KR20020026517A - 케라티노사이트 성장 인자-2 - Google Patents

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파블로 지메네즈
디. 록산느 두안
마크 에이. 람피
돈나 멘드릭
준 창
지안 니
폴 에이. 무어
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패트릭 제이. 딜론
라이너 엘. 겐츠
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Abstract

본 발명은 새로 동정된 폴리뉴클레오티드, 그 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 폴리펩티드, 그러한 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드의 용도, 그리고 그러한 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드의 생산에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 케라티노사이트 성장 인자이며, 이는 본원에서 가끔 "KGF-2"로 칭해지기도 하며 또한 이전에는 섬유아세포 성장 인자 12(FGF-12)로 알려져 있었다. 본 발명은 추가로 상처 치료를 촉진하기 위한 KGF-2의 치료적 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 증가된 활성, 증가된 안정성, 고 수율 또는 보다 나은 용해도를 갖는 신규의 돌연변이 KGF-2 형태에 관한 것이다.

Description

케라티노사이트 성장인자-2{KERATINOCYTE GROWTH FACTOR-2}
섬유아세포 성장인자 부류는 연(軟)조직 성장 및 재생에 연관된 성장인자의 큰 부류로서 출현했다. 그것은 현재 여러 부류를 포함하는데, 이 부류들은 단백질 수준에서 다양한 정도의 상동성(homology)을 공유하며, 하나만 제외하고 유사한 넓은 세포분열촉진 스펙트럼을 갖는다. 즉, 중배엽 및/또는 신경외배엽 기원의 다양한 세포의 증식을 촉진하고 및/또는 혈관형성을 촉진한다.
부류가 서로 다른 것들의 발현 패턴은 어떤 발생 단계의 극도로 제한된 발현으로부터 다양한 조직 및 기관에서의 편재하는 발현까지 매우 다르다. 모든 부류들은 헤파린 및 헤파린 설페이트 프로테오글리칸 및 글리코사미노글리칸에 결합하는 것으로 보이며 세포외 매트릭스에 강하게 집중된다. KGF는 처음에는 서열 상동성 또는 인자 정제 및 클로닝에 의하여 FGF 부류에 속하는 것으로 밝혀졌다. 케라티노사이트 성장인자(KGF)는 배양된 뮤린 케라티노사이트 세포주의 세포분열촉진물질(mitogen)로서 분리되었다(Rubin, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:802-806(1989)). FGF 부류에 속하는 다른 것들과는 다르게, 그것은 간엽-유도된 세포에 대한 활성이 적지만 표피세포의 성장을 촉진시킨다. 케라티노사이트 성장인자는 194-아미노산 폴리펩티드를 암호화한다(Finch, P.W. et al., Science 245:752-755(1989)). N-터미날 64 아미노산은 특유하지만, 단백질의 나머지는 bFGF와 약 30% 상동성을 갖는다. KGF는 FGF 부류 중 가장 확산적인(divergent) 것이다. 이 분자는 소수성 시그날 서열을 가지며 효율적으로 분비된다. 번역-후 변형은 시그날 서열의 절단 및 한 부위에서의 N-결합된 글리코실화를 포함하며, 이것에 의해 28kDa 단백질이 생성된다. 케라티노사이트 성장인자는 피부 및 태아 폐로부터 유도된 섬유아세포에 의해 생성된다(Rubin et al., (1989)). 케라티노사이트 성장인자 mRNA는 성인 신장, 결장 및 장골에서 발현되는 것으로 밝혀졌으며 뇌 또는 폐에서는 발현되지 않는 것으로 밝혀졌다(Finch, P.W. et al., Science 245:752-755(1989)). KGF는 FGF 단백질 부류내에서 보존되는 영역을 나타낸다. KGF는 FGF-2 리셉터에 고친화성으로 결합한다.
손상된 상처 치유는 병적상태의 중요한 근원이며 피열(披裂), 문합쇠약(anastomotic breakdown), 비-치유 상처 등의 합병증을 일으킬 수 있다. 정상의 개체에서는 병발증이 따르지 않은채로 상처 치유가 달성된다. 반대로, 손상된 치유는 당뇨병, 감염, 면역억제, 비만 및 영양불량 등의 여러 질환과 연관된다(Cruse, P.J. and Foord, R.., Arch. Surg. 107:206(1973); Schrock, T.R. et al., Ann. Surg. 177:513(1973); Poole, G.U.., Jr., Surgery 97:631(1985); Irvin, G.L. et al., Am. Surg. 51:418(1985)).
상처 치유는 복잡한 상호작용과 생물학적 과정의 결과이다. 정상 상처 치유에서는 3 단계가 기술되었다:급성 염증 단계, 세포외 매트릭스 및 콜라겐 합성, 및 재모델링(Peacock, E.E., Jr., Wound Repair, 2nd edition, WB Saunders, Philadelphia(1984)). 이 과정에는 케라티노사이트, 섬유아세포 및 염증 세포의 상처 부위에서의 상호작용이 관여한다.
조직 재생은 수리(repair) 과정에 관여하는 세포의 이동 및 증식을 조절하는 특이적인 펩티드 인자에 의하여 조절되는 것으로 보인다(Barrett, T.B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6772-6774(1985); Collins, T. et al., Nature 316:748-750(1985)). 따라서, 성장인자는 상처, 화상 및 다른 피부 질환의 치료에 있어서 가능성있는 치료법일 수 있다(Rifkin, D.B. and Moscatelli, J. Cell. Biol. 109:1-6(1989); Sporn, M.B. et al., J. Cell. Biol. 105:1039-1045(1987); Pierce, G.F. et al., J. Cell. Biochem. 45:319-326(1991)). 치유과정의 순서는 급성 염증 단계동안 일시적인 조직의 침착으로 개시된다. 그 후에는 재-상피화, 콜라겐 합성 및 침착, 섬유아세포 증식, 신경혈관화가 일어나는데, 이것들 모두 궁극적으로 재모델링 단계를 정의한다(Clark, R.A.F., J. Am. Acad. Dermatol. 13:701(1985)). 이들 사건들은 염증 세포에 의해 분비되는 성장인자와 시토카인에 의해 또는 상처의 가장자리에 국부화된 세포들에 의해 영향을 받는다(Assoian, R.K. et al., Nature(Lond.) 309:804(1984); Nemeth, G.G. et al., "Growth Factors and Their Role in Wound and Fracture Healing",Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing in Biological and Clinical Implications, New York(1988), pp.1-17.
여러개의 폴리펩티드 성장인자가 상처 치유에 관여하는 것으로 동정되었는데, 여기에는 케라티노사이트 성장인자(KGF)(Antioniades, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:565(1991)), 혈소판 유래 성장인자(PDGF)(Antioniades, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:565(1991); Staiano-Coico, L. et al., Jour. Exp. Med. 178:865-878(1993)), 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)(Golden, M.A. et al., J. Clin. Invest. 87:406(1991)), 산성 섬유아세포 성장인자(aFGF)(Mellin, T.N. et al., J. Invest. Dermatol. 104:850-855(1995)), 표피 성장인자(EGF)(Whitby, D.J. and Ferguson, W.J., Dev. Biol. 147:207(1991)), 형질전환 성장인자-α(TGF-α)(Gartner, M.H. et al., Surg. Forum 42:643(1991); Todd, R. et al., Am. J. Pathol. 138:1307(1991)), 형질전환 성장인자-β(TGF-β)(Wong, D.T.W. et al., Am. J. Pathol. 143:622(1987)), neu 분화인자(rNDF)(Danilenko, D.M. et al., J. Clin. Invest. 95:842-851(1995)), 인슐린-유사 성장인자 I(IGF-I), 인슐린-유사 성장인자 II(IGF-II)(Cromack, D.T. etal., J. Surg. Res. 42:622(1987))이 포함된다.
피부의 rKGF-1은 모낭 및 피지선내의 케라티노사이트, 표피 케라티노사이트를 자극한다는 것이 보고되었다(Pierce, G.F. et al., J. Exp. Med. 179:831-840(1994)).
본 발명은 새로 동정된 폴리뉴클레오티드, 이 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드, 이 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드의 사용, 그리고 이 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드의 제조에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 케라티노사이트 성장인자이며, 이것은 때로는 "KGF-2"로 나타낼 것이며, 종전에는 섬유아세포 성장인자 12(FGF-12)로 알려져 있었다. 본 발명은 또한 상처 치유를 촉진하거나 가속시키는 데 KGF-2를 치료적으로 사용하는 것에도 관련된다. 본 발명은 또한 증가된 활성, 증가된 안정성, 더 높은 수율 또는 더 양호한 가용성을 나타내는 KGF-2의 새로운 변이체 형태에도 관련된다. 또한, 본 발명은 KGF-2 폴리펩티드를 정제하는 방법에도 관련된다.
본 발명은 1994년 12월 16일에 ATCC 수탁번호 75977로서 기탁된 cDNA 클론에 의하여 암호화된 아미노산 서열 또는 제1도[서열 식별 번호:2]에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 케라티노사이트 성장인자(KGF-2)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산분자를 제공한다. 제1도[서열 식별 번호:1]에서 보여지는 기탁된 KGF-2 클론을 서열결정함으로써 결정된 뉴클레오티드 서열은 208 아미노산 잔기의 폴리펩티드를 암호화하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함하는데, 이것은 위치 1-3에서 개시 코돈을 포함하고 약 35 또는 36 아미노산 잔기의 추정되는 리더 서열과 약 23.4kDa의 추정되는 분자량을 갖는다. 성숙(mature) KGF-2의 아미노산 서열은 제1도에서 보여지며, 이것은 아미노산 약 36 또는 37 내지 208[서열 식별 번호:2]이다.
본 발명의 폴리펩티드는 FGF 부류에 속하는 것으로서 추정되었으며, 더 구체적으로는 폴리펩티드가 FGF 부류의 다른 것들과 아미노산 서열 상동성의 결과로서 KGF-2로 추정되었다.
본 발명의 한 면에 따르면, KGF-2인 새로운 성숙 폴리펩티드 뿐만아니라 생물학적으로 활성이 있고 진단 또는 치료에 유용한 그것의 단편, 유사체, 유도체가제공된다. 본 발명의 상기 폴리펩티드들은 인간으로부터 유래된다.
본 발명의 다른 면에 따르면, 인간 KGF-2를 암호화하는 분리된 핵산분자가 제공되는데, 여기에는 mRNA, DNA, cDNA, 게놈 DNA, 뿐만아니라 그것의 안티센스 유사체, 및 생물학적으로 활성이 있고 진단 또는 치료에 유용한 그것의 단편이 포함된다.
본 발명의 다른 면에 따르면, KGF-2 단백질의 재조합 제조시 시약으로 유용한 클로닝 및 발현 플라스미드 같은 재조합 벡터, 뿐만아니라 인간 KGF-2 핵산서열을 포함한 재조합 원핵 및/또는 진핵 숙주세포의 사용을 통해서 상기 폴리펩티드를 재조합 기술에 의해 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 면에 따르면, 그러한 폴리펩티드, 또는 그 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 치료 목적, 예를 들면, 상처 치유를 위한 상피세포 증식 및 기저 케라티노사이트를 자극시키고, 모낭 생성 및 진피 상처의 치유를 자극시키는데 이용하는 방법을 제공한다. KGF-2는 외과적 상처, 절제 상처, 진피와 표피 손상을 포함하는 깊은 상처, 눈 조직 상처, 치아 조직 상처, 구강 상처, 당뇨병 궤양, 피부궤양, 팔꿈치 궤양, 동맥 궤양, 정맥울혈 궤양, 열 노출 또는 화학물질로부터 야기되는 화상을 포함하는 상처의 치유, 스테로이드, 방사선 요법 및 항종양 의약, 대사길항물질로의 전신처리와 연관된 합병증 및 비타민 결핍, 요독증, 영양장애 등의 기타 비정상적인 상처 치유를 자극시키는데 임상적으로 유용할 수 있다. KGF-2는 진피 상실에 후속하는 진피 재확립을 촉진하는데 사용될 수도 있다.
KGF-2는 상처층(wound bed)에의 피부 이식편의 접착을 증가시키고 상처층으로부터 재-상피화를 자극시키는데도 사용될 수 있다. 다음은 KGF-2가 상처층에의 접착을 증가시키는데 사용될 수 있는 이식의 유형이다: 자가이식, 인공피부, 동종이식(allograft), 자가진피 이식, 자가표피 이식, 무혈관 이식, 블레어-브라운(Blair-Brown) 이식, 뼈 이식, 배조직 이식, 피부이식, 지연 이식(delayed graft), 진피 이식, 표피이식, 근막 이식, 총두께 이식(full thickness graft), 이형이식(heterologous graft), 이종이식(xenograft), 동형이식(homologous graft), 과형성 이식, 라멜라 이식, 메쉬 이식, 점막 이식, 올리어-티어쉬(Ollier-Thiersch) 이식, 오멘팔(omenpal) 이식, 패치(patch) 이식, 페디클(pedicle) 이식, 침투 이식, 분열 피부 이식(split skin graft), 또는 두꺼운 분열 이식(thick split graft). KGF-2는 피부 강도를 증가시키고 노화 피부의 형태를 개선하는데 사용될 수도 있다.
KGF-2는 또한 폐, 유방, 이자, 위, 소장 및 대장의 상피세포 증식, 그리고 간세포 증식의 변화를 생성하는 것으로 믿어진다. KGF-2는 피지 세포, 모낭, 간 세포, 타입 II 폐 세포, 뮤신 생성 배상세포, 및 기타 상피세포 등의 상피세포, 피부, 폐, 간, 및 위장관내에 포함된 상기 세포들의 전구세포의 증식을 촉진할 수 있다. KGF-2는 내피세포, 케라티노사이트, 기저 케라티노사이트의 증식을 촉진할 수 있다.
KGF-2는 또한 방사선, 화학요법 치료 또는 바이러스 감염으로부터 야기되는 소화관 독성의 부작용을 감소시키는데 사용될 수 있다. KGF-2는 소장 점막에 대한 세포 보호 효과를 가질 수 있다. KGF-2는 또한 화학요법 및 바이러스 감염으로부터야기되는 점막염(입 궤양)의 치유를 자극시킬 수 있다.
KGF-2는 또한 화상을 포함하는 총 두께 및 부분 두께 피부 손상의 피부의 완전 재생(즉, 모낭, 한선 및 피지선의 재집단화), 건선 같은 다른 피부 손상의 치료에 사용될 수 있다. KGF-2는 표피수포증, 빈번하고 벌어지고 아픈 포진으로 되는 표피와 밑에 있는 진피의 접착의 손상을, 손상부의 재상피화를 촉진시킴으로써 치료하는데 사용될 수 있다. KGF-2는 또한 위 궤양 및 십이지장 궤양을 치료하고 점막 내막의 자국 형성 및 점액선과 십이지장 점막내막의 재생에 의한 치유를 더욱 빠르게 하는데 사용될 수 있다. 크론(Crohn) 질환 및 궤양성 대장염 등과 같은 염증성 장 질환은 각각 소장 또는 대장의 점막 표면을 파괴시키는 질환이다. 따라서, KGF-2는 점막표면의 재표면화를 촉진하여 더욱 빠른 치유를 돕고 염증성 장 질환의 진행을 방지하는데 사용될 수도 있다. KGF-2 치료는 위장관 전체에 걸쳐서 점액의 생성에 대해 상당한 효과를 갖는 것으로 기대되고 수술후 또는 섭취된 유해한 물질로부터 장 점막을 보호하는데 사용될 수 있다. KGF-2는 KGF-2의 발현하에서 연관되어 있는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
더욱이, KGF-2는 각종 병리학적 상태에 기인하는 폐 손상을 예방하고 치유하는데에도 사용될 수 있다. 증식 및 분화를 자극할 수 있는 KGF-2 같은 성장인자는 폐포 및 기관지 상피의 수선을 촉진하여 급성 또는 만성 폐 손상을 예방 또는 치료할 수 있다. 예를 들면, 기관지 상피 및 폐포의 괴사를 일으키는, 흡연 및 화재로부터 생기는 흡입 손상, 그리고 폐포의 진행성 상실을 일으키는 폐기종은 KGF-2로 효과적으로 치료될 수 있다. 또한, KGF-2는 타입 II 폐 세포의 증식 및 분화를 자극하는데 사용될 수 있는데, 이것은 미성숙 유아에서 유아 호흡 곤란증 및 기관지폐 디스플라시아, 히알린 막증 등의 질환을 치료하거나 예방하는데 도움이 될 수 있다.
KGF-2는 간 세포의 증식 및 분화를 자극할 수 있으며 따라서 간경변에 의해 야기되는 급격히 진행하는 간 질환, 바이러스성 간염 및 독성 물질(즉, 아세트아미노펜, 카본 테트라클로라이드, 기타 당업계에서 알려진 간 독소)에 의해 야기되는 간 손상 등의 간질환 및 병리를 경감시키거나 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
부가적으로, KGF-2는 당뇨병의 개시를 치료하거나 예방하는데 사용될 수도 있다. 일부 섬 세포(islet cell) 기능이 남아 있는, 새로 진단된 타입 I 및 II 당뇨병을 갖는 환자에서, KGF-2는 섬 기능을 유지하여 질환의 영속적인 발현을 경감, 지연 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 또한, KGF-2는 섬 세포 이식에서 보조제로 사용되어 섬 세포 기능을 개선 또는 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 면에 따르면, 상기 폴리펩티드에 대한 항체가 제공된다.
본 발명의 또 다른 면에 따르면, 인간 KGF-2 서열에 특이적으로 하이브리드하는 충분한 길이의 핵산분자를 포함하는 핵산 프로브를 제공한다.
본 발명의 추가적인 면에 따르면, 치료용 펩티드로서 사용될 수 있는 KGF-2의 모조 펩티드(mimetic peptide)가 제공된다. 모조 KGF-2 펩티드는 KGF-2의 동족의 리셉터(cognate receptor)에 결합하여 활성화함으로써 KGF-2 단백질의 생물학적 활성을 모사하는 짧은 펩티드이다. 또한 모조 KGF-2 펩티드는 KGF-2의 동족 리셉터에 결합하여 억제할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 면에 따르면, 상기 폴리펩티드의 길항제를 제공하는데, 이것은 상기 폴리펩티드의 작용을 억제하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 상처 치유 과정동안의 흔적을 감소시키고 종양 증식, 당뇨병 망막병증, 류마티스 관절염, 골관절염 및 종양 성장을 방지하고 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다. 또한 KGF-2 길항제는 KGF-2의 과도한 발현과 연관된 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 면에 따르면, KGF-2 핵산 서열의 돌연변이 또는 상기 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 과잉 발현에 연관된 질환 또는 이 질환에의 감수성을 검출하는 진단분석법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 면에 따르면, 상기 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를, 과학적 연구에 관련된 시험관내 목적, DNA의 합성 및 DNA 벡터 제조에 이용하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 한 면은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다:(a) 제1도[서열식별번호:2]의 완전한 아미노산 서열을 갖는 KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;(b) 제1도[서열식별번호:2]에서 위치 36 또는 37 내지 208에서 아미노산 서열을 갖는 성숙 KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (c) ATCC 수탁번호 75977에 포함된 cDNA 클론에 의해 암호화된 완전한 아미노산 서열을 갖는 KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (d) ATCC 수탁번호 75977에 포함된 cDNA 클론에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 성숙 KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 (e) 상기 (a), (b), (c) 또는 (d)의 뉴클레오티드 서열중 어느 것에 상보적인 뉴클레오티드 서열.
본 발명의 추가 구체예는 상기 (a), (b), (c), (d) 또는 (e)의 뉴클레오티드 서열중 어느 것과 80% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열, 더 바람직하게는 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 (a), (b), (c), (d) 또는 (e)의 폴리뉴클레오티드에 스트린전트(stringent) 하이브리드화 조건하에서 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산분자를 포함한다. 하이브리드하는 이러한 폴리뉴클레오티드는 단지 A 잔기로 구성되거나 또는 단지 T 잔기로 구성되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 스트린전트 하이브리드화 조건하에서 하이브리드화하지 않는다. 본 발명의 추가적인 핵산 구체예는 상기 (a), (b), (c) 또는 (d)의 아미노산 서열을 갖는 KGF-2의 에피토프-함유 부분의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드룰 포함하는 분리된 핵산분자에 관한 것이다.
본 발명은 추가적으로 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 분리된 KGF-2 폴리펩티드를 제공한다:(a) 제1도[서열식별번호:2]에서 보여지는 리더 서열을 포함하여, 완전한 208 아미노산 서열을 갖는 KGF-2 폴리펩티드의 아미노산 서열;(b) 제1도[서열식별번호:2]에서 위치 36 또는 37 내지 208에서 아미노산 서열을 갖는 성숙 KGF-2 폴리펩티드(리더가 없다)의 아미노산 서열; (c) ATCC 수탁번호 75977에 포함된 cDNA 클론에 의해 암호화된, 리더를 포함하는, 완전한 아미노산 서열을 갖는 KGF-2 폴리펩티드의 아미노산 서열; (d) ATCC 수탁번호 75977에 포함된 cDNA 클론에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 성숙 KGF-2 폴리펩티드의 아미노산 서열. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 상기 (a), (b), (c) 또는 (d)에 기재된 것과 80% 이상 유사성(similarity), 더 바람직하게는 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 뿐만아니라 상술한 것들과 80% 이상 동일한, 더 바람직하게는 85% 이상 동일한, 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 또 다른 면은 상기 (a), (b), (c) 또는 (d)의 아미노산 서열을 갖는 KGF-2 폴리펩티드의 에피토프-함유 부분의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 KGF-2 폴리펩티드의 에피토프-함유부분의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드는, 상술한 본 발명의 폴리펩티드의 전체 아미노산 서열까지의 어떤 길이를 갖고 전체 아미노산 서열을 포함하는 에피토프-함유 폴리펩티드도 발명에 포함되지만, 적어도 6 또는 7, 바람직하게는 적어도 9, 더 바람직하게는 적어도 약 30 아미노산 내지 약 50 아미노산을 갖는 폴리펩티드의 부분을 포함한다. 다른 구체예에서는, 본 발명은 상기 (a), (b), (c) 또는 (d)의 아미노산 서열을 갖는 KGF-2 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 면에 따르면, KGF-2의 새로운 변이체도 제공된다. 이것은 KGF-2의 하나 이상의 아미노산을 결실 또는 치환시킴으로써 생성될 수 있다. 천연의 돌연변이는 대립 변이(allelic variation)라고 부른다. 대립 변이는 사일런트(암호화되는 폴리펩티드에는 변화없음)일 수도 있고 또는 변화된 아미노산 서열을 가질 수도 있다. 천연의 KGF-2의 특성의 개선 또는 변경을 시도하기 위해서 단백질 공학을 이용할 수 있다. 당업계에서 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 새로운 폴리펩티드를 만들수 있다. 뮤테인 및 결실 돌연변이는 예컨대 증가된 활성 또는 증가된 안정성을 나타낼 수 있다. 또한, 그것은 적어도 어떤 정제 및 저장 조건하에서 더 우수한 가용성을 나타내고 더 높은 수율로 정제될 수 있다.
본 발명의 상기 측면들 그리고 본 발명의 다른 측면들은 하기 기재로부터 당업자들에게 명백할 것이다.
첨부된 도면은 본 발명의 구체예들을 에시하는 것이며 특허청구범위에 의해 포괄되는 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
도면의 간단한 설명
제1A-1C도는 본 발명의 폴리펩티드의 cDNA 및 대응하는 추정 아미노산 서열을 도시한다. 처음 35 또는 36 아미노산 잔기는 추정되는 리더 서열(도시하지 않음)을 나타낸다. 아미노산에 대해서는 표준 1 문자 표기법을 사용하였다. 서열결정 부정확성은 폴리뉴클레오티드 서열의 결정을 시도할 때 공통의 문제점이다. 서열결정은 373 자동화된 DNA 시퀀서(Applied Biosystems, Inc.)를 이용하여 수행하였다. 시퀀싱 정확도는 97% 보다 더 큰 것으로 예상되었다.[서열식별번호:1]
제2A-2D도는 본 발명의 폴리펩티드와 다른 섬유아세포 성장인자의 아미노산 서열 비교를 도시한 것이다.[서열식별번호:13-22]
제3A-3D도는 KGF-2 유전자의 전체 길이의 mRNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.[서열식별번호:23 및 24]
제4A-4E도는 KGF-2 아미노산 서열의 분석을 보여준다. 알파, 베타, 턴 앤드 코일(turn and coil) 영역;친수성 및 소수성; 양쪽친매성 영역;가요성 영역;항원성 지수 및 표면 확률이 보여진다. "항원성 지수-제임슨-울프"(Antigenic Index-Jameson-Wolf) 그래프에서, 제1도[서열식별번호:2]의 아미노산 잔기 41-109는 KGF-2 단백질의 보여지는 항원성이 높은 영역에 해당한다. 소수성 영역(호프-우즈 곡선;Hopp-Woods Plot)은 메디안 라인 이하에서(네가티브 값) 발견되며 친수성 영역(카이트-둘리틀 곡선;Kyte-doolittle Plot)은 메디안 라인 이상에서(포지티브 값, 가령 아미노산 잔기 41-109) 발견되었다. 상기 곡선은 전체 208 아미노산 ORF에 걸쳐 있다.
제5도는 당뇨병 마우스의 상처 폐쇄(wound closure)에 대한 KGF-2의 평가를 나타낸다. 상처를 낸 후 즉시 그리고 5일 연속으로 매일 그리고 8일경에 상처를 측정하였다. 다음 식을 이용하여 퍼센트 상처 폐쇄를 계산하였다: [1일경의 면적(area)] - [8일경의 면적] / [1일경의 면적]. 통계분석은 언페어드 t 테스트(unpaired t test)를 이용하여 수행하였다(평균 +/- SEM, n=5).
제6도는 비-당뇨병 마우스의 상처 폐쇄에 대한 KGF-2의 평가를 나타낸다. 상처를 낸 후 즉시 그리고 5일 연속으로 매일 그리고 8일경에 상처를 측정하였다. 다음 식을 이용하여 퍼센트 상처 폐쇄를 계산하였다: [1일경의 면적(area)] - [8일경의 면적] / [1일경의 면적]. 통계분석은 언페어드 t 테스트(unpaired t test)를 이용하여 수행하였다(평균 +/- SEM, n=5).
제7도는 당뇨병 마우스에서 상처 폐쇄의 시간 경과를 나타낸다. 상처를 낸 후 즉시 그리고 5일 연속으로 매일 그리고 8일경에 상처를 측정하였다. 값이 전체 면적(mm2)으로 주어진다. 통계분석은 언페어드 t 테스트(unpaired t test)를 이용하여 수행하였다(평균 +/- SEM, n=5).
제8도는 비-당뇨병 마우스에서 상처 폐쇄의 시간 경과를 나타낸다. 상처를 낸 후 즉시 그리고 5일 연속으로 매일 그리고 8일경에 상처를 측정하였다. 값이 전체 면적(mm2)으로 주어진다. 통계분석은 언페어드 t 테스트(unpaired t test)를 이용하여 수행하였다(평균 +/- SEM, n=5).
제9도는 당뇨병 마우스에서 KGF-2에 대한 조직병리학적 평가를 나타낸다. 수치는 블라인드(blind) 관찰자에 의해서 주어졌다. 통계분석은 언페어드 t 테스트(unpaired t test)를 이용하여 수행하였다(평균 +/- SEM, n=5).
제10도는 비-당뇨병 마우스에서 KGF-2에 대한 조직병리학적 평가를 나타낸다. 수치는 블라인드(blind) 관찰자에 의해서 주어졌다. 통계분석은 언페어드 t 테스트(unpaired t test)를 이용하여 수행하였다(평균 +/- SEM, n=5).
제11도는 당뇨병 마우스에서 케라티노사이트 성장의 효과를 나타낸다. 수치는 블라인드(blind) 관찰자에 의해서 주어졌다. 통계분석은 언페어드 t 테스트(unpaired t test)를 이용하여 수행하였다(평균 +/- SEM, n=5).
제12도는 비-당뇨병 마우스에서 케라티노사이트 성장의 효과를 나타낸다. 수치는 블라인드(blind) 관찰자에 의해서 주어졌다. 통계분석은 언페어드 t 테스트(unpaired t test)를 이용하여 수행하였다(평균 +/- SEM, n=5).
제13도는 당뇨병 마우스에서 피부 증식의 효과를 나타낸다. 수치는 블라인드(blind) 관찰자에 의해서 주어졌다. 통계분석은 언페어드 t 테스트(unpaired t test)를 이용하여 수행하였다(평균 +/- SEM, n=5).
제14도는 비-당뇨병 마우스에서 피부 증식의 효과를 나타낸다. 수치는 블라인드(blind) 관찰자에 의해서 주어졌다. 통계분석은 언페어드 t 테스트(unpaired t test)를 이용하여 수행하였다(평균 +/- SEM, n=5).
제15도는 pQE60-Cys37 구조체로부터 발현되는 단백질 및 DNA 서열을 나탄내다[서열식별번호:29 및 30]. 발현된 KGF-2 단백질은 위치 37의 시스테인부터 위치 208의 세린까지의 서열을 포함하며 단백질의 N-터미날에 6X(his) 태그(tag)가 부착되어 있다.
제16도는 래트에서 상처 치유에 대한 메틸-프레드니솔론의 효과를 보여준다. 수컷 SD 성체 래트(n=5)에 상처를 낸 날 5mg의 메틸 프레드니솔론을 주사하였다. 상기 동물에 진피 펀치 상처(8mm)를 냈고 연속 5일간 50㎕ 완충용액 중의 KGF-2 용액 또는 완충용액으로 매일 처리하였다. 눈금을 매긴 제임슨 캘리퍼스(Jameson caliper)로 1-5일경 및 8일경 매일 상처를 측정하였다. 값은 8일경 취한 측정치를 나타낸다(평균 +/- SEM).
제17도는 상처 폐쇄에 대한 KGF-2의 효과를 보여준다. 수컷 SD 성체 래트(n=5)에 진피 펀치 상처(8mm)를 냈고 상처를 낸 날 5mg의 메틸 프레드니솔론을주사하였다. 상기 동물에 상처를 낸 날 시작하여 연속 5일간 50㎕ 완충용액 중의 KGF-2 또는 완충용액으로 매일 처리하였다. 연속 5일간 매일 그리고 8일경에 측정을 하였다. 상처 폐쇄는 하기 식에 의하여 계산하였다:[8일경의 면적(area)] - [1일경의 면적] / [1일경의 면적]. 진피 펀치에 의하여 만들어진 1일경의 면적은 64mm2으로 결정되었다. 통계분석은 언페어드 t 테스트(unpaired t test)를 이용하여 수행하였다(평균 +/- SEM).
제18도는 상처 치유의 글루코코르티코이드-손상된 모델에서 상처 치유의 시간 경과를 보여준다. 수컷 SD 성체 래트(n=5)에 1일경에 진피 펀치 상처(8mm)를 냈고 상처를 내고 50㎕의 KGF-2 용액 또는 완충용액으로 연속 5일간 매일 처리하였다. 상기 동물에 상처를 낸 날 5mg의 메틸 프레드니솔론을 투여하였다. 상기 동물에 상처를 낸 날 시작하여 연속 5일간 매일 그리고 8일경에 눈금을 매긴 제임슨 캘리퍼스로 상처를 측정하였다. 통계분석은 언페어드 t 테스트(unpaired t test)를 이용하여 수행하였다(평균 +/- SEM).
제19(A)도는 성처를 내고 5일후에 메틸-프레드니솔론 부재하에 상처 치유의 래트 모델에서 상처 부위에 대한 KGF-2의 효과를 나타낸다. 수컷 SD 래트(n=5)에 1일경에 진피 펀치 상처(8mm)를 냈고 상처를 내고, 상처를 낸 날 그리고 그후 연속 5일동안 50㎕의 KGF-2 용액 또는 완충용액으로 매일 처리하였다. 눈금을 매긴 제임슨 캘리퍼스로 상처를 매일 측정하였다. 통계분석은 언페어드 t 테스트(unpaired t test)를 이용하여 수행하였다(평균 +/- SEM). 제19(B)도는 수컷 SD 래트(n=6)에서PDGF-BB 및 KGF-2의 평가를 나타낸다. 모든 래트의 등에 8mm 상처를 내고 상처 치유를 손상시키기 위해 메틸프레드니솔론(MP)(17mg/kg)을 투여하였다. 각종 농도의 PDGF-BB 및 KGF-2 또는 완충액으로 매일 상처를 처리하였다. 눈금을 매긴 제임슨 캘리퍼스를 이용하여 2일, 4일, 6일, 8일 및 10일경에 상처를 측정하였다. 통계분석은 언페어드 t 테스트를 이용하여 수행하였다(평균 +/- SEM).※완충액과 비교.※※※PDGF-BB 1㎍ vs KGF-2/E3 1㎍.
제20도는 상처 치유의 글루코코르티코이드-손상된 모델에서 상처 거리에 대한 KGF-2의 효과를 보여준다. 수컷 SD 성체 래트(n=5)에 진피 펀치 상처(8mm)를 냈고 상처를 낸 날에 17mg/kg의 메틸-프레드니솔론을 투여하였다. 상기 동물에 연속 5일간 그리고 8일경에 50㎕ 완충액 중의 KGF-2 또는 완충용액으로 매일 처리하였다. 상처 거리는 광학현미경 하에서 눈금을 매긴 마이크로미터로 측정하였다. 통계분석은 언페어드 t 테스트를 이용하여 수행하였다(평균 +/- SEM).
제21(A)도는 KGF-2에 의한 정상의 일차 표피 케라티노사이트 증식의 자극을 나타낸다. (B)는 KGF-2 Δ33에 의한 정상의 일차 표피 케라티노사이트 증식의 자극을 나타낸다. (C)는 KGF-2 Δ28에 의한 정상의 일차 표피 케라티노사이트 증식의 자극을 나타낸다. 인간의 정상의 일차 표피 케라티노사이트를 각종 농도의 KGF-2, KGF-2 Δ33, KGF-2 Δ28와 3일간 배양하였다. 3개의 실험 모두에서 알라마르블루(alamarBlue)를 16시간 동안 첨가하였고, 세포에 의해 알라마르블루로부터 전환되는 적색의 강도를 O.D.570nm 와 O.D.600nm 사이의 차이에 의하여 측정하였다. KGF-2 단백질 각각에 대하여 완전 케라티노사이트 성장 배지(KGM)의 포지티브 콘트롤과 케라티노사이트 기초 배지(KBM)의 네가티브 콘트롤이 동일한 분석 플레이트에 포함되었다.
제22(A)도는 FGFR1b 및 FGFR2로 형질감염된 Baf3 세포에서 KGF-2 및 FGF7에 의한 티미딘 삽입의 자극을 보여준다. FGFR1iiib(오픈 서클) 또는 FGFR2iiib/KGFR(솔리드 서클)로 형질감염된 Baf3 세포의 증식에 대한 KGF-2(오른쪽 패널) 및 FGF7(왼쪽 패널)의 효과를 조사하였다. Y-축은 Baf3 세포의 DNA내로의 [3H]티미딘 삽입(cpm)의 양을 나타낸다. X-축은 조직배양 배지에 첨가되는 KGF-2 또는 FGF7의 최종 농도를 나타낸다. (B)는 FGFR2iiib로 형질감염된 Baf3 세포에서 KGF-2 Δ33 에 의한 티미딘 삽입의 자극을 보여준다. (C)는 FGFR2iiib로 형질감염된 Baf3 세포에서 KGF-2(백색 막대), KGF-2 Δ33(흑색 막대) 및 KGF-2 Δ28(회색 막대)에 의한 티미딘 삽입의 자극을 보여준다.
제23도는 E.coli 최적화된 전체 길이 KGF-2의 DNA 및 단백질 서열[서열식별번호:38 및 39]을 나타낸다.
제24A 및 24B도는 E.coli 최적화된 성숙 KGF-2의 DNA 및 단백질 서열[서열식별번호:42, 43, 54 및 55]을 나타낸다.
제25도는 KGF-2의 아미노산 36 내지 208을 포함하는 KGF-2 결실 구조체의 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열식별번호:65 및 66]을 나타낸다.
제26도는 KGF-2의 아미노산 63 내지 208을 포함하는 KGF-2 결실 구조체의 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열식별번호:67 및 68]을 나타낸다.
제27도는 KGF-2의 아미노산 77 내지 208을 포함하는 KGF-2 결실 구조체의 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열식별번호:69 및 70]을 나타낸다.
제28도는 KGF-2의 아미노산 93 내지 208을 포함하는 KGF-2 결실 구조체의 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열식별번호:71 및 72]을 나타낸다.
제29도는 KGF-2의 아미노산 104 내지 208을 포함하는 KGF-2 결실 구조체의 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열식별번호:73 및 74]을 나타낸다.
제30도는 KGF-2의 아미노산 123 내지 208을 포함하는 KGF-2 결실 구조체의 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열식별번호:75 및 76]을 나타낸다.
제31도는 KGF-2의 아미노산 138 내지 208을 포함하는 KGF-2 결실 구조체의 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열식별번호:77 및 78]을 나타낸다.
제32도는 KGF-2의 아미노산 36 내지 153을 포함하는 KGF-2 결실 구조체의 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열식별번호:79 및 80]을 나타낸다.
제33도는 KGF-2의 아미노산 63 내지 153을 포함하는 KGF-2 결실 구조체의 DNA 및 암호화된 단백질 서열[서열식별번호:81 및 82]을 나타낸다.
제34도는 KGF-2 시스테인-37의 세린 돌연변이 구조체의 DNA 서열을 나타낸다[서열식별번호:83].
제35도는 KGF-2 시스테인-37/시스테인-106의 세린 돌연변이 구조체의 DNA 서열을 나타낸다[서열식별번호:84].
제36도는 수컷 SD 래트(n=5)에서 상처 치유에 대한 KGF-2 Δ33 효과의 평가를 보여준다. 상기 동물의 등에 6mm 상처를 내고 연속 4일 동안 각종 농도의 완충액, 또는 KGF-2 Δ33으로 처리하였다. 눈금을 매긴 제임슨 캘리퍼스로 매일 상처를 측정하였다. 통계분석은 언페어드 t-테스트를 이용하여 행하였다. (평균 +/- SE)※완충액과의 비교.
제37도는 정상 래트에서 상처 치유에 대한 KGF-2 Δ33의 효과를 나타낸다. 수컷, SD, 250-300g, 래트(n=5)에 6mm 총두께 등 상처를 냈다. 수술한 날부터 시작하여 4일동안 캘리퍼스로 상처를 측정하고 각종 농도의 KGF-2 Δ33과 완충액으로 처리하였다. 마지막날에 상처를 수거하였다. 통계분석은 언페어드 t-테스트로 수행하였다.※값은 처리하지 않은 콘트롤과 비교하였다. †값은 완충액 콘트롤과 비교하였다.
제38도는 절개 상처의 파열 강도(breaking strength)에 대한 KGF-2 Δ33의 효과를 보여준다. 수컷 성체 SD 래트(n=10)에 1일경에 2.5cm 총두께 절개 상처를 냈고, 상처를 낸 후 완충액 또는 KGF-2(델타 33)(1, 4, 10㎍)을 한번의 투여로 절개부위에 처리하였다. 5일경에 동물을 희생하고 0.5cm 상처 표본을 통상의 조직학 및 파열강도 분석을 위해 절단하였다. 상처를 가로질러 적용되는 힘으로 인스트론 피부 장력측정기(Instron skin tensiometer)를 이용하여 생체역학 시험을 하였다. 파열강도는 파열 이전 각 상처에 의해 저지되는 최대의 힘으로 정의하였다. 통계분석은 언페어드 t-테스트를 이용하여 수행하였다.(평균 +/- SE)
제39도는 절개 상처의 표피 두께에 대한 KGF-2 (델타 33)의 효과를 보여준다. 수컷 성체 SD 래트(n=10)에 1일경에 2.5cm 총두께 절개 상처를 냈고, 상처를낸 후 완충액 또는 KGF-2(델타 33)(1, 4, 10㎍)을 한번의 투여로 절개부위에 처리하였다. 5일경에 동물을 희생하고 0.5cm 상처 표본을 통상의 조직학 및 파열강도 분석을 위해 절단하였다. 표피 두께는 상처 주위에서 취한 6번의 측정치의 평균값을 취함으로써 결정하였다. 눈금을 매긴 렌즈 마이크로미터를 이용하여 광학 현미경하에서 매손 트리크롬(Masson Trichrome) 염색 부위에 대하여 블라인드 관찰자에 의해 측정치가 취해졌다. 통계분석은 언페어드 t-테스트를 이용하여 수행하였다.(평균 +/- SE)
제40도는 단일의 진피내 주사 후 표피 두께에 대한 KGF-2 Δ33의 효과를 보여준다. 수컷 성체 SD 래트(n=18)에 0일에 완충액 또는 KGF-2를 50㎕ 중의 1㎍ 및 4㎍의 농도로 6번 진피내 주사를 하였다. 주사하고나서 24시간 및 48시간후 동물을 희생하였다. 표피 두께는 과립층으로부터 기저층의 밑에까지 측정하였다. 주사부위를 따라서 대략 20번 측정을 하였고 평균 두께를 결정하였다. 눈금을 매긴 마이크로미터를 이용하여 광학 현미경하에서 매손 트리크롬(Masson Trichrome) 염색 부위에 대하여 측정치를 결정하였다. 통계분석은 언페어드 t-테스트를 이용하여 수행하였다.(평균 +/- SE)
제41도는 BrdU 평점(scoring)에 대한 KGF-2(델타 33)의 효과를 보여준다. 수컷 성체 SD 래트(n=18)에 0일에 위약(placebo) 또는 KGF-2를 50㎕ 중의 1㎍ 및 4㎍의 농도로 6번 진피내 주사를 하였다. 주사하고나서 24시간 및 48시간후 동물을 희생하였다. 희생 2시간 전에 동물에 5-2'-브로모-데옥시우리딘(100mg/kg ip)을 주사하였다. 평점은 하기 평점 시스템을 이용하여 광학현미경하에서 블라인드 관찰자에의해 행해졌다:0-3 전혀 없거나 최소의 BrdU 표지화된 세포;4-6 중간 정도의 표지화;7-10 강하게 표지화된 세포. 통계분석은 언페어드 t-테스트를 이용하여 수행하였다.(평균 +/- SE)
제42도는 PAF-유도된 발 부종에 대한 KGF-2의 항-염증 효과를 나타낸다.
제43도는 루이스 래트에서 PAF-유도된 발 부종에 대한 KGF-2 Δ33의 항-염증 효과를 나타낸다.
제44도는 전체 몸체가 조사된 Balb/c 마우스의 생존에 대한 KGF-2 Δ33의 효과를 나타낸다. Balb/c 수컷 마우스(n=5), 22.1g을 519 RADS로 조사하였다. 조사하기 2일전에 그리고 그후 7일간 매일 완충액 또는 KGF-2(1 & 5 mg/kg, s.q.)로 상기 동물을 처리하였다.
제45도는 조사된 마우스의 체중에 대한 KGF-2 Δ33의 효과를 나타낸다. Balb/c 수컷 마우스(n=5), 22.1g을 519 RAD/분 으로 조사하기 2일전에, 완충액 또는 KGF-2 Δ33(1, 5 mg/kg)로 주사하였다. 상기 동물을 조사후 7일간 매일 체중을 재고 주사하였다.
제46도는 전체 몸체가 조사된 Balb/c 마우스의 생존에 대한 KGF-2 Δ33의 효과를 나타낸다. Balb/c 수컷 마우스(n=7), 22.1g을 519 RADS로 조사하였다. 조사하기 2일전에 그리고 그후 7일간 매일 완충액 또는 KGF-2(1 & 5 mg/kg, s.q.)로 상기 동물을 처리하였다.
제47도는 글루코코르티코이드-손상된 래트 모델에서 상처 치유에 대한 KGF-2 Δ33의 효과를 나타낸다.
제48도는 BrdU 표지화를 이용하여 결정하였을 때 세포 증식에 대한 KGF-2 Δ33의 효과를 보여준다.
제49도는 래트의 결장의 문합 수술 부위에 국부화된 콜라겐 함량에 대한 KGF-2 Δ33의 효과를 나타낸다.
제50도는 pHE4-5 발현 벡터(서열식별번호:147) 및 서브클로닝된 KGF-2 cDNA 암호화 서열의 모식도를 나타낸다. 카나마이신 저항성 마커 유전자의 위치, KGF-2 암호화 서열, oriC 서열, 및lacIq 암호화 서열이 표시되어 있다.
제51도는 pHE 프로모터의 조절 요소들의 뉴클레오티드 서열(서열식별번호:148)을 나타낸다. 두 lac 오퍼레이터 서열, 샤인-달가노(Shine-Delgarno) 서열(S/D), 및 터미날 HindIII 및 NdeI 제한위치(이탤릭체 부분)가 표시되어 있다.
제52도는 KGF-2 Δ33의 ip 또는 sc 투여 후 방광 표피의 증식을 보여준다.
제53도는 KGF-2 Δ33의 전신 투여 후 전립선 표피 세포의 증식을 보여준다.
제54도는 래트에서 시클로포스파미드-유도된 출혈성 방광염의 방광 벽 궤양에 대한 KGF-2 Δ33의 효과를 나타낸다.
제55도는 시클로포스파미드-유도된 방광염 래트 모델에서 방광 벽 두께에 대한 KGF-2 Δ33의 효과를 보여준다.
제56도는 KGF-2 Δ33를 SC 및 IP 경로를 이용해서 전신적으로 투여할 때 래트에서 정상 표피의 증식을 유도하는지의 여부를 결정하기 위한 연구 계획의 개요를 제공한다.
제57도에서는 정상 스프라그 다울리 래트를 매일 KGF-2 Δ33(5mg/kg, HG03411-E2) 또는 완충액으로 주사하고 최종 주사하고 나서 1일후 희생시켰다. 블라인드 관찰자로 하여금 10X 확대하여 동물 당 10 임의로 선택된 필드에서 증식하는 세포를 계수하게 하였다. KGF-2 Δ33의 SC 투여는 1일후 상당한 증식을 유발하였고 그 다음에는 2일경까지 정상으로 돌아갔다. ip 투여된 KGF-2 Δ33은 1-3일부터 증식을 자극시켰지만 단지 1일 및 3일경의 결과만이 통계적으로 유의성이 있었다.
제58도에서는 정상 스프라그 다울리 래트를 매일 KGF-2 Δ33(5mg/kg, HG03411-E2) 또는 완충액으로 주사하고 최종 주사하고 나서 1일후 희생시켰다. 블라인드 관찰자로 하여금 10X 확대하여 동물 당 10 임의로 선택된 필드에서 증식하는 세포를 계수하게 하였다. KGF-2 Δ33의 SC 투여는 어떤 시간점에서도 증식을 증가시키지 않았지만 ip 투여된 KGF-2 Δ33은 전체 연구 기간동안 증식을 자극시켰다.
제59도에서는 정상 스프라그 다울리 래트를 매일 KGF-2 Δ33(5mg/kg, HG03411-E2) 또는 완충액으로 주사하고 최종 주사하고 나서 1일후 희생시켰다. 블라인드 관찰자로 하여금 10X 확대하여 동물 당 하나의 단면에서 증식하는 세포를 계수하게 하였다. KGF-2 Δ33의 SC 투여는 매일 투여하고 나서 1, 2, 3일후에 증식의 상당한 증가를 유발하였다. ip 투여된 KGF-2 Δ33은 단지 2일 및 3일후에만 증식이 나타났다.
제60도는 정상 래트 폐에서 KGF-2 Δ33 유도된 증식을 나타낸다.
본 발명의 면에 따르면, 제1도[서열식별번호:2]의 추정되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 미국 버지니아 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10811 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션 페이턴트 디포지토리에서 1994년 12월 16일에 ATCC 수탁번호 75977로서 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 미국 버지니아 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10811 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션 페이턴트 디포지토리에서 1994년 9월 29일에 ATCC 수탁번호 75901로서 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산(폴리뉴클레오티드)가 제공된다.
핵산 분자
다른 기재가 없는한, 여기서 DNA 분자를 서열결정함으로써 결정되는 모든 뉴클레오티드 서열은 자동화된 DNA 시퀀서(Applied Biosystems, Inc.의 모델 373 등)를 이용하여 결정하였고, 여기서 결정된 DNA 분자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 모든 아미노산 서열은 상기와 같이 결정한 DNA 서열의 번역에 의해 추정되었다. 따라서, 이러한 자동화된 방법에 의해 결정되는 어떤 DNA 서열에 대하여 당업계에서 알려진 바와 같이, 여기서 결정되는 어떤 뉴클레오티드 서열은 일부 에러를 포함할 수 있다. 자동화에 의해서 결정되는 뉴클레오티드 서열은 서열결정되는 DNA 분자의 실제 뉴클레오티드 서열과 전형적으로는 적어도 약 90%가 동일하고, 더 전형적으로는 적어도 약 95% 내지 적어도 약 99.9%가 동일하다. 실제 서열은 당업계에서 알려진 수동의 DNA 시퀀싱 방법을 포함하는 다른 방법에 의해 더 정확하게 결정될 수 있다. 또한 당업계에서 잘 알려진 바와 같이, 실제 서열과 비교했을 때 결정된 뉴클레오티드 서열에서의 단일 삽입 또는 결실은 뉴클레오티드 서열의 번역의 프레임 시프트를 일으킬 수 있어서, 결정된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 추정 아미노산 서열이 그러한 삽입 또는 결실 포인트에서 시작하여 서열결정된 DNA 분자에 의해 실제로 암호화되는 아미노산 서열과 완전히 달라지게 될 것이다.
다른 기재가 없는한, 여기서 기재되는 각 "뉴클레오티드 서열"은 데옥시리보뉴클레오티드(A, G, C 및 T로 표기)의 서열로서 주어진다. 그러나, 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 "뉴클레오티드 서열"은, DNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 경우에는 데옥시리보뉴클레오티드의 서열이고, RNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 경우에는 리보뉴클레오티드(A, G, C 및 U)의 대응하는 서열인데, 여기서 특정된 데옥시리보뉴클레오티드 서열의 티미딘 데옥시리보뉴클레오티드(T)는 리보뉴클레오티드 우리딘(U)에 의하여 치환된다. 예컨대, 데옥시리보뉴클레오티드 표기를 이용하여 기재한 서열식별번호:1의 서열을 갖는 RNA 분자는, 서열식별번호:1의 각 데옥시리보뉴클레오티드 A, G 또는 C가 대응하는 리보뉴클레오티드 A, G 또는 C에 의해 치환되고 각 데옥시리보뉴클레오티드 T가 리보뉴클레오티드 U에 의해 치환된 서열을갖는 RNA 분자를 나타내는 것이다.
"분리된" 핵산 분자(들)는 천연의 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들면, 벡터에 포함된 재조합 DNA 분자는 본 발명의 목적상 분리된 것으로 간주한다. 분리된 DNA 분자의 추가 실례는 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 용액상의 DNA 분자 또는 이종 숙주세포에서 유지되는 재조합 DNA 분자를 포함한다. 분리된 RNA 분자는 본 발명의 DNA 분자의 생체내 또는 시험관내 RNA전사체를 포함한다. 본 발명에 따르는 분리된 핵산분자는 또한 합성에 의해 생성된 그러한 분자들을 포함한다.
본 발명의 분리된 핵산 분자는 제1도[서열식별번호:1]에 도시된 뉴클레오티드 서열의 위치 1-3에서 개시 코돈을 갖는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 DNA 분자; 제1도에서 보여지는 성숙 KGF-2 단백질(마지막 172 또는 173 아미노산)[서열식별번호:2]의 암호화 서열을 포함하는 DNA 분자; 및 상술한 것들과 실질적으로 다른 서열을 포함하지만 유전암호의 축퇴성(degeneracy) 때문에 여전히 KGF-2 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 포함한다. 물론, 유전암호는 당업계에서 잘 알려져 있다. 따라서, 당업자가 상술한 축퇴성 변이체를 생성하는 것은 용이하다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간 전립선 및 태아 폐로부터 얻어질 수 있다. 상기 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 단편은 처음에는 인간의 정상 전립선으로부터 유도된 라이브러리로부터 분리되었다. 그 후 전체 길이의 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 랜덤하게 프라이밍된 인간 태아 폐 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다. 그것은 구조적으로 FGF 부류에 연관된다. 그것은 208 아미노산 잔기의 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는데, 대략 처음 35 또는 36 아미노산 잔기가 추정되는 리더 서열이므로 성숙 단백질은 173 또는 172 아미노산을 포함하게 된다. 상기 단백질은 인간 케라티노사이트 성장인자와 가장 높은 상동성을 나타내며 206 아미노산 스트레치(stretch) 에 걸쳐서 45% 동일성(identity)과 82% 유사성(similarity)을 갖는다. 또한 FGF 부류에서 보존되는 서열이 본 발명의 단백질에서 보존되는 것으로 밝혀진 것이 중요하다.
또한, 라이브러리로부터의 KGF-2 cDNA의 네스티드 PCR(nested PCR) 결과는 KGF-2의 가능한 선택적 스플라이싱 형태가 있다는 것을 나타냈다. 구체적으로는, KGF-2의 오픈 리딩 프레임의 N-터미날 주변부의 프라이머를 이용하여, 0.2kb 및 0.4kb의 PCR 생성물을 각종 cDNA 라이브러리로부터 얻었다. 0.2kb 크기는 KGF-2의 예상되는 생성물이었지만, 0.4kb 크기는 KGF-2의 선택적으로 스플라이싱된 형태로부터 생길 수 있다. 04kb 생성물은 위암, 성인 고환, 십이지장 및 이자의 라이브러리로부터 관찰되었다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA의 형태 또는 DNA의 형태일 수 있는데, DNA에는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA가 포함된다. DNA는 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있으며, 단일가닥이라면 암호화 가닥 또는 비-암호화(안티-센스) 가닥일 수 있다. 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 서열은 제1도[서열식별번호:1]에서 보여지는 암호화 서열 또는 기탁된 클론의 것과 동일할 수 있고, 또는 유전암호의 중복 또는 축퇴의 결과로서 암호화 서열이 제1도[서열식별번호:1]의 DNA 또는 기탁된 cDNA와 동일한 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 다른 암호화 서열일 수 있다.
제1도[서열식별번호:2]의 추정되는 성숙 폴리펩티드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 추정되는 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 다음을 포함할 수 있다:단지 성숙 폴리펩티드의 암호화 서열;리더 또는 분비성 서열 또는 프로프로틴 서열과 같은 부가적인 암호화 서열 및 성숙 폴리펩티드의 암호화 서열;성숙 폴리펩티드의 암호화 서열(및 선택적으로 부가적인 암호화 서열) 그리고 추정되는 성숙 폴리펩티드의 암호화 서열의 5' 및/또는 3' 비-암호화 서열 또는 인트론과 같은 비-암호화 서열. 또, 유전자의 5' 및 3' 비번역 영역을 포함하는 전체 길이의 mRNA가 얻어졌다(제3도(서열식별번호:23)).
당업자가 이해하는 바와 같이, 다른 공지된 단백질에서 리더에 대한 절단 부위의 다양성 뿐만아니라 상술한 시퀀싱 에러때문에, 기탁된 cDNA에 의해 암호화되는 실제 KGF-2 폴리펩티드는 약 208 아미노산을 포함하지만, 200-220 아미노산 범위의 어디에 속할 수 있다;그리고 이 단백질의 실제 리더 서열은 약 35 또는 36 아미노산이지만, 약 30 내지 약 40 아미노산 범위의 어디에 속할 수 있다.
따라서, "폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드" 용어는 단지 폴리펩티드의 암호화 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 뿐만아니라 부가적인 암호화 및/또는 비-암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.
본 발명은 또한 제1도[서열식별번호:2]의 추정되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체를 암호화하는 상술한 폴리뉴클레오티드의 변이체에도 관련된다. 폴리뉴클레오티드의 변이체는 천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드의 대립 변이체 또는 비천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드의 변이체일 수 있다.
따라서, 본 발명은 제1도[서열식별번호:2]에서 보여지는 것과 동일한 추정되는 성숙 폴리펩티드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 추정되는 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 뿐만아니라 제1도[서열식별번호:2]의 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리펩티드의 변이체들을 포함한다. 그러한 뉴클레오티드 변이체는 결실 변이체, 치환 변이체, 첨가 또는 삽입 변이체를 포함한다.
본 발명은 치료용 펩티드로서 사용할 수 있는 KGF-2의 모조 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 모조 KGF-2 팹티드는 KGF-2의 동족 리셉터에 결합하고 활성화하여 KGF-2 단백질의 생물학적 활성을 모조하는 짧은 펩티드이다. 또한 모조 KGF-2 펩티드는 KGF-2의 동족 리셉터에 결합하여 억제시킬 수도 있다. KGF-2 리셉터는 FGFR2iiib 및 FGFR1iiib을 포함하지만 이것들로 제한되지는 않는다. 그러한 모조 펩티드는 파지 디스플레이 또는 콤비나토리알 화학(combinatorial chemistry)와 같은 방법으로부터 얻어지지만, 이것들로 제한되지는 않는다. 예컨대, 모조 KGF-2 펩티드를 생성하기 위한 Wrighton et al., Science 273:458-463(1996)에 의하여 개시된 방법이 있다.
위에서 지적한 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 제1도[서열식별번호:1]에서 보여지는 암호화 서열의 또는 기탁된 클론의 암호화 서열의 천연적으로 존재하는 대립 변이체인 암호화 서열을 가질 수 있다. 당업계에서 알려진 바와 같이, 대립 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 추가를 가질 수 있고 암호화 폴리펩티드의 기능을 실질적으로 변화시키지 않는 폴리뉴클레오티드 서열의 다른 형태이다.
본 발명은 또한 숙주세포로부터 폴리펩티드의 발현과 분비에 도움이 되는 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들면 숙주로부터 폴리펩티드의 수송을 조절하는 분비성 서열로서 기능하는 리더 서열과 성숙 폴리펩티드의 암호화 서열이 동일한 리딩 프레임으로 융합될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 리더 서열을 갖는 폴리펩티드는 프레프로틴(preprotein)이며 숙주세포에 의해 리더 서열이 절단되어 폴리펩티드의 성숙 형태를 형성할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 성숙 단백질 + 부가적인 5' 아미노산 잔기인 프로프로틴(proprotein)을 암호화할 수 있다. 프로서열(prosequence)을 갖는 성숙 단백질은 프로프로틴이며 단백질의 불활성화 형태이다. 프로서열이 절단되면 활성을 갖는 성숙 단백질이 남게 된다.
따라서, 예컨대 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 성숙 단백질을 암호화할 수 있고, 프로서열을 갖는 단백질을 암호화하거나 프로서열 및 프레서열(presequence)(리더 서열)을 갖는 단백질을 암호화할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명의 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 마커(marker) 서열과 프레임이 맞도록 융합된 암호화 서열을 가질 수 있다. 마커 서열은 세균 숙주의 경우에 마커에 융합된 성숙 폴리펩티드의 정제를 제공하도록 pQE-9에 의해 공급되는 헥사히스티딘일 수 있고, 또는 예컨대 포유동물 숙주, 가령 COS-7 세포가 사용될 때에는 마커 서열이 헤마글루티닌(HA) 태그일 수 있다. HA 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도되는 에피토프에 해당한다(Wilson, I. et al., Cell 37:767(1984)).
"유전자" 용어는 폴리펩티드 사슬을 생성하는데 관여하는 DNA 절편을 의미한다;그것은 암호화 영역 앞 뒤의 영역(리더 및 트레일러) 뿐만아니라 각 암호화 서열(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함한다.
본 발명의 전체 길이 유전자의 단편은 전체 길이의 cDNA를 분리하고 그리고 유전자와의 높은 서열 유사성 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는 다른 cDNA를 분리하는데 있어서 cDNA 라이브러리의 하이브리드화 프로브로서 사용할 수 있다. 이러한 유형의 프로브는 바람직하게는 적어도 30 염기를 갖고 예컨대 50 또는 그 이상의 염기를 포함할 수 있다. 이 프로브는 또한 조절 및 프로모터 영역, 엑손 및 인트론을 포함하는 완전한 유전자를 함유하는 게놈 클론 또는 클론들 및 전체 길이의 전사체에 대응하는 cDNA 클론을 동정하는데 사용될 수 있다. 스크린의 실례는 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하기 위해 알려진 DNA 서열을 사용함으로써 유전자의 암호화 영역을 분리하는 것을 포함한다. 본 발명의 유전자의 것에 상보적인 서열을 갖는 표지화된 올리고뉴클레오티드는 인간 cDNA, 게놈 DNA 또는 cDNA의 라이브러리를 스크리닝하여 프로브가 라이브러리중 어느 것과 하이브리드화하는지를 결정하는데 사용된다.
본 발명의 추가 구체예는 (a) 추정되는 리더 서열을 포함하여, 제1도[서열식별번호:2]의 완전한 아미노산 서열을 갖는 전체 길이의 KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;(b) 제1도[서열식별번호:2]에서 위치 36 또는 37 내지 208에서 아미노산 서열을 갖는 성숙 KGF-2 폴리펩티드(리더가 제거된 전체 길이의 폴리펩티드)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (c) ATCC 수탁번호 75977에 포함된 cDNA 클론에 의해 암호화된 리더를 포함한 완전한 아미노산 서열을 갖는 전체 길이의 KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (d) ATCC 수탁번호 75977에 포함된 cDNA 클론에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 성숙 KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 (e) 하기에서 기술하는 KGF-2 유사체 또는 결실 돌연변이체 중 어느 것을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 또는 (f) (a), (b),(c),(d) 또는 (e)의 뉴클레오티드 서열중 어느 것에 상보적인 뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 동일한, 더 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다.
KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 기준 뉴클레오티드 서열과 적어도, 예컨대 95% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는, 폴리뉴클레오티드 서열이 KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 기준 뉴클레오티드 서열의 각 100 뉴클레오티드 당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것을 제외하고는, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일한 것을 의미한다. 즉, 기준 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서는, 기준 서열의 뉴클레오티드의 5% 까지 결실되거나 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있고, 또는 기준 서열의 전체 뉴클레오티드의 5% 까지 다수의 뉴클레오티드가 기준 서열내에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 돌연변이는 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 터미날 위치에서 일어날 수 있고, 또는 기준 서열내의 하나 이상의 인접 기들내에서 또는 기준 서열내의 뉴클레오티드 사이에서 개별적으로 점재된, 이들 터미날 위치 사이의 어느 곳에서 일어날 수 있다.
실제적인 문제로서, 어떤 특정 핵산 분자가, 예를 들면 제1도[서열식별번호:1]에서 보여지는 뉴클레오티드 서열 또는 기탁된 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지 여부는 통상적으로 베스트피트(Bestfit) 프로그램같은 공지된컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetic Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). 베스트피트는 두 서열 사이의 최상의 상동성 영역을 발견하기 위해 Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)의 로칼 상동성 알고리즘을 사용한다. 특정 서열이 예컨대 본 발명에 따르는 기준 서열과 95% 동일한지의 여부를 결정하기 위해서 베스트피트 또는 어떤 다른 서열 정렬 프로그램을 사용할 때, 파라미터는 물론 동일성 백분율이 기준 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐서 계산되고 기준 서열의 뉴클레오티드의 전체 수의 5% 까지의 상동성 갭(gap)이 허용되도록 설정된다.
글로벌 서열 정렬이라고도 하는 대상서열(subject sequence)과 의문서열(query sequence)(본 발명의 서열) 사이의 최상의 전체 매치를 결정하는 바람직한 방법은 Brutlag et al.(Comp. App. Biosci.(1990) 6:237-245) 의 알고리즘에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정할 수 있다. 서열 정렬에서 의문서열과 대상서열은 둘다 DNA 서열이다. RNA 서열은 U를 T로 전환함으로써 비교할 수 있다. 상기 글로벌 서열 정렬의 결과는 퍼센트 동일성이다. 퍼센트 동일성을 계산하기 위한 DNA 서열의 FASTDB 정렬에 사용되는 바람직한 파라미터는 다음과 같다: 매트릭스=유니타리, k-tuple=4, 미스매치 페날티=1, 조이닝(joining) 페날티=30, 랜덤화 그룹 길이=0, 컷-오프 스코어=1, 갭 페날티=5, 갭 크기 페날티=0.05, 윈도우 크기=500 또는 보다 더 짧은 대상 뉴클레오티드 서열의 길이.
대상 서열이 내부 결실때문이 아니고 5' 또는 3' 결실때문에 의문서열 보다더 짧으면, 수동적인 보정이 그 결과들에 행해져야 한다. 이것은 FASTDB 프로그램이 퍼센트 동일성을 계산할 때 대상 서열의 5' 및 3' 절단(truncation)을 설명하지 못하기 때문이다. 의문서열과 비교하여 5' 또는 3' 말단에서 절단된 대상 서열의 경우, 매치/정렬되지 않는 대상 서열의 5' 및 3'인 의문서열의 염기 수를 의문서열의 전체 염기의 퍼센트로서 계산함으로써 퍼센트 동일성이 보정된다. 뉴클레오티드가 매치/정렬되는지의 여부는 FASTDB 서열 정렬의 결과에 의하여 결정된다. 그 다음에는 특정 파라미터를 이용하는 상기 FASTDB 프로그램에 의하여 계산된, 퍼센트 동일성으로부터 상기 백분율을 빼서 최종 퍼센트 동일성 스코어에 도달한다. 이 보정된 스코어가 본 발명의 목적에 사용되는 것이다. 의문서열과 매치/정렬되지 않는, FASTDB 정렬에 의해 나타나는 바와 같이, 대상서열의 5' 및 3' 염기 바깥에 있는 염기들만이 퍼센트 동일성 스코어를 수동적으로 조정하는 목적을 위해 계산된다.
예를 들면, 퍼센트 동일성을 결정하기 위해서 90 염기 대상서열을 100 염기 의문서열에 정렬시킨다. 결실이 대상서열의 5' 말단에서 일어나고, 따라서 FASTDB 정렬은 5' 말단에서 처음 10 염기의 매치/정렬을 나타내지 않는다. 쌍을 이루지 않는 10개의 염기는 서열의 10%를 나타내며(매치되지 않는 5' 및 3' 말단의 염기 수/ 의문서열의 염기의 전체 수) 따라서 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 퍼센트 동일성 스코어로부터 10%를 뺀다. 남아있는 90 염기가 완전히 매치되면 최종 퍼센트 동일성은 90%일 것이다. 다른 실례에서는, 90 염기 대상서열을 100 염기 의문서열과 비교한다. 이번에는 결실이 내부 결실이며 따라서 의문서열과 매치/정렬되지 않는 대상서열의 5' 또는 3'의 염기는 없게 된다. 이 경우에는 FASTDB에 의해 계산되는 퍼센트 동일성은 수동적으로 보정되지 않는다. 다시한번, 의문서열과 매치/정렬되지 않는 대상서열의 5' 및 3' 염기만이 수동적으로 보정된다. 본 발명의 목적상 다른 수동적인 보정은 행해지지 않는다.
본원은 KGF-2 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는지의 여부에 관계없이, 제1도[서열식별번호:1]에서 보여지는 핵산서열 또는 기탁된 cDNA의 핵산서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산분자에 관한 것이다. 이것은 특정 핵산분자가 KGF-2 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하지 않을때 조차도 당업자는 여전히 예컨대 하이브리드화 프로브 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 프라이머로서 핵산분자를 사용하는 방식을 알 것이기 때문이다. KGF-2 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하지 않는 본 발명의 핵산분자의 사용은, 특히 (1) cDNA 라이브러리에서 KGF-2 유전자 또는 그것의 대립 변이체를 분리하는 것;(2) Verma et al., Human Chromosomes:A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988) 에 기술된 바와 같이, KGF-2 유전자의 정확한 염색체 위치를 제공하기 위해서 중기 염색체 스프레드와의 인 시투 하이브리드화(가령, "FISH"); 및 특정 조직에서 KGF-2 mRNA 발현을 검출하는 노던 블롯 분석을 포함한다.
그러나, 사실상 KGF-2 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 제1도[서열식별번호:1]에서 보여지는 핵산 서열 또는 기탁된 cDNA의 핵산서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 갖는핵산분자가 바람직하다. "KGF-2 활성을 갖는 폴리펩티드"는 특정 생물학적 분석으로 측정하였을 때, 본 발명의 야생형 KGF-2 단백질의 활성 또는 야생형 KGF-2 단백질(전체 길이 단백질, 또는 바람직하게는 성숙 단백질)의 그것보다 증가된 활성과 유사한 (반드시 동일하지는 않음) 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다.
KGF-2 활성의 분석은 예컨대 하기의 실시예 10 및 11에 개시되어 있다. 이들 분석은 부분적으로 정제된 또는 정제된 천연의 또는 재조합 단백질의 KGF-2 활성을 측정하는데 사용할 수 있다.
KGF-2는 표피 케라티노사이트의 증식을 자극하지만 섬유아세포 같은 간엽성 세포는 그렇지 않다. 따라서, "KGF-2 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드"는 실시예 10에 개시된 케라티노사이트 증식 분석에서 KGF-2 활성을 나타내는 폴리펩티드를 포함하며, 이것은 FGF 리셉터 아이소폼(isoform) 1-iiib 및 2-iiib에 결합할 것이다(실시예 11). 활성 정도가 KGF-2 단백질의 그것과 동일할 필요는 없지만, 바람직하게는 "KGF-2 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드"는 KGF-2 단백질과 비교했을 때 실질적으로 유사한 활성을 나타낼 것이다(즉, 후보 폴리펩티드는 기준 KGF-2 단백질에 대하여 더 큰 활성 또는 약 10배 이하, 바람직하게는 약 2배이하의 활성을 나타낼 것이다.
물론, 유전자 코드의 축퇴성 때문에 당업자는 기탁된 cDNA의 핵산 서열 또는 도 1에 도시한 핵산 서열[서열번호 1]과 80%이상, 85%이상, 90%이상, 91%이상, 92%이상, 93%이상, 94%이상, 95%이상, 97%이상, 98%이상 또는 99%이상 동일한 서열을 보유하는 다수의 핵산 분자들이 "KGF-2 단백질 활성을 보유하는" 펩티드를 암호화할 것이라는 것을 즉시 인식할 것이다. 사실, 이들 뉴클레오티드 서열의 축퇴성 변이체 모두는 동일한 폴리펩티드를 암호화하기 때문에, 이것은 전술한 비교 분석을 수행하지 않아도 당업자에게 분명할 것이다. 게다가, 축퇴성 변이체가 아닌 이러한 핵산 분자의 경우, 적당수가 KGF-2 단백질 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화할 것이라고 당업계에 인식될 것이다. 이것은 당업자가 단백질 기능에 상당한 영향을 미칠 것 같지 않거나 덜 미칠 것 같은 아미노산 치환(예를 들면, 하나의 지방족 아미노산을 제2 지방족 아미노산으로 치환)을 충분히 인식할 것이기 때문이다.
예를 들면, 표현형적으로 침묵성인 아미노산 치환을 만드는 방법에 관한 안내서는 Bowie, J. U. 등의 "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions,", Science 247:1306-1310 (1990)에서 제공되며, 여기에서는 저자가 변화시킬 아미노산의 용인을 연구하는 2가지 주요 접근법을 지적하고 있다. 제1 방법은 진화의 과정에 의지하는 것이며, 여기서 돌연변이는 자연 선택에의해 수용되거나 거부된다. 제2 접근법은 클로닝된 유전자의 특정 위치에서 아미노산 변화를 도입하기 위해 유전적 기법을 사용하고 기능성을 유지하는 서열들을 확인하기 위해 선별 또는 스크리닝한다. 저자가 언급한 바와 같이, 이들 연구는 놀랍게도 단백질이 아미노산 치환을 용인하다는 것을 밝혔다. 게다가, 저자는 어떤 아미노산 변화가 단백질의 특정 위치에서 수용가능할 수 있는지를 지적한다. 예를들면, 깊히 있는 대부분의 아미노산 잔기는 비극성 측쇄일 필요가 있으며, 통상 소수의 표면 측쇄 특징만이 보존된다. 표현형적으로 침묵성인 기타 이러한 치환은 Bowie, J.U등의 상기 문허에 기재되어 있으며, 본원에 인용되어 있다.
나아가 본 발명은 서열들간에 70%이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85%이상, 더더욱 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성이 있는 경우 본원에서 전술한 서열들과 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 엄격한 조건하에 본원에서 전술한 폴리뉴클레오티드와 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "엄격한 조건"은 하이브리드화가 서열들 사이에 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상 동일성이 있는 경우 발생할 것을 의미한다. 바람직한 구체예에서 본원에서 전술한 폴리뉴클레오티드와 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드는 도 1(서열번호 1)의 cDNA 또는 기탁된 cDNA(들)에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화한다.
예를들면, "엄격 하이브리드화 조건"은 50% 포름아미드, 5×SSC(150 mM NaCl, 15 mM 트리소디움 시트레이트), 50 mM 인산나트륨(pH7.6), 5×덴하르드츠 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20 ug/ml 변성된 전단 연어 정자 DNA를 포함하는 용액중 42℃에서 밤새 항온처리한 후 약 65℃에서 0.1 ×SSC 중 필터를 세척하는 것을 포함한다. 달리, 폴리뉴클레오티드는 본원에서 전술한 바와 같이 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 하이브리드하고 이와 동일성을 보유하고, 활성을 보유할 수도 그렇지 않을 수도 있는 20 염기 이상, 바람직하게는 30 염기 이상, 더욱 바람직하게는 50 염기 이상을 보유할 수 있다. 예를들면, 이러한 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드를 회수하기 위해 예컨대 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 프로브로서 또는 진단 프로브로서 또는 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다.
또한, 적당히 높은 엄격 하이브리드화 조건에서 KGF-2 폴리뉴클레오티드와하이브리드하는 핵산 분자들도 예상된다. 하이브리드화의 엄격성에서의 변화 및 신호 검출은 주로 포름아미드 농도(낮은 퍼센트의 포름아미드는 낮은 엄격성을 산출한다); 염 조건 또는 온도를 조작하여 수행된다. 예를들면, 적당히 높은 엄격 조건은 6×SSPE(20×SSPE= 3M NaCl; 0.2M NaH4PO4; 0.02M EDTA, pH7.4), 0.5% SDS, 30% 포름아미드, 100 ug/ml 연어 정자 차단 DNA를 포함하는 용액중 3℃에서 밤새 항온처리한 후 약 50℃에서 1 ×SSPE, 0.1%SDS로 세척하는 것을 포함한다. 부가하여, 더 낮은 엄격성을 얻기 위해 엄격 하이브리드화 이후 수행되는 세척을 더 높은 염 농도(예, 5×SSC)에서 수행할 수 있다.
상기 조건에서 변형은 하이브리드화 실험에서 배경을 억제하는데 사용되는 대안적 차단 시약의 포함 및/또는 치환을 통하여 수행될 수 있음을 주의해야 한다. 통상 차단 시약은 덴하르츠 시약, BLOTTO, 헤파린, 변성된 연어 정자 DNA 및 시판되는 제제를 포함한다. 특정 차단 시약의 포함은 혼화성의 문제로 인하여 상술되는 하이브리드화 조건의 변이를 요구할 수 있다.
물론, 더큰 부위의 참조 폴리뉴클레오티드(예, 기탁된 cDNA 클론), 예컨대 길이가 50-750nt인 부위, 또는 전체 길이의 기준 폴리뉴클레오티드와 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드도, 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열 또는 도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열[서열번호 1]의 전부는 아니라도 대부분에 해당하는 폴리뉴클레오티드인, 본 발명에 따른 프로브로서 유용하다. "20 nt 길이 이상"의 폴리뉴클레오티드의 일부는 예를 들면 기준 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 기탁된 cDNA 또는 도1에 도시된 뉴클레오티드 서열[서열번호 1])의 뉴클레오티드 서열로부터 나온 20 이상의 인접 뉴클레오티드를 의미한다. 제시된 바와 같이, 이러한 부위는 통상적인 DNA 하이브리드화 기법에 따른 프로브로서 또는 예컨대 문헌[Molecular cloning, A Laboratory Manual, 2판, Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.에 의해 편집(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 상기 문헌은 본원에 전체로 인용되어 있음]에 기재된 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 표적 서열의 증폭을 위한 프라이머로서 진단에 유용하다.
KGF-2 cDNA 클론은 기탁되었고 이의 결정된 뉴클레오티드 서열은 도 1[서열번호 1]에 제공되어 있기 때문에, KGF-2 cDNA 분자의 일부와 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드를 형성시키는 것은 당업자에게 일상적인 것이다. 예를들면, KGF-2 cDNA 클론의 제한 엔도뉴클레아제 절단 또는 초음파처리에 의한 전단을 용이하게 사용하여, KGF-2 cDNA 분자의 일부와 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드인 다양한 크기의 DNA 부위들을 형성할 수 있다. 달리, 본 발명의 하이브리드화 폴리뉴클레오티드는 알려진 기법에 따라 합성될 수 있다. 물론, 폴리 A 서열(예, 도 1에 도시된 KGF-2 cDNA[서열번호 1]의 3' 말단 폴리(A) 트랙) 또는 T(또는 U) 잔기의 상보적 스트레치에만 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 핵산의 일부에 하이브리드하는데 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함되지 않는다. 왜냐하면 상기 폴리뉴클레오티드는 폴리(A) 스트레치 또는 이것의 상보물(예, 실제로 임의의 이본쇄 cDNA 클론)을 함유하는 임의의 핵산 분자에 하이브리드할 것이기 때문이다.
나아가, 본 발명은 KGF-2 단백질의 에피토프-보유 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 특히, 도 1의 하기 아미노산 잔기들을 포함하는 폴리펩티드(서열번호 2)를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공하며, 여기서 본 발명자가 결정한 것은 KGF-2 단백질의 항원성 영역이다:
1. Gly41-Asn71: GQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYN[서열번호 25];
2. Lys91-Ser109: KIEKNGKVSGTKKENCPYS[서열번호 26];
3. Asn135-Tyr164: NKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTY[서열번호27]; 및
4. Asn181-Ala199: NGKGAPRRGQKTRRKNTSA[서열번호 28].
또한, 도 1[서열번호 2] 중 2개의 추가의 예상되는 더짧은 항원성 영역으로 Gln74-Arg78 및 Gln170-Gln175가 존재한다. KGF-2의 상기 에피토프-함유 부위를 형성시키는 방법은 다음에서 설명한다.
본원에 언급한 기탁은 특허 절차를 목적으로 하는 미생물 기탁의 국제적 인정에 대한 부타페스트 조약하에 유지될 것이다. 이들 기탁은 단순히 당업자의 편의를 위해 제공되는 것이고 기탁이 35 U.S.C §112하에 요구되는 승인으로서 제공되는 것은 아니다. 기탁된 물질에 함유된 폴리뉴클레오티드 서열 뿐만아니라, 이에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 아미노산 서열도 참조에 의해 본원에 통합되어 있으며, 본원의 서열에 대한 임의의 설명과의 임의의 충돌 사건을 제어한다. 기탁된 물질을 제조, 사용 또는 판매하는데에는 실시권이 필요하며 본원에 의해 이러한 실시권이 허여되는 것은 아니다.
KGF-2 폴리펩티드 및 단편
나아가, 본 발명은 도 1의 추론된 아미노산 서열[서열번호 2]을 보유하거나기탁된 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드 뿐만아니라, 이러한 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체에 관한 것이다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 상기 논의된 서열분석 실수의 가능성 뿐만 아니라 상이한 공지 단백질의 리더에 대한 절단 부위의 다양성으로 인해, 기탁된 cDNA에 의해 암호화되는 실질적인 KGF-2 폴리펩티드는 약 208 아미노산을 함유하나, 약 200-220 아미노산의 범위 어딘가에 있을 수 있으며, 이 단백질의 실질적인 리더 서열은 약 35 또는 36 아미노산이나, 약 30 내지 약 40 아미노산의 범위 어딘가에 있을 수 있다.
도 1[서열번호 2]의 폴리펩티드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 대해 언급될 때, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 상기 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 유사체는 프로단백질 부위의 절단에 의해 활성화되어 활성의 성숙 폴리펩티드를 생산할 수 있는 프로단백질을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드일 수 있으며, 바람직하게는 재조합 폴리펩티드이다.
도 1[서열번호 2]의 폴리펩티드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)로 치환되고 그러한 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의하여 암호화되거나 암호화되지 않는 것; 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것; 또는 (iii) 성숙한폴리펩티드가 또다른 화합물, 예를 들면 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합되는 것, 또는 (iv) 추가의 아미노산이 성숙한 폴리펩티드에 융합되는 것, 예를 들면 리더 또는 분비성 서열 또는 성숙한 폴리펩티드 또는 프로단백질 서열의 정제를 위해 사용되는 서열일 수 있다. 상기 단편, 유도체 및 유사체는 본원에 교시된 것으로부터 당업자의 범위내에서 결정될 수 있다.
"펩티드" 및 "올리고펩티드" 용어는 (통상 인식되는 바와 같이) 동의어로 간주되며, 각 용어는 펩티드 결합에 의해 쌍을 이루는 2개 이상의 아미노산의 사슬을 지시하기 위해 본원에서 필요로 하는 바와 같이 교환가능하게 사용할 수 있다. "폴리펩티드"는 본원에서 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 사슬의 경우 사용한다. 본원에서 모든 올리고펩티드 및 폴리펩티드 방식이든 서열은 좌측에서 우측으로 그리고 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 기록되어 있다.
당업계에서는 KGF-2 폴리펩티드의 몇몇 아미노산 서열이 단백질의 구조 또는 기능에 상당한 영향 없이 변형될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 서열상의 이러한 차이가 예상되는 경우, 활성을 결정하는 단백질 상의 중요 영역이 존재할 것이라는 것을 기억하여야 한다. 통상, 유사한 기능을 수행하는 잔기가 사용된다면 3차 구조를 형성하는 잔기를 교체할 수 있다. 다른 예에서, 만일 변형이 단백질의 중요하지 않은 영역에서 발생한다면 잔기의 유형은 완전히 중요하지 않을 수 있다.
따라서, 본 발명은 실질적인 KGF-2 폴리펩티드 활성을 나타내거나 하기 논의된 단백질 부위와 같은 KGF-2 단백질의 영역을 포함하는 KGF-2 폴리펩티드의 변이를 추가로 포함한다. 상기 변이체는 결실, 삽입, 역위, 반복 및 치환 유형(예, 친수성 잔기를 다른 것으로 치환하나, 대체로 강한 친수성 잔기를 강한 소수성 잔기로 치환하지는 않음)을 포함한다. 소규모 변화 또는 이러한 "중성" 아미노산 치환은 통상 활성에 영향을 거의 주지 않을 것이다.
보존적 치환인 것에서 통상 볼 수 있듯이, 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile 중 하나를 다른 하나로 바꾸는 것; 수산화 잔기 Ser 및 Thr의 교환, 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환, 아미드 잔기 Asn 및 Gln 사이의 치환, 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환 및 방향족 잔기 Phe 및 Tyr 중에서의 교체가 있다.
상기 상술한 것에서 제시한 바와 같이, 어떤 아미노산 변화가 표현형적으로 침묵성일 수 있는 것[즉, 기능상 상당한 악영향을 갖지 않을 것 같은 것]에 대한 추가의 안내는 문헌[Bowie, J. U. 등의 "Deciphering the Message in Protein Sequence: Tolerance to Amino Acid Substitutions,", Science 247:1306-1310 (1990)]에서 확인할 수 있다.
본 발명은 치료 펩티드로 사용할 수 있는 KGF-2의 모방형 펩티드를 포함한다. 모방형 KGF-2 펩티드는 KGF-2의 동족형 수용체에 결합하고 이를 활성화시킴으로써 KGF-2 단백질의 생물학적 활성을 모방하는 짧은 펩티드이다. 모방형 KGF-2 펩티드는 또한 KGF-2의 동족형 수용체에 결합하여 이를 억제할 수 있다. KGF-2 수용체는 비제한적으로 FGFR2iiib 및 FGFR1iiib를 포함한다. 이러한 모방형 펩티드는 비제한적으로 파아지 디스플레이 및 조합형 화학반응과 같은 방법으로부터 수득된다. 예를들면, Wrighton등의 문헌[Science 273:458-463(1996)]에 개시된 방법은 모방형 KGF-2 펩티드를 형성하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 분리된 형태로 제공되며, 더욱 바람직하게는 균질하게 정제된다.
본 발명의 폴리펩티드는 분리된 형태가 바람직하다. "분리된 폴리펩티드"란 그것의 천연 환경으로부터 제거한 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 재조합 숙주 세포에서 생산되고/되거나 재조합 숙주 세포 내에 함유된 폴리펩티드는 본 발명의 목적 상 분리된 것으로 간주된다. 또한, 재조합 숙주 세포 또는 천연 공급원으로부터 부분적으로 또는 거의 정제된 폴리펩티드를 의미한다.
본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 2의 폴리펩티드(특히 성숙한 폴리펩티드) 뿐만아니라, 서열번호 2의 폴리펩티드와 80%이상, 85%이상, 90%이상, 91%이상, 92%이상, 93%이상, 94%이상, 95%이상, 97%이상, 98%이상 또는 99%이상의 유사성(더욱 바람직하게는 80%이상, 85%이상, 90%이상, 91%이상, 92%이상, 93%이상, 94%이상, 95%이상, 97%이상, 98%이상 또는 99%이상의 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 또한, 이러한 폴리펩티드 부위를 통상 30개 이상 아미노산 더욱 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 일부(예, 하기 기술한 결실 변이체)와 함께 포함한다.
당업계에 알려진 바와 같이, 두 폴리펩티드 사이의 "유사성"은 제1 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 그 보존적 아미노산 치환체와 제2 폴리펩티드의 서열을 비교함으로써 결정된다.
두 폴리펩티드의 "% 유사성"은 유사성을 결정하기 위해 베스티프 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스용 버젼 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹, 유니버시티 리서치 파크, 575 사이언스 드라이브, 메디슨 WI53711) 및 기정값 세팅을 사용하여 두 폴리펩티드의 아미노산 서열을 비교함으로써 제공되는 유사성 점수를 의미한다. 베스티프는 두 서열사이 최상의 유사성 분절을 찾기 위해 스미스 및 워터맨(Advances in Applied mathematics 2:482-489, 1981)의 국부적인 상동성 알고리듬을 사용한다.
KGF-2 폴리펩티드의 기준 아미노산 서열과 예를들면 95% 이상 "동일한" 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드란, 폴리펩티드 서열이 KGF-2 폴리펩티드의 기준 아미노산 서열 중 각 100 아미노산 마다 5개 이하의 아미노산 변형을 포함할 수 있다는 것을 제외하고는 폴리펩티드의 아미노산 서열이 기준 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 한편, 기준 아미노산 서열과 95%이상 동일한 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드를 수득하기 위해, 기준 서열 내 5%까지의 아미노산 잔기를 결실하거나 다른 아미노산으로 치환할 수 있거나, 기준 서열 내 총 아미노산 잔기 중 5%까지의 다수의 아미노산이 기준 서열에 첨가될 수 있다. 기준 서열의 이들 변형은 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서 또는 이들 말단 위치 사이 중 임의의 부위에서 발생할 수 있으며, 기준 서열 내 잔기들 중 개별적으로 또는 기준 서열 내 하나 이상의 인접 기들 내에 점재되어 있다.
실무적으로, 임의의 특정 폴리펩티드가 예를들면, 도 1에 도시된 아미노산 서열[서열번호 2] 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열과 80%이상, 85%이상, 90%이상, 91%이상, 92%이상, 93%이상, 94%이상, 95%이상, 97%이상, 98%이상 또는 99%이상 동일한지 여부는 베스티프 프로그램(위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스용 버젼 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹, 유니버시티 리서치 파크, 575 사이언스 드라이브, 메디슨 WI53711)과 같은 공지의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 베스티프 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하여 특정 서열이 예컨대 본 발명에 따른 기준 서열과 95% 동일한지 여부를 결정하고자 할 때, 물론 기준 아미노산 서열의 전길이에 대해 동일성(%)을 계산하고 기준 서열 중 아미노산 잔기의 총수의 5% 이하의 상동성 차이가 허용되도록 파라미터를 설정한다.
의문 서열(본 발명의 서열)과 전역 서열 정렬로 불리우는 대상 서열 간의 최상의 전체 정합을 결정하는 바람직한 방법은, Brutlag 등[Comp. App. Biosci. 6:237-245(1990)]의 알고리즘을 기초로 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 서열 정렬에서, 의문 및 대상 서열은 모두 뉴클레오티드 서열이거나 또는 모두 아미노산 서열이다. 상기 전역 서열 정렬 결과는 동일성(%)이다. FASTDB 아미노산 정렬에 사용된 바람직한 파라미터로는 행렬=PAM 0, k-튜플(tuple)=2, 부정합 벌점=1, 결합 벌점=20, 무작위화 그룹 길이=0, 컷오프 스코어=1, 윈도우 크기= 서열 길이, 갭 벌점=5, 갭 크기 벌점=0.05, 윈도우 크기=500 또는 대상 아미노산 서열 길이(어떤 것이나 더 짧은 것) 등이 있다.
내부 결실 때문이 아니라, N-말단 또는 C-말단 결실로 인하여 대상 서열이 의문 서열보다 짧은 경우, 결과에 대한 수동 보정을 실시해야 한다. 이는 FASTDB 프로그램이 전역 동일성(%)을 계산할 때 대상 서열의 N- 및 C-말단 절두를 설명할수 없기 때문이다. N- 및 C-말단에서 절두된 대상 서열의 경우, 의문 서열과 비교하여, 동일성(%)은 상응하는 대상 잔기와 정합/정렬되지 않은 대상 서열의 N- 및 C-말단인 의문 서열의 잔기의 수를 의문 서열 중 총 잔기의 백분율로서 계산하여 보정한다. 잔기가 정합/정렬되는지 여부는 FASTDB 서열 정렬 결과로서 결정한다. 그 다음 이 비율을 특정 파라미터를 사용하여 상기 FASTDB로 계산한 동일성(%)으로부터 제하여 최종 동일성(%) 스코어에 도달한다. 최종 동일성(%) 스코어가 본 발명에 사용된다. 동일성(%) 스코어를 수동 조정하기 위해서 의문 서열과 정합/정렬되지 않은 대상 서열의 N- 및 C-말단에 대한 잔기만이 고려된다. 즉, 대상 서열의 가장 원거리에 있는 N- 및 C-말단 잔기 외부의 의문 잔기 위치만을 고려한다.
예를 들어, 동일성(%)을 결정하기 위해서 90개의 아미노산 잔기 대상 서열은 100 개 잔기의 의문 서열과 정렬된다. 결실은 대상 서열의 N-말단에서 발생하므로, FASTDB 정렬은 N-말단에서의 처음 10개 잔기의 정합/정렬을 나타내지 않는다. 10개의 쌍을 이루지 않은 잔기는 서열의 10%를 나타내므로(정합되지 않은 N-말단 및 C-말단에서의 잔기 수/의문 서열의 총 수) 10%는 FASTDB 프로그램으로 계산된 동일성(%) 스코어에서 제한다. 남아있는 90개의 잔기가 완전히 정합되면, 최종 동일성(%)은 90%이다. 또 다른 예로서 90개 잔기의 대상 서열을 100개 잔기의 의문 서열과 비교한다. 이 때 결실이 내부에 있고, 따라서 의문 서열과 정합/정렬되지 않은 대상 서열의 N- 또는 C-말단에서의 잔기는 없다. 이 경우, FASTDB에 의해 계산된 동일성(%)은 수동 보정하지 않는다. 다시 한번, 의문 서열과 정합/정렬되지 않은, FASTDB 정렬에 표시된 대상 서열의 N- 및 C- 말단 외부의 잔기 위치만이 수동 보정된다. 본 발명의 목적에 있어서, 다른 수동 보정은 없다.
하기 자세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 다클론성 항체 및 단클론성 항체를 생산할 수 있으며, 이러한 항체는 하기 기술한 바와 같이, KGF-2 단백질 발현을 검출하는 진단 분석에 유용하거나 KGF-2 단백질 기능을 강화 또는 억제할 수 있는 작용제 및 길항제로서 유용하다. 나아가, 이러한 폴리펩티드는 효소 이중-하이브리드 시스템에 사용되어 본 발명에 따른 후보 작용제 및 길항제인 KGF-2 단백질 결합 단백질을 "포획"할 수 있다. 효모 이중 하이브리드 시스템은 문헌[Fieds and Song, Nautre 340:245-246(1989)]에 기재되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프 보유 부위를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 이 폴리펩티드 부위의 에피토프는 본 발명의 폴리펩티드의 면역원성 또는 항원성 에피토프이다. "면역원성 에피토프"는 전체 단백질이 면역원인 경우 항체 반응을 이끌어내는 단백질의 일부로서 정의된다. 이들 면역원성 에피토프는 분자 상에 몇몇 좌위에 한정된다고 여겨진다. 한편, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역은 "항원성 에피토프"로서 정의된다. 단백질의 면역원성 에피토프의 수는 일반적으로 항원성 에피토프의 수보다 작다. 예컨대, Geysen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002(1983) 참고.
항원성 에피토프를 보유하는(즉 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역을 함유하는) 펩티드 또는 폴리펩티드의 선택에 관하여, 단백질 서열의 일부를 모방하는 비교적 짧은 합성 펩티드는 대개 부분적으로 모방된 단백질과 반응하는 항혈청을 유도할 수 있다는 것이 당업계에 알려져 있다. 예컨대 Sutcliffe, J.G. 등,Shinnick, T.M., Green, N. and Learner, R.A. "Antibodies that react with predetermined sites on proteins", Science 219:660-666(1983) 참조. 단백질 반응성 혈청을 유도할 수 있는 펩티드는 단백질의 1차 서열에 주로 제공되며, 간단한 화학적 규칙들로 특성 규명할 수 있고, 완전한 단백질의 면역우성 영역(즉, 면역원성 에피토프)에도, 아미노 또는 카르복시 말단에도 한정되지 않는다. 극도로 소수성인 펩티드 및 6개 또는 더 적은 잔기의 펩티드는 모방형 단백질에 결합하는 항체들을 유도하는데 비효과적이며, 더 길고 수용성인 펩티드 특히 프롤린 잔기를 함유하는 펩티드는 통상 효과적이다[상기 문헌 Sutcliffe 등, 661에서]. 예컨대, 이들 안내서에 따라 고안되고 인플루엔자 바이러스 헤마글fn티닌 HA1 폴리펩티드 사슬의 서열 중 75%를 차지하는 8-39 잔기를 함유하는 20개 펩티드 중 18개는 HA1 단백질 또는 완전한 바이러스와 반응하는 항체를 포함하였으며; MuLV 폴리머라제로부터 나온 12/12 펩티드 및 토끼 당단백질로부터 나온 18/18 펩티드는 각 단백질을 침전시키는 항체를 유도하였다.
항원성 에피토프-보유 펩티드 및 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는, 단클론성 항체를 포함한 항체들을 생성시키는데 유용하다. 따라서, 항원 에피토프-보유 펩티드로 면역화시킨 제공자로부터 나온 비장 세포를 융합시켜 수득한 높은 비율의 하이브리도마는 통상 천연 단백질과 반응성이 있는 항체를 분비한다. 상기 문헌 Sutcliffe 등의 663에서. 항원성 에피토프-보유 펩티드 또는 폴리펩티드에 의해 생성된 항체는 모방형 단백질을 검출하는데 유용하고, 상이한 펩티드에 대한 항체들은 번역후 프로세싱을 겪는 단백질 선구체의 다양한 영역의 운명을 추적하는데 사용할 수 있다. 펩티드 및 항-펩티드 항체는 모방형 단백질에 대한 다양한 질적 또는 양적 분석(예, 경쟁 분석)에 사용될 수 있으며, 이는 이것이 짧은 펩티드(예, 약 9개 아미노산)조차도 면역침전 분석에서 더 큰 펩티드를 결합하여 대신할 수 있다는 것을 보여주기 때문이다. [참조 예를들면, Wilson 등의 Cell 37:767-778(1984), 777에서]. 또한, 본 발명의 항-펩티드 항체는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하면서 예컨대 흡착 크로마토그래피에 의해 모방형 단백질의 정제에 유용하다.
상기 안내서에 따라 고안된 본 발명의 항원성 항체-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열 내 함유된, 바람직하게 7개이상, 더욱 바람직하게 9개 이상 그리고 가장 바람직하게는 약 15개 내지 약 30개 아미노산을 포함한다. 그러나,약 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 150개 아미노산, 또는 본 발명의 폴리펩티드의 전체 아미노산 서열까지 임의의 길이를 포함하거나 본 발명의 폴리펩티드의 전체 아미노산 서열를 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드의 더 큰 부위의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드는 또한 본 발명의 에피토프-보유 펩티드 또는 폴리펩티드로 간주되며 또한 모방형 단백질과 반응하는 항체를 유도하는데 유용하다. 에피토프-보유 펩티드의 아미노산 서열은 수성 용매에 상당한 용해도를 제공하도록 선택하는 것이 바람직하고(예, 이 서열은 상대적으로 친수성 잔기를 포함하고 높은 소수성 서열은 피하는 것이 바람직하다); 프롤린 잔기를 함유하는 서열이 특히 바람직하다.
KGF-2-특이 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 항원성 폴리펩티드 또는 펩티드의 비제한적인 예는 다음을 포함한다.
1. Gly41-Asn71: GQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYN[서열번호 25];
2. Lys91-Ser109: KIEKNGKVSGTKKENCPYS[서열번호 26];
3. Asn135-Tyr164: NKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTY[서열번호27];및
4. Asn181-Ala199: NGKGAPRRGQKTRRKNTSA[서열번호 28].
또한, 도 1[서열번호 2] 중 2개의 추가의 예상되는 더짧은 항원성 영역으로 Gln74-Arg78 및 Gln170-Gln175가 존재한다.
본 발명의 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 핵산 분자들을 사용한 재조합 방법을 포함하는, 통상적인 펩티드 또는 폴리펩티드 제조 수단에 의해 생산될 수도 있다. 예를들면, 짧은 에피토프-보유 아미노산 서열은, 재조합 생산 및 정제 동안 뿐만아니라 항-펩티드 항체를 생산하기 위한 면역화 동안에 담체로서 작용하는 더 큰 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 또한, 에피토프-보유 펩티드는 화학 합성의 공지된 방법을 이용하여 합성될 수도 있다. 예를 들어, 휴튼(Houghten)은 HA1 폴리펩티드의 분절의 1 아미노산 변이를 나타내는 248개의 각각 구별되는 13잔기 펩티드 10-20 mgs 과 같은 많은 수의 펩티드 합성을 위한 간단한 방법을 개시하였으며, 이들 모두 4주 이내에 제조되고 (ELISA-유형 결합 연구에 의해)특성규명되었다. (Houghten, R.A. (1985)). 다수 펩티드의 신속한 고체상 합성에 대한 일반적인 방법: 개별적인 아미노산의 수준에서 항원-항체 상호작용의 특이성). (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135). 이 "동시 복수 펩티드 합성(SMPS)" 방법은 휴튼 등에게 허여된 미국 특허 제4,631,211호(1986)에서 더 기재되어 있다. 이 방법에서 다양한 펩티드의 고체상 합성을 위한 각각의 수지가 분리된 용매-투과성 패킷에 함유되어 고체상 방법에 관계된 많은 동일한 반복 단계를 적절히 이용할 수 있게 한다. 완전한 수동 방법은 500-1000 이상의 합성이 동시에 행해지도록 한다(상기문헌 Houghten et al., 5134쪽)
본 발명은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 에피토프, 또는 ATCC 기탁번호 No.75977호에 함유된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호되거나, 전술한 엄격한 하이브리드화 조건 또는 보다 낮은 엄격도의 하이브리드화 조건하에서 ATCC 기탁번호 제75977호에 함유된 서열 또는 서열 번호 1의 서열의 상보체에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 폴리펩티드 서열의 에피토프를 포함하거나 또는 이들로 구성되는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 서열의 에피토프를 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열 번호 1에 개시된 서열), 본 발명의 에피토프를 암호하는 폴리뉴클레오티드 서열의 상보성 쇄의 폴리뉴클레오티드 서열, 및 전술한 엄격한 하이브리드화 조건 또는 보다 낮은 엄격도의 하이브리드화 조건하에서 상보성 쇄에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
본원에서 사용된 "에피토프"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간에서 항원성 또는 면역원성 활성을 갖는 폴리펩티드 부위를 말한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 에피토프를 포함하는 폴리펩티드와 이 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용된 "면역원성 에피토프"는 예를 들어 이하에 개시된 항체 생성 방법과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법에의해 결정될 때 동물에서 항체 반응을 유도하는 단백질의 부위로 정의된다(Geysen et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002(1983) 참고). 본원에서 사용된 "항원성 에피토프"는 본원에서 개시된 면역분석과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 때 항체가 그 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질의 부위를 말한다. 면역특이적 결합은 비특이적 결합을 배제하지만, 다른 항원과의 교차-반응성을 반드시 배제하지는 않는다. 항원성 에피토프는 반드시 면역원성일 필요는 없다.
에피토프로 작용하는 단편은 임의의 통상적인 방법에 의해 생성될 수도 있다.(Houghten, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5131-5135(1985) 참고, 추가로 미국 특허 제4,631,211호에 개시됨)
본 발명에서, 항원성 에피토프는 바람직하게는 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7 아미노산의 서열, 더욱 바람직하게는 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50 아미노산의 서열, 그리고 가장 바람직하게는 약 15와 약 30 사이의 아미노산의 서열을 함유하는 것이 바람직하다. 면역원성 또는 항원성 에피토프를 포함하는 바람직한 폴리펩티드는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 아미노산 잔기 길이이다. 부가적으로 바람직한 항원성 에피토프는 서열 번호 2의 하기 잔기들을 포함하거나 이들로 구성된다: M-1 내지 H-15; W-2 내지 L-16; K-3 내지 P-17; W-4 내지 G-18; I-5 내지 C-19; L-6 내지 C-20; T-7 내지 C-21; H-8 내지 C-22; C-9 내지C-23; A-10 내지 F-24; S-11 내지 L-25; A-12 내지 L-26; F-13 내지 L-27; P-14 내지 F-28; H-15 내지 L-29; L-16 내지 V-30; P-17 내지 S-31; G-18 내지 S-32; C-19 내지 V-33; C-20 내지 P-34; C-21 내지 V-35; C-22 내지 T-36; C-23 내지 C-37; F-24 내지 Q-38; L-25 내지 A-39; L-26 내지 L-40; L-27 내지 G-41; F-28 내지 Q-42; L-29 내지 D-43; V-30 내지 M-44; S-31 내지 V-45; S-32 내지 S-46; V-33 내지 P-47; P-34 내지 E-48; V-35 내지 A-49; T-36 내지 T-50; C-37 내지 N-51; Q-38 내지 S-52; A-39 내지 S-53; L-40 내지 S-54; G-41 내지 S-55; Q-42 내지 S-56; D-43 내지 F-57; M-44 내지 S-58; V-45 내지 S-59; S-46 내지 P-60; P-47 내지 S-61; E-48 내지 S-62; A-49 내지 A-63; T-50 내지 G-64; N-51 내지 R-65; S-52 내지 H-66; S-53 내지 V-67; S-54 내지 R-68; S-55 내지 S-69; S-56 내지 Y-70; F-57 내지 N-71; S-58 내지 H-72; S-59 내지 L-73; P-60 내지 Q-74; S-61 내지 G-75; S-62 내지 D-76; A-63 내지 V-77; G-64 내지 R-78; R-65 내지 W-79; H-66 내지 R-80; V-67 내지 K-81; R-68 내지 L-82; S-69 내지 F-83; Y-70 내지 S-84; N-71 내지 F-85; H-72 내지 T-86; L-73 내지K-87; Q-74 내지 Y-88; G-75 내지 F-89; D-76 내지 L-90; V-77 내지 K-91; R-78 내지 I-92; W-79 내지 E-93; R-80 내지 K-94; K-81 내지 N-95; L-82 내지 G-96; F-83 내지 K-97; S-84 내지 V-98; F-85 내지 S-99; T-86 내지 G-100; K-87 내지 T-101; Y-88 내지 K-102; F-89 내지 K-103; L-90 내지 E-104; K-91 내지 N-105; I-92 내지 C-106; E-93 내지 P-107; K-94 내지 Y-108; N-95 내지 S-109; G-96 내지 I-110; K-97 내지 L-111; V-98 내지 E-112; S-99 내지 I-113; G-100 내지 T-114; T-10l 내지 S-115; K-102 내지 V-116; K-l03 내지 E-117; E-104내지 I-118; N-105 내지 G-119; C-106 내지 V-120; P-107 내지 V-121; Y-108 내지 A-122; S-109 내지 V-123; I-110 내지 K-124; L-111 내지 A-125; E-112 내지 I-126; I-113 내지 N-127; T-114 내지 S-128; S-115 내지 N-129; V-116 내지 Y-130; E-117 내지 Y-131; I-118 내지 L-132; G-119 내지 A-133; V-120 내지 M-134; V-121 내지 N-135; A-122 내지 K-136; V-123 내지 K-137; K-124 내지 G-138; A-125 내지 K-139; I-126 내지 L-140; N-127 내지 Y-141; S-128 내지 G-142; N-129 내지 S-143; Y-130 내지 K-144; Y-131 내지 E-145; L-132 내지 F-146; A-133 내지 N-147; M-134 내지 N-148; N-135 내지 D-149; K-136 내지 C-150; K-137 내지 K-151; G-138 내지 L-152; K-139 내지 K-153; L-140 내지 E-154; Y-141 내지 R-155; G-142 내지 I-156; S-143 내지 E-157; K-144 내지 E-158; E-145 내지 N-159; F-146 내지 G-160; N-147 내지 Y-161; N-148 내지 N-162; D-149 내지 T-163; C-150 내지 Y-164; K-151 내지 A-165; L-152 내지 S-166; K-153 내지 F-167; E-154 내지 N-168; R-155 내지 W-169; I-156 내지 Q-170; E-157 내지 H-171; E-158 내지 N-172; N-159 내지 G-173; G-160 내지 R-174; Y-161 내지 Q-175; N-162 내지 M-176; T-163 내지 Y-177; Y-164 내지 V-178; A-165 내지 A-179; S-166 내지 L-180; F-167 내지 N-181; N-168 내지 G-182; W-169 내지 K-183; Q-170 내지 G-184; H-171 내지 A-185; N-172 내지 P-186; G-173 내지 R-187; R-174 내지 R-188; Q-175 내지 G-189; M-176 내지 Q-190; Y-177 내지 K-191; V-178 내지 T-192; A-179 내지 R-193; L-180 내지 R-194; N-181 내지 K-195; G-182 내지 N-196; K-183 내지 T-197; G-184 내지 S-198; A-185 내지 A-199; P-186 내지 H-200; R-187 내지 F-201; R-188 내지 L-202; G-189내지 P-203; Q-190 내지 M-204; K-191 내지 V-205; T-192 내지 V-206; R-193 내지 H-207; 및/또는 R-194 내지 S-208. 이들 폴리펩티드 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 포함된다.
부가의 비배타적인 바람직한 항원성 에피토프는 본원에 개시된 항원성 에피토프뿐만 아니라 그 부분들도 포함한다. 항원성 에피토프는 예를 들어 그 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 포함한 항체를 생성시키는데 유용하다. 바람직한 항원성 에피토프는 본원에 개시된 항원성 에피토프 뿐만아니라 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상의 이들 항원성 에피토프의 임의의 조합을 포함한다. 항원성 에피토프는 면역분석에서 표적 분자로 이용될 수 있다(예를 들어, Wilson et al., Cell 37:767-778(1984);예를들어 Sutcliffe et al., Science 219:660-666(1983) 참고).
유사하게, 면역원성 에피토프는 예를 들어, 당업계에 공지된 방법에 따라 항체를 유도하기 위해 이용될 수 있다.(Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra; Chow et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:910-914; 및 Bittle et al., J.Gen.Virol.66:2347-2354(1985) 참고). 바람직한 면역원성 에피토프는 본원에 개시된 면역원성 에피토프를 포함하며, 이들 면역원성 에피토프의 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상의 임의의 조합을 포함한다. 하나 이상의 면역원성 에피토프를 포함하는 폴리펩티드는 알부민과 같은 담체 단백질과 함께 항체 반응을 유발하기 위해 동물 시스템(토끼 또는 마우스)에 제공되거나 또는 만일 그 폴리펩티드가 충분한 길이(적어도 약 25 아미노산)이면 그 폴리펩티드는 담체없이 제공될 수도 있다. 하지만, 8 내지 10개의 적은 아미노산을 포함하는 면역원성 에피토프는 변성된 폴리펩티드(예, 웨스턴 블롯)의 최소한의 선형 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생성시키기에 충분한 것으로 나타났다.
본 발명의 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 당업계의 공지된 방법에 따라 항체를 유도하는 데 이용될 수도 있다. 예를들어 Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra; Chow et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:910-914; 및 Bittle et al., J.Gen.Virol.66:2347-2354(1985) 참고. 통상 동물은 자유 펩티드로 면역화될 수 있다. 하지만, 항-펩티드 항체 역가는 펩티드를 거대분자 담체(예, 키홀 림펫 헤마시아닌(keyhole limpet hemacyanin)(KLH) 또는 테타누스 독소)에 결합시켜 증가될 수도 있다. 예를 들어, 시스테인을 함유하는 펩티드는 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS)와 같은 링커를 이용하여 담체에 결합될 수도 있으며, 다른 펩티드는 글루타르알데히드와 같은 보다 일반적인 연결제를 이용하여 담체에 결합될 수도 있다. 토끼, 쥐 및 마우스와 같은 동물은 약 100㎍의 펩티드 또는 담체 단백질 및 프로인트 보조제를 함유하는 에멀젼을 복강 주사 및/또는 내피 주사하여 자유 또는 담체-결합된 펩티드로 면역된다. 몇몇 증강 주사는 예를 들어 고체 표면에 흡착되는 자유 펩티드를 이용하는 ELISA 분석에 의해 검출될 수 있는 항-펩티드 항체의 유용한 역가를 제공하기 위해 약 2주 간격으로 필요할 수도 있다. 면역화된 동물의 혈청내의 항-펩티드 항체의 역가는 예를 들어 당업계에 공지된 방법에 따라 고체 지지체상 펩티드에 흡착시키고 선별 항체를 용출시킴으로써 항-펩티드 항체의 선별에 의해 증가될 수도 있다.
본 발명의 면역원성 에피토프-보유 펩티드, 즉 전체 단백질이 면역원일 때 항체 반응을 유도하는 단백질의 그러한 부분이 당업계에 알려진 방법에 따라 동정된다. 예를들면, Geyset등의 상기 문헌은 효소-연결된 면역흡착 분석에서 반응하기에 충분한 정제도를 갖는 수백개의 펩티드의 고체 지지체 상에서의 신속하고 동시 발생적인 합성에 대한 절차를 개시한다. 이어서, 합성된 펩티드의 항체와의 상호작용은 지지체로부터 이들을 제거함이 없이 용이하게 검출된다. 이 방식에서 원하는 단백질의 면역원성 에피토프를 보유하는 펩티드는 당업자에게 일상적인 방법에 의해 동정될 수 있다. 예를들면, 구제역 바이러스의 외피 단백질에 있는 면역학적으로 중요한 에피토프는 단백질의 전체 213 아미노산 서열을 포함하는 208개의 가능한 헥사펩티드 모두의 중첩 세트를 합성함으로써 Geysen등에 의해 7개 아미노산 분해능으로 그 위치를 밝혔다. 이어서, 20개 아미노산 모두가 에피토프 내 모든 위치에서 차례로 치환된 완전한 치환 세트를 합성하고, 항체와의 반응에 특이성을 부여하는 특정 아미노산을 결정하였다. 따라서, 본 발명의 에피토프-보유 펩티드의 펩티드 유사체는 이 방법에 의해 일상적으로 제조될 수 있다. Geysen의 미국 특허 제4,708,781호(1987)은 원하는 단백질의 면역원성 에피토프를 보유하는 펩티드를 동정하는 방법을 추가로 기재하고 있다.
나아가, Geysen의 미국특허 제5,194,392호(1990)는, 관심있는 항체의 특정 파라토프(항원 결합 부위)에 상보적인 에피토프(즉, "미모토프")와 위상기하학적으로 등가인 단량체(아미노산 또는 기타 화합물)를 검출하거나 그 서열을 결정하는 일반적인 방법을 기술하고 있다. 더욱 일반적으로, Geysen의 미국특허 제4,433,092호(1989)는 관심있는 특정 수용체의 리간드 결합 부위와 상보적인 리간드와 위상기하학적으로 등가인 단량체를 검출하거나 그 서열을 결정하는 방법을 기술하고 있다. 유사하게, Houghen, R. A.등의 미국특허 제5,480,971호(1996)("Peralkylated Oligopeptide Mixture"에 관한 것임)는 선형 C1-C7-알킬 퍼알킬화된 올리고펩티드 및 이러한 펩티드들의 세트 및 라이브러리를 개시하고 있으며, 관심있는 수령체 분자에 선호적으로 결합하는 퍼알킬화된 올리고펩티드의 서열을 결정하는데 이러한 올리고 펩티드 세트 및 라이브러리를 사용하는 방법을 기술하고 있다. 따라서, 본 발명의 에피토프-보유 펩티드의 비-펩티드 유사체도 이들 방법에 의해 일상적으로 제조될 수 있다.
