ES2529196T3 - Secuencias de nucleótidos y proteínas de genes Nogo y métodos basados en estas - Google Patents

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ES2529196T3 ES09160978.4T ES09160978T ES2529196T3 ES 2529196 T3 ES2529196 T3 ES 2529196T3 ES 09160978 T ES09160978 T ES 09160978T ES 2529196 T3 ES2529196 T3 ES 2529196T3
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Maio Su Chen
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Abstract

Un fragmento de proteína NogoA humana que consiste de (a) aminoácidos (i) 132-939, (ii) 206-501, o (iii) 501-680, de una secuencia con más de 90% de identidad sobre la longitud total de SEQ ID No: 29, o de SEQ ID No: 29, o (b) SEQ ID No: 29 que carece de los residuos de aminoácidos 132- 206 y 939-1127, pero por lo demás comprende el resto de SEQ ID No: 29.

Description

Secuencias de nucleótidos y proteínas de genes Nogo y métodos basados en estas
1.
Introducción
La presente invención se refiere al gen, Nogo, y en particular a sus productos de proteína codificada, Nogo, así como a los derivados y análogos del mismo. También se provee la producción de los anticuerpos, derivados, y proteínas Nogo. La invención se refiere además a las composiciones terapéuticas y métodos de diagnóstico y terapia.
2.
Antecedentes de la invención
En el sistema nervioso central (SNC) de los vertebrados superiores, la regeneración de los axones después de la lesión es casi ausente y la plasticidad estructural es limitada. Es probable que los inhibidores de crecimiento asociados con la mielina del SNC desempeñen un papel importante. Esto se evidencia por un anticuerpo monoclonal (mAb), IN-1, que neutraliza una potente proteína de mielina inhibidora del crecimiento de neuritas, promoviendo así la regeneración axonal de larga distancia y la mejora de la plasticidad compensatoria después de lesiones de médula espinal y de cerebro en ratas adultas.
Una serie de observaciones in vitro e in vivo han puesto de manifiesto un nuevo aspecto de la regulación del crecimiento de neuritas que es la presencia de señales y factores repulsivos e inhibidores (Keynes and Cook, 1995, Curr. Opin. Neurosci. 5:75-82). La mayoría de estas señales parecen ser proteínas o glicoproteínas. Un primer avance hacia la identificación de los factores fue la purificación y clonación de ADNc de una molécula que induce el colapso del cono de crecimiento derivado del cerebro de pollo, colapsina-1, que ahora se llama Semaforina 3A.
Un segundo grupo de señales de orientación repulsivas recientemente purificadas y clonadas se han designado como Efrinas. Son ligandos para la familia tirosina quinasa del receptor Eph. Efrina-A5 y Efrina-A2 se expresan como gradientes en el techo óptico del embrión de pollo, y su expresión ectópica o deleción causa errores de orientación de los axones retinianos que crecen hacia el interior. Al igual que las Semaforinas, la familia Efrina tiene de 15 a 20 miembros, cada uno con una expresión compleja y dinámica dentro y fuera del sistema nervioso. Las funciones de la mayoría de estas moléculas están pendientes de ser analizadas.
Un tercer grupo de señales de orientación que puede repeler el crecimiento de axones y se expresa en el desarrollo del sistema nervioso son las Netrinas. La Netrina ha sido purificada como un quimioatrayente derivado de placa de suelo para los axones comisurales en médulas espinales tempranas, al igual que su ortólogo C. elegans unc-6. La Netrina-1 resultó tener efectos repulsivos para ciertos tipos de neuronas dependiendo del tipo de receptor presente en los conos de crecimiento neuronales diana (Tessier-Lavigne et al., 1996, Science 274:1123-33).
Previamente, se presentó una potente actividad inhibidora del crecimiento de neuritas asociada con oligodendrocitos del SNC adulto y la mielina por Canoni and Schwab (1988, J. Cell Biol. 106:1281-1288). Un constituyente principal es una proteína de membrana de alto peso molecular (NI-250, con un componente más pequeño, NI-35, en ratas) que se purificó recientemente, y que se relaciona con el tema de la presente invención, y se une por medido de la neutralización mAb, IN-1 (Canoni and Schwab, 1988, J. Cell Biol. 106:1281-1288; U.S. Patent Nos. 5,684,133; 5,250,414; PCT Publication WO 93/00427).
Los inhibidores del crecimiento de neuritas asociadas con la mielina desempeñan un papel crucial en la prevención de la regeneración de los axones lesionados del SNC. Cuando el desarrollo de oligodendrocitos y la formación de la mielina se bloquean en el pollo o las ratas, se prolonga el período permisivo de regeneración tras lesiones del SNC. De hecho, la formación de la mielina coincide en el tiempo con el final del periodo de desarrollo en donde el SNC muestra una alta plasticidad estructural y un alto potencial de regeneración.
Es probable que NI-250 y NI-35 sean los componentes principales de la inhibición del crecimiento asociado con la mielina como se evidencia mediante la aplicación in vivo de IN-1 a ratas adultas con médula espinal lesionada lo que induce la regeneración de axones corticoespinales para largas distancias y permite la recuperación funcional de la conducta y motora especialmente en cuanto la locomoción. Experimentos similares en el nervio óptico y la vía colinérgica septo-hipocampal también demostraron la relevancia in vivo del antígeno reconocido de IN-1, NI-35/250 (Schnell and Schwab, 1990, Nature 343:269-272; Bregman et al., 1995, Nature 378:498-501).
Los sistemas de fibra no lesionada también responden a la neutralización de los inhibidores del crecimiento de neuritas mediante IN-1. Experimentos recientes han demostrado de manera concluyente que tras una lesión del tracto corticoespinal selectiva (piramidotomia), las fibras intactas germinan a través de la línea media en la médula espinal y el tronco encefálico y establecen un patrón de inervación bilateral, acompañado por una recuperación del
comportamiento casi completo de los movimientos de precisión en la presencia de IN-1 (Z’Graggen et al., 1998, J. Neuroscience 18(12):4744-4757).
El aislamiento del gen que codifica la proteína inhibidora del crecimiento de neuritas provee múltiples oportunidades para el desarrollo de productos útiles en la regeneración neuronal y en el tratamiento de diversos trastornos neurológicos, incluyendo tumor del SNC.
La cita de referencia mencionada anteriormente, no se interpretará como una admisión de que dicha referencia está disponible como técnica anterior a la presente invención.
3. Resumen de la invención
La invención provee un fragmento de proteína de NogoA humano que comprende los aminoácidos 132-939, 206501, o 501-680 de una secuencia con más de 90% de identidad sobre la longitud total de SEQ ID No: 29.
Adicionalmente se revela un ácido nucleico aislado que codifica el fragmento de proteína de la invención y un vector de clonación que comprende dicho ácido nucleico ligado operativamente a un promotor no nativo. Preferiblemente, dicho vector es un vector de expresión.
Además se revela una célula recombinante transformada con el vector de la invención. Preferiblemente, dicha célula es una célula recombinante procariota o eucariota.
Además se revela un método para producir el fragmento de proteína de la invención que comprende: (a) cultivar la célula de la invención; y (b) recuperar dicha proteína.
La invención provee además el fragmento de proteína de acuerdo con la invención para uso como un medicamento.
La invención provee además el uso del fragmento de proteína de acuerdo con la invención que es activo en la inhibición de la proliferación celular en un sujeto, para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad neoplásica del sistema nervioso central, en donde la enfermedad neoplásica es preferiblemente el glioma, glioblastoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, o retinoblastoma.
La proteína de la invención puede ser no glicosilada.
Además se revela una proteína de fusión o proteína quimérica que comprende la proteína de acuerdo con la invención como se define en cualquiera de las modalidades anteriores.
La invención provee además un ácido nucleico aislado que codifica la proteína de acuerdo con la invención como se define en cualquiera de las modalidades anteriores.
En una modalidad preferida, dicho ácido nucleico (a) es capaz de hibridar con un segundo ácido nucleico, dicho segundo ácido nucleico que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 29; (b) codifica una proteína de origen natural que une a un anticuerpo a una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 29.
En una modalidad preferida adicional, dicho ácido nucleico codifica una proteína humana de origen natural.
Además se revela un vector de clonación que comprende el ácido nucleico como se define en este documento ligado operativamente a un promotor no nativo. Preferiblemente, dicho vector es un vector de expresión
Además se revela una célula recombinante transformada con el ácido nucleico de SEQ ID No:1 o con el vector de la invención como se define por las modalidades anteriores. En una modalidad preferida, dicha célula recombinante es una célula recombinante procariota o eucariota.
Además se revela un método para producir la proteína de la invención como se define en cualquiera de las modalidades anteriores que comprende: (a) cultivar la célula de la invención como se define por las modalidades anteriores; y (b) recuperar dicha proteína. La invención provee además la proteína de la invención como se define en las modalidades anteriores para uso como un medicamento.
La invención provee además el uso de la proteína de la invención como se define en las modalidades anteriores, dicha proteína que es activa en la inhibición de la proliferación celular en un sujeto, para la fabricación de un
medicamento para tratar una enfermedad neoplásica del sistema nervioso central. Preferiblemente, el sujeto es humano.
En una modalidad preferida, la enfermedad neoplásica es el glioma, glioblastoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, o retinoblastoma. Preferiblemente, el sujeto es humano.
Además se revela el uso de una ribozima o un ácido nucleico antisentido de acuerdo con la invención como se define por las modalidades anteriores, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de daños en el centrum nervioso central, para inducir la regeneración de las neuronas de germinación, o para la promoción de la plasticidad del sistema nervioso central. Preferiblemente, el sujeto es humano.
Además se revela un anticuerpo monoclonal, en donde el anticuerpo monoclonal se une inmunoespecíficamente a la proteína de acuerdo con la invención como se define por las modalidades anteriores:
Además se revela un método de obtención de anticuerpos policlonales para la proteína de acuerdo con la invención como se define por las modalidades anteriores que comprenden:
(a)
administrar a un animal no humano una cantidad inmunogénica de una proteína de acuerdo con la invención como se define por las modalidades anteriores;
(b)
recuperar dichos anticuerpos policlonales a partir de dicho animal no humano.
Además se revela una muestra de antisuero aislado que comprende los anticuerpos policlonales producidos de acuerdo con dicho método, que se unen inmunoespecíficamente a la SEQ ID No: 29.
El anticuerpo o antisuero de acuerdo con la invención como se define por las modalidades anteriores, es preferiblemente un anticuerpo terapéutico o antisuero. Más preferiblemente, dicho anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo de cadena única.
Además se revela el anticuerpo de la invención o el antisuero de la invención para uso como un medicamento.
Además se revela el uso del anticuerpo o el antisuero de acuerdo con la invención como se define por las modalidades anteriores para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del daño al sistema nervioso central, para inducir la regeneración de las neuronas de germinación, o para promover la plasticidad del sistema nervioso central. Preferiblemente, el sujeto es humano.
La invención provee además un método de obtención de anticuerpos monoclonales para la proteína de acuerdo con la invención como se define por las modalidades anteriores, dicho método que comprende:
(a)
administrar a un animal no humano una cantidad inmunogénica de una proteína de acuerdo con la invención como se define por las modalidades anteriores;
(b)
producción de moléculas de anticuerpo monoclonal por líneas celulares continuas a partir de dicho animal no humano en cultivo;
(c)
recuperar dichos anticuerpos monoclonales a partir del cultivo.
La presente invención se relaciona con secuencias de nucleótidos de genes Nogo (Nogo humanos, de rata y bovino y homólogos de Nogo de otras especies), y secuencias de aminoácidos de sus proteínas codificadas, así como derivados (por ejemplo, fragmentos) y análogos de los mismos. También se proveen ácidos nucleicos hibridables o complementarios a las anteriores secuencias de nucleótidos. En una modalidad específica, la proteína Nogo es una proteína de rata, de bovino o humana.
La invención también se refiere a un método de identificación de genes que interactúan con Nogo.
Nogo es un gen proporcionado por la presente invención, identificado por el método de la invención, que tanto codifica como interactúa con las proteínas reguladoras de crecimiento neural
La invención también se refiere a derivados y análogos de Nogo de la invención que son funcionalmente activos, i. e., que son capaces de mostrar una o más actividades funcionales conocidas asociadas con una proteína Nogo de origen natural. Por ejemplo, se ha identificado una importante región inhibidora entre los aminoácidos 542 a 722. Tales actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, inhibición del crecimiento de neuritas de células
neurales, propagación y migración de fibroblastos, o cualquier célula que muestra crecimiento neoplásico, la capacidad de interactuar con o competir por la interacción con proteínas reguladoras de crecimiento neural, antigenicidad que tiene la capacidad de unirse (o competir con Nogo por el enlace) a un anticuerpo anti-Nogo, la inmunogenicidad que es la capacidad para generar anticuerpos que se unen a Nogo. Estos anticuerpos que tienen el potencial de inducir la excrecencia de neuritas o prevenir el colapso del cono de crecimiento de los ganglios de la raíz dorsal mediante la inhibición de la función de Nogo, y fragmentos funcionales o derivados de Nogo, con la capacidad de inhibir el crecimiento de neuritas.
Se revelan además los fragmentos (y derivados y análogos de los mismos) de Nogo que comprenden uno o más dominios de una proteína Nogo tal como el amino terminal rico en prolina y ácido (por ejemplo, en los aminoácidos 31-58 de SEQ ID No: 2), el carboxi terminal altamente conservado, y dos tramos hidrófobos de 35 y 36 aminoácidos de longitud en Nogo de rata, también en el extremo carboxi (por ejemplo, en los aminoácidos 988 a 1023, y en 1090 a 1125 de SEQ ID No: 2) .
Adicionalmente, se proveen los anticuerpos para los distintos Nogo, y derivados y análogos de Nogo. En particular, a modo de ejemplo, dos anticuerpos han sido derivados, el primer anticuerpo, denominado AS 472, se derivó utilizando como inmunógeno un péptido sintético correspondiente a los aminoácidos 623 a 640 de SEQ ID No: 2, y el segundo anticuerpo, denominado AS Bruna, se generó contra, el extremo carboxi, los aminoácidos 762 a 1163 de SEQ ID No: 2, de Nogo.
También se proveen, los métodos de producción de las proteínas, los derivados y análogos de Nogo, por ejemplo, por medios recombinantes.
La presente invención también se refiere a métodos terapéuticos y de diagnóstico y composiciones basadas en proteínas y ácidos nucleicos de Nogo. Los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a proteínas Nogo y análogos y derivados (incluyendo fragmentos) del mismo; anticuerpos de los mismos; ácidos nucleicos que codifican las proteínas Nogo, análogos, o derivados;
La presente invención también se refiere a métodos terapéuticos y de diagnóstico y composiciones basadas en proteínas Nogo y ácidos nucleicos y anticuerpos anti-Nogo. La invención provee el tratamiento del SNC y tumores derivados neuronales mediante la administración de los compuestos que promueven la actividad de Nogo (por ejemplo, proteínas Nogo y análogos y derivados funcionalmente activos, incluyendo fragmentos de los mismos, ácidos nucleicos que codifican las proteínas Nogo, análogos, o derivados, agonistas de Nogo).
La invención también provee el tratamiento de enfermedades, trastornos o daños que en última instancia resultan en daños del sistema nervioso; tales enfermedades, trastornos o daños incluyen, pero no se limitan a, el trauma de sistema nervioso central (SNC), (por ejemplo, médula espinal o lesiones del cerebro), infarto, infección, malignidad, exposición a agentes tóxicos, deficiencia nutricional, síndromes paraneoplásicos, y enfermedades nerviosas degenerativas (incluyendo pero no limitando a la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, Corea de Huntington, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, y parálisis supra-nuclear progresiva); mediante la administración de compuestos que interfieren con la actividad de Nogo (por ejemplo, un derivado de Nogo negativo dominante; anticuerpos para Nogo; ácidos nucleicos antisentido de Nogo; ribozimas de Nogo o grupos químicos que unen un sitio activo de Nogo).
Los modelos animales, métodos de diagnóstico y los métodos de selección para la predisposición a los trastornos y los métodos para identificar y evaluar los agonistas y antagonistas de Nogo, también son proporcionados por la invención.
3.1
Definiciones
Como se usa en este documento, el nombre de un gen que se subraya o pone en cursiva deberá indicar el gen, en contraste con su producto proteico codificado que se indica por el nombre del gen en ausencia de cualquier subrayado o puesto en cursiva. Por ejemplo, "Nogo" significará el gen Nogo, mientras que "Nogo" indicará el producto proteico del gen Nogo.
4.
Descripion de las figuras
Figura 1a-1b: (a) clones de ADNc de Nogo: CWP1-3 es un clon de ADNc bovino aislado a partir de la selección de una biblioteca de ADNc de la sustancia blanca de la médula espinal de bovino con oligonucleótidos degenerados MSC5-8 (mezcla) y MSC9. El ARN complementario derivado de este clon se utilizó para la posterior selección de biblioteca de ADNc de rata. Oli3 y Oli18 están aislados de una biblioteca de oligodendrocitos de rata oligo d(T)imprimados. R1-3U21, RO18U1 y R018U37-3 están aislados de una biblioteca médula espinal/tallo cerebral de rata imprimada con hexanucleótidos (Stratagene). Las posiciones de las 6 secuencias de péptidos NI220 (bNI220) de bovino se indican en CWP1-3 y R13U21. Las secuencias en las uniones de los diferentes exones de se marcan en
la parte superior de cada clon. Los signos de interrogación señalados en RO18U1 identifican la secuencia en este clon que no coincide con las secuencias de otros clones de Nogo. RO18U37-3 se secuenció sólo desde el extremo 5', y la porción sin secuenciar está representada por puntos. (b) Las representaciones esquemáticas que demuestran el mecanismo hipotético para la generación de tres transcritos de Nogo. P1 y P2 representan la ubicación putativa de los promotores alternativos. Se requiere un número mínimo de tres exones para generar los tres transcritos como se muestra esquemáticamente, aunque cada exón potencialmente podría dividirse en múltiples exones.
Figura 2a-2b: (a) Secuencias de nucleótidos (SEQ ID No: 1) y aminoácidos (SEQ ID No: 2) del transcrito de Nogo A (secuencia generada conectando las secuencias de ADNc de RO18U37-3, Oli18, y R1-3U21). Caja ovalada: codón de iniciación presunto; subrayado con puntos: tramo ácido; � : sitios potenciales de PKC; ∆: sitios potenciales de caseína quinasa II; subrayado grueso: regiones hidrofóbas carboxi terminal y dominios transmembrana potenciales; subrayado delgado: potenciales sitios de N-glicosilación. (b) Comparación de secuencias peptídicas entre NI220 de bovino purificada, secuenciada (bNI220; SEQ ID NOS: 3-8) y las secuencias correspondientes de bovino (SEQ ID NOS: 9-14) y de rata (SEQ ID NOS: 15-20) traducidas de ADNc de rata y bovino. Las secuencias de aminoácidos de bovino y rata, que no coinciden con las secuencias de péptidos bNI220, están en minúsculas.
La figura 3a-3b: (a) comparación de secuencias de aminoácidos de las regiones comunes de 180 aminoácidos carboxi terminal de NSP (humana; SEQ ID No: 21), S-REX (rata) (SEQ ID No: 22), CHS-REX (pollo; SEQ ID No: 23), NOGOBOV (bovino; SEQ ID No: 24), NOGORAT (rata; SEQ ID No: 25), un clon C. elegans EST (WO6A7A; SEQ ID No: 26), y un clon D. melanogaster EST (US51048; SEQ ID No: 27). (b) La conservación evolutiva de las dos regiones hidrófobas. Se muestran porcentajes de similitud dentro y a través de las especies de las regiones hidrófobas comunes. Letras sombreadas: aminoácidos conservados.
La Figura 4a-4c: (a) hibridación Northern de varios tejidos con la sonda común de Nogo. La sonda común contiene una secuencia del transcrito A entre los nucleótidos 2583-4678. ON, nervio óptico; SC, médula espinal; C, corteza cerebral; DRG, ganglios de la raíz dorsal; SN, nervio ciático; PC12, línea celular PC12. (b) Hibridación Northern de la médula espinal y ARNs de las células PC12 con una sonda específica del exón 1 (panel izquierdo) y ARNs de cerebro posterior (HB) y del músculo esquelético (M) con una sonda específica del exón 2 (panel derecho). (c) hibridación Northern con la sonda común de Nogo. K, riñón; B, cartílago (del esternón); Sk, piel; M, músculo esquelético; Lu, pulmón; Li, hígado; Sp, bazo. Los tres principales transcritos están marcados (4.6 kilobases (kb), 2.6 kb y 1.7 kb). ∆: una difusa pero consistente mano alrededor de 1.3 kb de tamaño.
Figura 5a-5f: Hibridación in situ de secciones de cerebelo y médula espinal de rata adulta. (a, d) Filas de oligodendrocitos (OL) en la médula espinal y la sustancia blanca del cerebelo, respectivamente, se pueden ver etiquetados por la ribosonda "común" antisentido de Nogo. Esto es muy similar a las señales detectadas cuando una sección de la médula espinal consecutiva se hibridó con una ribosonda plop antisentido (b). (c) Las neuronas de la materia gris (GM) también fueron etiquetadas por la ribosonda "común" antisentido de Nogo. WM: sustancia blanca. Campo brillante y vista fluorescente, respectivamente, de una sección cerebelo marcada doble con la ribosonda "común" antisentido de Nogo (e) y de un anticuerpo anti-GFAP (f). Las células de Purkinje (dobles puntas de flecha) están fuertemente marcadas con la sonda Nogo, mientras que los astrocitos (puntas de flecha, blanco y negro) son negativos. Unas pocas células en la capa de células granulares (Gr) también se marcan con la sonda Nogo, m: capa molecular. Barra de escala: a, b, d-f: 50 pm; c: 280 p.m.
Figura 6a-6i: Hibridación in situ de los nervios ópticos en diferentes días postnatales (a, f: P0; b, g: P3; c, h: P7; d, e,
i: P22) con ya sea sondas Nogo o plp (antisentido o sentido). (a-d) sonda antisentido Nogo; (e) sonda sentido Nogo; (g-i) sonda antisentido plp; (f) sonda sentido plp. La expresión de Nogo en precursores de oligodendrocitos se puede detectar ya en P0, mientras que la expresión de plp solo estaba empezando a ser detectable en los nervios ópticos P3 cerca al quiasma (g).
Figura 7: Ambos AS Bruna y AS 472 reconocen una proteína de la mielina de aproximadamente 200 kD. Los extractos de mielina de rata y mezcla-q de bovino se prepararon de acuerdo con Spillmann et al, 1998, J. Biol. Chem., 273(30):19283-19293. Cada uno de AS Bruna y AS 472 reconoció una banda de 200 kD así como varias bandas más bajas en la mielina bovina, que pueden ser productos de descomposición de bNI220. AS Bruna tiñe una banda de 200 kD en mielina de rata. I: AS Bruna; P: AS Bruna, suero preinmune; E: AS 472 purificado por afinidad.
Figura 8a-8i: La inmunohistoquímica en médula espinal de ratas y el cerebelo utilizando IN-1 (a-e), AS Bruna (d-f), y AS 472 (g-i), como se indica a la izquierda de cada panel. Se observó una fuerte tinción de la mielina en ambos tejidos con los tres anticuerpos cuando las secciones congeladas se fijaron con etanol/ácido acético (a, b, d, e, g, h). El tratamiento de las secciones con metanol abolió la tinción de mielina a excepción de los cuerpos celulares de oligodendrocitos (flechas: c, f, i). Puntas de flecha: células de Purkinje, WM, sustancia blanca; GM, materia gris, DR: raíz dorsal; Gr, capa granular de la célula; m, capa molecular. Barra de escala: a, d, g: 415 µm; b, c, e, f, h, i: 143 µm.
