JP2002527104A - Ｔｎｆｒ関連遺伝子１２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＴＮＦＲ関連遺伝子１２と称する、新規なヒトタンパク質、ならびにこのタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。また、このヒトタンパク質を生成するための、ベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法が提供される。本発明はさらに、この新規なヒトタンパク質に関する障害を診断および処置するために有用な、診断方法および治療方法に関する。本発明は、さらに、ＴＲ１２活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、腫瘍壊死因子レセプターファミリー、または「ＴＮＦＲ」ファミリ
ーのメンバーであるポリヌクレオチドをコードする、新規なヒト遺伝子に関する
。より詳細には、本発明は、ＴＮＦＲ関連遺伝子１２、または「ＴＲ１２」とい
う名の、新規なヒトポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発
明はまた、ＴＲ１２ポリペプチド、およびベクター、宿主細胞、ＴＲ１２ポリペ
プチドに対する抗体、ならびにこれらを生成するための化学的方法および組換え
方法に関する。また、免疫系、止血、新脈管形成、腫瘍転移、細胞移動、または
神経発生に関する障害を検出するための診断方法、およびこのような障害を処置
するため治療方法も提供される。本発明は、さらに、ＴＲ１２活性のアゴニスト
およびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。

【０００２】 （発明の背景） ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびβ（ＴＮＦ−βまたはリンホトキシ
ン）は、広範なクラスのポリペプチドメディエーターの関連するメンバーである
。このポリペプチドメディエーターは、インターフェロン、インターロイキンお
よび増殖因子を含み、まとめて、サイトカインと呼ばれている（Ｂｅｕｔｌｅｒ
，Ｂ．およびＣｅｒａｍｉ，Ａ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６
２５〜６５５（１９８９））。

【０００３】 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）は、その抗腫瘍活性の結果とし
て、元来発見された。しかし、現在これは、生物学的プロセスおよび病理の重要
な役割を宿主において果たす、多面発現性サイトカインとして認識されている。
今日までに、ＴＮＦ関連サイトカインファミリーの１０個の公知のメンバー（Ｔ
ＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン−α）、ＬＴ−β、ＴＲＡＩＬ、および
Ｆａｓレセプターのリガンド、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０（ＣＤｗ４０とし
ても公知）、ＯＸ４０および４−１ＢＢレセプター）が存在する。これらのタン
パク質（ただし、ＴＮＦ−βを除く）は、膜アンカーとしてしばしば使用される
、保存されたＣ末端配列および種々のＮ末端配列を有する。ＴＮＦ−αおよびＴ
ＮＦ−βの両方は、ＴＮＦレセプターに結合する場合に、ホモトリマーとして機
能する。

【０００４】 ＴＮＦは、多数の細胞型（単球、繊維芽細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（Ｎ
Ｋ）細胞を含む）により産生され、そして活性化されたマクロファージによって
主に産生される。ＴＮＦ−αは、腫瘍の迅速な壊死、免疫刺激、自己免疫疾患、
移植片拒絶、抗ウイルス応答の生成、敗血症ショック、大脳マラリア、細胞毒性
、化学療法の過程の間に生成されるイオン化放射線の有害な効果（例えば、酵素
の変性、脂質過酸化およびＤＮＡ損傷（Ｎａｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３
６：２４８３（１９８７））に対する防御、増殖調節、血管内皮効果および代謝
効果において役割を有することが報告されている。ＴＮＦ−αはまた、内皮細胞
が種々の因子（ＰＡＩ−１、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−６を含む）を
分泌するように誘発して、細胞増殖を促進する。さらに、ＴＮＦ−αは、種々の
細胞接着分子（例えば、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１）を
アップレギュレートする。ＴＮＦ−αおよびＦａｓリガンドはまた、プログラム
された細胞死を誘導することが示されている。

【０００５】 ＴＮＦ−βは、多くの活性（抗ウイルス状態および腫瘍壊死の誘導、多形核白
血球の活性化、内皮細胞上のクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体抗原の誘導、内
皮上の接着分子の誘導および成長ホルモン刺激を含む）を有する（Ｒｕｄｄｌｅ
，Ｎ．およびＨｏｍｅｒ，Ｒ．、Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ ４０：１６２〜１
８２（１９８８）。

【０００６】 ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βの両方は、増殖調節に関与し、そして分化のいく
つかの段階で造血細胞と相互作用し、種々の型の前駆細胞の増殖を阻害し、そし
て未熟骨髄性単球の増殖を誘導する（Ｐｏｒｔｅｒ，Ａ．、Ｔｉｂｔｅｃｈ ９
：１５８〜１６２（１９９１））。

【０００７】 「ノックアウト」マウスを用いた最近の研究は、ＴＮＦ−β産生が欠損したマ
ウスが、末梢リンパ系器官の異常な発達および脾臓構造の形態学的変化を示すこ
とを示した（Ａｇｇａｒｗａｌら、Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ ７：
９３〜１２４（１９９６）により概説される）。このリンパ系器官に関して、膝
窩リンパ節、鼡径リンパ節、大動脈傍体（ｐａｒａ−ａｏｒｔｉｃ）リンパ節、
腸間膜リンパ節、腋窩リンパ節および頸部リンパ節は、ＴＮＦ−β−／−マウス
を発生しなかった。さらに、ＴＮＦ−β−／−マウス由来の末梢血は、正常なマ
ウスと比較して、白血球において１／３に減少した。しかし、ＴＮＦ−β−／−
マウス由来の末梢血は、その正常な対照物と比較して、４倍以上のＢ細胞を含ん
だ。さらに、ＴＮＦ−αと対照的に、ＴＮＦ−βは、ＥＢＶに感染したＢ細胞の
増殖を誘導することが示されている。これらの結果は、ＴＮＦ−βがリンパ球の
発達に関与することを示す。

【０００８】 ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βにより媒介される種々の細胞性応答の誘導の第１
の工程は、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βが特定の細胞表面レセプターまたは可溶
性レセプターへ結合することである。約５５ＫＤａ（ＴＮＦ−ＲＩ）および７５
ＫＤａ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）である２つの異なるＴＮＦレセプターが、同定された
（Ｈｏｈｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４９２７〜１４９３４
（１９８９））。そして、両方のレセプター型に対応するヒトｃＤＮＡおよびマ
ウスｃＤＮＡが、単離され、そして特徴付けられた（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒら、Ｃ
ｅｌｌ ６１：３５１（１９９０））。両方のＴＮＦ−Ｒは、細胞表面レセプタ
ーの代表的構造（細胞外領域、膜貫通領域および細胞内領域を含む）を共有する
。

【０００９】 これらの分子は、細胞結合形態で存在するのみならず、インタクトなレセプタ
ーの切断された細胞外ドメイン（Ｎｏｒｐｈａｒら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ
９：３２６９〜７６（１９９０））、および膜貫通ドメインが欠失している他
のインタクトなレセプターからなる、可溶性形態でも存在する。ＴＮＦ−ＲＩお
よびＴＮＦ−ＲＩＩの細胞外ドメインは、２８％の同一性を共有し、そしてサブ
ユニット間配列の有意な相同性を有する４つの反復システインリッチモチーフに
より特徴付けられる。細胞型および組織の大多数は、両方のＴＮＦレセプターを
発現するようであり、そして両方のレセプターはシグナル伝達において活性であ
るが、しかし、両方のレセプターは、異なる細胞性応答を媒介し得る。さらに、
ＴＮＦ−ＲＩＩは、ＰＣＴ ＷＯ ９４／０９１３７に示されるように、ＴＮＦ
によるヒトＴ細胞増殖を排他的に媒介することが示された。

【００１０】 ＴＮＦ−ＲＩ依存性応答は、Ｃ−ＦＯＳ、ＩＬ−６およびマンガナーゼスーパ
ーオキシドジスムターゼｍＲＮＡの蓄積、プロスタグランジンＥ２の合成、ＩＬ
−２レセプターおよびＭＨＣクラスＩ細胞表面抗原およびＭＨＣクラスＩＩ細胞
表面抗原の発現、増殖阻害、および細胞毒性を含む。ＴＮＦ−ＲＩはまた、第２
メッセンジャー系（例えば、ホスホリパーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、ホスフ
ァチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣおよびスフィンゴミエリナーゼ）を誘発
する（Ｐｆｅｆｆｅｒｋら、Ｃｅｌｌ ７３：４５７〜４６７（１９９３））。

【００１１】 いくつかのインターフェロンおよび他の因子は、ＴＮＦレセプターの発現を調
節することが示された。例えば、レチノイン酸は、いくつかの細胞型においてＴ
ＮＦレセプターの生成を誘導しつつ、他の細胞型においてＴＮＦレセプターの生
成をダウンレギュレートすることが示された。さらに、ＴＮＦ−αは、両方の型
のレセプターの局在化に影響することが示された。ＴＮＦ−αは、ＴＮＦ−ＲＩ
のインターナリゼーションおよびＴＮＦ−ＲＩＩの分泌を誘導する（Ａｇｇａｒ
ｗａｌら、前出に概説される）。従って、両方のＴＮＦ−Ｒの生成および局在化
は、種々の因子のより調節される。

【００１２】 酵母ツーハイブリッド系ならびに同時沈殿および精製の両方が、ＴＮＦ−Ｒの
両方の型と結合するリガンドを同定するために使用されている（Ａｇｇａｒｗａ
ｌら、前出；Ｖａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ．５：３９２〜３９９（１９９５）に概説される）。マウスＴＮＦ−Ｒの
細胞質ドメインと相互作用するいくつかのタンパク質が同定されている。これら
のタンパク質のうちの２つは、バキュロウイルスのアポトーシスのインヒビター
に関連するようであり、このことは、プログラムされた細胞死の調節におけるＴ
ＮＦ−Ｒについて直接の役割を示唆する。

【００１３】 従って、細胞のプロセス（例えば、細胞増殖および分化）の調節に関与するサ
トカインおよびサイトカイン様分子のレセプターとして機能する、ポリペプチド
が必要である。なぜなら、このような調節の障害は、止血、新脈管形成、腫瘍転
移、細胞の移動、または神経発生に関する障害に関与し得るからである。従って
、このような障害を検出、予防、緩和または矯正する際に役割を果たし得るよう
なヒトポリペプチドの同定および特徴付けが必要である。

【００１４】 （発明の要旨） 本発明は、ＴＲ１２レセプターをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸
分子を提供し、このＴＲ１２レセプターは、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）
２に示されるアミノ酸配列、またはアメリカンタイプカルチャーコレクション（
「ＡＴＣＣ」）受託番号２０３３６５として寄託されるｃＤＮＡによりコードさ
れるアミノ酸配列を有する。本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む
組換えベクター、およびこの組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのよう
なベクターおよび宿主細胞を作製する方法、および組換え技術によりＴＲ１２ポ
リペプチドを生成するためにこれらのベクターおよび宿主細胞を使用するための
方法に、関する。

【００１５】 本発明はさらに、本明細書中に記載のポリヌクレオチドによりコードされるア
ミノ酸配列を有する単離されたＴＲ１２ポリペプチド、ならびにこれらのポリペ
プチドを生成するための組換え方法および合成方法に関する。

【００１６】 また、これらのポリペプチドに関連する障害を検出するための診断方法、およ
びこのような障害を処置するための治療方法も提供される。本発明は、さらに、
ＴＲ１２ポリペプチドの結合パートナーを同定するためのスクリーニング方法に
関する。

【００１７】 本発明はまた、ＴＲ１２により誘導される細胞性応答を増強または阻害し得る
化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は、ＴＲ１２
ポリペプチドを発現する細胞を候補化合物と接触させる工程、およびこの細胞性
応答を標準の細胞性応答と比較する工程を包含する。ここで、この標準は、接触
が、この候補化合物の不在下でなされる場合にアッセイされる。それにより、こ
の標準に対して増大した細胞性応答は、この化合物がアゴニストであることを示
し、そしてこの標準に対して低下した細胞性応答は、この化合物がアンタゴニス
トであることを示す。

【００１８】 別の局面において、アゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニン
グアッセイが提供され、このアッセイは、ＴＲ１２ポリペプチドへのリガンドの
結合に対して候補化合物が有する効果を決定する工程を包含する。特に、この方
法は、ＴＲ１２ポリペプチドをリガンドポリペプチドおよび候補化合物と接触さ
せる工程、ならびにＴＲ１２ポリペプチドへのリガンドの結合がこの候補化合物
の存在に起因して増大されるかまたは低減されるかを決定する工程を包含する。

【００１９】 本発明はさらに、ＴＲ１２ポリペプチド発現の変化から生じる疾患状態の診断
および予後の間に有用な、診断方法を提供する。

【００２０】 本発明のさらなる局面は、身体中で、ＴＲ１２ポリペプチド活性のレベルの増
加が必要な個体を処置するための方法に関し、この方法は、このような個体に、
治療有効量の本発明の単離されたＴＲ１２ポリペプチドまたはそのアゴニストを
含有する、組成物を投与する工程を包含する。

【００２１】 本発明のなおさらなる局面は、身体中で、ＴＲ１２ポリペプチド活性のレベル
の減少が必要な個体を処置するための方法に関し、この方法は、このような個体
に、治療有効量の単離されたＴＲ１２アンタゴニストを含有する、組成物を投与
する工程を包含する。

【００２２】 本発明はさらに、可溶性形態の本発明のポリペプチドを提供する。可溶性ポリ
ペプチドは、膜貫通ドメインを欠く、ＴＲ１２ポリペプチド配列を含む。このよ
うな可溶性形態のＴＲ１２は、膜貫通形態のそのレセプターのアンタゴニストと
して、有用である。

【００２３】 （定義） 以下の定義は、本明細書全体を通して使用される特定の用語の理解を容易にす
るために提供される。

【００２４】 本発明において、「単離された（単離した）」とは、そのもとの環境（例えば
、それが天然に存在する場合は天然の環境）から取り出された物質をいい、した
がって、その天然の状態から「人間の手によって」変更されている。例えば、単
離されたポリヌクレオチドは、ベクターまたは組成物の一部であり得るか、ある
いは細胞中に含まれ得、そしてなお「単離されている」。なぜなら、そのベクタ
ー、組成物、または特定の細胞は、そのポリヌクレオチドのもとの環境ではない
からである。用語「単離された」は、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブ
ラリー、丸ごとの細胞全体またはｍＲＮＡ調製物、ゲノムＤＮＡ調製物（電気泳
動により分離されたもの、およびブロットへトランスファーされたものを含む）
、せん断された全細胞ゲノムＤＮＡ調製物、あるいは当該分野が、本発明のポリ
ヌクレオチド／配列の識別する特徴を示さない他の組成物を、いわない。

【００２５】 本発明において、「分泌」ＴＲ１２タンパク質とは、ＥＲ、分泌小胞、または
細胞外間隙にシグナル配列の結果として指向され得るタンパク質、ならびにシグ
ナル配列を必ずしも含まないが細胞外間隙に放出されるＴＲ１２タンパク質をい
う。ＴＲ１２分泌タンパク質が、細胞外間隙に放出される場合、このＴＲ１２分
泌タンパク質は、「成熟」ＴＲ１２タンパク質を生成するために細胞外プロセシ
ングを受け得る。細胞外間隙への放出は、エキソサイトーシスおよびタンパク質
分解切断を含む、多くの機構によって生じ得る。

【００２６】 本明細書中で使用される場合、ＴＲ１２「ポリヌクレオチド」とは、配列番号
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）１に含まれる核酸配列を有する分子、ＡＴＣＣに寄託
されたプラスミド（受託番号２０３３６５）に含まれるｃＤＮＡ、配列番号１に
よりコードされるポリペプチド配列をコードする核酸配列、または寄託されたプ
ラスミドによりコードされるポリペプチド配列をコードする核酸配列をいう。例
えば、このＴＲ１２ポリヌクレオチドは、全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列
（５’非翻訳配列および３’非翻訳配列、シグナル配列を含むかもしくは含まな
いコード領域、分泌タンパク質コード領域を含む）、ならびにこの核酸配列のフ
ラグメント、エピトープ、ドメイン、および改変体を含み得る。さらに、本明細
書で使用される場合、ＴＲ１２「ポリペプチド」とは、広く定義される場合、そ
のポリヌクレオチドから生じた、翻訳されたアミノ酸配列を有する分子をいう。

【００２７】 本発明では、配列番号１として同定された全長ＴＲ１２配列は、寄託されたプ
ラスミド重複させることによって生成された（コンティグ分析）。配列番号１に
ついての配列のすべてまたはほとんどを含む代表的クローンを、アメリカンタイ
プカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）に、１９９８年１０月１９日に寄託
し、ＡＴＣＣ受託番号２０３３６５を割り当てられた。ＡＴＣＣは、１０８０１
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０
１１０−２２０９，ＵＳＡに位置する。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続目的のための
微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に拠って行われた。

【００２８】 ＴＲ１２「ポリヌクレオチド」はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下で、例えば、配列番号１に含まれる配列、その相補体、本明細書中
に記載されるポリヌクレオチドフラグメント、または寄託されたプラスミド内の
ｃＤＮＡに、ハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む。「ストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７
５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２
０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃で一晩のインキュ
ベーション、続いて０．１×ＳＳＣ中で約６５℃にてフィルターを洗浄すること
をいう。

【００２９】 また、中程度に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件でＴＲ
１２ポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子も意図される。ハイブリダ
イゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は、主として、ホ
ルムアミド濃度（より低い百分率のホルムアミドが、低下したストリンジェンシ
ーを生じる）；塩条件、または温度の操作を通じて、達成される。例えば、中程
度に高いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ Ｎ
ａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．
５％ ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ精子ブロッキングＤ
ＮＡを含む溶液中、３７℃で一晩のインキュベーション；次いで１×ＳＳＰＥ、
０．１％ ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに、さらにより低いスト
リンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション
後に行われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行われ得る。

【００３０】 上記の条件における変化が、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラ
ウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の、含有および／
または置換によって達成され得ることに留意のこと。代表的なブロッキング試薬
としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、お
よび市販の特許処方物が挙げられる。特定のブロッキング試薬の含有は、適合性
の問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし得る。

【００３１】 もちろん、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡの任意の３’末
端ポリＡ＋領域（ｔｒａｃｔ））のみに、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的
ストレッチにのみに、ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオ
チド」の定義に包含されない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ
（Ａ）ストレッチまたはその相補体を含む任意の核酸分子（例えば、プライマー
としてオリゴｄＴを用いて生成される、事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）
にハイブリダイズするからである。

【００３２】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキ
シリボヌクレオチドから構成され得、これは、非改変ＲＮＡもしくは非改変ＤＮ
Ａまたは改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る。例えば、ＴＲ１２ポリヌク
レオチドは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の
混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域お
よび二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖（またはより代表的には、二本鎖
、もしくは一本鎖領域および二本鎖領域の混合物）であり得るＤＮＡおよびＲＮ
Ａを含むハイブリッド分子、から構成され得る。さらに、ＴＲ１２ポリヌクレオ
チドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む、三本
鎖領域から構成され得る。ＴＲ１２ポリヌクレオチドはまた、安定性または他の
理由のために改変された、１つ以上の改変された塩基またはＤＮＡ骨格もしくは
ＲＮＡ骨格を含み得る。「改変された」塩基としては、例えば、トリチル化され
た塩基、およびイノシンのような通常でない塩基が挙げられる。種々の改変が、
ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ得；したがって、「ポリヌクレオチド」は、
化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態を含む。

【００３３】 ＴＲ１２ポリペプチドは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合（すな
わち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ））によって互いに連結した、
アミノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする２０個のアミノ酸以外のア
ミノ酸を含み得る。ＴＲ１２ポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然
のプロセス、または当該技術分野で周知の化学的改変技術のいずれかによって、
改変され得る。このような改変は、基本テキスト、およびより詳細な研究論文、
ならびに多くの研究文献に十分記載される。改変は、そのペプチド骨格、そのア
ミノ酸側鎖、およびそのアミノ末端またはそのカルボキシル末端を含む、ＴＲ１
２ポリペプチドのどこにでも生じ得る。同じ型の改変が、所定のＴＲ１２ポリペ
プチド中のいくつかの部位で、同じ程度または種々の程度で存在し得ることが理
解される。また、所定のＴＲ１２ポリペプチドは、多くの型の改変を含み得る。
ＴＲ１２ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として、分枝状であり得、
そしてこのＴＲ１２ポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まずに、環状であり
得る。環状、分枝状および分枝した環状の、ＴＲ１２ポリペプチドは、天然の翻
訳後プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。改変とし
ては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有
結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合
、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐ
ｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合
形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメート
の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成
、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（ｐｅ
ｇｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラ
セミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮ
Ａ媒介付加（例えば、アルギニル化）、およびユビキチン化が挙げられる。（例
えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．、Ｆｒ
ｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳ
ＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ
ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍ
ｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ
ら，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８−６２（１９９２）を参照
のこと）。

【００３４】 本発明のＴＲ１２ポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー（すなわち、ダ
イマ−、トリマー、テトラマーおよびより多くのマルチマー）であり得る。従っ
て、本発明は、本発明のＴＲ１２ポリペプチドのモノマーおよびマルチマー、そ
れらの調製、ならびにそれらを含む組成物（好ましくは、薬学的組成物）に関す
る。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、モノマー、ダイマ−、
トリマーまたはテトラマーである。さらなる実施形態において、本発明のマルチ
マーは、少なくともダイマ−、少なくともトリマー、または少なくともテトラマ
ーである。

【００３５】 本発明により包含されるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る
。本明細書中で使用される場合、用語「ホモマー」は、本発明のＴＲ１２ポリペ
プチド（本明細書中に記載されるような、ＴＲ１２フラグメント、改変体、スプ
ライス改変体、および融合タンパク質を含む）のみを含む、マルチマーをいう。
これらのホモマーは、同一のアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有する、
ＴＲ１２ポリペプチドを含み得る。特定の実施形態において、本発明のホモマー
は、同一のアミノ酸配列を有するＴＲ１２ポリペプチドのみを含む、マルチマー
である。別の特定の実施形態において、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配
列を有するＴＲ１２ポリペプチドのみを含む、マルチマーである。特定の実施形
態において、本発明のマルチマーは、ホモダイマ−（例えば、同一のアミノ酸配
列または異なるアミノ酸配列を有する、ＴＲ１２ポリペプチドを含む）あるいは
ホモトリマー（例えば、同一のアミノ酸配列および／または異なるアミノ酸配列
を有する、ＴＲ１２ポリペプチドを含む）。さらなる実施形態において、本発明
のホモメリックマルチマーは、少なくともホモダイマ−、少なくともホモトリマ
ー、または少なくともホモテトラマーである。

【００３６】 本明細書中で使用される場合、用語へテロマーは、本発明のＴＲ１２ポリペプ
チドに加えて、１つ以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質のポ
リペプチド）を含む、マルチマーをいう。特定の実施形態において、本発明のマ
ルチマーは、ヘテロダイマ−、ヘテロトリマー、またはヘテロテトラマーである
。さらなる実施形態において、本発明のヘテロメリックマルチマーは、少なくと
もヘテロダイマ−、少なくともヘテロトリマー、または少なくともヘテロテトラ
マーである。

【００３７】 本発明のマルチマーは、疎水性結合、親水性結合、イオン性結合および／また
は共有結合の結果であり得、そして／または例えば、リポソーム形成によって間
接的に連結され得る。従って、１つの実施形態において、本発明のマルチマー（
例えば、ホモダイマーまたはホモトリマー）は、本発明のポリペプチドが溶液中
で互いに接触する場合に形成される。別の実施形態において、本発明のヘテロマ
ルチマー（例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマー）は、本発明のポリ
ペプチドが本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質中の異
種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と溶液中で接触する場合に形成される
。他の実施形態において、本発明のマルチマーは、本発明のＴＲ１２ポリペプチ
ドとの共有結合および／または本発明のＴＲ１２ポリペプチド間での共有結合に
よって形成し得る。このような共有結合は、（例えば、配列番号２中に示された
、またはクローンＨＭＵＡＮ４５によってコードされるポリペプチド中に含まれ
た）ポリペプチド配列中に含まれる１つ以上のアミノ酸残基を含み得る。一例に
おいて、この共有結合は、ネイティブな（すなわち、天然に存在する）ポリペプ
チドにおいて相互作用するポリペプチド配列中に位置するシステイン残基の間で
の架橋である。別の例において、この共有結合は、化学的操作または組換え的操
作の結果である。あるいは、このような共有結合は、ＴＲ１２融合タンパク質中
の異種ポリペプチド配列に含まれる１つ以上のアミノ残基を含み得る。一例にお
いて、共有結合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列の間に存在する
（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例において
、この共有結合は、（本明細書中に記載される）本発明のＴＲ１２−Ｆｃ融合タ
ンパク質に含まれる異種配列の間に存在する。別の特定の例において、本発明の
融合タンパク質の共有結合は、例えば、オステオプロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐ
ｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）のような共有結合したマルチマーを形成し得る別のＴＮＦ
Ｒファミリーメンバー由来の異種ポリペプチド配列の間にある（例えば、国際公
開番号：ＷＯ９８／４９３０５を参照のこと、この内容は、本明細書中にその全
体が参考として援用される）。

【００３８】 本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を用いて作製され得る。例
えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分
野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋
され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第
５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のマルチマーは、当該分
野で公知の技術を用いて作製されて、そのマルチマーに含まれることが所望され
るポリペプチドの配列内に存在するシステイン残基間の１以上の分子間架橋を形
成し得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第
５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプチドは、その
ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付加によっ
て慣用的に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、１以上のこれらの改変
されたポリペプチドを含むマルチマーを作製するために適用され得る（例えば、
本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５
号を参照のこと）。さらに、当該分野で公知の技術が、本発明のマルチマーに含
まれることが所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを作製するために適
用され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許
第５，４７８，９２５号を参照のこと）。

【００３９】 あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて
作製され得る。１つの実施形態においては、本発明のマルチマーに含まれるポリ
ペプチドは、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の、融合タン
パク質技術を用いて組換え的に産生される（例えば、本明細書中にその全体が参
考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の
実施形態においては、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプ
チドをコードする配列に連結し、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端へと、逆
方向でポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配
列を欠く）に連結することによって作製される（例えば、本明細書中にその全体
が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別
の実施形態において、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組
換え技術は、膜貫通ドメイン（または疎水性ペプチドもしくはシグナルペプチド
）を含み、そして膜再構成技術によってリポソームに取り込まれ得る、本発明の
組換えポリペプチドを作製するのに適用される（例えば、本明細書中にその全体
が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。

【００４０】 「配列番号１」は、ＴＲ１２ポリヌクレオチド配列をいい、一方、「配列番号
２」は、ＴＲ１２ポリペプチド配列をいう。

【００４１】 「生物学的活性を有する」ＴＲ１２ポリペプチドとは、特定の生物学的アッセ
イで測定される場合、用量依存性を伴なってもまたは伴なわなくても、ＴＲ１２
ポリペプチド（成熟形態を含む）の活性と類似であるが、必ずしも同一ではない
活性を示すポリペプチドをいう。用量依存性が存在する場合において、その用量
依存性は、このＴＲ１２ポリペプチドの用量依存性と同一である必要はないが、
むしろこのＴＲ１２ポリペプチドと比較した場合に、所定の活性における用量依
存性に実質的に類似する（すなわち、候補ポリペプチドは、このＴＲ１２ポリペ
プチドと比較して、より大きな活性を示すか、または約１／２５以上、そして、
好ましくは約１／１０以上の活性、そして最も好ましくは約１／３以上の活性を
示す）。

【００４２】 （ＴＲ１２ポリヌクレオチドおよびポリペプチド） クローンＨＭＵＡＮ４５は、骨髄性前駆細胞株ｃＤＮＡライブラリーから単離
された。このクローンは、配列番号２として同定されたポリペプチドをコードす
るコード領域全体を含む。この寄託プラスミドは、全体で２７０１ヌクレオチド
を有するｃＤＮＡを含み、これは、４３０アミノ酸残基の推定オープンリーディ
ングフレームをコードする（図１Ａ〜Ｃを参照のこと）。このオープンリーディ
ングフレームは、ヌクレオチド２４４位に位置するＮ末端メチオニンから開始し
、そしてヌクレオチド１５３３位の終止コドンで終わる。このＴＲ１２タンパク
質の推定分子量は、４６ｋＤａである。

【００４３】 ＴＲ１２は、末梢血リンパ球、脾臓組織、大腸組織、胸腺組織、精巣組織、お
よび骨格筋組織に発現され、パターンは、免疫系、止血、新脈管形成、腫瘍転移
、細胞性移動、および／または神経発生の調節へのＴＲ１２の関与に一致する。

【００４４】 ＢＬＡＳＴ分析を使用して、配列番号２は、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦ
Ｒ）ファミリーのメンバーと相同的であることが見出された。特に、配列番号２
は、ＯＸ４０細胞表面抗原（ｇｉ／９１３４０６）に対するヒトｍＲＮＡの翻訳
産物に相同性を示すドメインを含み（図２）（配列番号３）、以下の保存された
ドメインを含む：（ａ）アミノ酸およそ１６５〜１８１に位置する推定膜貫通ド
メイン；（ｂ）アミノ酸およそ２６〜１６４に位置する推定細胞外ドメイン；（
ｃ）アミノ酸およそ１８２〜４３０に位置する推定細胞質のテール（ｔａｉｌ）
ドメイン。ＴＲ１２のこれらのポリペプチドフラグメントは、本発明において特
に意図される。ＯＸ４０細胞表面抗原（ｇｉ／９１３４０６）がＯＸ４０Ｌ／Ｇ
Ｐ３４サイトカインに対するレセプターとして重要であると考えられるので、Ｏ
Ｘ４０細胞表面抗原（ｇｉ／９１３４０６）とＴＲ１２との間の相同性は、ＴＲ
１２もまた細胞増殖および細胞分化のような細胞性プロセスの調節に関与するサ
イトカインおよびサイトカイン様分子に対するレセプターとして機能し得ること
を示す。

【００４５】 さらに、コードされるポリペプチドは、アミノ酸およそ１〜２５に位置する推
定リーダー配列を有する（図１Ａ〜Ｃを参照のこと）。図１Ａ〜Ｃにもまた示さ
れるが、推定成熟タンパク質は、アミノ酸およそ２６〜４３０を含み、一方、Ｔ
Ｒ１２の推定細胞外ドメインは、アミノ酸およそ２６〜１６４を含む。ＴＲ１２
のこれらのポリペプチドフラグメント、およびこれらのフラグメントをコードす
るポリヌクレオチド配列（例えば、図１Ａ〜Ｃ（配列番号１）に開示される）は
、本発明において特に意図される。

【００４６】 配列番号１として同定されたＴＲ１２ヌクレオチド配列は、寄託されたプラス
ミドから得られた部分的に相同的な（「重複する」）配列よりアセンブリされた
。この重複配列は、高い重複性の一本の連続する配列へとアセンブリされ、配列
番号１として同定された最終配列を生じる。

【００４７】 従って、配列番号１および翻訳された配列番号２は、十分に正確であり、そし
てさもなければ当該分野において周知の種々の使用およびさらに以下に記載され
る種々の使用に適切である。例えば、配列番号１は、配列番号１に含まれる核酸
配列または寄託されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡを検出する核酸ハイブリダ
イゼーションプローブの設計を含むがこれらに限定されない、使用を有する。こ
れらのプローブはまた、生物学的サンプル中の核酸分子にハイブリダイズし、そ
の結果、本発明の種々の法医学的な方法および診断的な方法を可能にする。同様
に、配列番号２より同定されたポリペプチドは、ＴＲ１２に特異的に結合する抗
体を作製するのに用いられ得る。

【００４８】 それにもかかわらず、配列決定反応によって作製されるＤＮＡ配列は、配列決
定誤差を含み得る。これらの誤差は、誤認ヌクレオチドとして、または作製され
たＤＮＡ配列中のヌクレオチドの挿入もしくは欠失として存在する。誤って挿入
されたかまたは欠失されたヌクレオチドは、推定アミノ酸配列の読み取り枠にお
いてフレームシフトを引き起こす。これらの場合、たとえ作製されたＤＮＡ配列
が実際のＤＮＡ配列と９９．９％を超えて同一（例えば、１０００を超える塩基
のオープンリーディングフレームにおける１塩基の挿入または欠失）であり得る
としても、この推定アミノ酸配列は実際のアミノ酸配列とは異なる。

【００４９】 従って、そのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列において精度が必要とされ
る適用のために、本発明は、配列番号１として同定された作製されたヌクレオチ
ド配列および配列番号２として同定されたその推定翻訳アミノ酸配列のみならず
、ＡＴＣＣに寄託されたＴＲ１２のヒトｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡの
サンプルもまた提供する。この寄託されたＴＲ１２プラスミドのヌクレオチド配
列は、公知の方法に従って、この寄託プラスミドを配列決定することによって容
易に決定され得る。次いで、推定ＴＲ１２アミノ酸配列は、この寄託物から確認
され得る。さらに、寄託されたプラスミドによってコードされるタンパク質のア
ミノ酸配列もまた、ペプチド配列決定によってか、または寄託されたヒトＴＲ１
２のｃＤＮＡを含有する適切な宿主細胞においてタンパク質を発現させ、このタ
ンパク質を収集し、そしてその配列を決定することによって、直接的に決定され
得る。

【００５０】 本発明はまた、配列番号１、配列番号２または寄託されたプラスミドに対応す
る、ＴＲ１２遺伝子に関する。ＴＲ１２遺伝子は、本明細書中に開示された配列
情報を使用して、公知の方法に従って単離され得る。そのような方法は、開示さ
れた配列からプローブまたはプライマーを調製すること、およびゲノム物質の適
切な供給源からＴＲ１２遺伝子を同定または増幅することを含むが、それらに限
定されない。

【００５１】 ＴＲ１２の種ホモログもまた、本発明において提供される。種ホモログは、本
明細書中に提供される配列から適切なプローブまたはプライマーを作製すること
、および所望のホモログの適切な核酸供給源をスクリーニングすることによって
、単離および同定され得る。

【００５２】 ＴＲ１２ポリペプチドは、任意の適切な様式で調製され得る。このようなポリ
ペプチドとしては、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え的に産生さ
れたポリペプチド、合成的に産生されたポリペプチド、またはこれらの方法の組
み合わせによって産生されたポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチ
ドを調製するための手段は、当該分野において周知である。

【００５３】 本発明のＴＲ１２ポリペプチドは、分泌タンパク質の形態（成熟形態を含む）
であってもよいし、より大きなタンパク質（例えば、融合タンパク質）の一部で
あってもよい（以下を参照のこと）。分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、
精製において補助する配列（例えば、複数のヒスチジン残基）、または組換え体
産生の間の安定性のためのさらなる配列を含む、さらなるアミノ酸配列を含むこ
とは、しばしば有利である。

【００５４】 示される通り、本発明はまた、本発明のＴＲ１２ポリペプチドの成熟形態をコ
ードするポリヌクレオチドおよびそれによりコードされるポリペプチド配列を提
供する。シグナル仮説に従うと、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、
一旦、粗面小胞体を横切る成長中のタンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タン
パク質から切断される、シグナル配列または分泌リーダー配列を有する。ほとん
どの哺乳動物細胞および昆虫細胞でさえも、同じ特異性を伴う分泌タンパク質を
切断する。しかし、いくつかの場合、分泌タンパク質の切断は、完全には、均一
ではなく、このことは、このタンパク質の２以上の成熟種を生じる。さらに、分
泌タンパク質の切断特異性は、最終的には、完全タンパク質の一次構造によって
決定される（すなわち、これは、このポリペプチドのアミノ酸配列に固有である
）ことが、長い間公知である。

【００５５】 従って、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号２０３３６５として同定され、そして図
１Ａ〜Ｃ（配列番号２）に示される、プラスミドに含まれるｃＤＮＡによってコ
ードされるアミノ酸配列を有する、成熟ＴＲ１２ポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列を提供する。ＡＴＣＣ受託番号２０３３６５として同定されたプラ
スミドに含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ
１２ポリペプチドは、寄託されたプラスミド中のヒトＤＮＡ配列によってコード
される完全オープンリーディングフレームの哺乳動物細胞（例えば、以下に記載
されるＣＯＳ細胞）における発現によって産生されたＴＲ１２ポリペプチドの成
熟形態を意味する。以下に記載されるように、ＡＴＣＣ受託番号２０３３６５に
含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＲ１２ポリ
ペプチドは、コンピューター分析に基づく推定切断部位の精度に依存して、配列
番号２（アミノ酸およそ２６〜およそ４３０）に示される推定成熟ＴＲ１２タン
パク質と異なり得るし、異ならないかもしれない。

【００５６】 タンパク質が、分泌リーダーおよびそのリーダー配列に対する切断点を有する
か否かを予測するための方法が、利用可能である。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈ（Ｖ
ｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３：２７１〜２８６（１９８５））の方法およびｖｏｎ Ｈ
ｅｉｎｊｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３〜４６９０
（１９８６））の方法が、使用され得る。これらの方法の各々についての、公知
の哺乳動物分泌タンパク質の切断点を予測することの精度は、７５〜８０％の範
囲にある（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、前出）。しかし、これらの２つの方法は、所
定のタンパク質について、同じ推定切断点（単数または複数）を常に生じるとは
限らない。

【００５７】 この場合において、本発明の完全なＴＲ１２ポリペプチドの推定アミノ酸配列
は、コンピュータープログラム（「ＰＳＯＲＴ」）によって分析された。Ｋ．Ｎ
ａｋａｉおよびＭ．Ｋａｎｅｈｉｓａ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：８９７〜９１
１（１９９２）を参照のこと。ＰＳＯＲＴは、アミノ酸配列に基づいてタンパク
質の細胞での位置を予測するための専門の系である。この位置決定のコンピュー
ター予測の一部として、ＭｃＧｅｏｃｈの方法およびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの方
法が援用される。このＰＳＯＲＴプログラムによる分析は、配列番号２中のアミ
ノ酸２５と２６との間に切断部位を予想した。その後、その完全アミノ酸配列は
、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの（−１，−３）則の単純な形態を適用して、視覚的な
検査によってさらに分析された。ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、前出。従って、ＴＲ１
２タンパク質に関するリーダー配列は、配列番号２中のアミノ酸残基およそ１〜
２５からなることが予想され、一方、成熟ＴＲ１２タンパク質は、配列番号２中
のおよそ残基２６〜４３０からなることが予想される。

【００５８】 当業者が認識するように、配列決定誤差の可能性および異なる公知のタンパク
質におけるリーダーに対する切断部位の多様性のために、寄託されたｃＤＮＡに
よってコードされる予想されるＴＲ１２ポリペプチドは、およそ４３０アミノ酸
を含むが、４２０〜４４０アミノ酸の範囲内のいずれかであり得；そしてこのタ
ンパク質の推定リーダー配列は、およそ２５アミノ酸であるが、およそ１５〜３
０アミノ酸の範囲内のいずれかであり得る。本明細書中に記載されるドメインは
、コンピューター分析によって予想されており、従って種々の機能的なドメイン
を同定するために用いられる分析基準に依存して、例えば、ＴＲ１２の細胞外ド
メイン、細胞内ドメイン、および膜貫通ドメインの正確な「所在位置（ａｄｄｒ
ｅｓｓ）」は、わずかに異なり得るということが、さらに認識され得る。例えば
、図１Ａ〜Ｃ（配列番号２）のＴＲ１２細胞外ドメインの正確な位置は、このド
メインを規定するのに用いられる基準に依存して、わずかに変動し得る（例えば
、その所在位置は、およそ１〜およそ２０残基、よりおそらくはおよそ１〜およ
そ５残基だけ「変動（ｓｈｉｆｔ）」し得る）。いずれにしても、さらに以下に
記載されるように、本発明は、完全なＴＲ１２のＮ末端および／またはＣ末端よ
り種々の残基が欠失されたポリペプチド（ＴＲ１２ポリペプチドの細胞外ドメイ
ンの可溶性形態を構成する、本明細書中に記載される細胞外ドメインのＮ末端よ
り１つ以上のアミノ酸を欠失するポリペプチドを含む）をさらに提供する。

【００５９】 ＴＲ１２ポリぺプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好
ましくは実質的に精製される。ＴＲ１２ポリぺプチド（分泌されるポリぺプチド
を含む）の組換え的に産生されたバージョンは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏ
ｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１〜４０（１９８８）に記載される１工程の方法（ｏｎ
ｅ−ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ）によって、実質的に精製され得る。ＴＲ１２ポリ
ぺプチドはまた、当該分野において周知の方法においてＴＲ１２タンパク質に対
して惹起される本発明の抗体を用いて、天然または組換えの供給源から精製され
得る。

【００６０】 本発明は、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメントにさら
に関する。例えば、寄託されたｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ受託番号２０３３６５）のヌ
クレオチド配列、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド配列を
コードするヌクレオチド配列、図１Ａ〜Ｃ（配列番号２）に示されるポリペプチ
ド配列をコードするヌクレオチド配列、図１Ａ〜Ｃ（配列番号１）に示されるヌ
クレオチド配列、またはその相補鎖を有する、単離された核酸分子のフラグメン
トは、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好ましくは、少なくとも約２０ｎｔ、
さらにより好ましくは、少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおより好ましくは、少
なくとも約４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３２５、３
５０、３７５、４００、４５０、５００、５５０、または６００ｎｔの長さの意
図されるフラグメントである。これらのフラグメントは、本明細書中に記載され
るような診断的なプローブおよびプライマーを含むが、それらに限定されない多
数の使用を有する。もちろん、５０１〜１５００ｎｔの長さのフラグメントのよ
うなより長いフラグメントもまた、本発明に従って有用であり得、寄託されたｃ
ＤＮＡ（ＡＴＣＣ受託番号２０３３６５）のヌクレオチド配列または図１Ａ〜Ｃ
（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列の全てでなくともほとんどに
対応するフラグメントも同様である。例えば、少なくとも２０ｎｔの長さのフラ
グメントは、例えば、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１Ａ〜Ｃ
（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列由来の、２０以上の連続する
塩基を含むフラグメントが意図される。この文脈において「およそ（約）」は、
特に記載されたサイズ、およびこれより数個（５、４、３、２、または１）のヌ
クレオチドだけ大きいかまたは小さなサイズを含む。好ましい実施形態において
、上記の本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、図１Ａ〜Ｃ（配列番号１）
に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１４０〜１６０、３００〜３２０、
４７０〜４９０および／または５４５〜５７０を含むか、またはこれらのヌクレ
オチドからなる。

【００６１】 さらに、ＴＲ１２ポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例えば、
配列番号１のもしくはその相補鎖、または寄託されたプラスミドに含まれるｃＤ
ＮＡのうちの以下の配列を含むかあるいはそれらからなる、フラグメントが挙げ
られる：ヌクレオチド位置およそ１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１
４０〜１６０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３００〜３
２０、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、４
７０〜４９０、５０１〜５５０、５４５〜５７０、５５１〜６００、６５１〜７
００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００〜８５０、８５１〜９００、９
０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、
１１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１
３００、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４
５１〜１５００、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５
０、１６５１〜１７００、１７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、１８０１
〜１８５０、１８５１〜１９００、１９０１〜１９５０、１９５１〜２０００、
２００１〜２０５０、２０５１〜２１００、２１０１〜２１５０、２１５１〜２
２００、２２０１〜２２５０、２２５１〜２３００、２３０１〜２３５０、２３
５１〜２４００、２４０１〜２４５０、２４５１〜２５００、２５０１〜２５５
０、２５５１〜２６００、２６０１〜２６５０、２６５１から末端。この文脈に
おいて、「およそ（約）」は、特に記載された範囲、およびいずれかの末端もし
くは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレ
オチドだけ大きいかまたは小さな範囲を含む。好ましくは、これらのフラグメン
トは、ＴＲ１２機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するポリペプチドをコ
ードする。さらに好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、本明細書中で議論
されるプローブまたはプライマーとして使用され得る。これらのポリヌクレオチ
ドフラグメントまたはその相補鎖のうちの１、２、３、４、５以上にハイブリダ
イズするポリヌクレオチドもまた、本発明によって含まれる。

【００６２】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、配列番
号１もしくはそれらの相補鎖、または寄託されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡ
うちの、ヌクレオチドのおよそ２４４〜およそ３１８、およそ３１９〜およそ７
３５、およそ３８５〜およそ４５６、およそ７３６〜およそ７８６、およそ７８
７〜およそ１５３３のヌクレオチドの配列、を含むか、またはこれらからなる。
この文脈において、「およそ（約）」は、特に記載された範囲、およびいずれか
の末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１
）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな範囲を含む。これらのポリヌクレオ
チドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に含まれる。

【００６３】 好ましくは、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、ＴＲ１２の機能的活
性を示すポリペプチドをコードする。ＴＲ１２の「機能的活性」を示すポリペプ
チドは、全長（完全）ＴＲ１２タンパク質と関連した１つ以上の公知の機能的活
性を示し得るポリペプチドを意味する。このような機能的活性としては、生物学
的活性、抗原性［抗ＴＲ１２抗体に結合する（または結合に関して、ＴＲ１２ポ
リペプチドと競合する）能力］、免疫原性（ＴＲ１２ポリペプチドに結合する抗
体を生成する能力）、本発明のＴＲ１２ポリペプチドとマルチマーを形成する能
力、およびＴＲ１２ポリペプチドについてのレセプターまたはリガンドに結合す
る能力が挙げられるが、これらに限定されない。

【００６４】 ＴＲ１２ポリペプチド、ならびにそれらのフラグメント、改変体、誘導体、お
よびアナログの機能的活性は、種々の方法によってアッセイされ得る。

【００６５】 例えば、抗ＴＲ１２抗体に結合する能力または抗ＴＲ１２抗体への結合につい
て全長ＴＲ１２ポリペプチドと競合する能力についてアッセイする１つの実施形
態においては、当該分野で公知の種々の免疫アッセイが、用いられ得る。このよ
うなアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）
、「サンドイッチ」免疫アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散
沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、コロイド金
標識、酵素標識または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降
反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結
合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動ア
ッセイなどのような技術を用いる、競合アッセイ系および非競合アッセイ系が挙
げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、抗体結合が、一
次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態において、こ
の一次抗体が、この一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することによ
って検出される。さらなる実施形態において、この二次抗体が標識される。多く
の手段が、免疫アッセイにおける結合の検出について当該分野で公知であり、そ
して本発明の範囲内である。

【００６６】 別の実施形態において、ＴＲ１２リガンドが同定される場合、または本発明の
ポリペプチドフラグメント、改変体、もしくは誘導体がマルチマー化する能力が
評価される場合、結合が、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、
タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、およびアフィニティーブロッテ
ィングのような当該分野で周知の手段によって、アッセイされ得る。一般には、
Ｐｈｉｚｉｃｋｙ、Ｅ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４〜１２３
（１９９５）を参照のこと。別の実施形態において、ＴＲ１２のその基質への結
合の生理学的相関（シグナル伝達）がアッセイされ得る。

【００６７】 さらに、本明細書中に記載されるアッセイ（実施例を参照のこと）および当該
分野で公知の他のアッセイは、ＴＲ１２ポリペプチドならびにそれらのフラグメ
ント、改変体、誘導体、およびアナログが、ＴＲ１２に関連した生物学的活性を
惹起する能力を測定する（インビトロまたはインビボのいずれかで）ために、慣
用的に適用され得る。他の方法は、当業者に公知であり、そして本発明の範囲内
である。

【００６８】 本発明の好ましいポリヌクレオチドフラグメントは、以下の群より選択される
メンバーをコードするポリヌクレオチドを含む：ＴＲ１２細胞外ドメイン（図１
Ａ〜Ｃおよび配列番号２中の１〜およそ１６４のアミノ酸残基）を含むかまたは
このドメインからなるポリペプチド；成熟ＴＲ１２細胞外ドメイン（図１Ａ〜Ｃ
および配列番号２中のおよそ２６〜およそ１６４のアミノ酸残基）を含むかまた
はこのドメインからなるポリペプチド；ＴＲ１２システインリッチドメイン（図
１Ａ〜Ｃおよび配列番号２中のおよそ４８〜およそ７１のアミノ酸残基）を含む
かまたはこのドメインからなるポリペプチド；ＴＲ１２膜貫通ドメイン（図１Ａ
〜Ｃおよび配列番号２中のおよそ１６５〜およそ１８１のアミノ酸残基）を含む
かまたはこのドメインからなるポリペプチド；およびＴＲ１２細胞内ドメイン（
図１Ａ〜Ｃおよび配列番号２中のおよそ１８２〜およそ４３０のアミノ酸残基）
を含むかまたはこのドメインからなるポリペプチド。これらのドメインの位置付
けがコンピューター分析によって予想されたので、当業者は、各々のドメインを
規定するのに用いられた基準に依存して、これらのドメインを構成するアミノ酸
残基がわずかに（例えば、およそ１〜１５アミノ酸残基だけ）変動し得ることを
認識する。これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた
、本発明によって含まれる。

【００６９】 本発明の好ましいポリヌクレオチドフラグメントは、アミノ末端メチオニン（
このメチオニンが天然に切断されることが公知であり、そしてこのような配列が
ＴＲ１２発現ベクターの遺伝的な操作に有用であり得るので）をコードするヌク
レオチド（配列番号１のヌクレオチド２４４〜２４６）を欠く全長ＴＲ１２ポリ
ペプチドをコードする。このようなポリヌクレオチドによってコードされるポリ
ペプチドもまた、本発明によって意図される。

【００７０】 本発明の好ましいポリヌクレオチドフラグメントは、ＴＲ１２タンパク質のエ
ピトープ保有部位をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。特に、本発明の
このようなポリヌクレオチドフラグメントは、以下をコードするポリヌクレオチ
ドを含むが、それらに限定されない：図１Ａ〜Ｃ（配列番号２）のアミノ酸残基
３２〜４７、５０〜５５、６１〜７３、８４〜９７、１１７〜１３３、１３８〜
１６０、１８５〜１９２、１９５〜２１０、２１２〜２２４、２３１〜２４１、
２４３〜２５４、２５６〜２７０、２７５〜２８０、２９０〜３０４、３２４〜
３４２、３５４〜３６３、３６５〜３７１、３７３〜３９３、３９７〜４１９、
および４２３〜４２８を含むポリペプチド。本発明者は、上記のポリペプチドフ
ラグメントがＴＲ１２タンパク質の抗原性領域であることを決定した。この文脈
において、「およそ（約）」は、特に記載された範囲、およびいずれかの末端も
しくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌク
レオチドだけ大きいかまたは小さな範囲を含む。ＴＲ１２タンパク質の他のこの
ようなエピトープ保有部位を決定するための方法は、以下に詳細に記載される。
これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
よって意図される。

【００７１】 図１Ａ〜Ｃ中に開示されるＴＲ１２の細胞外システインリッチドメインがＴＲ
１２とそのリガンドとの間の相互作用に重要であると、考えられる。従って、本
発明の特定の実施形態は、配列番号２の４８〜７１アミノ酸残基のアミノ酸配列
を含むか、またはこのアミノ酸配列からなる、ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプ
チドもまた、本発明によって意図される。

【００７２】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＲ１２の機能的
な特質を有するポリペプチドをコードする。この点において、本発明の好ましい
実施形態は、ＴＲ１２のα−へリックスおよびα−へリックス形成領域（「α−
領域」）、β−シートおよびβ−シート形成領域（「β−領域」）、ターンおよ
びターン形成領域（「ターン−領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイ
ル−領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可
撓性領域、表面形成領域、および高い抗原性指標領域を含むか、あるいはこれら
の領域からなる、ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含
む（図３および／または表Ｉを参照のこと）。これらのポリヌクレオチドによっ
てコードされるポリペプチドもまた、本発明によって含まれる。

【００７３】 これらの点において特定の好ましい領域は、図３に示されるが、この領域は、
表Ｉに示されるように、図３に提示されるデータの表の表示を用いることによっ
て提示および同定され得る。図３を作製するために使用されたＤＮＡ^*ＳＴＡＲ
コンピューターアルゴリズム（もともとのデフォルトパラメーターでセットされ
る）は、表の形式において図３でデータを提示するために使用された（表Ｉを参
照のこと）。図３におけるデータの表の形式は、好ましい領域の特異的な境界を
容易に決定するために使用され得る。図３および／または表Ｉに示される上記の
好ましい領域は、図１に示されるアミノ酸配列の分析によって同定される上記の
タイプの領域を含むが、これに限定されない。図３および表Ｉに示される、この
ような好ましい領域としては、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα−領域、β−
領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα−領域、β
−領域、およびターン領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域および
Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓの疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのα−両親媒性領域お
よびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可撓性領域、高い抗原
性指標のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの領域、ならびにＥｍｉｎｉの表面形成領域
が挙げられる。

【００７４】 図３および／または表Ｉに示されるＴＲ１２の構造的または機能的特質を表す
データは、デフォルトパラメーターにセットされたＤＮＡ^*ＳＴＡＲの種々のモ
ジュールおよびアルゴリズムを用いて作製された。好ましい実施形態において、
表Ｉの欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、およびＸＩＶに提示されるデータは、抗原
性について高い程度の可能性を示すＴＲ１２の領域を決定するために使用され得
る。高い抗原性の領域は、抗原認識が免疫応答の開始のプロセスにおいて生じ得
る環境中のポリペプチドの表面に曝露されるようなポリペプチドの領域を提示す
る値を選択することによって、欄ＶＩＩＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、およびＸＶにお
いて提示されるデータから決定される。