당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 KGF-2 폴리펩티드 및 이의 에피토프-보유 단편을 면역글로불린(IgG)의 불변 도메인의 일부와 결합하여, 키메라 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 이들 융합 단백질은 정제를 용이하게 하고, 증가된 생체내 반감기를 나타낸다. 예를 들어, 인간 CD4-폴리펩티드의 처음 2개의 도메인과 포유류 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변부의 각종 도메인으로 구성된 키메라 단백질의 경우, 이것이 확인되었다(EPA 394,827; Traunecker 등, Nature 331: 84-86(1988)). IgG 부분에 의한 이황화 결합된 이량체 구조를 보유한 융합 단백질은 단량체 KGF-2 단백질 또는 단백질 단편 자체 보다 다른 분자와 결합하여 중화시키는데 더욱 효과적이다(Fountoulakis등의 J Biochem 270:3958-3964(1995)).
본 발명에 따라, 신규한 KGF-2의 변이체도 기술되어 있다. 이들은 KGF-2의하나이상의 아미노산을 결실 또는 치환시킴으로써 생산될 수 있다. 자연 돌연변이는 대립유전자 변이로 지칭된다. 대립유전자 변이는 침묵적일 수 있거나(암호화된 폴리펩티드에 변화가 없음) 변경된 아미노산 서열을 보유할 수 있다.
천연 KGF-2의 특성을 개선 또는 변경시키기 위해, 단백질 조작이 사용될 수 있다. 당업자에게 알려진 재조합 DNA 기법을 사용하여 새로운 폴리펩티들르 생성시킬 수 있다. 뮤테인 및 결실은 예컨데 강화된 활성 또는 증가된 안정성을 나타낼 수 있다. 게다가, 이들은 고수율로 정제될 수 있으며, 적어도 특정 정제 및 저장 조건 하에 용해성이 더 우수할 수 있다. 제작될 수 있는 돌연변이의 예는 하기에 설명되어 있다.
본 발명의 KGF-2 폴리펩티드는 단량체 또는 다량체(예, 이량체, 삼량체, 사량체 또는 더 큰 다량체)일 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 KGF-2 폴리펩티드의 단량체 및 다량체, 이들의 제형 및 이들을 함유하는 조성물(바람직하게는 치료 조성물)에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 단량체, 이량체, 삼량체 또는 사량체이다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 다량체는 적어도 이량체, 적어도 삼량체 또는 적어도 사량체이다.
본 발명에 의해 포함되는 다량체는 동종다량체 또는 이종다량체일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 동종다량체(homomer)는 서열번호 2의 아미노산 서열에 해당하거나 기탁된 클론에 함유된 cDNA에 의해 암호회된 폴리펩티드(본원에 기술한 것들에 해당하는 단편, 변이체, 스플라이스 변이체 및 융합 단백질을 포함) 만을 포함하는 다량체를 의미한다. 이들 동종다량체는 동일한 또는 상이한 아미노산 서열을 갖는 KGF-2 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 특정 구체예로서, 본 발명의 동종다량체는 동일한 아미노산 서열을 갖는 KGF-2 폴리펩티드만을 포함하는 다량체이다. 또다른 구체예로서, 본 발명의 동종다량체는 상이한 아미노산 서열을 갖는 KGF-2 폴리펩티드를 포함하는 다량체이다. 구체예로서, 본 발명의 다량체는 동종이량체(예, 동일한 또는 상이한 아미노산 서열을 갖는 KGF-2 폴리펩티드를 포함) 또는 동종삼량체(예, 동일한 및/또는 상이한 아미노산 서열을 갖는 KGF-2 폴리펩티드를 포함)이다. 또다른 구체예로서, 본 발명의 동종다량체는 적어도 동종이량체, 적어도 동종삼량체 또는 적어도 동종사량체이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 이종다량체는 본 발명의 KGF-2 폴리펩티드에 부가하여 하나 이상의 이종 폴리펩티드(즉, 상이한 단백질의 폴리펩티드)를 포함하는 다량체를 의미한다. 구체예로서, 본 발명의 다량체는 이종이량체, 이종삼량체, 또는 이종사량체이다. 추가적 구체예로서, 본 발명의 이종다량체는 적어도 이종이량체, 적어도 이종삼량체, 또는 적어도 이종사량체이다.
본 발명의 다량체는 소수성, 친수성, 이온 및/또는 공유 결합의 결과일 수 있고/있거나, 예를 들면 리포좀 형성에 의하여 간접적으로 연결될 수 있다. 따라서, 한 구체예로서, 본 발명의 다량체, 예를 들면 동종이량체 또는 동종삼량체는 본 발명의 폴리펩티드가 용액내에서 서로 접촉하는 경우에 형성된다. 또다른 구체예로서, 본 발명의 이종다량체, 예를 들면 이종삼량체 또는 이종사량체는 본 발명의 폴리펩티드가 항체를 본 발명의 폴리펩티드(본 발명의 융합 단백질에서 이종 폴리펩티드 서열에 대한 항체를 포함)에 용액내 접촉시키는 경우에 형성된다. 또다른구체예에서, 본 발명의 다량체는 본 발명의 KGF-2 폴리펩티드와 및/또는 이들 사이에 공유 결합에 의하여 형성된다. 상기 공유 결합은 폴리펩티드 서열(예, 서열번호 2에 제시, 또는 클론 HPRCC57, 또는 ATCC 기탁번호 75977 또는 75901에 함유된 클론에 의하여 암호화되는 폴리펩티드에 포함됨)내 함유된 1 이상의 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 한 예로서, 공유 결합은 천연(즉, 천연 발생) 폴리펩티드에서 상호작용하는 폴리펩티드 서열내에 존재하는 시스테인 사이의 교차 결합이다. 또다른 예로서, 공유 결합은 화학 또는 재조합 조작의 결과이다. 이와는 달리, 상기 공유 결합은 KGF-2 융합 단백질중 이종 폴리펩티드 서열내 포함되는 1 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 한 예로서, 공유 결합은 본 발명의 융합 단백질에 함유된 이종 서열간에 존재한다(참조예, 미국 특허 제5,478,925호). 특정 구체예로서, 공유 결합은 본 발명의 KGF-2-Fc 융합 단백질에 함유되는 이종 서열 사이에 존재한다(상술된 바와 같음). 또다른 구체예로서, 본 발명의 융합 단백질의 공유 결합은 예컨대, 오스테오프로테게린(참조예, 국제 공개 WO 98/49305, 본원에서 참고로 인용)과 같은 공유적으로 결합된 다량체를 형성할 수 있는 또다른 단백질에서 유래한 이종 폴리펩티드 서열 사이에 존재한다. 또다른 구체예에서, 2 이상의 본 발명의 폴리펩티드는 펩티드 링커를 통하여 연결된다. 예들은 미국 특허 제5,073,627호(본원에서 참고로 인용)에 개시된 펩티드 링커를 포함한다. 펩티드 링커에 의해 분리된 본 발명의 다중 폴리펩티드를 포함하는 단백질은 통상적 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
본 발명의 다량체 폴리펩티드를 제조하는 또다른 방법은 류신 지퍼 또는 이소류신 지퍼 폴리펩티드 서열에 융합되는 본 발명의 폴리펩티드의 사용을 포함한다. 류신 지퍼 및 이소류신 지퍼 도메인은 이들이 발견되는 단백질의 다량체 형성을 촉진시키는 폴리펩티드이다. 류신 지퍼는 수개의 DNA-결합 단백질에서 처음으로 동정되었다(Landshulz 등, Science 240:1759, (1988)). 또한 다양한 상이한 단백질에서 발견되었다. 공지의 류신 지퍼 중에 이량화 또는 삼량화하는 자연발생적 펩티드 및 이것의 유도체가 존재한다. 본 발명의 가용성 다량체 단백질의 제조에 적절한 류신 지퍼 도메인의 예는 PCT 출원 WO 94/10308(본원에 인용되어 있음)에서 기재되어 있다. 용액내 이량체 형성 또는 삼량체 형성하는 폴리펩티드 서열에 융합되는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 재조합 융합 단백질은 적절한 숙주 세포에서 발현되고, 생성되는 가용성 다량체 융합 단백질은 공지의 기술을 사용하여 배양 상청액으로부터 회수된다.
본 발명의 삼량체 폴리펩티드는 생물학적 활성의 향상이라는 이점을 제공할 것이다. 바람직한 류신 지퍼 부분 및 이소류신 지퍼 부분은 삼량체를 형성하는 것이 바람직하다. 한 실시예는 Hopper 등의 문헌(FEBS Letters 344:191, (1994)) 및 미국 특허출원 제08/446,922호(본원에서 참고로 인용됨)에 기재된 바와 같이, 폐 계면활성제 단백질 D(SPD)에서 유래하는 류신 지퍼이다. 천연 발생적 삼량체 단백질로부터 유래하는 기타 펩티드는 본 발명의 삼량체 폴리펩티드를 제조하는데 사용될 것이다.
또다른 실시예에서, 본 발명의 단백질은 Flag(등록상표) 폴리펩티드 서열을 포함하는 본 발명의 융합 단백질에 함유되는 Flag(등록상표) 폴리펩티드 서열 간의상호작용에 의하여 결합된다. 추가적 구체예에서, 본 발명의 단백질 결합은 본 발명의 Flag(등록상표) 융합 단백질 및 항-Flag(등록상표) 항체에 포함된 이종 폴리펩티드 서열간의 상호작용에 의하여 결합된다.
본 발명의 다량체는 당업계에 공지된 화학적 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 다량체에 함유되는 것이 바람직한 폴리펩티드는 당업계에 공지된 링커 분자 및 링커 분자 길이 최적화 기술을 사용하여 화학적으로 교차 결합할 수 있다(참조예, 미국 특허 제5,478,925호, 이것은 전체가 본원에서 참고로 인용됨). 추가로, 본 발명의 다량체는 다량체내 함유되는 것이 바람직한 폴리펩티드의 서열내에 위치된 시스테인 잔기 사이에 하나 이상의 분자간 교차 결합을 형성하기 위하여 당업계의 공지 기술을 사용하여 생성될 수 있다(참조예, 미국 특허 제5,478,925호, 이것은 전체가 본원에서 참고로 인용됨). 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 시스테인 또는 비오틴의 첨가로 인하여 통상적으로 변형될 수 있고, 공지 기술을 하나 이상의 상기 변형된 폴리펩티드를 포함하는 다량체를 생성하는데 응용할 수 있다(참조예, 미국 특허 제5,478,925호, 이것은 전체가 본원에서 참고로 인용됨). 또한, 공지 기술은 본 발명의 다량체에 포함되는 것이 바람직한 폴리펩티드 성분을 포함하는 리포좀을 생성하기 위하여 응용될 수 있다(참조예, 미국 특허 제5,478,925호, 이것은 전체가 본원에서 참고로 인용됨).
이와는 달리, 본 발명의 다량체는 당업계에 공지된 유전 공학 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 다량체에 포함되는 폴리펩티드는 본원에서 기술되는 융합 단백질 기법 또는 이와는 다른 공지 기술(참조예, 미국 특허 제5,478,925호, 이것은 전체가 본원에서 참고로 인용됨)을 사용하여 재조합적으로 생성된다. 특정 구체예로서, 본 발명의 동종이량체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 링커 폴리펩티드를 암호화하는 서열에 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리펩티드 서열을 결찰시키고, 이어서 최초 C-말단에서 N-말단의 역 방향으로(리더 서열 결실) 폴리펩티드의 번역된 생성물을 암호화하는 합성 폴리뉴클레오티드에 추가로 결찰시킴으로써 생성된다((참조예, 미국 특허 제5,478,925호, 이것은 전체가 본원에서 참고로 인용됨). 또다른 구체예로서, 본원에 기재된 재조합 기술 또는 공지의 다른 기술은, 경막 도메인(또는 소수성 또는 시그널 펩티드)를 포함하고, 리포좀으로 막 재구성 기법(참조예, 미국 특허 제5,478,925호, 이것은 전체가 본원에서 참고로 인용됨)에 의하여 통합될 수 있는 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 생성하는데 응용한다.
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 단편
또한, 본 발명은 본원에 기재한 분리된 핵산 분자의 단편에 관한 것이다. 예컨대 기탁된 cDNA(클론 HPRCC57)의 뉴클레오티드 서열, 기탁된 cDNA에 의해 암호화되는 폴레펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 도 1에 도시된 폴리펩티드 서열(서열번호 2)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 도 1에 나타난 뉴클레오티드 서열(서열번호 1), 또는 이들의 상보성 서열을 보유하는 분리된 핵산 분자의 단편은, 길이가 15nt 이상, 바람직하게는 약 20nt 이상 더욱 바람직하게는 30nt 이상, 더더욱 바람직하게는 약 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 325, 350, 375,400, 450, 500, 550 또는 600 nt 이상인 단편들이 포함된다. 이들 단편은 비제한적으로 진단 프로브 및 본원에 논의 한 프라이머를 포함하는 다수 용도를 갖는다. 물론, 기탁된 cDNA(클론 HPRCC57)의 뉴클레오티드 서열 또는 도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)의 전부는 아니나 대부분에 해당하는 단편인, 더 큰 단편, 예컨대 길이가 501-1500 nt인 단편들도 본 발명에 따라 유용하다. 예컨대 길이가 20nt 이상인 단편은 예컨대 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열 또는 도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)로부터 20개 이상의 인접 염기들을 포함하는 단편들이 포함된다.
게다가, KGF-2 폴리뉴클레오티드 단편의 대표적인 예들은 예컨대, 서열번호 1 또는 이의 상보성 가닥 또는 기탁된 클론에 함유된 cDNA의 대략 뉴클레오티드 번호 1-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401-450, 451-500, 501-550, 551-600, 601-650, 651-700, 701-750, 751-800, 801-850, 851-900, 901-950, 951-1000, 1001-1050, 1051-1100, 1101-1150, 1151-1200, 1201-1250, 1251-1300, 1301-1350, 1351-1400, 1401-1450, 1451-1500, 1501-1550, 1551-1600, 1601-1650, 1651-1700, 1701-1750, 1751-1800, 1801-1850, 1851-1900, 1901-1950, 1951-2000 및/또는 2001 내지 말단으로부터 나온 서열을 보유하는 단편들을 포함한다. 여기에서, "대략"은 한쪽 말단 또는 양 말단에서 구체적으로 인용된 범위, 그 범위 보다 수개(5, 4, 3, 2, 또는 1) 뉴클레오티드가 많거나 적은 범위를 포함한다.
바람직하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 단편은 KGF-2 기능적인 활성을 나타내는 폴리펩티드를 암호화한다. KGF-2 "기능적인 활성"을 나타내는 폴리펩티드란, 전길이(완전한) KGF-2 단백질과 관련된 하나이상의 기능적인 활성들을 나타낼 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 기능적인 활성은 비제한적으로 생물학적 활성, 항원성[항-KGF-2-폴리펩티드에 결합(또는 결합에 있어서 KGF-2 폴리펩티드와 경쟁)하는 능력], 면역원성[KGF-2 폴리펩티드에 결합하는 항체를 형성시키는 능력], 본 발명의 KGF-2 폴리펩티드와 함께 다량체를 형성하는 능력 및 KGF-2 폴리펩티드에 대한 수용체 또는 리간드에 결합하는 능력을 포함한다.
KGF-2 폴리펩티드 및 이의 단편, 변이체, 유도체 및 유사체의 기능적인 활성은 다양한 방법에 의해 분석될 수 있다.
예컨대, 항-KGF-2 항체에 결합하는 경우 전길이 KGF-2 폴리펩티드와 결합 또는 경쟁하는 능력에 대하여 분석하는 일 구체예에서, 사용될 수 있는 당업계에 공지된 다양한 면역 분석은 비제한적으로 방사선면역분석, ELISA(효소 연결된 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역방사측정 분석, 젤 확산 침강 반응, 면역확산 분석, 원위치 면역분석(예컨대 콜로이드성 금, 효소 또는 방사선동위원소 표지를 사용함), 웨스턴 블럿, 침강 반응, 응집 분석(예, 젤 응집 분석, 혈구응집 분석), 보체-고정 분석, 면역형광 분석, 단백질 A 분석 및 면역전기영동 분석 등과 같은 기술을 이용하는 경쟁적 및 비경쟁적 분석을 포함한다. 일구체예에서, 항체 결합은 1차항체상의 표지를 검출함으로써 검출된다. 다른 구체예에서, 1차 항체는 1차 항체에 2차함체 도는 반응제가 검함하는 것을 검출함으로써 검출된다. 또다른 구체예에서는, 2차 항체가 표지된다. 면역분석에서 결합을 검출하는 다수의 방법들이 당업계에 알려져 있으며, 본 발명의 범위에 속한다.
KGF-2 리간드가 동정되거나 본 발명의 폴리펩티드 단편, 변이체 또는 유도체가 다량체를 형성하는 능력을 평가하는 다른 구체예에서, 결합은 예컨대 당업계에 잘 알려진 방법(예, 환원성 및 비환원성 젤 크로마토그래피, 단백질 친화성 크로마토그래피 및 친화도 블럿팅)에 의해 분석될 수 있다. 통상 Phizichy, E등의 문헌[Microbiol. Rev. 59:94-123(1995)]을 참조하라. 다른 구체예에서, 그 기질에 결합하는 KGF-2의 생리학적 상관물(신호 전달)을 분석할 수 있다.
게다가, 본원에 기재된 분석(실시예 참조) 또는 기타 당업계에 알려진 분석을 일상적인 방법으로 사용하여 KGF-2 관련 생물학적 활성(시험관내 또는 생체내)을 유도하는 KGF-2 폴리펩티드 및 이의 단편, 변이체, 유도체 및 유사체의 능력을 측정할 수 있다. 다른 방법이 당업자에게 알려져 있을 것이며, 본 발명의 범주에 속하다.
본 발명은 본원에 기재된 KGF-2 폴리펩티드의 단편에 관한 것이다. 예컨대 기탁된 cDNA(클론 HPRCC57)에 의해 암호화된 분리된 KGF-2 폴리펩티드, 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열, 도 1에 도시된 폴리펩티드 서열(서열번호 2)의 단편은, 서열번호 2에 함유되거나 기탁된 클론에 함유된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩티드 단편을 포함하는 의미이다. 단백질 단편은 "자립형(free-standing)"이거나, 또는 단편이 일부 또는 영역을 형성하는 더 큰 폴리펩티드 내에 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 단일 연속 영역으로서 존재할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 단편의 대표적인 예로는, 대략 아미노산 번호 1-20, 21-40, 41-60, 61-80,81-100, 102-120, 121-140, 141-160, 161-180, 181-200, 201-220, 221-240, 241-260, 261-280, 또는 281 내지 암호 영역의 말단으로부터 유래한 단편들을 포함한다. 또한, 폴리펩티드 단편은 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 이상의 아미노산 길이일 수 있다. 여기서, "대략"은 한쪽 말단 또는 양 말단에서 구체적으로 인용된 범위, 그 범위 보다 수개(5, 4, 3, 2, 또는 1) 아미노산이 많거나 적은 범위를 포함한다.
단백질의 N-말단으로부터 하나이상의 아미노산을 결실시켜 단백질의 하나이상의 생물학적 기능을 결실시키는 변형을 산출시킬지라도, 다른 기능적 활성(예, 생물학적 활성, 다량체를 형성하는 능력, KGF-2 리간드를 결합하는 능력)은 여전히 보유될 수 있다. 예컨대, 짧아진 KGF-2 뮤테인이 폴리펩티드의 완전하거나 성숙한 형태를 인식하는 항체를 유도 및/또는 결합하는 능력은 통상 완전하거나 성숙한 폴리펩티드 중 대다수의 잔기가 N-말단으로부터 제거되지 않을 때 보유될 것이다. 완전한 폴리펩티드 중 N-말단 잔기를 결여한 특정 폴리펩티드가 이러한 면역원적 활성을 보유하는지는 본원에 기재된 일상적인 방법에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 다수의 결실된 N-말단 아미노산 잔기를 갖는 KGF-2 뮤테인은 몇몇 생물학적 또는 면역원적 활성을 보유할지도 모른다. 사실상 6개 정도의 적은 KGF-2 아미노산 잔기로 구성된 펩티드는 종종 면역 반응을 일으킬 수 있다.
따라서, 폴리펩티드 단편은 분비성 KGF-2 단백질 뿐만아니라 성숙형도 포함한다. 나아가, 바람직한 폴리펩티드 단편은 아미노 또는 카르복시 말단 또는 양 말단으로부터 결실된 잔기의 연속물을 포함하는, 분비성 KGF-2 단백질 또는 성숙형을포함한다. 예를 들어, 1-60 범위의 임의의 수의 아미노산이 분비성 KGF-2 폴리펩티드 또는 성숙형의 아미노 말단으로부터 결실될 수 있다. 유사하게, 1-30 범위의 임의의 수의 아미노산이 분비성 KGF-2 폴리펩티드 또는 성숙형의 카르복시 말단으로부터 결실될 수 있다. 또한, 상기 아미노 및 카르복시 말단 결실의 조합이 바람직하다. 유사하게, 이들 KGF-2 폴리펩티드 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편도 바람직하다.
특히, KGF-2 폴리펩티드의 N-말단 결실은 일반식 m-208로 표시할 수 있는데, 여기서 m은 2 내지 207이고, m은 서열 번호 2에서 확인된 아미노산 잔기의 위치에 해당한다. 구체적으로, 본 발명은 다음과 같은 아미노산 잔기를 포함하는 또는 이들로 구성된 폴리펩티드를 포함한다: 서열 번호 2의 W-2 내지 S-208; K-3 내지 S-208; W-4 내지 S-208; I-5 내지 S-208; L-6 내지 S-208; T-7 내지 S-208; H-8 내지 S-208; C-9 내지 S-208; A-10 내지 S-208; S-11 내지 S-208; A-12 내지 S-208; F-13 내지 S-208; P-14 내지 S-208; H-15 내지 S-208; L-16 내지 S-208; P-17 내지 S-208; G-18 내지 S-208; C-19 내지 S-208; C-20 내지 S-208; C-21 내지 S-208; C-22 내지 S-208; C-23 내지 S-208; F-24 내지 S-208; L-25 내지 S-208; L-26 내지 S-208; L-27 내지 S-208; F-28 내지 S-208; L-29 내지 S-208; V-30 내지 S-208; S-31 내지 S-208; S-32 내지 S-208; V-33 내지 S-208; P-34 내지 S-208; V-35 내지 S-208; T-36 내지 S-208; C-37 내지 S-208; Q-38 내지 S-208; A-39 내지 S-208; L-40 내지 S-208; G-41 내지 S-208; Q-42 내지 S-208; D-43내지 S-208; M-44 내지 S-208; V-45 내지 S-208; S-46 내지 S-208; P-47 내지 S-208; E-48 내지 S-208; A-49내지 S-208; T-50 내지 S-208; N-51 내지 S-208; S-52 내지 S-208; S-53 내지 S-208; S-54 내지 S-208; S-55 내지 S-208; S-56 내지 S-208; F-57 내지 S-208; S-58 내지 S-208; S-59 내지 S-208; P-60 내지 S-208; S-61 내지 S-208; S-62 내지 S-208; A-63 내지 S-208; G-64 내지 S-208; R-65 내지 S-208; H-66 내지 S-208; V-67 내지 S-208; R-68 내지 S-208; S-69 내지 S-208; Y-70 내지 S-208; N-71 내지 S-208; H-72 내지 S-208; L-73 내지 S-208; Q-74 내지 S-208; G-75 내지 S-208; D-76 내지 S-208; V-77 내지 S-208; R-78 내지 S-208; W-79 내지 S-208; R-80 내지 S-208; K-81 내지 S-208; L-82 내지 S-208; F-83 내지 S-208; S-84 내지 S-208; F-85 내지 S-208; T-86 내지 S-208; K-87 내지 S-208; Y-88 내지 S-208; F-89 내지 S-208; L-90 내지 S-208; K-91 내지 S-208; I-92 내지 S-208; E-93 내지 S-208; K-94 내지 S-208; N-95 내지 S-208; G-96 내지 S-208; K-97 내지 S-208; V-98 내지 S-208; S-99 내지 S-208; G-100 내지 S-208; T-101 내지 S-208; K-102 내지 S-208; K-103 내지 S-208; E-104 내지 S-208; N-105 내지 S-208; C-106 내지 S-208; P-107 내지 S-208; Y-108 내지 S-208; S-109 내지 S-208; I-110 내지 S-208; L-111 내지 S-208; E-112 내지 S-208; I-113 내지 S-208; T-114 내지 S-208; S-115 내지 S-208; V-116 내지 S-208; E-117 내지 S-208; I-118 내지 S-208; G-119 내지 S-208; V-120 내지 S-208; V-121 내지 S-208; A-122 내지 S-208; V-123 내지 S-208; K-124 내지 S-208; A-125 내지 S-208; I-126 내지 S-208; N-127 내지 S-208; S-128 내지 S-208; N-129 내지 S-208; Y-130 내지 S-208; Y-131 내지 S-208; L-132 내지 S-208; A-l33 내지 S-208; M-134 내지 S-208; N-135 내지 S-208; K-136 내지 S-208;K-137 내지 S-208; G-l38 내지 S-208; K-139 내지 S-208; L-140 내지 S-208; Y-141 내지 S-208; G-142 내지 S-208; S-143 내지 S-208; K-144 내지 S-208; E-145 내지 S-208; F-146 내지 S-208; N-147 내지 S-208; N-148 내지 S-208; D-149 내지 S-208; C-150 내지 S-208; K-151 내지 S-208; L-152 내지 S-208; K-153 내지 S-208; E-154 내지 S-208; R-155 내지 S-208; I-156 내지 S-208; E-157 내지 S-208; E-158 내지 S-208; N-159 내지 S-208; G-160 내지 S-208; Y-161 내지 S-208; N-162 내지 S-208; T-163 내지 S-208; Y-164 내지 S-208; A-165 내지 S-208; S-166 내지 S-208; F-167 내지 S-208; N-168 내지 S-208; W-169 내지 S-208; Q-170 내지 S-208; H-171 내지 S-208; N-172 내지 S-208; G-173 내지 S-208; R-174 내지 S-208; Q-175 내지 S-208; M-176 내지 S-208; Y-177 내지 S-208; V-178 내지 S-208; A-179 내지 S-208; L-180 내지 S-208; N-181 내지 S-208; G-182 내지 S-208; K-183 내지 S-208; G-184 내지 S-208; A-185 내지 S-208; P-186 내지 S-208; R-187 내지 S-208; R-188 내지 S-208; G-189 내지 S-208; Q-190 내지 S-208; K-191 내지 S-208; T-192 내지 S-208; R-193 내지 S-208; R-194 내지 S-208; K-195 내지 S-208; N-196 내지 S-208; T-197 내지 S-208; S-198 내지 S-208; A-199 내지 S-208; H-200 내지 S-208; F-201 내지 S-208; L-202 내지 S-208; P-203 내지 S-208. 또한, 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 포함된다.
S69-S208; A63-S208; Y70-S208; V77-S208; E93-S208; E104-S208; V123-S208; G138-S208; R80-S208; A39-S208; S69-V178; S69-G173; S69-R188; S69-S198; S84-S208; V98-S208; A63-N162; S69-N162; 및 M35-N162를 포함하거나 이들로 구성된 단편이 특히 바람직하다.
또한, 상기 언급한 바와 같이, 단백질의 C-말단으로부터 하나이상의 아미노산을 결실시켜 단백질의 하나이상의 생물학적 기능을 결실시키는 변형을 산출시킬지라도, 다른 기능적 활성(예, 생물학적 활성, 다량체를 형성하는 능력, KGF-2 리간드를 결합하는 능력)은 여전히 보유될 수 있다. 예컨대, 짧아진 KGF-2 뮤테인이 폴리펩티드의 완전하거나 성숙한 형태를 인식하는 항체를 유도 및/또는 결합하는 능력은 통상 완전하거나 성숙한 폴리펩티드 중 대다수의 잔기가 C-말단으로부터 제거되지 않을 때 보유될 것이다. 완전한 폴리펩티드 중 C-말단 잔기를 결여한 특정 폴리펩티드는 본원에 기재된 일상적인 방법 또는 당업계에 알려진 기타 방법에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 다수의 결실된 C-말단 아미노산 잔기를 갖는 KGF-2 뮤테인은 몇몇 생물학적 또는 면역원적 활성을 보유할지도 모른다. 사실상 6개 정도의 적은 KGF-2 아미노산 잔기로 구성된 펩티드는 종종 면역 반응을 일으킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 도1(서열 번호 2)에 도시된 KGF-2 폴리펩티드 아미노산 서열의 카르복시 말단으로부터 결실된 1 이상의 잔기를 갖는 폴리펩티드를 제공하며, 일반식 1-n으로 나타내고, 이때, n은 2 내지 207의 정수이고, 서열 번호 2에서 동정된 아미노산 잔기의 위치에 상응한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 서열 번호 2의 M-1 내지 H-207; M-1 내지 V-206; M-1 내지 V-205; M-1 내지 M-204; M-1 내지 P-203; M-1 내지 L-202; M-1 내지 F-201; M-1 내지 H-200; M-1 내지 A-199; M-1 내지 S-198; M-1 내지 T-197; M-1 내지 N-196; M-1 내지 K-195; M-1 내지 R-194; M-1 내지 R-193; M-1 내지 T-192; M-1 내지 K-191; M-1 내지 Q-190; M-1 내지 G-189; M-1 내지 R-188; M-1 내지 R-187; M-1 내지 P-186; M-1 내지 A-185; M-1 내지 G-184; M-1 내지 K-183; M-1 내지 G-182; M-1 내지 N-181; M-1 내지 L-180; M-1 내지 A-179; M-1 내지 V-178; M-1 내지 Y-177; M-1 내지 M-176; M-1 내지 Q-175; M-1 내지 R-174; M-1 내지 G-173; M-1 내지 N-172; M-1 내지 H-171; M-1 내지 Q-170; M-1 내지 W-169; M-1 내지 N-168; M-1 내지 F-167; M-1 내지 S-166; M-1 내지 A-165; M-1 내지 Y-164; M-1 내지 T-163; M-1 내지 N-162; M-1 내지 Y-161; M-1 내지 G-160; M-1 내지 N-159; M-1 내지 E-158; M-1 내지 E-157; M-1 내지 I-156; M-1 내지 R-155; M-1 내지 E-154; M-1 내지 K-153; M-1 내지 L-152; M-1 내지 K-151; M-1 내지 C-150; M-1 내지 D-149; M-1 내지 N-148; M-1 내지 N-147; M-1 내지 F-146; M-1 내지 E-145; M-1 내지 K-144; M-1 내지 S-143; M-1 내지 G-142; M-1 내지 Y-141; M-1 내지 L-140; M-1 내지 K-139; M-1 내지 G-138; M-1 내지 K-137; M-1 내지 K-136; M-1 내지 N-135; M-1 내지 M-134; M-1 내지 A-133; M-1 내지 L-132; M-1 내지 Y-131; M-1 내지 Y-130; M-1 내지 N-129; M-1 내지 S-128; M-1 내지 N-127; M-1 내지 I-126; M-1 내지 A-125; M-1 내지 K-124; M-1 내지 V-123; M-1 내지 A-122; M-1 내지 V-121; M-1 내지 V-120; M-1 내지 G-119; M-1 내지 I-118; M-1 내지 E-117; M-1 내지 V-116; M-1 내지 S-115; M-1 내지 T-114; M-1 내지 I-113; M-1 내지 E-112; M-1 내지 L-111; M-1 내지 I-110; M-1 내지 S-109; M-1 내지 Y-108; M-1 내지 P-107; M-1 내지 C-106; M-1 내지 N-105; M-1 내지 E-104; M-1 내지 K-103; M-1 내지 K-102; M-1 내지 T-101; M-1 내지 G-100; M-1 내지 S-99; M-1 내지V-98; M-1 내지 K-97; M-1 내지 G-96; M-1 내지 N-95; M-1 내지 K-94; M-1 내지 E-93; M-1 내지 I-92; M-1 내지 K-91; M-1 내지 L-90; M-1 내지 F-89; M-1 내지 Y-88; M-1 내지 K-87; M-1 내지 T-86; M-1 내지 F-85; M-1 내지 S-84; M-1 내지 F-83; M-1 내지 L-82; M-1 내지 K-81; M-1 내지 R-80; M-1 내지 W-79; M-1 내지 R-78; M-1 내지 V-77; M-1 내지 D-76; M-1 내지 G-75; M-1 내지 Q-74; M-1 내지 L-73; M-1 내지 H-72; M-1 내지 N-71; M-1 내지 Y-70; M-1 내지 S-69; M-1 내지 R-68; M-1 내지 V-67; M-1 내지 H-66; M-1 내지 R-65; M-1 내지 G-64; M-1 내지 A-63; M-1 내지 S-62; M-1 내지 S-61; M-1 내지 P-60; M-1 내지 S-59; M-1 내지 S-58; M-1 내지 F-57; M-1 내지 S-56; M-1 내지 S-55; M-1 내지 S-54; M-1 내지 S-53; M-1 내지 S-52; M-1 내지 N-51; M-1 내지 T-50; M-1 내지 A-49; M-1 내지 E-48; M-1 내지 P-47; M-1 내지 S-46; M-1 내지 V-45; M-1 내지 M-44; M-1 내지 D-43; M-1 내지 Q-42; M-1 내지 G-41; M-1 내지 L-40; M-1 내지 A-39; M-1 내지 Q-38; M-1 내지 C-37; M-1 내지 T-36; M-1 내지 V-35; M-1 내지 P-34; M-1 내지 V-33; M-1 내지 S-32; M-1 내지 S-31; M-1 내지 V-30; M-1 내지 L-29; M-1 내지 F-28; M-1 내지 L-27; M-1 내지 L-26; M-1 내지 L-25; M-1 내지 F-24; M-1 내지 C-23; M-1 내지 C-22; M-1 내지 C-21; M-1 내지 C-20; M-1 내지 C-19; M-1 내지 G-18; M-1 내지 P-17; M-1 내지 L-16; M-1 내지 H-15; M-1 내지 P-14; M-1 내지 F-13; M-1 내지 A-12; M-1 내지 S-11; M-1 내지 A-10; M-1 내지 C-9; M-1 내지 H-8; M-1 내지 T-7 잔기의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명에 포함된다.
마찬가지로, 서열 번호 2로 나타낸 본 발명의 KGF-2 폴리펩티드의 C-말단 결실은 서열 번호 2의 S-69 내지 H-207; S-69 내지 V-206; S-69 내지 V-205; S-69 내지 M-204; S-69 내지 P-203; S-69 내지 L-202; S-69 내지 F-201; S-69 내지 H-200; S-69 내지 A-199; S-69 내지 S-198; S-69 내지 T-197; S-69 내지 N-196; S-69 내지 K-195; S-69 내지 R-194; S-69 내지 R-193; S-69 내지 T-192; S-69 내지 K-191; S-69 내지 Q-190; S-69 내지 G-189; S-69 내지 R-188; S-69 내지 R-187; S-69 내지 P-186; S-69 내지 A-185; S-69 내지 G-184; S-69 내지 K-183; S-69 내지 G-182; S-69 내지 N-181; S-69 내지 L-180; S-69 내지 A-179; S-69 내지 V-178; S-69 내지 Y-177; S-69 내지 M-176; S-69 내지 Q-175; S-69 내지 R-174; S-69 내지 G-173; S-69 내지 N-172; S-69 내지 H-171; S-69 내지 Q-170; S-69 내지 W-169; S-69 내지 N-168; S-69 내지 F-167; S-69 내지 S-166; S-69 내지 A-165; S-69 내지 Y-164; S-69 내지 T-163; S-69 내지 N-162; S-69 내지 Y-161; S-69 내지 G-160; S-69 내지 N-159; S-69 내지 E-158; S-69 내지 E-157; S-69 내지 I-156; S-69 내지 R-155; S-69 내지 E-154; S-69 내지 K-153; S-69 내지 L-152; S-69 내지 K-151; S-69 내지 C-150; S-69 내지 D-149; S-69 내지 N-148; S-69 내지 N-147; S-69 내지 F-146; S-69 내지 E-145; S-69 내지 K-144; S-69 내지 S-143; S-69 내지 G-142; S-69 내지 Y-141; S-69 내지 L-140; S-69 내지 K-139; S-69 내지 G-138; S-69 내지 K-137; S-69 내지 K-136; S-69 내지 N-135; S-69 내지 M-134; S-69 내지 A-133; S-69 내지 L-132; S-69 내지 Y-131; S-69 내지 Y-130; S-69 내지 N-129; S-69 내지 S-128; S-69 내지 N-127; S-69 내지 I-126; S-69 내지 A-125; S-69 내지 K-124; S-69 내지 V-123; S-69 내지 A-122; S-69 내지 V-121; S-69 내지 V-120; S-69 내지 G-119; S-69 내지 I-118; S-69 내지 E-117; S-69 내지 V-116; S-69 내지 S-115; S-69 내지 T-114; S-69 내지 I-113; S-69 내지 E-112; S-69 내지 L-111; S-69 내지 I-110; S-69 내지 S-109; S-69 내지 Y-108; S-69 내지 P-107; S-69 내지 C-106; S-69 내지 N-105; S-69 내지 E-104; S-69 내지 K-103; S-69 내지 K-102; S-69 내지 T-101; S-69 내지 G-100; S-69 내지 S-99; S-69 내지 V-98; S-69 내지 K-97; S-69 내지 G-96; S-69 내지 N-95; S-69 내지 K-94; S-69 내지 E-93; S-69 내지 I-92; S-69 내지 K-91; S-69 내지 L-90; S-69 내지 F-89; S-69 내지 Y-88; S-69 내지 K-87; S-69 내지 T-86; S-69 내지 F-85; S-69 내지 S-84; S-69 내지 F-83; S-69 내지 L-82; S-69 내지 K-81; S-69 내지 R-80; S-69 내지 W-79; S-69 내지 R-78; S-69 내지 V-77; S-69 내지 D-76; S-69 내지 G-75 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
또한, 전술한 N-말단 또는 C-말단 결실 중 어떤 것은 서로 조합하여 N-말단 및 C-말단 결실된 KGF-2 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 또한 본 발명은 아미노 말단 및 카르복실 말단 둘 다로부터 결실된 1 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 제공하며, 이들 말단은 서열 번호 2의 m-n 잔기를 갖는 것으로 통상 나타내는데, 이때, n 및 m은 전술한 바와 같은 정수이다. 또한, N-말단 또는 C-말단 결실 돌연변이체도 위치 특이적인 아미노산 치환체를 포함할 수 있다. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명에 포함된다.
ATCC 기탁번호 75977에 포함된 cDNA 클론으로 암호화된 완전한 KGF-2 아미노산 서열의 일부로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또한 포함되며, 상기 일부는 ATCC 기탁번호 75977에 포함된 cDNA 클론으로 암호화된 완전한 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터 1 내지 약 198 아미노산 중의 아미노산 잔기의 임의의 정수, 또는 카르복시 말단으로부터 1 내지 약 198 아미노산 중의 아미노산 잔기의 임의의 정수, 또는 ATCC 기탁번호 75977에 포함된 cDNA 클론으로 암호화된 완전한 아미노산 서열의 상기 아미노 말단 및 카르복시 말단 결실의 임의의 조합을 배제한다. 상기 결실 돌연변이체 폴리펩티드 형태 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 제공된다.
본 명세서는 m-n로 본 원에 기재한 KGF-2 폴리펩티드 서열과 80 % 이상, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 동일한 폴리펩티드를 포함하는 단백질에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 명세서는 특이적 KGF-2의 아미노산 서열 및 본원에서 기재한 C-말단 결실을 갖는 폴리펩티드와 80 % 이상, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 동일한 폴리펩티드를 포함하는 단백질에 관한 것이다. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 포함된다.
KGF-2의 기능적 또는 구조적 속성에 특징이 있는 단편이 본 발명의 바람직한 단편 중 하나이다. 그러한 단편은 완전한(즉, 전체 길이의) KGF-2(서열 번호 2)의 알파-헬릭스 및 알파-헬릭스 형성 부위("알파-부위"), 베타-시트, 베타-시트 형성 부위("베타-부위"), 턴 및 턴 형성 부위("턴-부위"), 코일 및 코일 형성 부위("코일-부위"), 친수성 부위, 소수성 부위, 알파 양친매성 부위, 베타 양친매성 부위, 표면 형성 부위, 및 고항원율 부위(즉, 1.5 또는 그 이상의 항원율을 갖는 이웃한 4 이상의 아미노산을 포함, 제임슨-울프 프로그램의 흠결 파라미터를 사용하여 동정)를 포함하는 아미노산 잔기를 포함한다. 특정의 바람직한 부위는 도4에 도시되어 있는 것이며, 도1(서열 번호 2)에 도시된 아미노산 서열의 분석에 의해 동정된 전술한 형태의 부위를 포함하지만 이에 국한되지는 않고, 상기 바람직한 부위는 가니어-롭슨 예언의 알파-부위, 베타-부위, 턴-부위, 및 코일 부위; 슈-파스만 예언의 알파-부위, 베타-부위, 턴-부위 및 코일-부위; 카이트-둘리틀 예언의 소수성 및 친수성 부위; 아이젠베르크 알파 및 베타 양친매성 부위; 에미니 표면-형성 부위; 및 제임슨-울프 고 항원율 부위를 들 수 있으며, 상기 컴퓨터 프로그램의 흠결 파라미터를 사용하여 예언한 바와 같다. 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 포함된다.
추가적인 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 KGF-2의 기능적인 속성을 암호화한다. 이와 관련하여 본 발명의 바람직한 구체예는 KGF-2의 알파-헬릭스 및 알파-헬릭스 형성 부위("알파-부위"), 베타-시트, 베타-시트 형성 부위("베타-부위"), 턴 및 턴 형성 부위("턴-부위"), 코일 및 코일 형성 부위("코일-부위"), 친수성 부위, 소수성 부위, 알파 양친매성 부위, 베타 양친매성 부위, 가요성 부위, 표면-형성 부위 및 및 고항원율 부위를 포함하는 단편을 포함한다.
전술한 바와 같이 도1 및/또는 표1에 나타낸 KGF-2의 구조적 또는 기능적 속성을 나타내는 데이터가 흠결 파라미터로 설정된 DNA*STAR 의 다양한 모듈러스 및알고리즘을 사용하여 형성되었다. 바람직한 구체예에서, 표1의 컬럼 VIII, IX, XIII 및 XIV 에 나타낸 데이터가 고도의 항원성 포텐셜을 나타내는 KGF-2의 부위를 판단하는 데 사용될 수 있다. 고도의 항원성 부위는 컬럼 VIII, IX, XIII 및/또는 IV 에 나타낸 데이터로부터, 항원 인식이 면역 반응의 개시 과정에서 일어나는 환경에 있는 폴리펩티드의 표면상에 노출되기 쉬운 폴리펩티드의 부위를 나타내는 값을 선택함으로써 결정된다.
이와 관련하여 특정의 바람직한 부위는 표1에 나타낸 것처럼 도4에 나타나 있지만, 도4에 나타낸 데이터의 표로 산출된 것을 이용하여 표현되고 동정될 수 있다. 도4를 작성하는 데 사용된 DNA*STAR 컴퓨터 알고리즘(종래의 흠결 파라미터로 사용)은 표 형태로 도4의 데이터를 나타내는 데 사용되었다(표1 참조). 도4에서의 데이터의 표 형태는 바람직한 부위의 특정 영역을 용이하게 판단하는 데 사용될 수 있다.
도4 및 표1에서 기재한 전술한 바람직한 부위는 도1에 나타낸 아미노산 서열의 분석에 의해 동정된 전술한 형태의 부위를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 도4 및 표1에서 설정한 바와 같이, 상기 바람직한 부위는 가니어-롭슨 알파-부위, 베타-부위, 턴-부위, 및 코일 부위; 슈-파스만 알파-부위, 베타-부위 및 코일-부위; 카이트-둘리틀 소수성 부위 및 친수성 부위; 아이젠베르크 알파 및 베타 양친매성 부위; 카플러스-슐츠 가요성 부위; 에미니 표면-형성 부위; 및 제임슨-울프 고 항원율 부위를 들 수 있다. 컬럼은 헤딩 "Res", "Position" 및 로마 숫자 I-XIV로 라벨링했다. 컬럼 헤딩은 도3 및 표1에서 나타낸 아미노산 서열의 다음과 같은특징을 의미한다: "Res": 서열 번호 2 및 도1A 및 1B의 아미노산 잔기; "Position": 서열 번호 2 및 도1A 및 1B 내에 상응하는 아미노산 잔기의 위치; I: 알파, 부위-가니어-롭슨; II: 알파, 부위- 슈-파스만; III: 베타, 부위-가니어-롭슨; IV: 베타, 부위- 슈-파스만; V: 턴, 부위-가니어-롭슨; VI: 턴, 부위-슈-파스만; VII: 코일, 부위-가니어-롭슨; VIII: 친수성 플롯-카이트-둘리틀; IX: 소수성 플롯-호프-우즈; X: 알파, 양친매성 부위-에이젠베르크; XI: 베타, 양친매성 부위-에이젠베르크; XII: 가요성 부위-카플러스-슐츠; XIII: 항원율-제임슨-울프; 및 XIV: 표면 확율 플롯-에미니.
이와 관련하여 몇 개의 구조적 특징을 조합한 KGF-2 부위를 포함하는 것이매우 바람직한 단편에 속하며, 이들 몇 개의 특징은 전술한 바와 같다.
게다가, 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링, 및/또는 코돈-셔플링(총체적으로 "DNA 셔플링") 기법은 KGF-2의 활성을 조절함으로써 KGF-2의 작용물질및 길항 물질을 효과적으로 제조하는 데 이용될 수 있다. 일반적으로 미국 특허 제 5,605,793호; 5,811,238호; 5,830,721호; 5,834,252호; 및 5,837,458호; 및 Patten, P.A. 등, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33(1997); Harayama, S., Trends Biotechnol. 16(2): 76-82(1998); Hansson, L.O. 등, J.Mol.Biol. 287:265-276(1999); 및 Lorenzo, M.M. 및 Blasco, R., Biotechniques 24(2): 308-313(1998)를 참조하라(이들 각각의 특허 및 간행물들은 참고문헌으로 인용되어 있다.).
한 구체예에서, KGF-2 폴리뉴클레오티드 및 이에 상응하는 폴리펩티드의 변경은 DNA 셔플링으로 수행된다. DNA 셔플링은 2 이상의 DNA 분절을 동종의 또는 위치-특이적인 재조합에 의해 소정의 KGF-2의 분자내에 도입한 조합체를 포함한다. 다른 구체예에서, KGF-2 폴리뉴클레오티드 및 이에 상응하는 폴리펩티드는 에러-프론 PCR, 랜덤 뉴클레오티드 삽입 또는 재조합 이전의 다른 방법들에 의한 랜덤한 돌연변이유발을 실시함으로써 변경된다. 다른 구체예에서, KGF-2의 1 이상의 성분, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편 등을 1 이상의 이종 분자의 1 이상의 성분, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편 등으로 재조합할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이종 분자는 KGF-2 과의 일원이다. 보다 바람직한 구체예에서, 이종 분자는 예컨대, 혈소판-유도 성장 인자(PDGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF-I), 형질전환 성장 인자(TGF)-알파, 표피 성장 인자(EGF) 섬유아세포 성장 인자(FGF), TGF-베타, 골 형태발생 단백질(BMP)-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, 액티빈 A 및 B, 데카펜타플레직(decapentaplegic, dpp), 60A, OP-2, 도르살린(dorsalin), 성장 차등 인자(GDFs), 결절, MIS, 인히빈-알파, TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3,TGF-베타5 및 신경교-유도 신경영양성 인자(GDNF)와 같은 성장 인자이다. 다른 바람직한 단편은 생물학적으로 활성인 KGF-2 단편이다. 생물학적으로 활성인 단편은 KGF-2 폴리펩티드의 활성과 유사한 활성을 나타내지만 반드시 동일한 것은 아니다. 단편의 생물학적인 활성은 바람직한 활성을 개선시키거나 또는 바람직하지 못한 활성을 감소시킬 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 활동을 조절하는 화합물을 동정하기 위하여 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 분석의 예는 포유류의 섬유아세포, 본 발명의 폴리펩티드, 스크리닝 될 화합물 및 3[H] 티미딘을 섬유아세포가 통상 증식할 수 있는 세포 배양 조건하에서 배합하는 단계를 포함한다. 조절 분석은 상기 화합물의 부재하에 실시하여, 각각의 경우에 3[H]티미딘의 섭취를 판단하고 화합물이 증식을 자극할 것인지 결정하기 위하여 상기 화합물의 존재하에서 스크리닝하여 섬유아세포 증식의 양과 비교할 수 있다. 섬유아세포 증식의 양은 3[H] 티미딘의 병입을 측정하는 액체 신틸레이션 크로마토그래피에 의해 측정한다. 상기 작용 물질 및 길항 물질 화합물은 모두 이러한 방법으로 동정될 수 있다.
다른 방법에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드용 수용체를 발현하는 포유류 세포 또는 막 제제는 상기 화합물의 존재하에 표지한 본 발명의 폴리펩티드로 항온배양한다. 따라서 이 상호작용을 증진시키거나 막기 위한 화합물의 능력을 측정할 수 있다. 또 다른 방법으로, 스크리닝되는 화합물과 KGF-2 수용체의 상호 작용에 따른 공지된 제2 메신저 시스템의 반응을 측정한 후, 수용체에 결합되고 제2 메신저 반응을 밝히는 화합물 능력을 측정하여 화합물이 잠재적인 작용 물질인지 또는 길항 물질인지 여부를 결정한다. 이러한 제2 메신저 시스템은 cAMP 구아닐레이트 시클라제, 이온 채널 또는 포스포이노시티드 하이드롤리시스를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 이러한 상기 모든 분석 방법은 진단의 또는 예후적인 표지로서 이용할 수 있다. 이러한 분석 방법을 이용하여 발견된 분자는 KGF-2 분자를 활성화하거나 억제함으로써 환자에게 특정 결과를 발생하게 하거나(예컨대, 혈관 성장) 또는 질병을 치료하는 데 이용할 수 있다. 게다가, 본 분석 방법에 의해 적절하게 조작된 세포 또는 조직으로부터 KGF-2의 생산을 억제하거나 증진시킬 수 있는 제제를 발견할 수 있다.
따라서, 본 발명은 (a) KGF-2와 화합물을 결합시키는 후보를 항온 배양하는 단계; 및 (b) 결합이 일어났는지를 판단하는 단계를 포함하는 KGF-2에 결합하는 화합물을 동정하는 방법을 포함한다. 게다가, 본 발명은 (a) KGF-2로 후보 화합물을 항온 배양하는 단계, (b) 생물학적 활성을 분석하는 단계, 및 (c) KGF-2의 생물학적 활성이 변경되었는지를 판단하는 단계를 포함하는 작용 물질/길항 물질을 동정하는 방법을 포함한다.
또한, 도4 및 표1에 개시된 베타-플리트 시트 부위를 이용하여 실험적으로 KGF-2와 결합하는 분자를 동정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정 구체예는 도3/표1에 개시된 각각의 베타 플리트 시트 부위의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 구체예는 도4/표1에 개시된 베타 플리트 시트 부위 모두또는 임의의 조합을 포함하거나 또는 이것으로 구성된 KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 추가적인 바람직한 구체예는 도4/표1에 개시된 베타 플리트 시트 부위 각각의 KGF-2 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성된 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 추가적인 구체예는 도4/표1에 개시된 베타 플리트 시트 부위 모두 또는 임의의 조합을 포함하거나 또는 이것으로 구성된 KGF-2 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예는 KGF-2 수용체와 결합하는 KGF-2 단편에 관한 것이다. KGF-2 수용체와 결합하는 단편은 KGF-2의 작용 물질 또는 길항 물질로서 유용할 수 있다. 예를 들어, 수용체에 결합되는 KGF-2의 단편은 KGF-2에 결합되는 것을 막을 수 있고 이의 일부를 활성화시킬 수 있다. 다른 단편은 수용체에 결합하여 수용체 및 수용체 활성을 특이적으로 불활성화시킬 수 있거나 또는 수용체-리간드 복합체를 인식할 수 있는 항체를 특이적으로 불활성화시킬 수 있고, 바람직하게는 결합되지 않은 수용체 또는 결합되지 않은 리간드를 특이적으로 인식하지 않는다. 마찬가지로, 수용체를 활성화시키는 단편이 본 발명에 포함된다. 이들 단편은 수용체 길항물질로서 작용할 수 있는데, 즉, 리간드-매개성 수용체 활성화의 생물학적인 활성의 서브셋 또는 전부를 예컨대 수용체의 이량화를 유도함으로써 강화시키거나 활성화시킬 수 있다. 상기 단편은 본원에서 개시된 본 발명 펩티드의 특이적인 생물학적 활성을 포함하는 생물학적 활성에 대한 작용 물질, 길항 물질 또는 역 작용 물질로서 구체화될 수 있다.
KGF-2 수용체와 결합하는 KGF-2 단편의 예로는 서열 번호 2의 아미노산 147-155, 95-105, 78-94, 119-146, 70-94, 78-105, 114-146, 70-105, 86-124, 100-139, 106-146, 160-209, 및/또는 156-209 를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 또한 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또한 바람직하다.
다른 바람직한 단편은 생물학적으로 활성인 KGF-2 단편이다. 생물학적으로 활성인 단편은 KGF-2 폴리펩티드의 활성과 반드시 동일하지는 않지만 유사한 활성을 나타내는 것이다. 상기 단편의 생물학적인 활성은 바람직한 활성을 개선하거나 바람직하지 못한 활성을 감소시킬 수도 있다.
그러나, 많은 폴리뉴클레오티드 서열(예컨대 EST 서열)은 공공연하게 입수가능하고 서열 데이터베이스를 통해 구할 수 있다. 이들 서열의 일부는 서열 번호 1과 관련되어 있으며, 본 발명의 창안 이전에 공공연하게 입수가능하였을 것이다. 그러한 관련된 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 범위로부터 구체적으로 제외되는 것이 바람직하다. 모든 관련된 서열을 수록하는 것은 귀찮은 일이다. 따라서, 일반식 a-b 으로 개시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 1 이상의 폴리뉴클레오티드가 본 발명으로부터 제외되는 것이 바람직하며, 이때, a 는 서열 번호 1의 1과 613 사이의 임의의 정수이고, b 는 15 내지 627 사이의 정수이며, a 및 b는 모두 서열 번호 1에 나타난 뉴클레오티드 잔기의 위치에 상응하고, 이때 b는 a+14 이거나 이보다 크다.
아미노 말단 및 카르복시 말단 결실
FGF 과의 다양한 구성원은 재조합 DNA 기술을 이용하여 개질되어왔다. 양으로 하전된 분자는 헤파린 결합에서 중요한 aFGF 및 bFGF 둘 다에서 결실되거나 치환되었다. 개질된 분자는 헤파린 결합 활성이 감소되었다. 따라서, 환자에게서 헤파린에 의해 격리된 개질된 분자의 양을 감소시켜 FGF가 적절한 수용체에 도달하는 만큼의 효력을 증가시킬 것이라는 것이 공지되어 있다(유럽 특허 0 298 723호).
천연의 KGF-2는 수성 상태에서 상대적으로 불안정해서 화학적으로 물리적으로 변성되어 가공 및 저장 동안 생물학적인 활성이 손상된다. 또한 천연의 KGF-2는 수용액에서 온도가 상승하면 응집하기 쉬워서 산성 조건하에서 불활성화된다.
천연의 KGF-2의 1 이상의 특성을 개선시키거나 변경시키기 위해서, 단백질 공학이 이용될 수 있다. Ron 등, J.Biol.Chem., 268(4): 2984-2988(1993)은 3, 8, 또는 27 아미노 말단의 아미노산 잔기들이 결여된 경우에조차 헤파린 결합 활성을 가지는 변경된 KGF 단백질을 개시하고 있다. 3 및 8 아미노산의 결실은 전체 활성을 가진다. KGF의 더 심한 결실은 PCT/IB/00971 에 개시되어 있다. 카르복시 말단 아미노산의 결실은 단백질의 활성을 증진시킬 수 있다. 한 예로는 단백질의 카르복시 말단으로부터 10개의 아미노산 잔기를 결실시킴으로써 10 배까지 더 높은 활성을 나타내는 인터페론 감마를 들 수 있다(Dobeli 등, J. of Biotechnology 7:199-216(1998)). 따라서, 본 발명의 한 태양은 천연의 KGF-2 폴리펩티드에 대해 증진된 안정성(예컨대, 통상의 pH에 노출되었을 때, 열 조건 또는 다른 저장 조건)을 보이는 KGF-2의 폴리펩티드 동족체 및 상기 동족체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 것이다.
특히 바람직한 KGF-2 폴리펩티드는 후술하는 바와 같다(단백질의 첫번째 아미노산(Met)부터 숫자를 매기기 시작)(도1(서열 번호 2)):
바람직한 구체예는 N-말단 결실 Ala(63)--Ser(208)(KGF-2△28)(서열번호 68) 및 Ser(69)-- Ser(208)(KGF-2△33)(서열번호 96)을 포함한다. 다른 바람직한 N-말단 및 C-말단 결실 돌연변이체는 명세서의 실시예 13 및 16(c) 에 기재되어 있으며 다음을 포함한다: Ala(39)--Ser(208)(서열번호 116); 도1의 Pro(47)--Ser(208)(서열번호 2); Val(77)--Ser(208)(서열번호 70); Glu(93)--Ser(208)(서열번호 72);Glu(104)--Ser(208)(서열번호 74); Val(123)--Ser(208)(서열번호 76); 및 Gly(138)--Ser(208)(서열번호 78). 다른 바람직한 C-말단 결실 돌연변이체는 도1(서열번호 2)의 Met(1), Thr(36), 또는 Cys(37)--Lys(153)을 포함한다.
본 발명에는 N- 말단 및 C-말단 모두로부터 결실된 아미노산을 갖는 결실 돌연변이체가 포함된다. 상기 돌연변이체는 N-말단 결실 돌연변이체 및 C- 말단 결실 돌연변이체의 조합을 포함하는데, 예컨대 도1(서열번호2)의 Ala(39)--His(200) , 도1(서열번호2)의 Met(44)--Arg(193), 도1(서열번호2)의 Ala(63)--Lys(153), 도1(서열번호2)의 Ser(69)-Lys(153) 등으로 나타낸다. 이들 조합은 당업자에게 공지된 재조합 기술을 이용하여 만들 수 있다.
따라서, 한 태양에서, N-말단 결실 돌연변이체가 본 발명에 의해 제공된다. 이러한 돌연변이체는 도1(서열번호 2)의 첫번째 38 N-말단 아미노산 잔기 이상(즉, Met(1)--Gln(38) 이상의 결실) 첫번째 147 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 제외한 도1(서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 것으로 이루어진다. 또 다른 방법으로, 상기 결실부는 첫번째 38 N-말단 아미노산 잔기(Met(1)--Gln(38) 이상) 이상 도1(서열번호 2)의 첫번째 137 N-말단 아미노산 잔기 이하로 이루어질 수 있다. 또 다른 방법으로, 결실부는 도1(서열번호 2)의 첫번째 46 N-말단 아미노산 잔기 이상 첫번째 137 N-말단 아미노산 잔기 이하로 이루어질 수 있다. 또 다른 방법으로, 결실부는 도1(서열번호 2)의 첫번째 62 N-말단 아미노산 잔기 이상 첫번째 137 N-말단 아미노산 잔기 이하로 이루어질 수 있다. 또 다른 방법으로, 결실부는 도1(서열번호 2)의 첫번째 68 N-말단 아미노산 잔기 이상 첫번째 137 N-말단 아미노산 잔기 이하로 이루어질 수 있다. 또 다른 방법으로, 결실부는 도1(서열번호 2)의 첫번째 76 N-말단 아미노산 잔기 이상 첫번째 137 N-말단 아미노산 잔기 이하로 이루어질 수 있다. 또 다른 방법으로, 결실부는 도1(서열번호 2)의 첫번째 92 N-말단 아미노산 잔기 이상 첫번째 137 N-말단 아미노산 잔기 이하로 이루어질 수 있다. 또 다른 방법으로, 결실부는 도1(서열번호 2)의 첫번째 103 N-말단 아미노산 잔기 이상 첫번째 137 N-말단 아미노산 잔기 이하로 이루어질 수 있다. 또 다른 방법으로, 결실부는 도1(서열번호 2)의 첫번째 122 N-말단 아미노산 잔기 이상 첫번째 137 N-말단 아미노산 잔기 이하로 이루어질 수 있다.
전술한 N-말단 결실 돌연변이체의 범위에 더하여, 본 발명은 전술한 범위의 모든 조합에 관한 것이며, 예컨대 다음과 같다: 도1(서열번호 2)의 첫번째 62 N-말단 아미노산 잔기 이상 첫번째 68 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부; 도1(서열번호 2)의 첫번째 62 N-말단 아미노산 잔기 이상 첫번째 76 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부; 도1(서열번호 2)의 첫번째 62 N-말단 아미노산 잔기 이상 첫번째 92 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부; 도1(서열번호 2)의 첫번째 62 N-말단 아미노산 잔기 이상 첫번째 103 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부; 도1(서열번호 2)의 첫번째 68 N-말단 아미노산 잔기 이상 첫번째 76 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부; 도1(서열번호 2)의 첫번째 68 N-말단 아미노산 잔기 이상 첫번째 92 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부; 도1(서열번호 2)의 첫번째 68 N-말단 아미노산 잔기 이상 첫번째 103 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부; 도1(서열번호 2)의 첫번째 46 N-말단 아미노산 잔기 이상 첫번째 62 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부; 도1(서열번호 2)의 첫번째 46 N-말단 아미노산 잔기 이상 첫번째 68 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부; 도1(서열번호 2)의 첫번째 46 N-말단 아미노산 잔기 이상 첫번째 76 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부 등.
다른 태양에서, C-말단 결실 돌연변이체는 본 발명에 의해 제공된다. 상기 C-말단 결실 돌연변이체의 N-말단 아미노산 잔기는 도1(서열번호 2)의 아미노산 잔기 1(Met), 36(Thr), 또는 37(Cys)가 바람직하다. 상기 돌연변이체는 최종 C-말단 아미노산 잔기(Ser(208)) 이상 최종 55 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실(즉, 아미노산 잔기 Glu(154)-Ser(208)의 결실)을 배제한 도1(서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 것으로 이루어진다. 또 다른 방법으로, 상기 결실부는 도1(서열번호 2)의 최종 C-말단 아미노산 잔기 이상 최종 65 C-말단 아미노산 잔기 이하로 이루어질 수 있다. 또 다른 방법으로, 상기 결실부는 도1(서열번호 2)의 최종 10 C-말단 아미노산 잔기 이상 최종 55 C-말단 아미노산 잔기 이하로 이루어질 수 있다.
또 다른 방법으로, 결실부는 도1(서열번호 2)의 최종 20 C-말단 아미노산 잔기 이상 최종 55 C-말단 아미노산 잔기 이하로 이루어질 수 있다. 또 다른 방법으로, 결실부는 도1(서열번호 2)의 최종 30 C-말단 아미노산 잔기 이상 최종 55 C-말단 아미노산 잔기 이하로 이루어질 수 있다. 또 다른 방법으로, 결실부는 도1(서열번호 2)의 최종 40 C-말단 아미노산 잔기 이상 최종 55 C-말단 아미노산 잔기 이하로 이루어질 수 있다. 또 다른 방법으로, 결실부는 도1(서열번호 2)의 최종 50 C-말단 아미노산 잔기 이상 최종 55 C-말단 아미노산 잔기 이하로 이루어질 수 있다.
전술한 C-말단 결실 돌연변이체의 범위에 더하여, 본 발명은 전술한 범위의모든 조합에 관한 것이며, 예컨대 다음과 같다: 도1(서열번호 2)의 최종 C-말단 아미노산 잔기 이상 최종 10 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부; 도1(서열번호 2)의 최종 C-말단 아미노산 잔기 이상 최종 20 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부; 도1(서열번호 2)의 최종 C-말단 아미노산 잔기 이상 최종 30 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부; 도1(서열번호 2)의 최종 C-말단 아미노산 잔기 이상 최종 40 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부; 도1(서열번호 2)의 최종 10 C-말단 아미노산 잔기 이상 최종 20 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부; 도1(서열번호 2)의 최종 10 C-말단 아미노산 잔기 이상 최종 30 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부; 도1(서열번호 2)의 최종 10 C-말단 아미노산 잔기 이상 최종 40 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부; 도1(서열번호 2)의 최종 20 C-말단 아미노산 잔기 이상 최종 30 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부 등.
또 다른 태양에서, N-말단 및 C-말단 잔기 모두로부터 결실된 아미노산을 갖는 결실 돌연변이체 또한 본 발명에 포함된다. 상기 돌연변이체는 전술한 N-말단 결실 돌연변이체 및 C-말단 결실 돌연변이체의 모든 조합을 포함한다. 상기 돌연변이체는 도1(서열번호 2)의 첫번째 46 N-말단 아미노산 잔기 이상 최종 첫번째 137 N-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부 및 도1(서열번호 2)의 최종 C-말단 아미노산 잔기 이상 최종 55 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부를 제외한 도1(서열번호2)의 아미노산 서열을 포함한 것으로 이루어진다. 또 다른 방법으로, 결실부는 도1(서열번호 2)의 첫번째 62, 68, 76, 92, 103 또는 122 N-말단 아미노산이고 137 N-말단 아미노산 잔기 이하, 도1(서열번호 2)의 최종 10, 20, 30, 40, 또는 50 C-말단 아미노산 잔기이고 최종 55 C-말단 아미노산 잔기 이하의 결실부로 이루어질 수 있다. 또한 전술한 범위의 모든 조합이 포함된다.
아미노산의 치환
본 발명의 추가적인 태양은 아미노산의 치환도 포함한다. 천연의 성숙한 KGF-2 는 44개의 하전된 잔기를 포함하며, 이들 중 32개는 양 전하를 가지고 있다. 단백질의 3차 구조에 있어서 상기 잔기의 위치에 따라 이들 1 이상의 클러스터형 잔기를 음 전하 또는 중성 전하를 가진 아미노산으로 치환하면 이웃한 잔기들의 정전기적 상호작용을 변경시킬 수 있고 상기 단백질의 응집을 감소시키고 안정성을 증가시키는 데 유용하다. 단백질의 응집은 면역원성일 수 있으므로 활성을 감소시킬 뿐 아니라 약학적 제제를 제조할 때 문제가 된다(Pinckard 등, Clin,Exp. Immunol. 2:331-340(1967), Robbins 등, Diabetes 36: 838-845(1987), Cleland 등, Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307-377(1993)). 일정 개질로 단백질 분자의 3차 구조에서의 전하 반발을 최소화하기 위한 노력을 해야 한다.따라서, 하전된 아미노산을 다른 전하 및 중성 또는 음으로 하전된 아미노산으로 치환하는 것을 특히 고려해야 한다. 중성 또는 음으로 하전된 아미노산으로 치환하면 단백질에서 양 전하를 감소시켜 KGF-2의 특성을 개선시킨다. 상기 개선은 천연의 KGF-2 단백질과 비교하여 동족체의 안정성을 증가시키고 응집을 감소시킨다.
아미노산의 치환은 선택적으로 세포 표면 수용체에의 결합을 변화시킬 수 있다. Ostade 등, Nature 361: 266-268(1993)에서는 특정 TNF 알파 돌연변이가 TNF 알파를 2개의 공지된 TNF 수용체 중 어느 하나에만 선택적으로 결합하게 한다는 것을 기재하였다.
또한 본 발명의 구체예는 1 이상 50 이하의, 보다 바람직하게는 40 이하의, 더욱 바람직하게는 30 이하의, 가장 바람직하게는 20 이하의 아미노산이 치환된 아미노산 서열을 갖는 KGF-2 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 물론, 바람직한 것을 순서대로 한다면, 1 이상, 20 이하, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1의 아미노산이 치환된 KGF-2 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 펩티드가 가장 바람직하다. 구체예에서, 도1의 아미노산 서열 또는 이의 단편(예컨대, 성숙형 및/또는 본원에 기재한 다른 단편)의 첨가, 치환 및/또는 결실의 수는 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 10-50 또는 50-150이고, 보전적 아미노산 치환이 바람직하다.
KGF-2 분자는 자연적인 돌연변이 또는 인간의 조작 모두에 의한 1 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함한다. 돌연변이는 전체 KGF-2, 성숙한 KGF-2, 다른 임의의 적합한 KGF-2 단편, 예컨대, A63-S208, S69-S208, V77-S208, R80-S208 또는 E-93-S208으로 제조할 수 있다. 어떤 바람직한 돌연변이의 예는 다음과 같은 것이 있다: Ala(49) Gln, Asn(51)Ala, Ser(54)Val, Ala(63)Pro, Gly(64)Glu, Val(67)Thr, Trp(79)Val, Arg(80)Lys, Lys(87)Arg, Tyr(88)Trp, Phe(89)Tyr, Lys(91)Arg, Ser(99)Lys, Lys(102)Gln, Lys(103)Glu, Glu(104)Met, Asn(105)Lys, Pro(107)Asn, Ser(109)Asn, Leu(111)Met, Thr(114)Arg, Glu(117)Ala, Val(120)Ile, Val(123)Ile, Ala(125)Gly, Ile(126)Val, Asn(127)Glu, Asn(127)Gln, Tyr(130)Phe,Met(134)Thr, Lys(136)Glu, Lys(137)Glu, Gly(142)Ala, Ser(143)Lys, Phe(146)Ser, Asn(148)Glu, Lys(151)Asn, Leu(152)Phe, Glu(154)Gly, Glu(154)Asp, Arg(155)Leu, Glu(157)Leu, Gly(160)His, Phe(167)Ala, Asn(168)Lys, Gln(170)Thr, Arg(174)Gly, Tyr(177)Phe, Gly(182)Gln, Ala(185)Val, Ala(185)Leu, Ala(185)Ile, Arg(187)Gln, Gln(190)Lys, Lys(195)Glu, Thr(197)Lys, Ser(198)Thr, Arg(194)Glu, Arg(194)Gln, Lys(191)Glu, Lys(191)Gln, Arg(188)Glu, Arg(188)Gln, Lys(183)Glu, Arg(187)Ala, Arg(188)Ala, Arg(174)Ala, Lys(183)Ala, Lys(144)Ala, Lys(151)Ala, Lys(153)Ala, Lys(136)Ala, Lys(137)Ala, 및 Lys(139)Ala.
상기 표시는 예를 들어, Ala(49)Gln은 도1(서열번호 2)의 49번 위치의 Ala가 Gln으로 치환되는 것을 나타내고자 한 것이다.
추가적으로, 다음의 돌연변이체가 특히 바람직하다: R188E에서의 점 돌연변이를 갖는 S69-S208; K191E에서의 점 돌연변이를 갖는 S69-S208; K149E에서의 점 돌연변이를 갖는 S69-S208; K183Q에서의 점 돌연변이를 갖는 S69-S208; K183E에서의 점 돌연변이를 갖는 S69-S208; R68G에서의 점 돌연변이를 갖는 S63-S208; R68S에서의 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R68A에서의 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R78A, R80A 및 K81A에서의 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; K81A, K87A 및 K91A에서의 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R78A, R80A, K81A, K87A 및 K91A에서의 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; K136A, K137A, K139A 및 K144A에서의 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; K151A, K153A 및 K155A에서의 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R68G, R78A, R80A 및 K81A에서의 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R68G, K81A, K87A 및K91A에서의 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R68G, R87A, R80A, K81A, K87A 및 K91A에서 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R68G, K136A, K137A, K139A 및 K144A에서의 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R68G, K151A, K153A 및 R155A에서의 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R68S, R78A, R80A 및 K81A에서 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R68S, K81A, R87A 및 K91A에서 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R68S, R78A, R80A, K81A, K87A 및 K91A에서 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R68S, K136A, K137A K139A 및 K144A에서 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R68S, K151A, K153A 및 R155A에서 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R68A, R78A, R80A 및 K81A에서 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R68A, K81A, K87A 및 K91A에서 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R68A, R78A, R80A, K81A, K87A 및 K91A에서 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R68A, K136A, K137A, K139A 및 K144A에서 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R68A, K151A, K153A 및 R155A에서 점 돌연변이를 갖는 A63-S208. 또한 R68 내지 K91의 양으로 하전된 잔기를 갖는 A63-S208은 알라닌[A63-S208(R68-K91A)]으로 치환된다; R68 내지 K91의 양으로 하전된 잔기를 갖는 총길이 KGF-2는 알라닌[KGF-2(R68-K91A)]으로 치환된다; R68 내지 K91의 양으로 하전된 잔기를 갖는 A63-S208은 중성의 잔기, 예컨대, G, S, 및/또는 A로 치환된다; R68 내지 K91의 양으로 하전된 잔기를 갖는 총길이 KGF-2는 중성 잔기, 예컨대, G, S, 및/또는 A로 치환된다; R68 내지 K91의 양으로 하전된 잔기를 갖는 A63-S208은 음으로 하전된 잔기, 예컨대, D 및/또는 E로 치환된다; R68 내지 K91의 양으로 하전된 잔기를 갖는 총길이 KGF-2는 음으로 하전된 잔기, 예컨대, D 및/또는 E로 치환된다; R78A, R80A 및 K81A에서 점 돌연변이를 갖는 총 길이KGF-2; K81A, K87A 및 K91A에서 점 돌연변이를 갖는 총 길이 KGF-2; R68G에서 점 돌연변이를 갖는 총 길이 KGF-2; R68S에서 점 돌연변이를 갖는 총 길이 KGF-2; R68A에서 점 돌연변이를 갖는 총 길이 KGF-2; R174A 및 K183A에서 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; 및 R187A와 R188A에서 점 돌연변이를 갖는 A63-S208.
또한 바람직하게는, R188E, K191E, K149E, K183Q 또는 K183E에서 점 돌연변이를 갖는 A63-S208; R78A, R80A 및 K81A에서 점 돌연변이를 갖는 S69-S208; K81A, K87A 및 K91A에서 점 돌연변이를 갖는 S69-S208; R174A 및 K183A에서 점 돌연변이를 갖는 S69-S208; R187A 및 R188A에서 점 돌연변이를 갖는 S69-S208; R188E, K191E, K149E, K183Q 또는 K183E에서 점 돌연변이를 갖는 V77-S208; R78A, R80A 및 K81A에서 점 돌연변이를 갖는 V77-S208; K81A, K87A 및 K91A에서 점 돌연변이를 갖는 V77-S208; R174A 및 K183A에서 점 돌연변이를 갖는 V77-S208; R187A 및 R188A에서 점 돌연변이를 갖는 V77-S208; R188E, K191E, K149E, K183Q 또는 K183E에서 점 돌연변이를 갖는 R80-S208; R174A 및 K183A에서 점 돌연변이를 갖는 R80-S208; R187A 및 R188A에서 점 돌연변이를 갖는 R80-S208; R188E, K191E, K149E, K183Q 또는 K183E에서 점 돌연변이를 갖는 E93-S208; R174A 및 K183A에서 점 돌연변이를 갖는 E93-S208; 또는 R187A와 R188A에서 점 돌연변이를 갖는 E93-S208.
상기 점 돌연변이 모두도 전체 길이 KGF-2, 성숙한 KGF-2, 또는 본원에 기재한 기타 임의의 단편 KGF-2으로 제조될 수 있다. 상기 기호에서, R188E는 188번 위치의 아르기닌을 글루탐산으로 치환한 것을 나타낸다.
또한, 부위 지향 돌연변이체는 KGF-2의 각 아미노산에서, 바람직하게는 아미노산 A63과 E93 사이에서 제조할 수 있다. 각 아미노산은 다른 19개의 잔존 아미노산 중 하나에 의해 치환할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 돌연변이체는 다음과 같은 것들을 포함한다: C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 A63; A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 G64; A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 R65; A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 H66; A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, 또는 Y로 치환된 V67; A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 R68; A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 또는 Y로 치환된 S69; A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W로 치환된 Y70; A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 N71; A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 H72; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 L73; A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 Q74; A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 D76; A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W, 또는 Y로 치환된 V77; A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 R78; A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 Y로 치환된 W79; A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 R80; A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된K81; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 L82; A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 F83; A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 또는 Y로 치환된 S84; A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 F85; A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 T86; A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 K87; A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W로 치환된 Y88; A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 F89; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 L90; A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 K91; A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 I92; 및/또는 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 또는 Y로 치환된 E93.
이들 돌연변이체는 전술한 N-말단 결실 구조물, 특히 아미노산 M1, T36, C37 또는 A63으로 시작되는 구조물로 제조할 수 있다. 또한, 1종 이상의 아미노산(예: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10종)은 이 영역(A63 내지 E93)에서 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 그 결과 생성된 구조물은 헤파린 결합의 손실, KGF-2 활성의 손실 및/또는 아미노산 R68과 S69 사이의 효소적 절단을 스크리닝할 수 있다.
바람직한 돌연변이체는 상기 열거된 모든 N-말단 돌연변이체, 특히 T36, C37, A63, S69, V77, R80 또는 E93의 헤파린 결합 도메인 내의 돌연변이체뿐만 아니라, N-말단 결실 구조물 M1, T36, C37 및 A63 내의 아미노산 R68 및 S69에 위치한다. 헤파린 결합 도메인은 Arg 174와 Lys 183 사이에 있다. 바람직한 Arg 68 돌연변이체는 아르기닌을 Gly, Ser 또는 Ala으로 치환하고; 바람직한 Arg 187 돌연변이체는 아르기닌을 알라닌으로 치환한다.
돌연변이체를 제조할 수 있는 2가지 방법은 부위 지향 돌연변이 또는 가속 돌연변이이다[Kuchner and Anold, Tibtech 5: 523-530 (1997); Crameri 등, Nature(1998); 및 Christian 등, Nature Biotechnology 17: 259264(1999)]. 이들 방법은 당업계에 주지된 것이다.
변화는 단백질의 중첩 또는 활성에 유의적으로 영향을 미치지 않는 보전적 아미노산 치환과 같은 부수적인(minor) 성질에 대한 것임이 바람직하다. 당업자에 공지된 보전적 아미노산 치환의 예는 하기와 같다:
지방족 아미노산: 페닐알라닌
트립토판
티로신
소수성 아미노산: 류신
이소류신
발린
극성 아미노산: 글루타민
아스파라긴
염기성 아미노산: 아르기닌
라이신
히스티딘
산성 아미노산: 아스파르트산
글루탐산
소량의 아미노산: 알라닌
세린
트레오닌
메티오닌
글리신
물론, 당업자가 할 수 있는 아미노산 치환의 수는 전술한 것을 비롯한 다수의 인자에 따라 달라진다. 일반적으로, 임의의 소정 KGF-2 폴리펩티드에 대한 치환 수는 목적에 따라 다르지만 50, 40, 30, 20, 10, 5 또는 3 이상일 수 없다. 예를 들어, KGF-2의 C-말단에서 이루어져 안정성을 향상시킬 수 있는 다수의 치환은 상기 및 실시예 22에 기술되어 있다.
다음과 같은 것들을 비롯한 보전적 아미노산 치환을 갖는 KGF-2 분자가 특히 바람직하다: A, G, I, L, S, T 또는 V로 치환된 M1; F 또는 Y로 치환된 W2; H 또는 R로 치환된 K3; F 또는 Y로 치환된 W4; A, G, L, S, T, M 또는 V로 치환된 I5; A, G, I, L, S, M 또는 V로 치환된 T7; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S11; G, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 A12; Y 또는 W로 치환된 F13; K 또는 R로 치환된 H15; A, G, I, S, T, M 또는 V로 치환된 L16; A, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 G18;A, G, I, S, T, M 또는 V로 치환된 L25; A, G, I, S, T, M 또는 V로 치환된 L26; A, G, I, S, T, M 또는 V로 치환된 L27; W 또는 Y로 치환된 F28; A, G, I, S, T, M 또는 V로 치환된 L29; A, G, I, L, S, T 또는 M으로 치환된 V30; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S31; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S32; A, G, I, L, S, T 또는 M으로 치환된 V33; A, G, I, L, S, T 또는 M으로 치환된 V35; G, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 A39; A, G, I, S, T, M 또는 V로 치환된 L40; A, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 G41; N으로 치환된 Q42; E로 치환된 D43; A, G, I, L, S, T 또는 V로 치환된 M44; A, G, I, L, S, T 또는 M으로 치환된 V45; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S46; D로 치환된 E48; G, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 A49; A, G, I, L, S, M 또는 V로 치환된 T50; Q로 치환된 N51; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S52; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S53; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S54; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S55; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S56; W 또는 Y로 치환된 F57; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S58; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S59; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S61; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S62; G, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 A63; A, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 G64; H 또는 K로 치환된 R65; K 또는 R로 치환된 H66; A, G, I, L, S, T 또는 M으로 치환된 V67; H 또는 K로 치환된 R68; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S69; F 또는 W로 치환된 Y70; Q로 치환된 N71; K 또는 R로 치환된 H72; A, G, I, S, T, M 또는 V로 치환된 L73; N으로 치환된 Q74; A, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 G75; E로 치환된 D76; A, G, I, L, S, T 또는 M으로 치환된V77; H 또는 K로 치환된 R78; F 또는 Y로 치환된 W79; H 또는 K로 차환된 R80; H 또는 R로 치환된 K81; A, G, I, S, T, M 또는 V로 치환된 L82; W 또는 Y로 치환된 F83; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S84; W 또는 Y로 치환된 F85; A, G, I, L, S, M 또는 V로 치환된 T86; H 또는 R로 치환된 K87; F로 치환된 Y88; W 또는 Y로 치환된 F89; A, G, I, S, T, M 또는 V로 치환된 L90; H 또는 R로 치환된 K91; A, G, L, S, T, M 또는 V로 치환된 I92; D로 치환된 E93; H 또는 R로 치환된 K94; Q로 치환된 N95; A, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 G96; H 또는 R로 치환된 K97; A, G, I, L, S, T 또는 M으로 치환된 V98; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S99; A, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 G100; A, G, I, L, S, M 또는 V로 치환된 T101; H 또는 R로 치환된 K102; H 또는 R로 치환된 K103; D로 치환된 E104; Q로 치환된 N105; F 또는 W로 치환된 Y108; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S109; A, G, L, S, T, M 또는 V로 치환된 I110; A, G, I, S, T, M 또는 V로 치환된 L111; D로 치환된 E112; A, G, L, S, T, M 또는 V로 치환된 I113; A, G, I, L, S, M 또는 V로 치환된 T114; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S115; A, G, I, L, S, T 또는 M으로 치환된 V116; D로 치환된 E117; A, G, L, S, T, M 또는 V로 치환된 I118; A, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 G119; A, G, I, L, S, T 또는 M으로 치환된 V120; A, G, I, L, S, T 또는 M으로 치환된 V121; G, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 A122; A, G, I, L, S, T 또는 M으로 치환된 V123; H 또는 R로 치환된 K124; G, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 A125; A, G, L, S, T, M 또는 V로 치환된 I126; Q로 치환된 N127; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S128; Q로 치환된 N129; F 또는 W로 치환된 Y130; F 또는 W로 치환된 Y131; A, G, I, S, T, M 또는 V로 치환된 L132; G, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 A133; A, G, I, L, S, T 또는 V로 치환된 M134; Q로 치환된 N135; H 또는 R로 치환된 K136; H 또는 R로 치환된 K137; A, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 G138; H 또는 R로 치환된 K139; A, G, I, S, T, M 또는 V로 치환된 L140; F 또는 W로 치환된 Y141; A, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 G142; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S143; H 또는 R로 치환된 K144; D로 치환된 E145; W 또는 Y로 치환된 F146; Q로 치환된 N147; Q로 치환된 N148; E로 치환된 D149; H 또는 R로 치환된 K151; A, G, I, S, T, M 또는 V로 치환된 L152; H 또는 R로 치환된 K153; D로 치환된 E154; H 또는 K로 치환된 R155; A, G, L, S, T, M 또는 V로 치환된 I156; D로 치환된 E157; D로 치환된 E158; Q로 치환된 N159; A, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 G160; F 또는 W로 치환된 Y161; Q로 치환된 N159; A, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 G162; A, G, I, L, S, M 또는 V로 치환된 T163; F 또는 W로 치환된 Y164; G, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 A165; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S166; W 또는 Y로 치환된 F167; Q로 치환된 N168; F 또는 Y로 치환된 W169; N으로 치환된 Q170; K 또는 R로 치환된 H171; Q로 치환된 N172; A, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 G173; H 또는 K로 치환된 R174; N으로 치환된 Q175; A, G, I, L, S, T 또는 V로 치환된 M176; F 또는 W로 치환된 Y177; A, G, I, L, S, T 또는 M으로 치환된 V178; G, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 A179; A, G, I, S, T, M 또는 V로 치환된 L180; Q로 치환된 N181; A, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 G182; H 또는 R로 치환된 K183; A, I, L, S, T, M 또는 V로치환된 G184; G, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 A185; H 또는 K로 치환된 R187; H 또는 K로 치환된 R188; A, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 G189; N으로 치환된 Q190; H 또는 R로 치환된 K191; A, G, I, L, S, M 또는 V로 치환된 T192; H 또는 K로 치환된 R193; H 또는 K로 치환된 R194; H 또는 R로 치환된 K195; Q로 치환된 N196; A, G, I, L, S, M 또는 V로 치환된 T197; A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S198; G, I, L, S, T, M 또는 V로 치환된 A199; K 또는 R로 치환된 H200; W 또는 Y로 치환된 F201; A, G, I, S, T, M 또는 V로 치환된 L202; A, G, I, L, S, T 또는 V로 치환된 M203; A, G, I, L, S, T 또는 M으로 치환된 V205; A, G, I, L, S, T 또는 M으로 치환된 V206; K 또는 R로 치환된 H207; 또는 A, G, I, L, T, M 또는 V로 치환된 S208.
그러나, 다음과 같은 것들을 비롯한 비보전적 아미노산 치환을 갖는 KGF-2 분자도 또한 바람직하다: D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 M1; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 W2; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K3; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 W4; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 I5; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 L6; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 T7; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 H8; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y 또는 P로 치환된 C9; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 A10; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S11; D, E, H,K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 A12; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 F13; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y 또는 C로 치환된 P14; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 H15; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 L16; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y 또는 C로 치환된 P17; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 G18; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y 또는 P로 치환된 C19; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y 또는 P로 치환된 C20; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y 또는 P로 치환된 C21; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y 또는 P로 치환된 C22; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y 또는 P로 치환된 C23; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 F24; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 L25; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 L26; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 L27; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 F28; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 L29; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 V30; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S31; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S32; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 V33; D, E, H, K, R, N, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y 또는 C로 치환된 P34; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 V35; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는C로 치환된 T36; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y 또는 P로 치환된 C37; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 Q38; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 A39; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 L40; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 G41; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 Q42; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 D43; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 M44; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 V45; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S46; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y 또는 C로 치환된 P47; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 E48; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 A49; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 T50; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 N51; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S52; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S53; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S54; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S55; D, E, H, K, R, A, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S56; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 F57; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S58; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S59; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y 또는 C로 치환된 P60; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S61; D, E, H, K, R,N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S62; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 A63; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 G64; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 R65; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 H66; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 V67; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 R68; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S69; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 Y70; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 N71; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 H72; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 L73; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 Q74; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 G75; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 D76; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 V77; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 R78; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 W79; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 R80; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K81; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 L82; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 F83; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S84; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S84; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 F85; D, E, H, K, R, N, Q, F,W, Y, P 또는 C로 치환된 T86; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K87; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 Y88; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 F89; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 L90; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K91; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 I92; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 E93; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K94; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 N95; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 G96; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K97; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 V98; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S99; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 G100; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 T101; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K102; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K103; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 E104; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 N105; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y 또는 P로 치환된 C106; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y 또는 C로 치환된 P107; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 Y108; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S109; D, E, H, K, R, N, Q, F, W,Y, P 또는 C로 치환된 I110; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 L111; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 E112; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 I113; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 T114; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S115; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 V116; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 E117; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 I118; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 G119; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 V120; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 V121; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 A122; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 V123; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K124; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 A125; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 I126; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 N127; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S128; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 N129; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 Y130; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 Y131; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 L132; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 A133; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 M134; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 N135; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q,F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K136; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K137; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 G138; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K139; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 L140; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 Y141; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 G142; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y. P 또는 C로 치환된 S143; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K144; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 E145; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 F146; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 N147; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 N148; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 D149; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y 또는 P로 치환된 C150; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K151; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 L152; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K153; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 E154; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 R155; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 I156; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 E157; H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 E158; D, E, H, K, R, A, G,I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 N159; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 G160; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 Y161; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 N162; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 T163; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 Y164; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 A165; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S166; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 F167; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 N 168; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 W169; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 Q170; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 H171; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 N172; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 G173; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 R174; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 Q175; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 M176; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 Y177; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 V178; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 A179; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 L180; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 N181; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 G182; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q,F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K183; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 G184; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 A185; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y 또는 C로 치환된 P186; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 R187; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 R188; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 G189; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 Q190; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K191; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 T192; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 R193; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 R194; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 K195; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 N196; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 T197; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S198; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 A199; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 H200; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P 또는 C로 치환된 F201; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 L202; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y 또는 C로 치환된 P203; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 M204; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 V205; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 V206; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 H207; 또는 D,E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P 또는 C로 치환된 S208.
본 명세서에 기술된 분석법 중 하나로 치환 돌연변이체의 활성을 시험할 수 있다. 보존적 치환을 갖는 KGF-2 분자는 야생형 단백질의 활성 및 특성을 유지시키고; 모든 다른 활성 또는 특성이 유지되는 한, 야생형 단백질에 비하여 향상된 활성 또는 특성을 가지며; 야생형 단백질에 비하여 하나 이상의 향상된 활성 또는 특성을 가지는 것이 특히 바람직하다. 이와는 대조적으로, 비보전적 치환을 갖는 KGF-2 분자는 모든 다른 활성 및 특성이 유지되는 한, 야생형 단백질의 활성 또는 특성이 부족하거나; 또는 야생형 단백질 중 하나 이상의 활성 또는 특성이 부족하다.
예를 들어, 보존적 또는 비보전적 치환을 갖는 KGF-2 분자 내에서 변질될 수 있는 KGF-2의 활성 또는 특성으로는 다음과 같은 것들을 들 수 있으나 이들로 한정되는 것은 아니다: 케라티노사이트, 상피 세포, 모낭, 헤파토사이트, 신장 세포, 유방 조직, 방광 세포, 전립선 세포, 췌장 세포의 성장 자극; 근육 세포, 신경 조직, 전립선 세포, 폐 세포, 헤파토사이트, 신장 세포, 유방 조직의 분화 자극; 상처 치유의 촉진; 혈관 형성 자극; 염증의 감소; 세포 보호; 헤파린 결합; 리간드 결합; 안정성; 용해성; 및/또는 정제에 영향을 미치는 특성.
기능에 필수적인 KGF-2 내의 아미노산은 당업계에 주지된 방법, 예컨대 부위 지향 돌연변이 또는 알라닌-주사(alanin-scanning) 돌연변이[Cunningham and Wella, Science 244: 1081-1085 (1989)]에 의해 동정할 수 있다. 후자의 방법은 분자 내의 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입시키는 것이다. 이어서, 그 결과로 생성된 돌연변이체 분자의 생물학적 활성, 예컨대 수용체 결합, 또는 생체외 및 생체내 증식 활성에 대한 시험을 한다(예를 들어, 실시예 10 및 11을 참조하라). 또한, 리간드-수용체 결합에 중요한 부위는 구조 분석, 예컨대 결정화, 핵 자기 공명 또는 광학적 친화성 표지에 의해 측정할 수 있다(예컨대, 문헌[Smith 등, J. Mol. Biol, 224:899-904(1992)]을 참조하라).
본 발명의 다른 측면은 아미노산 위치 37, 106 및 150에서의 시스테인의 세린으로의 치환에 관한 것이다. 홀수의 시스테인은, 하나 이상의 시스테인 잔기가 단백질이 바람직하지 못한 3차원 구조를 채택하게 할 수 있는 분자간 가교 또는 결합에 이용될 수 있다는 것을 의미한다. 일반적으로, 하나 이상의 시스테인이 세린 또는 예컨대 알라닌에 의해 치환되게 하는 신규 KGF-2 단백질은 가용성의 정확히 중첩된 단백질의 고수율로 정제된다. 증명되지는 않았지만, 위치 106의 시스테인 잔기는 기능에 중요하다고 여겨진다. 이 시스테인 잔기는 모든 다른 FGF 계통의 구성 요소들보다 고도로 보전된다.
본 발명의 또 다른 측면은 KGF-2의 다른 단백질 또는 그 단편과의 융합, 예컨대 다른 FGF 단백질[예: KGF (FGF-7), bFGF, aFGF, FGF-5, FGF-6 등]과의 융합 또는 하이브리드(hybrid)에 관한 것이다. 공개된 PCT 출원 제 90/08771호에 KGF의 최초 40개의 아미노산 잔기 및 aFGF의 C-말단 부분으로 구성된 키메라 단백질의 생산에 대해 기재되어 있다. 키메라는 KGF와 같은 표적 케라티노사이트로 보고되었지만, 키메라가 헤파린에 대한 감수성, aFGF의 특징이 부족한 반면에 KGF는 그러하지 아니하다. 면역글로불린(IgG)의 불변 도메인 중 일부와의 융합은 종종 생체내에서증가된 반감기를 나타낸다. 예를 들어, 이것은 포유동물 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 각종 도메인을 갖는 인간 CD4-폴리펩티드의 최초 2개의 도메인으로 구성된 키메라 단백질을 나타낸다[유럽 특허출원, 공개번호 제394827호, Traunecker 등, Nature 331: 84-86(1988)]. 또한, 디설피드 결합된 이합체 구조를 가지는 융합 단백질도 단독으로 단량체 분자를 결합시키는데 보다 효과적일 수 있다[Fountoulakis 등, J. of Biochemistry, 270: 3958-3964, (1995)].
본 발명의 추가의 융합 단백질은 유전자-슈플링(gene-shuffling), 모티프-슈플링(motif-shuffling), 엑손-슈플링 및/또는 코돈 슈플링(이들을 집합적으로 "DNA 슈플링"이라 칭함)을 통해 생성할 수 있다. DNA 슈플링은 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 조절하는데 이용할 수 있으며, 상기 방법은 변질된 활성을 갖는 폴리펩티드뿐만 아니라 폴리펩티드의 작동 물질 및 길항 물질을 생성시키는데 사용할 수 있다. 일반적으로, 미국 특허 제5,605,793호, 제5,811,238호, 제5,830,721호, 제5,834,252호 및 제5,837,458호; 및 문헌 [Patten 등, Curr. Opinion Biotechnol. 8: 724-33 (1997)], [Harayama, Trends Biotechnol. 16(2):76-82 (1998)], [Hansson 등, J. Mol. Biol. 287:265-76 (1999)] 및 [Lorenzo와 Blasco, Biotechniques 24(2): 308-13 (1998)]을 참조하라(이들 특허 및 간행물은 그 내용 모두를 본 명세서에 참고로 인용함). 일 실시태양에 있어서, SEQ ID NO:1에 상응하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 변질은 DNA 슈플링에 의해 달성할 수 있다. DNA 슈플링은 상동성 또는 부위 특이성 재조합에 의한 2 이상의 DNA 분절(segment)의 집합을 포함하여 폴리뉴클레오티드서열에 있어서의 변이를 일으킨다. 다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 암호화된 폴리펩티드는 오류를 일으키기 쉬운 PCR에 의한 무작위 돌연변위, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 재조합 이전의 다른 방법에 의해 변질될 수 있다. 다른 실시태양에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 1 이상의 구성 성분, 모티프, 절편(section), 부분(part), 단편 등은 1종 이상의 이종(異種) 분자의 1 이상의 구성 성분, 모티프, 절편, 부분, 단편 등과 재조합할 수 있다.
KGF-2의 항원성/친수성 부분
도 4A-4E에 설명되어 있는 바와 같이, KGF-2 단백질 내에 4개의 주요 고도 친수성 영역이 있다. 아미노산 잔기는 Gly 41-Asn 71, Lys 91-Ser 109, Asn 135-Tyr 164 및 Asn 181-Ala 199 [SEQ ID NOS 25-28]이다. 2개의 추가 항원성 영역으로서 보다 짧고 예정된 항원성 영역, 즉 도 1의 Gly 74-Arg 78(SEQ ID NO:2) 및 도 1의 Gln 170-Gln 175(SEQ ID NO:2)가 있다. 친수성 부분은 주로 단백질의 외부 (표면)에 있고 따라서 이들 영역을 인식하는 항체에 유용하다고 공지되어 있다. 또한, 이들 영역은 KGF-2와 그 수용체(들)의 결합과 관련되기 쉽다. 이들 영역으로부터 유도된 합성 펩티드는 KGF-2와 그 수용체(들)의 결합을 방해하고 따라서 단백질의 기능을 차단할 수 있다. 또한, 단백질의 친수성 부분으로부터 유래된 합성 펩티드는 KGF-2의 작동성, 즉 모의(mimic) 기능일 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 KGF-2의 친수성 영역을 포함하는 분리된 폴리펩티드에 관한 것인데, 상기 폴리펩티드는 1 이상의 전술한 KGF-2 친수성 영역을 포함하며, 그 길이가 150개 이하의 아미노산, 바람직하게는 100개, 75개 또는 50개 이하의 아미노산에 해당한다.
KGF-2의 에피토프 함유 부분
다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프 함유 부분을 포함하는 폴리펩티드 및 펩티드를 제공한다. 이들 에피토프는 본 발명의 폴리펩티드의 면역원성 또는 항원성 에피토프이다. "면역원성 에피토프"는 본 발명의 전체 폴리펩티드 또는 그 단편이 면역원일 경우 생체내 항체 반응을 유발하는 단백질의 부분이라고 정의한다. 반면에, 항체가 결합할 수 있는 폴리펩티드의 영역은 "항원 결정기" 또는 "항원성 에피토프"라고 정의한다. 일반적으로, 단백질의 생체내 면역원성 에피토프의 수는 항원성 에피토프의 수보다 적다. 예컨대, 문헌[Geysen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983)]을 참조하라. 그러나, 파지 디스플레이(phage display)를 사용함으로써, 항원성 에피토프에 대한 항체를 만들 수 있는데, 상기 에피토프가 면역원성 에피토프인가 여부를 불문한다. 예컨대, 문헌[Petersen G. 등, Mol. Gen. Genet. 249:425-431 (1995)]을 참조하라. 따라서, 면역원성 에피토프 및 항원성 에피토프 모두 본 발명에 포함된다.
면역원성 에피토프를 포함하는 예시된 아미노산 서열 목록은 하기 표 1에 나타나 있다. 표 1은 문헌[Jameson과 Wolf, (1988) Comp. Appl. Biosci. 4:181-186](이 문헌의 모든 내용을 본 명세서에 참고로 인용함)의 알고리즘을 사용하여 최고의 항원성을 가지도록 예정된 에피토프를 포함하는 아미노산 잔기들만 열거한다는 것을 나타낸다. 생략성 매개변수를 사용하는 컴퓨터 프로그램 PROTEAN(미국 위스콘신주 매디슨 사우스 파크 스트리트 1228 소재 DNASTAR, Inc의 파워 매킨토시 버전 3.11)을 사용하여 Jameson-Wolf 항원 분석을 수행하였다. 표 1 및 표 1에 열거되지 않은 폴리펩티드 부분은 비면역원성이라고 여겨진다. 다른 면역원성 에피토프는 사용된 특정 알고리즘에 의해 그 자체로서 인식되는 것만은 아니기 때문에, 표 1의 면역원성 에피토프는 예시된 목록이고 망라적인 목록이 아니다. 통상, 다른 면역원성 에피토프를 포함하는 아미노산 잔기는 Jameson-Wolf 분석과 유사한 알고리즘을 사용하거나, 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하는 생체내 항원 반응 시험에 의해 측정할 수 있다. 예컨대, Geysen 등의 상기 인용 문헌, 및 미국 특허 제4,708,781호, 제5,194,392호, 제4,433,092호 및 제5,480,971호를 참조하라(상기 참조 문헌들의 내용 모두를 본 명세서에 참고로 인용함).
본 발명의 항원성 에피토프 함유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열 내에 포함된 바람직하게는 7개 이상, 보다 바람직하게는 9개 이상, 가장 바람직하게는 15개 내지 30개 이상의 아미노산을 함유한다. KGF-2 특이성 항체에 사용될 수 있는 항원성 폴리펩티드 또는 펩티드의 예로는 다음과 같은 것들을 들 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다: SEQ ID NO:2 [약 Gly 41-Asn 71; Lys 91-Ser 109; Asn 135-Tyr 164; Asn 181-Ala 199; Gln74-Arg 78; 및 Gln 170-Gln175] 내의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드. 이들 폴리펩티드 단편은 도 4에 도시된 바와 같이 Jameson-Wolf 항원성 지수(index)의 분석에 의해 KGF-2 단백질의 항원성 에피토프의 함유 여부를 측정할 수 있다.
특히, 그것은 표 1의 아미노산 서열이 면역원성 에피토프를 포함한다는 것을가리킨다. 표 1은 Jameson-Wolf 분석에 의해 측정된 면역원성 에피토프의 중요한 잔기만을 열거한 것이다. 따라서, 표 1의 서열에 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 및 C-말단 종말부 상의 추가의 플랭킹(flanking) 잔기를 첨가하여 본 발명의 에피토프 함유 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 따라서, 표 1의 면역원성 에피토프는 추가의 N-말단 또는 C-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 추가의 플랭킹 아미노산 잔기는 본 발명의 폴리펩티드로부터 유래한 인접 플랭킹 N-말단 및/또는 C-말단 서열 또는 이종 폴리펩티드 서열이거나, 또는 본 발명의 폴리펩티드로부터 유래한 인접 플랭킹 서열 및 이종 폴리펩티드 서열 둘다를 포함할 수 있다. 면역원성 또는 항원성 에피토프를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는 그 길이가 7개 이상의 아미노산 잔기에 해당한다. "~이상"은 면역원성 또는 항원성 에피토프를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 길이가 7개의 아미노산 잔기에 해당하거나, 또는 7과 본 발명의 전체 폴리펩티드 길이의 아미노산 잔기의 수 사이의 임의의 정수일 수 있다. 면역원성 또는 항원성 에피토프를 포함하는 바람직한 폴리펩티드의 길이는 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개 또는 100개 이상의 아미노산 잔기에 해당한다. 그러나, 그것은 7과 전체 길이의 폴리펩티드의 아미노산 잔기 수 사이의 각각의 정수 및 모든 정수가 본 발명에 포함된다는 것을 가리킨다.
면역원성 및 항원성 에피토프 함유 단편들은 전술한 바와 같은 인접 아미노산 잔기에 의해 특정되거나 또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 상의 이들 단편의 N-말단 또는 C-말단 위치에 의해 특정될 수 있다. SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 상에 길이가 예컨대 7개 이상 또는 15개 이상의 인접 아미노산 잔기에 해당하는 단편이 차지하는 N-말단 또는 C-말단 위치의 모든 조합은 본 발명에 포함된다. 또한, "길이가 7개 이상의 인접 아미노산 잔기에 해당하는"이란 길이가 7개의 아미노산 잔기에 해당하거나, 또는 7과 본 발명의 전체 폴리펩티드 길이의 아미노산 잔기의 수 사이의 임의의 정수의 아미노산 잔기에 해당한다는 것을 의미한다. 구체적으로, 7과 전체 길이의 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 수 사이의 각각의 정수 및 모든 정수가 본 발명에 포함된다.
예를 들어, 본 발명의 면역원성 및 항원성 에피토프 함유 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드를 특이적으로 결합시키는데 유용하고, 본 발명의 폴리펩티드를 검출하는 면역 분석에 유용하다. 예를 들어, 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 친화성 정제에 유용하다. 또한, 항체는 각종 정성적 또는 정량적 면역 분석, 특히 공지의 방법을 사용하는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 정성적 또는 정량적 면역 분석에 통상적으로 사용할 수 있다. 예컨대, 문헌[Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 제2판, Cold Spring Harbor, 뉴욕 (1988)]을 참조하라.
본 발명의 에피토프 함유 폴리펩티드는 당업계에 공지된 합성 및 재조합 방법을 비롯하여 폴리펩티드를 생산하는 임의의 종래 수단에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, 에피토프 함유 펩티드는 공지된 화학적 합성 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, Houghten은 다수의 펩티드, 예컨대 HA1 폴리펩티드의 분절의 단일 아미노산 변이체들을 나타내고 이들 모두는 4주 이내에 제조되고 (ELISA 타입 결합 연구에 의해) 특성이 규명되는, 10-20 mg의 248 개체 및 별개의 13 잔기 펩티드 합성을 위한 간단한 방법에 대해 기술한 바 있다[Houghten, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985)]. 이러한 "동시 다중 펩티드 합성(Simultaneous Multiple Peptide Synthesis; SMPS)"은 Houghten과 그의 협력자들의 미국 특허 제4,631,211호에 추가로 기재되어 있다(1986). 이 방법에 있어서, 각종 펩티드의 고체상 합성을 위한 개별 수지는 고체상 방법과 관련된 다수의 동일한 반복 공정의 최적 사용을 가능하게 하는 분리된 용매 투과성 집괴(packet) 내에 함유된다. 완전 수작업 공정은 500-1000 또는 그 이상의 합성이 동시에 수행되는 것을 가능하게 한다[Houghten 등, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5131-5135, 특히 5134].
본 발명의 에피토프 함유 폴리펩티드는 생체내 면역화, 생체외 면역화 및 파지 디스플레이 방법을 포함하나 이들로 한정되는 것은 아닌 당업계에 주지된 방법에 따라 항체를 유발시키는데 사용할 수 있다. 예컨대, Sutcliff 등의 참고 문헌, Wilson 등의 참고 문헌, 및 Bittle 등의 참고 문헌[J. Gen. Virol., 66: 2347-2354 (1985)를 참조하라. 생체내 면역화를 사용하는 경우, 유리 펩티드로 동물을 면역화시킬 수 있다; 그러나, 거대분자 캐리어[예컨대, 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH) 또는 파상풍 톡소이드]에 펩티드를 커플링시킴으로써 항-펩티드 항체 역가를 추가 투여할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기 함유 펩티드는 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드(MBS)와 같은 결합제(linker)를 사용하여 캐리어에 커플링시킬 수 있는 반면에, 다른 펩티드는 보다 일반적인 결합제(예: 글루타르알데히드)를 사용하여 캐리어에 커플링시킬 수 있다. 예를 들어, 약 100 ㎍의펩티드 또는 캐리어 단백질, 및 프로인트 아쥬반트(Freund's adjuvant) 또는 면역 반응을 자극하는 것으로 공지된 임의의 다른 아쥬반트를 함유하는 에멀션의 복강내 및/또는 피내 주사에 의해 유리 펩티드 또는 캐리어가 커플링된 펩티드로 동물(예: 토끼, 랫트 및 마우스)을 면역화한다. 예를 들어, 고체 표면에 흡착된 유리 펩티드를 사용하는 ELISA 분석에 의해 검출될 수 있는 항펩티드 항체의 유용한 역가를 제공하기 위해 약 2주 간격으로 약간의 추가 접종 주사를 필요로 할 수 있다. 면역화된 동물 혈청 내의 항펩티드 항체의 역가는 항펩티드 항체의 선택(예컨대, 당업계에 주지된 방법에 따라 고체 지지체 상의 펩티드에의 흡착 및 선택된 항체의 용출)에 의해 증가시킬 수 있다.
당업자는 전술한 바와 같이 면역원성 또는 항원성 에피토프를 함유하는 본 발명의 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다고 평가할 것이다. 예를 들어, 면역글로불린(IgA, IgE, IgG, IgM)의 불변 도메인 또는 그 부분(CH1, CH2, CH3 또는 이들의 임의의 조합 및 그 부분)과 본 발명의 폴리펩티드를 융합시켜 키메라 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 상기 융합 단백질은 정제를 촉진시킬 수 있고, 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다. 이는 인간 CD4-폴리펩티드의 최초 2개의 도메인, 및 포유동물 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 각종 도메인으로 구성된 키메라 단백질의 경우에 나타난다. 예컨대, EP 394,827 및 문헌[Traunecker 등, Nature, 331: 84-86 (1988)]을 참조하라. FcRn 결합 파트너(예: IgG) 또는 Fc 단편에 포합된 항원(예: 인슐린)의 경우 상피 장벽을 횡단하여 면역계에 항원을 수송하는 성능이 향상된 것임을 입증한다(예컨대, PCT 공보 WO96/22024 및 WO 99/04813을 참조하라). 또한, IgG 부분의 디설피드 결합때문에 디설피드 결합된 이합체 구조를 가지는 IgG 융합 단백질은 단량체 폴리펩티드 또는 그 단편뿐일 때보다 다른 분자의 결합 및 중화에 더 효과적임이 밝혀졌다. 예컨대, 문헌[Fountoulakis 등, J. Biochem., 270: 3958-3964 (1995)]을 참조하라. 또한, 상기 에피토프를 암호화하는 핵산을 에피토프 표지[예: 적혈구응집소("HA") 표지 또는 플래그 표지(flag tag)]로서의 중요 유전자로 재조합하여, 발현된 폴리펩티드의 검출 및 정제를 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, Janknecht 등에 의해 기술된 시스템은 인간 세포주 내에 발현된 비변성(non-denatured) 융합 단백질의 신속하고 용이한 정제를 가능하게 한다(Janknecht 등, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897). 이 시스템에서, 중요 유전자는 백시니아(vaccinia) 재조합 플라스미드로 서브클로닝됨으로써, 유전자의 개방 해독 구조는 6개의 히스티딘 잔기로 이루어진 아미노 말단 표지에 번역가능하게 융합된다. 상기 표지는 융합 단백질을 위한 매트릭스 결합 도메인의 역할을 한다. 재조합 백시니아 바이러스로 감염된 세포로부터의 추출물을 Ni2+니트릴로아세트산-아가로스 칼럼상에 적재하고, 히스티딘 표지된 단백질을 이미다졸 함유 완충제로써 선택적으로 용출시킬 수 있다.
화학적 변형
또한, KGF 야생형 및 유사체는 통상의 단백질 부분이 아닌 추가의 화학적 부분을 함유하도록 변형시킬 수 있다. 이와 같이 유도체화된 부분은 용해도, 생물학적 반감기 또는 단백질의 흡착을 향상시킬 수 있다. 또한, 상기 유도체화된 부분은단백질의 임의의 바람직한 부작용 등을 감소시키거나 제거할 수 있다. 상기 유도체화된 부분에 대한 개관은 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 제18판, 미국 펜실베니아주 이스톤 소재 Mack Publishing Co. (1990)]에서 찾을 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)는 치료용 단백질의 제조에 유용한 화학적 부분이다. 단백질에의 PEG 부착은 단백질 분해로부터 보호하기 위해 나타난다[Sada 등, J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139 (1991)]. 각종 방법이 특정 PEG 부분의 부착에 유용하다. 이에 대한 검토를 하려는 경우, 문헌[Abuchowski 등, in Enzymes as Drugs.(Holcerberg and Roberts, eds.)pp. 367-383 (1981)]을 참조하라. 다수의 공개된 특허[예컨대, Ono 등의 미국 특허 제5,342,940호; Nitecki 등의 미국 특허 제5,089,261호; Delgado 등의 미국 특허 제5,349,052호]는 PEG 유도체 및 그 제조 방법에 대해 기술하고 있다. 일반적으로, PEG 분자는 단백질 상에서 밝혀진 반응성기에 의해 단백질과 연결된다. 아미노기(예컨대, 리신 상의 아미노기) 또는 단백질의 아미노 말단은 다른 어떤 것보다 상기 부착에 편리하다.
"폴리펩티드 및 펩티드"에 관하여 이 섹션에 인용된 각 문헌의 전체 기재 내용은 본 명세서에 참고로 인용한다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 기법을 사용하여 화학적으로 합성한다(예컨대, 문헌 [Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, 미국 뉴욕주 소재 W.H. Freeman & Co.] 및 [Hunkapiller 등, Nature, 310: 105-111 (1984)]을 참조하라. 예를 들어, KGF-2 폴리펩티드의 단편에 상응하는 폴리펩티드는 펩티드 합성 장치의 사용에 의해 합성할 수 있다. 또한, 경우에따라, KGF-2 폴리펩티드 서열에의 치환 또는 부가로서 비고전(nonclassical) 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체를 도입시킬 수 있다. 일반적으로, 비고전적 아미노산으로는 다음과 같은 것들을 들 수 있으나 이들로 한정되는 것은 아니다: 통상의 아미노산의 D-이성질체, 2,4-디아미노부티르산, α-아미노이소부티르산, 4-아미노부티르산, Abu, 2-아미노 부티르산, g-Abu, e-Ahx, 6-아미노 헥사노산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 히드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테인산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, b-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너(designer) 아미노산[예: b-메틸 아미노산, Ca-메틸 아미노산, Na-메틸 아미노산] 및 아미노산 유도체. 또한, 아미노산은 D(우선성) 또는 L(좌선성)일 수 있다.
본 발명은 예컨대 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지의 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 항체 분자 또는 다른 세포성 리간드에의 결합 등에 의해 번역 중 또는 후에 차별적으로 변형된 KGF-2 폴리펩티드를 포함한다. 시아노겐 브로마이드, 트립신, 키모트립신, 파파인, V8 프로테아제, NaBH4에 의한 특이성 화학적 절단; 아세틸화, 포르밀화, 산화, 환원; 튜니카마이신 존재 하의 대사성 합성 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 공지의 기법에 의해 임의의 수많은 화학적 변형을 수행할 수 있다.
