ID NO.26
<211>194
<212>PRT
<213>C.elegans
<400>26
Asp Val Ile Tyr Trp Arg Asp Ala Lys Lys Ser Ala Ile Val Leu Ser
 1               5                  10                  15
Leu Ala Leu Leu Val Leu Phe Val Leu Ala Lys Tyr Pro Leu Leu Thr
            20                  25                  30
Val Val Thr Tyr Ser Leu Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Ala Gly Phe
        35                  40                  45
Arg Val Phe Lys Lys Val Glu Ala Gln Ile Lys Lys Thr Asp Ser Glu
    50                  55                  60
His Pro Phe Ser Glu Ile Leu Ala Gln Asp Leu Thr Leu Pro Gln Glu
65                  70                  75                  80
Lys Val His Ala Gln Ala Asp Val Phe Val Glu His Ala Thr Cys Ile
                85                  90                  95
Ala Asn Lys Leu Lys Lys Leu Val Phe Val Glu Ser Pro Leu Glu Ser
            100                 105                 110
Ile Lys Phe Gly Leu Val Leu Trp Ser Leu Thr Tyr Ile Ala Ser Trp
        115                 120                 125
Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ala Ile Leu Gly Leu Leu Gly Val Phe Ser
    130                 135                 140
Val Pro Lys Val Tyr Glu Ser Asn Gln Glu Ala Ile Asp Pro His Leu
145                 150                 155                 160
Ala Thr Ile Ser Gly His Leu Lys Asn Val Gln AsnIle Ile Asp Glu
                165                 170                 175
Lys Leu Pro Phe Leu Arg Ser Ala Pro Val Ala Ala Glu Glu Lys Lys
            180                 185                 190
Asp Gln
SEQ ID NO.27
<211>150
<212>PRT
<213>D.melanogaster
<400>27
Asn Leu Leu Leu Trp Arg Asn Ser Arg Lys Thr Leu Ile Val Phe Thr
 1               5                  10                  15
Gly Ile Leu Leu Leu Leu Leu Asp Val Met Val His Ser Val Ile Ser
            20                  25                  30
Val Ile Ser Met Val Gly Ile Thr Val Leu Ile Ala Ala Ile Gly His
        35                  40                  45
Arg Leu Leu Val Gln Phe Trp Ser Ile Trp Lys Lys Asp Glu Asn Lys
    50                  55                  60
Asp Gln Ile Leu Arg Phe Tyr Pro His Pro Lys Ile Glu Ile Pro Arg
65                  70                  75                  80
Glu Glu Thr Leu Tyr Leu Ala Gly Lys Ala Val Ser His Ile Asn Leu
                85                  90                  95
Ile Leu Asn Arg Met Ile Glu Leu Leu Leu Val Glu Lys Trp Glu Asp
            100                 105                 110
Ser Leu Lys Phe Leu Val Leu Leu Cys Gly Ile Asn Leu Leu Gly Asp
        115                 120                 125
Cys Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Phe Gly Met Cys Ile Cys Cys
    130                 135                 140
Leu Thr Leu Leu Tyr Leu
145                 150
SEQ ID NO.28
<211>3833
<212>DNA
<213>Bos sp.
<400>28
ctatctcctc tctcagccgc tgcttttaaa gaacgtgaat accttggtga tttaccagca      60
gtactgccca ctgaaggaac acttccagca acttcaaatg aagcttctaa agcattctca     120
gagaaggcaa aaaatccatt tgtagagaga aatttaacag aattttcaga attggaatat     180
tcagaaatgg aatcatcatt cagtggctct caaaaggcag aacctgccgt aacagtagcg     240
aatcctaggg acgaaatagt tgtgaggagt agagataaag aagaggactt agttagtctt     300
aacatccttc atactcagca ggagttatct acagtcctta cgaaatcagt tgaagaagaa     360
gatagagttc tgtctccaga aaaaacaaag gacagtttta aggaaaaggg agttgcagca     420
gaagcttcta tgggggagga atatgcagac ttcaaaccat ttgagcgagt atgggaagtg     480
aaagatactt acaagcaaga tagtgatgtt ttgattgctg gaggtaatat agagagcaaa     540
ttggaaggta aagtggataa gaaacacttt tcagatagcc ttgaacaaac aaatcgtgaa     600
aaagatagtg aaagcagtaa tgatgacact tcatttccca gtacaccaga agctgtaaga     660
ggtggttccg gagcgtacat cacgtgtgct ccctttaacc caacaactga gaatgtttca     720
acaaacattt ttcccttgtt ggaagatcat acttcggaaa ataagacaga tgaaaaaaag     780
atagaaaaaa aaaggcacaa attgtaacag agaagaatgc aagtgtcaag acatcaaacc     840
ctttccttat ggcagcacag gagtctaaga cagattacgt tacaacagat catgtgtcaa     900
aggtgaccga ggaagtagtg gcaaacatgc ctgaaggtct aaccccagat ttggttcagg     960
aagcatgtga aagtgaattg aatgaagcta ctggtacaaa aattgccttt gaaacaaaaa    1020
tggacctggt tcaaacttca gaagctgtgc aggagtcact ttaccctgta acacagcttt    1080
gcccatcttt tgaagaatct gaagctactc cgtcaccggt tttgcctgac attgtcatgg    1140
aagcaccatt aaattctgta gttcctagtg ctggtgcttc tgcagtgcag ctcagttcat    1200
caccattaga aactcttcct tcagttaatt atgaaagcat aaagtttgag cctgaaaatc    1260
ccccaccata tgaggaggcc atgaatgtat cactaaaaaa agaatcagga atgaatgaag    1320
aaatcacaga gcctgaaggt attagtgtag ctgttcagga aacagaagct ccttatatat    1380
ctattgcatg tgatttaatt aaagaaacaa agatctctac tgaaccgact ccagatttct    1440
ctagttattc agaaatagca gaagttgcac agccagtgcc cgagcattct gagctagttg    1500
aagattcctc ccccgattct gaaccagttg acttatttag tgatgattca atacccgaag    1560
ttccacaaaa acaagatgaa gctgtaatac ttgtgaaaga aaacctcact gaaatttcat    1620
ctgagtcaat gacaggacat gacaataagg gaaaactcag tgcttcacca tcacctgagg    1680
gaggaaaacc gtatttggag tcttttcagc ccagtttagg catcacaaaa gataccttag    1740
cacctgatga agtttcagca ttgacccaaa aggagaaaat ccctttgcag atggaggagc    1800
tcaatactgc agtttattca agtgatggct tattcattgc tcaggaagca aacctaagag    1860
aaagtgaaac attttcagat tcatctccga ttgagattat agatgagttc ccgacctttg    1920
tcagttctaa agcagattct tctcctacat tagccaggga atacactgac ctagaagtag    1980
cccacaaaag tgaaattgct gacatccagg atggagctgg gtcattggct tgtgcaggat    2040
tgccccatga cctttctttc aagagtatac aacctaaaga ggaagttcat gtcccagatg    2100
agttctccaa agataggggt gatgtttcaa aggtgcccgt actgcctcca gatgtttctg    2160
ctttggatgc tcaagcagag ataggcagca tagaaaaacc caaagttctt gtgaaagaag    2220
ccgagagaaa acttccttct gatacagaaa aagagcgaag atctccatct gctatatttt    2280
cagcagagct gagtaaaact tcagttgttg acctcctcta ctggagagac attaagaaga    2340
ctggagtggt gtttggtgcc agcttgttcc tgctgctctc gctgacagta ttcagcattg    2400
tgagtgtaac ggcctacatt gccttggccc tgctctctgt gactatcagc tttaggatat    2460
ataagggtgt gatccaggct atccagaaat ctgatgaagg ccacccattc agggcatatt    2520
tggaatctga agttgctata tctgaggagt tggttcagaa gtacagcaat tctgctcttg    2580
gtcatgttaa ctgcacaata aaagaactca gacgcctctt cttagttgat gatttagttg    2640
attctctgaa gtttgcagtg ttgatgtggg tatttaccta tgttggtgcc ttgttcaatg    2700
gtctgacact actaattttg gctctgattt cactcttcag tgttcctgtt atttatgaac    2760
ggcatcaggc gcaaatagat cattatctgg gacttgcaaa taagaatgtt aaagatgcta    2820
tggctaaaat ccaagcaaaa atccctggat tgaagcgtaa agctgaatga gaaagcctga    2880
aagagttaac aatagaggag tttatcttta aaggggatat tcatttgatt ccattgggga    2940
gggtcaggga agaacaaagc cttgacattg cagtgcagtt tcacagatct ttatttttag    3000
caacgcagtg tctgaggaaa aatgacctgt cttgactgcc ctgtgttcat catcttaagt    3060
attgtaagct gctatgtatg gatttaaatc gtaatcatat ttgtttttcc tgtatgaggc    3120
actggtgaat aaacaaagat ctgagaaagc tgtatattac actttgtcgc aggtagtctt    3180
gctgtatttg gggaattgca aagaaagtgg agctgacaga aataaccctt ttcacagttt    3240
gtgcactgtg tacggtctgt gtaggttgat gcagattttc tgaaatgaaa tgtttagacg    3300
agatcatgcc accaaggcag gagtgaaaaa gcttgccttt cctggtatgt tctaggtgta    3360
ttgtgaaatt tactgttgta ttaattgcca atataagtaa atatagatta tatatatcta    3420
tatatagtgt ttcacgaagc ttagcccttt accttcccag ctgccccaca gtgcttgata    3480
cttctgtcat gggttttatg tgtgtagtcc caaagcacat aagctaggga gaaacgtact    3540
tctaggcgca ctaccatctg ttttcaacac gaaccgacgc catgcaaaca gaactcctca    3600
acataaactt cactgcacag acttactgta gttaatttta tcacaaactc tggactgaat    3660
ctaatgcttc caaaaatgtt tgcaaatatc aaacattgtt atgtaagaaa atataaatga    3720
cgatttatac aattgtggtt taagctgtat tgaactaaat ctgtggaatg cattgtgaac    3780
tgtaaaagca aagtatcaat aaagcttata gacttaaaaa aaaaaaaaaa aaa           3833
SEQ ID NO.29
<211>1178
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>VARIANT
<222>(1)...(1178)at all Xaa position
<223>Xaa＝any amino acid
<400>29
Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro
 1               5                  10                  15
Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu
            20                  25                  30
Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp
        35                  40                  45
Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser
    50                  55                  60
Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp
65                  70                  75                  80
Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala
                85                  90                  95
Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro ger Trp Asp Pro Ser Pro
            100                 105                 110
Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val
        115                 120                 125
Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro
    130                 135                 140
Pro Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr
145                 150                 155                 160
Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro
                165                 170                 175
Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ala Val Val Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Ile
            180                 185                 190
Met Asp Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn ThrIle Ser Ala Gly Gln Glu
        195                 200                 205
Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Xaa Pro Ser Leu
    210                 215                 220
Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His Glu Tyr Leu Gly Asn
225                 230                 235                 240
Leu Ser Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu Gln Glu Asn Val Ser
                245                 250                 255
Glu Ala Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys Thr Leu Leu Ile Asp
            260                 265                 270
Arg Asp Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met Gly Ser
        275                 280                 285
Ser Phe Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala Val Ile Val Ala Asn
    290                 295                 300
Pro Arg Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp Glu Glu Glu Lys Leu
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Asn Ile Leu His Xaa Gln Gln Glu Leu Pro Thr Ala Leu
                325                 330                 335
Thr Lys Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser Ser Glu Lys Ala Lys
            340                 345                 350
Asp Ser Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu Ala Pro Met Arg Glu
        355                 360                 365
Glu Tyr Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val Trp Glu Val Lys Asp
    370                 375                 380
Ser Lys Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly Gly Lys Ile Glu Ser
385                 390                 395                 400
Asn Leu Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe Ala Asp Ser Leu Glu
                405                 410                 415
Gln Thr Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser Asn Asp Asp Thr Ser
            420                 425                 430
Phe Pro Ser Thr Pro Glu Gly Ile Lys Asp Arg Ser Gly Ala TyrIle
        435                 440                 445
Thr Cys Ala Pro Phe Asn Pro Ala Ala Thr Glu Ser Ile Ala Thr Asn
    450                 455                 460
Ile Phe Pro Leu Leu Glu Asp Pro Thr Ser Glu Asn Xaa Thr Asp Glu
465                 470                 475                 480
Lys Lys Ile Glu Glu Lys Lys Ala Gln Ile Val Thr Glu Lys Asn Thr
                485                 490                 495
Ser Thr Lys Thr Ser Asn Pro Phe Phe Val Ala Ala Gln Asp Ser Glu
            500                 505                 510
Thr Asp Tyr Val Thr Thr Asp Asn Leu Thr Lys Val Thr Glu Glu Val
        515                 520                 525
Val Ala Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala
    530                 535                 540
Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Val Thr Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu
545                 550                 555                 560
Thr Lys Met Asp Leu Val Gln Thr Ser Glu Val Met Gln Glu Ser Leu
                565                 570                 575
Tyr Pro Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr
            580                 585                 590
Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser
        595                 600                 605
Ala Val Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln Pro Ser Ser Ser Pro
    610                 615                 620
Leu Glu Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu
625                 630                 635                 640
Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val Ser Leu Lys Val Ser
                645                 650                 655
Gly Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu
            660                 665                 670
Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys
        675                 680                 685
Glu Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser
    690                 695                 700
Glu Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val
705                 710                 715                 720
Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp
                725                 730                 735
Ser Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp Glu Thr Val Met Leu Val
            740                 745                 750
Lys Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu Ser MetIle Glu Tyr Glu
        755                 760                 765
Asn Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly Gly Lys Pro Tyr
    770                 775                 780
Leu Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn Thr Lys Asp Thr Leu Leu
785                 790                 795                 800
Pro Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys Glu Lys Ile Pro Leu Gln
                805                 810                 815
Met Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser Asn Asp Asp Leu Phe Ile
            820                 825                 830
Ser Lys Glu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Glu Thr Phe Ser Asp Ser Ser
        835                 840                 845
Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Leu Ile Ser Ser Lys Thr
    850                 855                 860
Asp Ser Phe Ser Lys Leu Ala Arg Glu Tyr Thr Asp Leu Glu Val  Ser
865                 870                 875                 880
His Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ala Pro Asp Gly Ala Gly Ser Leu Pro
                885                 890                 895
Cys Thr Glu Leu Pro His Asp Leu Ser Leu Lys Asn Ile Gln Pro Lys
            900                 905                 910
Val Glu Glu Lys Ile Ser Phe Ser Asp Asp Phe Ser Lys Asn Gly Ser
        915                 920                 925
Ala Thr Ser Lys Val Leu Leu Leu Pro Pro Asp Val Ser Ala Leu Gly
    930                 935                 940
His Thr Gln Ala Glu Ile Glu Ser Ile Val Lys Pro Lys Val Leu Glu
945                 950                 955                 960
Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp Arg
                965                 970                 975
Ser Pro Ser Ala Ile Phe Ser Ala Asp Leu Gly Lys Thr Ser Val Val
            980                 985                 990
Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe Gly
        995                 1000                1005
Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser
    1010                1015                1020
Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser Phe
1025                1030                1035                1040
Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu Gly
                1045                1050                1055
His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu
            1060                1065                1070
Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Cys Thr
        1075                1080                1085
Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp Ser
    1090                1095                1100
Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val  Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu
1105                1110                1115                1120
Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser
                1125                1130                1135
Val Pro Val Ile Tyr Glu Arg His Gln Ala Gln Ile Asp His Tyr Leu
            1140                1145                1150
Gly Leu Ala Asn Lys Asn Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala
       1155                1160                1165
Lys Ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Glu
    1170                1175
SEQ ID NO.30
<211>1163
<212>PRT
<213>Rattus sp.
<220>
<221>VARIANT
<222>(1)...(1163)at all Xaa position
<223>Xaa＝any amino acid
<400>30
Met Glu Asp Ile Asp Gln Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser Thr Asp Ser
 1               5                  10                  15
Pro Pro Arg Pro Pro Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Thr Glu Pro
            20                  25                  30
Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp
        35                  40                  45
Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly
    50                  55                  60
Leu Ser Ala Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp
65                  70                  75                  80
Phe Ser Ser Asp Ser Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala
                85                  90                  95
Ala Pro Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Glu Arg Ser Pro
            100                 105                 110
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val Leu Pro Ser
        115                 120                 125
Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro
    130                 135                 140
Pro Ala Gly Ala  Ser Pro Leu Ala Glu Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu
                165                 170                 175
Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Pro Ser Ser Ala Glu
            180                 185                 190