【００７５】

【表１】 別の局面において、本発明は、上記の本発明の核酸分子（例えば、ＡＴＣＣ受
託番号２０３３６５として寄託されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡ、配列番号
１のコード配列、もしくはその相補鎖、または本明細書中に記載されるポリヌク
レオチドフラグメントの１つ）中のポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズす
るポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。ポリヌクレオチド
の「部分（一部）」にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレ
オチドの、少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、およびより好ましくは、少
なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは、少なくとも約３０ｎｔ、およびさら
により好ましくは、約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（
ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意図する。これらのポリヌクレオチドは、上
記および以下により詳細に議論されるような診断用のプローブおよびプライマー
を含むが、これらに限定されない使用を有する。この文脈において、「およそ（
約）」とは、特に記載されたサイズまたは範囲、およびいずれかの末端もしくは
両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のアミノ酸だ
け大きいかまたは小さなサイズまたは範囲を含む。例えば、「少なくとも２０ヌ
クレオチド長」のポリヌクレオチドの部分は、参照ポリヌクレオチドのヌクレオ
チド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡ、または配列番号１に示されるようなヌ
クレオチド配列）由来の２０個以上連続するヌクレオチドを意図する。

【００７６】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１０００００ｋｂ、
５００００ｋｂ、１００００ｋｂ、１０００ｋｂ、５００ｋｂ、４００ｋｂ、３
５０ｋｂ、３００ｋｂ、２５０ｋｂ、２００ｋｂ、１７５ｋｂ、１５０ｋｂ、１
２５ｋｂ、１００ｋｂ、７５ｋｂ、５０ｋｂ、４０ｋｂ、３０ｋｂ、２５ｋｂ、
２０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、７．５ｋｂ、または５ｋｂ未満の長さである。

【００７７】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＲ１２コード配
列の少なくとも１５、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、も
しくは少なくとも２５０、少なくとも５００、または少なくとも１０００個連続
するヌクレオチドを含むが、図１Ａ〜Ｃ（配列番号１）に示される５’コードヌ
クレオチドまたは３’コードヌクレオチドに隣接するゲノムＤＮＡのうちの１０
００ｋｂ、５００ｋｂ、２５０ｋｂ、２００ｋｂ、１５０ｋｂ、１００ｋｂ、７
５ｋｂ、５０ｋｂ、３０ｋｂ、２５ｋｂ、２０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂもしく
は５ｋｂ以下からなる。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチド
は、ＴＲ１２コード配列のうちの少なくとも１５、少なくとも３０、少なくとも
５０、少なくとも１００、もしくは、少なくとも２５０、少なくとも５００、ま
たは少なくとも１０００の連続するヌクレオチドを含むが、どのＴＲ１２イント
ロンの全ても一部も含まない。別の実施形態において、ＴＲ１２コード配列を含
む核酸は、ゲノム隣接遺伝子（すなわち、ゲノムにおけるＴＲ１２に対して５’
側または３’側）のコード配列を含まない。他の実施形態では、本発明のポリヌ
クレオチドは、１０００、５００、２５０、１００、５０、２５、２０、１５、
１０、５、４、３、２、または１より多いゲノム隣接遺伝子のコード配列を含ま
ない。

【００７８】 示されるように、ＴＲ１２ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチ
ドは、以下の配列を含み得るが、それらに限定され得ない：それ自体が成熟ポリ
ペプチドのコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列、およびリーダー配列ま
たは分泌配列（例えば、プレタンパク質配列、またはプロタンパク質配列、また
はプレプロタンパク質配列）をコードするようなさらなる配列；上述のさらなる
コード配列を伴うかまたは伴わない、成熟ポリペプチドのコード配列およびさら
なる非コード配列（例えば、転写されるが翻訳されない配列であるイントロンお
よび非コード５’ 配列および３’配列（これは、転写、ｍＲＮＡプロセッシン
グ（スプライシングおよびポリアデニル化シグナル（例えば、ｍＲＮＡのリボソ
ーム結合および安定性）を含む）において役割を担う））を含むが、それらに限
定されない）；例えば、さらなる機能性を提供するさらなるアミノ酸をコードす
るさらなるコード配列。従って、例えば、このポリペプチドは、融合されたポリ
ペプチドの精製を容易にするペプチドのような、マーカー配列に融合され得る。
本発明のこの局面の特定の好ましい実施形態において、このマーカーアミノ酸配
列は、とりわけ、（例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．）中に提
供されるタグである）ヘキサヒスチジンペプチドであり、その多くは市販されて
いる。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：８２１〜８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキサヒスチジンは
、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、精製に有用な別の
ペプチドであり、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと
対応し、これはＷｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７〜７７８（１９８４）
によって記載されている。以下に議論するように、他のこのような融合タンパク
質は、そのＮ末端またはＣ末端においてＦｃドメインと融合されたＴＲ１２レセ
プターを含む。

【００７９】 本発明は、本明細書中に記載されるＴＲ１２ポリペプチドのフラグメントにさ
らに関する。本発明のタンパク質フラグメントは、以下のようなアミノ酸配列を
含むか、またはこのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む：配列番号２に含
まれるアミノ酸配列；寄託されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡによってコード
されるアミノ酸配列；または寄託されたプラスミドに含まれるヌクレオチド配列
に、（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下で）ハイブ
リダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列；あるいは図
１Ａ−Ｃ（配列番号１）に示されるアミノ酸配列もしくはその相補鎖配列。タン
パク質フラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であり得
るか、あるいはより大きなポリぺプチド（このフラグメントが、部分または領域
（最も好ましくは単一の連続した領域として）を形成する）内に含まれ得る。本
発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、以下のフラグ
メントを含む：配列番号２のアミノ酸およそ１〜２０、２１〜４０、４１〜６０
、６１〜８０、８１〜１００、１０２〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６
０、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜２２０、２２１〜２４０、２４
１〜２６０、２６１〜２８０、２８１〜３００、３０１〜３２０、３２１〜３４
０、３４１〜３６０、３６１〜３８０、３８１〜４００、および／または４０１
〜４３０。さらに、ポリペプチドフラグメントは、少なくとも約２０、３０、４
０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０
、または１５０アミノ酸の長さであり得る。この文脈において、「約（おおよそ
）」とは、特に記載された範囲またはサイズ、およびいずれかの端もしくは両方
の端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のアミノ酸だけ大き
いかまたは小さな、範囲またはサイズを含む。これらのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。

【００８０】 本発明のポリペプチドフラグメントのさらなる代表的な例としては、例えば、
以下を含むか、あるいは以下からなるフラグメントを含む：配列番号２のアミノ
酸残基およそ１〜２５、１５〜２５、２６〜５０、５１〜７５、７５〜８５、７
６〜１００、１００〜１１０、１０１〜１２４、１２５〜１６４、１６５〜１８
１、１８２〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、およ
び／または４０１〜４３０。さらに、ポリペプチドフラグメントは、少なくとも
約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、
１２０、１３０、１４０、１５０、１７５または２００アミノ酸の長さであり得
る。この文脈において、「およそ（約）」とは、特に記載された範囲またはサイ
ズ、およびいずれかの端もしくは両方の端において、これより数個（５、４、３
、２、または１）のアミノ酸だけ大きいかまたは小さな、範囲またはサイズを含
む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含ま
れる。

【００８１】 さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドフラグメントは、１つ以上
のＴＲ１２ドメインを含むか、あるいは１つ以上のＴＲ１２ドメインからなる。
本発明の好ましいポリペプチドフラグメントは、以下の群より選択されたメンバ
ーを含む：（ａ）ＴＲ１２細胞外ドメイン（図１Ａ〜Ｃおよび配列番号２のアミ
ノ酸残基およそ１〜およそ１６４を構成すると予想される）を含むかあるいはこ
のドメインよりなる、ポリペプチド；（ｂ）成熟ＴＲ１２細胞外ドメイン（図１
Ａ〜Ｃおよび配列番号２のアミノ酸残基およそ２６〜およそ１６４を構成すると
予想される）を含むかあるいはこのドメインよりなる、ポリペプチド；（ｃ）Ｔ
Ｒ１２システインリッチドメイン（図１Ａ〜Ｃおよび配列番号２のアミノ酸残基
およそ４８〜およそ７１を構成すると予想される）を含むかあるいはこのドメイ
ンよりなる、ポリペプチド；（ｄ）ＴＲ１２膜貫通ドメイン（図１Ａ〜Ｃおよび
配列番号２のアミノ酸残基およそ１６５〜およそ１８１を構成すると予想される
）を含むかあるいはこのドメインよりなる、ポリペプチド；（ｅ）ＴＲ１２細胞
内ドメイン（図１Ａ〜Ｃおよび配列番号２のアミノ酸残基およそ１８２〜およそ
４３０を構成すると予想される）を含むかあるいはこのドメインよりなる、ポリ
ペプチド；（ｆ）ＴＲ１２タンパク質の１、２、３、４、５以上のエピトープ保
有部位を含むかあるいはこのドメインよりなる、ポリペプチド；ならびに（ｇ）
ポリペプチド（ａ）〜（ｆ）の任意の組合せ。これらのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドもまた、本発明によって含まれる。

【００８２】 上述で議論される、ＴＲ１２の細胞外システインリッチドメインがＴＲ１２と
そのリガンドとの間の相互作用に重要であると、考えられる。従って、好ましい
実施形態において、本発明のポリペプチドフラグメントは、配列番号２のアミノ
酸配列４８〜７１アミノ酸残基を含むか、またはこのアミノ酸配列からなる。こ
れらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によって含ま
れる。

【００８３】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＲ１２の機能的
な特質をコードする。この点において、本発明の好ましい実施形態は、１、２、
３、４、５またはそれ以上のα−へリックスおよびα−へリックス形成領域（「
α−領域」）、β−シートおよびβ−シート形成領域（「β−領域」）、ターン
およびターン形成領域（「ターン−領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「
コイル−領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域
、可撓性領域、表面形成領域、ならびにＴＲ１２の高い抗原性指標領域を含むフ
ラグメントを含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた
、本発明に含まれる。

【００８４】 上記のように、図１および／または表Ｉに示されるＴＲ１２の構造的または機
能的特質を表すデータは、デフォルトパラメーターにセットされたＤＮＡ^*ＳＴ
ＡＲの種々のモジュールおよびアルゴリズムを用いて作成された。好ましい実施
形態において、表Ｉの欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、およびＸＩＶに提示される
データは、抗原性について高い程度の可能性を示すＴＲ１２の領域を決定するた
めに使用され得る。高い抗原性の領域は、抗原認識が免疫応答の開始のプロセス
において生じ得る、環境中のポリペプチドの表面に曝露されるようであるポリペ
プチドの領域を提示する値を選択することによって、欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩ
Ｉ、および／またはＩＶにおいて提示されるデータから決定される。

【００８５】 これらの点において特定の好ましい領域は図３に示されるが、この領域は、表
Ｉに示されるように、図３に提示されるデータの表の表示を用いることによって
提示および同定され得る。図３を生成するために使用されるＤＮＡ^*ＳＴＡＲコ
ンピューターアルゴリズム（もともとのデフォルトパラメーターでセットされる
）は、表の形式において図３でデータを提示するために使用された（表Ｉを参照
のこと）。図３におけるデータの表の形式は、好ましい領域の特定の境界を容易
に決定するために使用され得る。

【００８６】 図３、および表Ｉに示される上記の好ましい領域は、図１に示されるアミノ酸
配列の分析によって同定される上記のタイプの領域を含むが、これらに限定され
ない。図３および表Ｉにおいて示されるように、このような好ましい領域として
は、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα−領域、β−領域、ターン領域、および
コイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα−領域、β−領域、およびコイル領域
、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂ
ｅｒｇのα−およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可撓性
領域、Ｅｍｉｎｉの表面形成領域、ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの高度な
抗原性指標の領域が挙げられる。

【００８７】 この点に関して非常に好ましいフラグメントの中には、いくつかの構造的特徴
（例えば、上記に示す１、２、３、４、５またはそれ以上の特徴）を合わせるＴ
Ｒ１２の領域を含むフラグメントがある。

【００８８】 本発明はまた、図１Ａ〜Ｃ（配列番号２）に示されるアミノ酸配列、あるいは
寄託されたプラスミド中のｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列のＮ末端
および／またはＣ末端の欠失に相当するフラグメントを含んだ。

【００８９】 タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以
上の生物学的機能の改変または損失を生じるとしても、他の機能的活性（例えば
、生物学的活性、マルチマー化する能力、ＴＲ１２リガンドに結合する能力）は
、なお保持され得る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または成熟形態を認識
する抗体を誘導するおよび／または抗体に結合する、短縮型ＴＲ１２ムテインの
能力は、完全なポリペプチド、または成熟ポリペプチドの大部分より少ない残基
が、Ｎ末端から除去される場合には、一般的に保持される。完全なポリペプチド
のＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫原性活性を保持する
かどうかは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野において公知
の別の方法によって容易に決定され得る。多数の欠失したＮ末端アミノ酸残基を
有するＴＲ１２ムテインは、いくつかの生物学的活性または免疫源性活性を保持
し得るようである。実際に、６つと同じくらい少ないＴＲ１２アミノ酸残基から
なるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。

【００９０】 従って、本発明はさらに、図１Ａ〜Ｃに示されるＴＲ１２アミノ酸配列のアミ
ノ末端から４２６位のセリン残基までの、１つ以上の欠失した残基を有するポリ
ペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供
する。特に本発明は、一般式ｍ−４３０によって記載されるＴＲ１２ポリペプチ
ドを提供し、ここでｍは２〜４２６の整数であり、ここでｍは、配列番号２にお
いて同定されるアミノ酸残基の位置に相当する。好ましくは、配列番号２として
示される本発明のＴＲ１２ポリペプチドのＮ末端欠失は、配列番号２の以下の残
基のアミノ酸配列を含むか、または以下の残基のアミノ酸配列からなる、ポリペ
プチドを含む：

【００９１】

【化１】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる
。 さらに、本発明の特に好ましい実施形態は、ＴＲ１２ポリペプチドの成熟細
胞外部分または可溶性部分のＮ末端欠失であり、そして配列番号２の以下の残基
のアミノ酸配列を含むか、もしくは以下の残基のアミノ酸配列からなる：

【００９２】

【化２】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる
。

【００９３】 さらに、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、このタンパ
ク質の１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じるとしても、他の機能的
活性（例えば、生物学的活性、マルチマー化する能力、ＴＲ１２リガンドに結合
する能力）は、なお保持され得る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または成
熟形態を認識する抗体を誘導するおよび／またはこの抗体に結合する、短縮型Ｔ
Ｒ１２ムテインの能力は、完全なポリペプチド、または成熟ポリペプチドの大部
分ではない残基が、Ｃ末端から除去される場合には、一般的に保持される。完全
なポリペプチドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫原性
活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、および当該分
野において公知の他の方法によって容易に決定され得る。多数の欠失したＣ末端
アミノ酸残基を有するＴＲ１２ムテインは、いくつかの生物学的活性または免疫
源性活性を保持し得るようである。実際に、６つと同じくらい少ないＴＲ１２ア
ミノ酸残基からなるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。

【００９４】 従って、本発明はさらに、図１Ａ〜Ｃ（配列番号２）に示されるＴＲ１２ポリ
ペプチドのアミノ酸配列のカルボキシ末端から欠失させた１つ以上の残基を有す
るポリペプチドを提供する。

【００９５】 さらに、ＴＲ１２ポリペプチドのＣ末端欠失はまた、一般式１−ｎによって記
載され得、ここでｎは２〜４２９の整数であり、ここでｎは、配列番号２におい
て同定されるアミノ酸残基の位置に相当する。好ましくは、配列番号２として示
される本発明のＴＲ１２ポリペプチドのＣ末端欠失は、配列番号２の以下の残基
のアミノ酸配列を含むか、または以下の残基のアミノ酸配列からなる、ポリペプ
チドを含む：

【００９６】

【化３】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる
。 さらに、本発明の特に好ましい実施形態は、ＴＲ１２ポリペプチドの成熟細
胞外部分または可溶性部分のＣ末端欠失であり、そして配列番号２の以下の残基
のアミノ酸配列を含むか、もしくは以下の残基のアミノ酸配列からなる：

【００９７】

【化４】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる
。

【００９８】 さらに、上記に列挙されるＮ末端またはＣ末端の欠失のいずれかを組み合わせ
て、Ｎ末端およびＣ末端欠失型ＴＲ１２ポリペプチドを産生し得る。本発明はま
た、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方から欠失させた１つ以上のアミノ酸
を有するポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、配列番号２の残基ｍ−
ｎを有するように一般に記載され得、ここでｎおよびｍは、上記のように整数で
ある。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含
まれる。

【００９９】 また、ＡＴＣＣ受託番号２０３３６５に含まれるｃＤＮＡによってコードされ
る、完全なＴＲ１２アミノ酸配列の一部からなるポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列が含まれる。ここで、この部分は、ＡＴＣＣ受託番号２０３３６５
に含まれるｃＤＮＡによってコードされる完全なアミノ酸配列のアミノ末端から
、１〜約４２０アミノ酸の任意の整数のアミノ酸残基、あるいは、ＡＴＣＣ受託
番号２０３３６５に含まれるｃＤＮＡプラスミドによってコードされる完全アミ
ノ酸配列の、カルボキシ末端から１〜約４２０アミノ酸の任意の整数のアミノ酸
残基、または上記のアミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失の任意の組合せを
除外する。全ての上記の欠失変異ポリペプチド形態をコードするポリヌクレオチ
ドもまた、提供される。

【０１００】 本発明はまた、本明細書中でｍ−ｎで示されるＴＲ１２ポリペプチド配列に、
少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である
ポリペプチドを含むタンパク質に指向される。好ましい実施形態では、本出願は
、本明細書中に列挙される特定のＴＲ１２のＮ末端およびＣ末端欠失のアミノ酸
配列を有するポリペプチドに、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９
８％、または９９％同一であるポリペプチドを含むタンパク質に指向される。こ
れらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。

【０１０１】 本発明の他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性なＴＲ１２フラグメン
トである。生物学的に活性なフラグメントとは、ＴＲ１２ポリペプチドの活性に
類似の（しかし、同一である必要はない）活性を示すフラグメントである。この
フラグメントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または低下した望まれ
ない活性を含み得る。

【０１０２】 別の局面において、本発明は、本発明のＴＲ１２ポリペプチドのエピトープ保
有部位を含むポリペプチドを提供する。これらのエピトープは、本発明のポリペ
プチドの免疫原性エピトープおよび／または抗原性エピトープである。「免疫原
性エピトープ」は、本発明のポリペプチドの全体、またはそのフラグメントが免
疫源である場合に、インビボで抗体応答を引き起こすタンパク質の一部として定
義される。他方、抗体が結合し得るポリペプチドの領域は、「抗原決定基」また
は「抗原エピトープ」として定義される。インビボでのタンパク質の免疫原性エ
ピトープの数は、一般に、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙ
ｓｅｎら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１
：３９９８−４００２を参照のこと。しかし、抗体は、ファージディスプレーの
ような方法を用いることによって、任意の抗原性エピトープ（それが免疫原性エ
ピトープであるか否かにかかわらず）に合わせて作製され得る。例えば、Ｐｅｔ
ｅｒｓｅｎ Ｇ．ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４９：４２５
−４３１を参照のこと。従って、免疫原性エピトープおよび抗原性エピトープの
両方が本発明に含まれる。

【０１０３】 免疫原性エピトープを含む例示的アミノ酸配列のリストを、表１に示す。表１
は、ＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ、（１９８８）Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏ
ｓｃｉ．４：１８１〜１８６（この参考文献はその全体が参考として援用される
）のアルゴリズムを用いて最も高い程度の抗原性を有することが予想されたエピ
トープを含むアミノ酸残基のみを列挙することに注意する。Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗ
ｏｌｆ抗原性分析を、デフォルトのパラメータを用いて、コンピュータプログラ
ムＰＲＯＴＥＡＮ（Ｐｏｗｅｒ ＭａｃＩｎｔｏｓｈ バージョン３．１１、Ｄ
ＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、１２２８ Ｓｏｕｔｈ Ｐａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ Ｍ
ａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して行った。表１に列挙されないポリペプチドの部
分は、非免疫原性とみなされない。表１の免疫原性エピトープは、例示的なリス
トであり、網羅的なリストではない。なぜならば、他の免疫原性エピトープは、
用いられる特定のアルゴリズムによって、免疫原性エピトープとして単に認識さ
れない。他の免疫原性エピトープを含むアミノ酸残基は、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏ
ｌｆ分析に類似するアルゴリズムを用いてか、または当該分野で公知の方法を用
いる抗原性応答に対するインビボ試験によって慣用的に決定され得る。例えば、
Ｇｅｙｓｅｎら、前出；米国特許第４，７０８，７８１号；同第５，１９４，３
９２号；同第４，４３３，０９２号；および同第５，４８０，９７１号（これら
の参考文献はその全体が参考として援用される）を参照のこと。

【０１０４】 表１のアミノ酸配列が、免疫原性エピトープを含むことに特に注意する。表１
は、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析によって決定される免疫原性エピトープの重
要な残基のみを列挙する。従って、Ｎ末端またはＣ末端のいずれか、またはＮ末
端およびＣ末端の両方のさらなる隣接残基は、本発明のエピトープ保有ポリペプ
チドを作製するための表１の配列に加えられ得る。従って、表１の免疫原性エピ
トープは、さらなるＮ末端またはＣ末端のアミノ酸残基を含み得る。このさらな
る隣接アミノ酸残基は、本発明のポリペプチドから連続する隣接Ｎ末端配列およ
び／またはＣ末端配列であり得るか、異種ポリペプチド配列であり得るか、また
は本発明のポリペプチドおよび異種ポリペプチド配列の両方から連続する隣接配
列を含み得る。

【０１０５】 ＴＲ１２ポリペプチドの免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む本
発明のポリペプチドは、少なくとも７つのアミノ酸残基の長さである。「少なく
とも」とは、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペ
プチドが、７アミノ酸の長さ、または７アミノ酸と本発明の全長ポリペプチドの
アミノ酸残基の数との間の任意の整数であり得ることを意味する。免疫原性エピ
トープまたは抗原性エピトープを含む好ましいポリペプチドは、少なくとも７、
９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６
５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸残基の長さで
ある。しかし、７と全長ポリペプチドのアミノ酸残基の数との間の各々の整数お
よびあらゆる整数が本発明に含まれることに注意する。特定の実施形態において
、抗原性エピトープは、約１５アミノ酸残基と約３０アミノ酸残基との間の配列
を含む。ＴＲ１２特異的抗体を作製するために用いられ得る、抗原性ポリペプチ
ドまたはペプチドの制限されない例としては、以下のアミノ酸残基を含むポリペ
プチド、または以下のアミノ酸残基からなるポリペプチドが挙げられる：図１Ａ
〜Ｃ（配列番号２）のアミノ酸残基３２〜４７、５０〜５５、６１〜７３、８４
〜９７、１１７〜１３３、１３８〜１６０、１８５〜１９２、１９５〜２１０、
２１２〜２２４、２３１〜２４１、２４３〜２５４、２５６〜２７０、２７５〜
２８０、２９０〜３０４、３２４〜３４２、３５４〜３６３、３６５〜３７１、
３７３〜３９３、３９７〜４１９、および／または４２３〜４２８。これらのポ
リペプチドフラグメントは、図３に示されるようなＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗
原指数の分析による、ＴＲ１２タンパク質の抗原性エピトープを有することが決
定されている。

【０１０６】 免疫エピトープ保有フラグメントおよび／または抗原性エピトープ保有フラグ
メントは、上記のように、連続するアミノ酸残基の数によって特定され得るか、
または配列番号２のアミノ酸配列のこれらのフラグメントのＮ末端位置およびＣ
末端位置によってさらに特定され得るかのいずれかである。例えば、少なくとも
７または少なくとも１５の連続するアミノ酸残基の長さのフラグメントが、配列
番号２のアミノ酸配列を占有し得る、Ｎ末端位置およびＣ末端位置の全ての組合
せが、本発明に含まれる。また、「少なくとも７の連続するアミノ酸残基の長さ
」とは、７つのアミノ酸残基の長さ、または７アミノ酸と、本発明の全長ポリペ
プチドのアミノ酸残基数との間の任意の整数を意味する。特に、７と全長ポリペ
プチドのアミノ酸残基の数との間の、各々の整数およびあらゆる整数が、本発明
に含まれる。

【０１０７】 本発明の免疫原性エピトープ保有ポリペプチドおよび抗原性エピトープ保有ポ
リペプチドは、例えば、本発明のエピトープに特異的に結合する抗体を作製する
ため（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）
；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１９８３
）を参照のこと）、および免疫アッセイにおいて、本発明のポリペプチドを検出
するために有用である。この抗体は、例えば、本発明のポリペプチドのアフィニ
ティー精製において有用である。この抗体はまた、当該分野において公知の方法
を用いる本発明のポリペプチドに特異的な、種々の定性的免疫アッセイまたは定
量的免疫アッセイにおいて慣用的に用いられ得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；第二版、１
９８８）を参照のこと。

【０１０８】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で公知の合成方法および組
換え方法を含むポリペプチド作製のための任意の従来の手段により産生され得る
。例えば、エピトープ保有ペプチドは、化学合成の公知の方法を用いて合成され
得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、多数のペプチド（例えば、２４８の個々の
１０〜２０ｍｇ）およびＨＡ１ペプチドのセグメントの単一アミノ酸改変体を示
す別個の１３残基ペプチド（そのすべては、（ＥＬＩＳＡ型の結合研究により）
４週間未満で調製されそして特徴付けられた）の合成のための簡易な方法を記載
している（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８２：５１３１〜５１３５（１９８５））。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎ
ｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ
）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎおよび共同研究者（１９８６）の米国特許第
４，６３１，２１１号にさらに記載される。この手順において、種々のペプチド
の固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相方
法に関与する多数の同一反復工程の最適使用を可能にする。完全に手動手順は、
５００〜１０００以上の合成が同時に実行されることを可能にする（Ｈｏｕｇｈ
ｔｅｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：５１３１
〜５１３５の５１３４）。

【０１０９】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、インビボ免疫化、インビトロ免疫化
およびファージ提示方法を含むがこれらに限定されない、当該分野で周知の方法
による抗体を誘導するために用いられ得る。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前
出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出、およびＢｉｔｔｌｅら（１９８５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．６６：２３４７〜２３５４を参照のこと。インビボ免疫化が用いられ
る場合、動物は遊離のペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価
は、高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）ま
たは破傷風毒素）へのペプチドの結合によりブーストされ得る。例えば、システ
イン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得、一方
、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのような、より一般的な結合剤を用いて
キャリアに結合され得る。ウサギ、ラットおよびマウスのような動物は、遊離の
ペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、約１００μ
ｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントを含有す
る乳濁液の腹腔内および／または皮内注射によって免疫される。いくつかのブー
スター注射は、有用な力価の抗ペプチド抗体（例えば、固相に吸着する遊離のペ
プチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る）を提供するために、例
えば、約２週間の間隔で、必要であり得る。免疫された動物由来の血清における
抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により（例えば、当該分野で周
知の方法による、固体支持体上のペプチドへの吸着および選択した抗体の溶出に
より）上昇され得る。

【０１１０】 好ましい免疫原性エピトープは、ＴＲ１２のシステインリッチドメインを含む
。免疫原性エピトープは、動物系（例えば、ウサギまたはマウス）にアルブミン
のようなキャリアタンパク質とともに提示され得るか、または免疫原性エピトー
プが十分に長い場合（少なくとも、約２５アミノ酸）には、キャリアなしで提示
され得る。しかし、わずか８〜１０アミノ酸を含む免疫原性エピトープは、変性
ポリペプチドにおいて（例えば、ウエスタンブロッティングにおいて）、少なく
とも線状エピトープに結合し得る抗体を惹起するのに十分であることが示されて
いる。

【０１１１】 ＤＮＡｓｔａｒ分析を用いて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ；２は、以下のアミノ酸で
免疫原性であることが見出された：３２〜４７、５０〜５５、６１〜７３、８４
〜９７、１１７〜１３３、１３８〜１６０、１８５〜１９２、１９５〜２１０、
２１２〜２２４、２３１〜２４１、２４３〜２５４、２５６〜２７０、２７５〜
２８０、２９０〜３０４、３２４〜３４２、３５４〜３６３、３６５〜３７１、
３７３〜３９３、３９７〜４１９、および４２３〜４２８。従ってこれらの領域
は、ＴＲ１２タンパク質に対する抗体を産生するためのエピトープとして用いら
れ得る。

【０１１２】 多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号１に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったか
もしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範
囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好
ましくは、本発明から、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここ
で、ａは配列番号１の１〜２６８７の任意の整数であり、ｂは１５〜２７０１の
整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号１に示されるヌクレオチド残基
の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポリ
ヌクレオチドが除外される。

【０１１３】 本発明の範囲から特に除外される、特定の関連するポリヌクレオチドは、以下
の配列を含むが、それらに限定されない：ＨＵＭＧＳ００６２７、Ｇｅｎｂａｎ
ｋ登録番号ｇｂ／ＡＡ３５４０９４（配列番号３４）、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号
ｇｂ／ＡＡ２５１７９１（配列番号３５）、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｇｂ／Ｈ４
５３０５（配列番号３６）、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｇｂ／ＡＡ９２２６３８（
配列番号３７）、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｇｂ／Ｄ１９６７２（配列番号３８）
、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｇｂ／ＡＡ９２８３１３（配列番号３９）、Ｇｅｎｂ
ａｎｋ登録番号ｇｂ／Ｒ７４２５１（配列番号４０）、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号
ｇｂ／Ｈ４５２４５（配列番号４１）、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｇｂ／ＡＡ３３
９８００（配列番号４２）、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｇｂ／ＡＩ０４０１０４（
配列番号４３）、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｇｂ／ＡＩ０２３７６３（配列番号４
４）、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｇｂ／２２８１０６５（配列番号４５）、および
Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｔ１９５６２（配列番号４６）。

【０１１４】 本発明の範囲から特に除外されるさらなる特定の関連するポリヌクレオチドは
、以下の配列を含むが、それらに限定されない：ＨＪＰＢＮ７９Ｒ（配列番号５
）、ＨＣＥＤＤ０８Ｒ（配列番号６）、ＨＭＱＣＯ５１ＲＡ（配列番号７）、Ｈ
ＦＥＡＧ４６Ｒ（配列番号８）、およびＨＴＸＧＪ２０Ｒ（配列番号９）。

【０１１５】 本発明はまた、ＴＲ１２のポリヌクレオチド改変体およびポリペプチド改変体
に指向される。本明細書中で用いられる場合、「改変体」とは、ＴＲ１２のポリ
ヌクレオチドまたはポリぺプチドとは異なるが、それらの本質的な特性を保持す
るポリヌクレオチドまたはポリぺプチドをいう。一般に、改変体は、全体的に密
接に類似し、そして、多くの領域において、ＴＲ１２のポリヌクレオチドまたは
ポリぺプチドに同一である。

【０１１６】 従って、本発明のさらなる実施形態は、以下：（ａ）配列番号２のアミノ酸配
列を有する、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２の
アミノ酸配列を有するが、アミノ末端メチオニンを欠失する、ポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号２の約２６位〜約１６４位のアミノ
酸配列を有する、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号
２の約２６位〜約４３０位のアミノ酸配列を有する、ポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０３３６５に含まれるｃＤＮＡプ
ラスミドによってコードされるアミノ酸配列を有する、ＴＲ１２ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０３３６５に含まれる
ｃＤＮＡプラスミドによってコードされるアミノ酸配列を有する、成熟ＴＲ１２
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）ＴＲ１２細胞外ドメインを
コードするヌクレオチド配列；（ｈ）成熟ＴＲ１２細胞外ドメインをコードする
ヌクレオチド配列；（ｉ）ＴＲ１２システインリッチドメインをコードするヌク
レオチド配列；（ｊ）ＴＲ１２膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）ＴＲ１２細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｌ）ＴＲ１２
細胞内ドメイン、および欠失させた膜貫通ドメインの全てまたは部分を有する細
胞内ドメインコードするヌクレオチド配列；ならびに（ｍ）上記の（ａ）、（ｂ
）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ
）、または（ｌ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
に少なくとも９０％同一、およびより好ましくは、少なくとも９５％、９６％、
９７％、９８％、または９９％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドを含む、またはこれらのポリヌクレオチドからなる核酸分子を含む。これらの
核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、本発明に含まれる。

【０１１７】 本発明の参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」である
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチドのヌク
レオチド配列が、ポリヌクレオチド配列がＴＲ１２ポリぺプチドをコードする参
照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を含み得る
ことを除いて、参照配列に対して同一であることを意図する。換言すれば、参照
ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポ
リヌクレオチドを得るために、参照配列のヌクレオチドの５％までが、欠失され
得るか、または別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列中の総ヌク
レオチドの５％までの多数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。問い合
わせ（ｑｕｅｒｙ）配列は、配列番号１に示される配列全体、ＯＲＦ（オープン
リーディングフレーム）、または本明細書中で記載されるような任意のフラグメ
ントであり得る。

【０１１８】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、ま
たは９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使用して従
来的に決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最も
良好な全体的な適合性（全体的な配列整列としてもまた参照される）を決定する
ための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ
．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコン
ピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせ
配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵからＴ
に変換することによって比較され得る。この全体的な配列整列の結果は、同一性
パーセント（％）で示される。同一性パーセントを算定するためにＤＮＡ配列の
ＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝
Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１
、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒ
ｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａ
ｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓ
ｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらかより短い方）であ
る。

【０１１９】 対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失のためではなく）問い合
わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。こ
れは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列
の５’および３’切断を考慮しないからである。５’末端または３’末端で切断
される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは、問い
合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されない対象配列の５’およ
び３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。ヌ
クレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって
決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、特
定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定され、最
終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本発明
の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示されるように、問
い合わせ配列と一致／整列されない、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩
基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される。

【０１２０】 例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って
、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１
０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’末端での塩
基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、ＦＡＳＴＤ
Ｂプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。
残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％で
ある。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と比較
される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／整
列しない対象配列の５’または３’に塩基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤ
Ｂによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合わ
せ配列と一致／整列しない対象配列の５’および３’の塩基のみが手動で補正さ
れる。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。

【０１２１】 本発明は、例えば、配列番号１において示されるポリヌクレオチド配列、寄託
されたｃＤＮＡのコード領域のポリヌクレオチド配列、またはそのフラグメント
に対して少なくとも、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同
一のヌクレオチド配列を含むか、あるいはそのヌクレオチドから構成されるポリ
ヌクレオチドに向けられており、それらがＴＲ１２レセプター機能活性を有する
ポリペプチドをコードするか否かは無関係である。なせなら、これは、特定のポ
リヌクレオチド分子がＴＲ１２機能活性を有するポリペプチドをコードしない場
合においても、当業者は、そのポリヌクレオチド分子の使い方を知っているため
である（例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）プライマーとして）。ＴＲ１２レセプター活性を有するポリペプチド
をコードしない本発明のポリヌクレオチド分子の用途には、特に（１）ｃＤＮＡ
ライブラリーにおいて、ＴＲ１２レセプター遺伝子またはその対立遺伝子改変体
を単離すること；（２）Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｏｍｏｓｏｍｅ：Ａ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ
Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）に記載されるような、ＴＲ１２レセ
プター遺伝子の正確な染色体位置を提供するための分裂中期の染色体拡散に対す
るインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）；および（３
）特定の組織においてＴＲ１２レセプターｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザ
ンブロット分析が挙げられるが、これらに限定されない。

【０１２２】 しかし、例えば、配列番号１において示されるポリヌクレオチド配列、寄託さ
れたｃＤＮＡのコード領域のポリヌクレオチド配列、またはそのフラグメントに
対して少なくとも、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一
のヌクレオチド配列を含むか、あるいはそのヌクレオチドから構成されるポリヌ
クレオチドが好ましいが、実際に、これは、ＴＲ１２レセプター機能的活性を有
するポリペプチドをコードする。「ＴＲ１２機能的レセプター活性を有するポリ
ペプチド」によって、本発明のＴＲ１２レセプター（全長タンパク質または、好
ましくは、成熟タンパク質のいずれか）の活性と類似する（しかし、同一である
必要はない）活性を示すポリペプチドが意図され、特定のアッセイ（例えば、生
物学的アッセイ）において測定される。例えば、ＴＲ１２機能活性は、ＴＲ１２
リガンドに結合するＴＲ１２ポリペプチドの能力を決定することにより、慣用的
に測定され得る。ＴＲ１２機能活性はまた、ポリペプチド（例えば、遊離してい
る同族リガンドまたは細胞の表面上に発現される同族リガンド）の、そのポリペ
プチドを発現する細胞を誘導する能力を決定することにより測定され得る。

【０１２３】 もちろん、遺伝コードの縮重に起因して、当業者は、例えば、寄託されたｃＤ
ＮＡのコード領域のポリヌクレオチド配列、配列番号１において示されるポリヌ
クレオチド配列、またはそのフラグメントに対して少なくとも、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％または９９％同一のヌクレオチド配列を有する、多数
のポリヌクレオチドは、「ＴＲ１２レセプター機能活性を有する」ポリペプチド
をコードすることを直ちに認識する。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重し
たすべての改変体は同じポリペプチドを全てコードし、これは、上記の比較アッ
セイを実施しなくとも、当業者に対して明らかである。当該分野において、縮重
した改変体ではないこのようなポリヌクレオチド分子について、合理的な数のポ
リヌクレオチド分子がまた、ＴＲ１２機能活性を有するポリペプチドをコードす
ることがさらに認識される。なぜなら、これは、当業者が、タンパク質の機能に
有意にあまり影響を及ぼさないか、もしくは及ぼしそうにないアミノ酸置換を十
分に認識しているからである（例えば、１つの脂肪族アミノ酸を第２の脂肪族ア
ミノ酸で置換すること）。例えば、表現型的にサイレントアミノ酸置換をする方
法に関するガイダンスが、Ｊ．Ｕ．Ｂｏｗｉｅら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ
ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌ
ｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）において提供され、こ
こで、その筆者らは、タンパク質は、アミノ酸置換に関して驚くほど寛容である
ことを示す。

【０１２４】 本発明のポリペプチドは、以下のポリペプチドを含む；リーダーを含む寄託さ
れたｃＤＮＡによりコードされたＴＲ１２ポリペプチドを含むか、あるいはその
ポリペプチドから構成されるポリペプチド；リーダーを指し引いた寄託されたｃ
ＤＮＡによりコードされる成熟ＴＲ１２ポリペプチドを含むか、あるいはそのポ
リペプチドから構成されるポリペプチド；配列番号２の約１〜約４３０のアミノ
酸を含むか、あるいはそのアミノ酸から構成されるポリペプチド；配列番号２の
約２〜約４３０のアミノ酸を含むか、あるいはそのアミノ酸から構成されるポリ
ペプチド；配列番号２の約２６〜約１６４のアミノ酸を含むか、あるいはそのア
ミノ酸から構成されるポリペプチド；配列番号２の約２６〜約４３０のアミノ酸
を含むか、あるいはそのアミノ酸から構成されるポリペプチド；ＴＲ１２細胞外
ドメインを含むか、あるいはそのドメインから構成されるポリペプチド；成熟Ｔ
Ｒ１２細胞外ドメインを含むか、あるいはそのドメインから構成されるポリペプ
チド；ＴＲ１２システインリッチドメインを含むか、あるいはそのドメインから
構成されるポリペプチド；ＴＲ１２膜貫通ドメインを含むか、あるいはそのドメ
インから構成されるポリペプチド；ＴＲ１２細胞内ドメインを含むか、あるいは
そのドメインから構成されるポリペプチド；および、すべてまたは一部の欠失し
た膜貫通ドメインを有するＴＲ１２細胞外および細胞内ドメインを含むか、ある
いはそのドメインから構成されるポリペプチド；ならびに上記のポリペプチドに
対して少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％または９５％同
一、さらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同
一であるポリペプチド、そして本発明のポリペプチドはまた、少なくとも１０、
１５、２０、２５または３０アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも４０、
５０、７５または１００アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含む
。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により含
まれる。

【０１２５】 本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であ
るアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列
は、対象ポリぺプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸
あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に同
一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも
９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、対象配列に
おけるアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（消えない（ｉｎｄｅｌｓ））
または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸
配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端位置で生じ得るか、またはそれらの末
端位置の間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列
内の１つ以上の連続する群においてのいずれかで、散在される。

【０１２６】 実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、配列番号２に示され
るアミノ酸配列に対して、寄託されたｃＤＮＡプラスミドによってコードされる
アミノ酸配列に対して、または、そのポリペプチドフラグメントに対して、少な
くとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否
かは、従来的に、公知のコンピュータープログラムを使用して決定され得る。問
い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間での最良の全体的な一致（全体
的配列整列としても参照される）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌ
ａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））
のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定
され得る。配列整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともヌク
レオチド配列であるかまたは両方ともアミノ酸配列であるかのいずれかである。
上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセントで示される。ＦＡＳＴＤＢア
ミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、
ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ
Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇ
ｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ ＝ 配列
の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝
０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（
どちらかより短い方）である。

【０１２７】 対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問
い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならな
い。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する
場合に、対象配列のＮ末端切断およびＣ末端切断を考慮しないからである。Ｎ末
端およびＣ末端で短縮されている対象配列について、問い合わせ配列に対して、
同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対
象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配
列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されている
か否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパー
セントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムに
よって特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのス
コアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的で使
用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端
およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的
のために考慮される。すなわち、問い合わせ残基位置のみが、対象配列の最も遠
いＣ末端残基の外側に位置する。

【０１２８】 例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために
１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そ
してそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示
さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ
末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し
引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは
９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わ
せ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ
配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。こ
の場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正され
ない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整列
しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。
他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。

【０１２９】 本発明はまた、本明細書中でｎ−ｍとして示されたＴＲ１２ポリペプチド配列
に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一
であるポリペプチドを含むタンパク質に向けられる。好ましい実施形態において
、本出願は、本明細書中に列挙される特定のＴＲ１２ Ｎ末端欠失およびＣ末端
欠失のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、
９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチドを含むタンパク質
に向けられる。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本
発明により含まれる。

【０１３０】 特定の好まれる実施形態において、本発明のＴＲ１２タンパク質は、本明細書
書中に記載されるような融合タンパク質を含み、ここで、そのＴＲ１２ポリペプ
チドは、本明細書中でｎ−ｍとして記載されるポリペプチドである。好ましい実
施形態において、本出願は、本明細書中に列挙される特定のＮ末端欠失およびＣ
末端欠失のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列に対して少
なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸
分子に向けられる。これらの核酸分子によりコードされるポリペプチドもまた、
本発明により含まれる。

【０１３１】 本発明のＴＲ１２改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方にお
ける変化を含み得る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠
失を生成するが、コードされるポリぺプチドの特性または活性を変化させない変
化を含むポリヌクレオチド改変体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレン
トな置換によって生成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、任意の
組合せにおいて５〜１０、１〜５、もしくは１〜２アミノ酸が置換、欠失、また
は付加される改変体もまた、好ましい。特定の実施形態において、図１Ａ〜Ｃお
よび／または本明細書中に記載されるポリペプチドフラグメントのいずれか（例
えば、細胞外ドメイン、システインリッチドメインまたは細胞内ドメイン）のア
ミノ酸配列における置換、付加または欠失の数は、７５、７０、６０、５０、４
０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、
１、または３０〜２０、２０〜１５、２０〜１０、１５〜１０、１０〜１、５〜
１０、１〜５、１〜３または１〜２である。

【０１３２】 ＴＲ１２ポリヌクレオチド改変体は、種々の理由（例えば、特定の宿主につい
てのコドン発現を至適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉの
ような細菌宿主によって好ましいコドンに変化させる））のために、生成され得
る。

【０１３３】 天然に存在するＴＲ１２改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、そして生
物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態のうち
の１つをいう。（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子改
変体は、ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリぺプチドレベルのいずれか
で変化し得る。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発技術によってま
たは直接的な合成によって生成され得る。

【０１３４】 示されるように、性質の小さな変化が好ましい（例えば、そのタンパク質のフ
ォールディングまたは活性に有意に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換（表２
を参照のこと））。

【０１３５】

【表２】 ＴＲ１２中の、機能に必須であるアミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラ
ニンスキャニング変異誘発のような、当該分野で公知の方法によって同定され得
る（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８
１−１０８５（１９８９））。後者の手順は、分子中の全ての残基で単一のアラ
ニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子は、機能活性、例えば、レセ
プター結合またはインビトロ活性のような生物学的活性について試験される。リ
ガンド−レセプター結合のために重要な部位もまた、結晶化、核磁気共鳴、また
は光親和性標識のような構造解析によって決定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））。

【０１３６】 タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、改変体は、
ＴＲ１２ポリぺプチドの特性を改善または変化させるために作製され得る。例え
ば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実質的な欠損を伴わずに、分泌タン
パク質のＮ末端またはＣ末端から欠失され得る。Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３）の著者らは、３、８、または２
７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失させた後でさえもヘパリン結合活性を有
する改変体ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンγは、この
タンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させた後、１
０倍までのより高い活性を示した（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８））。

【０１３７】 さらに、豊富な証拠は、改変体が、天然に存在するタンパク質の生物学的活性
に類似する活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Ｇａｙｌｅおよび
共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５−２２１１１（１
９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる変異分析を行った
。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって改変体当たり
平均２．５アミノ酸の変化になる、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ変異
体を作製した。複数の変異が、全ての潜在的なアミノ酸の位置で試験された。こ
の研究者らは、「分子の大部分は、結合活性または生物学的活性のいずれに対し
てもほとんど影響を伴わないで変化され得る」ことを見出した。（要約を参照の
こと）。実際、試験された３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、わず
か２３個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタンパク質を生
成した。

【０１３８】 さらに、ポリぺプチドのＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失
が、１つ以上の生物学的機能の改変または欠失を生じたとしても、他の生物学的
活性はなお保持され得る。例えば、ＴＲ１２の細胞外ドメインを認識する抗体を
誘導および／または結合する、欠失改変体の能力は、ＴＲ１２の細胞外ドメイン
の決して多数ではない残基が、Ｎ末端またはＣ末端から除去される場合に保持さ
れるようである。タンパク質のＮ末端またはＣ末端残基を欠損する特定のポリぺ
プチドが、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載され
る慣用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の慣用的な方法に
よって容易に決定され得る。

【０１３９】 従って、本発明はさらに、実質的な機能的活性（例えば、生物学的活性）を示
すＴＲ１２ポリぺプチド改変体を含む。このような改変体としては、活性に対す
る影響をほとんど有さないように、当該分野において公知の一般的な法則に従っ
て選択される、欠失、挿入、逆位、反復、および置換が挙げられる。

【０１４０】 上記で議論されるように、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方
法に関する指針の例は、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１
３１０（１９９０）において提供され、ここで、著者らは変化に対するアミノ酸
配列の寛容性を研究するための２つの主要なストラテジーがあることを指摘する
。

【０１４１】 第１のストラテジーは、進化の過程の間の自然の選択によるアミノ酸置換の寛
容を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較して、保存されるアミノ酸
が同定され得る。これらの保存されるアミノ酸は、タンパク質の機能について重
要であるようである。対照的に、置換が自然の選択によって寛容されたアミノ酸
の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないことを示す。従って
、アミノ酸置換を寛容する位置は改変され得るが、タンパク質の生物学的活性を
なおも維持する。

【０１４２】 第２のストラテジーは、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クロ
ーン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を
使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（
分子中の各残基で１つのアラニン変異の導入）が、使用され得る。（Ｃｕｎｎｉ
ｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（
１９８９））。次いで、得られた変異分子は生物学的活性について試験され得る
。

【０１４３】 著者らが言及するように、これらの２つのストラテジーは、タンパク質がアミ
ノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミ
ノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示
す。例えば、（タンパク質の三次構造内に）ほとんど埋もれているアミノ酸残基
は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されな
い。さらに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸
のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基のＳｅｒお
よびＴｈｒの置換；酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基のＡｓｎ
およびＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香
族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズのアミノ
酸のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換を含む。

【０１４４】 保存的なアミノ酸置換に加えて、ＴＲ１２の改変体は、（ｉ）１つ以上の非保
存的なアミノ酸残基の置換、ここでは置換されるアミノ酸残基は、遺伝コードに
よってコードされるアミノ酸残基であってもよく、もしくはそうでなくてもよい
、または（ｉｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基での置換、または（ｉ
ｉｉ）別の化合物（例えば、ポリぺプチドの安定性および／もしくは可溶性を増
加するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール））との成熟ポリぺプチ
ドの融合、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペ
プチド、またはリーダーもしくは分泌配列、または精製を容易にする配列）との
ポリぺプチドへの融合を含む。このような改変体ポリぺプチドは、本明細書中の
教示から、当業者の範囲内であると考えられる。

【０１４５】 上記で議論されるように、タンパク質工学が、ＴＲ１２ポリペプチドの特徴を
改善もしくは改変するために使用され得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を
使用して、新規の変異タンパク質（すなわち単一または複数のアミノ酸置換、欠
失、付加を含むムテイン）または融合タンパク質を産生し得る。そのような改変
されたポリペプチドは、例えば増強した活性または増加した安定性を示し得る。
さらに、そのポリペプチドは、高い回収率で精製され、そして、少なくとも、特
定の精製および保管条件下において、対応する天然のポリペプチドよりも良好な
溶解性を示す。

【０１４６】 天然に存在しない改変体が、当該分野において公知の変異誘発技術を使用して
、産生され得、その技術には、オリゴヌクレオチド媒介性変異誘発、アラニンス
キャニング、ＰＣＲ変異誘発、部位特異的変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；およびＺｏｌｌ
ｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）を参照の
こと）カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１９
８５）を参照のこと）、制限選択変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌら、Ｐｈｉｌｏｓ
．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１９８
６）を参照のこと）。

【０１４７】 従って、本発明はまた、宿主細胞が選択される際に、発現、スケールアップな
どにより適したＴＲ１２ポリペプチドを産生するために欠失、付加、または置換
された１つ以上のアミノ酸残基を有するＴＲ１２誘導体およびアナログを含む。
例えば、荷電したアミノ酸と他の荷電したアミノ酸または中性アミノ酸とのアミ
ノ酸置換を含むＴＲ１２ポリペプチド改変体は、改善された特徴（例えば、より
少ない凝集）を有するタンパク質を産生し得る。薬学的処方物の凝集は、活性を
減少させ、かつ凝集体の免疫遺伝学的活性に起因するクリアランスを増加させる
（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４
０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−８４５
（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（１９９
３））。他の例において、システイン残基が、ジスルフィド結合を除去するため
に欠失されるか、または別のアミノ酸残基と置換され、そして／またはＮ連結グ
リコシル化部位が、例えば、過剰にグリコシル化されたＮ連結部位であると知ら
れる酵母宿主から、より容易に回収かつ精製される均質な産物の発現を達成する
ために改変されるか、もしくは除去される。このために、本発明のＴＲ１２ポリ
ペプチドにおける任意の１つ以上のグリコシル化認識配列上の第１または第３の
アミノ酸位置の１つまたは両方における種々のアミノ酸置換、および／または任
意の１つ以上のそのような認識配列の第２の位置におけるアミノ酸欠失は、改変
されたトリペプチド配列にてＴＲ１２のグリコシル化を妨げる（例えば、Ｍｉｙ
ａｊｉｍｏら、ＥＭＢＯ Ｊ ５（６）：１１９３−１１９７を参照のこと）。
さらに、本発明のポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基（例えば、アルギニン
および／またはリジン残基）は、例えば、フューリンまたはケキシンのようなプ
ロテアーゼによって本発明のＴＲ１２ポリペプチドの所望されないプロテアーゼ
切断を除去するために、欠失されるか、または別の残基と置換される。特定の実
施形態において、１つまたは両方の配列番号２の７５位および７６位のアルギニ
ンアミノ酸残基および／または１２９位および１３０位のアミノ酸が、ＴＲ１２
タンパク質の低い回収率を生じるプロテアーゼ切断を除去するために欠失される
か、または別のアミノ酸残基（好ましくは、リジンではない）と置換される。

【０１４８】 さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフ
リング、および／またはコドンシャッフリングの技術（集合的に「ＤＮＡシャッ
フリング」という）を利用して、ＴＲ１２の活性を調節し得、それによってＴＲ
１２のアゴニストおよびアンタゴニストを効果的に生成する。一般に、米国特許
第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５．８３０，７２１
号、同第５，８３４，２５２号、および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰ
ａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４
〜３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．１６（２）：７６〜８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．２８７：２６５〜７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏおよびＢｌ
ａｓｃｏ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）３０８〜１３（１９９８）
（これらの特許および刊行物の各々は、本明細書において参考として援用される
）を参照のこと。１つの実施形態において、ＴＲ１２ポリヌクレオチドおよび対
応するポリペプチドの変更は、ＤＮＡシャッフリングによって達成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングは、相同性、または部位特異的な組換えによる、２つ以上の
ＤＮＡセグメントの、所望のＴＲ１２分子への構築を含む。別の実施形態におい
て、ＴＲ１２ポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドは、組換えの前に、
誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入また
は他の方法によるランダム変異誘発に供することによって、変更され得る。別の
実施形態において、ＴＲ１２の１つ以上の成分、モチーフ、セクション、部分、
ドメイン、フラグメントなどが、１つ以上の非相同的な分子の１つ以上の成分、
モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどと組換えられ得る。好まし
い実施形態において、非相同的な分子は、ＴＮＦＲファミリーメンバーである。
特定の実施形態において、非相同的な分子は、以下からなる群より選択される：
可溶形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても知
られる）、ＬＴ−β（ＬＴ−α２−βのヘテロトリマー複合体において見出され
る）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢ
Ｌ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開第ＷＯ ９６／１４３２８号
）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開第ＷＯ ９７／３３８９９号）、エンドカイン（ｅｎ
ｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開第ＷＯ ９８／０７８８０号）、ＯＰＧおよびニ
ュートロカイン（Ｎｅｕｔｒｏｋｉｎｅ）−α（国際公開第ＷＯ ９８／１８９
２１号）、ＯＸ４０および神経成長因子(ＮＧＦ）およびＦａｓの可溶形態、Ｃ
Ｄ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開第ＷＯ ９６
／３４０９５号）、ＤＲ３（国際公開第ＷＯ ９７／３３９０４号）、ＤＲ４（
国際公開第ＷＯ ９８／３２８５６号）、ＴＲ５（国際公開第ＷＯ ９８／３０
６９３号）、ＴＲ６（国際公開第ＷＯ ９８／３０６９４号）、ＴＲ７（国際公
開第ＷＯ ９８／４１６２９号）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開第ＷＯ ９８
／５６８９２号）、ＴＲ１２（国際公開第ＷＯ ９８／５４２０２号）、３１２
Ｃ２（国際公開第ＷＯ ９８／０６８４２号）、およびＴＲ１２ならびに可溶形
態のＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣＤ１５３。さらに好ましい実施形態におい
て、非相同的な分子は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン
様増殖因子（ＩＧＦ−１）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−α、上皮増殖因子（
ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質（Ｂ
ＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、アクチビンＡ
およびＢ、デカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ｄｐｐ
）、６０Ａ、ＯＰ−２、ドルサリン（ｄｏｒｓａｌｉｎ）、増殖分化因子（ＧＤ
Ｆ）、結節（ｎｏｄａｌ）、ＭＩＳ、インヒビン−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−
β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５、およびグリア由来神経栄養性因子（ＧＤＮ
Ｆ）である。