Figura 9a-9d: Actividad neutralizante de AS 472 y AS Bruna en diferentes bioensayos. (a) los fibroblastos NIH 3T3 se sembraron en placas de cultivo celular recubiertas con mezcla-q y se pretrataron con IN-1, AS Bruna, AS 472 o el suero pre-inmune correspondiente. Ambos sueros policlonales mostraron incluso una neutralización levemente mejor del sustrato inhibidor que IN-1. El suero preinmune no tuvo ningún efecto significativo sobre la propagación de las células NIH 3T3. La adición de un exceso del péptido (P472) que se utilizó para aumentar AS 472 compitió la actividad neutralizante mientras que un péptido no específico (Px) no tuvo ningún efecto. (b) Pre-tratamiento del sustrato inhibidor con AS Bruna o AS 472 resultó en excrecencia de las neuritas de DRG comparable a lo que se puede observar en un sustrato de laminina. Ejemplos para el excrecencia de las neuritas de DRG en mezcla-q pretratada con PBS (c; puntuación = 0) y pretratadas con AS Bruna (d; puntuación = 4).
Figura 10a-10d: Inyección de explantes del nervio óptico con AS 472 resulta en el crecimiento hacia el interior de los axones. (a) Pares de nervios ópticos de rata adulta fueron disectados, se inyectaron con AS 472 o suero preinmune y se colocaron en cultivos de cámara de tal manera que un extremo de los nervios estuvo en contacto con neuronas DRG de rata PO disociadas. (b) Después de dos semanas in vitro, las secciones EM de los nervios se tomaron a 3.5 mm del sitio de corte (flechas en A) y se seleccionaron sistemáticamente por axones intactos (3 experimentos). (c) los manojos de axones regenerados (flechas) crecen a través de la degeneración del nervio óptico inyectado AS
472. (d) Regeneración de axones en contacto con la mielina. Ampliación: c, 12,000x; d, 35,000x.
Figura 11a-11c: La expresión de Nogo A recombinante en células COS transfectadas. (a) transferencia Western que muestra inmunoreactividad de AS Bruna con Nogo A recombinante (carril 2) y Nogo A endógeno de oligodendrocitos de rata de cultivos primarios (carril 3). Las movilidades de estas dos proteínas son virtualmente idénticas a aproximadamente 200 kD en un 5% de gel de SDS desnaturalizante. Una muestra transfectada de la construcción LacZ control (carril 1) no mostró inmunoreactividad con AS Bruna. La misma transferencia también se sondeó con el anticuerpo anti-myc, 9E10, como se indica. La banda que reaccionó con AS Bruna también reaccionó con el anticuerpo anti-myc tag, 9E10 (carril 5), mientras que el Nogo A endógeno no (carril 6). La muestra de transfección control LacZ mostró la banda esperada a aproximadamente 118 kD (carril 4). Las células COS transfectadas transitoriamente con una construcción de Nogo A se tiñeron doblemente con AS Bruna (b) e IN-1 (c). Las células teñidas positivamente con AS Bruna también fueron positivas con IN-1.
Figura 12: La secuencia de nucleótidos (SEQ ID No: 28) del ADNc de Nogo de bovino.
Figura 13: La secuencia de aminoácidos de Nogo A de rata (SEQ ID No: 2) alineada con la secuencia de aminoácidos teórica de Nogo humano (SEQ ID No: 29). La secuencia de aminoácidos de Nogo humano se derivó de la alineación de las etiquetas de secuencias expresadas (EST) para la secuencia de Nogo de rata y la traducción de las EST humanas alineadas utilizando el Nogo de rata como una plantilla guía.
Figura 14: Secuencia del ácido nucleico de Nogo C de Rata (SEQ ID No: 31) y su secuencia correspondiente de aminoácidos (SEQ ID No: 32).
Figura 15a-15e: Nogo A está presente en la membrana plasmática de los oligodendrocitos, como se demuestra por inmunocitoquímica y biotinilación de la superficie celular de los oligodendrocitos en cultivo.
La inmunocitoquímica (a-d): Los oligodendrocitos de nervios ópticos de ratas P10 se disociaron y se cultivaron durante 2 días. La tinción de células vivas con mAb IN-1 (a) o AS 472 (c) mostró inmunoreactividad en los procesos y cuerpos de células de oligodendrocitos. En la presencia de la competencia del péptido P472, AS 472 mostró sólo el etiquetado de fondo (todos los tipos de células) (d). Se observó una tinción no específica similar cuando se omitieron los anticuerpos primarios (b). Evaluación: platos codificados por número se mezclaron al azar y se clasificaron por 3 observadores independientes. 8/10 platos se clasificaron correctamente AS 472-positivo, mAb IN1-positivo o controles por los tres observadores.
Biotinilación (e): Cultivos de cerebro entero de rata P4 enriquecido en oligodendrocitos fueron biotinilados de superficie celular con un reactivo impermeable de membrana después de siete días en cultivo. Posteriormente, los homogeneizados celulares se trataron con estreptavidina-Dynabeads. El precipitado (Ppt) y el sobrenadante (sup) fueron transferidos con AS472; estos mostraron un patrón de proteína distinto: La superficie celular de Nogo A encontrada en el precipitado mostró un peso molecular aparente mayor que el intracelular de Nogo A. Este cambio se debe probablemente a la glicosilación. La proteína ER luminal BiP y la gran mayoría de β-tubulina sólo se pudieron encontrar en la fracción intracelular.
Figura 16a-16j: Los ensayos funcionales muestran la presencia de Nogo A en la membrana celular de los oligodendrocitos. La pre-incubación de cultivos de nervio óptico con AS 472 (a, b) permitió a los fibroblastos NIH 3T3 propagarse sobre los oligodendrocitos altamente ramificados que se describen por tinción inmunofluorescente para GalC (anticuerpo 01) (a). Las flechas en la imagen de contraste de fase correspondiente (b) indican los fibroblastos NIH 3T3 que se extienden en la parte superior de los oligodendrocitos. (c, d): Cuando AS 472 se adicionó junto con P472, los fibroblastos de NIH 3T3 estrictamente evitaron los territorios de los oligodendrocitos GalC-positivos
(puntas de flecha) (Caroni and Schwab, 1988 Neuron 1:85-96). (e, f): En la presencia de AS 472, neuronas de DRG disociadas de rata P0 fueron capaces de extender las neuritas sobre el territorio de oligodendrocitos ramificados altamente (flechas en f). (g, h): El péptido P472 compitió eficientemente la actividad de neutralización de AS 472: las neuritas evitan completamente los oligodendrocitos. AS 472 utilizado en estos experimentos se generó contra la secuencia del péptido 472 de rata. (i, j): La cuantificación de estos resultados (como se describe en métodos) demostró la fuerte actividad de neutralización de AS 472 en ambos tipos de ensayos. Barra de escala: 40 µm.
Figura 17a-17e: Nogo A recombinante es un sustrato inhibidor y su actividad inhibidora se neutraliza por mAb IN-1. Los extractos enriquecidos con RecNogo A de una línea celular CHO-Nogo estable, o β-galactosidasa, aislada en paralelo a partir de la línea celular CHO-LacZ estable, se recubrieron para los ensayos de propagación del fibroblasto NIH 3T3 y excrecencia de las neuritas DRG enriquecidas. (a) Gel de plata de myc-his-etiquetado recLacZ (carril 1) y recNogo A (carril 2) muestra la banda de Nogo A 180 kD. La identidad de la banda Nogo A se confirmó por transferencia Western incubado con AS Bruna (carril 3) y un anticuerpo anti-myc 9E10 (carril 4). (b) las placas recubiertas con RecNogo A fueron claramente inhibidoras para la propagación de NIH 3T3. La pre-incubación con mAb IN-1 o AS Bruna resultó en una neutralización altamente significativa (p <0.01) de la actividad inhibidora. El control 1 gM mAb O1 y suero pre-inmune fueron ineficaces. El extracto de CHO-LacZ tuvo un efecto inhibidor parcial sobre las células NIH 3T3, probablemente debido a las proteínas CHO endógenas. Esta actividad inhibidora no fue influenciada por la pre-incubación con anticuerpos.
(c) Para los ensayos de excrecencia de neuritas DRG, el mismo material proteínico como en (b) se mezcló con laminina y se recubrió. RecNogo A tuvo un efecto inhibidor muy potente en la excrecencia de neuritas de DRG disociado en una forma dependiente de la dosis. La actividad se neutralizó por mAb IN-1 (p <0.001), pero no por el control mAb 01. El material de proteína aislado de células CHO-lacZ mAb no fue inhibidor a ninguna de las concentraciones utilizadas, ni tampoco la incubación con anticuerpos tiene ningún efecto en la excrecencia de neuritas. Ejemplos para la puntuación se muestran en (d): 1 µg de recNogo A, sin o pocas neuritas (flechas) puntuación: 2, y en (e): 1 µg de CHOLacZ, de neuritas ramificadas, largas, (puntas de flecha) puntuación: 5-6. El análisis estadístico se realizó con la prueba t de Student de dos colas. Barra de escala: 280 µm.
Figura 18: Análisis funcional de los mutantes de deleción de Nogo. Se generaron las siguientes construcciones de deleción codificantes de las proteínas de fusión que contienen fragmentos de Nogo o porciones truncadas de Nogo (que se enumeran más abajo) como se describe a continuación en la Sección 6.2.7.
Nogo-A: His-tag/T7-tag/vector/Nogo-A seq. aal-1162
Nogo-B: His-tag/T7-tag/vector/Nogo-A seq. aa1-171 + 975-1162
Nogo-C: His-tag/T7-tag/Nogo-C N-terminal (11 aa) + Nogo-A seq. aa 975-1162
NiAext: His-tag/T7-tag/vector/Nogo-A seq. aa1-974/T7-tag
NiR: His-tag/T7-tag/vector/Nogo-A seq. aa1 -171/vector
NiG: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-974/His-tag
EST: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 760-1162
NiG-D1: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa172-908/vector
NiG-D2: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-866/His-tag
NiG-D3: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-723/His-tag
NiG-D4: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-646/vector
NiG-D5: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 291-646/His-tag
NiG-D7: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-234 + 292-974/His-tag
NiG-D8: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-628
NiG-D9: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-259 + 646-974/His-tag
NiG-D10: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 291-974/His-tag
NiG-D14: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-259
NiG-D15: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-189 + 491-974/His-tag
NiG-D16: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-189 + 619-974/His-tag
NiG-D17: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-189 + 257-974/His-tag
NiG-D18: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-189 + 261-974/His-tag
NiG-D20: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 542-722/His-tag
Los números de aminoácidos (aa) se basan en la numeración de secuencia de aminoácidos de Nogo A de rata (SEQ ID No: 2), comenzando con la primera metionina. Las His-tag y T7-tag comprenden 34 aminoácidos. Las secuencias de vectores N-y C-terminal se derivan del vector de expresión pET28.
5. Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a secuencias de nucleótidos de genes Nogo, y secuencias de aminoácidos de sus proteínas codificadas. La invención se refiere además a fragmentos y otros derivados, y análogos, de las proteínas Nogo. Los ácidos nucleicos que codifican tales fragmentos o derivados también están dentro del alcance de la invención. La invención provee genes Nogo y sus proteínas codificadas de muchas especies diferentes. Los genes Nogo de la invención incluyen Nogo humano, de rata y de bovino y genes relacionados (homólogos) en otras especies. Las subsecuencias de bovino reveladas en Spillman et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:19283-19293, no se reivindican como parte de la presente invención. En modalidades específicas, los genes Nogo y proteínas son de vertebrados, o más particularmente, mamíferos. En una modalidad preferida de la invención, los genes Nogo y proteínas son de origen humano. Se provee, la producción de las proteínas y derivados anteriores, por ejemplo, mediante métodos recombinantes.
El gen Nogo como se revela en el presente documento, abarca moléculas de ácido nucleico que codifican tres isoformas de Nogo; a saber Nogo A, Nogo B y Nogo C. La referencia al gen "Nogo" deberá incluir las moléculas de ácido nucleico que codifican las tres isoformas a menos que se especifique de otra manera. Del mismo modo, la referencia a la proteína Nogo deberá incluir las tres isoformas de Nogo a menos que se especifique de otra manera. Las proteínas Nogo de la invención pueden prevenir la regeneración de neuronas en la médula espinal o el cerebro (i.e., propiedades del sustrato no permisivas), inhiben excrecencia de neuritas de ganglios de la raíz dorsal, inducen el colapso del cono de crecimiento de los ganglios de la raíz dorsal, bloquean la propagación de las células NIH 3T3, bloquean la excrecencia de neuritas PC12, etc.
Las proteínas Nogo, fragmentos y derivados de las mismas están libres de todo el material de la mielina del sistema nervioso central; en particular, son libres de todo el material de mielina del sistema nervioso central con el cual la proteína Nogo se asocia naturalmente. Tal material puede incluir otras proteínas, lípidos y carbohidratos de la mielina del SNC. Las proteínas Nogo, fragmentos y derivados de las mismas de la invención también están preferiblemente libres de los reactivos utilizados en la purificación de especímenes biológicos, tales como detergentes.
En una modalidad específica, la invención provee proteínas Nogo recombinantes, fragmentos y derivados de las mismas como se prepara por métodos conocidos en la técnica, tales como la expresión del gen Nogo en una célula manipulada genéticamente.
La invención también se refiere a derivados y análogos de Nogo de la invención que son funcionalmente activos, i.e., son capaces de mostrar una o más conocidas actividades funcionales, asociadas con una proteína Nogo de longitud completa (de tipo salvaje). Tales actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a la capacidad de interactuar (o competir por el enlace) con proteínas reguladoras del crecimiento neural, antigenicidad [capacidad de unirse (o competir con Nogo por el enlace) a un anticuerpo anti-Nogo], inmunogenicidad (capacidad de generar anticuerpo que se une a Nogo), prevención de la regeneración de neuronas en la médula espinal o el cerebro, confiriendo a un sustrato la propiedad de restricción del crecimiento, propagación, y migración de las células neurales, y células neoplásicas, inhibiendo la excrecencia de las neuritas de ganglios de la raíz dorsal, induciendo el colapso del cono
de crecimiento de ganglios de raíz dorsal, el bloqueo de propagación de las células NIH 3T3 in vitro, bloqueando excrecencia de neuritas PC12, la restricción de la plasticidad neuronal, etc.
La invención se refiere además a fragmentos (y derivados y análogos de los mismos) de Nogo que comprenden uno
o más dominios de la proteína Nogo.
Los anticuerpos para Nogo, sus derivados y análogos, se proveen adicionalmente.
La presente invención también se refiere a métodos terapéuticos y de diagnóstico y composiciones basadas en proteínas y ácidos nucleicos Nogo y anticuerpos anti-Nogo. La invención provee el tratamiento de trastornos de crecimiento de células u órganos regulados mediante la administración de compuestos que promueven la actividad de Nogo (por ejemplo, proteínas Nogo y análogos activos funcionalmente y derivados (incluyendo fragmentos) de los mismos, ácidos nucleicos que codifican las proteínas Nogo, análogos, o derivados, agonistas de Nogo).
La invención también revela métodos de tratamiento del daño o trastorno del sistema nervioso mediante la administración de compuestos que antagonizan, o inhiben, la función Nogo (por ejemplo, anticuerpos, ácidos nucleicos antisentido Nogo, derivados de antagonistas Nogo).
También se revelan los modelos animales, métodos de diagnóstico y los métodos de selección para la predisposición a los trastornos
Para mayor claridad de la descripción, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las subsecciones que siguen.
5.1 Aislamiento de genes Nogo
La invención se refiere a las secuencias de nucleótidos de ácidos nucleicos o genes Nogo. En un aspecto, los ácidos nucleicos Nogo comprenden la secuencia de ADNc de rata de la Figura 2a (SEQ ID No: 1) identificada como Nogo A como se representa en la figura 1b, o las regiones codificantes de los mismos, o secuencias de nucleótidos que codifican una proteína Nogo de 1163 aminoácidos de longitud o cualquier fragmento funcional del derivado de la misma (por ejemplo, una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No: 2, como se muestra en la Figura 2a).
En otra modalidad más específica, la presente invención provee las secuencias de nucleótidos que codifican Nogo humano, y fragmentos de proteínas Nogo humanas, incluyendo los equivalentes humanos para Nogo A de rata. La secuencia de ácido nucleico de Nogo humano se explica utilizando el transcrito de Nogo A de rata como una plantilla y corte y empalme junto a etiquetas de secuencias expresadas (EST) humanas para revelar una secuencia de nucleótidos continua. Las secuencias de aminoácidos de rata y bovino de Nogo también proveen información en el marco de lectura traduccional correcto de tal manera que se deduce una secuencia de aminoácidos de Nogo humano. La presente invención también provee secuencias de aminoácidos de fragmentos del gen Nogo humano.
La invención también provee ácidos nucleicos purificados que comprenden al menos 8 nucleótidos (i.e., una porción hibridizable) de una secuencia de Nogo; En otras modalidades, los ácidos nucleicos comprenden al menos 25 nucleótidos (continuos), 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 150 nucleótidos, 20 nucleótidos, 500 nucleótidos, 700 nucleótidos, o 800 nucleótidos de una secuencia de Nogo, o una secuencia codificante de Nogo de longitud completa. En otra modalidad, los ácidos nucleicos son más pequeños de 35, 200 o 500 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos pueden ser mono o bicatenarios. La invención también se refiere a ácidos nucleicos hibridables o complementarios a las secuencias anteriores. En aspectos específicos, se proveen ácidos nucleicos que comprenden una secuencia complementaria a al menos 10, 25, 50, 100, o 200 nucleótidos o la región codificante total de un gen Nogo.
En una modalidad específica, se provee un ácido nucleico que es hibridizable con un ácido nucleico de Nogo (por ejemplo, que tiene la secuencia SEQ ID No: 2; Figura 2a), o con un ácido nucleico que codifica un derivado de Nogo, bajo condiciones de baja rigurosidad. A modo de ejemplo y sin limitación, los procedimientos que usan tales condiciones de baja rigurosidad son los siguientes (véase también Shilo and Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792): Los filtros que contienen ADN se pretratan durante 6 h a 40 °C en una solución que contiene 35% de formamida, 5X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, 0,1% de PVP, 0.1% de Ficoll, 1% de BSA, y 500 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Las hibridaciones se llevan a cabo en la misma solución con las siguientes modificaciones: 0.02% de PVP, 0.02% de Ficoll, 0.2% de BSA, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón, 10% (peso/vol) de sulfato de dextrano y se usa 5-20 X 106 cpm de sonda marcada con 32P. Los filtros se incubaron en mezcla de hibridación durante 18-20 horas a 40 °C, y luego se lavaron durante 1.5 horas a 55 °C en una solución que contiene 2X SSC, Tris-HCl 25 mM (pH 7.4), EDTA 5 mM, y 0.1% de SDS. La solución de lavado se sustituye con solución fresca y se incuba un adicional de 1.5 h a 60 °C. Los filtros se secaron sobre papel absorbente y fueron expuestos a autorradiografía. Si es necesario, los filtros se lavan una tercera vez a 65-68 °C y se vuelven a exponer a la película. Otras condiciones de baja rigurosidad que pueden usarse son bien conocidos en
la técnica (por ejemplo, tal como se emplea para hibridaciones de especies cruzadas como se demuestra en el ejemplo en la Sección 6.1.1).
En otra modalidad específica, se provee un ácido nucleico que es hibridable con un ácido nucleico de Nogo bajo condiciones de alta rigurosidad. A modo de ejemplo y no de limitación, los procedimientos que usan tales condiciones de alta rigurosidad son los siguientes: La prehibridación de filtros que contienen ADN se lleva a cabo durante 8 h hasta toda la noche a 65 °C en un compuesto regulador de 6X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7.5), EDTA 1 mM, 0.02% de PVP, 0.02% de Ficoll, 0.02% de BSA, y 500 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridan durante 48 h a 65 °C en la mezcla de prehibridación que contiene 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20 X 106 cpm de sonda marcada con 32P. El lavado de los filtros se realiza a 37 °C, durante 1 h en una solución que contiene 2X SSC, 0.01% de PVP, 0.01% de Ficoll, y 0.01% de BSA. Esto se sigue por un lavado en 0.1 X SSC a 50 °C, durante 45 min antes de la autorradiografía. Otras condiciones de alta rigurosidad que pueden usarse son bien conocidas en la técnica.
En otra modalidad específica, se provee un ácido nucleico, que es hibridable con un ácido nucleico de Nogo bajo condiciones de rigurosidad moderada. Por ejemplo, pero no limitando a, los procedimientos que usan tales condiciones de rigurosidad moderada son de la siguiente manera: Los filtros que contienen ADN se pretratan durante 6 horas a 55 °C, en una solución que contiene 6X SSC, 5X solución de Denhart, 0.5% de SDS y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Las hibridaciones se llevan a cabo en la misma solución y se usa 520 X 106 cpm de sonda marcada con 32P. Los filtros se incuban en la mezcla de hibridación durante 18-20 horas a 55 °C, y después se lavaron dos veces durante 30 minutos a 60 °C en una solución que contiene 1X SSC y 0.1% de SDS. Los filtros se secaron y se expusieron a autorradiografía. Otras condiciones de rigurosidad moderada que se pueden utilizar son bien conocidas en la técnica. El lavado de los filtros se realiza a 37 °C durante 1 h, en una solución que contiene 2X SSC, 0.1% de SDS. Tales condiciones de rigurosidad son adecuadas para el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de genes Nogo en otras especies, por ejemplo, utilizando los clones de ADNc de Nogo de rata o de bovino como sonda para aislar el ADNc de Nogo humano.
Un número de etiquetas de secuencias expresadas humanas (EST) reportadas en bases de datos publicadas de secuencia de ácido nucleico muestran un alto grado de identidad de secuencia cuando se compara con segmentos de las secuencias del gen Nogo de la invención. La siguiente lista preliminar de EST humanas se identificaron y se enumeran por sus números de acceso Genbank: AA158636 (SEQ ID No:35), AA333267 (SEQ ID No:36), AA081783 (SEQ ID No:37), AA167765 (SEQ ID No:38), AA322918 (SEQ ID No:39), AA092565 (SEQ ID No:40), AA081525 (SEQ ID No:41), y AA081840 (SEQ ID No:42) utilizando la consulta de nucleótidos ENTREZ. Antes de la presente invención, ninguna de las EST identificadas anteriormente se había caracterizado con respecto a la secuencias de aminoácidos, estas EST se pueden codificar in vivo. Nada se sabe acerca de la función de las proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos predichas de las EST humanas. Adicionalmente, una EST, tal como AA158636, alineada con el extremo 5' del ADNc de Nogo de rata y otra EST, tal como AA081840, alineada con el extremo 3' del ADNc de rata, no se superponen y no se perciben como parte de la misma secuencia de ADNc humano.
Basándose en las secuencias del gen Nogo de la presente invención, se cree que estas EST humanas representan porciones del gen Nogo humano que se expresan en el tejido del cual se obtuvieron las ESTs. Por consiguiente, la presente invención abarca las moléculas de ácido nucleico que comprenden dos o más de las EST humanas identificadas anteriormente. Las EST se pueden expresar en el mismo tejido humano, o en diferentes tejidos humanos. Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden las secuencias de nucleótidos de al menos dos EST humanas que no se superponen con respecto a la otra, o que no se superponen a una tercera o más EST humanas.
Dado que las EST humanas identificadas anteriormente se identifican ahora como fragmentos del gen Nogo humano debido a la clonación de ácidos nucleicos de Nogo de bovino y de rata, se contempla que las EST humanas tienen funciones similares relativas a las otras moléculas de ácido nucleico de Nogo en varios métodos de la invención, tales como, pero sin limitarse, por ejemplo, a la expresión de polipéptidos de Nogo humano, ensayos de hibridación, y la inhibición de la expresión de Nogo como moléculas de ácido nucleico antisentido, etc.