Lys Ile Met Asp Leu Met Glu Gln Pro Gly Asn Thr Val Ser Ser Gly
        195                 200                 205
Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Pro Leu Ser Thr Val Ser Phe Lys Glu His Gly Tyr Leu
225                 230                 235                 240
Gly Asn Leu Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ile Glu Glu Thr
                245                 250                 255
Leu Asn Glu Ala Ser Lys Glu Leu Pro Glu Arg Ala Thr Asn Pro Phe
            260                 265                 270
Val Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met
        275                 280                 285
Gly Ser Ser Phe Lys Gly Ser ProLys Gly Glu Ser Ala Ile Leu Val
    290                 295                 300
Glu Asn Thr Lys Glu Glu Val Ile Val Arg Ser Lys Asp Lys Glu Asp
305                 310                 315                 320
Leu Val Cys Ser Ala Ala Leu His Ser Pro Gln Glu Ser Pro Val Gly
                325                 330                 335
Lys Glu Asp Arg Val Val Ser Pro Glu Lys Thr Met Asp Ile Phe Asn
            340                 345                 350
Glu Met Gln Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu Tyr Ala Asp
        355                 360                 365
Phe Lys Pro Phe Glu Gln Ala Trp Glu Val Lys Asp Thr Tyr Glu Gly
    370                 375                 380
Ser Arg Asp Val Leu Ala Ala Arg Ala Asn Val Glu Ser Lys Val Asp
385                 390                 395                 400
Arg Lys Cys Leu Glu Asp Ser Leu Glu Gln Lys Ser Leu Gly Lys Asp
                405                 410                 415
Ser Glu Gly Arg Asn Glu Asp Ala Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Pro
            420                 425                 430
Val Lys Asp Ser Ser Arg Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Ser Phe Thr Ser
        435                 440                 445
Ala Thr Glu Ser Thr Thr Ala Asn Thr Phe Pro Leu Leu Glu Asp His
    450                 455                 460
Thr Ser Glu Asn Xaa Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Arg Lys Ala
465                 470                 475                 480
Gln Ile Ile Thr Glu Lys Thr Ser Pro Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu
                485                 490                 495
Val Ala Val Gln Asp Ser Glu Ala Asp Tyr Val Thr Thr Asp Thr Leu
            500                 505                 510
Ser Lys Val Thr Glu Ala Ala Val Ser Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr
        515                 520                 525
Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Thr
    530                 535                 540
Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Val Asp Leu Val Gln Thr Ser
545                 550                 555                 560
Glu Ala Ile Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Thr Ala Gln Leu Cys Pro Ser
                565                 570                 575
Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val
            580                 585                 590
Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Leu Leu Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val
        595                 600                 605
Val Gln Pro Ser Val Ser Pro Leu Glu Ala Pro Pro Pro Val Ser Tyr
    610                 615                 620
Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala
625                 630                 635                 640
Met Asn Val Ala Leu Lys Ala Leu Gly Thr Lys Glu Gly Ile Lys Glu
                645                 650                 655
Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala Val Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile
            660                 665                 670
Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Thr Glu Pro
        675                 680                 685
Ser Pro Asp Phe Ser Asn Tyr Ser Glu rle Ala Lys Phe Glu Lys Ser
    690                 695                 700
Val Pro Glu His Ala Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Glu Ser Glu
705                 710                 715                 720
Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Glu Val Pro Gln Thr
                725                 730                 735
Gln Glu Glu Ala Val Met Leu Met Lys Glu Ser Leu Thr Glu Val Ser
            740                 745                 750
Glu Thr Val Ala Gln His Lys Glu Glu Arg Leu Ser Ala Ser Pro Gln
        755                 760                 765
Glu Leu Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gln Pro Asn Leu His Ser
    770                 775                 780
Thr Lys Asp Ala Ala Ser Asn Asp Ile Pro Thr Leu Thr Lys Lys Glu
785                 790                 795                 800
Lys Ile Ser Leu Gln Met Glu Glu Phe Asn Thr Ala Ile Tyr Ser Asn
                805                 810                 815
Asp Asp Leu Leu Ser Ser Lys Glu Asp Lys Ile Lys Glu Ser Glu Thr
            820                 825                 830
Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Phe
        835                 840                 845
Val Ser Ala Lys Asp Asp Ser Pro Lys Leu Ala Lys Glu Tyr Thr Asp
    850                 855                 860
Leu Glu Val Ser Asp Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ile Gln Ser Gly Ala
865                 870                 875                 880
Asp Ser Leu Pro Cys Leu Glu Leu Pro Cys Asp Leu Ser Phe Lys Asn
                885                 890                 895
Ile Tyr Pro Lys Asp Glu Val His Val Ser Asp Glu Phe Ser Glu Asn
            900                 905                 910
Arg Ser Ser Val Ser Lys Ala Ser Ile Ser ProSer Asn Val Ser Ala
        915                 920                 925
Leu Glu Pro Gln Thr Glu Met Gly Ser Ile Val Lys Ser Lys Ser Leu
    930                 935                 940
Thr Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp
945                 950                 955                 960
Arg Ser Leu Ser Ala Val Leu Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val
                965                 970                 975
Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe
            980                 985                 990
Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val
        995                 1000                1005
Ser Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser
    1010                1015                1020
Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu
1025                1030                1035                1040
Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu
                1045                1050                1055
Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Ser
            1060                1065                1070
Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp
        1075                1080                1085
Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr Val Gly Ala
    1090                109S                1100
Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe
1105                1110                1115                1120
Ser Ile Pro Val Ile Tyr Glu Arg His Gln Val Gln Ile Asp His Tyr
                1125                1130                1135
Leu Gly Leu Ala Asn Lys Ser Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln
            1140                1145                1150
Ala Lys Ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Asp
        1155                1160
SEQ ID NO.31
<211>1568
<212>DNA
<213>Rattus sp.
<400>31
caggcttagt ctggggaagc gggtgtttca tgtctcaggg agaattttgc agtttacagc     60
gtttctgttg gtatgcataa tttgtaattg ctgctggagg gcagatcgtg gcaagaaatg    120
gacggacaga agaaacattg gaaggacaag gttgttgacc tcctctactg gagagacatt    180
aagaagactg gagtggtgtt tggtgccagc ttattcctgc tgctgtctct gacagtgttc    240
agcattgtca gtgtaacggc ctacattgcc ttggccctgc tctcggtgac tatcagcttt    300
aggatatata agggcgtgat ccaggctatc cagaaatcag atgaaggcca cccattcagg     360
gcatatttag aatctgaagt tgctatatca gaggaattgg ttcagaaata cagtaattct     420
gctcttggtc atgtgaacag cacaataaaa gaactgaggc ggcttttctt agttgatgat     480
ttagttgatt ccctgaagtt tgcagtgttg atgtgggtgt ttacttatgt tggtgccttg     540
ttcaatggtc tgacactact gattttagct ctgatctcac tcttcagtat tcctgttatt     600
tatgaacggc atcaggtgca gatagatcat tatctaggac ttgcaaacaa gagtgttaag     660
gatgccatgg ccaaaatcca agcaaaaatc cctggattga agcgcaaagc agattgaaaa     720
agccccaaac agaagttcat ctttaaaggg gacactcact tgattacggg ggtgggaggt     780
caggggtgag cccttggtgg ccgtgcggtt tcagctcttt atttttagca gtgcactgtt     840
tgaggaaaaa ttacctgtct tgacttcctg tgtttatcat cttaagtatt gtaagctgct     900
gtgtatggat ctcattgtag tcacacttgt cttccccaat gaggcgcctg gtgaataaag     960
gactcgggga aagctgtgca ttgtatctgc tgcagggtag tctagctgta tgcagagagt    1020
tgtaaagaag gcaaatctgg gggcagggaa aacccttttc acagtgtact gtgtttggtc    1080
agtgtaaaac tgatgcagat ttttctgaaa tgaaatgttt agatgagagc atactactaa    1140
agcagagtgg aaaactctgt ctttatggtg tgttctaggt gtattgtgaa tttactgtta    1200
tattgccaat ataagtaaat atagacctaa tctatatata gtgtttcaca aagcttagat    1260
ctttaacctt gcagctgccc cacagtgctt gacctctgag tcattggtta tgcagtgtag    1320
