JP2003520572A - ケラチノサイト増殖因子−２ - Google Patents

ケラチノサイト増殖因子−２

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kgf
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ドナ・メンドリック
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ニ・ジャン
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ヨアヒム・エル・グルーバー
パトリック・ジェイ・ディロン
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新しく同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、そしてまたそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関する。さらに具体的には、本発明のポリペプチドは、ケラチノサイト増殖因子（以下、「ＫＧＦ−２」とよぶこともある）であり、以前には線維芽細胞増殖因子１２(ＦＧＦ−１２)として知られていたものである。本発明はさらに、創傷治癒を促進または加速するためのＫＧＦ−２の治療的使用にも関する。本発明は、高い活性、増加した安定性、高い収率またはよりよい溶解性を示すＫＧＦ−２の新規な変異体形にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
製造に関する。とりわけ、本発明のポリペプチドは、時として以下で「ＫＧＦ−
２」と呼び、以前から線維芽細胞増殖因子１２(ＦＧＦ−１２)としてもまた知ら
れている、ケラチノサイト増殖因子−２である。本発明はさらに、創傷治癒を促
進または増進するための、ＫＧＦ−２の治療上の使用に関する。本発明はまた、
高められた活性、増大された安定性、より高い収率、またはより良好な溶解性を
示す、新規変異体型のＫＧＦ−２にも関する。加えて、本発明は、ＫＧＦ−２ポ
リペプチドを精製する方法に関する。
【０００２】 （関連技術） 線維芽細胞増殖因子ファミリーは、軟組織の増殖および再生に関与する増殖因
子の大きなファミリーとして現れた。それには、様々な程度の相同性をタンパク
質レベルで共有し、１つの例外はあるが、同様の広範なマイトジェンスペクトル
を有するらしい幾つかのメンバー、すなわち、中胚葉および神経外胚葉起源の様
々な細胞の増殖を促進する、および／または脈管形成を促進する幾つかのメンバ
ーが現在含まれる。 そのファミリーの様々なメンバーの発現パターンは、幾つかの発生段階の極め
て限られた発現から様々な組織および器官における幾分遍在する発現にまで及び
、非常に様々である。メンバーは全て、ヘパリンおよび硫酸ヘパリンプロテオグ
リカン並びにグリコサミノグリカンに結合して、細胞外マトリックス中に強く集
中するらしい。ＫＧＦは、元来、配列相同性または因子精製およびクローニング
により、ＦＧＦファミリーの一員として同定された。ケラチノサイト増殖因子(
ＫＧＦ)は、培養されたマウスのケラチノサイトラインのマイトジェンとして単
離された(Ｒubin, Ｊ. Ｓ. ら，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８６：８
０２−８０６（１９８９）)。ＦＧＦファミリーの他のメンバーとは違って、そ
れは、間葉から得られる細胞に対して殆ど活性を有していないが、上皮細胞の増
殖を刺激する。ケラチノサイト増殖因子遺伝子は、１９４のアミノ酸ポリペプチ
ドをコードする(Ｆinch, Ｐ. Ｗ. ら，Ｓcience ２４５：７５２−７５５（１９
８９）)。Ｎ末端の６４のアミノ酸は独自のものであるが、残りのタンパク質は
、bＦＧＦに対して約３０％の相同性を有する。ＫＧＦは、ＦＧＦファミリーの
最も逸脱したメンバーである。その分子は、疎水性シグナル配列を有しており、
効果的に分泌されている。翻訳後修飾には、そのシグナル配列の切断、および１
つの部位でのＮ結合型グリコシル化が含まれ、結果的には、２８kＤaのタンパク
質を生ずる。ケラチノサイト増殖因子は、皮膚および胎児の肺から得られる線維
芽細胞により産生される(Ｒubinら，１９８９）)。ケラチノサイト増殖因子のm
ＲＮＡは、成人の腎臓、結腸、および腸骨において発現するが、脳または肺にお
いては発現しないことが見いだされた(Ｆinch, Ｐ. Ｗ. ら，Ｓcience ２４５：
７５２−７５５（１９８９）)。ＫＧＦは、ＦＧＦタンパク質ファミリー内の保
存領域を示す。ＫＧＦは、ＦＧＦ−２受容体に高い親和性で結合する。
【０００３】 損なわれた創傷治癒は、病的状態の重要な原因であって、結果的には、離開、
吻合破壊、および未治癒の創傷といったような合併症を生じ得る。正常な個体に
おいては、創傷治癒は、面倒になることなく成し遂げられる。対照的に、損なわ
れた治癒は、糖尿病、感染、免疫抑制、肥満、および栄養失調といったような幾
つかの状態と関連している(Ｃruse, Ｐ. Ｊ. およびＦoord, Ｒ. ，Ａrch. Ｓur
g. １０７：２０６（１９７３）；Ｓchrock, Ｔ. Ｒ. ら，Ａnn. Ｓurg. １７７
：５１３（１９７３）;Ｐoole, Ｇ. Ｕ., Ｊr.，Ｓurgery ９７：６３１（１９
８５）；Ｉrvin, Ｇ. Ｌ. ら，Ａm. Ｓurg. ５１：４１８（１９８５）)。 創傷修復は、複雑な相互作用および生物学的プロセスの結果である。正常な創
傷治癒においては、３つの段階が記載されている；急性炎症段階、細胞外マトリ
ックスおよびコラーゲン合成、並びに再形成(Ｐeacock, Ｅ. Ｅ., Ｊr.，Ｗound
Ｒepair，第２版，ＷＢ Ｓaunders，Ｐhiladelphia（１９８４）)。そのプロセ
スは、創傷部位でのケラチノサイト、線維芽細胞、および炎症細胞の相互作用を
伴う。
【０００４】 組織再生は、修復プロセスに関与する細胞の遊走および増殖を調節する、特異
的なペプチド因子により制御されるらしい(Ｂarrett, Ｔ. Ｂ. ら，Ｐroc. Ｎat
l. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８１：６７７２−６７７４（１９８５）；Ｃollins,
Ｔ. ら，Ｎature ３１６；７４８−７５０（１９８５）)。従って、増殖因子は
、創傷、熱傷、および他の皮膚障害の処置における有望な療法であり得る(Ｒifk
in, Ｄ. Ｂ. およびＭoscatelli，Ｊ. Ｃell. Ｂiol. １０９：１−６（１９８
９）；Ｓporn, Ｍ. Ｂ. ら，Ｊ. Ｃell. Ｂiol. １０５：１０３９−１０４５（
１９８７）；Ｐierce, Ｇ. Ｆ. ら，Ｊ. Ｃell. Ｂiochem. ４５：３１９−３２
６（１９９１）)。治癒プロセスのシークエンスは、仮組織の沈着と共に、急性
炎症段階の間に開始される。この後、再上皮形成、コラーゲン合成および沈着、
線維芽細胞増殖、並びに血管新生が起こり、これらは全て、最終的には、再形成
段階を定義する(Ｃlark, Ｒ. Ａ. Ｆ.，Ｊ. Ａｍ. Ａcad. Ｄermatol １３：７
０１（１９８５）)。これらの事象は、炎症細胞により分泌される増殖因子およ
びサイトカインによって、または創傷の縁にある細胞によって影響される(Ａsso
ian, Ｒ. Ｋ. ら，Ｎature(Ｌond.) ３０９；８０４（１９８４）；Ｎemeth, Ｇ
. Ｇ. ら，“Ｇrowth Ｆactors and Ｔheir Ｒole in Ｗound and Ｆracture Ｈ
ealing"，Ｇrowth Ｆactors and Ｏther Ａspects of Ｗound Ｈealing in Ｂio
logical and Ｃlinical Ｉmplications，Ｎew Ｙork（１９８８），１−１７頁)
。 ケラチノサイト増殖因子(ＫＧＦ)(Ａntioniades, Ｈ. ら，Ｐroc. Ｎatl. Ａc
ad. Ｓci. ＵＳＡ ８８：５６５（１９９１）)、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)
(Ａntioniades, Ｈ. ら，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８８：５６５（
１９９１）；Ｓtaiano−Ｃoico, Ｌ. ら，Ｊour. Ｅxp. Ｍed. １７８：８６５
−８７８（１９９３）)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bＦＧＦ)(Ｇolden, Ｍ. Ａ
. ら，Ｊ. Ｃlin. Ｉnvest. ８７：４０６（１９９１）)、酸性線維芽細胞増殖
因子(aＦＧＦ)(Ｍellin, Ｔ. Ｎ. ら，Ｊ. Ｉnvest. Ｄermatol. １０４：８５
０−８５５（１９９５）、上皮増殖因子(ＥＧＥ)(Ｗhitby, Ｄ. Ｊ. およびＦer
guson, Ｗ. Ｊ. ，Ｄev. Ｂiol. １４７：２０７（１９９１）)、トランスフォ
ーミング増殖因子−α(ＴＧＦ−α)(Ｇartner, Ｍ. Ｈ. ら，Ｓurg. Ｆorum ４
２：６４３（１９９１）；Ｔodd, Ｒ. ら，Ａm. Ｊ. Ｐathol. １３８；１３０
７（１９９１）)、トランスフォーミング増殖因子−β(ＴＧＦ−β)(Ｗong, Ｄ.
Ｔ. Ｗ. ら，Ａm. Ｊ. Ｐathol. １４３；６２２（１９８７）)、ノイ(neu)分
化因子(rＮＤＦ)(Ｄanilenko, Ｄ. Ｍ. ら，Ｊ. Ｃlin. Ｉnvest. ９５：８４２
−８５１（１９９５）)、インスリン様増殖因子Ｉ(ＩＧＦ−Ｉ)、およびインス
リン様増殖因子ＩＩ(ＩＧＦ−ＩＩ)(Ｃromack, Ｄ. Ｔ. ら，Ｊ. Ｓurg. Ｒes.
４２：６２２（１９８７）)を含め、幾つかのポリペプチド増殖因子は、創傷治
癒に関与するものとして同定された。 皮膚におけるrＫＧＦ−１は、上皮ケラチノサイト、毛包および脂腺内のケラ
チノサイトを刺激することが報告された(Ｐierce, Ｇ. Ｆ. ら，Ｊ. Ｅxp. Ｍed
. １７９：８３１−８４０（１９９４）)。
【０００５】 （発明の要約） 本発明は、第１図［配列番号２］に示すアミノ酸配列、または１９９４年１２
月１６日にＡＴＣＣ寄託番号第７５９７７号として寄託されたcＤＮＡクローン
によりコードされるアミノ酸配列を有する、ケラチノサイト増殖因子(ＫＧＦ−
２)をコードするポリヌクレオチドを含んでなる、単離された核酸分子を提供す
る。第１図［配列番号１］に示す、寄託されたＫＧＦ−２クローンを配列決定す
ることにより決定されたヌクレオチド配列は、約３５または３６のアミノ酸残基
からなる推定リーダー配列と共に１−３の位置にある開始コドンを含む、約２３
.４kＤaの推定分子量をもつ、２０８のアミノ酸残基からなるポリペプチドをコ
ードするオープンリーディングフレームを含む。成熟ＫＧＦ−２のアミノ酸配列
は、第１図に示す、３６または３７〜２０８のアミノ酸残基である［配列番号２
］。
【０００６】 本発明のポリペプチドは、ＦＧＦのファミリーのメンバーであると推定的に同
定されており、とりわけ、そのポリペプチドは、ＦＧＦファミリーの他のメンバ
ーとのアミノ酸配列相同性の結果、ＫＧＦ−２であると推定的に同定された。 本発明の一態様により、ＫＧＦ−２である新規成熟ポリペプチド、さらにはま
た、その生物学的に活性で診断上または治療上有用なフラグメント、アナログ、
および誘導体を提供する。本発明のポリペプチドは、ヒト起源のものである。 本発明の別の態様により、mＲＮＡ、ＤＮＡ、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め、
ヒトＫＧＦ−２をコードする単離された核酸分子、さらにはまた、そのアンチセ
ンスアナログ、およびその生物学的に活性で診断上または治療上有用なフラグメ
ントを提供する。 本発明の別の態様により、ＫＧＦ−２タンパク質の組換え産生における試薬と
して有用なクローニングおよび発現プラスミドといったような組換えベクターの
使用によって、そのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方法、さら
にはまた、ヒトＫＧＦ−２の核酸配列を含んでなる組換え原核および／または真
核宿主細胞を提供する。
【０００７】 本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチド、またはそのよう
なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療目的に、例えば、創傷治
癒を目的として上皮細胞増殖を刺激するために、そして毛包産生および皮膚創傷
の治癒を刺激するために利用する。ＫＧＦ−２は、手術による創傷、切除による
創傷、真皮および表皮の損傷を伴う深い創傷、眼組織の創傷、歯組織の創傷、口
腔の創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚潰瘍、肘潰瘍、動脈潰瘍、静脈うっ血潰瘍、熱曝
露または化学薬品から生ずる熱傷、並びに尿毒症、栄養失調、ビタミン欠乏症、
およびステロイド、放射線療法、並びに抗腫瘍性薬物および代謝拮抗物質での全
身処置と関連している合併症といったような、他の異常な創傷治癒状態を含め、
創傷治癒を刺激するのに臨床的に有用であり得る。ＫＧＦ−２を使用して、皮膚
損失後の皮膚再癒着を促進することができる。
【０００８】 ＫＧＦ−２を使用して、皮膚移植片の付着を増大させ、また創傷床からの再上
皮形成を刺激することができる。次のものは、ＫＧＦ−２を使用して、創傷床へ
の付着を増大させることができるであろう移植片の種類である；自己移植片、人
工皮膚、ホモロガス移植片(allografts)、自己植皮片、自己表皮移植片、無血管
移植片、ブレア−ブラウン移植片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移植片、遅
延移植片、皮膚移植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、ヘテロロガ
ス移植片(heterologous graft)、ヘテロロガス移植片(xenograft)、ホモロガス
移植片(homologous graft)、増殖性移植片、層板移植片、網状移植片、粘膜移植
片、オリエ−ティールシュ移植片、大網移植片、パッチ移植片、茎状移植片、全
層移植片、中間層皮膚移植片、分層皮膚移植片。ＫＧＦ−２を使用して、皮膚強
度を促進し、また老化した皮膚の外観を改善することができる。 ＫＧＦ−２はまた、肝細胞増殖における変化、肺、胸部、膵臓、胃、小腸、お
よび大腸における上皮増殖も引き起こすであろうと信じられる。ＫＧＦ−２は、
皮脂細胞、毛包、肝細胞、ＩＩ型肺細胞、ムチンを産生する杯細胞、および他の
上皮細胞といったような上皮細胞、並びに皮膚、肺、肝臓、および胃腸管内に含
まれる、それらの前駆細胞の増殖を促進することができる。ＫＧＦ−２は、内皮
細胞、ケラチノサイト、および塩基性ケラチノサイトの増殖を促進することがで
きる。
【０００９】 ＫＧＦ−２を使用して、放射線、化学療法処置、またはウイルス感染から生ず
る消化管毒性の副作用を減少させることもできる。ＫＧＦ−２は、小腸粘膜に対
して細胞保護作用を有し得る。ＫＧＦ−２はまた、化学療法およびウイルス感染
から生ずる粘膜炎(口潰瘍)の治癒を刺激することもできる。 ＫＧＦ−２はさらに、熱傷(すなわち、毛包、汗腺、および脂腺のレポピュレ
ーション(repopulation))を含め、全体的および部分的厚さの皮膚欠損での皮膚
の完全な再生、乾癬のような他の皮膚欠損の処置において使用することができる
。ＫＧＦ−２を使用して、表皮水疱症、結果的には、口の開いた痛い水疱を生ず
ることの多い、基盤となる真皮への表皮の付着における欠損を、これらの病巣の
再上皮形成を増進することにより処置することができる。ＫＧＦ−２を使用して
、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を処置し、また粘膜内層の瘢痕形成および腺粘膜お
よび十二指腸粘膜内層の再生により、より迅速に治癒するのに役立てることもで
きる。クローン病および潰瘍性大腸炎といったような炎症性腸疾患は、各々、小
腸または大腸の粘膜表面の破壊を生ずる疾患である。従って、ＫＧＦ−２を使用
して、粘膜表面の再表面形成を促進し、より迅速な治癒を手助けして、炎症性腸
疾患の進行を予防することができる。ＫＧＦ−２の処置は、胃腸管中での粘液の
産生に対して重要な作用を有することが期待され、これを使用して、摂取された
有害な物質から、または手術後に腸粘膜を保護することができる。ＫＧＦ−２を
使用して、ＫＧＦ−２の発現不足と関連している疾患を処置することができる。 さらに、ＫＧＦ−２を使用して、様々な病的状態による肺への損傷を予防およ
び治癒することができる。ＫＧＦ−２のような増殖因子は、増殖および分化を刺
激し、肺胞および細気管支上皮の修復を促進し、急性または慢性肺損傷を予防ま
たは処置することができる。例えば、肺胞の進行性損失を生ずる気腫、および吸
入傷害(すなわち、煙の吸入から生ずる)、並びに細気管支上皮および肺胞の壊死
の原因となる熱傷は、ＫＧＦ−２で有効に処置することができる。そしてまた、
ＫＧＦ−２を使用して、ＩＩ型肺細胞の増殖および分化を刺激することができ、
これは、硝子膜疾患(例えば、乳児の呼吸窮迫症候群、および早産の乳児におけ
る気管支肺の非形成)のような疾患を処置または予防するのに役立てることがで
きる。
【００１０】 ＫＧＦ−２は、肝細胞の増殖および分化を刺激することができ、従って、これ
を使用して、硬変により引き起こされる劇症肝不全、ウイルス性肝炎および有毒
物質(すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素、および当業界で知られてい
る他の肝臓毒素)により引き起こされる肝損傷といったような肝疾患および病状
を軽減または処置することができる。 加えて、ＫＧＦ−２を使用して、糖尿病の発症を処置または予防することがで
きる。膵島細胞機能が幾分残存する、新たに診断されたＩおよびＩＩ型糖尿病を
患う患者において、ＫＧＦ−２を使用して、疾患の永続的な発現を軽減、遅延、
または予防するよう、膵島機能を維持することができるであろう。ＫＧＦ−２を
膵島細胞移植における補助物質として使用して、膵島細胞機能を改善または促進
することができるであろう。
【００１１】 本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提
供する。 本発明の別の態様により、ヒトＫＧＦ−２配列へ特異的にハイブリダイズする
のに十分な長さの核酸分子を含んでなる核酸プローブを提供する。 本発明のさらなる態様により、治療用ペプチドとして使用することができる、
ＫＧＦ−２の模倣(ミメティック)ペプチドを提供する。模倣ＫＧＦ−２ペプチド
は、ＫＧＦ−２のコグネイト受容体に結合して活性化することにより、ＫＧＦ−
２タンパク質の生物学的活性を模倣する短いペプチドである。模倣ＫＧＦ−２ペ
プチドはまた、ＫＧＦ−２のコグネイト受容体に結合して阻害することもできる
。 本発明のまた別の態様により、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニス
トを提供し、これを使用して、そのようなポリペプチドの作用を阻害する、例え
ば、創傷治癒プロセスの間の瘢痕形成を減少させ、また腫瘍増殖、糖尿病性網膜
症、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、および腫瘍増殖を予防および／または処
置することができる。 本発明のまた別の態様により、ＫＧＦ−２の核酸配列における変異、またはそ
のような配列によりコードされるポリペプチドの過剰発現に関係している疾患、
もしくはその疾患に対する罹病性を検出する診断用アッセイを提供する。 本発明の別の態様により、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、ＤＮＡの合成、およびＤ
ＮＡベクターの製造に関係している、インビトロにおける目的に利用する方法を
提供する。
【００１２】 従って、本発明の一態様は、（ａ）第１図［配列番号２］における完全なアミ
ノ酸配列を有する、ＫＧＦ−２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（
ｂ）第１図［配列番号２］において３６または３７〜２０８の位置にあるアミノ
酸配列を有する、成熟ＫＧＦ−２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５９７７号に含まれるcＤＮＡクローンによりコー
ドされる完全なアミノ酸配列を有する、ＫＧＦ−２ポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５９７７号に含まれるcＤＮＡク
ローンによりコードされるアミノ酸配列を有する、成熟ＫＧＦ−２ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列；および（ｅ）上の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、ま
たは（ｄ）における、いずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
；よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含ん
でなる、単離された核酸分子を提供する。 本発明のさらなる態様には、上の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、もしくは
（ｅ）における、いずれかのヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％が同
一のヌクレオチド配列、より好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９１％、
９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％が同一のヌ
クレオチド配列を有するポリヌクレオチド、またはストリンジェント条件下、上
の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、もしくは（ｅ）におけるポリヌクレオチド
にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでなる、単離された核酸分子が含
まれる。ハイブリダイズする、このポリヌクレオチドは、ストリンジェント条件
下、Ａ残基だけからなるヌクレオチド配列、またはＴ残基だけからなるヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチドにはハイブリダイズしない。本発明のさらな
る核酸態様は、上の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）におけるア
ミノ酸配列を有するＫＧＦ−２のエピトープを有する部分のアミノ酸配列をコー
ドするポリヌクレオチドを含んでなる、単離された核酸分子に関する。
【００１３】 本発明はさらに、（ａ）第１図［配列番号２］に示すリーダー配列を含め、完
全な２０８のアミノ酸配列を有するＫＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列；（
ｂ）第１図［配列番号２］において３６または３７〜２０８の位置にあるアミノ
酸配列を有する(リーダー配列のない)成熟ＫＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配
列；（ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５９７７号に含まれるcＤＮＡクローンにより
コードされる、リーダーを含め、完全なアミノ酸配列を有するＫＧＦ−２ポリペ
プチドのアミノ酸配列；および（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５９７７号に含まれ
るcＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＫＧＦ−２ポ
リペプチドのアミノ酸配列；よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、
単離されたＫＧＦ−２ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドにはまた
、上の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、もしくは（ｄ）に記載したアミノ酸配列に対し
て、少なくとも８０％の類似性、より好ましくは、少なくとも９０％、９５％、
９６％、９７％、９８％、または９９％の類似性をもつアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、さらにはまた、上のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％が同
一のアミノ酸配列、より好ましくは、少なくとも８５％が同一のアミノ酸配列、
さらにより好ましくは、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９
７％、９８％、もしくは９９％が同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも含
まれる。
【００１４】 本発明のさらなる態様は、上の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）に記載
したアミノ酸配列を有するＫＧＦ−２ポリペプチドのエピトープを有する部分の
アミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドに関する。本発明のＫＧＦ−
２ポリペプチドのエピトープを有する部分のアミノ酸配列を有するペプチドまた
はポリペプチドには、少なくとも６または７、好ましくは、少なくとも９、より
好ましくは、少なくとも約３０のアミノ酸〜約５０のアミノ酸をもつ、そのよう
なポリペプチドの部分が含まれるが、上に記載した本発明のポリペプチドの全体
のアミノ酸配列までの、いずれかの長さのエピトープを有するポリペプチド、お
よびその全体のアミノ酸配列が含まれる、エピトープを有するポリペプチドもま
た本発明に含まれる。別の態様において、本発明は、上の（ａ）、（ｂ）、（ｃ
）、または（ｄ）に記載したアミノ酸配列を有するＫＧＦ−２ポリペプチドへ特
異的に結合する、単離された抗体を提供する。 本発明の別の態様により、ＫＧＦ−２の新規変異体を記載する。これらは、Ｋ
ＧＦ−２の１個またはそれ以上のアミノ酸を欠失または置換することにより製造
することができる。天然の変異体は、アレル変異体と呼ばれている。アレル変異
体は、サイレントであり得る(コードされたポリペプチドには何の変化もない)か
、または変えられたアミノ酸配列を有し得る。天然のＫＧＦ−２の特性を改善ま
たは変更しようとするためには、タンパク質工学を使用することができる。当業
界で知られている組換えＤＮＡ技術を使用して、新規ポリペプチドを作り出すこ
とができる。ムテインおよび欠失変異体は、例えば、高められた活性、または増
大された安定性を示し得る。加えて、それらは、より高い収率で精製することが
でき、少なくともある精製および保存条件下、より良好な溶解性を示す。 本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明ら
かであろう。
【００１５】 （詳細な説明） 本発明の一態様により、第１図（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポ
リペプチド、またはＡmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection Patent Depository
, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209で１９９４年１２月
１６日にＡＴＣＣ寄託番号第７５９７７号として寄託されたクローンのcＤＮＡ
によりコードされるポリペプチドまたはAmerican Type Culture Collection Pat
ent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA20110-2209で１９
９４年９月２９日にＡＴＣＣ寄託番号第７５９０１号として寄託されたクローン
のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドをコードする、単離された核酸(ポ
リヌクレオチド)を提供する。
【００１６】 核酸分子 特にことわらない限り、本明細書中のＤＮＡ分子を配列決定することにより決
定されたヌクレオチド配列は全て、自動化ＤＮＡシークエンサー(例えば、Ａppl
ied Ｂiosystems, Ｉnc.製の３７３型)を使用して決定され、また本明細書中で
決定されたＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は全て、
先のように決定されたＤＮＡ配列の翻訳により予想された。従って、この自動化
方法により決定されたいずれのＤＮＡ配列に関しても当業界で知られているよう
に、本明細書中で決定されたいずれのヌクレオチド配列も、幾つかの誤りを含み
得る。自動化により決定されたヌクレオチド配列は、典型的には、配列決定され
たＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９０％が同一で
あり、より典型的には、少なくとも約９５％〜少なくとも約９９.９％が同一で
ある。実際の配列は、当業界でよく知られている手動ＤＮＡ配列決定法を含め、
他の方法により、より正確に決定することができる。当業界でも知られているよ
うに、実際の配列と比較した、決定されたヌクレオチド配列における唯一の挿入
または欠失が、核酸配列の翻訳におけるフレームシフトの原因となるであろうこ
とから、決定されたヌクレオチド配列によりコードされる予想アミノ酸配列は、
配列決定されたＤＮＡ分子により実際にコードされるアミノ酸配列とは全く異な
り、そのことは、そのような挿入または欠失の位置で始まるであろう。
【００１７】 特にことわらない限り、本明細書中に示す「ヌクレオチド配列」は各々、デオ
キシリボヌクレオチド(Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴと略す)の配列として示される。し
かし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」という語は、Ｄ
ＮＡ分子またはポリヌクレオチドに関しては、デオキシリボヌクレオチドの配列
を意図し、またＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドに関しては、対応するリボヌ
クレオチド(Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵ)の配列を意図し、この場合、具体的に記した
デオキシリボヌクレオチド配列におけるチミジンデオキシリボヌクレオチド(Ｔ)
を各々、リボヌクレオチドのウリジン(Ｕ)で置換する。例えば、デオキシリボヌ
クレオチドの略号を使用して示す配列番号１の配列を有するＲＮＡ分子に関して
は、配列番号１のデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｇ、またはＣが各々、対応する
リボヌクレオチドＡ、Ｇ、またはＣで置換され、またデオキシリボヌクレオチド
のＴがリボヌクレオチドのＵで置換された配列を有するＲＮＡ分子を示すことを
意図する。
【００１８】 「単離された」核酸分子という語は、その天然の環境から除去された核酸分子
、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ
分子は、本発明の目的には単離されたと考えられる。単離されたＤＮＡ分子のさ
らなる例には、ヘテロロガス宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子、または
溶液中で(部分的に、または実質的に)精製されたＤＮＡ分子が含まれる。単離さ
れたＲＮＡ分子には、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロにおける
ＲＮＡ転写産物が含まれる。本発明による単離された核酸分子にはさらに、合成
的に製造された、そのような分子が含まれる。 本発明の単離された核酸分子には、第１図（配列番号１）に示すヌクレオチド
配列の１−３の位置にある開始コドンと共に、オープンリーディングフレーム(
ＯＲＦ)を含んでなるＤＮＡ分子；第１図(最後の１７２または１７３のアミノ酸
)（配列番号２）に示す成熟ＫＧＦ−２タンパク質に関するコード配列を含んで
なるＤＮＡ分子；および先に記載した配列とは実質的に異なるが、遺伝コードの
縮重により、それでもなおＫＧＦ−２タンパク質をコードする配列を含んでなる
ＤＮＡ分子が含まれる。勿論、その遺伝コードは、当業界でよく知られている。
従って、先に記載した縮重変異体を発生させることは、当業者にとって通常であ
ろう。
【００１９】 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト前立腺および胎
児の肺から得ることができる。そのポリペプチドをコードするcＤＮＡのフラグ
メントは、最初、ヒトの正常な前立腺から得られるライブラリーから単離された
。その後、全長のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが、ラ
ンダムにプライムされたヒト胎児の肺のcＤＮＡライブラリーから単離された。
それは、構造上、ＦＧＦファミリーに関係している。それは、２０８のアミノ酸
残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、このうち
、最初の約３５または３６のアミノ酸残基が推定リーダー配列であることから、
成熟タンパク質は、１７３または１７２のアミノ酸を含んでなる。そのタンパク
質は、ヒトケラチノサイト増殖因子に対して、２０６のアミノ酸長さにわたり、
４５％の同一性および８２％の類似性をもって、最も高度な相同性を示す。ＦＧ
Ｆファミリーによって保存されるその配列が、本発明のタンパク質において保存
されているのが見出されることもまた重要である。 加えて、ライブラリー由来のＫＧＦ−２ cＤＮＡの入れ子(nested)ＰＣＲから
得られた結果は、可能性のある別のスプライスされた形のＫＧＦ−２があること
を示した。具体的には、ＫＧＦ−２のオープンリーディングフレームのＮ末端に
隣接するプライマーを使用して、０.２kbおよび０.４kbのＰＣＲ産生を様々なc
ＤＮＡライブラリーから得た。０.２kbサイズは、ＫＧＦ−２に関して予期され
る生成物であったが、０.４kbサイズは、別にスプライスされた形のＫＧＦ−２
から生じ得る。０.４kbの生成物は、胃癌、成人の睾丸、十二指腸、および膵臓
由来のライブラリーにおいて観察された。
【００２０】 本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形であり得るか、またはＤＮＡの形で
あり得、このＤＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれ
る。そのＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖であるなら、コー
ド鎖または非コード(アンチセンス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードす
るコード配列は、第１図（配列番号１）に示すコード配列もしくは寄託されたク
ローンのコーディング配列と同じであるのがよく、または遺伝コードの重複また
は縮重の結果として、コード配列が第１図（配列番号１）のＤＮＡもしくは寄託
されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする、異なったコード配列であ
ってもよい。
【００２１】 第１図（配列番号：２）の予想成熟ポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡに
よりコードされる予想成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、成
熟ポリペプチドに関するコード配列のみ；成熟ポリペプチドに関するコード配列
、およびリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列といったような付
加的コード配列；成熟ポリペプチドに関するコード配列(また場合により、付加
的コード配列)、および予想成熟ポリペプチドに関するコード配列のイントロン
または非コード配列５'および／または３'といったような非コード配列が含まれ
得る。加えて、遺伝子の５'および３'の非翻訳領域を含む、全長のmＲＮＡが得
られた(第３図（配列番号：２３)）。 当業者が認識するであろうように、先に論じた配列決定の誤りの可能性、さら
にはまた、様々な既知のタンパク質におけるリーダーに関する切断部位の可変性
により、寄託されたcＤＮＡによりコードされる実際のＫＧＦ−２ポリペプチド
は、約２０８のアミノ酸を含んでなるが、２００−２２０のアミノ酸範囲ならい
ずれであってもよく；このタンパク質の実際のリーダー配列は、約３５または３
６のアミノ酸であるが、約３０〜約４０のアミノ酸の範囲ならいずれであっても
よい。 従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、該ポ
リペプチドに関するコード配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた
、付加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリヌクレオチドを包含
する。
【００２２】 本発明はさらに、第１図（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプ
チド、または寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドの
フラグメント、アナログ、および誘導体をコードする、先に記載したポリヌクレ
オチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天
然に存在するアレル変異体、またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異
体であり得る。 従って、本発明には、第１図（配列番号２）に示すものと同じ予想成熟ポリペ
プチド、または寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ予想成熟
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌ
クレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、第１図（配列番号２）のポリ
ペプチド、または寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチ
ドのフラグメント、誘導体、またはアナログをコードする。そのようなヌクレオ
チド変異体には、欠失変異体、置換変異体、および付加または挿入変異体が含ま
れる。
【００２３】 本発明には、治療用ペプチドとして使用することができる、ＫＧＦ−２の模倣
ペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。模倣ＫＧＦ−２ペプチドは
、ＫＧＦ−２のコグネイト受容体に結合して活性化することにより、ＫＧＦ−２
タンパク質の生物学的活性とよく似ている短いペプチドである。模倣ＫＧＦ−２
ペプチドはまた、ＫＧＦ−２のコグネイト受容体に結合して阻害することもでき
る。ＫＧＦ−２受容体には、限定されるものではないが、ＦＧＦＲ２iiibおよび
ＦＧＦＲ１iiibが含まれる。そのような模倣ペプチドは、限定されるものではな
いが、ファージ展示または組み合わせ化学といったような方法から得られる。例
えば、Ｗrightonら，Ｓcience ２７３：４５８−４６３（１９９６）により開示
された模倣ＫＧＦ−２ペプチドを生成させる方法。 先に示したように、そのポリヌクレオチドは、第１図（配列番号１）に示すコ
ード配列の天然に存在するアレル変異体、または寄託されたクローンのコード配
列の天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有し得る。当業界で知られ
ているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠
失、または付加を有し得る、別の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コ
ードするポリペプチドの機能を実質的に変えない。
【００２４】 本発明にはまた、成熟ポリペプチドに関するコード配列が、宿主細胞からのポ
リペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞から
のポリペプチドの輸送を制御する分泌配列として機能するリーダー配列に、同じ
リーディングフレーム内で融合し得るポリヌクレオチドも含まれる。リーダー配
列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であって、宿主細胞により切断され
て、成熟型のポリペプチドを形成するリーダー配列を有し得る。そのポリヌクレ
オチドはまた、付加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプロタン
パク質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質は、プロタンパク質で
あって、不活性型のタンパク質である。プロ配列が一度切断されると、活性成熟
タンパク質が残る。 従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ
配列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列(リーダー配列)の両方
を有するタンパク質をコードし得る。
【００２５】 本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とする
マーカー配列にフレーム内で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合、
そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するた
めの、pＱＥ−９ベクターにより与えられるヘキサヒスチジンタグ(tag)であって
よく、または、例えば、哺乳動物宿主(例えば、ＣＯＳ−７細胞)を使用する場合
には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってもよい。そのＨＡ
タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応
する(Ｗilson, Ｉ. ら，Ｃell ３７：７６７（１９８４）)。
【００２６】 「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の製造に関与するＤＮＡのセグメン
トを意味し；それには、コード領域より前および後の領域(リーダーおよびトレ
ーラー)、さらにはまた、個々のコードセグメント(エキソン)の間の介在配列(イ
ントロン)が含まれる。 本発明の全長の遺伝子のフラグメントは、全長のcＤＮＡを単離するための、
およびその遺伝子に対して高い配列類似性、または同様の生物学的活性を有する
他のcＤＮＡを単離するための、cＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼー
ションプローブとして使用することができる。このタイプのプローブは、少なく
とも３０塩基を有するのが好ましく、例えば、５０またはそれ以上の塩基を含み
得る。そのプローブを使用して、全長の転写産物、およびゲノムクローン、また
は調節およびプロモーター領域、エキソン、並びにイントロンが含まれる完全な
遺伝子を含むクローンに対応するcＤＮＡクローンを同定することもできる。ス
クリーニングの例は、その既知のＤＮＡ配列を使用して、オリゴヌクレオチドプ
ローブを合成することにより、遺伝子のコード領域を単離することを含んでなる
。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを使
用し、ヒトcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはcＤＮＡのライブラリーをスクリーニ
ングして、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決
定する。
【００２７】 本発明のさらなる態様には、（ａ）予想リーダー配列を含め、第１図（配列番
号２）における完全なアミノ酸配列を有する、全長のＫＧＦ−２ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列；（ｂ）第１図（配列番号２）において約３６また
は３７〜２０８の位置にあるアミノ酸配列を有する、成熟ＫＧＦ−２ポリペプチ
ド(リーダーを除去した全長のポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列；（
ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５９７７号に含まれるcＤＮＡクローンによりコード
されるリーダーが含まれる完全なアミノ酸配列を有する、全長のＫＧＦ−２ポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５９７７
号に含まれるcＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する、成熟
ＫＧＦ−２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）以下に記載する
、いずれかのＫＧＦ−２アナログまたは欠失変異体をコードするヌクレオチド配
列；または（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）における、い
ずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；に対して、少なくとも
８０％が同一のヌクレオチド配列、より好ましくは、少なくとも８５％、９０％
、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％
が同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含んでなる、単離された
核酸分子が含まれる。
【００２８】 例えば、ＫＧＦ−２をコードする参考ヌクレオチド配列に対して、例えば、少
なくとも９５％が「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドという
語は、ＫＧＦ−２ポリペプチドをコードする参考ヌクレオチド配列の１００のヌ
クレオチド毎につき、そのポリヌクレオチド配列に点変異が５つまで含まれ得る
ことを除き、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参考配列と同一であるこ
とを意図する。言いかえれば、参考ヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５
％が同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参考配
列におけるヌクレオチドの５％までは、欠失してもよいし、もしくは別のヌクレ
オチドで置換されてもよく、または参考配列における全ヌクレオチドの５％まで
の数のヌクレオチドを参考配列に挿入してもよい。参考配列のこれらの変異は、
参考ヌクレオチド配列の５'もしくは３'末端位、またはそれらの末端部位の間の
どこかで起こり得て、参考配列におけるヌクレオチドの間に個別に、または参考
配列内部に１つまたはそれ以上の連続的な基として散在する。
【００２９】 実際的な問題として、個々の核酸分子がいずれも、例えば、第１図（配列番号
：１）に示すヌクレオチド配列に対して、または寄託されたcＤＮＡクローンの
ヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、または９９％が同一であるかど
うかは、Ｂestfitプログラム(Ｗisconsin Ｓequence Ａnalysis Ｐackage，Ｕni
x（登録商標）のバージョン８，Ｇenetics Ｃomputer Ｇroup，Ｕniversity Ｒe
search Ｐark，５７５ Ｓcience Ｄrive，Ｍadison，ＷＩ ５３７１１)のような
既知のコンピュータープログラムを従来通り使用して決定することができる。Ｂ
estfitは、ＳmithおよびＷaterman，Ａdvances in Ａpplied Ｍathematics ２：
４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列
の間の相同性が最良のセグメントを見出す。Ｂestfitまたはいずれかの他のシー
クエンスアラインメントプログラムを使用して、個々の配列が、本発明による参
考配列に対して、例えば、９５％が同一であるかどうかを決定する場合には、勿
論、同一性のパーセンテージを参考ヌクレオチド配列の全長にわたり計算して、
参考配列におけるヌクレオチドの全数の５％までの相同性におけるギャップが許
容されるよう、パラメーターを設定する。
【００３０】 質問（query）配列（本発明の配列）と主題（subject）配列との間での全体に
わたる最良のマッチを決定する好ましい方法（普遍的な配列アラインメントと称
する）は、Brutlagら（Comp. App. Biosci. (1990) 6: 237-245）のアルゴリズ
ムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて決定することができ
る。配列のアラインメントにおいて質問配列および主題配列はともにＤＮＡ配列
である。ＲＮＡ配列はＵをＴに変換することによって比較することができる。該
普遍的な配列アラインメントの結果は、パーセント同一性である。パーセント同
一性を計算するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントに用いる好まし
いパラメータは、行列＝ユニタリ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、ミスマッチペナルティ
＝１、ジョイニング（Joining）ペナルティ＝３０、無作為化グループ長（Rando
mization Group Length）＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝
５、ギャップサイズペナルティ＝０.０５、ウインドウサイズ＝５００または主
題ヌクレオチド配列の長さのいずれか短い方。
【００３１】 もしも主題配列が質問配列よりも、内部の欠失のためではなく５'または３'欠
失のために短いなら、結果を手動で補正しなければならない。これは、ＦＡＳＴ
ＤＢではパーセント同一性を計算するときに５'末端または３'末端での欠失を考
慮しないからである。質問配列に比べて５'末端または３'末端が欠失した主題配
列については、主題配列の５'末端および３'末端にあってマッチ／アラインメン
トしない質問配列の塩基数を質問配列の全塩基のパーセントとして計算すること
によりパーセント同一性を補正する。ヌクレオチドがマッチ／アラインメントし
たか否かはＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果により決定される。ついで、
このパーセントを、特定のパラメータを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムによ
り計算したパーセント同一性から差し引いて最終的なパーセント同一性のスコア
を得る。この補正したスコアは、本発明の目的のために用いるものである。ＦＡ
ＳＴＤＢアラインメントによって示されるように、質問配列とマッチ／アライン
メントしない主題配列の５'および３'塩基の外側の塩基のみが、パーセント同一
性スコアを手動で調整する目的で計算される。
【００３２】 たとえば、９０塩基の主題配列を１００塩基の質問配列にアラインメントさせ
てパーセント同一性を決定する。欠失は主題配列の５'末端にあり、それゆえＦ
ＡＳＴＤＢアラインメントは５'末端の最初の１０塩基のマッチ／アラインメン
トを示さない。この対合しない塩基は配列の１０％であるため（マッチしない５
'および３'末端の塩基数／質問配列中の塩基の総数）、１０％をＦＡＳＴＤＢプ
ログラムによって計算したパーセント同一性スコアから差し引く。もしも残りの
９０塩基が完全にマッチするなら最終的なパーセント同一性は９０％であろう。
他の例として、９０塩基の主題配列を１００塩基の質問配列と比較する。今度は
欠失は内部の欠失であるため、質問配列とマッチ／アラインメントしない主題配
列の５'または３'上の塩基は存在しない。この場合はＦＡＳＴＤＢによって計算
したパーセント同一性を手動で補正することはしない。繰り返すが、質問配列と
マッチ／アラインメントしない主題配列の５'および３'塩基のみを手動により補
正するのである。その他の手動による補正は本発明の目的のためには行わない。
【００３３】 本発明は、それらがＫＧＦ−２活性を有するポリペプチドをコードするかどう
かにかかわらず、第１図［配列番号１］に示す核酸配列に対して、または寄託さ
れたcＤＮＡの核酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％
、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、または９９％が同一であ
る核酸分子に関する。これは、特定の核酸分子がＫＧＦ−２活性を有するポリペ
プチドをコードしない場合でさえも、当業者が、それでもなお、核酸分子を、例
えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)プ
ライマーとしてどのように使用するかを知っているであろうからである。ＫＧＦ
−２活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用には、と
りわけ、（１）cＤＮＡライブラリーにおけるＫＧＦ−２遺伝子またはそのアレ
ル変異体を単離すること；（２）Ｖermaら，Ｈuman Ｃhromosomes：Ａ Ｍannual
of Ｂasic Ｔechniques，Ｐergamon Ｐress，Ｎew Ｙork（１９８８）に記載さ
れているような、ＫＧＦ−２遺伝子の正確な染色体位置を得るための、中期染色
体拡散に対する in situ ハイブリダイゼーション(例えば、“ＦＩＳＨ”)；お
よび特定の組織におけるＫＧＦ−２ mＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロ
ット分析が含まれる。 しかし、ＫＧＦ−２タンパク質活性を有するポリペプチドを実際にコードする
、第１図［配列番号１］に示す核酸配列に対して、または寄託されたcＤＮＡの
核酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３
％、９４％、９５％、９７％、９８％、または９９％が同一である配列を有する
核酸分子が好ましい。「ＫＧＦ−２活性を有するポリペプチド」という語は、必
ずしも同一であるとは限らないが、ある特定の生物学的アッセイにおいて測定さ
れる、本発明の野生型ＫＧＦ−２タンパク質の活性、または野生型ＫＧＦ−２タ
ンパク質(全長のタンパク質、もしくは好ましくは、成熟タンパク質のいずれか)
の活性以上に高められた活性と同様の活性を示すポリペプチドを意図する。
【００３４】 ＫＧＦ−２活性のアッセイを、例えば、以下の実施例１０および１１に開示す
る。これらのアッセイを使用して、部分的に精製された天然のタンパク質もしく
は組換えタンパク質、または精製された天然のタンパク質もしくは組換えタンパ
ク質のＫＧＦ−２活性を測定することができる。 ＫＧＦ−２は、表皮ケラチノサイトの増殖を刺激するが、線維芽細胞のような
間葉細胞の増殖は刺激しない。従って、「ＫＧＦ−２タンパク質活性を有するポ
リペプチド」には、実施例１０に示すケラチノサイト増殖アッセイにおいてＫＧ
Ｆ−２活性を示し、またＦＧＦ受容体イソ型１−iiibおよび２−iiib(実施例１
１)に結合するであろうポリペプチドが含まれる。活性の程度がＫＧＦ−２タン
パク質の活性と同一である必要はないが、好ましくは、「ＫＧＦ−２タンパク質
活性を有するポリペプチド」は、ＫＧＦ−２タンパク質と比較した場合、実質的
に同様の活性を示すであろう(すなわち、候補となるポリペプチドは、参考ＫＧ
Ｆ−２タンパク質に比べて、より優れた活性、または約１０倍以下の活性、好ま
しくは、約２倍以下の活性を示すであろう)。
【００３５】 勿論、遺伝コードの縮重により、当業者は、寄託されたcＤＮＡの核酸配列ま
たは第１図［配列番号１］に示す核酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、または
９９％が同一である配列を有する多数の核酸分子が、「ＫＧＦ−２タンパク質活
性を有する」ポリペプチドをコードするであろうことがすぐ分かるであろう。実
際、これらのヌクレオチド配列の縮重変異体は全て、同じポリペプチドをコード
することから、これは、先に記載した比較アッセイを行うことすらなく、当業者
に明らかとなるであろう。縮重変異体ではない、そのような核酸分子に関して、
妥当な数がまた、ＫＧＦ−２タンパク質活性を有するポリペプチドをコードする
であろうことも当業界でさらに分かるであろう。これは、当業者が、タンパク質
機能にほとんど著しくは影響しそうにない、または著しく影響しそうにないアミ
ノ酸置換(例えば、１つの脂肪族アミノ酸を、もう１つの脂肪族アミノ酸で置換
すること)を十分知っているからである。
【００３６】 例えば、表現型によるサイレントアミノ酸置換をどのように行うかということ
に関わるガイダンスは、Ｂowie, Ｊ. Ｕ. ら，“Ｄeciphering the Ｍessage in
Ｐrotein Ｓequences：Ｔolerance to Ａmino Ａcid Ｓubstitution"，Ｓcienc
e ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に与えられており、この中で、著者
は、アミノ酸配列の変化に対する許容度を試験するために２つの主要な方法があ
ることを示している。第１の方法は、変異が天然の選択により許容されるか、ま
たは拒絶されるかという進化のプロセスに頼っている。第２の方法は、遺伝子工
学を使用して、クローン化された遺伝子の特定の部位でアミノ酸変化を導入し、
選択またはスクリーニングして、機能を維持する配列を同定する。著者が述べて
いるように、これらの試験は、タンパク質がアミノ酸置換を驚くほど許容するこ
とを明らかにした。著者はさらに、どのアミノ酸変化がタンパク質のある位置で
許される可能性があるかを示している。例えば、最も埋没された(buried)アミノ
酸残基は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の僅かな特徴しか一般に保存さ
れていない。他のそのような表現型によるサイレント置換は、Ｂowie, Ｊ. Ｕ.
ら，上記、およびその中で引用されている文献に記載されている。
【００３７】 本発明はさらに、配列の間に、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０
％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性がある場合に
、先に記載した配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は
特に、ストリンジェント条件下、先に記載したポリヌクレオチドにハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェ
ント条件」という用語は、配列の間に、少なくとも９５％、好ましくは少なくと
も９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろう
ことを意味する。好ましい態様において、先に記載したポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドは、第１図（配列番号１）のcＤＮＡまたは寄
託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的
機能または活性を保持するポリペプチドをコードする。
【００３８】 「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」の例には、５０％ ホルム
アミド、５ｘＳＳＣ(１５０mＭ ＮaＣl、１５mＭ クエン酸三ナトリウム)、５０
mＭ リン酸ナトリウム(pＨ ７.６)、５ｘデンハルト溶液、１０％ 硫酸デキスト
ラン、および２０μg／ml 変性されて剪断されたサケ精子ＤＮＡを含んでなる溶
液中、４２℃で一晩インキュベーションした後、０.１ｘＳＳＣ中、そのフィル
ターを約６５℃で洗浄することが含まれる。 あるいはまた、そのポリヌクレオチドは、少なくとも２０塩基、好ましくは３
０塩基、より好ましくは少なくとも５０塩基を有するのがよく、これは、本発明
のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、また先に記載したように、それに対し
て同一性を有し、また活性を保持し得るか、または保持し得ない。例えば、その
ようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチドの発見のための、配列番
号１のポリヌクレオチドに対するプローブとして、または診断用プローブとして
、またはＰＣＲプライマーとして使用することができる。
【００３９】 また、適度に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件にてＫＧ
Ｆ−２ポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子も考えられる。ハイブリ
ダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は、主としてホ
ルムアミド濃度（低パーセントのホルムアミドは低ストリンジェンシーという結
果となる）、塩条件、または温度を操作することにより行う。たとえば、適度に
高いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３ＭのＮａＣ
ｌ、０.２ＭのＮａＨ２ＰＯ４、０.０２ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７.４）、０.５％の
ＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ブロッキングＤＮ
Ａを含む溶液中、３℃で一夜インキュベートし、ついで１×ＳＳＰＥ、０.１％
のＳＤＳで５０℃にて洗浄することを含む。さらに、さらに低いストリンジェン
シーを達成するため、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの後により高
い塩濃度（たとえば、５×ＳＳＣ）の洗浄を行うことができる。
【００４０】 上記条件の変形は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑える
ために用いたブロッキング試薬に別のブロッキング試薬を含めるかまたは別のブ
ロッキング試薬に置きかえることにより行うことができる。典型的なブロッキン
グ試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮ
Ａ、および市販の専売製剤が挙げられる。特定のブロッキング試薬の使用は、適
合性の問題のために上記ハイブリダイゼーション条件の変更を必要とする。
【００４１】 勿論、寄託されたcＤＮＡのヌクレオチド配列または第１図［配列番号１］に
示すヌクレオチド配列の、全てではないとしても、大部分に対応するポリヌクレ
オチドと同様に、参考ポリヌクレオチド(例えば、寄託されたcＤＮＡクローン)
の大きな部分(例えば、長さが５０−７５０ntの部分)にハイブリダイズするポリ
ヌクレオチド、または全体の長さの参考ポリヌクレオチドにさえもハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドもまた、本発明によるプローブとして有用である。「長
さが少なくとも２０nt」のポリヌクレオチドの部分という語は、参考ポリヌクレ
オチド(例えば、寄託されたcＤＮＡまたは第１図［配列番号１］に示すようなヌ
クレオチド配列)のヌクレオチド配列由来の２０またはそれ以上の連続ヌクレオ
チドを意図する。示したように、そのような部分は、従来のＤＮＡハイブリダイ
ゼーション技術によるプローブとして、または例えば、Ｓambrook, Ｊ. ，Ｆrit
sch, Ｅ. Ｆ. およびＭaniatis, Ｔ. により編集された、Ｍolecular Ｃloning
，Ａ Ｌaboratory Ｍannual，第２版，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐr
ess(この開示に記載されている内容は全て、本発明の一部を構成する)に記載さ
れているような、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)による標的配列の増幅のための
プライマーとして診断上有用である。
【００４２】 ＫＧＦ−２ cＤＮＡクローンは寄託されており、その決定されたヌクレオチド
配列は第１図［配列番号１］に与えられているので、ＫＧＦ−２ cＤＮＡ分子の
部分にハイブリダイズするポリヌクレオチドを作ることは、当業者にとって容易
であろう。例えば、ＫＧＦ−２ cＤＮＡクローンの制限エンドヌクレアーゼ切断
または音波処理による剪断を容易に使用して、ＫＧＦ−２ cＤＮＡ分子の部分に
ハイブリダイズするポリヌクレオチドである、様々なサイズのＤＮＡ部分を生成
させることができるであろう。あるいはまた、本発明のハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドは、既知の技術により、合成的に生成させることができる。勿論、
ポリＡ配列(例えば、第１図［配列番号１］に示すＫＧＦ−２ cＤＮＡの３'末端
ポリ(Ａ)域)にのみハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはＴ(もしくはＵ
残基)の相補的ストレッチ(stretch)にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、
本発明の核酸の部分にハイブリダイズさせるために使用する本発明のポリヌクレ
オチドには含まれないであろう。何故なら、そのようなポリヌクレオチドは、ポ
リ(Ａ)ストレッチまたはその相補物(例えば、いずれかの二本鎖cＤＮＡクローン
)を含む、いずれの核酸分子にもハイブリダイズするであろうからである。
【００４３】 本発明はさらに、ＫＧＦ−２タンパク質のエピトープを有する部分をコードす
るポリヌクレオチドを含んでなる、単離された核酸分子を提供する。特に、第１
図（配列番号２）における次のアミノ酸残基を含んでなる、ポリペプチドをコー
ドする単離された核酸分子を与える。本発明の発明者らは、それらをＫＧＦ−２
タンパク質の抗原領域であると決定した：
【化１】 そしてまた、さらに２つのより短い予想される抗原領域、第１図（配列番号：２
）のＧln７４−Ａrg７８、および第１図（配列番号：２）のＧln１７０−Ｇln１
７５がある。ＫＧＦ−２のそのようなエピトープを有する部分を生成させる方法
を、以下に詳細に記載する。
【００４４】 本明細書中でいう寄託は、特許手続を目的とした微生物の寄託の国際承認に関
するブダペスト条約の条件の下に維持されるであろう。これらの寄託は、単に当
業者への便宜として与えられるものであって、寄託が３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１２
の下に要求されることを承認するものではない。寄託された物質に含まれるポリ
ヌクレオチドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのア
ミノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載
と矛盾する際はいつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、また
は販売するには、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは
付与されない。
【００４５】 ＫＧＦ−２ポリペプチドおよびフラグメント 本発明はさらに、第１図（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプ
チド、または寄託されたcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、
および誘導体に関する。 当業者が認識するであろうように、先に論じた配列決定の誤りの可能性、さら
にはまた、様々な既知のタンパク質におけるリーダーに関する切断部位の可変性
により、寄託されたcＤＮＡによりコードされる実際のＫＧＦ−２ポリペプチド
は、約２０８のアミノ酸を含んでなるが、２００−２２０のアミノ酸範囲ならい
ずれであってもよく；このタンパク質の実際のリーダー配列は、約３５または３
６のアミノ酸であるが、約３０〜約４０のアミノ酸の範囲ならいずれであっても
よい。 第１図（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコード
されるポリペプチドに関する場合、「フラグメント」、「誘導体」、および「ア
ナログ」という用語は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能ま
たは活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、アナログには、プロタン
パク質部分の切断により活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することが
できるプロタンパク質が含まれる。
【００４６】 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または
合成ポリペプチド、好ましくは組換えポリペプチドであるのがよい。 第１図（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコード
されるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）１つま
たはそれ以上のアミノ酸残基が同類アミノ酸残基または非同類アミノ酸残基(好
ましくは、同類アミノ酸残基)で置換されており、またそのような置換アミノ酸
残基が、遺伝コードによりコードされるものであってもよく、または遺伝コード
によりコードされるものでなくてもよいもの、または（ii）１つまたはそれ以上
のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、
そのポリペプチドの半減期を増大させる化合物(例えば、ポリエチレングリコー
ル)のような、別の化合物と融合しているもの、または（iv）リーダーもしくは
分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される配列、またはプロタンパ
ク質配列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているも
のであり得る。そのようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書
中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
【００４７】 「ペプチド」および「オリゴペプチド」という用語は、(一般に認識されるよ
うに)同義語と見なされ、また文脈から、少なくともペプチジル結合により結合
したアミノ酸の鎖を示すことが必要な場合、各々の用語は、互換的に使用するこ
とができる。「ポリペプチド」という語は、１０以上のアミノ酸残基を含む鎖に
対して本明細書中で使用する。本明細書中のオリゴペプチドおよびポリペプチド
の式または配列は全て、左から右へ、またアミノ末端からカルボキシ末端の方向
で書かれている。 タンパク質の構造または機能の著しい影響なしに、ＫＧＦ−２ポリペプチドの
幾つかのアミノ酸配列を変えることができることが当業界で分かるであろう。配
列における、そのような相違が意図されるならば、活性を測定するタンパク質上
に重要な領域があることを思い出すべきである。一般に、同様の機能を果たす残
基を使用するならば、三次構造を形成する残基を置換することは可能である。他
の例においては、タンパク質の重要ではない領域で変化が起こる場合、残基の種
類は全く重要でないことがあり得る。
【００４８】 従って、本発明にはさらに、実質的なＫＧＦ−２ポリペプチド活性を示すＫＧ
Ｆ−２ポリペプチドの変異体、または以下に論ずるタンパク質部分のようなＫＧ
Ｆ−２タンパク質の領域を含むＫＧＦ−２ポリペプチドの変異体が含まれる。そ
のような変異体には、欠失、挿入、逆位、反復、およびタイプ置換(例えば、他
の残基を１つの親水性の残基で置換するが、一般に、強く疎水性のものを強く親
水性のものでは置換しない)が含まれる。小さな変化またはそのような「中立の
」アミノ酸置換は、一般に、活性に対してほとんど影響を有しないであろう。 別のものをあるものにする(one for another)置換、特に脂肪族アミノ酸Ａla
、Ｖal、Ｌeu、およびＩleの間での置換、ヒドロキシル残基ＳerおよびＴhrの相
互交換、酸性残基ＡspおよびＧluの交換、アミド残基ＡsnおよびＧlnの間での置
換、塩基性残基ＬysおよびＡrgの交換、並びに芳香族残基Ｐhe、Ｔyrの中での置
換は、同類置換として典型的に見られる。 先に詳細に示したように、どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントである可
能性がある(機能に関して著しく有害な影響を有していない可能性がある)かに関
するガイダンスは、Ｂowie, Ｊ. Ｕ. ら，“Ｄeciphering the Ｍessage in Ｐr
otein Ｓequences：Ｔolerance to Ａmino Ａcid Ｓubstitution"，Ｓcience ２
４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見出すことができる。 本発明には、治療用ペプチドとして使用することができる、ＫＧＦ−２の模倣
ペプチドが含まれる。模倣ＫＧＦ−２ペプチドは、ＫＧＦ−２のコグネイト受容
体に結合して活性化することにより、ＫＧＦ−２タンパク質の生物学的活性とよ
く似ている短いペプチドである。模倣ＫＧＦ−２ペプチドはまた、ＫＧＦ−２の
コグネイト受容体に結合して阻害することもできる。ＫＧＦ−２受容体には、限
定されるものではないが、ＦＧＦＲ２iiibおよびＦＧＦＲ１iiibが含まれる。そ
のような模倣ペプチドは、限定されるものではないが、ファージ展示または組み
合わせ化学といったような方法から得られる。例えば、Ｗrightonら，Ｓcience
２７３：４５８−４６３（１９９６）により開示された方法を使用して、模倣Ｋ
ＧＦ−２ペプチドを生成させることができる。
【００４９】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供するの
が好ましく、好ましくは、均一となるまで精製する。 本発明のポリペプチドは、単離された形であるのが好ましい。「単離されたポ
リペプチド」という語は、その天然の環境から除去されたポリペプチドを意図す
る。従って、組換え宿主細胞内で産生されるポリペプチド、および／または組換
え宿主細胞内に含まれるポリペプチドは、本発明の目的には単離されたと考えら
れる。組換え宿主細胞または天然源から部分的または実質的に精製されたポリペ
プチドもまた意図される。 本発明のポリペプチドには、配列番号２のポリペプチド(特に、成熟ポリペプ
チド)、さらにはまた、配列番号２のポリペプチドに対して、少なくとも８０％
、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％
、９９％の類似性(より好ましくは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１
％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性)を有
するポリペプチドが含まれ、一般に、少なくとも３０のアミノ酸、より好ましく
は少なくとも５０のアミノ酸を含むポリペプチド(例えば、以下に記載する欠失
変異体)のそのような部分をもつ、そのようなポリペプチドの部分もまた含まれ
る。 当業界で知られているように、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、ある
ポリペプチドのアミノ酸配列およびその同類アミノ酸置換物を、もう１つのポリ
ペプチドの配列と比較することにより決定される。 ２つのポリペプチドに関する「類似性％」とは、Ｂestfitプログラム(Ｗiscon
sin Ｓequence Ａnalysis Ｐackage，Ｕnix（登録商標）のバージョン８，Ｇene
tics Ｃomputer Ｇroup，Ｕniversity Ｒesearch Ｐark，５７５ Ｓcience Ｄri
ve，Ｍadison，ＷＩ ５３７１１)、および類似性を決定するためのデフォールト
セッティング(default settng)を使用して、２つのポリペプチドのアミノ酸配列
を比較することにより得られる類似性スコアを意図する。Ｂestfitは、Ｓmithお
よびＷaterman(Ａdvances in Ａpplied Ｍathematics ２：４８２−４８９（１
９８１）)の局所相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列の間の類似性が最
良のセグメントを見出す。
【００５０】 例えば、ＫＧＦ−２ポリペプチドの参考アミノ酸配列に対して、例えば、少な
くとも９５％が「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドという語は、ＫＧ
Ｆ−２ポリペプチドの参考アミノ酸配列の１００のアミノ酸毎につき、そのポリ
ペプチド配列にアミノ酸変化が５つまで含まれ得ることを除き、該ポリペプチド
のアミノ酸配列が参考配列と同一であることを意図する。言いかえれば、参考ア
ミノ酸配列に対して、少なくとも９５％が同一のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドを得るためには、参考配列におけるアミノ酸残基の５％までは、欠失しても
よいし、もしくは別のアミノ酸で置換されてもよく、または参考配列における全
アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸を参考配列に挿入してもよい。参考配列
のこれらの変化は、参考アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端部位、ま
たはそれらの末端部位の間のどこかで起こり得て、参考配列における残基の間に
個別に、または参考配列内部に１つまたはそれ以上の連続的な基として散在する
。
【００５１】 実際的な問題として、個々のポリペプチドがいずれも、例えば、第１図［配列
番号２］に示すアミノ酸配列に対して、または寄託されたcＤＮＡクローンによ
りコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９
１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、または９９％が同一
であるかどうかは、Ｂestfitプログラム(Ｗisconsin Ｓequence Ａnalysis Ｐac
kage，Ｕnix（登録商標）のバージョン８，Ｇenetics Ｃomputer Ｇroup，Ｕniv
ersity Ｒesearch Ｐark，５７５ Ｓcience Ｄrive，Ｍadison，ＷＩ ５３７１
１)のような既知のコンピュータープログラムを従来通り使用して決定すること
ができる。Ｂestfitまたはいずれかの他のシークエンスアラインメントプログラ
ムを使用して、個々の配列が、本発明による参考配列に対して、例えば、９５％
が同一であるかどうかを決定する場合には、勿論、同一性のパーセンテージを参
考アミノ酸配列の全長にわたり計算して、参考配列におけるアミノ酸残基の全数
の５％までの相同性におけるギャップが許容されるよう、パラメーターを設定す
る。
【００５２】 質問（query）配列（本発明の配列）と主題（subject）配列との間での全体に
わたる最良のマッチを決定する好ましい方法（普遍的な配列アラインメントと称
する）は、Brutlagら（Comp. App. Biosci. (1990) 6: 237-245）のアルゴリズ
ムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて決定することができ
る。配列のアラインメントにおいて質問配列および主題配列はともにヌクレオチ
ド配列であるかまたはともにアミノ酸配列である。該普遍的な配列アラインメン
トの結果は、パーセント同一性である。ＦＡＳＴＤＢによるアミノ酸アラインメ
ントに用いる好ましいパラメータは、行列＝ＰＡＭ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミ
スマッチペナルティ＝１、ジョイニング（Joining）ペナルティ＝２０、無作為
化グループ長（Randomization Group Length）＝０、カットオフスコア＝１、ウ
インドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ
＝０.０５、ウインドウサイズ＝５００または主題アミノ酸配列の長さのいずれ
か短い方。
【００５３】 もしも主題配列が質問配列よりも、内部の欠失のためではなくＮ末端またはＣ
末端欠失のために短いなら、結果を手動で補正しなければならない。これは、Ｆ
ＡＳＴＤＢでは普遍的パーセント同一性を計算するときにＮ末端またはＣ末端で
の欠失を考慮しないからである。質問配列に比べてＮ末端またはＣ末端が欠失し
た主題配列については、主題配列のＮ末端およびＣ末端にあってマッチ／アライ
ンメントしない質問配列の残基数を質問配列の全塩基のパーセントとして計算す
ることによりパーセント同一性を補正する。残基がマッチ／アラインメントした
か否かはＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果により決定される。ついで、こ
のパーセントを、特定のパラメータを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムにより
計算したパーセント同一性から差し引いて最終的なパーセント同一性のスコアを
得る。この補正したスコアは、本発明の目的のために用いるものである。質問配
列とマッチ／アラインメントしない主題配列のＮ末端残基およびＣ末端残基の外
側の位置の残基のみが、パーセント同一性スコアを手動で調整する目的のために
考慮される。すなわち、主題配列の最もＮ末端側およびＣ末端側よりも外側に位
置する質問配列の残基のみである。
【００５４】 たとえば、９０のアミノ酸残基の主題配列を１００残基の質問配列にアライン
メントさせてパーセント同一性を決定する。欠失は主題配列のＮ末端にあり、そ
れゆえＦＡＳＴＤＢアラインメントはＮ末端の最初の１０塩基のマッチ／アライ
ンメントを示さない。この１０の対合しない残基は配列の１０％であるため（マ
ッチしないＮ末端およびＣ末端の残基数／質問配列中の残基の総数）、１０％を
ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算したパーセント同一性スコアから差し引く
。もしも残りの９０残基が完全にマッチするなら最終的なパーセント同一性は９
０％であろう。他の例として、９０残基の主題配列を１００残基の質問配列と比
較する。今度は欠失は内部の欠失であるため、質問配列とマッチ／アラインメン
トしない主題配列のＮ末端またはＣ末端上の残基は存在しない。この場合はＦＡ
ＳＴＤＢによって計算したパーセント同一性を手動で補正することはしない。繰
り返すが、質問配列とマッチ／アラインメントしない主題配列のＮ末端およびＣ
末端の外側に位置する残基のみを手動により補正するのである。その他の手動に
よる補正は本発明の目的のためには行わない。
【００５５】 以下に詳細に記載するように、本発明のポリペプチドを使用して、ポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗体を生じさせることができる。それらは、以下に記
載するＫＧＦ−２タンパク質発現を検出するための診断用アッセイにおいて有用
であり、またはＫＧＦ−２タンパク質機能を高め、もしくは阻害することが可能
なアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。さらに、そのようなポリ
ペプチドを酵母のツーハイブリッドシステムで使用して、本発明により候補とな
るアゴニストおよびアンタゴニストでもある、ＫＧＦ−２タンパク質を結合する
タンパク質を「捕獲」することができる。酵母のツーハイブリッドシステムは、
ＦieldsおよびＳong，Ｎature ３４０：２４５−２４６（１９８９）に記載され
ている。
【００５６】 別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープを有する部
分を含んでなる、ペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部
分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原エピトープまたは抗原エピト
ープである。「免疫原エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合に、
抗体反応を誘引するタンパク質の部分として定義される。これらの免疫原エピト
ープは、分子上の幾つかの場所に限られると信じられる。他方では、抗体が結合
することができるタンパク質分子の領域は、「抗原エピトープ」として定義され
ている。タンパク質の免疫原エピトープの数は、一般に、抗原エピトープの数よ
り少ない。例えば、Ｇeysenら，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８１：３
９９８−４００２（１９８３）を参照。
【００５７】 抗原エピトープ(すなわち、抗体が結合することができるタンパク質分子の領
域を含む)を有するペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、あるタンパク
質配列の部分を模倣する(mimic)比較的短い合成ペプチドは、部分的に模倣され
たタンパク質と反応する抗血清を誘引することが可能であることは当業界でよく
知られている。例えば、Ｓutcliffe, Ｊ. Ｇ. ，Ｓhinnick, Ｔ. Ｍ. ，Ｇreen,
Ｎ. 、およびＬearner, Ｒ. Ａ. （１９８３）Ａntibodies that react with p
redetermined sites on proteins．Ｓcience ２１９：６６０−６６６を参照。
タンパク質反応性血清を誘引することが可能なペプチドは、しばしば、タンパク
質の一次配列において示され、一組の簡単な化学規則により特徴付けられ、また
無傷のタンパク質の免疫優性領域(すなわち、免疫原エピトープ)にも、またはア
ミノもしくはカルボキシル末端にも限られない。極めて疎水性であるペプチド、
および６つまたはより少ない残基のペプチドは、一般に、模倣されたタンパク質
に結合する抗体を誘引するのに有効ではなく；より長く、可溶性のペプチド、と
りわけプロリン残基を含むペプチドは、通常、有効である。Ｓutcliffeら，上記
，６６１。例えば、インフルエンザウイルス赤血球凝集素 ＨＡ１のポリペプチ
ド鎖の配列の７５％をカバーする８−３９の残基を含む、これらのガイダンスに
より設計された２０のペプチドのうち１８は、ＨＡ１タンパク質または無傷のウ
イルスと反応する抗体を誘導し；またＭuＬＶポリメラーゼ由来の１２／１２の
ペプチド、および狂犬病糖たんぱく質由来の１８／１８は、各々のタンパク質を
沈殿させる抗体を誘導した。
【００５８】 従って、本発明の抗原エピトープを有するペプチドまたはポリペプチドは、モ
ノクローナル抗体を含め、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を生じ
させるのに有用である。従って、抗原エピトープを有するペプチドで免疫化した
ドナー由来の膵臓細胞の融合により得られるハイブリドーマの多くは、一般に、
天然のタンパク質と反応する抗体を分泌する。Ｓutcliffeら，上記，６６３。抗
原エピトープを有するペプチドまたはポリペプチドにより生じさせた抗体は、模
倣されたタンパク質を検出するのに有用であり、また様々なペプチドに対する抗
体は、翻訳後プロセッシングを受けるタンパク質前駆体の様々な領域の結末を追
跡するのに使用することができる。免疫沈降アッセイにおいて、短いペプチド(
例えば、約９のアミノ酸)でさえも、より大きなペプチドを結合して置換するこ
とができることが示されたことから、そのペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模
倣されたタンパク質に関する様々な定性的アッセイまたは定量的アッセイにおい
て、例えば、競合アッセイにおいて使用することができる。例えば、Ｗilsonら
，Ｃell ３７：７６７−７７８（１９８４），７７７を参照。本発明の抗ペプチ
ド抗体はまた、例えば、当業界でよく知られている方法を使用する吸着クロマト
グラフィーによる模倣されたタンパク質の精製にも有用である。
【００５９】 先のガイダンスにより設計された、本発明の抗原エピトープを有するペプチド
およびポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、少
なくとも７、より好ましくは少なくとも９、最も好ましくは約１５〜約３０の間
のアミノ酸の配列を含むのが好ましい。しかし、約３０、４０、５０、６０、７
０、８０、９０、１００、もしくは１５０のアミノ酸を含む、本発明のポリペプ
チドのアミノ酸配列のより大きな部分、または本発明のポリペプチドの全体のア
ミノ酸配列までの、いずれの長さを含んでなるペプチドもしくはポリペプチド、
およびその全体のアミノ酸配列が含まれるペプチドもしくはポリペプチドもまた
、本発明のエピトープを有するペプチドまたはポリペプチドと考えれ、模倣され
たタンパク質と反応する抗体を誘導するのに有用である。好ましくは、エピトー
プを有するペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中で実質的な溶解性を与えるよ
う選択し(すなわち、その配列には、比較的親水性の残基が含まれており、比較
的疎水性の配列を避けるのが好ましい)；またプロリン残基を含む配列が特に好
ましい。
【００６０】 ＫＧＦ−２に特異的な抗体を生成させるために使用することができる抗原ポリ
ペプチドまたはペプチドの非限定的な例には、次のものが含まれる：
【化２】 そしてまた、さらに２つのより短い予想される抗原領域、第１図（配列番号：２
）のＧln７４−Ａrg７８、第１図（配列番号：２）のおよびＧln１７０−Ｇln１
７５がある。 本発明のエピトープを有するペプチドおよびポリペプチドは、本発明の核酸分
子を使用して、組換え法を含め、ペプチドまたはポリペプチドを製造するための
、いずれかの従来の方法により製造することができる。例えば、短いエピトープ
を有するアミノ酸配列を、組換え製造および精製の間、さらにはまた、免疫化の
間、担体として作用する、より大きなポリペプチドに融合させて、抗ペプチド抗
体を製造することができる。エピトープを有するペプチドはまた、化学合成の既
知の方法を使用して合成することもできる。例えば、Ｈoughtenは、４週間未満
で製造されて特徴付けられた(ＥＬＩＳＡ型の結合試験により)ＨＡ１ポリペプチ
ドのセグメントの１個のアミノ酸変異体である、１０−２０mgの２４８の異なっ
た１３の残基のペプチドのような、多数のペプチドの合成の簡単な方法を記載し
ている。Ｈoughten, Ｒ. Ａ. （１９８５）Ｇeneral method for the rapid sol
id−phase synthesis of large numbers of peptides：specificity of antigen
−antibody interaction at the level of individual amino acids．Ｐroc. Ｎ
atl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５。この「同時多重ペプチ
ド合成(ＳＭＰＳ)」のプロセスはさらに、Ｈoughtenら（１９８６）の米国特許
第４,６３１,２１１号に記載されている。この方法では、様々なペプチドの固相
合成のための個々の樹脂が別々の溶媒透過性バケットに含まれており、固相法に
関与する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全に手動の方法は
、５００−１０００またはそれ以上の合成を同時に行えるようにする。Ｈoughte
nら，上記，５１３４。
【００６１】 本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープ、ま
たはＡＴＣＣ寄託番号７５９７７に含まれるポリヌクレオチド配列または配列番
号１の配列の相補鎖もしくはＡＴＣＣ寄託番号７５９７７に含まれる配列の相補
鎖にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下または上記に記載した一
層低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによっ
てコードされるポリペプチド配列のエピトープを含むあるいはエピトープからな
るポリペプチドを包含する。本発明はさらに、本発明のポリペプチド配列のエピ
トープをコードするポリヌクレオチド配列（たとえば、配列番号１に記載する配
列など）、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖のポ
リヌクレオチド配列、および該相補鎖にストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件下または上記に記載した一層低いストリンジェンシー条件下でハイブリ
ダイズするポリヌクレオチド配列を包含する。
【００６２】 本明細書において「エピトープ」とは、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ま
しくはヒトにおいて抗原性または免疫原性の活性を有するポリペプチドの部分を
いう。好ましい態様において、本発明は、エピトープを含むポリペプチド並びに
該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。本明細書において「
免疫原性エピトープ」とは、当該技術分野で知られた方法、たとえば以下に記載
する抗体産生方法（たとえば、Geysenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 399
8-4002 (1983)）によって決定されるように、動物に抗体応答を引き起こすタン
パク質の部分として定義される。本明細書において「抗原性エピトープ」とは、
当該技術分野で知られた方法、たとえば本明細書に記載するイムノアッセイによ
って決定されるように、抗体がその抗原に免疫特異的に結合できるタンパク質の
部分として定義される。免疫特異的な結合には非特異的な結合は含まれないが、
必ずしも他の抗原との交差反応を排除するものではない。抗原性エピトープは必
ずしも免疫原性である必要はない。 エピトープとして機能する断片は、通常の手段により製造することができる（
たとえば、Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135 (1985)を参
照、さらに米国特許第４,６３１,２１１号に記載されている）。
【００６３】 本発明において、抗原性エピトープは、好ましくは少なくとも４、少なくとも
５、少なくとも６、少なくとも７、さらに好ましくは少なくとも８、少なくとも
９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少な
くとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３
０、少なくとも４０、少なくとも５０、および最も好ましくは約１５〜約３０の
範囲のアミノ酸の配列を含む。免疫原性または抗原性のエピトープを含む好まし
いポリペプチドは、長さが少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４
０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５また
は１００のアミノ酸残基である。さらに好ましい抗原性エピトープは、残基：Ｍ
−１〜Ｈ−１５；Ｗ−２〜Ｌ−１６；Ｋ−３〜Ｐ−１７；Ｗ−４〜Ｇ−１８；Ｉ
−５〜Ｃ−１９；Ｌ−６〜Ｃ−２０；Ｔ−７〜Ｃ−２１；Ｈ−８〜Ｃ−２２；Ｃ
−９〜Ｃ−２３；Ａ−１０〜Ｆ−２４；Ｓ−１１〜Ｌ−２５；Ａ−１２〜Ｌ−２
６；Ｆ−１３〜Ｌ−２７；Ｐ−１４〜Ｆ−２８；Ｈ−１５〜Ｌ−２９；Ｌ−１６
〜Ｖ−３０；Ｐ−１７〜Ｓ−３１；Ｇ−１８〜Ｓ−３２；Ｃ−１９〜Ｖ−３３；
Ｃ−２０〜Ｐ−３４；Ｃ−２１〜Ｖ−３５；Ｃ−２２〜Ｔ−３６；Ｃ−２３〜Ｃ
−３７；Ｆ−２４〜Ｑ−３８；Ｌ−２５〜Ａ−３９；Ｌ−２６〜Ｌ−４０；Ｌ−
２７〜Ｇ−４１；Ｆ−２８〜Ｑ−４２；Ｌ−２９〜Ｄ−４３；Ｖ−３０〜Ｍ−４
４；Ｓ−３１〜Ｖ−４５；Ｓ−３２〜Ｓ−４６；Ｖ−３３〜Ｐ−４７；Ｐ−３４
〜Ｅ−４８；Ｖ−３５〜Ａ−４９；Ｔ−３６〜Ｔ−５０；Ｃ−３７〜Ｎ−５１；
Ｑ−３８〜Ｓ−５２；Ａ−３９〜Ｓ−５３；Ｌ−４０〜Ｓ−５４；Ｇ−４１〜Ｓ
−５５；Ｑ−４２〜Ｓ−５６；Ｄ−４３〜Ｆ−５７；Ｍ−４４〜Ｓ−５８；Ｖ−
４５〜Ｓ−５９；Ｓ−４６〜Ｐ−６０；Ｐ−４７〜Ｓ−６１；Ｅ−４８〜Ｓ−６
２；Ａ−４９〜Ａ−６３；Ｔ−５０〜Ｇ−６４；Ｎ−５１〜Ｒ−６５；Ｓ−５２
〜Ｈ−６６；Ｓ−５３〜Ｖ−６７；Ｓ−５４〜Ｒ−６８；Ｓ−５５〜Ｓ−６９；
Ｓ−５６〜Ｙ−７０；Ｆ−５７〜Ｎ−７１；Ｓ−５８〜Ｈ−７２；Ｓ−５９〜Ｌ
−７３；Ｐ−６０〜Ｑ−７４；Ｓ−６１〜Ｇ−７５；Ｓ−６２〜Ｄ−７６；Ａ−
６３〜Ｖ−７７；Ｇ−６４〜Ｒ−７８；Ｒ−６５〜Ｗ−７９；Ｈ−６６〜Ｒ−８
０；Ｖ−６７〜Ｋ−８１；Ｒ−６８〜Ｌ−８２；Ｓ−６９〜Ｆ−８３；Ｙ−７０
〜Ｓ−８４；Ｎ−７１〜Ｆ−８５；Ｈ−７２〜Ｔ−８６；Ｌ−７３〜Ｋ−８７；
Ｑ−７４〜Ｙ−８８；Ｇ−７５〜Ｆ−８９；Ｄ−７６〜Ｌ−９０；Ｖ−７７〜Ｋ
−９１；Ｒ−７８〜Ｉ−９２；Ｗ−７９〜Ｅ−９３；Ｒ−８０〜Ｋ−９４；Ｋ−
８１〜Ｎ−９５；Ｌ−８２〜Ｇ−９６；Ｆ−８３〜Ｋ−９７；Ｓ−８４〜Ｖ−９
８；Ｆ−８５〜Ｓ−９９；Ｔ−８６〜Ｇ−１００；Ｋ−８７〜Ｔ−１０１；Ｙ−
８８〜Ｋ−１０２；Ｆ−８９〜Ｋ−１０３；Ｌ−９０〜Ｅ−１０４；Ｋ−９１〜
Ｎ−１０５；Ｉ−９２〜Ｃ−１０６；Ｅ−９３〜Ｐ−１０７；Ｋ−９４〜Ｙ−１
０８；Ｎ−９５〜Ｓ−１０９；Ｇ−９６〜Ｉ−１１０；Ｋ−９７〜Ｌ−１１１；
Ｖ−９８〜Ｅ−１１２；Ｓ−９９〜Ｉ−１１３；Ｇ−１００〜Ｔ−１１４；Ｔ−
１０１〜Ｓ−１１５；Ｋ−１０２〜Ｖ−１１６；Ｋ−１０３〜Ｅ−１１７；Ｅ−
１０４〜Ｉ−１１８；Ｎ−１０５〜Ｇ−１１９；Ｃ−１０６〜Ｖ−１２０；Ｐ−
１０７〜Ｖ−１２１；Ｙ−１０８〜Ａ−１２２；Ｓ−１０９〜Ｖ−１２３；Ｉ−
１１０〜Ｋ−１２４；Ｌ−１１１〜Ａ−１２５；Ｅ−１１２〜Ｉ−１２６；Ｉ−
１１３〜Ｎ−１２７；Ｔ−１１４〜Ｓ−１２８；Ｓ−１１５〜Ｎ−１２９；Ｖ−
１１６〜Ｙ−１３０；Ｅ−１１７〜Ｙ−１３１；Ｉ−１１８〜Ｌ−１３２；Ｇ−
１１９〜Ａ−１３３；Ｖ−１２０〜Ｍ−１３４；Ｖ−１２１〜Ｎ−１３５；Ａ−
１２２〜Ｋ−１３６；Ｖ−１２３〜Ｋ−１３７；Ｋ−１２４〜Ｇ−１３８；Ａ−
１２５〜Ｋ−１３９；Ｉ−１２６〜Ｌ−１４０；Ｎ−１２７〜Ｙ−１４１；Ｓ−
１２８〜Ｇ−１４２；Ｎ−１２９〜Ｓ−１４３；Ｙ−１３０〜Ｋ−１４４；Ｙ−
１３１〜Ｅ−１４５；Ｌ−１３２〜Ｆ−１４６；Ａ−１３３〜Ｎ−１４７；Ｍ−
１３４〜Ｎ−１４８；Ｎ−１３５〜Ｄ−１４９；Ｋ−１３６〜Ｃ−１５０；Ｋ−
１３７〜Ｋ−１５１；Ｇ−１３８〜Ｌ−１５２；Ｋ−１３９〜Ｋ−１５３；Ｌ−
１４０〜Ｅ−１５４；Ｙ−１４１〜Ｒ−１５５；Ｇ−１４２〜Ｉ−１５６；Ｓ−
１４３〜Ｅ−１５７；Ｋ−１４４〜Ｅ−１５８；Ｅ−１４５〜Ｎ−１５９；Ｆ−
１４６〜Ｇ−１６０；Ｎ−１４７〜Ｙ−１６１；Ｎ−１４８〜Ｎ−１６２；Ｄ−
１４９〜Ｔ−１６３；Ｃ−１５０〜Ｙ−１６４；Ｋ−１５１〜Ａ−１６５；Ｌ−
１５２〜Ｓ−１６６；Ｋ−１５３〜Ｆ−１６７；Ｅ−１５４〜Ｎ−１６８；Ｒ−
１５５〜Ｗ−１６９；Ｉ−１５６〜Ｑ−１７０；Ｅ−１５７〜Ｈ−１７１；Ｅ−
１５８〜Ｎ−１７２；Ｎ−１５９〜Ｇ−１７３；Ｇ−１６０〜Ｒ−１７４；Ｙ−
１６１〜Ｑ−１７５；Ｎ−１６２〜Ｍ−１７６；Ｔ−１６３〜Ｙ−１７７；Ｙ−
１６４〜Ｖ−１７８；Ａ−１６５〜Ａ−１７９；Ｓ−１６６〜Ｌ−１８０；Ｆ−
１６７〜Ｎ−１８１；Ｎ−１６８〜Ｇ−１８２；Ｗ−１６９〜Ｋ−１８３；Ｑ−
１７０〜Ｇ−１８４；Ｈ−１７１〜Ａ−１８５；Ｎ−１７２〜Ｐ−１８６；Ｇ−
１７３〜Ｒ−１８７；Ｒ−１７４〜Ｒ−１８８；Ｑ−１７５〜Ｇ−１８９；Ｍ−
１７６〜Ｑ−１９０；Ｙ−１７７〜Ｋ−１９１；Ｖ−１７８〜Ｔ−１９２；Ａ−
１７９〜Ｒ−１９３；Ｌ−１８０〜Ｒ−１９４；Ｎ−１８１〜Ｋ−１９５；Ｇ−
１８２〜Ｎ−１９６；Ｋ−１８３〜Ｔ−１９７；Ｇ−１８４〜Ｓ−１９８；Ａ−
１８５〜Ａ−１９９；Ｐ−１８６〜Ｈ−２００；Ｒ−１８７〜Ｆ−２０１；Ｒ−
１８８〜Ｌ−２０２；Ｇ−１８９〜Ｐ−２０３；Ｑ−１９０〜Ｍ−２０４；Ｋ−
１９１〜Ｖ−２０５；Ｔ−１９２〜Ｖ−２０６；Ｒ−１９３〜Ｈ−２０７；およ
び／またはＲ−１９４〜Ｓ−２０８のアミノ酸配列を含むあるいはアミノ酸配列
からなる。これらポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドもまた本発明
に包含される。
【００６４】 さらなる限定されない好ましい抗原性エピトープとしては、本明細書に開示す
る抗原性エピトープ並びにその部分が挙げられる。抗原性エピトープは、たとえ
ば、該エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を産生する
のに有用である。好ましい抗原性エピトープとしては、本明細書に開示する抗原
性エピトープ、並びにこれらエピトープの２、３、４、５またはそれ以上の組み
合せが挙げられる。抗原性エピトープはイムノアッセイにおいて標的分子として
用いることができる（たとえば、Wilsonら、Cell 37: 767-778 (1984); Sutclif
feら、Science 219: 660-666 (1983)を参照）。
【００６５】 同様に、免疫原性エピトープは、たとえば、当該技術分野でよく知られた方法
に従って抗体を誘発するのに用いることができる（たとえば、Sutcliffeら、上
掲；Wilsonら、上掲；Chowら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914；およ
びBittleら、J. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985)を参照）。好ましい免疫原
性エピトープとしては、本明細書に開示する免疫原性エピトープ、並びにこれら
免疫原性エピトープの２、３、４、５またはそれ以上の組み合せが挙げられる。
１またはそれ以上の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、動物（ウサギや
ラットなど）の免疫系に対して抗体産生を誘発するためにアルブミンなどの担体
タンパク質とともに提示することができ、あるいはポリペプチドが充分な長さで
あるときは（少なくとも約２５のアミノ酸）該ポリペプチドを担体なしで提示す
ることができる。しかしながら、わずかに８ないし１０のアミノ酸を含む免疫原
性エピトープが、少なくとも変性ポリペプチド中の線状エピトープに結合しうる
抗体を産生するに充分であることが示されている（たとえば、ウエスタンブロッ
ティングにおいて）。
【００６６】 当業界でよく知られている方法により、本発明のエピトープを有するペプチド
およびポリペプチドを使用して、抗体を誘導する。例えば、Ｓutcliffeら，上記
；Ｗilsonら，上記；Ｃhow, Ｍ. ら，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８２
：９１０−９１４；およびＢittle, Ｆ. Ｊ. ら，Ｊ. Ｇen. Ｖirol. ６６：２
３４７−２３５４（１９８５）を参照。。一般に、動物を遊離ペプチドで免疫化
するのがよい；しかし、そのペプチドは、カサガイヘマシアニン(ＫＬＨ)または
破傷風トキソイドといったような高分子担体に結合させることにより、抗ペプチ
ド抗体の力価を高めることができる。例えば、システインを含むペプチドは、m
−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＭＢＳ)のよ
うなリンカーを使用して担体に結合させるのがよいが、他のペプチドは、グルタ
ルアルデヒドのような、より一般的なリンキング剤を使用して担体に結合させる
のがよい。ウサギ、ラット、およびマウスといったような動物を、例えば、約１
００μgのペプチド、または担体タンパク質、およびフロイントアジュバントを
含むエマルションの腹腔内注射および／または皮内注射により、遊離ペプチドま
たは担体に結合させたペプチドで免疫化する。例えば、固体表面に吸着させた遊
離ペプチドを使用するＥＬＩＳＡアッセイにより検出することができる、抗ペプ
チド抗体の有用な力価を与えるために、ブースター注射が、例えば、約２週間の
間隔で数回必要とされ得る。免疫化した動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力
価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当業界でよく知られている方法に
よる、固体担体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増大さ
せることができる。
【００６７】 本発明の免疫原エピトープを有するペプチド、すなわち、タンパク質全体が免
疫原である場合に、抗体反応を誘引するタンパク質の部分を当業界でよく知られ
ている方法により同定する。例えば、Ｇeysenら，上記は、酵素結合免疫吸着ア
ッセイにおいて反応させるのに十分な純度の、何百というペプチドの固形支持体
上での急速同時合成方法を開示している。次いで、合成したペプチドと抗体との
相互作用は、それらを支持体から除去することなく、容易に検出される。この方
法では、所望のタンパク質の免疫原エピトープを有するペプチドは、当業者によ
り通常的に同定することができる。例えば、口蹄疫ウイルスのコートタンパク質
における免疫学的に重要なエピトープは、Ｇeysenらにより、タンパク質の全体
の２１３のアミノ酸配列をカバーする、重複する組の全ての２０８の可能なヘキ
サペプチドの合成による７のアミノ酸の分折(resolution)で位置確認された。次
に、全ての２０のアミノ酸がエピトープ内の全ての位置で順次(in turn)置換さ
れた、完全な置換された一組のペプチドを合成して、抗体との反応に特異性を与
える特定のアミノ酸を決定した。従って、この方法により、本発明のエピトープ
を有するペプチドのペプチドアナログを通常的に製造することができる。Ｇeyse
n（１９８７）の米国特許第４,７０８,７８１号はさらに、所望のタンパク質の
免疫原エピトープを有するペプチドを同定する、この方法を開示している。 なおさらに、Ｇeysen（１９９０）の米国特許第５,１９４,３９２号は、問題
のある抗体の特定のパラトープ(抗原結合部位)に相補的であるエピトープのトポ
ロジー的な等価物(すなわち、「ミモトープ」)であるモノマー(アミノ酸または
他の化合物)の配列を検出または決定する一般的な方法を記載している。より一
般的には、Ｇeysen（１９８９）の米国特許第４,４３３,０９２号は、問題の特
定の受容体のリガンド結合部位に相補的であるリガンドのトポロジー的な等価物
であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記載している。同様に、過ア
ルキル化オリゴペプチド混合物に関する、Ｈoughten, Ｒ. Ａ. ら（１９９６）
の米国特許第５,４０８,９７１号は、直鎖状Ｃ１−Ｃ７−アルキルで過アルキル
化されたオリゴペプチド、並びにそのようなペプチドの組およびライブラリー、
さらにはまた、問題の受容体分子に優先的に結合する過アルキル化オリゴペプチ
ドの配列を決定するために、そのようなオリゴヌクレオチドの組およびライブラ
リーを使用する方法を開示している。従って、本発明のエピトープを有するペプ
チドの非ペプチドアナログもまた、これらの方法により通常的に製造することが
できる。
【００６８】 当業者は、先に記載した本発明のＫＧＦ−２ポリペプチド、およびそのエピト
ープを有するフラグメントを、免疫グロブリン(ＩgＧ)の定常ドメインの部分と
組み合わせて、キメラポリペプチドを生じ得ることを認識するであろう。これら
の融合タンパク質は、精製を容易にして、インビボにおいて増大された半減期を
示す。これは、例えば、ヒトＣＤ−４−ポリペプチドの最初の２つのドメイン、
および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の様々なドメイン
からなるキメラタンパク質に関して示された(ＥＰＡ ３９４，８２７；Ｔraunec
kerら，Ｎature ３３１：８４−８６（１９８８）)。ＩgＧ部分によりジスルフ
ィド結合したダイマー構造を有する融合タンパク質もまた、モノマーＫＧＦ−２
タンパク質またはタンパク質フラグメント単独より、他の分子を結合して中和す
るのに有効であり得る(Ｆountoulakisら，Ｊ. Ｂiochem. ２７０：３９５８−３
９６４（１９９５）)。 本発明により、ＫＧＦ−２の新規変異体もまた記載する。これらは、ＫＧＦ−
２の１個またはそれ以上のアミノ酸を欠失または置換することにより製造するこ
とができる。天然の変異体は、アレル変異体と呼ばれている。アレル変異体は、
サイレントであり得る(コードされたポリペプチドには何の変化もない)か、また
は変えられたアミノ酸配列を有し得る。 天然のＫＧＦ−２の特性を改善または変更しようとするためには、タンパク質
工学を使用することができる。当業界で知られている組換えＤＮＡ技術を使用し
て、新規ポリペプチドを作り出すことができる。ムテインおよび欠失は、例えば
、高められた活性、または増大された安定性を示し得る。加えて、それらは、よ
り高い収率で精製することができ、少なくともある精製および保存条件下、より
良好な溶解性を示す。構築することができる変異の例を以下に示す。
【００６９】 本発明のＫＧＦ−２ポリペプチドはモノマーまたはマルチマー（すなわち、二
量体、三量体、四量体および高次の多量体）であってよい。従って、本発明は、
本発明のＫＧＦ−２ポリペプチドのモノマーおよびマルチマー、その製造および
それを含有する組成物（好ましくは医薬組成物）に関する。特別の態様において
、本発明のポリペプチドはモノマー、二量体、三量体または四量体である。さら
なる態様において、本発明のマルチマーは少なくとも二量体、少なくとも三量体
、または少なくとも四量体である。
【００７０】 本発明によって包含されるマルチマーは、ホモマーまたはへテロマーであって
よい。本明細書において「ホモマー」とは、配列番号２のアミノ酸配列に対応す
るポリペプチドまたは寄託したクローンに含まれるｃＤＮＡ（本明細書に記載す
るものに対応する、断片、変異体、スプライス変異体および融合タンパク質を含
む）によってコードされるポリペプチドのみを含むマルチマーをいう。これらホ
モマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有するＫＧＦ−２ポリペプチドを含
んでいてよい。特別の態様において、本発明のホモマーは同一のアミノ酸配列を
有するＫＧＦ−２ポリペプチドのみを含むマルチマーである。他の特別の態様に
おいて、本発明のホモマーは異なるアミノ酸配列を有するＫＧＦ−２ポリペプチ
ドを含むマルチマーである。特別の態様において、本発明のマルチマーは、ホモ
ダイマー（たとえば、同一または異なるアミノ酸配列を有するＫＧＦ−２ポリペ
プチドを含むもの）またはホモトリマー（たとえば、同一および／または異なる
アミノ酸配列を有するＫＧＦ−２ポリペプチドを含むもの）である。さらなる態
様において、本発明のホモのマルチマーは少なくともホモダイマー、少なくとも
ホモトリマー、または少なくともホモテトラマーである。
【００７１】 本明細書においてへテロマーとは、本発明のＫＧＦ−２ポリペプチドに加えて
１またはそれ以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質のポリペプ
チド）を含むマルチマーをいう。特別の態様において、本発明のマルチマーは、
へテロダイマー、へテロトリマー、またはへテロテトラマーである。さらなる態
様において、本発明のへテロマルチマーは、少なくともへテロダイマー、少なく
ともへテロトリマー、または少なくともへテロテトラマーである。
【００７２】 本発明のマルチマーは、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合性
の会合の結果であってよく、および／または、たとえばリポソーム形成により間
接的に連結されていてよい。それゆえ、一つの態様において、ホモダイマーやホ
モトリマーなどの本発明のマルチマーは本発明のポリペプチドが溶液中で互いに
接触したときに形成される。他の態様において、たとえばへテロトリマーやへテ
ロテトラマーなどの本発明のへテロマルチマーは、本発明のポリペプチドが本発
明のポリペプチドに対する抗体（本発明のポリペプチドに融合した異種ポリペプ
チド配列に対する抗体を含む）に溶液中で接触したときに形成される。他の態様
において、本発明のマルチマーは、本発明のＫＧＦ−２ポリペプチドとの、およ
び／または本発明のＫＧＦ−２ポリペプチド間での共有結合によって形成される
。そのような共有結合には、ポリペプチド配列に含まれる１またはそれ以上のア
ミノ酸残基（たとえば、配列番号２に示される残基、またはクローンＨＰＲＣＣ
５７またはＡＴＣＣ寄託番号７５９７７または７５９０１に含まれるクローンに
よってコードされるポリペプチドに含まれる残基）が関与する。
【００７３】 一つの例として、共有結合は、天然の（すなわち、天然に存在する）ポリペプ
チドで相互作用するポリペプチド配列内に位置するシステイン残基間の架橋であ
る。他の例として、共有結合は化学的操作または組換え操作の結果である。他の
態様において、そのような共有結合にはＫＧＦ−２融合タンパク質中の異種ポリ
ペプチド配列に含まれる１またはそれ以上のアミノ酸残基が関与する。一例とし
て、共有結合は本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間で形成される（た
とえば、米国特許第５,４７８,９２５号を参照）。特別の例として、共有結合は
本発明のＫＧＦ−２−Ｆｃ融合タンパク質に含まれる異種配列間で形成される（
本明細書に記載）。他の特別の例として、本発明の融合タンパク質の共有結合は
、共有結合してマルチマーを形成しうる他のタンパク質、たとえばオステオプロ
テゲリン（osteoprotegerin）からの異種ポリペプチド配列間で形成される（た
とえば、国際公開第ＷＯ９８／４９３０５を参照；その全体を参照のため本明細
書に引用する）。他の態様において、本発明の２またはそれ以上のポリペプチド
がペプチド結合を介して連結される。例としては、米国特許第５,０７３,６２７
号（参照のため本明細書に引用する）に記載のペプチドリンカーが挙げられる。
ペプチドリンカーにより隔てられた本発明の複数のポリペプチドを含むタンパク
質は、通常の組換えＤＮＡ法により製造できる。
【００７４】 本発明のマルチマーポリペプチドの他の製造方法は、ロイシンジッパーまたは
イソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドの使用
を含む。ロイシンジッパーおよびイソロイシンジッパードメインは、かかるドメ
インを含むタンパク質の多量体形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジ
ッパーは最初、幾つかのＤＮＡ結合タンパク質で同定されたが（Landschulzら、
Science 240: 1759 (1988)）、その後、種々の異なるタンパク質で見出されてい
る。知られたロイシンジッパーとしては、二量体化するまたは三量体化する天然
のペプチドおよびその誘導体がある。本発明の可溶性のマルチマータンパク質を
製造するのに適したロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１
０３０８号（参照のため本明細書に引用する）に記載されている。溶液中で二量
体化または三量体化するポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドを含
む組換え融合タンパク質を適当な宿主細胞で発現させ、得られた可溶性のマルチ
マー融合タンパク質を当該技術分野で知られた方法により培養上澄み液から回収
する。
【００７５】 本発明の三量体ポリペプチドは、生物学的活性の増大という利点を提供する。
好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分は、三量体を優先的に形
成するものである。一例は、Hoppeら（FEBS Letters 344: 191 (1994)）および
米国特許出願第０８／４４６,９２２号（参照のため本明細書に引用する）に記
載されている肺界面活性剤タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパー
である。天然に存在する三量体タンパク質に由来する他のペプチドもまた、本発
明の三量体ポリペプチドを製造するのに用いることができる。
【００７６】 他の態様において、本発明のタンパク質は、ＦｌａｇＲポリペプチド配列を含
む本発明の融合タンパク質に含まれるＦｌａｇＲポリペプチド間の相互作用によ
って会合する。さらなる態様において、本発明の会合タンパク質は、本発明のＦ
ｌａｇＲ融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチド配列と抗ＦｌａｇＲ抗体と
の間の相互作用により会合する。
【００７７】 本発明のマルチマーは、当該技術分野で知られた化学的方法により製造するこ
とができる。たとえば、本発明のマルチマーに含ませようと意図するポリペプチ
ドを、リンカー分子および当該技術分野で知られたリンカー分子距離最適化法（
たとえば、米国特許第５,４７８,９２５号を参照；その全体を参照のため本明細
書に引用する）を用いて化学的に架橋することができる。さらに、本発明のマル
チマーは、当該技術分野で知られた方法を用い、マルチマーに含ませようと意図
するポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基間で１またはそれ以上の分
子間架橋を形成することにより製造することができる（たとえば、米国特許第５
,４７８,９２５号を参照；その全体を参照のため本明細書に引用する）。さらに
、本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端にシステイン
またはビオチンを付加することによってルーチンに修飾することができ、当該技
術分野で知られた方法を適用してこれら修飾ポリペプチドを１またはそれ以上含
むマルチマーを製造することができる（たとえば、米国特許第５,４７８,９２５
号を参照；その全体を参照のため本明細書に引用する）。さらに、当該技術分野
で知られた方法を適用して、本発明のマルチマーに含ませようと意図するポリペ
プチド成分を含むリポソームを形成することができる（たとえば、米国特許第５
,４７８,９２５号を参照；その全体を参照のため本明細書に引用する）。
【００７８】 別法として、本発明のマルチマーは当該技術分野で知られた遺伝子組換え法に
より製造することができる。一つの態様において、本発明のマルチマーに含まれ
るポリペプチドは、本明細書に記載したまたは当該技術分野で知られた（たとえ
ば、米国特許第５,４７８,９２５号を参照；その全体を参照のため本明細書に引
用する）融合タンパク質法を用いて組換え法により製造する。特別の態様におい
て、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド配列をリンカーポリペプチドをコードする配
列にライゲートし、ついで、さらに該ポリペプチドの翻訳産物をコードする合成
ポリヌクレオチドに開始のＣ末端からＮ末端へ逆の方向でライゲートすることに
より製造する（リーダー配列を欠く）（たとえば、米国特許第５,４７８,９２５
号を参照；その全体を参照のため本明細書に引用する）。他の態様において、本
明細書に記載したまたは当該技術分野で知られた組換え法（たとえば、米国特許
第５,４７８,９２５号を参照；その全体を参照のため本明細書に引用する）を適
用して、膜貫通ドメイン（または疎水性またはシグナルペプチド）を含み、膜再
構成法によりリポソーム中に導入できる本発明の組換えポリペプチドを製造する
。
【００７９】ポリヌクレオチドおよびポリペプチド断片 本発明はさらに、本明細書に記載する単離核酸分子の断片に関する。たとえば
、寄託したｃＤＮＡ（クローンＨＰＲＣＣ５７）のヌクレオチド配列、寄託した
ｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列
、図１に示すポリペプチド配列（配列番号２）をコードするヌクレオチド配列、
図１に示すヌクレオチド配列（配列番号１）、またはそれらの相補鎖を有する単
離核酸分子の断片とは、長さが少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは
少なくとも約２０ヌクレオチド、さらに一層好ましくは少なくとも３０ヌクレオ
チド、より一層好ましくは少なくとも約４０、５０、１００、１５０、２００、
２５０、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、５００、５５０、
または６００ヌクレオチドの断片をいう。これら断片は、本明細書に記載する診
断プローブやプライマーを含む（これらに限られない）多数の用途を有する。も
ちろん、一層長い断片、たとえば長さが５０１〜１５００ヌクレオチドのものも
また、寄託したｃＤＮＡ（クローンＨＰＲＣＣ５７）のヌクレオチド配列または
図１に示すヌクレオチド配列（配列番号１）の全部とはいわないまでも殆どに対
応する断片がそうであるように、本発明に従って有用である。長さが少なくとも
２０ヌクレオチドの断片とは、たとえば、寄託したｃＤＮＡのヌクレオチド配列
または図１に示すヌクレオチド配列（配列番号１）からの２０またはそれ以上の
連続した塩基を含む断片をいう。
【００８０】 さらに、ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド断片の代表例としては、配列番号１また
はその相補鎖または寄託したクローンに含まれるｃＤＮＡの、たとえば、ヌクレ
オチド番号がおよそ１−５０、５１−１００、１０１−１５０、１５１−２００
、２０１−２５０、２５１−３００、３０１−３５０、３５１−４００、４０１
−４５０、４５１−５００、５０１−５５０、５５１−６００、６５１−７００
、７０１−７５０、７５１−８００、８００−８５０、８５１−９００、９０１
−９５０、９５１−１０００、１００１−１０５０、１０５１−１１００、１１
０１−１１５０、１１５１−１２００、１２０１−１２５０、１２５１−１３０
０、１３０１−１３５０、１３５１−１４００、１４０１−１４５０、１４５１
−１５００、１５０１−１５５０、１５５１−１６００、１６０１−１６５０、
１６５１−１７００、１７０１−１７５０、１７５１−１８００、１８０１−１
８５０、１８５１−１９００、１９０１−１９５０、１９５１−２０００および
／または２００１から末端までの配列を有する断片をいう。この場合に「およそ
」とは、特に指定した範囲のいずれかの末端または両末端において幾つかの（５
、４、３、２または１）ヌクレオチド分だけ長いかまたは短いことを意味する。
【００８１】 好ましくは、本発明のポリヌクレオチド断片は、ＫＧＦ−２の機能的活性を示
すポリペプチドをコードする。ここでＫＧＦ−２の「機能的活性」を示すポリペ
プチドとは、完全長の（完全な）ＫＧＦ−２タンパク質に付随する１またはそれ
以上の知られた機能的活性を示すことのできるポリペプチドを意味する。そのよ
うな機能的な活性としては、これらに限られるものではないが、生物学的活性、
抗原性［抗ＫＧＦ−２抗体に結合する（または結合に関してＫＧＦ−２ポリペプ
チドと競合する）能力］、免疫原性（ＫＧＦ−２ポリペプチドに結合する抗体を
産生する能力）、本発明のＫＧＦ−２ポリペプチドとマルチマーを形成する能力
、およびＫＧＦ−２ポリペプチドに対するレセプターまたはリガンドと結合する
能力が挙げられる。 ＫＧＦ−２ポリペプチド、およびその断片、変異体、誘導体およびアナログの
機能的活性は、種々の方法によりアッセイすることができる。
【００８２】 たとえば、抗ＫＧＦ−２抗体に結合する能力または抗ＫＧＦ−２抗体への結合
に関して完全長のＫＧＦ−２ポリペプチドと競合する能力をアッセイする一つの
態様において、当該技術分野で知られた種々のイムノアッセイを用いることがで
き、たとえば、これらに限られるものではないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬ
ＩＳＡ（酵素結合抗体免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、
イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、イン
シトゥイムノアッセイ（たとえば、コロイド状金、酵素または放射性同位体標識
を用いたもの）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（たとえば、ゲ
ル凝集アッセイ、血球凝集反応）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロ
テインＡアッセイ、およびイムノエレクトロフォレシスアッセイなどの技術を用
いた競合および非競合アッセイを用いることができる。一つの態様において、一
次抗体上の標識を検出することにより抗体結合を検出する。他の態様においては
、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより一次抗体を検出
する。さらなる態様において、二次抗体を標識する。イムノアッセイにおける結
合を検出する手段としては多くのものが当該技術分野で知られており、本発明の
範囲に包含される。
【００８３】 他の態様において、ＫＧＦ−２リガンドを同定する場合、または本発明のポリ
ペプチド、その断片、変異体または誘導体がマルチマーを形成する能力を評価す
る場合、結合は当該技術分野でよく知られた手段、たとえば還元および非還元ゲ
ルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、および
アフィニティーブロッティングによりアッセイすることができる。一般にPhizic
ky, E.ら、Microbiol. Rev. 59: 94-123 (1995)を参照。他の態様において、Ｋ
ＧＦ−２のその基質への結合の生理的相関（シグナル伝達）をアッセイできる。 さらに、本明細書に記載したおよび当該技術分野で知られたアッセイは、ＫＧ
Ｆ−２ポリペプチドおよびその断片、変異体、誘導体およびアナログがＫＧＦ−
２に関連する生物学的活性を引き起こす（インビトロかまたはインビボにて）能
力を測定するのにルーチンに応用することができる。他の方法は当業者に知られ
ており、本発明の範囲内である。
【００８４】 本発明はさらに、本明細書に記載するＫＧＦ−２ポリペプチドの断片に関する
。たとえば、寄託したｃＤＮＡ（クローンＨＰＲＣＣ５７）によってコードされ
る単離ＫＧＦ−２ポリペプチド、寄託したｃＤＮＡによってコードされるポリペ
プチド配列、図１に示すポリペプチド配列（配列番号２）の断片とは、配列番号
２に含まれるまたは寄託したクローンに含まれるｃＤＮＡによってコードされる
ポリペプチドの断片を包含することを意図する。タンパク質断片は「遊離の状態
（free-standing）」であってよいし、または該断片が一部または起源を構成す
る一層大きなポリペプチド内に、最も好ましくは単一の連続した領域として含ま
れていてもよい。本発明のポリペプチド断片の代表例としては、たとえば、コー
ド領域のアミノ酸のおよそ１−２０、２１−４０、４１−６０、６１−８０、８
１−１００、１０２−１２０、１２１−１４０、１４１−１６０、１６１−１８
０、１８１−２００、２０１−２２０、２２１−２４０、２４１−２６０、２６
１−２８０、または２８１から末端までからの断片が挙げられる。さらに、ポリ
ペプチド断片は長さが、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０
、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０アミノ酸であ
ってよい。この場合に「およそ」とは、特に指定した範囲のいずれかの末端また
は両末端において幾つかの（５、４、３、２または１）アミノ酸分だけ長いかま
たは短いことを意味する。
【００８５】 タンパク質のＮ末端からの１またはそれ以上のアミノ酸の欠失が該タンパク質
の１またはそれ以上の生物学的機能の修飾という結果となる場合でも、他の機能
的活性（たとえば、生物学的活性、マルチマーを形成する能力、ＫＧＦ−２リガ
ンドに結合する能力）は依然として残されているかもしれない。たとえば、短く
なったＫＧＦ−２変異体が、完全な形態または成熟形態のポリペプチドを認識す
る抗体を誘発および／または結合する能力は、一般に、完全なまたは成熟ポリペ
プチドのＮ末端の残基の実質部分を超えない部分が除去された場合には保持され
ているであろう。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが
そのような免疫学的活性を保持しているか否かは、本明細書に記載する常法およ
び当該技術分野で知られた常法により容易に決定できる。Ｎ末端アミノ酸残基の
大多数を欠くＫＧＦ−２変異体が幾つかの生物学的または免疫学的活性を保持し
ていることはよくあることである。事実、わずか６つのＫＧＦ−２アミノ酸残基
からなるペプチドがしばしば免疫応答を引き起こす。
【００８６】 従って、ポリペプチド断片は、成熟形態と同様に分泌されたＫＧＦ−２タンパ
ク質を含む。さらに好ましいポリペプチド断片としては、アミノ末端またはカル
ボキシ末端または両末端からの連続した一連の欠失残基を有する分泌されたＫＧ
Ｆ−２タンパク質または成熟形態が挙げられる。たとえば、分泌されたＫＧＦ−
２ポリペプチドまたは成熟形態のいずれかのアミノ末端から１〜６０の範囲でい
かなる数のアミノ酸が欠失されてもよい。同様に、分泌されたＫＧＦ−２ポリペ
プチドまたは成熟形態のいずれかのカルボキシ末端から１〜３０の範囲でいかな
る数のアミノ酸が欠失されてもよい。さらに、これらアミノ末端およびカルボキ
シ末端での欠失のいかなる組み合せも好ましい。同様に、これらＫＧＦ−２ポリ
ペプチド断片をコードするポリヌクレオチド断片もまた好ましい。
【００８７】 とりわけ、ＫＧＦ−２ポリペプチドのＮ末端欠失は、一般式ｍ−２０８（式中
、ｍは２〜２０７の整数であり、ｍは配列番号２に同定されるアミノ酸残基の位
置に対応する）で記載することができる。さらに詳細には、本発明は、配列番号
２の残基：Ｗ−２〜Ｓ−２０８；Ｋ−３〜Ｓ−２０８；Ｗ−４〜Ｓ−２０８；１
−５〜Ｓ−２０８；Ｌ−６〜Ｓ−２０８；Ｔ−７〜Ｓ−２０８；Ｈ−８〜Ｓ−２
０８；Ｃ−９〜Ｓ−２０８；Ａ−１０〜Ｓ−２０８；Ｓ−１１〜Ｓ−２０８；Ａ
−１２〜Ｓ−２０８；Ｆ−１３〜Ｓ−２０８；Ｐ−１４〜Ｓ−２０８；Ｈ−１５
〜Ｓ−２０８；Ｌ−１６〜Ｓ−２０８；Ｐ−１７〜Ｓ−２０８；Ｇ−１８〜Ｓ−
２０８；Ｃ−１９〜Ｓ−２０８；Ｃ−２０〜Ｓ−２０８；Ｃ−２１〜Ｓ−２０８
；Ｃ−２２〜Ｓ−２０８；Ｃ−２３〜Ｓ−２０８；Ｆ−２４〜Ｓ−２０８；Ｌ−
２５〜Ｓ−２０８；Ｌ−２６〜Ｓ−２０８；Ｌ−２７〜Ｓ−２０８；Ｆ−２８〜
Ｓ−２０８；Ｌ−２９〜Ｓ−２０８；Ｖ−３０〜Ｓ−２０８；Ｓ−３１〜Ｓ−２
０８；Ｓ−３２〜Ｓ−２０８；Ｖ−３３〜Ｓ−２０８；Ｐ−３４〜Ｓ−２０８；
Ｖ−３５〜Ｓ−２０８；Ｔ−３６〜Ｓ−２０８；Ｃ−３７〜Ｓ−２０８；Ｑ−３
８〜Ｓ−２０８；Ａ−３９〜Ｓ−２０８；Ｌ−４０〜Ｓ−２０８；Ｇ−４１〜Ｓ
−２０８；Ｑ−４２〜Ｓ−２０８；Ｄ−４３〜Ｓ−２０８；Ｍ−４４〜Ｓ−２０
８；Ｖ−４５〜Ｓ−２０８；Ｓ−４６〜Ｓ−２０８；Ｐ−４７〜Ｓ−２０８；Ｅ
−４８〜Ｓ−２０８；Ａ−４９〜Ｓ−２０８；Ｔ−５０〜Ｓ−２０８；Ｎ−５１
〜Ｓ−２０８；Ｓ−５２〜Ｓ−２０８；Ｓ−５３〜Ｓ−２０８；Ｓ−５４〜Ｓ−
２０８；Ｓ−５５〜Ｓ−２０８；Ｓ−５６〜Ｓ−２０８；Ｆ−５７〜Ｓ−２０８
；Ｓ−５８〜Ｓ−２０８；Ｓ−５９〜Ｓ−２０８；Ｐ−６０〜Ｓ−２０８；Ｓ−
６１〜Ｓ−２０８；Ｓ−６２〜Ｓ−２０８；Ａ−６３〜Ｓ−２０８；Ｇ−６４〜
Ｓ−２０８；Ｒ−６５〜Ｓ−２０８；Ｈ−６６〜Ｓ−２０８；Ｖ−６７〜Ｓ−２
０８；Ｒ−６８〜Ｓ−２０８；Ｓ−６９〜Ｓ−２０８；Ｙ−７０〜Ｓ−２０８；
Ｎ−７１〜Ｓ−２０８；Ｈ−７２〜Ｓ−２０８；Ｌ−７３〜Ｓ−２０８；Ｑ−７
４〜Ｓ−２０８；Ｇ−７５〜Ｓ−２０８；Ｄ−７６〜Ｓ−２０８；Ｖ−７７〜Ｓ
−２０８；Ｒ−７８〜Ｓ−２０８；Ｗ−７９〜Ｓ−２０８；Ｒ−８０〜Ｓ−２０
８；Ｋ−８１〜Ｓ−２０８；Ｌ−８２〜Ｓ−２０８；Ｆ−８３〜Ｓ−２０８；Ｓ
−８４〜Ｓ−２０８；Ｆ−８５〜Ｓ−２０８；Ｔ−８６〜Ｓ−２０８；Ｋ−８７
〜Ｓ−２０８；Ｙ−８８〜Ｓ−２０８；Ｆ−８９〜Ｓ−２０８；Ｌ−９０〜Ｓ−
２０８；Ｋ−９１〜Ｓ−２０８；Ｉ−９２〜Ｓ−２０８；Ｅ−９３〜Ｓ−２０８
；Ｋ−９４〜Ｓ−２０８；Ｎ−９５〜Ｓ−２０８；Ｇ−９６〜Ｓ−２０８；Ｋ−
９７〜Ｓ−２０８；Ｖ−９８〜Ｓ−２０８；Ｓ−９９〜Ｓ−２０８；Ｇ−１００
〜Ｓ−２０８；Ｔ−１０１〜Ｓ−２０８；Ｋ−１０２〜Ｓ−２０８；Ｋ−１０３
〜Ｓ−２０８；Ｅ−１０４〜Ｓ−２０８；Ｎ−１０５〜Ｓ−２０８；Ｃ−１０６
〜Ｓ−２０８；Ｐ−１０７〜Ｓ−２０８；Ｙ−１０８〜Ｓ−２０８；Ｓ−１０９
〜Ｓ−２０８；Ｉ−１１０〜Ｓ−２０８；Ｌ−１１１〜Ｓ−２０８；Ｅ−１１２
〜Ｓ−２０８；Ｉ−１１３〜Ｓ−２０８；Ｔ−１１４〜Ｓ−２０８；Ｓ−１１５
〜Ｓ−２０８；Ｖ−１１６〜Ｓ−２０８；Ｅ−１１７〜Ｓ−２０８；Ｉ−１１８
〜Ｓ−２０８；Ｇ−１１９〜Ｓ−２０８；Ｖ−１２０〜Ｓ−２０８；Ｖ−１２１
〜Ｓ−２０８；Ａ−１２２〜Ｓ−２０８；Ｖ−１２３〜Ｓ−２０８；Ｋ−１２４
〜Ｓ−２０８；Ａ−１２５〜Ｓ−２０８；Ｉ−１２６〜Ｓ−２０８；Ｎ−１２７
〜Ｓ−２０８；Ｓ−１２８〜Ｓ−２０８；Ｎ−１２９〜Ｓ−２０８；Ｙ−１３０
〜Ｓ−２０８；Ｙ−１３１〜Ｓ−２０８；Ｌ−１３２〜Ｓ−２０８；Ａ−１３３
〜Ｓ−２０８；Ｍ−１３４〜Ｓ−２０８；Ｎ−１３５〜Ｓ−２０８；Ｋ−１３６
〜Ｓ−２０８；Ｋ−１３７〜Ｓ−２０８；Ｇ−１３８〜Ｓ−２０８；Ｋ−１３９
〜Ｓ−２０８；Ｌ−１４０〜Ｓ−２０８；Ｙ−１４１〜Ｓ−２０８；Ｇ−１４２
〜Ｓ−２０８；Ｓ−１４３〜Ｓ−２０８；Ｋ−１４４〜Ｓ−２０８；Ｅ−１４５
〜Ｓ−２０８；Ｆ−１４６〜Ｓ−２０８；Ｎ−１４７〜Ｓ−２０８；Ｎ−１４８
〜Ｓ−２０８；Ｄ−１４９〜Ｓ−２０８；Ｃ−１５０〜Ｓ−２０８；Ｋ−１５１
〜Ｓ−２０８；Ｌ−１５２〜Ｓ−２０８；Ｋ−１５３〜Ｓ−２０８；Ｅ−１５４
〜Ｓ−２０８；Ｒ−１５５〜Ｓ−２０８；Ｉ−１５６〜Ｓ−２０８；Ｅ−１５７
〜Ｓ−２０８；Ｅ−１５８〜Ｓ−２０８；Ｎ−１５９〜Ｓ−２０８；Ｇ−１６０
〜Ｓ−２０８；Ｙ−１６１〜Ｓ−２０８；Ｎ−１６２〜Ｓ−２０８；Ｔ−１６３
〜Ｓ−２０８；Ｙ−１６４〜Ｓ−２０８；Ａ−１６５〜Ｓ−２０８；Ｓ−１６６
〜Ｓ−２０８；Ｆ−１６７〜Ｓ−２０８；Ｎ−１６８〜Ｓ−２０８；Ｗ−１６９
〜Ｓ−２０８；Ｑ−１７０〜Ｓ−２０８；Ｈ−１７１〜Ｓ−２０８；Ｎ−１７２
〜Ｓ−２０８；Ｇ−１７３〜Ｓ−２０８；Ｒ−１７４〜Ｓ−２０８；Ｑ−１７５
〜Ｓ−２０８；Ｍ−１７６〜Ｓ−２０８；Ｙ−１７７〜Ｓ−２０８；Ｖ−１７８
〜Ｓ−２０８；Ａ−１７９〜Ｓ−２０８；Ｌ−１８０〜Ｓ−２０８；Ｎ−１８１
〜Ｓ−２０８；Ｇ−１８２〜Ｓ−２０８；Ｋ−１８３〜Ｓ−２０８；Ｇ−１８４
〜Ｓ−２０８；Ａ−１８５〜Ｓ−２０８；Ｐ−１８６〜Ｓ−２０８；Ｒ−１８７
〜Ｓ−２０８；Ｒ−１８８〜Ｓ−２０８；Ｇ−１８９〜Ｓ−２０８；Ｑ−１９０
〜Ｓ−２０８；Ｋ−１９１〜Ｓ−２０８；Ｔ−１９２〜Ｓ−２０８；Ｒ−１９３
〜Ｓ−２０８；Ｒ−１９４〜Ｓ−２０８；Ｋ−１９５〜Ｓ−２０８；Ｎ−１９６
〜Ｓ−２０８；Ｔ−１９７〜Ｓ−２０８；Ｓ−１９８〜Ｓ−２０８；Ａ−１９９
〜Ｓ−２０８；Ｈ−２００〜Ｓ−２０８；Ｆ−２０１〜Ｓ−２０８；Ｌ−２０２
〜Ｓ−２０８；Ｐ−２０３〜Ｓ−２０８のアミノ酸配列を含む、あるいはアミノ
酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。これら
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の範囲に包含される。
【００８８】 とりわけ好ましいのは、Ｓ６９〜Ｓ２０８；Ａ６３〜Ｓ２０８；Ｙ７０〜Ｓ２
０８；Ｖ７７〜Ｓ２０８；Ｅ９３〜Ｓ２０８；Ｅ１０４〜Ｓ２０８；Ｖ１２３〜
Ｓ２０８；Ｇ１３８〜Ｓ２０８；Ｒ８０〜Ｓ２０８；Ａ３９〜Ｓ２０８；Ｓ６９
〜Ｖ１７８；Ｓ６９〜Ｇ１７３；Ｓ６９〜Ｒ１８８；Ｓ６９〜Ｓ１９８；Ｓ８４