본 발명에 포함되는 추가의 번역 후 변형의 예로는 N-결합된 또는 O-결합된 탄화수소쇄, N-말단 또는 C-말단 종말부의 처리, 아미노산 골격에의 화학적 부분의부착, N-결합된 또는 O-결합된 탄화수소쇄의 화학적 변형, 원핵생물 숙주 세포 발현의 결과로서 N-말단 메티오닌 잔기의 부가 또는 결실을 들 수 있다. 또한, 검출가능한 라벨(예컨대, 효소 라벨, 형광 라벨, 동위원소 또는 친화성 라벨)로 폴리펩티드를 변형시켜 단백질의 검출 및 분리를 가능하게 할 수 있다.
또한, 본 발명은 추가의 장점(예컨대, 증가된 용해도, 안정성 및 폴리펩티드의 순환 시간; 또는 감소된 면역원성)을 제공할 수 있는, 화학적으로 변형된 본 발명의 폴리펩티드의 유도체를 제공한다(미국 특허 제4,179,337호를 참조하라). 유도체화용 화학적 부분은 수용성 중합체(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜 등)으로부터 선택할 수 있다. 폴리펩티드는 분자 내 임의의 위치 또는 분자 내 예정된 위치에서 변형될 수 있고, 1, 2, 3 또는 그 이상의 부착된 화학적 부분을 포함할 수 있다.
상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지되거나 분지되지 아니할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 경우, 용이하게 조작 및 제조하는데 바람직한 분자량은 약 1 kDa 내지 약 100 kDa이다("약"이란 용어는 폴리에틸렌 글리콜 제조에 있어서 일부 분자의 경우 상기 분자량 이상이고 일부 분자의 경우 상기 분자량 이하임을 의미한다). 소정의 치료 프로필(예: 소정의 서방의 지속, 생물학적 활성과 무관한 효과, 조작의 용이성, 항원성의 정도 또는 부족, 치료용 단백질 또는 유사체에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 다른 공지된 효과)에 따라 다른 크기의 분자를 사용할 수 있다.
단백질의 기능성 또는 항원성 도메인에 대한 영향을 고려하여 단백질에 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 다른 화학적 부분)을 부착시켜야 한다. 당업자에게 유용한 다수의 부착 방법[예컨대, 본 명세서에 참고로 인용된 EP 0 401 384(G-CSF에 PEG를 커플링시키는 방법)]이 있으며, 그 밖에 문헌[Malik 등, Exp. Hematol. 20:1028-1035(1992); 트레실 클로라이드를 사용하는 GM-CSF의 PEG화(pegylation)에 대해 보고되어 있음]을 참조하라. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 반응성기(예컨대, 유리 아미노기 또는 카르복실기)에 의해 아미노산 잔기를 통해 공유 결합될 수 있다. 반응성기는 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 분자가 결합될 수 있는 기이다. 유리 아미노기를 가지는 아미노산 잔기는 리신 잔기 및 N-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며; 유리 카르복실기를 가지는 아미노산 잔기는 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기 및 C-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부착시키는 반응성기로서 설프히드릴기를 사용할 수 있다. 아미노기에의 부착(예컨대 N-말단 또는 리신 기에의 부착)은 치료 목적으로 바람직하다.
특히, N-말단에서 화학적으로 변형된 단백질이 바람직할 수 있다. 본 발명의 조성물의 실례로서 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 경우, 각종 폴리에틸렌 분자(분자량, 분지 등에 의해), 반응 혼합물 중의 폴리에틸렌 글리콜 대 단백질 (폴리펩티드) 분자의 비율, 수행되는 PEG화의 유형, 및 선택된 N-말단이 PEG화된 단백질을 수득하는 방법으로부터 선택할 수 있다. N-말단 PEG화 제제를 수득하는 방법(즉, 필요한 경우 다른 모노PEG화된(monopegylated) 부분으로부터 이 부분을 분리하는 방법)은 다수의 PEG화 단백질 분자로부터 N-말단이 PEG화된 물질의 정제에 의할 수있다. N-말단 변형에서 화학적으로 변형된 선택 단백질은 특정 단백질에 있어서의 유도체화에 유용한 상이한 유형의 1차 아미노기(리신 대 N-말단)의 차별적인 반응성을 이용하는 환원적 알킬화에 의해 달성할 수 있다. 적당한 반응 조건 하에, 중합체를 함유하는 카르보닐기로 N-말단에서 단백질의 실질적으로 선택적인 유도체화를 달성한다.
항체
본 발명의 추가의 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편, 또는 SEQ ID NO:2의 변이체, 및/또는 에피토프를 면역 특이적으로 결합시키는 항체 및 T-세포 항원 수용체(TCR)에 관한 것이다(특이성 항체-항원 결합을 분석하는 방법으로 당업계에 주지된 면역 분석에 의해 측정할 경우). 본 발명의 항체로는 다클론성 항체, 단일클론성 항체, 다중 특이성 항체, 인간 항체, 인유화 항체 또는 키메라 항체, 단일쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 단편 라이브러리에 의해 생산되는 단편, 항-이디오타입(항-Id) 항체(예컨대, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체를 포함) 및 이들의 임의의 에피토프 결합 단편을 들 수 있으나 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린의 면역학적 활성 부분, 즉 면역 특이적으로 항원을 결합시키는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 의미한다. 본 발명의 면역글로불린 분자는 면역글로불린의 임의의 유형(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
항체는 본 발명의 인간 항원-결합 항체 단편임이 가장 바람직하고, 상기 항체로는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일쇄 Fvs(scFv), 단일쇄 항체, 디설피드 결합된 Fvs (sdFv) 및 VL또는 VH도메인을 포함하는 단편을 들 수 있으나 이들로 한정되는 것은 아니다. 단일쇄 항체를 비롯한 항원-결합 항체 단편은 단독으로 또는 다음과 같은 것들과 함께 가변 영역(들)을 포함할 수 있다: 경첩(hinge) 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인. 또한, 경첩 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인과 가변 영역(들)의 임의의 조합을 포함하는 항원-결합 항체 단편도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체는 조류 및 포유류를 비롯한 동물에 기원을 둘 수 있다. 항체는 인간, 뮤린(예: 마우스 및 랫트), 원숭이, 발진(ship) 토끼, 산양(goat), 기니아 피그(guinea pig), 말 또는 닭임이 바람직하다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가지는 항체를 포함하고, 인간 면역글로불린 라이브러리 또는 1종 이상의 인간 면역글로불린에 대해 형질전환한 동물로부터 분리된 항체를 포함하며, 아래에 그리고 예컨대 Kucherlapati 등의 미국 특허 제5,939,598호에 기재되어 있는 바와 같이 내인성 면역글로불린을 발현시키지 않는다.
본 발명의 항체는 단일 특이성, 이중 특이성, 삼중 특이성 또는 그 이상의 다중 특이성일 수 있다. 다중 특이성 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 대한 특이성이 있을 수 있거나, 또는 본 발명의 폴리펩티드 및 이종 에피토프(예컨대, 이종 폴리펩티드 또는 고체 지지체 물질)에 대한 특이성이 있을 수 있다. 예컨대, PCT 공보 WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360, WO 92/05793; 문헌[Tutt 등, J. Immunol. 147: 60-69 (1991)]; 미국 특허 제4,474,893호,제4,714,681호, 제4,925,648호, 제5,573,920호, 제5,601,819호; 및 문헌[Kostelny 등, J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992)]을 참조하라.
본 발명의 항체는 인식하고 특이적으로 결합하는 본 발명의 에피토프(들) 또는 폴리펩티드 부분(들)의 관점에서 기술하거나 구체화할 수 있다. 에피토프(들) 또는 폴리펩티드 부분(들)은 예컨대 N-말단 위치 및 C-말단 위치, 인접 아미노산 잔기 내의 크기에 의해 본 명세서에 기술된 바와 같이 상세한 설명에 설명하거나, 또는 표 및 도면에 열거할 수 있다. 본 발명의 바람직한 에피토프는 이들 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 SEQ ID NO:2의 아미노산 41-71, 91-109, 135-164, 181-199, 74-78 및 170-175를 포함한다. 또한, 본 발명의 임의의 에피토프 또는 폴리펩티드를 특이적으로 결합시키는 항체를 배제할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 특이적으로 결합시키는 항체를 포함하며, 상기 항체를 배제하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명의 항체는 교차 반응성의 관점에서 기술하거나 구체화할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 임의의 다른 유사체, 정형체(ortholog) 또는 동족체를 결합시키지 않는 항체를 포함한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드에 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 65% 이상, 60% 이상, 55% 이상 및 50% 이상의 동일성(identity)으로(당업계에 공지되어 있고 본 명세서에 기재되어 있는 방법을 사용하여 계산된 것임) 폴리펩티드를 결합시키는 항체도 본 발명에 포함된다. 특정 실시태양에 있어서, 본 발명의 항체는 인간 단백질의 뮤린, 랫트 및/또는 토끼 동족체, 및 이들의 상응하는 에피토프와 교차 반응한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드에 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하 및 50% 이하의 동일성(identity)으로(당업계에 공지되어 있고 본 명세서에 기재되어 있는 방법을 사용하여 계산된 것임) 폴리펩티드를 결합시키지 않는 항체도 본 발명에 포함된다. 특정 실시태양에 있어서, 상기 교차 반응성은 임의의 단일 특이적 항원성 또는 면역원성 폴리펩티드, 또는 본 명세서에 기재되어 있는 특이적 항원성 또는 면역원성 폴리펩티드의 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 조합에 관한 것이다. 또한, 엄격한 하이브리드 형성 조건 하에서(본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이) 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 하이브리드를 형성시키는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 결합시키는 항체도 본 발명에 포함된다. 또한, 본 발명의 항체는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 결합 친화성의 관점에서 기술하거나 구체화할 수 있다. 바람직한 결합 친화성은 5 ×10-2M 이하, 10-2M 이하, 5 ×10-3M 이하, 10-3M 이하, 5 ×10-4M 이하, 10-4M 이하, 5 ×10-5M 이하, 10-5M 이하, 5 ×10-6M 이하, 10-6M 이하, 5 ×10-7M 이하, 10-7M 이하, 5 ×10-8M 이하, 10-8M 이하, 5 ×10-9M 이하, 10-9M 이하, 5 ×10-10M 이하, 10-10M 이하, 5 ×10-11M 이하, 10-11M 이하, 5 ×10-12M 이하, 10-12M 이하, 5 ×10-13M 이하, 10-13M 이하, 5 ×10-14M 이하, 10-14M 이하, 5 ×10-15M 이하 또는 10-15M 이하의 해리 상수를 가지는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 경쟁적 결합을 측정하는 방법으로서 당업계에 공지된 임의의 방법(예컨대, 본 명세서에 기재되어 있는 면역 분석)에 의해 측정할 경우 본 발명의 에피토프에 대한 항체의 결합을 경쟁적으로 저해하는 항체를 제공한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 항체는 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상 또는 50% 이상으로 에피토프에 대한 결합을 경쟁적으로 저해한다.
본 발명의 항체는 생체외 및 생체내 진단 및 치료 방법을 비롯한 본 발명의 폴리펩티드를 정제하고 검출하며 표적화하는 방법으로서 당업계에 공지된 방법을 포함하나 이에 한정되지 아니한 용도를 갖는다. 예를 들어, 상기 항체는 생물학적 샘플 내의 본 발명의 폴리펩티드의 레벨을 정성 및 정량적으로 측정하는 면역 분석에 있어서의 용도를 갖는다. 예컨대, 문헌[Harlow 등, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 제2판, 1988)](본 명세서에 상기 문헌의 기재 내용 모두를 참고로 인용함)을 참조하라.
본 발명의 항체는 단독으로 또는 다른 조성물과 함께 사용할 수 있다. 또한, 항체는 N-말단 또는 C-말단에서 이종 폴리펩티드에 재조합 방식으로 융합시키거나 폴리펩티드 또는 다른 조성물에 화학적으로 접합(공유 및 비공유 접함을 포함함)시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 검출 분석에 있어서의 라벨, 및 작동체(effector) 분자(예: 이종 폴리펩티드, 약물 또는 독소)에 재조합 방식으로 융합시키거나 접합시킬 수 있다. 예컨대, WO 92/08495, WO 91/14438, WO 89/12624; 미국 특허 제5,314,995호; 및 EP 0 396 387을 참조하라.
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 임의의 적당한 방법에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 항원성 단편을 동물에 투여하여 다클론성 항체를 함유하는 혈청의 생산을 유발시킬 수 있다. 용어 "단클론성 항체"는 하이브리도마 기법을 통해 생산된 항체로 한정되지 아니한다. 용어 "단클론성 항체"는 진핵생물 클론, 원핵생물 클론 또는 파지 클론으로부터 유도되는 항체를 의미하는 것이지 상기 항체가 생산되는 방법을 의미하는 것이 아니다.
하이브리도마 기법은 당업계에 공지되어 있고, 문헌 [Harlow 등, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 제2판, 1988)] 및 [Hammerling 등: MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS 563-681(Elsevier, N.Y., 1981)](이들 참조 문헌의 기재 내용 모두를 본 명세서에 참고로 인용함)에 기재된 방법을 포함한다. Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인(Fab 단편 생산을 위한) 또는 펩신[F(ab')2 단편 생산을 위한]과 같은 효소를 사용하여 단백질 분해 절단에 의해 생산할 수 있다.
대안으로, 본 발명의 항체는 재조합 DNA의 응용 및 파지 디스플레이 기법을 통해 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하는 합성 화학을 통해 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 각종 파지 디스플레이 기법을 사용하여 생산할 수 있다. 파지 디스플레이 방법에 있어서, 기능성 항체 도메인은 상기 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 파지 입자의 표면 상에 디스플레이한다. 소정의 결합 특성을 갖는 파지는 항원, 일반적으로는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원과 함께 직접 선택함으로써,레퍼토리형(repertoire) 또는 조합형 항체 라이브러리(예: 인간 또는 뮤린)를 선택한다. 일반적으로, 이들 방법에 사용되는 파지는 파지 유전자 Ⅲ 또는 유전자 Ⅷ 단백질에 재조합 방식으로 융합된 Fab, Fv 또는 디설피드로 안정화된 Fv 항체 도메인을 가지는 M13 또는 fd를 포함하는 섬유상 파지이다. 본 발명의 항체를 생산하는데 사용가능한 파지 디스플레이 방법의 예는 문헌 [Brinkman U. 등(1995), J. Immunol. Methods 182: 41-50], [Ames, R.S. 등(1995), J. Immunol. Methods 184: 177-186], [Kettleborough, C.A. 등(1994), Eur. J. Immunol. 24: 952-958], [Persic, L. 등(1997), Gene 187: 9-18], [Burton, D.R. 등(1994), Advances in Immunology 57: 191-280]; PCT/GB91/011334; WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401; 및 미국 특허 제5,698,426호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,750,753호, 제5,821,047호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5,516,637호, 제5,780,225호, 제5,658,727호 및 5,733,743호에 기재되어 있는 것들을 포함한다(상기 참조 문헌들의 기재 내용 모두를 본 명세서에 참고로 인용함).
상기 참고 문헌에 기재되어 있는 바와 같이, 파지 선택 후, 파지로부터의 항체 암호화 영역은 분리하고, 인간 항체 또는 임의의 다른 소정의 항원 결합 단편을 비롯한 모든 항체를 생성하는데 사용하며, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 비롯한 임의의 소정의 숙주에 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 당업계에 공지된 방법, 예컨대 WO 92/22324; 문헌 [Mullinax, R.L. 등(1992), BioTechniques 12(6): 864-869], [Sawai, H. 등(1995), AJRI 34:26-34], 및[Better, M. 등(1988), SCience 240:1041-1043](상기 참조 문헌의 기재 내용 모두를 본 명세서에 참고로 인용함)에 기재되어 있는 방법을 사용하여, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합 방식으로 생산하는 기법도 이용할 수 있다.
단일쇄 Fvs 및 항체를 생산하는데 사용가능한 기법의 예로는 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,258,498호; 문헌 [Huston 등(1991), Methods in Enzymology 203: 46-88], [Shu, L. 등(1993), PNAS 90:7995-7999] 및 [Skerra, A. 등(1988), Science 240:1038-1040]에 기재되어 있는 기법을 들 수 있다. 인간 항체의 생체내 사용 및 생체외 검출 분석을 비롯한 일부 사용의 경우, 키메라 항체, 인유화 항체 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 [Morrison, Science 229:1202 (1985)], [Oi 등, BioTechniques 4:214 (1986)], [Gillies, S.D. 등(1989), J. Immunol. Methods 125: 191-202]; 및 미국 특허 제5,807,715호를 참조하라. 항체는 CDR 이식(EP 0 239 400, WO 91/09967, 미국 특허 제5,530,101호 및 제5,585,089호), 베니어링(veneering) 또는 재표면화(resurfacing) (EP 0 592 106, EP 0 519 596; 문헌 [Padlan E.A.(1991), Molecular Innunology 28(4/5):489-498], [Studnicka G.M. 등(1994), Protein Engineering 7(6):805-814], [Roguska M.A. 등(1994), PNAS 91:969-973] 및 쇄 슈플링(미국 특허 제5,565,332호)를 비롯한 각종 기법을 사용하여 인유화할 수 있다. 인간 항체는 전술한 파지 디스플레이 방법을 비롯한 당업계에 공지된 각종 방법에 의해 생산할 수 있다. 또한, 미국 특허 제4,444,887호, 제4,716,111호, 제5,545,806호 및 제5,814,318호; WO 98/50433, WO 98/16654,WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO 91/10741을 참조하라(상기 참조 문헌의 기재 내용 모두를 본 명세서에 참고로 인용함).
본 발명의 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 작동물질 또는 길항물질로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드와 수용체/리간드의 상호 작용을 전부 또는 일부 붕괴시키는 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는 본 명세서에 기재되어 있는 항원성 에피토프 또는 그 일부를 결합시키는 것이 바람직하다. 본 발명은 수용체 특이성 항체 및 리간드 특이성 항체 모두를 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 리간드 결합을 방지하지 못하지만 수용체 활성화를 방지하는 수용체 특이성 항체를 특징으로 한다. 수용체 활성화(즉, 신호화)는 본 명세서 기재되어 있거나 기타 당업계에 공지된 기법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 수용체 활성화는 면역 침전에 이은 웨스턴 블로트(western blot) 분석(예컨대, 참조 문헌에 기재되어 있는 바와 같이)에 의해 수용체 또는 그 표면의 인산화(예: 티로신 또는 세린/트레오닌)을 검출함으로써 측정할 수 있다. 특정 실시태양에 있어서, 본 발명은 항체의 부재 하에 리간드 활성 또는 수용체 활성을 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상 또는 55% 이상 저해하는 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 수용체-리간드 복합체를 인식하고, 바람직하게 비결합 수용체 또는 비결합 리간드를 특이적으로 인식하지 못하는 항체뿐만 아니라, 리간드 결합 및 수용체 활성화 모두를 방지하는 수용체 특이성 항체를 특징으로 한다. 마찬가지로, 본 발명은 리간드를 결합시킴으로써 수용체 활성화를 방지하지만 리간드가수용체와 결합하는 것을 방지하지 못하는 항체뿐만 아니라, 리간드를 결합시키고 수용체에의 리간드 결합을 방지하는 항체를 포함한다. 또한, 본 발명은 수용체를 활성화시키는 항체를 포함한다. 이들 항체는 수용체 작동물질로서 작용할 수 있다. 즉, 예컨대 수용체의 이합체화를 유발시킴으로써 리간드 매개 수용체 활성화의 생물학적 활성의 전(全)집단 또는 부집단(subset)을 상승시키거나 활성화시킬 수 있다. 항체는 본 명세서에 기재되어 있는 발명의 펩티드의 특정 생물학적 활성을 포함하는 생물학적 활성에 대한 작동물질, 길항물질 또는 역(逆)작동물질로서 구체화할 수 있다. 상기 항체 작동물질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생산할 수 있다. 예컨대, PCT 공보 WO 96/40281; 미국 특허 제5,811,097호; 문헌 [Deng 등, Blood 92(6): 1981-1988 (1998)], [Chen 등, Cancer Res. 58(16):3668-3678 (1998)], [Harrop 등, J. Immunol. 161(4):1786-1794 (1998)], [Zhu 등, Cancer Res. 58(15):3209-3214 (1998)], [Yoon 등, J. Immunol. 160(7):3170-3179 (1998)], [Prat 등, J. Cell. Sci. 111(Pt2):237-247 (1998)], [Pitard 등, J. Immunol. Methods 205(2):177-190 (1997)], [Liautard 등, Cytokine 9(4):233-241 (1997)], [Carlson 등, J. Biol. Chem. 272(17):11295-11301 (1997)], [Taryman 등, Neuron 14(4):755-762 (1995)], [Muller 등, Structure 6(9):1153-1167 (1998)], [Bartunek 등, Cytokine 8(1):14-20 (1996)]을 참조하라(상기 참조 문헌의 기재 내용 모두를 본 명세서에 참고로 인용함).
본 발명의 항체를 사용하여, 예를 들어 시험관내 및 생체내 진단 방법 및 치료 방법을 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드를 정제하고, 검출하고, 표적화할 수 있는데, 이로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 항체들은 생물학적 샘플에서 본 발명의 폴리펩티드 레벨을 정성적으로 및 정량적으로 측정하기 위한 면역분석법에 사용된다[참조: 예를 들어, 본원에 참고 인용한 Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2판) (1998)]. 바람직한 구체예에서, KGF-2의 레벨은 정제된 샘플 내에서 염소 및 닭 항체를 이용하여 검출된다(후술하는 실시예 50 참조).
이하 더 상세히 논의되는 바와 같이, 본 발명의 항체는 단독으로 사용하거나, 또는 다른 조성물과 병용할 수 있다. 상기 항체는 추가로 N-말단 또는 C-말단에서 이종 폴리펩티드에 재조합적으로 융합하거나, 폴리펩티드 또는 다른 조성물에 화학적으로 접합(공유 접합 및 비공유 접합을 포함함)될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 검출 분석법에서 표지로서 유용한 분자 및 효과기 분자, 예를 들어 이종 폴리펩티드, 약물, 방사능핵종 또는 독소에 재조합적으로 융합되거나 접합될 수 있다(참조: 예를 들어, PCT 국제 공개 공보 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 미국 특허 제 5,314,995호; 및 EP 제396,387호).
본 발명의 항체는 변형된 유도체, 즉 상기 항체에 대한 임의 유형 분자의 공유 결합에 의해 변형된 유도체를 포함하는데, 이러한 공유 결합은 상기 항제가 항유전인자 응답을 생성하는 것을 방해하지 않는 것이다. 예를 들어, 상기 항체 유도체는 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도화, 단백분해성 절단, 세포성 리간드 또는 기타 단백질에 대한 연결 등(이로 제한되는 것은 아님)에 의해 변형된 항체를 포함한다. 다수의화학적 변형중 임의의 변형은 공지된 기법, 예를 들어 특이성 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신 등의 대사적 합성 등(이로 제한되는 것은 아님)에 의해 수행할 수 있다. 또한, 상기 유도체는 하나 이상의 통상적이지 않은 아미노산을 함유할 수 있다.
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생성할 수 있다. 관심있는 항원에 대한 폴리클로날 항체는 당업계에 공지된 여러가지 방법에 의해 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 여러가지 숙주 동물, 예를 들어 토끼, 마우스, 래트 등(이로 제한되는 것은 아님)에 첨가하여 상기 항원에 특이적인 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청의 생성을 유도할 수 있다. 숙주 종에 따라 여러 가지 보조제를 사용하여 면역학적 응답을 증가시킬 수 있는데, 이러한 보조제의 예로는 프레운트(완전 보조제 및 불완전 보조제), 미네랄 겔(예; 수산화 알루니늄), 계면 활성 물질(예; 라이소레시틴), 플루로닉 폴리올, 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 및 잠재적으로 유용한 인간 보조제(예; BCG(bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르범(Corynebacterium parvum))을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 이러한 보조제는 당업계에 널리 공지되어 있다.
모노클로날 항체는 당업계에 공지된 여러가지 기법을 이용하여 제조할 수 있는데, 이들 방법의 예로는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기법 또는 이의 조합을 들 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 하이브리도마 기법을 이용하여 생성할 수 있는데, 이 기법은 당업계에 공지 기법 및 예를 들어, 문헌[참조:Harlow 등, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988); Hammerling 등, in: MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMA 563-681(Elsevier, N.Y.1981) 이들 문헌 모두 본원에 전적으로 참고 인용함]에 개시된 기법을 포함한다. 본원에 사용한 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기법을 통해 생성된 항체로 제한되지 않는다. 상기 용어 "모노클로날 항체"는 진핵 클론, 원핵 클론 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유도된 항체를 의미하며, 모노클로날 항체를 생성하는 방법을 의미하는 것은 아니다.
하이브리도마 기법을 이용하여 특이성 항체를 생성하고 스크리닝하는 방법은 일반적인 것이며, 당업계에 널리 공지되어 있고, 실시예에 상세히 논의되어 있다. 비제한적인 실시예에서, 마우스는 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 세포를 이용하여 면역화할 수 있다. 일반 면역 응답이 검출되면, 예를 들어 항원에 특이적인 항체는 마우스 혈청 내에서 검출되며, 마우스 비장을 수집하고, 비장세포를 분리한다. 이어서, 비장세포는 널리 알려진 기법으로 임의의 적합한 흑색종 세포, 예를 들어 ATCC에서 용이하게 획득할 수 있는 세포주 SP20으로부터 유래한 세포에 융합한다. 하이브리도마는 선택하고, 제한 희석법으로 클로닝하였다. 이어서, 하이브리도마 클론은 본 발명의 항체를 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포에 대해 당업계에 공지된 방법으로 분석하였다. 일반적으로 고 레벨의 항체를 함유하는 복수는 양성 하이브리도마 클론을 이용하여 마우스를 면역화함으로써 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 모노클로날 항체를 생성하는 방법 및 상기 방법에 의해생성된 항체를 제공하는데, 이때 상기 방법은 본 발명의 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 배양하는 단계(이때, 상기 하이브리도마는 본 발명의 항원으로 면역화한 마우스로부터 분리한 비장세포를 흑색종 세포와 융합함) 및 이어서 본 발명의 폴리펩티드를 결합할 수 있는 항체를 분비하는 하이브리도마 클론을 위한 융합에 의해 생성된 하이브리도마를 스크리닝하는 단계를 포함한다.
특정 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 기법으로 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인(Fab 단편을 생성함) 또는 펩신(F(ab') 단편을 생성함)과 같은 효소를 이용하여 면역글로불린 분자를 단백질분해적으로 절단하여 생성할 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다.
예를 들어, 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 여러가지 파지 디스플레이 방법을 이용하여 생성할 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 기능적 항체 도메인은 그들을 암화화하는 폴리뉴크레오티드 서열을 보유하는 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된다. 특정 구체예에서, 이러한 파지를 이용하여 레퍼토리 또는 조합성 항체 라이브러리(예를 들어, 인간 또는 쥐과동물)로부터 발현된 항원 결합 도메인을 디스플레이시킬 수 있다. 관심있는 항원을 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는 항원, 예를 들어 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 이용하여 선택하거나 동정할 수 있다. 이들 방법에 사용된 파지는 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 이황화 안정화된 Fv 항체 도메인을 보유하는 파지로부터 발현된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함하는 전형적인 사상 파지이다. 본 발명의 항체를 제조하기 위해 사용할 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예로는 본원에 전적으로 참고 인용한 문헌[참조: Brinkman 등, J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995) ; Ames 등, J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough 등, Eur. J. Immunolo. 24:952-958 (1994); Persic 등, Gene 187:9-18 (1997); Burton 등, Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT/GB91/01134; WO90/02890; WO91/10737; WO92/01047; WO92/18619; WO93/11236; WO95/15982; WO95/20401; 및 미국 특허 제5,698,426호, 5,223,409호, 5,403,484호, 5,580,717호, 5,427,908호, 5,750,753호, 5,821,047호, 5,571,698호, 5,427,908호, 5,516,637호, 5,780,225호, 5,658,727호 ,5,733,743호 및 제5,969,108호]에 개시된 방법들을 들 수 있다.
상기 문헌에 기술된 바와 같이, 파지 선택후, 파지로부터 유래한 항체 암호 영역을 분리하고, 이를 이용하여 상세히 후술하는 바와 같은 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함하는 임으의 바람직한 숙주 내에서 발현된, 인간 항체 또는 임의의 기타 바람직한 항원 결합 단편을 포함하는 전체 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생성하는 기법은 본원에 전적으로 참고 인용한 문헌[참조: PCT 국제 공개 공보 WO 92/22324; Mullinax 등, BioTechniques 12(6): 864-869 (1992); 및 Sawai 등, AJRI 34: 26-34 (1995); 및 Better 등, Science 240: 1041-1043 (1988)]에 기술된 방법과 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
단일 사슬 Fvs 및 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있는 기법의 예로는 미국특허 제4,946,778호 및 제5,258,498호; Huston 등, Methods in Enzymology 203: 46-88 (1991); Shu 등, PNAS 90: 7995-7999 (1993); 및 Skerra 등, Science 240: 1038-1040 (1988)]에 기재된 방법을 들 수 있다. 인간에서 항체의 생체내 이용 및 시험관내 검출 분석법을 포함하는 몇몇 경우에서, 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 키메라 항체는 항체의 다른 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래한 분자, 예를 들어 쥐과동물 모노클로날 항체로부터 유도된 가변 영역과 인간 면역글로불린 불변 영역을 보유하는 항체를 의미한다.키메라 항체를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다[참조: 예를 들어, Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi 등, BioTechniques 4: 214 (1986); Gillies 등, J. Immunol. Methods 125: 191-202 (1989); 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제4,816,397호; 본원에 전적으로 참고 인용함]. 인간화된 항체는 비인간 종으로부터 유래한 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터 유래한 프레임웍 영역을 보유하는 소정의 항원을 결합하는 비인간 종 항체로부터 유래한 항체 분자이다. 종종, 인간 프레임웍 영역내의 프레임웍 잔기는 항원 결합을 변경시키기 위해, 바람직하게는 개선시키기 위해 CDR 공여 항체로부터 유래한 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임웍 치환은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 항원 결합을 위해 중요한 프레임웍 잔기를 확인하기 위한 CDR 및 프레임웍 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정 위치에서 통상적이지 않은 프레임웍 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다[참조: 예를 들어, Queen 등, 미국 특허 제5,585,089호; Riechmann 등, Nature 332: 323 (1988); 본원에 전적으로 참고 인용함]. 항체는 당업계에 공지된 여러 가지 기법, 예를 들어 CDR-그라프팅(참조: EP 제239,400호; PCT 국제 공개 공보 91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호), 피복(veneering) 및 재표면처리[참조: EP 제592,106호; EP 제519,596호; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498 (1991); Studnicka 등, Protein Engineering 7(6): 805-814 (1994); Roguska 등, PNAS 91: 969-973 (1994)] 및 사슬 셔플링(참조: 미국 특허 제5,565,332호)을 이용하여 인간화시킬 수 있다.
완전한 인간 항체는 인간의 치료적 처리에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로블린 서열로부터 유도된 항체 라이브러리를 이용하는 상기한 파지 디스플레이 방법을 포함하는 당업계에 공지된 여러 가지 방법으로 제조할 수 있다[참조: 예를 들어, 미국 특허 제4,444,887호 및 제4,716,111호; 및 PCT 국제 공개 공보 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16645, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO 91/10741; 모두 본원에 전적으로 참고 인용함].
또한, 인간 항체는 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만, 이간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스게닉 마우스를 이용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 무작위로 또는 이종 재조합에 의해 마우스 배 줄기 세포내로 도입할 수 있다. 또는, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 이외에 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역을 마우스 배 줄기 세포 내로 도입할 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 이종 재조합에 의한 인간 면역글로불린 좌의 도입과는 별도로 또는 상기 도입과 동시에 비기능적으로 될 수 있다. 구체적으로, JH 영역의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생성을 예방한다. 변형된 배 줄기 세포는 팽창하며, 블라스토사이트내로 미세주입하여 키메라 마우스를 생성한다. 이어서, 상기 키메라 마우스를 사육하여 인간 항체를 발현하는 동형접합성 후대를 생성한다. 트랜스게닉 마우스는 선택된 항원, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드 전부 또는 일부분을 이용하여 통상의 방식으로 면역화한다. 상기 항원에 대해 검출된 모노클로날 항체는 통상적인 하이브리도마 기법을 이용하여 면역화된 트랜스게닉 마우스로부터 얻을 수 있다. 인간 면역글로불린 트랜스유전자는 B 세포 분화중에 트랜스게닉 마우스 재배열에 의해 고정되며, 후속적으로 부류 스위칭 및 체세포성 돌연변이를 겪게된다. 따라서, 이러한 기법을 이용하면, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생성하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생성하는 이 기법에 대한 개요는 문헌[참조: Lonberg 및 Huszar, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)]에 기술되어 있다. 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체를 생성하는 이 기법 및 이러한 항체를 생성하는 프로토콜에 대한 상세한 설명은 본원에 전적으로 참고 인용한 문헌[참조: PCT 국제 공개 공보 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 유럽 특허 제0 598 877호; 미국 특허 제5,413,923호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,569,825호; 제5,661,016호; 제5,545,806호; 제5,814,318호; 제5,885,793호; 제5,916,771호; 및 제5,939,598호]에 기술되어 있다. 또한, 아브게닉스, 인크.(캘리포니아 프리몬트) 및 젠팜(캘리포니아 산 호세)와 같은 기업들이 상기한 방법과 유사한 방법을 이용하여 선택된 항원에 대해 유도된 인간 항체를 제공하는데 관여할 수 있다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체는 "유도된 선택(guided selection)"이라 칭하는 기법을 이용하여 생성할 수 있다. 이 방법에서, 선택된 비인간 모노클로날 항체, 예를 들어 마우스 항체를 이용하여 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선택을 유도할 수 있다[참조: Jespers 등, Bio/technology 12: 899-903 (1988)].
또한, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 이용하고, 당업계에 널리 알려진 기법을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 "의태하는" 항-유전인자 항체를 생성할 수 있다[참조: 예를 들어, Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5): 437-444 (1989); 및 Nissinoff, J. Immunol. 147 (8): 2429-2438 (1991)]. 예를 들어, 결합하여 폴리펩티드 다량체화 및/또는 리간드에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체를 이용하여 폴리펩티드 다량체화 및/또는 결합 도메인을 "의태하는" 항유전인자를 생성할 수 있는데, 결과적으로 결합하여 폴리펩티드 및/또는 그의 리간드를 중화시킨다. 이러한 중화 항유전인자 또는 이러한 항유전인자의 Fab 단편을 치료적 방법에 이용하여 폴리펩티드 리간드를 중화시킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 항유전인자 항체는 본 발명의 폴리펩티드를 결합하고/하거나 그의 리간드/수용체를 결합하는데 사용함으로써 그의 생물학적 활성을 차단시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 작용물질 또는 길항물질로서 작용하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드의 작용물질 또는 길항물질로서 작용하는 항체의 예로는 본 발명의 폴리펩티드와 수용체/리간드 상호작용을 부분적으로 또는 완전히 파괴하는 항체를 들 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 다량체화하는본 발명의 단백질의 능력을 파괴하는 항체를 포함한다. 다른 예에서, 본 발명은 본 발명의 단백질이 다량체화할 수 있도록 하나, 본 발명의 단백질의 하나 이상의 KGF-2 수용체(들)/리간드(들)을 결합하는 능력을 파괴하는 항체를 포함한다. 다른 예에서, 본 발명은 본 발명의 단백질이 다량체화할 수 있도록 하고, KGF-2 수용체(들)/리간드(들)을 결합하나, KGF-2/수용체/리간드 복합체와 관련된 생물학적 활성을 차단하는 항체를 포함한다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드의 작용물질 또는 길항물질로 작용하는 항체는 수용체-특이적 항체 및 리간드-특이적 항체 모두를 포함한다. 리간드 결합을 방해하지 않으나 수용체 활성화를 방해하는 수용체-특이적 항체를 포함한다. 수용체 활성화(즉, 신호전달)는 본원에 기술된 기법 또는 당업계에 공지된 다른 기법을 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 리간드 결합 및 수용체 결합 둘 다를 방해하는 수용체-특이적 항체도 포함된다. 유사하게, 리간드를 결합하고, 수용체에 대한 리간드의 결합을 방해하는 중화 항체 및 상기 리간드를 결합함으로써 수용체 활성화를 방해하나, 리간드가 수용체를 결합하는 것을 방해하지 않는 항체를 포함한다. 또한, 상기 수용체를 활성화시키는 항체도 포함된다. 이들 항체들은 리간드-매개된 수용체 활성화에 의해 영향받는 생물학적 활성의 전부 또는 일부에 대한 작용물질로 작용할 수 있다. 상기 항체는 본원에 개시된 특이 활성을 포함하는 생물학적 활성에 대한 작용물질 또는 길항물질로 특정될 수 있다. 상기 항체 작용물질은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다[참조: 예를 들어, WO 96/40281; 미국 특허 제5,811,097호; Deng, B, 등, Blood 92 (6): 1981-1988 (1998); Chen, Z. 등,Cancer Res. 58 (16): 3668-3678 (1998); Harrop, J.A. 등, J. Immunol. 161(4): 1786-1794 (1998); Zhu, Z. 등, Cancer Res. 58(15): 3209-3214 (1998); Yoon, D.Y. 등, J. Immunol. 160(7): 3170-3179 (1998); Prat, M. 등, J. Cell. Sci. 111(Pt2): 237-247 (1998); Pitard, V. 등, J. Immunol. Methods 205(2): 177-190(1997); Liautard, J 등, Cytokinde 9(4): 233-241 (1997); Carlson, N.G. 등, J. Biol. Chem. 272(17): 11295-11301(1997); Taryman, R.E. 등, Neuron 14(4): 755-762 (1995); Muller, Y.A. 등, Structure 6(9): 1153-1167 (1998); Bartunek, P. 등, Cytokine 8(1): 14-20 (1996); 본원에 전적으로 참고 인용함].
상기한 바와 같이, 본 발명의 KGF-2 단백질에 대한 항체를 사용하고, 당업자에게 널리 알려진 기법을 이용하여 KGF-2를 "의태하는" 항-유전인자 항체를 생성할 수 있다[참조: 예를 들어, Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5): 437-444 (1989); 및 Nissinoff, J. Immunol. 147(8): 2429-2438 (1991)]. 예를 들어, KGF-2에 결합하고, KGF-2 다량체화 및/또는 리간드에 대한 결합을 완전히 억제하는 항체를 이용하여 KGF-2 다량체화 및/또는 결합 도메인을 "의태하여", 결과적으로 KGF-2 및/또는 그의 리간드에 결합하여 이를 중화하는 항-유전인자를 생성할 수 있다. 이러한 중화 항-유전인자 또는 이러한 항-유전인자의 Fab 단편은 KGF-2 리간드를 중화하기 위한 치료법에 사용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 항-유전인자 항체를 이용하여 KGF-2를 결합하거나, KGF-2 리간드/수용체를 결합함으로써 KGF-2 생물학적 활성을 차단할 수 있다.
항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드
본 발명은 추가로 본 발명의 항체 및 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 예를 들어, 상기한 바와 같이, 엄하거나 덜 엄한 하이브리드화 조건하에서 항체, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드에 결합하는 항체를 암호화하는 폴리뉴크레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있고, 이 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있는 경우, 상기 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립할 수 있는데[참조: 예를 들어, Kutmeier 등, BioTechniques 17: 242 (1994)], 개략적으로 이 방법은 상기 항체를 암호화하는 서열의 일부분을 함유하는 중첩 올리고뉴클레오티드의 합성, 어닐링 및 이들 올리고뉴클레오티드의 연결 및 PCR에 의한 연결된 올리고뉴클레오티드의 증폭을 포함한다.
또는, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 공급원으로부터 유래한 핵산으로부터 생성할 수 있다. 특정 항체를 암호화하는 핵산을 함유하는 클론을 이용할 수 없으나, 상기 항체 분자의 서열이 공지된 경우, 면역글로불린을 암호화하는 핵산은 상기 서열의 3' 및 5' 말단에 하이브리드화할 수 있는 합성 프라이머를 이용하는 PCR 증폭 또는 예를 들어, 상기 항체를 암호화하는 cDNA 라이브러리로부터 유래한 cDNA 클론을 동정하기 위해 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하는 클로닝에 의해 화학적으로 합성하거나 적합한 공급원(예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리 또는 상기 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예를 들어 본 발명의 항체를 발현하기 위해 선택된 하이브리도마 세포로부터 분리된 핵산 또는 이로부터 생성된 cDNA 라이브러리)으로부터 얻을 수 있다. 이어서, PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 복제가능한 클로닝 벡터 내로 클로닝할 수 있다.
일단 상기 항체의 뉴크레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열이 결정되면, 상기 항체의 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열을 조작하기 위해 당업계에 널리 알려진 방법, 예를 들어 재조합 DNA 기법, 위치 지정된 돌연변이유발법, PCR 등[참조: 예를 들어, Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY and Ausubel에 기재된 방법; 본원에 전적으로 참고 인용함]을 이용하여 조작함으로써 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 생성하기 위해 상이한 아미노산 서열을 보유하는 항체를 생성할 수 있다.
특정 구체예에서, 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 서열 초가변성 영역을 결정하기 위한 기타 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 공지된 아미노산 서열과의 비교에 의해 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 조사하여 상보성 결정 영역(CDR)의 서열을 동정할 수 있다. 일반적인 재조합 DNA 기법을 이용하여, 하나 이상의 CDR을 프레임웍 영역, 예를 들어 인간 프레임웍 영역 내로 삽입하여 상기한 바와 같이, 비인간 항체를 인간화할 수 있다. 상기 프레임웍 영역은 자연발생하거나 공통 프레임웍 영역, 및 바람직하게는 인간 프레임웍 영역일 수 있다[참조: 예를 들어, Chothia 등, J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998); 인간 프레임웍 영역의 목록화]. 바람직하게는, 상기 프레임웍 영역 및 CDR의 조합에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드를 특이적으로 결합하는 항체를 암호화한다. 바람직하게는, 상기한 바와 같이, 하나 이상의 아미노산 치환은 프레임웍 영역 내에서 이루어질 수 있고, 아미노산 치환은 그의 항원에 대한 항체의 결합을 개선하는 것이 바람직하다. 또한, 하나 이상의 분자내 이황화 결합이 결핍된 항체 분자를 생성하기 위해, 이러한 방법을 이용하여 분자내 이황화 결합에 참여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인의 아미노산 치환 또는 결실을 수행할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드에 대한 다른 변경은 당업자의 인식 범위내에 포함되며, 본 발명에도 포함되는 것이다.
또한, 적합한 항원 특이성을 갖는 마우스 항체 분자로부터 유래한 유전자와 적합한 생물학적 활성을 갖는 인간 항체 분자로부터 유래한 유전자를 결찰시킴으로써 "키메라 항체"를 생성하기 위해 개발된 기법[참조: Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855 (1984); Neuberger 등, Nature 312: 604-608 (1984); Takeda 등, Nature 314: 452-454 (1985)]을 사용할 수 있다. 상기한 바와 같이, 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래한 분자, 예를 들어 쥐과동물 mAb로부터 유래한 가변 영역과 인간 면역글로불린 불변 영역을 보유하는 분자, 예를 들어 인간화된 항체이다.
또는, 단일 쇄 항체를 생성하기 위해 기술된 기법[참조: 미국 특허제4,946,778호; Bird, Science 242: 423-42 (1988); Huston 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988); 및 Ward 등, Nature 334: 544-54 (1989)]을 적용하여 단일 사슬 항체를 생성할 수 있다. 단일 사슬 항체는 아미노산 브리지에 의해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결하고, 결과적으로 단일 사슬 폴리펩티드를 생성함으로서 형성된다. 또한, 이. 콜리에서 기능적 Fv 단편의 어셈블리를 위한 기법도 이용할 수 있다[참조: Skerra 등, Science 242: 1038-1041 (1988)].
항체 생성 방법
본 발명의 항체는 항체 생성을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 구체적으로 화학적 합성, 바람직하게는 재조합 발현 기법에 의해 생성할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편, 유도체 또는 유사체(예를 들어, 본 발명의 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 본 발명의 항체의 단일 사슬)의 재조합 발현은 상기 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 구성을 필요로한다. 일단, 본 발명의 항체 분자 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이의 일부분(종쇄 또는 경쇄 가변 영역을 함유하는 것이 바람직함)이 얻어지면, 상기 항체 분자를 생성하기 위한 벡터는 당업계에 널리 알려진 기법을 이용하는 재조합 DNA 기법에 의해 생성할 수 있다. 따라서, 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴크레오티드를 발현함으로써 단백질을 제조하는 방법을 본원에 기술한다. 당업자에게 널리 알려진 방법을 이용하여 항체 암호 서열 및 적합한 전사 및 번역 조절 신호를 함유하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 이들 방법의 예로는 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합 기법을 들 수 있다. 따라서, 본발명은 본 발명의 항체 분자, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 암호화하며, 프로모터에 작용가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 상기 항체 분자의 불변 영역을 암호화하는 뉴크레오티드 서열을 포함할 수 있으며[참조: 예를 들어 PCT 국제 공개 공보 WO 86/05807; WO 89/01036; 및 미국 특허 제5,122,464호], 상기 항체의 가변 영역은 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위해 이러한 벡터 내로 클로닝할 수 있다.
상기 발현 벡터는 통상적인 방법으로 숙주 세포내로 전달되며, 이어서 형질감염된 세포는 통상적인 기법으로 배양하여 본 발명의 항체를 생성한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체, 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 본 발명의 단일 사슬 항체를 암호화하며, 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 이중 사슬 항체의 발현을 위한 바람직한 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 둘 다를 암호화하는 벡터는 후술하는 바와 같이, 전체적인 면역글로불린 분자의 발현을 위한 숙주 내에서 동시에 발현될 수 있다.
여러가지 숙주-발현 벡터 시스템을 이용하여 본 발명의 항체 분자를 발현할 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심있는 암호 서열이 생성되고, 후속적으로 정제될 수 있는 비히클을 의미하나, 또한 적합한 뉴클레오티드 암호 서열로 형질전환 또는 형질감염되는 경우, 동일계 내에서 본 발명의 항체 분자를 발현할 수 있는 세포도 의미한다. 이들의 예로는 미생물, 예를 들어 항체 암호 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질감염된 박테리아(예; 이. 콜리, 비. 섭틸리스); 항체 암호 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예; 사카로마이세스 피치아(Saccharomyces Pichia)); 항체 암호 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예; 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 암호 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예; 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV); 담배 모자이크 바이러스(TMV))로 감염되거나 항체 암호 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예; Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래한 프로모터(예; 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래한 프로모터(예; 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구성물을 보유하는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)를 들 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 에스케리치아 콜리와 같은 박테리아 세포 및 더 바람직하게는 진핵세포, 특히 전제 재조합 항체 분자의 발현을 위한 진핵세포는 재조합 항체 분자의 발현을 위해 사용된다. 예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유동물 세포는 인간 사이토메갈로바이러스로부터 유래한 주요한 중초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께 항체를 위한 효과적인 발현 시스템이다[참조: Foecking 등, Gene 45: 101 (1986); Cockett 등, Bio/Technology 8: 2(1990)].
박테리아 시스템에서, 다수의 발현 벡터는 발현되는 항체 분자를 위해 의도된 용도에 따라 유익하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 이러한 단백질 다량을 생성하려는 경우, 항체 분자로 이루어진 약학 조성물의 생성에 있어서, 용이하게 정제되는 고 수준의 융합 단백질 생성물 발현을 유도하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터로는 이. 콜리 발현 벡터 pUR278[참조: Ruther 등, EMBO J. 2: 1791 (1983)], 이 경우, 항체 암호 서열은 lacZ 암호 서열을 보유하는 프레임내 벡터 내로 개별적으로 연결하여 융합 단백질을 생성함; pIN 벡터[참조: Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109 (1985)]; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509 (1989)] 등을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, pGEX 벡터를 사용하여 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 흡착 및 매트릭스 글루타치온-아가로즈 비스에 대한 결합 이후의 유리 글루타치온 존재하의 용출에 의해 용해된 세포로부터 용이하게 정제할 수 있다. 상기 pGEX 벡터는 트롬빈 또는 Xa 인자 프로테아제 절단 위차를 포함하도록 구성하여 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 부분으로부터 유리될 수 있도록 한다.
곤충 시스템에서, 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV)가 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 사용된다. 상기 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 내에서 성장한다. 항체 암호 서열은 상기 바이러스의 비필수 영역(예를 들어 폴리헤드린 유전자)내로 개별적으로 클로닝되고 AcNPV 프로모터(예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 조절 하에 위치한다.
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스계 발현 시스템을 사용할 수 있다. 발현 벡터로서 아데노바이러스를 사용하는 경우, 관심있는 항체 암호 서열은 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및트리파타이트(tripartite) 리더 서열에 연결시킬 수 있다. 이어서, 이 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈 내로 삽입할 수 있다. 상기 바이러스 게놈의 비필수 영역(예를 들어, 영역 E1 또는 E3)내의 삽입은 감염된 숙주 내에서 생존할 수 있고, 항체 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 생성할 것이다[참조: 예를 들어, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 355-359 (1984)]. 또한, 특정 개시 신호가 삽입된 항체 암화 서열의 효율적인 번역을 위해 필요할 수 있다. 이들 서열은 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 또한, 개시 코돈은 소정 암호 서열의 리딩 프레임과 함께 상 내에 존재하여야만 전체 삽입물의 번역을 보장한다. 이들 외인성 번역 조절 신호 및 개시 코돈은 기원이 다양하며, 천연물일 수도 있고, 합성물일 수도 있다. 발현 효율은 적합한 전사 증강 요소, 전사 종결자 등을 포함시켜 증강시킬 수 있다[참조: Bittner 등, Methods in Enzymol. 153: 51-544 (1987)].
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 소망하는 특정 약식의 유전자 생성물을 변경하고, 프로세싱하는 숙주 세포 균주를 선택한다. 단백질 생성물의 이러한 변경(예를 들어, 글리코실화) 및 프로세싱(예를 들어, 절단)은 단백질의 융합에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역후 프로세싱 및 변경에 대한 특징적이며, 특이적인 메카니즘을 보유한다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택하여 발현된 외래 단백질의 올바른 변경 및 프로세싱을 보장할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 일차 전사체의 적합한 프로세싱, 유전자 생성물의 글리코실화 및 포스포릴화를 위한 세포성 장치를 보유하는 진핵 숙주 세포를 사용할 수있다. 이러한 포유동물 숙주 세포의 예로는 CHO, VERA, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 및 구체적으로 유방암 세포주, 예를 들어 BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, 및 정상적인 유선 세포주, 예를 들어 CRL7030 및 Hs578Bst를 들 수 있다.
장기간 높은 수율로 재조합 단백질을 생성하기 위해서는, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 바이러스 복제 원점을 함유하는 발현 벡터를 이용하는 것 보다는 숙주 세포를 적절한 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 전사 종결자, 폴리아데닐화 위치 등)에 의해 조절된 DNA로 형질전환시킬 수 있으며, 선택성 마커를 보유하게 할 수도 있다. 외래 DNA의 도입후, 조작된 세포는 풍부한 배지 내에서 1 내지 2일 동안 성장시키고, 이어서 선택성 배지로 스위칭한다. 재조합 플라스미드내의 선택성 마커는 선택에 대한 내성을 부여하여 세포가 플라스미드를 그들의 염색체 내에 안정하게 통합되고, 성장하여 클로닝되고 세포주로 신장될 수 있는 지점을 형성하게 한다. 이 방법은 상기 항체 분자를 발현하는 세포주를 조작하기 위해 사용하는 것이 유익하다. 이렇게 조작된 세포주는 상기 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용하다.
다수의 선택 시스템을 이용할 수 있으며, 이들의 예로는 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제[참조: Wigler 등, Cell 11: 223 (1997)]; 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제[참조: Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 202 (1992)] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제[참조: Lowy 등, Cell22: 817 (1980)] 유전자를 들 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니며, 이들은 각각 tk-세포, hgprt-세포 또는 aprt-세포에 사용할 수 있다. 또한, 항대사산물 내성을 하기 유전자를 위한 선택의 기초로 사용할 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr[참조: Wiegler 등, Natl. Acad. Sci. USA 77: 357 (1980); O'Hare 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527 (1981)]; 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt[참조: Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072 (1981)]; 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo[참조: Goldspiel 등, Clinical Pharmacy 12: 488-505 (1993); Wu 및 Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Res. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); 및 Morgan 및 Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); TIB TECH 11(5): 155-215 (1993. 5)]; 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro[참조: Santerre 등, Gene 30: 147 (1984). 당업계에 널리 알려진 재조합 DNA 기법을 일반적으로 적용하여 목적하는 재조합 클론을 선택할 수 있으며, 이러한 방법은 예를 들어, 문헌[참조: Ausubel 등(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, 뉴욕 스탁턴 출판사 (1990); 및 Dracopoli 등(eds.), Current Protocols in Human Genetics Ch. 12 & 13, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin 등, J. Mol. Biol. 150: 1 (1981); 모두 본원에 전적으로 참고 인용함]에 기술되어 있다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가시킬 수 있다[참조:Bebbington 및 Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3, 뉴욕 아카데미 출판사 (1987)]. 항체를 발현하는 벡터 시스템내의 마커가 증폭가능한 경우, 숙주 세포 배양물내에 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 사본수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체 유전자와 결합되었기 때문에, 상기 항체의 생성도 증가될 것이다[참조: Crouse 등, Mol. Cell. Biol. 3: 257 (1983)].
숙주 세포는 본 발명의 2개의 발현 벡터, 즉 중쇄 유도된 폴리펩티드를 암호화하는 제1 벡터와 경쇄 유도된 폴리펩티드를 암호화하는 제2 벡터를 이용하여 동시형질감염시킬 수 있다. 상기 2개의 벡터는 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드의 동일한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택성 마커를 함유할 수 있다. 또는, 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다을 암호화하고, 발현할 수 있는 단일 벡터를 사용할 수도 있다. 이러한 상황에서, 경쇄는 중쇄 이전에 위치되어 과량의 독성 유리 중쇄를 피해야만 한다[참조: Proudfoot, Nature 322: 52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2197 (1980)]. 중쇄 및 경쇄에 대한 암호 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
일단, 본 발명의 항체 분자가 동물에 의해 생성되거나, 화학적으로 합성되거나 또는 재조합적으로 발현되면, 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 특히 단백질 A후 특정 항원에 대한 친화성 크로마토그래피, 크기 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해, 또는 단백질 정제를 위한임의의 다른 표준 기법ㅇ로 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 본원에 개시하거나 당업계에 공지된 이종 폴리펩티드 서열에 융합하여 정제를 용이하게 할 수 있다.
본 발명은 융합 단백질을 생성하기 위해 본 발명의 폴리펩티드(또는 이의 일부분, 바람직하게는 상기 폴리펩티드(또는 이의 부분, 바람직하게는 상기 폴리펩티드의 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상 또는 100개 이상의 아미노산)에 재조합적으로 융합되거나 화학적으로 접합된 항체를 포함한다. 상기 융합은 반드시 직접적으로 일어날 필요는 없으며, 링커 서열을 통해 일어날 수도 있다. 상기 항체는 본 발명의 폴리펩티드(또는 이의 부분, 바람직하게는 상기 폴리펩티드의 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상 또는 100개 이상의 아미노산) 이외의 항원에 특이적일 수 있다. 예를 들어, 항체는 시험관내 또는 생체내에서 특정 세포 표면 수용체에 특이적인 항체에 본 발명의 폴리펩티드를 융합하거나 접합시킴으로써 특정 세포 유형에 본 발명의 폴리펩티드를 표적화하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드에 융합되거나 접합된 항체는 당업계에 공지된 방법을 이용하는 정제 방법 및 시험관내 면역 분석법에 사용할 수 있다[참조: 예를 들어, Harbor 등, 상기 문헌 및 PCT 국제 공개 공보 WO 93/21232; EP 제 439,095호; Naramura 등, Immunol. Lett. 39: 91-99 (1994); 미국 특허 제5,474,981호; Gillies 등, PNAS 89: 1428-1432 (1992); Fell 등, J. Immunol. 146: 2446-2452 (1991); 모두 본원에 전적으로 참고 인용함].
본 발명은 가변 영역 이외의 항체 도메인에 융합되거나 접합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 항체 Fc 영역 또는 이의 부분에 융합되거나 접합될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 융합된 항체 부분은 불변 영역, 힌지 영역, CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인 또는 전체 도메인 또는 이의 부분의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 상기 항체 부분에 융합되거나 접합되어 다량체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 융합된 Fc 부분은 Fc 부분들 사이의 이황화 결합을 통해 이량체를 형성할 수 있다. 더 높은 다량체 형태는 IgA 및 IgM의 부분에 상기 폴리펩티드를 융합시킴으로써 제조될 수 있다. 항체 부분에 본 발명의 폴리펩티드를 융합시키거나 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다[참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,336,603호; 제5,622,929호; 제5,359,046호; 제5,349,053호; 제5,447,851호; 제5,112,946호; EP 제307,434호; EP 제367,166호; PCT 국제 공개 공보 WO 96/04388; WO 91/06570; Ashkenazi 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539 (1991); Zheng 등, J. Immunol. 154: 5590-5600 (1995); 및 Vil 등, Proc. Natl. Sci. USA 89: 11337-11341 (1992); 본원에 전적으로 참고 인용함].
상기한 바와 같이, 폴리펩티드에 상응하는 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편 또는 서열 번호 2의 변이체는 상기 항체 부분에 융합 또는 접합되어 상기 폴리펩티드의 생체내 반감기를 증가시키거나, 당업계에 공지된 방법을 이용하는 면역분석법에 이용할 수 있다. 또한, 서열 번호 2에 상응하는 폴리펩티드는 상기 항체 부분에 융합 또는 접합시켜 정제를 용이하게 할 수 있다. 보고된 한 예에서는 인간 CD4-폴리펩티드의 제1 두개의 도메인 및 포유동물 면역글로블린의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 여러가지 도메인으로 이루어진 키메라 단백질에 대해 기술하고 있다[참조: EP 394,827; Traunecker 등, Nature 331: 84-86 (1988)]. 또한, 이황화-결합된 이량체 구조를 보유하는 항체에 융합 또는 접합된 본 발명의 폴리펩티드는 단량체성 분비 단백질 또는 단백질 단편 단독 이외의 기타 분자를 결합하고 중화하는데 더 효율적일 수 있다[참조: Fountoulakis 등, J. Biochem. 270: 3958-3964 (1995)]. 많은 경우, 융합 단백질내 Fc 부분은 치료 및 진단에 이로우며, 따라서 예를 들어 개선된 약리역학적 특성을 발휘할 수 있다(EP A 232,262). 또는, 융합 단백질이 발현되고, 검출되고, 정제된 후 Fc 부분을 결실시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, Fc 부분은, 융합 단백질이 면역화용 항원으로 사용되는 경우, 치료 및 진단을 방해할 수 있다. 예를 들어, 약물 개발에서, hIL-5 수용체와 같은 인간 단백질은 hIL-5 길항물질을 동정하기 위한 고용량 스크리닝 분석법을 위해 Fc 부분과 융합된다[참조: Bennett 등, J. Molecular Recognition 8: 52-58 (1995); Johanson 등, J. Biol. Chem. 270: 9459-7471 (1995)].
또한, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 예를 들어, 정제를 용이하게 하는 펩티드와 같은 마커 서열에 융합할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드, 예를 들어 시판되는 다수의 것들중 pQE 벡터(미국 캘리포니아 91311 채트스워스 이톤 애비뉴 9259에 소재하는 퀴아젠 인크.)내에 제공된 태그이다. 예를 들어, 문헌[참조: Gentz 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989)]에 기술된 바와 같이, 헥사-히스티딘이 융합 단백질의 용이한 정제를 위해 제공된다. 정제를 위해 유용한 다른 펩티드 태그의 예로는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래한 에피토프에 상응하는 "HA" 태그[참조: Wilson 등, Cell 37: 767 (1984)] 및 "플래그" 태그를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 진단제 또는 치료제에 접합된 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 상기 항체는 예를 들어 진단학적으로 사용되어 예를 들어, 소정 치료법의 효능을 결정하기 위한 임상적인 테스트 과정의 일부분으로서 종양의 발생 또는 진행을 모니터할 수 있다. 검출은 상기 항체를 검출가능한 물질에 커플링시킴으로써 수행할 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 여러가지 효소, 보결 분자단, 형광물질, 발광물질, 생발광물질, 방사성물질, 여러가지 양전자 방출 토모그래피를이용하는 양전자 방출 금속 및 비방사성 상자성 금속 이온을 들 수 있다. 상기 검출가능한 물질은 직접적으로 항체(또는 이의 단편)에 커플링 또는 접합시키거나, 당업계에 공지된 기법을 이용하여 중간체(예를 들어 당업계에 공지된 링커)를 통해 간접적으로 커플링 또는 접합시킬 수 있다. 본 발명에 따라 진단제로서 사용하기 위해 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대한 미국 특허 제4,741,900호를 참조할 것. 적합한 효소의 예로는 호스래디시 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 들 수 있으며; 적합한 보결 분자단 착물의 예로는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 들 수 있으며; 적합한 형광물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오로세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린을 들 수 있으며;발광물질의 예로는 루미놀을 들 수 있으며; 생발광물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린 및 아에쿠오린을 들 수 있으며; 적합한 방사성 물질의 예로는125I,131I,111In 또는99Tc를 들 수 있다.
또한, 항체 또는 이의 단편은 세포독소, 예를 들어 세포분열 억제제 또는 세포파괴제, 치료제 또는 방사성 금속 이온, 예를 들어 알파-방출제(예;213Bi)와 같은 치료부에 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제로는 세포에 유해한 영향을 미치는 임의의 제제를 들 수 있다. 이의 예로는 파크리탁솔, 사이토칼라이즘 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-디히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올, 및 퓨로마이신과 이의 유사체 또는 상동체를 들 수 있다. 치료제의 예로는 항대사제(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(구: 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(구: 액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)) 및 항유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 접합체는 소정의 생물학적 응답을 변형시키기 위해 사용할 수 있으며, 치료제 또는 약물 부분은 고전적인 화학적 치료제로 제한되는 것으로 이해되지 않는다. 예를 들어, 상기 약물 부분은 소정의 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어, 독소(예; 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소); 단백질(예; 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유도된 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성제, 세포자살제, 예를 들어 TNF-α, TNF-β, AIM I(참조: 국제 공개 공보 WO 97/33899), AIM II(참조: 국제 공개 공보 WO 97/34911), Fas 리간드[참조: Takashima 등, Int. Immunol. 6: 1567-1574 (1994)], VEGI(참조: 국제 공개 공보 WO 99/23105), 혈전형성제 또는 항-혈관형성제, 예를 들어 앤지오탠신 또는 엔도스타틴; 또는 생물학적 응답 변형제, 예를 들어 림포카인, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-6("IL-6"), 과립구 거식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 기타 성장 인자를 들 수 있다.
또한, 항체는 고형 지지체에 부착할 수 있는데, 이는 표적 항원의 면역분석 또는 정제를 위해 특히 유용하다. 이러한 고형 지지체의 예로는 유리, 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
그러한 치료부를 항체에 접합시키는 기술은 공지되어 있다[참조: Arnon 등,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al.(eds),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985); Hellstrom 등, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery(2nd ed), Robinson 등(eds) , pp.623-53 (Marcel Dekker,Inc.1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review",in Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinical Applications, Pinchera 등(eds),pp.475-506(1985); "Analysis, Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin 등(eds.),pp.303-16 (Academic Press 1985),and Thorpe 등,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol.Rev.62:119-58 (1982)].
한편, 항체는 Segal에 의해 미국 특허 제4,676,980호(본원에 전적으로 참고 인용함)에 개시된 바와같이, 항체 이종접합체를 형성하기 위하여 두번째 항체에 연결될 수 있다.
항체는 그에 연결된 치료부와 함께 또는 치료부없이 단독으로 투여되거나 또는 세포독성 인자 및/또는 사이토카인과 함께 투여되어 치료제로서 이용될 수 있다.
면역표현형 결정
본 발명의 항체는 세포주와 생물 시료의 면역표현형 결정에 이용될 수도 있다. 본 발명 유전자의 번역 산물은 세포 특이적 표지로서, 또는 더욱 구체적으로특정 세포 유형의 분화 및/또는 성숙의 다양한 단계에서 다르게 발현되는 세포 표지로서 유용할 수도 있다. 특정 에피토프, 또는 에피토프의 조합에 대해 형성된 모노클론 항체는 그 표지를 발현하는 세포 집단의 검색을 가능하게 할 것이다. 표지를 발현하는 세포 집단을 검색하기 위해 모노클로날 항체를 이용하는 다양한 기법이 이용될 수 있으며, 항체-피복된 자석 비드를 이용한 자석 분리, 고체 매트릭스(예, 평판)에 부착된 항체에 의한 "패닝(panning)" 및 플로우 사이토미트리를 포함한다[참조: 미국 특허 제5,985,660호; 및 Morrison 등, Cell 96:737-49 (1999)].
이러한 기법들은 혈액 종양(예, 급성 백혈병 환자에서 최소 잔여 질병(MRD))에서 발견될 수도 있는 것과 같은 특정 세포 집단 및 그래프트-대-호스트 질병(GVHD)을 방지하기 위한 이식에서의 "비-자기"세포의 스크리닝을 허용한다. 한편, 이들 기술은 사람 탯줄혈에서 발견될 수 있는 것과 같은, 증식 및/또는 분화를 진행할 수 있는 조혈 간세포 및 선구(progenitor) 세포의 스크리닝을 허용한다.
항체 결합에 대한 분석
본 발명의 항체는 임의의 공지 방법에 의해 면역 특이적 결합에 대해 분석될 수도 있다. 이용될 수 있는 면역 분석은 웨스턴 블롯, 방사선면역분석, ELISA(효소 연결된 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 침강소 반응, 젤 확산 침강소 반응, 면역확산 분석, 응집 분석, 보체-고정 분석, 면역복사계(immunoradiometric) 분석, 형광 면역분석, 단백질 A 면역분석과 같은 기술을 이용하는 경쟁적 및 비경쟁적 분석을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 그러한 분석은 일상적이며 업계에 잘 공지되어 있다[참조: Ausubel 등, eds., 1998,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 본원에 참고로 인용됨]. 이하, 예시적인 면역분석은 간략히 기술한다(면역분석이 기술된 것을 제한되는 것은 아니다).
면역침전 프로토콜은 일반적으로 세포 집단을 단백질 포스파타제 및/또는 프로테아제 저해제(예, EDTA, PMSF, 아프로티닌, 소듐 바나데이트)로 보충된 RIPA 완충액(1% NP-40 또는 Triton X-100, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 0.15M NaCl, 0.01M 소듐 포스페이트(pH 7.2), 1% Trasylol)같은 용해 완충액에서 용해시키고, 관심의 항체를 세포 용해액에 첨가하고, 4℃에서 일정 기간(예, 1-4 시간)동안 배양하고, 단백질 A 및/또는 단백질 G 세파로즈 비드를 세포 용해액에 첨가하고, 4℃에서 약 1시간 이상 항온처리하고, 용해 완충액중의 비드를 세척하고 그 비드를 SDS/시료 완충액에 재현탁시키는 것을 포함한다. 관심의 항체가 특정 항원을 면역침전시키는 능력은 예를 들어 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가될 수 있다. 당업자는 항원에의 항체 결합을 증가시키고 배경을 감소시키기 위해 변형될 수 있는 변수에 관해 알 것이다(예, 세파로즈 비드로 세포 용해액을 미리세정함). 면역침전 프로토콜에 관한 추가의 설명에 대해서는 문헌[참조: Ausubel 등, eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY의 10.16.1]을 참조할 것.
웨스턴 블롯 분석은 일반적으로 단백질 시료의 제조, 폴리아크릴아미드 젤(예, 항원의 분자량에 따라 8%-20% SDS-PAGE)에서의 단백질 시료의 전기영동, 폴리아크릴아미드 젤로부터 니트로셀룰로스, PVDF, 또는 나일론 같은 막으로의 시료의이동, 차단 용액(예, 3% BSA를 가진 PBS 또는 탈지유)에서 막의 차단, 세척 완충액(예, PBS-Tween 20)에서 막의 세척, 차단 완충액에 희석된 일차 항체(관심의 대상인 항체)를 이용한 막의 차단, 세척 완충액에서 막의 세척, 효소적 기질(호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알카라인 포스파타제) 또는 방사성 분자(예,32P 또는125I)에 연결되고 차단 완충액에 희석된 이차 항체(일차 항체를 인식함, 항-인간 항체)에 의한 막의 차단, 세척 완충액에서 막의 세척, 및 항원 존재의 검출을 포함한다. 당업자는 검출되는 시그날을 증가시키고 배경 잡음을 감소시키기 위해 변형될 수 있는 변수에 관해 알 것이다. 웨스턴 블롯에 대한 추가의 설명을 위해서는 문헌[참조: Ausubel 등, eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY 10.8.1]을 참조할 것.
ELISA는 항원 제조, 96웰 미량역가 평판의 웰의 항원에 의한 피복, 효소적 기질(호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제)과 같은 검출가능한 화합물에 연결된 관심 항체의 웰에의 첨가 및 일정 시간동안의 배양, 및 항원 존재의 검출을 포함한다. ELISA에서는 관심 항체는 검출가능한 화합물에 연결될 필요는 없다. 대신, 검출가능한 화합물에 연결된 두번째 항체(관심 항체를 인식함)가 웰에 첨가될 수도 있다. 더욱이, 웰을 항원으로 피복시키는 대신, 항체가 웰에 피복될 수도 있다. 이 경우, 검출가능한 화합물에 연결된 두번째 항체는 관심 항원을 피복된 웰에 첨가한 후 첨가할 수도 있다. 당업자는 검출되는 시그날을 증가시키기 위해 변형될 수 있는 변수와 ELISA의 다른 변이를 알 것이다. ELISA에 대한 추가의설명을 위해서는 문헌[참조: Ausubel 등, eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY 10.8.1]을 참조할 것. 항체의 항원에 대한 결합 친화성과 항체-항원 상호작용의 분리율은 경쟁적 결합 분석에 의해 결정될 수 있다. 경쟁적 결합 분석의 한 가지 예는 비표지 항원의 증가량 존재하에서 표지 항원을 관심 항체와 배양하고 표지 항원에 결합된 항체를 검출하는 것을 포함하는 방사성 면역분석이다. 특정 항원에 대한 관심 항체의 친화성과 결합 분리율을 스캐차드 플롯 분석에 의해 자료로부터 결정할 수 있다. 두 번째 항체와의 경쟁은 또한 방사성면역분석을 이용하여 결정될 수 있다. 이 경우, 항원은 비표지 두번째 항체의 증가량 존재하에서 표지 화합물(예,3H 또는125I)에 연결된 관심 항체와 배양된다.
벡터 및 숙주세포
또한, 본 발명은 본 발명의 분리된 DNA 분자를 포함하는 벡터, 상기 재조합 벡터로 유전자 조작된 숙주 세포 및 재조합 기법에 의해 KGF-2 폴리펩티드 또는 이의 단편의 생성에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드의 단편 또는 부분은 펩티드 합성에 의해 상응하는 전장 폴리펩티드를 생성하는데 사용할 수 있으며; 따라서, 상기 단편은 전장 폴리펩티드를 생성하기 위한 중간체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단편 또는 부분을 이용하여 본 발명의 전장 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터로유전자 조작된 숙주 세포 및 재조합 기법에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 것에 관한 것이다.
숙주 세포는 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터를 이용하여 유전적으로 조작된다(형질도입 또는 형질전환 또는 형질감염). 상기 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 입자, 파지 등의 형태일 수 있다. 조작된 숙주 세포는 프로모터를 활성화하거나, 형질전환체를 선택하거나, KGF-2 유전자를 증폭시키기 위해 적절히 변형된 통상적인 영양 배지내에서 배양시킬 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포 배양시에 사용한 조건일 수 있으며, 이는 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 이용하여 재조합 기법에 의해 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 따라서, 예를 들어 상기 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 발현하기 위한 여러 가지 발현 벡터중 임의의 벡터내에 포함될 수 있다. 이러한 벡터는 염색체 DNA 서열, 비염색체 DNA 서열 및 합성 DNA 서열, 예를 들어 SV40의 유도체; 박테리아 플라스미드; 파지 DNA; 바쿨로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드와 파지 DNA, 바이러스 DNA(예; 백시니아, 아데노바이러스, 계두 바이러스 및 슈도라비에스)로부터 유도된 벡터를 들 수 있다. 그러나, 숙주내에서 복제할 수 있고, 생존할 수 있는 임의의 다른 벡터를 사용할 수도 있다.
적합한 DNA 서열은 여러가지 방법으로 벡터 내로 삽입할 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 당업계에 공지된 방법에 의해 적합한 제한 엔도뉴클레아제 위치(들) 내로 삽입된다. 이러한 과정 및 다른 과정은 당업자의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다.
발현 벡터 내의 DNA 서열은 cDNA 합성을 유도하기 위해 적합한 발현 조절 서열(프로모터)에 작동가능하게 연결된다. 이러한 프로모터의 대표적인 예로는 LTR 또는 SV40 프로모터, 이.콜리 lac 또는 trp, 파지 람다 PL프로모터 및 원핵세포 또는 진핵세포 또는 그들의 바이러스내에서 유전자의 발현을 조절하는 것으로 공지된 기타 프로모터를 들 수 있다. 또한, 상기 발현 벡터는 번역 개시 및 전사 종력을 위한 리보좀 결합 위치를 함유한다. 또한, 상기 벡터는 발현을 증폭하기 위해 적합한 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커 유전자를 함유하여 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형적 특성을 제공하는 것이 바람직한데, 이의 예로는 진핵 세포 배양을 위한 디히드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성, 또는 이. 콜리 내에서의 테트라사이클린 또는 앰피실린 내성을 들 수 있다.
상기한 바와 같은 적합한 DNA 서열 및 적합한 프로모터 또는 조절 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 적합한 숙주를 형질전환시켜 숙주로하여금 단백질을 발현하도록 할 수 있다.
지시된 바와 같이, 발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마터를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 마커는 디히드로폴레이트 환원 효소, G418 또는 진핵 세포 배양물에 대한 네오마신 내성 및 이. 콜리 및 기타 박테리아에서 배양을 위한 테트라시클린, 카나마이신 또는 암피실린 내성을 포함한다. 적절한 숙주의 대표적예는 박테리아 세포, 예를 들면 E.coli, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피뮤리움 세포; 진균 세포, 예를 들면 효모 세포(예, 사카로마이세스 세레비지에 또는 피키아 파스토리스(ATCC 기탁번호 201178)); 곤충 세포, 예를 들면 드로소필라 S2 및 스포돕테라 Sf9 세포; 동물 세포, 예를 들면 CHO, COS, 293, 및 보우스 흑색종 세포; 및 식물 세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적절한 배양 매개물 및 상술된 숙주 세포를 위한 조건이 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 실시에서 발현 벡터의 이용 이외에, 본 발명은 관심있는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 오퍼레이터 및 프로모토 요소를 포함하는 신규의 발현 벡터를 추가로 포함한다. 이러한 벡터의 예로는 후술하는 pHE4-5이다.
도 50 및 51에 요약한 바와 같이, pHE4-5 벡터의 성분(서열 번호 147)은 1) 선택 마커로서 네오마이신포스포트랜스퍼라제 유전자, 2) 이. 콜리 복제 원점, 3) T5 파지 프로모터 서열, 4) 2개의 lac 프로모터 서열, 5) 샤인-달가노 서열, 6) 락토즈 오페론 억제제 유전자(lacIq)를 포함한다. 복제 원점(oriC)은 pUC19(메릴랜드 게티스버그의 LTI)로부터 유래한 것이다. 프로모터 서열 및 오퍼레이터 서열은 합성적으로 제조한다. 핵산 서열의 합성적인 생성은 당업계에 널리 공지되어 있다. 미국 캘리포니아 94303 팔로알토 이스트 미도우 서클 1020에 소재하는 클론테크의 클론테크 95/95 카탈로그 215-216면. KGF-2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)은 pHE4-5 벡터의 NdeI 및 Asp718 위치 사이에 상기 뉴크레오티드 서열을 삽입함으로써 상기 프로모터 및 오퍼레이터에 작동가능하게 연결된다.
상기한 바와 같이, pHE4-5 벡터는 lacIq 유전자를 포함한다. LacIq는 lac 오퍼레이터의 확실한 조절을 부여하는 lacI 유전자의 대립유전자이다. Amann, E 등, Gene 69:301-315(1988); Stak, M., Gene 51:255-267 (1987). lacIq 유전자는 lac 오퍼레이터 서열에 결합하고 하류(즉, 3') 서열의 전자를 차단하는 억제인자 유전자를 암호화한다. 그러나, lacIq 유전자 생성물은 락토즈 또는 특정 락토즈 유사체, 즉 이소프로필 B-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)의 존재시 lac 오퍼레이터로부터 분리된다. METH1 또는 METH2 는 따라서 pHE4-5 벡터를 함유하는 유도되지 않은 숙주 세포내에 상당한 양으로 생성되지 않는다. 그러나, IPTG와 같은 제제의 첨가에 의한 이러한 숙주 세포의 유도는 METH1 또는 METH2 코딩 서열의 발현을 야기한다.
pHE4-5 벡터(서열 번호 148)의 프로모터/오퍼레이터 서열은 T5 파지 프로모터 및 24개의 lac 오퍼레이터 서열을 포함한다. 하나의 오퍼레이터는 전사 개시 부위의 5'에 위치하고 다른 오퍼레이터는 동일한 부위의 3'에 위치한다. 이러한 오퍼레이터는 lacIq 유전자 생성물과 배합되어 존재하는 경우 lac 오페론 유도인자, 예컨대, IPTG의 부재시 하류 서열의 정확한 억제를 부여한다. lac 오퍼레이터로부터 하류에 위치하는 작동적으로 연결된 서열의 발현이 IPTG와 같은 lac 오페론 유도인자의 첨가에 의하여 유도될 수 있다. lacIq 단백질에 lac 유도인자가 결합하면 lac 오퍼레이터 서열로부터 이들이 방출되어 작동적으로 연결된 서열이 전사 개시된다. 유전자 발현의 Lac 오페론 조절은 문헌[참조: Devlin, T., TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRY WITH CLINICAL CORRELATIONS, 제4판, 802-807면 (1997)]에 제시되어있다.
일련의 pHE4 벡터는 METH1 또는 METH2 코딩 서열을 제외한 pHE4-5 벡터의 성분 모두를 함유한다. pHE4 벡터의 특성은 최적화된 합성 T5 파지 프로모터, lac 프로모터 및 샤인-델가노 서열을 포함한다. 추가로, 이러한 서열은 최적으로 간격이 떨어져 위치하므로 삽입된 유전자의 발현이 정확하게 조절되어 고 농도의 발현이 유도시 일어난다.
본 발명의 단백질의 생성에 사용하기 적절한 공지의 박테리아 프로모터중에서 E.coli lacI 및 lacZ 프로모터, T3 및 T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 PR 및 PL 프로모터 및 trp 프로모터를 포함한다. 적절한 진핵 프로모터는 CMV 즉각적 초기 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스 LTR의 프로모터, 예를 들면 라우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터, 예를 들면 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터를 포함한다.
pHE4-5 벡터는 또한 AUG 개시 코돈의 5' 샤인-델가노 서열을 포함한다. 샤인-델가노 서열은 AUG 개시 코돈으로부터 약 10 뉴클레오티드 상류(즉, 5')에 일반적으로 위치하는 짧은 서열이다. 이러한 서열은 AUG 개시 코돈에 필수적으로 원핵 리포좀을 위치시킨다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 단백질의 생성에 유용한 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 양태는 pHE4-5 벡터(서열번호 147)에 의하여 예시화된다. KGF-2 Δ33을 암호화하는 cDNA 삽입물을 함유하는 pHE4-5 벡터는 ATCC No. 209575로 1998년 1월 9일에 ATCC에 기탁되었다.
보다 구체적으로, 본 발명은 또한 앞에서 포괄적으로 설명한 1종 이상의 서열을 포함하는 재조합 작제물을 포함한다. 본 발명의 작제물은 본 발명의 서열이 삽입되는 진행 방향 또는 역방향의 벡터, 예를 들면 플라스미드성 또는 바이러스성 벡터를 포함한다. 이 실시 양태의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 작제물은, 예를 들면 서열에 조작 결합된 프로모터를 포함하는 조절 서열을 더 포함한다. 많은 수의 적당한 벡터 및 프로모터가 당업자들에게 공지되어 있고, 시판되고 있다. 하기의 벡터들을 그 예로 들 수 있다. 박테리아성 벡터: pQE70, pQE60, pQE-9(퀴아겐), pBS, pDIO, 파지스크립, psiX174, 피블루스크립 SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(스트라타젠); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(파마시아); 진핵성 벡터: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(스트라타젠), pSVK3, pBPV3, pMSG, pSVL(파마시아). 그러나, 숙주에서 복제 및 생존 가능한 것인 한 다른 어떤 플라스미드 또는 벡터도 사용할 수 있다.
박테리아에 사용하기에 바람직한 벡테에는 퀴아겐 인크.(QIAGEN, Inc.)에서 입수할 수 있는 pQE70, pQE60 및 pQE-9; 스트라젠 클로닝 시스템즈, 인크.에서 입수할 수 있는 피블루스크립 벡터, 파지스크립 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A; 및 파마시아 바이오테크, 인크.에서 입수할 수 있는 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5가 있다. 바람직한 진핵성 벡터에는 스트라타젠에서 입수할 수 있는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG 및 파마시아에서 입수할 수 있는 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL이 있다. 이스트 시스템에 사용하기에 바람직한 발현 벡터에는 pYES2, pYD1, pTEF1/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZ알파, pPIC9,pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K, pPIC9K 및 PAO815(모두 미국 칼바드, 인비트로겐에서 입수할 수 있음)가 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 당업자들은 다른 적합한 벡터들도 쉽게 알 수 있을 것이다.
프로모터 영역은 CAT(클로람페니콜 트랜스퍼라제) 벡터 또는 선택성 마커를 가진 다른 벡터를 사용하여 임의의 바람직한 유전자로부터 선택될 수 있다. 2개의 적당한 벡터는 pKK232-8 및 pCM7이다. 특히 명명된 박테리아성 프로모터에는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 PR, PL및 trp가 있다. 진핵성 프로모터에는 CMV 즉각적 초기 프로모터, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR 및 마우스 메탈로티오네인-I가 있다. 적당한 벡터 및 프로모토의 선택은 당업자들의 상식선에서 할 수 있다.
숙주 세포에 대한 작제물의 삽입은 인산칼슘 감염, DEAE-덱스트란 매개 감염, 양이온성 지질-매개 감염, 전기영동, 형질도입, 전염 또는 기타 방법으로 수행할 수 있다. 그러한 방법들은 다수의 표준 실험 책자, 예를 들면 데이비스 등의 문헌[Basic Methods in Molecular Biology(1986)]에 기재되어 있다. 구체적으로 KGF-2 폴리펩티드는 실제로 재조합 벡터 결함 숙주 세포에 의해 발현될 수 있을 것이다.
다른 실시 양태에 의하면, 본 발명은 전술한 작제물을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 고등 진핵 세포, 예를 들면 포유 동물 세포, 또는 저등 진핵 세포, 예를 들면 효모 세포일 수 있으며, 또는 숙주 세포는 원핵 세포, 예를들면 박테리아 세포일 수 있다. 숙주 세포에 대한 작제물의 도입은 인산칼슘 감염, DEAE-덱스트란 매개 감염, 또는 전기영동으로 수행할 수 있다[데이비스 등,Basic Methods in Molecular Biology(1986)].
숙주 세포 내의 작제물은 재조합 서열에 의해 암호화된 유전자 생성물을 제조하는 데 통상의 방법으로 사용될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 폴리펩티드는 통상의 펩티드 합성자에 의해 합성적으로 제조될 수 있다.
성숙 단백질은 포유 동물 세포, 효모, 박테리아 또는 기타 세포에서 적당한 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있다. 본 발명의 DNA 작제물에서 유도된 RNA를 사용하여 그러한 단백질을 제조하는 데 세포 배제 번역 시스템을 사용할 수도 있다. 원핵 및 진핵 숙주를 사용하는 데 적합한 클로닝 및 발현 벡터는 샘브룩 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, 미국 뉴욕주 콜드 스프링 하버(1989)]에 개시되어 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참고 인용한다.
고등 진핵 세포에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 전사는 벡터에 인핸서 서열을 삽입함으로써 증가된다. 인핸서는 보통 약 10 내지 300 bp의 DNA의 cis-작용 성분으로서 프로모터에 작용하여 그것의 전사를 증가시킨다. 그 예에는 bp 100 내지 270의 복제 기원의 후측에 대한 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후측에 대한 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스바이러스가 있다.
번역된 단백질을 내부 원형질 망상 조직의 내강에, 세포막 공간에 또는 세포외 공간에 분비하기 위해서, 적당한 분비 신호를 발현된 폴리펩티드에 도입시킬 수있다. 그 신호는 폴리펩티드에 대해 내인성이거나 이종성 신호일 수 있다.
폴리펩티드는 변형된 형태, 예를 들면 융합 단백질로 발현될 수 있으며, 분비 신호뿐만 아니라 추가의 이종성 작용 영역도 포함할 수 있다. 예를 들면, 추가의 아미노산 영역, 구체적으로 하전된 아미노산은 숙주 세포 내에서의 안정성 및 지속성을 위해 정제 중에, 또는 후속 처리 및 저장 중에 폴리펩티드의 N-말단에 첨가될 수 있다. 또한, 펩티드 성분은 정제를 촉진하기 위해 폴리펩티드에 첨가될 수 있다. 그러한 영역들은 폴리펩티드의 최종 제조 단계 전에 제거될 수 있다. 분비 또는 배출을 유도하고, 안정성을 향상시키고, 정제를 촉진하기 위해 폴리펩티드에 펩티드 성분을 첨가하는 것은 당업계에는 잘 알려진 통상의 기술이다. 바람직한 융합 단백질은 수용체를 안정화시키는 데 유용한 면역글로부린으로부터의 이종성 영역을 포함한다. 예를 들면, EP-A-O 464 533(카나다 대응 특허 제2045869호)에는 면역글로부린 분자의 일정 영역으로 이루어진 다양한 부분과 함께 다른 인체 단백질 또는 그 일부를 포함하는 융합 단백질이 개시되어 있다. 많은 경우에, 융합 단백질의 Fc 부분은 치료 및 진단용으로서 상당히 유리하며, 따라서 개량된 약물 생체 반응 특성을 제공한다(EP-A 0232 262). 한편, 몇몇 용도의 경우 전술한 바와 같은 유리한 방법으로 융합 단백질을 발현, 검출 및 정제한 후 Fc 부분을 제거할 수 있는 것이 바람직하다. 이것은 Fc 부분이 치료 및 진단에 사용하는 데 장애가 되는 경우, 예를 들면 융합 단백질이 면역화용 항원으로서 사용되는 경우이다. 약물 발견시, 예를 들면 shIL5-수용체와 같은 인체 단백질은 hIL-5의 안타고니스트를 동정하기 위한 고효율 스크리닝 분석을 위해 Fc 부분과 융합시켰다[참조: 디. 벤넷 등,J. Mol. Recognition, Vol. 8 52-58(1995) 및 케이. 존슨 등,J. Biol. Chem., 270(16): 9459-9471(1995)].
일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 기원과, 숙주 세포, 예를 들면E. coli및S. cerevisiaeTRPI 유전자의 앰피실린 저항 유전자를 형질 전환시키는 선택성 마커와, 하류 구조 서열의 전사를 유도하는 고발현 유전자로부터 유도된 프로모터를 포함한다. 그러한 프로모터는 예를 들면 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), α-인자, 산 포스파타제, 또는 열충격 단백질 등과 같은 글리콜 분해 효소를 암호화하는 오페론으로부터 유도될 수 있다. 이종성 구조 서열은 전사 개시 서열 및 종료 서열에 의해, 바람직하게는 세포막 공간 또는 세포외 매질에 전사 단백질의 분비를 유도할 수 있는 리더 서열을 이용하여 적당한 단계에서 조립된다. 임의로, 이종성 서열은 바람직한 특성, 예를 들면 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순 정제 특성을 부여하는 N-말단 동정 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 암호화할 수 있다.
박테리아용으로 유용한 발현 벡터는 소정의 단백질을 암호화하는 DNA 구조 서열을 작용성 프로모터를 가진 이용가능한 판독 상의 적합한 번역 개시 및 종료 신호와 함께 삽입함으로써 작제된다. 벡터는 벡터의 유지를 보장하고, 필요에 따라 숙주 내의 증폭을 제공하도록 1종 이상의 표현형 선택성 마커와 복제 기원을 포함한다. 형질 전환에 적합한 원핵 숙주에는 이. 콜리, 바실러스 서브틸리스, 살모넬라 티피무륨 및 슈도모나스 속, 스트렙토마이세스 속 및 스타필로코커스 속에 포함된 다양한 종이 포함되지만, 필요에 따라 다른 것도 사용할 수 있다.
대표적으로, 박테리아용으로 유용한 발현 벡터는 선택성 마커와 공지의 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 유전자 성분을 포함하는 시판 플라스미드로부터 유도된 박테리아성 복제 기원을 포함할 수 있으며, 이것에 한정되는 것은 아니다. 그러한 시판 벡터에는 예를 들면 pKK223-3(스웨덴 웁살라 소재의 파마시아 파인 케미칼스) 및 GEM1(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 바이오텍)이 있다. 이들 pBR322 "주쇄" 부분은 적당한 프로모터 및 발현시키고자 하는 구조 서열과 조합된다.
적당한 숙주 균주의 형질 전환과 적당한 세포 밀도를 갖도록 숙주 세포를 성장시킨 후, 선택된 프로모터는 적당한 방법(예를 들면, 온도 변화 및 화학적 유도)에 의해 유도되며 세포는 추가의 기간동안 배양된다.
세포는 일반적으로 원심분리에 의해 수집되고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 분열된 후, 얻어진 미정제 추출물은 추가의 정제를 위해 보관된다.
단백질의 발현에 사용된 미생물 세포는 동결-해동 사이클, 음파 처리, 기계적 분열을 비롯한 임의의 통상의 방법에 의해, 또는 세포 용해제를 이용하는 방법에 의해 분열될 수 있으며, 그러한 방법들은 당업자들에게 잘 알려져 있다.
재조합 단백질을 발현시키는 데 각종 포유 동물 세포 배양 시스템도 사용할 수 있다. 포유 동물 발현 시스템의 예에는 글루즈만의 문헌[Cell 23: 175(1981)]에 개시된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 세포주와, 상용성 벡터를 발현할 수 있는 다른 세포주, 예를 들면 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주가 포함된다. 포유 동물 발현 벡터는 복제 기원, 적합한 프로모터 및 인핸서와, 또한 임의의 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체 및 수용체 부위, 전사 종료 서열, 및 5' 측면 비전사 서열을 포함한다. SV40 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위에서 유도된 DNA 서열은 필요한 비전사 유전자 성분을 제공하는 데 사용할 수 있다.
KGF-2 폴리펩티드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 비롯한 공지의 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 정제에 사용하기에 가장 바람직한 것은 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")이다.
본 발명의 폴리펩티드는 천연에서 정제된 생성물, 또는 화학적 합성 방법에 의한 생성물 또는 원핵 또는 진핵 숙주(예를 들면 배양물 중의 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유 동물 세포)로부터 재조합 기술에 의해 제조된 생성물일 수 있다. 재조합 제조 방법에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화되거나 비글리코실화될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다.
KGF-2 폴리펩티드 및 바람직하게는 분비 형태는 직접 분리한 것이든 배양한 것이든 체액, 조직 및 세포를 비롯한 천연원으로부터 정제된 생성물, 화학적 합성 방법에 의한 생성물 및 예를 들면 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유 동물 세포를 비롯한 원핵 또는 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 제조된 생성물로부터 회수될 수 있다. 재조합 제조 방법에 사용된 숙주에 따라, KGF-2 폴리펩티드는 글리코실화되거나 비글리코실화될 수 있다. 또한, KGF-2 폴리펩티드는 또한 경우에 따라 숙주 매개 방법에서 유래한 초기 변성 메티오닌 잔기를 포함할 수도 있다. 즉, 번역 개시 코돈에 의해 암호화된 N-말단 메티오닌은 일반적으로 모든 진핵 세포 내에 존재하는 번역 후의 임의의 단백질로부터 고효율로 제거된다고 당업계에 알려져 있다. N-말단 메티오닌 또는 대부분의 단백질이 대부분의 원핵 세포에서 효율적으로 제거되지만, 일부 단백질의 경우에는 이 원핵 세포 제거 공정이 N-말단 메티오닌이 공유 결합되는 아미노산의 종류에 따라 비효율적이다.
일 실시 형태에서, 효모 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)는 진핵 시스템에서 KGF-2 단백질을 발현하는 데 사용된다. 피치아 파스토리스는 메탄올을 그것의 단일 탄소원으로서 대사할 수 있는 메틸로트로픽 효모이다. 메탄올 대사 경로의 주요 단계는 메탄올을 O2를 사용하여 포름알데히드로 산화시키는 것이다. 이 반응은 효소 알콜 옥시다제에 의해 촉매화된다. 메탄올을 그것의 단일 탄소원으로 대사하기 위해서, 피치아 파스토리스는 부분적으로는 O2에 대한 알콜 옥시다제의 친화도가 비교적 낮기 때문에 고농도의 알콜 옥시다제를 발생시켜야 한다. 결과적으로, 주 탄소원인 메탄올에 따른 성장 배지에서, 두 알콜 옥시다제 유전자(AOXI) 중 하나의 프로모터 영역이 활성이 더 높다. 메탄올의 존재 하에,AOXI유전자로부터 제조된 알콜 옥시다제는 피치아 파스토리스 중에 약 30% 이하의 총 가용성 단백질을 포함한다[참조: 엘리스 에스. 비. 등,Mol. Cell. Biol. 5:1111-21(1985); 코우츠 피.제이 등,Yeast 5:167-77(1989); 츠촙, 제이. 에프. 등,Nucl. Acids Res. 15: 3859-76(1987)]. 즉, 이종성 암호화 서열, 예를 들면 본 발명의 KGF-2 폴리누클레오티드는AOXI조절 서열의 전부 또는 일부의 전사 조절 하에 메탄올의 존재 하에서, 피치아 효모의 성장이 예외적으로 높은 효율로 발현된다.
일 실시예에서, 프라스미드 벡터 pPIC9K는, 디. 알. 히긴스 및 제이. 크레그의 문헌["Pichia Protocols: Methods in Molecular Biology," 미국 뉴저지주 토토와 소재 더 휴마나 프레스 발행(1998)]에 개시된 바와 같은 피치아 효모 시스템에서, 본 명세서에서 설명하는 바와 같이 본 발명의 KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 발현하는 데 사용된다. 이 발현 벡터는 다중 클로닝 부위의 상류에 위치한 피치아 파스토리스 알카리성 포스파타제(PHO) 분비 신호 펩티드(즉, 리더)에 결합된 강한AOXI프로모터에 의해 본 발명의 KGF-2 단백질을 발현 및 분비시킬 수 있다.
제안된 발현 작제물이 전사, 번역, 분비(필요하면) 등에 대한 적절하게 위치한 시그널, 예를 들면 필요에 따라 인-프레임 AUG을 제공하는 한, 당업자가 용이하게 알 수 있듯이, pPIC9K 대신에 다수의 기타 효모 벡터는, 예를 들면 pYES2, pYD1, pTEF1/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZ알파, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K 및 PAO815를 사용할 수 있다.
또다른 구체예에서, 이종 코딩 서열의 고농도 발현은 예를 들면 본 발명의 KGF-2 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터, 예를 들면, pGAPZ 또는 pGAPZ알파내로 클로닝하고 메탄올의 부재하에서 효모 배양물을 성장시킴으로써 달성될 수 있다.
본 명세서에 설명된 벡터 작제물을 함유하는 숙주 세포를 포함할 뿐 아니라, 본 발명은 또한 척추동물 기원, 특히 포유동물 기원의 1차, 2차 및 고정화된 숙주 세포를 포함한다. 상기 숙주 세포는 내인성 유전 물질(예, KGF-2 코딩 서열)을 결실하거나 또는 대체하도록 조작되거나, 및/또는 본 발명의 KGF-2 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 결합되고 내인성 KGF-2 폴리뉴클레오티드를 활성, 변형 및/또는 증폭시키는 유전 물질(예, 이종 폴리뉴클레오티드 서열)을 포함하도록 조작된다. 예를 들면, 공지의 방법은 상동성 재조합에 의하여 이종의 조절 서열(예, 프로모터 및/또는 인핸서) 및 내인성 KGF-2 폴리뉴클레오티드 서열과 작동적으로 결합시켜 신규한 전사 단위를 형성하는 데 사용될 수 있다(참조: 미국 특허 제5,641,670호, 1997년 6월 24일에 발행; 미국 특허 제5,733,761호, 1998년 3월 31일에 발행; 국제 공개 WO 96/29411, 1996년 9월 26일 공개; 국제 공개 WO 94/12650, 1994년 8월 4일 공개; Koller 등,Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); 및 Zijlstra 등,Nature 342;435-438 (1989), 상기 각 공보의 개시내용은 그 전체를 본 명세서에서 참고로 인용함).
KGF-2의 진단 및 치료 용도
하기 섹션에서 설명하는 바와 같이, "KGF-2"는 본 명세서에 개시된 KGF-2의 전길이 및 성숙 형태와 본 명세서에 개시된 KGF-2 유사체, 유도체 및 돌연변이체를 나타내는 것이다. 본 발명은 또한 KGF-2 핵산 서열 내에 돌연 변이의 존재와 관련된 질병의 검측 또는 그 질병에 걸리기 쉬운지를 검측하기 위한 진단 방법의 일부로서 KGF-2 유전자를 이용하는 것에 관한 것이다.
KGF-2 유전자에서 돌연 변이를 매개하는 개체는 다양한 기법에 의해 DNA 수준으로부터 검측될 수 있다. 진단용 핵산은 피검체의 세포, 예를 들어, 혈액, 소변, 타액, 생체 조직 또는 검시 물질에서 얻을 수 있다. 게놈 DNA를 검측에 직접 사용하거나, 분석 전에 PCR을 사용하여 효소적으로 증폭시킬 수 있다[사카이 등,Nature 324:163-166(1986)]. 또한, 유사한 방식으로 RNA 또는 cDNA를 사용할 수 있다. 일례로, KGF-2 돌연 변이를 동정 및 분석하는 데 KGF-2를 암호화하는 핵산에 상보성인 PCR 프라이머를 사용할 수 있다. 증폭 생성물의 크기 변화를 정상 게놈 타입과 비교하여 삭제(deletion) 및 삽입(insertion)을 검측할 수 있다. 증폭된 DNA와 방사선 표지된 KGF-2 RNA를, 또는 방사선 표지된 KGF-2 안티센스 DNA 서열을 하이브리드화시킴으로써 점 돌연변이를 동정할 수 있다. RNase A 소화에 의하여 또는 용융 온도차에 의하여 완전하게 매치된 서열을 미스매치된 듀플렉스와 구별할 수 있다.
DNA 서열 차이에 근거한 유전자 검사는 변성제(denaturing agent)를 사용하거나 사용하지 않고 겔 중의 DNA 단편의 전기 영동 이동성의 변화를 검측하여 수행할 수 있다. 소량의 서열 삭제 및 삽입은 고해상도 겔 전기 영동 분석에 의해 가시화할 수 있다. 서열이 다른 DNA 단편은, 특정의 용융 온도 또는 부분적 용융 온도에 따라 다른 DNA 단편의 겔 중에서의 이동성을 지연시키는 변성 폴리아미드 구배 겔을 이용하여 구별할 수 있다[Myerset al., Science 230:1242(1985)].
또한 특정 위치에서의 서열 변화는 RNas 및 SI 보호 또는 화학적 분해 방법과 같은 핵산 분해 효소 보호 분석법을 이용하여 확인할 수 있다[예를 들면 코튼 등,PNAS, USA, 85:4397-4401(1985)].
즉, 특정 DNA 서열의 삭제는 하이브리드화, RNas 보호, 화학적 분해, 직접 DNA 서열화 또는 제한 효소(예를 들면 제한 단편 길이 폴리모르피즘(RFLP))의 이용과 같은 방법 및 게놈 DNA의 서던 블로팅에 의해 수행할 수 있다.
종래의 겔-전기 영동법 및 DNA 서열화 외에도, 돌연 변이는 현장에서의 분석에 의해서도 검측할 수 있다.
본 발명은 또한 정상 대조 조직 시료와 비교한 단백질의 과발현이 질병 또는 질병에 걸리기 쉬운 상태, 예를 들면 종양의 존재를 검측할 수 있기 때문에 각종 조직에서의 KGF-2 단백질의 변화 수준을 검측하는 진단 분석법에 관한 것이다. 숙주에서 유도된 시료 중의 KGF-2 단백질의 농도를 검측하는 데 사용된 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있으며 방사선 면역 분석법, 경쟁적 결합 분석법, 웨스턴 블롯 분석법, ELISA 분석법 및 "샌드위치" 분석법이 있다. ELISA 분석법[Coliganet al.,Current Protocols in Immunology1(2): Chapter 6(1991)]은 먼저 KGF-2 항원에 특이적인 항체, 바람직하게는 모노클론 항체를 제조하는 단계를 포함한다. 또한 단일클론 항체에 대한 리포터 항체를 제조한다. 리포터 항체에는 방사능, 형광, 또는 이 실시예에서는 서양 고추냉이 페록시다제 효소와 같은 검출성 시약을 결합시킨다. 숙주에서 시료를 채취하여 고체 지지체, 예를 들면 폴리스티렌 디쉬 상에서 배양하여 시료 중의 단백질을 결합시킨다. 이어서 소 혈청 알부민과 같은 비특이성 단백질과 함께 배양하여 디쉬 상의 임의의 유리 단백질 결합 부위를 커버한다. 그다음, 폴리스티렌 디쉬에 부착된 임의의 KGF-2 단백질에 단일클론 항체를 부착시킨다. 결합되지 않은 단일클론 항체를 완충액을 이용하여 완전히 세정 제거한다. 고추냉이 페록시다제에 결합된 리포터 항체를 디쉬에 놓아 KGF-2에 결합된 임의의 단일클론 항체에 리포터 항체를 결합시킨다. 결합되지 않은 리포터 항체는 세정 제거한다. 이어서 페록시다제 기질을 디쉬에 첨가하는데, 소정 시간 내에 발현된 칼라의 양은 표준 곡선과 비교할 때 환자로부터의 소정 시료량에 존재하는 KGF-2 단백질의 양을 나타내는 것이다.
KGF-2에 특이적인 항체를 고체 지지체에 부착시키고 표지된 KGF-2와 숙주에서 유도된 시료를 고체 지지체에 통과시킨 다음, 예를 들면 액체 신틸레이션 크로마토그래피에 의해 검측된 표지의 양을 시료 중의 KGF-2의 양과 연관시킬 수 있는 경쟁적 분석법을 이용할 수 있다.
"샌드위치" 분석법은 ELISA 분석법과 유사하다. "샌드위치" 분석법에서는 KGF-2를 고체 지지체에 통과시켜 고체 지지체에 부착된 항체에 결합시킨다. 이어서 제2 항체를 KGF-2에 결합시킨다. 표지되어 제2 항체에 특이적인 제3 항체를 고체 지지체에 통과시켜 제2 항체에 결합시킨 다음 그 양을 정량할 수 있다.
폴리펩티드, 그것의 단편 또는 다른 유도체, 또는 그들의 유사체 또는 그들을 발현하는 세포는 그것에 대한 항체를 생산하는 데 면역원으로서 사용될 수 있다. 그 항체는 예를 들면 폴리클론 또는 단일클론 항체일 수 있다. 본 발명은 또한 키메라 항체, 단일쇄 항체 및 인체화 항체는 물론 Fab 단편, 또는 Fab 발현 라이브러리의 생성물도 포함한다. 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 그러한 항체및 단편을 제조할 수 있다.
본 발명의 서열에 해당하는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 폴리펩티드를 동물에 직접 주사하거나 또는 폴리펩티드를 동물, 바람직하게는 사람 이외의 동물에 투여하여 얻을 수 있다. 이어서 그렇게 얻은 항체를 폴리펩티드 자체에 결합시킨다. 그러한 방법으로, 폴리펩티드 단편만을 암호화하는 서열을 사용하는 경우에도 본래의 전체 폴리펩티드에 결합하는 항체를 생성시킬 수 있다. 그러한 항체는 그 폴리펩티드를 발현하는 조직으로부터 폴리펩티드를 분리하는 데 사용할 수 있다.
단일 클론 항체를 제조하는 데는, 연속 세포주 배양물에 의해 제조된 항체를 제공하는 어떤 기술이라도 이용할 수 있다. 그 예에는 하이브리도마 기술(Kohler & Milstein,Nature 256:495-497(1975)], 트리오마 기술, 인체 B-세포 하이브리도마 기술[Kozbor et al.,Immunology Today 4:72(1983)], 및 인체 단일클론 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술[Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, Inc., pp. 77-96(1985)]이 있다.
단일쇄 항체의 제조에 관한 기술(미국 특허 제4,946,778호)은 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 생성물에 대한 단일쇄 항체를 제조하는 데 적용시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 면역원성 폴리펩티드 생성물에 대한 인체화된 항체를 발현하는 데 유전자 변형 쥐를 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 상피의 성장을 자극하는 것으로 밝혀졌다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는 상피의 성장을 자극하는 데 사용할 수 있다. "상피"란 혈관및 기타 소강의 내막을 비롯한 신체의 내피 및 외피를 포괄하는 용어이다. 이것은 소량의 결합 물질에 의해 결합된 세포로 이루어진다. 상피는 층의 수, 깊이 및 표면 세포의 형태를 기초로 그 종류가 나누어진다. 상피 세포에는 각막전 상피, 바페트 상피, 피막 상피, 섬모 상피, 원주 상피, 각막 상피, 입방 상피, 반규관 상피, 법랑 상피, 가성 상피, 배 상피, 치은 상피, 선 상피, 신사구체 상피, 중층 상피, 수정체 상피, 간엽 상피, 후각 상피, 포석양 상피, 색소 상피, 보호 상피, 다열 상피, 추체성 상피, 호흡 상피, 간상 상피, 정세관 상피, 감각 상피, 단층 상피, 편평 상피, 중층 상피, 피막하 상피, 구 상피, 모자이크양 상피, 이행 상피, 및 눈, 혀, 선(腺), 구강 점막, 십이지장, 회장, 공장, 맹장, 비강 경로, 식도, 관상물, 유선, 및 여성 및 남성 생식기의 상피 세포가 있다.
"선"은 통상의 대사 필요성과 무관한 물질을 분비 또는 배출하는 특수 기능을 가진 세포를 총칭하는 것이다. 진핵 세포를 포함할 수 있는 선의 예에는 흡수선, 부선, 포상선, 산분비선, 부이하선, 부신선, 집합선, 알바란선, 항문선, 포상선, 전전립선, 대동맥선, 전설선, 아포크린선, 유륜선, 동맥선, 동맥미골선, 파열선, 아셀리선, 아비센나선, 부신선, 액와선, 바르톨린선, 바우힌선, 바움가르텐선, 담관점액선, 블란딩선, 혈관선, 뵈르하베선, 본노선, 보우만선, 상완선, 기관지선, 브루크선, 브루너선, 협선, 구해면체선, 분문선, 경동맥선, 복강선, 귀지선, 자궁경관선, 맥락선, 치아치오선, 모양선, 항문주위선, 클로케선, 코벨리선, 미골선, 코일선, 복합선, 구상선, 결막선, 쿠퍼선, 피부선, 세포분비선, 내분비선, 십이지장선, 뒤베르네선, 에브너선, 누출분비선, 에글리선, 내분비선, 상피내선, 식도선,배출선, 외분비선, 설소포선, 위저선, 위선, 위대망선, 게이선, 생식선, 치은선, 글레선, 구상선, 사구상선, 설구개선, 게랑선, 인후선, 할러선, 하더선, 하버스선, 쾌락선, 혈관선, 혈관림프선, 조혈선, 혈림프선, 헨레선, 간선, 이질분비선, 동면선, 전분비선 및 내분비선이 있다.
선의 또다른 예에는 경동맥간선, 중간선, 견갑간선, 간질선, 장선, 상피내선, 설근내선, 경정맥선, 크라우제선, 구순선, 누선, 부누선, 유선, 대장선, 대한선, 후두선, 위렌즈선, 설렌즈선, 리베르퀸선, 설선, 전설선, 리트레선, 루시카선, 림프선, 이하선림프절, 협선, 유선, 부유선, 악하선, 만즈선, 멜리스선, 마이봄선, 부분분비선, 장간막선, 결장간막선, 혼합선, 구치선, 몰선, 단층선, 몽고메리선, 모르가니선, 구강선, 점액선, 점액분비선, 점액선, 설점액선, 이관점액선, 십이지장점액선, 유스타키오관점액선, 다세포선, 자궁근선, 나보트선, 나보티안선, 비선, 경선, 포피취선, 지선, 후선, 산부비선, 파키오니선, 구개선, 췌비선, 방소대선, 부갑상선, 방요도선, 이하선, 부이하선, 흉부선, 위선, 한선, 파이어선, 인두선, 필립선, 송과선 및 하수체가 있다.
선의 또다른 예에는 포아리에선, 다층선, 미선, 임신선, 전설골선, 포피선, 전립선, 사춘기선, 유문선, 방상선, 후설선, 구후선, 리비누스선, 로젠뮐러선, 낭상선, 타액선, 복부타액선, 외타액선, 내타액선, 잔트스트룀선, 쉴러선, 피지선, 결막지선, 전초선, 장점액선, 장액선, 세르선, 지그문트선, 스킨선, 단순선, 소장선, 대장고립선, 비양선, 스타르선, 구개선, 이개하선, 설하선, 악하선, 한선, 부신, 부부신, 수잔느선, 한선, 활액선, 표적선, 타일레선, 흉선, 갑상선, 부갑상선,설선, 기관선, 트라코마선, 관상선, 과상포상선, 고실선, 타이슨선, 단세포선, 요도선, 여성요도선, 미선, 자궁선, 난형낭선, 질선, 혈관선, 대전정선, 소전정선, 비르효선, 난황선, 외음질선, 발타이어선, 베버선, 볼프링선, 자이스선, 주케르칸들선이 있다.
즉, KGF-2는 상기 세포 또는 상기 선 내의 세포의 성장을 자극하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 신규 혈관 성장 또는 혈관 형성을 자극하는 데 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 폴리펩티드는 각질 세포의 성장 및 증식을 자극할 수 있다. 따라서, 본 발명은 치료 목적, 예를 들면 상처를 치유하기 위해 상피 세포의 증식 및 기저 각질 세포를 자극하는 데, 그리고 모낭의 형성 및 피부 상처의 치유를 자극하는 데 그러한 폴리펩티드 또는 그러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하는 방법을 제공한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 상피 세포 증식을 자극하여 피부 상처를 치유하는 데 사용할 수 있다. 그러한 상처는 표피에 있거나 깊은 곳에 있을 수 있으며 피부의 진피 및 표피의 손상을 포함한다. 즉, 본 발명은 유효량의 KGF-2를 개체에 투여하는 것을 포함하여 상처 치유를 촉진하는 방법을 제공한다.
KGF-2를 투여받은 개체는 상처가 정상 속도로 치유되거나 치유가 저해될 수 있다. 치유가 저해되지 않는 개체에 투여되는 경우, KGF-2는 정상 치유 과정을 촉진시키기 위해 투여된다. 치유가 저해되는 개체에 투여되는 경우, KGF-2는 서서히 치유되거나 치유되지 않는 상처의 치유를 촉진시키기 위해 투여된다. 후술하는 바와 같이, 많은 질환과 증상이 상처 치유를 저해한다. 그러한 질환과 증상에는 당뇨병(예를 들면 II 타입 당뇨병), 스테로이드와 기타 약물 둘다에 의한 치료 및 허혈성 차단 또는 저해가 포함된다. 상처 치유를 저해하는 것으로 밝혀진 스테로이드에는 코르티손, 히드로코르티손, 덱사메타손 및 메틸프레드니솔론이 있다.
비스테로이드 화합물, 예를 들면 옥트레오티드 아세테이트도 상처 치유를 저해하는 것으로 밝혀졌다[Waddell, B. et al.,Am. Surg. 63:446-449(1997)]. 본 발명은 그러한 비스테로이드제에 의해 치료를 받는 개체에서 상처 치유를 촉진시키는 것으로 생각된다.