tcccaagcac ataaactagg aagagaaatg tatttgtagg agtgctacct accacctgtt    1380
ttcaagaaaa tatagaactc caacaaaaat atagaatgtc atttcaaaga cttactgtat    1440
gtatagttaa ttttgtcaca gactctgaaa ttctatggac tgaatttcat gcttccaaat    1500
gtttgcagtt atcaaacatt gttatgcaag aaatcataaa atgaagactt ataccattgt    1560
ggtttaag                                                             1568
SEQ ID NO.32
<211>141
<212>PRT
<213>Rattus sp.
<400>32
Gln Ala Ser Gly Glu Ala Gly Val Ser Cys Leu Arg Glu Asn Phe Ala
 1               5                  10                 15
Val Tyr Ser Val Ser Val Gly Met His Asn Leu Leu Leu Leu Glu Gly
            20                  25                  30
Arg Ser Trp Gln Glu Met Asp Gly Gln Lys Lys His Trp Lys Asp Lys
        35                  40                  45
Val Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val
    50                  55                  60
Phe Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile
65                  70                  75                  80
Val Ser Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile
                85                  90                  95
Ser Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Ala Lys Ser Asp
            100                 105                 110
Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser
        115                 120                 125
Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly
    130                 135                 140
SEQ ID NO.33
<211>18
<212>PRT
<213>Bos sp.
<400>33
Ser Tyr Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu
 1               5                  10                  15
Glu Ala
SEQ ID NO.34
<211>13
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>34                                                                13
gccgccrcca tgg
SEQID NO.35
<211>248
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(248)at all n positions
<223>n＝a，c，g or t
<400>35
gagccgtcac cacagtaggt ccctcggctc agtcggccca gcccctctca gtcctcccca     60
acccccacaa ccgcccgcgc tcctgagacg cgccccggcg gcggcggcan agctgcagca    120
tcatctccac cctccagcca tggaagacct ggaccagtct cctctggtct cgtcctcgga    180
cagcccaccc cggccgcagc ccgcgttcaa gtaccagttc gtgagggagc ccgaggacga    240
ggaggaag                                                             248
SEQ ID NO.36
<211>379
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(36)at all n positions
<223>n＝a，c，g or t
<400>36
gaaaatatgg acttgaagga gcagccaggt aacactattt cggctggtca agaggatttc     60
ccatctgtcc tgcttgaaac tgctgcttct nttccttctc tgtctcctct ctcagccgct    120
tctttcaaag aacatgaata ccttggtaat ttgtcaacag tattacccac tgaaggaaca    180
cttcaagaaa atgtcagtga agcttctaaa gaggtctcag agaaggcaaa aactctactc    240
atagatagag atttaacaga gttttcagaa ttaggaatac tcagaaatgg gatcatcgtt    300
cagtgtctct ccaaaagcag aatctgccgt aaatagtagg caaatcctag gggaagaaat    360
aattcgtgga aaaataaag                                                 379
SEQ ID NO.37
<211>281
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(281)at all n positions
<223>n＝a，c，g or t
<400>37
gatagagatt taacagagtt ttcagaatta gaatactcag aaatgggatc atcgttcagt     60
gtctctccaa aagcagaatc tgccgtaata gtagcaaatc ctagggaaga aataatcgtg    120
aaaaataaag atgaagaaga gaagttagtt agtaataaca tccttcatan tcaacaagag    180
ttacctacag ctcttactaa attggttaaa gaggatgaag ttgtgtcttc agaaaaagca    240
aaagacagtt ttatgaaaga gagttgcagt ggaantcctt g                        281
SEQ ID NO.38
<211>640
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(640)at all n positions
<223>n＝a，c，g or t
<400>38
ttaaagagga tgaagttgtg tcttcagaaa aagcaaaaga cagttttaat gaaaagagag     60
ttgcagtgga agctcctatg agggaggaat atgcagactt caaaccattt gagcgagtat    120
gggaagtgaa agatagtaag gaagatagtg atatgttggc tgctggaggt aaaatcgaga    180
gcaacttgga aagtaaagtg gataaaaaat gttttgcaga tagccttgag caaactaatc    240
acgaaaaaga tagtgagagt agtaatgatg atacttcttt ccccagtacg ccagaaggta    300
taaaggatcg ttcaggagca tatatcacat gtgctccctt taacccagca gcaactgaga    360
gcattgcaac naacattttt cctttgttgg agatcctact tcagaaaatt agaccgtgaa    420
aaaaaataga agaaaagaag gccnaatgtt accgagaaga atactagcac aaanctcaac    480
cctttcttgt gcagcacagg ntctgngaca gatatgtccc acgnttatta ccaagtgctg    540
agantcttgc aacatcctga ngctgactcc gattgttccn gagctttgaa tggattgtgg    600
ttctggtcaa gttntttgan caaatggctt gtcactcgat                          640
SEQ ID NO.39
<211>346
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(346)at all n positions
<223>n＝a，c，g or t
<400>39
ctgtgcccgg ccccaccccc tgggcagatg tcccccactg ctaaggctgc tggcttcagg     60
gagggttagc ctgcaccgcc gccaccctgc ccctaagtta ttacctctcc agttcctacc    120
gtactccctg caccgtctca ctgtgtgtnt cgtgtcagta atttatatgg tgttaaaatg    180
tgtatatttt tgtatgtnac tattttnact agggctgagg ggcctgcgcc cagagctggc    240
ctcccncaac acctgctgcg cttggtaggt gtggtggcgt tatggcagcc cggctgctgc    300
ttggatgcga gnttggnctt gggccggtgc tggggggcac agttgt                   346
SEQ ID NO.40
<211>325
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>40
gtggcaaaca tgcctgaagg cctgactcca gatttagtac aggaagcatg tgaaagtgaa     60
ttgaatgaag ttactggtac aaagattgct tatgaaacaa aatggacttg gttcaaacat    120
cagaagttat gcaagagtca ctctatcctg cagcacagct ttgcccatca tttgaagagt    180
cagaagctac tccttcacca gttttgcctg acattgttat ggaagcacca ttgaattctg    240
cagttcctag tgctggtgct tccgtgatac agcccagctc atcaccatta gaggcttctt    300
cagttaatta tgaagcataa acatg                                          325
SEQ ID NO.41
<211>338
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>41
gcatgtgaaa gtgaattgaa tgaagttact ggtacaaaga ttgcttatga aacaaaaatg     60
gacttggttc aaacatcaga agttatgcaa gagtcactct atcctgcagc acagctttgc    120
ccatcatttg aagagtcaga agctactcct tcaccagttt tgcctgacat tgttatggaa    180
gcaccattga attctgcagt tcctagtgct ggtgcttccg tgatacagcc cagctcatca    240
ccattagaag cttcttcagt taattatgaa agcataaaac atgagcctga aaacccccca    300
ccatatgaag aggccatgag tgtatcacta aaaaaagt                            338
SEQ ID NO.42
<211>480
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(480)at all n positions
<223>n＝a，c，g or t
<400>42
aagactggag tggtgtttgg tgccagccta ttcctgctgc tttcattgac agtattcagc     60
attgtgagcg taacagccta cattgccttg gccctgctct ctgtgaccat cagctttagg    120
atatacaagg gtgtgatcca agctatccag aaatcagatg aaggccaccc attcagggca    180
tatctggaat ctgaagttgc tatatctgag gagttggttc agaagtacag taattctgct    240
cttggtcatg tgaactgcac gataaaggaa ctcaggcgcc tcttcttagt tgatgattta    300
gttgattctc tgaagtttgc agtgttgatg tgggtattta cctatgttgg tgccttgttt    360
aatggtctga cactactgat ttnggctctc attccactcc tncaagtgtt cctggtattt    420
ntgaacggca tcnggcacag ntagatcatt atccaggact tgcaaatagg aatgtaaaga    480
SEQ ID NO.43
<211>13
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>43
Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser
 1               5                  10
SEQ ID NO.44
<211>16
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>44
Lys Ile Met Asp Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Ile Ser Ala Gly
 1               5                  10                  15
SEQ ID NO.45
<211>19
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>45
Lys Glu Asp Glu Val Val Ser Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser Phe Asn
 1               5                  10                  15
Glu Lys Arg
SEQ ID NO.46
<211>50
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>46
Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu
 1               5                  10                  15
Ser Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu Ala
            20                  25                  30
Pro Leu Asn Ser Ala Val Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln Pro
        35                  40                  45
Ser Ser
    50
SEQ ID NO.47
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>degenerate oligonucleotides designed from the bovine NI220peptide 1 sequence
<220>
<221>modified_base
<222>(1)...(26)at all n positions
<223>n＝inosine
<400>47
tcngtnggya anacngcngg yaartc                                        26
SEQ ID NO.48
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>degenerate oligonucleotides designed from the bovine NI220peptide 1 sequence
<220>
<221>modified_base
<222>(1)...(23)at all n positions
<223>n＝inosine
<400>48
tcngtnggna gnacnggyaa ytc                                           23
SEQ ID NO.49
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>degenerate oligonucleotides designed from the bovine NI220peptide 1 sequence
<220>
<221>modified_base
<222>(1)...(25)at all n positions
<223>n＝inosine
<400>49
tcngtnggya anacngcggn agrtc                                         25
SEQ ID NO.50
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>degenerate oligonucleotides designed from the bovine NI220peptide 1 sequence
<220>
<221>modified_base
<222>(1)...(26)at all n positions
<223>n＝inosine
<400>50
tcngtnggna gnacngcngg nagrtc                                          26
SEQ ID NO.51
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>degenerate oligonucleotides designed from the bovine NI220peptide 2 sequence
<220>
<221>modified_base
<222>(1)...(26)at all n positions
<223>n＝inosine
<400>51
garathgcng anathcarga yggnga                                          26