〜Ｓ２０８；Ｖ９８〜Ｓ２０８；Ａ６３〜Ｎ１６２；Ｓ６９〜Ｎ１６２；および
Ｍ５３〜Ｎ１６２を含むまたはからなる断片である。
【００８９】 また、上記に記載したように、タンパク質のＣ末端からの１またはそれ以上の
アミノ酸の欠失が該タンパク質の１またはそれ以上の生物学的機能の修飾という
結果となる場合でも、他の機能的活性（たとえば、生物学的活性、マルチマーを
形成する能力、ＫＧＦ−２リガンドに結合する能力）は依然として残されている
かもしれない。たとえば、短くなったＫＧＦ−２変異体が、完全な形態または成
熟形態のポリペプチドを認識する抗体を誘発および／または結合する能力は、一
般に、完全なまたは成熟ポリペプチドのＣ末端の残基の実質部分を超えない部分
が除去された場合には保持されているであろう。完全なポリペプチドのＣ末端残
基を欠く特定のポリペプチドがそのような免疫学的活性を保持しているか否かは
、本明細書に記載する常法および当該技術分野で知られた常法により容易に決定
できる。Ｃ末端アミノ酸残基の大多数を欠くＫＧＦ−２変異体が幾つかの生物学
的または免疫学的活性を保持していることはよくあることである。事実、わずか
６つのＫＧＦ−２アミノ酸残基からなるペプチドがしばしば免疫応答を引き起こ
す。
【００９０】 従って、本発明はさらに、一般式１−ｎ（式中、ｎは２〜２０７の整数であり
、ｎは配列番号２に同定されるアミノ酸残基の位置に対応する）で記載されるよ
うに、図１に示すＫＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）のカル
ボキシ末端から１またはそれ以上の残基が欠失したポリペプチドを提供する。さ
らに詳細には、本発明は、配列番号２の残基：Ｍ−１〜Ｈ−２０７；Ｍ−Ｉ〜Ｖ
−２０６；Ｍ−１〜Ｖ−２０５；Ｍ−１〜Ｍ−２０４；Ｍ−１〜Ｐ−２０３；Ｍ
−１〜Ｌ−２０２；Ｍ−１〜Ｆ−２０１；Ｍ−１〜Ｈ−２００；Ｍ−１〜Ａ−１
９９；Ｍ−１〜Ｓ−１９８；Ｍ−１〜Ｔ−１９７；Ｍ−１〜Ｎ−１９６；Ｍ−１
〜Ｋ−１９５；Ｍ−１〜Ｒ−１９４；Ｍ−１〜Ｒ−１９３；Ｍ−１〜Ｔ−１９２
；Ｍ−１〜Ｋ−１９１；Ｍ−１〜Ｑ−１９０；Ｍ−１〜Ｇ−１８９；Ｍ−１〜Ｒ
−１８８；Ｍ−１〜Ｒ−１８７；Ｍ−１〜Ｐ−１８６；Ｍ−１〜Ａ−１８５；Ｍ
−１〜Ｇ−１８４；Ｍ−１〜Ｋ−１８３；Ｍ−１〜Ｇ−１８２；Ｍ−Ｉ〜Ｎ−１
８１；Ｍ−１〜Ｌ−１８０；Ｍ−１〜Ａ−１７９；Ｍ−１〜Ｖ−１７８；Ｍ−１
〜Ｙ−１７７；Ｍ−１〜Ｍ−１７６；Ｍ−１〜Ｑ−１７５；Ｍ−１〜Ｒ−１７４
；Ｍ−１〜Ｇ−１７３；Ｍ−１〜Ｎ−１７２；Ｍ−１〜Ｈ−１７１；Ｍ−１〜Ｑ
−１７０；Ｍ−１〜Ｗ−１６９；Ｍ−１〜Ｎ−１６８；Ｍ−１〜Ｆ−１６７；Ｍ
−１〜Ｓ−１６６；Ｍ−１〜Ａ−１６５；Ｍ−１〜Ｙ−１６４；Ｍ−１〜Ｔ−１
６３；Ｍ−１〜Ｎ−１６２；Ｍ−１〜Ｙ−１６１；Ｍ−１〜Ｇ−１６０；Ｍ−１
〜Ｎ−１５９；Ｍ−１〜Ｅ−１５８；Ｍ−１〜Ｅ−１５７；Ｍ−１〜Ｉ−１５６
；Ｍ−１〜Ｒ−１５５；Ｍ−１〜Ｅ−１５４；Ｍ−１〜Ｋ−１５３；Ｍ−１〜Ｌ
−１５２；Ｍ−１〜Ｋ−１５１；Ｍ−１〜Ｃ−１５０；Ｍ−１〜Ｄ−１４９；Ｍ
−１〜Ｎ−１４８；Ｍ−１〜Ｎ−１４７；Ｍ−１〜Ｆ−１４６；Ｍ−１〜Ｅ−１
４５；Ｍ−１〜Ｋ−１４４；Ｍ−１〜Ｓ−１４３；Ｍ−１〜Ｇ−１４２；Ｍ−１
〜Ｙ−１４１；Ｍ−１〜Ｌ−１４０；Ｍ−１〜Ｋ−１３９；Ｍ−１〜Ｇ−１３８
；Ｍ−１〜Ｋ−１３７；Ｍ−１〜Ｋ−１３６；Ｍ−１〜Ｎ−１３５；Ｍ−１〜Ｍ
−１３４；Ｍ−１〜Ａ−１３３；Ｍ−１〜Ｌ−１３２；Ｍ−１〜Ｙ−１３１；Ｍ
−１〜Ｙ−１３０；Ｍ−１〜Ｎ−１２９；Ｍ−１〜Ｓ−１２８；Ｍ−１〜Ｎ−１
２７；Ｍ−１〜Ｉ−１２６；Ｍ−１〜Ａ−１２５；Ｍ−１〜Ｋ−１２４；Ｍ−１
〜Ｖ−１２３；Ｍ−１〜Ａ１２２；Ｍ−１〜Ｖ−１２１；Ｍ−１〜Ｖ−１２０；
Ｍ−１〜Ｇ−１１９；Ｍ−１〜Ｉ−１１８；Ｍ−１〜Ｅ−１１７；Ｍ−ｌ〜Ｖ−
１１６；Ｍ−１〜Ｓ−１１５；Ｍ−１〜Ｔ−１１４；Ｍ−１〜Ｉ−１１３；Ｍ−
１〜Ｅ−１１２；Ｍ−１〜Ｌ−１１１；Ｍ−１〜Ｉ−１１０；Ｍ−１〜Ｓ−１０
９；Ｍ−１〜Ｙ−１０８；Ｍ−１〜Ｐ−１０７；Ｍ−１〜Ｃ−１０６；Ｍ−１〜
Ｎ−１０５；Ｍ−１〜Ｅ−１０４；Ｍ−１〜Ｋ−１０３；Ｍ−１〜Ｋ−１０２；
Ｍ−１〜Ｔ−１０１；Ｍ−１〜Ｇ−１００；Ｍ−１〜Ｓ−９９；Ｍ−１〜Ｖ−９
８；Ｍ−１〜Ｋ−９７；Ｍ−Ｉ〜Ｇ−９６；Ｍ−１〜Ｎ−９５；Ｍ−１〜Ｋ−９
４；Ｍ−１〜Ｅ−９３；Ｍ−１〜Ｉ−９２；Ｍ−１〜Ｋ−９１；Ｍ−１〜Ｌ−９
０；Ｍ−１〜Ｆ−８９；Ｍ−１〜Ｙ−８８；Ｍ−１〜Ｋ−８７；Ｍ−１〜Ｔ−８
６；Ｍ−１〜Ｆ−８５；Ｍ−１〜Ｓ−８４；Ｍ−１〜Ｆ−８３；Ｍ−１〜Ｌ−８
２；Ｍ−１〜Ｋ−８１；Ｍ−１〜Ｒ−８０；Ｍ−１〜Ｗ−７９；Ｍ−１〜Ｒ−７
８；Ｍ−１〜Ｖ７７；Ｍ−１〜Ｄ−７６；Ｍ−１〜Ｇ−７５；Ｍ−１〜Ｑ−７４
；Ｍ−１〜Ｌ−７３；Ｍ−１〜Ｈ−７２；Ｍ−１〜Ｎ−７１；Ｍ−１〜Ｙ−７０
；Ｍ−１〜Ｓ−６９；Ｍ−１〜Ｒ−６８；Ｍ−１〜Ｖ−６７；Ｍ−１〜Ｈ−６６
；Ｍ−１〜Ｒ−６５；Ｍ−１〜Ｇ−６４；Ｍ−１〜Ａ−６３；Ｍ−１〜Ｓ−６２
；Ｍ−１〜Ｓ−６１；Ｍ−１〜Ｐ−６０；Ｍ−１〜Ｓ−５９；Ｍ−１〜Ｓ−５８
；Ｍ−１〜Ｆ−５７；Ｍ−１〜Ｓ−５６；Ｍ−１〜Ｓ−５５；Ｍ−１〜Ｓ−５４
；Ｍ−１〜Ｓ−５３；Ｍ−１〜Ｓ−５２；Ｍ−１〜Ｎ−５１；Ｍ−１〜Ｔ−５０
；Ｍ−１〜Ａ−４９；Ｍ−１〜Ｅ−４８；Ｍ−１〜Ｐ−４７；Ｍ−１〜Ｓ−４６
；Ｍ−１〜Ｖ−４５；Ｍ−１〜Ｍ−４４；Ｍ−１〜Ｄ−４３；Ｍ−１〜Ｑ−４２
；Ｍ−１〜Ｇ−４１；Ｍ−１〜Ｌ−４０；Ｍ−１〜Ａ−３９；Ｍ−１〜Ｑ−３８
；Ｍ−１〜Ｃ−３７；Ｍ−１〜Ｔ−３６；Ｍ−１〜Ｖ−３５；Ｍ−１〜Ｐ−３４
；Ｍ−１〜Ｖ−３３；Ｍ−１〜Ｓ−３２；Ｍ−１〜Ｓ−３１；Ｍ−１〜Ｖ−３０
；Ｍ−１〜Ｌ−２９；Ｍ−１〜Ｆ−２８；Ｍ−１〜Ｌ−２７；Ｍ−１〜Ｌ−２６
；Ｍ−１〜Ｌ−２５；Ｍ−１〜Ｆ−２４；Ｍ−１〜Ｃ−２３；Ｍ−１〜Ｃ−２２
；Ｍ−１〜Ｃ−２１；Ｍ−１〜Ｃ−２０；Ｍ−１〜Ｃ−１９；Ｍ−１〜Ｇ−１８
；Ｍ−１〜Ｐ−１７；Ｍ−１〜Ｌ−１６；Ｍ−１〜Ｈ−１５；Ｍ−１〜Ｐ−１４
；Ｍ−１〜Ｆ−１３；Ｍ−１〜Ａ−１２；Ｍ−１〜Ｓ−１１；Ｍ−１〜Ａ−１０
；Ｍ−１〜Ｃ−９；Ｍ−１〜Ｈ−８；Ｍ−１〜Ｔ−７のアミノ酸配列を含む、あ
るいはアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供
する。これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の範囲に
包含される。
【００９１】 同様に、配列番号２として示す本発明のＫＧＦ−２ポリペプチドのＣ末端欠失
は、配列番号２の残基：Ｓ−６９〜Ｈ−２０７；Ｓ−６９〜Ｖ−２０６；Ｓ−６
９〜Ｖ−２０５；Ｓ−６９〜Ｍ−２０４；Ｓ−６９〜Ｐ−２０３；Ｓ−６９〜Ｌ
−２０２；Ｓ−６９〜Ｆ−２０１；Ｓ−６９〜Ｈ−２００；Ｓ−６９〜Ａ−１９
９；Ｓ−６９〜Ｓ−１９８；Ｓ−６９〜Ｔ−１９７；Ｓ−６９〜Ｎ−１９６；Ｓ
−６９〜Ｋ−１９５；Ｓ−６９〜Ｒ−１９４；Ｓ−６９〜Ｒ−１９３；Ｓ−６９
〜Ｔ−１９２；Ｓ−６９〜Ｋ−１９１；Ｓ−６９〜Ｑ−１９０；Ｓ−６９〜Ｇ−
１８９；Ｓ−６９〜Ｒ−１８８；Ｓ−６９〜Ｒ−１８７；Ｓ−６９〜Ｐ−１８６
；Ｓ−６９〜Ａ−１８５；Ｓ−６９〜Ｇ−１８４；Ｓ−６９〜Ｋ−１８３；Ｓ−
６９〜Ｇ−１８２；Ｓ−６９〜Ｎ−１８１；Ｓ−６９〜Ｌ−１８０；Ｓ−６９〜
Ａ−１７９；Ｓ−６９〜Ｖ−１７８；Ｓ−６９〜Ｙ−１７７；Ｓ−６９〜Ｍ−１
７６；Ｓ−６９〜Ｑ−１７５；Ｓ−６９〜Ｒ−１７４；Ｓ−６９〜Ｇ−１７３；
Ｓ−６９〜Ｎ−１７２；Ｓ−６９〜Ｈ−１７１；Ｓ−６９〜Ｑ−１７０；Ｓ−６
９〜Ｗ−１６９；Ｓ−６９〜Ｎ−１６８；Ｓ−６９〜Ｆ−１６７；Ｓ−６９〜Ｓ
−１６６；Ｓ−６９〜Ａ−１６５；Ｓ−６９〜Ｙ−１６４；Ｓ−６９〜Ｔ−１６
３；Ｓ−６９〜Ｎ−１６２；Ｓ−６９〜Ｙ−１６１；Ｓ−６９〜Ｇ−１６０；Ｓ
−６９〜Ｎ−１５９；Ｓ−６９〜Ｅ−１５８；Ｓ−６９〜Ｅ−１５７；Ｓ−６９
〜Ｉ−１５６；Ｓ−６９〜Ｒ−１５５；Ｓ−６９〜Ｅ−１５４；Ｓ−６９〜Ｋ−
１５３；Ｓ−６９〜Ｌ−１５２；Ｓ−６９〜Ｋ−１５１；Ｓ−６９〜Ｃ−１５０
；Ｓ−６９〜Ｄ−１４９；Ｓ−６９〜Ｎ−１４８；Ｓ−６９〜Ｎ−１４７；Ｓ−
６９〜Ｆ−１４６；Ｓ−６９〜Ｅ−１４５；Ｓ−６９〜Ｋ−１４４；Ｓ−６９〜
Ｓ−１４３；Ｓ−６９〜Ｇ−１４２；Ｓ−６９〜Ｙ１４１；Ｓ−６９〜Ｌ−１４
０；Ｓ−６９〜Ｋ−１３９；Ｓ−６９〜Ｇ−１３８；Ｓ−６９〜Ｋ−１３７；Ｓ
−６９〜Ｋ−１３６；Ｓ−６９〜Ｎ−１３５；Ｓ−６９〜Ｍ−１３４；Ｓ−６９
〜Ａ−１３３；Ｓ−６９〜Ｌ−１３２；Ｓ−６９〜Ｙ−１３１；Ｓ−６９〜Ｙ−
１３０；Ｓ−６９〜Ｎ−１２９；Ｓ−６９〜Ｓ−１２８；Ｓ−６９〜Ｎ−１２７
；Ｓ−６９〜Ｉ−１２６；Ｓ−６９〜Ａ−１２５；Ｓ−６９〜Ｋ−１２４；Ｓ−
６９〜Ｖ−１２３；Ｓ−６９〜Ａ−１２２；Ｓ−６９〜Ｖ−１２１；Ｓ−６９〜
Ｖ−１２０；Ｓ−６９〜Ｇ−１１９；Ｓ−６９〜Ｉ−１１８；Ｓ−６９〜Ｅ−１
１７；Ｓ−６９〜Ｖ−１１６；Ｓ−６９〜Ｓ−１１５；Ｓ−６９〜Ｔ−１１４；
Ｓ−６９〜Ｉ−１１３；Ｓ−６９〜Ｅ−１１２；Ｓ−６９〜Ｌ−１１１；Ｓ−６
９〜Ｉ−１１０；Ｓ−６９〜Ｓ−１０９；Ｓ−６９〜Ｙ−１０８；Ｓ−６９〜Ｐ
−１０７；Ｓ−６９〜Ｃ−１０６；Ｓ−６９〜Ｎ−１０５；Ｓ−６９〜Ｅ−１０
４；Ｓ−６９〜Ｋ−１０３；Ｓ−６９〜Ｋ−１０２；Ｓ−６９〜Ｔ−１０１；Ｓ
−６９〜Ｇ−１００；Ｓ−６９〜Ｓ−９９；Ｓ−６９〜Ｖ−９８；Ｓ−６９〜Ｋ
−９７；Ｓ−６９〜Ｇ−９６；Ｓ−６９〜Ｎ−９５；Ｓ−６９〜Ｋ−９４；Ｓ−
６９〜Ｅ−９３；Ｓ−６９〜Ｉ−９２；Ｓ−６９〜Ｋ−９１；Ｓ−６９〜Ｌ−９
０；Ｓ−６９〜Ｆ−８９；Ｓ−６９〜Ｙ−８８；Ｓ−６９〜Ｋ−８７；Ｓ−６９
〜Ｔ−８６；Ｓ−６９〜Ｆ−８５；Ｓ−６９〜Ｓ−８４；Ｓ−６９〜Ｆ−８３；
Ｓ−６９〜Ｌ−８２；Ｓ−６９〜Ｋ−８１；Ｓ−６９〜Ｒ−８０；Ｓ−６９〜Ｗ
−７９；Ｓ−６９〜Ｒ−７８；Ｓ−６９〜Ｖ−７７；Ｓ−６９〜Ｄ−７６；Ｓ−
６９〜Ｇ−７５；のアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。
【００９２】 さらに、上記に列記したＮ末端またはＣ末端欠失を組み合せてＮ末端およびＣ
末端欠失ＫＧＦ−２ポリペプチドを製造することができる。本発明はまた、アミ
ノ末端およびカルボキシ末端の両者で１またはそれ以上のアミノ酸が欠失したポ
リペプチドをも提供し、かかるポリペプチドは一般に配列番号２の残基ｍ−ｎ（
式中、ｍおよびｎは上記と同じ）を有するものとして記載される。さらに、Ｎ末
端およびＣ末端欠失変異体はまた部位特異的なアミノ酸置換をも含んでいてよい
。これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の範囲に包含
される。
【００９３】 さらに、ＡＴＣＣ寄託番号７５９７７に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
ードされる完全なＫＧＦ−２アミノ酸配列の一部からなるポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列も本発明に包含され、その際、該部分は、ＡＴＣＣ寄託番
号７５９７７に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸
配列のアミノ末端からの１からおよそ１９８アミノ酸までのいずれの整数のアミ
ノ酸残基も含まず、または当該配列のカルボキシ末端からの１からおよそ１９８
アミノ酸までのいずれの整数のアミノ酸残基も含まず、または上記アミノ末端欠
失とカルボキシ末端欠失とのいずれの組み合せを含まない。
【００９４】 本願はまた、本明細書にｍ−ｎとして記載するＫＧＦ−２ポリペプチド配列に
対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９７％、９８％または９９％同一のポリペプチドを含むタンパク質に関
する。好ましい態様において、本願は、本明細書に記載した特定のＫＧＦ−２お
よびＣ末端欠失のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも８０％
、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％
または９９％同一のポリペプチドを含むタンパク質に関する。これらポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の範囲に包含される。
【００９５】 本発明の特に好ましい断片は、ＫＧＦ−２の構造的または機能的な特性によっ
て特徴付けられる断片である。そのような断片は、完全な（すなわち完全長の）
ＫＧＦ−２（配列番号２）のαヘリックスおよびαヘリックス形成領域（「α領
域」）、βシートおよびβシート形成領域（「β領域」）、ターンおよびターン
形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」）
、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、表面形成領域、
および高抗原性指標領域（すなわち、Jameson-Wolfプログラムのデフォールトパ
ラメータを用いて同定されるように、抗原性指標が１.５より大きいかまたは等
しい４またはそれ以上の連続したアミノ酸を含む）を含むアミノ酸残基を含む。
ある種の好ましい領域は図４に示すものであり、図１に示すアミノ酸配列（配列
番号１）の分析によって同定される上記型の領域（これに限られるものではない
）を含み、そのような好ましい領域としては、Garnier-Robsonによって予測され
たα領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域；Chou-Fasmanによって予測
されたα領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域；Kyte-Doolittleによっ
て予測された親水性領域および疎水性領域；Eisenbergのαおよびβ両親媒性領
域；Eminiの表面形成領域；およびJameson-Wolfの高抗原性指標領域（これらプ
ログラムのデフォールトパラメータを用いて予測される）が挙げられる。これら
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の範囲に包含される。
【００９６】 さらなる態様において、本発明のポリヌクレオチドはＫＧＦ−２の機能的特性
をコードする。この観点での本発明の好ましい態様は、ＫＧＦ−２のαヘリック
スおよびαヘリックス形成領域（「α領域」）、βシートおよびβシート形成領
域（「β領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルお
よびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性
領域、β両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域および高抗原性指標領
域を含む断片が挙げられる。
【００９７】 上記に記載したように図１および／または表Ｉに示すＫＧＦ−２の構造的およ
び機能的特性を表すデータは、デフォールトパラメータに対してセットしたＤＮ
Ａ＊ＳＴＡＲの種々のモデュールおよびアルゴリズムを用いて得た。好ましい態
様において、表Ｉの欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、およびＸＩＶに示すデータは
、高程度の抗原性を示すＫＧＦ−２の領域を決定するのに用いることができる。
欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、およびＸＩＶに示すデータからの高抗原性領域の
決定は、免疫応答の開始のプロセスにおいて抗原認識が起こる環境においてポリ
ペプチドの表面に暴露されやすい該ポリペプチド中の領域を表す値を選ぶことに
よって行う。
【００９８】 これらの観点で好ましい態様は図４に示すものであるが、表Ｉに示すように、
図４に示すデータを表で表示することにより表すかあるいは同定することができ
る。図４を得るのに用いたＤＮＡ＊ＳＴＡＲコンピューターアルゴリズム（最初
のデフォールトパラメータにセット）を、図４のデータを表形式で表すのに用い
た（表Ｉ参照）。表形式にした図４のデータは、好ましい領域の特定の境界を容
易に決定するのに用いることができる。
【００９９】 図４および表Ｉに示す上記好ましい領域としては、図１に示すアミノ酸配列の
分析によって同定した上記型の領域（これらに限られるものではない）が挙げら
れる。図４および表Ｉに示すように、そのような好ましい領域としては、Garnie
r-Robsonのα領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域；Chou-Fasmanのα
領域、β領域、およびコイル領域；Kyte-Doolittleの親水性領域および疎水性領
域；Eisenbergのαおよびβ両親媒性領域；Eminiの表面形成領域；Karplus-Schu
lzのフレキシブル領域、Eminiの表面形成領域およびJameson-Wolfの高抗原性指
標領域が挙げられる。
【０１００】 欄には「残基」、「位置」およびローマ数字のＩ〜ＸＩＶを表示してある。こ
れら欄の表示は図３および表Ｉに示すアミノ酸配列の以下の特徴を表す：「残基
」：配列番号２および図１Ａおよび１Ｂのアミノ酸残基；「位置」：配列番号２
および図１Ａおよび１Ｂ中の対応残基の位置；Ｉ：α領域（Garnier-Robson）；
ＩＩ：α領域（Chou-Fasman）；ＩＩＩ：β領域（Garnier-Robson）；ＩＶ：β
領域（Chou-Fasman）；Ｖ：ターン領域（Garnier-Robson）；ＶＩ：ターン領域
（Chou-Fasman）；ＶＩＩ：コイル領域（Garnier-Robson）；ＶＩＩＩ：ハイド
ロフィリシティープロット（Kyte-Doolittle）；ＩＸ：ハイドロフォビシティー
プロット（Hopp-Woods）；Ｘ：α両親媒性領域（Eisenberg）；ＸＩ：β両親媒
性領域（Eisenberg）；ＸＩＩ：フレキシブル領域（Karplus-Schulz）；ＸＩＩ
Ｉ：抗原性指標（Jameson-Wolf）；およびＸＩＶ：サーフィスプロバビリティー
プロット（Emini）。
【０１０１】
【化３】
【０１０２】
【化４】
【０１０３】
【化５】
【０１０４】
【化６】
【０１０５】
【化７】
【０１０６】
【化８】
【０１０７】
【化９】
【０１０８】
【化１０】
【０１０９】
【化１１】
【０１１０】
【化１２】
【０１１１】 この観点から特に好ましい断片は、上記特徴のうちの幾つかのような幾つかの
構造的特性を組み合せて有するＫＧＦ−２の領域を含む断片である。 さらに、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング
、および／またはコドンシャフリングの技術（まとめて「ＤＮＡシャフリング」
と称する）を用い、ＫＧＦ−２の活性を変調させ、それによってＫＧＦ−２のア
ゴニストおよびアンタゴニストを効果的に製造することができる。一般に、米国
特許第５,６０５,７９３号；同第５,８１１,２３８号；同第５,８３０,７２１号
；同第５,８３４,２５２号；および同第５,８３７,４５８号；およびPatten, P.
A.ら、Curr. Opinion Biotechnol. 8: 724-33 (1997); Harayama, S., Trends
Biotechnol. 16(2): 76-82 (1998); Hansson, L. O.ら、J. Mol. Biol. 287: 26
5-76 (1999);およびLorenzo, M. M.およびBlasco, R., Biotechniques 24(2): 3
08-13 (1998)（これら特許および刊行物を参照のため本明細書に引用する）を参
照。
【０１１２】 一つの態様において、ＫＧＦ−２ポリヌクレオチドおよび対応ポリペプチドの
変更はＤＮＡシャフリングにより達成できる。ＤＮＡシャフリングは、２または
それ以上のＤＮＡセグメントを相同的組換えまたは部位特異的組換えによって所
望のＫＧＦ−２分子に組み立てることを含む。他の態様において、ＫＧＦ−２ポ
リヌクレオチドおよび対応ポリペプチドは、誤りがちのＰＣＲ、ランダムなヌク
レオチドの挿入または組換え前の他の方法によりランダムな突然変異誘発に供す
ることによって変更できる。他の態様において、ＫＧＦ−２の１またはそれ以上
の配列、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などを１またはそれ以上
の異種分子の１またはそれ以上の配列、モチーフ、セクション、部分、ドメイン
、断片などと組換えることができる。
【０１１３】 好ましい態様において、異種分子はＫＧＦ−２ファミリーの成員である。さら
に好ましい態様において、異種分子は、増殖因子、たとえば血小板由来増殖因子
（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスフォーミング増
殖因子（ＴＧＦ）−α、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ
）、ＴＧＦ−β、骨誘導因子（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ
−６、ＢＭＰ−７、アクチビンＡおよびＢ、デカペンタプレジック（decapentap
legic）（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２、ドーサリン（dosalin）、増殖分化因子
（growth differentiation factors）（ＧＤＦ）、ノダル（nodal）、ＭＩＳ、
インヒビン（inhibin）−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、Ｔ
ＧＦ−β５、およびグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）である。他の好ま
しい断片は、生物学的に活性なＫＧＦ−２断片である。生物学的に活性な断片と
は、ＫＧＦ−２ポリペプチドの活性と同一である必要はないが同様の活性を示す
断片である。断片の生物学的活性としては、所望の活性が向上したもの、あるい
は所望でない活性が低減したものが挙げられる。
【０１１４】 さらに、本発明は、本発明のポリペプチドの活性を変調する化合物を同定する
ために化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのようなアッセイの一つ
の例は、哺乳動物の繊維芽細胞、本発明のポリペプチド、スクリーニングしよう
とする化合物および３[Ｈ]チミジンを，繊維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件
下で混合することを含む。スクリーニングしようとする化合物の不在下で対照の
アッセイを行い、該化合物の存在下で繊維芽細胞の量と比較し、３[Ｈ]チミジン
の取り込みを各場合に決定することにより該化合物が増殖を刺激するか否かを決
定する。繊維芽細胞の増殖量は、３[Ｈ]チミジンの取り込みを測定する液体シン
チレーションクロマトグラフィーにより測定する。アゴニストおよびアンタゴニ
ストの両化合物をこの方法で同定できる。
【０１１５】 他の態様において、本発明のポリペプチドに対するレセプターを発現する哺乳
動物細胞または膜調製物を、該化合物の存在下、本発明の標識ポリペプチドとと
もにインキュベートする。ついで、該化合物がこの相互作用を促進または阻止す
る能力を測定することができる。別法として、スクリーニングしようとする化合
物とＫＧＦ−２レセプターとの相互作用の後の知られた二次メッセンジャー系の
応答を測定し、該化合物が該レセプターに結合し、二次メッセンジャーの応答を
引き起こす能力を測定することにより該化合物が潜在的なアゴニストまたはアン
タゴニストか否かを決定する。そのような二次メッセンジャー系としては、これ
らに限られるものではないが、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネ
ルまたはホスホイノシチド（phosphoinositide）加水分解が挙げられる。これら
上記アッセイはすべて診断または予後マーカーとして用いることができる。これ
らアッセイを用いて見出された分子は、ＫＧＦ−２分子を活性化または阻害する
ことにより疾患を治療し、または患者に特別の結果（たとえば、血管壁の増殖）
をもたらすのに用いることができる。さらに、これらアッセイは、適当に操作し
た細胞または組織からＫＧＦ−２の産生を抑制または促進する因子を見出すこと
ができる。
【０１１６】 それゆえ、本発明は、ＫＧＦ−２に結合する化合物の同定方法であって、工程
：（ａ）候補結合化合物をＫＧＦ−２とともにインキュベートし、ついで（ｂ）
結合が起こるか否かを決定することを含む方法を包含する。さらに、本発明は、
アゴニスト／アンタゴニストの同定方法であって、工程：（ａ）候補化合物をＫ
ＧＦ−２とともにインキュベートし、（ｂ）生物学的活性をアッセイし、ついで
（ｃ）ＫＧＦ−２の生物学的活性が変化したか否かを決定することを含む方法を
包含する。 また、図４および表Ｉに開示したβプリーツシート領域を用いることにより、
ＫＧＦ−２に結合する分子を実験的に同定することができる。従って、本発明の
特別の態様は、図３／表Ｉに開示した各βプリーツシート領域のアミノ酸配列を
含むあるいはアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
に関する。
【０１１７】 本発明のさらなる態様は、図４／表Ｉに開示した各βプリーツシート領域のい
ずれかの組み合せまたは全てを含むあるいは組み合せまたは全てからなるポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のさらなる態様は、図４
／表Ｉに開示した各βプリーツシート領域のＫＧＦ−２アミノ酸配列を含むある
いはアミノ酸配列からなるポリペプチドに関する。本発明のさらなる態様は、図
４／表Ｉに開示した各βプリーツシート領域のいずれかの組み合せまたは全てを
含むあるいは組み合せまたは全てからなるＫＧＦ−２ポリペプチドに関する。
【０１１８】 本発明の他の好ましい態様は、ＫＧＦ−２レセプターに結合するＫＧＦ−２の
断片である。ＫＧＦ−２レセプターに結合する断片は、ＫＧＦ−２のアゴニスト
またはアンタゴニストとして有用である。たとえば、ＫＧＦ−２レセプターに結
合するＫＧＦ−２の断片は、ＫＧＦ−２およびその活性部分への結合を妨害する
。他の断片は、ＫＧＦ−２レセプターに結合して該レセプターおよびレセプター
活性化を特異的に不活化し、あるいはレセプター−リガンド複合体を認識するが
好ましくは未結合のレセプターまたは未結合のリガンドは特異的に認識しない抗
体に特異的に結合する。同様に、ＫＧＦ−２レセプターを活性化する断片も本発
明に包含される。これら断片はレセプターのアゴニストとして作用する、すなわ
ち、たとえば該レセプターの二量体形成を誘発することによりリガンド媒介レセ
プター活性化の生物学的活性の全てかまたはその一部を強化または活性化する。
これら断片は、本明細書に開示する本発明のペプチドの特定の生物学的活性を含
む生物学的活性に対するアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストとして
特定される。
【０１１９】 ＫＧＦ−２レセプターに結合するＫＧＦ−２断片の制限されない例としては、
配列番号２のアミノ酸１４７〜１５５、９５〜１０５、７８〜９４、１１９〜１
４６、７０〜９４、７８〜１０５、１１４〜１４６、７０〜１０５、８６〜１２
４、１００〜１３９、１０６〜１４６、１６０〜２０９および／または１５６〜
２０９が挙げられる。そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも
また好ましい。 他の好ましい断片は生物学的に活性なＫＧＦ−２断片である。生物学的に活性
な断片とは、ＫＧＦ−２ポリペプチドと同一である必要はないが同様の活性を示
す断片である。これら断片の生物学的活性としては、改善された所望の活性、ま
たは低減された所望でない活性が挙げられる。
【０１２０】 しかしながら、ＥＳＴ配列などの多くのポリヌクレオチド配列が配列のデータ
ベースにより公的に入手およびアクセスが可能である。これら配列のあるものは
配列番号１に関連しており、本発明の着想前に公的に利用可能であった。そのよ
うな関連するポリヌクレオチドは本発明の範囲から特別に除外されるのが好まし
い。関連する各配列を列記するのは煩雑である。従って、本発明の範囲から除外
されるのが好ましいのは、一般式ａ−ｂ（式中、ａは配列番号１の１〜６１３の
いずれかの整数、ｂは１５〜６２７の整数であり、ａおよびｂはともに配列番号
１に示すヌクレオチド配列の位置に対応し、ｂはａ＋４より大きいかまたは等し
い）により記載されるヌクレオチド配列を含む１またはそれ以上のポリヌクレオ
チドである。
【０１２１】 アミノ末端およびカルボキシ末端の欠失 組換えＤＮＡ技術を使用して、ＦＧＦファミリーの様々なメンバーを修飾した
。ヘパリン結合に重要であるaＦＧＦおよびbＦＧＦにおいて、正に帯電した分子
を置換または欠失させた。その修飾された分子は、減少されたヘパリン結合活性
を生じた。従って、患者においてヘパリンにより隔離される修飾された分子の量
は減少し、より多くのＦＧＦが適当な受容体に到達するであろうことから力価を
増大させることが知られている(欧州特許第０ ２９８ ７２３号)。 天然のＫＧＦ−２は、水性状態において比較的不安定であり、またそれは、化
学的分解および物理的分解を受けて、プロセッシングおよび保存の間に生物学的
活性の損失を生ずる。天然のＫＧＦ−２はまた、水溶液中、高温で凝集する傾向
があり、またそれは、酸性条件下に不活性となる。 天然のＫＧＦ−２の１つまたはそれ以上の特性を改善または変更するためには
、タンパク質工学を使用することができる。Ｒonら，Ｊ. Ｂiol. Ｃhem. ２６８
(４)：２９８４−２９８８（１９９３）は、たとえ３、８、または２７のアミノ
末端アミノ酸残基がなくても、ヘパリン結合活性を有する修飾ＫＧＦタンパク質
を報告した。３および８のアミノ酸の欠失は、完全な活性を有していた。より多
くのＫＧＦの欠失は、ＰＣＴ／ＩＢ９５／００９７１に記載されている。カルボ
キシ末端アミノ酸の欠失は、タンパク質の活性を高め得る。１つの例は、タンパ
ク質のカルボキシ末端から１０のアミノ酸残基を欠失することにより、より高い
活性を１０倍まで示すインターフェロンγである(Ｄoebeliら，Ｊ. of Ｂiotech
nology ７：１９９−２１６（１９８８）)。従って、本発明の一態様は、天然の
ＫＧＦ−２ポリペプチドに比べて高められた安定性を示す、(例えば、典型的なp
Ｈ、熱条件、または他の保存条件に曝露した場合)ＫＧＦ−２のポリペプチドア
ナログ、およびそのようなアナログをコードするヌクレオチド配列を提供するこ
とである。
【０１２２】 特に好ましいＫＧＦ−２ポリペプチドを以下に示す(ナンバリングは、タンパ
ク質における最初のアミノ酸(Ｍet)で始める)： Ｔhr(残基３６)--Ｓer(残基２０８)； Ｃys(３７)--Ｓer(２０８)； Ｇln(３８)--Ｓer(２０８)； Ａla(３９)--Ｓer(２０８)； Ｌeu(４０)--Ｓer(２０８)； Ｇly(４１)--Ｓer(２０８)； Ｇln(４２)--Ｓer(２０８)； Ａsp(４３)--Ｓer(２０８)； Ｍet(４４)--Ｓer(２０８)； Ｖal(４５)--Ｓer(２０８)； Ｓer(４６)--Ｓer(２０８)； Ｐro(４７)--Ｓer(２０８)； Ｇln(４８)--Ｓer(２０８)； Ａla(４９)--Ｓer(２０８)； Ｔhr(５０)--Ｓer(２０８)； Ａsn(５１)--Ｓer(２０８)； Ｓer(５２)--Ｓer(２０８)； Ｓer(５３)--Ｓer(２０８)； Ｓer(５４)--Ｓer(２０８)； Ｓer(５５)--Ｓer(２０８)； Ｓer(５６)--Ｓer(２０８)； Ｐhe(５７)--Ｓer(２０８)； Ｓer(５９)--Ｓer(２０８)； Ｓer(６２)--Ｓer(２０８)； Ａla(６３)--Ｓer(２０８)； Ｇly(６４)--Ｓer(２０８)； Ａrg(６５)--Ｓer(２０８)； Ｖal(６７)--Ｓer(２０８)； Ｓer(６９)--Ｓer(２０８)； Ｖal(７７)--Ｓer(２０８)； Ａrg(８０)--Ｓer(２０８)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ｈis(２０７)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ｖal(２０６)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ｖal(２０５)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ｍet(２０４)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ｐro(２０３)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ｌeu(２０２)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ｐhe(２０１)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ｈis(２００)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ａla(１９９)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ｓer(１９８)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ｔhr(１９７)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ａsn(１９６)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ｌys(１９５)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ａrg(１９４)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ａrg(１９３)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ｔhr(１９２)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ｌys(１９１)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ａrg(１８８)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ａrg(１８７)； Ｍet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ｌys(１８３)。
【０１２３】 好ましい態様には、Ｎ末端欠失のＡla(６３)--Ｓer(２０８)(ＫＧＦ−２ Δ２
８)（配列番号：６８）およびＳer(６９)--Ｓer(２０８)(ＫＧＦ−２ Δ３３)
（配列番号：９６）が含まれる。他の好ましいＮ末端およびＣ末端欠失変異体を
、本明細書の実施例１３および１６(ｃ)に記載し、これには、Ａla(３９)--Ｓer
(２０８) （配列番号：１１６）；第１図（配列番号：２）のＰro(４７)--Ｓer(
２０８)；Ｖal(７７)--Ｓer(２０８)（配列番号：７０）；Ｇlu(９３)--Ｓer(２
０８)（配列番号：７２）；Ｇlu(１０４)--Ｓer(２０８) （配列番号：７４）；
Ｖal(１２３)--Ｓer(２０８)（配列番号：７６）；およびＧly(１３８)--Ｓer(
２０８)（配列番号：７８）が含まれる。他の好ましいＣ末端欠失変異体には、
第１図（配列番号：２）のＭet(１)，Ｔhr(３６)，またはＣys(３７)--Ｌys(１
５３)が含まれる。 本発明には、Ｎ末端およびＣ末端の両方から欠失したアミノ酸を有する欠失変
異体もまた含まれる。そのような変異体には、先に記載したＮ末端欠失変異体お
よびＣ末端欠失変異体の全ての組み合わせ(例えば、第１図（配列番号：２）の
Ａla(３９)--Ｈis(２００)、第１図（配列番号：２）のＭet(４４)--Ａrg(１９
３)、第１図（配列番号：２）のＡla(６３)--Ｌys(１５３)、第１図（配列番号
：２）のＳer(６９)--Ｌys(１５３)等、等、等…)が含まれる。それらの組み合
わせは、当業者に知られている組換え技術を使用して製造することができる。
【０１２４】 従って、一態様において、本発明は、Ｎ末端欠失変異体を提供する。そのよう
な変異体には、第１図（配列番号２）の少なくとも最初の３８のＮ末端アミノ酸
残基の欠失(すなわち、少なくともＭet(１)--Ｇln(３８)の欠失)であるが、最初
の１４７以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失を除いては、第１図（配列番号２）に
示すアミノ酸配列を含んでなる変異体が含まれる。あるいはまた、その欠失には
、第１図（配列番号２）の少なくとも最初の３８のＮ末端アミノ酸残基(すなわ
ち、少なくともＭet(１)--Ｇln(３８)の欠失)であるが、最初の１３７以下のＮ
末端アミノ酸残基が含まれるであろう。あるいはまた、その欠失には、第１図（
配列番号２）の少なくとも最初の４６のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の１
３７以下のＮ末端アミノ酸残基が含まれるであろう。あるいはまた、その欠失に
は、第１図（配列番号２）の少なくとも最初の６２のＮ末端アミノ酸残基である
が、最初の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基が含まれるであろう。あるいはまた
、その欠失には、第１図（配列番号２）の少なくとも最初の６８のＮ末端アミノ
酸残基であるが、最初の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基が含まれるであろう。
あるいはまた、その欠失には、第１図（配列番号２）の少なくとも最初の７６の
Ｎ末端アミノ酸残基であるが、最初の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基が含まれ
るであろう。あるいはまた、その欠失には、第１図（配列番号２）の少なくとも
最初の９２のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の１３７以下のＮ末端アミノ酸
残基が含まれるであろう。あるいはまた、その欠失には、第１図（配列番号２）
の少なくとも最初の１０３のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の１３７以下の
Ｎ末端アミノ酸残基が含まれるであろう。あるいはまた、その欠失には、第１図
（配列番号２）の少なくとも最初の１２２のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初
の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基が含まれるであろう。
【０１２５】 先に記載したＮ末端欠失変異体の範囲に加えて、本発明はまた、先に記載した
範囲の全ての組み合わせにも関する。例えば、第１図（配列番号２）の少なくと
も最初の６２のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の６８以下のＮ末端アミノ酸
残基の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも最初の６２のＮ末端アミノ酸残
基であるが、最初の７６以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２
）の少なくとも最初の６２のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の９２以下のＮ
末端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも最初の６２のＮ末
端アミノ酸残基であるが、最初の１０３以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失；第１
図（配列番号２）の少なくとも最初の６８のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初
の７６以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも最
初の６８のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の９２以下のＮ末端アミノ酸残基
の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも最初の６８のＮ末端アミノ酸残基で
あるが、最初の１０３以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２）
の少なくとも最初の４６のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の６２以下のＮ末
端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも最初の４６のＮ末端
アミノ酸残基であるが、最初の６８以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失；第１図（
配列番号２）の少なくとも最初の４６のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の７
６以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失等、等、等…。
【０１２６】 別の態様において、本発明は、Ｃ末端欠失変異体を提供する。好ましくは、該
Ｃ末端欠失変異体のＮ末端アミノ酸残基は、第１図（配列番号２）のアミノ酸残
基１(Ｍet)、３６(Ｔhr)、または３７(Ｃys)である。そのような変異体には、第
１図（配列番号２）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基(Ｓer(２０８))であ
るが、最後の５５以下のＣ末端アミノ酸残基の欠失(すなわち、アミノ酸残基Ｇl
u(１５４)--Ｓer(２０８)の欠失)を除いては、第１図（配列番号２）に示すアミ
ノ酸配列を含んでなる変異体が含まれる。あるいはまた、その欠失には、第１図
（配列番号２）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基であるが、最後の６５以
下のＣ末端アミノ酸残基が含まれるであろう。あるいはまた、その欠失には、第
１図（配列番号２）の少なくとも最後の１０のＣ末端アミノ酸残基であるが、最
後の５５以下のＣ末端アミノ酸残基が含まれるであろう。あるいはまた、その欠
失には、第１図（配列番号２）の少なくとも最後の２０のＣ末端アミノ酸残基で
あるが、最後の５５以下のＣ末端アミノ酸残基が含まれるであろう。あるいはま
た、その欠失には、第１図（配列番号２）の少なくとも最後の３０のＣ末端アミ
ノ酸残基であるが、最後の５５以下のＣ末端アミノ酸残基が含まれるであろう。
あるいはまた、その欠失には、第１図（配列番号２）の少なくとも最後の４０の
Ｃ末端アミノ酸残基であるが、最後の５５以下のＣ末端アミノ酸残基が含まれる
であろう。あるいはまた、その欠失には、第１図（配列番号２）の少なくとも最
後の５０のＣ末端アミノ酸残基であるが、最後の５５以下のＣ末端アミノ酸残基
が含まれるであろう。
【０１２７】 先に記載したＣ末端欠失変異体の範囲に加えて、本発明はまた、先に記載した
範囲の全ての組み合わせに関する。例えば、第１図（配列番号２）の少なくとも
最後のＣ末端アミノ酸残基であるが、最後の１０以下のＣ末端アミノ酸残基の欠
失；第１図（配列番号２）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基であるが、最
後の２０以下のＣ末端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも
最後のＣ末端アミノ酸残基であるが、最後の３０以下のＣ末端アミノ酸残基の欠
失；第１図（配列番号２）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基であるが、最
後の４０以下のＣ末端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも
最後の１０のＣ末端アミノ酸残基であるが、最後の２０以下のＣ末端アミノ酸残
基の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも最後の１０のＣ末端アミノ酸残基
であるが、最後の３０以下のＣ末端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２）
の少なくとも最後の１０のＣ末端アミノ酸残基であるが、最後の４０以下のＣ末
端アミノ酸残基の欠失；第１図（配列番号２）の少なくとも最後の２０のＣ末端
アミノ酸残基であるが、最後の３０以下のＣ末端アミノ酸残基の欠失等、等、等
…。
【０１２８】 また別の態様において、本発明には、Ｎ末端およびＣ末端残基の両方から欠失
したアミノ酸を有する欠失変異体もまた含まれる。そのような変異体には、先に
記載したＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体の全ての組み合わせが含まれ
る。そのような変異体には、第１図（配列番号２）の少なくとも最初の４６のＮ
末端アミノ酸残基であるが、最初の１３７以下のＮ末端アミノ酸残基の欠失、お
よび第１図（配列番号２）の少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基であるが、最
後の５５以下のＣ末端アミノ酸残基の欠失を除いては、第１図（配列番号２）に
示すアミノ酸配列を含んでなる変異体が含まれる。あるいはまた、その欠失には
、第１図（配列番号２）の少なくとも最初の６２、６８、７６、９２、１０３、
または１２２のＮ末端アミノ酸残基であるが、最初の１３７以下のＮ末端アミノ
酸残基、および第１図（配列番号２）の少なくとも最後の１０、２０、３０、４
０、または５０のＣ末端アミノ酸残基であるが、最後の５５以下のＣ末端アミノ
酸残基の欠失が含まれ得る。さらに、先に記載した範囲の全ての組み合わせが含
まれる。
【０１２９】 アミノ酸の置換 本発明のさらなる態様にはまた、アミノ酸の置換も含まれる。天然の成熟ＫＧ
Ｆ−２は４４の帯電した残基を含み、このうち３２は正の電荷を帯びている。タ
ンパク質の三次元構造における、そのような残基の位置により、１つまたはそれ
以上の、これらの密集した残基を、負の電荷または中性の電荷を帯びたアミノ酸
で置換することは、隣接する残基の静電的相互作用を変え得、またタンパク質の
安定性の増大、および凝集性の減少を成し遂げるのに有用であり得る。タンパク
質の凝集は、活性の損失を生じ得るだけでなく、それらは免疫原であり得るので
、医薬品製剤を製造する場合に問題ともなり得る(Ｐinckardら，Ｃlin. Ｅxp.
Ｉmmunol. ２：３３１−３４０（１９６７）、Ｒobbinsら，Ｄiabetes ３６：８
３８−８４５（１９８７）、Ｃlelandら，Ｃrit. Ｒev. Ｔherapeutic Ｄrug Ｃ
arrier Ｓystems １０：３０７−３７７（１９９３）)。いずれの修飾も、タン
パク質分子の三次構造における電荷反発を最小とするよう考えるべきである。従
って、帯電したアミノ酸の、別の電荷での置換、および中性または負に帯電した
アミノ酸での置換が特に重要である。後者は、減少された正の電荷をもつタンパ
ク質を生じて、ＫＧＦ−２の特性を改善する。そのような改善には、天然のＫＧ
Ｆ−２タンパク質に比べて、アナログの安定性の増大および凝集性の減少が含ま
れる。 アミノ酸の置換はまた、細胞表面受容体への結合の選択性を変えることもでき
る。Ｏstadeら，Ｎature ３６１：２６６−２６８（１９９３）は、２つの既知
のＴＮＦ受容体の１つのみへのＴＮＦ αの選択的結合をもたらす、あるＴＮＦ
α変異体を記載している。
【０１３０】 本発明の更なる態様は、ＫＧＦ−２ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペ
プチドに関するものであって、該ＫＧＦ−２ポリペプチドは少なくとも１つのア
ミノ酸置換を含むが、５０個以下のアミノ酸置換（４０個以下のアミノ酸置換が
より好ましく、３０個以下のアミノ酸置換がより一層好ましく、２０個以下のア
ミノ酸置換が更により一層好ましい）を含むアミノ酸配列を有する。当然に、好
ましさが増大する順に、ペプチドまたはポリペプチドは、ＫＧＦ−２ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を含んでおり、少なくとも１個であるが、２０、１９、１８、
１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、
３、２または１個かもしくはそれ以下であるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を
有することが非常に好ましい。具体的な実施態様においては、図１のアミノ酸配
列またはそのフラグメント（例えば、成熟形態および／または本明細書に記載す
る他のフラグメント）中の付加、置換および／または欠失の数は１−５、５−１
０、５−２５、５−５０、１０−５０または５０−１５０であって、同類のアミ
ノ酸の置換が好ましい。
【０１３１】 ＫＧＦ−２分子には、天然の変異またはヒト操作由来の、１つまたはそれ以上
のアミノ酸置換、欠失、または付加が含まれ得る。その変異は、完全長のＫＧＦ
−２、成熟ＫＧＦ−２、他の適当なＫＧＦ−２フラグメント、例えばＡ６３−Ｓ
２０８、Ｓ６９−Ｓ２０８、Ｖ７７−Ｓ２０８、Ｒ８０−Ｓ２０８またはＥ９３
−Ｓ２０８について行なうことができる。 幾つかの好ましい変異の例は、下記の配列のものである。
【化１３】 上の表示により、例えば、Ａla(４９)Ｇlnは、第１図（配列番号２）の４９の
位置にあるＡlaがＧlnで置換されていることを意図する。
【０１３２】 加えて、以下の突然変異体： Ｒ１８８Ｅでの点突然変異を有するＳ６９−Ｓ２０８； Ｋ１９１Ｅでの点突然変異を有するＳ６９−Ｓ２０８； Ｋ１４９Ｅでの点突然変異を有するＳ６９−Ｓ２０８； Ｋ１８３Ｑでの点突然変異を有するＳ６９−Ｓ２０８； Ｋ１８３Ｅでの点突然変異を有するＳ６９−Ｓ２０８； Ｒ６８Ｇでの点突然変異を有するＡ６３−Ｓ２０８； Ｒ６８Ｓでの点突然変異を有するＡ６３−Ｓ２０８； Ｒ６８Ａでの点突然変異を有するＡ６３−Ｓ２０８； Ｒ７８Ａ、Ｒ８０ＡおよびＫ８１Ａでの点突然変異を有するＡ６３−Ｓ２０８
； Ｋ８１Ａ、Ｒ８７ＡおよびＫ９１Ａでの点突然変異を有するＡ６３−Ｓ２０８
； Ｒ７８Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｋ８１Ａ、Ｋ８７ＡおよびＫ９１Ａでの点突然変異を有
するＡ６３−Ｓ２０８； Ｋ１３６Ａ、Ｋ１３７Ａ、Ｋ１３９ＡおよびＫ１４４Ａでの点突然変異を有す
るＡ６３−Ｓ２０８； Ｋ１５１Ａ、Ｋ１５３ＡおよびＫ１５５Ａでの点突然変異を有するＡ６３−Ｓ
２０８； Ｒ６８Ｇ、Ｒ７８Ａ、Ｒ８０ＡおよびＫ８１Ａでの点突然変異を有するＡ６３
−Ｓ２０８； Ｒ６８Ｇ、Ｋ８１Ａ、Ｒ８７ＡおよびＫ９１Ａでの点突然変異を有するＡ６３
−Ｓ２０８； Ｒ６８Ｇ、Ｒ７８Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｋ８１Ａ、Ｋ８７ＡおよびＫ９１Ａでの点突
然変異を有するＡ６３−Ｓ２０８； Ｒ６８Ｇ、Ｋ１３６Ａ、Ｋ１３７Ａ、Ｋ１３９ＡおよびＫ１４４Ａでの点突然
変異を有するＡ６３−Ｓ２０８； Ｒ６８Ｇ、Ｋ１５１Ａ、Ｋ１５３ＡおよびＲ１５５Ａでの点突然変異を有する
Ａ６３−Ｓ２０８； Ｒ６８Ｓ、Ｒ７８Ａ、Ｒ８０ＡおよびＫ８１Ａでの点突然変異を有するＡ６３
−Ｓ２０８； Ｒ６８Ｓ、Ｋ８１Ａ、Ｋ８７ＡおよびＫ９１Ａでの点突然変異を有するＡ６３
−Ｓ２０８； Ｒ６８Ｓ、Ｒ７８Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｋ８１Ａ、Ｋ８７ＡおよびＫ９１Ａでの点突
然変異を有するＡ６３−Ｓ２０８； Ｒ６８Ｓ、Ｋ１３６Ａ、Ｋ１３７Ａ、Ｋ１３９ＡおよびＫ１４４Ａでの点突然
変異を有するＡ６３−Ｓ２０８； Ｒ６８Ｓ、Ｋ１５１Ａ、Ｋ１５３ＡおよびＲ１５５Ａでの点突然変異を有する
Ａ６３−Ｓ２０８； Ｒ６８Ａ、Ｒ７８Ａ、Ｒ８０ＡおよびＫ８１Ａでの点突然変異を有するＡ６３
−Ｓ２０８； Ｒ６８Ａ、Ｋ８１Ａ、Ｋ８７ＡおよびＫ９１Ａでの点突然変異を有するＡ６３
−Ｓ２０８； Ｒ６８Ａ、Ｒ７８Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｋ８１Ａ、Ｋ８７ＡおよびＫ９１Ａでの点突
然変異を有するＡ６３−Ｓ２０８； Ｒ６８Ａ、Ｋ１３６Ａ、Ｋ１３７Ａ，Ｋ１３９ＡおよびＫ１４４Ａでの点突然
変異を有するＡ６３−Ｓ２０８；および Ｒ６８Ａ、Ｋ１５１Ａ、Ｋ１５３ＡおよびＲ１５５Ａでの点突然変異を有する
Ａ６３−Ｓ２０８ が特に好ましい。 Ｒ６８〜Ｋ９１（これらを含む）の間の正に荷電した残基をアラニン［Ａ６３
−Ｓ２０８（Ｒ６８−Ｋ９１Ａ）］で置換したＡ６３−Ｓ２０８； Ｒ６８〜Ｋ９１（これらを含む）の間の正に荷電した残基をアラニン［ＫＧＦ
−２（Ｒ６８−Ｋ９１Ａ）］で置換した完全鎖ＫＧＦ−２； Ｒ６８〜Ｋ９１（これらを含む）の間の正に荷電した残基を中性残基（例えば
、Ｇ、Ｓおよび／またはＡ）で置換したＡ６３−Ｓ２０８； Ｒ６８〜Ｋ９１（これらを含む）の間の正に荷電した残基を中性残基（例えば
、Ｇ、Ｓおよび／またはＡ）で置換した完全鎖ＫＧＦ−２； Ｒ６８〜Ｋ９１（これらを含む）の間の正に荷電した残基を負に荷電した酸性
残基（例えば、Ｄおよび／またはＥ）で置換したＡ６３−Ｓ２０８； Ｒ６８〜Ｋ９１（これらを含む）の間の正に荷電した残基を負に荷電した酸性
残基（例えば、Ｄおよび／またはＥ）で置換した完全鎖ＫＧＦ−２； Ｒ７８Ａ、Ｒ８０ＡおよびＫ８１Ａでの点突然変異を有する完全鎖ＫＧＦ−２
； Ｋ８１Ａ、Ｋ８７ＡおよびＫ９１Ａでの点突然変異を有する完全鎖ＫＧＦ−２
； Ｒ６８Ｇでの点突然変異を有する完全鎖ＫＧＦ−２； Ｒ６８Ｓでの点突然変異を有する完全鎖ＫＧＦ−２； Ｒ１７４ＡおよびＫ１８３Ａでの点突然変異を有するＡ６３−Ｓ２０８；およ
び Ｒ１８７ＡおよびＲ１８８Ａでの点突然変異を有するＡ６３−Ｓ２０８ もまた好ましい。
【０１３３】 Ｒ１８８Ｅ、Ｋ１９１Ｅ、Ｋ１４９Ｅ、Ｋ１８３Ｑでの点突然変異を有するＡ
６３−Ｓ２０８； Ｒ７８Ａ、Ｒ８０ＡおよびＫ８１Ａでの点突然変異を有するＳ６９−Ｓ２０８
； Ｋ８１Ａ、Ｋ８７ＡおよびＫ９１Ａでの点突然変異を有するＳ６９−Ｓ２０８
； Ｒ１７４ＡおよびＫ１８３Ａでの点突然変異を有するＳ６９−Ｓ２０８； Ｒ１８７ＡおよびＲ１８８Ａでの点突然変異を有するＳ６９−Ｓ２０８； Ｒ１８８Ｅ、Ｋ１９１Ｅ、Ｋ１４９Ｅ、Ｋ１８３ＱまたはＫ１８３Ｅでの点突
然変異を有するＶ７７−Ｓ２０８； Ｒ７８Ａ、Ｒ８０ＡおよびＫ８１Ａでの点突然変異を有するＶ７７−Ｓ２０８
； Ｋ８１Ａ、Ｋ８７ＡおよびＫ９１Ａでの点突然変異を有するＶ７７−Ｓ２０８
； Ｒ１７４ＡおよびＫ１８３Ａでの点突然変異を有するＶ７７−Ｓ２０８； Ｒ１８７ＡおよびＲ１８８Ａでの点突然変異を有するＶ７７−Ｓ２０８； Ｒ１８８Ｅ、Ｋ１９１Ｅ、Ｋ１４９Ｅ、Ｋ１８３ＱまたはＫ１８３Ｅでの点突
然変異を有するＲ８０−Ｓ２０８； Ｒ１７４ＡおよびＫ１８３Ａでの点突然変異を有するＲ８０−Ｓ２０８； Ｒ１８７ＡおよびＲ１８８Ａでの点突然変異を有するＲ８０−Ｓ２０８； Ｒ１８８Ｅ、Ｋ１９１Ｅ、Ｋ１４９Ｅ、Ｋ１８３ＱまたはＫ１８３Ｅでの点突
然変異を有するＥ９３−Ｓ２０８； Ｒ１７４ＡおよびＫ１８３Ａでの点突然変異を有するＥ９３−Ｓ２０８；また
は Ｒ１８７ＡおよびＲ１８８Ａでの点突然変異を有するＥ９３−Ｓ２０８ もまた好ましい。
【０１３４】 全ての点突然変異を、本明細書に記載の完全鎖ＫＧＦ−２、成熟したＫＧＦ−
２またはＫＧＦ−２のいずれかの他のフラグメントで行なうこともできる。命名
に従えば、例えばＲ１８８Ｅは１８８位のアルギニンがグルタミン酸で置換され
ていることを意図する。
【０１３５】 さらに、ＫＧＦ−２の各アミノ酸、好ましくはＡ６３からＥ９３間のアミノ酸に
突然変異を施すことができる。各アミノ酸は他の残りの１９アミノ酸のいずれか
と置換することができる。例えば、好ましい変異としては、：Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、
Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置換さ
れるＡ６３；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、
Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置換されるＧ６４；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、
Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置換されるＲ６５；Ａ、
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、また
はＹで置換されるＨ６６；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、
Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹで置換されるＶ６７；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、
Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置換される
Ｒ６８；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、
Ｖ、Ｗ、またはＹで置換されるＳ６９；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、
Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＷで置換されるＹ７０；Ａ、Ｃ、
Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ
で置換されるＮ７１；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、
Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置換されるＨ７２；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、
Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置換されるＬ７
３；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、
Ｗ、またはＹで置換されるＱ７４；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、
Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置換されるＧ７５；Ａ、Ｃ、Ｅ、
Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置
換されるＤ７６；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、
Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹで置換されるＶ７７；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、
Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置換されるＲ７８；
Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、
またはＹで置換されるＷ７９；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、
Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置換されるＲ８０；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、
Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置換さ
れるＫ８１；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、
Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置換されるＬ８２；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、
Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置換されるＦ８３；Ａ、
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、また
はＹで置換されるＳ８４；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、
Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置換されるＦ８５；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、
Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置換される
Ｔ８６；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、
Ｖ、Ｗ、またはＹで置換されるＫ８７；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、
Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＷで置換されるＹ８８；Ａ、Ｃ、
Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ
で置換されるＦ８９；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、
Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置換されるＬ９０；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、
Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置換されるＫ９
１；Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、
Ｗ、またはＹで置換されるＩ９２；および／またはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ
、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹで置換されるＥ９３
が挙げられる。
【０１３６】 これらの突然変異は前述のＮ末端欠失構築物、特にアミノ酸Ｍ１、Ｔ３６、Ｃ
３７、またはＡ６３で始まる構築物として作成することが出来る。さらに、１個
以上のアミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９および１０）がこの
領域（Ａ６３からＥ９３）で他のアミノ酸と置きかえることが出来る。得られた
構築物はヘパリン結合の喪失、ＫＧＦ−２活性の喪失、および／またはアミノ酸
Ｒ６８とＳ６９の間の酵素切断の喪失についてスクリーニング出来る。
【０１３７】 好ましい変異は、ヘパリン結合ドメインにおける変異と同様、先に列記したＮ
末端変異体のＮ−末端欠失構造Ｍ１、Ｔ３６、Ｃ３７およびＡ６３、特にＴ３６
、Ｃ３７、Ａ６３、Ｓ６９、Ｖ７７、Ｒ８０またはＥ９３に置けるアミノ酸位置
Ｒ６８とＳ６９に位置する。ヘパリン結合ドメインはＡｒｇ１７４およびＬｙｓ
１８３の間である。好ましいＡｒｇ６８変異体はＧｌｙ、ＳｅｒまたはＡｌａで
そのアルギニンを置換し、好ましいＡｒｇ１８７変異体はアラニンでそのアルギ
ニンを置換する。 突然変異を作製できる２つの方法は、部位特異的突然変異誘発、または加速突
然変異誘発（Kuchner and Arnold, Tibtech 5: 523-530 (1997); Crameri et al
., Nature (1998); およびChristians et al., Nature Biotechnology 17:25926
4(1999))）のいずれかである。これらの方法は当業者に周知である。
【０１３８】 変化は、タンパク質の折りたたみまたは活性に著しく影響を与えない同類アミ
ノ酸置換のような、僅かな性質の変化であるのが好ましい。当業者に知られてい
る同類アミノ酸置換の例を以下に示す： 芳香族： フェニルアラニン； トリプトファン チロシン 疎水性： ロイシン イソロイシン バリン 極性： グルタミン アスパラギン 塩基性： アルギニン リジン ヒスチジン 酸性： アスパラギン酸 グルタミン酸 小さい： アラニン セリン トレオニン メチオニン グリシン。 勿論、当業者が行うであろうアミノ酸置換の数は、先に記載した因子を含め、
多くの因子に依存する。一般的に言うと、いずれかのあるＫＧＦ−２ポリペプチ
ドに対する置換の数も、目的物により、５０、４０、３０、２０、１０、５、ま
たは３を超えることはないであろう。例えば、ＫＧＦ−２のＣ末端において行わ
れて、安定性を改善することができる置換の数を先に記載し、また実施例２２に
記載する。
【０１３９】 特に好ましくは以下の保存アミノ酸置換を持つＫＧＦ−２分子である：Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換されるＭ１；Ｆ、またはＹで置換されるＷ２
；Ｈ、またはＲで置換されるＫ３；Ｆ、またはＹで置換されるＷ４；Ａ、Ｇ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＩ５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
で置換されるＬ６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換されるＴ７；Ｋ、
またはＲで置換されるＨ８；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＡ
１０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＳ１１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＡ１２；Ｗ、またはＹで置換されるＦ１３；Ｋ
、またはＲで置換されるＨ１５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
るＬ１６；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＧ１８；Ｗ、または
Ｙで置換されるＦ２４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＬ２５
；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＬ２６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換されるＬ２７；Ｗ、またはＹで置換されるＦ２８；Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＬ２９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ま
たはＭで置換されるＶ３０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＳ
３１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＳ３２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換されるＶ３３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで
置換されるＶ３５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換されるＴ３６；Ｎ
で置換されるＱ３８；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＡ３９；
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＬ４０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換されるＧ４１；Ｎで置換されるＱ４２；Ｅで置換されるＤ４
３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換されるＭ４４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、またはＭで置換されるＶ４５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換されるＳ４６；Ｄで置換されるＥ４８；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換されるＡ４９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換されるＴ５０；Ｑ
で置換されるＮ５１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＳ５２；
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＳ５３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換されるＳ５４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れるＳ５５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＳ５６；Ｗ、また
はＹで置換されるＦ５７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＳ５
８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＳ５９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＳ６１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換されるＳ６２；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＡ６３；Ａ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＧ６４；Ｈ、またはＫで置換される
Ｒ６５；Ｋ、またはＲで置換されるＨ６６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭ
で置換されるＶ６７；Ｈ、またはＫで置換されるＲ６８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換されるＳ６９；Ｆ、またはＷで置換されるＹ７０；Ｑで置換
されるＮ７１；Ｋ、またはＲで置換されるＨ７２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶで置換されるＬ７３；Ｎで置換されるＱ７４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
またはＶで置換されるＧ７５；Ｅで置換されるＤ７６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、またはＭで置換されるＶ７７；Ｈ、またはＫで置換されるＲ７８；Ｆ、または
Ｙで置換されるＷ７９；Ｈ、またはＫで置換されるＲ８０；Ｈ、またはＲで置換
されるＫ８１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＬ８２；Ｗ、ま
たはＹで置換されるＦ９３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＳ
８４；Ｗ、またはＹで置換されるＦ８５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで
置換されるＴ８６；Ｈ、またはＲで置換されるＫ８７；Ｆ、またはＷで置換され
るＹ８８；Ｗ、またはＹで置換されるＦ８９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖで置換されるＬ９０；Ｈ、またはＲで置換されるＫ９１；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換されるＩ９２；Ｄで置換されるＥ９３；Ｈ、またはＲで置
換されるＫ９４；Ｑで置換されるＮ９５；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換されるＧ９６；Ｈ、またはＲで置換されるＫ９７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、またはＭで置換されるＶ９８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
るＳ９９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＧ１００；Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換されるＴ１０１；Ｈ、またはＲで置換されるＫ
１０２；Ｈ、またはＲで置換されるＫ１０３；Ｄで置換されるＥ１０４；Ｑで置
換されるＮ１０５；Ｆ、またはＷで置換されるＹ１０８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換されるＳ１０９；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
されるＬ１１０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＩ１１１；Ｄ
で置換されるＥ１１２；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＩ１１
３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換されるＴ１１４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＳ１１５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭ
で置換されるＶ１１６；Ｄで置換されるＥ１１７；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶで置換されるＩ１１８；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される
Ｇ１１９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換されるＶ１２０；Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換されるＶ１２１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶで置換されるＡ１２２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される
Ｖ１２３；Ｈ、またはＲで置換されるＫ１２４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換されるＡ１２５；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＩ
１２６；Ｑで置換されるＮ１２７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れるＳ１２８；Ｑで置換されるＮ１２９；Ｆ、またはＷで置換されるＹ１３０；
Ｆ、またはＷで置換されるＹ１３１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
されるＬ１３２；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＡ１３３；Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換されるＭ１３４；Ｑで置換されるＮ１３
５；Ｈ、またはＲで置換されるＫ１３６；Ｈ、またはＲで置換されるＫ１３７；
Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＧ１３８；Ｈ、またはＲで置換
されるＫ１３９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＬ１４０；Ｆ
、またはＷで置換されるＹ１４１；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れるＧ１４２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＳ１４３；Ｈ、
またはＲで置換されるＫ１４４；Ｄで置換されるＥ１４５；Ｗ、またはＹで置換
されるＦ１４６；Ｑで置換されるＮ１４７；Ｑで置換されるＮ１４８；Ｅで置換
されるＤ１４９；Ｈ、またはＲで置換されるＫ１５１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、またはＶで置換されるＬ１５２；Ｈ、またはＲで置換されるＫ１５３；Ｄで置
換されるＥ１５４；Ｈ、またはＫで置換されるＲ１５５；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換されるＩ１５６；Ｄで置換されるＥ１５７；Ｄで置換される
Ｅ１５８；Ｑで置換されるＮ１５９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
されるＧ１６０；Ｆ、またはＷで置換されるＹ１６１；Ｑで置換されるＮ１６２
；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換されるＴ１６３；Ｆ、またはＷで置
換されるＹ１６４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＡ１６５；
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＳ１６６；Ｗ、またはＹで置換
されるＦ１６７；Ｑで置換されるＮ１６８；Ｆ、またはＹで置換されるＷ１６９
；Ｎで置換されるＱ１７０；Ｋ、またはＲで置換されるＨ１７１；Ｑで置換され
るＮ１７２；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＧ１７３；Ｈ、ま
たはＫで置換されるＲ１７４；Ｎで置換されるＱ１７５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、またはＶで置換されるＭ１７６；Ｆ、またはＷで置換されるＹ１７７；Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換されるＶ１７８；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、またはＶで置換されるＡ１７９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れるＬ１８０；Ｑで置換されるＮ１８１；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換されるＱ１８２；Ｈ、またはＲで置換されるＫ１８３；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換されるＧ１８４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換されるＡ１８５；Ｈ、またはＫで置換されるＲ１８７；Ｈ、またはＫで置換さ
れるＲ１８８；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＧ１８９；Ｎで
置換されるＱ１９０；Ｈ、またはＲで置換されるＫ１９１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｍ、またはＶで置換されるＴ１９２；Ｈ、またはＫで置換されるＲ１９３；Ｈ
、またはＫで置換されるＲ１９４；Ｈ、またはＲで置換されるＫ１９５；Ｑで置
換されるＮ１９６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換されるＴ１９７；
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＳ１９８；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換されるＡ１９９；Ｋ、またはＲで置換されるＨ２００；Ｗ
、またはＹで置換されるＦ２０１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れるＬ２０２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換されるＭ２０４；Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換されるＶ２０５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、またはＭで置換されるＶ２０６；Ｋ、またはＲで置換されるＨ２０７；または
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換されるＳ２０８。
【０１４０】 しかしながら、以下の非保存アミノ酸置換を有するＫＧＦ−２分子もまた好まし
い：Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＭ１
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、または
Ｃで置換されるＷ２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＫ３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されるＷ４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＩ５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＬ６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＴ７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＨ８；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、また
はＰで置換されるＣ９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換されるＡ１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換されるＳ１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換されるＡ１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されるＦ１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換されるＰ１４；Ｄ
、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換されるＨ１５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換されるＬ１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換されるＰ１７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＧ１８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換されるＣ１９
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、またはＰで置換されるＣ２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換されるＣ２１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換
されるＣ２２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換されるＣ２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されるＦ２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＬ２５；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＬ２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＬ２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換され
るＦ２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
るＬ２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
るＶ３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
るＳ３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
るＳ３２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
るＶ３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換されるＰ３４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＶ３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＴ３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換されるＣ３７；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換されるＱ３８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換されるＡ３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換されるＬ４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換されるＧ４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＱ４２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＤ４３；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＭ４４；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＶ４５；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＳ４６；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、または
Ｃで置換されるＰ４７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＥ４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＡ４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＴ５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＮ５１；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＳ５２；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＳ５３；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＳ５４；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＳ５５；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＳ５６；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで
置換されるＦ５７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換されるＳ５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換されるＳ５９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換されるＰ６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＳ６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＳ６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＡ６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＧ６４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＲ６５；Ｄ、Ｅ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
されるＨ６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
されるＶ６７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換されるＲ６８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換されるＳ６９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されるＹ７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＮ
７１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換されるＨ７２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換されるＬ７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＱ７４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
；Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＧ７５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＤ７６
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＶ７７
；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換されるＲ７８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されるＷ７９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＲ８０；Ｄ、Ｅ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
るＫ８１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
るＬ８２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ
、またはＣで置換されるＦ８３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換されるＳ８４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されるＦ８５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＴ８６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＫ８７；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで
置換されるＹ８８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されるＦ８９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＬ９０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＫ９１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＩ９２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
るＥ９３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換されるＫ９４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＮ９５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＧ９６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＫ９７
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＶ９８
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＳ９９
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＧ１０
０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＴ１
０１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換されるＫ１０２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＫ１０３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＥ１０
４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換されるＮ１０５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換されるＣ１０６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置
換されるＰ１０７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されるＹ１０８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＳ１０９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＩ１１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＬ１１１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＥ１１２；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＩ１１３
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＴ１１
４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＳ１
１５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＶ
１１６；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されるＥ１１７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換されるＩ１１８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＧ１１９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＶ１２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＶ１２１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＡ１２２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＶ１２３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＫ１２４；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＡ１２５；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＩ１２６；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換されるＮ１２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換されるＳ１２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＮ１２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されるＹ１３
０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、また
はＣで置換されるＹ１３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換されるＬ１３２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換されるＡ１３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換されるＭ１３４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＮ１３５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＫ
１３６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換されるＫ１３７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換されるＧ１３８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＫ１３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＬ１４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されるＹ１
４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＧ
１４２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
Ｓ１４３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換されるＫ１４４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＥ１４５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されるＦ
１４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されるＮ１４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＮ１４８；Ｈ、Ｋ、Ｉｔ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
されるＤ１４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換されるＣ１５０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＫ１５１；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＬ１５２；Ｄ
、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換されるＫ１５３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＥ１５４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＲ１５５；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＩ１５６；Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換されるＥ１５７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＥ１５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＮ１５
９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＧ１
６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、ま
たはＣで置換されるＹ１６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＮ１６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＴ１６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されるＹ１
６４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＡ
１６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
Ｓ１６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ
、またはＣで置換されるＦ１６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＮ１６８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されるＷ
１６９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されるＱ１７０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＨ１７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
Ｎ１７２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
るＧ１７３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されるＲ１７４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＱ１７５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＭ１７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換され
るＹ１７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れるＶ１７８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
されるＡ１７９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換されるＬ１８０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＮ１８１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＧ１８２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＫ１８３；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＧ１８４；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＡ１８５；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
またはＣで置換されるＰ１８６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＲ１８７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＲ１８８
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＧ１８
９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換されるＱ１９０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＫ１９１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＴ１９２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＲ１９
３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換されるＲ１９４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＫ１９５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＮ１９６
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＴ１９
７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＳ１
９８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＡ
１９９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換されるＨ２００；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されるＦ２０１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＬ２０２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換され
るＰ２０３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れるＭ２０４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
されるＶ２０５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換されるＶ２０６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＨ２０７；またはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されるＳ２０８。
【０１４１】 置換変異体はここに開示しているいずれのアッセイによってもその活性を試験
できる。特に好ましくは、野生型タンパクの活性と特性を保持する保存置換を有
するＫＧＦ−２分子；他のすべての活性または特性は保持されたままで、野生型
タンパクに比してより強い１つの活性または特性を有するもの；または野生型タ
ンパクに比してより強い活性または特性を１つ以上もつものである。対照的に、
非保存置換を有するＫＧＦ−２分子は野生型タンパクの他のすべての活性または
特性を保持しているが１つの活性または特性が欠如しているか；または、野生型
タンパクの活性または特性を１つ以上欠如している。
【０１４２】 例えば、保存または非保存置換を有するＫＧＦ−２において変化し得るＫＧＦ
−２の活性または特性は、これらに限定されないが以下のものである：ケラチノ
サイト細胞、上皮細胞、毛嚢、肝細胞、腎細胞、乳房細胞、膀胱細胞、前立腺細
胞、膵臓細胞の成長刺激；筋肉細胞、神経組織、前立腺細胞、肺細胞、肝細胞、
腎臓細胞、乳房細胞の発育刺激；創傷治癒促進；血管形成刺激；炎症抑制；細胞
保護；ヘパリン結合；リガンド結合；安定性；溶解性；および／または精製に影
響を及ぼす特性。
【０１４３】 機能に欠くことのできないＫＧＦ−２におけるアミノ酸は、部位指定変異誘発
またはアラニン走査変異誘発(ＣunninghamおよびＷells，Ｓcience ２４４：１
０８１−１０８５（１９８９）)といったような、当業界でよく知られている方
法により同定することができる。後者の方法は、分子における全ての残基で、た
だ１つのアラニン変異を誘発する。次いで、その結果得られた変異体分子を、受
容体結合、またはインビトロおよびインビボにおける増殖活性といったような生
物学的活性に関して試験する。(実施例１０および１１を参照)。リガンド−受容
体結合にとって重要である部位はまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標
識といったような構造分析によっても決定することができる(例えば、Ｓmithら
，Ｊ. Ｍol. Ｂiol. ２２４：８９９−９０４（１９９２）；およびde Ｖosら，
Ｓcience ２５５：３０６−３１２（１９９２）を参照)。
【０１４４】 本発明の別の態様は、３７および１０６および１５０のアミノ酸位置にあるシ
ステインに代わってのセリン置換である。奇数のシステインの数は、少なくとも
１つのシステイン残基を、タンパク質に望ましくない三次構造を採択させ得る、
分子間架橋および結合に利用できることを意味する。セリン、または例えば、ア
ラニンで置換されている、１つまたはそれ以上のシステインを有する新規ＫＧＦ
−２タンパク質は、一般に、より高い収率の、可溶性で正確に折りたたまれたタ
ンパク質で精製される。証明されてはいないが、１０６の位置にあるシステイン
残基は機能にとって重要であると信じられる。このシステイン残基は、他の全て
のＦＧＦファミリーのメンバーの中でも高度に保存されている。 本発明のさらなる態様は、他のＦＧＦタンパク質との融合体またはハイブリッ
ド(例えば、ＫＧＦ(ＦＧＦ−７)、bＦＧＦ、aＦＧＦ、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６
等)といったような、ＫＧＦ−２と他のタンパク質またはそのフラグメントとの
融合体である。そのようなハイブリッドは、ＫＧＦ(ＦＧＦ−７)に関して報告さ
れている。公開されたＰＣＴ出願第９０／０８７７１号において、ＫＧＦの最初
の４０のアミノ酸残基およびＦＧＦのＣ末端部分からなるキメラタンパク質が製
造された。そのキメラは、ケラチノサイト様ＫＧＦを標的とすることが報告され
たが、aＦＧＦの特徴であるが、ＫＧＦの特徴ではない、ヘパリンに対する感受
性が欠けていた。免疫グロブリン(ＩgＧ)の定常ドメインの部分との融合体は、
しばしば、インビボにおいて増大された半減期を示す。これは、例えば、哺乳動
物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の様々なドメインと共に、ヒト
ＣＤ−４ポリペプチドの最初の２つのドメインからなるキメラタンパク質に関し
て示された(欧州特許出願公開第３９４，８２７号；Ｔrauneckerら，Ｎature ３
３１：８４−８６（１９８８）)。ジスルフィド結合したダイマー構造を有する
融合タンパク質もまた、モノマー分子を単独で結合するのに、より有効であり得
る(Ｆountoulakisら，Ｊ. of Ｂiochemistry. ２７０：３９５８−３９６４（１
９９５）)。
【０１４５】 本発明の別の融合タンパク質は、遺伝子シャフリング（gene-shuffling）、モ
チーフ−シャフリング、エキソン−シャフリングおよび／またはコドン−シャフ
リング（総じて「ＤＮＡシャフリング」と称する）の手法によって作製すること
ができる。ＤＮＡシャフリングを使用し、本発明のポリペプチドの活性を調整す
ることができ、これは活性が改変されたポリペプチド、ならびに本発明ポリペプ
チドのアゴニストおよびアンタゴニストを作製するのに使用することができる。
一般には、米国特許第５,６０５,７９３号、第５,８１１,２３８号、第８,８３
０,７２１号、および第５,８３７,４５８号、ならびにPattenら、Curr.Opinion
Biotechnol. 8:724-33 (1997); Harayama, Trends Biotechnol. 16(2):76-82(19
98); Hansson et al., J.Mol.Biol. 287:265-76(1999);およびLorenzo and Blas
co, Biotechniques 24(2): 308-13(1998)を参照のこと（これらの特許および文
献は引用によって本明細書に本質的に包含される）。１つの態様では、配列番号
１に対応するポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによってコード
されているポリペプチドの改変はＤＮＡシャフリングによって行うことができる
。ＤＮＡシャフリングは、相同的または部位特異的組換えによる２つまたはそれ
以上のＤＮＡセグメントの組み立てを伴い、これによりポリヌクレオチド配列に
変異が創製される。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドまたはそれによっ
てコードされるポリペプチドは、誤りがちなＰＣＲ（error-prone PCR）、無作
為ヌクレオチド挿入または組換え前の他の方法による無作為突然変異誘発によっ
て改変することができる。また別の態様では、本発明のポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドの１つまたはそれ以上の成分、モチーフ、区域、部分、断片
などを、１つまたはそれ以上の相同分子における１つまたはそれ以上の成分、モ
チーフ、区域、部分、断片などと組換えることができる。
【０１４６】 ＫＨＦ−２の抗原／親水性部分 第４Ａ−４Ｅ図で実証したように、ＫＧＦ−２タンパク質には、４つの主要な
高度に親水性の領域がある。アミノ酸残基 Ｇly４１--Ａsn７１、Ｌys９１--Ｓe
r１０９、Ａsn１３５--Ｔyr１６４、およびＡsn１８１--Ａla１９９［配列番号
２５−２８］。さらなる２つのより短い予想される抗原領域、第１図（配列番号
：２）のＧln７４−Ａrg７８、および第１図（配列番号：２）のＧln１７０−Ｇ
ln１７５がある。親水性部分は、主にタンパク質の外側(表面)にあり、従って、
これらの領域を認識する抗体に利用できることが知られている。それらの領域は
また、ＫＧＦ−２の、その受容体への結合にも関与するらしい。これらの領域か
ら得られる合成ペプチドは、ＫＧＦ−２の、その受容体への結合を妨げ、従って
、そのタンパク質の機能をブロックすることができる。そのタンパク質の親水性
部分から得られる合成ペプチドもまたアゴニスト的であり得る、すなわち、ＫＧ
Ｆ−２の機能を模倣し得る。 従って、本発明はさらに、ＫＧＦ−２の親水性領域を含んでなる、単離された
ポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の先に記載したＫ
ＧＦ−２親水性領域を含んでなり、長さが１５０以下のアミノ酸、好ましくは、
長さが１００以下、７５以下、または５０以下のアミノ酸である。
【０１４７】 ＫＧＦ−２のエピトープ結合タンパク質 別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープを含む部分を含
有するペプチドおよびポリペプチドを提供する。このエピトープは本発明のポリ
ペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」と
は、本発明のポリペプチド全体またはその断片が免疫原の場合に、インビボにお
いて抗体応答を惹起するタンパク質の部分と定義される。他方、抗体が結合でき
るポリペプチドにおける領域は「抗原決定基」または「抗原性エピトープ」と定
義される。タンパク質のインビボ免疫原性エピトープの数は抗原性エピトープの
数よりも少ないのが一般である。例えば、Geysen, et al., Proc.Natl.Acad.Sci
. USA 81:3998-4002(1983)を参照のこと。しかし、抗原性エピトープに対しては
、それが免疫原性エピトープであろうとなかろうと、ファージディスプレイ法な
どの方法によって抗体を作製することができる。例えば、Petersen G. et al.,
Mol.Gen.Genet.249:425-431(1995)。従って、免疫原性エピトープおよび抗原性
エピトープの両者とも本発明に包含される。
【０１４８】 免疫原性エピトープを含有するアミノ酸配列を以下の表１に例示する。表１に
は、Jameson and Wolf, (1988) Comp.Appl.Biosci. 4:181-186（これは引用によ
って本明細書に本質的に包含される）のアルゴリズムを用いて抗原性が最も高い
と予測されたエピトープを含むアミノ酸残基しかリストしていない点に留意すべ
きである。Jameson and Wolfの抗原性分析は、デフォルトパラメーター（マッキ
ントッシュ用Version 3.11 DNASTAR, Inc., 1228 South Park Street Madion, W
I）によるＰＲＯＴＥＡＮコンピュータープログラムを用いて行った。表１およ
び表１に挙げられていないポリペプチドの部分は非免疫原性と考えられない。表
１以外の他の免疫原性エピトープはここに使用した具体的アルゴリズムによって
認識されなかったに過ぎないことがあるため、表１の免疫原性エピトープは、例
示的リストであり、網羅的なものではない。他の免疫原性エピトープを含有する
アミノ酸残基は通常、Jameson and Wolf分析と同様のアルゴリズムを使用して、
または当業者に既知の方法による抗原性応答のインビボ試験によって、決定する
ことができる。例えば、Geysen at al., 前掲：米国特許第４，７０８，７８１
号；第５，１９４，３９２号、４、４３３，０９２号および第５，４８０，９７
１号を参照のこと（これらの文献は引用によって本明細書に本質的に包含される
）。
【０１４９】 抗原性エピトープを保持する本発明のペプチドおよびポリペプチドは好ましく
は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる少なくとも７つのアミノ
酸、より好ましくは少なくとも９つのアミノ酸、最も好ましくは約１５から約３
０のアミノ酸の配列を含有する。ＫＧＦ−２特異的抗体に対して使用することが
できる抗原性ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸残基におけるおよそ
Ｇｌｙ４１−Ａｓｎ７１；Ｌｙｓ９１−Ｓｅｒ１０９；Ａｓｎ１３５−Ｔｙｒ１
６４；Ａｓｎ１８１−Ａｌａ１９９；Ｇｌｎ７４−Ａｒｇ７８；またはＧｌｎ１
７０−Ｇｌｎ１７５を含有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定され
ない。これらのポリペプチド断片についてJameson and Wolf抗原性インデックス
の分析によって、ＫＧＦ−２タンパク質の抗原性エピトープを保持しているかを
決定し、それを上記表４に示している。
【０１５０】 表１のアミノ酸配列は免疫原性エピトープを含有している点に特に留意すべき
である。表１には、Jameson and Wolf分析によって決定された免疫原性エピトー
プの重要な残基しかリストしていない。従って、Ｎ末端、Ｃ末端またはそれら両
末端およびＣ末端に付加的なフランキング残基を表１の配列に付加することで、
本発明のエピトープ保持ポリペプチドを作製することができる。従って、表１の
免疫原性エピトープには、付加的なＮ末端またはＣ末端アミノ酸残基を含むこと
ができる。付加的なフランキングアミノ酸残基は、本発明のポリペプチド由来の
連続するフランキングＮ末端および／またはＣ末端配列、異種ポリペプチドであ
ってよく、あるいは本発明のポリペプチドおよび異種ポリペプチド配列由来の両
方の連続フランキング配列を含むことができる。免疫原性または抗原性エピトー
プを含む本発明のポリペプチドの長さは少なくとも７つのアミノ酸残基である。
「少なくとも」とは、免疫原性または抗原性エピトープを含む本発明のポリペプ
チドが長さで７アミノ酸残基であり、７アミノ酸と本発明の完全長ポリペプチド
のアミノ酸残基数との間に何らかの整数があり得ることを意味する。免疫原性ま
たは抗原性エピトープを含む好ましいポリペプチドは長さで、１０、１５、２０
、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０
、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基である。しかし、７と完全長ポリ
ペプチドのアミノ酸残基数との間の整数それぞれまたはそのすべては本発明に含
まれることに留意すべきである。
【０１５１】 免疫および抗原性エピトープを保持する断片は、前記の連続アミノ残基の数に
よって特定でき、あるいは配列番号２のアミノ酸配列におけるこれら断片のＮ末
端およびＣ末端の位置によってさらに特定できる。例えば少なくとも７つまたは
少なくとも１５の長さの連続したアミノ酸残基の断片が配列番号２のアミノ酸配
列を占めることのできるＮ末端およびＣ末端位置のすべての組合わせは本発明に
包含される。繰り返すが、「少なくとも７つの連続アミノ酸残基の長さ」とは、
長さで７アミノ酸残基であり、または７アミノ酸と本発明の完全長ポリペプチド
のアミノ酸残基数との間における整数を意味する。具体的には、７と完全長ポリ
ペプチドのアミノ酸残基数との間におけるそれぞれおよびそのすべての整数は本
発明に含まれる。
【０１５２】 本発明の免疫原性および抗原性エピトープを保持するポリペプチドは例えば、
本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を作製するのに、および本発明の
ポリペプチドを検出するための免疫検定法に有用である。この抗体は例えば、本
発明ポリペプチドのアフィニティー精製に有用である。この抗体はまた、当業者
に既知の方法を用いる、具体的には本発明のポリペプチドに対する種々の定量的
または定性的免疫検定に通常用いられる。例えば、Harlow et al., Antibodies:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2nd Ed, Cold
Spring Harbor, NY (1988)。
【０１５３】 本発明のエピトープ保持ポリペプチドは、当業者に既知の合成および組換え法
などのポリペプチドを作製するための通常の手段によって調製することができる
。例えば、エピトープ保持ペプチドは化学合成の既知の方法によって合成するこ
とができる。例えば、Houghtenは、そのすべてが４週間足らずで調製され特性化
（ＥＬＩＳＡ型結合試験によって）された、ＨＡ１ポリペプチドのセグメントに
おける単一のアミノ酸変異体である、２４８個の別個の１３残基ポリペプチド１
０−２０ｍｇなどの多くの数のペプチドを合成する単純な方法が記載されている
（Houghten, R.A., Proc Natl Acad Sci USA, 82:5131-5135(1985)）。この「同
時多重ペプチド合成（PMPS）」方法は、Houghtenらの米国特許第４，６３１，２
１１号にさらに説明されている。この手法では、種々のペプチドを固相合成する
ための個々の樹脂は、別個の溶媒−浸透性のパケットに入れ、固相法に関連する
多くの同一の繰返し工程を最適に使用できるようにする。完全な手作業により、
５００−１０００またはそれ以上の合成を同時に行うことができる（Houghten e
t al. (1985)Proc Natl Acad Sci USA, 82:5131-5135 の5134）。
【０１５４】 本発明のエピトープ保持ポリペプチドは、インビボ免疫、インビトロ免疫およ
びファージディスプレイ法など（これらに限定されない）の当業者に周知の方法
によって抗体を惹起させるのに使用できる。例えば、Sutcliffeら、前掲；Wilso
n et al.,前掲、およびBittle et al., J.Gen.Virol., 66:2347-2354(1985)を参
照。インビボ免疫を使用する場合、動物は遊離のペプチドで免疫することができ
る、しかし、抗−ペプチド抗体力価は、ペプチドを高分子担体、例えばキーホー
ルリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイドと結合させること
により増強することができる。例えば、システイン残基を含有するペプチドは、
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）
などのリンカーを使用して担体と結合でき、同時に他のペプチドはグルタルアル
デヒドなどのより一般的な結合剤を用いて担体と結合できる。ウサギ、ラットお
よびマウスなどの動物を遊離または担体結合ペプチドで免疫するには、例えばペ
プチドまたは担体タンパク質約１００μｇおよびフロイントのアジュバントまた
は免疫応答を刺激すると知られている他のアジュバントを含有するエマルジョン
を腹腔内および／または皮下注射する。例えば固相表面に吸着された遊離ペプチ
ドを使用するＥＬＩＳＡ検定によって検出できる抗−ペプチド抗体の有用な力価
を得るには、例えば約２週間隔の幾つかのブースター注射が必要な場合がある。
免疫した動物由来の血清中における抗−ペプチド抗体の力価は、抗−ペプチド抗
体を選別、例えば固相に対するペプチドへ吸着させ周知の方法により選択した抗
体を溶出させることにより増強することができる。
【０１５５】 当業者であれば理解できようが、上述のように、免疫原性または抗原性エピト
ープを含有する本発明のポリペプチドは他のポリペプチド配列と融合させること
ができる。例えば、本発明のポリペプチドは免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、
ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはその部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３また
はあらゆるそれらの組合わせおよびそれらの部分）と融合し、キメラポリペプチ
ドを作製することができる。このような融合タンパク質により精製が容易になり
、インビボ半減期を増大させることができる。これは、ヒトＣＤ４−ポリペプチ
ドの最初の２つのドメインおよび哺乳類免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常
領域の種々のドメインから構成されるキメラタンパク質を示すものである。例え
ば、ＥＰ３９４，８２７；Traunecker et al., Nature, 331:84-86(1988)を参照
のこと。免疫系に対する上皮バリアーを越えて抗原供与が増大されることがＦｃ
Ｒｎ結合パートナー、例えばＩｇＧまたはＦｃ断片と結合させた抗原（例えばイ
ンスリン）について証明されている（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２２０２４
およびＷＯ９９／０４８１３を参照のこと）。ＩｇＧ部分のジスルフィド結合の
おかげてジスルフィド結合した二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質も、単
量体ポリペプチドまたはその断片単独よりも他の分子と結合し中和する能力が優
れていることも見出されている。例えば、Fountoulakis et al.l, J.Biochem.,
270:3958-3964(1995)。上記のエピトープをコードする核酸も、エピトープタグ
（例えば、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグまたはフラッグタグ）として目的遺伝子
と組換えれば、発現されたポリペプチドの検出と精製の便に供することができる
。例えば、Janknecht et al.が開示している系によれば、ヒト細胞株にて発現さ
れた非変性融合タンパク質を容易に精製することができる（Janknecht et al.,
1991, Proc Natl Acad Sci USA, 88:8972-897）。この系では、目的遺伝子をワ
クシニア組換えプラスミドにサブクローンし、遺伝子の読取り枠を、６つのヒス
チジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳可能に融合させる。このタグは融合タ
ンパク質のマトリックス結合ドメインとして役立つ。組換えワクシニアウイルス
で感染した細胞由来のエキスをＮｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラムに付し
、ヒスチジンをタグ化したタンパク質を、イミダゾール含有緩衝液とともに選択
的に溶出することができる。
【０１５６】 化学的修飾 普通、タンパク質の部分ではない付加的化学部分を含むよう、ＫＧＦの野生型
およびアナログをさらに修飾することができる。それらの誘導体化部分は、その
タンパク質の溶解性、生物学的半減期、または吸収を改善し得る。その部分はま
た、タンパク質等の所望の副作用のいずれかを減少させる、または排除すること
もできる。それらの部分に関する概要は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡ
ＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１８版，Ｍack Ｐublishing Ｃo. ，Ｅ
aston，ＰＡ（１９９０）に見出すことができる。ポリエチレングリコール(ＰＥ
Ｇ)は、治療用タンパク質の製造に使用されている、そのような化学部分の１つ
である。タンパク質へのＰＥＧの結合は、タンパク質分解に対して保護すること
が示された(Ｓadaら，Ｊ. Ｆermentaiton Ｂioengineering ７１：１３７−１３
９（１９９１）)。あるＰＥＧ部分の結合には、様々な方法を利用できる。レビ
ューのためには、Ａbuchowskiら，Ｅnzymes as Ｄrugs(ＨoucerbergおよびＲobe
rt編)３６７−３８３（１９８１）を参照。多くの公開された特許は、ＰＥＧの
誘導体、およびそれらを製造する方法を記載している(例えば、Ｏnoら，米国特
許第５,３４２,９４０号；Ｎiteckiら，米国特許第５,０８９,２６１号；Ｄelga
doら，米国特許第５,３４９,０５２号)。一般に、タンパク質上に見出される反
応性基によって、ＰＥＧ分子をタンパク質に結合させる。なかでも、例えば、タ
ンパク質のリジンまたはアミノ末端上のアミノ基が、この結合に便利である。 「ポリペプチドおよびペプチド」に関して、この節で引用した各々の文献の全
体の開示は、本明細書の一部を構成する。
【０１５７】 更に、本発明のポリペプタイドは公知の常法（例えば、Creighton, 1983, Pro
teins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y. 及
びHunkapiller et al., Nature, 310:105-111 (1984)参照）に従い化学的に合成
できる。例えば、ＫＧＦ−２ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドはペプ
チド合成機で合成できる。更に、所望なら、非古典的アミノ酸または化学合成ア
ミノ酸同族体をＫＧＦ−２ポリペプチドに置換基または付加物として、導入でき
る。非古典的アミノ酸には、特に制限はないが、通常のアミノ酸のＤ体、２，４
−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪
酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサノイック酸、Ａｉｂ、２−アミ
ノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン
、ヒドロキシプロリン、ザルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、シスチン酸
、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシ
ルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、ｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メ
チルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸の如き合成アミノ酸、一般のアミノ酸アナ
ログが含まれる。更にアミノ酸はＤ体、Ｌ体でありうる。
【０１５８】 本発明は、翻訳中または翻訳後に特異的に修飾、例えばグリコシル化、アセチ
ル化、ホスホリル化、アミド化、公知の保護基による誘導体化、蛋白分解的開裂
、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合などにより、修飾されるＫＧＦ−２
ポリペプチドを含む。いかなる種々の化学的修飾も公知の方法で実施される。特
に限定されないが、シアノゲンブロマイド、トリプシン、キモトリプシン、パパ
イン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的開裂、アセチル化、ホ
ルミル化、酸化、還元、ツニカマイシン存在下の代謝的合成などを含む。 本発明に含まれる付加的翻訳後の修飾は、例えば、ＮまたはＯに結合した炭化
水素鎖、Ｎ−末またはＣ−末のプロセス化、アミノ酸本体への化学モイエテイ（
moiety）の付加、ＮまたはＣに結合した炭化水素鎖の化学的修飾、原核性宿主細
胞の発現の結果としてのＮ末メチオニン残基の付加あるいは欠失を含む。該ポリ
ペプチドは、該蛋白の検出や分離が可能なように、例えば酵素的、蛍光的、同位
体またはアフィニテー標識のような検出可能な標識で修飾することもまた可能で
ある。
【０１５９】 本発明はまた、該ペプチドの増加した水溶性、安定性、循環時間、あるいは減
少した免疫原性のような更なる利点を提供する本発明の化学的に修飾されたポリ
ペプチドの誘導体を提供する（USPatent 4179337参照)。誘導される化学的モエ
テイ(moiety)はポリエチレングリコール、エチレングリコール/プロピレングリ
コール コポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニル
アルコールなどのような水溶性ポリマーから選ばれる。該ペプチドは分子内の任
意の位置で、あるいは予め決めた位置で修飾していてもよく、そして１−３ある
いはそれ以上の結合した化学的モエテイを含んでいてもよい。 該ポリマーの分子量は制限はなく、該ポリマーは分枝でも非分枝でもよい。ポ
リエチレングリコールに関しては、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造が容
易なのは、約１ｋＤａと１００ｋＤａの間である（約とは、ポリエチレングリコ
ールの場合、表示の分子量より、いくらかは多く、いくらかは少ないことを意味
する。）。他のサイズのものも所望の治療面に応じ使用される（例えば、所望の
持続時間、あれば生物活性の効果、取り扱いやすさ、抗原性の程度および欠徐、
治療用蛋白あるいはアナログに対するポリエチレングリコールの他の公知の効果
）。
【０１６０】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的モイエテイ）は、該蛋白の機
能的、抗原的ドメイン上の効果を考慮して、該蛋白に結合させるべきである。当
業者が利用できる沢山の結合方法がある。例えば、ここでreference として合体
するＥＰ ０４０１３８４（Ｇ−ＣＳＦへのＰＥＧの結合）、またMalik et al.