【０１４９】 本発明はまた、ＴＲ１２融合タンパク質およびこれらの融合タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドを含む。本発明の任意のＴＲ１２ポリペプチド配列は、
本発明のＴＲ１２融合タンパク質の成分であり得る。１つの例において、第２の
タンパク質と融合される場合、ＴＲ１２ポリペプチドは、抗原性タグとして使用
される。この例に従って、ＴＲ１２ポリペプチドに対して惹起された抗体を使用
して、ＴＲ１２に結合することにより、間接的に第２のタンパク質を検出し得る
。さらに、別の例において、分泌タンパク質は、輸送シグナルに基づく細胞位置
を標的とするので、ＴＲ１２ポリペプチドは、一旦他のタンパク質に融合された
標的分子として使用され得る。

【０１５０】 ＴＲ１２ポリペプチドと融合され得るドメインの例は、非相同的なシグナル配
列だけでなく、他の非相同的な機能的領域を含む。この融合は、必ずしも直接的
である必要はなく、リンカー配列を介して生じ得る。

【０１５１】 特定の好ましい実施形態において、本発明のＴＲ１２タンパク質は、上記ｍ−
ｎとして記載されるＴＲ１２ポリペプチド配列を含む融合タンパク質を含む。好
ましい実施形態において、本出願は、本明細書中に列挙される特定のＮ末端欠失
およびＣ末端欠失のアミノ酸配列に対して、少なくとも、９０％、９５％、９６
％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドに
向けられる。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発
明により含まれる。

【０１５２】 さらに、融合タンパク質はまた、ＴＲ１２ポリペプチドの特徴を改善するため
に操作され得る。例えば、付加的アミノ酸の領域、特に荷電したアミノ酸が、宿
主細胞からの精製または引き続く操作および貯蔵の間の安定性および持続性を改
善するために、ＴＲ１２ポリペプチドのＮ末端に添加され得る。また、ペプチド
部分が、精製を促進するために、ＴＲ１２ポリペプチドに添加され得る。そのよ
うな領域は、ＴＲ１２ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。ポリペプチ
ドの処理を容易にするためのペプチド部分の添加は、当該分野において精通し、
かつ慣用的な技術である。

【０１５３】 さらに、ＴＲ１２ポリペプチド（フラグメントおよび好ましくは、免疫原性エ
ピトープまたは抗原性エピトープを含む）は、非相同的なポリペプチド配列と融
合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、Ｉｇ
Ｅ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメイン、またはその部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ
３、ドメイン全体およびその一部の両方を含むこれらの任意の組み合わせ）と融
合され得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容
易にさせ、そしてインビボにおいて増加した半減期を示す。これは、例えば、ヒ
トＣＤ−４ポリペプチド第１の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの
重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質に対して
示される。例えば、ＥＰＡ ０，３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎ
ａｔｕｒｅ、３３１：８４−８６（１９８８）を参照のこと。ＩｇＧ部分に起因
するジスルフィド結合性ダイマ−構造を有する融合タンパク質はまた、他の分子
と結合し、そして中和する際に、モノマーのポリペプチドまたはそのフラグメン
ト単独よりもより効率的であり得る。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５）を参照のこと。上
記エピトープをコードする核酸はまた、発現されるポリペプチドの検出および精
製の際に援助するためのエピトープタグとして目的の遺伝子を用いて組換えられ
得る。

【０１５４】 同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（Ｃａｎａｄｉａｎ ｃｏｕｎｔｅｒ
ｐａｒｔ ２０４５８６９）は、別のヒトタンパク質またはその部分とともに免
疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多
くの場合において、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断において有益
であり、従って、例えば、改善された薬物動態学的特性を生じ得る。（ＥＰ−Ａ
０２３２ ２６２）。あるいは、この融合タンパク質が発現され、検出され、
そして精製された後、Ｆｃ部分を欠失することが所望される。例えば、そのＦｃ
部分は、その融合タンパク質が免疫化に対する抗原として使用される場合、治療
および診断を妨害し得る。薬物を発見する際、例えば、ヒトタンパク質（例えば
、ｈＩＬ−５）は、高生産性スクリーニングアッセイの目的で、ｈＩＬ−５のア
ンタゴニストを同定するためにＦｃ部分と融合される（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、
Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｏｎ ８：５２−５８（１９９５）
；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４
７１（１９９５）を参照のこと）。

【０１５５】 さらに、ＴＲ１２ポリペプチドは、マーカー配列と融合され得る（例えば、Ｔ
Ｒ１２の精製を容易にするようなペプチド）。好ましい実施形態において、この
マーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチドである（例えば、ｐＱＥベ
クターにおいて提供されるタグ（特に、ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅ
ｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１、この多くは
市販されている）。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）において記載されるように、例えば、
ヘキサヒスチジンは、この融合タンパク質の都合のよい精製を提供する。精製の
ために有用な別のペプチドタグである、「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球
凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３
７：７６７（１９８４））。

【０１５６】 従って、これらの上記融合体のいずれかは、ＴＲ１２のポリヌクレオチドまた
はポリペプチドを使用して操作され得る。

【０１５７】 本発明の好ましいＦｃ融合体としては、配列番号２の１〜１６４アミノ酸残基
、２６〜１６４アミノ酸残基、４８〜７１アミノ酸残基、３２〜４７アミノ酸残
基、５０〜５５アミノ酸残基、６１〜７３アミノ酸残基、８４〜９７アミノ酸残
基、１１７〜１３３アミノ酸残基、１３８〜１６０アミノ酸残基、１８５〜１９
２アミノ酸残基、１９５〜２１０アミノ酸残基、２１２〜２２４アミノ酸残基、
２３１〜２４１アミノ酸残基、２４３〜２５４アミノ酸残基、２５６〜２７０ア
ミノ酸残基、２７５〜２８０アミノ酸残基、２９０〜３０４アミノ酸残基、３２
４〜３４２アミノ酸残基、３５４〜３６３アミノ酸残基、３６５〜３７１アミノ
酸残基、３７３〜３９３アミノ酸残基、３９７〜４１９アミノ酸残基および４２
３〜４２８アミノ酸残基を含むか、あるいはそのアミノ酸残基からなる構築物が
挙げられるが、これらに限定されない。これらのＦｃ融合体をコードするポリヌ
クレオチドはまた、本発明により含まれる。

【０１５８】 （ベクター、宿主細胞、およびタンパク質生成） 本発明はまた、ＴＲ１２ポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、および
組換え技術および合成技術によるポリペプチドの生成に関する。ベクターは、例
えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレト
ロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製能があるかま
たは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、補完する宿主
細胞においてのみ生じる。

【０１５９】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含
むベクターに結合され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム
沈殿のような沈殿、または荷電した脂質との複合体において導入される。このベ
クターがウイルスである場合、これは適切なパッケージング細胞株を使用してイ
ンビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。

【０１６０】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドのインサートを、いくつかの名前を挙げてファージ
λＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、およびｔａｃ
プロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルス
ＬＴＲのプロモーターのような適切なプロモーターに作動可能に結合するべきで
ある。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、転写開
始のための部位、転写終結のための部位、および転写された領域における翻訳の
ためのリボソーム結合部位をさらに含む。構築物によって発現される転写物のコ
ード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの始めに翻訳開始コドンおよ
び翻訳されるポリペプチドの最後に適切に位置する終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ
またはＵＡＧ）を含む。

【０１６１】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ
葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉ
および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイ
シン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代
表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真
菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細
胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞
、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植物細胞
が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培
地および条件は当該分野で公知である。

【０１６２】 細菌における使用に好ましいベクターには、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、および
ｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮ
Ｈ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、
ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中に
は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯ
Ｇ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐ
ＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬがある。他の適切なベクターは
、当業者に容易に明らかである。

【０１６３】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって
もたらされ得る。このような方法は、多くの標準的研究室マニュアルに記載され
ている（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。ＴＲ１２ポリペプチドは、組換え
ベクターを欠く宿主細胞により実際に発現され得ることが特に意図される。

【０１６４】 ＴＲ１２ポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽
出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマ
トグラフィーを含む周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製
され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精
製のために用いられる。

【０１６５】 ＴＲ１２ポリペプチド、および好ましくはこの分泌形態はまた、以下から収集
され得る：天然の供給源から精製された生成物（直接単離されたか、または培養
されたかのいずれにせよ、体液、組織、および細胞を含む）；化学合成手順の生
成物；および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、
高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって
産生された産物。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、ＴＲ１２
ポリペプチドは、グリコシル化されていてもよく、またはグリコシル化されてい
なくともよい。さらに、ＴＲ１２ポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒
介プロセスの結果として、改変された開始メチオニン残基を含み得る。従って、
翻訳開始コドンによってコードされているＮ末端メチオニンは、一般的に、すべ
ての真核生物細胞において翻訳後に任意のタンパク質から高い効率で除去される
ことが当該分野において周知である。大部分の原核生物においても、大部分のタ
ンパク質上のＮ末端メチオニンはまた効率的に除去されるが、いくつかのタンパ
ク質では、この原核生物の除去プロセスは、Ｎ末端メチオニンが共有結合してい
るアミノ酸の性質に依存して、非効率的である。

【０１６６】 本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加え
て、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次（ｐｒｉｍａｒ
ｙ）宿主細胞、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）宿主細胞、および不死化宿主細胞を
含む。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、ＴＲ１２コード配列）
を欠失または置換するように操作されており、そして／または本発明のＴＲ１２
ポリヌクレオチドと作動可能に連結された遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオ
チド配列）を含むように操作されており、そして内因性のＴＲ１２ポリヌクレオ
チドを活性化、変更、および／または増幅する。例えば、当該分野で公知の技術
は、相同組換えを介して、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／または
エンハンサー）および内因性ＴＲ１２ポリヌクレオチド配列を作動可能に連結す
るために使用され得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第
５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際公開第ＷＯ ９
６／２９４１１号；１９９４年８月４日に公開された国際公開第ＷＯ ９４／１
２６５０；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと（これらの開示の各々
を、それら全体において参考として援用する））。

【０１６７】 ポリペプチドは、改変形態（例えば、融合タンパク質（異種タンパク質配列（
異なるタンパク質の）にペプチド結合を介して連結されたポリペプチドを含む）
）において発現され得、そして分泌シグナルだけでなく、さらなる異種機能領域
をも含み得る。あるいは、このような融合タンパク質は、タンパク質合成技術（
例えば、ペプチド合成装置の使用による）により作製され得る。従って、さらな
るアミノ酸（特に、荷電したアミノ酸）の領域を、ポリペプチドのＮ末端に付加
して、精製の間または引き続く操作および保存の間の宿主細胞における安定性な
らびに存続を改善し得る。また、ペプチド部分を、ポリペプチドに付加して、精
製を容易にし得る。このような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に取り除か
れ得る。特に、分泌または排出を生じさせるため、安定性を改善するため、およ
び精製を容易にするために、ポリペプチドにペプチド部分を付加することは、当
該分野で良く知られており、そして慣用的技術である。例えば、１つの実施形態
では、本発明のＴＲ１２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ｐｅｌ
Ｂペクタートリアーゼシグナル配列に融合して、グラム陰性細菌におけるこのよ
うなポリペプチドの発現および精製に対する効率を増加させ得る。米国特許第５
，５７６，１９５号および同第５，８４６，８１８号（これらの内容を、それら
の全体において、本明細書中で参考として援用する）を参照のこと。

【０１６８】 好ましい融合タンパク質は、タンパク質を可溶化するために有用である免疫グ
ロブリン由来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナ
ダ対応物２０４５８６９）は、別のヒトタンパク質、またはその部分とともに免
疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多
くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における用途のため
に全く有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ
−Ａ ０２３２ ２６２）。他方で、いくつかの用途については、記載されるよ
うな有利な様式で、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後
に、Ｆｃ部分を欠失し得ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診
断における使用を妨げることが証明されている場合、例えば、融合タンパク質が
免疫のための抗原として使用される場合である。薬物発見において、例えば、ｈ
ＩＬ−５レセプターのようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを
同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的で、Ｆｃ部分と
融合されている（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ．ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）、およびＫ．Ｊ
ｏｈａｎｓｏｎら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７０：１６：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこ
と）。

【０１６９】 本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成され得る（
例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅ
ｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら、１９８
４、Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１を参照のこと）。例えば、本発明の
ＴＲ１２ポリペプチドのフラグメントに対応するペプチドは、ペプチド合成機の
使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化学的
アミノ酸アナログが、置換または付加としてＴＲ１２ポリヌクレオチド配列に導
入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が一般に挙げられるがこれらに限
定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイ
ソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、
６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ，２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸
、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、
シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチル
アラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオ
ロアミノ酸、デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）アミノ酸（例えば、ｂ−メチルア
ミノ酸）、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般のアミノ
酸アナログ。さらにアミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。

【０１７０】 本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リ
ン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解
切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改変さ
れたＴＲ１２ポリペプチドを含む。任意の多数の化学的改変は、以下を含むがこ
れらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シアン、トリプシン
、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ₄による特異的な化
学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での
代謝合成；など。

【０１７１】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下が挙げら
れる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング）
、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖の化学修
飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加も
しくは欠失。このポリペプチドをまた、検出可能な標識（例えば、酵素標識、蛍
光標識、同位体標識または親和性標識）で改変して、このタンパク質の検出およ
び単離が可能にし得る。

【０１７２】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少（米国特許第４，１７９，３
３７号を参照のこと））を提供し得る、ＴＲ１２の化学修飾誘導体が提供される
。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコ
ール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチ
ルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選択され得る。
このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置で、またはこの分子内の予め
決定された位置で改変され得、そして１、２、３またはそれより多く結合した化
学部分を含み得る。このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして
分枝状であっても非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては
、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１
００ｋＤａとの間（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において、い
くつかの分子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いこ
とを示す）である。所望の治療的プロフィール（例えば、所望される持続放出の
持続時間、生物学的活性に対する効果（ある場合には）、取り扱いの容易さ、抗
原性の程度または欠如、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチ
レングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。

【０１７３】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮して、タンパク質に結
合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、
本明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦに
ＰＥＧをカップリングする）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：
１０２８−１０３５（１９９２）（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化
（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチ
レングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）
によってアミノ酸残基を介して共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチ
レングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残
基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカル
ボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸
残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、ポ
リエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療
目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基
での結合である。

【０１７４】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が、特に所望され得る。ポリエチレングリ
コールを本発明の組成の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子
（分子量、分枝などによって）から、反応混合物中でのポリエチレングリコール
分子 対 タンパク質（または、ペプチド）分子の比率、行われるべきペグ化反
応の型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法が選択され得る。
Ｎ末端ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペ
グ化部分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペ
グ化物質の精製により得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、
特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リ
ジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得
る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタ
ンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。

【０１７５】 （抗体） 本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体およびＴ細胞
抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、Ｉｇ
Ｇ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含
む）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭならびにＩｇＹを含む。本明細書中で使用さ
れる場合、用語「抗体」（Ａｂ）は、単鎖抗体全体およびその抗原結合フラグメ
ントを含む抗体全体を含むことが意味される。最も好ましくは、この抗体は、本
発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およ
びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合
Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、およびＶ_LまたはＶ_Hドメインのいずれかを含むフラグメン
トが挙げられるがこれらに限定されない。この抗体は、鳥類および哺乳動物を含
む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、マウス、ウ
サギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。

【０１７６】 単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を、単独または以下の
全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２および
ＣＨ３ドメイン。可変領域ならびにヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ド
メインの任意の組み合わせもまた本発明に含まれる。本発明はさらに、本発明の
ポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キ
メラ抗体、ヒト化抗体、ならびにヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクロー
ナル抗体を含む。本発明はさらに、本発明の抗体に対して抗イディオタイプであ
る抗体を含む。

【０１７７】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多価の多重
異的（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）であり得る。多重特異的な抗体は、
本発明のポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であり得るか、または
本発明のポリペプチドならびに異種の組成物（例えば、異種ポリペプチドまたは
固体支持体物質）の両方に特異的であり得る。例えば、ＷＯ ９３／１７７１５
；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／０５７９３；
Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０〜６９（１９９１）；米国特許
第５，５７３，９２０号、同第４，４７４，８９３号、同第５，６０１，８１９
号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３（１９９２）を参照のこ
と。

【０１７８】 本発明の抗体は、抗体により認識されるかまたは抗体により特異的に結合され
る本発明のポリペプチドのエピトープまたは部分の面から記載または特定化され
得る。このエピトープまたはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末
端位置によって、連続するアミノ酸残基におけるサイズによって本明細書中に記
載されるように、または表および図面に列挙されるように、特定化され得る。本
発明の任意のエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた排除
され得る。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合する抗体を
含み、そしてこの同一物の排除を可能にする。

【０１７９】 本発明の抗体はまた、それらの交差反応性の面で記載または特定化され得る。
本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）
またはホモログを結合しない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して
９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、
６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公
知の方法および本明細書において記載された方法を用いて計算される場合）を有
するポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。さらに本発明に
は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（本明細書において記載
のような）で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチドのみに結合する抗体が含まれる。本発明の抗体
はまた、それらの結合親和性の面で記載または特定化され得る。好ましい結合親
和性としては、５×１０^-6Ｍ未満、１０^-6Ｍ未満、５×１０^-7Ｍ未満、１０^-7Ｍ
未満、５×１０^-8Ｍ未満、１０^-8Ｍ未満、５×１０^-9Ｍ未満、１０^-9Ｍ未満、５
×１０^-10Ｍ未満、１０^-10Ｍ未満、５×１０^-11Ｍ未満、１０^-11Ｍ未満、５×１
０^-12Ｍ未満、１０^-12Ｍ未満、５×１０^-13Ｍ未満、１０^-13Ｍ未満、５×１０^{-1 4} Ｍ未満、１０^-14Ｍ未満、５×１０^-15Ｍ未満、および１０^-15Ｍ未満の解離定数
すなわちＫｄの親和性が挙げられる。

【０１８０】 本発明の抗体は、インビトロおよびインビボにおける診断方法および治療方法
の両方を含む、本発明のポリペプチドを精製、検出および標的化するのための当
該分野で公知の方法を含むがこれに限定されない用途を有する。例えば、この抗
体は、生物学的サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的および
定量的に測定するためのイムノアッセイにおいて用途を有する。例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版，１９８８）（全体が参考として援用される）を参照のこと。

【０１８１】 本発明の抗体は、単独、または他の組成物との組み合わせのいずれかで用いら
れ得る。この抗体は、さらに、Ｎ末端またはＣ末端で異種のポリペプチドに組換
え的に融合され得るか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に結合
（共有結合および非共有結合を含む）され得る。例えば、本発明の抗体は、検出
アッセイにおける標識として有用な分子およびエフェクター分子（例えば、異種
のポリペプチド、薬物または毒素）に組換え的に融合または結合され得る。例え
ば、ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米
国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第０ ３９６ ３８７号を参照
のこと。

【０１８２】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって調製され得る。
例えば、本発明のポリペプチドまたはその抗原性フラグメントは、ポリクローナ
ル抗体を含有する血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。用語「モノ
クローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって生成される抗体に限定されな
い。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物、またはファー
ジクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてモノクローナル
抗体が生成される方法ではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換
え、およびファージディスプレイ技術の使用を含む、当該分野で公知の広範な種
々の技術を用いて調製され得る。

【０１８３】 ハイブリドーマ技術としては、当該分野で公知の技術が挙げられ、そしてＨａ
ｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第二版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮ
ＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ Ｔ−ＣＥＬＬ ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が
参考として援用される）に教示される。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメン
トは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａ
ｂ’）２フラグメントを産生するため）のような酵素を使用して、タンパク質分
解切断によって産生され得る。

【０１８４】 あるいは、本発明の抗体は、当該分野で公知の方法を使用して、組換えＤＮＡ
技術およびファージディスプレイ技術を適用して、または合成化学を通して作製
され得る。例えば、本発明の抗体は、当該分野で公知の種々のファージディスプ
レイ方法を用いて調製され得る。ファージディスプレイ方法において、機能的抗
体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒
子の表面に提示される。所望の結合特性を有するファージは、抗原、代表的には
固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原を用いて直接的に選択するこ
とにより、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒ
トまたはマウス）から選択される。これらの方法において用いられるファージは
、代表的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩ
タンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド
安定化されたＦｖの抗体ドメインを有するｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージ
である。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法
の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１〜５０（１９９５）；Ａｍｅｓ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７〜１８６（１９９５
）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５
２〜９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９〜１８（１９
９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５
７：１９１〜２８０（１９９４）；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ ９０
／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２
／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８２；ＷＯ ９５
／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４
０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２
７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５
，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、
同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、および同第５，７３３
，７４３号（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）。

【０１８５】 上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体
をコードする領域は、ヒト抗体を含む抗体全体または任意の他の所望の抗原結合
フラグメントを作製するために単離および使用され得、そして哺乳動物細胞、昆
虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得
る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に
作製するための技術はまた、当該分野で公知の方法を用いて使用され得る。この
方法は、例えば、以下に開示される方法である：ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕ
ｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４〜８６９（
１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ ３４：２６〜３４（１９９５）；
およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１〜１０４３（１９８
８）（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される）。

【０１８６】 単鎖のＦｖおよび抗体を作製するために用いられ得る技術の例としては、米国
特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら
、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６〜８８（１９９
１）；Ｓｈｕ，Ｌ．ら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５〜７９９９（１９９３）；お
よびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８〜１０４０（１９８８
）に記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボ使用およびイン
ビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体ま
たはヒト抗体の使用が好適であり得る。キメラ抗体を作製するための方法は、当
該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２
９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４
（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ １２５：１９１〜２０２；および米国特許第５，８０７，７１５号を参
照のこと。抗体は、以下を含む種々の技術を用いてヒト化され得る：ＣＤＲ−グ
ラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）（欧州特許第０ ２３９ ４００号；ＷＯ
９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０
８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒ
ｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第０ ５９２ １０６号；欧州特許第０ ５
１９ ５９６号；Ｐａｄｌａｎ Ｅ．Ａ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９〜４９８（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋ
ａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５〜８１４（
１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９６９〜９７３（１９９４）
）、および鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第
５，５６５，３３２号）。ヒト抗体は、上記のファージディスプレイ方法を含む
当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国特許第４，４４４，８８
７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５４５，８０６号および同第５，８
１４，３１８号；ならびにＷＯ ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、Ｗ
Ｏ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６
／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１（上記の参考文献はその全体が参考
として援用される）もまた参照のこと。

【０１８７】 さらに、本発明には、本発明のポリペプチドに組換え的に融合または化学的に
結合（共有結合および非共有結合の両方を含む）した抗体が含まれる。この抗体
は、本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であり得る。例えば、抗体は、本
発明のポリペプチドを特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合または結
合することにより、インビトロまたはインビボのいずれかで本発明のポリペプチ
ドを特定の細胞型へ標的化するために用いられ得る。本発明のポリペプチドに対
して融合または結合体化された抗体はまた、当該分野で公知の方法を用いるイン
ビトロイムノアッセイおよび精製方法において使用され得る。例えば、Ｈａｒｂ
ｏｒら、前出、およびＷＯ ９３／２１２３２；欧州特許第０ ４３９ ０９５
号；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１〜９９（１９
９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９
：１４２８〜１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６
：２４４６〜２４５２（１９９１）（上記の参考文献は、その全体が参考として
援用される）を参照のこと。

【０１８８】 本発明は、可変領域以外の抗体ドメインと融合または結合体化された、本発明
のポリペプチドを含む組成物をさらに含む。例えば、本発明のポリペプチドは、
抗体のＦｃ領域またはその一部分と融合または結合体化され得る。本発明のポリ
ペプチドに融合した抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン
、およびＣＨ３ドメインまたはドメイン全体かまたはその一部の任意の組み合わ
せを含み得る。本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の方法を用いて、ポリ
ペプチドのインビボでの半減期を増大させるか、またはイムノアッセイにおける
使用のために、上記の抗体部分に融合または結合体化され得る。このポリペプチ
ドはまた、上記の抗体部分に融合または結合体化されて、マルチマーを形成し得
る。例えば、本発明のポリペプチドに融合されたＦｃ部分は、Ｆｃ部分の間のジ
スルフィド結合を通してダイマーを形成し得る。より高次のマルチマー形態は、
ＩｇＡおよびＩｇＭの部分にポリペプチドを融合することにより作製され得る。
本発明のポリペプチドを抗体部分に融合または結合体化するための方法は、当該
分野で公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２
，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，
４４７，８５１号、同第５，１１２，９４６号；欧州特許第０ ３０７ ４３４
号、欧州特許第０ ３６７ １６６号；ＷＯ９６／０４３８８、ＷＯ９１／０６
５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、ＰＮＡＳ ８８：１０５３５−１０５３９（１
９９１）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（
１９９５）；ならびにＶｉｌら、ＰＮＡＳ ８９：１１３３７−１１３４１（１
９９２）（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）を参照のこと
。

【０１８９】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用する抗体に関する。例えば、本発明は、部分的または完全にかのいずれ
かで、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を破壊する抗体
を含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれる。リ
ガンド結合を妨害しないが、レセプター活性化を妨げるレセプター特異的抗体が
含まれる。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載
の技術、そうでなければ、当該分野で公知の技術により決定され得る。リガンド
結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプター特異的抗体もまた含まれ
る。同様に、リガンドに結合し、そしてリガンドのレセプターへの結合を妨げる
中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それによってレセプター活性化を妨げる
が、リガンドがレセプターに結合することは妨げない抗体が含まれる。レセプタ
ーを活性化する抗体がさらに含まれる。これらの抗体は、リガンド媒介レセプタ
ー活性化により影響を及ぼされる、すべてまたはすべてには満たない生物学的活
性のいずれかについてのアゴニストとして作用し得る。この抗体は、本明細書中
に開示された特定の活性を含む生物学的活性についてのアゴニストまたはアンタ
ゴニストとして特定化され得る。上記の抗体アゴニストは、当該分野で公知の方
法を使用して作製され得る。例えば、ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８
１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（
１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３
６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１
７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５
）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６
０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃ
ｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；
Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｄｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９
７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９
５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：
７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）
：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ
８（１）：１４−２０（１９９６）（上記の文献は、その全体が参考として援用
される）を参照のこと。

【０１９０】 上記で議論されたように、本発明のポリペプチドに対する抗体は、次に、当業
者に周知の技術を用いて、本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイ
プ抗体を生成するために利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢ
ｏｎａ、ＦＡＳＥＢ Ｊ．７（５）：４３７−４４４（１９８９）；ならびにＮ
ｉｓｓｉｎｏｆｆ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（
１９９１）を参照のこと）。例えば、結合して、ポリペプチドのマルチマー化お
よび／または本発明のポリペプチドのリガンドへの結合を競合的に阻害する抗体
を用いて、ポリペプチドのマルチマー化および／または結合ドメインを「模倣し
」、そして結果として、ポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合して中
和する抗イディオタイプを生成し得る。このような中和抗イディオタイプまたは
このような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントは、治療レジメンにおいて使
用されて、ポリペプチドリガンドを中和し得る。例えば、このような抗イディオ
タイプ抗体を使用して、本発明のポリペプチドを結合し得るか、そして／または
そのリガンド／レセプターを結合し得、それによって、その生物学的活性をブロ
ックし得る。

【０１９１】 本発明はさらに、ＴＲ１２ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに特異的な抗
体を含有する血清をスクリーニングする際に使用するための診断用キットに関す
る。このようなキットは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に
免疫反応性であるエピトープを含む実質的に単離されたポリペプチド抗原を含み
得る。このようなキットはまた、抗原への上記抗体の結合を検出するための手段
を含む。特定の実施形態では、キットは、組換え産生されたポリペプチド抗原ま
たは化学合成されたポリペプチド抗原を含み得る。キットのポリペプチド抗原は
また、固体支持体に付着され得る。

【０１９２】 より特定の実施形態では、上記のキットの検出手段は、該ポリペプチド抗原が
付着される固体支持体を備える。このようなキットはまた、付着していないレポ
ーター標識化抗ヒト抗体を含み得る。この実施形態では、抗体のポリペプチド抗
原への結合が、上記レポーター標識化抗体の結合によって検出され得る。

【０１９３】 本発明は、試験被験体における増殖性および／または癌性の障害および状態を
検出する方法をさらに包含する。この検出方法は、試験被験体（例えば、増殖性
および／または癌性の細胞または組織が存在し得る被験体）由来の血清を実質的
に単離されたポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド抗原と反応させる工
程、および結合した抗体の存在について抗原を試験する工程を包含する。特定の
実施形態では、本方法は、固体支持体に付着されたポリペプチド抗原を包含し、
そして血清を、この支持体と反応させる。続いて、この支持体を、レポーター標
識化抗ヒト抗体と反応させる。次いで、この固体支持体を、レポーター標識化抗
体の存在について試験する。

【０１９４】 さらに、本発明は、増殖性状態ワクチン組成物を包含する。この組成物は、実
質的に単離されたポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド抗原を含み、こ
こでこの抗原は、少なくともそのエピトープに特異的な抗体と特異的に免疫反応
性であるエピトープを含む。このペプチドおよび／またはポリヌクレオチド抗原
は、当該分野で公知の方法（組換え発現および化学合成を含む）に従って生成さ
れ得る。ペプチド抗原は、好ましくは、薬学的に受容可能なキャリア中に薬理学
的に有効な用量で存在する。

【０１９５】 さらに、本発明は、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドエピトープ
と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を含む。本発明は、本発明のポ
リヌクレオチドおよび／またはポリペプチドと特異的に免疫反応性であるポリク
ローナル抗体の実質的に単離された調製物を含む。より特定の実施形態では、こ
のようなポリクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、および当
該分野で公知の他の方法によって調製される。

【０１９６】 別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド
抗原に対する抗体を生成する方法を包含する。本方法は、試験被験体に、実質的
に単離されたポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド抗原を投与する工程
を包含する。ここで、この抗原は、少なくとも１つの抗ポリペプチドおよび／ま
たはポリヌクレオチド抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む。この
抗原は、被験体において免疫応答を生じるのに十分な量で投与される。

【０１９７】 さらなる実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含有する血
清をスクリーニングする際に使用するための診断用キットを含む。この診断用キ
ットは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である
実質的に単離された抗体、およびこの抗体に対するポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチド抗原の結合を検出する手段を備える。１つの実施形態では、この抗体は
、固体支持体に付着される。特定の実施形態では、この抗体は、モノクローナル
抗体であり得る。キットの検出手段は、第二の標識化されたモノクローナル抗体
を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識化された競合抗原
を含み得る。

【０１９８】 １つの診断形態において、試験血清を、本発明の方法により得られる表面結合
抗原を有する固相試薬と反応させる。試薬への特異的抗原抗体の結合および洗浄
による結合していない血清成分の除去後、この試薬を、固体支持体上の結合され
た抗抗原抗体の量に比例して、レポーターを試薬に結合するように、レポーター
標識抗ヒト抗体と反応させる。試薬を、再度、結合していない標識化抗体を除去
するために洗浄し、そして、試薬と会合したレポーターの量を決定する。代表的
には、このレポーターは酵素であり、これは適切な蛍光定量（ｆｌｕｏｒｏｍｅ
ｔｒｉｃ）基質または比色定量基質（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の
存在下で固相をインキュベートすることにより検出される。

【０１９９】 上記アッセイにおける固体表面試薬は、固体支持体材料（例えば、ポリマー性
ビーズ、ディップスティック、９６ウェルプレート、またはフィルター材料）に
タンパク質材料を付着するための公知の技術によって調製される。これらの付着
方法は、一般に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着、または固体支持体上の
化学反応基（例えば、活性型カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒ
ド基）へのタンパク質の共有結合（代表的には、遊離アミン基を介する）を包含
する。あるいは、ストレプトアビジンでコーティングしたプレートを、ビオチン
化抗原と併用して使用し得る。

【０２００】 従って、本発明は、本診断方法を実施するためのアッセイ系またはキットを提
供する。このキットは、一般に、表面結合した組換え抗原を有する支持体、およ
び表面結合抗抗原抗体を検出するためレポーター標識化抗ヒト抗体を含む。

【０２０１】 （ＴＲ１２ポリヌクレオチドの使用） 本発明のＴＲ１２ポリヌクレオチドは、多数の方法において試薬として使用さ
れ得る。以下の記載は例示的であるとみなされるべきであり、そして公知の技術
を利用する。

【０２０２】 実際の配列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬のほとんどは
現在利用可能ではないので、新しい染色体マーカーを同定する必要性が目下のと
ころ存在する。

【０２０３】 簡単に言うと、配列は、配列番号１で示される配列からＰＣＲプライマー（好
ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することによって染色体にマッピングされ得る
。プライマーが、ゲノムＤＮＡ中の１つより多くの推定エキソンにまたがらない
ように、プライマーを、コンピューター分析を使用して選択し得る。次いで、こ
れらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスク
リーニングのために使用される。配列番号１に対応するヒトＴＲ１２遺伝子を含
むハイブリッドのみが、増幅フラグメントを産生する。

【０２０４】 同様に、体細胞ハイブリッドは、特定の染色体に対してポリヌクレオチドをＰ
ＣＲマッピングする迅速な方法を提供する。単一のサーマルサイクラーを使用し
て、１日あたり３つ以上のクローンが割り当てられ得る。さらに、ＴＲ１２ポリ
ヌクレオチドの準位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色
体フラグメントのパネルを用いて達成され得る。使用され得る他の遺伝子マッピ
ングストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化したフロー
ソートした（ｌａｂｅｌｅｄ ｆｌｏｗ ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリ
ーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリ
ダイゼーションによる前選択（ｐｒｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を含む。

【０２０５】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドの正確な染色体上位置は、中期染色体スプレッドの
インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）における蛍光を用いて達成さ
れ得る。この技術は、５００または６００塩基程度の短いポリヌクレオチドを用
いる；しかし、２，０００〜４，０００ｂｐのポリヌクレオチドが好ましい。こ
の技術の概説については、Ｖｅｒｍａら「Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ
：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ｐｅｒｇａｍ
ｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。

【０２０６】 染色体マッピングについては、ＴＲ１２ポリヌクレオチドが個々に（単一の染
色体またはその染色体上の単一部位をマークするため）、またはパネルで（複数
の部位および／または複数の染色体をマークするため）用いられ得る。好ましい
ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡの非コード領域に対応する。なぜなら、このコー
ド配列は、遺伝子ファミリー内で、より保存されているようであり、従って、染
色体マッピングの間の交差ハイブリダイゼーションの機会を増大するからである
。

【０２０７】 一旦、ポリヌクレオチドが正確な染色体位置にマッピングされると、このポリ
ヌクレオチドの物理的な位置は、連鎖解析において用いられ得る。連鎖解析は、
染色体位置と特定の疾患の提示との間の共遺伝を確立する。（疾患マッピングデ
ータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ、Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔ
ａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで入手可能で
ある）において見出される。）１メガベースマッピング分解能、かつ２０ｋｂあ
たり１遺伝子と仮定して、疾患に関連する染色体領域に正確に位置付けられるｃ
ＤＮＡは、５０〜５００の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。

【０２０８】 従って、一旦、共遺伝が確立されれば、罹患した個体と罹患してない個体との
間のＴＲ１２ポリヌクレオチドおよび対応する遺伝子における相違が試験され得
る。まず、染色体における可視的構造変化（例えば、欠失または転座）が染色体
スプレッドにおいてまたはＰＣＲによって試験される。構造的変化が存在しない
場合は、点変異の存在が確認される。いくつかのまたは全ての罹患した個体にお
いて観察されるが、正常な個体においては観察されない変異は、この変異が疾患
を生じ得ることを示す。しかし、いくつかの正常な個体からの、ＴＲ１２ポリペ
プチドおよび対応する遺伝子の完全な配列決定は、多型性から変異を識別するた
めに必要である。新しい多型性が同定される場合、この多型性ポリペプチドは、
さらなる連鎖解析のために用いられ得る。

【０２０９】 さらに、罹患してない個体と比べて、罹患した個体における遺伝子の増加した
発現または減少した発現が、ＴＲ１２ポリヌクレオチドを用いて評価され得る。
これらの変化（発現変化、染色体再配列、または変異）のいずれも、診断マーカ
ーまたは予後マーカーとして用いられ得る。

【０２１０】 前述に加えて、ＴＲ１２ポリヌクレオチドは、三重らせん形成またはアンチセ
ンスＤＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡを通じて遺伝子発現を制御するために用
いられ得る。両方の方法とも、ＤＮＡまたはＲＮＡに対するポリヌクレオチドの
結合に依存する。これらの技術のために、好ましいポリヌクレオチドは、通常、
２０〜４０塩基長であり、そして転写に関与する遺伝子のいずれかの領域に相補
的である（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ６：３
０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９
８８）；Ｄｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１）を参
照のこと）か、またはｍＲＮＡ自体に相補的である（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ
，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘ
ｙ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９８８））。三重らせん形成は、必要に応じて、ＤＮＡか
らのＲＮＡ転写の遮断（ｓｈｕｔ−ｏｆｆ）を生じ、一方、アンチセンスＲＮＡ
ハイブリダイゼーションは、ｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳をブロックす
る。両方の技術が、モデル系において有効であり、そして本明細書において開示
される情報は、疾患処置の試みにおいて、アンチセンスまたは三重らせんポリヌ
クレオチドを設計するために用いられ得る。

【０２１１】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療において有用である。遺伝子治
療の１つの目標は、遺伝子欠損を修正する試みにおいて、欠損遺伝子を有する生
物へ正常遺伝子を挿入することである。ＴＲ１２は、高度に正確な様式でこのよ
うな遺伝子欠損を標的とする手段を提供する。別の目標は、宿主ゲノム中には存
在しなかった新しい遺伝子を挿入することであり、それによって宿主細胞中に新
しい形質を生成する。

【０２１２】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドはまた、微小な生物学的サンプルから個体を同定す
るために有用である。例えば、米国軍は、その職員を同定するために制限断片長
多型（ＲＦＬＰ）の使用を考慮している。この技術において、個体のゲノムＤＮ
Ａは１つ以上の制限酵素で消化され、そして職員を同定するための固有なバンド
を生じるためにサザンブロットでプローブされる。この方法は、「認識票（Ｄｏ
ｇ ｔａｇ）」（これは、失われたり、交換されたり、または盗まれたりするこ
とにより、決定的な同定を困難にし得る）の現在の限界を受けない。ＴＲ１２ポ
リヌクレオチドは、ＲＦＬＰのためのさらなるＤＮＡマーカーとして使用され得
る。

【０２１３】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドはまた、個体のゲノムの選択された部分の実際の塩
基ごとのＤＮＡ配列を決定することによって、ＲＦＬＰに対する代替として使用
され得る。これらの配列は、このような選択されたＤＮＡ（これは、次いで配列
決定され得る）を増幅しそして単離するためのＰＣＲプライマーを調製するため
に使用され得る。各々の個体が独特のセットのＤＮＡ配列を有するので、この技
術を使用して、個体が同定され得る。一旦、独特のＩＤデータベースが個体につ
いて確立されると、個体が生存していようとまたは死亡していようと、その個体
の決定的な同定が、極めて小さな組織サンプルから行われ得る。

【０２１４】 法医学生物学もまた、本明細書に開示されるようなＤＮＡに基づく同定技術を
使用して利益を得る。組織（例えば、髪または皮膚）、または体液（例えば、血
液、唾液、精液など）のような非常にわずかな生物学的サンプルから得られたＤ
ＮＡ配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。ある先行技術において、ＤＱａク
ラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子のような多型性遺伝子座から増幅された遺伝子配列は、
個体を同定するための法医学生物学において使用される。（Ｅｒｌｉｃｈ， Ｈ
．， ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ． （
１９９２））。一旦、これらの特異的多型性遺伝子座が増幅されると、これらは
１つ以上の制限酵素で消化される。これは、ＤＱａクラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子に
対応するＤＮＡでプローブされたサザンブロットにおけるバンドのセットの同定
を生じる。同様に、ＴＲ１２ポリヌクレオチドは、法医学的目的のための多型性
マーカーとして使用され得る。

【０２１５】 また、特定の組織の供給源を同定し得る試薬についての必要性が存在する。例
えば、未知の起源の組織が提供される場合、法医学においてこのような必要性が
生じる。適切な試薬は、例えば、ＴＲ１２配列から調製される特定の組織に特異
的なＤＮＡプローブまたはプライマーを含み得る。このような試薬のパネルは、
種および／または器官型によって組織を同定し得る。同様の様式で、これらの試
薬は、夾雑物について組織培養物をスクリーニングするために使用され得る。

【０２１６】 ＴＲ１２は、末梢血リンパ球、脾臓、結腸、胸腺、精巣、および骨格筋におい
て発現が見出されているので、ＴＲ１２ポリヌクレオチドは、生物学的サンプル
中に存在する組織または細胞型の示差的同定のためのハイブリダイゼーションプ
ローブとして有用である。同様に、ＴＲ１２ポリペプチドに対するポリペプチド
および抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブを提供
するために有用である。さらに、上記の、特に自己免疫障害または免疫系の他の
障害、止血、血管形成、腫瘍転移、細胞遊走、または神経形成に関する、組織ま
たは細胞の多くの障害については、「標準」のＴＲ１２遺伝子発現レベル（すな
わち、自己免疫障害、あるいは免疫系の他の障害、または止血、血管形成、腫瘍
転移、細胞遊走、もしくは神経形成の障害を有さない個体からの健常組織におけ
るＴＲ１２発現レベル）に対して有意に高いかまたは低いレベルのＴＲ１２遺伝
子発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、ガ
ン性組織および創傷組織）または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、もしく
は髄液）において検出され得る。

【０２１７】 従って、本発明は、障害の診断方法を提供する。この方法は以下を包含する：
（ａ）個体の細胞または体液におけるＴＲ１２遺伝子の発現レベルをアッセイす
る工程；（ｂ）このＴＲ１２遺伝子の発現レベルを、標準のＴＲ１２遺伝子の発
現レベルと比較し、それによって標準の発現レベルと比較して、アッセイされた
ＴＲ１２遺伝子の発現レベルの増加または減少が、自己免疫障害、あるいは免疫
系の他の障害、または止血、血管形成、腫瘍転移、細胞遊走、もしくは神経形成
の障害の指標である、工程。

【０２１８】 少なくとも、ＴＲ１２ポリヌクレオチドは、サザンゲルでの分子量マーカーと
して、特定の細胞型における特定のｍＲＮＡの存在に関する診断用プローブとし
て、新規なポリヌクレオチドを発見するプロセスで公知の配列を「差し引き」す
るためのプローブとして、「遺伝子チップ」または他の支持体に付着させるため
のオリゴマーを選択および作製するため、ＤＮＡ免疫技術を用いて抗ＤＮＡ抗体
を惹起させるため、および免疫応答を誘発する抗原として、使用され得る。

【０２１９】 （ＴＲ１２ポリペプチドの使用） 本発明のＴＲ１２ポリペプチドは、多くの方法に使用され得る。以下の説明は
、例示としてみなされるべきであり、そして公知の技術を使用する。

【０２２０】 本発明のＴＲ１２ポリペプチドは、抗体に基づいた技術を使用して生物学的サ
ンプル中のタンパク質レベルをアッセイするために使用され得る。例えば、組織
におけるタンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法を用いて研究され得る（
Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５
（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：
３０８７−３０９６（１９８７））。タンパク質遺伝子発現を検出するのに有用
である、抗体に基づいた他の方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ
）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のような免疫アッセイが含まれる。適
切な抗体アッセイの標識は、当該分野で公知であり、これには、グルコースオキ
シダーゼのような酵素標識、ならびにヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１
４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、お
よびテクネチウム（９９ｍＴｃ）のような放射性同位体、ならびにフルオレセイ
ンおよびローダミンのような蛍光標識、ならびにビオチンが挙げられる。

【０２２１】 生物学的サンプル中の分泌タンパク質レベルをアッセイすることに加えて、タ
ンパク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質をインビボ
で画像化するための抗体の標識またはマーカーとしては、Ｘ線ラジオグラフィー
、ＮＭＲまたはＥＳＲにより検出可能なものが挙げられる。Ｘ線ラジオグラフィ
ーについては、適切な標識は、検出可能な放射線を発するが、被験体に対して明
白に有害ではないバリウムまたはセシウムのような放射性同位体を含む。ＮＭＲ
およびＥＳＲに適切なマーカーには、重水素のような検出可能な特徴的なスピン
を有するものが含まれ、これは、関連したハイブリドーマのための栄養素を標識
することにより抗体に取り込まれ得る。

【０２２２】 放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線不透過
性物質、または核磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像
化部分で標識された、タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントが、哺乳動
物に（例えば、非経口的、皮下、または腹腔内に）導入される。被験体のサイズ
および用いられる画像化システムが、診断画像を生成するために必要な画像化部
分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、
ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、９９ｍＴｃの約５〜２０
ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは
、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像
化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅ
ｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ
Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒ
ａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒの第１３
章、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。

【０２２３】 従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、この方法は、（ａ）個体の細胞
または体液中のＴＲ１２ポリペプチドの発現をアッセイする工程；（ｂ）この遺
伝子発現レベルを標準の遺伝子発現レベルと比較し、これによって、標準的な発
現レベルと比較して、アッセイされたポリペプチドの遺伝子発現レベルの増加ま
たは減少が、障害の指標である、工程、を包含する。

【０２２４】 さらに、ＴＲ１２ポリペプチドを用いて疾患を処置し得る。例えば、患者は、
ＴＲ１２ポリペプチドの非存在またはレベルの減少を元に戻すこと、異なるポリ
ペプチドの非存在またはレベルの減少を補充すること、ポリペプチドの活性を阻
害すること、ポリペプチドの活性を（例えば、レセプターに結合することによっ
て）活性化すること、遊離リガンド（例えば、炎症を低減させる際に用いられる
可溶性ＴＮＦレセプター）と膜結合レセプターまたはリガンドと競合させること
によって膜結合レセプターまたはリガンドの活性を減少させること、または所望
の応答（例えば、血管の増殖および／または形成）をもたらすことに取り組む際
に、ＴＲ１２ポリペプチドが投与され得る。

【０２２５】 同様に、ＴＲ１２ポリペプチドに対する抗体もまた使用されて疾患を処置し得
る。例えば、ＴＲ１２ポリペプチドに対する抗体の投与によって、ポリペプチド
に結合して、そしてポリペプチドの過剰産生を低減し得る。同様に、抗体の投与
によって、例えば、膜に結合したポリペプチド（レセプター）へ結合することに
より、ポリペプチドを活性化し得る。

【０２２６】 少なくともＴＲ１２ポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用され得
る。ＴＲ１２ポリペプチドを用いてもまた、抗体を惹起し得、次いで、この抗体
を使用して、宿主細胞の形質転換を評価する方法として、組換え細胞からのタン
パク質発現を測定する。さらに、ＴＲ１２ポリペプチドを使用して、生物学的活
性を試験し得る。

【０２２７】 （ＴＲ１２の生物学的活性） 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーリガンドは、なかでも最も多面的なサイト
カインであることが公知である。これは、細胞傷害性、抗ウイルス活性、免疫調
節活性、およびいくつかの遺伝子の転写調節を含む多数の細胞性応答を誘導する
（Ｇｏｅｄｄｅｌら、「Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ：Ｇｅｎ
ｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅ
ｓ」Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：５９７〜６０９（１９８６）、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ；ＢｅａｔｌｅｒおよびＣｅｒａｍｉ、Ａ
ｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：５０５〜５１８（１９８８）；Ｏｌｄ
，Ｓｃｉ．Ａｍ．２５８：５９〜７５（１９８８）；Ｆｉｅｒｓ、ＦＥＢＳ Ｌ
ｅｔｔ．２８５：１９９〜２２４（１９９１））。ＴＮＦファミリーリガンドは
、本発明のＴＲ１２ポリペプチドを含むＴＮＦ−ファミリーレセプターに結合す
ることによりこのような種々の細胞性応答を誘導する。

【０２２８】 本発明のＴＲ１２ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／また
はアンタゴニストは、ＴＲ１２の欠陥または欠損レベルにより（直接または間接
的に）媒介される任意の疾患または障害に罹患する患者（例えば、哺乳動物、好
ましくはヒト）に投与され得る。あるいは、遺伝子治療アプローチは、このよう
な疾患または障害を処置するために適用され得る。本発明の１つの実施形態にお
いて、ＴＲ１２ポリヌクレオチド配列は、欠損遺伝子を含むムテインＴＲ１２遺
伝子を検出するために用いられる。ムテイン遺伝子は、インビトロ診断アッセイ
において、およびこの遺伝子において欠損を保有する疑いのある患者から得られ
たＴＲ１２遺伝子の配列と本明細書において開示されるＴＲ１２ヌクレオチド配
列との比較により、同定され得る。欠損遺伝子は、当業者に公知の技術を用いて
、正常なＴＲ１２コード遺伝子で置換され得る。

【０２２９】 別の実施形態において、本発明のＴＲ１２ポリペプチド、ポリヌクレオチド、
アゴニストおよび／またはアンタゴニストは、種々の細胞型へのＴＮＦリガンド
／ＴＲ１２相互作用を阻害することから生じる表現型効果を研究するための研究
ツールとして用いられる。ＴＲ１２ポリペプチドおよびアンタゴニスト（例えば
、ＴＲ１２に対するモノクローナル抗体）はまた、ＴＲ１２リガンドもしくはＴ
Ｒ１２またはそれらの相互作用を検出するためにインビトロアッセイにおいて用
いられ得る。

【０２３０】 ＴＮＦファミリーの特定のリガンドが１つより多い別の細胞表面レセプタータ
ンパク質に結合することが報告されている。別の実施形態において、精製したＴ
Ｒ１２ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアンタゴニストが内因性細胞表
面ＴＲ１２へのＴＲ１２リガンドの結合を阻害するために用いられる。ＴＲ１２
リガンド結合についての競合により、本発明の可溶性ＴＲ１２ポリペプチドは、
細胞表面ＴＲ１２とだけでなく、ＴＲ１２と異なるＴＲ１２リガンドレセプター
タンパク質ＴＲ１２リガンドとの相互作用をも阻害するように使用され得る。従
って、さらなる実施形態において、本発明のＴＲ１２ポリヌクレオチド、ポリペ
プチド、アゴニストおよび／またはアンタゴニストは、インビトロ手順またはイ
ンビボ手順において、ＴＲ１２リガンドの機能的活性を阻害するために用いられ
る。細胞表面レセプターへのＴＲ１２リガンドの結合阻害により、ＴＲ１２はま
た、内因性レセプターへのＴＲ１２リガンドの結合から生じる生物学的効果を阻
害する。ＴＲ１２の種々の形態が用いられ得る。これには、例えば、ＴＲ１２リ
ガンドに結合し得る上記のＴＲ１２フラグメント、誘導体および改変体が挙げら
れる。好ましい実施形態において、可溶性ＴＲ１２は、ＴＲ１２リガンドの機能
的活性を阻害するために、例えば、ＴＲ１２リガンド媒介アポトーシス、または
このようなアポトーシスもしくは細胞シグナル伝達に感受性の細胞の細胞シグナ
ル伝達を阻害するために使用される。従って、さらなる実施形態において、ＴＲ
１２は、ＴＲ１２リガンド媒介障害を処置するために哺乳動物（例えば、ヒト）
に投与される。このようなＴＲ１２リガンド媒介障害は、ＴＲ１２リガンドによ
って（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化する状態を含む。

【０２３１】 本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あるいは
それらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、広範な種々の疾患および
／または状態の診断および処置または予防に有用である。このような疾患および
状態としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：癌（例えば、免疫細
胞関連癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、濾胞性リンパ腫、ｐ５３の変異または変化
と関連する癌、脳腫瘍、膀胱癌、子宮頸部癌、大腸癌、結腸直腸癌、肺の非小細
胞癌腫、肺の小細胞癌腫、胃癌、など）、リンパ球増殖性障害（例えば、リンパ
節症）、微生物（例えば、 ウイルス性、細菌性などの）感染（例えば、ＨＩＶ
−１感染、ＨＩＶ−２感染、ヘルペスウイルス感染症（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２
、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ＥＢＶを含むがこれに限定されな
い）、アデノウィルス感染症、ポックスウィルス感染、ヒト乳頭腫ウィルス感染
、肝炎感染（例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶなど）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅ
ｒ ｐｙｌｏｒｉ感染、侵入性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉａなど）、寄生虫感
染症、腎炎、骨疾患（例えば、骨粗鬆症）、アテローム性動脈硬化、疼痛、心血
管障害（例えば、血管新生、低血管新生（ｈｙｐｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉ
ｏｎ）または循環低下（例えば、虚血性疾患（例えば、心筋梗塞、発作、など）
））ＡＩＤＳ、アレルギー、炎症、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、
パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳退化など）（移植片
拒絶（急性および慢性）、移植片対宿主病、骨髄形成異常症に起因する疾患（例
えば、再生不良性貧血、など）、リウマチの関節組織破壊、肝疾患（例えば、急
性肝炎および慢性肝炎、肝損傷、および肝硬変）、自己免疫性疾患（例えば、多
発性硬化症、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、免疫複合体糸球体腎
炎、自己免疫性糖尿病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グレーヴス病、橋本甲
状腺炎、など）、心筋症（例えば、拡張型心筋症）、糖尿病、糖尿病合併症（例
えば、糖尿病性腎障害、糖尿病性ニューロパシー、糖尿病性網膜症）、インフル
エンザ、喘息、乾癬、糸球体腎炎、敗血症性ショックおよび潰瘍性大腸炎。