Además, la presente invención provee e incluye la secuencia de aminoácidos pronosticada de la proteína Nogo humana, y fragmentos de la misma. Como se muestra en la Figura 13, la secuencia de aminoácidos de la proteína Nogo de rata (Figura 2a; SEQ ID No: 2) se alinea con la secuencia de aminoácidos pronosticada de la proteína Nogo humana (Figura 13; SEQ ID No: 29). Por consiguiente, la presente invención abarca proteínas Nogo humanas que comprenden la pronosticada secuencia de aminoácidos de Nogo humano, (Figura 13 y SEQ ID No: 29) o una subsecuencia de la secuencia de aminoácidos pronosticada de Nogo humano, que consiste de al menos 6 residuos de aminoácidos, o una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos pronosticadas de fragmentos de Nogo humano: MEDLDQSPLVSSS (Nogo humano, correspondiente a los aminoácidos 1-13 con la SEQ ID No: 43), KIMDLKEQPGNTISAG (Nogo humano, correspondiente a los aminoácidos 187-203 con SEQ ID No: 44), KEDEVVSSEKAKDSFNEKR (Nogo humano, correspondiente a los aminoácidos 340 -358 con la SEQ ID No: 45), QESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASVIQPSS (Nogo humano, correspondiente a los
aminoácidos 570 -619 con la SEQ ID No: 46). Nogo humano de origen natural y Nogo humano recombinante, y fragmentos de los mismos que tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente y capaz de ser unido por un anticuerpo dirigido contra una proteína Nogo están dentro del alcance de la invención.
La presente invención provee además moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína Nogo humana que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a la secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 13 (Figura 13; SEQ ID No: 29). En modalidades específicas, las moléculas de ácido nucleico que codifican fragmentos de proteína Nogo humana que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a la secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 13 (SEQ ID No: 29) también se contemplan con la condición de que tales moléculas de ácido nucleico no comprendan la secuencia de nucleótidos de las EST humanas identificadas anteriormente.
Se considera que una secuencia de aminoácidos es sustancialmente similar a la secuencia de aminoácidos pronosticada de la proteína Nogo humana cuando más del 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,
o 97% de los residuos de aminoácidos en las dos moléculas son idénticos cuando se utiliza un algoritmo informático en donde la alineación se realiza mediante un programa informático de homología conocido en la técnica, por ejemplo se utiliza una búsqueda de ordenador BLAST (Altschul et al., 1994, Nature Genet. 6:119-129).
A modo de ejemplo y no de limitación, los programas informáticos de homología útiles incluyen los siguientes: Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul et al., 1990, J. of Molec. Biol., 215:403-410, "The BLAST Algorithm; Altschul et al., 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402) un algoritmo de búsqueda heurística adaptado a la búsqueda de similitud de secuencia que atribuye la significancia utilizando los métodos estadísticos de Karlin and Altschul 1990, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 87:2264-68; 1993, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90:5873-77. Cinco programas BLAST específicos realizan las siguientes tareas:
1) El programa BLASTP compara una secuencia de consulta de aminoácidos contra una base de datos de secuencias de proteínas.
2) El programa BLASTN compara una secuencia de consulta de nucleótido contra una base de datos de secuencia de nucleótidos.
3) El programa BLASTX compara los seis marcos conceptuales de los productos de traducción de una secuencia de consulta de nucleótidos (ambas cadenas) contra una base de datos de secuencias de proteínas.
4) El programa TBLASTN compara una secuencia de consulta de proteínas contra una base de datos de secuencia de nucleótidos traducida en los seis marcos de lectura (ambas cadenas).
5) El programa TBLASTX compara las traducciones de seis marcos de una secuencia de consulta de nucleótidos contra las traducciones de seis marcos de una base de datos de secuencia de nucleótidos.
Como se entenderá por los expertos en la técnica, el programa TBLASTN es particularmente útil para identificar los ácidos nucleicos con un porcentaje de identidad deseado y el programa BLASTP es particularmente útil para identificar secuencias de aminoácidos con un porcentaje de identidad deseado.
Smith-Waterman (base de datos: European Bioinformatics Institute wwwz.ebi.ac.uk/bic_sw/) (Smith-Waterman, 1981,
J. of Molec. Biol., 147:195-197) es un algoritmo matemático riguroso para alineamientos de secuencias.
FASTA (véase Pearson et al., 1988, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 85:2444-2448) es una aproximación heurística al algoritmo Smith-Waterman. Para una discusión general del procedimiento y beneficios de los algoritmos Smith-Waterman y FASTA, BLAST, ver Nicholas et al., 1998, "A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods" (www.psc.edu) y las referencias citadas en el mismo.
Los usos de las secuencias predichas de aminoácidos de Nogo humano, o las secuencias de nucleótidos de EST humanas, incluyendo secuencias degeneradas que codifican la secuencia de aminoácidos pronosticada de Nogo humano, para aislar o identificar el gen Nogo humano, los fragmentos, mutantes de origen natural y variantes de los mismos, está dentro del alcance de la invención. Tales usos que serán conocidos por un experto en la técnica incluyen pero no se limitan al uso de la información para preparar sondas de ácido nucleico para la detección de biblioteca de ADN, amplificación de ADN, selección genética de la población humana, y para preparar péptidos sintéticos para hacer anticuerpos. La descripción detallada de algunos de estos usos se provee en el presente documento en las secciones posteriores.
Los ácidos nucleicos que codifican derivados y análogos de Nogo, proteínas y ácidos nucleicos antisentido Nogo se revelan adicionalmente. Como es fácilmente aparente, tal como se utiliza aquí, un "ácido nucleico que codifica un
fragmento o porción de una proteína Nogo" se interpretará como una referencia a un ácido nucleico que codifica sólo el fragmento recitado o porción de la proteína Nogo y no las otras porciones contiguas de la proteína Nogo como una secuencia continua. En este contexto, una porción significa uno o más aminoácidos.
También se revelan, los fragmentos de ácidos nucleicos de Nogo que comprenden regiones conservadas entre (con homología a) otros ácidos nucleicos de Nogo, de la misma o diferentes especies. Los ácidos nucleicos que codifican uno o más dominios Nogo se proveen en la Figura 2a, por ejemplo, el dominio del carboxi terminal conservado de Nogo de rata, que tiene alrededor de 180 aminoácidos, y se codifica por los últimos 540 nucleótidos de la secuencia codificante antes al codón de terminación. También se proveen, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de dos dominios hidrófobos dentro del dominio del carboxi terminal conservado, i.e., de los aminoácidos 988 a 1023, y de los aminoácidos 1090 a 1125, en Nogo A de rata. También se proveen, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del dominio amino terminal ácido de Nogo A de rata, a partir de 31 a 58 residuos.
Para realizar el análisis funcional de varias regiones de Nogo, se ha generado una serie de deleciones en el gen Nogo y clonado en un vector de expresión por técnicas de ADN recombinante y se expresa como una proteína de fusión. Se proveen los ácidos nucleicos que codifican un fragmento de una proteína Nogo, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican los residuos de aminoácidos 1-171, 172-974, 259-542, 542-722, 172-259, 722-974, o 9751162 de la SEQ ID No: 2, o combinaciones de los mismos; y los ácidos nucleicos que codifican los residuos de aminoácidos 1-131, 132-939, 206-501, 501-680, 132-206, 680-939, y 940-1127 de la SEQ ID No: 29, o combinaciones de los mismos. Algunas de las construcciones de deleción comprenden porciones truncadas de Nogo y secuencias de nucleótidos adicionales que codifican una etiqueta de hexahistidina y/o una T7-tag. Se proveen los ácidos nucleicos que codifican las proteínas truncadas Nogo que carecen de los residuos de aminoácidos 172 -259, los residuos de aminoácidos 974 -1162, o residuos de aminoácidos 172 -259 y 974 -1162, de la SEQ ID No: 2 pero de otra manera comprende el resto de la SEQ ID No: 2; o residuos de aminoácidos 132206, los residuos de aminoácidos 939 -1127, o residuos de aminoácidos 132-206 y 939-1127, de la SEQ ID No: 29 pero de otro modo comprende el resto de la SEQ ID No: 29. La estructura de construcciones de deleción ejemplares se muestra en la Figura 18. Las construcciones de deleción producen fragmentos o porción(es) truncada(s) de Nogo cuando se introducen en una célula. Las actividades biológicas de estos mutantes se probaron en varios ensayos funcionales como se describe en la Tabla 2 en la Sección 6.2.7. -
Los ejemplos específicos para la clonación de un gen Nogo, presentados como un ejemplo particular pero no a modo de limitación, a continuación:
Para la clonación de expresión (un método comúnmente conocido en la técnica), se construye una biblioteca de expresión por medio de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ARNm (por ejemplo, humano) se aísla, el ADNc se hace y une en un vector de expresión (por ejemplo, un derivado de bacteriófago) de tal manera que es capaz de ser expresado por la célula huésped en la que luego se introduce. A continuación, varios ensayos de selección se pueden utilizar para seleccionar el producto Nogo expresado. En una modalidad, los anticuerpos anti-Nogo se pueden utilizar para la selección.
En otra modalidad, se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar la secuencia deseada en una biblioteca genómica o de ADNc, antes de la selección. Los cebadores de oligonucleótidos que representan las secuencias de Nogo conocidas se pueden usar como cebadores en PCR. En un aspecto preferido, los cebadores de oligonucleótidos representan al menos parte de los segmentos conservados de Nogo de fuerte homología entre Nogo de especies diferentes. Los oligonucleótidos sintéticos se pueden utilizar como cebadores para amplificar mediante secuencias de PCR a partir de una fuente (ARN o ADN), preferiblemente una biblioteca de ADNc, de interés potencial. La PCR se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el uso de un termociclador Perkin-Elmer Cetus y Taq polimerasa (Gene Amp ™). El ADN que se amplifica puede incluir ARNm o ADNc o ADN genómico de cualquier especie eucariótica. Se puede elegir sintetizar varios cebadores degenerados diferentes, para su uso en las reacciones de PCR. También es posible variar la rigurosidad de las condiciones de hibridación utilizadas en la imprimación de las reacciones de PCR, para permitir mayores o menores grados de similitud de secuencia de nucleótidos entre la secuencia de nucleótidos de Nogo conocida y el homólogo de ácido nucleico que se está aislado. Para la hibridación cruzada entre especies, se prefieren las condiciones de baja rigurosidad. Para la hibridación de la misma especie, se prefieren condiciones moderadamente rigurosas.
Después de la amplificación exitosa de un segmento de un homólogo Nogo, este segmento se puede secuenciar y clonar molecularmente, y utilizar como una sonda para aislar un ADNc completo o clon genómico. Esto, a su vez, permitirá la determinación de la secuencia de nucleótidos completa del gen, el análisis de su expresión, y la producción de su producto proteico para el análisis funcional, como se describe infra. De esta manera, se pueden identificar los genes adicionales que codifican proteínas Nogo y análogos Nogo.
Los métodos anteriores no pretenden limitar la siguiente descripción general de métodos por los cuales, se pueden obtener los clones de Nogo.
Cualquier célula eucariota puede servir potencialmente como fuente de ácido nucleico para la clonación molecular del gen Nogo. Las secuencias de ácido nucleico que codifican Nogo se pueden aislar de vertebrados, mamíferos, humano, porcino, murino, bovino, felino, aviar, equino, canino, así como fuentes de primates adicionales, insectos, etc. El ADN se puede obtener por procedimientos estándar conocidos en la técnica a partir de ADN clonado (por ejemplo, una "biblioteca" de ADN), por síntesis química, mediante clonación de ADNc, o por la clonación de ADN genómico, o fragmentos del mismo, purificado a partir de la célula deseada. (Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II). Los clones derivados de ADN genómico pueden contener regiones de ADN de intrones y reguladoras, además de la codificación de las regiones; los clones derivados de ADNc contendrán sólo secuencias de exón. Cualquiera que sea la fuente, el gen debe ser clonado molecularmente en un vector apropiado para la propagación del gen.
En la clonación molecular del gen a partir de ADN genómico, se generan los fragmentos de ADN, algunos de los cuales codificarán el gen deseado. El ADN se puede escindir en sitios específicos utilizando diversas enzimas de restricción. Alternativamente, se puede utilizar ADNasa en presencia de manganeso para fragmentar el ADN, o el ADN se puede cortar físicamente, como por ejemplo, por sonicación. Los fragmentos de ADN lineales pueden ser separados entonces según el tamaño mediante técnicas estándar, incluyendo pero no limitando a, electroforesis en gel de agarosa y poliacrilamida y cromatografía en columna.
Una vez que los fragmentos de ADN se generan, la identificación del fragmento de ADN específico que contiene el gen deseado se puede lograr en un número de maneras. Por ejemplo, si una cantidad de una porción de un gen Nogo (de cualquier especie) o su ARN específico, o un fragmento del mismo (véase la Sección 6.1.1), está disponible y puede ser purificado y marcado, los fragmentos de ADN generados pueden ser seleccionados por hibridación de ácido nucleico con la sonda marcada (Benton, W. and Davis, R., 1977, Science 196:180; Grunstein,
M. And Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961). Aquellos fragmentos de ADN con homología sustancial a la sonda serán hibridados. También es posible identificar el fragmento apropiado por digestión(es) de enzimas de restricción y comparación de tamaños de fragmentos con los esperados según un mapa de restricción conocido si tal está disponible. Además la selección se puede llevar a cabo sobre la base de las propiedades del gen.
Alternativamente, la presencia del gen se puede detectar mediante ensayos basados en las propiedades físicas, químicas o inmunológicas de su producto expresado. Por ejemplo, los clones de ADNc o clones de ADN que seleccionan-hibridan los ARNm apropiados, se pueden seleccionar los que producen una proteína que, por ejemplo, tiene la migración electroforética similar o idéntica, comportamiento de enfoque isoeléctrico, mapas de digestión proteolítica, modificaciones posteriores a la traducción, propiedades ácidas o básicas o propiedades antigénicas como se conocen para Nogo. Los anticuerpos para Nogo son disponibles, tales como IN-1 e IN-2 (U.S. Patent 5,684,133), AS Bruna y AS 472. La preparación de AS Bruna y AS 472 se describe en la Sección 6.1.7. La proteína Nogo se puede identificar por medio del enlace del anticuerpo marcado con los clones que sintetizan Nogo supuestamente, en un procedimiento de tipo ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) o por transferencia Western de extractos de células completas o purificadas.
El gen Nogo también se puede identificar por selección de ARNm mediante la hibridación del ácido nucleico seguido por la traducción in vitro. En este procedimiento, se utilizan los fragmentos para aislar los ARNm(s) complementarios por hibridación. Tales fragmentos de ADN pueden representar ADN de Nogo disponibles, purificados de otras especies (por ejemplo, ratón, humano). El análisis de inmunoprecipitación o ensayos funcionales (por ejemplo, capacidad de agregación in vitro; unión al receptor; véase infra) de los productos de la traducción in vitro de los productos aislados de los ARNm(s) aislados identifican el ARNm y, por lo tanto, los fragmentos de ADN complementarios que contienen las secuencias deseadas. Además, los ARNm(s) específicos se pueden seleccionar por adsorción de polisomas aislados de células para anticuerpos inmovilizados específicamente dirigidos contra la proteína Nogo. Un ADNc de Nogo radiomarcado se puede sintetizar utilizando el ARNm seleccionado (de los polisomas adsorbidos) como una plantilla. El ARNm o ADNc marcado radiactivamente puede usarse entonces como una sonda para identificar los fragmentos de ADN de Nogo entre otros fragmentos de ADN genómico.
Alternativas para aislar el ADN genómico de Nogo incluyen, pero no se limitan a, sintetizar químicamente la secuencia del gen en sí mismo a partir de una secuencia conocida o fabricar el ADNc con el ARNm que codifica la proteína Nogo. Por ejemplo, el ARN para la clonación de ADNc del gen Nogo se puede aislar a partir de células que expresan Nogo. Otros métodos son posibles y dentro del alcance de la invención.
A continuación, el gen identificado y aislado se puede insertar en un vector de clonación apropiado. Se puede utilizar un gran número de sistemas vector-huésped conocidos en la técnica. Los posibles vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema vector debe ser compatible con la célula huésped usada. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, bacteriófagos tales como derivados de lambda, o plásmidos tales como pBR322 o derivados del plásmido pUC o el vector Bluescript (Stratagene). En un ejemplo específico, Nogo se clona en pcDNA3 con etiquetas de epítopo para el análisis de la expresión de proteína simplificado (Sección 6.1.10).
La inserción en un vector de clonación, por ejemplo, se puede llevar a cabo mediante la ligación del fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene extremos cohesivos complementarios. Sin embargo, si los sitios de restricción complementarios utilizados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN se pueden modificar enzimáticamente. Alternativamente, cualquier sitio deseado se puede producir ligando secuencias de nucleótidos (conectores) sobre los extremos del ADN; estos conectores ligados pueden comprender oligonucleótidos sintetizados químicamente específicos que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción. En un método alternativo, el vector escindido y el gen Nogo se puede modificar por extensión homopolimérica. Las moléculas recombinantes se pueden introducir en células huésped a través de la transformación, transfección, infección, electroporación, etc., de modo que se generan muchas copias de la secuencia del gen.
En un método alternativo, el gen deseado se puede identificar y aislar después de la inserción en un vector de clonación apropiado en un enfoque de "secuenciación aleatoria". El enriquecimiento del gen deseado, por ejemplo, mediante fraccionamiento por tamaño, se puede hacer antes de la inserción en el vector de clonación.
En modalidades específicas, la transformación de células huésped con moléculas de ADN recombinante que incorporan el gen Nogo aislado, ADNc, o secuencia de ADN sintetizada permite la generación de múltiples copias del gen. Por lo tanto, el gen se puede obtener en grandes cantidades mediante el cultivo de transformantes, el aislado de las moléculas de ADN recombinantes de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperando el gen insertado del ADN recombinante aislado.
Las secuencias de Nogo proporcionadas por la presente invención incluyen aquellas secuencias de nucleótidos que codifican sustancialmente las mismas secuencias de aminoácidos tal como se encuentra en las proteínas Nogo nativas, y aquellas secuencias de aminoácidos codificadas con aminoácidos funcionalmente equivalentes, así como aquellas que codifican otros análogos o derivados de Nogo, tal como se describe en las Secciones 6.2.1 y 6.2.2 infra para los análogos o derivados de Nogo.
5.2 Expresión de los genes Nogo
La secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína Nogo o un análogo o fragmento funcionalmente activo u otro derivado de este (véanse las Figuras 1b y 2a; Secciones 6.2.1 y 6.2.2), se puede insertar en un vector de expresión apropiado, i.e., un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante de la proteína insertada. Las señales de transcripción y traducción necesarias también se pueden suministrar por el gen Nogo nativo y/o sus regiones flanqueantes. La secuencia codificante también se puede marcar con una secuencia que codifica para un antígeno así descrito, o molécula biológica que tiene conocidas propiedades de enlace con un socio de enlace (por ejemplo, etiqueta de epítopo myc, etiqueta de histidina, etiqueta de epítopo T7 etc., ver Sección 6.2.6 y Figura 11a-11c). Esta secuencia adicional entonces puede ser aprovechada para purificar la proteína Nogo, fragmento de proteína, o derivado utilizando la interacción del grupo de enlace con su socio correspondiente, que está unido a una matriz sólida.
Una variedad de sistemas huésped-vector se pueden utilizar para expresar la secuencia codificante de la proteína. Estos incluyen, pero no se limitan a sistemas de células de mamíferos infectadas con virus (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas de células de insecto infectadas con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos tales como vectores de levadura que contienen levadura, o bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, ADN de plásmido, o ADN cósmido. Los elementos de expresión de vectores varían en sus fortalezas y especificidades. Dependiendo del sistema huésped-vector utilizado, se puede usar uno cualquiera de un número de elementos de transcripción y traducción apropiados. En modalidades específicas, el gen Nogo humano se expresa, o una porción funcionalmente activa de Nogo humano que codifica una secuencia, como un ejemplo específico, ya sea Nogo A, Nogo B o Nogo C se expresa (Figura 1b). En incluso otra modalidad, se expresa un fragmento de Nogo que comprende un dominio de la proteína Nogo.
Como se usa en este documento, una célula es "transformada" con un ácido nucleico, cuando dicha célula contiene un ácido nucleico no nativa presente en la célula, después de la introducción del ácido nucleico en la célula o su antecesor, por ejemplo, por transfección, electroporación, transducción, etc.
También se proveen las secuencias de nucleótidos que codifican los fragmentos de Nogo A humano que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de los residuos de aminoácidos 132-939, 206-501, 501-680, 132-206 de la SEQ ID No: 29. También se proveen, las secuencias de nucleótidos que codifican porciones truncadas de Nogo A humano; las proteínas truncadas carecen de los residuos de aminoácidos 132-206, los residuos de aminoácidos 939 -1127, o los residuos de aminoácidos 132-206 y 939-1127, de SEQ ID NO. 29, pero de otra manera comprende el resto de la SEQ ID No: 29.
Cualquiera de los métodos descritos previamente para la inserción de fragmentos de ADN en un vector se puede utilizar para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que consiste en señales de control
apropiadas de la transcripción/traducción y secuencias de codificación de la proteína. Estos métodos pueden incluir en el ADN recombinante in vitro y técnicas sintéticas y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento de péptido o proteína Nogo puede ser regulada por una segunda secuencia de ácido nucleico de manera que la péptido o proteína Nogo se expresa en un huésped transformado con la molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de una proteína Nogo se puede controlar por cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica. Una modalidad ejemplar es utilizar uno de los promotores naturales de Nogo, ya sea P1 o P2, discutidos en la Sección 6.2.1. También se puede utilizar un promotor no nativo. Los promotores que pueden ser utilizados para controlar la expresión de Nogo incluyen, pero no se limitan a, la región del promotor temprano de SV40 (Bemoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de timidina quinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:14411445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); vectores de expresión procariotas tales como el promotor de β-lactamasa (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 75:3727-3731)., o el promotor tac (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25); ver también "proteínas útiles de bacterias recombinantes" en Scientific American, 1980, 242:74-94; vectores de expresión en plantas que comprenden la región promotora de la nopalina sintetasa (Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213) o el promotor de ARN del virus mosaico de la coliflor 35S (Gardner, et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120); elementos promotores de levadura u otros hongos tales como el promotor Gal 4, ADC (alcohol deshidrogenasa), el promotor PGK (fosfoglicerol quinasa), el promotor de la fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones de control transcripcional en animales, que muestran especificidad de tejido y han sido utilizadas en animales transgénicos: región de control del gen de la elastasa I que es activa en células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); región de control del gen de la insulina que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), región de control del gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:14361444), región de control del virus de tumor mamario en ratón, que es activa en mastocitos testiculares, de mama, y linfoides. (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), región de control del gen de la albúmina que es activa en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes y Devel. 1:268-276), región de control del gen de alfa-fetoproteína que es activa en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); región de control del gen de alfa 1-antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes y Devel. 1:161-171), región de control del gen beta-globina que es activa en células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); región de control del gen de la proteína básica de la mielina que es activa en células de oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712). región de control del gen de cadena 2 ligera de la miosina que es activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286), región de control de gen de la hormona de liberación gonadotrópica que es activa en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
En un ejemplo específico, se utiliza un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un ácido nucleico que codifica Nogo, uno o más orígenes de replicación, y, opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, un gen de resistencia a los antibióticos).
En una modalidad específica, una construcción de expresión se hace por medio de la subclonación de una secuencia codificante de Nogo en el sitio de restricción EcoRI de cada uno de los tres vectores pGEX (vectores de expresión de glutatión S-transferasa; Smith and Johnson, 1988, Gene 7:31-40). Esto permite la expresión del producto de la proteína Nogo del subclon en el marco de lectura correcto.
Los vectores de expresión que contienen insertos del gen Nogo se pueden identificar por tres enfoques generales:
(a) hibridación de ácido nucleico, (b) presencia o ausencia de funciones del gen "marcador", y (c) expresión de secuencias insertadas. En el primer enfoque, la presencia de un gen Nogo insertado en un vector de expresión puede ser detectado mediante hibridación del ácido nucleico usando sondas que comprenden secuencias que son homólogas a un gen Nogo insertado. En el segundo enfoque, el sistema huésped/vector recombinante puede identificarse y seleccionarse basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones del gen "marcador" (por ejemplo, actividad timidina quinasa, resistencia a antibióticos, fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.) causada por la inserción de un gen Nogo en el vector. Por ejemplo, si el gen vector se inserta dentro de la secuencia del gen marcador del vector, los recombinantes que contienen el inserto Nogo se pueden identificar por la ausencia de la función del gen marcador. En el tercer enfoque, los vectores de expresión recombinantes se pueden identificar ensayando el producto Nogo expresado por el recombinante. Tales ensayos pueden basarse, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales de la proteína Nogo en sistemas de ensayo in vitro, por ejemplo, en el enlace con el anticuerpo anti-Nogo.