, Exp. Hematol. 20:1028-1035(1992)( tresyl chloride を用いた ＧＭ−ＣＳ
Ｆの peg 化 を報告している。）。例えば、ポリエチレングリコールは、例えば
遊離アミノ基またはカルボキシ基のような反応基を介してアミノ酸残基と共有結
合的に結合しうる。反応基は活性化ポリエチレングリコール分子が結合し得る基
である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基は、リジン残基残基およびＮ末ア
ミノ基残基を含んでいてもよい；遊離のカルボキシ基を有するこれらはアスパラ
ギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末アミノ酸残基を含んでいてもよい。ス
ルフヒドリル基は、またポリエチレングリコール分子を結合させる反応基として
使用してもよい。Ｎ末やリジン基への結合のようなアミノ基への結合は治療目的
的に好ましい。 特にＮ末において、化学的に修飾された蛋白が望まれる。本組成物の具体例と
して、ポリエチレングリコールを用いて、種々のポリエチレングリコール分子（
分子量、分枝など）から、反応混合物における蛋白（ポリペプチド）分子とポリ
エチレングリコールの割合、実施されるpeg 化反応のタイプ、および選択された
Ｎ末のpeg 化蛋白の取得方法を選択することができる。Ｎ末端peg 化製品を得る
方法は（即ち、必要なら他のmonopeg 化モエテイからこのモエテイを分離するこ
と）pegyl 化蛋白の群からＮ末端peg 化物を精製する方法である。Ｎ末端修飾で
化学的に修飾された選択された蛋白は、特定蛋白の誘導化に利用される一級アミ
ノ基（リジン対そのＮ末端）の異なったタイプの特異的な反応性を利用する還元
的アルキル化で実施してもよい。適当な反応条件下、ポリマーを含むカルボニル
基で、Ｎ末での蛋白の実質的選択的誘導化が実施される。
【０１６１】 抗体 本発明の更なるペプチドは、ポリペプチド、ペプチド断片、またはＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ２の変異体、および/またはエピトープと免疫特異的に結合する、本発
明の抗体およびＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）（特異的抗原−抗体結合アッセイの
ための当業者に公知のイミュノアッセイで決定されるように）に関する。本発明
の抗体は、特に制限されないが、ポリクロナール、モノクロナール、多種特異性
（maltispecific)、ヒト、ヒト化、もしくはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片
、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーで作製された断片、抗イデオタイ
プ抗体（anti-Id) （例えば、本発明の抗体に対するanti-Id 抗体）および上記
のエピトープ結合断片を含む。ここに使用される”抗体”は免疫グロブリン分子
で、免疫グロブリン分子の免疫学的活性蛋白、即ち、免疫学的に抗原と結合する
抗原結合サイトを有する分子である。本発明の免疫グロブリン分子は免疫グロブ
リン分子のいかなるタイプ（例えば、IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, IgY) 、免疫グ
ロブリンのクラス（例えば、IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2)、またはそ
のサブクラスでありうる。
【０１６２】 最も好ましい抗体は、本発明のヒト抗原−結合抗体断片であり、そして特に限
定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ
）、単鎖抗体、ダイサルファイド−結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）およびＶＬかＶＨド
メインのいずれかを含む断片を含む。単鎖抗体を含む抗原−結合抗体断片は、可
変部だけか、以下の全部または部分；ヒンジ部、ＣＨ１，ＣＨ２，ＣＨ３部,
との組合せを含んでいてよい。また、本発明には、可変部とヒンジ部、ＣＨ１、
Ｃｈ２、およびＣＨ３部とのいかなる組合せをも含む抗原−結合抗体断片が含ま
れる。本発明の抗体は、鳥、哺乳動物を含むいかなる動物由来のものでもよい。
好ましい抗体は、ヒト、ネズミ（マウス、ラット）、ろば、ship rabbit 、やぎ
、モルモット、ラクダ、馬、鶏である。ここで使用する”ヒト”抗体には、ヒト
免疫グロブリンのノアミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリ
ン ライブラリーからか、あるいは、Kucherlapati et al のU S Patent 593959
8 の実施例に記載されているように、１つ以上のヒトイ免疫グロブリンためのト
ランスジェニックアニマルからで、かつ内因性免疫グロブリンを発現しないアニ
マルから抽出された抗体を含む。
【０１６３】 本発明の抗体は、monospecific, bispecific, trispecific またはより大きな
multispecificity でもよい。多特異性抗体は、本発明のポリペプチドの異なっ
たエピトープに特異的でもよく、あるいはheterologous ポリペプチドまたは個
体支持物質のような、heterologous エピトープのためのみならず、本発明のペ
プチドのために、特異的であってもよい。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ 93/17715;
ＷＯ 92/08802;ＷＯ 91/00360; ＷＯ 92/05793; Tutt, et al., J. Immunol.
147:60-69 (1991); U S Patent No. 4474893; 4714681; 4925648; 5573920; 56
01819; Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). 本発明の抗体はそれらが認識し、あるいは特異的に結合する本発明のポリペプ
チドのエピトープまたは部位（portion) の用語 で記載、特定される。このエピ
トープまたはポリペプチド部位（portion)は、以下に記載のように、特定されて
もよい。例えば、Ｎ末およびＣ末部位、連続したアミノ酸残基におけるサイズ、
または表及び図に掲げたものによって。本発明の好ましいエピトープは、ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ２のアミノ酸４１−７１、９１−１０９、１３５−１６４、１８１
−１９９、７４−７８、および１７０−１７５およびこれらのエピトープをコー
ドするポチペプチドを含む。本発明のいかなるエピトープまたはポリペプチドと
特異的に結合する抗体もまた含まれる。従って、本発明は本発明のペプチドと特
異的に結合する抗体を含み、そして同じものの除外も許す。
【０１６４】 本発明の抗体は、それらの交差反応性の用語で、また記載、特定されていても
よい。本発明のポリペプチドの他の同族体、orthorog 、または類似体と結合し
ない抗体が含まれる。本発明のペプチドに、少なくとも、９５％、９０％、８５
％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％および５０％でポリペプ
チドと結合する（常法およびここに記載の方法で計算して）抗体もまた、本発明
に含まれる。具体的例において、本発明の抗体は、ヒト蛋白のネズミ、ラット、
および/またはウサギ類似体およびその対応するエピトープと交差反応する。本
発明のポリペプチドに対し９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、
７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下および５０％以
下（常法およびここに記載の方法で計算して）で、ポリペプチドと結合しない抗
体は、また本発明に含まれる。具体的例において、上記の交差反応性は、single
specific 抗原性または免疫原性ポリペプチド、またはここに開示の２，３，４
，５またはそれ以上の特異抗原性または免疫原性ポリペプチドの組合せに関する
。更に本発明には、強いハイブリダイゼーション（stringent hybridization）
条件下（ここに述べるように）、本発明のポリペプチドにハイブリダイズするポ
リペプチドでコードされているポリペプチドに結合する抗体である。本発明の抗
体はそれらの本発明のポリペプチドへの結合アフィニテーの用語(term)で記載ま
たは特定してもよい。好ましい結合アフィニテーは、以下の値以下の解離常数
またはＫｄのものを含む。 5X10-2M, 10-2M, 5X10-3M, 10-3M, 5X10-4M, 10-4M, 5X10-5M, 10-5M, 5X10-6M,
10-6M, 5X10-7M, 107M, 5X10-8M, 10-8M, 5X10-9M, 10-9M, 5X10-10M, 10-10M,
5X10-11M, 10-11M, 5X10-12M, 10-12M, 5X10-13M, 10-13M, 5X10-14M, 10-14M,
5X10-15M, または 10-15M。
【０１６５】 例えば、ここで記載のイミュノアッセイのような競合的結合の決定に関する公
知の常法で決定されるような、本発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的
に阻止する抗体も提供する。好ましい具体例では、抗体は、少なくとも、９５％
、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％および５
０％でエピトープに結合することを阻止する。 本発明の抗体は、特に限定されないが、インビトロおよびインビボの診断的、
治療的方法の両方を含む本発明のポリペプチドを精製、検出、標的とする公知の
常法を含む用途（use) を有する。例えば、抗体は生物学的試料の本発明のポリ
ペプチドのレベルの定性的、定量的測定のためのイミュノアッセイに使用される
。例えば、Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Ha
rber Labaratory Press, 2nd ed. 1988)(全文がreference として合体される）
を参照。
【０１６６】 本発明の抗体は単独あるいは他の組成物と組み合わせて使用されてよい。抗体
は、更にＮ末またはＣ末でヘテロポリペプチドに組換え的に融合させるか、ポリ
ペプチドまたは他の組成物に化学的に結合（共有的、非共有的結合を含む）させ
てもよい。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイの標識として、そしてhetero
logous polypeptide 、薬剤、トキシンのようなエフェクター分子（effector mo
lecules） として使用し得る分子に組換え的に融合、結合されてもよい。ＷＯ
92/08495;ＷＯ 91/14438; ＷＯ 89/12624; US Patent 5314995; EP 0396387。 本発明の抗体は適当な公知の常法で製造しうる。例えば、本発明のポリペプチ
ドまたはその抗原的断片をポリクロナール抗体を含む血清の産生を誘導するため
に、動物に投与される。用語”ポリクロナール抗体”は。ハイブリドーマ技術に
より産生される抗体に限定されない。用語”モノクロナール抗体”は、原核性、
真核性、ファージ クローンを含む単一クローンから誘導された抗体で、それが
製造された方法に関係ない。モノクロナール抗体はハイブリドーマ、組換え体、
およびファージ 展示（display） 技術の使用を含む種々の公知の技術を使用し
て製造できる。
【０１６７】 ハイブリドーマ技術は、次の公知の技術を含む；Harlow et al., ANTIBODIES:
A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbour Laboratory Press, ２nd ed. 198
8); Hammerling, et al., in: MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS
563-681(Elsevier, N.Y., 1981)(このreferences 全文はreference として合体
される。）。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片はパパイン（Ｆａｂ断片製造用）
やペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片製造用）のような酵素を用いて、酵素的開裂で
製造してもよい。 代わりに、本発明の抗体は組換え体ＤＮＡと蛋白展示ファージ（phage displa
y） 技術を適用するか、あるいは公知の合成化学によって製造しうる。例えば、
本発明の抗体は、公知の種々のファージ展示（phage display） 技術を用いて製
造できる。ファージ展示（phage display） 技術では、機能的抗体ドメインはそ
れらをコードするポリ核酸配列を運ぶファージの表面に展示される。所望の結合
性質を有するファージは、repaertoire またはコンビンナトリアル 抗体ライブ
ラリー（ヒトまたはネズミの）から、直接抗原、典型的には、個体表面またはビ
ーズに結合、捕捉された抗原で選択することにより、選択される。これらの方法
で使用されるファージは典型的には、フィラメント状ファージで、ファージ ジ
ーンＩＩＩまたはファージ ジーンＶＩＩＩ蛋白のどちらかに組換え的に融合し
た、Ｆａｂ、Ｆｖまたはダイサルファイドで安定化されたＦｖ抗体ドメイン付き
Ｍ１３、およびｆｄを含む。本発明の抗体を作製するために使用されるうるファ
ージ展示（phage display）法の例は、以下に開示されている；Brinkman U. et
al. (1995) J. Immunol. Methods 182-41-50; Ames, R.S. et al. (1995) J. Im
munol. Methods 184:177-186; Kettleborough, C.A. et al. (1994) Eur. J. Im
munol. 24:952-958; Persic, L. et al. (1997) Gene 187:9-18; Burton, D.R.
et al. (1994) Advances in Immunology 57:191-280; PCT/GB91/01134;ＷＯ 90
/02809;ＷＯ 91/10737; ＷＯ 92/01047; ＷＯ 92/18619;ＷＯ 93/11236; Ｗ
Ｏ 95/15982;ＷＯ 95/20401; US Patent 5698426; 5223409; 5403484; 558071
7; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 565872
7; 5733743 (これらの文献全体はここに合体される。）
【０１６８】 上記文献に記載されているように、ファージ選択の後に、そのファージからの
抗体コーデング領域が抽出され、ヒト抗体、他の所望の抗原結合断片を含む全抗
体を作成するために使用され、そして哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、
バクテリアを含む所望の宿主で発現される。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ
（ａｂ’）２断片を組換え的に製造される技術は、以下に記載の公知の方法を採
用することができる；ＷＯ 92/22324; Mullinax, R.L. et al.(1992) Bio Tech
niques 12(6):864-869; Sawai, H. et al. (1995) AJRI 34:26-34; Better, M.
et al. (1988) Science 240:1041-1043 (これらの文献全体はここに合体される
。）。
【０１６９】 単鎖Ｆｖｓおよび抗体製造のために使用される技術の例は、以下に記載の技術
を含む；U S Patent 4946778; 5258498; Huston et al. (1991) Methods in Enz
ymology 203:46-88; Shu, et al. (1993) PNAS 90:7995-7999; Skerra, A et al
. (1988) Science 240:1038-1040。ヒトでの抗体のインビボでの使用、インビト
ロでの検出検定を含むいくつかの使用に関して、キメラ、ヒト化あるいはヒト抗
体を使用することが望ましい。キメラ抗体の製造方法は、当業者に公知である。
例えば、Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., Bio Techniques 4:2
14 (1986); Gilles, S.D. et al (1989) J.Immunol. Methods 125:191-202; U S
Patent 5807715 参照。抗体は、ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ（ＥＰ0239400; WO
91/09967; U S Patent 5530101; 5585089)、veneering またはresurfacing (EP
0592106; 0519596; Padlan E.A.,(1991) Molecular Immunology 28(4/5):489-49
8; Studnicka G.M. et al. (1994) Protein Engineering 7(6): 805-814; Rogus
ka M. A. et al. (1994) PNAS 91:969-973) および chain shuffling (U S Pate
nt 5565332)を含む種々の技術を用いてヒト化され得る。ヒト抗体は、上記のpha
ge display 法を含む種々の公知の方法で製造し得る。U S Patent 4444887; 471
6111; 5545806; 5814318; ＷＯ 98/46645;ＷＯ 98/50433;ＷＯ 98/24893; Ｗ
Ｏ 98/16654;ＷＯ 96/34096; ;ＷＯ 96/33735; ;ＷＯ 91/10741(これらの文
献全体はここに合体される。）参照。
【０１７０】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用しうる。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドで、部分的か全体的
のいずれかで、レセプター/リガンドの相互作用を崩壊する抗体を含む。好まし
くは、本発明の抗体はここに開示の抗原性エピトープ、あるいはその一部に結合
する。本発明は、またレセプター特異的抗体とリガンド特異的抗体の双方を特徴
づける。本発明は、またリガンド結合を阻害しないがレセプター活性を阻害する
レセプター特異的抗体を特徴づける。レセプター活性化（シグナル化）は、ここ
に記載の技術、あるいは公知の技術で決定されうる。例えば、レセプター活性化
は、レセプターまたはその基質の免疫沈澱法によるホスホリル化（例えば、チロ
シンまたはセリン/スレオニン）、続いてのウエスタン ブロット分析により検
出することにより決定されうる。具体的には、リガンド活性あるいはレセプター
活性を、抗体の非存在下、その活性の少なくとも、９５％、９０％、８５％、８
０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％および５０％で、阻害する抗体
が提供される。
【０１７１】 本発明は、またレセプター−リガンド複合体を認識し、そして好ましくは、非
結合レセプターや非結合リガンドを特異的には認識しない抗体のみならず、リガ
ンド結合とレセプター活性化を共に阻害するレセプター−特異的抗体を特徴づけ
る。同様に、本発明には、リガンドに結合し、それによりレセプター活性を阻害
するが、しかしレセプターに結合することからリガンドを阻害しない抗体のみな
らず、リガンドと結合し、レセプターへのリガンドの結合を阻止する中性化した
抗体を含む。更に、本発明には、レセプターを活性する抗体が含まれる。これら
の抗体は、レセプターアゴニストとして作用してもよい。即ち、例えばレセプタ
ーの二量化（dimerization） を含むことによって、リガンド起因レセプター活
性化の生物学的活性の全てか、あるいはサブセットのいずれかを増強あるいは活
性化すること。抗体は、ここに記載の本発明のペプチドの特異的生物活性からな
る生物活性のアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストとして、特定して
もよい。上記の抗体アゴニストは公知の方法で製造し得る。 PCT publication WO 96/40281; U.S. Patent No. 5,811,097; Deng et al.,Bloo
d 92 (6):1981-1988 (1998); Chen et al., Cancer Res.58 (16):3668-3678 (19
98); Harrop et al., J. Immunol. 161 (4): 1786-1794(1998); Zhu et al., Ca
nser Res. 58 (15): 3209-3214 (1998); Yoon et al., J. Immunol. 160 (7): 3
170-3179 (1998); Prat et al., J. Cell. Sci. 111 (Pt2):237-247 (1998); Pi
tard et al., Immunol. Methods 205 (2): 177-190 (1997); Liautard et al.,
Cytokine 9 (4): 233-241 (1997); Carlson et al., J. Biol. Chem. 272 (17):
11295-11301 (1997); Taryman et al., Neuron 14 (4): 755-762 (1995); Mull
er et al., Structure 6 (9): 1153-1167 (1998); Bartunek et al., Cytokine
8 (1):14-20 (1996)（これらの文献全体はここに合体される。）参照。
【０１７２】 本発明の抗体は、例えば、特に制限されないが、インビトロおよびインビボの
診断的、治療的方法を含む本発明のポリペプチドを精製、検出、標的とするため
にの使用されてもよい。例えば、抗体は生物学的試料の本発明のポリペプチドの
レベルの定性的、定量的測定のためのイミュノアッセイに使用される。例えば、
Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harber Labar
atory Press, 2nd ed. 1988)(全文がreference として合体される）を参照。好
ましい具体例は、KGF-2 のレベルがヤギおよび鶏抗体を用いた精製試料で検出
される（下記実施例５０参照）。
【０１７３】 以下に詳細に述べるようにい、本発明の抗体は、単独でも、他の組成物との組
み合わせでもよい。抗体は、更に組換え的にheterologous ポリペプチドにＮ末
あるいはＣ末で融合するか、ポリペプチドまたは他の組成物に化学的に結合（共
有、非共有的結合を含む）してもよい。例えば、本発明の抗体は組換え的に、検
出アッセイの標識として、そしてheterologous ポリペプチド、薬剤、radionucl
ides 、トキシンのようなエフェクター分子（effector molecules） として有用
な分子に融合または結合されていてよい。例えば、ＰＣＴ公報WO 92/08495; WO
89/12624; U S Patent5314995; EP 396387 参照。
【０１７４】 本発明の抗体は修飾された、即ち共有結合が抗イデオタイプ（antiidiotypic
） 応答を引き起こすことから抗体を阻害しないような抗体に、分子のどのタイ
プの共有結合によって、修飾された誘導体を含む。例えば、特に限定されないが
、抗体誘導体は修飾された、例えばグリコシル化、アセチル化、peg 化、ホスホ
リル化、アミド化、公知の保護基による誘導化、蛋白分解的開裂、細胞リガンド
または蛋白への結合することにより修飾された抗体を含む。いかなる多数の化学
修飾も、公知の技術、特に特定の化学的開裂に限定されないが、アセチル化、ホ
ルミル化、tunicamycin 代謝合成などを含む公知の技術で実施してもよい。更に
、誘導体は１つ以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。 本発明の抗体は、適当な公知の方法で行なってもよい。antigen-of-interest
に対するポリクロナール抗体は種々の公知の方法で製造できる。例えば、本発明
のポリペプチドは、種々の宿主動物、特に限定されないが、ウサギ、マウス、ラ
ットなどに投与され、その抗原に特異性のポリクロナール抗体を含む血清の産生
を誘導する。種々のアジュバントが、宿主種に応じ、免疫応答性を増加させるた
めに使用され得る。それらは特に制限されないが、フロイント(Freund's）（完
全および不完全）、水酸化アルミニウムゲルのようなミネラルゲル、リソロイシ
ン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油懸濁液のような界面
活性剤、keyhole limpet ヘモシアニン、ジニトロフェノールおよびＢＣＧやコ
リネバクテリア パルブムのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含む。そ
の様なアジュバントはまた当業者に公知である。
【０１７５】 モノクロナール抗体は、ハイブリドーマ、組換え体、ファージ展示（phage di
splay） 技術、あるいはそれらの組合せの使用を含む当業界で公知の種々の方法
で作成できる。例えば、モノクロナール抗体は、当業界で公知の技術を含むハイ
ブリドーマ技術を用いて作成できる。そして、例えば次の文献に教授されている
；Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour La
boratory Press, ２nd ed. 1988); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antib
odies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier, N.Y., 1981)(このreferences
全文はreference として合体される。）。ここで使用する”モノクロナール抗
体”の用語はハイブリドーマ技術で生成される抗体に限定されない。”モノクロ
ナール抗体”の用語は、原核性、真核性、ファージ クローンを含む単一クロー
ンから誘導された抗体で、それが製造された方法に関係ない。
【０１７６】 ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体の生成およびスクリーニング方法は、
常法で公知の方法であり、実施例で詳細に議論される。非限定的実施例において
、マウスが本発明のポリペプチドまたはそのようなペプチドを発現している細胞
で免疫される。一度免疫応答が認められると、例えば抗原特異的抗体がマウス血
清に認められると、マウス脾臓を取り出し、脾臓細胞を抽出する。脾臓細胞がつ
いで、公知の方法で融合され、適当なミエローマ細胞、例えばＡＴＣＣから入手
し得る細胞株ＳＰ２０からの細胞が作成される。ハイブリドーマは限定希釈で選
択、クローン化される。ハイブリドーマクローンは、ついで本発明のポリペプチ
ドと結合する能力のある抗体を分泌する細胞に関する、公知の方法でアッセイさ
れる。一般的に高レベルの抗体を含んでいる腹水液は、陽性のハイブリドーマク
ローンでマウスを免疫することによって生成される。
【０１７７】 従って、本発明は、本発明の抗体を分泌しているハイブリドーマ細胞を培養す
ることからなる方法で生成された抗体、その際に好ましくは、そのハイブリドー
マがミエローマ細胞で本発明の抗原で免疫したマウスから分離された脾臓細胞を
融合し、ついで本発明のポリペプチドと結合する能力のある抗体を分泌するハイ
ブリドーマクローンのための融合から生じるハイブリドーマをスクリーニングす
ることにより生成されるが、のみならずモノクロナール抗体の生成方法（method
of genarating) を提供する。 特定のエピトープを認識する抗体断片は、公知の方法で生成されてよい。例え
ば、本発明のＦａｂ、およびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片製造
用）やペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片製造用）のような酵素を用いて、免疫グロ
ブリンの酵素的開裂で製造してもよい。Ｆ（ａｂ’）２断片は可変領域、軽鎖一
定領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１７８】 例えば、本発明の抗体は、公知の種々のファージ展示（phrge display） 法を
使用して生成できる。ファージ展示（phrge display）法では、機能的抗体ドメ
インは、それらをコードしているポリペプチド配列を有するファージ粒子の表面
に展示(display)される。具体例においては、そのようなファージが、repertoir
e またはコンビナトリアル抗体ライブラリー（ヒト、ネズミなど）から発現(exp
ress)される抗原結合ドメイン展示するために利用されうる。目的の抗原に結合
する抗原結合ドメインを発現しているファージは抗原で選択または同定し得る、
例えば標識抗原あるいは個体表面またはビーズに結合、捕捉された抗原を使用す
ることによって。これらの方法で使用されるファージはこれらの方法で使用され
るファージは、典型的にはフィラメント状ファージで、ファージ ジーンＩＩＩ
またはファージ ジーンＶＩＩＩ蛋白のどちらかに組換え的に融合した、Ｆａｂ
、Ｆｖまたはダイサルファイドで安定化されたＦｖ抗体ドメイン付きファージか
ら発現されたドメインに結合するＭ１３、およびｆｄを含む。本発明の抗体を作
製するために使用されるうるファージ展示（phage display）法の例は、以下に
開示されている；Brinkman et al. J. Immunol. Methods 182-41-50(1995); Am
es, R.S. et al. J. Immunol. Methods 184:177-186(1995); Kettleborough, C
.A. et al. Eur. J. Immunol. 24:952-958(1994); Persic, L. et al. Gene 1
87:9-18(1997); Burton, D.R. et al. Advances in Immunology 57:191-280(19
94); PCT/GB91/01134;ＷＯ 90/02809;ＷＯ 91/10737; ＷＯ 92/01047; ＷＯ 92/18619;ＷＯ 93/11236; ＷＯ 95/15982;ＷＯ 95/20401; US Patent 5698
426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427
908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743；5969108 (これらの文献全体はここ
に合体される。）。
【０１７９】 上記引例に記載されるように、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領
域が単離され、ヒト抗体を含めて、全抗体または他の所望の抗原結合フラグメン
トの発生に使用され、例えば以下に詳細に記載されているような、哺乳動物細胞
、昆虫細胞、植物細胞、酵母およびバクテリアなどの所望の宿主で発現され得る
。例えば、Fab、Fab'およびF(ab')2フラグメントを組換製造する技術もPCT 公開
WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12 (6) : 864-869 (1992); Sa
wai et al., AJRI 34 : 26-34 (1995); および Better et al., Science 240: 1
041-1043 (1988)（これらの文献全体を引例としてとり入れる）に記載されるよ
うな公知の方法にて採用される。 一本鎖Fvsおよび抗体の製造に用いうる技術の例としては、米国特許 4,946,77
8 および 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203: 46-88 (199
1); Shu et al., PNAS 90: 7995-7999 (1993); および Skerra et al., Science
240: 1038-1040 (1988)等に記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体の
インビボでの使用およびインビトロでの検出アッセイを含むいくつかの用途には
、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を用いるのが好ましい。キメラ抗体は
、ネズミモノクローナル抗体から導かれる可変領域およびヒト免疫グロブリンの
不変領域を含む抗体のように、その抗体の分子の異なった部位が異種動物種から
導かれる。 キメラ抗体の製法は、例えば、Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et
al., BioTechniques 4: 214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Met
hods 125 : 191-202; 米国特許 5,807,715; 4,816,567; および 4,816397（それ
ら全体を引例としてとり入れる）などに記載され、公知である。 ヒト化抗体は、ヒト以外の動物種からの１以上の相補性決定領域（CDRs）を有
する所望の抗原とヒト免疫グロブリン分子からの枠組み構造領域を結合させたヒ
ト以外の動物種の抗体からの抗体分子である。しばしば、ヒト枠組み構造領域に
おけるフレーム残基はCDRドナー抗体からの対応残基で置換して抗原結合を改変
、好ましくは改良する。これらのフレーム置換は、例えば、CDRとフレーム残基
の相互反応を設計して抗原結合に重要なフレーム残基に合致させ、そして配列を
比較して特定の部位で特異フレーム残基に合せるようにするなどの公知の技法に
より確認される（例えば、Queen et al., 米国特許 5,585,089; Riechmann et a
l., Nature 332: 323 (1988)を参照。これら全体を引例としてとり入れる）。抗
体は、例えば、CDR-グラフティング（EP 239,400; PCT 公開 WO 91/09967; 米国
特許 5,225,539; 5,530,101; および 5,585,089を参照), 化粧張り（veneering
）または再装（resurfacing）(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Im
munology 28 (4/5) : 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineerin
g 7 (6) : 805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91: 969-973 (1994)を参照
), およびチェインシャフリング（chain shuffling）(米国特許 5,565,332を参
照)などの公知の各種の技術を用いてヒト化できる。
【０１８０】 完全にヒト由来の抗体は、ヒト患者の治療には特に望ましい。ヒト抗体の製造
は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いる上記ファージ
ディスプレイ法を含む、当該技術分野で知られた種々の方法により行うことがで
きる。米国特許第４,４４４,８８７号および第４,７１６,１１１号；およびＰＣ
Ｔ公開ＷＯ９８／４６６４５号、ＷＯ９８／５０４３３号、ＷＯ９８／２４８９
３号、ＷＯ９８／１６６５４号、ＷＯ９６／３４０９６号、ＷＯ９６／３３７３
５号、およびＷＯ９１／１０７４１号（これらはそれぞれ引用によりその全体が
本明細書中に包含される）をも参照。
【０１８１】 ヒト抗体はまた、機能性の内生免疫グロブリンを発現することはできないがヒ
ト免疫グロブリン遺伝子は発現できるトランスジェニックマウスを用いて産生で
きる。たとえば、ヒトの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を無作為に
または相同的組換えによりマウス胚幹細胞に導入することができる。あるいは、
ヒトの可変領域、定常領域および多様性（diversity）領域をヒトの重鎖および
軽鎖遺伝子に加えてマウス胚幹細胞に導入することができる。マウスの重鎖およ
び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子
座の導入と独立にまたは同時に非機能性にすることができる。特に、ＪＨ領域の
ホモ接合性の欠失は内生抗体の産生を防ぐ。修飾した胚幹細胞を拡張し、胚盤胞
にマイクロインジェクションしてキメラマウスを得る。ついで、このキメラマウ
スを成育させてヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を得る。このトランスジェ
ニックマウスを選択した抗原、たとえば本発明のポリペプチドの全体または一部
で通常の仕方により免疫する。該抗原に対するモノクローナル抗体は、免疫した
トランスジェニックマウスから通常のハイブリドーマ法を用いて得ることができ
る。トランスジェニックマウスが有するヒト免疫グロブリントランスジーンは、
Ｂ細胞分化の間に再配置し、その後、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受
ける。それゆえ、そのような方法を用いて治療学的に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ
抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体を産生させることが可能である。ヒト抗体を
産生させるためのこの技術の概説としては、LongbergおよびHuszar（1995, Int.
Rev. Immunol. 13: 65-93）を参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を
産生させるためのこの技術の詳細およびそのような抗体を産生させるためのプロ
トコールについては、たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３号；ＷＯ９２
／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６号；ＷＯ９６／３３７３５号；欧州特許第
０ ５９８ ８７７号；米国特許第５,４１３,９２３号；第５,６２５,１２６号；
５,６３３,４２５号；５,５６９,８２５号；５,６６１,０１６号；第５,５４５,
８０６号；第５,８１４,３１８号；第５,８８５,７９３号；５,９１６,７７１号
および第５,９３９,５９８号（これらは引用によりその全内容が包含される）を
参照。さらに、Abgenix, Inc. （フリーモント、カリフォルニア）およびGenPha
rm（サンホセ、カリフォルニア）などの企業は、上記と同様の技術を用いて選択
した抗原に対するヒト抗体を提供すべく予約することができる。
【０１８２】 選択したエピトープを認識する完全にヒト由来の抗体は、「誘導選択（guided
selection）」と呼ばれる技術を用いて生成することができる。このアプローチ
では、選択した非ヒトモノクローナル抗体、たとえばマウス抗体を用い、同エピ
トープを認識する完全にヒト由来の抗体の選択を誘導する（Jespersら、Bio/tec
hnology 12: 899-903 (1988)）。
【０１８３】 さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて、今度は本発明のポリペ
プチドを「模倣する（mimic）」抗イディオタイプ抗体を当業者によく知られた
方法（たとえば、Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5): 437-444 (1989)およびNis
sinoff, J. Immunol. 147(8): 2429-2438 (1991)）を用いて産生できる。たとえ
ば、結合し、ポリペプチドの多量体化（multimerization）および／または本発
明のポリペプチドのリガンドへの結合を競合的に阻害する抗体を、ポリペプチド
の多量体化および／または結合ドメインを「模倣し」、その結果、ポリペプチド
および／またはそのリガンドに結合および中和する抗イディオタイプを産生する
ことができる。そのような中和抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタ
イプのＦａｂフラグメントは、ポリペプチドリガンドを中和する治療計画に用い
ることができる。たとえば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリ
ペプチドを結合し、および／またはそのリガンド／レセプターを結合し、それに
よってその生物学的活性を阻止するのに用いることができる。
【０１８４】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用する抗体に関する。本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴ
ニストとして作用する抗体には、たとえば本発明のポリペプチドとのレセプター
／リガンド相互作用を部分的にかまたは完全に妨害する抗体を含む。たとえば本
発明は、本発明のタンパク質の多量体化能を妨害する抗体を含む。別の例では、
本発明は、本発明のタンパク質抗体の多量体化を可能にするが、本発明のタンパ
ク質が１以上のＫＧＦ−２レセプター（群）／リガンド（群）を結合する能力を
妨害する抗体を含む。さらに別の例では、本発明は、本発明のタンパク質の多量
体化およびＫＧＦ−２レセプター（群）／リガンド（群）との結合を可能にする
が、ＫＧＦ−２／レセプター／リガンド複合体と関連する生物学的活性を阻止す
る抗体を含む。
【０１８５】 本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する抗体
にはまた、レセプター特異的な抗体およびリガンド特異的な抗体の両者が含まれ
る。リガンド結合を妨害しないがレセプターの活性化を妨害するレセプター特異
的な抗体が含まれる。レセプターの活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明
細書に記載されているかまたは当該技術分野で知られた方法により決定できる。
またリガンド結合とレセプター活性化との両者を妨害するレセプター特異的な抗
体が含まれる。同様に、リガンドに結合しリガンドのレセプターへの結合を妨害
する中和抗体、並びにリガンドに結合し、それによってレセプターの活性化を妨
害するが、リガンドのレセプターへの結合は妨害しない抗体が含まれる。さらに
レセプターを活性化する抗体が含まれる。これら抗体は、リガンドによって媒介
されるレセプター活性化に影響される生物学的活性の全体かまたは一部に関する
アゴニストとして作用し得る。 抗体は、本明細書に開示される特定の活性を含む生物学的活性に対するアゴニ
ストまたはアンタゴニストとして特定できる。上記抗体アゴニストは、当該技術
分野で知られた方法を用いて調製できる。たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０
２８１；米国特許第５,８１１,０９７号；Deng, B. ら、Blood 92(6): 1981-198
8 (1998)；Chen, Z. ら、Cancer Res. 58(16): 3668-3678 (1998)；Harrop, J.A
. ら、J. Immunol. 161(4): 1786-1794 (1998)；Zhu, Z. ら、Cancer Res. 58(1
5): 3209-3214 (1998)；Yoon, D.Y. ら、J. Immunol. 160(7): 3170-3179 (1998
)；Prat, M. ら、J. Cell. Sci. 111(Pt2): 237-247 (1998)；Pitard, V. ら、J
. Immunol. Methods 205(2): 177-190 (1997)；Liautard, J. ら、Cytokine 9(4
): 233-241 (1997)；Carlson, N.G. ら、J. Biol. Chem. 272(17): 11295-11301
(1997)；Taryman, R.E. ら、Neuron 14(4): 755-762 (1995)；Muller, Y.A. ら
、Structure 6(9): 1153-1167 (1998)；Bartunek, P. ら、Cytokine 8(1): 14-2
0 (1996)（引用によりその全内容が包含される文献）を参照。
【０１８６】 上に議論されるように、本発明のＫＧＦ−２タンパク質に対する抗体を用いて
、今度は、ＫＧＦ−２を「模倣する（mimic）」抗イディオタイプ抗体を当業者
によく知られた方法（たとえば、Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5): 437-444 (
1989)およびNissinoff, J. Immunol. 147(8): 2429-2438 (1991)）を用いて産生
できる。たとえば、ＫＧＦ−２と結合し、ＫＧＦ−２の多量体化（multimerizat
ion）および／またはリガンドへの結合を競合的に阻害する抗体を、ＫＧＦ−２
の多量体化および／または結合ドメインを「模倣し」、その結果、ＫＧＦ−２お
よび／またはそのリガンドに結合および中和する抗イディオタイプを産生するこ
とができる。そのような中和抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイ
プのＦａｂフラグメントは、ＫＧＦ−２リガンドを中和する治療計画に用いるこ
とができる。たとえば、そのような抗イディオタイプ抗体は、ＫＧＦ−２を結合
し、および／またはＫＧＦ−２リガンド／レセプターを結合し、それによってＫ
ＧＦ−２の生物学的活性を阻止するのに用いることができる。
【０１８７】 抗体をコードするポリヌクレオチド また、本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌ
クレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、例えば、上
記のような、ストリンジェントまたはよりストリンジェントの低い条件下で、好
ましくは本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする抗体（好ま
しくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体）をコ
ードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドをも包含する
。
【０１８８】 当該分野において公知の任意の方法により、ポリヌクレオチドが得られ、ポリ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定され得る。例えば、抗体のヌクレオチド
配列が公知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成さ
れたオリゴヌクレオチドからアセンブリされ（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、Ｂ
ｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載）、これは、簡単
に述べると、抗体をコードする配列の一部を含む重複オリゴヌクレオチドの合成
、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、次いでラ
イゲーションしたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を含む。
【０１８９】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは適切な供給源由来の核酸から
産生され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンが入手可能ではない
が、抗体分子の配列が公知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化
学的に合成するか、または、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリー由
来のｃＤＮＡクローンを同定するために、配列の３’もしくは５’末端にハイブ
リダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅により、または特定の遺伝
子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングにより、
適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または本発明の抗体を発現
するように選択されたハイブリドーマ細胞のような抗体を発現する組織または細
胞から作製されたｃＤＮＡライブラリー、またはこれらから単離された核酸、好
ましくはポリＡ＋ ＲＮＡ）から入手することができる。次いで、ＰＣＲにより
作製された増幅された核酸を、当該分野において周知の任意の方法を使用して複
製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
【０１９０】 一旦、抗体のアミノ酸配列にヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が
決定されると、組み合えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなどのような
、ヌクレオチド配列の操作のための当該分野において周知の方法（例えば、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら、１９９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹおよ
びＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ
，ＮＹを参照のこと。これらは両方ともその全体を本明細書中に参照することに
より組み込む）を使用して、抗体のヌクレオチド配列を操作し、異なるアミノ酸
配列を有する抗体（例えば、アミノ酸置換体、欠失体および／または挿入体を作
製）を作製し得る。
【０１９１】 特別の態様において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列
を当該技術分野でよく知られた方法により、たとえば他の重鎖および軽鎖可変領
域の公知のアミノ酸配列との比較により調べて相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列
を同定して、配列の超可変領域を決定することができる。上記に記載したように
、ルーチンな組換えＤＮＡ法を用い、１またはそれ以上のＣＤＲをフレームワー
ク領域内、たとえばヒトのフレームワーク領域内に挿入して非ヒト抗体をヒト化
することができる。フレームワーク領域は天然に存在するまたはコンセンサスな
フレームワーク領域、好ましくはヒトのフレームワーク領域であってよい（ヒト
のフレームワーク領域の一覧については、たとえば、Chothiaら、J. Mol. Biol.
278: 457-479 (1998)を参照）。フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合せに
より生成したポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体
をコードしているのが好ましい。上記に記載したように、フレームワーク領域内
で１またはそれ以上のアミノ酸が置換されているのが好ましく、そのようなアミ
ノ酸置換が該抗体のその抗原への結合を改善するのが好ましい。さらに、そのよ
うな方法は、鎖内ジスルフィド結合に参画している１またはそれ以上の可変領域
システイン残基に対してアミノ酸置換または欠失を施して１またはそれ以上の鎖
内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を生成するために用いることができる。ポリ
ヌクレオチドに対する他の変更は本発明により包含され、当業者の技術範囲内で
ある。
【０１９２】 さらに、適当な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を適当な生物学的活
性のヒト抗体分子からの遺伝子とともにスプライシングすることによる「キメラ
抗体」を産生するために開発された方法（Morrisonら、1984, Proc. Natl. Acad
. Sic. 81: 851-855; Neubergerら、1984, Nature 312: 604-608; Takedaら、19
85, Nature 314: 452-454）を用いることができる。上記に記載したように、キ
メラ抗体は、マウスｍＡｂ抗体に由来する可変領域とヒトの免疫グロブリンの定
常領域とを有するもの、たとえばヒト化抗体のように、異なる部分が異なる動物
種に由来する分子である。
【０１９３】 別法として、一本鎖抗体の産生について記載された方法（米国特許第４,９４
６,７７８号；Bird, 1988, Science 242: 423-42; Hustonら、1988, Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883；およびWardら、1989, Nature 334: 544-554
）を一本鎖抗体を産生するために適合することができる。一本鎖抗体は、Ｆｖ領
域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントとをアミノ酸架橋により連結して一本
鎖ポリペプチドとすることにより生成する。大腸菌内で機能性のＦｖフラグメン
トをアセンブリする技術も用いることができる（Skerraら、1988, Science 242:
1038-1041）。
【０１９４】 抗体の製造方法 本発明の抗体は、抗体の合成法として当該技術分野で知られた方法、とりわけ
化学的合成により、または好ましくは組換え発現法により製造することができる
。
【０１９５】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体またはアナログ（たとえば本
発明の抗体の重鎖または軽鎖または本発明の１本鎖抗体）の組換え発現には、該
抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築することが必要で
ある。抗体分子または抗体の重鎖または軽鎖またはその一部（好ましくは重鎖ま
たは軽鎖の可変ドメインを含むもの）をコードする本発明のポリヌクレオチドが
得られたら、該抗体分子の製造のためのベクターを当該技術分野でよく知られた
方法を用いて組換えＤＮＡ法により製造することができる。それゆえ、抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現することによるタンパ
ク質の製造法を本明細書に記載する。当業者によく知られた方法を用い、抗体を
コードする配列および適当な転写および翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを
構築することができる。これら方法には、たとえば、インビトロ組換えＤＮＡ法
、合成法、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。それゆえ、本発明は、プロ
モーターに作動可能に連結した本発明の抗体分子またはその重鎖または軽鎖また
は重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可
能なベクターを提供する。そのようなベクターは抗体分子の定常領域をコードす
るヌクレオチド配列を含んでいてよく（たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ８６／０５８
０７号；ＰＣＴ公開ＷＯ８９／０１０３６号；および米国特許第５,１２２,４６
４号を参照）、重鎖または軽鎖の全体を発現させるために可変ドメインをそのよ
うなベクター中にクローニングすることができる。
【０１９６】 発現ベクターを常法により宿主細胞に移し、ついでトランスフェクションした
細胞を常法により培養して本発明の抗体を産生させる。それゆえ、本発明は、異
種プロモーターに作動可能に連結した本発明の抗体、またはその重鎖または軽鎖
、または１本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を包含する。
二本鎖抗体の発現のための好ましい態様において、以下に詳細に記載するように
、免疫グロブリン分子全体の発現のために重鎖および軽鎖の両者をコードするベ
クターを宿主細胞中で同時に発現させることができる。
【０１９７】 本発明の抗体分子を発現させるため、種々の宿主−発現ベクター系を用いるこ
とができる。そのような宿主−発現系は、目的コード配列を産生しその後に精製
するビヒクルであるばかりでなく、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換ま
たはトランスフェクションしたときに本発明の抗体分子をインサイチュで発現す
る細胞をも表す。これらとしては、以下に限られるものではないが、抗体コード
配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミド
ＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌（たとえば、大腸菌、B. subtilis）な
どの微生物；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母
（たとえば、Saccharomyces、Pichia）；抗体コード配列を含む組換えウイルス
発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；抗体コー
ド配列を含む組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウ
イルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、または抗体
コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（たとえば、Ｔｉプラスミド）
で形質転換した、植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム由来の（たとえば、
メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来の（たとえば、ア
デノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７.５Ｋプロモーター）プ
ロモーターを含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（たとえば、ＣＯＳ
、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられる。とりわけ全組換え抗体
分子の発現のため、好ましくは大腸菌などの細菌細胞、さらに好ましくは真核細
胞を組換え抗体分子の発現のために用いることができる。たとえば、チャイニー
ズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞をヒトサイトメガロウイル
スからの主要中間初期遺伝子（major intermediate early gene）プロモーター
などのベクターと組み合せたものは抗体のための有効な発現系である（Foecking
ら、1986, Gene 45: 101；Cockettら、1990, Bio/Technology 8: 2）。
【０１９８】 細菌系では、発現すべき抗体分子への使用に基づいて多くの発現ベクターを有
利に選択できる。たとえば、抗体分子の医薬組成物を製造するため、そのような
タンパク質を大量に製造する場合は、容易に精製できる融合タンパク質産物の高
レベルの発現を指令するベクターが望ましくあり得る。そのようなベクターとし
ては、以下に限られるものではないが、融合タンパク質が産生されるように抗体
コード配列を個別にｌａｃＺコード領域とインフレームでベクター中にライゲー
トした大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Rutherら、1983, EMBO J. 2: 1791）
；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-310
9; Van Heeke & Shuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509）などが挙げら
れる。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）
との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために用いることができ
る。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチ
オン−アガロースビーズに吸着および結合させた後に遊離のグルタチオンの存在
下で溶出することにより溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベ
クターは、クローニングした標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から遊離できるように
トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むようにデザインしてあ
る。
【０１９９】 昆虫系では、Autographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を外
来遺伝子を発現するためのベクターとして用いる。このウイルスはSpodoptera f
rugiperda細胞中で増殖する。抗体コード配列を個別に該ウイルスの非必須領域
（たとえば、ポリヘドリン遺伝子）中にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモータ
ー（たとえば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
【０２００】 哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系を用いることができる
。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合は、目的とする抗体コード配
列をアデノウイルス転写／翻訳調節複合体、たとえば後期プロモーターおよび３
部からなる（tripartite）リーダー配列にライゲートすることができる。ついで
、このキメラ遺伝子をインビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲ
ノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば、領域
Ｅ１またはＥ３）への挿入は、生存可能かつ抗体分子を感染宿主中で発現するこ
とのできる組換えウイルスを生じる（たとえば、Logan & Shenk, 1984, Proc. N
atl. Acad. Sic. USA 81: 355-359を参照）。また、挿入した抗体コード配列の
有効な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要となるかもしれない。これら
シグナルとしてはＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列が挙げられる。さらに、
挿入物全体の翻訳を確実にするため、開始コドンは所望のコード配列のリーディ
ングフレームと同じ位相でなければならない。これら外来の翻訳調節シグナルお
よび開始コドンは、天然および合成の両者を含む種々の由来のものであってよい
。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなど
を含めることによって高めることができる（Bittnerら、1987, Methods in Enzy
mol. 153: 51-544を参照）。
【０２０１】 さらに、挿入した配列の発現を変調し、あるいは遺伝子産物を所望の特定の仕
方で修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。そのよう
なタンパク質産物の修飾（たとえば、グリコシル化）およびプロセシング（たと
えば、開裂）はタンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、
翻訳後プロセシングおよびタンパク質や遺伝子産物の修飾についての特徴的かつ
特異的な機構を有する。発現された外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシ
ングを確実にするため、適当な細胞株または宿主系を選択することができる。こ
の目的のため、一次転写物の適切なプロセシング、および遺伝子産物の適切なグ
リコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を用いること
ができる。そのような哺乳動物宿主細胞としては、これらに限られるものではな
いが、ＣＨＯ、ＶＥＲＡ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ
３、ＷＩ３８、とりわけ、たとえばＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ
２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、および、たとえばＣＲＬ７０３０およ
びＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細胞株が挙げられる。
【０２０２】 組換えタンパク質の長期にわたる高収率の産生のためには安定な発現が好まし
い。たとえば、抗体分子を安定に発現する細胞株を操作することができる。ウイ
ルス性複製起点を有する発現ベクターを用いるよりも、適当な発現調節エレメン
ト（たとえば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリ
アデニル化部位など）により制御されたＤＮＡ、および選択マーカーで宿主細胞
を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作した細胞を富化培地で
１〜２日間増殖させ、ついで選択培地に切り替えてもよい。組換えプラスミド中
の選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞がその染色体中に該プラスミ
ドを安定に組込み増殖してフォーカスを形成することを可能にし、これを今度は
クローニングし、細胞株に拡張することができる。この方法は、抗体分子を発現
する細胞株を操作するのに有利に用いることができる。そのように操作した細胞
株は、抗体分子と直接または間接的に相互作用する化合物をスクリーニングおよ
び評価するうえで特に有用である。
【０２０３】 以下を含む多数の選択系を用いることができるが、これらに限られるものでは
ない：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Wiglerら、1977, Cell 1
1: 223）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子
（Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sic. USA 48: 202）、お
よびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowyら、1980, Cell 2
2: 817）を、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞に用いること
ができる。また、以下の遺伝子について代謝拮抗物質耐性（antimetabolites re
sistance）を選択の基礎として用いることができる：ｄｈｆｒ（メトトレキセー
トに対する耐性を付与）（Wiglerら、1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 357; O'
Haraら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527）；ｇｐｔ（ミコフェノ
ール酸に対する耐性を付与）（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 78: 2072）；ｎｅｏ（アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与）
（Goldspielら、1993, Clinical Pharmacy 12: 488-505; WuおよびWu, 1991, Bi
otherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 5
73-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932；およびMorganおよびAnderson
, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5): 155-2
15）；およびｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシンに対する耐性を付与）（Santerreら
、1984, Gene 30: 147）。当該分野において一般的に知られている組換えＤＮＡ
技術の方法は、所望の組換えクローンを選択するために慣用的に適用され得、こ
のような方法は、例えば、Ausubelら（編）、1993, Current Protocols in Mole
cular Biology、John Wiley & Sons, NY,；Krieger, 1990, Gene Transfer and
Expression, A Laboratory Manual、Stokton Press、NY；およびDracopoliら（
編）、1994, Current Protocols in Human Genetics、John Wiley & Sons, NY,
第１２章および第１３章；Colberre-Garapinら、1981, J. Mol. Biol. 150: 1（
その全体を参照することにより本明細書に引用する）に記載されている。
【０２０４】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅により増大させることができる（概説
はBebbingtonおよびHentschel, The use of vectors based on gene amplificat
ion for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning
, Vol. 3（アカデミックプレス、ニューヨーク、１９８７）を参照）。抗体を発
現するベクター系中のマーカーが増幅できる場合は、宿主細胞の培養液中に存在
するインヒビターレベルの増大はマーカー遺伝子のコピー数を増大させるであろ
う。増幅された領域は抗体遺伝子と繋がっているので、抗体の産生もまた増大さ
れるであろう（Crouseら、1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257）。
【０２０５】 宿主細胞を本発明の２つの発現ベクター、すなわち重鎖由来のポリペプチドを
コードする第一のベクターと軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクタ
ーで同時にトランスフェクションすることができる。これら２つのベクターは同
一の選択マーカーを含むようにして、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとを
等しく発現できるようにしてよい。別法として、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペ
プチドとの両者をコードし、発現し得る単一のベクターを用いることもできる。
そのような場合、過剰の毒性の遊離重鎖を避けるため軽鎖を重鎖の前に配置すべ
きである（Proudfoot, 1986, Nature 322: 52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 77: 2197）。重鎖および軽鎖のコード配列はｃＤＮＡまたはゲノム
ＤＮＡを包含し得る。
【０２０６】 本発明の抗体分子が動物により産生されたか、化学的に合成されたか、または
組換えにより発現されたら、免疫グロブリン分子の精製のための当該技術分野で
知られた方法、たとえば、クロマトグラフィー（たとえば、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、とりわけプロテインＡへの特
異的抗原に対するアフィニティー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー
）、遠心分離、分別溶解度、またはタンパク質の精製のための他のいずれかの標
準法により精製することができる。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメン
トは、本明細書中に記載の、または当該分野において公知の外来ポリペプチド配
列に縮合して精製を容易にし得る。
【０２０７】 本発明は、本発明のポリペプチド（またはそれらの一部であって、これらは該
ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、
９０または１００個のアミノ酸であることが好ましい）に組換え的に融合させる
か、または化学的に接合（これは、共有結合または非共有結合の両方を含む）さ
せて、融合タンパク質を生成する抗体を包含する。該融合は必ずしも直接的であ
る必要はないが、リンカー配列を介して生じることができる。該抗体は本発明の
ポリペプチド（またはそれらの一部、これらは該ポリペプチドの少なくとも１０
、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個のアミノ酸
であることが好ましい）以外の抗原について特異的であり得る。例えば、本発明
のポリペプチドをある細胞表面の受容体について特異的である抗体と融合させる
かまたは接合させることによって、本発明のポリペプチドがインビトロであるい
はインビボで特定の細胞タイプを標的とするのに、抗体を使用することができる
。本発明のポリペプチドに融合させるかまたは接合させた抗体を、当該分野で公
知の方法を用いたインビトロイムノアッセイおよび精製法においても使用するこ
とができる。例えば、Ｈａｒｂｏｒらによる上述、およびＰＣＴ公開公報ＷＯ９
３／２１２３２；ＥＰ４３９，０９５；ＮａｒａｍｕｒａらによるＩｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｌｅｔｔ．３９；９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１
号；ＧｉｌｌｉｅｓらによるＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）
；ＦｅｌｌらによるＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９
１）（これらは本明細書の一部を構成する）を参照のこと。
【０２０８】 本発明は更に、可変領域以外の抗体ドメインと融合するかまたは接合した本発
明のポリペプチドを含有する組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチドは、
抗体Ｆｃ領域またはその一部と融合するかまたは接合することができる。本発明
のポリペプチドに融合した抗体部分は、定常部、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、
ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインまたはそれら全てのドメインもしくはその
一部のいずれかの組合せを含むことができる。該ポリペプチドは上記の抗体部分
と融合するかまたは接合して、多量体を形成することもできる。例えば、本発明
のポリペプチドに融合したＦｃ部はＦｃ部間でのジスルフィド結合によって二量
体を形成することができる。より高度な多量体の形態は、該ポリペプチドをＩｇ
ＡおよびＩｇＭと融合させることによって製造することができる。本発明のポリ
ペプチドと抗体部分とを融合させるかまたは接合させる方法は、当該分野で知ら
れている。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号；第５，６２２，９２９号
；第５，３５９，０４６号；第５，３４９，０５３号；；第５，４４７，８５１
号；第５，１１２，９４６号；ＥＰ３０７，４３４；ＥＰ３６７，１６６；ＰＣ
Ｔ公開公報ＷＯ９６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ
らによるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８８：１０５３５
−１０５３９（１９９１）；ＺｈｅｎｇらによるＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：
５５９０−５６００（１９９５）；およびＶｉｌらによるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）（これ
らは本明細書の一部を構成する）を参照のこと。
【０２０９】 上記の通り、配列番号２のポリペプチド、そのポリペプチドフラグメント、ま
たはその変異体に相当するポリペプチドを、該ポリペプチドのインビボ半減期を
増大させるために、または当該分野で公知の方法を用いるイムノアッセイにおい
て使用するために、上記の抗体部分と融合させるかまたは接合させることができ
る。更に、精製を容易にするために、配列番号２に相当するポリペプチドを上記
の抗体部分に融合させたりまたは接合させることができる。ある報告されている
例では、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２ドメインおよび哺乳類イムノグロ
ブリンの重鎖または軽鎖の定常部の様々なドメインからなるキメラプロテインに
ついて記載している（ＥＰ３９４，８２７；ＴｒａｕｎｅｃｋｅｒらによるＮａ
ｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ジスルフィド結合した二量体構
造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合させるかまたは接合させた本発明の
ポリペプチドは、単量体の分泌型プロテインまたはプロテインフラグメントの単
独よりも、他の分子と結合したり、中和するのにより有効でもあり得る（Ｆｏｕ
ｎｔｏｕｌａｋｉｓらによる、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６
４（１９９５））。多くの場合において、融合プロテインのＦｃ部は治療および
診断において有利であり、従って、例えば薬物動態学的な性質を改善することが
できる（ＥＰ Ａ２３２，２６２）。あるいは、融合プロテインを発現させ、検
出しおよび精製した後に、Ｆｃ部を欠失させることが望まれるであろう。例えば
、融合プロテインを免疫化のための抗原として使用する場合には、該Ｆｃ部は治
療および診断を妨げることがある。薬物の発見においては、例えばヒトプロテイ
ン（例えば、ｈＩＬ−５）は、ｈＩＬ−５の拮抗薬を同定するためのハイ−スル
ープットスクリーニングアッセイの目的のために、Ｆｃ部と融合されている（Ｂ
ｅｎｎｅｔｔらによるＪ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：
５２−５８（１９９５）；ＪｏｈａｎｓｏｎらによるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
，２７０：９４５９−９４７１（１９９５））。
【０２１０】 さらに、本発明の抗体またはその断片は、ペプチドなどのマーカー配列に融合
させて、精製を促進することができる。好ましい具体例においては、マーカーア
ミノ酸配列は、特に、ｐＱＥベクターに提供されたタグ（QIAGEN，Inc.、カリフ
ォルニア９１３１１、チャッツワース、イートン・アベニュー９２５９）などの
ヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、多くのものが市販されている。たとえば、
GentzらのProc.Natl.Acad.Sci.USA、８６：８２１−８２４（１９８９）に記載
されているように、ヘキサ−ヒスチジンを用いて、融合タンパク質を簡便に精製
することができる。精製に有用な他のペプチドタグとして、インフルエンザ赤血
球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する“ＨＡ”タグ（Wilsonらの
Cell、３７：７６７（１９８４））および“ｆｌａｇ”タグが挙げられるが、こ
れに限定されるものではない。
【０２１１】 本発明はさらに、診断剤または治療剤に結合した抗体またはその断片を包含す
る。抗体を用いて、たとえば、与えられた治療養生法の効力を決定するといった
ような臨床試験手順の一環として、腫瘍の発生および経過をモニターすることが
できる。抗体を検出可能な物質にカップリングすることによって検出を促進する
ことができる。検出可能な物質の例として、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質
、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子放射断層撮影法を用いる
陽電子放射金属および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質
は、当業界で公知の技術を用い、直接的に、または中間体（たとえば、当業界で
公知のリンカーなど）を介して間接的に抗体にカップリングまたは複合させる。
たとえば、本発明診断法として用いるための抗体に複合することができる金属イ
オンについては米国特許第４７４１９００号を参照。適当な酵素の例としては、
西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ベータガラクトシダ
ーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適当な補欠分子族複合体
としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ
る；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオ
レセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオ
レセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の
例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラ
ーゼ、ルシフェリンおよびエクオリン；および適当な放射性物質の例としては、 １２５ Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げられる。
【０２１２】 さらに、抗体またはその断片は、細胞増殖抑制剤または細胞破壊剤などの細胞
毒素といったような治療部分、２１３Ｂｉなどのアルファエミッターといったよ
うな治療剤または放射性金属に複合してもよい。細胞増殖抑制剤または細胞破壊
剤と、細胞に有害などのような作用剤をも包含する。例としては、パクリタキソ
ール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、ミトマ
イシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチ
ン、ドクソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミト
キサントロン、ミトラマイシン、アンチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステ
ロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラ
ノロールおよびプロマイシンならびにそれらの類縁体もしくは同族体が挙げられ
る。治療剤としては、代謝拮抗物質（メトトレキサン、６−メルカプトプリン、
６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジンなど）、ア
ルキル化剤（メクロレタミン、チオエパクロラムビシル、メルファラン、カルム
スチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロソスファミド、ブス
ルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンＣおよび
cis-ジクロロジアミンプラチナ(ＩＩ)(ＤＤＰ)シスプラチンなど）、アントラサ
イクリン（ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドクソルビシンなど
）、抗生物質（ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン
、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ）など）および抗有糸分裂剤
（ビンクリスチンおよびビンブラスチンなど）が挙げられるが、これらに限定さ
れるものではない。
【０２１３】 本発明の複合体を用いて、与えられた生物学的応答を変更することができる。
治療剤または薬物部分は、古典的な科学的治療剤に限定されるように解釈される
べきではない。たとえば、薬物部分は、所望の生物学的活性をもつタンパク質ま
たはポリペプチドであってよい。このようなタンパク質としては、たとえば、ア
ブリン、リシンＡ、シュードモナスエキソトキシンまたはジフテリアトキシンな
どの毒素；腫瘍壊死因子αインターフェロン、βインターフェロン、神経増殖因
子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＴＮＦ−α、
ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開公報ＷＯ９７／３３８９９を参照）、ＡＩＭ
ＩＩ（国際公開公報ＷＯ９７／３４９１１を参照）、Ｆａｓリガンド（Takahash
iらのInt.Immunol.、６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際
公開公報ＷＯ９９／２３１０５を参照）、アンギオスタチンまたはエンドスタチ
ンなどの血栓剤または抗血管形成剤など細胞消滅因子のタンパク質またはリンホ
カイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２
）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因
子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または他の増殖因
子などの生物学的応答変更剤が挙げられる。
【０２１４】 抗体を固体支持体に結合してもよく、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に
特に有用である。このような固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリア
クリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニルまたはポリプロピレンが挙
げられるが、これらに限定されるものではない。 このような治療部分を抗体に複合させる技術は、公知であり、Arnonらの「Monoc
lonal Antibodies For Immunotageting Of Drugs In Cancer Therapy」、Monocl
onal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfieldら（編）ｐｐ２４３−５６（A
lan R. Liss, Inc.、１９８５）；Hellstormらの「Antibodies For Drug Delive
ry」、Controlling Drug Delivery（第２版）、Robinsonら（編）ｐｐ６２３−
５３（Marcel Dekker, Inc.、１９８７）；Thropeの「Antibody Carries Of Cyt
otoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」、Monoclonal Antibodies '８４
：Biological And Clinical Applications、Pincheraら（編）、ｐｐ４７５−５
０６（１９８５）；「Analysis, Results, And Future Prospective Of The The
rapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、Monoclonal An
tibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwinら（編）、ｐｐ３０３−
１６（Academic Press、１９８５）；およびThropeらの「The Preparation Of A
ntibody-Toxin Conjugates」、Immunol.Rev.、６２：１１９−５８（１９８２）
などを参照せよ。 単独または細胞毒素因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与され
た複合した治療部分有りまたは無しの抗体を、治療剤として用いることができる
。
【０２１５】 表現型決定 本発明の抗体は、細胞系および生物学的サンプルの免疫表現型決定に用いるこ
とができる。本発明の遺伝子翻訳産物は、細胞特異的マーカーとして有用であり
、さらに詳しくは、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で特異
的に発現される細胞マーカーとして有用である。特異的エピトープまたはエピト
ープの組み合わせに対するモノクローナル抗体を用いて、マーカーを発現してい
る細胞集団をスクリーニングすることができる。モノクローナル抗体を用いる種
々の技術を用いて、マーカーを発現している細胞集団をスクリーニングすること
ができ、そのような技術としては、抗体被覆磁性ビーズを用いる磁性分離、固相
マトリックス（プレートなど）に結合した抗体による“パニング”およびフロー
サイトメトリーなどが挙げられる（米国特許第５９８５６６０号；およびMorris
onらのCell、９６：７３７−４９（１９９９）を参照）。 これらの技術は、血液学的悪性（すなわち、急性白血病患者における微量残存
白血病（ＭＲＤ））および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を予防するための“非
自己”細胞の発見といったような特定の細胞集団のスクリーニングを可能にする
。他にも、これらの技術は、ヒト臍帯血の発見といったような増殖および分化す
る能力をもつ造血幹および／または先駆細胞のスクリーニングを可能にする。
【０２１６】 抗体結合アッセイ 当業界で公知の方法によって、免疫特異的結合について本発明の抗体をアッセ
イする。使用しうるイムノアッセイとしては、ウエスタンブロット、ラジオイム
ノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、“サンドイッ
チ”イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫分
散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリーアッセイ
、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイといったような技術を用い
る競合および非競合アッセイシステムが挙げられるが、これらに限定されるもの
ではない。このようなアッセイは、当業界で慣例的であり、公知である（Ausube
lら（編）、１９９４、Current Protocols in Molecular Biology、vol.１、Joh
n Wiley ＆ Sons, Inc.、ニューヨークなどを参照；これらは全体を参考文献と
して本発明に援用される）。典型的なイムノアッセイを以下に簡単に述べるが、
これに限定されるものではない。
【０２１７】 一般に、免疫沈降プロトコルは、プロテインホスファターゼおよび／またはプ
ロテアーゼインヒビター（ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジウム酸ナ
トリウムなど）を追加したＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０またはトリトンＸ−
１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５ＭのＮａ
Ｃｌ、０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１％Trasylol）などの溶解
緩衝液に細胞集団を溶解すること、対象の抗体を細胞溶解液に加えること、４℃
にて、ある時間（たとえば１〜４時間など）インキュベートすること、プロテイ
ンＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解液に加えること
、４℃にて約１時間またはそれ以上インキュベートすること、溶解緩衝液中のビ
ーズを洗浄すること、およびＳＤＳ／サンプルにビーズを再懸濁することそ含む
。対象の抗体の特定の抗原を免疫沈降する能力は、ウエスタンブロット分析など
によって評価することができる。当業者であれば、抗体の抗原への結合を増加す
るように変更しうるパラメーターおよびバックグラウンドを減少するように変更
しうるパラメーター（たとえば、細胞溶解液をセファロースビーズでプレクリー
ニングしておくなど）について知識があるものと考える。免疫沈降に関するさら
なる解説は、Ausubelら（編）、１９９４、Current Protocols in Molecular Bi
ology、vol.１、John Wiley ＆ Sons, Inc.、ニューヨーク、１０．１６．１を
参照。
【０２１８】 一般に、ウエスタンブロット分析は、ポリアクリルアミドゲル（抗原の分子量
に応じて８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥなど）においてサンプルを電気泳動して
タンパク質サンプルを調製すること、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロ
ース、ＰＶＤＦまたはナイロンなどの膜へタンパク質サンプルを移すこと、ブロ
ッキング溶液（３％ＢＳＡまたは脱脂乳を含むＰＢＳなど）で膜をブロックする
こと、洗浄緩衝液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０など）で膜を洗浄すること、ブロッ
キング緩衝液で希釈した一次抗体（対象の抗体）で膜をブロックすること、洗浄
緩衝液で膜を洗浄すること、ブロッキング緩衝液で希釈した酵素基質（西洋ワサ
ビペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼなど）または放射性分子（ ３２ Ｐまたは１２５Ｉなど）に複合した二次抗体（一次抗体を認識する抗ヒト抗
体など）で膜をブロックすること、洗浄液で膜を洗浄すること、および抗原の存
在を検出することそ含む。当業者であれば、検出されたシグナルを増加するよう
に変更しうるパラメーターおよびバックグラウンドノイズを減少するように変更
しうるパラメーター（たとえば、細胞溶解液をセファロースビーズでプレクリー
ニングしておくなど）について知識があるものと考える。ブロットプロトコルに
関するさらなる解説は、Ausubelら（編）、１９９４、Current Protocols in Mo
lecular Biology、vol.１、John Wiley ＆ Sons, Inc.、ニューヨーク、１０．
８．１を参照。
【０２１９】 ＥＬＩＳＡは、９６ウエルのマイクロプレートを抗原でコーティングすること
、酵素基質（西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼなど
）などの検出可能な化合物に複合した抗体をウエルに加えること、およびある時
間インキュベートし、抗原の存在を検出することそ含む。ＥＬＩＳＡにおいては
、対象の抗体は、検出可能な化合物に複合しなくてもよい；その代わりに、検出
可能な抗体に複合した二次抗体（対象の抗体を認識する）をウエルに加える。さ
らに、ウエルを抗原でコーティングする代わりに、抗体でウエルをコートする。
この場合、検出可能な化合物に複合した二次抗体は、対象の抗原をコートしたウ
エルに加えた後に加える。当業者であれば、検出されたシグナルならびに当業界
で公知のＥＬＩＳＡにおける他の変数を増加するように変更しうるパラメーター
について知識があるものと考える。ＥＬＩＳＡに関するさらなる解説は、Ausube
lら（編）、１９９４、Current Protocols in Molecular Biology、vol.１、Joh
n Wiley ＆ Sons, Inc.、ニューヨーク、１１．２．１を参照。抗原に対する抗
体の結合親和性および抗体−抗原相互作用の脱離速度は、競合結合アッセイによ
って決定することができる。競合結合アッセイの１つの例は、非標識抗原の量が
増加している状態で標識（３Ｈまたは１２５Ｉなど）抗原を対象の抗体とともに
インキュベートすることおよび標識抗原に結合した抗体の検出を含むラジオイム
ノアッセイである。特定の抗原に対する対象の抗体の親和性および結合脱離速度
は、スキャッチャードプロットによって決定することができる。二次抗体との競
合もまた、ラジオイムノアッセイを用いて決定することができる。この場合、非
標識二次抗体の量が増加している状態で標識（３Ｈまたは１２５Ｉなど）と複合
した対象の抗体とともに抗原をインキュベートする。
【０２２０】 ベクターおよび宿主細胞 本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子が含まれるベクター、組換えベ
クターで遺伝的に操作された宿主細胞、および組換え技術によるＫＧＦ−２ポリ
ペプチドまたはそのフラグメントの製造にも関する。 本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成により、対
応する全長のポリペプチドを製造するために使用することができ；従って、その
フラグメントは、全長のポリペプチドを製造するための中間体として使用するこ
とができる。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分を使用して、
本発明の全長のポリヌクレオチドを合成することができる。本発明はまた、本発
明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作さ
れた宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの製造にも関する
。 宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本
発明のベクターで遺伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトランス
フォームされ、またはトランスフェクトされる)。そのベクターは、例えば、プ
ラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、
プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはＫＧＦ−２遺
伝子を増幅するのに適するよう修飾された、従来の栄養培地で培養することがで
きる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現のために選択された宿主細
胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。
【０２２１】 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりペプチドを製造するために使
用することができる。従って、例えば、そのポリヌクレオチドを、ポリペプチド
を発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませてもよい。そのよ
うなベクターには、染色体、非染色体、および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４
０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラス
ミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター；ワクシニ
ア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病といったようなウイルス
ＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベクターも、それが宿主において複製
可能であって、生存可能である限り、使用することができる。
【０２２２】 様々な方法により、適当なＤＮＡ配列をベクターに挿入することができる。一
般には、当業界で知られている方法により、ＤＮＡ配列を適当な制限エンドヌク
レアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内で
あると考えられる。 発現ベクターにおけるＤＮＡ配列を適当な発現制御配列(プロモーター)に作動
可能に結合して、cＤＮＡ合成を指揮する。そのようなプロモーターの代表例と
して、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ. coli. lacまたはtrp、ファージ
λＰＬプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスにお
ける遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターを挙げること
ができる。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および
転写終結区も含む。そのベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み
得る。 加えて、発現ベクターは、真核細胞培養にはジヒドロ葉酸レダクターゼもしく
はネオマイシン耐性といったような、またはＥ. coliにおいてはテトラサイクリ
ンもしくはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細胞
の選択のための表現型特性を与える、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー
遺伝子を含むのが好ましい。 先に記載したような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターま
たは制御配列を含むベクターを使用し、適当な宿主をトランスフォームして、そ
の宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。
【０２２３】 指摘したように、発現ベクターが、少なくとも１つの選択可能なマーカーを含
むのが好ましい。このようなマーカーとしては、真核細胞培養についてはジヒド
ロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８またはネオマイシン耐性、および大腸菌および他
の細菌についてはテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝
子が挙げられる。適当な宿主の代表例としては、大腸菌、ストレプトミセスおよ
びサルモネラ・チフィムリウム細胞などの細菌細胞；酵母細胞（たとえば、サッ
カロミセス・セレビシアエまたはピチア・パストリス（ＡＴＣＣ受託番号２０１
１７８））などの真菌細胞；ドロソフィアＳ２およびスポドプテラＳｆ９細胞な
どの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３およびボーズメラノーマ細胞などの動物
細胞；アデノウイルスおよび植物細胞が挙げられるが、これらに限定されるもの
ではない。上記宿主細胞について適当な培養培地および条件は、当業界で公知で
ある。
【０２２４】 本発明の実施における発現ベクターの使用に加えて、本発明はさらに、対象の
タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したオペレーターお
よびプロモーターエレメントを含む新規な発現ベクターを包含する。このような
ベクターの一例は、以下に詳細に記載するｐＨＥ４−５である。 図５０および５１に要約したように、ｐＨＥ４−５ベクター（配列番号１４７
）の構成要素は、１）選択マーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラー
ゼ遺伝子、２）大腸菌複製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つ
のlacオペレーター配列、５）シャイン・ダルガーノ配列、６）ラクトースオペ
ロンリプレッサー遺伝子（lacIq）を含む。複製起点（oriＣ）は、ｐＵＣ１９（
ＬＴＩ、ゲーサーズバーグ、メリーランド）に由来する。プロモーター配列およ
びオペレーター配列は、合成した。核酸配列の合成的生産は当業界で公知である
。CLONETECH９５／９６カタログ、２１５〜２１６頁、CLONETECH、カリフォルニ
ア９４３０３パロアルト、イースト・メドウ・サークル１０２０。ＫＧＦ−２を
コードするヌクレオチド配列（配列番号１）は、ｐＨＥ４−５ベクターのＮｄｅ
ＩおよびＡｓｐ７１８サイトの間に該ヌクレオチド配列を挿入することによって
プロモーターおよびオペレーターに作動可能に連結する。
【０２２５】 上述したように、ｐＨＥ４−５ベクターは、lacIq遺伝子を含む。lacIqは、la
cオペレーターのタイトレギュレーションを付与するlacI遺伝子の対立遺伝しで
ある。Amann,E.ら、Gene、６９：３０１−３１５（１９８８）；Stark,M.、Gene
、５１：２５５−２６７（１９８７）。lacIq遺伝子は、lacオペレーター配列に
結合し、下流（すなわち、３'）配列の転写をブロックするリプレッサータンパ
ク質をコードする。しかし、lacIq遺伝子産物は、ラクトースまたはラクトース
類縁体（イソプロピルＢ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）など）のい
ずれかの存在下、lacオペレーターから解離する。したがって、ＫＧＦ−２は、
ｐＨＥ４−５ベクターを含む非誘導宿主細胞においては、評価しうる量で産生さ
れない。しかし、ＩＰＴＧなどの作用剤の添加によるこれらの宿主細胞の誘導か
ら、ＫＧＦ−２コーディング配列の発現が起こる。
【０２２６】 ｐＨＥ４−５のベクタープロモーター／オペレーター配列（配列番号１４８）
は、Ｔ５ファージプロモーターおよび２つのlacオペレーター配列を含む。１つ
のオペレーターは、転写開始サイトに対して５'に位置し、他方は、同じサイト
に対して３'に位置する。これらのオペレーターは、lacIq遺伝子産物と組み合わ
せて存在する場合に、ＩＰＴＧなどlacオペロンインデューサーの不在下で、下
流配列のタイトリプレッションを付与する。lacオペレーターから下流に位置す
る、作動可能に連結した配列の発現は、ＩＰＴＧなどlacオペロンインデューサ
ーの添加によって誘導される。lacIqタンパク質にlacインデューサーが結合する
と、それらのタンパク質がlacオペレーター配列から解離し、作動可能に連結し
た配列の転写が起こる。遺伝子発現のLacオペロン調節は、Devlin,T.のTEXT BOO
K OF BIOCHEMISTRY WITH CLINICAL CORRELATIONS、４版（１９９７）、８０２−
８０７頁、にて検討されている。
【０２２７】 ｐＨＥ４シリーズのベクターは、ＫＧＦ−２コーディング配列以外のｐＨＥ４
−５ベクターのすべての構成要素を含む。ｐＨＥ４ベクターの特徴は、最適化合
成Ｔ５ファージプロモーター、lacオペレーターおよびシャイン・デラガーノ配
列を包含する。さらに、これらの配列もまた、挿入された遺伝子の発現がタイト
に調節され、誘導の結果として高レベルの発現が起こるように、最適に間隔をお
いて配置される。
【０２２８】 本発明のタンパク質の産生において用いるのに適した公知の細菌プロモーター
としては、大腸菌lacIおよびlacZプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、
gptプロモーター。ラムダＰＲおよびＰＬプロモーターならびにtrpプロモーター
が挙げられる。適当な真核プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、
ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、
ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）といったようなレトロウイルスＬＴＲのプロモー
ター、およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターといったようなメタロチ
オネインプロモーターが挙げられる。
【０２２９】 ｐＨＥ４−５ベクターは、ＡＵＧ開始コドンに対して５'にシャイン・デラガ
ーノ配列も含む。シャイン・デラガーノ配列は、一般に、ＡＵＧ開始コドンから
約１０ヌクレオチド上流（すなわち、５'）に位置する短い配列である。これら
の配列は、本質的に、ＡＵＧ開始コドンに対する原核リボソームに関するもので
ある。 したがって、また本発明は、本発明のタンパク質の産生に有用な発現ベクター
に関する。本発明のこの態様は、ｐＨＥ４−５ベクター（配列番号１４７）によ
って代表される。ＫＧＦ−２ Δ３３をコードするｃＤＮＡインサートを含むｐ
ＨＥ４−５ベクターは、１９９８年１月９日に受託番号ＡＴＣＣ２０９５７５と
して寄託された。
【０２３０】 とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含ん
でなる組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向
で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクター
を含んでなる。この実施態様の好ましい態様において、その構築物はさらに、例
えば、その配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、調節配列を含んでな
る。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、また市
販されている。例として、次のベクターを与える；細菌用：pＱＥ７０、pＱＥ６
０、pＱＥ−９(Ｑiagen)、ＰＢＳ、pＤ１Ｏ、ファージスクリプト(phagescript)
、psiＸ１７４、pbluescript ＳＫ、ＰＢＳks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ
１８Ａ、pＮＨ４６Ａ(Ｓtratagene)；ptrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３
３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(Ｐharmacia)；真核生物用：pＷＬＮＥＯ、pＳ
Ｖ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、
pＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharmacia)。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクタ
ーも、それらが宿主において複製可能であって、生存可能である限り、使用する
ことができる。
【０２３１】 細菌で用いるのに好ましいベクターには、キアゲン社（QIAGEN，Inc.）から入
手し得るｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；ストラタジーン・クローニ
ング・システムズ社（Stratagene Cloning Systems，Inc.）から入手し得るｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、
ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；ファルマシア・バイオテック社（
Pharmacia Biotech，Inc.）から入手し得るｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３
、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が含まれる。好ましい真核ベク
ターには、ストラタジーン社から入手し得るｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐ
ＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ、およびファルマシア社から入手し得るｐＳＶ
Ｋ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬが含まれる。酵母系で用いられる好ま
しい発現ベクターは、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２
／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５
、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、および
ＰＡＯ８１５（いずれもインビトロゲン社（Invitrogen）、カナダ国、カールバ
ッドより入手し得る）が含まれるが、それらに限られない。他の好適なベクター
は当業者に自明であろう。
【０２３２】 プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベク
ター、または選択マーカーを有する他のベクターを使用して、いずれかの所望の
遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターは、pＫＫ２３２−８
およびpＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lac
Ｚ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、λＰＲ、ＰＬ、およびtrpが含まれる。真核プロモーター
には、前初期ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レト
ロウイルス由来のＬＴＲ、並びにマウスメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当
なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲内である
。
【０２３３】 構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオンリピドー媒介トランス
フェクション、エレクトポレーション、形質導入、感染、その他の方法が用いら
れる。そのような方法は、多くの標準的実験マニュアル、例えば、デイビスら（
Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology（１９８６））の文献に記
載されている。ＫＧＦ−２ポリペプチド類は実際組換ベクターを欠く宿主細胞で
発現されることに特に留意される。
【０２３４】 さらなる態様において、本発明は、先に記載した構築物を含む宿主細胞に関す
る。その宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低
等真核細胞であり得、またはその宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり
得る。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、
ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーシ
ョンにより果たすことができる(Ｄavis, Ｌ. ら，Ｂasic Ｍethods in Ｍolecul
ar Ｂiology（１９８６）)。 宿主細胞における構築物を従来の方法で使用して、組換え配列によりコードさ
れる遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチド
は、従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。 成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌
、または他の細胞において発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを使用して製造するために、細胞不含
有翻訳システムもまた使用することができる。原核および真核宿主での使用に適
当なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら，Ｍolecular Ｃloning：
Ａ Ｌaboratory Ｍannual，第２版，Ｃold Ｓpring Ｈarbor，Ｎ. Ｙ. （１９８
９)により記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。
【０２３５】 高等真核生物による、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エ
ンハンサー配列をベクターに挿入することにより増大する。エンハンサーは、プ
ロモーターに作用して、その転写を増大させる、通常、約１０〜３００bpの、Ｄ
ＮＡのシス作用性要素である。例には、bp１００〜２７０の、複製起点の後期側
にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハン
サー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルス
エンハンサーが含まれる。 小包体のルーメンへの、細胞周辺腔への、または細胞外環境への、翻訳された
タンパク質の分泌には、適当な分泌シグナルを発現されるペプチドに導入するの
がよい。そのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であってもよく、または
それらは、ヘテロロガスシグナルであってもよい。
【０２３６】 そのポリペプチドは、融合タンパク質のような、修飾された形で発現させても
よく、分泌シグナルだけでなく、付加的ヘテロロガス機能領域もまた含まれ得る
。例えば、付加的アミノ酸、特に帯電したアミノ酸の領域をポリペプチドのＮ末
端に加えて、精製の間の、またはその後の取り扱いおよび保存の間の、宿主細胞
における安定性および持続性を改善することができる。そしてまた、そのポリペ
プチドにペプチド部分を加えて、精製を容易にすることができる。そのポリペプ
チドの最終製造より前に、そのような領域を除去するのがよい。なかでも、分泌
または排出を引き起こすための、安定性を改善するための、そして精製を容易に
するための、ポリペプチドへのペプチド部分の付加は、よく知られており、また
当業界で通常の技術である。好ましい融合タンパク質は、受容体を可溶化するの
に有用である、免疫グロブリン由来のヘテロロガス領域を含んでなる。例えば、
ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３(対応カナダ特許 ２０４５８６９)は、別のヒトタ
ンパク質またはその一部と一緒に、免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分
を含んでなる融合タンパク質を開示している。多くの場合、治療および診断にお
ける使用には、融合タンパク質におけるＦc部分が完全に有利であり、従って、
例えば、改善された薬物動態学的特性を生ずる(ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２)。他
方、幾つかの使用には、融合タンパク質を記載する有利な方法で発現させ、検出
して、精製した後、Ｆc部分を削除できるのが望ましいであろう。これは、Ｆc部
分が治療および診断における使用に対して妨害物であることが証明されている場
合、例えば、融合タンパク質を免疫化のための抗原として使用すべき場合である
。薬物の発見において、例えば、hＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための
ハイスループットスクリーニングアッセイを目的として、shＩＬ５−のようなヒ
トタンパク質をＦc部分と融合した。Ｄ. Ｂennettら，Ｊournal of Ｍolecular
Ｒecognition，第８巻，５２−５８（１９９５）およびＫ. Ｊohansonら，Ｔhe
ＪouＲＮＡl of Ｂiological Ｃhemistry，第２７０巻，第１６号，９４５９−
９４７１頁（１９９５）を参照。
【０２３７】 通例、組換え発現ベクターには、複製起点、および宿主細胞のトランスフォー
メーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ. coliのアンピシリン
耐性遺伝子およびＳ. cerevisiae ＴＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転
写を指揮するために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれ
るであろう。そのようなプロモーターは、なかでも、３−ホスホグリセリン酸キ
ナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱シ
ョックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス構
造配列は、翻訳開始および終結配列、好ましくは、細胞周辺腔または細胞外媒体
への翻訳されたタンパク質の分泌を指揮することができるリーダー配列と共に、
適当な相(phase)で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の
特性、例えば、発現された組換え産物の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−
末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる。 細菌での使用に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造Ｄ
ＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結信号と一緒に、機能的プロモーターを有
する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。そのベクター
は、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主内での増
幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよび複
製起点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主には
、Ｅ. coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typhimurium、並びにＰseudomo
nas属、Ｓtreptomyces属、およびＳtaphylococcus属内の様々な種が含まれるが
、他のものもまた、選択物質として使用することができる。
【０２３８】 代表的であるが、非限定的な例として、細菌での使用に有用なベクターは、周
知のクローニングベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の遺伝要素を含
んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の複製
起点を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３
−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals，Ｕppsala，Ｓweden)およびＧＥＭ１(Ｐrom
ega Ｂiotec，Ｍadison，ＷＩ，ＵＳＡ)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨
核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。 適当な宿主株をトランスフォーメーションして、その宿主株を適当な細胞密度
まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフト
または化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。 細胞を、典型的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により
破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保持する。
【０２３９】 タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音
波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれかの便利な方法に
より破壊することができ、そのような方法は、当業者によく知られている。 組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物の細胞培養系もまた使
用することができる。哺乳動物の発現系の例には、Ｇluzman，Ｃell ２３：１７
５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、
および適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１
２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬa、およびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物の発
現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれ
かの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよび
アクセプター部位、転写終結配列、並びに５'に隣接する非転写配列もまた含ん
でなるであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およびポ
リアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができ
る。
【０２４０】 ＫＧＦ−２ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出
、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマト
グラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマト
グラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製するこ
とができる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終
精製工程に使用することができる。 本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物
であり得るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細菌、酵
母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞によって)組換え技術により製造する
ことができる。組換え製造法において使用される宿主により、本発明のポリペプ
チドは、グリコシル化されてもよいし、またはグルコシル化されなくてもよい。
本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。
【０２４１】 ＫＧＦ−２ポリペプチド、および好ましくはその分泌型はまた、直接単離され
たか、あるいは培養された体液、組織および細胞を含む、天然ソースから精製さ
れた産物；化学合成法の産物；ならびに原核もしくは真核宿主(例えば、細菌、
酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞を含む)から組換え技術により製造され
た産物から回収できる。組換え製造方法において使用する宿主により、ＫＧＦ−
２ポリペプチドは、グリコシル化されることもあり、またはグルコシル化されな
いこともある。さらにＫＧＦ−２ポリペプチドにはまた、時には宿主に媒介され
るプロセスの結果として、最初の修飾メチオニン残基が含まれることがある。す
なわち、すべての真核生物細胞において、一般に翻訳開始コドンによってコード
されるＮ末端メチオニンが、翻訳後に、任意のタンパク質から高い効率で除去さ
れることは当分野において周知である。ほとんどの原核生物では、ほとんどのタ
ンパク質のＮ末端メチオニンは効率的に除去されるが、いくつかのタンパク質に
関しては、Ｎ末端メチオニンが共有結合しているアミノ酸の性質に依存してこの
原核生物の除去プロセスは無効である。
【０２４２】 一態様では、酵母 Pichia pastoris を用い、真核生物系でＫＧＦ−２タンパ
ク質を発現させる。Pichia pastoris は、メタノールをその唯一の炭素源として
代謝できるメチロトローフの酵母である。メタノール代謝経路の主要な工程は、
Ｏ２を用いてメタノールをホルムアルデヒドに酸化することである。この反応は
酵素アルコールオキシダーゼによって触媒される。メタノールをその唯一の炭素
源として代謝するために、Pichia pastoris は、部分的には、アルコールオキシ
ダーゼのＯ２に対するアフィニティーが比較的低いため、高レベルのアルコール
オキシダーゼを生産しなければならない。結果的に、主要な炭素源としてメタノ
ールに依存する培養培地中、２個のアルコールオキシダーゼ遺伝子のうちの１個
（ＡＯＸ１）のプロモーター領域は高度に活性である。メタノールの存在下、Ａ
ＯＸ１遺伝子から生産されるアルコールオキシダーゼは Pichia pastoris 中、
トータルの可溶性タンパク質の約３０％まで含まれる。Ellis, S.B., et al., M
ol. Cell. Biol. 5:1111-21 (1985); Koutz, P.J, et al., Yeast 5:167-77 (19
89); Tschopp, J.F., et al., Nucl. Acids Res. 15:3859-76 (1987) を参照。
このように、すべての、あるいは部分的なＡＯＸ１調節配列の転写調節下、異種
コーディング配列、例えば本発明のＫＧＦ−２ポリヌクレオチドは、メタノール
の存在下で培養された Pichia 酵母中、例外的に高いレベルで発現される。
【０２４３】 一例では、プラスミドベクターｐＰＩＣ９Ｋを用いて、本明細書中に記載のよ
うに、Pichia 酵母系において（本質的に "Pichia Protocols: Methods in Mole
cular Biology," D.R. Higgins and J. Cregg, eds. The Humana Press, Totowa
, NJ, 1998 に記載のように）本発明のＫＧＦ−２ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを発現する。この発現ベクターは、マルチクローニング部位の上流に位置す
る Pichia pastoris アルカリホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド
（すなわちリーダー）に連結された強いＡＯＸ１プロモーターのおかげで、本発
明のＫＧＦ−２タンパク質の発現および分泌を可能にする。
【０２４４】 当業者であれば容易に理解できるであろうように、発現構築体が転写、翻訳、
分泌（所望であれば）などに関する適当な位置付けシグナルを提供する限り、ｐ
ＰＩＣ９Ｋの代わりに、必要とされるイン−フレームＡＵＧを含む、多くの他の
酵母ベクター、例えばｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２
／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈａ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩ
Ｃ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、およびＰＡＯ
８１５を用いることができる。
【０２４５】 別の態様では、異種コーディング配列、例えば本発明のＫＧＦ−２ポリヌクレ
オチドの高レベル発現は、本発明の異種ポリヌクレオチドを発現ベクター、例え
ばｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺａｌｐｈａにクローニングし、メタノールの不存
在下で酵母培養を生育させることによって達成することができる。
【０２４６】 本明細書中で議論されるベクター構築体を含む宿主細胞を含むことに加えて、
本発明はまた、内因性の遺伝的物質（例えばＫＧＦ−２コーディング配列）を欠
失あるいは置換するように、ならびに／あるいは本発明のＫＧＦ−２ポリヌクレ
オチドと作動可能に結合し、内因性ＫＧＦ−２ポリヌクレオチドを活性化、変更
、および／または増幅する遺伝的物質（例えば異種ポリヌクレオチド配列）を含
むように操作された脊椎動物起源、特に哺乳類起源の一次、二次、および不死化
宿主細胞を含む。例えば、当分野に既知の技術を用いて、相同組換えによって、
異種制御領域（例えばプロモーターおよび／またはエンハンサー）と内因性ＫＧ
Ｆ−２ポリヌクレオチド配列を作動可能に結合することができ、これにより新規
転写ユニットが形成することができる（例えば、１９９７年６月２４日発行の米
国特許第５，６４１，６７０号、１９９８年３月３１日発行の米国特許第５，７
３３，７６１号；１９９６年９月２６日公開の国際公開第ＷＯ９６／２９４１１
号；１９９４年８月４日公開の国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号；Koller et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); および Zijlstra et
al., Nature 342:435-438 (1989)（これらのそれぞれの開示内容は引用によりそ
の全体が包含される）を参照）。
【０２４７】 ＫＧＦ−２の診断上および治療上の適用 以下の節で使用するように、「ＫＧＦ−２」という語は、本明細書中に記載す
る全長のＫＧＦ−２、および成熟型のＫＧＦ−２、並びに本明細書中に記載する
ＫＧＦ−２アナログ、誘導体、および変異体を言うことを意図する。本発明はま
た、ＫＧＦ−２核酸配列中の変異の存在に関係がある疾患、またはその疾患に対
する感受性を検出するための診断アッセイの一部としての、ＫＧＦ−２遺伝子の
使用にも関する。 ＫＧＦ−２遺伝子において変異が起こっている個体は、様々な技術により、Ｄ
ＮＡレベルで検出することができる。診断用の核酸は、患者の細胞から、例えば
、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料から得ることができる。ゲノムＤＮ
Ａは、検出に直接使用することができ、または分析前にＰＣＲ(Ｓaikiら，Ｎatu
re ３２４：１６３−１６６（１９８６）)を使用することにより、酵素的に増幅
することができる。ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた、同じ目的に使用することがで
きる。例としては、ＫＧＦ−２をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを
使用して、ＫＧＦ−２変異を同定して分析することができる。例えば、欠失およ
び挿入は、正常な遺伝子型と比較しての増幅産物のサイズにおける変化により検
出することができる。点変異は、増幅されたＤＮＡが、放射能標識化ＫＧＦ−２
のＲＮＡ、あるいはまた、放射能標識化ＫＧＦ−２のアンチセンスＤＮＡ配列に
ハイブリダイズすることにより同定することができる。完全にマッチしている配
列は、ＲＮアーゼ Ａの消化により、または融解温度の相違により、マッチして
いない二本鎖と区別することができる。
【０２４８】 ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝試験は、変性剤を含む、または変性剤を含ま
ないゲルでのＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により成
し遂げることができる。小さな配列の欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動
により視覚化することができる。ＤＮＡフラグメントの様々な配列は、変性ホル
ムアミドのグラジエントゲル上で区別することができ、ここでは、様々なＤＮＡ
フラグメントの移動度が、それらの特異的な融解温度または部分的な融解温度に
より、ゲルにおける様々な位置で遅延される(例えば、Ｍyersら，Ｓcience ２３
０：１２４２（１９８５）を参照)。 特殊な位置での配列変化はまた、ＲＮアーゼおよびＳ１保護といったようなヌ
クレアーゼ保護アッセイ、または化学切断法(例えば、Ｃottonら，ＰＮＡＳ，Ｕ
ＳＡ ８５：４３９７−４４０１（１９８５）)によっても明らかとされ得る。 従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーショ
ン、ＲＮアーゼ保護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用(
例えば、制限断片長多型(ＲＦＬＰ)、およびサザンブロット法といったような方
法により成し遂げることができる。 より従来的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、in s
itu 分析により検出することもできる。
【０２４９】 本発明はまた、正常な対照組織のサンプルと比べてのタンパク質の過剰発現が
、疾患(例えば、腫瘍)、または疾患に対する感受性の存在を検出することができ
ることから、様々な組織におけるＫＧＦ−２タンパク質レベルの変化を検出する
ための診断アッセイにも関する。宿主から得られる試料におけるＫＧＦ−２タン
パク質レベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者によく知られてお
り、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、Ｅ
ＬＩＳＡアッセイ、および「サンドイッチ」アッセイが含まれる。ＥＬＩＳＡア
ッセイ(Ｃoliganら，Ｃurrent Ｐrotocols in Ｉmmunology，１(２)，第６章（
１９９１）)には、最初、ＫＧＦ−２抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクロ
ーナル抗体を製造することを含んでなる。加えて、リポーター抗体をモノクロー
ナル抗体に対して製造する。リポーター抗体に、放射能、蛍光、またはこの例で
は、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のような検出可能な試薬を結合させる。試
料を宿主から採取して、固形支持体(例えば、試料中のタンパク質を結合するポ
リスチレン皿)上でインキュベートする。次いで、ウシ血清アルブミンのような
非特異的タンパク質とインキュベーションすることにより、皿上のタンパク質が
結合していない部位をいずれもカバーする。次に、モノクローナル抗体が、ポリ
スチレン皿に付着した、いずれのＫＧＦ−２タンパク質にも結合する。結合して
いないモノクローナル抗体を全て、緩衝液で洗い流す。ここで、西洋ワサビペル
オキシダーゼに結合したリポーター抗体を皿に入れると、ＫＧＦ−２に結合した
全てのモノクローナル抗体へのリポーター抗体の結合が生ずる。次いで、結合し
ていないリポーター抗体を洗い流す。次いで、その皿にペルオキシダーゼ基質を
加えて、一定時間内に発色する量が、標準曲線に対して比べた場合、一定体積の
患者の試料中に存在するＫＧＦ−２タンパク質の量の測定値である。
【０２５０】 競合アッセイを使用してもよく、ここでは、ＫＧＦ−２に特異的な抗体を固形
支持体に結合させ、その固形支持体に標識化ＫＧＦ−２、および宿主から得られ
る試料を通過させて、例えば、液体シンチレーションクロマトグラフィーにより
検出されるレベルの量を試料中のＫＧＦ−２の量に相関させることができる。 「サンドイッチ」アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイに似ている。「サンドイッ
チ」アッセイでは、ＫＧＦ−２を固形支持体に通過させて、固形支持体に結合し
た抗体に結合させる。次いで、二次抗体をＫＧＦ−２に結合させる。標識化した
、また二次抗体に特異的な三次抗体を固形支持体に通過させて、二次抗体に結合
させた後、量を定量することができる。 ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらの
アナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに対す
る抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまた
はモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト
化抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの産物
も含まれる。当業界で知られている様々な方法を、そのような抗体およびフラグ
メントの製造に使用することができる。
【０２５１】 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、そのポリペ
プチドを動物に直接注射することにより、またはそのポリペプチドを動物、好ま
しくはヒトでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのよ
うにして得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法
では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、全ての天然の
ポリペプチドを結合する抗体を生成させるために使用することができる。次いで
、そのような抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチ
ドを単離することができる。 モノクローナル抗体の製造には、連続的な細胞系培養により製造される抗体を
与える技術をいずれも使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術(Ｋo
hlerおよびＭilstein，Ｎature ２５６:４９５−４９７（１９７５）)、トリオ
ーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら，Ｉmmunology Ｔ
oday ４：７２（１９８３）)、およびヒトモノクローナル抗体を製造するための
ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃoleら，Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer
Ｔherapy，Ａlan Ｒ. Ｌiss, Ｉnc. ，７７−９６頁（１９８５）)が含まれる。 単鎖抗体の製造に関して記載されている技術(米国特許第４,９４６,７７８号)
は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し
得る。そしてまた、トランスジェニックマウスを使用して、本発明の免疫原ポリ
ペプチド産物に対するヒト化抗体を発現させることもできる。
【０２５２】 本発明のポリペプチドは上皮の生育を刺激することが示された。したがって、
本発明のポリペプチドを用いて、上皮の生育を刺激することができる。「上皮」
とは、身体の内部および外部表面を覆うものを意味し、これには、血管内皮およ
び他の小腔が含まれる。これは少量の接合物質によって結合される細胞から構成
される。上皮は、層の深さの数および表面細胞の形に基づいて分類される。内皮
細胞には、角膜上皮、バレット上皮、糸球体包外壁、線毛上皮、円柱上皮、角膜
上皮、立方上皮、半規管上皮、エナメル上皮、仮性上皮、胚上皮、歯肉上皮、腺
上皮、糸球体包内壁、重層上皮、水晶体上皮（epithelium of the lend）、間葉
上皮、嗅上皮、単層扁平上皮、色素上皮、保護上皮、多列上皮、錐体状上皮、呼
吸上皮、杆状上皮、精上皮、感覚上皮、単層上皮、扁平上皮、重層上皮、被膜下
上皮、溝上皮、モザイク様上皮、移行上皮、および、眼、下、腺、口腔粘膜、十
二指腸、回腸、空腸、盲腸、鼻腔、食道、大腸、乳腺、および雌性および雄性の
生殖系の上皮細胞が含まれる。
【０２５３】 「腺」とは、細胞の集合を意味し、その通常の代謝的必要物に関係しない分泌
または排泄物質に特化している。上皮細胞を含み得る腺の例には、吸収腺（abso
rbent clangs）、副腺、房状腺、酸分泌腺、副耳下腺、副腎、集合腺、アルバラ
ン腺、肛門腺、胞状腺、前前立腺、大動脈腺、前舌腺、アポクリン腺、乳輪腺、
動脈腺、尾骨小体、後喉頭腺、アセリ腺、アビセンナ腺、副腎、腋窩腺、バルト
リン腺、バウヒン腺、バウムガルテン腺、胆管粘液腺、ブランジン腺、血管腺、
ボールハーベ腺、ボンノット腺、ボーマン腺、上腕腺、気管支腺、ブルック腺、
ブルンネル腺、頬腺、球海綿体腺、噴門腺、頚動脈腺、腹腔腺、耳道腺、子宮頚
管腺、脈絡腺、チャーチョ腺、毛様腺、肛門周囲腺、クロケー腺、コベリ腺、尾
骨腺、捲状腺、接合腺、球状腺、結膜腺、カウパー腺、皮膚腺、内分泌腺、十二
指腸腺、デュベルネ腺、エブネル腺、エクリン腺、エグリ腺、内分泌腺、上皮内
腺、食道腺、排出腺、外分泌腺、管小胞腺（follicular glands of the duct）
、胃底腺、胃腺、胃大網腺、ゲイ腺、生殖腺、歯肉腺、グレー腺、球状腺、糸球
状腺、舌口蓋腺、ゲラン腺、咽喉腺、ハレル腺、ハーダー腺、ハーバース腺、快
楽腺、血管腺、血管リンパ腺、造血腺、血リンパ腫、ヘンレ腺、肝腺、ヘテロク
リン腺、冬眠腺、ホロクリン腺および内分泌腺が含まれる。
【０２５４】 腺のさらなる例には、頚動脈間腺、中間腺、肩甲間腺、間質腺、腸腺、上皮内
腺、舌筋内腺、頚静脈腺、クラウゼ腺、口唇腺、涙腺、副涙腺、乳腺、大腸腺、
大汗腺、喉頭腺、胃レンズ状腺および下レンズ状腺、リーベルキューン腺、舌腺
、前舌腺、リトレー腺、ルシュカ腺、耳下腺リンパ節、頬腺、乳腺、副乳腺、顎
下腺、マンツ腺、メーリス腺、マイボーム腺、メロクリン腺、腸間膜腺、結腸間
膜腺、混合腺、臼歯腺、モル腺、単層腺、モントゴメリー腺、モルガン腺、口腔
腺、粘液腺、粘液分泌腺、粘液腺、舌粘液腺、耳管粘液腺、十二指腸粘液腺、ユ
ウスタキイ管粘液腺、多細胞腺、子宮筋腺、ナボット腺、ナボット腺（nabothia
n glands）、鼻腺、頚腺、包皮臭腺、脂腺、嗅腺、酸分泌腺、パキオニ腺、口蓋
腺、膵脾腺、傍小帯腺、傍甲状腺、傍尿道腺（parurethral glands）、耳下腺、
副耳下腺、胸部腺、ペプシン腺、汗腺、パイエル腺、咽頭腺、フィリップ腺、松
果腺および下垂体が含まれる。
【０２５５】 腺の他の例には、ポアリエ腺、多層腺、尾腺、妊娠腺、前舌骨腺、包皮腺、前
立腺、思春期腺、幽門腺、房状腺、後舌腺、臼後腺、リビーヌス腺、ローゼンミ
ュレル腺、嚢状腺、唾液腺、腹部唾液腺、外唾液腺、内唾液腺、サンドストレー
ム腺、シュレル腺、皮脂腺、結膜脂腺、前哨腺、混合腺、漿液腺、サース腺、ジ
グムンド腺、スキーン腺、単一腺、小腸孤立腺、大腸の孤立腺、脾様腺、スター
ル腺、口蓋腺、耳介下腺、舌下腺、顎下腺、汗腺、副腎、副副腎、スザンヌ腺、
汗腺、滑液腺、瞼板腺、タイレ腺、胸腺、甲状腺、副甲状腺、舌腺、気管腺、ト
ラコーマ腺、管状腺、管状胞状腺、鼓室腺、タイソン腺、単細胞腺、尿道腺、女
性尿道腺、尾腺、子宮腺、卵形嚢腺、膣腺、血管腺、前庭腺（大および小）、ウ
ィルヒョウ腺、卵黄腺、外陰膣腺、ワルダイエル腺、ウェーベル腺、ウォルフリ
ング腺、ツァイス腺およびツッカーカンドル腺が含まれる。
【０２５６】 したがって、ＫＧＦ−２を用いて、これらの腺に含まれる任意のこれらの細胞
または細胞群の生育を刺激することができる。
【０２５７】 本発明のポリペプチドを使用して、新たな血管成長または脈管形成を刺激する
ことができる。特に、本発明のポリペプチドは、ケラチノサイト細胞の成長およ
び増殖を刺激し得る。従って、本発明は、そのようなポリペプチド、またはその
ようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療目的に、例えば、創
傷治癒を目的として上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを刺激するために、
そして毛包産生および皮膚創傷の治癒を刺激するために利用する方法を提供する
。 先に述べたように、本発明のポリペプチドを使用して、上皮細胞増殖を刺激す
ることにより、皮膚創傷を治癒することができる。これらの創傷は、表在性のも
のであっても、深在性のものであってもよく、皮膚の真皮および表皮の損傷を伴
う。従って、本発明は、個体へのＫＧＦ−２の有効量の投与を伴う、創傷治癒の
促進方法を提供する。 ＫＧＦ−２を投与する個体は、創傷を正常な速度で治癒し得るか、または治癒
が損なわれ得る。治癒が損なわれていない個体に投与する場合には、ＫＧＦ−２
を投与して、正常な治癒プロセスを増進する。治癒が損なわれた個体に投与する
場合には、ＫＧＦ−２を投与して、治癒するのが遅いか、そうでなければ、全く
治癒しない創傷の治癒を容易にする。以下に述べるように、多くの苦痛および状
態は、治癒障害を生じ得る。これらの苦痛および状態には、糖尿病(例えば、Ｉ
Ｉ型真性糖尿病)、ステロイドおよび他の薬理学的物質の両方での処置、並びに
虚血性ブロックまたは傷害が含まれる。創傷治癒を損なうことが示されたステロ
イドには、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、およびメチルプレ
ドニゾロンが含まれる。
【０２５８】 非ステロイド化合物(例えば、酢酸オクトレオイド)もまた、創傷治癒を損なう
ことが示された。Ｗaddell，Ｂ. ら，Ａm. Ｓurg. ６３：４４６−４４９（１９
９７）。本発明は、そのような非ステロイド剤での処置を受けている個体におけ
る創傷治癒を促進すると信じられる。 多くの増殖因子は、治癒が損なわれた個体において創傷治癒を促進することを
示した。例えば、Ｓteed，Ｄ. ら，Ｊ. Ａm. Ｃoll. Ｓurg. １８３：６１−６
４（１９９６）；Ｒichard, Ｊ. ら，Ｄiabetes Ｃare １８：６４−６９（１９
９５）；Ｓteed，Ｄ. ，Ｊ. Ｖasc. Ｓurg. ２１：７１−７８（１９９５）；Ｋ
elly, Ｓ. ら，Ｐroc. Ｓoc. Ｅxp. Ｂiol. １９４：３２０−３２６（１９９０
）を参照。これらの増殖因子には、増殖ホルモン放出因子、血小板由来増殖因子
、および塩基性線維芽細胞増殖因子が含まれる。従って、本発明はまた、創傷治
癒を促進する、１つまたはそれ以上の付加的増殖因子または他の物質と共に、Ｋ
ＧＦ−２の投与も包含する。
【０２５９】 本発明はまた、創傷を正常な速度で治癒する個体、および治癒が損なわれてい
る個体の両方において、手術法により引き起こされる吻合創傷および他の創傷の
治癒を促進する方法も提供する。この方法は、吻合手術もしくは他の手術の前、
吻合手術もしくは他の手術の後、および／または吻合手術もしくは他の手術の間
に、個体へのＫＧＦ−２の有効量の投与を伴う。吻合は、例えば、腸管の中央切
片を摘出し、残りの部分を一緒に繋いで、腸管を再構築する場合に起こるような
、２つの管状構造の連結である。皮膚治癒とは違って、吻合創傷の治癒プロセス
は、一般に、見たところはっきりしていない。さらに、少なくとも胃腸管におけ
る創傷治癒は、合併症の不存在下で急速に起こる；しかし、合併症は、しばしば
、付加的手術による修正を必要とする。Ｔhornton, Ｆ. およびＢarbul, Ａ. ，
Ｓurg. Ｃlin. Ｎorth Ａm. ７７：５４９−５７３（１９９７）。 実施例２１および２８に示すように、ＫＧＦ−２での処置は、結腸吻合の後に
起こる腹膜漏出および吻合絞窄の著しい減少を引き起こす。ＫＧＦ−２は、治癒
プロセスを増進し、従って、そのような方法の後に生ずる合併症の見込みを減少
させることにより、これらの結果を引き起こすと信じられる。 従って、本発明はまた、創傷を正常な速度で治癒する個体、または治癒が損な
われている個体において、吻合または他の手術法後の治癒を増進する方法であっ
て、ＫＧＦ−２の有効量の投与を含んでなる方法も提供する。
【０２６０】 本発明のポリペプチドはまた、細胞(例えば、筋細胞、神経組織を構成する細
胞、前立腺細胞、および肺細胞)の分化を刺激するために使用することもできる
。 ＫＧＦ−２は、正常な個体において、並びに尿毒症、栄養失調、ビタミン欠乏
症、肥満、感染、免疫抑制、およびステロイド、放射線療法、並びに抗腫瘍性薬
物および代謝拮抗物質での全身処置と関連している合併症といったような、他の
異常な創傷治癒を誘発する状態にさらされている個体において、手術による創傷
、切除による創傷、真皮および表皮の損傷を伴う深い創傷、眼組織の創傷、歯組
織の創傷、口腔の創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚潰瘍、肘潰瘍、動脈潰瘍、静脈うっ
血潰瘍、並びに熱曝露または化学薬品から生ずる熱傷が含まれる創傷の創傷治癒
を刺激するのに臨床的に有用であり得る。ＫＧＦ−２はまた、虚血および虚血性
傷害(例えば、静脈循環系リターン(return)の障害および／または不全により引
き起こされる慢性静脈脚潰瘍)と関連している創傷の治癒を促進するのにも有用
である。
【０２６１】 ＫＧＦ−２を使用して、皮膚損失後の皮膚再癒着を促進することもできる。加
えて、ＫＧＦ−２を使用して、表皮の張力強度および表皮の厚さを増大させるこ
とができる。 ＫＧＦ−２を使用して、皮膚移植片の付着を増大させ、また創傷床からの再上
皮形成を刺激することができる。次のものは、ＫＧＦ−２を使用して、創傷床へ
の付着を増大させることができるであろう移植片の種類である；自己移植片、人
工皮膚、ホモロガス移植片、自己植皮片、自己表皮移植片、無血管移植片、ブレ
ア−ブラウン移植片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移植片、遅延移植片、皮
膚移植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、ヘテロロガス移植片、ヘ
テロロガス移植片、ホモロガス移植片、増殖性移植片、層板移植片、網状移植片
、粘膜移植片、オリエ−ティールシュ移植片、大網移植片、パッチ移植片、茎状
移植片、全層移植片、中間層皮膚移植片、分層皮膚移植片。ＫＧＦ−２を使用し
て、皮膚強度を促進し、また老化した皮膚の外観を改善することができる。
【０２６２】 ＫＧＦ−２はまた、肝細胞増殖、肺、胸部、膵臓、胃、小腸、および大腸にお
ける上皮増殖における変化も引き起こすであろうと信じられる。ＫＧＦ−２は、
皮脂細胞、毛包、肝細胞、ＩＩ型肺細胞、ムチンを産生する杯細胞、および他の
上皮細胞といったような上皮細胞、並びに皮膚、肺、肝臓、腎臓、および胃腸管
内に含まれる、それらの前駆細胞の増殖を促進することができる。実施例３１に
示される様に、ＫＧＦ−２は肝細胞の増殖を促進する。したがってＫＧＦ−２は
、予防的または治療的に用いて、急性または慢性ウイルス性肝炎ならびに、急性
ウイルス性肝炎、肝硬変、薬物およびトキシン誘導性肝炎（例えばアセトアミノ
フェン、四塩化炭素、メトトレキセート、有機アルセニカル（arsenicals）、お
よび当分野に既知の他のヘパトトキシン）、自己免疫慢性活性肝炎、肝移植およ
び部分的肝切除のような疾患によって引き起こされる劇症性またはサブ劇症性の
肝不全を予防または減弱することができる（Cortan et al., Pathologic basis
of disease. (5th ed). Philadelphia, W.B. Saunders Company, 1994）。また
、ＫＧＦ−２を用いて、肝再生を、ならびにアルコール性肝疾患の患者において
刺激または促進することができる。ＫＧＦ−２を用いて肝臓の線維症を処置でき
る。
【０２６３】 約８０％の急性膵炎の場合は胆管疾患およびアルコール症に関連する（Rattne
r D.W., Scand J Gastroenterol 31:6-9 (1996); Cortan et al., Pathologic b
asis of disease. (5th ed). Philadelphia, W.B. Saunders Company, 1994）。
急性膵炎は、重大な罹患率および死亡率を有する重大な臨床的問題である（Bane
rjee et al., British Journal of Surgery 81:1096-1103 (1994)）。この疾患
の病因は依然いくらか未解決であるが、膵臓の酵素が膵臓内に放出され、タンパ
ク質分解、間質性炎症、脂肪壊死、および出血を生じさせることが広く認識され
ている。急性膵炎は播種性血管内血液凝固、成人呼吸困難症候群、ショック、お
よび急性腎尿細管壊死を生じさせ得る（Cortan et al., Pathologic basis of d
isease. (5th ed). Philadelphia, W.B. Saunders Company, 1994）。対症処置
にもかかわらず、これらの患者の約５％は臨床経過の第一週の間にショックで死
ぬ。生存患者において、後遺症には、膵膿瘍、偽嚢胞、および十二指腸閉塞が含
まれ得る（Cortan et al., Pathologic basis of disease. (5th ed). Philadel
phia, W.B. Saunders Company, 1994）。慢性膵炎はしばしば、急性膵炎が繰り
返し突発することによって生じる膵臓の進行性破壊である。慢性膵炎は膵癌の危
険性を穏やかに増大させることを招くようである（Cortan et al., Pathologic
basis of disease. (5th ed). Philadelphia, W.B. Saunders Company, 1994）
。
【０２６４】 上および実施例３１に示されるように、ＫＧＦ−２はまた、膵細胞の増殖を促
進する。したがって、さらなる側面では、ＫＧＦ−２を予防的または治療的に用
いて、急性または慢性膵炎を予防または減弱できる。
【０２６５】 ＫＧＦ−２を使用して、ウイルス感染の処置、放射線療法、化学療法、または
他の処置から生ずる消化管毒性の副作用を減少させることもできる。ＫＧＦ−２
は、小腸粘膜に対して細胞保護作用を有し得る。ＫＧＦ−２を予防的に、または
治療的に使用して、粘膜炎を予防または減弱する、そして化学療法、他の物質、
およびウイルス感染から生ずる粘膜炎(口潰瘍、食道潰瘍、腸管潰瘍、結腸潰瘍
、直腸潰瘍、および肛門潰瘍)の治癒を刺激することもできる。従って、本発明
はまた、潰瘍性大腸炎、クローン病、および粘膜が損傷される他の疾患を含め、
粘膜の疾患または病的事象を予防または処置する方法であって、ＫＧＦ−２の有
効量の投与を含んでなる方法も提供する。本発明は同様に、この損傷を引き起こ
す物質またはモダリティー(modality)にかかわらず、口粘膜炎(咽頭および下咽
頭における粘膜傷害と関連している嚥下痛が含まれる)、食道粘膜炎、胃粘膜炎
、腸管粘膜炎、結腸粘膜炎、および直腸粘膜炎の予防または処置する方法を提供
する。
【０２６６】 さらに、ＫＧＦ−２は、化学物質による水疱および火傷、例えば化学療法剤に
よる治療またはシクロホスファミドによる治療などに起因する卵巣損傷、放射線
照射または化学療法により惹起された膀胱炎、または高投与量化学療法により惹
起された小腸損傷などの治療および／または予防に用いることができる。ＫＧＦ
−２は内的治療の促進、ドナー部位治療、外科的創傷の内的治癒、または、美容
外科で生じた切り傷の治療に用いることができる。
【０２６７】 ＫＧＦ−２は、内皮細胞、ケラチノサイト、および塩基性ケラチノサイトの増
殖を促進することができる。従って、本発明はまた、細胞を有効量のＫＧＦ−２
と接触させることを含む、そのような細胞タイプの増殖を刺激する方法も提供す
る。ＫＧＦ−２の有効量を個体に投与して、インビボにおける細胞増殖を刺激す
ることができ、またはＫＧＦ−２をそのような細胞とインビトロにおいて接触さ
せることができる。 本発明はさらに、尿路上皮の治癒を促進する方法であって、ＫＧＦ−２の有効
量を個体に投与することを含んでなる方法を提供する。従って、本発明は、尿路
上皮細胞(すなわち、尿路の内側を覆う細胞)を含む様々な病状の治癒または処置
を増進する方法を提供する。そのような細胞を含んでなる組織層は、カテーテル
法、手術、または細菌感染(例えば、淋病のような、性的に伝播する疾患を引き
起こす物質による感染)が含まれる多数の機構により損傷され得る。 本発明はまた、女性の生殖路における組織治癒の促進方法であって、ＫＧＦ−
２の有効量の投与を含んでなる方法も包含する。女性の生殖路における組織損傷
は、Ｃandida感染、トリコモナス症、Ｇardnerella、淋病、クラミジア、マイコ
プラスマ感染、および他の性的に伝播する疾患が含まれる、広範囲にわたる様々
な状態により引き起こされ得る。
【０２６８】 実施例１０、１８、および１９に示すように、ＫＧＦ−２は、表皮ケラチノサ
イトの増殖を刺激して、表皮の肥厚を増大させる。従って、ＫＧＦ−２は、皮膚
の全体的な再生において；熱傷(すなわち、毛包、汗腺、および脂腺のレポピュ
レーション)を含め、全体的および部分的厚さの皮膚欠損において；および乾癬
のような他の皮膚欠損の処置において使用することができる。 ＫＧＦ−２を使用して、表皮水疱症、結果的には、口の開いた痛い水疱を生ず
ることの多い、基盤となる真皮への表皮の付着における欠損を、これらの病巣の
再上皮形成を増進することにより処置することができる。ＫＧＦ−２を使用して
、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を処置し、また粘膜内層並びに腺粘膜および十二指
腸粘膜内層の再生をより迅速に治癒するのに役立てることもできる。クローン病
および潰瘍性大腸炎といったような炎症性腸疾患は、各々、小腸または大腸の粘
膜表面の破壊を生ずる疾患である。従って、ＫＧＦ−２を使用して、粘膜表面の
再表面形成を促進し、より迅速な治癒を手助けして、炎症性腸疾患の進行を予防
または減弱することができる。ＫＧＦ−２の処置は、胃腸管中での粘液の産生に
対して重要な作用を有することが期待され、これを使用して、摂取された有害な
物質から、または手術後に腸粘膜を保護することができる。先に述べたように、
ＫＧＦ−２を使用して、腸管吻合または結腸吻合の治癒を促進することもできる
。ＫＧＦ−２をさらに使用して、ＫＧＦ−２の発現不足と関連している疾患を処
置することができる。 さらに、ＫＧＦ−２を使用して、様々な病的状態により引き起こされる肺への
損傷を予防および治癒することができる。増殖因子として、ＫＧＦ−２は、増殖
および分化を刺激し、肺胞および細気管支上皮の修復を促進し、急性または慢性
肺損傷を予防、減弱、または処置することができる。例えば、肺胞の進行性損失
を生ずる気腫、および吸入傷害(すなわち、煙の吸入から生ずる)、並びに細気管
支上皮および肺胞の壊死の原因となる熱傷は、ＫＧＦ−２を使用して有効に処置
することができる。そしてまた、ＫＧＦ−２を使用して、ＩＩ型肺細胞の増殖お
よび分化を刺激することができ、これは、硝子膜疾患(例えば、乳児の呼吸窮迫
症候群、および早産の乳児における気管支肺の非形成)のような疾患を処置また
は予防するのに役立てることができる。
【０２６９】 以下の実施例３２に示されるように、ＫＧＦ−２は肺上皮細胞の増殖を促進す
る。したがって、ＫＧＦ−２は、様々な病的状態によって引き起こされる肺に対
する損傷を減少または阻止するために予防的に投与することができる。ＫＧＦ−
２はさらに、治癒を促すために、傷害事象が起こっている間かまたはその後に投
与することができる。例えば、ＫＧＦ−２は、増殖および分化を促進し、肺胞お
よび気管支の上皮の修復を促して、急性または慢性の肺損傷を阻止、減少または
処置することができる。気管支上皮および肺胞の壊死を引き起こす気腫（肺胞の
進行性の喪失をもたらす）および吸気傷害（即ち煙の吸引および火傷により引き
起こされる）は、化学療法、放射線治療、肺がん、喘息、黒肺塵症およびその他
肺の損傷状態に帰する損傷と同様、ＫＧＦ−２を用いて有効に処置することがで
きる。ＫＧＦ−２は、ＩＩ型肺胞細胞の増殖および分化を促進するために使用す
ることができ、硝子膜症などの疾患、早産児における小児型呼吸窮迫症候群およ
び気管支形成異常などの処置または阻止を助けることができる。
【０２７０】 急性腎不全の３つの原因は、腎前性(例えば、心不全)、内因性(例えば、化学
療法剤により誘発される腎毒性)、および腎後性(例えば、尿管閉塞)であり、腎
尿細管細胞の壊死、尿細管腔の閉塞、および糸球体への濾液の逆流をもたらす(
Ｔhadhaniら，Ｎ. Ｅugl. Ｊ. Ｍed. ３３４：１４４８−１４６０（１９９６）
によりレビューされている)。インスリン様増殖因子Ｉ、骨形成タンパク質−１
、肝細胞増殖因子、および表皮増殖因子といったような増殖因子は、動物モデル
における腎疾患を回復させることに対する可能性を示した。Ｔaubら，Ｃytokine
５：１７５−１７９（１９９３）；Ｖukicevicら，Ｊ. Ａm. Ｓoc. Ｎephrol.