【０２３２】 本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あるいは
それらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、脈管形成の促進、造血の
調節および創傷治癒（例えば、創傷、熱傷、および骨折）において有用である。

【０２３３】 本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドならびに／あるいはそ
れらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストはまた、特定抗原に対する免疫
応答性（抗ウイルス性免疫応答）を強化するためにアジュバントとして有用であ
る。

【０２３４】 より通常には、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはアゴ
ニストもしくはアンタゴニストは、免疫応答を調節（すなわち、上昇するかまた
は減らすこと）において有用である。例えば、本発明のポリヌクレオチド、ポリ
ペプチドおよび／または、アゴニストもしくはアンタゴニストは、外科、外傷、
放射線療法、薬物療法および移植物の準備またはそれらからの回復に有用であり
得るか、あるいは老齢および免疫無防備状態の個体における免疫応答および／ま
たは回復をブーストすために使用され得る。あるいは本発明のポリヌクレオチド
、ポリペプチドおよび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、例えば、
自己免疫性障害の治療または予防において免疫抑制因子として有効である。特定
の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または
アゴニストもしくはアンタゴニストは、本明細書において記載されているような
、さもなければ当該分野で公知の、慢性の炎症、アレルギー状態または自己免疫
性状態を処理するかまたは予防するために用いられる。

【０２３５】 より一般的には、ＴＲ１２ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはアゴ
ニストもしくはアンタゴニスト（例えば、ＴＲ１２に結合する分子）は、１つ以
上の生物学的活性について試験するためのアッセイにおいて用いられ得る。ＴＲ
１２ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはＴＲ１２に結合する分子が、
特定のアッセイにおいて活性を提示する場合、ＴＲ１２が生物学的活性と関連す
る疾患に関係し得る可能性がある。従って、ＴＲ１２、またはＴＲ１２に結合す
る分子は、関連する疾患を処置するために用いられ得る。

【０２３６】 （免疫活性） 上記のように、ＴＲ１２は、例えば、ＰＢＬ、脾臓および胸腺のような免疫細
胞および組織において発現される。従って、ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくは
ポリペプチド、またはＴＲ１２のアゴニストもしくはアンタゴニスト（例えば、
ＴＲ１２に結合する分子）は、免疫細胞の増殖、分化、または移動（走化性）を
活性化するかまたは抑制することによって、免疫系の欠損または障害を処置する
ことにおいて有用であり得る。免疫細胞は、多能性幹細胞から骨髄性細胞（血小
板、赤血球、好中球、およびマクロファージ）およびリンパ系（ＢおよびＴリン
パ球）細胞を産生する造血と称されるプロセスを介して発生する。これらの免疫
不全または障害の病因は、遺伝性、体細胞性（例えば、ガンまたはいくつかの自
己免疫障害）、後天性（例えば、化学治療または毒素による）、または感染性で
あり得る。さらに、ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＴ
Ｒ１２のアゴニストもしくはアンタゴニストは、特定の免疫系疾患または障害の
マーカーまたは検出因子として使用され得る。

【０２３７】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＴＲ１２のアゴニス
トもしくはアンタゴニストは、造血細胞の欠損または障害を処置または検出する
際に有用であり得る。ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または
ＴＲ１２のアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して、特定の（または多く
の）型の造血細胞の減少に関連する障害を処置するための取り組みにおいて、多
能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増殖を増加させ得る。免疫学的な不全症
候群の例には、以下が挙げられるがそれらに限定されない：血液タンパク質障害
（例えば、無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症（ｄｙｓｇａｍｍ
ａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ））、毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不
全、ディ・ジョージ（Ｄｉｇｅｏｒｇｅ）症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬ
Ｖ感染、白血球接着不全症候群、リンパ球減少、食細胞殺菌機能不全、重症複合
型免疫不全（ＳＣＩＤ）、ヴィスコット−オールドリッチ障害、貧血、血小板減
少症、または血色素尿。

【０２３８】 本発明のＴＲ１２ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、造血細胞の増殖および分化を阻害するために使用さ
れ得、従って、化学療法の間、化学療法剤から骨髄幹細胞を防御するために使用
され得る。この抗増殖効果は、化学療法剤のより高い用量の投与を可能にし得、
従って、より効果的な化学療法処置を可能にし得る。あるいは、本発明のＴＲ１
２ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはアゴニストもしくはアンタゴ
ニストは、造血細胞の増殖および／または分化を刺激するために（例えば、リン
パ生成および／または赤血球形成を刺激するために）使用され得る。

【０２３９】 本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、未熟な造血前駆細
胞、例えば顆粒球、マクロファージまたは単核細胞（例えば、ＣＤ３４＋、ｋｉ
ｔ＋）の分化を一時的に防ぐことによって、それらを拡大するために用いられ得
る。これらの骨髄細胞は、インビトロで培養され得る。このように、ＴＲ１２は
、骨髄移植および／または遺伝子治療の目的でインビトロにおいて造血幹細胞の
モジュレータとして有用であり得る。分裂している細胞を迅速に殺傷する５−Ｆ
ｕのような細胞毒の存在下で、細胞を培養することによって、幹細胞は富化され
得る。一方、幹細胞は、ＴＲ１２ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／また
はアゴニストもしくはアンタゴニストによって保護される。これらの幹細胞は、
骨髄移植患者に戻され得るかまたは次に遺伝子治療のための所望の遺伝子のトラ
ンスフェクションのために用いられ得る。さらに、ＴＲ１２ポリヌクレオチド、
ポリペプチドおよび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、動物の骨髄
から末梢血液への幹細胞の放出を生じる動物に注射され得る。これらの幹細胞は
、遺伝子治療のための自家骨髄移植または操作の目的で単離され得る。患者が化
学療法または放射線療法の処置を終えた後、単離された幹細胞は患者に戻され得
る。

【０２４０】 さらに、ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＴＲ１２の
アゴニストもしくはアンタゴニストはまた、止血活性（出血中止）または血栓溶
解性活性（血餅形成）を調節するために用いられ得る。例えば、止血活性または
血栓溶解性活性を増大することにより、ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドまたはＴＲ１２のアゴニストもしくはアンタゴニストは、血液凝固障害（
例えば、無フィブリノーゲン血症、因子欠乏）、血小板障害（例えば、血小板減
少症）、または、外傷、外科もしくは他の原因から生じる創傷を処置するために
用いられ得る。あるいは、ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ま
たはＴＲ１２のアゴニストもしくはアンタゴニスト（止血活性または血栓溶解性
活性を低下し得る）は、心臓発作（梗塞）、発作（ｓｔｒｏｋｅ）、または瘢痕
の治療において重要である、凝固を阻害するかまたは溶解するために用いられ得
る。

【０２４１】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＴＲ１２のアゴニス
トもしくはアンタゴニストはまた、自己免疫性障害を処理するかまたは検出する
ことに有用であり得る。多くの自己免疫性障害は、免疫細胞による外来物質とし
ての自己の不適切な認識から生じる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊を導
く免疫応答を生じる。従って、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性
を阻害し得るＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはＴＲ１２の
アゴニストもしくはアンタゴニストの投与は、自己免疫性障害を防ぐ際に効果的
な治療であり得る。

【０２４２】 処置または検出され得る自己免疫性障害の例としては、以下が挙げられるが、
それらに限定されない：アディソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、慢性関
節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症
候群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、眼炎、水疱性類天
疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑、ライター病、スティッフマン症候群、
自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺炎症、ギヤンバレ
ー症候群、インスリン依存性真性糖尿病、および自己免疫炎症性眼病。

【０２４３】 同様に、喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸問題のようなアレルギ
ー性反応および状態はまた、ＴＲ１２ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、
またはＴＲ１２のアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置され得る。さら
に、これらの分子を用いてアナフィラキシー（抗原性分子に対する過敏症）また
は血液型不適合性を処置し得る。

【０２４４】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＴＲ１２のアゴニス
トもしくはアンタゴニストはまた、器官拒絶または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ
）を処置および／または予防するために用いられ得る。器官拒絶は、宿主免疫細
胞による、免疫応答を介した移植された組織の破壊により生じる。同様に、免疫
応答はまた、ＧＶＨＤに関与するが、この場合、外来の移植された免疫細胞は宿
主組織を破壊する。免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化、または走化性を阻害す
るＴＲ１２ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはＴＲ１２のアゴニス
トもしくはアンタゴニストの投与は、器官拒絶またはＧＶＨＤを予防するのに有
効な治療であり得る。

【０２４５】 同様に、ＴＲ１２ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはＴＲ１２の
アゴニストもしくはアンタゴニストはまた、炎症を調節するために用いられ得る
。例えば、ＴＲ１２ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはＴＲ１２の
アゴニストもしくはアンタゴニストは、炎症性応答に関与する細胞の増殖および
分化を阻害し得る。これらの分子は、以下を含む炎症状態（慢性および急性の両
方の状態）を処置するために使用され得る：感染に関連した炎症（例えば、敗血
症性ショック、敗血症、または全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血性再
灌流傷害、内毒素死亡、関節炎、補体媒介性超急性拒絶、腎炎、サイトカインま
たはケモカイン誘導性肺傷害、炎症性腸疾患、クローン病、またはサイトカイン
（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰産生からもたらされる状態。

【０２４６】 （過剰増殖性障害） ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＴＲ１２のアゴニス
トもしくはアンタゴニスト（例えば、ＴＲ１２を結合する分子）は、新生物を含
む過剰増殖性障害を処置または検出するために用いられ得る。ＴＲ１２ポリヌク
レオチドもしくはポリペプチド、またはＴＲ１２のアゴニストもしくはアンタゴ
ニストは、直接的相互作用または間接的相互作用を通じて障害の増殖を阻害し得
る。あるいは、ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＴＲ１
２のアゴニストもしくはアンタゴニストは、過剰増殖性障害を阻害し得る他細胞
を増殖させ得る。

【０２４７】 例えば、過剰増殖性障害は、免疫応答を増大するか、特に過剰増殖性障害の抗
原性の質を増大するか、またはＴ細胞を増殖、分化、または動員することによっ
て、処置され得る。この免疫応答は、既存の免疫応答を強化することによってか
、または新規な免疫応答を始めることによってのいずれかで増やされ得る。ある
いは、免疫応答を減少させることは、また、過剰増殖性障害を処理する方法（例
えば化学療法剤）であり得る。

【０２４８】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＴＲ１２のアゴニス
トもしくはアンタゴニストにより処理または検出され得る過剰増殖性障害の例と
しては、以下に位置する腫瘍を含むが、これらに限定されない：腹部、骨、乳房
、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣
、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経（中枢神経および末梢神経）、リンパ系、
骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部および尿生殖器。

【０２４９】 同様に、他の過剰増殖性障害は、また、ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチド、またはＴＲ１２のアゴニストもしくはアンタゴニストによって処理
または検出され得る。このような過剰増殖性障害の例としては、以下が挙げられ
るがこれらに限定されない：高γグロブリン過剰血症、リンパ球増殖性障害、パ
ラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュ
トレームのマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、および上記に列
挙した器官系に位置付けられる新形成に加えて任意の他の過剰増殖性疾患。

【０２５０】 （心血管系の障害） ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＴＲ１２のアゴニス
トもしくはアンタゴニスト（ＴＲ１２をコードする）は、末梢の動脈疾患（例え
ば四肢虚血）を含む心血管障害を処置するために用いられ得る。

【０２５１】 心血管障害は、心血管異常（例えば、動脈瘻、動静脈瘻、脳動静脈奇形、先天
の心臓欠損、肺動脈弁閉鎖およびシミター症候群）を含む。先天の心臓欠損は、
大動脈絞窄、三房心、冠血管異常、交差心臓、右胸心症、動脈管開存症、エブス
タイン奇形、アイゼンメンガー複合体、左心室発育症候群、左胸心症、ファロー
四徴症、大血管転位、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖症、動脈管遺残および心
中隔欠損（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損、心内膜床欠損症、リュタンバッシェ
症候群、ファロー三徴症、心室性心中隔欠損）を含む。

【０２５２】 心血管障害はまた、以下を含む：心疾患、例えば不整脈、カルチノイド心疾患
、高い心拍出量、低心拍出量、心臓タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、
心臓動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心臓
性水腫、心臓肥大、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心臓破裂
、心室中隔破裂、心臓弁膜症、心筋疾患、心筋虚血症、心内膜液滲出、心外膜炎
（収縮性および結核性を含む）、気心膜症、心膜切開後症候群、右心疾患、リウ
マチ性心疾患、心室性機能不全、充血、心血管妊娠合併症、シミター症候群、心
血管梅毒および心血管結核症。

【０２５３】 不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダ
ムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、遺伝性ＱＴ延長症候群、
副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群、マヘーム（Ｍａｈａｉｍ）型
早期興奮症候群、ウルフ−パーキンソン（ＷＰＷ）症候群、洞不全症候群、頻脈
および心室性細動が挙げられる。頻脈としては、発作性頻拍、上室性頻拍症、心
室固有調律促進、房室結節のリエントリ頻脈、異所性心房性頻脈、異所性の接合
部頻拍症、洞房結節のリエントリ頻脈、洞性頻脈、トルサード・ド・ポワント（
Ｔｏｒｓａｄｅｓ ｄｅ Ｐｏｉｎｔｅｓ）および心室性頻拍症が挙げられる。

【０２５４】 心臓弁膜症としては、大動脈弁機能不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音、大動脈
弁脱出症、僧帽弁逸脱、三尖弁脱出症、僧帽弁機能不全症、僧帽弁狭窄症、肺動
脈弁閉鎖症、肺動脈弁不全、肺動脈弁狭窄、三尖弁閉鎖症、三尖弁機能不全症お
よび三尖弁狭窄症が挙げられる。

【０２５５】 心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、大
動脈の弁下部狭窄、肺の弁下部狭窄、拘束型心筋症、シャーガス心筋症、心内膜
線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害および心筋炎
が挙げられる。

【０２５６】 心筋虚血症としては、冠状血管疾患（例えば狭心症、冠状血管動脈瘤、冠状動
脈硬化症、冠動脈血栓症、冠血管痙攣、心筋梗塞および心筋の気絶（ｓｔｕｎｎ
ｉｎｇ））が挙げられる。

【０２５７】 心血管疾患はまた、血管疾患（例えば動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌
性血管腫症状、Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ病、クリペル−トルノネーウェーバ
ー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、血管神経性浮腫、大動脈疾患、高安動
脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、動脈閉塞性疾患、動脈炎、動脈外膜炎、結
節性多発動脈炎、脳血管障害、糖尿病性、脈管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、
血栓症、肢端紅痛症、痔核、肝静脈閉塞病、高血圧、低血圧、乏血、末梢血管疾
患、静脈炎、肺静脈閉塞性疾患、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞
、シミター症候群、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張性運動失調
（ａｔａｃｉａ）、遺伝性出血性毛細血管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静脈、
静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈不全が挙げられる。

【０２５８】 動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽性動脈瘤、感染性動脈瘤、破裂性大動脈瘤
、大動脈瘤、脳動脈瘤、冠動脈瘤、心臓動脈瘤および腸骨の動脈瘤が挙げられる
。

【０２５９】 動脈閉塞性疾患としては、動脈硬化、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形
成異常、腸間膜の血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞症、網膜動脈閉塞および閉
塞性血栓性血管炎が挙げられる。

【０２６０】 脳血管障害としては、頚動脈疾患、大脳のアミロイド脈管障害、脳動脈瘤、脳
無酸素症、脳動脈硬化症、脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、大脳の塞栓症および血
栓症、頸動脈血栓症、静脈洞血栓症、ヴァレンベルグ症候群、脳出血、硬膜外血
腫、硬膜下血腫、くも膜下出血、脳梗塞、脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈
盗血症候群、脳室周囲白質軟化症（ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、血管性頭痛、
群発性頭痛、片頭痛および椎骨脳底動脈不全症が挙げられる。

【０２６１】 塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チア
ノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症および血栓塞栓症を含む。血栓症は、
冠動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、静脈洞血栓症、ヴ
ァレンベルグ症候群および血栓性静脈炎が挙げられる。

【０２６２】 虚血としては、脳虚血、虚血性大腸炎、仕切り症候群、前仕切り（ａｎｔｅｒ
ｉｏｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）症候群、心筋虚血症、再灌流障害および末梢
の四肢虚血が挙げられる。脈管炎としては、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット症
候群、チャーグ−ストラウス症候群、粘膜皮膚リンパ節症候群、閉塞性血栓性血
管炎、過敏症脈管炎、シシェーンライン−ヘーノホ（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ−Ｈ
ｅｎｏｃｈ）紫斑病、アレルギー性皮膚血管炎およびヴェーグナー（Ｗｅｇｅｎ
ｅｒ）肉芽腫症が挙げられる。

【０２６３】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＴＲ１２のアゴニス
トもしくはアンタゴニストは、特に、危険な四肢虚血および冠状血管疾患の治療
のために有効である。実施例に示すように、実験的に誘導された虚血ウサギ後肢
に対するＴＲ１２ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの投与は、血液圧力比、
血流量、血管造影スコアおよび毛細管密度を回復し得る。

【０２６４】 ＴＲ１２ポリペプチドは、送達部位での直接の注射針注射、静脈内注射、局所
投与、カテーテル注入、微粒子銃の注射器、粒子加速器、ゲルフォームのスポン
ジデポ製剤、他の市販のデポ製剤材料、浸透圧ポンプ、経口または坐剤の固形の
薬学的処方物、外科の間のデカントまたは局所的適用、エアロゾル送達を含むが
これに限らない、当該分野で公知の任意の方法を使用して投与され得る。このよ
うな方法は、従来技術において公知である。ＴＲ１２ポリペプチドは、以下によ
り詳細に記載される、薬学的組成物の一部として投与され得る。ＴＲ１２ポリヌ
クレオチドを送達する方法は、本明細書においてさらに詳細に記載されている。

【０２６５】 （抗新脈管形成活性） 新脈管形成の内因性の刺激因子およびインヒビターとの間の天然に生じる平衡
は、阻害影響が優勢である平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ ５
６：３４５〜３５５（１９８９）。新生血管形成が正常な生理学的条件下におい
て生じるまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プ
ロセス）において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的
に定められる。病的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける）
下において、これらの調節コントロールはできない。調節されていない新脈管形
成は病的になり、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持
する。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型
の眼の障害、および乾癬を含む、異常な新生血管形成により支配される。例えば
、Ｍｏｓｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋ
ｍａｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜１７６３（１９９
５）；Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜
４１１（１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ
、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；および
Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７１９〜７２５（１９８３）によ
る概説を参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その
疾患状態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示
唆する有意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕ
ｎ、Ｓｃｅｉｎｃｅ ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。

【０２６６】 本発明は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドおよび／またはＴＲ１２ポリペプチド、
ならびにＴＲ１２のアゴニストまたはアンタゴニストの投与による新生血管形成
に関連する疾患または障害の処置を提供する。本発明のポリヌクレオチドおよび
ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置し得る悪
性状態および転移性状態には、本明細書に記載の、および他の当該分野で公知の
悪性腫瘍、固形腫瘍、および癌（このような障害の総説については、Ｆｉｓｈｍ
ａｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，
Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）が挙げられるが、これら
に限定されない。

【０２６７】 本発明のＴＲ１２ポリヌクレオチドおよびＴＲ１２ポリペプチド（ＴＲ１２の
アンタゴニストおよび／またはアゴニストを含む）を用いて処置され得る新生血
管形成に関連する眼の障害には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
血管新生緑内障、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜
炎、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性
疾患、眼の腫瘍、および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾患。例え
ば、Ｗａｌｔｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４〜７１０（１
９７８）およびＧａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１〜
３１２（１９７８）による総説を参照のこと。

【０２６８】 さらに、本発明のＴＲ１２ポリヌクレオチドおよびＴＲ１２ポリペプチド（Ｔ
Ｒ１２アゴニストおよび／またはＴＲ１２アゴニストを含む）で処置され得る障
害としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：血管腫、関節炎、乾
癬、血管線維腫、アテローム性プラーク、遅延型創傷治癒、顆粒化、血友病性関
節、過形成性瘢痕、偽関節骨折、オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂ
ｅｒ）症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、および血管接着。

【０２６９】 さらに、本発明のＴＲ１２ポリヌクレオチド、ＴＲ１２ポリペプチド（ＴＲ１
２アゴニストおよび／またはＴＲ１２アゴニストを含む）で処置され得る障害お
よび／または状態としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：固形
腫瘍、血液由来の（ｂｌｏｏｄ ｂｏｒｎ）腫瘍（例えば、白血病）、腫瘍転移
、カポージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコー
マ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、乾癬、眼の脈管形成疾患（例え
ば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障
、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、およびブドウ膜炎（ｕｖ
ｉｅｔｉｓ））、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、脈管形成、顆粒化、過形成性瘢
痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラコーマ、血管接着、心筋の新脈管形
成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、
動静脈奇形、虚血性四肢新脈管形成、オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗ
ｅｂｂｅｒ）症候群、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、
血管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆粒化、クローン病、アテローム性動脈硬
化症、産児制限薬剤（月経を制御する、胎芽着床のために必要な血管新生を予防
することによる）、病原性の結果（例えば、ネコ引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ
ｍｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙ
ｌｏｒｉ）、バルトネラ症および細菌性血管腫症状）のような新脈管形成を有す
る疾患。

【０２７０】 （細胞レベルでの疾患） ＴＲ１２ポリペプチドを発現する細胞およびＴＲ１２リガンドに対して強力な
細胞応答を有すると考えられている細胞には、末梢血リンパ球、脾臓、結腸、胸
腺、精巣、および骨格筋組織が含まれる。「ＴＮＦファミリーリガンドに対する
細胞応答」とは、ＴＮＦファミリーリガンドによって導入される、任意の、細胞
、細胞株、組織、組織培養物、または患者に対する遺伝子型の変化、表現型の変
化、および／または形態学的な変化を意図する。示されるように、このような細
胞応答には、ＴＮＦファミリーリガンドに対する通常の生理学的応答が含まれる
だけではなく、増加したアポトーシスもしくは細胞シグナル伝達、またはアポト
ーシスの阻害または細胞シグナル伝達に関連する疾患もまた含む。アポトーシス
−プログラムされた細胞死は、免疫系の末梢Ｔリンパ球の欠失に関与する生理的
メカニズムであり、そしてその調節不全は、多数の異なる病原性プロセスをもた
らし得る（Ａｍｅｉｓｅｎ，ＡＩＤＳ ８：１１９７−１２１３（１９９４）；
Ｋｒａｍｍｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２７９−２８９
（１９９４））。

【０２７１】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ１２ポリペプチドならびにＴＲ１２のア
ンタゴニストまたはアゴニストによって処置または検出され得る細胞生存の増大
またはアポトーシスの阻害に関連する疾患には、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、
ｐ５３変異を有する癌腫、およびホルモン依存性腫瘍、これらは以下：結腸癌、
心臓性腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸の癌、
精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、
骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫および卵
巣癌を含むが、これらに限定されない）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症
、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈ
ｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトー
デスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）およびウイルス感染
（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症
、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶、が挙げられる
。好ましい実施形態において、ＴＲ１２ポリヌクレオチド、ＴＲ１２ポリペプチ
ド、および／または本発明のアンタゴニストは、特に上記に列挙されるか、また
は引き続く段落において、癌の増殖、進行、および／または転移（ｍｅｔａｓｉ
ｓ）を阻害するために使用される。

【０２７２】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはＴＲ１２ポリペプチド、またはＴＲ１２の
アゴニストもしくはアンタゴニストによって処置あるいは検出され得る細胞生存
の増大に関連するさらなる疾患または状態には、悪性疾患の進行および／または
転移ならびに以下のような関連する障害が挙げられるが、これらに限定されない
：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄
芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）なら
びに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性
白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキ
ン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、
ならびに固形腫瘍（肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、
軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓ
ａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング
腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、
扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢
胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミ
ノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣の腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、
膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室
上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍ
ｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）を含むが
、これらに限定されない）。

【０２７３】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ１２ポリペプチド、ならびにＴＲ１２の
アゴニストまたはアンタゴニストによって処置または検出され得るアポトーシス
の増大に関連する疾患には、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例え
ば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、
小脳変性および脳腫瘍または以前に関連した疾患）；自己免疫障害（例えば、多
発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット
病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エ
リテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、脊髄形
成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性傷害（心
筋梗塞、発作および再灌流傷害によって生じるようなもの）、肝臓傷害（例えば
、肝炎関連肝臓傷害、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ
）（胆管傷害）および肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコールによって生じ
るようなもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。

【０２７４】 さらに、ＨＩＶに関連する多くの病理（ＨＩＶ誘導性のネフロパシーおよびＨ
ＩＶ脳炎を含む）がアポトーシスによって媒介される。従って、さらなる好まし
い実施形態において、本発明のＴＲ１２ポリヌクレオチド、ＴＲ１２ポリペプチ
ド、および／またはＴＲ１２アゴニストもしくはＴＲ１２アンタゴニストが、Ａ
ＩＤＳおよびＡＩＤＳに関連する病理を処置するために使用される。

【０２７５】 （創傷治癒および上皮細胞増殖） 本発明のなおさらなる局面に従って、ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはポリペ
プチド、ならびにＴＲ１２のアゴニストまたはアンタゴニストを、治療目的のた
め、例えば、創傷治癒の目的のために上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを
刺激するため、ならびに毛包産生および皮膚創傷の治癒を刺激するために、利用
するためのプロセスが提供される。ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ１２ポ
リペプチド、ならびにＴＲ１２のアゴニストまたはアンタゴニストは、以下を含
む創傷治癒を刺激することにおいて臨床的に有用であり得る：外科的創傷、切除
の創傷、深い創傷（真皮および表皮の損傷を含む）、眼組織の創傷、歯の組織の
創傷、口腔の創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚の潰瘍、肘の潰瘍、動脈性の潰瘍、静脈
うっ滞潰瘍、熱または化学物質への曝露から生ずる熱傷、および他の異常な創傷
治癒状態（例えば、尿毒症、栄養失調、ビタミン欠乏、ならびにステロイド、放
射能療法および抗腫瘍性薬物および代謝拮抗物質を用いる全身性処置に関連する
合併症。ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ１２ポリペプチド、ならびにＴＲ
１２のアゴニストまたはアンタゴニストは、皮膚の欠失に続く皮膚の回復を促進
するために使用され得る。

【０２７６】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはＴＲ１２ポリペプチド、ならびにＴＲ１２
のアゴニストもしくはアンタゴニストは、創傷床（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）への皮
膚移植片の付着を増大するため、および創傷床からの再上皮形成を刺激するため
に使用され得る。以下は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ１２ポリペプチ
ド、ＴＲ１２のアゴニストまたはアンタゴニストが創傷床への付着を増大するた
めに使用され得る、移植片の型である：自家移植片、人工皮膚、同種移植片（ａ
ｌｌｏｇｒａｆｔ）、自己植皮片、自己表皮移植片（ａｕｔｏｅｐｄｅｒｍｉｃ
ｇｒａｆｔ）、無血管性（ａｖａｃｕｌａｒ）移植片、ブレア−ブラウン移植
片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移植片、遅延移植片、皮膚移植片、表皮移
植片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、異種移植片（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ
ｇｒａｆｔ）、異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）、同種移植片（ｈｏｍｏｌｏ
ｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、増殖性移植片、層板状の移植片、網状移植片、粘膜移
植片、オリエ−ティールシュ移植片、大網移植片（ｏｍｅｎｐａｌ ｇｒａｆｔ
）、パッチの移植片、茎状移植片、全層移植片（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｇｒ
ａｆｔ）、分層植皮片、分層皮膚移植片。ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ
１２ポリペプチド、ならびにＴＲ１２のアゴニストまたはアンタゴニストは、皮
膚の強度を助長するため、および高齢の皮膚の外見を改善するために使用され得
る。

【０２７７】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ１２ポリペプチド、ならびにＴＲ１２の
アゴニストまたはアンタゴニストはまた、肝細胞増殖、および肺、乳房、膵臓、
胃、小腸（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｇ）、および大腸における上皮細胞増
殖における変化を生じ得る。ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ１２ポリペプ
チド、ならびにＴＲ１２のアゴニストもしくはアンタゴニストは、上皮細胞（例
えば、皮脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、毛包、肝実質細胞、肺胞上皮細胞ＩＩ型
（ｔｙｐｅ ＩＩ ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅ）、ムチン産生杯細胞、および他の上
皮細胞、ならびに皮膚、肺、肝臓、および胃腸管内に含まれるそれらの先祖）の
増殖を促進し得る。ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ１２ポリペプチド、Ｔ
Ｒ１２のアゴニストもしくはアンタゴニストは、内皮細胞、ケラチノサイト、お
よび基底ケラチノサイトの増殖を促進し得る。

【０２７８】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ１２ポリペプチド、ならびにＴＲ１２の
アゴニストまたはアンタゴニストはまた、照射、化学療法処置またはウイルス感
染から生じる腸の毒性の副作用を低減するために使用され得る。ＴＲ１２ポリヌ
クレオチドまたはＴＲ１２ポリペプチド、ならびにＴＲ１２のアゴニストまたは
アンタゴニストは、小腸粘膜上で細胞保護的な効果を有し得る。ＴＲ１２ポリヌ
クレオチドまたはＴＲ１２ポリペプチド、ならびにＴＲ１２のアゴニストまたは
アンタゴニストはまた、化学療法およびウイルス感染から生じる粘膜炎（ｍｕｃ
ｏｓｉｔｉｓ）（口潰瘍）の治癒を刺激し得る。

【０２７９】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ１２ポリペプチド、ならびにＴＲ１２の
アゴニストもしくはアンタゴニストは、熱傷を含む、完全なおよび部分的な厚さ
の皮膚欠損における皮膚の十分な再生（すなわち、毛包、汗腺、および皮脂腺の
再増殖）、乾癬のような他の皮膚欠損の処置においてさらに使用され得る。ＴＲ
１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ１２ポリペプチド、ならびにＴＲ１２のアゴニ
ストまたはアンタゴニストは、表皮水疱症（これらの損傷の再上皮形成を促進す
ることによる頻繁な開放性かつ疼痛性の水疱を生じる、下層の真皮に対する表皮
の接着における欠損）を処置するために使用され得る。ＴＲ１２ポリヌクレオチ
ドまたはＴＲ１２ポリペプチド、ならびにＴＲ１２のアゴニストまたはアンタゴ
ニストはまた、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を処置し、そして粘膜の内層の瘢痕形
成ならびにより迅速な腺の粘膜および十二指腸の粘膜の内層の再生による治癒を
助けるために使用され得る。炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大
腸結腸炎）は、それぞれ、小腸または大腸の粘膜表面の崩壊を生じる疾患である
。従って、ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ１２ポリペプチド、ならびにＴ
Ｒ１２のアゴニストまたはアンタゴニストは、粘膜表面の再表面形成（ｒｅｓｕ
ｌｆａｃｉｎｇ）を促進して、より迅速な治癒を助けるため、および炎症性腸疾
患の進行を予防するために、使用され得る。ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはＴ
Ｒ１２ポリペプチド、ＴＲ１２のアゴニストまたはアンタゴニストを用いる処置
は、胃腸管全体の粘液の産生に対して有意な効果を有し得、そして腸粘膜を、摂
取されたかまたは外科手術後の有害な物質から保護するために使用され得る。Ｔ
Ｒ１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ１２ポリペプチド、ならびにＴＲ１２のアゴ
ニストまたアンタゴニストは、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの発現下に関連する疾
患を処置するために使用され得る。

【０２８０】 さらに、ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ１２ポリペプチド、ならびにＴ
Ｒ１２のアゴニストまたはアンタゴニストは、種々の病的状態に起因する肺への
損傷を予防および治癒するために使用され得る。ＴＲ１２ポリヌクレオチドまた
はＴＲ１２ポリペプチド、ならびにＴＲ１２のアゴニストまたはアンタゴニスト
のような増殖因子は、急性または慢性の肺損傷を予防または処置するために、増
殖および分化を刺激し得、そして肺胞および細気管支（ｂｒｏｃｈｉｏｌａｒ）
上皮の修復を促進し得る。例えば、肺胞（ａｖｅｏｌｉ）の進行性の損失を生じ
る気腫、および細気管支上皮および肺胞の壊死を生じる吸入傷害（すなわち、煙
の吸入および熱傷から生じる）は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ１２ポ
リペプチド、ＴＲ１２のアゴニストまたはアンタゴニストを使用して効果的に処
置され得る。また、ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ１２ポリペプチド、な
らびにＴＲ１２のアゴニストまたはアンタゴニストは、肺胞上皮細胞ＩＩ型の増
殖および分化を刺激するために使用され得、これは、未熟な乳児における肺硝子
膜疾患（例えば、乳児呼吸窮迫症候群および気管支肺異形成症）のような疾患を
処置または予防することを助け得る。

【０２８１】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはア
ンタゴニストは、肝実質細胞の増殖および分化を刺激し得、従って、肝臓疾患お
よび病状（例えば、肝硬変により生じる劇症肝不全、肝炎ウイルスおよび毒性物
質（すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素、および他の当該分野で公知の
肝臓毒素）により生じる肝臓損傷）を緩和または処置するために用いられ得る。

【０２８２】 さらに、ＴＲ１２ポリヌクレオチドまたはＴＲ１２ポリペプチド、ならびにＴ
Ｒ１２のアゴニストまたはアンタゴニストは、真性糖尿病の発症を処置または予
防するために使用され得る。新たにＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病と診断された
患者において、いくつかの島細胞機能が残っている場合、ＴＲ１２ポリヌクレオ
チドまたはＴＲ１２ポリペプチド、ならびにＴＲ１２のアゴニストもしくはアン
タゴニストは、その疾患の永続する発現を緩和、遅延または予防するように、そ
の島機能を維持するために使用され得る。また、ＴＲ１２ポリヌクレオチドまた
はＴＲ１２ポリペプチド、ならびにＴＲ１２のアゴニストもしくはアンタゴニス
トは、島細胞機能を改善または促進するための島細胞移植における補助として使
用され得る。

【０２８３】 （感染性疾患） ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはＴＲ１２ポリペプチド、またはＴＲ１２の
アゴニストもしくはアンタゴニスト（例えば、ＴＲ１２に結合する因子）は、感
染因子を処置または検出するために用いられ得る。例えば、免疫応答を上昇させ
ることによって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を増加させ
ることによって、感染性疾患が処置され得る。免疫応答は、既存の免疫応答を上
昇させるか、または新たな免疫応答を開始させるかのいずれかにより上昇され得
る。あるいは、ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはＴＲ１２ポリペプチド、また
はＴＲ１２のアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、必ずしも免疫応答を誘
発することなく、感染因子を直接阻害し得る。

【０２８４】 ウイルスは、ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはＴＲ１２ポリペプチド、また
はＴＲ１２のアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置または検出され得る
疾患または症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例としては
、以下のＤＮＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス科が挙げられるがそれら
に限定されないウイルスの例を含むがそれらに限定されない：アルボウイルス、
アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス科、
ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、サルコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉ
ｄａｅ）、コロナウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）
、ヘルペスウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、帯状ヘ
ルペス）、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミ
クソウイルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科
（例えば、インフルエンザ）、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナ
ウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイ
ルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ
−ＩＩ、レンチウイルス）、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス）。
これらの科内に入るウイルスは、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患
または症状を引き起こし得る：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔ
ｉｓ）、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎
（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、髄膜炎、日和見感染症（例
えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳
下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染病
、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。ＴＲ１２ポリペプ
チドもしくはＴＲ１２ポリヌクレオチド、またはＴＲ１２のアゴニストもしくは
アンタゴニストを用いて、任意のこれらの症状または疾患が処置または検出され
得る。

【０２８５】 同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつＴＲ１２ポリヌクレオチドもし
くはＴＲ１２ポリペプチド、またはＴＲ１２のアゴニストもしくはアンタゴニス
トによって処置または検出され得る細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下のグ
ラム陰性およびグラム陽性の細菌および細菌科および真菌類を含むがこれらに限
定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓ
ｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ、Ｃ
ａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏ
ｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅ
ｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔ
ｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔ
ｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｎ
ｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒ
ｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａの感染
症（例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐａｓ
ｔｅｕｒｅｌｌａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ
、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃａｌ）。これらの細菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに限定され
ない以下の疾患または症状を引き起こし得る：菌血症、心内膜炎、眼感染症（結
膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連し
た感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感染症（例え
ば、百日咳または蓄膿症）、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチ
フス熱、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテリ
ア、ライ病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、
リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒ
ｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。ＴＲ１２ポリ
ペプチドもしくはＴＲ１２ポリヌクレオチド、ＴＲ１２のアゴニストもしくはア
ンタゴニストを用いて、任意のこれらの症状もしくは疾患を処置または検出し得
る。

【０２８６】 さらに、ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはＴＲ１２ポリペプチド、またはＴ
Ｒ１２のアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置または検出され得る疾患
あるいは症状を引き起こす寄生生物性因子としては以下のファミリーが挙げられ
るがこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプ
トスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交疫
、外部寄生生物症（Ｅｃｔｏｐａｒａｓｉｔｉｃ）、ジアルジア鞭毛虫症、蠕虫
症、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、
ならびにトリコモナス。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定されな
い種々の疾患または症状を引き起こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼感染症、腸
疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症
（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。
ＴＲ１２ポリペプチドもしくはＴＲ１２ポリヌクレオチド、またはＴＲ１２のア
ゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、任意のこれらの症状または疾患を処
置あるいは検出し得る。

【０２８７】 好ましくは、ＴＲ１２ポリペプチドもしくはＴＲ１２ポリヌクレオチド、また
はＴＲ１２のアゴニストもしくはアンタゴニストを用いる処置は、患者に有効量
のポリペプチドを投与するか、または患者から細胞を取り出して、ＴＲ１２ポリ
ヌクレオチドをこの細胞に供給し、そして操作した細胞を患者に戻す（エキソビ
ボ治療）かのいずれかによるものであり得る。さらに、ＴＲ１２ポリペプチドま
たはＴＲ１２ポリヌクレオチドはワクチン中の抗原として用いられて、感染性疾
患に対する免疫応答を惹起し得る。

【０２８８】 （再生） ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはＴＲ１２ポリペプチド、またはＴＲ１２の
アゴニストもしくはアンタゴニスト（例えば、ＴＲ１２に結合する分子）を用い
て、細胞を分化させ、増殖させ、そして誘引して、組織の再生を導き得る（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７６：５９−８７（１９９７）を参照のこと）。組織の再生を用
いて、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、または潰瘍）、加齢、疾患（例え
ば、骨粗鬆症、変形性関節炎（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、歯周病、肝
不全）、美容形成手術を含む手術、線維症、再灌流傷害、もしくは全身性サイト
カイン損傷により損傷を受けた組織を修復、置換、または保護し得る。

【０２８９】 本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる：器官（例えば、
膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、
脈管系（脈管およびリンパを含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱、
および靭帯）の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減されて
生じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。

【０２９０】 さらに、ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはＴＲ１２ポリペプチド、またはＴ
Ｒ１２のアゴニストもしくはアンタゴニストは、治癒するのが困難な組織の再生
を増加し得る。例えば、腱／靭帯再生を増大させることによって、損傷後の回復
時間が早まる。本発明のＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはＴＲ１２ポリペプチ
ド、またはＴＲ１２のアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、損傷を回避す
る試みにおいて予防的に使用され得る。処置され得る特定の疾患は、腱炎、手根
管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損を含む。非治癒創傷の組織再生のさ
らなる例は、圧迫性潰瘍（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｕｌｃｅｒ）、脈管不全、外科的
創傷、および外傷性創傷に関連する潰瘍を含む。

【０２９１】 同様に、神経および脳組織もまた、神経細胞を増殖および分化させるためにＴ
Ｒ１２ポリヌクレオチドもしくはＴＲ１２ポリペプチド、またはＴＲ１２のアゴ
ニストもしくはアンタゴニストを使用することによって再生され得る。本方法を
用いて処置され得る疾患は、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患、神経障害、
または機械的および外傷性障害（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、お
よび発作（ｓｔｏｋｅ））を含む。詳細には、末梢神経傷害と関連する疾患、末
梢神経障害（例えば、化学療法または他の医学的療法から生じる）、局在神経障
害、および中枢神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハン
チントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群）はすべて
、ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはＴＲ１２ポリペプチド、またはＴＲ１２の
アゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置され得る。

【０２９２】 （走化性） ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはＴＲ１２ポリペプチド、またはＴＲ１２の
アゴニストもしくはアンタゴニストは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、
細胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細
胞、および／または内皮細胞）を、身体中の特定の部位（例えば、炎症、感染、
または過剰増殖の部位）に誘引または動員する。次いで、動員された細胞は、特
定の外傷または異常性を撃退および／または治癒し得る。

【０２９３】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはＴＲ１２ポリペプチド、またはＴＲ１２の
アゴニストもしくはアンタゴニストは、特定の細胞の走化性活性を増大し得る。
次いで、これらの走化性分子を使用して、身体中の特定の位置に標的化した細胞
の数を増加させることによって、炎症、感染、過剰増殖性障害、または任意の免
疫系障害を処置し得る。例えば、走化性分子を使用して、傷害を受けた位置に免
疫細胞を誘引することによって、組織に対する創傷および他の外傷を処置し得る
。走化性分子として、ＴＲ１２はまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を処
置するために使用され得る。

【０２９４】 ＴＲ１２ポリヌクレオチドもしくはＴＲ１２ポリペプチド、またはＴＲ１２の
アゴニストもしくはアンタゴニストが走化性活性を阻害し得ることもまた意図さ
れる。これらの分子はまた、障害を処置するために使用され得る。従って、ＴＲ
１２ポリヌクレオチドもしくはＴＲ１２ポリペプチド、またはＴＲ１２のアゴニ
ストもしくはアンタゴニストは、走化性のインヒビターとして使用され得る。

【０２９５】 （結合活性） ＴＲ１２ポリペプチドは、ＴＲ１２に結合する分子またはＴＲ１２が結合する
分子についてスクリーニングするために使用され得る。ＴＲ１２とその分子との
結合は、ＴＲ１２の活性または結合する分子の活性を活性化（アゴニスト）、増
大、阻害（アンタゴニスト）、または減少し得る。このような分子の例は、抗体
、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、ＴＮＦリガンド）、または低分子
を含む。

【０２９６】 本発明の組成物に結合し得るＴＮＦ分子、ＴＮＦ関連分子、またはＴＮＦ様分
子には、ＴＮＦ−αの可溶型、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとし
ても知られる）、ＬＴ−β（複合体ヘテロトリマーＬＴ−α２−βにおいて見出
される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１
ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３２
８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、エンドカイン（ｅｎ
ｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＯＰＧ、ならびに
ニュートロカイン（Ｎｅｕｔｒｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／１８
９２１）、ＯＸ４０、および神経増殖因子（ＮＧＦ）、ならびにＦａｓ、ＣＤ３
０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、および４−ＩＢＢの可溶型、ＴＲ２（国際公開番号９
６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（国
際公開番号９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９３）
、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９
８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号９８／５６８９２）、Ｔ
Ｒ１２（国際公開番号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ
９８／０６８４２）、およびＴＲ１２、ならびにＣＤ１５４、ＣＤ７０、および
ＣＤ１５３の可溶型が含まれるがこれらに限定されない。

【０２９７】 好ましくは、その分子は、ＴＲ１２の天然のリガンド（例えば、リガンドのフ
ラグメント）、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物、もしくは機能的模
倣物に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）： 第５章（１９９１）を参照のこ
と）。同様に、その分子は、ＴＲ１２が結合する天然のリガンド、または少なく
ともＴＲ１２によって結合され得るリガンドのフラグメント（例えば、活性部位
）に密接に関連し得る。いずれの場合においても、その分子は、公知の技術を用
いて合理的に設計され得る。

【０２９８】 好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、ＴＲ１２を、分泌タ
ンパク質としてか、または細胞膜上でかのいずれかで発現する適切な細胞を産生
する工程を包含する。好ましい細胞としては、哺乳動物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる。次いで、ＴＲ１２を発現
する細胞（または、発現されたポリペプチドを含む細胞膜）は、好ましくは、Ｔ
Ｒ１２またはその分子のいずれかの結合、刺激、または活性の阻害を観察するた
めの分子を含む可能性のある試験化合物と接触される。

【０２９９】 アッセイは、ＴＲ１２への候補化合物の結合を簡単に試験し得、ここで結合は
、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセイにおいて検
出される。さらに、アッセイは、候補化合物がＴＲ１２への結合によって生成さ
れるシグナルを生じるか否かを試験し得る。

【０３００】 あるいは、アッセイは、細胞を含まない調製物、固体支持体に接着されたポリ
ペプチド／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され
得る。アッセイはまた、ＴＲ１２を含む溶液を候補化合物と混合する工程、ＴＲ
１２／分子の活性または結合を測定する工程、およびＴＲ１２／分子の活性また
は結合を、標準と比較する工程を単に包含し得る。

【０３０１】 好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体を用いて、サンプル（例えば、生物学的サンプル）におけるＴＲ１２レベ
ルまたは活性を測定し得る。抗体は、ＴＲ１２への直接的もしくは間接的な結合
のいずれか、または基質についてのＴＲ１２との競合によって、ＴＲ１２レベル
または活性を測定し得る。

【０３０２】 さらに、ＴＲ１２が結合するＴＮＦリガンドは、当業者に公知の多数の方法（
例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳ選別（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２）、Ｃｈａｐｔｅｒ
５，（１９９１））によって同定され得る。

【０３０３】 本発明はまた、ＴＲ１２ポリペプチドによって誘導される細胞応答を増強また
は阻害し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供し、この方法は
、ＴＲ１２ポリペプチドを発現する細胞を、候補化合物と接触させる工程、細胞
応答をアッセイする工程、および標準（この標準は、候補化合物の非存在下で接
触がなされたときにアッセイされる）の細胞応答に対して細胞応答を比較する工
程、を包含し；それによって、標準を超える細胞応答の増加は、その化合物がア
ゴニストであることを示し、そして標準を超える細胞応答の減少は、その化合物
がアンタゴニストであることを示す。

【０３０４】 別の局面において、ＴＲ１２ポリペプチドへのリガンドの結合に際して候補化
合物が有する効果を決定する工程を包含する、アゴニストおよびアンタゴニスト
についてのスクリーニングアッセイが提供される。詳細には、この方法は、ＴＲ
１２ポリペプチドをリガンドポリペプチドおよび候補化合物と接触させる工程、
ならびにＴＲ１２ポリペプチドへのリガンド結合が、候補化合物の存在によって
増加するかまたは減少するかを決定する工程を包含する。

【０３０５】 これらの上記のアッセイの全ては、診断マーカーまたは予後マーカーとして使
用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、ＴＲ１２／分子を活
性化または阻害することによって、疾患を処置するか、または患者における特定
の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用され得る。さらに、アッセイ
は、適切に操作された細胞または組織からのＴＲ１２の産生を阻害または増強し
得る因子を発見し得る。

【０３０６】 従って、本発明は、以下の工程を含むＴＲ１２に結合する化合物を同定する方
法を包含する：（ａ）候補結合化合物をＴＲ１２とともにインキュベートする工
程；および（ｂ）結合が生じたか否かを決定する工程。さらに、本発明は、以下
の工程を含むアゴニスト／アンタゴニストを同定する方法を包含する：（ａ）候
補化合物をＴＲ１２とともにインキュベートする工程、（ｂ）生物学的活性をア
ッセイする工程、および（ｂ）ＴＲ１２の生物学的活性が改変されているか否か
を決定する工程。

【０３０７】 （アンチセンスおよびリボザイム（アンタゴニスト）） 特定の実施形態において、本発明によるアンタゴニストは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１に含まれる配列に対応する核酸またはその相補鎖および／あるいはＡＴＣ
Ｃ受託番号２０３３６５で寄託されたプラスミドに含まれるヌクレオチド配列で
ある。１つの実施形態において、アンチセンス配列は、生物体により内部で生成
され、別の実施形態において、アンチセンス配列は別々に投与される（例えば、
Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６：５６０（１９９１）を参
照のこと）。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓ
ｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃ
ＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）。アンチセンス技
術を使用して、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを通してか、もしくは三重らせ
んの形成を通して遺伝子発現を制御し得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋ
ａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄ
ｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔ
ｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃ
ａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）で議論される。三重らせん形成は、例えば、
Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６：３０７３（１
９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：４５６（１９８８）；お
よびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３００（１９９１）において
議論される。これらの方法は、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチド
の結合に基づく。

【０３０８】 例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コー
ド部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域
に相補的であるように設計され、それにより転写およびレセプターの産生を阻害
する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブ
リダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロック
する。

【０３０９】 １つの実施形態において、本発明のＴＲ１２アンチセンス核酸は、外来の配列
からの転写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部は、転
写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベクター
は、ＴＲ１２アンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターは
、それが転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生し得る限り、エピソームを
保持し得るか、または染色体に組込まれ得る。このようなベクターは、当該分野
において標準的な組換えＤＮＡ技術方法により構築され得る。ベクターは、脊椎
動物細胞において複製および発現のために使用される、プラスミド、ウイルスま
たは当該分野で公知の他のものであり得る。ＴＲ１２をコードする配列またはそ
のフラグメントの発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用する当該
分野で公知の任意のプロモーターによってであり得る。そのようなプロモーター
は、誘導性または構成性であり得る。このようなプロモーターは、ＳＶ４０初期
プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２
９：３０４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含
まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９７（
１９８０））、ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８：１４４１−１４４５（１９８
１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、２９６：３９−４２（１９８２））などが含まれるが、これらに限定されな
い。

【０３１０】 本発明のアンチセンス核酸は、少なくともＴＲ１２遺伝子のＲＮＡ転写物の一
部に相補的な配列を含む。しかし、完全に相補的であることが好ましいが、必要
ではない。本明細書中でいわれる「少なくともＲＮＡの一部に相補的な」配列は
、ＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分相補性を有し、安定な二重鎖を形成する
配列を意味し；従って、二本鎖ＴＲ１２アンチセンス核酸の場合において、二重
鎖ＤＮＡの単一の鎖が試験され得るか、または三重鎖形成がアッセイされ得る。
ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方
に依存し、一般的に、ハイブリダイズする核酸が大きいほど、それが含み得るＴ
Ｒ１２ ＲＮＡとのより多くの塩基ミスマッチをともない、そしてなお安定な二
重鎖（または三重鎖の場合もあり得る）を形成し得る。当業者は、ハイブリダイ
ズ複合体の融点を決定するために標準的な手順を使用することによりミスマッチ
の寛容の程度を確認し得る。

【０３１１】 メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開
始コドンまで、およびＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害
の際に最も効率的に働くべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補
的な配列は、なおｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に効果を示さなかった。一般的に
、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ、３７２：３３３−３３５（１９９４）を
参照のこと。従って、図１Ａ〜１Ｃに示されるＴＲ１２の５’−または３’−の
非翻訳領域、非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性
ＴＲ１２ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチに使用され得る。
ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドン
の相補物を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、翻訳のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明に従
って使用され得る。ＴＲ１２ ｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域
にハイブリダイズするように設計されるか否かにかかわらず、アンチセンス核酸
は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、そして好ましくは６〜約５
０ヌクレオチド長にわたるオリゴヌクレオチドである。特定の局面において、こ
のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレ
オチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである
。

【０３１２】 本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはキメラ混合物、
あるいはその誘導体もしくは改変バージョン、一本鎖、または二本鎖であり得る
。このオリゴヌクレオチドは、例えば、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で
改変され、分子の安定性、ハイブリダーゼーションなどを改良し得る。このオリ
ゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビボにおいて宿
主細胞レセプターを標的化するために）、または細胞膜を通した輸送を促進する
因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８４：６４８−６５２（１９８７）
；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、または血液脳関門（例
えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）、ハイブリダイゼー
ション誘発切断剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｃｌｅ
ａｖａｇｅ ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
、６：９５８−９７６（１９８８）を参照のこと）、またはインターカレート剤
（例えば、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、５：５３９−５４９（１９８８）を
参照のこと）を含み得る。このために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例え
ば、ペプチド、ハイブリダーゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼー
ション誘発切断剤など）に結合体化され得る。

【０３１３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された塩基部分を
含み得、この塩基部分は、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される
：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨー
ドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カル
ボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２
−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシ
ル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデ
ニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、
２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシ
トシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシ
ル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュー
オシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２
−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ
）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キュ
ーオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシ
ル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチル
エステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、
３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）
ｗ、および２，６−ジアミノプリン。

【０３１４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下を含むがそれらに限定されない
群から選択される少なくとも１つの改変糖部分を含み得る：アラビノース、２−
フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。

【０３１５】 さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を含
むがそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変リン酸骨格を
含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート
、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキル
ホスホトリエステル、およびホルムアセタールまたはそのアナログ。