Una vez que una molécula de ADN recombinante particular se identifica y aísla, varios métodos conocidos en la técnica se pueden utilizar para propagarla. Una vez que se establecen un sistema huésped y condiciones de crecimiento apropiados, los vectores de expresión recombinantes pueden propagarse y prepararse en cantidad. Como se ha explicado previamente, los vectores de expresión que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, los
siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales tales como virus vaccinia o adenovirus; virus de insectos tales como baculovirus; vectores de levadura; vectores de bacteriófagos (por ejemplo, lambda), y vectores de ADN plásmido y cósmido, por nombrar sólo algunos.
Además, se puede escoger una cepa de célula huésped que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico en la forma específica deseada. La expresión de ciertos promotores se puede elevar en presencia de ciertos inductores; Así, se puede controlar la expresión de la proteína Nogo modificada genéticamente. Adicionalmente, diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para la modificación y el procesamiento traduccional y postraduccional (por ejemplo, glicosilación, fosforilación de proteínas). Líneas celulares o sistemas de huéspedes apropiados se pueden elegir para asegurar la modificación y el procesamiento deseados de la proteína foránea expresada. Por ejemplo, la expresión en un sistema bacteriano se puede utilizar para producir un producto de proteína de núcleo no glicosilado. La expresión en levaduras producirá un producto glicosilado. La expresión en células de mamífero se puede utilizar para asegurar la glicosilación "nativa" de una proteína heteróloga. Además, diferentes sistemas de expresión vector/huésped pueden efectuar reacciones de procesamiento a diferentes grados.
En otros ejemplos específicos, la proteína Nogo, fragmento, análogo o derivado puede expresarse como un producto de proteína quimérica o de fusión (que comprende la proteína, fragmento, análogo o derivado unido a través de un enlace peptídico a una secuencia de proteína heteróloga (de una proteína diferente)). Dicho producto quimérico se puede hacer ligando las secuencias de ácidos nucleicos apropiadas que codifican las secuencias de aminoácidos deseadas entre sí por métodos conocidos en la técnica, en el marco de codificación apropiado, y expresando el producto quimérico por métodos comúnmente conocidos en la técnica. Alternativamente, tal producto quimérico se puede hacer mediante técnicas sintéticas de proteínas, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de péptidos.
Tanto ADNc como las secuencias genómicas se pueden clonar y expresar.
5.3 Identificación y purificación de los productos del gen Nogo
En aspectos particulares, la invención provee secuencias de aminoácidos de Nogo, preferiblemente Nogo humano, y fragmentos y derivados de las mismas que comprenden un determinante antigénico (i.e., se pueden reconocer por un anticuerpo) o que son de otra manera funcionalmente activos, así como secuencias de ácidos nucleicos que codifican los anteriores. Material de Nogo "funcionalmente activo" como se utiliza en este documento se refiere a que al material que presenta una o más actividades funcionales conocidas asociadas con una proteína Nogo A (tipo salvaje) de longitud completa, por ejemplo, propiedades del sustrato no permisivas, el colapso del cono de crecimiento de ganglios de raíz dorsal, la inhibición de la propagación de NIH 3T3, la inhibición de excrecencia de las neuritas, el enlace con un sustrato de Nogo o socio de enlace de Nogo, antigenicidad (enlace con un anticuerpo anti-Nogo), inmunogenicidad, etc.
A modo de ejemplo, los fragmentos de una proteína Nogo se componen de al menos 6 aminoácidos, 10 aminoácidos, 17 aminoácidos, 50 aminoácidos, 100 aminoácidos o de al menos 220 aminoácidos. En otros ejemplos, las proteínas comprenden o consisten esencialmente en el dominio carboxi terminal de Nogo altamente conservado (188 aminoácidos carboxi terminal de Nogo A). También se revelan los fragmentos, o proteínas que comprenden fragmentos, que carecen del dominio carboxi terminal conservado, o los tramos carboxi terminal hidrófobos, o el dominio amino terminal ácido, o la región poli-prolina amino terminal o cualquier combinación de los mismos, de una proteína Nogo. Se revelan, los ácidos nucleicos que codifican los anteriores.
Una vez que se identifica un recombinante que expresa la secuencia del gen Nogo, el producto génico puede ser analizado. Esto se consigue mediante ensayos basados en las propiedades físicas o funcionales del producto, incluyendo marcación radioactiva del producto seguido por análisis mediante electroforesis en gel, inmunoensayo, etc.
Una vez que se identifica la proteína Nogo, se puede aislar y purificar por métodos estándar, incluyendo cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad y cromatografía de columna de exclusión molecular), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas, Las propiedades funcionales se pueden evaluar usando cualquier ensayo apropiado, incluyendo colapso del cono de crecimiento de ganglios de raíz dorsal, la inhibición de la propagación NIH 3T3, inhibición de regeneración neurítica en nervios ópticos (ver Secciones 6.2.4-6.2.5).
Alternativamente, una vez que se identifica una proteína Nogo producida por un recombinante, la secuencia de aminoácidos de la proteína se puede deducir de la secuencia de nucleótidos del gen quimérico contenido en el recombinante. Como resultado, la proteína se puede sintetizar por métodos químicos estándar conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Hunkapiller, M., et al., 1984, Nature 310:105-111).
En otro ejemplo alternativo, Nogo C nativo, se puede purificar a partir de fuentes naturales, por métodos estándar tales como los descritos anteriormente (por ejemplo, purificación por inmunoafinidad).
En una modalidad específica de la presente invención, tales proteínas Nogo, ya sea producidas por técnicas de ADN recombinante o mediante métodos sintéticos químicos o por purificación de proteínas nativas, incluyen pero no se limitan a los que contienen, como una secuencia de aminoácidos primaria, la totalidad o parte de la secuencia de aminoácidos sustancialmente como se representa en la Figura 2a (SEQ ID No: 2), bovino en la Figura 3a (SEQ ID No: 24), o humano en la Figura 13, (SEQ ID No: 29) así como los fragmentos y otros derivados (tales como, pero no limitando a los representados en la Figura 18), y los análogos de los mismos, incluyendo proteínas homólogas a los mismos. Preferiblemente, las proteínas Nogo de la invención están libres de todo el material de mielina del SNC con el cual normalmente se asocian.
5.4 Estructura de la proteína y el gen Nogo
La estructura de la proteína y del gen Nogo se puede analizar por diversos métodos conocidos en la técnica y varios de estos métodos se describen en las siguientes subsecciones.
5.4.1 Análisis genético
El ADN clonado o ADNc correspondiente al gen Nogo se puede analizar por medio de métodos incluyendo pero no limitando a hibridación Southern (Southern, E.M., 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517), hibridación Northern (ver por ejemplo,, Freeman et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:4094-4098), el mapeo con endonucleasa de restricción (Maniatis, T., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), y análisis de la secuencia de ADN. Reacción en cadena de polimerasa (PCR; patentes de EE.UU. Números 4,683,202, 4,683,195 y 4,889,818; Gyllenstein et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7652-7656; Ochman et al., 1988, Genetics 120:621-623; Loh et al., 1989, Science 243:217-220), seguido por la hibridación Southern con una sonda específica de Nogo puede permitir la detección del gen Nogo en ADN de diversos tipos de células. Métodos de amplificación distintos de PCR son comúnmente conocidos y también se pueden emplear. En una modalidad, la hibridación Southern se puede utilizar para determinar el ligamiento genético de Nogo. El análisis de hibridación Northern se puede utilizar para determinar la expresión del gen Nogo. Varios tipos de células, en varios estados de desarrollo o actividad se pueden probar para la expresión Nogo. La rigurosidad de las condiciones de hibridación tanto para la hibridación Southern como Northern puede ser manipulada para asegurar la detección de ácidos nucleicos con el grado deseado de relevancia con la sonda específica de Nogo utilizada. Las modificaciones de estos métodos y otros métodos comúnmente conocidos en la técnica pueden ser utilizados.
El mapeo con endonucleasas de restricción se puede utilizar para determinar a groso modo la estructura genética del gen Nogo. Los mapas de restricción derivados por escisión de endonucleasa de restricción se pueden confirmar por análisis de secuencia de ADN.
El análisis de la secuencia de ADN se puede realizar por cualquier técnica conocida en la técnica, incluyendo, pero no limitando al método de Maxam and Gilbert (1980, Meth. Enzymol. 65:499-560), el método didesoxi de Sanger (Sanger, F., et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463), el uso de ADN polimerasa T7 (Tabor and Richardson, patente de EE.UU. No. 4,795,699), o uso de un secuenciador de ADN automatizado (por ejemplo, Applied Biosystems, Foster City, CA).
5.4.2 Análisis de proteínas
La secuencia de aminoácidos de la proteína Nogo se puede derivar por deducción de la secuencia de ADN, o alternativamente, por secuenciación directa de la proteína, por ejemplo, con un secuenciador automático de aminoácidos.
La secuencia de la proteína Nogo se puede caracterizar además por un análisis de hidrofilicidad (Hopp, T. and Woods, K., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824). Se puede utilizar un perfil de hidrofilicidad para identificar las regiones hidrófobas e hidrófilas de la proteína Nogo y las regiones correspondientes de la secuencia del gen que codifica tales regiones.
También se puede hacer el análisis estructural secundario (Chou, P. and Fasman, G., 1974, Bioquímica 13: 222), para identificar regiones de Nogo que asumen estructuras secundarias específicas.
La manipulación, traducción, y predicción de la estructura secundaria, predicción del marco de lectura abierto y el trazado, así como la determinación de homologías de secuencia, también se pueden lograr utilizando programas de software disponibles en la técnica.
También se pueden emplear otros métodos de análisis estructural. Estos incluyen, pero no se limitan a cristalografía de rayos X (Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13) y modelado por ordenador (Fletterick, R. and Zoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).
5.5 Generación de anticuerpos para proteínas Nogo y sus derivados
De acuerdo con la invención, la proteína Nogo, sus fragmentos u otros derivados, o análogos de la misma, se pueden usar como un inmunógeno para generar anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a tal inmunógeno. Tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena sencilla, fragmentos Fab, y una biblioteca de expresión de Fab. Se producen los anticuerpos dirigidos a un fragmento recombinante de Nogo de rata y bovino (Sección 6.1.7), estos anticuerpos también reaccionan en cruz con otras especies epítopos. En otra modalidad, los fragmentos de una proteína Nogo identificados como hidrófilos se utilizan como inmunógenos para la producción de anticuerpos.
Varios procedimientos conocidos en la técnica se pueden utilizar para la producción de anticuerpos policlonales para una proteína Nogo o derivado o análogo. En una modalidad particular, se pueden obtener los anticuerpos policlonales de conejo para un epítopo de una proteína Nogo codificada por una secuencia de SEQ ID No: 2 en la Figura 2a, SEQ ID No: 24 en la Figura 12, SEQ ID No: 32 en la Figura 14, o SEQ ID No: 29 en la Figura 13, (Nogo A de rata, Nogo de bovino, Nogo C de rata, o Nogo humano respectivamente) o una subsecuencia de la misma. Para la producción de anticuerpos, diversos animales huésped se pueden inmunizar por inyección con la proteína nativa Nogo, o una versión sintética, o derivado (por ejemplo, fragmento) de la misma, incluyendo, pero no limitando a conejos, ratones, ratas, etc. Varios adyuvantes se pueden utilizar para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie huésped, e incluyendo pero no limitando a geles minerales de Freund (completo e incompleto), tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia una secuencia de la proteína Nogo o análogo de la misma, se puede utilizar cualquier técnica que provee la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica de hibridoma desarrollada originalmente por Kohler and Milstein (1975, Nature 256:495-497), así como la técnica de trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica de hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 7796). Los anticuerpos monoclonales se pueden producir en animales libres de gérmenes utilizando tecnología reciente (PCT/US90/02545). De acuerdo con la invención, los anticuerpos humanos se pueden utilizar y obtenerse mediante el uso de hibridomas humanos (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030) o transformando las células B humanas con el virus EBV in vitro (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96). De hecho, de acuerdo con la invención, se pueden utilizar las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) mediante el corte y empalme de los genes de una molécula de anticuerpo de ratón específico para Nogo junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada; tales anticuerpos están dentro del alcance de esta invención.
Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de EE.UU. 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos de Nogo. También se pueden utilizar las técnicas descritas para la construcción de bibliotecas de expresión Fab (Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) para permitir la identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para proteínas Nogo, derivados, o análogos.
Los fragmentos de anticuerpos que contienen el idiotipo de la molécula se pueden generar por técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a: el fragmento F(ab’)2 que puede ser producido por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro del fragmento F(ab’)2, los fragmentos Fab que se pueden generar tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor, y fragmentos Fv.
En la producción de anticuerpos, la selección del anticuerpo deseado se puede lograr mediante técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, ELISA (ensayo de inmunoabsorbente de enzima ligada). Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen un dominio específico de una proteína Nogo, se pueden ensayar hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento Nogo que contiene dicho dominio. Para la selección de un anticuerpo que se une específicamente a un primer homólogo Nogo pero que no se une específicamente a un homólogo Nogo diferente, se puede seleccionar sobre la base de enlace positivo con el primer homólogo Nogo y una deficiencia de enlace con el segundo homólogo Nogo.
También se proveen los anticuerpos específicos para un dominio de una proteína Nogo.
Los anticuerpos anteriores se pueden usar en métodos conocidos en la técnica relativos a la localización y actividad de las secuencias de proteínas Nogo de la invención, por ejemplo, para obtener imágenes de estas proteínas, midiendo los niveles de las mismas en muestras fisiológicas apropiadas, en métodos de diagnóstico, etc.
Los anticuerpos anti-Nogo y fragmentos de los mismos que contienen el dominio de enlace son Terapéuticos.
5.6 Proteínas Nogo, derivados y análogos
La invención se refiere además a las proteínas Nogo, y derivados (incluyendo pero no limitando a fragmentos) y análogos de proteínas Nogo. También se revelan, los ácidos nucleicos que codifican los derivados de la proteína Nogo y los análogos de la proteína. En un ejemplo, las proteínas Nogo se codifican por los ácidos nucleicos de Nogo descritos en la Sección 5.1 supra. En un aspecto particular, se revelan las proteínas Nogo A, Nogo B, o Nogo C y derivados, o análogos son de animales, por ejemplo, ratón, rata, cerdo, vaca, perro, mono, ser humano, moscas, o ranas.
También se revela la producción y el uso de derivados y análogos relacionados con Nogo. En un ejemplo específico, el derivado o análogo es funcionalmente activo, i.e., capaz de mostrar una o más actividades funcionales asociadas con una proteína Nogo de tipo salvaje, de longitud completa. Como un ejemplo, tales derivados o análogos que tienen la inmunogenicidad o antigenicidad deseada se pueden utilizar, por ejemplo, en inmunoensayos, para la inmunización, para la inhibición de la actividad de Nogo, etc. Los derivados o análogos que retienen, o alternativamente carecen o inhiben, una deseada propiedad Nogo de interés (por ejemplo, enlace con un socio de enlace de Nogo, se pueden utilizar como inductores o inhibidores, respectivamente, de tal propiedad y sus correlatos fisiológicos. Un ejemplo específico se refiere a un fragmento Nogo que se puede unir por un anticuerpo anti-Nogo. Los derivados o análogos de Nogo se pueden probar para la actividad deseada, mediante procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitando a los ensayos descritos en las Secciones 6.1.10 a 6.1.12.
Con el fin de cartografiar la(s) región(es) activa(s) de Nogo, han sido preparada una serie de mutantes de deleción Nogo por técnicas de ADN recombinante como se ha descrito en la sección 6.2.7. Las porciones de Nogo que están presentes en los mutantes de deleción se muestran en la Figura 18. En una modalidad específica, la invención provee fragmentos de Nogo por ejemplo, fragmentos que comprenden (o alternativamente que consisten en) los números de aminoácidos de Nogo A (SEQ ID No: 2) 1-171, 172-974, 259-542, 542-722, 722-974, 172-259, o 975 a 1162, o combinaciones de los anteriores. También se revelan los Mutantes truncados de Nogo que carecen de los números de aminoácidos 172 a 259 y/o 975 a 1162 de la SEQ ID No: 2, ya que estas regiones parecen ser no esenciales y se pueden retirar de Nogo sin afectar la actividad biológica. También se proveen los fragmentos correspondientes de Nogo A humano que comprenden los números de aminoácidos (o alternativamente que consisten en) 132-939, 206-501,501-680, 132-206, de la SEQ ID No: 29. Además se revelan los mutantes truncados de Nogo A humano cuyo No: 29 también se proveen. 132-206, los residuos de aminoácidos 939-1127, o los residuos de aminoácidos 132-206 y 939-1127, de la SEQ ID No: 29
En un ejemplo específico, los fragmentos están libres de todo el material de la mielina del SNC y/o muestran actividad inhibidora de Nogo. También se proveen las proteínas de fusión que comprenden uno o más de los fragmentos anteriores fusionados a una secuencia no-Nogo.
Los derivados de genes Nogo se pueden hacer mediante la alteración de las secuencias de Nogo por medio de sustituciones, adiciones o deleciones que proveen moléculas funcionalmente equivalentes. Debido a la degeneración de las secuencias codificantes de nucleótidos, otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que un gen Nogo se puede usar en la práctica de la presente invención. Estos incluyen, pero no se limitan a secuencias de nucleótidos que comprenden todo o porciones de genes Nogo que se alteran por la sustitución de diferentes codones que codifican un residuo de aminoácido funcionalmente equivalente dentro de la secuencia, produciendo así un cambio silencioso. Así mismo, los derivados de Nogo de la invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos que contienen, como una secuencia de aminoácidos primaria, toda o parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína Nogo incluyendo secuencias alteradas en las que se sustituyen residuos de aminoácidos funcionalmente equivalentes por residuos dentro de la secuencia que resulta en un cambio silencioso. Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia se pueden sustituir de forma conservadora por otro aminoácido de una polaridad similar que actúa como un equivalente funcional, dando como resultado una alteración silenciosa. Los sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia se pueden seleccionar de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico
En un ejemplo específico, se revelan las proteínas que consisten en o que comprenden un fragmento de una proteína Nogo que consiste en al menos 10 aminoácidos (continua) de la proteína Nogo. En otros ejemplos, el fragmento consiste de al menos 17 o 50 aminoácidos de la proteína Nogo. En ejemplos específicos, tales fragmentos no son más grandes de 35, 100 o 200 aminoácidos. Los derivados o análogos de Nogo incluyen pero no se limitan a aquellas moléculas que comprenden regiones que son sustancialmente homólogas a Nogo o fragmentos de los mismos (por ejemplo, en diversas modalidades, al menos 60% o 70% o 80% o 90% o 95% de identidad sobre una secuencia de aminoácidos de tamaño idéntico o cuando se compara con una secuencia alineada en la que la alineación se realiza mediante un programa de homología informático conocido en la técnica, por ejemplo la búsqueda de ordenador BLAST (Altschul et al., 1994, Nature Genet. 6:119-129)) o cuyo ácido nucleico codificante es capaz de hibridarse a una secuencia de Nogo codificante, bajo condiciones rigurosas, moderadamente rigurosas, o no rigurosas.
Las moléculas que comprenden fragmentos de Nogo también se revelan por ejemplo, que contienen enlaces hidrocarburo con otras fracciones incluyendo marcadores o fracciones bioactivas.
Los análogos o derivados de Nogo de la invención se pueden producir por diversos métodos conocidos en la técnica. Las manipulaciones que dan lugar a su producción pueden ocurrir a nivel del gen o proteína. Por ejemplo, la secuencia del gen Nogo clonado se puede modificar por cualquiera de numerosas estrategias conocidas en la técnica (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). La secuencia se puede escindir en sitios apropiados con endonucleasa(s) de restricción, seguido por la modificación enzimática adicional si se desea, aislar, y ligar in vitro. En la producción del gen que codifica un derivado o análogo de Nogo, se debe tener cuidado para asegurar que el gen modificado permanece dentro del mismo marco de lectura translacional como Nogo, sin interrupción por señales de parada traduccionales, en la región del gen donde se codifica la actividad de Nogo deseada.
Además, la secuencia de ácido nucleico que codifica Nogo se puede mutar in vitro o in vivo, para crear y/o destruir las secuencias de traducción, iniciación, y/o terminación, o para crear variaciones en regiones codificantes y/o formar nuevos sitios de restricción de endonucleasa o destruir los preexistentes, para facilitar aún más la modificación in vitro. Se puede utilizar cualquier técnica para la mutagénesis conocida en la técnica, incluyendo pero no limitando a, mutagénesis química, mutagénesis dirigida al sitio in vitro (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem 253:6551), el uso de conectores Tab® (Pharmacia), etc.
Las manipulaciones de la secuencia de Nogo también se pueden hacer al nivel de proteínas. Incluidos dentro del alcance de la invención están los fragmentos de proteínas Nogo u otros derivados o análogos que se modifican diferencialmente durante o después de la traducción, por ejemplo, mediante la glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos conocidos de protección/bloqueo, escisión proteolítica, enlace con una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas se pueden llevar a cabo mediante técnicas conocidas, incluyendo pero no limitando a escisión química específica mediante bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH4; acetilación, formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en presencia de tunicamicina; etc.
Además, los análogos y derivados de Nogo se pueden sintetizar químicamente. Por ejemplo, un péptido correspondiente a una porción de una proteína Nogo que comprende el dominio deseado o que media la actividad deseada in vitro, se puede sintetizar mediante el uso de un sintetizador de péptidos. Además, si se desea, los aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos se pueden introducir como una sustitución o adición en la secuencia de Nogo. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero no se limitan a los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido α-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino butírico, γ-Abu, ε-Ahx, 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, β-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos de diseño tales como β-metil aminoácidos, Cα-metil aminoácidos, Nα-metil aminoácidos y análogos de aminoácidos en general. Además, el aminoácido puede ser D (dextrógiro) o L (levógiro).
En un ejemplo específico, el derivado de Nogo es una proteína quimérica, o de fusión que comprende una proteína Nogo o fragmento de la misma (preferiblemente que consiste de al menos un dominio o motivo de la proteína Nogo,
o al menos 10 aminoácidos de la proteína Nogo) unida en su extremo amino o carboxi a través de un enlace peptídico con una secuencia de aminoácidos de una proteína diferente. En una modalidad, dicha proteína quimérica se produce por expresión recombinante de un ácido nucleico que codifica la proteína (que comprende una secuencia codificante de Nogo unida en marco a una secuencia codificante para una proteína diferente). Tal producto quimérico se puede hacer ligando las secuencias de ácidos nucleicos apropiados que codifican las secuencias de aminoácidos deseadas entre sí por métodos conocidos en la técnica, en el marco de codificación apropiado, y expresando el producto quimérico por métodos comúnmente conocidos en la técnica. Alternativamente, tal producto quimérico se puede hacer por la proteína sintética (técnicas, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de péptidos. Se pueden construir genes quiméricos que comprenden porciones de Nogo fusionados a cualquier secuencia de codificación de proteínas heterólogas. Tales secuencias de codificación de proteínas heterólogas
incluyen, por ejemplo, la etiqueta de hexahistidina, y la etiqueta T7. Una modalidad específica se refiere a una proteína quimérica que comprende un fragmento de Nogo de al menos seis aminoácidos.
En otro ejemplo específico, el derivado de Nogo es una molécula que comprende una región de homología con una proteína Nogo.
En un ejemplo adicional, los derivados de Nogo (por ejemplo, fragmentos) son proteínas que son de origen no natural.