다수의 성장 인자가 치유가 저해된 개체에서 상처 치유를 촉진하는 것으로 밝혀졌다[예를 들면, Steed, D. et al.,J. Am. Coll. Surg. 183:61-64(1996); Richard, J. et al.,Diabetes Care 18:64-69(1995); Steed, D.,J. Vasc. Surg. 21:71-78(1995); Kelley, S. et al.,Proc. Soc. Exp. Biol. 194:320-326(1990)]. 그러한 성장 인자에는 성장 홀몬-방출 인자, 혈소판-유도 성장 인자 및 기저 섬유아세포 성장 인자가 포함된다. 즉, 본 발명은 또한 1종 이상의 추가의 성장 인자 또는 상처 치유를 촉진하는 다른 약물과 함께 KGF-2를 투여하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 또한 정상 속도로 상처가 치유되거나 치유가 저해된 개체에서 봉합 및 수술에 의해 생긴 기타 상처의 치유를 촉진하는 방법을 제공한다. 이 방법은 유효량의 KGF-2를 봉합 또는 기타 수술 전, 그 후 및/또는 도중에 투여하는 것을 포함한다. 봉합술은 예를 들면 장의 중간 부분을 절제한 다음, 나머지 부분을 서로 연결시켜 장관을 재구성하는 경우에, 2개의 관형 구조물을 연결시키는 것이다. 피부의 치유와는 달리, 봉합 상처의 치유 과정은 일반적으로 눈으로 확인하기 어렵다. 또한, 적어도 위장관에서의 상처 치유는 합병증 없이 신속하게 일어나지만, 합병증은 추가의 수술에 의한 교정을 요하는 경우도 있다[Thotnton, F. 및 Barbul, A.,Surg. Clin. North Am.77:549-573(1997)]. 실시예 21 및 28에 개시된 바와 같이, KGF-2에 의한 치료는 관상 봉합 후의 복막 누출 및 봉합성 협착을 현저히 감소시킨다. KGF-2는 치유 과정을 촉진시켜서 그러한 절차 후에 일어나는 합병증의 가능성을 감소시킴으로써 그러한 결과를 가져오는 것으로 생각된다.
즉, 본 발명은 또한 유효량의 KGF-2를 투여하는 것을 포함하는, 정상 속도로 상처를 치유하거나 또는 치유가 저해되는 개체에서 봉합 후 또는 기타 수술 절차 후에 치유를 촉진하는 방법을 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 세포, 예를 들면 근육 세포, 신경 조직을 구성하는 세포, 전립선 세포 및 폐 세포의 분화를 자극하는 데 사용될 수 있다.
KGF-2는 정상 개체 및 상처 치유가 비정상화되는 상태에 놓인 개체, 예를 들면 요독증, 영양실조, 비타민 결핍증, 비대증, 감염증, 면역억제, 그리고 스테로이드, 방사선 치료 및 항종양 약물 및 항대사제의 전신적 치료와 관련된 합병증 증상을 보이는 개체에, 수술 상처, 적출 상처, 진피 및 표피의 손상을 포함한 깊은 상처, 눈 조직 상처, 치아 조직 상처, 구강 상처, 당뇨성 궤양, 피부 궤양, 전완 궤양, 동맥 궤양, 정맥 정지 궤양 및 열 노출 또는 화학 약품에 의한 화상을 비롯한 상처의 치유를 자극하는 데 임상적으로 유용할 수 있다. KGF-2는 또한 허혈 및 허혈성 손상, 예를 들면 정맥 순환계의 순환 저해 및 불충분으로 인한 만성 정맥 레그 궤양과 관련한 상처의 치유를 촉진하는 데 유용하다.
KGF-2는 또한 피부 소실 후의 피부 복구를 촉진하는 데 유용하다. 또한, KGF-2는 표피의 인장 강도 및 표피 두께를 증가시키는 데에도 사용될 수 있다.
KGF-2는 상처 부위에 대한 피부 이식편의 부착성을 증가시키고 상처 부위로부터 상피 형성을 자극하는 데 사용할 수 있다. 상처 부위에 대한 부착성을 증가시키는 데 KGF-2를 사용할 수 있는 이식편의 종류에는 다음과 같은 것들이 포함된다: 자가이식편, 인조 피부, 동종 이식편, 자가표피 이식편, 자가진피 이식편, 무혈관 이식편, 블레어-브라운 이식편, 골 이식편, 배태조직 이식편, 진피 이식편, 지연 이식편, 진피 이식편, 표피 이식편, 근막 이식편, 전층피부 이식편, 이종 이식편, 제노 이식편, 동종 이식편, 증식성 이식편, 층판 이식편, 망상 이식편, 점막 이식편, 올리에르-티르쉬 이식편, 대망 이식편, 첩부 이식편, 경상 이식편, 관통 이식편, 부분층피부 이식편, 후층부분 이식편. KGF-2는 피부 강도를 촉진시키고 노화된 피부의 외관을 개선시키는 데 사용될 수 있다.
KGF-2는 또한 간세포 증식 및 폐, 유방, 췌장, 위, 소장 및 대장에서의 상피 세포의 증식을 변화시킬 것이다. KGF-2는 상피 세포, 예를 들면 피지 세포, 모낭, 간세포, II 타입 폐포 세포, 뮤신 생성 고블릿 세포, 및 기타 상피 세포와 피부, 폐, 간, 신장 및 위장관에 포함된 그것의 선구체의 증식을 촉진할 수 있다. 실시예 31에 개시된 바와 같이, KGF-2는 간세포의 증식을 자극한다. 즉, KGF-2는 또한 급성 바이러스성 간염 및 만성 바이러스성 간염뿐만 아니라, 급성 바이러스성 간염, 간경변, 약물성 간염 및 독소성 간염(즉, 아세트아미노펜, 카본 테트라클로라이드,메토트렉세이트, 유기 아르세니칼 및 기타 당업계에 공지된 간독소), 자가면역 만성 활동성 간염, 간 이식 및 간 부분 절제와 같은 질병에 의한 전격성 또는 준전격성 간부전을 예방하거나 경감시키기 위해 예방 또는 치료 목적으로 사용할 수 있다(Cotran et al.,Pathologic basis of disease, 제5판, 미국 필라델피아 소재 W.B. Saunders Company, 1994). KGF-2는 또한 간 재생을 촉진하는 데, 그리고 알콜성 간 질환 환자에 사용할 수도 있다. KGF-2는 간의 섬유증을 치료하는 데도 사용할 수 있다.
급성 췌장염 경우의 약 80%는 담즙관 질병 및 알콜 중독증과 관련이 있다[Rattner D. W.,Scand J Gastroenterol 31:6-9(1996); Cotran et al.Pathologic basis of disease, 제5판, 미국 필라델피아 소재 W.B. Saunders Company, 1994]. 급성 췌장염은 사망률이 상당히 높은 중요한 임상적 문제이다[Banerjee et al.,British Journal of Surgery 81:1096-1103(1994)]. 이 질병의 발병학은 여전히 다소 밝혀지지 않은 상태지만, 췌장 효소는 췌장 내에서 분비되어 단백분해, 간질 감염, 지방 괴사 및 출혈을 유발하는 것으로 널리 인식되고 있다. 급성 췌장염은 산재성 혈관내 응혈, 성인 호흡 곤란 증후군, 쇼크 및 급성 신장 관상 괴사를 유발할 수 있다[Cotran et al.Pathologic basis of disease, 제5판, 미국 필라델피아 소재 W.B. Saunders Company, 1994]. 참고 사항이기는 하지만, 그 환자의 약 5%가 임상 단계 첫번째 주중에 쇼크로 사망한다. 생존 환자에서 나타나는 후유증에는 췌장 농양, 가성 낭포 및 십이지장 폐색이 있다[Cotran et al.Pathologic basis of disease, 제5판, 미국 필라델피아 소재 W.B. SaundersCompany, 1994]. 만성 췌장염은 급성 체장염의 반복적 재발이 원인인 진행성 췌장 파괴인 경우도 있다. 만성 췌장염은 다소 위험도가 높은 췌장 암종을 유발하는 것으로 보인다[Cotran et al.Pathologic basis of disease, 제5판, 미국 필라델피아 소재 W.B. Saunders Company, 1994].
전술한 내용과 실시예 31에서 알 수 있는 바와 같이, KGF-2는 또한 췌장 세포의 증식을 촉진한다. 즉, KGF-2는 급성 또는 만성 췌장염을 예방하거나 경감시키기 위해 예방 또는 치료 목적으로 사용할 수 있다.
KGF-2는 또한 바이러스성 감염, 방사선 치료, 화학 요법 또는 기타 치료로 인한 부작용인 내장 독성을 감소시키는 데에도 사용할 수 있다. KGF-2는 소장 점액에 대한 세포 보호 효과를 갖는다. KGF-2는 또한 화학 요법, 기타 약물 및 바이러스 감염으로 인한 점막염을 예방 또는 경감시키기 위해, 그리고 그 점막염(예를 들면, 구강, 식도, 장관, 관상, 신장 및 항문 궤양)의 치유를 자극하기 위해 예방 또는 치료 목적으로 사용할 수 있다. 즉, 본 발명은 또한 유효량의 KGF-2를 투여하는 것을 포함하는, 궤양성 대장염, 크론병 및 점막이 손상된 기타 질병을 비롯한 점액 질환 또는 병리 상태를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 또 본 발명은 그러한 손상의 원인인 약물 또는 사용 양태와 무관하게 경구(인두 및 하인두의 점막 손상과 관련된 연하통 포함), 식도, 위, 장관, 관상 및 신장 점막염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한, KGF-2는 다음 증상의 치료 및/또는 예방에 사용할 수 있다: 화학약품에 의한 물집 및 화상, 예를 들면 화학요법제에 의한 치료 또는 시클로포스파미드에 의한 치료로 인한 난소 손상, 방사선 또는 화학요법으로 인한 방광염, 또는 고용량 화학요법으로 인한 장관 손상. KGF-2는 내부 치유, 공여체 부위 치유, 내부 수술 상처 치유 또는 미용 수술 중에 생긴 절개 상처의 치유를 촉진하는 데 사용할 수 있다.
KGF-2는 내피 세포, 각질 세포 및 기저 각질 세포의 증식을 촉진할 수 있다. 즉, 본 발명은 그러한 종류의 세포를 유효량의 KGF-2와 접촉시키는 것을 포함하는, 그 세포의 증식을 자극하는 방법을 제공한다. KGF-2는 생체 내에서 세포 증식을 자극하는 데 유효한 양은 개체에 투여하거나 그러한 세포와 생체 외에서 접촉시킬 수 있다.
본 발명은 또한 유효량의 KGF-2를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 요로 상피 치유를 촉진하는 방법을 제공한다. 즉, 본 발명은 요로 상피 세포(즉, 요도관의 내막 세포)와 관련된 각종 병인의 치유 또는 치료를 촉진하는 방법을 제공한다. 그러한 세포를 포함하는 조직층은 카테터 시술, 수술 또는 박테리아 감염(예를 들면 성적 감염 질병, 예를 들면 임질을 일으키는 약물에 의한 감염)을 비롯한 다양한 메카니즘에 의해 손상될 수 있다.
본 발명은 또한 유효량의 KGF-2를 투여하는 것을 포함하는, 여성 생식관의 조직 치유를 촉진하는 방법을 제공한다. 여성 생식관의 조직 손상은 칸디다 감염, 트리코모나스증, 가르드네렐라, 임질, 클라미디아, 마이코플라스마 감염증 및 기타 성적 감염 질병을 비롯한 광범위한 증상이 원인일 수 있다.
실시예 10, 18 및 19에 개시된 바와 같이, KGF-2는 표피 각질 세포의 증식을자극하고 표피 세포의 두께를 증가시킨다. 즉, KGF-2는 피부의 완전 재생에, 화상을 비롯한 피부 결함의 완전 또는 부분 두께 회복(즉, 모낭, 한선 및 결막지선의 재생)에, 그리고 건선과 같은 기타 피부 결함을 치료하는 데 사용할 수 있다.
KGF-2는 수포성 표피 박리, 즉 통증이 있는 열린 물집을 자주 유발하는 표피의 진피에의 부착 결함을, 재상피화를 촉진시킴으로써 그러한 병변을 치료하는 데 사용할 수 있다. KGF-2는 위궤양 및 십이지장 궤양을 치료하고, 점막 내막의 치유 및 선성 점막 및 십이지장 점막 내막의 보다 신속한 재생을 돕는 데 사용할 수 있다.크론병 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환은 소장 또는 대장 각각의 점막 표면의 파괴를 유발하는 질병이다. 즉, KGF-2는 점막 표면의 재표면화를 촉진시켜서 보다 신속한 치유를 돕고 염증성 장 질환의 진행을 막거나 경감시키는 데 사용할 수 있다. KGF-2에 의한 치료는 위장관 전반의 점막을 생성시키는 데 상당한 효과가 있는 것으로 예상되며, 소화된 유해 물질로부터 또는 수술 후에 장관 점막을 보호하는 데 사용할 수 있다. 전술한 바와 같이, KGF-2는 또한 장관 또는 관상 문합술의 치유를 촉진하는 데 사용할 수 있다. KGF-2는 또 KGF-2의 저발현과 관련된 질병을 치료하는 데도 사용할 수 있다.
하기 실시예 32에 개시되어 있는 바와 같이, KGF-2는 폐 상피 세포의 증식을 자극한다. 즉, KGF-2는 각종 병리 상태로 인한 폐의 손상을 경감 또는 예방하기 위해 예방 목적으로 투여할 수 있다. KGF-2는 또한 손상이 일어나는 도중에 또는 그 후에 투여하여 치유를 촉진할 수 있다. 예를 들면,KGF-2는 폐포 및 기관지 상피의 증식 및 분화를 자극하고 그것의 복원을 촉진하여 급성 또는 만성 폐 손상을 예방,경감 또는 치료할 수 있다. 진행성 폐포 손상 및 흡입 장애, 즉 흡연 흡입 및 화상에서 유발되어 기관지 상피 및 폐포의 괴사를 일으키는 기종은 화학요법, 방사선 치료, 폐암, 천식, 흑폐 및 기타 폐 손상에 기인한 손상일 수 있기 때문에 KGF-2를 사용하여 효과적으로 치료할 수 있다. 또한, KGF-2는 II 타입 폐세포의 증식 및 분화를 자극할 수 있기 때문에, 유리질막 질병, 예를 들면 조산아의 소아 호흡 곤란 증후군 및 폐기관지 이형성증과 같은 질병을 치료 또는 예방하는 데 도움이 된다.
급성 신장 장애의 세가지 원인은 신장 관 세포 사멸, 관 내강의 폐색 및 여과물의 신사구체로의 역류를 일으키는 전신 관련 장애(예를 들면, 심부전), 장 관련 장애(예를 들면, 화학요법제에 의해 유도된 신독성) 및 후신 관련 장애(예를 들면, 요도관 폐색)이다[Thadhani et al.N. Engl. J. Med. 334:1448-1460(1996)]. 인슐린양 성장 인자 I, 오스테오겐 단백질-1, 간세포 성장 인자 및 표피 성장 인자와 같은 성장 인자는 동물 모델에서 신장 질환을 완화시키는 데 효과를 나타내었다[Taub et al.Cytokin 5:175-179(1993); Vakicevic et al.J.Am. Soc. Nephrol. 7:1867(1996)]. 하기 실시예 31에 개시된 바와 같이, KGF-2는 신장 상피 세포의 증식을 자극하므로 급성 및 만성 신부전 및 말기 신장 질환과 같은 신장 질환 및 병인을 경감 또는 치료하는 데 유용하다.
KGF-2는 유방 조직의 증식 및 분화를 자극할 수 있기 때문에, 수술, 외상 또는 종양으로 인한 유방 조직의 치유를 촉진하는 데 사용할 수 있다.
또한, KGF-2는 당뇨병의 발증을 치료 또는 예방하는 데 사용할 수 있다. I 및 II 타입 당뇨병을 새로 진단받은 환자에서, 일부 소도(islet) 세포 기능이 남아있는 경우에, KGF-2는 질병의 영속 소견을 경감, 지연 또는 예방하기 위하여 소도 기능을 유지시키는 데 사용할 수 있다. 또한, KGF-2는 소도 세포 기능을 증대시키거나 촉진시키기 위한 소도 세포 이식에 있어서 보조제로서 사용할 수 있다.
또한, KGF-2의 항염증성은 염증이 건선, 습진, 피부염 및/또는 관절염을 비롯한 질병의 주요 원인인 급성 및 만성 질환을 치료하는 데 유리할 수 있다. 즉, 본 발명은 유효량의 KGF-2를 투여하는 것을 포함하여, 개체에서 염증 및 염증과 관련된 질병을 예방 또는 경감시키는 방법을 제공한다.
KGF-2는 외상, 수술 또는 화학약품에 의한 위해로 인한 뇌조직 손상의 치유를 촉진하고 경감시키는 데 사용할 수 있다.
또한, KGF-2는 표피의 두께를 증가시키기 때문에, 그 단백질은 노화된 피부를 개선하고, 피부의 주름을 감소시키고, 수술 후 흉터가 생기는 것을 감소시키는 데 사용할 수 있다. 상처 조직이 흉터로 되는 것은 종종 진피 섬유 아세포의 과증식과 연관이 있다. 실시예 10에 개시되어 있는 바와 같이, 섬유 아세포 증식은 KGF-2에 의해 자극을 받지 않는다. 따라서, KGF-2는 표피 각질 세포에 특이적인 분열 촉진 인자로서 최소의 흉터를 남기면서 상처 치유를 유도하는 것으로 보인다. 즉, 본 발명은 개체에 유효량의 KGF-2를 투여하는 것을 포함하는, 최소의 흉터를 남기면서 상처 치유를 촉진하는 방법을 제공한다. KGF-2는 상처가 생기는 과정(예를 들면, 미용 수술, 일정 모양의 물체에 인한 돌발적 또는 의도적 조직 외상) 전에, 도중에 및/또는 그 후에 투여할 수 있다.
전술한 바와 같이, KGF-2는 각질 세포 및 모공의 증식을 자극하기 때문에 탈모 표면 및 모발 이식 환자에서의 모발의 성장을 촉진하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 모공의 생성을 촉진하는 데 충분한 양의 KGF-2를 투여하는 것을 포함하는 모발 성장 촉진 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 유효량의 KGF-2를 투여하는 것을 포함하는, 이온화 방사선, 화학요법 또는 항바이러스 약물의 영향으로부터 개체를 보호하는 방법을 제공한다. 또, 본 발명은 유효량의 KGF-2를 투여하는 것을 포함하는, 이온화 방사선, 화학요법 또는 항바이러스 약물에 노출됨으로 인한 조직 손상을 치료하는 방법을 제공한다. 개체는 치료 목적(예를 들면, 과증식성 장애의 치료), 방사선 동위원소의 돌발적인 환경에의 방출, 또는 비침해성 의료 진단 절차(예를 들면 X-선)를 비롯한 많은 이유로 이온화 방사선에 노출될 수 있다. 또한, 상당수의 개체들은 작업장 및 가정에서 방사성 라돈에 노출된다. 장기간 연속적으로 그러한 환경에 노출된 것을 이용하여 예상 단축 수명을 계산한 바 있다[Johnson, W. and Kearfott, K.,Health Phys. 73:312-319(1977)]. 실시예 23에 개시된 바와 같이, 본 발명의 단백질은 방사선에 노출된 동물의 생존률을 개선한다. 즉, KGF-2는 방사선에 의한 손상을 입은 개체의 생존률을 증가시키고, 준치사량의 방사선으로부터 개체를 보호하며, 과증식성 장애와 같은 질환의 치료에 방사선 조사 비율을 증가시킬 수 있다.
KGF-2는 또한 보통 내성이 생기지 않는 방사선, 화학요법제 또는 항바이러스제의 용량에 대해 개체를 보호하는 데 사용할 수 있다. 그러한 용도로, 또는 본 명세서에 기재된 바와같이 사용될 때, KGF-2는 방사선 치료/노출, 화학요법 또는 항바이러스제에 의한 치료 전, 후 및/또는 도중에 투여할 수 있다. 과증식성 장애와같은 진행된 질환 단계에 있는 개체를 치료할 때 고용량의 방사선 및 화학요법제가 특히 유용할 수 있다.
또한, 본 발명은 유효량의 KGF-2를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 방사선 관련 경구 및 위장관 손상, 점막염, 장 섬유증, 직장염, 방사선 유도 폐 섬유증, 방사선 유도 폐렴, 방사선 유도 늑막 수축, 방사선 유도 조혈성 증후군, 방사선 유도 척수독성과 같은 증상을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
KGF-2는 단독으로 사용해도 좋고 방사선 또는 기타 약물에 대한 보호 작용을 하는 1종 이상의 추가의 약물과 함께 사용해도 좋다. 다수의 사이토킨(예를 들면 IL-1, TNF, IL-6, IL-12)이 그러한 보호 작용을 하는 것으로 밝혀졌다[Neta, R. et al.,J. Exp. Med. 173:1177(1991)]. 또한, IL-11은 방사선 조사 및 화학요법을 병행한 후의 소장의 점막 세포[Du, X.X. et al.,Blood 83:33(1994)], 그리고 방사선 유도 흉부 손상을 보호하는 것으로 밝혀졌다[Redlich C.A. et al.,J. Immun. 157:1705-1710(1996)]. 다양한 성장 인자, 예를 들면 섬유아세포 성장 인자 및 형질 전환 성장 인자 베타-3은 또한 방사선 노출에 대해 보호 작용을 하는 것으로 밝혀졌다[Ding et al.,Acta Oncol. 36:337-340(1997); Potten, C. et al.,Br. J. Cancer 75:1454-1459(1997)]
출혈성 방광염은 특정 질병 상태 뿐만 아니라 약물, 바이러스 및 독소에 대한 노출과 관련이 있는 증후군이다. 방광의 상피 내막의 출guf이 확산되는 것으로 나타난다. 공지의 치료법에는 정맥 요법, 전신 요법 및 비약물 요법이 있다[West, N. J., Pharmacotherapy 17:696-706(1997)]. 임상적으로 사용된 일부 세포 독성 약물은 방광의 정상 표피의 증식 억제를 유발하고, 생명을 강하게 위협하는 궤양 및 상피 내막의 파괴를 유발하는 부작용이 있다. 예를 들면, 시클로포스파미드는 주로 간에서 생체 변환되어 마이크로좀 옥시다제 시스템의 복합 작용에 의해 대사물을 활성적으로 알킬화시키는 세포 독성 약물이다. 그러한 대사물은 급속히 성장하는 악성 세포의 성장을 방해한다. 작용 메카니즘은 종양 세포 DNA의 가교와 관련이 있는 것으로 생각된다(Physician's Desk reference, 1997).
시클로포스파미드는 일부 환자에서 출혈성 방광염을 일으키며, 그 합병증이 심할 수 있고 경우에 따라서는 사망에 이르게 하는 세포 독성 약물의 일례이다. 요도 방광의 섬유증은 또한 방광염을 동반하거나 동반하지 않고 진행될 수도 있다. 이 손상은 소변에서 배출된 시클로포스파미드 대사물에 의해 유발되는 것으로 생각된다. 시클로포스파미드가 원인인 혈뇨는 수일동안 일어나지만, 지속될 수도 있다. 심한 경우에, 약물 또는 수술 치료가 필요하다. 심한 출혈성 방광염의 경우 비연속적인 시클로포스파미드 요법을 취해야 한다. 또한, 요도 방광의 악화는 일반적으로 시클로포스파미드 치료 후 2년 내에 일어나며 출혈성 방광염을 이미 앓은 환자에서 일어난다[CYTOXAN(시클로포스파미드) 패키지 삽입물]. 시클로포스파미드는 전립선 및 남성 생식계에 유해하다. 시클로포스파미드 치료는 불임의 원인이 될 수 있고, 다소 고환의 퇴화를 유발할 수 있다.
도 52 및 도 53에 도시된 바와 같이, 개체에 KGF-2를 전신 투여하면 방광 및 전립선 상피 세포의 증식을 자극한다. 즉, 본 발명은 개체에 유효량의 KGF-2 폴리펩티드를 투여하여 방광 상피 및 전립선 상피 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 도 54 및 도 55에서 입증된 바와 같이, KGF-2는 방광 및 전립선 상피 세포 증식의 억제를 유발하는 부작용이 있는 세포 독성 물질에 의한 손상을 감소시키는 데 사용할 수 있다. 그러한 손상을 감소시키기 위해서, KGF-2는 세포 독성 물질에 의한 치료 또는 그것에 노출되기 전에, 후에 및/또는 도중에 투여할 수 있다. 따라서 본 발명은 개체에 유효량의 KGF-2를 투여하여 방광 또는 전립선 상피 세포의 정상적 증식의 억제로 인한 손상을 감소시키는 방법을 제공한다. 설명한 바와 같이, 방광 또는 전립선 상피의 정상적 증식의 억제 인자에는 방사선 요법(급성 또는 만성 방사선 손상을 일으킴) 및 예를 들면 시클로포스파미드, 부설판 및 이포스파미드(이들에 한정되는 것은 아님)를 비롯한 화학요법제 또는 항신생물제가 포함된다. 또, 본 발명에 있어서 KGF-2는 요도 방광의 섬유증 및 궤양을 경감 또는 예방하는 데 투여된다. KGF-2는 출혈성 방광염을 경감 또는 예방하는 데 투여된다. 적당한 용량, 제제화 및 투여 경로는 후술한다.
본 명세서에서, "개체"는 동물, 바람직하게는 포유 동물(예를 들면, 유인원, 소, 말, 돼지, 수퇘지, 양, 설치류, 염소, 개, 고양이, 닭, 원숭이, 토끼, 힌담비, 고래 및 돌고래)을 나타내며, 사람이 더욱 바람직하다.
아미노산 1 내지 35 또는 36을 암호화하는 KGF-2의 신호 서열은 일반적으로 하이브리드화 및/또는 컴퓨터 조사 알고리즘에 의해 분비 단백질을 동정하는 데 사용할 수 있다.
KGF-2 뉴클레오티드 서열은 하이브리드화에 의해 5' 서열을 분리하는 데 이용할 수 있다. 본래의 프로모터/인핸서 서열의 제어하에 KGF-2 유전자를 포함하는플라스미드는 KGF-2 유전자를 발현하는 내인성 세포 및 바이러스성 트랜스액티베이터를 동정하기 위한 생체 외 연구에 이용할 수 있다.
KGF-2 단백질은 또한 KGF-2 수용체에 작용하는 펩티도 유사물을 동정하기 위해 고안된 실험의 양성 대조물로서 사용할 수 있다.
또한 본 발명에 의하면, 그러한 폴리펩티드, 또는 그러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 과학적 연구, DNA 합성, DNA 벡터의 제조와 관련된 생체 외 목적과, 인체 질병을 치료하기 위한 진단제 및 치료제의 제공 목적을 위해 이용하는 방법을 제공한다.
전길이 KGF-2 유전자의 단편은 전길이 KGF-2 유전자를 분리하고 그러한 유전자와 서열 유사성이 높거나 생물학적 활성이 유사한 다른 유전자를 분리하기 위한 cDNA 라이브러리용 하이브리드화 프로브로서 사용할 수 있다. 이러한 종류의 프로브는 일반적으로 20개 이상의 염기를 갖는다. 그러나, 프로브는 30개 이상의 염기를 갖고 50개를 초과하지 않는 것이 바람직하지만, 더 많은 수의 염기를 가져도 된다. 프로브는 또한 전길이 복사물에 대응하는 cDNA 클론과 조절 및 프로모터 영역, 엑손 및 인트론을 비롯한 완전 KGF-2 유전자를 함유하는 게놈성 클론(들)을 동정하는 데 사용할 수 있다. 스크린 방법의 일례는 공지의 DNA 서열을 사용하여 KGF-2 유전자의 코딩 영역을 분리함으로써 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성한다. 본 발명의 유전자의 서열과 상보성인 서열을 가진 표지된 올리고뉴클레오티드는 인체 cDNA, 게놈 DNA 또는 cDNA의 라이브러리를 스크린하여 어떤 라이브러리 요소가 프로브에 하이드브리화하는지 결정하는 데 사용된다.
본 발명은 KGF-2 폴리펩티드의 수용체를 동정하는 방법을 제공한다. 수용체를 암호화하는 유전자는 당업계에 알려진 다양한 방법, 예를 들면 리간드 팬화(panning) 및 FACS 분류에 의해 동정할 수 있다[Coligan et al.,Current Protocols in Immun., 1(2), Ch. 5(1991)]. 폴리아데닐화 RNA를 폴리펩티드에 반응하는 세포로부터 제조하고, 그 RNA에서 생성된 cDNA 라이브러리를 풀(pool)로 분할하여 폴리펩티드에 반응하지 않는 COS 세포 또는 다른 세포를 형질 감염시키는 데 사용하는 발현 클로닝법을 이용하는 것이 바람직하다. 형질 감염된 세포를 유리 슬라이드 상에서 성장시켜서 표지된 폴리펩티드에 노출시킨다. 폴리펩티드는 부위 특이성 단백질 키나제의 인식 부위를 요오드화하거나 또는 삽입하는 것을 비롯한 다양한 방법으로 표지할 수 있다. 고정화 및 배양 후, 슬라이드를 방사선 사진 분석한다. 양성 풀을 동정하고 서브-풀을 제조한 다음, 반복적 서브-풀화 및 재스크리닝법을 이용하여 재형질 감염시켜서 추정 수용체를 암호화하는 단일 클론을 얻는다.
또다른 수용체 동정 방법으로서, 표지된 폴리펩티드는 수용체 분자를 발현하는 세포막 또는 추출물 제제와 광친화적으로 결합할 수 있다. 가교 결합 물질은 PAGE 분석에 의해 분해하여 X-선 필름에 노출시킨다. 폴리펩티드를 함유하는 표지된 복합체를 분리하여 펩티드 단편으로 분해하고, 단백질 미세 서열화를 수행한다. 미세 서열화에 의해 얻은 아미노산 서열은 추정 수용체를 암호화하는 유전자를 동정하기 위한 cDNA 라이브러리 스크린용의 변성 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 고안하는 데 사용된다.
본 발명은 KGF-2의 작용을 방해하거나 KGF-2의 기능을 차단하는 것들을 동정하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 그러한 분석의 일례는 포유 동물 각질 세포와, 스크린하고자 하는 화합물과3[H] 티미딘을 각질 세포가 정상적으로 증식하는 세포 배양 조건 하에서 결합시키는 것을 포함한다. 스크린하고자 하는 화합물의 부재 하에 대조 분석을 수행하고 그 화합물의 존재 하에 각질 세포 증식량과 비교하여 그 화합물이 각질 세포의 증식을 자극하는지 여부를 결정할 수 있다.
안타고니스트를 스크린하기 위해서, KGF-2의 존재 하에 동일한 분석을 수행할 수 있는데, 각질 세포 증식을 예방하는 화합물의 활성을 측정한 다음, 안타고니스트 활성을 측정한다. 각질 세포 증식량은3[H] 티미딘의 도입을 측정하는 액체 신틸레이션 크로마토그래피를 이용하여 측정한다.
다른 방법에서, KGF-2 수용체를 발현하는 포유 동물 세포 또는 막 제제는 화합물의 존재 하에 표지된 KGF-2와 함께 배양한다. 이어서 그 상호 작용을 향상시키거나 차단하는 화합물의 활성을 측정할 수 있다. 대안으로, KGF-2와 수용체의 상호 작용 후 공지된 제2 메신저 시스템의 반응을 측정하고 화합물의 존재 또는 부재 하에 비교한다. 그러한 제2 메신저 시스템에는 cAMP 구아닐레이트 시클라제, 이온 채널 또는 포스포이노시티드 가수분해가 있으며, 이들에 한정되는 것은 아니다.
잠재적 KGF-2 안타고니스트의 예에는 폴리펩티드에 결합하는 항체, 또는 경우에 따라 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 또한, 잠재적 KGF-2 안타고니스트는KGF-2 수용체에 결합하는 KGF-2의 돌연변이형일 수 있으나, 제2 메신저 반응이 나타나지 않기 때문에 KGF-2의 작용이 효과적으로 차단된다.
다른 잠재적 KGF-2 안타고니스트는 안티센스 기술을 사용하여 제조한 안티센스 작제물이다. 안티센스 기술은 3중 나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 제어하는 데 사용할 수 있는데, 두 방법은 모두 폴리뉴클레오티드가 DNA 또는 RNA에 결합하는 것에 근거한다. 예를 들면, 본 발명의 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 암호화 부분은 염기쌍의 길이가 약 10 내지 40인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 고안하는 데 사용된다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관여하는 유전자의 영역에 상보성을 갖도록 고안되므로[삼중 나선 - Lee et al.,Nucl. Acids Res. 6:3073(1979); Cooney et al.,Science 241:456(1988); and Dervan et al.,Science 251:1360(1991)] KGF-2의 전사 및 생성을 방지한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 cDNA에 하이브리드화하고 cDNA의 KGF-2 폴리펩티드로의 번역을 차단한다[안티센스 - Okano, J.,Neurochem. 56:560(1991); 유전자 발현의 안티센스 억제제로서의 올리고데옥시뉴클레오티드, CRC Press, Boca Raton, 리(1988)]. 전술한 올리고뉴클레오티드는 또한 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체 내에서 발현되어 KGF-2 생성을 억제할 수 있도록 세포로 전달될 수 있다.
잠재적 KGF-2 안타고니스트에는 KGF-2 수용체의 결합 부위에 결합하여 그 부위를 점유함으로써 정상의 생물학적 활성이 방지되도록 KGF-2에 접근 불가능한 수용체를 형성하는 소분자를 포함한다.
KGF-2 안타고니스트는 종양 내의 새로운 혈관의 성장 또는 맥관 형성의 유도를 방지하는 데 사용할 수 있다. KGF-2에 의해 자극된 맥관 형성은 또한 당뇨병성 망막증을 비롯한 여러 가지 병인에 기인하는데, 그 병인은 본 발명의 안타고니스트와, 류머티스성 관절염과 같은 병원성 조직의 성장을 억제하는 것에 의해 치료될 수 있다.
KGF-2 안타고니스트는 또한 바우만 공간을 채우는 세포 덩어리를 형성하는 신사구체 상피 세포가 현저히 증식하는 것을 특징으로 하는 사구체신염을 치료하는 데 사용할 수 있다.
안타고니스트는 또한 수술 후의 켈로이드 형성시에 나타나는 흉터 조직의 과형성, 심근경색증 후의 섬유증 또는 폐 섬유증 및 재협착과 관련된 섬유성 변병을 방지하는 데 사용할 수 있다. KGF-2 안타고니스트는 또한 암 및 카포시 육종을 비롯한 KGF-2에 의해 자극되는 기타 증식성 질병을 치료하는 데 사용할 수 있다.
KGF-2 안타고니스트는 또한 상피 세포 증식을 특징으로 하는 포도막 염증이 있는 각막의 심층의 만성적 침윤인 각막염을 치료하는 데 사용할 수 있다.
안타고니스트는 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들면 후술하는 것과 같은 담체와의 조성물 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 아고니스트 및 안타고니스트는 적당한 약학적 담체와 함께 사용하여 약학 조성물을 구성할 수 있다. 그러한 조성물은 치료적 유효량의 폴리펩티드의 아고니스트 또는 안타고니스트와 약학적 허용 담체 또는 부형제를 함유한다. 그러한 담체로는 염수, 완충 염수, 덱스트로즈, 물, 글리세롤, 에탄올및 이들의 조합물이 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다, 상기 제제는 투여 방식에 적합해야 한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 그러한 용기는 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에서 규정한 형태의 고지서를 첨부할 수 있으며, 이러한 고지서는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매용으로 상기 정부 기관이 허용한 것임을 반영하는 것이다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드의 아고니스트 및 안타고니스트는 다른 치료 화합물과 함께 사용할 수도 있다.
KGF-2 활성을 가진 폴리펩티드는 하나 이상의 약학적 허용 부형제와 함께 약학 조성물로 투여할 수도 있다. 환자에게 투여하는 경우, 본 발명의 약학 조성물의 일일 총 사용량은 합리적인 의학적 판단 범위 내에서 주치의가 결정하게 된다. 임의의 구체적 환자에 있어 특이적 치료 유효 투여 수준은 탈성하고자 하는 반응 유형 및 반응도; 존재하는 경우 사용되는 다른 제제의 구체적 조성; 환자의 연령, 체중, 전신 건강 상태, 성별 및 식이 형태; 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 배출율; 치료 기간; 특이적 조성물과 함께 또는 동시에 사용되는 약물(예, 화학 치료제)를 비롯한 여러 인자와 의학 분야에 공지된 유사 인자에 따라 좌우된다. 당업계에 공지된 적당한 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences(최신판), Mack Publishing Company, Easton, PA]에 기재되어 있다.
치료에 사용되는 KGF-2 조성물은 개별 환자의 임상 증상(특히, KGF-2 단독처료의 부작용), KGF-2 조성물의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 임상의에게 공지된 다른 인자를 고려하여, 양호한 치료에 부합되는 방식으로 제제화되고 투여된다. 따라서, 본 발명의 목적에 "효과적인 양"의 KGF-2는 그러한 고려 사항에 의해 결정된다.
약학 조성물은, 예를 들어 경구, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 피하, 비강내, 기관내 또는 피부내 경로를 통해 통상의 방식으로 투여핼 수도 있다. 약학 조성물은 특정 증상의 치료 및/또는 예방에 효과적인 양으로 투여한다. 대부분의 경우, 투여 경로, 증상 등을 고려한 투여량은 일일 체중(kg) 당 약 1 ㎍/kg 내지 약 30 mg/kg이다. 그러나, 투여량이 0,001 ㎍/kg 정도로 적을 수도 있다. 그러나, 국소 투여의 특이적 경우에는 약 0.01 ㎍/㎠ 내지 9 mg/㎠로 투여하는 것이 바람직하다.
일반적 전제로서, 비경구 투여시 KGF-2의 보다 바람직한 약학적 유효량은 일일 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg이나, 이는 상기 명시한 바와 같이 치료시마다 자유 자재로 결정된다. 연속적으로 투여하는 경우, KGF-2는 통상 1일 1회 내지 4회의 주사에 의해 또는 미니 펌프를 사용한 연속적 피하 주입에 의해 약 1 ㎍/kg/시간 내지 약 50 ㎍/kg/시간의 투여율로 투여한다. 정맥 백 용액 또는 병 용액도 사용할 수 있다.
피브린 용해계에 영향을 미치는 KGF-2 치료 기간은 특정의 최소 일수보다 길게 지속되는 것이 최적인 것으로 판단되며, 상기 최소 일수는 마우스의 경우 7일이다. 반응이 발생하기 위한 치료 후 간격 및 변화를 관찰하는 데 필요한 치료 기간은 원하는 효과에 따라 다른 것으로 판단된다. 그러힌 치료 길이는 이하 실시예에 지시되어 있다.
또한, KGF-2 폴리펩티드는 서방성 계에 의해 투여하는 것이 적당하다. 거방성 조성물의 적당한 예로는 성형 물품, 예를 들어 필름 또는 미소캡슐 형태의 반투성 중합체 매릭스가 있다. 거방성 매트릭스로는 폴리락티드(USP 3,773,919, EP 58,481), L-글루탐산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체(U. Sidman et al., Biopolymers 22:547-556(1983)), 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트(R. Langer et.al.,J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277(1981). 및 R. Langer,Chem. Tech. 12:98-105(1982)), 에틸렌 비닐 아세테이트(상기 R. Langer et.al 문헌 참조) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(EP 133,988)이 있다. 또한, 서방성 KGF-2 조성물은 리포좀에 포획된 KGF-2를 포함한다. KGF-2를 포함하는 리포좀은 자체 공지된 방법, 즉 DE3,218,121, 엡스타인 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692(1985)], 황 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034(1980)], EP 52,322, EP 36,676, EP 143,949, EP 142,641, 일본 특허 출원 제83-118008호, USP 4,485,045 및 4,544,545, 그리고 EP 102,304에 공지된 방법에 의해 제조한다. 대개, 리포좀은 지질 성분이 약 30몰 % 이상의 콜레스테롤인 소형(약 200∼800 Å) 단층 유형을 가지며, 상기 선택된 비율은 최적의 KGF-2 치료를 위해 조절된다.
하나의 실시 형태에서, 비경구 투여시에는 KGF-2를 원하는 정도의 순도로 주사 가능한 주사 투여 형태(용액, 현탁액 또는 에멀젼)로 하여 약학적 허용 담체, 즉 사용된 농도 및 투여량에서 수혜자에게 비독성이며 제제의 다른 성분들과 상용성인 것과 혼합하여 제제화한다. 예를 들어, 상기 제제는 산화제 및 폴리펩티드에 유해한 것으로 알려진 다른 화합물을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
통상적으로, 상기 제제는 KGF-2를 액상 담체 또는 미분된 고형 담체 또는 이들 양자와 균일하면서 긴밀하게 접촉시켜 제조한다. 이어서, 필요에 따라, 상기 생성물을 원하는 제형으로 성형한다. 상기 담체는 비경구용 담체인 것이 바람직하고, 수혜자의 혈액과 등장성인 용액인 것이 더욱 바람직하다. 그러한 담체 부형제의 예로는 물, 염수, 링거 용액 및 덱스트로즈 용액이 있다. 비휘발유 및 에틸 올레이트 등의 비수성 부형제도 또한 리포좀과 마찬가지로 본 발명에 유용하다. 당업계에 공지된 적당한 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences(최신판), Mack Publishing Company, Easton, PA]에 기재되어 있다.
담체는 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 물질 등의 첨가제를 소량 함유하는 것이 적당하다. 그러한 물질은 사용된 투여량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이며, 그 예로는 인산염, 구연산염, 숙신산염, 아세트산 및 다른 유기산 또는 이들의 염 등의 완충제, 아스코르빈산 등의 산화방지제, 폴리아르기닌 또는 트리펩티드 등의 저분자량(약 10개 미만의 잔기를 가진) 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로블린 등의 단백질, 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 중합체, 글리신 글루탐산, 아스파라긴산 또는 아르기닌 등의 아미노산, 단당류, 이당류, 및 셀룰로즈 또는 그 유도체, 글루코즈, 만노즈, 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물, EDTA 등의 킬레이트화제, 만니톨 또는 솔비톨 등의 당 알콜, 나트륨 등의 반대이온, 및/또는 폴리솔베이트, 폴록사머 또는 PEG 등의 비이온성 계면활성제가 있다.
KGF-2는 통상적으로 약 3 내지 8의 pH에서 약 0.01 ㎍/ml, 내지 100 ㎍/ml, 바람직하게는 0.01 ㎍/ml 내지 10 mg/ml의 농도로 그러한 부형제 중에 제제화된다. 전술한 부형제, 담체 또는 안정화제 중 특정의 것을 사용하면 KGF-2 염이 형성된다.
치료적 투여를 위해 사용되는 KGF-2는 무균성이어야 한다. 무균성은 무균 여과막(예, 0.2 미크론 막)을 통해 여과하면 용이하게 달성된다. 치료적 KGF-2 조성물은 통상 무균 접근구를 가진 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 가진 정맥 용액백 또는 바이알 내에 넣는다.
KGF-2는 대개 유닛 또는 다회 용기, 예를 들어 밀폐 앰플 또는 바이알 내에 수용액 형태로 또는 재구성을 위한 동결 건조 제제 형태로 저장된다. 동결 건조된 제제의 예로서, 10 ml의 바이알에 5 ml의 무균 여과된 1%(w/v) KGF 수용액을 채우고, 생성된 혼합물을 동결 건조시킨다. 주입 용액은, 동결 건조된 KGF-2를 정균성 주사수를 사용하여 재구성시켜 제조한다.
또한, 투여량은, 예를 들어 RIA 기술에 의해 측정했을 때 혈액 내 KGF-2 활성이 소정 농도로 제공되도록 환자 특이적 방식으로 조정할 수 있다. 따라서, 환자 투여량은 RIA에 의해 측정했을 때 일상의 진행되는 혈류 수준이 약 50 ∼1000 ng/ml, 바람직하게는 150∼500 ng/ml가 되도록 조절할 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구, 직장, 비경구, 조내, 피부내, 질내, 복강내, 국소적(분말, 연고, 겔, 크림, 점액 또는 경피 패치 형태), 협측, 또는 경구 또는 비강 스프레이 형태로 투여할 수도 있다. "약학적 허용 담체"는 비독성의 고형, 반고형 또는 액상 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 임의 유형의 제형 보조제를 의미한다. 본 명세서에 사용된 용어"비경구"는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입 방식을 칭하는 것이다.
바람직한 KGF-2 제제는 본 명세서에 참고로 인용한 미국 가출원 제60/068493호(1997.12.22)에 기재되어 있다.
폴리펩티드인 KGF-2 폴리펩티드의 아고니스트 및 안타고니스트도 또한 종종 "유전자 치료"로 칭해지는 그러한 폴리펩티드의 형질발현에 의해 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
따라서, 예를 들어 환자의 세포는 폴리펩티드를 생체외 암호화하는 폴리누클레오티드(DNA 또는 RNA)에 의해 공학 처리될 수 있으며, 공학 처리된 세포는 이어서 폴리펩티드로 처리하고자 하는 환자에게 제공한다. 그러한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 세포는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA를 함유한 레트로바이러스 입자를 사용함으로써 당업계에 공지된 방법에 의해 공학 처리할 수도 있다. 또한, 세포를 환자에게 재도입시키기 전에, 세포를 생분해성 매트릭스(예, 폴리글리콜산), 조직 대체물 또는 등가물(예, 인공 피부), 인공 기관 및 골라겐 유도 매트릭스 등을 비롯한 세포 담체 상에 접종할 수도 있다,
또한, 세포는 예를 들어 당업계에 공지된 방법에 의해 폴리펩티드의 생체내 형질발현을 위해 생체 내에서 공학 처리할 수도 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 RNA 함유 레트로바이러스 입자를 제조하기 위한 생산자 세포는 세포를 생체 내에서 공학 처리하고 폴리펩티드를 생체 내에서 형질 발현하기 위해 환자아게 투여할 수 있다. 그러한 방법에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 이들 밀 다른 방법은 당업자라면 본 발명의 교시 내용으로부터 명백히 알 수 있다. 에를 들어, 세포를 공학 처리하기 위한 형질 발현 부형제는 레트로 바이러스 이외의 것, 예를 들어 적당한 전달 부형제와의 조합 후 세포를 생체 내에서 공학 처리하는 데 사용할 수 있는 아데노바이러스일 수 있다. 다른 전달 부형제의 예로는 HSV계 벡터 시스템, 아데노 결합 바이러스 벡터 및 불활성 부형제, 예를 들어 덱스트란 코팅된 페라이트 입자가 있다.
전술한 레트로바이러스 플라스미드 벡텨가 유도될 수 있는 레트로바이러스로는 몰로니 뮤린 류캐미아 바이러스(Moloney Muring Leukemia virus), 비장 괴사 바이러스, 루스 사코마 바이러스(Rous Sarcoma Virus) 등의 레트로바이러스, 하비 사코마 바이러스(Harvey Sarcoma virus), 조류 백혈병 바이러스, 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 아데노바이러스, 골수증식성 육종 바이러스, 및 유방암 바이러스가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
상기 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 사용할 수 있는 적당한 프로모터로는 레트로바이러스 LTR, SV40 프로모터, 및 밀러 등의 문헌 [BiotechniquesVol. 7, No.9:980-990(1989)]에 기재된 인간 거대세포 바이러스(CMV), 또는 임의의다른 프로모터(예를 들어, 히스톤, pol III 및 β-액틴 프로모터를 비롯한 진핵 세포 프로모터 등의 세포 프로모터가 있으나, 이들에 국한되는 것은 아님)가 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 사용할 수 있는 다른 바이러스 프로모터로는 아데노바이러스 프로모터, 티미딘 키나아제(TK) 프로모터, 및 B19 파로바이러스 프로모터가 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 적당한 프로모터의 선택은 당업자라면 본 명세서에 기재된 교시 내용으로부터 명백히 알 수 있을 것이다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 적당한 프로모터의 제어 하에 있다. 사용할 수 있는 적당한 프로모터로는 아데노바이러스 메이져 레이트 프로모터 등의 아데노 바이러스 프로모터, 또는 거대세포 바이러스(CMV) 프로모터 등의 이종 프로모터, 호흡성 신시튬 바이러스(RSV) 프로모터, MMT 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터 등의 유도 가능한 프로모터, 열충격 프로모터, 알부민 프로모터, 아포AI 프로모터, 인간 글로빈 프로모터, 단순 포진 티미딘 키나아제 프로모터 등의 바이러스 티미딘 키나아제 프로모터, 레트로바이러스 LTR(예, 전술한 변성된 레트로바이러스 LTR), β-액틴 프로모터, 및 인간 성장 호르몬 프로모터가 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 또한, 프로모터는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 제어하는 천연 프로모터일 수도 있다.
레트로바이러스 플라스미드 벡터는 포장 세포주를 형질도입하여 생산자 세포주를 형성하는 데 사용된다. 형질도입될 수 있는 포장 세포주의 예로는 내용이 본 명세서에 참고로 인용된 밀러의 문헌 [Human Gene Therapy 1:5-14(1990)]에 기재된 PE501, PA317, Ψ-2, Ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ΨCRE, ΨCRIP, GP+E-86, GP+envAm12 및 DAN 세포주가 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 상기 벡터는 당업계에 공지된 임의의 수단을 통해 포장 세포를 형질 도입시킬 수 있따. 그러한 수단으로는 일렉트로포레이션, 리포좀의 사용, 및 CaPO4의 침전이 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 하나의 대안예로서, 레트로바이러스 플라스미드 벡터를 리포좀 내에 캡슐화시키거나 또는 지질에 결합시킨 후, 숙주에 투여할 수도 있다.
생산자 세포주는 핵산 서열(들)을 폴리펩티드를 포함하는 전염성 레트로바이러스 벡터를 생산한다. 이후, 진핵세포를 시험관내 또는 생체내에서 형질 도입시키기 위해, 그러한 레트로바이러스 벡터 입자를 사용할 수 있다. 형질도입된 진핵 세포는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열(들)을 형질 발현한다. 형질도입될 수 있는 진핵 세포로는 태아 간세포, 태아 종양세포, 조혈 간세포, 간 세포,섬유아세포, 근원세포, 케라틴 형성 세포, 내피세포, 및 기관지 내피세포가 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다.
본 발명은 본 발명의 화합물 또는 약학 조성물, 바람직하게는 본 발명의 항체 유효량을 개체에 투여하여 치료, 억제 및 예방하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 화합물은 실질적으로 정제된 상태(예를 들어, 그 효과를 제한하거나 또는 원치않는 부작용을 발생시키는 물질을 실질적으로 함유하지 않은 상태)이다. 상기 개체는 동물, 예를 들어 소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개 등을 비롯한 동물인 것이 바람직하나, 이들에 국한되는 것은 아니며, 포유 동물인 것이 더욱 바람직하고, 인간이 가장 바람직하다.
상기 화합물이 핵산 또는 면역글로블린을 함유하는 경우에 사용할 수 있는 투여 방법 및 제제는 전술하였으며, 추가의 적당한 제제 및 투여 경로는 이하 기재된 것들 중에서 선택할 수 있다.
본 발명의 화합물을 투여하는 것으로는 다양한 전달 시스템이 공지되어 있으며, 이들을 이용할 수 있는데, 그 예로는 리포좀, 미립자, 미소캡슐, 상기 화합물을 형질발현할 수 있는 재조합 세포 내 캡슐화법, 수용체 매개 막함입법(예, Wu 및 Wu의 문헌 [J. Biochem. 262:4429-4432(1987)] 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 작제 등이 있다. 도입 방법으로는 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 및 경구 경로가 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 상기 화합물 또는 조성물은, 임의의 용이한 경로를 통해, 예를 들어 주입 또는 환제 주입, 내피 또는 점막(예, 구강 점막, 직장 점막 및 장점막 등)에의해 투여할 수도 있으며, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여할 수도 있다. 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 화합물 또는 조성물을 임의의 적당한 경로, 예를 들어 심실내 및 수막강내 주입을 통해 중추 신경계 내로 주입할 수 있으며, 심실내 주입은, 예를 들어 보유고, 예를 들어 옴마야(Ommaya) 보유고에 부착된 심실내 카테터에 의해 도모될 수 있다. 또한, 폐 투여는, 예를 들어 흡입기 또는 분사기, 그리고 분사제를 함유하는 제제를 사용하여 이용할 수 있다.
구체적 실시형태에서, 본 발명의 약학 화합물 또는 조성물을 치료가 필요한 부위에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수도 있다. 이것은 카테터에 의한 주사, 좌약 또는 삽입물에 의한 수술 중 국소 주입, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 함께 국소 도포에 의해 달성할 수 있으나, 이것에 국한되는 것은 아니며, 상기 삽입물은 시알라스틱 막(sialastic membrane) 또는 섬유 등의 막을 비롯하여 다공성, 비다공성 또는 젤라틴 물질로 구성될 수 있다. 본 발명의 항체를 비롯한 단백질을 투여하는 경우, 단백질이 흡수되지 않는 물질을 사용하도록 주의를 기울여야한다.
또다른 실시 형태에서, 상기 화합물 또는 조성물은 소포, 특히 리포좀 내에 전달될 수 있다(랑거의 문헌 [Science 249: 1527-1533(1990)]; 트릿 등의 문헌 [Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Beresterin and Fidler(eds.), Liss, New York, pp. 353-365(1989)]; 로페즈-베레스타인의 상기 문헌 pp.317-327 참조).
또다른 실시 형태에서, 상기 화합물 또는 조성물은 서방성 시스템으로 전달될 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 펌프를 사용할 수도 있다(상기랑거의 문헌; 세프톤의 문헌 [CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201(1987)]; 부크발트 등의 문헌[Surgery 88:507(1980)]; 사우덱 등의 문헌 [N. Engl. J. Med. 321:574(1989)] 참조). 또다른 실시 형태에서는 중합체 물질을 사용할 수도 있다(문헌 [Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise(eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida(1974)]; [Controlled Drug Biovailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball(eds.), Wiley, New York(1984)]; [Ranger and Peppas,J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61(1983)]; [Levy et al., Science 228:190(1985)]; [During et al.,Ann. Neurol. 25:351(1989)]; [Howard et al.,J. Neurosurg. 71:105(1989)] 참고). 또다른 실시 형태에서, 서방성 시스템은 치료 타겟, 즉 뇌의 근처에 배치할 수 있으므로, 전신 투여량의 일부만이 필요하다(예, [Goodson, in Medical Application of Controlled Release, Vol 2, pp. 115-138(1984)] 참고).
다른 서방성 시스템은 랑거의 문헌 [Science 249:1527-1533(1990)]에 거론되어 있다.
본 발명의 화합물이 단백질을 암호화하는 핵산인 구체적 실시형태에서, 핵산을 적당한 핵산 형질발현 벡터의 일부로서 작제하고, 예를 들어 레트로바이러스 벡터를 사용하여(미국 특허 제4,980,286호 참고), 또는 간접 주사를 통해, 또는 미립자 충격(예, 유전자 건; 바이올리스틱, 듀퐁)을 사용하거나, 또는 지질 또는 세포 표면 수용체 또는 형질감염제로 코팅하거나, 또는 핵 내로 유입되는 것으로 알려진 호메오박스형 펩티드와 결합상태로 투여하여(예, [Joliot et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:1864-1868(1991)] 참고), 세포내로 유입되도록 그것을 투여함으로써, 생체내 투여하여 암호화된 단백질의 형질발현을 촉진시킨다. 또는, 핵산을 세포 내에 도입하여, 형질 발현을 위해, 상동적 재조합에 의해 숙주세포 DNA 내에 혼입시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 약학 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 치료적 유효량의 화합물과 약학적 허용 담체를 포함한다. 구체적 실시 형태에서, 용어 "약학적 허용"이란, 미국 약전 또는 동물, 보다 구체적으로 인간에 사용하기 위한 것으로 일반적으로 인식된 다른 약전에 나열된 또는 연방 또는 주정부의 규제 기관에 의해 승인된 것임 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 칭하는 것이다. 그러한 약학적 담체는 무균액, 예를 들어 물과, 석유, 동물, 식물에서 유래한 오일 또는 합성 오일(예, 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등)일 수 있다. 약학 조성물을 정맥 내 투여하는 경우에는 물이 바람직한담체이다. 염수 용액과, 덱스트로즈 및 글리세롤 수용액도 특히 주사 용액을 위한 액상 담체로서 사용할 수 있다. 적당한 약학적 부형제로는 전분, 글루코즈, 락토오즈, 수크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 쵸크, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤, 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 있다. 필요에 따라, 상기 조성물은 미량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방형 제제 등의 형태를 가질 수 있다, 상기 조성물은 전형적인 결합제 및 트리글리세라이드 등의 담체와 함께 좌약 형태로 제제화할 수 있다. 경구 제제는 약품용의 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로즈, 탄산마그네슘 등의 표준 담체를 포함할 수 있다. 적당한 약학 담체의 예는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin]에 기재되어 있다. 그러한 조성물은, 환자에게 적당한 투여를 위한 형태를 제공하도록, 치료적 유효량의 화합물을 바람직하게는 정제된 형태로 적당량의 담체와 함께 함유한다. 상기 ㅈ제는 투여 방식에 적합해야 한다.
바람직한 실시 형태에서, 조성물은 인간에게 정맥내 투여하기에적합한 약학 조성물로서 통상의 방식에 따라 제제화된다. 통상적으로, 정맥 투여를 위한 조성물은 무균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우, 상기 조성물은 가용화제와, 주사 부위의 통증을 완화시키기 위한 리도케인 등의 국소 마취제를 포함할 수도 있다. 통상적으로, 상기 성분들은 단위 투여 형태, 예를 들어 밀봉형 용기(예, 활성 성분의 양을 표시하는 앰플 또는 사켓) 내의 건성 동결 건조된 분말 또는 비수 농축액 형태로 별도로 또는 함께 혼합하여 제공한다. 상기 조성물을 주입에 의해 투여하고자 하는 경우, 약품용의 무균수 또는 염수를 수용한 주입병으로 분배할 수 있다. 상기 조성물을 주사에 의해 투여하는 경우, 성분들을 투여 전에 혼합할 수 있도록 주사용 무균수 또는 염수의 앰플을 제공할 수 있다.
본 발명의 조성물은 중성 형태 또는 염 형태로 제제화할 수 있다. 약학적 허용염으로는, 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 젖산 등으로부터 유도된 것 등의 음이온에 의해 형성된 것, 그리고 나트륨, 칼륨 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것과 같은 양이온에 의해 형성된 것이 있다,
본 발명의 폴리펩티드의 과도한 형질 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 또는 질병의 치료, 억제 및 예방에 효과적인 본 발명의 화합물의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정할 수 있다. 또한, 적정 튜여 범위의 확인을 돕기 위해 시험관 내 분석을 임의로 이용할 수도 있다. 제제 중에 사용되는 정확한 투여량은 투여 경로, 및 질병 또는 질환의 심각도에 따라 좌우되며, 임상의의 판단 및 각 환자의 환경에 따라 결정되어야 한다. 효과적인 투여량은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 투여량-반응 곡선으로부터 외삽할 수도 있다,
항체의 경우, 호나자에게 투여된 투여량은 통상적으로 환자 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg이다. 환자에게 투여된 투어량은 환자 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 20 mg인 것이 바람직하고, 1 mg 내지 10 mg인 것이 더욱 바람직하다. 통상적으로, 인간 항체는 외부 폴리펩티드에 대한 면역 반응으로 인해 다른 종 항체보다 인간 신체 내에서의 반감기가 보다 길다. 따라서, 보다 낮은 투여량의 인간 항체 및 보다 적은 투여 빈도가 가능한 경우가 많다. 또한, 본 발명의 항체의 투여량 및 투여 빈도는, 예를 들어 지질화 등의 변성에 의해 항체의 흡수 및 조직 침투(예, 뇌 내로의 침투)를 향상시킴으로써 저하시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물의 하나 이상의 성분들이 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 포함한다. 그러한 용기는 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에서 규정한 형태의 고지서를 첨부할 수 있으며, 이러한 고지서는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매용으로 상기 정부 기관이 허용한 것임을 반영하는 것이다.
항체에 기초한 치료 용도
또한, 본 발명은 상기 개시된 질환, 질병 또는 증상 중 하나 이상을 치료하기 위해 동물, 바람직하게는 포유류 환자에게 본 발명의 항체를 투여하는 항체에 기초한 치료법에 관한 것이다. 본 발명의 치료 화합물로는 본 발명의 항체(본 명세서에 기재된 바와 같이 그 단편, 유사체 및 유도체 포함) 및 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산(본 명세서에 기재된 바와 같은 그 단편, 유사체 및 유도체와 유전인자형 향체 포함)이 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 과도한 형질발현 및/또는 활성과관련된 질환, 질병 또는 증상, 예를 들어 본 명세서에 기재된 질환, 질병 또는 증상 중 임의의 하나 이상을 치료, 억제 또는 예방하는 데 사용될 수 있으며, 이들에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 폴리펩티드의 과도한 형질발현 및/또는 활성과 관련된 질환, 질병 또는 증상의치료 및/또는 예방으로는 상기 질환, 질병 또는 증상과 관련된 증상을 완화시키는 것이 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 바와 같이 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 약학적 허용 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 항체를 사용할 수 있는 방식에 대한 요약은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 체내에 국소적으로 또는 전신적으로, 또는 예를 들어 보체(CDC)에 의해 매개된 항체의 직접 세포에 의해, 또는 작동체 세포(ADCC)에 의해 결합시키는 방식이 있다. 본 명세서에 제공된 교시 내용을 이해한 당업자라면, 불필요한 실험없이 진단, 관측 또는 치료를 위해 본 발명의 항체를 사용하는 방법을 알 것이다.
본 발명의 항체는, 예를 들어 항체와 반응하는 작동체 세포의 수 또는 활성을 증가시키는 작용을 하는 다른 모노클론 또는 키메라 항체와 함께, 또는 림포카인 또는 조혈 증식 인자(예, IL-2, IL-3 및 IL-7)과 함께 사용하는 것이 유리할 수 있다.
본 발명의 항체는 단독으로, 또는 다른 유형의 치료(예, 방사선 치료, 화학요법, 호르몬 치료, 면역 치료 및 항암제)와 병용하여 투여할 수 있다. 통상적으로, 환자종과 동일한 종기원 또는 종 반응성(항체의 경우)을 가진 제품을 투여하는 것이 바라직하다. 따라서, 바람직한 실시 형태에서는, 치료 또는 예방을 위해 사람 항체, 단편 유도체, 유사체, 또는 핵산을 환자에게 투여한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 및 그 단편과 관련된 질병의치료와 그에 대한 면역 분석법 모두에는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드, 그 단편 또는 영역에 대해 항체를 생체내 억제 및/또는 중화시키는 높은 효능 및/또는 친화성을 이용하는 것이 바람직하다. 그러한 항체, 단편 또는 영역은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 및 그 단편에 대해 친화성을 갖는 것이 바람직하다. 바람직한 결합 친화체로는 해리 상수 또는 Kd가 5 X 10-2M, 10-2M, 5 X 10-3M, 10-3M, 5 X 10-4M, 10-4M, 5 X 10-5M, 10-5M, 5 X 10-6M, 10-6M, 5 X 10-7M, 10-7M, 5 X 10-8M, 10-8M, 5 X 10-9M, 10-9M, 5 X 10-10M, 10-10M, 5 X 10-11M, 10-11M, 5 X 10-12M, 10-12M, 5 X 10-13M, 10-13M, 5 X 10-14M, 10-14M, 5 X 10-15M 및 10-15M 미만인 것이 있다.
염색체 분석
또한, 본 발명의 서열은 염색체 확인에 가치가 있다. 상기 서열은 개별 인간 염색체 상의 특정 위치를 특이적으로 표적화하고 이것과 교배할 수 있다. 또한, 최근에는 염생체 상의 특정 부위를 확인하기 위한 필요성이 존재한다. 염색체 위치를 표시하는 데 유용한, 실제 서열 데이타(반복 다형성)에 기초한 염색체 표시 시약은 소수이다. 본 발명에 따른 염생체에 DNA를 지도작성하는 것은, 유전자 관련 질환과 상기 서열을 상호 관련시키는 중요한 제1 단계이다.
간략하게 말하면, cDNA로부터 PCR 프라이머(바람직하게는 15∼25 bp)를 제조하여 염색체에 지도를 작성할 수 있다. 게놈 DNA 중에 하나 이상의 엑손이 존재하지 않는 프라이머를 급속히 선택하는 데에는 3' 비번역된 영역의 컴퓨터 분석을 이용하므로, 증식 과정이 복잡하다. 이들 프라이머는 개별 인간 염색체를 함유하는 신체 세포 잡종의 PCR 검색에 사용된다. 상기 프라이머에 상응하는 인간 유전자를 함유하는 상기 잡종만이 증식된 단편을 산출한다.
신체 세포 잡종의 PCR 지도 작성은 특정 염색체에 특정의 DNA를 부여하는 급속한 방법이다. 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 본 발명을 이용하는 것은, 큰 게놈 클롬의 풀 또는 특이적 염색체 단편 패널에 의해 유사한 방식으로 달성할 수 있다. 그 염색체에 지도를 작성하는 데 유사하게 사용할 수 있는 다른 지도 작성법으로는 현장 잡종법, 표지된 유동 분류 염색체에 의한 예비 검색법, 및 잡종에 의한 예비 선택을 통해 염색체 특이적 cDNA 라이브러리를 작제하는 방법이 있다.
메타상 염색체 스프레드에 cDNA 클론의 형광성 현장 잡종법(FISH)은 정확한 염색체 위치를 한 단계에 제공하는 데 이용할 수 있다. 이 기술은 50 베이스 또는 60 베이스 정도로 짧은 cDNA를 사용할 수 있다. 이러한 기술에 대한 검토를 위해, Verma et. al.,Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)]를 참고한다.
정확한 염색체 위치에 서열을 지도 작성하면, 염색체 상의 서열의 물리적 위치가 유전적 지도 데이타와 상호 관련이 있을 수 있다. 그러한 데이타는, 예를 들어 V. McKusick의 문헌 [Mendelian Inheritance in Man(죤스 홉킨스 유니버시티 웰취 메디칼 라이브러리를 통해 온라인으로 입수)에서 찾아볼 수 있다. 이어서, 동일한 염색체 영역에 지도를 작성한 유전자와 질환간의 관계를 결합 분석(물리적으로 근접한 유전자의 공동상속)을 통해 확인한다.
이어서, 감염된 개체와 미감염된 개체 간의 cDNA 또는 게놈 서열에 있어서의 차이를 결정할 필요가 있다. 임의의 정상 개체를 제외한 감염된 개체 중 일부 또는 전부에서 돌연변이가 관찰되는 경우, 그 돌연변이는 질환의 소인이 될 것 같다.
물리적 지도 작성 및 유전적 지도 작성 기술에 대한 최근 해결과 함께, 상기 질환과 관련된 염색체 영역에 정확하게 국소화된 cDNA는 50 내지 500개의 잠재적 소인 중 하나가 될 수 있다(이것은 20 kb 당 1개의 유전자와 1 메가베이스의 지도작성 해상도를 갖는 것으로 추측됨).
본 발명은 이하 실시예를 참조하여 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 그러한 실시예에 국한되는 것이 아니다. 특별한 명시가 없는 한, 모든 부 또는 양은 중량을 기준으로 한다.
이하 실시예에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해, 자주 사용되는 방법 및/또는 용어를 기재하기로 한다.
"플라스미드"는 대문자 및/또는 숫자가 앞에 오고/오거나 뒤에 오는 보다 낮은 경우 p를 칭하는 것이다. 본 명세서에서 출발 플라스미드는 시판되거나, 공공연히 비제한된 기준으로 시판되거나, 또는 공개된 방법에 따라 시판되는 플라스미드로부터 작제할 수 있다. 또한, 전술한 것과 등가의 플라스미드는 당업계에 공지되어 있고, 당업자라면 명백히 알 것이다.
DNA의 "절단"은 DNA 중의 특정 서열에서만 작용하는 제한 효소로 DNA를 촉매적 분할하는 것을 칭하는 것이다. 본 발명에 사용된 다양한 제한 효소는 시판되고, 이들의 반응 조건, 보조 인자 및 다른 요건은 당업자에게 공지된 바와 같이 사용하였다. 분석을 위해, 약 20 ㎕의 완충용액 중의 약 20 단위의 효소와 함께 통상적으로 1 ㎍의 플라스미드 또는 DNA 단편을 사용한다. 플라스미드 작제를 위한 DNA 단편의 분리를 위해서는, 보다 큰 부피 중의 25 내지 250 단위의 효소를 사용하여 통상 5 ㎍ 내지 50 ㎍의 DNA를 절단하였다. 구체적 제한 효소에 적당한 완충제및 기질의 양은 제조업자에 의해 명시된다. 대개 37℃에서 약 1 시간의 항온 처리 시간을 사용하나, 공급업자의 지시에 따라 변경될 수도 있다. 절단 후에는, 폴리아크릴아미드 겔 상에서 직접 반응을 일렉트로포레이션시켜, 원하는 단편을 분리시킨다.
분할된 단편의 크기 분리는 괴델, 디 등의 문헌 [Nucleic Acids Res.,8:4057(1980)]에 기재된 8%의 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수행한다.
"올리고뉴클레오티드"는 화학적으로 합성될 수 있는 단일 스트랜드의 폴리데옥시뉴클레오티드 또는 2개의 상보적 폴리데옥시뉴클레오티드 스트랜드를 칭하는 것이다. 그러한 합성 올리고뉴클레오티드는 5' 인산염을 갖지 않으므로, 키나아제의 존재 하에 ATP와 함께 인산염을 첨가하는 일이 없이 또다른 올리고뉴클레오티드에 결찰하게 된다. 합성 올리고뉴클레오티드는 탈포스포릴화되지 않은 단편에 결찰하게 된다.
"결찰"이란 2개의 이중 스트랜드 핵산 단편 간에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 칭하는 것이다(Maniatis, T., et al.의 상기 문헌 p 146 참고). 특별한 지시가 없는 한, 결찰은 결찰시키고자 하는 DNA 단편의 대략적인 등몰량인0.5 ㎍ 당 10 단위의 T4 DNA 리가아제("리가아제")와 함께, 공지된 완충제 및 조건을 사용하여 수행할 수도 있다.
그러한 외부 DNA를 세포막 내로 도입시킨 경우, 외부 움 에 의해 세포가 "형질변환"되었다. 외부 DNA는 염색체간 DNA에 통합(공유 결합)되거나 또는 통합되지 않을 수도 있으며, 이로써 세포 게놈을 형성한다. 원핵생물 및 효소, 예를 들어 외부 DNA는 에피솜 요소 상에 유지될 수도 있다. 진핵세포와 관련하여, 안정하게 형질변환된 또는 형질감염된 세포는 외부 DNA가 염색체 내에 통합되어 염색체 복재를 통해 딸 세포에게 물려지는 것이다. 이러한 능력은, 외부 DNA를 함유하는 딸 세포군으로 구성된 세포주 또는 클론을 확립하는 진핵세포의 능력에 의해 입증된다. 형질변환의 예는 그라함, 에프 및 반 데어 엡, 에이의 문헌 [Virology, 52:456-457(1973)]에 기재되어 있다.
"형질도입" 또는 "형질도입된"이란 세포가 외부 DNA를 흡수하고, 그 외부 DNA를 그들의 염색체 내에 통합시키는 과정을 칭하는 것이다. 형질 도입은, 예를 들어 세포가 DNA를 흡수하는 다양한 기술을 칭하는 것인 형질감염에 의해, 또는 DNA를 세포로 전이시키는 데 바이러스를 사용하는 감염에 의해 달성될 수 있다.
유전자 치료법
본 발명의 또다른 특징은, 질환, 질병 및 증상을 치료하는 유전자 치료법에 관한 것이다. 유전자 치료법은 동물에 핵산(DNA, RNA 및 안티센스 DNA 또는 RNA)을 도입시켜 본 발명의 KGF-2 폴리펩티드를 형질발현시키는 것에 관한 것이다. 상기 방법은 프로모터에 효과적으로 결합하는 KGF-2 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드 및 표적 조직에 의한 폴리펩티드 발현에 필요한 기타 유전 요소를 요한다. 그러한 유전자 치료 및 송달 기법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 WO 90/11092를 참조하라.
따라서, 예를 들어, 생체외에서 조작에 의해서 KGF-2 폴리뉴클레티드에 결합될 수 있는 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 사용하여 환자에게서 채취한 세포를 조작한 후, 그 조작된 세포를 상기 폴리펩티드로 치료할 환자에게 제공할 수 있다. 그러한 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참고 문허으로 포함되어 있는 문헌들[Belldegrum, A.,et al., J. Natl. Cancer Inst. 85:207-216(1993)]; Ferrantini, M.et al., Cancer Research 53:1107-1112(1993); Ferrantini, M.et al., J. Immunology 153:4604-4615(1994); Kaido, T.,et al. Int. J. Cancer 60:221-229(1995); Ogura, H.,et al., Cancer Research 50:5102-5106(1990); Santodonato, L.,et al., Human Gene Therapy 7:1-10(1996); Santodonato, L.,et al., Gene Therapy 4:1246-1255(1997); 및 Zhang, J. F.et al., Cancer Gene Therapy 3:31-38(1996)]을 참조하라. 하나의 실시 태양에 있어서, 조작되는 세포들은 동맥 세포이다. 상기 동맥 세포는 동맥에 직접 주사하거나, 동맥 주위의 조직에 주사하거나, 또는 카테터 주사 등을 통하여 환자에게 재도입시킬 수 있다.
이하에서 더욱 상세히 설명하는 바와 같이, KGF-2 폴리뉴클레오티드 작제물은 동물 세포에게 주사 물질을 송달하는 임의의 방법, 예를 들어, 조직(심장, 근육, 피부, 폐, 간 등) 사이내 주사에 의하여 송달할 수 있다. KGF-2 폴리뉴클레오티드 작제물은 약학적 허용 액체 또는 수성 담체를 이용하여 송달할 수 있다.
하나의 실시 태양에 있어서, KGF-2 폴리뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 그대로(naked) 송달한다. 폴리뉴클레오티드, DNA 또는 RNA "그대로(naked)"라는 용어는 바이러스 서열, 바이러스 입자, 리포솜 제제, 리포펙틴 또는 침전제 등의 세포내 도입을 보조, 촉진 또는 용이화하는 작용을 하는 임의의 송달 비히클이 없는 서열을 의미한다. 그러나, KGF-2 폴리뉴클레오티드는 당업자에게 주지된 방법에 따라 제조할 수 있는 리포솜 제제 및 리포펙틴 제제 등으로 송달할 수도 있다. 상기 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,593,972호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호에 기술되어 있는데, 이들 문헌은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.
유전자 치료 방법에서 사용되는 KGF-2 폴리뉴클레오티드 벡터 작제물은 숙주 게놈내로 인테그레이트되지 않으며, 그들이 복제할 수 있는 서열을 함유하고 있지 않은 작제물인 것이 바람직하다. 적당한 벡터로는 스트라타젠(Stratagene)에서 구입할 수 있는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG; 파마시아(Pharmacia)에서 구입할 수 있는 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL; 및 인비트로젠(Invitrogen)에서 구입할 수 있는 pEF1/V5, pcDNA3.1 및 pRc/CMV2 등이 있다. 기타 적당한 벡터는 당업자에게 매우 명백하다.
당업계에 공지되어 있는 임의의 강력한 프로모터를 사용하여 KGF-2 DNA의 발현을 유도할 수 있다. 적당한 프로모터로는 아데노바이러스 프로모터, 예를 들어, 아데노바이러스 메이져 레이트 프로모터(adenoviral major late promoter); 또는 이종 프로모터, 예를 들어, 세포확대바이러스(CMV) 프로모터; 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 프로모터; 유도 프로모터, 예를 들어, MMT 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터; 열 쇼크 프로모터; 알부민 프로모터; 아포AI(ApoAI) 프로모터; 인간 글로빈 프로모터; 바이러스 티미딘 키나아제 프로모터, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나아제 프로모터; 레트로바이러스 LTRs; b-액틴 프로모터; 및 인간 성장 호르몬 프로모터 등이 있다. 프로모터는 KGF-2에 대한 선천적 프로모터일 수도 있다.
다른 유전자 치료 방법과 달리, 표적 세포에 핵산 서열 그 자체를 도입할 때의 한 주요 이점은 그 세포의 폴리뉴클레오티드 합성의 일과성(transiatory nature)이다. 연구들은 비-복제 DNA 서열을 세포내로 도입시킴으로써 6개월 이하의 기간 동안 목적 폴리펩티드의 생성을 제공할 수 있음을 보여준다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 작제물은 동물 내 조직, 예를 들어, 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 지라, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담즙낭, 위, 장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 눈, 내분비선 및 결합 조직 등 사이의 공간으로 송달될 수 있다. 조직 사이의 공간은 세포내액, 기관 조직의 망상 섬유 중의 점다당질 매트릭스, 혈관 또는 챔버 벽의 탄성 섬유, 섬유상 조직의 콜라겐 섬유, 또는 골소강내 또는 근육 세포를 덮어싸는 결합 조직 내의 그와 동일한 매트릭스를 포함한다. 그것은 순환 혈장 및 림프 채널의 림프액에 의하여 유사하게 점유된 공간이다. 근육 조직 사이의 공간에 송달하는 것이 이하의 이유 때문에 바람직하다. 그들은 이들 세포를 포함하는 조직내로 주사에 의하여 편리하게 송달될 수 있다. 송달 및 발현이 미-분화 또는 덜 완전하게 분화된 세포, 예를 들어, 혈액 또는 피부 섬유 아세포의 줄기 세포에서 달성될 수 있지만, 그들은 분화된 비-분할 세포내로 바람직하게 송달되어 계속적으로 발현된다. 생체내에서 근육 세포는 폴리뉴클레오티드를 취해서 발현시킬 수 있는 능력이 특히 우수하다.
산 서열 그대로를 주사하는 경우에, DNA 또는 RNA의 유효 투여량은 약 0.05 mg/체중kg 내지 약 50mg/체중kg의 범위일 것이다. 바람직한 투여량은 약 0.005 mg/kg 내지 약 20mg/kg이고, 더욱 바람직한 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 5mg/kg이다. 물론, 당업자는 이러한 투여량이 주사하는 조직 부위에 따라 변할 것이라는 것을 이해할 것이다. 핵산 서열의 적당한 유효 투여량은 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 치료할 증상 및 투여 경로에 따라 달라질 것이다.
바람직한 투여 경로는 조직 사이의 공간으로 주사하는 비경구 투여 경로이다. 그러나, 기타 비경구 경로, 예를 들어, 특히 폐 또는 기관지 조직, 목구멍 또는 코의 점막에 송달하기 위한 에어로졸 제제의 흡입 방법을 사용할 수도 있다. 또한, KGF-2 DNA 작제물은 그 과정에서 사용하는 카테터에 의하여 혈관성형술 중에 동맥으로 송달될 수 있다.
그대로의 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 송달할 수 있는데, 그 방법에는 송달 부위에 직접 바늘로 주사하는 방법, 정맥내 주사 방법, 국소 투여 방법, 카테터 주입 방법, 및 소위 "유전자 총(gene gun)" 방법 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 송달 방법은 당업계에 공지되어 있다.
상기 작제물들은 예를 들어, 바이러스 서열, 바이러스 입자, 리포솜 제제, 리포펙틴, 침전제 등과 같은 송달 비히클을 사용하여 송달할 수도 있다. 그러한송달 방법은 당업계에 공지되어 있다.
특정 실시 태양에 있어서, KGF-2 폴리뉴클레오티드 작제물을 리포솜 제제와 복합체화 시킨다. 본 발명에서 사용하기 위한 리포솜 제제에는 양이온성, 음이온성 및 중성 제제가 있다. 그러나, 양이온성 리포솜이 특히 바람직하다. 이는 양이온성 리포솜과 폴리음이온성 핵산 사이에 단단한 하전 복합체가 형성될 수 있기 때문이다. 양이온성 리포솜은 기능적 형태로서, 플라스미드 DNA[Felgneret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1987) 84:7413-7416, 이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨]; mRNA[Maloneet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1989) 86:6077-6081, 이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨]; 및 정제된 전사 인자[Debset al., J. Biol. Chem.(1990) 265: 10189-10192, 이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨]의 세포내 송달을 매개하는 것으로 밝혀졌다.
양이온성 리포솜은 용이하게 구입할 수 있다. 예를 들어, N[1-2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리에틸암모늄 (DOTMA) 리포솜이 특히 유용하며, 이는 GIBCO BRL(Grand Island, N.Y.)에서 Lipofectin이라는 상표명으로 구입할 수 있다. [또한, Felgner et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA (1987) 84:7413-7416을 참조하라. 이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨]. 기타 시판되고 있는 리포솜으로는 트랜스펙타스(transfectace)(DDAB/DOPE) 및 DOTAP/DOPE(Boehringer)가 있다.
기타 양이온성 리포솜은 당업계에 주지된 기술을 사용하여 용이하게 입수할 수 있는 물질로부터 제조할 수 있다. 예를 들어, DOTAP(1,2-비스 (올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니오)프로판) 리포솜의 합성 방법을 기술하고 있는 PCT 공개 No.WO 90/11092(이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨)을 참조하라. DOTMA 리포솜의 제조 방법은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되어 있는 문헌[P. Felgneret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:7413-7417]에 기술되어 있다. 유사한 방법을 사용하여 기타 양이온성 지질 물질로부터 리포솜을 제조할 수 있다.
유사하게, 음이온성 리포솜 및 중성 리포솜은 Avanti Polar Lipids (Birmingham, Ala.)로 부터와 같이 용이하게 입수할 수 있으며, 또한 용이하게 입수할 수 있는 물질로부터 용이하게 제조할 수 있다. 그러한 물질로는 포스파티딜, 콜린, 콜레스테롤, 포스파티딜, 에탄올아민, 디올레오일포스파티딜 콜린(DOPC), 디올레오일포스파티딜 글리세롤(DOPG), 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(DOPE) 등이 있다. 이들 물질은 또한, DOTMA 및 DOTAP 출발 물질과 적당한 비율로 혼합시킬 수도 있다. 이들 물질을 사용하여 리포솜을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
예를 들어, 시판 디올레오올포스파티딜 콜린(DOPC), 디올레오일포스파티딜 글리세롤(DOPG), 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(DOPE)을 다양한 조합으로 사용하여 (콜레스테롤을 첨가하거나 첨가하지 않고), 통상의 리포솜을 제조할 수 있다. 따라서, 예를 들어, DOPG/DOPC 비히클은 초음파 처리 바이알내 질소 가스의 스트림 하에서 DOPG 및 DOPC 각 50mg을 건조시킴으로써 제조할 수 있다. 상기 샘플을 밤새도록 진공 펌핑하고, 그 다음날 탈이온수로 수화시킨다. 그 후, 배쓰 (bath)를 15EC로 순환시키면서 최고 셋팅에서 반대 컵(inverted cup)(배쓰 타입) 프로브가 장착된 가열 시스템 모델 350 초음파 처리기(Heat Systems model 350sonicator)을 사용하여 캡이 있는 바이알에서 상기 샘플을 2시간 동안 초음파 처리한다. 대안적으로, 음전하 소포를 초음파 처리 없이 제조하여, 다층판(multilamellar) 소포를 생성시킬 수 있다. 또는, 음전하 소포를 핵공극(nucleopore) 막을 통하여 압출시켜 제조함으로써, 분리된 크기의 단위판(unilamellar) 소포를 제조할 수 있다. 기타 방법은 당업계에 공지되어 있고, 당업자가 이용할 수 있다.
리포솜은 다층판 소포(MLVs), 소형 단위판 소포(SUVs), 또는 대형 단위판 소포(LUVs)를 포함할 수 있고, SUVs를 포함하는 것이 바람직하다. 당업계에 공지된 방법을 사용하여 다양한 리포솜-핵산 복합체를 제조한다. 예를 들어, 문헌[Straubingeret al., Methods of Immunology(1983), 101:512-527, 이는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨]을 참조하라. 예를 들어, 핵산을 포함하는 MLVs는 유리관의 벽에 인지질의 박막을 부착시킨 후, 캡슐화시킬 물질의 용액으로 수화시킴으로써 제조할 수 있다. MLVs의 연장된 초음파 처리에 의하여 SUVs를 제조하여 단위판 리포솜의 동종 집단을 생성시킨다. 취해질 물질을 미리 형성된 MLVs의 현탁액에 첨가한 후, 초음파 처리한다. 양이온성 지질을 포함하는 리포솜을 사용하는 경우에, 건조 지질 막을 멸균수와 같은 적당한 용액 또는 10 mM Tris/NaCl과 같은 등장 완충액에 재현탁시키고, 초음파 처리한 후, 미리 형성된 리포솜을 DNA와 직접 혼합한다. 양으로 하전된 리포솜이 양이온성 DNA에 결합하기 때문에, 리포솜과 DNA는 매우 안정한 복합체를 형성한다. SUVs는 소형 핵산 단편과 사용한다.LUVs는 당업계에 공지된 다수의 방법으로 제조한다. 통상 사용하는 방법에는 Ca2+-EDTA 킬레이트화법[Papahadjopouloset al., Biochim. Biophys. Acta(1975) 394:483; Wilsonet al., Cell(1979) 17:77); 에테르 주사법[Deamer, D. and Bangham, A.,Biochim. Biophys. Acta(1976) 443:629; Ostroet al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1977) 76:836; Fraleyet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1979) 76:3348]; 세제 투석법[Enoch, H. and Strittmatter, P.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1979) 76:145]; 및 역상(reverse-phase) 증발법(REV)[Fraleyet al., J. Biol. Chem.(1980) 255:10431; Szoka, F. and Papahadjopoulos, D.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1978) 75:145]; Schaefer-Ridderet al., Science(1982) 215:166] 등이 있다. 상기에서 언급된 문헌들은 모두 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.
일반적으로, DNA 대 리포솜의 비율은 약 10:1 내지 약 1:10일 것이다. 상기 비율은 약 5:1 내지 약 1:5인 것이 바람직할 것이다. 상기 비율은 약 3:1 내지 약 1:3인 것이 더욱 바람직할 것이다. 상기 비율은 약 1:1인 것이 더욱 더 바람직할 것이다.
미국 특허 제5,676,954호(본원에 참고 인용함)은 마우스 내로 양이온성 리포좀 담체와 복합체를 형성한 유전 물질의 주입에 대해 기술하고 있다. 미국 특허 제4,897,355호, 제4,946,787호, 제5,049,386호, 제5,459,127호, 제5,589,466호, 제5,693,622호, 제5,580,859호, 제5,703,055호 및 국제 공제 No. WO 94/29469호(이들은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨)는 DNA를 세포 및 포유 동물내로 형질 전환시키는데 사용하는 양이온성 지질에 대하여 공개한다. 미국 특허 제5,589,466호, 제5,693,622호, 제5,580,859호, 제5,703,055호, 및 국제 공개 No. WO 94/29469(이들은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨)는 DNA-양이온성 지질 복합체를 포유 동물에 전달하는 방법을 제공한다.
특정 실시 태양에 있어서, KGF-2를 암호화하는 서열을 포함하는 RNA를 포함하는 레트로바이러스 입자를 사용하여 생체내 또는 생체외에서 세포를 조작한다. 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 유도될 수 있는 레트로바이러스로는 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus), 지라 탈저 바이러스(spleen necrosis virus), 루스 육종 바이러스(Rous sarcoma Virus), 하비 육종 바이러스(Harvey Sacoma Virus), 조류 백혈증 바이러스(avian leukosis virus), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus), 인간 면역결핍증 바이러스, 골수증식 육종 바이러스(Myeloproliferative Sarcoma Virus) 및 포유 동물 종양 바이러스 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
레트로바이러스 플라스미드 벡터를 사용하여 팩키징 세포주(packaging cell line)를 형질 도입함으로써 프로듀서 세포주(producer cell line)를 형성시킨다. 형질 전환될 수 있는 패키징 세포주의 예로는 PE501, PA317, R-2, R-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, RCRE, RCRIP, GP+E-86, GP+envAm12 및 Miller의 문헌[Human Gene Therapy1:5-14(1990), 이는 그 전체가 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨]에 기재되어 있는 DAN 세포주 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 벡터는당업계에 공지된 임의의 방법을 통해서 팩키징 세포를 형질 도입시킬 수 있다. 그러한 수단에는 전기 천공법(electroporation), 리포솜 사용법 및 CaPO4침전법 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 대안적 실시 태양에 있어서, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 리포솜내로 캡슐화되거나, 지질과 커플링된 후, 숙주에게 투여될 수 있다.
프로듀서 세포주는 KGF-2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전염성 레트로바일스 벡터 입자를 생성한다. 그 후, 그러한 레트로바이러스 벡터 입자를 사용하여 진핵 세포를 생체내 또는 생체외에서 형질도입시킬 수 있다. 형질 도입 진핵 세포는 KGF-2를 발현시킬 것이다.
기타 특정 실시 태양에 있어서, 생체내 또는 생체외에서 세포들을 아데노바이러스 벡터내에 함유되어 있는 KGF-2 폴리뉴클레오티드로 조작한다. 아데노바이러스는 KGF-2를 암호화하고 발현시키도록 조작될 것이며, 동시에 정상 라이틱(lytic) 바이러스 생존 주기에서의 그 복제 능력이 불활성화된다. 숙주 세포 염색체 내로 바이러스 DNA를 통합시키지 않고 아데노바이러스를 발현시킴으로써, 삽입 혈관 신생에 대한 우려를 감소시킨다. 또한, 아데노바이러스는 다년간 탁월한 안정성 프로파일을 가지고 생존 장 백신(live enteric vaccine)으로 사용되어 왔다[Schwartz, A. R. 등, (1974)Am. Rev. Respir. Dis. 109:233-238]. 마직막으로, 아데노바이러스 매개 유전자 형질 전환은 코튼 랫트(cotton rat)의 폐에 알파-1-항트립신 및 CFTR을 형질 전환시키는 것을 비롯하여 다수의 예에서 증명되어 있다[참조: Rosenfeld, M. A. 등, (1991)Science 252:431-434; Rosenfeld 등, (1992)Cell68:143-155]. 또한, 인간 암의 원인 병원체로서 아데노바이러스를 평가하려는 시도에 대한 광범위한 연구는 한결같이 부정적이었다[참조: Green, M. 등, (1979)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:6606].
본 발명에 사용할 수 있는 적당한 아데노바이러스 벡터는 문헌들[예를 들어, Kozarsky and Wilson,Curr. Opin. Genet. Devel.3:499-503(1993); Rosenfeld 등, Cell 68:143-155(1992); Engelhardt 등, Human Genet. Ther. 4:759-769(1993); Yang 등, Nature Genet. 7:362-369 (1994); Wilson 등, Nature 365:691-692 (1993); 및 미국 특허 제5,652,224호, 이들은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함됨]에 기술되어 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터 Ad2가 유용하고, 인간 293 세포에서 성장시킬 수 있다. 이들 세포는 아데노바이러스의 E1 영역을 함유하며, 상기 벡터에서 삭제된 유전자 생성물을 제공함으로써 결핍 아데노바이러스를 보충하는 Ela 및 Elb를 구성적으로 발현시킨다. Ad2에 더하여, 기타 아데노바이러스의 변종들(예, Ad3, Ad5 및 Ad7)을 또한 본 발명에서 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 아데노바이러스는 복제 결핍인 것이 바람직하다. 복제 결핍 아데노바이러스는 감염 입자를 형성하기 위하여 헬퍼 바이러스(helper virus) 및/또는 팩키징 세포주의 도움을 요한다. 생성 바이러스는 세포를 감염시킬 수 있고, 프로모터에 작용적으로 결합되는 당해 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있으나, 대부분의 세포에서 복제할 수 없다. 복제 결핍 아데노바이러스는 다음 유전자 하나 이상이 전부 또는 부분적으로 삭제될 것이다: Ela, Elb, E3, E4, E2a또는 L1 내지 L5.
특정 다른 실시 태양에 있어서, 아데노-회합 바이러스(AAV)를 사용하여 생체외 또는 생체내에서 세포를 조작한다. AAV는 감염 입자를 생성하기 위하여 헬퍼 바이러스를 요하는 천연 발생적 결핍 바이러스이다[참조: Muzyczka, N.,Curr. Topics in Microbiol. Immunol. 158:97 (1992)]. 그것은 또한 비-분할 세포내로 그의 DNA를 통합시킬 수 있는 몇몇 바이러스 중의 하나이다. AAV의 300 염기쌍만큼 작은 염기쌍을 함유하는 벡터는 팩키징될 수 있고, 통합될 수 있으나, 외인성 DNA에 대한 공간은 약 4.5kb로 제한된다. 그러한 AAV의 제조 방법 및 사용 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,139,941호, 제5,173,414호, 제5,354,678호, 제5,436,146호, 제5,474,935호, 제5,478,745호 및 제5,589,377호를 참조하라.
예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 적절한 AAV 벡터는 DNA 복제, 캡슐화 및 숙주-세포 통합에 필요한 모든 서열을 포함할 것이다. KGF-2 폴리뉴클레오티드 작제물은 표준 클로닝 방법, 예를 들어, 문헌[참조: Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)]에 기재되어 있는 방법을 사용하여 AAV 벡터에 삽입시킨다. 그 후, 재조합 AAV 벡터를 임의의 표준 기법, 예를 들어, 리포펙션, 전기 천공법, 칼슘 포스페이트 침전법 등을 사용하여 헬퍼 바이러스로 감염된 팩키징 세포내로 형질 전환시킨다. 적당한 헬퍼 바이러스에는 아데노바이러스, 세포확대바이러스(cytomegalovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 또는 헤르페스 바이러스 등이 있다. 일단 팩키징 세포가 형질 전환되어 감염되면, 그들은 KGF-2 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함하는 감염성 AAV 바이러스 입자를 제조할 것이다. 그 후, 이들 바이러스 입자를 사용하여 생체내 또는 생체외에서 진핵 세포에 형질 도입시킨다. 형질 도입된 세포는 그 게놈에 통합된 KGF-2 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함할 것이고, METH1 및/또는 KGF-2를 발현시킬 것이다.
유전자 치료법의 기타 방법에는 동종간의 재조합을 통하여 내인성 폴리뉴클레오티드 서열(예, KGF-2를 암호화하는 것) 및 이종간의 제어 영역을 실시가능하게 회합시키는 것을 포함한다[예를 들어, 1997. 6. 24. 등록된 미국 특허 제5,641,670호; 1996. 9. 26. 공개된 국제 공개 No. WO 96/29411; 1994. 8. 4. 공개된 국제 공개 No. WO 94/12650; Koller 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935(1989); 및 Zijlstra 등, Nature 342:435-438(1989)를 참조하라]. 이 방법은 표적 세포에 존재하나 통상 그 세포에서 발현되지 않거나, 소정의 것보다 낮은 수준으로 발현되는 유전자의 활성화를 포함한다.
당업계의 표준 기법을 사용하여 프로모터 옆의 표적 서열을 갖는 프로모터를 함유하는 폴리뉴클레오티드 작제물을 제조한다. 적당한 프로모터는 본 명세서에 기술되어 있다. 표적 서열은 내인성 서열에 충분히 상보적이어서 내인성 서열을 갖는 프로모터-표적 서열의 동종간의 재조합을 허용한다. 표적 서열은 KGF-2 소정 내인성 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 충분히 근접해 있어서, 그 프로모터는 동종간 재조합시에 내인성 서열에 작동적으로 결합될 것이다.
프로모터 및 표적 서열은 PCR을 사용하여 증폭시킬 수 있다. 증폭된 프로모터는 5' 및 3' 말단에 분리된 제한 효소 자리를 포함하는 것이 바람직하다. 제1 표적 서열의 3' 말단은 증폭된 프로모터의 5' 말단과 동일한 제한 효소 자리를 가지며, 제2 표적 서열의 5' 말단은 증폭된 프로모터의 3' 말단과 동일한 제한 효소 자리를 갖는다. 증폭된 프로모터 및 표적 서열은 소화되어 서로 연결된다.
프로모터-표적 서열 작제물은 폴리뉴클레오티드 그 자체로 또는 형질 전환-용이화제, 예를 들어, 리포솜, 바이러스 서열, 바이러스 입자, 전체 바이러스, 리포펙션, 침전제 등(상기에서 상세히 설명하였음)과 결합하여 세포내로 전달된다. 상기 프로모터-표적 서열은 직접 주사법, 정맥 주사법, 국소 투여법, 카테터 주입법, 입자 촉진제법 등을 비롯한 임의의 방법을 사용하여 전달할 수 있다. 상기 방법은 이하에서 더욱 상세히 설명한다.
프로모터-표적 서열 작제물은 세포에 의하여 취해진다. 작제물과 내인성 서열 사이의 동종간 재조합은 프로모터의 제어하에 내인성 KGF-2 서열이 위치되도록 일어난다. 그 후, 상기 프로모터는 내인성 KGF-2 서열의 발현을 유도한다.
KGF-2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 기타 단백질을 암호화하는 기타 폴리뉴클레오티드와 함께 투여할 수 있다. 그러한 단백질에는 산성 및 염기성 섬유아세포 성장 인자, VEGF-1, 상피 성장 인자 알파 및 베타, 혈소판-유도 내피 세포 성장 인자, 혈소판-유도 성장 인자 알파 및 베타, 종양 탈저 인자 알파, 간세포 성장 인자, 인슐린류 성장 인자, 콜로니 자극 인자, 매크로파지 콜로니 자극 인자, 과립구/매크로파지 콜로니 자극 인자 및 산화 질소 신타제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
KGF-2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 단백질의 분비를 용이하게 하는 분비 신호 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 전형적으로, 상기 신호 서열은 코딩 영역의 5' 말단쪽으로 또는 5' 말단에서 발현되는 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역에 위치한다. 상기 신호 서열은 당해 폴리뉴클레오티드와 동종성이거나 이종성일 수 있고, 형질 전환되는 세포와 동종성이거나 이종성일 수 있다. 또한, 상기 신호 서열은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
전술한 임의의 폴리뉴클레오티드 작제물의 투여 모드는 치료 효과를 제공하기에 충분한 양으로 1종 이상의 분자를 발현시키는 모드인한 사용할 수 있다. 이에는 직접 주사법, 전신 주사법, 카테터 주입법, 바이오리스틱 인젝터(biolistic injector)법, 입자 가속기법[즉, "유전자 총(gene gun)"법], 겔포움 스폰지 데포우(gelfoam sponge depot)법, 기타 시판 데포우 물질법, 삼투성 펌프법[예, 알자 미니펌프(Alza minipump), 경구 또는 좌제 고형 약학 제제법(정제 또는 환제), 수술 중 경사(decanting) 또는 국소 적용법 등이 있다. 예를 들어, 칼슘 포스페이트-침전 플라스미드 그 자체를 랫트의 간 및 랫트의 지라로 직접 주사하거나, 또는 단백질-코팅 플라스미드를 간문맥에 직접 주사함으로써 외래 유전자를 랫트의 간에서 발현시켰다[참조: Kaneda 등, Science243:375 (1989)].
바람직한 국소 투여 방법은 직접 주사법이다. 전달 비히클과 복합체화된 본 발명의 재조합 분자를 직접 주사 투여하거나, 동맥 영역내에 국소 투여하는 것이 바람직하다. 조성물을 동맥 영역내에 국소적으로 투여하는 것은 동맥내 센티미터에, 바람직하게는 밀리미터에 상기 조성물을 주사하는 것을 의미한다.
기타 국소 투여 방법은 수술 창상에 또는 그 주위에 본 발명의 폴리뉴클레오티드 작제물을 접촉시키는 것이다. 예를 들어, 환자를 수술하고, 폴리뉴클레오티드 작제물을 창상 내부 조직의 표면에 코팅하거나, 또는 그 작제물을 창상 내부 조직의 영역내로 주사할 수 있다.
전신 투여에 유용한 치료 조성물은 본 발명의 표적 전달 비히클에 복합체화된 본발명의 재조합 분자를 포함한다. 전신성 투여를 이용하는 용도에 있어서 적당한 전달 비히클은 특정 부위에 비히클을 표적화하기 위한 리간드를 포함하는 리포솜을 포함한다.
바람직한 전신성 투여 방법에는 정맥내 주사, 에어로졸, 경구 및 피부(국소) 전달 등이 있다. 정맥내 주사는 당업계의 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 에어로졸 전달도 당업계의 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다[참조: 예를 들어, Stribling 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189:11277-11281 (1992) 본 명세서에 참고로 인용함]. 경구 전달은 동물의 장에서 소화 효소에 의한 소화를 견딜 수 있는 담체에 본 발명의 폴리뉴클에오티드 작제물을 복합체화시킴으로써 수행할 수 있다. 그러한 담체의 예로는 당업계에 공지되어 있는 플라스틱 캡슐 또는 정제 등이 있다. 국소 전달은 피부내로 통과될 수 있는 친유성 시약(예, DMSO)과 본 발명의 폴리뉴클레오티드 작제물을 혼합함으로써 수행할 수 있다.
전달되는 물질의 유효량의 결정은 예를 들어, 그 물질의 화학 구조 및 생물학적 활성, 동물의 연령 및 체중, 및 치료를 요하는 정확한 증상 및 그 심각도 및 투여 경로을 비롯한 다수의 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료 빈도는 다수의 인자, 예를 들어, 투여량 당 투여되는 폴리뉴클레오티드 작제물의 양, 및 피검체의 건강 및 병력에 따라 달라진다. 정확한 양, 투여 횟수 및 투여 시점은 내과 의사 또는 수의사가 결정할 수 있다.
본 발명의 치료 조성물은 임의의 동물, 바람직하게는 포유 동물 및 조류에게 투여할 수 있다. 바람직한 동물에는 인간, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 토끼, 양, 소, 말 및 피그 등이 있고, 인간이 특히 바람직하다.
특정 실시 태양에 있어서, 유전자 치료법에 의하여 본 발명의 폴리펩티드의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 또는 장애를 치료, 억제 또는 예방하기 위하여 항체 또는 그의 기능성 유도체를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 투여한다. 유전자 치료법은 발현된 또는 발현 가능한 핵산을 피검체에 투여함에 의하여 수행되는 치료법을 의미한다. 본 발명의 이러한 실시 태양에 있어서, 상기 핵산은 치료 효과를 매개하는 그의 암호화 단백질을 생성시킨다.
당업계에서 이용할 수 있는 유전자 치료에 대한 임의의 방법을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 그러한 방법을 이하에 예시한다.
유전자 치료법의 일반적 검토를 위해서는 문헌들[참조: Goldspiel 등, Clinical Pharmacy 12:488-505(1993); Wu and Wu,Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev,Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan,Science 260:926-932 (1993); and Morgan and Anderson,Ann. Rev. Biochem. 62:191-217(1993); May,TIBTECH11(5):155-215 (1993)]을 참고하라. 사용할 수 있는 재조합 DNA 기술로서 당업계에 공지되어 있는 방법들은 문헌들[참조: Ausubel등(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); 및 Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]에 기술되어 있다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 화합물은 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 핵산 서열은 적당한 숙주에서 항체 또는 그 단편 또는 키메릭 단백질 또는 중쇄 또는 경쇄를 발현시키는 발현 벡터의 일부이다. 특히, 그러한 핵산 서열은 항체 코딩 영역에 작동적으로 결합되는 프로모터를 가지며, 그러한 프로모터는 유도성 또는 구성성이고, 임의로 조직-특이적이다. 다른 특정 실실 태양에 있어서, 항체 코딩 서열 및 기타 소정 서열이 게놈에 있어서 소정 부위에 동종간 재조합을 촉진하는 영역 옆에 위치하는 핵산 분자를 사용함으로써 핵산을 암호화하는 항체의 염색체내 발현을 제공할 수 있다[참조: Koller 및 Smithies,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra 등, Nature 342:435-438 (1989)]. 특정 실시 태양에 있어서, 발현된 항체 분자는 단일쇄 항체이고; 대안적으로, 핵산 서열은 항체의 중쇄 및 경쇄 양자를 암호화하하는 서열, 또는 그의 단편을 포함한다.
환자 내로 핵산의 송달은 환자가 핵산 또는 핵산-운반 벡터에 직접 노출되는 경우에는 직접적으로, 또는 세포가 시험관에서 핵산으로 우선 형질 전환된 후, 환자에게 주입되는 경우에는 간접적으로 이루어질 수 있다. 이러한 2가지 접근법은 생체내 또는 생체외 유전자 치료법으로서 각각 공지되어 있다.
특정 실시양태에 있어서, 핵산 서열은 생체내에 직접 투여되며, 여기서 그것은 발현되어 암호화된 생성물을 생성한다. 이는 당업계에 공지된 다수의 방법 중 임의의 방법, 예를 들면 적당한 핵산 발현 벡터의 일부로서 그들을 구성하고, 그것을 세포내로 투여하는 방법, 결핍성 또는 약독화 레트로바이러스 또는 기타 바이러스 벡터를 사용하여 감염시키는 방법(미국 특허 제4,980,286호 참조), 또는 DNA 그 자체를 직접 주사하는 방법, 또는 마이크로입자 충격법을 사용하는 방법(예를 들면, 유전자 총, 바이오리스틱, 듀퐁), 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질 전환제로 코팅하는 방법, 리포솜, 마이크로 입자 또는 마이크로캡슐내에 캡슐화하는 방법, 핵 도입을 위하여 공지된 펩티드에 결합된 그들을 투입하는 방법, 또는 수용체-매개 세포 이물 흡수시킨 리간드에 결합된 그들을 투여하는 방법[예를 들면, Wu and Wu,J. Biol., Chem. 262:4429-4432(1987)](이는 수용체를 특이적으로 발현시키는 세포 유형을 표적화하는 데 이용할 수 있음) 등에 의해 달성될 수 있다. 또다른 실시양태에 있어서, 리간드가 엔도솜을 붕괴시키는 융합 유전자(fusogenic) 바이러스 펩티드를 포함하는 핵산-리간드 복합체를 형성시켜, 핵산의 라이소솜(lysosomal) 변성을 피할 수 있다. 또다른 실시양태에 있어서, 특이적 수용체를 표적화함으로써 세포 특이적 흡수 및 발현을 위하여 핵산을 생체내에서 표적화할 수 있다(예를 들면, PCT 공개 WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; WO 93/14188, WO 93/20221 참조). 대안으로, 동종간 재조합에 의해 핵산을 세포내로 도입하고 발현을 위하여 숙주 세포 DNA 내에 포함시킬 수 있다[Koller and Smithies,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935(1989); Zijlstraet al., Nature 342:435-438(1989) 참조].
특정 실시양태에 있어서, 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 바이러스 벡터를 사용한다. 예를 들면, 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있다[Milleret al., Meth. Enzymol. 217:581-599(1993) 참조]. 이들 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈을 정확하게 팩키징하고 숙주 세포 DNA 내로 인테그레이션하는 데 필요한 필수 성분을 함유한다. 유전자 치료법에서 사용하는 항체를 암호화하는 핵산 서열을, 환자 내로 유전자의 송달을 용이하게 하는 1종 이상의 벡터내로 클로닝한다. 레트로바이러스 벡터에 관한 보다 상세한 설명은 문헌[Boesenet al., Biotherapy 6:291-302(1994)]에서 찾을 수 있는데, 상기 문헌에서는 조혈 줄기 세포가 화학 치료에 대하여 더 큰 내성을 갖도록 하기 위하여 그 줄기 세포에 mdr1 유전자를 송달하는 레트로바이러스 벡터의 사용 방법에 대하여 기술하고 있다. 유전자 치료법에서 레트로바이러스 벡터를 사용하는 방법을 예시하고 있는 기타 참고 문헌으로는 문헌[Cloweset al., J. Clin. Invest. 93:644-651(1994); Kiemet al., Blood 83:1467-1473(1994); Salmons and Gunzberg,Human Gene Therapy 4:129-141(1993); 및 Grossman and Wilson,Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114(1993)]이 있다.
아데노바이러스는 유전자 치료법에 사용할 수 있는 기타 바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 호흡기 상피에 유전자를 송달하는 데 특히 효과적인 담체이다. 아데노바이러스는 본래 그들이 경증의 질병을 유발하는 호흡기 상피를 감염시킨다. 아데노바이러스-계 송달 시스템에 대한 기타 표적은 간, 중추 신경계, 내피 세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 비-분할 세포를 감염시킬 수 있는 이점이 있다.문헌[Kozarsky and Wilson,Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503(1993)]은 아데노바이러스-계 유전자 치료법의 개설서를 제공한다. 문헌[Boutet al., Human Gene Therapy 5:3-10(1994)]에서는 레서스(rhesus) 원숭이의 호흡기 상피에 유전자를 전달하는 아데노바이러스 벡터의 사용 방법을 설명하였다. 유전자 치료법에서의 아데노바이러스 사용 방법에 대한 기타 예는 문헌[Rosenfeldet al., Science 252:431-434(1991); Rosenfeldet al., Cell 68:143-155(1992); Mastrangeliet al., J. Clin. Invest. 91:225-234(1993); PCT 공개 WO 94/12649; 및 Wang,et al.,Gene Therapy 2:775-783(1995)]에서 찾을 수 있다. 바람직한 실시양태에 있어서, 아데노바이러스 벡터를 사용한다.
아데노-회합 바이러스(AAV)도 유전자 치료법에 사용하도록 제안되어 왔다[Walshet al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300(1993); 미국 특허 제5,436,146호].
유전자 치료법에 대한 또다른 접근법은 전기 천공법, 리포펙션법, 칼슘 포스페이트 매개 형질 전환법 또는 바이러스 감염법과 같은 방법에 의해 조직 배양물 중의 세포에 유전자를 도입시키는 것을 포함한다. 통상, 형질 전환 방법은 세포에 선택성 마커(selectable marker)를 도입시키는 것을 포함한다. 그 후, 세포는 취해져서 형질 전환 유전자를 발현시키는 세포를 분리하기 위한 선택 하에 놓여진다. 그 후, 이들 세포는 환자에게 송달된다.
이러한 실시양태에 있어서, 핵산은 생성된 재조합 세포의 생체내 투여 전에 세포내로 도입된다. 그러한 도입은, 예를 들면 형질 전환법, 전기 천공법, 마이크로인젝션법, 핵산 서열을 함유하는 박테이오파지 또는 바이러스 벡터를 이용한 감염법, 세포 융합법, 염색체-매개 유전자 도입법, 마이크로셀-매개 유전자 도입법, 스페로플라스트 융합법 등을 비롯한 당업계에 임의의 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 외래 유전자를 세포에 도입하기 위한 다양한 기술은 당업계에 공지되어 있고{예를 들면, 문헌[Loeffler and Behr,Meth. Enzymol. 217:599-618(1993); Cohenet al., Meth. Enzymol. 217:618-644(1993); Cline,Pharmac. Ther. 29:69-92m(1985)] 참조}, 본 발명에 따라 사용할 수 있는데, 단 수용 세포의 필요한 발육 및 생리학적 기능은 파괴되지 않는다. 상기 기술은 세포에 핵산을 안정하게 도입시킴으로써 핵산을 세포에 의해 발현시켜야 하며, 바람직하게는 그 세포의 자손에 유전되어 발현될 수 있어야 한다.
생성된 재조합 세포는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 환자에게 송달할 수 있다. 재조합 혈액 세포(예, 조혈 줄기 또는 선조 세포)는 정맥내로 투여되는 것이 바람직하다. 세포의 사용 예상 양은 원하는 효과, 환자의 상태에 따라 달라지며, 당업자가 결정할 수 있다.
핵산이 유전자 치료 목적으로 도입될 수 있는 세포는 임의의 소정 사용 가능한 세포 유형을 포함하는데, 이에는 상피 세포, 내피 세포, 각질 형성 세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; 혈액 세포, 예를 들면 T-림프구, B-림프구, 단핵구, 매크로파지, 호중구, 호산구, 거대핵세포, 과립구; 다양한 줄기 세포 또는 선조 세포, 특히 조혈 줄기 세포 또는 선조 세포, 예를 들면 골수, 탯줄 혈액, 말초 혈액, 태아 간 등에서 얻어진 것 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 실시양태에 있어서, 유전자 치료법에 사용되는 세포는 환자의 자가 조직에서 유래한 것이다.
유전자 치료법에서 재조합 세포를 사용하는 실시양태에 있어서, 항체를 암호화하는 핵산 서열을 세포 내로 도입함으로써 그들을 그 세포 또는 그 자손에 의해 발현시킨 후, 상기 재조합 세포를 치료 목적을 위하여 생체 내로 도입시킬 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 줄기 또는 선조 세포를 사용한다. 분리되어 시험관에서 유지될 수 있는 임의의 줄기 및/또는 선조 세포는 본 발명의 본 실시양태에 따라 유용하게 사용할 수 있다[예를 들면, PCT 공개 WO 94/08598; Stemple and Anderson,Cell 71:973-985(1992); Rheinwald,Meth. Cell Bio. 21A:229(1980); 및 Pittelkow and Scott,Mayo Clinic Proc. 61:771(1986) 참조].
특정 실시양태에 있어서, 유전자 치료 목적으로 도입되는 핵산은 코딩 영역에 작동적으로 결합된 유도성 프로모터를 포함함으로써 상기 핵산의 발현이 적당한 전사 유도자의 존재 또는 부재의 조절에 의해 제어될 수 있도록 한다(Demonstration of Therapeutic or Prophylatic Activity).
본 발명의 화합물 또는 약학 조성물은 인간에게 사용되기 전에 바람직하게 시험관내에서 시험된 후, 소정 치료 또는 예방 활성을 위하여 생체내 시험된다. 예를 들면, 화합물 또는 약학 조성물의 치료 또는 예방 효과를 입증하기 위한 시험관내 분석법은 환자 조직 샘플 또는 세포주에 대한 화합물의 효과를 포함한다. 세포주 및/또는 조직 샘플에 대한 화합물 또는 조성물의 효과는 로제트(rosette) 형성 분석법 및 세포 용해(lysis) 분석법 등(단, 이에 한정되는 것은 아님)을 비롯한당업자에게 공지되어 있는 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 본 발명에 따라, 특정 화합물의 투여가 요구되는가 여부를 결정하는 데 이용할 수 있는 시험관내 분석법에는 환자 조직 샘플을 배양액 중에서 성장시키고, 투여 화합물에 노출시키며, 조직 샘플에서 그러한 화합물의 효과를 관찰하는 시험관내 세포 배양 분석법이 있다.