７：１８９６（１９９６）。ＫＧＦ−２は、腎細胞の増殖および分化を刺激する
ことができ、従って、これを使用して、急性および慢性腎不全といったような腎
疾患および病状、並びに末期の腎疾患を軽減または処置することができる。 ＫＧＦ−２は、胸部組織の増殖および分化を刺激することができ、それゆえに
、これを使用して、手術、外傷、または癌による胸部組織傷害の治癒を促進する
ことができる。 加えて、ＫＧＦ−２を使用して、糖尿病の発症を処置または予防することがで
きる。膵島細胞機能が幾分残存する、新たに診断されたＩおよびＩＩ型糖尿病を
患う患者において、ＫＧＦ−２を使用して、疾患の永続的な発現を軽減、遅延、
または予防するよう、膵島機能を維持することができる。ＫＧＦ−２を膵島細胞
移植における補助物質として使用して、膵島細胞機能を改善または促進すること
ができる。
【０２７１】 さらに、ＫＧＦ−２の抗炎症性は、限定されるものではないが、乾癬、湿疹、
皮膚炎、および／または関節炎を含め、炎症が疾患の鍵となる病状である、急性
および慢性状態を処置するのに有利であり得る。従って、本発明は、個体におけ
る炎症、および炎症を伴う疾患を予防または減弱する方法であって、ＫＧＦ−２
の有効量の投与を含んでなる方法を提供する。 ＫＧＦ−２を使用して、外傷、手術、または化学薬品由来の傷害による脳組織
の損傷の治癒を促進して、軽減することができる。 加えて、ＫＧＦ−２は、表皮の厚さを増大させることから、老化した皮膚を改
善するために、皮膚の皺を減少させるために、手術後の瘢痕形成を減少させるた
めに、そのタンパク質を使用することができる。創傷組織の瘢痕形成は、しばし
ば、皮膚線維芽細胞の過増殖を伴う。実施例１０に示すように、線維芽細胞増殖
は、ＫＧＦ−２により刺激されない。従って、ＫＧＦ−２は、表皮ケラチノサイ
トに特異的なマイトジェンであるらしく、最小の瘢痕形成を有する創傷治癒を誘
発する。従って、本発明は、個体へのＫＧＦ−２の有効量の投与を伴う、最小の
瘢痕形成を有する創傷の治癒を促進する方法を提供する。ＫＧＦ−２は、創傷(
例えば、美容手術、鋭利な物体により引き起こされる偶発的または故意的組織外
傷)が引き起こされる前、創傷が引き起こされている間、および／または創傷が
引き起こされた後に投与するのがよい。
【０２７２】 先に述べたように、ＫＧＦ−２はまた、ケラチノサイトおよび毛包の増殖も刺
激し、従って、これを使用して、禿げかかった頭皮からの毛髪成長、および毛髪
移植患者における毛髪成長を促進することができる。従って、本発明はさらに、
毛髪成長を促進する方法であって、毛包の産生を刺激するのに十分な量のＫＧＦ
−２の投与を含んでなる方法を提供する。 本発明はまた、電離放射線、化学療法、または抗ウイルス剤での処置の作用か
ら個体を保護する方法であって、ＫＧＦ−２の有効量の投与を含んでなる方法も
提供する。本発明はさらに、電離放射線、化学療法剤、または抗ウイルス剤に対
する曝露から生ずる組織損傷を処置する方法であって、ＫＧＦ−２の有効量の投
与を含んでなる方法を提供する。環境への放射性同位体の偶発的放出の結果とし
て、または非侵襲的な医用診断法(例えば、Ｘ線)の間に、治療上の目的(例えば
、過増殖性傷害の処置のため)を含め、多くの理由から、個体は電離放射線に曝
露され得る。さらに、相当な数の個体が、彼らの仕事場および家庭において放射
性ラドンに曝露される。長期にわたる連続的な環境曝露を使用して、損失した平
均余命の推定値が計算された。Ｊohnson, Ｗ. およびＫearfott，Ｋ. ，Ｈealth
Ｐhys. ７３：３１２−３１９（１９９７）。実施例２３に示すように、本発明
のタンパク質は、放射線に曝露した動物の生存を高める。従って、ＫＧＦ−２を
使用して、放射線により誘発される傷害を患っている個体の生存率を増大させる
こと、致死量以下の放射線から個体を保護すること、そして過増殖性障害のよう
な苦痛の処置における治療上の照射割合を増大させることができる。
【０２７３】 ＫＧＦ−２を使用して、普通、耐性がない放射線、化学療法薬、または抗ウイ
ルス剤に対して個体を保護することもできる。この方法で使用する場合、または
本明細書中で特に記載する場合、ＫＧＦ−２は、放射線療法／曝露、化学療法、
または抗ウイルス剤での処置の前、放射線療法／曝露、化学療法、または抗ウイ
ルス剤での処置の後、および／または放射線療法／曝露、化学療法、または抗ウ
イルス剤での処置の間に投与してもよい。過増殖性障害のような、進行した段階
の苦痛を有する個体を処置する場合には、高用量の放射線および化学療法剤がと
りわけ有用であり得る。 別の態様において、本発明は、放射線により誘発される口傷害および胃腸管傷
害、粘膜炎、腸管線維症、直腸炎、放射線により誘発される肺線維症、放射線に
より誘発される肺炎、放射線により誘発される胸膜退縮、放射線により誘発され
る造血症候群、放射線により誘発される骨髄毒性といったような状態を予防また
は処置する方法であって、個体にＫＧＦ−２の有効量を投与することを含んでな
る方法を提供する。
【０２７４】 ＫＧＦ−２は、単独で使用してもよいし、または放射線もしくは他の物質に対
する保護を与える、１つまたはそれ以上のさらなる物質と組み合わせて使用して
もよい。多くのサイトカイン(例えば、ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１
２)は、そのような保護を与えることが示された。例えば、Ｎeta, Ｒ. ら，Ｊ.
Ｅxp. Ｍed. １７３：１１７７（１９９１）を参照。加えて、ＩＬ−１１は、組
み合わされた照射および化学療法(Ｄu, Ｘ. Ｘ. ら，Ｂlood ８３：３３（１９
９４）)、並びに放射線により誘発される胸郭傷害の後、小腸粘膜細胞を保護す
ることが示された。Ｒedlich, Ｃ. Ａ. ら，Ｊ. Ｉmmun. １５７：１７０５−１
７１０（１９９６）。幾つかの増殖因子(例えば、線維芽細胞増殖因子およびト
ランスフォーミング増殖因子β−３)はまた、放射線曝露に対する保護を与える
ことが示された。Ｄing, Ｉ. ら，Ａcta ＯＮcol. ３６：３３７−３４０（１９
９７）；Ｐotten, Ｃ. ら，Ｂr. Ｊ. Ｃancer ７５：１４５４−１４５９（１９
９７）。
【０２７５】 以下の実施例３２に示されるように、ＫＧＦ−２は肺上皮細胞の増殖を促進す
る。したがって、ＫＧＦ−２は、様々な病的状態によって引き起こされる肺に対
する損傷を減少または阻止するために予防的に投与することができる。ＫＧＦ−
２はさらに、治癒を促すために、傷害事象が起こっている間かまたはその後に投
与することができる。例えば、ＫＧＦ−２は、増殖および分化を促進し、肺胞お
よび気管支の上皮の修復を促して、急性または慢性の肺損傷を阻止、減少または
処置することができる。気管支上皮および肺胞の壊死を引き起こす気腫（肺胞の
進行性の喪失をもたらす）および吸気傷害（即ち煙の吸引および火傷により引き
起こされる）は、化学療法、放射線治療、肺がん、喘息、黒肺塵症およびその他
肺の損傷状態に帰する損傷と同様、ＫＧＦ−２を用いて有効に処置することがで
きる。ＫＧＦ−２は、ＩＩ型肺胞細胞の増殖および分化を促進するために使用す
ることができ、硝子膜症などの疾患、早産児における小児型呼吸窮迫症候群およ
び気管支形成異常などの処置または阻止を助けることができる。
【０２７６】 本明細書中で使用する場合、「個体」という語は、動物、好ましくは哺乳動物
(例えば、エープ、ウシ、ウマ、ブタ、イノシシ、ヒツジ、ネズミ、ヤギ、イヌ
、ネコ、トリ、サル、ウサギ、フェレット、クジラ、およびイルカ)、より好ま
しくはヒトを意図する。 １〜３５または３６のアミノ酸をコードするＫＧＦ−２のシグナル配列を使用
して、一般には、ハイブリダイゼーションおよび／またはコンピューターサーチ
アルゴリズムにより、分泌されたタンパク質を同定することができる。 ＫＧＦ−２のヌクレオチド配列を使用して、ハイブリダイゼーションにより、
５'配列を単離することができる。次いで、その天然のプロモーター／エンハン
サー配列の制御下にＫＧＦ−２遺伝子を含んでなるプラスミドは、内因性細胞お
よびウイルスのＫＧＦ−２遺伝子発現トランスアクチベーターの同定を目的とし
たインビトロにおける試験で使用することができる。 ＫＧＦ−２受容体に対して作用するペプチド模倣物(mimetics)を同定するため
に設計された実験において、ＫＧＦ−２タンパク質を正の対照として使用する。
【０２７７】 本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチド、またはそのよう
なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、ＤＮＡの合成、
ＤＮＡベクターの製造に関係している、インビトロにおける目的に利用する方法
、並びにヒト疾患の処置に関する診断および治療を与える目的に利用する方法を
提供する。 全長のＫＧＦ−２遺伝子のフラグメントは、全長のＫＧＦ−２遺伝子を単離す
るための、およびこれらの遺伝子に対して高い配列類似性、または同様の生物学
的活性を有する他の遺伝子を単離するための、cＤＮＡライブラリーに対するハ
イブリダイゼーションプローブとして使用することができる。このタイプのプロ
ーブは、一般に、少なくとも２０塩基を有する。しかし、好ましくは、そのプロ
ーブは、少なくとも３０塩基を有しており、一般には、５０塩基を超えないが、
それらは、より多数の塩基を有していてもよい。そのプローブを使用して、全長
の転写産物、およびゲノムクローン、または調節およびプロモーター領域、エキ
ソン、並びにイントロンが含まれる完全なＫＧＦ−２遺伝子を含むクローンに対
応するcＤＮＡクローンを同定することもできる。スクリーニングの例は、その
既知のＤＮＡ配列を使用して、オリゴヌクレオチドプローブを合成することによ
り、ＫＧＦ−２遺伝子のコード領域を単離することを含んでなる。本発明の遺伝
子の配列に相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを使用し、ヒトcＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはcＤＮＡのライブラリーをスクリーニングして、ラ
イブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定する。 本発明は、ＫＧＦ−２ポリペプチドに対する受容体の同定方法を提供する。そ
の受容体をコードする遺伝子は、当業者に知られている多数の方法、例えば、リ
ガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング(Ｃoliganら，Ｃurrent Ｐrotocols
in Ｉmmun．，１(２)，第５章（１９９１）)により同定することができる。好
ましくは、発現クローニングを使用し、ここでは、ポリアデニル化ＲＮＡをポリ
ペプチドに反応する細胞から製造し、このＲＮＡから作成されたcＤＮＡライブ
ラリーをプールに分けて、これを使用して、ＣＯＳ細胞、またはポリペプチドに
反応しない他の細胞をトランスフェクトする。ガラススライド上で培養した、ト
ランスフェクトした細胞を標識化ポリペプチドに曝露する。そのポリペプチドは
、ヨウ素化、または部位特異的なプロテインキナーゼの認識部位の封入が含まれ
る様々な方法により標識化することができる。固定およびインキュベーションに
続いて、そのスライドをオートラジオグラフィー分析にかける。正のプールを同
定して、サブプールを製造し、反復サブプーリングおよび再スクリーニング法を
使用して、再びトランスフェクトし、最終的には、推定受容体をコードする単一
クローンを得る。
【０２７８】 別の受容体同定方法として、標識化ポリペプチドを、細胞膜または受容体分子
を発現する抽出調製物と光親和性結合させることができる。架橋物質をＰＡＧＥ
分析により分折して、Ｘ−線フィルムに曝露する。そのポリペプチドの受容体を
含む標識化複合体を切り出し、ペプチドフラグメントに分折して、タンパク質マ
イクロシークエンシングにかけることができる。マイクロシークエンシングから
得られたアミノ酸配列を使用して、一組の縮重オリゴヌクレオチドプローブを設
計し、cＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、推定受容体をコードする遺
伝子を同定することができる。
【０２７９】 本発明は、ＫＧＦ−２の作用をアゴナイズする化合物、またはＫＧＦ−２の機
能をブロックする化合物を同定するために、化合物をスクリーニングする方法を
提供する。そのようなアッセイの例は、ケラチノサイト細胞が、普通、増殖する
であろう細胞培養条件下、哺乳動物のケラチノサイト細胞、スクリーニングすべ
き化合物、および３[Ｈ]チミジンを混合することを含んでなる。対照アッセイを
スクリーニングすべき化合物の不在下に行い、その化合物の存在下におけるケラ
チノサイト増殖量と比べて、その化合物がケラチノサイトの増殖を刺激するかど
うかを決定することができる。 アンタゴニストに関してスクリーニングするためには、同じアッセイをＫＧＦ
−２の存在下に準備するのがよく、ケラチノサイト増殖を妨げる化合物の能力を
測定して、アンタゴニスト能力の決定を行う。３[Ｈ]チミジンの取込みを測定す
る液体シンチレーションクロマトグラフィーにより、ケラチノサイト細胞増殖量
を測定する。
【０２８０】 別の方法では、ＫＧＦ−２受容体を発現する哺乳動物細胞または膜調製物を、
その化合物の存在下に標識化ＫＧＦ−２と共にインキュベーションする。次いで
、この相互作用を高める、またはブロックする化合物の能力を測定することがで
きる。あるいはまた、ＫＧＦ−２と受容体との相互作用に続いて、その化合物の
存在下または不在下において既知の第二メッセンジャーシステムの反応を測定し
、比較する。そのような第二メッセンジャーシステムには、限定されるものでは
ないが、cＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル、またはホスホイノ
シチド加水分解が含まれる。 可能性のあるＫＧＦ−２アンタゴニストの例には、そのポリペプチドに結合す
る抗体、または幾つかの場合には、オリゴヌクレオチドが含まれる。あるいはま
た、可能性のあるＫＧＦ−２アンタゴニストは、ＫＧＦ−２受容体に結合する、
変異体型のＫＧＦ−２であり得るが、しかし、第二メッセンジャー反応は誘引せ
ず、従って、ＫＧＦ−２の作用を有効にブロックする。
【０２８１】 別の可能性のあるアンタゴニストは、アンチセンス技術を使用して製造される
アンチセンス構築物である。アンチセンス技術を使用して、三重らせん形成また
はアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御することができ
、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づ
く。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の
５'コード部分を使用して、長さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオ
リゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺
伝子領域に対して相補的であるよう設計し(三重らせん−Ｌeeら，Ｎucl. Ａcids
Ｒes. ６：３０７３（１９７９）；Ｃooneyら，Ｓcience ２４１：４５６（１
９８８）；およびＤervanら，Ｓcience ２５１：１３６０（１９９１）を参照)
、そのことによって、転写およびＫＧＦ−２の産生を妨げる。そのアンチセンス
ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてcＤＮＡにハイブリダイズして
、cＤＮＡ分子のＫＧＦ−２ポリペプチドへの翻訳をブロックする(Ａntisense−
ＯＫano，Ｊ. Ｎeurochem. ５６：５６０（１９９１）；Ｏligodeoxynucleotide
s as Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpression，ＣＲＣ Ｐress，Ｂoca
Ｒaton，ＦＬ（１９８８）)。先に記載したオリゴヌクレオチドをまた、細胞に
送り込んで、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発現させて、
ＫＧＦ−２の産生を阻害することができる。 可能性のあるＫＧＦ−２アンタゴニスト化合物には、ＫＧＦ−２受容体の結合
部位に結合して占有し、そのことによって、その受容体をＫＧＦ−２に近づき難
くすることから、正常な生物学的活性を妨げる小さな分子が含まれる。小さな分
子の例には、限定されるものではないが、小さなペプチドまたはペプチド様分子
が含まれる。
【０２８２】 ＫＧＦ−２アンタゴニストを使用して、腫瘍における新たな血管成長または脈
管形成の誘発を妨げることができる。ＫＧＦ−２により刺激される脈管形成はま
た、糖尿病性網膜症を含め、本発明のアンタゴニストにより処置することもでき
る幾つかの病状、および慢性関節リウマチにおけるような病的組織の増殖の阻害
により処置することもできる幾つかの病状の原因でもある。 ＫＧＦ−２のアンタゴニストを使用して、ボーマン腔を満たす細胞塊を形成す
る糸球体上皮細胞の著しい増殖により特徴付けられる、糸球体腎炎を処置するこ
ともできる。 そのアンタゴニストを使用して、手術後のケロイド形成、心筋梗塞後の線維症
、または肺線維症および再狭窄と関連している線維症病変において見られる瘢痕
組織の過剰産生を阻害することもできる。ＫＧＦ−２アンタゴニストを使用して
、癌およびカポージ肉腫を含め、ＫＧＦ−２により刺激される他の増殖性疾患を
処置することもできる。 ＫＧＦ−２アンタゴニストを使用して、上皮細胞増殖により特徴付けられるブ
ドウ膜炎症を有する、角膜の深葉の慢性湿潤である角膜炎を処置することもでき
る。
【０２８３】 そのアンタゴニストは、例えば、以下に記載するような、医薬的に許容され得
る担体と共に、組成物において使用することができる。 本発明のポリペプチド、アゴニスト、およびアンタゴニストは、医薬組成物を
構成するために、適当な医薬担体と組み合わせて使用することができる。そのよ
うな組成物は、治療上有効な量のポリペプチド、アゴニスト、またはアンタゴニ
スト、および医薬的に許容され得る担体もしくは賦形剤を含んでなる。そのよう
な担体には、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキ
ストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含ま
れる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。
【０２８４】 本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１
つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そ
のような容器と関連して、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売
を規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒ
トへの投与のための製造、使用、または販売の、その当局による承認を反映する
。加えて、本発明のポリペプチド、アゴニスト、およびアンタゴニストは、他の
治療用化合物と共に使用することができる。 ＫＧＦ−２活性を有するポリペプチドは、１つまたはそれ以上の医薬的に許容
され得る賦形剤と組み合わせて、医薬組成物で投与することができる。ヒトの患
者に投与する場合、本発明の医薬組成物の全１日使用量は、医師により正しい医
療判断(sound medical judgment)の範囲内で決定されるであろうことが理解され
るであろう。全ての個々の患者に対する具体的な治療上の有効用量レベルは、成
し遂げられるべき反応のタイプおよび程度；使用する具体的な組成物、およびも
しあれば、他の物質；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別、および食事；
投与時間、投与経路、および組成物の排出速度；処置期間；具体的な組成物と組
み合わせて、または具体的な組成物と一緒に使用する薬物(例えば、化学療法剤)
；並びに医薬品業界でよく知られている同様の因子が含まれる、様々な因子に依
存するであろう。当業界で知られている適当な製剤は、Ｒemington's Ｐharmace
utical Ｓciences(最終版)，Ｍack Ｐublishing Ｃompany，Ｅaston，ＰＡに見
出すことができる。
【０２８５】 治療において使用すべきＫＧＦ−２組成物は、個々の患者の臨床的状態(とり
わけ、ＫＧＦ−２単独での処置の副作用)、ＫＧＦ−２組成物を送り込む部位、
投与方法、投与計画、および担当医に知られている他の因子を考慮に入れて、良
好な医療実施と一致する方法で製剤化されて投薬されるであろう。従って、本明
細書中での目的に対するＫＧＦ−２の「有効量」は、そのような考慮事項により
決定される。 その医薬組成物は、経口経路、局所経路、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経
路、関節内経路、皮下経路、鼻腔内経路、または皮内経路といったような、便利
な方法で投与することができる。その医薬組成物は、具体的な徴候を治療および
／または予防するのに有効である量で投与される。大抵の場合、投与経路および
症状等を考慮に入れて、その用量は、毎日約１μg／kg〜約３０mg／kg(体重)で
ある。しかし、用量は０．００１μg／kgほどの低用量でもよい。局所投与の具
体的な場合、１cm２あたり０.０１μg〜９mgの用量を投与するのが好ましい。 一般的な提案として、より好ましくは用量あたり非経口的に投与されるＫＧＦ
−２の全医薬的有効量は、約１μg／kg(患者の体重)／日〜１００mg／kg(患者の
体重)／日の範囲であるが、先に述べたように、これは、治療上の判断にかかっ
ている。連続的に与えるのなら、ＫＧＦ−２は、典型的には、例えば、ミニポン
プを使用して、１日あたり１−４回の注射により、または連続的な皮下注入によ
り、約１μg／kg／時間〜約５０μg／kg／時間の用量速度で投与される。静脈内
バッグ溶液またはボトル溶液もまた使用することができる。
【０２８６】 線維素溶解システムに影響を与えるためのＫＧＦ−２処置の経過は、ある最小
日数(マウスの場合には７日)より長く続けるならば、最適であるらしい。変化を
観察するのに必要とされる処置期間、および反応に対する処置が起こるまでの間
隔は、所望の作用によって異なるらしい。そのような治療期間は後記実施例に例
示されている。 ＫＧＦ−２ポリペプチドはまた、持続的放出システムにより適当に投与される
。持続的放出組成物の適当な例には、賦形品の形での半透過性ポリマーマトリッ
クス(例えば、フィルム、またはマイクロカプセル)が含まれる。持続性放出マト
リックスには、ポリラクチド(米国特許第３,７７３,９１９号、欧州特許第５８,
４８１号)、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマ
ー(Ｕ. Ｓidmanら，Ｂiopolymers ２２：５４７−５５６（１９８３）)、ポリ(
２−ヒドロキシエチルメタクリレート)(Ｒ. Ｌangerら，Ｊ. Ｂiomed. Ｍater.
Ｒes. １５：１６７−２７７（１９８１）、およびＲ. Ｌanger，Ｃhem. Ｔech.
１２：９８−１０５（１９８２）)、エチレン酢酸ビニル(Ｒ. Ｌangerら，同上
)、またはポリ−Ｄ−(−)−３−ヒドロキシ酪酸(欧州特許第１３３,９８８号)が
含まれる。持続的放出ＫＧＦ−２組成物にはまた、リポソームに閉じ込められた
ＫＧＦ−２も含まれる。ＫＧＦ−２を含むリポソームは、公知の方法により製造
される：独国特許第３,２１８,１２１号；Ｅpsteinら，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad.
Ｓci. ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈwangら，Ｐroc. Ｎat
l. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；欧州特許第
５２,３２２号；欧州特許第３６,６７６号；欧州特許第８８,０４６号；欧州特
許第１４３,９４９号；欧州特許第１４２,６４１号；日本国特許出願第８３−１
１８００８号；米国特許第４,４８５,０４５号および同第４,５４４,５４５号；
並びに欧州特許第１０２,３２４号。通常、そのリポソームは、脂質含量が約３
０mol.％コレステロールを超えおり、選択される割合が最適なＫＧＦ−２療法の
ために調節される、小さい(約２００−８００Å)単層状タイプのものである。
【０２８７】 非経口投与に関し、一態様において、ＫＧＦ−２は、一般に、医薬的に許容さ
れ得る担体(使用する用量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、また
その製剤の他の成分と適合する担体)と共に、それを所望の純度で混合すること
により、単位用量の注射可能な形(溶液、懸濁液、またはエマルション)に製剤化
される。例えば、その製剤には、酸化剤、およびポリペプチドに対して有害であ
ることが知られている他の化合物は含まれないのが好ましい。 一般に、その製剤は、ＫＧＦ−２を、液状担体、または微細に分割した固体担
体、またはその両方と、均一かつ密接に接触させることにより製造される。次い
で、必要ならば、その生成物を所望の製剤に成形する。好ましくは、その担体は
非経口担体であり、より好ましくは、レシピエントの血液と等張である溶液であ
る。そのような担体ビヒクルの例には、水、生理食塩水、リンゲル液、およびデ
キストロース溶液が含まれる。不揮発性油およびオレイン酸エチルといったよう
な非水性ビヒクル、さらにはまた、リポソームもまた、本明細書中で有用である
。当業界で知られている適当な製剤は、Ｒemington's Ｐharmaceutical Ｓcienc
es(最終版)，Ｍack Ｐublishing Ｃompany，Ｅaston，ＰＡに見出すことができ
る。
【０２８８】 その担体は、等張性および化学安定性を高める物質のような添加剤を少量含む
のが適当である。そのような物質は、使用する用量および濃度でレシピエントに
対して無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、および他の有機
酸またはその塩といったような緩衝液；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分
子量(約１０残基未満)のポリペプチド(例えば、ポリアルギニンまたはトリペプ
チド)；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンといったようなタン
パク質；ポリビニルピロリドンのようなポリマー；グリシン、グルタミン酸、ア
スパラギン酸、またはアルギニンといったようなアミノ酸；セルロースもしくは
その誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンが含まれる、単糖類
、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトール
またはソルビトールといったような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン
；および／またはポリソルベート、ポロキサマー、またはＰＥＧといったような
非イオン性界面活性剤が含まれる。 ＫＧＦ−２は、典型的には、そのようなビヒクル中、pＨ 約３〜８、約０.０
１μg／ml〜１００mg／ml、好ましくは０.０１μg／ml〜１０mg／mlの濃度で製
剤化される。前述の賦形剤、担体、または安定剤の幾つかの使用は、ＫＧＦ−２
塩の形成を生ずるであろうことが理解されるであろう。
【０２８９】 治療上の投与に使用すべきＫＧＦ−２は、無菌でなければならない。無菌は、
無菌濾過膜(例えば、０.２ミクロンの膜)を通しての濾過により容易に達成され
る。治療用ＫＧＦ−２組成物は、一般に、無菌出入口を有する容器(例えば、静
脈内溶液バッグ、または皮下注射針で刺して穴をあける栓を有するバイアル)に
入れられる。 ＫＧＦ−２は、通常、単位用量または多数回用量の容器(例えば、密閉したア
ンプルまたはバイアル)中、水溶液として、または再構築用の凍結乾燥させた製
剤として保存される。凍結乾燥させた製剤の例として、１０mlのバイアルを、無
菌濾過した１％(ｗ／ｖ)のＫＧＦ−２水溶液５mlで充填して、その結果得られた
混合物を凍結乾燥させる。注入溶液は、静菌注射用蒸留水を使用して、凍結乾燥
させたＫＧＦ−２を再構築することにより製造する。
【０２９０】 投薬はまた、例えば、ＲＩＡ技術により決定されるような、予め決定された濃
度のＫＧＦ−２活性を血中で与えるよう、患者に特異的な方法で取り決めること
もできる。従って、患者への投薬は、ＲＩＡ技術により測定されるような、約５
０〜１０００ng／ml、好ましくは１５０〜５００ng／mlの、一定の進行するトラ
フ(trough)血液レベルに達するよう調節することができる。 本発明の医薬組成物は、経口により、直腸により、非経口により、槽内により
、皮内により、膣内により、腹腔内により、局所により(粉末、軟膏、ゲル、ク
リーム、ドロップ、もしくは経皮パッチによるものとして)、頬側により投与す
ることができ、または口腔または鼻腔スプレーとして投与してもよい。「医薬的
に許容され得る担体」という語は、無毒の固形、半固形、または液状の充填剤、
希釈剤、封入物質、またはあらゆるタイプの製剤補助物質を意味する。本明細書
中で使用する場合、「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内
、皮下、および関節内の注射および注入が含まれる投与方法を言う。 好ましいＫＧＦ−２の処方は、１９９７年１２月２２日付出願の米国仮出願第
６０／０６８４９３号に記載されており、ここに引用する。
【０２９１】 ＫＧＦ−２ポリペプチド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニス
トはまた、「遺伝子治療」と呼ばれることの多い、そのようなポリペプチドのイ
ンビボにおける発現によって、本発明により使用することもできる。 従って、例えば、患者由来の細胞を、エクスビボにおいて、ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、そのペプチドで
処置すべき患者に、操作した細胞を与える。そのような方法は、当業界でよく知
られている。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウ
イルス粒子の使用によって、当業界で知られている方法により、細胞を操作する
ことができる。さらに、細胞を患者に再導入する前に、それらを、生体分解性マ
トリックス（例えばポリグリコール酸）、組織代替体または等価物（例えば人工
皮膚）、人工臓器、およびコラーゲン誘導物質等の細胞担体上に種付けしてもよ
い。
【０２９２】 同様に、例えば、当業界で知られている方法により、ポリペプチドのインビボ
における発現のために、細胞をインビボにおいて操作することができる。当業界
で知られているように、細胞をインビボにおいて操作して、ポリペプチドをイン
ビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含
む、レトロウイルス粒子を産生するためのプロデューサー細胞を患者に投与する
ことができる。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与する、これら
の方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかとなるべきであろう
。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、
例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をインビボにおいて操作す
るために使用することができるアデノウイルスであってもよい。他の運搬ビヒク
ルの例には、ＨＳＶに基づいたベクター系、アデノ関連ウイルスベクター、およ
び不活性ビヒクル(例えば、デキストランで被覆したフェライト粒子)が含まれる
。 先に述べたレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスに
は、限定されるものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイル
ス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テ
ナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性
肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスといったようなレトロウイルスが含まれる。
一態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病
ウイルスから得られる。
【０２９３】 そのベクターには、１つまたはそれ以上のプロモーターが含まれる。使用する
ことができる適当なプロモーターには、限定されるものではないが、レトロウイ
ルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびＭillerら，Ｂiotechniques 第７巻
，第９号：９８０−９９０（１９８９）に記載されているヒトサイトメガロウイ
ルス(ＣＭＶ)プロモーター、またはいずれかの他のプロモーター(例えば、限定
されるものではないが、ヒストン、pol III、およびβ−アクチンプロモーター
が含まれる、真核細胞性プロモーターのような細胞性プロモーター)が含まれる
。使用することができる他のウイルスプロモーターには、限定されるものではな
いが、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ(ＴＫ)プロモーター、お
よびＢ１９パルボウイルスプロモーターが含まれる。適当なプロモーターの選択
は、本明細書中に含まれる教示から当業者に明らかであろう。 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適当なプロモーターの制御下
にある。使用することができる適当なプロモーターには、限定されるものではな
いが、アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモータ
ー；またはサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターのようなヘテロロガスプ
ロモーター；呼吸合胞体ウイルス(ＲＳＶ)プロモーター；MＭＴプロモーター、
メタロチオネインプロモーターといったような誘導可能なプロモーター；熱ショ
ックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡpoＡＩプロモーター；ヒトグロ
ビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのようなウイル
スチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ(先に記載した、修飾
されたレトロウイルスＬＴＲが含まれる)；β−アクチンプロモーター；および
ヒト成長ホルモンプロモーターが含まれる。そのプロモーターはまた、そのポリ
ペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであってもよい。
【０２９４】 レトロウイルスプラスミドベクターを使用し、パッケージング細胞系をトラン
スデュースして、プロデューサー細胞系を形成する。トランスフェクトすること
ができるパッケージング細胞系の例には、限定されるものではないが、ＰＥ５０
１、ＰＡ３１７、Ψ−２、Ψ−ＡＭ、ＲＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−
１７−Ｈ２、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋envＡm１２、およ
びＭiller、Ｈuman Ｇene Ｔherapy １：５−１４（１９９０）(これに記載され
ている内容は全て、本発明の一部を構成する)に記載されているＤＡＮ細胞系が
含まれる。そのベクターは、当業界で知られている、いずれかの方法によって、
パッケージング細胞をトランスデュースすることができる。そのような方法には
、限定されるものではないが、電気穿孔、リポソームの使用、およびＣaＰＯ４
沈殿が含まれる。１つの別の方法では、レトロウイルスプラスミドベクターをリ
ポソームに封入する、または脂質に結合させた後、宿主に投与することができる
。 そのプロデューサー細胞系は、そのポリペプチドをコードする核酸配列が含ま
れる感染性レトロウイルスベクター粒子を生成させる。次いで、そのようなレト
ロウイルスベクター粒子を使用して、真核細胞をインビトロまたはインビボにお
いてトランスデュースすることができる。トランスデュースされた真核細胞は、
そのポリペプチドをコードする核酸配列を発現するであろう。トランスデュース
することができる真核細胞には、限定されるものではないが、胚幹細胞、胚癌細
胞、さらにはまた、造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、角質細胞、内
皮細胞、および気管支上皮細胞が含まれる。
【０２９５】 本発明は、本発明の化合物または医薬組成物、好ましくは本発明の抗体の有効
量を被験者に投与することによる処置方法、抑制方法および予防方法を提供する
。好ましい態様において、本化合物は実質的に精製されたものである(例えば、
その効果を制限するか、または望まない副作用を有する物質を実質的に含まない
)。被験者は、好ましくは例えばウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなど
を含むが、これらに制限されない動物であり、好ましくは哺乳類であり、最も好
ましくはヒトである。
【０２９６】 化合物が核酸または免疫グロブリンを含有する場合に実施し得る、製剤および
投与方法は以上に記載する；加えて、適当な製剤および投与経路は本明細書中以
下に記載するものの中から選択し得る。
【０２９７】 例えば、リポソーム内へのカプセル包嚢、微粒子、マイクロカプセル、化合物
を発現することが可能な組換え細胞、受容体が介在するエンドサイトーシス（例
えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432を参照）、レトロウイ
ルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などの、様々な送達システム
が知られており、本発明の化合物を投与するために用いることができる。導入の
方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外および経口経路
が含まれるがこれらに限定されない。化合物または組成物は、任意の慣用的な経
路、例えば、注入またはボーラス注入により、上皮または皮膚粘膜の内面（例え
ば、口腔粘膜、直腸および小腸など）を通じての吸収により投与することができ
、他の生物学的に活性な作用物質とともに投与することができる。投与は全身的
または局所的なものであり得る。さらに、本発明の医薬化合物または組成物を、
脳室内およびくも膜下注入を含む任意の適当な経路によって中枢神経系に導入す
ることが望ましいかもしれない。脳室内注入は、例えば、Ｏｍｍａｙａ貯臓器な
どの貯蔵器に取り付けた脳室内カテーテルによって容易に行なうことができる。
例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤との製剤化によって
、肺への投与も用いることができる。
【０２９８】 具体的な態様では、本発明の医薬化合物または組成物を、処置を必要とする領
域に局所的に投与することが望ましいかもしれない。これは、注射、カテーテル
、浣腸により、あるいは多孔質、無孔質のもしくはシアラスティック（sialasti
c）膜等の膜を含むゼラチン質材料または線維である移植片により、例えば外科
手術中の局所的な注入、例えば外科手術後の創傷被覆剤と組み合わせた局所的適
用よって達成することができるがこれに限定されない。好ましくは、本発明の、
抗体を含むタンパク質を投与する場合は、そのタンパク質が吸収されないような
材料を使用するよう注意を払わなければならない。
【０２９９】 別の態様では、化合物または組成物を小嚢、特にリポソーム内にて送達するこ
とができる（Langer, 1990, Science 249: 1527-1533, Treat et. al., in Lipo
somes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein a
nd Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, i
bid, pp. 317-327, generally ibidを参照）。
【０３００】 さらに別の態様では、化合物または組成物を、制御された放出システムにて送
達することができる。一態様ではポンプを使用することができる（Langer, supr
a; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. BIomed. Eng. 14: 201; Buchwald et. al.,
1980, Surgery 88: 507; Saudek et. al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を
参照）。別の態様では、高分子材料を使用することができる（Medical Applicat
ion of Controlled Release, Langer and Wise (eds.) CRC Pres., Boca Raton,
Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design an
d Performance, Smolen and Ball (eds. ), Wiley, New York (1984); Ranger a
nd Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照；Le
vy et. al., 1985, Science 228:190, During et. al., 1989, Ann. Neurol. 25
:351; Howard et. al., 1989, J. Neurosurg. 71:105も参照）。さらに別の態様
では、治療標的、即ち脳、の近傍に制御された放出システムを設置することがで
き、こうすると全身投与用量のほんの一部しか必要としない（例えば、Goodson,
in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-1
38 (1984)を参照）。
【０３０１】 他の制御された放出システムは、Langerによるレビューで議論されている（19
90, Science 249: 1527-1533）。
【０３０２】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である具体的な態様では、例え
ば、レトロウイルスベクターの使用（米国特許第４，９８０，２８６号を参照）
によって、または直接注入によって、または微粒子衝撃（microparticle bombar
dment）（例えば、遺伝子銃；Biolistic, DuPont）、または脂質または細胞表面
受容体でのコーティングまたはトランスフェクト剤の使用によって、または核に
入ることが知られているホメオボックス様ペプチド（例えば、Joliot et. al.,
1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868を参照）へ連結してそれを投
与することなどによって、その核酸を適当な核酸発現ベクターの一部として構築
し、細胞内に生じるように投与することにより、その核酸を生体内に投与してそ
のコードされたタンパク質の発現を促進することができる。別法として、核酸を
細胞内に導入し、相同的組換えによって、発現のための宿主細胞ＤＮＡ内に組込
むことができる。
【０３０３】 本発明は、さらに医薬組成物を提供する。そのような組成物は、治療上有効な
量の化合物、および医薬的に許容され得る担体を含有してなる。具体的な態様で
は、用語「医薬的に許容され得る」は、連邦政府または州政府の規制の下で認可
されているか、または米国薬局方、または動物、さらに具体的にはヒトにおいて
使用するための他の一般に認識されている薬局方に載っていることを意味する。
用語「担体」は、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはその治療剤がそれとと
もに投与されるビヒクルを意味する。そのような製薬的な担体は、水、および石
油、動物油、植物油または合成品由来の油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油
、ゴマ油などを含む油等の、無菌の液体であり得る。医薬組成物を静脈内投与す
る場合、水が好ましい担体である。生理食塩溶液および水性デキストランおよび
グリセロール溶液も、特に注射用液剤の、液状担体として用いることができる。
適当な医薬的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼ
ラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、
グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、
グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。所望
ならば、組成物は、さらに微量の湿潤剤または乳化剤または pＨ緩衝剤を含有す
ることができる。これらの組成物は、溶液、懸濁剤、エマルジョン、錠剤、丸剤
、カプセル剤、粉末剤、徐放製剤などの形態をとることができる。組成物は、ト
リグリセリド等の伝統的な結合剤や担体とともに座剤として製剤化することがで
きる。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステア
リン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムな
どの標準的な担体を含有することができる。適当な医薬用担体の例は、E. W. Ma
rtin著の“Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。そのよう
な組成物は、好ましくは精製された形態の、治療上有効な量の化合物を、患者に
対する適切な投与のための形態がもたらされるように、適当な量の担体とともに
含有する。製剤は、投与の様式に適合させる。
【０３０４】 好ましい態様では、常套的な手順にしたがって、組成物を、ヒトへの静脈内投
与に適した医薬組成物として製剤化する。典型的には、静脈内投与のための組成
物は、無菌の等張性水性緩衝液中の溶液剤である。必要ならば、組成物に、可溶
化剤や、注射部位の痛みを和らげるためのリグノカイン等の局所麻酔剤を含有さ
せることもできる。一般に、成分は、別々に、または単位投与剤型において一緒
に混合された状態で、例えば、活性成分の量を表示したアンプルまたはサシェ等
の密封された容器内の乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として提供される。組
成物を輸液により投与する場合、無菌の医薬品等級の水または生理食塩水を含む
輸液用ボトルを用いて組成物を調剤することができる。組成物を注射によって投
与する場合、成分を投与前に混合することができるように、注射用の無菌水また
は生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０３０５】 本発明の化合物は、中性の、または塩の形態で製剤化することができる。医薬
的に許容され得る塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来す
るアニオンと形成した塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシ
ウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミ
ノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのカチオンと形成した塩が含まれる
。
【０３０６】 本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連する疾患または
障害の、処置、抑制および予防において有効である本発明化合物の量は、標準的
な臨床的技術によって決定することができる。さらに、場合により、試験管内分
析を用いて、最適な投与量範囲の決定の助けとしてもよい。製剤に使用する的確
な用量は、投与経路、および疾患または障害の重篤度にも依存し、実施者の判断
と個々の患者の状況にしたがって決定すべきである。有効な投与量は、試験管内
でまたは動物モデル試験系から得られた用量応答曲線から推定してもよい。
【０３０７】 抗体に関して、患者に投与する用量は、典型的には、０.１ｍg／ｋｇ〜１００
ｍg／ｋｇ（患者体重）である。好ましくは、患者に投与する用量は、０.１ｍg
／ｋｇ〜２０ｍg／ｋｇ（患者体重）の間、より好ましくは１ｍg／ｋｇ〜１０ｍ
g／ｋｇ（患者体重）の間である。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対
する免疫応答のために、ヒトの体内で、他の種に由来する抗体よりも長い半減期
を有する。したがって、より少ない用量、より少ない頻度でヒト抗体を投与する
ことが可能である場合が多い。さらに、例えば、リピデーション（lipidation）
などの修飾によって、抗体の取り込みおよび組織（例えば、脳内への）の浸透性
を増大させることにより、本発明の抗体の投与量と投与頻度を減らすことができ
る。
【０３０８】 本発明はまた、本発明の医薬組成物の１またはそれ以上の成分が詰められた、
１またはそれ以上の容器を含んでなる医薬品包装物またはキットを提供する。場
合により、そのような容器には、医薬品または生物学的製品の製造、使用または
販売を規制している政府機関によって規定された様式の注意書を付けることがで
き、その注意書は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売についてのその
政府機関による認可を反映するものである。
【０３０９】 抗体をベースとする治療的使用 本発明は、さらに抗体をベースとする治療に関し、該治療は本発明の抗体を動
物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトである患者に、本明細書中に開示さ
れる１以上の疾患、障害または症状を処置するために投与することを含む。本発
明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書に記載するそれらのフラグメ
ント、アナログおよび誘導体を含む）および、本発明の抗体をコードする核酸（
本明細書に記載するそれらのフラグメント、アナログおよび誘導体、および抗−
イディオタイプ抗体を含む）を含むが、それらに限定されない。本発明の抗体を
用いて、１以上の本明細書中に記載の疾患、障害または症状のいずれかを含むが
これらに限定されない、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性
と関連する疾患、障害または症状を処置、阻止または予防することができる。本
発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連する疾患、障害また
は症状の処置および／または予防には、これらの疾患、障害または症状に関連す
る徴候の軽減が含まれるが、これに限定されない。本発明の抗体は、当分野に既
知であるか、あるいは本明細書中に記載される医薬的に許容される組成物中で提
供することができる。
【０３１０】 本発明の抗体を治療的に使用することができる方法の例には、体内に局所的に
もしくは全身的に本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを結合させる
こと、または抗体の直接的な細胞毒性によること（例えば、補体（ＣＤＣ）また
はエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）によって媒介されるもの）が含まれる。これら
のアプローチのうちいくつかを以下にさらに詳細に記載する。本明細書中に提供
される教示により、当業者であれば、診断、モニターまたは治療目的のための、
本発明の抗体の使用方法を、過度に実験することなく知るであろう。
【０３１１】 本発明の抗体は、他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体、またはリンフ
ォカインまたは造血成長因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７）と
併用して有利に使用することができる。これを用いて、例えば、抗体と相互作用
するエフェクター細胞の数または活性を増大させることができる。
【０３１２】 本発明の抗体は、単独でまたは他のタイプの処置（例えば、放射線療法、化学
療法、ホルモン療法、免疫療法および抗腫瘍物質）と組み合わせて投与すること
ができる。通常、患者の種と同一の種である種起源または種反応性（抗体の場合
）である産物を投与することが好ましい。従って、好ましい実施態様においては
、治療または予防のために、ヒト抗体、フラグメント誘導体、アナログ、または
核酸をヒト患者に投与する。
【０３１３】 本発明のポリヌクレチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に関
するイムノアッセイおよびそれらに関連する障害の治療の両者において、本発明
のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、それらのフラグメントまたは領域に対
する、高い親和性の、ならびに／あるいは強いインビボ阻害および／または中和
抗体を使用することが好ましい。それらの抗体、フラグメントまたは領域は、本
発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む）に
関して親和性を有することが好ましい。好ましい結合アフィニティーは、解離定
数またはＫｄが、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、
５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、
１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×
１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ
、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０− １３ Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍおよび１０−１５ Ｍより小さいものを含む。
【０３１４】 染色体アッセイ 本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色
体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることがで
きる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配
列データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置を
マークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッ
ピングは、それらの配列を病気と関連している遺伝子と関係付ける重要な第一段
階である。 簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましくは、１５−２５bp)
を製造することにより、配列を染色体にマップすることができる。３'非翻訳領
域のコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上のエクソンをス
パン(span)しないプライマーを迅速に選択し、従って、増幅プロセスを複雑なも
のとする。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイ
ブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。そのプライマーに対応するヒト遺
伝子を含む、それらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるで
あろう。
【０３１５】 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰
属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
の本発明を使用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きい
ゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いての類似の方法で成
し遂げることができる。その染色体へマップするために同様に使用することがで
きる他のマッピング方法には、in situ ハイブリダイゼーション、標識化フロー
−ソーティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染
色体に特異的なcＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーション
によるプレセレクションが含まれる。 cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼ
ーション(ＦＩＳＨ)を使用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができ
る。この技術は、５０または６０塩基という短いcＤＮＡで使用することができ
る。この技術のレビューのためには、Ｖermaら，Ｈuman Ｃhromosomes：a Ｍanu
al of Ｂasic Ｔechniques，Ｐergamon Ｐress，Ｎew Ｙork（１９８８）を参照
。 ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的
位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例え
ば、Ｖ. ＭcＫusick，Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕni
versity Ｗelch Ｍedical Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出
される。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係
を結合分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認す
る。
【０３１６】 次に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間のcＤＮＡまたはゲノ
ム配列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全
てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、そ
の変異は疾患の原因となるものであるらしい。 現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピング技術の分析から、疾患と関連
している染色体領域に正確に局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の間の可能な
原因となる遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピ
ング分析および２０kbあたり１つの遺伝子を仮定する)。 本発明をさらに、次の実施例によって記載する；しかし、本発明は、そのよう
な実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にこと
わらない限り、重量単位である。
【０３１７】 次の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および／
または用語を記載する。 「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および
／または数字により示す。本明細書中での出発プラスミドは、市販されているか
、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により
入手可能なプラスミドから構築することができる。加えて、記載したプラスミド
と同等のプラスミドは、当業界で知られており、当業者に明らかであろう。 ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中のある配列にのみ作用する制限酵素を用いての
ＤＮＡの触媒的切断を言う。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて
おり、それらの反応条件、補因子、および他の必要条件は、当業者に知られてい
るように使用した。分析を目的として、典型的には、緩衝溶液約２０μl中、１
μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。
プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離することを目的として、典型
的には、より大きい体積中、ＤＮＡ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消
化する。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定され
ている。通常、３７℃で約１時間のインキュベーション時間が使用されるが、供
給者の指示に従って変えることができる。消化後、その反応物をポリアクリルア
ミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離する。 切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇoeddel, Ｄ. ら，Ｎucleic Ａcids
Ｒes. ８：４０５７（１９８０）により記載されている８％ ポリアクリルアミ
ドゲルを使用して行う。
【０３１８】 「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオ
キシヌクレオチド、または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を言う。そのような
合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有しておらず、従って、キナーゼ
の存在下にＡＴＰでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチ
ドにライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されて
いないフラグメントにライゲートするであろう。 「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステ
ル結合を形成するプロセスを言う(Ｍaniatis, Ｔ.ら，同上，１４６頁)。特にこ
とわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメント
のほぼ等モル量の０.５μgあたり１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)
と共に、既知の緩衝液および条件を使用して達成することができる。
【０３１９】 細胞が外因性ＤＮＡによって「トランスフォームされた」というのは、そのよ
うな外因性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入された場合である。外因性ＤＮＡは、細
胞のゲノムを製造する、組み込まれた(共有結合された)染色体間(inter-chromos
omal)ＤＮＡであっても、または組み込まれた(共有結合された)染色体間ＤＮＡ
でなくてもよい。原核生物および酵母、例えば、外因性ＤＮＡは、プラスミドの
ようなエピソーム要素上に維持され得る。真核生物細胞に関して、安定してトラ
ンスフォームされた細胞、または安定してトランスフェクトされた細胞は、外因
性ＤＮＡが染色体複製によって娘細胞により遺伝されるよう、外因性ＤＮＡが染
色体に組み込まれたものである。この能力は、外因性ＤＮＡを含む娘細胞集団か
らなる細胞系またはクローンを確立する真核生物細胞の能力により実証される。
トランスフォーメーションの例は、Ｇraham, Ｆ. およびＶan der Ｅb, Ａ. ，
Ｖirology ５２：４５６−４５７（１９７３））に示されている。 「トランスダクション」または「トランスデュースされた」という語は、細胞
が外来ＤＮＡを取り込み、その外来ＤＮＡをそれらの染色体に組み込むプロセス
を言う。トランスダクションは、例えば、トランスフェクション(細胞がＤＮＡ
を取り込む様々な技術を言う）、または感染(ウイルスを使用して、ＤＮＡを細
胞に移動する様々な技術を言う)によって行うことができる。
【０３２０】 遺伝子療法 本発明の別の局面は、障害、疾病、および病状を治療するための遺伝子療法で
ある。遺伝子療法は、核酸(DNA、RNA、およびアンチセンスDNAまたはRNA)配列を
動物に導入し、本発明のKGF-2ポリペプチドを発現させることに関する。本方法
は、標的組織により該ポリペプチドを発現させるのに必要なプロモーターおよび
あらゆる他の遺伝子エレメントと機能性に連結したKGF-2ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを必要とする。そのような遺伝子療法および供給技術は当
該分野で知られている。例えば、W090/11092参照。この内容は本明細書の一部を
構成する。 すなわち、例えば、患者由来の細胞を、ex vivoでKGF-2ポリヌクレオチドと機
能性に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)で操作し、
次いでこの操作した細胞を患者に与えて該ポリペプチドで治療することができよ
う。そのような方法は当該分野でよく知られている。例えば、Belldegrun, A.,
et al., J. Nall. Cancer Inst. 85 : 207-216 (1993); Ferrantini, M. et al.
, Cancer Research 53: 1107-1112 (1993); Ferrantini, M. et al., J Immunol
ogy 153: 4604-4615 (1994); Kaido, T. et al., Int. J. Cancer 60: 221-229
(1995); Ogura, H. et al., Cancer Research 50: 5102-5106 (1990); Santodon
ato, L. et al., Human Gene Therapy 7: 1-10 (1996); Santodonato, L. et al
., Gene Therapy 4: 1246-1255 (1997); and Zhang, J.-F. et al., Cancer Gen
e Therapy 3: 31-38 (1996)) （これらの内容は本明細書の一部を構成する）。
ある態様において、操作する細胞は動脈細胞である。該動脈細胞は、動脈に直接
注射するか、動脈周囲の組織を介して、またはカテーテル（catheter）注射を介
して患者に再導入してよい。 以下により詳細に述べるように、KGF-2ポリヌクレオチド構築物は、注射可能
な物質を動物の細胞に供給するあらゆる方法、例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚
、肺、肝臓など）の間質空間内への注射により供給することができる。KGF-2ポ
リヌクレオチド構築物は医薬的に許容される液体または水性担体を用いて供給し
てよい。
【０３２１】 ある態様において、KGF-2ポリヌクレオチドは生（naked）ポリヌクレオチドと
して供給される。用語「生（naked）」ポリヌクレオチド、DNA、またはRNAは、
ウイルス配列、ウイルス劉氏、リポソーム製剤、リポフェクチン、または沈殿物
質（precipitating agents）などを含む、細胞内に入ることを助け、促進し、ま
たは促すように働くあらゆる供給ビークルが存在しない配列をいう。しかしなが
ら、KGF-2ポリヌクレオチドはリポソーム製剤を用いて供給することもでき、ま
たリポフェクチン製剤などは当業者によく知られた方法により製造することがで
きる。そのような方法は、例えば、米国特許第5,593,972、5,589,466、および5,
580,859号に記載されている（この内容は本明細書の一部を構成する）。 遺伝子療法に用いるKGF-2ポリヌクレオチドベクター構築物は、宿主ゲノムに
統合されず、複製を許す配列を含まない構築物であることが好ましい。適切なベ
クターには、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl、およびpSG（Stratageneから入手
可能）; pSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVL（Pharmaciaから入手可能）;およびpEF
l/V5、pcDNA3.1、およびpRc/CMV2（Invitrogenから入手可能）が含まれる。他の
適切なベクターは当業者に容易にわかるであろう。 当業者に知られたあらゆる強力なプロモーターをKGF-2 DNAを発現させるため
に用いることができる。適切なプロモーターにはアデノウイルスプロモーター、
例えば、アデノウイルス主要後期（late)プロモーター、またはヘテロローガスな
プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター; RS（respira
tory syncytial）ウイルス(RSV)プロモーター; 誘導性プロモーターs、例えば、
MMTプロモーター、メタロチオネインプロモーター; 熱ショックプロモーター;
アルブミンプロモーター; ApoAIプロモーター; ヒトグロビンプロモーター; ウ
イルスチミジンキナーゼプロモーター、例えばHerpes Simplexチミジンキナーゼ
プロモーター; レトロウイルスLTRs; バクチンプロモーター; およびヒト成長ホ
ルモンプロモーターが含まれる。該プロモーターはKGF-2のための天然のプロモ
ーターであってもよい。 他の遺伝子治療技術と違って、生核酸配列を標的細胞内に導入する１つの主な
利点は、細胞内における該ポリヌクレオチド合成が一時的であることである。非
複製DNA配列を細胞内に導入することにより、６ヶ月間までの期間、所望のポリ
ペプチドを産生することができることが研究により示されている。
【０３２２】 KGF-2ポリヌクレオチド構築物を、動物中の、筋肉、組織、皮膚、脳、肺、肝
臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、膀胱、胃
、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、目、腺、および結合組織を含む組織の
間質間隙（空間）に供給することができる。該組織の間質間隙には、臓器組織の
細網繊維、管または小室壁中の弾性繊維、繊維性組織のコラーゲン繊維間の細胞
間、液体、ムコポリサッカライドマトリックス、または筋肉細胞をシールする結
合組織内もしくは骨小腔内の同じマトリックスを含む。同じく、該間隙を、循環
中の血漿、およびリンパチャンネルのリンパ液が占める。下記の理由により筋肉
組織の間質間隙に供給することが好ましい。該構築物はこれら細胞を含む組織内
に注射することにより好都合に供給することができよう。該構築物は、持続性の
、分化した非分割細胞に供給するかその中で発現させることが好ましいが、供給
および発現は、非分化もしくは完全には分化していない細胞、例えば血液幹細胞
または皮膚繊維芽細胞中で達成されるかも知れない。in vivoの筋肉細胞はポリ
ヌクレオチドを取込み、発現する能力が特に優れている。 生酸配列を注射するための、DNAまたはRNAの有効用量は約0.05 mg/kg体重〜約
50 mg/kg体重の範囲であろう。好ましくは、該用量は約0.005 mg/kg〜約20 mg/k
g、より好ましくは約0.05 mg/kg〜約5 mg/kgであろう。もちろん、当業者が認識
するであろうように、この用量は注射する組織の部位により異なるであろう。核
酸配列の適切および有効用量は、当業者が容易に決定することができ、治療する
病状および投与経路に依存してよい。 好ましい投与経路は、組織の間質間隙内への非経口経路での注射による。しか
しながら、他の非経口経路、例えば、特に肺や気管組織、喉もしくは鼻粘膜に供
給するためのエアロゾル製剤の吸入を用いてもよい。さらに、生KGF-2 DNA構築
物を、該方法に用いるカテーテルにより血管形成時に動脈に供給することができ
る。 生ポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、供給部位に直接針で注射
、局所投与、カテーテル注入、および所謂「遺伝子銃（gene guns）」を含む当
該分野で知られたあらゆる方法により供給される。これらの供給方法は当該分野
で知られている。 実施例に示すように、in vivoで投与することができる生KGF-2核酸配列は、ウ
サギの大腿動脈でKGF-2ポリペプチドをうまく発現させる。 該構築物は、供給ビークル、例えばウイルスは配列、ウイルス粒子、リポソー
ム製剤、リポフェクチン、沈殿物質などを用いて供給してもよい。そのような供
給方法は当該分野で知られている。
【０３２３】 ある態様において、KGF-2ポリヌクレオチド構築物はリポソーム調製物中でコ
ンプレックスとなる。本発明に用いるリポソーム調製物には、カチオニック（正
に荷電）、アニオニック（負に荷電）、および中性調製物が含まれる。しかしな
がら、カチオニックリポソームとポリアニオニック核酸の間にタイトな荷電のコ
ンプレックスを形成することができるので、カチオニックリポソームが特に好ま
しい。カチオニックリポソームは、機能形のプラスミドDNA、（Felgner et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 7413-7416, この内容は本明細書の一
部を構成する); mRNA (Maloneetal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:
6077-6081（この内容は本明細書の一部を構成する); および精製転写因子 (Debs
et al., J. Biol. Chem. (1990) 265: 10189-10192（この内容は本明細書の一
部を構成する)の細胞内供給に介在することが示されている。カチオニックリポ
ソームは容易に利用可能である。例えば、N[1-2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]
-N, N, N-トリエチルアンモニウム(DOTMA)リポソームは特に有用であり、登録商
標LipofectinとしてGIBCO BRL, Grand Island, N. Yから入手可能である (Felgn
er et al., Proc. Natl Acad Sci. USA (1987) 84: 7413-7416（この内容は本明
細書の一部を構成する）も参照のこと）。他の市販のリポソームにはトランスフ
ェクテース(DDAB/DOPE)およびDOTAP/DOPE (Boehringer)が含まれる。 他のカチオニックリポソームは、当該分野でよく知られた技術を用いて容易に
利用可能な物質から製造することができる。例えば、DOTAP (1,2-ビス(オレオイ
ルオキシ)-3- (トリメチルアンモニオ)プロパン リポソームの合成の説明につい
てはPCT公開公報No. WO 90/11092 (この内容は本明細書の一部を構成する）参照
。DOTMAリポソームの製造法は文献に記載されている。例えば、P. Felgner et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417(この内容は本明細書の一部を
構成する）参照。同様の方法を用いて他のカチオニック脂質物質からリポソーム
を製造することができる。 同様に、アニオニックおよび中性リポソームareは、例えば、Avanti Polar Li
pids (Birmingham, Ala.)から容易に入手できるか、または容易に入手可能な物
質を用いて容易に製造することができる。そのような物質には、ホスファチジル
、コリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレイルホス
ファチジルコリン(DOPC)、ジオレイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジオ
レイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)などが含まれる。これら物質は適
切な割合でDOTMAおよびDOTAP出発物質と混合することもできる。これらの物質を
用いるリポソームの製造方法は当該分野でよく知られている。 例えば、市販のジオレイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジオレイルホスファ
チジルグリセロール(DOPG)、およびジオレイルホスファチジルエタノールアミン
(DOPE)を種々の組み合わせで用いてコレステロールを加えるかまたは加えずに通
常のリポソームを製造することができる。すなわち、例えば、DOPG/DOPC小胞は
、超音波処理用バイアル中、窒素ガス流で各50 mgのDOPGおよびDOPCを乾燥する
ことにより製造することができる。試料を一夜真空ポンプ下におき、翌日脱イオ
ン水で水和する。次に、試料を反転カップ（バスタイプ）プローブを取り付けた
Heat Systems model 350ソニケーター（超音波処理装置）を最大にセットして（
ただし、バス（浴）を15ECで循環する）栓をしたバイアル中で試料を2時間超音
波処理する。あるいはまた、負に荷電したビークルを超音波処理せずに調整して
多層小胞を得るか、またはヌクレオポア膜を通して押し出し成型することにより
分離したサイズの多層小胞を得ることができる。 リポソームは多層小胞(MLVs)、小単層小胞(SUVs)、または大単層小胞(LUVs)を
含むことができるが、SUVsが好ましい。種々のリポソーム-核酸コンプレックス
が当該分野でよく知られた方法を用いて製造される。例えば、Straubinger et a
l., Methods of Immunology (1983), 101: 512-527（この内容は本明細書の一部
を構成する）参照。例えば、核酸を含有するMLVsはリン脂質の薄膜をガラスチュ
ーブ壁に沈着させ、次いで被包する物質の溶液で水和することにより製造するこ
とができる。SUVsはMLVsの超音波処理を延長し、単層リポソームの均質なポピュ
レーションを得ることにより製造される。捕捉される物質を予め形成したMLVsの
懸濁液に加え、次いで超音波処理する。カチオニック脂質を含むリポソームを用
いる場合は、乾燥脂質膜を適切な溶液、例えば滅菌水、または等張緩衝溶液、例
えば10 mM Tris/NaClに再懸濁し、超音波処理し、次いで予め形成したリポソー
ムを直接DNAと混合する。リポソームおよびDNAは、正に荷電したリポソームがカ
チオニックDNAと結合することにより非常に安定なコンプレックスを形成する。
SUVsは小核酸断片と用いることがわかる。LUVsは当該分野でよく知られた多くの
方法により製造される。一般に用いる方法には、Ca2+-EDTAキレーション(Papaha
djopoulos et al., Biochim. Biophys. Acta (1975) 394: 483; Wilson et al.,
Cell (1979) 17: 77); エーテル注射 (Deamer, D. and Bangham, A., Biochim.
Biophys. Acta (1976) 443: 629; Ostro et al., Biochem. Biophys. Res. Com
mun. (1977) 76: 836; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76
: 3348); 界面活性剤透析 (Enoch, H. and Strittmatter, P., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA (1979) 76: 145); および逆層蒸発 (REV) (Fraley et al., J. Bio
l. Chem. (1980) 255: 10431; Szoka, F. and Papahadjopoulos, D., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA (1978) 75: 145; Schaefer-Ridder et al., Science (1982)
215: 166)（これらの内容は本明細書の一部を構成する）が含まれる。 一般に、DNA／リポソーム比は、約10: 1〜約1: 10であろう。好ましくは該比
は約5: 1〜約1: 5であろう。より好ましくは、該比は約3: 1〜約1: 3であろう。
さらにより好ましくは、該比は約1:1であろう。 米国特許第5,676,954 (この内容は本明細書の一部を構成する) は、カチオニ
ックリポソーム担体とコンプレックスにした遺伝（子）物質のマウスへの注射に
ついて報告している。米国特許第4,897,355、4,946,787、5,049,386、5,459,127
、5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055号、および国際公開公報第WO 9
4/9469号 (これらの内容は本明細書の一部を構成する)は、DNAを細胞および哺乳
動物にトランスフェクトするのに用いるカチオニック脂質を提供する。米国特許
第5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055号、および国際公開公報第WO 9
4/9469号 (これらの内容は本明細書の一部を構成する)は、DNA-カチオニック脂
質コンプレックスの哺乳動物への供給方法を提供する。 ある態様において、細胞は、KGF-2コード配列を含むRNAを含有するレトロウイ
ルス粒子を用いてex vivoまたはin vivoで操作される。レトロウイルスベクター
が得られるレトロウイルスには、限定されるものではないが、サルネズミ白血病
ウイルス（Moloney Murine Leukemia Virus）、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫
ウイルス、Harvey肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ギボンアペ（gibbon ape
）白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、脊髄増殖性肉腫ウイルス、および乳
癌ウイルスが含まれる。 レトロウイルスプラスミドベクターを用いて、パッケージング細胞系を形質導
入しプロデューサー細胞系を形成する。トランスフェクトするパッケージング細
胞の例には、限定されるものではないが、Miller, Human Gene Therapy 1: 5-14
(1990)に記載の、PE501、PA317、R-2、R-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、RC
RE、RCRIP、GP+E-86、GP+envAm 12、およびDAN 細胞系（この内容は本明細書の
一部を構成する）が含まれる。該ベクターは、当該分野で知られたあらゆる方法
によりパッケージング細胞に形質導入してよい。そのような方法には、限定され
るものではないが、エレクトロポーレーション、リポソームの使用、およびCaP0 4 沈殿が含まれる。あるいはまた、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソ
ーム内に被胞させるか、または脂質と結合させ、次いで宿主に投与する。 プロデューサー細胞系は、KGF-2をコードするポリヌクレオチドを含む感染性
レトロウイルスベクター粒子を生じる。次に、そのようなレトロウイルスベクタ
ー粒子を用いて、in vitroまたはin vivoで真核細胞を形質導入する。形質導入
した真核細胞はKGF-2を発現するであろう。
【０３２４】 ある別の態様において、アデノウイルスベクター中に含まれるKGF-2ポリヌク
レオチドを用いてex vivoまたはin vivoで細胞を操作する。アデノウイルスは、
KGF-2をコードし、発現し、同時に正常な溶解性ウイルスライフサイクルにおい
て複製する能力が不活化されるように操作することができる。アデノウイルスの
発現は、ウイルスDNAを宿主細胞染色体に統合することなく達成され、それによ
り挿入突然変異に関する心配が軽減される。したがって、アデノウイルスは、多
年にわたり安全性の極めて高い生腸（live enteric）ワクチンとして用いられて
きた (Schwartz, A. R. et al. (1974) Am. Rev. Respir. Dis. 109: 233-238)
。最終的に、アデノウイルス介在性遺伝子伝達はα-1-抗トリプシンおよびCFTR
のコットンラット肺への伝達を含む多くの例で示されてきた(Rosenfeld, M. A.
et al. (1991) Science 252: 431-434; Rosenfeld et al., (1992) Cell 68: 14
3-155)。さらに、アデノウイルスをヒトの癌の原因物質として確立するための広
範な研究は一様に否定的であった (Green, M. et al. (1979) Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 76: 6606)。 本発明に有用な適切なアデノウイルスベクターは、例えば、Kozarsky and Wil
son, Curr. Opin. Genet. Devel. 3:499-503(1993); Rosenfeld et al., Cell 6
8:143-155(1992); Engelhardt et al., Human Genet.Ther. 4:759-769(1993); Y
ang et al., Nature genet. 7:362-369(1994); Wilson et al. Nature 365:691-
692(1993);および米国特許第5,652,224号（これらの内容は本明細書の一部を構
成する）に記載されている。例えば、アデノウイルスベクターAd2は有用であり
、ヒト293細胞中で増殖することができる。これら細胞はアデノウイルスのE1領
域を含み、ElaおよびElbを構造的に発現し、ベクターから除去した遺伝子の産物
をもたらすことにより不完全アデノウイルスを完全なものとする。Ad2に加え、
他のアデノウイルス（例えば、Ad3、Ad5、およびAd7）も本発明に有用である。 好ましくは、本発明に用いるアデノウイルスは複製欠陥性である。複製欠陥性
アデノウイルスは感染性粒子を形成するのにヘルパーウイルスおよび／またはパ
ーケージング細胞系の助けが必要である。得られるウイルスは細胞に感染するこ
とができ、プロモーター、例えば本発明のHARPプロモーターと機能性に連結した
目的とするポリヌクレオチドを発現することができるが、ほとんどの細胞で複製
することができない。複製欠陥性アデノウイルスは、１またはそれ以上の、下記
遺伝子: Ela, Elb, E3, E4, E2a、または L1〜L5のすべてまたは一部が欠失して
いてよい。 ある別の態様では、該細胞はアデノ関連ウイルス(AAV)を用いてex vivoまたは
in vivoで操作される。AAVは感染性粒子を生じるのにヘルパーウイルスを必要と
する天然の欠損性ウイルスである (Muzyczka, N., Curr. Topics in Microbiol.
Immunol. 158: 97 (1992))。それはそのDNAを非分裂（dividing）細胞中に統合
する数種類のウイルスのひとつでもある。AAVのわずか300塩基対を含むベクター
をパッケージし、統合することができるが、異種DNAのためのスペースは約4.5 k
bに限定される。そのようなAAVを製造し、用いる方法は当該分野で知られている
。例えば、米国特許第5,139,941、5,173,414、5,354,678、5,436,146、5,474,93
5,5,478,745、および5,589,377号参照。 例えば、本発明に用いる適切なAAVベクターには、DNA複製、カプセル（被胞）
化、および宿主細胞統合に必要なすべての配列を含むであろう。KGF-2ポリヌク
レオチド構築物は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)に記載の標準的クローニング法を用
いてAAVベクターに挿入される。次に、組換えAAVベクターをパッケージング細胞
にトランスフェクトし、これに、リポフェクション、エレクトロポーレーション
、リン酸カルシウム沈殿などを含むあらゆる標準的技術を用いてヘルパーウイル
スを感染させる。適切なヘルパー細胞には、アデノウイルス、サイトメガロウイ
ルス、ワクシニアウイルス、またはヘルペスウイルスが含まれる。パッケージン
グ細胞がトランスフェクトし、感染したら、KGF-2ポリヌクレオチド構築物を含
む感染性AAVウイルス粒子を生じるであろう。次に、これらウイルス粒子を用い
てex vivoまたはin vivoで真核細胞を形質導入する。形質導入細胞はそのゲノム
に統合されたKGF-2ポリヌクレオチドを含み、KGF-2を発現するであろう。 別の遺伝子療法には、機能性に結合したヘテロローガスな制御領域およびホモ
ローガスな組換えによる内在性ポリヌクレオチド配列 (例えば、KGF-2をコード
する)が含まれる(例えば、米国特許第5,641,670号（1997年6月24日発行）; 国際
公開公報 No. WO 96/29411（1996年9月26日公開）; 国際公開公報 No. WO 94/12
650（1994年8月4日公開）; Koller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8
932-8935 (1989); およびZijlstra et al., Nature 342: 435-438 (1989)参照）
。この方法は、標的細胞に存在するが、通常該細胞では発現しないか、または希
望より低レベルしか発現しない遺伝子の活性化を含む。
【０３２５】 ポリヌクレオチド構築物を、プロモーターを含み、該プロモーターの側面に位置
する配列を標的とする（targeting）当該分野で知られた標準的方法を用いて作
製する。適切なプロモーターは本明細書に記載している。標的配列は、プロモー
ター-標的配列と内在性配列のホモローガスな組換えができるように内在性配列
と十分相補正である。標的配列はKGF-2の所望の内在性ポリヌクレオチド配列の5
'末端に十分近く、プロモーターはホモローガスな組換えにより内在性配列と機
能性に連結するであろう。 プロモーターおよび標的配列はPCRを用いて増幅することができる。好ましく
は、増幅（した）プロモーターは、5'および3'末端に別個の制限酵素部位を含む
。好ましくは、最初の標的配列の3'末端は増幅プロモーターの5'末端と同じ制限
酵素部位を含み、第二の標的配列の5'末端は増幅プロモーターの3'末端と同じ制
限部位を含む。増幅プロモーターおよび標的配列を消化し、一緒に連結する。 プロモーター-標的配列構築物を生ポリヌクレオチドとしてかまたはトランス
フェクション促進物質、例えばリポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、全ウ
イルス、リポフェクション、沈殿物質など（先により詳細に記載）と組み合わせ
て細胞に供給される。プロモーター-標的配列は、直接針注射、静脈内注射、局
所投与、カテーテル注入、粒子アクセラレーターなどを含むあらゆる方法により
供給することができる。該方法を以下にさらに詳述する。 プロモーター-標的配列構築物は細胞に取込まれる。該構築物と内在性配列の
ホモローガスな組換えが生じ、内在性KGF-2配列をプロモーターの制御化に置く
。次に、該プロモーターが内在性KGF-2配列を発現させるように働く。 KGF-2をコードするポリヌクレオチドは、他の血管形成タンパク質をコードす
る他のポリヌクレオチドとともに投与してよい。血管形成タンパク質には、限定
されるものではないが、酸性および塩基性繊維芽細胞成長因子、VEGF1、表皮成
長因子αおよびβ、血小板性内皮細胞成長因子、血小板斉成長因子、腫瘍壊死因
子α、肝細胞成長因子、インスリン様成長因子、コロニー刺激因子、マクロファ
ージコロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、および酸化
窒素シンターゼが含まれる。
【０３２６】 好ましくは、KGF-2コーディングポリヌクレオチドは、該タンパク質の分泌を
促す分泌シグナル配列を含む。典型的には、該シグナル配列は、該コーディング
領域の5'末端に向かってかまたは5'末端で発現するように該ポリヌクレオチドの
コーディング領域に位置する。シグナル配列は目的とするポリヌクレオチドとホ
モローガスまたはヘテロローガスであってよく、トランスフェクトする細胞とホ
モローガスまたはヘテロローガスであってよい。さらに、シグナル配列は当業者
に知られた方法を用いて化学的に合成してよい。 治療効果をもたらすのに充分な量の１またはそれ以上の分子の発現をもたらす
限りにおいて、あらゆる上記ポリヌクレオチド構築物のあらゆる投与方法を用い
ることができる。これには、直接針注射、全身注射、カテーテル注入、バイオリ
スティックインジェクター（biolistic injector）、粒子アクセラレーター（す
なわち、「遺伝子銃」、ゲルホームスポンジデポー（depot）、他の市販のデポ
ー物質、浸透圧ポンプ（例えば、Alza ミニポンプ）、経口もしくは坐剤用固形
物（錠剤もしくは丸剤）医薬製剤、および外科手術時の注入（decanting）もし
くは局所塗布剤が含まれる。例えば、生リン酸カルシウム沈殿プラスミドのラッ
ト肝およびラット脾臓への直接注射、またはタンパク質コートプラスミドの門脈
への直接注射はラット肝における異種遺伝子の遺伝子発現をもたらした (Kaneda
et al., Science 243: 375 (1989))。 好ましい局所投与方法は直接注射による。好ましくは、供給ビークルとコンプ
レックスにした本発明の組換え遺伝子を、動脈の領域内に局所的にかまたは直接
注射することにより投与する。動脈の領域内に局所的に組成物を投与するとは、
動脈内にセンチメートル、好ましくはミリメートルで組成物を注射することをい
う。 別の局所投与法は、本発明のポリヌクレオチド構築物を外科的損傷内または周
辺に接触させることである。例えば、患者は外科手術を受け、該ポリヌクレオチ
ド構築物を該損傷の内側の組織の領域内に注射することができる。 全身同様に有用な治療的組成物には、本発明の標的供給ビークルとコンプレッ
クスになった本発明の組換え分子が含まれる。全身投与に用いる適切な供給ビー
クルは、該ビークルを特定部位に標的化する（targeting）ためのリガンドを含
むリポソームを含む。 好ましい全身投与方法には、静脈内注射、エアロゾル、経口および皮下（局所
）供給が含まれる。静脈内注射は当該分野の標準的方法を用いて行うことができ
る。エアロゾル供給も当該分野の標準的方法を用いて行うことができる（例えば
、Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189: 11277-11281,1992, こ
の内容は本明細書の一部を構成する）。経口供給は本発明のポリヌクレオチド構
築物を、動物の腸の消化酵素による分解に耐えるようにする担体とコンプレック
スにすることにより行うことができる。そのような担体の例には、当該分野でし
られているようなプラスチックカプセルや錠剤が含まれる。局所供給は、本発明
のポリヌクレオチド構築物を皮膚を通過することができる脂質親和性試薬（例え
ばDMSO）と混合することにより行うことができる。 供給する物質の有効量の決定は、例えば物質の化学構造と生物活性、動物の年
齢と体重、治療を要する正確な病状およびその重症度、および投与経路を含む多
くの因子に依存し得る。治療頻度は、用量あたりの投与するポリヌクレオチド構
築物の量、および対象の健康と病歴といった多くの因子に依存する。正確な量、
投与回数、および投与時期は担当する医師や獣医師が決定するであろう。
【０３２７】 本発明の治療的組成物はあらゆる動物、好ましくは哺乳動物および鳥に投与す
ることができる。好ましい哺乳動物にはヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウ
サギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、およびブタが含まれ、ヒトが特に好ましい。 具体的な態様において、遺伝子療法により、抗体またはその機能的誘導体をコ
ードする配列を含む核酸を投与し、本発明のポリペプチドの異常な発現および／
または活性と関連する疾病または障害を治療し、阻害し、もしくは予防する。遺
伝子療法とは、発現した、もしくは発現し得る核酸を対象に投与することに行う
療法をいう。本発明のこの態様において、該核酸は、それがコードする、治療効
果をもたらすタンパク質を産生する。 当該分野で利用可能なあらゆる遺伝子療法のための方法を本発明に従って用い
ることができる。例となる方法を以下に示す。 遺伝子療法の方法に関する一般的総説については、Goldspiel et al., Clinic
al Pharmacy 12: 488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3 : 87-95 (1991);
Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993); Mulligan,
Science 260: 926-932 (1993); およびMorgan and Anderson, Ann. Rev. Bioche
m. 62: 191-217 (1993); May, TIBTECH 11 (5) : 155-215 (1993)を参照のこと
。使用できる組換えDNA技術の当該分野で一般的に知られた方法は、Ausubel et
al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N
Y (1993); およびKriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Man
ual, Stockton Press, NY (1990)に記載されている。 好ましい局面において、該化合物は抗体をコードする核酸配列を含み、該核酸
配列は、抗体またはその断片、キメラタンパク質、重もしくは軽鎖を適切な宿主
中で発現する発現ベクターの部分である。特に、そのような核酸配列は、抗体を
コードする領域と機能性に連結した、誘導性もしくは構造性、および所望により
組織特異的なプロモーターを有する。別の具体的な態様において、抗体をコード
する配列およびあらゆる他の所望の配列がゲノム内の所望の部位でホモローガス
な組換えを生じる領域により隣り合った（flanked）核酸分子を用いることによ
り、抗体をコードする核酸の染色体内発現を生じる (Koller and Smithies, Pro
c. Natl. Acad Sci. USA 86: 8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342
: 435-438 (1989)。具体的な態様において、発現した抗体分子は一本鎖抗体であ
るか、または該核酸配列は該抗体の重および軽鎖の両方またはその断片をコード
する配列を含む。 該核酸の患者への供給は、直接的（患者を核酸もしくは核酸保持ベクターに直
接さらす）でも間接的（最初にin vitroで細胞を核酸で形質転換し、次いで患者
に移植する）でもよい。これら２つのアプローチ法はそれぞれin vivoまたはex
vivo遺伝子療法として知られている。 ある具体的態様において、該核酸配列を直接in vivoで投与し、それを発現さ
せてコードされた生成物を産生させる。これは、当該分野で知られた多くのあら
ゆる方法、例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの部分として構築し、次い
でこれを、例えば、欠損性もしくは弱毒化レトロウイルスもしくは他のウイルス
ベクターを用いて感染させるか(米国特許No.4,980,286参照)、または生DNAの直
接感染、または微粒子衝撃（例えば遺伝子銃; Biolistic, Dupont)、または脂質
でコーティング、または細胞表面レセプターもしくはトランスフェクティング物
質、リポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセルへの被包、または核内に入る
ことが知られているペプチドと連結したそれらを投与するか、またはレセプター
介在性エンドサイトーシスを受けるリガンドと結合したものを投与する（例えば
、Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)) (これは該レセプターを
特異的に発現する細胞種を標的化するのに用いることができる）などにより投与
して細胞内にあるようすることにより達成することができる。別の態様において
、リガンドがフソジェニック（fusogenic)ウイルスペプチドを含む核酸-リガン
ドコンプレックスを形成させてエンドソームを崩壊させ、核酸がリソゾームで分
解するのを防ぐことができる。さらに別の態様において、特異的レセプターを標
的化することにより細胞への特異的な取り込みと発現をもたらすように該核酸を
in vivoで標的化することができる (例えば、PCT 公開公報 WO 92/06180; WO 92
/22635; W092/20316; W093/14188, WO 93/20221参照)。あるいはまた、該核酸を
細胞内に導入し、ホモローガスな組換えにより発現させるために宿主細胞DNA内
に組み込むことができる (Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86: 8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342: 435-438 (1989))。 具体的な態様において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルスベ
クターを用いる。例えばレトロウイルスベクターを用いることができる (Miller
et al., Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)参照)。このレトロウイルスベク
ターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングと宿主細胞DNA内への統合に必
要な成分を含む。遺伝子療法に用いる抗体をコードする核酸配列を１またはそれ
以上のベクター中にクローンすることにより遺伝子の患者への供給を促す。レト
ロウイルスベクターの詳細は、Boesen et al., Biotherapy 6 : 291-302 (1994)
に記載されている（幹細胞を化学療法により耐性にするために、造血幹細胞にmd
rl遺伝子を供給するためのレトロウイルスベクターの使用について記載）。遺伝
子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を記載した他の参考文献には、Cl
owes et al., J. Clin. Invest. 93: 644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:
1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4: 129-141 (
1993); およびGrossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics -and Devel. 3:
110-114 (1993)がある。 アデノウイルスは遺伝子療法に使用できる他のウイルスベクターである。アデ
ノウイルスは、遺伝子を呼吸器上皮に供給するために特に魅力的なビークルであ
る。アデノウイルスは、天然に呼吸器上皮に感染し、軽度な疾病を引き起こす。
アデノウイルスによる供給系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、およ
び筋肉である。アデノウイルスには非分裂細胞に感染できるという利点がある。
Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3 : 499
-503 (1993)には、アデノウイルスによる遺伝子療法に関する総説が記載されて
いる。Bout et al., Human Gene Therapy 5: 3-10 (1994)は、遺伝子をアカゲザ
ルの呼吸器上皮に伝達するためのアデノウイルスベクターの使用を記載した。遺
伝子療法にアデノウイルスを用いる他の例は、Rosenfeld et al., Science 252:
431- 434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68 : 143-155 (1992); Mastrangel
i etal., J Clin. Invest. 91: 225-234 (1993); PCT公開公報W094/12649; およ
びWang, et al., Gene Therapy 2 : 775-783 (1995)に記載されている。好まし
い態様では、アデノウイルスベクターを用いる。 アデノ関連ウイルス(AAV)も遺伝子療法に用いることが提唱されてきた (Walsh
etal., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300 (1993); 米国特許No. 5,43
6,146)。
【０３２８】 遺伝子療法に対する別のアプローチには、エレクトロポーレーション、リポフ
ェクション、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、またはウイルス感
染といった方法により遺伝子を組織培養中の細胞に伝達（トランスファー）する
ことを含む。通常、伝達の方法には、選択可能なマーカーの細胞への伝達が含ま
れる。次に、細胞を選択にかけ、伝達した細胞を取り込み、発現した細胞を単離
する。次に、該細胞を患者に供給する。 この態様において、該核酸を細胞内に導入し、次いで得られた組換え細胞をin
vivoで投与する。そのような導入は、限定されるものではないが、トランスフ
ェクション、エレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、該核酸配
列を含むウイルスもしくはバクテリオファージベクターの感染、細胞融合、染色
体による遺伝子伝達、マイクロセルによる遺伝子伝達、スフェロプラスト融合な
どを含む当該分野で知られたあらゆる方法により行うことができる。レシピエン
ト細胞の必要な発生的および生理学的機能を破壊せずに、異種遺伝子を細胞に導
入するための多くの技術が当該分野で知られており(例えば、Loeffler and Behr
, Meth. Enzymol. 217: 599-618 (1993); Cohen etal., Meth. Enzymol. 217: 6
18-644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29: 69-92m (1985)、本発明に従って用
いることができよう。該技術は、該核酸を細胞に安定して伝達し、該核酸が細胞
により発現可能になり、好ましくはその細胞の子孫に遺伝し、発現可能であるよ
うにすることをもたらすべきである。 得られた組換え細胞は、当該分野で知られた種々の方法により患者に供給する
ことができる。組換え血液細胞(例えば、造血幹または先祖細胞)は、好ましくは
静脈内に投与される。使用を想定した細胞の量は所望の効果、患者の状態などに
依存し、当業者が決定することができる。 遺伝子療法のために核酸を導入することができる細胞にはあらゆる所望の利用
可能な細胞種が含まれ、限定されるものではないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラ
チノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；血液細胞、例えばTリンパ球、Bリン
パ球、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、巨核球、顆粒球；種々の幹も
しくは先祖細胞、特に造血幹もしくは先祖細胞（例えば骨髄、臍帯血、末梢血、
胎児肝などから得られる）が含まれる。 好ましい態様において、遺伝子療法に用いる細胞は患者の自己由来である。 組換え細胞を遺伝子療法に用いる態様において、抗体をコードする核酸配列を
細胞内に導入し、それらが細胞またはその子孫により発現可能になるようにし、
次いで、治療効果を得るために組換え細胞をin vivo投与する。具体的な態様で
は幹または先祖細胞を用いる。in vitroで単離し、維持することができるあらゆ
る幹および／または先祖細胞を本発明のこの態様に従って用いることができる可
能性がある(例えば、PCT公開公報WO 94/08598; Stemple and Anderson, Cell 71
: 973-985 (1992); Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A: 229 (1980); およびPitt
elkow and Scott, Mayo Clinic Proc. 61:771 (1986)参照)。 具体的態様において、遺伝子療法のために導入する核酸は、該核酸の発現が転
写の適切なインデューサーが存在するかしないかを制御することにより制御され
るようにコード領域と機能性に連結された誘導性（inducible）プロモーターを
含む。治療的または予防的活性の証明。 本発明の化合物または治療的組成物は、ヒトに用いる前に、所望の治療的また
は予防的活性を、in vitro、次いでin vivoで試験することが好ましい。例えば
、化合物または医薬組成物の治療的または予防的有用性を証明するためのin vit
roアッセイには、細胞系または患者の組織試料に対する化合物の効果を含む。細
胞系または組織試料に対する化合物の効果は、限定されるものではないが、ロゼ
ット形成アッセイおよび細胞溶解アッセイを含む当業者に知られた技術を利用し
て測定することができる。本発明によれば、特定化合物の投与が必要であるか否
かを決定するのに用いることができるin vitroアッセイには、患者組織試料を培
養中で増殖させ、化合物に曝露するかまたは化合物を投与し、組織試料に対する
該化合物の効果を試験するin vitro細胞培養アッセイが含まれる。
【０３２９】 免疫活性 KGF-2 ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはKGF-2のアゴニストも
しくはアンタゴニストは、免疫細胞の増殖、分化、もしくは移動（走化性）を活
性化もしくは阻害することにより免疫系の不全もしくは障害を処置するのに有用
であるかもしれない。免疫細胞は、多能性幹細胞からミエロイド（血小板、赤血
球、好中球、およびマクロファージ）およびリンフォイド（BおよびTリンパ球）
を生じる造血（血液新生）と呼ばれる過程を通して発達する。これら免疫不全ま
たは障害の病因は遺伝的、身体的、例えば癌もしくはいくつかの自己免疫障害、
後天性（例えば化学療法または毒素による）、または感染性であってよい。さら
に、KGF-2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはKGF-2のアゴニストもし
くはアンタゴニストは、特定の免疫系疾患もしくは障害のマーカーもしくはディ
テクターとして用いることができる。 KGF-2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはKGF-2のアゴニストもしく
はアンタゴニストは、造血細胞の不全もしくは障害を処置（治療）もしくは検出
するのに有用であるかもしれない。KGF-2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド
、またはKGF-2のアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、ある（または多
くの）種の造血細胞の減少に関連した障害を処置するために、多能性幹細胞を含
む造血幹細胞の分化と増殖を増大させるのに用いられよう。免疫不全症候群の例
には、限定されるものではないが、血液タンパク質障害（例えば、無γグロブリ
ン血症、γグロブリン異常血症）、毛細血管拡張性運動失調症、分類不能型免疫
不全、Digeorge症候群、HIV感染症、HTLV-BLV感染症、白血球付着不全症候群、
リンパ球減少症、食細胞殺菌機能不全、重症複合型免疫不全(SCIDs)、Wiskott-A
ldrich障害、貧血、血小板減少症、またはヘモグロビン尿症が含まれる。 さらに、KGF-2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはKGF-2のアゴニス
トもしくはアンタゴニストは、止血（出血の停止）または血栓溶解活性（血餅形
成）を調節するのに用いることもできる。例えば、止血または血栓溶解活性を増
大することにより、KGF-2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはKGF-2の
アゴニストもしくはアンタゴニストは、血液凝固障害（例えば、無フィブリノー
ゲン血症、因子不全）、血小板障害（例えば、血小板減少症）、または外傷、外
科手術もしくは他の原因によって生じる損傷を処置するのに用いられよう。ある
いはまた、止血もしくは血栓溶解活性を低下させることができるKGF-2ポリヌク
レオチドまたはポリペプチド、またはKGF-2のアゴニストもしくはアンタゴニス
トは、心臓発作（梗塞）、卒中、もしくは傷の治療において重要な、凝固を阻害
し、または溶解させるのに用いられよう。 KGF-2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはKGF-2のアゴニストもしく
はアンタゴニストは、自己免疫障害を処置または検出するのにも有用であろう。
多くの自己免疫症がは免疫細胞が自己を異種物質と不適切に認識することにより
生じる。この不適切な認識は宿主組織の破壊を招く免疫反応を生じる。したがっ
て、T細胞の免疫反応、特に増殖、分化もしくは走化を阻害することができるKGF
-2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはKGF-2のアゴニストもしくはア
ンタゴニストの投与は、自己免疫障害を予防するのに有効な療法であろう。 治療または検出できる自己免疫障害の例には、限定されるものではないが、ア
ジソ病、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、リウマチ性関節炎、皮膚炎、アレルギ
ー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、Goodpasture症候群、グレーブス病、多発性硬化症
、筋無力症Gravis、神経炎、眼炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多内分泌障害、紫
斑、ライター症候群、スティフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性紅斑性
狼瘡、自己免疫性肺炎（Autoimmune Pulmonary Inflammation）、ギランバレー
症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫性炎症性眼疾患が含まれる。 同様に、アレルギー性反応および病状、例えば喘息（特にアレルギー性喘息）
や他の呼吸器系の問題も、KGF-2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはK
GF-2のアゴニストもしくはアンタゴニストで処置することができよう。さらに、
これら分子を用いて抗原性分子に対する過敏症、アナフィラキシー、または血液
型不適合を処置することができる。 KGF-2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはKGF-2のアゴニストもしく
はアンタゴニストを用いて臓器拒絶や移植対宿主病(GVHD)を治療および／または
予防することもできよう。臓器拒絶は免疫反応を介して移植組織を宿主免疫細胞
が破壊することにより生じる。同様に、免疫反応はGVHDも含むが、この場合には
異種移植免疫細胞は宿主組織を破壊する。免疫反応、特にT細胞の増殖、分化ま
たは走化性を阻害するKGF-2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはKGF-2
のアゴニストもしくはアンタゴニストの投与は、臓器拒絶やGVHDを予防するのに
有効な療法かも知れない。 同様に、KGF-2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはKGF-2のアゴニス
トもしくはアンタゴニストを用いて炎症を調節することもできよう。例えば、KG
F-2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはKGF-2のアゴニストもしくはア
ンタゴニストは、炎症反応に関与する細胞の増殖および分化を阻害することがで
きよう。これら分子を用いて、感染性の炎症（例えば、性ショック、敗血症、ま
たは全身性炎症反応症候群(SIRS)）、虚血−再還流傷害、エンドトキシン致死性
、関節炎、補体性甚急性（hyperacute）拒絶、腎症、サイトカインもしくはケモ
カイン誘導性肺傷害、炎症性腸疾患、クローン病を含む、またはサイトカイン(
例えば、TNFまたはIL-1)の過剰産生により生じる慢性および急性両方の炎症性の
病状を処置することができる。
【０３３０】 過剰増殖障害 KGF-2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはKGF-2のアゴニストもしく
はアンタゴニストを用いて、新生物を含む過剰増殖障害を処置または検出するこ
とができる。KGF-2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはKGF-2のアゴニ
ストもしくはアンタゴニストは過剰増殖障害を阻害することができる他の細胞を
増殖させることができよう。 例えば、免疫反応を増大、特に過剰増殖障害の抗原性の特性を増大させるか、
またはT細胞を増殖、分化もしくは移動させることにより、過剰増殖障害を処置
することができる。この免疫反応は、存在する免疫反応を増大させるかまたは新
たな免疫反応を生じることにより増大させることができよう。あるいはまた、免
疫反応を低下させることは、過剰増殖障害の治療方法、例えば化学療法剤であっ
てもよい。 KGF-2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはKGF-2のアゴニストもしく
はアンタゴニストにより処置または検出することができる過剰増殖障害の例には
、限定されるものではないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、
内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、脳、お
よび首、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部
、および尿生殖器に局在する新生物を含む。 同様に、他の過剰増殖障害も、KGF-2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
またはKGF-2のアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置または検出するこ
とができる。そのような過剰増殖障害の例には、限定されるものではないが、高
γグロブリン血症、リンパ増殖性障害、パラプロテイン血症、紫斑、サルコイド
ーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシ
ェ病、組織球増殖症、および上記臓器系に局在するあらゆる他の過剰増殖障害、
さらに腫瘍形成が含まれる。 心臓血管障害 KGF-2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはKGF-2のアゴニストもしく
はアンタゴニスト、エンコーディングKGF-2を用いて末梢動脈疾患、例えば四肢
虚血を含む心臓血管障害を処置することができよう。 心臓血管障害には、心臓血管異常、例えば動脈−動脈瘻、動脈−静脈瘻、脳動
静脈奇形、先天的な心臓の欠陥、肺閉鎖症、およびシミター症候群が含まれる。
先天的な心臓の欠陥には、動脈解離、三房心、冠血管奇形、交差心、右胸心、動
脈管開存症、Ebstein奇形、Eisenmengerコンプレックス、左心低形成症候群、左
胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、右室の二重アウトレット（outlet）、三
尖弁閉鎖症、動脈管遺残、および心臓中隔欠損症、例えば、大動脈肺動脈中隔欠
損、心内膜床欠損、Lutembacher症候群、ファロー三徴症、および心室中隔欠損
が含まれる。 心臓血管障害には、心臓病、例えば、不整脈、カルチノイド心疾患、高心拍出
量、低心拍出量、心(臓)タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心動脈瘤、
先天的な心臓の欠陥、先天的心筋症、呼吸困難、心臓水腫（cardiac edema）、 心臓肥大、先天的心筋症、左室肥大、右室肥大、梗塞後心臓破裂、心臓弁疾患、
心筋疾患、心筋虚血、心外膜液、心膜炎(先天的および結核性を含む）、気腹、
心膜切開後症候群、肺心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能障害、充血、心臓血
管妊娠合併症、Scimitar症候群、心血管梅毒、および心血管結核も含まれる。 不整脈には、洞性不整脈、心房(性)細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、Adams-
Stokes症候群、束-分岐（bundle-branch）ブロック、洞房ブロック、長QT症候群
、副収縮、LGL（Lown-Ganong-Levine）症候群、Mahaim型摘出前（pre-excitatio
n）症候群、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、洞不全症候群、頻脈、お
よび心室細動が含まれる。 頻脈には、発作性頻脈、上室性頻脈、加速性心室固有調律、房室結節再入（re
entry)頻脈、異所性心房性頻脈、異所性結節性頻脈、洞結節再入頻脈、洞性頻脈
、Torsades de Pointes（トルサデス・デ・ポインテス）、および心室性頻脈が
含まれる。
【０３３１】 心臓弁疾患には、大動脈弁機能不全、大動脈弁狭窄、心雑音、大動脈弁逸脱、
僧帽弁逸脱、三尖弁逸脱、僧帽弁機能不全、僧帽弁狭窄、肺動脈閉鎖、肺動脈弁
機能不全、肺動脈弁狭窄、三尖弁閉鎖(症)、三尖弁機能不全、および三尖弁狭窄
が含まれる。 心筋疾患には、アルコール性心筋症、先天的心筋症、肥大性心筋症、大動脈弁
下狭窄、肺動脈弁下狭窄、拘束型心筋症、シャーガス心筋症、心内膜繊維弾性症
、心内膜繊維症、Kearns症候群、心筋再還流傷害、および心筋炎が含まれる。 心筋虚血には、冠動脈疾患、例えば狭心症、冠動脈動脈瘤、冠動脈硬化(症)、
冠動脈血栓症、冠動脈痙攣、心筋梗塞、および心筋スタニング（stunning）が含
まれる。 心（臓）血管疾患には、血管疾患、例えば動脈瘤、血管異形成、血管腫症、細
菌性血管腫症、Hippel-Lindau病、Klippel-Trenaunay-Weber症候群、Sturge-Web
er症候群、血管(運動)神経性浮腫、大動脈疾患、Takayasu動脈炎、大動脈炎、Le
riche症候群、動脈閉塞性疾患、動脈炎、エナルテリシス（enarteritis）、結節
性多発性動脈炎、脳血管障害、糖尿病性アンギオパシー、糖尿病性網膜症、塞栓
症、血栓症、肢端紅痛症、痔核、肝静脈閉塞性疾患、高血圧、低血圧、虚血、末
梢血管疾患、静脈炎、肺動脈閉塞性疾患、レイノー病、CREST症候群、網膜静脈
閉塞、Scimitar症候群、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、アタシア（atacia）
毛細血管拡張症、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、静脈瘤、静脈瘤性潰
瘍、血管炎、および静脈機能不全が含まれる。 動脈瘤には、解離性動脈瘤、動脈瘤感染、動脈瘤破裂、大動脈瘤、脳動脈瘤、
冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨動脈瘤が含まれる。 動脈閉塞疾患には、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄、線維筋過形成、腸
間膜血管閉塞症、Moyamoya病、腎動脈障害、腎動脈閉塞、および閉塞性血栓血管
炎が含まれる。 脳血管障害には、頸動脈疾患、脳アミロイドアンギオパシー、脳動脈瘤、脳酸
素欠乏症、脳動脈硬化症、脳動静脈奇形、脳動脈疾患、脳塞栓および血栓症、頸
動脈血栓症、洞血栓症、Wallenberg症候群、脳出血、硬膜外血腫、硬膜下血腫、
くも膜下出血、脳溢血、脳虚血(一過性を含む）、鎖骨下静脈スチール症候群、
脳室周囲白質軟化症、血管性頭痛、群発頭痛、および椎骨脳底動脈循環不全(症)
が含まれる。
【０３３２】 塞栓症には、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チアノー
ゼ症候群、脂肪塞栓症、肺塞栓症、および血栓塞栓症が含まれる。血栓症には、
冠動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、洞血栓症、Wallen
berg症候群、および血栓性静脈炎が含まれる。 虚血には、脳虚血、虚血性大腸炎、コンパートメント症候群、コンパートメン
ト症候群、心筋虚血、再還流傷害、および末梢性四肢虚血が含まれる。血管炎に
は、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット症候群、Churg-Strauss症候群、粘膜皮膚
リンパ節症候群、閉塞性血栓血管炎、過敏性血管炎、Schoenlein Henoch紫斑、
アレルギー性皮膚血管炎、およびヴェグナー肉芽腫症が含まれる。 KGF-2 ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはKGF-2のアゴニストも
しくはアンタゴニストは、重大な四肢虚血や冠動脈疾患の処置に特に有効である
。実施例に示すように、実験的に誘導した虚血ウサギ後肢に対するKGF-2 ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの投与は、血圧比、血流量、血管造影スコア、お
よび毛細血管密度を回復させよう。 KGF-2ポリペプチドは、限定されるものではないが、供給部位への直接針注射
、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、バイオリスティック（biolistic）
インジェクター、粒子アクセラレーター、ゲルフォームスポンジデポー、他の市
販のデポー物質、浸透圧ポンプ、経口もしくは坐剤用固体医薬製剤、外科手術時
の注入もしくは局所適用、エアロゾル供給を含む当該分野で知られたあらゆる方
法を用いて投与することができよう。そのような方法は当該分野で知られている
。KGF-2ポリペプチドは、以下に詳述する医薬組成物の部分として投与してよい
。KGF-2 ポリヌクレオチドの供給方法は本明細書中に詳述している。 抗血管新生活性 血管新生の内因性刺激物質とインヒビターの天然のバランスは、阻害性の影響
が支配的である。Rastinejad et al., Cell 56 : 345-355 (1989)。新血管形成
が正常な生理学的状態、例えば傷の治癒、臓器再生、胚発生、およびメスの繁殖
プロセス下で起きる希な場合には、血管新生は厳密に制御され、空間的および時
間的に範囲が決められる。病的血管新生、例えば固形癌の増殖を特徴とするもの
の条件下では、これら制御的調節はうまくいかない。制御されない血管新生は病
的となり、多くの新生物および非新生物疾患を進行させ続ける。多くの重症疾患
は、固形癌増殖と転位、関節炎、ある種の眼障害、および乾癬を含む異常な新血
管新生が顕著である。例えば、Moses et al., Biotech. 9: 630-634 (1991); Fo
lkman et al., N. Engl. J Med, 333: 1757-1763 (1995); Auerbach et al., J.