Otros ejemplos de derivados y análogos se describen en la subsección a continuación y las secciones de ejemplos infra.
5.6.1 Derivados de Nogo que contienen uno o más dominios de la proteína
En una modalidad específica, la invención se refiere a derivados y análogos de Nogo, en particular fragmentos de Nogo y derivados de tales fragmentos, que comprenden, o alternativamente consisten en, uno o más dominios de una proteína Nogo, incluyendo pero sin limitarse a los dominios hidrófobos y carboxi terminal conservados o los dominios amino terminal ácido o ricos en poli prolina, fragmentos funcionales (por ejemplo, enlace) de cualquiera de los anteriores, o cualquier combinación de los anteriores.
Una modalidad específica se refiere a las moléculas que comprenden fragmentos específicos de Nogo que son los fragmentos en la respectiva proteína Nogo más homólogos con los fragmentos específicos de una proteína Nogo de rata o bovina. Un fragmento que comprende un dominio de un homólogo de Nogo se puede identificar, mediante métodos de análisis de proteína como se describe en las Secciones 6.1.2, 6.1.8, 6.1.9, 6.1.10,6.1.11, o 6.1.12.
En otro ejemplo, se revela una molécula que comprende uno o más dominios (o porción funcional de la misma) de una proteína Nogo pero que también carece de uno o más dominios (o porción funcional de la misma) de una proteína Nogo. En otra modalidad, se revela una molécula que comprende uno o más dominios (o porción funcional de la misma) de una proteína Nogo, y que tiene uno o más dominios mutantes (por ejemplo, debido a la deleción o mutación(es) puntual) de una proteína Nogo (por ejemplo, de manera que el dominio mutante tiene función disminuida).
5.7 Ensayos de proteínas Nogo, derivados y análogos
La actividad funcional de las proteínas Nogo, derivados y análogos se puede ensayar por medio de diversos métodos. La descripción de ensayos funcionales en las siguientes secciones no está destinada a ser limitante, y puede incluir otros ensayos conocidos por un experto en la técnica.
5.7.1 Ensayos de inhibición del crecimiento de neuritas de Nogo in vitro
En un ejemplo específico, las proteínas Nogo, derivados y análogos se pueden ensayar para la inhibición de la propagación de NIH 3T3 o la inhibición de la excrecencia de las neuritas PC12 usando cultivo de tejido in vitro (sección 6.1.10).
En un ejemplo alternativo, las proteínas Nogo, derivados y análogos se pueden utilizar para ensayo de colapso del cono de crecimiento de ganglios de raíz dorsal de pollo explantado, inducido por la presencia de Nogo. Del mismo modo, la función de Nogo se pueden ensayar para la inhibición de la excrecencia de las neuritas de ganglios de la raíz dorsal de pollo explantados (spillman et al.,1998 j. Biol. Chem. 273:19283-19293).
5.7.2 Ensayos de propiedades funcionales de Nogo in vivo
En un ejemplo, los antagonistas de proteínas Nogo, derivados y análogos se pueden utilizar para ensayos in vivo de la función utilizando un modelo animal para regeneración del tracto corticoespinal (CST) a través de largas distancias y recuperación del comportamiento
En un ejemplo preferido, un tracto corticoespinal de roedor se daña por medio de la resección quirúrgica o contusión de la médula espinal, y se administran los antagonistas de Nogo al animal. La plasticidad neural, la regeneración y recuperación funcional, en comparación con animales de control no tratados o animales tratados con anticuerpo control, se monitorean para la plasticidad estructural o la regeneración por medio de técnicas anatómicas, principalmente por medio de la marcación de los tractos neurales definidos. La recuperación funcional se mide, mediante pruebas de locomoción y por habilidad de electrofisiología realizadas por el roedor (por ejemplo, prueba de papel pegajoso, tarea de alcanzar el pellet de comida, etc.) (Thallmair et al., 1998 Nat. Neuroscience 1(2):124-131).
5.7.3 Inhibición del enlace del ligando Nogo y sus ensayos
En un ejemplo, donde se evalúa de la capacidad de unir o competir con Nogo de tipo salvaje por el enlace con un anticuerpo anti-Nogo, se pueden utilizar varios inmunoensayos conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitando a sistemas de ensayo competitivo y no competitivo que utilizan técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), inmunoensayos "sandwich", ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (usando oro coloidal, marcadores enzimáticos o radioisotópicos, por ejemplo), transferencias Western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación de complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una modalidad, el enlace del anticuerpo se detecta por medio de la detección de un marcador en el anticuerpo primario. En otra modalidad, el anticuerpo primario se detecta por medio de la detección del enlace de un anticuerpo secundario o reactivo con un anticuerpo primario. En una modalidad adicional, se marca el anticuerpo secundario. Se conocen muchos medios en la técnica para detectar el enlace en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente invención.
En otro ejemplo, donde se identifica una proteína de enlace-Nogo, el enlace se puede ensayar, por ejemplo, por medios bien conocidos en la técnica. En otra modalidad, se pueden ensayar las correlaciones fisiológicas del enlace Nogo con sus sustratos.
5.8 Usos terapéuticos
La invención provee el tratamiento o la prevención de diversas enfermedades y trastornos mediante la administración de un compuesto terapéutico (denominado en el presente documento "Terapéutico"). Tales "Terapéuticos" incluyen, pero no se limitan a: proteínas Nogo (por ejemplo, como se describe anteriormente); anticuerpos de los mismos (como se describe anteriormente); Los trastornos que afectan el crecimiento celular desregulado, por ejemplo, tumores del SNC, se tratan o previenen mediante la administración de un Terapéutico que promueve la función Nogo. Los trastornos en los que la excrecencia de las neuritas, regeneración, o mantenimiento son deficientes o deseados se tratan mediante la administración de un Terapéutico que antagoniza (inhibe) la función Nogo. Lo anterior se describe en detalle en las siguientes subsecciones.
En general, la administración de productos de origen de la especie o reactividad de especie (en el caso de anticuerpos) es decir la misma especie que la del paciente preferido. Por lo tanto, en una modalidad preferida, una proteína Nogo humana, o un anticuerpo para una proteína Nogo humana, se administra terapéuticamente o profilácticamente a un paciente humano.
5.8.1 Tratamiento y prevención de los trastornos relacionados con el crecimiento celular desregulado
Las enfermedades y trastornos que involucran el crecimiento celular desregulado se tratan o previenen mediante la administración de un Terapéutico que promueve (i.e., aumenta o suministra) la función Nogo. Ejemplos de dicho Terapéutico incluyen pero no se limitan a proteínas Nogo, derivados, o fragmentos que son funcionalmente activos, particularmente que son activos en la inhibición de extensión de neuritas o inhibición del crecimiento celular (por ejemplo, como se ha demostrado en ensayos in vitro o en modelos realizados en animales), y los ácidos nucleicos que codifican una proteína Nogo o derivado funcionalmente activo o fragmento del mismo (por ejemplo, para uso en terapia génica). Preferiblemente, las proteínas Nogo, derivados o fragmentos de las mismas están libres de todo el material de mielina del SNC con el que está asociado de forma natural. Otros Terapéuticos que se pueden utilizar, por ejemplo, agonistas de Nogo, se pueden identificar utilizando ensayos in vitro o modelos animales, ejemplos de los cuales se describen infra.
En modalidades específicas, los Terapéuticos que promueven la función Nogo se administran terapéuticamente (incluyendo por vía profiláctica): (1) en enfermedades o trastornos que implican una ausencia o disminución (relativo a normal o deseado) del nivel de proteína o función Nogo, por ejemplo, en pacientes en los que se carece de la proteína Nogo, genéticamente defectuoso, biológicamente inactiva o poco activa, o de expresión reducida; o (2) en enfermedades o trastornos en los que los ensayos in vitro (o in vitro) (ver infra) indican la utilidad de la administración del agonista de Nogo. La ausencia o disminución del nivel de proteína o función Nogo se pueden detectar fácilmente, por ejemplo, mediante la obtención de una muestra de tejido del paciente (por ejemplo, a partir de tejido de biopsia) y ensayándolo in vitro para niveles de ARN o proteína, la estructura y/o actividad del ARN o proteína Nogo expresada.
Muchos métodos estándar en la técnica se pueden emplear por lo tanto, incluyendo pero no limitando a ensayos de quinasa, inmunoensayos para detectar y/o visualizar la proteína Nogo (por ejemplo, transferencia Western, inmunoprecipitación seguida de electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio poliacrilamida, inmunocitoquímica, etc.) y/o ensayos de hibridación para detectar la expresión Nogo por detección y/o la visualización de ARNm de Nogo (por ejemplo. ensayos Northern, transferencia puntual, hibridación in situ, etc.), etc.
Las enfermedades y trastornos que involucran el crecimiento celular desregulado que se pueden tratar o prevenir incluyen, pero no se limitan a trastornos proliferativos, tumores malignos, tumores del sistema nervioso, etc. Ejemplos de estos se detallan a continuación.
5.8.1.1 Crecimiento neoplásico 5 El crecimiento neoplásico y los trastornos relacionados que pueden tratarse o prevenirse mediante la administración de un Terapéutico que promueve la función Nogo incluyen pero no se limitan a los enumerados en la Tabla 1 (para una revisión de tales trastornos, véase Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia):
TABLA 1 CRECIMIENTO NEOPLÁSICO Y TRASTORNOS RELACIONADOS
Tumores sólidos Sarcomas y carcinomas Glioma, glioblastoma astrocitoma meduloblastoma craneofaringioma ependimoma pinealoma hemangioblastoma neuroma acústico oligodendroglioma menangioma neuroblastoma retinoblastoma
En modalidades específicas, tumores malignos o cambios disproliferativos (tales como metaplasias y displasias), o
10 trastornos hiperproliferativos, se tratan o previenen en el sistema nervioso central, la médula espinal o los tejidos nerviosos.
5.8.1.2 Condiciones premalignas
Los Terapéuticos de la invención que promueven la actividad de Nogo también se pueden administrar para tratar condiciones premalignas y para prevenir la progresión a un estado neoplásico o maligno, incluyendo pero no
15 limitando a aquellos trastornos enumerados en la Tabla 1. Tal uso profiláctico o terapéutico se indica en condiciones conocidas o sospechosas de preceder la progresión a la neoplasia o el cáncer, en particular, donde se ha producido el crecimiento celular no neoplásico que consiste en hiperplasia, metaplasia, o más particularmente, displasia (para revisión de tales condiciones de crecimiento anormal, véase Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed.,
W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79). La hiperplasia es una forma de proliferación que implica un aumento
20 en el número de células en un tejido u órgano, sin alteración significativa en la estructura o función. La metaplasia es una forma de crecimiento celular controlado en el cual un tipo de células adultas o completamente diferenciadas se sustituye por otro tipo de células adultas. La metaplasia puede ocurrir en células de tejido conjuntivo o epitelial. La metaplasia atípica implica un epitelio metaplásico algo desordenado. La displasia es frecuentemente un precursor del cáncer y se encuentra principalmente en los epitelios; es la forma más desordenada de crecimiento celular no
25 neoplásico, que implica una pérdida de uniformidad celular individual y en la orientación arquitectónica de las
células. Las células displásicas suelen tener anormalmente grandes núcleos, profundamente manchados, y muestran pleomorfismo. La displasia se produce característicamente donde existe irritación o inflamación crónica.
Alternativamente o además de la presencia del crecimiento celular anormal caracterizado como hiperplasia, metaplasia, o displasia, la presencia de una o más características de un fenotipo transformado, o de un fenotipo maligno, mostrado in vivo o mostrado in vitro por una muestra de células de un paciente, puede indicar la conveniencia de administración profiláctica/terapéutica de un Terapéutico que promueva la función Nogo. Como se menciona supra, tales características de un fenotipo transformado incluyen cambios en la morfología, pérdida de la unión del sustrato, pérdida de inhibición de contacto, pérdida de dependencia de anclaje, liberación de la proteasa, aumento del transporte de azúcar, disminución del requerimiento de suero, expresión de antígenos fetales, desaparición de la proteína de la superficie celular de 250,000 dalton, etc. (véase también id., en las págs. 84-90 para características asociadas con un fenotipo transformado o maligno).
En otras modalidades, un paciente que presenta uno o más de los siguientes factores de predisposición para la malignidad se trata mediante la administración de una cantidad efectiva de un Terapéutico: neurofibromatosis de Von Recklinghausen o retinoblastoma; (ver Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 112-113) etc.
En otra modalidad específica, un Terapéutico de la invención se administra a un paciente humano para prevenir la progresión del cáncer, melanoma, o sarcoma del riñón, cartílago (del esternón), piel, músculo esquelético, pulmón, o bazo.
5.8.1.3. Trastornos hiperproliferativos y disproliferativos
En otro ejemplo, un terapéutico que promueve la actividad de Nogo se usa para tratar o prevenir trastornos hiperproliferativos o disproliferativos benignos. Ejemplos específicos se dirigen al tratamiento o prevención de cirrosis del hígado (una condición en la cual la cicatrización ha superado a los procesos normales de regeneración del hígado), tratamiento de formación de queloide (cicatriz hipertrófica) (desfiguración de la piel en la que el proceso de cicatrización interfiere con la renovación normal), psoriasis (una condición común de la piel caracterizada por la proliferación excesiva de la piel y retraso en la determinación del destino celular apropiado), tumores benignos, condiciones fibroquísticas, e hipertrofia del tejido (por ejemplo, hiperplasia de próstata).
5.8.1.4 Terapia génica
En un ejemplo específico, los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica una proteína Nogo o derivado funcional de la misma, se administran para promover la función Nogo, por medio de terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia realizada por la administración de un ácido nucleico a un sujeto. En este ejemplo, el ácido nucleico produce su proteína codificada que intermedia un efecto terapéutico promoviendo la función Nogo.
Se puede utilizar cualquiera de los métodos para la terapia génica disponibles en la técnica. Los métodos ejemplares se describen a continuación.
Para revisiones generales de los métodos de terapia génica, ver Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxidol, 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; y Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biothem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215). Los métodos conocidos comúnmente en la técnica de la tecnología de recombinación de ADN que se pueden utilizar se describen en Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; y Kriegler, 1990, Gene Transfer y Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.
En un aspecto preferido, el Terapéutico comprende un ácido nucleico de Nogo que es parte de un vector de expresión que expresa una proteína Nogo o fragmentos del mismo en un huésped apropiado. En particular, tal ácido nucleico tiene un promotor ligado operativamente a la región codificante de Nogo siendo dicho promotor inducible o constitutiva, y, opcionalmente, específico de tejido. En otro ejemplo, se usa una molécula de ácido nucleico en la cual las secuencias de codificación de Nogo y cualquier otra de las secuencias deseadas están flanqueadas por regiones que promueven la recombinación homóloga en un sitio deseado en el genoma, proporcionando de este modo la expresión intracromosómica del ácido nucleico de Nogo (Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438).
La administración del ácido nucleico en un paciente puede ser directa, en cuyo caso el paciente se expone directamente al ácido nucleico o vector que lleva el ácido nucleico, o indirecta, en cuyo caso, las células se transforman primero con el ácido nucleico in vitro, y luego se trasplantan en el paciente. Estos dos enfoques, se conocen respectivamente, como terapia génica in vivo o ex vivo.
En un ejemplo específico, el ácido nucleico se administra directamente in vivo, cuando se expresa para producir el producto codificado. Esto se puede lograr por medio de cualquiera de los numerosos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la construcción como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de modo que se convierta en intracelular, por ejemplo, mediante la infección utilizando un vector retroviral defectuoso o atenuado u otro vector viral (véase Patente de EE. UU. No. 4,980,286), o por inyección directa de ADN desnudo, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont), o recubrimiento con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, encapsulación en liposomas, micropartículas, o microcápsulas, o mediante la administración del mismo en enlace con un péptido que se conoce para entrar el núcleo, mediante la administración del mismo en enlace con un ligando sujeto a la endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem 262:4429-4432) (que puede ser usado para tipos de células diana que expresan específicamente los receptores), etc. En otra modalidad, se puede formar un complejo de ligando-ácido nucleico en el cual el ligando comprende un péptido viral fusogeme para interrumpir los endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosomal. En incluso otra modalidad, el ácido nucleico se puede dirigir in vivo para la absorción y expresión específica de la célula, dirigiendo un receptor específico (véase, por ejemplo, PCT Publications WO 92/06180 con fecha 16 de abril de 1992 (Wu et al.), WO 92/22635 con fecha 23 de diciembre de 1992 (Wilson et al.); WO92/20316 con fecha 26 de noviembre de 1992 (Findeis et al.); WO93/14188 con fecha 22 de julio, 1993 (Clarke et al.), WO 93/30221 con fecha octubre 14 de 1993 (Young)). Alternativamente, el ácido nucleico se puede introducir intracelularmente e incorporar dentro del ADN de la célula huésped para la expresión, por recombinación homóloga (Koller and Smithies, 1989, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438).
En un ejemplo específico, se puede utilizar un vector viral que contiene el ácido nucleico de Nogo. Por ejemplo, se puede utilizar un vector retroviral (ver Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599). Estos vectores retrovirales se han modificado para eliminar las secuencias retrovirales que no son necesarias para el empaquetamiento del genoma viral y la integración en el ADN de la célula huésped. El ácido nucleico de Nogo para ser utilizado en la terapia génica se clona en el vector, que facilita la administración del gen en un paciente. Más detalles acerca de los vectores retrovirales se pueden encontrar en Boesen et al., 1994, Biotherapy 6:291-302, que describe el uso de un vector retroviral para administrar el gen mdrl a las células madre hematopoyéticas para hacer las células madre más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de los vectores retrovirales en terapia génica son: Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest, 93:644-651; Kiem et al., 1994, Blood 83:1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4.129-141; y Grossmanand Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110
114.
Los adenovirus son otros vectores virales que se pueden utilizar en la terapia génica, los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para suministrar los genes al sistema nervioso central. Los adenovirus infectan de forma natural el epitelio respiratorio donde causan una enfermedad leve. Otros objetivos para los sistemas de entrega basados en adenovirus son el hígado, el epitelio respiratorio, las células endoteliales, y el músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células que no se dividen. Kozarsky and Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 presentan una revisión de la terapia génica basada en adenovirus. Bout et al., 1994, Human Gene Therapy 5:3-10 demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes al epitelio respiratorio de monos rhesus. Otros casos del uso de adenovirus en terapia génica se pueden encontrar en Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434; Rosenfeld et, al., 1992, Cell 68:143-155; y Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234.
Además de los Adenovirus, el virus Adeno-asociado (AAV) también se ha propuesto para uso en terapia génica (Walsh et al., 1993. Proc.Soc.Exp.Biol Med. 204:289-300).
Otro enfoque para la terapia génica implica transferir un gen a las células en cultivo de tejido por métodos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio, o infección viral. Por lo general, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. Las células se colocan entonces bajo selección para aislar aquellas células que han tomado y están expresando el gen transferido. Esas células se administran a un paciente.
En este ejemplo, el ácido nucleico se introduce en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Tal introducción se puede llevar a cabo por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitando a, transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o bacteriófago que contiene las secuencias de ácidos nucleicos, fusión celular, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes mediada por microcélulas, fusión de esferoplastos, etc. Numerosas técnicas son conocidas en la técnica para la introducción de genes extraños en células (véase, por ejemplo, Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618; Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29:69-92) y se puede utilizar de acuerdo con la presente invención, siempre que las funciones de desarrollo y fisiológicas necesarias de las células receptoras no se interrumpan. La técnica debe proporcionar la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de modo que el ácido nucleico es expresable por la célula y preferiblemente heredable y expresable por su progenie celular.
Las células recombinantes resultantes se pueden entregar a un paciente por varios métodos conocidos en la técnica. En una modalidad preferida, las células epiteliales se inyectan, por ejemplo, por vía subcutánea. En otra modalidad, células de la piel recombinantes se pueden aplicar como un injerto de piel sobre el paciente. Células sanguíneas recombinantes (por ejemplo, células madre o progenitoras hematopoyéticas) se administran preferiblemente por vía intravenosa. La cantidad de células previstas para uso depende del efecto deseado, estado del paciente, etc., y puede ser determinada por un experto en la técnica.
Las células en las que un ácido nucleico se puede introducir para propósitos de terapia génica abarcan cualquier, tipo de célula disponible, deseada e incluyen pero no se limitan a células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos, células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; diversas células madre o progenitoras, en particular células madre o progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, como se obtienen de la médula ósea, sangre del cordón umbilical; sangre periférica, hígado fetal, etc.
En un ejemplo, la célula utilizada para la terapia génica es autóloga para el paciente.
En una modalidad en la que se usan células recombinantes en terapia génica, un ácido nucleico de Nogo se introduce en las células de manera que es expresable por las células o su progenie, y las células recombinantes se administran luego in vivo para el efecto terapéutico. En una modalidad específica, se derivan o se utilizan células progenitoras. Cualquier célula madre y/o progenitora que se puede aislar y mantener in vitro potencialmente pueden ser utilizadas de acuerdo con esta modalidad de la presente invención. Tales células madre incluyen pero no se limitan a células madre neurales (Stemple and Anderson, 1992, Cell 71: 973-985). En un ejemplo específico, el ácido nucleico que se introducirá para los fines de terapia génica comprende un promotor inducible ligado operativamente a la región codificante, de tal forma que la expresión del ácido nucleico es controlable mediante el control de la presencia o ausencia del inductor apropiado de la transcripción.
Los métodos adicionales que pueden ser adaptados para su uso para administrar un ácido nucleico que codifica una proteína Nogo o derivado funcional.
5.8.2 Tratamiento y prevención de trastornos en los que Nogo bloquea la regeneración
Las enfermedades y trastornos en los que la extensión de neuritas, crecimiento o regeneración se desean son tratados mediante la administración de un Terapéutico que antagoniza (inhibe) la función Nogo. Las enfermedades, trastornos o daños que en última instancia resultan en daños del sistema nervioso incluyen, pero no se limitan a trauma del sistema nervioso central (SNC), (por ejemplo, médula espinal o lesiones del cerebro), infarto, infección, malignidad, exposición a agentes tóxicos, deficiencia nutricional, síndromes paraneoplásicos, y enfermedades nerviosas degenerativas (incluyendo pero no limitando a la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, Corea de Huntington, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, y parálisis supra-nuclear progresiva); mediante la administración de compuestos que interfieren con la actividad de Nogo (por ejemplo, un derivado de Nogo negativo dominante; anticuerpos para Nogo; ácidos nucleicos antisentido que codifican Nogo; los ribozimas de Nogo o grupos químicos que unen un sitio activo de Nogo).
El Terapéutico que se pueden usar incluye, pero no se limita a ácidos nucleicos antisentido Nogo, los ácidos nucleicos Nogo que son disfuncionales (por ejemplo, debido a una inserción heteróloga (secuencia no-Nogo) dentro de la secuencia codificante de Nogo) que se utilizan para función Nogo endógena "knockout" por recombinación homóloga (véase, por ejemplo, Capecchi, 1989, Science 244: 1288-1292). Los anticuerpos anti-Nogo (y fragmentos y derivados de los mismos que contienen la región de enlace de los mismos) se pueden utilizar como un antagonista de Nogo. En un ejemplo específico de la invención, se utiliza un ácido nucleico que contiene una porción de un gen Nogo en el cual las secuencias de Nogo flanquean (son ambos 5 'y 3' a) una secuencia de gen diferente, como un antagonista Nogo, para promover la inactivación de Nogo por recombinación homóloga (ver también Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al:, 1989, Nature 342:435-438). Otros Terapéuticos que inhiben la función Nogo se pueden identificar, mediante el uso de conocidos ensayos in vivo convenientes, por ejemplo, basándose en su capacidad para inhibir el enlace de Nogo con otra proteína, o inhibir cualquier función de Nogo conocida, como se ensayó preferiblemente in vitro o en cultivo celular, aunque también pueden ser empleados los ensayos genéticos. Preferiblemente, los ensayos apropiados in vitro o in vivo, se utilizan para determinar el efecto de un Terapéutico específico y si su administración está indicada para el tratamiento del tejido afectado.