【０３１６】 さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ−アノ
マーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的な
ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のｂ−ユニットとは反対に
、その鎖は互いに平行にする（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、１５：６６２５−６６４１（１９８７））。このオリゴヌクレオチドは、
２−０−メチルリボヌクレオチドであるか（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮＡ
−ＤＮＡアナログである（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７
−３３０（１９８７））。

【０３１７】 本発明のポリヌクレオチドは当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動Ｄ
ＮＡ合成機により（このような装置はＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されている）の使用により）合成され得る。例
えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：３２０９（１９８８））により合成され得、
メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御化細孔ガラス（ｐｏｒｅ ｇｌ
ａｓｓ）ポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：７４４８−７４５１（１９８８））などの使用により
調製され得る。

【０３１８】 一方、ＴＲ１２コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが、使用
され得、転写された非翻訳領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ま
しい。

【０３１９】 本発明による潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４
日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９
９０）を参照のこと）。一方、部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザ
イムを使用して、ＴＲ１２ ｍＲＮＡを破壊し得るが、ハンマーヘッド型リボザ
イムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的
な塩基対を形成する隣接領域により決定される位置で、ｍＲＮＡを切断する。た
った１つの必要条件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基の配列を有することで
ある：５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および生成は当該
分野で周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３３４：５８５−５９１（１９８８）により十分に記載される。ＴＲ１２ヌ
クレオチド配列内に多くの潜在的なハンマーヘッド型リボザイム切断部位が存在
する（図１Ａ〜Ｃ）。好ましくは、このリボザイムは、切断認識部位がＴＲ１２
ｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように；すなわち、効率を増大し、そして
非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小化するように、操作される。

【０３２０】 アンチセンスアプローチの場合、本発明のリボザイムは、改変されたオリゴヌ
クレオチド（例えば、安定性、標的化などについて改良された）から構成され得
、そしてインビボにおいてＴＲ１２を発現する細胞に送達されるべきである。リ
ボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンスの導入
のための上記と同じ様式において細胞中に導入され得る。送達の好ましい方法は
、強力な構成性プロモーター（例えば、ｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｌ ＩＩプロモ
ーターのような）の制御下で、リボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用
することを含み、その結果トランスフェクトした細胞が内因性ＴＲ１２メッセー
ジを破壊し、そして翻訳を阻害するに十分な量のリボザイムを生成する。リボザ
イムはアンチセンス分子と異なり触媒性であるので、より低い細胞内濃度が効率
のために必要とされる。

【０３２１】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、本明細書中に記載される疾患を
処置し得る。

【０３２２】 上記の適用は、広範に種々の宿主（本明細書中で、患者または個体とも称され
る）において使用されている。そのような宿主としては、ヒト、ネズミ、ウサギ
、ヤギ、モルモット、ブタ、ラクダ、ウマ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ
、ミクロピッグ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｇ）、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ
、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。特
定の実施形態において、宿主は、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ニワトリ
、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌまたはネコである。好ましい実施形
態において、宿主は、哺乳動物である。最も好ましい実施形態において、宿主は
、ヒトである。

【０３２３】 概して、本発明を記載してきたが、本発明は、例示の目的のために提供され、
そして限定を意図しない、以下の実施例を参照することによってより容易に理解
される。

【０３２４】 （実施例） （実施例１：ＴＲ１２ ｃＤＮＡクローンの寄託されたサンプルからの単離） ＴＲ１２についてのｃＤＮＡを、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３のマルチクローニング
部位に挿入する。ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３はアンピシリン耐性遺伝子を含み、そし
てＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可
能である）に形質転換され得る。（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｆｏｃ
ｕｓ １５：５９（１９９３）を参照のこと）。

【０３２５】 ２つのアプローチを使用して、寄託されたサンプルから、ＴＲ１２を単離し得
る。第１に、寄託されたクローンを、当業者に公知の技術（例えば、ベクター供
給者によって提供される技術または関連の刊行物もしくは特許において提供され
る技術）を用いて、適切な宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ））に形質転換する。形質転換体を１．５％寒天プレート（適切な選択薬
剤、例えば、アンピシリンを含む）に、１プレートあたり約１５０の形質転換体
（コロニー）の密度でプレーティングする。次いで、単一のコロニーを使用して
、当業者に周知の核酸単離技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、（
１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、１．９３〜１．１０４頁）を用いて、ＤＮＡを生成する。

【０３２６】 あるいは、配列番号１の両端（すなわち、クローンの５’ＮＴおよび３’ＮＴ
によって囲まれる配列番号１の領域内）に由来する、１７〜２０ヌクレオチドの
２つのプライマーを合成し、そしてこれらを使用して、寄託されたｃＤＮＡプラ
スミドをテンプレートとして使用して、ＴＲ１２ ｃＤＮＡを増幅する。ポリメ
ラーゼ連鎖反応を、慣用の条件下で、例えば、０．５μｇの上記ｃＤＮＡテンプ
レートとの反応混合物の２５μｌ中で実施する。簡便な反応混合物は、１．５〜
５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、それぞれ２０μＭのｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマーおよび０．
２５ユニットのＴａｑポリメラーゼである。３５サイクルのＰＣＲ（９４℃での
変性を１分間；５５℃でのアニールを１分間；７２℃での伸長を１分間）を、Ｐ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ自動化サーマルサイクラーを用いて実施す
る。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、そして予想される分子量
のＤＮＡバンドを切り出し、そして精製する。ＰＣＲ産物を、ＤＮＡ産物をサブ
クローニングおよび配列決定することによって選択された配列であることを確認
する。

【０３２７】 寄託されたクローンに存在しないかもしれないＴＲ１２遺伝子の５’非コード
部分または３’非コード部分の同定のために、いくつかの方法が利用可能である
。これらの方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フィルタープローブ探
索、特異的プローブを使用するクローン富化、および当該分野で周知である５’
および３’「ＲＡＣＥ」プロトコルと類似するかまたは同一のプロトコル。例え
ば、５’ＲＡＣＥに類似する方法は、所望の全長転写物の欠けている５’末端を
生成するために利用可能である（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３））。

【０３２８】 簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転写物をお
そらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結する。連結されたＲＮＡオリゴヌクレ
オチドに特異的なプライマーおよび目的のＴＲ１２遺伝子の公知の配列に特異的
なプライマーを含むプライマーセットを使用して、ＴＲ１２全長遺伝子の５’部
分をＰＣＲ増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれを
使用して全長遺伝子を生成し得る。

【０３２９】 この上記の方法は、所望の供給源から単離された総ＲＮＡを用いて開始するが
、ポリＡ＋ＲＮＡを使用し得る。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスファ
ターゼで処理して、後のＲＮＡリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷ＲＮＡ
の５’リン酸基を排除し得る。次いで、ホスファターゼを不活化するべきであり
、そしてＲＮＡをメッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を除
去するために、タバコ酸性ピロホスファターゼを用いて処理するべきである。こ
の反応は、次いでＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドに連
結され得る、キャップ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残す。

【０３３０】 この改変型ＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第
一鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用する。第一鎖合成反応物を、
連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子
の公知の配列に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のた
めのテンプレートとして使用する。次いで、得られた生成物を配列決定し、そし
て分析して５’末端配列がＴＲ１２遺伝子に属することを確認する。

【０３３１】 （実施例２：ＴＲ１２ゲノムクローンの単離） ヒトゲノムＰ１ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）
を、実施例１に記載される方法に従って、配列番号１に対応するｃＤＮＡ配列に
ついて選択されたプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングする（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋもまた参照のこと）。

【０３３２】 （実施例３：ＴＲ１２ポリペプチドの組織分布） ＴＲ１２ ｍＲＮＡ発現の組織分布を、とりわけ、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによっ
て記載されるノーザンブロット分析についてのプロトコルを用いて決定する。例
えば、実施例１に記載される方法によって生成されるＴＲ１２プローブを、ｒｅ
ｄｉｐｒｉｍｅ^TM ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、製造者の指示に従って、Ｐ³²で標識
する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００^TMカラム（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して、製造者のプロ
トコル番号ＰＴ１２００−１に従って精製する。次いで、精製した標識プローブ
を使用して、種々のヒト組織をｍＲＮＡ発現について試験する。

【０３３３】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン
（ＭＴＮ）ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ^TMハイブリ
ダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造者のプロトコル番号Ｐ
Ｔ１１９０−１に従って、標識プローブで試験する。ハイブリダイゼーションお
よび洗浄後、ブロットをマウントして、そして−７０℃で一晩フィルムに露出し
、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。

【０３３４】 （実施例４：ＴＲ１２の染色体マッピング） オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、配列番号１の５’末端の配列に従
って設計する。このプライマーは、好ましくは約１００ヌクレオチドにわたる。
次いで、このプライマーセットを、以下のセットの条件下でポリメラーゼ連鎖反
応に使用する：９５℃で３０秒；５６℃で１分；７０℃で１分。このサイクルを
３２回反復し、次いで１回、７０℃で５分間のサイクルを行う。個々の染色体ま
たは染色体フラグメントを含む体細胞ハイブリッドパネル（Ｂｉｏｓ，Ｉｎｃ）
に加えて、ヒト、マウス、およびハムスターのＤＮＡを鋳型として使用する。反
応物を、８％ポリアクリルアミドゲルまたは３．５％アガロースゲルのいずれか
で分析する。染色体マッピングを、特定の体細胞ハイブリッドにおける約１００
ｂｐのＰＣＲフラグメントの存在によって決定する。

【０３３５】 （実施例５：ＴＲ１２の細菌性発現） ＴＲ１２ポリペプチドをコードするＴＲ１２ポリヌクレオチドを、実施例１に
概説するように、ＤＮＡ配列の５’および３’末端に対応するＰＣＲオリゴヌク
レオチドプライマーを使用して増幅して挿入フラグメントを合成する。ｃＤＮＡ
挿入物を増幅するために使用されるプライマーは、発現ベクターに増幅産物をク
ローニングするために、プライマーの５’末端にＢａｍＨＩおよびＸｂａＩのよ
うな制限部位を好ましくは含むべきである。例えば、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ
は、細菌性発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏ
ｒｔｈ，ＣＡ）の制限酵素部位に対応する。このプラスミドベクターは、抗生物
質耐性（Ａｍｐ^r）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧで調節可能なプロモ
ーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−ヒスチ
ジンタグ（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位をコードする。

【０３３６】 ｐＱＥ−９ベクターをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして、増幅され
たフラグメントを細菌性ＲＢＳにおいて開始されるリーディングフレームを維持
しながらｐＱＥ−９ベクターに連結する。次いで連結混合物を、ｌａｃＩリプレ
ッサーを発現し、かつまたカナマイシン耐性（Ｋａｎ^r）を与えるプラスミドｐ
ＲＥＰ４の多重コピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ
，Ｉｎｃ．）を形質転換するために使用する。形質転換体を、それらのＬＢプレ
ート上で生育する能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性
コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって確認
する。

【０３３７】 所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（
２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）
増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を、１：１００〜１：２５０の比で大量培養物に接種
するために使用する。細胞を、０．４と０．６との間の光学密度６００（Ｏ．Ｄ
．⁶⁰⁰）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド）を最終濃度１ｍＭになるように加える。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩ
リプレッサーの不活化により誘導し、Ｐ／Ｏを除去し、遺伝子発現の増加を導く
。

【０３３８】 細胞を、さらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離（６０００×
ｇで２０分間）によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック剤である６
ＭグアニジンＨＣｌ中に、４℃で３〜４時間攪拌することによって可溶化させる
。細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてポリペプチドを含む上清を、ニ
ッケル−ニトリロ三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（ＱＩ
ＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．前出より入手可能）にロードする。６×Ｈｉｓタグを有する
タンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高い親和性で結合し、そして単純な１工程手
順で精製され得る（詳細には、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（１
９９５）ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出を参照のこと）。

【０３３９】 手短に言えば、上清を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８のカラムにロードし
、このカラムを、最初に１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８で洗浄し、
次いで１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ６で洗浄し、最後にポリペプチ
ドを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ５で溶出する。

【０３４０】 次いで、精製したＴＲ１２タンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）
または５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６の緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌ
に対して透析することにより再生させる。あるいは、ＴＲ１２タンパク質はＮｉ
−ＮＴＡカラムに固定化している間に、首尾よく再折畳みされ得る。推奨条件は
以下の通りである：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ｍＭ ＮａＣｌ、
２０％グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４中の６Ｍ〜１Ｍ
尿素の直線勾配を使用する再生。再生は１．５時間以上の時間をかけて行うべき
である。再生後、タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールの添加によって溶出させ
る。イミダゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ６の緩衝液お
よび２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最終の透析工程によって除去する。精製した
ＴＲ１２タンパク質を、４℃で保存するか、または−８０℃で冷凍する。

【０３４１】 上記の発現ベクターに加えて、本発明はさらに、ＴＲ１２ポリヌクレオチドに
作動可能に連結されたファージオペレーターおよびプロモーターエレメントを含
み、ｐＨＥ４ａと呼ばれる発現ベクターを含む（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４５
、１９９８年２月２５日に寄託）。このベクターは以下を含む：１）選択マーカ
ーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏｌｉ複
製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配
列、５）シャイン−ダルガーノ配列、および６）ラクトースオペロンリプレッサ
ー遺伝子（ｌａｑＩｑ）。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ，Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に由来する。プロモーター配列およびオペレータ
ー配列を合成的に作製する。

【０３４２】 ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８によっ
てベクターを制限処理し、制限生成物をゲルで泳動し、そしてより大きな方のフ
ラグメント（スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントは約３１０塩基対で
あるはずである）を単離することによって、ＤＮＡをｐＨＥａに挿入し得る。Ｄ
ＮＡ挿入物を、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘｈ
ｏＩ、またはＡｓｐ７１８（３’プライマー）に対する制限部位を有するＰＣＲ
プライマーを使用して、実施例１に記載のＰＣＲプロトコルに従って生成する。
ＰＣＲ挿入物を、ゲル精製し、そして適合する酵素で制限処理する。挿入物およ
びベクターを標準的なプロトコルに従って連結する。

【０３４３】 詳細には、ｐＨＥ４におけるＴＲ１２タンパク質の細胞外（または可溶性）部
分をクローニングするために、５’プライマーは、以下の配列：

【０３４４】

【化５】 であり、これは、ＮｄｅＩ制限部位、続いて配列番号１におけるＴＲ１２配列の
可溶性部分の配列をコードするアミノ末端の多数のヌクレオチドを含む。当業者
は、当然のことながら、５’プライマーが開始するタンパク質コード配列におけ
るポイント（ｐｏｉｎｔ）が、完全ＴＲ１２タンパク質の可溶性部分よりも短い
かまたは長いこのタンパク質の任意の所望の部分をコードするＤＮＡセグメント
を増幅するために改変され得ることを理解する。３’プライマーは、以下の配列
：

【０３４５】

【化６】 を有し、これは、ＸｂａＩ制限部位、続いて配列番号１のＴＲ１２ ＤＮＡ配列
のコード配列の３’末端に相補的な多数のヌクレオチドおよびヌクレオチド位置
７１７〜７３５で挿入された停止コドンを含む。

【０３４６】 同様に、全長ＴＲ１２をｐＣＤＮＡ３にクローニングするために使用されるプ
ライマーは、以下を含む：

【０３４７】

【化７】 操作されたベクターは、上記のプロトコルにおいて、細菌系でタンパク質を発
現させるために容易に置換され得る。

【０３４８】 （実施例６：封入体からのＴＲ１２ポリペプチドの精製） 以下の代替方法は、ＴＲ１２ポリペプチドが封入体の形態で存在する場合に、
Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されたＲ１２ポリペプチドを精製するために使用され得る
。他に指定されない場合には、以下のすべての工程は４〜１０℃で行われる。

【０３４９】 Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生産期の完了後、細胞培養物を４〜１０℃に冷却し、そし
て１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）に
よって細胞を採集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想され
る収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切
な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を含む緩衝溶液に懸濁させる。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸濁
液に分散させる。

【０３５０】 次いで、細胞をマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（
Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ
．）に２回、４０００〜６０００ｐｓｉで溶液を通すことによって溶解させる。
次いでホモジネートを、最終濃度０．５Ｍ ＮａＣｌになるようにＮａＣｌ溶液
と混合し、続いて７０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。得られたペレットを
、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を使用して再度洗浄する。

【０３５１】 得られた洗浄した封入体を、１．５Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜
４時間可溶化する。７０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄し
、そしてポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートしてさらなるＧｕ
ＨＣｌ抽出を可能にする。

【０３５２】 不溶性粒子を除去するための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）に続き、Ｇｕ
ＨＣｌ可溶化タンパク質を、ＧｕＨＣｌ抽出物と、５０ｍＭ ナトリウム、ｐＨ
４．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝液とを
、激しい攪拌で迅速に混合することによって、再折畳みさせる。再折畳みした希
釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合しないで４℃で保
つ。

【０３５３】 再折畳みされたポリペプチド溶液を清澄にするために、４０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ６．０で平衡化した、適切な表面積を有する０．１６μｍメンブレンフ
ィルターを備えるあらかじめ準備した接線濾過ユニット（例えば、Ｆｉｌｔｒｏ
ｎ）を使用する。濾過したサンプルを、カチオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ
ＨＳ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にロードする
。カラムを４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄し、そして同じ緩衝液
中の２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ ＮａＣｌで
、段階的な様式で溶出する。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を連続的にモニ
ターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析する。

【０３５４】 次いでＴＲ１２ポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量の水と混合
する。次いで希釈されたサンプルを、あらかじめ準備した強アニオン（Ｐｏｒｏ
ｓ ＨＱ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）交換樹脂およ
び弱アニオン（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ）交換樹脂の直列カラムのセットにロードする。カラムを４０ｍＭ 酢
酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化する。両方のカラムを、４０ｍＭ 酢酸ナト
リウム、ｐＨ６．０、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いでＣＭ−２０カラ
ムを１０カラム容量の直線勾配（０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ６．０から１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．
５の範囲）を用いて溶出させる。画分を、溶出液の定常Ａ₂₈₀モニタリング下で
収集する。次いで、（例えば、１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判明した）ポ
リペプチドを含む画分をプールする。

【０３５５】 得られたＴＲ１２ポリペプチドは、上記の再折畳みおよび精製工程の後で９５
％より高い純度を示すはずである。５μｇの精製タンパク質がロードされる場合
、いかなる主たる混在バンドも、クマシーブルー染色した１６％ ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲルから観察されないはずである。精製ＴＲ１２タンパク質はまた、エンド
トキシン／ＬＰＳ混在について試験され得、そして代表的には、ＬＰＳ含量はＬ
ＡＬアッセイに従って、０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。

【０３５６】 （実施例７：バキュロウイルス発現系におけるＴＲ１２のクローニングおよ
び発現） この実施例では、ＴＲ１２を発現するために、プラスミドシャトルベクターｐ
Ａ２を使用してＴＲ１２ポリヌクレオチドをバキュロウイルスに挿入する。この
発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウ
イルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてＢａｍＨＩ
、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８のような簡便な制限部位を含む。シミアンウイ
ルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化の
ために使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、プラスミドは、同方向
にある弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下でＥ．ｃｏｌｉ由来のβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナ
ルを含む。挿入された遺伝子は、両方の側で、クローン化したＴＲ１２ポリヌク
レオチドを発現する生存可能なウイルスを生成するために、野生型ウイルスＤＮ
Ａとの細胞媒介性の相同組換えのためのウイルス配列と隣接する。

【０３５７】 他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル（必要とされる場合、シグナル
ペプチドおよびインフレームなＡＵＧを含む）を提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。

【０３５８】 具体的には、寄託されたクローンに含まれるＴＲ１２ ｃＤＮＡ配列（これは
、ＡＵＧ開始コドンおよび任意の天然に付随するリーダー配列を含む）を、実施
例１に記載されるＰＣＲプロトコルを使用して増幅させる。天然に存在するシグ
ナル配列を使用して分泌タンパク質を産生する場合、ｐＡ２ベクターは第２のシ
グナルペプチドを必要としない。あるいは、ベクターは、Ｓｕｍｍｅｒｓら（「
Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ
Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃ
ｅｄｕｒｅｓ」、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７））に
記載される標準的な方法を用いて改変され、バキュロウイルスリーダー配列を含
ませ得る（ｐＡ２ ＧＰ）。

【０３５９】 より詳細には、全長ＴＲ１２タンパク質をコードする寄託されたプラスミドに
おけるｃＤＮＡ配列（ＡＵＧ開始コドンおよび配列番号１に示される天然に会合
したリーダー配列を含む）を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣ
Ｒオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。５’プライマーは、以下
の配列：

【０３６０】

【化８】 を有し、これは、ＢｇｌＩＩ制限酵素部位（真核生物細胞における翻訳の開始の
ために有効なシグナル）（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：
９４７−９５０（１９８７））、続いて、図１Ａ〜１Ｃに示される完全ＴＲ１２
タンパク質の配列の多数のヌクレオチド（ＡＵＧ開始コドンで開始する）を含む
。３’プライマーは、以下の配列：

【０３６１】

【化９】 を有し、これは、ＸｂａＩ制限部位、続いて図１Ａ〜１Ｃにおける３’非コード
配列に相補的な多数のヌクレオチドを含む。

【０３６２】 同様に、寄託されたクローンにおけるＴＲ１２タンパク質の細胞外部分または
可溶性部分をコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対
応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。５’プライマ
ーは、以下の配列：

【０３６３】

【化１０】 を有し、これは、ＢｇｌＩＩ制限酵素部位（真核生物細胞における翻訳の開始の
ために有効なシグナル）（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：
９４７−９５０（１９８７））、続いて、図１Ａ〜１Ｃに示される完全ＴＲ１２
タンパク質の配列の多数のヌクレオチド（ＡＵＧ開始コドンで開始する）を含む
。３’プライマーは、以下の配列：

【０３６４】

【化１１】 を有し、これは、ＸｂａＩ制限部位、続いて図１Ａ〜１Ｃにおける３’非コード
配列に相補的な多数のヌクレオチド、およびヌクレオチド位置７１７〜７３５で
挿入された停止コドンを含む。

【０３６５】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」，ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲ
ルから単離する。次いでフラグメントを適切な制限酵素で消化し、そして再び１
％アガロースゲルで精製する。

【０３６６】 プラスミドを対応する制限酵素で消化し、そして必要に応じて、当該分野で公
知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化し得る。
次いでＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎ
ｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲルから単離する
。

【０３６７】 フラグメントおよび脱リン酸化したプラスミドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用
いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ
ａ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合液で形質転換し、そ
して培養プレート上に拡げる。プラスミドを含む細菌を、個々のコロニー由来の
ＤＮＡを消化し、そして消化産物をゲル電気泳動によって分析することにより同
定する。クローニングしたフラグメントの配列をＤＮＡ配列決定によって確認す
る。

【０３６８】 このポリヌクレオチドを含む５μｇのプラスミドを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９
８７）によって記載されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市販の
線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TM ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ととも
に同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TMウイルスＤＮＡ
および５μｇのプラスミドを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む、
マイクロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０μｌの
リポフェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で１５
分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清グレ
ース培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細胞（
ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加える。次いでプレートを２７℃で５
時間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をプレートから除
去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加す
る。次いで培養を２７℃で４日間継続する。

【０３６９】 ４日後上清を収集し、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出によって記載さ
れたようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むアガロース
ゲルを、ｇａｌが発現しているクローン（青色に着色したプラークを生ずる）の
容易な同定および単離を可能にするために使用する。（この型の「プラークアッ
セイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇによって配布される、昆虫細胞培養およびバキュロ
ウイルス学のための使用者ガイドの中の９−１０頁に見出され得る）。適切なイ
ンキュベーションの後、青色に着色したプラークをマイクロピペッター（例えば
、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を
、２００μｌのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁させ、そし
て組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を、３５ｍｍディッシュに播種したＳｆ
９細胞に感染させるために使用する。４日後、これらの培養ディッシュの上清を
採集し、次いで４℃に貯蔵する。

【０３７０】 ポリペプチドの発現を確認するために、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレ
ース培地中でＳｆ９細胞を増殖させる。細胞を、約２の感染多重度（「ＭＯＩ」
）で、ポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスで感染させる。放射性標
識したタンパク質を所望する場合には、６時間後に培地を除去し、そしてメチオ
ニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能）に置き換
える。４２時間後、５μＣｉの³⁵Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの³⁵Ｓ−システ
イン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに１６時間イン
キュベートし、次いで遠心分離によって採集する。上清中のタンパク質および細
胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで（放射性標識した場合）オートラ
ジオグラフィーによって分析する。

【０３７１】 精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定法を使用して、産
生されたＴＲ１２タンパク質のアミノ末端配列を決定し得る。

【０３７２】 （実施例８：哺乳動物細胞におけるＴＲ１２の発現） ＴＲ１２ポリペプチドを、哺乳動物細胞中で発現させ得る。代表的な哺乳動物
発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモーターエレメント、タ
ンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要
なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハンサー、コザック配列
、および、ＲＮＡスプライシングのドナー部位およびアクセプター部位に隣接す
る介在配列が挙げられる。非常に効率的な転写は、ＳＶ４０由来の初期および後
期プロモーター、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来
の長末端反復（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモ
ーターを用いて達成される。しかし、細胞エレメント（例えば、ヒトアクチンプ
ロモーター）もまた、使用され得る。

【０３７３】 本発明を実施する際の使用に適切な発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶＬ
およびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲ
ＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４
６）、ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、
ならびにｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０のようなベクターが挙げられる。使用され得
る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞および
Ｊｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １細
胞、Ｃｏｓ ７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、
ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。

【０３７４】 あるいは、ＴＲ１２ポリペプチドは、染色体に組み込まれたＴＲ１２ポリヌク
レオチドを含む、安定な細胞株中で発現され得る。ＤＨＦＲ、ｇｐｔ、ネオマイ
シン、ハイグロマイシンのような選択可能なマーカーを用いる同時トランスフェ
クションは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。

【０３７５】 トランスフェクトされたＴＲ１２遺伝子はまた、大量のコードされたタンパク
質を発現するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）マーカー
は、目的の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する細胞株の開発に有用
である。（例えば、Ａｌｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１
３７０（１９７８）；ＨａｍｌｉｎおよびＭａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：１０７−１４３（１９９０）：Ｐａｇｅおよび
Ｓｙｄｅｎｈａｍ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８（１９９１）
を参照のこと）。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ
）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１
９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１
６９−１７５（１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選
択培地中で増殖させ、そしてもっとも高い耐性を有する細胞を選択する。これら
の細胞株は、染色体に組み込まれた、増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生のためにしばし
ば使用される。

【０３７６】 プラスミドｐＳＶ２−ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体であ
る、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴ
ＣＣ受託番号２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７（
１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）、およびＣＭＶエンハンサ
ー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））のフラ
グメントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８の制限酵
素切断部位を有するマルチプルクローニングサイトは、ＴＲ１２のクローニング
を容易にする。ベクターはまた、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イント
ロン、ポリアデニル化および終結シグナル、ならびに、ＳＶ４０初期プロモータ
ーの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。

【０３７７】 具体的には、プラスミドｐＣ４を、ＢａｇｌＩＩおよびＸｂａＩによって消化
し、次いで当該分野で公知の手順に従って、仔ウシ腸ホスファターゼ（ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ）を使用して脱リン酸化する。次いで、このベクターを１％アガロー
スゲルから単離する。

【０３７８】 寄託されたクローンにおける全長ＴＲ１２タンパク質をコードするｃＤＮＡ配
列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプ
ライマーを使用して増幅する。５’プライマーは、以下の配列：

【０３７９】

【化１２】 を有し、これは、ＢｇｌＩＩ制限酵素部位（真核生物細胞における翻訳の開始の
ために有効なシグナル）（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：
９４７−９５０（１９８７））、続いて、図１Ａ〜１Ｃに示される完全ＴＲ１２
タンパク質の配列の多数のヌクレオチド（ＡＵＧ開始コドンで開始する）を含む
。３’プライマーは、以下の配列：

【０３８０】

【化１３】 を有し、これは、ＸｂａＩ制限部位、続いて図１Ａ〜１Ｃにおける３’非コード
配列に相補的な多数のヌクレオチドを含む。

【０３８１】 同様に、寄託されたクローンにおけるＴＲ１２タンパク質の細胞外部分または
可溶性部分をコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対
応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。５’プライマ
ーは、以下の配列：

【０３８２】

【化１４】 を有し、これは、ＢｇｌＩＩ制限酵素部位（真核生物細胞における翻訳の開始の
ために有効なシグナル）（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：
９４７−９５０（１９８７））、続いて、図１Ａ〜１Ｃに示される完全ＴＲ１２
タンパク質の配列の多数のヌクレオチド（ＡＵＧ開始コドンで開始する）を含む
。３’プライマーは、以下の配列：

【０３８３】

【化１５】 を有し、これは、ＸｂａＩ制限部位、続いて図１Ａ〜１Ｃにおける３’非コード
配列に相補的な多数のヌクレオチド、およびヌクレオチド位置７１７〜７３５で
挿入された停止コドンを含む。

【０３８４】 天然に存在するシグナル配列が、分泌タンパク質を産生するために使用される
場合、このベクターは、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天
然に存在するシグナル配列が使用されない場合には、このベクターは、細胞から
タンパク質を分泌させるための異種シグナル配列を含むように改変され得る（例
えば、ＷＯ９６／３４８９１を参照のこと）。

【０３８５】 次いで、増幅フラグメントを、ＢａｇｌＩＩおよびＸｂａＩで消化し、市販の
キット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ，Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲルから精製する。次いで、増幅フラグ
メントを同じ制限酵素で消化し、そして１％アガロースゲルで精製する。次いで
、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化したベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガ
ーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ
細胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメントを含む細
菌を、例えば、制限酵素分析を用いて同定する。

【０３８６】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ６ ｐＣ４を、リポフ
ェクチン（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶ
ｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優
性選択マーカーである、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐性を付与する酵
素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４
１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し
、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／
ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプ
レート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種する。約１０〜１４日後、
単一のクローンをトリプシン処理し、次いでメトトレキサートの異なる濃度（５
０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して、６ウ
ェルのペトリ皿または１０ｍｌのフラスコに播種する。次いで、メトトレキサー
トの最高濃度で増殖するクローンを、さらに高い濃度（１μＭ、２μＭ、５μＭ
、１０ｍＭ、２０ｍＭ）のメトトレキサートを含む新たな６ウェルプレートに移
す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで
繰り返す。ＴＲ１２の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロ
ットによって、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。

【０３８７】 （実施例９：Ｎ末端および／またはＣ末端欠失変異体の構築） 以下の一般的なアプローチを使用して、Ｎ末端またはＣ末端欠失ＴＲ１２欠失
変異体をクローニングし得る。一般には、約１５〜２５ヌクレオチドの２つのオ
リゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１のポリヌクレオチドの所望の５’位
および３’位に由来する。プライマーの５’位および３’位は、所望のＴＲ１２
ポリヌクレオチドフラグメントに基づいて決定される。必要な場合は、開始コド
ンおよび終止コドンを５’プライマーおよび３’プライマーにそれぞれ付加し、
ポリヌクレオチドフラグメントによってコードされるＴＲ１２ポリペプチドフラ
グメントを発現する。好ましいＴＲ１２ポリヌクレオチドフラグメントは、明細
書の「ポリヌクレオチドおよびポリペプチドフラグメント」の節において上記に
で開示されるＮ末端およびＣ末端欠失変異体をコードするフラグメントである。

【０３８８】 所望のベクターにおけるＴＲ１２ポリヌクレオチドフラグメントのクローニン
グを促進するための制限部位を含むさらなるヌクレオチドもまた、５’および３
’プライマー配列に付加され得る。ＴＲ１２ポリヌクレオチドフラグメントは、
本明細書中で議論されるかまたは当該分野において公知の適切なＰＣＲオリゴヌ
クレオチドプライマーおよび条件を用いて、ゲノムＤＮＡから、または寄託され
たｃＤＮＡクローンから増幅される。本発明のＴＲ１２ポリヌクレオチドフラグ
メントによってコードされるＴＲ１２ポリペプチドフラグメントは、全長ポリペ
プチドと同じ一般的な様式で発現および精製され得るが、慣用的な改変が、特定
のフラグメントと全長ポリペプチドとの間の化学的特性および物理的特性におけ
る差異に起因して必要であり得る。

【０３８９】 本発明の限定ではなく例示の手段として、ＴＲ１２ポリペプチドフラグメント
Ｇｌｙ−３５〜Ｐｒｏ−２７６をコードするポリヌクレオチドは、以下のように
増幅およびクローニングされる：Ｇｌｙ−３５で開始するポリペプチドフラグメ
ントのＮ末端部分をコードするポリヌクレオチド配列をインフレームに、制限酵
素部位、続いて開始コドンを含む５’プライマーを生成する。Ｐｒｏ−２７６で
終結するＴＲ１２ポリペプチドフラグメントのＣ末端部分をコードするポリヌク
レオチド配列をインフレームに、制限酵素部位、続いて終止コドンを含む相補的
３’プライマーを生成する。

【０３９０】 増幅したポリヌクレオチドフラグメントおよび発現ベクターを、プライマー中
の部位を認識する制限酵素で消化する。次いで、消化したポリヌクレオチドをと
もに連結する。ＴＲ１２ポリヌクレオチドフラグメントを、制限発現ベクターに
、好ましくはＴＲ１２ポリペプチドフラグメントコード領域をプロモーターから
下流に配置する様式で挿入する。連結混合物を、標準的な手順を用いて、本明細
書中の実施例に記載されるように、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換す
る。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてクローニングされたＤ
ＮＡのアイデンティティを制限分析、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によって確認
する。

【０３９１】 （実施例１０：ＴＲ１２のタンパク質融合物） ＴＲ１２ポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。これら
の融合タンパク質は、種々の適用について使用され得る。例えば、ＴＲ１２ポリ
ぺプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマ
ルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（実施例５を参照のこと
；ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１
：８４−８６（１９８８）もまた参照のこと）。同様に、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−
３、およびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大させる。ＴＲ１２
ポリぺプチドに融合した核局在化シグナルは、タンパク質を特定の細胞内局在に
標的化し得る。一方、共有結合ヘテロダイマーまたはホモダイマーは、融合タン
パク質の活性を増大または減少させ得る。融合タンパク質はまた、１つより多い
機能を有するキメラ分子を作製し得る。最後に、融合タンパク質は、非融合タン
パク質と比較して、融合タンパク質の可溶性および／または安定性を増大させ得
る。上記の融合タンパク質の全ての型は、ポリぺプチドのＩｇＧ分子への融合を
概説する以下のプロトコル、または実施例５に記載されるプロトコルを改変する
ことによって作製され得る。

【０３９２】 簡単には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載の配列の５’および３’
末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマーは
また、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクローニングを
容易にする都合の良い制限酵素部位を有するべきである。

【０３９３】 詳細には、ＴＲ１２の細胞外部分または可溶性部分をクローニングするために
、寄託されたクローンを、遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。５’プライマーは、Ｂｇｌ Ｉ
Ｉ制限酵素部位、続いて図１Ａ〜Ｃに示される完全なＴＲ１２タンパク質の配列
の多くのヌクレオチドを含む配列５’ＧＣＧＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＴＧＡ
ＡＧＣＣＡＡＧＴＣＴＧＣＴＧＴＧ３’（配列番号２２）を有する。３’プライ
マーは、ＸｂａＩ制限部位、続いて図１Ａ〜Ｃにおける３’非コード配列に相補
的な多くのヌクレオチドを含む配列５’ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＣＧＣＧＴＡＣＴＧ
ＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣ３’（配列番号２３）を有する。

【０３９４】 例えば、ｐＣ４（受託番号第２０９６４６号）またはｐＡ２が使用される場合
、ヒトＦｃ部分は、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨ
Ｉ部位が破壊されるべきであることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有す
るベクターが、ＢａｍＨＩによって再び制限され、ベクターを線状化し、そして
実施例１に記載するＰＣＲプロトコルによって単離されたＴＲ１２ポリヌクレオ
チドが、このＢａｍＨＩ部位に連結される。このポリヌクレオチドは、終止コド
ンなしにクローン化され、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないこと
に注意すること。

【０３９５】 天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される場
合、ｐＣ４は、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、このベクターは、異種シグナル配列を含
むように改変され得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。

【０３９６】

【化１６】 （実施例１１：抗体の産生） ａ）ハイブリドーマ技術 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。例えば、ＴＲ１２を発現する細胞は、
ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与される。好ま
しい方法において、ＴＲ１２タンパク質の調製物が調製され、そして精製されて
、天然の夾雑物を実質的に含まないようにされる。次いで、より大きな比活性の
ポリクローナル抗血清を生成するために、このような調製物は、動物に導入され
る。

【０３９７】 最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（または、
そのタンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、
ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る（Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、このような
手順は、動物（好ましくは、マウス）をＴＲ１２ポリぺプチドで免疫すること、
またはより好ましくは、分泌ＴＲ１２ポリぺプチド発現細胞で免疫することを含
む。このような細胞は、任意の適切な組織培養培地において培養され得る；しか
し、１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化した）を補充し、そして約１０ｇ／
ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ
／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変イーグル培地において細
胞を培養することが好ましい。

【０３９８】 このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切なミエローマ細胞株と融合
される。任意の適切なミエローマ細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しか
し、ＡＴＣＣから入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好
ましい。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に
維持し、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２
５−２３２（１９８１））に記載されるように限界希釈によってクローニングす
る。このような選択によって得られるハイブリドーマ細胞は、次いでＴＲ１２ポ
リぺプチドに結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされ
る。

【０３９９】 あるいは、ＴＲ１２ポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタ
イプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は、
抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可
能であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使
用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾
細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ
細胞は、ＴＲ１２タンパク質特異的抗体に結合する能力がＴＲ１２によってブロ
ックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。
このような抗体は、ＴＲ１２タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗
体を含み、そして動物を免疫してさらなるＴＲ１２タンパク質特異的抗体の形成
を誘導するために使用され得る。

【０４００】 本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに他のフラグメントは、本
明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが理解される。このような
フラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）
またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため）のような酵素を
使用して、タンパク質分解性切断によって産生される。あるいは、分泌型ＴＲ１
２タンパク質結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用により、または合成
化学により産生され得る。

【０４０１】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル
抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用すること
によって産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法は当該分野で公知であ
る（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（
１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；
Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、
ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒ
ｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１
；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕ
ｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。

【０４０２】 （ｂ）ｓｃＦｖｓのライブラリーからのＴＲ１２に対する抗体フラグメントの
単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、ドナーが曝露されていて
もよいし、曝露されていなくてもよいＴＲ１２に対する反応性を含む抗体フラグ
メントの大きいライブラリーに構築する（例えば、米国特許第５，８８５，７９
３号（その全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。

【０４０３】 （ライブラリーのレスキュー） ＷＯ ９２／０１０４７に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓｃＦｖｓ
のライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージをレスキュー
するため、ファージミドを保有する約１０⁹個のＥ．ｃｏｌｉを用いて、５０ｍ
ｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
る）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を接種し、そして振盪しながら０．８のＯ．
Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ
−ＧＬＵを接種（ｉｎｎｏｃｕｌａｔｅ）し、２×１０⁸ＴＵのΔ遺伝子３ヘル
パー（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ、ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を添加し、
そして培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しな
がら３７℃で４５分間インキュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．
ｐ．ｍ．で遠心分離し、そしてペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／
ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し
、そして一晩増殖させる。ファージをＷＯ９２／０１０４７に記載のように調製
する。

【０４０４】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質
を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖さ
せることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪な
しで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時
間インキュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４０００
ｒｅｖｓ／分で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μ
ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ
）３００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファ
ージ粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培
地から精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフ
ィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１
０¹³形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。

【０４０５】 （ライブラリーパニング） Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明のポリペプチドの１００μｇ
／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜す
る。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし、
次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０¹³ＴＵのファージをチューブに適用し、
そして、回転盤で上下に傾けながら室温で３０分間インキュベートし、次いでさ
らに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で
１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミン
を添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることによりファージを溶
出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４
で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃で３０分間
インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数増殖中期の
Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを１％グルコースお
よび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプレートする
。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝子３ヘルパーファ
ージでレスキューし、次の回の選択のためのファージを調製する。次いで、この
プロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復し、３回目および４回目
にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２０回、そしてＰＢＳ
で２０回に増加する。

【０４０６】 （結合剤の特徴付け） 第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．
６中の本発明のポリペプチドの１０ピコグラム／ｍｌのいずれかで被膜したマイ
クロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ中の陽性クロ
ーンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＷＯ９２／０１０４７を参照
のこと）、次に配列決定することによりさらに特徴付ける。

【０４０７】 （実施例１２：高処理能力スクリーニングアッセイのためのＴＲ１２タンパク
質の産生） 以下のプロトコルは、上記の実施例における方法によって構築された可溶性Ｔ
Ｒ１２ポリペプチドを含む上清を産生する。次いで、この上清は、実施例１４〜
２１に記載されるスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。

【０４０８】 第一に、ポリ−Ｄ−リジン（６４４ ５８７ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）ストック溶液（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（カルシウム
もマグネシウムも含まない１７−５１６Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で１
：２０に希釈して、作業溶液５０μｇ／ｍｌにする。２００μｌのこの溶液を、
各ウェル（２４ウェルプレート）に添加し、そして室温で２０分間インキュベー
トする。溶液を各ウェルにわたって分配させることを確実にする（注記：１２チ
ャンネルピペッターを、１つおきのチャンネルにチップをつけて使用し得る）。
ポリ−Ｄ−リジン溶液を吸引除去し、そして１ｍｌ ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理
食塩水）でリンスする。ＰＢＳは、細胞をプレートする直前までウェル中に残す
べきであり、そしてプレートは２週間前までに予めポリリジンでコーティングし
得る。

【０４０９】 ２９３Ｔ細胞（Ｐ＋２０を過ぎて細胞を保有しない）を、２×１０⁵細胞／ウ
ェルで、０．５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）（４．
５Ｇ／ＬのグルコースおよびＬ−グルタミン（１２−６０４Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔ
ｔａｋｅｒ）を含む）／１０％熱非働化ＦＢＳ（１４−５０３Ｆ Ｂｉｏｗｈｉ
ｔｔａｋｅｒ）／１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（１７−６０２Ｅ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａ
ｋｅｒ）中にプレートする。細胞を一晩増殖させる。

【０４１０】 翌日、滅菌溶液容器（ｂａｓｉｎ）中で、３００μｌＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉ
ｎｅ（１８３２４−０１２ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）および５ｍｌ Ｏｐｔｉｍｅ
ｍ Ｉ（３１９８５０７０ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）／９６ウェルプレートを、一
緒に混合する。少容量のマルチチャンネルピペッターを用いて、実施例８〜１０
に記載する方法によって産生されたポリヌクレオチド挿入物を含む約２μｇの発
現ベクターを、適切に標識された９６ウェルの丸底プレート中にアリコートする
。マルチチャンネルピペッターを用いて、５０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ
ｅ／Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ混合物を各ウェルに添加する。ピペットで緩やかに吸い
上げたり下げたりして混合する。室温で１５〜４５分間インキュベートする。約
２０分後、マルチチャンネルピペッターを使用して１５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ
Ｉを各ウェルに添加する。コントロールとして、挿入物を欠失するベクターＤ
ＮＡの１つのプレートは、トランスフェクションの各セットでトランスフェクト
されるべきである。

【０４１１】 好ましくは、トランスフェクションは、以下の作業をタッグチームを組んで（
ｔａｇ−ｔｅａｍｉｎｇ）行うべきである。タッグチームを組むことによって、
時間に関する労力は半減され、そして細胞にはＰＢＳ上であまり多くの時間を過
ごさせない。まず、Ａさんは、培地を細胞の４つの２４ウェルプレートから吸引
除去し、次いでＢさんが０．５〜１ｍｌのＰＢＳで各ウェルをリンスする。次い
で、Ａさんは、ＰＢＳリンスを吸引除去し、そしてＢさんは、１つおきのチャン
ネルにチップのついた１２チャンネルピペッターを使用して、２００μｌのＤＮ
Ａ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ複合体を、まず奇数のウ
ェルに、次いで偶数のウェルにと、２４ウェルプレート上の各列に添加する。３
７℃で６時間インキュベートする。

【０４１２】 細胞をインキュベートする間に、１×ペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）を
有するＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡか、または２ｍＭグルタミンおよび１×ペンスト
レップを含むＨＧＳ ＣＨＯ−５培地（１１６．６ｍｇ／ＬのＣａＣｌ₂（無水
物）；０．００１３０ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ₄−５Ｈ₂Ｏ；０．０５０ｍｇ／ＬのＦ
ｅ（ＮＯ₃）₃−９Ｈ₂Ｏ；０．４１７ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ₄−７Ｈ₂Ｏ；３１１．
８０ｍｇ／ＬのＫＣｌ；２８．６４ｍｇ／ＬのＭｇＣｌ₂；４８．８４ｍｇ／Ｌ
のＭｇＳＯ₄；６９９５．５０ｍｇ／ＬのＮａＣｌ；２４００．０ｍｇ／ＬのＮ
ａＨＣＯ₃；６２．５０ｍｇ／ＬのＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｈ₂Ｏ；７１．０２ｍｇ／Ｌの
Ｎａ₂ＨＰＯ₄；０．４３２０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ₄−７Ｈ₂Ｏ；０．００２ｍｇ／
Ｌのアラキドン酸；１．０２２ｍｇ／Ｌのコレステロール；０．０７０ｍｇ／Ｌ
のＤＬ−α−酢酸トコフェロール；０．０５２０ｍｇ／Ｌのリノール酸；０．０
１０ｍｇ／Ｌのリノレン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのミリスチン酸；０．０１０ｍ
ｇ／Ｌのオレイン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミトレイン酸（ｐａｌｍｉｔｒ
ｉｃ ａｃｉｄ）；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミチン酸；１００ｍｇ／ＬのＰｌ
ｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；０．０１０ｍｇ／Ｌのステアリン酸；２．２０ｍｇ／
ＬのＴｗｅｅｎ８０；４５５１ｍｇ／ＬのＤ−グルコース；１３０．８５ｍｇ／
ｍｌのＬ−アラニン；１４７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アルギニン−ＨＣｌ；７．
５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン−Ｈ₂Ｏ；６．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパ
ラギン酸；２９．５６ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン−２ＨＣｌ−Ｈ₂Ｏ；３１．２
９ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン−２ＨＣｌ；７．３５ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン
酸；３６５．０ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン；１８．７５ｍｇ／ｍｌのグリシン
；５２．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン−ＨＣｌ−Ｈ₂Ｏ；１０６．９７ｍｇ
／ｍｌのＬ−イソロイシン；１１１．４５ｍｇ／ｍｌのＬ−ロイシン；１６３．
７５ｍｇ／ｍｌのＬ−リジンＨＣｌ；３２．３４ｍｇ／ｍｌのＬ−メチオニン；
６８．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−フェニルアラニン；４０．０ｍｇ／ｍｌのＬ−プロ
リン；２６．２５ｍｇ／ｍｌのＬ−セリン；１０１．０５ｍｇ／ｍｌのＬ−スレ
オニン；１９．２２ｍｇ／ｍｌのＬ−トリプトファン；９１．７９ｍｇ／ｍｌの
Ｌ−チロシン（Ｔｒｙｒｏｓｉｎｅ）−２Ｎａ−２Ｈ₂Ｏ；および９９．６５ｍ
ｇ／ｍｌのＬ−バリン；０．００３５ｍｇ／Ｌのビオチン；３．２４ｍｇ／Ｌの
Ｄ−Ｃａパントテネート；１１．７８ｍｇ／Ｌの塩化コリン；４．６５ｍｇ／Ｌ
の葉酸；１５．６０ｍｇ／Ｌのｉ−イノシトール；３．０２ｍｇ／Ｌのナイアシ
ンアミド；３．００ｍｇ／ＬのピリドキサールＨＣｌ；０．０３１ｍｇ／Ｌのピ
リドキシンＨＣｌ；０．３１９ｍｇ／Ｌのリボフラビン；３．１７ｍｇ／Ｌのチ
アミンＨＣｌ；０．３６５ｍｇ／Ｌのチミジン；０．６８０ｍｇ／Ｌのビタミン
Ｂ₁₂；２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤；２．３９ｍｇ／ＬのＮａヒポキサンチン；
０．１０５ｍｇ／Ｌのリポ酸；０．０８１ｍｇ／Ｌのプトレシンナトリウム−２
ＨＣｌ；５５．０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム；０．００６７ｍｇ／Ｌの亜
セレン酸ナトリウム；２０μＭのエタノールアミン；０．１２２ｍｇ／Ｌのクエ
ン酸鉄；リノール酸と複合体化した４１．７０ｍｇ／Ｌのメチル−Ｂ−シクロデ
キストリン；オレイン酸と複合体化した３３．３３ｍｇ／Ｌのメチル−Ｂ−シク
ロデキストリン；レチナールアセテートと複合体化した１０ｍｇ／Ｌのメチル−
Ｂ−シクロデキストリン）のいずれかの適切な培地を調製する。２ｍｍグルタミ
ンおよび１×ペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）を用いて、浸透圧モル濃度を
３２７ｍＯｓｍに調整する（１０％ＢＳＡストック溶液のために、１Ｌ ＤＭＥ
Ｍ中にＢＳＡ（８１−０６８−３ Ｂａｙｅｒ）１００ｇを溶解した）。培地を
濾過し、そして５０μｌを内毒素アッセイのために１５ｍｌポリスチレンコニカ
ル中に収集する。

【０４１３】 トランスフェクション反応を、好ましくはタッグチームを組んでインキュベー
ション時間の終わりに終結させる。Ａさんは、トランスフェクション培地を吸引
除去し、その間Ｂさんは、１．５ｍｌの適切な培地を各ウェルに添加する。使用
された培地に依存して４５時間または７２時間、３７℃でインキュベートする：
１％ＢＳＡは４５時間、またはＣＨＯ−５は７２時間。

【０４１４】 ４日目に、３００μｌのマルチチャンネルピペッターを使用して、６００μｌ
を１ｍｌの深底ウェルプレート１枚にアリコートし、そして残りの上清を２ｍｌ
の深底ウェルにアリコートする。次いで、各ウェルからの上清を実施例１４〜２
１に記載するアッセイにおいて使用し得る。

【０４１５】 活性が、上清を使用して以下に記載する任意のアッセイにおいて得られる場合
、この活性は、ＴＲ１２ポリぺプチドから直接に（例えば、分泌タンパク質とし
て）か、または他のタンパク質のＴＲ１２誘導発現によって（このタンパク質は
、次いで上清中に分泌される）のいずれかに由来することが特に理解される。従
って、本発明はさらに、特定のアッセイにおける活性によって特徴づけられる上
清中のタンパク質を同定する方法を提供する。

【０４１６】 （実施例１３：ＧＡＳレポーター構築物の構築） 細胞の分化および増殖に関与する１つのシグナル伝達経路は、Ｊａｋ−ＳＴＡ
Ｔ経路と呼ばれる。Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路において活性化されたタンパク質は、
多くの遺伝子のプロモーターに位置する、γ活性化部位「ＧＡＳ」エレメントま
たはインターフェロン感受性応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）に結合する。これ
らのエレメントに対するタンパク質の結合は、関連する遺伝子の発現を変化させ
る。

【０４１７】 ＧＡＳエレメントおよびＩＳＲＥエレメントは、Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄ
ｕｃｅｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ
ｎ、すなわち「ＳＴＡＴ」と呼ばれるクラスの転写因子によって認識される。Ｓ
ＴＡＴファミリーには６つのメンバーが存在する。Ｓｔａｔ１およびＳｔａｔ３
は、Ｓｔａｔ２と同様に（ＩＦＮαに対する応答が広範であるように）、多くの
細胞型において存在する。Ｓｔａｔ４は、より限定されており、そして多くの細
胞型には存在しないが、ＩＬ−１２での処理後のＴヘルパークラスＩ細胞に見出
されている。Ｓｔａｔ５は、元々は乳房成長因子と呼ばれたが、骨髄性細胞を含
む他の細胞においてより高い濃度で見出されている。それは、多くのサイトカイ
ンによって組織培養細胞において活性化され得る。

【０４１８】 ＳＴＡＴは活性化されて、Ｊａｎｕｓ Ｋｉｎａｓｅ（「Ｊａｋ」）ファミリ
ーとして知られる１セットのキナーゼによるチロシンリン酸化に際して細胞質か
ら核へトランスロケートする。Ｊａｋは、可溶性のチロシンキナーゼの別個のフ
ァミリーの代表であり、そしてＴｙｋ２、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＪａｋ３
を含む。これらのキナーゼは、有意な配列類似性を示し、そして一般には休止細
胞において触媒的に不活性である。

【０４１９】 Ｊａｋは、以下の表によって要約されるように広範なレセプターによって活性
化される。（ＳｃｈｉｄｌｅｒおよびＤａｒｎｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．６４：６２１−５１（１９９５）による総説から改変）。Ｊａｋを活
性化し得るサイトカインレセプターファミリーは、２つの群に分けられる：（ａ
）クラス１は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９
、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｅｐｏ、ＰＲＬ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、
ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびトロンボポエチンに対するレセプター
を含み；そして（ｂ）クラス２は、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−ｇ、およびＩＬ−１０
を含む。クラス１レセプターは、保存されたシステインモチーフ（４つの保存さ
れたシステインおよび１つのトリプトファンのセット）、およびＷＳＸＷＳモチ
ーフ（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（配列番号４７）をコードする
膜近接（ｐｒｏｘｉａｌ）領域）を共有する。

【０４２０】 従って、リガンドのレセプターへの結合の際に、Ｊａｋは活性化され、これは
次いでＳＴＡＴを活性化し、これは、次いでトランスロケートし、そしてＧＡＳ
エレメントに結合する。この全プロセスは、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路
に包含される。