Microvasc. Res. 29: 401-411 (1985); Folkman, Advances in Cancer Researc
h, eds. Klein and Weinhouse, Academic Press, New York, pp. 175-203 (1985
); Patz, Am. J. Opthalmol. 94: 715-743 (1982); およびFolkman et al., Sci
ence 221: 719-725 (1983)の総説参照。多くの病的状態において、血管新生の過
程は病状に寄与する。例えば、固形癌の増殖は血管新生に依存することを示唆す
る重要なデータが蓄積されてきた。Folkman and Klagsbrun, Science 235: 442-
447 (1987)。 本発明は、本発明のKGF-2 ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、お
よびKGF-2のアゴニストまたはアンタゴニストの投与により新血管新生に関連す
る疾患もしくは障害の治療（処置）法を提供する。本発明のポリヌクレオチドお
よびポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて治療する
ことができる悪性および転位性の病状には、限定されるものではないが、悪性腫
瘍、固形癌、および本明細書に記載の癌、および当該分野で知られた他のものが
含まれる（そのような障害の総説は、Fishman et al., Medicine, 2d Ed., J. B
. Lippincott Co., Philadelphia (1985)参照)。
【０３３３】 本発明のKGF-2 ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（KGF-2アゴニストおよ
び／またはアンタゴニストを含む）で治療することができる新血管新生に関連す
る眼障害には、限定されるものではないが、血管新生緑内障、糖尿病網膜症、網
膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜
移植新血管新生、および他の眼炎症性疾患、脈絡膜または虹彩に関連する癌腫瘍
および疾患が含まれる。例えば、Waltman et al., Am. J Ophthal. 85: 704-710
(1978)およびGartner et al., Surv. Ophthal. 22: 291-312 (1978)の総説参照
。 さらに、本発明のKGF-2 ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（KGF-2アゴニ
ストおよび／またはアンタゴニストを含む）で治療することができる障害には、
限定されるものではないが、血管腫、乾癬、血管線維腫、アテローム硬化症性（
atherosclerotic）斑、傷治癒の遅延、肉芽形成、血友病性関節、瘢痕過形成、O
sler Weber症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、および血管癒着が含ま
れる。 さらに、本発明のKGF-2 ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（KGF-2アゴニ
ストおよび／またはアンタゴニストを含む）で治療することができる障害および
／または状態には、限定されるものではないが、固形癌、血液性腫瘍、例えば白
血病、腫瘍転位、カポジ肉腫、良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫
症、トラコーマ、および化膿性肉芽腫、リウマチ性関節炎、乾癬、眼血管新生疾
患、例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生
緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫およびブドウ膜炎、
傷治癒の遅延、子宮内膜症、血管新生（vascluogenesis）、肉芽形成、瘢痕過形
成（ケロイド）、接着不能骨折、強皮症、コラコーマ、血管癒着、心筋血管新生
、冠動脈側枝、脳側枝、動静脈奇形、虚血性四肢血管新生、Osler-Webber症候群
、斑（plaque）新血管新生、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管繊維症、線維
筋性形成異常、傷の肉芽形成、クローン病、アテローム性動脈硬化症、月経を制
御する胚移植に必要な血管形成を防ぐことによる避妊物質、病的結果として血管
新生がある疾病、例えばネコ引っかき病(Rochele minalia quintosa)、潰瘍(Hel
icobacter pylori)、Bartonellosis（バルトネローシス）および細菌性血管腫症
が含まれる。
【０３３４】 消化器疾患 KGF-2は、胃腸管の細胞の増殖を刺激することが示されている。すなわち、KGF
-2ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアンタゴニスト
を用いて消化器疾患を処置および／または検出することができる。 処置または検出できる消化器疾患の例には、胆管疾患(例えば、胆管新生物、
胆管閉塞、Caroli病、胆管炎を含む胆管疾患; 総胆管疾患、例えば、総胆管嚢胞
、総胆管結石、および総胆管新生物; 胆汁逆流、胆道閉鎖症、胆管ジスキネジア
、胆道瘻、胆管新生物、膀胱新生物、胆石症、例えば、総胆管結石；胆汁鬱滞、
胆管閉塞、アラジル（alagille）症候群および肝硬変; 胆嚢疾患、例えば、胆嚢
炎、胆石症、および胆嚢新生物; 胆道出血および胆嚢摘出後症候群)、消化器系
異常(例えば、鎖肛、Barrett食道、胆道閉鎖症、横隔膜弛緩症、食道閉鎖症、Hi
rschsprung病、長閉鎖、メッケル憩室、消化器系瘻(胆管瘻および食道瘻、例え
ば気管食道瘻、腸瘻、例えば直腸瘻を含む)、消化器系瘻(例えば、腸瘻、例えば
直腸膣瘻を含む直腸瘻、および膵液瘻を含む）、消化器系新生物(例えば、総胆
管新生物、胆嚢新生物を含む胆管新生物）、食道新生物、胃腸新生物、例えば腸
新生物、例えば、虫垂新生物、例えば結腸ポリープ、以下のものを含む盲腸新生
物、例えば大腸腺腫様ポリポーシス、結腸直腸新生物、例えば遺伝的結腸直腸新
生物および非ポリポーシス、Ｓ字状結腸新生物、十二指腸新生物、十二指腸新生
物、回腸新生物、腸ポリープ、例えば結腸ポリープ、例えば大腸腺腫様ポリポー
シス、Gardner症候群およびPeutz-Jeghers症候群、空腸新生物、直腸新生物、例
えば肛門新生物)、消化器系新生物(例えば、胃腸新生物、例えば腸新生物、例え
ば肛門新生物および肛門線新生物を含む直腸新生物、胃新生物、膵臓新生物、お
よび腹膜新生物）、食道疾患 (例えば、Barrett食道、食道および胃静脈瘤、食
道閉鎖症、食道嚢胞、食道憩室、例えばZenker憩室、食道運動障害、例えばCRES
T症候群、嚥下障害、例えばPlummer-Vinson症候群、食道無弛緩症、びまん性食
道痙攣症、および胃食道逆流、食道新生物、食道穿孔、例えばMallory-Weiss症
候群、食道狭窄、食道炎、例えば消化性食道炎、横隔膜ヘルニア、例えば外傷性
横隔膜ヘルニア、裂孔ヘルニア)が含まれる。 処置または検出することができる胃腸疾患の例には、胃腸炎、例えばコレラ、
梅毒、胃腸出血(例えば、吐血、下血、および消化性潰瘍)、ヘルニア (例えば、
外傷性横隔膜ヘルニアおよび裂孔ヘルニアを含む横隔膜ヘルニア、大腿ヘルニア
、鼡径ヘルニア、閉鎖孔ヘルニア、臍ヘルニア、および腹壁ヘルニア)、腸疾患(
例えば、以下を含む盲腸疾患、虫垂炎、盲腸新生物、例えば、虫垂新生物、結腸
（大腸）疾患、例えば以下を含む結腸炎、虚血性結腸炎、潰瘍性結腸炎、例えば
中毒性巨大結腸、全腸炎、例えば偽膜性腸炎、直腸結腸炎（proctocolitis）、
機能性結腸疾患、例えば結腸偽性閉塞症、結腸新生物、例えば結腸ポリープ、例
えば大腸腺腫様ポリポーシス、結腸直腸新生物、例えば遺伝性結腸直腸新生物お
よび非ポリポーシス、Ｓ字状結腸新生物、結腸憩室、巨大結腸、例えばHirschsp
rung病、および中毒性巨大結腸、Ｓ字状結腸疾患、例えば直腸結腸炎、およびＳ
字状結腸新生物、便秘、クローン病、下痢、例えば乳幼児下痢症、赤痢、例えば
アメーバ赤痢および細菌性赤痢、十二指腸疾患、例えば十二指腸新生物、十二指
腸閉塞、例えば上腸間膜動脈症候群、十二指腸潰瘍、例えばCurling潰瘍、およ
び十二指腸炎、腸炎、例えば偽膜性腸炎を含む全腸炎、回腸疾患、例えば回腸新
生物および回腸炎、免疫増殖性小腸疾患、炎症性腸疾患、例えば潰瘍性結腸炎、
クローン病、腸閉塞、寄生虫性腸疾患、例えばアニサキシス症、バランチジウム
症、ブラストシスティス感染症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症（di
entamoebiasis）、二核アメーバ症、アメーバ赤痢、およびランブル鞭毛虫症、
腸瘻、例えば直腸膣瘻を含む直腸瘻、腸新生物、例えば虫垂新生物を含む盲腸新
生物、結腸新生物、例えば大腸腺腫様ポリポーシスを含む結腸ポリープ、結腸直
腸新生物、例えば遺伝性結腸直腸新生物および非ポリポーシス、Ｓ字状結腸新生
物、十二指腸新生物、回腸新生物、腸ポリープ、例えば結腸ポリープ、大腸腺腫
様ポリポーシス、Gardner症候群、Peutz-Jeghers症候群、腸閉塞、例えば輸入脚
症候群、十二指腸閉塞、嵌頓便（impacted feces）、腸偽閉塞、例えば結腸偽閉
塞、腸重積（intussusception）、腸穿孔、例えば大腸腺腫様ポリポーシスを含
む結腸ポリープ、空腸疾患、例えば空腸新生物、吸収不良症候群、例えば盲係蹄
症候群、セリアック病、乳糖不耐症、腸性脂肪異栄養症、短腸症候群、熱帯性ス
プルー、腸間膜血管閉塞症、腸壁嚢胞状気腫、蛋白喪失性腸症、例えば腸リンパ
管拡張症、例えば肛門新生物、例えば肛門腺新生物、肛門裂創、肛門掻痒、便失
禁、痔核を含む直腸疾患、直腸炎、例えば直腸結腸炎、直腸瘻、例えば直腸膣瘻
、直腸新生物、例えば直腸新生物、例えば肛門腺新生物、直腸疾患、例えば直腸
脱、消化性潰瘍、消化性食道炎、辺縁潰瘍、消化性潰瘍出血、消化性潰瘍穿孔、
胃潰瘍、Zollinger-Ellison症候群、胃切除後症候群、例えばダンピング症候群
、胃疾患、例えば塩酸欠乏症、十二指腸胃逆流、例えば胆汁逆流、胃瘻、胃粘膜
脱、幽門閉塞（gastric outlet obstruction）、例えば幽門狭窄、胃炎、例えば
萎縮性胃炎、および肥厚性胃炎、胃不全麻痺、胃拡張、胃憩室、胃新生物、胃破
裂、胃潰瘍、および胃捻転、胃腸結核、胃下垂、嘔吐、例えば吐血および妊娠悪
阻)、膵臓疾患、例えば嚢胞性線維症、膵嚢胞(症)、例えば膵偽嚢胞(症)、膵液
瘻、膵機能不全、膵新生物、および膵炎)、腹膜疾患、例えば乳び腹膜（chylope
ritoneum）、血腹膜（hemoperitoneum）、腸間膜嚢胞、腸間膜リンパ節炎、腸間
膜血管閉塞症、腹膜妊娠、腹膜新生物、腹膜炎、気腹、横隔膜下膿瘍、および腹
膜結核が含まれる。 処置または検出される消化器疾患には肝疾患も含まれる。肝疾患には、急性黄
色（肝）萎縮、肝内胆汁鬱滞、例えばアラジル症候群、および胆汁性肝硬変、脂
肪肝、例えばアルコール性脂肪肝、Reye症候群、肝静脈血栓症、肝静脈閉塞性疾
患、肝炎、例えばアルコール性肝炎、動物性肝炎、例えば動物ウイルス性肝炎、
イヌ伝染性肝炎、およびリフトバレー熱、中毒性肝炎、ヒトウイルス性肝炎、例
えばデルタ感染、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、慢性活動性肝炎、およびＥ型
肝炎、肝レンズ核変性症、肝腫脹、肝腎症候群、門脈性高血圧、例えばCruveilh
ier Baumgarten症候群、および食道および胃静脈瘤、肝膿瘍、例えばアメーバ性
肝膿瘍、肝硬変、例えばアルコール性肝硬変、胆汁性肝硬変、および実験的肝硬
変、アルコール性肝疾患、例えばアルコール性脂肪肝、アルコール性肝炎、およ
びアルコール性肝硬変、寄生虫性肝疾患、例えば肝性脳症、肝蛭症、およびアメ
ーバ性肝膿瘍、肝不全、例えば肝性脳症、および急性肝不全、肝新生物、肝臓紫
斑病、赤血球肝性ポルフィリン症、および肝性ポルフィリン症、例えば急性間欠
性ポルフィリン症、および晩発性皮膚ポルフィリン症、肝結核、およびZellwege
r症候群)も含まれる。
【０３３５】 処置または検出することができる顎口腔疾患の例には、顎疾患（例えば、ケル
ビム症、巨大細胞肉芽腫、顎異常、例えば口蓋裂、ミクログナティズム（microg
nathism）、Pierre Robin症候群、顎前突および顎後退、顎嚢胞、例えば非歯原
性嚢胞、非歯原性嚢胞、例えば基底細胞母斑症候群、含歯性嚢胞、石灰化歯原性
嚢胞、歯周病、例えば神経根嚢胞、無歯顎（edentulous jaw）、例えば部分無歯
顎、顎新生物、例えば下顎新生物、上顎新生物、および口蓋新生物、下顎疾患、
例えば顎関節機能不全を含む頭蓋下顎障害、下顎新生物、顎前突および顎後退、
上顎障害、例えば上顎新生物）、口疾患(例えば、ベーチェット病（症候群）、
バーニングマウス症候群、口腔カンジダ症、歯槽骨炎、局所性上皮肥厚、口腔白
色水腫、口腔扁平苔癬、唇疾患、例えば口唇炎、兎唇、ヘルペス唇（herpes lab
ialis）、および唇新生物、Ludwigアンギナ、Melkersson-Rosenthal症候群、口
の異常、例えば兎唇、口蓋裂、繊維腫性歯肉、大舌症、巨口症、小口症、および
口蓋帆咽頭不全、無歯口、例えば無歯顎、例えば部分無歯顎、口新生物、例えば
歯肉新生物、例えば歯肉新生物、口腔白斑、例えば毛髪状白斑、唇新生物、口蓋
新生物、唾液腺新生物、例えば耳下腺新生物、舌下腺新生物、および顎下腺新生
物、および舌新生物、水癌、口腔瘻、口腔上顎洞瘻、および唾液腺瘻、口腔出血
、例えば歯肉出血、口腔徴候、口腔粘膜下線維症、根尖周囲歯周炎、例えば根尖
膿瘍および根尖肉芽腫および神経根嚢胞)、歯周疾患(例えば、歯槽骨損失、分岐
欠陥（furcation defects）、例えば歯肉出血、歯肉過形成、歯肉肥大、歯肉新
生物、歯肉後退、歯肉炎、例えば歯肉溝（crevicular）液、歯肉ポケット、壊死
性潰瘍性歯肉炎、巨細胞性肉芽腫、および歯冠周囲炎、歯根付着部損失、歯根嚢
胞、歯根炎、例えば歯根膿瘍、歯根ポケット、および歯根炎、歯剥脱、歯損失、
歯の移動、例えば歯の近心移動、および歯の移動）、がま腫、唾液腺疾患(例え
ば、Mikulicz病、耳下腺疾患、例えば耳下腺新生物および耳下腺炎、例えばおた
ふく風邪、唾液腺結石、唾液腺瘻、唾液腺新生物、例えば耳下腺新生物、舌下腺
新生物および顎下腺新生物)、唾液腺炎、壊死性唾液腺化生、唾液分泌過多、顎
下腺疾患、例えば顎下腺新生物、口腔乾燥症、例えばシェーグレン症候群、胃炎
(例えば、Stevens Johnson 症候群、アフタ性口内炎、アフタ性口内炎、義歯性
口内炎およびヘルペス性口内炎)、舌疾患(例えば、舌痛、例えば、良性移動性絶
縁)、大舌症、舌疾患(例えば、亀裂舌、毛舌、および舌新生物および口腔結核）
、咽頭疾患(例えば、咽頭疾患、例えば鼻咽頭疾患、例えば鼻咽頭新生物および
鼻咽頭炎)、扁桃周囲膿瘍、咽頭新生物、例えば下咽頭新生物および中咽頭新生
物（扁桃新生物、咽頭炎、咽後膿瘍、扁桃腺炎、および口蓋帆咽頭不全を含む）
)、顎口腔系異常、顎関節疾患、例えば顎関節症候群、歯疾患(例えば、歯ぎしり
、以下のものを含む歯沈着症（depositis)、歯石および歯垢、歯漏（dental lea
kage）、以下のものを含む歯髄（dental pulp）疾患、歯髄自己分解、歯髄カル
シウム沈着、歯髄露出、歯髄壊疽、第二象牙質および歯髄炎、象牙質過敏（sens
itivity)、歯限局性感染、セメント質肥大、歯列不正、例えば外傷性交合、正中
解離、角度クラスＩ歯列不正、角度クラスII歯列不正、角度クラスIII歯列不正
、虫食いエナメル質、歯異常、例えばエナメル質形成不全症、例えば歯エナメル
質過形成、無歯症、内反歯、象牙質異形成症、象牙質形成不全症、融合歯、歯牙
形成不全症、および過剰歯、歯の摩耗、歯の無機質脱落、例えば以下のものを含
む虫歯、歯の裂溝（fissures）および根虫歯、歯の変色、歯の酸蝕症、異所性歯
萌出、埋伏歯、歯傷害、例えば歯牙破折、例えば歯ひび割れ症候群、歯の損失、
歯の再吸収、例えば根再吸収および未萠出歯、および歯痛)が含まれる。
【０３３６】 眼疾患 KGF-2は、眼細胞の増殖を刺激することが示されている。すなわち、KGF-2 ポ
リヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアンタゴニストを用
いて眼疾患を処置および／または検出することができる。 処置および／または検出することができる肝疾患の例には、眼精疲労、結膜疾
患、結膜新生物、結膜炎(アレルギー性、細菌性、封入体、新生児眼炎、トラコ
ーマ、ウイルス性、急性出血性)、角結膜炎、(感染性または乾燥性)、ライター
病、翼状片、眼球乾燥症、角膜疾患、角膜ジストロフィー(遺伝性)、Fuchs内皮
ジストロフィー、角膜水腫、角膜新血管新生、角膜混濁、老人環、角膜炎、アカ
ントアメーバ角膜炎、角膜潰瘍、ヘルペス角膜炎、樹状角膜炎、角結膜炎、コラ
コーマ、眼異常(無虹彩、WAGR症候群、Anophthamos（アノフタルモス）、瞼裂縮
小症、コロボーム、水晶体転位症、水眼、小眼症、網膜形成異常)、遺伝性眼疾
患(白化症、眼白化症、眼皮膚白皮症、先天性脈絡膜欠如、遺伝性角膜ジストロ
フィー、螺旋状（gyrate）アトロフィー、遺伝性眼アトロフィー、網膜形成異常
、網膜色素変性)、眼出血 (脈絡膜出血、前房出血、網膜出血、硝子体出血)、眼
感染症 (角膜潰瘍、細菌性眼感染症、細菌性結膜炎、封入体結膜炎、新生児眼炎
、トラコーマ、麦粒腫、感染性角結膜炎)、真菌眼感染症、寄生虫眼感染症(アカ
ントアメーバ角膜炎、眼回旋糸状虫症、眼トキソプラズマ症)、ウイルス眼感染
症(ウイルス性結膜炎、急性出血性結膜炎、サイトメガロウイルス網膜炎、眼帯
状ヘルペス、ヘルペス角膜炎、樹状角膜炎)、化膿性ブドウ膜炎(眼内炎、全眼球
炎)、眼傷害 (眼の火傷、眼の異物、透過性眼傷害)、眼徴候、眼新生物(結膜新
生物、眼窩新生物、ブドウ膜新生物 (脈絡膜新生物、虹彩新生物)、眼瞼疾患(眼
瞼炎、眼瞼縮小症、眼瞼下垂、眼瞼痙攣、霰粒腫、眼瞼外反、眼瞼内反、眼瞼新
生物、麦粒腫)、涙器疾患(涙腺炎、ドライアイ症候群、乾燥性角結膜炎、シェー
グレン症候群、眼球乾燥症、涙管閉塞)、水晶体疾患(無水晶体、白内障後無水晶
体、白内障、水晶体亜脱臼、水晶体転位症、高眼圧症、緑内障 (閉塞隅角、血管
新生、開放隅角、水眼)、低眼圧症、眼運動障害 (弱視、眼振、眼運動神経麻痺
、眼筋麻痺(Duane症候群、Horner症候群、慢性進行性外眼筋麻痺、Kearns症候群
)、斜視(内斜視)、眼神経疾患(眼萎縮症、遺伝性眼萎縮症、視神経乳頭ドルーゼ
（drusen）、眼神経炎、視神経脊髄炎、乳頭浮腫)、眼窩疾患(眼球陥凹、眼球突
出、グレーブス病、眼窩形質細胞肉芽腫、眼窩新生物)、瞳孔機能異常(瞳孔不同
、緊張性瞳孔、Adie症候群、縮瞳、散瞳、Horner症候群)、屈折異常（不等像視
、屈折左右不同症、乱視、遠視、近視、老視）、網膜疾患（網膜色素線条、糖尿
病性網膜症、網膜動脈閉塞、網膜変性、黄斑変性、類嚢胞黄斑(部)浮腫、網膜ド
ルーゼ、網膜色素変性(症)、Kearns症候群、網膜剥離、網膜形成異常、網膜出血
、網膜新血管新生、網膜穿孔、網膜静脈閉塞、網膜炎（脈絡網膜炎、サイトメガ
ロウイルス網膜炎、急性網膜壊死症候群）、未熟児網膜症、増殖性硝子体網膜症
）、強膜疾患（強膜炎）、ブドウ膜疾患（脈絡膜疾患、脈絡膜出血、脈絡膜新生
物、脈絡膜浮腫（水腫）、脈絡膜炎、脈絡膜網膜炎、パルス・ラニティス（pars
lanitis）、脳回転状（網膜脈絡膜）萎縮（gyrate atropy）、虹彩疾患（落屑
症候群、虹彩毛様体炎、虹彩新生物）、ブドウ膜炎（汎ブドウ膜炎（panuveitis
）、交感性眼炎、前ベーチェット症候群、イリオシクリティス（iriocyclitis）
、虹彩炎、後部ブドウ膜炎、脈絡膜炎、脈絡網膜炎、扁平部炎、中間部ブドウ膜
炎、扁平部炎、化膿性ブドウ膜炎(眼内炎、全眼球炎)、ブドウ膜髄膜脳炎（uveo
meningoencephalitic） 症候群、視覚障害(弱視、盲目、半盲、色覚異常、複視
、夜盲症、暗点、亜正常視覚)、および増殖性硝子体網膜症が含まれる。
【０３３７】 皮膚及び結合組織の病気 ＫＧＦ−２は皮膚及び結合組織の細胞の増殖を刺激する。従ってＫＧＦ−２ポ
リヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト、及び／又はアンタゴニストは皮膚
及び／又は結合組織の病気を処置し及び／又は検出するのに用いることができる
。
【０３３８】 結合組織の病気の例には、再発生多発軟骨炎、ティーゼ症候群等の軟骨病；蜂
巣炎；エーレダンロス症候群、ケロイド（アクネケロイドを含む）、ムコ多糖沈
着症、壊死性障害（肉芽腫輪状、ネクロバイオシスリポイドを含む）、及び骨形
成不全等のコラーゲン病、皮膚ラクサ；デマトマイオシティス；ヂュピトレン拘
縮、ホモシスチン尿症、ループス紅斑（皮膚の円盤状の皮下脂肪組織、全身性の
及び腎炎を含む）；マルファン症候群；混合結合組織病、少胞のムコ多糖沈着症
（Ｉ，ＩＩ，ＵＵ，ＩＶ及びＶＩＩ）、粘液水腫、浮腫性強度症、アダルトラム
及び滑液のう胞を含むムチン症；結合組織腫瘍；ヌーナン症候群オステオポイキ
リー；紅班硬化、結節非サピュラチブ及び腹膜炎を含む皮下脂肪組織炎；陰茎硬
化、シュウドキサントーマエラスチクム、関節炎（リュウマチ、若年性リュウマ
チ、カプラン症候群、フェルティ症候群、リュウマチ結節、強直性脊髄炎及びス
チル病）、骨化過剰症、多発性筋肉痛、限局性スクレロデルマ及び全身性スクレ
ロデルマ（ＣＲＥＳＴ症候群）を含む。
【０３３９】 皮膚の病気の例には好酸球症による血管過形成；瘢痕（肥大性を含む）；皮膚
のフィステル、クイスラクサ；先端皮膚炎、アトピー性皮膚炎、コンタクト皮膚
炎（アレルギーコンタクト、光アレルギーコンタクト、トキシコデンドロン）、
刺激性皮膚炎（光毒性、ジアパーラッシュ）、職業性皮膚炎；剥奪性皮膚炎、ほ
うしん状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、薬剤エラプション（中毒性表皮融解症、紅斑ノ
ドサム、血清病等）、発汗障害、間擦疹、神経皮膚炎及び放射皮膚炎を含む湿疹
；皮膚筋炎；慢性マイグラン、硬化、感染性、マルチフォーム（スチーブンス−
ジョンソン症候群）及びノドサム（スイート症候群）を含む紅斑；スビタムを含
む発疹；ざそう状発疹（ケロイド、ロサシ、普通の、及びファブレ−ラコウホッ
ト症候群）；白癬ペヂスを含む足の皮膚炎；手の皮膚炎；角化細胞腫；カロサイ
ティ、コレステアトーマ（ミドルイアを含む）、魚りんせん（コンジェンシャル
魚りんせん様紅皮症、表皮剥離ハイパーケラトシス、層状魚りんせん、魚りんせ
んバルガリス、Ｘ−結合魚りんせん、及びスジョグレン−ラルソン症候群を含む
）、角皮症、膿漏性のパルモプランター角皮症、伝染性角皮症、脂漏性角化症、
パラケラトシス及びポロケラトシス；脚の皮膚炎、肥満細胞症（蕁麻疹、ピグメ
ントーサ）、壊死性障害（グラニュローマアニュラーレ及びネクロバイオシスリ
ポイジカ）、光感受性障害（光アレルギー又は光毒性皮膚炎、ハイドロアワクシ
ニフォルメ、日焼け、及び乾皮症ピグメントサム）；アルジリア、ハイパー色素
沈着障害、メラノシス、アコントトシスニグリカンス、レンチゴ、Peutz−Jeghe
rs症候群、ハイポ色素沈着障害、アルビニスム、ピバルディスム、ヴィチグリオ
、インコンチネンシャ色素症、ウルチカリア色素症、及びキセロデルマ色素症を
含む色素沈着障害がある。
【０３４０】 皮膚障害の更なる例は、痒疹；かゆみ症（アニ及び陰裂を含む）；膿そう及び
膿内症ガングレノサムを含む膿皮症；スクラップ皮膚炎；スクレオデマネオナト
ラム；毛髪の病気（アロペシア、フォリクリチス、ヒルスチスム、ハイパーチコ
シス、Kinky毛髪症候群）、つめの病気（つめパテラ症候群、イングラウン又は
マルホームドつめ、オニコマイコシス、パロニシア）、皮脂性腺病（リノフィマ
、ネオプラスムス）、汗腺病（ヒドラデンチチス、ハイパーヒドロシス、ハイポ
ヒドロシス、ミリアラ、Fox-Fordyce病、腫瘍）を含む皮膚アッペエイジ病；ア
ルフィンイスム、クチスラクサ、良性のファミリアルペムフィギス、ポルフリア
、アクロデルマトチス、エクトデルマルジスプラシア、Ellis-VanCreveld症候群
、フォーカルデルマルハイポプラシア、Ehlers−Danlos症候群、エピデルモリシ
スブォーザ、イチチソシスを含む遺伝的な皮膚病；デルマトマイコス、ブラスト
マイコシス、キャンヂダシス、クロモブラストマイコシス。マヅロマイコシス、
パラコシジオイドマイコシス、スポロトリコシス、チニアを含む伝染性の皮膚病
；セルビオコフェイシャルアクチノマイコシス、バシリラリアンギオマトシス、
エチーマ、エリシペラス、エリテマクロニクムマイグランス、エリスラスマ、グ
ラニュォーマイングイナーレ、ハイドラデンチスサプラチヴァ、マヅロマイコシ
ス、パロニチア、ピンタ、リノスレローマ、スタヒロコッカス皮膚感染症（フル
ンコロシス、カルブンクル、インペジゴ、スケイルド皮膚症候群）、皮膚のシフ
ィリス、皮膚の結核、ヨース、幼虫ミグランス、Leishmaniasis、シラミ症及び
疥癬を含む寄生虫による皮膚の病気を含む。
【０３４１】 皮膚の病気の更なる例は、代謝性皮膚病（アジポシスドロローサ、リポジスト
ロフィ、ネクロバイオシスリポイヂカ、ポルフィリア、ジュベニーレキサントグ
ラニュローマ、キサントマトシス（Wolmann病）等）；リチェノイドエラプショ
ン、パルパソリアシス、ピチリアシス及びプソリアシスを含む丘疹皮膚病；血管
の皮膚病（Behchet症候群、ムコクテイニアスリンパ節症候群、ポリアリテリチ
スノドサ、ピオデルマガンゲルノサム、Takayasu動脈炎等）；アカントリシス、
ブリスター、ヘルペスジェスタション、ハイブロアワクシノフォルメ、ペムフィ
ゴイド、ペムフィガスを含むベスクロブラス皮膚病；皮膚腫瘍；皮膚潰瘍（デク
ビタス潰瘍、脚潰瘍、足潰瘍、糖尿病足潰瘍、バリコース潰瘍及びピオデルマガ
ングレノサム）がある。
【０３４２】 尿−生殖器病及び障害 ＫＧＦ−２は尿−生殖器管の細胞の増殖を刺激し得る。従ってＫＧＦ−２のポ
リヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト、及び／又はアンタゴニストは雄及
び雌の生殖器の病気及び／又は障害及び妊娠合併症を処置し及び／又は検出する
のに用いることができる。
【０３４３】 処置し及び／又は検出することができる泌尿器的及び雄の生殖器病は、エピジ
ジミチス、雄の生殖器腫瘍、ペニスの腫瘍、前立腺の腫瘍、睾丸の腫瘍、ヘマト
セーレ、ヘルペス生殖器、雄の不妊、オリゴスペルミアを含み、ペニス病（バラ
ニチス、ハイポスパジアス、ペニスインジュレーション、ペニス腫瘍、フィモシ
ス、パラフィモシス、プリアピスム）、前立腺（ハイパートロフィー、腫瘍、前
立腺炎）、性障害（インポテンツ、血管形成インポテンツ、精液コード捻転、精
液瘤）、睾丸の病気(潜在睾丸、睾丸炎、及び睾丸腫瘍）、雄の生殖器結核、精
索静脈瘤、尿生殖器結核（雄の生殖器、腎臓）、尿生殖器異常、膀胱エクストロ
フィー、潜在睾丸、尿道上裂、ハイポスパヂアス、多のう胞腎臓（常染色体優性
及び常染色体劣性）、遺伝性の腎炎、性分化障害、性器発育異常、混合性器発育
異常、半陰陽、偽半陰陽、Kallman症候群、Klenefelter症候群、睾丸女性化、WA
GR症候群、尿生殖器腫瘍、雄生殖器腫瘍（ペニス、前立腺、睾丸）泌尿器腫瘍（
膀胱、腎臓、尿管、尿道）、膀胱病（結石、外反、フィステル、ぼう膣ろう、首
閉塞、腫瘍、神経性膀胱炎、尿道逆流）、血尿、ヘモグロビヌリア、AIDS関連ネ
フロパシー、無尿症、乏尿症、糖尿病ネフロパシー、Fanconi症候群、肝腎性症
候群、水腎症、１次蓚酸過剰症、腎性高血圧、腎血管性高血圧、腎臓結石、腎臓
皮質壊死、のうほう性腎臓、多のう胞腎臓、ポリシステック腎臓（常染色体優性
及び常染色体劣性）、スポンジ腎臓、腎不全（腎原発性ジスベテスインシピダス
、急性腎不全、腎臓乳頭状の壊死）、腎炎（糸球体腎炎 IGA、メムブロノプロ
リフェラチブ、膜性の、巣状の、Goodpasture症候群、ループス腎炎）、遺伝性
の腎炎、間質性腎炎、バルカン腎症、腎盂腎炎、黄色肉芽腫腎盂腎炎、腎石灰、
ネフロスクレロシス、ネフローゼ、脂質ネフローゼ、ネフローゼ症候群、腎周囲
炎、腎盂炎（じん膀胱炎、腎盂腎炎、黄色肉芽腫、腎盂腎炎）、腎動脈閉塞、腎
骨形成異常、腎臓の管状輸送の先天性の異常、腎臓の管状アシドーシス、腎臓の
アミノ酸症、シスチン尿症、Hartnup病、Cystinosis、Franconi症候群、腎の糖
尿、家族性の低リン酸症、オクロセレブロリーナル症候群、偽低アルドステロン
、腎結核、尿毒症、Hemolytic−Uremic症候群、Wegenerのグラニュロマトシス、
Zeeweger症候群、タンパク尿、アルブミン尿、尿管のカルシウム、尿管の腫瘍、
尿管の閉塞、尿管だめを含む尿管の病気、エピスパヂアス、尿道の腫瘍、尿道の
オブストオークション、尿道の狭窄、尿道炎(reiter病）を含む尿道の病気、尿
のカルクリ（膀胱、腎臓、尿管）、尿のフィステル（膀胱のフィステル、膀胱膣
のフィステル）、尿管感染（細菌尿、膿尿、住血吸虫ヘマトビア）及び排尿障害
（寝小便、ポリウリア、尿失禁、ストレスに関連する失禁、尿保持）がある。
【０３４４】 処置又は検出することができる雌の生殖器の病気及び妊娠合併症は、付属器炎
（卵巣炎、子宮傍組織炎、卵管炎）を含む付属器の病気、卵管腫瘍及び卵管炎等
の卵管の病気、卵巣の病気（無排卵、オウホリチス、卵巣ののう胞、ポリシスチ
ック卵巣症候群、プレマチュア卵巣不全、卵巣ハイパースチムレーション症候群
、卵巣腫瘍、Meigs症候群）、パロヴァリアンシスト、エンドメトリオシス、雌
の生殖器の腫瘍、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、セルビス腫瘍、子宮内膜の腫瘍、ワギナ
の腫瘍、外陰の腫瘍、外陰閉鎖、膣留血症、子宮留血症、陰部疱疹、雌の不妊、
無月経、月経困難、月経過多、オリゴメルヒ、月経前症候群を含む月経障害、想
像妊娠、ダイパレウニア及び不感症等の性障害、尿生殖器結核、雌の生殖器の結
核、膀胱外反を含む尿生殖器病、尿道上裂、多のう胞腎臓（常染色体優性及び常
染色体劣性）、遺伝性の腎炎、性腺発育不全（46XY、混合）、Turner症候群、半
陰陽、偽半陰陽、Kallmann症候群、WAGR症候群を含む性分化障害、尿生殖器の腫
瘍、泌尿器の腫瘍（膀胱、尿管、尿道）、頚部病（子宮けい炎、頚部エロシオン
、頚部ハイパートロフィー、頚部インコンピーテンス、頚部腫瘍）、子宮内膜過
形成、頚部腫瘍及び子宮内膜腫瘍を含む子宮腫瘍、子宮逸脱、子宮破裂、子宮穿
孔、外陰部のカンジダ症、ダイスパレヌイア、膣留血症、こしけ、ワギナフィス
テル、直腸膣フィステル、膀胱膣のフィステル、ワギナの腫瘍、膣炎（トリコモ
ナスワギニチス、細菌ワギノシス、バルボワギニチス）を含むワギナの病気、習
慣性流産、頚部機能不全、不完全流産、ミスされた流産、敗血症流産、おどされ
た流産、獣医学的流産、胎児の死、胚吸収、胎児吸収、胎児の病気（コリオアミ
ノニチス、胎児エリスロブラストシス、ハイドロップフェイタリス、胎児のアル
コール症候群、胎児のアノキシア、胎児のジストレス、胎児の成長遅滞、胎児の
巨人症、及び胎児の吸引）、ヘルペス妊娠、胎盤剥離、難産、子宮無力、胎児膜
の成熟破壊、じゅうウイルス毛羊膜炎、胎盤癒着、胎盤プラエビア、分娩後出血
、子宮破裂、早産、羊水過小、母性のフェニルケトン尿、胎盤病（胎盤早期剥離
、コリオアムニオス、胎盤アクレタ、胎盤保持、胎盤不全）、ポリヒドラムニオ
ス、心血管の妊娠合併症、羊膜液塞栓、血液学的妊娠合併症、感染性妊娠合併症
（敗血症流産、寄生虫妊娠合併症、産褥感染）、腫瘍妊娠合併症（トロホブラス
ト腫瘍、ジュウ毛癌、奇胎、侵食性奇胎、ヒダチジフォームモル、胎盤部位トロ
ホブラスト腫瘍）子宮外妊娠、腹膜妊娠、卵管妊娠、糖尿病妊娠、妊娠性糖尿病
、胎児巨人症、妊娠結果、妊娠毒血症（子癇症、HELLP症候群、プレエクラムシ
ア、EPH Gestsis、ハイパーエメシスグラビダルム）出産障害、Chiari-Frommel
症候群、ガラクトレーア、及び乳腺炎等の乳の分泌障害、出産後の出血、出産感
染を含む出産合併症がある。
【０３４５】 不妊症 上に述べたように、ＫＧＦ−２のポリヌクレオチド、ポリペプチド、バリアン
ト、抗体、アゴニスト、及び／又はアンタゴニストは雄又は雌の不妊症を処置す
るのに用いることができる。従って本発明の１態様ではＫＧＦ−２のポリヌクレ
オチド、ポリペプチド、バリアント、抗体、アゴニスト、及び／又はアンタゴニ
ストを用いて雄の不妊症を処置し及び／又は予防する方法を提供する。他の態様
ではＫＧＦ−２のポリヌクレオチド、ポリペプチド、バリアント、抗体、アゴニ
スト、及び／又はアンタゴニストを用いて雌の不妊症を処置し及び／又は予防す
る方法を提供する。不妊症を処置するのに用いる好ましいＫＧＦ−２ポリペプチ
ドは、ＫＧＦ−２Δ３３、全長及び成熟ＫＧＦ−２，ＫＧＦ−２Δ２８、並びに
ＫＧＦ−２のアミノ酸７７−２０８、８０−２０８、及び９３−２０８を含むポ
リペプチド、そしてまた本明細書に記載したＫＧＦ−２変異体のいずれかを含む
。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０３４６】 不妊症の処置又は予防のために、ＫＧＦ−２の好ましい投与様式は、経口、直
腸、非経口、皮内、ワギナ内、腹腔内、局所的（粉末、軟膏、ゲル、クリーム、
ドロップ、経皮パッチ）、頬側、又は経口若しくは鼻のスプレーを含む。他の投
与様式は本明細書に記載する。好ましくはＫＧＦ−２ポリヌクレオチド、ポリペ
プチド、バリアント、抗体、アゴニスト、及び／又はアンタゴニストは医薬組成
物の部分として医薬的担体とともに投与する。適当な担体は本明細書に記載する
。
【０３４７】 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド、ポリペプチド、バリアント、抗体、アゴニスト
、及び／又はアンタゴニストは、コーヒー、ＭＳＧ，プラスチック、Nutrasweet
、アルコール、食品添加物、化学品、タバコ、殺虫剤、ビークル排出、及び汚染
等の環境的な原因；年齢；先天的な不妊症；低精子数；マンプス、結核、インフ
ルエンザ、小児麻痺、サイトメガロスウイルス（ＣＭＶ）感染、クラミジア、マ
イコプラズマ、淋病、梅毒及び他の性的に伝染する病気等の感染性の病気、糖尿
病等の内分泌の病気、対麻痺等の神経学的な病気；高熱；子宮内膜症；ペイント
、ワニス、自動製造剤中の鉛、エチレンオキサイド、紙製造等の化学及び素材産
業に見出される物質；化学療法；低重量又は過剰重量；肥満又は極端な体重増加
；ストレス；卵子の障害；ホルモンのアンバランス、クッシング症候群、ファロ
ピオ管封鎖；骨盤の感染；外科癒着、子宮頚部狭窄；子宮内癒着、子宮ライニン
グに対する外傷、及び／又は感染、Asherman症候群；子宮フィブロイド等の子宮
の病気、卵巣瘢痕；チョコレートシストを含む卵巣シスト；精子無力；成熟停止
；低精子；Sertoli Cell症候群；LH及び分泌を妥協する拡張下垂体腫瘍から、
外科的な損傷から、又は門静脈の血液供給にたいする損傷を有する頭骨に対する
外傷から生じたものを含むゴナドトロピン欠損；同化ステロイド；ニコチン；マ
リファナ、ヘロイン及びコカイン等の不法な薬剤；アルカリ剤、プロカボジン、
殺虫剤で用いるハロゲン化炭化水素、及び多量のエタノールへの度々の曝露；骨
盤の炎症性の病気（PID);副睾丸炎；鉛、カドミウム、水銀、エチレンオキサイ
ド、塩化ビニル、放射線、Ｘ線等の有毒な物質又は要因に対する曝露；潰瘍又は
乾癬用処方薬；ウテロにおけるＤＥＳ曝露；高温（熱いお湯、渦巻き、スチーム
ルーム）に対する雄の生殖器の曝露；ヘルニア回復；降りた睾丸；ビタミン不足
；前の流産；並びにシクロホスファミドを含むいずれかの要因によって起される
不妊症を処置するのに用いることができる。
【０３４８】 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド、ポリペプチド、バリアント、抗体、アゴニスト
、及び／又はアンタゴニストは、一次的又は二次的不妊症を処置するのに用いる
ことができる。ＫＧＦ−２は一時的な、又は永久的な不妊症を処置するためにも
用いることができる。
【０３４９】 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド、ポリペプチド、バリアント、抗体、アゴニスト
、及び／又はアンタゴニストは、クエン酸クロミフェン（クロミド、セロフェン
）、プロゲステロン、及び／又は１７βエストラヂオール等の他の妊娠促進物質
と共に投与できる。
【０３５０】 ＫＧＦ−２は自然な受胎の間又は助力生殖の間、雌の不妊を処置するのに用い
ることができる。助力生殖技術はインビトロ受精（ＩＶＦ），胚移植（ＥＴ）、
配偶子卵管内移稙（ＧＩＦＴ），受精卵卵管内移植（ＺＩＦＴ）、ドナーの卵、
ドナーの精液、及びドナーの胚とＩＶＦ，卵及び胚のミクロマニプレーションを
含む。ＩＶＦ−ＥＴにおいては卵母細胞を外科的に除去し、インビトロで受精さ
せ、同じ女性の子宮又はFallopian管に置く。卵母細胞寄贈では卵母細胞をドナ
ーから回収し、ＩＶＦの後、ＥＴにおけるように不妊の受取人に移植する。この
方法はドナーと受取人の間の同時化を必要とし、それは受取人にステロイドホル
モンを投与することによって一般に達成される。正規なＩＶＦ−ＥＴにおいては
多数の卵胞成長を誘導するために与えられた治療剤により黄体機能がしばしば不
十分になる。従って移植はＫＧＦ−２等の分子で補助処置なしに行なってもよい
。
【０３５１】 雌における不妊を処置し又は予防するためのＫＧＦ−２の運搬の１つの好まし
い方法は、米国特許第５８６９０８１号（その開示は本願明細書の一部を構成す
る）に開示された、ワギナリングを介する徐放性のシステムによる。
【０３５２】 ポリシロキサン担体は授乳する婦人のための避妊用としてのプロゲステロンの
運搬に（Croxatto et al., 1991,"Female Contraception and Male Fertility R
egulation. Advnces in Gynecological and Obstetric Researches Series", Re
innebaumu et al., eds.）及び閉経後の女性におけるエストラジオールの運搬に
（Stumpf et al., (1982), J. Clin. Endocrinol. Metab.,58:208)用いられてい
る。Simon et al., (1986), Fertility and Sterlity, 46:619は機能的に性腺欠
損の婦人における子宮内膜プライミングのための17β―エストラジオール及び／
又はプロゲステロンで妊娠させるポリシロキサンのワギナリング及び円筒を開示
する。そのリング及び円筒システムは全体の月経サイクルについての正常な範囲
内に17β―エストラジオール及びプロゲステロンの血清レベルを達成するために
用いられた。米国特許第４８１６２５７号は機能的に性腺欠損の婦人における正
常なステロイドホルモンレベルを模倣するための17β―エストラジオール、又は
17β―エストラジオール及びプロゲステロンを含むポリシロキサンのリングの使
用を開示する。
【０３５３】 本発明は妊娠の確立及び維持のためのＫＧＦ−２の投与方法を提供する。本発
明の方法は、ＫＧＦ−２を含む担体を雌のワギナに挿入し、その担体を約１−２
８日ワギナ内に維持することを含む。好ましい態様では、その担体は、１μｇ／
日〜１０００ｍｇ／日のインビトロ放出速度を有するポリシロキサンのリングで
あるが、この量は治療判断に付される。
【０３５４】 更に、その方法は、助力生殖を受けている雌における不妊を処置し又は防止す
るのに用いうる。その方法はＫＧＦ−２を含む担体を雌のワギナに挿入し、その
担体を妊娠の約第７週〜１２週までワギナ内に維持することを含む。好ましい態
様では、その担体は、１μｇ／日〜１０００ｍｇ／日のＫＧＦ−２のインビトロ
放出速度を有するポリシロキサンのリングである。
【０３５５】 本発明は、機能する卵巣を有する婦人に対して、及び機能的に性腺欠損の婦人
に対してＫＧＦ−２を投与する方法に関する。そのパートナーが不妊であるため
不妊であるか子どもを宿すことができない機能する卵巣を有する婦人は助力生殖
技術により妊娠するようになる。しかしがら、多数の卵胞成長を誘導するために
用いるホルモン処置は黄体によるプロゲステロンの不十分な生産を起す。従って
、移植の開始及び維持は損なわれる。機能的に性腺欠損の婦人は未発達の又は不
適当に発達した卵巣、卵巣の外科的除去、又は他の卵巣の不全又は欠陥の結果と
して不妊性である。ＯＤ，ＩＶＦ，及びＥＴ等の助力生殖技術は機能的に性腺欠
損の婦人が妊娠することを可能にする。しかしがら、妊娠の確立と維持のため子
宮内膜を準備するためにホルモン補充が助力生殖技術に必要である。
【０３５６】 従って本発明によれば、ＫＧＦ−２を用いて、なかんずく胚移植の促進によっ
て不妊症を処置し、又は予防し得る。本発明は正常な性腺における、及び機能的
に性腺欠損の婦人における助力生殖技術による妊娠の確立と維持のためにＫＧＦ
−２を投与する方法を提供する。その方法は正常な性腺又は機能的に性腺欠損を
有する雌のワギナにＫＧＦ−２を含む担体を挿入し、少なくとも約２８日その担
体をワギナ内に維持することを含む。
【０３５７】 本発明は助力生殖を受けている婦人に対するホルモン置換治療の方法をも提供
する。その方法は助力生殖を受けている婦人のワギナにＫＧＦ−２を含む担体を
挿入し、妊娠の約第７週〜１２週までその担体をワギナ内に維持することを含む
。
【０３５８】 本発明の方法に有用な生理学的に許容しうるＫＧＦ−２を含む担体は好ましく
はシリコンゴム（本願明細書でポリシロキサンとも呼ぶ）、又は他の適当な材料
から作ったリングの形をした固体の担体である。ポリシロキサンワギナリングに
よるステロイドホルモンの運搬は当業者に知られている。ポリシロキサンリング
からのＫＧＦ−２の移動速度はリングの表面積を含む要因による。従ってリング
におけるＫＧＦ−２の量はリングからのＫＧＦ−２のインビトロ放出速度に基づ
いて便利に記述できる。インビトロで放出速度はホルモンを含むポリシロキサン
リングを特徴づけるため当業界で日常的に用いられている。１日当たり約０．０
０１〜約１０００ｍｇのＫＧＦ−２のインビトロ放出速度を有するＫＧＦ−２を
含むポリシロキサンリングを本発明の方法における使用のために意図する。好ま
しい態様ではポリシロキサンリングは１日当たり約０．０１〜約１００ｍｇのＫ
ＧＦ−２のインビトロ放出速度を有する。もっとも好ましい態様ではポリシロキ
サンリングは１日当たり約０．１〜約１０ｍｇのＫＧＦ−２のインビトロ放出速
度を有する。
【０３５９】 ＫＧＦ−２を含むポリシロキサンリング担体はワギナに挿入することにより投
与する。そのリングをワギナに挿入して子宮頚部あたりに位置させる。そのリン
グを一般的に用いられているペッサリーのそれに似た方法で雌の被験者により挿
入し、除去でき、従って本発明の他の利点を提供する。
【０３６０】 ＫＧＦ−２を含む担体は胚移植の約２〜７日、好ましくは３日前に投与し得、
他のホルモン投与、例えばエストラヂオール１７β又はプロゲステロンの経口投
与により補い得る。好ましい態様ではその担体はリングであり、胚移植の３日前
に挿入する。その担体は約２８日後に除去し、他の担体により置きかえる。もし
妊娠が起こったなら、その担体は黄体−胎盤移動まで妊娠の維持のための十分な
ＫＧＦ−２を可能にし、その時に投与を止めてもよい。好ましい態様では、その
リングをワギナに続けて保持し、投与を妊娠の約１２週に止める。
【０３６１】 外傷、職業病 ＫＧＦ−２は様々な組織の増殖を刺激することが示された。従ってＫＧＦ−２
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト、及び／又はアンタゴニストは外
傷、職業病を処置するのに用いることができる。 処置し又は検出できる外傷、職業病、中毒の例は、農夫の肺及びシロフィラー
病を含む農業労働者の病気、鳥愛好家の肺、職業的皮膚病、高圧神経症候群、不
活性ガス昏睡、労働感染、アスベスト中毒、ベリリウム中毒、綿肺、Caplan症候
群、シデローシス、炭珪肺、及び珪肺結核等の塵肺症、アルコール心筋症、胎児
のアルコール症候群、アルコール脂肪肝、アルコール性肝炎、アルコール性肝硬
変、アルコール性記憶喪失障害、アルコール中止狂乱等のアルコール性中毒等の
中毒、銀中毒、アラキニズム等の噛み及び刺し、昆虫の噛み及び刺し、蛇の噛み
、チック麻痺等のダニ中毒、カドミウム中毒、四塩化炭素中毒、薬剤誘発静座不
能、中毒性の表皮融解薬剤発疹、紅班ノドサム、及び血清病、薬剤誘発異常運動
及び静穏悪性症候群、麦角中毒、フルオライド中毒等の薬剤中毒、ボツヌリス中
毒、そら豆、マッシュルーム中毒、サルモネラ食品中毒、スタフィロコッカス食
品中毒等の食品中毒、１酸化炭素中毒等のガス中毒、不活性ガス昏睡、中毒性肝
炎、鉛中毒、水銀中毒、麦角中毒及びマッシュルーム中毒等のマイコトキシン中
毒、過量、麦角中毒、そら豆中毒等の植物中毒、ラチリスム、ミルク病、物質誘
発精神病、外傷の核膜ヘルニア、スプレノシス等の脾臓の破裂、胃の破裂、外傷
切断、とう骨骨折及び尺骨骨折を含む前腕等の傷、上腕骨の骨折、肩の脱臼、肩
の骨折、テニス肘及び手首外傷、仮死、運動傷、突風傷及び脱圧縮等の気圧性外
傷、分娩麻痺等の出産障害、人の噛み等の噛み及び刺し、化学火傷、電気火傷、
煙吸入障害等の吸入障害、眼の火傷、日焼け、打撲症、ヒップ及び肩脱臼等の脱
臼、臨溺死等の溺死、電気火傷及び光線障害、食道穿孔、診断及び治療材料の侵
出、胃石、眼の異物、異物移動、異物肉芽腫等の異物反応等の異物、大腿骨の頚
部骨折、閉鎖骨折、細片骨折、マルユナイテッド骨折、開放骨折、突発骨折、ス
トレス骨折、偽関節等のアンユナイテッド骨折、上腕骨骨折、Colle骨折等のと
う骨骨折、肋骨骨折、肩骨折、下顎及び上顎骨折等の顎骨折、眼の骨折、及び頬
骨等の頭骨骨折、背骨の骨折、けい骨骨折、Monteggia骨折等の尺骨骨折等の骨
折、霜焼け等の凍傷、指の障害等の手の障害、脳震盪を含む脳障害等の頭の障害
、脊髄のオトリア、セレブロスピナルリノリア、閉鎖頭障害、眼の火傷、眼の異
物及び貫通性の眼の障害等の眼の障害を含む顔の障害、下顎及び上顎骨折等の顎
の障害、下顎骨折等の下顎の障害、及び頬骨の骨折、顎骨の骨折、日射病等の熱
消耗、足首障害等の足障害、大腿骨けい部骨折をヒップ骨折等度の大腿骨骨折、
脚の障害、ヒップ脱臼、膝障害およびけい骨骨折、スペース運動病などの運動病
、多数の外傷、放射線誘発異常、放射線誘発白血病、放射線誘発腫瘍、放射線性
骨壊死、実験放射線障害、放射線肺炎、および放射線皮膚炎などの放射線傷害、
後肺腹膜、大動脈破裂、脾分解等の脾臓破裂、胃破裂及び子宮穿孔等の子宮破裂
、自己切断、クラッシュ症候群等の外傷性シヨック、軟組織外傷、脊髄圧縮等の
脊髄傷害、背骨骨折及びむち打ち症等の背骨傷害、ねんざ及び反復挫傷等の挫傷
、腱傷害、動揺胸、心臓傷害及び肋骨骨折等の胸の傷害、砕歯症候群を含む歯骨
折、歯脱臼、鼓膜穿孔、外傷感染、脳震盪及び閉鎖頭外傷等の非貫通性外傷、眼
の貫通外傷、ガンショット外傷及び針外傷等の刺し傷等の貫通性外傷を含む。
【０３６２】 血液疾患およびリンパ系疾患 ＫＧＦ−２はポリヌクレオチド、ポリペプチド、作動薬および／または拮抗薬
を、血液疾患およびリンパ系疾患を処置したりおよび／または検出するのに使用
することができる。
【０３６３】 処置したりまたは検出することができる血液疾患およびリンパ系疾患の例とし
ては、再生不良性貧血（例えば、ファンコニ貧血）、溶血性貧血（例えば、自己
免疫溶血性貧血および先天性溶血性貧血（これは、先天性異常赤血球産生貧血を
含む）、先天性非球状赤血球性溶血性貧血、鎌形赤血球貧血（例えば、ヘモグロ
ビンＳＣ疾患および鎌形赤血球形質（sickle cell trait））、遺伝性楕円赤血
球症およびグルコースリン酸デヒドロゲナーゼ欠乏症（例えば、ソラマメ中毒症
）、ヘモグロビンＣ疾患、遺伝性球状赤血球症、地中海貧血症（Thalassemia）
（例えば、α−地中海貧血症（これは、胎児水症を含む）およびβ−地中海貧血
症）、ソラマメ中毒症、血色素尿（例えば、発作性血色素尿および溶血性尿毒症
性症候群））、低色素貧血（例えば、鉄欠乏症貧血）、大赤血球性貧血症（例え
ば、巨赤芽球性貧血（これは、悪性貧血を含む））、骨髄ろう性貧血、新生児貧
血（例えば、胎児致死性（fetofatal）輸血および胎児母体輸血）、難治性貧血
（例えば、過剰芽細胞合併性難治性貧血）、鉄芽球性貧血、純赤血球形成不全、
胎児赤芽球症（例えば、胎児水症および核黄疸）、Ｒｈ免疫（Rh Isimmunizatio
n）、無βリポタンパク質血症、無ガンマグロブリン血症、異常γグロブリン血
症（例えば、ＩｇＡ欠損症およびＩｇＧ欠損症）、高ガンマグロブリン血症（例
えば、良性モノクローナル免疫グロブリン血症）、高蛋白血症、異常蛋白血症（
例えば、アミロイドーシス（これは、アミロイド性神経障害および大脳アミロイ
ド性血管症を含む））、クリオグロブリン血症、重鎖疾患（例えば、免疫増生性
小腸疾患、多発性骨髄腫、ＰＯＥＭＳ症候群、ワレデンストレーム・マクログロ
ブリン血症）、プロテインＳ欠乏症を含む。
【０３６４】 処置したりまたは検出することができる血液疾患およびリンパ系疾患の更なる
例としては、骨髄疾患（例えば、再生不良性貧血）、脊髄形成異常症候群（これ
は、難治性貧血（例えば、過剰芽細胞合併性難治性貧血）、鉄芽球貧血、発作性
血色素尿および骨髄球性白血病）、骨髄増殖性障害（これは、脊髄ろう性（myel
ophthisic）貧血、急性赤芽球白血病、類白血病性反応、骨髄線維症、骨髄異形
成、真性多血症、出血性血小板血症および血小板増多症を含む）、血管内赤血球
凝集、異常血色素症（例えば、鎌形赤血球貧血（これは、ヘモグロビンＳＣ疾患
および鎌形赤血球形質を含む））、ヘモグロビンＳＣ疾患、地中海貧血症（これ
は、α−地中海貧血症（例えば、胎児水症）およびβ−地中海貧血症を含む）、
出血性素因（例えば、アブリン原性貧血（abrinogenemia））、クリスマス病、
播種性血管内血液凝固、第ＶＩＩ因子欠損、第ＸＩ因子欠損、第ＸＩＩ因子欠損
、第ＸＩＩＩ因子欠損、血友病、低プロトロンビン血症（これは、第Ｖ因子欠損
および第Ｘ因子欠損を含む）、シュワルツマン現象、ベルナール−スーリエ症候
群、溶血性尿毒症症候群、血小板貯蔵欠乏症（platelet storage pool deficiec
y）、血小板無力症、出血性血小板減少症（これは、血小板減少性紫斑病（例え
ば、特発性血小板減少性紫斑病）、血栓性血小板減少性紫斑病およびウィスコッ
ト−アルドリッチ症候群を含む）、グロブリン過剰血性紫斑病、シェーンライン
−ヘノッホ紫斑病、血小板減少性紫斑病（特発性の血小板減少紫斑病）、血小板
減少性紫斑病、ウィスコット−アルドリッチ症候群、遺伝性出血性毛細管拡張症
、ビタミンＫ欠乏症（これは、新生児の出血性疾患を含む）、フォンウィルブラ
ンド病、白血球障害（例えば、好酸球増加症であって、これは好酸球増多症合併
性血管リンパ過形成、好酸球増加症−筋肉痛症候群、好酸球増加症肉芽腫および
過好酸性症候群（例えば、肺性好酸球増加症）を含む）、感染性単核球症、白血
球増多症（これは、類白血病性反応およびリンパ球増加症を含む）、白血球減少
症（これは、無顆粒球症（例えば、好中球減少）およびリンパ球減少症（例えば
、特発性ＣＤ４−陽性Ｔ−リンパ球減少症）を含む）、ペルゲル−ヒュエト核異
常、貪食細胞殺菌不全（これは、チェディアック−東症候群、慢性肉芽腫疾患、
ジョブ症候群を含む）、メトヘモグロビン血症、汎血球減少症、赤血球増加症、
血液学的な疾患（hematologic）、前白血病およびスルフヘモグロビン血症を含
む。
【０３６５】 処置したりまたは検出することができる血液疾患およびリンパ系疾患の更なる
例としては、リンパ性疾患（例えば、リンパ節炎（これは、猫ひっかき病および
腸間膜リンパ節炎を含む）、リンパ管拡張症、リンパ管炎、リンパ浮腫（これは
、象皮症およびフィラリア性象皮症を含む）、リンパ瘤、リンパ球増殖性疾患（
これは、無ガンマグロブリン血症、アミロイドーシス（例えば、アミロイド性神
経障害および大脳アミロイド性血管症）、巨大リンパ節過形成を含む）、重鎖疾
患（例えば、免疫増生性小腸疾患）、免疫芽細胞リンパ節腫張、感染性単核球症
、毛様細胞白血病、リンパ性白血病、骨髄球性白血病（これは、急性非リンパ球
性白血病および急性骨髄球性白血病を含む）、リンパ血管筋腫（これは、リンパ
血管筋腫症を含む）；およびリンパ腫（これは、ホジキン病、非ホジキンリンパ
腫（例えば、Ｂ−細胞リンパ腫であって、これはバーキットリンパ腫、ＡＩＤＳ
関連リンパ腫、粘膜関連性リンパ組織リンパ腫および小細胞リンパ腫を含む）、
び漫性リンパ腫（これは、び漫性大細胞性リンパ腫、大細胞免疫芽球性リンパ腫
、免疫芽球性リンパ腫、び漫性細胞混合性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫およ
び小非分割細胞性リンパ腫を含む）、ろ胞性リンパ腫（これは、ろ胞性大細胞性
リンパ腫、ろ胞性細胞混合性リンパ腫およびろ胞性小分割細胞性リンパ腫を含む
）、高グレードリンパ腫（これは、大細胞免疫芽球性リンパ腫、免疫芽球性リン
パ腫および小非分割細胞性リンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫）を含む）、
中間グレードリンパ腫（これは、び漫性大細胞性リンパ腫、ろ胞性大細胞性リン
パ腫、び漫性細胞混合性リンパ腫およびび漫性小分割性リンパ腫を含む）、大細
胞性リンパ腫（これは、び漫性大細胞性リンパ腫、ろ胞性大細胞性リンパ腫、大
細胞性免疫芽球性リンパ腫、Ｋｉ−１大細胞リンパ腫および大細胞性免疫芽球性
リンパ腫を含む）、低グレードリンパ腫（これは、ろ胞性細胞混合性リンパ腫、
粘膜関連性リンパ腫組織、ろ胞性小分割細胞性リンパ腫および小リンパ性リンパ
腫を含む）、細胞混合性リンパ腫（これは、び漫性細胞混合性リンパ腫およびろ
胞性細胞混合性リンパ腫を含む）、小細胞リンパ腫（これは、び漫性小分割細胞
性リンパ腫、ろ胞性小分割細胞性リンパ腫、小リンパ性リンパ腫および小非分割
性細胞腫を含む）、ｔ−細胞性リンパ腫（これは、リンパ芽球性リンパ腫、皮膚
性Ｔ−細胞性リンパ腫（例えば、Ｋｉ−１大細胞リンパ腫、きのこ状真菌症およ
びセザリー症候群）および末梢Ｔ−細胞性リンパ腫を含む）、未分化リンパ腫（
これは、び漫性大細胞性リンパ腫および小非分割細胞性リンパ腫（例えば、バー
キット腫、リンパ腫様肉芽腫症を含む）を含む）；マレック病、サルコイドーシ
ス（これは、肺サルコイドーシスおよびぶどう膜耳下腺熱を含む）、腫瘍融解症
候群、皮膚粘膜リンパ節症候群；細網内皮症（これは、ゴーシェ病、組織球増殖
症（例えば、悪性組織球増殖症であって、これは悪性組織球増殖症、急性単核球
性リンパ腫、大細胞性リンパ腫（例えば、Ｋｉ−１大細胞リンパ腫）、ランゲル
ハンス細胞組織球増殖症（例えば、好酸性肉芽腫）、ハンド−シェラー−クリス
チャン症候群およびレトラー−シー−ヴェ病を含む）、非ランゲルハンス細胞組
織球増殖症（例えば、洞組織球増殖症、ニーマン-ピック病、海青色組織球症候
群および若年性黄色肉芽腫）、マスト細胞肉腫を含む）；脾臓疾患（これは、脾
機能亢進症、骨髄様異形成、脾臓梗塞、脾臓新生物、脾臓破裂（例えば、脾症、
脾腫および脾臓結核）を含む）、胸腺過形成、胸腺新生物、リンパ節結核（例え
ば、キング病）を含む。
【０３６６】 新生児の疾患および異常症 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド、ポリペプチド、作動薬および／または拮抗薬を
、新生児の疾患および／または異常症を処置し、予防し、および／または検出す
るのに使用することができる。
【０３６７】 処置したりまたは検出することができる新生児の疾患および異常症の例として
は、薬物誘発性の異常症；多発性異常症（これは、アラギーユ症候群、アンゲル
マン症候群、基底細胞性母斑症候群、ベクウィス−ビーデマン症候群、ブルーム
症候群、ボネビ−ウルリッヒ症候群、コケイン症候群、ねこ鳴き症候群、ド・ラ
ンゲ症候群、ダウン症候群、外肺葉性異形成症（例えば、エリス−ファン−クレ
フェルト症候群および巣状皮膚低形成）、ガードナー症候群、全前脳症、色素失
調症、ローレンス−ムーン・ビードル症候群、マルファン症候群、爪膝蓋症候群
、眼・脳・腎症候群、口・顔・指症候群、プレーダー−ウィリィ症候群、プロテ
ウス症候群、プルーン・ベリー症候群、先天性風疹症候群、ルービンステイン（
Rubenstein）−テイビー症候群、短肋骨−多指症（Short Rib-Polydactyly）症
候群、ワーデンブルグ症候群、ウォルフラム症候群、ツェルウェガー症候群を含
む）；放射腺誘発性異常症；染色体異常症（これは、アンゲルマン症候群、ベク
ウィス−ビーデマン症候群、ねこ鳴き症候群、ダウン症候群、全前脳症、プレー
ダー−ウィリィ症候を含む）；性染色体異常症（例えば、ボネビ−ウルリッヒ症
候群）、外葉葉性形成異常（これは、巣状皮膚低形成、脆弱Ｘ染色体症候群、Ｘ
Ｙ性器発育異常、複合型性腺発育不全、カルマン症候群、クラインフェルター症
候群、眼・脳・腎症候群、ターナー症候群およびＸＹＹ核型を含む）および消化
系異常症を含む。
【０３６８】 呼吸疾患 ＫＧＦ−２は、呼吸器官の細胞の増殖を刺激することが分かっている。従って
、ＫＧＦ−２はポリヌクレオチド、ポリペプチド、作動薬および／または拮抗薬
を、呼吸疾患を処置したり、および／または検出するのに使用することができる
。
【０３６９】 処置したりまたは検出することができる呼吸気管疾患の例としては、気管支疾
患、例えば喘息（これは、運動誘発性の喘息および喘息重積状態を含む）気管支
フィステル、気管支機能亢進、気管支新生物、気管支けいれん、気管支拡張症、
気管支炎（これは、細気管支炎、閉塞性細気管支炎、組織化（organizing）肺炎
、ウイルス性細気管支炎、気管支原性のう胞、気管支肺炎、気管気管支肥大を含
む）、毛様運動性障害（例えば、カルタゲナー症候群）；喉頭疾患（例えば、喉
頭肉芽腫、喉頭浮腫、喉頭新生物、喉頭軟骨膜炎、声紋けいれん、喉頭炎（例え
ば、クループ）、喉頭狭窄、喉頭結核、声帯麻痺、声障害（例えば、失声症およ
びさ声））；肺疾患（例えば、無気肺、これは中葉症候群、気管支肺形成異常、
肺の先天性のう胞性腺腫様奇形、のう胞性線維症、肺プラスマ細胞肉芽腫、喀血
、肺膿瘍、真菌肺疾患（例えば、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症および
ニューモシスティス・カリニ）、間質性肺疾患（例えば、鳥飼肺、農夫肺などの
外因性アレルギー肺胞炎）、グッドパスチャー症候群、ランゲルハンス細胞組織
球増殖症、塵肺症（例えば、石綿沈着症、ベリリウム中毒症、綿肺症、カプラン
症候群、鉄沈着症、珪肺症（例えば、炭粉珪肺症および珪肺結核症））、肺線維
症、放射線肺炎、肺サルコイドーシス、ヴェゲナー肉芽腫症）、閉塞性肺疾患、
ウイルス性細気管支炎、肺気腫、寄生性肺疾患（例えば、肺エキノコックス症）
、肺新生物（例えば、気管支原性癌腫、肺銭形陰影およびパンコースト症候群）
、胎便吸引、肺炎（例えば、気管支肺炎、胸膜肺炎、吸引性肺炎（例えば、脂質
性肺炎）、バクテリア性肺炎（例えば、大葉性肺炎、肺炎マイコプラズマ、リケ
ッチア性肺炎およびブドウ球菌性肺炎）、カリニ肺、ウイルス性肺炎）、肺胞淡
白症、肺浮腫、肺塞栓症、肺好酸球増加症、肺静脈閉塞性疾患、呼吸窮迫症候群
（例えば、ヒアリン膜症、成人呼吸窮迫症候群）、シミター症候群、サイロ充満
ガス病、肺結核（例えば、珪肺結核症）；鼻疾患（例えば、後鼻孔閉鎖症）、鼻
出血、致死性正中部肉芽腫、鼻閉鎖症、鼻ポリープ、後天性鼻変形、鼻新生物（
例えば、鼻ポリープ）、副鼻傍新生物（例えば、副上顎新生物）、副鼻腔炎（例
えば、篩骨副鼻腔炎、前頭部副鼻腔炎、上顎副鼻腔炎および蝶形副鼻腔炎）、鼻
炎（例えば、枯草熱、多年生アレルギー鼻炎、萎縮性鼻炎および血管運動性鼻炎
）、鼻硬化症を含む。
【０３７０】 処置したりおよび／または診断することができる呼吸疾患としてはまた、胸膜
疾患、例えば乳び胸、胸膜膿胸（例えば、結核膿胸）、血気胸、血胸、水気胸、
水胸症、胸水（例えば、悪性胸水）、胸膜新生物（例えば、悪性胸膜新生物）、
胸膜炎（例えば、胸膜肺炎）、気胸、胸膜結核（例えば、胸膜膿胸）、呼吸障害
（例えば、睡眠無呼吸症候群などの無呼吸、これはピックウィック症候群を含む
）、チェーンストークス呼吸、咳、呼吸困難（例えば、発作性呼吸困難）、さ声
、過換気（例えば、呼吸アルカロージス）、声紋けいれん、胎便呼吸、口呼吸、
呼吸困難症候群（例えば、ヒアリン膜症）、成人呼吸窮迫症候群、呼吸機能不全
（例えば、呼吸アシドーシス）、気道閉塞（例えば、鼻閉塞、喉頭肉芽腫、ハン
タウイルス呼吸症候群、換気低下、内因性陽圧呼吸および呼吸麻痺）、呼吸過敏
症（例えば、鳥飼肺および農夫肺などの外因性アレルギー肺胞炎）、アレルギー
性気管支肺アスペルギルス、喘息（例えば、運動誘発性喘息および喘息重積状態
）、枯草熱、多年生アレルギー嚢胞、呼吸系異常症（例えば、気管支原性のう胞
）、気管支肺隔離症、後鼻孔閉鎖症、肺の先天性のう胞性腺腫様奇形、カルタゲ
ナー症候群、シミター症候群、気管気管支肥大、呼吸器官フィステル（例えば、
気管支フィステルであって、これは気官咽頭フィステルを含む）、呼吸気管感染
症（例えば、気管支炎であって、これはウイルス性細気管支炎などの細気管支炎
を含む）、かぜ、胸膜膿胸（例えば、結核性膿胸）、インフルエンザ、喉頭炎（
例えば、喉頭蓋（epilottitis）、レジオネラ症（例えば、在郷軍人病）、肺膿
瘍、胸膜炎（例えば、胸膜肺炎）、肺炎（例えば、気管支肺炎）、胸膜肺炎、吸
引性肺炎（例えば、脂質性肺炎）、バクテリア性肺炎（例えば、大葉性肺炎）、
肺炎マイコプラズマ、リケッチア性肺炎およびブドウ球菌性肺炎、カリニ肺、ウ
イルス性肺炎、鼻炎、鼻硬化症、副鼻腔炎（例えば、篩状副鼻腔炎、前頭部副鼻
腔炎、上顎副鼻腔炎および蝶形骨副鼻腔炎）、扁桃炎（例えば、扁桃周囲膿瘍）
、気管炎、喉頭結核、胸膜結核（例えば、結核性膿胸）、肺結核（例えば、珪肺
結核）、百日咳、呼吸気管新生物（例えば、気管支新生物）、喉頭新生物、肺新
生物（例えば、気管支原性癌腫、肺銭形陰影およびパンコースト症候群）、鼻新
生物（例えば、鼻ポリープ）、副鼻傍新生物（例えば、副上顎新生物）、胸膜新
生物（例えば、悪性胸水）、気管新生物、気管疾患（例えば、気管新生物）、気
管狭窄、気管支炎、気管気管支肥大および気管食道のフィステルを含む。
【０３７１】 処置したりまたは検出することができる耳鼻咽喉科学的な疾患の例としては、
毛様運動性障害（例えば、カルタゲナー症候群）、耳疾患（例えば、中耳胆脂腫
）、後天性耳奇形、耳新生物、耳痛、聴覚障害（例えば、突発性難聴を含む難聴
）、部分的な聴力損失（例えば、両側性の聴力損失、伝音難聴）、機能性難聴、
高周波難聴、感音難聴（例えば、中枢的な聴覚損失）、雑音誘発性難聴および老
人性難聴、音漸増（loudness Recruitment）、耳鳴り、耳帯状ヘルペス、内耳疾
患（例えば、蝸牛疾患）、内リンパ水症（例えば、メニエール病）、内耳炎、前
庭疾患（例えば、運動酔いであって、これは空間運動酔いを含む）、めまい、耳
炎（例えば、外耳炎）、中耳炎（例えば、乳様突起炎、浸出性中耳炎および化膿
性中耳炎）、耳硬化症、蝸牛後方疾患（例えば、内耳神経疾患であって、これは
２型神経線維腫症などの内耳神経腫を含む）、中枢の聴覚性疾患（例えば、聴覚
性知覚障害、中枢性聴力損失、鼓膜の穿孔）、喉頭疾患（例えば、喉頭肉芽腫、
喉頭浮腫、喉頭新生物、喉頭軟骨膜炎、声紋けいれん、喉頭炎（例えば、クルー
プ、喉頭狭窄、喉頭結核、声帯麻痺、声障害（例えば、失声症、さ声）；鼻疾患
（（例えば、後鼻孔閉鎖症）、鼻出血、致死性正中部肉芽腫、鼻閉鎖症、鼻ポリ
ープ、後天性鼻奇形）、鼻新生物（例えば、鼻ポリープ）、副鼻傍新生物（例え
ば、副上顎新生物）、副鼻傍疾患（例えば、副鼻傍新生物であって、これは副上
顎新生物を含む）、副鼻腔炎（例えば、篩骨副鼻腔炎、前頭部副鼻腔炎、上顎副
鼻腔炎および蝶形副鼻腔炎）、鼻炎（例えば、枯草熱）、多年生アレルギー鼻炎
、萎縮性鼻炎および血管運動性鼻炎、鼻硬化症））；耳鼻咽喉学的な新生物（例
えば、耳新生物、喉頭新生物、聴覚性新生物（例えば、２型神経線維腫症）、鼻
新生物（例えば、鼻ポリープ）、副鼻傍新生物（例えば、副上顎新生物）、咽頭
新生物（例えば、下咽頭新生物）、鼻咽頭新生物、口咽頭新生物（例えば、扁桃
腺新生物）、咽頭新生物（例えば、下咽頭新生物）、鼻咽頭新生物、口咽頭新生
物（これは、扁桃腺新生物を含む）、咽頭炎、咽頭後膿瘍、扁桃炎および口蓋帆
咽頭不全を含む。
【０３７２】 神経性疾患 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアン
タゴニストを神経性疾患の治療および／または検出に用いることができる。
【０３７３】 治療または検出され得る神経性疾患の例として下記のものが含まれる：母性フ
ェニルケトン尿症などのフェニルケトン尿症、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損
症、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合欠損症、ワーニック(Wernicke's)脳傷害、
脳浮腫を含む代謝性脳疾患などの脳疾患、幕状骨下腫瘍を含む小脳腫瘍、脈絡叢
腫瘍などの脳室腫瘍、視床下部腫瘍、幕状骨上腫瘍、カナバン疾患などの脳腫瘍
、毛細血管拡張性運動失調を含む運動失調、小脳協調傷害、フリードリッヒ運動
失調、マカド−ヨセフ(Machado-Joseph)疾患、オリーブ橋小脳萎縮症などの脊髄
小脳変性、幕状骨下腫瘍などの小脳腫瘍、腋下周囲脳炎、グロボイド細胞白質萎
縮症、異染性白質萎縮症および亜急性硬化性全脳炎などの散在性大脳硬化症など
の小脳疾患、脳血管性疾患(頚動脈血栓症、頚動脈狭窄症およびモヤモヤ疾患を
含む頚動脈疾患、大脳アミロイド血管傷害、大脳動脈瘤、大脳無酸素症、大脳動
脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、大脳塞栓症および頚動脈血栓症、洞
血栓症およびワーレンバーグ(Wallenberg's)症候群などの血栓症、硬膜外血腫、
硬膜下血腫およびクモ膜下出血などの大脳出血、大脳硬塞、一過性大脳虚血、鎖
骨下スチール(Steal)症候群および椎骨脳底不全などの大脳虚血、多梗塞痴呆、
室周囲ロイコマレーシア(leukomalacia)などの血管性痴呆、群発性頭痛、扁頭痛
などの血管性頭痛、エイズ痴呆複合などの痴呆、アルツハイマー疾患およびクロ
イツェルフェルト−ヤコブ症候群などの初老性痴呆、アルツハイマー疾患および
進行性核上麻痺などの老年性痴呆、多梗塞性痴呆などの血管性痴呆、軸周囲脳炎
を含む脳炎、伝染性脳炎、日本脳炎、セントルイス脳炎、チック−ボーン脳炎お
よび西ナイル熱などのウイルス性脳炎、急性播種性脳脊髄炎、ブドウ膜脳炎症候
群、脳炎後パーキンソン病および亜急性硬化性全脳炎などの髄膜脳炎、室周囲白
色軟化などの脳軟化症、小児痙攣、欠神癲癇を含む全身性痙攣、マーフ(MERRF)
症候群、硬直性-間代性癲癇を含む間代性筋痙攣などの癲癇、複合部分癲癇、前
頭葉癲癇および側頭葉癲癇などの部分癲癇、外傷後癲癇、持続性部分癲癇(Epile
psia Partialis Continua)などの癲癇重積、ハラーボルデン−スパッツ(Hallerv
orden-Spatz)症候群、ダンディー−ウオーカー(Dandy-Walker)症候群および正常
圧水頭症などの水頭症、視床下部腫瘍などの視床下部疾患、大脳マラリア、脱力
発作を含む睡眠発作、延髄灰白髄炎、大脳偽腫瘍、レット(Rett)症候群、レイ(R
eye's)症候群、視床疾患、大脳トキソプラズマ症、脳内結核およびツェルベーガ
ー(Zellweger)症候群、エイズ痴呆複合、脳膿傷、硬膜下蓄膿などの中枢神経系
感染症、ウマ脳脊髄炎、ベネズエラウマ脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、ビス
ナ(Visna)、大脳マラリアなどの脳脊髄炎、クモ膜炎などの髄膜炎、リンパ性脈
絡髄膜炎を含むウイルス性髄膜炎などの無菌性髄膜炎、ヘモフィルス属髄膜炎、
リステリア髄膜炎を含む細菌性髄膜炎、ウォーターハウス・フリーデリクセン(W
aterhouse−Friderichsen)症候群、肺炎球菌髄膜炎よび髄膜結核などの髄膜炎菌
性髄膜炎、クリプトコッカス髄膜炎、硬膜下浸出などの真菌性髄膜炎、ブドウ膜
髄膜炎症候群などの髄膜脳炎、横行脊髄炎などの脊髄炎、脊髄ろうなどの神経梅
毒、延髄灰白髄炎および灰白髄炎後症候群を含む灰白髄炎、プリオン疾患(クロ
イツェルフェルト−ヤコブ症候群、ウシ海綿状脳傷害、ガーストマン・シュトラ
ウスラー(Gerstmann-Straussler)症候群、クル(Kuru)、スクレイピーなど)、大
脳トキソプラズマ症、幕状骨下腫瘍などの小脳腫瘍を含む脳腫瘍などの中枢神経
系腫瘍、脈絡叢腫瘍、視床下部腫瘍および幕状骨上腫瘍などの脳室腫瘍、髄膜腫
瘍、硬膜外腫瘍を含む脊柱腫瘍、カナバン疾患などの脱髄性疾患、副腎白質萎縮
症を含む散在性大脳硬化症、軸周囲脳炎、グロボイド細胞白質萎縮症、異染性白
質萎縮症などの散在性大脳硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄
炎、進行性多巣性白室脳症、多発性硬化症、中枢脳橋ミエリン溶解、横行脊髄炎
、神経脊髄炎屈折、スクレイピー、脊柱前湾慢性疲労症候群、ビスナ(Visna)、
高圧神経症候群、髄膜症、先天性筋無緊張などの脊柱疾患、筋萎縮性側索硬化症
、ヴェルドニッヒ・ホフマン(Werdnig-Hoffmann)疾患などの脊柱筋萎縮症、脊柱
圧縮、硬膜外腫瘍などの脊柱腫瘍、脊髄空洞症、脊髄ろう、スティフ−マン(Sti
ff-Man)症候群、アンゲルマン(Angelman)症候群、クリ−デュ−シャ(Cri-du-Cha
t)症候群、ド・ランジュ(De Lange's)症候群、ダウン症候群などの精神発達遅滞
、ガングリオシド蓄積症G(M1)などのガングリオシド蓄積症、サンドホフ(Sandho
ff)疾患、テイ−サックス(Tay-Sachs)疾患、ハートナップ(Hartnup)疾患、ホモ
シスチン尿症、ローレンス−ムーン−ビードル(Laurence-Moon-Biedl)症候群、
レッシュ−ニーハン(Lesch-Nyhan)症候群、メープルシロップ尿疾患、フコース
蓄積症などのムコ脂質症、神経細胞セロイド−リポフスチン沈着症、眼脳腎症候
群、母性フェニルケトン尿症などのフェニルケトン尿症、プレーダー−ウイリ(P
rader-Willi)症候群、レット(Rett)症候群、ルービンシュタイン−テイビ(Rubin
stein-Taybi)症候群、塊茎状硬化症、ＷＡＧＲ症候群、全前脳症などの神経系異
常、水無脳症を含む無脳症などの神経管欠損症、アーノルド−カイリ(Arnold-Ch
airi)奇形、脳ヘルニア、髄膜ヘルニア、脊髄髄膜瘤、嚢胞性二股脊髄(spina bi
fida systica)および閉鎖性二股脊髄(spina bifida occulta)などの脊柱閉鎖不
全、シャルコット・マリー(Charcot Marie)疾患を含む遺伝性運動および感覚神
経障害、遺伝性視覚萎縮症、レフムス(Refsum's)疾患、遺伝性痙攣性対麻痺、ヴ
ェルトニッヒ−ホフマン(Werdnig-Hoffmann)疾患、先天性無痛および家族性自律
神経障害などの遺伝性感覚および自律神経障害、神経性症状(ガーストマン(Gers
tmann's)症候群を含む失認、逆行性健忘症などの健忘症、失行症、神経性膀胱、
脱力発作など、聴力傷害、部分聴力欠損症、大声補充(loudness recruitment)お
よび耳鳴りを含む聴覚傷害などの伝達傷害、失書症、名称失語症、ブローカ失語
症およびヴエーニッケ(Wernicke)失語症を含む失語症などの言語傷害、後天性失
読症などの失読症、言語発達傷害、名称失語症、ブローカ失語症およびヴエーニ
ッケ(Wernicke)失語症を含む失語症などの言語傷害、発語傷害、構語傷害、反響
語、無言症および吃音を含む言語傷害、失声症およびしわがれ声などの音声傷害
などの伝達傷害、除脳症状、譫妄、線維束形成、幻覚、髄膜症、アンゲルマン(a
ngelman)症候群、運動失調、アテトーシス、舞踏病、筋緊張異常、運動低下、筋
肉低圧、間代性筋痙攣、チック、斜頚および振戦などの運動傷害、スティフ−マ
ン(stiff-man)症候群などの筋肉硬直などの筋肉筋緊張亢進、筋肉痙攣、ヘルペ
ス−ゾスター・オチクス(Herpes Zoster Oticus)を含む顔面麻痺などの麻痺、軽
症胃アトニー、半身不随、二重視などの眼筋麻痺、ドエイン(Duane's)症候群、
ホーナー(Horner's)症候群、カーンズ(Kearns)症候群などの慢性進行性外面眼筋
麻痺、延髄麻痺、局所痙攣性不全対麻痺、ブラウン−シカード(Brown-Sequard)
症候群、四肢麻痺、呼吸麻痺および声帯麻痺などの対麻痺、運動麻痺、幻肢痛、
無味覚症および味覚不全などの味覚傷害、弱視、盲目、色覚欠損症、二重視、半
盲、暗点および低能力視力などの視力傷害、クライン−レビン(Kleine-Levin)症
候群を含む過眠症、不眠症および夢遊病などの睡眠傷害、開口傷害などの攣縮、
昏睡などの意識喪失、持続性栄養核症状および失神およびめまい、先天性筋無緊
張などの神経筋疾患、筋萎縮性側索硬化症、ランベール−イートン(Lambert-Eat
on)筋無力症症候群、運動神経疾患、脊柱筋萎縮症、Charcot-Marie疾患およびヴ
ェードニッヒ−ホフマン(Werdnig-Hoffmann)疾患などの筋萎縮症、灰白髄炎後症
候群、筋ジストロフィー、重症筋無力症、萎縮性筋緊張症、先天性筋緊張症、ネ
マリン(Nemaline)筋疾患、家族性間欠性麻痺、複合パラミロクロヌス、局所痙攣
性不全対麻痺およびスティフ−マン(Stiff-Man)症候群、先端疼痛症などの末梢
神経系疾患、アミロイド神経障害、アディエス(Adie's)症候群、バーレ−リウ(B
arre-Lieou)症候群、家族性自律神経障害、ホーナー(Horner's)症候群、反射交
感神経ジストロフィーおよびシャイ−ドレイガー(Shy-Drager)症候群などの自律
神経系疾患、神経線維腫症 2を含む聴覚神経腫などの内耳神経疾患などの脳神経
疾患、顔面神経痛などの顔面神経疾患、メルカーソン−ローゼンタール(Melkers
son-Rosenthal)症候群、弱視、眼振、動眼神経麻痺を含む眼球運動傷害、ドエイ
ンズ(Duane's)症候群などの眼筋麻痺、ホーナー(Horner's)症候群、カーンズ(Ke
arns)症候群を含む慢性進行性外部眼筋麻痺、斜視および外斜視などの斜視、動
眼神経麻痺、遺伝性視覚萎縮症を含む視覚萎縮症を含む視覚神経疾患、視覚円形
結晶腔、屈折神経脊髄炎などの視覚神経炎、うっ血乳頭、三叉神経痛、声帯麻痺
、屈折神経脊髄炎および脊柱前湾症などの脱髄性疾患、糖尿病性歩行などの糖尿
病性神経障害、手根管症候群、足根管症候群などの神経圧縮症候群、頚部肋骨症
候群などの胸部出口症候群、尺骨神経圧縮症候群、灼熱痛、頚腕部神経痛などの
神経痛、先天性無痛および家族性自律神経障害を含む顔面神経神経障害、実験性
アレルギー神経炎、視覚神経炎、多発性神経炎、多発性神経根神経炎、多発性神
経根炎などの神経根炎などの神経炎、遺伝性視覚萎縮症、シャルコット−マリー
(Charcot-Marie)疾患、レフズム(Refsum)疾患、遺伝性痙攣性対麻痺およびヴェ
ードニッヒ−ホフマン(Werdnig-Hoffman)疾患などの遺伝性運動および感覚神経
障害、先天性無痛および家族性自律神経障害を含む遺伝性感覚および自己免疫神
経障害、ＰＯＥＭＳ症候群、坐骨神経痛、味覚発汗および強直)。
【０３７４】 代謝性および内分泌疾患 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアン
タゴニストは代謝性または内分泌疾患の治療および診断に用いることができる。
【０３７５】 治療および検出され得る栄養性および代謝性疾患の例には下記のものが含まれ
る：塩酸欠乏症、酸−塩基不均衡、アシドーシス(乳酸、腎尿細管、または呼吸
性を含む)、糖尿病性ケトアシドーシス、ケトン症、アルカローシス、呼吸アル
カローシス、カルシウム代謝性傷害、石灰沈着、カルシフィラキシー、ＣＲＥＳ
Ｔ症候群、腎石灰化症、病的脱灰、高カルシウム血症、低カルシウム血症、テタ
ニー、骨軟化症、偽性副甲状腺機能低下症、クル病、尿崩症、腎発生尿崩症、ウ
ォルフラム(Wolfram)症候群、糖尿病(実験およびインシュリン依存性、脂肪組織
萎縮性、インシュリン非依存性を含む)、糖尿病性血管傷害、糖尿病性歩行、妊
娠性糖尿病、胎児性巨人症、グルコース耐性不調、糖尿、腎性糖尿、高血糖症、
高脂血症、高コレステロール血症、高リポ蛋白血症、高トリグリセリド血症、高
プロラクチン血症、ビタミンＡ過剰症、低血糖症、インシュリン昏睡、吸収不良
症候群(盲係蹄症候群、腹腔疾患、ラクトース耐性不調、腸管脂肪異栄養症、局
所スプルーを含む)、先天的代謝異常(先天的アミノ酸代謝異常、眼球白皮症、眼
皮膚白皮症、限局性白毛を含む)、アルカプトン尿症、組織異変症、腎臓アミノ
酸尿、シスチン尿症、ハートナップ(Hartnup)疾患、ホモシスチン尿症、メープ
ルシロップ尿疾患、多発性カルボキシラーゼ欠損症、フェニルケトン尿症、母性
フェニルケトン尿症、アミロイドーシス、アミロイド神経障害、大脳アミロイド
血管欠損症、先天性フルクトース代謝異常(フルクトース-1,6-ジホスファターゼ
欠損症、フルクトース耐性不調)などの先天性炭水化物代謝異常、ガラクトース
血症、グルコース耐性不調、糖原病疾患(I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII型)
、高シュウ酸尿症、原発性高シュウ酸尿症、マンノース症、ムコ多糖症(I、II、
III、IV、VI、VII)、多発性カルボキシラーゼ欠損症、先天性ピルビン酸代謝異
常、レイ(Leigh)疾患、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症、ピルビン酸デヒド
ロゲナーゼ複合欠損症、グルコース燐酸デヒドロゲナーゼ欠損症、遺伝性高ビリ
ルビン血症、クリガー−ナジャール(Crigler-Najjar)症候群、ギルバート(Gilbe
rt's)疾患、慢性特発性黄疸、高リポ蛋白血症などの先天性脂質代謝異常、家族
性高コレステロール血症、家族性複合高脂血症、高コレステロール血症(家族性
、III、IV、V型)、家族性リポタンパク質リパーゼ欠損症、低リポ蛋白血症(無β
リポタンパク質血症、低βリポ蛋白症、レシチンアシルトランスフェラーゼ欠損
症、タンジャー(Tangier)疾患)、リポイド沈着症(コレステロールエステル貯蔵
疾患、リポイド蛋白症、神経細胞セロイド−リポフスチン沈着症、レフズム(Ref
sum's)疾患、スジョグレン−ラルソン(Sjogren-Larsson)症候群、スフィンゴリ
ピト症(副腎白質萎縮症、ファルビー(Fabry's)疾患、ガングリオシド蓄積症、サ
ンドホフ(Sandhoff)疾患、テイ−サックス(Tay-Sachs)疾患、ゴーチャー(Gauche
r's)疾患、グロボイド細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症、ニーマン−ピック(N
iemann-Pick)疾患、シー−ブルー(Sea-Blue)組織球症候群、ウォルマン(Wolman)
疾患、ミトコンドリア筋傷害、ミトコンドリア脳筋症、ＭＥＬＡＳ症候群、ＭＥ
ＲＲＦ症候群、外部慢性進行性眼筋麻痺、コレステロールエステル貯蔵疾患など
のリソソーム貯蔵疾患、マンノシドーシス、ムコ脂質症、フコース蓄積症、ムコ
多糖沈着症(I、II、III、IV、VIおよびVII)、血色素症、肝レンズ状変性、低ホ
スファターゼ血症、家族性低リン酸血症、ちぢれ毛症候群、家族性周期的麻痺お
よび偽性副甲状腺機能低下症を含む先天性金属代謝異常、ムコ脂質症、フコース
蓄積症、ポルフィリン症、(発赤熱性(erythroheatic)、赤血球新生、肝臓、急性
間欠性、クタネア・タルダ(cutanea tarda))、痛風、痛風性関節炎およびレシュ
−ナイハン(Lesch-Nyhan)症候群などの先天性プリン-ピリミジン代謝異常、腎尿
細管アシドーシス、腎臓アミノ酸尿、シスチン尿症、ハートナップ(hartnup)疾
患、シスチン症、ファンコーニ(Fanconi)症候群、腎性糖尿、家族性低リン酸血
症、眼脳腎症候群および偽低アルドステロン症などの先天性腎尿細管輸送異常、
リン代謝不全、低リン酸血症、蛋白喪失腸疾患、腸管リンパ管拡張症、水−電解
質不均衡(脱水症、高カルシウム血症、高カリウム血症、高ナトリウム血症、低
カルシウム血症、低ナトリウム血症、不適合抗利尿ホルモン症候群、水中毒)、
黄色腫症、ウォルマン(Wolman)疾患、乳児栄養欠乏症などの小児栄養欠乏症、ビ
タミン欠乏症、アスコルビン酸欠乏症、壊血病、ビタミンＡ欠乏症、ビタミンＢ
欠乏症、コリン欠乏症、葉酸欠乏症、ペラグラ、ピリドキシン欠乏症、リボフラ
ビン欠乏症、チアミン欠乏症、脚気、ヴェーニック(Wernicke's)脳傷害、ビタミ
ンＢ12欠乏症(貧血、悪性)、ビタミンＤ欠乏症、(骨軟化症、脂肪組織炎)、ビタ
ミンＥ欠乏症(脂肪組織炎)、ビタミンＫ欠乏症、マグネシウム欠乏症、カリウム
欠乏症、蛋白質欠乏症(蛋白質-エネルギー栄養不良、クワシオルコル)などの欠
乏症、脊柱前湾症、糖尿病性肥満症、病的肥満症、ピックウイッキアン(Pickwic
kian)症候群、プレーダー−ウイリ(Prader-Willi)症候群および飢餓。
【０３７６】 治療および検出され得る内分泌疾患の例として下記のものが含まれる：副腎疾
患(皮質疾患、ノルテックス腫瘍)、副腎機能亢進症(クッシング(Cushing's)症候
群、高アルドテロン症、バーター(Bartter's)疾患)、副腎機能不全(アジソン(Ad
dison's)疾患、副腎白質萎縮症、低アルドテロン症)、副腎腫瘍、副腎皮質腫瘍
、先天性副腎肥厚化症、ウォーターハウス−フリデリクセン(Waterhouse-Frider
ichsen)症候群、胸部腫瘍、男性胸部腫瘍、胸部線維嚢胞疾患、女性化乳房、カ
イアリ−フロメル(Chiari-Frommel)症候群および乳汁漏出などの授乳傷害、乳腺
炎、バウイー(Bowie)乳腺炎、糖尿病(実験、インシュリン−依存性、ウォルフラ
ム(Wolfram)症候群、脂肪組織萎縮およびインシュリン非依存性)、糖尿病性血管
傷害、糖尿病性歩行、糖尿病性網膜症、糖尿病性昏睡、高血糖性高浸透圧性非ケ
トン性昏睡、糖尿病性ケトアシドーシス、糖尿病性歩行と関連する糖尿病性腎傷
害、糖尿病性肥満、妊娠性糖尿病、胎児巨人症、小人症(コッケイン(Cockayne)
症候群、下垂体、致死性形成異常)、副腎皮質新生物などの内分泌腺腫瘍、複数
内分泌異常増殖(1、2a、2b型)、腫瘍性内分泌-様症候群、ＡＣＴＨ症候群(異所
性)、ゾーリンガー−エリソン(Zollinger-Ellison)症候群、卵巣腫瘍、メイグ(M
eig's)症候群、副甲状腺腫瘍、下垂体腫瘍、ネルソン(Nelson)症候群、睾丸腫瘍
、胸腺腫瘍、甲状腺腫瘍、甲状腺小結節、副腎肥厚化(先天性)などの性腺傷害、
女性化、女性化睾丸、高アンドロゲン症、生殖機能不全、宦官症、カルマン(Kal
lmann)症候群、クラインフェルター(Klinefelter's)症候群、無排卵、卵巣炎、
卵巣嚢胞、多嚢胞性卵巣症候群、未成熟卵巣不全、卵巣過刺激症候群、卵巣腫瘍
、メイグ(Meigs')症候群、思春期遅延症および思春期早発症などの卵巣疾患、性
腺形成不全(46、XY、混合)およびターナー(Turner's)症候群などの性分化傷害、
雌雄同体、偽雌雄同体、カルマン(Kallmann)症候群、クラインフェルター(Kline
felter's)症候群、女性化睾丸、停留睾丸、睾丸炎、睾丸腫瘍などの睾丸疾患、
男性化症、多毛症、高インスリン症、ＡＣＴＨ症候群(異所性)およびゾーリンガ
ー−エリソン(Zollinger-Ellison)症候群などの腫瘍性内分泌-様症候群、副甲状
腺機能亢進症(二次的)を含む副甲状腺疾患、腎臓骨形成異常、副甲状腺機能低下
症、強直、副甲状腺腫瘍、下垂体疾患、エンピ・セラ(Empy Sella)症候群、下垂
体機能亢進症、末端肥大症、巨人症、下垂体機能低下症(尿崩症、腎発生尿崩症
、ウォルフラム(Wolfram)症候群、下垂体小人症)、不適正ＡＤＨ症候群、下垂体
卒中、下垂体腫瘍、ネルソン(Nelson)症候群、自己免疫多腺性内分泌障害、早老
症、ウェーナー(Werner's)症候群、胸腺肥厚化、甲状腺機能正常病症候群、甲状
腺腫(地方性、結節性、胸骨下、グレイブ(Graves')疾患)、甲状腺機能亢進症お
よびグレイブ疾患と関連する甲状腺機能亢進症、高サイロキシン血症、甲状腺機
能低下症(クレチン症および粘液水腫)、甲状腺ホルモン抵抗症候群、甲状腺腫瘍
、甲状腺小結節、甲状腺症(自己免疫、亜急性、化膿性)、バセドウ病、甲状腺急
性発症および内分泌結核などの甲状腺疾患。
【０３７７】 細胞レベルでの疾患 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド又はポリペプチド、並びにＫＧＦ−２のアンタゴ
ニスト又はアゴニストにより、処置し得る又は検出し得る、細胞生存増加又はア
ポトーシスの阻害に関連する疾患には、癌（例えば濾胞性リンパ腫、ｐ５３の突
然変異を伴う癌腫、及び例えば結腸癌、心臓の腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽腫
、膠芽細胞腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫
、内皮腫、骨芽細胞腫、破骨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌
、カポジ肉腫、及び卵巣癌のようなホルモン依存性腫瘍のようなもの）、自己免
疫障害（例えば多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性胆硬
変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性紅斑性狼瘡、免疫関連糸
球体腎炎及びリューマチ性関節炎のようなもの）及びウイルス感染症（例えばヘ
ルペスウイルス、ポックスウイルス及びアデノウイルスのようなもの）、炎症、
移植片対宿主疾患、急性移植片拒絶、及び慢性移植片拒絶が包含されるが、これ
らに限定されない。好ましい態様において、本発明のＫＧＦ−２ポリヌクレオチ
ド、ポリペプチド及び／又はアンタゴニストは、癌、特に上に列挙したものの増
殖、進行、及び／又は転移を阻害するために使用される。
【０３７８】 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド又はポリペプチド、並びにＫＧＦ−２のアンタゴ
ニスト又はアゴニストにより、処置し得る又は検出し得る、細胞生存増加に関連
するさらなる疾患又は症状には、悪性の進行及び／又は転移及び関連する障害、
例えば白血病（急性白血病（例えば急性リンパ球性白血病、急性骨髄球白血病（
骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄性単球性、単球性及び赤白血病を含む）））及び
慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ球性白血病
））、真性多血症、リンパ腫（例えばホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨
髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、及び固体腫瘍（肉
腫及び癌腫、例えば繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫（liposarcoma）、軟骨肉腫
、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（endotheliosarcoma）、リンパ管
肉腫（lymphangiosarcoma）、リンパ管内皮肉腫（lymphangioendotheliosarcoma
）、滑液肉腫（synovioma）、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉
腫、結腸癌腫、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌腫、基底細胞癌
腫、腺癌、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌腫（papillary adenocar
cinomas）、嚢胞腺癌（cystadenocarcinoma）、骨髄癌腫（medullary carcinoma
）、気管支原性癌腫（bronchogenic carcinoma）、腎細胞癌腫（renal cell car
cinoma）、肝癌、胆管癌腫、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫、子宮
頚癌、精巣腫（testicular tumor）、肺癌腫、肺小細胞癌、膀胱癌腫、上皮癌腫
、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫（ependymoma）、松
果体腫（pinealoma）、血管芽細胞腫（hemangioblastoma）、内耳神経腫（acous
tic neuroma）、乏突起細胞腫、メナンギオーマ（menangioma）、黒色腫、神経
芽腫及び網膜芽細胞腫が含まれるがこれらに限定されない）が含まれるがこれら
に限定されない。
【０３７９】 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド又はポリペプチド、並びにＫＧＦ−２のアンタゴ
ニスト又はアゴニストにより、処置し得る又は検出し得る、アポトーシス増加に
関連する疾患には、ＡＩＤＳ；神経変性性疾患（例えばアルツハイマー病、パー
キンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性及び脳腫瘍又は以前
の関連疾患）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋
本甲状腺炎、胆汁性胆硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性
紅斑性狼瘡、免疫関連糸球体腎炎及びリューマチ性関節炎）、脊髄形成異常症候
群（例えば無形成性貧血）、移植片対宿主疾患、虚血性損傷（例えば心筋梗塞、
発作（stroke）及び再潅流損傷に起因するもの）、肝臓損傷（例えば肝炎に関連
する肝臓損傷、虚血性／再潅流損傷、コレストシス（cholestosis）（胆管損傷
）及び肝臓癌）；トキシン誘導性肝臓疾患（例えばアルコールに起因するもの）
、敗血性ショック、潰瘍性大腸炎、悪液質及び食欲不振が含まれる。
【０３８０】 傷の治癒及び上皮細胞増殖 本発明は、さらなる側面に従って、KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド
、並びにKGF-2のアゴニスト又はアンタゴニストを治療目的、例えば、傷の治癒
のために上皮細胞増殖及び基底ケラチノサイト（角化細胞）を刺激すること、及
び、毛嚢母斑の産生及び皮膚創傷を治癒するために、使用する方法を提供する。
KGF-2ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並びにKGF-2アゴニスト又はアンタゴ
ニストは、外科的な創傷、切除後の創傷、真皮及び表皮の損傷を含む深い創傷、
眼組織の創傷、歯科組織の創傷、口腔創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚潰瘍、肘潰瘍、
動脈潰瘍、静脈うっ滞性潰瘍、熱暴露又は化学物質による火傷等の創傷の治癒刺
激、及び尿毒症、栄養失調、ビタミン欠乏症、並びにステロイド、放射線治療及
び抗新生物薬、及び代謝拮抗物質による全身治療に関連した合併症などの、その
他の異常な創傷治癒状況に、臨床上有用であろう。KGF-2 ポリヌクオチド又はポ
リヌペプチド、並びにKGF-2アゴニスト又はアンタゴニストは、皮膚喪失後の、
皮膚再樹立を促進するために使用しうる。
【０３８１】 KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並びにKGF-2アゴニスト又はアン
タゴニストは、創傷床への皮膚移植片の接着を増強し、創傷床からの再上皮形成
を刺激するために使用しうる。以下に、KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチ
ド、並びにKGF-2アゴニスト又はアンタゴニストを用いて創傷床への接着を増強
しうる移植（片）の例を挙げる。自家移植片、人工皮膚、同種移植片、自家皮膚
移植片、自家表皮移植片、avacular移植片、Blair Brown移植片、骨移植片、胚
胎組織移植片、真皮移植片、遅延移植、皮膚移植、表皮移植、筋膜移植片、全層
植皮術、異種移植、同種移植、増殖性移植片、層状移植、網状移植片、粘膜移植
、Ollier-Thiersch移植片、大網移植、パッチ移植片、茎状移植片、全層角膜移
植片（penetrating graft）、分層植皮術、及び厚い分層植皮片。KGF-2ポリヌク
オチド又はポリヌペプチド、並びにKGF-2アゴニスト又はアンタゴニストはまた
皮膚の強度を増進し、加齢皮膚の外観を改善するためにも使用しうる。
【０３８２】 KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並びにKGF-2アゴニスト又はアン
タゴニストはまた、肝細胞増殖、及び肺、乳房、膵、胃、小腸及び大腸の上皮細
胞の増殖を変化させると考えられている。KGF-2ポリヌクオチド又はポリヌペプ
チド、並びにKGF-2アゴニスト又はアンタゴニストは、sebocytes、毛包、肝細胞
、II型肺胞上皮細胞、ムチン産生杯細胞等の上皮細胞、その他の上皮細胞、及び
皮膚、肺、肝臓及び胃腸管などに含有されるそれらの先祖等の増殖を促進しうる
。KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並びにKGF-2アゴニスト又はアン
タゴニストは、内皮細胞、ケラチノサイト、及び基底ケラチノサイトの増殖を促
進しうる。
【０３８３】 KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並びにKGF-2アゴニスト又はアン
タゴニストは、放射線照射、化学療法又はウイルス感染に起因する消化管毒性の
副作用を減少するためにも使用しうる。KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチ
ド、並びにKGF-2アゴニスト又はアンタゴニストは、小腸粘膜への細胞毒性効果
に対する細胞保護作用を有しうる。KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、
並びにKGF-2アゴニスト又はアンタゴニストはまた、化学療法及びウイルス感染
に起因する口内炎 (口内潰瘍)の治癒を刺激しうる。
【０３８４】 KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並びにKGF-2アゴニスト又はアン
タゴニストはまた、火傷を含む、全及び一部皮膚欠損にかかる皮膚の完全な再生
（すなわち、毛包、汗腺、及び脂腺の再生（repopulation））、乾癬他の皮膚欠
損の治療に使用しうる。KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並びにKGF-
2アゴニスト又はアンタゴニストは、再上皮形成を加速することにより、表皮水
疱症、しばしば、解放型の、痛みを伴う水疱を生じる表皮と下方の真皮との接着
欠損、の治療に有用でありうる。KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並
びにKGF-2アゴニスト又はアンタゴニストはまた、胃及び十二指腸潰瘍の治療に
有用であり、被覆粘膜の瘢痕形成、及び粘膜腺及び十二指腸被覆粘膜の再生によ
りより迅速な治癒を助成する。炎症性腸疾患、例えばクローン病及び潰瘍性大腸
炎は、それぞれ、小腸又は大腸の粘膜表面の破壊に至る疾患である。このように
、KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並びにKGF-2アゴニスト又はアン
タゴニストは、粘膜表面の再構築を促進し、より迅速な治癒を助け、炎症性腸疾
患の進行の防止に役立つ。KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並びにKG
F-2アゴニスト又はアンタゴニストによる治療は、胃腸管全体の粘膜生産に有意
な効果を奏すると予測され、摂取した障害性物質から、又は術後に腸管粘膜を保
護するのに使用可能である。KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並びに
KGF-2アゴニスト又はアンタゴニストは、KGF-2の低発現に伴う疾患の治療に有用
であろう。
【０３８５】 さらに、KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並びにKGF-2アゴニスト
又はアンタゴニストは、様々な病的状態に起因する肺損傷の予防及び治療に使用
しうる。KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並びにKGF-2アゴニスト又
はアンタゴニストのような成長因子は、肺胞及び気管支上皮の増殖及び分化を刺
激し、その回復を促進することができ、急性又は慢性の肺損傷を予防又は治療し
うる。例えば、気管支上皮細胞及び肺胞の壊死の原因である、進行性の肺胞の損
失に至る肺気腫、並びに煤煙吸入損傷及び火傷に起因する気道障害は、KGF-2 ポ
リヌクオチド又はポリヌペプチド、並びにKGF-2アゴニスト又はアンタゴニスト
により効果的に治療しうる。KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並びに
KGF-2アゴニスト又はアンタゴニストは、II型肺胞の増殖及び分化を刺激するの
に使用しうる、そのことにより未熟児における、乳児呼吸窮迫症候群や気管支肺
形成不全のような、肺硝子膜症等の疾患の治療に有用でありうる。
【０３８６】 KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並びにKGF-2アゴニスト又はアン
タゴニストは、肝細胞の増殖及び分化を刺激し得るので、肝硬変により引き起こ
される劇症肝炎、ウイルス性肝炎や毒物(即ち、アセトアミノフェン、四塩化炭
素及び当該技術分野で既知のその他の肝臓毒素)によって引き起こされる肝損傷
などの肝疾患や病態の軽減や治療に使用可能である。
【０３８７】 加えて、KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並びにKGF-2アゴニスト
又はアンタゴニストは、糖尿病の発現を阻止又は治療するのに使用し得る。幾分
の島細胞機能が残っている、I型又はII型糖尿病と診断されたばかりの患者では
、KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並びにKGF-2アゴニスト又はアン
タゴニストを、島細胞機能の維持のために使用し、糖尿病の恒久的な発現を軽減
、遅延又は阻止しうる。また、KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、並び
にKGF-2アゴニスト又はアンタゴニストは、島細胞移植の補助剤として使用し、
島細胞機能を改善又は増進することができる。
【０３８８】 感染性疾患 KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、又はKGF-2アゴニスト又はアンタ
ゴニストは、感染性疾患の治療又は検出に使用し得る。例えば、免疫応答の増大
、特にＢ及び/又はＴ細胞の増殖及び分化を増大することにより、感染性疾患を
治療することができる。現存の免疫を高めること、又は新たな免疫応答を開始す
ることにより、免疫応答を増大することができる。別法として、KGF-2 ポリヌク
オチド又はポリヌペプチド、又はKGF-2アゴニスト又はアンタゴニストはまた、
必ずしも免疫応答を刺激しなくとも、それ自身が感染性物質を直接阻害すること
ができる。
【０３８９】 ウイルスは、KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、又はKGF-2アゴニス
ト又はアンタゴニストにより治療又は検出し得る疾患又は症状を起こしうる感染
性物質の一つである。ウイルスの例として、以下のファミリーのDNA及びRNAウイ
ルス類に属するものが挙げられるが、これらに限定されない。アルボウイルス、
アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス科、
ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、シストウイルス科、コロナウイルス科、
フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科(サイト
メガロウイルス、単純疱疹ウイルス、帯状ヘルペスウイルスなど)、Mononegavir
us (例えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス属、ラブドウイルス科)、オ
ルト（オルソ）ミクソウイルス科(例えば、インフルエンザウイルス)、パポバウ
イルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科(痘瘡
ウイルス又はワクシニアウイルスなど)、レオウイルス科(例えば、ロタウイルス
)、レトロウイルス科(HTLV-I、HTLV-II、レンチウイルス)、及びトガウイルス科
(例えば、風疹ウイルス)。
【０３９０】 これらのファミリーに含まれるウイルス類は関節炎、気管支炎、脳炎、眼感染
症(例えば、結膜炎、角膜炎)、慢性疲労症候群、肝炎(A、B、C、E、慢性活動性
肝疾患、デルタ型肝炎）、髄膜炎、日和見感染症(例えば、AIDS)、肺炎、バーキ
ットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、感
冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染性疾患、皮膚病(例えば、カポージ肉腫、い
ぼ)、及びウイルス血症等の様々な疾患又は症状の病因となりうるが、これらに
限定されない。KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、又はKGF-2アゴニス
ト又はアンタゴニストはこれらの症状又は疾患の任意のものを治療又は検出する
のに使用し得る。
【０３９１】 同様に、KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、又はKGF-2アゴニスト又
はアンタゴニストにより治療又は検出し得る疾患又は症候群を引き起こしうる細
菌又は真菌物質には、以下のグラム陰性及びグラム陽性バクテリアファミリー、
並びに真菌が含まれるが、これらに限定されない。放線菌目（Actinomycetales
）(例えば、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ミコバクテリウム属（
Mycobacterium）、ノカルディア（Norcardia)、アスペルギロシス（Aspergillos
is）、バチルス属（Bacillaceae）(例えば、アンスラックス（Anthrax）、クロ
ストリジウム（Clostridium)）、バクテロイデス科、ブラストミセス（Blastomy
cosis）、ボルデテラ属（Bordetella）、ボレリア属（Borrelia）、ブルセラ（B
rucellosis）、カンジダ（Candidiasis）、キャンピロバクター（Campylobacter
）、コクシジオイデス真菌（Coccidioidomycosis）、クリプトコッカス症（Cryp
tococcosis）、皮膚真菌症（Dermatocycoses）、腸内細菌（Enterobacteriaceae
）(クレブシーラ（Klebsiella）、サルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serra
tia）、エルジニア（Yersinia)）、エリジペロスリックス属（Erysipelothrix）
、ヘリコバクター（Helicobacter）、レジオネローシス（Legionellosis）、レ
プトスピラ症（Leptospirosis）、リステリア属（リステリア属）、マイコプラ
スマ目（Mycoplasmatales）、ナイセリア科（Neisseriaceae）(例、アシネトバ
クター属（Acinetobacter）、 淋菌（Gonorrhea）、メニゴコッカル（Menigococ
cal)）、パスツレラ・インフェクション（Pasteurellacea Infections）(例、ア
クチノバチルス属（Actinobacillus）、ヘモフィルス属（Heamophilus）、パス
ツレラ属（Pasteurella)）、シュードモナス属（Pseudomonas）、リケッチア属
（Rickettsiaceae）、クラミジア科（Chlamydiaceae）、シフフィリス属（Syphi
lis）及びスタフィロコッカス属（Staphylococcal）。これらの細菌又は真菌類
は以下の疾患又は症状の病因となりうるがこれらに限定されない。菌血症、心内
膜炎、眼感染症(例えば、結膜炎、結核、ブドウ膜炎)、歯肉炎、日和見感染症(
例えば、AIDS関連感染症)、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター病、呼
吸器感染症、例えば、百日咳又は蓄膿、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤
痢、パラチフス熱、食中毒、チフス、肺炎、淋疾、髄膜炎、クラミジア、梅毒、
ジフテリア、らい、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿
痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染症、皮膚疾患(例えば、蜂巣炎、皮膚嚢腫)、
毒血症、尿路感染症、及び創傷感染症。KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチ
ド、又はKGF-2アゴニスト又はアンタゴニストは、これらの症状又は疾患の任意
のものの治療又は検出に利用可能である。
【０３９２】 さらに、KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、又はKGF-2アゴニスト又
はアンタゴニストにより治療又は検出し得る疾患又は症状の原因となる寄生虫に
は以下の種類があるが、これらに限定されない。アメーバ症（Amebiasis）、バ
ベシア症（Babesiosis）、コクシジウム症（Coccidiosis）、クリプトスポリジ
ウム症（Cryptosporidiosis）、二核アメーバ下痢（Dientamoebiasis）、Dourin
e、Ectoparasitic、ジアルジア鞭毛虫症（Giardiasis）、蠕虫病（Helminthiasi
s）、リーシュマニア症（Leishmaniasis）、タイレリア症（Theileriasis）、ト
キソプラスマ症（Toxoplasmosis）、トリパノソーマ症（Trypanosomiasis）、及
びトリコモナス属（Trichomonas）。これらの寄生虫は以下の疾患又は症状の病
因となりうるが、これらに限定されない。疥癬（Scabies）、ツツガムシ病、眼
感染症、消化器疾患(例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症)、肝疾患、肺疾患、日
和見感染症(例えば、AIDS関連疾患)、マラリア（Malaria）、妊娠合併症及びト
キソプラズマ症。KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、又はKGF-2アゴニ
スト又はアンタゴニストは、これらの症状又は疾患の任意のものの、治療又は検
出に利用可能である。
【０３９３】 KGF-2 ポリヌクオチド又はポリヌペプチド、又はKGF-2アゴニスト又はアンタ
ゴニストを使用する治療は、有効量のKGF-2ポリペプチドを患者に投与するか、
患者から細胞を摘出し、細胞にKGF-2ポリヌクレオチドを与え、患者に操作した
細胞を戻す（ex vivo 治療法)ことにより行うのが好ましい。さらに、KGF-2ポリ
ヌペプチド又はポリヌクオチドは感染症に対する免疫応答を引き起こすためのワ
クチン用の抗原として使用することができる
【０３９４】 再生 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド若しくはポリペプチド、又はＫＧＦ−２のアゴニ
スト若しくはアンタゴニストを用いて、細胞を分化、増殖及び誘導し、組織を再
生することができる（Science、２７６：５９−８７（１９９７）を参照）。組
織の再生によって、天性欠損、外傷（創傷、火傷、切り傷又は潰瘍）、加齢、疾
患（骨粗鬆症、骨軟骨炎、歯周病、肝不全など）、美容形成術などの手術、線維
症、再潅流傷害又は全身性サイトカイン損傷により損傷を受けた組織を修復、交
換又は保護することもできる。
【０３９５】 本発明を用いて再生しうる組織としては、臓器（すい臓、肝臓、腸、腎臓、皮
膚、内皮など）、筋肉（平滑筋、骨格筋又は心筋）、脈管構造（血管及びリンパ
管など）、神経、造血及び骨格（骨、軟骨、腱及び靭帯）組織が挙げられる。瘢
痕形成がないか又は少ない状態で再生が起こるのが好ましい。再生には、血管形
成も含まれる。
【０３９６】 さらに、ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド若しくはポリペプチド、又はＫＧＦ−２
のアゴニスト若しくはアンタゴニストは、治癒の困難な組織の再生を増進するこ
とができる。例えば、腱／靱帯の再生が増進すると、損傷後の回復が速まる。本
発明のＫＧＦ−２ポリヌクレオチド若しくはポリペプチド、又はＫＧＦ−２のア
ゴニスト若しくはアンタゴニストは、損傷を回避する努力において予防的に用い
ることもできる。治療しうる特定の疾患としては、腱炎、手根管症候群及び他の
腱又は靱帯の欠陥が挙げられる。回復困難な創傷の組織再生の例としては、圧迫
潰瘍、脈管不全、手術及び外傷性損傷が挙げられる。
【０３９７】 同様に、ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド若しくはポリペプチド、又はＫＧＦ−２
のアゴニスト若しくはアンタゴニストを用いて、神経細胞を増殖及び分化させる
ことによって、神経及び脳組織を再生することもできる。本発明方法を用いて治
療しうる疾患としては、中枢及び末梢神経系の疾患、神経障害又は機械的及び外
傷性障害（脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患及び発作など）が挙げられる。特に
、末梢神経傷害、末梢神経障害（化学療法又は他の医学療法に由来するものなど
）、局在性神経障害及び中枢神経系疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、
ハンティングトン舞踏病、萎縮性側索硬化症及びシャイ−ドレーガー症候群など
）に関連する疾患はすべて、ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド若しくはポリペプチド
、又はＫＧＦ−２のアゴニスト若しくはアンタゴニストを用いて治療することが
できる。
【０３９８】 走化性 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド若しくはポリペプチド、又はＫＧＦ−２のアゴニ
スト若しくはアンタゴニストは、走化性であってもよい。走化性分子は、細胞（
単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、マスト細胞、好酸球、上皮及び／又は内皮
細胞など）を誘引し、炎症部位、感染部位又は過剰増殖部位といったような体内
の特定の部位へ移動させる。次いで、移動させられた細胞が、特定の外傷又は異
常を撃退及び／又は治癒することができる。
【０３９９】 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド若しくはポリペプチド、又はＫＧＦ−２のアゴニ
スト若しくはアンタゴニストは、特定の細胞の走化性活性を増進する。次いで、
これらの走化性分子を用いて、体内の特定の位置へ標的化された細胞の数を増や
すことにより、炎症、感染、過剰増殖性障害又はどのような免疫系障害でも治療
することができる。例えば、走化性分子を用いて、免疫細胞を傷害部位へ誘引す
ることにより、組織の創傷及び他の外傷を治療することができる。走化性分子と
して、ＫＧＦ−２もまた、線維芽細胞を誘引することができ、創傷の治療に用い
ることができる。
【０４００】 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド若しくはポリペプチド、又はＫＧＦ−２のアゴニ