Como ejemplos, los Terapéuticos que inhiben la función Nogo se administran terapéuticamente (incluyendo por vía profiláctica): (1) en enfermedades o trastornos que implican un aumento del nivel (relativo a normal o deseado) de la proteína o función Nogo, por ejemplo, en pacientes en los que la proteína Nogo es hiperactiva o sobreexpresada; o
(2) unas enfermedades o trastornos en los que los ensayos in vitro (o in vivo) (ver infra) indican la utilidad de la administración del antagonista Nogo. Los niveles incrementados en proteína o función Nogo se pueden detectar fácilmente, por ejemplo, mediante la cuantificación de la proteína y/o ARN, mediante la obtención de muestra de tejido (por ejemplo, a partir de tejido de biopsia) y ensayándolo in vitro para niveles de ARN o proteína, la estructura
y/o actividad de la proteína o ARN Nogo expresado. Por lo tanto, muchos métodos estándar en la técnica se pueden emplear, incluyendo pero no limitando a ensayos de quinasa, inmunoensayos para detectar y/o visualizar la proteína Nogo (por ejemplo, transferencia Western, immunoprecipitación seguido por electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio de poliacrilamida, inmunocitoquímica, etc.) y/o ensayos de hibridación para detectar la expresión de Nogo por detección y/o visualización respectivamente de ARNm de Nogo (por ejemplo, ensayos Northern, transferencia puntual, hibridación in situ, etc.), etc.
5.9 Demostración de la utilidad terapéutica o profiláctica
Como se revela los Terapéuticos se pueden probar in vitro, y luego in vivo para la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes de su uso en seres humanos. Por ejemplo; ensayos in vitro que se pueden utilizar para determinar si la administración de un Terapéutico específico se indica, incluir ensayos de cultivo celular in vitro en el cual una muestra de tejido del paciente se siembra en el cultivo, y se expone o de otra manera se le administra un Terapéutico, y el efecto de dicho Terapéutico se observa en la muestra de tejido. Por ejemplo, un Terapéutico que es un inhibidor de la función Nogo se pueden ensayar midiendo el nuevo crecimiento de las neuritas o la recuperación funcional del control motor en el paciente.
En varios ejemplos específicos, se pueden llevar a cabo ensayos in vitro con células representativas de tipos de células implicadas en el trastorno de un paciente, para determinar si un Terapéutico tiene un efecto deseado sobre tales tipos de células.
Los compuestos para uso en terapia se pueden probar en sistemas de modelos animales apropiados antes de la prueba en humanos, incluyendo pero no limitando a ratas, ratones, pollos, vacas, monos, conejos, etc. Para las pruebas in vivo, antes de la administración a seres humanos, se puede utilizar cualquier sistema de modelo animal conocido en la técnica.
5.10 Administración terapéutica/profiláctica y composiciones
La invención revela los métodos de tratamiento (y profilaxis) por medio de la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de un Terapéutico de la invención. En un aspecto preferido, el Terapéutico se purifica sustancialmente. El sujeto es preferiblemente un animal, incluyendo pero no limitando a animales tales como vacas, cerdos, caballos, gallinas, gatos, perros, etc., y es preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente humano. En una modalidad específica, un mamífero no humano es el sujeto.
Las formulaciones y métodos de administración que se pueden emplear cuando el Terapéutico comprende un ácido nucleico que se ha descrito anteriormente; las formulaciones y vías de administración apropiadas adicionales se pueden seleccionar entre los descritos a continuación;
Varios sistemas de administración se conocen y se pueden utilizar para administrar un Terapéutico de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el Terapéutico, endocitosis mediada por el receptor (véase, por ejemplo, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), la construcción de un ácido nucleico Terapéutico como parte de un vector retroviral o de otro tipo, etc. Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a rutas intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Los compuestos se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local, además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, incluyendo la inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular se puede facilitar mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un reservorio Ommaya. La administración pulmonar también se puede emplear, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente de aerosol.
Como un ejemplo, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente en el área con necesidad de tratamiento; esto se puede lograr mediante, por ejemplo, y no a modo de limitación, infusión local durante cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, en conjunción con un apósito para heridas después de la cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. En una modalidad, la administración puede ser por inyección directa en el sitio (o sitio formador) de un tumor maligno o tejido neoplásico o pre-neoplásico.
Como otro ejemplo, el Terapéutico se puede suministrar en una vesícula, en particular un liposoma (véase Longer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez
Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; ver en líneas generales ibid)
Como otro ejemplo, el Terapéutico se puede administrar en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, se puede utilizar una bomba (véase Langer; supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). En otra modalidad, se pueden utilizar materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem 23:61 (1983); véase también Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neural. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg.
71:105 (1989)). En incluso otra modalidad, se puede colocar un sistema de liberación controlada en proximidad del objetivo terapéutico, i.e., el cerebro, necesitando así, sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión de Langer (Science 249: 1527-1533 (1990)).
En un ejemplo específico donde el Terapéutico es un ácido nucleico que codifica una proteína Terapéutica, el ácido nucleico se puede administrar in vivo para promover la expresión de su proteína codificada, construyéndolo como parte de un vector de expresión del ácido nucleico apropiado y administrándolo de manera que se convierta en intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (véase la Patente de EE.UU. No. 4,980,286), o por inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont), o recubrimiento con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transección, o mediante la administración del mismo en enlace con un péptido similar a homeobox, que es conocido por entrar en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), etc. Alternativamente, un Terapéutico de ácido nucleico se puede introducir intracelularmente e incorporar dentro del ADN de la célula huésped para la expresión, mediante recombinación homóloga.
La presente invención también revela las composiciones farmacéuticas. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un Terapéutico, y un portador farmacéuticamente aceptable. El término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o un gobierno estatal o indicado en la Farmacopea de los EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el cual se administra el agente terapéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de petróleo, origen de animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos apropiados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, silica gel, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes reguladores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La formulación oral puede incluir portadores convencionales tales como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio de calidad farmacéutica, etc. Ejemplos de portadores farmacéuticos apropiados se describen en "Remington’s Pharmaceutical, Sciences" por E.W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del Terapéutico, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad apropiada del portador para proveer la forma para la administración apropiada al paciente. La formulación debe adecuarse al modo de administración.
La composición se puede formular de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Por lo general, las composiciones para administración intravenosa son soluciones reguladoras acuosas isotónicas estériles. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o mezclados juntos en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o un sobre que indique la cantidad del agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua de calidad farmacéutica estéril o solución salina. Cuando la composición se administra por inyección, una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina se puede proporcionar para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.
Los Terapéuticos de la invención se pueden formular como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con grupos amino libres tales como los derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico,
acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con grupos carboxilo libres tales como las derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos de hierro, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
La cantidad del Terapéutico que será efectiva en el tratamiento de un trastorno o afección particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección, y puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. Además, los ensayos in vitro opcionalmente se pueden emplear para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa a emplear en la formulación dependerá también de la vía de administración, y la gravedad de la enfermedad
o trastorno, y debe decidirse de acuerdo con el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente. Sin embargo, los intervalos de dosificación apropiados para administración intravenosa son generalmente aproximadamente de 20-500 microgramos del compuesto activo por kilogramo de peso corporal. Los intervalos de dosificación apropiados para la administración intranasal son por lo general aproximadamente 0.01 pg/kg de peso corporal a 1 mg / kg de peso corporal. Las dosis eficaces se pueden extrapolar a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba modelo in vitro o animales.
La invención también revela un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención Opcionalmente asociado con dicho(s) recipiente(s) puede(n) tener un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, anuncio que refleje la aprobación por la agencia de la fabricación, uso o venta para la administración humana.
5.11 Diagnóstico y detección
Las proteínas Nogo, análogos, derivados, y subsecuencias de las mismas, los ácidos nucleicos de Nogo (y secuencias complementarias de las mismas), los anticuerpos anti-Nogo, tienen usos en diagnóstico. Tales moléculas se pueden usar en ensayos, tales como inmunoensayos, para detectar, pronosticar, diagnosticar, o monitorear varias condiciones, enfermedades y trastornos que afectan a la expresión de Nogo, o monitorear el tratamiento de los mismos. En particular, dicho inmunoensayo se lleva a cabo por un método que comprende poner en contacto una muestra derivada de un paciente con un anticuerpo anti-Nogo bajo condiciones tales que pueda producirse el enlace inmunoespecífico, y detectar o medir la cantidad de cualquier enlace inmunoespecífico por el anticuerpo. En un aspecto específico, dicho enlace del anticuerpo, en secciones de tejido, se puede utilizar para detectar la localización de Nogo aberrante o niveles aberrantes (por ejemplo, bajos o ausentes) de Nogo. En una modalidad específica, el anticuerpo para Nogo se puede utilizar para ensayo en un tejido o muestra de suero del paciente para la presencia de Nogo donde un nivel aberrante de Nogo es una indicación de una condición de enfermedad. Por "niveles aberrantes," se entiende el aumento o disminución de los niveles relativos al nivel actual, o estándar que representa el actual, en una muestra análoga a partir de una porción del cuerpo o de un sujeto que no tiene el trastorno.
Los inmunoensayos que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como inmunohistoquímica, patología, transferencias Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorción con enzima ligada), inmunoensayos "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, ensayos de inmunohistoquímica, inmunoensayos de proteína A, por nombrar sólo algunos:
Los genes Nogo y subsecuencias y secuencias de ácido nucleico relacionadas, incluyendo las secuencias complementarias, también se pueden utilizar en ensayos de hibridación. Las secuencias de ácido nucleico de Nogo,
o subsecuencias de las mismas que comprenden aproximadamente al menos 8 nucleótidos, se pueden utilizar como sondas de hibridación. Los ensayos de hibridación se pueden utilizar para detectar, pronosticar, diagnosticar o monitorear las condiciones, desórdenes; o estados de enfermedad asociados con cambios aberrantes en la expresión y/o actividad de Nogo como se ha descrito supra. En particular, dicho ensayo de hibridación se lleva a cabo mediante un método que comprende poner en contacto un ácido nucleico que contiene muestra con una sonda de ácido nucleico capaz de hibridar con ADN o ARN de Nogo, bajo condiciones tales que puede producirse la hibridación, y detectar o medir cualquier hibridación resultante.
Por ejemplo, las enfermedades y trastornos que afectan los trastornos de crecimiento y desarrollo celulares pueden ser diagnosticados, o su sospecha de presencia pueden ser seleccionados, o una predisposición para desarrollar este tipo de trastornos se pueden detectar, mediante la detección de la disminución de los niveles de la proteína Nogo, ARN de Nogo, o actividad funcional de Nogo como la inhibición del crecimiento demostrada, o mediante la detección de mutaciones en proteína, ARN o ADN de Nogo (por ejemplo, translocaciones en los ácidos nucleicos de Nogo, truncaciones en el gen o proteína Nogo, cambios en secuencias de nucleótidos o de aminoácidos en relación con el Nogo de tipo salvaje) que causa disminución de la expresión de la actividad de Nogo. Tales enfermedades y trastornos incluyen, pero no se limitan a los descritos en la Sección 3 y la Sección 5.8.1.1. A modo de ejemplo, los niveles de proteína Nogo se pueden detectar por inmunoensayo, se pueden detectar niveles de ARN de Nogo mediante ensayos de hibridación (por ejemplo, transferencias Northern, transferencia puntual), el enlace de Nogo
con receptores de proteínas de inhibidor del crecimiento celular se puede hacer por ensayos de enlace comúnmente conocidos en la técnica, translocaciones y mutaciones puntuales en ácidos nucleicos de Nogo se pueden detectar mediante la transferencia Southern, análisis RFLP, PCR utilizando cebadores que generan preferiblemente un fragmento que abarca al menos la mayoría del gen Nogo, secuenciación del ADN genómico de Nogo o ADNc obtenido a partir el paciente, etc.
También se revelan los Kits para uso de diagnóstico, que comprenden uno o más recipientes un anticuerpo anti-Nogo, y, opcionalmente, un socio de enlace marcado para el anticuerpo. Alternativamente, el anticuerpo anti-Nogo se puede marcar (con un marcador detectable, por ejemplo, un quimioluminiscente, enzimática, fluorescente, o una fracción radiactiva). También se provee un kit que comprende en uno o más recipientes una sonda de ácido nucleico capaz de hibridar con ARN de Nogo. En una modalidad específica, un kit puede comprender en uno o más recipientes un par de cebadores (por ejemplo, cada uno en el rango de tamaño de 6-30 nucleótidos) que son capaces de cebar la amplificación [por ejemplo, por reacción en cadena de la polimerasa (ver por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA), reacción en cadena de la ligasa (ver EP 320,308) uso de Qβ replicasa, reacción de sonda cíclica, u otros métodos conocidos en la técnica] en condiciones de reacción apropiadas de al menos una porción de un ácido nucleico de Nogo. Un kit puede comprender además opcionalmente en un recipiente una cantidad predeterminada de una proteína o ácido nucleico de Nogo purificado, por ejemplo, para su uso como un estándar o control.
5.12 Proyección de agonistas y antagonistas de Nogo
Los derivados, proteínas y ácidos nucleicos de Nogo también tienen usos en ensayos de selección para detectar moléculas que se unen específicamente a los derivados, proteínas y ácidos nucleicos de Nogo y por lo tanto tienen un uso potencial como agonistas o antagonistas de Nogo, en particular, las moléculas que por lo tanto afectan la regulación del crecimiento celular. En una modalidad preferida, tales ensayos se realizan para seleccionar las moléculas con potencial utilidad como promotores de crecimiento neural para el desarrollo de fármacos. La invención revela así los ensayos para detectar las moléculas que se unen específicamente a derivados, proteínas o ácidos nucleicos de Nogo. Por ejemplo, se pueden utilizar las células recombinantes que expresan ácidos nucleicos de Nogo para producir proteínas Nogo recombinantemente en estos ensayos, para detectar las moléculas que se unen a una proteína Nogo. Las moléculas (por ejemplo, socios de enlace putativo de Nogo) se ponen en contacto con la proteína Nogo (o fragmento de la misma) en condiciones que conducen al enlace, y a continuación se identifican las moléculas que se unen específicamente a la proteína Nogo. Se pueden utilizar métodos similares para detectar las moléculas que se unen a derivados o ácidos nucleicos de Nogo. Los métodos que se pueden utilizar para llevar a cabo lo anterior se conocen comúnmente en la técnica,
A modo de ejemplo, una diversidad de bibliotecas, tales como bibliotecas de no-péptidos o de péptidos combinatorios o aleatorios se pueden seleccionar las moléculas que se unen específicamente a Nogo. Se pueden utilizar muchas bibliotecas que se conocen en la técnica, por ejemplo, bibliotecas de recombinantes sintetizados químicamente, (por ejemplo, bibliotecas de presentación de fagos), y bibliotecas basadas en traducción in vitro.
Ejemplos de bibliotecas sintetizadas químicamente se describen en Fodor et al., 1991, Science 251:767-773; Houghten et al., 1991, Nature 354:84-86: Lam et al., 1991, Nature 354:82-84; Medynski, 1994, Bio/Technology 12:709-710; Gallop et al., 1994, J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251; Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Natl, Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426; Houghten et al., 1992, Biotechniques 13:412, Jayawickreme et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618; Salmon et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712; PCT Publication No. WO 93/20242; y Brenner and Lerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5881-583..
Ejemplos de bibliotecas de presentación de fagos se describen en Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin et al., 1990, Science, 249:404-406; Christian, R.B., et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:711-718); Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152:149-157; kay et at, 1993, Gene 128:59-65; y PCT Publication No. WO 94/18318 con fecha Agosto 18,1994.
Bibliotecas basadas en traducción in vitro incluyen pero no se limitan a las descritas en PCT Publication No. WO 91/05058 con fecha 18 de abril, 1991; y Mattheakis et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026.
A modo de ejemplos de bibliotecas de no péptidos, una biblioteca de benzodiazepina (véase por ejemplo, Bunin et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712) se pueden adaptar para su uso. También se pueden utilizar, bibliotecas de péptidos Simon et al., 1992, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371). Otro ejemplo de una biblioteca que se puede utilizar, en la cual las funciones amida en los péptidos se han permetilado para generar una biblioteca combinatoria transformada químicamente, se describe por Ostresh et al. (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142).
La selección de las bibliotecas se puede lograr mediante cualquiera de una variedad de métodos comúnmente conocidos. Véase, por ejemplo, las siguientes referencias, que revelan la selección de bibliotecas de péptidos: Parmley and Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218; Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Fowlkes et al., 1992; BioTechniques 13:422-427; Oldenburg et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-53397; Yu et al., 1994, Cell 76:933-945; Staudt et al., 1988, Science 241:577-580; Bock et al., 1992, Nature 355:564-566; Tuerk et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992; Ellington et al., 1992, Nature 355:850-852; U.S. Patent No. 5,096,815, U.S. Patent No. 5,223,409, y U.S. Patent No. 5,198,346, todos a Ladner et al.; Rebar and Pabo, 1993, Science 263:671-673; y PCT Publication No. WO 94/18318.
A modo de ejemplo la selección se puede llevar a cabo poniendo en contacto los miembros de la biblioteca con una proteína Nogo (o ácido nucleico o derivado) inmovilizada sobre una fase sólida y la recolección de los miembros de la biblioteca que se unen a la proteína (o ácido nucleico o derivado). Ejemplos de tales métodos de selección, denominados técnicas "panning" se describen a modo de ejemplo en Parmley and Smith, 1988, Gene 73:305-318; Fowlkes et al., 1992. BioTechniques 13:422-427; PCT Publication No. WO 94/18318; y en las referencias citadas anteriormente.
Como otro ejemplo, el sistema de dos híbridos para seleccionar proteínas que interactúan en levadura (Fields and Song, 1989, Nature 340:245-246; Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582) se puede utilizar para identificar moléculas que se unen específicamente a una proteína Nogo o derivado.
5.13 Modelos animales
La invención también revela modelos animales, incluyendo pero no limitando a modelos en ratones, hámsters, ovejas, cerdos, ganado, y preferiblemente mamíferos no humanos.
En una modalidad, se proveen modelos animales para enfermedades y trastornos que involucran regeneración, crecimiento y extensión de neuritas. Tal animal se puede producir inicialmente promoviendo la recombinación homóloga entre un gen Nogo en su cromosoma y un gen Nogo exógeno que se ha vuelto inactivo biológicamente (preferiblemente por inserción de una secuencia heteróloga, por ejemplo, un gen de resistencia al antibiótico). En un aspecto preferido, esta recombinación homóloga se lleva a cabo mediante la transformación de las células madre derivadas de embriones (ES) con un vector que contiene el gen Nogo inactivado de forma insercional, de manera que se produce la recombinación homóloga, seguida por la inyección de las células ES en un blastocisto, e implantación del blastocisto en una madre adoptiva, seguido por el nacimiento del animal quimérico ("animal carente") en donde un gen Nogo ha sido inactivado (véase Capecchi, 1989, Science 244:1288-1292). El animal quimérico puede ser criado para producir animales carentes adicionales Tales animales pueden ser ratones, hámsters, ovejas, cerdos, vacas, etc., y son preferiblemente mamíferos no humanos. En una modalidad específica, se produce un ratón carente.
Se espera que tales animales carentes desarrollen o estén predispuestos a desarrollar enfermedades o trastornos que implican el sistema nervioso central y por lo tanto pueden tener uso como modelos animales de tales enfermedades y trastornos, por ejemplo, para seleccionar o probar moléculas (por ejemplo, el potenciales Terapéuticos de un trastorno del sistema nervioso para la capacidad de inhibir tumores del tejido nervioso y por lo tanto tratar o prevenir tales enfermedades o trastornos.
Varias referencias se citan en el presente documento, cuyas descripciones se incorporan por referencia en su totalidad.
6. EJEMPLO: Caracterización del nucleótido y producto de proteína del gen Nogo
Los ejemplos descritos en este documento demuestran que el gen clonado, Nogo, codifica una proteína que es un inhibidor del crecimiento celular neural potente y también se reconoce por los anticuerpos monoclonales descritos en Schwab et al., Patente de Estados Unidos No. 5.684.133.
6.1 Materiales y métodos
Las siguientes secciones describen los materiales y métodos utilizados en la presente invención. Un experto en la técnica reconocerá que estos materiales y métodos son meramente ilustrativos de la invención actualmente reivindicada y las modificaciones se contemplan por los presentes inventores. Se pretende que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
6.1.1 Purificación de Nogo de bovino a partir de mielina
Todos los pasos de purificación se llevaron a cabo a 4 °C y la actividad inhibidora del sustrato de las fracciones obtenidas se determinó rutinariamente por ensayos de propagación de NIH 3T3 y excrecencia de las neuritas PC12
(Sección 6.1.10). El tejido de la médula espinal bovina fue limpiado cuidadosamente quitando las meninges y se corta en trozos pequeños. A continuación, la mielina se extrajo en solución reguladora de extracción (CHAPS 60 mM, Tris-Cl 100 mM, pH 8,0, solución reguladora de EDTA 10 mM, pH 8,0, yodacetamida 2.5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 0.1 µg/ml de aprotinina, 1 µg/ml de leupeptina, 1 µg/ml de peptstatina A).
Para obtener el extracto de médula espinal, el tejido se homogeneizó directamente en solución reguladora de extracción CHAPS en una relación de (1:1; p:v). El homogeneizado se centrifugó dos veces a 100,000 X g (tipo Kontron: K50.13, ángulo fijo), durante 1 hora a 4 °C. El sobrenadante claro (extracto) se aplicó inmediatamente a una columna de Q-Sepharose (2.6 X 11.5 cm), equilibrada en solución reguladora A (Tris-Cl 20 mM, pH 8.0, 0.5% (p/v) de CHAPS). Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de volumen de cinco lechos de NaCl 0 a 1 M en solución reguladora A (100 ml de gradiente en 50 minutos). Las fracciones activas que contienen bovino NI220 eluyeron alrededor de NaCl 0.4 M y se combinaron (mezcla-q 1) para aplicaciones posteriores sobre columna Superdex 200 (2.6 X 60 cm), equilibrada en solución reguladora B (NaCl 150 mM, Tris-Cl 20 mM, pH 8.0, 0.5% (p/v) de CHAPS).
Las fracciones activas, después de la filtración en gel (mezcla-s 1) se separaron, mediante 6% de SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y potencia constante baja (2 watts / gel) por un total de 2500 Voltios-hora. Las bandas y regiones de gel se identificaron después de la tinción con azul de Coomassie (0.1% p/v de R250 en 50% de metanol y ácido acético al 10%), se cortaron, y extrajeron en 800 µl de solución reguladora de elución en gel (0.5% (p/v) de CHAPS, Tris-Cl 20 mM, pH 8.0, EDTA 10 mM, pH 8.0, yodacetamida 2.5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM,
0.1 µg/ml de aprotinina, 1 µg/ml de leupeptina, 1 µg/ml de pepstatina A) durante al menos 48 horas a 4 °C.
6.1.2 Microsecuenciación de Nogo purificado
El material de gel eluido activa neutralizable IN-1 de varios geles se volvió a fluir en un gel al 10% de SDSpoliacrilamida en condiciones reductoras, y se tiñeron con 0.1% (p/v) de Azul de Coomassie R250 en 50% de metanol y 10% de ácido acético. La banda de 220 kDa fue cortada, y la digestión con endoproteinasa Lys-C (relación molar 1:50) se realizó directamente en el gel. La muestra se acidificó y se aplicó a una columna de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa, los péptidos se separaron con un gradiente lineal (0100%) de 0.04% de ácido trifluoroacético y 80% de acetonitrilo, y las fracciones que contienen especies de péptidos individuales fueron sometidos a degradación de Edman automatizada.