【０４２１】 それゆえ、ＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントの結合によって反映されるＪａｋ
−ＳＴＡＴ経路の活性化は、細胞の増殖および分化に関与するタンパク質を示す
ために使用され得る。例えば、増殖因子およびサイトカインは、Ｊａｋ−ＳＴＡ
Ｔ経路を活性化することが知られている。（以下の表を参照のこと）。従って、
レポーター分子に連結したＧＡＳエレメントを使用することにより、Ｊａｋ−Ｓ
ＴＡＴ経路のアクチベーターが同定され得る。

【０４２２】

【表３】 実施例１４〜１５に記載される生物学的アッセイにおいて使用されるプロモー
ターエレメントを含む合成ＧＡＳを構築するために、ＰＣＲに基づいたストラテ
ジーを用いてＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター配列を生成する。５’プライマーは
、ＩＲＦ１プロモーターにおいて見出され、そして一定の範囲のサイトカインで
の誘導の際にＳＴＡＴに結合することが以前に実証されたＧＡＳ結合部位の４つ
のタンデムコピーを含むが（Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４５７
−４６８（１９９４））、他のＧＡＳエレメントまたはＩＳＲＥエレメントを代
わりに使用し得る。５’プライマーはまた、ＳＶ４０初期プロモーター配列に対
して相補的な１８ｂｐの配列も含み、そしてＸｈｏＩ部位に隣接する。５’プラ
イマーの配列は以下である：

【０４２３】

【化１７】 下流プライマーはＳＶ４０プロモーターに対して相補的であり、そしてＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位に隣接する：５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧ
ＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列番号２６）。

【０４２４】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したＢ−ｇａｌ：プロモータープラ
スミド中に存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを用いて実施する。得
られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いて消化し、そし
てＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。正方向およ
び逆方向のプライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むこと
を確認する：

【０４２５】

【化１８】 このＧＡＳプロモーターエレメントがＳＶ４０プロモーターに結合されると、
次に、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ２レポーター構築物を操作する。ここで、レポーター分
子は、分泌アルカリホスファターゼ、すなわち「ＳＥＡＰ」である。しかし、明
らかに、この実施例または他の実施例のいずれにおいても、任意のレポーター分
子が、ＳＥＡＰの代わりとなり得る。ＳＥＡＰの代わりに使用され得る周知のレ
ポーター分子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グ
リーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または抗体により検出可能な任意のタンパク
質が挙げられる。

【０４２６】 上記の配列により確認された合成ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーターエレメントを
、ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターを作製するために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ
を用いて、増幅したＧＡＳ：ＳＶ４０プロモーターエレメントでＳＶ４０プロモ
ーターを有効に置換し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＳＥＡＰ−プロモータ
ーベクターにサブクローニングする。しかし、このベクターはネオマイシン耐性
遺伝子を含まず、それゆえ、哺乳動物の発現系には好ましくない。

【０４２７】 従って、ＧＡＳ−ＳＥＡＰレポーターを発現する哺乳動物の安定な細胞株を作
製するために、ＧＡＳ−ＳＥＡＰカセットを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて
ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターから取り出し、そしてＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベク
ターを作製するために、マルチクローニング部位におけるこれらの制限部位を用
いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含むバックボーンベクター（例えば、ｐＧＦＰ
−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に挿入する。一旦、このベクターを哺乳動物細胞に
トランスフェクトすれば、次いでこのベクターは、実施例１４〜１５に記載され
るようにＧＡＳ結合についてのレポーター分子として使用され得る。

【０４２８】 他の構築物を、上記の説明を使用し、そしてＧＡＳを異なるプロモーター配列
で置換して、作製し得る。例えば、ＮＦＫ−ＢおよびＥＧＲプロモーター配列を
含むレポーター分子の構築を、実施例１６および１７に記載する。しかし、多く
の他のプロモーターを、これらの実施例に記載のプロトコルを使用して置換し得
る。例えば、ＳＲＥ、ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、またはオステオカルシンのプロモー
ターを単独で、または組み合わせて（例えば、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ／ＥＧＲ、Ｇ
ＡＳ／ＮＦ−ＫＢ、Ｉｌ−２／ＮＦＡＴ、またはＮＦ−ＫＢ／ＧＡＳ）置換し得
る。同様に、他の細胞株（例えば、ＨＥＬＡ（上皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（内皮細
胞）、Ｒｅｈ（Ｂ細胞）、Ｓａｏｓ−２（骨芽細胞）、ＨＵＶＡＣ（大動脈細胞
）、または心筋細胞）を、レポーター構築物の活性を試験するために使用し得る
。

【０４２９】 （実施例１４：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを使用して、およびＴＲ１２上清がＴ細胞を増殖および／ま
たは分化するか否かを決定することによって、ＴＲ１２のＴ細胞活性を評価する
。Ｔ細胞の活性を実施例１３で作製したＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用い
て評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグ
ナル伝達経路を活性化する能力を示す。このアッセイに使用したＴ細胞は、Ｊｕ
ｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ−１５２）であるが、Ｍｏｌｔ−３
細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５５２）およびＭｏｌｔ−４細胞（ＡＴＣＣ
受託番号ＣＲＬ−１５８２）細胞もまた使用し得る。

【０４３０】 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、リンパ芽球性ＣＤ４＋ Ｔｈ１ヘルパー細胞である
。安定な細胞株を作製するために、およそ２００万のＪｕｒｋａｔ細胞をＤＭＲ
ＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ
／ｎｅｏベクターでトランスフェクトする（以下に記載のトランスフェクション
手順）。トランスフェクトした細胞を、およそ２０，０００細胞／ウェルの密度
まで播種し、そして１ｍｇ／ｍｌのゲンチシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）に対して耐
性であるトランスフェクト体を選択する。耐性コロニーを拡大させ、次いで、漸
増する濃度のインターフェロンγに対するそれらの応答について試験する。選択
したクローンの用量応答を示す。

【０４３１】 詳細には、以下のプロトコルにより、２００μｌの細胞を含む７５のウェルに
ついて十分な細胞を得る。従って、複数の９６ウェルプレートについて十分な細
胞を産生するために、これをスケールアップするか、または複数で実施するかの
いずれかを行う。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含むＲＰＭ
Ｉ＋１０％血清中で維持する。Ｔ２５フラスコ中で２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥ
Ｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０μｇのプラスミドＤＮＡとを
組み合わせる。５０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃを含む２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ
を添加し、そして、室温で１５〜４５分間インキュベートする。

【０４３２】 インキュベート時間の間、細胞濃度をカウントし、必要な細胞数（トランスフ
ェクションあたり１０⁷個）をスピンダウンし、そして最終濃度が１０⁷細胞／ｍ
ｌとなるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で再懸濁する。次いで、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中
の１×１０⁷個の細胞の１ｍｌをＴ２５フラスコに加え、そして３７℃で６時間
インキュベートする。インキュベーションの後、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％の
血清を添加する。

【０４３３】 Ｊｕｒｋａｔ：ＧＡＳ−ＳＥＡＰ安定レポーター株をＲＰＭＩ＋１０％血清、
１ｍｇ／ｍｌゲンチシン、および１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。これ
らの細胞は、実施例１２に記載のプロトコールにより産生されるようなＴＲ１２
ポリペプチドまたはＴＲ１２誘導ポリペプチドを含む上清で処理される。

【０４３４】 上清での処理日に細胞を洗浄すべきであり、そして１ｍｌあたり５００，００
０個の細胞の密度となるように新鮮なＲＰＭＩ＋１０％血清中に再懸濁するべき
である。必要な細胞の正確な数は、スクリーニングされる上清の数に依存する。
１枚の９６ウェルプレートについて、およそ１０００万個の細胞（１０枚のプレ
ートについて１億個の細胞）を必要とする。

【０４３５】 １２チャンネルのピペットを用いて９６ウェルのディッシュに細胞を分与する
ために、三角のリザーバーボートに細胞を移す。２００μｌの細胞を、１２チャ
ンネルのピペットを用いて、それぞれのウェルに移す（従って、ウェル当たり１
００，０００個の細胞を添加する）。

【０４３６】 全てのプレートに播種した後、５０μｌの上清を、１２チャンネルピペットを
用いて、上清を含む９６ウェルプレートから各ウェルに直接的に移す。さらに、
外因性のインターフェロンγの用量（０．１、１．０、１０ｎｇ）を、ウェルＨ
９、ウェルＨ１０、およびウェルＨ１１に添加し、アッセイについてのさらなる
陽性コントロールとして使用する。

【０４３７】 上清で処理したＪｕｒｋａｔ細胞を含む９６ウェルディッシュをインキュベー
ターに４８時間置く（注記：この時間は４８〜７２時間の間で変更可能である）
。次いで、各ウェルから３５μｌのサンプルを１２チャンネルのピペットを用い
て、不透明な９６ウェルプレートに移す。不透明なプレートを（セロファンのカ
バーを用いて）覆うべきであり、そして実施例１８に従ってＳＥＡＰアッセイを
実施するまで、−２０℃で保存するべきである。残存する処理した細胞を含むプ
レートを４℃に置き、そして、所望するならば、特定のウェル上でのアッセイを
繰り返すための物質の供給源として供する。

【０４３８】 陽性コントロールとして、１００ユニット／ｍｌのインターフェロンγを使用
し得、これは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を活性化することが公知である。代表的に
は、３０倍を超える誘導が、陽性コントロールのウェルにおいて観察される。

【０４３９】 （実施例１５：骨髄性の活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを使用して、ＴＲ１２が骨髄性細胞を増殖および／または分
化させるか否かを決定することによりＴＲ１２の骨髄性の活性を評価する。骨髄
性細胞の活性を実施例１３において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物
を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋ−ＳＴＡ
ＴＳシグナル伝達経路を活性化させる能力を示す。このアッセイに使用した骨髄
性細胞は、Ｕ９３７（前単球（ｐｒｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ）細胞株である）が、
ＴＦ−１、ＨＬ６０、またはＫＧ１も使用し得る。

【０４４０】 Ｕ９３７細胞を、実施例１３において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構
築物で、一過性にトランスフェクトするために、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（
Ｋｈａｒｂａｎｄａら、１９９４，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ，５：２５９−２６５）を用いる。最初に、２×１０ｅ⁷個
のＵ９３７細胞を回収し、そしてＰＢＳで洗浄する。Ｕ９３７細胞を、通常、１
００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補
充した１０％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地中
で増殖させる。

【０４４１】 次に、０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、８μｇのＧＡＳ−ＳＥ
ＡＰ２プラスミドＤＮＡ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３７５μＭ
Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、および６７５μＭ ＣａＣｌ₂
を含む１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液に細胞を懸
濁する。３７℃で４５分間インキュベートする。

【０４４２】 １０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を洗浄し、次いで、１０
ｍｌの完全培地に再懸濁し、そして３７℃で３６時間インキュベートする。

【０４４３】 ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｕ９３７安定細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細
胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を使用して、慣用的に
増殖させるが、１〜２ヶ月毎に細胞を二継代の間、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８
中で再増殖させるべきである。

【０４４４】 これらの細胞を１×１０⁸個の細胞（これは１０枚の９６ウェルプレートアッ
セイのために十分である）を回収することにより試験し、そしてＰＢＳで洗浄す
る。上記の２００ｍｌの増殖培地中に、５×１０⁵細胞／ｍｌの最終密度で細胞
を懸濁する。９６ウェルプレートにおいてウェルあたり２００μｌの細胞（すな
わち、１×１０⁵細胞／ウェル）をプレートする。

【０４４５】 実施例１２に記載されるプロトコルにより調製された上清の５０μｌを添加す
る。３７℃で４８〜７２時間インキュベートする。陽性コントロールとして、１
００単位／ｍｌのインターフェロンγを使用し得、これはＵ９３７細胞を活性化
させることが公知である。代表的には、３０倍を超える誘導が、陽性コントロー
ルウェルにおいて観察される。実施例１８に記載のプロトコルに従って上清をＳ
ＥＡＰアッセイする。

【０４４６】 （実施例１６：ニューロン活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ
） 細胞が分化および増殖を経る場合、一群の遺伝子が多くの異なるシグナル伝達
経路を介して活性化される。これらの遺伝子の１つであるＥＧＲ１（初期増殖応
答遺伝子１）は、活性化時に種々の組織および細胞型において誘導される。ＥＧ
Ｒ１のプロモーターはこのような誘導を担う。レポーター分子に結合したＥＧＲ
１プロモーターを使用して、細胞の活性化をＴＲ１２によって評価し得る。

【０４４７】 詳細には、以下のプロトコルをＰＣ１２細胞株におけるニューロン活性を評価
するために使用する。ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫（ｐｈｅｎｏｃｈｒｏｍ
ｏｃｙｔｏｍａ ｃｅｌｌ））は、多くのマイトジェン（例えば、ＴＰＡ（テト
ラデカノイルホルボールアセテート）、ＮＧＦ（神経成長因子）、およびＥＧＦ
（上皮増殖因子））での活性化により増殖および／または分化することが公知で
ある。この処理の間にＥＧＲ１遺伝子発現を活性化する。従って、ＳＥＡＰレポ
ーターに結合したＥＧＲプロモーターを含む構築物でＰＣ１２細胞を安定にトラ
ンスフェクトすることにより、ＴＲ１２によってＰＣ１２細胞の活性化を評価し
得る。

【０４４８】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰレポーター構築物を以下のプロトコルにより組み立て得る。
ＥＧＲ−１プロモーター配列（−６３３〜＋１）（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋら、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ ６： ８６７−８７１（１９９１））を以下のプライマーを用
いて、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し得る：

【０４４９】

【化１９】 次いで、実施例１３において作製したＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを使
用して、ＥＧＲ１増幅産物をこのベクターに挿入し得る。制限酵素ＸｈｏＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩを使用してＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを線状化し、ＧＡＳ
／ＳＶ４０スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を取り除く。これらと同じ酵素を用
いて、ＥＧＲ１増幅産物を制限処理する。ベクターとＥＧＲ１プロモーターとを
連結する。

【０４５０】 細胞培養のための９６ウェルプレートを調製するために、コーティング溶液（
コラーゲンＩ型（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ． カタログ番号０
８−１１５）の３０％エタノール（滅菌濾過）での１：３０希釈）を１つの１０
ｃｍプレートあたり２ｍｌ、または９６ウェルプレートのウェルあたり５０μｌ
添加し、そして２時間風乾させる。

【０４５１】 ＰＣ１２細胞を、予めコートした１０ｃｍ組織培養ディッシュ上で、ペニシリ
ン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充
した、１０％ウマ血清（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カタログ番号１２４
４９−７８Ｐ）、５％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４
０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で慣用的に増殖させる。１つから４つ
への分割を３〜４日毎に行う。細胞を掻き取ることによりプレートから取り出し
、そして１５回より多く上下にピペッティングして再懸濁する。

【０４５２】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を、実施例１２に記載のＬｉｐｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅプロトコルを使用して、ＰＣ１２にトランスフェクトする。ＥＧＲ−Ｓ
ＥＡＰ／ＰＣ１２安定細胞を、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を増殖させ
ることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を慣用的増殖のために使用するが、
１〜２ヶ月毎に、細胞を２継代の間、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で再増殖さ
せるべきである。

【０４５３】 ニューロン活性をアッセイするために、およそ７０〜８０％コンフルエントで
ある細胞を有する１０ｃｍプレートを、古い培地を除去することによりスクリー
ニングする。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）を用いて１回洗浄する。
次いで、細胞を低血清培地（抗生物質とともに１％ウマ血清および０．５％ Ｆ
ＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）中で一晩、飢餓させる。

【０４５４】 翌朝、培地を除去し、そしてＰＢＳで細胞を洗浄する。プレートから細胞を掻
き取り、細胞を２ｍｌの低血清培地中でよく懸濁する。細胞数をカウントし、そ
してより低血清の培地を添加し、５×１０⁵細胞／ｍｌの最終細胞密度に到達さ
せる。

【０４５５】 ２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加する（１×１
０⁵細胞／ウェルに等しい）。実施例１２により産生された５０μｌの上清を、
３７℃で４８〜７２時間加える。陽性コントロールとして、ＥＧＲを介してＰＣ
１２細胞を活性化することが公知の成長因子（例えば、５０ｎｇ／μｌの神経成
長因子（ＮＧＦ））を使用し得る。代表的には、５０倍を超えるＳＥＡＰ誘導が
陽性コントロールウェルにおいて見られる。ＳＥＡＰは実施例１８に従って、上
清をアッセイする。

【０４５６】 （実施例１７：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） ＮＦ−κＢ（核因子κＢ）は、広範な種々の薬剤（炎症性サイトカインである
ＩＬ−１およびＴＮＦ、ＣＤ３０およびＣＤ４０、リンホトキシン−αおよびリ
ンホトキシン−βを含む）により、ＬＰＳまたはトロンビンへの曝露により、な
らびに特定のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される転写因子である。転
写因子として、ＮＦ−κＢは免疫細胞の活性化に関与する遺伝子の発現、アポト
ーシスの制御（ＮＦ−κＢは、アポトーシスから細胞を保護するようである）、
Ｂ細胞およびＴ細胞の発生、抗ウイルス応答および抗菌応答、ならびに複数のス
トレス応答を調節する。

【０４５７】 刺激されない条件において、ＮＦ−κＢは、Ｉ−κＢ（インヒビターκＢ）を
有する細胞質に保持される。しかし、刺激の際に、Ｉ−κＢはリン酸化され、そ
して分解（ｄｅｇｒａｄｅｄ）され、ＮＦ−κＢの核へのシャトル（ｓｈｕｔｔ
ｌｅ）を引き起こし、これにより標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−κＢに
より活性化される標的遺伝子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ
ＣＡＭ−１およびクラス１ＭＨＣが挙げられる。

【０４５８】 その中心的な役割および一定の範囲の刺激に応答する能力に起因して、ＮＦ−
κＢプロモーターエレメントを利用するレポーター構築物を、実施例１２におい
て産生された上清をスクリーニングするために使用する。ＮＦ−κＢのアクチベ
ーターまたはインヒビターは、疾患の処置に有用である。例えば、ＮＦ−κＢの
インヒビターを、急性または慢性的なＮＦ−κＢの活性化に関連するこれらの疾
患（例えば、慢性関節リウマチ）を処置するために使用し得る。

【０４５９】 ＮＦ−κＢプロモーターエレメントを含むベクターを構築するために、ＰＣＲ
に基づいたストラテジーを用いる。上流のプライマーは、ＮＦ−κＢ結合部位（
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ）（配列番号３０）の４つの直列のコピー、ＳＶ４０
初期プロモーター配列の５’末端に対して相補的な１８ｂｐの配列を含み、そし
てＸｈｏＩ部位に隣接する：

【０４６０】

【化２０】 下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターの３’末端に対して相補的であり、
そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列
番号３２）。

【０４６１】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐβ−ｇａｌ：プロモータープ
ラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを使用して行う。得ら
れたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＢＬ
ＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。Ｔ７およびＴ３プ
ライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むことを確認する：

【０４６２】

【化２１】 次に、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＳＥＡＰ２−プロモータ
ープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＳＶ４０最小プロモーターエレメ
ントをこのＮＦ−κＢ／ＳＶ４０フラグメントで置換する。しかし、このベクタ
ーはネオマイシン耐性遺伝子を含まず、そしてそれゆえ哺乳動物の発現系には好
ましくない。

【０４６３】 安定な哺乳動物細胞株を作製するために、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカ
セットを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用して上記のＮＦ−κＢ／ＳＥＡ
Ｐベクターから取り出し、そしてネオマイシン耐性を含むベクターに挿入する。
詳細には、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでｐＧＦＰ−１を制限処理した後に、ＮＦ−
κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットをｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入
し、ＧＦＰ遺伝子を置換した。

【０４６４】 一旦、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製した後は、実
施例１４に記載のプロトコルに従って、安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を作製し、
そして維持する。同様に、これらの安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を含む上清をア
ッセイするための方法がまた、実施例１４に記載される。陽性コントロールとし
て、外因性のＴＮＦα（０．１、１、１０ｎｇ）をウェルＨ９、Ｈ１０、および
Ｈ１１に添加し、代表的には、５〜１０倍の活性化が観察される。

【０４６５】 （実施例１８：ＳＥＡＰ活性についてのアッセイ） 実施例１４〜１７に記載されるアッセイのためのレポーター分子として、ＳＥ
ＡＰ活性を、以下の一般的な手順に従ってＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉ
ｇｈｔ Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＰ−４００）を用いてアッセイする。Ｔｒｏｐ
ｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔは、以下で使用される希釈緩衝液、
アッセイ緩衝液、および反応緩衝液を供給する。

【０４６６】 ディスペンサーに２．５×希釈緩衝液を満たし、そして１５μｌの２．５×希
釈緩衝液を３５μｌの上清を含むオプティプレート（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）に分
与する。プラスチックシーラーでプレートをシールし、そして６５℃で３０分間
インキュベートする。一様でない加温を避けるためにオプティプレートを離して
おく。

【０４６７】 サンプルを室温まで１５分間冷却する。ディスペンサーを空にし、そしてアッ
セイ緩衝液を満たす。５０μｌのアッセイ緩衝液を添加し、そして室温で５分間
インキュベートする。ディスペンサーを空にし、そして反応緩衝液を満たす（以
下の表を参照のこと）。５０μｌの反応緩衝液を添加し、そして室温で２０分間
インキュベートする。化学発光シグナルの強度は時間依存的であり、そしてルミ
ノメーターで５つのプレートを読み取るために約１０分間を費やすので、１回に
５つのプレートを処理し、１０分後に２つ目のセットを開始するべきである。

【０４６８】 ルミノメーターにおける相対的な光の単位（ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を読み取
る。ブランクとしてＨ１２をセットし、そして結果を印字する。化学発光の増加
は、レポーター活性を示す。

【０４６９】

【表４】 （実施例１９：低分子の濃度および膜透過性における変化を同定する高処理能
力スクリーニングアッセイ） レセプターへのリガンドの結合は、カルシウム、カリウム、ナトリウムのよう
な低分子およびｐＨの細胞内レベルを変化させ、さらに膜電位を変化させること
が公知である。これらの変化を特定細胞のレセプターに結合する上清の同定を行
うアッセイで測定し得る。以下のプロトコルは、カルシウムについてのアッセイ
を記載するが、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位、また
は蛍光プローブにより検出可能な任意の他の低分子における変化を検出するよう
に容易に改変し得る。

【０４７０】 以下のアッセイは、蛍光測定画像化プレートリーダー（「ＦＬＩＰＲ」）を使
用して低分子と結合する蛍光分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）におけ
る変化を測定する。明らかに、低分子を検出する任意の蛍光分子を本明細書で用
いるカルシウム蛍光分子、ｆｌｕｏ−３の代わりに使用し得る。

【０４７１】 接着細胞については、細胞を１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルで、底
が透明なＣｏ−ｓｔａｒ黒色９６ウェルプレートに播種する。プレートをＣＯ₂
インキュベーター内で２０時間インキュベートする。接着細胞をＢｉｏｔｅｋ洗
浄器内で２００μｌのＨＢＳＳ（ハンクスの平衡塩類溶液）で二回洗浄し、最後
の洗浄後、緩衝液１００μｌを残す。

【０４７２】 １ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３のストック溶液を１０％プルロン酸（ｐｌｕｒｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）ＤＭＳＯで作製する。細胞にｆｌｕｏ−３を負荷するため、
１２μｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３（５０μｌ）を各ウェルに添加する。このプレー
トをＣＯ₂インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベートする。プレー
トをＢｉｏｔｅｋ洗浄器で、ＨＢＳＳにより４回洗浄し、緩衝液１００μｌを残
す。

【０４７３】 非接着細胞については、細胞を培養培地からスピンダウンする。細胞を、５０
ｍｌのコニカルチューブ内でＨＢＳＳを用いて２〜５×１０⁶細胞／ｍｌに再懸
濁する。細胞懸濁液１ｍｌあたり、１ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３の１０％プルロ
ン酸ＤＭＳＯ溶液４μｌを加える。次に、チューブを３７℃の水浴中に３０〜６
０分間置く。細胞をＨＢＳＳで二回洗浄し、１×１０⁶細胞／ｍｌに再懸濁し、
そしてマイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分配する。プレートを１００
０ｒｐｍで５分間遠心分離する。次に、プレートをＤｅｎｌｅｙ ＣｅｌｌＷａ
ｓｈ中で２００μｌで一回洗浄した後、吸引工程により最終容量を１００μｌに
する。

【０４７４】 非細胞ベースのアッセイについては、各ウェルは、ｆｌｕｏ−３のような蛍光
分子を含有する。上清をウェルに添加し、そして蛍光変化を検出する。

【０４７５】 細胞内カルシウムの蛍光を測定するため、ＦＬＩＰＲを以下のパラメーターに
ついて設定する：（１）システムゲインは、３００〜８００ｍＷであり；（２）
曝露時間は、０．４秒間であり；（３）カメラＦ／ストップは、Ｆ／２であり；
（４）励起は４８８ｎｍであり；（５）発光は５３０ｎｍであり；そして（６）
サンプル添加は５０μｌである。５３０ｎｍにおける発光の増加は、細胞内Ｃａ ⁺⁺ 濃度の増加を生じる分子（ＴＲ１２またはＴＲ１２によって誘導される分子の
いずれか）によって引き起こされる、細胞外シグナル伝達事象を示す。

【０４７６】 （実施例２０：チロシンキナーゼ活性を同定する高処理能力スクリーニングア
ッセイ） プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、多様な群の膜貫通キナーゼおよび
細胞質キナーゼを表す。レセプタープロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）群
内に、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦおよびインスリンレセプター
サブファミリーを含む、一定の範囲の有糸分裂促進性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）お
よび代謝性成長因子のレセプターがある。さらに、対応するリガンドが未知であ
る大きなＲＰＴＫファミリーがある。ＲＰＴＫのリガンドは、主として分泌され
る低分子量タンパク質を含むが、膜結合型および細胞外マトリックスタンパク質
も含む。

【０４７７】 リガンドによるＲＰＴＫの活性化は、リガンド媒介レセプターダイマ−化を含
み、これはレセプターサブユニットのトランスリン酸化および細胞質チロシンキ
ナーゼの活性化を生じる。細胞質チロシンキナーゼとしては、ｓｒｃファミリー
（例えば、ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）のレセプター関連チロシ
ンキナーゼ、ならびにＪａｋファミリーのような非レセプター結合型および細胞
質ゾルプロテインチロシンキナーゼが挙げられる。これらのメンバーは、サイト
カインスーパーファミリー（例えば、インターロイキン、インターフェロン、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦおよびレプチン）のレセプターによって誘発されるシグナル伝達を媒
介する。

【０４７８】 チロシンキナーゼ活性を刺激し得る公知の因子は広範であるため、ＴＲ１２ま
たはＴＲ１２によって誘導される分子が、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を
活性化し得るか否かを同定することは、興味深い。従って、以下のプロトコルを
設計して、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化し得る、このような低分
子を同定する。

【０４７９】 標的細胞（例えば、初代ケラチノサイト）を約２５，０００細胞／ウェルの密
度で、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入した９６
ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅに播種す
る。プレートを１００％エタノールで３０分間、二回リンスして滅菌し、水でリ
ンスした後、一晩乾燥させる。幾つかのプレートを、１００ｍｌの細胞培養グレ
ードＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）またはポリリジン（
５０ｍｇ／ｍｌ）（これらは全て、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る）で、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した１０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ、あるいは仔
ウシ血清で２時間コートし、ＰＢＳでリンスした後、４℃で保存する。増殖培地
に５，０００細胞／ウェルを播種し、製造業者のＡｌａｍａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）が記載するように、ａｌａ
ｍａｒＢｌｕｅを使用して４８時間後に細胞数を間接定量することにより、これ
らのプレート上の細胞増殖をアッセイする。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＦａｌｃｏｎプレートカバー＃３０７１を使用し、
Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅを覆う。Ｆａｌ
ｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ ＩＩＩ細胞培養プレートもまた、いくつかの増殖
実験において使用し得る。

【０４８０】 抽出物を調製するため、Ａ４３１細胞をＬｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイロ
ン膜上に播種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、そして完全培地中で一
晩培養する。細胞を無血清基本培地中で２４時間インキュベートして静止させる
。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）または実施例１２で生成した上清５０μｌで５〜２
０分間処理した後、培地を除去し、１００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ ｐＨ７．５，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，０
．１％ＳＤＳ，２ｍＭ Ｎａ₃ＶＯ₄，２ｍＭ Ｎａ₄Ｐ₂Ｏ₇およびＢｏｅｈｅｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手し
たプロテアーゼインヒビターの混合物（＃１８３６１７０））を各ウェルに添加
し、そしてプレートを回転振盪器上、４℃で５分間振盪する。次に、プレートを
真空トランスファーマニホールド（ｖａｃｕｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍａｎｉ
ｆｏｌｄ）に設置し、そしてハウスバキュームを使用して抽出物を各ウェルの底
の０．４５ｍｍ膜で濾過する。抽出物をバキュームマニホールドの底の９６ウェ
ル捕獲／アッセイプレートに集め、そして直ちに氷上に置く。遠心分離により明
澄化した抽出物を得るため、界面活性剤で５分間可溶化した後、各ウェルの含有
物を取り出し、４℃、１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。

【０４８１】 濾過抽出物をチロシンキナーゼ活性のレベルについて試験する。チロシンキナ
ーゼ活性を検出する多数の方法が公知であるが、本明細書においては方法の一つ
を記載する。

【０４８２】 一般的に、特定の基質（ビオチン化ペプチド）上のチロシン残基をリン酸化す
る能力を決定することにより、上清のチロシンキナーゼ活性を評価する。この目
的に使用し得るビオチン化ペプチドとしては、ＰＳＫ１（細胞分裂キナーゼｃｄ
ｃ２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に相当）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミノ
酸１〜１７に相当）が挙げられる。両ペプチドは、一連のチロシンキナーゼの基
質であり、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能である。

【０４８３】 以下の成分を順に添加することにより、チロシンキナーゼ反応を設定する。ま
ず、５μＭビオチン化ペプチド１０μｌを添加した後、順に、ＡＴＰ／Ｍｇ²⁺（
５ｍＭ ＡＴＰ／５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂）１０μｌ、５×アッセイ緩衝液（４０
ｍＭ塩酸イミダゾール、ｐＨ７．３、４０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ
ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ ＭｎＣｌ₂、０．５ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ）１０μｌ、バナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）５μｌ、最後に水５μｌを
加える。成分を穏やかに混合し、反応混合物を３０℃で２分間プレインキュベー
トする。コントロール酵素または濾過上清１０μｌを加えて反応を開始させる。

【０４８４】 次に、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ １０μｌを添加することによりチロシンキナー
ゼアッセイ反応を停止し、反応物を氷上に置く。

【０４８５】 反応混合物の５０μｌのアリコートをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モ
ジュールに移し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、チロシンキ
ナーゼ活性を測定する。これにより、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａ
ｄｉｎ）コーティング９６ウェルプレートをビオチン化ペプチドと会合させ得る
。ＭＴＰモジュールを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、西洋
ワサビペルオキシダーゼに結合体化した抗ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｏｔｙｒ
ｏｓｉｎｅ）抗体（抗Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））７５μｌを、各
ウェルに添加した後、３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記のよう
に洗浄する。

【０４８６】 次に、ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）１００μｌを加え、室温で少なくとも５分間（最長３０分間）インキュベート
する。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４０５ｎｍにおけるサンプルの吸光度を
測定する。結合したペルオキシダーゼ活性のレベルをＥＬＩＳＡリーダーを使用
して定量し、これは、チロシンキナーゼ活性のレベルを反映する。

【０４８７】 （実施例２１：リン酸化活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 実施例２０に記載のプロテインチロシンキナーゼ活性アッセイの可能性のある
代替物および／または補完物（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）として、主要な細胞内シ
グナル伝達中間体の活性化（リン酸化）を検出するアッセイもまた使用し得る。
例えば、下記のように、一つの特定のアッセイは、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２
キナーゼのチロシンリン酸化を検出し得る。しかし、Ｒａｆ、ＪＮＫ、ｐ３８
ＭＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ、筋肉特
異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＩＲＡＫ、ＴｅｃおよびＪａｎｕｓのような他の分
子、ならびに他の任意のホスホセリン、ホスホチロシンまたはホスホスレオニン
分子のリン酸化を、以下のアッセイにおいてこれらの分子でＥｒｋ−１またはＥ
ｒｋ−２を置き換えることにより検出し得る。

【０４８８】 詳細には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルをプロテインＧ（１μｇ／
ｍｌ）０．１ｍｌにより室温（ＲＴ）で２時間コーティングしてアッセイプレー
トを作製する。次に、プレートをＰＢＳでリンスし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳにより
室温で１時間ブロックする。次に、プロテインＧプレートをＥｒｋ−１およびＥ
ｒｋ−２に対する二つの市販のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル）（Ｓ
ａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理（ＲＴで１時間）す
る。（他の分子を検出するために、上記の任意の分子を検出するモノクローナル
抗体を交換することにより、この工程を容易に改変し得る）。ＰＢＳで３〜５回
リンスした後、使用時まで、プレートを４℃で貯蔵する。

【０４８９】 Ａ４３１細胞を２０，０００／ウェルで９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィル
タープレートに播種し、増殖培地中で一晩培養する。次に、細胞を基本培地（Ｄ
ＭＥＭ）中で４８時間飢餓させた後、ＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）または実施例１
２で得た上清５０μｌで５〜２０分間処理する。次に、細胞を可溶化し、抽出物
を濾過して直接アッセイプレート中に入れる。

【０４９０】 抽出物を用いて室温で１時間インキュベートした後、ウェルを再度リンスする
。陽性コントロールとして、市販のＭＡＰキナーゼ調製物（１０ｎｇ／ウェル）
をＡ４３１抽出物の代わりに使用する。次に、プレートを、Ｅｒｋ−１およびＥ
ｒｋ−２キナーゼのリン酸化エピトープを特異的に認識する市販のポリクローナ
ル（ウサギ）抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理する（室温で１時間）。この抗体を標
準的な手順によりビオチン化する。次に、結合ポリクローナル抗体をユーロピウ
ムストレプトアビジンおよびユーロピウム蛍光増強剤と、Ｗａｌｌａｃ ＤＥＬ
ＦＩＡ装置内で連続的にインキュベートする（時間分解性蛍光）ことによって定
量する。バックグラウンドを超える蛍光シグナルの増加は、ＴＲ１２またはＴＲ
１２によって誘導される分子によるリン酸化を示す。

【０４９１】 （実施例２２：ＴＲ１２遺伝子における変化の決定方法） 目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者から単離
されたＲＮＡを単離する。次に、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分
野で公知のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。
次に、このｃＤＮＡを、配列番号１における目的の領域を取り囲むプライマーを
用いるＰＣＲのテンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄ
ｒａｎｓｋｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）に記載の緩衝溶
液を使用し、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；および７０
℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルからなる。

【０４９２】 次に、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐｉ
ｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、５’末端にＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。ＴＲ１２の選択
したエキソンのイントロン−エキソン境界もまた決定し、ゲノムＰＣＲ産物を分
析してその結果を確認する。次に、ＴＲ１２に疑わしい変異を有するＰＣＲ産物
のクローン化および配列決定を行い、直接配列決定の結果を確認する。

【０４９３】 ＴＲ１２のＰＣＲ産物を、ＨｏｌｔｏｎおよびＧｒａｈａｍ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１１５６（１９９１）に記載のように
Ｔテールベクターにクローン化し、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔ
ｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で配列決定する。罹患個体を、非罹患個体には
存在しないＴＲ１２における変異により同定する。

【０４９４】 ゲノム再配置もまた、ＴＲ１２遺伝子における改変を決定する方法として観察
する。実施例２に従って単離したゲノムクローンを、ジゴキシゲニンデオキシ−
ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を用いてニ
ックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ． ３５： ７３−９９（１９９１）に記載のようにＦＩＳＨを行
う。ＴＲ１２ゲノム遺伝子座への特異的ハイブリダイゼーションのために、大過
剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて標識プローブとのハイブリダイゼーション
を行う。

【０４９５】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウム
で対比染色し、ＣおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピングの
ための整列イメージを、三重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）と冷却電荷結合素子カメラ（Ｐ
ｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および可変励起波長フィルター
（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８：７５
（１９９１））とを組み合わせて用いて得る。ＩＳｅｅ Ｇｒａｐｈｉｃａｌ
Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ， Ｄｕｒｈａｍ， ＮＣ）を使用して、イメージ収集、分析および染色体部
分長測定を行う。（プローブがハイブリダイズした）ＴＲ１２ゲノム領域の染色
体変化を、挿入、欠失および転座として同定する。これらのＴＲ１２の変化を関
連疾患の診断マーカーとして使用する。

【０４９６】 （実施例２３：生物学的サンプル中のＴＲ１２異常レベルを検出する方法） ＴＲ１２ポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてＴＲ１２の
上昇または低下が検出されるなら、このポリペプチドは、特定表現型のマーカー
である。検出方法は数多くあり、そしてそれ故、当業者は以下のアッセイをそれ
らの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解される。

【０４９７】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、サンプル中、好ましくは、生
物学的サンプル中のＴＲ１２を検出する。マイクロタイタープレートのウェルを
、ＴＲ１２に特異的抗体を最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌで用いてコーティン
グする。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであって
、実施例１０に記載の方法により産生される。ウェルに対するＴＲ１２の非特異
的結合が減少するように、このウェルをブロックする。

【０４９８】 次に、コーティングしたウェルを、ＴＲ１２含有サンプルを用いて室温で２時
間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系列希釈を使用して結
果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水で三回洗浄し
、非結合ＴＲ１２を除去する。

【０４９９】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イオン水
または蒸留水で三回洗浄し、未結合の結合体を除去する。

【０５００】 ４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートする。反応物をマイクロタイタープレートリーダーにより測定する。コ
ントロールサンプルの系列希釈を使用して標準曲線を作成し、そしてＸ軸（対数
スケール）にＴＲ１２ポリペプチド濃度を、そしてＹ軸（線形スケール）に蛍光
または吸光度をプロットする。標準曲線を用いてサンプル中のポリペプチド濃度
を補間する。

【０５０１】 （実施例２４：ＴＲ１２ポリペプチドおよび本発明の他の組成物の処方） ＴＲ１２ポリペプチドおよび本発明の他の組成物（例えば、抗ＴＲ１２抗体）
の組成物を、個々の患者の臨床状態（特に、ＴＲ１２ポリペプチドまたは組成物
単独での処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の
他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的
とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される。

【０５０２】 一般的提案として、用量当り、非経口的に投与されるＴＲ１２ポリペプチドお
よび本発明の他の組成物の総薬学的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日
〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねら
れる。より好ましくは、このホルモンについて、この用量は、少なくとも０．０
１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約
１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続投与する場合、代表的には、ＴＲ１２を約
１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注
射かまたは連続皮下注入（例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与す
る。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期
間および応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである
。

【０５０３】 本発明のＴＲ１２タンパク質または他の組成物（例えば、抗ＴＲ１２抗体）を
含む薬学的組成物を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅ
ｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤または経皮パ
ッチによるなど）、口内、あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与する。「
薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤
、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をいう。好ましくは、キャリアは
、滅菌状態である。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、
腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。

【０５０４】 ＴＲ１２ポリペプチドおよび本発明の他の組成物はまた、徐放性システムによ
り適切に投与される。徐放性組成物の適切な例は、例えば、フィルムまたはマイ
クロカプセルの成形品の形態の半透過性ポリマーマトリックスを包含する。徐放
性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、Ｅ
Ｐ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコ
ポリマー（Ｓｉｄｍａｎ，Ｕ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５
５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇ
ｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９
８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９
８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら）またはポリ−Ｄ−（−
）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。徐放性組成物は
また、リポソームに封入されたＴＲ１２ポリペプチドおよび本発明の他の組成物
を包含する。ＴＲ１２ポリペプチドおよび本発明の他の組成物を含有するリポソ
ームは、それ自体が公知である方法により調製される：ＤＥ３，２１８，１２１
；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：
３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２
２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，
６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４
５号および第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ第１０２，３２４号。通常、
リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、
脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された割合が、最
適分泌ポリペプチド治療のために調整される。

【０５０５】 非経口投与のために、１つの実施形態において、一般に、ＴＲ１２ポリペプチ
ドおよび本発明の他の組成物は、それを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能
なキャリア、すなわち用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がな
く、かつ処方物の他の成分と適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態（溶
液、懸濁液、または乳濁液）で混合することにより処方される。例えば、この処
方物は、好ましくは、酸化剤、およびポリペプチドに対して有害であることが知
られている他の化合物を含まない。

【０５０６】 一般に、ＴＲ１２ポリペプチドおよび本発明の他の組成物のを液体キャリアま
たは微細分割固体キャリアあるいはその両方と均一および緊密に接触させて処方
物を調製する。次に、必要であれば、生成物を所望の処方物に成形する。好まし
くは、キャリアは、非経口的キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等
張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩
水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油および
オレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書
において有用である。

【０５０７】 キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩
、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のよう
な抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリア
ルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリ
ンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシ
ン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンのようなアミノ酸；セル
ロースもしくはその誘導体、ブドウ糖、マンノース、またはデキストリンを含む
、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニ
トールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン
；および／またはポリソルベート、ポロキサマー、またはＰＥＧのような非イオ
ン性界面活性剤が挙げられる。

【０５０８】 ＴＲ１２ポリペプチドおよび本発明の他の組成物は、代表的には約０．１ｍｇ
／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８
のｐＨで、このようなビヒクル中に処方される。前記の特定の賦形剤、キャリア
、または安定化剤を使用することにより、ポリペプチド塩が形成されることが理
解される。

【０５０９】 治療的投与に用いられるＴＲ１２ポリペプチドおよび本発明の他の組成物は無
菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過する
ことにより無菌状態は容易に達成される。一般に、治療用ポリペプチド組成物は
、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッ
パー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される。

【０５１０】 ＴＲ１２ポリペプチドおよび本発明の他の組成物は、通常、単位用量または複
数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成する
ための凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌ
のバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）ＴＲ１２ポリペプチド水溶液または
本発明の他の組成物を含む水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結
乾燥する。凍結乾燥したＴＲ１２ポリペプチドおよび本発明の他の組成物を注射
用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。

【０５１１】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を満たした一つ以上の
容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品
の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような
容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関
する政府機関による承認を表す。さらに、ＴＲ１２ポリペプチドおよび本発明の
他の組成物を他の治療用化合物と組み合わせて使用し得る。

【０５１２】 本発明の組成物は、単独で、または他の治療剤と組み合わせて投与され得る。
本発明の組成物と組み合わせて投与され得る治療剤としては、ＴＮＦファミリー
の他のメンバー、化学療法剤、抗生物質、ステロイド性および非ステロイド性の
抗炎症剤、従来の免疫療法剤、サイトカインおよび／または成長因子が挙げられ
るが、これらに限定されない。組み合わせは、同時に（例えば、混合物として）
、同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）または同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌ
ｙ）ではあるが別々に；あるいは連続的にかの、いずれかで投与され得る。これ
は、この組み合わせ薬剤が、治療混合物として共に投与される状態、およびこの
組み合わせ薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体への別々の静脈内ラ
インを通して）投与される手順をも含む。「組み合わせ」での投与は、さらに、
化合物または薬剤の１つが最初に与えられ、その後、第２の化合物または薬剤が
続く、別々の投与を含む。

【０５１３】 １つの実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦファミリーの他のメンバ
ーと組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得るＴＮＦ、ＴＮ
Ｆ関連分子またはＴＮＦ様分子としては、以下があげられるが、これらに限定さ
れない：可溶化形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−β
としても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロダイマーＬＴ−α２−βに見出される）
、ＯＰＧｌ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ，４−１ＢＢＬ、
ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３２８）、Ａ
ＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、エンドカイン（ｅｎｄｏｋｉ
ｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＯＰＧ、およびＮｅｕｔｒ
ｏｋｉｎｅ−α（国際公開番号ＷＯ９８／１８９２１）、ＯＸ４０、および神経
成長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶化形態のＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ
４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３
（国際公開番号ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２
８５６）、ＴＲ５（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番
号ＷＯ９８／３０６９４）、ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６９２）、Ｔ
ＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１２（国際公開
番号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２
）、およびＴＲ１２、ならびに可溶化形態ＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣＤ１
５３。

【０５１４】 本発明の組成物と組合わせて投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤としては
、ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミド
、メチルプレドニソン（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、プレドニソン（
ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオキシスパ
ガリン、およびＴ細胞応答機能を抑制することによって作用する他の免疫抑制剤
が挙げられるが、これらに限定されない。

【０５１５】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗生物質と組合わせて投与さ
れる。本発明の組成物と共に投与され得る抗生物質剤としては、テトラサイクリ
ン、メトロニダゾール、アモキシリン、β−ラクタマーゼ、アミノグリコシド、
マクロライド、キノロン、フルオロキノロン、セファロスポリン、エリスロマイ
シン、シプロフロキサシン、およびストレプトマイシンが挙げられるが、これら
に限定されない。

【０５１６】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独または抗炎症剤と組合わ
せて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗炎症剤としては、グル
ココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸誘導体
、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプ
ロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカル
ボキサミド、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−ア
ミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎｅ）、ベンダ
ザック、ベンジドアミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモル
ファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセ
プロール、パラニリン、ペリゾキサル、ピフオキシム、プロキアゾン、プロキサ
ゾール、およびテニダップが挙げられるが、これらに限定されない。

【０５１７】 別の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組合わせて投与され
る。本発明の組成物とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導体
（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノ
マイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば、
フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロックスウリジン（ｆｌｏ
ｘｕｒｉｄｉｎｅ）、インターフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシ
ン、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カル
ムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホ
スファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマ
イシン、ブスルファン、シス−プラチン、およびビンクリスチンスルフェート）
；ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナト
リウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、メゲストロールアセテ
ート、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストールジホスフェート、クロ
ロトリアニセン、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（
例えば、メファレン、クロランブシル、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタ
ード）およびチオテパ）；ステロイドおよび組合わせ（例えば、ベタメタゾンリ
ン酸ナトリウム）；ならびにその他（例えば、ジカルバジン、アスパラギナーゼ
、ミトタン、ビンクリスチンスルフェート、ビンブラスチンスルフェート、およ
びエトポシド）が挙げられるが、これらに限定されない。

【０５１８】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、サイトカインと組合わせて投
与される。本発明の組成物とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ２
、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、
ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられる
が、これらに限定されない。

【０５１９】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、脈管形成タンパク質と組合わ
せて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る脈管形成タンパク質とし
ては、欧州特許ＥＰ−３９９８１６に開示されるようなグリオーム由来増殖因子
（Ｇｉｌｉｏｍａ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）（ＧＤＧＦ
）；欧州特許ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小板由来増殖因子−Ａ（
ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許ＥＰ−２８２３１７に開示されるような血小板由来増
殖因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号ＷＯ９２／０６１９４号に開示され
るような胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇｏｒｗｔｈ Ｆａｃｔ
ｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるような胎盤増殖因子−２
（ＰｌＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に開示されるような血
管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許ＥＰ−５０６４７７に開示されるような
血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号ＷＯ９６／３９５１５号
に開示されるような血管内皮増殖因子−２（ＶＥＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ
９６／２６７３６号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ
−Ｂ１８６）；国際公開番号ＷＯ９８／０２５４３号に開示されるような血管内
皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；国際公開番号ＷＯ９８／０７８３２号に開示
されるような血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびドイツ国特許ＤＥ
１９６３９６０１に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が
挙げられるが、これらに限定されない。上記の参考文献は、本明細書で参考とし
て援用される。

【０５２０】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、線維芽細胞増殖因子と組合わ
せて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子とし
ては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ
−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、Ｆ
ＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられるが
、これらに限定されない。

【０５２１】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、他の治療レジメまたは予防レ
ジメ（例えば、放射線治療）と組合わせて投与される。

【０５２２】 （実施例２５：ＴＲ１２のレベルを低下させる方法） 本発明は、体内におけるＴＲ１２活性のレベルを低下させる必要のある個体を
処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量のＴＲ１２アンタゴニスト
を含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。本発明において使用
するための好ましいアンタゴニストは、ＴＲ１２特異的抗体である。

【０５２３】 さらに、個体におけるＴＲ１２の標準または正常発現レベルの増加により引き
起こされる状態は、ＴＲ１２を、好ましくは可溶性形態で投与することにより処
置し得ることが理解される。従って、本発明はまた、ＴＲ１２ポリペプチドのレ
ベルの増加が必要な個体の処置方法を提供する。この方法は、このような個体に
、このような個体でＴＲ１２の活性レベルを増加させる量の可溶性ＴＲ１２を含
む薬学的組成物を投与する工程を包含する。

【０５２４】 例えば、ＴＲ１２ポリペプチドのレベルが増加した患者は、ポリペプチドを、
１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好ましくは、ポリペ
プチドは可溶性形態である。投与および処方物に基づく投薬計画の正確な詳細は
、実施例２４に提供されている。

【０５２５】 さらに、アンチセンス技術を使用して、ＴＲ１２の産生を阻害し得る。例えば
、ＴＲ１２のレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチセンスポリヌ
クレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ／ｋｇ／日で
静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性があれば、７日間の休
薬期間後に、この処置を繰り返す。アンチセンスポリヌクレオチドの処方は、実
施例２４に提供されている。

【０５２６】 （実施例２６：ＴＲ１２のレベルを上昇させる方法） 本発明はまた、体内におけるＴＲ１２活性のレベルを増大させる必要のある個
体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量のＴＲ１２またはその
アゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。本発明に
おいて使用するための好ましいアゴニストは、ＴＲ１２特異的抗体である。

【０５２７】 （実施例２７：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、ＴＲ１２ポリペプチドを発現し得る線維芽細胞を
患者に移植する方法である。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験者から
得られる。得られた組織を組織培養培地中に配置し、小片に分割する。組織の小
塊を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、ほぼ１０片を各フラスコに置く。この
フラスコを倒置し、しっかりと閉めた後、室温で一晩放置する。室温で２４時間
後、フラスコを反転させ、組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、そして
新鮮培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有
するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次に、フラスコを３７℃で約１週間イン
キュベートする。

【０５２８】 この時点で、新鮮培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間
培養した後に単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、さらに大
きなフラスコにスケールアップする。

【０５２９】 Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉ
ｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理
する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して
精製する。

【０５３０】 ＴＲ１２をコードするｃＤＮＡを、実施例１に記載のそれぞれ５’および３’
末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得る。好ましくは、５’
プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部
位を含む。等量の、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線状骨格および増幅した
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在
下で一緒に加える。得られた混合物を二つのフラグメントを連結するのに適した
条件下で維持する。次に、連結混合物を使用し、細菌ＨＢ１０１を形質転換する
。次に、それを、カナマイシンを含む寒天上にプレーティングし、ベクターが正
確に挿入されたＴＲ１２を有することを確認する。

【０５３１】 アンフォトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、
１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベ
ッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな密度まで増
殖させる。次に、ＴＲ１２遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加え、そしてパ
ッケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パッケージング細胞は
、ＴＲ１２遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、パッケージン
グ細胞をプロデューサー細胞という）。

【０５３２】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、次いで培地を１０ｃ
ｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過し、はがれた
プロデューサー細胞を除去した後、この培地を使用して、線維芽細胞を感染させ
る。線維芽細胞のコンフルエント未満のプレートから培地を除去し、そしてプロ
デューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そして新
鮮培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽細胞
が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまたはｈｉｓ
のような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必要で
ある。一旦、線維芽細胞が効率的に感染したなら、線維芽細胞を分析し、ＴＲ１
２タンパク質が産生されているか否かを決定する。

【０５３３】 次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで宿主に移植する。

【０５３４】 （実施例２８：内因性ＴＲ１２遺伝子を使用する遺伝子治療） 本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、内因性ＴＲ１２配列を、例えば、米国
特許第５，６４１，６７０号；国際公開第ＷＯ ９６／２９４１１号；国際公開
第ＷＯ ９４／１２６５０号；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓ
ｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８（１９８９）に記載されるよ
うに、相同組換えを介してプロモーターに作動可能に結合する工程を包含する。
この方法は、その標的細胞中に存在するが、その細胞中で発現されないかまたは
所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝子の活性化を包含する。

【０５３５】 プロモーターおよび標的化配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製する。こ
の標的配列は、プロモーターに隣接する、内因性ＴＲ１２の５’非コード配列と
相同である。この標的化配列は、ＴＲ１２の５’末端に十分に近く、その結果、
このプロモーターは、相同組換えの際にこの内因性配列に作動可能に連結される
。このプロモーターおよび標的化配列を、ＰＣＲを使用して増幅し得る。好まし
くは、この増幅したプロモーターは、５’末端および３’末端上に異なる制限酵
素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅したプロモー
ターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末端
は、増幅したプロモーターの３’末端と同じ制限酵素部位を含む。

【０５３６】 この増幅したプロモーターおよび増幅した標的化配列を、適切な制限酵素で消
化し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消
化した標的化配列を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。生じた混
合物を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構築
物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール
沈殿により精製する。

【０５３７】 この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーショ
ンを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチ
ド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス
配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）とともにも投与し得る。送達のためのこのよ
うな方法は、当該分野で公知である。

【０５３８】 一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが、このプロモーターで生
じて、この内因性ＴＲ１２配列に作動可能に連結される。これは、この細胞中に
おけるＴＲ１２の発現を生じる。発現は、免疫学的染色または当該分野で公知の
他の任意の方法により、検出され得る。

【０５３９】 線維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋
１０％胎仔ウシ血清中に配置する。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を
、トリプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細
胞懸濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離
に供する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩
衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、０．７ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。この
細胞を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブミ
ン１ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終細
胞懸濁物は、約３×１０⁶細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再懸
濁直後に実施すべきである。