スト若しくはアンタゴニストが走化性活性を阻害することもまた企図される。こ
れらの分子もまた、障害の治療に用いることができる。したがって、ＫＧＦ−２
ポリヌクレオチド若しくはポリペプチド、又はＫＧＦ−２のアゴニスト若しくは
アンタゴニストは、走化性のインヒビターとして用いることができる。
【０４０１】 結合活性 ＫＧＦ−２ポリペプチドは、ＫＧＦ−２に結合する分子またはＫＧＦ−２が結
合する分子を検索するために使用しうる。分子とＫＧＦ−２との結合は、結合し
た分子またはＫＧＦ−２の活性を活性化（作動剤）、増大、阻害（拮抗剤）また
は減少しうる。そのような分子の例は、抗体、オリゴヌクレオチド、プロテイン
（たとえば受容体）または低分子を含む。
【０４０２】 好ましくは、この分子は、たとえばリガンドの断片などＫＧＦ−２の天然リガ
ンド、または天然の基質、構造的または機能的類似体に密接に関連する（Coliga
n et al., Current Protocols in Immunology, 1(2), 第５章(1991) を参照）。
同様に、この分子は、ＫＧＦ−２が結合する天然受容体に近縁であるか、少なく
ともＫＧＦ−２が結合することのできる受容体の断片（たとえば活性部位）であ
ることができる。いずれの場合も、この分子は、公知の技術を使用して合理的に
設計できる。
【０４０３】 好ましくは、これらの分子についての検索には、ＫＧＦ−２を分泌蛋白質とし
てまたは細胞表面上に発現する、適当な細胞を産生することを包含する。好適な
細胞には、哺乳類細胞、酵母、ショウジョウバエ細胞または大腸菌が含まれる。
次にＫＧＦ−２を発現する細胞（または発現されたポリペプチドを含む細胞膜）
をＫＧＦ−２または該分子のいずれかとの結合、活性の刺激または阻害を観察す
るための分子を含む可能性のある被験化合物と接触させる。
【０４０４】 この検定は、ＫＧＦ−２に対する候補化合物の単純な結合試験（結合は標識で
検出する）であってもよく、または標識した競合体との競合を含む検定であって
もよい。さらに、この検定は、候補化合物がＫＧＦ−２との結合によって発生す
るシグナルが起きるかどうかの試験であってもよい。
【０４０５】 あるいは、この検定は、細胞不含製品、固相支持体に固定したポリペプチド／
分子、化学的ライブラリーまたは天然産物の混合物を用いて行うこともできる。
この検定は、また単に候補化合物をＫＧＦ−２含有溶液と混合し、ＫＧＦ−２／
分子活性または結合を測定し、標準とのＫＧＦ−２／分子活性または結合を比較
する、各段階を含むものであってもよい。
【０４０６】 好ましくは、ＥＬＩＳＡ検定では、ＫＧＦ−２レベルまたはモノクローナル抗
体またはポリクローナル抗体を用いて、試料（たとえば生物学的試料）の活性を
測定することもできる。この抗体は、直接的または間接的なＫＧＦ−２への結合
によって、または基質に対するＫＧＦ−２との競合によってＫＧＦ−２のレベル
または活性を測定できる。
【０４０７】 これに加えて、ＫＧＦ−２が結合する受容体は、例えばリガンドパンニングお
よびＦＡＣＳソーティング（Coligan, et al., Current Protocols in Immun.,
1(2), 第５章(1991)）など、当技術分野の熟練者に知られている多数の方法によ
って、確認できる。例えば、発現クローニングを採用する。ここでは、ポリアデ
ニル化ＲＮＡを例えばＮＩＨ３Ｔ３細胞（この細胞は、ＦＧＦ族蛋白質に対する
受容体を多重に含むことが知られている）およびＳＣ−３細胞などのポリペプチ
ドに反応する細胞から調製する。次にこのＲＮＡから作成したｃＤＮＡライブラ
リーをプールに分け、ＣＯＳ細胞またはそのポリペプチドに応答しない他の細胞
に遺伝子移入する。遺伝子移入した細胞をスライドグラス上で増殖させ、予め標
識した本発明のポリペプチドと接触させる。なお、このポリペプチドは、ヨード
化または部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位の挿入を含む、様々な
手段で標識できる。
【０４０８】 固定およびインキュベーションの後、スライドをオートラジオグラフィー分析
にかける。陽性のプールを確認し、サブプールを作成し、反復的サブプール作成
および再検索の過程を用い、再遺伝子移入して、最後に推測上の受容体をコード
する単一クローンを入手する。
【０４０９】 受容体を確認する別の方法として、標識したポリペプチドを、受容体分子を発
現する細胞膜または抽出物の製品に、光親和性結合をさせることもできる。交差
結合した材料をＰＡＧＥ分析によって分割し、Ｘ線フィルムに接触させる。その
ポリペプチドの受容体を含む標識コンプレックスを切出し、ペプチド断片に分解
し、蛋白質微量配列決定にかける。微量配列決定から得たアミノ酸配列は、推測
上の受容体をコードする遺伝子を確認するための、ｃＤＮＡライブラリー検索に
用いる一群の縮退性オリゴヌクレオチドプローブを設計するために使用されよう
。
【０４１０】 さらにその上、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシ
ャッフリング、および／またはコドンシャッフクリング（これを「ＤＮＡシャッ
フリング」と総称する）は、ＫＧＦ−２の活性を変調して、効率的にＫＧＦ−２
の作動剤または拮抗剤を作製するために採用しうる。一般的には米国特許第5,60
5,793; 5,811,238; 5,830,721; 5,843,252; および 5,837,458号およびPattern,
P. A. et al., Curr. Opinion Biotechnol., 8: 724-33 (1997); Harayama, S.
, Trends Biotechnol. 16(2): 76-82 (1998); Hansson, L.O. et al., J. Mol.
Biol., 287: 265-76 (1999); および Lorenzo, M.M. and Blasco, R., Biotechn
iques, 24(2); 308-13 (1998) （この特許および論文は全て出典明示により本明
細書の一部とする）を参照。一態様においてＫＧＦ−２ポリヌクレオチドおよび
対応するポリペプチドの変更は、ＤＮＡシャッフリングで行ってもよい。ＤＮＡ
シャッフリングには、相同的なまたは部位特異的な組み替えによって所望するＫ
ＧＦ−２分子にＤＮＡ断片２種またはそれ以上を集合することを含む。別の態様
では、ＫＧＦ−２ポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドを、組換えの前
にエラー指向ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入またはその他の方法によるラン
ダム突然変異誘発に付して変更させることもできる。他の態様では、ＫＧＦ−２
の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、断片、その他の１種またはそれ以上
と、異種分子１種またはそれ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、断
片、その他の１種またはそれ以上とで組換えを行ってもよい。好適な態様ではこ
の異種分子は、繊維芽細胞増殖因子ファミリーに属する。さらに好適な態様では
、この異種分子は、たとえば血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増
殖因子（ＩＧＦ−I）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−α、上皮増
殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、骨形態形成蛋
白質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、アク
チビンＡおよびＢ、デカペンタプレジック（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２、ドル
サリン、増殖分化因子類（ＧＤＦ）、ノーダル、ＭＩＳ、インヒビン−α、ＴＧ
Ｆ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５およびグリア由来神経栄
養因子（ＧＤＮＦ）のような増殖因子である。
【０４１１】 その他の好適な断片は、生物学的に活性なＫＧＦ−２断片である。生物学的に
活性な断片は、必ずしもＫＧＦ−２ポリペプチドの作用と同一でなくてもよいが
、ＫＧＦ−２ポリペプチドの作用と類似する作用を示す。この断片の生物学的活
性には、所望する活性の改善または望ましくない活性の低下が含まれうる。
【０４１２】 これに加えて、この発明は、本発明のポリペプチドの作用を変調する化合物を
確認するための化合物検索法を提供する。そのような検定法の一例は、次のよう
にして行う。哺乳類繊維芽細胞、本発明のポリペプチド、検索する化合物、およ
び3[Ｈ]チミジンを、通常なら該繊維芽細胞が増殖する細胞培養条件下に混合す
る。対照実験は、検索すべき化合物の不在化に行う。各々の場合に3[Ｈ]チミジ
ンの取り込み量を決定する。その化合物が増殖を刺激するかどうかを決定すべき
化合物存在下の繊維芽細胞増殖量と比較する。繊維芽細胞の増殖量は、3[Ｈ]チ
ミジンの取り込み量を測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーによっ
て測定する。この操作法によって、作動剤と拮抗剤化合物の両方を確認できる。
【０４１３】 別の方法では、本発明のポリペプチドに対する受容体を発現する哺乳類細胞ま
たは膜製品を、標識された本発明のポリペプチドとともに、該化合物の存在下に
インキュベーションする。次に、この相互作用を強化または遮断する該化合物の
性能を測定する。これとは別に、検索すべき化合物とＫＧＦ−２受容体との相互
作用の後に発生する既知の第二メッセンジャー系の応答を測定し、該受容体に結
合し、第二のメッセンジャー応答を誘導する該化合物の性能を測定し、該化合物
が作動剤であるか拮抗剤である可能性があるかどうかを決定する。このような第
二メッセンジャー系には、これに限定するものではないが、ｃＡＭＰグアニレー
トシクラーゼ、イオンチャネルまたはホスホイノシチド加水分解が含まれる。
【０４１４】 前記検定法はすべて、診断用または予後徴候用マーカーとしても使用できる。
これらの検定法を用いて発見される分子は、疾患を処置するために、またはＫＧ
Ｆ−２／分子を活性化または阻害することによって患者に特定の結果（たとえば
血管の増殖）をもたらすために使用できる。さらにその上、この検定法は、適切
に処理された細胞または組織でのＫＧＦ−２産生を阻害または強化しうる薬剤を
発見できる。
【０４１５】 それ故、本発明にはＫＧＦ−２に結合する化合物を確認する方法が含まれる。
この方法は次の段階を含む：（ａ）結合化合物候補をＫＧＦ−２とともにインキ
ュベーションする段階；および（ｂ）結合が起きたかどうかを決定する段階。さ
らにその上、本発明は、作動剤／拮抗剤を確認する方法を含む。この方法は次の
段階を含む：（ａ）候補化合物をＫＧＦ−２とともにインキュベーションする段
階；（ｂ）生物学的活性を検定する段階；および（ｃ）ＫＧＦ−２の生物学的活
性が変化したかどうかを決定する段階。
【０４１６】 また、図４および表１に開示するベータプリーツシート領域を使用することに
よって、ＫＧＦ−２を結合する分子を、実験的に確認できよう。従って、本発明
の特異的な態様は、図４／表１に開示する各ベータプリーツシート領域のアミノ
酸配列を含むか、あるいは該アミノ酸配列から構成されるポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを指向する。本発明の別の態様は、図４／表１に開示する
ベータプリーツシート領域全体またはそのいずれかの組合せを、含むか、あるい
はそれから構成されるＫＧＦ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
指向する。本発明の別の態様は、図４／表１に開示する各ベータプリーツシート
領域のＫＧＦ−２アミノ酸配列を含むか、あるいは該アミノ酸配列から構成され
るポリペプチドを指向する。本発明の別の態様は、図４／表１に開示するベータ
プリーツシート領域全体またはいずれかの組合せを含むか、あるいはそれから構
成されるＫＧＦ−２ポリペプチドを指向する。
【０４１７】 アンチセンス体およびリボチーム（拮抗剤） 特異的態様では、本発明の拮抗剤は、配列番号１に含まれる配列またはその相
補鎖に対応する核酸、および／または寄託されたクローン75977に含まれるヌク
レオチド配列に対応する核酸配列である。一態様ではアンチセンス配列は生物体
によって内部的に作製され、別の態様では、アンチセンス配列を個別に投与する
（例えば、O'Connor, J., Neurochem., 56: 560 (1991); Oligonucleotides as
Antisense Inhibitor of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)
を参照）。アンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡによって、
または三重ラセンの形成によって遺伝子発現を制御するために使用できる。アン
チセンス技術は例えば、Okano, J., Neurochem., 56: 560 (1991); Oligonucleo
tides as Antisense Inhibitor of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton,
FL (1988)で検討されている。三重ラセン形成は、例えばLee et al., Nucleic A
cids Research, 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 241: 456 (1988);
およびDervan et al., Science, 251: 1300 (1991) に検討されている。この方
法は相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。
【０４１８】 例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’−コ
ード部分は、長さ約１０から約４０塩基対までのアンチセンスＲＮＡオリゴヌク
レオチドを設計するために使用しうる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関
与する遺伝子の領域に対して相補的になるように設計され、受容体の転写および
産生を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、生体内でｍＲＮＡ
とハイブリッドを形成し、ｍＲＮＡ分子から受容体ポリペプチドへの翻訳を遮断
する。
【０４１９】 一態様では、本発明のＫＧＦ−２アンチセンス核酸は、外因性配列から転写に
よって細胞内で産生される。例えばベクターまたはその一部は、転写されて、本
発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベクターは、ＫＧＦ
−２アンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターは、エピソ
ームに残留するか、または染色体に取り込まれ、転写されて所望のアンチセンス
ＲＮＡを産生する。そのようなベクターは、当技術分野で標準的な組換えＤＮＡ
技術によって構築できる。このベクターは、プラスミド、ウイルスまたはその他
当技術分野で知られているものであることができ、脊椎動物細胞内で複製され、
発現するために使用される。ＫＧＦ−２またはその断片をコードする配列の発現
は、脊椎動物、好ましくはヒト、の細胞内で活動している、当技術分野で知られ
ているいかなるプロモーターによって行うこともできる。そのようなプロモータ
ーは誘導性であることも、構成的であることもできる。このようなプロモーター
には、これに限定するものではないが、ＳＶ４０早期プロモーター領域（Bernoi
st & Chambon, Nature, 29: 304-310 (1981)）、ラウス肉腫の３’−長い末端反
復内に含まれるプロモーター（Yamamoto et al., Cell, 22: 787-797 (1980)）
、ヘルペスチミジンプロモーター（Wagner etal., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S
.A., 78: 1441-1445 (1981)）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Brinster
et al, Nature, 296: 39-42(1982)）などが含まれる。
【０４２０】 本発明のアンチセンス核酸は、ＫＧＦ−２遺伝子のＲＮＡ転写体の少なくとも
一部と相補的な配列を含む。しかしながら、絶対的な相補性は好適ではあるが、
必須ではない。本明細書に記載する「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列
は、そのＲＮＡと二重鎖を形成し、ハイブリッドを形成することができるために
充分な相補性を有する配列を意味する；そこで二重鎖ＫＧＦ−２アンチセンス核
酸の場合には、その二重鎖ＤＮＡの一重鎖を試験するか、または三重鎖の形成を
検定する。ハイブリッドを形成する性能は、そのアンチセンス核酸が持つ相補性
の強度と長さとに依存する。一般に、ハイブリッドを形成する核酸が長いほど、
それに含まれるＫＧＦ−２ＲＮＡとの塩基ミスマッチが多くなるが、なお安定な
二重鎖（または場合によっては三重鎖）を形成する。当技術分野の熟練者は、形
成されたハイブリッド複合体の融点を決定するために標準的な操作法を使用して
容認できるミスマッチの程度を確認することができる。
【０４２１】 メッセージの５’末端に相補的なオリゴヌクレオチド、たとえばＡＵＧ開始コ
ドンを含み、そこまでの５’−非翻訳配列は、翻訳の阻害に最も効果的に作用す
るに違いない。しかしながら、ｍＲＮＡの３’−非翻訳配列に相補的な配列も、
ｍＲＮＡの翻訳を効果的に阻害することが証明されている。一般的には、Wagner
, R., 1994, Nature, 372: 333-335 を参照。そこで、図１Ａ−Ｂに示すＫＧＦ
−２の５’−または３’−のいずれかの非翻訳領域、非コード領域に相補的なオ
リゴヌクレオチドも、内因性ＫＧＦ−２ｍＲＮＡの翻訳を阻害するためのアンチ
センス手法に使用できると思われる。このｍＲＮＡの５’−非翻訳領域に相補的
なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補性鎖を含むべきである。ｍＲ
ＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳の阻害剤と
しては効率が低いが、本発明に従って使用できると思われる。ＫＧＦ−２ｍＲＮ
Ａの５’−領域、３’−領域またはコード領域のいずれにハイブリッドを形成す
るように設計されるにしても、このアンチセンス核酸は少なくとも長さ６ヌクレ
オチドとすべきであり、好ましくは長さ６から約５０ヌクレオチドの範囲内のオ
リゴヌクレオチドである。特異的な側面では、このオリゴヌクレオチドは、少な
くとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレ
オチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０４２２】 本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物または
その誘導体または修飾型であって、一重鎖または二重鎖であることができる。こ
のオリゴヌクレオチドは、例えば分子の安定性、ハイブリッド形成、その他を改
善するために、塩基部位、糖部位、または燐酸骨格において修飾されることがで
きる。このオリゴヌクレオチドは、他の付加的な基、たとえばペプチド（たとえ
ば生体内で宿主細胞に指向させるための）または細胞膜を通過する輸送を促進す
る基（たとえばLetsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:
6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84: 64
8-652; 1988年12月15日公表のPCT 国際公表WO88/09810を参照）または脳血管バ
リアを通過する輸送を促進する基（たとえば1988 年4月25日公表のPCT 国際公表
WO89/10134を参照）またはハイブリッド形成を触発する基（たとえばKrol et a
l., 1988, BioTechniques 6: 958-976を参照）または挿入する基（たとえばZon,
1988, Pharm. Res., 5: 539-549を参照）を含んでいてもよい。ここに、該オリ
ゴヌクレオチドは他の分子、たとえばペプチド、ハイブリッド形成交差結合剤、
輸送剤、ハイブリッド形成切断剤、などと結合していてもよい。
【０４２３】 このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、これに限定するものではないが、5-
フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、
ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシ
ルメチル）ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カ
ルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-Ｄ-ガラクトシル
ケノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチ
ルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-
メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチ
ルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-Ｄ-マ
ンノシルケノシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシ
ル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワ
イブトキソシン、シュードウラシル、ケノシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-
チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル
-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウ
ラシル、3-（3-アミノ-3-Ｎ-2-カルボキシプロピル）ウラシル、(acp3)wおよび2
,6-ジアミノプリンを含む群から選択された修正塩基部分少なくとも１種を含む
ことができる。
【０４２４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、これに限定するものではないが、ア
ラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含む
群から選択された修正糖部分少なくとも１種を含むことができる。
【０４２５】 さらに別の態様では、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、これに限定す
るものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミ
ドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネー
ト、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタールまたはこれらの類似体
を含む群から選択された修正燐酸骨格部分少なくとも１種を含むことができる。
【０４２６】 さらに別の態様では、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ-アノマー
性のオリゴヌクレオチドである。ａ-アノマー性のオリゴヌクレオチドは、相補
的ＲＮＡと特異的な二重鎖ハイトリッドを形成する。ここでは通常のｂ-ユニッ
トとは反対に、両鎖が互いに並行して伸びている（Gautier et al., 1987, Nucl
. Acids Res., 15: 6625-6641）。このオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルリボ
ヌクレオチド（Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res., 15: 6131-6184）また
はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoue et al., 1987, FEBS Lett., 215: 327-3
30）である。
【０４２７】 本発明のポリヌクレオチドは、当技術分野で知られている標準的方法によって
、たとえば自動化ＤＮＡ合成器（たとえば Biosearch社、Applied Biosystems社
などから購入できるようなもの）を使用して合成してもよい。例として、ホスホ
ロチオエートのオリゴヌクレオチドはSteinらの方法（1988, Nucl. Acids Res.
16: 3209）で合成してもよく；メチルホスホネートのオリゴヌクレオチドは制御
されたポアガラスポリマー支持体を用いて製造できる（Sarin et al., 1988, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 7448-7451）；など。
【０４２８】 ＫＧＦ−２コード領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドを使用できる一方
で、転写された非翻訳領域に相補的なものは最も好適である。
【０４２９】 本発明の拮抗剤候補には、触媒的ＲＮＡまたはリボチーム（たとえば、PCT国
際公表 WO 90/11364, 1990年10月4日公表; Sarver et al., Science, 247: 1222
- 1225 (1990)を参照）も含まれる。部位特異的な認識配列でｍＲＮＡを切断す
るリボチームは、ＫＧＦ−２ｍＲＮＡを破壊するために使用できるが、ハンマー
ヘッドリボチームの使用は好適である。ハンマーヘッドリボチームは、標的ｍＲ
ＮＡと相補的な塩基対を形成するフランキング領域が記録している部位でｍＲＮ
Ａを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが塩基２個からなる配列：5'-ＵＧ-
3'を持つことである。ハンマーヘッドリボチームの構築および生産は、当技術分
野でよく知られており、Haseloff & Gerlach, Nature, 334: 585-591 (1988) に
はさらに完全に記載されている。ＫＧＦ−２のヌクレオチド配列（図１Ａ−Ｂ）
内にはハンマーヘッドリボチームが切断する可能性がある部位が多数存在する。
好ましくは、該リボチームは、切断認識部位がＫＧＦ−２ｍＲＮＡの５’末端近
くに位置するように、すなわち効率を増大させ、非機能的ｍＲＮＡ転写体の細胞
内蓄積を減少させるように加工される。
【０４３０】 アンチセンス手法においてと同様、本発明のリボチームは、修正オリゴヌクレ
オチド（たとえば安定性、標的指向性などを改善するための）を含むことができ
、また、生体内でＫＧＦ−２を発現する細胞に送達されるべきものである。リボ
チームをコードするＤＮＡ構築物は、アンチセンスコードするＤＮＡについて前
記した様式と同じ様式で細胞内に導入してもよい。送達の好適な方法には、リボ
チームを「コードする」ＤＮＡ構築物が遺伝子移入された細胞が、内因性ＫＧＦ
−２のメッセージを破壊し、翻訳を阻害するために充分な量のリボチームを産生
するようになる、例えばｐｏｌIIIまたはｐｏｌIIプロモーターのような強力な
構成的プロモーターの制御下に使用することを含む。アンチセンス分子とは異な
って、リボチームは触媒的であって、効果発揮に必要な細胞内濃度はさらに低い
。
【０４３１】 新生物細胞および組織において本発明ポリペプチドが細胞を成長させ、増殖さ
せる効果を阻害、すなわち腫瘍血管形成刺激、それ故、例えば腫瘍の形成または
増殖における非正常細胞の成長および増殖、を遅延または防止するために、拮抗
剤／アゴニスト化合物を採用してもよい。
【０４３２】 また、血管過多疾患を防止するために、および水晶体外白内障手術後の上皮レ
ンズ細胞の増殖を防止するために拮抗剤／アゴニストを採用してもよい。本発明
ポリペプチドの分裂促進活性の防止はまた、たとえばバルーン血管形成術のよう
な症例に望まれるであろう。
【０４３３】 拮抗剤／アゴニストは、創傷治癒中の傷痕組織の成長を防止するためにも採用
しうる。
【０４３４】 拮抗剤／アゴニストは、本明細書に記載する疾患を処置するためにも採用しう
る。
【０４３５】 その他の活性 本発明のポリペプチドは、血管内皮細胞増殖を刺激する性能の結果として、た
とえば血栓症、動脈硬化症およびその他の循環器疾患のように様々な病状に起因
する虚血性組織の血管再形成刺激のために採用しうる。これらのポリペプチドは
また前記のように血管形成刺激および四肢再生のために採用しうる。
【０４３６】 このポリペプチドはまた、たとえば繊維芽細胞および骨格筋細胞のように異な
る起源の様々な細胞に対して分裂促進性であって、それ故、損傷したまたは罹患
した組織の修復または置換を促進するので、外傷、火傷、外科手術後の組織修復
および潰瘍による創傷処置のために採用しうる。
【０４３７】 本発明のポリペプチドはまた、ニューロンの成長を刺激し、たとえばアルツハ
イマー疾患、パーキンソン病およびＡＩＤＳ関連合併症のような、ある種のニュ
ーロン性疾患または神経変性病状に伴うニューロンの損傷を処置、予防するため
に採用しうる。ＫＧＦ−２は、軟骨の成長を促進する性能を有する。それ故、骨
および歯周の再生を強化するため、および組織移植または骨移植を援助するため
に採用できる。
【０４３８】 本発明のポリペプチドはまた、ケラチン生成細胞の成長を刺激することにより
日焼けによる皮膚老化を予防するために採用しうる。
【０４３９】 ＫＧＦ−２ポリペプチドはまた、ＦＧＦファミリーは毛髪形成細胞を活性化し
、メラニン細胞の増殖を促進するので、毛髪減少を予防するために、採用しうる
。同じ手法で、本発明のポリペプチドは、他のサイトカインと組合せて使用して
、造血細胞および骨髄細胞の増殖および分化を促進するために、採用しうる。
【０４４０】 ＫＧＦ−２ポリペプチドはまた、移植前の器官を維持するために、または初代
組織の細胞培養を維持するために採用しうる。
【０４４１】 本発明のポリペプチドはまた、早期胚中で分化する中胚葉起源の組織を誘導す
るために採用しうる。
【０４４２】 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはＫＧＦ−２のアゴニ
ストまたは拮抗剤は、また、胚幹細胞に加えて前記のように造血細胞族の分化ま
たは増殖を増加または減少しうる。
【０４４３】 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはＫＧＦ−２のアゴニ
ストまたは拮抗剤は、また、たとえば身長、体重、毛色、眼色、皮膚、脂肪組織
の割合、色素含有、サイズおよび形（たとえば整形外科手術）のような哺乳類の
特性を変調するために使用しうる。同様に、ＫＧＦ−２ポリヌクレオチドまたは
ポリペプチド、またはＫＧＦ−２のアゴニストまたは拮抗剤は、また、異化、同
化、エネルギーの処理、利用および貯蔵に影響を与える哺乳類の代謝を変調する
ために使用しうる。
【０４４４】 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはＫＧＦ−２のアゴニ
ストまたは拮抗剤は、また、バイオリズム、心拍リズム、抑欝（欝病を含む）、
暴力的傾向、疼痛に対する忍耐、生殖能力（好ましくはアクチビンまたはインヒ
ビン様活性による）、ホルモンまたは内分泌レベル、食欲、リビドー、記憶、ス
トレス、またはその他の認知的資質に影響を与えることによって、哺乳類の精神
状態または身体的状態を変化させるために使用しうる。
【０４４５】 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはＫＧＦ−２のアゴニ
ストまたは拮抗剤は、また、たとえば貯蔵性能、脂肪含有量、脂質、蛋白質、炭
水化物、ビタミン、ミネラル、コファクターまたはその他の栄養成分を向上また
は低下させるために、食餌の添加物または保存剤としても使用しうる。
【０４４６】 前記適用は広範囲の宿主における利用を有する。この宿主には、これに限定す
るものではないが、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、テンジクネズミ、ラクダ、ウ
マ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミニブタ、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ヒ
ツジ、イヌ、ネコ、ヒト以外の霊長類およびヒトが含まれる。特異的な態様では
、この宿主はマウス、ウサギ、ヤギ、テンジクネズミ、ニワトリ、ラット、ハム
スター、ブタ、ヒツジ、イヌまたはネコである。好適な態様では、この宿主は哺
乳類である。最も好適な態様では、この宿主はヒトである。
【０４４７】診断および映像 標識された抗体およびその誘導体および同族体であって、対象とするポリペプ
チドに特異的に結合するものは、本発明ポリペプチドの異常な発現および／また
は活性に伴う疾患、障害および／または病状を検出、診断または観察するために
診断の目的に使用できる。本発明は対象とするポリペプチドの異常発現の検出法
を提供する。この検出法には、次の操作を含む：（ａ）対象とするポリペプチド
に特異的な抗体１種またはそれ以上を使用して、個体の細胞内または体液内にあ
る対象とするポリペプチドの発現を検定すること；および（ｂ）遺伝子発現のレ
ベルを標準的遺伝子発現レベルと比較し、それによって標準的発現レベルに比較
して測定されたポリペプチド遺伝子発現レベルの増大または減少により異常発現
を表示すること。
【０４４８】 本発明は疾病を診断するための診断用検定法を提供する。この検出法は次を含
む：（ａ）対象とするポリペプチドに特異的な抗体１種またはそれ以上を使用し
て、個体の細胞内または体液内にある対象とするポリペプチドの発現を検定する
こと；および（ｂ）遺伝子発現のレベルを標準遺伝子発現レベルと比較し、それ
によって標準的発現レベルに比較して測定されたポリペプチド遺伝子発現レベル
の増大または減少により特定の疾病を表示すること。癌については、個体から得
た生検組織中における比較的大量の転写物の存在は、疾病の発生のための素因を
示すか、または実際の臨床的徴候が出現する前に疾病を検出する方法を提供する
。この型のさらに決定的な診断は、医療関係者が早期に予防的手段または積極的
処置を採用することを可能にして、癌の発症またはさらなる進行を予防すること
を可能にする。
【０４４９】 本発明の抗体は、当技術分野の熟練者に知られている古典的な免疫組織学的方
法を用いて、生物学的試料中の蛋白質レベルを検定するために使用できる（たと
えばJalkanen et al., J. Cell. Biol., 101: 976-985 (1985); Jalkanen et al
., J. Cell. Biol., 105: 3087-3096 (1987) を参照）。蛋白質遺伝子の発現を
検出するために有用な、抗体に基づく別の方法は、たとえば酵素免疫吸着測定法
（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫検定法（ＲＩＡ）のような免疫検定法を含む。適
当な抗体検定標識は、当技術分野で知られており、たとえばグルコースオキシダ
ーゼのような酵素標識；たとえばヨード（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄
（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）、およびテクネチウム（ 99 Ｔｃ）のような放射性同位元素；たとえばルミノールのような発光標識；およ
びたとえばフルオレッセインおよびロダミンのような螢光標識；およびビオチン
；を含む。
【０４５０】 本発明の一側面は、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトにおける、
対象とするポリペプチドの異常発現に伴う疾患または障害の検出および診断であ
る。態様の一つでは、診断は次の処置を含む：ａ）対象とするポリペプチドに特
異的に結合する、標識された分子の有効量を被検者に投与（例えば非経口、皮下
または腹腔内）すること；ｂ）標識分子を被検者内のポリペプチドが発現される
部位に優先的に濃縮させる（および非結合標識化合物を背景レベルから消失させ
る）ために投与後、一定時間間隔を待機すること；ｃ）背景レベルを測定するこ
と；およびｄ）被検者内の標識分子を検出すること。標識分子が背景レベル以上
検出されると、被検者は、対象ポリペプチドの異常発現に伴う特定の疾患または
障害を有することを示す。背景レベルは、検出された標識分子の量を予め特定の
系で決定しておいた標準値と比較することを含む、様々な方法で測定できる。
【０４５１】 被検者のサイズと使用する撮像系が、診断用の画像を作製するために必要な映
像基の量を決定することが、当技術分野では理解されている。放射性同位元素基
の場合には、ヒト被検者では、注射すべき放射能の量は約５から２０ミリキュー
リーのテクネチウム99ｍＴｃである。標識された抗体または抗体断片は、すると
特異的な蛋白質を含む細胞の位置に優先的に蓄積する。生体内腫瘍撮像は S.W.
Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and
Their Fragments" (Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detecti
on of Cancer, S.W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing In
c. (1982) に著述されている。
【０４５２】 使用する標識の型および投与法を含む数種の変数に依存して、標識分子を優先
的に被検者内の部分に優先的に濃縮させ、かつ非結合標識分子を背景レベルから
消失させるために要する、投与後時間は６から４８時間または６から２４時間ま
たは６から１２時間である。別の態様では、この時間間隔は投与後５から２０日
間または５から１０日間である。
【０４５３】 一態様では、疾患または障害の観察は、疾患または障害を診断するこの方法を
例えば最初の診断から１ケ月後、最初の診断から６ケ月後、最初の診断から１年
後などに、反復することによって行われる。
【０４５４】 標識分子の存在は、当技術分野で知られている生体内走査法の方法を使用すれ
ば患者内で検出できる。この方法は使用する標識の型に依存する。熟練した専門
家には、この特定の標識を検出するために適当な方法を決定できる。本発明の診
断法で使用しうる方法および装置には、これに限定するものではないが、コンピ
ューター連動断層撮影（ＣＴ）、たとえば陽電子射出断層撮影法（ＰＥＴ）、磁
気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および音波検査法のような全身走査法が含まれる。
【０４５５】 特異的な一態様では、分子を放射性同位元素で標識し、照射応答性外科的装置
を使用して患者体内で検出する（Thurston et al., 米国特許5,441,050号）。別
の態様では、分子を螢光性化合物で標識し、螢光応答性走査装置を使用して患者
体内で検出する。別の態様では、分子を陽電子射出性金属で標識し、陽電子射出
断層撮影法を使用して患者体内で検出する。なお、さらに別の態様では、分子を
反磁性標識で標識し、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて患者体内で検出する。
【０４５６】キット 本発明は、前記方法に使用されるキットを提供する。一態様では、そのキット
は、本発明の抗体、好ましくは精製された抗体、を１個またはそれ以上の容器内
に含む。特定的な態様では、本発明のキットには、キットに含まれる抗体と特異
的に免疫反応をするエピトープを含有する、ポリペプチドであって、実質的に単
離されたものが含まれる。好ましくは、本発明のキットにはさらに、対象とする
ポリペプチドとは反応しない、対照抗体が含まれる。別の特異的な態様では、本
発明のキットは、対象とするポリペプチドに対する抗体の結合を検出する手段を
含む（たとえばこの抗体は螢光性化合物、酵素基質、放射性化合物または発光性
化合物のような検出可能な基質と複合体を形成していてもよく；または一次抗体
を認識する二次抗体を検出可能な基質と複合体を形成させてもよい）。
【０４５７】 本発明の別な特異的態様では、このキットは、増殖性および／または腫瘍性の
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清を検索す
るために使用する診断用キットである。このようなキットは、対象とするポリペ
プチドと反応しない対照抗体を含みうる。このようなキットには、抗−ポリペプ
ド抗原抗体の少なくとも１種と特異的に免疫反応性であるエピトープを有する、
実質的に単離された、ポリペプチド抗原を含みうる。さらに、このようなキット
には、抗原への該抗体（たとえばこの抗体は、フローサイトメトリーによって検
出できる、たとえばフルオレッセインまたはロダミンのような螢光性化合物と複
合体を形成させてもよい）の結合を検出する手段を含む。特異的な態様では、こ
のキットには、組換え生産または化学合成で製造した抗原を含みうる。このキッ
トのポリペプチド抗原は、固体支持体に付着させておいてもよい。
【０４５８】 さらに特異的な態様では、前記キットの検出法には、該ポリペプチド抗原を付
着させた固体支持体を含む。このキットにはまた、非付着レポーター標識の抗−
ヒト抗体を含みうる。この態様では、抗体のポリペプチド抗原への結合は、該レ
ポーター標識抗体の結合によって検出できる。
【０４５９】 別の態様では、本発明には、本発明のポリペプチドに対する抗原を含む血清を
スクリーニングするために使用される診断用キットを含む。この診断用キットに
は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に反応する、実質的に単
離された抗体、およびポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原と抗体との結合
を検出するための手段が含まれる。一態様では、この抗体は固体支持体に付着し
ている。特異的な態様では、この抗体はモノクローナル抗体である。キットのこ
の検出手段には、標識モノクローナル二次抗体を含みうる。あるいは、またはこ
れに加えて、検出手段には標識された競合的抗原を含みうる。
【０４６０】 一態様では、本発明の方法によって得られる表面結合抗原を有する固相試薬と
被験血清とを反応させる。特異的抗原抗体と試薬とを結合し、非結合血清成分を
洗浄によって除去した後に、試薬をレポーター標識した抗ヒト抗体と反応させて
、固体支持体上の抗−抗原抗体の量に比例して、レポーターを試薬に結合させる
。試薬を再び洗浄して非結合標識抗体を除去し、試薬と反応したレポーターの量
を決定する。典型的には、このレポーターは酵素であり、これは、適当な螢光性
、化学発光性または呈色性基質（Sigma, St. Louis, MO）の存在下、固相ととも
にインキュベーションすることによって検出される。
【０４６１】 前記検定法の固相試薬は、たとえばポリマービーズ、ディップスティック、９
６ウェルプレートまたはフィルター材料のような、蛋白質物質を固体支持体材料
に付着させる既知の技術によって調製できる。これらの付着法には、一般に支持
体への蛋白質の非特異的吸着；または、たとえば活性化カルボキシル、ヒドロキ
シルまたはアルデヒド基のような、固体支持体上の化学反応性基への蛋白質の、
典型的には遊離アミノ基を介する、共有結合的付着が含まれる。あるいは、スト
レプトアビジン被覆プレートは、ビオチン化抗原とともに使用できる。
【０４６２】 そこで、本発明は、この診断法を実施するための検定系またはキットを提供す
る。このキットには、一般に表面結合した組換え抗原を有する支持体、および表
面結合した抗−抗原抗体を検出するためのレポーター標識した抗−ヒト抗体が含
まれる。
【０４６３】 以上に本発明を一般的に記載し終わったので、本発明がさらに容易に理解され
るように、以下に実施例を参考のために記載する。各実施例は例示のために提供
するものであって、限定を意図されたものではない。
【０４６４】
【実施例】
実施例１ ＫＧＦ−２の細菌発現および精製 まず、プロセシングされたＫＧＦ−２ cＤＮＡ(シグナルペプチド配列を含む)
の５'末端配列と３'末端配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを
使って、ＫＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列ＡＴＣＣ＃７５９７７を増幅する。
この５'オリゴヌクレオチドプライマーは、
【化１４】 という配列を持ち、ＡflIII制限酵素部位を含み、その後ろに推定開始コドンか
ら始まるＫＧＦ−２コード配列の３０ヌクレオチドが続いている。３'配列
【化１５】 は、ＨindIII部位に相補的な配列を含み、ＫＧＦ−２の２６ヌクレオチドが続い
ている。これらの制限酵素部位は、細菌発現ベクターpＱＥ−６０(Ｑiagen, Ｉn
c. ，Ｃhatsworth，ＣＡ)上の制限酵素部位と適合する。pＱＥ−６０は、抗生物
質耐性(Ａmpｒ)、細菌複製起点(ori)、ＩＰＴＧ制御性プロモーター・オペレー
ター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈis標識および制限酵素部位
をコードする。次いで、pＱＥ−６０をＮcoＩとＨindIIIで消化する。増幅した
配列をpＱＥ−６０に連結し、読み枠をあわせて挿入する。次いで、Ｓambrook,
J. ら，Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍannual，Ｃold Ｓpring Ｌabo
ratory Ｐress（１９８９）に記載の手法により、その連結混合物を使って大腸
菌Ｍ１５／rep４株(Ｑiagen, Ｉnc. )を形質転換する。Ｍ１５／rep４は、lacＩ
リプレッサーを発現し、カナマイシン耐性(Ｋanｒ)をも付与するプラスミドpＲ
ＥＰ４のコピーを複数含有している。ＬＢ平板での生育能によって形質転換体を
同定し、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮ
Ａを単離し、制限分析によって確認する。所望の構築物を含有するクローンを、
Ａmp(１００μg／ml)とＫan(２５μg／ml)の両方を添加したＬＢ培地での液体培
養により終夜(Ｏ／Ｎ)生育する。このＯ／Ｎ培養を１：１００〜１：２５０の比
率で大量培養の接種に使用する。光学密度６００(Ｏ.Ｄ.６００)が０.４〜０.６
に達するまで細胞を生育する。次いで、ＩＰＴＧ(イソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド)を最終濃度が１mＭとなるように添加する。ＩＰＴＧは、la
cＩリプレッサーを不活化してオペレーターから解離させ、プロモーターを転写
に向かわせる。細胞をさらに３〜４時間生育する。次いで、細胞を遠心分離によ
って収集する。その細胞ペレットをカオトロピック剤６Ｍ塩酸グアニジン中で可
溶化する。清浄化の後、タンパク質が強固に結合しうる条件下にヘパリンアフィ
ニティーカラムでクロマトグラフィーを行なうことにより、可溶化したＫＧＦ−
２をこの溶液から精製する(Ｈochuli, Ｅ. ら，Ｊ. Ｃhromatography ４１１：
１７７−１８４（１９８４）)。ＫＧＦ−２(純度７５％)は、高塩濃度緩衝液に
よりこのカラムから溶出させる。
【０４６５】 実施例２ 先端切断型ＫＧＦ−２の細菌発現と精製 まず、先端切断型ＫＧＦ−２ポリペプチドの５'配列と３'配列に対応するＰＣ
Ｒオリゴヌクレオチドプライマーを使って、ＫＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列
ＡＴＣＣ＃７５９７７を増幅する。この先端切断型は、３６アミノ酸のシグナル
配列を欠くポリペプチドからなり、メチオニンおよびアラニン残基が全長のタン
パク質のアミノ酸３７を構成するシステイン残基の直前に付加されている。５'
オリゴヌクレオチドプライマーは、
【化１６】 という配列を持ち、ＮcoＩ制限酵素部位を含み、その後ろにＫＧＦ−２コード配
列の２４ヌクレオチドが続いている。３'配列
【化１７】 は、ＨindIII部位に相補的な配列を含有し、ＫＧＦ−２遺伝子の２６ヌクレオチ
ドが続いている。これらの制限酵素部位は、細菌発現ベクターpＱＥ−６０(Ｑia
gen, Ｉnc. ，Ｃhatsworth，ＣＡ)上の制限酵素部位と適合する。pＱＥ−６０は
、抗生物質耐性(Ａmpｒ)、細菌複製起点(ori)、ＩＰＴＧ制御性プロモーター・
オペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、６−Ｈis標識および制限
酵素部位をコードする。次いで、pＱＥ−６０をＮcoＩとＨindIIIで消化する。
増幅した配列をpＱＥ−６０に連結し、読み枠をあわせて挿入する。次いで、Ｓa
mbrook, J. ら，Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍannual，Ｃold Ｓpri
ng Ｌaboratory Ｐress（１９８９）に記載の手法により、その連結混合物を使
って大腸菌Ｍ１５／rep４株(Ｑiagen, Ｉnc. )を形質転換する。Ｍ１５／rep４
は、lacＩリプレッサーを発現しカナマイシン耐性(Ｋanｒ)をも付与するプラス
ミドpＲＥＰ４のコピーを複数含有している。ＬＢ平板での生育能によって形質
転換体を同定し、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラス
ミドＤＮＡを単離し、制限分析によって確認する。所望の構築物を含有するクロ
ーンを、Ａmp(１００μg／ml)とＫan(２５μg／ml)の両方を添加したＬＢ培地で
の液体培養により終夜(Ｏ／Ｎ)生育する。このＯ／Ｎ培養を１：１００〜１：２
５０の比率で大量培養の接種に使用する。光学密度６００(Ｏ.Ｄ.６００)が０．
４〜０．６に達するまで細胞を生育する。次いで、ＩＰＴＧ(イソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトピラノシド)を最終濃度が１mＭとなるように添加する。ＩＰ
ＴＧによる誘導は、lacＩリプレッサーを不活化してＰ／Ｏを解放し、それが遺
伝子発現量の増大につながることによる。細胞をさらに３〜４時間生育する。次
いで、細胞を遠心分離によって収集する。その細胞ペレットをカオトロピック剤
６Ｍ塩酸グアニジン中で可溶化する。清浄化の後、タンパク質が強固に結合しう
る条件下にヘパリンアフィニティーカラムでクロマトグラフィーを行なうことに
より、可溶化したＫＧＦ−２をこの溶液から精製する(Ｈochuli, Ｅ. ら，Ｊ.
Ｃhromatography ４１１：１７７−１８４（１９８４）)。ＫＧＦ−２タンパク
質は、高塩濃度緩衝液によりこのカラムから溶出させる。
【０４６６】 実施例３ バキュロウイルス発現系を使用するＫＧＦ−２のクローニングおよび発現 全長のＫＧＦ−２タンパク質をコードするＤＮＡ配列ＡＴＣＣ＃７５９７７を
、その遺伝子の５'配列と３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて増幅する。 ５'プライマーは、
【化１８】 という配列を持ち、ＢamＨＩ制限酵素部位(太字部分)を含有し、その後ろに、真
核細胞における翻訳開始用の効率のよいシグナルに似た６ヌクレオチド(Ｋozak
，Ｍ. ，Ｊ. Ｍol. Ｂiol. ，１９６：９４７−９５０（１９８７）)が続き、そ
のすぐ後ろにＫＧＦ−２遺伝子の最初の17ヌクレオチドが続いている(翻訳開始
コドンＡＴＧに下線を引いてある)。 ３'プライマーは、
【化１９】 という配列を持ち、制限エンドヌクレアーゼＡsp７１８の切断部位と、ＫＧＦ−
２遺伝子の３'非翻訳配列に相補的な１９ヌクレオチドとを含有する。増幅した
配列を、Ｑiagen, Ｉnc. ，Ｃhatsworth，ＣＡから市販されているキットを使っ
て１％ アガロースゲルから単離する。次いで、その断片をエンドヌクレアーゼ
ＢamＨＩとＡsp７１８で消化した後、１％ アガロースゲルで再び精製する。こ
の断片をＦ２と命名する。
【０４６７】 バキュロウイルス発現系(概要については、ＳumＭers，Ｍ. Ｄ. およびＳmith
，Ｇ. Ｅ. ，Ａ manual of methods for baculovirus vectors and insect cell
culture procedures，Ｔexas Ａgricultural Ｅxperimental Ｓtation Ｂullet
in Ｎo. １５５５（１９８７）を参照)を用いたＫＧＦ−２タンパク質の発現に
は、ベクターpＡ２(pＶＬ９４１ベクターを改良したもの；後述)を使用する。こ
の発現ベクターは、オートグラファ(Ａutographa californica)核多角体病ウイ
ルス(ＡcＭＮＰＶ)の強力なポリヘドリンプロモーターと、それに続く制限エン
ドヌクレアーゼＢamＨＩおよびＡsp７１８の認識部位とを含有する。効率のよい
ポリアデニル化のため、シミアンウイルス(ＳＶ)４０のポリアデニル化部位が使
用される。組換えウイルスを簡単に選択するため、大腸菌由来のβ-ガラクトシ
ダーゼ遺伝子が、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルの前に、ポリヘ
ドリンプロモーターと同じ方向に挿入される。ポリヘドリン配列の両端には、同
時にトランスフェクトされる野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同組換え用に
、ウイルス配列が隣接する。pＡc３７３、pＶＬ９４１、pＡcＩＭ１(Ｌuckow，
Ｖ. Ａ. およびＳumＭers，Ｍ. Ｄ. ，Ｖirology １７０：３１−３９)などとい
った他の多くのバキュロウイルスベクターも使用できる。
【０４６８】 そのプラスミドを制限酵素ＢamＨＩおよびＡsp７１８で消化する。次いで、市
販のキット(Ｑiagen, Ｉnc. ，Ｃhatsworth，ＣＡ)を使って、そのＤＮＡを１％
アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡをＶ２と命名する。 断片Ｆ２とプラスミドＶ２をＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、大腸
菌ＨＢ１０１細胞を形質転換し、そのプラスミド(pＢacＫＧＦ−２)を含有する
細菌を、両クローニングオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより同定する。ク
ローニングした断片の配列をＤＮＡ配列決定によって確認する。 リポフェクション法(Ｆelgnerら，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８４
：７４１３−７４１７（１９８７）)を用いて、５μgのプラスミドpＢacＫＧＦ
−２を、市販の直鎖状バキュロウイルス("ＢaculoＧoldＴＭバキュロウイルスＤ
ＮＡ"；Ｐharmingen，Ｓan Ｄiego，ＣＡ)１.０μgと同時にトランスフェクトす
る。 １μgのＢaculoＧoldＴＭウイルスＤＮＡと５μgのプラスミドpＢacＫＧＦ−
２を、無血清グレース培地(Ｌife Ｔechnologies, Ｉnc. ，Ｇaithersburg，Ｍ
Ｄ）５０μlを含む微量滴定プレートの滅菌ウェル中で混合する。次いで、リポ
フェクチン１０μlとグレース培地９０μlを加え、混合し、室温で１５分間イン
キュベートする。次いで、血清を含まないグレース培地１mlの入った３５mＭ組
織培養プレートに接種したＳf９昆虫細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)に、上記
トランスフェクション混合物を滴下する。プレートを前後にゆすって、新たに加
えた溶液を混合する。次いで、そのプレートを２７℃で５時間インキュベートす
る。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから取り除き、１０％ ウ
シ胎児血清を添加したグレース昆虫培地１mlを加える。そのプレートを培養器に
戻し、培養を２７℃で４日間続ける。
【０４６９】 ４日後に上清を集め、ＳumＭersおよびＳmith(上記)の記述と同様にしてプラ
ークアッセイを行なう。変更点として"Ｂlue Ｇal"(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.
，Ｇaithersburg)を含むアガロースゲルを使用する。これにより青く染まったプ
ラークの容易な単離が可能になる。(「プラークアッセイ」に関する詳細な説明
は、Ｌife Ｔechnologies Ｉnc. ，Ｇaithersburgが発行している昆虫細胞培養
とバキュロウイルス学に関するユーザーズガイドの９〜１０頁にも認められる）
。 段階希釈の４日後に、ウイルスを細胞に加え、青く染まったプラークをエッペ
ンドルフピペットのチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含むその寒天を、
グレース培地２００μlの入ったエッペンドルフチューブに再懸濁する。短い遠
心分離によって寒天を除去し、組換えバキュロウイルスを含むその上清を使って
、３５mＭ皿に接種したＳf９細胞を感染させる。４日後に、それら培養皿の上清
を収集し、４℃で保存する。 Ｓf９細胞を、１０％ 熱非働化ＦＢＳを添加したグレース培地で生育する。そ
の細胞を組換えバキュロウイルスＶ−ＫＧＦ−２に感染多重度(ＭＯＩ)２で感染
させる。６時間後、培地を除去し、メチオニンとシステインを欠くＳＦ９００Ｉ
Ｉ培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc. ，Ｇaithersburg)に置換する。４２時間後
、５μＣiの３５Ｓ−メチオニンと５μＣiの３５Ｓ−システイン(Ａmersham)を
加える。細胞をさらに１６時間培養した後、遠心分離によって収集し、標識され
たタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーによって可視化する
。
【０４７０】 実施例４ 哺乳類細胞でのＫＧＦ−２タンパク質遺伝子配列の一過性発現に使用されるベ
クターの大半は、ＳＶ４０複製起点を保持すべきである。これにより、ウイルス
ＤＮＡ合成の開始に必要なT抗原を発現する細胞(例えば、ＣＯＳ細胞)における
そのベクターの高コピー数への複製が可能になる。この目的には、他の任意の哺
乳類細胞系も使用できる。 典型的な哺乳類発現ベクターは、mＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモータ
ー配列、タンパク質コード配列、および転写の終結と転写物のポリアデニル化に
必要なシグナルを含有する。その他の配列には、エンハンサー、コザック(Ｋoza
k)配列、およびＲＮＡスプライシングの供与部位と受容部位が隣接した逆方向配
列がある。高効率の転写は、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、レト
ロウイルス(例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩなど)の末端反復配列(ＬＴ
Ｒ)、およびサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)の初期プロモーターを使って達成で
きる。しかし細胞性シグナル(例えば、ヒトアクチンプロモーターなど)を使うこ
ともできる。本発明の実施に好適な発現ベクターには、例えばpＳＶＬおよびpＭ
ＳＧ(Ｐharmacia，Ｕppsala，Ｓweden)、pＲＳＶcat(ＡＴＣＣ ３７１５２)、p
ＳＶ２ＤＨＦＲ(ＡＴＣＣ ３７１４６)、pＢＣ１２ＭＩ(ＡＴＣＣ ６７１０９)
などといったベクターがある。使用できる哺乳類宿主細胞には、ヒトのヒーラ細
胞、２８３細胞、Ｈ９細胞およびジャーカット細胞、マウスのＮＩＨ３Ｔ３細胞
およびＣ１２７細胞、Ｃos１、Ｃos７およびＣＶ１アフリカミドリザル細胞、ウ
ズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞があ
る。
【０４７１】 また、遺伝子が染色体中に組込まれている安定細胞系でその遺伝子を発現させ
ることもできる。ＤＨＦＲ、gpt、ネオマイシン、ハイグロマイシンなどの選択
可能マーカーとの同時トランスフェクションにより、遺伝子導入された細胞の同
定と単離が可能になる。 コードされているタンパク質を大量に発現させるために、導入された遺伝子を
増幅することができる。ＤＨＦＲ(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)は、数百コピーさ
らには数千コピーの目的遺伝子を保持する細胞系を開発するのに有用なマーカー
である。もう1つの有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ(ＧＳ)で
ある(Ｍurphyら，Ｂiochem. Ｊ. ２７７：２７７−２７９（１９９１）;Ｂebbin
gtonら，Ｂio／Ｔechnology １０：１６９−１７５（１９９２）)。これらのマ
ーカーを使用して哺乳類細胞を選択培地中で生育し、最も高い耐性を持つ細胞を
選択する。それらの細胞系の染色体には、増幅された遺伝子が組込まれている。
チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞は、タンパク質の生産に多用されてい
る。 発現ベクターpＣ１とpＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター(Ｌ
ＴＲ)(Ｃullenら，Ｍolecular and Ｃellular Ｂiology：４３８−４４７（１９
８５年３月））とＣＭＶエンハンサーの断片(Ｂoshartら，Ｃell ４１：５２１
−５３０（１９８５））とを含む。制限酵素切断部位ＢamＨＩ、ＸbaＩおよびＡ
sp７１８などを含む多重クローニング部位により、目的遺伝子のクローニングが
容易になる。さらにこれらのベクターは、ラットプレプロインスリン遺伝子の３
'イントロン、ポリアデニル化および終結シグナルを含有する。
【０４７２】 Ａ．ＣＯＳ細胞における組換えＫＧＦ−２の発現 プラスミドＫＧＦ−２ ＨＡの発現は、次に挙げる要素を含むベクターpcＤＮ
ＡＩ／Ａmp(Invitrogen)から得た：１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリン耐
性遺伝子、３）大腸菌複製起点、４）ＣＭＶプロモーターとそれに続くポリリン
カー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位。ＨＡ標識は、既に記
述されているように、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープ
に相当する(Ｗilson, Ｉ. ら，Ｃell ３７：７６７（１９８４））。標的タンパ
ク質にＨＡ標識を融合すると、ＨＡエピトープを認識する抗体を使ってその組換
えタンパク質を容易に検出できるようになる。全ＫＧＦ−２前駆体ＨＡ標識は、
ＨＡ標識と同じ読み枠で融合しているので、この組換えタンパク質の発現は、Ｃ
ＭＶプロモーターに支配される。 プラスミドの構築法は次の通りである。 ＫＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列ＡＴＣＣ＃７５９７７を、次の２つのプラ
イマーを用いるＰＣＲによって構築する。５'プライマー：
【化２０】 は、ＢamＨＩ部位を含み、それに開始コドンから始まるＫＧＦ−２コード配列の
２２ヌクレオチドが続いている。３'配列：
【化２１】 は、ＸhoＩ部位、ＨＡ標識およびＫＧＦ−２コード配列の最後の２６ヌクレオチ
ド(停止コドンを含まない)に相補的な配列を含有する。従って、そのＰＣＲ産物
は、ＢamＨＩ部位およびＫＧＦ−２コード配列とそれに続くＸhoＩ部位、インフ
レーム融合したＨＡ標識およびＨＡ標識に続く翻訳終結停止コドンを含有する。
そのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片とベクターpcＤＮＡ-３'ＨＡをＢamＨＩおよびＸhoＩ
制限酵素で消化し、それらを連結して、pcＤＮＡ-３'ＨＡ-ＫＧＦ−２を得る。
その連結混合物で大腸菌ＸＬ１ Ｂlue株(Ｓtratagene Ｃloning Ｓystems，Ｌa
Jolla，ＣＡ)を形質転換し、その形質転換培養をアンピシリン培地平板で培養し
て、耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、ＰＣ
Ｒと制限分析によって正しい断片の存在を調べた。この組換えＫＧＦ−２を発現
させるため、ＤＥＡＥ−デキストラン法(Ｓambrook，J. ら，Ｍolecular Ｃloni
ng：Ａ Ｌaboratory Ｍannual，Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress（１９８９
）)により、ＣＯＳ細胞に上記発現ベクターをトランスフェクトした。ＫＧＦ−
２ ＨＡタンパク質の発現は、放射線標識と免疫沈降法(Ｈarlow, Ｅ. およびＬa
ne，Ｄ. ，Ａntibodies：Ａ Ｌaboratory Ｍanual，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌa
boratory Ｐress（１９８８）)によって検出した。トランスフェクションの２日
後に、細胞を３５Ｓ−システインで８時間標識した。次いで、培養培地を集め、
細胞を界面活性剤(ＲＩＰＡ緩衝液(１５０mＭ ＮaＣl、１％ ＮＰ−４０、０.１
％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０.５％ ＤＯＣ、５０mＭ Ｔris, pＨ ７.５)で
溶解した(Ｗilson, I. ら，同上 ３７：７６７（１９８４）)。細胞溶解液と培
養培地の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈殿させた。沈殿したタンパ
ク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。
【０４７３】 Ｂ．ＣＨＯ発現系を使用するヒトＫＧＦ−２タンパク質の発現および精製 ＫＧＦ−２タンパク質の発現にベクターpＣ１を使用する。プラスミドpＣ１は
、プラスミドpＳＶ２-ＤＨＦＲ[ＡＴＣＣ受託番号３７１４６号]の誘導体である
。これらのプラスミドは共に、マウスＤＨＦＲ遺伝子をＳＶ４０初期プロモータ
ーの制御下に含有する。これらのプラスミドをトランスフェクトされたジヒドロ
葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞その他の細胞は、化学療法剤メ
トトレキセートを添加した選択培地(アルファマイナスＭＥＭ(alpha minus ＭＥ
Ｍ)，Ｌife Ｔechnologies)中でそれらの細胞を生育することにより選択できる
。メトトレキセート(ＭＴＸ)に耐性な細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅につい
ては、詳細に報告されている(例えば、Ａlt，Ｆ. Ｗ. ，Ｋellems，Ｒ. Ｍ. ，
Ｂertino，Ｊ. Ｒ. およびＳchimke，Ｒ. Ｔ. ,１９７８，Ｊ. Ｂiol. Ｃhem.
２５３：１３５７−１３７０、Ｈamlin，Ｊ. Ｌ. およびＭa，Ｃ. ,１９９０，
Ｂiochem. et Ｂiophys. Ａcta １０９７：１０７−１４３、Ｐage，Ｍ. Ｊ. お
よびＳydenham，Ｍ. Ａ.，１９９１，Ｂiotechnology 第９巻：６４−６８を参
照）。ＭＴＸ濃度を増大させつつ培養した細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果
として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生することにより、この薬物に対する耐性を
発達させる。そのＤＨＦＲ遺伝子に第２の遺伝子を連鎖させると、通常、それが
同時に増幅されて過剰発現する。１,０００コピーを超える遺伝子を保有する細
胞系を開発することが現在の技術水準である。その後メトトレキセートを取り除
くと、細胞系は、染色体に組込まれた増幅された遺伝子を含有する。
【０４７４】 プラスミドpＣ１は、目的遺伝子を発現させるために、ラウス肉腫ウイルスの
末端反復配列(ＬＴＲ)の強力なプロモーター(Ｃullenら，Ｍolecular and Ｃell
ular Ｂiology，１９８５年３月：４３８−４４７０)とヒトサイトメガロウイル
ス(ＣＭＶ)の前初期遺伝子のエンハンサーから単離される断片(Ｂoshartら，Ｃe
ll ４１：５２１−５３０,１９８５)とを含有する。このプロモーターの下流に
は、遺伝子の組込みを可能にする次の単一制限酵素切断部位がある：ＢamＨＩ、
ＰvuII、およびＮruI。このプラスミドは、それらクローニング部位の後ろに、3
種類全ての読み枠で翻訳停止コドンを含有し、それに続いてラットプレプロイン
スリン遺伝子の３'イントロンとポリアデニル化部位を含む。発現には、ヒトβ-
アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、その他のウイル
ス(例えば、ＨＩＶやＨＴＬＶＩ)に由来する末端反復配列などといった、他の高
効率プロモーターも使用できる。mＲＮＡのポリアデニル化には、ヒト成長ホル
モンやグロビン遺伝子などに由来する他のシグナルも同様に使用できる。 染色体に組込まれた目的遺伝子を保有する安定細胞系は、gpt、Ｇ４１８、ま
たはハイグロマイシンなどの選択可能マーカーとの同時トランスフェクションに
よって選択できる。まず最初は、２種類以上の選択可能マーカー(例えば、Ｇ４
１８とメトトレキセート)を使用すると有利である。 プラスミドpＣ１を制限酵素ＢamＨＩで消化した後、ウシ腸ホスファターゼを
使って、当技術分野で知られる手法により脱リン酸化する。次いで、そのベクタ
ーを１％ アガロースゲルから単離する。
【０４７５】 ＫＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列ＡＴＣＣ番号７５９７７を、その遺伝子の
５'配列と３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅
する。 ５'プライマーは、
【化２２】 という配列を持ち、これは、ＢamＨＩ制限酵素部位と、それに続く第１図のＫＧ
Ｆ−２配列の２１塩基とを含有する。後述するように、発現ベクターに挿入され
ると、ヒトＫＧＦ−２をコードする増幅断片の５'末端は、効率のよいシグナル
ペプチドを与える。Ｋozak，Ｍ. ,Ｊ. Ｍol. Ｂiol. １９６：９４７−９５０（
１９８７）に記述されているような真核細胞における翻訳開始の効率のよいシグ
ナルは、この構築物のベクター部分に適切に配置されている。 ３'プライマーは、
【化２３】 という配列を持ち、これは、ＢamＨＩ制限部位と、それに続いて第１図に記載の
ＫＧＦ−２コード配列の最後の２６ヌクレオチド(停止コドンを含まない)に相補
的なヌクレオチドとを含有する。 増幅された断片を上述のように１％ アガロースゲルから単離した後、制限エ
ンドヌクレアーゼＢamＨＩで消化し、再び１％ アガロースゲルで精製する。 次いで、単離した断片と脱リン酸化したベクターをＴ４ ＤＮＡリガーゼで連
結する。次いで大腸菌ＨＢ１０１細胞を形質転換し、プラスミドpＣ１を含む細
菌を同定する。挿入された遺伝子の配列と向きをＤＮＡ配列決定によって確認す
る。
【０４７６】 ＣＨＯ-ＤＨＦＲ細胞のトランスフェクション 活性なＤＨＦＲ酵素を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞をトランスフェク
ションに使用する。リポフェクチン法(Ｆelgnerら,上記)を用いて、5μgの発現
プラスミドpＣ１を０.５μgのプラスミドpＳＶneoと同時にトランスフェクトす
る。プラスミドpＳＶ２-neoは、優勢選択可能マーカー(Ｇ４１８を含む抗生物質
群に対する耐性を付与する酵素をコードするＴn5由来の遺伝子neo)を含有する。
その細胞を、１mg／ml Ｇ４１８を添加したアルファマイナスＭＥＭに接種する
。２日後、細胞をトリプシン処理し、ハイブリドーマクローニングプレート(Ｇr
einer,Ｇermany)に接種し、１０〜１４日間培養する。この期間の後、単一クロ
ーンをトリプシン処理し、異なる濃度のメトトレキセート(２５nＭ、５０nＭ、
１００nＭ、２００nＭ、４００nＭ)を使って、それらを６ウェルペトリ皿に接種
する。最高濃度のメトトレキセートで成長するクローンを、さらに高いメトトレ
キセート濃度(５００nＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ)を含む新しい６ウェルプレ
ートに移す。クローンが１００μＭ濃度で成長するまで、同じ操作を繰り返す。 所望の遺伝子産物の発現は、ウェスタンブロット分析とＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
って分析する。
【０４７７】 実施例５ 組換えＫＧＦ−２のインビトロにおける転写および翻訳 ＫＧＦ−２の昆虫細胞発現に使用したpＡ２ベクター中のクローン化ＤＮＡか
らＰＣＲ産物を得る。このＰＣＲに使用したプライマーは次の通りである：
【化２４】 第一のプライマーは、ＡＴＧ開始コドンの５'側にＴ３プロモーターの配列を
含有する。第二のプライマーは、ＫＧＦ−２オープンリーディングフレームの３
'末端に相補的であり、停止コドンの逆方向相補鎖をコードする。 得られたＰＣＲ産物をＱiagenから市販されているキットを使って精製する。
そのＤＮＡ ０.５μgを試験管内転写翻訳反応のテンプレートとして使用する。
この反応は、ＴＮＴという名称でＰromegaから市販されているキットを使って行
なう。アッセイは、放射活性標識されたメチオニンを基質とし、示された試薬体
積の１／２しか使用しない点と反応を３３℃で１.５時間進行させる点以外は、
そのキットの使用説明書に記述されているように行なう。 ５μlの反応液を変性１０−１５％ ポリアクリルアミドゲルで電気泳動的に分
離する。そのゲルを体積比６：３：１の水：メタノール：酢酸混合液中で３０分
間固定する。次いで、そのゲルを加熱下に真空乾燥した後、Ｘ線フィルムに１６
時間曝露する。そのフィルムを現像すると、概念的に翻訳されたＫＧＦ−２に相
当するサイズを持つ放射活性タンパク質バンドの存在が示されることから、クロ
ーニングされたＫＧＦ−２のcＤＮＡが予想されるサイズのタンパク質をコード
するオープンリーディングフレームを含むことが強く示唆される。
【０４７８】 実施例６ 遺伝子療法による発現 皮膚生検によって対象から線維芽細胞を得る。得られた組織を組織培養培地に
入れ、小片に分割する。小さい組織塊を組織培養フラスコの湿表面に置き、各フ
ラスコに約１０片ずつ入れる。そのフラスコを上下逆さにし、密閉して、室温に
終夜放置する。室温で２４時間後、そのフラスコを逆さにし、組織塊をフラスコ
の底に固定したまま、新鮮な培地(例えば、１０％ ＦＢＳ、ペニシリン、および
ストレプトマイシンを含むハムＦ１２培地)を加える。次いで、これを３７℃で
約１週間培養する。この時点で、新鮮な培地を加え、以後、数日毎に交換する。
さらに２週間培養すると、線維芽細胞の単層が生じる。その単層をトリプシン処
理して、より大きなフラスコに移す。 モロニーネズミ肉腫ウイルスの末端反復配列が隣接したpＭＶ−７(Ｋirschmei
er，Ｐ. Ｔ. ら，ＤＮＡ ７：２１９−２５（１９８８）)をＥcoＲＩとＨindIII
で消化した後、ウシ腸ホスファターゼで処理する。その線状ベクターをアガロー
スゲルで分画し、ガラスビーズを用いて精製する。 本発明のポリペプチドをコードするcＤＮＡを、それぞれ５'末端配列と３'末
端配列に対応するＰＣＲプライマーを用いて増幅する。その５'プライマーは、
ＥcoＲＩ部位を含有し、３'プライマーはさらに、ＨindIII部位を含む。モロニ
ーネズミ肉腫ウイルス線状骨格と、増幅したＥcoＲＩおよびＨindIII断片とを、
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下に等量ずつ混合する。得られた混合物を、上記二
断片の連結に適した条件下に維持する。その連結混合物を用いて細菌ＨＢ１０１
を形質転換し、目的の遺伝子がベクターに正しく挿入されていることを確認する
ために、それをカナマイシン含有寒天上で平板培養する。
【０４７９】 両種性pＡ３１７またはＧＰ＋am１２パッケージング細胞を、１０％ 仔ウシ血
清(ＣＳ)、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改良イーグル
培地(ＤＭＥＭ)中、コンフルエント密度まで組織培養する。次いで、上記遺伝子
を含有するＭＳＶベクターをその培地に加え、パッケージング細胞をそのベクタ
ーで形質導入する。パッケージング細胞は、上記遺伝子を含有する感染性ウイル
ス粒子を産生するようになる(このパッケージング細胞を産生細胞と呼ぶ)。 形質導入された産生細胞に新鮮な培地を加えた後、コンフルエントな産生細胞
の１０cmプレートから培地を収集する。感染性ウイルス粒子を含有するその消費
済み培地をミリポアフィルターに通して、剥離した産生細胞を除去し、その培地
を使って線維芽細胞を感染させる。線維芽細胞のサブコンフルエント(sub-confl
uent)プレートから培地を除去し、産生細胞から得た培地にすばやく置換する。
この培地を除去し、新鮮な培地で置換する。ウイルスの力価が高ければ、事実上
全ての線維芽細胞が感染され、選択の必要はないだろう。力価が極めて低い場合
は、neoやＨisなどの選択可能マーカーを持つレトロウイルスベクターを使用す
る必要がある。 次いで、操作した上記線維芽細胞を、そのまま、もしくはサイトデックス(Ｃy
todex)３マイクロキャリアービーズ上でコンフルエントに成長させた後、宿主に
注射する。その線維芽細胞は、上記タンパク質産物を産生するようになっている
。
【０４８０】 実施例７ 糖尿病マウスモデルにおける創傷治癒のＫＧＦ−２による刺激 ケラチノサイト増殖因子２(ＫＧＦ−２)が治癒過程を加速することを立証する
ために、創傷治癒の遺伝性糖尿病マウスモデルを使用した。db+／db+マウスにお
ける全層創傷治癒モデルは、よく特徴づけられた臨床に関連する再現性ある創傷
治癒障害モデルである。糖尿病性創傷の治癒は、収縮(contraction)よりもむし
ろ肉芽組織の形成と再上皮化に依存する(Ｇartner，Ｍ. Ｈ. ら，Ｊ. Ｓurg. Ｒ
es ５２：３８９（１９９２）；Ｇreenhalgh，Ｄ. Ｇ. ら, Ａm. Ｊ. Ｐathol.
１３６：１２３５（１９９０）)。 この糖尿病動物は、II型真性糖尿病に観察される特性の多くを持つ。ホモ接合
性(db+／db+)マウスは、その正常なヘテロ接合性(db+／+m)同腹仔と比較して、
肥満している。突然変異糖尿病(db+／db+)マウスは、染色体４に単一の常染色体
劣性突然変異(db+)を持つ(Ｃolemanら，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ７
７:２８３−２９３（１９８２）)。動物は、多食、煩渇多飲および多尿を示す。
突然変異糖尿病マウス(db+／db+)は、血糖値が高く、インスリンレベルが増大し
ているかまたは正常であって、細胞性免疫が抑制されている(Ｍandelら，Ｊ. Ｉ
mmunol. １２０：１３７５（１９７８）；Ｄebray−Ｓachs，Ｍ. ら，Ｃlin. Ｅ
xp. Ｉmmunol. ５１(１)：１−７（１９８３）；Ｌeiterら，Ａm. Ｊ. of Ｐath
ol. １１４：４６−５５（１９８５）)。これらの動物では、末梢神経障害、心
筋合併症、微小血管損傷、基底膜肥厚および糸球体濾過異常が記述されている(
Ｎorido，Ｆ. ら，Ｅxp. Ｎeurol. ８３(２)：２２１−２３２（１９８４）；Ｒ
obertsonら，Ｄiabetes ２９(１)：６０−６７（１９８０）；Ｇiacomelliら，
Ｌab Ｉnvest. ４０(４)：４６０−４７３（１９７９）；Ｃoleman，Ｄ. Ｌ. ，
Ｄiabetes ３１(付録)：１−６（１９８２）)。これらホモ接合性糖尿病マウス
は、ヒトＩＩ型糖尿病と同様にインスリンに対して耐性な高血糖症を発症する(
Ｍandelら，Ｊ. Ｉmmunol. １２０：１３７５−１３７７（１９７８）)。 これらの動物に観察される特徴は、このモデルにおける治癒がヒト糖尿病で観
察される治癒に類似しうることを示唆している(Ｇreenhalghら，Ａm. Ｊ. of Ｐ
athol. １３６：１２３５−１２４６（１９９０）)。この試験の結果から、ＫＧ
Ｆ−２が糖尿病および非糖尿病ヘテロ接合性同腹仔における全層創傷に対して強
力な刺激作用を持つことが明らかになった。ＫＧＦ−２処置動物では、再上皮化
と、真皮内での肉芽組織、コラーゲン細線維の増加に対する著しい効果が観察さ
れた。増殖因子類の外因的適用は、炎症性細胞を創傷に引き寄せることにより肉
芽組織形成を加速しうる。
【０４８１】 動物 この試験では、遺伝性糖尿病メスＣ５７ＢＬ／ＫsＪ(db+／db+)マウスとその
非糖尿病(db+／+m)ヘテロ接合性同腹仔を使用した(Ｊackson Ｌaboratories)。
これらの動物は６週齢で購入し、試験の開始時点で８週齢だった。動物は個別に
飼育し、水と食物を無制限に摂取させた。すべての操作は、無菌技術を使って行
なった。実験は、Ｈuman Ｇenome Ｓciences，Ｉnc. の社内動物実験委員会(Ｉn
stitutional Ａnimal Ｃare and Ｕse ＣomＭittee)の規則と指針および動物実
験ガイドライン(Ｇuidelines for the Ｃare and Ｕse of Ｌaboratory Ａnimal
s)に従って行なった。
【０４８２】 ＫＧＦ−２ 創傷治癒試験に使用した組換えヒトＫＧＦ−２は、大腸菌発現ベクター系(pＱ
Ｅ−９；Ｑiagen)の１つpＱＥ６０−Ｃys３７から過剰発現させ、精製した。こ
の構築物から発現されるタンパク質は、３７番目のシステインから２０８番目の
セリンまでよりなるＫＧＦ−２で、そのタンパク質のＮ末端に結合した６×(Ｈi
s)標識を持つ（配列番号２９−３０)(第１５図)。純度９５％を超える組換え物
質を含有する画分を実験に使用した。ケラチノサイト増殖因子２は、１００mＭ
トリス(８.０)と６００mＭ ＮaＣlを含む賦形剤中に調剤した。原液の最終濃度
は、８０μg／mLおよび８μg／mLとした。希釈液は、同じ賦形剤を使って原液か
ら調製した。
【０４８３】 手術創形成 創傷の形成は、過去に報告されている方法に従って行なった(Ｔsuboi，Ｒ. お
よびＲifkin，Ｄ. Ｂ. ，Ｊ. Ｅxp. Ｍed. １７２：２４５−２５１（１９９０
）)。簡単に述べると、創傷形成の日に動物をアバーティン(脱イオン水に溶解し
た２,２,２−トリブロモエタノールと２−メチル−２−ブタノール)(０.０１mg
／mL)の腹腔内注射によって麻酔した。その動物の背中を剃毛し、皮膚を７０％
エタノール溶液とヨウ素で洗浄した。創傷形成に先立って手術領域を滅菌ガーゼ
で乾燥させた。次いで、キーズ(Ｋeyes)組織穿孔具を使って８mＭの全層創傷を
形成させた。創傷の拡大を排除するため、創傷形成直後に、周囲の皮膚を穏やか
に引き伸ばした。実験期間中は、創傷を開放状態にしておいた。処置の適用は、
創傷形成の日に開始して５日間連続して局所的に行なった。処置に先立ち、創傷
を滅菌食塩水とガーゼスポンジを使って穏やかに洗浄した。 手術の日とその後の２日置きに、創傷を目視検査し、一定の距離から写真撮影
した。創傷の閉鎖は、第１−５日の毎日と第８日に行なった計測によって決定し
た。創傷は、較正済ジェームソン(Ｊameson)キャリパーを使って水平および垂直
方向に計測した。肉芽組織がもはや視認できず、創傷が連続した上皮で覆われた
ら、その創傷は治癒したとみなした。 ＫＧＦ−２は、２種類のＫＧＦ−２用量(５０μLの賦形剤中、一つは１日あた
り創傷あたり４μgを８日間、もう一つは１日あたり創傷あたり４０μgを８日間
)を使って投与した。賦形剤対照群には、５０μLの賦形剤を与えた。 第８日にナトリウムペントバルビタール(３００mg／kg)の腹腔内注射により動
物を安楽死させた。次いで、組織学的検査と免疫組織化学的検査のために、創傷
と周囲の皮膚を採取した。組織標本は、さらなる処理のため、生検スポンジ(bio
psy sponge)間の組織カセット中の１０％ 中性緩衝ホルマリンに入れた。
【０４８４】 実験計画 それぞれ１０匹の動物(５匹は糖尿病で、５匹は非糖尿病対照)からなる３群：
１）賦形剤プラシーボ対照群、２）ＫＧＦ−２ ４μg／日群、および３）ＫＧＦ
−２ ４０μg／日群を評価した。この試験は次のように計画した。
【０４８５】
【表１】
【０４８６】 創傷の面積と閉鎖の計測 創傷の閉鎖は、その面積を垂直および水平軸方向に計測し、創傷の総平方面積
を求めることによって分析した。次いで、最初(第０日)と処置後(第８日)の創傷
面積の差を定めることによって収縮を見積もった。第１日での創傷面積は６４m
Ｍ２で、これは真皮穿孔具のサイズに相当する。計算は次式を使って行なった。 ［第８日の開口面積］−［第１日の開口面積］／［第１日の開口面積］
【０４８７】 組織学 標本を１０％ 緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋ブロックを創傷表
面に対して垂直に薄片化(５μm)し、ライヘルト−ユングミクロトームを使って
切断した。二等分した創傷の横断面に対して常用のヘマトキシリン・エオジン(
Ｈ−Ｅ)染色を施した。創傷の組織学的検査を用いて、治癒過程と修復された皮
膚の形態的外観がＫＧＦ−２を用いた処置によって変化したかどうかを評価した
。この評価には、細胞集積、炎症性細胞、毛細管、線維芽細胞、再上皮化および
表皮成熟の存在の確認を含めた(Ｇreenhalgh，Ｄ. Ｇ. ら, Ａm. Ｊ. Ｐathol.
１３６：１２３５（１９９０）)(表１)。盲検観察者が較正済のレンズマイクロ
メーターを使用した。
【０４８８】 免疫組織化学 再上皮化 ＡＢＣ Ｅlite検出システムを用いて、組織切片をポリクローナルウサギ抗ヒ
トケラチン抗体で免疫組織化学的に染色した。ヒトの皮膚を陽性組織対照として
使用し、非免疫ＩgＧを陰性対照として使用した。ケラチノサイトの増殖は、創
傷の再上皮化の程度を較正済のレンズマイクロメーターを使って評価することに
より測定した。
【０４８９】 細胞増殖マーカー ＡＢＣ Ｅlite検出システムを使用し、抗ＰＣＮＡ抗体(１：５０)を用いるこ
とにより、皮膚標本中の増殖細胞核抗原／サイクリン(ＰＣＮＡ)を明らかにした
。ヒト結腸癌を陽性組織対照とし、ヒト脳組織を陰性組織対照として使用した。
各標本には、一次抗体を省略し、非免疫マウスＩgＧに置換した切片を含めた。
これらの切片の格付けは、増殖の程度に基き０−８の尺度で行なった(尺度が低
いほど増殖がわずかで、高いほど強い増殖を表わす)。
【０４９０】 統計分析 独立t検定を使って実験データを分析した。０.０５未満のp値を有意とみなし
た。データは、平均±ＳＥＭとして表す。
【０４９１】 結果 創傷閉鎖に対するＫＧＦ−２の効果 糖尿病マウスは、ヘテロ接合性の正常マウスと比較して、治癒障害を示した。
一部位あたり４μgのＫＧＦ−２用量で糖尿病動物と非糖尿病動物に最大反応が
もたらされたようである(第５、６図)。これらの結果は、緩衝液対照群と比較し
て、統計的に有意だった(p＝０.００２およびp＜０.０００１)。ＫＧＦ−２によ
る処置は、４μg／日を与えた群で６０.６％、４０μg／日群で３４.５％の最終
平均閉鎖率をもたらした。緩衝液対照群の創傷は、第８日までに３.８％の閉鎖
率しか示さなかった。ＫＧＦ−２で処置したdb+／db+マウスから創傷形成後の第
２−５日と第８日に繰返して得た創傷の計測値により、緩衝液対照群と比較して
、創傷形成後第３日までに総創傷面積(mＭ２)の有意な改善が立証された。この
改善は持続し、実験の終了時までに統計的に有意な結果が観察された(第７図)。
ＫＧＦ−２を与えたdb／+m群の動物も繰返し行なった計測で緩衝液対照群より大
きな創傷面積の減少を示した(第８図)。これらの結果から、ＫＧＦ−２で処置し
た動物の方が創傷閉鎖率が高いことが確認された。
【０４９２】 組織学的スコアに対するＫＧＦ−２の効果 第８日に行なった糖尿病(db+／db+)モデルにおけるＫＧＦ−２の病理組織的評
価により、緩衝液対照と比較して、創傷スコアの統計学的に有意な改善(p＜０.
０００１)が示された。４μgおよび４０μgのＫＧＦ−２用量の両者に観察され
た薬理作用には互いに有意差がなかった。緩衝液対照群が示す細胞集積はごくわ
ずかで、肉芽組織または上皮移動を伴わなかったが、４μgおよび４０μgのＫＧ
Ｆ−２投与量(それぞれp＜０.０００１およびp＝０.０６)は、創傷を覆う上皮、
新血管新生、肉芽組織形成および線維芽細胞とコラーゲンの沈着を示した(第９
図)。 皮膚創傷の病理組織学的評価は、ヘマトキシリン・エオジン染色試料に対して
行なった。採点基準には、１−１２の尺度を含めた。ここにスコア１は、細胞集
積がごくわずかで肉芽形成をほとんど伴わないか全く伴わないことを表わし、ス
コア１２は、線維芽細胞、コラーゲン沈着および創傷を覆う新しい上皮の豊富な
存在を表わす(表１)。
【０４９３】
【表２】 表１ 組織学切片の採点 両投与量のＫＧＦ−２を投与した後の非糖尿病同腹仔の評価は、評価したどの
測定についても、緩衝液対照群と比較して有意な活性を示さなかった(第１０図)
。緩衝液対照群は、未熟な肉芽組織、炎症性細胞および毛細管を示した。平均ス
コアは糖尿病群より高く、このことから糖尿病(db+／db+)マウスにおける治癒障
害が示された。
【０４９４】 再上皮化に対するＫＧＦ−２の効果 サイトケラチン免疫染色法を使って再上皮化の程度を測定した。スコアは、０
(閉鎖なし)から８(完全な閉鎖)までの尺度で、閉鎖の程度に基いて与えた。４μ
g／日投与群では、緩衝液対照群と比較して、再上皮化スコアに統計的に有意な
改善があった(p＜０.００１)(第１１図)。この群では、創傷を覆う新たに形成し
た表皮に局在したケラチノサイトが観察された。ＫＧＦ−２の両投与量は、様々
な段階の有糸分裂像をも示した。両投与量のＫＧＦ−２で非糖尿病群を評価した
ところ、やはり再上皮化ランクが有意に改善された(それぞれp＝０.００６およ
び０.０１)(第１２図)。
【０４９５】 細胞増殖に対するＫＧＦ−２の効果 増殖細胞核抗原免疫染色により、４μg群と４０μg群の両方に有意な増殖が示
された(第１３図)。非糖尿病群の結果も同様で、両投与量のＫＧＦ−２を与えた
群はどちらも、緩衝液対照群より高い有意な得点を示した(第１４図)。表皮増殖
は特に、表皮の基底層で観察された。また真皮、とりわけ毛包に高密度のＰＣＮ
Ａ標識細胞が観察された。
【０４９６】 結論 これらの結果は、ＫＧＦ−２が初代表皮ケラチノサイトの増殖を特異的に刺激
することを立証している。またこれらの実験は、局所的に適用された組換えヒト
ＫＧＦ−２が糖尿病マウスにおける全層切除真皮創傷の治癒速度を著しく加速す
ることを立証している。組織学的評価は、ＫＧＦ−２が表皮肥厚を伴うケラチノ
サイト増殖を誘導することを示している。この増殖は表皮の基底層に局在するこ
とが、増殖細胞核抗原(ＰＣＮＡ)によって立証された。真皮のレベルでコラーゲ
ン沈着、線維芽細胞増殖および新血管新生により、正常な皮膚構造が再建された
。 ＰＣＮＡ標識細胞が少ない緩衝液群とは対照的に、ＫＧＦ−２処置動物におけ
るＰＣＮＡ標識細胞の密度が高いことは、真皮-表皮レベルでのケラチノサイト
、線維芽細胞および毛包の刺激を示している。この実験では、ＫＧＦ−２による
治癒過程の強化が一貫して観察された。この効果は、評価したパラメーター(再
上皮化率および創傷閉鎖率)で統計的に有意だった。重要なことに、ＰＣＮＡ標
識ケラチノサイトは、主として表皮の下層−基底層に観察された。真皮は、線維
芽細胞、コラーゲンおよび肉芽組織を伴う正常化された組織を示した。 非糖尿病動物で観察された活性は、第８日の時点で、また毎日行なった計測に
よればこの実験の経過中、ＫＧＦ−２が創傷閉鎖率に有意な薬理学的応答を得た
ことを示している。病理組織学的評価には、緩衝液対照と比較して有意差がなか
ったが、ケラチノサイト増殖とＰＣＮＡスコアから有意な効果が立証された。 要約すると、これらの結果から、ＫＧＦ−２がdb+／db+マウスモデルを使った
障害を持つおよび正常な切除創傷モデルのどちらでも有意な活性を示すこと、ま
たそれゆえに手術創、糖尿病性潰瘍、静脈うっ血性潰瘍、熱傷およびその他の皮
膚状態を含む創傷の治療に有用であるといえることが立証された。
【０４９７】 実施例８ ステロイド障害ラットモデルにおけるＫＧＦ−２が媒介する創傷治癒 ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々の試験管内および生体内系で詳細に
報告されている(Ａnti−ＩnflamＭatory Ｓteroid Ａction：Ｂasic and Ｃlini
cal Ａspectsの２８０−３０２頁，Ｗahl，Ｓ. Ｍ. 著，Ｇlucocorticoids and
Ｗound healing（１９８９）；Ｗahl，Ｓ. Ｍ. ら，Ｊ. Ｉmmunol. １１５：４
７６−４８１（１９７５）；Ｗerb，Ｚ. ら，Ｊ. Ｅxp. Ｍed. １４７：１６８
４−１６９４（１９７８）)。グルココルチコイドは、血管新生を阻害し、血管
透過性(Ｅbert，Ｒ. Ｈ. ら，Ａn. Ｉntern. Ｍed. ３７：７０１−７０５（１
９５２）)、線維芽細胞増殖およびコラーゲン合成(Ｂeck，Ｌ. Ｓ. ら，Ｇrowth
Ｆactors. ５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈaynes，Ｂ. Ｆ. ら，Ｊ. Ｃli
n. Ｉnvest. ６１：７０３−７９７（１９７８）)を低下させ、循環単球の一時
的低下をもたらす(Ｈaynes，Ｂ. Ｆ. ら，Ｊ. Ｃlin. Ｉnvest. ６１：７０３−
７９７（１９７８）；ＡntiinflamＭatory Ｓteroid Ａction：Ｂasic and Ｃli
nical Ａspects，Ａcademic Ｐress，Ｎew Ｙork)の２８０−３０２頁，Ｗahl，
Ｓ. Ｍ. 著，Ｇlucocorticoids and wound healing（１９８９）)ことによって
創傷治癒を遅らせる。ステロイド剤の全身投与による創傷治癒の障害は、ラット
で十分に確証された現象である(Ｂeck，Ｌ. Ｓ. ら，Ｇrowth Ｆactors. ５：２
９５−３０４（１９９１）；Ｈaynes，Ｂ. Ｆ. ら，Ｊ. Ｃlin. Ｉnvest. ６１
：７０３−７８７（１９７８）；ＡntiinflamＭatory Ｓteroid Ａction：Ｂasi
c and Ｃlinical Ａspects，Ａcademic Ｐress，Ｎew Ｙork)の２８０−３０２
頁，Ｗahl，Ｓ. Ｍ. 著，Ｇlucocorticoids and wound healing（１９８９）；
Ｐierce，Ｇ. Ｆ. ら，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ. ８６：２２２９−
２２３３（１９８９）)。
【０４９８】 ＫＧＦ−２が治癒過程を加速することを立証するため、メチルプレドニゾロン
の全身投与によって治癒機能に障害を受けたラットにおける全層切除皮膚創傷に
対するＫＧＦ−２の複数回局所適用の効果を評価した。試験管内試験により、Ｋ
ＧＦ−２は、初代ヒト表皮ケラチノサイトの増殖を特異的に刺激することが立証
されている。この実施例は、局所的に適用された組換えヒトＫＧＦ−２がラット
の全層切除皮膚創傷の治癒速度を加速することを、較正済ジェームソンキャリパ
ーによる創傷間隙の計測と組織形態測定および免疫組織化学によって立証するも
のである。組織学的評価により、ＫＧＦ−２が再上皮化を加速し、続いて創傷修
復を加速することが立証される。
【０４９９】 動物 この実施例では、体重２５０−３００gの若い成体の雄のスプレーグ・ドーリ
ーラット(Ｃharles Ｒiver Ｌaboratories)を使用した。これらの動物は８週齢
で購入し、試験の開始時点で９週齢だった。創傷形成時にメチルプレドニゾロン
を全身投与(筋肉内に１７mg／kg／ラット)することにより、ラットの治癒反応を
障害した。動物は個別に飼育し、水と食物を無制限に摂取させた。すべての操作
を無菌技術を使って行なった。この試験は、Ｈuman Ｇenome Ｓciences，Ｉnc.
の社内動物実験委員会(Ｉnstitutional Ａnimal Ｃare and Ｕse ＣomＭittee)
の規則と指針および動物実験ガイドライン(Ｇuidelines for the Ｃare and Ｕs
e of Ｌaboratory Ａnimals)に従って行なった。
【０５００】 ＫＧＦ−２ 組換えヒトＫＧＦ−２は、大腸菌発現ベクター系(pＱＥ−９；Ｑiagen)の１つ
pＱＥ６０−Ｃys３７から過剰発現させ、精製した。この構築物から発現される
タンパク質は、３７番目のシステインから２０８番目のセリンまでよりなるＫＧ
Ｆ−２で、そのタンパク質のＮ末端に結合した６×(Ｈis)標識を持つ(第１５図)
（配列番号２９−３０）。純度９５％を超える組換え物質を含有する画分を実験
に使用した。ＫＧＦ−２は、１×ＰＢＳを含む賦形剤中に調剤した。原液の最終
濃度は、２０μg／mLおよび８０μg／mLとした。希釈液は、同じ賦形剤を使って
原液から調製した。 ＫＧＦ−２Δ２８は、大腸菌発現系から過剰発現させ、精製した。純度９５％
を超える組換え物質を含む画分を実験に使用した。ＫＧＦ−２は、１×ＰＢＳを
含む賦形剤中に調剤した。原液の最終濃度は、２０μg／mLおよび８０μg／mLと
した。希釈液は、同じ賦形剤を使って原液から調製した。
【０５０１】 手術創形成 創傷形成法は、上記実施例７に従った。創傷形成の日に動物をケタミン(５０m
g／kg)とキシラジン(５mg／kg)の筋肉内注射によって麻酔した。その動物の背中
を剃毛し、皮膚を７０％ エタノール溶液とヨウ素液で洗浄した。創傷形成に先
立って手術領域を滅菌ガーゼで乾燥させた。次いで、キーズ組織穿孔具を使って
８mＭの全層創傷を形成させた。実験期間中は、創傷を開放状態にしておいた。
試験物質の適用は、創傷形成の日に開始し、メチルプレドニゾロンの投与に続い
て７日間連続して局所的に行なった。処置に先立ち、創傷を滅菌食塩水とガーゼ
スポンジを使って穏やかに洗浄した。 創傷形成の日と処置の終了時に創傷を目視検査し、一定の距離から写真撮影し
た。創傷の閉鎖は、第１−５日の毎日と第８日に行なった計測によって決定し、
図面した。創傷は、較正済ジェームソンキャリパーを使って水平および垂直方向
に計測した。肉芽組織がもはや視認できず、創傷が連続した上皮で覆われたら、
その創傷は治癒したとみなした。 用量反応測定は、２種類のＫＧＦ−２用量(５０μLの賦形剤中、一つは１日あ
たり創傷あたり１μg、もう一つは１日あたり創傷あたり４μgを５日間)を使っ
て行なった。賦形剤対照群には、５０μLの１×ＰＢＳを与えた。 第８日にナトリウムペントバルビタール(３００mg／kg)の腹腔内注射により動
物を安楽死させた。次いで、組織学的検査のために、創傷と周囲の皮膚を採取し
た。組織標本は、さらなる処理のため、生検スポンジ間の組織カセット中の１０
％ 中性緩衝ホルマリンに入れた。
【０５０２】 実験計画 それぞれ１０匹の動物(５匹はメチルプレドニゾロンを投与、５匹はグルココ
ルチコイドの投与なし)からなる４群：１）無処置群、２）賦形剤プラシーボ対
照群、３）ＫＧＦ−２ １μg／日群および４）ＫＧＦ−２ ４μg／日群を評価し
た。この試験は次のように計画した。
【０５０３】
【表３】
【０５０４】 創傷の面積と閉鎖の測定 創傷の閉鎖は、その面積を垂直および水平軸方向に計測し、創傷の総面積を求
めることによって分析した。次いで、最初(第０日)と処置後(第８日)の創傷面積
の差を定めることによって閉鎖を見積もった。第１日での創傷面積は６４mＭ２
で、これは真皮穿孔具のサイズに相当する。計算は次式を使って行なった。 ［第８日の開口面積］−［第１日の開口面積］／［第１日の開口面積］
【０５０５】 組織学 標本を１０％ 緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋ブロックを創傷表
面に対して垂直に薄片化(５μm)し、オリンパスミクロトームを使って切断した
。二等分した創傷の横断面に対して常用のヘマトキシリン・エオジン(Ｈ−Ｅ)染
色を施した。創傷の組織学的検査により、治癒過程と修復された皮膚の形態的外
観がＫＧＦ−２を用いた処置によって改善されたかどうかを評価することができ
た。創傷間隙の間隔は、盲検観察者が較正済のレンズマイクロメーターを使って
決定した。
【０５０６】 統計分析 独立t検定を使って実験データを分析した。０.０５未満のp値を有意とみなし
た。データは、平均±ＳＥＭとして表した。
【０５０７】 結果 メチルプレドニゾロンを投与した無処置対照群とメチルプレドニゾロンを投与
しない無処置対照群の創傷閉鎖を比較すると、メチルプレドニゾロンで処置され
たラットは、正常なラットと比較して、創傷形成後８日の時点で有意な創傷治癒
障害を示すことがわかる。総創傷面積は、メチルプレドニゾロン注射群では５８
.４mＭ２、グルココルチコイド非投与群では２２.４mＭ２だった(第１６図)。
【０５０８】 創傷閉鎖に対するＫＧＦ−２の効果 創傷形成時にラットにメチルプレドニゾロンを全身投与すると、正常ラットの
創傷閉鎖が遅延した(p＝０.００２)。第８日の実験終了時に行なったメチルプレ
ドニゾロン障害群の創傷閉鎖測定から、ＫＧＦ−２群の創傷閉鎖は、無処置群と
比較して統計的に有意に大きい(１μg群はp＝０.００２；４μg群はp＝０.００
５)ことが明らかになった(第１６図)。創傷閉鎖率は、１μg−ＫＧＦ−２投与群
で６０.２％(p＝０.００２)、４μg-ＫＧＦ−２投与群で７３％(p＝０.０００８
)だった。これに対し、無処置群では１２.５％、賦形剤プラシーボ群では２８.