면역 활성
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질은 면역 세포의 증식, 분화 또는 가동(화학 주성)을 활성화시키거나 억제시킴으로써 면역계의 장애 또는 결핍을 치료하는 데 유용할 수 있다. 면역 세포는 다능성 줄기 세포(pluripotent stem cell)로부터 림프 세포(B 및 T 림프구) 및 골수양성 세포(혈소판, 적혈구, 호중구 및 매크로파지)를 생성하는 조혈 과정을 통하여 발육된다. 상기 면역 결핍 또는 장애의 병인은 유전적 원인, 신체적 원인, 예를 들면, 화학 치료 또는 독성에 의해 얻어지는 일부 자가면역 장애 또는 암, 또는 전염 등일 수 있다. 또한, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질은 특정 면역계 질병 또는 장애의 마커(marker) 또는 디텍터(detector)로서 사용할 수 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질은 조혈 세포의 결핍 또는 장애를 검측 또는 치료하는 데 유용할 수 있다. KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질은 특정 (또는 많은) 유형의 조혈 세포 감소와 연관된 장애를 치료하는 데 있어서 다능성 줄기 세포를 비롯한 조혈 세포의 분화 및 증식을 증대시키는 데 사용할 수 있다. 면역학적 결핍 증후군의 예로는 혈액 단백질 장애(blood protein disorder)(예를 들면, 무감마글로불린혈증, 이상감마글로불린혈증), 모세혈관확장성 운동실조증, 공통 가변성 면역부전증, 디조지 증후군(Digeorge Syndrome), HIV 감염증, HTLV-BLV 감염증, 백혈구 접착 결핍증(leukocyte adhesion deficiency syndrome), 림프구 감소증, 식세포 살균 장애(phagocyte bactericidal dysfunction), 중증 복합성 면역결핍증(SCID), 위스콧-알드리치 장애(Wiskott-Aldrich Disorder), 빈혈증, 혈소판 감소증, 또는 헤모글로빈뇨증 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질은 지혈 활성(출혈을 멈추게 하는 것) 또는 혈전 용해 활성(응혈 형성)을 조정하는 데 사용할 수도 있다. 예를 들면, 지혈 또는 혈전 용해 활성을 증대시킴으로써, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질은 혈액 응고 장애(예, 무피브리노겐혈증, 인자 결핍증), 혈액 혈소판 장애(예, 혈소판 감소증), 또는 외상, 외수술 또는 기타 원인에 의해 생긴 상처를 치료하는 데 사용할 수 있다. 대안으로, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질은 지혈 또는 혈전 용해 활성을 감소시킬 수 있어, 심장 발작(경색), 발작 또는 상흔의 치료에 중요한 혈액 응고를 억제 또는 용해시키는 데 사용할 수 있다.
또한, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질은 자가면역 장애를 치료하거나 검측하는데도 유용할 수 있다. 많은 자가면역 장애는 면역 세포가 자기를 외래 물질로 부적절하게 인식함으로써 발생한다. 이러한 부적절한 인식은 숙주 조직의 파괴를 유도하는 면역 반응을 초래한다. 그러므로, 면역 반응, 특히 T-세포의 증식, 분화 또는 화학 주성을 억제할 수 있는 KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질의 투여는 자가면역 장애의 치료에 효과적일 수 있다.
치료 또는 검측될 수 있는 자가면역 장애의 예로는 애디슨병(Addison's Disease), 용혈성 빈혈증, 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome), 류마티스양 관절염, 피부염, 알러지성 뇌척수염, 사구체신염, 굿파스튜어 증후군(Goodpasture's Syndrome), 그라브스병(Graves' Disease), 다중 경화증, 중증 근무력증, 신경염, 안염, 수포성 유천포창, 유천포창, 다내분비 질환, 자반병, 라이터 증후군(Reiter's Disease), 스티프-만 증후군(Stiff-Man Syndrome), 자가면역 갑상선염, 전신성 홍반성 루푸스, 자가면역 폐염증, 귈랑-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome), 인슐린 의존성 당뇨병 및 자가면역 염증성 안질환 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
유사하게, 알러지 반응 및 증상, 예를 들면 천식(특히 알러지성 천식) 또는 기타 호흡기 질환도 KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질로 치료할 수 있다. 또한, 이들 분자는 아나팔락시, 항원성 분자에 대한 과민증 또는 혈액 군 부적합성(blood group incompatibility)을 치료하는 데 사용할 수 있다.
또한, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질은 기관 거부 반응 또는 이식편-대-숙주 질병(GVHD: graft-versus-host disease)을 치료 및/또는 예방하는 데 사용할 수 있다. 기관 거부 반응은 면역 반응을 통한 이식 조직의 숙주 면역 세포 파괴에 의해 발생한다. 유사하게, 면역 반응도 GVHD에 관여하나, 이 경우에 외래 이식 면역 세포는 숙주 조직을 파괴한다. 면역 반응, 특히 T-세포의 증식, 분화 또는 화학 주성을 억제하기 위한 KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질의 투여는 기관 거부 반응 또는 GVHD 예방에 있어서 효과적인 치료법일 수 있다.
유사하게, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질도 염증을 조절하는 데 사용할 수 있다. 예를 들면, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질은 염증 반응에 관여하는 세포의 증식 및 분화를 억제할 수 있다. 이들 분자는 만성 및 급성 증상 양자 모두의 염증 증상을 치료하는 데 사용할 수 있는데, 그러한 염증 증상의 예로는 감염 관련 염증(예, 패혈증 쇼크, 패혈증 또는 전신성 염증 반응 증후군(SIRS)), 허혈-재관류 손상, 내독소 치사, 관절염, 보체-매개 과민성 거부 반응, 신염, 사이토카인 또는 케모카인 유도 폐 손상, 염증성 장 질병, 크론병(Crohn's disease) 또는 사이토카인(예, TNF 또는 IL-1) 과생성으로 인한 증상 등을 들 수 있다.
과증식 장애(Hyperproliferative Disorders)
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질은 종양을 비롯한 과증식 장애를 치료 또는 검측하는 데 사용할 수 있다. KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질은 직접 또는 간접 상호 작용을 통하여 상기 장애의 과증식을 억제할 수 있다. 대안으로, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질은 과증식 장애를 억제할 수 있는 기타 세포를 증식시킬 수 있다.
예를 들면, 과증식 장애의 면역 반응을 증대시킴으로써, 특히 항원 성 질(antigenic quality)을 증대시킴으로써, 또는 T-세포를 증식, 분화 또는 가동화시킴으로써, 과증식 장애를 치료할 수 있다. 이러한 면역 반응은 존재하는 면역 반응을 향상시키거나, 또는 새로운 면역 반응을 개시함으로써 증대시킬 수 있다. 대안으로, 면역 반응을 감소시키는 것은 화학 치료제와 같은 과증식 장애 치료 방법일 수도 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질로 치료하거나 검측할 수 있는 과증식 장애의 예로는 복부, 뼈, 가슴, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비 선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 머리 및 목, 신경(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 지라, 흉곽 및 비뇨성기에 존재하는 종양을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
유사하게, 기타 과증식 장애도 KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질로 치료하거나 검측할 수 있다. 그러한 과증식 장애의 예로는 전술한 기관 계에 위치하는 종양외에도, 감마글로불린혈증, 림프세포 증식성 장애, 이상단백혈증, 자반병, 유육종증, 세자리 증후군(Sezary Syndrome), 발덴스트론 매크로글로불린혈증 (Waldenstron's Macroglobulinemia), 고셔병(Gaucher's Disease), 조직구증 및 임의의 기타 과증식 질병을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
심혈관 장애
KGF-2를 암호화하는, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질은 말초 동맥 질병, 예를 들면 사지 빈혈을 비롯한 심혈관 장애를 치료하는 데 사용할 수 있다.
심혈관 장애로는 심혈관 이상, 예를 들면 동동맥루(arterio-arterial fistula), 동정맥루, 대뇌 동정맥 기형(cerebral arteriovenous malformation), 선천성 심장 결손, 폐 폐쇄증 및 시미타 증후군(Scimitar Syndrome) 등이 있다. 선천성 심장 결손으로는 대동맥 교착증, 삼방심, 관상 혈관 이상, 십자 심장(crisscross heart), 우심증, 동맥관 열림증, 에브스타인 이상(Ebstein's anomaly), 아이젠멘거 증후군(Eisenmenger complex), 좌심발육부전 증후군, 좌심증, 팔로증후증(tetralogy of fallot), 대혈관 착위증(transpositon of great vessel), 양대혈관우실기시증(double outlet right ventricle), 삼첨판 폐쇄증, 동맥간 존속증, 및 심중격 결손증, 예를 들면 대동맥폐동맥 중격 결손증, 심내막 융기 결손증, 뤼탕바쉬에 증후군(Lutembacher's Syndrome), 팔로증후군 및 심실의 심중격 결손증(ventricular heart septal defect) 등이 있다.
또한, 심혈관 장애로는 심질환, 예를 들면 부정맥, 카르시노이드심질환(carcinoid heart disease), 고심박출증(high cardiac output), 저심박출증, 심장탐폰(cardiac tamponade), 심내막염(세균성 포함), 심동맥류(heart aneurysm), 심박동 정지(cardiac arrest), 충혈성 심부전, 충혈성 심근증, 발작성 호흡곤란, 심인성 부종, 심비대증, 충혈성 심근증, 좌심실 비대증, 우심실 비대증, 경색형성 후 심장 파열(post-infarction heart rupture), 심실 중격 파열, 심장판 질환, 심근 질환, 심근 허혈, 심낭 삼출(pericardial effusion), 심막염(협착성 및 결행성 포함), 기심낭(pneumopericardium), 심막절개술후 증후군, 폐 심질환, 류마티즘성 심질환, 심실 기능부전, 충혈, 심혈관 임신 합병증(cardiovascular pregnancy complication), 쉬미터 증후군(Scimitar Syndrome), 심혈관 매독(cardiovascular syphilis) 및 심혈관 결핵(cardiovascular tuberculosis) 등이 있다.
부정맥으로는 동부정맥, 심방세동, 심방조동, 서맥, 기외수축, 아담스-스토크스병(Adams-Stokes Syndrome), 각블록(bundle-branch block), 동방블록, 장 QT 증후군(long QT syndrome), 수축동시성(parasystole), 로운-가농-레빈 증후군(Lown-Ganong-Levine Syndrome), 마하임-형 조기흥분 증후군(Mahaim-type pre-excitation syndrome), 월프-파킨슨-화이트 증후군(Wolff-Parkinson-White syndrome), 동기능 부전 증후군(sick sinus syndrome), 빈박(tachycardias), 및 심실 세동 등이 있다. 빈박에는 발작성 빈박, 심실상성 빈박, 가속된 심실고유 리듬(accelerated idioventricular rhythm), 방실 결절 재진입성 빈박(atrioventricular nodal reentry tachycardia), 이소성 심방성 빈박(ectopic atrial tachycardia), 이소성 접합부성 빈박, 동방 결절 재진입성 빈박,동빈박(sinus tachycardia), 토르사드 데 포인트(Torsades de Pointes) 및 심실성 빈박 등이 있다.
심장판막 질환으로는 대동맥 판막 기능부전, 대동맥 판막 협착증, 심잡음, 대동맥 판막 탈출증, 승모판 탈출증(mitral valve prolapse), 삼첨판 탈출증, 승모판 기능부전, 승모판 협착증, 폐 폐쇄증, 폐 판막 기능부전, 폐 판막 협착증, 삼첨 폐쇄증, 삼첨판 기능부전 및 삼첨판 협착증 등이 있다.
심근 질환으로는 알콜성 심근증, 울혈성 심근증, 비후성 심근증, 대동맥 판하부 협착증, 폐 판하부 협착증, 제한성 심근증, 샤가스 심근증(Chagas cardiomyopathy), 심내막 섬유탄성증, 심근내막 섬유증, 컨스 증후군(Kearns Syndrome), 심근 재관류 손상 및 심근염 등이 있다.
심근 허혈로는 관상 질환, 예를 들면 협심증, 관상 동맥류, 관상 동맥경화증, 관상 혈전증, 관상 혈관경련, 심근 경색 및 심근 졸도(myocardial stunning) 등이 있다.
또한, 심혈관 질환으로는 혈관 질환, 예를 들면 동맥류, 혈관 형성 이상, 혈관종, 세균성 혈관종, 힙펠-린도우병(Hippel-Lindau Disease), 클리펠-트렌오네이-웨버 증후군(Klippel-Trenaunay-Weber Syndrome), 스터지-웨버 증후군(Sturge-Weber Syndrome), 혈관신경성 부종, 대동맥 질환, 타카야쓰 동맥염(Takayasu's Arteritis), 대동맥염, 레리체 증후군(Leriche's Syndrome), 대동맥 폐쇄성 질환, 동맥염, 구관절염(enarteritis), 결절성 다발성 동맥염, 대뇌혈관 질환, 당뇨병성 맥관장애, 당뇨병성 망막증, 색전증(embolism), 혈전증, 피부홍통증, 치질, 간 정맥 폐색 질환, 고혈압, 저혈압, 허혈, 말초 혈관 질환, 정맥염, 폐 정맥 폐색 질환, 레이노드병(Raynaud's disease), CREST 증후군(CREST syndrome), 망막 정맥 폐색, 쉬미터 증후군(Scimitar Syndrome), 상대정맥 증후군(superior vena cava syndrome), 혈관확장증(telangiectaisia), 혈관확장성 운동실조증(atacia telangiectasia), 유전성 출혈성 혈관확장증(hereditary hemorrhagic telangiectasia), 정계정맥류(varicocele), 정맥류성 정맥, 정맥류성 궤양, 혈관염 및 정맥 기능 부전 등이 있다.
동맥류로는 해리성 동맥류(dissecting aneurysm), 가성 동맥류, 전염성 동맥류, 파열 동맥류(ruptured aneurysm), 대동맥류, 뇌동맥류, 관상 동맥류, 심장 동맥류 및 장골 동맥류 등이 있다.
동맥 폐색 질환으로는 동맥 경화증, 간헐성 파행, 경동맥 협착증, 섬유근성 이형성, 장간막 맥관 폐색증, 모야모야병(Moyamoya disease), 신장 동맥 폐색증, 망막 동맥 폐색증 및 폐색성 혈전 혈관염 등이 있다.
대뇌혈관 장애에는 경동맥 질환, 대뇌 아밀로이드 맥관장애, 대뇌 동맥류, 대뇌 산소결핍증, 뇌동맥 경화증, 대뇌 동정맥 기형, 대뇌 동맥 질환, 대뇌 색전증 및 혈전증, 경동맥 혈전증, 정맥동 혈전증, 발렌버그 증후군(Wallenberg's syndrome), 뇌출혈, 경막외 혈종, 경막하혈종, 거미막하 출혈(subaraxhnoid hemorrhage), 뇌경색, 대뇌 허혈(일시적인 것도 포함), 쇄골하동맥도류 증후군, 심실 주위 백색연화증(periventricular leukomalacia), 맥관 두통(vascular headache), 군발성 두통, 편두통 및 척골기저동맥 순환 부전 등이 있다.
색전증에는 공기 색전증, 양수 색전증, 콜레스테롤 색전증, 푸른 발가락 증후군(blue toe syndrome), 지방 색전증, 폐 색전증 및 혈전 색전증 등이 있다. 혈전으로는 관상 혈전증, 간정맥 혈전증, 망막 정맥 폐색, 경동맥 혈전증, 정맥동 혈전증, 발렌버그 증후군(Wallenberg's syndrome) 및 혈성 정맥염 등이 있다.
허혈에는 대뇌 허열, 허혈성 대장염, 소실 증후군(compartment syndrome), 전엽 소실 증후군(anterior compartment syndrome), 심근 허혈, 재관류 손상 및 말초성 사지 허혈 등이 있다. 맥관염에는 대동맥염, 동맥염, 버세트 증후군(Behcet's Syndrome), 처르그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss Syndrome), 피부점막 림프절 증후군, 폐쇄성 혈전혈관염, 과민성 혈관염, 쉐라인-헤노호 자반증(Schoenlein-Henoch purpura), 알러지성 피부 맥관염 및 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis) 등이 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용물질 또는 길항물질은 중증 사지 허혈 및 관상 질환의 치료에 특히 효과적이다. 실시예에 의해 나타낸 바와 같이, KGF-2 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 실험적으로 유도된 허혈 래빗 사지후부(hindlimb)에게 투여하는 것은 혈압 비율, 혈류, 혈관조영 점수 및 모세혈관 밀도를 회복시킬 수 있다.
KGF-2 폴리펩티드는 송달 부위에의 직접 주사, 정맥내 주사, 국소 투여, 카테터 주입, 바이오리스틱 인젝터(biolistic injector), 입자 가속기, 겔포움 스폰지 데포우(gelfoam sponge depot), 기타 시판 데포우 물질, 삼투성 펌프, 경구 또는 좌제 고형 약학 제제, 외수술 중 경사(decanting) 또는 국소 도포, 분무 송달등(단, 이에 한정되는 것은 아님)을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 투여할 수 있다. 상기 방법들은 당업계에 공지되어 있다. KGF-2 폴리펩티드는 이하에서 보다 상세히 설명하는 바와 같이 약학 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. KGF-2 폴리뉴클레오티드를 송달하는 방법은 본 명세서에서 보다 상세히 기술한다.
항-혈관형성 활성
혈관형성의 내인성 자극물질과 억제제 사이의 자연 발생적 균형은 억제 영향이 우세한 것에 있다. 이에 대해서는 Rastinejad 등의 문헌[Cell 56:345-355(1989)]을 참조할 수 있다. 혈관신생이 상처 치료, 기관 재생, 태아 발생 및 여성 생식 과정과 같은 정상적인 생리 조건에서 일어나는 드문 경우에, 혈관형성은 엄격하게 조절되고 공간적 및 시간적으로 제한된다. 고형 종양 성장 등을 특징으로 하는 병리적 혈관형성의 조건하에서는 이러한 조절 기능이 제 역할을 하지 못한다. 조절되지 않은 혈관형성은 병적으로 되고, 많은 종양 질환 및 비종양 질환의 진행을 지속하게 한다. 고형 종양 성장 및 전이, 관절염, 몇몇 종류의 안질환 및 건선을 비롯한 수많은 심각한 질환들은 비정상적 혈관신생의 영향을 받는다. 이에 대해서는 Moses 등의 문헌[Biotech. 9:630-634(1991)], Folkman 등의 문헌[N. Engl. J. Med. 333:1757-1763(1995)], Auerbach 등의 문헌[J. Microvasc. Res.29:401-411(1985)], Folkman 등의 문헌[Advances in Cancer Research, Klein and Weinhouse 편저, 아카데믹 프레스, 뉴욕, pp. 175-203(1985)], Patz 등의 문헌[Am. J. Opthalmol. 94:715-743(1982)] 및 Folkman 등의 문헌[Science 221:719-725(1983)]을 참조할 수 있다. 혈관형성 과정은 수 많은 병리 증상에서 질병 상태에 기여한다. 예를 들면, 고형 종양의 성장은 혈관형성에 의해 좌우된다는 것을 제시하는 많은 데이타가 축적되어 있다. 이에 대해서는 Folkman 및 Klagsbrun 등의 문헌[Science 235:442-447(1987)]을 참조할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 KGF-2 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드는 물론, KGF-2의 작용물질 또는 길항물질을 투여하여 혈관신생과 관련된 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드나 작용물질 또는 길항물질로 치료할 수 있는 악성 및 전이 증상으로는 본 명세서 설명하는 것과, 그 밖의 당업계에 알려진 악성종양, 고형 종양 및 암을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다(이러한 질환에 대해서는 Fishman 등의 문헌[Medicine 2판, J.B. Lippincott Co., 필라델피아(1985)]을 참조할 수 있다).
본 발명의 KGF-2 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드(KGF-2 작용물질 및/또는 길항물질 포함)로 치료할 수 있는 혈관신생과 관련된 안질환으로는 혈관신생 녹내장, 당뇨병성 망막증, 망막아세포종, 후수정체 섬유증식증, 포도막염, 조발성 각만반 퇴화, 각막 이식편 혈관신생은 물론 기타 염증성 안질환, 안종양, 및 맥락막 또는 홍채 혈관신생과 관련된 안질환을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이에 대해서는 Waltman 등의 문헌[Am. J. Ophthal. 85:704-710(1978)] 및 Gartner 등의 문헌[Surv. Ophthal.22:291-312(1978)]을 참조할 수 있다.
본 발명의 KGF-2 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드(KGF-2 작용물질 및/또는 길항물질 포함)로 치료할 수 있는 추가 질환으로는 혈관종, 관절염, 건선, 맥관섬유증, 아테롬성 경화증 플라크, 상처 치유의 지연, 과립화, 호혈성 관절, 비대성 반흔, 유착결여 골절, 오슬러-웨버 증후군, 화농성 육아종, 경화부종, 트라코마 및 혈관유착증 등을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
이외에도, 본 발명의 KGF-2 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드(KGF-2 작용물질 및/또는 길항물질 포함)로 치료할 수 있는 질환 및/또는 상태로는 고형 종양, 혈액 종양(예컨대, 백혈병), 종양 전이, 카포시 육종, 양성 종양(예컨대, 혈관종, 청각 신경종, 신경섬유종, 트라코마 및 화농성 육아종), 류마티스양 관절염, 건선, 안 혈관형성 질환(예컨대, 당뇨성 망막증, 조발성 망막증, 각만반 퇴화, 각막 이식 거부, 혈관신생 녹내장, 후수정체 섬유증식증, 피부조홍, 망막아세포증 및 포도막염), 상처 치료의 지연, 자궁내막염, 맥관형성, 과립화, 비대성 반흔(켈로이드), 유착결여 골절, 경화부종, 트라코마, 혈관 유착증, 심근 혈관형성, 관상 부축삭, 뇌 부축삭, 동정맥 기형, 허혈정 사지 혈관형성, 오슬러-웨버 증후군, 플라크 혈관신생, 모세혈관확장증, 호혈성 관절, 맥관섬유증, 섬유근성 형성장애증, 상처 과립화, 크론병, 아테롬성 경화증, 태아 착상에 필요한 혈관형성을 막아 월경을 조절하는 임신조절제, 고양이 긁힘 질병(로첼레 미날리아 퀸토사; Rochele minalia quintosa), 궤양(헬리코박터 파이로리), 바르토넬라증 및 바실러스 혈관종증 등의 발병 결과로서 혈관형성 상태가 된 질병 등을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
소화성 질환
KGF-2는 위장관 세포의 증식을 촉진하는 것으로 나타났다. 따라서, KGF-2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 작용물질 및/또는 길항물질은 소화성 질환을 치료 및/또는 검측하는 데 사용될 수 있다.
치료 또는 검측될 수 있는 소화성 질환의 예로는 담관 질병(예컨대, 담관 종양, 담관 폐색, 카롤리병, 담관염을 포함하는 담관 질병; 총담관 낭종, 총수담관 결석 및 총수담관 종양과 같은 총수담관 질병; 담즙 역류, 담관 폐쇄증, 담관 디스키네시아, 담관 누공, 담관 종양, 담낭 종양, 담석증[예컨대, 총수담관 결석]; 담즙울체, 담관 폐색, 알라질(allagile) 증후군 및 간 경변증; 담낭염, 담석증 및 담낭 종양과 같은 담낭 질병; 혈액담즙증 및 후담낭절제술 증후군), 소화계 이상(예컨대, 무공 항문, 바레트 식도, 담관 폐쇄증, 횡격막성 내장전위, 식도 폐쇄증, 허쉬스프룽병, 장관 폐쇄증, 멕켈 게실), 소화계 누공(예컨대, 담관 누공 및 식도 누공[예컨대, 식도기관루], 위루, 장관 누공[예컨대, 직장 누공]), 소화계 누공(예컨대, 직장 질루를 포함하는 직장 누공 및 췌장 누공과 같은 장관 누공), 소화계 종양(예컨대, 총수담관 종양, 담낭 종양을 포함하는 담관 종양), 식도 종양, 위장 종양(예컨대, 결장 폴립[예컨대, 선종상 폴립증 콜리]과 같은 충수 종양을 포함하는 맹장 종양, 유전성 결장직장 종양 및 비폴립증과 같은 결장직장 종양, S상 결장 종양, 십이지장 종양, 회장 종양, 장관 폴립[예컨대, 선종상 폴립증 콜리와 같은 결장 폴립, 가드너 증후군, 포이츠-제거스 증후군], 공장 종양, 항문 종양과 같은 직장 종양 등의 장관 종양), 소화계 종양(항문 종양 및 항문선 종양을 포함하는 직장 종양, 위 종양, 췌장 종양 및 복막 종양과 같은 장관 종양 등의 위장관 종양), 식도 질병(예컨대, 바레트 식도, 식도 및 위 정맥류, 식도 폐쇄증, 식도 낭종, 젠커게실과 같은 식도 게실, CREST 증후군과 같은 식도 자동운동성 장애, 플루머-빈슨 증후군과 같은 연하 장애, 식도 이완불능증, 확산성 식도 경련 및 위식도 역류, 식도 종양, 맬로리-웨이스 증후군과 같은 식도 천공, 식도 협착증, 소화성 식도염과 같은 식도염, 외상 횡격막성 탈장과 같은 횡격막성 탈장, 열공 탈장)을 들 수 있다.
치료 또는 검측될 수 있는 위장관 질병의 예로는 콜레라 질병과 같은 위장염, 위장 출혈(예컨대, 토혈증, 하혈 및 소화성 궤양), 탈장(예컨대, 외상 횡격막성 탈장 및 열공 탈장을 포함하는 횡격막성 탈장, 대퇴 탈장, 서혜 탈장, 전색자 탈장, 제탈장 및 복벽 탈장), 장관 질병(예컨대, 충수염, 충수 종양과 같은 맹장 종양을 포함하는 맹장 질병, 결장 질병[허혈성 대장염, 독성 거대결장증과 같은 궤양성 대장염, 가성막 소장결장염과 같은 소장결장염, 직장결장염, 결장 가성-폐색과 같은 기능성 결장 질병, 선종상 폴립증 콜리와 같은 결장 폴립 등의 결장 종양, 유전성 결장직장 종양 및 비폴립증과 같은 결장직장 종양, S상 결장 종양, 결장 게실염, 결장 다발성 게실증, 허쉬스프룽병 및 독성 거대결장증과 같은 거대결장증, 직장결장염 및 S상 결장 종양과 같은 S상 결장 질병], 변비증, 크론병, 설사[예컨대, 소아설사], 이질[예컨대, 아메바성 이질 및 세균성 이질], 십이지장 질병[예컨대, 십이지장 종양, 십이지장 폐색(예컨대, 상방 장간막 동맥 증후군), 십이지장 궤양(예컨대, 컬링스 궤양 및 십이지장염)], 장염[예컨대, 가막성 소장결장염을 비롯한 소장결장염], 회장 질병[예컨대, 회장 종양 및 회장염], 면역증식성 소장 질병, 염증성 장 질병[예컨대, 궤양성 대장염 및 크론병], 장관 폐쇄증, 기생충성 장질병[예컨대, 아나사키스병, 발란티듐증, 포배 감염, 크립토스포리디아증, 쌍핵아메바증, 아메바성 이질 및 지아르디아증], 장관 누공[예컨대, 직장 누공(직장질루 포함)], 장관 종양[예컨대, 맹장 종양(충수 종양 포함)], 결장 종양[예컨대, 결장 폴립(선종상 폴립증 콜리 포함)], 결장직장 종양[예컨대, 유전성 결장직장 종양 및 비폴립증], S상 결장 종양, 십이지장 종양, 회장 종양, 장관 폴립[예컨대, 결장 폴립(예컨대, 선종상 폴립증 콜리), 가드너 증후군, 포이츠-제거스 증후군], 장관 폐색[예컨대, 구심성 루프 증후군, 십이지장 폐색], 밀착성 대변, 장관 가성 폐색[예컨대, 결장 가성 폐색], 중첩증, 장관 천공, 장관 폴립[예컨대, 결장 폴립(선종상 폴립증 콜리 포함)], 공장 질병[예컨대, 공장 종양], 흡수 장애 증후군[예컨대, 맹 루프 증후군], 복강 질병, 락토스 비내성, 장성 지방이영양증, 단장 증후군, 열대 스프루우(tropical sprue), 폐색 장간막 혈관, 장벽 낭상 기종, 단백질 손실 장질환[예컨대, 장 림프관 확장증], 직장 질병[예컨대, 항문 질병(항문선 종양과 같은 항문 종양, 항문 열상, 항문 소양증, 배변 실금, 치질 포함)], 직장염[예컨대, 직장대장염], 직장 질루와 같은 직장 누공, 직장 종양[예컨대, 항문선 종양과 같은 항문 종양], 직장 탈출증과 같은 직장 질병, 소화성 궤양, 소화성 식도염, 주변성 궤양, 소화성 궤양 출혈, 소화성 궤양 천공, 위 궤양, 졸링거-엘리슨 증후군, 후위절제술 증후군[예컨대, 급속이동 증후군], 위 질병[예컨대, 무염산증], 십이지장 위 역류[예컨대, 담즙 역류], 위 누공, 위 점막 탈출증, 위 출구 폐쇄[예컨대, 유문 협착증], 위염[예컨대, 위축성 위염 및 비후성 위염], 위부전마비, 위 확장증, 위 허실, 위 종양, 위 파열, 위 궤양 및 위 장축염전증, 위장 결핵, 장기하수증,구토[예컨대, 토혈증 및 임부 출혈증]), 췌장 질병(예컨대, 낭종성 섬유증, 췌장 낭종[예컨대, 췌장 가낭종, 췌장 누공, 췌장 기능부전증, 췌장 종양 및 췌장염]), 복막 질병(예컨대, 유미복막증, 복강 내출혈, 장간막 낭종, 장간막 림프절염, 장간막 혈관 폐색, 복막 지방층염, 복막 종양, 복막염, 복강기종, 횡경막하 농양 및 복막 결핵)을 들 수 있다.
치료 또는 검측될 수 있는 소화성 질환은 간 질환도 포함한다. 간 질환으로는 급성 황색 간위축증, 간내 담즙울체(예컨대, 알라질 증후군 및 담즙성 간 경변증), 지방간(예컨대, 알콜성 지방간 및 레이 증후군), 간 정맥 혈전증, 간성 정맥-폐색 질병, 간염(예컨대, 알콜성 간염), 동물성 간염(예컨대, 동물 바이러스성 간염[감염성 개 간염 및 리프트 밸리 열]), 독성 간염, 사람 바이러스성 간염(예컨대, 델타 간염, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 만성 활성 간염 및 E형 간염), 간렌즈핵 퇴화, 간종, 간신성 증후군, 문맥 고혈압증(예컨대, 크루베일히어 보임가르텐 증후군 및 식도 및 위 정맥류), 간 농양(예컨대, 아메바성 간 농양), 간 경변증(예컨대, 알콜성 간 경변증, 담즙성 간경변증 및 실험성 간 경변증), 알콜성 간 질환(예컨대, 알콜성 지방간, 알콜성 간염 및 알콜성 간 경변증), 기생충성 간 질환(예컨대, 간 포낭충증, 파시올라증 및 아메바성 간 농양), 간 부전증(예컨대, 간성뇌증 및 급성 간 부전증), 간 종양, 자반병 간염, 적혈구조성 포르피린증 및 간성 포르핀증(예컨대, 급성 간헐성 포르피린증 및 만발 피부 포르피린증), 간성 결핵 및 젤베거 증후군을 들 수 있다.
치료 또는 검측될 수 있는 구강하악 질병의 예로는 하악 질병(예컨대, 케루범증, 거대 세포 육아종, 하악 이상[예컨대, 구개 피열, 소하악증, 피에르 로빈 증후군, 상악전돌증 및 하악후퇴증], 하악 낭종[예컨대, 비치아발생 낭종], 치아발생 낭종[예컨대, 기저 세포 모반 증후군, 상아질형성 낭종, 석회형성 치아발생 낭종], 치근막 낭종[예컨대, 근성 낭종], 무치 하악[예컨대, 부분 무치 하악], 하악 종양[예컨대, 하악골 종양], 상악골 종양 및 구개 종양, 하악골 질병[예컨대, 두개하악골 장애(측두하악골 관절 질병, 예컨대 측두 하악골 관절 증후군, 하악골 종양, 상악전돌증 및 하악후퇴증을 포함함), 상악골 질병[예컨대, 상악골 종양]), 구강 질병(예컨대, 베세트 증후군, 버닝 마우스 증후군, 경구 칸디다증, 드라이 소켓, 병소 상피 과다형성, 경구 맥반부종, 경구 편평 태선, 구순 질병[예컨대, 구순염, 구순피열, 순음 포진 및 구순 종양], 루트비히 후두염, 멜커슨-로센탈 증후군, 구강 이상[예컨대, 구순 피열, 구개 피열, 치은섬유종증, 대거설증, 대구증, 소구증 및 구개범인두 부전], 무치 구강[예컨대, 무치 하악(부분 무치 하악)], 구강 종양[예컨대, 치은 종양(치근 종양)], 경구 백반증[예컨대, 모발 맥반증], 구순 종양, 구개 종양, 타액선 종양[예컨대, 이하선 종양, 설하선 종양, 하악골하선 종양 및 혀 종양], 수암, 경구 누공[예컨대, 치아 누공, 경구상악동 누공 및 타액선루], 경구 출혈[예컨대, 치은 출혈], 경구 증상, 경구 점막하 섬유증, 치근단주위 치근막염[예컨대, 치근단주위 농양 및 치근단주위 육아종] 및 근성 낭종), 치근막 질병(예컨대, 폐포 골 손실, 치근분기 결손[예컨대, 치은 출혈], 치은 과다형성, 치은 비대증, 치은 종양, 치은 열성, 치은염[예컨대, 치은 구액, 치은 포켓, 괴사성 궤양성 치은염, 거대 세포 육아종 및 치관주위염], 치근막 부착 손실, 치근막 낭종, 치근막염[예컨대, 치근막 출혈, 치근막 포켓 및 치근막염], 치아 박탈, 치아 손실, 치아 이동[예컨대, 치아의 근심 이동 및 치아 이동성]), 하마종, 타액선 질병(예컨대, 미쿨릭즈병, 이하선 질병[예컨대, 이하선 종양] 및 이하선염[예컨대, 멈프스], 타액선 결석[예컨대, 타액관 결석], 타액선 누공, 타액선 종양[예컨대, 이하선 종양, 설하선 종양 및 하악골하선 종양]), 타액선염, 괴사성 타액선화상, 타액분비과잉증, 하악골하선 질병(예컨대, 하악골하선 종양, 구내건조증[예컨대, 소그렌 증후군], 구내염[예컨대, 스티븐스-존슨 증후군, 아프타성 구내염, 의치 구내염 및 허피스성 구내염]), 혀 질병(예컨대, 설증상, 설염[예컨대, 양성 이행성 설염]), 거대설염, 혀 질병(예컨대, 열구 혀, 모상 혀, 설 종양 및 경구 결핵), 인두 질병(예컨대, 비인두 질병과 같은 인두 질병[비인두 종양 및 비인두염]), 편도주위 농양, 인두 종양(예컨대, 하인두 종양, 비인두 종양 및 구강인두 종양[편도 종양, 인두염, 인두후 농양, 편도염 및 구개범인두 부전을 포함함]), 구강하악계 이상, 측두하악골 관절 질병(예컨대, 측두하악골 관절 증후군), 치아 질병(예컨대, 알치증, 치아 침착염[치아 결석 및 치아 플라크 포함], 치아누출, 치아 펄프 질병[치아 펄프 자가융해, 치아 펄프 석회화, 치아 펄프 노출, 치아 펄프 괴저, 제2 상아질 및 치수염 포함], 감수성 상아질, 치아 병소 감염, 과대백악질증, 폐색부전[예컨대, 외상 치아 폐색, 치간이개, 앵글 클래스 I 폐색부전, 앵글 클래스 II 폐색부전, 앵글 클래스 III 폐색부전, 반상 법랑질], 치아 이상[예컨대, 법랑질형성 부전증(예컨대, 치아 법랑질 발육부전), 무치증, 치수내치, 상아질 형성장애증, 상아질형성 부전증, 치아 융해, 치아형성장애증 및 정수이상 치아], 치아 마모증, 치아 광물질탈실[예컨대, 치아 우식증(치아 열구 및 근 우식증 포함)], 치아 탈색, 치아 침식, 전위성 치아 맹출, 치아 매복, 치아 손상[예컨대, 치아 골절(치아 분열 증후군 및 치아 탈구), 치아 손실, 치아 재흡수[예컨대, 뿌리 흡수 및 치아 맹출] 및 치통)을 들 수 있다.
안질환
KGF-2는 안세포의 증식을 촉진시키는 것으로 나타났다. 따라서, KGF-2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 작용물질 및/또는 길항물질은 안질환의 치료 및/또는 검측에 사용될 수 있다.
치료 또는 검측될 수 있는 안질환의 예로는 안정피로, 결막 질병, 결막 종양, 결막염(알러지성, 박테리아성, 봉입, 신생아안염, 트라코마, 바이러스성, 급성 출혈), 각결막염(감염성 또는 건성), 라이터병, 익상편, 안구건조증, 각막 질병, 각막 이영양증(유전성), 푸흐 내피 이영양증, 각막 부종, 각막 혈관신생, 각막 혼탁, 노인환, 각막염, 아칸트아메바 각막염, 각막 궤양, 허피스성 각막염, 수상 각막염, 각결막염, 원추각막, 트라코마, 눈 이상(무홍채증, WAGR 증후군, 무안구증, 검열축소증, 안조직결손증, 수정체 전위증, 수안증, 소안구증, 망막 형성장애증), 유전성 안질환(백색증, 눈 백색증, 안피부 백색증, 맥락막결손증, 유전성 각막 이영양증, 화환상(gyrate) 위축증, 유전성 안위축증, 망막 형성장애증, 색소성 망막염), 안출혈(맥락막 출혈, 전방출혈, 망막 출혈, 유리체 출혈), 안감염(각막 궤양 박테리아성 안감염, 박테리아성 결막염, 봉입 결막염, 신생아안염, 트라코마 맥립종, 감염성 각결막염, 안 결핵), 균류 눈 감염, 기생충성 눈 감염(아카트아메바 각막염, 눈 회선사상층증, 눈 톡소플라즈마증), 바이러스성 눈 감염(바이러스성 결막염, 급성 출혈성 결막염, 사이토메갈로바이러스성 망막염, 허피스 조스터 안구염, 허피스성 각막염, 수상 각막염), 화농성 포도막염(내안구염, 전안구염), 눈 손상(눈 화상, 눈 외부 항체, 침투성 눈 손상), 눈 증상, 눈 종양(결막 종양, 눈꺼풀 종양, 안와 종양, 포도막 종양(맥락막 종양, 홍채 종양), 눈꺼풀 질병(안검염, 검열축소, 안검하수, 안검경련, 산립종, 안검외번, 안검내번, 눈꺼풀 종양, 맥립종), 최루성 기관 질병(누낭염, 건조 눈 선 드로메스(sun dromes), 건성 각결막염 시카(sicca), 소그렌 증후군, 안구건조증, 최루관 폐쇄증), 렌즈 질병(무수정체, 포스백내장 무수정체, 백내장, 렌즈 부전탈, 수정체 전위증, 눈 고혈압증, 녹내장(시각-폐쇄 혈관신생, 시각-개방, 수안증), 눈 고혈압증, 눈 이동성 장애(약시, 안진, 동안 신경 마비, 안근 마비, 두안 증후군, 호너 증후군, 만성 진행성 외부 안근마비, 컨스 증후군), 사시(내사시증), 시신경 질병(시위축증, 유전성 시위축증, 시신경원판 결정강, 시신경염, 시속신경수염, 유두부종), 안와 질병(안구함몰, 안구돌출, 그레이브병, 안와 혈장 세포 육아종, 안와 종양), 비정상 동공 기능(동공부동증, 긴장성 동공, 애디 증후군, 축동, 산동, 호너 증후군), 굴절 오차(부등상시증, 굴절좌우부동증, 난시, 원시, 근시, 노시), 망막 질병(망막색소선조, 당뇨병성 망막증, 망막 동맥 폐색, 망막 퇴화, 황반 퇴화, 포상 황반 부종, 망막 결정강, 색소성 망막염, 컨스 증후군, 망막 박리, 망막 형성장애, 망막 출혈, 망막 혈관신생, 망막 천공, 망막 정맥 폐색), 망막염(맥락망막염, 사이토메칼로바이러스성 망막염, 급성 망막 괴사 증후군), 조발성 망막증, 증식성 유리체망막증), 공막 질병(공막염), 포도막 질병(맥락막 질병, 맥락막 출혈, 맥락막 종양, 맥락막결손증, 맥락막염, 맥락망막염, 국부 라니티스, 화환상 위축증), 홍채 질병(박탈 증후군, 홍채모양체염, 홍채 종양), 포도막염(전포도막염, 교감성안염, 전방 베세트 증후군, 홍채모양체염, 홍채염, 후방 포도막염, 맥락막염, 맥락망막염, 국부 플라니티스, 중간 포도막염, 국부 플라니티스, 화농성 포도막염(내안구염, 전안구염), 포도막수막뇌염 증후군), 시각 장애(약시, 실명, 반맹증, 색각 결핍, 복이중시, 야맹증, 암점, 정상이하시각) 및 증식성 유리체망막증을 들 수 있다.
피부 및 결합 조직 질환
KGF-2는 피부 및 결합 조직의 세포의 증식을 촉진한다. 따라서, KGF-2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 작용물질 및/또는 길항물질은 피부 및/또는 결합 조직의 치료 및/또는 검측에 사용될 수 있다.
결합 조직 질환의 예로는 연골 질병, 예컨대 재발성 다연골염 및 티체 증후군; 봉와직염; 콜라겐 질병, 예컨대 엘러 다놀스 증후군, 켈로이드(여드름 켈로이드 포함), 뮤코다당체침착증 I, 생유괴사 장애(환상 육아종, 유지방성생괴사 포함), 및 불완전골형성증; 피부 이완증; 피부근염; 뒤퓌트랑 구축; 호모시스틴뇨증; 홍반성 루푸스(피부, 원판상, 지방층염, 전신 및 신장염 포함); 마르팡 증후군; 혼성 결합 조직 질병; 뮤신침착증(소포, 뮤코다당체침착증[I, II, UU, IV, IV 및 VII] 포함), 점액수종, 성인부종성 경화증 및 활액 낭종; 결합 조직 종양; 노오난 신드로멜 골반문증; 지방층염(경결성 홍반, 소결절성 비화농성 및 복막 포함); 음경 경화; 가성황색종 엘라스티쿰; 류마티스성 질병(관절염[류마티스양, 유년기류마티스양, 카플란 증후군, 펠티 증후군, 류마티스양 소결절, 폐색 척추골염 및 스틸병], 과골화증, 다발성근육통 류마티스 포함); 국한성 공피증 및 전신성 공피증(CREST 증후군)을 들 수 있다.
피부 질환의 예로는 호산구증가증을 수반한 혈관림프관양 증식; 반흔(비대성 반흔 포함); 피부 누공, 퀴스(cuis) 완하제; 피부염(선단피부염 포함), 아토피성 피부염, 접촉성 피부염(알러지성 접촉, 광알러지성 톡시코덴드론), 자극성 피부염(광독성, 기저귀 발진), 직업적 피부염; 박락성 피부염, 포진성 피부염, 지루성 피부염, 약진(예컨대, 독성 표피 괴사성용해, 결절성 홍반, 혈청병), 습진(발한장애, 간찰진, 신경피부염 및 방사선피부염 포함); 피부근염; 홍반(만성 유주성, 경화성, 감염성, 다형(스티븐스-존슨 증후군), 및 결절(스위트 증후군); 발진(돌발성 발진 포함); 안면 피부병(여드름모양 발진[켈로이드, 주사비, 통상 및 파브레-라코우초트 증후군] 포함); 발 피부병(족부 백선 포함); 손 피부병; 각화극세포종; 각화증(피부경렬, 콜레스테린종[중이 포함] 포함), 어린선(선천성 어린선 형태의 에리트로덤스, 표피박리 과각화증, 층판상 어린선, 심상 어린선, X-선 관련 어린선, 및 소그렌-라르손 증후군 포함), 점액루성 각피증, 손발바닥 각피증, 모낭 각화증, 지루성 각화증, 부전각화증 및 한공각화증; 다리 피부병, 비반세포증(색소성 두드러기), 생괴사 장애(환상 육아종 및 유지방성생괴사), 광과민성 장애(광알러지성 또는 광독성 피부염, 백시니아상 수포증, 햇볕 화상 및 색소성 건피증); 색소침착 장애(은침착증, 과잉색소침착, 멜라닌증, 아콘토시스 니그리칸스[aconthosis nigricans], 흑점, 포이츠-제거스 증후군, 저색소침착, 백색증,피발디즘[pibaldism], 백반, 색소실조증, 색소성 두드러기 및 색소성 건피성)을 들 수 있다.
피부 질환의 예로는 양진; 소양증(항문 및 외음부 포함); 농피증(괴저성 농창 및 괴저성 농피증 포함); 스클랩(sclap) 피부병; 성인성 공피증, 신생아피부경화증; 피부 부속기 질병[모발 질병(탈모증, 모낭염, 다모증, 털과다증, 킨키모(Kinky hair) 증후군), 조 질병(조-슬개골 증후군, 갑입조 또는 조기형, 조진균증, 조갑주위염), 피지선 질병(주사비, 종양), 한선 질병(한선염, 다한증, 소한증, 한진, 폭스-포디스병, 종양) 포함]; 유전적 피부 질환(예컨대, 알피니즘(alfinism), 피부이완증, 양성 가족성 천포창, 포르피린증, 선단피부염, 외배엽성 형성장애, 엘리스 반 크레벨드 증후군, 병소 피부 발육부전증, 엘러스-다늘로스 증후군, 표피 수포증, 어린선); 감염성 피부 질환(예컨대, 피부근염, 분아진균증, 칸디다증, 색소효모균증, 마두라진균증, 파라콕시디오이드진균증, 스포로트라쿰증, 윤선); 박테리아성 피부 질환(예컨대, 자궁경관근막 악티노마이시스증, 간균성 다발성혈관종, 농창, 단독, 만성 유주성 홍반, 홍색음선, 서혜부 육아종, 화농성 한선염, 마두라진균증, 조갑주위염, 열대백반성피부염, 비경결종, 포도상구균속 피부 감염[푸룽클증, 카르분클, 농가진, 증기열상 피부 증후군], 피부 매독, 피부 결핵, 요우스); 기생충성 피부 질환(예컨대, 유충 이행증, 레슈마니아증, 이기생증 및 옴); 바이러스성 피부 질환(예컨대, 감염성 홍반, 돌발성 발진, 단순 ㅍ포진, 물러섬 콘타기오섬[moolusum contagiosum] 및 사마귀)를 들 수 있다.
피부 질환의 또 다른 예로는 대사적 피부 질환, 예컨대 동통성 지방증, 지방이영양증, 유지방성생괴사, 포르피린증, 연소성 황색 육아, 황색종증(울만병); 파풀로세콰무스 피부병(태선상 발진 포함), 파르파소라아시스[parpasoriasis], 비강진 및 건선; 혈관 피부병, 예컨대 바세트 증후군, 점액피부 림프절 증후군, 다발성동맥염 소결절, 괴저성 농피증, 타카야스 동맥염; 대수포성 피부병(극세포분리증 포함), 수포, 허피스성 임신증, 종두상 수포증, 유천포창, 천포창; 피부 종양; 피부 궤양, 예컨대 와위 궤양, 다리 궤양, 발 궤양, 당뇨성 발 궤양, 정맥류 궤양 및 괴저성 농피층을 들 수 있다.
비뇨성기 질환 및 장애
KGF-2는 비뇨성기의 세포 증식을 촉진할 수 있다. 따라서, KGF-2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 작용물질 및/또는 길항물질은 남성 및 여성의 생식기 질환 및/또는 장애 및 임신 합병증을 치료 및 검측하는 데 이용될 수 있다.
치료 또는 검측될 수 있는 비뇨기 및 남성 성기 질환의 예로는 부고환염, 남성 성기 종양, 음경 종양, 전립성 종양, 고환 종양, 음낭혈종, 음부 포진, 음낭수종, 남성 불임증, 정충감소증, 음경 질병(예컨대, 귀두염, 요도하열증, 음경 경화, 음경 종양, 포경, 감돈포경, 음경강직증), 전립선 질병(예컨대, 비대증, 종양 및 전립선염), 성기능 장애(예컨대, 발기부전 및 맥관형성 발기부전), 정핵 비틀림, 정액수류, 고환 질병(예컨대, 잠복고환, 고환염 및 고환 종양), 남성 성기 결핵, 정삭정맥류, 비뇨성기 결핵(남성 성기, 신장), 비뇨성기 이상, 방광 외번증, 잠복고환, 요도상열, 요도하열, 다낭성 신장(상염색체성 우성 및 상염색체성 열성), 유전성 신장염, 성 분화 장애, 성기발육 이상, 혼성 성기발육 이상, 반음양, 가성반음양, 칼만 증후군, 클린펠터 증후군, 고환 여성화, WAGR 증후군, 비뇨성기 종양, 남성 성기 종양(음경, 전립선, 고환), 비뇨기 종양(방광, 신장, 요관, 요도), 방광 질환(결석, 외번증, 누공, 방광질루, 목 폐쇄, 종양, 신경원성, 방광염, 방광요관 환류), 혈료, 혈색소뇨증, AIDS 관련 신장병증, 무뇨증, 빈뇨증, 당뇨병성 신장병증, 팬코니 증후군, 간신성 증후군, 수신증, 원발성 수산과잉뇨증, 신장 고혈압, 신장혈관 고혈압, 신장 결석, 신장 피질 괴사, 낭종성 긴장, 다낭 신장, 다낭 신장염(상염색체성 우성, 상염색체성 열성), 해면 신장, 신장 부전(신원발성 잠행성 당뇨병, 급성 신장 부전, 신장 유두상 괴사), 신장염(사구체신염(IGA, 막성증식성, 막성, 병소, 굿패스쳐 증후군, 루푸스 신장염), 유전성 신장염, 장 신장염, 발칸 신장병증, 신우신염, 황색육아종, 사구체신염, 신석회침착증, 신경화증, 신증, 지질신증, 신증 증후군, 신주위염), 신우염(신우방광염, 신우신증, 황색육아종성 신우신증), 신장 정맥 폐색, 신장 골이영양증, 세뇨관 수송의 선천성 하자, 세뇨관 산증, 신장 아미노산증, 시스틴뇨증, 하트넙병, 시스티노시스, 프란코니 증후군, 신성 당뇨증, 가족성 저인산혈액증, 안뇌신증 증후군, 가성저알도스테론증, 신장 결핵, 요독증, 용혈뇨 증후군, 베게너 그래뉼로마토시스, 젤베거 증후군, 단백뇨증, 알부민뇨증, 요관 질병(예컨대, 요관 결석, 요관 종양, 요관 폐쇄, 요관류), 요도 질병(예컨대, 요도상열, 요도 종양, 요도 폐쇄, 요도 협착증), 요도염(라이터 증후군), 뇨 결석(방광, 신장, 요관), 뇨 누공(방광루[방광질루]), 요관 감염(박테리아뇨, 농뇨, 빌하르쯔 주혈흡충증) 및 배뇨 장애(야뇨증, 다뇨증, 요실금, 스트레스 관련 요실금, 뇨 잔류)를 들 수 있다.
치료 또는 검측될 수 있는 여성 생식기 질환 및 임신 합병증의 예로는 부속기 질병(예컨대, 부속기염[난소염, 자궁주위염, 난관염]), 난관 질병(예컨대, 난관 종양 및 난관염), 난소 질환(무배란, 난소염, 난소 낭종, 다낭 난소 증후군, 미성숙 난소 부전, 난소 과잉자극 증후군, 난소 종양, 메이그 증후군), 부난소 낭종, 자궁내막증, 여성 성기 종양, 난소 종양, 자궁 종양, 경부 종양, 자궁내막 종양, 질 종양, 외음부 종양, 성기폐색증, 질유혈증, 자궁유혈증, 음부 포진, 여성 불임증, 월경 장애(예컨대, 무월경, 월경불순, 월경과다, 월경과소 및 월경전 증후군), 가성임신, 성기능 장애(예컨대, 성교불쾌증 및 불감증), 비뇨성기 결핵, 여성 성기 결핵, 비뇨성기 질병(예컨대, 방광 외번증, 요도상열, 다낭성 신장[상염색체성 우성 및 상염색체성 열성], 유전성 신장염), 성 분화 장애(예컨대, 성기 발육이상[46 XY, 혼성], 터너 증후군, 반음양, 가성반음양, 칼만 증후군, WAGR 증후군), 비뇨성기 종양, 비뇨기 종양(방광, 요관, 요도), 자궁 질병(예컨대, 자궁경부 질병[자궁경관염, 자궁경부 미란, 자궁경부 비대증, 무력경관, 자궁경부 종양], 자궁내막 과다형성, 자궁내막염, 자궁 출혈, 월경과다, 자궁루), 자궁 종양(예컨대, 자궁경부 종양 및 자궁내막 종양), 자궁 탈출증, 자궁 파열, 자궁 천공, 질 질병(예컨대, 외음질 칸디다증, 성교불쾌증, 질유혈증, 백대하, 질루, 직장질루, 방광질루, 질 종양, 질염[트리코모나스 질염, 박테리아성 질염, 외음질염]), 임신 합병증(예컨대, 습관성 유산), 무력경관, 불완전 유산, 계류 유산, 폐혈증 유산, 절박 유산, 수의학적 유산, 태아 치사, 배아 흡수, 태아 흡수, 태아 질병(융모양막염, 태아적아구증, 선천성 태아수종, 태아 알콜 증후군, 태아 산소결핍증, 태아 곤란, 태아 성장지연, 태아 대구증 및 태변 흡인), 임신 포진, 분만 합병증(예컨대, 태반 박리, 난산, 자궁 무력증, 태아 막의 조숙성 파열, 융모양막염, 태반 유착, 전치 태반, 분만후 출혈, 자궁 파열, 미숙아 분만, 양수과소증, 모의 페닐키톤뇨증), 태반 질병(예컨대, 태반 박리, 융모양막염, 태반 유착, 태반 유지, 태반 부전), 양수과다, 심혈관 임신 합병증, 양막 유체 색전증, 혈액 임신 합병증, 감염성 임신 합병증(패혈증 유산, 기생충성 임신 합병증, 산욕 감염), 종양 임신 합병증(영양막 종양, 융모암, 포충상 모반, 침윤성 포충상 모반, 태반 부위 영양막 종양), 자궁외 임신, 복강 임신, 난관 임신, 당뇨병증 하의 임신, 임신 당뇨병, 태아 대구증, 임신 결과(pregnancy outcome), 임신중독증(자간증, HELLP 증후군, 전방-자간증, EPH 임신중독증, 임신오조), 산욕 장애, 유즙 분비 장애(예컨대, 치아리-프롬멜 증후군, 유즙누설 및 유방염), 분만후 출혈 및 산욕 감염을 들 수 있다.
불임
상기 설명한 바와 같이, KGF-2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 변형, 항체, 작용물질 및/또는 길항물질은 남성 또는 여성 불임을 치료하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에 있어서는 남성 불임을 치료 및/또는 방지하는 데 KGF-2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 변형, 항체, 작용물질 및/또는 길항물질을 사용하는 방법이 제공된다. 또다른 실시양태에 있어서는 여성 불임을 치료 및/또는 방지하는 데 KGF-2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 변형, 항체, 작용물질 및/또는 길항물질을 사용하는 방법을 제공한다. 불임을 치료하기 위한 바람직한 KGF-2 폴리펩티드로는 KGF-2 Δ33, 충분한 길이 및 성숙 KGF-2, KGF-2 Δ28, 및 KGF-2의 아미노산 77∼208, 80∼208 및 93∼208을 포함하는 폴리펩티드 뿐만 아니라 본 명세서에 기술된 임의의 KGF-2 돌연변이를 들 수 있다. 또한, 이들 폴리펩티드를 암호화한 폴리뉴클레오티드도 바람직하다.
불임을 치료 또는 방지하기 위한, KGF-2의 바람직한 투여 방식으로는 경구, 직장, 비경구, 조내(intracisternally), 피부내, 질내, 복강내, 국부(산제, 연고, 겔, 크림, 액제 또는 경피 패치에 의해서와 같이), 협측, 또는 경구 또는 비강 분무를 들 수 있다. 다른 투여 방식은 본 명세서에 기술되어 있다. KGF-2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 변형, 항체, 작용물질 및/또는 길항물질은 약학 조성물의 일부로서 약학 담체와 함께 투여하는 것이 바람직하다. 적당한 담체는 본 명세서에 기술되어 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 변형, 항체, 작용물질 및/또는 길항물은 환경적 원인, 예컨대 커피, MSG, 성형술, 뉴트라스위트(Nutrasweet), 알콜, 식품 첨가제, 화공약품, 담배, 살충제, 자동차 배기 및 오염; 연령; 선천성 불임; 낮은 계수의 정자; 감염성 질병, 예컨대 멈프스(mumps), 결핵, 인플루엔자, 소두진(small pox), 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염, 클라미디아, 마이코플라즈마, 임질, 매독 및 다른 성적 전염 질병; 내분비성 질병, 예컨대 당뇨병; 신경학적 질병, 예컨대 대마비; 고열; 자궁내막증; 독소, 예컨대 페인트, 바니시 및 자동차 제조용 시약 중에 함유된 납, 산화에틸렌, 화학 및 재료 산업, 예컨대 제지 산업에서 발견되는 물질; 화학요법; 저체중 또는 과체중 손실; 비만증 또는 과체중 이득; 스트레스; 배란 장애; 호르몬 불균형, 쿠싱스 신드롬(Cushings Syndrome); 난관 붕쇄; 골반 감염; 외과술 유착; 자궁내 장치(IUD); 자궁경부 장애, 예컨대 해부학적 문제점, 자궁경부 감염 및 점액의 질(mucus quality); 자궁경부 협착증; 자궁 장애, 예컨대 자궁내 유착, 자궁내막 외상 및/또는 자궁내막 감염; 아서만 신드롬(Asherman's Syndrome), 자궁 유섬유증; 난소 반흔 조직; 초콜릿 낭종을 비롯한 난소 낭종; 아스테노스퍼미아(asthenospermia); 성숙 정지; 히포스퍼미아(hypospermia); 세로톨리 셀-신드롬(Sertoli Cell-syndrome); LH 및 FSH 분비에 손상을 가하는 확장된 뇌하수체 종양으로부터, 외과술 손상으로부터, 문맥 혈액 공급에 손해를 가하는 두개 외상으로부터 야기되는 것을 비롯한 고나도트로핀 결핍; 아나볼릭 스테로이드; 니코틴; 금지 약물, 예컨대 마리화나, 헤로인 및 코카인; 알칼리성 약물, 프로카르보진, 살충제에 사용되는 일부 할로겐화된 탄화수소 및 대량의 알콜에 대한 상습적 노출; 골반 염증성 질병(PID); 부고환염; 독성 물질 또는 위험, 예컨대 납, 카드뮴, 수은, 산화에틸렌, 염화비닐, 방사선 및 x선에 대한 노출; 궤양 또는 건선에 대한 처방 약물; 자궁내 DES 노출; 상승된 온도-열탕, 와류, 증기탕에 대한 남성 성기 노출; 허니아 치유; 늘어지지 않은 고환; 비타민 결핍; 사전 유산(prior abortions); 및 시클로포스파미드를 비롯하여 임의의 인자에 의해 야기되는 불임을 치료하는 데 사용할 수 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드, 폴리렙티드, 변형, 항체, 작용물질 및/또는 길항물질은 제1차적 불임 또는 제2차적 불임을 치료 또는 예방하는 데 사용할 수도 있다. 또한, KGF-2는 일시적 불임 또는 영구적 불임을 치료하는 데 사용할 수 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드, 폴피펩티드, 변형, 항체, 작용 물질 및/또는 길항물질은 다른 수정 촉진 물질, 예컨대 클로미핀 시트레이트(클로미드, 세로핀), 프로게스테론 및/또는 17β-에스트라디올과 함께 투여할 수 있다.
KGF-2는 자연 수태 동안 또는 보조 생식 동안 여성의 불임을 치료하는 데 사용할 수 있다. 보조 생식 기법으로는 생체외 수정(IVF), 배아 전이(ET), 생식자 난관내 전이(GIFT), 수정란 난관내 전이(ZIFT), 제공자의 난자, 제공자의 정자 및 제공자의 배아를 사용한 IVF, 그리고 난자 및 배아의 마이크로조작일 수 있다. IVF-ET에 있어서는 난모세포를 외과술로 제거하고, 생체외에서 수정한 다음, 동일 여성의 자궁 또는 난관에 배치한다. 난모세포 제공에서는 ET애서와 같이 난모세포를 제공자로부터 회수하고, 생체외에서 수정 후 이것을 불임 수용자에게 전이시킨다. 이러한 절차는 제공자와 수용자 사이에 동시성이 요구되는데, 이는 일반적으로 수용자에게 스테로이드 호르몬을 투여함으로써 달성된다. 표준적인 IVF-ET에 있어서, 복수개의 여포 성장을 유도하기 위해 실시한 처리는 불충분한 황체 기능을 유도하는 경우가 많다. 그러므로, 착상은 KGF-2와 같은 분자를 사용하는 보충 처리를 이용하지 않고서는 수행할 수 없다.
여성의 불임을 치료 또는 방지하기 위한 KGF-2의 한가지 바람직한 송달 방법은, 개시 내용이 본 명세서에 참고 인용되어 있는 미국 특허 제5,869,081호에 개시되어 있는 바와 같이, 질 링(vaginal ring)에 의한 서방형 방출 시스템을 통해 이루어진다.
폴리실록산 담체는 수유(lactating) 여성을 위한 피임법으로서 프로게스테론의 송달(Croxatto et al., 1991, in "Female Contraception and Male FertilityRegulation . Advances in Gynecological and Obstetric Research Series", Reinnebaum et al. eds.)과 폐경기후 여성에 있어 에스트라디올의 송달[(Stumpf et al., 1982, J. Clin. Endocrinol. Metab., 58:208)과 (Simon et al., 1986, Fertility and Sterility, 46:619)에는 기능적으로 비생식선(agonadal)의 여성에 있어서 자궁내막 프라이밍(priming)을 위한 17β-에스트라디올 및/또는 프로게스테론-포화된 폴리실록산 질 링 및 실리더가 개시되어 있다]에 사용되고 있다. 이 링 및 실린더 시스템은 전체 월경 주기에 있어 정상 범위 내에 속하는 17β-에스트라디올 및 프로게스테론의 혈청 수준을 달성시키는 데 사용되었다. 미국 특허 제4,816,257호에는 기능적으로 비생식선의 사람 여성에 있어서 정상 스테로이드 호르몬 수준을 모방하는 17β-에스트라디올 또는 17β-에스트라디올 및 프로게스테론을 함유하는 폴리실록산 링의 용도가 개시되어 있다.
본 발명은 임신의 달성 및 유지를 위해 KGF-2를 투여하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 KGF-2를 함유하는 담체를 여성의 질 내로 삽입하는 단계 및 상기 담체를 질 내에서 약 1∼28일 동안 유지하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시양태에 있어서, 상기 담체는 생체외 방출 속도가 약 1 ㎕/일 내지 1000 mg/일인 폴리실록산 링이고, 한편 이러한 양은 치료적 판단 재량에 속한다.
또한, 본 발명의 방법은 보조 생식의 치료를 받고 있는 여성에 있어서 불임을 치료 또는 방지하는 데 이용할 수 있다. 이 방법은 KGF-2를 함유하는 담체를 여성의 질 내로 삽입하는 단계 및 임신 7주 내지 12주까지 상기 담체를 질 내에서 유지하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시양태에 있어서, 상기 담체는 생체외 방출속도가 약 1 ㎕/일 내지 1000 mg/일 KGF-2인 폴리실록산 링이다.
본 발명은 기능하는 난소를 지닌 여성에게, 그리고 기능적으로 비생식선 여성에게 KGF-2를 투여하기 위한 방법에 관한 것이다. 불임인 여성 또는 파트너가 불임이기 때문에 피임할 수 없는, 기능하는 난소를 지닌 여성은 보조 생식 기법을 통해 임신할 수 있다. 그러나, 복수개의 여포 성장을 유도하는 데 이용되는 호르몬 치료는 황체에 의해 프로게스테론의 불충분한 생성을 발생시킨다. 따라서, 착상의 개시 및 유지가 손상된다. 기능적으로 비생식선의 여성은 미발달되거나 부적절하게 발달된 난소, 난소의 외과술 제거, 또는 다른 난소의 부전 또는 기능부전의 결과로서 생긴 불임이다. OD, IVF 및 ET와 같은 보조 생식 기법은 기능적으로 비생식선의 여성이 임신 가능하게 해준다. 그러나, 이러한 보조 생식 기법에는 임신의 달성 및 유지를 위한 자궁내막을 갖추기 위해 호르몬 보충 기법이 반드시 필요하다.
따라서, 본 발명에 있어서, KGF-2는, 특히 배아 착상의 촉진을 통해 불임을 치료 또는 방지하는 데 사용할 수 있다. 본 발명은 정상 생식선의 사람 여성 및 기능적으로 비생식선의 사람 여성에 있어서 보조 생식 기법에 의한 임신의 달성 및 유지를 위해 KGF-2를 투여하는 방법을 제공한다. 이 방법은 정상 생식선의 사람 여성 또는 기능적으로 비생식선의 사람 여성의 질 내로 KGF-2 함유 담체를 삽입하는 단계 및 상기 담체를 질 내에서 적어도 약 28일 동안 유지하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 보조 생식 치료를 받고 있는 사람 여성을 위한 호르몬 대체 치료 방법을 제공한다. 이 방법은 보조 생식 치료를 받고 있는 사람 여성의 질 내로 KGF-2 함유 담체를 삽입하는 단계 및 상기 담체를 질 내에서 임신 약 7주 내지12주 까지 유지하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에 유용한 생리학적으로 허용 가능한 KGF-2 함유 담체는 실리콘 고무(또는 본 명세서에서 폴리실록산이라고 칭하기도 함) 또는 다른 적당한 물질로 제조된 링 모양의 고형 담체인 것이 바람직하다. 폴리실록산 질 링에 의한 스테로이드 호르몬의 송달은 해당 기술 분야에 공지되어 있다. 폴리실록산 링으로부터 KGF-2의 방출 속도는 링의 표면적을 비롯한 인자에 의존한다. 따라서, 링 내의 KGF-2의 양은 링으로부터 방출되는 KGF-2의 생체외 방출 속도의 용어로 용이하게 기술된다. 생체외 방출 속도는 호르몬 함유 폴리실록산을 특성화시키는 데 있어 해당 기술 분야에서 통상으로 이용된다. 생체외 방출 속도가 1 일 당 약 0.001 mg 내지 약 1000 mg인 KGF-2 함유 폴리실록산 링은 본 발명의 방법에 유용한 것으로 고려된다. 바람직한 실시양태에 있어서, 폴리실록산 링은 생체외 방출 속도가 1 일 당 KGF-2 약 0.1 mg 내지 약 100 mg이다. 가장 바람직한 실시양태에 있어서, 폴리실록산 링은 생체외 방출 속도가 1 일 당 KGF-2 약 0.1 mg 내지 약 10 mg이다.
KGF-2 함유 폴리실록산 담체는 질 내로 삽입함으로써 투여된다. 이 링은 질 내에 삽입되어 자궁경부 근방에 위치한다. 링은 여성 환자에 의해 통상적으로 사용된 횡격막의 것과 유사한 방식으로 삽입되고 제거될 수 있으므로, 본 발명의 또다른 이점을 제공한다.
KGF-2 함유 담체는 배아 전이 이전 약 2일 내지 7일, 바람직하게는 3일에 투여할 수 있고, 다른 호르몬 투여, 예를 들면 17β-에스트라디올 또는 프로게스테론의 경구 투여에 의해 보충될 수 있다. 바람직한 실시양태에 있어서, 담체는 링이고, 배아 전이 이전 3일에 삽입한다. 담체는 약 28일 후에 제거하고 또다른 담체로 대체한다. 임신이 일어나는 경우, 담체는 황체 태반 이동까지 임신 유지를 위해 KGF-2가 충분해야 하는데, 이 때 투여는 불연속적으로 행해질 수 있다. 바람직한 실시양태에 있어서, 링은 질 내에 계속적으로 유지하고, 투여는 임신 약 12주에 중단한다.
상해, 직업적 질병
KGF-2는 다양한 조직의 증식을 자극하는 것으로 나타났다. 따라서, KGF-2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 작용제 및/또는 길항제가 상해 또는 직업적 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.
치료 및 진단가능한 상해, 직업적 질병 및 중독증의 예로는 다음과 같다: 농업 노농자의 질병과 같은 직업병, 농부의 폐 및 실로 필로(silo filler's) 질병, 조류 애호가의 폐, 직업적 피부염, 고압 신경 증후군, 불활성 가스 혼수, 실험실 감염, 석면폐증과 같은 진폐증, 베릴륨중독, 면폐증, 카플란스 증후군, 철침착증, 탄규폐증 및 실리카결핵증과 같은 규폐증, 알코올 중독증과 같은 중독증, 예를 들면 알코올 중독, 예컨대, 알코올성 심근병증, 태아 알코올 증후군, 알코올성 지방간, 알코올성 간염, 알코올성 간경변증, 알코올성 신경병, 예를 들면 알코올성 건만증, 알코올성 금단 섬망, 은중독, 교상 및 자상, 예를 들면 거미교자증, 곤충 교상 및 자상, 뱀 교상, 진드기 중독증, 예를 들면 진드기 마비증, 카드뮴 중독, 사염화탄소 중독, 약물 중독, 예를 들면 약물 유도된 정좌불능, 약물 발진, 예를 들면 독성 표피 융해증, 결전성 홍반 및 혈청병, 약물 유도된 이상운동증 및 신경성악성 증후군, 맥각중독, 불소 중독, 식중독, 예를 들면 보툴리누스 중독, 짐두중독증, 버섯 중독증, 살모넬라 식중독 및 스타필로코쿠스 식중독, 가스 중독, 예를 들면 일산화탄소 중독, 불활성 가스 마취, 독성 간염, 납중독, 수은 중독, 곰팡이중독, 예를 들면 맥각중독 및 버섯 중독, 과투여, 식물 중독, 예를 들면 맥각중독, 짐두중독증, 라티리즘 및 우유병, 물질-유도된 신경병, 상처 및 상해, 예를 들면 복부 상해, 예를 들면 외상성 횡격막 탈장, 비장 파열, 예를 들면 비증, 위장 파열, 외상성 절단, 팔 상해, 예를 들면 앞팔 상해, 예를 들면 반경 골절 및 자뼈 골절, 상관 골절, 어깨 전위, 어깨 골절, 테니스 엘보우 및 손목 상해, 질식, 운동성 상해, 압력상해, 예를 들면 폭풍 혼상 및 잠함병, 출산 상해, 예를 들면 산과 마비, 교상 및 자상, 예를 들면 인간 교상, 화상, 예를 들면 화학적 화상, 전기적 화상, 흡입성 화상, 예를 들면 연기 흡입 상해, 눈 화상 및 일광화상, 좌상, 전위, 예를 들면 엉덩이 및 어깨 전위, 익사, 예를 들면 근 익사, 전기 화상 및 빛 상해, 식도 천공, 진단적 및 치료적 물질의 유출, 외체, 예를 들면 위석, 인공 안체, 외체 이동, 외체 반응, 예를 들면 외체 육아종, 골절, 예를 들면 대퇴 골절 예를 들면 엉덩이 골절, 예를 들면 대퇴목 골절, 폐색 골절, 분쇄 골절, 미통일된 골절, 개방 골절, 자발적 골절, 스트레스 골절, 비통일된 골절, 예를 들면 가관절 상완 골절, 반경 골절, 예를 들면 콜 골절, 늑골 골절, 어깨 골절, 두개골 골절, 예를 들면 턱골절, 예를 들면 하악골 및 상악골 골절, 안와골절 및 협골 골절, 척추 골절, 경골 골절, 적골 골절, 예를 들면 몬테기아 골절, 동상, 예를 들면 동창, 손 상해, 예를 들면 손가락 상해, 머리 상해, 예를 들면, 뇌상해, 예를 들면, 뇌진탕,뇌척수액 이루, 뇌척수액 비루, 폐색된 머리 상해, 악안면 상해, 예를 들면 안면 상해, 예를 들면 눈 상해, 예를 들면 눈 화상, 눈 외체 및 천공성 눈 상해, 턱 골절, 예를 들면 하악 및 상악 골절, 하악골 상해, 예를 들면 하악골 골절 및 협골 골절, 상악 골절, 기뇌, 두개골 골절, 예를 들면 턱 골절, 예를 들면 하악 및 상악 골절, 안와 골절 및 협골 골절, 열탈진, 예를 들면 일사병, 다리 상해, 예를 들면, 발목 상해, 대퇴골절, 예를 들면 엉덩이 골절, 예를 들면 대퇴목 골절, 발 상해, 엉덩이 전위, 무릎 상해 및 경골 골절, 운동병, 예를 들면 공간 이동병, 다발성 외상, 방사선 상해, 예를 들면 방사선-유도된 비정상, 방사선-유도된 백혈병, 방사선-유도된 종양, 방사선골괴사, 실험실 방사선 상해, 방사선 폐렴 및 방사선 피부염, 역기복증, 파열, 예를 들면 대동맥 파열, 비장 파열, 예를 들면 비증, 위장 파열, 자궁 파열, 예를 들면 자궁 천공, 자기절단, 외상성 쇼크, 예를 들면 분쇄 증후군, 연조직 상해, 척추 상해, 예를 들면 척추 압박, 척추 상해, 예를 들면 척추 골절 및 편타성 상해, 염좌 및 긴장, 예를 들면, 반복성 긴장 상해, 건세포 상해, 흉곽 상해, 예를 들면 동요 흉부, 심장 상해 및 늑골 골절, 치상해, 예를 들면 치골절, 예를 들면 균열 치증후군, 치탈구, 고실막 천공, 상해 감염, 비천공성 상해, 예를 들면 뇌진탕 및 폐색된 머리 상해 및 천공성 상해, 예를 들면 천공성 눈 상해, 총상 및 자창, 예를 들면 바늘 상해를 포함한다.
혈액 및 림프 질환
KGF-2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 작용제 및/또는 길항제는 혈액 및 림프 질환을 치료 및/또는 검색하는데 사용될 수 있다.
치료 및 검색할 수 있는 혈액 및 림프 질환의 예는 다음을 포함한다: 무형성 빈혈(예, 판코니아 빈혈), 용혈성 빈혈(예, 자가면역 용혈성 빈혈 및 선천성 용혈성 빈혈, 예를 들면 선천성 적혈구이형성 빈혈, 선천성 비구상적혈구성 용혈성 빈혈, 겸상적혈구성 빈혈, 예를 들면 헤모글로빈 SC 질환 및 겸상적혈구성 특징, 유전성 타원구성 및 글루코스포스페이트 탈수소효소 결핍, 예를 들면 잠두중독증, 헤모글로빈 C 질환, 유전성 구형적혈구증, 탈라세미아, 예를 들면 알파-탈라세미아, 예컨대, 태아수증 및 베타-탈라세미아,잠두중독증, 헤모글로빈뇨증, 예를 들면 발작성 헤모글로빈뇨증 및 용혈성-요독성 증후군), 혈색소감소증 빈혈(예, 철결핍 빈혈), 대적혈구성 빈혈(예, 거대적아구성 빈혈, 예를 들면 악성 빈혈), 골수종성 빈혈, 신생아 빈혈(예, 태아-태아 수혈 및 태아-모체 수혈), 불응성 빈혈(예, 과모세포 불응성 빈혈), 철적모구성 빈혈, 적혈구계무형성증, 태아적모구증(예, 태아수증 및 핵황달), Rh 면역화, 무베타지단백혈증, 무감마글로블린혈증, 이상감마글로블린혈증(예, IgA 결핍 및 IgG 결핍), 고감마글로블린혈증(예, 양성 단일클론 감마병증), 고단백질혈증, 파라프로테인혈증(예, 아밀로이드증, 예를 들면 아밀로이드 신경증 및 뇌아밀로이드 조영술, 한성글로블린혈증, 중쇄 질병, 예를 들면 면역증식성 소장 질환, 다발성 골수증, POEMS 증후군, 발덴스트롬 대글로블린혈증), 단백질 S 결핍증.
치료 및 검색가능한 혈액 및 림프 질환의 또다른 실시예는 다음을 포함한다: 골수 질환, 예를 들면 무형성 빈혈, 골수이형성 증후군(예, 불응성 빈혈, 예를 들면 모세포 과다 불응성 빈혈, 찰적모구성 빈혈, 발작성 헤모글로빈뇨증 및 골수종백혈증), 골수증식 질환(예, 골수병성 빈혈, 급성 적모구성 백혈병, 유백혈성 반응, 골수섬유증, 골수양화생, 진성적혈구증가증, 출혈성혈소판혈증 및 혈소판증가증), 혈관내 적혈구 응괴, 혈색소병증, 예를 들면 겸상적혈구성 빈혈(예를 들면 헤모글로빈 SC 질환 및 겸상적혈구성 특징), 헤모글로빈 SC 질환, 탈라세미아(알파-탈라세미아 포함, 예를 들면 태아수증 및 베타 탈라세미아), 출혈성 소질, 예를 들면 아브리노지네미아, 크리스마스병, 파종성 혈관내 응고, 인자 VII 결핍, 인자 XI 결핍, 인자 XII 결핍, 인자 XIII 결핍, 혈우병, 저프로트롬빈혈증(인자 V 결핍 및 인자 X 결핍 포함), 스와츠만 현상, 버나르도-술리에 증후군, 용혈성 요독 증후군, 혈소판 저장 풀 결핍, 혈소판무력증, 용혈성 혈소판감소증(혈소판감소증 자반병 포함, 예를 들면 특발성 혈소판감소증 자반병, 혈전성 혈소판감소증 자반병 및 위스코트-알드리히 증후군 포함), 과글로블린형성 자반병, 쇤라인-헤노흐 자반병, 혈소판감소증 자반병(특발성 혈소판감소증 자반병), 트롬보혈소판감소증 자반병, 위스코트-알드리히 증후군, 유전성 혈전성 모세혈관확장, 비타민 K 결핍(신생아의 출혈성 질환 포함) 및 본 빌브란드병, 백혈구 질환, 예를 들면 호산구증가(호산구증가 혈림프관 증식, 호산구증가성-근육통 증후군, 호산구성 육아종 및 과호산구혈성 증후군, 예를 들면 폐호산구증가), 전염성 단핵구증, 백혈구증가증(유백혈성 반응 및 림프구증가증), 백혈구감소증(무과립증, 예를 들면 호중구감소증 및 림프구감소증, 예를 들면 특발성 CD4-양성 T-림프구감소증 포함), 펠거-후엣 이상, 식세포 박테리아성 기능부전(케디악-히가시 증후군, 만성 육아종병, 잡 증후군 포함), 메트헤모글로빈혈증, 범혈구감소증, 다혈구증, 혈액성 전백혈병 및 설프헤모글로빈혈증.
치료 및 진단가능한 혈액 및 림프 질환의 추가적 예는 다음을 포함한다: 림프절염(캐트-스크래치 질환 및 장간막 림프절염 포함), 림프관확장증, 림프관염, 림프부종(상피증 및 필라리아 상피증), 림포셀, 림프증식성 질환(무감마글로블린혈증, 아밀로이드증, 예를 들면 아밀로이드 신경병 및 뇌유전분혈관증, 거대 림프절 과형성, 중쇄질환, 예를 들면 면역증식성 소장 질환, 면역아세포성 림프선병증, 전염성 단핵구종, 모발상세포 백혈병, 림프성 백혈병, 골수종 백혈병(급성 무림프성 백혈병 및 급성 골수종 백혈병 포함), 림프관근종(림프관근종증 포함), 및 림프종(호드킨병, 비호드킨 림프종, 예를 들면 B-세포 림프종, 버키트 림프종, AIDS-관련 림프종, 점막-결합된 림프성 조직 림프종 및 소형 세포 림프종, 범발성 림프종, 예를 들면 범발성 대형 림프종, 면역아세포성 대형 세포 림프종, 림프아세포성 림프종, 범발성 혼합된 세포 림프종, 소형 림프성 림프종, 및 소형 비결합된 세포 림프종, 여포성 림프종, 예를 들면, 여포성 대형-세포 림프종, 여포성 혼합된 세포 림프종 및 여포성 소형 절단된 세포 림프종, 고등급 림프종, 예를 들면 면역아세포성 대형 세포 림프종, 림프아세포성 림프종, 및 소형 비절단된 세포 림프종, 예를 들면 버키트 림프종, 중간등급 림프종, 예를 들면 범발성 대형 세포 림프종, 여포성 대형 세포 림프종, 범발성 혼합-세포 림프종 및 범발성 소형 절단-세포 림프종, 대형 림프종, 예를 들면 범발성 대형 림프종, 여포성 대형 세포 림프종, 면역아세포성 대형 세포 림프종, Ki-1 대형세포 림프종 및 면역아세포성 대형 세포 림프종, 저등급 림프종, 예를 들면 여포성 혼합된 세포 림프종, 점막-결합된 림프성 조직, 여포성 소형 절단된 세포 림프종, 및 소형 림프구성 림프종, 혼합된 세포 림프종,예를 들면 범발성 혼합된 세포 림프종 및 여포성 혼합된 세포 림프종, 여포성 소형 절단된 세포 림프종, 소형 림프구성 림프종, 및 소형 비절단된 세포 림프종, t-세포 림프종, 예를 들면 림프아세포성 림프종, 피부성 T-세포 림프종, 예를 들면 Ki-1 대형-세포 림프종, 균상식육종 및 세자리(Sezary) 증후군 및 말초 T-세포 림프종, 비분화된 림프종, 예를 들면 범발성 대형-세포 림프종 및 소형 비절단된 세포 림프종, 예를 들면 버키트 림프종, 림프종양 육아종증), 마렉병, 유육종증(폐형유육종증 및 포도막이하선열 포함), 종양 용해성 증후군, 점막피부성 림프절 증후군, 세망내피증(고쉬병, 조직구증, 예를 들면 악성 조직구성 질병, 즉, 악성 조직구증 포함, 급성 단세포성 백혈병, 대형 림프종, 예를 들면 Ki-1 대형 세포 림프종, 랑게르한스-세포 조직구증, 예를 들면 호산구성 과립구, 한드-쉘러-크리스티안 증후군 및 레터러-시웨병, 비-랑겔한스-세로 조직구증, 예를 들면 시너스 조직구증, 니에만-픽병, 시-블루 조직구 증후군 및 연소성 황색육아종, 비만세포성 육종), 비장병(고비장증, 골수양화생, 비경색증, 비장이상증식, 비장파열, 예를 들면 비증, 비종대 및 비장결핵), 흉선과증식, 흉선종양, 림프절 결핵, 예를 들면 킹스 에빌.
종양성 질환 및 이상증
KGF-2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 작용제 및/또는 길항제는 종양성 질환 및/또는 이상증을 치료, 예방 및/또는 검색하는데 사용할 수 있다.
치료 또는 검색가능한 종양성 질환 및 이상증의 예는 다음과 같다: 약물-유도성 이상증, 다발성 이상증, 예를 들면 알라길 증후군, 안젤만 증후군, 기저세포 모반 증후군, 벡위드-비데만 증후군, 블룸 증후군, 본네비-울리히 증후군, 콕카인증후군, 크리-듀-샤 증후군, 드 랑지 증후군, 다운 증후군, 외배엽형성장애, 예를 들면 엘리스-반 크레벨드 증후군 및 국소진피형성부전증, 가드너 증후군, 전전뇌증, 색소실조증, 로렌스-문 비들 증후군, 마판 증후군, 손톱-무릎 증후군, 눈뇌신증후군, 오로파시오디지털 증후군, 프라더-윌리 증후군, 프로테우스 증후군, 프룬 벨리 증후군, 선천성 풍진 증후군, 루벤스테인-타이비 증후군, 짧은 늑골-폴리닥틸릴 증후군, 와덴버그 증후군, 울프만 증후군, 젤베저 증후군, 방사선-유도된 이상성, 염색체 이상, 예를 들면 안젤만 증후군, 벡위드-비데만, 크리-듀-샤 증후군, 다운 증후군, 전전뇌증, 프라더-윌리 증후군, 성염색체 이상, 예를 들면 본네비-울리히 증후군, 진피형성부전증, 예를 들면 국소 진피형성부전증, 연약한 X 증후군, 46, XY 생식선발생장애, 혼합된 생식선발생장애, 칼만 증후군, 클리펠터 증후군, 눈뇌신증후군, 터너 증후군, 및 XYY 카리오타입 및 소화계 이상.
호흡기 질환
KGF-2는 호흡기도의 세포의 증식을 자극하였다. 따라서, KGF-2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 작용제 및/또는 길항제는 호흡기 질환을 치료 및/또는 검색하는데 사용될 수 있다.
치료 또는 검색가능한 호흡기도 질병의 예는 기관지 질환, 예를 들면 천식(운동-유도성 천식 및 천식지속상태 포함) 기관지 누공, 기관지 고반응성, 기관지 종양, 기관지 경련, 기관지확증, 기관지염(세기관지염 포낭, 기관지폐렴, 기관기관지거대증 포함), 섬모 운동성 질병, 예를 들면 카르타제너 증후군, 후두 질환(예, 후두육아종, 후두부종, 후두종양, 후두연골막염, 후두경련, 후두염, 예를 들면 크루프, 후두협착, 후두결핵, 음성 마비, 음성 질환, 예를 들면 실성증 및 애성), 폐질환, 예를 들면 무기폐, 예를 들면 중간엽 증후군, 기관지폐 형성장애, 폐의 선천성 낭포성 선양기형, 낭포성 섬유증, 폐 형질성 세포육종, 객혈, 폐농양, 진균성 폐질환, 예를 들면 알레르기성 기관지폐 아스페르길로증 및 뉴모시스티스 카리니 폐렴, 기질간 폐 질환, 예를 들면 외인성 알레르기성 폐포염, 예를 들면 새 애호가의 폐, 농부의 폐, 굿패스추어 증후군, 랑게르한스-세포 조직구증, 진폐증, 예를 들면 석면증, 베릴륨증, 내과면폐증, 카플란병, 철침착증, 규폐증, 예를 들면 탄규폐증 및 규폐결핵증, 폐섬유증, 방사선 폐렴, 폐유육종증, 베게너 육아종), 폐쇄성 폐질환, 바이러스 기관지염, 폐기종, 기생충 폐질환, 예를 들면 폐포낭충증, 폐조양, 예를 들면 기관지성 암종, 폐동전형 변경 및 판코아스트 증후군, 메토니움 흡인, 폐렴(예, 기관지폐렴, 흉막폐렴, 흡인 폐렴, 예를 들면 지질폐렴, 박테리아성 폐렴, 예를 들면 결핵대엽성 폐렴, 미코플라스마 폐렴, 리켓차폐렴 및 스타필로코코스 폐렴, 뉴모시스티스 카르니 폐렴, 바이러스 폐렴), 폐 폐포성 단백증, 폐부종, 폐색전증, 폐호산구증가증, 폐정맥폐쇄증, 호흡곤란증, 예를 들면 유리질막병, 성인호흡곤란증, 스키미타 증후군, 실로 필러병, 폐결핵, 예를 들면 규폐결핵증; 비강병, 예를 들면 후비공폐쇄증, 비출혈, 악성 중심성 선 육아종, 비폐색, 비폴립, 후천성비강기형, 비강종양, 예를 들면 비강 폴립, 부비동종양, 예를 들면 상악동 종양, 사골동염, 전두동염, 안면동 및 접형동염과 같은 동염, 고초열, 통년성 알레르기성비염, 위축성비염 및 혈관운동성비염, 비경화증과 같은 비염).
치료 및/또는 진단가능한 호흡기 질환은 다음과 같다: 흉막 질환, 예를 들면유미흉, 흉막축농증(예, 결핵성 축농증), 혈기흉증, 혈흉, 저폐흉증, 저흉증, 흉막삼출, 예를 들면 악성 흉막삼출, 흉막종양, 예를 들면 악성 흉막삼출, 흉막염, 예를 들면 흉막폐렴, 폐흉, 흉막결핵, 예를 들면 결핵성축농증, 호흡기 장애, 예를 들면 무호흡, 예를 들면 수면 무호흡, 예를 들면 픽위키안병, 체인-스트록 호흡, 기침, 호흡곤란, 예를 들면 발작성 호흡곤란, 애청, 과호흡, 예를 들면 호흡성 알칼리증, 후두경련, 태변성호흡, 구강호흡, 호흡곤란증, 예를 들면 유리질막병, 성인호흡곤란병, 호흡결핍, 예를 들면 호흡산증, 기공폐색, 예를 들면 비강폐색, 후두경련성육아종균, 한타바이러스 폐증후군, 저호흡, 내인성 양성-압력 호흡 및 호흡성 마비, 호흡성 고감증, 예를 들면 외인성 알레르기성 폐포염, 예를 들면 조류 애호가의 폐 및 농부의 폐, 알레르기성 기관지폐 아스페르길로증, 천식, 예를 들면 운동-유도성 천식 및 천식지속상태, 고초열, 통년 알레르기성 비염, 호흡계 이상, 예를 들면 기관지낭종, 기관지폐분리증, 후비공폐쇄, 폐의 선천성 낭종선양 이상형성, 카르타게너병, 스키미타병, 기관기관지확대증, 호흡기관루, 예를 들면 기관지루, 예컨대 기관식도루), 호흡관 전염(예, 기관지염, 예를 들면 바이러스 기관지염과 같은 기관지염, 일반적 감기, 흉막축농증, 예를 들면 결핵성축농증, 인플루엔자, 후두염, 예를 들면 후두개염, 레기오넬라증병, 예를 들면 레기오나리증, 폐농증, 흉막염, 예를 들면 흉막폐렴, 폐렴, 예를 들면 기관지폐렴, 흉막폐렴, 호흡폐렴, 예를 들면 지질폐렴, 박테리아페렴, 예를 들면 엽성 폐렴, 미코플라스마 폐렴, 리켓차 폐렴 및 스타필로코쿠스 폐렴, 뉴모시스티스 카리니 폐렴, 바이러스 폐렴, 비염, 비경화증, 부비동염, 예를 들면 사골동염, 전두동염, 상악동염 및 접형동염,편도염, 예를 들면 편도주위농염, 기관염, 후두성 결핵, 흉막결핵, 예를 들면 결핵성 축농증, 폐결핵, 예를 들면 규폐결핵증, 백일해, 호흡관종양, 예를 들면 기관지 종양, 후두종양, 폐종양, 예를 들면 기관지원암, 폐 동정형 병변 및 판코우스트병, 비강종양, 예를 들면 비강폴립, 부비동 종양, 예를 들면 상악동종양, 흉막종양, 예를 들면 악성 흉막 삼출, 기관종양, 기관질환, 예를 들면 기관종양, 기관협착, 기관염, 기관기관지비대증 및 기관식도누출공.
치료 및 진단가능한 이비인후과적 질환의 예는 다음과 같다: 섬모운동성 장애, 예를 들면 카르타게너병, 귀병, 예를 들면 중이진주종, 후천성이형성이상, 이종양, 이통, 청력질환, 예를 들면 난청, 돌발성 난청, 부분난청, 예를 들면 양쪽 난청, 유도성 난청, 기능성 난청, 고음파 난청, 감각신경난청, 예를 들면 중추난청, 소음-유도된 난청 및 노인성난청, 음량동원, 이명, 귀대상포진, 미로질환, 예를 들면, 달팽이관병, 내림프수종, 예를들면 메니어병, 미로염, 베스티불라병, 예를 들면 운동병, 예를 들면 공간운동병, 현기증, 이염, 예를 들면 외이도염, 중이도염, 예를 들면 유양돌기염, 삼출성중이염 및 화농성중이염, 이경화증, 후미로병, 예를 들면 청신경병, 예를 들면 청신경종, 예를 들면 신경섬유종증 2, 중추청각병, 예를 들면, 청각인식병 및 중추난청, 고실막 천공), 후두병, 예를 들면 후두육종, 후두부종, 후두종양, 후두연골막염, 후두경련, 후두염, 예를 들면 크루프, 후두협착, 후두결핵, 음성 마비, 음성 질환, 예를 들면 실성증 및 애성, 비강병(예를 들면 후비공폐쇄증, 비출혈, 악성 중심성 선 육아종, 비폐색, 비폴립, 후천성비강기형, 비강종양, 예를 들면 비강 폴립, 부비동종양, 예를 들면 상악동 종양, 사골동염, 예를 들면, 사골종양, 예를 들면 상악종 종양, 부비동염, 안면동 및 접형동염과 같은 동염, 고초열, 통년성 알레르기성비염, 위축성비염 및 혈관운동성비염, 비경화증과 같은 비염), 이비인후과성 종양, 예를 들면 이종양, 후두종양, 청신경종, 예를 들면 신경섬유종증 2, 비강종양, 예를 들면 비강폴립, 부비동종양, 에를 들면 상악동종양, 인두종양, 예를 들면 저인두성종양, 비인두성 종양, 구인두성종양, 예를 들면 편도성종양, 인두염, 역인두농, 편도염 및 벨로인드결핍증.
신경병
KGF-2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 작용제 및/또는 길항제는 신경병을 치료 및/또는 검색하는데 사용될 수 있다.
치료 및/또는 진단할 수 있는 신경병의 예는 다음과 같다: 뇌질환(대사성 뇌질환, 예를 들면 페닐케토뉴리아, 예를 들면 모성 페닐케토뉴리아, 피루베이트 카르복실라아제 결핍, 피루베이트 탈수소효소 복합체 결핍, 베르닉케 뇌질환, 뇌부종, 뇌종양, 예를 들면 대뇌종양, 예를 들면 천막하종양, 뇌실종양, 예를 들면 맥락막신경종양, 시상하부종양, 천막상종양, 카나반병, 소뇌병, 예를 들면 소쇠성운동실조, 예컨대, 척수소뇌변성, 예컨대 혈관확장성운동실조증, 소뇌근실조, 프리에데릭 운동실조, 마카도-조셉병, 올리브교소뇌위축, 소뇌종양, 예컨대 천막하 종양, 범발성 뇌경화증, 예를 들면 축삭주위뇌염, 구성체 백질이영양증, 이염성백질이영양증 및 아급성경화성번뇌염, 뇌혈관질환(예, 경동맥병, 예컨대 경동맥혈전증, 경동맥협착 및 미야모야병, 대뇌아밀로이드혈관병증, 뇌동맥류, 뇌무산소증, 뇌동맥경화증, 뇌동정맥 이상형성, 뇌동맥증, 뇌색전증 및 혈전증, 예를 들면 경동맥혈전증, 동혈전증 및 발렌버그병, 뇌출혈, 예를 들면 경막외혈종, 경막하혈종 및 거미막하출혈, 뇌골절, 뇌허혈, 예를 들면, 일과성뇌허혈, 쇄골하동맥도류증후군 및 처척추골뇌저동맥기전증, 혈관성치매, 예를 들면 치매, 뇌실주위백색연화증, 관상두통, 예를 들면 군집두통, 편두통, 치매, 예를 들면 AIDS 치매 복합증, 초로성 치매, 예컨대 알츠하이머병 및 크루츠펠트-자콥병, 노인성치매, 예를 들면 알츠하이머병 및 진행성상핵마비, 혈관성 치매, 예를 들면 치매, 뇌염, 예를 들면 축삭주위뇌염, 바이러스 뇌염, 예컨대 유행성뇌염, 일본뇌염, 세인트루이스뇌염, 진드기매개성뇌염 및 웨스트 나일 열병, 급성 파종성 뇌척수염, 수막뇌염, 예컨대 포도막수막뇌염증, 뇌염후 파킨슨병 및 아급성 경화성 범뇌염, 뇌연화증, 예컨대 뇌실주위백색연화증, 간질, 예컨대 일반적 간질, 예를 들면 유아성 경련, 부재 간질, 근간대성 간질, 예컨대 MERRF 증후군, 긴장성-간대성 간질, 부분적 간질, 예를 들면 복합성 부분 간질, 전두엽 간질 및 관자엽 간질, 후외상성 간질, 간질지속상태, 예를 들면 지속성 부분적 간질, 할러보든-스파츠 증후군, 수두증, 예컨대 단디-워커 증후군 및 일반압력 수두증, 시상하부질환, 예컨대 시상하부 종양, 뇌말라리아, 수면발작, 예컨대 탈력발작, 연수성회색척수염, 대뇌가종양, 레트(Rett) 증후군, 레이(Reye's) 증후군, 시상질환, 뇌 톡소플라스마종, 두개내결핵종 및 젤베거 증후군, 중추신경계 감염, 예컨대 AIDS 치매성 콤플렉스, 뇌농양, 경막하충농증, 뇌척수염, 예컨대 에퀸 뇌척수염, 베네주엘라 에퀸 뇌척수염, 괴사출혈성뇌척수염, 비스나, 뇌말라리아, 수막염, 예를 들면 거미막염, 무균성 뇌막염, 예를 들면 바이러스 뇌막염, 예컨대 림프구성 맥락수막염, 박테리아 수막염, 예를 들면 헤모필러스수막염, 리스테리아 수막염, 수막염구균수막염, 예를 들면 워터하우스-프리데릭센 증후군, 폐렴구균 수막염 및 수막염성 결핵종, 진균성수막염 예를 들면 크립토코쿠스성 수막염, 경막하 삼출, 수막성뇌염, 예를 들면 포도막수막뇌염 증후군, 척수염 예를 들면 횡단성 척수염, 신경매독, 예를 들면 척수로, 폴리오척수염, 예를 들면 연수성 폴리오척수염 및 후폴리오척수염 증후군, 프리온병(예, 크루츠펠트-자콥병, 보빈 스폰지형 뇌장애, 제스트만-스트라우슬러 증후군, 크루, 스크라피), 뇌 톡소플라스마증, 중추신경계 종향, 예를 들면 뇌종양, 예컨대 소뇌종양, 예를 들면 천막하종양, 뇌실종양, 예를 들면 맥락막신경종양, 시상하부종양 및 천막상종양, 수막종양, 척수종양, 예를 들면 경막외종양, 탈수초성 질환, 예를 들면 카나반병, 범발성 뇌경화증, 예를 들면 부신백질이영양증, 축삭주위성뇌염, 구상세포 백질이영양증, 범발성뇌경화증, 예컨대 이염질성 백질이영양증, 알레르기성 뇌척수염, 괴사성 출혈성 뇌척수염, 진행성 다중점백질이영양증, 다발성경화증, 중추교수초용해증, 횡단성 척수염, 안신경척수염, 스크라피, 스웨이백, 만성피로증후군, 비스나, 고압신경증, 수막증, 척수병, 예를 들면 선천성근무력증, 근위축성 외측경화증, 척수근 위축, 예를 들면 베르드니그-호프만병, 척수 압착, 척수종양, 예를 들면 경막외종양, 척수공동증, 척수로, 스티프-만 증후군, 정신지체, 예컨대 안겔만 증후군, 크리-듀-샤 증후군, 드 레인지 증후군, 다운 증후군, 강글리오시도스, 예를 들면 강글리오시도스 G(M1), 산드호프병, 타이-사크병, 하트넙병, 호모시스티뉴리아, 로렌스-문-비들 증후군, 레쉬-니한 증후군, 메이플시럽 유린 증후군, 뮤코리피드증, 예를 들면 퓨코사이드축적증, 신경성 세로이드-리포퓨시노시스, 안뇌신증, 페닐케토뉴리아, 예를 들면 모성 페닐케토뉴리아, 프라더-윌리 증후군, 레트 증후군, 루빈스테인-타이비 증후군, 결절경화증, WAGR 증후군, 신경계 이상, 예를 들면 완전전죄증, 신경관 결손, 예를 들면 무뇌증, 예를 들면 무뇌수두증, 아놀드-카이리 형성장애, 뇌장애, 수막류, 수막척수류, 척추 유합부전, 예를 들면 낭상척추피열 및 잠재척추피열, 유전성 운동감각 신경증, 예를 들면 샤콧-마리병, 유전성 안위축, 레프섬병, 유전성 경련대마비, 워디니그-호프만병, 유전성 감각 및 자율신경증, 예를 들면 선천성무통증 및 가족형 자율신경이상증, 신경성 증상(예, 거스트만 증후군과 같은 인지불능, 건망증, 예를 들면 역행성건망증, 실행증, 신경원방광, 탈력발작, 청각 이상과 같은 의사소통 장애, 예를 들면, 청각장애, 부분 청각장애, 음량동원 및 이명, 언어 장애, 예를 들면 실어증, 불면증, 명칭실어증, 브로카실어증 및 베닉크 실어증, 실독증, 예를 들면 후천성 실독증, 예를 들면 언어발달장애, 발어장애, 예를 들면 실어증, 예를 들면 명칭실어증, 브로카실어증 및 베닉크 실어증, 구음장애, 대화소통 장애, 예를 들면 발어장애, 예를 들면 눌어증, 반향언어증, 무언증 및 말더듬증, 음성장애, 예를 들면 무음성증,및 애성, 소뇌제거상태, 섬망, 속상수축, 환각, 수막증, 운동장애, 예를 들면 안겔만 증후군, 운동실조, 무정위운동, 무도병, 이긴장증, 운동저하증, 근이완, 간대성근경련, 틱, 사경 및 진전, 근수축, 예를 들면 근긴장, 예를 들면 스티프-만 증후군, 근유경력증, 마비, 예를 들면 안면마비, 예를 들면 귀대상포진, 위마비, 편마비, 안근마비, 예를 들면 복시, 두안증후군, 호너증후군, 만성진행성외안근마비, 예를 들면 컨스증후군, 연수마비, 열대성 경련대부전마비, 마비, 예를 들면 브라운-시콰드 증후군, 사지마비, 호흡마비 및 음성마비, 부전마비, 유령사지, 미각장애, 예를 들면 미각소실 및 미각장애, 시각장애, 예를 들면 약시, 맹각, 색맹, 복시, 반맹증, 암점 및 정상하 시각, 수면장애, 예컨대, 과면증, 클레닌-레빈 증후군, 불면증 및 몽유병, 경련, 예를 들면 개구장애, 무감각, 예를 들면 혼수, 계속적 식물 상태 및 실신 및 현기증, 신경근육질환, 예를 들면 선천성근무증, 근위축성 축상 경화증, 람버트-이튼 근무력증, 운동신경병 근위축증, 예를 들면 척수근위축증, 샤코트-마리병 및 베르디니그-호프만병, 후폴리오척수염 증후군, 근육이영양증, 그레이브 근무력증, 위축성근긴장증, 선천성근긴장증, 소간강체근증, 가족형 주기적 마비증, 다발성 근간대경련, 열대성 경련대부전마비 및 스티프-만 증후군, 말초신경계병, 예를 들면 선단통, 아밀로이드 신경병, 자율신경계병, 예를 들면 아디 증후군, 바레-리우 증후군, 가족성 자율신경이상증, 호너 증후군, 반사교감신경이영양증, 샤이-드라거 증후군, 두방신경병, 예를 들면 청신경병, 예를 들면 청신경종, 예를 들면 신경신경종증 2, 안면신경병, 예를 들면 안면신경통, 멜커슨-로센탈 증후군, 시각운동장애, 예를 들면 약시, 안진, 동안신경마비, 안근마비, 예를 들면 두안 증후군, 호너증후군, 만성 진행성외부안근마비, 예를 들면 컨스 증후군, 사시, 예를 들면 내사시 및 외사시, 동안신경마비, 안신경병, 예를 들면 안위축, 예를 들면 유전성 안위축, 안디스크 드러슨, 안신경염, 예를 들면 시각신경수초염, 유두부종, 삼중신경통, 음성마비, 탈수초성 질환, 예를 들면 안신경수초증 및 스웨이백, 당뇨성 신경증, 예를 들면 당뇨성 발, 신경 압박증후군, 예를 들면 수근관증후군, 족근골관증후군, 흉곽출구증후군, 경늑골증후군, 척골신경압박증후군, 신경통, 예를 들면 작열통, 경완신경통, 안면신경통 및 삼배신경통, 신경염, 예를 들면 실험적 알레르기성 신경염, 시신경염, 다발성신경염, 다발성신경근염 및 신경근염, 예컨대 다발성신경근염, 유전성운동 및 감각신경병, 예를 들면 샤르콧-마리병, 유전성 안위축, 레프섬병, 유전성경련대부전마비 및 베드니그-호프만병, 유전성 감각 및 자율신경증, 예를 들면 선천성 통각과민 및 가족성 자율신경이상증, POEMS 증후군, 좌골신경통, 미각성 발한 및 테타니).
대사성 및 내분비계 질환
KGF-2 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 작용제 및/또는 길항제는 대사성 또는 내분비계 질환을 치료 및/또는 진단하는데 유용할 수 있다.
치료 또는 진단가능한 영양 및 대사성 질환의 예는 다음과 같다: 염산결핍증, 산-염기 불균형, 산증(젖산성, 신튜블성 또는 호흡성 포함), 당뇨성케토산증, 케톤증, 알칼리증, 호흡성 알칼리증, 칼슘대사성 시소더스(sisorders), 석회증, 저항성칼슘형성, CREST 증후군, 신석회증, 병적 탈칼슘화, 과칼슘혈증, 저칼슘혈증, 테타니, 골연화증, 가저부갑상선혈증, 리켓, 당뇨성 인시피더스(ihsipidus), 신원당뇨성 인시피더스, 울프람 증후군, 당뇨 멜리터스(실험 및 인슐린-의존성, 지방위축성, 비-인슐린-의존성 포함), 당뇨성 혈관병, 당뇨성 발, 당뇨성 위장관, 태아 대구증, 글루코스 내성, 글리코스리아, 신글리코스리아, 과혈당증, 과지질혈증, 과콜레스테롤혈증, 과리포프로틴혈증, 과트리글리세리드혈증, 과프로락틴혈증, 과비타민A혈증, 저혈당증, 인슐린혼수, 흡수장애증(블라인드 루프 증후군, 셀리악병, 락토스 내성, 장의 지질영양장애, 트로피칼 스프루 포함), 대사의 선천성 장애(아미노산 대사의 선천성 장애, 안구 알비노증, 안피부성 알비노증, 피부얼룩증), 알캅토뉴리아, 조직흑변증, 신아미노산뇨증, 시스틴뇨증, 하트넙병, 호모시스틴뇨증, 메이플시럽뇨병, 다발성 카르복실라제 결핍, 페닐케톤뇨증, 모성 페닐케토뉴리아, 아밀로이드증, 아밀로이드신경증, 뇌아밀로이드 혈관증, 탄화수소 대사의 선천성 장애, 예컨대 프룩토즈 대사의 선천성 장애(프룩토즈-1,6-디포스파타제 결핍, 프룩토즈 내성), 갈라토세미아, 글루코즈 내성, 글리코겐 저장병(유형 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII), 과옥살뇨증, 1차 과옥살뇨증, 만노시스증, 뮤코폴리사카라이드증(I,II,III,VI,VII), 다발성 카르복실라아제 결핍, 피루베이트 대사의 선천성 장애, 레이병, 피루베이트 카르복실라아제 결핍, 피루베이트 탈수소효소 착물 결핍, 글루코스포스페이트 디하이드로지나제 결핍,유전성 과빌리루빈혈증, 크리글러-나자르 증후군, 길버트병, 만성 특발성 황달, 지질 대사의 선천성 장애, 예를 들면 과리포프로틴혈증(가족형, 유형 III, IV, V), 가족형 리포프로틴 리파아제 결핍, 저리포프로틴혈증(무베타리포프로틴혈증, 저베타리포프로틴혈증, 레시틴 아실전이효소 결핍, 탄지어병), 리포이드증(콜레스테롤 에스테르 저장병, 리포이드프로틴증, 신경성 세로이드-리포푸시노증, 레프섬병, 소그렌-라손 증후군, 스핑고리피드증(부신백질이영양증, 파브리병, 강글리오시드증, 산드호프병, 타이-사쉬병, 고쉬병, 구상 세포 백질이영양증, 이염성 백질이영양증, 니에만-픽병, 시-블루 조직구 증후군, 울만병, 미토콘드리아성 근증, 미토콘드리아성 뇌심근증, MELAS 증후군, MERRF 증후군, 외부 만성 진행성 안근마비, 리소좀 저장병, 예를 들면 콜레스테롤 에스테르 저장병, 만노스증, 뮤코리피드증, 푸코사이드축적증, 뮤코폴리사카라이드증(I,II, III, IV, VI 및 VII), 금속 대사의 선천성 장애, 헤모크로마토시스, 헤파토렌티클 저하, 저포스파테이스증, 가족형 저포스파테이스증, 킨키모 증후군, 가족형 주기성 마비, 및 가저파라티로이드증, 뮤코리피드증, 푸코사이드축적증, 포피리아(적혈구열성, 적혈구조혈성, 간성, 급성 간헐성, 큐타니아 타르다), 퓨린-피리미딘 대사의 선천성 장애, 예를 들면 고우트, 고우트성 관절염 및 레쉬-니한 증후군, 신튜블 이동의 선천성 장애, 예를 들면 신튜블 산증, 신아미노산증, 시스틴뇨증, 하트넙병, 시스틴뇨증, 판코니 증후군, 신글리코스뇨증, 가족형 저포스페이트혈증, 안뇌신증 증후군 및 가저알도스테론혈증, 인대사장애, 저포스페이트혈증, 단백질-결핍 장질환, 장의 림프관확장증, 및 수-전해액 불균형(탈수, 과칼슘혈증, 하이퍼칼레미아, 과나트륨혈증, 저칼슘혈증, 저나트륨혈증, 부적절 adh 증후군, 수독성), 황색종증, 울만병, 유아 영양 장애, 예를 들면 유년기 영양 장애, 결핍성 장애, 예를 들면 무비타민혈증, 아스코르브산 결핍증, 괴혈병, 비타민 A 결핍, 비타민 B 결핍, 콜린 결핍, 엽산 결핍, 펠라그라, 피리독신 결핍, 리보플라빈 결핍, 티아민 결핍, 베리베리, 워닉 뇌질환, 비타민 B12결핍(빈혈, 악성), 비타민 D 결핍, (골연화증, 지방조직염), 비타민 E 결핍(지방조직염), 비타민 K 결핍, 마그네슘 결핍, 칼륨 결핍, 단백질 결핍(단백질-에너지 영양장애, 크와쉬오르코르), 스웨이백, 당뇨성 비만, 병적 비만, 픽위키안 증후군, 프라더-윌리 증후군, 및 기아.
치료 또는 진단가능한 내분비성 질환의 예는 다음과 같다: 부신질환(피질 병, 노르텍스 종양), 부신 과기능(쿠싱 증후군, 과알도스테론혈증, 바터병), 부신저기능(아디손병, 부신백질이영양증, 저알도스테론혈증), 부신선종양, 부신피질 종양, 선천성 부신과증식, 워터하우스-프리데릭슨 증후군, 가슴 종양, 남성 가슴 종양, 가슴의 섬유낭포성 질환, 여성형유방증, 락테이트화 장애, 예를 들면 키아리-프롬멜 증후군 및 갈라토리아, 유선염, 보위 유선염, 당뇨병(실험성, 인슐린-의존성, 울프람 증후군, 리포축소성, 및 비인슐린-의존성), 당뇨성 혈관병, 당뇨성 발, 당뇨성 망막증, 당뇨성 혼수, 고혈당고삼투성 비케톤성 혼수, 당뇨성 케톤증, 당뇨성 발과 연관된 당뇨성 신증, 당뇨성 비만, 위장관 당뇨병, 태아 대구증, 왜소발육증(콕카인 증후군, 뇌하수체성, 치명적 형성장애), 내분비선 종양, 예를 들면 부신피질 종양, 다발성 내분비성 종양(유형 1, 2a, 2b), 종양성 내분비유사 증후군, ACTH 증후군(전위성), 졸링거-엘리슨 증후군, 난소 종양, 메이그 증후군, 부갑상선 종양, 뇌하수체 종양, 넬슨 증후군, 고환 종양, 흉선 종양, 갑상선 종양, 갑상선괴, 성선장애, 예를 들면 부신과증식(선천성), 여성화, 고환 여성화, 과안드로겐혈증, 저성선증, 환관증, 칼만 증후군, 크린펠터 증후군, 난소 장애, 예를 들면 무배란증, 난소염, 난소 포낭, 다중포낭성 난소 증후군, 비성숙 난소 부전, 난소 과자극성 증후군, 난소 종양, 메이그 증후군, 지연 성숙 및 조숙 성숙증, 성분화 장애, 예를 들면 성선 기능부전(46, XY, 혼합형) 및 터너 증후군, 반음양, 가반응양, 갈만 증후군, 클린펠턴 증후군, 고환 여성화, 고환병, 예를 들면 잠재고환증, 고환염, 고환종양, 남성증, 남성형다모증, 고인슐린혈증, 종양성 내분비유형 증후군, 예를 들면 ACTH 증후군(전외성) 및 졸링거-엘리슨 증후군, 부갑상선병, 예를 들면 과부갑상선증(2차), 신성골이영양증, 저부갑상선증, 테타니, 부갑상선 종양, 뇌하수체병, 엠티 셀라 증후군, 과뇌하수체증, 말단거대증, 거인증, 저뇌하수체증(당뇨성 인시피더스, 종양당뇨성 인시피더스, 울프만 증후군, 뇌하수체성 왜소발육증), 부적절한 ADH 증후군, 뇌하수체성 중풍, 뇌하수체종양, 넬슨 증후군, 자가면역 다발성내분비증, 프로제리아, 베너 증후군, 흉선 과증식, 흉선병, 예를 들면 유티로이드 식 증훈군, 고이터(풍토성, 절형, 흉골하, 그라브스병), 그라브병과 관련된 과갑상선증, 과티록신증, 저갑상선증(크레티니즘 및 믹세데마), 갑상선 호르몬 내성 증후군, 갑상선 종양, 갑상선괴, 갑상선염(자가면역, 아급성, 화농성), 갑상선중독증, 갑상선중독발증 및 내분비성 폐렴.