【０５４０】 プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、ＴＲ１２遺伝子
座に標的化するためのプラスミドを構築するために、プラスミドｐＵＣ１８（Ｍ
ＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎｄＩＩＩで消化す
る。５’末端にＸｂａＩ部位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を有するＣＭＶプ
ロモーターを、ＰＣＲにより増幅する。２つのＴＲ１２非コード配列をＰＣＲを
介して増幅する：５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端にＸｂａＩ部位
を有する一方のＴＲ１２非コード配列（ＴＲ１２フラグメント１）を、増幅する
；５’末端にＢａｍＨＩ部位および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する他方
のＴＲ１２非コード配列（ＴＲ１２フラグメント２）を、増幅する。このＣＭＶ
プロモーターおよびフラグメントを、適切な酵素（ＣＭＶプロモーター−Ｘｂａ
ＩおよびＢａｍＨＩ；ＴＲ１２フラグメント１−ＸｂａＩ；ＴＲ１２フラグメン
ト２−ＢａｍＨＩ）で消化し、そしてともに連結する。生じた連結生成物をＨｉ
ｎｄＩＩＩで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと
連結する。

【０５４１】 プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０⁶細胞
を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を
、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ
、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生
存が減少するが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割
合は劇的に増加する。これらのパラメーターを考慮すると、パルス時間約１４〜
２０ｍＳｅｃが観察されるはずである。

【０５４２】 エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキ
ュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞
を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤ
ＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この
培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４
時間インキュベートする。

【０５４３】 次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か、またはサイトデックス
（ｃｙｔｏｄｅｘ）３マイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）ビーズ上
でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいずれかで、注入する。ここで、
この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次いで、この線維芽細胞を、上
記のような患者に導入し得る。

【０５４４】 （実施例２９：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、ＴＲ１２ポリペプチド
の発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、お
よびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）ＴＲ１２配列の導入に関する。ＴＲ１２
ポリヌクレオチドは、プロモーター、または標的組織によるＴＲ１２ポリペプチ
ドの発現に必要な任意の他の遺伝子エレメントに、作動可能に連結され得る。こ
のような遺伝子治療および送達の技術および方法は、当該分野で公知である。例
えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５６９３６２
２号、同第５７０５１５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａら（１９９
７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−４７９；Ｃｈａｏ
Ｊら（１９９７）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５（６）：５１７−５２２；
Ｗｏｌｆｆ、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１
８（１９９７）、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３（５）：４０５
−４１１（１９９６）；Ｔｓｕｒｕｍｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（１
２）：３２８１−３２９０（１９９６）（本明細書中に参考として援用される）
を参照のこと。

【０５４５】 従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボでＴＲ１２ポリヌクレオチド
に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ）を用いて操作され得、この操作された細胞は次いで、このポリペプチドで
処置されるべき患者に提供される。このような方法は、当該分野で周知である。
例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８
５：２０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ，５３：１０７−１１１２（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ
ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：４６０４−４６１５（１９９４）；Ｋ
ａｉｄｏら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６０：２２１−２２９（１９９５）；
Ｏｇｕｒａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：５１０２−５１０６（
１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ７：１−１０（１９９６）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ ４：１２４６−１２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇら，Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：３１−３８（１９９６）を参照のこと
。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。１つの実施形態では、
操作される細胞は、動脈細胞である。動脈細胞は、動脈、動脈周囲の組織への直
接注射によって、またはカテーテル注射によって患者に再度導入され得る。

【０５４６】 以下でより詳細に考察するように、ＴＲ１２ポリヌクレオチド構築物は、注射
可能な物質を動物の細胞へ送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮
膚、肺、肝臓など）の間隙空間への注射）によって送達され得る。ＴＲ１２ポリ
ヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリア中で送達さ
れ得る。

【０５４７】 １つの実施形態では、ＴＲ１２ポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチドと
して送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞
への侵入を補助、促進または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（
ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱
剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、ＴＲ１２ポリヌクレオチドはま
た、リポソーム処方物中で送達され得、そしてリポフェクチン処方物などは当業
者に周知の方法によって調製され得る。このような方法は、例えば、本明細書中
に参考として援用される、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，
４６６号および同第５，５８０，８５９号に記載される。

【０５４８】 この遺伝子治療方法において使用されるＴＲ１２ポリヌクレオチドベクター構
築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列も含ま
ない構築物である。適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可
能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ
；ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３
．１、およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に
容易に明白である。

【０５４９】 当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、ＴＲ１２ ＤＮＡの発現を駆動
するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモ
ーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロモー
ター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイルス
（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター、
メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモ
ーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジ
ンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター
）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモ
ンプロモーターが挙げられる。プロモーターはまた、ＴＲ１２についてネイティ
ブなプロモーターであり得る。

【０５５０】 他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主
要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研
究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの間の期間、所
望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。

【０５５１】 ＴＲ１２ポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝
臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃
、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）
の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、細胞間液、ムコ多糖基質（
器官組織の細網線維、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織における
コラーゲン線維に間にある）、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞内または骨の裂孔
中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャンネル
のリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下
に考察する理由のために好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織への注入
によって、好都合に送達され得る。それらは、好ましくは、分化した持続性の非
分裂細胞に送達され、そしてその細胞において発現されるが、送達および発現は
、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または
皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボで、筋肉細胞は、ポリヌクレ
オチドを取り込み、そして発現する能力において、特に適格である。

【０５５２】 裸の核酸配列（ｎａｋｅｄ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）注入のために、Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋ
ｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから
約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約
５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識するように、この投薬量は、注入
の組織部位に従って変化する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によ
って容易に決定され得、そして処置される状態および投与経路に依存し得る。

【０５５３】 好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注入経路によってである。し
かし、他の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に肺または気管
支組織、咽喉、または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げ
られる。さらに、裸のＴＲ１２ ＤＮＡ構築物が、血管形成術の間にこの手順に
おいて用いられるカテーテルによって動脈に送達され得る。

【０５５４】 裸のポリヌクレオチドは、送達部位での直接針注射、静脈内注射、局所投与、
カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない、
当該分野で公知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該分
野で公知である。

【０５５５】 構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェク
チン、沈澱剤などのような送達ビヒクルを用いて送達され得る。このような送達
方法は、当該分野で公知である。

【０５５６】 特定の実施形態において、ＴＲ１２ポリヌクレオチド構築物はリポソーム調製
物中で複合体化している。本発明にて使用するためのリポソームの調製物は、陽
イオン性（正に荷電した）、陰イオン性（負に荷電した）および中性の調製物を
包含する。しかしながら、陽イオン性リポソームと多陰イオン性核酸との間で強
固な荷電複合体を形成し得るので、陽イオン性リポソームが特に好ましい。陽イ
オン性リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（本明細書中で参
考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１６（１９８７））；ｍＲＮＡ（本明細書中
で参考として援用される、Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ、８６：６０７７〜６０８１（１９８９））；および精製された転
写因子（本明細書中で参考として援用される、Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６５：１０１８９〜１０１９２（１９９０））の細胞内送達を媒介する
ことが示されている。

【０５５７】 陽イオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジ
オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは特に有用であり、そして登録商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎのもと
にＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参
考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１６（１９８７）をもまた参照のこと）より
入手可能である。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒ
ａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。

【０５５８】 当該分野で周知の技術を使用して、他の陽イオン性リポソームを、容易に入手
可能な物質より調製し得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−
３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記述に関しては、
例えばＰＣＴ公開第ＷＯ ９０／１１０９２号（本明細書中で参考として援用さ
れる）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献にて説明されており、
例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３〜７４１７を参照のこ
と。類似した方法を使用して、他の陽イオン性脂質物質よりリポソームを調製し
得る。

【０５５９】 同様に、陰イオン性リポソームおよび中性リポソームは、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏ
ｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）のようなところから
容易に入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して簡単に調製され
得る。そのような物質としてはとりわけ、ホスファチジル、コリン、コレステロ
ール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（
ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオ
イルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質
はまた、ＤＯＴＭＡ出発物資およびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な割合において混
合され得る。これらの物質を使用してリポソームを生成する方法は当該分野で周
知である。

【０５６０】 例えば、商業的に、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレ
オイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせにおいて使用し、コレ
ステロールの添加の有り無しで、従来のリポソームを生成し得る。従って、例え
ば超音波処理バイアル中で窒素ガス流下で、ＤＯＰＧおよびＤＯＰＣの各５０ｍ
ｇを乾燥することによりＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製し得る。このサンプルを
一晩真空ポンプ下に置き、そして次の日、脱イオン水で水和する。次いで、浴が
、１５ＥＣで循環している間、最大設定にて、逆位カップ（浴タイプ）プローブ
を装備したＨｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ モデル３５０超音波処理器を使用して、
このサンプルを栓をしたバイアル中にて２時間超音波処理する。あるいは、負に
荷電した小胞を超音波処理なしで調製し、多重膜小胞を生成し得るか、または核
孔膜（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して押し出すことにより
別々の大きさの単膜小胞を生成し得る。他の方法は当業者に公知および利用可能
である。

【０５６１】 このリポソームとしては、多重膜小胞（ＭＬＶ）、小さな単膜小胞（ＳＵＶ）
または大きな単膜小胞（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶが好ましい。当該分野で
周知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体が調製される。例えば、
本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０１：５１２〜５２７（１９８３）を参照
のこと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラスチューブの壁面にリン脂質の
薄膜を沈着させ、そしてその後、カプセル化されるべき物質の溶液で水和するこ
とによって調製され得る。ＳＵＶはＭＬＶの長期超音波処理により調製され、単
膜リポソームの均質集団を生成する。封入されるべき物質を予め形成されたＭＬ
Ｖの懸濁液に添加し、次いで、超音波処理する。陽イオン性脂質を含むリポソー
ムを使用する場合、乾燥した脂質膜を滅菌水または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＮａＣ
ｌのような等張性緩衝溶液のような適切な溶液中に再懸濁し、超音波処理し、次
いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと直接混合する。正に荷電したリポソ
ームの陽イオン性ＤＮＡへの結合に起因して、リポソームおよびＤＮＡは非常に
安定な複合体を形成する。ＳＵＶは小核酸フラグメントについての用途を見出す
。ＬＵＶは、当該分野で周知の多くの方法により調製される。一般に使用される
方法としては、Ｃａ²⁺−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ
ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、３９４：４８３（１９７５）
；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ、１７：７７（１９７９））；エーテル注入（Ｄｅ
ａｍｅｒ，Ｄ．およびＢａｎｇｈａｍ，Ａ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ａｃｔａ、４４３：６２９（１９７６）；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．、７６：８３６（１９７７）；Ｆｒａｌ
ｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：３３４８（１
９７９））；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．およびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅ
ｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：１４５（１９７９
））；および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．、２５５：１０４３１（１９８０）；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈ
ａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５
：１４５（１９７８）；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、
２１５：１６６（１９８２））が挙げられ、これらの文献は本明細書中で参考と
して援用される。

【０５６２】 一般に、ＤＮＡのリポソームに対する割合は約１０：１から約１：１０までで
ある。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は約５：１から約１：５までであ
る。より好ましくは、その割合は約３：１から約１：３までである。さらにより
好ましくは、その割合は約１：１である。

【０５６３】 米国特許第５，６７６，９５４号（本明細書中で参考として援用される）は陽
イオン性リポソームキャリアで複合体化された遺伝物質のマウスへの注入につい
て報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同
第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６
号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，
０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考と
して援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に
使用するための陽イオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、
同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５
５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として
援用される）は、ＤＮＡ−陽イオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提
供する。

【０５６４】 特定の実施形態において、ＴＲ１２をコードする配列を含有するＲＮＡを含む
レトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。
レトロウイルスプラスミドベクターを誘導し得るレトロウイルスとしては、モロ
ニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ
肉腫ウイルス、鳥類白血症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全
ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺癌ウイルスが挙げられるが、こ
れらに限定されない。

【０５６５】 レトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を形質
導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケー
ジング細胞株の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される、Ｍ
ｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅａｐｙ、１：５〜１４（１９９０）
にて記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１２、
Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−
８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるがこれらに限定さ
れない。このベクターは当該分野で公知の任意の手段によりパッケージング細胞
を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーション、リポソ
ームの使用、ＣａＰＯ₄沈澱が挙げられるが、それらに限定されない。１つの代
替法において、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソームにカプセル化し
得るか、または脂質に結合し、次いで宿主に投与し得る。

【０５６６】 プロデューサー細胞株は、ＴＲ１２をコードするポリヌクレオチドを含む感染
性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのようなレトロウイルス
ベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのどちらかにおいて、真核
生物細胞を形質導入し得る。形質導入された真核生物細胞はＴＲ１２を発現する
。

【０５６７】 特定の他の実施形態において、アデノウイルスベクター中に含まれるＴＲ１２
ポリヌクレオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。アデ
ノウイルスは、それがＴＲ１２をコードし、そして発現し、それと同時に通常の
溶解性ウイルス生活環にて複製するその能力に関して不活性化されるように操作
され得る。アデノウイルス発現はウイルスＤＮＡの宿主細胞染色体への組み込み
無しに達成され、その結果、挿入性変異誘発についての心配が軽減される。さら
に、アデノウイルスは何年もの間、生腸性ワクチンとして優れた安全側面を伴っ
て使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ
．、１０９：２３３−２３８（１９７４））。最終的に、アデノウイルス媒介性
遺伝子移入が、α−１−アンチトリプシンおよびＣＦＴＲのコトンラットの肺へ
の移入を含む多くの例において実証されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ、２５２：４３１〜４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅ
ｌｌ、６８：１４３〜１５５（１９９２））。さらに、ヒト癌における原因物質
としてアデノウイルスを確立しようとする大量の研究は、一様に陰性であった（
Ｇｒｅｅｎら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：６６０
６（１９７９））。

【０５６８】 本発明にて有用である適切なアデノウイルスベクターが、例えば、Ｋｏｚａｒ
ｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．、
３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：１
４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ
．Ｔｈｅｒ．、４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔ、７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ
、３６５:６９１〜６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２２４
号記載されており、これらは本明細書中で参考として援用される。例えば、アデ
ノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞にて増殖され得
る。これらの細胞はアデノウイルスのＥ１領域を含み、そして構成的にＥ１ａお
よびＥ１ｂを発現し、これらはそのベクターより欠失している遺伝子の産物を提
供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加えて、他の多様
なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もまた本発明にお
いて有用である。

【０５６９】 好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは複製欠損である。複
製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルスおよ
び／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは細胞
に感染する能力があり、そしてプロモーター（例えば、本発明のＨＡＲＰプロモ
ーター）に作動可能に連結された目的のポリヌクレオチドを発現し得るが、ほと
んどの細胞にて複製し得ない。複製欠損アデノウイルスは次の遺伝子：Ｅ１ａ、
Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａまたはＬ１からＬ５までのすべてまたは一部の１つ
以上にて欠失され得る。

【０５７０】 特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、エ
キソビボまたはインビボで細胞を操作する。ＡＡＶは感染性粒子を生成するため
にヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（Ｍｕｚ
ｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．，１５８：９７（１９９２））。それはまた、分裂していない細胞
の中にそのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。３００塩
基対程度の小さいＡＡＶを含むベクターがパッケージされ得、そして組み込み得
るが、外来性ＤＮＡに対するスペースは約４．５ｋｂに限られる。そのようなＡ
ＡＶの生成および使用の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，
１３９，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７８号、同
第５，４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８，７４５
号および同第５，５８９，３７７号を参照のこと。

【０５７１】 例えば、本発明にて使用するために適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製、キ
ャプシド形成、および宿主細胞組み込みに関して必要な全ての配列を含む。Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１
９８９）にて見い出される方法のような、標準的クローニング方法を使用して、
ＴＲ１２を含むポリヌクレオチド構築物をＡＡＶベクターに挿入する。次いで、
リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈澱などを含む
、任意の標準的技術を使用して、この組み換えＡＡＶベクターを、ヘルパーウイ
ルスに感染しているパッケージング細胞にトランスフェクトする。適切なヘルパ
ーウイルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイ
ルス、またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッケージング細胞がトラン
スフェクトおよび感染されると、それらはＴＲ１２ポリヌクレオチド構築物を含
む感染性ＡＡＶウイルス粒子を生成する。次いで、エキソビボまたはインビボの
どちらかで、これらのウイルス粒子を使用して真核生物細胞を形質導入する。形
質導入細胞はそのゲノムに組み込まれたＴＲ１２ポリヌクレオチド構築物を含み
、そしてＴＲ１２を発現する。

【０５７２】 遺伝子治療の別の方法は、相同組み換え（例えば、米国特許第５，６４１，６
７０号；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０
号；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：
８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ、
３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）による、作動可能に連結し
ている異種制御領域および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、ＴＲ１２をコ
ードしている配列）を含む。この方法は標的細胞中に存在しているが、通常はそ
の細胞中にて発現しないか、もしくは所望するよりも低いレベルにて発現する遺
伝子の活性化を含む。

【０５７３】 当該分野で既知の標準的技術を使用して、ポリヌクレオチド構築物を作製する
。この構築物はプロモーターに隣接した標的化配列とともにプロモーターを含む
。適切なプロモーターが本明細書中に記載されている。標的化配列は内在性配列
に対して十分に相補的であり、プロモーター標的化配列と内在性配列との相同組
換えを可能にする。標的化配列は、所望される内在性ＴＲ１２ポリヌクレオチド
配列の５’末端の十分近くに存在し、それゆえ、相同組換えによって、プロモー
ターは作動可能に内在性配列に連結される。

【０５７４】 このプロモーターおよび標的化配列はＰＣＲを使用して増幅され得る。好まし
くは、この増殖されたプロモーターは５’末端および３’末端に別の制限酵素部
位を含む。好ましくは、最初の標的化配列の３’末端は増幅されたプロモーター
の５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末端は増
幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限酵素部位を含む。増幅されたプロモ
ーターおよび標的化配列を消化し、そしてともに連結する。

【０５７５】 裸のポリヌクレオチドとしてか、もしくは上記にてより詳細に記載されている
ようなリポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクシ
ョン、沈澱剤などのようなトランスフェクション促進剤と一緒にかのいずれかで
、このプロモーター−標的化配列構築物を細胞に送達する。直接針注射、静脈内
注射、局所投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法によりＰプ
ロモーター−標的化配列を送達し得る。この方法を下記により詳細に記載する。

【０５７６】 プロモーター−標的化配列構築物は細胞により、取り込まれる。この構築物と
内在性配列との間に相同組換えが起こり、その結果、内在性ＴＲ１２配列はこの
プロモーターの制御下に配置される。次いで、このプロモーターは内在性ＴＲ１
２配列の発現を駆動する。

【０５７７】 ＴＲ１２をコードするポリヌクレオチドは、脈管形成タンパク質をコードする
他のポリヌクレオチドと一緒に投与され得る。脈管形成タンパク質としては、酸
性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、上皮増殖因子αおよびβ
、血小板由来の内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子α、肝細
胞増殖因子、インスリン様増殖因子、コロニー刺激因子、マクロファージコロニ
ー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子および一酸化窒素シンタ
ーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

【０５７８】 好ましくは、ＴＲ１２をコードするポリヌクレオチドは、タンパク質の分泌を
促進する分泌シグナル配列を含む。代表的に、シグナル配列は、コード領域の５
’末端に向かってまたは５’末端にて発現されるポリヌクレオチドのコード領域
に位置づけられる。このシグナル配列は、目的のポリヌクレオチドに対して同種
または異種であり得、そしてトランスフェクトされる細胞に対して同種または異
種であり得る。さらに、当該分野で公知の方法を使用して、このシグナル配列は
化学合成され得る。

【０５７９】 その方法によって、治療効果を提供するのに十分な量において１つ以上の分子
が発現される限り、上記の任意のポリヌクレオチド構築物の任意の投与方法が使
用され得る。これは、直接針注入、全身注射、カテーテル注入、バイオリスティ
ック注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、ゲルフォームスポンジデ
ポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経
口または坐剤固形（錠剤または丸剤）薬学的処方物、および手術中のデカンティ
ングまたは局所適用を含む。例えば、ラット肝臓およびラット脾臓へのリン酸カ
ルシウム沈澱した裸のプラスミドの直接注入または門脈へのタンパク質被覆プラ
スミド直接注入は、ラット肝臓における外来性遺伝子の遺伝子発現をもたらした
（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：３７５（１９８９））。

【０５８０】 局所投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達ビ
ヒクルと複合体を形成した本発明の組換え分子は、動脈領域に直接注入により投
与されるか、または動脈領域内部に局所投与される。動脈領域内部での組成物の
局所投与とは、その組成物を動脈内に数センチメートル、好ましくは数ミリメー
トルで注射することをいう。

【０５８１】 局部投与の別の方法は、外科的創傷内またはその周辺に本発明のポリヌクレオ
チド構築物を接触させることである。例えば、患者は手術を経験し得、そしてポ
リヌクレオチド構築物を創傷内部の組織表面上に被覆し得るか、またはその構築
物を創傷内部の組織領域に注射し得る。

【０５８２】 全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクルと複合体
を形成した本発明の組換え分子を含む。全身投与で使用するために適切な送達ビ
ヒクルは、特定部位に対してそのビヒクルを標的化するリガンドを含むリポソー
ムを含む。

【０５８３】 全身投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口および経皮
（局所的）送達が挙げられる。当該分野で標準的な方法を使用して、静脈内注射
が実行され得る。当該分野で標準的な方法を使用して、エアロゾル送達もまた実
行され得る（例えば、本明細書中で参考として援用されるＳｔｒｉｂｌｉｎｇら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１８９：１１２７７〜１１
２８１（１９９２）を参照のこと）。動物の腸内の消化酵素による分解に耐える
能力をもつキャリアに対して本発明のポリヌクレオチド構築物が複合体を形成す
ることにより、経口送達は実行され得る。そのようなキャリアの例としては、当
該分野で公知であるもののような、プラスチックカプセルまたは錠剤が挙げられ
る。皮膚内へ通過可能な親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と本発明のポリヌクレ
オチド構築物を混合することによって、局所的送達は実行され得る。

【０５８４】 送達される物質の有効量を決定することは、例えば、その物質の化学構造およ
び生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびそ
の重症度ならびに投与経路を含む多数の因子に依存し得る。処置の頻度は、１用
量あたりで投与されるポリヌクレオチド構築物の量ならびに被験体の健康および
病歴のような多くの因子に依存する。正確な量、投薬回数および投薬のタイミン
グは、内科医または獣医により決定される。

【０５８５】 インビボでの筋肉における注入されたＴＲ１２ポリヌクレオチドの用量応答効
果を、以下のようにして決定する。ＴＲ１２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
の生成のための適切なＴＲ１２鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従
って調製する。鋳型ＤＮＡ（これは環状または線状のいずれかであり得る）を裸
のＤＮＡとして使用するか、またはリポソームと複合体化するかのいずれかであ
る。次いで、マウスの四頭筋に、種々の量の鋳型ＤＮＡを注入する。

【０５８６】 ５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。ＴＲ１２鋳型ＤＮＡを、０．１ｍ
ｌのキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわたって
、筋肉の遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約０．２ｃｍの深さで
注入する。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上で行い、そしてその皮
膚をステンレス鋼クリップで閉じる。

【０５８７】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、Ｔ
Ｒ１２タンパク質発現について組織化学的に染色する。ＴＲ１２タンパク質発現
についてのタイムコースは、異なるマウスからの四頭を異なる時間で採取するこ
と以外は、同様な様式で行い得る。注入後の筋肉中のＴＲ１２ ＤＮＡの持続性
を、注入したマウスおよびコントロールマウスからの全細胞性ＤＮＡおよびＨＩ
ＲＴ上清を調製した後、サザンブロット分析によって決定し得る。マウスにおけ
る上記実験の結果は、裸のＴＲ１２ ＤＮＡを用いて、ヒトおよび他の動物にお
いて適切な投薬量および他の処置パラメーターを推定するために使用し得る。

【０５８８】 本発明の治療的組成物は任意の動物に、好ましくは哺乳動物および鳥類に投与
され得る。好ましい哺乳動物としてはヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサ
ギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが挙げられ、特に好ましいのは、ヒトである
。

【０５８９】 （実施例３０：ＴＲ１２トランスジェニック動物） 本発明のＴＲ１２ポリペプチドはまた、トランスジェニック動物において発現
され得る。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ
（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば
、ヒヒ、サルおよびチンパンジー）を含むがこれらに限定されない任意の種の動
物は、トランスジェニック動物を作製するために用いられ得る。特定の実施形態
において、本明細書に記載されるかまたはさもなければ当該分野で公知の技術が
、遺伝子治療プロトコルの一部として、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発
現のために用いられる。

【０５９０】 当該分野で公知の任意の技術を、導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレ
オチド）の動物への導入に用いて、トランスジェニック動物の創始系統（ｆｏｕ
ｎｄｅｒ ｌｉｎｅ）を生成し得る。このような技術は、前核マイクロインジェ
クション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；お
よびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖系列
（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９８５））、胚盤胞または胚へのレトロ
ウイルス媒介遺伝子移入；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ
ら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレクト
ロポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３
−１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入
（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を参
照のこと）；胚性多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞への核酸構築物の
導入および胚盤胞へのこの幹細胞の再移入；ならびに精子媒介遺伝子移入（Ｌａ
ｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８９））；などを含
むがこれらに限定されない。このような技術の総説については、本明細書中にそ
の全体が参考として援用される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎ
ｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９
８９）を参照のこと。

【０５９１】 当該分野で公知の任意の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトラ
ンスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された、静止状態に誘導さ
れた胚細胞、胎児細胞または成体の細胞由来の除核した卵母細胞の核への核移入
（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌ
ｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）））。

【０５９２】 本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ）を提供する。導入遺伝子は、１つ
の導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−
尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子は
また、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定
の細胞型に選択的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異
的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれ
らは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内因性遺伝子の染
色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。

【０５９３】 手短に言えば、このような技術が利用される場合、内因性遺伝子に対して相同
ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同な組換え
を介して内因性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列
の機能を破壊することを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞
型に選択的に導入され得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、導入された細胞型にお
いてのみ内因性遺伝子が不活化される。そのような細胞型特異的不活化に必要と
される調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明ら
かである。この段落に引用される書類の各々の内容は、本明細書中にその全体に
おいて参考として援用される。

【０５９４】 一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きた
ことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザ
ンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素Ｐ
ＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得る
。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異
的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。

【０５９５】 一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配され、同系交配され、異系交
配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そのような
交配戦略の例は、以下を含むがそれらに限定されない：別の系統を樹立するため
の１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相
加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジ
ェニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析
による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部
位に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニック動物の
交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々のホモ接合
系統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導
入遺伝子を配置するための交配。

【０５９６】 本発明のトランスジェニック動物は、ＴＲ１２ポリペプチドの生物学的機能の
詳述、異常なＴＲ１２発現に関連する状態および／または障害の研究、ならびに
このような状態および／または障害の改善に有効な化合物についてのスクリーニ
ングに有用な動物モデル系を含むがこれらに限定されない用途を有する。 （実施例３１：ＴＲ１２ノックアウト動物） 内因性ＴＲ１２遺伝子発現もまた、標的化された相同組換えを使用してＴＲ１
２遺伝子および／またはそのプロモーターを不活性化あるいは「ノックアウトす
る」ことによって減少し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３
１７：２３０−２３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃ
ｅｌｌ ５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ
５：３１３−３２１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、本明細書中で
その全体が参考として援用される）。例えば、内因性ポリヌクレオチド配列（こ
の遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）と相同性のＤＮＡに隣接され
る、本発明の変異体、非機能的なポリヌクレオチド（または完全に関連のないＤ
ＮＡ配列）を、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを用いてま
たは用いずに使用し、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞をトラン
スフェクトし得る。別の実施形態において、当該分野で公知の技術を、目的の遺
伝子を含むが、発現しない細胞中でノックアウトを生じるために使用する。標的
化された相同性組換えを介した、このＤＮＡ構築物の挿入は、標的化された遺伝
子の不活性化を生じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改変が不
活性な標的化された遺伝子を有する動物の子孫を作製するために使用され得る研
究および農業分野に特に適する（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ
１９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ １９８９、前出を参照のこと）。しかし、
このアプローチは、当業者に明白な、適切なウイルスベクターを使用して、組換
えＤＮＡ構築物がインビボで要求された部位に直接投与されるか、または標的化
される場合、ヒトにおける使用に慣用的に適合され得る。

【０５９７】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するために
遺伝子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝
子操作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。こ
のような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナー
から入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂
肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞
を、例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入
遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プ
ラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソー
ムなどの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポ
リペプチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／ま
たは本発明のポリペプチドに結合している内因性の調節配列を破壊するために、
組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチ
ドのコード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたは
プロモーター／エンハンサーの制御下に配置し、ＴＲ１２ポリペプチドの発現お
よび好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好ましく
は分泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患者中へ
全身的に導入し得る。

【０５９８】 あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（
例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；遺
伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る
（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号ならびにＭｕ
ｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこ
と。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。

【０５９９】 投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞を被包性の形態で導入し得、構成成分と即時の細胞外環
境との交換が可能である間は、導入細胞が宿主免疫系によって認識され得ない。

【０６００】 本発明のノックアウト動物は、ＴＲ１２ポリペプチドの生物学的機能の詳述、
異常なＴＲ１２発現に関連する状態および／または障害の研究、ならびにこのよ
うな状態および／または障害を改善させる場合に有効な化合物のスクリーニング
において有用な動物モデル系を含むが、それらに限定されない用途を有する。

【０６０１】 （実施例３２：Ｂ細胞増殖および分化のアッセイ検出刺激または阻害） 機能的体液性免疫応答の生成は、Ｂ系列の細胞とそれらの微小環境との間に、
可溶性のシグナル伝達および同族のシグナル伝達の両方を必要とする。シグナル
は、陽性の刺激（Ｂ系列の細胞がプログラムされた発生を持続するようにさせる
）、または陰性の刺激（細胞が電流発生経路を阻止するように指示する）を伝え
得る。現在までに、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ
−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４およびＩＬ−１５を含む、多数の刺激シグナル
および阻害シグナルがＢ細胞応答性に影響することが見出されている。興味深い
ことに、これらのシグナルはそれ自体は弱いエフェクターであるが、種々の同時
刺激タンパク質と組み合わせて、Ｂ細胞集団中の活性、増殖、分化、ホーミング
、耐性、および細胞死を誘導し得る。

【０６０２】 Ｂ細胞同時刺激タンパク質の最も研究されたクラスの１つがＴＮＦスーパーフ
ァミリーである。このファミリー内で、ＣＤ４０、ＣＤ２７およびＣＤ３０は、
そのそれぞれのリガンドである、ＣＤ１５４、ＣＤ７０およびＣＤ１５３と共に
種々の免疫応答を調節することが見出されている。これらのＢ細胞集団およびそ
れらの前駆細胞の増殖および分化の検出および／または観察を可能にするアッセ
イは、種々のタンパク質がこれらのＢ細胞集団上に、増殖および分化の点で有し
得る効果を決定する際に価値のあるツールである。以下に列挙するのは、Ｂ細胞
集団およびそれらの前駆体の分化、増殖、または阻害の検出を可能にするように
設計された２つのアッセイである。

【０６０３】 （インビトロアッセイ）−精製されたＴＲ１２タンパク質、またはそれらの短
縮化形態を、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体において活性化、増殖、分化もし
くは阻害および／または細胞死を誘導する能力について評価する。精製したヒト
扁桃腺Ｂ細胞へのＴＲ１２タンパク質の活性（定性的に０．１〜１０，０００ｎ
ｇ／ｍＬの用量範囲にわたって測定した）を、標準的なＢリンパ球同時刺激アッ
セイにおいて評価する。このアッセイでは、精製した扁桃腺Ｂ細胞を、プライミ
ング因子として、ホルマリン固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ
Ｃｏｗａｎ Ｉ（ＳＡＣ）、または固定した抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかの存
在下で培養する。ＩＬ−２およびＩＬ−１５のような第２のシグナルは、トリチ
ウム化チミジン取り込みにより測定した場合、ＳＡＣおよびＩｇＭ架橋と協同し
てＢ細胞増殖を誘発する。新規な協同因子を、このアッセイを用いて容易に同定
し得る。このアッセイは、ＣＤ３陽性細胞の磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）枯渇により
ヒト扁桃腺Ｂ細胞を単離する工程を包含する。得られる細胞集団は、ＣＤ４５Ｒ
（Ｂ２２０）の発現により評価する場合、９５％のＢ細胞より大きい。

【０６０４】 種々の希釈のそれぞれのサンプルを９６ウェルプレートの個々のウェルに配置
し、ここへ、培養培地（１０％ＦＢＳ、５×１０^-5Ｍ ２ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌ
ペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０^-5希釈のＳＡＣを
含有するＲＰＭ１６４０）中で懸濁した、総量１５０μｌ中の、１０⁵Ｂ細胞を
添加する。増殖または阻害を、因子の添加後７２時間から開始して、３Ｈ−チミ
ジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）で２０ｈパルス（１μＣｉ／ウェル）により定量する
。陽性コントロールおよび陰性コントロールは、それぞれＩＬ２および培地であ
る。

【０６０５】 （インビボアッセイ）−ＢＡＬＢ／ｃマウスに、緩衝液のみ、またはＴＲ１２
タンパク質の２ｍｇ／ｋｇ、またはそれらの短縮形態を、１日２回注射（ｉ．ｐ
．）する。マウスにこの処置を４日間連続して与え、この時点でそれらを屠殺し
、そして分析のために種々の組織および血清を収集した。正常な脾臓およびＴＲ
１２タンパク質で処理した脾臓由来のＨ＆Ｅ切片の比較により、脾臓細胞でのＴ
Ｒ１２タンパク質の活性の結果、例えば、動脈周囲リンパ性鞘の拡散および／ま
たは赤色脾髄領域の有核の細胞充実性の有意な増加（これは、Ｂ細胞集団の分化
および増殖の活性化を示し得る）が確認される。Ｂ細胞マーカーである、抗ＣＤ
４５Ｒ（Ｂ２２０）を用いる免疫組織化学的研究を用いて、脾臓細胞への任意の
生理的な変化（例えば、脾臓組織崩壊）が、樹立されたＴ細胞領域に浸潤する漠
然と規定されたＢ細胞区画内のＢ細胞提示の増加に起因するか否かを決定する。

【０６０６】 ＴＲ１２タンパク質で処置したマウス由来の脾臓のフローサイトメトリー分析
を用いて、ＴＲ１２タンパク質が、ＴｈＢ＋であるＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ｄｕ
ｌｌ Ｂ細胞の比を、コントロールマウスで観察される比よりも特異的に増加す
るか否かを示す。

【０６０７】 同様に、増加した成熟Ｂ細胞のインビボでの提示の推定される結果は、血清Ｉ
ｇ力価が相対的に増加である。従って、血清ＩｇＭおよびＩｇＡレベルを緩衝液
処置マウスとＴＲ１２タンパク質処置マウスとの間で比較する。

【０６０８】 本実施例において記載する試験は、ＴＲ１２タンパク質の活性を試験する。し
かし、当業者は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、ア
ゴニストの活性、および／またはＴＲ１２のアンタゴニストの活性を試験するた
めに、例示する研究を容易に改変し得る。

【０６０９】 （実施例３３：Ｔ細胞増殖アッセイ） ＣＤ３誘導性の増殖アッセイをＰＢＭＣで実行し、そして³Ｈ−チミジンの取
り込みにより測定する。このアッセイを以下のように実行する。９６ウェルプレ
ートを、ＣＤ３に対するｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の１００
μｌ／ウェル、またはアイソタイプ適合のコントロールｍＡｂ（Ｂ３３．１）（
０．０５Ｍ 炭酸水素緩衝液、ｐＨ９．５中、１μｇ／ｍｌ）で４℃で一晩、コ
ートし、次いでＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣをヒト末梢血から、Ｆ／Ｈ勾配
遠心分離により単離し、そしてＴＲ１２タンパク質の種々の濃度での存在下で、
１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有するＲＰＭＩ中、ｍＡｂでコートしたプレート
の４通りのウェル（５×１０⁴／ウェル）に添加する（総量２００μｌ）。関連
するタンパク質緩衝液および培地単独がコントロールである。３７℃での培養の
４８時間後、プレートを１０００ｒｐｍで２分間回転させ、そして１００μｌの
上清を除去し、そして、増殖への効果が観察される場合、ＩＬ−２（または他の
サイトカイン）の測定のために−２０℃で貯蔵する。ウェルに０．５μＣｉの³
Ｈチミジンを含有する１００μｌの培地を補充し、そして３７℃で１８〜２４時
間培養する。ウェルを収集し、そして³Ｈチミジンの取り込みを増殖の指標とし
て用いた。抗ＣＤ３単独が増殖の陽性コントロールである。ＩＬ−２（１００Ｕ
／ｍｌ）をまた、増殖を増強するコントロールとして用いる。Ｔ細胞の増殖を誘
導しないコントロール抗体をＴＲ１２タンパク質の効果についての陰性コントロ
ールとして用いる。

【０６１０】 本実施例において記載される研究は、ＴＲタンパク質の活性を試験する。しか
し、当業者は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、アゴ
ニストの活性、および／またはＴＲ１２のアンタゴニストの活性を試験するため
に、例示する研究を容易に改変し得る。

【０６１１】 （実施例３４：ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現、なら
びに単球および単球由来ヒト樹状細胞の細胞分化へのＴＲ１２の効果） （樹状細胞の成熟への効果）樹状細胞を末梢血において見出される増殖前駆体
の増殖により生成する：接着性ＰＢＭＣまたは清浄化単球画分を、ＧＭ−ＣＳＦ
（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）とともに７〜１０日間培
養する。これらの樹状細胞は、非成熟細胞の特徴的表現型（ＣＤ１、ＣＤ８０、
ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現）を有する。ＴＮＦ−α
のような活性化因子での処理は、表面表現形に迅速な変化（ＭＨＣクラスＩおよ
びＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現の増加、ＦＣγＲＩＩの下方制御、
ＣＤ８３の上方制御）を生じる。これらの変化は抗原提示能力の増加、および樹
状細胞の機能的成熟と関連する。

【０６１２】 表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下のように実施する。細胞を、ＴＲ１２またはＬ
ＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜３日処理し、１％ＢＳＡおよび
０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで１：２０希釈
の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モノクローナル抗体と
ともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄後、標識した細胞を
ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリ
ーにより分析する。

【０６１３】 （ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現への効果）細胞表面
抗原の３つの主なファミリー：接着分子、抗原提示に関与する分子、およびＦｃ
レセプター、が、単球上で同定され得る。ＭＨＣクラスＩＩ抗原および他の同時
刺激分子（例えば、Ｂ７およびＩＣＡＭ−Ｉ）の発現の調節は、単球の抗原提示
能力、およびＴ細胞活性化を誘導する能力に変化を生じ得る。Ｆｃレセプターの
発現増加は、単球細胞傷害性活性、サイトカイン放出および食菌作用の改善と相
関し得る。

【０６１４】 ＦＡＣＳ分析は、以下のような表面抗原を試験するために用いられる。単球を
、ＴＲ１２またはＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜５日処理し
、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、
次いで１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モ
ノクローナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄
後、標識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）での
フローサイトメトリーにより分析する。

【０６１５】 （単球活性化および／または生存の増加）単球を活性化する（あるいは、不活
化する）および／または単球の生存を増加する（あるいは、単球生存を低下させ
る）分子についてのアッセイは、当該分野で公知であり、そして本発明の分子が
単球のインヒビターまたはアクチベーターとして機能するか否かを決定するため
に慣用的に適用され得る。ＴＲ１２、アゴニストまたはＴＲ１２のアンタゴニス
トは、以下に記載の３つのアッセイを用いてスクリーニングされ得る。これらの
アッセイのそれぞれについて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａ
ｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）を通じた遠心分離により、単一のドナーｌｅｕｋｏｐ
ａｃｋ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）
から精製する。単球を向流遠心性エルトリエーション（ｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏｗ
ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）によりＰＢＭＣから単離
する。

【０６１６】 （単球生存アッセイ）ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激の非存在下で培
養した場合、次第に生存度を失う。それらの死は、内部調節されたプロセス（ア
ポトーシス）から生じる。活性化因子、例えばＴＮＦαの培養への添加は、劇的
に、細胞生存を改善し、そしてＤＮＡの断片化を妨げる。プロピジウムヨード（
ＰＩ）染色を用いて、以下のようにアポトーシスを測定する。単球を、１００ｎ
ｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（陰性コントロール）の存在下、および試験される種々の
濃度の化合物の存在下で、ポリプロピレンチューブ中の無血清培地（陽性コント
ロール）中で、４８時間培養する。細胞を、最終濃度５μｇ／ｍｌでＰＩを含有
するＰＢＳ中で２×１０⁶／ｍｌの濃度に懸濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎ分析の
前に５分間室温でインキュベートする。ＰＩ取り込みは、この試験パラダイムに
おけるＤＮＡの断片化と相関することを示している。

【０６１７】 （サイトカイン放出への効果）単球／マクロファージの重要な機能は、刺激後
のサイトカインの放出を通じた免疫系の他の細胞集団への調節活性である。サイ
トカイン放出を測定するためのＥＬＩＳＡを、以下のように実施する。ヒト単球
を、５×１０⁵細胞／ｍｌの密度で、ＴＲ１２の漸増する濃度とともに、および
同じ条件下でＴＲ１２の非存在下で、インキュベートする。ＩＬ−１２の生成に
ついては、この細胞を、ＴＲ１２の存在下でＩＦＮ（１００Ｕ／ｍｌ）で一晩プ
ライムする。次いで、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。馴化培地を２４時
間後に収集し、そして使用するまで凍結保存する。次いで、ＴＮＦ−α、ＩＬ−
１０、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の測定を市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ
＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用い、そしてキット
に提供される標準的プロトコールを適用して実施する。

【０６１８】 （酸化的バースト（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ））精製した単球を９６
ウェルプレートに２〜１×１０⁵細胞／ウェルでプレートする。ＴＲ１２の漸増
濃度を総量０．２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＣＳ、グルタ
ミンおよび抗生物質）でウェルに添加する。３日間のインキュベーション後、こ
のプレートを遠心分離し、そして培地をウェルから除く。マクロファージの単層
に、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ
、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、５．５ｍＭデキストロース、０
．５６ｍＭフェノールレッドおよび１９Ｕ／ｍｌのＨＲＰＯ）を、刺激物質（２
００ｎＭ ＰＭＡ）とともに添加する。このプレートを３７℃で２時間インキュ
ベートし、そして１ウェルあたり２０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを添加して反応を停
止する。吸収を６１０ｎｍで読む。マクロファージにより生成されるＨ₂Ｏ₂の量
を算出するため、既知のモル濃度のＨ₂Ｏ₂溶液の標準曲線をそれぞれの実験につ
いて実施する。

【０６１９】 本実施例において記載される研究は、ＴＲ１２タンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
アゴニストの活性、および／またはＴＲ１２のアンタゴニストの活性を試験する
ために、例示する研究を容易に改変し得る。

【０６２０】 （実施例３５：ＴＲ１２の生物学的効果） （星状細胞および神経アッセイ） 上記のように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで発現され、そして精製さ
れた組換えＴＲ１２を、皮質ニューロン細胞の生存、神経突起成長または表現型
分化を促進する活性について、およびグリア線維性酸性タンパク質免疫陽性細胞
、星状細胞の増殖の誘導について試験し得る。バイオアッセイのための皮質細胞
の選択は、皮質構造中のＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２の広く行き渡っている発現
、ならびにＦＧＦ−２処理から生じる皮質ニューロン生存の以前に報告された増
強に基づく。チミジン取り込みアッセイを用いて、例えば、これらの細胞へのＴ
Ｒ１２の活性を解明し得る。

【０６２１】 さらに、インビトロにおける皮質ニューロンまたは海馬ニューロンへのＦＧＦ
−２（塩基性ＦＧＦ）の生物学的効果を記載する以前のレポートは、ニューロン
生存および神経突起成長の両方における増大を実証している（Ｗａｌｉｃｋｅ，
Ｐら、「Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅ
ｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａ
ｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎｅｕｒｉｔｅ ｅｘｔｅｎ
ｓｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：３０１２〜
３０１６（１９８６）、本明細書中のアッセイはその全体が参考として援用され
る）。しかし、ＰＣ−１２細胞で実行される実験からの報告は、これらの２つの
応答が必ずしも同義でないこと、そしてどのＦＧＦを試験しいるかだけでなく、
どのレセプターが標的細胞で発現されているかにも依存し得ることを示唆する。
神経突起成長を誘導するＴＲ１２の能力を、一次の皮質ニューロン培養パラダイ
ムを用いて、例えば、チミジン取り込みアッセイを用いてＦＧＦ−２で得られた
応答と比較し得る。

【０６２２】 （線維芽細胞および内皮細胞アッセイ） ヒト肺線維芽細胞をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入
手し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓからの増殖培地で維持する。真皮性微小血管内
皮細胞をＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）か
ら得る。増殖アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞および真皮性微小血管内皮
細胞を、９６ウェルプレートの増殖培地中で１日間、５，０００細胞／ウェルで
培養し得る。次いでこの細胞を０．１％ＢＳＡ基礎培地中で１日間インキュベー
トする。新鮮な０．１％ＢＳＡ培地で培地を置換した後、細胞を試験タンパク質
と３日間インキュベートする。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ａｌｍａｒ Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）を１０％の最終濃度になるよう
に各ウェルに添加する。この細胞を４時間インキュベートする。細胞生存度をＣ
ｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーでの読取りにより測定する。ＰＧＥ₂アッセイに
ついては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で１日間、５，０００細
胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地を変換した後、細胞をＩ
Ｌ−１αとともに、またはそれをともなわずに、ＦＧＦ−２またはＴＲ１２と２
４時間インキュベートする。上清を収集し、そしてＥＩＡキット（Ｃａｙｍａｎ
，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によりＰＧＥ₂についてアッセイする。ＩＬ−６
アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で１日間、５
，０００細胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地を変換した後
、細胞をＩＬ−１αとともに、またはそれをともなわずに、ＦＧＦ−２またはＴ
Ｒ１２と２４時間インキュベートする。上清を収集し、そしてＥＬＩＳＡキット
（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によりＩＬ−６についてアッセ
イする。

【０６２３】 ヒト肺線維芽細胞をＦＧＦ−２またはＴＲ１２とともに基礎培地中で３日間培
養し、その後、線維芽細胞の増殖への効果を評価するためＡｌａｍａｒ Ｂｌｕ
ｅを添加する。ＦＧＦ−２は、ＴＲ１２での刺激に匹敵して用いられ得る１０〜
２５００ｎｇ／ｍｌの刺激を示すはずである。

【０６２４】 （パーキンソンモデル） パーキンソン病における運動機能の喪失は、黒質線条体のドーパミン作動性投
射ニューロンの変性から生じる線条体ドーパミンの欠乏に起因する。広範に特徴
付けされたパーキンソン病の動物モデルは、１−メチル−４フェニル１，２，３
，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の全身投与を含む。ＣＮＳにおいて、
ＭＰＴＰは、星状細胞に取り込まれ、そしてモノアミンオキシダーゼＢにより１
−メチル−４−フェニルピリジン（ＭＰＰ⁺）に異化され、そして放出される。
引き続き、ＭＰＰ⁺は、ドーパミンの高親和性再取り込みトランスポーターによ
りドーパミン作動性ニューロンに能動的に蓄積する。次いで、ＭＰＰ⁺は、電気
化学勾配によりミトコンドリア中で濃縮され、そしてニコチンアミド（ｎｉｃｏ
ｔｉｄａｍｉｄｅ）アデニン二リン酸：ユビキノン酸化還元酵素（ｏｘｉｄｏｒ
ｅｄｕｃｔｉｏｎａｓｅ）（複合体Ｉ）を選択的に阻害し、これにより電子伝達
を妨害し、そして最終的に酸素ラジカルを生成する。

【０６２５】 ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）が黒質のドーパミン作動性ニューロンへの栄養活
性を有することが組織培養パラダイムにおいて実証されている（Ｆｅｒｒａｒｉ
ら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９８９）。近年、Ｕｎｓｉｃｋｅｒ博士のグループは
、線条体のゲルフォームインプラントでのＦＧＦ−２投与がＭＰＴＰ曝露と関連
する毒性からの黒質のドーパミン作動性ニューロンのほぼ完全な防御を生じるこ
とを実証している（ＯｔｔｏおよびＵｎｓｉｃｋｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅ
ｎｃｅ，１９９０）。

【０６２６】 ＦＧＦ−２を用いたデータに基づいて、ＴＲ１２は、インビトロにおけるドー
パミン作動性ニューロン生存を増強する際において、ＴＲ１２がＦＧＦ−２の作
用と類似の作用を有するか否かを決定するために評価され得、そして、ＴＲ１２
はまた、線条体におけるドーパミン作動性ニューロンの、ＭＰＴＰ処理と関連す
る損傷からの防御についてインビボで試験され得る。ＴＲ１２の潜在的効果を、
まずドーパミン性ニューロン細胞培養パラダイムにおいてインビトロで試験する
。妊娠１４日のＷｉｓｔａｒラット胚由来の中脳底板を解剖することにより、培
養物を調製する。この組織をトリプシンで解離し、そしてポリオルチニン−ラミ
ニンでコートしたカバーガラスに２００，０００細胞／ｃｍ²の密度で播く。こ
の細胞を、ホルモン補充物（Ｎ１）を含有するダルベッコ改変イーグル培地およ
びＦ１２培地中で維持する。インビトロで８日後培養物をパラホルムアルデヒド
で固定し、そしてチロシンヒドロキシラーゼ（ドーパミン作動性ニューロンにつ
いての特異的マーカー）での免疫組織化学染色のために処理する。解離した細胞
培養物を胚性ラットから調製する。培養培地を３日ごとに交換し、そしてこの因
子もまたその時点に添加する。

【０６２７】 ドーパミン作動性ニューロンを妊娠１４日目（ドーパミン作動性前駆細胞が増
殖する段階を過ぎた発生時間）で動物から単離するので、チロシンヒドロキシラ
ーゼ免疫陽性ニューロンの数の増加は、インビトロで生存しているドーパミン作
動性ニューロンの数の増加を示す。従って、もしＴＲ１２がドーパミン作動性の
生存を延長するように作用するならば、このことは、このＴＲ１２がパーキンソ
ン病に関与し得ることを示唆する。

【０６２８】 本実施例において記載される研究は、ＴＲ１２の活性を試験する。しかし、当
業者は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、ＴＲ１２の
アゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験するために、例示する研究を
容易に改変し得る。

【０６２９】 （実施例３６：血管内皮細胞の増殖へのＴＲ１２の効果） １日目に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、４％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ
）、１６ユニット／ｍｌ ヘパリン、および５０ユニット／ｍｌ 内皮細胞増殖
補充物（ＥＣＧＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含有するＭ１９９
培地中で、３５ｍｍシャーレあたり２〜５×１０⁴細胞の密度で播種する。２日
目に、この培地を、１０％ＦＢＳ、８ユニット／ｍｌヘパリンを含有するＭ１９
９で置換する。配列番号２のＴＲ１２タンパク質および陽性コントロール（例え
ば、ＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））を種々の濃度で添加する。４日
目および６日目に、培地を置き換える。８日目に、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔ
ｅｒを用いて細胞数を決定する。

【０６３０】 ＨＵＶＥＣ細胞数の増加は、ＴＲ１２が血管内皮細胞を増殖させ得ることを示
す。

【０６３１】 本実施例において記載される研究は、ＴＲ１２タンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
ＴＲ１２のアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験するために、例示
する研究を容易に改変し得る。

【０６３２】 （実施例３７：血管内皮細胞の増殖へのＴＲ１２の刺激効果） 増殖因子の分裂促進活性の評価のために、電子共役試薬ＰＭＳ（フェナジンメ
トサルフェート）を用いる、比色分析ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾー
ル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフ
ォフェニル）２Ｈ−テトラゾリウム）アッセイを実行した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ
９６ ＡＱ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞を０．１ｍＬの血清補充培地中で９６ウ
ェルプレートに播種し（５，０００細胞／ウェル）、そして一晩付着させる。０
．５％ＦＢＳ中、１２時間の血清飢餓後、Ｈｅｐａｒｉｎ（８Ｕ／ｍｌ）を伴う
かまたは伴わない、条件（０．５％ＦＢＳ中のｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ₁₆₅またはＴ
Ｒ１２）をウェルに４８時間添加する。２０ｍｇのＭＴＳ／ＰＭＳ混合物（１：
０．０５）を１ウェルあたりに添加し、そして３７℃で１時間インキュベートさ
せ、その後ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定する。コン
トロールウェル（何らかの培地、細胞なし）のバックグラウンドの吸光度を差し
引きし、そしてそれぞれの条件について７つのウェルを並行して実施する。Ｌｅ
ａｋら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０Ａ：５１２〜５
１８（１９９４）を参照のこと。

【０６３３】 本実施例において記載される研究は、ＴＲ１２タンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
ＴＲ１２のアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験するために、例示
する研究を容易に改変し得る。

【０６３４】 （実施例３８：ＰＤＧＦ誘導性血管平滑筋細胞増殖刺激効果の阻害） ＨＡｏＳＭＣ増殖を、例えば、ＢｒｄＵｒｄ取り込みにより測定し得る。手短
には、４チャンバスライド上で増殖させたコンフルエント未満の静止期細胞を、
ＣＲＰまたはＦＩＴＣ標識ＡＴ２−３ＬＰでトランスフェクトする。次いで、こ
の細胞に１０％仔ウシ血清および６ｍｇ／ｍｌのＢｒｄＵｒｄをパルスする。２
４時間後、ＢｒｄＵｒｄ染色キット（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
を用いることにより免疫細胞化学を実施する。簡略には、この細胞を、変性溶液
への曝露後、ビオチン化マウス抗ＢｒｄＵｒｄ抗体と４℃で２時間インキュベー
トし、次いでストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジン
とともにインキュベートする。ヘマトキシリンでの対比染色後、この細胞を検鏡
のために取り付け、そしてＢｒｄＵｒｄ陽性細胞を計数する。ＢｒｄＵｒｄ指数
は、総細胞数に対するＢｒｄＵｒｄ陽性細胞の％として計算される。さらに、個
々の細胞について、明視野照明および暗視野ＵＶ蛍光照明の同時使用により、Ｂ
ｒｄＵｒｄ染色（核）およびＦＩＴＣ取り込み（細胞質）の同時検出を実行する
。Ｈａｙａｓｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６：２７１（３６）：２１
９８５〜２１９９２（１９９６）を参照のこと。