Claims (26)

1.一种从培养细胞中纯化的重组NogoA蛋白，所述蛋白由SEQID NO：29的氨基酸序列组成。
2.权利要求1的重组蛋白，其中所述蛋白为哺乳动物蛋白。
3.权利要求1的重组蛋白，其中所述蛋白为人蛋白。
4.权利要求1的重组蛋白，其中所述蛋白由第一核酸编码，而所述第一核酸可与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列、或由SEQ ID NO：28的核苷酸序列组成的第二核酸杂交。
5.权利要求1的蛋白，其中所述蛋白未糖基化。
6.权利要求4的蛋白，其中所述蛋白与针对由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的第二蛋白的抗体结合。
7.一种分离的核酸，所述核酸包含编码SEQ ID NO：29的氨基酸序列的核苷酸序列。
8.一种分离的核酸，所述核酸由：
(a)一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码由SEQ ID NO：29的氨基酸序列组成的多肽；或
(b)(a)的核苷酸序列的互补序列。
9.一种能够与第二核酸杂交的、经分离的第一核酸，所述第二核酸由互补于编码下述的多肽的核苷酸序列的核苷酸序列组成，而所述多肽由SEQ ID NO：29的氨基酸序列组成。
10.一种可与第二核酸杂交的、经分离的第一核酸，所述第二核酸由SEQ ID NO：1的核苷酸序列、或由SEQ ID NO：28的核苷酸序列组成，并且其中所述第一核酸编码第一蛋白，所述第一蛋白能够与针对由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的第二蛋白的抗体结合。
11.一种分离的核酸，所述核酸编码下述的蛋白，所述蛋白与针对由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白的抗体结合。
12.一种分离的核酸，所述核酸包含编码权利要求1或4的蛋白的核苷酸序列，并且所述蛋白显示出权利要求1或4的蛋白的一种或多种功能活性，其中所述蛋白不是人蛋白、果蝇属(Drosophila)蛋白或秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)蛋白。
13.一种载体，所述载体包含与非天然启动子有效连接的权利要求7-12中任一项的核酸。
14.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求7-12任一项的核酸。
15.一种重组细胞，所述重组细胞是用权利要求7-12任一项的核酸转化的重组细胞。
16.权利要求15的重组细胞，所述重组细胞是原核重组细胞。
17.权利要求15的重组细胞，所述重组细胞是真核重组细胞。
18.一种生产重组蛋白的方法，所述方法包括：
(a)培养用权利要求7-12任一项的核酸转化的宿主细胞，使得所述宿主细胞表达由所述核酸编码的蛋白；并且
(b)回收所述表达的蛋白。
19.权利要求18的方法，其中在培养所述宿主细胞之前，将权利要求14的载体转化到所述宿主细胞中。
20.权利要求18的方法，其中所述重组细胞是原核重组细胞。
21.权利要求18的方法，其中所述重组细胞是真核重组细胞。
22.用作中枢神经系统肿瘤疾病治疗药物的权利要求1或4的蛋白。
23.权利要求22的蛋白，其中所述肿瘤疾病是神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、menagioma、成神经细胞瘤或成视网膜细胞瘤。
24.权利要求1或4的蛋白的用途，所述蛋白在抑制细胞增殖方面有活性，所述用途是用于生产中枢神经系统肿瘤疾病的治疗药物。
25.权利要求24的用途，其中所述肿瘤疾病是神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、menagioma、成神经细胞瘤或成视网膜细胞瘤。
26.权利要求24或25的用途，其中所述药物用于治疗人类。
CN998153486A 1998-11-06 1999-11-05 Nogo基因的核苷酸序列和蛋白序列以及基于其的方法 Expired - Fee Related CN1354755B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10744698P 1998-11-06 1998-11-06
US60/107,446 1998-11-06
PCT/US1999/026160 WO2000031235A2 (en) 1998-11-06 1999-11-05 Nucleotide and protein sequences of nogo genes and methods based thereon