세포성 수준의 질병
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 및 KGF-2의 작용제 또는 길항제에 의하여 치료 또는 진단할 수 있는 세포유도사(apoptosis)의 억제 또는 세포 생존 증가와 관련된 질병에는 암[예를 들어, 소포 림프종, p53 돌연변이를 갖는 암종, 및 호르몬-의존성 종양 등이 있으며, 이에는 예를 들어, 결장암, 심장 종양, 췌장암, 흑색종, 망막 세포종, 교모세포종, 폐암, 장암, 고환암, 위암, 신경세포종, 점액종, 근종, 림프종, 내피종, 골모세포종, 파골세포종, 골원성육종, 연골육종, 선종, 유방암, 전립선암, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma) 및 난소암 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아님]; 자가면역 장애[예를 들어, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군(Sjogren' syndrome), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 담즙성 간경변, 베세트 증후군(Behcet's disease), 크론병(Crohn's disease), 다발성근염, 전신성 루프스 홍반염 및 면역-관련 사구체신염 및 류마티스 관절염] 및 바이러스감염(예를 들어, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스 및 아데노바이러스), 염증, 숙주에 대한 이식편 질환, 급성 이식편 거부 반응 및 만성 이식편 거부 반응 등이 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 본 발명의 KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및/또는 길항제를 사용하여 상기 특히 열거한 질병 중 암의 성장, 진행 및/또는 전이를 억제한다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용제 또는 길항제에 의하여 검출하거나 치료할 수 있는 질병으로서, 셀 생존 증가와 관련된 추가의 질병 또는 증상에는 악성 종양의 진행 및/또는 전이 및 관련 장애, 예를 들어, 백혈병[예를 들어, 급성 백혈병, 예컨대, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병(골수모세포성, 전골수세포성, 골수단핵세포성, 단구성 및 적백혈병 등) 및 만성 백혈병, 예컨대, 만성 척수낭종 (과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병 등], 진성 적혈구 증가증, 림프종[예를 들어, 호즈킨병(Hodgkin's disease) 및 비-호즈킨병(non-Hodgkin's disease)], 다발성 골수종, 발덴스트룀 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄병(heavy chain disease), 및 고형 종양(solid tumor), 예를 들어, 육종 및 암종, 예를 들어, 섬유 육종, 점액 육종, 지방 육종, 연골 육종, 골원성 육종, 척삭종, 맥관 육종, 내피 육종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종, 활막종, 중피종, 유윙종(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근 육종, 결장암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평상피암, 기저세포암, 선암, 땀샘 암종, 기름샘 암종, 유두암, 유두상선암종, 낭선암종, 수양암, 기관지암, 신세포암, 간암, 담관 암종, 융모막 암종, 정상피종, 태생기암,윌름 종양(Wilm's tumor), 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종(small cell lung carcinoma), 방광 암좀, 상피암종, 교종, 성상세포종, 수아세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 혈관종(menangioma), 흑색종, 신경모세포종 및 망막세포종 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 및 KGF-2의 작용제 또는 길항제에 의하여 검출하거나 치료할 수 있는 질병으로서, 세포 유도사 증가와 관련된 질병에는 AIDS; 신경변성 장애[예를 들어, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 색소성 망막염(Retinitis pigmentosa), 소뇌 변성(Cerebellar degeneration) 및 뇌종양 또는 상기 관련 종양]; 자가면역 장애[예를 들어, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 담즙성 간경변, 베세트 증후군(Behcet's disease), 크론병(Crohn's disease), 다발성근염, 전신성 홍반성 루푸스 및 및 면역-관련 사구체신염 및 류마티스 관절염], 골수이형성 증후군(예를 들어, 재생불량성 빈혈), 숙주에 대한 이식편 질병, 허혈성 손상[예를 들어, 심근 경색증, 뇌졸중 및 재관류 손상에 의하여 유발되는 것], 간 손상[예를 들어, 간염 관련 간 손상, 허혈/재관류 손상, 담즙울체(cholestosis)(담관 손상) 및 간암]; 독소-유발 간질환(예를 들어, 알콜에 의해서 유발된 것), 폐혈성 쇼크, 악액질 및 거식증 등이 있다.
상처 치료 및 상피 세포 증식
본 발명의 다른 양상에 따라, 치료 목적으로, 예를 들어 상처 치료를 위하여 상피 세포 증식과 기저 케라티노사이트를 자극하기 위하여, 그리고 모발 소포 생산과 진피 상처 치유를 촉진하기 위하여, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트를 이용하는 방법이 제공된다. KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 수술 상처, 절개 상처, 진피와 표피의 손상에 관련되는 깊은 상처, 눈 조직 상처, 치아 조직 상처, 구강 상처, 당뇨성 궤양, 진피 궤양, 팔꿈치 궤양, 동맥 궤양, 정맥 울혈 궤양, 열 노출 또는 화학 물질에 의한 화상, 및 기타 요독증, 영양실조, 비타민 결핍증 및 스테로이드, 방사선 치료 및 종양 억제제 및 항대사제의 전신성 치료와 관련된 합병증과 같은 비정상적 상처 치유 상태를 포함하는 상처 치유를 자극하는데 임상적으로 유용할 수도 있다. KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 진피 손실에 이어지는 진피 재확립을 증진시키기 위해 이용될 수 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 상처 베드에의 피부 이식편의 부착을 증가시키고 상처 베드로부터 재상피화를 자극하기 위해 이용될 수 있다. 하기는 KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트가 상처 베드에의 부착을 증가시키기 위해 이용될 수 있는 이식편의 유형이다: 자가이식편, 인공 피부, 동종이계 이식편, 자가 식피, 자가표피 이식편, 무혈관 이식편, 블레어-브라운 이식편, 뼈 이식편, 브레포플라스틱(brephoplastic) 이식편, 진피 이식편, 지연된 이식편, 식피,표피 이식편, 근막 이식편, 전층 피부 이식편, 이종성 이식편, 이종 이식편, 상동성 이식편, 이상증식(hyperplastic) 이식편, 표층 이식편, 메쉬(mesh) 이식편, 점막 이식편, 올리에르-티에르쉬 이식편, 대망 이식편, 패치 이식편, 경상 이식편, 전층 이식편, 부분층 식피, 및 두꺼운 파열 이식편. KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 또한 피부 강도를 증진시키고 노화 피부의 외관을 개선시키기 위해 이용될 수 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 또한 간세포 증식, 및 폐, 가슴, 췌장, 위, 소장 및 대장에서 상피 세포 증식의 변화를 일으킬 것이다. KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 세보사이트(sebocyte), 모발 포낭, 간세포, 타입 II 폐세포, 뮤신 생산 배상 세포 및 기타 상피 세포와 같은 상피 세포, 그리고 피부, 폐, 간 및 위장간내에 함유된 그 전구 세포들의 증식을 증진시킬 수 있다. KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 내피 세포, 케라티노사이트, 및 기저 케라티노사이트의 증식을 증진시킬 수도 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 또한 방사선, 화학치료 또는 바이러스 감염에 기인하는 소화관 독성의 부작용을 감소시키기 위해 이용될 수 있다. KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 소장 점막에 대해 세포보호 효과를 가질 수도 있다. KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 또한 화학 치료와 바이러스 감염에서 기인하는 점막염(입 궤양)의 치유를 촉진할 수도 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 추가로 화상을 포함하는 전층 및 부분층 피부 결함에서 피부의 완전한 재생(예, 모발 소포, 땀샘 및 피지선의 재증식), 건선과 같은 다른 피부 결함의 치료에 이용될 수 있다. KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 기저에 놓인 진피에 표피가 잘 부착하지 못하여 빈번한 개방되고 고통스러운 물집을 일으키는 수포성 표피박리증의 병변의 재상피화를 가속화시켜 치료하는 데 이용될 수 있다. KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 또한 위와 십이지장 궤양을 치료하고 점막 벽의 흉터 형성과 선형 점막과 십이지장 점막 벽의 재생을 빠르게 하여 치료를 돕는다. 크론병 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환은 각각 소장 또는 대장의 점막 표면의 파괴로 귀결되는 질병이다. 따라서, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 더욱 빠른 치유를 돕고 염증성 장 질환의 진전을 막기 위해 점막 표면의 재표면화를 증진시키기 위해 이용될 수 있다. KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트를 이용한 치료는 위장관 전체를 통한 점막의 생성에 중요한 효과를 가질 것으로 기대되며, 소화되거나 수술후의 상처성 물질로부터 장 점막을 보호하기 위해 이용될 수 있다. KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 KGF-2 저발현 관련 질병을 치료하기 위해 이용될 수 있다.
더욱이, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 다양한 병리학적 상태에 기인하는 폐 손상을 방지하고 치료하기 위해 이용될 수 있다. KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트와 같은 성장 인자는 증식과 분화를 촉진하고, 포상 및 세기관지 상피의 손상 회복을 증진시켜 급성 또는 만성 폐 손상을 방지하거나 치료한다. 예를 들어, 포상의 점진적인 손실로 귀결되는 기종, 및 연기 흡입 및 화상으로 인해 발생하며 세기관지 상피와 포상의 괴사를 야기하는 흡입 손상은 KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트를 이용하여 효과적으로 치료될 수 있다. 또한, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 타입 II 폐세포의 증식과 분화를 자극하여 미숙 유아에서의 유리질 막 질병(예,유아 호흡곤란 증후군 및 기관지폐 형성장애)과 같은 질병의 치료 또는 예방을 도울 수도 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 간세포의 증식과 분화를 자극하여 간경변에 의해 야기되는 급성 간 부전, 바이러스성 간염과 독성 물질(아세타미노펜, 사염화탄소 및 기타 간독소)에 의한 간 손상과 같은 병리와 간 질환을 완화시키거나 치료하는 데 이용될 수 있다.
더욱이, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 당뇨병 개시를 치료하거나 방지하기 위해 이용될 수 있다. 새로 진단된 타입 I과 II 당뇨병(이 경우, 일부 소도 세포 기능은 남아 있음)을 가진 환자에서, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 소도 기능을 유지하여 질병의 영구적 징후를 완화시키거나 지연시키거나 또는 방지하기 위해 이용될 수 있다. 또한, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 소도 세포 기능을 개선하거나 증진시키기 위하여 소도 세포 이식에서 보조제로 이용될 수도 있다.
감염성 질병
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 감염성 제제를 치료하거나 검출하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 증가시켜, 특히 B 및/또는 T 세포의 증식 및 분화를 증가시켜, 감염성 질병을 치료할 수도 있다. 면역 반응은 기존의 면역 반응을 증가시키거나 또는 새로운 면역 반응을 시작하여 증가될 수 있다. 다른 한편으로는, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 면역 반응을 일으킬 필요없이 직접 감염성 제제를 저해할 수도 있다.
바이러스는 KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트에 의해 치료되거나 검출될 수 있는 질병 또는 증상을 야기할 수 있는 감염성 제제의 예이다. 바이러스의 예는 하기의 DNA 및 RNA 바이러스 군을 포함하며 이에 한정되지 않는다: 아르보바이러스, 아데노바이러스과, 아레나바이러스과, 알테리바이러스, 비르나바이러스과, 버니아바이러스과, 칼리시바이러스과, 설코바이러스과, 코로나바이러스과, 플라비바이러스과, 헤파드나바이러스과(헤파티티스), 허피스바이러스과(사이토메갈로바이러스, 허피스 심플렉스, 허피스조스터), 모노네가바이러스(예, 파라믹소바이러스과, 모르빌리바이러스, 랍도바이러스과), 오르소믹소바이러스과(예, 인플루엔자), 파포바바이러스과, 파보바이러스과, 피코르나바이러스과, 폭스바이러스과(스몰폭스 또는 백시니아), 레오바이러스과(예, 로타바이러스), 레트로바이러스과(HTLV-I, HTLV-II, 렌티바이러스), 및 토가바이러스과(예, 루비바이러스). 이들 군에 속하는 바이러스는 하기를 포함하며 이에 한정되지 않는 다양한 질병 또는 증상을 야기할 수 있다:관절염, 기관지염, 뇌염, 눈 감염(예, 결막염, 각막염), 만성 피로 증후군, 간염(A,B,C,E, 만성 활성, 델타), 수막염, 통성 감염(예, AIDS), 결핵, 버키트 림포마, 수두, 출혈열, 홍역, 유행성 이하선염, 파라인플루엔자, 광견병, 감기, 폴리오, 백혈병, 루벨라, 성적으로 감염되는 질병, 피부병(예, 카포시, 사마귀), 및 바이러스혈증. KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 이들 증상 또는 질병을 치료 또는 검출하기 위해 이용될 수 있다.
유사하게, 질환 또는 증상을 야기할 수 있으며 KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용제 또는 길항제에 의해 치료 또는 검출될 수 있는 박테리아 또는 곰팡이 병원체는 비제한적으로 하기의 그람-음성 및 그람-양성 박테리아과 및 곰팡이를 포함한다: 방선균(예, 코리네박테륨, 마이코박테륨, 노르카디아), 아스페르길로시스, 바실라세아에(예, 탄저, 클로스트리듐), 박테로이다세아에, 블라스토마이코시스, 보르데텔라, 보르렐리아, 브루셀로시스, 칸디디아시스, 캄필로박터, 코시디오이도마이코시스, 크립토코코시스, 더마토시코세스, 엔테로박테이라세아에(클레브시엘라, 살모넬라, 세라티아, 예르시니아), 에리시펠로트릭스,헬리코박터, 레기오넬로시스, 렙토스피로시스, 리스테리아, 마이코플라스마탈레스, 나이세리아세아에(예, 아시네토박터, 고노르헤아, 메니고콕칼), 파스퇴렐라세아 감염(예, 안티노바실러스, 헤아모필러스, 파스퇴렐라), 슈도모나스, 리케치아세아에, 클라미디아세아에, 시필리스, 및 스타필로콕칼. 이들 박테리아 또는 곰팡이과는 다음과 같은 질병 또는 증상을 일으킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다: 균혈종, 심내막염, 눈 감염(결막염, 결핵, 포도막염), 치은염, 기회 감염(예, AIDS 관련 감염), 손발톱 주위염, 인공삽입물-관련 감염, 라이터병(Reiter's Disease), 기도 감염, 예를 들어, 백일해 또는 축농증, 패혈증, 라임 질환(Lyme Disease), 고양이-할퀴기 병(Cat-Scratch Disease), 이질, 파라장티프스, 식중독, 장티푸스, 폐렴, 임질, 수막염, 클라미디아(Chlamydia), 매독, 디프테리아, 나병, 파라결핵, 결핵, 루푸스, 보툴리누스중독, 괴저, 파상풍, 농가진, 류마티스성 열, 성홍열, 성적 전파 질환, 피부 질환[예, 봉와직염, 더마토사이코스(dermatocycoses)], 중독증, 요로 감염증, 창상 감염증. KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용제 또는 길항제는 이들 증상 또는 질환 중 임의의 것을 검출 또는 치료하는데 사용할 수 있다.
또한, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용제 또는 길항제에 의하여 검출되거나 치료될 수 있는 질병 또는 증상을 유발하는 기생충 병원체로는 아메비아시스, 바베시오시스, 콕시디오시스, 크립토스포리디오시스, 디엔타모에비아시스, 듀린, 엑토파라시틱, 기아르디아시스, 헬민티아시스, 레이슈마니아시스, 타일레리아시스, 톡소플라스모시스, 트립파노소미아시스 및 트리코모나스등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 기생충은 옴, 쓰쓰가무시병, 눈 감염, 장 질환(예, 이질, 편모충증), 간 질환, 폐 질환, 기회 감염(예, AIDS 관련), 말라리아, 임신 합병증, 및 톡소플라스마증 등을 비롯한 다양한 질병 또는 증상을 유발할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용제 또는 길항제는 이들 증상 또는 질환 중 임의의 것을 검출하거나 치료하는데 사용할 수 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용제 또는 길항제를 사용한 치료는 KGF-2 폴리펩티드 유효량을 환자에게 투여하거나, 또는 환자로부터 세포를 제거하고, KGF-2 폴리뉴클레오티드를 그 세포에 공급한 후, 그 조작된 세포를 환자에게 돌려보내는 것(예, 생체내 치료)이 바람직할 것이다. 또한, KGF-2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 백신 중의 항원으로 사용함으로써 감염증에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
재생
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용제 또는 길항제를 사용하여 세포를 분화, 증식 및 유인하여 조직의 재생을 유도할 수 있다(Science 276:59-87(1997) 참조). 조직 재생을 이용하여 선천적 결함, 외상(창상, 화상, 절개 또는 궤양), 노화, 질병[예, 골다공증, 골관절염(asteocarthritis), 치주 질환, 간 기능부전(liver failure)], 성형 수술을 비롯한 수술, 섬유증, 재관류 손상 또는 전신성 사이토카인 손상에 의하여 손상된 조직을 회복, 치환 또는 보호할 수 있다.
본 발명을 이용해서 재생시킬 수 있는 조직으로는 기관(예, 췌장, 간, 장, 신장, 피부, 내피), 근육 조직(평활근, 골격근 또는 심근), 맥관 조직(혈관 및 림프관 포함), 신경 조직, 조혈 조직 및 골격 조직(뼈, 연골, 건 및 인대) 등이 있다. 재생은 반흔 없이 또는 반흔을 감소시키면서 일어나는 것이 바람직하다. 재생은 혈관 신생(angiogenesis)도 포함할 수 있다.
또한, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용제 또는 길항제는 치료하기 어려운 조직 재생을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 건/인대 재생을 향상시킴으로써 손상 후 재생 시간을 단축시킬 수 있다. 본 발명의 KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용제 또는 길항제는 손상을 피하기 위한 예방 목적으로도 사용할 수 있다. 치료할 수 있는 특정 질병으로는 건염, 수근관 증후군, 기타 건 또는 인대 결함 등이 있다. 악성 창상(non-healing wound)의 조직 재생의 다른 예로는 궤양, 심혈관 기능부전 관련 궤양, 수술 창상 및 외상성 창상 등이 있다.
유사하게, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용제 또는 길항제를 사용하여 신경 세포를 증식 및 분화시킴으로써 신경 조직 및 뇌 조직을 재생시킬 수 있다. 이러한 방법을 사용하여 치료할 수 있는 질병으로는 중추 신경계 및 말초 신경계 질병, 신경병증 또는 기계적 및 외상성 장애[예, 척수 장애, 두부 외상, 뇌혈관성 질환 및 스토크(stoke)] 등이 있다. 특히, 말초신경 손상, 말초 신경병(예, 화학치료 또는 기타 의학적 치료로 인한 것), 국소 신경병, 및 중추신경계 질환[예, 알츠하이머병(Alzheimer's disease),파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅톤병 (Huntington's disease), 근위축성 측삭 경화증 및 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager syndrome)]과 관련한 질병은 모두 KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용제 또는 길항제를 사용하여 치료할 수 있다.
화학 주성
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용제 또는 길항제는 화학 주성 활성을 가질 수 있다. 화학 주성 분자는 세포[예, 단핵구, 섬유아세포, 호중구, T-세포, 비만 세포(mast cell), 호산구, 상피 및/또는 내피 세포]를 특정 신체 부위, 예를 들어, 염증 부위, 감염 부위 또는 과증식 부위로 유인 또는 가동화시킨다. 그 후, 가동화된 세포는 특정 외상 또는 이상과 싸우고/싸우거나 이를 치료할 수 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용제 또는 길항제는 특정 세포의 화학 주성 활성을 향상시킬 수 있다. 그 후, 이러한 화학 주성 분자를 사용하여 신체의 특정 위치의 표적화 세포수를 증가시킴으로써 염증, 감염, 과증식 장애 또는 기타 면역계 장애를 치료할 수 있다. 예를 들어, 화학 주성 분자를 사용하여 손상 부위에 면역 세포를 유도함으로써 창상 및 조직에 대한 기타 외상을 치료할 수 있다. 화학 주성 분자로서, KGF-2는 또한 창상을 치료하는데 사용할 수 있는 섬유아세포를 유도할 수 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용제 또는 길항제가 화학 주성 활성을 억제할 수 있다는 것도 고려된다. 이들 분자를 사용하여 또한 장애들을 치료할 수 있다. 그래서, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 작용제 또는 길항제를 화학 주성 억제제로 사용할 수 있다.
결합 활성
KGF-2 폴리펩티드를 사용하여 KGF-2에 결합하는 분자 또는 KGF-2가 결합하는 분자를 스크리닝할 수 있다. KGF-2 및 상기 분자는 KGF-2 또는 그 분자 결합의 활성을 활성화시키거나(작용제), 증대시키거나, 억제하거나(길항제), 또는 감소시킬 수 있다. 그러한 분자들의 예로는 항체, 올리고뉴클레오티드, 단백질(예, 수용체) 또는 소형 분자 등이 있다.
상기 분자는 KGF-2의 천연 리간드, 예컨대, 리간드의 단편, 또는 천연 기질, 리간드, 구조 또는 기능적 모방체(mimetic)와 친밀하게 관련되는 것이 바람직하다. [Coliganet al., Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5(1991) 참조]. 유사하게, 상기 분자는 KGF-2가 결합하는 천연 수용체, 또는 적어도 KGF-2(예, 활성 부위)가 결합될 수 있는 상기 수용체의 단편과 친밀하게 관련될 수 있다. 양자 어느 경우에도, 상기 분자는 공지 기술을 사용하여 합리적으로 디자인할 수 있다.
이들 분자에 대한 스크리닝은 분비 단백질로서 또는 세포막 상에서 KGF-2를 발현시키는 적당한 세포를 생성시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 세포로는 포유 동물, 효모, 초파리 또는E. coli.로부터 수득한 세포 등이 있다. 그 후, 바람직하게, KGF-2를 발현시키는 세포(또는 발현 폴리펩티드를 포함하는 세포막)를 상기 분자를 잠재적으로 포함하는 시험 화합물과 접촉시켜 KGF-2 또는 상기 분자의 활성을 억제, 자극 또는 결합시키는 것을 관찰한다.
상기 분석은 표지된 경쟁 물질과의 경쟁을 포함하는 분석에서, 또는 표지에 의하여 결합이 검측되는 KGF-2에 대한 후보 화합물의 단순한 결합 시험일 수 있다. 또한, 상기 분석은 후보 화합물이 KGF-2에 결합함에 의하여 생성되는 신호를 초래하는가 여부를 시험할 수 있다.
대안적으로, 상기 분석은 세포-유리 제제(cell-free preparation), 고체 지지체에 부착된 폴리펩티드/분자, 화학 라이브러리, 또는 천연 생성 혼합물을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 분석은 단순히 후보 화합물을 KGF-2를 포함하는 용액과 혼합하는 단계, KGF-2 분자 활성 또는 결합을 측정하는 단계, 및 KGF-2 활성 또는 결합을 표준 물질과 비교하는 단계를 포함할 수도 있다.
바람직하게, ELISA 분석은 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 사용하여 샘플(예, 생물학적 샘플) 중의 KGF-2 농도 또는 활성을 측정할 수 있다. 상기 항체는 직접 또는 간접적으로 KGF-2에 결합함에 의해서, 또는 기질에 대해서 KGF-2와 경쟁함에 의해서 KGF-2 농도 또는 활성을 측정할 수 있다.
대안적으로, KGF-2가 결합하는 수용체는 당업자에게 공지되어 있는 다수의 방법에 의하여 동정할 수 있다. 그러한 방법의 예로는 리간드 패닝(ligand panning) 및 FACS 쏘팅(sorting)이 있다[Coligan,et al. Current Protocols in Immun., 1(2), Chapter 5, (1991)]. 예를 들어, 상기 폴리펩티드에 대하여 반응성인 세포, 예를 들어 FGF계 단백질에 대한 다중 수용체를 포함하는 것으로 공지되어 있는 NIH3T3 세포, 및 SC-3세포로부터 폴리아데닐화 RNA를 제조하고, 상기 RNA로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 풀(pool)로 분할하여 COS 세포 또는 상기 폴리펩티드에 반응성이 없는 기타 세포를 형질 전환시키는데 사용하는 발현 클로닝을 이용한다. 유리 슬라이드 상에서 성장된 형질 전환된 세포를 표지화한 후, 본 발명의 폴리펩티드에 노출시킨다. 부위-특이적 단백질 키나아제(site-specific protein kinase)에 대한 인식 자리를 봉입(inclusion) 또는 요오드화시키는 등의 다양한 수단에 의하여 상기 폴리펩티드를 표지화할 수 있다.
고정화 및 항온 처리 후, 상기 슬라이드를 방사선 사진 분석하였다. 양성 풀을 동정하고, 반복 서브-풀링(sub-pooling) 및 재스크리닝 방법을 사용하여 서브-풀(sub-pool)을 제조하고 재형질감염시켜, 추정 수용체를 암호화하는 단일 클론을 얻는다.
수용체 동정에 대한 대안적인 접근법으로서, 표지된 폴리펩티드는 수용체 분자를 발현시키는 추출물 제제 또는 세포막과 결합되는 광친화성일 수 있다. 가교 결합된 물질을 PAGE 분석법으로 분석하고, X-선 필름에 노출시킨다. 폴리펩티드의 수용체를 함유하는 표지된 복합체를 절제하여 펩티드 단편으로 분해하고, 단백질 마이크로시퀀싱(microsequencing)을 실시한다. 마이크로시퀀싱에서 얻은 아미노산 서열을 사용하여 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프로브 셋트를 고안하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 추정 수용체를 암호하는 유전자를 동정할 수 있다.
또한, 유전자-셔플링(shuffling), 모티프-셔플링, 엑손-셔플링, 및/또는 코돈-셔플링(총괄적으로 "DNA 셔플링"으로 칭함) 기법을 이용하여 KGF-2의 활성을 조정함으로써, KGF-2의 아고니스트 및 안타고니스트를 효과적으로 생성할 수 있다. 일반적으로 미국 특허 제5,605,793호; 제5,811,238호; 제5,830,721호; 제5,834,252호 및 제5,837,458호 및 Patten et al., Curr.Opinion Biotechnol. 8:724-33(1997); Harayama, S., Trends Biotechnol. 16(2):76-82(1998); Hansson, L.O. et al., J.Mol.Biol. 287:265-76(1999); 및 Lorenzo, M.M. and Blasco, R., Biotechniques 24(2):308-13(1998)참고(이들 특허 및 문헌 각각은 참고로 본원에 인용됨). 하나의 구체예에서, KGF-2 폴리뉴클레오티드 및 해당 폴리펩티드의 변화는 DNA 셔플링에 의해 이루어질 수도 있다. DNA 셔플링은 상동성 또는 부위-특이적 재조합에 의해 둘 또는 그 이상의 DNA 단편의 조합에 관계된다. 다른 구체예에서, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 해당 폴리펩티드는, 착오형(error-prone) PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 기타 방법으로 재조합 이전에 무작위 돌연변이를 실시함으로써 변화될 수도 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 KGF-2의 하나 또는 그 이상의 성분, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편, 등은 하나 이상의 이종성 분자의 하나 이상의 성분, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 이종성 분자는 섬유아세포 증식 인자 계열의 구성원이다. 추가의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 이종성 분자는 성장 인자, 예컨대, 혈소판-유도 성장 인자(PDGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF-I), 형질전환 성장 인자(TGF)-알파, 상피세포 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), TGF-베타, 뼈 형태발생 단백질(BMP: bone morphogenetic protein)-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, 액티빈 A 및 B, 데카펜타플레직(dpp: decapentaplegic), 60A, OP-2, 도잘린(dorsalin), 성장 분화 인자(GDFs), 노달(nodal), MIS, 인히빈-알파(inhibin-alpha), TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타5, 및 글리알-유도 신경영양 인자(GDNF: glial-derived neurotrophic factor)이다.
기타 바람직한 단편은 생물학적 활성 KGF-2 단편이다. 생물학적 활성 단편은 KGF-2 폴레펩티드의 활성과 유사한 활성을 나타내나, 반드시 동일한 것은 아니다. 상기 단편의 생물학적 활성은 개선된 소정의 활성, 또는 감소된 원하지 않는 활성을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 작용을 조정하는 화합물을 동정하기 위한 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 그러한 분석의 예는 포유 동물 섬유아세포, 본 발명의 폴리펩티드, 스크리닝하고자 하는 화합물 및 세포 배양 조건하의3[H] 티미딘의 배합을 포함하는데, 여기에서 상기 섬유아세포는 정상적으로 증식할 것이다. 스크리닝할 화합물의 부재하에 대조군 분석을 수행한 후, 각 경우에 있어서의3[H] 티미딘의 흡수를 측정함으로써 상기 화합물 존재하의 섬유아세포 증식의 양을 비교하여 상기 화합물이 증식을 자극하는지 여부를 측정한다. 섬유아세포 증식의 양은3[H] 티미딘의 혼입을 측정하는 액체 신틸레이션 크로마토그래피로 결정한다. 아고니스트 화합물과 안타고니스트 화합물 모두 이러한 과정으로 동정할 수 있다.
다른 방법에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 수용체를 발현시키는 포유 동물 세포 또는 막 제제를 상기 화합물의 존재하에 본 발명의 표지된 폴리펩티드와 항온 처리한다. 그 후, 이러한 상호 작용을 향상시키거나 차단하는 상기 화합물의 능력을 측정할 수 있다. 대안적으로, 스크리닝할 화합물과 KGF-2 수용체의상호 작용 후 공지된 제2 메신저 시스템의 응답을 측정하고, 상기 수용체에 결합하고 제2 메신저 응답을 유도하는 상기 화합물의 능력을 측정하여 상기 화합물이 잠재적 아고니스트 또는 안타고니스트인지 여부를 결정한다. 그러한 제2 메신저 시스템으로는 cAMP 구아닐레이트 시클라제, 이온 채널 또는 포스포이노사이티드 가수분해물이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
전술한 분석법 모두는 진단 또는 예후 마커로 사용할 수 있다. 이들 분석법을 사용하여 발견한 분자들을 사용하여 KGF-2/분자를 활성화시키거나 억제함으로써 환자에 있어서 특정 결과(예, 혈관 성장)를 유발하거나 질병을 치료할 수 있다. 또한, 상기 분석법을 이용하여, 적당히 조작된 세포 또는 조직으로부터 KGF-2의 생성을 억제 또는 향상시킬 수 있는 제제를 발견할 수 있다.
따라서, 본 발명은, (a) KGF-2와 후보 결합 화합물을 항온 처리하는 단계; 및 (b) 결합이 일어났는지 여부를 측정하는 단계를 포함하여 KGF-2에 결합되는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은, (a) KGF-2와 후보 화합물을 항온 처리하는 단계, (b) 생물학적 활성을 분석하는 단계, 및 (c) KGF-2의 생물학적 활성이 변경되었는지 여부를 측정하는 단계를 포함하여 아고니스트/안타고니스트를 동정하는 방법을 제공한다.
또한, 도 4 및 표 1에 공개된 베타-병풍 구조(beta-pleated sheet) 영역을 사용하여 실험적으로 KGF-2와 결합하는 분자를 동정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정 구체예는 도 4/표 1에 제시된 각각의 베타 병풍 구조 영역의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이들 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 구체예는 도 4/표 1에 제시된 모든 베타 병풍 구조 영역 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나, 또는 이들로 구성되는 KGF-2 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 바람직한 구체예는 도 4/표 1에 제시된 베타 병풍 구조 영역 각각의 KGF-2 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이들 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 구체예는 도 4/표 1에 개시된 베타 병풍 구조 모두 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나, 또는 이들로 구성된 KGF-2 폴리펩티드에 관한 것이다.
안티센스 및 라이보자임(안타고니스트)
특정 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 안타고니스트는 서열 번호 1에 포함되는 서열, 또는 그 상보성 가닥, 및/또는 기탁 클론 75977에 포함되는 뉴클레오티드 서열에 상응하는 핵산이다. 하나의 구체예에 있어서, 안티센스 서열은 유기체에 의하여 내부적으로 생성되고, 다른 구체예에 있어서, 안티센스 서열은 별도로 투여된다[예를 들어, O'Connor, J.,Neurochem. 56:560(1991), Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL(1988)을 참조하라]. 안티센스 기술을 사용하여 안티센스 DNA 또는 RNA를 통하여, 또는 3중-나선 형성을 통하여 유전자 발현을 조절할 수 있다. 안티센스 기술은, 예컨대 문헌[예, Okano, J.Neurochem. 56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL(1998)]에 논의되어 있다. 3중 나선 구조 형성은, 예컨대 문헌[예,Leeet al., Nucleic Acids Research 6:3073(1979); Cooneyet al., Science 241:456(1988); 및 Dervan et al., Science 251:1300(1991)]에 논의되어 있다. 상기 방법들은 상보성 DNA 또는 RNA에 대한 폴리뉴클레오티드의 결합에 기초한 것이다.
예를 들어, 본 발명의 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5' 암호화 부분을 사용하여 약 10 내지 40 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 고안할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드를 전사에 관여하는 유전자 영역에 상보성이 되도록 디자인함으로써 전사를 막고 수용체를 생성시킬 수 있다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 생체내에서 mRNA에 하이브리드화시키고, mRNA 분자의 수용체 폴리펩티드로의 번역을 차단한다.
하나의 구체예에 있어서, 본 발명의 KGF-2 안티센스 핵산은 외인성 서열로부터의 전사에 의하여 세포내 생성된다. 예를 들어, 본 발명의 안티센스 핵산(RNA)을 생성하는 벡터 또는 그 부분이 전사된다. 그러한 벡터는 KGF-2 안티센스 핵산을 암호화하는 서열을 포함한다. 그러한 벡터는 그것이 전사되어 소정 안티센스 RNA를 생성할 수 있는 한, 에피좀에 남거나 염색체로 통합될 수 있다. 그러한 벡터는 당업계의 재조합 DNA 기술 표준 방법을 이용하여 작제할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 또는 척추 동물 세포에서 복제 및 발현용으로 사용되는 당업계에 공지된 기타 벡터일 수 있다. KGF-2를 암호화하는 서열 또는 그 단편의 발현은 척추 동물, 바람직하게 인간 세포에서 작용하는 당업계에 공지된 임의의 프로모터에 의할 수 있다. 그러한 프로모터는 유도성이거나 구성성일 수 있다. 그러한프로모터로는 SV40 초기 프로모터 영역[Bernoist and Chambon, Nature 29:304-310(1981)], 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus)의 3' 장말단 반복 단위에 포함되는 프로모터[Yamamotoet al., Cell 22:787-797(1980)], 헤르페스 티미딘 프로모터[Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445(1981)], 메탈로티오닌(metallothionein) 유전자의 조절 서열[Brinster,et al., Nature 296:39-42(1982)] 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 안티센스 핵산은 KGF-2 유전자의 RNA 전사물의 적어도 일부에 상보적인 서열을 포함한다. 그러나, 완전한 상보성이 바람직하기는 하지만, 반드시 요구되지는 않는다. 본 명세서에서 사용한 용어 "RNA의 적어도 일부에 상보적인" 서열은 RNA와 하이브리드화될 수 있는 충분한 상보성을 가져, 안정한 듀플렉스(duplex)를 형성하는 서열을 의미한다. 따라서, 이중 가닥 KGF-2 안티센스 핵산의 경우에는, 듀플렉스 DNA의 1 가닥이 시험되거나, 3중 가닥 형성이 분석될 것이다. 하이브리드화 능력은 안틴센스 핵산의 길이 및 상보성의 정도 모두에 좌우될 것이다. 일반적으로, 하이브리드화 핵산이 클수록 안정한 듀플렉스(경우에 따라 트리플렉스일 수 있음)를 함유하고, 또한 이를 형성할 수 있는 KGF-2 RNA와의 염기 부정합이 커진다. 당업자는 하이브리드화된 복합체의 융점을 측정하는 표준 과정을 이용하여 관용되는 부정합도를 확인할 수 있다.
메시지의 5' 말단(예를 들어, 5' 미번역 서열 이하 및 AUG 개시 코돈 포함)에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 번역 억제 시에 가장 효율적으로 작용해야만 한다. 그러나, mRNA의 3' 미번역 서열에 상보적인 서열은 mRNA의 번역 억제시에 효과적인 것으로 나타났다. 일반적으로 문헌[Wagner, R., 1994,Nature 372:333-335] 참조. 따라서, 도 1A-1B에 도시된 KGF-2의 5'- 또는 3'-미번역 비암호화 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 내인성 KGF-2 mRNA의 번역을 억제하는 안티센스 접근법에 사용될 수 있다. mRNA의 5' 미번역 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 AUG 출발 코돈의 보체를 포함해야 한다. mRNA의 암호화 영역에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 번역을 억제하는데는 덜 효과적이나, 본 발명에 따라 사용할 수 있다. KGF-2 mRNA의 5'-, 3- 또는 암호화 영역에 하이브리드화되도록 디자인되었는지에 관계없이, 안티센스 핵산은 길이가 6개 이상의 뉴클레오티드이어야 하며, 길이가 6 내지 약 50개의 뉴클레오티드 범위인 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 특정 양상에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 10개 이상의 뉴클레오티드, 17개 이상의 뉴클레오티드, 25개 이상의 뉴클레오티드 또는 50개 이상의 뉴클레오티드이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 또는 키메라 혼합물이나 그 유도체 또는 변형물, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 염기 부분, 당부분, 또는 인산 주쇄 부분에서 변형되어, 예를 들어 분자 안정성, 하이브리드화 등을 개선시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 기타 추가 그룹, 예를 들어 펩티드(예, 생체내 숙주 세포 수용체를 표적화하기 위한 것), 또는 세포막 횡단 수송을 용이하게 하는 약제[예를 들어, 문헌(Letsingeret al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitreet al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; PCT 공개 번호 WO 88/09810, 1988. 12. 15. 공개) 참조],또는 혈뇌 장벽[예를 들어, 문헌(PCT 공개 번호 WO 89/10134, 1988. 4. 25. 공개) 참조], 하이브리드화-유발 개열제[예를 들어, 문헌(Krolet al., 1988,BioTechniques6:958-976) 참조], 또는 삽입제(intercalating agent)[예를 들어, 문헌(Zon, 1988,Pharm. Res. 5:539-549) 참조] 등을 포함할 수 있다. 이를 위해서, 올리고뉴클레오티드를 다른 분자, 예를 들어, 펩티드, 하이브리드화 유발 가교제, 수송제, 하이브리드화 유발 개열제 등에 결합시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록시메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실큐에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실큐에오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함(단, 이에 한정되는 것은 아님)하는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 개질 염기 부분을 포함할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 아라비노스, 2-플루오로아라비노스, 크실루로스 및 헥소스를 포함(단, 이에 한정되는 것은 아님)하는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 개질된 당 부분을 포함할 수도 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미도티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포르디아미데이트, 메틸포스포네이트, 알킬 포스포트리에스테르, 및 포름아세탈 또는 그의 유사체를 포함(단, 이에 한정되는 것은 아님)하는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 개질된 포스페이트 주쇄를 포함한다.
또 다른 구체예에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-아노머성(a-anomeric) 올리고뉴클레오티드이다. 비-아노머성 올리고뉴클레오티드는 통상의 b-단위와 달리, 가닥이 서로 평행으로 주행하는 상보성 RNA와 특이적 이중-가닥 하이브리드를 형성한다(Gautier et al., 1987,Nucl. Acids Res. 15:6625-6641). 상기 올리고뉴클레오티드는 2'-0-메틸리보뉴클레오티드 (Inoue et al., 1987,Nucl. Acids Res. 15:6131-6148), 또는 키메라성 RNA-DNA 유사체(Inoue et al., 1987,FEBS Lett. 215:327-330)이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 표준 방법, 예를 들어, 자동 DNA 합성기(예를 들어, Biosearch, Applied Biosystems 등에서 시판)를 사용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 Stein 등의 방법[1988, Nucl. Acids Res. 16:3209]에 의하여 합성할 수 있고, 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드는 제어 공극 유리 중합체 지지체(controlled pore glasspolymer supports)(Sarinet al., 1988,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451)를 사용하여 제조할 수 있다.
KGF-2 암호화 영역 서열에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 사용할 수 있지만, 전사 미번역 영역에 상보성인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 잠재성 안타고니스트로는 또한 촉매적 RNA 또는 라이보자임이 있다[예를 들어, PCT 국제 공개 WO 90/11364, 1990. 10. 4. 공개; Sarveret al., Science 247:1222-1225(1990) 참고]. 부위 특이적 인식 서열에서 mRNA를 개열시키는 라이보자임을 사용하여 KGF-2 mRNA를 파괴시킬 수 있으나, 해머헤드(hammerhead) 라이보자임을 사용하는 것이 바람직하다. 해머헤드 라이보자임은 표적 mRNA와 상보성 염기쌍을 형성하는 영역의 측부 위치에서 mRNA를 개열시킨다. 유일한 조건은 표적 mRNA가 하기 두 개의 염기 서열을 갖는다는 것이다: 5'-UG-3'. 해머헤드 라이보자임의 작제 및 생성은 당업계에 주지되어 있으며, 문헌[Haseloff and GerlachNature 334:585-591(1988)]에 더욱 자세히 기술되어 있다. KGF-2의 뉴클레오티드 서열내에는 다수의 잠재성 해머헤드 라이보자임 개열 부위가 있다(도 1A-1B). 효율을 증대시키고, 비작용성 mRNA 전사물의 세포내 축적을 최소화하기 위해서 라이보자임을 조작하여 개열 인식 부위가 KGF-2 mRNA의 5'말단 근처에 위치하도록 하는 것이 바람직하다.
안티센스 접근법에 있어서와 같이, 본 발명의 라이보자임은 개질(예를 들어, 안정성, 표적화 등의 개선)된 올리고뉴클레오티드로 구성될 수 있고, 생체내에서 KGF-2를 발현시키는 세포에 전달되어야 한다. 라이보자임을 암호화하는 DNA 작제물은 DNA를 암호화하는 안티센스 도입과 관련하여 전술한 바와 동일한 방법으로 상기 세포내에 도입시킬 수 있다. 전달의 바람직한 방법은 강력한 구성 프로모터, 예를 들어, pol Ⅲ 또는 pol Ⅱ 프로모터의 제어하에 라이보자임을 "암호화"하는 DNA 작제물의 사용을 포함하는데, 이를 통하여 형질 전환된 세포는 내인성 KGF-2 메시지를 파괴하고 번역을 억제하는 충분량의 라이보자임을 생성시킬 것이다. 안티센스 분자와 달리 라이보자임은 촉매이기 때문에, 효율을 위하여 보다 낮은 세포내 농도가 요구된다.
안타고니스트/아고니스트 화합물들을 사용하여 종양 세포 및 조직상에서 본 발명의 폴리펩티드의 증식 효과 및 세포 성장(즉, 종양의 혈관 신생 자극)을 억제할 수 있고, 따라서, 예를 들어 종양 형성 또는 성장에 있어서 비정상적인 세포 성장 및 증식을 지연시키거나 억제할 수 있다.
또한, 안타고니스트/아고니스트를 사용하여 혈관과다 질병을 예방할 수 있고, 낭외 백내장 수술 후, 상피 수정체 세포의 증식을 예방할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드의 분열 유발 활성의 방지는 풍선 혈관 성형술 후, 재협착과 같은 경우에 바람직할 수 있다.
또한, 안타고니스트/아고니스트를 사용하여 상처 치유 중에 반흔 조직의 성장을 방지할 수 있다.
또한, 안타고니스트/아고니스트를 사용하여 본 명세서에 기술되어 있는 질병을 치료할 수 있다.
기타 활성
본 발명의 폴리펩티드는, 혈관 내피세포 증식을 자극하는 능력이 있기 때문에, 혈전증, 동맥경화증 및 기타 심혈관 질병 등의 각종 질병 증상으로 인한 허혈 조직의 재혈관형성을 자극하는 치료에 사용할 수 있다. 이들 폴리펩티드를 사용하여 후술하는 바와 같이 혈관형성 및 사지 재생을 자극할 수 있다.
폴리펩티드는 상이한 기원의 각종 세포(예, 섬유아세포 및 골격근 세포)에 대한 분열 유발원이고, 따라서 손상 또는 병에 걸린 조직의 회복 및 대체가 용이하기 때문에, 상처, 화상, 수술후 조직 손상 및 궤양에 기인한 상처 치유에 이들 폴리펩티드를 이용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 이용하여 신경원 성장을 자극하고, 일부 신경원 질병 또는 신경 퇴행성 증상, 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 및 AIDS 관련 증후군에서 발생하는 신경원 손상을 치료 및 예방할 수 있다. KGF-2에는 연골세포 증식을 자극하는 능력이 있어서, 뼈 및 치근막 재생을 증가시키고 조직 이식편 또는 뼈 이식편을 보조하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 케라티노사이트 성장을 자극함으로써 햇볕에 그을려 생기는 피부 노화를 예방할 수 있다.
KGF-2 폴리펩티드는, FGF 계열 구성원이 모발 형성 세포를 활성화시키고 흑색 세포 성장을 촉진하기 때문에 모발 손실을 예방하는데 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 다른 시토킨과 병행하여 사용하는 경우 조혈세포 및 골수 세포의 성장 및 분화를 촉진할 수 있다.
KGF-2 폴리펩티드를 사용하여 이식 전에 기관을 유지하거나, 또는 1차 조직의 세포 배양을 지탱할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 초기 배아를 분화시키기 위해서 중배엽 기원의 조직을 유도하는데 사용할 수 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 전술한 바와 같이 조혈계 외에도 배아 간세포의 분화 또는 증식을 증가 또는 감소시킬 수 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 포유 동물의 특성, 예를 들어 신장, 체중, 모발 색, 눈 색, 피부, 지방 조직의 퍼센트, 색소 형성, 크기 및 모양(예, 성형 수술)을 조정하는데 사용할 수도 있다. 유사하게, KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 이화 작용, 동화 작용, 에너지 처리, 이용 및 저장에 영향을 미치는 포유동물 신진 대사를 조정하는데 사용할 수도 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는 바이오리듬, 주기 리듬, 우울(우울증 포함), 폭력성, 고통에 대한 내성, 재생산 능력(바람직하게, 액티빈 또는 인히빈-유사 활성에 의함), 호르몬 또는 내분비 농도, 식욕, 성욕, 기억력, 스트레스, 또는 기타 인식력에 영향을 끼침으로써 포유 동물의 정신 상태 또는 신체 상태를 변화시키는데 사용할 수 있다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 KGF-2의 아고니스트 또는 안타고니스트는, 예를 들어 저장 능력을 증대 또는 감소시키는 식품 첨가제 또는 방부제, 지방 함유물, 지질, 단백질, 탄수화물, 비타민, 무기질, 조인자 또는 기타영양 성분으로서 사용할 수도 있다.
상기 언급한 적용례들은 다양한 숙주에서 이용할 수 있다. 그러한 숙주로는 인간, 쥐과 동물, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말, 마우스, 랫트, 햄스터, 돼지, 마이크로-피그, 닭, 염소, 소, 양, 개, 고양이, 인간 이외의 영장류 및 인간 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 구체예에 있어서, 숙주는 마우스, 토끼, 염소, 기니아 피그, 닭, 랫트, 햄스터, 돼지, 양, 개 또는 고양이이다. 바람직한 구체예에 있어서, 숙주는 포유 동물이다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 숙주는 인간이다.
진단 및 영상화
관심 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 표지된 항체, 및 그 유도체와 상동체는 본 발명 폴리펩티드의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병, 질환, 및/또는 상태를 검출, 진단 또는 감시하기 위한 진단 목적을 위해 이용될 수 있다. 본 발명은 (a)관심 폴리펩티드에 특이적인 항체 하나 이상을 이용하여 개체의 세포 또는 체액에서 관심 폴리펩티드의 발현을 분석하는 것과 (b) 표준 유전자 발현 수준과 유전자 발현 수준을 비교하며, 이때 표준 발현 수준과 비교하여 분석된 폴리펩티드 유전자 발현 수준의 감소 또는 증가가 이상 발현의 표시가 되는 것을 포함하는, 관심 폴리펩티드의 이상 발현의 검출을 제공한다.
본 발명은 (a)관심 폴리펩티드에 특이적인 항체 하나 이상을 이용하여 개인의 세포 또는 체액에서 관심 폴리펩티드의 발현을 분석하는 것과 (b) 표준 유전자 발현 수준과 유전자 발현 수준을 비교하며, 이때 표준 발현 수준과 비교하여 분석된 폴리펩티드 유전자 발현 수준의 감소 또는 증가가 특정 질병의 표시가 되는 것을 포함하는, 질병 진단을 위한 진단 분석을 제공한다. 암과 관련하여, 상대적으로 높은 양의 전사물이 개체로부터의 검시 조직에 존재하는 것은 질병의 발달을 위한 전조를 나타낼 수도 있고, 또는 실질적인 임상 증상의 출현에 앞서 질병을 검출하기 위한 수단을 제공할 수도 있다. 이러한 유형의 더욱 확실한 진단은 의료 전문가들이 예방적 수단 또는 공격적 치료를 보다 초기에 이용하여 암의 발달 또는 추가 진전을 방지할 수 있도록 한다.
본 발명의 항체는 당업자에게 공지된 고전적인 면역조직학적 방법을 이용하여 생물 시료에서 단백질 농도를 분석하기 위해 이용될 수 있다(Jalkanen, et al.,J.Cell.Biol.101:976-985(1985); J.Cell.Biol.105:3087-3096(1987)). 단백질 유전자 발현을 검출하는 데 유용한 다른 항체-기초 방법은 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA) 및 방사성 면역분석(RIA)과 같은 면역분석을 포함한다. 적절한 항체 분석 표지는 공지이며 글루코스 옥시다제; 방사성 동위원소, 예 요오드(125I,121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(112In), 및 테크네튬(99Tc); 루미놀 같은 발광 표지; 및 플루오르세인과 로다민 및 비오틴같은 형광 표지를 포함한다.
본 발명의 한 가지 양상은 동물, 바람직하게는 포유동물 및 가장 바람직하게는 사람에서 관심 폴리펩티드의 이상 발현과 관련된 질병 또는 증상의 검출 및 진단이다. 한 가지 구체예에서, 진단은 a)관심 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 표지된 분자 유효량을 피험체에게 투여(예를 들어, 비경구적으로, 피하로, 또는 복강내로)하는 것; b) 표지된 분자가 폴리펩티드가 발현되는 피험체 내 위치에서 우선적으로 집중되도록(그리고 비결합 표지 분자가 배경 수준으로 제거되도록) 투여 후 일정 시간 간격동안 기다리는 것; c) 배경 수준을 결정하는 것; 및 d) 피험체에서 표지 분자를 검출하여 배경 수준 이상의 표지 분자의 검출이 그 피험체가 관심 폴리펩티드의 이상 발현과 관련되는 특정 질병 또는 질환을 갖는다는 것을 나타내는 것을 포함한다. 배경 수준은 검출된 표지 분자의 양을 특정 시스템에 대해 미리 결정된 표준값과 비교하는 것을 포함하는 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다.
피험체의 크기와 사용되는 영상화 시스템이 진단 영상을 생성하기 위해 필요한 영상화 부의 양을 결정할 것이라는 것을 당업자는 이해할 것이다. 방사성 동위원소 부의 경우, 사람 피험체를 위해, 주사되는 방사성 동위원소의 양은 일반적으로 약 5 내지 약 20밀리큐리의99mTc 범위일 것이다. 표지된 항체 또는 항체 단편은 이어서 우선적으로 특정 단백질을 함유한 세포 위치에서 축적될 것이다. 생체내 종양 영상화는 S.W.Burchiel et al.,"Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibiotics and Their Fragment"에 설명된다.(Chapter 13 in Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer, S.W.Burchiel and B.A.Rhodes,eds,Masson Publishing Inc.(1982)).
사용된 표지의 유형과 투여 형식을 포함한 몇 가지 변수에 따라서, 표지된 분자가 피험체내 위치에서 우선적으로 집중되도록 하고 비결합 표지 분자가 배경 수준으로 제거되도록 하기 위한 투여 후의 시간 간격은 6 내지 48시간 또는 6 내지24시간 또는 6 내지 12시간이다. 다른 구체예에서, 투여 후 시간 간격은 5 내지 20일 또는 5 내지 10일이다.
한 구체예에서, 질병 또는 질환의 감시는 예를 들어 초기 진단 1 개월 후, 초기 진단 6개월 후, 초기 진단 1년 후에 질병 또는 질환의 진단을 위한 방법을 반복함으로써 수행된다.
표지된 분자의 존재는 생체내 스캐닝을 위한 공지 방법을 이용하여 환자에서 검출될 수 있다. 이들 방법은 사용된 표지의 유형에 의존한다. 당업자는 특정 표지의 검출을 위한 적절한 방법을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 진단 방법에서 이용될 수 있는 방법과 장치는 컴퓨터 토모그래피(CT), 위치 방출 토모그래피와 같은 전신 스캔, 자기 공명 영상화(MRI), 및 소노그래피를 포함하며 이에 제한되지 않는다.
특정 구체예에서, 분자는 방사성 동위원소로 표지되며 방사선 반응성 외과 기구를 이용하여 환자에서 검출된다(Thurston et al.,미국 특허 제5,441,050호).다른 구체예에서, 분자는 형광 화합물로 표지되며 형광 반응성 스캐닝 기구를 이용하여 환자에서 검출된다. 다른 구체예에서, 분자는 포지트론 방출 금속으로 표지되며 포지트론 방출-토모그래피를 이용하여 환자에서 검출된다. 또 다른 구체예에서, 분자는 상자성체 표지로 표지되고 자기 공명 영상화(MRI)를 이용하여 환자에서 검출된다.
키트
본 발명은 전술한 방법들에 사용할 수 있는 키트들을 제공한다. 한 구체예에 있어서, 키트는 본 발명의 항체, 바람직하게 정제된 항체를 1종 이상의 용기에 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 키트는 그 키트에 포함된 항체와 특이적으로 면역 반응하는 에피토프를 포함하는 실질적으로 분리된 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 키트는 또한 당해 폴리펩티드와 반응하지 않는 조절 항체를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 또 다른 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 키트는 당해 폴리펩티드에 대한 항체의 결합을 검출하기 위한 수단을 포함한다(예를 들어, 상기 항체는 검출 가능한 기질, 예를 들어, 형광 화합물, 효소 기질, 방사활성 화합물 또는 발광 화합물과 결합될 수 있고, 또는 제1 항체를 인식하는 제2항체가 검출 가능한 기질과 결합될 수 있다).
본 발명의 또 다른 특정 구체예에 있어서, 키트는 증식 및/또는 암 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대하여 특이적인 항체를 함유하는 혈청을 스크리닝하는데 사용하기 위한 진단용 키트이다. 그러한 키트는 당해 폴리펩티드와 반응하지 않는 조절 항체를 포함할 수 있다. 그러한 키트는 1종 이상의 항-폴리펩티드 항원 항체와 특이적으로 면역반응하는 에피토프를 포함하는 실질적으로 분리된 폴리펩티드 항원을 포함할 수 있다. 또한, 그러한 키트는 항원에 대한 상기 항체의 결합을 검출하기 위한 수단을 포함한다(예를 들어, 상기 항체는 유세포 분석법에 의하여 검출할 수 있는 로다민 또는 플루오레세인과 같은 형광 화합물에 결합될 수 있다). 특정 구체예에 있어서, 키트는 재조합적으로 생성되거나 화학적으로 합성된 폴리펩티드 항원을 포함할 수 있다. 상기 키트의 폴리펩티드 항원은 고체 지지체에 부착시킬 수도 있다.
더욱 특이적인 구체예에 있어서, 전술한 키트의 검출 수단은 상기 폴리펩티드 항원이 부착되는 고체 지지체를 포함한다. 그러한 키트는 비-부착 리포터-표지 항-인간 항체를 포함할 수도 있다. 이러한 구체예에 있어서, 폴리펩티드 항원에 대한 항체의 결합은 상기 리포터-표지 항체의 결합에 의하여 검출할 수 있다.
추가의 구체예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 항원을 포함하는 혈청을 스크리닝하는데 사용하기 위한 진단 키트를 포함한다. 상기 진단 키트는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 항원과 특이적으로 면역반응하는 실질적으로 분리된 항체, 및 상기 항체에 대한 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 항원의 결합을 검출하기 위한 수단을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 상기 항체는 고체 지지체에 부착된다. 특정 구체예에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 상기 키트의 검출 수단은 제2 표지된 모노클로날 항체를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 상기 검출 수단은 표지된 경쟁 항원을 포함할 수 있다.
하나의 진단 구성에 있어서, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 표면-결합 항원을 갖는 고체 상 시약과 시험 혈청을 반응시킨다. 상기 시약에 특정 항원 항체를 결합시키고, 비결합 혈청 성분을 세척에 의하여 제거한 후, 상기 시약을 리포터-표지 항-인간 항체와 반응시킴으로써 상기 고체 지지체 상에 결합된 항-항원 항체 양에 비례하게 상기 시약을 리포터와 결합시킨다. 상기 시약을 다시 세척하여 비결합 표지 항체를 제거하고, 그 시약과 회합된 리포터의 양을 측정한다. 통상, 상기 리포터는 적당한 형광계, 발광계 또는 비색계 기질의 존재하에 고체상을 항온 처리함으로써 검측되는 효소이다(Sigma, St. Louis, MO).
상기 분석법에 있어서의 고체 표면 시약은 예를 들어, 중합체 비드, 딥 스틱(dip stick), 96-웰 플레이트 또는 필터 물질과 같은, 고체 지지체 물질에 단백질 물질을 부착시키기 위한 공지의 기술을 사용하여 제조한다. 이들 부착 방법은 일반적으로 활성 카르복실, 하이드록실 또는 알데히드기와 같은 고체 지지체 상의 화학적 반응기에, 통상 자유 아민기를 통하여, 단백질을 공유 결합시키거나, 지지체에 단백질을 비-특이적으로 흡착시키는 것을 포함한다. 대안적으로, 스트렙트아비딘 코팅 플레이트를 비오티닐화 항원(들)과 함께 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 이러한 진단 방법을 수행하기 위한 키트 또는 분석 시스템을 제공한다. 상기 키트는 일반적으로 표면-결합 항-항원 항체를 검출하기 위한 리포터-표지 항-인간 항체 및 표면-결합 재조합 항원을 갖는 지지체를 포함한다.
본 발명을 일반적으로 기술하였으며, 이하의 실시예를 참고하여 본 발명을 더욱 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 다만, 하기 실시예는 설명 목적으로 제공되는 것이며, 본 발명을 한정하고자 의도된 것은 아니다.
실시예 1
KGF-2의 박테리아 발현 및 정제
처음에, 가공된 KGF-2 cDNA의 5' 및 3' 말단 서열에 대응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머(시그날 펩티드 서열을 포함)를 사용하여 KGF-2, ATCC #75977을 암호화하는 DNA 서열을 증폭한다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음의 서열로 나타난다: 5'CCCCACATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCC 3'(서열 번호 3)은 Af1III 제한 효소와 추정된 개시 코돈으로 부터 출발하는 KGF-2 암호 서열의 30개 뉴클레오티드 서열을 순차적으로 함유한다. 3' 서열은 5'CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG 3'(서열 번호 4)은 Hind III 부위에 상보적인 서열 및 KGF-2의 26개 뉴클레오티드를 순차적으로 함유한다. 제한 효소 부위는 박테리아 발현 벡터 pQE-60(Qiagen, Inc. Chatsworth, CA)상의 제한효소 부위와 화합성이 있다. pQE-60은 항생제 내성(Ampr), 복제의 박테리아 오리진(ori), IPTG-조절가능한 프로모터 오퍼레이터(P/O), 리보좀 결합 부위(RBS), 6-His 태그 및 제한 효소 부위를 암호화한다. 이어서, pQE-60은 NcoI 및 HindIII으로 분해한다. 증폭된 서열을 pQE-60에 결합한 후 프레임에 삽입한다. 그 다음에, Sambrook, J., 등의Molecular Cloning;A Laboratory Manual,Cold Spring Laboratory Press(1989)에 기술된 방법대로 결합 혼합물을 사용하여 대장균 균주 M15/rep 4(Qiagen, Inc)를 형질전환시킨다. M15/rep 4는 플라스미드 pREP4의 다수 복사물을 함유하는데, 이는 lacI 리플레서를 발현하여 카나마이신 내성(Kanr)을 부여한다. 형질전환체의 동정은 LB 평판상에서 증식하는 이들의 능력에 의해 이루어지며, 또 암피실린/카나마이신 내성 콜로니가 선택된다. 플라스미드 DNA를 단리하고 억제 분석으로 확인한다. 소정의 구조물을 함유하는 클론을 Amp(100 ug/ml) 및 Kan(25ug/ml) 둘 모두로 보충된 LB 배지의 액체 배양액중에서 밤새(O/N) 증식시킨다. 밤새 배양한 배양물을 사용하여 대규모 배양물에 1:100 내지 1:250의 비로 접종한다. 광학 밀도 600(O.D.600)가 0.4 내지 0.6이 될때까지 세포를 증식시킨다.IPTG("이스프로필-B-D-티오갈락토 피라노시드")를 가해서 최종 농도가 1mM의 농도가 되게한다. IPTG는 lacI 리프레서와 반응하여 오퍼레이터로부터 분리되므로써 프로모터를 직접 전사시킨다. 세포를 추가로 3시간 또는 4시간동안 증식한다. 이후 세포를 원심분리로 수거한다. 세포 펠릿을 챠오트로픽 제제(chaotropic agent)인 6 몰의 구아니딘 HCl중에서 가용화한다. 정화한후에, 가용화된 KGF-2를 단백질을 친밀하게 결합시키는 조건하에서 헤파린 친화도상에 크로마토그래피하여 상기 용액으로 부터 정제한다(Hochuli,E 등,J. Chromatography 411:177-184(1984)). KGF-2(75% 순도) 를 고염 버퍼로 칼럼으로부터 용출한다.
실시예 2
절단형의 KGF-2의 박테리아의 발현 및 정제
처음에, 절단형 KGF-2 폴리펩티드의 5' 및 3' 말단 서열에 대응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 KGF-2, ATCC #75977을 암호화하는 DNA 서열을 증폭한다. 상기 절단형은 36개의 아미노산 시그날 서열이 없는 펩티드로서, 메티오닌 및 알라닌 잔기가 시스테인 잔기 바로 앞에 첨가되어 전장 단백질의 아미노산 37개를 포함한 것이다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음의 서열로 나타난다: 5'CATGCCATGGCGTGCCAAGCCCTTGGTCAGGACATG 3'(서열 번호 5)은 NcoI 제한 효소 부위와 KGF-2 암호 서열의 24개 뉴클레오티드 서열을 순차적으로 함유한다. 3' 서열은 5'CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG 3'(서열 번호 6)은 Hind III 부위에 상보적인 서열 및 KGF-2 유전자의 26개 뉴클레오티드를 순차적으로 함유한다. 제한 효소는 박테리아 발현 벡터 pQE-60(Qiagen, Inc. Chatsworth, CA)상의 제한효소 부위와 화합성이 있다. pQE-60은 항생제 내성(Ampr), 복제의 박테리아 오리진(ori), IPTG-조절가능한 프로모터 오퍼레이터(P/O), 리보좀 결합 부위(RBS), 6-His 태크 및 제한 효소 부위를 암호화한다. 이어서, pQE-60을 NcoI 및 HindIII로 분해한다. 증폭된 서열을 pQE-60에 결합하고 프레임에 삽입한다. 그 다음에, Sambrook, J., 등의Molecular Cloning;A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press(1989)에 기술된 방법대로 결합 혼합물을 사용하여 대장균 균주 M15/rep 4(Qiagen, Inc)를 형질전환시킨다. M15/rep 4는 플라스미드 pREP4의 다수 복사물을 함유하는데, 이는 lacI 리플레서를 발현하여 카나마이신 내성(Kanr)을 부여한다. 형질전환체의 동정은 LB 평판상에서 증식하는 이것의 능력으로 이루어지며, 또 암피실린/카나마이신 내성 콜로니가 선택된다. 플라스미드 DNA를 단리하고 억제 분석으로 확인한다. 소정의 구조물을 함유하는 클론을 Amp(100 ug/ml) 및 Kan(25ug/ml) 둘 모두로 보충된 LB 배지의 액체 배양액중에서 밤새(O/N) 증식시킨다. 밤새 배양한 배양물을 사용하여 대규모 배양물에 1:100 내지 1:250의 비로 접종한다. 광학 밀도 600(O.D.600)가 0.4 내지 0.6이 될때까지 세포를 증식한다. IPTG("이스프로필-B-D-티오갈락토 피라노시드")를 가해서 최종 농도가 1mM의 농도가 되게한다. lacI 리프레서를 불활성화시키면 IPTG가 유도되어 프로모터가 제거하여 유전자 발현이 증가된다. 세포를 3시간 또는 4시간동안 더 증식한다. 이후 세포를 원심분리로 수거한다. 세포 펠릿을 챠오트로픽 제제인 6 몰의 구아니딘 HCl중에서 가용화한다. 정화한후에, 가용화된 KGF-2을 단백질을 친밀하게 결합시키는조건하에서 헤파린 친화도상에 크로마토 그래피하여 상기 용액으로 부터 정제한다(Hochuli,E 등,J. Chromatography 411:177-184(1984)). KGF-2 단백질을 고염 버퍼로 칼럼으로부터 용출한다.
실시예 3
배큘로바이러스 발현계를 사용하는 KGF-2의 클로닝 및 발현
전장 KGF-2 단백질, ATCC #75977호를 암호화하는 DNA서열은 후술되는 유전자 서열의 5' 및 3' 서열에 대응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭한다:
5' 프라이머는 5'GCGGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTCAC 3'(서열번호 7) 서열로 나타나며, BamHI 제한 효소 부위(굵은 글씨부분), 진핵세포중에서 번역 개시에 효율적인 시그날과 유사한 6개의 뉴클레오티드(Kozak, M.,J.Mol.Biol., 196:947-950(1987)), 및 이것 바로 뒤의 KGF-2 유전자의 처음 17개 뉴클레오티드(번역 "ATG"개시 코돈은 상기 서열에서 밑줄로 표시됨)를 순차적으로 함유한다.
3' 프라이머는 5'GCGCGGTACCACAAACGTTGCCTTCCT 3'(서열번호 8)로 나타나며, 제한 엔도뉴클레아제 Asp 718의 분해 부위와 KGF-2 유전자의 3' 비-번역 서열에 상보적인 19개 뉴클레오티드를 함유한다. 증폭된 서열은 Qiagen, Inc., Chatsworth, CA에서 시판되는 키트를 사용하여 1% 아가로즈 겔로부터 단리한다. 이후, 단편을 엔도뉴클레아제 BamHI 및 Asp718로 분해하고, 이어서 1% 아가로즈 겔상에서 정제한다. 이 단편을 F2라 명명한다.
벡터 pA2(pVL941 벡터의 변형, 후술됨)를 사용하여 배큘로 발현계를 사용하는 KGF-2 단백질을 발현한다(참조:Summers, M.D.& Smith, G.E.,A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures,Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555(1987)). 이 발현 벡터는 오토그래파 캘리포니카(Autogapha californica) 뉴클리어 폴리히드로시스 바이러스(AcMNPV)의 강한 폴리히드린 프로모터, 및 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 및 Asp 718의 인식부위를 순차적으로 함유한다. 시미안 바이러스(SV) 40의 폴리아데닐화반응 부위를 사용하여 효율적인 폴리아데닐화를 수행한다. 재조합 바이러스를 용이하게 선택하기 위해서는 폴리히드린 프로모터 및 그 뒤의 폴리히드린 유전자의 폴리아데닐화 시그날과 동일한 배향으로 대장균으로부터 베타-갈락토시다제 유전자를 삽입한다. 폴리히드린 서열은 양측면에서 야생형 바이러스 DNA로 공동 감염된 세포 매개의 상동성 재조합의 바이러스 서열과 인접해있다. 많은 다른 배큘로바이러스 벡터로서 pAc373, pVL941, 및 pAcIMI(Luckow, V.A.& Summers, M.,Virology, 170:31-39)를 사용할 수있다.
플라스미드를 제한 효소 BamHI 및 Asp 718로 분해한다. 이후 상업적으로 시판되는 키트(Qiagen, Inc., Chatworth, CA)를 사용하여 1% 아가로즈 겔로부터 DNA를 단리한다. 이 벡터 DNA를 V2라 명명한다.
단편 F2 및 플라스미드 V2를 T4 DNA 리가제로 결합한다. 대장균 HB101 세포를 형질전환시키고 PCR과 올리고뉴클레오티드 클로닝을 함께 사용하여 KGF-2 유전자를 지닌 플라스미드 (pBACKGF-2) 함유의 박테리아를 동정힌다. 클론된 단편 서열은 DNA 서열분석으로 확인한다.
리포팩션 방법(Felgner, 등.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417(1987))을 사용하여 5㎍의 플라스미드 pBacKGF-2를 상업적으로 시판하는 선형화된 배큘로바이러스 1.0㎍("BaculoGoldTM배큘로바이러스 DNA")으로 공동감염시킨다.
1㎍의 BaculoGoldTM바이러스 DNA 및 5㎍의 플라스미드 pBacKGF-2 를 50㎕의 혈청 유리의 Grace 배지(Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD)를 함유하는 미량 역가 평판의 멸균 웰중에서 혼합한다. 10㎕의 리포팩틴과 90㎕의 Grace 배지를 가한 후, 혼합하고 이를 실온에서 15분간 항온배양한다. 이어서, 형질감염 혼합물을 Sf9 곤충세포(ATCC CRL 1711)에 소적으로 적가한다. 이 곤충세포는 1㎖의 Grace 배지를 혈청없이 35mm 조직 배양 판에 시드된 것이다. 평판을 앞뒤로 움직이면서 새롭게 가해진 용액을 혼합한다. 이후 평판을 27℃에서 5시간동안 항온해양한다. 5시간 후에 형질감염 용액을 평판으로부터 제거하고 1㎖의 Grace 곤충 배지를 가한다. 이 곤충배지는 10%의 송아지의 태아 혈청이 보충된 것이다. 평판을 항온 배양기에 다시 넣고 27℃에서 4일간 배양을 계속한다.
4일후에, 상청액을 수거하고 플레이크 분석을 수행하는데, 이 분석은 Summers 및 Smith(상기 참조)에 의해 제시된 방법과 유사하게 수행한다. 이 분석법의 변형으로서, "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg)을 지닌 아가로즈 겔을 사용하는데, 이것은 청색으로 염색된 플레이크를 쉽게 분리한다("플레이크 분석"에 대한 자세한 설명은 또한 곤충 세포 배양물 및 배큘로비올로지의 사용자의 지침서에 나와 있다. 이 지침서는 Life Technologies Inc., Gaithersburg, page 9-10에 제시되어 있다).
순차적인 희석이 끝난지 4일후에, 바이러스를 세포에 가하고, 에펜도르프 피펫끝을 사용하여 청색으로 염색된 플레이크를 집는다. 재조합 바이러스를 함유하는 아가를 200㎕의 Grace 배지를 함유하는 에펜도르프 튜브중에 재현탁한다. 아가를 간단히 원심분리로 제거하고, 재조합 배큘로바이러스를 함유하는 상청액을 사용하여 35㎜의 접시에 시드된 Sf 9세포를 감염시킨다. 이들 배양액 접시 상청액을 4일후에 수거한 후 4℃에서 보관한다.
Sf9 세포를 10% 열불활성화 FBS로 보충한 Grace 배지중에서 증식한다. 세포를 재조합 배큘로바이러스 V-KGF-2로 감염시키되, 감염의 다발도(MOI)가 2가 되게 한다. 6시간 후에 배지를 제거하고, 메티오닌과 시스테인이 제거된 SF900 II배지로 대체한다(Life Technologies Inc., Gaithesburg). 42시간후에 5μCi의35S 메티오닌 및 5μCi의35S 시스테인(Amersham)을 첨가한다. 이후, 세포를 16시간동안 항온배양하고, 원심분리로 수거한후 표지된 단백질을 SDS-PAGE 및 자동방사기록기로 기록한다.
실시예 4
포유동물 세포의 KGF-2 단백질 유전자 서열을 일시적으로 발현하는데 사용되는 대부분의 벡터는 복제의 SV 40 오리진을 운반하여야 한다. 이는 벡터가 세포(예, COS 세포)중에서 높은 복사수로 복제되는 결과 바이러스 DNA 합성 개시에 필요한 T 항원을 발현케한다. 임의의 다른 포유동물 세포주를 이러한 목적에서 사용할 수있다.
일반적인 포유동물 발현 벡타는 프로모터 요소를 가지기 때문에 mRNA의 전사를 개시하고, 단백질 암호 서열 및 전사물의 전사 종결 및 폴리아데닐화에 필요한 시그날을 매개한다. 부가의 요소로는 인헨서, 코작(Kozak) 서열 및 도너가 인접한 간섭 서열 및 RNA 스플라이싱의 수용체 부위를 함유한다. 높은 효율의 전사는 SV 40의 초기 및 말기 프로모터, 레트로바이러스(예,RSV, HTLVI, HIVI)의 길다란 말단 반복부(LTR), 및 시토메갈로바이러스(CMV)의 최초기(immediate early) 프로모터에 의해 이루어질 수있다. 그러나, 세포성 시그날 또한 사용할 수있다(예, 인간 액틴 프로모터). 본발명을 실시하는 데 사용되는 적합한 발현 벡터로는, 예를 들면 pSVL 및 pMSG(Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat(ATCC 37152), pSV2dhfr(ATCC 37146) 및 pBC12MI(ATCC 67109)와 같은 벡터를 들 수있다. 사용가능한 포유동물 숙주세포는 인간 Hela, 283, H9 및 Jurkart 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7, 및 CV1, 아프리카 녹색 원숭이 세포, quail QC1-3세포, 293T 세포, 마우스 L 세포 및 중국 햄스터 난소 세포등이 있다.
대안으로서, 유전자는 염색체내에 통합된 유전자를 함유하는 안정한 세포주중에서 발현가능하다. dhfr, gpt, 네오마이신, 히그로마이신과 같은 선택성 마커로 공동 감염시키면 형질감염된 세포의 동정 및 분리가 가능하다.
형질감염된 유전자는 암호화된 단백질 다량을 발현하도록 증폭될 수있다. DHFR(디히드로폴레이트 리덕타제)는 대상 유전자 수백개 또는 심지어 수천개의 복사물을 운반하는 세포주를 형성하는데 유용한 마커이다. 다른 유용한 선택 마커는 효소 글루타민 신쎄타제이다(GS)(Murphy 등,Biochem J. 227:277-279(1991);Bebbington등,Bio/Technology 10:169-175(1992). 이러한 마커를 사용하여 포유동물의 세포를 선택배지중에서 증식하고, 가장 내성이 높은 세포를 선택한다. 이 세포주들은 염색체내로 통합되는 증폭된 유전자들을 함유한다. 중국 햄스터 난소(CHO) 세포가 단백질 생산에 자주 사용된다.
발현 벡터 pC1 및 pC4는 Rous Sarcoma Virus 의 강력한 프로모터(LTR)(Cullen 등.,Molecular and Cellular Biology, 438-447(March, 1985))와 CMV-인헨서 단편(Boshart등,Cell 41:521-530(1985))을 함유한다. 다수의 클로닝 부위, 예를 들면 제한 효소 분해 부위 BamHI, XbaI 및 Asp718을 지닌 다수의 클로닝 부위는 대상 유전자의 클로닝을 용이하게 한다. 벡터는 래트의 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론외에 폴리아데닐 및 종결하는 시그날을 함유한다.
A. COS 세포에서 재조합 KGF-2의 발현
플라스미드 KGF-2 HA의 발현은 1) SV 40 복제 오리진, 2) 암피실린 내성 유전자, 3) 대장균 복제 오리진, 4) CMV 프로모터 및 그 뒤의 폴리링커 부위, SV 40 인트론 및 폴리아데닐 부위를 함유하는 벡터 pcDNAI/Amp(Invitrogen)에서 유래되었다. HA 태그는 전술한 바와 같이 인풀루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래한 에피토프에 대응한다(Wilson, I., 등.,Cell 37:767,(1984)). 표적 단백질에 HA 태그를 주입하면 HA 에피토프를 인식하는 항체를 지닌 재조합 단백질의 검출이 용이해진다. 전체 KGF-2 전구체 HA 태그를 암호화한 DNA 단편은 HA 태그와 함께 프레임내에서 융합되므로, 재조합 단백질의 발현은 CMV 프로모터하에서 일어난다.
플라스미드 구조물은 다음과 같다:
KGF-2, ATCC #75977을 암호화하는 DNA 서열은 다음의 두개의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 구축된다: 5' 프라이머 인 5'TAACGAGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTGACAC 3'(서열번호 9)는 BamHI 부위, 개시코돈으로 부터 출발하는 서열을 암호하는 KFG-2의 22개 뉴클레오티드를 함유한다. 3' 서열인 5' TAAGCACTCGAGTGAGTGTACCACCATTGGAAGAAATG3'(서열번호 10)은 XhoI 부위에 상보하는 서열, HA 태그, 및 KGF-2의 암호 서열의 마지막 26개 뉴클레오티드(정지 코돈 함유 하지 않음)을 함유한다. 그러므로, PCR 생성물은 BamHI 부위, KGF-2 암호 서열, 이어서 XhoI 부위, 프레임에서 융합된 HA 태그, 및 HA 태그옆의 번역 종결 정지 코돈을 함유한다. PCR 증폭 DNA 단편과 벡터 pcDNA-3'HA를 BamHI 및 XhoI 제한 효소로 분해하고 결합하여 pcDNA-3'HA-KGF-2를 생산한다. 결합 혼합물을 대장균 균주 XL1 블루(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)내에서 형질전환시키고, 형질전환된 배양물을 암피실린 배지 평판상에서 도말한 후 내성 콜로니를 선택한다. 플라스미드 DNA를 형질전환체로부터 분리한 후 정확한 단편의 존재를 위해 PCR 및 억제 분석으로 조사한다. 재조합 KGF-2의 발현의 경우, COS 세포를 DEAE-DEXTRAN 방법(Sambrook, J.,등.,Molecualr Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press(1989))에 의해 발현 벡터로 형질감염시킨다. KGF-2 HA 단백질의 발현은 방사 라벨링 및 면역 침전 방법(Harlow, E, & Lane, D.,Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress,(1988))으로 검출한다. 세포를 형질감염 시킨지 2일 후에35S-시스테인으로 8시간동안 표지하였다. 이후 배양 배지를 수거하고 세포를 세정제(RIPA 버퍼-150㎖ NaCl, 1%의 NP-40, 0.1%의 SDS, 1%의 NP-40, 0.5%의 DOC, 50mM의 트리스, pH 7.5)(Wilson, I., 등.,Id, 37:767(1984))로 용균하였다. 세포 용균물과 배양 배지를 모두 HA 특이적 단일클론 항체로 침전하였다. 침전된 단백질을 15% SDS-PAGE 겔상에서 분석하였다.
B. CHO 발현계를 이용하는 인간 KGF-2 단백질의 발현 및 정제
벡터 pC1을 사용하여 KGF-2 단백질을 발현한다. 플라스미드 pC1은 플라스미드 pSV 2-dhfr(ATCC 번호 제37146)의 유도체이다. 이 두 플라스미드는 SV 40 초기 프로모터의 조절하에 마우스 DHFR 유전자를 함유한다. 중국 햄스터 난소 세포 또는 다른 세포들은 디히드로폴로레이트 활성이 결손되어 있는 것들로서, 이들은 상기 플라스미드로 형질감염된 후 화학요법제 메토트랙세이트로 보충된 선택 배지(alpha 마이너스 MEM, Life Technologies)중에서 세포들을 증식시키는 방식으로 선택된다. 메토트렉세이트(MTX)에 내성인 세포중에서 DHFR 유전자의 증폭 과정은 잘 설명되어 있다(참조, Alt, F.W., Kellems, R., M., Bertino, J.R., 및 Schimke, R.T., 1978, J.Biol. Chem. 253:13357-1370, Hamlin, J.L. and Ma, C. 1990,Biochem, et Biophys. Acta. 1097:107-143, Page., M.J. 및 Sydenham, M.A. 1991,Biotechology Vol.9;64-68)). MTX의 농도를 증가시키면서 증식한 세포들은 DHFR 유전자의 증식 결과 표적 효소, DHFR을 과잉 생산하므로써 약물에 대한 내성을 나타낸다. 두번째 유전자가 DHFR 유전자에 결합했다면 이것은 공동 증식되고 과다 발현된다. 유전자의 1000 개 이상의 복사물을 운반하는 세포주를 개발하는 것은 최첨단 기술이다. 이후에, 메트로트렉세이트가 회수되는 경우 세포주는 염색체중에 통합된 증폭 유전자를 함유한다.
플라스미드 pC1은 대상 유전자의 발현을 위해 Rouse Sarcoma Virus(Cullen등,Molecular and Cellular Biology,March 1985:438-4470)의 길다란 말단 반복부(LTR)의 강한 프로모터와 인간 시토메갈로바이러스(CMV)(Boshart등,Cell 41:521-530, 1985)의 최초기 유전자의 인헨서로부터 분리된 단편을 함유한다. 하부 프로모터는 유번자의 통합을 허용하는 다음의 단일 제한 효소 분해 부위들이다:BamHI, Pvull, 및 Nrul이다. 이들 클로닝 부위뒤에 있는 플라스미드는 래트의 프리프로인슐링 유전자의 모든 3개의 리딩 프레임내에서 전사 정지 코돈, 3' 인트론 및 폴리아데닐 부위를 순차적으로 함유하고 있다. 기타 다른 고효율의 프로모터는 발현에 사용될 수있는데, 그러한 것들의 예로는 인간 β-액틴 프로모터, SV 40 초기 또는 후기 프로모터 또는 다른 레트로바이러스(예, HIV 및 HTLVI)로부터의 LTR등이 있다. mRNA의 폴리아데닐의 경우, 다른 시그날, 예를 들면 글로빈 유전자 또는 인간 성장 호르몬 유래의 다른 시그날도 또한 사용할 수있다.
염색체내로 통합되는 대상 유전자를 운반하는 안정한 세포주는 또한 gpt, G418, 또는 히그로마이신과 같은 선택 마커로 공동 형질 감염시에 선택가능하다. 또한 처음 개시시에 하나이상의 선택 마커, 예를 들면 G418 과 메트로트렉사이트를 사용하는 것이 유리하다.
플라스미드 pC1은 제한 효소 BamHI로 분해한 후 당업계에 알려진 절차에 따라 송아지의 장 인산염을 사용하여 디포스포릴화한다. 이후 벡터는 1%의 아가로즈 겔로부터 분리한다.
KFG-2, ATCC #75977을 암호화하는 DNA 서열은 유전자의 5' 및 3' 서열에 대응하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭한다:
5' 프라이머는 하기 밑줄친 BamHI 제한 효소, 그리고 도1에 제시된 KFG-2 서열(서열번호 1)의 21개 염기 서열이 순서대로 함유되어 있는 5' TAACGAGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTGACAC 3'(서열번호 9)로 나타난다. 후술되는 바와 같이 발현 벡터내에 인간 KFG-2를 암호화하는 증폭된 단편의 5' 말단을 제공하면 효율적인 시그날 펩티드가 제공된다. Kozak, M.,J.Mol.Biol, 196:974-950(1987)에 기술된 바와 같이 진핵세포에서 번역 개시를 위한 효율적인 시그날은 구조물의 벡터 부위중 적절한 곳에 위치한다.
3' 프라이머는 BamHI 제한 효소, 그리고 도1에 지시된 KFG-2 암호 서열(서열번호 1)의 마지막 26 뉴클레오티드(단, 정지 코돈은 함유하지 않음)에 상응하는 뉴클레오티드를 순서대로 함유하는 5' TAAGCAGGATCCTGAGTGTACCACCATTGGAAGAAATG 3'(서열번호 10)로 나타난다.
증폭된 단편들은 상술한 바와 같이 1%의 아가로즈 겔로부터 분리된 후 엔도뉴클레아제 BamHI로 분해되고 또 다시 1%의 아가로즈 겔상에서 정제된다.
분리된 단편과 탈포스포릴화 벡터를 이후에 T4 DNA 리가제로 결합한다. 대장균 HB101 세포를 형질전환하고, 플라스미드 pC1를 함유하는 박테리아를 동정한다.삽입된 유전자의 서열과 배향은 DNA 서열분석으로 확인한다.
CHO-DHFR-세포의 형질감염
활성 DHFR 효소가 결손된 중국 햄스터 난소 세포를 형질감염에 사용한다. 리포펙팅 방법(Felgenr 등, 상기 참조)을 사용하여 발현 플라스미드 C1 5㎍을 0.5㎍의 플라스미드 pSV 네오로 공동 형질감염한다. 플라스미드 pSV2-네오는 우세한 선택성 마커를 함유하는 데, 여기서 유전자의 네오는 G418을 비롯한 항생제 군에 내성을 부여하는 효소를 암호화하는 Tn5로부터 유래한다. 이 세포를 1 mg/ml의 G418로 보충된 알파 마이너스 MEM에 시드한다. 2일후에, 세포에 트립신을 첨가하고 하이브리도마 클로닝 평판(Greiner, Germany)에 시드한 후 10-14일간 배양한다. 이 기간후에 단일클론을 트립신을 첨가하고 여러가지 농도의 메토트렉세이트(25nM, 50nM, 100nM, 200nM, 400nM)을 사용하여 6-웰 페트리 디쉬에 시드한다. 메토트렉세이트의 심지어 높은 농도(500nM, 1μM, 2μM, 5μM)를 함유하는 새로운 6-웰 평판에 가장 높은 농도의 메토프렉세이트에서 성장하는 클론을 옮긴다. 클론이 100μM의 농도에서 증식될때까지 동일한 절차를 반복한다.
소정의 유전자 생성물의 발현은 웨스턴 블럿 분석과 SDS-PAGE에 의해 분석한다.
실시예 5
실험관내에서 재조합 KFG-2의 전사 및 번역
PCR 생성물은 KFG-2의 곤충세포 발현에 사용되는 pA2 벡터중의 클론화된 cDNA로부터 유래한 것이다. 이 PCR에 사용되는 프라이머는 다음과 같다: 5'ATTAACCCTCACTAAAGGGAGGCCATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCC 3'(서열번호 11) 및 5' CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG 3'(서열번호 12).
첫번째, 프라이머는 ATG 개시 코돈에 T3 프로모터 5'의 서열을 함유한다. 두번째 프라이머는 KFG-2 오픈 리딩 프레임의 3'말단에 상보적인 것으로 정지 코돈의 역 보체를 암호화한다.
산출된 PCR 생성물은 Qiagen으로 부터 상업적으로 시판되는 키트를 사용하여 정제한다. 0.5㎍의 상기 DNA 를 시험관내에서 전사-번역 반응의 템플레이트로서 사용한다. TNT라는 이름으로 Promega로부터 시판되는 키트를 사용하여 이 반응을 수행한다. 분석은 기질로서 방사적으로 활성 표지된 메티오닌을 사용하여 키트의 지침서에 기재된 바와 같이 수행하되, 단 지시된 시약양의 1/2 되는 양만 사용하고 또한 반응은 1.5시간동안 33℃에서 수행하는 것을 다르게 한다.
5㎕의 반응물을 변성하는 10 내지 15%의 폴리아크릴아미드 겔에 전기영동적으로 분리한다. 이 겔을 물:메탄올:아세트산이 6:3:1의 부피비를 갖는 혼합물 중에서 30분간 정치한다. 겔을 열 및 진공하에서 건조하고 16시간동안 X-선 필름에 노출한다. 필름을 현상하면, 개념적으로 번역된 KFG-2에 크기적으로 대응하는 방사활성 단백질의 밴드가 보이는데. 이는 KFG-2의 클론 cDNA가 예상된 크기의 단백질을 암호하는 오픈 리딩 프레임을 함유함을 강력히 제시한다.
실시예 6
유전자 치료법을 통한 발현
섬유아세포는 스킨 조직 절편에서 얻는다. 조직 배양 매질중에 생성된 조직을 놓고 조그만 조각의 단편으로 자른다. 조그만 단편의 조직을 조직 배양 플라스크의 습윤된 표면상에 두고, 약 10 조각을 각 플라스크에 넣는다. 플라스크를 뒤집어 밀폐한 후 실온에서 밤새도록 방치한다. 실온에서 24시간 방치한 후에, 플라스크를 다시 뒤집고 조직 단편을 플라스크 바닥에 고정한 후 신선한 배지(예, Ham's F12 배지, 10%의 FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신)를 첨가한다. 이것을 37℃에서 항온배양하는데 약 1주일간 한다. 이때에 신선한 배지를 가하고 매 2-3일 마다 바꾸어준다. 배양액중에서 추가로 2주간 더 유지하면 섬유아세포 단층이 나타난다. 단층을 트립신을 첨가하고 커다란 플라스크내로 스케일링한다.
Moloney 쥐의 육종 바이러스의 LTR에 인접한 pMV-7(Kirschmeier, P.T.등,DNA, 7:219-25(1988))을 EcoRI 및 HindIII으로 분해한다. 이후에 송아지의 장 인산염으로 처리한다, 유리 비드를 사용하여, 선형 벡터를 아가로즈 겔상에 분별하고 정제한다.
본발명의 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 5' 및 3' 말단 서열에 각기 대응하는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭한다. EcoRI 부위를 함유하는 5' 프라이머 및 3' 프라이머는 HindIII를 더 함유한다. Moloney 쥐의 육종 바이러스 선형 백본과 증폭된 EcoRI 및 HindIII 단편 동량을 함께 첨가하되, 이때 T4 DNA 리가제의 존재하에 수행한다. 산출된 혼합물을 두개의 단편을 결합시키는 적당한 조건하에서 유지한다. 결합 혼합물을 사용하여 박테리아 HB 101을 형질전환하고, 이후에 이를 아가 함유의 카나마이신상에 도말하여 벡터가 대상 유전자를 적절히 삽입했나를 확인한다.
양쪽성의 pA317 또는 GP + am12 패키징 세포를 조직 배양물중에서 10%의 송아지 혈청(CS), 페니실린 및 스트렙토마이신과 함께 증식하는데 DMEM(Dulbecco 의 Modified Eagle Medium)의 합류 밀도로 증식시킨다. 그 유전자를 함유하는 MSV 벡터를 배지에 가하고 패키징 세포를 벡터로 형질도입한다. 그 결과 패키징 세포는 그 유전자를 함유하는 감염성 바이러스 입자를 생산한다(패키징 세포는 현재 생산자 세포로도 지칭되고 있음).
신선한 배지를 형질도입된 생산자 세포에 가하고, 배지를 합류성 생산자 세포의 10cm 평판으로부터 수거한다. 감염성 바이러스 입자를 함유하는 사용된 배지를 미세 공극 필터에 여과시켜 분리된 생산자 세포를 제거하고, 이 배지를 사용하여 섬유아세포를 감염시킨다. 배지를 섬유아세포의 준 합류성 평판에서 제거한 후 생산자 세포의 배지와 재빨리 대체한다. 이 배지를 제거하고 새로운 배지로 대체한다. 바이러스 역가가 높으면, 실질적으로 모든 섬유아세포는 감염되므로 선택은 필요치 않다. 역가가 매우 낮다면 그때는neo또는his같은 선택성 마커를 지닌 리트로바이러스 벡터를 사용하는 것이 필요하다.
가공된 섬유아세포를 이후 숙주에 삽입하는데, 단독으로 삽입하던지 아니면 시토덱스 3 마이크로담체 비드상의 합류점까지 증식한 후에 삽입한다. 그 결과 섬유 아세포는 단백질 생성물을 생산한다.
실시예 7
당뇨병을 앓고 있는 마우스 모델에서 KFG-2 자극에 의해 상처를 치료하는 방법
KFG-2에 의해 치유 과정이 촉진됨을 입증하기 위해서, 상처 치료과정을 거치고 있는 유전학적으로 당뇨병에 걸린 마우스 모델을 사용한다. db+/db+ 마우스에서 전두께의 상처를 치료받고 있는 모델은 손상된 상처 치료과정이 잘 특성화되고, 임상적으로 관련있고, 또 재생이 가능한 모델이다. 당뇨병성 상처를 치유하는 것은 과립화 조직을 형성하느냐에 좌우되며 수축보다는 상피세포가 다시 재생하느냐에 달려있다(Gartner, M.H.등,J. Surg, Res. 52:389(1992); Greenhalgh, D.G.등Am, J. Pathol, 136:1235(1990).
당뇨병에 걸린 동물들은 유형 II의 당뇨병 멜리터스에서 관찰되는 많은 특징들을 가진다. 동형 접합(db+/db+) 마우스들은 정상의 이형 접합(db+/+m)의 한배 새끼와 비교해볼때 뚱뚱하다. 변이된 당뇨병 마우스(db+/db+)는 염색체 4(db+)상에 단일의 상염색체 후퇴 변이를 가지고 있다(Coleman 등.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:283-293(1982)). 상기 동물들은 다식증, 번갈증, 다뇨증을 나타낸다. 변이된 당뇨병 마우스(db+/db+)는 혈당량이 올라가고, 정상의 또는 증가된 인슐린 레벨을 나타내며 세포가 조절하는 면역을 억제한다(Mandel등,J.Immunol. 120:1375(1978);Debray-Sachs, M등,Clin. Exp. Immunol 51(1):1-7(1983); Leiter 등,Am. J. of Pathol. 114:46-55(1985)). 말초 신경병, 심혈관 합병증, 심혈관 병변, 기저막 농후화증 및 사구체 여과 비정상증이 이들 동물에게서 나타난다(Norido, F등,Exp. Neurol, 83(2):221-232(1984); Robertson등., Diabetes29(1):60-67(1980);Giacomelli 등d,Lab Invest, 40(4):460-473(1979); Coleman, D.L.,Diabetes 31(Suppl):1-6(1982). 이들 동형 접합 당뇨병 마우스는인간 유형 II 당뇨병에 유사한 인슐린에 내성이 있는 과다혈당증을 진행시킨다(Mandel등,J. Immunol. 120:1375-1377(1978)).
이들 동물에게서 관찰되는 특성은 이 모델에서의 치유가 인간의 당뇨병에서 관찰되는 치유와 유사할 수도 있다는 것을 제시한다(Greenhalgh 등,Am. J. of Pathol. 136:1235-1246(1990)). 이 연구 결과는 KFG-2가 당뇨병을 앓고 있는 이형 접합의 한배 새끼와 당뇨병을 앓고 있지 않은 이형 접합의 한배 새끼에서 상처 전두께를 치료하는데 있어서 강력한 자극 효과를 가진다는 것을 입증한다. 콜라겐 섬유, 진피내의 과립 조직에서의 증가 및 상피세포의 재구축이라는 놀라운 효과가 KFG-2로 치료한 동물에서 나타났다. 성장 인자를 외부적으로 투여한다는 것은 염증 세포를 상처부위로 유인하므로써 과립 조직을 형성하는 것을 촉발할 수있다.
동물
유전학적으로 당뇨병이 있는 암컷 C57BL/KsJ(db+/db+) 마우스와 당뇨병이 없는 (db+/+m) 이형 접합 한배 새끼를 이 연구에 사용하였다(Jackson Laboratories). 이 동물들은 6주령때 구입하여 8주령일때 연구를 시작하였다. 동물을 개별적으로 우리에 가두고 음식과 물 그리고 리비튬을 투여받게 하였다. 무균 기술을 사용하여 모든 과정을 수행하였다. 실험은 휴먼 게놈 사인언시스 코오포레이티드의 동물 취급 및 사용 위원회의 규칙과 가이드라인, 실험실 동물의 취급 및 사용에 대한 가이드 라인에 따라 수행하였다.
KGF-2
창상 치유 연구에 사용되는 재조합 사람 KGF-2를 과발현시키고, E. coli 발현 벡터 시스템(pQE-9, Qiagen 사)인 pQE60-Cys37로부터 정제하였다. 이 작제물(construct)로부터 발현된 단백질은 단백질의 N-말단에 결합된 6X(His) 태그가 있는 37번 위치의 시스테인으로부터 208번 위치의 세린까지의 KGF-2 이다(서열 번호 : 29-30)(도 15). 95% 이상의 순수 재조합 재료를 포함하는 분획물을 실험에 사용하였다. 100mM 트리스, 8.0 및 600mM NaCl를 함유하는 비히클 내에서 케라티노사이트 성장 인자(Keratinocyte growth factor)-2를 제제화하였다. 최종 농도는 모액(stock solution) 80㎍/㎖ 및 8㎍/㎖ 였다. 동일한 비히클을 사용하여 모액으로부터 희석하였다.
수술 창상
이전에 보고된 방법[Tsuboi, R. 및 Rifkin, D.B., J. Exp. Med. 172:245-251(1990)]에 따라 창상 프로토콜을 수행하였다. 요약하면, 창상을 형성시키는 날, 탈이온수에 용해시킨 아버틴(Avertin, 0.01mg/㎖), 2,2,2-트리브로모에탄올 및 2-메틸-2-부탄올의 복강내 주사로 동물을 마취시켰다. 동물의 배면부의 털을 제거하고, 70% 에탄올 용액 및 요오드로 피부를 세척하였다. 창상 형성 이전에 수술 부위를 멸균 가제로 건조시켰다. Keyes 조직 펀치를 사용하여 8mm 의 충분한 두께로 창상을 입혔다. 창상을 입힌 이후 즉시 주변 피부를 부드럽게 펴서 창상 팽창을 억제하였다. 실험 기간 동안 창상 부위를 개방한 채로 두었다. 창상을 입힌 날로부터 시작하여 5일 연속으로 국소적인 처리를 적용하였다. 처리 이전에, 멸균 염수 및 가제 스폰지로 창상 부위를 부드럽게 세척하였다.
수술일 및 이후 이틀 간격으로 창상을 시각적으로 관찰하고, 고정된 거리에서 사진을 찍었다. 1-5일에 매일 및 8일째에 창상 폐쇄(closure)를 측정하였다. 눈금이 있는 제임슨(Jameson) 캘리퍼를 사용하여 수평 및 수직으로 창상을 측정하였다. 과립 조직이 더 이상 보이지 않고, 창상이 연속된 상피 조직으로 덮여지는 경우에 창상이 치유된 것으로 간주하였다.
두 개의 상이한 용량의 KGF-2 를 사용하여, 즉, 비히클 50㎕ 중에, 하나는 1일 1 창상 당 4㎍으로 8일간, 다른 하나는 1일 1 창상 당 40㎍으로 8일간 KGF-2 를 투여하였다. 비히클 대조군은 50㎕의 비히클 용액을 투여하였다.
동물을 8일째에 소듐 펜토바르비탈(300mg/kg)의 복강내 주사로 안락사시켰다. 조직학적 및 면역조직화학적 연구를 위하여 창상 및 이를 둘러싼 피부를 수집하였다. 추가 처리를 위하여 생체 검사 스폰지 사이의 조직 카세트 중의 10%의 중성 완충 포르말린에 조직 견본을 놓았다.
실험 계획
10마리 동물의 3개 군 각각(5마리의 당뇨 및 5마리의 비-당뇨 대조군)을 평가하였다:
1) 비히클 위약 대조군
2) KGF-2 4㎍/일 및
3) KGF-2 40㎍/일
본 연구를 다음과 같이 계획하였다:
N 군 처리
N=5 db+/db+N=5 db+/+m 비히클비히클 50㎕50㎕
N=5 db+/db+N=5 db+/+m KGF-2KGF-2 4 ㎍/50㎕4 ㎍/50㎕
N=5 db+/db+N=5 db+/+m KGF-2KGF-2 40㎍/50㎕40㎍/50㎕
창상 면적 및 폐쇄 측정
수직 및 수평 축으로 면적을 측정하여 창상 부위의 총 평방 면적을 얻어 창상 폐쇄를 분석하였다. 그 후, 초기 창상 면적(0일 째) 및 처리 이후의 창상 면적(8일 째) 사이의 차이를 측정하여 수축을 평가하였다. 1일 째의 창상 면적은 64㎟ 이었고, 피부 펀치의 크기와 일치하였다. 하기 식을 사용하여 계산하였다:
[8일 째의 개방 면적] - [1일 째의 개방 면적]/[1일 째의 개방 면적]
조직학
10% 완충 포르말린에 표본을 고정하고, 파라핀 함유 블록을 창상 표면(5㎛)에 수직으로 분할하고, 라이헤르트-융(Reichert-Jung) 마이크로톰(microtome)을 사용하여 절개하였다. 양분된 창상의 횡단면에 통상의 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색을 수행하였다. 치유 과정 및 치료한 피부의 형태학적 외관이 KGF-2 처리에 의하여 변화가 있었는지를 평가하기 위해 창상에 대한 조직학적 검사가 사용되었다. 본 평가는 세포 축적, 염증 세포, 모세혈관, 섬유아세포, 재-상피화(re-epithelialization) 및 표피 성숙의 존재 확인을 포함한다[Greenhalgh, D.G.et al., Am. J. Pathol. 136:1235(1990)](표 1). 맹검 관측자(blinded observer)가 눈금이 있는 렌즈 마이크로미터를 사용하였다.
면역조직화학
재-상피화
ABC 엘리트(Elite) 검출 시스템을 사용하여 폴리클로날 토기 항-사람 케라틴 항체로 조직 절편을 면역조직화학적으로 염색하였다. 사람의 피부를 양성 조직 대조군으로 사용하는 한편, 비-면역 IgG를 음성 대조군으로 사용하였다. 눈금이 있는 렌즈 마이크로미터를 사용하여 창상의 재상피화 정도를 평가하여 케라티노사이트 성장을 결정하였다.
세포 증식 마커
피부 표본의 증식 세포 핵 항원/사이클린(Proliferating cell nuclear antigen/cyclin, PCNA)을 항-PCNA 항체(1:50)를 사용하여 ABC 엘리트 검출 시스템으로 나타내었다. 양성 조직 대조군으로 사람 클론 암을 사용하고, 음성 조직 대조군으로 사람 뇌 조직을 사용하였다. 각각의 표본은 주요(primary) 항체가 누락되고, 비-면역 마우스 IgG 로 대체된 절편을 포함하였다. 이들 절편의 증식을 낮은 증식을 나타내는 쪽부터 높은 증식을 나타내는 쪽까지 0-8의 단계로 나타내어 증식의 정도를 표시한다.
통계 분석
언페어드 t 테스트(unpaired t test)를 사용하여 실험 데이터를 분석하였다. ＜0.05의 p값은 유의적인 것으로 고려되었다. 상기 데이터를 평균±SEM으로 표현하였다.
결과
창상 폐쇄에 있어서 KGF-2의 효과
당뇨병 마우스는 이형접합성 정상 마우스에 비하여 손상된 치유 과정을 나타내었다. 부위 당 KGF-2 4㎍의 용량은 당뇨병 동물과 비당뇨병 동물에서의 최대 반응을 생성하는 것으로 보였다(도 5, 6). 이들 결과는 완충 대조군과 비교했을 때 통계학적으로 유의 수준의 것이었다(p=0.002 및 p＜0.0001). KGF-2로 처리함으로써, 4㎍/일을 투여받은 군에서는 60.6%, 그리고 40㎍/일을 투여받은 군에서는 34.5%의 최종 평균 폐쇄가 나타났다. 완충 대조군에서는 8일째까지 단지 3.8%만의 창상 폐쇄가 나타났다. 창상 발생 2 내지 5일째에, 그리고 8일째에, KGF-2로 처리한 db+/db+ 마우스의 창상 부위 측정을 반복하였는 바, 창상 발생 3일 후에 완충 대조군과 비교할 때 총 창상 면적(㎟)의 유의적인 개선이 증명되었다. 개선은 계속되었고, 실험 말기에 통계학적으로 유의적인 결과가 관찰되었다(도 7). KGF-2를 투여받은 db/+m 군의 동물에서도 반복적인 측정 결과, 완충 대조군에 비하여 창상 면적이 크게 감소한 것으로 나타났다(도 8). 이러한 결과는 KGF-2 처리 동물의 빠른 창상 폐쇄 속도를 증명하는 것이었다.
조직학적 스코어에 대한 KGF-2의 효과
8일째에 당뇨병(db+/db+) 모델에서 KGF-2의 조직학적 평가로, 완충 대조군과 비교할 때, 창상 스코어에 있어서 통계학적으로 유의적인 개선이 입증되었다 (p＜0.0001). KGF-2의 용량 4㎍과 40㎍ 모두에서 관찰된 약리학적 효과는 통계학적으로 서로 상이한 것이 아니었다. 완충 대조군은 과립화 조직이나 상피 주행이 없는 최소 세포 축적을 나타낸 반면, KGF-2 4㎍ 및 40㎍ 용량(각각 p＜0.0001 &p=0.06)은 창상을 덮은 상피, 신혈관 형성, 과립화 조직 형성 및 섬유 아세포 및 콜라겐 침착을 나타내었다(도 9).
피부 창상의 조직학적 평가는 헤마톡실린-에오신 염색 샘플에서 수행하였다. 스코어링 표준은 1 내지 12 단계, 즉, 과립화가 거의 없거나 전혀 없는 최소 세포 축적을 나타내는 1 단계로부터 섬유아세포의 풍부한 존재, 콜라겐 침착 및 창상을 덮은 신규 상피를 나타내는 12 단계까지를 포함하였다(표 1).
[표 1] 조직학 분야의 스코어
스코어 표준
1-3 최소 세포 축적 없음. 과립 조직 또는 상피 주행 없음.
4-6 염증성 세포에 의하여 지배되나, 약간의 섬유아세포, 모세혈관 또는 콜라겐 침착이 있는 얇고 미성숙한 과립. 최소 상피 이동.
7-9 염증성 세포에 의하여 지배되는 영역으로부터 더 많은 섬유아세포 및 콜라겐 침착 영역까지 포함할 수 있는 적당히 두꺼운 과립 조직. 광대한 신혈관 형성. 상피는 최소 내지 적당한 이동 범위일 수 있음.
10-12 섬유아세포 및 광범위한 콜라겐 침착에 의하여 지배되는 두꺼운 혈관 과립화 조직. 상피는 부분적으로 내지 완전히 창상을 덮음.
KGF-2 양자 모두의 용량 투여 후, 비당뇨병 한배새끼의 평가는 평가된 모든 측정에 대한 완충 대조군과 비교할 때 유의적인 활성을 보이지 않는 것으로 나타났다(도 10). 완충 대조군은 미성숙 과립 조직, 염증성 세포 및 모세혈관을 나타내었다. 평균 스코어는 당뇨병 (db+/db+) 마우스의 손상된 치유 과정을 나타내는 당뇨병 군보다 높았다.
재-상피화에 대한 KGF-2의 효과
사이토케라틴 면역염색법을 사용하여 재-상피화의 정도를 측정하였다. 0(폐쇄되지 않음) 내지 8(완전한 폐쇄)의 단계로 폐쇄의 정도에 기초하여 스코어를 표시하였다. 4㎍/일을 투여한 군에서는 완충 대조군과 비교할 때 재-상피화의 스코어에 통계학적으로 유의적인 개선이 있었다(p＜0.001)(도 11). 상기 군에 있어서, 케라티노사이트는 창상을 덮은 새로 형성된 상피에 편재하는 것으로 관찰되었다. 또한, KGF-2 양자 모두의 용량은 다양한 단계에서 유사분열 형상(mitotic figure)이 나타났다. KGF-2 양자 모두의 용량에서 비당뇨병 군의 평가에서도 재상피화 수준이 유의적으로 개선된 것으로 나타났다(각각 p=0.006 및 0.01)(도 12).
세포 증식에 대한 KGF-2의 효과
증식 세포 핵 항원 면역염색법으로 4㎍ 및 40㎍ 군 양자 모두에서 유의적인 증식이 있었음이 증명되었다(도 13). 비당뇨병 군은, KGF-2의 두 용량 투여군과 유사한 결과를 나타내었는데, 이들은 완충 대조군과 비교할 때 상당히 유의적인 스코어를 나타내었다(도 14). 특히 표피의 기저 층에서 표피 증식이 관찰되었다. 또한, 진피, 특히 모낭에서 고 밀도 PCNA-표지된 세포가 관찰되었다.
결론
결과는 KGF-2가 주요 표피 케라티노사이트의 성장을 특이적으로 자극한다는 것을 증명한다. 또한, 이러한 실험은 국부 적용된 재조합 사람 KGF-2가 당뇨병 마우스의 완전한 두께로 절개된 표피 창상의 치유 속도를 현저하게 촉진시킨다는 것을 증명한다. 조직학적 평가는 KGF-2가 표피 두께를 두껍게 하는 케라티노사이트 증식을 유도한다는 것을 보여준다. 이러한 증식은 증식 세포 핵 항원(PCNA)에 의하여 증명된 바와 같이 표피의 기저층에 편재된다. 진피 수준에서, 콜라겐 침착, 섬유아세포 증식 및 신혈관 형성은 피부의 정상적인 구조를 재형성하였다.
PCNA-표지 세포가 거의 없는 완충 군과는 대조적으로 KGF-2 처리된 동물의 고밀도의 PCNA-표지 세포는 모낭, 섬유아세포 및 진피-표피 수준에서의 케라티노사이트의 자극을 나타낸다. KGF-2에 의한 치유 과정의 향상은 본 실험에서 계속적으로 관찰되었다. 이러한 효과는 평가된 파라미터(재-상피화 % 및 상처 폐쇄 %)에서 통계학적으로 유의적인 것이었다. PCNA-표지된 케라티노사이트는 표피의 아래쪽 기저층에서 주로 관찰되었다는 것이 중요하다. 진피는 섬유아세포, 콜라겐 및 과립화 조직을 갖는 정상화된 조직을 나타내었다.
비당뇨병 동물에서 관찰된 활성은, 매일매일의 측정에 기초할 때 실험 경과 중뿐만 아니라 8일째에, KGF-2가 창상 폐쇄의 퍼센트에 있어서 유의적인 약리학적 반응을 보인다는 것을 타나낸다. 조직병리학적 평가가 완충 대조군과 비교할 때 유의적으로 상이한 것이 아니었음에도 불구하고, 케라티노사이트 성장 및 PCNA 스코어는 유의적인 효과를 증명하였다.
요약하면, 이러한 결과는, db+/db+ 마우스 모델을 사용한 손상된 절개 창상 및 정상적 절개 창상 양자 모두에 있어서 KGF-2가 유의적인 활성을 나타내고, 따라서, 수술 창상, 당뇨병성 궤양, 정맥 울혈 궤양, 화상 및 기타 피부 증상을 비롯한 창상의 치료에 유용할 것임을 입증하는 것이었다.
실시예 8
스테로이드-손상 랫트 모델에서 KGF-2 매개 창상 치유
스테로이드에 의한 창상 치유의 억제는 다양한 시험관내 및 생체내 시스템에서 잘 증명되어 있다[Wahl, S.M. Glucocorticoids and Wound healing. In Anti-Inflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects. 280-302(1989); Wahl, S.M.et al., J. Immunol. 115:476-481(1975); Werb, Z.et al., J. Exp. Med. 147:1684-1694(1978)]. 글루코코르티코이드는 혈관형성 유도(angiogenesis)를 억제하고, 혈관 투과성을 감소시키며[Ebert, R.H.,et al., An. Intern. Med.37:701-705(1952)], 섬유아세포 증식을 감소시키고, 콜라겐 합성을 감소시시며[Beck, L.S.et al., Growth Factors. 5: 295-304(1991); Haynes, B.F., et al.,J. Clin. Invest. 61: 703-797(1978)], 순환 모노사이트의 일시적인 감소를 유도함[Haynes, B.F.,et al., J. Clin. Invest. 61: 703-797(1978); Wahl, S.M. Glucocorticoids and wound healing.In AntiinflammatorySteroid Action: Basic and Clinical Aspects. Academic Press. New York. pp280-302(1989)]에 의하여 창상 치유를 지연시킨다. 스테로이드의 전신 투여가 창상 치유를 손상시킨다는 것은 랫트에서 관찰된 현상으로 잘 알려져 있다[Beck, L.S.et al., Growth Factors. 5: 295-304(1991); Haynes, B.F., et al.,J. Clin. Invest. 61: 703-797(1978); Wahl, S.M. Glucocorticoids and wound healing.In AntiinflammatorySteroid Action: Basic and Clinical Aspects. Academic Press. New York. pp280-302(1989); Pierce, G.F., et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 2229-2233(1989)].