６％だった(第１７図)。 第１日から第８日までのグルココルチコイド群における創傷閉鎖の経過分析に
より、処置群では、どちらのＫＧＦ−２投与量でも創傷形成後の第３日から第８
日まで創傷サイズの有意な減少が示される(第１８図)。 これらの結果は、４μgのＫＧＦ−２で処置した群では、無処置群と比較して
創傷閉鎖が統計的に有意(p＝０.０５)に加速されたことを示している(第１９Ａ
図)。正常な動物においてタンパク質またはその他化合物の創傷治癒加速力を評
価することは(回復が迅速なために)困難であるが、それでもなお、ＫＧＦ−２は
、このモデルで創傷治癒を加速することが示された。
【０５０９】 ＫＧＦ−２で処置した創傷の病理組織学的評価 創傷間隙の組織形態測定は、ＫＧＦ−２処置群の創傷間隔の減少を示した。無
処置群で観察された創傷間隙が５３３６ミクロンであったのに対し、１μgのＫ
ＧＦ−２で処置した群では２９７２ミクロンに減少し、４μgのＫＧＦ−２で処
置した群(p＝０.０４)では創傷間隙が３０８５ミクロンに減少していた(第２０
図)。
【０５１０】 創傷治癒に関するＫＧＦ−２Δ２８の効果 メチルプレドニゾロン障害ラットモデルの創傷治癒に関するＫＧＦ−２Δ２８
とＰＤＧＦ−ＢＢの評価も検討した。この実験は、ＫＧＦ−２Δ２８タンパク質
がＨis標識を持たない点と創傷治癒を第２、４、６、８、および１０日に測定し
た点以外は、上記ＫＧＦ−２タンパク質の場合と同様に行なった。これらタンパ
ク質用の緩衝賦形剤は、全長のＫＧＦ−２の"Ｅ２"調製品を除くいずれについて
も４０mＭ ＮaＯＡcおよび１５０mＭ ＮaＣl(pＨ 6.5)とした。"Ｅ２"ＫＧＦ−
２調製品用の緩衝賦形剤は、２０mＭ ＮaＯＡcおよび４００mＭ ＮaＣl(pＨ ６.
４)とした。 第１９Ｂ図に示す結果は、ＫＧＦ−２Δ２８が無処置群と比較して創傷閉鎖を
統計的に有意に加速し、創傷治癒に対するメチルプレドニゾロンの作用をくつが
えしたことを立証している。
【０５１１】 結論 この実施例は、ＫＧＦ−２が創傷治癒に対するメチルプレドニゾロンの作用を
くつがえしたことを証明している。増殖因子類の外因的適用は、創傷に炎症性細
胞を引き寄せることにより肉芽組織形成を加速しうる。類似の活性は、毎日の測
定からＫＧＦ−２が第５日の時点で創傷閉鎖率に有意な薬理学的応答を得たこと
を示すメチルプレドニゾロン非投与動物でも観察された。ラットにおけるグルコ
コルチコイド障害創傷治癒モデルは、創傷治癒領域におけるＫＧＦ−２とその他
の化合物の効力を測定するのに適した再現性あるモデルであることがわかった。 要約すると、これらの結果は、ＫＧＦ−２がグルココルチコイド障害切除創傷
モデルと正常切除創傷モデルの両方で有意な活性を示すことを証明している。従
って、ＫＧＦ−２は、手術創、糖尿病性潰瘍、静脈うっ血性潰瘍、熱傷およびそ
の他の異常な創傷治癒状態(例えば、尿毒症、栄養不良、ビタミン欠乏症、ステ
ロイド剤や抗腫瘍剤での全身処置など)を含む創傷治癒の刺激に臨床的に有用で
あるといえる。
【０５１２】 実施例９ ＫＧＦ−２ mＲＮＡ発現の組織分布 上記Ｓambrookらの著書などに記載の方法を使ってＫＧＦ−２タンパク質をコ
ードする遺伝子のヒト組織における発現レベルを調べるために、ノーザンブロッ
ト分析を行なう。本発明のＫＧＦ−２の全オープンリーディングフレーム（配列
番号１）に相当するプローブをＰＣＲで得て、rediprimeＴＭＤＮＡラベリング
システム(Ａmersham Ｌife Ｓcience)を製造者の指示に従って使用することによ
り、そのプローブを３２Ｐで標識した。標識した後、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−
１００ＴＭカラム(Ｃlontech Ｌaboratories，Ｉnc. )を製造者の実験計画案(プ
ロトコル)番号ＰＴ１２００−１に従って使用することにより、プローブを精製
した。次いで、精製した標識プローブを使って、種々のヒト組織をＫＧＦ−２を
コードする遺伝子の発現について調べた。 種々のヒト組織(Ｈ)またはヒト免疫系組織(ＩＭ)に由来するポリＡ ＲＮＡを
含むマルチプル・ティシュ・ノーザン(Ｍultiple Ｔissue Ｎorthern；ＭＴＮ)
ブロットをＣlontechから入手し、ＥxpressＨybＴＭハイブリダイゼーション溶
液(Ｃlontech)を製造者のプロトコル番号ＰＴ１１９０−１に従って使用するこ
とにより、標識プローブで調べた。ハイブリダイゼーションと洗浄の後、ブロッ
トをフィルムに載せて−７０℃で終夜露出し、標準的な手法でフィルムを現像し
た。 ほとんどのヒト組織に約４.２kbの多量のmＲＮＡ種が観察された。ＫＧＦ−２
mＲＮＡは、心臓、膵臓、胎盤および卵巣に比較的豊富だった。約５.２kbの微
量なmＲＮＡ種も遍在することがわかった。この５.２kb mＲＮＡ種の正体は不明
だった。この５.２kb転写物は、択一的にスプライシングされた形態のＫＧＦ−
２か、ＫＧＦファミリーの第３の要素をコードする可能性がある。ＫＧＦ−２ c
ＤＮＡは４.１kbであり、これは４.２kbのmＲＮＡのサイズと合致する。
【０５１３】 実施例１０ ケラチノサイト増殖アッセイ 皮膚ケラチノサイトは、皮膚の表皮中の細胞である。皮膚におけるケラチノサ
イトの増殖と展開は、創傷治癒の重要な過程である。従って、ケラチノサイトの
増殖アッセイは、タンパク質のケラチノサイト増殖刺激活性(従って、創傷治癒
刺激活性)の貴重な指標である。 しかしケラチノサイトは、試験管内で生育することが難しい。ケラチノサイト
細胞系はわずかしか存在しない。これらの細胞系は、細胞的遺伝的に異なる欠陥
を持っている。生育に重要な増殖因子レセプターの喪失や生育に重要な増殖因子
の欠乏などといった細胞的欠陥によるこのアッセイの複雑化を避けるため、この
アッセイには、初代皮膚ケラチノサイトを選択する。これらの初代ケラチノサイ
トは、Ｃlonetics，Inc. (Ｓan Ｄiego，ＣＡ)から得る。
【０５１４】 アラマーブルーによるケラチノサイト増殖アッセイ アラマーブルー(alamarＢlue)は、培養培地に加えるとミトコンドリアによっ
て代謝される生細胞青色色素である。次いで、この色素は、組織培養上清中で赤
色に変わる。この赤色色素の量は、５７０nＭと６００nＭの光学密度の差を読み
取ることによって直接定量できる。この示数は、細胞活性と細胞数を反映する。 正常な初代皮膚ケラチノサイト(ＣＣ−０２５５，ＮＨＥＫ−Ｎeoプール)は、
Ｃloneticsから購入する。これらの細胞は、継代数２である。ケラチノサイトを
完全ケラチノサイト生育培地(ＣＣ−３００１，ＫＧＭ；Ｃlonetics，Ｉnc. )中
で８０％ コンフルエントに達するまで生育する。これらの細胞を製造者の仕様
書に従ってトリプシン処理する。簡単に述べると、細胞をハンクス平衡塩類溶液
で２回洗浄した。２−３mlのトリプシンを室温で約３−５分間細胞に加えた。ト
リプシン中和液を加え、細胞を集めた。細胞を室温にて６００×ｇで５分間遠心
し、予め温めておいた培地を使って新しいフラスコに１平方センチメートルあた
り３,０００細胞の密度で播種する。 増殖アッセイには、Ｃorningの平底９６ウェルプレートの最も外側の列を除く
各ウェルに１,０００−２,０００個のケラチノサイトを播種する。外側のウェル
を滅菌水２００μlで満たす。これはウェルの温度と湿度の変動を最小限に保つ
のを助ける。細胞を５％ ＣＯ２と共に３７℃で終夜生育する。細胞をケラチノ
サイト基礎培地(ＣＣ−３１０１，ＫＢＭ；Ｃlonetics，Ｉnc. )で２回洗浄し、
１００μlのＫＢＭを各ウェルに加える。２４時間培養する。増殖因子類をＫＢ
Ｍ中に段階希釈法で希釈し、各ウェルに１００μlずつ加える。ＫＧＭを陽性対
照として使用し、ＫＢＭを陰性対照として使用する。各濃度点につき６つのウェ
ルを使用する。２〜３日間培養する。培養終了時に細胞をＫＢＭで１回洗浄し、
使用前に培地に混合した１０％ｖ／ｖ アラマーブルーを含むＫＢＭ １００μl
を加える。培地の色がＫＧＭ陽性対照で赤色に変化しはじめるまで６〜１６時間
培養する。プレートリーダーにプレートを直接置いて、Ｏ.Ｄ. ５７０nＭ−Ｏ.
Ｄ. ６００nＭを測定する。
【０５１５】 結果 ＫＧＦ−２によるケラチノサイト増殖の刺激 ＫＧＦ−２(すなわち上記実施例７および８に記述したようにアミノ酸Ｃys３
７から始まるもの)とＮ末端欠失突然変異体ＫＧＦ−２Δ３３およびＫＧＦ−２
Δ２８が表皮ケラチノサイト増殖を刺激する活性を持つことを立証するために、
正常初代ヒト表皮ケラチノサイトを大腸菌が発現した精製ＫＧＦ−２タンパク質
(バッチ番号Ｅ３)（配列番号２）、ＫＧＦ−２Δ３３(バッチ番号Ｅ１)およびＫ
ＧＦ−２Δ２８(バッチ番号Ｅ２)と共に培養した。ＫＧＦ−２タンパク質は、Ｆ
ＧＦ７／ＫＧＦ−１と同等な約５ng／mlのＥＣ５０で表皮ケラチノサイトの増殖
を刺激した(第２１Ａ図)。これに対し、ＦＧＦ−１やＦＧＦ−２などの他のＦＧ
Ｆ類は、初代ケラチノサイトの増殖を刺激しなかった。ＫＧＦ−２Δ３３に関す
るＥＣ５０は０.２ng／mlで、ＫＧＦ−２Δ２８のＥＣ５０は２ng／mlだった(第
２１ＢおよびＣ図を参照)。このようにＫＧＦ−２は、初代表皮ケラチノサイト
の増殖を刺激する点で、ＦＧＦ７／ＫＧＦと同じぐらい強力だと思われた。しか
しＫＧＦ−２Δ３３は、ケラチノサイト増殖を刺激する点で、上記実施例７およ
び８に記載の"Ｃys(３７)"ＫＧＦ−２やＫＧＦ−２Δ２８よりもさらに強力であ
る。 創傷組織の瘢痕化は、真皮線維芽細胞の過剰増殖を伴う。ＫＧＦ−２の刺激作
用が線維芽細胞ではなくケラチノサイトに特異的であるかどうかを決定するため
に、マウスＢＡＬＢ.c.３Ｔ３線維芽細胞とヒト肺線維芽細胞を試験した。増殖
アッセイでは、どちらのタイプの線維芽細胞もＫＧＦ−２に反応しなかった。従
って、ＫＧＦ−２は、表皮ケラチノサイトに特異的で、線維芽細胞などの間葉細
胞には特異的でない分裂促進物質であると思われた。このことから、ＫＧＦ−２
が創傷組織の瘢痕化を引き起こす可能性は低いことが示唆された。
【０５１６】 実施例１１ Ａ．特定のＦＧＦレセプターを遺伝子導入した細胞に対するＫＧＦ−２の分裂促
進作用 どのＦＧＦレセプターアイソフォームがＫＧＦ−２の増殖作用を媒介するのか
を決定するため、特定のＦＧＦレセプターアイソフォームを発現する細胞に対す
るＫＧＦ−２の作用を、Ｓantos-ＯcＡmpoら，Ｊ. Ｂiol. Ｃhem. ２７１：１７
２６−１７３１（１９９６）に記載の方法に従って試験した。ＦＧＦ７／ＫＧＦ
はＦＧＦＲ２iiib型に結合し、これを特異的に活性化することによって表皮細胞
の有糸分裂誘発を誘導することが知られていた(Ｍikiら，Ｓcience ２５１：７
２−７５（１９９１）)。そこで有糸分裂誘発アッセイにおけるＫＧＦ−２の増
殖作用を、次に挙げるＦＧＦレセプターアイソフォームの一つを発現する細胞を
使って調べた：ＦＧＦＲ１iiib、ＦＧＦＲ２iiib、ＦＧＦＲ３iiib、およびＦＧ
ＦＲ４。
【０５１７】 ＦＧＦレセプターを発現する細胞の有糸分裂誘発アッセイ 特定のＦＧＦレセプターを発現するＢaＦ３細胞のチミジン取り込み実験をＳa
ntos-ＯcＡmpoら，Ｊ. Ｂiol. Ｃhem. ２７１：１７２６−１７３１（１９９６
）に記述されているように行なった。簡単に述べると、特定のＦＧＦレセプター
を発現するＢaＦ３細胞を、ダルベッコ改良イーグル培地、１０％ ウシ新生仔血
清、L−グルタミンで洗浄し、それに再懸濁した。２μg／mlヘパリンを含む培地
が入った９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに約２２,５００個の細胞を播
種した。各ウェルが総体積２００μlになるよう、各ウェルに試験試薬類を加え
た。細胞を３７℃で２日間培養した。次いで、各ウェルに１μＣiの３Ｈ−チミ
ジンを５０μlの体積で加えた。４−５時間後に細胞をガラス繊維紙を通す濾過
によって収集した。取り込まれた３Ｈ−チミジンをＷallacのベータプレートシ
ンチレーションカウンターでカウントした。
【０５１８】 結果 その結果から、３Ｈ−チミジン取り込みが示すように、ＫＧＦ−２タンパク質
(第１図（配列番号２）のＴhr(３６)−Ｓer(２０８)にＮ末端Ｍetが付加したも
の)は、ＫＧＦレセプターＦＧＦＲ２iiibアイソフォームを発現するＢaＦ３細胞
の増殖を強く刺激することが明らかになった(第２２Ａ図)。興味深いことに、Ｆ
ＧＦＲ１iiibアイソフォームを発現するＢaＦ３細胞の増殖に対してＫＧＦ−２
のわずかな刺激作用が観察された。ＫＧＦ−２は、ＦＧＦＲ３iiib型またはＦＧ
ＦＲ４型のレセプターを発現する細胞に対して何の作用も示さなかった。 ＦＧＦ７／ＫＧＦは、ＫＧＦレセプターＦＧＦＲ２iiibアイソフォームを発現
する細胞の増殖を刺激したが、ＦＧＦＲ１iiibアイソフォームを発現する細胞の
増殖は刺激しなかった。ＫＧＦ−２とＦＧＦ７／ＫＧＦの相違は興味深いものだ
った。対照実験では、aＦＧＦは、そのレセプターＦＧＦＲ１iiibおよびiiicを
刺激し、bＦＧＦは、そのレセプターＦＧＦＲ２iiicを刺激した。このようにこ
れらの結果から、ＫＧＦ−２は、ＦＧＦＲ２iiibアイソフォームに結合して有糸
分裂誘発を刺激することが示唆された。ＦＧＦ７／ＫＧＦとは対照的に、ＫＧＦ
−２は、ＦＧＦＲ１iiibアイソフォームをも結合し有糸分裂誘発を刺激する。
【０５１９】 Ｂ．特定のＦＧＦレセプターを遺伝子導入した細胞に対するＫＧＦ−２Δ３３の
分裂促進作用 上に示したように、ＦＧＦ類またはＫＧＦ−１とＫＧＦ−２は共に、ＦＧＦ２
iiibレセプター(ＦＧＦＲ２iiib)に結合し、これを活性化する。有糸分裂誘発ア
ッセイにおけるＫＧＦ−２Δ３３の増殖作用を、次に挙げるＦＧＦレセプターア
イソフォームの一つを発現する細胞を使って調べた：ＦＧＦＲ２iiibまたはＦＧ
ＦＲ２iiic(２iiicレセプターを遺伝子導入した細胞は、陰性対照として含める)
。 これらの実験は、この実施例の上記A項と同様に行なった。簡単に述べると、
１０％ 親ウシ仔ウシ血清(ＢＣＳ−胎仔血清でないもの)、ＷＥＨＩ３細胞(５％
ＢＣＳを含むＲＰＭＩ中で生育)の培養から得た１０％ 調整培地、５０nＭ β-
メルカプトエタノール、Ｌ−Ｇlu(１００×液で２％)およびpen／strep(１００
×液で１％)を含むＲＰＭＩ中でＢaＦ３細胞を生育した。 アッセイのため、１０％ ＢＣＳと１μg／mlヘパリンを含むＲＰＭＩ培地中で
ＢaＦ３細胞を２回洗浄した。１０％ ＢＣＳと１μg／mlヘパリンを含むＲＰＭ
Ｉ培地１５０μlが入った９６ウェルプレートにＢaＦ３細胞(２２,０００個／ウ
ェル)を播種した。酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、ＫＧＦ-1(ＨＧ１５４００)また
はＫＧＦ−２タンパク質(ＨＧ０３４００、０３４０１、０３４１０、または０
３４１１)を約０nＭから１０nＭまでの濃度で添加した。それらの細胞を２００
μlの最終体積中３７℃で４８時間培養した。すべてのアッセイを３つずつ行な
った。トリチウム化チミジン(０.５μＣi)を３７℃で４時間各ウェルに加え、次
いで、ガラス繊維フィルターを通す濾過によって細胞を収集した。次いで、取り
込まれた放射活性の総量を液体シンチレーションカウントによって決定した。次
に挙げる陽性対照を使用した：ＦＧＦＲ２iiic細胞には、塩基性ＦＧＦと酸性Ｆ
ＧＦ；ＦＧＦＲ２iiib細胞には、酸性ＦＧＦとＫＧＦ-1。次に挙げる陰性対照を
使用した：基礎培地(１０％ ＢＣＳと１μg／mlヘパリンを含むＲＰＭＩ培地)。
【０５２０】 結果 その結果から、３Ｈ−チミジン取り込みによって示されるように、ＫＧＦ−２
(Ｎ末端にＭetが付加されているＴhr(３６)−Ｓer(２０８))、ＫＧＦ−２Δ３３
およびＫＧＦ−２Δ２８タンパク質は、ＫＧＦレセプターＦＧＦＲ２iiibアイソ
フォームを発現するＢaＦ３細胞の増殖を強く刺激することが明らかになった(第
２２Ａ−Ｃ図)。ＫＧＦ−２タンパク質は、ＦＧＦＲ２iiic型のレセプターを発
現する細胞には何の作用も示さなかった。これらの結果から、ＫＧＦ−２タンパ
ク質がＦＧＦＲ２iiibアイソフォームに結合して有糸分裂誘発を刺激することが
示唆された。またＫＧＦ−２Δ３３は、ＫＧＦ−２(Ｔhr(３６)−Ｓer(２０８))
以上にＢaＦ３細胞の増殖を刺激することができたようである。
【０５２１】 実施例１２ Ａ．大腸菌に最適化した全長のＫＧＦ−２の構築 大腸菌発現系での全長のＫＧＦ−２の発現レベルを高めるために、遺伝子のア
ミノ末端部分のコドンを使用頻度の高い大腸菌コドンに最適化した。最適化され
たＫＧＦ−２の領域を合成するため、６種類の一連のオリゴヌクレオチド（番号
１−６；配列は後述）を合成した。これらの一部重複オリゴを使って次の条件で
７ラウンドのＰＣＲ反応を行なった： 変性 ９５度 ２０秒 アニーリング ５８度 ２０秒 伸長反応 ７２度 ６０秒 第二ＰＣＲ反応には第一ＰＣＲ反応液１μlを使用し、３'プライマーをＫＧＦ
−２合成プライマー６に、５'プライマーをＫＧＦ−２合成５'ＢamＨＩにして、
上記と同じ条件で２５サイクルに設定した。この最終反応によって生成した産物
をＡvaIIとＢamＨＩで制限消化した。実施例１のＫＧＦ−２構築物をＡvaIIとＨ
indIIIで制限消化し、その断片を単離した。これら２つの断片をＢamＨＩとＨin
dIIIで制限消化したpＱＥ−９に三断片連結法によりクローニングした。
【０５２２】 最適化された合成ＫＧＦ−２ １／２０８の構築に使用したプライマーは次の
通りである：
【化２５】 得られたクローンを第２３図に示す（配列番号３８および３９）。
【０５２３】 Ｂ．大腸菌に最適化した成熟ＫＧＦ−２の構築 大腸菌発現系での成熟型ＫＧＦ−２の発現レベルをさらに高めるために、遺伝
子のアミノ末端部分のコドンを使用頻度が高い大腸菌コドンに最適化した。成熟
型ＫＧＦ-1と一致するように、スレオニン３６から始まる先端切断型のＫＧＦ−
２を構築した。実施例１２Ａで得た大腸菌合成ＫＧＦ−２をテンプレートとし、
５'プライマーにはＢspＨＩ ５' ＫＧＦ−２（配列は後述）を、３'プライマー
にはＨindIII ３' ＫＧＦ−２（配列は後述）を使用してＰＣＲ反応を行なった
。増幅は、上記実施例１２Ａに記述したような標準的条件を使って２５サイクル
行なった。得られた生成物をＢspＨＩとＨindIIで制限消化し、ＮcoＩとＨindII
Iで消化した大腸菌発現ベクターpＱＥ６０にクローニングした。
【化２６】 得られたクローンを第２４図（配列番号４２および４３）に示す。
【０５２４】 Ｃ．もう一つの大腸菌最適化成熟ＫＧＦ−２の構築 大腸菌発現系での成熟型ＫＧＦ−２の発現レベルをさらに高めるために、上記
大腸菌最適化遺伝子のアミノ末端部分にある53アミノ酸のコドンを使用頻度が高
い別の大腸菌コドンに変えた。最適化されたＫＧＦ−２の領域を合成するため、
６種類の一連のオリゴヌクレオチド（番号１８０６２、１８０６１、１８０５８
、１８０６４、１８０５９、および１８０６３；配列は後述）を合成した。これ
らの一部重複オリゴを使って次の条件で７ラウンドのＰＣＲ反応を行なった： 変性 ９５度 ２０秒 アニーリング ５８度 ２０秒 伸長反応 ７２度 ６０秒
【０５２５】 ７ラウンドの合成に続いて、その領域に対する５'プライマー１８１６９とそ
の全領域に対する３'プライマー１８０６０を、上記６種類のオリゴヌクレオチ
ドによる初反応から得た１マイクロリットルを含むＰＣＲ反応に加えた。この産
物は次の条件を使って３０ラウンド増幅した： 変性 ９５度 ２０秒 アニーリング ５５度 ２０秒 伸長反応 ７２度 ６０秒
【０５２６】 第二ＰＣＲ反応は、遺伝子の３'領域を、プライマー１８０６６と１８０６５
を使って上と同じ条件下に２５ラウンド増幅するように設定した。得られた生成
物をアガロースゲルで分離した。生成物を含むゲル切片を１０mＭ トリス、1mＭ ＥＤＴＡ(pＨ ７.５)に希釈した。希釈した各ゲル切片から得たそれぞれ１マイ
クロリットルを使用し、５'プライマーにはプライマー１８１６９を、３'プライ
マーにはプライマー１８０６５を使ってさらなるＰＣＲ反応を行なった。この産
物は、上と同じ条件を使って２５サイクル増幅した。この最終反応によって生成
した産物をＥcoＲＩとＨindIIIで制限消化し、やはりＥcoＲＩとＨindIIIで切断
したpＱＥ６０にクローニングした(pＱＥ６)。 ５'合成プライマーの配列：
【化２７】 合成ＫＧＦ−２遺伝子の配列とそれに対応するアミノ酸を第２４Ｂ図（配列番
号５４および５５）に示す。
【０５２７】 実施例１３ ＫＧＦ−２欠失突然変異体の構築 実施例１２Ａで得た最適化したＫＧＦ−２構築物をテンプレートとして、ＫＧ
Ｆ−２遺伝子の５'末端と３'末端から欠失突然変異体を構築した。欠失部位は、
大腸菌での発現に悪影響をあたえないと思われる遺伝子の領域に基いて選択した
。５'欠失体については、後述のプライマーを５'プライマーとして使用した。こ
れらのプライマーは、表記の制限部位と開始メチオニンをコードするＡＴＧとを
含有する。３'プライマーには、ＫＧＦ−２(ＦＧＦ−１２)２０８アミノ酸３'
ＨindIIIプライマーを使用した。実施例１２に示したような標準的条件を用いて
、２５ラウンドのＰＣＲ増幅を行なった。ＫＧＦ−２ ３６aa／２０８aa欠失突
然変異体用の産物は、５'部位についてはＢspＨＩで、３'部位についてはＨindI
IIで制限消化し、ＢspＨＩとＨindIIIで消化しておいたpＱＥ６０にクローニン
グした。その他の産物はすべて、５'制限酵素としてのＮcoＩと、３'部位につい
てはＨindIIIで制限消化し、ＮcoＩとＨindIIIで消化しておいたpＱＥ６０にク
ローニングした。ＫＧＦ−２(ＦＧＦ−１２)については、５'プライマーとして
のＦＧＦ−１２ ３６aa／２０８aaと共に、３６aa／１５３aaおよび１２８aa ３
' ＨindIIIを３'プライマーとして使用した。ＦＧＦ−１２ ６２aa／１５３aaに
ついては、５'プライマーとしてのＦＧＦ−１２ ６２aa／２０８aaと共に、１２
８aa ３' ＨindIIIを３'プライマーとして使用した。得られたクローンの名称は
、その欠失によって得られたポリペプチドの最初と最後のアミノ酸を示している
。例えばＫＧＦ−２ ３６aa／１５３aaは、その欠失突然変異体の最初のアミノ
酸がＫＧＦ−２のアミノ酸３６であり、最後のアミノ酸がアミノ酸１５３である
ことを示している。また第２５−３３図に示すように、各突然変異体は、そのＮ
末端にＭetが付加されている。 欠失プライマーの配列：
【化２８】 ５' ＮcoＩおよび３' ＨindIII、上記の通り。
【０５２８】 得られた欠失突然変異体の配列を第２５−３３図［配列番号６５−８２］に記
載する。大腸菌でＫＧＦ−２Δ２８（アミノ酸６３−２０８）を発現する場合、
グアニジン塩酸塩（Ｇu−ＨＣｌ）のようなプロテアーゼ抑制剤を用いて蛋白質
の分解を防ぐ。例えば、大腸菌ペーストを５０ｍＭトリス-アセテート、１０ｍ
ＭＥＤＴＡ−ＮＡ２、ｐＨ７．７±０．２に再懸濁させ、ついで細胞溶解させる
。細胞溶解させた懸濁液を等量の１．０ＭＧｕ−ＨＣｌ溶液で処理し、２〜８℃
でゆるやかに２〜４時間攪拌する。ついで懸濁液を遠心し、精製用第１カラムに
加える前に濾過する。ＳＰ−セファロースＦＦカラムにて最初の濾過を行ない、
塩グラジエントにて結合したＫＧＦ−２を溶出させる。得られたＳＰ−セファロ
ース溶出プールを希釈し、０．２μｍ濾過し、フラクトゲルＣＯＯ−(Ｓ)カラム
にかける。塩グラジエントにて溶出し、溶出液プールをダイアフィルトレーショ
ンに付し、バッファー中に濃縮する。
【０５２９】 実施例１４ ＫＧＦ−２のシステイン突然変異体の構築 Ｃ−３７突然変異プライマー５４５７ ５' ＢspＨＩと５２５８ １７３aa ３'
ＨindIIIの構築により、実施例１２Ａで得たＫＧＦ−２(ＦＧＦ−１２)テンプ
レートを増幅した。プライマー５４５７ ５' ＢspＨＩは、システイン３７をセ
リンに変える。増幅は、上記実施例１２Ａに概説した標準的条件を使って２５サ
イクル行なった。得られた産物をＢspＨＩとＨindIIIで制限消化し、ＢspＨＩと
ＨindIIIで消化した大腸菌発現ベクターpＱＥ６０にクローニングした(第３４図
)［配列番号８３］。 システイン１０６をセリンに突然変異させるため、このシステインのオリゴヌ
クレオチド部位特異的突然変異誘発用に２つのＰＣＲ反応を設定した。一つの反
応では、５４５３ ＢspＨＩを５'プライマーとして使用し、５４５５をその反応
の３'プライマーとして使用した。第二の反応では、５４５６を５'プライマーと
して使用し、５２５８ ＨindIIIを３'プライマーとして使用した。これらの反応
は、実施例１２に記述したような標準的条件下に２５ラウンド増幅した。これら
ＰＣＲ反応のそれぞれから得た1μlをテンプレートとし、５'プライマーとして
５４５３ ＢspＨＩを、３'プライマーとして５２５８ ＨindIIIを使用して次の
反応を行なった。実施例１２に記述したような標準的条件を使って２５ラウンド
の増幅を行なった。得られた産物をＢspＨＩとＨindIIIで制限消化し、ＮcoＩと
ＨindIIIで制限消化した大腸菌発現ベクターpＱＥ６０にクローニングした。
【０５３０】 Ｃ−３７／Ｃ−１０６突然変異体を作成するには、２つのＰＣＲ反応が必要だ
った。システイン３７からセリンへの置換を含むこの突然変異体の５'領域を作
成するには、プライマー５４５７ ＢspＨ1と５４５５を使用し、システイン１０
６からセリンへの置換を含むこの突然変異体の３'領域を作成するには、プライ
マー５４５６と５２５８ ＨindIIIを使用した。第二の反応では、５４５７ Ｂsp
ＨＩプライマーを５'プライマーとして使用し、５２５８ ＨindIIIプライマーを
３'プライマーとして使用することにより、各初反応から得た1μlを合わせてテ
ンプレートとして、Ｃ−３７／Ｃ−１０６突然変異体を作成した。このＰＣＲ産
物をＢspＨＩとＨindIIIで制限消化し、ＮcoＩとＨindIIIで制限消化しておいた
pＱＥ６０にクローニングした。得られたクローンを第３５図（配列番号８４）
に示す。
【０５３１】 システイン突然変異体プライマーの配列：
【化２９】
【０５３２】 実施例１５ ＫＧＦ(ＦＧＦ−１２)の生産と精製 実施例１２Ｂに記載の最適化された成熟タンパク質(すなわちＫＧＦ−２のア
ミノ酸Ｔ３６からＳ２０８まで)をコードするＤＮＡ配列をプラスミドpＱＥ−９
(Ｑiagen)にクローニングした。１００μg／mlアンピシリンと２５μg／mlカナ
マイシンを含むＬＢ中３７℃で大腸菌(Ｍ１５／rep４；Ｑiagen)を定常期まで終
夜生育した。この培地を、１００μg／mlアンピシリンと２５μg／mlカナマイシ
ンを含む新しいＬＢ培地の接種に、１：５０の希釈率で使用した。その細胞をＯ
.Ｄ.５９５が０.７になるまで３７℃で生育し、最終濃度１mＭのイソプロピル−
１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)の添加によって誘導した。３
−４時間後、細胞を遠心分離によって収集し、６０mＭ ＮaＰＯ４と３６０mＭ
ＮaＣlを含む緩衝液に緩衝液５体積部：細胞ペースト１体積部の割合で再懸濁し
た。Ｍautin−Ｇaulinホモジナイザーで破砕した後、ＮaＯＨの添加によってそ
の抽出物をpＨ ８.０に調節し、遠心分離によって清浄化した。
【０５３３】 清浄化した可溶性抽出物をＰoros ＨＳ−５０カラム(２.０×１０.０cm；Ｐer
Ｓeptive Ｂiosystems，Ｉnc. )にのせ、結合したタンパク質を０.５Ｍ、１.０
Ｍ、および１.５ＭのＮaＣlを含む５０mＭ ＮaＰＯ４(pＨ ８.０)で段階的に溶
出した。ＫＧＦ−２は、１.５Ｍ塩画分に溶出した。次いで、これを５０mＭ Ｎa
ＰＯ４(pＨ ６.５)で５倍に希釈して、最終塩濃度を３００mＭにした。次いで、
このＫＧＦ−２含有画分をＰoros ＨＱ−２０カラム(２.０×７.０cm；ＰerＳep
tive Ｂiosystems，Ｉnc. )に通し、続いてＰoros ＣＭ−２０カラム(２.０×９
.０cm；ＰerＳeptive Ｂiosystems，Ｉnc. )に通して、そこに結合させた。約５
００mＭ−約７５０mＭ ＮaＣlで溶出したＫＧＦ−２(ＦＧＦ−１２)含有画分を
集め、再びＣＭ−２０カラムにかけることによって濃縮した。最後にそのタンパ
ク質を４０mＭ ＮaＯＡc(pＨ ６.５)／１５０mＭ ＮaＣlのゲルろ過カラム(Ｓ−
７５；Ｐharmacia)で分離した(バッチＥ−５)。これとは別に、ゲルろ過カラム
をリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)でも行なった(バッチＥ−４)。ＫＧＦ−２含有画分
を集め、タンパク質濃度をＢio−Ｒadプロテインアッセイで測定した。タンパク
質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度＞９０％と判断された。最後にエンドトキシンレ
ベルをリムルスアメボサイトライゼートアッセイ(カブトガニ遊走細胞分解産物
試験；Ｃape Ｃod Ａssociates)によって測定したところ、内毒素レベルは≦１
Ｅu／mgであることがわかった。この方法で調製したタンパク質は、ＦＧＦファ
ミリー構成要素の特徴であるヘパリン結合能を有した。
【０５３４】 実施例１６ Ａ．Ｎ末端欠失突然変異体ＫＧＦ−２Δ３３の構築 大腸菌でのＫＧＦ２の発現レベルを高めるため、また大腸菌が発現したＫＧＦ
２の溶解性と安定性を強化するために、プレプロセシングされた(pre-processed
)ＫＧＦ２の最初の６８アミノ酸を欠く欠失変異種ＫＧＦ−２Δ３３(ＫＧＦ−２
aa６９−２０８)を作成した。この欠失変異種を作成する理論的根拠は、次の観
察結果に基いている。第一に、成熟ＫＧＦ２(ＫＧＦ−２ aa３６−２０８)は、
奇数個(３個)のシステイン残基を含有し、これらは分子内ジスルフィド橋形成に
よる凝集につながりうる。ＫＧＦΔ３３欠失変異種は２つのシステイン残基しか
含まず、これにより分子内ジスルフィド橋形成とそれに続く凝集の可能性が減少
する。凝集の減少は、活性なＫＧＦ２タンパク質の収率の増大につながるはずで
ある。第二に、ＫＧＦΔ３３欠失変異種は、ＫＧＦ−１には存在せず活性にとっ
ては重要でないと思われるが大腸菌における当該タンパク質の発現を妨げるであ
ろうポリセリン区間を欠く。従って、ポリセリン区間の除去は、活性なＫＧＦ−
２タンパク質の発現レベルを高めるだろう。第三に、大腸菌でＫＧＦΔ３３を発
現させると、ＫＧＦ−２の残基６８と残基６９の間は初めから切断されているこ
とになる。従って、ＫＧＦ２Δ３３は、大腸菌中で効率よくプロセシングされ、
大腸菌中で安定だろうと予想される。
【０５３５】 pＱＥ６中のＫＧＦ２Δ３３の構築 ポリメラーゼ連鎖反応による増幅とＫＧＦ−２Δ３３の大腸菌タンパク質発現
ベクターpＱＥ６へのサブクローニングを可能にするため、ＫＧＦ２の所望の領
域に相補的な次の配列を持つ２種類のオリゴヌクレオチドプライマー(５９５２
と１９１３８)を合成した。
【化３０】
【０５３６】 Ｎ末端プライマー(５９５２)にはＡflIII制限部位を組み込み、Ｃ末端プライ
マー(１９１３８)にはＨindIII制限部位を組込んだ。プライマー５９５２は、ク
ローニングした断片の大腸菌での翻訳が可能なようにＫＧＦ２コード領域に隣接
しかつ同じ読み枠でＡＴＧ配列をも含有する。一方、プライマー１９１３８は、
ＫＧＦ２コード領域に隣接しかつ読み枠が一致した２つの停止コドン(大腸菌で
優先的に使用されるもの)を含み、これによって大腸菌での正しい翻訳の終結が
保証される。 ポリメラーゼ連鎖反応は、成熟ＫＧＦ−２(aa３６−２０８)のヌクレオチド配
列(実施例１２Ｃで構築したもの)をテンプレートとし、当業者によく知られてい
る標準的な条件を用いて行った。得られたアンプリコンをＡflIIIとＨindIIIで
制限消化し、ＮcoＩ／ＨindIIIで消化したpＱＥ６タンパク質発現ベクターにサ
ブクローニングした。
【０５３７】 pＨＥ１中のＫＧＦ２Δ３３の構築 ポリメラーゼ連鎖反応による増幅とＫＧＦ２Δ３３の大腸菌発現ベクターpＨ
Ｅ１へのサブクローニングを可能にするため、ＫＧＦ２の所望の領域に対応する
次の塩基配列を持つ２種類のオリゴヌクレオチドプライマー(６１５３と６１５
０)を合成した。
【化３１】
【０５３８】 Ｎ末端プライマー(６１５３)にはＮdeＩ制限部位を組み込み、Ｃ末端プライマ
ー(６１５０)にはＡsp７１８制限部位を組込んだ。プライマー６１５３は、クロ
ーニングした断片の大腸菌での翻訳が可能なように、ＫＧＦ２コード領域に隣接
しかつ同じ読み枠でＡＴＧ配列をも含有する。一方、プライマー６１５０は、Ｋ
ＧＦ２コード領域に隣接しかつ同じ読み枠で2つの停止コドン(大腸菌で優先的に
使用されるもの)を含み、これにより大腸菌での正しい翻訳の終結が保証される
。 ポリメラーゼ連鎖反応は、成熟ＫＧＦ−２(aa３６−２０８)のヌクレオチド配
列(実施例１２Ｃで構築したもの)をテンプレートとし、当業者によく知られてい
る標準的条件を用いて行なった。得られたアンプリコンをＮdeＩとＡsp７１８で
制限消化し、ＮdeＩ／Ａsp７１８で消化したpＨＥ１タンパク質発現ベクターに
サブクローニングした。
【０５３９】 ＫＧＦ２Δ３３のヌクレオチド配列
【化３２】 ＫＧＦΔ３３のアミノ酸配列：
【化３３】
【０５４０】 Ｂ．最適化されたＫＧＦ−２Δ３３の構築 大腸菌でのＫＧＦ２Δ３３の発現レベルを高めるために、全遺伝子のコドンを
大腸菌で最も使用頻度が高いものと合致するように最適化した。ＫＧＦ２Δ３３
の作成に使用したテンプレートは、Ｎ末端領域のコドンが最適化されているので
、Ｃ末端アミノ酸(８４−２０８)を最適化する必要があった。 まずアミノ酸１７２−２０８のコドンを最適化してＫＧＦ２Δ３３(s１７２−
２０８)を作成した。これは、オーバーラッピングＰＣＲ法によって達成した。
オリゴヌクレオチドＰＭ０７とＰＭ０８(アミノ酸１７２−２０８に対応)を混合
し、それらを７０℃に加熱することによって両者をアニーリングし、それらを３
７℃に冷ました。次いで、アニールしたオリゴヌクレオチドをテンプレートとし
て、プライマーＰＭ０９とＰＭ１０による標準的ＰＣＲ反応を行なった。ＫＧＦ
２Δ３３をテンプレートとし当業者によく知られている標準的条件に従って行な
った別個のＰＣＲ反応では、オリゴヌクレオチドＰＭ０５(これは、ＫＧＦ２の
コード領域内にあるＰstＩ部位と一部重複する)とＰＭ１１を使って、アミノ酸
８４−１７２に対応するＫＧＦ２の領域を増幅した。第三のＰＣＲ反応では、第
一ＰＣＲ反応の産物(コドンが最適化されたアミノ酸１７２−２０８に相当する)
と第二ＰＣＲ反応の産物(コドンが最適化されていないアミノ酸８４−１７２に
相当する)を混合し、それらをテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＰＭ０
５とＰＭ１０による標準的ＰＣＲ反応を行なった。得られたアンプリコンをＰst
Ｉ／ＨindIIIで消化し、ＰstＩ／ＨindIIIで消化したpＱＥ６ＫＧＦ２Δ３３に
サブクローニングすることにより、対応する非コドン最適化領域を効果的に置換
し、pＱＥ６ＫＧＦ２Δ３３(s１７２−２０８)を得た。
【０５４１】 ＫＧＦ２のコドン最適化を完了するため、アミノ酸８４−１７２に対応するＫ
ＧＦ２の領域についてコドンが最適化された合成遺伝子を、重複オリゴヌクレオ
チド群を使用して作成した。まず、4種類のオリゴヌクレオチド(ＰＭ３１、ＰＭ
３２、ＰＭ３３、およびＰＭ３４)を組み合せて、次の７サイクルのＰＣＲを行
なった：９４℃、３０秒；４６.５℃、３０秒；７２℃、３０秒。 次いで、プライマーＰＭ３５とＰＭ３６による第二ＰＣＲ反応を、１μlの第
一ＰＣＲ反応液をテンプレートとして使用して標準的手法に従って行なった。次
いで、得られたコドン最適化遺伝子断片をＰstＩ／ＳalIで消化し、ＰstＩ／Ｓa
lIで消化したpＱＥ６ＫＧＦ２Δ３３(s１７２−２０８)にサブクローニングする
ことにより、完全に最適化されたＫＧＦ２コード領域pＱＥ６ＫＧＦ２Δ３３sを
作成した。 これに代わる大腸菌タンパク質発現ベクターを作成するため、pＱＥ６ＫＧＦ
２Δ３３sに対してプライマーＰＭ１０２とＰＭ１３０を使用することにより、
ＫＧＦ２Δ３３sをＰＣＲ増幅した。得られたアンプリコンをＮdeＩとＥcoＲＶ
で消化し、ＮdeＩとＡsp７１８で消化しておいたpＨＥ１発現ベクター(平滑末端
化したもの)にサブクローニングすることにより、pＨＥ１Δ３３sを作成した。
【０５４２】 コドン最適化ＫＧＦ２Δ３３sの構築に使用したオリゴヌクレオチド配列は次
の通りである。
【化３４】
【化３５】 ＫＧＦ２Δ３３(s１７２−２０８)のヌクレオチド配列：
【化３６】 ＫＧＦ２Δ３３(s１７２−２０８)のアミノ酸配列
【化３７】 Ｃ．Ｎ末端欠失突然変異体ＫＧＦ−２Δ４の構築 大腸菌でのＫＧＦ２の発現レベルを高めるため、また大腸菌が発現したＫＧＦ
２の安定性と溶解性を強化するために、プレプロセシングされたＫＧＦ２の最初
の３８アミノ酸(３７番目のシステインを含む)を欠く欠失変異種ＫＧＦ２Δ４(
アミノ酸３９−２０８)を構築した。得られたＫＧＦ２欠失分子は偶数個のシス
テインを含むので、分子内ジスルフィド橋形成が引き起こす凝集による問題は減
少し、活性なタンパク質の発現レベルが高まることになるはずである。 ポリメラーゼ反応による増幅とＫＧＦ２Δ４の大腸菌タンパク質発現ベクター
pＱＥ６へのサブクローニングを可能にするため、次の塩基配列を持つ２種類の
オリゴヌクレオチドプライマー(ＰＭ６１と１９１３８)を合成した。
【化３８】
【０５４３】 Ｎ末端プライマー(ＰＭ６１)にはＮcoＩ制限部位を組み込み、Ｃ末端プライマ
ー(１９１３８)にはＨindIII制限部位を組込んだ。ＰＭ６１は、クローニングし
た断片が大腸菌で翻訳されうるように、ＫＧＦ２コード領域に隣接しかつ読み枠
が一致したＡＴＧ配列をも含有する。一方、１９１３８は、ＫＧＦ２コード領域
に隣接しかつ読み枠が一致した停止コドン(大腸菌で優先的に使用されるもの)を
含み、これは大腸菌での正しい翻訳の終結を保証する。 ポリメラーゼ連鎖反応は、全長のＫＧＦ２(aa３６−２０８)(実施例１２Ｃで
構築したもの)をテンプレートとし、当業者によく知られている標準的条件を用
いて行なった。得られたアンプリコンをＮcoＩとＨindIIIで消化し、ＮcoＩ／Ｈ
indIIIで消化したpＱＥ６タンパク質発現ベクターにサブクローニングした。
【０５４４】 ＫＧＦ２Δ４のヌクレオチド配列：
【化３９】 ＫＧＦ２Δ４のアミノ酸配列：
【化４０】
【０５４５】 実施例１７ 正常ラットにおける創傷治癒のＫＧＦ−２Δ３３による刺激 ＫＧＦ−２Δ３３が治癒過程を加速することを立証するため、次のモデルを用
いて切除創傷の創傷治癒を調べた。 キーズ皮膚穿孔具を使ってスプレーグ・ドーリーラット(ｎ＝５)の背中に６m
Ｍの切除創傷を作る。その創傷を開放状態にしておき、様々な濃度のＫＧＦ−２
Δ３３(４０mＭ ＮaＯＡcと１５０mＭ ＮaＣlのpＨ ６.５緩衝液中)と緩衝液(４
０mＭ ＮaＯＡcおよび１５０mＭ ＮaＣl，pＨ ６.５)で、創傷形成の日から始め
て４日間処置する。較正済ジェームソンキャリパーを用いて創傷を毎日計測する
。創傷のサイズは、平方ミリメートルで表わす。最終日に創傷を計測し、さらに
分析するため、それを採取した。統計分析は、独立t検定を使って行なった(平均
±ＳＥＭ)。評価パラメーターには、創傷閉鎖率、組織学的スコア(１−３ わず
かな細胞集積、肉芽形成なし；４−６ 未熟な肉芽形成、炎症性細胞、毛細管；
７−９ 肉芽組織、細胞、線維芽細胞、新しい上皮；１０−１２ 線維芽細胞、コ
ラーゲン、上皮を伴う成熟した皮膚)、再上皮化および免疫組織化学を含める。 創傷形成の３日後に、ＫＧＦ−２Δ３３による処置は、緩衝液対照の３８.９m
Ｍ２と比較して、創傷サイズの減少(４μgで３０.４mＭ２、p＝０.００６；１μ
gで３３.６mＭ２、p＝０.０００７)を示した。創傷形成後４日に、ＫＧＦ−２Δ
３３による処置は、緩衝液対照の３３.８mＭ２と比較して、創傷サイズの減少(
０.１μgで２７.２mＭ２、p＝０.０２；０.４μgで２７.９mＭ２、p＝０.０４)
を示した。創傷形成後５日に、ＫＧＦ−２Δ３３による処置は、緩衝液対照の２
５.１mＭ２と比較して、創傷サイズの減少(４μgで１８.１mＭ２、p＝０.０２)
を示した。第３６図を参照。
【０５４６】 第５日に創傷を採取した後、さらなるパラメーターを評価した。ＫＧＦ−２Δ
３３は、緩衝液対照６０.２％と比較して、４μgで創傷閉鎖率の増加(７１.２％
、p＝０.０２)を示した。ＫＧＦ−２Δ３３の投与は、緩衝液対照の６.４と比較
して、１μgと４μgで組織学的スコアの改善(１μgで８.４、p＝０.００５;４μ
gで８.５、p＝０.０４)をももたらす。再上皮化も、緩衝液対照の９２３μmと比
較して、１μgと４μgのＫＧＦ−２Δ３３で改善された(１μgで１３８９μm、p
＝０.００７；４μgで１２２０μm、p＝０.０２)。第３７図を参照。 この試験は、ＫＧＦ−２Δ３３で毎日処置することにより、全創傷面積の減少
が示すように、正常動物における創傷治癒速度が加速されることを立証している
。また、創傷標本の組織学的評価と再上皮化の評価も、ＫＧＦ−２Δ３３がこの
正常ラットモデルにおける治癒速度を改善することを示している。
【０５４７】 実施例１８ 正常ラットにおける引張り強さと表皮厚に対するＫＧＦ−２Δ３３の作用 ＫＧＦ−２Δ３３が創傷の引張り強さと表皮厚を増大させることを立証するた
め、次の実験を行なった。 ２.４cmの全層正中線切開創傷を雄のスプレーグ・ドーリーラット(ｎ＝８また
は９)の背中に作る。皮膚切開は、等間隔の３つの皮膚ステープルで閉じる。緩
衝液(４０mＭ ＮaＯＡcおよび１５０mＭ ＮaＣl，pＨ ６.５)またはＫＧＦ−２
Δ３３(４０mＭ ＮaＯＡcおよび１５０mＭ ＮaＣlのpＨ ６.５緩衝液中)を創傷
形成時に局所的に適用した。幅０.５cmの４本の創傷片を第５日に摘出する。そ
れらの標本を、ＩnstronＴＭ皮膚張力計による破壊強さの試験、ヒドロキシプロ
リン測定および病理組織学的評価に使用する。破壊強さは、破断前に各創傷が堪
えた最大の力と定義した。統計分析は、独立t検定を用いて行なった(平均±ＳＥ
)。 切開皮膚ラットモデルにおいて、局所適用されたＫＧＦ−２Δ３３は、創傷形
成後の単回の切開内適用の結果として、統計的に有意な破壊強さ、引張り強さお
よび上皮厚の増大を示した。ある試験では、１、４、および１０μgのＫＧＦ−
２で処置した創傷の破壊強さが緩衝液対照と比較して有意に高かった(１μgで１
０７.３ｇ、p＝０.０００６；４μgで１２６.４ｇ、p＜０.０００１；１０μgで
１２３.８ｇ、p＜０.０００１)。第３８図を参照。 表皮厚は、マッソン三重染色切片で光学顕微鏡下に評価した。ＫＧＦ−２Δ３
３で処置した創傷は、緩衝液対照が５４.８ミクロンであったのに対して、増加
した表皮肥厚(１μgで６６.５１ミクロン；４μgで６６.５１ミクロン、p＝０.
０１；１０μgで５９.６ミクロン)を示した。第３９図を参照。 これらの試験は、ＫＧＦ−２の単回切開内適用が、切開創傷の破壊強さと表皮
厚の増大を特徴とする創傷治癒過程を強化および加速することを立証している。
【０５４８】 実施例１９ 正常ラット皮膚に対するＫＧＦ−２Δ３３の作用 ＫＧＦ−２Δ３３がその皮内注射後に正常なラット皮膚に与える作用を決定す
るため、次の実験を行なった。 第０日に、雄の成体ＳＤラット(ｎ＝３)にプラシーボか、５０μl中１μgおよ
び４μg濃度のＫＧＦ−２Δ３３(４０mＭ ＮaＯＡcと１５０nＭ ＮaＣlのpＨ ６
.５緩衝液中)を６回皮内注射した。２４時間および４８時間の時点で犠牲にする
２時間前に、５−２'−ブロモ-デオキシウリジン(ＢrdＵ)(腹腔内１００mg／kg)
を動物に注射した。表皮厚を顆粒層から基底層の底面まで測定した。注射部位に
沿って約２０回の測定を行い、平均厚を見積もった。測定は、マッソン三重染色
切片で光学顕微鏡下に較正済マイクロメーターを使って行なった。ＢrdＵ採点は
、盲検観察者２人が光学顕微鏡下に次の採点法を用いて行なった：０−３ Ｂrd
Ｕ標識細胞なし〜ごくわずか；４−６ 中等度の標識；７−１０ 強い標識細胞。
注射の２４時間後と４８時間後に動物を犠牲にした。統計分析は、独立t検定を
使って行なった。(平均±ＳＥ)。 ＫＧＦ−２Δ３３で処置した皮膚は、緩衝液対照が２７.１ミクロンだったの
に対して、２４時間で増大した表皮肥厚を示した(１μgで３２.２ミクロン、p＜
０.００１；４μgで３５.４ミクロン、p＜０.０００１)。４８時間では、緩衝液
対照の２７.８ミクロンと比較して、ＫＧＦ−２Δ３３で処置した皮膚は、増大
した表皮肥厚(１μgで３４.０ミクロン、p＝０.０００３；４μgで４２.４ミク
ロン、p＜０.０００１)を示した。第４０図を参照。またＫＧＦ−２Δ３３で処
置した皮膚は、４８時間で、緩衝液対照の３.３３と比較して増大したＢrdＵ免
疫染色を示した(１μgで４.７３、p＝０.０７；４μgで６.８５、p＜０.０００
１)。第４１図を参照。 これらの試験は、ＫＧＦ−２の皮内注射が、表皮肥厚を強化し加速することを
立証している。従って、ＫＧＦ−２は、しわの予防または緩和、老化した肌の改
善、瘢痕化の軽減、または美容外科からの治癒の改善に応用されるだろう。また
ＫＧＦ−２は、化学療法やその他の薬剤に反応しておこる腸炎、口腔粘膜炎(口
内炎)を防止もしくは軽減するために予防的に使用することもできる。
【０５４９】 実施例２０ ＰＡＦ誘導性足浮腫に対するＫＧＦ−２の抗炎症作用 ＫＧＦ−２の抗炎症作用を立証するため、ＰＡＦ誘導性足浮腫炎症モデルを用
いて次の実験を行なった。 ルイスラット(１９０〜２１０g)４匹の群に、２.５nＭolのＰＡＦと１２５μg
のＣkb−１０(Ｂ５)、２４μgのＬＰＳもしくは７３μgのＫＧＦ−２(Ｎ末端Ｍe
tを持つ第１図（配列番号２）のＴhr(３６)−Ｓer(２０８))とを含む(またはタ
ンパク質なしの)溶液１２０μlを右後足の足蹠に皮下注射した。左後足には同量
の緩衝液を投与し、並行対照として使用した。足体積をＰＡＦ注射の直前、３０
分後および９０分後にプレチスモグラフシステムを使って定量した。足体積変化
率(％)を計算した。
【０５５０】
【表４】 実験番号１および２における試験試薬
【０５５１】 第４２図に示すように、ＰＡＦのみを注射した右後足は、予想通り注射後０.
５時間で足体積に有意な増加をもたらした(実験番号１または２でそれぞれ７５
または１００％)が、緩衝液を投与した左後足もしくはＬＰＳまたはＳＥＢのみ
を与えた右後足は、浮腫の症状をほとんど示さなかった(非開示データ)。しかし
、ＫＧＦ−２をＰＡＦと共に局所投与すると、ＰＡＦのみで攻撃した足と比較し
て足体積にかなりの減少(実験番号１または２でそれぞれ２５または５０％)が起
る。Ｃkb−１０(別のタンパク質)、ＬＰＳまたはＳＥＢ(これら2つは炎症メディ
エーター)と共にＰＡＦを投与した動物には、足浮腫の軽減は観察されなかった
。これらの結果から、ＫＧＦ−２の抗炎症作用が特異的であり、このタンパク質
の何らかの非特異的性質によるのではないことが示唆される。
【０５５２】 ラットにおけるＰＡＦ誘導性足浮腫に対するＫＧＦ−２Δ３３の作用 ＫＧＦ−２Δ３３を使用して、ケラチノサイト増殖の刺激に関するその試験管
内生物活性と、創傷治癒に対するその生体内作用とを確認するために、上述の実
験に行なうことにより、さらにＫＧＦ−２Δ３３をラットのＰＡＦ誘導性足浮腫
モデルで評価した。ルイスラット(１９０〜２１０ｇ)４匹の群に、２.５nＭolの
ＰＡＦと２１０μgのＫＧＦ−２Δ３３またはアルブミンとを含む溶液１２０μl
を右後足の足蹠に皮下注射した。左後足には、同量の緩衝液、アルブミン、また
はＫＧＦ−２Δ３３のみを投与し、並行対照として使用した。ＰＡＦ注射後様々
な間隔でプレチスモグラフシステムを使って足体積を定量した。足体積の変化率
(％)を計算した。 第４３図に示すように、ＰＡＦとアルブミンを注射した右後足は、予想通り、
注射後０.５時間で足体積の有意な増加(７５％)をもたらしたが、緩衝液、アル
ブミンまたはＫＧＦ−２Δ３３のみを投与した左後足は、浮腫の症状をほとんど
示さなかった。しかしＫＧＦ−２Δ３３をＰＡＦと共に局所投与すると、ＰＡＦ
とアルブミンとで攻撃した足と比較して足体積にかなりの減少(平均２０％)が４
時間で終了した全実験期間にわたって観察された。これらの結果から、ＫＧＦ−
２Δ３３の抗炎症性が確認される。
【０５５３】
【表５】 試験試薬 従って、ＫＧＦ−２は、炎症をその疾患の重要な病因とする急性および慢性の
状態、例えば乾癬、湿疹、皮膚炎および／または関節炎など(ただしこれらに限
らない)の治療に役立つ。
【０５５４】 実施例２１ 端々結腸吻合ラットモデルに対するＫＧＦ−２Δ３３の作用 この実施例では、ＫＧＦ−２Δ３３がウィスターラットまたはスプレーグ・ド
ーリーラットの腸または結腸吻合モデルにおける腸管修復速度を上昇させること
を示す。 実験的に吻合術を施したラットの使用は、よく特徴づけられた適切な再現性あ
る手術創治癒のモデルである。このモデルは、結腸および小腸での手術創治癒の
質や速度に対する長期ステロイド治療の影響や種々の化学療法の影響を調べるた
めに拡大することもできる(Ｍastboom Ｗ. Ｊ. Ｂ. ら，Ｂr. Ｊ. Ｓurg. ７８
：５４−５６（１９９１）；Ｓalm Ｒ. ら，Ｊ. Ｓurg. Ｏncol. ４７：５−１
１（１９９１）；Ｗeiber Ｓ. ら，Ｅur. Ｓurg. Ｒes. ２６：１７３−１７８
（１９９４）)。吻合部の治癒は、身体の他の部位での創傷治癒に似ている。治
癒の初期相は、急性炎症とそれに続く線維芽細胞増殖およびコラーゲンの合成を
特徴とする。コラーゲンは徐々に形作られ、新しいコラーゲンが合成されるにつ
れて、創傷は強化される(Ｋoruda Ｍ. Ｊ. およびＲolandelli, Ｒ. Ｈ. Ｊ. Ｓ
urg. Ｒes. ４８：５０４−５１５（１９９０）)。吻合部漏洩などのほとんどの
術後合併症は、手術後最初の数日間−すなわち結腸の強度が主として創縁が縫合
糸を保持する能力によって確保されている期間−に起る。胃腸路の縫合糸保持力
は、術後最初の数日間は８０％も減少すると報告されている(Ｈogstrom Ｈおよ
びＨaglund Ｕ. Ａcta Ｃhir Ｓcand １５１：５３３−５３５（１９８５）；Ｊ
onsson Ｋ. ら，Ａm. Ｊ. Ｓurg. １４：８００−８０３（１９８３）)。
【０５５５】 雄の成体ＳＤラット(ｎ＝５)を、ケタミン(５０mg／kg)とキシラジン(５mg／k
g)を組み合せて筋肉内投与することにより麻酔した。その腹腔を長さ４cmの正中
線切開で開いた。腹膜反転部に対し近位３cmの位置で辺縁の血管を残して左結腸
の幅１cmの切片を切除した。８−１０の断続的５−０Ｖicryl内反縫合で単層端
々吻合術を行なうことにより、腸の連続性を回復した。次いで、その吻合部を緩
衝液または１μgおよび４μgのＫＧＦ−２Δ３３で注射器により局所的に処置し
た。切開創を筋肉層については３−０連続絹縫合糸で、皮膚については外科用ス
テープルで閉じた。その後、緩衝液またはＫＧＦ−２Δ３３(皮下に１および５m
g／kg)からなる処置を毎日施した。手術の日とその後の毎日に体重を測定した。
最後の処置(第５日)から２４時間後に動物を安楽死させた。動物を麻酔してバリ
ウム注腸を施し、一定の距離からＸ線撮影した。盲検観察者２人による結腸内投
与後の放射線分析により、ＫＧＦ−２Δ３３処置群は、１）手術部位でのバリウ
ム漏洩速度の減少、２）手術部位での狭窄度の低下、および３）外科部位より遠
位に存在する糞粒の増加を示すことが明らかになった。
【０５５６】
【表６】 結腸吻合 放射線分析
【０５５７】 実施例２２ ＫＧＦ−２のカルボキシ末端突然変異体の構築 ＫＧＦ−２のカルボキシル末端を高度に荷電させる。それら荷電残基の密度は
、タンパク質の安定性に影響を及ぼし、その結果、その溶解性に影響しうる。溶
液状態でタンパク質を安定化しうる突然変異タンパク質を作成するため、その遺
伝子のこの領域に一連の突然変異を導入した。 点突然変異体１９４Ｒ／Ｅ、１９４Ｒ／Ｑ、１９１Ｋ／Ｅ、１９１Ｋ／Ｑ、１
８８Ｒ／Ｅ、１８８Ｒ／Ｑを作成するため、５９５２ＫＧＦΔ３３ ５' Ａfl II
I ５'プライマーと、ＫＧＦ−２に関して適当な点変異を含む表記の３'プライマ
ーとを使用し、ＫＧＦ−２Δ３３をテンプレートとして、当業者によく知られて
いる標準的条件でＰＣＲ反応を行なった。得られた生成物をＡflIIIとＨindIII
で制限消化し、ＮcoＩとＨindIIIで制限消化した大腸菌発現ベクターpＱＥ６０
にクローニングした。 ＫＧＦ２Δ３３，１９４Ｒ／Ｅ構築： 次のプライマーを使用した：
【化４１】 ＫＧＦ２Δ３３，１９４Ｒ／Ｅヌクレオチド配列：
【化４２】 ＫＧＦ２Δ３３，１９４Ｒ／Ｅアミノ酸配列：
【化４３】 ＫＧＦ２Δ３３，１９４Ｒ／Ｑ構築：
【化４４】 ＫＧＦ２Δ３３，１９４Ｒ／Ｑヌクレオチド配列：
【化４５】 ＫＧＦ２Δ３３，１９４Ｒ／Ｑアミノ酸配列：
【化４６】 ＫＧＦ２Δ３３，１９１Ｋ／Ｅ構築： を使用した：
【化４７】 ＫＧＦ２Δ３３，１９１Ｋ／Ｅヌクレオチド配列：
【化４８】 ＫＧＦ２Δ３３，１９１Ｋ／Ｅアミノ酸配列：
【化４９】 ＫＧＦ２Δ３３，１９１Ｋ／Ｑ構築： 次のプライマーを使用した：
【化５０】 ＫＧＦ２Δ３３，１９１Ｋ／Ｑヌクレオチド配列：
【化５１】 ＫＧＦ２Δ３３，１９１Ｋ／Ｑアミノ酸配列：
【化５２】 ＫＧＦ２Δ３３，１８８Ｒ／Ｅ構築： 次のプライマーを使用した：
【化５３】 ＫＧＦ２Δ３３，１８８Ｒ／Ｅヌクレオチド配列：
【化５４】 ＫＧＦ２Δ３３，１８８Ｒ／Ｅアミノ酸配列：
【化５５】 ＫＧＦ２Δ３３，１８８Ｒ／Ｑ構築： 次のプライマーを使用した：
【化５６】 ＫＧＦ２Δ３３，１８８Ｒ／Ｑヌクレオチド配列：
【化５７】 ＫＧＦ２Δ３３，１８８Ｒ／Ｑアミノ酸配列：
【化５８】 ＫＧＦ２Δ３３，１８３Ｋ／Ｅ構築：
【０５５８】 突然変異１８３／Ｅについては、このリジンのオリゴヌクレオチド部位特異的
突然変異誘発を行なうために２つのＰＣＲ反応を設定した。一つの反応では、５
９５２ＫＧＦΔ３３ ５' ＡflIIIを５'プライマーとして使用し、ＫＧＦ２ １８
３aaＫ→Ｅアンチセンスを３'プライマーとして反応に使用した。第二の反応で
は、ＫＧＦ２ ５' １８３aaＫ→Ｅセンスを５'プライマーとして使用し、ＫＧＦ
２ ３' ＨindIII ＴＡＡストップを３'プライマーとして使用した。これらの反
応には、ＫＧＦ−２Δ３３をテンプレートとして使用した。これらの増幅反応は
、当業者によく知られている標準的条件下で行なった。次の反応では、これらＰ
ＣＲ反応で得た各１μlをテンプレートとし、５'プライマーとして５４５３ Ｂs
pＨＩを、３'プライマーとして５２５８ ＨindIIIを使用した。増幅は、当業者
によく知られている標準的条件を用いて行なった。得られた生成物をＡfl IIIと
ＨindIIIで制限消化し、ＮcoＩとＨindIIIで制限消化した大腸菌発現ベクターp
ＱＥ６０にクローニングした。 次のプライマーを使用した： ５９５２ＫＧＦΔ３３ ５' Ａfl III：
【化５９】 ＫＧＦ２ ５' １８３aa Ｋ→Ｅセンス：
【化６０】 ＫＧＦ２ １８３aa Ｋ→Ｅアンチセンス：
【化６１】 ＫＧＦ２ ３' ＨindIII ＴＡＡストップ：
【化６２】 ＫＧＦ２Δ３３，１８３Ｋ／Ｅヌクレオチド配列：
【化６３】 ＫＧＦ２Δ３３，１８３Ｋ／Ｅアミノ酸配列：
【化６４】
【０５５９】 実施例２３ ＢＡＬＢ/cマウスの全身照射後の生存に対するＫＧＦ−２の作用 電離放射線は、肺癌、乳癌、リンパ腫、骨盤腫瘍を含む多くの悪性腫瘍の治療
に広く使用されている(Ｗard，Ｗ. Ｆ. ら，ＣＲＣ Ｈandbook of Ａnimal Ｍod
els of Ｐulmonary Ｄisease，ＣＲＣ Ｐress，１６５−１９５（１９８９）)。
しかし放射線が誘発する損傷(肺、腸など)が放射線療法の強度と成功を制限して
いる(Ｍorgan，Ｇ. Ｗ. ら，Ｉnt. Ｊ. Ｒadiat. Ｏncol. Ｂiol. Ｐhys. ３１
：３６１（１９９５）)。胃腸粘膜は、速い細胞周期を持ち、細胞障害因子に対
する感受性がとりわけ高い(Ｐotten，Ｃ. Ｓ. ら，Ｃytotoxic Ｉnsult to Ｔis
sue，Ｃhurchill Ｌivingstone，１０５−１５２頁（１９８３）)。腸放射線損
傷の症状発現には、急性直腸炎、腸線維症、狭窄症または瘻孔形成などが含まれ
る(Ａnseline，Ｄ. Ｆ. ら，Ａnn. Ｓurg. １９４：７１６−７２４（１９８１
）)。腫瘍の放射線感受性を変えずに正常な構造を放射線から保護する処置は、
これらの障害の管理に有益だろう。照射面積とは無関係に、放射線量は、正常組
織の放射線感受性によって制限される。全身照射または部分照射後の合併症には
、肺炎、線維症、胃腸損傷および骨髄障害が含まれる。 ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２を含む数種類のサイトカインは、Ｔ
ＢＩ後の放射線防護作用が証明されている(Ｎeta，Ｒ. ら，Ｊ. Ｅxp. Ｍed. １
７３：１１７７（１９９１）)。ＩＬ−１１は、照射と化学療法の併用後(Ｄu，
Ｘ. Ｘ. ら，Ｂlood ８３：３３（１９９４）)および放射線誘発性胸部損傷後(
Ｒedlich，Ｃ. Ａ. ら，Ｔhe Ｊournal of Ｉmmunology １５７：１７０５−１
７１０（１９９６）)の小腸粘膜細胞を保護することが示されている。
【０５６０】 動物 すべての実験は、ＢＡＬＢ/cマウスを用いて行なった。動物は６週齢で購入し
、試験の開始時に７週齢だった。すべての操作を無菌技術を使って行なった。こ
の試験は、実験計画を検閲して認可したＨuman Ｇenome Ｓciences，Ｉnc. の社
内動物実験委員会による指針に従って行われた。
【０５６１】 ＫＧＦ−２ このタンパク質は、ＫＧＦ−２Δ３３と名づけた１４１アミノ酸のヒトタンパ
ク質からなる。このタンパク質は、成熟タンパク質の最初の３３アミノ末端残基
を欠く、ＫＧＦ−２の先端切断型アイソフォームである。このタンパク質をコー
ドする遺伝子は、大腸菌発現ベクターにクローニングされている。純度９５％を
超える組換え物質を含む画分を実験に使用した。ＫＧＦ−２は、４０mＭ 酢酸ナ
トリウム＋１５０mＭ ＮaＣl(pＨ ６.５)を含む賦形剤中に調剤した。希釈液は
、その原液から同じ賦形剤を使って調製した。
【０５６２】 全身照射と実験計画 ６８ Ｍark Ｉ Ｓhepherdセシウム照射装置を用いて、マウスに５１９ラド(５
.１９Ｇy)を照射した。ＫＧＦ−２Δ３３を、照射２日前から始めて照射後７日
間、毎日皮下投与した。全てのマウスについて毎日体重を測定した。マウス群は
、次に挙げる３種類の処置のうちの１つに無作為に割り当てた：全身照射(ＴＢ
Ｉ)＋緩衝液、ＴＢＩ＋ＫＧＦ−２Δ３３(皮下１mg／kg)、ＴＢＩ＋ＫＧＦ−２
Δ３３(皮下５mg／kg)。２回の独立した実験を行なった。
【０５６３】 結果 照射した動物を使って２回の試験を行なった。第１の試験では、動物に５１９
ラド(５.１９Ｇy)を照射した。照射前の２日間と照射後毎日７日間にわたって、
緩衝液または１mg／kgおよび５mg／kgのＫＧＦ−２Δ３３で動物を処置した。全
身照射後２５日の時点で、緩衝液群では５匹中１匹が生き残った。これに対しＫ
ＧＦ−２処置群では、１mg／kgで５匹中５匹が、５mg／kgで５匹中４匹が生き残
った(第４４図)。 また、ＫＧＦ−２処置動物は、ＴＢＩ後２０日で０.９％および５.３％の体重
増加を示した。これに対し、緩衝液処置群は、第２０日で４.２％の体重減少を
示した。正常な非照射同年齢対照動物は、同じ期間内に６.７％の体重増加を示
した(第４５図)。 第二の試験でも動物に５１９ラド(５.１９Ｇy)を照射した。照射前の２日間と
照射後の毎日７日間にわたって、動物に緩衝液または１mg／kgおよび５mg／kgの
ＫＧＦ−２Δ３３を皮下投与した。全身照射後１５日の時点で、緩衝液群のすべ
ての動物が死亡していた。ＫＧＦ−２は、１mg／kgで３０％の生存率、５mg／kg
で６０％の生存率を示した。ＴＢＩ後２５日の時点で、１mg／kg群は２０％の生
存率、５mg／kg群は５０％の生存率を示した(第４６図)。
【０５６４】 結論 要約するとこれらの結果は、ＫＧＦ−２がＴＢＩ後の保護作用を持つことを示
している。ＫＧＦ−２がＴＢＩを受けた動物の生存率を向上させるうることは、
これが放射線誘発性損傷にも有用であり、悪性腫瘍の治療における照射の治療可
能比を増大させるのにも有用であることを示唆している。
【０５６５】 実施例２４ マウスの皮膚炎症のＴＰＡモデルにおけるＫＧＦ−２の評価 ＫＧＦ−２が接触皮膚炎の進行を減衰することを立証するため、マウスのテト
ラデカノイルホルボールアセテート(ＴＰＡ)誘発性皮膚炎症モデルを使用した。
実験的に皮膚炎を起こした雌のＢＡＬＢ／cマウスと雄のＳwiss Ｗebsterマウス
の使用は、よく特徴づけれた適切な再現性ある接触皮膚炎のモデルである。これ
らの系統のマウスは、ＴＰＡの局所適用後に、局所的血流動態、血管透過性およ
び白血球の局所的移動からなる持続性の炎症反応を起すことが示されており、そ
れらの病的変化は、ヒトの皮膚炎と類似している(Ｒaoら，１９９３，Ｉnflamma
tion １７(６)：７２３；Ｒaoら，１９９４，Ｊ. Ｋipid Ｍediators Ｃell Ｓi
gnalling １０：２１３)。 マウス群にＴＰＡ(４μg／耳)をアセトン溶液(２００μg／ml)として耳の内表
面と外表面に１０μlずつ局所適用した６０分後に、賦形剤またはＫＧＦ−２を
腹腔内、皮下または静脈内投与する。対照群には、アセトン２０μlを局所適用
する。ＴＰＡ適用の４時間後に耳の厚さを測定し、組織学的検査のために耳を切
除する。ＴＰＡに反応した血管透過性を測定するため、ＴＰＡ局所適用後の選択
した時点でエバンスブルー(３００mg／kg)を尾静脈からマウスに静脈内注射し、
その１５分後にマウスを犠牲にする。耳を切除した後、ジメチルホルムアミド中
に抽出し、遠心分離する。５９０nＭの吸光度値を分光光度法で測定する。
【０５６６】 実施例２５ 創傷治癒におけるＫＧＦ−２Δ３３の作用 初代ヒト表皮ケラチノサイトと、ＦＧＦＲアイソフォーム２iiibを遺伝子導入
したマウスプロ−Ｂ ＢaＦ３細胞をＫＧＦ−２が刺激できることを示す初期の試
験管内データに基き、皮膚におけるＫＧＦ−２Δ３３の生物学的作用を調べた。
最初の実験は、皮内投与後のＫＧＦ−２Δ３３の生物学的作用を決定するために
行なった。皮内試験に続いて、ＫＧＦ−２Δ３３を種々の創傷治癒モデル(全層
パンチ生検創傷と切開創傷を含む)で調査することにより、創傷治癒剤としての
潜在能力を決定した。
【０５６７】 創傷治癒のグルココルチコイド障害ラットモデルにおけるＫＧＦ−２Δ３３の作
用 創傷治癒障害は、糖尿病などの様々な病的状態に伴う重要な臨床課題であり、
ステロイド剤や代謝拮抗物質の全身投与の合併症である。全身グルココルチコイ
ドによる治療は、ヒトおよび組織修復の動物モデルにおいて創傷治癒を損なうこ
とが知られている。グルココルチコイド投与に続いて、循環単球レベルの低下と
プロコラーゲン合成の阻害が観察されている。従って、治癒の炎症相とマトリッ
クス合成は、組織修復の複雑な過程に関わる重要な因子である。この試験では、
ＫＧＦ−２の複数回局所投与の効果を、メチルプレドニゾロンの全身投与によっ
て治癒機能が損なわれているラットの全層切除皮膚創傷で評価した。 スプレーグドーリーラット(ｎ＝５／処置群)の背中に８mＭの創傷を負わせ、
治癒を損なうためにメチルプレドニゾロン(筋肉内１７mg／kg)を与えた。創傷を
体積５０μlの緩衝液または投与量０.１、０.５、および１.５μgのＫＧＦ−２
で毎日局所的に処置した。第２、４、６、および８日に較正済ジェームソンキャ
リパーを用いて創傷を計測した。第６日(非開示データ)と第８日(第４７図)に、
ＫＧＦ−２処置群は、緩衝液対照と比較して創傷の閉鎖に関して統計的に有意な
縮小を示した。
【０５６８】 糖尿病マウスモデルにおける創傷治癒に対するＫＧＦ−２Δ３３の作用 ６週齢で体重３０−３５ｇの遺伝性糖尿病ホモ接合性の雌の(db＋／db＋)マウ
ス(ｎ＝６)の背中に６mＭ生検穿孔具で全層創傷を負わせた。その創傷を開放状
態にしておき、毎日プラシーボまたは０.１、０.５、および１.５μgのＫＧＦ−
２で処置した。創傷の閉鎖は、ジャームソンキャリパーを用いて測定した。第１
０日に動物を安楽死させ、組織学的検査のために創傷を採取した。 ＫＧＦ−２は、プラシーボまたは無処置群と比較して、０.１μgで創傷閉鎖率
に有意な改善を示した(p＝０.０２)。ＫＧＦ−２の投与は、プラシーボまたは無
処置群と比較して０.１μg(p＝０.０３)で、また無処置群と比較して１.５μg(p
＝０.０５)で、組織学的スコアにも改善をもたらした。
【０５６９】 結論 上記の結果から、ＫＧＦ−２は、グルココルチコイド投与や糖尿病などの障害
状態に有意な活性を示す。従って、ＫＧＦ−２は、手術後、糖尿病または循環不
全(静脈不全や静脈性潰瘍など)を持つ患者の慢性潰瘍、熱傷、その他の異常な創
傷治癒状態(例えば尿毒症、栄養不良、ビタミン欠乏症およびステロイドや抗腫
瘍剤による全身治療など)の治癒を刺激するのに臨床的に有用であるといえる。
【０５７０】 実施例２６ 口腔粘膜に対するＫＧＦ−２Δ３３の作用 臨床的に使用される細胞障害剤は、口腔粘膜などのいくつかの部位で正常な上
皮の増殖を阻害するという残念な作用を持ち、粘膜障壁に生命を脅かす障害をも
たらす。我々は、この臨床領域におけるＫＧＦ−２の効力を調べるための試験を
行なった。そのデータは、粘膜炎のモデルにおけるＫＧＦ−２の治療効果を裏付
けるものである。
【０５７１】 ハムスター口腔粘膜に対するＫＧＦ−２の作用 ＫＧＦ−２が正常な口腔粘膜上皮の増殖を誘導しうるかどうかを決定しようと
した。口腔粘膜でのＫＧＦ−２の作用を雄のゴールデンシリアンハムスターで評
価した。ハムスターの頬嚢を緩衝液またはＫＧＦ−２Δ３３(０.１、１、および
１０μg／頬)(麻酔したハムスターの頬に頬あたり１００μlの体積で局所的に適
用)で毎日処置した。この化合物は、頬と最低６０秒間接触した後、嚥下された
。７日間の処置後、上述のように動物にＢrdＵを注射し、犠牲にした。増殖細胞
を抗ＢrdＵ抗体で標識した。第４８図は、動物を１μgおよび１０μgのＫＧＦ−
２Δ３３で処置すると(緩衝液処置と比較して)ＢrdＵ標識(細胞増殖)が有意に増
大したことを示している。 ＫＧＦ−２による局所処置は、正常な粘膜上皮細胞の増殖を誘導した。これら
の結果から、ＫＧＦ−２は、化学療法剤(またはその他の毒物療法)、放射線療法
または化学療法と放射線療法の併用によって起る口腔粘膜炎の予防に臨床的に有
用であるといえる。またＫＧＦ−２は、毒物(化学療法)または放射線療法の結果
としての口腔粘膜への傷害の重篤度を軽減する点で、治療剤としても有用である
。
【０５７２】 実施例２７ ラットにおける虚血性創傷治癒に対するＫＧＦ−２Δ３３の作用 この実施例に記載する実験の目的は、虚血性創傷治癒モデルを用いた創傷治癒
におけるＫＧＦ−２の効力を決定することにあった。 局部的な皮膚の血液供給を、一つの有茎全層ランダム筋皮弁(３×４cm)の挙上
によって部分的に妨害した。その筋皮弁を構成する皮膚局所に全層創傷を負わせ
た。この試験には、６０匹の成体スプレーグ・ドーリーラットを使用し、それら
をＫＧＦ−２Δ３３群とプラシーボ群に無作為に分割した(５匹／群／時点)。創
傷形成後第１、３、５、７、１０、および１５日に、それぞれ創傷を採取した。 創傷の破壊強さは、創傷形成後１０日と１５日に至るまでの早い時点では、Ｋ
ＧＦ−２処置群と緩衝液処置群の間で有意差を示さなかった。 結果は、ＫＧＦ−２が創傷形成の１０日後に虚血性創傷修復における創傷の破
壊強さを有意に改善したことを示した。またこれらの結果は、正常な創傷治癒の
試験で過去に得たデータと比較して、虚血がどちらの群の治癒過程をも遅延させ
ることを示唆している。 この筋皮弁モデルは、静脈還流による虚血状況下のデータと情報を提供する。
これらの結果は、ＫＧＦ−２が静脈還流の障害および／または静脈不全によって
起る慢性静脈性脚潰瘍の治療に使用しうることを示唆している。
【０５７３】 実施例２８ ラットにおける結腸吻合部の治癒に関するＫＧＦ−２の評価 この実験の結果は、ＫＧＦ−２Δ３３がウィスターラットまたはスプレーグ・
ドーリーラットの腸もしくは結腸吻合モデルにおいて腸管修復の速度を高めるこ
とを立証する。またこのモデルは、ＫＧＦ−２とそのアイソフォームが胃腸壁ま
たは結腸壁の縫合結合力を増大させることを立証するためにも使用できる。 実験的吻合術を施したラットの使用は、よく特徴づけられた適切な再現性ある
手術創治癒のモデルである。このモデルは、結腸および小腸の手術創治癒の質と
速度に対する長期ステロイド治療の影響や種々の化学療法の影響を調べるために
拡張することもできる(Ｍastboom，Ｗ. Ｊ. Ｂ. ら, Ｂr. Ｊ. Ｓurg. ７８：５
４−５６（１９９１）；Ｓalm，Ｒ. ら，Ｊ. Ｓurg. Ｏncol. ４７：５−１１（
１９９１）；Ｗeiber，Ｓ. ら，Ｅur. Ｓurg. Ｒes. ２６：１７３−１７８（１
９９４）)。吻合部の治癒は、身体の他の部位における創傷治癒と似ている。治
癒の初期相は、急性炎症とそれに続く線維芽細胞増殖およびコラーゲンの合成を
特徴とする。コラーゲンは徐々に形作られ、新しいコラーゲンが合成されるにつ
れて、創傷は強化される(Ｋoruda Ｍ. Ｊ. およびＲolandelli，Ｒ. Ｈ. ，Ｊ.
Ｓurg. Ｒes. ４８：５０４−５１５（１９９０）)。吻合部漏洩などのほとんど
の術後合併症は、手術後最初の数日間−すなわち結腸の強度が主として創縁が縫
合糸を保持する能力によって確保されている期間−に起る。胃腸路の縫合糸保持
力は、術後最初の数日間は８０％も減少すると報告されている(Ｈogstrom Ｈ.
およびＨaglund Ｕ.，Ａcta Ｃhir Ｓcand １５１：５３３−５３５（１９８５
）；Ｊonsson Ｋ. ら，Ａm. Ｊ. Ｓurg. １４：８００−８０３（１９８３）)。
【０５７４】 ケタミン(５０mg／kg)とキシラジン(５mg／kg)を組み合せて筋肉内投与するこ
とにより、ラットを麻酔した。皮膚消毒中、手術中および手術後は、動物を加熱
パッドの上に保った。腹腔を長さ４cmの正中線切開で開いた。腹膜反転部に対し
近位3cmの位置で辺縁の血管を残して左結腸の幅1cmの切片を切除した。８−１０
の断続的５−０プロピレン内反縫合で単層端々吻合術を行なうことにより、腸の
連続性を回復した。切開創を筋肉層については３−０連続絹縫合糸で、皮膚につ
いては外科用ステープルで閉じた。各動物について毎日、個々の体重、体温およ
び食物消費パターンからなる臨床評価を行なった。 ＫＧＦ−２Δ３３処置とプラシーボ処置は、術後直ちに、皮下、局所、腹腔内
、筋肉内、胃内、または結腸内に毎日施し、その後、犠牲にする日(第７日)まで
続けた。無処置対照群、プラシーボ群およびＫＧＦ−２Δ３３群を設けた。安楽
死の２時間前に、動物の腹腔内に１００mg／kg ＢrdＵを注射した。最後の処置(
第５日)の２４時間後に動物を安楽死させた。正中線切開を前腹壁に施し、吻合
部を含む長さ１cmの結腸切片を摘出した。手術部位の第三の切片を総コレステロ
ール分析のために採取した。
【０５７５】 一連の２つの実験では、雄の成体ＳＤラット(ｎ＝５)を麻酔し、８−１０の断
続的６−０プロレン内反縫合で遠位結腸の単層端々吻合術を施した。次いで、吻
合部位を緩衝液または濃度１μgおよび４μgのＫＧＦ−２Δ３３で注射器により
局所的に処置した。その後、緩衝液または濃度１mg／kgもしくは５mg／kgのＫＧ
Ｆ−２Δ３３の腹腔内投与により動物を毎日処置した。第５日に動物を安楽死さ
せ、結腸を摘出し、液体窒素で急速冷凍し、凍結乾燥して、コラーゲン測定にか
けた。コラーゲン濃度は、μgコラーゲン／mg乾燥重量組織として表わす。統計
分析は、独立t検定を使って行なった。平均±ＳＥ。第５日に、ラットを麻酔し
、バリウム注腸を施した後、放射線像分析を行なった。２回の実験で得た端々左
結腸吻合のバリウム注腸放射線評価は、１mg／kgおよび５mg／kgのＫＧＦ−２で
処置された動物について腹腔漏洩の一貫した低下を示した。このデータを下記の
表に示す。また張力計を用いて手術部位の破壊強さも調べた。ＫＧＦ−２Δ３３
群と緩衝液群の間に有意差は観察されなかった。第４９図に示すように、緩衝液
対照に対して、手術部位でのコラーゲン含量の有意な増加が、１mg／kg ＫＧＦ
−２Δ３３(p＝０.０２)と５mg／kg(p＝０.００４)の両方で明らかになった。
【０５７６】
【表７】 表 結腸吻合 放射線分析
【０５７７】 雄の成体ＳＤラット(ｎ＝５)を、ケラチン(５０mg／kg)とキシラジン(５mg／k
g)を組み合せて筋肉内投与することにより麻酔した。その腹腔を長さ４cmの正中
線切開で開いた。腹膜反転部に対し近位３cmの位置で辺縁の血管を残して左結腸
の幅１cmの切片を切除した。８−１０の断続的５−０プロレン内反縫合で単層端
々吻合術を行なうことにより、腸の連続性を回復した。次いで、その吻合部を緩
衝液または１μgおよび４μgのＫＧＦ−２で注射器により局所的に処置した。切
開創を筋肉層については３−０連続絹縫合糸で、皮膚については外科用ステープ
ルで閉じた。その後、緩衝液またはＫＧＦ−２Δ３３(皮下に１および５mg／kg)
からなる処置を毎日施した。手術の日とその後の毎日に体重を測定した。最後の
処置(第５日)から２４時間後に動物を安楽死させた。動物を麻酔してバリウム注
腸を施し、一定の距離からX線撮影した。次いで、吻合部を摘出して病理組織学
的分析と生体力学的分析を行なった。
【０５７８】 実施例２９ 炎症性腸疾患のモデルにおけるＫＧＦ−２の評価 ＫＧＦ−２は、試験管内でケラチノサイトの増殖を誘導し、種々の生体内創傷
治癒モデルで活性なタンパク質である。この試験の目的は、飲用水中のデキスト
ラン硫酸ナトリウムへの無制限の曝露によって誘発したネズミ結腸炎のモデルで
ＫＧＦ−２が有効かどうかを決定することにあった。 ６〜８週齢の雌のスイスウェブスターマウス(２０−２５ｇ；Ｃharles Ｒiver
，Ｒaleigh，ＮＣ)を、硫酸ナトリウムの４％溶液(ＤＳＳ，分子量３６,０００
−４４,０００，Ａmerican Ｉnternational Ｃhemistry，Ｎatick，ＭＡ)を１週
間無制限に与えることによって誘発した炎症性腸疾患のモデルに使用した。ＫＧ
Ｆ−２は毎日非経口投与によって与えた(ｎ＝１０)。効力の決定には、次の３つ
のパラメーターを使用した：１）糞便の評価に基く臨床スコア、２）結腸の評価
に基く組織学的スコア、および３）体重変化。臨床スコアは、合計して４を上限
とする２つの部分からなる。糞便軟度は、０＝固い、１=ゆるい、２=下痢と採点
した。糞便中の血液も０〜２の尺度で、０＝血液なし、１＝潜血、２=著しい直
腸出血と評価した。３を超える平均群スコアは、ほぼ確実な致死性と、治療可能
な段階を超えて進行した疾患を示した。臨床スコアは、第０、４、５、６、およ
び７日に採点した。組織学的スコアを得るため、上行、横行および下行結腸のス
ライドを炎症スコア(０−３）と陰窩スコア(０−４)に基く盲検法で評価した。
体重は、毎日測定した。データを平均±ＳＥＭとして表した。独立スチューデン
トt検定を使って、疾患対照と比較した有意差を決定した(＊p＜０.０５；＊＊p
＜０.０１；＊＊＊p＜０.００１)。 ＤＳＳ処置マウスに投与量１、５、または１０mg／kgのＫＧＦ−２Δ３３を毎
日７日間腹腔内(ＩＰ)注射した場合、ＫＧＦ−２は、臨床スコアをそれぞれ２８
、３８、および５０％有意に低下させた。組織学的評価は、臨床スコアの用量依
存的抑制とよく類似し、１、５、および１０mg／kgの投与量で組織学的スコアを
有意に２６、４８、および５１％低下させた。ＫＧＦ−２は、ＤＳＳ誘発性結腸
炎に伴う体重減少も有意に抑制した。
【０５７９】 第二の試験では、ＩＰまたは皮下(ＳＣ)に毎日投与した場合のＫＧＦ−２Δ３
３(１０mg／kg)の相対効力を比較した。第７日の実験終了時点までに、ＫＧＦ−
２をＩＰ注射した動物は臨床スコアに有意な３４％の減少を示し、一方、ＫＧＦ
−２のＳＣ注射は有意な４６％の減少をもたらした。ＳＣ投与は、ＤＳＳ対照に
対して体重減少をも有意に抑制した。臨床スコアと体重の測定から、ＫＧＦ−２
のＳＣ投与は、少なくともＩＰ投与と同等に有効である。
【０５８０】実施例３０ ラットの正常な膀胱および前立腺に対する、およびサイクロホスファミドが誘導 する出血性膀胱炎におけるＫＧＦ−２Δ３３の効果 この実験の目的は、ＫＧＦ−２Δ３３が正常ラットにおいて膀胱細胞の増殖を
刺激できること、およびラットモデルのサイクロホスファミド誘導出血性膀胱炎
ではＫＧＦ−２Δ３３に治療効果があること、を証明することにある。
【０５８１】 臨床的に使用される細胞傷害性薬剤には膀胱の正常上皮で増殖阻害を起こす副
作用があり、結果として生命に危険を及ぼし、膀胱上皮層の崩壊を起こす可能性
がある。例えば、サイクロホスファミドは、患者によっては重篤で、場合によっ
て致死的な合併症である出血性膀胱炎が起きる。膀胱炎を伴うか伴わない膀胱の
繊維形成症を発症することもある。この傷害は、尿に排泄されるサイクロホスフ
ァミド代謝物によって起きるものと思われる。通常サイクロホスファミドに起因
する血尿は数日間存在するが、永続することもある。重症の場合には薬剤的また
は外科的処置を要する。重症の出血性膀胱炎では、サイクロホスファミド療法を
中断することになる。これに加えて、一般にサイクロホスファミド処置から２年
以内に膀胱の悪性腫瘍が起き、以前に出血性膀胱炎の病歴がある患者に起きる（
CYTOXAN（サイクロホスファミド）中入れ説明書）。サイクロホスファミドは前
立腺および雄性生殖系に毒性を示す。サイクロホスファミド処置は、不妊を起こ
し、ある程度の精巣萎縮をもたらす。
【０５８２】正常な膀胱、精巣および前立腺に対するＫＧＦ−２Δ３３の効果 実験計画 雄性スプラークドーリーラット（１６０−２２０ｇ）（ｎ＝４−６／処置群）
をこの研究に使用した。ＫＧＦ−２Δ３３を５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与した
。組換えＫＧＦ−２Δ３３または緩衝液（４０ｍＭ−酢酸ナトリウム＋１５０ｍ
Ｍ−ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）を腹腔内または皮下に１日から７日までの期間連日
投与し、翌日ラットを屠殺した。ＫＧＦ−２Δ３３が誘導する効果の可逆性を検
査するために、別の動物にＫＧＦ−２Δ３３または緩衝液を７日間腹腔内に注射
し、無処置期間７日間の後にラットを屠殺した。
【０５８３】 屠殺する日にラットにＢｒｄＵを１００ｍｇ／ｋｇ腹腔注射した。２時間後、
ラットにエーテルを過剰投与し、選択した器官を摘出した。組織の試料を１０％
中性緩衝液ホルマリンで２４時間固定し、パラフィンに埋没した。複製しつつあ
った細胞へのＢｒｄＵ取り込みを検出するために、マウス抗−ＢｒｄＵモノクロ
ーナル抗体およびABC Elite検出系を用いて５ミクロン切片に免疫組織化学的操
作を施した。切片はヘマトキシリンで軽く対比染色した。
【０５８４】 複数の実験者に切片を盲検的判定をさせた。前立腺における増殖中の細胞数を
動物毎に無作為的な視野１０個について倍率×１０で計数した。膀胱におけるＫ
ＧＦ−２Δ３３の効果を評価するために、この組織の交差切片を作製し、増殖中
および非増殖中の細胞数を無作為的な視野１０個について倍率×２０で計数した
。この結果を、標識された細胞の非標識細胞に対する百分率で表示する。データ
を平均値±ＳＥＭで示す。StatViewソフトウェアパッケージを用いて統計的分析
（２テイル非ペアｔ検定）を行い、統計的有意性をｐ＜０．０５と定義した。
【０５８５】結果 膀胱 ＫＧＦ−２Δ３３の腹腔注射は、７日間の研究期間にわたって膀胱上皮細胞の
増殖を誘導した（図５２の黒四角）が、器官の重量には影響がなかった。皮下注
射は増殖に小さな増加をもたらしたが、統計的有意性には至らなかった（図５２
の黒丸）。
【０５８６】 前立腺および精巣 ＫＧＦ−２Δ３３の皮下および腹腔投与は共に前立腺の有意な増殖を誘導した
（図５３）が、これは２回目の注射の後には正常化した。腹腔内長期ＫＧＦ−２
Δ３３処置では、前立腺または精巣の重量は増加しなかった。
【０５８７】サイクロホスファミド誘導出血性膀胱炎に対するＫＧＦ−２Δ３３の効果 実験計画 雄性スプラークドーリーラット（３００−４００ｇ）（ｎ＝５／群）に、緩衝
液プラセボまたはＫＧＦ−２Δ３３の１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ濃度を、
尾静脈から静脈注射し、２４時間後にサイクロホスファミド２００ｍｇ／ｋｇを
腹腔内注射した。サイクロホスファミド注射の４８時間後の最終日に、ラットに
ＢｒｄＵ１００ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した。２時間後にラットをＣＯ2投与で
屠殺した。膀胱内腔に１０％ホルマリンを直接注入し、また膀胱外面をホルマリ
ンで洗浄して膀胱を固定した。５分後、膀胱および前立腺を摘出した。膀胱およ
び前立腺をパラフィンに埋没させ、切片として、Ｈ＆Ｅおよびマウス抗−Ｂｒｄ
Ｕモノクローナル抗体で染色した。膀胱上皮損傷の程度は次の評点系を用いて評
価した：独立した二人の観察者が膀胱を評価して膀胱上皮の損失程度を記録した
（膀胱上皮の０％、２５％、５０％、７５％および１００％損失として、膀胱上
皮損傷を記録した）。これに加えて、各切片毎に膀胱壁の厚さを無作為な位置１
０個所で測定し、μｍで表記した。
【０５８８】結果 巨視的観察： プラセボおよびサイクロホスファミドで処置したラットでは、膀胱は肥厚し、堅
かった。１０％ホルマリン注入後、膀胱の僅かな拡大が認められた。しかしなが
ら、事前にＫＧＦ−２Δ３３処置した群では、ホルマリンの直接注入ではより大
きな弾力性が観察され、繊維症が低いことを示唆する。
【０５８９】 顕微鏡的観察： 図５４は、ＫＧＦ−２Δ３３前処置の膀胱における潰瘍の程度に関する効果を示
す。食塩水腹腔内投与（食塩水対照）で処置した正常ラットでは、膀胱は組織学
的に正常と認められ、膀胱上皮の潰瘍は観察されなかった。サイクロホスファミ
ド２００ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与は、膀胱上皮の潰瘍を起こし、これは上皮全面
積の２５％と５０％との間（平均３７％）に及んだ。サイクロホスファミド投与
プラセボ処置動物と比較して、サイクロホスファミド投与の２４時間前にＫＧＦ
−２Δ３３を投与すると、潰瘍の程度は有意に低下した（１ｍｇ／ｋｇ、０．４
％、ｐ＝０．０１２８、および５ｍｇ／ｋｇ、５％、ｐ＝０．０３３８）。
【０５９０】 図５５は、上皮、平滑筋層および漿膜表面を包含する膀胱壁の厚さに及ぼすＫ
ＧＦ−２Δ３３の効果を示す。緩衝液のみで処置した群では、膀胱壁の厚さは約
４０μｍである。サイクロホスファミドで処置すると、膀胱壁の厚さは５倍に肥
厚して２１０μｍとなる。サイクロホスファミド処置動物では、ＫＧＦ−２Δ３
３前処置が、サイクロホスファミド単独処置動物と比較して、膀胱壁の肥厚に有
意な阻害を起こした（１ｍｇ／ｋｇ、９８．６μｍ（ｐ＝０．００７）および５
ｍｇ／ｋｇ、５２．３μｍ（ｐ＝０．００１））。
【０５９１】 顕微鏡的観察： 前立腺：緩衝液とサイクロホスファミドとを投与したラットでは、前立腺の顕
著な萎縮（腺房）が観察され、これには正常と比較して間質空間の拡大および顕
著な浮腫が観察された。これに加えて、前立腺を覆う上皮細胞が、正常前立腺組
織の細胞と比較して、かなり短く、薄いことが観察された。用量１ｍｇ／ｋｇお
よび５ｍｇ／ｋｇでＫＧＦ−２Δ３３前処置すると前立腺の組織学的外観が正常
化した。間質空間または浮腫の増大は観察されず、前立腺を覆う上皮細胞はサイ
ズも密度も正常な前立腺と同様であった。
【０５９２】結論 ： この結果はＫＧＦ−２が特異的に膀胱上皮細胞および前立腺を覆う上皮細胞の
増殖を誘導することを証明する。また、この結果は、ＫＧＦ−２がサイクロホス
ファミド誘導膀胱炎における潰瘍の程度に有意な低下を特異的に起こすことを証
明する。
【０５９３】実施例３１ 正常ラットの細胞増殖に対するＫＧＦ−２Δ３３の効果 緒言 ： ＦＧＦファミリーに属するＫＧＦ−２は正常なヒトおよびラットのケラチン生
成細胞の増殖を誘導する。この物質はＫＧＦ−１（ＦＧＦファミリーに属する）
に対して５７％の相同性を有する。ＫＧＦ−１は器官多数で上皮の増殖を誘導す
ると報告されている（Housley et al., Keratinocyte growth factor induces p
roliferation of hepatocytes and epithelial cells throughout the rat gast
rointestinal tract., J. Clin. Invest, 94: 1764-1777 (1994); Ulich et al.