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2005100700739A Division CN1721444A (zh) 1998-11-06 1999-11-05 Nogo基因的核苷酸序列和蛋白序列以及基于其的方法
CN200910175738A Division CN101684155A (zh) 1998-11-06 1999-11-05 Nogo基因的核苷酸序列和蛋白序列以及基于其的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1354755A CN1354755A (zh) 2002-06-19
CN1354755B true CN1354755B (zh) 2010-06-02

Family

ID=22316666

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2005100700739A Pending CN1721444A (zh) 1998-11-06 1999-11-05 Nogo基因的核苷酸序列和蛋白序列以及基于其的方法
CN998153486A Expired - Fee Related CN1354755B (zh) 1998-11-06 1999-11-05 Nogo基因的核苷酸序列和蛋白序列以及基于其的方法
CN200910175738A Pending CN101684155A (zh) 1998-11-06 1999-11-05 Nogo基因的核苷酸序列和蛋白序列以及基于其的方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2005100700739A Pending CN1721444A (zh) 1998-11-06 1999-11-05 Nogo基因的核苷酸序列和蛋白序列以及基于其的方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200910175738A Pending CN101684155A (zh) 1998-11-06 1999-11-05 Nogo基因的核苷酸序列和蛋白序列以及基于其的方法

Country Status (27)