6.1.3 Electroforesis de Nogo purificado
Se llevó a cabo una SDS-PAGE de alta resolución utilizando 6% (p/v) de geles de poliacrilamida de SDS (10 X 24 X
0.01 cm) bajo condiciones reductoras (ditiotreitol 100 mM). La transferencia sobre membranas Immobilon-P (Millipore) se realizó en base Tris 20 mM, glicina 192 mM, pH 8.3, 0.037% (p/v) de SDS, 20% de metanol con un aparato de transferencia semi-seca (Bio-Rad, Trans Blot SD). El tiempo de transferencia fue de 2 horas a 0.8 mA/cm2. El reactivo de bloqueo (1 hora a temperatura ambiente) fue de 3% de gelatina en PBS (solución salina reguladora con fosfato, pH 7.2, 8 g de NaCl, 0.2 g de KH2PO4, 2.8 g de Na2HPO4 • 12H2O, y 0.2 g de KCl, disuelto en 1 litro de agua) y la solución de lavado contenía Tris-Cl 20 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, y 0.4% de Tween (3 X 10 minutos a temperatura ambiente). El tiempo de incubación para el primer anticuerpo (para la dilución con 1% de gelatina en PBS) fue usualmente durante la noche a 4 °C. El anticuerpo secundario IgG anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano (1:2000) se incubó, durante 1 hora a temperatura ambiente. El sistema de quimioluminiscencia ECL se utilizó para la detección (Amersham Pharmacia Biotech)
6.1.4 Búsqueda de biblioteca de ADNc
La sustancia blanca disectada recientemente de la médula espinal de bovino, y poli(A)+ ARN se extrajo utilizando el kit FastTrack (Invitrogen). La construcción de bibliotecas de ADNc se realizó utilizando el kit Uni-ZAP (Stratagene) siguiendo las instrucciones del fabricante. La complejidad de las bibliotecas fue mayor que 4x106 unidades formadoras de placa en total, y el tamaño promedio de los insertos fue aproximadamente 1.8 kilobases.
Los oligonucleótidos degenerados MSC5-8 (MSC5: TCIGTIGGYAAIACIGCIGGYAARTC (SEQ ID No:47); MSC6:TCIGTIGGIAGIACIGCIGGYAAYTC (SEQ ID No:48); MSC7: TCIGTIGGYAAIACIGCIGGIAGRTC (SEQ ID No:49); MSC8: TCIGTIGGIAGIACIGCIGGIAGRTC (SEQ ID No:50)) se diseñaron a partir de la secuencia del péptido 1 bNI220, y MSC9 (GARATHGCIGAIATHCARGAYGGIGA (SEQ ID No:51)) se diseñó a partir de la secuencia del péptido 2 bNI220. Los oligonucleótidos fueron sintetizados por MWG Biotech (Munchenstein, Suiza) y se marcaron con el kit de marcación del extremo 3' del ADN DIG. Las ribosondas se sintetizaron utilizando el kit de marcación de ARN DIG (Boehringer Mannheim).
La hibridación con sonda y condiciones de lavado fueron como se describe por el fabricante (MSC5-8 y MSC9 se utilizaron a una temperatura de hibridación y lavado de 57 °C). La detección de la sonda se realizó utilizando el sistema CDP-star (Boehringer Mannheim). El manejo de la biblioteca de ADNc y la detección se realizaron de
acuerdo con los protocolos para las bibliotecas de ADNc ZAP lambda (Stratagene). Se utilizaron las membranas de nylon Genescreen (DuPont) para elevar la placa.
6.1.5 Secuenciación de ADN
Ambas hebras de CWP1-3, Oli18, Oli3, y R1-3U21 se secuenciaron con el sistema Perkin Elmer AB1377 por Microsynth (Balgach, Suiza). Las secuencias de ADN se analizaron por el programa DNASIS (Hitachi). Las búsquedas de bases de datos se realizaron con el programa BLAST (NCBI).
6.1.6 Análisis de ARN
El ARN total y poli (A) + ARN se extrajeron de los tejidos utilizando el RNAgent (Promega) o kit FastTrack (Invitrogen), respectivamente. Los ARN se separaron por electroforesis en geles de 1% de formaldehído y se transfirieron a membranas Genescreen. Las transferencias se hibridaron con ribosondas antisentido, que se generaron con el kit de marcación de ARN DIG (Boehringer Mannheim), a partir de los plásmidos relevantes. Las condiciones de hibridación de transferencia, de lavado, y de detección-star CDP fueron como se describe por el fabricante. La sonda “común”, EST111410 (TIGR, ATCC, Rockville, MD, EE.UU.) contiene la secuencia A de transcripción entre los nucleótidos 2535-4678, la sonda específica del exón 1 contiene la secuencia A de transcripción entre los nucleótidos 65 -769, y la sonda específica del exón 2 contiene la secuencia A de transcripción entre los nucleótidos 815 -3183.
6.1.7 Producción antisueros
El antisuero 472 (AS 472) se generó mediante Research Genetics, Inc. (Huntsville AL; EE.UU.) contra el péptido sintético P472, SYDSIKLEPENPPPYEEA (secuencia de bovino; SEQ ID No:33), que corresponde a la secuencia de aminoácidos de Nogo de rata en 623-640 de la SEQ ID No: 2, con tres apareamientos incorrectos.
Se generó el antisuero Bruna (AS Bruna) contra un fragmento de la proteína Nogo recombinante, expresada en E. coli como una proteína de fusión. Específicamente, se utilizó el carboxi terminal de la secuencia de nucleótidos de Nogo de rata que codifica los aminoácidos 762 a 1,163 de la SEQ ID No: 2 (expresada en E. coli utilizando el sistema Novagen pET) para generar antisueros anti-Nogo AS Bruna.
6.1.8 Electroforesis y transferencia Western
SDS-PAGE y Western Blot se realizaron por métodos estándar bien conocidos por los expertos en la técnica. Los anticuerpos se diluyeron de la siguiente manera: AS Bruna 1: 7,500; AS 472 1: 2,000; anti-myc (9E10) 1:5,000 (Invitrogen); 2 µg/ml de anti-BiP (Stressgen); se utilizó sobrenadante de hibridoma mAb IN-1 sin diluir. Los anticuerpos secundarios fueron: HRP anti-conejo conjugado (Pierce; 1: 20.000); IgM anti-ratón (1:50,000); y antiratón conjugada con fosfatasa alcalina (Milan Analytica AG, La Roche, Switzerland; 1: 5,000).
6.1.9 Inmunohistoquímica
El cerebelo o la médula espinal de rata adulta fue disectada rápidamente, se incrustó en el compuesto OTC y se congeló a -40 °C. Veinte secciones post mortem se cortaron y fijaron en etanol/ácido acético a 40 °C. La inmunotinción se realizó como se describe por Rubin et al., 1994, J. Neurocytol. 23:209-217, excepto que se omitió la etapa de apagado. Alternativamente, las secciones de tejido se fijaron con metanol (2 minutos a -20 °C), y la inmunotinción se llevó a cabo como per Rubin et al., supra. Los anticuerpos primarios utilizados fueron (Anticuerpo: (dilución)): sobrenadante de hibridoma de IN-1: (sin diluir); AS Bruna: (1: 5000); o purificado por afinidad AS 472: (1:50).
6.1.10 Ensayo de propagación de fibroblastos NIH 3T3
Los fibroblastos NIH 3T3 se sembraron en placas de cultivo pre-recubiertas con 5 µg/pozo de mezcla-q (= 1 cm2). La mezcla-q es la mezcla de las fracciones activas del extracto de médula espinal bovina separadas en una columna de sefarosa Q. Se utilizó IN-1 como sobrenadante de cultivo sin diluir (1-10 µg/ml), AS Bruna y suero pre-inmune se diluyeron 1:1000 en PBS, y el AS 472 y suero preinmune se diluyeron 1:500 en PBS. Para compensar las variaciones de actividad en diferentes preparaciones de mezcla-q el número de células redondas, inhibidas se sembró en placas, la mezcla-q se normalizó a 100% y a 0% sembradas en placas sobre solución reguladora de control (Spillman et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:19283-93).
6.1.11 Ensayo de excrecencia de neuritas DRG
Los ganglios de la raíz dorsal (DRG)s fueron disectados de embriones de pollo E16 en solución salina balanceada de Hank (HBSS), dividida en dos partes y se sembraron en placas pre-recubiertas con la mezcla-q en 100 µl de medio F12 con 10% de (FCS) y 1% de Methocel. La excrecencia de Neuritas de DRGs individuales se obtuvo después de 24 horas de incubación a 37 °C en una forma semi-cuantitativa utilizando una escala de 0 (no excrecencia) a 4 (máxima excrecencia).
6.1.12 ensayo de co-cultivo de DRG/Nervio óptico
Los nervios ópticos se disectaron de ratas adultas, se irradiaron con 5500 Grays y se inyectaron tanto con AS 472 o el suero pre-inmune correspondiente (dilución 1:10). Los pares de nervios se cultivaron en 3 cámaras de cultivo, de tal manera que un extremo de cada nervio se alcanzó a través de una barrera de anillo de teflón/grasa de silicona en la cámara media, donde se colocaron neuronas de DRGs primarias cultivadas disociadas de ratas P0. Después de dos semanas en cultivo, los nervios se fijaron con técnicas estándar conocidas en la técnica y se fijaron para microscopía electrónica (EM), y se tomaron secciones ultrafinas a una distancia de unos 3.5 mm desde la cepa expuesta de DRG. Las secciones se analizaron sistemáticamente para la presencia de axones de nuevo crecimiento utilizando un Zeiss EM 902.
6.1.13 Expresión de Nogo A en células COS
El marco de lectura abierto de Nogo A se subclonó en el vector pcDNA3.1mychis (Invitrogen) utilizando técnicas de clonación estándar conocidos en la técnica. El plásmido resultante (Nogo-myc19) dio lugar a una proteína recombinante que contiene la secuencia de Nogo A fusionada a la etiqueta myc-his (21 aminoácidos). Nogo-mycl9 (2 µg de ADN por plato de 35 mm) o plásmido control (pcDNAmychisLacZ) se transfectaron en células COS utilizando Superfect (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células transfectadas se recogieron 3648 horas después de la transfección. Basándose en la tinción de inmunofluorescencia con anticuerpo anti-myc y reacción de color β-galactosidasa enzimática, se estimó que la tasa de transfección media fue aproximadamente 20%. Las células COS transfectadas se fijaron con 95% de etanol/5% de ácido acético (4 °C, 25 minutos), se bloquearon en PBS/10% de FCS, y se incubaron con AS Bruna (1:200) o IN-1 (1:2) durante 2 horas en PBS/1% de FCS a temperatura ambiente. Las células se lavaron con PBS y reaccionaron con anticuerpos secundarios fluorescentes (cabra anti-conejo-FITC para AS Bruna y cabra anti-ratón-TRITC para detección de IN-1, Jackson Immuno Research Lab. Inc., West Grove, PA).
6.1.14 Cultivos de oligodendricitos
Los oligodendrocitos aislados a partir de cerebro de rata recién nacida se sembraron en matraces de poli-lisina de 75 cm2 (Sigma, St. Louis, MO) y se cultivaron durante 10-12 días en DMEM suplementado con 5% de FCS. Las poblaciones mezcladas, enriquecidas de oligodendrocitos y sus progenitoras se liberaron de la monocapa de astrocitos por agitación durante la noche a 210 rpm en un agitador orbital. Las células se sembraron a una densidad de 1-2x106 células en platos de 35 cm2 recubiertos con poli-lisina. Las progenitoras se dejaron diferenciar en medio químicamente definido (CDM) durante 3-4 días.
6.1.15 Biotinilación de la superficie celular
Se prepararon cultivos de cerebro completos de rata P4 como se describe en van der Haar, et al. (1998, J. Neurosci. Res. 51:371-81). En el día 7 in vitro se biotinilaron con la célula impermeable EZ-LINK-sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce) como se describe, excepto que todas las etapas se llevaron a cabo a 15 °C y las células se lisaron en 1 ml de solución reguladora de lisis (NaH2PO4 0.05 M pH 8.0, NaCl 0.15 M, 0.5% de CHAPS (Sigma), yodacetamida 2.5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 0.1 µg/ml de aprotinina, 1 µg/ml de leupeptina, 1 µg/ml de pepstatina A). Las proteínas biotiniladas fueron inmunoprecipitadas con Dynabeads M-280 de estreptavidina (Dynal) se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa que se probaron con AS472, α-Bip y α-β-tubulina. Las membranas se trataron con Kit Re-Blot Western Blot Recycling (Chemicon).
6.1.16 Inmunocitoquímica
Se prepararon los oligodendrocitos del nervio óptico como se describe en Schwab and Caroni (1988, J. Neurosci. 8:2381-2393). Los cultivos de dos días se incubaron con AS 472 (1:200) o mAb IN-1 (1:3) en medio, durante 25 minutos a temperatura ambiente (rt). Los cultivos se lavaron, se fijaron con paraformaldehído al 4%/sacarosa al 5% en PBS, y se bloquearon en ácido maleico 0.1 M/ reactivo de bloqueo al 2% (Boehringer Mannheim) durante 1 hora. Los anticuerpos conjugados de fosfatasa alcalina secundarios (Milan Analytica) se utilizaron a 1:7,500 en ácido maleico 0.1 M/ reactivo de bloqueo al 1% (1 hora, rt). Las células COS transfectadas se fijaron con 95% de etanol/ ácido acético al 5% (4 °C, 25 minutos), se bloquearon y se incubaron con AS Bruna (1:200) o mAb IN-1 durante 2 horas a rt. Las células se hicieron reaccionar con anticuerpo de cabra anti-conejo-FITC y de cabra anti-ratón TRITC (Jackson Immuno Research Lab).
6.1.17 Cámara de nervio óptico
Los pares de nervio óptico se cultivaron en un sistema de cultivo de 3 cámaras como se describe en Schwab et al. (1988, J. Neurosci. 8:2381-2393), inyectado con y expuesto a cualquiera de los dos AS 472 o el suero pre-inmune correspondiente (1:10). Los nervios ópticos se fijaron para microscopía electrónica (EM), y secciones ultrafinas se tomaron a una distancia de aproximadamente 3.5 mm desde la cepa expuesta de DRG. Las secciones se analizaron sistemáticamente para la presencia de nuevo crecimiento de axones utilizando un microscopio Zeiss EM 902.
6.2 Resultados experimentales
La siguiente sección revela los resultados experimentales obtenidos a partir de las secciones de métodos establecidos en el punto 6.1 y subsecciones.
6.2.1 Aislamiento de ADNc de Nogo
Se purificó el homólogo bovino de NI-250 de rata, bNI220, y los péptidos de la proteína purificada se generaron mediante digestión con proteasas. Múltiples oligonucleótidos degenerados etiquetados con digoxigenina fueron diseñados de acuerdo con seis secuencias diferentes de péptidos bNI220. Varios clones de ADNc se aislaron de la selección de una biblioteca de sustancia blanca de bovino utilizando estos oligonucleótidos. El inserto del clon más largo (CWP1-3, Figura 1a) se utilizó para sintetizar sondas para la posterior selección de bibliotecas de ADNc de rata. Los clones seleccionados a partir de tales selecciones se muestran en la Figura 1a. El análisis de la secuencia de ADN de estos clones de ADNc sugirió que tres diferentes transcritos originados de un gen, y este gen se designó Nogo. Los diferentes transcritos resultado probablemente de ya sea el uso del promotor alternativo como del corte y empalme alternativo (Nogo A, Nogo B y Nogo C; Figura 1b). Las secuencias de ADN se recopilaron a partir de los clones mostrados en la Figura 1A para crear el transcrito A, la secuencia de ADN que se muestra en la Figura 2a.
La traducción conceptual de los tres transcritos da lugar a los productos de proteína designados Nogo A (1163 aminoácidos), Nogo B (360 aminoácidos) y Nogo C (199 aminoácidos). Dado que Nogo A contiene todas las seis secuencias de péptidos obtenidos a partir de bNI220 purificado (Figura 2b), es equivalente probablemente a la proteína purificada, rata NI-250. Nogo A, B, y C tienen un carboxi terminal común de 188 aminoácidos (el dominio común), y Nogo A y B comparten un extremo amino de 172 aminoácidos. Nogo A es más largo que Nogo B por 803 aminoácidos debido al corte y empalme alternativo.
Ninguna de las isoformas de Nogo posee un tramo hidrófobo de aminoácidos en el N-terminal, que podría ser utilizado como un péptido señal convencional. Sin embargo, se ha descrito que las proteínas carecen de un péptido señal convencional pero aún son transferidas a través de membranas, por ejemplo factor de crecimiento de fibroblastos (Florkiewicz et al., 1995, J. Cell. Physiology 162:388-399), factor neurotrófico ciliar (Sendtner et al., 1994, J. Neurobiology 25:1436-1353) y la interleucina-1 (Rubartelli et al., 1990, EMBO J. 9:1503-1510). Las proteínas de membrana tales como commissureless (Tear et al., 1996, Neuron 16:501-514) también carecen de un péptido señal convencional no obstante se insertan en la membrana.
Aunque no existe un codón de terminación en marco en la región 5' no traducida putativa que defina inequívocamente el codón de iniciación, la siguiente evidencia sugiere que la metionina indicada en la Figura 2a es el codón de iniciación para Nogo A y Nogo B: (1) la secuencia alrededor de este codón de inicio presunto se ajusta bien con la secuencia de consenso para los sitios de inicio de la traducción (GCCGCC A/G CCATGG; SEQ ID No:34); (2) Se hicieron grandes esfuerzos para buscar más secuencias en dirección 5', mediante tanto la detección de la biblioteca y 5'-RACE. Ninguna de estas búsquedas han dado como resultado la identificación de más secuencias en dirección 5’; y (3) Nogo A recombinante eucariota expresado a partir de la metionina mencionada anteriormente tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 200 kD, según lo estimado por SDS-PAGE, que es indistinguible del endógeno de Nogo A de oligodendrocitos de rata (Figura 11a).
6.2.2 Análisis de la secuencia Nogo
Nogo A contiene siete sitios potenciales de N-glicosilación, sin embargo la evidencia bioquímica indica que Nogo A no tiene un importante componente de polisacárido. Nogo A también tiene diecinueve sitios de reconocimiento para PKC, y siete sitios de reconocimiento para la caseína quinasa II (Figura 2a). Los tres Nogos tienen dos dominios hidrófobos comunes carboxi terminal de 35 y 36 aminoácidos, respectivamente. Uno o ambos de ellos se pueden utilizar como dominios trans-o intra-membrana, que es consistente con la caracterización de bNI220 como una proteína de membrana integral. Nogo A (así como Nogo B y C) no contiene ninguno de los motivos de moléculas conocidas de adhesión celular, proteínas de matriz extracelular, u otras moléculas de orientación.
Se utilizaron secuencias de Nogo para buscar diferentes bases de datos para los genes homólogos, el dominio común carboxi terminal de los tres productos Nogo es similar (62.5%) a un gen humano identificado, nsp (c113 y srex en ratas, y chsrex en pollo) (Figura 3). Una EST de C. elegans y una Drosophila melanogaster EST también
tienen similitud significativa (16.6% y 13.6%, respectivamente) a ambos Nogo y nsp en esta misma región. Los dominios carboxi terminal de 180 aminoácidos de ambos Nogos y Nsps son altamente conservados a través de las especies de mamíferos (98.3% y 97.3%, respectivamente), lo que sugiere que pueden realizar funciones similares y esenciales. Fuera de esta región, la similitud para una proteína dada entre las especies también es alta (73% entre Nogo A de rata y bovino; 76.2% entre NSP-A y S-rexb; 50% entre Chs-rexb y NSP-A o S-rexb). La similitud entre NSPs y Nogos, sin embargo, está limitada a su dominio común carboxi terminal, hidrófobo (Figura 3a), y a la naturaleza ácida de las proteínas fuera de esta región conservada. Los NSPs (NSP-A, -B y -C) se han descrito previamente como productos específicos neuroendocrinos con funciones desconocidas. La hibridación in situ y la inmunohistología mostraron una localización neuronal de NSPs en el sistema nervioso. Recientemente se identificó otro gen humano, nsp-like-1, que también tiene una región hidrófoba carboxi terminal con 50% de similitud con ambos Nsp y Nogos.
6.2.3 Expresión de tejido Nogo
El patrón de expresión de Nogos se examinó mediante transferencia Northern e hibridación in situ. Cuando se utilizó una sonda "común" (Sección 6.1.6), tres transcritos de Nogo principales (Designados: A, 4.6 kb; B, 2.6 kb; y C, 1,7 kb) se detectaron en el nervio óptico, la médula espinal, y la corteza cerebral (Figura 4a). En ganglios de raíz dorsal, se detectaron sólo los dos transcritos más grandes. Se detectó un transcrito principal de 2.6 kb, en células PC12, mientras que una banda de 4.6 kb se puede detectar sólo después de largas exposiciones (Figura 4a). En nervio ciático, se detectaron niveles más bajos de los transcritos, siendo el principal transcrito la banda de 2.6 kb. Cuando la médula espinal y la célula PC 12 poli (A) + ARN se hibridaron con una sonda específica del exón I, sólo se detectaron los transcritos de 4.6 kb y 2.6 kb; cuando el cerebro posterior y el músculo esquelético poli (A) + ARN se hibridaron con una sonda de exón 2-específico, sólo se detectó el transcrito de 4.6 kb en el cerebro posterior (Figura 4b). Estos resultados verifican el mapa del transcrito mostrado en la Figura 1B. Los resultados de transferencia Northern, sin embargo, también demostraron que la expresión de Nogo no está restringida al sistema nervioso (Figura 4c); También se detectaron los transcritos de Nogo en el músculo esquelético (1.7 kb), el riñón (2.6 kb y 1.7 kb), el cartílago (del esternón, 1.7 kb), la piel (1.7 kb), el pulmón (2.6 kb) y el bazo (2.6 kb). Excepto para el músculo esquelético, que expresa los transcritos de Nogo C en un nivel alto, el nivel de transcritos de Nogo fuera del sistema nervioso es más bajo que el del sistema nervioso. Hasta el momento, los transcritos de Nogo A de 4.6 kb parecen ser transcritos únicamente en el sistema nervioso.
Las hibridaciones in situ en secciones de tejido del SNC de rata adulta utilizando la sonda común mostraron marcación moderada de filas de los cuerpos celulares en la sustancia blanca de varias partes del cerebro y la médula espinal. Esta disposición es típica de oligodendrocitos interfasciculares (Figura 5a, d). Además de los oligodendrocitos, varios tipos de neuronas también expresan los transcritos de Nogo en niveles altos (Figura 5c, e). En cerebelo, la doble tinción de las secciones con un anticuerpo anti-GFAP y la hibridación in situ mostró claramente una fuerte marcación de las células de Purkinje mediante la sonda Nogo, mientras que los astrocitos no se marcaron (Figura 5e, f). En los nervios ópticos de desarrollo, se detectaron los transcritos de Nogo ya en el día postnatal 0 (P0), i.e., varios días antes de que los ARNm de las proteínas principales de la mielina, la proteína proteolipídica (PLP) y la proteína básica de la mielina (MBP) se puedan detectar (Figura 6). Este momento es consistente con la aparición de los primeros oligodendrocitos galactocerebrósido-positivos y la expresión de una actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas, que puede ser neutralizada por IN-1.
Los antisueros se generaron contra un péptido sintético basado en una secuencia específica de Nogo A de bovino (AS 472), y contra un recombinante de 45 kD, Nogo A parcial de rata (AS Bruna) (Sección 6.1.7). AS 472 y AS Bruna cada uno, reconoció una proteína de aproximadamente 200 kD en mielina de bovino, y AS Bruna reconoció además una proteína de mielina de rata 200 kD en transferencia Western (Figura 7). Las secciones de médula espinal y cerebelo de rata adulta se tiñeron con AS 472, AS Bruna, e IN-1. Cuando las secciones se fijaron con etanol/ácido acético (un procedimiento mostrado anteriormente que se requiere para la preservación y accesibilidad de los antígenos IN-1), se observó una fuerte tinción de la sustancia blanca/mielina con los tres anticuerpos (Figura 8). La tinción de cuerpos de células de oligodendrocitos fue particularmente distinta con AS Bruna. El tratamiento de las secciones congeladas frescas con metanol en lugar de etanol/ácido acético abolió la tinción de la mielina a excepción de los cuerpos celulares de oligodendrocitos.