【０６３５】 本実施例において記載される研究は、ＴＲ１２タンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
ＴＲ１２のアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験するために、例示
する研究を容易に改変し得る。

【０６３６】 （実施例３９：内皮移動の刺激） 本実施例は、ＴＲ１２がリンパ性の内皮細胞移動を刺激し得る可能性を探索す
るために用いられる。

【０６３７】 内皮細胞移動アッセイは、４８ウェルの微小走化性チャンバを用いて実行され
る（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ，ＭＤ；Ｆａｌｋ
，Ｗ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８０；３３
：２３９〜２４７）。８μｍの孔サイズの、ポリビニルピロリドンを含まないポ
リカーボネートフィルター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．Ｃａｍｂｒｉｄ
ｇｅ，ＭＡ）を室温で少なくとも６時間０．１％ゼラチンでコートし、そして滅
菌空気のもとで乾燥する。０．２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充した
Ｍ１９９中で試験物質を適切な濃度に希釈し、そして２５μｌの最終希釈物を改
変Ｂｏｙｄｅｎ装置の下部チャンバに置く。コンフルエント未満の、早期継代（
２〜６）のＨＵＶＥＣまたはＢＭＥＣ培養物を洗浄し、そして細胞の剥離を達成
するために必要な最小の時間トリプシン処理する。下部チャンバと上部チャンバ
との間のフィルターを配置した後、１％ＦＢＳを含有する５０μｌ Ｍ１９９中
に懸濁した２．５×１０⁵細胞を上部コンパートメントに播種する。次いでこの
装置を、５％ＣＯ₂を用いて加湿にしたチャンバ中で３７℃で５時間インキュベ
ートして細胞を移動させた。インキュベーション期間後、このフィルターを取り
出し、そして非移動細胞を有するフィルターの上部側をゴム性のポリスマン（ｐ
ｏｌｉｃｅｍａｎ）でかきとる。このフィルターをメタノールで固定し、そして
Ｇｉｅｍｓａ溶液（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ，Ｂａｘｔｅｒ，ＭｃＧｒａｗ Ｐａ
ｒｋ，ＩＬ）で染色する。移動を、それぞれのウェルにおいて、３つの無作為の
高倍率視野（４０×）の細胞を計数することにより定量する。そしてすべての群
を４連で実行する。

【０６３８】 本実施例において記載される研究は、ＴＲ１２タンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
ＴＲ１２のアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験するために、例示
する研究を容易に改変し得る。

【０６３９】 （実施例４０：内皮細胞による一酸化窒素生成の刺激） 血管内皮により放出される一酸化窒素は、血管内皮弛緩の介在物質であると考
えられてる。従って、ＴＲ１２活性は、ＴＲ１２に応答した内皮細胞による一酸
化窒素産生を決定することによってアッセイされ得る。

【０６４０】 一酸化窒素を、２４時間の飢餓、次いで、様々なレベルの陽性コントロール（
例えば、ＶＥＧＦ−１）およびＴＲ１２への４時間の曝露の後のコンフルエント
な微小血管内皮細胞の９６ウェルプレート中で測定する。培地中の一酸化窒素を
、Ｇｒｉｅｓｓ試薬の使用により決定して、硝酸還元酵素による一酸化窒素由来
の硝酸塩の還元後の亜硝酸塩の総量を測定する。一酸化窒素放出の際のＴＲ１２
の効果を、ＨＵＶＥＣに対して試験する。

【０６４１】 簡単には、培養したＨＵＶＥＣ単層からのＮＯ放出を、ＮＯメーター（Ｉｓｏ
−ＮＯ，Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．
）（１０４９）に接続したＮＯ特異的なポーラログラフ電極を用いて測定する。
ＮＯエレメントの較正を、以下の式に従って行う： ２ＫＮＯ₂＋２ＫＩ＋２Ｈ₂ＳＯ₄６２ＮＯ＋Ｉ₂＋２Ｈ₂Ｏ＋２Ｋ₂ＳＯ₄。

【０６４２】 標準較正曲線を、ＫＩおよびＨ₂ＳＯ₄を含む較正溶液中に段階的な濃度のＫＮ
Ｏ₂（０、５、１０、２５、５０、１００、２５０、および５００ｎｍｏｌ／Ｌ
）を添加することによって得る。ＮＯに対するＩｓｏ−ＮＯ電極の特異性を、確
実なＮＯ気体（１０５０）からのＮＯを測定することにより、事前に決定する。
この培養培地を取り除き、そしてＨＵＶＥＣを、ろ過したＤｕｌｂｅｃｃｏリン
酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄する。次いで、細胞を、６ウェルプレート中で５
ｍｌの濾過したＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液に浸し、そしてこの細胞プ
レートを、３７℃に温度を維持するために、スライドウォーマー（Ｌａｂ Ｌｉ
ｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）で保持する。ＮＯセンサープローブ
をウェルに垂直に挿入して、異なる条件の追加の前に、電極の先端を溶液の表面
の２ｍｍ下で保持する。Ｓ−ニトロソアセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）を、陽
性コントロールとして用いる。放出したＮＯの量を、１×１０⁶内皮細胞あたり
のピコモルとして表す。全ての報告した値は、各群における４〜６（細胞培養ウ
ェルの数）の測定値の平均である。Ｌｅａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１７：９６−１０５（１９９５）を参照のこ
と。

【０６４３】 本実施例において記載される研究は、ＴＲ１２タンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
ＴＲ１２のアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験するために、例示
する研究を容易に改変し得る。

【０６４４】 （実施例４１：新脈管形成における索形成に対するＴＲ１２の効果） 新脈管形成における別の工程は、内皮細胞の分化により特徴付けられる索（ｃ
ｏｒｄ）形成である。このバイオアッセイは、インビトロで培養した場合の微小
血管内皮細胞が毛細管様構造（中空構造）を形成する能力を測定する。

【０６４５】 ＣＡＤＭＥＣ（微小血管内皮細胞）を、増殖細胞（２継代）としてＣｅｌｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．から購入し、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓのＣＡＤＭＥＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ中で培養し、そして５継
代で使用する。インビトロ新脈管形成アッセイのために、４８ウェル細胞培養プ
レートのウェルを、Ｃｅｌｌ ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓのＡｔｔａｃｈｍｅｎ
ｔ Ｆａｃｔｏｒ Ｍｅｄｉｕｍ（２００ｍｌ／ウェル）を用いて、３７℃にて
３０分間コートする。コートしたウェルに７，５００細胞／ウェルでＣＡＤＭＥ
Ｃを播種し、Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ中で一晩培養する。次いで、このＧｒ
ｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍを、コントロール緩衝液またはＴＲ１２（０．１〜１０
０ｎｇ／ｍｌ）を含む３００ｍｇのＣｅｌｌ ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓのＣｈ
ｏｒｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍと交換し、そしてこの細胞をさらに
４８時間培養する。毛細管様索の数および長さを、Ｂｏｅｃｋｅｌｅｒ ＶＩＡ
−１７０ビデオ画像分析装置の使用を通じて定量する。全てのアッセイを三連で
行う。

【０６４６】 市販の（Ｒ＆Ｄ）ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロールとして用
いる。β−エストラジオール（１ｎｇ／ｍｌ）を、陰性コントロールとして用い
る。適切な緩衝液（タンパク質なし）もまた、コントロールとして利用する。

【０６４７】 本実施例において記載される研究は、ＴＲ１２タンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
ＴＲ１２のアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験するために、例示
する研究を容易に改変し得る。

【０６４８】 （実施例４２：ニワトリ漿尿膜に対する脈管形成効果） ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）は、新脈管形成を試験するために十分に確立した系
である。ＣＡＭにおける血管形成は、容易に可視化および定量可能である。ＴＲ
１２のポリペプチドのＣＡＭにおける新脈管形成を刺激する能力を試験し得る。

【０６４９】 Ｗｈｉｔｅ Ｌｅｇｈｏｒｎニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）の受精
卵および日本ウズラ（ｑｕａｌ）（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ ｃｏｔｕｒｎｉｘ）を、
３７．８℃および湿度８０％でインキュベートする。１６日齢のニワトリの分化
したＣＡＭおよび１３日齢のウズラの胚を以下の方法で研究する。

【０６５０】 発生の４日目に、ニワトリ卵の卵殻に窓を作る。この胚を正常な発生について
調べ、そしてこの卵をセロテープ（登録商標）で封着する。これらを、さらに１ ３日目までインキュベートする。Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバーガラス（Ｎｕｎｃ， Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を、直径約５ｍｍのディスクに切る。滅菌かつ無 塩成長因子を滅菌水に溶解し、そして約３．３ｍｇ／５ｍｌをディスクにピペッ トで移す。風乾後、逆さにしたディスクをＣＡＭに適用する。３日後、標本を３ ％グルタルアルデヒドおよび２％ホルムアルデヒド中に固定し、そして０．１２ Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液ですすぐ。これらを実体顕微鏡［Ｗｉｌｄ Ｍ８ ］を用いて写真撮影し、上記のように半薄層切片化および超薄層切片化のために 包埋する。コントロールを、キャリアディスク単独について行う。

【０６５１】 本実施例において記載される研究は、ＴＲ１２タンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
ＴＲ１２のアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験するために、例示
する研究を容易に改変し得る。

【０６５２】 （実施例４３：マウスにおけるＭａｔｒｉｇｅｌ移植片を用いる新脈管形成ア
ッセイ） ＴＲ１２のインビボ新脈管形成アッセイは、既存の毛細管網様構造の、マウス
細胞外マトリックス物質（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の移植したカプセル中に新しい脈
管を形成する能力を測定する。このタンパク質を、４℃で液体Ｍａｔｒｉｇｅｌ
と混合し、次いでこの混合物を、マウスに皮下（ここで、この混合物は凝固する
）注射する。７日後、Ｍａｔｒｉｇｅｌの固体「プラグ」を取り除き、そして新
しい血管の存在について試験する。Ｍａｔｒｉｇｅｌを、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ／Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入する。

【０６５３】 ４℃で解凍した時、Ｍａｔｒｉｇｅｌ物質は液体である。このＭａｔｒｉｇｅ
ｌを、４℃にて１５０ｎｇ／ｍｌでＴＲ１２と混合し、冷３ｍｌシリンジ中に引
き抜く。約８週齢の雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、腹部の中腹側面の２つの部位
にＭａｔｒｉｇｅｌおよび実験タンパク質の混合物を注射する（０．５ｍｌ／部
位）。７日後、このマウスを頚椎脱臼により屠殺し、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグを
取り除きそして洗浄する（すなわち、全ての付着する膜および腺維組織を取り除
く）。複製した全プラグを中性緩衝化１０％ホルムアルデヒド中に固定し、パラ
フィン中に包埋し、そしてＭａｓｓｏｎのＴｒｉｃｈｒｏｍｅで染色後、組織学
的試験のために切片を作製するために使用する。各プラグの３つの異なる領域由
来の断面をプロセスする。選択した切片をｖＷＦの存在について染色する。この
アッセイについての陽性コントロールは、ウシ塩基性ＦＧＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ
）である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ単独を用いて、新脈管形成の基礎レベルを決定する
。

【０６５４】 本実施例において記載される研究は、ＴＲ１２タンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
ＴＲ１２のアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験するために、例示
する研究を容易に改変し得る。

【０６５５】 （実施例４４：ウサギ下肢モデルにおける虚血のレスキュー） ＴＲ１２の虚血に対するインビボでの効果を研究するため、ウサギ後肢虚血モ
デルを、以前に記載（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ
１４７：１６４９−１６６０（１９９５））のように１つの大腿動脈の外科的除
去により作製する。大腿動脈の切除は、血栓の逆行性伝播および外腸骨動脈の閉
塞を生じる。従って、虚血肢への血流は、内腸骨動脈から生じる側副血管に依存
する（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ １４７：１６４
９−１６６０（１９９５））。１０日間の間隔は、ウサギの手術後の回復および
内因性の側副血管の発達を可能にする。手術（０日）後１０日目に、ベースライ
ン血管造影を行った後、虚血肢の内腸骨動脈を、本発明のポリヌクレオチドを含
む５００ｍｇの裸のＴＲ１２発現プラスミドを用いて、（Ｒｉｅｓｓｅｎ，Ｒ．
ら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：７４９−７５８（１９９３）；Ｌｅｃｌ
ｅｒｃ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：９３６−９４４（１９９
２））に記載されるように、ヒドロゲル被覆バルーンカテーテルを用いる動脈遺
伝子移入技術により、トランスフェクトする。ＴＲ１２を処置に用いる場合、５
００ｍｇのＴＲ１２タンパク質またはコントロールの単回ボーラスを、注入カテ
ーテルを通じて１分間の時間にわたり、虚血肢の内腸骨動脈中に送達する。３０
日目に、種々のパラメーターを、これらのウサギで測定する：（ａ）ＢＰ比−虚
血肢の収縮期血圧の、正常肢の収縮期血圧に対する比；（ｂ）血流および逆流−
停止ＦＬ：非拡張性状態の間の血流、および最大ＦＬ：完全な拡張性状態の間の
血流（これはまた、血管量の間接的測定）、ならびに逆流は、最大ＦＬ：停止Ｆ
Ｌの比に反映される；（ｃ）血管造影スコア−これを側副血管の血管造影により
測定する。スコアを、オーバーレイグリッド（ｏｖｅｒｌａｙｉｎｇ ｇｒｉｄ
）内の円の百分率（ウサギ大腿の総数ｍで割った横断不透明化動脈を用いる）に
より決定する；（ｄ）毛細血管密度−側副毛細血管の数は、後肢から得た光学顕
微鏡的切片において決定した。

【０６５６】 本実施例において記載される研究は、ＴＲ１２タンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
ＴＲ１２のアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験するために、例示
する研究を容易に改変し得る。

【０６５７】 （実施例４５：ＴＲ１２の血管拡張に対する効果） 血管内皮の拡張は、血圧の低下に重要であるので、ＴＲ１２の、自然発症高血
圧ラット（ＳＨＲ）の血圧に影響する能力を試験する。漸増用量（０、１０、３
０、１００、３００、および９００ｍｇ／ｋｇ）のＴＲ１２を、１３〜１４週齢
の自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）に投与する。データを平均＋／−ＳＥＭで表
す。統計学的分析を、両側ｔ検定を用いて行い、そして統計学的な有意性を、ｐ
＜０．０５対緩衝液単独への応答として定義する。

【０６５８】 本実施例において記載される研究は、ＴＲ１２タンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
ＴＲ１２のアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験するために、例示
する研究を容易に改変し得る。

【０６５９】 （実施例４６：ラット虚血皮膚弁モデル） 評価パラメーターは、皮膚の血流、皮膚温度、および第ＶＩＩＩ因子の免疫組
織化学または内皮アルカリホスファターゼ反応を含む。皮膚虚血の間のＴＲ１２
の発現を、インサイチュハイブリダーゼーションを用いて研究する。

【０６６０】 このモデルにおける研究を、以下の３つの部分に分ける： ａ）虚血皮膚 ｂ）虚血皮膚創傷 ｃ）通常の創傷。

【０６６１】 実験プロトコルは以下を含む： ａ）３×４ｃｍの単一茎全層無作為皮膚弁（ｓｉｎｇｌｅ ｐｅｄｉｃｌｅ
ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｒａｎｄｏｍ ｓｋｉｎ ｆｌａｐ）（動物の
下背部にわたる筋皮弁）を生じさせる。

【０６６２】 ｂ）虚血皮膚（皮膚弁）に切除創傷をつくる（直径４〜６ｍｍ）。

【０６６３】 ｃ）次の種々の投薬範囲のＴＲ１２による、切除創傷（創傷後の０、１、２、
３、４日目）の局所的な処置：１ｍｇ〜１００ｍｇ。

【０６６４】 ｄ）組織学的研究、免疫組織化学的研究、およびインサイチュ研究のために、
創傷後の３、５、７、１０、１４、および２１日目に創傷組織を収集する。

【０６６５】 本実施例において記載される研究は、ＴＲ１２タンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
ＴＲ１２のアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験するために、例示
する研究を容易に改変し得る。

【０６６６】 （実施例４７：末梢動脈疾患モデル） ＴＲ１２を用いる脈管形成治療は、末梢動脈疾患の場合の虚血の周囲の血流の
回復を得る新規の治療的ストラテジーである。実験プロトコルは以下を含む： ａ）一方の片側の大腿動脈を、後肢の虚血筋肉を作製するために結紮する。他
方の片側の後肢は、コントロールの役割をする。

【０６６７】 ｂ）ＴＲ１２タンパク質を、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲で、一週間あた
り静脈内および／または筋肉内に３回（おそらくより多く）で２〜３週間、送達
する。

【０６６８】 ｃ）この虚血筋肉組織を、大腿動脈の結紮後、１、２、および３週間目に、Ｔ
Ｒ１２の発現の分析ならびに組織学のために収集する。生検もまた、他方の側の
対側後肢の正常な筋肉において行う。

【０６６９】 本実施例において記載される研究は、ＴＲ１２タンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
ＴＲ１２のアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験するために、例示
する研究を容易に改変し得る。

【０６７０】 （実施例４８：虚血心筋疾患モデル） ＴＲ１２を、側副血管の発達を刺激し得、かつ冠状動脈閉塞後の新しい血管を
再構成し得る強力なマイトジェンとして評価する。ＴＲ１２の発現の変化を、イ
ンサイチュで研究する。実験プロトコルは、以下を含む： ａ）心臓を、ラットの左側開胸術を介して露出する。直ちに、左冠状動脈を、
細い縫合糸（６〜０）を用いて咬合し、そして胸郭を閉じる。

【０６７１】 ｂ）ＴＲ１２タンパク質を、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲で、一週間あた
り静脈内および／または筋肉内に３回（おそらくより多く）で２〜４週間、送達
する。

【０６７２】 ｃ）手術の３０日後、この心臓を、形態測定のために取り出しそして横断切片
化し、そしてインサイチュで分析する。

【０６７３】 本実施例において記載される研究は、ＴＲ１２タンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、ＴＲ１２ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
ＴＲ１２のアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験するために、例示
する研究を容易に改変し得る。

【０６７４】 （実施例４９：ラット角膜創傷治癒モデル） この動物モデルは、新生血管形成に対するＴＲ１２の効果を示す。実験プロト
コルは、以下を含む： ａ）角膜の中心から間質層へと１〜１．５ｍｍの長い切開を作る ｂ）目の外端に面する切開の唇縁の下にへらを挿入する ｃ）ポケットを作る（その基底は、目の縁から１〜１．５ｍｍである） ｄ）５０ｎｇ〜５μｇのＴＲ１２を含む小丸剤を、ポケット内に配置する ｅ）ＴＲ１２の処置をまた、２０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲の投薬範囲内で（毎
日の処置を５日間）角膜創傷に局所的に適用し得る。

【０６７５】 本実施例において記載される研究は、ＴＲ１２タンパク質の活性を試験する。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＴＲ１２ポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、ＴＲ１２アゴニスト、および／またはＴＲ１２アンタ
ゴニストの活性を試験し得る。

【０６７６】 （実施例５０：糖尿病マウスおよび糖質コルチコイド障害性創傷治癒モデル） （Ａ．糖尿病ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスモデル） ＴＲ１２が、治癒プロセスを促進することを実証するために、創傷治癒の遺伝
的糖尿病マウスモデルを使用する。ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスにおける全層（ｆｕｌ
ｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）創傷治癒モデルは、障害性の創傷治癒の十分に特徴付
けられた、臨床的に関連性のある、そして再現可能なモデルである。糖尿病性創
傷の治癒は、収縮よりむしろ肉芽組織の形成および再上皮形成に依存する（Ｇａ
ｒｔｎｅｒら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５２：３８９（１９９２）；Ｇｒｅｅｎ
ｈａｌｇｈら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９０））。

【０６７７】 この糖尿病動物は、ＩＩ型真性糖尿病において観察される多くの特徴的な特性
を有する。ホモ接合（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、それらの正常なヘテロ接合（
ｄｂ＋／＋ｍ）同腹仔と比較して肥満である。変異体糖尿病（ｄｂ＋／ｄｂ＋）
マウスは、第４染色体上に１個の常染色体性の劣性変異（ｄｂ＋）を有する（Ｃ
ｏｌｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２８
３−２９３（１９８２））。動物は、多食症、多渇症、および多尿症を示す。変
異体糖尿病マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋）は、上昇した血中グルコース、増加したま
たは正常なインスリンレベル、および抑制された細胞媒介免疫を有する（Ｍａｎ
ｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５（１９７８）；Ｄｅｂｒａｙ
−Ｓａｃｈｓら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１（１）：１−７（１
９８３）；Ｌｅｉｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１１４：４６−５
５（１９８５））。末梢神経障害、心筋合併症、および微小血管病変、基底膜肥
厚、および糸球体濾過異常は、これらの動物において記載されている（Ｎｏｒｉ
ｄｏ，Ｆ．ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．８３（２）：２２１−２３２（１９８４
）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２９（１）：６０−６７（１９
８０）；Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．４０（４）：４６０
−４７３（１９７９）；Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３１（補
遺）：１−６（１９８２））。これらのホモ接合糖尿病マウスは、高血糖症を発
症し、これは、ヒトＩＩ型糖尿病に類似してインスリンに対して耐性である（Ｍ
ａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５−１３７７（１９７８）
）。

【０６７８】 これらの動物において観察された特徴は、このモデルにおける治癒が、ヒト糖
尿病において観察された治癒に類似し得ることを示唆する（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇ
ｈら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５−１２４６（１９９０
））。

【０６７９】 遺伝的糖尿病の雌性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウス、およびそ
れらの非糖尿病（ｄｂ＋／＋ｍ）へテロ接合性同腹仔（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、この研究に用いた。これらの動物を６週齢で購入する
。研究の開始時は８週齢である。動物を個別に飼育し、そして自由に食物と水を
与える。全ての操作を、無菌操作を用いて行う。この実験を、Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉ
ｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｇ
ｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って行う。

【０６８０】 創傷プロトコルを、以前に報告された方法に従って行う（Ｔｓｕｂｏｉおよび
Ｒｉｆｋｉｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：２４５−２５１（１９９０））。
簡単には、創傷させる日に、動物を、脱イオン水に溶解したアベルチン（Ａｖｅ
ｒｔｉｎ）（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、２，２，２−トリブロモエタノールおよび
２−メチル−２−ブタノールの腹腔内注射で麻酔する。動物の背面領域を剃毛し
、そして皮膚を７０％エタノール溶液およびヨウ素で洗浄する。手術領域を、創
傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。次いで、８ｍｍの全層創傷を、Ｋｅｙｅ
ｓ組織パンチを用いて作製する。創傷させたすぐ後に、周囲の皮膚を、創傷の拡
大を取り除くために穏やかに伸ばす。実験の間この創傷の左を開放する。処置の
適用は、創傷させた日から５日間連続で、局所的に与えられる。処置の前に、創
傷を、滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。

【０６８１】 創傷を視覚的に検査し、そして手術の日およびその後２日間隔で、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目の毎日および８日目の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎノギスを用
いて水平および垂直に測定する。肉芽組織がもはや目に見えずかつ創傷を連続し
た上皮が覆う場合に、創傷を治癒したとみなす。

【０６８２】 ＴＲ１２を、ビヒクル中で８日間、異なる用量の範囲（１日あたり創傷あたり
４ｍｇ〜５００ｍｇ）のＴＲ１２を用いて投与する。ビヒクルコントロール群は
、５０ｍＬのビヒクル溶液を受けた。

【０６８３】 動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学および免疫組
織化学のために収集する。組織標本を、さらなるプロセシングのために、生検ス
ポンジの間の組織カセット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。

【０６８４】 各々１０匹の動物（５匹の糖尿病および５匹の非糖尿病コントロール）の３つ
の群：１）ビヒクルプラシーボコントロール、２）ＴＲ１２を、評価する。

【０６８５】 創傷閉鎖を、水平軸および垂直軸で面積を測定すること、および創傷の四角の
面積全体を得ることにより分析する。次いで、収縮を、最初の創傷の面積（０日
）と処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目
のこの創傷面積は、６４ｍｍ²（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を
以下の式を用いて行う： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］ 標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミ
クロトームを用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染
色を、二等分した創傷の断面上で行う。創傷の組織学的試験を用いて、修復した
皮膚の治癒プロセスおよび形態的な外見が、Ｔ１２を用いる処置によって変更さ
れたか否かを評価する。この評価は、細胞蓄積、炎症細胞、毛細管、線維芽細胞
、再上皮形成、および表皮成熟の存在の検証を含む（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈら、
Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９０））。目盛り付きレンズ
マイクロメーターを盲検観察者（ｂｌｉｎｄｅｄ ｏｂｓｅｒｖｅｒ）が用いる
。

【０６８６】 組織切片をまた、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ検出システムを使用してポリクローナル
ウサギ抗ヒトケラチン抗体で免疫組織化学的に染色する。ヒト皮膚を陽性組織コ
ントロールとして用いて、一方、非免疫ＩｇＧを陰性コントロールとして用いる
。ケラチノサイト増殖を、目盛り付きレンズマイクロメーターを用いて創傷の再
上皮形成の程度を評価することによって決定する。

【０６８７】 皮膚標本における増殖細胞核抗原／サイクリン（ＰＣＮＡ）を、ＡＢＣ Ｅｌ
ｉｔｅ検出システムを用いて抗ＰＣＮＡ抗体（１：５０）を使用することにより
実証する。ヒト結腸癌は、陽性組織コントロールとして役割を果たし得、そして
ヒト脳組織を、陰性組織コントロールとして用い得る。各標本は、１次抗体の脱
落および非免疫マウスＩｇＧとの置換を用いた切片を含む。これらの切片の順位
は、０〜８のスケール（わずかな増殖を反映するより低い側のスケール〜激しい
増殖を反映するより高い側）の増殖の程度に基づく。

【０６８８】 実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみな
す。

【０６８９】 （Ｂ．ステロイド障害性ラットモデル） ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々のインビトロおよびインビボ系にお
いて十分に実証されている（Ｗａｈｌ，Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎ
ｄ Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ：Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔ
ｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅ
ｃｔｓ．２８０−３０２（１９８９）； Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
１５：４７６−４８１（１９７５）；Ｗｅｒｂら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７
：１６８４−１６９４（１９７８））。糖質コルチコイドは、新脈管形成を阻害
すること、血管透過性（Ｅｂｅｒｔら、Ａｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．３７：７
０１−７０５（１９５２））、線維芽細胞増殖、およびコラーゲン合成（Ｂｅｃ
ｋら、Ｇｒｏｗｓ Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａｙ
ｎｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８））
を低下させること、ならびに循環する単球の一過性の減少を生じること（Ｈａｙ
ｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１
９７８）；Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗ
ｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏ
ｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ
，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９
８９））によって創傷治癒を遅延させる。障害性創傷治癒に対するステロイドの
全身性投与は、ラットにおいて十分に確立された現象である（Ｂｅｃｋら、Ｇｒ
ｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａｙｎｅｓら
、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）；Ｗａｈｌ
，「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ」
：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓ
ｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９）；Ｐｉｅｒｃｅら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２２２９−２２３３（１
９８９））。

【０６９０】 ＴＲ１２が治癒プロセスを促進し得るか否かを実証するために、治癒がメチル
プレドニゾロンの全身性投与により損なわれている、ラットの全層切除皮膚創傷
に対するＴＲ１２の複数の局所適用の効果を評価する。

【０６９１】 若年成体の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（体重２５０〜３００ｇ
）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこの実験に用
いる。この動物を、８週齢で購入する。研究の開始時は９週齢である。ラットの
治癒応答は、創傷の時点で、メチルプレドニゾロンの全身性投与（１７ｍｇ／ｋ
ｇ／ラット、筋肉内）により損なわれる。動物を個別に飼育し、そして自由に食
物と水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて行う。この研究を、Ｈｕｍａ
ｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ
Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔ
ｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏ
ｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って
行う。

【０６９２】 創傷プロトコルは、上記Ａ節に従う。創傷させる日に、動物をケタミン（５０
ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔する。この
動物の背面領域を剃毛し、そして皮膚を７０％エタノールおよびヨウ素溶液で洗
浄する。手術範囲を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。８ｍｍの全層創
傷をＫｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。実験の間、この創傷の左を開放す
る。創傷させ、次いでメチルメチルプレドニゾロン投与した日から開始して、試
験物質の適用を、７日間連続で、１日１回、局所的に与える。処置の前に、創傷
を滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。

【０６９３】 創傷を視覚的に検査し、そして創傷させた日および処置の終りに、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目の毎日および８日目の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎノギスを用
いて水平および垂直に測定する。肉芽組織がもはや目に見えずかつ創傷を連続し
た上皮が覆う場合に、創傷を治癒したとみなす。

【０６９４】 ＴＲ１２を、ビヒクル中で８日間、異なる用量の範囲（１日あたり創傷あたり
４ｍｇ〜５００ｍｇ）のＴＲ１２を用いて投与する。ビヒクルコントロール群は
、５０ｍＬのビヒクル溶液を受けた。

【０６９５】 動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学のために収集
する。組織標本を、さらなるプロセシングのために、生検スポンジの間の組織カ
セット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。

【０６９６】 各々１０匹の動物（メチルメチルプレドニゾロンを用いる５匹および糖質コル
チコイドを用いない５匹）の４つの群を評価する：１）非処置群、２）ビヒクル
プラシーボコントロール、および３）ＴＲ１２処置群。

【０６９７】 創傷閉鎖を、垂直軸および水平軸で面積を測定すること、および創傷の面積全
体を得ることにより分析する。次いで、閉鎖を、最初の創傷の面積（０日）と処
置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこの
創傷面積は、６４ｍｍ²（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下の
式を用いて行う： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］ 標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＯｌｙｍｐｕｓミクロトームを
用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、二等分
した創傷の断面上で行う。創傷の組織学的試験は、修復した皮膚の治癒プロセス
および形態的な外見がＴＲ１２での処置によって改善されたかどうかを評価する
ことを可能にする。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲検観察者（ｂｌｉｎ
ｄｅｄ ｏｂｓｅｒｖｅｒ）が用いて、創傷の隙間の距離を決定する。

【０６９８】 実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみな
す。

【０６９９】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリヌクレオチド活性を試験す
る。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＴＲ１２ポリヌクレオ
チド（例えば、遺伝子治療）、ＴＲ１２アゴニスト、および／またはＴＲ１２ア
ンタゴニストの活性を試験し得る。

【０７００】 （実施例５１：リンパ水腫（ｌｙｍｐｈａｄｅｍａ）動物モデル） この実験アプローチの目的は、ラット後肢におけるリンパ管形成（ｌｙｍｐｈ
ａｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）およびリンパの循環系の再確立におけるＴＲ１２の治
療的効果を試験するための、適切かつ一貫したリンパ水腫モデルを作製すること
である。有効性は、罹患した肢の腫脹体積、リンパの脈管構造、総血漿タンパク
質の量の定量、および組織病理学により測定される。急性リンパ水腫は、７〜１
０日間観察される。恐らくより重要なことは、水腫の慢性進行は、３〜４週間ま
で続く。

【０７０１】 手術を始める前に、血液サンプルを、タンパク質濃度分析のために採血する。
雄性ラット（体重約３５０ｇ）に、ペントバルビタールを投薬する。次いで、右
肢を膝から股関節部まで剃毛する。この剃毛した範囲を７０％ＥｔＯＨに浸した
ガーゼで拭く。血液を、血清総タンパク質試験のために採血する。周径測定およ
び体積測定を行った後に、２つの測定レベル（踵の０．５ｃｍ上、足背の中間点
）に印をつけた後、足へと色素を注射する。右足背および左足背の両方の内皮に
、０．０５ｍｌの１％Ｅｖａｎ’ｓ Ｂｌｕｅを注射する。次いで、足への色素
の注射の後、周径測定および体積測定を行う。

【０７０２】 目印として膝関節を用いて、中肢鼡径部切開を、大腿血管の位置を確認できる
ように環状に行う。鉗子および止血鉗子を用いて、皮膚弁を切開し、そして分離
する。大腿血管の位置確認後、血管の横に沿ってかつ血管の下に走るリンパ管を
位置確認する。次いで、この範囲の主要なリンパ管を、電気凝固縫合結紮（ｅｌ
ｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｓｕｔｕｒｅ ｌｉｇａｔｅ）する。

【０７０３】 顕微鏡を用いて、肢の背の筋肉（半腱様筋（ｓｅｍｉｔｅｎｄｉｎｏｓｉｓ）
および内転筋の付近）を平滑に切開する。次いで、膝窩リンパ節の位置を確認す
る。次いで、２つの近位リンパ管および２つの遠位リンパ管、ならびに膝窩節の
遠位血液供給部を縫合糸により結紮する。次いで、膝窩リンパ節および任意の付
随する脂肪組織を、結合組織を切断することによって取り除く。

【０７０４】 この手順で生じるいかなる軽度の出血をも管理するように注意すること。リン
パ管を咬合した後、皮膚弁を、液体皮膚（Ｖｅｔｂｏｎｄ）（ＡＪ Ｂｕｃｋ）
を使用することによって密封する。別々の皮膚縁を、その下の筋肉組織に、脚の
周囲に約０．５ｃｍのギャップを残しながら密封する。皮膚はまた、必要なとき
にその下の筋肉に縫合することによって係留してもよい。

【０７０５】 感染を回避するために、動物を、メッシュを用いて個別に収容する（床敷きな
し）。回復した動物を、最適な水腫ピークを通して毎日チェックする。このピー
クは、代表的には５〜７日まで生じる。次いで、プラトーの水腫ピークを観察す
る。リンパ水腫の強度を評価するために、各肢上の２つの指定した場所の周径お
よび体積を、操作の前および７日間毎日測定する。リンパ水腫に対する血漿タン
パク質の効果を決定し、そしてタンパク質分析が有用な試験周界であるか否かも
また調査する。コントロール肢および水腫肢の両方の重量を、２箇所で評価する
。分析を盲目様式（ｂｌｉｎｄ ｍａｎｎｅｒ）で行う。

【０７０６】 周径測定：肢の動きを防止するための短期気体麻酔のもとで、布巻尺を使用し
て、肢の周径を測定する。測定を、距骨および背面の足にて、２人の異なる人物
によって行い、次いで、これらの２つの読み取りを平均する。読み取りを、コン
トロールおよび水腫肢の両方から得る。

【０７０７】 体積測定：手術の日に、動物をペントバルビタールで麻酔し、そして手術の前
に試験する。毎日の体積測定のために、動物を短期ハロタン麻酔（迅速な固定化
およびすばやい回復）のもとにおき、両方の脚を剃毛し、そして耐水性マーカー
を用いて脚に等しく印をつける。脚を、最初に水に漬け、次いで各々顕著なレベ
ルまで装置に漬け、次いでＢｕｘｃｏ水腫ソフトウェア（Ｃｈｅｎ／Ｖｉｃｔｏ
ｒ）によって測定する。データを１人の人物によって記録し、一方他者は、脚を
しるしを付けた領域まで漬ける。

【０７０８】 血液−血漿タンパク質測定：手術の前に血液を取り出し、遠心分離し、そして
血清を分離し、次いで、全タンパク質およびＣａ２＋比較について結論付ける。

【０７０９】 肢重量比較：血液を取り出した後、この動物を、組織収集のために調製する。
この肢を、キリチン（ｑｕｉｌｌｉｔｉｎｅ）を用いて切断し、次いで、実験用
脚とコントロール脚の両方を、結紮して切断し、そして秤量する。２回目の秤量
を、脛踵（ｔｉｂｉｏ−ｃａｃａｎｅａｌ）関節を外し、そして足を秤量して行
う。

【０７１０】 組織学的調製：膝（膝窩）領域の後ろに位置する横筋を切り出し、そして金属
型に配置し、ｆｒｅｅｚｅＧｅｌで満たし、冷メチルブタンに漬け、標識したサ
ンプルバッグに切断するまで−８０ＥＣにて配置する。切断の際に、筋肉を、蛍
光顕微鏡のもとで、リンパ管について観察する。

【０７１１】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験する。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＴＲ１２ポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、ＴＲ１２アゴニスト、および／またはＴＲ１２アンタ
ゴニストの活性を試験し得る。

【０７１２】 （実施例５２：ＴＮＦα誘導性接着分子発現のＴＲ１２による抑制） 炎症および新脈管形成の領域に対するリンパ球の漸増は、リンパ球上の細胞表
面接着分子（ＣＡＭ）と血管内皮との間の特異的なレセプター−リガンド相互作
用に関する。この接着プロセスは、通常の設定および病理学的設定の両方におい
て、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−
１）、および内皮細胞（ＥＣ）における内皮白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチ
ン）発現を含む、多段階カスケードに続く。これらの分子および他の分子の血管
内皮における発現は、白血球が局所血管系に接着し得、そして炎症応答の発生の
間に局所組織に溢出し得る効率を決定する。サイトカインおよび増殖因子の局所
濃度は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。

【０７１３】 腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）（強力な前炎症性サイトカイン）は、内皮細胞
における３つ全てのＣＡＭの刺激因子であり、そして広範な種々の炎症応答に関
与し得、しばしば病理学的結果をもたらす。

【０７１４】 ＴＮＦ−α誘導性ＣＡＭ発現の抑制を媒介するＴＲ１２の潜在能力を試験し得
る。改変型ＥＬＩＳＡアッセイ（これは、固相吸着剤としてＥＣを使用する）を
使用して、ＦＧＦファミリーのタンパク質のメンバーを用いて同時刺激した場合
に、ＴＮＦ−α処理ＥＣにおけるＣＡＭ発現の量を測定する。

【０７１５】 この実験を行うために、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）培養物を、プール
した索採取物から得、そして１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマ
イシンを補充した増殖培地（ＥＧＭ−２；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，ＣＡ）中で、５％ＣＯ₂を含む３７℃の加湿インキュベーターにおいて維
持する。ＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ培地中１×１０⁴細胞／ウェルの濃度で、９６ウ
ェルプレート中に、３７℃で１８〜２４時間またはコンフルエントになるまで播
種する。続いて、単層を、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌス
トレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０の無血清溶液で３回洗浄し、そ
して所定のサイトカインおよび／または増殖因子を用いて、２４時間３７℃にて
処理する。インキュベーション後、次いで、この細胞を、ＣＡＭ発現について評
価する。

【０７１６】 ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、標準的な９６ウェルプレートにおいて
コンフルエントになるまで増殖させる。増殖培地を、細胞から取り除き、そして
９０μｌの１９９培地（１０％ＦＢＳ）に置き換える。試験のためのサンプルお
よびポジティブまたはネガティブコントロールを、このプレートに三連で添加す
る（１０μｌ容量）。プレートを、３７℃にて、５時間（セレクチンおよびイン
テグリン発現）または２４時間（インテグリン発現のみ）のいずれかでインキュ
ベートする。プレートを吸引して、培地を除去し、そして１００μｌの０．１％
パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を有する）を各ウェル
に添加する。プレートを、４℃にて３０分間保持する。

【０７１７】 次いで、固定液をウェルから除去し、そしてウェルをＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）
＋０．５％ＢＳＡを用いて１回洗浄し、そして排水する。このウェルを乾燥させ
ないこと。１０μｌの希釈した一次抗体を、試験ウェルおよびコントロールウェ
ルに添加する。抗ＩＣＡＭ−１−Ｂｉｏｔｉｎ、抗ＶＣＡＭ−１−Ｂｉｏｔｉｎ
および抗Ｅ−セレクチン−Ｂｉｏｔｉｎを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ
／ｍｌストック抗体の１：１０希釈）で使用する。細胞を、加湿した環境におい
て、３７℃にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ
）＋０．５％ＢＳＡを用いて３回洗浄する。

【０７１８】 次いで、２０μｌの希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈ
ｏｓｐｈｏｔａｓｅ（１：５，０００希釈）を各ウェルに添加し、そして３７℃
にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５
％ＢＳＡを用いて３回洗浄する。１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐ
ＮＰＰ）を、５ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ１０．４）に溶解させる。グリシン
緩衝液中のｐＮＰＰ基質１００μｌを、各試験ウェルに添加する。三連の標準ウ
ェルを、グリシン緩衝液中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏ
ｓｐｈｏｔａｓｅの操作希釈（ｗｏｒｋｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（１：５，
０００（１０⁰）＞１０^-0.5＞１０^-1＞１０^-1.5）から調製する。５μｌの各希
釈物を、三連のウェルに添加し、そして各ウェル中の得られたＡＰ含量は、５．
５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇである。次いで、１００
μｌのｐＮＰＰ試薬を、標準ウェルの各々に添加しなければならない。このプレ
ートを、３７℃にて４時間インキューベートしなければならない。３Ｍ ＮａＯ
Ｈの５０μｌの容量を全てのウェルに添加する。この結果を、プレートリーダー
において４０５ｎｍにて定量する。バックグラウンド減算オプションを、グリシ
ン緩衝液のみで満たしたブランクウェルにおいて使用する。このテンプレートを
、各々の標準ウェルにおけるＡＰ結合体の濃度を示すように設定する［５．５０
ｎｇ；１．７４ｎｇ；０．５５ｎｇ；０．１８ｎｇ］。結果を、各サンプル中の
結合したＡＰ結合体の量として示す。

【０７１９】 本実施例において記載される研究は、ＴＲ１２タンパク質活性を試験する。し
かし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ＴＲ１２ポリヌクレオチド（
例えば、遺伝子治療）、ＴＲ１２アゴニスト、および／またはＴＲ１２アンタゴ
ニストの活性を試験し得る。

【０７２０】 本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得
ることは、明らかである。本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の
教示を考慮して可能であり、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内に
ある。

【０７２１】 発明の背景、詳細な説明および実施例において引用された各文書の全開示（特
許、特許出願、学術文献、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示を含む）
は、本明細書中に参考として援用される。さらに、配列表は、本明細書中に参考
として援用される。

【０７２２】

【表５】 ＡＴＣＣ受託番号２０３３６５ （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。

【０７２３】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。

【０７２４】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。

【０７２５】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（国立特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）に
より）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による
決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる
旨を、請求する。

【０７２６】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルは専門家に対してのみ利用可能にさ
れる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が
完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。

【０７２７】 ＡＴＣＣ受託番号２０３３６５ （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。

【０７２８】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ出願人ガイド第Ｉ巻の付属文書Ｚに
記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人により
なされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用
される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成
された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅ
ｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により
承認された任意の者であり得る。

【０７２９】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａ〜Ｃは、ＴＲ１２のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ
酸配列（配列番号２）を示す。その推定リーダー配列は、ほぼ、アミノ酸１〜２
５（下線部）に位置し；アミノ酸およそ２６〜およそ１６４は、ＴＲ１２細胞外
ドメインを構成すると予測され；アミノ酸およそ４８〜およそ７１は、ＴＲ１２
のシステインリッチドメインを構成すると予測され；アミノ酸およそ１６５〜お
よそ１８１は、ＴＲ１２膜貫通ドメインを構成すると予測され；アミノ酸およそ
１８２〜およそ４３０は、ＴＲ１２細胞内ドメインを構成すると予測される。

【図２】 図２は、ＴＲ１２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）とヒトＯＸ４０細
胞表面抗原（ｇｉ／９１３４０６）の翻訳産物（配列番号３）との間の同一性の
領域を示す。この領域は、ＢＬＡＳＴ分析により決定された。この２つのポリペ
プチド間の同一なアミノ酸は、黒塗りにされており、一方、保存的アミノ酸は、
枠で囲んである。黒塗りしてあるアミノ酸および／または枠で囲んだアミノ酸の
領域を試験することによって、当業者は、この２つのポリペプチド間の保存され
たドメインを容易に同定し得る。これらの保存されたドメインは、本発明の好ま
しい実施形態である。

【図３】 図３は、ＴＲ１２アミノ酸配列の分析を示す。α領域、β領域、ターン領域お
よびコイル領域；親水性領域および疎水性領域；両親媒性領域；可撓性領域；抗
原性指標および表面確率が示される。そしてすべては、示されたコンピューター
プログラムのデフォールト設定を使用して作製された。「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ
ＩｎｄｅｘまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフにおいて、正のピークは、
ＴＲ１２タンパク質の非常に抗原性な位置（すなわち、本発明のエピトープ保有
ペプチドが得られ得る領域）を示す。図１Ａ〜Ｃ中（配列番号２）のアミノ酸残
基３２〜４７、５０〜５５、６１〜７３、８４〜９７、１１７〜１３３、１３８
〜１６０、１８５〜１９２、１９５〜２１０、２１２〜２２４、２３１〜２４１
、２４３〜２５４、２５６〜２７０、２７５〜２８０、２９０〜３０４、３２４
〜３４２、３５４〜３６３、３６５〜３７１、３７３〜３９３、３９７〜４１９
、および４２３〜４２８は、示された、ＴＲ１２タンパク質の非常に抗原性の領
域に、対応する。これらのグラフにより規定されたドメインは、本発明により意
図される。 図３に示されるデータはまた、表Ｉにおいて、表形式で示される。その欄は、
見出し「Ｒｅｓ」、「Ｐｏｓｉｔｉｏｎ」およびローマ数字Ｉ〜ＸＩＶで分類さ
れている。この欄の見出しは、図３および表Ｉ中に示されるアミノ酸配列の以下
の特徴をいう：「Ｒｅｓ」：配列番号２および図１Ａ〜１Ｃのアミノ酸残基；「
Ｐｏｓｉｔｉｏｎ」：配列番号２および図１Ａ〜１Ｃ中の対応する残基の位置；
Ｉ：α、領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＩＩ：α、領域−Ｃｈｏｕ−Ｆ
ａｓｍａｎ；ＩＩＩ：β、領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＩＶ：β、領
域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；Ｖ：ターン、領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏ
ｎ；ＶＩ：ターン、領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；ＶＩＩ：コイル、領域−Ｇ
ａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＶＩＩＩ：親水性プロット−Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌ
ｉｔｔｌｅ；ＩＸ：α、両親媒性領域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；Ｘ：β、両親媒性
領域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；ＸＩ：可撓性領域−Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ
；ＸＩＩ：抗原性指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ；およびＸＩＩＩ：表面確率
プロット−Ｅｍｉｎｉ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/04 Ａ６１Ｐ 11/00 ４Ｃ０８４ 9/00 13/00 ４Ｃ０８６ 11/00 17/00 ４Ｈ０４５ 13/00 19/00 17/00 25/00 19/00 27/00 25/00 29/00 27/00 31/00 29/00 33/00 31/00 35/00 33/00 35/04 35/00 37/00 35/04 43/00 １０５ 37/00 １１１ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/715 １１１ 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/715 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/06 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/06 33/50 Ｚ 1/68 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ 33/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ルーベン， スティーブン エム． アメリカ合衆国 メリーランド 20832， オルニー， ヘリテッジ ヒルズ ドラ イブ 18528 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB10 BB14 BB20 BB50 BB51 DA13 DA36 FB02 4B024 AA01 AA12 BA63 CA04 CA12 DA02 DA03 EA02 HA11 HA17 4B063 QA01 QA08 QA17 QA18 QA19 QQ08 QQ43 QQ96 QR32 QR48 QR56 QR62 QR66 QR72 QR77 QS03 QS25 QS32 QS34 QX02 4B064 AG20 CA19 DA14 4B065 AA90X AA90Y AB01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 CA18 CA25 DC50 NA14 ZA012 ZA362 ZA532 ZB022 ZB212 ZB262 ZC022 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA36 ZA53 ZB02 ZB21 ZB26 ZC02 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA51 DA76 EA28 EA51 FA74

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号１のポリヌクレオチドフラグメント、またはＡＴＣＣ受託番号
   ２０３３６５に含まれるｃＤＮＡ配列のポリヌクレオチドフラグメント； （ｂ）配列番号２のポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド
   、またはＡＴＣＣ受託番号２０３３６５に含まれるｃＤＮＡ配列； （ｃ）配列番号２のポリペプチドドメインをコードするポリヌクレオチド、ま
   たはＡＴＣＣ受託番号２０３３６５に含まれるｃＤＮＡ配列； （ｄ）配列番号２のポリペプチドエピトープをコードするポリヌクレオチド、
   またはＡＴＣＣ受託番号２０３３６５に含まれるｃＤＮＡ配列； （ｅ）生物学的活性を有する配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌク
   レオチド、または生物学的活性を有するＡＴＣＣ受託番号２０３３６５に含まれ
   るｃＤＮＡ配列； （ｆ）配列番号１の改変体である、ポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号１の対立遺伝子改変体である、ポリヌクレオチド； （ｈ）配列番号２の種相同体をコードする、ポリヌクレオチド； （ｉ）（ａ）〜（ｈ）において特定されるポリヌクレオチドのうちのいずれか
   １つにストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであっ
   て、ここで、該ポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみのヌクレオチ
   ド配列を有する核酸分子に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズしない、
   ポリヌクレオチド、 からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列
   を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、成熟形態タンパク質
   または分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の
   単離された核酸分子。
3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号２として同
   定される配列をコードするヌクレオチド配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０３３
   ６５に含まれるコード配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号１のヌクレ
   オチド配列全体、またはＡＴＣＣ受託番号２０３３６５に含まれるｃＤＮＡ配列
   を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
5. 【請求項５】 前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかか
   ら連続するヌクレオチド欠失を含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。
6. 【請求項６】 前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかか
   らの連続するヌクレオチド欠失を含む、請求項３に記載の単離された核酸分子。
7. 【請求項７】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組換えベクタ
   ー。
8. 【請求項８】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組換え宿主細
   胞を作製する方法。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法によって産生される、組換え宿主細胞
   。
10. 【請求項１０】 ベクター配列を含む、請求項９に記載の組換え宿主細胞。
11. 【請求項１１】 単離されたポリペプチドであって、以下： （ａ）配列番号２のポリペプチドフラグメント、またはＡＴＣＣ受託番号２０
    ３３６５に含まれるコードされた配列のポリペプチドフラグメント； （ｂ）生物学的活性を有する、配列番号２のポリペプチドフラグメント、また
    は生物学的活性を有する、ＡＴＣＣ受託番号２０３３６５に含まれるコードされ
    た配列のポリペプチドフラグメント； （ｃ）配列番号２のポリペプチドドメイン、またはＡＴＣＣ受託番号２０３３
    ６５に含まれるコードされた配列のポリペプチドドメイン； （ｄ）配列番号２のポリペプチドエピトープ、またはＡＴＣＣ受託番号２０３
    ３６５に含まれるコードされた配列のポリペプチドエピトープ； （ｅ）成熟形態の分泌タンパク質； （ｆ）全長分泌タンパク質； （ｇ）配列番号２の改変体； （ｈ）配列番号２の対立遺伝子改変体；あるいは （ｉ）配列番号２の種相同体、 からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、
    単離されたポリペプチド。
12. 【請求項１２】 前記成熟形態または全長の、分泌タンパク質が、Ｃ末端ま
    たはＮ末端のいずれかからの連続するアミノ酸欠失を含む、請求項１１に記載の
    単離されたポリペプチド。
13. 【請求項１３】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドに特異的に結
    合する、単離された抗体。
14. 【請求項１４】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドを発現する、
    組換え宿主細胞。
15. 【請求項１５】 単離されたポリペプチドを作製する方法であって、以下： （ａ）該ポリペプチドが発現されるような条件下で、請求項１４に記載の組換
    え宿主細胞を培養する工程；および （ｂ）該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する、方法。
16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法によって産生される、ポリペプチ
    ド。
17. 【請求項１７】 医学的状態を予防、処置、または緩和するための方法であ
    って、請求項１１に記載のポリペプチドまたは請求項１に記載のポリヌクレオチ
    ドの、治療有効量を、哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、方法。
18. 【請求項１８】 被験体において、分泌タンパク質の発現または活性に関連
    する、病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を、診断する方法であっ
    て、以下： （ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドにおいて変異の存在または非存在を
    決定する工程；および （ｂ）該変異の存在または非存在に基づいて、病理学的状態または病理学的状
    態に対する感受性を、診断する工程、 を包含する、方法。
19. 【請求項１９】 被験体において、分泌タンパク質の発現または活性に関連
    する、病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を、診断する方法であっ
    て、以下： （ａ）生物学的サンプルにおいて請求項１１に記載のポリペプチドの発現の、
    存在または量を決定する工程、および （ｂ）該ポリペプチドの発現の、存在または量に基づいて、病理学的状態また
    は病理学的状態に対する感受性を、診断する工程、 を包含する、方法。
20. 【請求項２０】 請求項１１に記載のポリペプチドに対する結合パートナー
    を同定する方法であって、以下： （ａ）請求項１１に記載のポリペプチドを結合パートナーと接触させる工程；
    および （ｂ）該結合パートナーが該ポリペプチドの活性に変化をもたらすか否かを決
    定する工程、 を包含する、方法。
21. 【請求項２１】 配列番号２のｃＤＮＡ配列に対応する、遺伝子。
22. 【請求項２２】 生物学的アッセイにおいて活性を同定する方法であって、
    ここで該方法が、以下： （ａ）細胞において配列番号１を発現させる工程； （ｂ）その上清を単離する工程； （ｃ）生物学的アッセイにおいて活性を検出する工程；および （ｄ）該活性を有する該上清において、そのタンパク質を同定する工程、 を包含する、方法。
23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の方法によって産生される、産物。