, Keratinocyte growth factor is a growth factor for type II pneumocytes
in vivo., J. Clin. Invest., 93: 1298-1306 (1994); Ulich et al., Keratino
cyte growth factor is a growth factor for mammary epithelium in vivo. T
he mammary epithelium of lactating rat is resistant to the proliferative
action of keratinocyte growth factor., Am. J. Pathol., 144: 862-868 (19
94); Nguyen et al., Expression of keratinocyte growth factor in embryoni
c liver of transgenic mice causes changes in epithelial growth and diffe
rentiation resulting in polycystic kidneys and other organ malformations
., Oncogene, 12: 2109-2119 (1996); Yi et al., Keratinocyte growth factor
induces pancreatic ductal epithelial proliferation., Am. J. Pathol., 14
5: 80-85 (1994); and Yi et al., Keratinocyte growth factor causes prolif
eration of urothelium in vivo., J. Urology, 154: 1566-1570 (1995)）。我
々は同様な実験をＫＧＦ−２について行って、皮下および腹腔内の経路を用いて
全身的に投与した時に、ラットの正常な上皮において増殖を誘導するかどうかを
判定した。
【０５９４】方法 ： この研究に使用する体重１６０−２２０ｇの雄性スプラークドーリーラットは
、Harlan Sprague-Dawley社から入手した。ＫＧＦ−２Δ３３（HG03411-E2）は
、５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与した。腹腔内または皮下に毎日ＫＧＦ−２Δ３
３または組換え緩衝液（４０ｍＭ−酢酸ナトリウム＋１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐ
Ｈ６．５）を１−７日間注射し、翌日にラットを屠殺した（下記参照）。ＫＧＦ
−２Δ３３が誘導する効果の可逆性を試験するために、別の動物にＫＧＦ−２Δ
３３または緩衝液を７日間腹腔内注射し、無処置期間７日間の後に屠殺した。
【０５９５】 屠殺の日に、ラットにＢｒｄＵを１００ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射した。２時間後
にラットに過剰用量のエーテルを与え、選択した器官を摘出した。組織の試料を
１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間固定し、パラフィンに埋没した。複製しつ
つある細胞へのＢｒｄＵ取り込みを検出するために、マウスの抗−ＢｒｄＵモノ
クローナル抗体（Boehringer Mannheim）およびABC Elite検出システム（Vector
Laboratories）を使用して、５ミクロン切片に免疫組織化学的処置を施した。
各切片は、ヘマトキシリンで軽く対比染色した。
【０５９６】 複数の実験者に切片の盲検的判定をさせた。増殖中の細胞数を次の組織：肝臓
、膵臓、前立腺、および心臓について、動物毎に無作為的な視野１０個について
倍率×１０で計数した。肺の分析には、無作為的な視野１０個を使用したが、増
殖は倍率×２０で定量した。腎臓は多数の機能的に異なる部分を有するので、増
殖は動物毎に腎臓１個の中心を経る冠状横断面について評価した。食道および膀
胱におけるＫＧＦ−２Δ３３の効果を評価するために、これらの組織の断片を作
製して増殖中の細胞数および非増殖中の細胞数を無作為的な視野１０個について
倍率×１０および×２０で計数した。この結果を標識された細胞の非標識細胞に
対する百分率で表示する。
【０５９７】 データを平均値±ＳＥＭで示す。StatViewソフトウェアパッケージ（Abacus C
oncepts, Inc., Berkeley, CA）を用いて統計的分析（２テイル非ペアｔ検定）
を行い、統計的有意性をｐ＜０．０５と定義した。
【０５９８】結果 ： 図５６は実験プロトコルの概観を示す。各群に動物６匹を使用した。しかし、
盲検観察者による分析の間にＢｒｄＵ注射が不成功だったものがあることが明ら
かになった。結果を分析する前にラット１１６匹の中で８匹（または動物全部の
７％）のデータを研究から排除した。得られた群のサイズは次の表に示す。
【０５９９】研究に使用した各群のサイズ
【化６５】
【０６００】 肝臓：腹腔内投与した時、ＫＧＦ−２Δ３３は、注射１回目の後に肝細胞（黒
四角）（図５７）の迅速な増殖を誘導し、この増大した分裂活性は３日間継続し
、毎日注射７日間の後に正常に復帰した。肝臓が示したＫＧＦ−２の、腹腔内投
与での劇的な効果とは対照的に、皮下投与（黒丸、図５７）ではこの成長因子は
小さな効果を示した。増殖は１日の処置後に上昇したが、２回の毎日注射後には
正常値に復帰した。
【０６０１】 膵臓：肝臓におけるＫＧＦ−２Δ３３の腹腔内投与の迅速で可逆的な効果とは
対照的に、そのような注射は、１４日間の研究期間にわたる、膵臓の増殖を誘導
した（図５８、黒四角）。驚くべきことに、ＫＧＦ−２Δ３３（黒丸）の皮下投
与はいかなる時点においても増殖を誘導しなかった。
【０６０２】 腎臓および膀胱：ＫＧＦ−２Δ３３は、皮下または腹腔内経路で投与した時に
は、腎臓上皮の増殖を誘導したが、前者ではより大きな効果を誘導した。皮下投
与は増殖の迅速な上昇を誘導し（黒丸）、２日目に最大に達し、毎日処置７日目
には正常値に復帰した（図５９）。ＫＧＦ−２Δ３３を腹腔内（黒四角）投与し
た時には、穏やかであるが有意な増殖の上昇が２日目と３日目にのみ見られた。
ＫＧＦ−２Δ３３の腹腔内注射は、７日間の研究期間にわたって（図５２、黒四
角）膀胱上皮細胞の増殖も誘導した。皮下投与は増殖の僅かな上昇を起こしたが
、統計的有意性を持つには至らなかった（図５２、黒丸）。
【０６０３】 前立腺：ＫＧＦ−２Δ３３の皮下および腹腔内投与は、双方とも有意な前立腺
の増殖を誘導した（図５３）が、これは注射２回の後には正常化した。
【０６０４】 食道：ＫＧＦ−２Δ３３の皮下または腹腔内投与は、食道細胞の早期で短期の
増殖増加を誘導する（各々１日および２日間）が、迅速に正常値に復帰する（結
果は提示せず）。
【０６０５】 その他の器官：腹腔内および皮下経路によるＫＧＦ−２Δ３３の全身的投与は
肺上皮の増殖を７日間の投与期間にわたって示さなかった（結果は提示せず）。
【０６０６】討論 ： 皮下経路で投与した時に、いくつかの器官（肝臓、腎臓、食道および前立腺）
で正常な上皮の増殖刺激を観察したが、この効果は大部分短期間で、全て可逆的
であった。これらの器官での増殖はＫＧＦ−２の毎日皮下投与中にも逆転した。
【０６０７】 投与経路は、観察された増殖に対して劇的な効果を示した。腹腔内毎日投与は
、肝臓増殖の速度を３日間にわたって増加した一方で、ＫＧＦ−２を毎日皮下投
与した動物では、処置の１日後にのみ速度が増大した。さらに驚くべきは膵臓の
反応であった。動物にＫＧＦ−２を腹腔内に投与した時には、研究期間１４日間
にわたって膵臓の増殖レベルは有意に上昇した。しかし、ＫＧＦ−２の皮下投与
は膵臓内の分裂活性を増加しなかった。同様に、ＫＧＦ−２の腹腔内投与は、膀
胱粘膜の増殖を示したが、皮下投与では示さなかった。
【０６０８】 ＫＧＦ−２の腹腔内投与は腎臓に短期の小さな増殖加速を起こしたが、これは
集合管を含む領域に集中していた。皮下毎日処置は長期間の非常に増大した増殖
を誘導した。
【０６０９】実施例３２ ＫＧＦ−２Δ３３の気管内投与が肺臓細胞増殖に及ぼす効果 この実施例の目的は、正常ラットに気管内投与（肺臓へのＫＧＦ−２Δ３３の
直接投与）した後に、ＫＧＦ−２Δ３３が肺臓の増殖を刺激する性能があること
を証明することにある。
【０６１０】 方法：雄性Lewisラット（２２０−２７０ｇ）（ｎ＝５／処置群）をこの研究
に使用した。ＫＧＦ−２Δ３３またはプラセボ（４０ｍＭ−酢酸ナトリウム＋１
５０ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）を０．６ｍＬ、続いて３ｍＬの空気容積中、
１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇの用量で、気管内投与した。処置では実験プロ
トコルの第１日と第２日に投与した。
【０６１１】 第３日に、ラットにＢｒｄＵ１００ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した。２時間後に
ラットを二酸化炭素窒息死させた。食道カテーテルを介して、１０％緩衝ホルマ
リンで肺臓を膨らませ、肺臓矢状部切片をパラフィンに埋没した。複製しつつあ
る細胞へのＢｒｄＵ取り込みを検出するために、マウス−抗ＢｒｄＵモノクロー
ナル抗体およびABC Elite検出系を使用して、５ミクロンの切片を免疫組織化学
的操作に付した。切片をヘマトキシリンで軽く対比染色した。
【０６１２】 複数の実験者に各切片の盲検的判定をさせた。増殖中の細胞数を切片毎に無作
為的な視野１０個について倍率×２０で計数した。結果を視野当りＢｒｄＵ陽性
細胞数として表示する。データを平均値±ＳＥＭで示す。Instat v2.0.1を使用
して統計的分析（非ペアｔ検定）を行い、統計的有意性をｐ＜０．０５と定義し
た。
【０６１３】 結果：ＫＧＦ−２Δ３３の１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇの用量における気
管内吸入は、肺臓上皮細胞の増殖増大をもたらした。これを図６０に示す。ＫＧ
Ｆ−２Δ３３処置は、ＢｒｄＵ陽性細胞数／視野の統計的に有意な増大を起こし
た。緩衝液対照の１．５８細胞／視野に対して、１ｍｇ／ｋｇでは２３．４細胞
／視野（ｐ＝０．０００２）であり、５ｍｇ／ｋｇでは１０．３細胞／視野（ｐ
＝０．０００３）であった。
【０６１４】実施例３３ 感染切開創における局所投与ＫＧＦ−２Δ３３ 創傷の細菌感染症は、相変わらず臨床的に重要である。正常な状態では、創傷
の治癒過程は難なく進行する。しかしながら、創傷に細菌が接種されると、炎症
性応答での細胞介在物質の不均衡が生じ、創傷治癒が遅れる。露出創傷の汚染は
、創傷縮小の減少、正常創傷コラーゲン含量低下および伸長強度低下によって特
徴付けられる創傷治癒過程を阻害する。雄性成熟スプラークドーリーラット（ｎ
＋１０／群）を第１日にケタミン（５３ｍｇ／ｋｇ筋注）とキシラジン（５．３
ｍｇ／ｋｇ筋注）の組合せで麻酔する。背面領域を剃毛し、７０％アルコールで
殺菌する。肩甲骨の下約１ｃｍから始まる全厚（上皮、真皮から皮下層まで）２
．５ｃｍの外科的創傷を無菌１０号メスを用いて作製した。創傷を等距離皮膚ス
テープル３個で留めた。切開創に黄色ブドー球菌（１０７ｃｆｕ／５０μＬ）を
ＰＢＳ液として植菌した。ＫＧＦ−２Δ３３は、創傷時（第０日）に創傷当り５
０μＬ中０．１、１、および１０μｇの用量で局所投与した。創傷をガス浸透性
閉鎖包帯（Tegaderm）で覆った。動物を第５日にケタミン／キシラジンで麻酔し
、ナトリウムペントバルビタール致死量（３００ｍｇ／ｋｇ）の心内投与によっ
て屠殺した。創傷の０．５ｃｍ中央セグメントを切開して、コラーゲン定量のた
めに冷凍した。幅０．５ｃｍの別な創傷２個を切開した。切り出した創傷片を用
いてIntron皮膚張力計を用いて切断強度を研究した。切断強度は、０ｍｍ／秒の
速度で１１ポンド負荷細胞を用いて各創傷が切断前に耐えられる最大の強度と定
義した。動物毎に２個の測定値を平均して創傷の切断強度値平均を得た。統計分
析は非ペアｔ検定（平均±ＳＥ）で行う。
【０６１５】 創傷内黄色ブドー球菌の切開部内適用は、切断強度の測定でも創傷治癒に明確
な悪化が起きる（ある実験では、細菌の担体で処置した非感染創傷が１３６ｇ±
６ｇ；感染創傷が８７ｇ±６ｇ、ｐ＜０．０００１であり、他の実験では細菌の
担体で処置した非感染創傷が２００ｇ±１４ｇ；感染創傷が１５４ｇ±１０ｇ、
ｐ＜０．０１であった）。ＫＧＦ−２の局所投与は、０．１、１および１０μｇ
用量で、ＫＧＦ−２緩衝液＋黄色ブドー球菌対照と比較して、統計的に有意な切
断強度の強化を起こした［ある実験ではＫＧＦ−２を０．１μｇでは１５２±１
６ｇ（ｐ＝０．００２）；１μｇでは１３５±１２ｇ（ｐ＝０．００３）；およ
び１０μｇでは１５８±１０ｇ（ｐ＝０．０００１）であり、他の実験では、Ｋ
ＧＦ−２を０．１μｇでは１８５±１０ｇ（ｐ＝０．０３）；１μｇでは１８６
±１１ｇ（ｐ＝０．０３）；１０μｇでは１９０±７ｇ（ｐ＝０．００９）であ
った］。中間０．５ｃｍ創傷片のコラーゲン分析は、ＫＧＦ−２処理群にコラー
ゲン含量の増加を示した。しかしながら、緩衝液対照と比較するとコラーゲン含
有量の増加は統計的に有意ではなかった。
【０６１６】実施例３３ １ｍｇ／ｋｇ用量ＫＧＦ−２Δ３３の１日おき静脈内投与が示す増殖効果 雄性スプラークドーリーラットに、１ｍｇ／ｋｇ用量のＫＧＦ−２Δ３３また
は緩衝液を静脈注射した。動物には毎日または１日おきに注射した。各処置群を
１週間注射し、その週末に屠殺した。屠殺の日に、動物にＢｒｄＵ１００ｍｇ／
ｋｇを腹腔内注射した。２時間後、動物を屠殺し、血清を採取した。様々な組織
を収集して１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。各組織を処理して組織学的評
価を行った。組織をヘマトシリンおよびエオシン、過ヨード酸−シッフ、または
アルシアンブルーで染色した。別の切片を抗−ＢｒｄＵ抗体で免疫組織化学的染
色に付した。増殖は画像分析スペクトル、IPlabスペクトル、を用いて定量化し
た。血清化学分析は、自動化学分析装置を用いて行った。次のパラメータを定量
した：甲状腺重量、腸内杯状細胞増殖（十二指腸、空腸および回腸）；大腸内杯
状細胞増殖；唾液腺および顎下腺内増殖；および血清化学被分析物（グルコース
、ＢＵＮ、カルシウム、全蛋白質、アルブミン、アルカリホスファターゼ、アラ
ニンアミノトランスフェラーゼ、コレステロールおよびトリグリセリド）。
【０６１７】 小腸および結腸では、ＫＧＦ−２の毎日投与は杯状細胞数の有意な増大を起こ
した。１日おき投与も確かに杯状細胞数の僅かな増加を示したが、統計的有意な
水準には達しなかった。唾液腺では、細胞数の増加は耳下腺のみで観察された。
処置群間に差はなかった。両投与処方による甲状腺の肥大が認められた。この増
加の大きさは毎日処置群で大であった。ＫＧＦ−２の毎日投与は、統計的有意な
増加を次の被分析物に起こした：トリグリセリド、アルカリホスファターゼ、カ
ルシウム、アルブミンおよび全蛋白質。１日おき投与は、これら被分析物に影響
がなかった。コレステロールのレベルは両投与群で上昇した。しかし、増加は毎
日投与群の方が大きかった。たとえばＡＬＴおよびＡＳＴのような細胞損傷マー
カーは、同様に両投与群で低下した。
【０６１８】実施例３４ ポリペプチドの製剤化 ＫＧＦ−２の組成物は、ＧＭＰに適合する様式で製剤化され、担当医に知られ
ている患者個々の臨床的状況（特にＫＧＦ−２ポリペプチド単独での処置の副作
用）、送達部位、投与方法、投与計画、およびその他の因子、を考慮して投与さ
れる。本明細書の目的では、「有効量」は、このような配慮から決定される。
【０６１９】 一般的な計画として、投与毎のＫＧＦ−２医薬的合計有効量は、非経口投与で
は患者体重当り、約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内にあるが
、前記の通り、これは治療的裁量の対象である。さらに好ましくは、この用量は
少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日であり、最も好ましくはヒトではこのホルモ
ン約０．０１および１ｍｇ／ｋｇ／日の間である。連続的に投与するなら、ＫＧ
Ｆ−２は典型的には約１μｇ／ｋｇ／時間から約５０μｇ／ｋｇ／時間の速度で
、毎日１−４回注射または例えばミニポンプなどを使用する連続的皮下点滴によ
って投与される。静脈内バッグ溶液も採用されうる。変化を観察するために必要
な処置の長さおよび発生する応答のための処置後の間隔は、所望の効果に依存し
て変化すると思われる。
【０６２０】 ＫＧＦ−２を含む医薬的組成物は、経口的、直腸内、非経口的、槽内的、膣内
的、腹腔内的、局所的（粉末、軟膏、ゲル、ドロップまたは経皮パッチ剤による
）、口腔内的に；または経口または経鼻スプレー剤として、投与される。「医薬
的に許容される担体」は非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カ
プセル化材料またはその他いずれかの型の製剤用添加剤を示す。本明細書に使用
する用語「非経口的」は、脈管内、筋肉内、腹腔内、槽内、皮下および眼内注射
および点滴を含む、投与の形態を示す。
【０６２１】 ＫＧＦ−２は、持続放出システムによっても適宜投与される。持続放出組成物
の適切な例は、たとえばフィルムまたはマイクロカプセルなどの形に整形された
半浸透性ポリマーマトリックスを含む。持続放出マトリックスには、ポリアクチ
ド（米国特許3,773,919、欧州特許EP58,481）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル
−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Sidman, U. et al., Biopolymers, 22: 54
7-556 (1983)）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメトアクリレート）（R. Langer
et al., J. Biomed. Master. Res., 15: 167-277 (1981);および R. Langer, Ch
em. Tech., 12: 98-105 (1982)）、エチレンビニルアセテート（R. Langer et a
l.）またはポリＤ-（-）-３-ヒドロキシ酪酸（欧州特許EP133,988）が含まれる
。持続放出組成物は、リポソーム的に捕捉されたＫＧＦ−２ポリペプチドも含む
。ＫＧＦ−２を含むリポソームは、それ自体公知の方法によって製造される（ド
イツ特許DE3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 368
8-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (
1980); 欧州特許EP52,322; 欧州特許EP36,676; 欧州特許EP88,046; 欧州特許EP1
43,949; 欧州特許EP142,641; 日本特許出願83-118008; 米国特許4,485,045およ
び米国特許4,544,545; および欧州特許EP102,324）。通常、リポソームは、小さ
な（約２００−８００オングストローム）単層型であって、脂質含有量は約３０
モルパーセントのコレステロールであるが、選択する比率は分泌ポリペプチド療
法に最適になるように調製される。
【０６２２】 非経口的投与のために、一態様では、ＫＧＦ−２を一般的に、所望の純度で、
医薬的に許容される担体と混合することによって、単位用量の注射用剤型（液剤
、懸濁剤または乳剤）に製剤化する。この担体は、投与を受ける者に対して採用
する用量および濃度で非毒性であって、その製剤の他成分と適合するものである
。例えば、この製剤は、好ましくは酸化剤および、ポリペプチドを劣化させるこ
とが知られている、その他の化合物を含まない。
【０６２３】 一般に、この製剤はＫＧＦ−２を均質にかつ丁寧に液体担体または微細に粉砕
された固体担体またはそれらの双方と接触させることによって製造される。そこ
で、要すれば、この生成物を所望の剤型に整形する。好ましくは、この担体は、
非経口的担体、より好ましくは被投与者の血液と等張な溶液である。このような
担体の例には、水、食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液が含まれ
る。たとえば硬化油およびオレイン酸エチルのような非水性基剤も、リポソーム
と同様に、本発明に有用である。
【０６２４】 担体は、たとえば等張性および化学安定性を強化する物質のような適切な添加
剤を少量含む。そのような材料は、採用する用量および濃度で被投与者に無毒性
であって、これには、たとえばホスフェート、クエン酸、コハク酸、酢酸、その
他の有機酸またはその塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；た
とえばポリアルギニンまたはトリペプチドなどの低分子量ポリペプチド（約１０
残基以下）；たとえば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのような
蛋白質；たとえばポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；たとえばグリ
シン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セル
ロースまたはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単
糖類、二糖類その他の炭水化物；たとえばＥＤＴＡのようなキレート剤；たとえ
ばマンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；たとえばナトリウム
のようなカウンターイオン；および／またはたとえばポリソルベート、ポロキサ
マーまたはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０６２５】 ＫＧＦ−２は、典型的にはこのような基剤中に約０．１ｍｇ／ｍＬから１００
ｍｇ／ｍＬまで、好ましくは１−１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように、ｐＨ約３
から８として、製剤化される。前記の添加剤、担体または安定化剤のあるものの
使用では、ポリペプチドの塩が形成されることも理解されるであろう。
【０６２６】 治療用投与に使用されるＫＧＦ−２は、無菌であることもできる。無菌性は、
無菌濾過膜（たとえば０．２ミクロン膜）を通して濾過することによって容易に
達成される。一般に治療用ポリペプチド組成物は、例えば皮下注射針で貫通可能
な栓を有する静脈注射液用バッグまたはバイアルなど、無菌進入路を有する容器
に加えられる。
【０６２７】 通常、ＫＧＦ−２ポリペプチドは、たとえば閉鎖したアンプルまたはバイアル
など、単位用量または多回用量用容器内に、水溶液としてまたは再構築のための
凍結乾燥製剤として、貯蔵される。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍＬバイアル
に無菌濾過１％（ｗ／ｖ）水性ＫＧＦ−２ポリペプチド溶液を５ｍＬ加え、得ら
れる混合物を凍結乾燥する。点滴用溶液は、滅菌注射用水を使用して、凍結乾燥
したＫＧＦ−２ポリペプチドを再構築することによって製造される。
【０６２８】 本発明はまた、医薬用のパックまたはキットも提供するが、これは本発明の医
薬組成物の成分を１種またはそれ以上入れた容器１個またはそれ以上からなる。
このような容器とともに、医薬または生物学的産物の製造、使用または販売を管
轄する政府機関が指定する型の注意書きも含むことができる。この注意書は政府
機関によるヒトに投与するための製造、使用または販売の承認を反映するもので
ある。これに加えて、ＫＧＦ−２は他の治療用化合物と組合せて採用しうる。
【０６２９】 本発明の組成物は単独でまたは他の治療用薬剤と組合せて投与しうる。本発明
の組成物と組合せて投与しうる治療用薬剤には、これに限定するものではないが
、ＴＮＦファミリーの別な化合物、化学療法剤、抗生物質、ステロイド性または
非ステロイド性抗炎症剤、通常の免疫治療剤、サイトカインおよび／または成長
因子が含まれる。これらの組合わせは、たとえば、混合剤などとして同時に、個
別であるが同時にまたは同時進行的に；または順次に投与してもよい。これには
、混合した薬剤が治療用混合物としてともに投与する方法および混合した薬剤を
個別であるが、たとえば別の静脈注射系を経て同じ個体に同時に投与するなどの
方法、を含む。「組合せ」投与には、さらに個別の投与が含まれ、ここでは最初
に化合物または薬剤の１種を投与し、続いて第二のものを投与する。
【０６３０】 一態様では本発明の組成物は、ＴＮＦファミリーの別の化合物と組合せて投与
される。本発明の組成物とともに投与しうるＴＮＦ、ＴＮＦ関連またはＴＮＦ様
分子には、これに限定するものではないが、ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（
ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとも称される）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマーＬＴ−α
２−β中に存在する）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４
０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公表WO96/14328
）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公表WO97/33899）、エンドカイン−α（国際公表WO98/078
80）、ＴＲ６（国際公表WO98/30694）、ＯＰＧ、およびニュートロカイン−α（
国際公表WO98/18921）、ＯＸ４０、および神経成長因子（ＮＧＦ）、および可溶
性Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公表
WO96/34095）、ＤＲ３（国際公表WO97/33904）、ＤＲ４（国際公表WO98/32856）
、ＴＲ５（国際公表WO98/30693）、ＴＲ６（国際公表WO98/30694）、ＴＲ７（国
際公表WO98/41629）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公表WO98/56892）、ＴＲ１０（
国際公表WO98/54202）、３１２Ｃ２（国際公表WO98/06842）、およびＴＲ１２お
よび可溶性ＣＤ１５４、ＣＤ７０およびＣＤ１５３が含まれる。
【０６３１】 通常の非特異的免疫抑制剤であって、本発明の組成物と組合せて投与しうるも
のには、これに限定するものではないが、ステロイド、サイクロスポリン、サイ
クロスポリン類似体、サイクロホスファミド、メチルプレドニゾン、プレドニソ
ン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５ーデオキシスペルグアリン、およびそ
の他の免疫抑制剤であって、応答するＴ細胞の機能を抑制することによって作用
するものが含まれる。
【０６３２】 別の態様では、本発明の組成物は、抗生物質剤と組合せて投与される。本発明
の組成物と組合せて投与しうる抗生物質剤には、これに限定するものではないが
、テトラサイクリン、メトロニダゾール、アモキシシリン、β−ラクタマーゼ、
アミノグリコシド、マクロライド、キノロン、フルオロキノロン、セファロスポ
リン、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、およびストレプトマイシンが含
まれる。
【０６３３】 別の態様では、本発明の組成物は単独で投与されるか、または抗炎症剤と組合
せて投与される。本発明の組成物と組合せて投与しうる抗炎症剤には、これに限
定するものではないが、グルココルチコイドおよび非ステロイド性抗炎症剤、ア
ミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、ア
リールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サ
リチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−
アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、ベ
ンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモ
ルファゾン、グアヤズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセ
プロール、パラニリン、ペリソキサール、ピフォキシム、プロクアゾン、プロキ
サゾール、およびテニダップが含まれる。
【０６３４】 別の態様では、本発明の組成物は、化学療法剤と組合せて投与される。本発明
の組成物と組合せて投与しうる化学療法剤には、これに限定するものではないが
、抗生物質誘導体（たとえばドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン
、およびダクチノマイシンなど）；抗エストロゲン剤（たとえばタモキシフェン
）；抗代謝剤（たとえばフルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキセート、フロ
キシウリジン、インターフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン、メ
ルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（たとえばカルムスチ
ン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、サイクロホスフ
ァミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイシ
ン、ブスルファン、シスプラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン（た
とえばメドロキシプロゲステロン、エストラムスチン燐酸ナトリウム、エチニル
エストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステ
ロン、二燐酸ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセン、およびテスト
ラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（たとえばメファレン、クロロア
ンブシル、メクロエタミン（ナイトロゲンマスタード）、およびチオテーパ）；
ステロイドおよび複合剤（たとえばベタメタゾン燐酸ナトリウム）；およびその
他（たとえばジカルバジン、アスパラギナーゼ、ミトテイン、硫酸ビンクリスチ
ン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が含まれる。
【０６３５】 別の態様では、本発明の組成物は、サイトカインと組合せて投与される。本発
明の組成物と組合せて投与しうるサイトカインには、これに限定するものではな
いが、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２
、ＩＬ１３、ＩＬ１５、抗−ＣＤ４０、ＣＤ４０、ＩＮＦ−γおよびＴＮＦ−α
が含まれる。
【０６３６】 別の態様では、本発明の組成物は、血管由来蛋白質剤と組合せて投与される。
本発明の組成物と組合せて投与しうる血管由来蛋白質剤には、これに限定するも
のではないが、欧州特許EP399816に開示されているグリオーマ由来増殖因子（Ｇ
ＤＧＦ）；欧州特許EP682110に開示されている血小板由来増殖因子−Ａ（ＰＤＧ
Ｆ−Ａ）；欧州特許EP282317に開示されている血小板由来増殖因子−Ｂ（ＰＤＧ
Ｆ−Ｂ）；国際公表WO92/06194に開示されている胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）；Ha
user et al., Growth Factors, 4: 259-268 (1993)に開示されている胎盤増殖因
子−２（ＰｌＧＦ−２）；国際公表WO90/13649に開示されている血管内皮増殖因
子（ＶＥＧＦ）；欧州特許EP506477に開示されている血管内皮増殖因子−Ａ（Ｖ
ＥＧＦ−Ａ）；国際公表WO96/39515に開示されている血管内皮増殖因子−２（Ｖ
ＥＧＦ−２）；国際公表WO96/26736に開示されている血管内皮増殖因子Ｂ−１８
６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際公表WO98/02543に開示されている血管内皮増殖
因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；国際公表WO98/07832に開示されている血管内皮増殖因
子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびドイツ特許DE19639601に開示されている血管内皮
増殖因子Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が含まれる。前記文献は全て出典明示により本明細
書の一部とする。
【０６３７】 別の態様では、本発明の組成物は、繊維芽細胞増殖因子と組合せて投与される
。本発明の組成物と組合せて投与しうる繊維芽細胞増殖因子には、これに限定す
るものではないが、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ
−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧ
Ｆ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が
含まれる。
【０６３８】 別の態様では、本発明の組成物は、たとえば放射線療法のような治療用薬剤ま
たは予防用薬剤と組合せて投与される。
【０６３９】実施例３５ ＫＧＦ−２の低レベルを処置する方法 本発明は、体内でＫＧＦ−２活性のレベルを上昇させる必要がある個体を処置
する方法も提供する。この方法は、患者にＫＧＦ−２またはその作動剤を治療的
有効量含む組成物を投与することを含む。
【０６４０】 さらにその上、個体でＫＧＦ−２が標準または正常発現レベルから減少するこ
とによって起きる病状は、好ましくは分泌型の、ＫＧＦ−２を投与することによ
って処置できることは認められよう。そこで、本発明はＫＧＦ−２ポリペプチド
のレベルを上昇させる必要のある個体を処置する方法も提供する。この方法は、
そのような個体のＫＧＦ−２活性レベルを上昇させる量のＫＧＦ−２を含む医薬
的組成物をその個体に投与することからなる。
【０６４１】 例えば、ＫＧＦ−２ポリペプチドのレベルが低下した患者に、日用量０．１−
１００μｇ／ｋｇでこのポリペプチドを連続６日間投与する。好ましくは、この
ポリペプチドは分泌型である。投与および製剤に基く投与方法の詳細は、実施例
２４に提供する。
【０６４２】実施例３６ ＫＧＦ−２の高レベルを処置する方法 本発明は、体内でＫＧＦ−２活性のレベルを低下させる必要がある個体を処置
する方法も提供する。この方法は、そのような個体にＫＧＦ−２拮抗剤を治療的
有効量含む組成物を投与することを含む。本発明での使用に好適な拮抗剤は、Ｋ
ＧＦ−２に特異的な抗体である。
【０６４３】 アンチセンス技術はＫＧＦ−２の産生を阻害するために使用される。この技術
は、好ましくは、たとえば癌のような様々な病因に基づく、分泌型のＫＧＦ−２
ポリペプチドのレベルを低下させる方法の一例である。
【０６４４】 例えば、ＫＧＦ−２のレベルが異常に上昇していると診断された患者に、アン
チセンスポリヌクレオチドを日用量０．５、１．０、１．５、２．０および３．
０ｍｇ／ｋｇで２１日間静脈内投与する。受忍できれば７日間の休薬期間をおい
てこの処置を反復する。アンチセンスポリヌクレオチドの製剤は実施例２４に提
供する。
【０６４５】実施例３７ 遺伝子治療を使用する処置法−生体外 遺伝子療法の一つでは、患者にＫＧＦ−２ポリペプチドを発現できる繊維芽細
胞を移植する。一般に繊維芽細胞は患者から皮膚生検によって採取する。得られ
た組織を組織培養用培地に入れて小片に分ける。組織の小さな断片約１０個を各
組織培養フラスコの濡れた表面に置く。フラスコを上下反転し、密栓し、室温に
一夜放置する。室温で２４時間後、フラスコを逆転し、組織の断片をフラスコの
底に残し、新鮮な培地（たとえば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプト
マイシン添加のハムのＦ１２培地）を加える。フラスコを３７℃で約１週間イン
キュベーションする。
【０６４６】 この時点で、新鮮な培地を加え、続いて数日毎に変更する。培地中でさらに２
週間培養後、繊維芽細胞の単層が出現する。単層をトリプシン処理し、大きなフ
ラスコで拡大産生する。
【０６４７】 モロニーのマウス肉腫ウイルスの長末端リピートに結合したｐＭＶ−７（Kirs
chmeier, P.T. et al., DNA, 7: 219-25 (1988)）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化し、次にウシ小腸ホスファターゼで処理する。線状ベクターを寒天
ゲルで分画し、ガラスビーズを用いて精製する。
【０６４８】 ＫＧＦ−２をコードするｃＤＮＡは、実施例１に示した５’および３’−末端
配列に対応するＰＣＲプライマーを用いて増幅できる。好ましくは、５’プライ
マーはＥｃｏＲＩ部位を含み、３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等
量のモロニーマウス肉腫ウイルス線状骨格および増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉ
ｎｄＩＩＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下に加える。得られる混合物をこの
断片２種の連結に適切な条件下に維持する。連結混合物を用いて細菌ＨＢ１０１
を形質転換し、これをカナマイシン添加寒天上に塗布して、このベクターに正し
くＫＧＦ−２が挿入されたことを確認する。
【０６４９】 両方性ｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を組織培養中で全
面成長密度まで１０％ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン
添加ダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させる。ＫＧＦ−２遺
伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加えてパッケージング細胞にベクターを形質
導入する。このパッケージング細胞は、今やＫＧＦ−２遺伝子を含む感染ウイル
ス粒子を産生する（このパッケージング細胞を産生細胞と称する）。
【０６５０】 新鮮な培地を形質導入産生細胞に加え、続いて培地を全面成長産生細胞の１０
ｃｍプレートから収集する。感染ウイルス粒子を含む培地をミリポアフィルター
で濾過し、離脱した産生細胞を除き、次にこの培地を用いて繊維芽細胞を感染さ
せる。培地を全面成長以下の繊維芽細胞から除去し、産生細胞からの培地に置換
する。この培地を除去し、新鮮な培地と置換する。ウイルスの力価が高ければ、
繊維芽細胞の殆ど全てが感染しており、選択は不要になる。力価が非常に低けれ
ば、たとえばｎｅｏまたはｈｉｓのような選択マーカーを持つ、レトロウイルス
ベクターの使用が必要になる。繊維芽細胞が効果的に感染すれば、その繊維芽細
胞を分析してＫＧＦ−２蛋白質が産生されるかどうかを判定する。
【０６５１】 加工した繊維芽細胞を次に、単独でまたはcytodes 3 マイクロキャリアービー
ズ上で全面成長まで増殖させた後に、宿主に移植する。
【０６５２】実施例３８ 内因性ＫＧＦ−２遺伝子を使用する遺伝子治療 本発明による別の遺伝子療法では、内因性ＫＧＦ−２配列を、相同的組換えに
よって作動可能にプロモーターに関連付ける。この方法は、例えば、1997年6月2
4日発行の米国特許第5,641,670号；1996年9月26日公表の国際公表WO96/29411；1
994年8月4日公表の国際公表WO94/12650；Koller et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 86: 8932-8935 (1989)；およびZijlstra et al., Nature, 342: 435-43
8 (1989)；に記載されている。この方法は標的細胞に存在するが、細胞中では発
現されないか、または所望のレベルよりも低いレベルでしか発現されない遺伝子
の活性化を含む。
【０６５３】 ポリヌクレオチド構築物を作製するが、この構築物は、プロモーターおよび標
的配列を含み、またこれらは、プロモーターに結合する内因性ＫＧＦ−２の５’
非コード配列に相同的である。標的配列は、ＫＧＦ−２の５’末端に十分に近接
させて、プロモーターが相同的組換え後に内因性配列に作動可能に結合するよう
にする。このプロモーターと標的配列は、ＰＣＲを用いて増幅できる。増幅した
プロモーターは、好ましくは異なる制限酵素部位を５’および３’末端に含む。
好ましくは、第一標的配列の３’末端は、増幅されたプロモーターの５’末端と
同じ制限酵素部位を含み、および第二標的配列の５’末端は、増幅されたプロモ
ーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されたプロモーターおよび増幅さ
れた標的配列を適当な制限酵素で消化し、続いてウシ小腸ホスファターゼで処理
する。消化されたプロモーターおよび消化された標的配列をＴ４ＤＮＡリガーゼ
の存在下に混合する。得られる混合物を、この断片２種の連結に適する条件下に
維持する。構築物をアガロースゲル上でサイズ画分し、次にフェノール抽出およ
びエタノール沈殿によって精製する。
【０６５４】 この実施例では、ポリヌクレオチド構築物を電気穿孔法により裸のポリヌクレ
オチドとして投与する。しかしながら、このポリヌクレオチド構築物は、たとえ
ばリポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、沈殿剤、などのような、遺伝子移
入促進剤とともに投与してもよい。このような送達法は当技術分野で知られてい
る。
【０６５５】 細胞が遺伝子移入されると、相同的な組換えが行われ、プロモーターが内因性
ＫＧＦ−２配列に作動可能に結合する。これで該細胞内でのＫＧＦ−２発現が起
きる。発現は免疫染色またはその他当技術分野で知られている他の方法によって
検出しうる。
【０６５６】 繊維芽細胞は皮膚生検から得られる。得られる組織は１０％ウシ胎児血清添加
ＤＭＥＭに入れる。幾何級数的増殖または早期定常相の繊維芽細胞をトリプシン
処理し、栄養培地でプラスチックの表面から洗浄する。所定量の細胞懸濁液を採
取して計数し、残りの細胞を遠心分離する。上清液を吸引し、ペレットを電気穿
孔緩衝液（２０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、１３７ｍＭ−ＮａＣｌ、５ｍＭ
−ＫＣｌ、０．７ｍＭ−Ｎａ2ＨＰＯ4、６ｍＭ−デキストロース）５ｍＬに再懸
濁する。細胞を再度遠心分離し、上清液を吸引し、細胞をアセチル化ウシ血清ア
ルブミン１ｍｇ／ｍＬを含む電気穿孔緩衝液に再懸濁する。最終細胞懸濁液は約
３×１０６細胞／ｍＬを含む。電気穿孔は再懸濁直後に行うべきである。
【０６５７】 プラスミドＤＮＡは、標準的技術にしたがって調製する。例えばＫＧＦ−２座
を標的とするプラスミドを構築するためには、プラスミドｐＵＣ１８（MBI Ferm
entas, Amherst, NY）をＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＣＭＶプロモーターをＰＣ
Ｒで増幅するが、これはＸｂａＩ部位を５’末端に、およびＢａｍＨＩ部位を３
’末端に有する。ＫＧＦ−２非コード配列２種をＰＣＲで増幅する：ＫＧＦ−２
非コード配列の一方（ＫＧＦ−２断片１）は５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を持
ち、３’末端にＸｂａＩ部位を持つ；他方のＫＧＦ−２非コード配列（ＫＧＦ−
２断片２）は５’末端にＢａｍＨＩ部位を持ち、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位
を持つ。ＣＭＶプロモーターおよびＫＧＦ−２断片を適当な酵素（ＣＭＶプロモ
ーター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；ＫＧＦ−２断片１−ＸｂａＩ；ＫＧＦ−２
断片２−ＢａｍＨＩ）で消化し、相互に連結する。得られる連結産物をＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＵＣ１８プラスミドに連結する。
【０６５８】 プラスミドＤＮＡを電極間隔０．４ｃｍの無菌キュベット（Bio-Rad）に加え
る。最終ＤＮＡ濃度は、一般には少なくとも１２０μｇ／ｍＬである。次にこの
細胞懸濁液０．５ｍＬ（約１．５×１０6細胞を含む）をキュベットに入れ、懸
濁液およびＤＮＡ溶液をおだやかに混合する。Gene-Pulser装置（Bio-Rad）を用
いて電気穿孔を行う。静電容量と電圧をおのおの９６０μＦおよび２５０−３０
０Ｖに設定する。電圧が上昇するに従って細胞の生存率が減少するが、導入され
たＤＮＡをゲノム内に安定に取り込む生存細胞の百分率は劇的に増大する。この
パラメータでは、約１４−２０ミリ秒のパルス時間が観察されるであろう。
【０６５９】 電気穿孔された細胞を室温に約５分間維持し、キュベットの内容物を次に無菌
移動ピペットで取り出す。細胞を、１０ｃｍ皿に入れて予め加温しておいた栄養
培地（ＤＭＥＭ＋１５％ウシ血清）１０ｍＬに直接加え、３７℃でインキュベー
ションする。翌日、培地を吸引し、新鮮培地１０ｍＬと置換し、さらに１６−２
４時間インキュベーションする。
【０６６０】 加工した繊維芽細胞を次に、単独で、またはcytodex 3 マイクロキャリアービ
ーズ上で全面成長するまで増殖した後に、宿主に注射する。繊維芽細胞は今や蛋
白質産物を産生する。この繊維芽細胞を前記のように患者に導入する。
【０６６１】実施例３９ 遺伝子治療を使用する処置法−生体内 遺伝子研究の進歩はヒトの細胞内に遺伝子を送達し、発現させる技術の発展を
もたらした。遺伝子治療の理想的な目標は、活性な蛋白質を作製し、内因性産生
の欠乏を補充するための正常遺伝子の送達である（Gorecki, D.C., et al., Arc
h. Immunol. Ther. Exp., 45(5-6): 375-381 (1997)）。
【０６６２】 サイトカインまたは成長因子をコードする遺伝子は、創傷治癒および組織修復
の様々な段階に関与するが、その送達は創傷治癒の結果を修正する可能性を持つ
（Taub, P. J. et al., J. Reconst. Microsur., 14(6): 387-390 (1998)）。成
長因子またはその他のサイトカインのｃＤＮＡを創傷治癒および組織修復に使用
については詳細に論述されている（Tchorzewski, M.T. et al., J. Surg. Res.,
77: 99-103 (1998)）。ベクターが輸送する遺伝子は、新細胞系列を作製するた
め、移植された細胞を確認するため、および増殖因子または酵素を発現するため
に使用できる。遺伝子治療の利点の一つは、遺伝子由来蛋白質の治療用濃度を病
巣内に局所的に達成することにある。ヒトの組換えＫＧＦ−２蛋白質は、皮膚、
消化器および上皮起源の細胞を含むその他の器官の創傷治癒を促進することが証
明されている。ＫＧＦ−２遺伝子の使用は、組換え蛋白質と類似の薬理学的側面
を持つことが期待される。ＫＧＦ−２遺伝子は、たとえば細胞増殖、移動および
細胞外マトリックスの形成のように、組織修復に関する事象に関与するであろう
。
【０６６３】 転写され、翻訳されたｃＤＮＡを用いて、遺伝子を目的とする部位に送達する
ために使用された。この様式で使用された遺伝子の例には、ａＦＧＦとＢＭＰ−
７が含まれる（Breitbart, A.S. et al., Ann. Plast. Surg., 24(5): 488-495
(1999)）。これらの細胞は、生分解性マトリックス（たとえばポリグリコール酸
）、組織置換物または均等物（たとえば人工皮膚）、人工臓器、コラーゲン由来
マトリックス、などを含む細胞担体にも使用された。リポソームは、ｃＤＮＡを
運搬するために使用された。日本赤血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）中のＰＤＧＦ−
ＢＢ−ｃＤＮＡのリポソーム懸濁液は、膝蓋靭帯の治癒について研究された（Na
kamura et al., Gene Ther.,5(9): 1165-1170 (1998)）。遺伝子は、直接的注射
によって作用部位（たとえば心臓）に直接的に送達できる。
【０６６４】 そこで本発明の別の側面は、障害、疾患および病状を処置するために、生体内
遺伝子治療法を使用することにある。この遺伝子治療法は、裸の核酸（ＤＮＡ、
ＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を動物に導入するものであ
って、ＫＧＦ−２ポリペプチドの発現を増大または減少させるものである。この
ＫＧＦ−２ポリヌクレオチドは、プロモーターまたは標的組織によるＫＧＦ−２
ポリペプチドの発現に必要な、いかなるその他の遺伝子要素とも作動可能に連結
していてもよい。そのような遺伝子治療技術および送達技術および方法は、当技
術分野で知られており、例えばここに全て出典明示により本明細書の一部とする
WO90/11092; WO98/11779; 米国特許5,693,622; 5,705,151; 5,589,859; Tabata,
H. et al., Cardiovasc. Res., 35(3): 470-479 (1997); Chao, J. et al., Ph
armacol. Res., 35(6): 517-522 (1997); Wolff, J.A., Neuromuscul. Disord.,
7(5): 314-318 (1997); Schwartz, B. et al., Gene Ther., 3(5): 405-411 (1
996); Tsurumi, Y. et al., Circulation, 94(12): 3281-3290 (1996) に記載さ
れている。
【０６６５】 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物は、たとえば組織（心臓、筋肉、皮膚、肺
臓、肝臓、小腸など）の間質空隙への注射のように注射可能な材料を動物細胞に
送達するいかなる方法によっても送達できる。このＫＧＦ−２ポリヌクレオチド
構築物は医薬的に許容される液体または水性担体中で送達することができる。
【０６６６】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、その配列が細胞への
進入を援助し、促進し、加速する送達担体、例えばウイルス配列、ウイルス粒子
、リポソーム製剤、リポフェクチンまたは沈殿剤、など、を含まない配列である
ことを示す。しかしながら、ＫＧＦ−２ポリヌクレオチドは、リポソーム製剤（
たとえばFelgner, P.L. et al., Ann. NY Acad. Sci., 772: 126-139 (1995); A
bdalah B. et al., Biol. Cell., 85(1) 1-7 (1995) に教示されているもののよ
うな）として送達しうるが、これは当技術分野でよく知られている方法で調製で
きる。
【０６６７】 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチドベクター構築物であって、遺伝子療法で使用され
るものは、好ましくは宿主のゲノムに組み込まれず、複製できる配列を含まない
構築物である。当技術分野の熟練者に知られている強力なプロモーターはいずれ
もＤＮＡの発現を操作するために使用できる。他の遺伝子治療技術とは異なり、
標的細胞に裸の核酸配列を導入することの主たる利点は、一つには細胞内でのポ
リヌクレオチド合成の一過性の性質である。複数の研究で、非複製ＤＮＡ配列が
細胞に導入されると所望のポリペプチドを６ケ月までの期間産生することが証明
されている。
【０６６８】 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物を、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肝臓
、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ腺、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃
、小腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺および結合組織を含む）の間
質空隙に送達することができる。組織の間質空隙は、細胞間液、器官組織の網状
繊維内にある粘液多糖類マトリックス、管または房の壁内にある弾力繊維、繊維
組織のコラーゲン繊維または筋肉細胞を鞘内に収める結合組織内または骨の小腔
内の同マトリックスを含む。同様に循環系の血漿およびリンパ系のリンパ液で占
められている空間もある。筋肉組織の間質空隙への送達は以下に検討する理由か
ら好適である。それらはその細胞を含む組織に注射することによって容易に送達
される。それらは、持続性の、分化した、非分裂細胞中に送達され発現されるの
が好ましいのであるが、送達および発現は、たとえば血液の幹細胞または皮膚の
繊維芽細胞のような、非分化または不完全分化細胞中で達成されてもよい。生体
内筋肉細胞はポリヌクレオチドを取り込み、発現する性能について殊に有能であ
る。
【０６６９】 裸のＫＧＦ−２ポリヌクレオチド注射のためには、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効
用量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内にあろう。
好ましくは、この用量は約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、
さらに好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇの範囲内にあろう。
勿論、通常の熟練した専門家はこの用量が注射する組織の部位に従って変動する
ことを認識するものである。核酸配列の適切で有効な用量は、当技術分野の通常
の熟練者が容易に決定でき、処置すべき病状および投与経路に依存する。好適な
投与経路は、組織の間質空隙への注射である、非経口的経路によるものである。
しかしながら、たとえば殊にエアロゾル製剤を肺臓または気管支の組織、咽喉ま
たは鼻腔粘膜に送達するための吸入など、他の非経口経路も使用できる。これに
加えて、裸のＫＧＦ−２ポリヌクレオチド構築物は、処置に使用するカテーテル
による血管形成術の間に動脈に送達することもできる。
【０６７０】 ＫＧＦ−２ポリヌクレオチドの用量作用効果は、生体内で筋肉に注射した場合
次のようにして判定する。ＫＧＦ−２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを産生
するために適当なＫＧＦ−２鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方策に従って
調製する。この鋳型ＤＮＡは、環状でも線状でもよいが、裸のＤＮＡとしてリポ
ソームと複合体させて使用する。マウスの大腿四頭筋に、様々な量の鋳型ＤＮＡ
を注射する。
【０６７１】 ５週齢から６週齢の雌性および雄性Ｂａｌｂ／Ｃマウスに２．５％アベルチン
０．３ｍＬを腹腔内注射して麻酔する。後大腿に１．５ｃｍ切開創を作成して大
腿四頭筋を直視可能にする。ＫＧＦ−２鋳型ＤＮＡを担体０．１ｍＬ中で１ｃｃ
シリンジと２７ゲージの注射針を用いて、１分間にわたって、この筋肉の膝への
遠位挿入部位から約０．５ｃｍ、深さ約０．２ｃｍの位置に注射する。次回の目
印のために注射部位を閉じ、ステンレス鋼製クリップで皮膚を閉鎖する。
【０６７２】 適当なインキュベーション時間（たとえば７日間）の後に、大腿四頭筋全体を
摘出して筋肉抽出物を調製する。大腿四頭筋の第５の１５ｕｍ断面毎にＫＧＦ−
２蛋白質の発現について染色する。別の時間については別の動物から大腿四頭筋
を様々な時間に採取し、同様にＫＧＦ−２蛋白質発現の時間的経過を追跡する。
注射後に筋肉内に持続するＫＧＦ−２のＤＮＡを、注射マウスおよび対照マウス
から全細胞ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清液を調製し、サザンブロット分析によって
判定する。マウスでの前記実験結果は、ヒトおよびその他の動物でＫＧＦ−２の
裸のＤＮＡを使用する処置の、正しい用量およびその他の処置パラメータを外挿
するために使用できる。
【０６７３】実施例４０ 炎症性腸疾患のＫＧＦ−２療法 この実施例では、飲料水に入れたデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）への
接触によって起きる病理学的変化の、ＫＧＦ−２ポリヌクレオチドの全身（鼻腔
内）投与および腹腔内投与による阻害、をマウスの大腸で判定する。
【０６７４】 鼻腔内投与：ＫＧＦ−２Δ３３をコードするポリヌクレオチドの１、１０また
は１００μｇ用量を、麻酔した雌性スイスウェブスターマウス（ｎ＝１０／群）
の鼻道に、平滑２６ゲージ針で導入する。対照ポリヌクレオチドを別群のマウス
に投与する。ポリヌクレオチド鼻腔内投与から５日後に、５％ＤＳＳを飲料水に
加える。マウスを体重、ヘマトクリット値およびスツール値について観察する。
飲料水にＤＳＳを加え始めてから７日後に、マウスを屠殺する。組織病理学的評
価を大腸および小腸について行う。ＲＴ−ＰＣＲ分析で、肝臓、脾臓および大腸
内のＫＧＦ−２発現量を判定する。
【０６７５】 腹腔内投与：ＫＧＦ−２Δ３３をコードするポリヌクレオチドの１、１０また
は１００μｇ用量を、雌性スイスウェブスターマウス（ｎ＝１０／群）に、平滑
２６ゲージ針で、第０日と第３日に腹腔内注射する。対照ポリヌクレオチドを別
群のマウスに、同じ計画により、投与する。第７日に５％ＤＳＳを飲料水に加え
る。マウスを体重、ヘマトクリット値およびスツールについて観察する。第１４
日にマウスを屠殺する。組織病理学的評価を大腸および小腸について行う。ＲＴ
−ＰＣＲ分析で、肝臓、横隔膜および大腸内のＫＧＦ−２発現量を判定する。
【０６７６】 この実施例に記載する研究では、ＫＧＦ−２Δ３３ポリヌクレオチドの活性を
試験する。しかしながら、当技術分野の熟練者は例示した研究を容易に修正して
、全長ＫＧＦ−２および成熟ＫＧＦ−２、ＫＧＦ−２Δ２８およびＫＧＦ−２の
アミノ酸７７から２０８まで、８０から２０８まで、および９３から２０８まで
をコードするポリヌクレオチド；およびＫＧＦ−２ポリペプチド、変異体、断片
、アゴニスト、および／または拮抗剤；および本明細書に記載するＫＧＦ−２突
然変異体を含む他のＫＧＦ−２ポリヌクレオチドの活性を試験することができる
。
【０６７７】実施例４１ 眼表面疾患のＫＧＦ−２療法 この実施例では、ラットの結膜、角膜または涙腺に及ぼす、ＫＧＦ−２Δ３３
ポリヌクレオチド結膜下投与の効果を判定する。
【０６７８】 ＫＧＦ−２Δ３３をコードするポリヌクレオチドを、麻酔した雌性スプラーク
ドーリーラット（１５０−２００ｇ体重、６匹／処置群）の結膜下洞に、１、１
０または１００μｇ用量で注射する。対照ポリヌクレオチドを同様にして別群の
対照ラットに注射する。各群のラットを注射後第３、７、および１４日に屠殺す
る。麻酔の３０分前にＢｒｄＵをラット何匹かの腹腔内に投与する。眼と周囲の
組織を摘出して組織学的分析を行う。角膜、結膜および涙腺の上皮細胞へのＢｒ
ｄＵ取り込みの程度を測定する。角膜および結膜にある上皮層の厚みを評価する
。結膜にある杯状細胞の数を測定する。
【０６７９】 この実施例に記載する研究はＫＧＦ−２Δ３３ポリヌクレオチドの活性を試験
する。しかしながら、当技術分野の熟練者は、例示した研究を、全長または成熟
ＫＧＦ−２、ＫＧＦ−２Δ２８、およびＫＧＦ−２のアミノ酸７７から２０８、
８０から２０８、および９３から２０８をコードするポリヌクレオチド；および
ＫＧＦ−２ポリペプチド、変異体、断片、アゴニストおよび／または拮抗剤；な
らびに本明細書に記載するいずれかのＫＧＦ−２突然変異体、を含む他種ＫＧＦ
−２ポリヌクレオチドの活性を試験するように、容易に修正できよう。
【０６８０】実施例４２ 唾液腺機能不全のＫＧＦ−２療法 この実施例では、正常ラット耳下唾液腺管突起へのＫＧＦ−２ポリヌクレオチ
ド投与が、該腺の管およびの上皮細胞に及ぼす効果を判定する。
【０６８１】 雌性スプラークドーリーラット（１５０−２５０ｇ体重、６匹／群）に、ケタ
ミンとキシラジンとを筋肉内注射して麻酔する。ＫＧＦ−２Δ３３をコードする
ポリヌクレオチドを１、１０または１００μｇ用量で、３０ゲージ鋼製栄養補給
針を用いて、耳下唾液腺の突起に導入する。ポリヌクレオチドは１０分間にわた
って毎分１μＬの速度で点滴する。対照ポリヌクレオチドは別群のラットに投与
する。各群のラットを点滴後第３、７および１４日に屠殺する。麻酔の３０分前
にＢｒｄＵを腹腔内投与する。唾液腺を秤量し、組織学的切片についてＢｒｄＵ
染色細胞を計数する。別の実験で、ラットのピロカルピン刺激唾液分泌を点滴後
第７日に測定する。
【０６８２】 この実施例に記載する研究はＫＧＦ−２Δ３３ポリヌクレオチドの活性を試験
する。しかしながら、当技術分野の熟練者は、例示した研究を、全長または成熟
ＫＧＦ−２、ＫＧＦ−２Δ２８、およびＫＧＦ−２のアミノ酸７７から２０８、
８０から２０８、および９３から２０８をコードするポリヌクレオチド；および
ＫＧＦ−２ポリペプチド、変異体、断片、作動剤および／または拮抗剤；ならび
に本明細書に記載するいずれかのＫＧＦ−２突然変異体、を含む他種ＫＧＦ−２
ポリヌクレオチドの活性を試験するように、容易に修正できよう。
【０６８３】実施例４３ 皮膚創傷治癒のＫＧＦ−２療法 この実験では、創傷治癒を促進するＫＧＦ−２ポリヌクレオチドの性能を、正
常ラットおよび糖尿病マウスにおいて、判定する。
【０６８４】 正常ラット：麻酔した雌性スプラークドーリーラット（１７５−２５０ｇ体重
、６匹／処置群）を８ｍｍ生検パンチで傷付ける。ＫＧＦ−２Δ３３ポリヌクレ
オチド（１、１０または３０μｇ）を創傷に沿って４個の部位に皮内送達する。
対照ポリヌクレオチドは、同様な様式で別群のラットに投与する。創傷を無菌通
気繊維パッドで覆う。このパッドを置いてから、耐水性接着テープでラットの正
中線に沿って包む。各群のラットが傷付いてから第２および５日に屠殺する。創
傷組織を１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに埋没する。以前から存在する
か、新しい表皮で増殖しつつある上皮細胞へのＢｒｄＵ取り込み、および新しい
上皮舌の長さおよび厚さを測定する。
【０６８５】 糖尿病マウス：糖尿病マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋、１０匹／処置群）および非糖
尿病マウス（ｄｂ＋／ｍ＋、１０匹／処置群）の背部に６ｍｍ生検パンチで傷付
ける。ＫＧＦ−２Δ３３ポリヌクレオチド（１、１０または３０μｇ）を傷に沿
って４個の部位に皮内送達する。対照ポリヌクレオチドは、同様にして別群のマ
ウスに投与する。創傷をTegaderm（糖尿病マウス）またはTegadermと接着テープ
（非糖尿病マウス）で覆う。傷付けてから第０、３、７、１０および１４日に創
傷を写真撮影する。創傷の表面部分を画像分析で測定する。
【０６８６】 この実施例に記載する研究はＫＧＦ−２Δ３３ポリヌクレオチドの活性を試験
する。しかしながら、当技術分野の熟練者は、例示した研究を、全長または成熟
ＫＧＦ−２、ＫＧＦ−２Δ２８、およびＫＧＦ−２のアミノ酸７７から２０８、
８０から２０８、および９３から２０８をコードするポリヌクレオチド；および
ＫＧＦ−２ポリペプチド、変異体、断片、作動剤および／または拮抗剤；ならび
に本明細書に記載するいずれかのＫＧＦ−２突然変異体、を含む他種ＫＧＦ−２
ポリヌクレオチドの活性を試験するように、容易に修正できよう。
【０６８７】実施例４４ ＫＧＦ−２送達用構築物 ＫＧＦ−２遺伝子治療用送達のための適当な構築物は、ｐＶＧＩ．０−ＫＧＦ
−２である。この構築物は、ＫＧＦ−２の完全な在来型読取り枠を、発現ベクタ
ーｐＶＧＩ．０にクローニングさせて含む。ｐＶＧＩ．０は、カナマイシン耐性
遺伝子、ＣＭＶエンハンサー、およびＲＳＶプロモーターを含む。ｐＶＧＩ．０
−ＫＧＦ−２は、10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 にあ
るアメリカンタイプカルチャーコレクションの特許用寄託部門に１９９９年６月
３０日に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ２９０を受けている。この構築物は、
以前に配列を検証してあるＫＧＦ−２構築物から得られたＫＧＦ−２のＯＲＦを
、発現ベクターｐＶＧＩ．０に、当技術分野でよく知られている方法を使用して
、サブクローニングすることによって製造された。
【０６８８】 別なＫＧＦ−２送達用の適当な構築物は、ｐＶＧＩ−０−ＭＰＩＦｓｐＫＧＦ
−２Δ３３である。この構築物は、ＫＧＦ−２Δ３３の在来型配列を、ＭＰＩＦ
（ＣＫ６８）異種シグナルペプチドに融合させ、これを発現ベクターｐＶＧＩ−
０にクローニングさせて含む。ｐＶＧＩ−０−ＭＰＩＦｓｐＫＧＦ−２Δ３３は
、10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 にあるアメリカンタ
イプカルチャーコレクションの特許用寄託部門に１９９９年６月３０日に寄託し
、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ２８９を受けている。この構築物は、当技術分野でよ
く知られている方法および次のプライマーを使用して製造した： ５’−プライマー：
【化６６】
【０６８９】実施例４５ ＫＧＦ−２遺伝子治療進行中の血管形成 透明なウインドウを通して観察されるマウス微小血管生理学の様々な側面の特
性は、血管形成、炎症、微細血管輸送、組織拒絶および腫瘍生理学に関する価値
のあるデータを提供する。この実施例では、移植したコラーゲンゲルにおける、
創傷治癒反応中の血管形成進行を、組織および関連する微小血管ベッドを、皮膚
に移植したウインドウで直接観察することによって、評価する。このモデルを用
いれば、ＫＧＦ−２遺伝子療法が、組織の再成長と血管再形成の促進とを、同時
に誘導するかどうかを判定できる。
【０６９０】 皮膚の生検試料をヌードマウスからとり、これをコラーゲナーゼで消化し、こ
の細胞懸濁液を洗浄し、次に１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭで培養して、皮膚繊維芽
細胞を得る。全面成長繊維芽細胞培養物に、ＫＧＦ−２または対照ポリヌクレオ
チドを遺伝子移入し、収集し、ＰＢＳで洗浄する。１０６細胞をコラーゲンマト
リックス２０μＬに懸濁する。細胞懸濁液の試料を採取し、ウェスタンブロット
でＫＧＦ−２産生を確認する。存在する背側皮膚ウインドウに２ｍｍ生検パンチ
を行い、この皮膚をガラスカバーグラス２枚の間に挟む。細胞コラーゲン混合物
を円形のウインドウに入れて、空隙を塞ぐ。移植したゲルでの血管成育を所定の
間隔で観察する。創傷への組織再成長をコラーゲンゲルの光学密度変化として、
３週間にわたって監視する。組織学的評価研究の終了後、背側空隙から得られる
組織を採取する。対照実験では、繊維芽細胞に代えてコラーゲンゲルに、ＫＧＦ
−２ポリペプチドまたは緩衝液を加える。
【０６９１】 マウスの準備：スイスヌードマウスに外科的処置を行う。外科的処置の間は、
動物（２０−３０ｇ）を、体重ｋｇ当りケタミン９０ｍｇとキシララジン９ｍｇ
とのカクテルを皮下注射して、麻酔する。外科的処置は全て無菌環境の下で水平
な層流フードの中で、全ての装置を上記、ガスまたは化学的に滅菌して、行う。
手術の間、動物の体温を加温作業表面で定常に保つ。マウスは全て、マイクロア
イソレータケージで飼育し、操作はすべて層流フードの中で行う。鎮痛剤として
ブプレノフリン（０．１ｍｇ／ｋｇ、１２時間）を移植後３日間投与する。
【０６９２】 マウスを、チャンバーが背側表面に伸びる皮膚の二層の間に挟まれるように、
固定する。皮膚の１層を直径約１５ｍｍの円形領域で除去する。第二層（表皮、
筋鞘および横紋筋から構成される）をチャンバーの枠に配置し、無菌のガラス製
カバーグラスで覆う。このチャンバーを、伸長する皮膚を通り、チャンバー上の
孔に沿ったナイロン製ポストで、その位置に固定する。３日後、カバーグラスを
注意深く除去し、ゲルを挿入する。新しい、滅菌カバーグラスを観察する表面に
置く。測定には、増感ＣＣＤカメラ、Ｓ−ＶＨＳビデオカセット記録装置および
直接的ディジタル画像取り込みを使用して、外形計測分析を行う。移植したチェ
ンジャーを有するマウスは２８日間観察した。
【０６９３】 測定：マウスを、体重ｋｇ当りケタミン９０ｍｇとキシララジン９ｍｇとのカ
クテルを皮下注射して麻酔し、滅菌プラスチックケージ装置に固定する。ウイン
ドウの血管像を透照（背側皮膚ウインドウ）またはＢＳＡ−ＦＩＴＣ（１ｍｇ／
ｍＬ、静脈内）後の外照射で観察する。血管ベッドのビデオ映像を１倍から４０
倍の倍率範囲内で撮影し、ならびにディジタルフレームをオフライン分析する。
移植したゲルの血管形成判定はビデオテープのオフライン分析で行う。
【０６９４】 この実施例に記載する研究はＫＧＦ−２Δ３３ポリヌクレオチドの活性を試験
する。しかしながら、当技術分野の熟練者は、例示した研究を、全長または成熟
ＫＧＦ−２、ＫＧＦ−２Δ２８、およびＫＧＦ−２のアミノ酸７７から２０８、
８０から２０８、および９３から２０８をコードするポリヌクレオチド；および
ＫＧＦ−２ポリペプチド、変異体、断片、作動剤および／または拮抗剤；ならび
に本明細書に記載するいずれかのＫＧＦ−２突然変異体、を含む他種ＫＧＦ−２
ポリヌクレオチドの活性を試験するように、容易に修正できよう。
【０６９５】実施例４６ ＫＧＦ−２トランスジェニック動物 ＫＧＦ−２ポリペプチドはまた、トランスジェニック動物内でも発現される。
いかなる種の動物もトランスジェニック動物を作成するために使用しうる。この
動物には、これに限定するものではないが、マウス、ラット、ウサギ、ハムスタ
ー、テンジクネズミ、ブタ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、および非ヒト霊長
類、たとえばヒヒ、サルおよびチンパンジーが含まれる。特異的態様では、本明
細書に記載する技術またはその他の当技術分野で知られている技術を、ヒトでも
遺伝子療法の一部として、本発明のポリペプチドを発現するために使用できる。
【０６９６】 当技術分野で知られているいかなる技術もトランスジーン（すなわち本発明の
ポリペプチド）を動物に導入するために使用でき、トランスジェニック動物の創
始系列が作成される。このような技術には、これに限定するものではないが、プ
ロヌクレアー微量注射（Paterson et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 40:
691-698 (1994); Carver et al., Biotechnology(NY), 11: 1263-1270 (1993);
Wright et al., Biotechnology (NY), 9: 830-834 (1991); および Hoppe et a
l., 米国特許 4,873,191 (1989)）；生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子伝
達（Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6148-6152 (1
985)）、胚盤胞または胚へのレトロウイルス媒介遺伝子伝達；胚幹細胞への遺伝
子ターゲッティング（Thompson et al., Cell, 56: 313-321 (1989)）；細胞ま
たは胚の電気穿孔（Lo, Mol. Cell. Biol., 3: 1803-1814 (1983)）；遺伝子ガ
ンを用いる本発明ポリヌクレオチドの導入（たとえばUlmer et al., Science, 2
59: 1745 (1993)を参照）；核酸構築物の胚分化可能幹細胞への導入およびその
幹細胞の胚盤胞への戻し伝達；および精子媒介遺伝子伝達（Lavitrano et al.,
Cell, 57: 717-723 (1989)）などを含む。このような技術の綜説にとしては、こ
こに全体を出典明示により本明細書の一部とするGordon,"Transgenic Animals"
, Intl. Rev. Cytol., 115: 171-229 (1989)を参照。
【０６９７】 当技術分野で知られているいかなる技術も、本発明のポリヌクレオチドを含む
トランスジェニッククローンを作成するために使用しうる。この例は、培養し、
制止状態に誘導した成体細胞、胎児、または胚からの核の脱核卵母細胞への核伝
達である（Campell et al., Nature, 380: 64-66 (1996); Wilmut et al., Natu
re, 385: 810-813 (1997)）。
【０６９８】 本発明は、形質転換遺伝子を全部の細胞に有するか、ならびに全部ではないが
一部の細胞に形質転換遺伝子を有する、トランスジェニック動物、すなわちモザ
イク動物またはキメラ動物、を提供する。この形質転換遺伝子は、単独の形質転
換遺伝子としてまたは、たとえば、頭−頭縦列または頭−尾縦列など鎖状体のよ
うな多重コピーとして取り込まれる。この形質転換遺伝子は、例えばＬａｓｋｏ
の教示（Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6232-6236 (1992)）
に従って、選択的に特定の細胞型に導入され、その細胞型内で活性化される。こ
のような細胞型特異的活性化に必要な制御配列は対象とする特定の細胞型に依存
し、当技術分野の熟練者には明白となる。ポリヌクレオチド形質転換遺伝子を内
因性遺伝子の染色体部位に取り込むことを望むなら、遺伝子ターゲティングが好
適である。
【０６９９】 略述すれば、そのような技術を利用する時には、内因性遺伝子に相同的なヌク
レオチドを含むベクターを、取り込みの目的で設計し、染色体配列との相同的組
換えによって、その内因性遺伝子のヌクレオチド配列に導入し、およびその機能
を阻害する。この形質転換遺伝子は、例えばＧｕらの教示（Gu et al., Science
, 265: 103-106 (1994)）に従って、特定の細胞型に選択的に導入され、その細
胞型内の内因性遺伝子を不活化する。このような細胞型特異的不活化に必要な制
御配列は対象とする特定の細胞型に依存し、当技術分野の熟練者には明白である
。この節に引用したこれらの文献は全て出典明示により本明細書の一部とする。
【０７００】 トランスジェニック動物が作成されると、組換え遺伝子の発現を、標準的技術
を使用して検定する。初期のスクリーニングは、形質転換遺伝子の取り込みが起
きたかどうかを検証するために、動物組織のサザンブロット分析またはＰＣＲ分
析によって行う。トランスジェニック動物の組織内での形質転換遺伝子のｍＲＮ
Ａ発現レベルは、これに限定するものではないが、その動物から得た組織試料の
ノーザンブロット分析、原位置ハイブリッド形成分析および逆転写酵素−ＰＣＲ
（ｒｔ−ＰＣＲ）を含む、技術を使用しても評価しうる。形質転換遺伝子発現組
織の試料は、その形質転換遺伝子の産物に対して特異的な抗体を使用して、免疫
細胞化学的または免疫組織化学的にも評価しうる。
【０７０１】 創始系統動物が作製されたら、それを繁殖、同系交配、異系交配または異種交
配して特定の動物コロニーを産生する。そのような繁殖の方策には、これに限定
するものではないが、異なる系統を樹立するために、取り込み部位１個所または
それ以上を持つ創始動物の異系交配；各形質転換遺伝子を追加的に発現する効果
のため、形質転換遺伝子を高レベルで発現する化合物形質転換体を産生するため
の、異なる系統の同系交配；発現を増大し、かつＤＮＡ分析による動物のスクリ
ーニングを不要とするために、所定の取り込み部位に対してホモ接合的動物を産
生するための、ヘテロ接合的形質転換動物の異種交配；化合物ヘテロ接合的また
はホモ接合的系統を産生するための、異なるホモ接合的系統の異種交配；および
目的とする動物モデルに適する明確な背景に形質転換遺伝子を配置するための繁
殖；が含まれる。
【０７０２】 本発明のトランスジェニック動物の使用には、これに限定するものではないが
、ＫＧＦ−２ポリペプチドの生物学的機能を研究するために；異常なＫＧＦ−２
発現に関連する病状および／または疾患を研究するために；およびそのような病
状および／または障害を緩和するために有効な化合物をスクリーニングするため
に；有用な動物モデルとしての使用が含まれる。
【０７０３】実施例４７ ＫＧＦ−２ノックアウト動物 内因性ＫＧＦ−２遺伝子の発現は、標的を指向する相同的組換えを使用して、
ＫＧＦ−２遺伝子および／またはそのプロモーターを、不活化するかまたは”ノ
ックアウト”することによって、低下させることもできる（たとえば、いずれも
出典明示により本明細書の一部とするSmithies et al., Nature, 317: 230-234
(1985); Thomas & Capecchi, Cell, 51: 503-512 (1987); Thompson et al., Ce
ll, 5: 313-321 (1989)を参照）。例えば、内因性ポリヌクレオチド配列（該遺
伝子のコード領域または制御領域のいずれでも）に相同的なＤＮＡが隣接する突
然変異体、本発明の非機能性ポリペプチド（または完全に無関係なＤＮＡ配列）
を使用すれば、選択マーカーおよび／または陰性選択マーカーは使うか、または
使わずに、生体内で本発明のポリペプチドを発現する細胞を遺伝子移入する。別
の態様では、当技術分野で知られている技術を使用すれば、目的の遺伝子を含ん
でいるが、それを発現しないノックアウト細胞が作製される。標的を指向する相
同的組換えによるＤＮＡ構築物の挿入は、標的遺伝子の不活性化をもたらす。こ
のような手法は、特に研究および農業分野に適する。この分野では、胚幹細胞の
修飾を使用して、不活化された標的遺伝子を有する動物の子孫を作製することが
できる（たとえば前記Thomas & Capecchi, 1987およびThompson, 1989を参照）
。しかしながら、この手法は、ヒトにおける日常的使用に適合させることができ
るのであるが、その組換えＤＮＡ構築物は生体内の必要な部位に、直接投与され
るか、または当技術分野の熟練者には明白なウイルスベクターから適当なものを
用いてその標的に指向されるものである。
【０７０４】 本発明の別の態様では、本発明のポリペプチドを発現するように遺伝子操作さ
れた細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝子操作された
細胞（たとえばノックアウト）を、患者に生体内投与する。そのような細胞は、
患者（すなわちヒトを含む動物）、またはＭＨＣ適合性ドナーから得られ、これ
に限定するものではないが、繊維芽細胞、骨髄細胞、血球（たとえばリンパ球）
、脂肪細胞、筋肉細胞、内皮細胞、その他を含む。この細胞は、組換えＤＮＡ技
術を使用して試験管内で遺伝子的に操作されて、その細胞に本発明のポリペプチ
ドのコード配列を導入するか、あるいは本発明のポリペプチドに関連するコード
配列および／または、これに限定するものではないが、プラスミド、コスミド、
ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、電気穿孔、リポソーム、などを使用する形質導入（ウイス
ルベクターを用いるもの、好ましくは細胞ゲノムに形質遺伝子を組み込むベクタ
ー）または遺伝子移入操作によって、内因性制御配列を混乱させる。本発明のポ
リペプチドのコード配列を強力な構成的または誘導可能なプロモーターまたはプ
ロモーター／エンハンサーの支配下に置いて、好ましくはＫＧＦ−２ポリペプチ
ドを分泌させる。本発明のポリペプチドを発現し、好ましくは分泌する、遺伝子
操作された細胞は、患者のたとえば循環系内に全身的に、または腹腔内に導入で
きる。
【０７０５】 あるいは、この細胞をマトリックスに入れて、たとえば遺伝子操作した繊維芽
細胞は皮膚移植の一部として移植できる；または遺伝子操作した内皮細胞をリン
パまたは血管移植の一部として移植できる；（例えば、いずれも全体を出典明示
により本明細書の一部とするAnderson et al., 米国特許5,399,349；およびMull
igan & Wilson, 米国特許5,460,959を参照）など；により、体内に移植する。
【０７０６】 投与する細胞が非自己由来であるか、ＭＨＣ非適合細胞である時には、導入し
た細胞に対する宿主の免疫反応の発生を予防する、よく知られている技術を使用
して該細胞を投与する。例えば、細胞をカプセルに封入して投与し、一方で直近
細胞外環境と成分を交換させるが、導入した細胞が宿主の免疫系に認識されない
ようにする。
【０７０７】 本発明のノックアウト動物には、これに限定するものではないが、ＫＧＦ−２
ポリペプチドの生物学的機能を研究するために；異常なＫＧＦ−２発現が関与す
る病状および／または障害の研究に；およびそのような病状および／または障害
を緩和するために有効な化合物のスクリーニングに；有用な動物モデル系として
の使用がある。
【０７０８】実施例４８ ＫＧＦ−２突然変異体の構築 点突然変異体を作成するために、当技術分野の熟練者によく知られている標準
的な条件を用いるＰＣＲ反応に、指定したプライマーを使用する。得られる産物
をＮｄｅおよびＡｓｐ７１８のいずれかで制限消化し、ｐＨＥ４にクローニング
するか；またはＢａｍＨＩおよびＸｂａで制限消化し、ｐｃＤＮＡ３にクローニ
ングする。記載したＫＧＦ−２変異体は、いずれも他のベクターの中に、または
それ自体によって、当技術分野でよく知られている方法を用いて、産生される。 ｐＨＥ４：ＫＧＦ２：Ｒ８０−Ｓ２０８は次のプライマーを使用して構築した
：
【化６７】 ｐＨＥ４：ＫＧＦ２：Ａ６３−Ｓ２０８（Ｒ６８Ｇ）は次のプライマーを使用
して構築した：
【化６８】 ｐＨＥ４：ＫＧＦ２：Ａ６３−Ｓ２０８（Ｒ６８Ｓ）は次のプライマーを使用
して構築した：
【化６９】 ｐＨＥ４：ＫＧＦ２：Ａ６３−Ｓ２０８（Ｒ６８Ａ）は次のプライマーを使用
して構築した：
【化７０】 ｐＨＥ４：ＫＧＦ２：Ａ６３−Ｓ２０８（Ｒ７８Ｒ８０Ｋ８１Ａ）は次のプラ
イマーを使用して構築した：
【化７１】 ｐｃＤＮＡ３：ＫＧＦ２（Ｋ１３６１３７１３９１４４Ａ）は次のプライマー
を使用して構築した：
【化７２】 ｐｃＤＮＡ３：ＫＧＦ２（Ｋ１５１１５３Ｒ１５５Ａ）は次のプライマーを使
用して構築した：
【化７３】 ｐｃＤＮＡ３：ＫＧＦ２（Ｒ１７４Ｋ１８３Ａ）は次のプライマーを使用して
構築した：
【化７４】 ｐｃＤＮＡ３：ＫＧＦ２（Ｒ１８７Ｒ１８８Ａ）は次のプライマーを使用して
構築した：
【化７５】 ｐＨＥ４：ＫＧＦ２．Ａ６３（Ｋ１３６１３７１３９１４４Ａ）は次のプライ
マーを使用して構築した：
【化７６】 ｐＨＥ４：ＫＧＦ２．Ａ６３（Ｋ１５１１５３Ｒ１５５Ａ）は次のプライマー
を使用して構築した：
【化７７】
【０７０９】実施例４９ 不妊症を処置および／または予防するためのＫＧＦ−２の使用 着床は妊娠の成功に唯一で最も決定的な因子であり、臨床的、経済的に重要で
ある。ヒトでは、胚生命喪失の７０％もが着床の際に起きる。マウスは哺乳類の
着床を研究するために選択すべきモデルである。着床前後のマウス胚では基本的
細胞系列３種：すなわち胚、胎盤および卵黄嚢の前駆体、に分化し、分割する。
繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−４は３種の細胞系列全ての発育に必須である。
【０７１０】 機能のゲインおよび機能の喪失（主たる陰性）ＦＧＦ受容体遺伝子を送達する
「一過性トランスジェニック」手法を使用して、着床前２日の第５分裂に始まる
内因性ＦＧＦシグナル発生が、マウス胚の幹細胞すべてが胚系列および胎盤系列
に分化するために必要であることが、発見された。
【０７１１】 興味深いことに、ｆｇｆｒ−２およびｆｇｆ４のヌル突然変異体は子宮内で着
床後１日以内に死に、ＩＣＭも死ぬ。胚が子宮細胞に着床する前に胚系統および
胎盤系列ではＦＧＦが増殖を継続する必要がある。
【０７１２】 他の１９ＦＧＦリガンドの１種または数種がマウス胚着床前後に一過性に発現
している可能性もある。そしてこのリガンドが着床までｆｇｆｒ−２およびｆｇ
ｆ４のヌル突然変異体の効果を遅らせている可能性がある。われわれはＲＴ−Ｐ
ＣＲを用いて６種のＦＧＦリガンドを試験した。今までにＫＧＦ−２およびＦＧ
Ｆ−８だけがＦＧＦリガンドであるが、ＦＧＦ−４は着床前後の胚に検出された
。ＫＧＦ−２ｍＲＮＡは、二細胞段階の後、および着床後の早期を通じて胚内に
検出された。
【０７１３】 ＫＧＦ−２のヌル突然変異体は、マウス胚着床前後のＫＧＦ−２が発現する間
の生存に、ＫＧＦ−２が必須でないことを示唆する（Min et al., 1998; Sekine
et al., 1999）。しかしながら、ＦＧＦファミリーの他の分子が着床前後の胚
発育の間、ＫＧＦ−２を補償するかまたは過剰であるかも知れない。マウスでの
ヌル突然変異体を分析する間に過剰な遺伝子的効果の多く、および遺伝子ファミ
リー内での補償、も観察された（Thomas et al., 1995; Stein et al.,1994）。
ＫＧＦ−２のヌル突然変異体が示唆するよりも早期の発育には、ＫＧＦ−２はさ
らに重要かもしれない。
【０７１４】 ＫＧＦ−２が、ヌル突然変異体が必須の機能を示唆しない時期の、早期の発育
に役割を演じているかどうかを検出するための最善の方法は、機能のゲイン実験
を行うことである。この実験は、ＫＧＦ−２が、胚盤胞の発芽後成長おける（Ch
ai et al., 1998）および内部細胞塊（ＩＣＭ）発芽後成長中の内胚葉系統内細
胞における（Rappolee et al., 1994）胎盤／栄養芽層細胞上にある着床前後の
胚発育に影響を与える(Rappolee1994) かどうかを試験する。機能のロス試験は
、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するか（Rappolee et al., 1992）ま
たは 抗体を遮断（LaFleur et al.,1996）することによる、限定された方法で行
うことができる。胚は着床直後に、サイズの制御を行い、細胞数の大きなプラス
とマイナスの変化が定常的に制御されることが（Rappolee et al., 1998）知ら
れている。これは小さな致死下量のＫＧＦ−２依存性効果がＫＧＦ−２ヌル突然
変異体では完全に失われていることを示唆する。機能のロスおよびゲイン試験を
使用して着床前後のマウス胚をＫＧＦ−２の効果について試験する。
【０７１５】 今日まで、着床前後のマウス胚で、成長因子のためのｍＲＮＡを検出する試み
は、常に対応する蛋白質の検出を誘導した（Rappolee et al., 1998, 1992, 199
4; なお、1998, 1999に綜説）。ＫＧＦ−２ｍＲＮＡが検出された胚にＫＧＦ−
２蛋白質が存在するかどうかを確認するには、免疫細胞化学に適する、ＫＧＦ−
２に対する抗体を使用する。
【０７１６】実施例５０ 臨床試料中でのＫＧＦ−２の検出 精製したヤギＰＡｂを、コーティング緩衝液（０．０５Ｍ−ＮａＨＣＯ3、ｐ
Ｈ９．５）で２μｇ／ｍＬまで希釈する。希釈した抗体ウェル当り１００μＬを
Immuno４マイクロプレートに添加する。このマイクロプレートを４℃で一夜放置
する。この抗体溶液をプレートからデカンテーションする。ブロッキング緩衝液
（コーティング衝液中、１％乾燥ミルク（BioRad））２００μＬを各ウェルに入
れる。このプレートを室温で２時間インキュベーションする。ブロッキング緩衝
液をプレートからデカンテーションする。このプレートを真空室中、３２℃で１
．５時間完全に減圧乾燥する。プレートを真空室から取出し、乾燥パック３個で
マイラー製ポーチに封入する。このプレートは使用直前まで４℃で保存する。
【０７１７】 ＫＧＦ−２を希釈剤（０．１％トゥイーン２０、１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡおよ
び０．００１％チメロサール）で１６ｎｇ／ｍＬまで希釈し、続いて×２．５倍
に希釈し、さらに７回希釈する。濃度は１６ｎｇ／ｍＬから０．０２６ｎｇ／ｍ
Ｌの範囲となり、これを標準として使用する。背景値のウェルには、蛋白質不含
の希釈剤を用いる。
【０７１８】 未知の試料を希釈剤１で×１０、×５０および×２５０に希釈する。ウェル当
り１００μＬの順次希釈標準液および未知試料をコーティングしたＥＬＩＳＡプ
レートに加える。このプレートを一夜４℃に維持する。溶液をプレートからデカ
ンテーションする。プレートを、洗浄緩衝液（０．１％トゥイーン２０および１
×ＰＢＳ）１．６ｍＬ（各ウェルには洗浄毎に２００μＬが入る）でWheaton In
strument社のセットを用いて、５回洗浄する。各洗浄の間に１５秒間洗浄緩衝液
のインキュベーションを行う。
【０７１９】 検出剤であるビオチン化ニワトリ抗−ＫＧＦ−２を０．５μｇ／ｍＬまで希釈
剤１で希釈する。希釈した検出剤を各ウェルに加える。プレートを室温で２時間
インキュベーションする。溶液をデカンテーションし、プレートを前記の通りに
洗浄緩衝液で５回洗浄する。各洗浄の間に１５秒間洗浄緩衝液のインキュベーシ
ョンを行う。
【０７２０】 ペルオキシダーゼ／ストレプトアビジンを希釈剤１で１：２０００まで希釈す
る。希釈したペルオキシダーゼ／ストレプトアビジン１００μＬ／ウェルをプレ
ートに加え、室温で１時間インキュベーションする。プレートをデカンテーショ
ンし、洗浄緩衝液で５回洗浄する。各洗浄の間に１５秒間洗浄緩衝液のインキュ
ベーションを行う。プレートは乾燥させない。
【０７２１】 室温ＴＭＢペルオキシダーゼ基質とペルオキシダーゼ溶液Ｂ（TMB Peroxidase
Microwell Substrate System, KPLから）との等量を混合する。混合液１００μ
Ｌを各ウェルに加え、室温で１０分間放置して発色させる。１Ｍ−Ｈ2ＳＯ4を各
ウェルに５０μＬ加えて発色を停止させる。プレートを４５０ｎｍで測定する。
【０７２２】実施例５１ 大腸菌に最適化させたトランケートＫＧＦ−２の構築 大腸菌発現系内でのトランケートＫＧＦ−２発現レベルを向上させるために、
遺伝子のコドンを頻繁に使用される大腸菌のコドンに最適化させた。
【０７２３】 例えば、次の構築物を作成して、ｐＨＥ４：ＫＧＦ−２．Ａ６３−Ｓ６０８と
命名した：
【化７８】
【０７２４】 配列番号１７３のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡを含むプラスミドは２０
００年７月３日に10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 にあ
るアメリカンタイプカルチャーコレクションの特許用寄託部門に寄託し、ＡＴＣ
Ｃ受託番号 を受けている。
【０７２５】 ｐＨＥ４：ＫＧＦ−２．Ａ６３−Ｓ２０８ｃｏｄ．ｏｐｔと命名した別の構築
物を次のプライマーを使用して構築した。
【化７９】
【０７２６】 ｐＨＥ４：ＫＧＦ−２．Ａ６３−Ｓ２０８ｃｏｄ．ｏｐｔのヌクレオチド配列
は次の通りである：
【化８０】
【０７２７】 配列番号１７６のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡを含むプラスミドは２０
００年７月３日に10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 にあ
るアメリカンタイプカルチャーコレクションの特許用保管部門に寄託し、ＡＴＣ
Ｃ受託番号 を受けている。
【０７２８】 この実施例に記載した両構築物は、例えば実施例１３に記載する、ＫＧＦ−２
ポリペプチドの生産に有用である。配列番号１７３のヌクレオチド４から４４４
まで、および配列番号１７６のヌクレオチド１から４４１までは、配列番号２の
アミノ酸６３から２０８まで、およびそれに加えてＮ末端メチオニンをコードす
る。
【０７２９】 本発明は、前記の記載および実施例に開示したものとは別の様式でも実施しう
ることは明白である。
【０７３０】 前記の教示に照らせば、本発明には多数の修飾および変化が可能であって、そ
れ故、それらは付記する特許請求の範囲内にある。本発明は、特定的に記載した
もの以外の様式でも実施しうる。
【０７３１】 本明細書に引用する印刷物の全て（特許、特許公報類、雑誌、著書、実験室便
覧、本またはその他の書類）は、全開示を出典明示により本明細書の一部とする
。
【０７３２】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
次の図面は、本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含さ
れる本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【図１】 第１Ａ−１Ｃ図は、本発明のポリペプチドのcＤＮＡおよび対
応する推定アミノ酸配列を説明する。最初の３５または３６のアミノ酸残基は、
推定リーダー配列(下線の部分)を表わす。アミノ酸に関する標準的な１文字略号
を使用する。配列決定の不正確さは、ポリヌクレオチド配列を決定しようとする
場合に共通の問題である。３７３ 自動化ＤＮＡシークエンサー(Ａpplied Ｂios
ystems, Ｉnc. )を使用して、配列決定を行った。配列決定の正確さは、９７％
以上が正確であると予想される［配列番号１］。
【図２】 第２Ａ−２Ｄ図は、本発明のポリペプチドと他の線維芽細胞増
殖因子とのアミノ酸配列の比較を説明するものである［配列番号１３−２２］。
【図３】 第３Ａ−３Ｄ図は、ＫＧＦ−２遺伝子に関する完全長のmＲＮＡ
およびアミノ酸配列を示す［配列番号２３および２４］。
【図４】 第４Ａ−４Ｅ図は、ＫＧＦ−２アミノ酸配列の分析を示す。α、
β、回転(turn)およびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可動(f
lexible)領域；抗原指数および表面確率を示す。「抗原指数−Ｊameson−Ｗolf
」というグラフにおいて、第１図におけるアミノ酸残基４１−１０９は、示され
たＫＧＦ−２タンパク質の高度に抗原性の領域に対応する。疎水性領域(Ｈoop−
Ｗoods プロット)は中央線以下(負の値)となるが、親水性領域(Ｋyte−Ｄoolitt
le Ｐlot)は、中央線以上(正の値、例えば、アミノ酸残基４１−１０９)に見出
される。そのプロットは、全体の２０８のアミノ酸ＯＲＦにわたっている。
【図５】 第５図は、糖尿病のマウスにおける創傷閉鎖に対するＫＧＦ−２
の評価を示す。創傷は、負傷した直後、および５日間連続して毎日、および８日
目に測定した。次の式を使用して、創傷閉鎖％を計算した：［１日目の領域］−
［８日目の領域］／［１日目の領域］。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行っ
た(平均＋／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。
【図６】 第６図は、糖尿病ではないマウスにおける創傷閉鎖に対するＫＧ
Ｆ−２の評価を示す。創傷は、負傷した直後、および５日間連続して毎日、およ
び８日目に測定した。次の式を使用して、創傷閉鎖％を計算した：［１日目の領
域］−［８日目の領域］／［１日目の領域］。不対ｔ試験を使用して、統計分析
を行った(平均＋／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。
【図７】 第７図は、糖尿病のマウスにおける創傷閉鎖の時間経過を示す。
創傷領域は、負傷した直後、および５日間連続して毎日、および８日目に測定し
た。値は、全領域として表す(mＭ２)。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行っ
た(平均＋／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。
【図８】 第８図は、糖尿病ではないマウスにおける創傷閉鎖の時間経過を
示す。創傷領域は、負傷した直後、および５日間連続して毎日、および８日目に
測定した。値は、全領域として表す(mＭ２)。不対ｔ試験を使用して、統計分析
を行った(平均＋／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。
【図９】 第９図は、糖尿病のマウスに関するＫＧＦ−２に対する組織病理
学的評価を示す。スコアは、ブラインド観察者により与えられた。不対ｔ試験を
使用して、統計分析を行った(平均＋／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。
【図１０】 第１０図は、糖尿病ではないマウスに関するＫＧＦ−２に対す
る組織病理学的評価を示す。スコアは、ブラインド観察者により与えられた。不
対ｔ試験を使用して、統計分析を行った(平均＋／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。
【図１１】 第１１図は、糖尿病のマウスにおけるケラチノサイト増殖作用
を示す。スコアは、ブラインド観察者により与えられた。不対ｔ試験を使用して
、統計分析を行った(平均＋／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。
【図１２】 第１２図は、糖尿病ではないマウスにおけるケラチノサイト増
殖作用を示す。スコアは、ブラインド観察者により与えられた。不対ｔ試験を使
用して、統計分析を行った(平均＋／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。
【図１３】 第１３図は、糖尿病のマウスにおける皮膚増殖作用を示す。ス
コアは、ブラインド観察者により与えられた。不対ｔ試験を使用して、統計分析
を行った(平均＋／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。
【図１４】 第１４図は、糖尿病ではないマウスにおける皮膚増殖作用を示
す。スコアは、ブラインド観察者により与えられた。不対ｔ試験を使用して、統
計分析を行った(平均＋／−ＳＥＭ，ｎ＝５)。
【図１５】 第１５図は、pＱＥ６０−Ｃys３７構築物から発現されるＤＮ
Ａ配列およびタンパク質を示す。発現されるＫＧＦ−２タンパク質は、そのタン
パク質のＮ末端に結合した６Ｘ(ヒスチジン)タグと共に、３７の位置にあるシス
テインから２０８の位置にあるセリンまでの配列を含む。
【図１６】 第１６図は、ラットにおける創傷治癒に対するメチルプレドニ
ゾロンの作用を示す。負傷してから５日目に、雄のＳＤ成体ラット(ｎ＝５)にメ
チルプレドニゾロン５mgを注射した。動物に皮膚パンチ創傷(８mＭ)を与えて、
緩衝液または緩衝液５０μl中のＫＧＦ−２溶液で５日間連続して毎日処置した
。創傷は、較正されたＪamesonカリパスで、１−５日目は毎日、および８日目に
測定した。値は、８日目に測った測定値を表す(平均＋／−ＳＥＭ)。
【図１７】 第１７図は、創傷閉鎖に対するＫＧＦ−２の作用を示す。雄の
ＳＤ成体ラット(ｎ＝５)に皮膚パンチ創傷(８mＭ)を与えて、負傷した日にメチ
ルプレドニゾロン５mgを与えた。負傷した日から始めて５日間連続して、動物を
緩衝液または緩衝液５０μl中のＫＧＦ−２溶液で毎日処置した。測定は、５日
間連続して毎日、および８日目に行った。創傷閉鎖を次の式により計算した：［
８日目の領域］−［１日目の領域］／［１日目の領域］。１日目の領域は、６４
mＭ２であると測定され、その領域は、皮膚パンチにより成された。不対ｔ試験
を使用して、統計分析を行った(平均＋／−ＳＥＭ)。
【図１８】 第１８図は、糖質コルチコイドで損なわれた創傷治癒モデルに
おける創傷治癒の時間経過を示す。１日目に、雄のＳＤ成体ラット(ｎ＝５)に皮
膚パンチ創傷(８mＭ)を与えて、緩衝液または５０μl中のＫＧＦ−２溶液で５日
間連続して毎日処置した。負傷した日に、動物にメチルプレドニゾロン５mgを与
えた。創傷は、較正されたＪamesonカリパスで、負傷した日から始めて５日間連
続して毎日、および８日目に測定した。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行っ
た(平均＋／−ＳＥＭ)。
【図１９】 第１９（Ａ）図は、負傷してから５日後におけるメチルプレド
ニゾロンを与えないラットの創傷治癒モデルにおける創傷領域に対するＫＧＦ−
２の作用を示す。１日目に、雄のＳＤラット(ｎ＝５)に皮膚パンチ創傷(８mＭ)
を与えて、負傷した日、およびその後５日間連続して毎日、緩衝液または溶液５
０μl中のＫＧＦ−２で処置した。較正されたＪamesonカリパスを使用して、創
傷を測定した。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行った(平均＋／−ＳＥＭ)。
（Ｂ）雄のＳＤラット(ｎ＝６)におけるＰＤＧＦ−ＢＢおよびＫＧＦ−２の評価
。全てのラットに８mＭの背側創傷およびメチルプレドニゾロン(ＭＰ)(１７mg／
kg)を与えて、創傷治癒を損なった。創傷を緩衝液または様々な濃度のＰＤＧＦ
−ＢＢおよびＫＧＦ−２で毎日処置した。較正されたＪamesonカリパスを使用し
て、創傷を２、４、６、８、および１０日目に測定した。不対ｔ試験を使用して
、統計分析を行った(平均＋／−ＳＥ)。＊緩衝液と比較した。＊＊ＰＤＧＦ−Ｂ
Ｂ １μg 対 ＫＧＦ−２／Ｅ３ １μg。
【図２０】 第２０図は、糖質コルチコイドで損なわれた創傷治癒モデルに
おける創傷距離に対するＫＧＦ−２の作用を示す。雄のＳＤラット(ｎ＝５)に皮
膚パンチ創傷(８mＭ)を与えて、１７mg／kgのメチルプレドニゾロンを負傷した
日に与えた。５日間連続して毎日、および８日目に、動物を緩衝液または緩衝液
５０μl中のＫＧＦ−２で処置した。創傷距離を、較正されたマイクロメーター
で光学顕微鏡法の下に測定した。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行った(平
均＋／−ＳＥＭ)。
【図２１】 第２１（Ａ）図は、ＫＧＦ−２による正常な一次表皮ケラチノ
サイト増殖の刺激を示す。（Ｂ）は、ＫＧＦ−２ Δ３３による正常な一次表皮
ケラチノサイト増殖の刺激を示す。（Ｃ）は、ＫＧＦ−２ Δ２８による正常な
一次表皮ケラチノサイト増殖の刺激を示す。ヒトの正常な一次表皮ケラチノサイ
トを様々な濃度のＫＧＦ−２、ＫＧＦ−２ Δ３３、またはＫＧＦ−２ Δ２８と
共に３日間インキュベートした。次いで、３つの実験全てに関して、alamarＢlu
eを１６時間加えて、その細胞によりalamarＢlueから変わった赤色の強度を、Ｏ
. Ｄ. ５７０nＭとＯ. Ｄ. ６００nＭとの間の差により測定した。各々のＫＧＦ
−２タンパク質に関して、完全なケラチノサイト増殖培地(ＫＧＭ)を含む正の対
照、およびケラチノサイト基礎培地(ＫＢＭ)を含む負の対照を、同じアッセイプ
レートにおいてインキュベートした。
【図２２】 第２２（Ａ）図は、ＦＧＦＲ１bおよびＦＧＦＲ２でトランス
フェクトしたＢaＦ３細胞における、ＫＧＦ−２およびＦＧＦ７によるチミジン
取込みの刺激を示す。ＦＧＦＲ１iiib(オープンサークル)またはＦＧＦＲ２iiib
／ＫＧＦＲ(ソリッドサークル)でトランスフェクトしたＢaＦ３細胞の増殖に対
するＫＧＦ−２(右のパネル)およびＦＧＦ７(左のパネル)の作用を試験した。Ｙ
軸は、ＢaＦ３細胞のＤＮＡへの[３Ｈ]チミジン取込み(cpm)の量を表す。Ｘ軸は
、組織培養培地に加えたＫＧＦ−２またはＦＧＦ７の最終濃度を表す。（Ｂ）は
、ＦＧＦＲ２iiibでトランスフェクトしたＢaＦ３細胞における、ＫＧＦ−２ Δ
３３によるチミジン取込みの刺激を示す。（Ｃ）は、ＦＧＦＲ２iiibでトランス
フェクトしたＢaＦ３細胞における、ＫＧＦ−２(白色の棒)、ＫＧＦ−２ Δ３３
(黒色の棒)、およびＫＧＦ−２ Δ２８(灰色の棒)によるチミジン取込みの刺激
を示す。
【図２３】 第２３図は、Ｅ. coli最適化全長のＫＧＦ−２に関するＤＮＡ
およびタンパク質配列[配列番号：３８および３９]を示す。
【図２４】 第２４（Ａ）および（Ｂ）図は、Ｅ. coli最適化成熟ＫＧＦ−
２に関するＤＮＡおよびタンパク質配列[配列番号：４２、４３、５４および５
５]を示す。
【図２５】 第２５図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸３６〜２０８を含んでなる
、ＫＧＦ−２欠失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列[配
列番号：６５および６６]を示す。
【図２６】 第２６図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸６３〜２０８を含んでなる
、ＫＧＦ−２欠失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列[配
列番号：６７および６８]を示す。
【図２７】 第２７図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸７７〜２０８を含んでなる
、ＫＧＦ−２欠失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列[配
列番号：６９および７０]を示す。
【図２８】 第２８図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸９３〜２０８を含んでなる
、ＫＧＦ−２欠失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列[配
列番号：７１および７２]を示す。
【図２９】 第２９図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸１０４〜２０８を含んでな
る、ＫＧＦ−２欠失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列[
配列番号：７３および７４]を示す。
【図３０】 第３０図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸１２３〜２０８を含んでな
る、ＫＧＦ−２欠失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列[
配列番号：７５および７６]を示す。
【図３１】 第３１図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸１３８〜２０８を含んでな
る、ＫＧＦ−２欠失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列[
配列番号：７７および７８]を示す。
【図３２】 第３２図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸３６〜１５３を含んでなる
、ＫＧＦ−２欠失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列[配
列番号：７９および８０]を示す。
【図３３】 第３３図は、ＫＧＦ−２のアミノ酸６３〜１５３を含んでなる
、ＫＧＦ−２欠失構築物に関するＤＮＡおよびコードされるタンパク質配列[配
列番号：８１および８２]を示す。
【図３４】 第３４図は、ＫＧＦ−２のシステイン−３７のセリンへの変異
体構築物に関するＤＮＡ配列[配列番号：８３]を示す。
【図３５】 第３５図は、ＫＧＦ−２のシステイン−３７／システイン−１
０６のセリンへの変異体構築物に関するＤＮＡ配列[配列番号：８４]を示す。
【図３６】 第３６図は、雄のＳＤラット(ｎ＝５)における創傷治癒に対す
るＫＧＦ−２ Δ３３の作用評価を示す。動物に６mＭの背側創傷を与えて、様々
な濃度の緩衝液またはＫＧＦ−２ Δ３３で４日間連続して処置した。較正され
たＪamesonカリパスを使用して、創傷を毎日測定した。不対ｔ試験を使用して、
統計分析を行った(平均＋／−ＳＥ)。＊緩衝液と比較した。
【図３７】 第３７図は、正常なラットにおける創傷治癒に対するＫＧＦ−
２ Δ３３の作用を示す。雄、ＳＤ、２５０−３００ｇのラットに、全体的な厚
さが６mＭの背側創傷を与えた。創傷をカリパスで測定して、手術した日から始
めて４日間、様々な濃度のＫＧＦ−２ Δ３３および緩衝液で処置した。最終日
に、創傷を収集した(harvested)。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行った。
＊値を未処置の対照と比較する。†値を緩衝液の対照と比較する。
【図３８】 第３８図は、切開による創傷における破損強度に対するＫＧＦ
−２ Δ３３の作用を示す。雄の成体ＳＤラット(ｎ＝１０)に、全体的な厚さが
２.５cmの切開による創傷を１日目に与えて、負傷した後に、緩衝液またはＫＧ
Ｆ−２(Δ３３)(１、４、および１０μg)の１回適用で切開内を処置した。５日
目に、動物を犠牲にして、通常の組織学および破損強度分析のために、０.５cm
の創傷標本を切除した。創傷をはさんで力を加えてインストロン皮膚表面張力計
を使用して、生体力学的試験を達成した。破損強度は、裂開前の各々の創傷によ
り抑えられる(withheld)最も大きい力として定義された。不対ｔ試験を使用して
、統計分析を行った(平均＋／−ＳＥ)。
【図３９】 第３９図は、切開による創傷における表皮の厚さに対するＫＧ
Ｆ−２(Δ３３)の作用を示す。雄の成体ＳＤラット(ｎ＝１０)に、全体的な厚さ
が２.５cmの切開による創傷を１日目に与えて、負傷した後に、緩衝液またはＫ
ＧＦ−２(Δ３３)(１、４、および１０μg)の１回適用で切開内を処置した。５
日目に、動物を犠牲にして、通常の組織学および破損強度分析のために、０.５c
mの創傷標本を切除した。創傷部位の周囲を測った６回の測定値の平均をとるこ
とにより、表皮の厚さを測定した。測定値は、光学顕微鏡法の下に、較正された
レンズマイクロメーターを使用して、Ｍasson Ｔrichromeで染色された切片に対
してブラインド観察者により測られた。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行っ
た(平均＋／−ＳＥ)。
【図４０】 第４０図は、単回の皮内注射後の表皮の厚さに対するＫＧＦ−
２(Δ３３)の作用を示す。雄の成体ＳＤラット(ｎ＝１８)に、５０μl中の１お
よび４μgの濃度での緩衝液またはＫＧＦ−２の６回の皮内注射を０日目に与え
た。注射してから２４および４８時間後に、動物を犠牲にした。表皮の厚さを、
顆粒層から基底層の底部まで測定した。約２０回の測定を注射部位に沿って行い
、平均の厚さを定量した。測定値は、光学顕微鏡法の下に、較正されたマイクロ
メーターを使用して、Ｍasson Ｔrichromeで染色された切片に対して測定された
。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行った(平均＋／−ＳＥ)。
【図４１】 第４１図は、ＢrdＵスコア記録(scoring)に対するＫＧＦ−２(
Δ３３)の作用を示す。雄の成体ＳＤラット(ｎ＝１８)に、５０μl中の１および
４μgの濃度でのプラセボまたはＫＧＦ−２の６回の皮内注射を０日目に与えた
。注射してから２４および４８時間後に、動物を犠牲にした。犠牲にする２時間
前に、動物に５−２'−ブロモ−デオキシルジン(１００mg／kg、腹腔内)を注射
した。スコア記録は、光学顕微鏡法の下に、次のスコア記録システムを使用して
、ブラインドされた観察者により行われた：０−３ 全く標識化されていない〜
最小限に標識化されたＢrdＵ細胞；４−６ 中程度の標識化；７−１０ 強度に標
識化された細胞。不対ｔ試験を使用して、統計分析を行った(平均＋／−ＳＥ)。
【図４２】 第４２図は、ＰＡＦにより誘発される足水腫に対するＫＧＦ−
２の抗炎症作用を示す。
【図４３】 第４３図は、Ｌewisラットにおいて、ＰＡＦにより誘発される
足水腫に対するＫＧＦ−２ Δ３３の抗炎症作用を示す。
【図４４】 第４４図は、全身照射されたＢＡＬＢ／cマウスの生存に対す
るＫＧＦ−２ Δ３３の作用を示す。２２.１ｇの雄のＢＡＬＢ／cマウス(ｎ＝５
)に、５１９ＲＡＤＳを照射した。照射する２日前、およびその後は７日間毎日
、動物を緩衝液またはＫＧＦ−２(１および５mg／kg、皮下)で処置した。
【図４５】 第４５図は、照射したマウスの体重に対するＫＧＦ−２ Δ３
３の作用を示す。５１９Ｒad／分で照射する２日前に、２２.１ｇの雄のＢＡＬ
Ｂ／cマウス(ｎ＝５)に緩衝液またはＫＧＦ−２ Δ３３(１、５mg／kg)を注射し
た。動物の体重を毎日測って、照射してから７日間注射した。
【図４６】 第４６図は、全身照射されたＢＡＬＢ／cマウスの生存率に対
するＫＧＦ−２ Δ３３の作用を示す。２２.１ｇの雄のＢＡＬＢ／cマウス(ｎ＝
７)に、５１９ＲＡＤＳを照射した。照射する２日前、およびその後は７日間毎
日、動物を緩衝液またはＫＧＦ−２(１および５mg／kg、皮下)で処置した。
【図４７】 第４７図は、糖質コルチコイドで損なわれたラットモデルにお
ける創傷治癒に対するＫＧＦ−２ Δ３３の作用を示す。
【図４８】 第４８図は、ＢrdＵ標識化を使用して測定される、細胞増殖に
対するＫＧＦ−２ Δ３３の作用を示す。
【図４９】 第４９図は、ラットの結腸における吻口手術部位に局在するコ
ラーゲン含量に対するＫＧＦ−２ Δ３３の作用を示す。
【図５０】 ｐＨＥ４−５発現ベクター（配列番号１４７）およびサブクロ
ーニングしたＫＧＦ−２ ｃＤＮＡコーティング配列の模式図を示す。カナマイ
シン耐性マーカー遺伝子、ＫＧＦ−２コード配列、ｏｒｉＣ配列、およびｌａｃ
Ｉｑコード配列の位置を示す。
【図５１】 ｐＨＥプロモーター制御配列のヌクレオチド配列（配列番号１
４８）を示す。２つのｌａｃオペレーター配列であるシャインダルガーノ配列（
Ｓ／Ｄ）および末端ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｄｅＩ制限部位（イタリック）を示
す。
【図５２】 ＫＧＦ−２Δ３３の腹腔内または皮下投与後の膀胱上皮の増殖
を示す。
【図５３】 ＫＧＦ−２Δ３３の全身投与後の前立腺上皮細胞の増殖を示す
。
【図５４】 ラットのシクロホスファミド誘発出血膀胱炎モデルにおける膀
胱壁潰瘍形成に対するＫＧＦ−２Δ３３の効果を示す。
【図５５】 ラットのシクロホスファミド誘発出血膀胱炎モデルにおける膀
胱壁肥厚に対するＫＧＦ−２Δ３３の効果を示す。
【図５６】 皮下および腹腔内経路で全身投与したときにＫＧＦ−２Δ３３
がラットの正常上皮の増殖を誘発するか否かを決定するためにデザインした研究
の概略を示す。
【図５７】 正常なスプラーグドーリーラットに毎日ＫＧＦ−２Δ３３（５
ｍｇ／ｋｇ；ＨＧ０３４１１−Ｅ２）または緩衝液を注射し、最後の注射の１日
後に屠殺した。目隠しした観察者が、動物１匹当たり１０のランダムに選択した
視野での増殖細胞を１０倍の倍率でカウントした。ＫＧＦ−２Δ３３の皮下投与
は１日後に有意の増殖を引き起こしたが、これは２日で正常に戻った。腹腔内投
与したＫＧＦ−２Δ３３は１〜３日から増殖を刺激したが、第１日目と第３日目
の結果のみが統計的に有意であった。
【図５８】 正常なスプラーグドーリーラットに毎日ＫＧＦ−２Δ３３（５
ｍｇ／ｋｇ；ＨＧ０３４１１−Ｅ２）または緩衝液を注射し、最後の注射の１日
後に屠殺した。目隠しした観察者が、動物１匹当たり１０のランダムに選択した
視野での増殖細胞を１０倍の倍率でカウントした。腹腔内投与したＫＧＦ−２Δ
３３は試験の期間を通じて増殖を刺激したが、一方、ＫＧＦ−２Δ３３の皮下投
与はいずれの時点でも増殖を増大させなかった。
【図５９】 正常なスプラーグドーリーラットに毎日ＫＧＦ−２Δ３３（５
ｍｇ／ｋｇ；ＨＧ０３４１１−Ｅ２）または緩衝液を注射し、最後の注射の１日
後に屠殺した。目隠しした観察者が、動物１匹当たり１の切片での増殖細胞を１
０倍の倍率でカウントした。皮下投与したＫＧＦ−２Δ３３は毎日の投与の１日
、２日および３日後に増殖の有意な増大を引き起こした。ＫＧＦ−２Δ３３を腹
腔内で投与した場合は、増殖は２日および３日後にのみ認められた。
【図６０】 正常なラット肺でＫＧＦ−２Δ３３によって誘発された増殖を
示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１月２２日（２００２．１．２２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０７２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０７２４】 配列番号１７３のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡを含むプラスミドは２０
００年７月３日に10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 にあ
るアメリカンタイプカルチャーコレクションの特許用寄託部門に寄託し、ＡＴＣ
Ｃ受託番号ＰＴＡ−２１８３を受けている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０７２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０７２７】 配列番号１７６のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡを含むプラスミドは２０
００年７月３日に10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 にあ
るアメリカンタイプカルチャーコレクションの特許用保管部門に寄託し、ＡＴＣ
Ｃ受託番号ＰＴＡ−２１８４を受けている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 3/04 ４Ｃ０８７ 1/18 3/06 3/04 3/10 3/06 5/00 3/10 7/02 5/00 7/04 7/02 7/06 7/04 9/00 7/06 9/04 9/00 9/06 9/04 9/10 9/06 １０１ 9/10 １０３ １０１ 9/12 １０３ 11/00 9/12 11/06 11/00 13/02 11/06 13/08 13/02 13/10 13/08 13/12 13/10 15/00 13/12 15/02 15/00 15/06 15/02 15/08 15/06 15/14 15/08 17/00 15/14 17/02 17/00 17/06 17/02 19/00 17/06 19/02 19/00 21/02 19/02 21/04 21/02 25/02 21/04 25/06 25/02 25/08 25/06 25/14 25/08 25/16 25/14 25/28 25/16 27/02 25/28 29/00 １０１ 27/02 31/04 29/00 １０１ 31/10 31/04 31/12 31/10 33/00 31/12 35/00 33/00 37/02 35/00 37/08 37/02 43/00 １０５ 37/08 Ｃ１２Ｎ 1/15 43/00 １０５ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ａ６１Ｋ 31/7088 5/10 35/76 Ｃ１２Ｐ 21/02 48/00 // Ａ６１Ｋ 31/7088 Ｃ１２Ｒ 1:19 35/76 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 48/00 5/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ６０／１４４，０２４ (32)優先日 平成11年７月15日(1999．7．15) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１４８，６２８ (32)優先日 平成11年８月12日(1999．8．12) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１４９，９３５ (32)優先日 平成11年８月19日(1999．8．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１６３，３７５ (32)優先日 平成11年11月３日(1999．11．3) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１７１，６７７ (32)優先日 平成11年12月22日(1999．12．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１９８，３２２ (32)優先日 平成12年４月19日(2000．4．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２０５，４１７ (32)優先日 平成12年５月19日(2000．5．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／６１０，６５１ (32)優先日 平成12年６月30日(2000．6．30) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 パブロ・ヒメネス アメリカ合衆国21043メリーランド州エリ コット・シティ、カレッジ・アベニュー 3843番 (72)発明者 ディ・ロクサーヌ・デュアン アメリカ合衆国20817メリーランド州ベセ ズダ、ノースフィールド・ロード5515番 (72)発明者 マーク・エイ・ラムピー アメリカ合衆国20886メリーランド州モン トゴメリー・ビレッジ、ワイルド・アップ ル・サークル10224番 (72)発明者 ドナ・メンドリック アメリカ合衆国21771メリーランド州マウ ント・エアリー、リッジ・ロード29112番 (72)発明者 ジャン・ジュン アメリカ合衆国20817メリーランド州ベセ ズダ、クレストベリー・プレイス10100番 (72)発明者 ニ・ジャン アメリカ合衆国20853メリーランド州ロッ クビル、マナーフィールド・ロード5502番 (72)発明者 ポール・エイ・ムーア アメリカ合衆国20874メリーランド州ジャ ーマンタウン、レザーバーク・ドライブ 19005番 (72)発明者 ティモシー・エイ・コールマン アメリカ合衆国20879メリーランド州ゲイ ザーズバーグ、ボックスベリー・テラス 7512番 (72)発明者 ヨアヒム・エル・グルーバー アメリカ合衆国75205テキサス州ダラス、 ノーマンディ4501番、アパートメント１ (72)発明者 パトリック・ジェイ・ディロン アメリカ合衆国92009カリフォルニア州カ ールスバッド、スナイプ・コート1055番 (72)発明者 ライナー・エル・ゲンツ アメリカ合衆国20850メリーランド州ロッ クビル、マウント・プロスペクト・ドライ ブ13608番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 4B064 AG02 CA02 CC24 DA01 4B065 AA90X AA91X AB01 AC14 BA02 BD03 CA24 CA44 4C084 AA02 AA03 AA07 AA13 BA44 DB52 MA13 MA17 MA22 MA23 MA24 MA31 MA32 MA35 MA36 MA38 MA41 MA44 MA52 MA57 MA60 MA63 MA66 NA14 ZA062 ZA082 ZA152 ZA162 ZA222 ZA332 ZA362 ZA402 ZA452 ZA512 ZA532 ZA542 ZA552 ZA662 ZA672 ZA682 ZA702 ZA812 ZA892 ZA942 ZA962 ZB022 ZB072 ZB132 ZB152 ZB212 ZB262 ZB332 ZB352 ZB372 ZC022 ZC332 ZC412 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA04 MA13 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA31 MA35 MA36 MA37 MA38 MA41 MA44 MA52 MA59 MA60 MA63 MA65 MA66 NA14 ZA02 ZA06 ZA15 ZA16 ZA20 ZA22 ZA36 ZA40 ZA42 ZA45 ZA51 ZA54 ZA55 ZA59 ZA66 ZA67 ZA68 ZA70 ZA75 ZA81 ZA94 ZA96 ZB02 ZB07 ZB11 ZB13 ZB21 ZB26 ZB33 ZB37 ZC02 ZC33 ZC35 ZC41 4C087 AA01 AA02 BC83 CA09 MA13 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA31 MA32 MA36 MA37 MA41 MA44 MA52 MA57 MA60 MA63 MA66 NA14 ZA02 ZA06 ZA08 ZA15 ZA20 ZA22 ZA33 ZA36 ZA40 ZA45 ZA51 ZA53 ZA54 ZA55 ZA59 ZA66 ZA67 ZA70 ZA75 ZA81 ZA89 ZA94 ZA96 ZB07 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26 ZB33 ZB35 ZB37 ZC02 ZC33 ZC41

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｒ６８Ｇ、Ｒ６８Ｓ、Ｒ６８Ａ、Ｒ７８Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｋ８
    １Ａ、Ｋ８７Ａ、Ｋ９１Ａ、Ｋ１３６Ａ、Ｋ１３７Ａ、Ｋ１３９Ａ、Ｋ１４４Ａ
    、Ｋ１４８Ｅ、Ｋ１４９Ｅ、Ｋ１５１Ａ、Ｋ１５３Ａ、Ｋ１５５Ａ、Ｒ１７４Ａ
    、Ｋ１８３Ａ、Ｋ１８３Ｑ、Ｋ１８３Ｅ、Ｒ１８７Ａ、Ｒ１８８Ａ、Ｒ１８８Ｅ
    、Ｋ１９１Ｅ、Ｒ６８からＫ９１間（Ｒ６８およびＫ９１も含む）にある正電荷
    残基のアラニンへの置換、Ｒ６８からＫ９１間（Ｒ６８およびＫ９１も含む）に
    ある正電荷残基の中性残基への置換、Ｒ６８からＫ９１間（Ｒ６８およびＫ９１
    も含む）にある正電荷残基の負電荷残基への置換からなる群の中から選ばれる１
    つまたはそれ以上の変異を除いては、配列番号２の参照ポリペプチドと同一であ
    るポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド
    。
  2. 【請求項２】 該参照ポリペプチドが配列番号２における６３から２０８位
    、６９から２０８位、６９から２０８位、７７から２０８位、８０から２０８位
    、または９３から２０８位のアミノ酸を含有する、請求項１記載のポリヌクレオ
    チド。
  3. 【請求項３】 請求項１記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
  4. 【請求項４】 請求項１記載のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞。
  5. 【請求項５】 ポリペプチドを生産するための方法であって、該ポリペプチ
    ドが発現する条件下に請求項４記載の宿主細胞を培養し、得られたポリペプチド
    を回収することを特徴とする方法。
  6. 【請求項６】 請求項１記載のポリヌクレオチドによってコードされている
    ポリペプチド。
  7. 【請求項７】 請求項６記載のポリペプチドを患者に投与することを特徴と
    する、該患者における上皮細胞増殖を刺激するための方法。
  8. 【請求項８】 該患者が、傷、粘膜炎、潰瘍、炎症性腸疾患、肝障害、肺障
    害、糖尿病、口腔傷害、胃腸傷害、腸管毒、表皮水疱症、皮膚移植片、皮膚障害
    、腎不全、脳傷害、乳房組織傷害、尿路上皮障害、女性生殖管障害、腸線維症、
    直腸炎、肺線維症、肺炎、胸膜後退症、造血性症候群、および骨髄毒性からなる
    群の中から選ばれる障害を有している、請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 患者における卵巣傷害、不妊症または肝臓線維症を処置する
    ための方法であって、配列番号２のポリペプチドまたはその活性断片もしくは変
    異体の有効量を該患者に投与することを特徴とする方法。
  10. 【請求項１０】 患者における自発治癒、供与部位治癒、自発外科傷害治癒
    、または美容整形外科により付けられた切開創の治癒を促進させるための方法で
    あって、配列番号２のポリペプチドまたはその活性断片もしくは変異体の有効量
    を該患者に投与することを特徴とする方法。
  11. 【請求項１１】 ポリペプチドの調製方法であって、 （ａ）６３から２０８位のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドをベクター
    に挿入し、 （ｂ）該ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、 （ｃ）該ポリペプチドが発現する条件下に該宿主細胞を培養し、 （ｄ）塩酸グアニジンの存在下に該細胞を溶解し、そして （ｅ）該ポリペプチドを回収する、ことを特徴とする方法。
  12. 【請求項１２】 配列番号１７３の４から４４４位、または配列番号１７６
    の１から４４１位のヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
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