KGF-2가 치유를 촉진시킨다는 것을 증명하기 위하여, 치유 과정이 메틸프레드니솔론의 전신 투여에 의하여 손상된 랫트에 있어서 완전한 두께로 절개된 피부 창상에 대하여 KGF-2를 다중 국소 적용한 효과를 평가하였다. 시험관내 연구는KGF-2가 주요 사람 표피 케라티노사이트의 성장을 특이적으로 자극한다는 것을 증명하였다. 이러한 실시예는, 눈금이 있는 제임슨 캘리퍼을 사용한 창상 간격 측정에 의하여, 그리고 조직형태학 및 면역조직화학에 의하여, 국소 적용된 재조합 사람 KGF-2가 랫트의 완전한 두께로 절개된 창상의 치유를 촉진시킨다는 것을 증명한다. 조직학적 평가는 KGF-2가 재-상피화를 촉진하고, 이에 따라 창상 회복을 촉진한다는 것을 증명한다.
동물
본 실시예에서는 몸무게가 250 내지 300g인 젊고 성숙한 수컷 스프라그 다울리 랫트(Sprague Dawley rats; Charles River Laboratories)를 사용하였다. 동물들은 8주된 것을 구입하였고, 연구 시작시에 9주된 것이었다. 랫트의 치유 반응은 창상 생성시에 메틸프레드니솔론의 전신 투여(17mg/kg/랫트, 근육내 투여)에 의하여 손상되었다. 동물들을 개별적으로 거주하게 하고, 무제한으로 음식물 및 물을 주었다. 모든 조작은 무균 기술을 이용하여 수행하였다. 이러한 연구는 휴먼 게놈 사이언스 인크.(Human Genome Sciences, Inc. Institutional Animal Care and Use Committee and the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals) 등의 규칙 및 가이드라인에 따라 수행하였다.
KGF-2
재조합 사람 KGF-2를 과발현시키고, E. coli 발현 벡터 시스템(pQE-9, Qiagen 사)인 pQE60-Cys37로부터 정제하였다. 이 작제물로부터 발현된 단백질은 단백질의 N-말단에 결합된 6X(His) 태그가 있는 37번 위치의 시스테인으로부터 208번 위치의 세린까지의 KGF-2 이다(서열 번호 : 29-30)(도 15). 95% 이상의 순수 재조합 재료를 포함하는 분획물을 실험에 사용하였다. 1X PBS를 함유하는 비히클 내에서 KGF-2를 제제화하였다. 최종 농도는 모액 20㎍/㎖ 및 80 ㎍/㎖ 였다. 동일한 비히클을 사용하여 모액으로부터 희석하였다.
KGF-2△28을 과발현시키고, E. coli 발현 벡터 시스템으로부터 정제하였다. 95% 이상의 순수 재조합 재료를 포함하는 분획물을 실험에 사용하였다. 1X PBS를 함유하는 비히클 내에서 KGF-2를 제제화하였다. 최종 농도는 모액 20㎍/㎖ 및 80 ㎍/㎖ 였다. 동일한 비히클을 사용하여 모액으로부터 희석하였다.
수술 창상
상기 실시예 7의 방법에 따라 창상 프로토콜을 수행하였다. 창상을 형성시키는 날, 케타민(50mg/kg) 및 크실라진(5mg/kg)의 근육내 주사로 동물들을 마취시켰다. 동물의 배면부의 털을 제거하고, 70% 에탄올 용액 및 요오드로 피부를 세척하였다. 창상 형성 이전에 수술 부위를 멸균 가제로 건조시켰다. Keyes 조직 펀치를 사용하여 8mm 의 충분한 두께로 창상을 입혔다. 실험 기간 동안 창상 부위를 개방한 채로 두었다. 창상을 입힌 날로부터 시작하여 7일 연속으로 시험 물질을 국소적으로 적용하고, 이어서 메틸프레드니솔론을 투여하였다. 처리 이전에, 멸균 염수 및 가제 스폰지로 창상 부위를 부드럽게 세척하였다.
창상 형성일 및 처리 말기에 창상을 시각적으로 관찰하고, 고정된 거리에서 사진을 찍었다. 1-5일에 매일 및 8일째에 창상 폐쇄를 측정하였다. 눈금이 있는 제임슨 캘리퍼를 사용하여 수평 및 수직으로 창상을 측정하였다. 과립 조직이 더이상 보이지 않고, 창상이 연속된 상피 조직으로 덮여지는 경우에 창상이 치유된 것으로 간주하였다.
두 개의 상이한 용량의 KGF-2 를 사용하여, 즉, 비히클 50㎕ 중에, 하나는 1일 1 창상 당 1㎍으로 5일간, 다른 하나는 1일 1 창상 당 4㎍으로 5일간 KGF-2 를 투여하였다. 비히클 대조군은 1X PBS 50㎕를 투여하였다.
동물을 8일째에 소듐 펜토바르비탈(300mg/kg)의 복강내 주사로 안락사시켰다. 조직학적 연구를 위하여 창상 및 이를 둘러싼 피부를 수집하였다. 추가 처리를 위하여 생체 검사 스폰지 사이의 조직 카세트 중의 10%의 중성 완충 포르말린에 조직 견본을 놓았다.
실험 계획
10마리 동물의 4개 군 각각(5마리의 메틸프레드니솔론 처리군 및 5마리의 글루코코르티코이드 미처리군)을 평가하였다:
1) 미처리 군
2) 비히클 위약 대조군
3) KGF-2 1㎍/일 및
4) KGF-2 4㎍/일.
본 연구를 다음과 같이 계획하였다:
n 군 처리
·글루코코르티코이드-처리
N=5미처리-
N=5비히클50㎕
N=5KGF-2(1㎍)50㎕
N=5KGF-2(4㎍)50㎕
·글루코코르티코이드 없음
N=5미처리-
N=5비히클50㎕
N=5KGF-2(1㎍)50㎕
N=5KGF-2(4㎍)50㎕
창상 면적 및 폐쇄 측정
수직 및 수평 축으로 면적을 측정하여 창상 부위의 총 평방 면적을 얻어 창상 폐쇄를 분석하였다. 그 후, 초기 창상 면적(0일 째) 및 처리 이후의 창상 면적(8일 째) 사이의 차이를 측정하여 폐쇄를 평가하였다. 1일 째의 창상 면적은 64㎟ 이었고, 피부 펀치의 크기와 일치하였다. 하기 식을 사용하여 계산하였다:
[8일 째의 개방 면적] - [1일 째의 개방 면적]/[1일 째의 개방 면적]
조직학
10% 완충 포르말린에 표본을 고정하고, 파라핀 함유 블록을 창상 표면(5㎛)에 수직으로 분할하고, 올림푸스 마이크로톰을 사용하여 절개하였다. 양분된 창상의 횡단면에 통상의 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색을 수행하였다. 치유 과정 및 치료한 피부의 형태학적 외관이 KGF-2 치료에 의하여 향상되었는지를 창상에 대한 조직학적 검사로 평가하였다. 맹검 관측자가 눈금이 있는 렌즈 마이크로미터를 사용하여 상처 간격의 거리를 측정하였다.
통계 분석
언페어드 t 테스트를 사용하여 실험 데이터를 분석하였다. ＜0.05의 p값은 유의적인 것으로 고려되었다. 상기 데이터를 평균±SEM으로 표현하였다.
결과
메틸프레드니솔론을 처리한 것과 처리하지 않은 미처리 대조군의 창상 폐쇄의 비교를 통하여 메틸프레드니솔론-처리 랫트가 정상 마우스에 비하여 창상 형성 8일 후에 창상 처리 과정의 상당한 손상이 있다는 것이 증명되었다. 총 창상 면적은 메틸프레드니솔론 주사 군에서 58.4㎟, 글루코코르티코이드 미처리 군에서 22.4㎟인 것으로 측정되었다(도 16).
창상 폐쇄에 대한 KGF-2의 효과
창상 형성시에 랫트에게 메틸프레드니솔론을 전신적으로 투여하면 정상 랫트의 창상 폐쇄가 지연되었다(p=0.002). 8일째 실험 말기에 메틸프레드니솔론-손상 군의 창상 폐쇄 측정을 통하여, KGF-2 처리한 경우 창상 폐쇄가 미처리 군과 비교할 때 통계적으로 매우 유의적으로 높다는 것(1㎍ p=0.002 & 4㎍ p=0.005)이 증명되었다(도 16). 1㎍ KGF-2를 투여받은 군에서 창상 폐쇄 퍼센트는 60.2%였고(p=0.002), 4㎍ KGF-2를 투여받은 군에서 창상 폐쇄 퍼센트는 73%였다(p=0.0008). 반면에, 미처리 군의 창상 폐쇄는 12.5%였고, 비히클 위약 군은 28.6%였다(도 17).
1 내지 8일에, 글루코코르티코이드 군에서의 창상 폐쇄의 세로 분석으로,KGF-2 처리된 군의 두 개의 용량 모두에서 창상 형성 3일 내지 8일째에 창상 크기의 유의적인 감소가 나타났다(도 18).
결과는, KGF-2 4㎍로 처리한 군은 미처리 군과 비교했을 때 통계학적 유의 수준으로 창상 폐쇄가 촉진되었음을 증명한다(p=0.05)(도 19A). 정상적인 동물의 창상 치유를 촉진시키는 단백질 또는 기타 화합물의 능력을 평가하는 것이 어려운 일임에도 불구하고(왜냐하면 회복이 빠르기 때문에), KGK-2는 이러한 모델에서 창상 치유를 촉진하는 것으로 나타났다.
KGF-2 처리 창상의 조직병리학적 평가
창상 간격의 조직형태학은 KGF-2 처리 군의 창상 거리가 감소되었음을 나타내었다. 미처리 군에서 관찰된 창상 간격은 5336μ였던 반면, KGF-2 1㎍ 처리 군은 창상 간격이 2972μ로 감소되었으며, KGF-2 4㎍ 처리 군은 창상 간격이 3086μ로 감소되었다(p=0.04)(도 20).
창상 치유에 있어서 KGF-2△28의 효과
메틸프레드니솔론 손상 랫트의 창상 치유에 있어서 KGF-2△28 및 PDGF-BB의 효과를 또한 조사하였다. KGF-2△28 단백질에 His 태그를 붙이지 않고, 창상 치유 과정을 2, 4, 6, 8 및 10일째에 측정한 것을 제외하고, 본 실험은 상기 KGF-2 단백질에 대한 것과 동일한 조건하에서 수행하였다. 상기 단백질에 대한 완충 비히클은 전장 KGF-2의 "E2" 제제를 제외한 전부에 대하여 40mM NaOAc 및 150mM NaCl, pH6.5였다. "E2" 제제에 대한 완충 비히클은 20mM NaOAc 및 400mM NaCl, pH6.4였다.
도 19B에 나타낸 결과는 KGF-2△28이 미처리 군에 비하여 통계학적 유의 수준으로 창상 폐쇄를 촉진시키며, 창상 치유에 있어서 메틸프레드니솔론의 효과를 역전시켰다는 것을 증명한다.
결론
본 실시예는 KGF-2가 창상 치유에 있어서 메틸프레드니솔론의 효과를 역전시켰다는 것을 증명한다. 성장 인자의 외인성 적용은 창상내로 염증성 세포를 끌어들임으로써 과립화 조직 형성을 촉진시킬 수 있다. 또한, 메틸프레드니솔론을 투여하지 않은 동물에서 있어서 매일의 측정에 기초할 때, KGF-2가 5일째에 창상 폐쇄 퍼센트에서 유의적인 약리학적 반응을 나타내었음을 보이는 유사한 활성이 관찰되었다. 클루코코르티코이드-손상 창상 치유 랫트 모델은 KGF-2 및 창상 치유 영역에서의 다른 화합물의 측정 효율에 대한 적당하고 재현가능한 모델인 것으로 나타났다.
요약하면, 상기 결과는 글루코코르티코이드 손상 절개 창상 모델 및 정상 절개 창상 모델 양자 모두에 있어서 KGF-2가 유의적인 활성을 나타낸다는 것을 증명한다. 따라서, KGF-2는 수술 창상, 당뇨병성 궤양, 정맥 울혈 궤양, 화상 및 기타 비정상적 창상 치유 증상, 예를 들어, 요독증, 영양 실조, 비타민 결핍증 및 스테로이드 및 항신생물제를 사용한 전신적 치료에 있어서의 창상 치료를 비롯한 창상 치유를 자극하는데 있어서 임상적으로 유용할 것이다.
실시예 9
KGF-2 mRNA 발현의 조직 분포
사람 조직 중의 KGF-2 단백질을 암호하는 유전자의 발현 수준을 조사하기 위하여 전술한 문헌[Sambrooket al.]에 기술된 방법을 이용하여 노던 블롯 분석을 수행한다. 본 발명의 KGF-2의 전체 오픈 리딩 프레임에 상응하는 프로브(서열 번호: 1)를 PCR에 의하여 얻고,rediprimeTMDNA 표지 시스템(아머샴 라이프 사이언스)을 사용하여 제조자의 지시에 따라32P로 표지하였다. 표지 후, CHROMA SPIN-100TM컬럼(클론테크 래버러토리즈, 인크.)을 사용하여 제조자의 프로토콜 넘버 PT1200-1에 따라, 상기 프로브를 정제하였다. 그 후, 정제되고 표지된 프로브를 사용하여, KGF-2를 암호하는 유전자의 발현에 대하여 다양한 사람 조직을 조사하였다.
다양한 사람 조직(H) 또는 사람 면역계 조직(IM)에서 유래한 폴리 A RNA를 함유하는 다중 조직 노던(MTN) 블롯을 클론테크에서 입수하고, 제조자의 프로토콜 넘버 PT1190-1에 따라, ExpressHybTM하이브리드형성 용액(클론텍크) 및 표지된 프로브를 사용하여 조사하였다. 하이브리드 형성 및 세척 후에, 상기 블롯을 장착하고 -70℃에서 밤새도록 필름에 노출시키고, 필름들을 표준 과정에 따라 현상하였다.
대부분의 사람 조직에서 약 4.2kb의 주 mRNA 종이 관찰되었다. 심장, 췌장, 태반 및 난소에 KGF-2 mRNA가 비교적 풍부하였다. 약 5.2kb의 소 mRNA 종도 또한 편재되어 있음이 관찰되었다. 이러한 5.2 mRNA 종의 동일성은 명백하지 않았다.5.2kb 전사가 KGF-2의 연결된 형태 또는 KGF 계의 세 번째 멤버를 대안적으로 암호화할 수 있는 가능성이 있다. KGF-2 cDNA는 4.2kb의 mRNA의 크기와 일치하는 4.1kb였다.
실시예 10
케라티노사이트 증식 분석
진피 케라티노사이트는 피부의 표피에 있는 세포이다. 피부에서 케라티노사이트의 성장 및 유포는 창상 치유에 있어서 중요한 과정이다. 따라서, 케라티노사이트의 증식 분석은 케라티노사이트 성장을 자극하고 결과적으로 창상을 치유하는 데 있어서 단백질 활성의 유용한 지표이다.
그러나, 케라티노사이트는 시험관내에서 성장하기 어렵다. 소수의 케라티노사이트 세포주가 존재한다. 이들 세포주는 상이한 세포 및 유전적 결함을 갖는다. 중요 성장 인자 수용체 또는 성장을 위한 중요 성장 인자의 의존성과 같은 세포 결함에 의한 상기 분석의 복잡화를 피하기 위하여, 상기 분석을 위하여 주요 (primary) 진피 케라티노사이트를 선택한다. 이들 주요 케라티노사이트는 클로네틱스, 인크.(San Diego, CA)에서 구입한다.
알라마블루(alamarBlue)를 사용한 케라티노사이트 증식 분석
알라마블루는 배지에 첨가되었을 때 미토콘드리아에 의하여 대사되는 생육가능한 푸른색 염료이다. 그 다음 상기 염료는 조직 배양 상청액 중에서 붉은색으로 변화된다. 상기 붉은색 염료의 양은 570nm 내지 600nm의 광학 밀도에서의 차이를 측정함으로써 직접적으로 정량할 수 있다. 이러한 측정은 세포 활성 및 세포 수를반영한다.
정상적인 주요 진피 케라티노사이트(CC-0255, NHEK-Neo pooled)는 클로네틱스, 인크.(San Diego, CA)에서 구입한다. 이들 세포는 통과(passage) 2이다. 케라티노사이트는 그들이 80% 융합성(confluency)에 이를 때까지 완전한 케라티노사이트 성장 배지(CC-3001, KGM; 클로네틱스, 인크.)에서 성장시킨다. 제조자의 명세서에 따라 상기 세포들을 트립신화시킨다. 요약하면, 세포들을 행크 균형 염류 용액(Hank's balanced salt solution)으로 두 번 세척하였다. 실온에서 약 3∼5분 동안 트립신 2∼3㎖를 세포들에 첨가하였다. 트립신 중화 용액을 첨가하고, 세포들을 수집하였다. 세포들을 실온에서 5분 동안 600 x g에서 회전시키고, 예열된 배지를 사용하여 ㎠ 당 3,000 세포로 새로운 플라스크에 도말하였다.
증식 분석을 위하여. 완전 배지 중의 코닝 평평한 바닥 96-웰 플레이트의 웰 당 1,000∼2,000의 케라티노사이트를 도말하는데, 이때 가장 바깥 열은 제외한다. 외부 웰을 멸균수 200㎕로 충진한다. 이는 웰의 온도 및 습도 변화를 최소한으로 유지시키는데 도움이 된다. 5% CO2하, 37℃에서 세포들을 밤새도록 성장시킨다. 케라티노사이트 기초 배지(CC-3101, KBM, 클로네틱스, 인크.)로 세포들을 두 번 세척하고, 각 웰에 KBM 100㎕를 첨가한다. 24시간 동안 배양한다. KBM 중에서 성장인자를 희석시켜 일련의 희석물을 만들고, 각 웰에 100㎕ 첨가한다. 양성 대조군으로 KGM을 사용하고, 음성 대조군으로 KBM을 사용한다. 6개의 웰을 각 농도 점으로 사용한다. 2 내지 3일 동안 배양시킨다. 배양 기간 말기에, 일단 KBM으로 세포들을 세척하고, 배지 중에 미리 혼합된 10%v/v 알라마블루와 KBM 100㎕를 첨가한다. KGM 양성 대조군에서 배지 색깔이 붉은색으로 변하기 시작할 때까지 6 내지 16시간 동안 배양한다. 플레이트 리더(plate reader) 중에 플레이트들을 직접 배치함으로써 O.D. 570nm 마이너스 O.D. 600nm를 측정한다.
결과
KGF-2에 의한 케라티노사이트 증식의 자극
KGF-2(즉, 상기 실시예 7 및 8에서 기술한 바와 같은 아미노산 Cys37에서 출발) 및 N-터미날 결실 돌연변이체 KGF-2△33 및 KGF-2△28이 표피 케라티노사이트 성장을 자극하는 활성이 있음을 증명하기 위하여, 정상적인 주요 사람 표피 케라티노사이트를 E. coli-발현 및 정제 KGF-2 단백질(배치 넘버 E3)(서열 번호:2), KGF-2△33(배치 넘버 E1) 및 KGF-2△28(배치 넘버 E2)로 배양하였다. KGF-2 단백질은 FGF7/KGF-1의 그것에 상응하는 약 5ng/㎖의 EC50으로 표피 케라티노사이트의 성장을 자극하였다(도 21A). 반면에, FGF-1 및 FGF-2와 같은 기타 FGF는 주요 케라티노사이트의 성장을 자극하지 않았다. KGF-2△33에 대한 EC50은 0.2ng/㎖이었고, KGF-2△28에 대한 EC50은 2ng/㎖였다(도 21B 및 21C). 따라서, KGF-2는 주요 표피 케라티노사이트의 증식을 자극하는데 있어서 FGF7/KGF 만큼 효력이 있는 것으로 보였다. 그러나, KGF-2△33은 전술한 실시예 7 및 8에 기술된 "Cys(37)" KGF-2 및 KGF-2△28보다 케라티노사이트 증식을 자극하는데 있어서 더욱 강력하다.
창상 조직의 반흔 형성은 진피 섬유아세포의 과증식을 포함한다. KGF-2의 자극 효과가 케라티노사이트에 대해서만 특이적이고 섬유아세포에 대해서는 특이적이지 않은지 여부를 측정하기 위하여, 마우스 Balb.c.3T3 섬유아세포 및 사람 폐 섬유아세포를 시험하였다. 어떤 유형의 섬유아세포도 증식 분석에 있어서 KGF-2에 반응하지 않았다. 따라서, KGF-2는 표피 케라티노사이트에 대해서 특이적인 마이토젠이지만 섬유아세포와 같은 간엽 세포에 대해서는 특이적이지 않은 것으로 보였다. 이는 KGF-2가 창상 조직의 반흔 형성을 유발할 가능성이 낮음을 암시하였다.
실시예 11
A. 특이적 FGF 수용체로 형질전환된 세포에 대한 KGF-2의 마이토젠 효과
FGF 수용체 아이소폼(isoform)이 KGF-2의 증식 효과를 매개하는지를 측정하기 위하여, 특이적 FGF 수용체 아이소폼을 발현시키는 세포에 대한 KGF-2의 영향을 문헌[Santos-Ocampoet al. J. Biol. Chem. 271:1726-1731(1996)]에 기재된 방법에 따라 시험하였다. FGF7/KGF는 FGFR2iiib 형태에 결합하여 특이적으로 활성화시킴으로써 상피 세포의 마이토제네시스(mitogenesis)를 유도하는 것으로 알려져 있다[Mikiet al. Science251:72-75(1991)]. 따라서, 마이토제네시스 분석에 있어서 KGF-2의 증식 효과는 하기 FGF 수용체 아이소폼 중 하나를 발현시키는 세포를 사용하여 시험하였다: FGFR1iiib, FGFR2iiib, FGFR3iiib 및 FGFR4.
FGF 수용체를 발현시키는 세포의 마이토제네시스 분석
문헌[Santos-Ocampoet al. J. Biol. Chem. 271:1726-1731(1996)]에 기술된 바와 같이, 특이적 FGF 수용체를 발현시키는 BaF3 세포의 티미딘 혼입을 수행하였다. 요약하면, 특이적 FGF 수용체를 발현시키는 BaF3 세포들을 세척하고, 듈벡코 개질 이글 배지(Dulbecco's modified Eagel's medium), 10% 신생아 소 혈청, L-글루타민 중에 재현탁시켰다. 2㎍/㎖ 헤파린을 함유하는 배지 중의 96-웰 분석 플레이트 중에 웰 당 약 22,500개의 세포를 도말하였다. 시약을 각 웰에 첨가하여 웰 당 총 부피가 200㎕가 되도록 하였다. 세포들을 37℃에서 2일 동안 배양하였다. 그 후, 각 웰에3H-티미딘 1μCi를 50㎕ 부피로 첨가하였다. 유리 섬유지를 통한 여과에 의하여 4 내지 5 시간 후에 세포들을 수확하였다. 혼입된3H-티미딘을 왈락 베타 플레이트 섬광 계수기(Wallac beta plate scintillation counter)로 계수하였다.
결과
결과는, KGF-2 단백질[거기에 첨가된 N-터미날 Met를 갖는 도 1의 Thr(36)-Ser(208)(서열 번호: 2)]이,3H-티미딘 혼입에 의하여 지시되는 바와 같이, KGF 수용체, FGFR2iiib 아이소폼을 발현시키는 Baf3 세포의 증식을 강력하게 자극하는 것으로 드러났다(도 22 A). 흥미롭게, FGFR1iiib 아이소폼을 발현시키는 Baf3 세포의 증식에 대한 KGF-2의 약한 자극 효과가 관찰되었다. KGF-2는 상기 수용체의 FGFR3iiib 또는 FGFR4를 발현시키는 세포에 대하여 어떠한 효과도 나타내지 않았다.
FGF7/KGF는 KGF 수용체인 FGFR2iiib를 발현시키는 세포의 증식을 자극하였으나, FGFR1iiib 아이소폼은 자극하지 않았다. KGF-2와 FGF7/KGF 사이의 차이는 흥미로운 것이었다. 대조군 실험에 있어서, aFGF는 그의 수용체인 FGFR1iiib 및 iiic를 자극하였고, bFGF는 그의 수용체 FGFR2iiic를 자극하였다. 따라서, 이러한결과는 KGF-2가 FGFR2iiib 아이소폼에 결합하여 마이토제네시스를 자극한다는 것을 암시하였다. FGF7/KGF와 달리, KGF-2도 또한 FGFR1iiib 아이소폼에 결합하여 마이토제네시스를 자극한다.
B. 특이적 FGF 수용체로 형질전환된 세포에 대한 KGF-2△33의 마이토젠 효과
상기에서 증명된 바와 같이, FGF들 또는 KGF-1 및 KGF-2 양자 모두는 FGF2iiib 수용체(FGFR2iiib)에 결합하여 이를 활성화시킨다. 하기 FGF 수용체 아이소폼 중 하나를 발현시키는 세포를 사용하여 마이토제네시스 분석에 있어서 KGF-2△33의 증식 효과를 시험하였다: FGFR2iiib 또는 FGFR2iiic(2iiic 수용체-형질전환된 세포는 음성 대조군으로서 포함됨).
본 실시예의 파트 A에서 설명한 바와 같이, 본 실험을 수행하였다. 요약하면, 10% 송아지 혈청(BCS- 태아 혈청이 아님), WEHI3 세포(5% BCS를 함유하는 RPMI 중에서 성장)의 배양에서 유래한 조절된 배지 10%, 50nM β-머캅토에탄올, L-Glu(100X 모액의 2%) 및 펜(pen)/스트렙(strep)(100X 모액의 1%)를 포함하는 RPMI 중에서 BaF3 세포를 성장시켰다.
분석을 위하여, 10% BCS 및 1㎍/㎖ 헤파린을 함유하는 RPMI 배지 중에서 BaF3 세포를 두 번 세척하였다. 10% BCS 및 1㎍/㎖ 헤파린을 함유하는 RPMI 배지 150㎕ 중의 96-웰 플레이트에 BaF3 세포(22,000/웰)를 도말하였다. 산성 FGF, 염기성 FGF, KGF-1(HG15400) 또는 KGF-2 단백질(HG03400, 03401, 03410 또는 03411)을 약 0 내지 10nM의 농도로 첨가하였다. 상기 세포들을 37℃에서 48시간 동안 최종 부피 200㎕로 배양하였다. 모든 분석은 세 번 수행하였다. 37℃에서 4시간 동안 삼중수소표지 티미딘(0.5μCi)을 각 웰 에 첨가한 후, 유리 섬유지를 통한 여과에 의하여 세포들을 수확하였다. 그 후, 액체 섬광 계수법에 의하여 혼입된 방사 활성의 총량을 측정하였다. 하기 양성 대조군을 사용하였다: FGFR2iiic 세포에 대하여 염기성 FGF 및 산성 FGF; FGFR2iiib에 대하여 산성 FGF 및 KGF-1. 하기 음성 대조군을 사용하였다: 기초 배지(10% BCS 및 1㎍/㎖ 헤파린을 함유하는 RPMI 배지).
결과
결과는 KGF-2[첨가된 N-터미날 Met를 갖는 Thr(36)-Ser(208)], KGF-2△33 및 KGF2△28 단백질이,3H-티미딘 혼입에 의하여 지시되는 바와 같이, KGF 수용체 FGFR2iiib 아이소폼을 발현시키는 Baf3 세포의 증식을 강력하게 자극하는 것으로 드러났다(도 22 A∼C). KGF-2 단백질은 상기 수용체의 FGFR2iiic 형태를 발현시키는 세포에는 어떠한 영향도 미치지 않았다. 이러한 결과는 KGF-2 단백질이 FGFR2iiib 아이소폼에 결합하여 마이토제네시스를 자극한다는 것을 암시하였다. 또한, KGF-2△33은 KGF-2[Thr(36)-Ser(208)] 보다 더 잘 BaF3 세포의 증식을 자극할 수 있었다.
실시예 12
A. E. coli 최적화 전장 KGF-2의 작제
E. coli 발현 시스템 중의 전장 KGF-2의 발현 수준을 증대시키기 위하여, 유전자의 아미노 터미날 부분의 코돈을 고 사용 E. coli 코돈으로 최적화하였다. KGF-2의 최적화 영역의 합성을 위하여, 6개의 일련의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다: 수 1∼6(서열은 이하에서 언급함). 이들 중첩 올리고들은 하기 조건에서 7 회전 동안의 PCR 반응에 사용하였다:
변성95도20초
어닐링58도20초
신장72도60초
3' 프라이머로서 KFG-2 합성 프라이머 6 및 5' 프라이머로서 KGF-2 합성 5' BamHI을 사용하는 제1 PCR 반응물 1㎕를 이용하고, 전술한 바와 동일한 조건을 이용하여, 25 주기 동안의 제2 PCR 반응을 설계하였다. 상기 최종 반응에 의하여 제조된 생성물은 AvaII 및 BamHI를 사용하여 절단하였다. 실시예 1의 KGF-2 작제물은 AvaII 및 HindIII을 사용하여 절단하여, 그 단편을 분리하였다. 이들 두 개의 단편은 세 개의 단편 결찰에서 BamHI 및 HindIII으로 절단한 pQE-9 내로 클로닝하였다.
최적화 합성 KGF-1 1/208을 작제하기 위하여 프라이머를 사용하였다:
KGF-2 합성 프라이머 1:
ATGTGGAAATGGATACTGACCCACTGCGCTTCTGCTTTCCCGCACCTGCCGGGTTGCTGCTGCTGCTGCTTCCTGCTGCTGTTC (서열 번호: 31)
KGF-2 합성 프라이머 2:
CCGGAGAAACCATGTCCTGACCCAGAGCCTGGCAGGTAACCGGAACAGAAGAAACCAGGAACAGCAGCAGGAAGCAGCAGCA (서열 번호: 32)
KGF-2 합성 프라이머 3:
GGGTCAGGACATGGTTTCTCCGGAAGCTACCAACTCTTCTTCTTCTTCTTTCTCTTCTCCGTCTTCTGCTGGTCGTCACG (서열 번호: 33)
KGF-2 합성 프라이머 4:
GGTGAAAGAGAACAGTTTACGCCAACGAACGTCACCCTGCAGGTGGTTGTAAGAACGAACGTGACGACCAGCAGAAGACGG (서열 번호: 34)
KGF-2 합성 프라이머: 5
CGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAA (서열 번호: 35)
KGF-2 합성 프라이머 6:
TTTGGTCCCAGAAACTTTACCGTTTTTTTCGATTTTCAG (서열 번호: 36)
KGF-2 합성 5'BamHI
AAAGGATCCATGTGGAAATGGATACTGACCCACTGC (서열 번호: 37)
생성된 클론은 도 23에 나타낸다 (서열 번호: 38 및 39).
B. E. coli 최적화 성숙 KGF-2의 작제
E. coli 발현 시스템에서 KGF-2의 성숙 형태의 발현 수준을 추가로 증가시키기 위하여, 유전자의 아미노 터미날 부분의 코돈을 고 사용 E. coli 코돈으로 최적화하였다. KGF-1의 성숙 형태와 상응하도록, 트레오닌 36에서 시작하여 KGF-2의 절단 형태를 구성하였다. 5' 프라이머로서 BspHI 5' KGF-2(서열은 이하에 주어짐) 및 3' 프라이머로서 HindIII3' KGF-2(서열은 이하에 주어짐)를 이용하는 PCR 반응에서, 실시예 12A으로부터의 E.coli 합성 KGF-2를 주형으로 사용하였다. 상기 실시예 12 A에서 주어진 표준 조건을 사용하여 25 주기 동안 증폭 과정을 수행하였다. 결과 생성물을 BspHI 및 HindII로 절단하고, NcoI 및 HindIII로 소화된 E.coli 발현 벡터 pQE60 내로 클로닝하였다.
BspHI 5' KGF-2 프라이머:
TTTCATGACTTGTCAAGCTCTGGGTCAAGATATGGTTC (서열 번호: 40)
HindIII3'KGF-2 프라이머:
GCCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCC (서열 번호: 41)
생성된 클론은 도 24A에 나타낸다 (서열 번호: 42 및 43).
C. 대안적인 E. coli 최적화 성숙 KGF-2의 작제
E. coli 발현 시스템 중의 KGF-2의 성숙 형태의 발현 수준을 추가로 증대시키기 위하여, E. coli 최적화 유전자의 아미노 터미날 부분에 53 아미노산의 코돈을 고 사용 E. coli 코돈으로 변화시켰다. KGF-2의 최적화 영역의 합성을 위하여, 6개의 일련의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다: 넘버 18062, 18061, 18058, 18064, 18059 및 18063(서열은 이하에서 언급함). 이들 중첩 올리고들은 하기 조건에서 7 회전 동안의 PCR 반응에 사용하였다:
변성95도20초
어닐링58도20초
신장72도60초
합성 7 회전 후, 6개의 올리고뉴클레오티드의 개시 반응에서 유래한 1 ㎕를 함유하는 PCR 반응물에, 상기 영역에 대한 5' 프라이머 18169 및 상기 전체 영역에 대한 3' 프라이머 18060을 첨가하였다. 하기 조건을 사용하여 상기 생성물을 30 회전 동안 증폭시켰다:
변성95도20초
어닐링55도20초
신장72도60초
제2 PCR 반응은 25 회전 동안 전술한 바와 동일한 조건하에서 프라이머 18066 및 18065를 사용하여 유전자의 3' 영역을 증폭시키기 위하여 설계하였다. 생성물을 아가로스 겔에서 분리시켰다. 상기 생성물을 함유하는 겔 조각을 10mM Tris, 1mM EDTA, pH7.5에서 희석시켰다. 각각의 희석된 겔 조각으로부터 취한 각각 1㎕를 추가 PCR 반응에서 사용하였는데, 상기 추가 PCR 반응에서는 5' 프라이머로서 프라이머 18169 및 3' 프라이머로서 프라이머 18065를 사용하였다. 전술한 바와 동일한 조건을 이용하여 상기 생성물을 25 주기 동안 증폭시켰다. 상기 최종 반응에 의하여 제조된 생성물을 Eco R1 및 HindIII로 절단하고, Eco R1 및 HindIII로 또한 절단된 pQE60으로 클로닝하였다(이제 pQE6).
5' 합성 프라이머의 서열:
18169 KGF2 5'EcoRI/RBS:
TCAGTGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAATCATGACTTGCCAGG [서열 번호: 44]
18062 KGF2 합성 신규 R1 센스:
TCATGACTTGCCAGGCACTGGGTCAAGACATGGTTTCCCCGGAAGCTA [서열 번호: 45]
18061 KGF2 합성 R2 센스:
GCTTCAGCAGCCCATCTAGCGCAGGTCGTCACGTTCGCTCTTACAACC [서열 번호: 46]
18058 KGF2 합성 R3 센스:
GTTCGTTGGCGCAAACTGTTCAGCTTTACCAAGTACTTCCTGAAAATC [서열 번호: 47]
18066 KGF 2 20bp Ava II 센스:
TCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGAC [서열 번호: 48]
18064 KGF2 합성 F1 안티센스:
GATGGGCTGCTGAAGCTAGAGCTGGAGCTGTTGGTAGCTTCCGGGGAA [서열 번호: 49]
18059 KGF2 합성 F2 안티센스:
AACAGTTTGCGCCAACGAACATCACCCTGTAAGTGGTTGTAAGAG [서열 번호: 50]
18063 KGF2 합성 F3 안티센스:
TTCTTGGTCCCAGAAACTTTACCGTTTTTTTCGATTTTCAGGAAGTA [서열 번호: 51]
18060 KGF 2 AvaII 안티센스:
TTCTTGGTCCCAGAAACTTTACCG [서열 번호: 52]
18065 KGF2 HindIII 3' 정지:
AGATCAGGCTTCTATTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAG [서열 번호: 53]
합성 KGF-2 유전자 및 상응하는 아미노산 서열을 도 24B에 나타낸다(서열 번호: 54 및 55).
실시예 13
KGF-2 결실 돌연변이체의 작제
주형으로서 실시예 12A로부터의 최적화 KGF-2 작제물을 사용하여 KGF-2 유전자의 5' 터미날 및 3' 터미날로부터 결실 돌연변이체를 작제하였다. E.coli. 중의 발현에 부정적 영향을 미칠 유전자의 영역에 기초하여 상기 결실을 선택하였다. 5' 결실을 위하여, 하기 리스트된 프라이머를 5' 프라이머로 사용하였다. 이들 프라이머는 개시 메티오닌에 대하여 코딩하는 ATG 및 지시된 제한 위치를 포함한다. 3' 프라이머로 KGF-2(FGF-12) 208 아미노산 3' HindIII 프라이머를 사용하였다. 실시예12에서 언급한 바와 같은 표준 조건을 이용하여 25 회전 동안의 PCR 증폭을 수행하였다. KGF-2 36aa/208aa 결실 돌연변이체에 대한 생성물은 5' 위치를 위하여 BspHI로 절단하고, 3' 위치를 위하여 HindIII로 절단한 후, BspHI 및 HindIII으로 절단된 pQE60으로 클로닝하였다. 기타 모든 생성물은 5' 제한 효소에 대하여 NcoI로 절단하고, 3' 위치에 대하여 HindIII으로 절단한 후, NcoI 및 HindIII으로 절단된 pQE60으로 클로닝하였다. KGF-2(FGF-12)를 위하여, 3' 프라이머로서 36aa/153aa 및 128aa 3' HindIII를 사용하고, 5' 프라이머로서 FGF-12 36aa/208aa를 사용하였다. FGF-12 62aa/153aa를 위하여, 128aa 3'HindIII를 3' 프라이머로 사용하고, FGF-12 62aa/208aa를 5' 프라이머로 사용하였다. 생성된 클론의 명칭은 결실에서 초래되는 폴리펩티드의 첫 번째 및 마지막 아미노산을 지시한다. 예를 들어, KGF-2 36aa/153aa는 결실 돌연변이체의 첫 번째 아미노산이 36이고, 마지막 아미노산이 KGF-2의 아미노산 153임을 의미한다. 또한, 도 25 내지 33에서 나타낸 바와 같이, 각각의 돌연변이체는 거기에 첨가된 N-터미날 Met를 갖는다.
결실 프라이머의 서열:
FGF12 36aa/208aa:
5' BsphI GGACCCTCATGACCTGCCAGGCTCTGGGTCAGGAC [서열 번호: 56]
FGF12 63aa/208aa:
5' NcoI GGACAGCCATGGCTGGTCGTCACGTTCG [서열 번호: 57]
FGF12 77aa/208aa:
5' NcoI GGACAGCCATGGTTCGTTGGCGTAAACTG [서열 번호: 58]
FGF12 93aa/208aa:
5' NcoI GGACAGCCATGGAAAAAAACGGTAAAGTTTC [서열 번호: 59]
FGF12 104aa/208aa:
5' NcoI GGACCCCCATGGAGAACTGCCCGTAGAGC [서열 번호: 60]
FGF12 123aa/208aa:
5' NcoI GGACCCCCATGGTCAAAGCCATTAACAGCAAC [서열 번호: 61]
FGF12 138aa/208aa:
5' NcoI GGACCCCCATGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAG [서열 번호: 62]
FGF12 3' HindIII:(상기 모든 결실 클론에 대하여 사용)
CTGCCCAAGCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG [서열 번호: 63]
FGF12 36aa/153aa:
5' BsphI(전술한 바와 같음)
3' HindIII CTGCCCAAGCTTATTACTTCAGCTTACAGTCATTGT [서열 번호: 64]
FGF12 63aa/153aa:
5' NcoI 및 3' HindIII, 전술한 바와 같음.
생성된 결실 돌연변이에 대한 서열은 도 25 내지 33에 나타낸다[서열 번호: 65 내지 82].
E. coli 중에서 KGF-2△28(아미노산 63-208)을 발현시킬 때, 프로테아제 억제제, 예를 들어, 구아니딘 하이드로클로라이드(Gu-HCl)를 사용하여 단백질 변성을 막는다. 예를 들어, 50mM 트리스-아세테이트, 10mM EDTA-NA2, pH7.7±0.2에 E.coli 페이스트를 재현탁시킨 후, 용균시킨다. 용균 현탁물을 1.0M Gu-HCl 용액 동일 부피로 처리하고, 2 내지 8℃에서 2 내지 4 시간 동안 온화하게 교반한다. 그 후, 상기 현탁물을 원심분리하고, 여과한 후, 정제를 위하여 제1 컬럼 상에 적하한다. 결합된 KGF-2를 염 구배로 용출시키는 SP-세파로스 FF 컬럼 상에 초기 정제물을 위치시킨다. 생성된 SP-세파로스 용출 푸울을 희석하고, 0.2㎛ 여과한 후, 프락토겔 COO-(S)컬럼 상에 적하한다. 염 구배를 통하여 용출을 수행하였고, 용출 푸울을 투석여과하고, 완충액 내에 농축시켰다.
실시예 14
KGF-2의 시스테인 돌연변이체의 작제
C-37 돌연변이 프라이머 5457 5' BsphI 및 5258 173aa3' HindIII의 작제물을 사용하여 실시예 12A로부터의 KGF-2(FGF-12) 주형을 증폭시켰다. 프라이머 5457 5' BsphI 는 시스테인 37을 세린으로 변화시킨다. 실시예 12A에서 전술한 표준 조건을 이용하여 25 주기 동안 증폭을 수행하였다. 결과 생성물을 BspHI 및 HindIII로 절단하고, BspHI 및 HindIII로 절단된 E.coli 발현 벡터 pQE60 내로 클로닝하였다(도 34)[서열 번호: 83].
시스테인 106의 세린으로의 변이를 위하여, 상기 시스테인의 올리고뉴클레오티드 자리 유도 뮤타제네시스를 위한 두 번의 PCR 반응을 설계하였다. 첫 번째 반응에서, 5453 BsphI를 5' 프라이머로 사용하고, 5455를 3' 프라이머로 사용하였다. 두 번째 반응에서, 5456을 5' 프라이머로 사용하고, 5258 HindIII를 3'프라이머로 사용하였다. 실시예 12에서 기술한 표준 조건 하에서 25 회전 동안 증폭 반응을 수행하였다. 각 PCR 반응으로부터 1㎕씩을 취하여, 5'프라이머로 5453 BspHI 및 3'프라이머로 5258 HindIII를 사용하는 순차 반응에서 주형으로 사용하였다. 실시예12에 기술된 표준 조건을 이용하여 25 회전 동안 증폭을 수행하였다. 생성물을 BspHI 및 HindIII로 절단하고, NcoI 및 HindIII로 절단한 E.coli 발현 벡터 pQE60내로 클로닝하였다.
C-37/C-106 돌연변이체를 제조하기 위하여 두 번의 PCR 반응이 필요하였다. 프라이머 5457 Bsph1 및 5455를 사용하여 시스테인 37을 세린으로 치환시킨 돌연변이체 5' 영역을 생성시키고, 프라이머 5456 및 5258 HindIII를 사용하여 시스테인 106을 세린으로 치환시킨 돌연변이체의 3' 영역을 생성시켰다. 두 번째 반응에서, 5457 BsphI 프라이머를 5' 프라이머로 사용하고, 5258 HindIII 프라이머를 3' 프라이머로 사용하며, 주형으로서 상기 각 개시 반응으로부터 취한 1㎕를 사용하여 C-37/C-106 돌연변이체를 생성시켰다. 상기 PCR 생성물을 BsphI 및 HindIII로 절단하고, NcoI 및 HindIII로 절단한 pQE60내로 클로닝하였다. 생성된 클론을 도 35에 나타낸다(서열 번호: 84).
시스테인 돌연변이체 프라이머의 서열:
5457 BspHI:
GGACCCTCATGACCTCTCAGGCTCTGGGT (서열 번호: 85)
5456:
AAGGAGAACTCTCCGTACAGC (서열 번호: 86)
5455:
GCTGTACGGTCTGTTCTCCTT (서열 번호: 87)
5453 BspHI:
GGACCCTCATGACCTGCCAGGCTCTGGGTCAGGAC (서열 번호: 88)
5258 HindIII:
CTGCCCAAGCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG (서열 번호: 89)
실시예 15
KGF-2(FGF-12)의 제조 및 정제
실시예 12B에 기술된 최적화 성숙 단백질을 암호하는 DNA서열(즉, KGF-2의 아미노산 T36 내지 S208)을 플라스미드 pQE-9(Qiagen) 내로 클로닝하였다. 100㎍/㎖ 앰피실린 및 25㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 중에서, 37℃에서 밤새도록 정지상으로 E.coli(M15/rep4; Qiagen)을 성장시켰다. 상기 배양물을 이용하여, 1:50 희석으로 100㎍/㎖ 앰피실린 및 25㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 새로운 LB 배지를접종시켰다. 세포들을 37℃에서 0.7 O.D.595로 성장시켜, 이소프로필 1-티오-b-D-갈락토피라노사이드(IPTG)의 첨가에 의하여 1mM의 최종 농도로 유도하였다. 3 내지 4 시간 후, 원심분리에 의하여 세포들을 수집하고, 60mM NaPO4및 360mM NaCl을 함유하는 완충액에 완충액 5 부피:세포 페이스트 1부피의 비율로 재현탁시켰다. 마우틴 가울린(Mautin Gaulin) 중에서 파열시킨 후, NaOH를 첨가하여 상기 추출물을 pH8.0으로 조정하고, 원심분리시켜 정제하였다.
정제한 가용성 추출물을 다공성 HS-50 컬럼(2.0 X 10.O㎝; 퍼셉티브 바이오시스템스, 인크.)에 적용하고, 결합된 단백질을 0.5M, 1.0M 및 1.5M NaCl을 함유하는 50mM NaPO4pH8.0으로 단계-용출시켰다. KGF-2를 1.5M 염 분획물 중에 용출시킨 후, 상기 염 분획물을 50mM NaPO4pH6.5로 5배 희석시켜 최종 농도 300mM로 만들었다. 그 후, KGF-2 함유 분획물을 다공성 HQ-20 컬럼(2.0 X 7.0㎝; 퍼셉티브 바이오시스템스, 인크.)에 순차적으로 통과시킨 후, 다공성 CM-20 컬럼(2.0 X 9.0㎝; 퍼셉티브 바이오시스템스, 인크.)에 결합시켰다. 약 500mM 내지 약 750mM NaCl로 용출된 KGF-2(FGF-12)-함유 분획물을 모으고, 희석시킨 후, CM-20 컬럼에 다시 적용하여 농축시켰다. 마지막으로, 단백질을 40mM NaOAC pH6.5; 150mM NaCl(배치 E-5) 중의 겔 여과 컬럼(S-75; 파마시아) 상에서 분리하였다. 대안적으로, 겔 여과 컬럼을 포스페이트 완충 염수(PBS, 배치 E-4) 중에서 작동시켰다. KGF-2 함유 분획물을 모으고, 바이오-래드 단백질 분석법(Bio-Rad Protein Assay)에 의하여 단백질 농도를 측정하였다. SDS-PAGE에 의하여 단백질은 ＞90% 순도로 판단되었다.마지막으로, 리물루스 아메바양 세포용해물 분석법(Limulus Amebocyte Lysate Assay; Cape Cod Associates)에 의하여 측정한 내독소 수치는 1Eμ/㎎으로 밝혀졌다. 이러한 방법으로 제조한 단백질은 FGF 계 멤버의 홀마크인 헤파린에 결합될 수 있었다.
실시예 16
A. N-터미날 결실 돌연변이체 KGF-2△33의 작제
E.coli 중의 KGF-2의 발현 수준을 증대시키기 위하여, 그리고 E.coli 발현 KGF2의 용해성 및 안정성을 향상시키기 위해서, 예비 처리된 KGF2의 첫 번째 68 아미노산을 제거한 결실 돌연변이체 KGF-2△33(KGF-2 aa 69-208)(서열 번호: 96)을 제조하였다. 이러한 결실 돌연변이를 제조하기 위한 이유는 다음과 같은 관찰에 근거하였다. 우선, 성숙 KGF2(KGF-2 aa 36-208)는 내부 분자가 다이설파이드 다리를 형성함으로 인하여 집합될 수 있는 홀수(3)의 시스테인 잔기를 함유한다. KGF △33 결실 돌연변이체는 단지 두 개의 시스테인 잔기만을 함유하는데, 이는 내부 분자가 다이설파이드 다리를 형성하고, 이어서 집합될 수 있는 잠재력을 감소시킨다. 집합의 감소는 활성 KGF2 단백질의 수율을 증가시키도록 유도되어야 한다. 두 번째로, KGF △33 결실 돌연변이체는, KGF-1 중에 존재하지 않고, 활성을 위하여 중요한 것으로 보이지 않으나, E.coli. 중의 단백질 발현을 방해할 수 있는 폴리-세린 스트레치를 제거한다. 따라서, 폴리-세린 스트레치의 제거는 활성 KGF-2 단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 세 번째로, E.coli. 중의 KGF △33의 발현은 잔기 68 및 69 사이의 KGF-2의 자연적 분할을 초래한다. 따라서, KGF2 △33은 효과적으로 처리될 수 있으며, E.coli 중에서 안정할 것임이 예상된다.
pQE6에서 KGF2△33의 작제
폴리머라제 연쇄 반응 유도 증폭 및 E.coli 단백질 발현 벡터 pQE6 내로 KGF2△33을 서브-클로닝하기 위하여, KGF2의 소정 영역에 상보성인 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머(5952 및 19138)를 하기 염기 서열로 합성하였다.
프라이머 5952:
5'GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG3' (서열 번호: 91)
프라이머 19138:
5'GGGCCCAAGCTTATGAGTGTACCACCAT3' (서열 번호: 92)
N-터미날 프라이머(5952)의 경우에는 AflIII 제한 위치를 포함시키는 한편, C-터미날 프라이머(19138)의 경우에는 HindIII 제한 위치를 포함시켰다. 또한, 프라이머 5952는 E.coli. 중에서 클로닝된 단편의 번역을 가능하게 하는 KGF2 코딩 영역을 갖는 프레임 중에 인접한 ATG 서열을 포함하는 한편, 프라이머 19138은 E.coli. 중에서 정확한 번역 종결을 보장하는 KGF2 코딩 영역을 갖는 프레임 중에 인접한 두 개의 정지 코돈(바람직하게 E.coli중에서 사용)을 포함한다.
당업계에 주지된 표준 조건 및 주형으로서 성숙 KGF-2(aa 36-208)(실시예 12C에서 작제함)에 대한 뉴클레오티드 서열을 사용하여, 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하였다. 생성된 앰플리콘을 AflIII 및 HindIII로 소화시켜 절단하고 NcoI/HindIII 소화된 pQE6 단백질 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다.
pHE1 중에서 KGF2△33의 작제
폴리머라제 연쇄 반응 유도 증폭 및 E.coli 발현 벡터 pHE1 내로 KGF2△33을 서브-클로닝하기 위하여, KGF2의 소정 영역에 상보성인 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머(6153 및 6150)를 하기 염기 서열로 합성하였다.
프라이머 6153:
5'CCGGCGGATCCCATATGTCTTACAACCACCTGCAGG3'(서열 번호: 93)
프라이머 6150:
5'CCGGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGG3' (서열 번호: 94)
N-터미날 프라이머(6153)의 경우에는 NdeI 제한 위치를 포함시키는 한편, C-터미날 프라이머(6150)의 경우에는 Asp718 제한 위치를 포함시켰다. 또한, 프라이머 6153은 E.coli. 중에서 클로닝된 단편의 번역을 가능하게 하는 KGF2 코딩 영역을 갖는 프레임 중에 인접한 ATG 서열을 포함하는 한편, 프라이머 6150은 E.coli. 중에서 정확한 번역 종결을 보장하는 KGF2 코딩 영역을 갖는 프레임 중에 인접한 두 개의 정지 코돈(바람직하게 E.coli중에서 사용)을 포함한다.
당업계에 주지된 표준 조건 및 주형으로서 성숙 KGF-2(aa 36-208)(실시예 12C에서 작제함)에 대한 뉴클레오티드 서열을 사용하여, 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하였다. 생성된 앰플리콘을 NdeI 및 Asp718로 소화시켜 절단하고 NdeI/Asp718 소화된 pHE1 단백질 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다.
KGF2 Δ33의 뉴클레오티드 서열:
ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAA (서열 번호 95)
KGF Δ33의 아미노산 서열:
MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAN1NKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMWALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS (서열 번호 96)
B. 최적화된 KGF-2 Δ33의 구성
대장균의 KGF2 Δ33의 발현 레벨을 증가시키기 위하여, 완전 유전자의 코돈을 이들이 대장균에 가장 잘 사용될 수 있도록 최적화하였다. KGF2 Δ33을 발생하는 데 사용된 주형이 N-말단 영역 내에서 코돈 최적화되었기때문에, C-말단 아미노산(84-208)은 최적화가 요구된다.
먼저, 아미노산 172-208은 코돈 최적화되어 KGF2 Δ33(s172-208)을 발생하였다. 이것은 중첩 PCR 전략에 의해 달성되었다. 올리고뉴클레오티드 PM07 및 PM08(아미노산 172-208에 해당함)을 조합하고, 이들을 70℃로 가열하고 37℃로 냉각시킴으로써 어닐링하였다. 그 다음, 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 프라이머 PM09 및 PM10에 의해 행해진 표준 PCR 반응에 대한 주형으로서 사용하였다. 당업계의 숙련자에게 널리 알려진 표준 조건을 따르고, KGF2 Δ33을 주형으로서 사용하는 별도의 PCR 반응에서, 올리고뉴클레오티드 PM05(KGF2의 암호화 영역 내 Pst1 부위와 중첩함) 및 PM11을 사용하여 아미노산 84-172에 해당하는 KGF2의 영역을 증폭시켰다. 제3 PCR 반응에서, 제1 PCR 반응의 산물(코돈 최적화된 아미노산 172-208에 해당함)과 제2 PCR 반응의 산물(코돈 비최적화된 아미노산 84-172에 해당함)을 조합하고, 올리고뉴클레오티드 PM05 및 PM10에 의해 행해진 표준 PCR 반응에 대한 주형으로서 사용하였다. 얻은 앰플리콘을 Pst1/HindIII으로 분해하고, Pst1/HindIII 분해된 pQE6KGF2Δ33에 서브클로닝하여, 효과적으로 해당 비코돈 최적화 영역을 치환하고, pQE6KGF2Δ33(s172-208)을 생성한다.
KGF2의 코돈 최적화를 완결하기 위하여, 아미노산 84-172에 해당하는 KGF2의 영역에 대해 최적화된 합성 유전자 코돈은 올리고뉴클레오티드 중첩을 이용하여 생성하였다. 먼저, 네 개의 올리고뉴클레오티드(PM31, PM32, PM33 및 PM34)를 조합하고, 다음 PCR의 7 회 사이클을 수행하였다: 94℃, 30 초; 46.5℃, 30 초; 및 72℃, 30 초.
그 후, 프라이머 PM35 및 PM36에 의해 행해진 제2 PCR 반응을, 1 ㎕의 제1 PCR 반응물을 주형으로서 사용하여 표준 절차에 따라서 수행하였다. 그 후, 생성된 코돈 최적화된 유전자 분획을 Pst1/Sall로 분해하고, Pst1/Sall 분해된 pQE6KGF2Δ33(s172-208)에 서브클로닝하여 완전 최적화된 KGF2 암호화 유전자, pQE6KGF2Δ33을 생성하였다.
대안의 대장균 단백질 발현 벡터를 생성하기 위하여, KGF2Δ33을, pQE6KGFΔ33 상에 프라이머 PM102 및 PM130을 사용하여 PCR 증폭하였다. 생성된 앰플리콘을 NdeI 및 EcoRV로 분해하고, NdeI 및 Asp718(블런트 말단화)로 분해된pHE1 발현 벡터에 서브클로닝하여 pHE1Δ33을 생성하였다.
코돈 최적화된 KGF2 A33의 구성에 사용된 올리고뉴클레오티드 서열:
PM05: CAACCACCTGCAGGGTGACG (서열 번호 97)
PM07:
AACGGTCGACAAATGTATGTGGCACTGAACGGTAAAGGTGCTCCACGTCGTGGTCAGAAAACCCGTCGTAAAAACACC (서열 번호 98)
PM08:
GGGCCCAAGCTTAAGAGTGTACCACCATTGGCAGAAAGTGAGCAGAGGTGnTTTACGACGGGTTTTCTGACCACG (서열 번호 99)
PM09: GCCACATACATTTGTCGACCGTT (서열 번호 100)
PM10: GGGCCCAAGCTTAAGAGTG (서열 번호 101)
PM11: GCCACATACATTTGTCGACCGTT (서열 번호 102)
PM31:
CTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCCTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGTACCAAG(서열 번호 103)
PM32:
AGCTTTAACAGCAACAACACCGATTTCAACGGAGGTGATTTCCAGGATGGAGTACGGGCAGTTTTCTTTCTTGGTAC CAGAAACTTTACC (서열 번호 104)
PM33:
GGTGTTGTTGCTGTTAAAGCTATCAACTCCAACTACTACCTGGCTATGAACAAGAAAGGTAAACTGTACGGTTCCAAAGAATTTAACAAC (서열 번호 105)
PM34:
GTCGACCGTTGTGCTGCCAGTTGAAGGAAGCGTAGGTGTTGTAACCGTTTTCTTCGATACGTTCTTTCAGTTTACAGTCGTTGTTAAATTCTTTGGAACC (서열 번호 106)
PM35: GCGGCGTCGACCGUGTGCTGCCAG (서열 번호 107)
PM36: GCGGCCTGCAGGGTGACGTTCGTTGG (서열 번호 108)
PM102: CCGGCGGATCCCATATGTCTTACAACCACCTGCAGG (서열 번호 109)
PM130: CGCGCGATATCTTATTAAGAGTGTACCACCATTG (서열 번호 110)
KGF2 Δ33(s172-208)의 뉴클레오티드 서열:
ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCCTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGTACCAAGAAAGAAAACTGCCCGTACTCCATCCTGGAAATCACCTCCGTTGAAATCGGTGTTGTTGCTGTTAAAGCTATCAACTCCAACTACTACCTGGCTATGAACAAGAAAGGTAAACTGTACGGTTCCAAA GAATTTAACAACGACTGTAAACTGAAAGAACGTATCGAAGAAAACGGTTACAACACCTACGCTTCCTTCAACTGGCAGCACAACGGTCGACAAATGTATGTGGCACTGAACGGTAAAGGTGCTCCACGTCGTGGTCAGAAAACCCGTCGTAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTGC CAATGGTGGTACACTCTTAA (서열 번호 111)
KGF2 Δ33(s172-208)의 아미노산 서열:
MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSlLEITSVEIGVVAVKAINSNYYLANINKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMWALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS (서열 번호 112)
C. N-말단 결실 돌연변이 KGF-2Δ4의 구성
대장균 내 KGF2의 발현 레벨을 증가시키고, 대장균 발현된 KGF2의 안정성과 용해성을 향상시키기 위하여, 예비 처리된 KGF2의 제1 38 아미노산을 제거한 결실 변이체 KGF2Δ4(아미노산 39-208)를 37 번 위치에 시스테인을 포함시켜 구성하였다. 생성된 KGF2 결실 분자가 짝수의 시스테인을 함유하기 때문에, 분자내 이황화물 다리 결합 형성으로 인한 집합에 기인하는 문제점을 감소시켜, 활성 단백질의 발현 레벨을 향상시켜야 한다.
증폭 및 KGF2 Δ4를 대장균 단백질 발현 벡터, pQE6에 서브클로닝하는 것으로 행해지는 폴리머라제 연쇄 반응을 가능하게 하기 위하여, 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머(PM61 및 19138)를 하기 염기 서열로 합성하였다.
PM61 : CGCGGCCATGGCTCTGGGTCAGGACATG (서열 번호 113)
19138: GGGCCCAAGCTTATGAGTGTACCACCAT (서열 번호 114)
N-말단 프라이머(PM61)의 경우, NcoI 제한 부위를 통합한 반면에, C-말단 프라이머(19138)의 경우, HindIII 제한 부위를 통합하였다. 또한, PM61은 KGF2 암호화 영역을 가진 프레임 및 그에 인접한 ATG 서열을 함유하여 대장균 내 클로닝된 분획의 번역을 허용하는 반면에, 19138은 대장균 내 정확한 번역 말단화를 보장하는 KGF2 암호화 영역을 가진 프레임 및 그 에 인접한 정지 코돈(우선적으로 대장균에 사용됨)을 함유한다.
폴리머라제 연쇄 반응은 당업계의 숙련자에게 널리 알려진 표준 조건과 주형(실시예 12C에서 구성됨)으로서 전체 길이 KGF2(aa 36-208)을 사용하여 수행된다. 생성된 앰플리콘은 NcoI 및 HindIII으로 제한 분해되고, NcoI/HindIII 분해된 pQE6 단백질 발현 벡터에 서브클로닝된다.
KGF2 Δ4의 뉴클레오티드 서열:
ATGGCTCTGGGTCAAGATATGGTTTCTCCGGAAGCTACCAACTCTTCCTCTTCCTCTTTCTCTTCCCCGTCTTCCGCTGGTCGTCACGTTCGTTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAA (서열 번호 115)
KGF2Δ4의 아미노산 서열:
MALGQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS (서열 번호 116)
Example 17
정상 쥐의 KGF-2Δ33 자극된 상처 치유
KGF-2Δ33이 치유 과정을 촉진한다는 것을 설명하기 위하여, 절제 상처 부위의 상처 치유를 하기 모델을 이용하여 실험하였다.
Keyes 피부 천공기로 스프라그 돌리 래트(n=5)의 등 부위에 6 mm 절제 상처 부위를 형성하였다. 상처 부위를 개방한 채로 방치하고, 상처 생성일로부터 시작하여 4 일 동안 여러 농도의 KGF-2 Δ33(40 mM NaOAc 및 150 mM NaCl, pH 6.5 완충제) 및 완충제(40 mM NaOAc 및 150 mM NaCl, pH 6.5)로 국소 처치하였다. 보정된 제임슨(Jameson) 캘리퍼스를 사용하여 상처 부위를 매일 측정하였다. 상처 크기는 평방 밀리미터로 표시하였다. 마지막 날에 상처 부위를 측정하고, 더 이상의 분석을 위해 수거하였다. 부대(unpaired) t 테스트(평균 ±SE)를 사용하여 통계 분석을 행하였다. 평가 매개변수는 상처 부위 폐쇄율(%), 조직학적 스코어(1-3 최소 세포 축적, 새로운 피부 생성 없음; 4-6 미성숙 피부 형성, 염증성 세포, 모세관; 7-9 피부 생성 조직, 세포, 섬유아세포, 새로운 상피 10-12 섬유아세포, 콜라겐, 상피를 가진 성숙 피부), 재상피화 및 면역 조직 화학을 포함한다.
상처 후 3 일째에 KGF-2 Δ33으로의 처치는 38.9 ㎟의 완충제 대조군과 비교하였을 때 상처 크기의 감소(4 ㎍에서 30.4 ㎟, p=0.006, 1 ㎍에서 33.6 ㎟, p=0.0007)를 나타내었다. 상처 후 4 일째에, KGF-2 Δ33으로의 처치는 33.8 ㎟의 완충제 대조군과 비교하였을 때 상처 크기의 감소(0.1 ㎍에서 27.2 ㎟, p=0.002, 0.4 ㎍에서 27.9 ㎟, p=0.04)를 나타내었다. 상처 후 5 일째에 KGF-2 Δ33으로의 처치는 25.1 ㎟의 완충제 대조군과 비교하였을 때, 상처 크기의 감소(4 ㎍에서 18.1 ㎟, p=0.02)를 나타내었다. 도 36 참조.
5 일째에 상처 수거한 후, 추가의 매개변수를 측정하였다. KGF-2 Δ33은 완충제 대조군 60.2%와 비교하였을 때 4 ㎍에서의 상처 폐쇄율 증가(71.2%, p=0.02)를 나타내었다. 또한, KGF-2 Δ33의 투여도 6.4의 완충제 대조군에 비해 1 및 4 ㎍에서의 조직학적 스코어의 개선(1 ㎍에서 8.4, p=0.005, 4 ㎍에서 8.5, p=0.04)을 나타내었다. 또한, 재상피화는 923 ㎛의 완충제 대조군과 비교하였을 때 1 ㎍ 및 4㎍ KGF-2 Δ33에서 개선(1 ㎍에서 1389 ㎛, p=0.007, 4 ㎍에서의 1220 ㎛, p=0.02)되었다. 도 37 참조.
이 연구는 KGF-2 Δ33으로의 매일 처치가 전체 상처 부위의 감소로 나타나는 바와 같이 정상 동물의 상처 치유 속도를 촉진한다는 것을 설명한다. 또한, 상처 샘플의 조직학적 평가와 재상피화의 평가도 KGF-2 Δ33이 이러한 정상 래트 모델에서 치유 속도를 개선한다는 것을 나타낸다.
실시예 18
정상 래트에서 인장 강도 및 표피 두께에 대한 KGF-2 Δ33 효과
KGF-2 Δ33이 상처 부위의 인장 강도와 표피 두께를 증가시킨다는 것을 설명하기 위하여 다음 실험을 수행하였다.
2.5 cm 전체 길이 중선 절개 상처 부위를 수컷 스프라그 돌리 래트(n=8 또는 9)의 등에 형성하였다. 피부 절개는 등거리 금속 피부 스테이플을 사용하여 폐쇄하였다. 완충제(40 mM NaOAc 및 150 mM NaCl, pH 6.5) 또는 KGF-2 Δ33(40 mM NaOAc 및 150 mM NaCl, pH 6.5 완충제)을 상처 형성 시 국소 도포하였다. 폭이 0.5 cm인 네 개의 상처 스트립을 5 일째에 절제하였다. 이 표본을, InstronTM피부 인장계를 이용한 파단 강도, 히드록시프롤린 측정 및 조직학적 평가의 연구를 위해 사용하였다. 파단 강도는 파열 전 각각의 상처 부위에 의해 지탱되는 최대 힘으로서 정의하였다. 통계 분석은 부대 t 테스트(평균 ±SE)를 사용하여 행하였다.
절개 피부 래트 모델에서, 국소 도포된 KGF-2 Δ33은 상처 발생 후 단일 절개내 도포의 결과로서 파단 강도, 인장 강도 및 표피 두께의 통계학적으로 유의적인 증가를 나타내었다. 한 연구에서, 1, 4 및 10 ㎍에서 KGF-2 처치된 상처 부위의 파단 강도는 완충제 대조군과 비교했을 때 유의적으로 더 높았다(1 ㎍에서 107.3 g, p=0.0006, 4 ㎍에서 126.4 g, p<0.0001, 10 ㎍에서 123.8 g, p<0.0001). 도 38 참조.
표피 두께는 매슨 트리크롬(Masson Trichrome) 섹션 상에서 광 현미경 하에 측정하였다. KGF-2 Δ33 처리된 상처 부위는 54.8 μ의 완충제 대조군과 대조했을 때, 증가된 표피 두께(1 ㎍에서 60.5 μ, 4 ㎍에서 66.51 μ, p=0.01, 10 ㎍에서 59.6 μ)를 나타내었다. 도 39 참조.
이들 연구는 KGF-2의 단일 절개내 도포가 상처 치유 과정을 증대시키고 촉진하여 절개 상처 부위의 파단 강도와 표피 두께를 증가시키는 것을 특징으로 한다는 것을 설명해준다.
실시예 19
정상 래트 피부에 대한 KGF-2 Δ33 효과
피부내 주사 후 정상 래트 피부에 대한 KGF-2 Δ33의 효과를 측정하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
수컷 성체 SD 래트(n=3)에 0 일째에 50 ㎕당 1 및 4 ㎍의 농도로 위약 또는 KGF-2 Δ33(40 mM NaOAc 및 150 mM NaCl, pH 6.5 완충제)의 6 회 피부내 주사를 행하였다. 24 및 48 시간째에 동물에 5-2'-브로모데옥시루딘(BrdU)(100 mg/kg 복강내)을 주사한 후 2 시간 후에 희생하였다. 표피 두께는 피부 형성층으로부터 기층저부까지 측정하였다. 주사 부위를 따라 대략 20 회 측정하고, 평균 두께를 정량하였다. 이 측정은 광 현미경 하에 매슨 트리크롬 염색 섹션 상에서 보정된 현미경을 사용하여 측정하였다. BrdU 스코어링은 하기 스코어링 시스템을 사용하여 광 현미경 하에 두 명의 맹검 관찰자에 의해 행하였다: 0-3 없음 내지 최소 BrdU 표지된 세포; 4-6 중간 표지화; 7-10 강한 표지된 세포. 동물을 주사 후 24 및 48 시간째에 희생하였다. 통계학적 분석은 부대 t 테스트(평균 ±SE)를 사용하여 행하였다.
24 시간째에 KGF-2 Δ33 처치된 피부는 27.1 μ의 완충제 대조군과 대조하였을 때 증가된 표피 두께(1 ㎍에서 32.2 μ, p<0.001, 4 ㎍에서 35.4 μ, p<0.0001)를 나타내었다. 48 시간째에 KGF-2 Δ33 처치된 피부는 27.8 μ의 완충제 대조군과 비교하였을 때 증가된 표피 두께(1 ㎍에서 34.0 μ, p=0.0003, 4 ㎍에서 42.4 μ, p<0.0001)를 나타내었다. 도 40 참조. 또한, KGF-2 Δ33 처치된 피부는 48 시간째에 3.33의 완충제 대조군과 비교하였을 때 증가된 BrdU 면역 염색(1 ㎍에서 4.73, p=0.07, 4 ㎍DPTJ 6.85, p<0.0001)을 나타내었다. 도 41 참조.
이들 연구는 KGF-2의 피부내 주사가 표피 두께를 증대시키고 촉진한다는 것을 설명한다. 따라서, KGF-2는 주름을 예방 또는 경감시키고, 피부 노화를 개선하며, 흉터 형성을 감소시키거나 미용 수술로부터의 치유를 개선하는 응용 분야를 가질 것이다. 또한, KGF-2는 화학 요법 또는 기타 약제에 따른 경구 점막염(구강 궤양), 장 염증을 예방하거나 감소시키기 위해 예방학적으로 사용될 수 있다.
실시예 20
PAF 유발 발 부종에 대한 KGF-2의 항염증 효과
KGF-2의 항염증 효과를 설명하기 위하여 PAF 유발 발 부종 염증 모델을 사용하여 하기 실험을 수행하였다.
네 마리의 루이스 래트(190-210 gm) 군을, 2.5 nMol의 PAF를 함유하는 120 ㎕ 용액과 함께, 125 ㎍의 Ckb-10(B5), 24 ㎍의 LPS, 73 ㎍의 KGF-2{N-말단 Met를 가진 도 1(SEQ ID:2)의 Thr(36)-Ser(208)}를 함유하거나 또는 단백질을 함유하지 않는 시약으로 우측 뒷발의 발바닥에 피하 주사하였다. 좌측 뒷발은 동량의 완충제를 제공하여 평행 대조군으로 사용하였다. 발 부피는 혈량계 시스템을 사용하여 PAF 주사 직전에, 또는 30 및 90 분 후에 정량화였다. 발 부피의 변화율(%)을 산출하였다.
[표]
실험 번호 1 및 2에서의 테스트 시약
군(N=4) PAF(R.)2.5 nMol Ckβ-10(R.)1.04 mg/㎖ LPS(R.)200 ㎍/㎖ KGF-2(R.)0.73 mg/㎖ 완충제
1 20 ㎕ - - - 100 ㎕
2 20 ㎕ 100 ㎕ - - -
3 20 ㎕ - 100 ㎕ - -
4 20 ㎕ - - 100 ㎕ -
도 42에 나타낸 바와 같이, PAF 단독으로 주사된 우측 뒷발은 예상한 바와 같이 주사 후 0.5 시간째에 발 부피의 유의적인 증가(실험 번호 1 또는 2에 대해 각각 75% 또는 100%)가 있는 반면에, 완충제를 수용한 좌측 뒷발 또는 LPS 또는 SEB 단독을 수용한 우측 뒷발은 부종의 약한 증상을 나타내었다(데이터는 도시하지 않음). 그러나, KGF-2를 PAF와 함께 국소적으로 제공한 경우, PAF 단독 공격된 발과 비교하였을 때, 실질적인 감소(실험 번호 1 또는 2에 대해 각각 25% 또는 50%)가 있었다. 발 부종의 감소는 Ckb-10(상이한 단백질), LPS 또는 SEB(두 개의 염증성 매개인자)와 함께 PAF를 수용한 동물에게서 관찰되지 않았다. 이들 결과는 KGF-2의 항염증 효과가 특이적이고, 단백질의 특정한 비특이적인 성질에 기인하지 않는다는 것을 시사한다.
래트의 PAF 유발 발 부종에 대한 KGF-2 Δ33의 효과
각질 세포 증식을 자극하기 위한 시험관내 생물학적 활성 및 상처 치유에 대한 생체내 효과를 확인하기 위한 KGF-2 Δ33으로의 전술한 실험 후에, KGF-2 Δ33를 래트의 PAF 유발 발 부종 모델에서 더 평가하였다. 네 마리의 루이스 래트(190-210 gm)의 군을, 2.5 nMol의 PAF와 함께 210 ㎍의 KGF-2 Δ33 또는 알부민을 함유하는 120 ㎕ 용액으로 우측 뒷발의 발바닥에 피하 주사하였다. 좌측 뒷발에는 동량의 완충제, 알부민 또는 KGF-2 Δ33 단독을 제공하여 평행 대조군으로서 사용하였다. 발 부피는 혈류계 시스템을 사용하여 PAF 주사 후 여러 간격을 두고 정량화하였다. 발 부피의 변화율(%)을 측정하였다.
도 43에 나타낸 바와 같이, PAF 및 알부민으로 주사한 우측 뒷발은 예상한 대로 주사 후 0.5 시간째에 발 부피의 유의적인 증가(75%)가 있었으며, 반면에 완충제, 알부민 또는 KGF-2 Δ33 단독을 수용한 좌측 뒷발은 약간의 부종 증상을 나타내었다. 그러나, KGF-2 Δ33을 PAF와 함께 국소적으로 제공한 경우, 4 시간 이내에 끝난 전체 실험을 통하여 PAF 및 알부민 공격된 발과 비교하였을 때, 발 부피의 실질적인 감소(평균 20%)가 있었다. 이들 결과는 KGF-2 Δ33의 항염증 성질을 뒷받침한다.
[표]
테스트 시약
군(N=4) PAF2.5 nMol 알부민2.1 mg/㎖ KGF-2 Δ332.1 mg/㎖ 완충제
1 20 ㎕ 100 ㎕ - -
2 20 ㎕ - 100 ㎕ -
3 - 120 ㎕ - -
4 - - 120 ㎕ -
5 - - - 120 ㎕
따라서, KGF-2는 염증이, 한정하는 것은 아니지만 건선, 습진, 피부염 및/또는 관절염을 비롯한 질환의 핵심 병인인 급성 및 만성 상태를 치료하는 데 유용하다.
실시예 21
엔드-투-엔드(end-to-end) 결장 문합 래트 모델에 대한 KGF-2 Δ33의 효과
본 실시예는 KGF-2 Δ33이 위스타 또는 스프라그 돌리 래트의 장 또는 결장 문합에서 장 회복 속도를 증가시킨다는 것을 설명한다. 실험적 문합술에서의 래트 사용은 외과 상처 치유의 잘 특징 규명되고, 적절하며 재생 가능한 모델이다. 또한, 이 모델은 결장과 소장에서 외과 상처 치유의 질과 속도에 대한 만성 스테로이드 치료 또는 다양한 화학 요법 섭생의 효과를 연구하는 데로 확장할 수 있다{Mastboom W.J.B. 등Br. J. Surg. 78: 54-56 (1991), Salm R. 등J. Surg. Oncol. 47: 5-11, (1991), Weiber S. 등Eur. Surg. Res. 26: 173-178 (1994)}. 문합의 치유는 체내 어느 부위의 상처 치유의 것과 유사하다. 치유의 초기 상태는 급성 염증, 이어서 섬유 아세포 증식 및 콜라겐의 합성을 특징으로 한다. 콜라겐은 점진적으로 모델화되고, 상처는 새로운 콜라겐이 합성됨에 따라서 강화된다{KorudaM.J. 및 Rolandelli R.H.J. Surg. Res. 48: 504-515 (1990)}. 문합 누출과 같은 대부분의 외과 수술 후 합병증은 수술 후 첫번째 수 일 중에 일어나며, 그 기간 중에 장의 강도는 주로 상처 가장자리의 봉합사를 유지할 수 있는 능력에 의해 보장된다. 위장관의 봉합사 유지 능력은 첫번째 수술 후 일들 동안 80% 정도로 감소된다고 보고되었다{Hogstrom H 및 Haglund U.Acta Chri Scand 151: 533-535 (1985), Jonsson K, 등Am J. Surg. 145: 800-803 (1983)}.
수컷 성체 SD 래트(n=5)를 케타민(50 mg/kg) 및 크실라진(5 mg/kg)의 배합물로 근육내 마취시켰다. 복강을 4 cm 길이 중선 절개로 개방하였다. 좌측 결장의 1 cm 폭 세그먼트를 가장자리 혈관을 보전하면서 복부 반전에 근접하여 3 cm 절제하였다. 단층의 엔드-투-엔드 문합술을, 8-10 차단된 5-0 비크릴 반전 봉합사로 수행하여 장 연속체를 복구하였다. 그 후, 문합 부위는 1 및 4 ㎍의 농도의 완충제 또는 KGF-2 Δ33으로 주사기에 의해 국소 처치하였다. 절개 상처 부위는 근육층용 3-0 러닝 실크 봉합사 및 피부용 외과 스테이플로 폐쇄하였다. 그 다음, 처치는 매일 투여하였으며, 완충제 또는 KGF-2 Δ33로 구성되었으며, 1 및 5 mg/kg 피하 투여하였다. 수술 당일 및 그 후 매일 체중을 재었다. 최종 처치(5 일) 후 24 시간째에 동물을 마취시켰다. 동물을 마취시키고, 바륨 관장제를 수용시킨 다음, 고정 거리에서 x선 촬영하였다. 2 명의 맹검 관찰자에 의한 결장내 투여 후 방사선 분석으로, KGF-2 Δ33 처치된 군이 1) 수술 부위에서의 바륨 누출의 감소된 비율, 2) 수술 부위의 보다 낮은 수축도 및 3) 수술 부위에서 먼 대소변 펠렛의 존재의 증가를 가진 것으로 나타났다.
[표]
결장 문합술방사선 분석
군 대소변 존재율 문합 수축률 근단 팽창률 복부 누출률
처치없음(N=5) 20% 80% 80% 60%
완충제(N=5) 40% 60% 80% 75%
KGF-2 Δ33[1 mg/kg](N=5) 60% 20% 100% 20%
KGF-2 Δ33[5 mg/kg](N=4) 100% 0% 75% 25%
실시예 22
KGF-2의 카르복시 말단 돌연변이의 구조물
KGF-2의 카르복실 말단은 크게 하전된다. 이들 하전된 잔기의 밀도는 단백질의 안정성과, 따라서 그 용해도에 영향을 미칠 수 있다. 용액 내 단백질을 안정화실 수 있는 뮤테인을 생성하기 위하여 일련의 돌연변이가 유전지의 이 영역에서 생성되었다. 점 돌연변이체 194 R/E, 194 R/Q, 191 K/E, 191 K/Q, 188 R/E, 188 R/Q를 생성하기 위하여, 주형으로서 KGF-2 Δ33과 함께 당업계의 숙련자에게 널리 알려진 표준 조건을 사용한 PCR 반응에서 5952 KGF Δ33 5' Afl III 5' 프라이머를, KGF-2에 대한 적절한 점 돌연변이를 함유하는 지시된 3' 프라이머와 함께 사용하였다. 생성된 산물은 AflIII 및 Hind III으로 제한하였으며, NcoI 및 Hind III으로 제한된 대장균 발현 벡터 pQE60에 클로닝하였다.
KGF2Δ33,194 R/E 구조물:
하기 프라이머를 사용하였다:
5952 KGF A 33 5' Afl III:
5'GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG3' (서열 번호 117)
KGF2 3'HindIII 194aa R/E :
5'CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTTTCTCGTGTTTTCTGTCC3' (서열 번호 118)
KGF2Δ33,194 R/E 뉴클레오티드 서열:
ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGMCAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAGAAAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG (서열 번호 119)
KGF2Δ33,194 R/E 아미노산 서열:
MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMWALNGKGAPRRGQKTR E KNTSAHFLPMVVHS (서열 번호 120)
KGF2 Δ33,194 R/Q 구조물:
하기 프라이머를 사용하였다:
5952 KGF Δ33 5' Afl III:
5'GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3' (서열 번호 121)
KGF2 Δ33 HindIII 194aa R/Q:
5'CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCTGTCGTGTTTTCTGTCC3' (서열 번호 122)
KGF2 Δ33,194 R/Q 뉴클레오티드 서열:
ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGACAGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG (서열 번호 123)
KGF2 Δ33,194 R/Q 아미노산 서열:
MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMWALNGKGAPRRGQKTR Q KNTSAHFLPMVVHS (서열 번호 124)
KGF2Δ33,191 K/E 구조물:
하기 프라이머를 사용하였다:
5952 KGF Δ33 5' Afl III:
5'GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG3' (서열 번호 125)
KGF2 3' HindIII 191aa K/E
5'CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCCTTCGTGTTTCCTGTCCTCTCCTTGG3' (서열 번호 126)
KGF2Δ33,191 K/E 뉴클레오티드 서열:
ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGGAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG (서열 번호 127)
KGF2Δ33,191 K/E 아미노산 서열:
MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLANlNKKGKLYGS KEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQ E TRRKNTSAHFLPMVVHS (서열 번호 128)
KGF2 Δ33, 191 K/Q 구조물:
하기 프라이머를 사용하였다:
5952 KGFΔ33 5' Afl III:
5'GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG3' (서열 번호 129)
KGF2 3' HindIII 191 aa K/Q
5'CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCCTTCGTGTCTGCTGTCCTCTCCTTGG3' (서열 번호 130)
KGF2 Δ33, 191 K/Q 뉴클레오티드 서열:
ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGCAGACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG (서열 번호 131)
KGF2 Δ33, 191 K/Q 아미노산 서열:
MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKlEKNGKVSGTKKENCPYSILElTSVElGVVAVKAINSNYYLANINKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMWALNGKGAPRRGQ Q TRRKNTSAHFLPMVVHS (서열 번호 l32)
KGF2Δ33, 188 R/E 구조물:
하기 프라이머를 사용하였다:
5952 KGFΔ33 5' Afl III:
5'GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG3' (서열 번호 133)
KGF2 3' HindIII 188aa R/E:
5'CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCCTTCGTGTTTTCTGTCCTTCCCTTGGAGCTCCTTT3' (서열 번호 134)
KGF2Δ33, 188R/E 뉴클레오티드 서열:
ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGGAAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG (서열 번호 135)
KGF2Δ33, 188R/E 아미노산 서열:
MYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPR E GQKTRRKNTSAHFLPMVVHS (서열 번호 136)
KGF2Δ33, 188 R/Q 구조물:
하기 프라이머를 사용하였다:
5952 KGF Δ33 5' Afl III:
5'GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG3' (서열 번호 137)
KGF2 3' HindIII 188aa R/Q:
5'CTGCCCAAGCTTTTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTTTTCCTTCGTGTTTTCTGTCCCTGCCTTGGAGCTCCTTT3' (서열 번호 138)
KGF2Δ33, 188 R/Q 뉴클레오티드 서열:
ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGCAGGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG (서열 번호 139)
KGF2Δ33, 188 R/Q 아미노산 서열:
MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERlEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALJNGKGAPR Q GQKTRRKNTSAHFLPMVVHS (서열 번호 140)
KGF2 A33, 183K/E 구조물:
돌연변이 183K/E에 대하여 두 가지 PCR 반응을 이 리신의 올리고뉴클레오티드 부위 지향된 돌연변이 발생에 대해 설정하였다. 한 반응에서, 5952 KGFΔ33 5' AflIII을 5' 프라이머로 사용하고, KGF2 183aa K/E 안티센스를 반응에서 3' 프라이머로서 사용하였다. 제2 반응에서, KGF2 5' 183aa K/E 센스를 5' 프라이머로 사용하고, KGF2 3' HindIII TAA 스톱을 3' 프라이머로 사용하였다. KGF-2 Δ33을 이 반응에 대한 주형으로 사용하였다. 반응물을 당업계의 숙련자에게 널리 알려진 표준 조건 하에서 증폭시켰다. 이들 PCR 반응물 각각으로부터의 1 마이크로리터를, 5' 프라이머로서 5453 BsphI, 그리고 3' 프라이머로서 5258 HindIII으로서 사용한 후속 반응에서 주형으로서 사용하였다. 당업계의 숙련자에게 널리 알려진 표준 조건을 사용하여 증폭을 수행하였다. 생성된 산물을 Afl III 및 HindIII으로 제한하고, NcoI 및 HindIII로 제한된 대장균 발현 벡터 pQE60에 클로닝하였다.
하기 프라이머를 사용하였다:
5952 KGF Δ33 5' Afl III:
5'GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG3' (서열 번호 141)
KGF2 5' 183aa K/E 센스:
5'TTGAATGGAGAAGGAGCTCCA3' (서열 번호 142)
KGF2 183aa K/E 안티센스:
5'TGGAGCTCCTTCTCCATTCAA3' (서열 번호 143)
KGF2 3' HindIII TAA 스톱:
5'CTGCCCAAGCTT TTATGAGTGTACCACCATTGG3' (서열 번호 144)
KGF2 Δ33, 183K/E 뉴클레오티드 서열:
ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGMGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAGAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAG (서열 번호 145)
KGF2 Δ33, 183K/E 아미노산 서열:
MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNG E GAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS (서열 번호 146)
실시예 23
Balb/c 마우스의 전체 신체 방사 후 생존에 대한 KGF-2의 효과
이온화 방사선은 폐암 및 유방암, 림프종 및 골반 종양을 비롯한 많은 악성 종양을 치료하는 데 통상적으로 사용된다{Ward, W.F. 등,CRC Handbook of Animal Models of Pulmonary Disease, CRC Press, pp.165-195 (1989)}. 그러나, 방사선 유발 상해(폐, 장 등)는 방사선 요법의 강도 및 연속성에 제한이 있다{Morgan, G.W. 등,Int. J. Radiat. Onco1. Biol. Phys. 31:361 (1995)}. 위장 점막은 신속한 세포 주기를 가지며, 세포 독성제에 특히 민감하다{Potten, C.S., 등,In: Cytotoxic Insult to Tissue, Churchill Livingstone, pp. 105-152 (1983)}. 장 방사선 손상의 표현의 일부는 급성 직장염, 장 섬유증, 협착 및 누공 형성을 포함한다{Anseline, D.F. 등Ann. Surg. 194:716-724 (1981)}. 종양의 방사선 민감성을 변화시키지 않으면서 방사선으로부터 정상 구조물을 보호하는 치료는 이러한 장애의 관리에 유리하다. 조사 면적과는 무관하게, 방사선 조사량은 정상 조직의 방사선 민감성에 의해 제한된다. 전신 또는 부분 신체 조사 후 합병증으로는 폐렴, 섬유증, 위장 상해 및 골수 장애가 있다.
IL-1, TNF, IL-6, IL-12을 비롯한 몇가지 시토킨은 TBI 후 방사선 보호 효과를 나타낸다{Neta, R. 등,J. Exp. Med. 173: 1177 (1991)}. IL-11은 조합된 조사 및 화학요법 후 소장 점막 세포{Du, X.X. 등,Blood 83:33 (1994)} 및 방사선 유발 흉부 상해{Redlich, C.A. 등, The Journal of Immunology 157: 1705-1710 (1996)}를 보호하는 것으로 나타났다.
동물
모든 실험은 BALB/c 마우스를 사용하여 수행하였다. 동물은 6 주령때 구입하였으며, 연구 개시시에는 7 주령이었다. 모든 조작은 무통 기술을 사용하여 수행하였다. 이 연구는 실험 프로토콜을 조사하고 승인한 휴먼 게놈 사이언스 인코포레이티드, 인스티튜셔널 애니멀 케어 앤드 유즈 커미티에 의해 설명된 지침서에 따라서 수행한 것이다.
KGF-2
단백질은 KGF-2 Δ33이라고 칭한 141 아미노산 사람 단백질로 구성되었다. 이 단백질은 성숙 단백질의 첫번째 33 아미노-말단 잔기가 결여된 KGF-2의 절두 이성체이다. 이 단백질을 암호화하는 유전자를 대장균 발현 벡터에 클로닝하였다. 95% 이상의 순수 재조합 물질을 함유하는 분획을 실험에 사용하였다. KGF-2는 40 mM Na 아세테이트 + 150 mM NaCl, pH 6.5를 함유하는 비히클 내에서 조제하였다. 동일 비히클을 사용하여 스톡 용액으로부터 희석물을 만들었다.
전신 조사 및 실험 설계
68 Mark I Shepherd 세슘 조사기를 사용하여 519 RADS(5.19 Gy)로 마우스를 조사하였다. KGF-2 Δ33을 조사 2 일 전에 시작하여 조사 후 7 일 동안 계속 매일 피하 주사하였다. 모든 마우스에게서 일일 체중을 얻었다. 마우스 군을 무작위화하여 세 가지 처리 중 하나를 받게 하였다: 전신 조사(TBI) 및 완충제, TBI 및 KGF-2 Δ33(1 mg/kg sq), TBI 및 KGF-2 Δ33(5 mg/kg sq). 2 회의 독립적인 실험을 수행하였다.
결과
조사된 동물을 사용하여 두 가지 연구를 수행하였다. 첫번째 연구에서, 동물을 519 RADS(5.19 Gy)로 조사하였다. 동물을 조사 전 2 일 동안 1 및 5 mg/kg s.q.로, 그리고 그 후 7 일 동안 매일 완충제 또는 KGF-2 Δ33으로 처치하였다. 전신 조사 후 25 일째에 완충제 군에서 1/5 동물이 생존하였다. 이와는 대조적으로, KGF-2 처치된 군은 1 mg/kg에서 5/5 동물이, 그리고 5 mg/kg에서 4/5 동물이 생존하였다(도 44).
또한, KGF-2 처치된 동물은 TBI 후 20 일째에 0.9% 및 5.3% 체중 증가를 나타내었다. 이와는 대조적으로, 완충제 처치군은 20 일째에 4.2% 체중 감소를 가졌다. 정상 비조사된 연령에 대응하는 대조 동물은 동일 시기에서 6.7% 체중 증가를 나타내었다(도 45).
또한, 두번째 연구에서의 동물도 519 RADS(5.19 Gy)로 조사하였다. 이들 동물은 조사 전 2 일 동안 1 및 5 mg/kg s.q.로, 그리고 그 후 7 일 동안 매일 완충제 또는 KGF-2 Δ33으로 처치하였다. 전신 조사 후 15 일째에 완충제 군의 모든 동물은 사망하였다. 1 mg/kg에서의 KGF-2는 30% 생존율을 나타내었으며, 5 mg/kg에서는 60% 생존율을 나타내었다. TBI 후 25 일째에 1 mg/kg 군은 20% 생존율을 나타내었으며, 5 mg/kg 군은 50% 생존율을 나타내었다(도 46).
결론
요약하면, 이들 결과는 KGF-2가 TBI 후 보호 효과를 가진다는 것을 설명한다. KGF-2의 TBI 처치된 동물의 생존율을 증가시키는 능력은 방사선 유발 상해에 유용하고, 악성 종양의 치료에서 조사의 치료 비율을 증가시키는 데에도 유용하다는 것을 시사한다.
실시예 24
마우스의 피부 염증의 TPA 모델에서 KGF-2의 평가
KGF-2가 접촉 피부염의 진행을 완화시킨다는 것을 설명하기 위하여, 마우스의 테트라데카노일포르볼 아세테이트(TPA) 유발 피부 염증 모델을 사용하였다. 피부 염증 실험에서 암컷 BALB/c 및 수컷 스위스 웹스터 마우스를 사용하는 것은 접촉 피부염의 잘 특징 규명되고, 적절하며, 재생 가능한 모델이다. 이들 품종의 마우스는 백혈구의 혈류 역학, 혈관 투과성 및 국소 이동으로 이루어진, TPA의 국소 도포 후 장기간 염증 반응을 발전시키는 것으로 나타났으며, 이들 병인적 변화는 사람 피부염의 것과 유사하다{Rao 등, 1993,Inflammation 17(6): 723; Rao 등, 1994,J. Kipid Mediators Cell Signalling 10: 213}.
마우스 군은 귀의 내부 표면 및 외부 표면에 각각 10 ㎕씩, 아세톤 중의 용액(200 ㎍/㎖)으로 도포된 TPA(4 ㎍/귀)의 국소 도포 60 분 후에 비히클 또는 KGF-2를 복강내, 피하 또는 정맥내 수용하였다. 대조군은 국소 도포제로서 20 ㎕의 아세톤을 수용하였다. TPA 도포 4 시간 후, 귀 두께의 증가가 측정되었으며, 귀를 조직학을 위해 절개하였다. TPA에 따른 혈관 투과율을 측정하기 위하여, TPA 국소 도포 후 소정 시간에서 에반스 블루(300 mg/kg)으로 꼬리 정맥을 통하여 마우스에 정맥내 주사한 후, 15 분 후에 마우스를 희생하였다. 귀를 절개하여 제거한 다음, 다메틸포름아미드로 추출하고, 원심분리하였다. 흡광도 판독은 590 nm에서 분광학적으로 측정하였다.
실시예 25
상처 치유에서 KGF-2 Δ33의 효과
피부에서의 KGF-2 Δ33의 생물학적 효과는 FGFR 이성체 2 iiib로 트랜스펙션된 쥐과 pro-B BaF3 세포 뿐만 아니라 일차 사람 표피 각질 세포를 자극하는 KGF-2의 능력을 나타내는 초기 시험관내 데이타를 토대로 실험하였다. 초기 실험은 피내 투여 후 KGF-2 Δ33의 생물학적 효과를 측정하기 위하여 수행하였다. 피내 연구 후, KGF-2 Δ33을 다양한 상처 치유 모델(예컨대, 전체 두께 천공 생검 상처 및 절개 상처)에서 탐사하여 상처 치유제로서 그 효능을 측정하였다.
상처 치유의 글루코코르티코이드 손상 래트 모델에서의 KGF-2 Δ33의 효과
손상된 상처 치유는 당뇨병과 같은 여러 가지 병리학적 상태와 관련된 중요한 임상 문제이며, 스테로이드 또는 항대사제의 전신 투여의 합병증이다. 전신 글루코코르티코이드로의 치료는 조직 회복의 사람 및 동물 모델에서 상처 치유를 손상시키는 것으로 알려졌다. 단세포 레벨의 감소 및 프로콜라겐 합성의 저해는 글루코코르티코이드 투여 후에 관찰되었다. 그러므로, 치유의 염증 상태 및 매트릭스 합성은 조직 회복의 복잡한 과정에 수반되는 중요한 인자이다. 현재의 연구에서, KGF-2의 다중 국소 도포의 효과는 치유가 메틸프레드니솔론의 전신 투여에 의해 손상된 래트의 전체 두께 절개 피부 상처에 대해 평가되었다.
치유를 손상시키기 위하여 스프라그 돌리 래트(n=5/치료군)에 8 mm 배면 상처를 주었다. 상처 부위는 0.1, 0.5 및 1.5 ㎍의 투여량 및 50 ㎕의 부피로 완충제 또는 KGF-2로 매일 국소 처치하였다. 상처 부위는 보정된 제임슨 캘리퍼스를 사용하여 2, 4, 6 및 8 일째에 측정하였다. 6 일째(데이타 도시하지 않음) 및 8 일째(도 47)에 KGF-2 처치군은 완충제 대조군과 비교하였을 때 통계학적으로 유의적인 상처 폐쇄 감소가 나타났다.
당뇨병 마우스 모델의 상처 치유에 대한 KGF-2 Δ33의 효과
6 주령의 체중이 30-35 g인 유전적 당뇨병 동형 접합 암컷(db+/db+) 마우스에 6 mm 생검 천공기로 배면 전체 두께 상처를 제공하였다. 상처는 개방시킨 채로 방치하고, 0.1, 0.5 및 1.5 ㎍의 위약 또는 KGF-2로 매일 처치하였다. 상처 폐쇄는 제임슨 캘리퍼스를 사용하여 측정하였다. 10 일째에 동물을 안락사시키고, 상처 부위를 조직학을 위해 수거하였다.
KGF-2는 위약 또는 미처치군과 비교했을 때 0.1 ㎍(p=0.02)에서 상처 폐쇄율 면에서 유의적인 개선을 나타내었다.
또한, KGF-2의 투여는 위약 또는 미처치군(p=0.01)과 비교했을 대 0.1 ㎍(p=0.03)에서, 그리고 미처치군과 비교했을 때 1.5 ㎍에서 조직학적 스코어의 개선을 나타내었다.
결론
전술한 결과를 토대로, KGF-2는 글루코코르티코이드 투여 및 당뇨병과 같은 손상된 상태에서 유의적인 활성을 나타낸다. 그러므로, KGF-2는 수술 후 상처, 당뇨병 또는 빈약한 순환(예를 들면, 정맥 부전 및 정맥 궤양), 화상 및 기타 비정상적 상처 치유 상태, 예컨대 요독증, 영양실조, 비타민 결핍증, 그리고 스테로이드 및 항신생물약으로의 전신 치료에 임상적으로 유용할 수 있다.
실시예 26
구강 점막에 대한 KGF-2 Δ33의 효과
임상적으로 사용되는 세포독성제는 특정 국소 부위, 예컨대 구강 점막에서 정상 상피의 증식을 저해하여 점막 배리어에서 생명을 위협하는 장애를 초래하는 불리한 효과를 가진다. 본 발명자들은 이러한 임상 분야에서 KGF-2의 효능을 조사하는 연구를 구성하였다. 데이타는 점막염의 모델에서 KGF-2의 치료 효과를 지지한다.
햄스터 구강 점막에 대한 KGF-2 Δ33의 효과
본 발명자들은 KGF-2가 정상 구강 점막 상피의 증식을 유도할 수 있는 지를 결정하려고 하였다. 구강 점막에서의 KGF-2의 효과는 수컷 골든 시리안 햄스터로 평가하였다. 햄스터의 협낭을 완충제 또는 KGF-2 Δ33(0.1, 1 및 10 ㎍/협측)으로 협측당 100 ㎕의 부피로 마취된 햄스터 협측에 국소 도포하여 매일 처치하였다. 화합물을 최소 60 초 동안 협측과 접촉시킨 후, 삼키게 하였다. 처치 7 일 후, 동물을 BrdU로 주사하고, 전술한 바와 같이 희생시켰다. 증식하는 세포는 항-BrdU 항체를 사용하여 표지화하였다. 도 48은 동물을 1 ㎍ 및 10 ㎍의 KGF-2 Δ33을 치료한 경우(완충제 처치와 비교하였을 때), BrdU 표지화의 유의적인 증가(세포 증식)가 있었다는 것을 나타낸다.
KGF-2로의 국소 처치는 정상 점막 상피 세포의 증식을 유발한다. 이러한 결과를 토대로, KGF-2는 임의의 화학요법제(또는 기타 독성 약물 섭생), 방사선요법, 또는 임의의 조합된 화학요법-방사선요법 섭생에 의해 요발되는 구강 점막염의 예방에 임상적으로 유용할 수 있다. 또한, KGF-2는 독성 약제(화학요법) 또는 방사선요법의 결과로서 생긴 구강 점막에 대한 손상의 중증도를 감소시킴으로써 치료제로서 유용할 수 있다.
실시예 27
래트의 허혈 상처 치유에 대한 KGF-2 Δ33의 효과
본 실시예에서 제공되는 실험의 목적은 허혈 상처 치유 모델을 사용하여 상처 치유에서의 KGF-2의 효능을 결정하는 것이다.
국소 피부의 혈액 공급을, 단경 전체 두께 랜덤 근육피판(3 ×4 cm)을 상승시킴으로써 부분 중단시켰다. 전체 두께 상처는 국소 피부로 만들었으며, 근육피판으로 이루어진다. 60 마리의 성체 스프라그 돌리 래트를 사용하고, 이 연구에 대해 KGF-2 Δ33 처치군 및 위약군으로 무작위로 나누었다(5 마리/군/시점). 상처 부위를 상처 형성 후 1, 3, 5, 7, 10 및 15 일째에 각기 수거하였다.
상처 파단 강도는 상처 형성 후 10 일 및 15 일까지 초기 시점에서 KGF-2와 완충제 처치군 간의 유의적인 차를 나타내지는 않았다.
결과는 KGF-2가 상처 형성 후 10 일 후에 허혈 상처 회복에서 상처 파단 강도를 유의적으로 개선시키는 것으로 나타났다. 또한, 이러한 결과는 정상 상처 치유 연구에서 이미 얻은 데이타와 비교하였을 때, 허혈이 양 군에서 치유 과정을 지연시킨다는 것을 시사한다.
이 근육피판 모델은 정맥 역류로부터 얻은 허혈 상황에서의 데이타와 정보를 제공한다. 이러한 결과는 KGF-2가 정맥 역류 및/또는 부전의 손상에 의해 유발된 만성 정맥 다리 궤양의 치료에 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예 28
래트의 결장 문합의 치유에서의 KGF-2의 평가
본 실험의 결과는 KGF-2 Δ33가 위스타 또는 스프라그 돌리 래트의 장 또는 결장 문합의 모델에서 장 회복 속도를 증가시킨다는 것을 설명한다. 또한, 이 모델은 KGF-2와 그 이성체가 봉합사를 결합하는 위장 또는 결장의 능력을 증가시킨다는 것을 설명하는 데 사용될 수 있다.
실험적 문합에서 래트를 사용하는 것은 외과 상처 치유의 잘 특징 규명되고, 적절하며, 재생 가능한 모델이다. 또한, 이 모델은 결장과 소장에서 외과 상처 치유의 질과 속도에 대한 만성 스테로이드 치료 또는 다양한 화학 요법 섭생의 효과를 연구하는 데로 확장할 수 있다{Mastboom W.J.B. 등Br. J. Surg. 78: 54-56 (1991), Salm R. 등J. Surg. Oncol. 47: 5-11, (1991), Weiber S. 등Eur. Surg. Res. 26: 173-178 (1994)}. 문합의 치유는 체내 어느 부위의 상처 치유의 것과 유사하다. 치유의 초기 상태는 급성 염증, 이어서 섬유 아세포 증식 및 콜라겐의 합성을 특징으로 한다. 콜라겐은 점진적으로 모델화되고, 상처는 새로운 콜라겐이 합성됨에 따라서 강화된다{Koruda M.J. 및 Rolandelli R.H.J. Surg. Res. 48: 504-515 (1990)}. 문합 누출과 같은 대부분의 외과 수술 후 합병증은 수술 후 첫번째 수 일 중에 일어나며, 그 기간 중에 장의 강도는 주로 상처 가장자리의 봉합사를 유지할 수 있는 능력에 의해 보장된다. 위장관의 봉합사 유지 능력은 첫번째 수술 후 일들 동안 80% 정도로 감소된다고 보고되었다{Hogstrom H 및 Haglund U.Acta Chri Scand 151: 533--535 (1985), Jonsson K, 등Am J. Surg. 145: 800-803(1983)}.
래트를 케타민(50 mg/kg) 및 크실라진(5 mg/kg)의 배합물로 근육내 마취시켰다. 동물을 피부 소독, 수술 및 수술 후 중에 치유 패드에 놓았다. 복강을 4 cm 길이 중선 절개로 개방하였다. 좌측 결장의 1 cm 폭 세그먼트를 가장자리 혈관을 보전하면서 복부 반전에 근접하여 3 cm 절제하였다. 단층의 엔드-투-엔드 문합술을, 8-10 차단된 8-0 프롤렌 반전 봉합사로 수행하여 장 연속체를 복구하였다. 절개 상처 부위는 근육층용 3-0 러닝 실크 봉합사 및 피부용 외과 스테이플로 폐쇄하였다. 개체 체중, 체온 및 음식 소비 패턴으로 구성된 일일 임상 평가를 각각의 동물에 대해 수행하였다.
KGF-2 Δ33 및 위약 처치는 수술 직후 매일 피하, 국소, 복강내, 근육내, 위장내 또는 결장내 투여한 후, 7 일째에 희생시킬 때까지 계속하였다. 미처리 대조군, 위약군 및 KGF-2 Δ33 군이 있었다. 안락사시키기 2 시간 전에, 동물을 100 mg/kg BrdU로 복강내 주사하였다. 동물을 최종 처치(5 일)한 지 24 시간 후에 안락사시켰다. 내측 복강벽에 중선 절개를 행하고, 문합을 포함하여 1 cm 길이 결장 세그먼트를 제거하였다. 수술 부위에서 제3 세그먼트를 전체 콜라겐 분석을 위해 취하였다.
일련의 두 실험에서, 수컷 성체 SD 래트(n=5)를 마취시키고, 8-10 차단된 6-0 프롤렌 반전 봉합사로 원단 결장의 단층 엔드-투-엔드 문합을 수용시켰다. 그 후, 문합 부위는 1 및 4 ㎍의 농도의 완충제 또는 KGF-2 Δ33으로 주사기에 의해 국소 처치하였다. 그 다음, 동물을 1 mg/kg 또는 5 mg/kg의 농도의 완충제 또는KGF-2 Δ33으로 복강내로 그 후 매일 처치하였다. 5 일째에 동물을 안락사시키고, 결장을 절제하였으며, 액체 질소에 즉시 냉동시키고, 동결 건조시켰으며, 콜라겐 측정을 행하였다. 콜라겐 농도는 ㎍ 콜라겐/mg 건조 중량 조직으로 표시하였다. 부대 t 테스트(평균 ±SE)를 사용하여 통계학적 분석을 행하였다. 5 일째에 래트를 마취시키고, 바륨 관장제를 수용시킨 다음, 방사선 사진 분석을 행하였다. 두 가지 실험으로부터 엔드-투-엔드 좌측 결장 문합의 바륨 관장제 방사선 평가는 1 및 5 mg/kg에서 KGF-2 Δ33 처치된 동물로 복강 누출의 일관된 감소를 나타내었다. 이 데이타는 하기 표에 나타낸다. 또한, 수술 부위의 파단 강도도 장력계를 사용하여 실험하였다. KGF-2 Δ33와 완충제 군 간의 유의적인 차는 관찰되지 않았다. 도 49에 나타낸 바와 같이, 수술 부위에서 콜라겐 함량의 유의적인 증가가 완충제 대조군에 비하여 1 mg/kg KGF-2 Δ33(p=0.02) 및 5 mg/kg(p=0.004)에서 나타났다.
[표]
결장 문합술방사선 분석
군 대소변 존재율 문합 수축* 복강 누출률
비처치군(N=8) 50% 2.0 75%
완충제(N=8) 57% 1.0 50%
KGF-2 Δ33[1 mg/kg](N=8) 50% 1.3 37%
KGF-2 Δ33[1 mg/kg](N=9) 77% 1.6 11%
*문합 수축 스코어링: 0 - 수축 없음; 1-5 - 최소 내지 중증 수축
수컷 성체 SD 래트(n=5)를 케타민(50 mg/kg) 및 크실라진(5 mg/kg)의 배합물로 근육내 마취시켰다. 복강을 4 cm 길이 중선 절개로 개방하였다. 좌측 결장의 1 cm 폭 세그먼트를 가장자리 혈관을 보전하면서 복부 반전에 근접하여 3 cm 절제하였다. 단층의 엔드-투-엔드 문합술을, 8-10 차단된 6-0 프롤렌 반전 봉합사로 수행하여 장 연속체를 복구하였다. 그 후, 문합 부위는 1 및 4 ㎍의 농도의 완충제 또는 KGF-2 Δ33으로 주사기에 의해 국소 처치하였다. 절개 상처 부위는 근육층용 3-0 러닝 실크 봉합사 및 피부용 외과 스테이플로 폐쇄하였다. 그 다음, 처치는 매일 투여하였으며, 완충제 또는 KGF-2 Δ33로 구성되었으며, 1 및 5 mg/kg 피하 투여하였다. 수술 당일 및 그 후 매일 체중을 재었다. 최종 처치(5 일) 후 24 시간째에 동물을 마취시켰다. 동물을 마취시키고, 바륨 관장제를 수용시킨 다음, 고정 거리에서 x선 촬영하였다. 그 다음, 문합 부위를, 조직 병리학 및 생체역학 분석을 위해 절제하였다.
실시예 29
염증성 장 질환 모델에서 KGF-2 Δ33의 평가
KGF-2는 시험관내 각질 세포 증식을 유발하고, 생체내 여러 가지 상처 치유 모델에서 활성인 단백질이다. 이 연구의 목적은 KGF-2가 식수 중의 덱스트란 나트륨 술페이트에 무작위 노출시킴으로써 유발된 쥐과 대장염 모델에서 효능이 있는지를 결정하는 것이다.
6 내지 8 주령의 암컷 스위스 위스터 마우스(20-25 g, 찰스 리버, 미국 노스캐롤라이나주 레일레이 소재)를, 1 주 동안 황산나트륨(DSS, 36,000-44,000 MW, 아메리칸 인터내셔널 케미스트리, 미국 매사추세츠주 나틱 소재)의 4% 용액을 무작위로 투여하여 유발된 염증성 장 질환의 모델에 사용하였다. 세 가지 매개변수를 효능 결정에 사용하였다: 1) 대변의 평가를 토대로 한 임상 스코어; 2) 결장의 평가를 토대로 한 조직학적 스코어; 및 3) 체중 변화. 임상 스코어는 최대 스코어 4를 합계를 낸 두 부분으로 구성되었다. 대변 견고도는 0=단담함; 1=무름; 2=설사로 등급을 매겼다. 대변 내 혈액도 0=혈액 없음; 1=혈액이 잘 보이지 않음; 및 2=대량의 장 출혈로 0 내지 2의 스코어로 평가하였다. 3 이상의 평균 군 스코어는 가능성이 큰 치사율 및 그 치료 가능한 단계를 지나 진행된 질환을 가리킨다. 임상 스코어는 0, 4, 5, 6 및 7 일째에 취하였다. 조직학적 스코어에 도달하기 위하여 상승하고, 가로지르고 하강하는 결장의 슬라이드를, 염증 스코어(0-3) 및 선와 스코어(0-4)에 기초한 맹검 양식으로 평가하였다. 체중은 매일 측정하였다. 데이타는 평균 + SEM으로 표시하였다. 부대 스튜던트 t 테스트를 사용하여 질환 대조군과 비교하였을 때 유의적인 차를 결정하였다(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001).
DSS 처치된 마우스에게 7 일 동안 1, 5 또는 10 mg/kg의 투여량으로 KGF-2 Δ33의 복강내 주사를 매일 제공하였을 때, KGF-2는 임상 스코어를 각각 28%, 38% 및 50% 유의적으로 감소시켰다. 조직학적 평가는 임상 스코어의 투여량 의존성 저해와 밀접하게 대응하였으며, 1, 5 및 10 mg/kg 투여량은 조직학적 스코어를 유의적인 26%, 48% 및 51% 감소시켰다. 또한, KGF-2도 DSS 유발 대장염과 관련된 체중 감소를 유의적으로 감소시켰다.
제2 연구에서, 매일 복강내 또는 피하 제공한 경우의 KGF-2 Δ33(10 mg/kg)의 상대 효능을 비교하였다. 7 일째 실험의 중단까지 KGF-2로 복강내 주사된 동물은 유의적인 34%의 임상 스코어 감소가 있는 반면에, 피하 주사된 KGF-2는 유의적인 46% 감소가 있었다. 또한, 피하 투여는 DSS 대조군에 비하여 유의적으로 체중 감소를 감소시켰다. 임상 스코어 및 체중의 측정을 토대로, KGF-2의 피하 투여는 적어도 복강내 투여만큼 효능이 있었다.
실시예 30
정상 방광 및 전립선에 대한, 그리고 래트에서 시클로포스파미드에 의해 유도된 출혈성 방광염에 대한 KGF-2 △33의 효과
이 실시예의 목적은 KGF-2 △33이 정상적인 래트에서 방광의 증식을 자극할 수 있고, 시클로포스파미드에 의해 유도된 출혈성 방광염을 가진 래트 모델에서 KGF-2 △33의 치료적 효과가 있음을 보여주기 위한 것이다.
임상적으로 사용되는 일부 세포독성 작용제는 방광에서 정상적인 상피의 증식을 저해하여 방광의 상피 내부에서 잠재적으로 생명을 위협하는 궤양 발생과 붕괴(breakdown)가 일어나게 된다. 예를 들어, 시클로포스파미드는 일부 환자에서 출혈성 방광염, 심각할 수 있고 어떤 경우 치명적일 수 있는 합병증을 일으킨다. 방광의 섬유화는 또한 방광염에 의하거나 또는 이것과 상관없이 진행될 수 있다. 이러한 손상은 뇨에서 분비된 시클로포스파미드 대사체에 의해 유발되는 것으로 생각된다. 심각한 출혈성 방광염의 경우에는 시클로포스파미드 치료을 중단시키는 결과를 초래한다. 또한, 방광의 악성 종양은 일반적으로 시클로포스파미드 치료 후 2년 이내에 발생하고, 이전에 출혈성 방광염을 이전에 앓은 환자에서 발생한다(CYTOXAN(시클로포스파미드) 포장에 기입되어 있음). 시클로포스파미드는 전립선 및 남성의 생식계에 대한 독성을 가지고 있다. 시클로포스파미드 치료는 불임을 진행시킬 수 있어서, 어느 정도의 고환 위축을 가져올 수 있다.