Country Link
US (4) US7781188B1 (zh)
EP (3) EP2333064A1 (zh)
JP (2) JP2003531566A (zh)
KR (1) KR100728405B1 (zh)
CN (3) CN1721444A (zh)
AT (1) ATE435232T1 (zh)
AU (1) AU774367C (zh)
BR (1) BR9915137A (zh)
CA (1) CA2350395C (zh)
CY (1) CY1110679T1 (zh)
CZ (1) CZ304224B6 (zh)
DE (1) DE69941059D1 (zh)
DK (1) DK1124846T3 (zh)
ES (2) ES2529196T3 (zh)
HK (1) HK1038027A1 (zh)
HU (1) HUP0301829A3 (zh)
IL (3) IL142989A0 (zh)
MX (1) MXPA01004598A (zh)
NO (1) NO332460B1 (zh)
NZ (1) NZ511683A (zh)
PL (1) PL204293B1 (zh)
PT (1) PT1124846E (zh)
RU (3) RU2304585C2 (zh)
SK (1) SK287323B6 (zh)
TR (1) TR200700740T2 (zh)
WO (1) WO2000031235A2 (zh)
ZA (1) ZA200103714B (zh)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020072493A1 (en) * 1998-05-19 2002-06-13 Yeda Research And Development Co. Ltd. Activated T cells, nervous system-specific antigens and their uses
PT1098972E (pt) * 1998-07-22 2010-12-14 Smithkline Beecham Ltd Proteína semelhante a proteína especificamente neuroendócrina e adnc codificante
US7781188B1 (en) 1998-11-06 2010-08-24 University Of Zurich Nucleotide and protein sequences of Nogo genes and methods based thereon
US7186530B1 (en) 2000-04-07 2007-03-06 Chiron Corporation Protein associated with cell stress response
WO2000060083A1 (en) * 1999-04-08 2000-10-12 Chiron Corporation Novel protein associated with cell stress response
CZ20022438A3 (cs) * 2000-01-12 2002-10-16 Yale University Nukleová kyselina kódující receptor Nogo, izolovaný polypeptid a farmaceutický přípravek pro stimulaci růstu axonů
US7119165B2 (en) * 2000-01-12 2006-10-10 Yale University Nogo receptor-mediated blockade of axonal growth
US7049395B2 (en) 2000-05-02 2006-05-23 Yale University Anti-inflammatory compounds and uses thereof
ATE458815T1 (de) 2000-10-06 2010-03-15 Univ Yale Homologe des nogo rezeptors
GB0101312D0 (en) * 2001-01-18 2001-02-28 Glaxo Group Ltd Assay
GB0101313D0 (en) * 2001-01-18 2001-02-28 Glaxo Group Ltd Assay
AR040778A1 (es) 2002-08-06 2005-04-20 Glaxo Group Ltd Anticuerpos alterados o fragmentos funcionales que se unen a mag (glicoproteina asociada a mielina).
GB0228832D0 (en) 2002-12-10 2003-01-15 Novartis Ag Organic compound
US20060287501A1 (en) * 2002-10-31 2006-12-21 Pieris Proteolab Ag Soluble truncated polypeptides of the nogo-a protein
GB0306309D0 (en) 2003-03-19 2003-04-23 Glaxo Group Ltd Method of treatment
RS54160B1 (sr) 2003-03-19 2015-12-31 Biogen Idec Ma Inc. Protein koji se vezuje za nogo receptor
TWI329649B (en) * 2003-12-22 2010-09-01 Glaxo Group Ltd Immunoglobulins
CA2572193A1 (en) 2004-06-24 2006-01-05 Biogen Idec Ma Inc. Treatment of conditions involving oligodendrocytes with sp35 based agents
KR100659820B1 (ko) 2004-11-17 2006-12-19 삼성에스디아이 주식회사 리튬 이온 이차 전지
SG157418A1 (en) * 2004-12-01 2009-12-29 Univ Singapore Nogo a protein fragments as neuronal network- interacting peptides
WO2007008732A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Yale University Compositions and methods for suppressing axonal growth inhibition
EP2238986A3 (en) 2005-07-08 2010-11-03 Biogen Idec MA Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
WO2007014382A1 (en) * 2005-07-28 2007-02-01 Wyeth Compositions and methods of mutant nogo-66 domain proteins
KR20080073748A (ko) 2005-11-16 2008-08-11 노파르티스 아게 척수 손상에서의 항-ｎｏｇｏ-ａ 항체 치료를 위한바이오마커
GB0525662D0 (en) 2005-12-16 2006-01-25 Glaxo Group Ltd Immunoglobulins
CA2653456A1 (en) * 2006-05-24 2007-11-29 Richard Daneman Permeability of blood-brain barrier
CN101015683B (zh) * 2007-01-18 2010-07-21 复旦大学 人rtn4b蛋白在制备创伤愈合药物中的应用
BRPI0818928B1 (pt) * 2007-11-02 2021-12-07 Novartis Ag Moléculas de ligação a nogo-a isoladas, seu método de produção e seu uso, polinucleotídeo isolado, vetor e sistema de expressão, célula hospedeira isolada, e composição farmacêutica
US20090186423A1 (en) * 2007-11-22 2009-07-23 Symphogen A/S Method for Characterization of a Recombinant Polyclonal Protein
AU2009269099B2 (en) 2008-07-09 2016-03-10 Biogen Ma Inc. Compositions comprising antibodies to LINGO or fragments thereof
AU2010256880B2 (en) * 2009-06-02 2015-01-22 Opko Health, Inc. Identification of small molecules recognized by antibodies in subjects with neurodegenerative diseases
US8828390B2 (en) 2010-07-09 2014-09-09 Universitat Zurich Uses of NOGO-A inhibitors and related methods
RU2478646C1 (ru) * 2011-11-28 2013-04-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) Способ получения высокоаффинных поликлональных антител
JP2015518829A (ja) 2012-05-14 2015-07-06 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 運動ニューロンに関する状態の処置のためのｌｉｎｇｏ−２アンタゴニスト
EA032285B1 (ru) * 2013-08-08 2019-05-31 Глобал Био Терапьютикс, Инк. Прибор для инъекций с минимальным захватом и его использование
KR101685109B1 (ko) * 2014-12-22 2016-12-09 경북대학교 산학협력단 근육 분화, 재생, 또는 질환 상태와 관련된 노고-에이의 용도
CA2973266A1 (en) 2015-01-08 2016-07-14 Biogen Ma Inc. Lingo-1 antagonists and uses for treatment of demyelinating disorders
US20180015144A1 (en) * 2015-01-27 2018-01-18 Universitat Zurich Agonists of the nogo-a s1pr pathway for the treatment of glioblastoma