AS Bruna y AS 472 también tiñeron algunos tipos de neuronas, incluyendo las neuronas motoras en la médula espinal, y capas granulares y moleculares en el cerebelo. Las células de Purkinje se tiñeron fuertemente con AS 472 y AS Bruna, pero no hubo tinción detectable con IN-1.
6.2.4 Los anticuerpos de Nogo inhiben la inhibición del crecimiento inducido de Nogo in vitro
Las preparaciones de NI-220 de la médula espinal de bovino semi-purificada (mezcla-q) pueden prevenir la propagación de fibroblastos NIH 3T3 y la excrecencia de las neuritas. En presencia de cualquiera de los antisueros de Nogo, AS Bruna, AS 472, o IN-1, se redujo la actividad inhibidora de la mezcla-q, i.e., los fibroblastos NIH 3T3 se sometieron a propagación y neuritas extendidas ganglios de la raíz dorsal (DRG) de embriones de pollo en placas recubiertas con la mezcla-q (Figura 9). La especificidad se demostró mediante la adición del péptido P472, que fue
el péptido utilizado para levantar AS 472 (Sección 6.1.7). P472 bloqueó exitosamente el efecto inhibidor de AS 472, mientras que, un péptido control no tuvo ningún efecto sobre la inhibición.
Además, la presencia de Nogo A en la superficie celular de los oligodendrocitos se demostró inmunocitoquímicamente, funcional y bioquímicamente utilizando AS 472. Cuando los oligodendrocitos cultivados primarios vivos, se tiñeron con ya sea mAb IN-1 o AS 472, se observó una tinción relativamente débil (en comparación con la inmunocitoquímica para galactocerebrósido) pero clara de la superficie en los oligodendrocitos diferenciados (Figura 15a, c). La adición del péptido (P472) que compite por AS 472 o que omite el anticuerpo primario suprimió la tinción específica (Figura 15b, d). La biotinilación de la superficie celular y posterior precipitación con estreptavidina además demostró la presencia de Nogo A en la membrana plasmática de los oligodendrocitos. En el precipitado, AS 472 detectó una banda que corre aproximadamente 40 kD por encima de la banda inmunopositiva de AS 472 intracelular, probablemente no procesada y no glicosilada. La proteína de ER BiP no podría ser detectada en la fracción biotinilada (Figura 15e).
Nogo A como una molécula de superficie celular de oligodendrocitos se analizó también funcionalmente. El cocultivo de los oligodendrocitos y fibroblastos NIH 3T3 u oligodendrocitos y neuronas de DRG mostró claramente las propiedades inhibitorias de los oligodendrocitos maduros. Estos ensayos
8.3 Nogo pertenece a una nueva familia de moléculas reguladoras de neuritas
El análisis de secuencia de Nogo revela motivos no conocidos de las proteínas de la superficie celular o matriz que participan en la guía axonal (repulsiva o atractiva); i.e. podrían ser identificado dominios de EGF, fibronectina tipo III
o no Inmunoglobulina. Tampoco hubo homología con los inhibidores de crecimiento neural descritos, las Semaforinas, las Netrinas, o las Efrinas.
Los Nogos forman una familia novedosa con un grupo de proteínas recientemente descritas, las proteínas la NSP/srex y NSP-like 1, basándose en la similitud de sus 180 aminoácidos carboxi terminal. Al igual que en el caso de Nogo, tanto el uso alternativo del promotor (ambos genes Nsp y Nsp-like 1) como el corte y empalme alternativo (solo Nsp) son responsables de la producción de productos de proteína alternativos con carboxi terminal común que contienen dos tramos de aminoácidos hidrófobos. Como se indica por el nombre, las NSPs (proteínas neuroendocrinas específicas) se expresan predominantemente en las neuronas y varios tipos de células endocrinas. Se localizan en la mayoría de los casos intracelularmente en asociación con el retículo endoplásmico. El gen NSPlike 1 se expresa predominantemente en cerebro y músculo. No se conocen las funciones de las familias de NSP ni tampoco de Nsp-like 1. El hecho de que existen ortólogos potenciales en ambos C. elegans y Drosophila melanogaster sugiere que Nogo, con su regeneración del nervio y actividad inhibidora de la germinación, puede ser un miembro recién desarrollado y hasta ahora sin describir de la familia de NSP.
8.4 Nogo en tejidos no neuronales
El transcrito de Nogo C se expresa en el músculo esquelético en un nivel comparable al del sistema nervioso. Una posible función de Nogo C de músculo es repeler a los axones motores y limitarlos en la región de placa terminal motora. Los bajos niveles de expresión de Nogo también se pueden detectar en otros tejidos no nerviosos. La inhibición observada de la propagación de fibroblastos y astrocitos por el extracto de mielina y NI-250 alude a la presencia de receptores y mecanismos de respuesta de las proteínas Nogo en estas células. Esto sugiere una posible función general de Nogos en la inhibición del contacto del movimiento celular.
La presente invención no debe estar limitada en su alcance por las modalidades específicas descritas en el presente documento. De hecho, diversas modificaciones de la invención además de las descritas en el presente documento serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y las figuras adjuntas. Se pretende que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. 10b). Los últimos se encontraron exclusivamente asociados con membranas basales y astrocitos en la superficie de los nervios. En contraste, la mayoría de los nervios ópticos inyectados con AS 472 contuvieron un número considerable de los axones, a menudo hasta varios cientos. El contacto con la mielina con frecuencia se podía ver (Figura 10c, d).
6.2.6 Reconocimiento de Nogo a recombinante por IN-1
Cuando Nogo A se expresó como una proteína recombinante myc-his-etiquetada carboxi terminal en células COS transfectadas, la transferencia Western usando tanto anticuerpos anti-myc como AS Bruna demostró que el Nogo A recombinante tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 200 KD en geles de SDS desnaturalizantes (Figura 11a). En la misma transferencia, una banda de movilidad similar se detectó por AS Bruna en oligodendrocitos de rata de cultivo primario, sugiriendo que Nogo A recombinante tiene un peso molecular casi idéntico que el Nogo A endógeno a partir de oligodendrocitos (Figura 1a). Cuando las células COS transfectadas se tiñeron por inmunofluorescencia con IN-1 y AS Bruna, IN-1 y AS Bruna, se reconocieron las mismas, células
transfectadas (Figura 11b, c). La mayoría de la inmunoreactividad se localizó intracelularmente y fue accesible solamente después de la permeabilización.
6.2.7 Mapeo de la(s) región(es) activa(s) de Nogo
Se generó una serie de mutantes de deleción de Nogo con el fin de mapear el(los) dominio(s) inhibidor(es) o
5 región(es) de Nogo. Las construcciones de deleción del gen Nogo se generaron utilizando sitios de restricción internos, digestiones con exonucleasa III de frijol mung y reacciones en cadena de la polimerasa. Una descripción de los mutantes se provee en la Figura 18 y su Breve Descripción. La mayoría de las construcciones tienen una etiqueta T7 N-terminal para la identificación con anticuerpos monoclonales anti-T7; y una etiqueta de hexahistidina N-o C-terminal ("His-tag") para la purificación utilizando cromatografía de afinidad Co(II) inmovilizada. Los mutantes
10 de deleción de Nogo, denominados NiG-D1, NiG-D2, hasta NiG-D20, todos fueron probados mediante el ensayo de propagación de fibroblastos NIH 3T3 para determinar la actividad inhibidora. Algunos mutantes se pusieron a prueba en ensayos de excrecencia de las neuritas PC12, excrecencia de neuritas de DRG de rata disociada o con tiras de membrana ganglios de la retina. Los resultados se muestran, a continuación en la Tabla 2.
Tabla 2. Actividades funcionales de mutantes de deleción Nogo
3T3
PC12 DRG RGC
Nogo-A
++ + +
Nogo-B
+
Nogo-C
- -
NiAext
++ + +
EST
+/-
NiR
+
NiG
++ +
NiG-D11
+
NiG-D2
+
NiG-D3
++
NiG-D4
+
NiG-D5
-
NiG-D7
+
NiG-D8
+
NiG-D9
+
NiG-D10
+/-
NiG-D14
-
NiG-D15
+
NiG-D16
+
NiG-D17
+
3T3
PC12 DRG RGC
NiG-D18
+
NiG-D20
++
Un resultado positivo en el ensayo de fibroblastos NIH 3T3 (3T3) o ensayo de PC12 se anota cuando los fibroblastos
o las células PC12 son ocupados de la propagación en una placa recubierta con una preparación de Nogo obtenido de un mutante de deleción. Un resultado positivo en el ensayo excrecencia de neuritas de ganglio de la raíz dorsal de embrión de pollo (DRG) o el ensayo de colapso del cono de crecimiento del ganglio (RGC) indica que la excrecencia de neuritas se inhibe o que causa que el cono de crecimiento colapsa en presencia de una preparación de Nogo obtenido de un mutante de deleción.
Los datos indican que se identificó un dominio inhibidor principal en la región específica de Nogo A de los números de aminoácidos 172 -974, en particular los números de aminoácidos 542-722. Además, la secuencia N-terminal de Nogo-A y Nogo-B (números de aminoácido 1 -171) también fue inhibidora de la propagación de 3T3. Basándose en los resultados, las regiones de Nogo a partir de los números de aminoácidos 172 -259, y de los números 975 -1162 parecen ser no esenciales y pueden eliminarse sin pérdida de actividad inhibidora.
7. EJEMPLO: Ácidos nucleicos y proteínas de Nogo humano, derivados y fragmentos
La presente invención provee las secuencias de nucleótidos que codifican los fragmentos de proteínas Nogo humanas. La secuencia de aminoácidos de Nogo humano se representa en la Figura 13 y ha sido asignada SEQ ID No: 29
La presente invención también provee secuencias de nucleótidos de fragmentos del gen Nogo humano. La secuencia de nucleótidos de Nogo humano se puede determinar utilizando el transcrito de Nogo A de rata como una ayuda para alinear y empalmar juntas las etiquetas de secuencias expresadas humanas (EST) que son homólogas a la secuencia de ADNc de rata o bovino.
Por ejemplo, las EST AA081783 y AA333267 (Sección 5.1) se solapan entre sí y corresponden a las posiciones de ácidos nucleicos 765 a 1272 de Nogo A de rata (Figura 2a; SEQ ID No: 1). Las EST AA322592, AA092565 y AA081525 (sección 5.1) también se superponen entre sí y las secuencias superpuestas corresponden a los ácidos nucleicos 1642 a 2131de Nogo de rata. Estos dos conjuntos independientes de ESTs superpuestas no se pueden alinear para dar la secuencia humana sin comparación directa por ordenador con la secuencia de nucleótidos de Nogo de rata o bovino de la presente invención. Para la alineación por ordenador inicial, se prefiere ENTREZ Nucleotide QUERY. Otros programas de alineación por ordenador, se muestran en la Sección 5.1, como ejemplos alternativos y no están destinados a limitar el alcance de programas de ordenador que se puede utilizar.
8. Discusión
8.1 Clonación del inhibidor de crecimiento de neuritas Nogo
Nogo A tiene muchas propiedades que lo soportan siendo el NI-250 de rata descrito previamente, una importante proteína inhibidora de excrecencia de las neuritas de mielina del SNC y el antígeno del IN-1. A nivel molecular, Nogo A contiene los seis péptidos originalmente obtenidos por medio de la secuenciación de bNI-220, el componente más inhibidor de la mielina de la médula espinal bovina. En el nivel de expresión, los oligodendrocitos son el principal tipo de células de SNC adulto para la expresión de Nogo A, y el momento de la expresión de Nogo en el nervio óptico coincide con la descripción anterior de una actividad inhibidora de la mielina neutralizada IN-1 para el crecimiento de las neuritas. Además, la transferencia Western reveló la presencia de Nogo A en fracciones activas de la mezcla-q, y la sustancia blanca de varias regiones del SNC se tiñó con AS Bruna así como AS 472 (específica para Nogo A) en un patrón idéntico al de IN-1. Ambos hechos coinciden con la interpretación de que Nogo A es NI-250.
Dos antisueros construidos contra las secuencias de Nogo A, AS Bruna y AS 472, disminuyeron en gran medida la actividad inhibidora de una preparación de la médula espinal bovina parcialmente purificada (mezcla-q). AS 472 también permitió el crecimiento interno de un gran número de axones de los ganglios de la raíz dorsal por encima de varios milímetros, en explantes del nervio óptico de adultos, muy similares a IN-1.
Aunque el peso molecular calculado de Nogo A es aproximadamente 140 kD, este tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 200 kD en geles de SDS desnaturalizantes, el cual está en el rango de la estimación previa de aproximadamente 250 kD. La movilidad aberrante de Nogo A en geles de SDS probablemente se causa por su
naturaleza ácida en lugar de las modificaciones post-traduccionales. La movilidad aberrante de las proteínas en SDS-PAGE se ha postulado para otras proteínas altamente ácidas tales como la Proteína Asociada con el Crecimiento GAP-43, así como NSP-A. Además, Nogo A recombinante expresado en bacterias tiene el mismo peso molecular aparente que el de Nogo A endógeno expresado por oligodendrocitos de rata. Esto va en contra de las principales modificaciones del mecanismo de Nogo A, tal como la glicosilación.
8.2 Nogo impide la regeneración y restringe la plasticidad del SNC adulto
La expresión de Nogo en los oligodendrocitos del nervio óptico de rata de P0 coincide bien con los hallazgos anteriores de una actividad inhibidora del crecimiento de neuritas neutralizables IN-1. Curiosamente, esta expresión precede a la de las principales proteínas de la mielina, y la formación de mielina compacta por varios días. La apariencia de Nogo, posiblemente en respuesta a las señales axonales, podría prevenir además el crecimiento del axón en los correspondientes tractos de fibras (los números de axón pico en E20 en nervios ópticos de rata). Nogo también podría inhibir la formación colateral y por lo tanto estabilizar la estructura general del SNC diferenciado. En materia gris de diferentes regiones del SNC, el contenido de la mielina y la inmunoreactividad de IN-1 se correlacionan inversamente con el nivel de GAP-43 y el potencial de plasticidad de las regiones dadas. De hecho, los anticuerpos IN-1 aplicados al SNC adulto permiten que la germinación y la plasticidad ocurran en el tronco cerebral y la médula espinal en una medida conocida anteriormente sólo del SNC del recién nacido. La gran recuperación funcional que es paralela a esta plasticidad indica que los axones de germinación son capaces de formar conexiones funcionalmente apropiadas.
Se ha demostrado previamente que la respuesta de las neuronas para Nogos inhibitorios difiere entre las neuronas de diferentes edades. Presumiblemente, esto se debe a una expresión diferencial de los receptores, que se espera que en fecha cercana se caracterice. Al igual que las Netrinas y muchos factores de crecimiento, la existencia de diferentes receptores Nogo, las cuales desencadenan diferentes respuestas, sigue siendo una posibilidad. El hecho de que Nogos también se expresan en algunos tipos de puntos de neuronas para posibles interacciones entre las mismas y/o diferentes isoformas de Nogo.
8.3 Nogo pertenece a una nueva familia de moléculas reguladora de neuritas
Análisis de secuencias de Nogo revela motivos no conocidos de las proteínas de la superficie celular o matriz que participan en la guía axonal (repulsiva o atractiva); i.e., dominios de EGF, fibronectina tipo III, o no inmunoglobulina podrían ser identificados. Tampoco hubo homología con los inhibidores del crecimiento neural descritos, las Semaforinas, las Netrinas, o las Efrinas.
Nogos forman una familia novedosa con un grupo de proteínas recientemente descritas, las proteínas NSP/s-rex y NSP-like 1, basándose en la similitud de sus 180 aminoácidos carboxi terminal. Al igual que en el caso de Nogo, tanto el uso del promotor alternativo (ambos genes Nsp y Nsp-like 1) y el corte y empalme alternativo (solo Nsp) son responsables de la producción de productos de proteína alternativos con extremos carboxi comunes que contienen dos tramos de aminoácidos hidrófobos. Como se indica por el nombre, las NSPs (proteínas específicas de neuroendocrinos) se expresan predominantemente en las neuronas y varios tipos de células endocrinas. Se localizan sobre todo intracelularmente en asociación con el retículo endoplásmico. El gen NSP-like 1 se expresa predominantemente en cerebro y músculo. No se conocen las funciones de las familias de NSP ni tampoco de Nsplike 1. El hecho de que existen ortólogos potenciales en ambos C. elegans y Drosophila melanogaster sugiere que Nogo, con su regeneración del nervio y la actividad inhibidora de la germinación, puede ser un miembro recién evolucionado y hasta ahora sin describir de la familia de NSP.
8.4 Nogo en tejidos no neuronales
El transcrito de Nogo C se expresa en el músculo esquelético en un nivel comparable al del sistema nervioso. Una de las funciones imaginables de Nogo C de músculo es repeler a los axones motores y limitarlos en la región de placa motora terminal. Los bajos niveles de expresión de Nogo también se pueden detectar en otros tejidos nonervios. La inhibición observada de propagación de fibroblastos y astrocitos por el extracto de la mielina y NI-250 alude a la presencia de receptores y mecanismos de respuesta para las proteínas Nogo, en estas células. Esto sugiere una posible función general de Nogos en la inhibición de contacto del movimiento celular.
La presente invención no debe estar limitada en su alcance por las modalidades específicas descritas en el presente documento. De hecho, diversas modificaciones de la invención además de las descritas en el presente documento serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y las figuras adjuntas. Se pretende que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Listado de secuencias
<110> Universidad de Zürich
<120> SECUENCIAS DE NUCLEÓTIDOS Y PROTEÍNAS DE GENES NOGO Y MÉTODOS BASADOS EN ESTAS
<130> NIAG-001-EP-DIV1
<150> 99972673.0
<151> 1999-11-05 5 <150> PCT/US99/26160
<151> 1999-11-05
<150> 60/107,446
<151> 1998-11-06
<160> 51 10 <170> FastSEQ para la Versión 3.0 de Windows
<210> 1
<211> 3741
<212> ADN
<213> Rattus sp. 15 <220>
<221> CDS
<222> (253)...(3741)
<400> 1
<210> 2
<211> 1163
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 2
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> Bos sp.
<400> 3
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Bos sp.
<400> 4
<210> 5
<211> 15
<212> PRT 10 <213> Bos sp.
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)...(2)
<223> Xaa = cualquier aminoácido 15 <400> 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT 20 <213> Bos sp.
<220>
<221> VARIANTE
<222> 2,5
<223> Xaa = cualquier aminoácido 25 <400> 6
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> Bos sp.
<400> 7
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> Bos sp.
<400> 8
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> Bos sp. 15 <400> 9
<210> 10
<211> 12
<212> PRT 20 <213> Bos sp.
<400> 10
<210> 11
<211> 15 25 <212> PRT
<213> Bos sp.
<400> 11
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> Bos sp.
<400> 12
<210> 13 10 <211> 11
<212> PRT
<213> Bos sp.
<400> 13
15 <210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> Bos sp.
<400> 14
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> Rattus sp. 25 <400> 15
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 16
<210> 17
<211> 15 10 <212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 17
<210> 18 15 <211> 9
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 18
20 <210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 19
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 20
<210> 21
<211> 186
<212> PRT 10 <213> Homo sapiens
<400> 21
<210> 22
<211> 186 15 <212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 22
<210> 23
<211> 186
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 23
<210> 24
<211> 186
<212> PRT
<213> Bos sp.
<400> 24
<210> 25
<211> 186
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 25
<210> 26
<211> 194
<212> PRT
<400> 26
<210> 27
<211> 150
<212> PRT
<400> 27
<210> 28
<211> 3833
<212> ADN 10 <213> Bos sp.
<400> 28
<210> 29
<211> 1178
<212> PRT 5 <213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(1178) en toda la posición Xaa
<223> Xaa = cualquier aminoácido 10 <400> 29
<210> 30
<211> 1163 <212> PRT
<213> Rattus sp.
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(1163) en toda la posición Xaa
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<400> 30
<210> 31
<211> 1568
<212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 31
<210> 32
<211> 199
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 32
<210>
34 <211> 13 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 34 gccgccrcca tgg 13 <210> 35 <211> 248 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)... (248) en todas las posiciones n <223> n=a, c, g o t <400> 35
<210>
36 <211> 379 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)... (36) en todas las posiciones n
10 <223>n=a,c,g o t
<400> 36
<210> 37
<211> 281 15 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)... (281) en todas las posiciones n 20 <223>n=a,c,g o t
<400> 37 <210> 38
<211> 640
<212> ADN 5 <213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)... (640) en todas las posiciones n
<223>n=a,c,g o t 10 <400> 38
<210> 39
<211> 346
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)... (346) en todas las posiciones n
<223>n=a,c,g o t 20 <400> 39
<210> 40
<211> 325
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 40
<210> 41
<211> 338
<212> ADN 10 <213> Homo sapiens
<400> 41
<210> 42
<211> 480 15 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)... (480) en todas las posiciones n 20 <223>n=a,c,g o t
<400> 42
<210> 43
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
<210> 44
<211> 16 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
<210> 45 15 <211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
20 <210> 46
<211> 50
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
<210> 47 5 <211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> oligonucleótidos degenerados diseñados de la secuencia 1 del péptido NI220 de bovino 10 <220>
<221> base_modificada
<222> (1)... (26) en todas las posiciones n
<223> n=inosina
<400> 47 15 tcngtnggya anacngcngg yaartc 26
<210> 48
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial 20 <220>
<223> oligonucleótidos degenerados diseñados de la secuencia 1 del péptido NI220 de bovino
<220>
<221> base_modificada
<222> (1)... (23) en todas las posiciones n 25 <223> n=inosina
<400> 48 tcngtnggna gnacnggyaa ytc 23
<210> 49
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial 5 <220>
<223> oligonucleótidos degenerados diseñados de la secuencia 1 del péptido NI220 de bovino
<220>
<221> base_modificada
<222> (1)... (25) en todas las posiciones n 10 <223> n=inosina
<400> 49 tcngtnggya anacngcggn agrtc 25
<210> 50
<211> 26 15 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> oligonucleótidos degenerados diseñados de la secuencia 1 del péptido NI220 de bovino
<220> 20 <221> base_modificada
<222> (1)...(26) en todas las posiciones n
<223> n=inosina
<400> 50
tcngtnggna gnacngcngg nagrtc 26 25 <210> 51
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220> 30 <223> oligonucleótidos degenerados diseñados de la secuencia 2 del péptido NI220 de bovino
<220> <221> base_modificada
<222> (1)... (26) en todas las posiciones n
<223> n=inosina
<400> 51 garathgcng anathcarga yggnga 26

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un fragmento de proteína NogoA humana que consiste de
    (a) aminoácidos (i) 132-939, (ii) 206-501, o (iii) 501-680, de una secuencia con más de 90% de identidad sobre la longitud total de SEQ ID No: 29, o de SEQ ID No: 29, o
    5 (b) SEQ ID No: 29 que carece de los residuos de aminoácidos 132-206 y 939-1127, pero por lo demás comprende el resto de SEQ ID No: 29.
  2. 2.
    El fragmento de proteína de acuerdo con la reivindicación 1, que está libre de todo el material de mielina del SNC.
  3. 3.
    El fragmento de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que muestra actividad inhibidora de Nogo.
    10 4. Un ácido nucleico aislado que codifica el fragmento de proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
  4. 5.
    El fragmento de la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para uso como un medicamento.
  5. 6.
    El uso del fragmento de proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, siendo dicha proteína activa en la inhibición de la proliferación celular en un sujeto, para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad neoplásica del sistema nervioso central.
    15 7. El uso de la reivindicación 6, en donde la enfermedad neoplásica del sistema nervioso central se selecciona del grupo que consiste en: glioma, glioblastoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, y retinoblastoma.
  6. 8. El fragmento de la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso en el tratamiento de glioma,
    glioblastoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, 20 oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, o retinoblastoma.
  7. 9. El fragmento de la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso como un inmunógeno para generar anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a tal inmunógeno.
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