정상적인 방광, 고환 및 전립선에 대한 KGF-2 △33의 효과
실험 설계
이 시험에서는 수컷 스프라그-다울리 래트(160-220 g),(n=4 내지 6/치료 집단)을 사용하였다. KGF-2 △33을 5 mg/kg/일의 용량으로 투여하였다. 재조합 KGF-2 △33 또는 완충액(pH 6.5에서 40 mM 나트륨 아세테이트 + 150 mM NaCl)을 매일 복막내 또는 피하 주사로 1-7일간 투여하였고, 다음날 래트를 치사시켰다. KGF-2 △33에 의해 유도된 효과의 가역성을 조사하기 위하여, 추가 동물에 KGF-2 △33을 매일 복막내로 7일간 투여하였고, 치료가 이루어지지 않은 7일간의 기간이 경과한 후 치사시켰다.
치사시키는 날에, 래트에 BrdU 100 mg/kg을 정맥 투여하였다. 2시간 후에, 래트에 에테르를 과용량 투여하고, 제거된 장기를 선택하였다. 조직 샘플을 10% 중성 완충 포르말린 중에 24시간동안 고정시키고 파라핀 매립시켰다. 복제 세포로 BrdU의 혼입을 탐지하기 위하여, 마우스 항-BrdU 모노클로날 항체 및 ABC 엘리트 검출 시스템을 사용하여 5 마이크론 단편에 대한 면역조직화학적 절차를 수행하였다. 이 단편은 헤마톡실린으로 약하게 반대염색(counterstain)되었다.
단편들을 맹검 관찰자에 의해 판독하게 하였다. 증식하는 세포의 수는 전립선에 있어서 10배 배율로 동물 마리당 10개의 무작위적 필드에서 계수하였다. 방광에서 KGF-2 △33의 효과를 평가하기 위하여, 이들 조직의 단면을 제조하여 증식하는 세포 및 증식하지 않는 세포의 수를 20배 배율로 10개의 무작위적인 필드에서 계수하였다. 결과는 표지되지 않은 세포에 대한 표지된 세포의 백분율로서 나타낸다. 데이타는 평균 + SEM으로서 제시된다. 통계적 분석(2개의 꼬리를 가진 쌍을 이루지 않은 t-테스트)을 스타뷰 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행하였고, 통계적 의미는 P<0.05로 정의된다.
결과
방광
KGF-2 △33의 복막내 주사는 7일의 시험 기간에 걸쳐 방광 상피 세포의 증식을 유도하였지만, 이것은 장기의 중량에 영향을 주지 않았다(검정색 사각형, 도 52). 피하 투여는 증식의 작은 증가를 유도해냈지만, 통계적 유의성을 획득하는 데에는 실패하였다(검정색 원형, 도 52).
전립선 및 고환
KGF-2 △33의 피하 및 복막내 투여 둘다는 전립선의 유의성 있는 증식을 유도했지만(도 53), 2회 투여 후에 이것은 정상화되었다. 장기간의 KGF-2 △33을 사용한 복막내 치료는 전립선 및 고환의 중량을 증가시키지 않았다.
시클로포스파미드에 의해 유도된 출혈성 방광염에 대한 KGF-2 △33의 효과
실험 설계
수컷 스프라그 다울리 래트(300-400 g)(n=5/집단)에 꼬리 정맥을 통해 1 내지 5 mg/kg 농도의 KGF-2 △33를 정맥 주사한 뒤 24시간 후에 시클로포스파미드를200 mg/kg을 복막내 주사하였다. 마지막날에, 시클로포스파미드 투여 후 48시간후에, 래트에 100 mg/kg의 BrdU를 복막내 주사하였다. 2시간 후, 래트를 CO2 투여에 의해 치사시켰다. 방광의 고정은 방광의 강내로 10% 포르말린의 직접 주사 및 포르말린으로 방광 외부를 세척하는 것에 의해 이루어졌다. 5분 후, 방광 및 전립선을 제거하였다. 방광 및 전립선을 파라핀 매립시키고, 단면을 잘라, H&E으로 염색하고, 마우스 항-BrdU 모노클로날 항체를 사용하여 염색하였다. 요상피 손상 범위는 하기 스코어 시스템을 사용하여 평가하였다 : 2명의 각기 다른 관찰자에 의해 방광을 분류하여, 요상피의 손상 정도를 기록하였다. (요상피 손상은 요상피의 0, 25%, 50%, 75%, 및 100% 손실로 스코어링하였다). 또한, 방광벽의 두께는 단편 하나당 10개의 무작위적인 부위에서 측정되었고, ㎛로 표현되었다.
결과
육안 관찰
플라시보 및 시클로포스파미드로 치료한 래트에서, 방광은 두꺼웠고, 단단했다. 10% 포르말린을 주사한 후, 방광이 아주 조금 팽창한 것이 관찰되었다. 그러나, KGF-2 △33으로 예비처리된 집단에서는, 포르말린의 직접 주사 후 더 큰 유연성이 관찰되었는데, 이것은 더 작은 정도의 섬유화를 의미하였다.
현미경 관찰
도 54는 방광에서 궤양 부위상에 KGF-2 △33 예비처리 결과를 보여준다. 복막내 식염수로 처리한 정상적인 래트(식염수 대조군)에서, 방광은 조직학적으로 정상적이었고, 요상피에 궤양 형성이 관찰되지 않았다. 시클로포스파미드 200 mg/kg복막내 주사 투여는 총 상피 영역의 25 내지 50%(평균 37%)인 방광 상피에 궤양을 형성하였다. 시클로포스파미드를 투여하기 24시간 전에 KGF-2 △33을 투여한 경우, 시클로포스파미드를 투여받은 플라시보 처리된 동물에 비해 궤양 영역이 상당히 감소되었다(1 mg/kg 0.4% p=0.0128, 및 5 mg/kg 5%, p=0.0338%).
도 55는 KGF-2 △33이 상피, 평활근층 및 세로살(serosal) 표면을 포함하는 방광벽의 두께에 미치는 영향을 보여준다. 완충액만으로 처리된 집단에서, 방광벽의 두께는 약 40 ㎛였다. 시클로포스파미드로 처리한 결과, 방광벽의 두께는 210㎛로 5배 증가되었다. 시클로포스파미드로 처리된 동물을 KGF-2 △33로 예비처리한 결과, 시클로포스파미드만을 단독으로 처리한 경우에 비해 방광벽의 시클로포스파미드 확장을 상당히 저해시켰다(1 mg/kg 98.6 ㎛(p=0.007) 및 5 mg/kg 52.3 ㎛(p<0.0001)).
육안 관찰
전립선 : 완충액과 시클로포스파미드를 투여한 래트에서, 정상에 비해 전립선(acini)의 현저한 위축과, 상당한 부종을 가진 간극 확장이 관찰되었다. 또한, 상피 세포 내부의 전립선이 해당 정상적인 전립선 조직에 비해 더 짧아지고, 더욱 밀도가 저하됨이 관찰되었다. 1 mg/kg 및 5 mg/kg에서의 KGF-2 △33 예비처리는 전립선의 정상적인 조직학적 외관을 나타내였다. 간극 또는 부종의 증가도 관찰되지 않았고, 상피 세포 내부의 전립선의 크기와 밀도는 정상적인 전립선 조직과 유사하였다.
결론
이러한 결과는 KGF-2 △33가 방광 상피 세포 및 상피 세포 내부의 전립선의 증식을 특이적으로 유도한다는 것을 입증한다. 이 결과는 또한 KGF-2 △33가 시클로포스파미드에 의해 유도된 출혈성 방광염에서 궤양이 형성된 영역을 특이적으로 상당히 감소시킨다는 것을 입증한다.
실시예 31
정상적인 래트에서 세포의 증식에 대한 KGF-2의 영향
FGF 부류의 하나인 KGF-2는 정상적인 인간 및 래트 케라티노사이트의 증식을 유도한다. 이것은 KGF-1(FGF 부류의 하나임)과 약 57% 상동성을 가지고 있다. KGF-1은 다수의 장기에서 상피의 증식을 유도하는 것으로 보고되었다. 문헌 참조[Housley et al., Keratinocyte growth factor induces proliferation of hepatocytes and epithelial cells throughout the rat gastrointestinal tract.J Clin INvest94:1764-1777(1994); Ulich et al., Keratinocyte growth factor is a growth factor for type II pneumocytes in vivo,J Clin Invest93: 1298-1306(1994); Ulich et al., Keratinocyte growth factor is a growth factor for mammary epithelium in vivo. The mammary epithelium of lactating rats is resistant to the proliferative action of keratinocyte growth factor.Am J Pathol144:862-868 (1994); Nguyen et al., Expression of keratinocyte growth factor in embryonic liver of transgenic mice causes changes in epithelial growth and differentiation resultion in polycystic kidneys and other organ malformations.Oncogene12:2109-2119 (1996); Yi et al., Keratinocyte growthfactior induces pancreatic ductal epithelial proliferarion,AM J pathol145:80-85 (1994); and Yi et al., Keratinocyte growth factor causes proliferation of urothelium in vivo.J Urology154:1455-1570 (1995)]. 우리는 KGF-2를 사용하여 유사한 실험을 수행하여, 피하 및 복막내 경로를 이용하여 전신적으로 투여되었을 때 이것이 래트에서 정상적인 상피의 증식을 유도하는가를 알아보기로 하였다.
방법:
이 시험에서는 수컷 스프라그-다울리 래트(160-220 g)를 할란 스프라그 다울리로부터 입수하였다. KGF-2 △33(HG03411-E2)을 5 mg/kg/일의 용량으로 투여하였다. KGF-2 △33 또는 재조합 완충액(pH 6.5에서 40 mM 나트륨 아세테이트 + 150 mM NaCl)을 매일 복막내 또는 피하 주사로 1-7일간 투여하였고, 다음날 래트를 치사시켰다(아래 참조). KGF-2 △33에 의해 유도된 효과의 가역성을 조사하기 위하여, 추가 동물에 KGF-2 △33 또는 완충액을 매일 복막내로 7일간 투여하였고, 치료가 이루어지지 않은 7일간의 기간이 경과한 후 치사시켰다.
치사시키는 날에, 래트에 BrdU 100 mg/kg을 정맥 투여하였다. 2시간 후에, 래트에 에테르를 과용량 투여하고, 제거된 장기를 선택하였다. 조직 샘플을 10% 중성 완충 포르말린 중에 24시간동안 고정시키고 파라핀 매립시켰다. 복제 세포로 BrdU의 혼입을 탐지하기 위하여, 마우스 항-BrdU 모노클로날 항체(베링거 만하임) 및 ABC 엘리트 검출 시스템(벡터 라보래토리즈)을 사용하여 5 마이크론 단편에 대한 면역조직화학적 절차를 수행하였다. 이 단편은 헤마톡실린으로 약하게 반대염색되었다.
단편들을 맹검 관찰자에 의해 판독하게 하였다. 증식하는 세포의 수는 하기 조직에 있어서 10배 배율로 동물 마리당 10개의 무작위적 필드에서 계수하였다: 간, 췌장, 전립선 및 심장. 폐 분석에 있어서, 증식을 20배 배율에서 정량한 것을 제외하고는, 10개의 무작위적인 필드를 사용하였다. 신장은 다수의 기능적으로 구별되는 영역을 가지므로, 증식은 동물 한마리당 하나의 신장의 중심에서 취한 대조 절편중에서 평가되었다. 식도 및 방광에 대한 KGF-2 △33의 효과를 평가하기 위하여, 이들 조직의 절편을 제조하여 증식하는 세포 및 증식하지 않는 세포의 수를 각각 10배 및 20배 배율로 10개의 무작위적인 필드에서 계수하였다. 결과는 표지되지 않은 세포에 대한 표지된 세포의 백분율로서 나타낸다.
데이타는 평균 + SEM으로서 제시된다. 통계적 분석(2개의 꼬리를 가진 쌍을 이루지 않은 t-테스트)을 스타뷰 소프트웨어 패키지(아바쿠스 컨셉 인코포레이티드, 버클리, 캘리포니아주)를 사용하여 수행하였고, 통계적 유의성은 P<0.05로 정의된다.
결과:
도 56은 실험 프로토콜의 개관을 보여준다. 하나의 집단에는 6마리의 동물이 사용되었다. 그러나, 맹검 관찰자에 의한 분석시에, 때때로 BrdU 주사는 비성공적임이 명확해졌다. 결과를 해독하기 전에, 115 마리 가운데 8 마리의 래트(또는 7%의 동물)의 데이타는 연구로부터 제외되었고, 얻어진 집단의 크기는 하기 표에서 도시한다.
이 연구에 사용된 집단의 크기
n=
처리시간ipsc
KGF-2 △331일 65
완충액1일66
KGF-2 △332일64
완충액2일66
KGF-2 △333일55
완충액3일55
KGF-2 △337일66
완충액7일65
KGF-2 △337일 + 7일간 처리안함6ND
완충액7일 + 7일간 처리안함6ND
간. 복막내로 투여되었을 때, 1회 주사 후 KGF-2 △33은 간세포의 급속한 증식을 유도하였고(검정색 사각형)(도 57), 이것은 3일간 지속되는 유사분열 활성을 증가시켰으며, 7일간의 매일 주사 후 정상으로 되돌아왔다. 간에서 수행된 KGF-2의 복막내 투여의 급격한 효과와 대조적으로, 피하 투여되었을 때(검정색 원형, 도 57), 이러한 성장 인자는 작은 효과를 나타내었다. 증식은 1일간의 처리 후 증가되었으나, 2일간의 매일 주사 후에 정상적인 수준으로 되돌아왔다.
췌장. 간에 있어서 복막 투여된 KGF-2 △33의 급속한 가역적인 효과와 대조적으로, 이러한 주사는 14일의 시험 기간에 걸쳐 지속되는 췌장의 증식을 유도하였다(검정색 사각형, 도 58). 놀랍게도, KGF-2 △33의 피하 주사(검정색 원형)는 어떤 시점에서도 증식을 유도하는데 실패하였다.
신장 및 방광. KGF-2 △33은 피하 또는 복막내 경로로 투여되었을 때 신장 상피의 증식을 유도하였지만, 전자는 더욱 큰 효과를 유도하였다. 피하 투여는 2일 후에 피크에 도달하고 7일 처리 후 정상으로 되돌아가는 급속한 증식 증가를 유도하였다(검정색 원형, 도 59). KGF-2 △33이 복막내로 투여되었을 때(검정색 사각형), 중간 정도이지만, 하지만 2일 및 3일째에만 관찰되는 증식의 상당한 증가가 있었다. 또한, KGF-2 △33의 복막내 주사는 7일의 시험 기간에 걸쳐 방광 상피 세포의 증식을 유도하였다(검정색 사각형, 도 52). 피하 투여는 약간의 증식 증가를 유도했지만, 통계적 유의성을 얻는 데에는 실패하였다(검정색 원형, 도 52).
전립선. KGF-2 △33의 피하 및 복막내 투여 둘다는 전립선의 상당한 증식을 유도하였지만(도 53), 이것은 2회의 투여 후 정상화되었다.
식도. 피하 또는 복막내로 투여된 KGF-2 △33은 식도 세포의 증식에서 급속히 정상으로 되돌아가는 초기, 단기간(각각 1일 및 2일)의 증식을 유도하였다(결과는 도시하지 않음).
기타 장기. KGF-2 △33의 복막 및 피하 경로를 통한 전신 투여는 7일간의 투여 기간에 걸쳐 폐 상피의 증식을 유도하는 데 실패하였다.
논의
피하 경로로 투여되었을 때, 우리는 일부 장기(간, 신장, 식도 및 전립선)에서 정상적인 상피 증식의 자극을 관찰하였지만, 이러한 효과는 대부분 단시간 지속되며 가역적이었다. 이들 장기에서의 증식은 KGF-2 △33의 매일 피하 투여시에도 역전되었다.
투여 경로는 관찰된 증식에 대하여 현저한 효과를 가지고 있었다. 매일 복막 투여는 3일의 기간에 걸쳐 간의 증식 속도를 증가시킨 반면에, 매일 피하로 KGF-2이 투여된 동물은 처치 1일 후에만 증가된 속도를 보여주었다. 더욱 놀라운 것은 췌장의 응답이었다. 복막내로 KGF-2를 투여받은 동물의 췌장은 14일의 시험 기간에 걸쳐 상당히 증가된 증식 수준을 나타내였다. 하지만, KGF-2의 피하 투여는 췌장에서 유사분열 활성의 증가를 유도하지 않았다. 또한, KGF-2의 피하 투여가 아닌 복막 투여는 방광 점막의 증식을 유도하였다.
KGF-2의 복막 투여는 집합 도관을 포함하는 영역을 중심으로 신장에서 단기간의 소규모 증식을 유도하였다. 일일 피하 처리는 이 영역에서 장기간의 과대한 증식을 유도해 냈다.
실시예 32
기관내 투여에 따른 폐의 세포 증식에 대한 KGF-2 △33의 영향
본 실시예의 목적은 KGF-2 △33이 기관내 투여(폐로의 직접적인 KGF-2 △33 투여)에 따른 정상 래트에서 폐의 증식을 자극할 수 있음을 보여주기 위함이다.
방법: 이 연구에서는 수컷 루이스 래트(220-270 g),(n=5/처리 집단)를 사용하였다. KGF-2 △33 또는 플라시보(pH 6.5에서 40 mM 나트륨 아세테이트 + 150 mM NaCl)을 0.6 ml의 체적의 1 내지 5 mg/kg의 용량으로 기관내 투여한 후, 3 ml의 공기를 투여하였다. 처리는 실험 프로토콜의 1일째 및 2일째에 투여되었다.
치사일인 3일째에, 래트에 BrdU 100 mg/kg을 복막내 주사하였다. 2시간 후, 래트를 CO2질식에 의해 치사시켰다. 기관지 카테터를 통해 10% 완충 포르말린으로 폐를 확장시켰고, 폐의 구결 영역은 파라핀 매립시켰다. 복제 세포로의 BrdU 혼입을 검출하기 위하여, 마우스 항-BrdU 모노클로날 항체 및 ABC 엘리트 검출 시스템을 사용하여 5 마이크론 영역에 대한 면역조직화학적 절차를 수행하였다. 이 영역은 헤마톡실린으로 약하게 반대염색되었다.
이 영역은 2명의 맹검 관찰자에 의해 판독되었다. 증식 세포의 수는 20 배 배율로 단편 하나당 10개의 무작위적인 필드에서 계수되었다. 이 결과는 필드 당 BrdU 양성 세포의 개수로서 표현되었다. 데이타는 평균값 ±SEM으로 제시된다. 통계적 분석(쌍을 이루지 않은 t-테스트)은 인스타트 v2.01을 사용하여 수행되었고, 통계적 유의성은 p<0.05로 정의되었다.
결과: 1 및 5 mg/kg로 KGF-2 △33을 기관내 주사한 결과 도 60에서 보는 바와 같이 폐의 상피 세포 증식이 증가되었다. KGF-2 △33 처리 결과, 필드당 1.58 세포의 완충액 대조군에 비해, 1 mg/kg 23.4 세포/필드(p=0.0002) 및 5 mg/kg 10.3 세포/필드(p=0.0003)에서 BrdU 양성 세포/필드 개수에서 통계적으로 유의성 있는 증가를 나타내었다.
실시예 33
감염된 절개 상처에서 국소 KGF-2
상처의 박테리아 감염은 임상에서 계속적으로 중요하다. 정상적인 상황에서, 상처 치료의 복잡한 과정은 무리없이 진행된다. 그러나, 박테리아에 의한 상처의 감염은 염증 반응에서 세포성 매개체의 불균형을 초래하여 상처 치료를 지연시킨다. 개방된 상처의 감염은 정상 상처 콜라겐 함량에 비해 낮은 감소된 상처 수축과 감소된 인장 강도를 특징으로 하는 상처 치료 과정을 저해한다. 수컷 성인 스프라그 다울리 래트(n+10/집단)는 1일째에 케타민(5.3 mg/kg im) 및 자일라진(5.3 mg/kg im)의 조합물로 마취시켰다. 배면부를 면도하고, 70% 알코올로 소독하였다. 멸균한 10번 수술용 메스를 사용하여 견갑골에서 약 1 cm 아래에서 시작해서 전체 두께(상피, 진피 내지 피하 층까지) 2.5 cm의 수술 상처를 내었다. 상처는 3개의 등거리 피부 스테플로 코팅시켰다. 이어서, 절개부를 PBS 중의 스타필로코쿠스 아우레우스(107 cfu/50 ㎕)로 절개내부로 감염시켰다. KGF-2 △33를 50㎕ 부피로 상처당 0.1, 1 및 10 ㎍의 용량으로 상처를 낸 시점에(0일)국소 도포하였다. 이어서, 상처를 가스 투과성 폐색 드레싱(Tegaderm)으로 덮었다. 동물은 케타민/자일라진으로 마취시킨 후 페노바르비탈 나트륨염(300 mg/kg)의 치사량 심장내 투여에 의해 5일째에 치사시켰다. 상처의 중간 0.5 cm 단편을 절개하고, 콜라겐 측정을 위해 일시에 동결시켰다. 너비가 0.5 cm인 2개의 다른 상처 조각들을 절개하였다. 절개된 상처 조각은 인스트론 피부 인장시험기를 사용하여 파단 강도를 시험하는 데 사용되었다. 파단 강도는 0 mm/초의 속도에서 11 1 b 로드 셀을 사용한 파열 이전에 각각의 상처에 의해 저지되는 최대 힘으로서 정의되었다. 각각의 동물에 대한 2가지 값을 평균하여 각각의 상처당 파단 강도 값의 평균을 제공하였다. 통계적 분석은싸을 이루지 않은 t 테스트(평균 ±SE)를 사용하여 수행되었다.
상처에 스타필로코쿠스 아우레우스의 절개부내로의 적용은 파단 강도에 의해 측정되는 바와 같이, 상처 치료에 상당한 장애를 가져왔다(한가지 실험에서 박테리아 비히클로 처리된 비감염된 상처 136 ±6 g; 감염된 상처 87 ±6 g; p<0.0001; 다른 실험에서 박테리아 비히클로 처리된 비감염된 상처 200 ±14 g; 감염된 상처 154 ±10 g p=0.1). KGF-2의 국소 투여는 KGF-2 완충액 + S. 아우레우스 대조군(하나의 실험에서 KGF-2 0.1 ㎍ 152 ±16 g(p=0.002); 1 ㎍ 135 ±12 g(p=0.003); 10 ㎍ 158 ±10 g(p<0.0001); 다른 실험에서 0.1 ㎍ 185 ±10 g(p=0.03); 1 ㎍ 186 ±11 g(p=0.03); 10 ㎍ 190 ±7 g(p=0.009))에 비교할 때, 0.1, 1 및 10 ㎍ 용량에서 통계적으로 유의성 있는 파단 강도의 증가를 유발하였다. 중간의 0.5 cm 상처 조각의 콜라겐 분석은 KGF-2로 처리된 상처에서 콜라겐 함량의 증가를 나타내었다. 그러나, 완충액 대조군에 비해, 통계적으로 유의성있는 콜라겐 함량 증가는 관찰되지 않았다.
실시예 33
1 mg/kg KGF-2 △33의 이틀 단위 정맥 투여의 증식 효과
수컷 스프라그 다울리 래트에 1 mg/kg 용량의 KGF-2 △33 또는 완충액중 하나를 정맥 주사하였다. 동물에 매일 또는 이틀에 한번씩 주사하였다. 각각의 처리집단에 일주일동안 주사하고, 일주일의 마지막날에 치사시켰다. 치사일에, 동물의 복막내로 BrdU 100 mg/kg을 주사하였다. 2시간 후, 동물을 치사시키고, 혈청을 수집하였다. 다양한 조직을 수집하였고, 10% 중성 완충 포르말린 중에 고정시켰다.조직은 조직학적 평가를 위해 처리되었다. 조직을 헤마톡실린 및 에오신, 페리오드산-쉬프(periodic-acid-Schiff) 또는 알키안(alcian) 블루로 염색하였다. 다른 단편은 항-BrdU 항체로 면역조직화학적 염색을 하였다. 이미지 분석 스펙트럼을 사용하여 증식을 정량하였다. 혈청 화학 분석은 자동화된 화학 분석기를 사용하여 수행되었다. 하기 파라메타를 정량하였다 : 갑상선 중량; 소장(십이지장, 공장 및 회장)의 고블릿(goblet) 세포 증식; 이하선 및 하악선에서의 증식; 혈청 화학 분석물(포도당, BUN, 칼슘, 총단백, 알부민, 알카라인 포스파타아제, 알라닌 아미노트랜스퍼라아제, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제, 콜레스테롤 및 트리글리세라이드).
소장 및 대장에서, KGF-2 일일 처리는 고블릿 세포 개수에 유의성 있는 증가를 유발하였다. 이틀에 한번의 처리는 고블릿 세포 개수에 경미한 증가를 일으켰지만, 이것은 통계적으로 유의성 있는 수준에 도달하지 못했다. 침샘에서, 세포의 증가는 이하선에서만 관찰되었다. 처리 집단 사이에 차이는 없었다. 양쪽의 투여 용법에 따라 갑상선의 확장이 있었다. 이러한 증가는 일일 처리 집단에서 더욱 현저하였다. KGF-2로의 일일 처리 결과, 아래 분석물에서 통계적으로 유의성 있는 증가가 나타났다: 트리글리세라이드, 알카라인 포르파타아제, 칼슘, 알부민, 총 단백. 이틀마다의 처리는 이러한 분석물 상에 어떠한 영향을 미치지 않았다. 콜레스테롤 수치는 양쪽 처리 집단에서 모두 상승하였다. 그러나, 이러한 증가는 일일 처리 집단에서 더욱 현저하였다. 세포 손상의 마커, 예를 들어 ALT 및 AST는 양쪽 처리 집단에서 유사하게 감소하였다.
실시예 34
폴리펩티드의 제조
KGF-2 조성물은 개개의 환자의 임상적 상태(특히, KGF-2 폴리펩티드 단독의 처리의 부작용), 전달의 부작용, 투여 방법, 투여 계획 및 숙련자에게 알려진 기타 인자를 고려하여, 우수한 의학적 기술에 부합하는 방식으로 제조되고 투여될 수 있다. 본원에서의 목적에 대한 "유효량"은 이러한 고려에 의해 결정된다.
일반적인 제안으로서, 1회 투여시에 비경구적으로 투여되는 KGF-2의 총 약학적 유효량은 환자의 체중을 기준으로 약 1 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일이지만, 전술한 바와 같이, 이것은 치료에 대한 판단에 따라 달라질 것이다. 더욱 바람직하게, 이러한 용량은 0.01 mg/kg/일 이상이고, 가장 바람직하게는 인간에 있어서 호르몬 0.01 내지 1 mg/kg/일이다. 연속적으로 투여되는 경우, KGF-2는 통상 하루에 1-4회의 주사 또는 연속적인 피하 주입, 예를 들어 미니 펌프를 이용하여 1 ㎍/kg/일 내지 50㎍/kg/일의 용량 비율로 투여된다. 정맥 주머니 용액이 또한 사용될 수 있다. 변화를 관찰하는 데 필요한 치료의 길이 및 응답이 나타나는 처리의 간격은 목ㅈ거하는 효과에 따라 달라질 것이다.
KGF-2를 포함하는 약학 조성물은 경구로, 직장으로, 비경구적으로, 전신내로, 질내료, 복막내로, 국소적으로(분말, 연고, 겔, 점적액 또는 경피 패취에 의해), 협측으로 또는 경구 또는 비강 스프레이로서 투여된다. "약학적 허용 담체"라는 용어는 비독성 고쳐, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 임의의 형태의 보조제 조성물을 의미한다. 본원에 사용된 "비경구적"이라는 용어는 정맥내, 근육내, 복막내, 흉골내 및 동맥내 주사 또는 주입을 포괄하는 투여 방식을 의미한다.
KGF-2는 또한 서방성 시스템으로 투여되기에 적합하다. 서방성 조성물의 적합한 예로는 성형된 물품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스, 예컨대 필름 또는 마이크로캡슐을 들 수 있다. 서방성 매트릭스는 폴리락티드(미국 특허 제3,773, 319호, 유럽특허 58,481호), L-글루탐산 및 감마-에틸 L-글루타메이트의 공중합체(Sidman, U. et al., Biopolymers 22;547-556(1983)), 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트(R. langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981) 및 R. Langer Chem. Tech. 12:98-105(1982)), 에틸렌 비닐 아세테이트(R. Langer et al.) 또는 폴리-D-(-)=3-히드록시부티르산(EP 133,988)을 들 수 있다. 서방성 조성물은 또한 리포좀으로 둘러싸인 KGF-2 폴리펩티드를 포함한다. KGF-2를 포함하는 리포좀은 당업계에 공지된 기법으로 제조된다: DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Dci. USA 82:3688-3692 1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Scid. USA 77:4030-4034 (1980); Ep 52,322; EP 36,676; EP 88,406; EP 143,949; Ep 142;641; 일본 특허 출원 83-118008; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324. 통상적으로, 리포좀은 지질 함량이 약 30 몰% 콜레스테롤(선택된 비율은 최적의 분비 폴리펩티드 치료를 위해 조정됨) 이상인 작은(약 200-800 옹스트롬)의 단일층 형태이다.
비경구 투여의 한가지 구체예에서, KGF-2는 일반적으로 이것을 하나의 단위 투여량 주사형태(용액, 현탁액 또는 에멀젼) 중에서 약학적 허용 담체(즉, 조성물중의 기타 성분과 상용성이며 사용된 투여량 및 농도에서 이를 투여받는 피검체에 비독성인 것)와 함께 소정의 순도로 혼합함으로써 제조된다. 예를 들어, 제제는 폴리펩티드에 유해한 것으로 알려진 기타 화합물 및 산화제를 포함하지 않는 것이 바람직하다.
일반적으로, 조성물은 KGF-2를 액체 담체 또는 균일하게 분배된 고체 담체 또는 둘다를 직접적으로 그리고 균일하게 접촉시킴으로써 제조된다. 이어서, 필요에 따라, 제품을 소정의 제제로 성형한다. 담체가 비경구성 담체라면 바람직하고, 이를 투여받는 피검체의 헐액과 등장액인 용액이 더욱 바람직하다. 이러한 담체 비히클의 예로는 물, 식염수, 링거액 및 덱스트로즈 용액을 들 수 있다. 비휘발성 오일 및 에틸 올레이트와 같은 비수성 비히클과 리포좀 역시 본원에서 유용하다.
캐리어는 등장성 및 화학적 안정성을 증진시키는 물질과 같은 첨가제를 소량 함유하는 것이 적합하다. 이러한 물질은 사용된 용량 및 농도에서 피검채에게 비독성이며, 포스페이트, 시트레이트, 숙시네이트, 아세트산, 기타 유기산 또는 이것의 염; 아스코르브산과 같은 항산화제; 저분자량(약 10 잔기 이하) 폴리펩티드, 예를 들어 폴리아르기닌 또는 트리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루탐산, 아스파르트산 또는 아르기닌과 같은 아미노산; 셀룰로오스 또는 이의 유도체, 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 카르보하이드레이트; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 대이온; 및/또는 폴리소르베이트, 폴록사머 또는 PEG와 같은 음이온성 계면활성제를 포함한다.
KGF-2는 통상적으로 pH 약 3 내지 8에서 약 0.1 mg/ml 내지 100 mg/ml, 바람직하게는 1-10 mg/ml의 농도로 이러한 비히클 중에 제제화된다. 전술한 특정 부형제, 담체 또는 안정화제의 사용은 폴리펩티드 염을 형성시킬 것이다.
치료적 투여를 위해 사용된 KGF-2는 멸균될 수 있다. 멸균은 멸균 여과 멤브레인(예를 들어 0.2 미크론 멤브레인)을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다. 치료적 폴리펩티드 조성물은 일반적으로 멸균 어세스 포트를 가진 용기, 예를 들어 정맥내 용액 주머니, 또는 피하 주사 바늘에 의해 구멍을 뚫을 수 있는 마개를 가진 바이알내로 배치된다.
KGF-2 폴리펩티드는 통상적으로 수성 용액 또는 수화시키는 동결화 제제로서 단위 용기 또는 다중용량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 또는 바이알 중에 보관될 것이다. 동결화 제제의 예로서, 10 ml 바이알은 5 ml의 멸균 여과된 1%(w/v) 수성 KGF-2 폴리펩티드 용액으로 충전되어 있고, 생성된 혼합물은 동결된다. 주입 용액은 정균 주사용수를 사용하여 동결된 KGF-2 폴리펩티드를 수화시킴으로써 제조된다.
본 발명은 또한 본 발명의 약학 조성물의 하나 또는 그 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기(들)와 관련하여, 약물, 또는 생물학적 제제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 노티스(notice)에는 인체 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 있어서 정부 기관의 허가를 반영한다. 또한, KGF-2는 기타 치료 화합물과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로 또는 기타 치료제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 치료제는 기타 TNF 류, 화학요법제, 항생제, 스테로이드제 및 비스테로이드성 항염증제, 통상의 면역요법제, 사이토킨 및/또는 성장 인자를 예로 들 수 있지만, 이것만으로 제한되는 것은 아니다. 조합물은 혼합물과 함께 동시에; 각각이지만 동시 또는 부수적으로; 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 이것은 조합된 약제가 치료 혼합물과 함께 투여되는 프리젠테이션, 또한 조합된 약제가 개별적으로 투여되지만 동시에 투여되는 방법(예를 들어, 동일한 개인에게 별도의 정맥 라인으로 투여되는 것)을 포함한다. "조합" 투여는 또한 주어진 화합물 또는 약제 중 하나를 먼저 투여한 후, 제2의 화합물 또는 약제를 개별적으로 투여하는 것을 또한 포함한다.
한가지 구체예에서, 본 발명의 조성물은 다른 TNF류와 함께 투여된다. TNF, TNF-관련 또는 TNF-유사 분자는 가용성 형태의 TNF-알파, 림포톡신-알파(LT-알파 또는 TNF-베타로 일려져 있음), LT-베타(복합 이형삼량체인 LT-알파2-베타에서 발견됨), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-1BBL, DcR3, OX29L, TNF-감마(국제특허공보 96/14328), AIM-I(국제특허공보 WO 97/33899), 엔도킨-알파(국제특허공보 WO 98/30694), OPG 및 뉴트로킨-알파(국제특허공보 WO 98/18921, OX40, 및 신경 성장 인자(NGF), 및 가용성 형태의 Fas, CD30, CD27, CD40, 및 4-IBB, TR2(국제특허공보 WO 96/34096), DR3(국제특허공보 WO 97/33904), DR4(국제특허공보 WO 98/32856), TR5(국제특허공보 WO 98/30693), TR6(국제특허공보 WO 98/30894), TR7(국제특허공보 WO 98/41629), TRANK, TR9(국제특허공보 WO 98/56892), TR10(국제특허공보 WO 98/54202), 312C2(국제특허공보 WO 98/06842) 및 TR12 및 가용성 CD154, CD70 및 CD153을 포함하나, 이것만으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명이 조성물과 함께 투여될 수 있는 통상의 비특이적인 면역억제제는 스테로이드, 시클로스포린, 시클로스포린 유사체, 시클로포스파미드 메틸프레드니손, 프레드니손, 아자티오프린, FK-506, 15-데옥시스페르구알린, 및 응답하는 T 세포의 작용을 억제함으로써 작용하는 기타 면역억제제를 포함하나, 이것만으로 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 항생제와 함께 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여되는 항생제는 테트라사이클린, 메트로니다졸, 아목시실린, 베타-람타마제, 아미노글리코시드, 마크롤리드, 퀴나졸론, 플루오로퀴놀론, 세팔로스포린, 에리스로마이신, 시프로플록사신 및 스트렙토마이신을 포함하나, 이것만으로 제한되는 것은 아니다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 항염증제와 함께 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 항염증제는 글루코코르티코이드 및 비스테로이드성 항염증제, 아미노아릴카르복실산 유도체, 아릴아세트산 유도체, 아릴부티르산 유도체, 아릴카르복실산 유도체, 아릴프로피온산 유도체, 피라졸, 피라졸론, 살리실산 유도체, 티아진카르복스아미드, e-아세트아미도카프로인산, S-아데노실메티오닌, 3-아미노-4-히드록시브티르산, 아믹세트린, 벤다작, 벤지다민, 부콜롬, 디펜프라민, 다타졸, 에모파존, 구아이아줄렌, 나부메톤, 니메술리드, 오르고테인, 옥사세프롤, 파라닐린, 페리속살, 피폭심, 프로쿠아존, 프록사졸 및 테니댑을 포함하나, 이것만으로 제한되는 것은 아니다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 화학요법제와 함께 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 화학요법제는 항생제 유도체(예를 들어, 독소루비신, 블레오마이신, 다우노루비신 및 닥티노마이신); 안티에스트로겐(예를 들어, 타목시펜); 항대사물질(예를 들어, 플루오로우라실, 5-FU, 메토트렉세이트, 플록스우리딘, 인터페론 알파-2b, 글루탐산, 플리카마이신, 메르캅토퓨린 및 6-티오구아닌); 세포독성화제(예를 들어, 카르무스틴, BCNU, 로부스틴, CCNU, 시토신 아라비노시드, 시클로포스파미드, 에스트라무스틴, 히드록시우레아, 프로카르바진, 미토마이신, 부술판, 시스-플라틴 및 빈크리스틴 황산염); 호르몬제(예를 들어, 메드록시프로게스테론, 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨염, 에티닐 에스트라디올, 에스트라디올, 메게스트롤 아세테이트, 메틸테스토스테론, 디에틸스틸베스트롤 디포스페이트, 클로로트리아니센, 및 테스토락톤); 질소 머스타드 유도체(예를 들어, 메팔렌, 클로람부실, 메클로르에타민(질소 머스타드) 및 티오테파); 스테로이드 및 조합물(예를 들어, 베타메타손 나트륨 인산염) 및 기타(예를 들어, 디카르바진, 아스파라기나아제, 미토탄, 빈크리스틴 황산염, 빈블라스틴 황산염, 및 에토포시드)를 포함하나, 이것만으로 제한되는 것은 아니다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 사이토킨과 함께 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 사이토킨은 IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL10, IL12, IL13, IL15, 항-CD40, CD40L, IFN-감마 및 TNF-알파를 포함하나, 이것만으로 제한되는 것은 아니다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 맥관형성성(angiogenic) 단백질과 함께 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 맥관형성성 단백질은 EP-339816에 개시된 바와 같은 글리오마에서 유래된 성장 인자(GDGF); EP-682110에 개시된 바와 같은 혈소판 유래의 성장 인자-A(PDGF-A); EP-282317에 개시된 바와 같은 혈소판 유래의 성장인자-B(PDGF-B); 국제특허공보 WO 92/06194에 개시된 바와 같은 태반 성장 인자(PIGF); 문헌[Hauser et al., Growth facors, 4:259-268(1993)]에 개시된 바와 같은 태반 성장 인자-2(PIGF-2); 국제특허공보 WO 90/13649에 개시된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자(VEGF); EP-506477에 개시된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자-A(VEGF-A); 국제특허공보 WO 96/39515에 개시된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자-2(VEGF-2); 국제특허공보 WO 96/26736에 개시된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자 B-186(VEGF-B186); 국제특허공보 WO 98/02543에 개시된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자-D(VEGF-D); 국제특허공보 WO 98/07832에 개시된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자-D(VEGF-D); 및 DE19639601에 개시된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자-E(VEGF-E)를 포함하나, 이것만으로 제한되는 것은 아니다. 상기 언급된 문헌들은 본 명세서에 참고로 인용된다.
또다른 구체에에서, 본 발명의 조성물은 섬유아세포 성장 인자와 함께 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 섬유아세포 성장 인자는 FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14 및 FGF-15를 포함하나, 이것만으로 제한되는 것은 아니다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 기타 치료 또는 예방 요법(예를 들어 방사선 치료)과 함께 투여된다.
실시예 35
KGF-2의 감소를 치료하는 방법
본 발명은 또한 치료적 유효량의 KGF-2 또는 이것의 효능제를 포함하는 조성물을 체내에서 KGF-2 활성 레벨의 증가를 요하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 이러한 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
또한, 이것은 KGF-2, 바람직하게는 분비형 KGF-2를 투여함으로써 개체에서 KGF-2의 표준 또는 정상적인 발현 레벨의 감소에 의해 유발된 상태를 치료될 수 있는 것으로 해석된다. 따라서, 본 발명은 또한 KGF-2 폴리핍테드 레벨의 증가를 요하는 개체에서 KGF-2의 활성 레벨을 증가시키는 양의 KGF-2를 포함하는 약학 조성물을 이러한 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 이러한 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
예를 들어, KGF-2 폴리펩티드 레벨이 감소된 환자는 일일 0.1 내지 100 ㎍/kg의 폴리펩티드를 6일동간 계속해서 투여받는다. 폴리펩티드가 분비형인 것이 바람직하다. 투여 및 제제에 기초한, 투여 계획의 보다 정확한 세부 사항은 실시예 24에 제시되어 있다.
실시예 36
증가된 레벨의 KGF-2를 치료하는 방법
본 발명은 또한 치료적 유효량의 KGF-2 길항제를 포함하는 조성물을 체내에서 KGF-2 활성 레벨이 감소될 것을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하여이러한 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 사용하기에 바람직한 길항제는 KGF-2 특이 항체이다.
안티센스 기법은 KGF-2의 생산을 저해하는 데 사용된다. 이 기법은 암과 같은 다양한 병인으로 인한 KGF-2 폴리펩티드, 바람직하게는 분비형 KGF-2 폴리펩티드의 레벨을 감소시키는 방법의 한가지 예이다.
예를 들어, KGF-2이 비정상적으로 증가된 레벨로 진단받은 환자에게 안티센스 폴리뉴클레오티드를 1일 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 및 3.0 mg/kg으로 21일간 투여한다. 이러한 치료를 잘 견딜 수 있다면, 7일간의 휴지 기간 후에 반복한다. 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 실시예 24에 제시되어 있다.
실시예 37
유전자 치료를 사용한 치료 방법-생체외
유전자 치료의 한가지 방법은 KGF-2 폴리펩티드를 발현할 수 있는 섬유아세포를 환자에게 이식하는 것이다. 일반적으로, 섬유아세포는 피부 생체검사법에 의해 피검체로부터 얻는다. 이렇게 얻어진 조직을 조직 배양 배지중에 배치하고, 작은 조각으로 분리한다. 조직의 작은 덩어리(chunk)를 조직 배양 플라스크의 습윤한 표면 상에 배치하고, 약 10개의 조각을 각각의 플라스크내에 둔다. 이 플라스크를 거꾸로 뒤집어, 단단하게 고정시키고 밤새 실온에 둔다. 실온에서 24시간이 경과한 후, 플라스크를 뒤집어 조직 덩어리가 플라스크의 바닥에 고정된 상태로 하고, 새로운 배지(예를 들어, 햄스 F12 배지, 10% FES, 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유함)를 첨가한다. 이어서, 이 플라스크를 약 1주일동안 37℃에서 배양한다.
이 시점에서, 새로운 배지를 첨가하고, 이어서 7일마다 바꾸어 준다. 배지에서 추가의 2주 후에, 단일층의 섬유아세포가 출현한다. 단일층을 트립신으로 분해하고, 더 큰 플라스크로 옮긴다.
몰로니 뮤린 육종 바이러스의 장쇄 말단 반복부위의 측면에 위치하는 pMV-7(Kirschmeier, P.T. et al., DNA, 7:219-25(1988))를 EcoRI 및 HindIII로 분해한 후, 송아지 장의 포스파타아제로 처리한다. 유리 비이드를 사용하여 이 선형 벡터를 아가로즈 겔 상에서 분획화하고, 정제한다.
실시예 1에 제시된 바와 같이 5' 및 3' 말단 서열에 각각 상응하는 PCR 프라이머를 사용하여 KGF-2를 암호하는 cDNA를 증폭할 수 있다. 5' 프라이머가 EcoRI 부위 및 3' 프라이머가 HindIII 부위를 포함하는 것이 바람직하다. T4 DNA 리가아제 존재하에 동량의 몰로니 뮤린 육종 바이러스 선형 주쇄와 증폭된 EcoRI 및 HindIII 단편을 함께 첨가한다. 생성된 혼합물을 2개의 단편을 연결하기에 적합한 조건하에 유지시킨다. 이어서, 연결 혼합물을 사용하여 박테리아 GB101을 형질전환시키는데, 이후 벡터가 절적하게 삽입된 KGF-2를 함유하는가 하는 것을 확인하기 위하여 이것을 카나마이신을 함유하는 한천 상에 접종한다.
양쪽 친화성(amphotropic) pA317 또는 GP+am12 패키징 세포를 조직 배양액 중에서 10% 송아지 혈청(CS), 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 둘베코의 개질 이글스 배지(DMEM)에서 군집 밀도로 성장시킨다. 이후, KGF-2 유전자를 함유하는 MSV 벡터를 배지에 첨가하고, 상기 벡터로 패키징 세포를 형질도입시킨다. 이제 패키징 세포는 KGF-2 유전자를 함유하는 감염성 바이러스 입자를 생산한다(패키징세포는 이제 생산 세포라 부른다).
형질도입된 생산 세포에 새로운 배지를 첨가하고, 이어서 밀집된 생산 세포 10 cm 플레이트로부터 배지를 수집한다. 감염성 바이러스 입자를 포함하는 소비된 배지를 밀리포어 필터를 통해 여과시켜 부착된 생산 세포를 제거한 후, 이 배지는 섬유아세포를 감염시키는 데 사용된다. 배지를 섬유아세포의 소군집 플레이트로부터 제거하고, 신속하게 생산 세포로부터 배지를 대체한다. 이 배지를 제거하고, 새로운 배지로 대체한다. 바이러의 역가가 높은 경우, 실질적으로 모든 섬유아세포가 감염될 것이고, 어떤 선택도 필요하지 않다. 역가가 매우 낮다면, 선택적인 마커, 예를 들어 neo 또는 his를 가진 레트로바이러스 벡터를 사용할 필요가 있다. 섬유아세포가 효과적으로 감염된 후, 섬유아세포를 분석하여 KGF-2 단백질이 생산되는가 여부를 결정한다.
조작된 섬유아세포는 이어서 숙주상에 단독으로 또는 사이덱스 3 마이크로캐리어 비이드 상에서 군집까지 성장한 후에 이식된다.
실시예 38
내인성 KGF-2 유전자를 사용한 유전자 요법
본 발명에 따른 또다른 방법의 유전자 요법은 예를 들어 미국특허 제5,641,670호(1997. 6. 24 특허됨); 국제특허공보 Wo 96/29411(1996. 9. 26 공개됨); 국제특허공보 WO 94/12650(1994. 8. 4 공개됨); 문헌[Koller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86;8923-8935(1989)]; 및 문헌[Zijlstra et al., Nature 342:435-438(1989)]에 개시된 바와 같이 동종 재조합을 통해 프로모터와 내인성KGF-2 서열을 작동적으로 조합하는 것을 포함한다. 이 방법은 표적 세포 중에 존재하는 유전자의 활성화를 포함하지만, 이것은 세포내에서 발현되지 않거나 또는 목적하는 것보다 낮은 수준으로 발현된다.
프로모터의 측면에 내인성 KGF-2의 5' 비암호화 서열에 상동성을 가진, 표적 서열과 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체를 제조한다. 표적 서열은, 프로모터가 상동 재조합시에 내인성 서열과 작동적으로 결합될 수 있도록 KGF-2의 5' 말단에 충분히 인접할 것이다. 프로모터 및 표적 서열은 PCR을 사용하여 증폭될 수 있다. 증폭된 프로모터가 5' 및 3' 말단상에 구별된 제한 효소 부위를 함유하는 것이 바람직하다. 제1 표적 서열의 3' 말단이 증폭된 프로모터의 5' 말단과 동일한 제한 효소 부위를 함유하고, 제2 표적 서열의 5' 말단이 증폭된 프로모터의 3' 말단과 동일한 제한 부위를 함유하는 것이 바람직하다. 증폭된 프로모터 및 증폭된 표적 서열을 적절한 제한 효소를 사용하여 분해한 후, 송아지 장의 포스파타아제로 처리한다. T4 DNA 리가아제의 존재하에, 분해된 프로모터 및 분해된 표적 서열을 함께 첨가한다. 얻어진 혼합물을 2개 단편의 연결에 적합한 조건하에서 유지한다. 이 구조체를 아가로즈 겔 상에서 크기별로 분획한 다음, 페놀 추출과 에탄올 침전에 의해 정제한다.
이 실시예에서, 폴리뉴클레오티드 구조체를 전기영동에 의해 네이키드 폴리뉴클레오티드로서 투여한다. 그러나, 폴리뉴클레오티드 구조체는 또한 형질감염 촉진제(예를 들어, 리포좀, 바이러스 서열, 바이러스 입자, 침전제 등)와 함께 투여될 수 있다. 이러한 전달 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
일단 세포가 형질감염되면, 프로모터가 내인성 KGF-2 서열에 작동적으로 결합되는 상동 재조합이 일어날 것이다. 그 결과, 세포내에서 KGF-2가 발현된다. 발현은 면역학적 염색에 의해 검출되거나 또는 임의의 당업계에 알려진 방법에 의해 검출될 수 있다.
섬유아세포는 피부 생체검사법에 의해 피검체로부터 얻어진다. 얻어진 조직을 10% 태아 송아지 혈청을 함유하는 DMEM 중에 둔다. 지수속도로 성장하는 초기 정지상 섬유아세포를 트립신으로 분해하고 유연한 표면으로부터 영양 배지를 사용하여 세척한다. 세포 현탁액의 분할물(aliquot)은 계수를 위해 제거하고, 남아있는 세포를 원심분리시킨다. 상청액을 흡인하고, 펠렛을 전기영동 완충액(20 mM hepes pH 7.3, 137 mM NaCl, 0.7mM Na2HPO4, 6mM 덱스트로즈) 5 ml 중에서 재현탁시킨다. 이 세포를 재원심분리하고, 상청액을 흡인한 다음, 세포를 1 mg/ml 아세틸화 소 혈청 알부민을 함유하는 전기영동 완충액 중에서 재현탁시킨다. 전기영동은 재현탁 이후에 즉시 수행되어야 한다.
플라스미드 DNA는 표준 기법에 따라 제조된다. 예를 들어, KGF-2 위치를 표적화하는 플라스미드를 구성하기 위하여, 플라스미드 pUC18(MBI 발효기, 암허스트, 뉴욕)를 HindIII로 분해한다. CMV 프로모터는 5' 말단상의 XbaI 부위 및 3' 말단 상의 BamHI 부위를 이용하여 PCR에 의해 증폭된다. 2개의 KGF-2 비암호화 서열이 PCR에 의해 증폭된다: 하나의 KGF-2 비암호화 서열(KGF-2 단편 1)은 5' 말단에서 HindIII 부위 및 3' 말단에서 Xba 부위에 의해 증폭되고, 나머지 KGF-2 비암호화 서열(KGF-2 단편 2)는 5' 말단에서 BamHI 부위 및 3' 말단에서 HindIII 부위에 의해 증폭된다. CMV 프로모터 및 KGF-2 단편을 적절한 효소(CMV 프로모터 - XbaI 및 BamHI; KGF-2 단편 1-XbaI; KGF-2 단편 2-BamHI)로 분해되고 함께 연결된다. 그 결과 생성된 결합 생성물을 HindIII로 분해하고, HindIII로 분해된 pUC18 플라스미드로 연결시킨다.
플라스미드 DNA를 0.4 cm 전극 갭(바이오-라드)를 가진 멸균 쿠베트(cuvette)에 첨가한다. 최종 DNA 농도는 일반적으로 120 ㎍/ml 이상이다. 이어서, 세포 현탁액 0.5 ml(약 1.5 X 106개의 세포를 함유하고 있음)를 쿠베트에 첨가하고, 세포 현탁액과 DNA 용액을 부드럽게 혼합한다. 전기영동은 진-펄서 장치(바이오-라드)를 이용하여 수행된다. 정전 용량과 전압은 960 μF 및 250-300 V로 각각 설정한다. 전압이 올라감에 따라, 세포 생존율이 감소하지만, 도입된 DNA를 그들의 게놈내로 안정하게 혼입시키는 생존 세포의 백분율은 급격하게 증가한다. 소정의 파라메터로서 약 13-20 mSec의 진동 시간이 관찰된다.
전기영동된 세포를 약 5분간 실온에서 유지하고, 쿠베트의 내용물을 멸균 이동 피펫으로 부드럽게 제거한다. 세포를 10 cm 접시내에 미리 가온한 영양 배지(15% 송아지 혈청을 함유한 DMEM) 10 ml에 직접 첨가하여, 37℃로 배양한다. 다음날, 배지를 흡인하고, 새로운 배지 10 ml로 대체하여 16-24시간동안 추가로 배양한다.
이어서, 조작된 섬유아세포를 숙주에, 단독으로 또는 사이토덱스 3 마이크로캐리어 비이드 상에 군집으로 성장한 후 감염시킨다. 이 섬유아세포는 단백질 생성물을 생산한다. 이 섬유아세포는 전술한 바와 같이 환자에게 도입될 수 있다.
실시예 39
유전자 요법을 사용한 치료 방법-생체내
유전자 연구의 발달은 인간 세포에서 유전자를 전달하고 발현하는 기법의 발전을 가져왔다. 유전자 요법의 이상적인 목적은 정상적인 유전자를 전달하여 활성 단백질을 생성하고 내인적 생산의 결핍을 보충하는 것이다(Gorecki, D.C. et al., Arch. Immunol. ther. Exp. 45(5-6):375-381 (1997)).
상처 치료와 조직 복구의 다른 상에 연관된 사이토킨과 성장 인자를 암호하는 유전자의 전달은 상처 치료의 결과를 변화시킬 가능성을 가지고 있다(Taub, T.J. et al., J. Reconst. Microsur. 14(6):387-390(1998)). 상처의 치료와 조직의 복구를 위해 성장 인자 및 기타 사이토킨의 cDNA를 사용하는 것은 광범위하게 알려져 있다(Tchorzewski, M.T. et al., J. Surg. Res. 77:99-103(1998)). 벡터에 의해 전달되는 유전자는 새로운 세포주를 생산하기 위하여, 이식된 세포를 확인하기 위하여, 또 성장 인자 또는 효소를 발현하기 위하여 사용될 수 있다. 유전자 요법의 한가지 이점은 병변 부위에 국소적으로 유전자에서 유래된 단백질의 치료적 농도를 얻는다는 점이다. 인간 재조합 KGF-2 단백질은 피부, 위장관 및 상피 기원의 세포를 함유하는 기타 장기의 상처 치료를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. KGF-2의 사용은 재조합 단백질과 유사한 약리학적 양상을 가질 것으로 예상된다. KGF-2 유전자는 세포 증식, 이동 및 외부 매트릭스의 형성과 같은 조직 복구에 관계된 과정에 관계되어 있을 것이다.
전사 및 번역된 cDNA는 유전자를 원하는 부위에 전달하는 데 사용되어 왔다. 이러한 방식에 사용된 유전자의 몇가지 예는 FGF, BMP-7(Britbart, A.S. et al., Ann. Plast. Surg. 24(5):488-495(1999))를 포함한다. 이들 세포는 또한 생분해성 매트릭스(예를 들어, 폴리글리콜론산), 조직 대체물 또는 등가물(예를 들어, 인공 피부), 인공 장기, 콜라겐에서 유래된 매트릭스 등을 포함하는 세포 캐리어에 접종되었다. 리포좀은 cDNA를 운반하는데 사용되었다. 일본(HVJ)의 헤마글루티네이팅(Haemagglutinating) 바이러스-리포좀 현탁액 중의 PDGF-BB cDNA는 슬개골 인대의 치료에서 연구되었다(Nakamura et al., Gene Ther. 5(9):1165-1170(1998)). 또한, 유전자는 직접 주사(예를 들어, 심장)에 의해 작용 부위로 직접 전달될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 장애, 질환 및 상태를 치료하기 위해 유전자 치료 방법을 사용하는 것이다. 이 유전자 치료 방법은 네이키드 핵산(DNA, RNA 및 안티센스 DNA 또는 RNA) KGF-2 서열을 동물내로 도입하여 KGF-2 폴리펩티드의 발현을 증가 또는 감소시키는 것에 관계된다. KGF-2 폴리뉴클레오티드는, 표적 조직에 의해 KGF-2 폴리펩티드의 발현에 필요한 임의의 기타 유전 요소 또는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 유전자 치료 및 전달 기법 및 방법은 예를 들어 WO 90/11092; WO 98/11779; 미국특허 제5,693,622호; 제5,705,151호; 제5,580,859호; 문헌[Tabara, H., et al., Cardiovasc. Res. 35(3):470-479 (1997)]; 문헌[Chao, J., et al., Pharmacol. Res. 25(6):517-522(1997)]; 문헌[Wolff, J.A., Neuromuscul. Disord. 7(5):314-318(1997)]; 문헌[Schwartz B.,et al., gene ther. 3(5):405-411(1996)]; 문헌[Tsurumi, Y., et al., circulation 94(12):3281-3290(1996)]와 같이 당업자에게 잘 알려져 있다(모두 본 명세서에서 참고로 인용됨).
KGF-2 폴리뉴클레오티드 구조체는 주사가능한 물질을 동물의 세포로 전달하는 임의의 방법, 예를 들어 조직(심장, 근육, 피부, 폐, 간, 소장 등)의 간극으로 주사하는 방법에 의해 전달될 수 있다. KGF-2 폴리펩티드 구조체는 약학적 허용 액체 또는 수용성 담체 중에서 전달될 수 있다.
"네이키드(naked)" 폴리펩티드, DNA 또는 RNA는 바이러스 서열, 바이러스 입자, 리포좀 제제, 리포펙틴 또는 침전제 등을 포괄하여 세포내로의 진입을 조력하거나, 증진하거나, 촉진하는 역할을 하는 임의의 전달 비히클이 없는 서열을 의미한다. 그러나, KGF-2 폴리펩티드는 당업계에 잘 공지된 임의의 기법에 의해 제조될 수 있는 리포좀 제제중으로 전달될 수 있다. 예로서 문헌[Felgner P.L. et al., Ann. NY Acad. Sci. 772:126-139 (1995) 및 Abdallab B. et al., Biol. Cell 85(1):1-7(1995)] 참조.
유전자 치료 방법에 사용되는 KGF-2 폴리뉴클레오티드 벡터 구조체가 숙주 게놈내로 삽입되지 않고 또한 복제를 허용하는 서열을 함유하지 않는 구조체라면 바람직하다. 당업계에 공지된 임의의 강한 프로모터는 DNA 발현을 조절하는 데 사용될 수 있다. 기타 유전자 치료 기법과 달리, 네이키드 핵산 서열을 표적 세포내로 도입하는 것의 큰 이점은 세포내에서 폴리뉴클레오티드 합성이라이라는 일시적인 특성이다. 연구 결과, 비복제성 DNA 서열이 세포내로 도입되어 6개월까지의 기간동안 소정의 폴리펩티드를 생산할 수 있음이 밝혀졌다.
KGF-2 폴리뉴클레오티드 구조체는 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 눈, 선 및 관련 조직을 비롯한, 동물내에서 조직의 간극으로 전달될 수 있다. 조직의 간극은 세포내액, 장기 조직의 세망 섬유 사이의 점성다당류(mucopolysacchride) 매트릭스, 용기 또는 챔버의 벽에 있는 유연한 섬유, 섬유성 조직의 콜라겐 섬유 또는 뼈의 소공내 또는 근육 세포를 피복하고 있는 관련 조직내의 매트릭스를 포함한다. 이들은 림프 채널의 림프액 및 순환하는 혈장에 의해 채워지는 공간과 유사하다. 근육 세포의 간극으로의 전달은 후술하는 이유로 바람직하다. 이들은 이들 세포를 포함하는 조직내로의 주사에 의해 전달되는 것이 편리할 수 있다. 전달과 발현이 예를 들어 혈액의 줄기 세포 또는 피부의 섬유아세포와 같은 비분화되거나 또는 완전하게 분화되지 않는 세포내에서 수행되더라도, 이들은 영구적이고, 분화되지 않는 비분할 세포로 전달되고 발현되는 것이 바람직하다. 생체내 근육 세포는 폴리뉴클레오티드를 포획하고 발현하는 능력에 특히 적합하다.
네이키드 KGF-2 폴리뉴클레오티드 주사에 있어서, 유효량의 DNA 또는 RNA는 약 0.05 g/kg(체중) 내지 50 mg/kg(체중) 범위내에 있을 것이다. 용량이 약 0.005 내지 약 20 mg/kg인 것이 바람직하고, 약 0.05 내지 약 5 mg/kg인 것이 더욱 바람직하다. 물론, 당업자는 이러한 용량이 주사하는 조직 부위에 따라 달라짐을 잘 알고 있을 것이다. 이러한 적절하고 유효한 양의 핵산 서열은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 투여 경로 및 치료하고자 하는 상태에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 투여 경로는 조직의 간극으로 주사하는 비경구적인 경로에 의하는 것이다. 그러나, 기타 비경구적인 경로, 예를 들어 폐 또는 기관지 조직, 목청 또는 비강의 점막으로의 전달을 위한 에어로졸 제제의 흡입이 사용될 수 있다. 또한, 네이키드 KGF-2 폴리뉴클레오티드 구조체는 이 방법에 사용된 카테터에 의해 혈관성형시에 동맥으로 전달될 수 있다.
생체내 군육에서 주사된 KGF-2 폴리뉴클레오티드의 용량 반응 효과는 하기와 같이 결정될 수 있다. KGF-2 폴리뉴클레오티드를 암호하는 mRNA의 생산에 적합한 KGF-2 주형 DNA를 표준 재조합 DNA 방법에 따라 제조한다. 원형 또는 선형 중 어느 하나인 주형 DNA는 네이키드 DNA으로서, 또는 리포좀과 복합되어 사용된다. 이어서, 마우스의 대퇴근(quadriceps muscle)에 다양한 양의 주형 DNA를 주사한다.
5 내지 6주령된 암컷 및 수컷 Balb/C 마우스를 2.5% 아베틴 0.3 ml를 복막내 주사하여 마취시킨다. 앞쪽 대퇴부 상에 1.5 cm의 절개를 만들고, 대퇴근을 직접 가시화시킨다. 1분의 시간에 걸쳐, 근육의 원위 삽입부로부터 무릎까지 약 0.5 cm 및 약 0.2 cm 깊이로, 27 게이지 바늘을 통해 1 cc 시린지 중의 0.1 ml 담체 중에서 KGF-2 주형 DNA를 주사한다. 장래의 국부화를 위한 주사 부위를 봉합하고, 피부를 스테인리스 강 클립으로 폐쇄시킨다.
절절한 배양 시간(예를 들어 7일)이 경과한 후, 완전한 대퇴부를 절개함으로써 근육 추출물을 준비한다. 개개의 대퇴부의 매 5번째 15 ㎛ 단면을 KGF-2 단백질 발현에 대하여 조직학적으로 염색한다. KGF-2 단백질 발현에 대한 시간 경과는, 다른 시간에서 다른 마우스로부터의 대퇴부가 수집되는 것을 제외하고는 유사한 양상으로 수행될 수 있다. 주사 후 근육에서 KGF-2 DNA의 존재는 주사된 마우스 및 대조군 마우스로부터 HIRT 상청액 및 총 세포 DNA를 제조한 후 서던 블롯 분석에 의해 측정될 수 있다. 상기 마우스 실험에서 얻어진 결과는 KGF-2 네이키드 DNA를 사용하는 기타 동물 및 인간에서 적절한 용량과 기타 치료 파라메타를 외삽하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 40
염증성 장 질환에 있어서의 KGF-2 치료
이 실시예에서는, KGF-2 폴리뉴클레오티드의 전신성(비강내로) 및 복막내 투여에 의한, 음용수 중 덱스트란 나트륨 황산염(DSS)에의 노출로 인해 유발된 마우스 대장의 병리학적 변화의 저해를 측정한다.
비강내 투여. KGF-2 △33을 암호하는 폴리뉴클레오티드를 1, 10 또는 100 ㎍ 용량으로 무딘 26 게이지 바늘을 통해 마취시킨 암컷 스위스 웹스터 마우스(n=10/집단)의 비강 경로로 도입한다. 대조 폴리뉴클레오티드를 각각의 집단의 마우스에게 투여한다. 폴리뉴클레오티드의 비강 투여 후 5일이 경과되었을 때, 5% DSS를 음용수에 첨가한다. 마우스의 체중, 헤마토크릿치 및 스툴(stool) 스코어를 모니터링한다. 음용수 중의 DSS에 노출된 후 7일이 경과되었을 때, 마우스를 치사시킨다. 대장 및 소장의 조직학적 평가를 수행한다. RT-PCR 분석을 수행하여 간, 비장 및 대장에서 KGF-2의 발현을 측정한다.
복막내 투여. KGF-2 △33를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 1, 10 또는 100 ㎍용량으로 무딘 26 게이지 바늘을 통해 0일 및 3일에 마취시킨 암컷 스위스 웹스터 마우스(n=10/집단)의 복막내로 주사한다. 대조 폴리뉴클레오티드를 동일한 방법을 사용하여 각각의 집단의 마우스에게 투여한다. 폴리뉴클레오티드의 비강 투여 후 7일이 경과되었을 때, 5% DSS를 음용수에 첨가한다. 마우스의 체중, 헤마토크릿치 및 스툴 스코어를 모니터링한다. 14일째 되는 날에, 마우스를 치사시킨다. 대장 및 소장의 조직학적 평가를 수행한다. RT-PCR 분석을 수행하여 간, 횡경막 및 대장에서 KGF-2의 발현을 측정한다.
이 실시예에 기재된 연구는 KGF-2 △33 폴리뉴클레오티드에서 활성을 시험하는 것이다. 그러나, 당업자는 예시된 연구를 쉽게 변화시켜 완전한 길이 및 성숙한 KGF-2, KGF-2△28, 및 KGF-2의 아미노산 77 내지 208, 80 내지 208, 및 93 내지 208을 암호하는 폴리뉴클레오티드; KGF-2 폴리뉴클레오티드, 변이체, 단편, 효능제 및/또는 길항제; 및 전술한 임의의 KGF-2 돌연변이를 비롯하여 기타 KGF-2 폴리뉴클레오티드의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 41
눈의 표면 질환에 있어서의 KGF-2 치료
이 실시예에서는, 결막, 각막 또는 누선상에서 △33 KGF-2 폴리뉴클레오티드의 각막하(subconjuctival) 투여 효과를 측정한다.
△33 KGF-2를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 1, 10 또는 100 ㎍의 용량으로 마취시킨 암컷 스프라그 다울리 래트(150-200 g의 체중, 6/처리 집단)의 각막하 공간으로 주사한다. 대조 폴리뉴클레오티드를 대조군 래트의 각각의 집단에 유사한방식으로 투여한다. 주사 후 3일, 7일 및 14일이 경과되었을 때, 각각의 래트 집단을 치사시킨다. 마취하기 30분전 일부 래트에 BrdU를 복막내로 투여한다. 조직학적 분석을 위해 눈과 주변 조직을 제거한다. 각막, 결막 및 누선의 상피 세포에서 BrdU 혼입 정도를 측정한다. 각막 및 결막에서 상피층의 두께를 평가한다. 결막에서 고블릿 세포의 개수를 측정한다.
이 실시예에서 전술한 연구는KGF-2 △33 폴리뉴클레오티드에서 활성을 시험한다. 그러나, 당업자는 예시된 연구를 쉽게 변화시켜 완전한 길이 및 성숙한 KGF-2, KGF-2△28, 및 KGF-2의 아미노산 77 내지 208, 80 내지 208, 및 93 내지 208을 암호하는 폴리뉴클레오티드; KGF-2 폴리뉴클레오티드, 변이체, 단편, 효능제 및/또는 길항제; 및 전술한 임의의 KGF-2 돌연변이를 비롯하여 기타 KGF-2 폴리뉴클레오티드의 활성을 시험할 수 있다.
실시예 42
타액선 기능장애를 위한 KGF-2 치료
본 실시예에서는, 정상 래트의 이하선 타액선 관의 유두상 돌기내로 그 관의 상피 세포와 그 선의 포도상선상에서 KGF-2 폴리뉴클레오티드를 투여한 효과를 측정한다.
암컷 스프라그 다울리 래트(15-250 그램, 그룹당 6마리)를 케타민과 크실라진을 근육내 주사하여 마비시킨다. △33 KGF-2를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 30게이지 스틸 가비지(gavage) 주사바늘을 이용하여 1, 10, 또는 100㎍ 투여량으로 이하선 타액선의 유두상 돌기내로 도입한다. 이 폴리뉴클레오티드는 분당 1㎕의 속도로 10분에 걸쳐 주입된다. 별도의 래트 그룹에 대조군 폴리뉴클레오티드를 투여한다. 각각의 래트 그룹을 주입 후 3, 7, 및 14일에 죽인다. 안락사 30분전에 BrdU를 복강내 주사로 투여한다. 타액선을 중량 측정하고, BrdU 염색 세포의 수를 조직 절편에서 계산한다. 별도의 실험에서, 주사 후 7일에 래트에서 피로카르핀 자극된 타액 분비를 측정한다.
본 실시예에 설명된 연구는 KGF-2 △33 폴리뉴클레오티드의 활성을 시험한다. 하지만, 당업자는 전길이 및 성숙 KGF-2, KGF-2 △28, 그리고 KGF-2의 아미노산 77 내지 208, 80 내지 208, 및 93 내지 208을 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 기타 KGF-2 폴리뉴클레오티드; 및 KGF-2 폴리펩티드, 변이체, 단편, 아고니스트, 및/또는 안타고니스트; 그리고 임의의 본원에 개시된 KGF-2 돌연변이의 활성을 시험하기 위해 예시된 연구를 쉽게 변형할 수 있다.
실시예 43
피부 상처 치유를 위한 KGF-2 치료
본 실시예에서는, 정상 래트와 당뇨병 마우스에서 상처 치유를 자극하는 KGF-2 폴리뉴클레오티드 능력을 측정한다.
정상 래트.
마취된 암컷 스프라그 다울리 래트(175-250 그램, 처리 그룹 당 6마리)를 8mm 생검 펀치로 상처를 만든다. △33 KGF-2 폴리뉴클레오티드(1, 10, 또는 30㎍)를 상처를 따라 4개의 다른 부위에서 내피로 전달한다. 대조군 폴리뉴클레오티드를 유사한 방식으로 별도의 래트 그룹에 투여한다. 상처를 멸균 통풍 섬유 패드로 덮는다. 패드를 위치시킨 후, 방수 접착 테이프를 래트의 중앙절단 주위에 감는다. 각각의 래트 그룹을 상처 후 2일과 5일에 죽인다. 상처 조직을 파라핀에 고정된 10% 포르말린에 고정시킨다. 기존의 표피와 신생 표피에서 증식하는 상피 세포내로의 BrdU 통합, 그리고 신생 상피 혀의 길이와 두께를 측정한다.
당뇨병 마우스.
당뇨병 마우스(db+/db+, 처리 그룹당 10 마리)와 비당뇨병 마우스(db+/m+, 처리 그룹당 10마리)를 등에서 6mm 펀치로 상처를 낸다. △33 KGF-2 폴리뉴클레오티드(1, 10, 또는 30㎍)를 상처를 따라 4가지 다른 부위에서 내피로 전달한다. 대조군 폴리뉴클레오티드를 별도의 마우스 그룹에 유사한 방식으로 투여한다. 테가덤(당뇨병 마우스) 또는 테가덤 플러스 접착 테이프(비당뇨병 마우스)로 상처를 덮는다. 상처 후 0, 3, 7, 10 및 14일에 상처의 사진을 찍는다. 상처의 표면 면적을 영상 분석에 의해 측정한다.
본 실시예에 설명된 연구는 KGF-2 △33 폴리뉴클레오티드의 활성을 시험한다. 하지만, 당업자는 전길이 및 성숙 KGF-2, KGF-2 △28, 그리고 KGF-2의 아미노산 77 내지 208, 80 내지 208, 및 93 내지 208을 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 다른 KGF-2 폴리뉴클레오티드; 및 KGF-2 폴리펩티드, 변이체, 단편, 아고니스트, 및/또는 안타고니스트; 그리고 임의의 본원에 개시된 KGF-2 돌연변이의 활성을 시험하기 위해 예시된 연구를 쉽게 변형할 수 있다.
실시예 44
KGF-2 전달을 위한 구조체
KGF-2 유전자 치료 전달을 위한 적절한 구조체는 pVG I.0-KGF-2이다. 이 구조체는 발현 벡터 pVGI.0내에 클론된 KGF-2 전체 천연 오픈 리딩 프레임을 함유한다. pVGI.0은 카나마이신 내성 유전자, CMV 인핸서, 및 RSV 프로모터를 함유한다. pVGI.0-KGF-2는 1999년 6월 30일에 버지니아 20110-2209, 마나사스, 유니버시티 불레바드 10801의 ATCC 특허 기탁소에 ATCC 기탁 번호 PTA290으로 기탁되었다. 이 구조체는 이미 서열 입증된 KGF-2 구조체로부터의 KGF-2 ORF를 발현 벡터 pVGI-0내로 공지 기술을 이용하여 서브클로닝하여 제조되었다.
KGF-2 전달에 적합한 다른 구조체는 pVGI-0-MPIFspKGF2△33이다. 이 구조체는 발현 벡터 pVGI.0내로 클론된 MPIF(CKδ8)이종성 시그날 펩티드에 융합된 KGF-2△33의 천연 서열을 함유한다. pVGI.0-MPIFspKGF2△33은 1999년 6월 30일에 버지니아 20110-2209, 마나사스, 유니버시티 불레바드 10801의 ATCC 특허 기탁소에 ATCC 기탁 번호 PTA289로 기탁되었다. 이 구조체는 공지 기술과 하기의 프라이머를 이용하여 만들어졌다.
5' 프라이머:
GAGCGCGGATCCGCCACCATGAAGGTCTCCGTGGCTGCCCTCTCCTGCCTCATGCTTGTTACTGCCCTTGGATCTCAGGCCAGCTACAATCACCTTCAAGGAGATG(서열 번호 149)
3' 프라이머:
GAGCGCGGATCCCTATGAGTGTACCACCATTGGAAG(서열 번호 150)
실시예 45
KGF-2 유전자 치료동안 혈관 생성
마우스에서 투명 창 시스템에서 미세혈관 생리학의 다양한 측면의 특성 규명은 혈관 생성, 염증, 미세혈관 수송, 조직 거부 및 종양 생리학에 대한 중요한 자료들을 제공해 왔다. 본 실시예에서는, 이식된 피부 창을 통한 조직 및 관련 미세 혈관 베드의 직접 관찰을 통해, 이식된 콜라겐 젤에서 상처 치유 반응동안의 관다발 발생을 평가한다. 이 모델은 KGF-2 유전자 치료가 가속화된 조직 재성장과 재혈관화를 동시에 유도할 수 있는지를 결정하기 위해 이용된다.
누드 마우스의 피부 생검을 콜라게나제로 분해하고, 생성된 세포 현탁액을 세척한 후 10% FBS를 가진 DMEM에서 배양하여 피부 섬유아세포를 얻는다. 합류성 섬유아세포 배양물을 KGF-2 또는 대조군 폴리뉴클레오티드로 형질감염시킨 뒤, 모아서 PBS에서 세척한다. 106개의 세포를 20㎕의 콜라겐 매트릭스에 현탁시킨다. 세포 현탁액 샘플을 KGF-2 생성 확인을 위한 웨스턴 블롯을 위해 제거한다. 2mm 펀치 생검을 기존의 등 피부 창내에 만들고 피부를 두 개의 유리 커버슬립 사이에 위치시킨다. 세포 콜라겐 혼합물을 원형 상처에 놓고 챔버를 밀봉시킨다. 혈관 발생에 대해 이식된 젤을 정기적인 간격으로 관찰한다. 상처내에 조직 재성장은 3주에 걸쳐 콜라겐 젤의 광학 밀도 변화로 감시된다. 등 챔버로부터의 조직은 조직학적 평가를 위한 연구의 결론 후에 제거된다. 대조군 실험은 섬유아세포 대신 콜라겐 젤내에 완충액 또는 KGF-2 폴리펩티드를 부가한다.
마우스 준비.
스위스 누드 마우스에서 외과적 수술을 수행한다. 외과적 과정을 위해, 동물을 체중 ㎏당 케타민 90㎎과 크실라진 9㎎의 혼합물을 피하 주사하여 마비시킨다.모든 외과적 과정은 수평 라미나 유동 후드내에서 멸균 조건하에서 수행되며, 모든 장비는 스팀, 가스 또는 화학 멸균된다.
수술동안, 동물의 체온은 가열된 작업 표면에 의해 일정하게 유지된다. 모든 마우스는 미세분리기 우리내에서 개별적으로 수용되며 모든 조작은 라미나 유동 후드내에서 이루어진다. 부프레노르핀(0.1㎎/㎏ q12h)을 이식 후 3일동안 진통제로 투여한다.
챔버가 등 표면 위로 확장하는 피부의 이중층 사이에 위치되도록 마우스를 위치시킨다. 피부 한 층을 직경 15mm 정도의 원형 면적으로 제거한다. 두번 째 층(상피, 근막, 및 줄무늬근으로 구성됨)을 챔버의 프레임상에 위치시키고 멸균 유리 커버슬립으로 덮는다. 챔버의 상부를 따라 있는 구멍과 확장 피부를 통과하는 나일론 포스트와 챔버를 함께 유지시킨다. 3일 후에, 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 젤을 삽입한다. 새로운, 멸균 커버슬립을 이어서 관찰 표면에 놓는다. 강화 CCD 카메라, S-VHS 비디오카세트 레코더를 이용한 형태 측정 분석 및 직접 디지탈 영상 획득에 의해 측정한다. 이식된 변화자를 가진 마우스를 28일동안 관찰했다.
측정.
마우스를 체중 ㎏당 케타민 90㎎과 크실라진 9㎎의 혼합물을 피하 주사하여 마비시킨 후, 멸균 플라스틱 단 조립품에 위치시킨다. 투과법을 이용하여 또는 100㎕의 BSA-FITC(1㎎/㎖, i.v.) 주사와 상피 조명에 이어 창의 혈관 지도를 만든다. 혈관 베드의 비디오 기록을 오프-라인 분석을 위한 디지탈 프레임뿐만 아니라 일정 확대 범위(1x 내지 40x)에서 만든다. 이식 젤의 혈관생성 측정은 비디오 테입의 오프라인 분석으로부터 만들어진다.
본 실시예에 설명된 연구는 KGF-2 △33 폴리뉴클레오티드의 활성을 시험한다. 하지만, 당업자는 전길이 및 성숙 KGF-2, KGF-2 △28, 그리고 KGF-2의 아미노산 77 내지 208, 80 내지 208, 및 93 내지 208을 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 다른 KGF-2 폴리뉴클레오티드; 및 KGF-2 폴리펩티드, 변이체, 단편, 아고니스트, 및/또는 안타고니스트; 그리고 임의의 본원에 개시된 KGF-2 돌연변이의 활성을 시험하기 위해 예시된 연구를 쉽게 변형할 수 있다.
실시예 46
KGF-2 트랜스제닉 동물
KGF-2 폴리펩티드는 트랜스제닉 동물에서 발현될 수 있다. 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니아 피그, 돼지, 마이크로-돼지, 염소, 양, 소 및 비인간 영장류(예, 비비, 원숭이, 및 침팬지)를 포함하며 이에 제한되지 않는 임의의 종의 동물이 트랜스제닉 동물을 생성하기 위해 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에서 개시되거나 당업계에 공지된 기술을 이용하여 유전자 치료 프로토콜의 일부로서 본 발명의 폴리펩티드를 사람에서 발현시킨다.
트랜스제닉 동물의 조상 계통을 생산하기 위해 트랜스유전자(예, 본 발명의 폴리뉴클레오티드)를 동물내로 도입하기 위해 공지된 임의의 기법을 이용할 수도 있다. 그러한 기술은 전핵 미세주사(Paterson et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.40:691-698(1994); Carver et al.,Biotechnology(NY) 11:1263-1270(1993);Wright et al.,Biotechnology(NY)9:830-834(1991); 및 Hoppe et al., 미국 특허 제4,873,191호(1991)); 레트로바이러스 매개된 초기배 주, 블라스토시스트 또는 배내로의 유전자 전이(Van der Putten et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 82:6148-6152(1985)); 배간세포내 유전자 표적화(Thompson et al.,Cell 56:313-321(1989)); 세포 또는 배의 일렉트로포레이션(Lo, Mol.Cell.Biol.3:1803-1814(1983)); 유전자 총을 이용한 본 발명 폴리뉴클레오티드의 도입(참고, Ulmer et al., Science 259:1745(1993)); 배의 다능성 간세포내로 핵산 구조체를 도입하고 그 간 세포를 블라스토시스트내로 옮기기; 및 정자-매개 유전자 전이(Lavitrano et al.,Cell 57:717-723(1989)); 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 이러한 기술들의 리뷰를 위해서는 Gordon, "Transgenic Animals", Intl.Rev.Cytol.115:171-229(1989)를 참고하기 바라며, 이는 본원에 참고로 통합된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 트랜스제닉 클론을 생성하기 위해, 예를 들어 배양된 배, 태아, 또는 휴지기로 유도된 성체 세포로부터의 탈핵 난모 세포내로의 핵 전이와 같은 당업계에 공지된 임의의 기술이 이용될 수 있다(Campell et al., Nature 380:64-66(1996); Wilmut et al., Nature 385:810-813(1997)).
본 발명은 모든 그들의 세포내에 트랜스유전자를 보유하는 트랜스제닉 동물과 모든 세포가 아닌 일부 세포에 트랜스유전자를 보유하는 동물(예, 모자이크 동물 또는 키메라)을 제공한다. 트랜스유전자는 단일 트랜스유전자로서 통합될 수도 있고, 또는 헤드-대-헤드 탠덤(tandem) 또는 헤드-대-테일 탠덤과 같은콘카타머(concatamer)로 다수가 통합될 수도 있다. 트랜스유전자는 예를 들어 Lasko et al.(Lasko et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6232-6236(1992))의 교시에 따라 특정 세포 유형내로 선택적으로 도입되어 활성화될 수도 있다. 이러한 세포 유형 특이적 활성화에 요구되는 조절 서열은 관심의 특정 세포 유형에 의존할 것이며, 당업자에게 자명할 것이다. 폴리뉴클레오티드 트랜스유전자가 내인성 유전자의 염색체 부위내로 통합되는 것이 바람직할 경우, 유전자 표적화가 바람직하다.
요약하자면, 이러한 기술이 이용될 경우, 내인성 유전자에 상동성인 일부 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터가 염색체 서열과의 상동성 재조합을 통하여 내인성 유전자의 뉴클레오티드 서열의 기능내로 통합되어 파괴할 목적으로 고안된다. 트랜스유전자는 또한 예를 들어 Gu et al.(Gu et al., Science 265:103-106(1994))의 교시에 따라 특정 세포 유형내로 선택적으로 도입되어 단지 그 세포 유형에서만 내인성 유전자를 불활성화시킬 수도 있다. 그러한 세포 유형 특이적 활성화에 요구되는 조절 서열은 관심의 특정 세포 유형에 의존할 것이며, 당업자에게 자명할 것이다. 본 문단에서 인용된 문서들의 각 내용은 본원에 그 전체가 참고로 통합된다.
일단 트랜스제닉 동물이 생성되면, 재조합 유전자의 발현은 표준 기술을 이용하여 분석될 수 있다. 서던 블롯 분석 또는 PCR 기법에 의해 동물 조직을 분석하여 트랜스유전자의 통합이 일어났는지를 입증함으로써 초기 스크리닝을 할 수 있다. 트랜스제닉 동물의 조직에서 트랜스유전자의 mRNA 발현 정도는 또한, 동물로부터 얻은 조직 샘플의 노던 블롯 분석, 인시추 하이브리드화 분석, 및 역전사 효소-PCR(rt-PCR)을 포함하며 이에 제한되지 않는 기술에 의해 평가될 수도 있다. 트랜스제닉 유전자 발현 조직의 샘플은 또한 그 트랜스유전자 산물에 대해 특이적인 항체를 이용하여 면역세포화학적으로 또는 면역조직화학적으로 평가될 수도 있다.
일단 조상 동물이 생산되면, 그들을 사육, 근교배, 이계 교배, 또는 교차교배시켜 특정 동물의 콜로니를 생산할 수 있다. 그러한 교배 전략의 예는 하나 이상의 통합 부위를 가진 조상 동물을 이계 교배시켜 별도의 라인을 확립하는 것; 별도의 라인을 근교배시켜 각 트랜스유전자의 부가 발현 효과에 의해 더 높은 수준의 트랜스유전자를 발현하는 복합 트랜스제닉을 생산하는 것; 이형 트랜스제닉 동물을 교배시켜 주어진 통합 부위에 대해 동형인 동물을 생산하여 발현을 증대시키고 DNA 분석에 의해 동물을 스크리닝할 필요성을 제거하는 것; 별도의 동형 라인을 교배시켜 복합 이형 또는 동형 라인을 생산하는 것; 및 관심의 실험 모델에 적합한 별도의 배경에 트랜스유전자를 놓기 위해 교배시키는 것을 포함하며 이에 제한되지 않는 전략을 포함한다.
본 발명의 트랜스제닉 동물은 KGF-2 폴리펩티드의 생물 기능을 다듬고, 비정상적인 KGF-2 발현과 관련된 상태 및/또는 질환을 연구하고, 그러한 상태 및/또는 질환을 완화시키는 데 효과적인 화합물을 스크리닝하는 데 유용한 동물 모델 시스템을 포함하며 이에 제한되지 않는 용도를 갖는다.
실시예 47
KGF-2 넉-아웃(knock-out) 동물
내인성 KGF-2 유전자 발현은 또한 표적화된 상동성 재조합(예, Smithies et al.,Nature 317:230-234(1985);Thomas & Capecchi, Cell 51:503-512(1987);Thompson et al.,Cell 5:313-321(1989) 참고; 각각은 전체가 참고로 본원에 통합됨)을 이용하여 KGF-2 유전자 및/또는 그 프로모터를 불활성화시키거나 또는 "넉-아웃"시킴으로써 감소될 수 있다. 예를 들어, 내인성 폴리뉴클레오티드 서열에 상동성인 DNA에 의해 인접된 본 발명의 돌연변이 비기능성 폴리뉴클레오티드(또는 완전히 무관한 DNA 서열)를 선택적 마커 및/또는 음성 선택적 마커와 함께 또는 없이 이용하여 생체내에서 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포를 형질감염시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 관심 유전자를 함유하나 발현하지 않는 세포에서 넉아웃을 생성할 수 있다. 표적화된 상동성 재조합을 통한 DNA 구조체의 삽입은 표적화된 유전자의 불활성화로 귀결된다. 그러한 접근은 배간 세포에 대한 변형을 이용하여 불활성 표적화 유전자를 갖는 동물 자손을 생성할 수 있는 연구 및 농업 분야에 특히 적합하다(예, Thomas & Capecchi 1987 and Thompson 1989, 상기 참고). 하지만 이 접근법은 당업자에게 자명할 적절한 바이러스 벡터를 이용하여 생체내에서 요구되는 부위로 재조합 DNA가 직접 투여되거나 표적화되면 사람에서 사용하기에 적합하게 쉽게 조절될 수 있다.
본 발명의 추가 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 조작된 세포, 또는 본 발명의 폴리펩티드를 발현하지 않도록 유전적으로 조작된 세포(예, 넉아웃)는 생체내로 환자에게 투여된다. 그러한 세포는 환자로부터(예,사람을 포함한 동물) 또는 MHC 양립성 공여자로부터 수득될 수도 있으며 섬유아세포, 골수 세포, 혈액 세포(예, 림프구), 지방세포, 근육 세포, 상피 세포 등을 포함할 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 세포는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, YACs,순수(naked) DNA, 일렉트로포레이션, 리포좀 등을 포함하며 이에 제한되지 않는 형질 감염 과정 또는 형질도입(바이러스 벡터, 바람직하게는 트랜스유전자를 세포 게놈내로 통합시키는 벡터를 이용함)에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 암호 서열을 세포내로 도입하기 위하여, 또는 본 발명의 폴리펩티드의 암호 서열 및/또는 관련 내인성 조절 서열을 파괴하기 위하여 재조합 DNA 기법을 이용하여 생체외에서 유전적으로 조작된다. 본 발명의 폴리펩티드의 암호 서열은 강한 구성형 또는 유도형 프로모터 또는 프로모터/인핸서의 조절하에 놓여 KGF-2 폴리펩티드의 발현 및 바람직하게는 분비를 이룰 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 바람직하게는 분비하는 조작된 세포는 전신적으로 예를 들어 순환계로 또는 복강내로 환자에게 도입될 수 있다.
다른 한편으로는, 세포는 매트릭스내로 통합되어 신체에 이식될 수 있다. 즉, 유전적으로 조작된 섬유아세포는 피부 이식편의 일부로서 이식될 수 있으며, 유전자 조작된 내피 세포는 임파구 또는 혈관 이식편의 일부로서 이식될 수 있다(예, Anderson et al.미국 특허 제5,399,349; 및 Mulligan & Wilson, 미국 특허 제5,460,959호 참고, 각각은 참고로 본원에 통합됨).
투여될 세포가 비-자기성이거나 비-MHC 양립성 세포이면, 그들은 도입된 세포에 대한 숙주 면역 반응의 발생을 방지하는 공지 기술을 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 세포는 캡슐화된 형태로 도입될 수도 있으며, 이는 바로 이웃한 세포외 환경과 성분 교환을 가능하게 하는 반면 도입된 세포가 숙주 면역 시스템에 의해 인식되게 하지 않는다.
본 발명의 넉아웃 동물은 KGF-2 폴리펩티드의 생물학적 기능을 다듬는데 유용한 동물 모델 시스템으로서의 용도, 비정상 KGF-2 발현과 관련된 상태 및/또는 질환 연구, 및 그러한 상태 및/또는 질환을 완화시키는 데 효과적인 화합물의 검색에의 용도 등을 갖는다.
실시예 48
KGF-2 돌연변이의 구성
점 돌연변이를 제조하기 위하여, 당업계에 공지된 표준 조건을 이용하는 PCR 반응에서 하기 프라이머를 이용하였다. 생성된 산물을 Nde와 Asp718로 절단한 뒤 pHE4내로 클론하거나, 또는 BamHI과 Xba로 절단한 뒤 pcDNA3내로 클론하였다. 설명된 KGF-2 변이체 중 임의의 것은 공지 방법을 이용하여 다른 벡터에서 생산되거나 또는 스스로 생산될 수 있다.
프라이머 서열
pHE4:KGF2:R80-S208은 하기 프라이머를 이용하여 구성되었다:
5' primer:CCGGC CATATG CGTAAACTGTTCTCTTTCACC (서열 번호 151)
3' primer:CCGGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGG (서열 번호 152)
pHE4:KGF2:A63-S208(R68G)은 하기 프라이머를 이용하여 구성되었다:
5' primer:GATCGC CATATG GCTGGTCGTCACGTTCGTTC (서열 번호 153)
3' primer:GATCGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG (서열 번호 154)
pHE4:KGF2:A63-S208(R68S)은 하기 프라이머를 이용하여 구성되었다:
5' primer:GATCGC CATATG GCTGGTCGTCACGTTCGTTC (서열 번호 155)
3' primer:GATCGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG (서열 번호 156)
pHE4:KGF2:A63-S208(R68A)은 하기 프라이머를 이용하여 구성되었다:
5' primer:GATCGC CATATG GCTGGTCGTCACGTTCGTTC (서열 번호 157)
3' primer:GATCGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG (서열 번호 158)
pHE4:KGF2:A63-S208(R78R80K81A)은 하기 프라이머를 이용하여 구성되었다:
5' primer:GATCGC CATATG GCTGGTCGTCACGTTCGTTC (서열 번호 159)
3' primer:GATCGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG (서열 번호 160)
pcDNA3:KGF2(K136137139144A)은 하기 프라이머를 이용하여 구성되었다:
5' primer:GATCGCGGATCCGCCACCATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGC (서열 번호 161)
3' primer:GATCGCTCTAGATTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAG (서열 번호 162)
pcDNA3:KGF2(K151153R155A)는 하기 프라이머를 이용하여 구성되었다:
5' primer:GATCGCGGATCCGCCACCATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGC (서열 번호 163)
3' primer:GATCGCTCTAGATTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAG (서열 번호 164)
pcDNA3:KGF2(R174K183A)은 하기 프라이머를 이용하여 구성되었다:
5' primer:GATCGCGGATCCGCCACCATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGC (서열 번호 165)
3' primer:GATCGCTCTAGATTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAG (서열 번호 166)
pcDNA3:KGF2(R187R188A)은 하기 프라이머를 이용하여 구성되었다:
5' primer:GATCGCGGATCCGCCACCATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGC (서열 번호 167)
3' primer:GATCGCTCTAGATTATGAGTGTACCACCATTGGAAGAAAG (서열 번호 168)
pHE4:KGF2.A63(K136137139144A)은 하기 프라이머를 이용하여 구성되었다:
5' primer:GATCGCCATATGGCTGGTCGTCACGTTCGTTC (서열 번호 169)
3' primer:GATCGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG (서열 번호 170)
pHE4:KGF2.A63(K151153R155A)은 하기 프라이머를 이용하여 구성되었다:
5' 프라이머: GATCGCCATATGCGTGGTCGTCACGTTCGTTC (서열 번호 171)
3' 프라이머: GATCGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGGAAG (서열 번호 172)
실시예 49
불임을 치료하고/하거나 방지하기 위한 KGF-2의 용도
이식은 성공적인 임신에서 단일의 가장 중요한 인자이며 임상학적으로 및 경제적으로 중요하다. 사람에서, 배 생명에서 70% 손실의 가장 큰 분율이 이식에서 일어난다. 마우스는 포유동물 이식 연구를 위한 선택 모델이다. 세 개의 필수 세포 계통이 페리(peri)-이식 마우스 배로 분화하고 분열한다. 배, 태반 및 난황낭 전구체. 섬유아세포 성장 인자(FGF)-4는 모든 세 개의 세포 계통의 발생에 필수적이다.
기능 획득 및 기능 손실(우성 음성) FGF 수용체 유전자를 전달하는 '일시적 트랜스제닉' 접근법을 이용하여, 내인성 FGF 시그날링이 이식 2일전 다섯 번째 세포 분열에서 시작하는 마우스 배의 배와 태반 계통을 위한 모든 간세포의 세포 분열에 필수적임이 밝혀졌다.
흥미롭게도, fgfr-2와 fgf4의 공(null) 돌연변이는 이식 후 1일 내에 자궁내에서 죽고 ICM도 죽는다는 것이 밝혀졌다. 배 계통과 태반 계통에서 자궁 세포내로의 배 이식은 FGF가 증식을 계속할 것을 요구한다.
다른 19 FGF 리간드의 하나 또는 몇몇이 마우스 이식전 배에서 일시적으로발현되고 이 리간드가 이식후까지 fgfr-2와 fgf4 공 돌연변이의 효과를 지연시키는 것이 가능하다. RT-PCR을 이용하여 여섯 개의 FGF 리간드를 시험했다. 현재까지, FGF-4외에 KGF-2와 FGF-8이 이식전 배에서 검출되는 유일한 FGF 리간드이다. KGF-2 mRNA는 2세포 단계후에 초기 이식후 동안 배에서 검출된다.
KGF-2 공 돌연변이는 페리-이식 마우스 배에서 KGF-2의 발현동안 KGF-2가 생존에 필수적이 아님을 제안한다(Min et al.,1998;Sekine et al.,1999). 하지만, 다른 FGF 계 성분들이 페리 이식 배 발생동안 KGF-2를 대신하거나 여분이 될 수도 있다. 많은 여분의 유전적 효과가 마우스에서 공 돌연변이의 분석동안 관찰되었고, 유전자 계내의 보상 또한 관찰되었다(Thomas et al.,1995:Stein et al.,1994). KGF-2는 KGF-2 공 돌연변이에 의해 제안되는 것보다 초기 발생에서 더 중요할 수도 있다.
공 돌연변이가 필수 기능을 전혀 제안하지 않는 시기에 초기 발생에서 KGF-2가 역할을 갖는지를 검출하는 최선의 방법은 기능 획득 실험을 하는 것이다. 이들 실험은 KGF-2가 페리이식 배의 성장에 대해(Rappolee et al., 1994), 블라스토시스트 과성장(Chai et al., 1998) 및 내부 콜 매스(call mass)내의 내배엽 계통 세포(Rappolee et al., 1994)에서 태반/트로포블라스트(TROPHOBLAST) 세포에 대해 영향을 갖는지를 시험한다. 기능 손실 시험은 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하거나(Rappolee et al., 1992) 항체를 차단함으로써(LaFLeur et al., 1996) 제한된 방법으로 이루어질 수 있다. 이식후 곧 배는 크기 조절을 일으키며, 세포수에서 대형 양성 및 음성 변화가 생체항상성적으로 조절됨이 알려져 있다(Rappolee,1998). 이는 작고 덜 치명적인 KGF-2-의존성 효과가 KGF-2 공 돌연변이에서 완전히 소실될 수도 있음을 제안한다. 기능 손실 및 획득 실험은 KGF-2의 효과에 대해 페리 이식 마우스 배를 시험하기 위해 이용된다.
현재까지, 페리이식 마우스배에서 성장 인자에 대한 mRNA 의 검출은 상응하는 단백질의 검출로 이어졌다(Rappolee et al., 1998, 1992, 1994; Rappolee 1998, 1999에서 정리). KGF-2 단백질이 KGF-2 mRNA가 검출되는 배에 존재하는지(그리고 어디에)를 결정하기 위해 면역세포화학에 적합한 KGF-2 항체를 이용한다.
실시예 50
임상 샘플에서 KGF-2의 검출
정제된 염소 PAb를 피복 완충액(0.05M NaHCO3, Ph 9.5)에 2㎍/㎖로 희석시킨다. 희석 항체 100㎕를 Immuno 4 미세플레이트 웰마다 첨가한다. 미세플레이트를 4℃에서 밤새 저장한다. 항체 용액을 플레이트로부터 따라 버린다. 차단 완충액(피복 완충액중의 1% 건조 우유(BioRad)) 200㎕를 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 실온에서 2시간동안 항온처리한다. 차단 완충액을 플레이트로부터 따라 버린다. 플레이트를 진공 흡인시키고, 진공 챔버에서 1.5시간동안 32℃에서 완전히 건조시킨다. 플레이트를 진공 챔버로부터 제거하고 3개의 건조제 팩을 가진 미라(mylar) 파우치에 밀봉시킨다. 플레이트를 사용할 때까지 4℃에서 저장한다.
KGF-2를 희석제 1(0.1% 트윈 20, 1XPBS, 1% BSA, 및 0.001% Thimerosal)로 16ng/ml로 희석하고, 이어서 다음 7회 희석동안 연속하여 2.5x 희석 한다. 16ng/ml내지 0.026ng/ml의 농도 범위를 표준으로 사용한다. 배경 웰은 단백질없이 희석제로만 이루어진다.
미지 샘플을 희석제 1로 10x, 50x, 및 250x 희석한다. 연속 희석 표준 용액과 미지 샘플을 100㎕씩 피복된 ELISA 플레이트에 웰에 첨가한다. 플레이트를 4℃에서 밤새 저장한다. 용액을 플레이트로부터 따라 버린다. 1.6 ml에 고정된 Wheaton Instrument를 사용하여 플레이트를 세척 완충액(0.1% 트윈 20과 1XPBS)으로 다섯 번 세척한다. 각 세척 사이에 세척 완충액으로 15초간 항온처리한다.
검출자인 비오티닐화된 닭 항-KGF-2를 희석제 1에 0.5㎍/ml로 희석한다. 희석된 검출자 100㎕를 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 실온에서 2시간동안 항온처리한다. 용액을 따라 버리고 플레이트를 앞서처럼 세척 완충액으로 5회 세척한다. 각 세척 사이에 세척 완충액으로 15초간 항온처리한다.
퍼옥시다제 스트렙타비딘을 희석제 1에 1:2000으로 희석한다. 희석된 퍼옥시다제 스트렙타비딘을 웰당 100㎕씩 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간동안 항온처리한다. 플레이트를 따라 버리고 세척 완충액으로 5회 세척한다. 각 세척 사이에 세척 완충액으로 15초간 항온처리한다. 플레이트를 건조시키지 않는다.
실온의 TMB 퍼옥시다제 기질과 퍼옥시다제 용액 B(TMB 퍼옥시다제 마이크로웰 기질 시스템, KPL)의 동량을 혼합한다. 혼합된 용액 100㎕를 각 웰에 첨가하고 실온에서 10분동안 발색시킨다. 각 웰에 1M H2SO450㎕를 첨가하여 발색을 정지시킨다. 플레이트를 450nm에서 판독한다.
실시예 51
이.콜리(E.coli) 최적화된 절단 KGF-2의 구성
이.콜리 발현 시스템에서 절단 KGF-2의 발현 정도를 증가시키기 위해, 유전자 코돈을 고도로 이용되는 이.콜리 코돈에 최적화시켰다.
예를 들어, pHE4:KGF-2.A63-S608로 불리는 하기의 구조체를 만들었다.
5' CATATGGCTGGTCGTCACGTTCGTTCTTACAACCACCTGCAGGGT
GACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAA
AATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTG
CCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTT
GCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGA
AGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCT
GAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATT
TAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGG
AAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACA
CCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAATAAGGTACC
3' (서열 번호 173)
서열 번호 173의 뉴클레오티드 서열을 갖는 cDNA를 포함하는 플라스미드를 2000년 7월 3일에 ATCC 기탁 번호로 버지니아 20110-2209 마나사스 유니버시티 불레바드 10801 ATCC 특허 기탁소에 기탁하였다.
pHE4:KGF-2.A63-S208 cod.opt로 불리는 다른 구조체를 하기 프라이머를 이용하여 구성하였다:
센스 5' GACTACATATGGCTGGTCGTCACGTTCGTTCTTACAACCACCTGCA GG 3'(서열 번호 174)
안티센스 5' CTAGTCTCTAGATTATGAGTGTACAACCATCGGCAGGAAGTGAG 3'(서열 번호 175)
pHE4:KGF-2.A63-208 cod.opt의 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:
5' ATGGCTGGTCGTCACGTTCGTTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAGAACGGTAAAGTTTCTGGTACCAAGAAAGAAAACTGCCCGTACTCTATCCTGGAAATCACCTCCGTTGAAATCGGTGTTGTAGCCGTTAAAGCCATCAACTCCAACTATTACCTGGCCATGAACAAAAAGGGTAAACTGTACGGCTCTAAAGAATTCAACAACGACTGCAAACTGAAAGAACGTATCGAAGAGAACGGTTACAACACCTACGCATCCTTCAACTGGCAGCACAACGGTCGTCAGATGTACGTTGCACTGAACGGTAAAGGCGCTCCGCGTCGCGGTCAGAAAACCCGTCGCAAAAACACCTCTGCTCACTTCCTGCCGATGGTTGTACACTCATAATAA 3'(서열 번호 NO:176)
서열 번호 176의 뉴클레오티드 서열을 갖는 cDNA를 포함하는 플라스미드를 2000년 7월 3일에 ATCC 기탁 번호로 버지니아 20110-2209 마나사스 유니버시티 불레바드 10801 ATCC 특허 기탁소에 기탁하였다.
본 실시예에 개시된 두 구조체 모두 예를 들어 실시예 13에 설명된 대로 KGF-2 폴리펩티드를 생산하는 데 유용하다. 서열 번호 173의 뉴클레오티드 4 내지 444와 서열 번호 176의 뉴클레오티드 1 내지 441은 서열 번호 2의 아미노산 63 내지 208과 N-말단 메티오닌을 암호한다.
본 발명이 전술한 설명과 실시예에 구체적으로 개시된 바와 달리 실시될 수도 있음은 명백할 것이다.
본 발명의 많은 변형과 변화가 전술한 교시로부터 가능할 것이며, 따라서 첨부되는 특허청구범위의 범위내에서 본 발명은 구체적으로 설명된 바와 달리 실시될 수도 있다.
본원에서 인용되는 모든 문헌의 전체적인 개시(특허, 특허 출원, 저널 기사, 실험 방법, 책, 또는 기타 문서)가 참고로 본원에 통합된다.
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DNA 플라스미드 366885A
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DNA 플라스미드 366,885
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기탁일: 1999. 6. 30 수탁 번호: ATCC PTA-290
C. 추가 증명(불필요한 경우 공백으로 하시오) 이 정보는 첨부한 용지에 계속됨
DNA 플라스미드 pVGI-0:KGF2(F.L.)(Ref.PF155)
D. 증명을 필요로 하는 국가의 지정(이 증명이 모든 지정국에 대한 것이 아닌 경우)
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이 용지는 국제 출원과 함께 수리되었습니다 이 용지는 국제 수리 관청에 의해 수리되었습니다
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기탁 기관의 주소(우편 번호와 국가명 포함):미국 버지니아주 20110-2209 마나싸스 유니버시트 볼레발드 10801
기탁일: 1999.6.30 수탁 번호: ATCC PTA-289
C. 추가 증명(불필요한 경우 공백으로 하시오) 이 정보는 첨부한 용지에 계속됨
DNA 플라스미드 pVGI-0:△33KGF2(Ref.PF155)
D. 증명을 필요로 하는 국가의 지정(이 증명이 모든 지정국에 대한 것이 아닌 경우)
E. 증명서의 별도 제공(불필요한 경우 공백으로 하시오)
아래에 제시된 증명서은 이후 국제 사무국에 제출될 것이다(증명서의 일반적인 종류를 구체화하시오, 예를 들어 "기탁의 수탁 번호")
수리 관청용 국제 사무국용
이 용지는 국제 출원과 함께 수리되었습니다 이 용지는 국제 수리 관청에 의해 수리되었습니다
권한을 가진 자 권한을 가진 자
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기탁 기관의 주소(우편 번호와 국가명 포함):미국 버지니아주 20110-2209 마나싸스 유니버시트 볼레발드 10801
기탁일: 1998. 1. 9 수탁 번호: ATCC 209575
C. 추가 증명(불필요한 경우 공백으로 하시오) 이 정보는 첨부한 용지에 계속됨
DNA 플라스미드 pHEKGF-2delta33
D. 증명을 필요로 하는 국가의 지정(이 증명이 모든 지정국에 대한 것이 아닌 경우)
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B. 기탁의 증명추가 기탁물은 첨부한 용지에서 확인됨
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기탁 기관의 주소(우편 번호와 국가명 포함):미국 버지니아주 20110-2209 마나싸스 유니버시트 볼레발드 10801
기탁일: 2000. 7. 3 수탁 번호: 통보될 것임
C. 추가 증명(불필요한 경우 공백으로 하시오) 이 정보는 첨부한 용지에 계속됨
(통보될 것임)
D. 증명을 필요로 하는 국가의 지정(이 증명이 모든 지정국에 대한 것이 아닌 경우)
E. 증명서의 별도 제공(불필요한 경우 공백으로 하시오)
아래에 제시된 증명서은 이후 국제 사무국에 제출될 것이다(증명서의 일반적인 종류를 구체화하시오, 예를 들어 "기탁의 수탁 번호")
수리 관청용 국제 사무국용
이 용지는 국제 출원과 함께 수리되었습니다 이 용지는 국제 수리 관청에 의해 수리되었습니다
권한을 가진 자 권한을 가진 자
미생물 기탁 증명서(PCT Rule 13bis)
A. 다음에 작성된 증명서는 명세서 505페이지의 17째줄에 언급된 미생물에 관한 것이다
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수리 관청용 국제 사무국용
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권한을 가진 자 권한을 가진 자

Claims (12)

  1. 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리펩티드는 R68G, R68S, R68A, R78A, R80A, K81A, K87A, K91A, K136A, K137A, K139A, K144A, K148E, K149E, K151A, K153A, K155A, R174A, K183A, K183Q, K183E, R187A, R188A, R188E, K191E, R68 내지 K91을 포함한 그 사이의 알라닌으로 치환된 양전하 잔기, R68 내지 K91을 포함한 그 사이의 중성 잔기로 치환된 양전하 잔기, 및 R68 내지 K91을 포함한 그 사이의 음성 전하 잔기로 치환된 양전하 잔기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 제외하고는 서열 번호 2의 기준 폴리펩티드와 동일한 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기준 폴리펩티드가 서열 번호 2의 아미노산 63 내지 208, 69 내지 208, 77 내지 208, 80 내지 208 또는 93 내지 208을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  4. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  5. 폴리펩티드가 발현될 수 있는 조건하에서 제4항의 숙주 세포를 배양하고 그폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 폴리펩티드 생산 방법.
  6. 제1항의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호되는 폴리펩티드.
  7. 제6항의 폴리펩티드를 환자에 투여하는 것을 포함하는 환자에서 상피 세포 증식을 자극하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 환자가 상처, 점막염, 궤양, 염증성 장질환, 간 질환, 폐 손상, 당뇨병, 구강 손상, 위장 손상, 장 독성, 수포성 표피 박리증, 피부 이식, 피부 질환, 신부전, 뇌 손상, 가슴 조직 손상, 자궁 손상, 암컷 생식관 질환, 장섬유증, 직장염, 폐 섬유증, 폐렴, 늑막 수축, 혈우병, 및 골수독성으로 구성된 군에서 선택되는 질환을 갖는 방법.
  9. 서열 번호 2의 폴리펩티드 또는 그 활성 단편 또는 변이체 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 난소 손상, 불임, 또는 간 섬유증을 치료하거나 방지하는 방법.
  10. 서열 번호 2의 폴리펩티드 또는 그 활성 단편 또는 변이체 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자에서 내부적 치유, 공여부위 치유, 내부적 수술 상처 치유, 또는 성형 수술동안 생성된 절개 상처의 치유를 증진시키는 방법.
  11. (a) 벡터에 아미노산 63 내지 208을 암호하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 단계;
    (b) 상기 벡터를 숙주 세포내로 형질감염시키는 단계;
    (c) 상기 폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계;
    (d) 구아니딘 염산염 존재하에 상기 세포를 분해하는 단계; 및
    (e) 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 폴리펩티드 생산 방법.
  12. 서열 번호 173의 뉴클레오티드 4 내지 444 또는 서열 번호 176의 1 내지 441을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102691028B1 (ko) * 2021-11-15 2024-08-05 (주)피앤피바이오팜 안정성이 증가된 인간 각질세포 성장인자1 변이체 및 이의 용도

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6693077B1 (en) 1995-02-14 2004-02-17 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
US6077692A (en) 1995-02-14 2000-06-20 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
US7232667B2 (en) 1995-02-14 2007-06-19 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 polynucleotides
NZ505324A (en) 1997-12-22 2002-11-26 Human Genome Sciences Inc Liquid and lyophilised KGF-2 polypeptide formulations used to accelerate soft tissue growth or regeneration
US6869927B1 (en) 1997-12-22 2005-03-22 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 formulations
EP1054900A4 (en) 1998-02-13 2004-12-22 Human Genome Sciences Inc THERAPEUTIC USE OF THE KERATINOCTENT GROWTH FACTOR-2
JP4734245B2 (ja) 2003-08-01 2011-07-27 ストラタテック コーポレーション 外因性ポリペプチドを発現するヒト皮膚等価物
KR100524326B1 (ko) 2003-12-08 2005-10-31 한밭대학교 산학협력단 직접변환 낮은 중간주파수 방식 상향변환에 의한 동위상채널과 직교채널간 부정합 추출 장치와 그를 이용한 직접변환 디지털 직교 송신 시스템 및 그 방법
US20080119433A1 (en) * 2006-07-06 2008-05-22 Aaron Thomas Tabor Compositions and Methods for Genetic Modification of Cells Having Cosmetic Function to Enhance Cosmetic Appearance
CA2700729A1 (en) * 2007-10-19 2009-04-23 The University Of Tokyo Therapeutic agent for vitiligo and method of accelerating pigmentation
CN102471769A (zh) 2009-07-17 2012-05-23 亚伦·T.·塔波尔 用于具有美容功能的细胞的遗传修饰以提高美容外观的方法和组合物
CN102477093B (zh) * 2010-11-22 2014-03-12 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种热稳定人角质细胞生长因子突变体的制备方法及其应用
CN102119935B (zh) * 2011-03-07 2012-09-26 苏州大学 衣霉素在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用
ES2861453T3 (es) * 2016-01-04 2021-10-06 Univ Leland Stanford Junior Terapia génica para la epidermólisis ampollosa distrófica recesiva utilizando queratinocitos autólogos corregidos genéticamente
CN107233360B (zh) * 2017-06-26 2021-08-10 刘国灿 一种治疗烫伤、烧伤的中药
CN108686201A (zh) * 2018-06-29 2018-10-23 上海新生源医药集团有限公司 用于治疗口腔黏膜炎的kgf-2及其制剂
CN110404051A (zh) * 2019-03-27 2019-11-05 汪炬 用于治疗脱发的短肽、药物及其应用
EP4183796A1 (en) 2021-11-19 2023-05-24 Enantis s.r.o. Thermostable fgf10 polypeptide or fragment thereof use thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2269077C (en) * 1996-10-15 2004-04-06 Amgen Inc. Keratinocyte growth factor-2 products
PT941110E (pt) * 1996-10-15 2004-07-30 Amgen Inc Utilizacao do factor 2 de crescimento dos ceratinocitos

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102691028B1 (ko) * 2021-11-15 2024-08-05 (주)피앤피바이오팜 안정성이 증가된 인간 각질세포 성장인자1 변이체 및 이의 용도

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