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5684133A (en) * 1988-11-04 1997-11-04 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Neurite growth regulatory factors, antibodies thereto, and pharmaceutical compositions

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4196265A (en) * 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
CA1173823A (en) 1980-08-26 1984-09-04 Leonard M. Hjelmeland Nondenaturing zwitterionic detergent for membrane biochemistry
EP0155433A1 (en) 1984-03-23 1985-09-25 Adriano Fontana Immunosuppressant factor
CA1341401C (en) 1984-03-23 2002-11-26 Adriano Fontana Immunosuppressant factor derived from human glioblastoma cells
EP0233838A3 (en) 1986-02-04 1990-01-31 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Neurite-promoting factor and process for the manufacture thereof
DE68927438T2 (de) 1988-06-13 1997-03-20 American Biogenetic Sciences Verfahren zur herstellung monoklonaler antikörper mit hilfe eines keimfreien tieres
US5250414A (en) 1988-11-04 1993-10-05 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Diagnostic methods using neurite growth regulatory factors
EP0396719B1 (en) 1988-11-04 1995-07-05 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Neurite growth regulatory factors
WO1993000427A2 (en) * 1991-06-24 1993-01-07 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Neurite growth regulatory factors
US5858708A (en) * 1996-08-12 1999-01-12 Bandman; Olga Polynucleotides encoding two novel human neuroendocrine-specific proteins
WO1998017687A2 (en) * 1996-10-25 1998-04-30 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
EP1042470A2 (en) * 1997-12-30 2000-10-11 Chiron Corporation Bone marrow secreted proteins and polynucleotides
US6607879B1 (en) * 1998-02-09 2003-08-19 Incyte Corporation Compositions for the detection of blood cell and immunological response gene expression
US20020072493A1 (en) * 1998-05-19 2002-06-13 Yeda Research And Development Co. Ltd. Activated T cells, nervous system-specific antigens and their uses
PT1098972E (pt) 1998-07-22 2010-12-14 Smithkline Beecham Ltd Proteína semelhante a proteína especificamente neuroendócrina e adnc codificante
EP1107978A1 (en) * 1998-08-24 2001-06-20 Alphagene, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
US7781188B1 (en) 1998-11-06 2010-08-24 University Of Zurich Nucleotide and protein sequences of Nogo genes and methods based thereon
WO2001036631A1 (en) * 1999-11-15 2001-05-25 Smithkline Beecham P.L.C. Human nogo-c polynucleotide and polypeptide and their uses
US20030134301A1 (en) * 2001-07-27 2003-07-17 Brooksbank Robert Alan Identification and use of molecules implicated in pain

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5684133A (en) * 1988-11-04 1997-11-04 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Neurite growth regulatory factors, antibodies thereto, and pharmaceutical compositions

Also Published As

Publication number Publication date
CA2350395C (en) 2014-07-08
SK6222001A3 (en) 2001-12-03
ES2529196T3 (es) 2015-02-17
CN1721444A (zh) 2006-01-18
AU1469200A (en) 2000-06-13
ES2329635T3 (es) 2009-11-27
HUP0301829A2 (hu) 2003-08-28
BR9915137A (pt) 2004-06-08
RU2009103533A (ru) 2010-11-10
NO20012223L (no) 2001-07-02
CA2350395A1 (en) 2000-06-02
CN101684155A (zh) 2010-03-31
US7781188B1 (en) 2010-08-24
ATE435232T1 (de) 2009-07-15
HUP0301829A3 (en) 2009-03-30
US20090162367A1 (en) 2009-06-25
RU2004103555A (ru) 2005-07-20
US20110086034A1 (en) 2011-04-14
WO2000031235A3 (en) 2000-11-09
EP2093294A1 (en) 2009-08-26
NZ511683A (en) 2004-06-25
KR100728405B1 (ko) 2007-06-13
RU2358982C2 (ru) 2009-06-20
EP1124846A2 (en) 2001-08-22
IL142989A0 (en) 2002-04-21
RU2304585C2 (ru) 2007-08-20
PT1124846E (pt) 2009-10-08
IL198027A (en) 2011-10-31
DK1124846T3 (da) 2009-10-26
RU2432364C2 (ru) 2011-10-27
US20050260616A1 (en) 2005-11-24
ZA200103714B (en) 2004-06-25
AU774367C (en) 2005-04-21
RU2001115705A (ru) 2004-03-10
EP1124846A4 (en) 2002-06-12
AU774367B2 (en) 2004-06-24
WO2000031235A2 (en) 2000-06-02
KR20020003353A (ko) 2002-01-12
DE69941059D1 (de) 2009-08-13
EP2333064A1 (en) 2011-06-15
PL204293B1 (pl) 2009-12-31
MXPA01004598A (es) 2002-04-24
IL142989A (en) 2010-12-30
EP1124846B1 (en) 2009-07-01
CZ20011608A3 (cs) 2001-10-17
NO332460B1 (no) 2012-09-24
CN1354755A (zh) 2002-06-19
TR200700740T2 (tr) 2007-04-24
CZ304224B6 (cs) 2014-01-15
NO20012223D0 (no) 2001-05-04
CY1110679T1 (el) 2015-06-10
US7425334B2 (en) 2008-09-16
SK287323B6 (sk) 2010-07-07
PL362990A1 (en) 2004-11-15
EP2093294B1 (en) 2014-10-29
HK1038027A1 (en) 2002-03-01
JP2012213406A (ja) 2012-11-08
JP2003531566A (ja) 2003-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1354755B (zh) Nogo基因的核苷酸序列和蛋白序列以及基于其的方法
EP0861261B9 (en) Nucleotide and protein sequences of vertebrate delta genes and methods based thereon
EP0813545B1 (en) Nucleotide and protein sequences of vertebrate serrate genes and methods based thereon
US5229500A (en) Brain derived neurotrophic factor
US5453361A (en) Method for producing biologically active human brain derived neurotrophic factor
JPH08502168A (ja) ニューロン細胞においてイオンチャンネル誘導活性をもつ栄養因子
WO1998020021A1 (en) Nucleotide and amino acid sequences of c4-2, a tumor suppressor gene, and methods of use thereof
CA2125767A1 (en) Nucleotide and protein sequences of the serrate gene and methods based thereon

Legal Events

Date Code Title Description
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C06 Publication
PB01 Publication
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: ZURICH UNIVERSITY

Free format text: FORMER OWNER: MARTIN E. SCHWAB; APPLICANT

Effective date: 20051223

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20051223

Address after: Zurich

Applicant after: Univ Zuerich

Address before: Zurich

Applicant before: Martin E. Schwab

Co-applicant before: Maio S. Chen

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20100602

Termination date: 20161105

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee