JP2002530062A - １２個のヒト分泌タンパク質 - Google Patents

１２個のヒト分泌タンパク質

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JP2002530062A JP2000582421A JP2000582421A JP2002530062A JP 2002530062 A JP2002530062 A JP 2002530062A JP 2000582421 A JP2000582421 A JP 2000582421A JP 2000582421 A JP2000582421 A JP 2000582421A JP 2002530062 A JP2002530062 A JP 2002530062A
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protein
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ジアン ニ，
スティーブン エム． ルーベン，
ヘンリク エス． オルセン，
ポール イー． ヤング，
ジョセフ ジェイ． ケニー，
ポール エイ． ムーア，
イン−フェイ ウェイ，
ジョン エム． グリーン，
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Human Genome Sciences Inc
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、１２個の新規なヒト分泌タンパク質に関する。本発明はまた、このような分泌タンパク質をコードする遺伝子のコード領域を含む、単離された核酸に関する。また、本発明によって、これらのヒト分泌タンパク質を生成するための、ベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法が提供される。本発明はさらに、これらの新規なヒトタンパク質に関する障害を、診断するためおよび処置するために有用な、診断方法および治療方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチ
ドによってコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの使用、ならびにそれらの産生に関する。
【０００２】 （発明の背景） 膜によって取り囲まれる単一コンパートメントとして存在する細菌とは異なり
、ヒト細胞および他の真核生物は、膜によって多くの機能的に異なるコンパート
メントに細分される。それぞれの膜で区切られたコンパートメント、すなわちオ
ルガネラは、そのオルガネラの機能に不可欠な異なるタンパク質を含む。細胞は
、特定の細胞オルガネラにタンパク質を標的化するために、タンパク質内部に位
置するアミノ酸モチーフである「選別シグナル」を使用する。
【０００３】 シグナル配列、シグナルペプチド、またはリーダー配列と呼ばれる選別シグナ
ルの１つの型は、小胞体（ＥＲ）と呼ばれるオルガネラに１つのクラスのタンパ
ク質を指向する。ＥＲは、膜で区切られたタンパク質をすべての他の型のタンパ
ク質から分離する。一旦、ＥＲに局在すると、両方の群のタンパク質とも、ゴル
ジ装置と呼ばれる別のオルガネラにさらに指向され得る。ここで、ゴルジは、タ
ンパク質を、分泌小胞を含む小胞、細胞膜、リソソーム、および他のオルガネラ
に分布させる。
【０００４】 シグナル配列によってＥＲに標的化されたタンパク質は、分泌タンパク質とし
て細胞外間隙に放出され得る。例えば、分泌タンパク質を含む小胞は、細胞膜と
融合し得、そして細胞外間隙にその内容物を放出し得る（エキソサイトーシスと
呼ばれるプロセスである）。エキソサイトーシスは、構成的に、または誘発シグ
ナルの受け取りの後に生じ得る。後者の場合には、タンパク質は、エキソサイト
ーシスが誘発されるまで、分泌小胞（または分泌顆粒）に貯蔵される。同様に、
細胞膜上に存在するタンパク質はまた、タンパク質を膜に保持する「リンカー」
のタンパク質分解切断によって、細胞外間隙に分泌され得る。
【０００５】 近年大きく進歩したにもかかわらず、ヒトの分泌タンパク質をコードする遺伝
子は少数しか同定されていない。これらの分泌タンパク質としては、商業的価値
のあるヒトインスリン、インターフェロン、第ＶＩＩＩ因子、ヒト成長ホルモン
、組織プラスミノーゲンアクチベーター、およびエリスロポエチンが挙げられる
。従って、ヒトの生理学における分泌タンパク質の広範な役割を考慮すると、新
規のヒトの分泌タンパク質およびそれらをコードする遺伝子を同定および特徴付
けるための必要性がある。この知見は、分泌タンパク質またはそれらをコードす
る遺伝子を使用することによって、医学的障害を検出、処置、および予防するこ
とを可能にする。
【０００６】 （発明の要旨） 本発明は、新規ポリヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドに関する。
さらに、本発明は、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するためのベク
ター、宿主細胞、抗体、ならびに組換え方法および合成方法に関する。このポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドに関連する障害および状態を検出するための診
断方法、およびこのような障害および状態を処置するための治療方法もまた提供
される。本発明は、さらに、このポリペプチドの結合パートナーを同定するため
のスクリーニング方法に関する。
【０００７】 （詳細な説明） （定義） 以下の定義は、本明細書全体を通して使用される特定の用語の理解を容易にす
るために提供される。
【０００８】 本発明において、「単離された」とは、その本来の環境（例えば、それが天然
に存在する場合は天然の環境）から取り出された物質をいい、したがって、天然
の状態から「人間の手によって」変更されている。例えば、単離されたポリヌク
レオチドは、ベクターまたは物質の組成物の一部であり得るか、あるいは細胞中
に含まれ得、そしてなお「単離されている」。なぜなら、そのベクター、物質の
組成物、または特定の細胞は、ポリヌクレオチドの本来の環境ではないからであ
る。用語「単離された（単離した）」は、ゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡ
ライブラリー、全細胞の総ＲＮＡ調製物もしくはｍＲＮＡ調製物、ゲノムＤＮＡ
調製物（電気泳動により分離され、そしてブロットに移動されるものを含む）、
共有される全ＤＮＡゲノムＤＮＡ調製物、または他の組成物（当該技術では、本
発明のポリヌクレオチド／配列を識別する特徴を示さない）をいわない。
【０００９】 本発明において、「分泌」タンパク質とは、ＥＲ、分泌小胞、または細胞外間
隙にシグナル配列の結果として指向され得るタンパク質、ならびにシグナル配列
を必ずしも含まないが細胞外間隙に放出されるタンパク質をいう。分泌タンパク
質が、細胞外間隙に放出される場合、この分泌タンパク質は、「成熟」タンパク
質を産生するために細胞外プロセシングを受け得る。細胞外間隙への放出は、エ
キソサイトーシスおよびタンパク質分解切断を含む多くの機構によって生じ得る
。
【００１０】 特定の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも、１５、
少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少な
くとも５００、または少なくとも１０００の連続ヌクレオチドであるが、長さが
３００ｋｂ、２００ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、７．５
ｋｂ、５ｋｂ、２．５ｋｂ、２０ｋｂ、または１ｋｂ未満である。さらなる実施
態様において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に開示のように、コー
ド配列の１部を含むが、任意のイントロンの全てまたは一部を含まない。別の実
施態様において、コード配列を含むポリヌクレオチドは、ゲノム隣接遺伝子のコ
ード配列（すなわち、ゲノムにおける目的の遺伝子に対して５’または３’）を
含まない。他の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、１０００、５
００、２５０、１００、５０、２５、１５、１０、５、４、３、２、または１よ
り多いゲノム隣接遺伝子のコード配列を含まない。
【００１１】 本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」とは、配列番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）に含まれる核酸配列を有する分子、またはＡＴＣＣに寄託さ
れたクローン内に含まれるｃＤＮＡをいう。例えば、ポリヌクレオチドは、５’
および３’非翻訳配列、シグナル配列を含むかもしくは含まないコード領域、分
泌タンパク質コード領域を含む全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列、ならびに
この核酸配列のフラグメント、エピトープ、ドメイン、および改変体を含み得る
。さらに、本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」とは、広く定義される
場合、ポリヌクレオチドから生じた翻訳されたアミノ酸配列を有する分子をいう
。
【００１２】 本発明では、配列番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）として同定された全長配
列は、しばしば、複数のクローンに含まれる配列を重複させることによって生成
された（コンティグ分析）。配列番号Ｘについての配列のすべてまたはほとんど
を含む代表的クローンを、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣ
Ｃ」）に寄託した。表ＸＩＩＩに示すように、各クローンは、ｃＤＮＡクローン
ＩＤ（識別子）およびＡＴＣＣ受託番号によって同定される。ＡＴＣＣは、１０
８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉ
ｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに位置する。ＡＴＣＣ寄託は、特
許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に拠って行
われた。
【００１３】 本発明の「ポリヌクレオチド」はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下で、配列番号Ｘに含まれる配列、その相補体、またはＡＴＣＣに寄
託されたクローン内に含まれるｃＤＮＡにハイブリダイズし得るポリヌクレオチ
ドを含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホ
ルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウ
ム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％
硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中
での４２℃での一晩インキュベーション、次いで０．１×ＳＳＣ中で約６５℃に
てフィルターを洗浄することをいう。
【００１４】 より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で本発明のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた意図される。ハイブリダイゼー
ションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は、主として、ホルムア
ミド濃度（より低い百分率のホルムアミドが、低下したストリンジェンシーを生
じる）；塩条件、または温度の操作を通じて達成される。例えば、より低いスト
リンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ；０．
２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ ＳＤＳ
、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶
液中、３７℃で一晩のインキュベーション；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％ Ｓ
ＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに、さらにより低いストリンジェンシ
ーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に行われる
洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行われ得る。
【００１５】 上記の条件における変化が、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラ
ウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の含有および／ま
たは置換によって達成され得ることに留意すること。代表的なブロッキング試薬
としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、お
よび市販の製品処方物が挙げられる。特異的ブロッキング試薬の含有は、適合性
の問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし得る。
【００１６】 当然ながら、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡの任意の３’
末端ポリＡ＋領域（ｔｒａｃｔ））に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的ス
トレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレ
オチドが、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補体を含む任意の核酸分子（例え
ば、プライマーとしてオリゴｄＴを用いて生成した事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡ
クローン）にハイブリダイズするので、「ポリヌクレオチド」の定義に包含され
ない。
【００１７】 本発明のポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキ
シリボヌクレオチドから構成され得、これは、非改変ＲＮＡもしくは非改変ＤＮ
Ａまたは改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチド
は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ
、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物である
ＲＮＡ、一本鎖、またはより代表的には二本鎖もしくは一本鎖および二本鎖領域
の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得
る。さらに、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤ
ＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチドはまた、安定
性のために、または他の理由のために改変された１つ以上の改変された塩基また
はＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含み得る。「改変された」塩基としては、例えば
、トリチル化された塩基およびイノシンのような普通でない塩基が挙げられる。
種々の改変が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ得；従って、「ポリヌクレオ
チド」は、化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態を含む。
【００１８】 本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合、すな
わち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）によって互いに連結したアミ
ノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする２０個のアミノ酸以外のアミノ
酸を含み得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然のプロセスに
よって、または当該技術分野で周知の化学的改変技術によってのいずれかで、改
変され得る。このような改変は、基本テキスト、およびより詳細な研究論文、な
らびに多くの研究文献に十分記載される。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖
、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含むポリペプチドのどこにでも生
じ得る。同じ型の改変が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で同じまたは
種々の程度で存在し得ることが理解される。また、所定のポリペプチドは多くの
型の改変を含み得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝
状であり得、そしてポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない、環状であり
得る。環状、分枝状および分枝した環状ポリペプチドは、天然の翻訳後プロセス
から生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。改変としては、アセチ
ル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部
分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または
脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙ
ｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチ
ル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホル
ミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨ
ウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、
タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化
、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮ
Ａ媒介付加、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−
ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，第
２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍ
ｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡ
Ｌ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，
Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
，１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １
８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【００１９】 「配列番号Ｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）」とは、ポリヌクレオチド配列をい
うが、「配列番号Ｙ」とは、ポリペプチド配列をいい、両方の配列とも、表ＸＩ
ＩＩに特定された整数によって同定される。
【００２０】 「生物学的活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイで測定
した場合、用量依存性を伴なっても伴なわなくても、本発明のポリペプチド（成
熟形態を含む）の活性と類似であるが、必ずしも同一ではない活性を示すポリペ
プチドをいう。用量依存性が存在する場合、ポリペプチドの用量依存性と同一で
ある必要はないが、むしろ本発明のポリペプチドと比較した場合に、所定の活性
における用量依存性に実質的に類似する（すなわち、候補ポリペプチドは、本発
明のポリペプチドと比較して、より大きな活性を示すか、または約１／２５以上
、そして好ましくは約１／１０以上の活性、そして最も好ましくは約１／３以上
の活性を示す）。
【００２１】 （本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド） （遺伝子番号１によってコードされるタンパク質の特徴） この遺伝子の翻訳産物は、オタマジャクシにおいて甲状腺ホルモンに応答して
上方制御されると記載されており、そして、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ変態
の間の尾吸収プロセスにおいて重要であると考えられるＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅ
ｖｉｓ由来のタンパク質と配列相同性を共有する（参考として本明細書において
援用される、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６ ５月
５日）：９３（５）：１９２４〜９、を参照のこと）。さらに、この遺伝子の翻
訳産物は、現在記載されている群のタンパク質（ヘッジホッグ相互作用タンパク
質（ＨＩＰ）と呼ばれる）と配列相同性を共有する（本明細書において参考とし
て援用される国際公開番号ＷＯ９８／１２３２６を参照のこと）。これらのタン
パク質は、ＳｈｈおよびＤｈｈのようなヘッジホッグポリペプチドに高い親和性
で結合する（Ｋｄ 約 １ｎＭ）。ＨＩＰは、ヘッジホッグ媒介誘導において重
要な役割の指標である空間的かつ時間的に制限された発現ドメインを表す。それ
らは、神経細胞の分化を調節し、分化したニューロン細胞の生存、軟骨細胞の増
殖、精巣胚株細胞の増殖および／またはパッチされた遺伝子もしくはヘッジホッ
グ遺伝子の発現を調節する。このポリペプチドの生物学的活性は、当該分野で公
知の技術、または本明細書に開示され、そして国際公開番号ＷＯ９８／１２３２
６（本明細書において参考として援用される）に記載の技術によりアッセイされ
る。
【００２２】 本発明の好ましいポリペプチドは以下のアミノ酸配列を含む：
【００２３】
【化１】 また、前述の配列の残基４２〜７２４からなると予想される成熟ポリペプチドを
含むポリペプチド、およびこの成熟ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメン
トも好ましい。
【００２４】 図１Ａ〜Ｃは、このタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１１）および推
定アミノ酸配列（配列番号２９）を示す。
【００２５】 図２は、配列番号２９のアミノ酸配列、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ尾吸収
タンパク質（ｇｉ｜１２３４７８７）（配列番号４８）、とヘッジホッグ相互作
用タンパク質（「ＨＩＰ」；ｇｉ｜ＡＡＤ３１１７２．１）（配列番号４９）の
間の類似性の領域を示す。
【００２６】 図３は、配列番号２９のアミノ酸配列の分析を示す。α領域、β領域、ターン
領域およびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原
性指数および表面確率を示す。
【００２７】 ノーザン分析は、この遺伝子の２．５〜３．０ｋｂの転写物は、主に精巣組織
およびＡ５４９肺ガン組織において発現されるが、興味深いことに、通常の肺組
織には存在しないことを示す。この遺伝子はまた、変形性関節症組織およびヒト
胎児組織において発現される。
【００２８】 本発明は、図１Ａ〜Ｃ（配列番号２９）に示されるアミノ酸配列（これは、ク
ローン化したｃＤＮＡを配列決定することにより決定した）を有するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。図１Ａ
〜Ｃ（配列番号１１）に示されるヌクレオチド配列をクローン化したｃＤＮＡ（
これは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
に１９９８年１１月１７日に寄託され、受託番号２０３４８４を得た）を配列決
定することによって得た。この寄託された遺伝子は、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ切断部位を使用してｐＳｐｏｒｔプラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に挿入される。
【００２９】 本発明は、さらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメン
トに関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１１に示さ
れるヌクレオチド配列を有する単離されたＤＮＡ分子のフラグメントによって、
本明細書中で記載されるような診断プローブおよびプライマーとして有用である
、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらに
より好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおより好ましくは少なくとも約
４０ｎｔ長のＤＮＡフラグメントが意図される。当然のことながら、より大きな
フラグメント５０〜１５００ｎｔ長もまた、本発明に従って有用であり、全てで
はないにしても、ほとんどの寄託されたｃＮＤＡのヌクレオチド配列または配列
番号１１に示されるようなヌクレオチド配列に対応したフラグメントもまた有用
である。例えば、少なくとも約２０ｎｔ長のフラグメントによって、寄託された
ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列または配列番号１１に示されるヌクレオチド配
列由来の２０以上の連続する塩基を含むフラグメントが意図される。この文脈に
おいて「約」は、特に記載されたサイズ、いずれかの末端もしくは両方の末端に
おいて、これよりいくつか（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大
きいかまたは小さなサイズを含む。本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代
表例としては、例えば、以下を含むか、あるいは以下からなるフラグメントが挙
げられる：配列番号１１の１〜約５０、約５１〜約１００、約１０１〜約１５０
、約１５１〜約２００、約２０１〜約２５０、約２５１〜約３００、約３０１〜
約３５０、約３５１〜約４００、約４０１〜約４５０、約４５１〜約５００、約
５０１〜約５５０、約５５１〜約５７０の配列、またはそれらの相補鎖、あるい
は寄託された遺伝子に含まれるｃＤＮＡ。この文脈において、「約」は、特に記
載された範囲、いずれかの末端もしくは両方の末端において、これよりいくつか
（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな範囲を
含む。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、対応するタン
パク質の機能的特性をコードする。
【００３０】 この点において、本発明の好ましい実施形態は、α−へリックスおよびα−へ
リックス形成領域（「α−領域」）、β−シートおよびβ−シート形成領域（「
β−領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン−領域」）、コイルおよ
びコイル形成領域（「コイル−領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性
領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、および高い抗原性指標領域
を含むフラグメントを含む。上記のように図３および／または表Ｉに示されるタ
ンパク質の構造的または機能的特性を表すデータは、デフォルトパラメーターに
セットされたＤＮＡ*ＳＴＡＲの種々のモジュールおよびアルゴリズムを用いて
生成された。好ましい実施形態において、表Ｉの欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、
およびＸＩＶに提示されるデータは、抗原性についての可能性の高い程度を示す
タンパク質の領域を決定するために使用され得る。高い抗原性の領域は、抗原認
識が免疫応答の開始のプロセスにおいて存在し得る環境中でポリペプチドの表面
に曝露されるようであるポリペプチドの領域を提示する値を選択することによっ
て、欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、および／またはＸＩＶにおいて提示されるデ
ータから決定される。
【００３１】 これらの点において特定の好ましい領域は図３に示されるが、この領域は、表
Ｉに示されるように、図３に提示されるデータの表の表示を用いることによって
提示および同定され得る。図３を生成するために使用されるＤＮＡ*ＳＴＡＲコ
ンピューターアルゴリズム（元々のデフォルトパラメーターでセットされる）は
、表の形式において図３でデータを提示するために使用された（表Ｉを参照のこ
と）。図３におけるデータの表の形式は、好ましい領域の特定の境界を容易に決
定するために使用される。図３および表Ｉに示される上記の好ましい領域は、図
１Ａ−Ｃ（配列番号：２９）に示されるアミノ酸配列の分析によって同定される
上記のタイプの領域を含むが、これらに限定されない。図３および表Ｉに示され
るように、このような好ましい領域としては、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎの
α−領域、β−領域、ターン−領域、およびコイル−領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍ
ａｎのα−領域、β−領域、およびターン−領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌ
ｅの親水性領域およびＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの
α−およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可撓性領域、Ｊ
ａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの高い抗原性指数領域、およびＥｍｉｎｉの表面形成領
域が挙げられるがこれらに限定されない。タンパク質のＮ末端からの１つ以上の
アミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生
じるとしても、他の機能的活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力など
）はなお保持され得る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または成熟な形態を
認識する抗体を誘導するおよび／またはその抗体に結合する短縮化されたムテイ
ン能力は一般に、完全なポリペプチドあるいは成熟ポリペプチドの残基の大部分
より少ない残基が、Ｎ末端から除去される場合には、保持される。完全なポリペ
プチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保
持するかどうかは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野におい
て公知の別の方法によって、容易に決定され得る。大多数の欠失したＮ末端アミ
ノ酸残基を有するムテインは、いくらかの生物学的または免疫原性活性を保持し
得るようである。実際に、６個ほどのアミノ酸残基から構成されるペプチドは、
しばしば免疫応答を惹起し得る。
【００３２】 従って、本発明はさらに、図１Ａ〜Ｃに示されるアミノ酸配列のアミノ末端か
ら５２４位のアラニン残基までに、１つ以上の残基が欠失したポリペプチド、お
よびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に本
発明は、図１Ａ〜Ｃの残基ｎ１〜５２４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提
供し、ここでｎ１は１〜５２４の範囲の整数であり、図１Ａ〜Ｃ（これは、配列
番号２９として示される配列と同じである）のアミノ酸残基の位置に対応する。
配列番号２９として示される本発明のポリペプチドのＮ−末端欠失には、以下の
残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる：
【００３３】
【化２】
【００３４】
【化３】
【００３５】
【化４】
【００３６】
【化５】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
よって包含される。
【００３７】 また、上記のように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が
、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じるとしても、他
の機能的活性（例えば、生物学的活性（例えば、マイトジェン活性を誘発（ｉｌ
ｌｉｃｉｔ）する能力、正常の細胞または悪性の細胞の分化を誘導する能力、Ｅ
ＧＦレセプターに結合する能力など）はなお保持され得る。例えば、ポリペプチ
ドの完全な形態または成熟な形態を認識する抗体を誘導するおよび／またはその
抗体に結合する能力は一般に、完全なポリペプチドあるいは成熟ポリペプチドの
残基の大部分より少ない残基がＣ末端から除去される場合には、保持される。完
全なポリペプチドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学
的活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該
分野において別の公知の方法によって、容易に決定され得る。大多数の欠失した
Ｃ末端アミノ酸残基を有するムテインが、いくらかの生物学的活性または免疫原
性活性を保持し得るようである。実際に、６個ほどのアミノ酸残基から構成され
るペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。
【００３８】 従って、本発明はさらに、図１Ａ〜Ｃに示されるポリペプチドのアミノ酸配列
のカルボキシ末端から７位のグルタミン残基までに、１つ以上の残基が欠失した
ポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
提供する。特に本発明は、図１Ａ〜Ｃの残基１〜ｍ１のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドを提供し、ここでｍ１は７〜５２８の整数であり、図１Ａ〜Ｃのアミノ
酸残基の位置に対応する。さらに、本発明は、配列番号２９として示される本発
明のポリペプチドのＣ末端欠失のアミノ酸配列を含むか、あるいは代替的にその
アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
それには、以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる：
【００３９】
【化６】
【００４０】
【化７】
【００４１】
【化８】
【００４２】
【化９】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
包含される。
【００４３】 従って、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル
中に存在する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに発生障害および変
性障害；変形性関節症、ならびに肺癌を含むがそれらに限定されない疾患および
状態の診断のための試薬として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれら
のポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学
的プローブを提供する際に有用である。上記の組織または細胞、特に発生中の組
織、軟骨および骨の多くの障害に関連して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち
、この障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の発現レベル）に対して
有意により高いまたはより低いレベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を
有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型（例えば、骨組織、肺組織
、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑
液および髄液）、または別の組織もしくは細胞サンプルの中で、慣用的に検出さ
れる。
【００４４】 本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号２９において残基：
【００４５】
【化１０】 として示される免疫原性エピトープを含む。このポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドもまた、提供される。
【００４６】 多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号１１に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であった
かもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の
範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、
好ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（
ここで、ａは配列番号１１の１〜２５９５の任意の整数であり、ｂは１５〜２６
０９の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号１１に示されるヌクレオ
チド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以
上のポリヌクレオチドが除外される。
【００４７】 （遺伝子番号２によってコードされるタンパク質の特徴） この遺伝子の翻訳産物（時に、ＴＩＤＥ（ＥＧＦ相同性を有する１０のインテ
グリンドメイン（Ｔｅｎ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｄｏｍａｉｎｓ ｗｉｔｈ ＥＧ
Ｆ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）について）として本明細書中で呼ばれる）は、インテグ
リンと配列相同性を共有し、これは、多くの細胞型の接着機能を媒介するダイマ
ーａｂ細胞表面糖タンパク質のスーパーファミリーであって、細胞が、互いおよ
び細胞外マトリクスと相互作用するのを可能にする（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５６，
１６９〜１７８（１９９９）；この文献に含まれるすべての情報および参考文献
は、本明細書によって、本明細書中で参考として援用される）。８のヒトインテ
グリンｂサブユニットが現在のところ記載されており、そして１２の公知のもの
と組み合わせて、サブユニットは、隣接する細胞上のカウンターレセプターに対
する細胞接着およびＥＣＭタンパク質に対する細胞接着を媒介するヘテロダイマ
ー細胞表面レセプターの大きなファミリーを形成する（Ｈｙｎｅｓ，１９９２に
よって概説される）。インテグリン−リガンド相互作用は、基本的な生物学的プ
ロセス（例えば、細胞移動および運動性）およびリンパ球管外遊出に必須である
。
【００４８】 別の実施形態において、推定シグナルペプチドの上流にオープンリーディング
フレームのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、本発明によって意図される。特
に、本発明のポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む：
【００４９】
【化１１】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【００５０】 本発明において好ましいドメインとして、ＥＧＦ様ドメインシグネチャー１お
よび２ドメインが含まれる。これらは、ＰｒｏＳｉｔｅ分析ツール（Ｓｗｉｓｓ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）を用いて同定さ
れた。上皮増殖因子（ＥＧＦ）の配列において見出される約３０〜４０のアミノ
酸残基長の配列は、大多数の他のほとんどの動物タンパク質において、多かれ少
なかれ保存された形態で存在することが示された［１〜６］。関連しないタンパ
ク質のようであるものにおけるＥＧＦドメインの機能的重要性は未だに明らかで
はない。しかし、共通の特徴は、これらの反復が、膜結合タンパク質の細胞外ド
メインにおいて、または分泌されることが公知のタンパク質（例外：プロスタグ
ランジンＧ／Ｈシンターゼ）において見出される。ＥＧＦドメインは、ジスルフ
ィド結合に関与することが（ＥＧＦにおいて）示されている６システイン残基を
含む。主な構造は、２つの鎖（ｔｗｏ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）のβシート、続いて
Ｃ末端の短い２つの鎖のシートへのループである。保存されたシステイン間のサ
ブドメインは、以下のＥＧＦ様ドメインの模式図において示されるように、長さ
が強く変化する：
【００５１】
【化１２】 「Ｃ」：ジスルフィド結合に関与する保存されたシステイン。「Ｇ」：頻繁に保
存されるグリシン。「ａ」：頻繁に保存される芳香族アミノ酸。「*」：両方の
パターンの位置。「ｘ」：任意の残基。５番目のシステインと６番目のシステイ
ンの間の領域は、少なくとも１つがほとんどのＥＧＦ様ドメインにおいて存在す
る２つの保存されたグリシンを含む。コンセンサスパターンは、以下のとおりで
ある：Ｃ−ｘ−Ｃ−ｘ（５）−Ｇ−ｘ（２）−Ｃ［３つのＣは、ジスルフィド結
合に関与する］。
【００５２】 本発明の好ましいポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む：
【００５３】
【化１３】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【００５４】 この遺伝子について表Ｉに参照される配列のＥＧＦ様ドメインシグネチャー１
および２ドメイン、ならびにこの参照された配列の少なくとも５、１０、１５、
２０、２５、３０、５０または７５のさらなる連続するアミノ酸残基を含むポリ
ペプチドがさらに好ましい。さらなる連続するアミノ酸残基は、ＥＧＦ様ドメイ
ンシグネチャー１および２ドメインに対するＮ末端またはＣ末端である。
【００５５】 あるいは、さらなる連続するアミノ酸残基は、ＥＧＦ様ドメインシグネチャー
１および２ドメインに対するＮ末端およびＣ末端の両方であり、ここでＮ末端お
よびＣ末端の連続するアミノ酸残基の総数は、指定された数に等しい。上記の好
ましいポリペプチドドメインは、ＥＧＦ様ドメイン１および２含有タンパク質に
特異的なシグネチャーに特徴的である。配列類似性に基づいて、この遺伝子の翻
訳産物は、ＥＧＦ様含有タンパク質と少なくともいくつかの生物学的活性を共有
することが予測される。そのような活性は、当該分野において公知であり、その
いくつかは、本明細書中の他の箇所に記載される。
【００５６】 本発明において好ましいドメインとして、インテグリンβ鎖システインリッチ
ドメインが含まれる。これは、ＰｒｏＳｉｔｅ分析ツール（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）を用いて同定された。イ
ンテグリン［７，８］は、細胞対細胞の接着ならびに細胞対マトリクスの接着を
媒介する細胞表面レセプターの大きなファミリーである。いくつかのインテグリ
ンは、それらの細胞外マトリクスタンパク質リガンドにおいてＲ−Ｇ−Ｄ配列を
認識する。構造的に、インテグリンは、α鎖およびβ鎖のダイマーからなる。各
サブユニットは、大きなＮ末端細胞外ドメイン、続く膜貫通ドメインおよび短い
Ｃ末端細胞質領域を有する。いくつかのレセプターは、共通のβ鎖を共有するが
、異なるα鎖を有する。すべてのインテグリンβ鎖は、それらの細胞外ドメイン
のＣ末端の先端における４０のアミノ酸領域の４つの反復を含む。各反復は、８
つのシステインを含む。コンセンサスパターンは、以下のとおりである：Ｃ−ｘ
−［ＧＮＱ］−ｘ（１，３）−Ｇ−ｘ−Ｃ−ｘ−Ｃ−ｘ（２）−Ｃ−ｘ−Ｃ［５
つのＣは、おそらくジスルフィド結合に関与する］。
【００５７】 本発明の好ましいポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む：
【００５８】
【化１４】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【００５９】 この遺伝子について表ＸＩＩＩに参照される配列のインテグリンβ鎖システイ
ンリッチドメイン、ならびにこの参照された配列の少なくとも５、１０、１５、
２０、２５、３０、５０または７５のさらなる連続するアミノ酸残基を含むポリ
ペプチドがさらに好ましい。さらなる連続するアミノ酸残基は、インテグリンβ
鎖システインリッチドメインに対するＮ末端またはＣ末端である。
【００６０】 あるいは、さらなる連続するアミノ酸残基は、インテグリンβ鎖システインリ
ッチドメインに対するＮ末端およびＣ末端の両方であり、ここでＮ末端およびＣ
末端の連続するアミノ酸残基の総数は、指定された数に等しい。上記の好ましい
ポリペプチドドメインは、インテグリンタンパク質に特異的なシグネチャーに特
徴的である。配列類似性に基づいて、この遺伝子の翻訳産物は、インテグリンタ
ンパク質、および特にインテグリンβ鎖システインリッチドメインを有するイン
テグリンタンパク質と少なくともいくつかの生物学的活性を共有することが予測
される。そのような活性は、当該分野において公知であり、そのいくつかは、本
明細書中の他の箇所に記載される。以下の刊行物が上記で参照され、そして本明
細書によって本明細書中において参考として援用される：
【００６１】
【化１５】 本発明のポリペプチドは、推定によってインテグリンファミリーのメンバーと
して同定され、そしてＥＧＦ相同性を有する１０のインテグリンドメイン（「Ｔ
ＩＤＥ」）と呼ばれた。この同定は、ヒトインテグリンβ−８サブユニット（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ登録番号ｇｉ｜１８４５２１を参照のこと）に対するアミノ酸配列
相同性の結果としてなされた。
【００６２】 図４Ａ〜Ｃは、ＴＩＤＥのヌクレオチド配列（配列番号１２）および推定アミ
ノ酸配列（配列番号３０）を示す。約１〜約２３の推定アミノ酸は、推定シグナ
ルペプチド（配列番号３０における約１〜約２３のアミノ酸残基）を構成し、そ
して下線を付したアミノ酸領域によって示され；約１０８〜約１３６、約１９５
〜約２２３、約２９１〜約３１９、約３７９〜約４０７および／または約４６５
〜約４９３のアミノ酸は、推定ＥＧＦ様ドメインシグネチャー１および２ドメイ
ン（配列番号３０における約１０８〜約１３６、約１９５〜約２２３、約２９１
〜約３１９、約３７９〜約４０７および／または約４６５〜約４９３のアミノ酸
）を構成し、そして二重下線を付したアミノ酸によって示され；約５５〜約８９
、約９７〜約１２９、約１４２〜約１７５、約１８６〜約２１６、約２２８〜約
２６１、約２８１〜約３１４、約３２７〜約３５９、約３６８〜約３９８、約４
１７〜約４４８および／または約４５５〜約４８７のアミノ酸は、推定インテグ
リンβ鎖システインリッチドメイン（配列番号３０における約５５〜約８９、約
９７〜約１２９、約１４２〜約１７５、約１８６〜約２１６、約２２８〜約２６
１、約２８１〜約３１４、約３２７〜約３５９、約３６８〜約３９８、約４１７
〜約４４８および／または約４５５〜約４８７のアミノ酸）を構成し、そして影
を付したアミノ酸によって示される。
【００６３】 図５は、ＥＧＦ相同性を有する１０のインテグリンドメイン（ＴＩＤＥ）タン
パク質（配列番号３０）のアミノ酸配列と、ヒトインテグリンβ−８サブユニッ
ト（配列番号６７）との間に類似性領域を示す。
【００６４】 図６は、ＥＧＦ相同性を有する１０のインテグリンドメイン（ＴＩＤＥ）アミ
ノ酸配列の分析を示す。α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；親水性
および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数および表面確率を示す。
【００６５】 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト骨芽細胞、滑膜
低酸素組織（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｈｙｐｏｘｉａ ｔｉｓｓｕｅ）、骨芽細胞お
よび破骨細胞、骨髄間質細胞、臍静脈、平滑筋、胎盤ならびに胎児肺から得られ
る。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト骨芽細胞ＩＩ ｃＤＮＡライブラリーに
おいて発見された。その翻訳産物は、インテグリンファミリーメンバーの特徴的
なインテグリンβ鎖システインリッチドメインに対して相同性を有する。ポリヌ
クレオチドは、４９４アミノ酸のＴＩＤＥポリペプチドをコードするオープンリ
ーディングフレームを含む。ＴＩＤＥは、ヒトインテグリンβ８−サブユニット
に対してアミノ酸レベルで高程度の相同性を示す（図５に示されるとおり）。
【００６６】 本発明は、図４Ａ〜Ｃ（配列番号３０）に示されるアミノ酸配列を有するＴＩ
ＤＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提
供する。図４Ａ〜Ｃ（配列番号１２）において示されるヌクレオチド配列は、ク
ローニングされたｃＤＮＡ（ＨＯＨＣＨ５５）（これは、アメリカンタイプカル
チャーコレクションに１１月１７日に寄託され、そして受託番号２０３４８４を
付与された）を配列決定することによって得られた。本発明はさらに、本明細書
中に記載される単離された核酸分子のフラグメントに関する。寄託されたｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列または配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を有する
単離されたＤＮＡ分子のフラグメントによって、本明細書中で議論されるような
診断用プローブおよびプライマーとして有用な、少なくとも約１５ｎｔ長、そし
てより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ長、なおより好ましくは少なくとも約３
０ｎｔ長、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔ長のＤＮＡフラグ
メントが意図される。当然のことながら、５０〜１５００ｎｔ長のより大きなフ
ラグメントもまた、本発明に従って有用であり、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列または配列番号１２に示されるヌクレオチド配列のすべてではないとし
てもほとんどに対応するフラグメントもまた同様に有用である。例えば、少なく
とも２０ｎｔ長のフラグメントによって、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配
列または配列番号１２に示されるヌクレオチド配列からの連続する２０以上の塩
基を含むフラグメントが意図される。この文脈において、「約」は、特に記載さ
れるサイズ、いずれかの末端または両方の末端にて、いくつか（５、４、３、２
または１）のヌクレオチドでより大きいまたはより小さいサイズを含む。本発明
のＴＩＤＥポリヌクレオチドフラグメントの代表的な例は、例えば、配列番号１
２のほぼヌクレオチド１〜約５０、約５１〜約１００、約１０１〜約１５０、約
１５１〜約２００、約２０１〜約２５０、約２５１〜約３００、約３０１〜約３
５０、約３５１〜約４００、約４０１〜約４５０、約４５１〜約５００、約５０
１〜約５５０、約５５１〜約６００、約６０１〜約６５０、約６５１〜約７００
、約７０１〜約７５０、約７５１〜約８００、約８０１〜約８５０、約８５１〜
約９００、約９０１〜約９５０、約９５１〜約１０００、約１００１〜約１０５
０、約１０５１〜約１１００、約１１０１〜約１１５０、約１１５１〜約１２０
０、約１２０１〜約１２５０、約１２５１〜約１３００、約１３０１〜約１３５
０、約１３５１〜約１４００、約１４０１〜約１４５０、約１４５１〜約１５０
０、約１５０１〜約１５５０、約１５５１〜約１６００、約１６０１〜約１６５
０、約１６５１〜約１７００、約１７０１〜約１７５０、約１７５１〜約１８０
０、約１８０１〜約１８５０、約１８５１〜約１９００、約１９０１〜約１９５
０、約１９５１〜約２０００、約２００１〜約２０５０、約２０５１〜約２１０
０、約２１０１〜約２１５０、約２１５１〜約２２００、約２２０１〜約２２５
０、約２２５１〜約２３００、約２３０１〜約２３５０、約２３５１〜約２４０
０、約２４０１〜約２４５０、約２４５１〜約２４９９、約２８９〜約１７０５
および／または約２２１〜約１７０５の配列、またはそれに対する相補鎖、また
は寄託された遺伝子に含まれるｃＤＮＡを含むまたはからなるフラグメントが挙
げられる。この文脈において、「約」は、特に列挙される範囲、いずれかの末端
または両方の末端にて、いくつか（５、４、３、２または１）のヌクレオチドで
より大きいまたはより小さい範囲を含む。
【００６７】 本発明の好ましい核酸フラグメントとしては、以下の群から選択されるメンバ
ーをコードする核酸分子を含む：成熟ＴＩＤＥタンパク質（図４Ａ〜Ｃにおける
約２２１〜約１７０５のアミノ酸残基（配列番号３０における約２２１〜約１７
０５のアミノ酸））を含むか、あるいはそれからなるポリペプチド。これらのド
メインの位置は、コンピューター解析によって推定されたので、当業者は、これ
らのドメインを構成するアミノ酸残基が、各ドメインを規定するために使用され
る基準に依存して、わずかに（例えば、約１〜１５のアミノ酸残基で）変化し得
ることを理解する。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、
ＴＩＤＥの機能的特性をコードする。
【００６８】 この点における本発明の好ましい実施形態は、ＴＩＤＥのα−へリックスおよ
びα−へリックス形成領域（「α領域」）、β−シートおよびβ−シート形成領
域（「β領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルお
よびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性
領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、および高い抗原性指数領域
を含むフラグメントを含む。図６および／または上記の表ＩＩにおいて示される
ＴＩＤＥの構造的特性または機能的特性を示すデータは、デフォルトパラメータ
ーにセットされたＤＮＡ*ＳＴＡＲの種々のモジュールおよびアルゴリズムを使
用して得られた。好ましい実施形態において、表ＩＩのＶＩＩＩ欄、ＩＸ欄、Ｘ
ＩＩＩ欄およびＸＩＶ欄において示されるデータを用いて、抗原性について高い
程度の可能性を示すＴＩＤＥの領域を決定し得る。高い抗原性の領域は、抗原認
識が、免疫応答の開始のプロセスにおいて生じ得る環境下で、ポリペプチドの表
面上に曝露されるようであるポリペプチドの領域を示す値を選択することによっ
て、ＶＩＩＩ欄、ＩＸ欄、ＸＩＩＩ欄および／またはＸＩＶ欄に示されるデータ
から決定される。
【００６９】 これらの点において特定の好ましい領域は図６に示されるが、この領域は、表
ＩＩに示されるように、図６に提示されるデータの表の表示を用いることによっ
て提示および同定され得る。図６を生成するために使用されるＤＮＡ*ＳＴＡＲ
コンピューターアルゴリズム（もともとのデフォルトパラメーターでセットされ
る）は、表の形式において図６でデータを提示するために使用された（表ＩＩを
参照のこと）。図６におけるデータの表の形式は、好ましい領域の特定の境界を
容易に決定するために使用される。図６、および表ＩＩに示される上記の好まし
い領域は、図４Ａ〜Ｃに示されるアミノ酸配列の分析によって同定される上記の
タイプの領域を含むが、これらに限定されない。図６および表ＩＩにおいて示さ
れるように、このような好ましい領域としては、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ
のα−領域、β−領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａ
ｎのα−領域、β−領域、およびターン領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの
親水性領域およびＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓの疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのα
−およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可撓性領域、Ｊａ
ｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの高度な抗原性指標の領域、ならびにＥｍｉｎｉの表面形
成領域が挙げられる。タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、
タンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じるとしても、他の
機能的活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力など）は、なお保持され
得る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘導
するおよび／または抗体に結合する、短縮型ＴＩＤＥムテインの能力は、完全な
ポリペプチド、または成熟ポリペプチドの大部分より少ない残基が、Ｎ末端から
除去される場合には、一般的に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を
欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持するかどうかは、本
明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野において公知の別の方法によ
って容易に決定され得る。多数の欠失したＮ末端アミノ酸残基を有するＴＩＤＥ
ムテインは、いくつかの生物学的活性または免疫原性活性をおそらく保持し得る
。実際に、６つと同じくらい少ないＴＩＤＥアミノ酸残基から構成されるペプチ
ドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。
【００７０】 従って、本発明はさらに、図４Ａ〜Ｃに示されるＴＩＤＥアミノ酸配列のアミ
ノ末端から４８９位のロイシン残基までの、１つ以上の欠失した残基を有するポ
リペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提
供する。特に本発明は、図４Ａ〜Ｃのｎ１〜４９４残基のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドを提供し、ここでｎ１は２〜４８９の整数であり、これは、図４Ａ〜
Ｃ（これは、配列番号３０として示される配列と同一である）におけるアミノ酸
残基の位置に相当する。別の実施形態において、ＴＩＤＥポリペプチドのＮ末端
欠失は、一般式ｎ２〜４９４（ここで、ｎ２は２〜４８９までの数である）によ
って記載され得、これは、図４Ａ〜Ｃにおいて同定されるアミノ酸の位置に相当
する。配列番号３０として示される本発明のＴＩＤＥポリペプチドのＮ末端欠失
は、以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：配列番号３０として
示される本発明のＴＩＤＥポリペプチドのＮ末端欠失は、以下の残基のアミノ酸
配列を含む、ポリペプチドを含む：
【００７１】
【化１６】
【００７２】
【化１７】
【００７３】
【化１８】
【００７４】
【化１９】
【００７５】
【化２０】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
含まれる。
【００７６】 また上記に記載されるように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸
の欠失が、このタンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じる
としても、他の機能的活性は、なお保持され得る。例えば、ポリペプチドの完全
な形態または成熟形態を認識する抗体を誘導するおよび／またはこの抗体に結合
する、短縮型ＴＩＤＥムテインの能力は、完全なポリペプチド、または成熟ポリ
ペプチドの大部分より少ない残基が、Ｃ末端から除去される場合には、一般的に
保持される。完全なポリペプチドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、こ
のような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方
法、および当該分野において公知の他の方法によって容易に決定され得る。多数
の欠失したＣ末端アミノ酸残基を有するＴＩＤＥムテインは、いくつかの生物学
的活性または免疫原性活性を保持し得るようである。実際に、６つと同じくらい
少ないＴＩＤＥアミノ酸残基から構成されるペプチドは、しばしば免疫応答を惹
起し得る。
【００７７】 従って、本発明はさらに、図４Ａ〜Ｃに示されるＴＩＤＥポリペプチドのアミ
ノ酸配列のカルボキシ末端から６位でのフェニルアラニン残基まで欠失させた１
つ以上の残基を有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、図１の残基１〜ｍ１のアミノ
酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｍ１は、６〜４９４の整数であり
、これは、図４Ａ〜Ｃのアミノ酸残基の位置に相当する。さらに、本発明は、以
下を含むか、または以下からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
提供し、配列番号３０として示される本発明のＴＩＤＥポリペプチドのＣ末端欠
失のアミノ酸配列は、以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：
【００７８】
【化２１】
【００７９】
【化２２】
【００８０】
【化２３】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
よって包含される。
【００８１】 さらに、本発明は、配列番号１２の広範な部分に関連するヌクレオチド配列を
有する核酸分子を提供し、これは、以下関連のｃＤＮＡ遺伝子から決定された：
ＨＬＨＦＶ３４Ｒ（配列番号６８）、ＨＳＲＤＡ８５Ｒ（配列番号６９）、ＨＳ
ＲＡＺ６２Ｒ（配列番号７０）、ＨＳＲＤＡ１７Ｒ（配列番号７１）、およびＨ
ＳＬＥＣ４５Ｒ（配列番号７２）。
【００８２】 ヒトインテグリンβ−８サブユニットに対する配列類似性に基づいて、この遺
伝子の翻訳産物は、インテグリンタンパク質（そして詳細には、ヒトインテグリ
ンβ−８サブユニット）と、少なくとも幾分かの生物学的活性を共有すると予期
される。このような活性は当該分野において公知であり、そのうちのいくつかを
本明細書中の他の箇所に記載する。
【００８３】 詳細には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはまた、正常細胞お
よび悪性細胞の分化を調節するため、癌および新生物細胞の増殖および／または
分化を調節するため、ならびに免疫応答を調節するために有用である。本発明の
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、造血疾患および／または造血障害、な
らびに免疫疾患および／または免疫障害の診断マーカーを表し得る。全長タンパ
ク質は、インテグリンファミリーに対する相同性に基づいて、分泌タンパク質で
あるはずである。従って、これは血清、尿、または糞便中に分泌される。従って
、このレベルは、患者サンプルからアッセイ可能である。特定の発現レベルが免
疫障害の存在を反映すると考えると、このタンパク質は、早期検出のための簡便
な診断を提供する。さらに、この遺伝子産物の発現はまた、免疫疾患の進行と関
連付けられ得、従ってこれ自体、癌の処置の治療または治療標的を実際に表し得
る。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒトの癌および細胞性ト
ランスフォーメーション（特に、免疫系および造血系の癌および細胞性トランス
フォーメーション）の病因において重要な役割を果たし得る。本発明のポリヌク
レオチドおよびポリペプチドはまた、細胞および組織細胞型の増殖および分化に
対するその潜在的な効果に基づいて、発生異常の病因に関与し得る。このポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの潜在的な増殖活性および分化活性に起因して、
本発明は、炎症状態（例えば、炎症性腸症候群、憩室炎など）を処置するために
組織再生を誘導する際の治療剤として有用である。さらに、本発明は、特に腺癌
細胞および他の癌で迅速に増殖する細胞および組織細胞型において存在し得るよ
うな、異常なポリペプチドに対する免疫応答を調節する際に有用である。
【００８４】 あるいは、増殖している細胞により特徴付けられる細胞供給源内での発現は、
このタンパク質が細胞分裂の調節において役割を果たし得ることを示し、そして
発生疾患および発生障害（癌、および他の増殖性状態を含む）の診断、処置、お
よび／または予防において有用性を示し得ることを示す。代表的な用途は、以下
の「過剰増殖性障害」および「再生」の節、ならびに本明細書中の他の箇所に記
載される。簡潔には、発生組織は、パターン形成における細胞分化および／また
はアポトーシスに関与する決定に依存する。
【００８５】 アポトーシスの調節不全は、いくつかの癌の発生において生じるような細胞死
の不適切な抑制を生じ得るか、または、後天性免疫不全および特定の神経変性障
害（例えば、棘筋萎縮症（ＳＭＡ））において生じると考えられるような、細胞
死の程度の制御失敗を生じ得る。
【００８６】 あるいは、この遺伝子産物は、初期胚形成に付随する細胞増殖のパターンに関
与する。従って、組織（特に、成体組織）におけるこの遺伝子産物の異常な発現
は、種々の癌において見出されるような異常な細胞増殖のパターンと相関し得る
。増殖および分化における潜在的な役割が理由で、この遺伝子産物は、組織再生
および癌の処置について、成体における適用を有し得る。これはまた、細胞およ
び組織型の特異化を制御するためのモルフォゲンとして作用し得る。従って、本
発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、他の型の変性状態に加えて、上
記の障害および状態を処置、検出、および／または予防する際に有用である。従
って、このタンパク質は、アポトーシスまたは組織分化を調節し得、そして変性
性または増殖性の状態および疾患の検出、処置、および／または予防において有
用である。このタンパク質は、増殖性および癌性の細胞および組織において存在
し得るような、異常なポリペプチドに対する免疫応答を調節する際に有用である
。このタンパク質はまた、細胞の成長および増殖の調節への新たな洞察を得るた
めに使用され得る。さらに、このタンパク質はまた、栄養補給物としてのその用
途に加えて、生物学的活性を測定するため、抗体を惹起するため、組織マーカー
として、同属リガンドまたはレセプターを単離するため、それらの相互作用を調
節する薬剤を同定するために用いられ得る。タンパク質ならびにこのタンパク質
に対する抗体は、上記に列挙した組織の腫瘍マーカーとしておよび／または免疫
治療の標的として有用性を示し得る。
【００８７】 この遺伝子の翻訳産物（時として、本明細書中でＴＩＤＥ（ＥＧＦ相同性を伴
う１０個のインテグリンドメイン（Ｔｅｎ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｄｏｍａｉｎｓ
ｗｉｔｈ ＥＧＦ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）と言及される）は、インテグリンと配
列相同性を共有する。インテグリンは、多くの細胞型の接着機能を媒介し、細胞
が互いとおよび細胞外マトリクスと相互作用することを可能にする、ダイマー性
ａｂ細胞表面糖タンパク質のスーパーファミリーである（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５
６、１６９−１７８（１９９９）を参照のこと；この刊行物中に含まれるすべて
の情報および参考文献を、ここに本明細書中で参考として援用する）。
【００８８】 開示されたｃＤＮＡをコードする遺伝子は、第１３染色体上の１３ｑ３３遺伝
座に存在すると考えられる。従って、本発明に関連するポリヌクレオチドは、概
して第１３染色体、そして特に１３ｑ３３遺伝子座についての連鎖解析における
マーカーとして有用である。
【００８９】 この遺伝子は主に、滑膜低酸素症組織、骨芽細胞、および破骨細胞、骨髄間質
細胞において発現され、そしてより少ない程度で臍静脈、平滑筋、胎盤、および
胎児肺のｃＤＮＡライブラリーにおいて発現される。従って、本発明のポリヌク
レオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在する組織（１つまた
は複数）または細胞型（１つまたは複数）の示差的同定のため、ならびに骨およ
び結合組織の障害、免疫疾患および／または免疫障害ならびに造血疾患および／
または造血障害、脈管障害、および細胞表面相互作用における異常に関与する他
の障害を含むが、これらに限定されない疾患および状態の診断のための試薬とし
て有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体
は、組織（１つまたは複数）または細胞型（１つまたは複数）の示差的同定のた
めの免疫学的プローブを提供する際に有用である。上記組織または細胞、特に結
合組織および骨格系の多くの障害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち
、障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の発現レベル）に対して有意
に高いまたは低いレベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する個体か
ら採取された特定の組織もしくは細胞型（例えば、軟骨組織、骨組織、脈管組織
、低酸素症組織、ならびに癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リン
パ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくは細胞サンプル
の中で、慣用的に検出される。
【００９０】 本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号３０において以下の残基：
【００９１】
【化２４】 として示される免疫原性エピトープを含む。このポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドもまた提供される。
【００９２】 この組織分布およびヒトインテグリンβ−８サブユニットに対する相同性は、
この遺伝子に対応するポリヌクレオチドおよびポリペプチドが、種々の免疫系障
害の診断および処置に有用であることを示す。代表的な用途は、以下の「免疫活
性」および「感染性疾患」の節、実施例１１、１３、１４、１６、１８、１９、
２０、および２７、ならびに本明細書中の他の箇所において記載される。
【００９３】 簡潔には、この発現は、造血細胞系列（血液幹細胞を含む）の増殖；生存；分
化；および／または活性化を調節する際の役割を示す。サイトカイン産生、抗原
提示、または他のプロセスの調節における関与は、癌の処置（例えば、免疫応答
をブーストすることによる）に対する有用性を示す。リンパ起源の細胞における
発現は、この天然の遺伝子産物が、免疫機能に関与することを示す。従って、こ
れはまた、関節炎、喘息、免疫不全疾患（例えば、ＡＩＤＳ）、白血病、慢性関
節リウマチ、肉芽腫症、炎症性腸疾患、敗血症、挫瘡、好中球減少症、好中球増
加症、乾癬、過敏症（例えば、Ｔ細胞媒介細胞傷害）、移植器官および組織への
免疫反応（例えば、対移植片性宿主病および対宿主性移植片病）、または自己免
疫性障害（例えば、自己免疫不妊症）、水晶体組織傷害、脱髄、全身性エリテマ
トーデス、薬物誘引溶血性貧血、慢性関節リウマチ、シェーグレン病、および強
皮症を含む免疫学的障害のための薬剤として有用である。さらに、このタンパク
質は、他の血球の分化もしくは挙動に影響する分泌因子、または損傷部位に造血
細胞を補充する分泌因子を表し得る。従って、この遺伝子産物は、種々の血液系
列の幹細胞および方向付けられた前駆体の拡大において、ならびに種々の細胞型
の分化および／または増殖において有用であると考えられる。このタンパク質の
組織分布に基づいて、このタンパク質に対するアンタゴニストは、このタンパク
質の活性をブロックする際に有用である。従って、この遺伝子の翻訳産物の一部
分に特異的に結合する抗体が好ましい。
【００９４】 このタンパク質の発現が生じる腫瘍を検出するためのキットもまた提供される
。このようなキットは、１つの実施形態において、固体支持体に結合されたこの
遺伝子の翻訳産物に特異的な抗体を含む。個体におけるこれらの腫瘍を検出する
方法もまた提供され、この方法は、この遺伝子の翻訳産物に特異的な抗体を個体
由来の体液（好ましくは、血清）と接触させる工程、およびこの抗体がこの体液
に見出される抗原に結合するか否かを確認する工程を包含する。好ましくは、抗
体は固体支持体に結合され、そして体液は血清である。上記の実施形態ならびに
他の処置および診断試験（キットおよび方法）は、本明細書中の他の箇所により
詳細に記載される。
【００９５】 さらに、このタンパク質はまた、その栄養補給剤としての用途に加えて、生物
学的活性を決定するため、抗体を惹起するため、組織マーカーとして、同属のリ
ガンドまたはレセプターを単離するため、それらの相互作用を調節する薬剤を同
定するために使用され得る。タンパク質ならびにこのタンパク質に対する抗体は
、上記に列挙された組織の腫瘍マーカーおよび／または免疫療法標的としての有
用性を示し得る。
【００９６】 多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号１２に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であった
かもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の
範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、
好ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（
ここで、ａは配列番号１２の１〜２４８５の任意の整数であり、ｂは１５〜２４
９９の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号１２に示されるヌクレオ
チド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以
上のポリヌクレオチドが除外される。
【００９７】 （遺伝子番号３によってコードされるタンパク質の特徴） この遺伝子の翻訳産物は、ＲＡＭＰ３（レセプター活性調節タンパク質）と配
列相同性を共有する。ＲＡＭＰ３は、別のグループが近年公開し、形質膜へのカ
ルシトニンレセプター様レセプター（ＣＲＬＲ）の輸送において重要であると考
えられている。ＲＡＭＰは、カルシトニンレセプター様レセプターの輸送および
リガンド特異性を調節する。２つの他の関連したレセプター活性調節タンパク質
（ＲＡＭＰ１およびＲＡＭＰ２として公知（Ｎａｔｕｒｅ １９９８ Ｍａｙ
２８；３９３（６６８３）：３３３−９））が存在する。ＲＡＭＰ１は、成熟糖
タンパク質およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）レセプターとし
て、細胞表面でレセプターを提示すると考えられる。
【００９８】 あるいは、ＲＡＭＰ２輸送レセプターはコア−グリコシル化され、そしてアド
レノメデュリン（ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）レセプターである。ＣＧＲＰ
（３７アミノ酸の神経ペプチド）およびそのレセプターは、身体内で広範に分布
され、そしてこれまでに発見された最も強力な内在性の血管拡張性ペプチドであ
る（Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １９９７；１１（２−３）：１６
７−２３９）。アドレノメデュリンに対する特異的な結合部位は、ヒト脳（大脳
皮質、小脳、視床、視床下部、橋、および延髄）のすべての領域において存在し
た。このことは、新規の神経伝達物質／神経調節因子の役割が、ヒト脳における
アドレノメデュリンについて存在し得ることを示唆する（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １
９９７；１８（８）：１１２５−９）。
【００９９】 図７Ａ〜Ｂは、腸由来の細胞外タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１３
）および推定アミノ酸配列（配列番号３１）を示す。約１から約２７までの推定
アミノ酸は、推定シグナルペプチドを構築し（配列番号３１の約１から約２７ま
でのアミノ酸残基）、そして下線を付したアミノ酸領域によって示され；そして
約１２２から約１３８までのアミノ酸は、推定膜貫通ドメインを構築し（配列番
号３１の約１２２から約１３８のアミノ酸残基）、そして二重下線を付したアミ
ノ酸によって示される。
【０１００】 図８は、腸由来の細胞外タンパク質である配列番号３１のアミノ酸配列とＲＡ
ＭＰ３タンパク質（ｇｉ｜４５８７０９９）（配列番号７５）との間の類似性領
域を示す。
【０１０１】 図９は、配列番号３１のアミノ酸配列の分析を示す。
【０１０２】 α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒
性領域；可撓性領域；抗原性指標および表面可能性を示す。
【０１０３】 ノーザン分析は、この遺伝子の１．４ｋｂ転写物が主に小腸組織において発現
され、そしてより少ない程度で結腸組織および前立腺組織において発現されるこ
とを示す。
【０１０４】 本発明は、クローン化されたｃＤＮＡ（ＨＴＬＥＷ８１）を配列決定すること
により決定された、図１（配列番号３１）に示されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する
。図７Ａ〜Ｂ（配列番号１３）に示されるヌクレオチド配列は、クローン化され
たｃＤＮＡ（ＨＴＬＥＷ８１）を配列決定することによって得られ、これを１９
９８年１１月１７日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託し、そし
て受託番号２０３４８４を得た。寄託された遺伝子は、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ制限
エンドヌクレアーゼ切断部位を使用して、ｐＳｐｏｒｔプラスミド（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に挿入されている。本
発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメントに関
する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１３に示されるヌ
クレオチド配列を有する単離されたＤＮＡ分子のフラグメントとは、本明細書中
に考察されるような診断用プローブおよびプライマーとして有用な、少なくとも
約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは
少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長
さのＤＮＡフラグメントが意図される。当然、より長いフラグメントである５０
〜１５００ｎｔの長さもまた本発明に従って有用であり、寄託されたｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列、または配列番号１３に示されるようなヌクレオチド配列の全
てでないにしても大半に対応するフラグメントも同様に有用である。少なくとも
２０ｎｔ長のフラグメントとは、例えば、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配
列または配列番号１３に示されるヌクレオチド配列由来の２０以上の連続した塩
基を含むフラグメントが意図される。この文脈において、「約」は、特定の引用
されたサイズ、いずれかの末端または両方の末端で数個の（５、４、３、２また
は１）ヌクレオチドだけより長いかまたはより短いサイズを含む。本発明のポリ
ヌクレオチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、配列番号１３の約ヌ
クレオチド１〜約５０、約５１〜約１００、約１０１〜約１５０、約１５１〜約
２００、約２０１〜約２５０、約２５１〜約３００、約３０１〜約３５０、約３
５１〜約４００、約４０１〜約４５０、約４５１〜約５００、および約５０１〜
約５５０、および約５５１〜約６００、約６０１〜約６５０、約６５１〜約７０
０、約７０１〜約７５０、約７５１〜約８００、約８０１〜約８５０、約８５１
〜約９００、約９０１〜約９５０、約９５１〜約１０００、約１００１〜約１０
５０、約１０５１〜約１１００、約１１０１〜約１１５０、約１１５１〜約１２
００、約１２０１〜約１２５０、約１２５１〜約１３００、約１３０１〜約１３
３９の配列、もしくはそれに対する相補鎖、または寄託された遺伝子に含まれる
ｃＤＮＡを含むか、あるいはそれらからなるフラグメントが挙げられる。この文
脈において、「約」は、特定の引用された範囲、いずれかの末端または両方の末
端で数個の（５、４、３、２または１）ヌクレオチドだけより長いかまたはより
短い範囲を含む。さらなる実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、対応す
るタンパク質の機能的属性をコードする。
【０１０５】 本発明の好ましい実施態様は、これに関して、αヘリックス領域およびαヘリ
ックス形成領域（「α−領域」）、βシート領域およびβシート形成領域（「β
−領域」）、ターン領域およびターン形成領域（「ターン−領域」）、コイル領
域およびコイル形成領域（「コイル−領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両
親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、および高抗原性指数
領域を含むフラグメントを含む。上記のように、図９および／または表ＩＩＩに
示されるタンパク質の構造的または機能的属性を表すデータを、デフォルトパラ
メーターで設定されたＤＮＡ*ＳＴＡＲの種々のモジュールおよびアルゴリズム
を使用して作成した。好ましい実施形態では、表ＩＩＩＩのＶＩＩＩ欄、ＩＸ欄
、ＸＩＩＩ欄、およびＸＩＶ欄に示されるデータを使用して、抗原性について高
い程度の可能性を示すタンパク質の領域を決定し得る。高い抗原性の領域を、免
疫応答の開始のプロセスで抗原認識が生じ得る環境において、ポリペプチドの表
面上に曝露される可能性が高いポリペプチドの領域を示す値を選択することによ
って、ＶＩＩＩ欄、ＩＸ欄、ＸＩＩＩ欄、および／またはＸＩＶ欄に提示される
データから決定する。
【０１０６】 これらに関して特定の好ましい領域を図９に示すが、これは、表ＩＩＩに示さ
れるように、図９に提示されるデータの表の表示を使用することによって、表示
または同定され得る。図９を作成するために使用されたＤＮＡ*ＳＴＡＲコンピ
ューターアルゴリズム（もともとのデフォルトパラメーターで設定）を使用して
、表形式で図９のデータを提示した（表ＩＩＩを参照のこと）。図９のデータの
表形式を使用して、好ましい領域の特定の境界を容易に決定する。図９および表
ＩＩＩに示される上記の好ましい領域としては、図７Ａ〜Ｂに示されるアミノ酸
配列の分析によって同定された上述の型の領域が挙げられるが、これに限定され
ない。図９および表ＩＩＩに示されるように、このような好ましい領域としては
、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα−領域、β−領域、ターン領域、およびコ
イル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα−領域、β−領域、およびコイル領域、
Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域およびＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓの疎水
性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのα−およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−
Ｓｃｈｕｌｚの可撓性領域、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの高度な抗原性指標なら
びにＥｍｉｎｉの表面形成の領域が挙げられる。タンパク質のＮ末端からの１つ
以上のアミノ酸の欠失が、そのタンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改
変を生じるとしても、他の機能的活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能
力など）はなお保持され得る。例えば、短縮化されたムテインが、ポリペプチド
の完全または成熟形態を認識する抗体を誘導および／または結合する能力は、一
般的に、完全または成熟ポリペプチドの大半よりも少ない残基がＮ末端から除去
される場合に保持される。完全ポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプ
チドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載の慣用的
方法および当該分野において公知の他の方法によって、容易に決定され得る。多
数の欠失したＮ末端アミノ酸残基を伴うムテインが、幾分かの生物学的活性また
は免疫原性活性を保持し得ることは可能性が無いわけではない。実際、６アミノ
酸残基程度に少ない残基からなるペプチドが、しばしば免疫応答を誘発し得る。
【０１０７】 従って、本発明は、さらに、図７Ａ〜Ｂに示されるアミノ酸配列のアミノ末端
から１４３位のアルギニン残基までで、１つ以上の残基が欠失されているポリペ
プチドならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供す
る。特に、本発明は、図７Ａ〜Ｂのｎ１〜１４８残基のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドを提供し、ここで、ｎ１は、図７Ａ〜Ｂのアミノ酸残基の位置に対応す
る２〜１４３までの整数である（これは、配列番号３１として示される配列と同
一である）。配列番号３１として示される本発明のポリペプチドのＮ末端欠失は
、以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：
【０１０８】
【化２５】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
よって包含される。
【０１０９】 また、上記のように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が
、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または欠失を生じるとしても、他
の機能的活性（例えば、生物学的活性（例えば、マイトジェン活性を誘発する（
ｉｌｌｉｃｉｔ）能力、正常または悪性の細胞の分化を誘導する能力、ＥＧＦレ
セプターに結合する能力など））はなお保持され得る。例えば、ポリペプチドの
完全な形態または成熟した形態を認識する抗体を誘導する能力および／またはそ
れを結合する能力は、一般的に、完全なポリペプチドまたは成熟したポリペプチ
ドの残基の大部分がＣ末端から除去されない限り、保持される。完全なポリペプ
チドのＣ末端残基を欠損する特定のポリぺプチドが、このような免疫学的活性を
保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、およびそうでなけれ
ば当該分野において公知の慣用的な方法によって容易に決定され得る。多数の欠
失したＣ末端アミノ酸残基を有するムテインがいくらかの生物学的活性または免
疫原性活性を保持し得るようである。実際、６個程度の少ないアミノ酸残基から
構成されるペプチドが、しばしば免疫応答を誘発し得る。
【０１１０】 従って、本発明は、さらに、図７Ａ〜Ｂに示されるポリペプチドのアミノ酸配
列のカルボキシ末端から７位のアルギニン残基までで、１つ以上の残基が欠失さ
れているポリペプチドならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドを提供する。特に、本発明は、図７Ａ〜Ｂのｌ〜ｍｌ残基のアミノ酸配列
を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｍｌは、図７Ａ〜Ｂのアミノ酸残基の位
置に対応する７〜１４７までの整数である。さらに、本発明は、配列番号３１と
して示される本発明のポリペプチドのＣ末端欠失のアミノ酸配列を含むか、ある
いはこのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提
供し、配列番号３１は、以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：
【０１１１】
【化２６】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
よって包含される。
【０１１２】 さらに、本発明は、配列番号３１の広範囲の部分に関連するヌクレオチド配列
を有する核酸分子を提供し、これは、以下の関連するｃＤＮＡ遺伝子から決定さ
れた：
【０１１３】
【化２７】 この遺伝子のポリペプチドは、この遺伝子について表ＸＩＩＩで参照されるア
ミノ酸配列のアミノ酸のおよそ１２２〜１３８位に膜貫通ドメインを有すること
が決定されている。さらに、このタンパク質のアミノ酸１３９〜１４９を含む細
胞質テイルもまた、決定されている。これらの特徴に基づくと、この遺伝子のタ
ンパク質産物は、Ｉａ型膜タンパク質に対する構造的特徴を共有すると考えられ
る。
【０１１４】 従って、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル
中に存在する組織または細胞型の差示的同定のため、ならびに胃腸疾患および障
害ならびに神経変性疾患および障害を含むが、これらに限定されない疾患および
障害の診断のための試薬として有用である。同様に、これらのポリペプチドに関
するポリペプチドおよび抗体は、同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプ
チドに対する抗体は、組織または細胞型の差示的同定のための免疫学的プローブ
の提供に有用である。上記組織または細胞、特に中枢神経系および胃腸系の多く
の障害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち、この障害を有さない個体
由来の健常組織または体液中の発現レベル）に対して有意により高いまたはより
低いレベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取された
特定の組織もしくは細胞型（例えば、脳、ＣＮＳ、胃腸、癌性組織および創傷組
織）または体液（例えば、リンパ、精液、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）
または別の組織もしくは細胞サンプルの中で、慣用的に検出される。
【０１１５】 本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号３１において、残基Ａｌａ−５〜
Ｇｌｎ−１０、Ｐｒｏ−２３〜Ｃｙｓ−２８、Ａｒｇ−１４０〜Ａｓｐ−１４５
として示される免疫原性エピトープを含む。上記のポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドもまた提供される。
【０１１６】 その組織分布およびＲＡＭＰ３に対する相同性は、この遺伝子の翻訳産物が、
アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ツレット症候群、精神分
裂病、躁病、痴呆、偏執症、強迫性障害、恐慌性障害、学習障害、ＡＬＳ、精神
病、自閉、および行動変化（栄養補給、睡眠パターン、平衡、および知覚の障害
を含む）のような神経変性疾患状態および行動障害の検出／処置に有用であるこ
とを示す。さらに、この遺伝子または遺伝子産物がまた、発生している胚と関連
する発達障害の処置および／または検出において役割を果たし得る。
【０１１７】 あるいは、小腸および結腸組織における組織分布は、この遺伝子に対応するポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドが、小腸を含む障害の診断および／または処
置に有用であることを示す。これは、消化および食物吸収に関連した疾患、なら
びに小腸または他の身体内の造血細胞および組織のパイアー斑を含む造血障害を
含み得る。同様に、再び、結腸組織におけるこの遺伝子産物の発現は、食物の消
化、プロセシング、および排泄における関与、ならびに結腸癌、および一般の癌
の発生における診断マーカーまたは原因物質としてこの遺伝子の潜在的な役割を
示す。タンパク質、ならびにこのタンパク質に対する抗体は、上記に挙げられた
組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療の標的として有用性を示し得
る。
【０１１８】 多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号１３に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であった
かもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の
範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、
好ましくは、本発明から、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（こ
こで、ａは配列番号１３の１〜１３２５の任意の整数であり、ｂは１５〜１３３
９の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号１３に示されるヌクレオチ
ド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上
のポリヌクレオチドが除外される。
【０１１９】 （遺伝子番号４によってコードされるタンパク質の特徴） この遺伝子の翻訳産物は、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ由来のプロテオグリカ
ンと配列相同性を共有し、そしてこのプロテオグリカンは、軟骨形成の骨形成プ
ロセスに関与すると考えられている（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｇｉ｜２２２８４
７を参照のこと）。配列類似性に基づいて、この遺伝子の翻訳産物は、Ｇａｌｌ
ｕｓ ｇａｌｌｕｓプロテオグリカンポリペプチドと生物学的活性を共有すると
予期される。
【０１２０】 図１０Ａ〜Ｂは、ヌクレオチド（配列番号１４）および網膜特異的タンパク質
の推定のアミノ酸配列（配列番号３２）を示す。約１〜約２１由来の予期される
アミノ酸は、予想されたシグナルペプチド（配列番号３２の約１〜約２１由来の
アミノ酸残基）を構成し、下線の引かれたアミノ酸領域によって表される。
【０１２１】 図１１は、網膜特異的タンパク質のアミノ酸配列である配列番号３２とＧａｌ
ｌｕｓ ｇａｌｌｕｓプロテオグリカン（配列番号７９）との間の類似性の領域
を示す。
【０１２２】 図１２は、配列番号３２のアミノ酸配列の分析を示す。
【０１２３】 α、β、ターンおよびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓
性領域；抗原性指標および表面確率が示される。
【０１２４】 ノーザン分析は、この遺伝子が副腎皮質および腎髄質組織において発現される
ことを示す。この遺伝子はまた、網膜組織において発現される。
【０１２５】 本発明は、図１０Ａ〜Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号３２）を有するポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供し、
これは、クローン化されたｃＤＮＡ（ＨＡＲＡＯ４４）を配列決定することによ
って決定された。図１０Ａ〜Ｂに示されるヌクレオチド配列（配列番号１４）は
、クローン化されたｃＤＮＡ（ＨＡＲＡＯ４４）を配列決定することによって得
られ、これは、１９９８年１１月１７日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、登録番号２０３４８４を与えられ
た。寄託された遺伝子は、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位
を使用して、ｐＳｐｏｒｔプラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に挿入されている。
【０１２６】 本発明は、さらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメン
トに関する。寄託されたｃＤＮＡの核酸配列を有する単離されたＤＮＡ分子のフ
ラグメントまたは配列番号１４で示されるヌクレオチド配列によって、ＤＮＡフ
ラグメントは、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０
ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおより好ましくは
少なくとも約４０ｎｔの長さであると意図され、これは、本明細書中で開示され
る診断用プローブおよびプライマーとして有用である。もちろん、５０〜１５０
０ｎｔの長さのより長いフラグメントもまた、本発明に従って有用であり、これ
は、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１４に示されるよう
なヌクレオチド配列の大部分（全てではないとしても）に対応するフラグメント
である。例えば、少なくとも約２０ｎｔの長さのフラグメントは、寄託されたｃ
ＤＮＡまたは配列番号１４に示されるヌクレオチド配列由来の２０以上の連続す
る塩基を含むフラグメントが意図される。この文脈において「約（おおよそ）」
は、特に記載された値（いずれかの末端もしくは両方の末端において、これより
数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな値
）を含む。
【０１２７】 例えば、本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、以下のお
およそのヌクレオチドの配列を含むか、あるいは以下からなるフラグメントが挙
げられる：配列番号１４の、１〜約５０、約５１〜約１００、約１０１〜約１５
０、約１５１〜約２００、約２０１〜約２５０、約２５１〜約３００、約３０１
〜約３５０、約３５１〜約４００、約４０１〜約４５０、約４５１〜約５００、
約５０１〜約５５０、約５５１〜約６００、約６０１〜約６５０、約６５１〜約
７００、約７０１〜約７５０、約７５１〜約８００、約８０１〜約８５０、約８
５１〜約９００、約９０１〜約９５０、約９５１〜約１０００、約１００１〜約
１０５０、約１０５１〜約１１００、約１１０１〜約１１５０、約１１５１〜約
１２００、約１２０１〜約１２５０、約１２５１〜約１３００、約１３０１〜約
１３５０、約１３５１〜約１３８９、約１８７〜約１１１９、またはそれらに対
する相補鎖、あるいは寄託された遺伝子に含まれるｃＤＮＡ。この文脈において
、「おおよそ（約）」は、特に記載された範囲、およびいずれかの末端もしくは
両方の末端において、数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大
きいかまたは小さな範囲を含む。さらなる実施形態では、本発明のポリヌクレオ
チドは、対応するタンパク質の機能性の属性をコードする。
【０１２８】 このことについて本発明の好ましい実施形態は、α−へリックスおよびα−へ
リックス形成領域（「α−領域」）、β−シートおよびβ−シート形成領域（「
β−領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよび
コイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域
、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、および高い抗原性指標領域を含
むフラグメントを含む。上記のように図１２および／または表ＩＶに記載される
タンパク質の構造的または機能的寄与を表すデータは、デフォルトパラメータで
設定されたＤＮＡ＊ＳＴＡＲの種々のモジュールおよびアルゴリズムを使用して
生成された。好ましい実施形態では、表ＩＶのカラムＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ
、およびＸＩＶに提示されるデータは、抗原性に対する高い程度の可能性を示す
タンパク質の領域を決定するために使用され得る。高い抗原性の領域は、抗原認
識が免疫応答の開始のプロセスにおいて生じ得る環境においてポリペプチドの表
面に暴露されそうなポリペプチドの領域を表す値を選択することによって、カラ
ムＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、および／またはＸＩＶに提示されるデータから決
定される。
【０１２９】 これらに関して特定の好ましい領域は、図１２に記載されるが、表ＩＶに示さ
れるように、図１２に提示されるデータの表での表示を使用することによって、
表され得るかまたは同定され得る。図１２を生成するために使用されるＤＮＡ＊
ＳＴＡＲコンピュータアルゴリズム（オリジナルのデフォルトパラメータで設定
される）は、表の形態で図１２にデータを提示するために使用された（表ＩＶを
参照のこと）。図１２のデータの表の形態は、好ましい領域の特定の境界を容易
に決定するために使用される。図１２および表ＩＶに記載される、上に述べた好
ましい領域は、図１０Ａ〜Ｂに記載されるアミノ酸配列の分析によって同定され
る前述のタイプの領域を含むが、これに限定されない。図１２および表ＩＶに記
載されるように、このような好ましい領域は、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ
α−領域、β―領域、ターン−領域、およびコイル−領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍ
ａｎ α−領域、β−領域、およびターン−領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌ
ｅ親水性領域およびＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ α
−およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可撓性領域、高い抗
原性指標のＪａｍｅｒｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域ならびにＥｍｉｎｉ表面形成領域を
含む。たとえ、タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失がタンパク
質の１つ以上の生物学的機能の損失という改変を生じるとしても、他の機能的活
性（例えば、生物学的活性、マルチマー化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚｅ）する能力
など）はなお保持され得る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または成熟した
形態を認識する抗体を誘導および／または結合する、短いムテインの能力は、一
般的に、完全なポリペプチドまたは成熟したポリペプチドの残基の大部分がＮ末
端から除去されない限り、保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠損
する特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持するか否かは、本明
細書中に記載される慣用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知
の慣用的な方法によって容易に決定され得る。多数の欠失したＮ末端アミノ酸残
基を有するムテインがいくらかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し得る
ようである。実際、６個程度の少ないのアミノ酸残基から構成されるペプチドが
、しばしば免疫応答を誘発し得る。
【０１３０】 従って、本発明はさらに、位置番号３２７におけるプロリン残基までの、図１
０Ａ〜Ｂに示されるアミノ酸配列のアミノ末端から１つ以上の残基の欠失を有す
るポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を提供する。特に、本発明は、図１０Ａ〜Ｂの残基ｎ１〜３３２のアミノ酸配列
を含むポリペプチドを提供し、ここでｎ１は図１０Ａ〜Ｂ（これは、配列番号３
２として示される配列と同一である）のアミノ酸残基の位置に対応する２〜３２
７の整数である。配列番号３２として示される本発明のポリペプチドのＮ末端欠
失は、配列番号３２の以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：
【０１３１】
【化２８】
【０１３２】
【化２９】
【０１３３】
【化３０】
【０１３４】
【化３１】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
含まれる。
【０１３５】 上記に言及したように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失
が、そのタンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じるとして
も、他の機能的活性（例えば、生物学的活性（例えば、有糸分裂促進的な活性を
誘発する（ｉｌｌｉｃｉｔ）能力、正常細胞または悪性細胞の分化を誘導する能
力、ＥＧＦレセプターに結合する能力など））はなお保持され得る。例えば、ポ
リペプチドの完全型または成熟型を認識する抗体を誘導するか、そして／または
それに結合する能力は、一般的に、完全ポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの
残基の大部分未満がＣ末端から除去された場合に保持される。完全ポリペプチド
のＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、そのような免疫学的活性を保持する
か否かは、本明細書中に記載され、そしてさもなくば当該分野で公知の慣用的な
方法によって容易に決定され得る。多数の欠失したＣ末端アミノ酸残基を有する
ムテインは、何らかの生物学的活性または免疫学的活性を保持し得るようである
。実際、６アミノ酸残基程度まで少ないアミノ酸残基からなるペプチドは、しば
しば免疫応答を惹起し得る。
【０１３６】 従って、本発明はさらに、位置番号７におけるグルタミン残基までの、図１０
Ａ〜Ｂに示されるポリペプチドのアミノ酸配列のカルボキシ末端から１つ以上の
残基の欠失を有するポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、図１０Ａ〜Ｂの残基１〜ｍ１の
アミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここでｍ１は図１０Ａ〜Ｂのアミノ
酸残基の位置に対応する７〜３３１の整数である。さらに、本発明は、配列番号
３２として示される本発明のポリペプチドのＣ末端欠失のアミノ酸配列を含むか
、または代替的に、そのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを提供し、配列番号３２の以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプ
チドを含む：
【０１３７】
【化３２】
【０１３８】
【化３３】
【０１３９】
【化３４】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
含まれる。
【０１４０】 さらに、本発明は、配列番号１４の広範な部分に関連するヌクレオチド配列を
有する核酸分子を提供し、これは、以下の関連するｃＤＮＡ遺伝子から決定され
た：ＨＡＲＡＹ７９Ｒ（配列番号８０）、ＨＡＲＡＯ４４Ｒ（配列番号８１）、
ＨＡＲＡＪ７４Ｒ（配列番号８２）、ＨＡＲＡＯ６６Ｒ（配列番号８３）、ＨＡ
ＲＡＮ１９Ｒ（配列番号８４）、およびＨＡＲＡＴ７８Ｒ（配列番号８５）。
【０１４１】 従って、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル
中に存在する組織または細胞型の差示的同定のため、ならびに網膜障害を含むが
、これに限定されない、疾患および状態の診断のための試薬として有用である。
同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、組織または
細胞型の差示的同定のための免疫学的プローブの提供に有用である。上記組織ま
たは細胞、特に網膜の多くの障害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち
、この障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の発現レベル）に対して
有意により高いまたはより低いレベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を
有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型（例えば、網膜組織、なら
びに癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、
滑液、および髄液）または別の組織もしくは細胞サンプルの中で、慣用的に検出
される。
【０１４２】 本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号３２において、残基Ｌｅｕ−２２
〜Ａｓｐ−３９、Ａｓｎ−６４〜Ｐｒｏ−７６、Ｐｒｏ−９８〜Ｔｈｒ−１１１
、Ｐｒｏ−２９１〜Ｇｌｕ−３０２として示される免疫原性エピトープを含む。
上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０１４３】 網膜組織におけるその組織分布、および骨形成プロセスに関与する野鶏属（Ｇ
ａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）プロテオグリカンに対する相同性は、ポリヌクレオ
チドおよびこの遺伝子に対応するポリペプチドが、組織の接着または細胞表面に
対する特定のタンパク質の結合に関与する網膜の障害の処置のために有用である
ことを示す。この遺伝子の翻訳産物は、網膜の障害（例えば、近視を罹患するか
、または黄斑変性の処置中である個体における網膜剥離）の処置のために有用で
ある。さらに、この遺伝子は、網膜芽細胞腫または関連する腫瘍についての腫瘍
マーカーとして機能し得る。より一般的には、網膜組織における組織分布は、こ
の遺伝子の翻訳産物が、眼の障害（例えば、盲、色盲、視覚減損、短視力および
長視力、色素性網膜炎、増殖性網膜炎、ならびに網膜芽細胞腫、脈絡網膜炎、網
膜症、および網膜分離を含む）の診断、検出、および／または処置のために有用
であることを示す。このタンパク質の組織分布に基づいて、このタンパク質に対
するアンタゴニストは、このタンパク質の活性をブロックする際に有用である。
従って、この遺伝子の翻訳産物の一部に特異的に結合する抗体が好ましい。
【０１４４】 このタンパク質の発現が起こる腫瘍を検出するためのキットもまた提供される
。１つの実施形態において、このようなキットは、固体支持体に結合したこの遺
伝子の翻訳産物について特異的な抗体を含む。個体におけるこれらの腫瘍を検出
する方法もまた提供され、この方法は、この遺伝子の翻訳産物に対して特異的な
抗体を、その個体からの体液（好ましくは、血清）に接触させる工程、および抗
体が体液において見出される抗原と結合するか否かを確認する工程、を包含する
。好ましくは、その抗体は固体支持体に結合され、そしてその体液は血清である
。上記の実施形態、ならびに他の処置および診断試験（キットおよび方法）は、
本明細書の他の箇所でより詳細に記載される。さらに、このタンパク質はまた、
栄養補給剤としてのその使用に加えて、生物学的活性を決定するために、抗体を
惹起するために、組織マーカーとして、同属のリガンドまたはレセプターを単離
するために、それらの相互作用を調節する薬剤を同定するために使用され得る。
タンパク質ならびにこのタンパク質に対する抗体は、上記に挙げられた組織に対
する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療の標的として有用性を示し得る。
【０１４５】 多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号１４に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であった
かもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の
範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、
好ましくは、本発明から、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（こ
こで、ａは配列番号１４の１〜１３７５の任意の整数であり、ｂは１５〜１３８
９の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号１４に示されるヌクレオチ
ド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上
のポリヌクレオチドが除外される。
【０１４６】 （遺伝子番号５によってコードされるタンパク質の特徴） この遺伝子の翻訳産物は、ＣＤ３３タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ｇｉ
｜２９１３９９５を参照のこと）と配列相同性を共有する。造血系におけるＣＤ
３３の発現パターンは、骨髄細胞分化の調節における潜在的な役割を示す。しか
し、この発現は、造血幹細胞には欠けている。ＣＤ３３は、急性骨髄性白血病（
ＡＭＬ）を罹患する患者の約９０％で、クローン原性の白血病細胞において発現
される。ＡＭＬを罹患する成体の約６０〜７０％が、化学療法の適用によって完
全な寛解を経験するが、これらの患者の大部分は、再発した白血病によって最終
的には死亡する。ＣＤ３３と同様に、本発明のＣＤ３３様タンパク質もまた、Ａ
ＭＬを有する患者の大部分からのクローン原性の白血病細胞によって発現される
と考えられている。従って、ＣＤ３３様タンパク質活性を有するさらなるポリペ
プチドをコードする核酸分子を同定および単離する明確な必要性が存在する。癌
性組織は、有意により多い量のＣＤ３３様タンパク質遺伝子コピー数を含み、そ
して、「標準的な」哺乳動物（すなわち、癌または炎症性の疾患を有さない同じ
種の哺乳動物）と比較した場合に、有意に増強されたレベルのＣＤ３３様タンパ
ク質およびＣＤ３３様タンパク質をコードするｍＲＮＡを発現すると考えられる
。従って、増強されたレベルのＣＤ３３タンパク質は、癌または炎症性の疾患を
有さない同じ種の哺乳動物からの血清と比較した場合に、哺乳動物からの特定の
体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）中で検出される。
【０１４７】 ２つの関連するｃＤＮＡ遺伝子、ＨＤＰＩＢ３６およびＨＥＯＭＨ１０が単離
された。これらのｃＤＮＡ遺伝子は、この遺伝子のスプライシング改変体をコー
ドするようである。好ましいポリヌクレオチドは、以下の配列を含む：
【０１４８】
【化３５】
【０１４９】
【化３６】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、好ましい
。
【０１５０】 図１３Ａ〜Ｃは、ＣＤ３３様タンパク質のヌクレオチド（配列番号１５）およ
び推定アミノ酸配列（配列番号３３）を示す。約１〜約１６の推定アミノ酸が、
推定シグナルペプチド（配列番号３３における約１〜約１６のアミノ酸残基）を
構成し、そして下線を付したアミノ酸領域によって示され；そして約４９６〜約
５１２のアミノ酸が、推定貫通膜ドメイン（配列番号３３における約４９６〜約
５１２のアミノ酸残基）を構成し、そして二重下線を付したアミノ酸領域によっ
て表される。
【０１５１】 図１４は、ＣＤ３３様タンパク質アミノ酸配列、配列番号３３と、ＣＤ３３Ｌ
１タンパク質のアミノ酸配列（ｇｉ｜８８１７８）（配列番号９２）との同一性
の領域を示す。
【０１５２】 図１５は、配列番号３３のアミノ酸配列の分析を示す。
【０１５３】 α、β、ターンおよびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓
性領域；抗原性指標および表面可能性が示される。
【０１５４】 ノーザン分析は、この遺伝子が、脾臓組織および末梢血液白血球において最も
高く、そして少ない程度で卵巣および肺組織において発現されることを示す。
【０１５５】 本発明は、図１３Ａ〜Ｃにおいて示されるアミノ酸配列（配列番号３３）を有
するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提
供し、このポリヌクレオチドは、クローン化ｃＤＮＡ（ＨＤＰＣＬ０５）を配列
決定することによって決定された。図１３Ａ〜Ｃ（配列番号１５）において示さ
れるヌクレオチド配列は、クローン化ｃＤＮＡ（ＨＤＰＣＬ０５）を配列決定す
ることによって得られ、このクローン化ｃＤＮＡ（ＨＤＰＣＬ０５）は、Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに１９９８年１
１月１７日に寄託され、そして寄託番号２０３４８４が与えられた。寄託された
遺伝子は、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を使用して、ｐ
Ｓｐｏｒｔプラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ、ＭＤ）に挿入される。
【０１５６】 本発明は、さらに、本明細書中で記載される単離された核酸分子のフラグメン
トに関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１５に示さ
れるヌクレオチド配列を有する単離されたＤＮＡ分子のフラグメントによって、
本明細書中で考察されるような診断学的プローブおよびプライマーとして有用で
ある、少なくとも約１５ヌクレオチド長、そしてより好ましくは少なくとも約２
０ヌクレオチド長、さらにより好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド長、そ
してなおより好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド長のＤＮＡフラグメント
が意図される。当然ながら、５０〜１５００ヌクレオチド長のより長いフラグメ
ントもまた、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１５におい
て示されるようなヌクレオチド配列の、全部でないとしてもほとんどに対応する
フラグメントである場合、本発明によって有用である。例えば少なくとも２０ヌ
クレオチド長のフラグメントによって、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列
または配列番号１５に示されるヌクレオチド配列からの２０以上の連続する塩基
を含むフラグメントが意図される。この文脈において、「約」は、いずれかの末
端または両方の末端において、数（５、４、３、２、または１）ヌクレオチドだ
けより大きいかまたはより小さい、特に説明されたサイズを含む。本発明のポリ
ヌクレオチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、配列番号１５または
それらに対する相補鎖、あるいは寄託された遺伝子に含まれるｃＤＮＡの、約ヌ
クレオチド１〜約５０、約５１〜約１００、約１０１〜約１５０、約１５１〜約
２００、約２０１〜約２５０、約２５１〜約３００、約３０１〜約３５０、約３
５１〜約４００、約４０１〜約４５０、約４５１〜約５００、約５０１〜約５５
０、約５０１〜約６００、約６０１〜約６５０、約６５１〜約７００、約７０１
〜約７５０、約７５１〜約８００、約８０１〜約８５０、約８５１〜約９００、
約９０１〜約９５０、約９５１〜約１０００、約１００１〜約１０５０、約１０
５１〜約１１００、約１１０１〜約１１５０、約１１５１〜約１２００、約１２
０１〜約１２５０、約１２５１〜約１３００、約１３０１〜約１３５０、約１３
５１〜約１４００、約１４０１〜約１４５０、約１４５１〜約１５００、約１５
５１〜約１５５０、約１５０１〜約１６００、約１６０１〜約１６５０、約１６
５１〜約１７００、約１７０１〜約１７５０、約１７５１〜約１８００、約１８
０１〜約１８５０、約１８５１〜約１９００、約１９０１〜約１９５０、約１９
５１〜約２０００、約２００１〜約２０５０、約２０５１〜約２１００、約２１
０１〜約２１５０、約２１５１〜約２２００、約２２０１〜約２２５０、約２２
５１〜約２２９５、約３０７〜約１９７７、そして約１０６〜約１９７７の配列
、を含むか、または、それからなるフラグメントを含む。この文脈において、「
約」は、いずれかの末端または両方の末端において、数（５、４、３、２、また
は１）ヌクレオチドだけより大きいかまたはより小さい、特に説明されたサイズ
を含む。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、対応するタ
ンパク質の機能的性質をコードする。
【０１５７】 この点における本発明の好ましい実施形態は、α−へリックスおよびα−ヘリ
ックス形成領域（「α領域」）、βシートおよびβシート形成領域（「β領域」
）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成
領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒
性領域、可撓性領域、表面形成領域および高い抗原性指標領域を含むフラグメン
トを含む。図１５および／または表Ｖ（上述のように）に示されるタンパク質の
構造的性質および機能的性質を示すデータは、デフォルトパラメータで設定され
るＤＮＡ＊ＳＴＡＲの種々のモジュールおよびアルゴリズムを使用して、作られ
た。好ましい実施形態において、表Ｖの列ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩおよびＸＩ
Ｖにおいて示されるデータは、抗原性についての高い程度の潜在能力を示すタン
パク質の領域を決定するために使用され得る。高い抗原性の領域は、抗原認識が
免疫応答の開始のプロセスにおいて生じ得る環境において、ポリペプチドの表面
上に曝露される傾向にあるポリペプチドの領域を示す値を選択することによって
、列ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、および／またはＸＩＶにおいて示されるデータ
から決定される。
【０１５８】 これらの点に関して、特定の好ましい領域は、図１５に記載されるが、表Ｖに
おいて示されるように、図１５において示されるデータの表の表示を使用して、
示されるか、または同定され得る（オリジナルのデフォルトパラメータで設定さ
れる）。図１５を作製するために使用されたＤＮＡ＊ＳＴＡＲコンピュータアル
ゴリズムは、表形式で図１５のデータを示すために使用された（表Ｖを参照のこ
と）。図１５のデータの表形式は、好ましい領域の特定の境界を容易に決定する
ために使用される。図１５および表Ｖに示される上述の好ましい領域は、図１３
Ａ〜Ｃに記載されるアミノ酸配列セットの分析によって同定された前述の型の領
域を含むが、これらに限定されない。図１５および表Ｖに記載されるような、こ
のような好ましい領域は、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ α領域、β領域、タ
ーン領域、およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ α領域、β領域、およ
びターン領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性領域およびＨｏｏｐ−Ｗｏ
ｏｄｓ疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ α両親媒性領域およびβ両親媒性領域
、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可撓性領域、高い抗原性指標のＪａｍｅｓｏｎ
−Ｗｏｌｆ領域ならびにＥｍｉｎｉ表面形成領域を含む。タンパク質のＮ末端か
ら１以上のアミノ酸の欠失が、このタンパク質の１以上の生物学的機能の改変ま
たは損失を生じる場合でさえ、他の機能的活性（例えば、生物学的活性、多量体
化する能力など）が依然として残存する。例えば、ポリペプチドの完全形態また
は成熟形態を認識する抗体を誘導するおよび／またはそのような抗体に結合する
、短縮されたムテインの能力は、一般的に、上記の完全なまたは成熟したポリペ
プチドの大部分より少ない残基がＮ末端から除去される場合に、保持される。完
全なポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定ポリペプチドがこのような免疫学的活
性を保持するかどうかが、本明細書中で記載されるかそうでなければ当該分野で
公知である慣用的な方法によって、容易に決定され得る。多数の欠失したＮ末端
アミノ酸残基を有するムテインがいくつかの生物学的活性または免疫学的活性を
保持し得ることはなくはない。実際に、６個ほどの少ないアミノ酸残基からなる
ペプチドは、しばしば、免疫応答を惹起し得る。
【０１５９】 したがって、本発明は、さらに、図１３Ａ〜Ｃに示されるアミノ酸配列のアミ
ノ末端から６３４位のアラニン残基までで、１以上の残基が欠失されたポリペプ
チド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する
。詳細には、本発明は、図１３Ａ〜Ｃの残基ｎ１−６３９のアミノ酸配列を含む
ポリペプチドを提供し、ここで、ｎ１は、図１３Ａ〜Ｃのアミノ酸残基（これは
、配列番号３３として示される配列と同一である）の位置に対応する２〜６３４
の整数である。配列番号３３として示される本発明のポリペプチドのＮ末端欠失
は、以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：
【０１６０】
【化３７】
【０１６１】
【化３８】
【０１６２】
【化３９】
【０１６３】
【化４０】
【０１６４】
【化４１】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
よって包含される。
【０１６５】 また、上述のように、タンパク質のＣ末端からの１以上のアミノ酸の欠失が、
１以上の生物学的機能の改変または損失を生じる場合でさえ、他の機能的活性（
例えば、生物学的活性（例えば、分裂促進活性を誘発する（ｉｌｌｉｃｉｔ）能
力、正常細胞または悪性細胞の分化を誘導する能力、ＥＧＦレセプターへ結合す
る能力など））が依然として残存し得る。例えば、ポリペプチドの完全形態また
は成熟形態を認識する抗体を誘導するおよび／またはそのような抗体に結合する
能力が、一般的に、上記完全ポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの大部分より
も少ない残基がＣ末端から除去される場合に、保持される。完全なポリペプチド
のＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか
どうかが、本明細書中で記載されるかまたはそうでなければ当該分野において公
知である慣用的な方法によって、容易に決定され得る。多数の欠失したＣ末端ア
ミノ酸残基を有するムテインがいくつかの生物学的活性または免疫学的活性を保
持し得ることはなくはない。実際に、６個ほどの少ないアミノ酸残基からなるペ
プチドは、しばしば、免疫応答を惹起し得る。
【０１６６】 従って、本発明は、図１３Ａ〜Ｃに示されるポリペプチドのアミノ酸配列のカ
ルボキシ末端から位置番号７のロイシン残基までに、１以上の残基が欠失された
ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
、さらに提供する。詳細には、本発明は、図１３Ａ〜Ｃの残基１〜ｍｌのアミノ
酸配列を含むポリペプチドを提供する。ここで、ｍｌは、図１３Ａ〜ｃにおける
アミノ酸残基の位置に対応する、７〜６３８の整数である。さらに、本発明は、
配列番号３３として示される本発明のポリペプチドのＣ末端欠失のアミノ酸配列
を含むか、あるいはその配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを提供し、これらのポリペプチドとしては、配列番号３３の以下の残基のアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる：
【０１６７】
【化４２】
【０１６８】
【化４３】
【０１６９】
【化４４】
【０１７０】
【化４５】
【０１７１】
【化４６】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
含まれる。
【０１７２】 さらに、本発明は、配列番号１５の広範な部分に関連するヌクレオチド配列を
有する核酸分子を提供し、この配列番号１５は、以下の関連するｃＤＮＡ遺伝子
から決定された：ＨＴＯＦＡ２６Ｒ（配列番号９３）、ＨＷＡＥＭ４３Ｒ（配列
番号９４）、ＨＤＰＭＱ６９Ｒ（配列番号９５）、ＨＤＰＧＡ０９ＲＡ（配列番
号９６）、ＨＥＯＭＨ１０Ｒ（配列番号９７）、およびＨＦＫＣＴ７３Ｆ（配列
番号９８）。
【０１７３】 この遺伝子のポリペプチドは、この遺伝子について表ＸＩＩＩに参照されるア
ミノ酸配列の約アミノ酸４９６〜５１２位で、膜貫通ドメインを有することが決
定されている。さらに、このタンパク質のアミノ酸５１３〜６３９を含む細胞質
テールもまた、決定されている。これらの特徴に基づいて、この遺伝子のタンパ
ク質産物は、Ｉａ型膜タンパク質に対する構造特徴を共有すると考えられる。
【０１７４】 従って、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的試料中に
存在する組織または細胞型の差示的同定のため、ならびに免疫系の障害を含むが
それらに限定されない以下の疾患および症状の診断（特に、急性白血病の免疫診
断）のために試薬として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリ
ペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の差示的同定のための免疫学的プロ
ーブを提供することに有用である。上記組織または細胞の多くの障害、特に免疫
系の多くの障害について、標準的な遺伝子発現レベル、すなわち，障害を有さな
い個体からの健常組織中の発現レベルに対して、このような障害を有する個体か
ら採取された、特定の組織もしくは細胞型（例えば、免疫組織、癌性組織および
創傷組織）または体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）あ
るいは別の組織もしくは細胞試料中で、有意により高いまたはより低いレベルの
この遺伝子の発現が検出される。
【０１７５】 好ましいエピトープとしては、以下の残基のような、配列番号３３に示される
配列を含むエピトープが挙げられる：
【０１７６】
【化４７】 ＣＤ３３モノクローナル抗体（ＭｏＡＢ）は、ＡＭＬの免疫診断に重要である
。ＣＤ３３ ＭｏＡＢは、移植前または化学療法に耐性の疾患のためのいずれか
で、ＡＭＬ患者の骨髄を浄化するための予備治療試行に使用されていた。寛解中
のＡＭＬ患者を再発の罹患から予防するために、または適切な同種異系の骨髄ド
ナーの非存在に起因して、進行性ＡＭＬに罹患する患者の自家移植片から、白血
病細胞を浄化するための方法が必要とされる。本発明によって、この方法が提供
され、この方法により、ＡＭＬ患者由来の骨髄を、例えば、後腸骨稜から経皮吸
引によって得て、Ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心によって骨髄単球
を単離し、そして抗ＣＤ３３様タンパク質ＭｏＡＢと共に、例えば、１５〜３０
分間、４〜６℃で３〜５回インキュベートし、その後、ウサギ補体と共に約３７
℃で、３０分間インキュベートする。次いで、患者を、骨髄切除化学療法に供し
、次いで、標準的な技術に従って、処置された自家骨髄を再注入する。本発明に
よって、クローン原性腫瘍細胞を、移植に必要な造血細胞を維持しながら（ｓｐ
ａｒｉｎｇ）骨髄から枯渇させる。さらなる実施形態において、本発明は、本発
明のＣＤ３３様タンパク質抗原を発現する腫瘍細胞の増殖を、選択的に殺傷また
は阻害するためのインビボ方法を提供する。この方法は、ＣＤ３３様タンパク質
レセプターシグナル伝達経路を阻害するために、有効量のアンタゴニストを患者
に投与する工程を包含する。本発明によって、このようなＣＤ３３様タンパク質
のアンタゴニストを患者に投与することはまた、関節炎および大腸炎を含む炎症
性疾患を処置するために有用であり得る。本発明における使用のためのアンタゴ
ニストとしては、以下が挙げられる：ＣＤ３３様タンパク質に対して惹起された
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体またはそれらのフラグメント、ア
ンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡあるいは三重らせん形成によって遺伝子発現を制
御するアンチセンス分子、ＣＤ３３様タンパク質ドメインに結合するタンパク質
または他の化合物、あるいは、ＣＤ３３レセプターリガンドに結合するために細
胞表面ＣＤ３３様タンパク質と競合することによって、ＣＤ３３様タンパク質媒
介シグナル伝達をアンタゴナイズする可溶化形態のＣＤ３３様タンパク質（例え
ば、全長レセプター由来の細胞外領域を含むタンパク質フラグメント）。
【０１７７】 多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号１５に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であった
かもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の
範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、
好ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（
ここで、ａは配列番号１５の１〜２２８１の任意の整数であり、ｂは１５〜２２
９５の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号１５に示されるヌクレオ
チド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以
上のポリヌクレオチドが除外される。
【０１７８】 （遺伝子番号６によりコードされるタンパク質の特徴） 本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチド
によってコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドの使用、ならびにこのようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドの産生
に関する。本発明のポリペプチドは、ヒト一次樹状細胞ｃＤＮＡライブラリー由
来のＣＤ３３ホモログとして、推定的に同定された。より詳細には、本発明のポ
リペプチドは、ヒトｓｉｇｌｅｃホモログ（時折、本明細書中以降、「ＣＤ３３
様３」および／または「ｓｉｇｌｅｃ７」と呼ばれる）として推定的に同定され
た。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。
【０１７９】 ｓｉｇｌｅｃ（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン）は、Ｉｇスーパーファミリーの
異なるサブセットを構成する１型膜タンパク質であり、これは、それらの配列類
似性ならびに糖タンパク質および糖脂質におけるシアル酸を結合する、および能
力によって特徴付けられる（Ｃｒｏｃｋｅｒ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ：８（１９９８））。Ｉｇスーパーファミリーメンバーのタンパク質は、
抗体の可変ドメインまたは定常ドメインと、配列類似性のドメインを共有する分
子として定義される。
【０１８０】 多くのＩｇスーパーファミリータンパク質は、他のドメイン（例えば、Ｆｎ−
ＩＩＩ繰り返しドメイン）に結合される、複数の直列Ｉｇ様ドメインからなる（
Ｖａｕｇｈｎ，Ｄ．Ｅ．およびＰ．Ｊ．Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｎｅｕｒｏｎ，１６
：２６１−７３（１９９６））。一次構造レベルで、従来のＩｇ様ドメインは、
約５５〜７５アミノ酸残基によって分離される２つのシステイン残基、およびこ
の２つの保存システイン残基の第１のシステインのＣ末端側１０〜１５残基に位
置される「不変」トリプトファン残基の存在によって同定され得る。この２つの
保存システイン残基は、フォールディングされたＩｇ構造を形成するジスルフィ
ド結合に関与すると考えられる（Ｖａｕｇｈｎ，Ｄ．Ｅ．（１９９６））。
【０１８１】 Ｉｇ様ドメインは、共通のフォールディングパターン（５〜１０アミノ酸を含
む逆平行ｂ鎖からなる２つのｂ−シートのサンドイッチ構造またはフォールド構
造のパターン）をさらに共有する（Ｈｕａｎｇ，Ｚ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ
ｓ，４３：３６７−８２（１９９７））。Ｉｇ様ドメインは、配列類似性および
構造類似性に基づいて、Ｃ１、Ｃ２、ＩおよびＶ様ドメインとして公知の４つの
分類に分けられる。
【０１８２】 Ｉｇ様ドメインの機能的決定基は、Ｉｇフォールドのｂ−シートの表面または
ループ領域上に存在する。従って、タンパク質−タンパク質相互作用は、Ｉｇフ
ォールドの、ｂ−シートの表面、またはループ領域のいずれかの間で生じ得る（
Ｈｕａｎｇ，Ｚ．（１９９８））。これらのＩｇ様ドメインは、分子間結合およ
びタンパク質−タンパク質の同種親和性または異種親和性相互作用のような、多
様な生物学的機能の媒介に関与する。
【０１８３】 従って、Ｉｇ様ドメインは、Ｉｇスーパーファミリーのタンパク質活性の促進
において必須の役割を果たす。哺乳動物において、このグループは、現在、シア
ロアドヘシン（シアル酸付着因子）（ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ）／ｓｉｇｌｅ
ｃ−１、ＣＤ２２／ｓｉｇｌｅｃ−２、ＣＤ３３／ｓｉｇｌｅｃ−３、ミエリン
結合糖タンパク質（ＭＡＧ／ｓｉｇｌｅｃ−４）、ｓｉｇｌｅｃ−５、ｓｉｇｌ
ｅｃ−６およびｓｉｇｌｅｃ−７を含む（Ｃｒｏｃｋｅｒ，Ｐ．Ｒ．ら、ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．，１３：４４９０−５０３（１９９４）；Ｓｇｒｏｉ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：７０１１−１８（１９９３）；Ｆｒｅｅｍａｎ，
Ｄ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ，８５：２００５−１２（１９９５）；Ｋｅｌｍ，Ｓ．
ら、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．，４：９６５−７２（１９９４）；Ｃｏｒｎｉｓｈ，
Ａ．Ｌ．ら、Ｂｌｏｏｄ，９２：２１２３−１３２（１９９８）；Ｐａｔｅｌ，
Ｎ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７４：２２７２９−７３８（１９９９）；
Ｎｉｃｏｌ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）
）。Ｓｉｇｌｅｃ−７はまた、最近、ＮＫレセプターｐ７５／ＡＩＲＭ１として
独立して特徴付けられている（Ｆａｌｃｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１
９０：７９３−８０２（１９９９））。さらに、別のｓｉｇｌｅｃ様配列、ＯＢ
ＢＰ様タンパク質をコードする遺伝子が、報告されているが、その結合活性につ
いての情報は存在しない（Ｙｏｕｓｅｆ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９９））。
【０１８４】 これらのタンパク質の各々は、膜遠位性（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉｓｔａｌ）
Ｖセットドメインから構成される細胞外領域、それに続く、種々の数（１６（シ
アロアドヘシンにおいて）から１（ＣＤ３３において）までの範囲にわたる）の
Ｃ２セットドメインを有する。シアロアドヘシン、ＣＤ２２、ＭＡＧおよびＣＤ
３３の場合において、シアル酸結合部位は、Ｖセットドメインにマッピングされ
ており、そしてシアロアドヘシンについては、これは、Ｘ線結晶解析１１によっ
て、分子レベルでさらに特徴付けられている（Ｎａｔｈ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．，２７０：２６１８４−９１（１９９５）；ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅ
ｒｗｅ，Ｐ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：９２７３−８０（１
９９６）；Ｔａｎｇ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３８：１３５５−
６６（１９９７）；Ｔａｙｌｏｒ，Ｖ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
７４：１１５０５−１２（１９９９）；Ｍａｙ，Ａ．Ｐ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｅｌｌ，１：７１９−２８（１９９８））。
【０１８５】 神経系に排他的に見出されるＭＡＧおよびＳＭＰとは別に、今日までに特徴付
けられた全てのｓｉｇｌｅｃは、異なる造血細胞のサブセット上で発現され、そ
して有用な系統限定マーカーを提供し得る。従って、ＣＤ２２は、成熟Ｂ細胞上
のみに存在し、シアロアドヘシンは、マクロファージサブセット上に存在し、Ｃ
Ｄ３３は、初期骨髄性前駆細胞のマーカーであり、ｓｉｇｌｅｃ−５は、単球お
よび成熟好中球によって発現され、ｓｉｇｌｅｃ−６は、Ｂ細胞上に存在し、そ
してｓｉｇｌｅｃ−７は、ＮＫ細胞および単球によって発現される（Ｄｏｒｋｅ
ｎ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３６：４４７０−７９（１９８６）
；Ｃｒｏｃｋｅｒ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６４：１８６２−７
５）１９８６）；Ｐｅｉｐｅｒ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｉｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙ
ｐｉｎｇ ＩＶ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ．８１４−１６（１９８９）；Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ａ．Ｌ．ら、Ｂｌｏｏｄ，
９２：２１２３−１３２（１９９８）；Ｐａｔｅｌ．Ｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ，２７４：２２７２９−７３８（１９９９）；Ｎｉｃｏｌ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９９））。これらの発現パターンは
、造血細胞サブセット間の異なる機能を示すが、しかし、ＣＤ２２（よく特徴付
けられたＢ細胞活性化のネガティブ調節因子（Ｃｙｓｔｅｒ，Ｊ．Ｇ．およびＣ
．Ｃ．Ｇｏｏｄｎｏｗ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６：５０９−１７（１９９７）に概
説される））は別に、この造血系において発現されるｓｉｇｌｅｃの生物学的機
能は、未知である。提唱された機能としては、他の細胞上のシアル酸化された糖
結合体の認識を介する、細胞−細胞相互作用が挙げられる。しかし、多くの研究
もまた、ｓｉｇｌｅｃによって媒介される細胞−細胞接着が、宿主形質膜に存在
するシアル酸とのシス相互作用によって調節され得ることを示している。これは
、ＣＤ２２、ＣＤ３３およびｓｉｇｌｅｃ−５に特に顕著であり、これらの結合
活性は、宿主細胞を、シアリダーゼで前処理してシス競合性シアル酸を除去した
場合に、非常に増加され得る（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｄ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ，８５
：２００５−１２（１９９５）；Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ａ．Ｌ．ら、Ｂｌｏｏｄ，９
２：２１２３−１３２（１９９８）；Ｓｇｒｏｉ，Ｄ．ら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，
９２：４０２６−３０（１９９５））。
【０１８６】 細胞性相互作用における潜在的役割に加えて、ＣＤ２２に類似の、より最近に
特徴付けられたｓｉｇｌｅｃが、シグナル伝達機能に関与するという、高まる証
拠が存在する。ＣＤ３３ならびにｓｉｇｌｅｃ−５、ｓｉｇｌｅｃ−６およびｓ
ｉｇｌｅｃ−７の細胞質テールは、他の白血球レセプターにおけるよく特徴付け
られたシグナル伝達モチーフ（Ｇｅｒｇｅｌｙ，Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎ．Ｌｅｔｔ
．，６８：３−１５（１９９９））に類似する、よく保存された２つのチロシン
ベースモチーフを有する。研究した場合に、両方のチロシン残基は、ｓｒｃ様キ
ナーゼによってリン酸化され得、そして膜近位のチロシンの場合において、これ
は、その後、チロシンホスファターゼＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２の漸増を導く
（Ｆａｌｃｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９０：７９３−８０２（１９
９）；Ｔａｙｌｏｒ，Ｖ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１１５
０５−１２（１９９９））。
【０１８７】 従って、免疫グロブリンタンパク質のｓｉｇｌｅｃファミリーの新規なメンバ
ーを同定し、そして開発することが、明らかに必要である。構造的に関連してい
るが、このようなタンパク質は、様々な細胞型および組織型において、様々な、
多方面にわたる機能を有し得る。本発明の精製したｓｉｇｌｅｃタンパク質は、
細胞シグナル伝達分子の同定、特徴付けおよび精製のために有用な、研究ツール
である。さらに、新たなｓｉｇｌｅｃの同定は、核酸レベルおよびタンパク質レ
ベルでの、ある範囲の誘導体、アゴニストおよびアンタゴニストの開発を可能と
し、これは次に、ある範囲の状態（他の多数の状態のうちでもとりわけ、例えば
、癌、炎症、神経性障害および免疫性障害）の処置および診断における応用を有
する。本発明のポリペプチドは、ｓｉｇｌｅｃファミリーのメンバーとして推定
により同定されており、そしてＣＤ３３様３と呼ばれている。この同定は、ヒト
ｃｄ３３ｌ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｇｉ｜２９１３９９５を参照のこと）に
対するアミノ酸配列の相同性の結果としてなされた。
【０１８８】 図１６Ａ〜Ｂは、ＣＤ３３様３のヌクレオチド配列（配列番号１６）および推
定アミノ酸配列（配列番号３４）を示す。約１から約１８までの予測したアミノ
酸は、予測したシグナルペプチド（配列番号３４における約１から約１８までの
アミノ酸残基）を構成し、そして下線を引いたアミノ酸領域により表される；そ
して約３６０から約３７６までのアミノ酸は、予測した膜貫通ドメイン（配列番
号３４における約３６０から約３７６までのアミノ酸）を構成し、そして二重下
線を引いたアミノ酸により表される。
【０１８９】 図１７は、ＣＤ３３様３タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３４）とヒトＣ
Ｄ３３Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９９）との間の類似する領域を
示す。
【０１９０】 図１８は、ＣＤ３３様３アミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターンおよびコ
イル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数および
表面確率が示される。
【０１９１】 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒトＮＫ細胞、Ｔ細
胞、一次樹状細胞、胎盤、脾臓、原発性乳癌、胆嚢、アポトーシス性Ｔ細胞、マ
クロファージ、および慢性リンパ性白血病脾臓から得られる。本発明のポリヌク
レオチドは、ヒト一次樹状細胞ｃＤＮＡライブラリーにおいて発見された。
【０１９２】 図１６Ａ〜Ｂに示すように、ＣＤ３３様３は、膜貫通ドメイン（この膜貫通ド
メインは、配列番号３４の約３６０から約３７６までのアミノ酸を含む；これは
、図１６Ａ〜Ｂの約３６０から約３７６までのアミノ酸に対応する）を有する。
このポリヌクレオチドは、４６７アミノ酸のＣＤ３３様３ポリペプチドをコード
するオープンリーディングフレームを含む。ＣＤ３３様３は、ヒトＣＤ３３Ｌ１
に対して高度の相同性を、アミノ酸レベルで示す（図１８に示すように）。
【０１９３】 本発明は、図１６Ａ〜Ｂに示すアミノ酸配列（配列番号３４）を有するＣＤ３
３様３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子
を提供する。図１６Ａ〜Ｂに示すヌクレオチド配列（配列番号１６）は、クロー
ン化ｃＤＮＡ（ＨＤＰＵＷ６８）を配列決定することにより得られ、このクロー
ン化ｃＤＮＡは、１１月１７日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、そして登録番号２０３４８４を与えられた
。
【０１９４】 本発明はさらに、本明細書中に記載の単離された核酸分子のフラグメントに関
する。この寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１６に示すヌ
クレオチド配列を有する、単離されたＤＮＡ分子のフラグメントによって、少な
くとも約１５ｎｔ長、より好ましくは少なくとも約２０ｎｔ長、なおより好まし
くは少なくとも約３０ｎｔ長、さらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔ長の
ＤＮＡフラグメントが意図され、これらは、本明細書中で議論されるように、診
断プローブおよびプライマーとして有用である。もちろん、５０〜１５００ｎｔ
長の、より長いフラグメントもまた、本発明に従って有用である。なぜなら、こ
れらのフラグメントは、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号
１６に示すようなヌクレオチド配列に、全てでないとしても大部分に対応してい
るからである。例えば、少なくとも２０ｎｔ長のフラグメントによって、寄託さ
れたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１６に示すようなヌクレオチド
配列由来の２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。これに関
して、「約」とは、具体的に記載される大きさ、いずれかまたは両方の末端にお
いていくつか（５、４、３、２、もしくは１個）のヌクレオチドだけより大きい
かまたはより小さいものを含む。本発明のＣＤ３３様３ポリヌクレオチドフラグ
メントの代表的な例には、例えば、配列番号１６、またはそれに相補的な鎖、あ
るいはその寄託遺伝子に含まれるｃＤＮＡの、ヌクレオチド約１〜約５０、約５
１〜約１００、約１０１〜約１５０、約１５１〜約２００、約２０１〜約２５０
、約２５１〜約３００、約３０１〜約３５０、約３５１〜約４００、約４０１〜
約４５０、約４５１〜約５００、約５０１〜約５５０、約５５１〜約６００、約
６０１〜約６５０、約６５１〜約７００、約７０１〜約７５０、約７５１〜約８
００、約８０１〜約８５０、約８５１〜約９００、約９０１〜約９５０、約９５
１〜約１０００、約１００１〜約１０５０、約１０５１〜約１１００、約１１０
１〜約１１５０、約１１５１〜約１２００、約１２０１〜約１２５０、約１２５
１〜約１３００、約１３０１〜約１３５０、約１３５１〜約１４００、約１４０
１〜約１４５０、約１４５１〜約１５００、約１５０１〜約１５５０、約１５５
１〜約１６００、約１６０１〜約１６５０、約１６５１〜約１７００、約１７０
１〜約１７４８の配列を含むか、あるいはそのような配列から構成されるフラグ
メントが挙げられる。これに関して、「約」とは、具体的に記載した範囲、いず
れかまたは両方の末端においていくつか（５、４、３、２、もしくは１個）のヌ
クレオチドだけより大きいかまたはより小さいものを含む。
【０１９５】 本発明の好ましい核酸フラグメントは、以下の群から選択されるメンバーをコ
ードする核酸分子を含む：膜貫通ドメイン（図１６Ａ〜Ｂの約３６０〜約３７６
のアミノ酸残基（配列番号３４の約３６０〜約３７６のアミノ酸））を含むか、
あるいはこの膜貫通ドメインから構成される、ポリペプチド。これらのドメイン
の位置はコンピュータ分析により予測されているので、当業者は、これらのドメ
インを構成するアミノ酸残基が、各ドメインを規定するために使用される基準に
依存して、わずかに（例えば、約１〜１５アミノ酸残基）変動し得ることを理解
する。
【０１９６】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＣＤ３３様３の機
能的属性をコードする。
【０１９７】 この点に関する本発明の好ましい実施形態は、ＣＤ３３様３のαヘリックスお
よびαヘリックス形成領域（「α領域」）、βシートおよびβシート形成領域（
「β領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよび
コイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域
、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域ならびに高抗原性指数領域を含む
フラグメントを含む。図１８および／または表ＶＩに示すＣＤ３３様３の構造的
または機能的属性を表すデータは、上記のように、デフォルトパラメータに設定
されるＤＮＡ＊ＳＴＡＲの様々なモジュールおよびアルゴリズムを使用して、生
成した。好ましい実施形態において、表ＶＩの欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、お
よびＸＩＶに与えるデータを使用して、高度な抗原性の可能性を示すＣＤ３３様
３の領域を決定し得る。高抗原性を有する領域は、欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ
、および／またはＸＩＶに与えるデータから、免疫応答の開始のプロセスにおい
て抗原認識が生じ得る環境において、ポリペプチドの表面に曝露されやすいポリ
ペプチドの領域を示す値を選択することによって、決定される。
【０１９８】 これらの観点における特定の好ましい領域を図１８に示すが、表ＶＩに示すよ
うに、図１８に与えるデータの表の表現を使用して、表現または同定され得る。
図１８を生成するために使用したＤＮＡ＊ＳＴＡＲコンピュータアルゴリズム（
元々のデフォルトパラメータ上に設定される）を使用して、図１８の表形式のデ
ータを与えた（表ＶＩを参照のこと）。図１８の表形式のデータを使用して、好
ましい領域の特定の境界が容易に決定される。図１８および表ＶＩに示す上述の
好ましい領域には、図１６Ａ〜Ｂに示すアミノ酸配列の分析により同定される上
述の型の領域が挙げられるが、これらに限定されない。図１８および表ＶＩに示
すように、このような好ましい領域には、以下が挙げられる：Ｇａｒｎｉｅｒ−
Ｒｏｂｓｏｎ α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆ
ａｓｍａｎ α領域、β領域、およびターン領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌ
ｅ親水性領域ならびにＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ
αおよびβ両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可撓性領域、Ｊａｍｅ
ｓｏｎ−Ｗｏｌｆ高抗原指数領域、ならびにＥｍｉｎｉ表面形成領域。タンパク
質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失の結果、そのタンパク質の生物学的
機能の１つ以上が喪失されるよう改変される場合においてさえ、他の機能的活性
（例えば、生物学的活性、多量体化の能力、細胞相互作用の調節、またはシグナ
ル伝達経路など）は、依然として維持され得る。例えば、短縮ＣＤ３３様３ムテ
インが、そのポリペプチドの完全形態もしくは成熟形態を認識する抗体を誘導し
、そして／またはその抗体に結合する能力は、一般に、その完全なポリペプチド
または成熟したポリペプチドの大部分より少ない残基がそのＮ末端から除去され
る場合に、維持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプ
チドがこのような免疫活性を維持するか否かは、本明細書中に記載され、そして
さもなければ当該分野において公知の慣用的な方法によって、容易に決定され得
る。Ｎ末端アミノ酸残基の多数が欠失されたＣＤ３３様３ムテインが、いくらか
の生物学的活性または免疫原活性を維持し得ることは、ありそうにない。実際に
、６個程度のＣＤ３３様３アミノ酸残基から構成されるペプチドは、しばしば免
疫応答を誘発し得る。
【０１９９】 従って、本発明は、図１６Ａ〜Ｂに示すＣＤ３３様３アミノ酸配列のアミノ末
端から位置番号４６２のグルタミン酸残基までの、１つ以上の残基が欠失された
ポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
さらに提供する。特に、本発明は、図１６Ａ〜Ｂのｎ１〜４６７の残基のアミノ
酸配列を含むポリペプチドを提供する。ここで、ｎ１は、図１６Ａ〜Ｂのアミノ
酸残基の位置に対応する、２〜４６２の整数である（これは、配列番号３４に示
す配列と同一である）。別の実施形態において、ＣＤ３３様３ポリペプチドのＮ
末端の欠失は、一般式ｎ２−４６７により記載され得、ここでｎ２は、２〜４６
２の数であり、図１６Ａ〜Ｂに同定するアミノ酸の位置に対応する。配列番号３
４に示す、本発明のＣＤ３３様３ポリペプチドのＮ末端欠失には、配列番号３４
の以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる：
【０２００】
【化４８】
【０２０１】
【化４９】
【０２０２】
【化５０】
【０２０３】
【化５１】 これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明に含
まれる。
【０２０４】 また上述のように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失の結
果、そのタンパク質の改変または１つ以上の生物学的機能の欠損が生じる場合に
おいてさえ、他の機能的活性は依然として維持され得る。例えば、完全なポリペ
プチドまたは成熟した形態のポリペプチドを認識する抗体を、短縮ＣＤ３３様３
ムテインが誘導し、そして／またはその抗体に結合する能力は、一般に、その完
全なポリペプチドまたは成熟したポリペプチドの残基の大部分未満がそのＣ末端
から除去される場合に、維持される。完全なポリペプチドのＣ末端残基を欠く特
定のポリペプチドがそのような免疫活性を維持するか否かは、本明細書中に記載
され、そうでなければ当該分野において公知の慣用的な方法によって、容易に決
定され得る。多数のＣ末端アミノ酸残基が欠失したＣＤ３３様３ムテインは、い
くらかの生物学的活性または免疫原活性を維持し得ることは、大いにあり得る。
実際に、６つ程度のＣＤ３３様３アミノ酸残基から構成されるペプチドは、しば
しば、免疫応答を誘発し得る。
【０２０５】 従って、本発明はさらに、図１６Ａ〜Ｂに示すＣＤ３３様３ポリペプチドのア
ミノ酸配列のカルボキシ末端から位置番号６のロイシン残基まで１つ以上の残基
が欠失したポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを提供する。特に、本発明は、図１の残基１〜ｍ１のアミノ酸配列を
含むポリペプチドを提供する。ここで、ｍ１は、図１６Ａ〜Ｂのアミノ酸残基の
位置に対応する６〜４６７の整数である。
【０２０６】 さらに、本発明は、配列番号３４として示される、本発明のＣＤ３３様３ポリ
ペプチドのＣ末端欠失のアミノ酸配列を含む（あるいは以下の残基から構成され
る）ポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチ
ドとしては、配列番号３４の以下の残基のアミノ酸配列を含むポリヌクレオチド
が挙げられる：
【０２０７】
【化５２】
【０２０８】
【化５３】
【０２０９】
【化５４】
【０２１０】
【化５５】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリぺプチドもまた本発明に含
まれる。
【０２１１】 さらに、本発明は、以下の関連するｃＤＮＡ遺伝子：ＨＧＢＡ Ｙ０２Ｒ（配
列番号１００）およびＨＬＹＢＹ６２Ｒ（配列番号１０１）から決定された配列
番号１６の広範な部分に関連するヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する
。
【０２１２】 ヒトＣＤ３３Ｌ１に類似する配列に基づいて、この遺伝子の翻訳産物は、ＣＤ
３３タンパク質、ならびに具体的には、骨髄調節タンパク質および／またはｓｉ
ｇｌｅｃタンパク質と少なくともいくつかの生物学的活性を共有することが予測
される。このような活性は、当該分野で公知であり、これらのいくつかは、本明
細書中他の箇所で記載される。
【０２１３】 具体的に、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはまた、正常および
悪性細胞の分化を調節するため、癌および新生物の細胞の増殖および／または分
化を調節するため、ならびに免疫応答を調節するために有用である。本発明のポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドは、造血および免疫の疾患および／または障
害のための診断マーカーを示し得る。全長タンパク質は、ＣＤ３３ファミリーに
対する相同性に基づくと、分泌タンパク質であるはずである。従って、血清、尿
、または糞便へと分泌され、従ってこのレベルは、患者のサンプルからアッセイ
可能である。特定の発現レベルが、免疫障害の存在を反映すると仮定すると、こ
のタンパク質は、早期検出のための簡便な診断剤を提供する。さらに、この遺伝
子産物の発現はまた、免疫疾患の進行に関連し得、従って、それ自体、癌の処置
のための診断標的および治療標的を実際に示し得る。
【０２１４】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒトの癌および細胞形質転
換（特に、免疫系および造血系の癌および細胞形質転換）の病理において重要な
役割を果たし得る。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはまた、細胞
および組織細胞型の増殖および分化に対するその潜在的な影響に基づく発生的異
常性の病理に関与し得る。上記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの潜在的な
増殖活性および分化活性に起因して、本発明は、組織再生を誘導する際の治療剤
として、炎症状態（例えば、炎症性腸症候群（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏ
ｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、憩室炎など）を処置するために有用である。さら
に、本発明は、急激に増殖する細胞および組織細胞型（特に腺癌および他の癌）
に存在し得るような、異所性のポリペプチドに対する免疫応答を調節する際に有
用である。
【０２１５】 この遺伝子は、ＮＫ細胞に対して突出して発現され、そしてより少ない程度に
は、Ｔ細胞において発現される。従って、本発明のポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドは、生物学的サンプル中に存在する組織または細胞型の示差的同定のた
め、免疫障害および癌を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断のた
めの試薬、ならびに急性白血病の免疫診断剤として有用である。同様に、ポリペ
プチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の示差的
同定のための免疫学的プローブの提供に有用である。上記組織または細胞、特に
免疫系組織、および乳房組織の多くの障害に関連して、標準の遺伝子発現レベル
（すなわち、障害を有さない個体由来の健常組織中の発現レベル）に対して有意
により高いまたはより低いレベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を有す
る個体から採取された特定の組織もしくは細胞型（例えば、免疫組織、癌性組織
および創傷組織）または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、または髄液）、
または別の組織もしくは細胞サンプルの中で、検出され得る。
【０２１６】 本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号３４において、Ｇｌｙ−１２〜Ｔ
ｙｒ−２６、Ｖａｌ−５２〜Ａｓｐ−５９、Ｇｌｎ−８８〜Ａｓｐ−９３、Ａｒ
ｇ−１２４〜Ａｓｎ−１２９、Ｈｉｓ−１９３〜Ａｒｇ−１９８、Ｇｌｎ−２０
７〜Ｔｈｒ−２１３、Ｇｌｎ−３３８〜Ａｒｇ３４６、Ｓｅｒ−３７８〜Ａｌａ
−３８４、Ｓｅｒ−４１３〜Ａｒｇ−４２０、Ｓｅｒ−４２８〜Ｇｌｕ−４３４
、Ｈｉｓ−４４３〜Ｓｅｒ−４５１、Ｇｌｕ−４５４〜Ｓｅｒ−４６１残基とし
て示される免疫学的エピトープを含む。上記のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドもまた提供される。
【０２１７】 ｓｉｇｌｅｃファミリーのタンパク質に対する相同性と組み合わせて、ＮＫ細
胞におけるにおけるこの組織分布は、この遺伝子のタンパク質産物が、種々の免
疫系障害の診断および／または処置に有用であることを示す。ＮＫ細胞は、感染
性疾患に対する天然の免疫において重要な役割を果たし、そしてダウンレギュレ
ートされたＭＨＣクラスＩ抗原発現を有する特定のウイルスに感染した細胞およ
び腫瘍細胞を殺傷する能力を有する、骨髄由来の顆粒リンパ球である。ＮＫ細胞
の殺傷および前炎症性活性は、活性または阻害性シグナルのいずれかを媒介し得
る種々の細胞表面レセプターを通じて調節される。最も良好に理解されたレセプ
ターは、細胞表面におけるＭＨＣクラスＩ分子を認識し、そしてネガティブなシ
グナルを送達するレセプターであり、それにより細胞傷害から正常な宿主細胞を
防御する。これらのレセプターは、Ｃ型レクチンスーパーファミリーまたはＩｇ
スーパーファミリーのいずれかに属し得るが、ヒトにおいては、その大部分は、
キラー細胞のＩｇ様レセプター（ＫＩＲ）として公知のＩｇスーパーファミリー
のメンバーである。代表的な使用は、本明細書中の以下の実施例１１、１３、１
４、１６、１８、１９、２０、および２７、ならびに他において、「免疫活性」
および「感染性疾患」のセクションに記載される。要するに、この発現は、血液
幹細胞を含む、造血性細胞系列の増殖；生存；分化；および／または活性化を調
節することにおける役割を示す。サイトカイン産生、抗原提示、または他のプロ
セスの調節における関与は、癌の処置のための有用性（例えば、免疫応答をブー
ストすることによる）を示す。リンパ起源の細胞における発現は、天然の遺伝子
産物が免疫機能に関与することを示す。従って、これはまた、関節炎、喘息、免
疫不全疾患（例えば、ＡＩＤＳ）、白血病、慢性関節リウマチ、慢性肉芽腫症、
炎症性腸疾患、敗血症、挫瘡、好中球減少症、好中球増加症、乾癬、過敏症（例
えば、Ｔ細胞媒介細胞障害）、移植器官および組織への免疫反応（例えば、宿主
対移植片病および移植片対宿主病）、または自己免疫性障害（例えば、自己免疫
不妊症）、水晶体組織傷害、脱髄、全身性エリテマトーデス、薬物誘引溶血性貧
血、慢性関節リウマチ、シェーグレン病、強皮症を含む免疫学的障害のための薬
剤としても有用であり得る。さらに、このタンパク質は、他の血液細胞の分化ま
たは挙動に影響を与えるか、または損傷部位に造血細胞を補充する分泌因子を示
し得る。従って、この遺伝子産物は、様々な血液系統の幹細胞および方向付けら
れた前駆体の拡大ならびに多様な細胞型の分化および／または増殖においてに有
用であると考えられる。このタンパク質の組織分布に基づくと、このタンパク質
に対するアンタゴニストは、このタンパク質の活性をブロックする際に有用であ
る。従って、この遺伝子の翻訳産物の一部を特異的に結合する抗体は好ましい。
【０２１８】 このタンパク質の発現が生じる腫瘍を検出するためのキットもまた提供される
。このようなキットは、１つの実施形態において、固体支持体に結合したこの遺
伝子の翻訳産物に対して特異的な抗体を含む。個体におけるこれらの腫瘍を検出
する方法もまた提供される。この方法は、この遺伝子の翻訳産物に対して特異的
な抗体と、この個体由来の体液（好ましくは、血清）とを接触させる工程、およ
び抗体が体液中で見出された抗原に結合するか否かを確認する工程を包含する。
好ましくは、この抗体は、固体支持体に結合され、そしてこの体液は血清である
。上記の実施形態、ならびに他の処置および診断試験（キットおよび方法）は、
本明細書中他の箇所でより詳細に記載される。さらに、このタンパク質は、栄養
補助物質としてのその用途に加えて、生物学的活性を決定するため、抗体を惹起
するため、組織マーカーとして、同属リガンドまたはレセプターを単離するため
、それらの相互作用を調節する薬剤を同定するためにも使用され得る。タンパク
質、ならびにこのタンパク質に対する抗体は、上記に列挙した組織についての腫
瘍マーカーおよび／または免疫治療の標的としての有用性を示し得る。
【０２１９】 多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号１６に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であった
かもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の
範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、
好ましくは、本発明から、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（こ
こで、ａは配列番号１６の１〜１７３４の任意の整数であり、ｂは１５〜１７４
８の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号１６に示されるヌクレオチ
ド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上
のポリヌクレオチドが除外される。
【０２２０】 （遺伝子番号７によりコードされるタンパク質の特徴） 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドに
よってコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの使用、ならびにそれらの産生に関する。本発明のポリペプチドは、ヒト骨
芽細胞ＩＩ ｃＤＮＡライブラリーに由来するヒトインテグリンα１１ホモログ
として推定的に同定された。より具体的には、本発明のポリペプチドは、ヒトイ
ンテグリンα１１サブユニットホモログ（ときおり、本明細書中以降「インテグ
リンアルファ１１」、「インテグリンアルファ１１サブユニット」、「α１１」
、「(１１」、「(１１サブユニット」、および／または「インテグリンα１１サ
ブユニット」といわれる）として推定的に同定された。本発明はまた、このよう
なポリペプチドの作用を阻害すること関する。
【０２２１】 インテグリンは、非共有結合的に会合するαβヘテロダイマーからなる細胞接
着分子の大きなファミリーである。
【０２２２】 本発明者らは、新規なヒトインテグリンαサブユニットｃＤＮＡ（α１１と称
される）をクローニングし、そして配列決定した。α１１ ｃＤＮＡは、２２ア
ミノ酸のシグナルペプチド、２０７残基のＩドメインを含みかつ膜貫通ドメイン
により２４アミノ酸の短い細胞質ドメインに連結されている大きな１１２０残基
の細胞外ドメインを有するタンパク質コードする。推定されるα１１タンパク質
は、インテグリンαサブユニットの代表的な構造特徴を示し、そしてコラーゲン
結合インテグリンとは異なる群のαサブユニットに類似する。しかし、これは、
不完全に保存された細胞質のＧＦＦＫＲモチーフにより大部分のインテグリンα
鎖とは異なる。
【０２２３】 ヒトＩＴＧＡ１１遺伝子を、第１５染色体のバンドｑ２２．３−２３に位置決
定し、そしてその転写物は、骨、コラーゲン、ならびに心筋および骨格筋におい
て顕著に見出された。５．５ｋｂの全てのｍＲＮＡの発現はまた、卵巣および小
腸において検出可能であった。
【０２２４】 全ての脊椎動物細胞は、細胞接着分子であるインテグリンファミリーのメンバ
ーを発現し、これは、他の細胞および細胞外基層（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｓｕｂｔｒａｔｕｍ）に対する細胞接着、細胞移動を媒介し、そして細胞増殖
および分化へのシグナル伝達に由来する重要な生理学的プロセスに関与する｛Ｈ
ｙｎｅｓ，９２；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，９２｝。
【０２２５】 インテグリンは、今日までに示された、８つのβサブユニットのうちの１つと
１７の異なるαサブユニットのうちの１つとの非共有結合的会合により形成され
、少なくとも２２の異なるαβ複合体を生じる、構造的に相同なヘテロダイマー
Ｉ型膜糖タンパク質である。細胞および細胞外リガンドに対するそれらの結合特
異性は、両方のサブユニットにより決定され、そして細胞環境により、ならびに
細胞の発生および活動状態により、細胞型特異的様式で動的に調節される｛Ｄｉ
ａｍｏｎｄおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ，９４｝。インテグリンαサブユニットにお
いて、大きな細胞外ドメインのアミノ末端領域は、βプロペラドメインに折り畳
みされると予測される７回反復構造からなる｛Ｃｏｒｂｉら，１９８７；Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ，１９９７｝。３回または４回のＣ末端反復は、リガンド結合および
サブユニット会合のために重要と考えられる推定二価カチオン結合モチーフを含
む｛ＤｉａｍｏｎｄおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ，９４｝。α１、α２、α１０、α
Ｄ、αＥ、αＬ、αＭおよびαＸのサブユニットは、他のα鎖には存在しない第
２の繰り返しと第３の繰り返しとの間に挿入された約２００のアミノ酸Ｉ−ドメ
インを含む｛Ｌａｒｓｏｎら，１９８９｝。いくつかの単離されたＩ−ドメイン
は、親インテグリンヘテロダイマーのリガンドを独立して結合することを示した
｛ＫａｍａｔａおよびＴａｋａｄａ，１９９４；ＲａｎｄｉおよびＨｏｇｇ，１
９９４｝。α３、α５〜８、αＩＩｂおよびαＶのサブユニットは、保存された
部位でジスルフィド結合した重鎖および軽鎖にタンパク質分解的にプロセシング
されるが、α４−サブユニットは、非共有的に会合したままである２つのフラグ
メントへとよりアミノ末端部位で切断される｛Ｈｅｍｌｅｒら，９０｝。さらな
るαサブユニット改変体は、一次転写物の選択的スプライシングにより生成され
る｛Ｚｉｏｂｅｒら，９３；Ｄｅｌｗｅｌら，９５；Ｌｅｕｎｇら，９８｝。
【０２２６】 αインテグリンサブユニットの細胞外ドメインは、１つの膜貫通ドメイン（ｓ
ｐａｎｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）から、わずかに
保存された特徴が膜近位のＫＸＧＦＦ（Ｋ／Ｒ）Ｒモチーフである、短く、多様
な細胞質ドメインにより接続される｛ＳａｓｔｒｙおよびＨｏｒｗｉｔｚ，１９
９３｝。細胞質ドメインは、インテグリン親和性状態の細胞型特異的調節に関与
した｛Ｗｉｌｌｉａｍｓら，１９９４｝。
【０２２７】 本発明のポリペプチドは、インテグリンファミリーのメンバーとして推定的に
同定され、そしてインテグリンα１１サブユニット（「α１１」）と称されてい
る。この同定は、ヒトインテグリンα１サブユニット（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号
ｇｉ｜３４６２１０を参照のこと）に対するアミノ酸相同性の結果として行われ
た。
【０２２８】 図１９Ａ〜Ｆは、α１１のヌクレオチド配列（配列番号１７）および推定アミ
ノ酸配列（配列番号３５）を示す。約１〜約２２の推定アミノ酸は、予測される
シグナルペプチドを構成し（配列番号３５において約１〜約２２のアミノ酸残基
）、そして下線を付したアミノ酸領域により表される；約６６６〜約６８２のア
ミノ酸および／または約１１４５〜約１１６１のアミノ酸は、推定膜貫通領域（
配列番号３５において約６６６〜約６８２のアミノ酸および／または約１１４５
〜約１１６１のアミノ酸）を構成し、そして二重下線を付したアミノ酸により表
され；そして約６４〜約９６のアミノ酸は、推定免疫グロブリンおよび主要組織
適合性複合体タンパク質ドメイン（配列番号３５における約６４〜約９６のアミ
ノ酸）を構成し、そして太字のアミノ酸により表される。
【０２２９】 図２０は、インテグリンα１１サブユニット（ａ１１）タンパク質のアミノ酸
配列（配列番号３５）とヒトインテグリンα１サブユニットのアミノ酸配列（配
列番号１０３）との間の類似性の領域を示す。
【０２３０】 図２１は、インテグリンα１１サブユニット（ａ１１）アミノ酸配列の分析を
示す。α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；親水性領域および疎水性
領域；両親媒性領域；可撓性領域；するポリヌクレオチドは、ヒト卵巣、小腸、
胎児心臓、胎児脳、大腸、骨芽細胞抗原性指数および表面確率が示される。
【０２３１】 本発明のポリペプチドをコード、ヒト小柱（ｔｒａｂｅｌｃｕｌａｒ）骨細胞
、血管間膜細胞（ｍｅｓｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌ）、脂肪細胞、骨肉腫、軟骨
肉腫、乳癌細胞、ならびに骨髄組織および細胞から得られる。本発明のポリヌク
レオチドは、ヒト骨芽細胞ＩＩ ｃＤＮＡライブラリーにおいて発見された。こ
の翻訳産物は、特徴的な免疫グロブリンおよびインテグリンファミリーメンバー
の主要組織適合性複合タンパクドメインに対する相同性を有する。図１９Ａ〜Ｆ
に示されるように、ａ１１は、インテグリンファミリーの他のメンバーの間での
強力な保存性を伴う膜貫通ドメインを有する（膜貫通ドメインは、配列番号３５
のアミノ酸６６６〜６８２および／または１１４５〜１１６１を含む；これは、
図１９Ａ〜Ｆのアミノ酸６６６から６８２および／または１１４５〜１１６１に
対応する）。このポリヌクレオチドは、１１８９個のアミノ酸のａ１１ポリペプ
チドをコードするオープンリーディングフレームを含む。本発明は、ヒトインテ
グリンα１サブユニットに対するアミノ酸レベルでの高い程度の相同性を示す（
図２０に示される）。
【０２３２】 本発明の好ましいポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む：ＴＮＧＹＱＫ
ＴＧＤＶＹＫＣＰＶＩＨＧＮＣＴＫＬＮＬＧＲＶＴＬＳＮＶ（配列番号１０２）
。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０２３３】 本発明は、図１９Ａ〜Ｆに示されるアミノ酸配列（配列番号３５）を有するａ
１１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提
供する。図１９ＡからＦに示されるヌクレオチド配列（配列番号３５）は、クロ
ーニングされたｃＤＮＡ（ＨＯＨＢＹ６９）を配列決定することによって得られ
た。このｃＤＮＡは、１１月１７日にアメリカンタイプカルチャーコレクション
に寄託され、そして受託番号２０３４８４が与えられた。
【０２３４】 本発明はさらに、本明細書中に記載された、単離された核酸分子のフラグメン
トに関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１７で示さ
れたヌクレオチド配列を有する単離されたＤＮＡ分子のフラグメントは、本明細
書中に記載される診断プローブおよびプライマーとして有用である、長さが少な
くとも約１５ｎｔ、より好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましく
は少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおさらに好ましくは少なくとも約４０ｎｔの
ＤＮＡフラグメントを意図する。当然、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列
または、配列番号１７に示されるようなヌクレオチド配列の、全てではなくても
、ほとんどに対応するフラグメントであるように長さが５０〜１５００ｎｔより
長いフラグメントもまた、本発明によれば有用である。例えば、長さが少なくと
も２０ｎｔのフラグメントは、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配
列番号１７に示されるようなヌクレオチド配列からの２０以上の連続塩基を含む
フラグメントを意図する。この状況において、「約」は、いずれかの末端もしく
は両方の末端で、いくつか（５、４、３、２、もしくは１個）のヌクレオチドだ
けより大きいかまたはより小さい、具体的に示される大きさを含む。本発明のａ
１１ポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例えば、配列番号１７の
以下の配列：
【０２３５】
【化５６】
【０２３６】
【化５７】
【０２３７】
【化５８】 またはこれらに対する相補鎖配列、あるいは寄託された遺伝子に含まれるｃＤＮ
Ａの配列を含むか、あるいは、これらからなるフラグメントが挙げられる。この
状況において、「約」は、いずれかの末端もしくは両方の末端で、いくつか（５
、４、３、２、もしくは１個）のヌクレオチドだけより大きいかまたはより小さ
い、具体的に示される範囲を含む。
【０２３８】 本発明の好ましい核酸フラグメントとしては、以下からなる群から選択される
メンバーをコードする核酸分子が挙げられる：免疫グロブリンおよび主組織適合
性複合タンパク質ドメイン（図１９Ａ〜Ｆの約６４〜約９６のアミノ酸残基（配
列番号３５の約６４〜約９６のアミノ酸））に加えて、膜貫通ドメイン（図１９
Ａ〜Ｆの約６６６〜約６８２および／または１１４５〜約１１６１のアミノ酸残
基（配列番号３５の約６６６〜約６８２および／または１１４５〜約１１６１の
アミノ酸））のいずれか１つを含むか、あるいはそれからなるポリペプチド。こ
れらのドメインの位置がコンピュータ分析によって予測されているので、当業者
は、これらのドメインを構成するアミノ酸残基が各ドメインを規定するために使
用される基準に依存してわずかに（例えば、約１〜１５個のアミノ酸残基だけ）
変化され得ることを理解する。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレ
オチドはａ１１の機能特性をコードする。
【０２３９】 この観点から本発明の好ましい実施形態は、本発明のαヘリックスおよびαヘ
リックス形成領域（「α領域」）、βシートおよびβシート形成領域（「β領域
」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形
成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親
媒性領域、可撓性領域、表面形成領域および本発明の抗原性指数の高い領域を含
むフラグメントを含む。
【０２４０】 上記のように、図２１および／または表ＶＩＩに記載されるａ１１の構造特性
または機能特性を示すデータは、種々のモジュールならびにデフォルトパラメー
タに設定されたＤＮＡ*ＳＴＡＲのアルゴリズムを使用して生成された。好まし
い実施形態において、表ＶＩＩの欄ＸＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、およびＸＩＶに
示されるデータが使用され、抗原性について高い程度の可能性を示すａ１１の領
域を決定し得る。高抗原性の領域は、欄ＶＩＩＩ、ＩＸ，ＸＩＩＩおよび／また
はＸＩＶに示されるデータから、抗原認識が免疫応答の阻害のプロセスで起こり
得る環境中に存在するポリペプチドの表面に恐らく露出されるポリペプチドの領
域を表す値を選択することによって決定される。
【０２４１】 これらの観点から特定の好ましい領域を図２１に示すが、表ＶＩＩに示される
ように、図２１で示した表の提示を使用して表され得るか、または同定され得る
。図２１を作成するために使用されたＤＮＡ*ＳＴＡＲコンピュータアルゴリズ
ム（もともとのデフォルトパラメータに設定されている）が、表形式で図２１の
データを示すために使用された（表ＶＩＩを参照のこと）。表形式の図２１のデ
ータは、好ましい領域の特定の境界を容易に決定するために使用される。図２１
および表ＶＩＩに記載された上述の好ましい領域としては、図１９Ａ〜Ｆに記載
されるアミノ酸配列の分析によって同定される上述の型の領域が挙げられるが、
これらに限定されない。図２１および表ＶＩＩに記載されるように、このような
好ましい領域としては、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα領域、β領域、ター
ン領域、およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα領域、β領域、および
ターン領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域ならびにＨｏｐｐ−Ｗ
ｏｏｄｓの疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのα両親媒性領域およびβ両親媒性
領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可撓性領域、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ
の抗原性指数の高い領域ならびにＥｍｉｎｉの表面形成領域が挙げられる。タン
パク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、このタンパク質の１つ以上
の生物学的機能の損失の改変を生じる場合でも、他の機能活性（例えば、生物学
的活性、多量化する能力など）がさらに保持され得る。例えば、ポリペプチドの
完全形態もしくは成熟形態を認識する抗体を誘導し、そして／またはそれを認識
する抗体に結合する、短縮されたａ１１ムテインの能力は、一般に、完全なポリ
ペプチドもしくは成熟ポリペプチドの残基の過半数がＮ末端から除去されるとき
に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこ
のような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載された慣用的な方
法、当該分野で公知のそれ以外の方法によって容易に決定され得る。多数のＮ末
端アミノ酸残基が欠失したａ１１ムテインが、いくらかの生物学的活性または免
疫原生活性を保持し得ないようである。実際、わずか６つのａ１１アミノ酸残基
から構成されるペプチドは、しばしば、免疫反応を応答し得る。
【０２４２】 従って、本発明は、さらに、図１９Ａ〜Ｆに示されるａｌｌアミノ酸配列のア
ミノ末端から位置番号１１８４におけるスレオニン残基までの１つ以上の残基が
欠失したポリペプチドならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドを提供する。特に、本発明は、図１９Ａ〜Ｆの残基ｎ１〜１１８９（ここ
でｎ１は、図１９Ａ〜Ｆのアミノ酸残基の位置に対応する２〜１１８４の整数で
ある）のアミノ酸配列（これは配列番号３５として示される配列と同一である）
を含むポリペプチドを提供する。別の実施形態において、ａ１１ポリペプチドの
Ｎ末端欠失は、一般式ｎ２〜１１８９（ここで、ｎ２は２〜１１８４の数であり
、図１９に同定されたアミノ酸の位置に対応する）で記載され得る。配列番号３
５として示される本発明のａ１１ポリペプチドのＮ末端欠失は、以下の残基のア
ミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：配列番号３５として示される本発明のａ
１１ポリペプチドのＮ末端欠失は、以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドを含む：配列番号３５の
【０２４３】
【化５９】
【０２４４】
【化６０】
【０２４５】
【化６１】
【０２４６】
【化６２】
【０２４７】
【化６３】
【０２４８】
【化６４】
【０２４９】
【化６５】
【０２５０】
【化６６】
【０２５１】
【化６７】
【０２５２】
【化６８】 。これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはまた、本発明
に包含される。
【０２５３】 また上記のように、タンパク質のＣ末端からの１以上のアミノ酸の欠失が、こ
のタンパク質の１以上の生物学的活性の改変または損失を生じる場合でも、他の
機能的活性（例えば、生物学的活性（例えば、正常細胞または悪性細胞のマイト
ジェン活性化を禁制にして（ｉｌｌｉｃｉｔ）、分化を誘導する能力、多量体化
する能力など））が、なお保持され得る。例えば、短縮ａ１１ムテインがポリペ
プチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導および／または結合する
能力は、一般に、完全または成熟ポリペプチドの残基の過半数未満がこのＣ末端
から除去される場合に保持される。完全ポリペプチドのＣ末端残基を欠損してい
る特定のポリペプチドが、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細
書中に記載される慣用的な方法、および当該分野において公知の他のものによっ
て、容易に決定され得る。多数の欠失したＣ末端アミノ酸残基を有するａ１１ム
テインは、いくらかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し得るようではな
い。実際、６個程度の少なさのアミノ酸残基から構成されるペプチドは、しばし
ば、免疫応答を誘発し得る。
【０２５４】 従って、本発明はさらに、図１９Ａ〜Ｆに示されるａ１１ポリペプチドのアミ
ノ酸配列のカルボキシ末端から、位置番号６のグリシンまでを欠失した１以上の
残基を有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを提供する。特に、本発明は、図１９Ａ〜Ｆの残基１〜ｍ１のアミノ
酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここでｍ１は、図１９〜Ｆにおけるアミノ
酸残基の位置に対応する、６〜１１８９の整数である。さらに、本発明は、配列
番号３５として示される本発明のａ１１ポリペプチドのＣ末端欠失のアミノ酸を
含む、あるいはそれらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提
供する。これらのポリペプチドは、以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドを含む：
【０２５５】
【化６９】
【０２５６】
【化７０】
【０２５７】
【化７１】
【０２５８】
【化７２】
【０２５９】
【化７３】
【０２６０】
【化７４】
【０２６１】
【化７５】
【０２６２】
【化７６】
【０２６３】
【化７７】 。これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明
に含まれる。
【０２６４】 さらに、本発明は、以下の関連ｃＤＮＡ遺伝子から決定された、配列番号１７
の広範な部分に関連するヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する。
【０２６５】
【化７８】 。
【０２６６】 ヒトインテグリンα１サブユニットに対する配列類似性に基づくと、この遺伝
子の翻訳産物は、インテグリンタンパク質、および特に、インテグリンα１タン
パク質と、少なくともいくらかの生物学的活性を共有すると予測される。このよ
うな活性は、当該分野において公知であり、これらのうちのいくつかは、本明細
書の他の箇所に記載されている。
【０２６７】 特に、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはまた、正常細胞および
悪性細胞の分化を調整するために、癌細胞および腫瘍性細胞の増殖および／また
は分化を調整するために、ならびに免疫応答を調整するために有用である。本発
明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、造血疾患および／または造血障害
、ならびに免疫疾患および／または免疫障害に対する診断マーカーを示し得る。
全長タンパク質は、インテグリンファミリーに対する相同性に起因して、分泌タ
ンパク質であるはずである。従って、これは、血清、尿、または糞便中に分泌さ
れ、それによってこのレベルは、患者サンプルからアッセイ可能である。特定の
発現レベルは、免疫障害の存在を反映すると仮定すると、このタンパク質は、早
期検出のために簡便な診断を提供する。さらに、この遺伝子産物の発現はまた、
免疫障害の進行と関連付けられ、それによりそれ自体、実際には、癌の処置に対
する治療または治療標的を表す。
【０２６８】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒト癌および細胞の形質転
換の病因、特に、免疫系および造血系の病因に重要な役割を果たし得る。本発明
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはまた、細胞型および組織細胞型の増殖
および分化に対するその潜在的な効果に基づく、発生異常の病因に関与し得る。
上記のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの潜在的な増殖および分化活性に起
因して、本発明は、炎症性状態（例えば、炎症性腸症候群、憩室炎など）を処置
するために、組織再生を誘導する際に、治療剤として有用である。さらに、本発
明は、迅速に増殖している細胞型および組織細胞型において、特に腺癌細胞、お
よび他の癌において存在し得るように、異常なポリペプチドに対する免疫応答を
調整する際に有用である。
【０２６９】 あるいは、増殖している細胞により注目される細胞供給源内での発現は、この
タンパク質が細胞分裂の調節に役割を果たし得、そして発達疾患および発達障害
（癌、および他の増殖状態を含む）の診断、処置、および／または予防に有用性
を示し得ることを示す。代表的な使用は、以下の「過剰増殖障害」および「再生
」の節、ならびに本明細書中の他の箇所に記載される。簡潔には、発達組織は、
パターン形成における細胞分化および／またはアポトーシスに関与する決定に依
存する。
【０２７０】 アポトーシスの調節不全は、いくつかの癌の発達において生じるような、細胞
死の不適切な抑制を生じ得るか、または後天性免疫不全および特定の神経変性障
害（例えば、棘筋萎縮症（ＳＭＡ））において生じると考えられるような、細胞
死の程度の制御の失敗を生じ得る。
【０２７１】 あるいは、この遺伝子産物は、初期の胚発生に伴う細胞増殖のパターンに関与
する。従って、組織（特に、成体組織）におけるこの遺伝子産物の異常な発現は
、異常な細胞増殖のパターン（種々の癌において見出されるような）と関連し得
る。増殖および分化における潜在的な役割を果たすという理由から、この遺伝子
産物は、組織再生および癌の処置のために成体における適用を有し得る。それは
また、細胞型および組織型の特異化を制御するためのモルフォゲンとして作用し
得る。従って、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、他の型の変性
状態に加えて、上述の障害および状態を処置、検出、および／または予防する際
に有用である。従って、このタンパク質は、アポトーシスおよび組織分化を調節
し得、そして変性状態および変性疾患または増殖状態および増殖疾患の検出、処
置、および／または予防において有用である。このタンパク質は、異常なポリペ
プチドに対する免疫応答を調節する際に有用であり、増殖細胞および増殖組織な
らびに癌性細胞および癌性組織に存在し得る。このタンパク質はまた、細胞成長
および増殖の調節について新規の洞察を得るために使用され得る。さらに、この
タンパク質はまた、栄養補給剤としてのその使用に加えて、生物学的活性を決定
するために、抗体を惹起するために、組織マーカーとして、同属のリガンドまた
はレセプターを単離するために、それらの相互作用を調節する薬剤を同定するた
めに使用され得る。タンパク質ならびにこのタンパク質に対する抗体は、上記に
挙げられた組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療の標的として有用
性を示し得る この遺伝子は、骨芽細胞、ヒト柵状織骨細胞、糸球体間質（ｍｅｓｓａｎｇｉ
ａｌ）細胞、脂肪細胞において、ならびにより少ない程度で骨肉腫、軟骨肉腫、
乳癌細胞および骨髄においてほとんど独占的に発現される。
【０２７２】 従って、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル
に存在する組織または細胞型の示差的同定のための試薬として、および以下の疾
患および状態（これには骨格系、結合組織の障害、ならびに免疫および造血性疾
患および／または障害が挙げられるが、これらに限定されない）の診断のための
試薬として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに特
異的な抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブを提供
するために有用である。上記組織または細胞、特に結合組織および骨格系の多く
の障害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち、障害を有さない個体由来
の健常組織の発現レベル）に対して有意に高いまたは低いレベルのこの遺伝子の
発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型
（例えば、免疫組織、造血組織、骨格組織、骨組織、軟骨組織、発生組織、生殖
組織、分泌組織ならびに癌性組織および創傷組織）または体液もしくは細胞型（
例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液または髄液）、または別の組織もしくは
細胞サンプルの中で、検出される。
【０２７３】 本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号３５において残基：
【０２７４】
【化７９】 として示される免疫原性エピトープを含む。このポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドもまた、提供される。
【０２７５】 骨芽細胞における組織分布およびインテグリンαサブユニット１０に対する相
同性は、この遺伝子のタンパク質産物が、骨格系、特に骨粗鬆症ならびに結合組
織を冒す障害（例えば、関節炎、外傷、腱炎、軟骨軟化（ｃｈｒｏｎｄｏｍａｌ
ａｃｉａ）および炎症）に影響を及ぼす障害および状態の処置、例えば、種々の
自己免疫障害（例えば、慢性関節リウマチ、狼瘡、強皮症および皮膚真菌症）な
らびに小人症、脊椎変形、および特定の関節異常、ならびに軟骨形成不全（すな
わち、先天性脊椎骨端形成異常、家族性変形性関節症、ＩＩ型骨形成不全（Ａｔ
ｅｌｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｙｐｅ ＩＩ）、シュミット型骨幹端軟骨形
成不全））の診断および処置に有用であることを示す。間質細胞は造血系統の細
胞の産生において重要であるので、この遺伝子に対応するポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドは、造血関連障害（例えば、貧血、汎血球減少症、白血球減少症
、血小板減少症または白血病）の処置および診断に有用である。骨髄細胞におけ
る組織分布と関連して、そのような用途は、インテグリンファミリーメンバーに
対して観察される相同性と一貫している。インテグリンは、細胞移動、炎症、増
殖、および細胞浸潤において中心的な役割を果たす。従って、本発明は、少なく
ともいくつかのこれらの活性を共有することが予期される。代表的な用途は、以
下の「免疫活性」および「感染性疾患」の節、実施例１１、１３、１４、１６、
１８、１９、２０および２７、ならびに本明細書中の他の箇所に記載される。簡
潔には、その用途は、骨髄細胞のエキソビボ培養、骨髄移植、骨髄再構成、新生
物形成の放射線治療または化学療法を含む。従って、この遺伝子産物はまた、リ
ンパ球新生に関与し、それは、感染、炎症、アレルギー、免疫不全などのような
免疫障害において使用され得る。さらに、この遺伝子産物は、種々の血液系統の
幹細胞および方向付けられた前駆体（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏ
ｒ）の拡張において、ならびに種々の細胞型の分化および／または増殖における
商業的有用性を有し得る。このタンパク質の組織分布に基づいて、このタンパク
質に対して方向づけられるアンタゴニストは、このタンパク質の活性をブロック
する際に有用である。従って、この遺伝子の翻訳産物の一部に特異的に結合する
抗体が好ましい。
【０２７６】 このタンパク質の発現が生じる腫瘍を検出するためのキットもまた、提供され
る。１つの実施形態において、そのようなキットは、固体支持体に結合されるこ
の遺伝子の翻訳産物に対して特異的な抗体を含む。個体におけるこれらの腫瘍を
検出する方法もまた提供され、その方法は、この遺伝子の翻訳産物に対して特異
的な抗体を個体由来の体液（好ましくは、血清）と接触させる工程を包含し、そ
して抗体が体液中に見出される抗原と結合するか否かを確認する。好ましくは、
この抗体は、固体支持体と結合され、そして体液は血清である。上記の実施形態
ならびに他の処置および診断試験（キットおよび方法）は、本明細書中の他の箇
所により詳しく記載される。さらに、このタンパク質はまた、栄養補給剤として
のその使用に加えて、生物学的活性を決定するために、抗体を惹起するために、
組織マーカーとして、同属のリガンドまたはレセプターを単離するために、それ
らの相互作用を調節する薬剤を同定するために使用され得る。タンパク質ならび
にこのタンパク質に対して方向付けられた抗体は、上記に挙げられた組織に対す
る腫瘍マーカーおよび／または免疫治療の標的として有用性を示し得る。多くの
ポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり、そして
配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつかは、配
列番号１７に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったかもしれ
ない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範囲から
特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好ましく
は、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここで、
ａは配列番号１７の１〜４９８１の任意の整数であり、ｂは１５〜４９９５の整
数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号１７に示されるヌクレオチド残基
の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポリ
ヌクレオチドが除外される。
【０２７７】 （遺伝子番号８によってコードされるタンパク質の特徴） 本発明は、ケラチノサイト、創傷治癒組織および軟骨肉腫組織により発現され
る３つの新規ペプチドグリカン認識結合タンパク質に関する。より詳細には、ヒ
トペプチドグリカン認識タンパク質関連タンパク質をコードする単離された核酸
分子が提供され、時折、本明細書中において「ヒトｔａｇ７」または「ｔａｇ７
」または「ｈｔａｇ７」として言及される。さらに、ベクター、宿主細胞および
同じものを産生するための組換え方法が提供される。本発明はまた、ｔａｇ７タ
ンパク質、ポリペプチドの活性の阻害および増強ならびにｔａｇ７遺伝子発現を
検出するための診断方法の両方に関する。
【０２７８】 ペプチドグリカンならびにリポ多糖（ＬＰＳ）は、ヒトにおいて、広範な生理
および免疫応答を誘発する（ｉｌｌｉｃｉｔ）多くの細菌の表面成分である。詳
細には、ペプチドグリカンは、ほとんどの細菌感染（熱、急性期応答、炎症、敗
血症性ショック、白血球増加症、眠気、倦怠感、膿瘍（ａｂｃｅｓｓ）形成およ
び関節炎（Ｄｚｉａｒｓｋｉら、ＪＢＣ、２７３（１５）：８６８０（１９９８
）を参照のこと）を含む）の徴候を再現することによりそれ自体を臨床的に明ら
かにするために示されてきた。さらに、この型のペプチドグリカン（すなわち、
ムラミルジペプチド、Ｎ−アセチルグルコサミニル−β（１−４）−Ｎ−アセチ
ルムラミルテトラペプチドなどの特定の立体異性体またはアナログ）は、広範な
活性（より大きな発熱性を示すこと、急性関節炎を誘導すること、マクロファー
ジを刺激すること、および初回刺激部位において出血性壊死を引き起こすこと（
Ｋｏｔａｎｉら、Ｆｅｄ Ｐｒｏｃ、４５（１１）：２５３４（１９８６）を参
照のこと）を含む）を誘発することを示された。ヒトにおいて、微量血漿タンパ
ク質として発見されたリポ多糖結合タンパク質が存在することが実証されている
（Ｓｃｈｕｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９（４９７５）：１４２９（１９
９０）を参照のこと）。このリポ多糖結合タンパク質が機能する１つの作用の様
式は、リポ多糖と高い親和性の複合体を形成することによるものであり、次いで
、それはマクロファージおよび単球と結合し、腫瘍壊死因子の分泌を誘導する。
ＤｚｉａｒｓｋｉおよびＧｕｐｔａ（Ｄｚｉａｒｓｋｉら、ＪＢＣ、２６９（３
）：２１００（１９９４）を参照のこと）は、７０ｋＤａのレセプタータンパク
質が、ヘパリン、ヘパリノイド（ｈｅｐａｒｉｎｏｉｄ）、細菌性リポテイコ酸
、ペプチドグリカン、およびリポ多糖を結合するために供給されたマウスリンパ
球の表面に存在することを実証した。最近、Ｄｚｉａｒｓｋｉらが、ＣＤ１４、
グリコシルホスファチジルイノシトール連結タンパク質が、マクロファージ、多
形核白血球、結合したペプチドグリカンおよびリポ多糖の表面上に存在すること
を実証した。
【０２７９】 さらに、ＣＤ１４のリポ多糖に対する結合親和性は、血漿中に存在するＬＰＳ
結合タンパク質の存在下において有意に増加された。ＬＰＳ結合タンパク質は転
移分子として機能し、それによって、ＬＰＳ結合タンパク質はＬＰＳを結合し、
そしてＬＰＳをＣＤ１４レセプターに提示すると考えられる（Ｄｚｉａｒｓｋｉ
ら、ＪＢＣ、２７３（１５）：８６８０（１９９８）を参照のこと）。Ｙｏｓｈ
ｉｄａらは、カラムクロマトグラフィーを使用して、ペプチドグリカン結合タン
パク質をカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）の血リンパから単離した。このタン
パク質は、ペプチドグリカンに対して非常に特異的な親和性を有すること見い出
された（Ｙｏｓｈｉｄａら、ＪＢＣ、２７１（２３）：１３８５４（１９９６）
を参照のこと）。
【０２８０】 さらにＫａｎｇらは、最近ペプチドグリカン結合タンパク質をガ（Ｔｒｉｃ
ｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）からクローン化した。このペプチドグリカン結合タン
パク質は、不溶性のペプチドグリカンと強く結合することが示された（Ｋａｎｇ
ら、ＰＮＡＳ、９５（１７）：１００７８（１９９８）を参照のこと）。この研
究において、ペプチドグリカン結合タンパク質は、Ｔ．ｎｉにおいて細菌感染に
よって上方制御された。昆虫の免疫系は、先天性免疫についてのモデルとして見
なされる。従って、Ｋａｎｇらは、Ｔ．ｎｉペプチドグリカン結合タンパク質の
マウスホモログおよびヒトホモログの両方の遺伝子をクローン化し得た。すべて
のこれらのペプチドグリカン結合タンパク質は、おそらく、結合ドメインを形成
するために役に立つ相同性領域ならびにこのタンパク質の３次構造において機能
し得る４つの保存されたシステイン残基の領域を共有していた。ペプチドグリカ
ンが、細菌細胞壁の絶対必要な成分であり、そしてそれが、炎症およびマクロフ
ァージ活性化に対してサイトカイン分泌に由来する多くの生理学的応答を誘導す
ると仮定すると、あたかもこのタンパク質のファミリーは、ペプチドグリカンの
結合および認識、抗原の提示（例えば、細胞壁成分など）、および免疫系の活性
化（例えば、ＴＮＦのようなサイトカインの分泌）に関与する偏在性の群である
ように見える。ＴＮＦは、組織障害（例えば、血管性内皮細胞における凝血原活
性の誘導（Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：１６８０（
１９８６））、増加した好中球およびリンパ球の接着（Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：３３１９（１９８７））、ならびにマクロファ
ージ、好中球および血管性内皮細胞由来の血小板活性化因子の放出の刺激（Ｃａ
ｍｕｓｓｉ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３９０（１９８７）））
を生じるプロ炎症性作用について注目される。
【０２８１】 最近の文献は、多くの感染の病原（Ｃｅｒａｍｉ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｔｏｄａｙ ９：２８（１９８８））、免疫障害、腫瘍性病理学（例えば、いく
つかの悪性腫瘍を伴う悪液質において（Ｏｌｉｆｆ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ５０：
５５５（１９８７））、ならびに自己免疫病理学および移植片対宿主病理学（Ｐ
ｉｇｕｅｔ，Ｐ．−Ｆ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１２８０（１９８７
））において、ＴＮＦを関係付けている。癌および感染病理学とＴＮＦとの関連
性は、しばしば宿主の異化状態に関連している。癌患者における主要な問題は、
体重減少であり、通常、食欲不振に関連している。生じるこの広範な消耗は、「
悪液質」として知られる（Ｋｅｒｎ，Ｋ．Ａ．ら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｅｎｔｅ
ｒ．Ｎｕｔｒ．１２：２８６−２９８（１９８８））。悪液質は、進行性の体重
減少、食欲不振、および悪性腫瘍の増殖に対する応答におけるボディマスの持続
性の侵食を含む。従って、悪液性状態は有意な罹患率に関連し、そして大多数の
癌死亡率の原因である。
【０２８２】 多くの研究が、ＴＮＦは、癌、感染病理学、および他の異化状態における悪液
質の重要な媒介物であることを示唆してきた。ＴＮＦは、グラム陰性敗血症およ
び内毒素ショック（熱、倦怠感、食欲不振、および悪液質を含む）の病態生理学
的な結果において中心的な役割を果たすと考えられる（Ｍｉｃｈｉｅ，Ｈ．Ｒ．
ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．７６：６７０−６７１（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓ，
Ｊ．Ｍ．Ｈ．ら、Ｓｅｃｏｎｄ Ｖｉｅｎｎａ Ｓｈｏｃｋ Ｆｏｒｕｍ，４６
３−４６６頁（１９８９）；Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｑ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ
Ｃｌｉｎ．５：２７−４７（１９８９））。エンドトキシンは、ＴＮＦ（Ｋｏ
ｒｎｂｌｕｔｈ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：２５８５−２５９
１（１９８６））および他のサイトカインの産生および分泌を刺激する強力な単
球／マクロファージ活性化因子である。なぜなら、ＴＮＦは、エンドトキシンの
多くの生物学的効果を模倣し得るので、エンドトキシンに関連する病気の臨床症
状に対する原因である中心的な媒介物であることが結論付けられた。ＴＮＦおよ
び他のサイトカイン由来の単球は、エンドトキシンに対する代謝性応答および神
経ホルモン応答を媒介する（Ｍｉｃｈｉｅ，Ｈ．Ｒ．ら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅ
ｄ．３１８：１４８１−１４８６（１９８８））。ヒト任意行為者に対するエン
ドトキシン投与は、インフルエンザ様症状（熱、頻脈、増加した代謝率およびス
トレスホルモン放出を含む）を伴う急性の病気を生じる（Ｒｅｖｈａｕｇ，Ａ．
ら、Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１２３：１６２−１７０（１９８８））。循環するＴ
ＮＦの増大したレベルはまた、グラム陰性敗血症を罹患する患者において見出さ
れてきた（Ｗａａｇｅ，Ａ．ら、Ｌａｎｃｅｔ ｌ：３５５−３５７（１９８７
））；Ｈａｍｍｅｒｌｅ，Ａ．Ｆ．ら、Ｓｅｃｏｎｄ Ｖｉｅｎｎａ Ｓｈｏｃ
ｋ Ｆｏｒｕｍ ７１５−７１８頁（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈ．
ら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１７：４８９−４９７（１９８９）；Ｃａｌ
ａｎｄｒａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１６１：９８２−９８７（１９
９０））。上記で議論されるように、増加したＴＮＦ産生およびこれらの病理状
態における増大したＴＮＦレベルに基づくと、ＴＮＦを中和することに方向付け
られる受動的な免疫治療は、グラム陰性敗血症および内毒血症において有益な効
果を有し得る。
【０２８３】 カケクチン（後に、ＴＮＦと同一であることが見出された）として特徴づけら
れた「修飾因子」物質に対する抗体が、Ｃｅｒａｍｉらにより開示された。（Ｅ
ＰＯ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｉｃａｔｉｏｎ ０，２１２，４８９，１９８７年
３月４日）。このような抗体は、診断的免疫アッセイおよび細菌感染におけるシ
ョックの治療において有用であると言われた。Ｒｕｂｉｎら（ＥＰＯ Ｐａｔｅ
ｎｔ Ｐｕｂｉｃａｔｉｏｎ ０，２１８，８６８，１９８７年４月２２日）は
、ヒトＴＮＦに対するモノクローナル抗体、このような抗体を分泌するハイブリ
ドーマ、そのような抗体を産生する方法、およびＴＮＦの免疫アッセイにおける
そのような抗体の用途を開示した。Ｙｏｎｅら（ＥＰＯ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂ
ｉｃａｔｉｏｎ ０，２８８，０８８，１９８８年１０月２６日）は、抗ＴＮＦ
抗体（ｍＡｂｓを含む）および病理の免疫アッセイ診断における抗ＴＮＦ抗体の
利用（特に、Ｋａｗａｓａｋｉの病理および細菌感染において）を開示した。Ｋ
ａｗａｓｋｉの病理を伴う患者の体液（小児急性熱皮膚粘膜リンパ節症候群；Ｋ
ａｗａｓａｋｉ，Ｔ．、Ａｌｌｅｒｇｙ １６：１７８（１９６７）；Ｋａｗａ
ｓａｋｉ，Ｔ．、Ｓｈｏｎｉｃａ（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）２６：９３５（１９
８５））は、病理の進行に関連した増大したＴＮＦレベルを含むと言われた（Ｙ
ｏｎｅら、前出）。
【０２８４】 従って、病理条件に関与する分子を提供する必要性が存在する。このような新
規のタンパク質は、免疫認識、抗原提示、および免疫系の活性化のような分野に
おける免疫系を増大させる際に有用であり得る。これらのタンパク質に対して方
向づけられた抗体またはアンタゴニストは、ＴＮＦおよびＴＮＦ様サイトカイン
に関連する障害（例えば、内毒素ショックおよび自己免疫障害）を減少または除
去する際に有用である。
【０２８５】 本発明のポリペプチドは、新規ペプチドグリカン認識結合タンパク質ファミリ
ーのメンバーとして推定的に同定され、そしてヒトｔａｇ７と呼ばれている。こ
の同定は、マウスｔａｇ７に対するアミノ酸配列相同性の結果としてなされてい
る（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｅｍｂ｜ＣＡＡ６０１３３を参照のこと）。
【０２８６】 図３４は、ｈｔａｇ７のヌクレオチド配列（配列番号１８）および推定された
アミノ酸配列（配列番号３６）を示す。約１〜約２１の推定アミノ酸は推定シグ
ナルペプチドを構成し（配列番号３６における約１〜約２１のアミノ酸残基）、
そして下線のアミノ酸領域によって表され、ならびに約３４〜約１１７のアミノ
酸は、推定ＰＧＲＰ様ドメインを構成し（配列番号３６の約３４〜約１１７のア
ミノ酸）、そして二重下線のアミノ酸によって表される。
【０２８７】 図３５は、ｈｔａｇ７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３６）とマウスｔ
ａｇ７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１４）との間の類似する領域を示
す。
【０２８８】 図３６は、ｈｔａｇ７アミノ酸配列の分析を示す。α領域、β領域、ターン領
域およびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性
指標および表面確率が示される。
【０２８９】 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはヒト軟骨肉腫細胞、骨
髄、および好中球から得られる。本発明のポリヌクレオチドはヒト軟骨肉腫細胞
ｃＤＮＡライブラリーにおいて発見された。
【０２９０】 図３４に示されるように、ｈｔａｇ７は、ＰＧＲＰドメインを有する（このＰ
ＧＲＰドメインは、配列番号３６の約３４〜約１１７のアミノ酸を含み；これは
、図３４の約３４〜約１１７のアミノ酸に対応する）。このポリヌクレオチドは
、１９８アミノ酸のｈｔａｇ７ポリペプチドをコードするオープンリーディング
フレームを含む。ｈｔａｇ７は、アミノ酸レベルにおいてマウスｔａｇ７に対す
る高い程度の相同性を示す（図３５に示される通り）。本発明は、図３４に示さ
れるアミノ酸配列（配列番号３６）を有するｈｔａｇ７ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。図３４に示される
ヌクレオチド配列（配列番号１８）を、クローニングされたｃＤＮＡ（ＨＣＤＤ
Ｐ４０）を配列決定することによって得、これを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに１１月１７日に寄託し、そして登録
番号２０３４８４を取得した。
【０２９１】 本発明は、さらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメン
トに関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１８に示さ
れるヌクレオチド配列を有する単離されたＤＮＡ分子のフラグメントによって、
少なくとも約１５ｎｔ長、そしてより好ましくは、少なくとも約２０ｎｔ長、な
おより好ましくは、少なくとも約３０ｎｔ長、そしてさらにより好ましくは、少
なくとも約４０ｎｔ長のＤＮＡフラグメントが意図され、これは、本明細書で議
論されるような診断プローブおよびプライマーとして有用である。当然のことな
がら、フラグメントが、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号
１８に示されるようなヌクレオチド配列のほとんど（全てではないとしても）に
対応する場合、より大きなフラグメント（５０〜１５００ｎｔ長）もまた、本発
明によって有用である。少なくとも２０ｎｔ長のフラグメントによって、例えば
、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１８に示されるヌクレ
オチド配列からの、２０以上の連続する塩基を含むフラグメントが、意図される
。この状況において、「およそ（または、約）」は、いずれかの末端もしくは両
方の末端で、いくつか（５、４、３、２、もしくは１個）のヌクレオチドだけよ
り大きいまたはより小さい、具体的に列挙されるサイズ）を含む。本発明のｈｔ
ａｇ７ポリヌクレオチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、配列番号
１８のおよそヌクレオチド１〜およそ５０、およそ５１〜およそ１００、およそ
１０１〜およそ１５０、およそ１５１〜およそ２００、およそ２０１〜およそ２
５０、およそ２５１〜およそ３００、およそ３０１〜およそ３５０、およそ３５
１〜およそ４００、およそ４０１〜およそ４５０、およそ４５１〜およそ５００
、およそ５０１〜およそ５５０、およそ５５１〜およそ６００、およそ６０１〜
およそ６５０、およそ６５１〜およそ７００、およそ７０１〜およそ７２６、お
よびおよそ１３０〜およそ３７９、もしくはそれらの相補鎖、または寄託された
遺伝子に含まれるｃＤＮＡの配列を含むか、あるいはそれらからなるフラグメン
トが挙げられる。この状況において、「およそ（または、約）」は、いずれかの
末端もしくは両方の末端で、いくつか（５、４、３、２、もしくは１個）のヌク
レオチドだけより大きいまたはより小さい、具体的に列挙されるサイズ）を含む
。
【０２９２】 本発明の好ましい核酸フラグメントとしては、以下の群から選択されるメンバ
ーをコードする核酸分子が挙げられる：ＰＧＲＰ様ドメイン（図３４においてお
よそ３４〜およそ１１７のアミノ酸残基（配列番号３６においておよそ３４〜お
よそ１１７のアミノ酸））を含むか、あるいはそれからなるポリペプチド。これ
らのドメインの位置は、コンピュータ分析によって予測されているので、当業者
は、これらのドメインを構成するアミノ酸残基が、各ドメインを規定するために
使用される基準に依存してわずかに（例えば、約１〜１５アミノ酸残基）変化し
得ることを理解する。示されるように、ｈｔａｇ７ポリペプチドをコードする本
発明の核酸分子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：それ自体
、このポリペプチドのＰＧＲＰ様ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸分子
；およびこのポリペプチドのＰＧＲＰ様ドメインのコード配列およびさらなる配
列（例えば、プレタンパク質配列、もしくはプロタンパク質配列、またはプレプ
ロタンパク質配列）。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは
、ｈｔａｇ７の機能的特質をコードする。
【０２９３】 この点において、本発明の好ましい実施形態は、ｈｔａｇ７のα−へリックス
およびα−へリックス形成領域（「α−領域」）、β−シートおよびβ−シート
形成領域（「β−領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン−領域」）
、コイルおよびコイル形成領域（「コイル−領域」）、親水性領域、疎水性領域
、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、および高い抗
原性指標領域を含むフラグメントを含む。上記のように、図３６および／または
表ＸＩＩに示されるｈｔａｇ７の構造的または機能的特質を表すデータは、デフ
ォルトパラメーターにセットされたＤＮＡ*ＳＴＡＲの種々のモジュールおよび
アルゴリズムを用いて生成された。好ましい実施形態において、表ＸＩＩの欄Ｖ
ＩＩＩ、ＩＸ，ＸＩＩＩおよびＸＩＶに提示されるデータは、抗原性についての
高い程度の潜在性を示すｈｔａｇ７の領域を決定するために使用され得る。高い
抗原性の領域は、抗原認識が免疫応答の開始のプロセスにおいて存在し得る、環
境中のポリペプチドの表面に曝露されるようであるポリペプチドの領域を提示す
る値を選択することによって、欄ＶＩＩＩ、ＩＸ，ＸＩＩＩおよび／またはＸＩ
Ｖに提示されるデータから決定される。
【０２９４】 これらの点において特定の好ましい領域は図３６に示されるが、この領域は、
表ＸＩＩに示されるように、図３６に提示されるデータの表の表示を用いること
によって提示または同定され得る。図３６を生成するために使用されるＤＮＡ*
ＳＴＡＲコンピューターアルゴリズム（もともとのデフォルトパラメーターでセ
ットされる）は、表の形式において図３６のデータを提示するために使用された
（表ＸＩＩを参照のこと）。図３６におけるデータの表の形式は、好ましい領域
の特異的な境界を容易に決定するために使用される。図３６および表ＸＩＩに示
される上記の好ましい領域は、図３４Ａに示されるアミノ酸配列の分析によって
同定される上記のタイプの領域を含むが、これらに限定されない。図３６および
表ＸＩＩにおいて示されるように、このような好ましい領域としては、Ｇａｒｎ
ｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα−領域、β−領域、ターン領域、およびコイル領域、
Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα−領域、β−領域、およびコイル領域、Ｋｙｔｅ−
Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域およびＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓの疎水性領域、Ｅ
ｉｓｅｎｂｅｒｇのα−およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌ
ｚの可撓性領域、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの高度な抗原性指標の領域、ならび
にＥｍｉｎｉの表面形成領域が挙げられる。タンパク質のＮ末端からの１つ以上
のアミノ酸の欠失が、そのタンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または損
失を生じるとしても、他の機能的活性（例えば、生物学的活性、重合する能力、
細胞性相互作用またはシグナル伝達経路を調節する能力など）はなお保持され得
る。例えば、完全形態のポリペプチドまたは成熟形態のポリペプチドを認識する
抗体を誘導する短縮化されたｈｔａｇムテインの能力および／またはその抗体に
結合するそれらの能力は、完全なポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの残基の
大部分より少ない残基が、Ｎ末端から除去される場合には、一般的に保持される
。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免
疫学的活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される慣用的な方法および
当該分野において公知の別の方法によって、容易に決定され得る。多数のＮ末端
アミノ酸残基が欠失されたｈｔａｇ７ムテインは、おそらく、いくつかの生物学
的活性または免疫学的活性を保持し得ることはなくはない。実際、ｈｔａｇ７の
６個程度の少数のアミノ酸残基から構成されるペプチドは、しばしば、免疫応答
を惹起し得る。
【０２９５】 従って、本発明はさらに、図３４に示されるｈｔａｇ７のアミノ酸配列のアミ
ノ末端から１９１位のプロリン残基までの、１つ以上の残基が欠失されたポリペ
プチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供す
る。特に本発明は、図３４の残基ｎ１〜１９６のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドを提供し、ここで、ｎ１は、図３４（これは、配列番号３６として示される配
列と同一である）のアミノ酸残基の位置に対応する２〜１９１の整数である。別
の実施形態において、ｈｔａｇ７ポリペプチドのＮ末端欠失は、一般式ｎ２〜１
９６によって記載され得、ここで、ｎ２は、２〜１９１の整数であり、図３４に
同定されるアミノ酸の位置に対応する。配列番号３６に示される本発明のｈｔａ
ｇ７ポリペプチドのＮ末端欠失は、配列番号３６の以下の残基のアミノ酸配列を
含むポリペプチドを含み：配列番号３６に示される本発明のｈｔａｇ７ポリペプ
チドのＮ末端欠失は、配列番号３６の以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプ
チドを含む：
【０２９６】
【化８０】
【０２９７】
【化８１】
【０２９８】
【化８２】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
包含される。
【０２９９】 上記に言及されるように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠
失が、このタンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または欠失を生じる場合
さえ、他の機能的活性（例えば、生物学的活性）はなお、保持され得る。例えば
、短縮型ｈｔａｇ７ムテインがポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識す
る抗体を誘導する能力および／またはこの抗体に結合する能力は、一般に、この
完全ポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの残基の大部分未満がＣ末端から取り
除かれる場合に保持される。完全ポリペプチドのＣ末端残基を欠如する特定のポ
リペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載さ
れるおよびさもなければ当該分野で公知の、慣用的な方法によって容易に決定さ
れ得る。多数のＣ末端アミノ酸残基が欠失されたｈｔａｇ７ムテインが、いくつ
かの生物学的活性または免疫学的活性を保持し得ることはなくはない。実際、ｈ
ｔａｇ７の６程度の少数のアミノ酸残基から構成されるペプチドは、しばしば、
免疫応答を惹起し得る。
【０３００】 従って、本発明は、さらに、図３４に示されるｈｔａｇ７ポリペプチドのアミ
ノ酸配列のカルボキシ末端から、６位のメチオニン残基までで、１つ以上のアミ
ノ酸残基が欠失されるポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、図１の残基１〜ｍ１のアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｍ１は、図３４のアミノ酸残基
の位置に対応する６〜１９６の整数である。さらに、本発明は、配列番号３６の
以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、配列番号３６に示される
本発明のｈｔａｇ７ポリペプチドのＣ末端欠失のアミノ酸配列を含むか、あるい
はこのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供
する：
【０３０１】
【化８３】
【０３０２】
【化８４】 これらのポリヌクレオチドをコードするポリペプチドもまた、本発明に包含され
る。
【０３０３】 さらに、本発明は、配列番号３６の広範な位置に関連するヌクレオチド配列を
有する核酸分子を提供し、これは、以下の関連するｃＤＮＡ遺伝子から決定され
た：ＨＢＮＴＢ７９Ｒ（配列番号１１５）およびＨＣＤＤＰ４０Ｒ（配列番号１
１６）。
【０３０４】 マウスｔａｇ７およびＰＧＲＰ様ドメインに対する配列類似性に基づいて、こ
の遺伝子の翻訳産物は、ｔａｇ７タンパク質、および特にサイトカイン調節タン
パク質との少なくともいくらかの生物学的活性を共有することが予測される。こ
のような活性は、当該分野に公知であり、これらのいくらかは、本明細書の他の
箇所に記載されている。詳細には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドはまた、正常細胞および悪性細胞の分化を調節するため、癌および腫瘍性細胞
の増殖および／または分化を調節するため、ならびに免疫応答を調節するために
有用である。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、造血疾患および
／または障害ならびに免疫疾患および／または障害のための診断マーカーを示し
得る。全長タンパク質は、ｔａｇ７タンパク質に対する相同性に基づいて、分泌
タンパク質である。従って、これは、血清、尿または糞便へ分泌され、それゆえ
に、このレベルは、患者のサンプルからアッセイ可能である。特定の発現レベル
を仮定することは、免疫障害の存在を反映し、このタンパク質は、初期の検出の
ための簡便な診断を提供する。さらに、この遺伝子産物の発現はまた、免疫疾患
の進行に関連し得、従って、それ自身が実際に癌の処置のための治療剤または治
療的標的を示し得る。
【０３０５】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒトの癌および細胞トラン
スフォーメーション、特に免疫および造血型のヒトの癌および細胞トランスフォ
ーメーションの病理において重要な役割を果たし得る。本発明のポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドはまた、細胞および組織細胞型の増殖および分化に対する
その潜在的な効果に基づく、発生異常の病理に関与し得る。上記ポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの潜在的な増殖および分化の活性に起因して、本発明は、
炎症性状態（炎症性腸症候群、憩室炎など）を処置するために、組織再生を誘導
する治療剤として有用である。
【０３０６】 さらに、迅速に増殖する細胞および組織細胞型（特に腺癌細胞）、および他の
癌において存在し得るので、本発明は、異常なポリペプチドに対する免疫応答を
調節する際に有用である。この遺伝子の翻訳産物は、Ｔａｇ７との配列相同性を
共有し、これは、可溶性形態において、インビトロにおいてマウスＬ９２９細胞
にアポトーシスを誘発（ｔｒｉｇｇｅｒ）するマウスサイトカインである。
【０３０７】 この遺伝子の翻訳産物はまた、抗菌ＢＧＰ−Ａ（ウシ好中球由来のウシ抗菌ペ
プチド）との配列相同性を共有する。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番
号３６に示される残基１８４〜１９６を含む。このポリペプチドは、この遺伝子
の翻訳産物の活性な成熟形態であると考えられる。
【０３０８】 この遺伝子は、主に骨髄において、そして少ない程度でヒト軟骨肉腫および好
中球において発現される。
【０３０９】 従って、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル
中に存在する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに感染、癌、および
免疫系の傷害を含むがこれらに限定されない疾患および状態の診断のための試薬
として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する
抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有用
である。上記組織または細胞の多くの障害、特に感染した組織および免疫系の障
害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち、障害を有さない個体由来の健
常組織または体液中の発現レベル）に対して有意により高いかまたはより低いレ
ベルの遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織
または細胞型（例えば、免疫組織、造血組織、ならびに癌性組織および創傷組織
）または体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液または髄液）または別の
組織もしくは細胞型において慣用的に検出される。
【０３１０】 本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号３６において残基：Ａｌａ−６３
〜Ａｓｎ−６８、Ａｌａ−７１〜Ｇｌｎ−８１、Ｔｙｒ−１３５〜Ｔｈｒ−１４
１、Ｌｅｕ−１６７〜Ｇｌｎ−１７４、Ｐｒｏ−１９１〜Ｐｒｏ−１９６で示さ
れる免疫学的エピトープを含む。上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドもまた提供される。
【０３１１】 （遺伝子番号９によってコードされるタンパク質の特徴） 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチド
によってコードされたポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生
に関する。本発明のポリペプチドは、ヒト精巣腫瘍ｃＤＮＡライブラリー由来の
ヒトブチロフィリン相同体として推測的に同定された。本発明のポリペプチドは
、時折本明細書以下において「ＢｕｔｙｒｏｐｈｌｉｎおよびＢ７様ＩｇＧスー
パーファミリーレセプター」、および／または「ＢＢＩＲ ＩＩ」といわれる。
本発明はまた、このようなポリペプチドの作用の阻害に関する。
【０３１２】 ブチロフィリンは、哺乳動物上皮細胞由来の乳脂肪小球膜と会合して分泌され
る免疫グロブリンスーパーファミリーの糖タンパク質である。このブチロフィリ
ン遺伝子は、免疫グロブリンスーパーファミリー内の遺伝子およびジンクフィン
ガータンパク質のファミリー内に保存されるＢ３０．２ドメインをコードする遺
伝子のサブセットから進化したようである。さらに、ブチロフィリン遺伝子の発
現分析は、ブチロフィリン発現が授乳中に乳脂肪含量の増加と関連して増加する
ことを示した。これらの結果は、哺乳動物上皮細胞内の乳脂肪小球膜糖タンパク
質の段階特異的発現が、主要な乳タンパク質、β−かセインの機構と同様である
が必ずしも同一ではない機構において調節される。
【０３１３】 本発明のポリペプチドは、乳脂肪小球膜糖タンパク質ファミリー、より特定す
るとブチロフィリンファミリーのメンバーとして推測的に同定され、Ｂｕｔｙｒ
ｏｐｈｌｉｎおよびＢ７様ＩｇＧスーパーファミリーレセプター（「ＢＢＩＲ
ＩＩ」）と命名された。この同定は、ウシブチロフィリン前駆体に対するアミノ
酸配列相同性の結果として行われた。（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｇｉｌ１６２７
７３を参照のこと）。
【０３１４】 本発明の好ましいポリペプチドは、以下の核酸配列を含む：
【０３１５】
【化８５】
【０３１６】
【化８６】
【０３１７】
【化８７】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた提供される
。
【０３１８】 本発明の好ましいポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む：
【０３１９】
【化８８】 これらのポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０３２０】 本発明の好ましいポリヌクレオチドスプライス改変体は、以下の核酸配列を含
む：
【０３２１】
【化８９】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリぺプチドもまた提供される
。
【０３２２】 図２２Ａ〜Ｄは、ＢＢＩＲ ＩＩのヌクレオチド（配列番号１９）および推定
アミノ酸配列（配列番号３７）を示す。約１〜約１７の予測されたアミノ酸は、
予測されたシグナルペプチド（配列番号３７の約１〜約１７のアミノ酸残基）を
構成し、下線を引いたアミノ酸領域によって表される。
【０３２３】 図２３は、ＢｕｔｙｒｏｐｈｉｌｉｎおよびＢ７様ＩｇＧスーパーファミリー
レセプター（ＢＢＩＲ ＩＩ）タンパク質（配列番号３７）とウシブチロフィリ
ン前駆体（配列番号１２１）のアミノ酸配列間の類似性の領域を示す。
【０３２４】 図２４は、インテグリンαＩＩサブニット（ＢＢＩＲ ＩＩ）アミノ酸配列の
分析を示す。
【０３２５】 α、β、ターンおよびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓
性領域；抗原性指数および表面確率が示される。
【０３２６】 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト小腸、結腸腫瘍
、およびヒト精巣腫瘍細胞および組織から得られる。本発明のポリヌクレオチド
は、ヒト精巣腫瘍ｃＤＮＡライブラリー中に発見された。
【０３２７】 その翻訳産物は、亜鉛結合Ｂ−ボックスモチーフを含有するタンパク質、特に
ブチロフィリンファミリーメンバーに対して特徴的なＢ３０．２様度メインに対
して相同性を有する。このポリヌクレオチドは、３１８アミノ酸のＢＢＩＲ Ｉ
Ｉポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。ＢＢＩＲ
ＩＩは、ウシブチロフィリン前駆体に対してアミノ酸レベルで高度な相同性を示
す（図２３に示されるように）。本発明は、図２２Ａ〜Ｄに示されるアミノ酸配
列（配列番号３７）を有するＢＢＩＲ ＩＩポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを含む単離した核酸分子を提供する。図２２Ａ〜Ｄに示されるヌクレオ
チド配列（配列番号１９）は、クローン化ｃＤＮＡ（ＨＴＴＤＢ４６）を配列決
定することによって得られ、このクローン化ｃＤＮＡは、１１月１７日にＡｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに登録番号２０
３４８４で寄託された。
【０３２８】 本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメント
に関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号１９に示され
るヌクレオチド配列を有する単離されたＤＮＡ分子のフラグメントは、少なくと
も約１５ｎｔ長、より好ましくは少なくとも約２０ｎｔ長、なおさらに好ましく
は少なくとも約３０ｎｔ長、さらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔ長のＤ
ＮＡフラグメントが意図され、これらは、本明細書中で議論されるように、診断
プローブおよびプライマーとして有用である。当然のことながら、５０〜１５０
０ｎｔ長のより大きなフラグメントはまた、寄託されたｃＤＮＡヌクレオチド配
列のまたは配列番号１９に示されるようなヌクレオチド配列の、全てではないと
しても、大部分に対応するフラグメントであるため、本発明に従って有用である
。例えば、少なくとも２０ｎｔ長のフラグメントは、寄託されたｃＤＮＡのヌク
レオチド配列または配列番号１９に示されるようなヌクレオチド配列からの２０
以上の連続塩基を含むフラグメントが意図される。このコンテクストにおいて、
「約」は、一方の末端または両方の末端のいずれかにおいて、幾らかの（５、４
、３、２、または１）ヌクレオチド分大きいかまたは小さい、特に記載したサイ
ズを含む。本発明のＢＢＩＲ ＩＩポリヌクレオチドフラグメントの代表例は、
例えば、配列番号１９の約ヌクレオチド１〜約５０、約５１〜約１００、約１０
１〜約１５０、約１５１〜約２００、約２０１〜約２５０、約２５１〜約３００
、約３０１〜約３５０、約３５１〜約４００、約４０１〜約４５０、約４５１〜
約５００、約５０１〜約５５０、約５５１〜約６００、約６０１〜約約６５０、
約６５１〜約７００、約７０１〜約７５０、約７５１〜約８００、約８０１〜約
８５０、約８５１〜約９００、約９０１〜約９５０、約９５１〜約１０００、約
１００１〜約１０５０、約１０５１〜約１１００、約１１０１〜約１１５０、約
１１５１〜約１２００、約１２０１〜約１２５０、約１２５１〜約１３００、約
１３０１〜約１３５０、約１３５１〜約１４００、約１４０１〜約１４５０、約
１４５１〜約１５００、約１５０１〜約１５５０、約１５５１〜約１６００、約
１６０１〜約１６５０、約１６５１〜約１７００、約１７０１〜約１７５０、約
１７５１〜約１８００、約１８０１〜約１８５０、約１８５１〜約１９００、約
１９０１〜約１９５０、約１９５１〜約２０００、約２００１〜約２０５０、約
２０５１〜約２１００、約２１０１〜約２１５０、約２１５１〜約２２００、約
２２０１〜約２２５０、約２２５１〜約２３００、約２３０１〜約２３５０、約
２３５１〜約２４００、約２４０１〜約２４５０、約２４５１〜約２５００、約
２５０１〜約２５５０、約２５５１〜約２６００、約２６０１〜約２６５０、約
２６５１〜約２７００、約２７０１〜約２７５０、約２７５１〜約２８００、約
２８０１〜約２８５０、約２８５１〜約２９００、約２９０１〜約２９５０、約
２９５１〜約３０００、約３００１〜約３０５０、約３０５１〜約３０５９、の
配列またはそれらに対する相補鎖、あるいは寄託された遺伝子に含まれるｃＤＮ
Ａの配列を含むか、あるいはそれらからなるフラグメントを含む。このコンテク
ストにおいて、「約」は、一方の末端または両方の末端のいずれかにおいて、幾
らかの（５、４、３、２、または１）ヌクレオチド分大きいかまたは小さい、特
に記載したサイズを含む。
【０３２９】 本発明の好ましい核酸フラグメントは、成熟ＢＢＩＲ ＩＩタンパク質（図２
２Ａ〜Ｄの約１８〜３１８のアミノ酸残基（配列番号３７中の約１８〜約３１８
のアミノ酸））を含むポリペプチドか、あるいはそれらからなる群から選択され
るメンバーをコードする核酸分子を含む。この形態のタンパク質の位置はコンピ
ューター分析によって予測されるため、当業者は、これらのドメインを構成する
アミノ酸残基が、この位置を規定するのに使用される基準に依存して、非常にわ
ずかに（例えば、約１〜１５アミノ酸残基）変化し得ることを理解する。さらな
る実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＢＢＩＲ ＩＩの機能的属
性をコードする。
【０３３０】 この点について、本発明の好ましい実施形態は、ＢＢＩＲ ＩＩのα−へリッ
クスおよびα−へリックス形成領域（「α−領域」）、β−シートおよびβ−シ
ート形成領域（「β−領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン−領域
」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル−領域」）、親水性領域、疎水性
領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域および高 い抗原指数領域を含むフラグメントを含む。上記のように、図２４および／また
は表ＶＩＩＩに記載されるＢＢＩＲ ＩＩの構造的または機能的属性を表すデー
タは、デフォルトパラメータに設定されたＤＮＡ*ＳＴＡＲの種々のモジュール
およびアルゴニズムを使用して生成された。好ましい実施形態において、表ＶＩ
ＩＩの第ＶＩＩＩ欄、第ＩＸ欄、第ＸＩＩＩ欄、および第ＸＩＶ欄に示されたデ
ータは、抗原性に対して高度な潜在性を示すＢＢＩＲ ＩＩの領域を決定するた
めに使用され得る。高い抗原性の領域は、抗原認識が免疫応答の開始のプロセス
において起こり得る環境にあるポリペプチドの表面上に曝露されそうなポリペプ
チドの領域を表現する値を選択することによって、第ＶＩＩＩ欄、第ＩＸ欄、第
ＸＩＩＩ欄、および／または第ＸＩＶ欄に表されるデータから決定される。
【０３３１】 これらの点において特定の好ましい領域は図２４に記載されるが、表ＶＩＩＩ
に示されるように、図２４に表されるデータの表形式の表示を使用することによ
って表され得るか、または同定され得る。（元のデフォルトパラメータに設定さ
れた）図２４を得るために使用されるＤＮＡ＊ＳＴＡＲコンピュータアルゴニズ
ムは、表形式で図２４にデータを表すために使用された（表ＶＩＩＩを参照のこ
と）。図２４のデータの表形式フォーマットは、好ましい領域の特異的な境界を
容易に決定するために使用される。図２４および表ＶＩＩＩに記載される上述の
好ましい領域は、図２２Ａ〜Ｄに記載されるアミノ酸配列の分析によって同定さ
れる上記のタイプの領域を含むが、これらに限定されない。図２４および表ＶＩ
ＩＩに記載されるように、このような好ましい領域として、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒ
ｏｂｓｏｎ α−領域、β−領域、ターン−領域、およびコイル−領域、Ｃｈｏ
ｕ−Ｆａｓｍａｎ α−領域、β−領域、およびターン−領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏ
ｏｌｉｔｔｌｅ親水性領域およびＨｏｏｐ−Ｗｏｏｄｓ疎水性領域、Ｅｉｓｅｎ
ｂｅｒｇα−およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可撓性領
域、高い抗原指数のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域およびＥｍｉｎｉ表面形成領
域が挙げられる。たとえタンパク質のＮ末端からの１個以上のアミノ酸の欠失が
タンパク質の１個以上の生物学的機能の損失の改変を生じたとしても、他の機能
的活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力など）がなおも保持され得る
。例えば、ポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導しそし
て／または結合する短縮化ＢＢＩＲ ＩＩムテインの能力は、一般に完全または
成熟したポリペプチドの残基の大部分未満がＮ末端から除去される場合に保持さ
れる。完全ポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免
疫活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載され、当業者に別の方法で公知
の慣用方法によって容易に決定され得る。多分、大多数の欠失されたＮ末端アミ
ノ酸残基を有するＢＢＩＲ ＩＩムテインがいくらかの生物学的または免疫原性
活性を保持し得る。事実、わずか６のＢＢＩＲ ＩＩアミノ酸残基から構成され
るペプチドはしばしば、免疫応答を惹起し得る。
【０３３２】 従って、本発明はさらに、図２２Ａ〜Ｄに示されるＢＢＩＲ ＩＩアミノ酸配
列（位置番号３１３のシステイン残基まで）のアミノ末端からの１以上の残基の
欠失を有するポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを提供する。特に、本発明は、図２２Ａ〜Ｄの残基ｎ１〜３１８のアミ
ノ酸配列（これは、配列番号３７として示される配列に同一である）を含むポリ
ペプチドを提供し、ここでｎ１は、図２２Ａ〜Ｄにおけるアミノ酸残基の位置に
対応する２〜３１３の整数である。別の実施態様において、ＢＢＩＲ ＩＩポリ
ペプチドのＮ−末端欠失は、一般式ｎ２〜３１８によって記載され得、ここでｎ
２は、図２２Ａ〜Ｄに同定されるアミノ酸の位置に対応する、２〜３１３の数で
ある。配列番号３７として示される本発明のＢＢＩＲ ＩＩポリペプチドのＮ−
末端欠失は、以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：
【０３３３】
【化９０】
【０３３４】
【化９１】
【０３３５】
【化９２】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
包含される。
【０３３６】 また、上記のように、タンパク質のＣ−末端からの１以上のアミノ酸の欠失が
、このタンパク質の１以上の生物学的機能の改変または損失を生じる場合でさえ
、他の機能的活性（例えば、生物学的活性（例えば、マイトジェン活性を誘発す
る（ｉｌｌｉｃｉｔ）能力、正常細胞または悪性細胞の分化を誘導する能力、多
量体化する能力など））は、なお保持され得る。例えば、短縮されたＢＢＩＲ
ＩＩムテインの、ポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導
および／または結合する能力は、完全ポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの残
基の過半数未満がＣ−末端から除去される場合、保持される。完全ポリペプチド
のＣ−末端残基を欠如する特定のポリペプチドがこのような免疫原性活性を保持
するか否かは、本明細書中に記載されるか、そうでなければ当該分野で公知の、
慣用的な方法によって容易に決定され得る。おそらく、多数の欠失Ｃ−末端アミ
ノ酸残基を有するＢＢＩＲ ＩＩムテインは、いくらかの生物学的活性または免
疫原性活性を保持し得る。事実、６個ほどのＢＢＩＲ ＩＩアミノ酸残基から構
成されるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。
【０３３７】 従って、本発明はさらに、図２２Ａ〜Ｄに示されるＢＢＩＲ ＩＩポリペプチ
ドのアミノ酸配列（位置番号６のセリン残基まで）のカルボキシ末端から１つ以
上の残基の欠失を有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、図１の残基１〜ｍ１のアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここでｍ１は、図２２Ａ〜Ｄにおけるア
ミノ酸残基の位置に対応する６〜３１８の整数である。さらに、本発明は、配列
番号３７として示される本発明のＢＢＩＲ ＩＩポリペプチドのＣ−末端欠失の
アミノ酸配列を含む（または、そのようなアミノ酸からなる）ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを提供し、このポリペプチドは、以下の残基のアミノ
酸配列を含む：
【０３３８】
【化９３】
【０３３９】
【化９４】
【０３４０】
【化９５】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
包含される。
【０３４１】 さらに、本発明は、配列番号１９の広範な部分に関連するヌクレオチド配列を
有する核酸分子を提供し、これは、以下の関連ｃＤＮＡ遺伝子：ＨＴＴＤＢ４６
Ｒ（配列番号１２２）およびＨＳＩＥＡ４４Ｒ（配列番号１２３）から決定され
ている。
【０３４２】 ウシブチロフィリン（ｂｕｔｙｒｏｐｈｉｌｉｎ）前駆体に対する配列類似性
に基づいて、この遺伝子の翻訳産物は、Ｂ３０．２様ドメイン含有タンパク質、
および詳細には、ブチロフィリンタンパク質と、少なくともいくらかの生物学的
活性を共有すると予期される。このような活性は、当該分野で公知であり、その
いくつかは、本明細書中の他の箇所に記載される。詳細には、本発明のポリヌク
レオチドおよびポリペプチドはまた、正常細胞および悪性細胞の分化を調節する
ため、癌細胞および腫瘍性細胞の増殖および／もしくは分化を調節するため、な
らびに細胞増殖および分化の調節のために有用である。本発明のポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドは、分泌器官および組織の障害（これには、精巣障害およ
び胃腸障害、特に、精液または消化管ホルモンについての分泌機能に役立つ細胞
、ならびにこのような細胞および組織の粘膜の障害などが含まれる）に加えて、
乳房疾患および／または障害についての診断用マーカーを提示し得る。
【０３４３】 全長タンパク質は、タンパク質のブチロフィリンファミリーに対する相同性に
基づいて、分泌タンパク質であるはずである。それゆえ、このタンパク質は、乳
汁、血清、尿、精液、または糞便に分泌され、従って、そのレベルは、患者のサ
ンプルからアッセイ可能である。特異的な発現レベルを仮定することは、乳房障
害（すなわち、乳癌、乳房機能不全など）の存在を反映し、このタンパク質は、
このような障害の初期検出のための簡便な診断を提供する。
【０３４４】 さらに、この遺伝子産物の発現はまた、乳房疾患の進行に関連し得、それゆえ
、それ自体が実際に、乳癌の処置のための治療法または治療標的を提示し得る。
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒトの癌および細胞形質転換
の病因、特に、分泌細胞および組織の病因において重要な役割を果たし得る。本
発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはまた、細胞および組織細胞型の増
殖および分化に対するその潜在的な効果に基づいて、発生異常の病因に関与し得
る。
【０３４５】 これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの潜在的な増殖活性および分化
活性に起因して、本発明は、炎症状態を処置するための、組織再生を誘導する際
の治療剤として有用である。さらに、本発明は、迅速に増殖する細胞および組織
細胞型、特に、癌に存在し得るような、異常なポリペプチドに対する免疫応答を
調節する際に有用である。本発明（そのアゴニストおよび／またはアンタゴニス
トを含む）は、乳汁の栄養値、そのカロリー含量、その脂肪含量を調節する際に
有用であり、そしておそらく、治療剤のための送達ビヒクル（すなわち、乳児に
治療的に活性なタンパク質を移入するためのトランスジェニック乳房分泌組織）
として、乳房分泌機能の適応を媒介する際に有用であり得る。
【０３４６】 あるいは、増殖している細胞により特徴付けられる細胞供給源内の発現は、こ
のタンパク質が細胞分裂の調節において役割を果たし得ることを示し、そして発
生疾患および障害（癌、および他の増殖性状態を含む）の診断、処置、および／
または予防に有用性を示し得ることを示す。代表的な使用は、以下の「過剰増殖
性障害」および「再生」の節、ならびに本明細書中の他の箇所に記載される。簡
潔には、発生組織は、パターン形成における細胞分化および／またはアポトーシ
スに関する決定に依存する。
【０３４７】 アポトーシスの調節不全は、いくつかの癌の発生において生じるような細胞死
の不適切な抑制を生じ得るか、または、後天性免疫不全および特定の神経変性障
害（例えば、棘筋萎縮症（ＳＭＡ））において生じると考えられるように、細胞
死の程度を制御できないことになり得る。
【０３４８】 あるいは、この遺伝子産物は、初期胚形成に付随する細胞増殖のパターンに関
与する。従って、この遺伝子産物の組織（特に、成体組織）における異常な発現
は、種々の癌に見出されるような、異常な細胞増殖のパターンと相関し得る。増
殖おおよび分化における潜在的な役割のために、この遺伝子産物は、組織再生お
よび癌の処置のための成体における適用を有し得る。これらはまた、細胞および
組織型の特定化を制御するためのモルフォゲンとして作用し得る。従って、本発
明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、上記障害および状態、ならびに他
の型の変性状態の、処置、検出および／または予防において有用である。従って
、このタンパク質は、アポトーシスまたは組織分化を調節し得、そして変性また
は増殖性の状態および疾患の、検出、処置、および／または予防において有用で
ある。このタンパク質は、増殖中および癌性の、細胞および組織に存在し得るよ
うな、異常なポリペプチドに対する免疫応答を調節する際に有用である。このタ
ンパク質はまた、細胞の成長および増殖の調節についての新たな洞察を得るため
に用いられ得る。さらに、このタンパク質はまた、栄養補給剤としてのその使用
に加えて、生物学的活性を決定するために、抗体を惹起するために、組織マーカ
ーとして、同族のリガンドまたはレセプターを単離するために、それらの相互作
用を調節する薬剤を同定するために使用され得る。タンパク質ならびにこのタン
パク質に対する抗体は、上記に挙げられた組織に対する腫瘍マーカーおよび／ま
たは免疫治療の標的として有用性を示し得る。
【０３４９】 この遺伝子は、主に小腸、結腸腫瘍において発現され、そしてより少ない程度
には、ヒト精巣腫瘍細胞において発現される。
【０３５０】 従って、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル
中に存在する組織または細胞型の差示的同定のため、ならびに授乳障害に加えて
胃腸疾患および／または障害ならびに精巣の腫瘍を含むが、これに限定されない
、疾患および状態の診断のための試薬として有用である。同様に、ポリペプチド
およびこれらのポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の差示的同定の
ための免疫学的プローブの提供に有用である。上記組織または細胞、特に免疫系
および生殖系の多くの障害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち、この
障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の発現レベル）に対して有意に
より高いまたはより低いレベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する
個体から採取された特定の組織もしくは細胞型（例えば、免疫組織、精巣組織、
胃腸組織、ならびに癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、精
液、血漿、尿、滑液、および髄液）または別の組織もしくは細胞サンプルの中で
、慣用的に検出される。
【０３５１】 本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号３７において、残基Ｔｙｒ−６７
〜Ｐｒｏ−７４、Ｓｅｒ−１１７〜Ｇｌｎ−１２３、Ｐｒｏ−１６１〜Ｍｅｔ−
１８５、Ｇｌｙ−２２４〜Ｈｉｓ−２４２、Ｔｈｒ−２９９〜Ｔｒｐ−３０７と
して示される免疫原性エピトープを含む。上記のポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドもまた提供される。
【０３５２】 （遺伝子番号１０によってコードされるタンパク質の特徴） この遺伝子の翻訳産物はセリンプロテアーゼモチーフを含み、従ってセリンプ
ロテアーゼ活性を有すると考えられる。このような活性を決定するためのアッセ
イは、当該分野において周知である。本発明の好ましいポリペプチドは、このよ
うな活性を有する。
【０３５３】 本発明において、好ましいドメインとして含まれるのは、セリンプロテアーゼ
ヒスチジン活性部位ドメインであり、このドメインは、ＰｒｏＳｉｔｅ分析ツー
ル（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）
を用いて同定された。トリプシンファミリー由来のセリンプロテアーゼの触媒活
性は、ヒスチジンに水素結合したアスパラギン酸残基（これ自身が、セリンに水
素結合する）を伴う電荷リレー系により、提供される。活性部位のセリン残基お
よびヒスチジン残基の近傍の配列は、このプロテアーゼファミリーにおいてよく
保存される［１］。コンセンサスパターン：［ＬＩＶＭ］−［ＳＴ］−Ａ−［Ｓ
ＴＡＧ］−Ｈ−Ｃ、Ｈは活性部位の残基である。
【０３５４】 本発明の好ましいポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む：ＧＴＬＶＡＥ
ＫＨＶＬＴＡＡＨＣＩＨＤＧＫＴＹＶＫＧＴＱ（配列番号１２４）。これらのポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０３５５】 この遺伝子について表ＸＩＩＩに参照される配列のセリンプロテアーゼヒスチ
ジン活性部位ドメイン、およびこの参照される配列のうちの少なくとも５、１０
、１５、２０、２５、３０、５０、または７５個連続するさらなるアミノ酸残基
を含む、ポリペプチドがさらに好ましい。このさらなる、連続するアミノ酸残基
は、セリンプロテアーゼヒスチジン活性部位ドメインに対してＮ末端またはＣ末
端である。
【０３５６】 あるいは、このさらなる連続するアミノ酸残基は、セリンプロテアーゼヒスチ
ジン活性部位ドメインに対してＮ末端側およびＣ末端側の両方である。ここでＮ
末端およびＣ末端の連続するアミノ酸残基の合計が、特定された数字と一致する
。上記の好ましいポリペプチドドメインは、セリンプロテアーゼタンパク質に対
して特異的な特性に特徴的である。配列類似性に基づいて、この遺伝子の翻訳産
物は、セリンプロテアーゼと、少なくともいくつかの生物学的活性を共有するこ
とが予測される。このような活性は、当該分野で公知であり、これらのうちのい
くつかは、本明細書中の他の箇所に記載される。
【０３５７】 別の実施形態において、推定シグナルペプチドの上流のオープンリーディング
フレームのアミノ酸配列を含むポリペプチドが、本発明によって意図される。特
に、本発明のポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む：
【０３５８】
【化９６】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０３５９】 本発明の好ましいポリペプチド改変体は、以下のアミノ酸配列を含む：
【０３６０】
【化９７】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０３６１】 図２５Ａ〜Ｂは、本発明のヌクレオチド（配列番号２０）および推定アミノ酸
配列（配列番号３８）を示す。推定アミノ酸およそ１〜およそ１９は、推定シグ
ナルペプチド（配列番号３８のアミノ酸残基およそ１〜およそ１９）を構成し、
下線を引いたアミノ酸領域によって表される；アミノ酸およそ１６２〜およそ１
８８は、推定セリンプロテアーゼヒスチジン活性部位ドメイン（配列番号３８の
アミノ酸残基およそ１６２〜およそ１８８）を構成し、二重下線を引いたアミノ
酸領域によって表される。そしてアミノ酸残基１７５（配列番号３８のアミノ酸
残基１７５）は、推定ヒスチジン活性部位残基を構成し、太字のアミノ酸により
表される。
【０３６２】 図２６は、本発明のアミノ酸配列の配列番号３８とヒト膵臓エラスターゼ２タ
ンパク質（ｇｉ│２１９６２０）（配列番号１２７）とのアミノ酸配列間の類似 性領域を示す。
【０３６３】 図２７は、配列番号３８のアミノ酸配列の分析を示す。α領域、β領域、ター
ン領域およびコイル領域；親水性領域および疎水性領域；両親媒性領域；可撓性
領域；抗原性指標および表面確率が示される。
【０３６４】 ノーザン分析は、この遺伝子がＨＵＶＥＣ、ＨＵＶＥＣ＋ＬＰＳ、平滑筋、線
維芽細胞において最も多く発現し、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、筋肉、腎臓、膵
臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸中に存在し、ＰＢＬにわずか
に存在することを示す。本発明は、図２５Ａ〜Ｂで示されるアミノ酸配列（配列
番号３８）を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離さ
れた核酸分子を提供し、この配列は、クローン化されたｃＤＮＡの配列決定によ
り決定された。図２５Ａ〜Ｂで示されるヌクレオチド配列（配列番号２０）は、
クローン化されたｃＤＮＡ（ＨＵＳＡＱ０５）の配列決定によって得られ、この
ｃＤＮＡは、１９９８年１１月１７日、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、受託番号２０３４８４が与えられた
。寄託された遺伝子は、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を
使用して、ｐＳｐｏｒｔプラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に挿入されている。
【０３６５】 本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメント
に関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号２０で示され
るヌクレオチド配列を有する、単離されたＤＮＡ分子のフラグメントは、本明細
書中で議論されるような診断プローブおよびプライマーとして有用である、少な
くとも約１５ｎｔ、より好ましくは、少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好まし
くは、少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおより好ましくは、少なくとも４０ｎｔ
の長さのＤＮＡフラグメントを意図する。もちろん、より大きなフラグメント（
５０〜１５００ｎｔの長さ）もまた、本発明によると有用である。寄託されたｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号２０で示されるヌクレオチド配列の全
てではないにしても、ほとんどと一致するフラグメントも同様である。少なくと
も２０ｎｔの長さのフラグメントは、例えば、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列または配列番号２０に示されるようなヌクレオチド配列由来の、２０個以
上連続した塩基を含むフラグメントが意図される。この文脈において、「およそ
（約）」は、特に記載された値、およびいずれかの末端もしくは両方の末端にお
いて、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいか
または小さな値を含む。本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表例として
は、例えば、以下を含むか、あるいは以下からなるフラグメントが挙げられる：
配列番号２０またはそれらの相補鎖、あるいは寄託された遺伝子に含まれるｃＤ
ＮＡの配列、およそ１〜およそ５０、およそ５１〜およそ１００、およそ１０１
〜およそ１５０、およそ１５１〜およそ２００、およそ２０１〜およそ２５０、
およそ２５１〜およそ３００、およそ３０１〜およそ３５０、およそ３５１〜お
よそ４００、およそ４０１〜およそ４５０、およそ４５１〜およそ５００、およ
そ５０１〜およそ５５０、およそ５５１〜およそ６００、およそ６０１〜およそ
６５０、およそ６５１〜およそ７００、およそ７０１〜およそ７５０、およそ７
５１〜およそ８００、およそ８０１〜およそ８５０、およそ８５１〜およそ９０
０、およそ９０１〜およそ９５０、およそ９５１〜およそ１０００、およそ１０
０１〜およそ１０５０、およそ１０５１〜およそ１１００、およそ１１０１〜お
よそ１１５０、およそ１１５１〜およそ１２００、およそ１２０１〜およそ１２
５０、およそ１２５１〜およそ１３００、およそ１３０１〜およそ１３５０、お
よそ１３５１〜およそ１４００、およそ１４０１〜およそ１４５０、およそ１４
５１〜およそ１５００、およそ１５０１〜およそ１５５０、およそ１５５１〜お
よそ１６００、およそ１６０１〜およそ１６５０、およそ１６５１〜およそ１６
９９。この文脈において、「およそ（約）」は、特に記載された範囲、およびい
ずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、ま
たは１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな範囲を含む。さらなる実施形
態において、本発明のポリヌクレオチドは、対応するタンパク質の機能的属性を
コードする。
【０３６６】 この点において、本発明の好ましい実施形態は、α−へリックスおよびα−へ
リックス形成領域（「α領域」）、β−シートおよびβ−シート形成領域（「β
領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイ
ル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β
両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、および高い抗原性指標領域を含む、
フラグメントを含む。上記のような図２７および／または表ＩＸに示されるタン
パク質の構造的または機能的属性を表すデータは、デフォルトパラメーターに設
定されたＤＮＡ*ＳＴＡＲの種々のモジュールおよびアルゴリズムを使用して作
製された。好ましい実施形態において、表ＩＸのＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩおよ
びＸＩＶ欄に示されるデータは、抗原性について高い程度の可能性を示すタンパ
ク質の領域を決定するために使用され得る。高い抗原性の領域は，免疫応答の開
始プロセスにおいて抗原認識が起こり得る環境中のポリペプチドの表面上に曝さ
れる可能性のあるポリペプチドの領域を示す値を選択することによって、ＶＩＩ
Ｉ、ＩＸ、ＸＩＩＩおよび／またはＸＩＶ欄に示されるデータから決定される。
【０３６７】 これらの点における特定の好ましい領域は図２７に示されるが、表ＩＸに示さ
れるように、図２７に示されるデータの形式表示表を使用することによって表さ
れるかまたは同定され得る。図２７を作製するために使用されたＤＮＡ*ＳＴＡ
Ｒコンピューターアルゴリズム（オリジナルのデフォルトパラメータにて設定さ
れた）は、図２７のデータを表の様式で表すために使用された（表ＩＸを参照の
こと）。図２７の表の様式のデータが、好ましい領域の特定の境界を容易に決定
するために使用される。図２７および表ＩＸに示される上記の好ましい領域には
、図１に示されたアミノ酸配列の分析によって同定された上記のタイプの領域が
挙げられるが、これらに限定されない。図２７および表ＩＸに示されるように、
このような好ましい領域には、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα領域、β領域
、ターン領域およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα領域、β領域、タ
ーン領域およびコイル領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域、およ
びＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓの疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのαおよびβ両親媒
性領域、およびＫａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可撓性領域、高い抗原性指標の
Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域、ならびにＥｍｉｎｉ表面形成領域が挙げられる
。タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、そのタンパク質の１
つ以上の生物学的機能の欠損の改変を生じたとしても、他の機能的活性（例えば
、生物学的活性、多量体化する能力）はなお保持され得る。例えば、ポリペプチ
ドの完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘導および／または結合する、
短縮改変体の能力は、一般に、この完全または成熟ポリペプチドのうちの大多数
より少ない残基が、Ｎ末端から除去される場合に保持されるようである。完全ポ
リペプチドのＮ末端残基を欠損する特定のポリぺプチドが、このような免疫原性
活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、およびそうで
なければ当該分野において公知の慣用的な方法によって、容易に決定され得る。
多くの欠失Ｎ末端アミノ酸残基を有するムテインが、いくつかの生物学的活性ま
たは免疫原性活性を保持し得る可能性がないわけではない。実際に、６個ほどの
わずかなアミノ酸残基から構成されるペプチドは、しばしば、免疫応答を引き起
こし得る。
【０３６８】 従って、本発明はさらに、図２５Ａ〜Ｂに示されるアミノ酸配列の（位置番号
３７０のアスパラギン酸残基まで）アミノ酸末端から欠失された１つ以上の残基
を有するポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを提供する。特に、本発明は、図２５Ａ〜Ｂの残基ｎｌ−３７５のアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｎｌは、図２５Ａ〜Ｂのアミノ
酸残基の位置に対応する２〜３７０の整数である（この残基は、配列番号３８と
示される配列と同一である）。配列番号３８として示される本発明のポリペプチ
ドのＮ末端欠失は、以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する：
【０３６９】
【化９８】
【０３７０】
【化９９】
【０３７１】
【化１００】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
包含される。
【０３７２】 上でも示されるように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失
が、そのタンパク質の１つ以上の生物学的機能の欠損の改変を生じたとしても、
他の機能的活性（例えば、細胞外マトリックスを調節する能力のような生物学的
活性など）はなお保持され得る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または成熟
形態を認識する抗体を誘導および／または結合する能力は、一般に、この完全ま
たは成熟ポリペプチドのうちの大多数より少ない残基がＣ末端から除去される場
合に、保持される。完全ポリペプチドのＮ末端残基を欠損する特定のポリぺプチ
ドが、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣
用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の慣用的な方法によっ
て、容易に決定され得る。多くの欠失Ｃ末端アミノ酸残基を有するムテインが、
いくつかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し得る可能性がないわけでは
ない。実際に、６個ほどのわずかなアミノ酸残基から構成されるペプチドは、し
ばしば、免疫応答を引き起こし得る。
【０３７３】 従って、本発明はさらに、図２５Ａ〜Ｂに示されるポリペプチドのアミノ酸配
列のカルボキシ末端から１つ以上の残基が（位置番号６のグリシン残基まで）欠
失しているポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを、提供する。特に、本発明は、図２５Ａ〜Ｂの残基１−ｍ１のアミノ
酸配列を含むポリペプチドを提供する。ここで、ｍ１は、図２５Ａ〜Ｂ中のアミ
ノ酸残基の位置に対応する６〜３７５の整数である。さらに、本発明は、配列番
号３８として示される本発明のポリペプチドのＣ末端欠失物のアミノ酸配列を含
むかまたはこのアミノ酸配列からなる、ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを提供する。これは、配列番号３８の以下の残基のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドを含む：
【０３７４】
【化１０１】
【０３７５】
【化１０２】
【０３７６】
【化１０３】
【０３７７】
【化１０４】 。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明に
より包含される。
【０３７８】 さらに、本発明は、配列番号２０の広範な部分に関連するヌクレオチド配列を
有する、核酸分子を提供する。この配列は、以下の関連するｃＤＮＡ遺伝子から
決定された：ＨＦＫＣＦ４０Ｆ（配列番号１２８）、ＨＳＲＤＦ２６Ｒ（配列番
号１２９）、ＨＴＥＢＥ０７Ｒ（配列番号１３０）、ＨＦＴＢＰ８２Ｒ（配列番
号１３１）、ＨＡＱＢＪ１１Ｒ（配列番号１３２）、ＨＡＦＢＢ１１Ｒ（配列番
号１３３）、ＨＯＥＦＯ８５Ｒ（配列番号１３４）、およびＨＵＶＧＹ９５Ｒ（
配列番号１３５）。
【０３７９】 開示されたｃＤＮＡをコードする遺伝子は、第１２染色体上に位置すると考え
られる。従って、本発明に関するポリヌクレオチドは、第１２染色体についての
連鎖解析におけるマーカーとして有用である。
【０３８０】 この遺伝子は、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋、および骨芽細胞において主に
発現され、そしてより少ない程度で、脳、心臓、胎盤組織、肺、および他の多く
の組織において発現される。さらに、その転写物は、ＨＵＶＥＣ、ＨＵＶＥＣ＋
ＬＰＳ、平滑筋、線維芽細胞に存在し、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、筋肉、腎臓
、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸に存在し、そしてＰＢＬ
に弱く存在する。
【０３８１】 従って、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル
中に存在する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに血管新生組織の障
害を含むがこれに限定されない、疾患および状態の診断のための、試薬として有
用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、
組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有用である。
上記組織または細胞、特に血管組織の多くの障害に関して、その標準の遺伝子発
現レベル（すなわち、この障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の発
現レベル）に対して有意に高いかまたは低いレベルのこの遺伝子の発現が、この
ような障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型（例えば、血
管組織、骨格組織、発生組織、神経組織、心血管組織、肺組織、腎臓組織、免疫
組織、造血組織、生殖組織、胃腸組織、ならびに癌性組織および創傷組織）また
は体液（例えば、リンパ、精液、羊水、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）ま
たは別の組織もしくは細胞サンプルの中で、慣用的に検出される。
【０３８２】 本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号３８において、残基Ｐｒｏ−６７
〜Ｔｈｒ−７３、Ｐｒｏ−７６〜Ｇｌｎ−８３、Ａｓｎ−９３〜Ｔｈｒ−９９、
Ｈｉｓ−１１５〜Ａｒｇ−１２８、Ｈｉｓ−１７８〜Ｌｙｓ−１８９、Ｐｒｏ−
１９７〜Ａｌａ−２１２、Ｖａｌ−２２４〜Ｔｒｐ−２３３、Ｌｙｓ−２５３〜
Ｌｙｓ−２５９、Ｓｅｒ−２８０〜Ａｓｎ−２８９、Ａｓｐ−２９６〜Ｔｙｒ−
３０２、Ｇｌｎ−３０８〜Ａｌａ−３１５、Ａｒｇ−３２７〜Ｌｙｓ−３３５、
Ａｓｐ−３４９〜Ｇｌｙ−３５８として示される免疫原性エピトープを含む。上
記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０３８３】 血管新生内皮細胞における組織分布は、この遺伝子に対応するポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドが、血管新生組織の疾患（例えば、アテローム性動脈硬化
症、運動失調、吸収不良（ｍａｌａｂｓｏｒｔｉｏｎ）、および高脂質血症）の
診断および処置に有用であることを示す。これらの因子および他の因子は、しば
しば、他の心血管疾患を生じる。さらに、この遺伝子の翻訳産物は、創傷の処置
に有用であり、そして創傷治癒プロセスを容易にし得る。さらに、このタンパク
質は、微小血管疾患、血管漏出症候群、動脈瘤、発作、塞栓症、血栓症、冠状動
脈疾患、動脈硬化症、および／またはアテローム性動脈硬化症を含むがこれらに
限定されない、種々の血管障害および状態の検出、処置、および／または予防に
おいて有用である。このタンパク質の組織分布に基づいて、このタンパク質に対
するアンタゴニストは、このタンパク質の活性をブロックする際に有用である。
従って、この遺伝子の翻訳産物の一部に特異的に結合する抗体が、好ましい。
【０３８４】 このタンパク質の発現が生じる腫瘍を検出するためのキットもまた、提供され
る。このようなキットは、１つの実施形態において、固体支持体に結合したこの
遺伝子の翻訳産物に特異的な抗体を含む。また、個体においてこれらの腫瘍を検
出する方法が提供される。この方法は、この遺伝子の翻訳産物に特異的な抗体を
、その個体由来の体液（好ましくは、血清）に接触させ、そして抗体がこの体液
において見出される抗原に結合するか否かを確認する工程を、包含する。好まし
くは、この抗体は固体支持体に結合されており、そしてこの体液は血清である。
上記の実施形態、ならびに他の処置および診断試験（キットおよび方法）は、本
明細書中の他の部分により詳細に記載される。さらに、このタンパク質はまた、
栄養補給剤としてのその使用に加えて、生物学的活性を決定するために、抗体を
惹起するために、組織マーカーとして、同族のリガンドまたはレセプターを単離
するために、それらの相互作用を調節する薬剤を同定するために使用され得る。
タンパク質ならびにこのタンパク質に対する抗体は、上記に挙げられた組織に対
する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療の標的として有用性を示し得る。
【０３８５】 多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号２０に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であった
かもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の
範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、
好ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（
ここで、ａは配列番号２０の１〜１６８５の任意の整数であり、ｂは１５〜１６
９９の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号２０に示されるヌクレオ
チド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以
上のポリヌクレオチドが除外される。
【０３８６】 （遺伝子番号１１によりコードされるタンパク質の特徴） この遺伝子の翻訳産物は、細胞傷害性調節Ｔ細胞関連分子（ＣＲＴＡＭ）タン
パク質と配列相同性を共有する。このタンパク質は、種々の細胞型（造血細胞お
よび種々のＴ細胞前駆体）の細胞の生理学、発生、分化または機能の調節におい
て重要であると考えられる。例えば、本明細書中にその全体が参考として援用さ
れる、ＰＣＴ公報ＷＯ９６／３４１０２を参照のこと。さらに、この遺伝子のタ
ンパク質産物はまた、胸腺細胞活性化および発達タンパク質およびクラスＩ Ｍ
ＨＣ拘束Ｔ細胞関連分子と相同性を共有する（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ｇｉ｜２
６６５７９０、ｇｂ｜ＡＡＢ８８４９１．１、ｇｂ｜ＡＡＣ８０２６７．１およ
びｇｉ｜３９３０１６３を参照のこと；これらの登録番号中に含まれるすべての
情報および参照は、本明細書中に参考として援用される）。この配列類似性に基
づいて、この遺伝子の翻訳産物は、Ｔ細胞調節タンパク質と少なくともいくらか
の生物学的活性を共有することが、予期される。このような活性は、当該分野で
公知であり、そのいくらかは、本明細書中の他の部分に記載される。
【０３８７】 本発明の好ましいポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む：
【０３８８】
【化１０５】 （配列番号１３６）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもま
た、提供される。
【０３８９】 この後者の実施形態のポリペプチドは、この遺伝子について表ＸＩＩＩに示さ
れるアミノ酸配列のおよそのアミノ酸位置３７９〜３９５に膜貫通ドメインを有
することが決定された。さらに、このタンパク質のアミノ酸３９６〜４４２を含
む細胞質テイルもまた、決定された。これらの特徴に基づいて、この遺伝子のタ
ンパク質産物は、Ｉａ型膜タンパク質に対して構造的特徴を共有する。
【０３９０】 好ましいポリヌクレオチドは、以下の配列を含む：
【０３９１】
【化１０６】
【０３９２】
【化１０７】 （配列番号１３７）。また、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリ
ペプチドも好ましい。
【０３９３】 図２８Ａ〜Ｂは、本発明のヌクレオチド配列（配列番号２１）および推定アミ
ノ酸配列（配列番号３９）を示す。推定アミノ酸およそ１〜およそ４４は、推定
シグナルペプチド（配列番号３９のアミノ酸残基およそ１〜およそ４４）を構成
し、そして下線のアミノ酸領域により示される。
【０３９４】 図２９は、本発明の配列番号３９、ヒトポリオウイルスレセプタータンパク質
（ｇｉ｜１５２４０８８）（配列番号１３８）、ヒトクラスＩ ＭＨＣ拘束Ｔ細
胞関連分子（ＷＯ９６３４１０２）（配列番号１４４）、ならびにＧａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ胸腺細胞活性化および発達タンパク質（ｇｂ｜ＡＡＢ８８４９１
．１）（配列番号１４５）のアミノ酸配列間の類似性の領域を示す。
【０３９５】 図３０は、配列番号３９のアミノ酸配列の分析を示す。α領域、β領域、ター
ン領域およびコイル領域；親水性領域および疎水性領域；両親媒性領域；可撓性
領域；抗原性指標および表面確率が示される。
【０３９６】 本発明は、図２８Ａ〜Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号３９）を有するポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供す
る。この配列は、クローン化されたｃＤＮＡを配列決定することにより決定され
た。図２８Ａ〜Ｂに示されるヌクレオチド配列（配列番号２１）は、クローン化
されたｃＤＮＡ（ＨＯＵＤＪ８１）を配列決定することにより得られた。このク
ローン化ｃＤＮＡは、アメリカンタイプカルチャーコレクションに１９９８年１
１月１７日に寄託され、そして受託番号２０３４８４を与えられた。この寄託さ
れた遺伝子は、ｐＳｐｏｒｔプラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中に、そのＳａｌＩ／ＮｏｔＩ制限エンドンクレ
アーゼ切断部位を使用して挿入される。
【０３９７】 本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメント
に関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号２１に示され
るヌクレオチド配列を有する、単離されたＤＮＡ分子のフラグメントによって、
本明細書中に考察されるように診断プローブおよびプライマーとして有用な、長
さが少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なお
より好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも
約４０ｎｔのＤＮＡフラグメントが、意図される。当然、長さがより長いフラグ
メント５０〜１５００ｎｔもまた、本発明に従って有用であり、同様に、寄託さ
れたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号２１に示されるようなヌクレオ
チド配列のうちの、（すべてではないにしても）ほとんどに対応するフラグメン
トも有用である。例えば、少なくとも長さ２０ｎｔのフラグメントによって、寄
託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号２１に示されるヌクレオチ
ド配列からの、２０個以上連続する塩基を含むフラグメントが意図される。この
文脈において「およそ（約）」は、特に記載されたサイズ、およびいずれかの末
端もしくは両方の末端においてこれより数個（５、４、３、２、または１）のヌ
クレオチドだけ大きいかまたは小さなサイズを含む。本発明のポリヌクレオチド
フラグメントの代表的例は、例えば、配列番号２１、もしくはその相補鎖、また
は寄託された遺伝子に含まれるｃＤＮＡのうちの、ヌクレオチドおよそ１〜およ
そ５０、およそ５１〜およそ１００、およそ１０１〜およそ１５０、およそ１５
１〜およそ２００、およそ２０１〜およそ２５０、およそ２５１〜およそ３００
、およそ３０１〜およそ３５０、およそ３５１〜およそ４００、およそ４０１〜
およそ４５０、およそ４５１〜およそ５００、およそ５０１〜およそ５５０、お
よそ５５１〜およそ６００、およそ６０１〜およそ６５０、およそ６５１〜およ
そ７００、およそ７０１〜およそ７５０、およそ７５１〜およそ８００、およそ
８０１〜およそ８５０、およそ８５１〜およそ９００、およそ９０１〜およそ９
５０、およそ９５１〜およそ１０００、およそ１００１〜およそ１０５０、およ
そ１０５１〜およそ１１００、およそ１０１１〜およそ１１５０、およそ１１５
１〜およそ１２００、およそ１２０１〜およそ１２５０、およそ１２５１〜およ
そ１３００、およそ１３０１〜およそ１３５０、およそ１３５１〜およそ１４０
０、およそ１４０１〜およそ１４５０、およそ１４５１〜およそ１５００、およ
そ１５０１〜およそ１５２０、の配列、を含むかまたはこれらの配列からなる、
フラグメントを含む。この文脈において、「およそ（約）」は、特に記載された
範囲、およびいずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、
４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな範囲を含む。
さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、その対応するタンパ
ク質の機能的特性をコードする。
【０３９８】 このことに関して、本発明の好ましい実施形態は、αへリックスおよびαへリ
ックス形成領域（「α領域」）、βシートおよびβシート形成領域（「β領域」
）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成
領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒
性領域、可撓性領域、表面形成領域、および高い抗原性指標領域を含むフラグメ
ントを含む。上記のように図３０および／または表Ｘに示されるタンパク質の構
造的特質または機能的特質を表すデータは、デフォルトパラメーターにセットさ
れたＤＮＡ*ＳＴＡＲの種々のモジュールおよびアルゴリズムを用いて作成され
た。好ましい実施形態において、表Ｘの欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、およびＸ
ＩＶに提示されるデータは、抗原性についての高い程度の可能性を示すタンパク
質の領域を決定するために使用され得る。高い抗原性の領域は、抗原認識が免疫
応答の開始のプロセスにおいて存在し得る、環境中のポリペプチドの表面に曝露
されるようであるポリペプチド領域を提示する値を選択することによって、欄Ｖ
ＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、および／またはＸＩＶにおいて提示されるデータから
決定される。
【０３９９】 これらに関する特定の好ましい領域は図３０に示されるが、この領域は、表Ｘ
に示されるように、図３０に提示されるデータの表の表示を用いることによって
提示および同定され得る。図３０を生成するために使用されるＤＮＡ*ＳＴＡＲ
コンピューターアルゴリズム（もともとのデフォルトパラメーターでセットされ
る）は、表の形式において図３０でデータを提示するために使用された（表Ｘを
参照のこと）。図７におけるデータの表の形式は、好ましい領域の特異的な境界
を容易に決定するために使用され得る。
【０４００】 これらの点において特定の好ましい領域は図３０に示されるが、この領域は、
表Ｘに示されるように、それぞれ図３０に提示されるデータの表の表示を用いる
ことによって提示または同定され得る。図３０を生成するために使用されるＤＮ
Ａ*ＳＴＡＲコンピューターアルゴリズム（もともとのデフォルトパラメーター
でセットされる）は、表の形式において図３０でデータを提示するために使用さ
れた（表Ｘを参照のこと）。図３０におけるデータの表の形式は、好ましい領域
の特異的な境界を容易に決定するために使用される。図３０および表Ｘに示され
る上記の好ましい領域は、図２８Ａ〜Ｂに示されるアミノ酸配列の分析によって
同定される上記の型の領域を含むが、これらに限定されない。図３０および表Ｘ
において示されるように、このような好ましい領域としては、Ｇａｒｎｉｅｒ−
Ｒｏｂｓｏｎのα領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆ
ａｓｍａｎのα領域、β領域、およびターン領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌ
ｅの親水性領域およびＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓの疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ
のα両親媒性領域およびβ両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可撓
性領域、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの高度な抗原性指標の領域、ならびにＥｍｉ
ｎｉの表面形成領域が挙げられる。タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ
酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じるとして
も、他の機能的活性（例えば、生物学的活性、マルチマーを形成する能力など）
はなお保持され得る。例えば、完全な形態または成熟形態のポリペプチドを認識
する抗体を誘導する能力および／またはその抗体に結合する能力は、完全なポリ
ペプチドまたは成熟ポリペプチドの残基の大部分より少ない残基が、Ｎ末端から
除去された場合には、一般的に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を
欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持するか否かは、本明
細書中に記載される慣用的な方法および当該分野において公知の別の方法によっ
て、容易に決定され得る。多数のＮ末端アミノ酸残基が欠失したムテインが、い
くつかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し得ることはありそうもないこ
とではない。実際に、６程度の少ないアミノ酸残基から構成されるペプチドはし
ばしば、免疫応答を誘発し得る。
【０４０１】 従って、本発明は、図２８Ａ〜Ｂに示されるアミノ酸配列のアミノ末端から３
５９位のトレオニン残基までの１つ以上の残基が欠失したポリペプチド、および
このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発
明は、図２８Ａ〜Ｂの残基ｎ１〜３６４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提
供し、ここでｎ１は、図２８Ａ〜Ｂのアミノ酸残基（これは、配列番号３９に示
される配列と同一である）の位置に対応する２〜３５９の範囲の整数である。配
列番号３９として示される本発明のポリペプチドのＮ末端欠失物は、配列番号の
以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：
【０４０２】
【化１０８】
【０４０３】
【化１０９】
【０４０４】
【化１１０】 これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明によ
って包含される。
【０４０５】 また上記のように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、
タンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じるとしても、他の
機能的活性（例えば、細胞外マトリクスを調節する能力のような生物学的活性な
ど）はなお保持され得る。例えば、短縮化されたムテインが、完全な形態または
成熟形態のポリペプチドを認識する抗体を誘導する能力および／またはその抗体
に結合する能力は、完全なポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの残基の大部分
より少ない残基が、Ｃ末端から除去された場合には、一般的に保持される。完全
なポリペプチドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的
活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分
野において公知の別の方法によって、容易に決定され得る。多数のＣ末端アミノ
酸残基が欠失したムテインが、いくつかの生物学的活性または免疫原性活性を保
持し得ることはありそうもないことではない。実際に、６程度の少ないアミノ酸
残基から構成されるペプチドはしばしば、免疫応答を誘発し得る。
【０４０６】 従って、本発明はさらに、図２８Ａ〜Ｂに示されるポリペプチドのアミノ酸配
列のカルボキシ末端から６位のロイシン残基までの１つ以上の残基が欠失したポ
リペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提
供する。さらに、本発明はさらに、図２８Ａ〜Ｂの残基１〜ｍ１のアミノ酸配列
を含むポリペプチドを提供し、ここでｍ１は、図２８Ａ〜Ｂのアミノ酸残基の位
置に対応する６〜３６４の範囲の整数である。さらに、本発明は、配列番号３９
の以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、配列番号３９として示
される本発明のポリペプチドのＣ末端欠失物のアミノ酸配列を含むか、またはこ
のアミノ酸配列からなる、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供す
る：
【０４０７】
【化１１１】
【０４０８】
【化１１２】
【０４０９】
【化１１３】 これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明によ
って包含される。
【０４１０】 さらに、本発明は、以下の関連するｃＤＮＡ遺伝子から決定された配列番号２
１の広範囲の部分に関連するヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する：Ｈ
ＳＱＦＪ９２Ｒ（配列番号１３９）、ＨＦＬＡＢ１８Ｆ（配列番号１４０）、Ｈ
ＡＱＢＨ８２Ｒ（配列番号１４１）、ＨＬＨＴＭ１０Ｒ（配列番号１４２）およ
びＨＬＨＡＬ６５Ｒ（配列番号１４３）。
【０４１１】 この遺伝子は、主に免疫系関連組織（例えば、潰瘍性大腸炎、拒絶された腎臓
組織）において、そしてより少ない程度で胸腺および骨髄において発現される。
従って、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中
に存在する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに免疫および造血の疾
患および／または障害、特に潰瘍性大腸炎および拒絶された器官を含むが、これ
らに限定されない、疾患および状態の診断のための試薬として有用である。同様
に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞
型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有用である。上記組織または
細胞、特に免疫系の多くの障害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち、
障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の発現レベル）に対して有意に
より高いまたはより低いレベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する
個体から採取された特定の組織もしくは細胞型（例えば、移植された腎臓、免疫
組織、造血組織、腎臓組織、ならびに癌性組織および創傷組織）または体液（例
えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）または別の組織もしくは細
胞サンプルの中で、慣用的に検出される。
【０４１２】 本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号３９において、残基：Ｇｌｙ−４
２〜Ｐｈｅ−４８、Ｖａｌ−６６〜Ａｓｐ−７１、Ａｓｎ−７８〜Ｔｈｒ−８３
、Ａｓｐ−８８〜Ａｒｇ−９６、Ｔｙｒ−１２７〜Ｔｙｒ−１３５、Ｌｙｓ−１
８１〜Ｔｒｐ−１９５、Ｈｉｓ−２１０〜Ｇｌｙ−２１５、Ｌｅｕ−３０３〜Ｔ
ｈｒ−３１０、Ｔｈｒ−３４１〜Ｔｈｒ−３５０として示される免疫原性エピト
ープを含む。上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供され
る。
【０４１３】 ＣＲＴＡＭ、胸腺細胞活性化および発生タンパク質、クラスＩ ＭＨＣ拘束Ｔ
細胞結合分子タンパク質、ならびにポリオウイルス（ｐｏｌｉｖｉｒｕｓ）レセ
プターに対する相同性と組み合わせた、主に免疫細胞および免疫組織における組
織分布は、この遺伝子のタンパク質産物が、造血細胞および特にＴ細胞前駆体を
含む種々の細胞型の細胞生理、発達、分化または機能の調節に有用であることを
示す。代表的な用途は、以下の「免疫活性」の節および「感染性疾患」の節、実
施例１１、実施例１３、実施例１４、実施例１６、実施例１８、実施例１９、実
施例２０、および実施例２７、ならびに本明細書の他の箇所に記載される。この
タンパク質は、異常増殖（例えば、ガン）または変性状態を包含する、異常な生
理機能または異常な発達に関連する状態の診断および処置に関する産物を開発す
るために用いられ得る。細胞の生理機能または発達は、細胞をアゴニストまたは
アンタゴニスト（すなわち、抗ＣＲＴＡＭ様ペプチド抗体）と接触させることに
より調節され得る。さらに、本発明のＣＲＴＡＭ様ポリペプチドは、潰瘍性大腸
炎、器官拒絶および他の免疫系関連障害の処置を含む。アゴニストまたはアンタ
ゴニストは、潰瘍性大腸炎および拒絶された器官（例えば、腎臓）のような障害
を処置または予防し得る。このタンパク質の組織分布に基づいて、このタンパク
質に対するアンタゴニストは、このタンパク質の活性をブロックする際に有用で
ある。従って、この遺伝子の翻訳産物の一部に特異的に結合する抗体が好ましい
。
【０４１４】 このタンパク質の発現が生じる腫瘍の検出のためのキットもまた、提供される
。１つの実施形態においては、このようなキットは、固体支持層に結合されるこ
の遺伝子の転写産物に対して特異的な抗体を含む。個体におけるこれらの腫瘍を
検出するための方法もまた、提供され、これは、この遺伝子の転写産物に対して
特異的な抗体が個体からの体液（好ましくは、血清）に接触させる工程、および
抗体がこの体液中に見出される抗原に結合するか否かを確認する工程を含む。好
ましくは、この抗体は、固体支持層に結合され、この体液は、血清である。上記
の実施形態、ならびに他の処置および診断的試験（キットおよび方法）は、本明
細書中の他でより詳しく記載される。さらに、このタンパク質もまた、栄養性補
助食品としてのその使用に加えて、生物学的活性を決定するため、組織のマーカ
ーとして抗体を惹起するため、同族のリガンドまたはレセプターを単離するため
、これらの相互作用を調節する薬剤を同定するために用いられ得る。タンパク質
ならびにそのタンパク質に対する抗体は、腫瘍マーカーおよび／または上記に列
挙された組織の免疫療法の標的としての有用性を示し得る。
【０４１５】 ＥＳＴ配列のような多数のポリヌクレオチド配列は、公的に入手可能であり、
そして配列データベースを通じて接近可能である。これらの配列のいくつかは、
配列番号２１に関し、そして本発明の構想の前に公的に利用可能であり得た。好
ましくは、このような関連ポリヌクレオチドは、本発明の範囲から特に除外され
る。あらゆる関連配列を列挙することは、煩わしい。従って、好ましくは、一般
式ａ〜ｂによって記載されたヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチ
ドが本発明から除外される。ここでａは、配列番号２１の１〜１５０６の間の任
意の整数であり、ｂは、１５〜１５２０の整数であり、ａおよびｂの両方は、配
列番号２１に示されるヌクレオチド残基の位置と対応し、そしてｂは、＋１４以
上である。
【０４１６】 （遺伝子１２番によってコードされるタンパク質の特徴） 図３１は、本発明のヌクレオチド（配列番号２２）および推定アミノ酸（配列
番号４０）を示す。約１〜約２３の推定アミノ酸は、推定のシグナルペプチド（
配列番号の４０の約１〜約２３のアミノ酸残基）を構成し、そして下線のアミノ
酸領域によって示される。
【０４１７】 図３２は、本発明配列番号４０のアミノ酸配列とヒトＦＡＰタンパク質（ｇｉ
｜１８９０６４７）（配列番号１４６）との間の類似性の領域を示す。
【０４１８】 図３３は、配列番号４０のアミノ酸配列の分析を示す。
【０４１９】 α、β、ターンおよびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓
性領域；抗原性指標および表面確率を示す。
【０４２０】 本発明は、図３１（配列番号４０）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供し、これは
、クローン化ｃＤＮＡを配列決定することによって決定された。図３１（配列番
号２２）に示されるヌクレオチド配列は、クローン化ｃＤＮＡ（ＨＰＷＣＭ７６
）を配列決定することによって得られ、これは、１９９８年１１月１７日にＡｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、
受託番号２０３４８４を与えられた。この寄託された遺伝子は、ＳａｌＩ／Ｎｏ
ｔＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を用いてｐＳｐｏｒｔプラスミド（Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に挿入される。
【０４２１】 本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメント
に関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号２２に示され
るヌクレオチド配列を有する単離されたＤＮＡ分子のフラグメントは、少なくと
も約１５ｎｔ、そしてより好ましくは、少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ま
しくは、少なくとも約３０ｎｔ、そしてずっとより好ましくは、少なくとも約４
０ｎｔの長さが意図され、これらは、本明細書中に記載されるような診断的プロ
ーブおよびプライマーとして有用である。もちろん、フラグメントが、寄託され
たｃＤＮＡのヌクレオチド配列または配列番号２２に示されるようなヌクレオチ
ド配列の全てでなくともほとんどに対応する場合、５０−１５００ｎｔの長さよ
り長いフラグメントもまた、本発明によって有用である。例えば、少なくとも２
０ｎｔの長さのフラグメントは、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または
配列番号２２に示されるようなヌクレオチド配列由来の２０以上の連続する塩基
を含むフラグメントが意図される。この文脈において「約（およそ）」は、特に
記載されたサイズ、およびいずれかの末端もしくは両方の末端において、これよ
り数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな
サイズを含む。本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例え
ば、以下のおおよそのヌクレオチド数の配列を含むか、あるいは以下から成るフ
ラグメントが挙げられる：配列番号２２の１〜約５０、約５１〜約１００、約１
０１〜約１５０、約１５１〜約２００、約２０１〜約２５０、約２５１〜約３０
０、約３０１〜約３５０、約３５１〜約４００、約４０１〜約４５０、約４５１
〜約５００、約５０１〜約５５０、約５５１〜約６００、約６０１〜６５０、約
６５１〜約７００、約７０１〜約７５０、約７５１〜約８００、約８０１〜約８
０７、もしくはそれらの相補鎖、または寄託された遺伝子に含まれるｃＤＮＡ。
この文脈において、「約（およそ）」は、特に記載された範囲、およびいずれか
の末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１
）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな範囲を含む。さらなる実施形態にお
いて、本発明のポリヌクレオチドは、対応するタンパク質の機能的な特質をコー
ドする。
【０４２２】 この点において、本発明の好ましい実施形態は、α−へリックスおよびα−へ
リックス形成領域（「α−領域」）、β−シートおよびβ−シート形成領域（「
β−領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン−領域」）、コイルおよ
びコイル形成領域（「コイル−領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性
領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、および高い抗原性指標領域
を含むフラグメントを含む。上記のように図３３および／または表ＸＩに示すタ
ンパク質の構造的または機能的特質を表すデータは、デフォルトパラメーターに
セットされたＤＮＡ*ＳＴＡＲの種々のモジュールおよびアルゴリズムを用いて
作製された。好ましい実施形態において、表ＸＩの欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ
、およびＸＩＶに提示されるデータは、抗原性についての可能性の高い程度を示
すタンパク質の領域を決定するために使用され得る。高い抗原性の領域は、抗原
認識が免疫応答の開始のプロセスにおいて生じ得る環境中のポリペプチドの表面
に曝露されるようなポリペプチドの領域を提示する値を選択することによって、
欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、および／またはＸＩＶにおいて提示されるデータ
から決定される。
【０４２３】 これらの点において特定の好ましい領域は、図３３に示されるが、この領域は
、表ＸＩに示されるように、図３３に提示されるデータの表の表示を用いること
によって提示および同定され得る。図３３を作製するために使用されたＤＮＡ*
ＳＴＡＲコンピューターアルゴリズム（もともとのデフォルトパラメーターでセ
ットされる）は、表の形式において図３３でデータを提示するために使用された
（表ＸＩを参照のこと）。図３３におけるデータの表の形式は、好ましい領域の
特異的な境界を容易に決定するために使用され得る。図３３および表ＸＩに示さ
れる上記の好ましい領域は、図３１に示されるアミノ酸配列の分析によって同定
される上記のタイプの領域を含むが、これに限定されない。図３３および表ＸＩ
に示される、このような好ましい領域としては、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ
のα−領域、β−領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａ
ｎのα−領域、β−領域、およびターン領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの
親水性領域およびＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓの疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのα
−およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可撓性領域、Ｊａ
ｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの高度な抗原性指標の領域、ならびにＥｍｉｎｉの表面形
成領域が挙げられる。タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、
タンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じるとしても、他の機能
的活性（例えば、生物学的活性、マルチマーを形成する能力など）はなお保持さ
れ得る。例えば、短縮化されたムテインが、完全な形態または成熟形態のポリペ
プチドを認識する抗体を誘導する能力および／またはその抗体に結合する能力は
、完全なポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの残基の大部分より少ない残基が
、Ｎ末端から除去された場合には、一般的に保持される。完全なポリペプチドの
Ｎ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持するか
どうかは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野において公知の
別の方法によって、容易に決定され得る。多数のＮ末端アミノ酸残基が欠失した
ムテインが、いくつかの生物学的活性または免疫学的活性を保持し得ることはあ
りそうもないことではない。実際に、６程度の少ないアミノ酸残基から構成され
るペプチドはしばしば、免疫応答を誘発し得る。
【０４２４】 従って、本発明は図３１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から、位置番号
６１にあるアルギニン残基までの、１つ以上の残基欠失されたポリペプチド、お
よびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。
特に本発明は、図３１の残基ｎ１〜６６のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提
供し、ここで、ｎ１は、図３１（これは、配列番号４０として示される配列と同
じである）のアミノ酸残基の位置に対応する２〜６１に対応する整数である。配
列番号４０に示される本発明のポリペプチドのＮ末端欠失は、配列番号４０の内
の以下の残基のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む：
【０４２５】
【化１１４】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
よって包含される。
【０４２６】 また上記のように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、
タンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じたとしても、他の
機能的活性（例えば、細胞外マトリックスを調節する能力のような生物学的活性
など）は、なお保持され得る。例えば、ポリペプチドの完全なまたは成熟した形
態を認識する抗体を誘導し、そして／またはその抗体に結合する能力は一般に、
完全なまたは成熟したポリペプチドの大部分より少ない残基がＣ末端から除去さ
れる場合、保持される。完全なポリペプチドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプ
チドがこのような免疫原性活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される
、そしてさもなくば当該分野で公知の慣習的な方法によって容易に決定され得る
。多数の欠失したＣ末端アミノ酸残基を有するムテインが、幾つかの生物学的活
性または免疫原性活性を保持し得ることは、起こりそうもないことではない。事
実、６個のように少ないアミノ酸残基からからなるペプチドは、しばしば、免疫
応答を誘起し得る。
【０４２７】 従って、本発明は、図３１に示されるポリペプチドのアミノ酸配列のカルボキ
シ末端から位置番号６のロイシン残基までの１つ以上の残基が欠失したポリペプ
チド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提
供する。特に、本発明は図３１の残基１〜ｍｌのアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドを提供し、ここで、ｍｌは図３１のアミノ酸残基の位置に対応する６〜６
６の整数である。さらに、本発明は、配列番号４０に示される本発明のポリペプ
チドのＣ末端欠失のアミノ酸配列を含有する、またはあるいは、そのアミノ酸配
列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、そして配列番
号４０の内の以下の残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：
【０４２８】
【化１１５】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
よって包含される。
【０４２９】 さらに、本発明は、以下の関係するｃＤＮＡ遺伝子から決定された配列番号２
２の広範な部分（ＨＰＷＣＭ７６Ｒ（配列番号１４７））に関係するヌクレオチ
ド配列を有する核酸分子を提供する。
【０４３０】 この遺伝子は、前立線ＢＰＨ（良性前立腺肥大）組織において、主として発現
される。それゆえ、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的
サンプル中に存在する組織（単数または複数）または細胞型（単数または複数）
の示差的同定、および前立腺または関係した組織の炎症を含むが、これらに限定
されない疾患および状態の診断のための試薬として有用である。同様に、ポリペ
プチドおよびこれらのポリペプチドに関係する抗体は、組織（単数または複数）
または細胞型（単数または複数）の示差的同定のための免疫学的プローブの提供
において有用である。上記組織または細胞、特に前立腺の多くの障害に関して、
標準的な遺伝子発現レベル、すなわち障害を有さない個体からの健康な組織また
は体液における発現レベルに対して、有意により高いまたはより低いレベルでの
この遺伝子の発現は、このような障害を有する個体から採取された特定の組織ま
たは細胞型（例えば、前立線、癌性組織および創傷した組織）または体液（例え
ば、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、あるいは別の組織または細胞サンプル
において、慣用的に検出される。
【０４３１】 前立腺ＢＰＨ組織における組織分布は、この遺伝子に対応するポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドは、前立腺または関係する組織の拡大を生じる炎症状態の
処置のために有用であることを示す。この遺伝子に対応するポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは、適切な精巣機能（例えば、内分泌機能、精子成熟）、なら
びに癌に関係する状態の処置および診断のために有用である。それゆえ、この遺
伝子産物は、男性不妊症および／またはインポテンスの処置において有用である
。この遺伝子産物はまた、雄性避妊剤として有用である薬剤（アンタゴニスト）
のような結合薬剤を同定するために設計されたアッセイにおいて有用である。同
様に、このタンパク質は、精巣癌の処置および／または診断に有用であると考え
られる。精巣はまた、身体の他の組織において特に低レベルで発現される転写物
の活性遺伝子発現の部位である。それゆえ、この遺伝子産物は、他のプロセスに
おいて、関連した機能的な役割（幾つかの可能な標的の指標を挙げると、造血、
炎症、骨形成、および腎機能）を担い得る、他の特異的組織または器官において
発現される。このタンパク質の組織分布に基づいて、このタンパク質に対して関
係するアンタゴニストは、このタンパク質の活性をブロックする上で有用である
。従って、この遺伝子の翻訳産物の一部分を特異的に結合する抗体が好ましい。
【０４３２】 また、このタンパク質の発現が起こる腫瘍を検出するためのキットが提供され
る。このようなキットは、１つの実施態様において、固体支持体に結合されたこ
の遺伝子の翻訳産物に対して特異的である抗体を含む。また、個体中のこれらの
腫瘍を検出する方法が提供され、この方法は、この遺伝子の翻訳産物に対して特
異的である抗体を、個体からの体液、好ましくは、血清に接触させる工程、およ
び抗体が体液中に見出される抗原と結合するかどうかを確認する工程を包含する
。好ましくは、この抗体は固体支持体に結合され、そしてこの体液は血清である
。上記の実施形態、ならびに他の処置および診断試験（キットおよび方法）は、
本明細書中の他の場所に、より具体的に記載される。ＦＡＰタンパク質に対する
相同性は、この遺伝子のタンパク質産物が、鉄代謝障害、特に、高酸化状態、組
織損傷、アテローム性動脈硬化（ａｔｈｅｒｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、フリーラジ
カル損傷、脈管障害、鉄結合タンパク質機能障害、一酸化窒素シンターゼの機能
障害または異常、血管拡張障害および組織水腫を生じる鉄代謝障害の処置、検出
、および／または防止において有用であることを示す。配列類似性に基づいて、
この遺伝子の翻訳産物は、鉄代謝調節性タンパク質と少なくとも幾つかの生物学
的活性を共有すると期待される。このような活性は当該分野で公知であり、それ
らの幾つかは本明細書中の他の場所に記載される。さらに、このタンパク質はま
た、生物学的活性を決定するために、抗体を惹起するために、組織マーカーとし
て、同族のリガンドまたはレセプターを単離するために、それらの相互作用を調
節する薬剤を同定するために、さらに栄養補充物としてのその使用のために使用
され得る。タンパク質、およびこのタンパク質に対する抗体は、上に列挙された
組織についての腫瘍マーカーおよび／または免疫療法標的としての有用性を示し
得る。
【０４３３】 多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は公的に入手可能であり
、そして配列データベースを介してアクセス可能である。これらの配列の幾つか
は、配列番号２２と関連し、そして本発明の着想の前に、公的に入手可能であり
得たかもしれない。好ましくは、このような関連したポリヌクレオチドは、本発
明の範囲から特に排除される。全ての関連した配列を列挙することは厄介である
。従って、好ましくは、一般式ａ−ｂ（ここで、ａは配列番号２２の１〜７９３
の任意の整数であり、ｂは１５〜８０７の整数であり、ここでａおよびｂの両方
は配列番号２２に示されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂは
ａ＋１４以上である）で記載される１つ以上のヌクレオチド配列を含有するポリ
ヌクレオチドは、本発明から除外される。
【０４３４】
【表１】
【０４３５】
【表２】
【０４３６】
【表３】
【０４３７】
【表４】
【０４３８】
【表５】
【０４３９】
【表６】
【０４４０】
【表７】
【０４４１】
【表８】
【０４４２】
【表９】
【０４４３】
【表１０】
【０４４４】
【表１１】
【０４４５】
【表１２】
【０４４６】
【表１３】 表ＸＩＩＩは、上記の各「遺伝子番号」に対応する情報を要約する。「ヌクレ
オチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ」として同定されるヌクレオチド配列は、表ＸＩ
ＩＩにおいて同定される「ｃＤＮＡクローンＩＤ」から、およびいくつかの場合
において、さらなる関連のＤＮＡクローンから得られる部分的に相同な（「重複
する」）配列から構築された。重複する配列は、高い冗長性の単一の連続した配
列に構築され（通常、各ヌクレオチド部位で３〜５個の重複する配列）、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：Ｘとして同定される最終的な配列を得た。
【０４４７】 ｃＤＮＡクローンＩＤは、その日付に寄託され、そして「ＡＴＣＣ受託番号Ｚ
および日付」において列挙される対応する寄託番号が与えられた。寄託物のいく
つかは、同じ遺伝子に対応する複数の異なるクローンを含む。「ベクター」とは
、ｃＤＮＡクローンＩＤにおいて含まれるベクターの型をいう。
【０４４８】 「総ヌクレオチド配列」は、「遺伝子番号」によって同定されるコンティグに
おけるヌクレオチドの総数をいう。寄託されたクローンは、これらの配列の全て
またはほとんどを含み得、これらは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘの「クローン配列
の５'ヌクレオチド」および「クローン配列の３'ヌクレオチド」として示される
ヌクレオチドの位置によって反映される。推定開始コドン（メチオニン）のＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：Ｘのヌクレオチドの位置は、「開始コドンの５'ヌクレオチド
」として同定される。同様に、推定シグナル配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘのヌ
クレオチドの位置は、「シグナルペプチドの第一のアミノ酸の５'ヌクレオチド
」として同定される。
【０４４９】 翻訳されたアミノ酸配列は、メチオニンで始まり、「アミノ酸ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：Ｙ」として同定されるが、他のリーディングフレームもまた、公知の分子
生物学技術を使用して容易に翻訳され得る。これらの選択的オープンリーディン
グフレームによって生成されるポリペプチドは、本発明によって具体的に意図さ
れる。
【０４５０】 推定シグナルペプチドのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙの第一および最後のアミノ酸
の位置は、「シグナルペプチドの第一のアミノ酸」および「シグナルペプチドの
最後のアミノ酸」として同定される。分泌部分のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙの推定
される第一アミノ酸の位置は、「分泌部分の推定される第一のアミノ酸」として
同定される。最後には、オープンリーディングフレームにおける最後のアミノ酸
のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙのアミノ酸の位置は、「ＯＲＦの最後のアミノ酸」と
して同定される。
【０４５１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ（ここでＸは、配列表に開示される任意のポリヌクレ
オチド配列であり得る）および翻訳されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙ（ここでＹは
、配列表に開示される任意のポリペプチド配列であり得る）は、十分に正確であ
り、そしてそうでなければ、当該分野において周知の種々の使用および以下でさ
らに記載される種々の使用に適切である。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘにおいて含まれる核酸配列または寄託されたクローンに
含まれるｃＤＮＡを検出する核酸ハイブリダイゼーションプローブを設計するた
めに有用である。これらのプローブはまた、生物学的サンプル中の核酸分子にハ
イブリダイズし、それによって本発明の種々の法医学の方法、および診断の方法
を可能にする。同様に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙから同定されるポリぺプチドは
、例えば、表ＸＩＩＩにおいて同定されるｃＤＮＡクローンによってコードされ
るタンパク質（ポリペプチドおよび分泌タンパク質を含む）に特異的に結合する
抗体を作製するために使用され得る。
【０４５２】 それにもかかわらず、配列決定反応によって生成されるＤＮＡ配列は、配列決
定のエラーを含み得る。このエラーは、誤って同定されたヌクレオチドとして、
または生成されたＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの挿入または欠失として存在
する。誤って挿入されたか、または欠失されたヌクレオチドは、推定アミノ酸配
列のリーディングフレームにおいてフレームシフトを引き起こす。これらの場合
において、作製されるＤＮＡ配列は、実際のＤＮＡ配列と９９．９％（例えば、
１０００塩基を超えるオープンリーディングフレームにおける１塩基の挿入また
は欠失）を超えて同一であり得るにもかかわらず、推定アミノ酸配列は、実際の
アミノ酸配列とは異なる。
【０４５３】 従って、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における正確さを必要とするこ
れらの適用のために、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘとして同定され作製さ
れたヌクレオチド配列、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙとして同定された推定の
翻訳されたアミノ酸配列のみではなく、表ＸＩＩＩにおいて記載されるような、
ＡＴＣＣに寄託された本発明のヒトｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡのサンプル
もまた提供する。各々の寄託されたクローンのヌクレオチド配列は、公知の方法
に従って寄託されたクローンの配列決定によって容易に決定され得る。次いで、
推定アミノ酸配列は、このような寄託物から証明され得る。さらに、特定のクロ
ーンによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列はまた、ペプチド配列決定
によって、または寄託されたヒトｃＤＮＡを含む適切な宿主細胞中でタンパク質
を発現させ、このタンパク質を収集し、そしてその配列を決定することによって
、直接的に決定され得る。
【０４５４】 本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙ、または寄
託されたクローンに対応する遺伝子に関する。対応する遺伝子は、本明細書中に
開示される配列情報を使用して、公知の方法に従って単離され得る。このような
方法は、開示された配列からプローブまたはプライマーを調製する工程、および
ゲノム物質の適切な供給源から対応する遺伝子を同定または増幅する工程を包含
する。
【０４５５】 本発明においてまた提供されるものは、対立遺伝子改変体、オーソログ（ｏｒ
ｔｈｏｌｏｇ）、および／または種相同体である。当該分野において公知の手順
は、本明細書中に開示される配列またはＡＴＣＣに寄託されたクローンの情報を
使用して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙまたは寄託された
クローンに対応する全長遺伝子、対立遺伝子改変体、スプライシング改変体、全
長のコーディング部分、オーソログ、および／または種相同体を得るために使用
され得る。例えば、対立遺伝子改変体および／または種相同体は、本明細書中に
提供される配列から適切なプローブまたはプライマーを作製し、そして対立遺伝
子改変体および／または所望の相同体について適切な核酸供給源をスクリーニン
グすることによって単離および同定され得る。
【０４５６】 本発明のポリぺプチドは、任意の適切な様式で調製され得る。このようなポリ
ぺプチドとしては、単離された天然に存在するポリぺプチド、組換え的に生成さ
れたポリぺプチド、合成的に生成されたポリぺプチド、またはこれらの方法の組
合せによって生成されたポリぺプチドが挙げられる。このようなポリぺプチドを
調製するための手段は、当該分野において十分に理解される。
【０４５７】 ポリぺプチドは、分泌タンパク質の形態（成熟形態を含む）であり得るか、ま
たはより大きいタンパク質（例えば、融合タンパク質）の部分であり得る（以下
を参照のこと）。分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、精製を補助する配列
（例えば、複数のヒスチジン残基）、または組換え生成の間の安定性のためのさ
らなる配列を含むさらなるアミノ酸配列を含むことは、しばしば有利である。
【０４５８】 本発明のポリぺプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好
ましくは実質的に精製される。ポリぺプチド（分泌されるポリぺプチドを含む）
の組換え的に生成されたバージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ）は、本明細書中に記載さ
れる技術または当該分野で公知のそれ以外の技術を使用して（例えば、Ｓｍｉｔ
ｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８）に記載され
る１工程の方法によって）実質的に精製され得る。本発明のポリぺプチドはまた
、例えば、分泌タンパク質に対して惹起される本発明の抗体のような、本明細書
中に記載される技術または当該分野において公知のそれ以外の技術を使用して、
天然、合成または組換えの供給源から精製され得る。
【０４５９】 本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘの核酸配列、および／またはＡＴＣＣ寄託
物Ｚ中に含まれるｃＤＮＡを含むか、あるいはそれらからなるポリヌクレオチド
を提供する。本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙのポリペプチド配列および
／またはＡＴＣＣ寄託物Ｚ中に含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチ
ドを含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドを提供する。ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：Ｙのポリペプチド配列および／またはＡＴＣＣ寄託物Ｚ中に含まれるｃＤ
ＮＡによりコードされるポリペプチド配列を含むか、あるいはそれらからなるポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に包含される。
【０４６０】 （シグナル配列） 本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙのポリペプチド配列、および／または
寄託されたクローン中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配列を有する
ポリペプチドの成熟形態を包含する。成熟形態をコードするポリヌクレオチド（
例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘのポリヌクレオチド配列、および／または寄託
されたクローンのｃＤＮＡに含まれるポリヌクレオチド配列のような）もまた、
本発明に包含される。シグナル仮説に従うと、一旦、粗面小胞体を横切る成長中
のタンパク質鎖の輸送が開始されると、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク
質は、成熟タンパク質から切断される、シグナル配列または分泌リーダー配列を
有する。ほとんどの哺乳動物細胞および昆虫細胞でさえも、同じ特異性を有する
分泌タンパク質を切断する。しかし、いくつかの場合、分泌タンパク質の切断は
、完全には、均一ではなく、このことは、このタンパク質の２以上の成熟種を生
じる。さらに、分泌タンパク質の切断特異性は、最終的には、完全なタンパク質
の一次構造によって決定される（すなわち、これは、このポリペプチドのアミノ
酸配列に固有である）ことが長い間公知である。
【０４６１】 タンパク質が、シグナル配列、ならびにその配列についての切断点を有するか
否かを予測するための方法が、利用可能である。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｖｉ
ｒｕｓ Ｒｅｓ．３：２７１−２８６（１９８５）の方法は、短いＮ末端荷電領
域およびそれに続く完全な（切断されていない）タンパク質の非荷電領域からの
情報を使用する。ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．１４：４６８３−４６９０（１９８６）の方法は、切断部位の周辺の残基（代
表的に−１３〜＋２残基）からの情報を使用し、ここで、＋１は、分泌タンパク
質のアミノ末端を示す。これらの方法のそれぞれについての、公知の哺乳動物分
泌タンパク質の切断点を予測することの正確さは、７５〜８０％の範囲にある（
ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、前出）。しかし、２つの方法は、所定のタンパク質につ
いて、同じ推定切断点を必ずしも生成するとは限らない。
【０４６２】 本発明の場合において、分泌されるポリぺプチドの推定アミノ酸配列は、Ｓｉ
ｇｎａｌＰと呼ばれるコンピュータープログラム（Ｈｅｎｒｉｋ Ｎｉｅｌｓｅ
ｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：１−６（１９９７））
によって分析された。このプログラムは、アミノ酸配列に基づいてタンパク質の
細胞での位置を予測する。この局在化のコンピューター予測の一部として、Ｍｃ
Ｇｅｏｃｈおよびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの方法が援用される。このプログラムに
よって、本明細書中に記載される分泌タンパク質のアミノ酸配列の分析は、表Ｘ
ＩＩＩにおいて示される結果を提供した。
【０４６３】 しかし、当業者に理解されるように、切断部位は、時折、生物に応じて変化し
、そして絶対的な確実性を伴っては予測され得ない。従って、本発明は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：Ｙにおいて示される配列を有する分泌されるポリぺプチドを提供
し、これは推定切断点の５残基（すなわち、＋または−５残基）内で始まるＮ末
端を有する。同様に、ある場合において、分泌タンパク質からのシグナル配列の
切断は、必ずしも均一ではなく、１つより多くの分泌される種を生じることもま
た認識される。これらのポリぺプチド、およびこのようなポリぺプチドをコード
するポリヌクレオチドは、本発明によって意図される。
【０４６４】 さらに、上述の分析によって同定されるシグナル配列は、天然に存在するシグ
ナル配列を必ずしも予測しないかもしれない。例えば、天然に存在するシグナル
配列は、推定シグナル配列からさらに上流にあり得る。しかし、推定シグナル配
列は、分泌タンパク質をＥＲに指向し得るようである。それにもかかわらず、本
発明は、哺乳動物細胞（例えば、下記のようなＣＯＳ細胞）において、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：Ｘのポリヌクレオチド配列および／または寄託されたクローンのｃ
ＤＮＡに含まれるポリヌクレオチド配列の発現により産生される成熟タンパク質
を提供する。これらのポリぺプチド、およびこのようなポリぺプチドをコードす
るポリヌクレオチドは、本発明によって意図される。
【０４６５】 （ポリヌクレオチドおよびポリぺプチド改変体） 本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘに開示されたポリヌクレオチド配列、それ
に対する相補鎖、および／または寄託されたクローン中に含まれるｃＤＮＡ配列
の改変体に関する。
【０４６６】 本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙに開示されるポリペプチド配列、およ
び／または寄託されたクローンによりコードされるポリペプチド配列の改変体を
包含する。
【０４６７】 「改変体」とは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリぺプチドとは異なるが
、それらの本質的な特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリぺプチドをいう
。一般に、改変体は、全体的に密接に類似し、そして、多くの領域において、本
発明のポリヌクレオチドまたはポリぺプチドに同一である。
【０４６８】 本発明はまた、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘのヌクレオチドをコードする
配列またはその相補鎖、寄託されたｃＤＮＡクローンに含まれるヌクレオチドを
コードする配列またはその相補鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙのポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列、寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／またはこれらの
核酸分子のいずれかのポリヌクレオチドフラグメント（例えば、本明細書中に記
載されるフラグメント）に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか
、あるいはそれらからなる核酸分子に関する。ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件またはより低いストリンジェントな条件の下で、これらの核酸分
子にハイブリダイズするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチドもまた、本発明により包含される。
【０４６９】 本発明はまた、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙに示されるポリペプチド配列
、寄託されたクローン中に含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配
列、および／またはこれらのポリペプチドのいずれかのポリペプチドフラグメン
ト（例えば、本明細書中に記載されるフラグメント）に対して、少なくとも８０
％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミ
ノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドに関する。
【０４７０】 本発明の参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」である
ヌクレオチド配列を有する核酸とは、核酸のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド
配列がポリぺプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド
あたり５つまでの点変異を含み得ることを除いて、参照配列に対して同一である
ことを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％
同一のヌクレオチド配列を有する核酸を得るために、参照配列中のヌクレオチド
の５％までが、欠失され得るか、または別のヌクレオチドで置換され得るか、ま
たは参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが参照配列中
に挿入され得る。問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）配列は、表ＸＩＩＩに示される配列
全体、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、または本明細書中で記載され
るように特定される任意のフラグメントであり得る。
【０４７１】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログ
ラムを使用して従来的に決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象
配列との間の最も良好な全体的な適合性（全体的な配列整列としてもまた参照さ
れる）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ
． Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づく
ＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列にお
いて、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ
配列は、ＵからＴに変換することによって比較され得る。この全体的な配列整列
の結果は、同一性パーセント（％）で示される。同一性パーセントを算定するた
めにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは
：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐ
ｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚ
ａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、
Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、
Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらか
より短い方）である。
【０４７２】 対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失のためではなく）問い合
わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。こ
れは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列
の５’および３’切断を考慮しないからである。５’末端または３’末端で切断
される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは、問い
合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されない対象配列の５’およ
び３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。ヌ
クレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって
決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、特
定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定され、最
終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本発明
の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示されるように、問
い合わせ配列と一致／整列されない、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩
基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される。
【０４７３】 例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って
、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１
０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’末端での塩
基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、ＦＡＳＴＤ
Ｂプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。
残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％で
ある。別の例では、９０塩基の対象配列は、１００塩基の問い合わせ配列と比較
される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせ配列と一致
／整列しない対象配列の５’または３’に塩基が存在しない。この場合、ＦＡＳ
ＴＤＢによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い
合わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’および３’の塩基のみが手動で補
正される。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【０４７４】 本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であ
るアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列
は、対象ポリぺプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸
あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に同
一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも
９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、対象配列に
おけるアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（消えない（ｉｎｄｅｌｓ））
または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸
配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末
端部位の間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列
内の１つ以上の連続する群においてのいずれかで、散在される。
【０４７５】 実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、表ＸＩＩＩに示され
るアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙ）に対して、または寄託されたクロー
ンに含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも
８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一
であるか否かは、従来的に、公知のコンピュータープログラムを使用して決定さ
れ得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列（全体的配列整列ともいわ
れる）との間での最良の全体的な一致を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕ
ｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０
））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して
決定され得る。配列整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方とも
ヌクレオチド配列であるかまたは両方ともアミノ酸配列であるかのいずれかであ
る。上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセントである。ＦＡＳＴＤＢア
ミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、
ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ
Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇ
ｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ ＝ 配列
の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝
０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（
どちらかより短い方）である。
【０４７６】 対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問
い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならな
い。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する
場合に、対象配列のＮ末端切断およびＣ末端切断を考慮しないからである。Ｎ末
端およびＣ末端で短縮されている対象配列について、問い合わせ配列に対して、
同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対
象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配
列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されている
か否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパー
セントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムに
よって特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのス
コアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的で使
用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端
およびＣ末端の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的の
ために考慮される。すなわち、問い合わせ残基のみが、対象配列の最も遠いＮ末
端およびＣ末端残基の外側に位置する。
【０４７７】 例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために
１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そ
してそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示
さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ
末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し
引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは
９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わ
せ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ
配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。こ
の場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正され
ない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示されるように、問い合わせ配列と一致
／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正さ
れる。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【０４７８】 改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方における変化を含み得
る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠失を生成するが、
コードされるポリぺプチドの特性または活性を変化させない変化を含むポリヌク
レオチド改変体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレントな置換によって
生成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、任意の組合せにおいて５
〜１０、１〜５、もしくは１〜２アミノ酸が置換、欠失、または付加される改変
体もまた、好ましい。ポリヌクレオチド改変体は、種々の理由（例えば、特定の
宿主についてのコドン発現を至適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを、Ｅ．
ｃｏｌｉのような細菌宿主によって好ましいコドンに変化させる））のために、
生成され得る。
【０４７９】 天然に存在する改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、そして生物の染色
体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態のうちの１つを
いう。（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子改変体は、
ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリぺプチドレベルのいずれかで変化し
得、そして本発明に含まれる。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発
技術によってまたは直接的な合成によって生成され得る。
【０４８０】 タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、改変体は、
本発明のポリぺプチドの特性を改善または変化させるために作製され得る。例え
ば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実質的な欠損を伴わずに、分泌タン
パク質のＮ末端またはＣ末端から欠失され得る。Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３）の著者らは、３、８、または２
７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失させた後でさえもヘパリン結合活性を有
する改変体ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンγは、この
タンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させた後、１
０倍までのより高い活性を示した（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８））。
【０４８１】 さらに、豊富な証拠は、改変体が、天然に存在するタンパク質の生物学的活性
に類似する活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Ｇａｙｌｅおよび
共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５−２２１１１（１
９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる変異分析を行った
。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって改変体当たり
平均２．５アミノ酸の変化になる、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ変異
体を作製した。複数の変異が、全ての潜在的なアミノ酸の位置で試験された。こ
の研究者らは、「分子の大部分は、［結合活性または生物学的活性］のいずれに
対してもほとんど影響を伴わないで変化され得る」ことを見出した。（要約を参
照のこと）。実際、試験された３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、
わずか２３個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタンパク質
を生成した。
【０４８２】 さらに、ポリぺプチドのＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失
が、１つ以上の生物学的機能の改変または欠失を生じたとしても、他の生物学的
活性はなお保持され得る。例えば、分泌される形態を認識する抗体を誘導および
／または結合する、欠失改変体の能力は、分泌される形態の大多数より少ない残
基が、Ｎ末端またはＣ末端から除去される場合に保持されるようである。タンパ
ク質のＮ末端またはＣ末端残基を欠損する特定のポリぺプチドが、このような免
疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、および
そうでなければ当該分野において公知の慣用的な方法によって容易に決定され得
る。
【０４８３】 従って、本発明はさらに、実質的な生物学的活性を示すポリぺプチド改変体を
含む。このような改変体としては、活性に対する影響をほとんど有さないように
、当該分野において公知の一般的な法則に従って選択される、欠失、挿入、逆位
、反復、および置換が挙げられる。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置
換を作製する方法に関する指針は、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１
３０６−１３１０（１９９０）において提供され、ここで、著者らは変化に対す
るアミノ酸配列の寛容性を研究するための２つの主要なストラテジーがあること
を指摘する。
【０４８４】 第１のストラテジーは、進化の過程の間の自然の選択によるアミノ酸置換の寛
容を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較して、保存されるアミノ酸
が同定され得る。これらの保存されるアミノ酸は、タンパク質の機能について重
要であるようである。対照的に、置換が自然の選択によって寛容されたアミノ酸
の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないことを示す。従って
、アミノ酸置換を寛容する位置は改変され得るが、タンパク質の生物学的活性を
なおも維持する。
【０４８５】 第２のストラテジーは、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クロ
ーン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を
使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（
分子中の各残基で１つのアラニン変異の導入）が、使用され得る。（Ｃｕｎｎｉ
ｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（
１９８９））。次いで、得られた変異分子は生物学的活性について試験され得る
。
【０４８６】 著者らが言及するように、これらの２つのストラテジーは、タンパク質がアミ
ノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミ
ノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示
す。例えば、（タンパク質の三次構造内に）ほとんど埋もれているアミノ酸残基
は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されな
い。さらに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸
のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基のＳｅｒお
よびＴｈｒの置換；酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基のＡｓｎ
およびＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香
族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズのアミノ
酸のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換を含む。
【０４８７】 保存的なアミノ酸置換に加えて、本発明の改変体は、（ｉ）１つ以上の非保存
的なアミノ酸残基との置換、ここでは置換されるアミノ酸残基は、遺伝コードに
よってコードされるアミノ酸残基であってもよく、もしくはそうでなくてもよい
、または（ｉｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基での置換、または（ｉ
ｉｉ）別の化合物（例えば、ポリぺプチドの安定性および／もしくは可溶性を増
加するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール））との成熟ポリぺプチ
ドの融合、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペ
プチド、またはリーダーもしくは分泌配列、または精製を容易にする配列）との
ポリぺプチドの融合を含む。このような改変体ポリぺプチドは、本明細書中の教
示から、当業者の範囲内であると考えられる。
【０４８８】 例えば、他の荷電されたアミノ酸または中性のアミノ酸での荷電されたアミノ
酸のアミノ酸置換を含むポリぺプチド改変体は、改善された特性（例えば、より
少ない凝集性）を有するタンパク質を生成し得る。薬学的処方物の凝集は、凝集
体の免疫原活性に起因して、活性の減少およびクリアランスの増加の両方をもた
らす。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１
−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−
８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（
１９９３））。
【０４８９】 本発明のさらなる実施態様は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、５０
アミノ酸置換を超えず、さらにより好ましくは、４０アミノ酸置換を超えず、な
おより好ましくは、３０アミノ酸置換を超えず、そしてなおさらにより好ましく
は、２０アミノ酸置換を超えないアミノ酸配列を有する本発明のアミノ酸配列を
含むポリペプチドに関する。当然、好ましさの増大する順番に、ペプチドまたは
ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、１０、９、８、７、
６、５、４、３、２、または１アミノ酸置換を超えない本発明のアミノ酸配列を
含むアミノ酸配列を有することが非常に好ましい。特定の実施態様において、本
発明のアミノ酸配列またはそのフラグメント（例えば、本明細書に記載の成熟形
態および／または他のフラグメント）における付加、置換、および／または欠失
の数は、１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０、または５０〜１
５０であり、保存的アミノ酸置換が好ましい。
【０４９０】 （ポリヌクレオチドおよびポリペプチドフラグメント） 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメントに
関する。
【０４９１】 本発明において、「ポリヌクレオチドフラグメント」とは、以下である核酸配
列を有する短いポリヌクレオチドをいう：寄託されたクローンに含まれるか、も
しくは寄託されたクローン中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドをコー
ドする核酸配列の一部であるか；配列番号Ｘもしくはそれらの相補鎖に示される
核酸配列の一部であるか、または配列番号Ｙのポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド配列の一部である。本発明のヌクレオチドフラグメントは、好ましく
は、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さら
により好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおより好ましくは少なくとも
約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約７５ｎｔ、または少なくとも
約１５０ｎｔの長さである。例えば、「少なくとも約２０ｎｔの長さ」のフラグ
メントは、寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡ配列または配列番号Ｘに示さ
れるヌクレオチド配列由来の２０以上の連続する塩基を含むことが意図される。
この文脈において「約（おおよそ）」は、特に記載された値（いずれかの末端も
しくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌク
レオチドだけ大きいかまたは小さな値）を含む。これらのヌクレオチドフラグメ
ントは、本明細書中で議論されるように、診断プローブおよびプライマーとして
の使用を含むが、それらに限定されない使用を有する。もちろん、より大きなフ
ラグメント（例えば、５０、１５０、５００、６００、２０００ヌクレオチド）
は好ましい。
【０４９２】 さらに、本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例えば、
以下のおおよそのヌクレオチド数の配列を含むか、あるいは以下からなるフラグ
メントが挙げられる：１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２０
０、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０
１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６５１〜７０
０、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００〜８５０、８５１〜９００、９０
１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、１
１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１３
００、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４５
１〜１５００、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５０
、１６５１〜１７００、１７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、１８０１〜
１８５０、１８５１〜１９００、１９０１〜１９５０、１９５１〜２０００、も
しくは２００１から配列番号Ｘの末端、またはそれらの相補鎖、あるいは寄託さ
れたクローンに含まれるｃＤＮＡ。この文脈において、「おおよそ（約）」は、
特に記載された範囲、およびいずれかの末端もしくは両方の末端において、これ
より数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さ
な範囲を含む。好ましくは、これらのフラグメントは、生物学的活性を有するポ
リペプチドをコードする。より好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、本明
細書中、上記で議論されるようにプローブまたはプライマーとして使用され得る
。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジ
ェンシー条件下でこれらの核酸分子にハイブリダイズするポリヌクレオチドもま
た本発明に含まれ、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
も同様に含まれる。
【０４９３】 本発明において、「ポリペプチドフラグメント」とは、配列番号Ｙに含まれる
か、または寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ
酸配列の一部である、アミノ酸配列をいう。タンパク質（ポリペプチド）フラグ
メントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であり得るか、あるい
はより大きなポリぺプチド内（このフラグメントが、部分または領域を（最も好
ましくは単一の連続した領域として）形成する）に含まれ得る。本発明のポリペ
プチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、以下のおおよそのアミノ酸
数を含むか、あるいは以下からなるフラグメントを含む：１〜２０、２１〜４０
、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０２〜１２０、１２１〜１４０、
１４１〜１６０、または１６１からコード領域の末端まで。さらに、ポリペプチ
ドフラグメントは、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１０
０、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０アミノ酸の長さであり得る
。この文脈において、「約（おおよそ）」とは、特に記載された範囲または値、
およびいずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３
、２、または１）のアミノ酸だけ大きいかまたは小さな範囲または値を含む。こ
れらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０４９４】 好ましいポリペプチドフラグメントとしては、分泌タンパク質および成熟形態
が挙げられる。さらに好ましいポリペプチドフラグメントとしては、アミノ末端
もしくはカルボキシ末端またはその両方から、連続した一連の欠失した残基を有
する分泌タンパク質もしくは成熟形態が挙げられる。例えば、任意の数のアミノ
酸（１〜６０の範囲）は、分泌ポリペプチドもしくは成熟形態のいずれかのアミ
ノ末端から欠失され得る。同様に、任意の数のアミノ酸（１〜３０の範囲）が、
分泌タンパク質もしくは成熟形態のカルボキシ末端から欠失され得る。さらに、
上記のアミノ末端およびカルボキシ末端の欠失の任意の組み合わせもまた好まし
い。同様に、これらのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド
もまた好ましい。
【０４９５】 構造的または機能的ドメインによって特徴付けられるポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチドのフラグメント（例えば、α−へリックスおよびα−へリックス形
成領域、β−シートおよびβ−シート形成領域、ターンおよびターン形成領域、
コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両
親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高い抗原性指標
領域を含むフラグメント）もまた、好ましい。保存性ドメインの中に含まれる配
列番号Ｙのポリペプチドフラグメントは、本発明によって特に意図される。さら
に、これらのドメインをコードするポリヌクレオチドもまた、意図される。
【０４９６】 他の好ましいポリペプチドフラグメントは、生物学的に活性なフラグメントで
ある。生物学的に活性なフラグメントは、類似の活性を示すが本発明のポリペプ
チドの活性とは必ずしも同一ではないフラグメントである。このフラグメントの
生物学的活性は、改善された所望の活性または減少した所望でない活性を含み得
る。これらのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドもまた、
本発明に含まれる。
【０４９７】 好ましくは、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、機能的活性を示すポ
リペプチドをコードする。「機能的活性」を示すポリペプチドとは、本発明のタ
ンパク質の全長（完全）ポリペプチドと関連した１つ以上の公知の機能的活性を
示し得るポリペプチドを意味する。このような機能的活性としては、生物学的活
性、抗原性［本発明のポリペプチドに対する抗体に結合する（または結合するこ
とについて、本発明のポリペプチドと競合する）能力］、免疫原性（本発明のポ
リペプチドに結合する抗体を生成する能力）、本発明のポリペプチドとマルチマ
ーを形成する能力、および本発明のポリペプチドについてのレセプターまたはリ
ガンドに結合する能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４９８】 本発明のポリペプチド、ならびにそれらのフラグメント、改変体、誘導体、お
よびアナログの機能的活性は、種々の方法によってアッセイされ得る。
【０４９９】 例えば、本発明のポリペプチドの抗体に結合するための本発明の全長ポリペプ
チドに結合するかまたはそれと競合する能力についてアッセイする、１つの実施
態様では、当該分野で公知の種々の免疫アッセイが、用いられ得る。このような
アッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッ
セイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲ
ル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、コロ
イド金、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反
応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血液凝集アッセイ）、補体結合
アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッ
セイなどのような技術を用いる競合および非競合アッセイ系が挙げられるが、こ
れらに限定されない。１つの実施態様では、抗体結合が、一次抗体上の標識を検
出することによって検出される。別の実施態様では、この一次抗体が、二次抗体
またはこの一次抗体に対する試薬の結合を検出することによって検出される。さ
らなる実施態様では、この二次抗体が標識される。多くの手段が、免疫アッセイ
における結合の検出について当該分野で公知であり、そして本発明の範囲内であ
る。
【０５００】 別の実施態様では、同定された本発明のポリペプチドについてのリガンド、ま
たは本発明のポリペプチドフラグメント、改変体、または誘導体が多量体化する
能力が評価される場合、結合が、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフ
ィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、およびアフィニティーブ
ロッティングのような当該分野で周知の手段によって、アッセイされ得る。一般
には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ、Ｅ．ら、１９９５、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５
９：９４−１２３を参照のこと。別の実施態様では、その基質への本発明のポリ
ペプチドの結合の生理学的相関（シグナル伝達）がアッセイされ得る。
【０５０１】 さらに、本明細書中に記載のアッセイ（実施例を参照のこと）および当該分野
で公知の他のアッセイは、本発明のポリペプチドならびにそれらのフラグメント
、改変体、誘導体、およびアナログが、本発明のポリペプチドに関連した生物学
的活性を惹起する能力を測定する（インビトロまたはインビボのいずれかで）た
めに、慣用的に適用され得る。他の方法は、当業者に公知であり、そして本発明
の範囲内である。
【０５０２】 （エピトープおよび抗体） 本発明はまた、配列番号Ｙに示されるポリペプチド配列もしくは寄託されたク
ローンに含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配列のエピトープを
含むか、またはそれらからなるポリペプチドフラグメントに関する。これらのエ
ピトープをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号Ｘに示される配列）
もまた、本発明に含まれる。また、本発明のポリヌクレオチドは、これらのエピ
トープをコードするポリヌクレオチドの相補鎖のヌクレオチド配列、およびスト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシ
ー条件下で相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
【０５０３】 本発明において、「エピトープ」とは、動物（特に、ヒト）において抗原性活
性または免疫原性活性を有するポリペプチドフラグメントをいう。本発明の好ま
しい実施態様は、エピトープを含むポリペプチドフラグメント、ならびにこのフ
ラグメントをコードするポリヌクレオチドに関する。抗体が結合し得るタンパク
質の領域は、「抗原性エピトープ」として規定される。対照的に、「免疫原性エ
ピトープ」は、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として規定される（例えば
、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３
９９８〜４００２（１９８３）を参照のこと）。
【０５０４】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来技術により生成され得
る（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）（米国特許第４，６３１
，２１１号にさらに記載される）を参照のこと）。
【０５０５】 本発明において、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４、少なくと
も５、少なくとも６、少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、少なくとも
９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、そし
て最も好ましくは約１５〜約３０のアミノ酸の配列を含む。免疫原性エピトープ
または抗原性エピトープを含む好ましいポリペプチドは、少なくとも１０、１５
、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５
、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基長である。例えば、抗原性
エピトープは、このエピトープに対して特異的に結合する、モノクローナル抗体
を含む抗体を惹起するために有用である。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ
３７：７６７−７７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照のこと）。
【０５０６】 同様に、免疫原性エピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に従
う抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら
，前出；Ｃｈｏｗら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：
９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３
４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープは、
分泌タンパク質を含む。免疫原性エピトープは、キャリアタンパク質（例えば、
アルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に提示され得るか
、このエピトープが十分に長い場合（少なくとも約２５アミノ酸）は、キャリア
なしで動物系に提示され得る。しかし、８〜１０程度の少なさのアミノ酸を含む
免疫原性エピトープは、少なくとも変性ポリペプチド中の直鎖状エピトープに結
合し得る抗体を惹起するには十分であることが示されている（例えば、ウェスタ
ンブロッティングにおいて）。
【０５０７】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。これらの周知の方法としては、インビボ免疫、
インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定
されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；およ
びＢｉｔｔｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９
８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用い
て免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キー
ホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチド
を結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペプ
チドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢ
Ｓ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペプチ
ドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリアに
結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチド
またはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、エマルジョン（約１
００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントを
含む）の腹腔内注射および／または皮内注射により免疫される。いくつかのブー
スター注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週
間の間隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離の
ペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の
血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で
周知の方法に従う固体支持体上のペプチドの吸着および選択された抗体の溶出に
よる）により上昇し得る。
【０５０８】 当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピト
ープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、異種ポリペプチド
配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ
Ａ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、Ｃ
Ｈ２、ＣＨ３、それらの任意の組み合わせ（全ドメインおよびそれらの部分の両
方を含む））と融合し得、これがキメラポリペプチドを生じる。これらの融合タ
ンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボにおいて増加した半減期を示す。
これは、例えば、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動
物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメ
ラタンパク質を示す。例えば、ＥＰＡ ０，３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋ
ｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４〜８６（１９８８）を参照のこと。ＩｇＧ
部分に起因してジスルフィド架橋二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単
量体ポリペプチドまたはそれらのフラグメント単独よりも、他の分子の結合およ
び中和においてより効果的であり得る。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８〜３９６４（１９９５）を参照のこと
。上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグとして目的の遺伝
子と組換えられ、発現されたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。
【０５０９】 本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを利用して、配列番号Ｙに対応するポリペプチドの活性を調
節し得、それによってこのポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを効
率的に生成し得る。一般には、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１
１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号および同
第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ
ｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａ
ｙａｍａ，Ｓ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８
２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７
：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａ
ｓｃｏ，Ｒ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９
９８）（これらの特許および刊行物の各々が本明細書によって参考として援用さ
れる）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号Ｘに対応するポリヌク
レオチドおよび対応するポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達
成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えによ
り、２つ以上のＤＮＡセグメントを、本発明の配列番号Ｘのポリヌクレオチドに
対応する所望の分子に構築することを含む。別の実施形態において、配列番号Ｘ
に対応するポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドは、組換え前にエラー
−プローン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入また
は他の方法により、ランダムな変異誘発に供されることによって改変され得る。
別の実施形態において、配列番号Ｘに対応するコードポリヌクレオチドの１つ以
上の成分、モチーフ、区切り（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラグメン
トなど、またはそれらによりコードされるポリペプチドは、１つ以上の異種分子
の１つ以上の成分、モチーフ、区切り（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フ
ラグメントなどと組み換えられ得る。
【０５１０】 （抗体） 本発明はさらに、本発明のポリペプチドを特異的に結合する抗体およびＴ細胞
抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、Ｉｇ
Ｇ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含
む）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭならびにＩｇＹを含む。本明細書中で使用さ
れる場合、用語「抗体」（Ａｂ）は、単鎖抗体全体およびその抗原結合フラグメ
ントを含む抗体全体を含むことが意味される。最も好ましくは、この抗体は、本
発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およ
びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合
Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）およびＶLまたはＶHドメインのいずれかを含むフラグメント
が挙げられるがこれらに限定されない。この抗体は、鳥類および哺乳動物を含む
任意の動物起源であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、
ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。
【０５１１】 単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およ
びＣＨ３ドメイン。また、可変領域ならびにヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２および
ＣＨ３ドメインの任意の組み合わせが本発明に含まれる。本発明はさらに、本発
明のポリペプチドを特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体
、キメラ抗体、ヒト化抗体、ならびにヒトモノクローナル抗体およびヒトポリク
ローナル抗体を含む。本発明はさらに、本発明の抗体に対して抗イディオタイプ
である抗体を含む。
【０５１２】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異的であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピト
ープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異種の組
成物（例えば、異種ポリペプチドまたは固体支持体物質）の両方に特異的であり
得る。例えば、ＷＯ ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ ９１／
００３６０；ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４
７：６０〜６９（１９９１）；米国特許第５，５７３，９２０号、同第４，４７
４，８９３号、同第５，６０１，８１９号、同第４，７１４，６８１号、同第４
，９２５，６４８号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．１４８：１５４
７〜１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０５１３】 本発明の抗体は、抗体により認識されるかまたは特異的に結合される本発明の
ポリペプチドのエピトープまたは部分によって記載されるかまたは特定化され得
る。このエピトープまたはポリペプチドの部分は、本明細書中に記載されるよう
に、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置により、連続するアミノ酸残基におけるサ
イズにより、または表および図に列挙されるように、特定化され得る。本発明の
任意のエピトープまたはポリペプチドを特異的に結合する抗体はまた排除され得
る。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そしてこれの
排除を可能にする抗体を含む。
【０５１４】 本発明の抗体はまた、その交差反応性によって記載されるか、または特定化さ
れ得る。本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログ（ｏｒｔｈｏ
ｌｏｇ）またはホモログを結合しない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチド
に対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０
％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該
分野で公知の方法および本明細書において記載された方法を用いて計算される場
合）を有するポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に特に含まれる。さ
らに本発明には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（本明細書
において記載のような）で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのみを結合する抗体が含まれる。
本発明の抗体はまた、その結合親和性によって記載または特定化され得る。好ま
しい結合親和性としては、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、
５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ
、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１
０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍ未満の
解離定数すなわちＫdの親和性が挙げられる。
【０５１５】 本発明の抗体は、インビトロおよびインビボの両方における診断方法ならびに
治療方法を含む、本発明のポリペプチドを精製、検出および標的化するのための
当該分野で公知の方法を含むがこれに限定されない用途を有する。例えば、この
抗体は、生物学的サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的およ
び定量的に測定するためのイムノアッセイにおいて用途を有する。例えば、Ｈａ
ｒｌｏｗら，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ
，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，第２版，１９８８）（全体が参考として援用されている）を参照のこと。
【０５１６】 本発明の抗体は、単独、または他の組成物との組み合わせのいずれかで用いら
れ得る。この抗体は、さらに、Ｎ末端またはＣ末端で異種のポリペプチドに組換
え的に融合され得るか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に結合
（共有結合および非共有結合を含む）され得る。例えば、本発明の抗体は、検出
アッセイにおける標識として有用な分子およびエフェクター分子（例えば、異種
のポリペプチド、薬物または毒素）に組換え的に融合または結合され得る。例え
ば、ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米
国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第０ ３９６ ３８７号を参照
のこと。
【０５１７】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって調製され得る。
例えば、本発明のポリペプチドまたはその抗原性フラグメントは、ポリクローナ
ル抗体を含有する血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。用語「モノ
クローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって生成される抗体に限定されな
い。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物、またはファー
ジクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてそれが生成され
る方法ではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファ
ージディスプレイ技術の使用を含む、当該分野で公知の広範な種々の技術を用い
て調製され得る。
【０５１８】 ハイブリドーマ技術は、当該分野で公知の技術を含み、そしてＨａｒｌｏｗら
、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第二版、
１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＯＢＯＤ
ＩＥＳ ＡＮＤ Ｔ−ＣＥＬＬ ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ ５６３−６８１（Ｅｌ
ｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が参考として
援用される）に教示される。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパ
イン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フ
ラグメントを産生するため）のような酵素を使用して、タンパク質分解切断によ
って産生され得る。
【０５１９】 あるいは、本発明の抗体は、当該分野で公知の方法を使用して、組換えＤＮＡ
技術およびファージディスプレイ技術を適用して、または合成化学を通して作製
され得る。例えば、本発明の抗体は、当該分野で公知の種々のファージディスプ
レイ方法を用いて調製され得る。ファージディスプレイ方法において、機能的抗
体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒
子の表面に提示される。所望の結合特性を有するファージは、抗原、代表的には
固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原を用いて直接的に選択するこ
とにより、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒ
トまたはマウス）から選択される。これらの方法において用いられるファージは
、代表的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩ
タンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド
安定化されたＦｖの抗体ドメインを有するｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージ
である。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法
の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１〜５０（１９９５）；Ａｍｅｓ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７〜１８６（１９９５
）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５
２〜９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９〜１８（１９
９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５
７：１９１〜２８０（１９９４）；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ ９０
／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２
／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８２；ＷＯ ９５
／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４
０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２
７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５
，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、
同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、および同第５，７３３
，７４３号（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）。
【０５２０】 上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体
をコードする領域は、単離され、そしてヒト抗体を含む抗体の全体または任意の
他の所望の抗原結合フラグメントを作製するために用いられ得、そして哺乳動物
細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発
現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組
換え的に作製するための技術はまた、当該分野で公知の方法を用いて使用され得
る。この方法は、例えば、以下に開示される方法である：ＷＯ ９２／２２３２
４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４〜
８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ ３４：２６〜３４（１９
９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１〜１０４３
（１９８８）（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される）。
【０５２１】 単鎖のＦｖおよび抗体を作製するために用いられ得る技術の例としては、米国
特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら
、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６〜８８（１９９
１）；Ｓｈｕ，Ｌ．ら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５〜７９９９（１９９３）；お
よびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８〜１０４０（１９８８
）に記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボ使用およびイン
ビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体ま
たはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体を作製するための方法は、
当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１
４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ １２５：１９１〜２０２；および米国特許第５，８０７，７１５号を
参照のこと。抗体は、以下含む種々の技術を用いてヒト化され得る：ＣＤＲ−グ
ラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）（欧州特許第０ ２３９ ４００号；ＷＯ
９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０
８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒ
ｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第０ ５９２ １０６号；欧州特許第０ ５
１９ ５９６号；Ｐａｄｌａｎ Ｅ．Ａ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９〜４９８（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋ
ａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５〜８１４（
１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９６９〜９７３（１９９４）
）、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国
特許第５，５６５，３３２号）。ヒト抗体は、上記のファージディスプレイ方法
を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国特許第４，４４４
，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５４５，８０６号および同第
５，８１４，３１８号；ならびにＷＯ ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３
３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、Ｗ
Ｏ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１（上記の参考文献はその全体
が参考として援用される）もまた参照のこと。
【０５２２】 さらに、本発明には、本発明のポリペプチドに組換え的に融合または化学的に
結合（共有結合および非共有結合の両方を含む）した抗体が含まれる。この抗体
は、本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であり得る。例えば、抗体は、本
発明のポリペプチドを特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合または結
合することにより、インビトロまたはインビボのいずれかで本発明のポリペプチ
ドを特定の細胞型へ標的化するために用いられ得る。本発明のポリペプチドに対
して融合または結合体化された抗体はまた、当該分野で公知の方法を用いてイン
ビトロイムノアッセイおよび精製方法において用いられ得る。例えば、Ｈａｒｂ
ｏｒら、前出、およびＷＯ ９３／２１２３２；欧州特許第０ ４３９ ０９５
号；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１〜９９（１９
９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９
：１４２８〜１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６
：２４４６〜２４５２（１９９１）（上記の参考文献は、その全体が参考として
援用される）を参照のこと。
【０５２３】 本発明はさらに、可変領域以外の抗体ドメインと融合されたか、または結合体
化された本発明のポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリペプ
チドは、抗体のＦｃ領域またはその一部分と融合され得るか、またはそれに結合
体化され得る。本発明のポリペプチドに融合した抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨ
１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインまたはドメイン全体かまた
はその一部の任意の組み合わせを含み得る。本発明のポリペプチドは、当該分野
で公知の方法を用いて、ポリペプチドのインビボでの半減期を増大するか、また
はイムノアッセイにおける使用のために上記の抗体部分に融合され得るか、また
はそれに結合体化され得る。このポリペプチドはまた、上記の抗体部分に融合さ
れるか、またはそこに結合体化されて、マルチマーを形成し得る。例えば、本発
明のポリペプチドに融合されたＦｃ部分は、Ｆｃ部分の間のジスルフィド結合に
よってダイマーを形成し得る。より高次のマルチマー形態は、ＩｇＡおよびＩｇ
Ｍの部分にそのポリペプチドを融合することにより作製され得る。本発明のポリ
ペプチドを抗体部分に融合または結合体化するための方法は、当該分野で公知で
ある。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、
同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５
１号、同第５，１１２，９４６号；ＥＰ ０ ３０７ ４３４号、ＥＰ ０ ３
６７ １６６号；ＷＯ９６／０４３８８号、ＷＯ９１／０６５７０号；Ａｓｈｋ
ｅｎａｚｉら、ＰＮＡＳ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｚｈｅ
ｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９５）；なら
びにＶｉｌら、ＰＮＡＳ ８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）（上記の
参考文献は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０５２４】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用する抗体に関する。例えば、本発明は、部分的または完全にかのいずれ
かで本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を破壊する抗体を
含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれる。リガ
ンド結合を妨害しないが、レセプター活性化を妨害するレセプター特異的抗体が
含まれる。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載
の技術、そうでなければ、当該分野で公知の技術により決定され得る。リガンド
結合およびレセプター活性化を両方とも妨害するレセプター特異的抗体もまた含
まれる。同様に、リガンドを結合し、そしてリガンドのレセプターへの結合を妨
害する中和抗体、ならびにリガンドを結合し、それによってレセプター活性化を
妨害するが、リガンドがレセプターを結合することを妨害しない抗体が含まれる
。レセプターを活性化する抗体がさらに含まれる。これらの抗体は、リガンド媒
介レセプター活性化により影響を及ぼされる生物学的活性の全てまたは全て未満
のいずれかについてのアゴニストとして作用し得る。この抗体は、本明細書中に
開示された特定の活性を含む生物学的活性についてのアゴニストまたはアンタゴ
ニストとして特定され得る。上記の抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を
使用して作製され得る。例えば、ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１
，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１９
９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７
８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８
６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：
３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（
７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．
１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉ
ａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｄｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９７）
；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−
１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５
５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１
１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（
１）：１４−２０（１９９６）（上記の文献は、その全体が参考として援用され
る）を参照のこと。
【０５２５】 上記で議論されるように、次に、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業
者に周知の技術を用いて、本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイ
プ抗体を生成するために利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢ
ｏｎａ、ＦＡＳＥＢ Ｊ．７（５）：４３７−４４４（１９８９）；ならびにＮ
ｉｓｓｉｎｏｆｆ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（
１９９１）を参照のこと）。例えば、結合して、ポリペプチドのマルチマー化お
よび／または本発明のポリペプチドのリガンドに対する結合を競合的に阻害する
抗体を用いて、ポリペプチドのマルチマー化および／または結合ドメインを「模
倣し」そして結果として、ポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合して
中和する抗イディオタイプを生成し得る。このような中和抗イディオタイプまた
はこのような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントは、治療レジメンにおいて
使用されて、ポリペプチドリガンドを中和し得る。例えば、このような抗イディ
オタイプ抗体を使用して、本発明のポリペプチドを結合し得るか、そして／また
はそのリガンド／レセプターを結合し得、それによって、その生物学的活性をブ
ロックし得る。
【０５２６】 本発明はさらに、増殖性および／または癌性ポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドに対して特異的な抗体を含有する血清をスクリーニングする際に使用するた
めの診断用キットに関する。このようなキットは、少なくとも１つの抗ポリペプ
チド抗原抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む実質的に単離された
ポリペプチド抗原を含み得る。このようなキットはまた、抗原への上記抗体の結
合を検出するための手段を含む。特定の実施形態では、キットは、組換え産生さ
れたポリペプチド抗原または化学合成されたポリペプチド抗原を含み得る。キッ
トのポリペプチド抗原はまた、固体支持体に付着され得る。
【０５２７】 より特定の実施形態では、上記のキットの検出手段は、該ポリペプチド抗原が
付着される固体支持体を備える。このようなキットはまた、非付着レポーター標
識抗ヒト抗体を備え得る。この実施形態では、抗体のポリペプチド抗原への結合
が、上記レポーター標識化抗体の結合によって検出され得る。
【０５２８】 本発明はさらに、試験被験体における増殖性および／または癌性の障害および
状態を検出する方法を包含する。この検出方法は、試験被験体（例えば、増殖性
および／または癌性の細胞もしくは組織が存在し得る被験体）由来の血清を実質
的に単離されたポリペプチド抗原および／またはポリヌクレオチド抗原と反応さ
せる工程、および結合された抗体の存在についてその抗原を試験する工程を包含
する。特定の実施形態では、本方法は、固体支持体に付着されたポリペプチド抗
原を包含し、そして血清は、この支持体と反応される。続いて、この支持体は、
レポーター標識抗ヒト抗体と反応される。次いで、この固体支持体が、レポータ
ー標識抗体の存在について試験される。
【０５２９】 さらに、本発明は、増殖性症状ワクチン組成物を包含する。この組成物は、実
質的に単離されたポリペプチド抗原および／またはポリヌクレオチド抗原を含み
、ここでこの抗原は、エピトープに特異的な少なくとも抗体と特異的に免疫反応
性であるエピトープを含む。このペプチド抗原および／またはポリヌクレオチド
抗原は、当該分野で公知の方法（組換え発現または化学合成を包含する）に従っ
て生成され得る。ペプチド抗原は、好ましくは、薬学的に受容可能なキャリア中
に薬理学的に有効な用量で存在する。
【０５３０】 さらに、本発明は、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドエピトープ
と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を包含する。本発明は、本発明
のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドと特異的に免疫反応性であるポ
リクローナル抗体の実質的に単離された調製物を含む。より特定の実施形態では
、このようなポリクローナル抗体は、当該分野で公知の他の方法に加えて、アフ
ィニティークロマトグラフィーによって調製される。
【０５３１】 別の実施形態では、本発明は、ポリペプチド抗原および／またはポリヌクレオ
チド抗原に対する抗体を生成する方法を包含する。本方法は、試験被験体に、実
質的に単離されたポリペプチド抗原および／またはポリヌクレオチド抗原を投与
する工程を包含する。ここで、この抗原は、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗
体および／または抗ポリヌクレオチド抗体と特異的に免疫反応性であるエピトー
プを包含する。この抗原は、被験体に免疫応答を生じるのに十分な量で投与され
る。
【０５３２】 さらなる実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含有する血
清をスクリーニングする際に使用するための診断用キットを包含する。この診断
用キットは、ポリペプチド抗原またはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応
性である実質的に単離された抗体、およびこの抗体に対するポリヌクレオチド抗
原またはポリペプチド抗原の結合を検出する手段を含む。１つの実施形態では、
この抗体は、固体支持体に付着される。特定の実施形態では、この抗体は、モノ
クローナル抗体であり得る。キットの検出手段は、第二の標識化されたモノクロ
ーナル抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識化され
た競合抗原を含み得る。
【０５３３】 １つの診断形態において、試験血清は、本発明の方法により得られる表面結合
抗原を有する固相試薬と反応される。試薬への特異的抗原抗体との結合および洗
浄による非結合血清成分の除去後、この試薬は、固体支持体上の結合された抗抗
原抗体の量に比例してレポーターを試薬に結合するように、レポーター標識抗ヒ
ト抗体と反応される。試薬は、再度、非結合標識抗体を除去するために洗浄され
、そして、試薬と会合したレポーターの量が決定される。代表的には、このレポ
ーターは、適切な比蛍光（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）基質または比色基質（Ｓ
ｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で固相をインキュベートすること
により検出される酵素である。
【０５３４】 上記アッセイにおける固体表面試薬は、固体支持材料（例えば、ポリマー性ビ
ーズ、ディップスティック、９６ウェルプレート、またはフィルター材料）にタ
ンパク質材料を付着するための公知の技術によって調製される。これらの付着方
法は、一般に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着、または固体支持体上の化
学反応基（例えば、活性型カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド
基）へのタンパク質（代表的には、遊離アミン基を介する）の共有結合を包含す
る。あるいは、ストレプトアビジンコーティングプレートは、ビオチン化抗原と
併用して使用され得る。
【０５３５】 従って、本発明は、本診断方法を実施するためのアッセイ系またはキットを提
供する。このキットは、一般に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、お
よび表面結合抗抗原抗体を検出するためのレポーター標識抗ヒト抗体を含む。
【０５３６】 （融合タンパク質） 本発明の任意のポリペプチドを使用して、融合タンパク質を生成し得る。例え
ば、本発明のポリペプチドは、第２のタンパク質に融合された場合、抗原性タグ
として使用され得る。本発明のポリペプチドに対して惹起された抗体を使用して
、そのポリペプチドに結合させることにより第２のタンパク質を間接的に検出し
得る。さらに、分泌タンパク質が輸送シグナルに基づいて細胞位置を標的化する
ので、本発明のポリペプチドは、一旦他のタンパク質に融合されると、標的化分
子として使用され得る。
【０５３７】 本発明のポリペプチドに融合され得るドメインの例は、異種シグナル配列だけ
でなく他の異種機能領域もまた含む。融合は、必ずしも直接的である必要はなく
、リンカー配列を介して起こり得る。
【０５３８】 さらに、融合タンパク質はまた、本発明のポリペプチドの特徴を改善するため
に操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸領域（特に、荷電したアミノ酸）は
、そのポリペプチドのＮ末端に付加されて、宿主細胞からの精製の間または引き
続く取り扱いおよび貯蔵の間に安定性および持続性を改善し得る。また、ペプチ
ド部分は、精製を容易にするためにこのポリペプチドに付加され得る。このよう
な領域は、このポリペプチドの最終的な調製の前に取り除かれ得る。ポリペプチ
ドの取り扱いを容易にするペプチド部分の付加は、当該分野で周知かつ慣用的な
技術である。
【０５３９】 さらに、本発明のポリペプチド（フラグメントおよび詳細には、エピトープを
含む）は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメイン
またはそれらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびそれらの任意の組み合わ
せ（ドメイン全体およびそれらの部分を含む））の一部と組み合わせられ、キメ
ラポリペプチドを生じ得る。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そし
てインビボでの半減期の増大を示す。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペ
プチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖
の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載する（ＥＰ Ａ
３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６
（１９８８））。ジスルフィド結合したダイマー構造（ＩｇＧに起因する）を有
する融合タンパク質はまた、モノマーの分泌タンパク質またはタンパク質フラグ
メント単独より、他の分子を結合し、そして中和するにより効率的であり得る（
Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６
４（１９９５））。
【０５４０】 同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ対応出願第２０４５８６９号
）は、別のヒトタンパク質、またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常
領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク
質中のＦｃ部分は、治療および診断において有利であり、従って、例えば改善さ
れた薬物動態学的特性を生じ得る（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。あるいは、
融合タンパク質が、発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠
失することが望ましい。例えば、Ｆｃ部分は、融合タンパク質が免疫のための抗
原として使用される場合、治療および診断を妨げ得る。薬物探索において、例え
ば、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定
するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的で、Ｆｃ部分と融合
されている（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉ
ｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。
【０５４１】 さらに、本発明のポリペプチドは、例えば、その融合ポリペプチドの精製を容
易にするペプチドのようなマーカー配列に融合され得る。好ましい実施態様にお
いて、このマーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ヘキサヒスチジンペプチド、例
えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅ
ｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）に提供されるタグであり、
多くのものは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記述されるよう
に、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な
別のペプチドタグである「ＨＡ」タグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質
に由来するエピトープと対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（
１９８４））。
【０５４２】 従って、これらの上記の融合体のいずれも、本発明のポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドを使用して操作され得る。
【０５４３】 （ベクター、宿主細胞、およびタンパク質生成） 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、および
組換え技術によるポリペプチドの生成に関する。ベクターは、例えば、ファージ
ベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベク
ターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製能があるかまたは複製欠損で
あり得る。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、補完する宿主細胞においての
み起こる。
【０５４４】 そのポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含むベ
クターに結合され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱
のような沈澱、または荷電した脂質との複合体において導入される。このベクタ
ーがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロで
パッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【０５４５】 そのポリヌクレオチドインサートは、例えば、いくつかの名前を挙げると、フ
ァージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、および
ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウ
イルスＬＴＲのプロモーターなどのような、適切なプロモーターに作動可能に結
合されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構
築物は、転写開始のための部位、転写終結のための部位、および転写された領域
において翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。構築物によって発現さ
れる転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの始めの翻訳
開始コドンおよび翻訳されるポリペプチドの最後に適切に位置する終結コドン（
ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【０５４６】 示されたように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ
葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉ
および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイ
シン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代
表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真
菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細
胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞
、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；ならびに植物
細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培
養培地および条件は当該分野で公知である。
【０５４７】 細菌における使用に好ましいベクターには、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、および
ｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮ
Ｈ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、
ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中に
は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯ
Ｇ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐ
ＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬがある。他の適切なベクターは
、当業者に容易に明らかである。
【０５４８】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって
もたらされ得る。このような方法は、多くの標準的研究室マニュアルに記載され
ている（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。本発明のポリペプチドは、組換え
ベクターを欠如する宿主細胞により実際に発現され得ることが具体的に意図され
る。
【０５４９】 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽
出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマト
グラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精
製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が
精製のために用いられる。
【０５５０】 本発明のポリペプチド、および好ましくはこの分泌形態はまた、以下から収集
され得る：天然の供給源からの精製産物（直接的に単離されたか、または培養さ
れたかのいずれにせよ、体液、組織、および細胞を含む）；化学合成手順の産物
；および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等
植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生
された産物。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明のポリ
ペプチドは、グリコシル化されていてもよく、またはグリコシル化されていなく
てもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プ
ロセスの結果として、改変された開始メチオニン残基を含み得る。従って、翻訳
開始コドンによってコードされているＮ末端メチオニンは、一般的に、すべての
真核生物細胞において翻訳後に任意のタンパク質から高い効率で除去されること
が当該分野において周知である。大部分の原核生物においても、大部分のタンパ
ク質上のＮ末端メチオニンは効率的に除去されるが、いくつかのタンパク質では
、この原核生物の除去プロセスは、Ｎ末端メチオニンが共有結合しているアミノ
酸の性質に依存して、非効率的である。
【０５５１】 本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加え
て、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の初代（ｐｒｉｍａｒ
ｙ）宿主細胞、二代（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）宿主細胞、および不死化宿主細胞を
含む。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、コード配列）を欠失ま
たは置換するように操作されており、そして／または本発明のポリヌクレオチド
と作動可能に連結された遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含む
ように操作されており、そして内因性のポリヌクレオチドを活性化、変更、およ
び／または増幅する。例えば、当該分野で公知の技術は、相同組換えを介して、
異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）および内因
性ポリヌクレオチド配列を作動可能に連結するために使用され得る（例えば、１
９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年
９月２６日に公開された国際公開第ＷＯ ９６／２９４１１号；１９９４年８月
４日に公開された国際公開第ＷＯ ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８
９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１
９８９）を参照のこと。これらの開示の各々は、それら全体において参考として
援用される）。
【０５５２】 さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成さ
れ得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．
Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら，Ｎａ
ｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、本発
明のポリペプチド配列のフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチド合成
機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化
学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてこのポリペプチド配列に導入さ
れ得る。非古典的アミノ酸としては、以下が一般に挙げられるがこれらに限定さ
れない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪
酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−
アミノヘキサン酸、Ａｉｂ，２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オ
ルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シト
ルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラ
ニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロア
ミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、ｂ−メチルアミノ酸）、Ｃａ−メチルア
ミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般のアミノ酸アナログ。さらにアミノ
酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０５５３】 本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リ
ン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質
分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改
変されるポリペプチドを含む。任意の多数の化学的改変は、以下を含むがこれら
に限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シアン、トリプシン、キ
モトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4による特異的化学的切
断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合
成；など。
【０５５４】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙
げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロ
セシング）、アミノ酸バックボーンへの化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結
合型の炭水化物鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末
端メチオニン残基の付加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標
識（例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変
して、このタンパク質の検出および単離が可能にされ得る。
【０５５５】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、本発明のポ
リペプチドの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を
参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエ
チレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カ
ルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選
択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置で、またはこの
分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を
含み得る。
【０５５６】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は示
した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）である
。所望の治療的プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間、ある場
合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または抗原
性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリ
コールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。
【０５５７】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してタンパク質に結合
されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、本
明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦにＰ
ＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−
１０３５（１９９２）（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙ
ｌａｔｉｏｎ）を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコ
ールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）によってア
ミノ酸残基を介して共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコ
ール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては
、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基
を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基および
Ｃ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、ポリエチレン
グリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療目的のため
に好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合で
ある。
【０５５８】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質を具体的に所望し得る。ポリエチレングリ
コールを本発明の組成の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子
から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール
分子のタンパク質（ポリペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の
型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端
ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部
分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物
質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、
特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リ
ジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得
る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタ
ンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０５５９】 本発明のポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー（すなわち、ダイマー、
トリマー、テトラマーおよびより高度のマルチマー）であり得る。従って、本発
明は、モノマーおよびマルチマーの本発明のポリペプチド、それらの調製および
それらを含む組成物（好ましくは治療薬）に関する。特定の実施態様では、本発
明のポリペプチドは、モノマー、ダイマー、トリマーまたはテトラマーである。
さらなる実施態様では、本発明のマルチマーは、少なくともダイマー、少なくと
もトリマー、または少なくともテトラマーである。
【０５６０】 本発明によって含まれるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る
。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、配列番号Ｙのアミノ酸配列に
対応するかまたは寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによってコードされる
ポリペプチド（本明細書中に記載されるこれらのポリペプチドに対応する、フラ
グメント、改変体、スプライス改変体および融合タンパク質を含む）のみを含む
マルチマーをいう。これらのホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有す
るポリペプチドを含み得る。特定の実施態様では、本発明のホモマーは、同一の
アミノ酸配列を有するポリペプチドのみを含むマルチマーである。別の特定の実
施態様では、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを
含むマルチマーである。特定の実施態様では、本発明のマルチマーは、ホモダイ
マー（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む）ま
たはホモトリマー（例えば、同一および／または異なるアミノ酸配列を有するポ
リペプチドを含む）である。さらなる実施態様では、本発明のホモマー性マルチ
マーは、少なくともホモダイマー、少なくともホモトリマーまたは少なくともホ
モテトラマーである。
【０５６１】 本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のポリペプチドに
加えて１以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質のポリペプチド
）を含むマルチマーをいう。特定の実施態様では、本発明のマルチマーは、ヘテ
ロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーである。さらなる実施態様
では、本発明のヘテロマー性マルチマーは、少なくともヘテロダイマー、少なく
ともヘテロトリマーまたは少なくともヘテロテトラマーである。
【０５６２】 本発明のマルチマーは、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合
的な結合の結果であり得、ならびに／または例えば、リポソーム形成によって間
接連結され得る。従って、１つの実施態様では、本発明のマルチマー（例えば、
ホモダイマーまたはホモトリマーなど）は、本発明のポリペプチドが溶液中で互
いに接触する場合に形成される。別の実施態様では、本発明のへテロマルチマー
（例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーなど）は、本発明のポリペプ
チドが、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質
における異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触した場合に形成され
る。他の実施態様では、本発明のマルチマーは、本発明のポリペプチドとの、お
よび／または本発明のポリペプチド間での共有結合によって形成される。このよ
うな共有結合は、ポリペプチド配列（例えば、配列表に記載されるかまたは寄託
されたクローンによってコードされるポリペプチドに含まれる、ポリペプチド配
列）中に含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、この共有結合は
、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）ポリペプチドにおいて相互作用する
ポリペプチド配列内に存在するシステイン残基間での架橋である。別の例では、
この共有結合は、化学的操作または組換え操作の結果である。あるいは、このよ
うな共有結合は、本発明の融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列において含
まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。
【０５６３】 １例では、共有結合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある
（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例では、こ
の共有結合は、（本明細書中に記載されるような）本発明のＦｃ融合タンパク質
に含まれる異種配列間にある。別の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共
有結合は、共有結合したマルチマーを形成し得る別のタンパク質（例えば、オス
テオプロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）など）由来の異種ポリ
ペプチド配列間にある（例えば、国際公開第ＷＯ ９８／４９３０５号（この内
容はその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。別の実施
態様では、２以上の本発明のポリペプチドは、ペプチドリンカーを通して連結さ
れる。例としては、米国特許第５，０７３，６２７号（本明細書中に参考として
援用される）に記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーに
よって隔てられた本発明の複数のポリペプチドを含むタンパク質は、従来の組換
えＤＮＡ技術を用いて生成され得る。
【０５６４】 本発明のマルチマーポリペプチドを調製するための別の方法は、ロイシンジッ
パーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合され
た本発明のポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインおよびイソロ
イシンジッパードメインは、そのドメインが見出されるタンパク質のマルチマー
形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは元々、いくつかのＤＮ
Ａ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１７５９、（１９８８））、そしてそれ以来種々の異なるタンパク質
において見出されている。とりわけ公知のロイシンジッパーは、ダイマー形成ま
たはトリマー形成をする、天然に存在するペプチドおよびその誘導体である。本
発明の可溶性マルチマータンパク質を生成するために適切なロイシンジッパード
メインの例は、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０
３０８に記載されるロイシンジッパードメインである。溶液中でダイマー形成ま
たはトリマー形成をするポリペプチド配列に融合された本発明のポリペプチドを
含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得られる可
溶性マルチマー融合タンパク質は、当該分野で公知の技術を用いて培養上清から
回収される。
【０５６５】 本発明のトリマーポリペプチドは、増強された生物学的活性の利点を提供し得
る。好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分は、トリマーを優先
的に形成する部分である。１例は、本明細書中に参考として援用されるＨｏｐｐ
ｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１，（１９９４））および米国
特許出願第０８／４４６，９２２号に記載される肺界面活性物質プロテインＤ（
ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。天然に存在するトリマータンパク
質由来の他のペプチドは、本発明のトリマーポリペプチドの調製の際に使用され
得る。
【０５６６】 別の例では、本発明のタンパク質を、Ｆｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列
を含む本発明の融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配
列間の相互作用によって会合させる。さらなる実施形態では、本発明のタンパク
質の会合を、本発明のＦｌａｇ（登録商標）融合タンパク質に含まれる異種ポリ
ペプチド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によって会合させ
る。
【０５６７】 本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を用いて生成され得る。例
えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分
野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を使用して化学的に架
橋され得る（例えば、本明細書においてその全体が参考として援用される、米国
特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のマルチマーは、
当該分野で公知の技術を用いて生成されて、マルチマーに含まれることが所望さ
れるポリペプチドの配列内に位置付けられるシステイン残基間の１以上の分子間
架橋を形成し得る（例えば、本明細書においてその全体が参考として援用される
、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプ
チドは、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付
加によって慣用的に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、１以上のこれ
らの改変されたポリペプチドを含むマルチマーを生成するために適用され得る（
例えば、本明細書においてその全体が参考として援用される、米国特許第５，４
７８，９２５号を参照のこと）。さらに、当該分野で公知の技術は、本発明のマ
ルチマーに含まれることが所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを生成
するために適用され得る（例えば、本明細書においてその全体が参考として援用
される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０５６８】 あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を使用し
て生成され得る。１つの実施形態では、本発明のマルチマーに含まれるポリペプ
チドは、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の融合タンパク質
技術を使用して組換え的に生成される（例えば、本明細書においてその全体が参
考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の
実施形態では、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本発明
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドを
コードする配列に連結し、次いでさらに本来のＣ末端からＮ末端の配向とは逆方
向で、ポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配
列を欠く）に連結することによって生成される（例えば、本明細書においてその
全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）
。別の実施形態では、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組
換え技術を適用して、膜貫通ドメイン（または疎水性ペプチドもしくはシグナル
ペプチド）を含み、そして膜再構成技術によってリポソームに取り込まれ得る、
本発明の組換えポリペプチドを生成する（例えば、本明細書においてその全体が
参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０５６９】 （ポリヌクレオチドの使用） 本明細書中で同定されたポリヌクレオチドの各々は、試薬として多数の方法に
おいて使用され得る。以下の説明は例示的であるとみなされるべきであり、そし
て公知の技術を利用する。
【０５７０】 本発明のポリヌクレオチドは、染色体同定のために有用である。実際の配列デ
ータ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬のほとんどは現在利用可能で
はないので、新しい染色体マーカーを同定する必要性が目下のところ存在する。
本発明の各ポリヌクレオチドは、染色体マーカーとして使用され得る。
【０５７１】 簡単に言うと、配列は、配列番号Ｘで示される配列からＰＣＲプライマー（好
ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することによって染色体にマッピングされ得る
。プライマーが、ゲノムＤＮＡ中の１つより多くの推定エキソンにまたがらない
ように、プライマーを、コンピューター分析を使用して選択し得る。次いで、こ
れらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスク
リーニングのために使用される。配列番号Ｘに対応するヒト遺伝子を含むハイブ
リッドのみが、増幅されたフラグメントを産生する。
【０５７２】 同様に、体細胞ハイブリッドは、特定の染色体に対してポリヌクレオチドをＰ
ＣＲマッピングする迅速な方法を提供する。単一のサーマルサイクラーを使用し
て１日あたり３つ以上のクローンが割り当てられ得る。さらに、ポリヌクレオチ
ドの準位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体フラグメ
ントのパネルを用いて達成され得る。使用され得る他の遺伝子マッピングストラ
テジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化したフローソートした
（ｌａｂｅｌｅｄ ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリーニング、
および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーシ
ョンによる前選択（ｐｒｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を含む。
【０５７３】 ポリヌクレオチドの正確な染色体位置はまた、中期染色体スプレッド（ｓｐｒ
ｅａｄ）の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して達
成され得る。この技術は５００または６００塩基ほどの短さのポリヌクレオチド
を使用する；しかし２，０００〜４，０００ｂｐのポリヌクレオチドが好ましい
。この技術の総説に関しては、Ｖｅｒｍａら、「Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏ
ｍｅｓ： ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，
Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）を参照のこ
と。
【０５７４】 染色体マッピングについては、ポリヌクレオチドは、個々に（単一染色体また
はその染色体上の単一部位をマークするために）またはパネルで（複数部位およ
び／または複数染色体をマークするために）使用され得る。好ましいポリヌクレ
オチドは、ｃＤＮＡの非コード領域に対応する。なぜなら、コード配列は、遺伝
子ファミリー内でより保存される傾向があり、従って、染色体マッピングの間の
交差ハイブリダイゼーションの機会が増加するからである。
【０５７５】 一旦、ポリヌクレオチドが正確な染色体位置にマッピングされると、ポリヌク
レオチドの物理的位置は、連鎖分析において使用され得る。連鎖分析は、染色体
位置と特定の疾患の提示との間の同時遺伝（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）を確
立する。（疾患マッピングデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄ
ｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉ
ｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを
通してオンラインで利用可能である）において見い出される）。１メガベースマ
ッピング解像度および２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定すると、疾患と関連する染
色体領域に正確に位置決定されるｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在的な原因遺伝
子のうちの１つであり得る。
【０５７６】 従って、一旦、同時遺伝が確立されると、罹患個体と罹患していない個体との
間でのポリヌクレオチドおよび対応する遺伝子における差異が試験され得る。ま
ず、染色体中の可視的な構造変化（例えば、欠失または転座）は染色体スプレッ
ドにおいて、またはＰＣＲによって試験される。構造的変化が存在しない場合、
点変異の存在が確認される。数人または全ての罹患した個体で観察されたが、正
常な個体では観察されない変異は、この変異がこの疾患を引き起こし得ることを
示す。しかし、いくつかの正常な個体由来のポリペプチドおよび対応する遺伝子
の完全な配列決定は、変異を多型性と区別するために必要とされる。新しい多型
性が同定される場合、この多型性ポリペプチドはさらなる連鎖分析のために使用
され得る。
【０５７７】 さらに、罹患していない個体と比較して、罹患個体における遺伝子の発現の増
加または減少が、本発明のポリヌクレオチドを使用して評価され得る。任意のこ
れらの変化（変化した発現、染色体再配置、または変異）は、診断マーカーまた
は予後マーカーとして使用され得る。
【０５７８】 従って、本発明はまた、障害の診断の間に有用な診断方法を提供し、この方法
は、個体由来の細胞または体液中の本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測
定する工程、および測定された遺伝子発現レベルをポリヌクレオチド発現レベル
の標準レベルと比較し、これによって標準と比較して、遺伝子発現レベルの増加
または減少が障害の指標になる工程、を包含する。
【０５７９】 なお別の実施形態では、本発明は、サンプルを、試験被験体に由来する増殖性
および／または癌性のポリヌクレオチドの存在について分析するためのキットを
含む。一般的な実施形態において、このキットは、本発明のポリヌクレオチドと
特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのポリヌク
レオチドプローブ、および適切な容器を備える。特定の実施形態では、このキッ
トは、本発明のポリヌクレオチドの内部領域を規定する２つのポリヌクレオチド
プローブを含み、ここで各プローブは、この領域に対して内部の３１’マーの末
端を含む一本鎖を有する。さらなる実施形態では、このプローブは、ポリメラー
ゼ連鎖反応増幅のためのプライマーとして有用であり得る。
【０５８０】 障害の診断が既に従来方法によってなされている場合、本発明は、予後指標と
して有用であり、それによって増強または抑制された本発明のポリヌクレオチド
発現を示す患者が、標準レベルにより近いレベルでこの遺伝子を発現する患者と
比較して悪い臨床結果を経験する。
【０５８１】 「本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する」とは、本発明のポリペ
プチドのレベルまたはこのポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを、第１
の生物学的サンプルにおいて、直接的（例えば、絶対的なタンパク質レベルまた
はｍＲＮＡレベルを決定または評価することによって）または相対的（例えば、
第２の生物学的サンプル中のポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルに対して
比較することによって）のいずれかで、定性的または定量的に測定または評価す
ることが意図される。好ましくは、第１の生物学的サンプル中のポリペプチドレ
ベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または評価され、そして標準のポリペプチドレ
ベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較され、この標準は、障害を有さない個体
から得られる第２の生物学的サンプルから得られるかまたは障害を有さない個体
の集団からのレベルを平均化することによって決定される。当該分野で認識され
るように、一旦標準的なポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが公知になれ
ば、これを、比較のための標準として反復して使用し得る。
【０５８２】 「生物学的サンプル」とは、本発明のポリペプチドまたはｍＲＮＡを含む、個
体、体液、細胞株、組織培養物または他の供給源から得られる任意の生物学的サ
ンプルが意図される。示されるように、生物学的サンプルは、本発明のポリペプ
チドを含む体液（例えば、精液、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、
および本発明のポリペプチドを発現することが見出された他の組織供給源を含む
。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は、当該分野で周知である
。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含むようにする場合、組織生検が好ましい供給
源である。
【０５８３】 上記で提供された方法は、好ましくは、ポリヌクレオチドおよび／またはポリ
ペプチドが固体支持体に結合される診断方法および／またはキットに適用され得
る。１つの例示的な方法では、この支持体は、米国特許第５，８３７，８３２号
、同第５，８７４，２１９号および同第５，８５６，１７４号に記載されるよう
な「遺伝子チップ」または「生物学的チップ」であり得る。さらに、本発明のポ
リヌクレオチドが結合されたこのような遺伝子チップを用いて、このポリヌクレ
オチド配列と、試験被験体から単離されたポリヌクレオチドとの間の多型性を同
定し得る。このような多型性の見識（すなわち、それらの位置ならびにそれらの
存在）は、癌性の疾患および状態を含む多くの障害についての疾患の遺伝子座を
同定する際に有益である。このような方法は、米国特許第５，８５８，６５９号
および同第５，８５６，１０４号に記載される。上記に参照した米国特許は、こ
こにその全体が本明細書中に参考として援用される。
【０５８４】 本発明は、化学的に合成された（すなわち、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として再
現された）または当該分野で公知の他の方法に従って合成された、本発明のポリ
ヌクレオチドを包含する。ＰＮＡの使用は、ポリヌクレオチドが固体支持体、す
なわち、遺伝子チップに取り込まれる場合に、好ましい形態として作用する。本
発明の目的のために、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ポリアミド型のＤＮＡアナロ
グであり、そしてアデニン、グアニン、チミンおよびシトシンについてのモノマ
ー単位が市販されている（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。Ｄ
ＮＡの特定の成分（例えば、リン、酸化リンまたはデオキシリボース誘導体）は
、ＰＮＡ中に存在しない。Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｒ．Ｈ
．ＢｅｒｇおよびＯ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１４９７（
１９９１）；ならびにＭ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｃｈｒｉ
ｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｓ．Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｄｒｉ
ｖｅｒ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ、Ｓ．Ｋ．Ｋｉｍ，Ｂ．ＮｏｒｄｅｎおよびＰ．Ｅ．
Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６５，６６６（１９９３）によって開示され
るように、ＰＮＡは、相補的なＤＮＡ鎖に対して特異的かつ強力に結合し、そし
てヌクレアーゼによって分解されない。実際、ＰＮＡは、ＤＮＡ自体が結合する
よりも強力にＤＮＡに結合する。これはおそらく、２つの鎖の間に静電反発力が
存在せず、そしてまたポリアミド骨格がより可撓性であるからである。このため
、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖よりも広範囲のストリンジェ
ンシー条件下で結合し、多重鎖ハイブリダイゼーションを行うのをより容易にす
る。強力な結合に起因して、ＤＮＡを用いる場合よりも小さいプローブが用いら
れ得る。さらに、単一の塩基ミスマッチが、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーシ
ョンを用いて決定され得る可能性がより高い。なぜなら、ＰＮＡ／ＤＮＡの１５
マーにおける単一のミスマッチは、ＤＮＡ／ＤＮＡの１５マー二重鎖についての
４℃〜１６℃に対して融点（Ｔm）を８〜２０℃低下させるからである。また、
ＰＮＡ中に荷電基が存在しないことは、ハイブリダイゼーションが、低いイオン
強度で行われ得、そして分析の間の塩によってありうる妨害を減少させることを
意味する。
【０５８５】 本発明は、哺乳動物におけるガンの検出のために有用である。特に、本発明は
、以下を含むがこれらに限定されない、病理学的な細胞増殖新形成の診断の間に
有用である：急性骨髄性白血病（急性単球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急
性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性赤白血病、急性巨核球性白血
病、および急性未分化白血病などを含む）；および慢性骨髄性白血病（慢性骨髄
単球性白血病、慢性顆粒球性白血病などを含む）。好ましい哺乳動物としては、
有尾猿（ｍｏｎｋｅｙ）、無尾猿（ａｐｅ）、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、
ウサギおよびヒトを含む。特に好ましいのは、ヒトである。
【０５８６】 病理学的な細胞増殖障害はしばしば、原癌遺伝子の非適切な活性化に関連する
（Ｇｅｌｍａｎｎ，Ｅ．Ｐ．ら，「Ｔｈｅ Ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｃｕｔ
ｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｖｉ
ｒａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」，Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ，第１巻，Ｗｉｅｒｎｉｋ、Ｐ．Ｈ．ら編，１６１−１８
２（１９８５））。新形成は現在、ウイルス配列の染色体への挿入、より活性に
転写される領域への遺伝子の染色体転座、または何らかの他の機構による、正常
な細胞遺伝子産物の定性的変化から、または遺伝子発現の定量的改変から生じる
と考えられている（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。特定の遺伝子の変異または変更
された発現が、他の組織および他の細胞型の中でも、いくつかの白血病の病因と
関与しているようである（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。実際、いくつかの動物新
形成に関与する原癌遺伝子のヒト対応物は、ヒトの白血病および癌腫のいくつか
の症例において増幅または転座されていた（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。
【０５８７】 例えば、ｃ−ｍｙｃ発現は、非リンパ性白血病細胞株ＨＬ−６０において高度
に増幅される。ＨＬ−６０細胞が増幅を停止するように化学的に誘導される場合
、ｃ−ｍｙｃのレベルは、ダウンレギュレートされることが見出されている（国
際公開第ＷＯ９１／１５５８０号）。しかし、ｃ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｂの５
’末端に相補的であるＤＮＡ構築物へのＨＬ−６０細胞の暴露が、ｃ−ｍｙｃタ
ンパク質またはｃ−ｍｙｂタンパク質の発現をダウンレギュレートする対応のｍ
ＲＮＡの翻訳をブロックし、処理した細胞の細胞増殖および分化の停止を引き起
こすことが示された（国際公開第ＷＯ９１／１５５８０号；Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：１０２８（１９８８）；Ａ
ｎｆｏｓｓｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３３７９（１
９８９））。しかし、当業者は、増殖性の表現型を示すことが公知である種々の
起源の多数の細胞および細胞型を考慮して、本発明の有用性が造血性の細胞およ
び組織の増殖性障害の処置に限定されないことを認識する。
【０５８８】 前記に加えて、ポリヌクレオチドは、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮ
ＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセ
ンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１
９９１），「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓ
ｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，
ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）に考察される。
三重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１
３６０（１９９１）に考察される。両方の方法は、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへ
のポリヌクレオチドの結合に依存する。これらの技術に関して、好ましいポリヌ
クレオチドは通常、２０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチドであり、そして転写
に関与する遺伝子領域（三重らせん−Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５
６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（
１９９１）をを参照のこと）またはｍＲＮＡ自体（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａ
ｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））のいずれかに相補的である。三重らせん形成は、最
適にはＤＮＡからのＲＮＡ転写の遮断を生じるが、アンチセンスＲＮＡハイブリ
ダイゼーションは、ポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止する。両方の技
術は、モデル系において有効であり、そして本明細書に開示される情報が、疾患
を処置するための試みにおいて、アンチセンスまたは三重らせんポリヌクレオチ
ドを設計するために使用され得る。
【０５８９】 本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療において有用である。遺伝子治
療の１つの目標は、遺伝欠損を修正する試みにおいて、欠損遺伝子を有する生物
へ正常遺伝子を挿入することである。本発明に開示されるポリヌクレオチドは、
高度に正確な様式でこのような遺伝欠損を標的とする手段を提供する。別の目標
は、宿主ゲノム中には存在しなかった新たな遺伝子を挿入し、それによって宿主
細胞中で新しい形質を生成することである。
【０５９０】 ポリヌクレオチドはまた、微小な生物学的サンプルから個体を同定するために
有用である。例えば、米国軍は、その職員を同定するために制限断片長多型（Ｒ
ＦＬＰ）の使用を考慮している。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは１つ
以上の制限酵素で消化され、そして職員を同定するため固有なバンドを生じるた
めにサザンブロットに対してプローブされる。この方法は、「認識票（Ｄｏｇ
ｔａｇ）」（これは、失われたり、交換されたり、または盗まれたりすることに
より、決定的な同定を困難にし得る）の現在の限界を被らない。本発明のポリヌ
クレオチドは、ＲＦＬＰのためのさらなるＤＮＡマーカーとして使用され得る。
【０５９１】 本発明のポリヌクレオチドはまた、個体のゲノムの選択された部分の実際の塩
基ごとのＤＮＡ配列を決定することによって、ＲＦＬＰに対する代替物として使
用され得る。これらの配列は、このような選択されたＤＮＡを増幅および単離す
るためのＰＣＲプライマーを調製するために使用され得、次いで、この選択され
たＤＮＡが、配列決定され得る。各個体が固有のセットのＤＮＡ配列を有するの
で、この技術を使用して、個体が同定され得る。一旦、固有のＩＤデータベース
が個体について確立されると、その個体が生存していようとまたは死亡していよ
うとにかかわらず、その個体の決定的な同定が、極めて小さな組織サンプルから
なされ得る。
【０５９２】 法医学生物学もまた、本明細書に開示されるようなＤＮＡに基づく同定技術を
使用して利益を得る。組織（例えば、髪または皮膚）、または体液（例えば、血
液、唾液、精液、滑液、羊水、乳汁、リンパ、肺痰（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓｐ
ｕｔｕｍ）または肺界面活性物質、尿、糞便物質など）のような非常に少量の生
物学的サンプルから採取されたＤＮＡ配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。
ある先行技術において、ＤＱａクラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子のような多型性遺伝子
座から増幅された遺伝子配列は、個体を同定するための法医学生物学において使
用される。（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍ
ａｎ ａｎｄ Ｃｏ．（１９９２））。一旦、これらの特異的多型性遺伝子座が
増幅されると、これらは１つ以上の制限酵素で消化される。これは、ＤＱａクラ
スＩＩ ＨＬＡ遺伝子に対応するＤＮＡでプローブされたサザンブロットに対し
て同定するバンドのセットを生じる。同様に、本発明のポリヌクレオチドは、法
医学的目的のための多型性マーカーとして使用され得る。
【０５９３】 また、特定の組織の供給源を同定し得る試薬についての必要性が存在する。例
えば、未知の起源の組織が提示される場合、法医学においてこのような必要性が
生じる。適切な試薬は、例えば、本発明の配列から調製される、特定の組織に特
異的なＤＮＡプローブまたはプライマーを含み得る。このような試薬のパネルは
、種および／または器官型によって組織を同定し得る。同様の様式で、これらの
試薬は、夾雑物に対して組織培養物をスクリーニングするために使用され得る。
【０５９４】 少なくとも、本発明のポリヌクレオチドは、サザンゲルでの分子量マーカーと
して、特定の細胞型における特定のｍＲＮＡの存在に関する診断プローブとして
新規なポリヌクレオチドを発見するプロセスでの公知の配列を「差し引き」する
ためのプローブとして、「遺伝子チップ」または他の支持体に付着させるための
オリゴマーを選択および作製するため、ＤＮＡ免疫技術を用いて抗ＤＮＡ抗体を
惹起させるため、および免疫応答を誘発する抗原として、使用され得る。
【０５９５】 （ポリペプチドの使用） 本明細書中に同定される各ポリペプチドは、多くの方法に使用され得る。以下
の説明は、例示としてみなされるべきであり、そして公知の技術を使用する。
【０５９６】 本発明のポリペプチドは、抗体に基づいた技術を使用して生物学的サンプル中
のタンパク質レベルをアッセイするために使用され得る。例えば、組織における
タンパク質発現は、古典的な免疫組織化学法を用いて研究され得る（Ｊａｌｋａ
ｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５
）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−
３０９６（１９８７））。タンパク質遺伝子発現を検出するのに有用である、抗
体に基づいた他の方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラ
ジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のような免疫アッセイが含まれる。適切な抗体ア
ッセイの標識は、当該技術分野で公知であり、そして例えば、グルコースオキシ
ダーゼのような酵素標識、ならびにヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４
Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およ
びテクネチウム（９９ｍＴｃ）のような放射性同位体、ならびにフルオレセイン
およびローダミンのような蛍光標識、ならびにビオチンが挙げられる。
【０５９７】 生物学的サンプル中の分泌タンパク質レベルをアッセイすることに加えて、タ
ンパク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質をインビボ
で画像化するための抗体の標識またはマーカーとしては、Ｘ線ラジオグラフィー
、ＮＭＲまたはＥＳＲにより検出可能なものが挙げられる。Ｘ線ラジオグラフィ
ーについては、適切な標識は、検出可能な放射線を発するが、被験体に対して明
白には有害ではないバリウムまたはセシウムのような放射性同位体を含む。ＮＭ
ＲおよびＥＳＲに適切なマーカーには、例えば重水素のような検出可能な特徴的
なスピンを有するものが含まれ、これは、関連したハイブリドーマのための栄養
素を標識することにより抗体に取り込まれ得る。
【０５９８】 放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線不透過
性物質、または核磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像
化部分で標識された、タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、哺乳動
物に（例えば、非経口的、皮下、または腹腔内に）導入される。被験体のサイズ
および用いられる画像化システムは、診断画像を生成するために必要な画像化部
分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、
ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、９９ｍＴｃの約５〜２０
ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは
、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像
化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅ
ｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ
Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ
Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒの第１
３章、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。
【０５９９】 従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、この方法は、（ａ）個体の細胞
または体液中の本発明のポリペプチドの発現をアッセイする工程；（ｂ）この遺
伝子発現レベルを標準の遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、これによっ
て、標準的な発現レベルと比較して、アッセイされたポリペプチドの遺伝子発現
レベルの増加または減少が、障害の指標になる。癌に関しては、個体由来の生検
組織中での比較的多量の転写物の存在は、この疾患の発症の素因を示し得るか、
または実際の臨床症状の出現前にこの疾患を検出するための手段を提供し得る。
この型のより決定的な診断は、保健専門家が、より早期に予防的測定または積極
的処置を用い、それによって癌の発生またはさらなる進行を予防することを可能
にし得る。
【０６００】 さらに、本発明のポリペプチドを用いて疾患を処置し得る。例えば、患者には
、ポリペプチド（例えば、インスリン）の非存在またはレベルの減少を元に戻す
こと、異なるポリペプチド（例えば、ヘモグロビンＢに対するヘモグロビンＳ、
ＳＯＤ、カタラーゼ、ＤＮＡ修復タンパク質）の非存在またはレベルの減少を補
充すること、ポリペプチド（例えば、ガン遺伝子または腫瘍サプレッサー）の活
性を阻害すること、ポリペプチドの活性を（例えば、レセプターに結合すること
によって）活性化すること、遊離リガンド（例えば、炎症を低減させる際に用い
られる可溶性ＴＮＦレセプター）と膜結合レセプターと競合させることによって
膜結合レセプターの活性を減少させること、または所望の応答（例えば、血管の
増殖阻害、増殖細胞または組織への免疫応答の増強）をもたらすことに取り組む
際に、本発明のポリペプチドが投与され得る。
【０６０１】 同様に、本発明のポリペプチドに指向される抗体もまた使用されて疾患を処置
し得る。例えば、本発明のポリペプチドに指向される抗体の投与によって、その
ポリペプチドに結合して、そしてそのポリペプチドの過剰産生を低減し得る。同
様に、抗体の投与によって、例えば、膜に結合したポリペプチド（レセプター）
へ結合することにより、ポリペプチドを活性化し得る。
【０６０２】 少なくとも本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用され得
る。ポリペプチドを用いてもまた、抗体を惹起し得、次いで、この抗体を使用し
て、宿主細胞の形質転換を評価する方法として、組換え細胞からのタンパク質発
現を測定する。さらに、本発明のポリペプチドを使用して、以下の生物学的活性
を試験し得る。
【０６０３】 （遺伝子治療方法） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するために遺伝子治療方
法を使用することである。遺伝子治療法は、本発明のポリペプチドの発現を達成
するために、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）
配列の動物への導入に関する。この方法は、標的組織によるこのポリペプチドの
発現のために必要なプロモーターおよび任意の他の遺伝的エレメントに作動可能
に連結された、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを必要とす
る。このような遺伝子治療および送達の技術は、当該分野で公知であり、例えば
、本明細書中に参考として援用されるＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。
【０６０４】 従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボで本発明のポリヌクレオチド
に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ）を用いて操作され得、この操作された細胞は次いで、このポリペプチドで
処置されるべき患者に提供される。このような方法は、当該分野で周知である。
例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，
８５：２０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉら，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：１０７−１１１２（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎ
ｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：４６０４−４６１５（１９９４）；
Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６０：２２１−２２９（１９
９５）；Ｏｇｕｒａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：５１０２−５
１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ ７：１−１０（１９９６）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏら，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２４６−１２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇら
，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：３１−３８（１９９６）を参
照のこと。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。１つの実施形
態では、操作される細胞は、動脈細胞である。動脈細胞は、動脈、動脈周囲の組
織への直接注射によって、またはカテーテル注射によって患者に再度導入され得
る。
【０６０５】 以下でより詳細に考察するように、ポリヌクレオチド構築物は、注射可能な物
質を動物の細胞へ送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、
肝臓など）の間隙空間への注射）によって送達され得る。ポリヌクレオチド構築
物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリア中で送達され得る。
【０６０６】 １つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチドと
して送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞
への侵入を補助、促進または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（
ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱
剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、本発明のポリヌクレオチドはま
た、リポソーム処方物中で送達され得、そしてリポフェクチン処方物などは当業
者に周知の方法によって調製され得る。このような方法は、例えば、本明細書中
に参考として援用される、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，
４６６号および同第５，５８０，８５９号に記載される。
【０６０７】 遺伝子治療方法において使用される本発明のポリヌクレオチドベクター構築物
は好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列を含まない構
築物である。適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐ
ＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ、なら
びにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．１、
およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に
明白である。
【０６０８】 当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、本発明のポリヌクレオチド配列
の発現を駆動するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、アデノウ
イルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または
異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプ
ロモーター、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アル
ブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウ
イルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ
プロモーター）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒ
ト成長ホルモンプロモーターが挙げられる。プロモーターはまた、本発明のポリ
ヌクレオチドについてネイティブなプロモーターであり得る。
【０６０９】 他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主
要な利点は、細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究に
よって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの間の期間、所望の
ポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０６１０】 本発明のポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝
臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃
、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）
の間隙空間に送達され得る。組織の間隙空間は、器官組織の細網線維間の細胞間
の、液のムコ多糖基質、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織におけ
るコラーゲン線維、結合組織鞘性筋肉細胞内または骨の裂孔中の同じ基質を包含
する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャンネルのリンパ液により占
められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下で議論される理由の
ために好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織への注射によって、好都合
に送達され得る。それらは、好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送達さ
れ、その細胞において発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全
には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）におい
て達成され得る。インビボ筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発
現する能力において、特に適格である。
【０６１１】 裸の核酸配列注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５
ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、投薬量は
、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好ましくは
約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識する
ように、この投薬量は、注射の組織部位に従って変化する。核酸配列の適切かつ
有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状態およ
び投与経路に依存し得る。
【０６１２】 好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注射経路によってである。し
かし、他の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に肺または気管
支の組織、咽喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げ
られる。さらに、裸のＤＮＡ構築物が、血管形成術の間にこの手順において用い
られるカテーテルによって動脈に送達され得る。
【０６１３】 裸のポリヌクレオチドは、送達部位での直接針注射、静脈内注射、局所投与、
カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない、
当該分野で公知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該分
野で公知である。
【０６１４】 構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェク
チン、沈澱剤などのような送達ビヒクルを用いて送達され得る。このような送達
方法は、当該分野で公知である。
【０６１５】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド構築物はリポソーム調製
物中で複合体化している。本発明にて使用するためのリポソームの調製物は、陽
イオン性（正に荷電した）、陰イオン性（負に荷電した）および中性の調製物を
包含する。しかしながら、陽イオン性リポソームと多陰イオン性核酸との間で強
固な荷電複合体を形成し得るので、陽イオン性リポソームが特に好ましい。陽イ
オン性リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（本明細書中で参
考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１６（１９８７））；ｍＲＮＡ（本明細書中
で参考として援用される、Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ、８６：６０７７〜６０８１（１９８９））；および精製された転
写因子（本明細書中で参考として援用される、Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．、２６５：１０１８９〜１０１９２（１９９０））の細胞内送達を媒介す
ることが示されている。
【０６１６】 陽イオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジ
オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは特に有用であり、そして登録商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎのもと
にＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参
考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１６（１９８７）をもまた参照のこと、）よ
り入手可能である。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔ
ｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。
【０６１７】 当該分野で周知の技術を使用して、他の陽イオン性リポソームを、容易に入手
可能な物質より調製し得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−
３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記述に関して、例
えばＰＣＴ公開第ＷＯ ９０／１１０９２号（本明細書中で参考として援用され
る）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献にて説明されており、例
えば、本明細書中で参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７を参照のこと。類
似した方法を使用して、他の陽イオン性脂質物質よりリポソームを調製し得る。
【０６１８】 同様に、陰イオン性リポソームおよび中性リポソームは、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏ
ｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）のようなところから
容易に入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して簡単に調製され
得る。そのような物質としてはとりわけ、ホスファチジル、コリン、コレステロ
ール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（
ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオ
イルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質
はまた、ＤＯＴＭＡ出発物資およびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な割合において混
合され得る。これらの物質を使用してリポソームを生成する方法は当該分野で周
知である。
【０６１９】 例えば、商業的に、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレ
オイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせにおいて使用し、コレ
ステロールの添加の有り無しで、従来のリポソームを生成し得る。従って、例え
ば超音波処理バイアル中で窒素ガス流下で、ＤＯＰＧおよびＤＯＰＣの各５０ｍ
ｇを乾燥することによりＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製し得る。このサンプルを
一晩真空ポンプ下に置き、そして次の日、脱イオン水で水和する。次いで、浴が
、１５ＥＣで循環している間、最大設定にて、逆位カップ（浴タイプ）プローブ
を装備したＨｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ モデル３５０超音波処理器を使用して、
このサンプルを栓をしたバイアル中にて２時間超音波処理する。あるいは、負に
荷電した小胞を超音波処理なしで調製し、多重膜小胞を生成し得るか、または核
孔膜（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して押し出すことにより
別々の大きさの単膜小胞を生成し得る。他の方法は当業者に公知および利用可能
である。
【０６２０】 このリポソームとしては、多重膜小胞（ＭＬＶ）、小さな単膜小胞（ＳＵＶ）
または大きな単膜小胞（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶが好ましい。当該分野で
周知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体が調製される。例えば、
本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０１：５１２〜５２７（１９８３）を参照
のこと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラスチューブの壁面にリン脂質の
薄膜を沈着させ、そしてその後、カプセル化されるべき物質の溶液で水和するこ
とによって調製され得る。ＳＵＶはＭＬＶの長期超音波処理により調製され、単
膜リポソームの均質集団を生成する。封入されるべき物質を予め形成されたＭＬ
Ｖの懸濁液に添加し、次いで、超音波処理する。陽イオン性脂質を含むリポソー
ムを使用する場合、乾燥した脂質膜を滅菌水または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＮａＣ
ｌのような等張性緩衝溶液のような適切な溶液中に再懸濁し、超音波処理し、次
いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと直接混合する。正に荷電したリポソ
ームの陽イオン性ＤＮＡへの結合に起因して、リポソームおよびＤＮＡは非常に
安定な複合体を形成する。ＳＵＶは小核酸フラグメントについての用途を見出す
。ＬＵＶは、当該分野で周知の多くの方法により調製される。一般に使用される
方法としては、Ｃａ2+−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ
ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、３９４：４８３（１９７５）
；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ、１７：７７（１９７９））；エーテル注入（Ｄｅ
ａｍｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、４４３：６２９（１
９７６）；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
ｕｍ．、７６：８３６（１９７７）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：３３４８（１９７９））；界面活性剤透析（Ｅ
ｎｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：１４５（
１９７９））；および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５：１０４３１（１９８０）；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：１４５（１９７８）；Ｓｃ
ｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１５：１６６（１９８２）
）が挙げられ、これらの文献は本明細書中で参考として援用される。
【０６２１】 一般に、ＤＮＡのリポソームに対する割合は約１０：１から約１：１０までで
ある。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は約５：１から約１：５までであ
る。より好ましくは、その割合は約３：１から約１：３までである。さらにより
好ましくは、その割合は約１：１である。
【０６２２】 米国特許第５，６７６，９５４号（本明細書中で参考として援用される）は陽
イオン性リポソームキャリアで複合体化された遺伝物質のマウスへの注入につい
て報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同
第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６
号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，
０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考と
して援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に
使用するための陽イオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、
同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５
５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として
援用される）は、ＤＮＡ−陽イオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提
供する。
【０６２３】 特定の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする配列を含有する
ＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで細胞
を操作する。レトロウイルスプラスミドベクターを誘導し得るレトロウイルスと
しては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイル
ス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、
ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺癌ウイルスが挙げ
られるが、これらに限定されない。
【０６２４】 レトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を形質
導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケー
ジング細胞株の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される、Ｍ
ｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅａｐｙ、１：５〜１４（１９９０）
にて記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１２、
Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−
８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞系が挙げられるがこれらに限定さ
れない。このベクターは当該分野で公知の任意の手段によりパッケージング細胞
を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーション、リポソ
ームの使用、ＣａＰＯ4沈澱が挙げられるが、それらに限定されない。１つの代
替法において、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソームにカプセル化し
得るか、または脂質に結合し、次いで宿主に投与し得る。
【０６２５】 プロデューサー細胞株は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのようなレ
トロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのどちらかに
おいて、真核生物細胞を形質導入し得る。形質導入された真核生物細胞は本発明
のポリペプチドを発現する。
【０６２６】 特定の他の実施形態において、アデノウイルスベクター中に含まれる本発明の
ポリヌクレオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。アデ
ノウイルスは、それが本発明のポリペプチドをコードし、そして発現し、それと
同時に通常の溶解性ウイルス生活環にて複製するその能力に関して不活性化され
るように操作され得る。アデノウイルス発現はウイルスＤＮＡの宿主細胞染色体
への組み込み無しに達成され、その結果、挿入性変異誘発についての心配が軽減
される。さらに、アデノウイルスは何年もの間、生腸性ワクチンとして優れた安
全側面を伴って使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ
ｉｒ．Ｄｉｓ．、１０９：２３３−２３８（１９７４））。最終的に、アデノウ
イルス媒介性遺伝子移入が、α−１−アンチトリプシンおよびＣＦＴＲのコトン
ラットの肺への移入を含む多くの例において実証されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌ
ｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：４３１〜４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅ
ｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：１４３〜１５５（１９９２））。さらに、ヒト癌にお
ける原因物質としてアデノウイルスを確立しようとする大量の研究は、一様に陰
性であった（Ｇｒｅｅｎら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
７６：６６０６（１９７９））。
【０６２７】 本発明において有用である適切なアデノウイルスベクターが、例えば、Ｋｏｚ
ａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ
．、３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８
：１４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅｔ．Ｔｈｅｒ．、４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｇｅｎｅｔ、７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３６５:６９１〜６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２
２４号に記載されており、これらは本明細書中で参考として援用される。例えば
、アデノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞にて増殖
され得る。これらの細胞はアデノウイルスのＥ１領域を含み、そして構成的にＥ
ｌａおよびＥｌｂを発現し、これらはそのベクターから欠失している遺伝子の産
物を提供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加えて、他
の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もまた本発
明において有用である。
【０６２８】 好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは複製欠損である。複
製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルスおよ
び／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは細胞
に感染する能力があり、そしてプロモーターに作動可能に連結された、目的のポ
リヌクレオチドを発現し得るが、ほとんどの細胞にて複製し得ない。複製欠損ア
デノウイルスは次の遺伝子：Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａまたはＬ１か
らＬ５までのすべてまたは一部の１つ以上にて欠失され得る。
【０６２９】 特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、エ
キソビボまたはインビボで細胞を操作する。ＡＡＶは感染性粒子を生成するため
にヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（Ｍｕｚ
ｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．，１５８：９７（１９９２））。それはまた、分裂していない細胞の中に
そのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。３００塩基対程
度の小さいＡＡＶを含むベクターがパッケージされ得、そして組み込み得るが、
外来性ＤＮＡに対するスペースは約４．５ｋｂに限られる。そのようなＡＡＶの
生成および使用の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，１３９
，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７８号、同第５，
４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８，７４５号およ
び同第５，５８９，３７７号を参照のこと。
【０６３０】 例えば、本発明において使用するために適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製
、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みに関して必要な全ての配列を含む。
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ
（１９８９）において見い出される方法のような、標準的クローニング方法を使
用して、本発明のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築物をＡＡＶベク
ターに挿入する。次いで、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸
カルシウム沈澱などを含む、任意の標準的技術を使用して、この組み換えＡＡＶ
ベクターを、ヘルパーウイルスに感染しているパッケージング細胞にトランスフ
ェクトする。適切なヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロ
ウイルス、ワクシニアウイルス、またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パ
ッケージング細胞がトランスフェクトおよび感染されると、それらは本発明のポ
リヌクレオチド構築物を含む感染性ＡＡＶウイルス粒子を生成する。次いで、エ
キソビボまたはインビボのいずれかで、これらのウイルス粒子を使用して真核生
物細胞を形質導入する。形質導入細胞はそのゲノムに組み込まれたポリヌクレオ
チド構築物を含み、そして所望される遺伝子産物を発現する。
【０６３１】 遺伝子治療の別の方法は、相同組み換え（例えば、米国特許第５，６４１，６
７０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、１９
９６年９月２６日公開；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４
日公開；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）を介する、作動可能に
連結している異種制御領域および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、目的の
ポリペプチド配列をコードしている配列）を含む。この方法は標的細胞中に存在
しているが、通常はその細胞中で発現しないか、または所望するよりも低いレベ
ルで発現する遺伝子の活性化を含む。
【０６３２】 当該分野で既知の標準的技術を使用して、ポリヌクレオチド構築物を作製する
。この構築物はプロモーターに隣接した標的化配列とともにプロモーターを含む
。適切なプロモーターが本明細書中に記載されている。標的化配列は内在性配列
に対して十分に相補的であり、プロモーター標的化配列と内在性配列との相同組
換えを可能にする。標的化配列は、所望される内在性ポリヌクレオチド配列の５
’末端の十分近くに存在し、それゆえ、相同組換えに際して、プロモーターは作
動可能に内在性配列に連結される。
【０６３３】 このプロモーターおよび標的化配列はＰＣＲを使用して増幅され得る。好まし
くは、この増殖されたプロモーターは、５’末端および３’末端に別の制限酵素
部位を含む。好ましくは、最初の標的化配列の３’末端は増幅されたプロモータ
ーの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末端は
増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されたプロモー
ターおよび標的化配列を消化し、そしてともに連結する。
【０６３４】 裸のポリヌクレオチドとしてか、もしくは上記により詳細に記載されるような
リポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクション、
沈澱剤などのようなトランスフェクション促進剤と一緒にかのいずれかで、この
プロモーター−標的化配列構築物を細胞に送達する。直接針注射、静脈内注射、
局所投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法によりＰプロモー
ター−標的化配列を送達し得る。この方法を下記により詳細に記載する。
【０６３５】 プロモーター−標的化配列構築物は、細胞により取り込まれる。この構築物と
内在性配列との間に相同組換えが起こり、その結果、内在性配列はこのプロモー
ターの制御下に配置される。次いで、このプロモーターは内在性配列の発現を駆
動する。
【０６３６】 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、他の脈管形成タンパ
ク質をコードする他のポリヌクレオチドと一緒に投与され得る。脈管形成タンパ
ク質としては、酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、ＶＥＧ
Ｆ−２（ＶＥＧＦ−Ｃ）、ＶＥＧＦ−３（ＶＥＧＦ−Ｂ）、上皮増殖因子αおよ
びβ、血小板由来の内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子α、
肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、コロニー刺激因子、マクロファージコ
ロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子および一酸化窒素シ
ンターゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６３７】 好ましくは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、タンパ
ク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含む。代表的に、シグナル配列は、コ
ード領域の５’末端に向かってまたは５’末端で発現されるポリヌクレオチドの
コード領域に位置づけられる。このシグナル配列は、目的のポリヌクレオチドに
対して同種または異種であり得、そしてトランスフェクトされる細胞に対して同
種または異種であり得る。さらに、当該分野で公知の方法を使用して、このシグ
ナル配列は化学合成され得る。
【０６３８】 その投与様式によって、治療効果を提供するのに十分な量において１つ以上の
分子が発現される限り、上記の任意のポリヌクレオチド構築物の任意の投与様式
が使用され得る。これは、直接針注入、全身注射、カテーテル注入、バイオリス
ティック注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、ゲルフォームスポン
ジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）
、経口または坐剤固形（錠剤または丸剤）薬学的処方物、および手術中のデカン
ティングまたは局所適用を含む。例えば、ラット肝臓およびラット脾臓へのリン
酸カルシウム沈澱した裸のプラスミドの直接注入または門脈へのタンパク質被覆
プラスミド直接注入は、ラット肝臓における外来性遺伝子の遺伝子発現をもたら
した（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：３７５（１９８９））。
【０６３９】 局所投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達ビ
ヒクルと複合体を形成した本発明の組換え分子は、動脈領域に直接注入により投
与されるか、または動脈領域内部に局所投与される。動脈領域内部での組成物の
局所投与とは、その組成物を動脈内に数センチメートル、好ましくは数ミリメー
トルで注射することを言う。
【０６４０】 局部投与の別の方法は、外科的創傷内またはその周辺に本発明のポリヌクレオ
チド構築物を接触させることである。例えば、患者は手術を経験し得、そしてポ
リヌクレオチド構築物を創傷内部の組織表面上に被覆し得るか、またはその構築
物を創傷内部の組織領域に注射し得る。
【０６４１】 全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクルと複合体
を形成した本発明の組換え分子を含む。全身投与で使用するために適切な送達ビ
ヒクルは、特定部位に対してそのビヒクルを標的化するリガンドを含むリポソー
ムを含む。
【０６４２】 全身投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口および経皮
（局所的）送達が挙げられる。当該分野で標準的な方法を使用して、静脈内注射
が実行され得る。当該分野で標準的な方法を使用して、エアロゾル送達もまた実
行され得る（例えば、本明細書中で参考として援用されるＳｔｒｉｂｌｉｎｇら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１８９：１１２７７〜１１
２８１（１９９２）を参照のこと）。動物の腸内の消化酵素による分解に耐える
能力をもつキャリアに対して本発明のポリヌクレオチド構築物が複合体を形成す
ることにより、経口送達は実行され得る。そのようなキャリアの例としては、当
該分野で公知であるもののような、プラスチックカプセルまたは錠剤が挙げられ
る。皮膚内へ通過可能な親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と本発明のポリヌクレ
オチド構築物を混合することによって、局所的送達は実行され得る。
【０６４３】 送達される物質の有効量を決定することは、例えば、その物質の化学構造およ
び生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびそ
の重症度ならびに投与経路を含む多数の因子に依存し得る。処置の頻度は、１用
量あたりで投与されるポリヌクレオチド構築物の量ならびに被験体の健康および
病歴のような多くの因子に依存する。正確な量、投薬回数および投薬のタイミン
グは、内科医または獣医により決定される。本発明の治療的組成物は任意の動物
に、好ましくは哺乳動物および鳥類に投与され得る。好ましくは、哺乳動物とし
てはヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブ
タが挙げられ、特にヒトである。
【０６４４】 （生物学的活性） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストをアッセイに使用し、１つ以上の生物学的活性について試験し得
る。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドが特定のアッセイにおいて活
性を示す場合、これらの分子はその生物学的活性に関連した疾患に関与し得るよ
うである。従って、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストを使用し、関連した疾患を処置し得る。
【０６４５】 （免疫活性） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストは、免疫細胞の増殖、分化、もしくは動員（走化性）を活性化ま
たは阻害することにより、免疫系の欠乏症または障害の処置において有用であり
得る。免疫細胞は造血と呼ばれるプロセスを介して発生し、多能性幹細胞から骨
髄性細胞（血小板、赤血球、好中球およびマクロファージ）およびリンパ系細胞
（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）を生成する。これら免疫の欠乏症または障害の
病因は、遺伝的、体細胞的（例えば、癌またはいくつかの自己免疫障害）、後天
的（例えば、化学療法もしくは毒素による）または感染的であり得る。さらに、
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはア
ンタゴニストは、特定の免疫系の疾患または障害のマーカーまたは検出物質（ｄ
ｅｔｅｃｔｏｒ）として使用され得る。
【０６４６】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストは造血細胞の欠乏症および障害の処置または検出において有用で
あり得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、特定の（または多くの）型の造血細胞の減少に関連
したそれらの障害を処置する試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化
および増殖を増加させるために用いられ得る。免疫学的欠損症候群の例としては
、血液タンパク質障害（例えば、無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン
血症）、毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不全、ディジョージ症候群、
ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着不全症候群、リンパ球減少、食
細胞殺細菌機能不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、ヴィスコット−オール
ドリッチ障害、貧血、血小板減少、またはヘモグロビン尿症が挙げられるが、そ
れらに限定されない。
【０６４７】 さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストをもまた使用し、止血性活性（出血を止めること）また
は血栓崩壊活性（血餅形成）を調節し得る。例えば、止血活性または血栓崩壊活
性の増大により、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴ
ニストもしくはアンタゴニストを使用し、血液凝固障害（例えば、無線維素原血
症、因子欠損症）、血液血小板障害（例えば、血小板減少症）、もしくは外傷、
手術または他の原因から生じる創傷を処置し得る。あるいは、止血活性または血
栓崩壊活性を減少させ得る本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ま
たはアゴニストもしくはアンタゴニストを使用し、血餅を阻害または溶解し得る
。心臓発作（梗塞）、発作（ｓｔｒｏｋｅ）または瘢痕の治療において、これら
の分子は重要であり得る。
【０６４８】 自己免疫障害を処置または検出において、本発明のポリヌクレオチドもしくは
ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストはまた有用であり得る
。多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって外来性物質として不適切に自己認識
することから生じる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊となる免疫応答を引
き起こす。従って、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性を阻害する
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはア
ンタゴニストの投与は、自己免疫障害の防止において効果的な治療であり得る。
【０６４９】 本発明により処置または検出され得る自己免疫障害の例としては、アディソン
病、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性
脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病、多発性硬化症
、重症筋無力症、神経炎、眼炎痛、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症
、紫斑病、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エ
リテマトーデス、自己免疫性の肺の炎症、ギヤン−バレー症候群、インスリン依
存性糖尿病、および自己免疫炎症性眼疾患が挙げられるが、それらに限定されな
い。
【０６５０】 同様に、ぜん息（特にアレルギー性ぜん息）または他の呼吸の問題のような、
アレルギー反応およびアレルギー状態もまた、本発明のポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置され得る
。さらに、これらの分子を使用し、抗原性分子に対するアナフィラキシー、過敏
症または血液型不適合性を処置し得る。
【０６５１】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストをもまた使用し、器官拒絶または対移植片宿主病（ＧＶＨＤ）を
処置および／または防止し得る。器官拒絶は、免疫応答を介する宿主免疫細胞に
よる移植組織の破壊によって起こる。同様に、免疫応答はＧＶＨＤにもまた関与
しているが、この場合、外来性の移植免疫細胞が宿主組織を破壊する。免疫応答
、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性を阻害する、本発明のポリヌクレオチド
もしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストの投与は、器
官拒絶またはＧＶＨＤの防止において効果的な治療であり得る。
【０６５２】 同様に、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストをもまた使用し、炎症を調整し得る。例えば、このポリ
ペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニスト
は、炎症応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの分子を使
用して、感染（例えば、敗血症ショック、敗血症、または全身炎症応答症候群（
ＳＩＲＳ））、虚血再灌流傷害、内毒素致死、関節炎、補体媒介性超急性拒絶、
腎炎、サイトカインまたはケモカインが誘導する肺傷害、炎症性腸障害、クロー
ン病またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰生成から生じ
るものに関連する炎症を含む、慢性および急性の両方の状態の炎症状態を処置し
得る。
【０６５３】 （過増殖障害） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストを使用し、新生物を含む過増殖障害を処置または検出し得る。本
発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアン
タゴニストは、直接または間接的な相互作用を介してこの障害の増殖を阻害し得
る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニ
ストもしくはアンタゴニストは、過増殖障害を阻害し得る他の細胞を増殖させ得
る。
【０６５４】 例えば、免疫応答を増大させること、特に過増殖障害の抗原性の質を増大させ
ることによって、またはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員することによって、
過増殖障害を処置し得る。存在する免疫応答を増強するか、または新たな免疫応
答を開始するかのいずれかによって、この免疫応答を増大させ得る。あるいは、
免疫応答を減少させることもまた、化学療法剤のような、過増殖障害を処置する
方法であり得る。
【０６５５】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストによって処置または検出され得る過増殖障害の例としては、腹部
、骨、胸、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精
巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭および首、神経（中枢および末梢）、リンパ
系、骨盤、皮膚、柔組織、脾臓、胸郭、ならびに泌尿生殖器に位置する新生物が
挙げられるが、それらに限定されない。
【０６５６】 同様に、他の過増殖障害もまた、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置または検出され得る
。そのような過増殖障害の例としては、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖障
害、パラプロテイン血症、紫斑病、類肉腫症、セザリー症候群、ヴァルデンスト
レームマクログロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および任意の他の過増
殖疾患、さらに上記に収載されている器官系に位置している新生物が挙げられる
が、それらに限定されない。
【０６５７】 １つの好ましい実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを利用して、本発明、
および／またはタンパク質融合物もしくはそのフラグメントを用いる遺伝子治療
により、異常な細胞分裂を阻害する。
【０６５８】 従って、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを、異常に増殖している細胞に
挿入することにより細胞増殖障害を処置するための方法を提供する。ここで、上
記のポリヌクレオチドは、上記の発現を抑制する。
【０６５９】 本発明の別の実施形態は、個体における細胞増殖障害を処置する方法を提供し
、この方法は、異常に増殖している細胞（単数または複数）に本発明の１つ以上
の活性な遺伝子コピーを投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、
本発明のポリヌクレオチドは、上記のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列
を発現する際に有効な組換え発現ベクターを含むＤＮＡ構築物である。本発明の
別の好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ
構築物を細胞に挿入して、レトロウイルス（または、より好ましくは、アデノウ
イルスベクター）を利用して処置し得る（本明細書によって参考として援用され
る、Ｇ Ｊ．Ｎａｂｅｌら、ＰＮＡＳ １９９９ ９６：３２４−３２６を参照
のこと）。最も好ましい実施形態において、このウイルスベクターは欠損性であ
り、そして非増殖細胞を形質転換せず、増殖細胞のみを形質転換する。さらに、
好ましい実施形態において、増殖している細胞内に、単独で、または他のポリヌ
クレオチドとともに、もしくは他のポリヌクレオチドと融合して挿入される本発
明のポリヌクレオチドは、次いで、外部刺激（すなわち、磁性、特定の低分子、
化学物質、または薬物投与など）を介して調節され得る。この刺激は、上記のポ
リヌクレオチドの上流にあるプロモーターに作用して、コードされたタンパク質
産物の発現を誘導する。このようにして、本発明の有益な治療効果は、上記の外
部刺激に基づいて、明らかに調節され得る（すなわち、本発明のポリヌクレオチ
ドの発現を増加、減少、または阻害するため）。
【０６６０】 本発明のポリヌクレオチドは、発癌性遺伝子または抗原の発現を抑制する際に
有用であり得る。「発癌性遺伝子の発現を抑制する」ことにより、遺伝子の転写
の抑制、遺伝子転写物の分解（前メッセンジャー（ｐｒｅ−ｍａｓｓａｇｅ）Ｒ
ＮＡ）、スプライシングの阻害、メッセンジャーＲＮＡの破壊、タンパク質の翻
訳後修飾の妨げ、タンパク質の破壊、またはタンパク質の正常機能の阻害を意図
する。
【０６６１】 異常に増殖する細胞に対する局所的な投与に関しては、本発明のポリヌクレオ
チドは、当業者に公知の任意の方法により投与され得、この方法としては、細胞
のトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション
、例えば、または、リポソームのようなビヒクル、リポフェクチンにおいて、ま
たは裸のポリヌクレオチドとして、あるいは本明細書中全体を通して記載される
任意の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオ
チドは、公知の遺伝子送達系（例えば、当業者に公知のレトロウイルスベクター
（Ｇｉｌｂｏａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：８４５（１９８２）；Ｈｏｃｋ
ｅ，Ｎａｔｕｒｅ ３２０：２７５（１９８６）；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：３０１４）；ワクシニアウイルス
系（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：３４０３（
１９８５））または他の効率的なＤＮＡ送達系（Ｙａｔｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ
３１３：８１２（１９８５））に限定されない）により送達され得る。これらの
参考文献は、例示にすぎず、そして本明細書によって参考として援用される。異
常に増殖している細胞に特異的に送達またはトランスフェクトし、そして非分裂
細胞を残す（ｓｐａｒｅ）ために、当業者に公知のレトロウイルスまたはアデノ
ウイルス（当該分野および本明細書中の他の箇所で記載されるように）送達系を
利用することが好ましい。宿主ＤＮＡ複製は、レトロウイルスＤＮＡを組み込む
ために必要であるので、このレトロウイルスは、その生活環についての必要とさ
れるレトロウイルス遺伝子の欠如に起因して自己複製できない。本発明のポリヌ
クレオチドに、このようなレトロウイルス送達系を利用して、上記の遺伝子およ
び構築物を、異常に増殖している細胞に標的化し、そして非分裂性の正常細胞を
残す。
【０６６２】 本発明のポリヌクレオチドは、疾患部位に直接注射針を導くために使用される
画像化デバイスの使用によって、内部器官、体腔などにおける細胞増殖性障害／
疾患部位に直接送達され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、手術介入時に
疾患部位に投与され得る。
【０６６３】 「細胞増殖性障害」によって、任意のヒトまたは動物の疾患または障害が、器
官、腔、または身体部分のいずれか１つもしくはいずれかの組み合わせを冒して
いることを意味される。この疾患は、良性または悪性に拘わらず、細胞、もしく
は細胞群、もしくは組織の単一または複数の局所的な異常な増殖により特徴づけ
られる。
【０６６４】 本発明のポリヌクレオチドの任意の量は、この量が、処置細胞の増殖に対して
生物学的に阻害性の効果を有する限り、投与され得る。さらに、本発明の１つよ
り多くのポリヌクレオチドを、同時に同じ部位に投与することが可能である。「
生物学的に阻害性の」により、部分的または全体的な成長阻害ならびに細胞の増
殖または成長の速度における減少を意味する。生物学的に阻害性の用量は、標的
の悪性または組織培養において異常に増殖している細胞、動物および細胞培養物
における腫瘍成長に対する本発明のポリヌクレオチドの効果を評価すること、あ
るいは当業者に公知の任意の他の方法により決定され得る。
【０６６５】 本発明はさらに、抗体に基づく治療に関し、この方法は、上記の障害の１つ以
上を処置するために、哺乳動物患者（好ましくはヒト患者）に抗ポリペプチド抗
体および抗ポリヌクレオチド抗体を投与する工程を包含する。抗ポリペプチド抗
体および抗ポリヌクレオチド抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体）を生成するための方法は、本明細書中の他の箇所に詳細に記載される。この
ような抗体は、当該分野で公知のように、または本明細書中に記載されるように
薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０６６６】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の概要は、例えば、補体（ＣＤＣ）
もしくはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるように、本発明のポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを、身体において局所的もしくは全身的に、ま
たは抗体の直接的な細胞傷害性により結合させる工程を包含する。これらのアプ
ローチのいくつかは、以下により詳細に記載される。本明細書中に提供される教
示があれば、当業者は、本発明の抗体を、過度の実験なくして、診断、モニタリ
ングまたは治療の目的のために使用する方法を理解する。
【０６６７】 詳細には、本発明の抗体、フラグメントおよび誘導体は、本明細書中に記載さ
れるように、細胞増殖性障害および／もしくは分化障害を有するか、または発症
している被験体を処置するために有用である。このような処置は、単一用量また
は複数用量の抗体、そのフラグメント、誘導体、または結合体を投与する工程を
包含する。
【０６６８】 本発明の抗体は、他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体と組み合わせて
、またはリンホカインもしくは造血増殖因子（例えば、これは、抗体と相互作用
するエフェクター細胞の数または活性が増加するように作用する）と組み合わせ
て、有利に利用され得る。
【０６６９】 本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、そのフラグメントもしくは
領域に対して、高親和性および／または強力なインビボ阻害抗体および／または
中和抗体を使用することは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（
そのフラグメントを含む）に対するイムノアッセイおよびそれに関する障害の治
療の両方のために好ましい。このような抗体、フラグメント、または領域は、好
ましくは、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（そのフラグメントを含む）
に対する親和性を有する。好ましい結合親和性は、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５
×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５
×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12 Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、
および１０-15Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有する親和性を含む。
【０６７０】 さらに、本発明のポリペプチドは、本明細書中の他の箇所に記載されるように
、単独で、融合タンパク質として、または直接的にもしくは間接的に他のポリペ
プチドとの組み合わせでかのいずれかで、増殖性細胞もしくは組織の脈管形成を
阻害する際に有用である。最も好ましい実施形態において、上記の抗脈管形成効
果は、間接的に、例えば、造血性の腫瘍特異的細胞（例えば、腫瘍関連マクロフ
ァージ）の阻害を通じて、達成され得る（参考として援用される、Ｊｏｓｅｐｈ
ＩＢら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，９０（２１）：１６４８−
５３（１９９８）を参照のこと）。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ドに対する抗体はまた、脈管形成の直接的または間接的な阻害を生じ得る（参考
として援用される、Ｗｉｔｔｅ Ｌ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ
Ｒｅｖ．１７（２）：１５５−６１（１９９８）を参照のこと）。
【０６７１】 本発明のポリペプチド（タンパク質融合物を含む）、またはそのフラグメント
は、アポトーシスの誘導を通じて増殖性細胞または組織を阻害する際に有用であ
り得る。上記のポリペプチドは、直接的または間接的のいずれかで、増殖性の細
胞および組織のアポトーシスを誘導するように、例えば、死ドメインレセプター
（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター−１、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ
−１）、ＴＮＦレセプター関連アポトーシス媒介タンパク質（ＴＲＡＭＰ）なら
びにＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）レセプター１および２
（本明細書中に参考として援用されるＳｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ Ｋ，ら
、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５４（３）：４３９−５９（１９９８）を参
照のこと））の活性化において作用し得る。さらに、本発明の別の好ましい実施
形態において、上記のポリペプチドは、他の機構を通じて（例えば、アポトーシ
スを活性化する他のタンパク質の活性化において）あるいは上記タンパク質の発
現を単独でまたは低分子薬物もしくはアジュバント（例えば、アポプトニン、ガ
レクチン、チオレドキシン、抗炎症性タンパク質）と組み合わせてかのいずれか
で刺激することを通じて、アポトーシスを誘導し得る（例えば、本明細書中に参
考として援用される、Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ４００（１−２）：４４７−５５（
１９９８），Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．５０（５）：４２３−３３（１９
９８），Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．Ａｐｒ ２４；１１１−１１
２；２３−２４（１９９８））、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．７６（６）：４０２−１
２（１９９８），Ｉｎｔ Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔ；２０（１）：３−１
５（１９９８）を参照のこと）。
【０６７２】 本発明のポリペプチド（それに対するタンパク質融合物）、またはそのフラグ
メントは、増殖性細胞または組織の転移を阻害する際に有用である。阻害は、本
明細書中他の箇所に記載されるように、ポリペプチドまたは上記ポリペプチドに
対する抗体を投与する工程の直接的結果として、または間接的に（例えば、転移
を阻害することが公知のタンパク質（例えば、α４インテグリン）の発現を活性
化する）生じ得る（例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｃｕｒｒ Ｔ
ｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；２３１：１２５−４１
を参照のこと）。本発明のこのような治療効果は、単独で、または低分子薬物も
しくはアジュバントと組み合わせてかのいずれかで達成され得る。
【０６７３】 別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、ポリペプ
チドまたは異種ポリペプチドに関連するポリペプチド抗体、異種核酸、毒素、ま
たはプロドラッグを含む組成物）を、本発明のポリペプチドを発現する標的とさ
れた細胞に送達する方法を提供する。本発明のポリペプチドまたはポリペプチド
抗体は、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグと、疎水性、
親水性、イオン性および／または共有結合的な相互作用を通じて関連し得る。
【０６７４】 本発明のポリペプチド、それに対するタンパク質融合物、またはそのフラグメ
ントは、上記の抗原および免疫原に対して、直接的（例えば、本発明のポリペプ
チドがワクチン接種された場合、増殖性抗原および免疫原に対して応答するよう
に免疫応答を生じる）または間接的（例えば、免疫応答を増強することが公知の
タンパク質（例えば、ケモカイン）の発現を活性化することにおいて）のいずれ
かで、増殖している細胞または組織の免疫原性および／または抗原性を増強する
際に有用である。
【０６７５】 （心臓血管障害） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストを使用して、四肢虚血のような末梢動脈疾患を含む、心臓血管障
害を処置し得る。
【０６７６】 心臓血管障害としては、動動脈瘻（ａｒｔｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ ｆｉ
ｓｔｕｌａ）、動静脈瘻、大脳動静脈先天異常、先天性心欠陥（ｃｏｎｇｅｎｉ
ｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｅｆｅｃｔｓ）、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候
群のような心臓血管異常が挙げられる。先天性心欠陥としては、大動脈縮窄、三
房心、冠状脈管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｖｅｓｓｅｌ ａｎｏｍａｌｉｅｓ）
、交差心、右胸心、開存性動脈管（ｐａｔｅｎｔ ｄｕｃｔｕｓ ａｒｔｅｒｉ
ｏｓｕｓ）、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合体、左心室発育不全症候
群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖
症、動脈管遺残、および心中隔欠損症（ｈｅａｒｔ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃ
ｔｓ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損症（ａｏｒｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓ
ｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔ）、心内膜床欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファ
ロー三徴症、心室心中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｈｅａｒｔ ｓｅｐ
ｔａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ））が挙げられる。
【０６７７】 心臓血管障害としてはまた、不整脈、カルチノイド心臓病、高心拍出量（ｈｉ
ｇｈ ｃａｒｄｉａｃ ｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出量（ｌｏｗ ｃａｒｄｉａｃ
ｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ（ｃａｒｄｉａｃ ｔａｍｐｏｎａｄｅ）、
心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、うっ血性心
筋症、発作性呼吸困難、心臓水腫、心肥大、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心
室肥大、梗塞後心破裂、心室中隔破裂、心臓弁疾患、心筋疾患、心筋虚血、心内
膜液浸出、心外膜炎（梗塞性および結核性を含む）、気心膜症、心膜切開後症候
群、右心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充血、心臓血管妊娠合併症（
ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ）、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓ
ｃｕｌａｒ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような心臓病が挙げられる。
【０６７８】 不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダ
ムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、長ＱＴ症候群、副収縮、
ローン−ギャノング−レヴァイン症候群、マヘーム型早期興奮症候群、ウルフ−
パーキンソン−ホワイト症候群、洞不全症候群、頻拍、および心室性細動が挙げ
られる。頻拍としては発作性頻拍、上室性頻拍、心室固有調律促進、房室結節性
再入頻拍、異所心房性頻拍、異所接合部頻拍、洞房結節再入頻拍、洞性頻拍、ト
ルサード・ド・ポワント、および心室性頻拍が挙げられる。
【０６７９】 心臓弁疾患としては、大動脈弁機能不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音（ｈｅａ
ｒ ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁
機能不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁機能不全、肺動脈弁狭窄症
、三尖閉鎖症、三尖弁機能不全、および三尖弁狭窄症が挙げられる。
【０６８０】 心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、弁
下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャーガス心筋症
、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、お
よび心筋炎が挙げられる。
【０６８１】 心筋性虚血としては、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈
血管痙攣、心筋梗塞、および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｓｔｕｎｎｉｎ
ｇ）のような冠動脈障害が挙げられる。
【０６８２】 心臓血管疾患としてはまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫
症、ヒッペル−リンダラ疾患、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタ
ージ−ウェーバー症候群、血管運動神経性水腫、大動脈障害、高安動脈炎、大動
脈炎、ルリーシュ症候群、動脈閉塞障害、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒ
ｉｔｉｓ）、結節性多発性動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網
膜症、塞栓症、血栓症、先端紅痛症、痔、肝静脈閉塞障害、高血圧、低血圧、虚
血、末梢血管障害、静脈炎、肺静脈閉塞障害、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、
網膜静脈閉塞、シミター症候群、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡
張性運動失調、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静脈、静脈瘤
性潰瘍、脈管炎、および静脈機能不全のような血管障害が挙げられる。
【０６８３】 動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染した動脈瘤、破裂した動脈瘤
、大動脈性動脈瘤、大脳性動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨性動脈瘤が
挙げられる。
【０６８４】 動脈閉塞障害としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形
成異常、腸間膜性血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉
塞性血栓性血管炎が挙げられる。
【０６８５】 脳血管障害としては、頸動脈障害、脳のアミロイド血管症、大脳動脈瘤、大脳
無酸素症、大脳動脈硬化、大脳動静脈先天異常、大脳動脈障害、大脳の閉塞症お
よび血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、大脳出血、硬膜
上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎｏｉｄ ｈｅｍｏｒｒ
ｈａｇｅ）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症候群、室
周白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、
血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨基部（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉ
ｌａｒ）機能不全が挙げられる。
【０６８６】 塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チア
ノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられる。血
栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、
洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられる。
【０６８７】 虚血としては、大脳虚血、虚血性大腸炎、区画症候群、前区画症候群、心筋虚
血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血が挙げられる。脈管炎としては、大動脈炎
、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅｔ）症候群、チャーグ−ストラウス症候群
、皮膚粘膜リンパ節症候群、閉塞性血栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライ
ン紫斑病（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ ｐｕｒｐｕｒａ）、アレルギ
ー性皮膚血管炎およびヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０６８８】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストは、危険な四肢虚血および冠状動脈疾患の処置に対して特に有効
である。
【０６８９】 ポリペプチドは、当該分野で公知である任意の方法を使用して投与され得、送
達部位における直接的針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、バイオ
リスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子加速器、ゲルフォームスポンジ
デポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経口または坐剤の固形薬学的処方
物、手術中のデカンティングまたは局所適用、エアロゾル送達という方法が挙げ
られるが、これらに限定されない。そのような方法は当該分野で公知である。本
発明のポリペプチドは、下記により詳細に記載される、治療剤の一部として投与
され得る。本発明のポリヌクレオチド送達の方法は本明細書中にてより詳細に記
載される。
【０６９０】 （抗新脈管形成活性） 新脈管形成の内因性の刺激因子とインヒビターとの間の天然に生じる平衡は、
阻害影響が優勢する平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ ５６：３
４５〜３５５（１９８９）。新生血管形成が正常な生理学的条件下において生じ
るまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プロセス
）において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的に定め
られる。病的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける）下にお
いて、これらの調節コントロールはできない。調節されていない新脈管形成は病
的になり、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する。
多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼の
障害、および乾癬を含む、異常な新生血管形成により支配される。例えば、Ｍｏ
ｓｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋｍａｎ
ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜１７６３（１９９５）；
Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜４１１
（１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、Ａｍ
．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；およびＦｏｌ
ｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７１９〜７２５（１９８３）による概説
を参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状
態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する
有意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓ
ｃｅｉｎｃｅ ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。
【０６９１】 本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに
本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの投与による新生血管形成に関連する
疾患または障害の処置を提供する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置され得る悪性状態お
よび転移性状態には、本明細書に記載の、およびそうでなければ当該分野で公知
の悪性腫瘍、固形腫瘍、および癌（このような障害の総説については、Ｆｉｓｈ
ｍａｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．
，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）が挙げられるが、これ
らに限定されない。従って、本発明は、治療有効量の、本発明のポリヌクレオチ
ド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストをそれの必要な個
体に投与する工程を包含する、新脈管形成関連疾患および／または障害の処置方
法を提供する。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよ
び／またはアゴニストは、癌または腫瘍を治療的に処置するために、種々のさら
なる方法で利用され得る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストお
よび／またはアゴニストで処置され得る癌としては、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵
巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結
腸癌、直腸癌、頸部癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌を含む
固形腫瘍；原発性腫瘍および転移；黒色腫；グリオブラストーマ；カポージ肉腫
；平滑筋肉腫；非小細胞肺癌；結腸直腸癌；進行性（ａｄｖａｎｃｅｄ）悪性疾
患；および血液から生じる腫瘍（例えば、白血病）が挙げられるが、これらに限
定されない。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび
／またはアゴニストは、皮膚癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍およびカポージ肉腫のよ
うな癌を処置するために、局所送達され得る。
【０６９２】 なお他の局面において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストお
よび／またはアゴニストは、例えば膀胱内投与によって膀胱癌の表面形態を処置
するために利用され得る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストお
よび／またはアゴニストは、腫瘍に直接的に、または注射もしくはカテーテルを
介して腫瘍部位付近に送達され得る。当然のことながら、当業者が理解するよう
に、適切な投与様式は、処置されるべき癌によって変化する。他の送達様式は本
明細書中において議論される。
【０６９３】 ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニスト
は、癌に加えて、他の障害（新脈管形成を含む）を処置する際に有用であり得る
。これらの障害には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：良性腫瘍（
例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）；
動脈硬化プラーク；眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、
黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス、
網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ）および眼の翼状片（Ｐｔｅｒｙｇ
ｉａ）（異常な血管増殖））；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延型創傷治癒；子宮
内膜症；脈管形成；顆粒化；過形成性瘢痕（ケロイド）；偽関節骨折；強皮症；
トラコーマ；血管接着；心筋の新脈管形成；冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃ
ｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性四肢新脈管形成；オ
ースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群；プラーク新生血管
形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；線維筋性形成異常；創傷顆
粒化；クローン病；およびアテローム性動脈硬化症。
【０６９４】 例えば、本発明の１つの局面において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプ
チド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを過形成性瘢痕またはケロイド
に投与する工程を包含する、過形成性瘢痕およびケロイドを処置するための方法
が提供される。
【０６９５】 本発明の１つの実施形態において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタ
ゴニストおよび／またはアゴニストは、過形成性瘢痕またはケロイドに、これら
の病変の進行を妨げるために直接注射される。この治療は、過形成性瘢痕および
ケロイド（例えば、やけど）の発生を生じることが知られている状態の予防処置
において特に価値があり、そして好ましくは、増殖期が進行する時間（最初の傷
害の約１４日後）を有した後であるが、過形成性瘢痕またはケロイドの発生の前
に開始される。上述のように、本発明はまた、眼の新生血管形成疾患（例えば、
角膜新生血管形成、血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖お
よび黄斑変性を含む）を処置するための方法を提供する。
【０６９６】 さらに、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（アンタゴニストおよ
び／またはアゴニストを含む）を用いて処置され得る新生血管形成に関連する眼
の障害には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血管新生緑内障、糖
尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟児網膜症、
黄斑変性、角膜移植新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、お
よび脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾患。例えば、Ｗａｌｔｍａｎ
ら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４〜７１０（１９７８）およびＧａ
ｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１〜３１２（１９７８）
による総説を参照のこと。
【０６９７】 従って、本発明の１つの局面において、治療有効量の化合物（上記）を患者に
対して、血管の形成が阻害されるように角膜に投与する工程を包含する、角膜新
生血管形成（角膜移植新生血管形成を含む）のような眼の新生血管形成疾患を処
置するための方法が提供される。簡潔には、角膜は、通常には血管を欠く組織で
ある。しかし、特定の病的状態において、毛細血管は、縁の角膜周囲脈管叢から
角膜に伸長し得る。角膜が血管化されるようになる場合、角膜はまた混濁される
ようになり、患者の視力における衰えを生じる。角膜が完全に不透明になる（ｏ
ｐａｃｉｔａｔｅ）場合に、視力喪失が完全になり得る。広範な種々の障害は、
例えば、以下を含む角膜新生血管形成を生じ得る：角膜感染（例えば、トラコー
マ、単純ヘルペス角膜炎、リーシュマニア症およびオンコセルカ症）、免疫学的
プロセス（例えば、移植片拒絶およびスティーヴンズ−ジョンソン症候群）、ア
ルカリやけど、外傷、炎症（任意の原因による）、毒性および栄養欠乏状態、な
らびにコンタクトレンズを装着することの合併症として。
【０６９８】 特に好ましい実施形態において、本発明は、生理食塩水（眼に用いる調製物に
おいて一般に使用される任意の保存剤および抗菌剤と組合せて）中で局所投与の
ために調製され、そして点眼剤形態で投与され得る。溶液または懸濁液は、純粋
な形態で調製され、そして１日に数回投与され得る。あるいは、上記のように調
製される抗脈管形成組成物はまた、角膜に直接投与され得る。好ましい実施形態
において、抗脈管形成組成物は、角膜に結合する粘膜接着性ポリマーとともに調
製される。さらなる実施形態において、抗脈管形成因子または抗脈管形成組成物
は、従来のステロイド治療に対する補助剤として利用され得る。局所治療はまた
、脈管形成応答（例えば、化学的やけど）を誘導する高い可能性を有することが
知られる角膜病変において予防的に有用であり得る。これらの場合において、処
置（たいてい、ステロイドと組み合わされる）は、その後の合併症を予防するの
を補助するためにすぐに開始され得る。
【０６９９】 １つの実施形態において、上記の化合物は、角膜支質に直接、顕微鏡の案内の
下で眼科医によって注射され得る。好ましい注射部位は、個々の病巣の形態で変
化し得るが、投与の目標は、脈管構造の前進している面に組成物を置くこと（す
なわち、血管と正常な角膜との間に分散される）である。ほとんどの場合におい
て、これは、前進している血管から角膜を「防御」するための縁周囲（ｐｅｒｉ
ｌｉｍｂｉｃ）角膜注射を含む。この方法はまた、角膜新生血管形成を予防的に
防ぐために、角膜傷害の直後に利用され得る。この状況において、この物質は、
角膜病巣とその所望されない潜在的な縁血液供給との間に分散させて、縁周囲角
膜に注射され得る。このような方法はまた、類似の様式で、移植された角膜の毛
細血管浸潤を予防するために利用され得る。徐放形態において、注射は、１年に
２〜３回のみ必要とされ得る。ステロイドもまた、注射溶液に添加され、その注
射自体から生じる炎症を低減し得る。
【０７００】 本発明の別の局面において、患者に、血管の形成を阻害するように、治療有効
量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニス
トを眼に投与する工程を包含する、血管新生緑内障を処置するための方法が提供
される。１つの実施形態において、化合物は、血管新生緑内障の早期形態を処置
するために、眼に局所投与され得る。他の実施形態において、化合物は、前房角
（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｈａｍｂｅｒ ａｎｇｌｅ）の領域に注射によって移植
され得る。他の実施形態において、化合物はまた、化合物が眼房水に連続的に放
出されるように、任意の位置に置かれ得る。本発明の別の局面において、患者に
、血管の形成が阻害されるように、治療有効量のポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを眼に投与する工程を包含する、
増殖性糖尿病網膜症を処置するための方法が提供される。
【０７０１】 本発明の特に好ましい実施形態において、増殖性糖尿病網膜症は、網膜におけ
るポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニスト
の局所濃度を増加させるために、眼房水または硝子体への注射によって処置され
得る。好ましくは、この処置は、光凝固を必要とする重篤な疾患の獲得の前に開
始されるべきである。
【０７０２】 本発明の別の局面において、患者に、血管の形成が阻害されるように、治療有
効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニ
ストを眼に投与する工程を包含する、水晶体後線維増殖症を処置するための方法
が提供される。化合物は、硝子体内注射を介して、および／または眼内移植を介
して局所投与され得る。
【０７０３】 さらに、このポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはア
ゴニストで処置され得る障害としては、以下が挙げられるが、それらに限定され
ない：血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム性プラーク、遅延型創傷
治癒、顆粒化、血友病性関節、過形成性瘢痕、偽関節骨折、オースラー−ウェー
バー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、
および血管接着。
【０７０４】 さらに、このポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはア
ゴニストで処置され得る障害および／または状態としては、以下が挙げられるが
、それらに限定されない：固形腫瘍、血液関連（ｂｌｏｏｄ ｂｏｒｎ）腫瘍（
例えば、白血病）、腫瘍転移、カポージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神
経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、乾
癬、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角
膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞
腫、およびブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ））、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、脈
管形成、顆粒化、過形成性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラコーマ
、血管接着、心筋の新脈管形成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔ
ｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新脈管形成、オースラー−
ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群、プラーク新生血管形成、毛細
血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆粒化、クロ
ーン病、アテローム性動脈硬化症、産児制限薬剤（月経を制御する、胎芽着床の
ために必要な血管新生を予防することによる）、病原性の結果（例えば、ネコ引
っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅ
ｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、バルトネラ症および細菌性血管腫症状
）として新脈管形成を有する疾患。
【０７０５】 産児制限方法の１つの局面において、胎芽着床をブロックするに十分な化合物
の量は、性交および受精が起こる前またはその後に投与され、従って産児制限の
有効な方法、おそらく「事後用」方法を提供する。ポリヌクレオチド、ポリペプ
チド、アゴニストおよび／またはアゴニストはまた、月経を制御することにおい
て使用され得るか、または子宮内膜症の処置における腹膜洗浄液として、もしく
は腹膜移植のためのいずれかで投与され得る。
【０７０６】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニ
ストは、縫合（ｓｔｉｔｃｈ）肉芽腫を予防するために、外科縫合に組み込まれ
得る。
【０７０７】 ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストは、
広範な種々の外科手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの局面にお
いて、組成物（例えば、スプレーまたはフィルムの形態）は、悪性組織から正常
な周囲の組織を分離するため、そして／または周囲の組織への疾患の広がりを予
防するために、腫瘍の除去の前に、領域をコートまたはスプレーするために利用
され得る。本発明の他の局面において、組成物（例えば、スプレーの形態）は、
腫瘍をコートするため、または所望の場所において新脈管形成を阻害するために
、内視鏡手順を介して送達され得る。本発明のなお他の局面において、本発明の
抗脈管形成組成物でコートされている外科メッシュが、外科メッシュが利用され
得る任意の手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの実施形態におい
て、抗脈管形成組成物を有した外科メッシュは、構造に対する支持を提供するた
め、そして一定の量の抗脈管形成因子を放出するために、腹部癌切除手術の間（
例えば、結腸切除の後）に利用され得る。
【０７０８】 本発明のさらなる局面において、腫瘍切除部位での癌の局所的再発および新し
い血管の形成が阻害されるように、切除後にポリヌクレオチド、ポリペプチド、
アゴニストおよび／またはアゴニストを腫瘍の切除縁に投与する工程を包含する
、腫瘍切除部位を処置するための方法が提供される。本発明の１つの実施形態に
おいて、抗脈管形成化合物は、腫瘍切除部位に直接投与される（例えば、塗布、
ブラッシング（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）、または他の方法で抗脈管形成化合物で腫瘍
の切除縁をコートすることによって適用される）。あるいは、抗脈管形成化合物
は、投与前に公知の外科ペーストに組み込まれ得る。本発明の特に好ましい実施
形態において、抗脈管形成化合物は、悪性疾患についての肝切除後および神経外
科手術後に適用される。
【０７０９】 本発明の１つの局面において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト
および／またはアゴニストは、広範な種々の腫瘍（例えば、乳房腫瘍、結腸腫瘍
、脳腫瘍および肝腫瘍を含む）の切除縁に投与され得る。例えば、本発明の１つ
の実施形態において、抗脈管形成化合物は、切除後の神経学的腫瘍の部位に、そ
の部位での新しい血管の形成が阻害されるように投与され得る。
【０７１０】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニ
ストはまた、他の脈管形成因子とともに投与され得る。他の抗脈管形成因子の代
表的な例としては以下が挙げられる：抗侵襲性因子、レチノイン酸およびその誘
導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビタ
ー、メタロプロテイナーゼ−２の組織インヒビター、プラスミノーゲン活性化因
子−１、プラスミノーゲン活性化因子−２および種々の形態のより軽い「ｄ群」
遷移金属。
【０７１１】 より軽い「ｄグループ」遷移金属には、例えばバナジウム、モリブデン、タン
グステン、チタン、ニオブおよびタンタル種が挙げられる。そのような遷移金属
種は、遷移金属錯体を形成し得る。上述の遷移金属種の適切な錯体には、オキソ
遷移金属錯体が挙げられる。
【０７１２】 バナジウム錯体の代表的な例としては、バナデート錯体およびバナジル錯体の
ようなオキソバナジウム錯体が挙げられる。適切なバナデート錯体としては、例
えばメタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウムおよびオルトバナ
ジン酸ナトリウムのようなメタバナデート錯体およびオルトバナデート錯体が挙
げられる。適切なバナジル錯体としては、バナジルアセチルアセトネートおよび
硫酸バナジル（硫酸バナジル一水和物および硫酸バナジル三水和物のような硫酸
バナジル水和物を含む）が挙げられる。
【０７１３】 タングステン錯体およびモリブデン錯体の代表的な例としてはまた、オキソ錯
体が挙げられる。適切なオキソタングステン錯体としては、タングステート錯体
およびタングステンオキシド錯体が挙げられる。適切なタングステート錯体とし
ては、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン
酸ナトリウム二水和物およびタングステン酸が挙げられる。適切なタングステン
オキシドとしては、タングステン（ＩＶ）オキシドおよびタングステン（ＶＩ）
オキシドが挙げられる。適切なオキソモリブデン錯体としては、モリブデート、
モリブデンオキシドおよびモリブデニル錯体が挙げられる。適切なモリブデート
錯体としては、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナト
リウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙
げられる。適切なモリブデンオキシドとしては、モリブデン（ＶＩ）オキシド、
モリブデン（ＶＩ）オキシドおよびモリブデン酸が挙げられる。適切なモリブデ
ニル錯体としては、例えばモリブデニルアセチルアセトネートが挙げられる。他
の適切なタングステン錯体およびモリブデン錯体としては、例えばグリセロール
、酒石酸および糖由来のヒドロキソ誘導体が挙げられる。
【０７１４】 広範な種々の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の状況において利用され得る
。代表的な例としては、血小板第４因子；硫酸プロタミン；硫酸化（ｓｕｌｐｈ
ａｔｅｄ）キチン誘導体（ズワイガニ（ｑｕｅｅｎ ｃｒａｂ）の甲羅から調製
される）（Ｍｕｒａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：２２〜２６、１９９
１）；硫酸化ポリサッカライドペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化
合物の機能は、エストロゲンのようなステロイドおよびクエン酸タモキシフェン
の存在によって増強され得る）；スタウロスポリン；マトリクス代謝のモジュレ
ーター（例えば、プロリンアナログ、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４
−デヒドロプロリン、チアプロリン、α，α−ジピリジル、アミノプロピオニト
リルフマレートが挙げられる）；４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（
３Ｈ）−オキサゾロン；メトトレキサート；ミトザントロン；ヘパリン；インタ
ーフェロン；２マクログロブリン−血清；ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、
Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７３２１−１７３２６，１９９２）；キモス
タチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２８６：４７５−４８０
，１９９２）；シクロデキストリンテトラデカスルフェート；エポネマイシン（
Ｅｐｏｎｅｍｙｃｉｎ）；カンプトテシン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）；フマ
ギリン（Ｉｎｇｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５５−５５７，１９９０）
；チオリンゴ酸金ナトリウム（「ＧＳＴ」；ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ
，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０−１４４６，１９８７）；抗コ
ラーゲナーゼ−血清；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６２（４）：１６５９−１６６４，１９８７）；ビサントレン（Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリット二ナトリ
ウム（Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸（ｃｈｌｏ
ｒｏａｎｔｈｒｏｎｉｌｉｃ ａｃｉｄ）二ナトリウムまたは「ＣＣＡ」；Ｔａ
ｋｅｕｃｈｉら、Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ ３６：３１２−３１６，１９
９２）；サリドマイド；アンゴスタティックステロイド（Ａｎｇｏｓｔａｔｉｃ
ｓｔｅｒｏｉｄ）；ＡＧＭ−１４７０；カルボキシンアミノルミダゾール（ｃ
ａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｍｉｄａｚｏｌｅ）；およびメタロプロテイナーゼ
インヒビター（例えば、ＢＢ９４）。
【０７１５】 （細胞レベルでの疾患） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはアンタゴニス
トもしくはアゴニストによって処置または検出され得る細胞生存の増大あるいは
アポトーシスの阻害に関連する疾患には、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３
変異を有する癌腫、およびホルモン依存性腫瘍、これらは以下：結腸癌、心臓性
腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸の癌、精巣癌
、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細
胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫および卵巣癌を
含むが、これらに限定されない）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェ
ーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ
’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスお
よび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）およびウイルス感染（例え
ば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、対宿
主性移植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶、が挙げられる。好ま
しい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およ
び／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、特に上記に列挙される、癌の
増殖、進行、および／または転移（ｍｅｔａｓｉｓ）を阻害するために使用され
る。
【０７１６】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストによって処置あるいは検出され得る細胞生存の増大に関連するさ
らなる疾患または状態には、以下のような悪性疾患ならびに関連する障害の進行
および／または転移が挙げられるが、これらに限定されない：白血病（急性白血
病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性
、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）ならびに慢性白血病（例
えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤
血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄
腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固形腫瘍（
肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉
腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リ
ンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、
横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細
胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気
管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、
ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣の腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神
経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体
腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ
）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）を含むが、これらに限定され
ない）。
【０７１７】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストによって処置あるいは検出され得るアポトーシスの増大
に関連する疾患には、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、ア
ルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変
性および脳腫瘍または以前に関連した疾患）；自己免疫障害（例えば、多発性硬
化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂ
ｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマ
トーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常
症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性傷害（心筋梗塞
、発作および再灌流傷害によって生じるようなもの）、肝臓傷害（例えば、肝炎
関連肝臓傷害、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆
管傷害）および肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコールによって生じるよう
なもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。
【０７１８】 （創傷治癒および上皮細胞増殖） 本発明のなおさらなる局面に従って、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストを、治療目的のた
め、例えば、創傷治癒の目的のために上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを
刺激するため、ならびに毛包産生および皮膚創傷の治癒を刺激するために、利用
するためのプロセスが提供される。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、以下を含む創傷治癒を刺激す
ることにおいて臨床的に有用であり得る：外科的創傷、切除の創傷、深い創傷（
真皮および表皮の損傷を含む）、眼組織の創傷、歯の組織の創傷、口腔の創傷、
糖尿病性潰瘍、皮膚の潰瘍、肘の潰瘍、動脈性の潰瘍、静脈うっ滞潰瘍、熱への
曝露または化学物質による熱傷、および他の異常な創傷治癒状態（例えば、尿毒
症、栄養失調、ビタミン欠乏、ならびにステロイド、放射能療法および抗腫瘍性
薬物および代謝拮抗物質を用いる全身性処置に関連する合併症。本発明のポリヌ
クレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴ
ニストは、皮膚の欠失に続く皮膚の回復を促進するために使用され得る。
【０７１９】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、創傷床（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）への皮膚移植片の付
着を増大するため、および創傷床からの再上皮形成を刺激するために使用され得
る。以下は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、アゴニストまたは
アンタゴニストが創傷床への付着を増大するために使用され得る、移植片の非網
羅的な列挙である：自家移植片、人工皮膚、同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）
、自己植皮片、自己表皮移植片（ａｕｔｏｅｐｄｅｒｍｉｃ ｇｒａｆｔ）、無
血管性（ａｖａｃｕｌａｒ）移植片、ブレア−ブラウン移植片、骨移植片、胚胎
組織移植片、真皮移植片、遅延移植片、皮膚移植片、表皮移植片、筋膜移植片、
全層皮膚移植片、異種移植片（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、異種
移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）、同種移植片（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａｆ
ｔ）、増殖性移植片、層板状の移植片、網状移植片、粘膜移植片、オリエ−ティ
ールシュ移植片、大網移植片（ｏｍｅｎｐａｌ ｇｒａｆｔ）、パッチの移植片
、茎状移植片、全層移植片（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｇｒａｆｔ）、分層植皮
片、分層皮膚移植片。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および
／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、皮膚の強度を助長するため、お
よび高齢の皮膚の外見を改善するために使用され得る。
【０７２０】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストはまた、肝細胞増殖、および肺、乳房、膵臓、胃、小腸
（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｇ）、および大腸における上皮細胞増殖におけ
る変化を生じると考えられる。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド
、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、上皮細胞（例えば、皮
脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、毛包、肝実質細胞、肺胞上皮細胞ＩＩ型（ｔｙｐ
ｅ ＩＩ ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅ）、ムチン産生杯細胞、および他の上皮細胞、
ならびに皮膚、肺、肝臓、および胃腸管内に含まれるそれらの先祖）の増殖を促
進し得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストは、内皮細胞、ケラチノサイト、および基底ケ
ラチノサイトの増殖を促進し得る。
【０７２１】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストはまた、照射、化学療法処置またはウイルス感染から生
じる腸の毒性の副作用を低減するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは
、小腸粘膜上で細胞保護的な効果を有し得る。本発明のポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、化
学療法およびウイルス感染から生じる粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）（口潰瘍）
の治癒を刺激し得る。
【０７２２】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、熱傷を含む、完全なおよび部分的な厚さの皮膚欠損
における皮膚の十分な再生（すなわち、毛包、汗腺、および皮脂腺の再増殖）、
乾癬のような他の皮膚欠損の処置においてさらに使用され得る。本発明のポリヌ
クレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴ
ニストは、表皮水疱症（これらの損傷の再上皮形成を促進することによる頻繁な
開放性かつ疼痛性の水疱を生じる、下層の真皮に対する表皮の接着における欠損
）を処置するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、胃潰瘍および
十二指腸潰瘍を処置し、そして粘膜の内層の瘢痕形成ならびにより迅速な腺の粘
膜および十二指腸の粘膜の内層の再生による治癒を助けるために使用され得る。
炎症性腸疾患（例えば、クーロン病および潰瘍性大腸結腸炎）は、それぞれ、小
腸または大腸の粘膜表面の崩壊を生じる疾患である。従って、本発明のポリヌク
レオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニ
ストは、粘膜表面の再表面形成（ｒｅｓｕｌｆａｃｉｎｇ）を促進して、より迅
速な治癒を助けるため、および炎症性腸疾患の進行を予防するために、使用され
得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニ
ストもしくはアンタゴニストを用いる処置は、胃腸管全体の粘液の産生に対して
有意な効果を有することが予測され、そして腸粘膜を、摂取されたか有害な物質
から保護するためまたは外科手術後に使用され得る。本発明のポリヌクレオチド
もしくはポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、
本発明のポリヌクレオチドの発現下に関連する疾患を処置するために使用され得
る。
【０７２３】 さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストは、種々の病的状態に起因する肺への損傷を予
防および治癒するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストのような増殖因子
は、急性または慢性の肺損傷を予防または処置するために、増殖および分化を刺
激し得、そして肺胞および細気管支（ｂｒｏｃｈｉｏｌａｒ）上皮の修復を促進
し得る。例えば、肺胞（ａｖｅｏｌｉ）の進行性の損失を生じる気腫、および細
気管支上皮および肺胞の壊死を生じる吸入傷害（すなわち、煙の吸入および熱傷
から生じる）は、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／ま
たはアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して効果的に処置され得る。また
、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、肺胞上皮細胞ＩＩ型の増殖および分化を刺激するた
めに使用され得、これは、未熟な乳児における硝子膜疾患（例えば、乳児呼吸窮
迫症候群および気管支肺異形成症）のような疾患を処置または予防することを助
け得る。
【０７２４】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、肝実質細胞の増殖および分化を刺激し得、そして従
って、肝臓疾患および病状（例えば、肝硬変により生じる劇症肝不全、肝炎ウイ
ルスおよび毒性物質（すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素（ｃａｒｂｏ
ｎ ｔｅｔｒａｈｏｌｏｒｉｄｅ）、および他の当該分野で公知の肝臓毒素）に
より生じる肝臓損傷）を緩和または処置するために用いられ得る。
【０７２５】 さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストは、真性糖尿病の発症を処置または予防するた
めに使用され得る。新たにＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病と診断された患者にお
て、いくつかの島細胞機能が残っている場合、本発明のポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、その疾
患の永続する発現を緩和、遅延または予防するように、その島機能を維持するた
めに使用され得る。また、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、お
よび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、島細胞機能を改善または促
進するための島細胞移植における補助として使用され得る。
【０７２６】 （感染性疾患） 本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、感染因子を処置または検出するために用いられ得る
。例えば、免疫応答を上昇させることによって、特にＢ細胞および／またはＴ細
胞の増殖および分化を増加させることによって、感染性疾患が処置され得る。免
疫応答は、既存の免疫応答を上昇させるか、または新たな免疫応答を開始させる
かのいずれかにより上昇され得る。あるいは、本発明のポリペプチドもしくはポ
リヌクレオチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、必
ずしも免疫応答を誘発することなく、感染因子を直接阻害し得る。
【０７２７】 ウイルスは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／また
はアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置または検出され得る疾患または
症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤ
ＮＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス科が挙げられるがそれらに限定され
ないウイルスの例を含むがそれらに限定されない：アルボウイルス、アデノウイ
ルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイ
ルス科、カルシウイルス科、サルコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、
コロナウイルス科、デング、ＥＢＶ、ＨＩＶ、フラビウイルス科、ヘパドナウイ
ルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘ
ルペス、帯状ヘルペス）、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（
例えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミ
クソウイルス科（例えば、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、およびパライ
ンフルエンザ）、パピローマウイルス（Ｐａｐｉｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、パポ
バウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（
例えば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、
レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、および
トガウイルス科（例えば、ルビウイルス）。これらの科内に入るウイルスは、以
下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：関節
炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、ＲＳウイルス、脳炎、眼性
感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型
、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、日本脳炎、フニン、チクングニヤ、リフトバレ
ー熱、黄熱病、髄膜炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキット
リンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病
、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染病、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）
、およびウイルス血症。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、また
はアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、任意のこれらの症状または疾患
が処置または検出され得る。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチ
ド、ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、以下を処置す
るために使用される：髄膜炎、デング、ＥＢＶ、および／または肝炎（例えば、
Ｂ型肝炎）。さらなる特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポ
リペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、１以上の他の市販の
肝炎ワクチンに対して非応答性の患者を処置するために使用される。さらなる特
定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴ
ニストもしくはアンタゴニストは、ＡＩＤＳを処置するために使用される。
【０７２８】 同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつ本発明のポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストによって
処置または検出され得る細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下のグラム陰性お
よびグラム陽性の細菌および細菌科および真菌類を含むがこれらに限定されない
：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃ
ｅａｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔｅｒｏ
ｉｄａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒ
ｒｅｌｉａ（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅ
ｌｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｃ
ｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｄｅｒｍａ
ｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、エンテロトキシン産生性（Ｅｎｔ
ｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ、および腸出血性Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅ
ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、およびＳａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、Ｅｒｙ
ｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓ
ｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ
ｔａｌｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈ
ｏｌｅｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａの感染症（例えば
、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、Ｈｅａｍ
ｏｐｈｉｌｕｓインフルエンザＢ型）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、
Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａ
ｌ、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃａｌ、ＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌおよびＳｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃａｌ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅおよびＢ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。これらの細菌または真菌の科は
、以下を含むがこれらに限定されない以下の疾患または症状を引き起こし得る：
菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感
染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症
、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血症、ライム病
、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜
炎（例えば、髄膜炎Ａ型およびＢ型）、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ライ病
、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱
、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃ
ｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。本発明のポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチド、アゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、任意の
これらの症状もしくは疾患を処置または検出し得る。特定の実施形態において、
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストは
、以下を処置するために使用される：破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒およ
び／または髄膜炎Ｂ型。
【０７２９】 さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストにより処置または検出され得る疾患あるいは症
状を引き起こす寄生生物性因子としては以下のファミリーまたはクラスが挙げら
れるがこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリ
プトスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交
疫、外部寄生生物症（Ｅｃｔｏｐａｒａｓｉｔｉｃ）、ジアルジア鞭毛虫症、蠕
虫症、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症
、ならびにトリコモナスおよび胞子虫（例えば、三日熱マラリア原虫、熱帯熱マ
ラリア原虫、四日熱マラリア原虫および卵形マラリア原虫）。これらの寄生生物
は、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る
：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫
症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、
妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、任意のこれらの
症状または疾患を処置あるいは検出し得る。特定の実施形態において、本発明の
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは
、マラリアを処置するために使用される。
【０７３０】 好ましくは、本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、および／また
はアゴニストもしくはアンタゴニストを用いる処置は、患者に有効量のポリペプ
チドを投与するか、または患者から細胞を取り出して、本発明のポリヌクレオチ
ドをこの細胞に供給し、そして患者に操作した細胞を戻す（エキソビボ治療）か
のいずれかによるものであり得る。さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌ
クレオチドはワクチン中の抗原として用いられて、感染性疾患に対する免疫応答
を惹起し得る。
【０７３１】 （再生） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストを用いて、細胞を分化させ、増殖させ、そして誘引して
、組織の再生を導き得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：５９−８７（１９９７）を
参照のこと）。組織の再生を用いて、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、ま
たは潰瘍）、加齢、疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性関節炎（ｏｓｔｅｏｃａｒ
ｔｈｒｉｔｉｓ）、歯周病、肝不全）、美容形成手術を含む手術、線維症、再灌
流傷害、もしくは全身性サイトカイン損傷により損傷を受けた組織を修復、置換
、または保護し得る。
【０７３２】 本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる：器官（例えば、
膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、
脈管系（脈管およびリンパを含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱、
および靭帯）の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減されて
生じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。
【０７３３】 さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストは、治癒するのが困難な組織の再生を増加し得
る。例えば、腱／靭帯再生を増大させることによって、損傷後の回復時間が早ま
る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニス
トもしくはアンタゴニストはまた、損傷を回避する試みにおいて予防的に使用さ
れ得る。処置され得る特定の疾患は、腱炎、手根管症候群、および他の腱欠損ま
たは靭帯欠損を含む。非治癒創傷の組織再生のさらなる例は、圧迫性潰瘍（ｐｒ
ｅｓｓｕｒｅ ｕｌｃｅｒ）、ならびに脈管不全、外科的創傷、および外傷性創
傷に関連する潰瘍を含む。
【０７３４】 同様に、神経および脳組織もまた、神経細胞を増殖および分化させるために本
発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニストもし
くはアンタゴニストを使用することによって再生され得る。本方法を用いて処置
され得る疾患は、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患、神経障害、または機械
的および外傷性障害（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および発作（
ｓｔｏｋｅ））を含む。詳細には、末梢神経傷害と関連する疾患、末梢神経障害
（例えば、化学療法または他の医学的療法から生じる）、局在神経障害、および
中枢神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病
、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群）はすべて、本発明の
ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはア
ンタゴニストを用いて処置され得る。
【０７３５】 （走化性） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、細胞（例え
ば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞、および
／または内皮細胞）を、身体中の特定の部位（例えば、炎症、感染、または過剰
増殖の部位）に誘引または動員する。次いで、動員された細胞は、特定の外傷ま
たは異常性を撃退および／または治癒し得る。
【０７３６】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、特定の細胞の走化性活性を増大し得る。次いで、こ
れらの走化性分子を使用して、身体中の特定の位置に標的化した細胞の数を増加
させることによって、炎症、感染、過剰増殖性障害、または任意の免疫系障害を
処置し得る。例えば、走化性分子を使用して、傷害を受けた位置に免疫細胞を誘
引することによって、組織に対する創傷および他の外傷を処置し得る。本発明の
走化性分子はまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を処置するために使用さ
れ得る。
【０７３７】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストが走化性活性を阻害し得ることもまた意図される。これ
らの分子はまた、障害を処置するために使用され得る。従って、本発明のポリヌ
クレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴ
ニストは、走化性のインヒビターとして使用され得る。
【０７３８】 （結合活性） 本発明のポリペプチドは、ポリペプチドに結合する分子、またはポリペプチド
が結合する分子をスクリーニングするために使用され得る。ポリペプチドと分子
との結合は、結合したポリペプチドまたは分子の活性を活性化（アゴニスト）、
増大、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。そのような分子の例とし
ては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、レセプター）、または
低分子が挙げられる。
【０７３９】 好ましくは、分子は、ポリペプチドの天然のリガンド（例えば、リガンドのフ
ラグメント）、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物、もしくは機能的模
倣物に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）： 第５章（１９９１）を参照のこ
と）。同様に、分子は、ポリペプチドが結合する天然のレセプター、または少な
くともポリペプチドによって結合され得るレセプターのフラグメント（例えば、
活性部位）に密接に関連し得る。いずれの場合においても、分子は、公知の技術
を用いて合理的に設計され得る。
【０７４０】 好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、ポリペプチドを、分
泌タンパク質としてか、または細胞膜上でのいずれかで発現する適切な細胞を産
生する工程を包含する。好ましい細胞としては、哺乳動物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐ
ｈｉｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる。次いで、ポリペプチド
を発現する細胞（または、発現されたポリペプチドを含む細胞膜）は、好ましく
は、ポリペプチドまたは分子のいずれかの結合、刺激、または活性の阻害を観察
するための分子を含む可能性のある試験化合物と接触される。
【０７４１】 アッセイは、ポリペプチドへの候補化合物の結合を簡単に試験し得、ここで結
合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセイにおい
て検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がポリペプチドへの結合によっ
て生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。
【０７４２】 あるいは、アッセイは、細胞を含まない調製物、固体支持体に接着されたポリ
ペプチド／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され
得る。アッセイはまた、ポリペプチドを含む溶液を候補化合物と混合する工程、
ポリペプチド／分子の活性または結合を測定する工程、およびポリペプチド／分
子の活性または結合を、標準と比較する工程を単に包含し得る。
【０７４３】 好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体を用いて、サンプル（例えば、生物学的サンプル）におけるポリペプチド
のレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、ポリペプチドへの直接的もしくは間
接的な結合のいずれか、またはポリペプチドとの基質についての競合によって、
ポリペプチドのレベルまたは活性を測定し得る。
【０７４４】 さらに、本発明のポリペプチドが結合するレセプターは、当業者に公知の多数
の方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳ選別（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２）、Ｃｈａｐ
ｔｅｒ ５，（１９９１））によって同定され得る。例えば、発現クローニング
が利用され、そこでは、ポリアデニル化ＲＮＡが、そのポリペプチドに対して応
答性の細胞（例えば、ＦＧＦファミリータンパク質についての複数のレセプター
を含有することが知られるＮＩＨ３Ｔ３細胞、およびＳＣ−３細胞）から調製さ
れ、そしてこのＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーが、プールに分けら
れ、そしてＣＯＳ細胞またはそのポリペプチドに対して応答性ではないその他の
細胞をトランスフェクトするために使用される。スライドガラス上で増殖される
トランスフェクトされた細胞は、標識された後に本発明のポリペプチドに曝露さ
れる。そのポリペプチドは、ヨウ素化、または部位特異的タンパク質キナーゼに
ついての認識部位の包入を含む種々の手段により標識され得る。
【０７４５】 固定化およびインキュベーションの後に、そのスライドをオートラジオグラフ
ィー分析にかける。陽性のプールを同定し、そしてサブプールを調製し、そして
反復的サブプーリングおよび再スクリーニングプロセスを使用して再トランスフ
ェクトされ、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生じる。
【０７４６】 レセプター同定のための代替のアプローチとして、標識されたポリペプチドは
、細胞膜、またはレセプター分子を発現する抽出物調製物に光親和性連結され得
る。架橋した材料は、ＰＡＧＥ分析によって分解され、そしてＸ線フィルムに曝
露される。そのポリペプチドのレセプターを含有するその標識した複合体は、切
り出され、ペプチドフラグメントへと分解され、そしてタンパク質ミクロシーク
エンシングに供され得る。ミクロシークエンシングによって得られたそのアミノ
酸配列は、縮重オリゴヌクレオチドプローブのセットを設計するために使用され
、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定レセプターをコードする遺伝
子を同定する。
【０７４７】 さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフ
リング、および／またはコドンシャッフリング（集合的に、「ＤＮＡシャッフリ
ング」と呼ばれる）の技術は、本発明のポリペプチドの活性を調節するために利
用され得、それにより効果的に、本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアン
タゴニストを生成する。一般には、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，
８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、お
よび同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ
．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈ
ａｒａｙａｍａ，Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６
−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２
８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢ
ｌａｓｃｏ，Ｒ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（
１９９８）を参照のこと（これらの各々の特許および刊行物が、本明細書中に参
考として援用される）。１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドお
よび対応するポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る
。ＤＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、２つ以
上のＤＮＡセグメントを、本発明の分子の所望のポリヌクレオチド配列に構築す
ることを含む。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドおよび対応す
るポリペプチドは、組換え前に、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ
、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法により、ランダムな変異誘発に供さ
れることによって改変され得る。別の実施形態において、本発明のポリペプチド
の１つ以上の成分、モチーフ、区切り（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フ
ラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、区切り（
ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。好
ましい実施形態において、この異種分子は、ファミリーメンバーである。さらに
好ましい実施形態において、この異種分子は、例えば、血小板由来増殖因子（Ｐ
ＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスホーミング増殖因子
（ＴＧＦ）−α、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｔ
ＧＦ−β、骨形態（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ）タンパク質（ＢＭ
Ｐ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７．アクチビン（ａ
ｃｔｉｖｉｎ）ＡおよびＢ、デカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅ
ｇｉｃ）（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２、ドルサリン（ｄｏｒｓａｌｉｎ）、増
殖分化因子（ＧＤＦ）、結節（ｎｏｄａｌ）、ＭＩＳ、インヒビン−α、ＴＧＦ
−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５、および神経膠由来神経栄
養因子（ＧＤＮＦ）のような増殖因子である。
【０７４８】 他の好ましいフラグメントは、本発明のポリペプチドの生物学的に活性なフラ
グメントである。生物学的に活性なフラグメントは、このポリぺプチドの活性に
類似の活性を示すが、必ずしも同一である必要はないフラグメントである。フラ
グメントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または減少された所望され
ない活性を含み得る。
【０７４９】 さらに、本発明は、本発明のポリペプチドの作用を調節する化合物を同定する
ために化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイの例は
、哺乳動物線維芽細胞、本発明のポリペプチド、スクリーニングされるべき化合
物および３[Ｈ]チミジンを、線維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で合わせ
る工程を包含する。コントロールアッセイは、スクリーニングされるべき化合物
の非存在下で実施され得、そしてこの化合物の存在下での線維芽細胞の増殖の量
と比較して、各々の場合における３[Ｈ]チミジンの取り込みの決定によって、こ
の化合物が増殖を刺激するか否かを決定し得る。線維芽細胞の増殖の量は、３[
Ｈ]チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーに
よって測定される。アゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物の両方が、こ
の手順により同定され得る。
【０７５０】 別の方法において、本発明のポリペプチドに対するレセプターを発現する哺乳
動物細胞または膜調製物は、この化合物の存在下において標識化した本発明のポ
リペプチドとともにインキュベートされる。次いで、この化合物がこの相互作用
を増強またはブロックする能力が、測定され得る。あるいは、スクリーニングさ
れるべき化合物の相互作用に従う既知のセカンドメッセンジャー系の応答および
レセプターが測定され、そしてこの化合物がこのレセプターに結合し、そしてセ
カンドメッセンジャー応答を誘発する能力を測定して、この化合物が潜在的なア
ゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する。このようなセカンドメ
ッセンジャー系には、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルまたはホ
スホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７５１】 これらの上記のアッセイの全ては、診断マーカーまたは予後マーカーとして使
用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、ポリペプチド／分子
を活性化または阻害することによって、疾患を処置するか、または患者における
特定の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用され得る。さらに、アッ
セイは、適切に操作された細胞または組織からの本発明のポリペプチドの産生を
阻害または増強し得る薬剤を発見し得る。従って、本発明は、以下の工程を含む
本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定する方法を包含する：（ａ）候補
結合化合物をこのポリペプチドとともにインキュベートする工程；および（ｂ）
結合が生じたか否かを決定する工程。さらに、本発明は、以下の工程を含むアゴ
ニスト／アンタゴニストを同定する方法を包含する：（ａ）候補化合物をこのポ
リペプチドとともにインキュベートする工程、（ｂ）生物学的活性をアッセイす
る工程、および（ｂ）このポリペプチドの生物学的活性が改変されているか否か
を決定する工程。
【０７５２】 また、当業者は、タンパク質のポリペプチド配列に含まれるβプリーツシート
領域を用いることにより実験的に、本発明のポリペプチドを結合する分子を同定
し得る。従って、本発明の特定の実施形態は、開示されたポリペプチド配列にお
ける各βプリーツシート領域のアミノ酸配列を含む（あるいは、このアミノ酸配
列からなる）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のさ
らなる実施形態は、本発明のポリペプチド配列に含まれる任意の組み合わせまた
は全てを含む（あるいは、それらからなる）ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドに関する。本発明のさらなる好ましい実施形態は、本発明のポリペプチ
ド配列のうちの１つにおけるβプリーツシート領域の各々のアミノ酸配列を含む
（あるいは、そのアミノ酸配列からなる）ポリペプチドに関する。本発明のさら
なる実施形態は、本発明のポリペプチド配列のうちの１つにおけるβプリーツシ
ート領域の任意の組み合わせまたは全てを含む（あるいは、それらからなる）ポ
リペプチドに関する。
【０７５３】 （標的化された送達） 別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドについてのレセプタ
ーを発現する標的とされた細胞、または本発明のポリペプチドの細胞結合形態を
発現する細胞に、組成物を送達する方法を提供する。
【０７５４】 本明細書中で議論されるように、本発明のポリペプチドまたは抗体は、疎水性
相互作用、親水性相互作用、イオン相互作用および／または共有結合相互作用に
よって、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグと会合し得る
。
【０７５５】 １つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合する
本発明のポリペプチド（抗体を含む）を投与することによって、本発明の組成物
を細胞に特異的に送達する方法を提供する。１つの例において、本発明は、治療
的タンパク質を標的とされた細胞に送達するための方法を提供する。別の例にお
いて、本発明は、１本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または
二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムへと組み込まれ得るか、またはエピソームと
して複製され得、そして転写され得るＤＮＡ）を標的とされた細胞に送達する方
法を提供する。
【０７５６】 別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、本発明の
ポリペプチドまたは本発明の抗体）を、毒素または細胞傷害性プロドラッグと共
同して投与することによる、細胞の特異的分布のため（例えば、腫瘍細胞の破壊
）の方法を提供する。
【０７５７】 「毒素」により、内因性細胞傷害性エフェクター系を結合および活性化させる
化合物、放射性同位体、ホロ毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変毒素、毒素の触
媒サブユニット、または任意の酵素もしくは酵素が、細胞死を引き起こす規定さ
れた条件下にある細胞に通常は存在しないか、または通常は細胞の表面に存在し
ない、任意の分子または酵素を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒
素としては、当該分野で公知の放射性同位体、例えば、固有もしくは誘導された
内因性細胞傷害性エフェクター系を結合する抗体のような化合物（またはその補
体結合含有部分）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡアーゼ、α
毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、
サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇ
ｅｌｏｎｉｎ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓａ
ｒｃｉｎ）およびコレラ毒素が挙げられるが、これらに限定されない。「細胞傷
害性プロドラッグ」により、細胞に通常存在するが、酵素により細胞傷害性化合
物へと変換される非毒性化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る
細胞傷害性プロドラッグは、安息香酸マスタードアルキル化剤のグルタミル誘導
体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシンアラビノシド
、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド誘導体が挙
げられるが、これらに限定されない。
【０７５８】 （薬物スクリーニング） 本発明のポリペプチドの活性を改変する分子についてスクリーニングするため
に、本発明のポリペプチドの使用、またはこれらのポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドの使用がさらに企図される。このような方法は、本発明のポリペ
プチドと、アンタゴニストまたはアゴニスト活性を有すると疑われる、選択され
た化合物とを接触させる工程、および結合の後に、これらのポリペプチドの活性
を測定する工程を包含する。
【０７５９】 本発明は、本発明のポリペプチドまたはその結合フラグメントを、任意の種々
の薬物スクリーニング技術において使用することにより、治療的化合物をスクリ
ーニングするために特に有用である。このような試験において使用されるポリペ
プチドまたはフラグメントは、固体支持体に固定され得るか、細胞表面に発現さ
れ得るか、溶液中で遊離し得るか、または細胞内で位置決定され得る。薬物スク
リーニングのための１つの方法は、このポリペプチドまたはフラグメントを発現
する組換え核酸で安定に形質転換された真核生物宿主細胞または原核生物宿主細
胞を利用する。薬物は、競合的結合アッセイにおいて、このような形質転換細胞
に対してスクリーニングされる。当業者は、例えば、試験される薬剤と本発明の
ポリペプチドとの間の複合体の処方物を測定する。
【０７６０】 従って、本発明は、本発明のポリペプチドにより媒介される、活性に影響を及
ぼす薬物または任意の他の薬剤についてスクリーニングする方法を提供する。こ
れらの方法は、このような薬剤と、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメン
トとを接触させる工程、および当該分野で周知の方法により、この薬剤とこのポ
リペプチドまたはそのフラグメントとの間の複合体の存在についてアッセイする
工程を包含する。このような競合的結合アッセイにおいて、スクリーニングされ
る薬剤は、代表的には標識される。インキュベーション後、遊離の薬剤は、結合
形態で存在するものから分離され、そして遊離または非複合体化標識の量は、特
定の薬剤が本発明のポリペプチドに結合する能力の尺度である。
【０７６１】 薬物スクリーニングのための別の技術は、本発明のポリペプチドに対する適切
な結合親和性を有する化合物についての高スループットスクリーニングを提供し
、そしてこのスクリーニングは、本明細書中に参考として援用される、欧州特許
出願第８４／０３５６４号（１９８４年９月１３日公開）に非常に詳細に記載さ
れている。簡単に述べると、多数の異なる低分子ペプチド試験化合物は固体基材
（例えば、プラスティックピンまたはある他の表面）上で合成される。このペプ
チド試験化合物は、本発明のポリペプチドと反応し、そして洗浄される。次いで
、結合したポリペプチドは、当該分野で周知の方法により検出される。精製され
たポリペプチドは、前述の薬物スクリーニング技術における使用のために直接プ
レートにコーティングされる。さらに、非中和抗体を用いて、この固体支持体上
でこのポリペプチドを捕捉し得、そしてこれを固定化し得る。
【０７６２】 本発明はまた、本発明のポリペプチドを結合し得る中和抗体が、このポリペプ
チドまたはそのフラグメントへの結合に関して試験化合物と特異的に競合する、
競合的薬物スクリーニングアッセイの使用を企図する。この様式において、抗体
を用いて、本発明のポリペプチドと１つ以上の抗原性エピトープを共有する任意
のペプチドの存在を検出する。
【０７６３】 （アンチセンスおよびリボザイム（アンタゴニスト）） 特定の実施形態において、本発明によるアンタゴニストは、配列番号Ｘに含ま
れる配列に対応する核酸もしくはその相補鎖および／または寄託されたクローン
に含まれるヌクレオチド配列である。１つの実施形態において、アンチセンス配
列は、生物体により内部で生成され、別の実施形態において、アンチセンス配列
は別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６
：５６０（１９９１）を参照のこと）。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１
９８８）。アンチセンス技術を使用して、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを通
してか、もしくは三重らせんの形成を通して遺伝子発現を制御し得る。アンチセ
ンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６：５６０（１９
９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎ
ｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）で議論される。三重ら
せん形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ、６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：４
５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３００
（１９９１）において議論される。これらの方法は、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ
へのポリヌクレオチドの結合に基づく。
【０７６４】 例えば、非リンパ球性白血病細胞株であるＨＬ−６０および他の細胞株の増殖
を阻害するためのｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｍｙｂアンチセンスＲＮＡ構築物の使用
は、以前に記載された（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（１９８８）；Ａｎｆｏｓｓｉら
（１９８９））。これらの実験は、このオリゴヌクレオチドとともに細胞をイン
キュベートすることによりインビトロで行われた。インビボでの使用のための同
様の手順は、ＷＯ９１／１５５８０に記載されている。簡潔には、所定のアンチ
センスＲＮＡについての１対のポリヌクレオチドを以下のように生成する：オー
プンリーディングフレームの最初の１５塩基に相補的な配列を、５末端部位上の
ＥｃｏＲ１部位および３末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接させる。次に、この対
のオリゴヌクレオチドを９０℃で１分間加熱し、次いで、２×連結緩衝液（２０
ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ジチ
オスレイトール（ＤＴＴ）および０．２ｍＭ ＡＴＰ）中でアニールし、次いで
、レトロウイルスベクターＰＭＶ７（ＷＯ９１／１５５８０）のＥｃｏＲ１／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ部位に連結する。
【０７６５】 例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コー
ド部分を用いて、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレ
オチドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領
域に相補的であるように設計され、これによりレセプターの転写および生成が妨
げられる。このアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡ
にハイブリダイズし、そしてレセプターポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳を
ブロックする。
【０７６６】 １つの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、外来の配列からの転
写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部は、転写され、
本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベクターは、本発
明のアンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターは、それが
転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生し得る限り、エピソームを保持し得
るか、または染色体に組込まれ得る。このようなベクターは、当該分野において
標準的な組換えＤＮＡ技術方法により構築され得る。ベクターは、脊椎動物細胞
において複製および発現のために使用される、プラスミド、ウイルスまたは当該
分野で公知の他のものであり得る。本発明のポリペプチドをコードする配列また
はそのフラグメントの発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用する
当該分野で公知の任意のプロモーターによってであり得る。そのようなプロモー
ターは、誘導性または構成性であり得る。このようなプロモーターとしては、Ｓ
Ｖ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔ
ｕｒｅ、２９：３０４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末
端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７
−７９７（１９８０））、ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８：１４４１−１４４
５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、
Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９−４２（１９８２））などが挙げられるが、これら
に限定されない。
【０７６７】 本発明のアンチセンス核酸は、少なくとも目的の遺伝子のＲＮＡ転写物の一部
に相補的な配列を含む。しかし、完全に相補的であることが好ましいが、必要で
はない。本明細書中でいわれる「少なくともＲＮＡの一部に相補的な」配列は、
ＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分相補性を有し、安定な二重鎖を形成する配
列を意味し；従って、本発明の二本鎖アンチセンス核酸の場合において、二重鎖
ＤＮＡの単一の鎖が試験され得るか、または三重鎖形成がアッセイされ得る。ハ
イブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に
依存し、一般的に、ハイブリダイズする核酸が大きいほど、それが含み得る本発
明のＲＮＡ配列とのより多くの塩基ミスマッチをともない、そしてなお安定な二
重鎖（または三重鎖の場合もあり得る）を形成し得る。当業者は、ハイブリダイ
ズ複合体の融解点を決定するために標準的な手順を使用することによりミスマッ
チの寛容の程度を確認し得る。
【０７６８】 メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開
始コドンまで、およびＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害
の際に最も効率的に働くべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補
的な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に効果を示した。一般的に、Ｗ
ａｇｎｅｒ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ、３７２：３３３−３３５（１９９４）を参照
のこと。従って、本発明ポリヌクレオチド配列の５’−または３’−の非翻訳領
域、非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性ｍＲＮＡ
の翻訳を阻害するアンチセンスアプローチに使用され得る。ｍＲＮＡの５’非翻
訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補物を含むべき
である。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻
訳のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明に従って使用され得る。
ｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域にハイブリダイズするように設
計されるか否かにかかわらず、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド
長であるべきであり、そして好ましくは６〜約５０ヌクレオチド長にわたるオリ
ゴヌクレオチドである。特定の局面において、このオリゴヌクレオチドは、少な
くとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレ
オチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０７６９】 本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはキメラ混合物、
あるいはその誘導体もしくは改変バージョン、一本鎖、または二本鎖であり得る
。このオリゴヌクレオチドは、例えば、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で
改変され、分子の安定性、ハイブリダーゼーションなどを改良し得る。このオリ
ゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビボにおいて宿
主細胞レセプターを標的化するために）、または細胞膜を通した輸送を促進する
因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８４：６４８−６５２（１９８７）
；１９８８年１２月１５日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を
参照のこと）、または血液脳関門（例えば、１９８８年４月２５日に公開された
ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）、ハイブリダイゼーション
誘発切断剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｃｌｅａｖａ
ｇｅ ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：
９５８−９７６（１９８８）を参照のこと）、またはインターカレート剤（例え
ば、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、５：５３９−５４９（１９８８）を参照の
こと）を含み得る。このために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペ
プチド、ハイブリダーゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション
誘発切断剤など）に結合体化され得る。
【０７７０】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された塩基部分を
含み得、この塩基部分は、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される
：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨー
ドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カル
ボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２
−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシ
ル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデ
ニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、
２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシ
トシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシ
ル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュー
オシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２
−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ
）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キュ
ーオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシ
ル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチル
エステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、
３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）
ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【０７７１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下を含むがそれらに限定されない
群から選択される少なくとも１つの改変糖部分を含み得る：アラビノース、２−
フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。
【０７７２】 さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を含
むがそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変リン酸骨格を
含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート
、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキル
ホスホトリエステル、およびホルムアセタールまたはそのアナログ。
【０７７３】 さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ−アノ
マーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的な
ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のｂ−ユニットとは反対に
、その鎖は互いに平行になる（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、１５：６６２５−６６４１（１９８７））。このオリゴヌクレオチドは、
２−０−メチルリボヌクレオチドであるか（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮＡ
−ＤＮＡアナログである（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７
−３３０（１９８７））。
【０７７４】 本発明のポリヌクレオチドは当該分野で公知の標準的な方法により（例えば、
自動ＤＮＡ合成機により（このような装置はＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されている）の使用による）合成され得
る。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：３２０９（１９８８））により合成さ
れ得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御化細孔ガラス（ｐｏｒｅ
ｇｌａｓｓ）ポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：７４４８−７４５１（１９８８））などの使用
により調製され得る。
【０７７５】 一方、本発明のコード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが、使用
され得、転写された非翻訳領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ま
しい。
【０７７６】 本発明による潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４
日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９
９０）を参照のこと）。一方、部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザ
イムを使用して、本発明のポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡを破壊し得るが
、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイム
は、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域により決定される位置で
、ｍＲＮＡを切断する。たった１つの必要条件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの
塩基の配列を有することである：５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッド型リボザイ
ムの構築および生成は当該分野で周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧ
ｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５−５９１（１９８８）により十分
に記載される。配列表に開示される各ヌクレオチド配列内に多くの潜在的なハン
マーヘッド型リボザイム切断部位が存在する。好ましくは、このリボザイムは、
切断認識部位が本発明のポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡの５’末端付近に
位置するように；すなわち、効率を増大し、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物の細
胞内蓄積を最小化するように、操作される。
【０７７７】 アンチセンスアプローチの場合、本発明のリボザイムは、改変されたオリゴヌ
クレオチド（例えば、安定性、標的化などについて改良された）から構成され得
、そしてインビボにおいて本発明のポリヌクレオチドを発現する細胞に送達され
るべきである。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするア
ンチセンスの導入のための上記と同じ様式において細胞中に導入され得る。送達
の好ましい方法は、強力な構成性プロモーター（例えば、ｐｏｌ ＩＩＩまたは
ｐｏｌ ＩＩプロモーターのような）の制御下で、リボザイムを「コードする」
ＤＮＡ構築物を使用することを含み、その結果トランスフェクトした細胞が内因
性メッセージを破壊し、そして翻訳を阻害するに十分な量のリボザイムを生成す
る。リボザイムはアンチセンス分子と異なり触媒性であるので、より低い細胞内
濃度が効率のために必要とされる。
【０７７８】 アンタゴニスト／アゴニスト化合物を利用して、新生物細胞および新生物組織
に対して本発明のポリペプチドの細胞成長および増殖効果を阻害し得る（すなわ
ち、腫瘍の脈管形成の刺激、従って、例えば、腫瘍形成または増殖における異常
な細胞成長および増殖を遅らせるか、または妨げる）。
【０７７９】 アンタゴニスト／アゴニストをまた使用して、血管過多の疾患を妨げ得、そし
て水晶体嚢外（ｅｘｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）白内障手術後に上皮水晶体細胞の
増殖を妨げる。本発明のポリペプチドのマイトジェン活性の妨害はまた、バルー
ン血管形成術後の再狭窄のような場合において望ましくあり得る。
【０７８０】 アンタゴニスト／アゴニストをまた使用して、創傷治癒の間の瘢痕組織の増殖
を妨げ得る。
【０７８１】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、本明細書中に記載される疾患を
処置し得る。従って、本発明は、患者に（ａ）本発明のポリヌクレオチドに対す
るアンチセンス分子、および／または（ｂ）本発明のポリヌクレオチドに対する
リボザイムを投与することにより本発明のポリヌクレオチドの過剰発現と関連し
た、本出願全体を通して列挙された障害または疾患を含むが、それらに限定され
ない障害または疾患を処置する方法を提供する。
【０７８２】 （他の活性） 本発明のポリペプチドは、血管の内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、
種々の疾患状態（例えば、血栓症、アテローム硬化症および他の心臓血管状態）
に起因する虚血性組織の再血管新生を刺激するための処置において使用され得る
。これらのポリペプチドはまた、上記で議論されるように、脈管形成および四肢
の再生を刺激するために使用され得る。
【０７８３】 このポリペプチドを、傷害、火傷、手術後組織修復、および潰瘍に起因する創
傷の処置にもまた用い得る。なぜなら、それらは異なる起源の種々の細胞（例え
ば、線維芽細胞および骨格筋細胞）に対してマイトジェン性であり、それゆえ損
傷組織または疾患組織の修復または置換を促進するからである。
【０７８４】 本発明のポリペプチドはまた、ニューロンの成長を刺激し、そして特定のニュ
ーロンの障害または神経変性状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病
、およびエイズ関連複合体）において生じるニューロンの損傷を処置および予防
するために用いられ得る。本発明のポリペプチドは、軟骨細胞増殖を刺激する能
力を有し得、それゆえ、骨および歯周の再生を増強し、そして組織移植片または
骨の移植片における補助のために用いられ得る。
【０７８５】 本発明のポリペプチドをまた用いて、ケラチノサイト増殖を刺激することによ
り、日焼けに起因する皮膚の老化を予防し得る。
【０７８６】 本発明のポリペプチドをまた、抜け毛を予防するために用い得る。なぜなら、
ＦＧＦファミリーのメンバーは毛髪形成細胞を活性化し、そしてメラノサイト増
殖を促進するからである。同じ系列にそって、本発明のポリペプチドを用いて、
他のサイトカインと組み合わせて使用した場合、造血細胞および骨髄細胞の増殖
および分化を刺激し得る。
【０７８７】 本発明のポリペプチドをまた用いて、移植前の器官を維持し得るか、または始
原組織の細胞培養を支持するために使用し得る。
【０７８８】 本発明のポリペプチドはまた、初期胚における分化のための中胚葉起源の組織
を誘導するためにい用られ得る。
【０７８９】 本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストはまた、先に議論されるように造血系統に加えて、胚性幹
細胞の分化もしくは増殖を増加または減少し得る。
【０７９０】 本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストはまた、哺乳動物の特徴（例えば、身長、体重、毛の色、
眼の色、皮膚、脂肪組織の割合、色素沈着、大きさ、および形状（例えば、美容
外科））を調節するために使用され得る。同様に、本発明のポリペプチドもしく
はポリヌクレオチドおよび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、異化
作用、同化作用、プロセシング、利用、およびエネルギーの貯蔵に影響を及ぼす
哺乳動物の代謝を調節するために使用され得る。
【０７９１】 本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストは、バイオリズム、カリカディック（ｃａｒｉｃａｄｉｃ
）リズム、うつ病（抑うつ性障害を含む）、暴力の傾向、痛みへの耐性、生殖能
力（好ましくは、アクチビンまたはインヒビン様活性によって）、ホルモンレベ
ルもしくは内分泌レベル、食欲、性欲、記憶、ストレス、または他の認知の質に
影響を及ぼすことによって、哺乳動物の精神状態または身体状態を変化するため
に使用され得る。
【０７９２】 本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストはまた、例えば、貯蔵能力、脂肪含有量、脂質、タンパク
質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子、または他の栄養成分を増加または
減少させるような食品添加物または保存剤として使用され得る。
【０７９３】 （他の好ましい実施形態） 本願発明の他の好ましい実施形態は、配列番号Ｘのヌクレオチド配列中の少な
くとも約５０の連続したヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌ
クレオチド配列を含む、単離された核酸分子を含み、ここで、Ｘは表ＸＩＩＩに
規定されるような任意の整数である。
【０７９４】 上記連続したヌクレオチドの配列が、表ＸＩＩＩ中の配列番号Ｘについて規定
されるような、クローン配列のほぼ５’ヌクレオチドの位置のヌクレオチドで始
まり、そしてクローン配列のほぼ３’ヌクレオチドの位置のヌクレオチドで終わ
る位置の範囲で、配列番号Ｘのヌクレオチド配列に含まれる核酸分子もまた好ま
しい。
【０７９５】 上記連続したヌクレオチドの配列が、表ＸＩＩＩ中の配列番号Ｘについて規定
されるような、開始コドンのほぼ５’ヌクレオチドの位置のヌクレオチドで始ま
り、そしてクローン配列のほぼ３’ヌクレオチドの位置のヌクレオチドで終わる
位置の範囲で、配列番号Ｘのヌクレオチド配列に含まれる核酸分子もまた好まし
い。
【０７９６】 上記連続したヌクレオチドの配列が、表ＸＩＩＩ中の配列番号Ｘについて規定
されるような、シグナルペプチドの第１のアミノ酸のほぼ５’ヌクレオチドの位
置のヌクレオチドで始まり、そしてほぼクローン配列の３’ヌクレオチドの位置
のヌクレオチドで終わる位置の範囲で、配列番号Ｘのヌクレオチド配列に含まれ
る、核酸分子も同様に好ましい。
【０７９７】 配列番号Ｘのヌクレオチド配列中の少なくとも約１５０の連続したヌクレオチ
ドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された
核酸分子もまた好ましい。
【０７９８】 配列番号Ｘのヌクレオチド配列中の少なくとも約５００の連続したヌクレオチ
ドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された
核酸分子がさらに好ましい。
【０７９９】 さらに好ましい実施形態は、表ＸＩＩＩ中の配列番号Ｘについて規定されるよ
うな、シグナルペプチドの第１のアミノ酸のほぼ５’ヌクレオチドの位置のヌク
レオチドで始まり、そしてクローン配列のほぼ３’ヌクレオチドの位置のヌクレ
オチドで終わる配列番号Ｘのヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌ
クレオチド配列を含む核酸分子である。
【０８００】 さらに好ましい実施形態は、配列番号Ｘの完全なヌクレオチド配列に、少なく
とも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子である。
【０８０１】 ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で核酸分子にハイブリダイ
ズする単離された核酸分子もまた好ましく、ここで上記のハイブリダイズする核
酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ａ残基のみま
たはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズし
ない。
【０８０２】 表ＸＩＩＩにおけるｃＤＮＡクローンＩＤによって同定されるヒトｃＤＮＡク
ローンを含むＤＮＡ分子を含む物質の組成物もまた好ましく、このＤＮＡ分子は
、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された物質中に含まれ、そし
て上記のｃＤＮＡクローンＩＤについて表ＸＩＩＩ中に示されるＡＴＣＣ受託番
号が与えられている。
【０８０３】 表ＸＩＩＩ中のｃＤＮＡクローンＩＤによって同定されるヒトｃＤＮＡクロー
ンのヌクレオチド配列中の少なくとも５０の連続したヌクレオチドの配列に少な
くとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子もまた好ま
しく、このＤＮＡ分子は表ＸＩＩＩにおいて示されるＡＴＣＣ受託番号を付与さ
れた寄託物中に含まれる。
【０８０４】 上記の少なくとも５０の連続したヌクレオチドの配列が、上記ヒトｃＤＮＡク
ローンによってコードされる完全なオープンリーディングフレームの配列のヌク
レオチド配列中に含まれる、単離された核酸分子もまた好ましい。
【０８０５】 上記ヒトｃＤＮＡクローンによってコードされるヌクレオチド配列中の少なく
とも１５０の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であるヌクレ
オチド配列を含む、単離された核酸分子もまた好ましい。
【０８０６】 さらに好ましい実施形態は、上記ヒトｃＤＮＡクローンによってコードされる
ヌクレオチド配列中の少なくとも５００の連続したヌクレオチドの配列に少なく
とも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子である。
【０８０７】 さらに好ましい実施形態は、上記ヒトｃＤＮＡクローンによってコードされる
完全なヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む
、単離された核酸分子である。
【０８０８】 さらに好ましい実施形態は、以下からなる群から選択される配列中の少なくと
も５０の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチ
ド配列を含む核酸分子を、生物学的サンプルにおいて検出するための方法である
：配列番号Ｘのヌクレオチド配列であって、ここでＸは表ＸＩＩＩにおいて規定
されるような任意の整数である；および表ＸＩＩＩ中のｃＤＮＡクローンＩＤに
よって同定され、そして表ＸＩＩＩにおいて上記ｃＤＮＡクローンについて示さ
れるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物中に含まれるヒトｃＤＮＡクローンによっ
てコードされるヌクレオチド配列；上記の方法は、上記の群から選択される配列
と、上記のサンプル中の少なくとも１つの核酸分子のヌクレオチド配列とを比較
する工程、および上記サンプル中の上記核酸分子の配列が、上記の選択された配
列に対して少なくとも９５％同一であるか否かを決定する工程を包含する。
【０８０９】 上記の配列を比較する工程が、上記サンプル中の核酸分子と、上記の群から選
択される上記の配列を含む核酸分子との間の核酸ハイブリダイゼーションの程度
を決定する工程を包含する、上記方法もまた好ましい。同様に、上記の配列を比
較する工程が、上記サンプル中の核酸分子から決定されるヌクレオチド配列と、
上記の群から選択される上記配列とを比較する工程によって実施される、上記方
法もまた好ましい。核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含み得る。
【０８１０】 さらに好ましい実施形態は、生物学的サンプルの種、組織、または細胞型を同
定するための方法であって、この方法は、以下からなる群から選択される配列中
の少なくとも５０の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一である
ヌクレオチド配列を含む上記サンプル中の核酸分子を（もしあれば）検出する工
程を包含する：配列番号Ｘのヌクレオチド配列であって、ここでＸは表ＸＩＩＩ
において規定されるような任意の整数である；および表ＸＩＩＩ中のｃＤＮＡク
ローンＩＤによって同定され、そして表ＸＩＩＩにおいて上記ｃＤＮＡクローン
について示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物中に含まれるヒトｃＤＮＡク
ローンによってコードされるヌクレオチド配列。
【０８１１】 生物学的サンプルの種、組織、または細胞型を同定するための方法は、少なく
とも２つのヌクレオチド配列のパネル中のヌクレオチド配列を含む核酸分子を検
出する工程を包含し得、ここで上記パネル中の少なくとも１つの配列は、上記の
群から選択される配列中の少なくとも５０の連続したヌクレオチドの配列に少な
くとも９５％同一である。
【０８１２】 表ＸＩＩＩにおいて同定される分泌タンパク質をコードする遺伝子の異常な構
造または発現と関連する病理学的状態を、被験体において診断するための方法も
また好ましく、この方法は、以下からなる群から選択される配列中の少なくとも
５０の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド
配列を含む、核酸分子を、（もしあれば）上記被験体から得られる生物学的サン
プルにおいて検出する工程を包含する：配列番号Ｘのヌクレオチド配列、ここで
Ｘは表ＸＩＩＩにおいて規定されるような任意の整数である；および表ＸＩＩＩ
中のｃＤＮＡクローンＩＤによって同定され、かつ表ＸＩＩＩ中の上記のｃＤＮ
Ａクローンについて示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれるヒトｃ
ＤＮＡクローンによってコードされるヌクレオチド配列。
【０８１３】 病理学的状態を診断するための方法は、少なくとも２つのヌクレオチド配列の
パネル中のヌクレオチド配列を含む核酸分子を検出する工程を包含し得、ここで
、上記パネル中の少なくとも１つの配列は、上記群から選択される配列中の少な
くとも５０の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一である。
【０８１４】 上記の核酸分子のヌクレオチド配列が、少なくとも２つのヌクレオチド配列の
パネルを含む、単離された核酸分子を含む物質の組成物もまた好ましく、ここで
上記のパネル中の少なくとも１つの配列は、以下からなる群から選択される配列
中の少なくとも５０の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であ
る：配列番号Ｘのヌクレオチド配列、ここでＸは表ＸＩＩＩにおいて規定される
ような任意の整数である；および表ＸＩＩＩ中のｃＤＮＡクローンＩＤによって
同定され、かつ表ＸＩＩＩ中の上記のｃＤＮＡクローンについて示されるＡＴＣ
Ｃ受託番号を有する寄託物に含まれるヒトｃＤＮＡクローンによってコードされ
るヌクレオチド配列。核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含み得る。
【０８１５】 配列番号Ｙのアミノ酸配列中の少なくとも約１０の連続したアミノ酸の配列に
、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた
好ましく、ここでＹは、表ＸＩＩＩにおいて規定されるような任意の整数である
。
【０８１６】 上記連続したアミノ酸の配列が、表ＸＩＩＩ中の配列番号Ｙについて示される
ような、分泌部分のほぼ第１のアミノ酸の位置の残基で始まり、そしてオープン
リーディングフレームのほぼ最後のアミノ酸の残基で終わる位置の範囲で、配列
番号Ｙのアミノ酸配列中に含まれる、ポリペプチドもまた好ましい。
【０８１７】 配列番号Ｙのアミノ酸配列中の少なくとも約３０の連続したアミノ酸の配列に
少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好
ましい。
【０８１８】 配列番号Ｙのアミノ酸配列中の少なくとも約１００の連続したアミノ酸の配列
に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドはさら
に好ましい。
【０８１９】 配列番号Ｙの完全なアミノ酸配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含
む、単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
【０８２０】 表ＸＩＩＩ中のｃＤＮＡクローンＩＤによって同定され、かつ表ＸＩＩＩ中の
上記のｃＤＮＡクローンについて示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含
まれるヒトｃＤＮＡクローンによってコードされる分泌タンパク質の完全なアミ
ノ酸配列において、少なくとも約１０の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９
０％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
【０８２１】 上記の連続したアミノ酸の配列が、表ＸＩＩＩ中のｃＤＮＡクローンＩＤによ
って同定され、かつ表ＸＩＩＩ中の上記のｃＤＮＡクローンについて示されるＡ
ＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれるヒトｃＤＮＡクローンによってコード
される分泌タンパク質の分泌部分のアミノ酸配列に含まれる、ポリペプチドもま
た好ましい。
【０８２２】 表ＸＩＩＩにおけるｃＤＮＡクローンＩＤによって同定され、かつ表ＸＩＩＩ
のこのｃＤＮＡクローンについて示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含
まれる、ヒトｃＤＮＡクローンによってコードされるタンパク質の分泌部分のア
ミノ酸配列中の少なくとも約３０の連続的なアミノ酸の配列に少なくとも９５％
同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた、好ましい。
【０８２３】 表ＸＩＩＩにおけるｃＤＮＡクローンＩＤによって同定され、かつ表ＸＩＩＩ
のこのｃＤＮＡクローンについて示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含
まれる、ヒトｃＤＮＡクローンによってコードされるタンパク質の分泌部分のア
ミノ酸配列中の少なくとも約１００の連続的なアミノ酸の配列に少なくとも９５
％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた、好ましい。
【０８２４】 表ＸＩＩＩにおけるｃＤＮＡクローンＩＤによって同定され、かつ表ＸＩＩＩ
のこのｃＤＮＡクローンについて示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含
まれるヒトｃＤＮＡクローンによってコードされるタンパク質の分泌部分のアミ
ノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペ
プチドもまた、好ましい。
【０８２５】 以下からなる群から選択される配列中の少なくとも１０個の連続的なアミノ酸
の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して
特異的に結合する単離された抗体は、さらに好ましい：配列番号Ｙのアミノ酸配
列（ここで、Ｙは表ＸＩＩＩで規定される任意の整数である）；および表ＸＩＩ
ＩにおけるｃＤＮＡクローンＩＤによって同定され、かつ表ＸＩＩＩのこのｃＤ
ＮＡクローンについて示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒ
トｃＤＮＡクローンによってコードされるタンパク質の完全アミノ酸配列。
【０８２６】 以下からなる群から選択された配列中の少なくとも１０個の連続的なアミノ酸
の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを、生物
学的サンプルにおいて検出する方法はさらに好ましい：配列番号Ｙのアミノ酸配
列（ここで、Ｙは表ＸＩＩＩで規定される任意の整数である）；および表ＸＩＩ
ＩにおけるｃＤＮＡクローンＩＤによって同定され、かつ表ＸＩＩＩのこのｃＤ
ＮＡクローンについて示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒ
トｃＤＮＡクローンによってコードされるタンパク質の完全アミノ酸配列；この
方法は、このサンプル中における少なくとも１つのポリペプチド分子のアミノ酸
配列をこの群から選択された配列と比較する工程およびこのサンプル中における
このポリペプチド分子の配列が、少なくとも１０個の連続的なアミノ酸のこの配
列と少なくとも９０％同一であるかどうかを決定する工程を含む。
【０８２７】 このサンプル中における少なくとも１つのポリペプチド分子のアミノ酸配列を
、この群から選択された配列と比較するこの工程は、このサンプル中のポリペプ
チドの、以下からなる群から選択された配列中の少なくとも１０個の連続的なア
ミノ酸の配列に対して、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペ
プチドと特異的に結合する抗体に対する特異的な結合の程度を決定する工程を含
む、上記の方法もまた、好ましい：配列番号Ｙのアミノ酸配列（ここで、Ｙは表
ＸＩＩＩに規定される任意の整数である）；および表ＸＩＩＩにおけるｃＤＮＡ
クローンＩＤによって同定されかつ表ＸＩＩＩのこのｃＤＮＡクローンについて
示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれるヒトｃＤＮＡクローンによ
ってコードされるタンパク質の完全アミノ酸配列。
【０８２８】 配列を比較する上記工程が、このサンプル中のポリペプチド分子から決定され
たアミノ酸配列を、この群から選択された上記配列と比較することによって行わ
れる、上記の方法もまた好ましい。
【０８２９】 生物学的サンプルの種、組織または細胞型を同定する方法もまた好ましく、こ
こでこの方法は、このサンプル中のポリペプチド分子（このポリペプチドは、も
し存在するならば、以下からなる群から選択される配列における少なくとも１０
の連続的なアミノ酸の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む）
を検出する工程を含む：配列番号Ｙのアミノ酸配列（ここで、Ｙは表ＸＩＩＩに
規定される任意の整数である）；および表ＸＩＩＩにおけるｃＤＮＡクローンＩ
Ｄによって同定されかつ表ＸＩＩＩのこのｃＤＮＡクローンについて示されるＡ
ＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトｃＤＮＡクローンによってコー
ドされる、分泌タンパク質の完全アミノ酸配列。
【０８３０】 生物学的サンプルの種、組織または細胞型を同定する上記の方法もまた好まし
く、ここでこの方法は、少なくとも２つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ
酸配列を含むポリペプチド分子を検出する工程を含み、ここでこのパネル中の少
なくとも１つの配列は、上記の群から選択された配列における少なくとも１０の
連続的なアミノ酸の配列と少なくとも９０％同一である。
【０８３１】 被験体において、表ＸＩＩＩにおいて同定された分泌タンパク質をコードする
遺伝子の異常な構造または発現に関連する病的状態を診断する方法もまた、好ま
しい。ここで、この方法は、この被験体から得られた生物学的サンプルにおいて
、少なくとも２つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ酸配列を含むポリペプ
チド分子を検出する工程を含み、ここでこのパネル中の少なくとも１つの配列は
、以下からなる群から選択される配列における少なくとも１０の連続的なアミノ
酸の配列と少なくとも９０％同一である：配列番号Ｙのアミノ酸配列（ここで、
Ｙは表ＸＩＩＩに規定される任意の整数である）；および表ＸＩＩＩにおけるｃ
ＤＮＡクローンＩＤによって同定されかつ表ＸＩＩＩのこのｃＤＮＡクローンに
ついて示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトｃＤＮＡクロ
ーンによってコードされる分泌タンパク質の完全アミノ酸配列。
【０８３２】 これらの方法のいずれかにおいて、これらのポリペプチド分子を検出する工程
は、抗体を使用することを包含する。
【０８３３】 以下からなる群から選択された配列中の少なくとも１０の連続的なアミノ酸の
配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む上記ポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列と、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含
む、単離された核酸分子もまた、好ましい：配列番号Ｙのアミノ酸配列（ここで
、Ｙは表ＸＩＩＩに規定される任意の整数である）；および表ＸＩＩＩにおける
ｃＤＮＡクローンＩＤによって同定されかつ表ＸＩＩＩのこのｃＤＮＡクローン
について示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトｃＤＮＡク
ローンによってコードされる分泌タンパク質の完全アミノ酸配列。
【０８３４】 ポリペプチドをコードする上記ヌクレオチド配列が、原核生物宿主でのこのポ
リペプチドの発現について最適化されている、単離された核酸分子もまた、好ま
しい。
【０８３５】 上記ポリペプチドが以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離
された核酸分子もまた、好ましい：配列番号Ｙのアミノ酸配列（ここで、Ｙは表
ＸＩＩＩに規定される任意の整数である）；および表ＸＩＩＩにおけるｃＤＮＡ
クローンＩＤによって同定されかつ表ＸＩＩＩのこのｃＤＮＡクローンについて
示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトｃＤＮＡクローンに
よってコードされる分泌タンパク質の完全アミノ酸配列。
【０８３６】 上記の単離された核酸分子のいずれかをベクター中に挿入する工程を含む、組
換えベクターの作製方法はさらに好ましい。この方法によって生成された組換え
ベクターも、好ましい。宿主細胞中にベクターを導入する工程を含む、組換え宿
主細胞を作製する方法、ならびにこの方法によって生成された組換え宿主細胞も
また、好ましい。
【０８３７】 単離されたポリペプチドを作製する方法であって、このポリペプチドが発現さ
れるような条件下でこの組換え宿主細胞を培養する工程、およびこのポリペプチ
ドを回収する工程を包含する方法もまた、好ましい。単離されたポリペプチドを
作製するこの方法もまた好ましく、ここでこの組換え宿主細胞は真核生物細胞で
あり、そしてこのポリペプチドは、以下からなる群から選択されたアミノ酸配列
を含む、ヒト分泌タンパク質の分泌部分である：配列番号Ｙの分泌部分の第１の
アミノ酸の位置の残基で始まる、配列番号Ｙのアミノ酸配列（ここで、Ｙは表Ｘ
ＩＩＩに記載される整数であり、そして配列番号Ｙの分泌部分の第１のアミノ酸
のこの位置は表ＸＩＩＩに規定される）；および表ＸＩＩＩにおけるｃＤＮＡク
ローンＩＤによって同定されかつ表ＸＩＩＩのこのｃＤＮＡクローンについて示
されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトｃＤＮＡクローンによ
ってコードされるタンパク質の分泌部分のアミノ酸配列。この方法によって産生
された単離されたポリペプチドもまた、好ましい。
【０８３８】 増加したレベルの分泌タンパク質活性を必要とする個体を処置する方法もまた
、好ましい。ここで、この方法は、このような個体に、この個体においてこのタ
ンパク質の活性のレベルを増加させるのに有効な本願発明の単離されたポリペプ
チド、ポリヌクレオチド、または抗体の量を含む薬学的組成物を投与する工程を
包含する。
【０８３９】 上記の適用は、広範に種々の宿主における用途を有する。そのような宿主とし
ては、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マウス、ラッ
ト、ハムスター、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｇ）、ニワトリ、ヤギ、ウ
シ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒトが挙げられるが、これらに
限定されない。特定の実施形態において、宿主は、マウス、ウサギ、ヤギ、モル
モット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌまたはネコである
。好ましい実施形態において、宿主は、哺乳動物である。最も好ましい実施形態
において、宿主は、ヒトである。
【０８４０】 概して、本発明を記載してきたが、本発明は、例示の目的のために提供され、
そして限定を意図しない、以下の実施例を参照することによってより容易に理解
される。
【０８４１】 （実施例） （実施例１：選択されたｃＤＮＡクローンの寄託されたサンプルからの単離） 引用されるＡＴＣＣ寄託物中の各ｃＤＮＡクローンは、プラスミドベクター中
に含まれる。表ＸＩＩＩは、各クローンが単離されたｃＤＮＡライブラリーを構
築するために用いられたベクターを示す。多くの場合において、ライブラリーを
構築するために使用されたベクターは、プラスミドが切り出されたファージベク
ターである。すぐ下の表は、ｃＤＮＡライブラリーを構築する際に使用される各
ファージベクターについて関連するプラスミドを相関づける。例えば、特定のク
ローンがベクター「Ｌａｍｂｄａ Ｚａｐ」中に単離されていると表ＸＩＩＩに
示される場合、対応する寄託クローンは、「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ」である。
【０８４２】
【表１４】 ベクターＬａｍｂｄａ Ｚａｐ（米国特許第５，１２８，２５６号および同第
５，２８６，６３６号）、Ｕｎｉ−Ｚａｐ ＸＲ（米国特許第５，１２８，２５
６号および同第５，２８６，６３６号）、Ｚａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓ（米国特許第
５，１２８，２５６号および同第５，２８６，６３６号）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ（ｐＢＳ）（Ｓｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ． １６：７５８３−７６００（１９８８））；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ
．Ａ．およびＳｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１７：９４９４（１９８９））ならびにｐＢＫ（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．
Ａ．ら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ５：５８−６１（１９９２））は、Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、１１０１１ Ｎ．Ｔ
ｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，９２０３７から
市販されている。ｐＢＳは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてｐＢＫはネ
オマイシン耐性遺伝子を含む。両方とも、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（
これもまた、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）に形質転換され得る。
ｐＢＳは、ＳＫ＋、ＳＫ−、ＫＳ＋およびＫＳの４形態で入荷する。ＳおよびＫ
とは、ポリリンカー領域（「Ｓ」とはＳａｃＩであり、そして「Ｋ」とは、Ｋｐ
ｎＩのことであり、これらは、リンカーのそれぞれの各末端での最初の部位であ
る）に隣接するＴ７およびＴ３プライマー配列に対するポリリンカーの配向をい
う。「＋」または「−」とは 、ある方向においてｆ１ ｏｒｉから開始される
一本鎖レスキューがセンス鎖ＤＮＡを生成し、そして他方においてアンチセンス
であるようなｆ１複製起点（「ｏｒｉ」）の配向をいう。
【０８４３】 ベクターｐＳｐｏｒｔ１、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ ２．０およびｐＣＭＶＳｐｏ
ｒｔ３．０をＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ
６００９、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ２０８９７から入手した。全ての
Ｓｐｏｒｔベクターはアンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株Ｄ
Ｈ１０Ｂ（これもまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能であ
る）に形質転換され得る。（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｆｏｃｕｓ
１５：５９（１９９３）を参照のこと）。ベクターｌａｆｍｉｄ ＢＡ（Ｂｅｎ
ｔｏ Ｓｏａｒｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ）は、ア
ンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅに形質
転換され得る。ベクターｐＣＲ（登録商標）２．１（これはＩｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ、１６００ Ｆａｒａｄａｙ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ９２
００８から入手可能である）は、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃ
ｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である
）に形質転換され得る（例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１６：９６７７−９６８６（１９８８）およびＭｅａｄ，Ｄ．ら、Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：（１９９１）を参照のこと）。好ましくは、本
発明のポリヌクレオチドは、表ＸＩＩＩにおける特定のクローンについて同定さ
れたファージベクター配列、ならびに上記に示された対応するプラスミドベクタ
ー配列を含まない。
【０８４４】 表ＸＩＩＩに引用される、任意の所定のｃＤＮＡクローンについてＡＴＣＣ受
託番号を与えられたサンプルにおける寄託された物質はまた、１つ以上のさらな
るプラスミド（これは各々、その所定のクローンとは異なるｃＤＮＡクローンを
含む）を含み得る。従って、同じＡＴＣＣ受託番号を共有する寄託物は、表ＸＩ
ＩＩに示される各ｃＤＮＡクローンのための少なくとも１つのプラスミド含む。
代表的には、表ＸＩＩＩに引用される各ＡＴＣＣ寄託物のサンプルは、ほぼ等量
（重量で）の約５０個のプラスミドＤＮＡ（これは各々、異なるｃＤＮＡクロー
ンを含む）の混合物を含む；しかし、このような寄託サンプルは、５０個よりも
多いかまたは少ないｃＤＮＡクローン（約５００個までのｃＤＮＡクローン）の
ためのプラスミドを含み得る。
【０８４５】 表ＸＩＩＩにおける特定のクローンについて引用されるプラスミドＤＮＡの寄
託サンプルからそのクローンを単離するために２つのアプローチが使用され得る
。第一に、プラスミドを、配列番号Ｘに対応するポリヌクレオチドプローブを使
用して、クローンをスクリーニングすることによって直接単離する。
【０８４６】 特に、３０〜４０ヌクレオチドを有する特定のポリヌクレオチドを、報告され
ている配列に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＤＮＡ合成装置
を使用して合成する。オリゴヌクレオチドを、例えば、32Ｐ−γ−ＡＴＰで、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識し、そして慣用の方法に従って精製す
る。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ、ＮＹ（１９８２））。プラスミド混
合物を、当業者に公知の技術（例えば、ベクター供給者によって提供される技術
または上記で引用された関連の刊行物もしくは特許において提供される技術）を
用いて、上記のような適切な宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ））に形質転換する。形質転換体を１．５％寒天プレート（適切な選択
薬剤、例えば、アンピシリンを含む）に、１プレートあたり約１５０の形質転換
体（コロニー）の密度でプレーティングする。これらのプレートを、細菌コロニ
ースクリーニングについての慣用の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第
２版、（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１．９３〜１．１０４頁）または当業者に公知の他の技術
に従って、ナイロンメンブレンを使用してスクリーニングする。
【０８４７】 あるいは、配列番号Ｘの両端（すなわち、表ＸＩＩＩに規定されるクローンの
５’ＮＴおよび３’ＮＴによって囲まれる配列番号Ｘの領域内）に由来する、１
７〜２０ヌクレオチドの２つのプライマーを合成し、そしてこれらを使用して、
寄託されたｃＤＮＡプラスミドをテンプレートとして使用して、所望のｃＤＮＡ
を増幅する。ポリメラーゼ連鎖反応を、慣用の条件下で、例えば、０．５μｇの
上記ｃＤＮＡテンプレートとともに反応混合物の２５μｌ中で実施する。都合の
よい反応混合物は、１．５〜５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチ
ン、それぞれ２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏ
ｌの各プライマーおよび０．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼである。３５サ
イクルのＰＣＲ（９４℃での変性を１分間；５５℃でのアニールを１分間；７２
℃での伸長を１分間）を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ自動化サーマ
ルサイクラーを用いて実施する。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析
し、そして予想される分子量のＤＮＡバンドを切り出し、そして精製する。ＰＣ
Ｒ産物を、ＤＮＡ産物をサブクローニングおよび配列決定することによって選択
された配列であることを確認する。
【０８４８】 寄託されたクローンに存在しないかもしれない遺伝子の５’非コード部分また
は３’非コード部分の同定のために、いくつかの方法が利用可能である。これら
の方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フィルター探索、特異的プロー
ブを使用するクローン富化、および当該分野で周知である５’および３’「ＲＡ
ＣＥ」プロトコルと類似するかまたは同一のプロトコル。例えば、５’ＲＡＣＥ
に類似する方法は、所望の全長転写物の欠けている５’末端を生成するために利
用可能である（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３））。
【０８４９】 簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転写物をお
そらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結する。連結されたＲＮＡオリゴヌクレ
オチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライ
マーを含むプライマーセットを使用して、所望の全長遺伝子の５’部分をＰＣＲ
増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれを使用して全
長遺伝子を生成し得る。
【０８５０】 この上記の方法は、所望の供給源から単離された総ＲＮＡを用いて開始するが
、ポリＡ＋ＲＮＡを使用し得る。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスファ
ターゼで処理して、後のＲＮＡリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷ＲＮＡ
の５’リン酸基を除去し得る。次いで、ホスファターゼを不活化するべきであり
、そしてＲＮＡをメッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を除
去するために、タバコ酸性ピロホスファターゼを用いて処理するべきである。こ
の反応は、次いでＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドに連
結され得る、キャップ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残す。
【０８５１】 この改変型ＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第
一鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用する。第一鎖合成反応物を、
連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子
の公知の配列に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のた
めのテンプレートとして使用する。次いで、得られた生成物を配列決定し、そし
て分析して５’末端配列が所望の遺伝子に属することを確認する。
【０８５２】 （実施例２：ポリヌクレオチドに対応するゲノムクローンの単離） ヒトゲノムＰ１ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）
を、実施例１に記載される方法に従って、配列番号Ｘに対応するｃＤＮＡ配列に
ついて選択されたプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングする（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋもまた参照のこと）。
【０８５３】 （実施例３：ポリペプチドの組織分布） 本発明のポリヌクレオチドのｍＲＮＡ発現の組織分布を、とりわけ、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋらによって記載されるノーザンブロット分析についてのプロトコルを用
いて決定する。例えば、実施例１に記載される方法によって生成されるｃＤＮＡ
プローブを、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅTM ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、製造者の指示に従
って、Ｐ32で標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００ TM カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用し
て、製造者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って精製する。次いで、精製
した標識プローブを使用して、種々のヒト組織をｍＲＮＡ発現について試験する
。
【０８５４】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン
（ＭＴＮ）ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリ
ダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造者のプロトコル番号Ｐ
Ｔ１１９０−１に従って、標識プローブで試験する。ハイブリダイゼーションお
よび洗浄後、ブロットをマウントして、そして−７０℃で一晩フィルムに露出し
、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。
【０８５５】 （実施例４：ポリヌクレオチドの染色体マッピング） オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、配列番号Ｘの５’末端の配列に従
って設計する。このプライマーは、好ましくは約１００ヌクレオチドにわたる。
次いで、このプライマーセットを、以下のセットの条件下でポリメラーゼ連鎖反
応に使用する：９５℃で３０秒；５６℃で１分；７０℃で１分。このサイクルを
３２回反復し、次いで１回、７０℃で５分間のサイクルを行う。個々の染色体ま
たは染色体フラグメントを含む体細胞ハイブリッドパネル（Ｂｉｏｓ，Ｉｎｃ）
に加えて、ヒト、マウス、およびハムスターのＤＮＡを鋳型として使用する。反
応物を、８％ポリアクリルアミドゲルまたは３．５％アガロースゲルのいずれか
で分析する。染色体マッピングを、特定の体細胞ハイブリッドにおける約１００
ｂｐのＰＣＲフラグメントの存在によって決定する。
【０８５６】 （実施例５：ポリペプチドの細菌性発現） 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、実施例１に概説する
ように、ＤＮＡ配列の５’および３’末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド
プライマーを使用して増幅して挿入フラグメントを合成する。ｃＤＮＡ挿入物を
増幅するために使用されるプライマーは、発現ベクターに増幅産物をクローニン
グするために、プライマーの５’末端にＢａｍＨＩおよびＸｂａＩのような制限
部位を好ましくは含むべきである。例えば、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩは、細菌
性発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，
ＣＡ）の制限酵素部位に対応する。このプラスミドベクターは、抗生物質耐性（
Ａｍｐr）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧで調節可能なプロモーター／
オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−ヒスチジンタグ
（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位をコードする。
【０８５７】 ｐＱＥ−９ベクターをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして、増幅され
たフラグメントを細菌性ＲＢＳにおいて開始されるリーディングフレームを維持
しながらｐＱＥ−９ベクターに連結する。次いで連結混合物を、ｌａｃＩリプレ
ッサーを発現し、またカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を与えるプラスミドｐＲＥ
Ｐ４の複数のコピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，
Ｉｎｃ．）を形質転換するために使用する。形質転換体を、それらのＬＢプレー
ト上で生育する能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コ
ロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって確認す
る。
【０８５８】 所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（
２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）
増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を、１：１００〜１：２５０の比で大量培養物に接種
するために使用する。細胞を、０．４と０．６との間の光学密度６００（Ｏ．Ｄ
．600）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド）を最終濃度１ｍＭになるように加える。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩ
リプレッサーの不活化により誘導し、Ｐ／Ｏの障害物を除去し、遺伝子発現の増
加を導く。
【０８５９】 細胞を、さらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離（６０００×
ｇで２０分間）によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック剤である６
ＭグアニジンＨＣｌ中に、４℃で３〜４時間攪拌することによって可溶化させる
。細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてポリペプチドを含む上清を、ニ
ッケル−ニトリロ三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（ＱＩ
ＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．前出より入手可能）にロードする。６×Ｈｉｓタグを有する
タンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高い親和性で結合し、そして単純な１工程手
順で精製され得る（詳細には、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（１
９９５）ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出を参照のこと）。
【０８６０】 手短に言えば、上清を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８のカラムにロードし
、カラムを、最初に１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８で洗浄し、次い
で１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ６で洗浄し、最後にポリペプチドを
、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ５で溶出する。
【０８６１】 次いで、精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または５
０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６の緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌに対して
透析することにより再生させる。あるいは、タンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラムに
固定化している間に、首尾よく再折畳みされ得る。推奨条件は以下の通りである
：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロー
ル、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４中の６Ｍ〜１Ｍ尿素の直線勾配を
使用する再生。再生は１．５時間以上の時間をかけて行うべきである。再生後、
タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールの添加によって溶出させる。イミダゾール
を、ＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ６の緩衝液および２００ｍＭ
ＮａＣｌに対する最終の透析工程によって除去する。精製したタンパク質を、４
℃で保存するか、または−８０℃で冷凍する。
【０８６２】 上記の発現ベクターに加えて、本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドに
作動可能に連結されたファージオペレーターおよびプロモーターエレメントを含
み、ｐＨＥ４ａと呼ばれる発現ベクターを含む（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４５
、１９９８年２月２５日に寄託）。このベクターは以下を含む：１）選択マーカ
ーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏｌｉ複
製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配
列、５）シャイン−ダルガーノ配列、および６）ラクトースオペロンリプレッサ
ー遺伝子（ｌａｑＩｑ）。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ，Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に由来する。プロモーター配列およびオペレータ
ー配列を合成的に作製する。
【０８６３】 ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８によっ
てベクターを制限処理し、制限生成物をゲルで泳動し、そしてより大きな方のフ
ラグメント（スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントは約３１０塩基対で
あるべきである）を単離することによって、ＤＮＡをｐＨＥａに挿入し得る。Ｄ
ＮＡ挿入物を、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘｈ
ｏＩ、またはＡｓｐ７１８（３’プライマー）に対する制限部位を有するＰＣＲ
プライマーを使用して、実施例１に記載のＰＣＲプロトコルに従って生成する。
ＰＣＲ挿入物を、ゲル精製し、そして適合する酵素で制限処理する。挿入物およ
びベクターを標準的なプロトコルに従って連結する。
【０８６４】 操作されたベクターは、上記のプロトコルにおいて、細菌系でタンパク質を発
現させるために容易に置換され得る。
【０８６５】 （実施例６：封入体からのポリペプチドの精製） 以下の別の方法は、ポリペプチドが封入体の形態で存在する場合に、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ中で発現されたポリペプチドを精製するために使用され得る。他に指定され
ない場合には、以下のすべての工程は４〜１０℃で行われる。
【０８６６】 Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生産期の完了後、細胞培養物を４〜１０℃に冷却し、そし
て１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）に
よって細胞を採集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想され
る収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切
な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を含む緩衝溶液に懸濁させる。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸濁
液に分散させる。
【０８６７】 次いで、細胞をマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（
Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ
．）に２回、４０００〜６０００ｐｓｉで溶液を通すことによって溶解させる。
次いでホモジネートを、最終濃度０．５Ｍ ＮａＣｌになるようにＮａＣｌ溶液
と混合し、続いて７０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。得られたペレットを
、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を使用して再度洗浄する。
【０８６８】 得られた洗浄した封入体を、１．５Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜
４時間可溶化する。７０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄し
、そしてポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートしてさらなるＧｕ
ＨＣｌ抽出を可能にする。
【０８６９】 不溶性粒子を除去するための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）に続き、Ｇｕ
ＨＣｌ可溶化タンパク質を、ＧｕＨＣｌ抽出物と、５０ｍＭ ナトリウム、ｐＨ
４．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝液とを
、激しい攪拌で迅速に混合することによって、再折畳みさせる。再折畳みした希
釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合しないで４℃で保
つ。
【０８７０】 再折畳みされたポリペプチド溶液を清澄にするために、４０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ６．０で平衡化した、適切な表面積を有する０．１６μｍメンブレンフ
ィルターを備えるあらかじめ準備した接線濾過ユニット（例えば、Ｆｉｌｔｒｏ
ｎ）を使用する。濾過したサンプルを、カチオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ
ＨＳ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にロードする
。カラムを４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄し、そして同じ緩衝液
中の２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ ＮａＣｌで
、段階的な様式で溶出する。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を連続的にモニ
ターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析する。
【０８７１】 次いでポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量の水と混合する。次
いで希釈されたサンプルを、あらかじめ準備した強アニオン（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ
−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）交換樹脂および弱アニ
オン（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）交換樹脂の直列カラムのセットにロードする。カラムを４０ｍＭ 酢酸ナトリ
ウム、ｐＨ６．０で平衡化する。両方のカラムを、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、
ｐＨ６．０、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いでＣＭ−２０カラムを１０
カラム容量の直線勾配（０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ
６．０から１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．５の範囲
）を用いて溶出させる。画分を、溶出液の定常Ａ280モニタリング下で収集する
。次いで、（例えば、１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判明した）ポリペプチ
ドを含む画分をプールする。
【０８７２】 得られたポリペプチドは、上記の再折畳みおよび精製工程の後で９５％より高
い純度を示すはずである。５μｇの精製タンパク質がロードされる場合、いかな
る主たる混在バンドも、クマシーブルー染色した１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
から観察されないはずである。精製タンパク質はまた、エンドトキシン／ＬＰＳ
混在について試験され得、そして代表的には、ＬＰＳ含量はＬＡＬアッセイに従
って、０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。
【０８７３】 （実施例７：バキュロウイルス発現系におけるポリペプチドのクローニング
および発現） この実施例では、ポリペプチドを発現するために、プラスミドシャトルベクタ
ーｐＡ２を使用してポリヌクレオチドをバキュロウイルスに挿入する。この発現
ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイル
ス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてＢａｍＨＩ、Ｘ
ｂａＩ、およびＡｓｐ７１８のような便利な制限部位を含む。シミアンウイルス
４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のため
に使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、プラスミドは、同方向にあ
る弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下でＥ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを
含む。挿入された遺伝子は、両方の側で、クローン化したポリヌクレオチドを発
現する生存可能なウイルスを生成するために、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒
介性の相同組換えのためのウイルス配列と隣接する。
【０８７４】 他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル（必要とされる場合、シグナル
ペプチドおよびインフレームなＡＵＧを含む）を提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。
【０８７５】 具体的には、寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡ配列（これは、表ＸＩＩ
Ｉに同定されるＡＵＧ開始コドンおよび天然に付随するリーダー配列を含む）を
、実施例１に記載されるＰＣＲプロトコルを使用して増幅させる。天然に存在す
るシグナル配列を使用して分泌タンパク質を産生する場合、ｐＡ２ベクターは第
２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、ベクターは、Ｓｕｍｍｅｒｓ
ら（「Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒ
ｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐ
ｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７
））に記載される標準的な方法を用いて改変され、バキュロウイルスリーダー配
列を含ませ得る（ｐＡ２ ＧＰ）。
【０８７６】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」，ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲ
ルから単離する。次いでフラグメントを適切な制限酵素で消化し、そして再び１
％アガロースゲルで精製する。
【０８７７】 プラスミドを対応する制限酵素で消化し、そして必要に応じて、当該分野で公
知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化し得る。
次いでＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎ
ｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲルから単離する
。
【０８７８】 フラグメントおよび脱リン酸化したプラスミドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用
いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ
Ａ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合液で形質転換し、そ
して培養プレート上に拡げる。プラスミドを含む細菌を、個々のコロニー由来の
ＤＮＡを消化し、そして消化産物をゲル電気泳動によって分析することにより同
定する。クローニングしたフラグメントの配列をＤＮＡ配列決定によって確認す
る。
【０８７９】 このポリヌクレオチドを含む５μｇのプラスミドを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９
８７）によって記載されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市販の
線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ととも
に同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルスＤＮＡ
および５μｇのプラスミドを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む、
マイクロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０μｌの
リポフェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で１５
分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清グレ
ース培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細胞（
ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加える。次いでプレートを２７℃で５
時間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をプレートから除
去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加す
る。次いで培養を２７℃で４日間継続する。
【０８８０】 ４日後上清を収集し、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出によって記載さ
れたようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むアガロース
ゲルを、ｇａｌが発現しているクローン（青色に着色したプラークを生ずる）の
容易な同定および単離を可能にするために使用する。（この型の「プラークアッ
セイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇによって配布される、昆虫細胞培養およびバキュロ
ウイルス学のための使用者ガイドの中の９−１０頁に見出され得る）。適切なイ
ンキュベーションの後、青色に着色したプラークをマイクロピペッター（例えば
、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を
、２００μｌのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁させ、そし
て組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を、３５ｍｍディッシュに播種したＳｆ
９細胞に感染させるために使用する。４日後、これらの培養ディッシュの上清を
採集し、次いで４℃に貯蔵する。
【０８８１】 ポリペプチドの発現を確認するために、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレ
ース培地中でＳｆ９細胞を増殖させる。細胞を、約２の感染多重度（「ＭＯＩ」
）で、ポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスで感染させる。放射性標
識したタンパク質を所望する場合には、６時間後に培地を除去し、そしてメチオ
ニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能）に置き換
える。４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの35Ｓ−システ
イン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに１６時間イン
キュベートし、次いで遠心分離によって採集する。上清中のタンパク質および細
胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで（放射性標識した場合）オートラ
ジオグラフィーによって分析する。
【０８８２】 精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定法を使用して、産
生されたタンパク質のアミノ末端配列を決定し得る。
【０８８３】 （実施例８：哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現） 本発明のポリペプチドを、哺乳動物細胞中で発現させ得る。代表的な哺乳動物
発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモーターエレメント、タ
ンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要
なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハンサー、コザック配列
、および、ＲＮＡスプライシングのドナー部位およびアクセプター部位に隣接す
る介在配列が挙げられる。非常に効率的な転写は、ＳＶ４０由来の初期および後
期プロモーター、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来
の長末端反復（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモ
ーターを用いて達成される。しかし、細胞エレメント（例えば、ヒトアクチンプ
ロモーター）もまた、使用され得る。
【０８８４】 本発明を実施する際の使用に適切な発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶＬ
およびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲ
ＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４
６）、ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、
ならびにｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０のようなベクターが挙げられる。使用され得
る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞および
Ｊｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １細
胞、Ｃｏｓ ７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、
ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
【０８８５】 あるいは、ポリペプチドは、染色体に組み込まれたポリヌクレオチドを含む、
安定な細胞株中で発現され得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマ
イシンのような選択可能なマーカーを用いる同時トランスフェクションは、トラ
ンスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
【０８８６】 トランスフェクトされた遺伝子はまた、大量のコードされたタンパク質を発現
するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）マーカーは、目的
の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する細胞株の開発に有用である。
（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−
１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：１０７−１４３（１９９０
）：Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ９：６４−６８（１９９１）を参照のこと）。別の有用な選択マー
カーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（１９９２））。これら
のマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させ、そしてもっとも
高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組み込まれた、
増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳＯ
細胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。
【０８８７】 プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体であ
る、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴ
ＣＣ受託番号２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７（
１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）、およびＣＭＶエンハンサ
ー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））のフラ
グメントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８の制限酵
素切断部位を有するマルチプルクローニングサイトは、目的の遺伝子のクローニ
ングを容易にする。ベクターはまた、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イ
ントロン、ポリアデニル化および終結シグナル、ならびに、ＳＶ４０初期プロモ
ーターの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【０８８８】 具体的には、例えば、プラスミドｐＣ６を、適切な制限酵素によって消化し、
次いで当該分野で公知の手順に従って、仔ウシ腸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ）を使用して脱リン酸化する。次いで、このベクターを１％アガロースゲ
ルから単離する。
【０８８９】 本発明のポリヌクレオチドを、実施例１に概説するプロトコルに従って増幅す
る。天然に存在するシグナル配列が、分泌タンパク質を産生するために使用され
る場合、このベクターは、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、
天然に存在するシグナル配列が使用されない場合には、このベクターは異種シグ
ナル配列を含むように改変され得る（例えば、ＷＯ９６／３４８９１を参照のこ
と）。
【０８９０】 増幅フラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０
１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲルから
単離する。次いで、フラグメントを、適切な制限酵素で消化し、そして再び１％
アガロースゲル上で精製する。
【０８９１】 次いで、増幅フラグメントを同じ制限酵素で消化し、そして１％アガロースゲ
ルで精製する。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化したベクター
を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１また
はＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＣ６に挿入された
フラグメントを含む細菌を、例えば、制限酵素分析を用いて同定する。
【０８９２】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ６ ｐＣ４を、リポフ
ェクチン（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶ
ｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優
性選択マーカーである、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐性を付与する酵
素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４
１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し
、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／
ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプ
レート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種する。約１０〜１４日後、
単一のクローンをトリプシン処理し、次いでメトトレキサートの異なる濃度（５
０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して、６ウ
ェルのペトリ皿または１０ｍｌのフラスコに播種する。次いで、メトトレキサー
トの最高濃度で増殖するクローンを、さらに高い濃度（１μＭ、２μＭ、５μＭ
、１０ｍＭ、２０ｍＭ）のメトトレキサートを含む新たな６ウェルプレートに移
す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで
繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエス
タンブロットによって、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０８９３】 （実施例９：タンパク質融合物） 本発明のポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。これら
の融合タンパク質は、種々の適用について使用され得る。例えば、本発明のポリ
ぺプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマ
ルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（実施例５を参照のこと
；ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１
：８４−８６（１９８８）もまた参照のこと）。同様に、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−
３、およびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大させる。本発明の
ポリぺプチドに融合した核局在化シグナルは、タンパク質を特定の細胞内局在に
標的化し得る。一方、共有結合ヘテロダイマーまたはホモダイマーは、融合タン
パク質の活性を増大または減少させ得る。融合タンパク質はまた、１つより多い
機能を有するキメラ分子を作製し得る。最後に、融合タンパク質は、非融合タン
パク質と比較して、融合タンパク質の可溶性および／または安定性を増大させ得
る。上記の融合タンパク質の全ての型は、ポリぺプチドのＩｇＧ分子への融合を
概説する以下のプロトコル、または実施例５に記載されるプロトコルを改変する
ことによって作製され得る。
【０８９４】 簡単には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載の配列の５’および３’
末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマーは
また、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクローニングを
容易にする都合の良い制限酵素部位を有するべきである。
【０８９５】 例えば、ｐＣ４（受託番号第２０９６４６号）が使用される場合、ヒトＦｃ部
分は、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨＩ部位が破壊
されるべきであることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターが
、ＢａｍＨＩによって再び制限され、ベクターを線状化し、そして実施例１に記
載するＰＣＲプロトコルによって単離された本発明のポリヌクレオチドが、この
ＢａｍＨＩ部位に連結される。このポリヌクレオチドは、終止コドンなしにクロ
ーン化され、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意するこ
と。
【０８９６】 天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される場
合、ｐＣ４は、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、このベクターは、異種シグナル配列を含
むように改変され得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。
【０８９７】
【化１１６】 （実施例１０：ポリぺプチドからの抗体の産生） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、本
発明のポリぺプチドを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を
誘導するために動物に投与される。好ましい方法において、分泌タンパク質の調
製物が調製され、そして精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないようにさ
れる。次いで、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するために、こ
のような調製物は、動物に導入される。
【０８９８】 最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（または、
そのタンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、
ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：
２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ，Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、このような手順は
、動物（好ましくは、マウス）をポリぺプチドで免疫すること、またはより好ま
しくは、分泌ポリぺプチド発現細胞で免疫することを含む。このような細胞は、
任意の適切な組織培養培地において培養され得る；しかし、１０％ウシ胎仔血清
（約５６℃で非働化した）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約
１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイ
シンを補充したＥａｒｌｅ改変イーグル培地において細胞を培養することが好ま
しい。
【０８９９】 このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切なミエローマ細胞株と融合
される。任意の適切なミエローマ細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しか
し、ＡＴＣＣから入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好
ましい。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に
維持し、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２
５−２３２（１９８１））に記載されるように限界希釈によってクローニングす
る。このような選択によって得られるハイブリドーマ細胞は、次いでポリぺプチ
ドに結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる。
【０９００】 あるいは、ポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタイプ抗体
を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は、抗体それ
自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可能である
という事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使用して、
動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾細胞を使
用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ細胞は、
抗体のタンパク質特異的抗体に結合する能力がこのポリぺプチドによってブロッ
クされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。こ
のような抗体は、タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、
そして動物を免疫してさらなるタンパク質特異的抗体の形成を誘導するために使
用され得る。
【０９０１】 ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明の抗体の他のフラグメントは、本
明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが理解される。このような
フラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）
またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため）のような酵素を
使用して、タンパク質分解性切断によって産生される。あるいは、分泌されるタ
ンパク質結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用により、または合成化学
により産生され得る。
【０９０２】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル
抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用すること
によって産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法は当該分野で公知であ
る（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（
１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；
Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、
ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒ
ｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１
；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕ
ｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。
【０９０３】 （実施例１１：高処理能力スクリーニングアッセイのための分泌タンパク質の
産生） 以下のプロトコルは、試験されるべきポリぺプチドを含有する上清を産生する
。次いで、この上清は、実施例１３〜２０に記載されるスクリーニングアッセイ
において使用され得る。
【０９０４】 第一に、ポリ−Ｄ−リジン（６４４ ５８７ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）ストック溶液（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（カルシウム
もマグネシウムも含まない１７−５１６Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で１
：２０に希釈して、作業溶液５０μｇ／ｍｌにする。２００μｌのこの溶液を、
各ウェル（２４ウェルプレート）に添加し、そして室温で２０分間インキュベー
トする。溶液を各ウェルにわたって分配させることを確実にする（注記：１２チ
ャンネルピペッターを、１つおきのチャンネルにチップをつけて使用し得る）。
ポリ−Ｄ−リジン溶液を吸引除去し、そして１ｍｌ ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理
食塩水）でリンスする。ＰＢＳは、細胞をプレートする直前までウェル中に残す
べきであり、そしてプレートは２週間前までに予めポリリジンでコーティングし
得る。
【０９０５】 ２９３Ｔ細胞（Ｐ＋２０を過ぎて細胞を保有しない）を、２×１０5細胞／ウ
ェルで、０．５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）（４．
５Ｇ／ＬのグルコースおよびＬ−グルタミン（１２−６０４Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔ
ｔａｋｅｒ）を含む）／１０％熱非働化ＦＢＳ（１４−５０３Ｆ Ｂｉｏｗｈｉ
ｔｔａｋｅｒ）／１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（１７−６０２Ｅ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａ
ｋｅｒ）中にプレートする。細胞を一晩増殖させる。
【０９０６】 翌日、滅菌溶液容器（ｂａｓｉｎ）中で、３００μｌＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉ
ｎｅ（１８３２４−０１２ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）および５ｍｌ Ｏｐｔｉｍｅ
ｍ Ｉ（３１９８５０７０ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）／９６ウェルプレートを、一
緒に混合する。少容量のマルチチャンネルピペッターを用いて、実施例８または
９に記載する方法によって産生されたポリヌクレオチド挿入物を含有する約２μ
ｇの発現ベクターを、適切に標識された９６ウェルの丸底プレート中にアリコー
トする。マルチチャンネルピペッターを用いて、５０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ混合物を各ウェルに添加する。ピペットで緩やか
に吸い上げたり下げたりして混合する。室温で１５〜４５分間インキュベートす
る。約２０分後、マルチチャンネルピペッターを使用して１５０μｌのＯｐｔｉ
ｍｅｍ Ｉを各ウェルに添加する。コントロールとして、挿入物を欠失するベク
ターＤＮＡの１つのプレートは、トランスフェクションの各セットでトランスフ
ェクトされるべきである。
【０９０７】 好ましくは、トランスフェクションは、以下の作業をタッグチームを組んで（
ｔａｇ−ｔｅａｍｉｎｇ）行うべきである。タッグチームを組むことによって、
時間に関する労力は半減され、そして細胞にはＰＢＳ上であまり多くの時間を過
ごさせない。まず、Ａさんは、培地を細胞の４つの２４ウェルプレートから吸引
除去し、次いでＢさんが０．５〜１ｍｌのＰＢＳで各ウェルをリンスする。次い
で、Ａさんは、ＰＢＳリンスを吸引除去し、そしてＢさんは、１つおきのチャン
ネルにチップのついた１２チャンネルピペッターを使用して、２００μｌのＤＮ
Ａ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ複合体を、まず奇数のウ
ェルに、次いで偶数のウェルにと、２４ウェルプレート上の各列に添加する。３
７℃で６時間インキュベートする。
【０９０８】 細胞をインキュベートする間に、１×ペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）を
有するＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡか、または２ｍＭグルタミンおよび１×ペンスト
レップを含むＣＨＯ−５培地（１１６．６ｍｇ／ＬのＣａＣｌ2（無水物）；０
．００１３０ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ4−５Ｈ2Ｏ；０．０５０ｍｇ／ＬのＦｅ（ＮＯ 3 ）3−９Ｈ2Ｏ；０．４１７ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏ；３１１．８０ｍｇ
／ＬのＫＣｌ；２８．６４ｍｇ／ＬのＭｇＣｌ2；４８．８４ｍｇ／ＬのＭｇＳ
Ｏ4；６９９５．５０ｍｇ／ＬのＮａＣｌ；２４００．０ｍｇ／ＬのＮａＨＣＯ3 ；６２．５０ｍｇ／ＬのＮａＨ2ＰＯ4−Ｈ2Ｏ；７１．０２ｍｇ／ＬのＮａ2ＨＰ
Ｏ4；０．４３２０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ4−７Ｈ2Ｏ；０．００２ｍｇ／Ｌのアラ
キドン酸；１．０２２ｍｇ／Ｌのコレステロール；０．０７０ｍｇ／ＬのＤＬ−
α−酢酸トコフェロール；０．０５２０ｍｇ／Ｌのリノール酸；０．０１０ｍｇ
／Ｌのリノレン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのミリスチン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌの
オレイン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミトオレイン酸（ｐａｌｍｉｔｒｉｃ
ａｃｉｄ）；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミチン酸；１００ｍｇ／ＬのＰｌｕｒｏ
ｎｉｃ Ｆ−６８；０．０１０ｍｇ／Ｌのステアリン酸；２．２０ｍｇ／ＬのＴ
ｗｅｅｎ８０；４５５１ｍｇ／ＬのＤ−グルコース；１３０．８５ｍｇ／ｍｌの
Ｌ−アラニン；１４７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アルギニン−ＨＣｌ；７．５０ｍ
ｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン−Ｈ2Ｏ；６．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン
酸；２９．５６ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン２ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ；３１．２９ｍｇ／
ｍｌのＬ−シスチン−２ＨＣｌ；７．３５ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン酸；３６
５．０ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン；１８．７５ｍｇ／ｍｌのグリシン；５２．
４８ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン−ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ；１０６．９７ｍｇ／ｍｌの
Ｌ−イソロイシン；１１１．４５ｍｇ／ｍｌのＬ−ロイシン；１６３．７５ｍｇ
／ｍｌのＬ−リジンＨＣｌ；３２．３４ｍｇ／ｍｌのＬ−メチオニン；６８．４
８ｍｇ／ｍｌのＬ−フェニルアラニン；４０．０ｍｇ／ｍｌのＬ−プロリン；２
６．２５ｍｇ／ｍｌのＬ−セリン；１０１．０５ｍｇ／ｍｌのＬ−スレオニン；
１９．２２ｍｇ／ｍｌのＬ−トリプトファン；９１．７９ｍｇ／ｍｌのＬ−チロ
シン（Ｔｒｙｒｏｓｉｎｅ）−２Ｎａ−２Ｈ2Ｏ；９９．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−
バリン；０．００３５ｍｇ／Ｌのビオチン；３．２４ｍｇ／ＬのＤ−Ｃａパント
テン酸；１１．７８ｍｇ／Ｌの塩化コリン；４．６５ｍｇ／Ｌの葉酸；１５．６
０ｍｇ／Ｌのｉ−イノシトール；３．０２ｍｇ／Ｌのナイアシンアミド；３．０
０ｍｇ／ＬのピリドキサールＨＣｌ；０．０３１ｍｇ／ＬのピリドキシンＨＣｌ
；０．３１９ｍｇ／Ｌのリボフラビン；３．１７ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌ；０
．３６５ｍｇ／Ｌのチミジン；および０．６８０ｍｇ／ＬのビタミンＢ12；２５
ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤；２．３９ｍｇ／ＬのＮａヒポキサンチン；０．１０５
ｍｇ／Ｌのリポ酸；０．０８１ｍｇ／Ｌのプトレシンナトリウム−２ＨＣｌ；５
５．０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム；０．００６７ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナ
トリウム；２０μＭのエタノールアミン；０．１２２ｍｇ／Ｌのクエン酸鉄；リ
ノール酸と複合体化した４１．７０ｍｇ／Ｌのメチル−Ｂ−シクロデキストリン
；オレイン酸と複合体化した３３．３３ｍｇ／Ｌのメチル−Ｂ−シクロデキスト
リン；ならびにレチナールと複合体化した１０ｍｇ／Ｌのメチル−Ｂ−シクロデ
キストリン）のいずれかの適切な培地を調製する（１０％ＢＳＡストック溶液の
ために、１Ｌ ＤＭＥＭ中にＢＳＡ（８１−０６８−３ Ｂａｙｅｒ）１００ｇ
を溶解した）。培地を濾過し、そして５０μｌを内毒素アッセイのために１５ｍ
ｌポリスチレンコニカル中に収集する。
【０９０９】 トランスフェクション反応を、好ましくはタッグチームを組んでインキュベー
ション時間の終わりに終結させる。Ａさんは、トランスフェクション培地を吸引
除去し、その間Ｂさんは、１．５ｍｌの適切な培地を各ウェルに添加する。使用
された培地に依存して４５時間または７２時間、３７℃でインキュベートする：
１％ＢＳＡは４５時間、またはＣＨＯ−５は７２時間。
【０９１０】 ４日目に、３００μｌのマルチチャンネルピペッターを使用して、６００μｌ
を１ｍｌの深底ウェルプレート１枚にアリコートし、そして残りの上清を２ｍｌ
の深底ウェルにアリコートする。次いで、各ウェルからの上清を実施例１３〜２
０に記載するアッセイにおいて使用し得る。
【０９１１】 活性が、上清を使用して以下に記載する任意のアッセイにおいて得られる場合
、この活性は、ポリぺプチドから直接に（例えば、分泌タンパク質として）か、
または他のタンパク質の発現を誘導するポリぺプチドによって（このタンパク質
は、次いで上清中に分泌される）のいずれかに由来することが特に理解される。
従って、本発明はさらに、特定のアッセイにおける活性によって特徴づけられる
上清中のタンパク質を同定する方法を提供する。
【０９１２】 （実施例１２：ＧＡＳレポーター構築物の構築） 細胞の分化および増殖に関与する１つのシグナル伝達経路は、Ｊａｋ−ＳＴＡ
Ｔ経路と呼ばれる。Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴｓ経路において活性化されたタンパク質
は、多くの遺伝子のプロモーターに位置する、γ活性化部位「ＧＡＳ」エレメン
トまたはインターフェロン感受性応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）に結合する。
これらのエレメントに対するタンパク質の結合は、関連する遺伝子の発現を変化
させる。
【０９１３】 ＧＡＳエレメントおよびＩＳＲＥエレメントは、転写のシグナルトランスデュ
ーサーおよびアクチベーター、すなわち「ＳＴＡＴ」と呼ばれるクラスの転写因
子によって認識される。ＳＴＡＴファミリーには６つのメンバーが存在する。Ｓ
ｔａｔ１およびＳｔａｔ３は、Ｓｔａｔ２と同様に（ＩＦＮαに対する応答が広
範であるように）、多くの細胞型において存在する。Ｓｔａｔ４は、より限定さ
れており、そして多くの細胞型には存在しないが、ＩＬ−１２での処理後のＴヘ
ルパークラスＩ細胞に見出されている。Ｓｔａｔ５は、元々は乳房成長因子と呼
ばれたが、骨髄細胞を含む他の細胞においてより高い濃度で見出されている。そ
れは、多くのサイトカインによって組織培養細胞において活性化され得る。
【０９１４】 ＳＴＡＴは活性化されて、Ｊａｎｕｓ Ｋｉｎａｓｅ（「Ｊａｋｓ」）ファミ
リーとして知られる１セットのキナーゼによるチロシンリン酸化に際して細胞質
から核へ移動する。Ｊａｋｓは、可溶性のチロシンキナーゼの独特のファミリー
の代表であり、そしてＴｙｋ２、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＪａｋ３を含む。
これらのキナーゼは、有意な配列類似性を示し、そして一般には休止細胞におい
て触媒的に不活性である。
【０９１５】 Ｊａｋｓは、以下の表において要約されるように広範なレセプターによって活
性化される。（ＳｃｈｉｄｌｅｒおよびＤａｒｎｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．６４：６２１−５１（１９９５）による総説から改変）。Ｊａｋｓ
を活性化し得るサイトカインレセプターファミリーは、２つの群に分けられる：
（ａ）クラス１は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ
−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｅｐｏ、ＰＲＬ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳ
Ｆ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびトロンボポエチンに対するレセプ
ターを含み；そして（ｂ）クラス２は、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−ｇ、およびＩＬ−
１０を含む。クラス１レセプターは、保存されたシステインモチーフ（４つの保
存されたシステインおよび１つのトリプトファンのセット）、およびＷＳＸＷＳ
モチーフ（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（配列番号２）をコードす
る膜近接領域）を共有する。
【０９１６】 従って、リガンドのレセプターへの結合の際に、Ｊａｋｓは活性化され、これ
は次いでＳＴＡＴを活性化し、これは、次いで移動し、そしてＧＡＳエレメント
に結合する。この全プロセスは、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に包含さ
れる。
【０９１７】 それゆえ、ＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントの結合によって反映されるＪａｋ
ｓ−ＳＴＡＴ経路の活性化は、細胞の増殖および分化に関与するタンパク質を示
すために使用され得る。例えば、増殖因子・成長因子およびサイトカインは、Ｊ
ａｋｓ−ＳＴＡＴ経路を活性化することが知られている。（以下の表を参照のこ
と）。従って、レポーター分子に連結したＧＡＳエレメントを使用することによ
り、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴ経路のアクチベーターが同定され得る。
【０９１８】
【表１５】 実施例１３〜１４に記載される生物学的アッセイにおいて使用されるプロモー
ターエレメントを含む合成ＧＡＳを構築するために、ＰＣＲに基づいたストラテ
ジーを用いてＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター配列を生成する。５’プライマーは
、ＩＲＦ１プロモーターにおいて見出され、そして一定の範囲のサイトカインで
の誘導の際にＳＴＡＴに結合することが以前に実証されたＧＡＳ結合部位の４つ
の直列のコピーを含むが（Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４５７−
４６８（１９９４））、他のＧＡＳエレメントまたはＩＳＲＥエレメントを代わ
りに使用し得る。５’プライマーはまた、ＳＶ４０初期プロモーター配列に対し
て相補的な１８ｂｐの配列も含み、そしてＸｈｏＩ部位に隣接する。５’プライ
マーの配列は以下である：
【０９１９】
【化１１７】 下流プライマーはＳＶ４０プロモーターに対して相補的であり、そしてＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位に隣接する：５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧ
ＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列番号４）。
【０９２０】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したＢ−ｇａｌ：プロモータープラ
スミド中に存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを用いて実施する。得
られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いて消化し、そし
てＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。正方向およ
び逆方向のプライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むこと
を確認する：
【０９２１】
【化１１８】 このＧＡＳプロモーターエレメントがＳＶ４０プロモーターに結合されると、
次に、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ２レポーター構築物を操作する。ここで、レポーター分
子は、分泌アルカリホスファターゼ、すなわち「ＳＥＡＰ」である。しかし、明
らかに、この実施例または他の実施例のいずれにおいても、任意のレポーター分
子が、ＳＥＡＰの代わりとなり得る。ＳＥＡＰの代わりに使用され得る周知のレ
ポーター分子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グ
リーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または抗体により検出可能な任意のタンパク
質が挙げられる。
【０９２２】 上記の配列により確認された合成ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーターエレメントを
、ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターを作製するために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ
を用いて、増幅したＧＡＳ：ＳＶ４０プロモーターエレメントでＳＶ４０プロモ
ーターを有効に置換し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＳＥＡＰ−プロモータ
ーベクターにサブクローニングする。しかし、このベクターはネオマイシン耐性
遺伝子を含まず、それゆえ、哺乳動物の発現系には好ましくない。
【０９２３】 従って、ＧＡＳ−ＳＥＡＰレポーターを発現する哺乳動物の安定な細胞株を作
製するために、ＧＡＳ−ＳＥＡＰカセットを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて
ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターから取り出し、そしてＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベク
ターを作製するために、マルチクローニング部位におけるこれらの制限部位を用
いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含むバックボーンベクター（例えば、ｐＧＦＰ
−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に挿入する。一旦、このベクターを哺乳動物細胞に
トランスフェクトすれば、次いでこのベクターは、実施例１３〜１４に記載され
るようにＧＡＳ結合についてのレポーター分子として使用され得る。
【０９２４】 他の構築物を、上記の説明を使用し、そしてＧＡＳを異なるプロモーター配列
で置換して、作製し得る。例えば、ＮＦＫ−ＢおよびＥＧＲプロモーター配列を
含むレポーター分子の構築を、実施例１５および１６に記載する。しかし、多く
の他のプロモーターを、これらの実施例に記載のプロトコルを使用して置換し得
る。例えば、ＳＲＥ、ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、またはオステオカルシンのプロモー
ターを単独で、または組み合わせて（例えば、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ／ＥＧＲ、Ｇ
ＡＳ／ＮＦ−ＫＢ、Ｉｌ−２／ＮＦＡＴ、またはＮＦ−ＫＢ／ＧＡＳ）置換し得
る。同様に、他の細胞株（例えば、ＨＥＬＡ（上皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（内皮細
胞）、Ｒｅｈ（Ｂ細胞）、Ｓａｏｓ−２（骨芽細胞）、ＨＵＶＡＣ（大動脈細胞
）、または心筋細胞）を、レポーター構築物の活性を試験するために使用し得る
。
【０９２５】 （実施例１３：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを使用して、因子を同定すること、および本発明のポリペプ
チドを含有する上清がＴ細胞を増殖および／または分化するか否かを決定するこ
とによって、Ｔ細胞活性を評価する。Ｔ細胞の活性を実施例１２で作製したＧＡ
Ｓ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加さ
せる因子は、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化する能力を示す。
このアッセイに使用したＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号Ｔ
ＩＢ−１５２）であるが、Ｍｏｌｔ−３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５５
２）およびＭｏｌｔ−４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８２）細胞もまた
使用し得る。
【０９２６】 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、リンパ芽球性ＣＤ４＋ Ｔｈ１ヘルパー細胞である
。安定な細胞株を作製するために、およそ２００万のＪｕｒｋａｔ細胞をＤＭＲ
ＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ
／ｎｅｏベクターでトランスフェクトする（以下に記載のトランスフェクション
手順）。トランスフェクトした細胞を、およそ２０，０００細胞／ウェルの密度
で播種し、そして１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）に対して
耐性であるトランスフェクト体を選択する。耐性コロニーを増殖させ、次いで、
漸増する濃度のインターフェロンγに対するそれらの応答について試験する。選
択したクローンの用量応答を示す。
【０９２７】 詳細には、以下のプロトコルにより、２００μｌの細胞を含む７５のウェルに
ついて十分な細胞を得る。従って、複数の９６ウェルプレートについて十分な細
胞を産生するために、これをスケールアップするか、または複数で実施するかの
いずれかを行う。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＲＰＭＩ＋１０％血清および１％のＰｅｎ
−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。Ｔ２５フラスコ中で２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０μｇのプラスミドＤＮＡとを組
み合わせる。５０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃを含む２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを
添加し、そして、室温で１５〜４５分間インキュベートする。
【０９２８】 インキュベート時間の間、細胞濃度をカウントし、必要な細胞数（トランスフ
ェクションあたり１０7個）をスピンダウンし、そして最終濃度が１０7細胞／ｍ
ｌとなるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で再懸濁する。次いで、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中
の１×１０7個の細胞の１ｍｌをＴ２５フラスコに加え、そして３７℃で６時間
インキュベートする。インキュベーションの後、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％の
血清を添加する。
【０９２９】 Ｊｕｒｋａｔ：ＧＡＳ−ＳＥＡＰ安定レポーター株をＲＰＭＩ＋１０％血清、
１ｍｇ／ｍｌジェネティシン、および１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。
これらの細胞は、本発明のポリペプチドを含む上清で処理されるか、および／ま
たは実施例１１に記載のプロトコールにより産生されたような本発明のポリペプ
チドを誘導される。
【０９３０】 上清での処理日に細胞を洗浄すべきであり、そして１ｍｌあたり５００，００
０個の細胞の密度となるように新鮮なＲＰＭＩ＋１０％血清中に再懸濁するべき
である。必要な細胞の正確な数は、スクリーニングされる上清の数に依存する。
１枚の９６ウェルプレートについて、およそ１０００万個の細胞（１０枚のプレ
ートについて１億個の細胞）を必要とする。
【０９３１】 細胞を、１２チャンネルのピペットを用いて９６ウェルのディッシュに細胞を
分与するために、三角のリザーバーボートに細胞を移す。２００μｌの細胞を、
１２チャンネルのピペットを用いて、それぞれのウェルに移す（従って、ウェル
当たり１００，０００個の細胞を添加する）。
【０９３２】 全てのプレートに播種した後、５０μｌの上清を、１２チャンネルピペットを
用いて、上清を含む９６ウェルプレートから各ウェルに直接的に移す。さらに、
外来性のインターフェロンγの用量（０．１、１．０、１０ｎｇ）を、ウェルＨ
９、ウェルＨ１０、およびウェルＨ１１に添加し、アッセイについてのさらなる
陽性コントロールとして使用する。
【０９３３】 上清で処理したＪｕｒｋａｔ細胞を含む９６ウェルディッシュをインキュベー
ターに４８時間置く（注記：この時間は４８〜７２時間の間で変更可能である）
。次いで、各ウェルから３５μｌのサンプルを１２チャンネルのピペットを用い
て、不透明な９６ウェルプレートに移す。不透明なプレートを（セロファンのカ
バーを用いて）覆うべきであり、そして実施例１７に記載のＳＥＡＰアッセイを
実施するまで、−２０℃で保存するべきである。残存する処理した細胞を含むプ
レートを４℃に置き、そして、所望するならば、特定のウェル上でのアッセイを
繰り返すための物質の供給源として供する。
【０９３４】 陽性コントロールとして、１００ユニット／ｍｌのインターフェロンγを使用
し得、これは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を活性化することが公知である。代表的に
は、３０倍を超える誘導が、陽性コントロールのウェルにおいて観察される。
【０９３５】 上述のプロトコルは、一過性および安定性の両方のトランスフェクト細胞の作
製に用いられ得、このことは当業者に明らかである。
【０９３６】 （実施例１４：骨髄性の活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを使用して、本発明のポリペプチドが骨髄性細胞を増殖およ
び／または分化させるか否かを決定することにより骨髄性の活性を評価する。骨
髄性細胞の活性を実施例１２において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築
物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋｓ−Ｓ
ＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化させる能力を示す。このアッセイに使用した
骨髄性細胞は、Ｕ９３７（前単球（ｐｒｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ）細胞株である）
が、ＴＦ−１、ＨＬ６０、またはＫＧ１も使用し得る。
【０９３７】 Ｕ９３７細胞を、実施例１２において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構
築物で、一過性にトランスフェクトするために、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（
Ｋｈａｒｂａｎｄａら、１９９４，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ，５：２５９−２６５）を用いる。最初に、２×１０ｅ7個
のＵ９３７細胞を回収し、そしてＰＢＳで洗浄する。Ｕ９３７細胞を、通常、１
００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補
充した１０％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地中
で増殖させる。
【０９３８】 次に、０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、８μｇのＧＡＳ−ＳＥ
ＡＰ２プラスミドＤＮＡ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３７５μＭ
Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、および６７５μＭ ＣａＣｌ2
を含む１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液に細胞を懸
濁する。３７℃で４５分間インキュベートする。
【０９３９】 １０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を洗浄し、次いで、１０
ｍｌの完全培地に再懸濁し、そして３７℃で３６時間インキュベートする。
【０９４０】 ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｕ９３７安定細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細
胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を使用して、慣用的に
増殖させるが、１〜２ヶ月毎に細胞を二継代の間、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８
中で再増殖させるべきである。
【０９４１】 これらの細胞を１×１０8個の細胞（これは１０枚の９６ウェルプレートアッ
セイのために十分である）を回収することにより試験し、そしてＰＢＳで洗浄す
る。上記の２００ｍｌの増殖培地中に、５×１０5細胞／ｍｌの最終密度で細胞
を懸濁する。９６ウェルプレートにおいてウェルあたり２００μｌの細胞（すな
わち、１×１０5細胞／ウェル）をプレートする。
【０９４２】 実施例１１に記載されるプロトコルにより調製された上清の５０μｌを添加す
る。３７℃で４８〜７２時間インキュベートする。陽性コントロールとして、１
００単位／ｍｌのインターフェロンγを使用し得、これはＵ９３７細胞を活性化
させることが公知である。代表的には、３０倍を超える誘導が、陽性コントロー
ルウェルにおいて観察される。実施例１７に記載のプロトコルに従って上清をＳ
ＥＡＰアッセイする。
【０９４３】 （実施例１５：ニューロン活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ
） 細胞が分化および増殖を経る場合、一群の遺伝子が多くの異なるシグナル伝達
経路を介して活性化される。これらの遺伝子の１つであるＥＧＲ１（初期増殖応
答遺伝子１）は、活性化時に種々の組織および細胞型において誘導される。ＥＧ
Ｒ１のプロモーターはこのような誘導を担う。レポーター分子に結合したＥＧＲ
１プロモーターを使用して、細胞の活性化を評価し得る。
【０９４４】 詳細には、以下のプロトコルをＰＣ１２細胞株におけるニューロン活性を評価
するために使用する。ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫（ｐｈｅｎｏｃｈｒｏｍ
ｏｃｙｔｏｍａ）細胞）は、多くのマイトジェン（例えば、ＴＰＡ（テトラデカ
ノイルホルボールアセテート）、ＮＧＦ（神経成長因子）、およびＥＧＦ（上皮
増殖因子））での活性化により、増殖および／または分化することが公知である
。この処理の間にＥＧＲ１遺伝子発現を活性化する。従って、ＳＥＡＰレポータ
ーに結合したＥＧＲプロモーターを含む構築物でＰＣ１２細胞を安定にトランス
フェクトすることにより、ＰＣ１２細胞の活性化を評価し得る。
【０９４５】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰレポーター構築物を以下のプロトコルにより組み立て得る。
ＥＧＲ−１プロモーター配列（−６３３〜＋１）（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋら、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ ６：８６７−８７１（１９９１））を以下のプライマーを用い
て、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し得る： ５’ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＡＴＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧ−
３’（配列番号６） ５’ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＣＴＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣ−３
’（配列番号７）。
【０９４６】 次いで、実施例１２において作製したＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを使
用して、ＥＧＲ１増幅産物をこのベクターに挿入し得る。制限酵素ＸｈｏＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩを使用してＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを直鎖状化し、ＧＡ
Ｓ／ＳＶ４０スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を取り除く。これらと同じ酵素を
用いて、ＥＧＲ１増幅産物を制限処理する。ベクターとＥＧＲ１プロモーターと
を連結する。
【０９４７】 細胞培養のための９６ウェルプレートを調製するために、コーティング溶液（
コラーゲンＩ型（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．カタログ番号０８
−１１５）の３０％エタノール（滅菌濾過）での１：３０希釈）を１つの１０ｃ
ｍプレートあたり２ｍｌ、または９６ウェルプレートのウェルあたり５０ｍｌ添
加し、そして２時間風乾させる。
【０９４８】 ＰＣ１２細胞を、予めコートした１０ｃｍ組織培養ディッシュ上で、ペニシリ
ン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充
した、１０％ウマ血清（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カタログ番号１２４
４９−７８Ｐ）、５％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４
０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で慣用的に増殖させる。１つから４つ
への分割を３〜４日毎に行う。細胞を掻き取ることによりプレートから取り出し
、そして１５回より多く上下にピペッティングして再懸濁する。
【０９４９】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を、実施例１１に記載のＬｉｐｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅプロトコルを使用して、ＰＣ１２にトランスフェクトする。ＥＧＲ−Ｓ
ＥＡＰ／ＰＣ１２安定細胞を、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を増殖させ
ることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を慣用的な増殖のために使用するが
、１〜２ヶ月毎に、細胞を２継代の間、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で再増殖
させるべきである。
【０９５０】 ニューロン活性をアッセイするために、およそ７０〜８０％コンフルエントで
細胞を有する１０ｃｍプレートを、古い培地を除去することによりスクリーニン
グする。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）を用いて１回洗浄する。次い
で、細胞を低血清培地（抗生物質とともに１％ウマ血清および０．５％ ＦＢＳ
を含むＲＰＭＩ−１６４０）中で一晩、飢餓（ｓｔａｒｖｅ）させる。
【０９５１】 翌朝、培地を除去し、そしてＰＢＳで細胞を洗浄する。プレートから細胞を掻
き取り、細胞のウェルを２ｍｌの低血清培地中で懸濁する。細胞数をカウントし
、そしてより低血清の培地を添加し、５×１０5細胞／ｍｌの最終細胞密度に到
達させる。
【０９５２】 ２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加する（１×１
０5細胞／ウェルに等しい）。実施例１１により産生された５０μｌの上清を、
３７℃で４８〜７２時間添加する。陽性コントロールとして、ＥＧＲを介してＰ
Ｃ１２細胞を活性化することが公知の成長因子（例えば、５０ｎｇ／μｌの神経
成長因子（ＮＧＦ））を使用し得る。代表的には、５０倍を超えるＳＥＡＰ誘導
が陽性コントロールウェルにおいて見られる。実施例１７に従って、上清をＳＥ
ＡＰアッセイする。
【０９５３】 （実施例１６：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） ＮＦ−κＢ（核因子κＢ）は、広範な種々の薬剤（炎症性サイトカインである
ＩＬ−１およびＴＮＦ、ＣＤ３０およびＣＤ４０、リンホトキシン−αおよびリ
ンホトキシン−βを含む）により、ＬＰＳまたはトロンビンへの曝露により、な
らびに特定のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される転写因子である。転
写因子として、ＮＦ−κＢは免疫細胞の活性化に関与する遺伝子の発現、アポト
ーシスの制御（ＮＦ−κＢは、アポトーシスから細胞を保護するようである）、
Ｂ細胞およびＴ細胞の発生、抗ウイルス応答および抗菌応答、ならびに複数のス
トレス応答を調節する。
【０９５４】 刺激されない条件において、ＮＦ−κＢは、Ｉ−κＢ（インヒビターκＢ）を
有する細胞質に保持される。しかし、刺激の際に、Ｉ−κＢはリン酸化され、そ
して分解され、ＮＦ−κＢの核への往復（ｓｈｕｔｔｌｅ）を引き起こし、これ
により標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−κＢにより活性化される標的遺伝
子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ−１およびクラス１
ＭＨＣが挙げられる。
【０９５５】 その中心的な役割および一定の範囲の刺激に応答する能力に起因して、ＮＦ−
κＢプロモーターエレメントを利用するレポーター構築物を、実施例１１におい
て産生された上清をスクリーニングするために使用する。ＮＦ−κＢのアクチベ
ーターまたはインヒビターは、疾患の処置に有用である。例えば、ＮＦ−κＢの
インヒビターを、急性または慢性的なＮＦ−κＢの活性化に関連する疾患（例え
ば、慢性関節リウマチ）を処置するために使用し得る。
【０９５６】 ＮＦ−κＢプロモーターエレメントを含むベクターを構築するために、ＰＣＲ
に基づいたストラテジーを用いる。上流のプライマーは、ＮＦ−κＢ結合部位（
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ）（配列番号８）の４つの直列のコピー、ＳＶ４０初
期プロモーター配列の５’末端に対して相補的な１８ｂｐの配列を含み、そして
ＸｈｏＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡ
ＴＴＡＧ：３’（配列番号９）。
【０９５７】 下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターの３’末端に対して相補的であり、
そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列
番号４）。
【０９５８】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＢ−ｇａｌ：プロモータープ
ラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを使用して実施する。
得られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして
ＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。Ｔ７およびＴ
３プライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むことを確認す
る：
【０９５９】
【化１１９】 次に、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＳＥＡＰ２−プロモータ
ープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＳＶ４０最小プロモーターエレメ
ントをこのＮＦ−κＢ／ＳＶ４０フラグメントで置換する。しかし、このベクタ
ーはネオマイシン耐性遺伝子を含まず、そしてそれゆえ哺乳動物の発現系には好
ましくない。
【０９６０】 安定な哺乳動物細胞株を作製するために、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカ
セットを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用して上記のＮＦ−κＢ／ＳＥＡ
Ｐベクターから取り出し、そしてネオマイシン耐性を含むベクターに挿入する。
詳細には、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでｐＧＦＰ−１を制限処理した後に、ＮＦ−
κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットをｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入
し、ＧＦＰ遺伝子を置換した。
【０９６１】 一旦、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製すると、実施
例１３に記載のプロトコルに従って、安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を作製し、そ
して維持する。同様に、これらの安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を含む上清をアッ
セイするための方法がまた、実施例１３に記載される。陽性コントロールとして
、外因性のＴＮＦα（０．１、１、１０ｎｇ）をウェルＨ９、Ｈ１０、およびＨ
１１に添加し、代表的には、５〜１０倍の活性化が観察される。
【０９６２】 （実施例１７：ＳＥＡＰ活性についてのアッセイ） 実施例１３〜１６に記載されるアッセイのためのレポーター分子として、ＳＥ
ＡＰ活性を、以下の一般的な手順に従ってＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉ
ｇｈｔ Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＰ−４００）を用いてアッセイする。Ｔｒｏｐ
ｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔは、以下で使用される希釈、アッセ
イ、および反応の緩衝液を供給する。
【０９６３】 ディスペンサーに２．５×希釈緩衝液を満たし、そして１５μｌの２．５×希
釈緩衝液を３５μｌの上清を含むオプティプレート（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）に分
与する。プラスチックシーラーでプレートをシールし、そして６５℃で３０分間
インキュベートする。一様でない加温を避けるためにオプティプレートを離して
おく。
【０９６４】 サンプルを室温まで１５分間冷却する。ディスペンサーを空にし、そしてアッ
セイ緩衝液を満たす。５０ｍｌのアッセイ緩衝液を添加し、そして室温で５分間
インキュベートする。ディスペンサーを空にし、そして反応緩衝液を満たす（以
下の表を参照のこと）。５０μｌの反応緩衝液を添加し、そして室温で２０分間
インキュベートする。化学発光シグナルの強度は時間依存的であり、そしてルミ
ノメーターで５つのプレートを読み取るために約１０分間を費やすので、各回に
５つのプレートを処理し、１０分後に２つ目のセットを開始させるべきである。
【０９６５】 ルミノメーターにおける相対光単位（ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を読み取る。ブ
ランクとしてＨ１２をセットし、そして結果を印字する。化学発光の増加は、レ
ポーター活性を示す。
【０９６６】
【表１６】 （実施例１８：低分子の濃度および膜透過性における変化を同定する高処理能
力スクリーニングアッセイ） レセプターへのリガンドの結合は、カルシウム、カリウム、ナトリウムのよう
な低分子およびｐＨの細胞内レベルを変化させ、ならびに膜電位を変化させるこ
とが公知である。これらの変化を特定細胞のレセプターに結合する上清の同定す
るためのアッセイで測定し得る。以下のプロトコルは、カルシウムについてのア
ッセイを記載するが、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位
、または蛍光プローブにより検出可能な任意の他の低分子における変化を検出す
るように容易に改変され得る。
【０９６７】 以下のアッセイは、蛍光測定画像化プレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒ
ｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）（「ＦＬＩＰＲ」）を使用
して低分子と結合する蛍光分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）における
変化を測定する。明らかに、低分子を検出する任意の蛍光分子を、本明細書で用
いるカルシウム蛍光分子、ｆｌｕｏ−４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，
Ｉｎｃ．；カタログ番号Ｆ−１４２０２）の代わりに使用し得る。
【０９６８】 接着細胞については、細胞を１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルで、底
が透明なＣｏ−ｓｔａｒ黒色９６ウェルプレートに播種する。プレートをＣＯ2
インキュベーター内で２０時間インキュベートする。接着細胞をＢｉｏｔｅｋ洗
浄器内で２００μｌのＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）で二回洗浄し、最後の
洗浄後、１００μｌの緩衝液を残す。
【０９６９】 １ｍｇ／ｍｌのｆｌｕｏ−４のストック溶液を１０％プルロニック酸（ｐｌｕ
ｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ＤＭＳＯで作製する。細胞にｆｌｕｏ−４を負荷するた
め、１２μｇ／ｍｌのｆｌｕｏ−４（５０μｌ）を各ウェルに添加する。このプ
レートをＣＯ2インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベートする。プ
レートをＢｉｏｔｅｋ洗浄器で、ＨＢＳＳにより４回洗浄し、１００μｌの緩衝
液を残す。
【０９７０】 非接着細胞については、細胞を培養培地からスピンダウンする。細胞を、５０
ｍｌのコニカルチューブ内でＨＢＳＳを用いて２〜５×１０6細胞／ｍｌに再懸
濁する。細胞懸濁液１ｍｌあたりに対し、１０％プルロニック酸ＤＭＳＯ中の１
ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−４溶液４μｌを添加する。次に、チューブを３７℃の水
浴中に３０〜６０分間置く。細胞をＨＢＳＳで二回洗浄し、１×１０6細胞／ｍ
ｌに再懸濁し、そしてマイクロプレートに１００μｌ／ウェルで分配する。プレ
ートを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。次に、プレートをＤｅｎｌｅｙ
ＣｅｌｌＷａｓｈ中で２００μｌで一回洗浄した後、吸引工程により最終容量を
１００μｌにする。
【０９７１】 非細胞ベースのアッセイについて、各ウェルは、ｆｌｕｏ−４のような蛍光分
子を含有する。上清をウェルに添加し、そして蛍光における変化を検出する。
【０９７２】 細胞内カルシウムの蛍光を測定するため、ＦＬＩＰＲを以下のパラメーターに
ついて設定する：（１）システムゲイン（Ｓｙｓｔｅｍ ｇａｉｎ）は、３００
〜８００ｍＷであり；（２）曝露時間は、０．４秒間であり；（３）カメラＦ／
ストップは、Ｆ／２であり；（４）励起は４８８ｎｍであり；（５）発光は５３
０ｎｍであり；そして（６）サンプル添加は５０μｌである。５３０ｎｍにおけ
る発光の増加は、細胞内Ｃａ++濃度の増加を生じる、細胞外シグナル伝達事象を
示す。
【０９７３】 （実施例１９：チロシンキナーゼ活性を同定する高処理能力スクリーニングア
ッセイ） プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、多様な群の膜貫通キナーゼおよび
細胞質キナーゼを表す。レセプタープロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）群
内に、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦおよびインスリンレセプター
サブファミリーを含む、一定の範囲のマイトジェン性および代謝性成長因子のレ
セプターがある。さらに、対応するリガンドが未知である大きなＲＰＴＫファミ
リーがある。ＲＰＴＫのリガンドは、主として分泌される低分子量タンパク質を
含むが、膜結合型および細胞外マトリックスタンパク質も含む。
【０９７４】 リガンドによるＲＰＴＫの活性化は、リガンド媒介レセプター二量体化を含み
、これはレセプターサブユニットのトランスリン酸化および細胞質チロシンキナ
ーゼの活性化を生じる。細胞質チロシンキナーゼとしては、ｓｒｃファミリー（
例えば、ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）のレセプター関連チロシン
キナーゼ、ならびにＪａｋファミリーのような非レセプター結合型および細胞質
ゾルプロテインチロシンキナーゼが挙げられる。これらのメンバーは、レセプタ
ーのサイトカインスーパーファミリー（例えば、インターロイキン、インターフ
ェロン、ＧＭ−ＣＳＦおよびレプチン（Ｌｅｐｔｉｎ））によって誘発されるシ
グナル伝達を媒介する。
【０９７５】 チロシンキナーゼ活性を刺激し得る公知の因子は広範であるので、チロシンキ
ナーゼシグナル伝達経路を活性化し得る新規なヒト分泌タンパク質の同定は興味
深い。従って、以下のプロトコルを設計して、チロシンキナーゼシグナル伝達経
路を活性化し得るこれらの新規なヒト分泌タンパク質を同定する。
【０９７６】 標的細胞（例えば、初代ケラチノサイト）を約２５，０００細胞／ウェルの密
度で、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入した９６
ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅに播種す
る。プレートを１００％エタノールで３０分間、二回リンスして滅菌し、水でリ
ンスし、そして一晩乾燥させる。幾つかのプレートを、１００ｍｌの細胞培養グ
レードＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）またはポリリジン
（５０ｍｇ／ｍｌ）（これらは全て、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る）で、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した１０％ Ｍａｔｒｉｇｅｌ、あるい
は仔ウシ血清で２時間コーティングし、ＰＢＳでリンスし、そして４℃で保存す
る。増殖培地に５，０００細胞／ウェルを播種し、製造業者のＡｌａｍａｒ Ｂ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）が記載するよ
うに、ａｌａｍａｒＢｌｕｅを使用して４８時間後に細胞数を間接定量すること
により、これらのプレート上の細胞増殖をアッセイする。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＦａｌｃｏｎプレートカバー＃３０７
１を使用して、Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅ
を覆う。Ｆａｌｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ ＩＩＩ細胞培養プレートもまた、
いくつかの増殖実験において使用され得る。
【０９７７】 抽出物を調製するために、Ａ４３１細胞をＬｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイ
ロンメンブレン上に播種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、そして完全
培地中で一晩培養する。細胞を、無血清基本培地中で２４時間インキュベートし
て静止させる。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）または実施例１１で生成した上清５０
μｌで５〜２０分間処理した後、培地を除去し、そして１００ｍｌの抽出緩衝液
（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００，０．１％ＳＤＳ、２ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、２ｍＭ Ｎａ4Ｐ2Ｏ7お
よびＢｏｅｈｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，
ＩＮ）から入手したプロテアーゼインヒビターのカクテル（＃１８３６１７０）
）を各ウェルに添加し、そしてプレートを回転振盪器上、４℃で５分間振盪する
。次に、プレートを真空トランスファーマニホルド（ｖａｃｕｕｍ ｔｒａｎｓ
ｆｅｒ ｍａｎｉｆｏｌｄ）に設置し、そしてハウスバキュームを使用して抽出
物を各ウェルの底の０．４５ｍｍ膜を通して濾過する。抽出物をバキュームマニ
ホールドの底の９６ウェル捕獲／アッセイプレートに集め、そして直ちに氷上に
置く。遠心分離により明澄化した抽出物を得るため、界面活性剤で５分間可溶化
した後、各ウェルの含有物を取り出し、そして４℃にて１６，０００×ｇで１５
分間遠心分離する。
【０９７８】 濾過抽出物をチロシンキナーゼ活性のレベルについて試験する。チロシンキナ
ーゼ活性を検出する多数の方法が公知であるが、本明細書においては方法の一つ
を記載する。
【０９７９】 一般的に、特定の基質（ビオチン化ペプチド）上のチロシン残基をリン酸化す
る能力を決定することにより、上清のチロシンキナーゼ活性を評価する。この目
的に使用され得るビオチン化ペプチドとしては、ＰＳＫ１（細胞分裂キナーゼｃ
ｄｃ２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に相当）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミ
ノ酸１〜１７に相当）が挙げられる。両方のペプチドは、一定範囲のチロシンキ
ナーゼの基質であり、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能で
ある。
【０９８０】 以下の成分を順に添加することにより、チロシンキナーゼ反応を設定する。ま
ず、５μＭビオチン化ペプチド１０μｌを添加した後、次いで、１０μｌのＡＴ
Ｐ／Ｍｇ2+（５ｍＭ ＡＴＰ／５０ｍＭ ＭｇＣｌ2）、次いで１０μｌの５×
アッセイ緩衝液（４０ｍＭ塩酸イミダゾール、ｐＨ７．３、４０ｍＭ β−グリ
セロリン酸塩、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＭｎＣｌ2 、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、次いでバナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）５μｌ
、次いで水５μｌを添加する。成分を穏やかに混合し、反応混合物を３０℃で２
分間プレインキュベートする。コントロール酵素または濾過上清１０μｌを加え
て反応を開始させる。
【０９８１】 次に、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ １０μｌを添加することによりチロシンキナー
ゼアッセイ反応を停止し、その反応物を氷上に置く。
【０９８２】 反応混合物の５０μｌのアリコートをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モ
ジュールに移し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、チロシンキ
ナーゼ活性を測定する。これにより、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａ
ｄｉｎ）コーティング９６ウェルプレートをビオチン化ペプチドと会合させる。
ＭＴＰモジュールを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、西洋ワ
サビペルオキシダーゼに結合体化した抗ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｏｔｙｒｏ
ｓｉｎｅ）抗体（抗Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））７５μｌを、各ウ
ェルに添加し、そして３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記のよう
に洗浄する。
【０９８３】 次に、ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）１００μｌを加え、室温で少なくとも５分間（最長３０分間）インキュベート
する。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４０５ｎｍにおけるサンプルの吸光度を
測定する。結合したペルオキシダーゼ活性のレベルをＥＬＩＳＡリーダーを使用
して定量する。これは、チロシンキナーゼ活性のレベルを反映する。
【０９８４】 （実施例２０：リン酸化活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 実施例１９に記載のプロテインチロシンキナーゼ活性アッセイの可能性のある
代替物および／または補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）として、主要な細胞内シグ
ナル伝達中間体の活性化（リン酸化）を検出するアッセイもまた使用し得る。例
えば、下記のように、一つの特定のアッセイは、Ｅｒｋ−１キナーゼおよびＥｒ
ｋ−２キナーゼのチロシンリン酸化を検出し得る。しかし、Ｒａｆ、ＪＮＫ、ｐ
３８ ＭＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ、
筋肉特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＩＲＡＫ、ＴｅｃおよびＪａｎｕｓのような
他の分子、ならびに他の任意のホスホセリン、ホスホチロシンまたはホスホスレ
オニン分子のリン酸化を、以下のアッセイにおいてこれらの分子でＥｒｋ−１ま
たはＥｒｋ−２を置き換えることにより検出し得る。
【０９８５】 詳細には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルをプロテインＧ（１μｇ／
ｍｌ）０．１ｍｌにより室温（ＲＴ）で２時間コーティングしてアッセイプレー
トを作製する。次に、プレートをＰＢＳでリンスし、そして３％ＢＳＡ／ＰＢＳ
によりＲＴで１時間ブロックする。次に、プロテインＧプレートをＥｒｋ−１お
よびＥｒｋ−２に対する二つの市販のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル
）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理（ＲＴで１時
間）する。（他の分子を検出するために、上記の任意の分子を検出するモノクロ
ーナル抗体を交換することにより、この工程を容易に改変し得る。）ＰＢＳで３
〜５回リンスした後、使用時まで、プレートを４℃で貯蔵する。
【０９８６】 Ａ４３１細胞を２０，０００／ウェルで９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィル
タープレートに播種し、そして増殖培地中で一晩培養する。次に、細胞を基本培
地（ＤＭＥＭ）中で４８時間飢餓させ、次いでＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）または
実施例１１で得た上清５０μｌで５〜２０分間処理する。次に、細胞を可溶化し
、そして抽出物を濾過して直接アッセイプレート中に入れる。
【０９８７】 抽出物を用いてＲＴで１時間インキュベートした後、ウェルを再度リンスする
。陽性コントロールとして、市販のＭＡＰキナーゼ調製物（１０ｎｇ／ウェル）
をＡ４３１抽出物の代わりに使用する。次に、プレートを、Ｅｒｋ−１キナーゼ
およびＥｒｋ−２キナーゼのリン酸化エピトープを特異的に認識する市販のポリ
クローナル（ウサギ）抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理する（ＲＴで１時間）。この
抗体を標準的な手順によりビオチン化する。次に、Ｗａｌｌａｃ ＤＥＬＦＩＡ
装置内で、結合ポリクローナル抗体をユーロピウムストレプトアビジンおよびユ
ーロピウム蛍光増強剤と連続的にインキュベートする（時間分解性蛍光）ことに
よって定量する。バックグラウンドを超える蛍光シグナルの増加は、リン酸化を
示す。
【０９８８】 （実施例２１：ポリヌクレオチドに対応する遺伝子における変化の決定方法） 目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者から単離
されたＲＮＡを単離する。次に、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分
野で公知のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。
次に、このｃＤＮＡを、配列番号Ｘにおける目的の領域を取り囲むプライマーを
用いるＰＣＲのテンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄ
ｒａｎｓｋｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）に記載の緩衝溶
液を使用し、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；および７０
℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルからなる。
【０９８９】 次に、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐｉ
ｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、５’末端にＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。選択したエキソ
ンのイントロン−エキソン境界もまた決定し、ゲノムＰＣＲ産物を分析してその
結果を確認する。次に、疑わしい変異を有するＰＣＲ産物のクローン化および配
列決定を行い、直接配列決定の結果を確認する。
【０９９０】 ＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ，１９：１１５６（１９９１）に記載のようにＴテールベクターにクローン
化し、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ）で配列決定する。罹患個体を、非罹患個体には存在しない変異により同定す
る。
【０９９１】 ゲノム再配置もまた、ポリヌクレオチドに対応する遺伝子における改変を決定
する方法として観察する。実施例２に従って単離したゲノムクローンを、ジゴキ
シゲニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈ
ｅｉｍ）を用いてニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎら、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３５： ７３−９９（１９９１）に記載の
ようにＦＩＳＨを行う。対応するゲノムの遺伝子座への特異的ハイブリダイゼー
ションのために、大過剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて標識プローブとのハ
イブリダイゼーションを行う。
【０９９２】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウム
で対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピ
ングのための整列イメージを、三重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）と冷却電荷結合素子カメ
ラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および可変励起波長フィ
ルター（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８
：７５（１９９１））とを組み合わせて用いて得る。ＩＳｅｅ Ｇｒａｐｈｉｃ
ａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ， Ｄｕｒｈａｍ， ＮＣ）を使用して、イメージ収集、分析および染
色体部分長測定を行う。プローブがハイブリダイズしたゲノム領域の染色体変化
を、挿入、欠失および転座として同定する。これらの変化を関連疾患の診断マー
カーとして使用する。
【０９９３】 （実施例２２：生物学的サンプル中のポリペプチドの異常レベルを検出する方
法） 本発明のポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてポリペプチ
ドレベルの上昇または低下が検出されるなら、このポリペプチドは、特定表現型
のマーカーである。検出方法は数多くあり、そしてそれ故、当業者は以下のアッ
セイをそれらの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解される。
【０９９４】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、サンプル中、好ましくは、生
物学的サンプル中のポリペプチドを検出する。マイクロタイタープレートのウェ
ルを、特異的抗体を最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌで用いてコーティングする
。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであって、実施
例１０に記載の方法により産生される。ウェルに対するポリペプチドの非特異的
結合が減少するように、このウェルをブロックする。
【０９９５】 次に、コーティングしたウェルを、ポリペプチド含有サンプルを用いてＲＴで
２時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系列希釈を使用し
て結果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水で三回洗
浄し、非結合ポリペプチドを除去する。
【０９９６】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イオン水
または蒸留水で三回洗浄し、未結合の結合体を除去する。
【０９９７】 ４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートする。反応物をマイクロタイタープレートリーダーにより測定する。コ
ントロールサンプルの系列希釈を使用して検量線を作成し、そしてＸ軸（対数ス
ケール）にポリペプチド濃度を、そしてＹ軸（直線スケール）に蛍光または吸光
度をプロットする。検量線を用いてサンプル中のポリペプチド濃度を補間する。
【０９９８】 （実施例２３：処方） 本発明はまた、有効量の治療剤の被験体への投与による、疾患または障害（例
えば、本明細書中に開示される１以上の疾患または障害のいずれかのような）の
処置および／または予防の方法を提供する。治療剤は、薬学的に受容可能なキャ
リア型（例えば、滅菌キャリア）と組み合せた、本発明のポリヌクレオチドまた
はポリペプチド（フラグメントおよび改変体を含む）、それらのアゴニストまた
はアンタゴニスト、ならびに／あるいはそれらに対する抗体を意味する。
【０９９９】 治療剤を、個々の患者の臨床状態（特に、治療剤単独処置の副作用）、送達部
位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施
基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方お
よび投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような
考慮を行って決定される。
【１０００】 一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効
量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、
上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、このホルモン
について、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒ
トに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続
投与する場合、代表的には、治療剤を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ
／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポ
ンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得
る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、
所望の効果に応じて変化するようである。
【１００１】 治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌ
ｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチに
よるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与し得る。「薬学的
に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈
剤、被包材または任意の型の処方補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口
的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注
入を含む投与の様式をいう。
【１００２】 本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療
剤の適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａ
ｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッ
チによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与される。「薬
学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、
希釈剤、被包材または任意の型の処方補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非
経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射およ
び注入を含む投与の様式をいう。
【１００３】 本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療
剤の適切な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまた
はマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性
物質（例えば、許容品質油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、お
よび貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩）を包含する。
【１００４】 徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９
号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメー
トのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５
５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇ
ｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９
８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９
８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ
−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【１００５】 徐放性治療剤はまた、リポソームに包括された本発明の治療剤を包含する（一
般に、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０
）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ
−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）。治
療剤を含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製され得る：
ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４０３０−４０３４（
１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１
４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；
米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ
第１０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニ
ラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも
多く、選択された割合が、最適治療剤のために調整される。
【１００６】 なおさらなる実施形態において、本発明の治療剤は、ポンプにより送達される
（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅ
ｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ
８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３
２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
【１００７】 他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５
３３（１９９０））による総説において議論される。
【１００８】 非経口投与のために、１つの実施形態において、一般に、治療剤は、それを所
望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および
濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するもの
と、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合すること
により処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、および治療剤
に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【１００９】 一般に、治療剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方
と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物
を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より
好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビ
ヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液
が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもま
た、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【１０１０】 キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩
、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のよう
な抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリア
ルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリ
ンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシ
ン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロ
ースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖
類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール
またはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；およ
び／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界
面活性剤が挙げられる。
【１０１１】 治療剤は、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１
〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に処方さ
れる。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、ポ
リペプチド塩が形成されることが理解される。
【１０１２】 治療的投与に用いられる任意の薬剤は無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例え
ば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成され
る。一般に、治療剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射
針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される
。
【１０１３】 治療剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたは
バイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。
凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ
）治療剤水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾
燥した治療剤を、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。
【１０１４】 本発明はまた、本発明の治療剤の１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を
備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造
、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に
付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政
府機関による承認を表す。さらに、本発明の治療剤を他の治療用化合物と組み合
わせて使用し得る。
【１０１５】 本発明の治療剤は、単独またはアジュバントと組合わせて投与され得る。本発
明の治療剤と組合わせて投与され得るアジュバントとしては、ミョウバン、ミョ
ウバン＋デオキシコレート（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎ
ｅ Ｃｏｒｐ．）、ＱＳ２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧおよび
ＭＰＬが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発
明の治療剤は、ミョウバンとの組み合わせで投与される。別の実施形態において
、本発明の治療剤は、ＱＳ−２１との組み合わせで投与される。本発明の治療剤
と共に投与され得るさらなるアジュバントとしては、モノホスホリル脂質免疫調
節剤、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、
アルミニウム塩、ＭＦ−５９およびＶｉｒｓｏｍａｌアジュバント技術が挙げら
れるが、これに限定されない。本発明の治療剤と共に投与され得るワクチンとし
ては、以下に対する保護に指向されるワクチンを含むが、これらに限定されない
：ＭＭＲ（麻疹、流行性耳下腺炎、風疹）、ポリオ（ｐｏｌｉｏ）、水痘、破傷
風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエンザ、百日咳（ｗｈｏｏ
ｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ）、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイルス、コ
レラ、黄熱病、日本脳炎、ポリオ（ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、狂犬病、腸
チフスおよび百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）。組合わせは、例えば、混合物とし
て同時に；同時にまたは並行してだが別々に；あるいは経時的のいずれかで投与
され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療用混合物として共に投与される
という提示、およびまた、組み合わされた薬剤が、別々にしかし同時に、例えば
、同じ個体に別々の静脈ラインを通じて投与される手順を含む。「組合わせて」
の投与は、一番め続いて二番目に与えられる化合物または薬剤のうち１つの別々
の投与をさらに含む。
【１０１６】 本発明の治療剤は、単独または他の治療剤と組合わせて投与され得る。本発明
の治療剤と組合わせて投与され得る治療剤としては、ＴＮＦファミリーの他のメ
ンバー、化学療法剤、抗生物質、ステロイドおよび非ステロイドの抗炎症剤、従
来の免疫治療剤、サイトカインおよび／または増殖因子が挙げられるが、これら
に限定されない。組合わせは、例えば、混合物として同時に；同時にまたは並行
してだが別々に；あるいは経時的のいずれかで投与され得る。これは、組み合わ
された薬剤が、治療用混合物として共に投与されるという提示、およびまた、組
み合わされた薬剤が、別々にしかし同時に、例えば、同じ個体に別々の静脈線を
通じて投与される手順を含む。「組合わせて」の投与は、一番め続いて二番目に
与えられる化合物または薬剤のうち１つの別々の投与をさらに含む。
【１０１７】 １つの実施形態において、本発明の治療剤は、ＴＮＦファミリーのメンバーと
組合わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得るＴＮＦ、ＴＮＦ関
連分子またはＴＮＦ様分子としては、ＴＮＦ−αの可溶形態、リンホトキシン−
α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても公知である）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマ
ーＬＴ−α２−β中に見出される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３
０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公
開番号第ＷＯ９６／１４３２８号)、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号第ＷＯ９７／３
３８９９号）、エンドカイン−α（国際公開番号第ＷＯ９８／０７８８０号）、
ＴＲ６（国際公開番号第ＷＯ９８／３０６９４号）、ＯＰＧ、およびニュートロ
カイン（ｎｅｕｔｒｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号第ＷＯ９８／１８９２１）
、ＯＸ４０、および神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびにＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ
２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢの可溶形態、ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９６／
３４０９５号）、ＤＲ３（国際公開番号第ＷＯ９７／３３９０４号）、ＤＲ４（
国際公開番号第ＷＯ９８／３２８５６号）、ＴＲ５（国際公開番号第ＷＯ９８／
３０６９３号）、ＴＲ６（国際公開番号第ＷＯ９８／３０６９４号）、ＴＲ７（
国際公開番号第ＷＯ９８／４１６２９号）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号
第ＷＯ９８／５６８９２号）、ＴＲ１０（国際公開番号第ＷＯ９８／５４２０２
号）、３１２Ｃ２（国際公開番号第ＷＯ９８／０６８４２号）、およびＴＲ１２
、ならびに可溶形態ＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣＤ１５３が挙げられるが、
これらに限定されない。
【１０１８】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレ
オシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、およ
び／またはプロテーアーゼインヒビターとの組み合わせで投与される。本発明の
治療剤との組み合わせで投与され得るヌクレオシド逆転写酵素インヒビターとし
ては、ＲＥＴＲＯＶＩＲTM（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥＸTM（ジダノシン
／ｄｄｉ）、ＨＩＶＩＤTM（ザルシタビン／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴTM（スタブジ
ン／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲTM（ラミブジン／３ＴＣ）、およびＣＯＭＢＩＶＩ
ＲTM（ジドブジン／ラミブジン）が挙げられるが、これらに限定されない。本発
明の治療剤との組み合わせで投与され得る非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビタ
ーとしては、ＶＩＲＡＭＵＮＥTM（ネビラピン）、ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲTM（デ
ラビリジン）、およびＳＵＳＴＩＶＡTM（エファビレンズ）が挙げられるが、こ
れらに限定されない。本発明の治療剤との組み合わせで投与され得るプロテアー
ゼインヒビターとしては、ＣＲＩＸＩＶＡＮTM（インジナバー（ｉｎｄｉｎａｖ
ｉｒ））、ＮＯＲＶＩＲTM（リトナバー（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ））、ＩＮＶＩＲ
ＡＳＥTM（サクイナバー（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ））、およびＶＩＲＡＣＥＰＴ TM （ネルフィナバー（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ））が挙げられるが、これらに限定
されない。特定の実施形態において、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレオシド逆転
写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、および／または
プロテーアーゼインヒビターを、本発明の治療剤との任意の組み合わせで使用し
て、ＡＩＤＳを処置し得るか、および／またはＨＩＶ感染を予防もしくは処置し
得る。
【１０１９】 他の実施形態において、本発明の治療剤は、抗日和見感染剤と組み合わせて投
与され得る。本発明の治療剤と組み合わせて投与され得る抗日和見感染愛として
は、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰ
ＳＯＭＥTM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥTM、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTM、ＩＳＯＮＩ
ＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡＭＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、ＥＴＨＡＭＢ
ＵＴＯＬTM、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、ＡＺＩ
ＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、Ｃ
ＩＤＯＦＯＶＩＲTM、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM 、ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTM、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩ
ＲTM、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥTM、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩTM、ＮＥＵＰＯＧＥ
ＮTM（フィルグラシティム（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬ
ＥＵＫＩＮＥTM（サルグラモスティム（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）／ＧＭ−Ｃ
ＳＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発
明の治療剤は、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥ TM 、ＤＡＰＳＯＭＥTM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥTM、および／またはＡＴＯＶＡ
ＱＵＯＮＥTMとの任意の組み合わせで使用され、日和見Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉ
ｓ ｃａｒｉｎｉｉ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ感染を予防的に処置するか、または予
防する。別の特定の実施形態において、本発明の治療剤は、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤ TM 、ＲＩＦＡＭＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、および／またはＥＴＨ
ＡＭＢＵＴＯＬTMとの任意の組み合わせで使用され、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ複合感染を予防的に処置するか、または予防する。別の特
定の実施形態において、本発明の治療剤は、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩ
ＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、および／またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTMとの任意の
組み合わせで使用され、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌ
ｏｓｉｓ感染を予防的に処置するか、または予防する。別の特定の実施形態にお
いて、本発明の治療剤は、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、
および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲTMとの任意の組み合わせで使用され、日和見
サイトメガロウイルス感染を予防的に処置するか、または予防する。別の特定の
実施形態において、本発明の治療剤は、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣ
ＯＮＡＺＯＬＥTM、および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥTMとの任意の組み
合わせで使用され、日和見真菌感染を予防的に処置するか、または予防する。別
の特定の実施形態において、本発明の治療剤は、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTM、および
／またはＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲTMとの任意の組み合わせで使用され、日和見Ｉ
型単純ヘルペスウイルス感染および／またはＩＩ型単純ヘルペスウイルス感染を
予防的に処置するか、または予防する。別の特定の実施形態において、本発明の
治療剤は、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥTM、および／またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩ
ＮTMとの任意の組み合わせで使用され、日和見Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄ
ｉｉ感染を予防的に処置するか、または予防する。別の特定の実施形態において
、本発明の治療剤は、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTM、および／またはＮＥＵＰＯＧＥ
ＮTMとの任意の組み合わせで使用され、日和見細菌感染を予防的に処置するか、
または予防する。
【１０２０】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、抗ウイルス剤と組み合わせて
投与される。本発明の治療剤と投与され得る抗ウイルス剤としては、アクリクロ
ビル、リバビリン、アマンタジンおよびレマンチジン（ｒｅｍａｎｔｉｄｉｎｅ
）が挙げられるが、これらに限定されない。
【１０２１】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、抗生物質と組合わせて投与さ
れる。本発明の治療剤と共に投与され得る抗生物質としては、アモキシリン、β
−ラクタマーゼ、アミノグリコシド、β−ラクタム（糖ペプチド）、β−ラクタ
マーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロ
フロキサシン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン、マ
クロライド、メトロニダゾール、ペニシリン、キノロン、リファンピン、ストレ
プトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリム、トリメト
プリム−スルファメソキサゾールおよびバンコマイシンが挙げられるが、これら
に限定されない。
【１０２２】 本発明の組成物と組合わせて投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤としては
、ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミド
、メチルプレドニソン（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、プレドニソン（
ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオキシスパ
ガリン、およびＴ細胞応答機能を抑制することによって作用する他の免疫抑制剤
が挙げられるが、これらに限定されない。
【１０２３】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、免疫抑制剤と組み合わせて投与
される。本発明の治療剤と共に投与され得る免疫抑制剤調製物は、ＯＲＴＨＯＣ
ＬＯＮＥTM（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥTM／ＮＥＯＲＡＬTM／ＳＡＮＧ
ＤＹＡTM（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦTM（タクロリムス）、ＣＥＬＬＣ
ＥＰＴTM（ミクロフェノレート）、アザチオプリン、グリコチコステロイド、お
よびＲＡＰＡＭＵＮＥTM（シロリムス）が挙げられるが、これらに限定されない
。特定の実施形態において、免疫抑制剤は、器官または骨髄移植の拒絶を予防す
るために使用され得る。
【１０２４】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、単独または１以上の静脈内免
疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の治療剤と共に投与され
得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲTM、ＩＶＥＥＧＡＭTM 、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮTM、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ Ｓ／ＤTMおよびＧＡＭ
ＩＭＵＮＥTMが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において
、本発明の治療剤は、移植治療（例えば、骨髄移植）において静脈内免疫グロブ
リン調製物と組み合わせて投与される。
【１０２５】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、単独または抗炎症剤と組合わ
せて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る抗炎症剤としては、グル
ココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸誘導体
、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプ
ロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカル
ボキサミド、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−ア
ミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎｅ）、ベンダ
ザック、ベンジドアミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモル
ファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセ
プロール、パラニリン、ペリゾキサル、ピフオキシム、プロキアゾン、プロキサ
ゾール、およびテニダップが挙げられるが、これらに限定されない。
【１０２６】 別の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組合わせて投与され
る。本発明の治療剤とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導体
（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノ
マイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば、
フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロックスウリジン（ｆｌｏ
ｘｕｒｉｄｉｎｅ）、インターフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシ
ン、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カル
ムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホ
スファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマ
イシン、ブスルファン、シス−プラチン、およびビンクリスチンスルフェート）
；ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナト
リウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、メゲストロールアセテ
ート、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストールジホスフェート、クロ
ロトリアニセン、およびテストラクトン）；窒素マスタード誘導体（例えば、メ
ファレン、クロランブシル、メクロレタミン（窒素マスタード）およびチオテパ
）；ステロイドおよび組合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；な
らびにその他（例えば、ジカルバジン、アスパラギナーゼ、ミトタン、ビンクリ
スチンスルフェート、ビンブラスチンスルフェート、およびエトポシド）が挙げ
られるが、これらに限定されない。
【１０２７】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、ＣＨＯＰ（シクロフォスファミ
ド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレジニゾン）と組み合わせて投
与され得るか、ＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせで投与され得る。別の実施形
態において、本発明の治療剤は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与される
。さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨ
ＯＰと共に、またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせ
と共に投与される。
【１０２８】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、サイトカインと組合わせて投
与される。本発明の治療剤とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ２
、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、
ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられる
が、これらに限定されない。別の実施形態において、本発明の治療剤は、任意の
インターロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、
ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１
、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７
、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０およびＩＬ−２１を含むが、これらに限
定されない）と共に投与され得る。
【１０２９】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、脈管形成タンパク質と組合わ
せて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る脈管形成タンパク質とし
ては、欧州特許ＥＰ−３９９８１６に開示されるようなグリオーム誘導増殖因子
（Ｇｉｌｉｏｍａ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）（ＧＤＧＦ
）；欧州特許ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小板誘導増殖因子−Ａ（
ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許ＥＰ−２８２３１７に開示されるような血小板誘導増
殖因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号ＷＯ９２／０６１９４号に開示され
るような胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇｏｒｗｔｈ Ｆａｃｔ
ｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるような胎盤増殖因子−２
（ＰＩＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に開示されるような血
管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許ＥＰ−５０６４７７に開示されるような
血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号ＷＯ９６／３９５１５号
に開示されるような血管内皮増殖因子−２（ＶＥＧＦ−２）；血管内皮増殖因子
−Ｂ（ＶＥＧＦ−３）；国際公開番号ＷＯ９６／２６７３６号に開示されるよう
な血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際公開番号ＷＯ９８
／０２５４３号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；国
際公開番号ＷＯ９８／０７８３２号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｄ（
ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびドイツ国特許ＤＥ１９６３９６０１に開示されるような
血管内皮増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が挙げられるが、これらに限定されない
。上記の参考文献は、本明細書で参考として援用される。
【１０３０】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、造血増殖因子と組み合わせて
投与される。本発明の治療剤と共に投与され得る造血増殖因子としては、ＬＥＵ
ＫＩＮＥTM（ＳＡＲＧＲＡＭＯＳＴＩＭTM）およびＮＥＵＰＯＧＥＮTM（ＦＩＬ
ＧＲＡＳＴＩＭTM）が挙げられるが、これらに限定されない。
【１０３１】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、線維芽細胞増殖因子と組合わ
せて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子とし
ては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ
−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、Ｆ
ＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられるが
、これらに限定されない。
【１０３２】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、他の治療レジメまたは予防レ
ジメ（例えば、放射線治療）と組合わせて投与される。
【１０３３】 （実施例２４：ポリペプチドのレベル低下を処置する方法） 本発明は、体内における本発明のポリペプチドのレベルを増大させる必要のあ
る個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量の本発明のアゴニ
スト（本発明のポリペプチドを含む）を含む組成物をそのような個体に投与する
工程を包含する。さらに、個体における分泌タンパク質の標準または正常発現レ
ベルの低下により引き起こされる状態は、本発明のポリペプチドを、好ましくは
分泌形態で投与することにより処置し得ることが理解される。従って、本発明は
また、ポリペプチドのレベルの増加が必要な個体の処置方法を提供する。この方
法は、このような個体に、このような個体でポリペプチドの活性レベルを増加さ
せる量のポリペプチドを含む治療剤を投与する工程を包含する。
【１０３４】 例えば、ポリペプチドのレベルが低下した患者は、ポリペプチドを、１日用量
０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好ましくは、ポリペプチドは
分泌形態である。投与および処方物に基づく投薬計画の正確な詳細は、実施例２
３に提供されている。
【１０３５】 （実施例２５：ポリペプチドのレベル上昇を処置する方法） 本発明はまた、体内における本発明のポリペプチドのレベルを減少させる必要
のある個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量の本発明のア
ンタゴニスト（本発明のポリペプチドおよび抗体を含む）を含む組成物をそのよ
うな個体に投与する工程を包含する。
【１０３６】 １つの例において、アンチセンス技術を使用して本発明のポリペプチドの産生
を阻害する。この技術は、ガンのような様々な病因に起因するポリペプチド、好
ましくは分泌形態のポリペプチドのレべルを低下させる方法の１つの例である。
例えば、ポリペプチドのレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチセ
ンスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ／
ｋｇ／日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性があれば、
７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。アンチセンスポリヌクレオチドの
処方は、実施例２３に提供されている。
【１０３７】 （実施例２６：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、ポリペプチドを発現し得る線維芽細胞を患者に移
植する方法である。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験者から得られる
。得られた組織を組織培養培地中に配置し、小片に分割する。小塊の組織を組織
培養フラスコの湿潤表面に置き、ほぼ１０片を各フラスコに置く。このフラスコ
を倒置し、しっかりと閉めた後、室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラ
スコを反転させ、組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、そして新鮮培地
（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＨａ
ｍのＦ１２培地）を添加する。次に、フラスコを３７℃で約１週間インキュベー
トする。
【１０３８】 この時点で、新鮮培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間
培養した後に単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、さらに大
きなフラスコにスケールアップする。
【１０３９】 Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉ
ｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理
する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して
精製する。
【１０４０】 本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、必要な場合、プライマーを用
いそして適切な制限部位および開始／終止コドンを有する、実施例１に記載のそ
れぞれ５’および３’末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得
る。好ましくは、５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマ
ーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量の、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線
状骨格および増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を二つのフラグメント
を連結するのに適した条件下で維持する。次に、連結混合物を使用し、細菌ＨＢ
１０１を形質転換する。次に、それを、カナマイシンを含む寒天上にプレーティ
ングし、ベクターが正確に挿入された目的の遺伝子を有することを確認する。
【１０４１】 アンフォトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、
１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤｕｌ
ｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな
密度まで増殖させる。次に、遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加え、そして
パッケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パッケージング細胞
は遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、パッケージング細胞を
プロデューサー細胞という）。
【１０４２】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、次いで培地を１０ｃ
ｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過し、はがれた
プロデューサー細胞を除去した後、この培地を使用して、線維芽細胞を感染させ
る。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そしてプロ
デューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そして新
鮮培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽細胞
が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまたはｈｉｓ
のような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必要で
ある。一旦、線維芽細胞が効率的に感染したなら、線維芽細胞を分析し、タンパ
ク質が産生されているか否かを決定する。
【１０４３】 次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで宿主に移植する。
【１０４４】 （実施例２７：本発明のポリヌクレオチドに対応する内因性遺伝子を使用する
遺伝子治療） 本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、本発明の内因性ポリヌクレオチド配列
を、例えば、米国特許第５，６４１，６７０号（１９９７年６月２４日出願）；
国際公開第ＷＯ ９６／２９４１１号（１９９６年９月２６日公開）；国際公開
第ＷＯ ９４／１２６５０号（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２〜８９３５（１
９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８
（１９８９）に記載されるように、相同組換えを介してプロモーターに作動可能
に結合する工程を包含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが、その細
胞中で発現されないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝子
の活性化を包含する。
【１０４５】 プロモーターおよび標的化配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製する。こ
の標的配列は、プロモーターに隣接する、内因性ポリヌクレオチド配列の５’非
コード配列と相同である。この標的配列は、このポリヌクレオチド配列の５’末
端に十分に近く、その結果、このプロモーターは、相同組換えの際にこの内因性
配列に作動可能に連結される。このプロモーターおよび標的化配列を、ＰＣＲを
使用して増幅し得る。好ましくは、この増幅したプロモーターは、５’末端およ
び３’末端上に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３
’末端は、増幅したプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして
第２の標的化配列の５’末端は、増幅したプロモーターの３’末端と同じ制限酵
素部位を含む。
【１０４６】 この増幅したプロモーターおよび増幅した標的化配列を、適切な制限酵素で消
化し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消
化した標的化配列を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。生じた混
合物を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構築
物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール
沈殿を行う。
【１０４７】 この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーショ
ンを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチ
ド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス
配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）とともにも投与し得る。送達のためのこのよ
うな方法は、当該分野で公知である。
【１０４８】 一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが、このプロモーターで生
じて、この内因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結される。これは、この
細胞中におけるこのポリヌクレオチドに対応するポリヌクレオチドに発現を生じ
る。発現は、免疫学的染色または当該分野で公知の他の任意の方法により、検出
され得る。
【１０４９】 線維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋
１０％胎仔ウシ血清中に配置する。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を
、トリプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細
胞懸濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離
に供する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩
衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。この
細胞を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブミ
ン１ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終細
胞懸濁物は、約３×１０6細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再懸
濁直後に実施すべきである。
【１０５０】 プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、本発明のポリヌ
クレオチドに対応する遺伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために
、プラスミドｐＵＣ１８（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ
）をＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＣＭＶプロモーターを、５’末端にＸｂａＩ部
位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を備えてＰＣＲにより増幅する。２つの非コ
ード配列をＰＣＲを介して増幅する：一方の非コード配列（フラグメント１）を
、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端にＸｂａＩ部位を備えて増幅す
る；他方の非コード配列（フラグメント２）を、５’末端にＢａｍＨＩ部位およ
び３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を備えて増幅する。このＣＭＶプロモーターお
よびこれらのフラグメント（１および２）を、適切な酵素（ＣＭＶプロモーター
−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；フラグメント１−ＸｂａＩ；フラグメント２−Ｂ
ａｍＨＩ）で消化し、そしてともに連結する。生じた連結生成物をＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する
。
【１０５１】 プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０6細胞
を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を
、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ
、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生
存が減少するが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割
合が劇的に増加する。これらのパラメーターを与えると、パルス時間約１４〜２
０ｍＳｅｃが観察されるはずである。
【１０５２】 エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキ
ュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞
を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤ
ＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この
培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４
時間インキュベートする。
【１０５３】 次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か、またはサイトデックス
（ｃｙｔｏｄｅｘ）３マイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）ビーズ上
でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいずれかで、注入する。ここで、
この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次いで、この線維芽細胞を、上
記のような患者に導入し得る。
【１０５４】 （実施例２８：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、本発明のポリペプチド
の発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、お
よびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列の導入に関する。本発明のポリヌク
レオチドは、プロモーター、または標的組織によるそのポリペプチドの発現に必
要な任意の他の遺伝子エレメントに、作動可能に連結され得る。このような遺伝
子治療および送達の技術および方法は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９
０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５６９３６２２号、同第５
７０５１５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓ
ｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−４７９（１９９７）；Ｃｈａｏら、Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５（６）：５１７−５２２（１９９７）；Ｗｏｌｆｆ、
Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８（１９９７
）、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３（５）：４０５−４１１（
１９９６）；Ｔｓｕｒｕｍｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（１２）：３２
８１−３２９０（１９９６）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこ
と。
【１０５５】 ポリヌクレオチド構築物は、注入可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方
法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙空間への注入
）によって送達され得る。このポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な
液体または水性キャリア中で送達され得る。
【１０５６】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助
、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、本発明のポリヌクレオチドはまた、当業者に
周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ
Ｐ．Ｌ．ら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１
３９およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ．ら（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ８５（
１）：１−７で教示されたもの）中で送達され得る。
【１０５７】 この遺伝子治療方法において使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、
好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列も含まない構築
物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、ＤＮＡの発現を駆動す
るために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細
胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一
過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ
月までの間の期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【１０５８】 このポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、
脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸
、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）の間
隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、細胞間液、ムコ多糖基質（器官
組織の細網線維、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織におけるコラ
ーゲン線維に間にある）、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞内または骨の裂孔中の
同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャンネルのリ
ンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下に考
察する理由のために好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織への注入によ
って、好都合に送達され得る。それらは、好ましくは、分化した持続性の非分裂
細胞に送達され、そしてその細胞において発現されるが、送達および発現は、非
分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚
線維芽細胞）において達成され得る。インビボで、筋肉細胞は、ポリヌクレオチ
ドを取り込み、そして発現する能力において、特に適格である。
【１０５９】 裸のポリヌクレオチド注入のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約
０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、こ
の投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより
好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業
者が認識するように、この投薬量は、注入の組織部位に従って変化する。核酸配
列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置さ
れる状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間隙空間へ
の非経口注入経路によってである。しかし、他の非経口経路もまた用い得、これ
には、例えば、特に肺または気管支組織、咽喉、または鼻の粘膜への送達のため
のエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のポリヌクレオチド構築物
を、血管形成術の間にこの手順において用いられるカテーテルによって動脈に送
達し得る。
【１０６０】 インビボでの筋肉における注入ポリヌクレオチドの用量応答効果を、以下のよ
うにして決定する。本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生成のための
適切な鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。鋳型ＤＮ
Ａ（これは環状または線状のいずれかであり得る）を裸のＤＮＡとして使用する
か、またはリポソームと複合体化するかのいずれかを行う。次いで、マウスの四
頭筋に、種々の量の鋳型ＤＮＡを注入する。
【１０６１】 ５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスを、０．３ｍｌの２．５％
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。鋳型ＤＮＡを、０．１ｍｌのキャ
リアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわたって、筋肉の
遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約０．２ｃｍの深さで注入する
。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上で行い、そしてその皮膚をステ
ンレス鋼クリップで閉じる。
【１０６２】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、タ
ンパク質発現について組織化学的に染色する。タンパク質発現についてのタイム
コースは、異なるマウスからの四頭を異なる時間で採取すること以外は、同様な
様式で行い得る。注入後の筋肉中のＤＮＡの持続性を、注入したマウスおよびコ
ントロールマウスからの全細胞性ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後、サザ
ンブロット分析によって決定し得る。マウスにおける上記実験の結果は、裸のＤ
ＮＡを用いて、ヒトおよび他の動物において適切な投薬量および他の処置パラメ
ーターを推定するために使用し得る。
【１０６３】 （実施例２９：トランスジェニック動物） 本発明のポリペプチドはまた、トランスジェニック動物において発現され得る
。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃ
ｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、
サルおよびチンパンジー）を含むがこれらに限定されない、任意の種の動物を、
トランスジェニック動物を作製するために用い得る。特定の実施形態において、
本明細書に記載されるかさもなければ当該分野で公知の技術を、遺伝子治療プロ
トコルの一部として、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発現のために用いる
。
【１０６４】 当該分野で公知の任意の技術を、導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレ
オチド）の動物への導入に用いて、トランスジェニック動物の創始系統（ｆｏｕ
ｎｄｅｒ ｌｉｎｅ）を作製し得る。このような技術は、前核マイクロインジェ
クション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；お
よびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖系列
（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９８５））、胚盤胞または胚へのレトロ
ウイルス媒介遺伝子移入；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ
ら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレクト
ロポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３
−１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入
（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を参
照のこと）；胚性多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞への核酸構築物の
導入および胚盤胞へのこの幹細胞の再移入；ならびに精子媒介遺伝子移入（Ｌａ
ｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８９））；などを含
むがこれらに限定されない。このような技術の総説については、本明細書中にそ
の全体が参考として援用される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎ
ｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９
８９）を参照のこと。
【１０６５】 当該分野で公知の任意の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトラ
ンスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された、静止状態に誘導さ
れた胚細胞、胎児細胞または成体の細胞由来の除核した卵母細胞への核移入（Ｃ
ａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌｍｕ
ｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）））。
【１０６６】 本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ動物）を提供する。導入遺伝子は、
１つの導入遺伝子としてかまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型また
は頭−尾タンデム型）のようにして複数のコピーとして、組み込まれ得る。この
導入遺伝子はまた、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））
に従って特定の細胞型に選択的に導入され得、そしてそこで活性化され得る。こ
のような細胞型特異的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に
依存し、そしてそれらは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が
、内在性遺伝子の染色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子ター
ゲッティングが好ましい。手短に言えば、このような技術が利用する場合、内在
性遺伝子に対して相同ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターを、染色体
配列との相同な組換えを介して内在性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込み、そ
してそのヌクレオチド配列の機能を破壊することを目的として、設計する。導入
遺伝子はまた、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３−１
０６（１９９４））の教示に従って、特定の細胞型に選択的に導入され得、その
ようにして、その細胞型においてのみ内在性遺伝子を不活化する。そのような細
胞型特異的不活化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そ
してそれらは当業者に明らかである。
【１０６７】 一旦トランスジェニック動物を作製すると、その組換え遺伝子の発現を、標準
的な技術を利用してアッセイし得る。最初のスクリーニングは、サザンブロット
分析またはＰＣＲ技術によって動物組織を分析して、導入遺伝子の組み込みが起
きたことを確認することによって達成し得る。トランスジェニック動物の組織に
おける導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、その動物から得た組織サンプル
のノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転
写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価
し得る。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、その導入遺伝子
産物に特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価し得る
。
【１０６８】 一旦、創始動物を作製すると、それらを、交配、同系交配、異系交配または交
雑して、特定の動物のコロニーを作製し得る。そのような交配戦略の例は、以下
を含むがそれらに限定されない：別の系統を樹立するための、１つより多くの組
み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相加的発現効果によっ
て、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジェニックを作製する
ための、別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析による動物のスク
リーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部位につおてホモ接
合性の動物を作製するヘテロ接合性トランスジェニック動物の交雑；複合ヘテロ
接合性またはホモ接合性系統を作製するための、別々のホモ接合系統の交雑；な
らびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導入遺伝子を配置
するための交配。
【１０６９】 本発明のトランスジェニック動物は、本発明のポリペプチドの生物学的機能の
詳述、異常な発現に関連する状態および／または障害の研究、ならびにこのよう
な状態および／または障害の改善に有効な化合物についてのスクリーニングに有
用な、動物モデル系を含むがこれらに限定されない用途を有する。
【１０７０】 （実施例３０：ノックアウト動物） 内因性遺伝子発現もまた、標的化された相同組換えを使用して遺伝子および／
またはそのプロモーターを不活性化あるいは「ノックアウトする」ことによって
減少し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０−２
３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ ５１：５
０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５：３１３−３２
１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、本明細書中でその全体が参考と
して援用される）。例えば、内因性ポリヌクレオチド配列（この遺伝子のコード
領域または調節領域のいずれか）と相同性のＤＮＡに隣接する、本発明の変異体
の非機能的なポリヌクレオチド（または完全に関連のないＤＮＡ配列）を、選択
マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを用いてかまたは用いずに使用
し、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞をトランスフェクトし得る
。別の実施形態において、当該分野で公知の技術を、目的の遺伝子を含むが発現
しない細胞中でノックアウトを生じるために使用する。標的化された相同性組換
えを介した、このＤＮＡ構築物の挿入は、標的化された遺伝子の不活性化を生じ
る。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改変を不活性な標的化された
遺伝子を有する動物子孫を作製するために使用し得る研究および農業分野におい
て、特に適する（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ １９８７およ
びＴｈｏｍｐｓｏｎ １９８９、前出を参照のこと）。しかし、このアプローチ
は、当業者に明白な適切なウイルスベクターを使用して、組換えＤＮＡ構築物を
、インビボで要求された部位に直接投与または標的化する場合、ヒトにおける使
用に慣用的に適合させ得る。
【１０７１】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するように
遺伝子操作された細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝
子操作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。こ
のような細胞は、その患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ド
ナーから入手し得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、
脂肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細
胞を、例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導
入遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（
プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソ
ームなどの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明の
ポリペプチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／
または本発明のポリペプチドに関連している内因性の調節配列を破壊するために
、組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプ
チドのコード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまた
はプロモーター／エンハンサーの制御下に配置し、本発明のポリペプチドの発現
および好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好まし
くは分泌する操作した細胞を、例えば、循環中においてかまたは腹腔内に、患者
中へ全身的に導入し得る。
【１０７２】 あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（
例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；遺
伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る
（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号ならびにＭｕ
ｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこ
と。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【１０７３】 投与される細胞が非自己細胞または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを
、この導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投
与し得る。例えば、この細胞を被包性の形態で導入し得、構成成分と細胞のすぐ
外の環境との交換が可能である間は、導入細胞が宿主免疫系によって認識され得
ない。
【１０７４】 本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物は、本発明のポリペ
プチドの生物学的機能の詳述、異常な発現に関連する状態および／または障害の
研究、ならびにこのような状態および／または障害を改善させる場合に有効な化
合物のスクリーニングにおいて、有用な動物モデル系を含むが、それらに限定さ
れない用途を有する。
【１０７５】 （実施例３１：ｓｃＦｖのライブラリーからの本発明のポリペプチドに対する
抗体フラグメントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、配列番号Ｙのアミノ酸配
列を有するポリペプチドに対する反応性を含む抗体フラグメントの大きいライブ
ラリーへと構築する。このポリペプチドは、ドナーが曝露されていてもよいし、
曝露されていなくてもよい（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（その全
体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。
【１０７６】 （ライブラリーのレスキュー） ＷＯ ９２／０１０４７に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓｃＦｖの
ライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージをレスキューす
るため、ファージミドを保有する約１０9個のＥ．ｃｏｌｉを用いて、５０ｍｌ
の２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）に接種し、そして振盪しながらＯ．Ｄ． ０．
８まで増殖させる。この培養物５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−Ｇ
ＬＵに接種し、２×１０８ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ、
ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を添加し、そして培養物を振盪なしで３７
℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃で４５分間インキュ
ベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、そして
ペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μ
ｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し、そして一晩増殖させる。ファ
ージをＷＯ９２／０１０４７に記載のように調製する。
【１０７７】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質
を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖さ
せることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪な
しで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時
間インキュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４０００
ｒｅｖｓ／分で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μ
ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ
）３００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファ
ージ粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培
地から精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフ
ィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１
０13形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）という最終濃度を得る。
【１０７８】 （ライブラリーパニング） Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／
ｍｌのいずれかの本発明のポリペプチド４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜する
。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし、次
いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０13ＴＵのファージをチューブに適用し、そ
して、回転盤で上下に傾けながら室温で３０分間インキュベートし、次いでさら
に１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１
０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンを
添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることによりファージを溶出
し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で
直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃で３０分間イ
ンキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数増殖中期のＥ
．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを、１％グルコースお
よび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプレートする
。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝子３ヘルパーファ
ージでレスキューし、次の回の選択のためのファージを調製する。次いで、この
プロセスを、全４回のアフィニティー精製について反復し、３回目および４回目
にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２０回、そしてＰＢＳ
で２０回に増加する。
【１０７９】 （結合剤の特徴付け） 第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ ２１５１に感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから作製する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．
６中の本発明のポリペプチド １０ピコグラム／ｍｌのいずれかで被膜したマイ
クロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ中の陽性クロ
ーンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＷＯ９２／０１０４７を参照
のこと）、次に配列決定することにより、さらに特徴付ける。
【１０８０】 （実施例３２：Ｂ細胞増殖および分化の刺激または阻害を検出するアッセイ） 機能的体液性免疫応答の生成は、Ｂ系列の細胞とそれらの微小環境との間に、
可溶性のシグナル伝達および同族のシグナル伝達の両方を必要とする。シグナル
は、陽性の刺激（Ｂ系列の細胞がプログラムされた発生を持続するようにさせる
）、または陰性の刺激（細胞が電流発生経路を阻止するように指示する）を伝え
得る。現在までに、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ
−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４およびＩＬ−１５を含む、多数の刺激シグナル
および阻害シグナルがＢ細胞応答性に影響することが見出されている。興味深い
ことに、これらのシグナルはそれ自体は弱いエフェクターであるが、種々の同時
刺激タンパク質と組み合わせて、Ｂ細胞集団中の活性、増殖、分化、ホーミング
、耐性、および死を誘導し得る。
【１０８１】 Ｂ細胞同時刺激タンパク質の最も研究されたクラスの１つがＴＮＦスーパーフ
ァミリーである。このファミリー内で、ＣＤ４０、ＣＤ２７およびＣＤ３０は、
そのそれぞれのリガンドである、ＣＤ１５４、ＣＤ７０およびＣＤ１５３と共に
種々の免疫応答を調節することが見出されている。これらのＢ細胞集団およびそ
れらの前駆細胞の増殖および分化の検出および／または観察を可能にするアッセ
イは、種々のタンパク質がこれらのＢ細胞集団に対して、増殖および分化の点で
有し得る効果を決定する際に価値のあるツールである。以下に列挙するのは、Ｂ
細胞集団およびそれらの前駆体の分化、増殖、または阻害の検出を可能にするよ
うに設計された２つのアッセイである。
【１０８２】 （インビトロアッセイ）−本発明の精製されたポリペプチド、またはそれらの
短縮形態を、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体において活性化、増殖、分化もし
くは阻害および／または死を誘導する能力について評価する。精製したヒト扁桃
Ｂ細胞に対する本発明のポリペプチドの活性（定性的に０．１〜１０，０００ｎ
ｇ／ｍＬの用量範囲にわたって測定する）を、標準的なＢリンパ球同時刺激アッ
セイにおいて評価する。このアッセイでは、精製した扁桃Ｂ細胞を、プライミン
グ因子として、ホルマリン固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ
Ｃｏｗａｎ Ｉ（ＳＡＣ）、または固定した抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかの存在
下で培養する。ＩＬ−２およびＩＬ−１５のような第２のシグナルは、トリチウ
ム化チミジン取り込みにより測定した場合、ＳＡＣおよびＩｇＭ架橋と共同して
Ｂ細胞増殖を誘発する。新規な共同因子を、このアッセイを用いて容易に同定し
得る。このアッセイは、ＣＤ３陽性細胞の磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）枯渇によりヒ
ト扁桃Ｂ細胞を単離する工程を包含する。得られる細胞集団は、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ
２２０）の発現により評価する場合、９５％のＢ細胞より大きい。
【１０８３】 種々の希釈のそれぞれのサンプルを９６ウェルプレートの個々のウェルに配置
し、このウェルへ、培養培地（１０％ＦＢＳ、５×１０-5Ｍ ２ＭＥ、１００Ｕ
／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０-5希釈のＳ
ＡＣを含有する、ＲＰＭ１６４０）中で懸濁した１０5Ｂ細胞を総量１５０μｌ
で添加する。増殖または阻害を、因子の添加後７２時間から開始して、３Ｈ−チ
ミジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）で２０ｈパルス（１μＣｉ／ウェル）により定量す
る。陽性コントロールおよび陰性コントロールは、それぞれＩＬ２および培地で
ある。
【１０８４】 （インビボアッセイ）−ＢＡＬＢ／ｃマウスに、緩衝液のみ、または本発明の
２ｍｇ／ｋｇのポリペプチド、またはそれらの短縮形態を、１日２回注射（ｉ．
ｐ．）する。マウスにこの処置を４日間連続して与え、この時点でそれらを屠殺
し、そして分析のために種々の組織および血清を収集する。正常な脾臓および本
発明のポリペプチドで処理した脾臓由来のＨ＆Ｅ切片の比較により、脾臓細胞に
対するこのポリペプチドの活性の結果（例えば、動脈周囲リンパ鞘の拡散および
／または赤色脾髄領域の有核の細胞充実性の有意な増加（これは、Ｂ細胞集団の
分化および増殖の活性化を示し得る））が確認される。Ｂ細胞マーカーである、
抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）を用いる免疫組織化学的研究を用いて、脾臓細胞への
任意の生理的な変化（例えば、脾臓組織崩壊）が、樹立されたＴ細胞領域に浸潤
する漠然と規定されたＢ細胞区画内のＢ細胞提示の増加に起因するか否かを決定
する。
【１０８５】 ポリペプチドで処置したマウス由来の脾臓のフローサイトメトリー分析を用い
て、このポリペプチドが、ＴｈＢ＋であるＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ｄｕｌｌ Ｂ
細胞の比を、コントロールマウスで観察される比よりも特異的に増加するか否か
を示す。
【１０８６】 同様に、増加した成熟Ｂ細胞のインビボでの提示について推定される結果は、
血清Ｉｇ力価の相対的に増加である。従って、血清ＩｇＭおよびＩｇＡレベルを
、緩衝液処置マウスとポリペプチド処置マウスとの間で比較する。
【１０８７】 本実施例において記載する研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した。
しかし、当業者は、本発明のポリペプチドの活性（例えば、遺伝子治療）、本発
明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストおよび／またはアンタ
ゴニストを試験するために、例示した研究を容易に改変し得る。
【１０８８】 （実施例３３：Ｔ細胞増殖アッセイ） ＣＤ３誘導性の増殖アッセイをＰＢＭＣで実行し、そして3Ｈ−チミジンの取
り込みにより測定する。このアッセイを以下のように実行する。９６ウェルプレ
ートを、ＣＤ３に対するｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の１００
μｌ／ウェル、またはアイソタイプ適合のコントロールｍＡｂ（Ｂ３３．１）（
０．０５Ｍ 炭酸水素緩衝液、ｐＨ９．５中、１μｇ／ｍｌ）で４℃で１晩、コ
ートし、次いでＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣをヒト末梢血から、Ｆ／Ｈ勾配
遠心分離により単離し、そして本発明のポリペプチドの種々の濃度での存在下で
、１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有するＲＰＭＩ中、ｍＡｂでコートしたプレー
トの４連のウェル（５×１０4／ウェル）に添加する（総量２００μｌ）。関連
するタンパク質緩衝液および培地単独がコントロールである。３７℃での４８時
間の培養後、プレートを１０００ｒｐｍで２分間回転させ、そして１００μｌの
上清を取り出し、そして、増殖への効果を観察する場合、ＩＬ−２（または他の
サイトカイン）の測定のために−２０℃で貯蔵する。ウェルに０．５μＣｉの3
Ｈチミジンを含有する１００μｌの培地を補充し、そして３７℃で１８〜２４時
間培養する。ウェルを収集し、そして3Ｈチミジンの取り込みを増殖の指標とし
て用いる。抗ＣＤ３単独が増殖の陽性コントロールである。ＩＬ−２（１００Ｕ
／ｍｌ）をまた、増殖を増強するコントロールとして用いる。Ｔ細胞の増殖を誘
導しないコントロール抗体を本発明のポリペプチドの効果についての陰性コント
ロールとして用いる。
【１０８９】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、本発
明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニストおよび／もしくはアン
タゴニストの活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。
【１０９０】 （実施例３４：ＭＨＣクラスＩＩ分子、補助的刺激分子および接着分子の発現
、ならびに単球および単球由来ヒト樹状細胞の細胞分化への本発明のポリペプチ
ドの効果） 樹状細胞を末梢血において見出される増殖前駆体の増殖により生成する：接着
性ＰＢＭＣまたは溶出単球画分を、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ
−４（２０ｎｇ／ｍｌ）とともに７〜１０日間培養する。これらの樹状細胞は、
非成熟細胞の特徴的表現型（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭＨ
ＣクラスＩＩ抗原の発現）を有する。ＴＮＦ−αのような活性化因子での処理は
、表面表現型に迅速な変化（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子、補助的刺激分子お
よび接着分子の発現の増加、ＦＣγＲＩＩの下方制御、ＣＤ８３の上方制御）を
生じる。これらの変化は抗原提示能力の増加、および樹状細胞の機能的成熟と関
連する。
【１０９１】 表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下の様に実施する。細胞を、漸増濃度の本発明の
ポリペプチドまたはＬＰＳ（陽性コントロール）で１〜３日処理し、１％ＢＳＡ
および０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで１：２
０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モノクローナル
抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄後、標識した
細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイト
メトリーにより分析する。
【１０９２】 （サイトカインの生成への効果）樹状細胞により生成されるサイトカイン、特
にＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性免疫応答の開始において重要である。ＩＬ−１２
は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応答の発生に強力に影響し、そして細胞傷害性Ｔ
細胞機能およびＮＫ細胞機能を誘導する。ＥＬＩＳＡを用いて以下のようにＩＬ
−１２放出を測定する。樹状細胞（１０6／ｍｌ）を、漸増濃度の本発明のポリ
ペプチドで４時間処理する。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロール
として細胞培養物に添加する。次いで、細胞培養物からの上清を収集し、そして
市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏ
ｌｉｓ，ＭＮ））を用いてＩＬ−１２含量について分析する。キットに提供され
る標準的プロトコールを用いる。
【１０９３】 ＭＨＣクラスＩＩ分子、補助的刺激分子および接着分子の発現への効果。細胞
表面抗原の３つの主なファミリー（接着分子、抗原提示に関与する分子、および
Ｆｃレセプター）が、単球上で同定され得る。ＭＨＣクラスＩＩ抗原および他の
補助的刺激分子（例えば、Ｂ７およびＩＣＡＭ−１）の発現の調節は、単球の抗
原提示能力、およびＴ細胞活性化を誘導する能力に変化を生じ得る。Ｆｃレセプ
ターの発現増加は、単球細胞傷害性活性、サイトカイン放出および食菌作用の改
善と相関し得る。
【１０９４】 ＦＡＣＳ分析は、以下のような表面抗原を試験するために用いられる。単球を
、漸増濃度の本発明のポリペプチドまたはＬＰＳ（陽性コントロール）で１〜５
日処理し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで
洗浄し、次いで１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰ
Ｅ標識モノクローナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さら
なる洗浄後、標識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ）でのフローサイトメトリーにより分析する。
【１０９５】 （単球活性化および／または生存の増加）単球を活性化する（あるいは、不活
化する）および／または単球の生存を増加させる（あるいは、単球の生存を低下
させる）分子についてのアッセイは、当該分野で公知であり、そして本発明の分
子が単球のインヒビターまたはアクチベーターとして機能するか否かを決定する
ために慣用的に適用され得る。本発明のポリペプチド、アゴニストまたはアンタ
ゴニストは、以下に記載の３つのアッセイを用いてスクリーニングされ得る。こ
れらのアッセイのそれぞれについて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔ
ｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）を通じた遠心分離により、単一のドナーｌｅｕ
ｋｏｐａｃｋ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，
ＭＤ）から精製する。単球を向流遠心性溶出（ｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏｗ ｃｅｎ
ｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）によりＰＢＭＣから単離する。
【１０９６】 （単球生存アッセイ）ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激の非存在下で培
養した場合、次第に生存力を失う。それらの死は、内部調節されたプロセス（ア
ポトーシス）から生じる。活性化因子、例えばＴＮＦαの培養物への添加は、劇
的に、細胞生存を改善し、そしてＤＮＡの断片化を妨げる。ヨウ化プロピジウム
（ＰＩ）染色を用いて、以下のようにアポトーシスを測定する。単球を、１００
ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（陰性コントロール）の存在下、および試験される種々
の濃度の化合物の存在下で、ポリプロピレンチューブ中の無血清培地（陽性コン
トロール）中で、４８時間培養する。細胞を、最終濃度５μｇ／ｍｌでＰＩを含
有するＰＢＳ中で２×１０6／ｍｌの濃度に懸濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎ分析
の前に５分間室温でインキュベートする。ＰＩ取り込みは、この試験パラダイム
におけるＤＮＡの断片化と相関することを示している。
【１０９７】 （サイトカイン放出への影響）単球／マクロファージの重要な機能は、刺激後
のサイトカインの放出を通じた免疫系の他の細胞集団への調節活性である。サイ
トカイン放出を測定するためのＥＬＩＳＡを、以下のように実施する。ヒト単球
を、５×１０5細胞／ｍｌの密度で、漸増濃度の本発明のポリペプチドとともに
、およびこのポリペプチドが存在しない以外は同じ条件下で、インキュベートす
る。ＩＬ−１２の生成については、この細胞を、本発明のポリペプチドの存在下
でＩＦＮ（１００Ｕ／ｍｌ）で１晩プライムする。次いで、ＬＰＳ（１０ｎｇ／
ｍｌ）を添加する。馴化培地を２４時間後に収集し、そして使用するまで凍結し
続ける。次いで、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の測定を
市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏ
ｌｉｓ，ＭＮ））を用い、そしてキットに提供される標準的プロトコールを適用
して実施する。
【１０９８】 （酸化的バースト（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ））精製した単球を９６
ウェルプレートに２〜１×１０5細胞／ウェルでプレートする。漸増濃度の本発
明のポリペプチドをウェルに総容量０．２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ １６４０
＋１０％ＦＣＳ、グルタミンおよび抗生物質）中で添加する。３日間のインキュ
ベーション後、このプレートを遠心分離し、そして培地をウェルから除く。マク
ロファージの単層に、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（１４
０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、５．５ｍＭデ
キストロース、０．５６ｍＭフェノールレッドおよび１９Ｕ／ｍｌのＨＲＰＯ）
を、刺激物質（２００ｎＭ ＰＭＡ）とともに添加する。このプレートを３７℃
で２時間インキュベートし、そして１ウェルあたり２０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを
添加して反応を停止させる。吸光度を６１０ｎｍで読み取る。マクロファージに
より生成されるＨ2Ｏ2の量を算出するため、既知のモル濃度のＨ2Ｏ2溶液の標準
曲線をそれぞれの実験について実施する。
【１０９９】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、本発明のポリペプチドの活性、ポリヌクレオチドの活性（
例えば、遺伝子治療）、アゴニストの活性、および／またはアンタゴニストの活
性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。
【１１００】 （実施例３５：本発明のポリペプチドの生物学的効果） （星状細胞およびニューロンアッセイ） 上記のように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで発現され、そして精製さ
れた本発明の組換えポリペプチドを、皮質ニューロン細胞の生存、神経突起成長
または表現型分化を促進する活性について、およびグリア原線維性酸性タンパク
質免疫陽性細胞、星状細胞の増殖の誘導について試験し得る。バイオアッセイの
ための皮質細胞の選択は、皮質構造中のＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２の広く行き
渡っている発現、ならびにＦＧＦ−２処理から生じる皮質ニューロン生存の以前
に報告された増強に基づく。例えば、チミジン取り込みアッセイを用いて、これ
らの細胞への本発明のポリペプチドの活性を解明し得る。
【１１０１】 さらに、インビトロにおける皮質ニューロンまたは海馬ニューロンへのＦＧＦ
−２（塩基性ＦＧＦ）の生物学的効果を記載する以前の報告は、ニューロン生存
および神経突起成長の両方における増大を実証している（Ｗａｌｉｃｋｅら、「
Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓｕ
ｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅ
ｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎｅｕｒｉｔｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ
」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：３０１２〜３０１６
（１９８６）、この文献におけるアッセイはその全体が参考として援用される）
。しかし、ＰＣ−１２細胞で実行される実験からの報告は、これらの２つの応答
が必ずしも同義でないこと、そしてどのＦＧＦを試験しているかだけでなく、ど
のレセプターが標的細胞で発現されているかにも依存し得ることを示唆する。神
経突起成長を誘導する本発明のポリペプチドの能力を、一次の皮質ニューロン培
養パラダイムを用いて、例えば、チミジン取り込みアッセイを用いてＦＧＦ−２
で得られた応答と比較し得る。
【１１０２】 （線維芽細胞および内皮細胞アッセイ） ヒト肺線維芽細胞をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入
手し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓからの増殖培地で維持する。真皮性微小血管内
皮細胞をＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）か
ら得る。増殖アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞および真皮性微小血管内皮
細胞を、９６ウェルプレートの増殖培地中で１日間、５，０００細胞／ウェルで
培養し得る。次いでこの細胞を０．１％ ＢＳＡ基本培地中で１日間インキュベ
ートする。新鮮な０．１％ ＢＳＡ培地で培地を置換した後、細胞を試験タンパ
ク質と３日間インキュベートする。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ａｌａｍａｒ Ｂ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）を１０％の最終濃度にな
るように各ウェルに添加する。この細胞を４時間インキュベートする。細胞生存
率をＣｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーでの読取りにより測定する。ＰＧＥ2アッ
セイについては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で１日間、５，０
００細胞／ウェルで培養する。０．１％ ＢＳＡ基本培地に培地を変換した後、
細胞をＩＬ−１αとともに、またはそれをともなわずに、ＦＧＦ−２または本発
明のポリペプチドと２４時間インキュベートする。上清を収集し、そしてＥＩＡ
キット（Ｃａｙｍａｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によりＰＧＥ2についてア
ッセイする。ＩＬ−６アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプ
レート中で１日間、５，０００細胞／ウェルで培養する。０．１％ ＢＳＡ基本
培地に培地を変換した後、細胞をＩＬ−１αとともに、またはそれをともなわず
に、ＦＧＦ−２または本発明のポリペプチドと２４時間インキュベートする。上
清を収集し、そしてＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，
ＭＡ）によりＩＬ−６についてアッセイする。
【１１０３】 ヒト肺線維芽細胞をＦＧＦ−２または本発明のポリペプチドとともに基本培地
中で３日間培養し、その後、線維芽細胞の増殖への効果を評価するためＡｌａｍ
ａｒ Ｂｌｕｅを添加する。ＦＧＦ−２は、本発明のポリペプチドでの刺激と比
較するために用いられ得る１０〜２５００ｎｇ／ｍｌの刺激を示すはずである。
【１１０４】 （パーキンソンモデル） パーキンソン病における運動機能の喪失は、黒質線条体のドーパミン作動性投
射ニューロンの変性から生じる線条体ドーパミンの欠乏に起因する。広範に特徴
付けされたパーキンソン病の動物モデルは、１−メチル−４フェニル１，２，３
，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の全身投与を含む。ＣＮＳにおいて、
ＭＰＴＰは、星状細胞に取り込まれ、そしてモノアミンオキシダーゼＢにより１
−メチル−４−フェニルピリジン（ＭＰＰ+）に異化され、そして放出される。
引き続き、ＭＰＰ+は、ドーパミンの高親和性再取り込みトランスポーターによ
りドーパミン作動性ニューロンに能動的に蓄積する。次いで、ＭＰＰ+は、電気
化学勾配によりミトコンドリア中で濃縮され、そしてニコチンアミド（ｎｉｃｏ
ｔｉｄａｍｉｄｅ）アデニン二リン酸：ユビキノン酸化還元酵素（ｏｘｉｄｏｒ
ｅｄｕｃｔｉｏｎａｓｅ）（複合体Ｉ）を選択的に阻害し、これにより電子伝達
を妨害し、そして最終的に酸素ラジカルを生成する。
【１１０５】 ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）が黒質のドーパミン作動性ニューロンへの栄養活
性を有することが組織培養パラダイムにおいて実証されている（Ｆｅｒｒａｒｉ
ら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９８９）。近年、Ｕｎｓｉｃｋｅｒ博士のグループは
、線条体のゲルフォームインプラントでのＦＧＦ−２投与がＭＰＴＰ曝露と関連
する毒性からの黒質のドーパミン作動性ニューロンのほぼ完全な防御を生じるこ
とを実証している（ＯｔｔｏおよびＵｎｓｉｃｋｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅ
ｎｃｅ，１９９０）。
【１１０６】 ＦＧＦ−２を用いたデータに基づいて、本発明のポリペプチドは、インビトロ
におけるドーパミン作動性ニューロン生存を増強する際において、本発明のポリ
ペプチドがＦＧＦ−２の作用と類似の作用を有するか否かを決定するために評価
され得、そして、本発明のポリペプチドはまた、線条体におけるドーパミン作動
性ニューロンの、ＭＰＴＰ処理と関連する損傷からの防御についてインビボで試
験され得る。本発明のポリペプチドの潜在的効果を、まずドーパミン性ニューロ
ン細胞培養パラダイムにおいてインビトロで試験する。妊娠１４日のＷｉｓｔａ
ｒラット胚由来の中脳底板を解剖することにより、培養物を調製する。この組織
をトリプシンで解離し、そしてポリオルチニン−ラミニンでコートしたカバーガ
ラスに２００，０００細胞／ｃｍ2の密度で播く。この細胞を、ホルモン補充物
（Ｎ１）を含有するダルベッコ改変イーグル培地およびＦ１２培地中で維持する
。インビトロで８日後培養物をパラホルムアルデヒドで固定し、そしてチロシン
ヒドロキシラーゼ（ドーパミン作動性ニューロンについての特異的マーカー）で
の免疫組織化学染色のために処理する。解離した細胞培養物を胚性ラットから調
製する。培養培地を３日ごとに交換し、そしてこの因子もまたその時点に添加す
る。
【１１０７】 ドーパミン作動性ニューロンを妊娠１４日目（ドーパミン作動性前駆細胞が増
殖する段階を過ぎた発生時間）で動物から単離するので、チロシンヒドロキシラ
ーゼ免疫陽性ニューロンの数の増加は、インビトロで生存しているドーパミン作
動性ニューロンの数の増加を示す。従って、もし本発明のポリペプチドがドーパ
ミン作動性ニューロンの生存を延長するように作用するならば、このことは、こ
のポリペプチドがパーキンソン病に関与し得ることを示唆する。
【１１０８】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、アゴ
ニストおよび／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示する研究を
容易に改変し得る。
【１１０９】 （実施例３６：血管内皮細胞の増殖への本発明のポリペプチドの効果） １日目に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、４％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ
）、１６ユニット／ｍｌ ヘパリン、および５０ユニット／ｍｌ 内皮細胞増殖
補充物（ＥＣＧＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含有するＭ１９９
培地中で、３５ｍｍディッシュあたり２〜５×１０4細胞の密度で播種する。２
日目に、この培地を、１０％ＦＢＳ、８ユニット／ｍｌヘパリンを含有するＭ１
９９で置換する。配列番号Ｙのアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび陽性コ
ントロール（例えば、ＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））を種々の濃度
で添加する。４日目および６日目に、培地を置き換える。８日目に、Ｃｏｕｌｔ
ｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて細胞数を決定する。
【１１１０】 ＨＵＶＥＣ細胞数の増加は、本発明のポリペプチドが血管内皮細胞を増殖させ
得ることを示す。
【１１１１】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、アゴ
ニストおよび／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示する研究を
容易に改変し得る。
【１１１２】 （実施例３７：血管内皮細胞の増殖への本発明のポリペプチドの刺激効果） 増殖因子の分裂促進活性の評価のために、電子共役試薬ＰＭＳ（フェナジンメ
トサルフェート）を用いる、比色分析ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾー
ル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフ
ォフェニル）２Ｈ−テトラゾリウム）アッセイを実行した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ
９６ ＡＱ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞を０．１ｍＬの血清補充培地中で９６ウ
ェルプレートに播種し（５，０００細胞／ウェル）、そして一晩付着させる。０
．５％ＦＢＳ中、１２時間の血清飢餓後、Ｈｅｐａｒｉｎ（８Ｕ／ｍｌ）を伴う
かまたは伴わない、条件（０．５％ＦＢＳ中のｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ165また本発
明のポリペプチド）をウェルに４８時間添加する。２０ｍｇのＭＴＳ／ＰＭＳ混
合物（１：０．０５）を１ウェルあたりに添加し、そして３７℃で１時間インキ
ュベートさせ、その後ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定
する。コントロールウェル（何らかの培地、細胞なし）のバックグラウンドの吸
光度を差し引きし、そしてそれぞれの条件について７つのウェルを並行して実施
する。Ｌｅａｋら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０Ａ：
５１２〜５１８（１９９４）を参照のこと。
【１１１３】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、アゴ
ニストおよび／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示する研究を
容易に改変し得る。
【１１１４】 （実施例３８：ＰＤＧＦ誘導性血管平滑筋細胞増殖刺激効果の阻害） ＨＡｏＳＭＣ増殖を、例えば、ＢｒｄＵｒｄ取り込みにより測定し得る。手短
には、４チャンバスライド上で増殖させたコンフルエント未満の静止期細胞を、
ＣＲＰまたはＦＩＴＣ標識ＡＴ２−３ＬＰでトランスフェクトする。次いで、こ
の細胞に１０％仔ウシ血清および６ｍｇ／ｍｌのＢｒｄＵｒｄをパルスする。２
４時間後、ＢｒｄＵｒｄ染色キット（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
を用いることにより免疫細胞化学を実施する。簡略には、この細胞を、変性溶液
への曝露後、ビオチン化マウス抗ＢｒｄＵｒｄ抗体と４℃で２時間インキュベー
トし、次いでストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジン
とともにインキュベートする。ヘマトキシリンでの対比染色後、この細胞を検鏡
のために取り付け、そしてＢｒｄＵｒｄ陽性細胞を計数する。ＢｒｄＵｒｄ指数
は、総細胞数に対するＢｒｄＵｒｄ陽性細胞の％として計算される。さらに、個
々の細胞について、明視野照明および暗視野ＵＶ蛍光照明の同時使用により、Ｂ
ｒｄＵｒｄ染色（核）およびＦＩＴＣ取り込み（細胞質）の同時検出を実行する
。Ｈａｙａｓｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６：２７１（３６）：２１
９８５〜２１９９２（１９９６）を参照のこと。
【１１１５】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、アゴ
ニストおよび／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示する研究を
容易に改変し得る。
【１１１６】 （実施例３９：内皮移動の刺激） 本実施例は、本発明のポリペプチドがリンパ性の内皮細胞移動を刺激し得る可
能性を探索するために用いられる。
【１１１７】 内皮細胞移動アッセイは、４８ウェルの微小走化性チャンバを用いて実行され
る（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ，ＭＤ；Ｆａｌｋ
，Ｗ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８０；３３
：２３９〜２４７）。８μｍの孔サイズの、ポリビニルピロリドンを含まないポ
リカーボネートフィルター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．Ｃａｍｂｒｉｄ
ｇｅ，ＭＡ）を室温で少なくとも６時間０．１％ゼラチンでコートし、そして滅
菌空気のもとで乾燥する。０．２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充した
Ｍ１９９中で試験物質を適切な濃度に希釈し、そして２５μｌの最終希釈物を改
変Ｂｏｙｄｅｎ装置の下部チャンバに置く。コンフルエント未満の、早期継代（
２〜６）のＨＵＶＥＣまたはＢＭＥＣ培養物を洗浄し、そして細胞の剥離を達成
するために必要な最小の時間トリプシン処理する。下部チャンバと上部チャンバ
との間にフィルターを配置した後、１％ＦＢＳを含有する５０μｌ Ｍ１９９中
に懸濁した２．５×１０5細胞を上部コンパートメントに播種する。次いでこの
装置を、５％ＣＯ2を有する加湿チャンバ中で３７℃で５時間インキュベートし
て細胞を移動させた。インキュベーション期間後、このフィルターを取り出し、
そして非移動細胞を有するフィルターの上部側をゴム性のポリスマン（ｐｏｌｉ
ｃｅｍａｎ）でかきとる。このフィルターをメタノールで固定し、そしてＧｉｅ
ｍｓａ溶液（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ，Ｂａｘｔｅｒ，ＭｃＧｒａｗ Ｐａｒｋ，
ＩＬ）で染色する。移動を、それぞれのウェルにおいて、３つの無作為の高倍率
視野（４０×）の細胞を計数することにより定量する。そしてすべての群を４連
で実行する。
【１１１８】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を
試験し得る。
【１１１９】 （実施例４０：内皮細胞による一酸化窒素生成の刺激） 血管内皮による一酸化窒素の放出は、血管内皮弛緩の介在物質であると考えら
れてる。従って、本発明のポリペプチドの活性は、このポリペプチドに応答する
内皮細胞による一酸化窒素産生を測定することによってアッセイされ得る。
【１１２０】 一酸化窒素を、２４時間の飢餓、次いで、様々なレベルの陽性コントロール（
例えば、ＶＥＧＦ−１）および本発明のポリペプチドへの４時間の曝露の後のコ
ンフルエントな微小血管内皮細胞の９６ウェルプレート中で測定する。培地中の
一酸化窒素を、Ｇｒｉｅｓｓ試薬の使用により定量して、硝酸還元酵素による一
酸化硝酸由来の硝酸の還元後の亜硝酸の総量を測定する。一酸化窒素放出の際の
本発明のポリペプチドの効果を、ＨＵＶＥＣにおいて試験する。
【１１２１】 簡単には、培養したＨＵＶＥＣ単層からのＮＯ放出は、ＮＯメーター（Ｉｓｏ
−ＮＯ、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．
）（１０４９）に接続したＮＯ特異的なポーラログラフ電極を用いて測定する。
ＮＯエレメントの較正を、以下の式に従って行う： ２ＫＮＯ2＋２ＫＩ＋２Ｈ2ＳＯ4６２ＮＯ＋Ｉ2＋２Ｈ2Ｏ＋Ｋ2ＳＯ4 検量線を、ＫＩおよびＨ2ＳＯ4を含む較正溶液中に段階的な濃度のＫＮＯ2（
０、５、１０、２５、５０、１００、２５０、および５００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添
加することによって得る。ＮＯに対するＩｓｏ−ＮＯ電極の特異性を、オーセン
ティックなＮＯ気体からのＮＯの測定により、事前に決定する（１０５０）。こ
の培養培地を取り除き、そしてＨＵＶＥＣを、Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝化生
理食塩水で２回洗浄する。次いで、細胞を、６ウェルプレート中で５ｍｌのろ過
したＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液に浸し、そしてこの細胞プレートを、
３７℃に温度を維持するために、スライドウォーマー（Ｌａｂ Ｌｉｎｅ Ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）で保持する。ＮＯセンサープローブをウェルに
垂直に挿入して、異なる条件の追加の前に、電極の先端を溶液の表面の２ｍｍ下
で保持する。Ｓ−ニトロソアセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）を、陽性コントロ
ールとして用いる。放出したＮＯの量を、１×１０6内皮細胞あたりのピコモル
濃度として表す。全ての報告した値は、各群（細胞培養ウェルの数）における４
〜６の測定値の平均である。Ｌｅａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１７：９６−１０５（１９９５）を参照のこと。
【１１２２】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を
試験し得る。
【１１２３】 （実施例４１：新脈管形成における臍形成に対する本発明のポリペプチドの効
果） 新脈管形成における別の工程は、内皮細胞の分化により特徴付けられる臍（ｃ
ｏｒｄ）形成である。このバイオアッセイは、インビトロで培養した場合の微小
血管内皮細胞の毛細管様構造（中空構造）を形成する能力を測定する。
【１１２４】 ＣＡＤＭＥＣ（微小血管内皮細胞）を、増殖性（２継代）細胞としてＣｅｌｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．から購入し、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ’ＣＡＤＭＥＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ中で培養し、そして５
継代で使用する。インビトロ新脈管形成アッセイのために、４８ウェル細胞培養
プレートのウェルをＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’Ａｔｔａｃｈｍｅｎ
ｔ Ｆａｃｔｏｒ Ｍｅｄｉｕｍ（２００ｍｌ／ウェル）を用いて、３７℃で３
０分間コートする。ＣＡＤＭＥＣを、７，５００細胞／ウェルでコートしたウェ
ルに播種し、Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ中で一晩培養する。次いで、このＧｒ
ｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍを、コントロール緩衝液または本発明のポリペプチド（
０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ）を含む３００ｍｇのＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ’Ｃｈｏｒｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍと交換し、そしてこの
細胞をさらに４８時間培養する。毛細管様の臍の数および長さを、Ｂｏｅｃｋｅ
ｌｅｒ ＶＩＡ−１７０ビデオ画像分析装置の使用を通じて定量する。全てのア
ッセイを三連で行う。
【１１２５】 市販の（Ｒ＆Ｄ）ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロールとして用
いる。ｂ−エストラジオール（１ｎｇ／ｍｌ）を、陰性コントロールとして用い
る。適切な緩衝液（タンパク質なし）もまた、コントロールとして利用する。
【１１２６】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチ
ド（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性
を試験し得る。
【１１２７】 （実施例４２：ニワトリ漿尿膜に対する脈管形成効果） ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）は、新脈管形成を試験するために十分に確立した系
である。ＣＡＭにおける血管形成は、容易に可視性および定量可能である。本発
明のポリペプチドのＣＡＭにおける新脈管形成を刺激する能力を試験し得る。
【１１２８】 Ｗｈｉｔｅ Ｌｅｇｈｏｒｎニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）の受精
卵および日本ウズラ（ｑｕａｌ）（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ ｃｏｕｔｕｒｎｉｘ）を
、３７．８℃および湿度８０％でインキュベートする。１６日齢のニワトリおよ
び１３日齢のウズラの胚の分化したＣＡＭを以下の方法で研究する。
【１１２９】 発生の４日目に、ニワトリ卵の卵殻に窓を作る。この胚を正常な発生について
調べ、そしてこの卵をセロテープ（登録商標）で封着する。これらを、さらに１ ３日目までインキュベートする。Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバーガラス（Ｎｕｎｃ， Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を、直径約５ｍｍのディスクに切る。滅菌かつ無 塩の成長因子を滅菌水に溶解し、そして約３．３ｍｇ／５ｍｌをディスクにピペ ットで移す。風乾後、逆さにしたディスクをＣＡＭに適用する。３日後、標本を ３％グルタルアルデヒドおよび２％ホルムアルデヒド中で固定し、そして０．１ ２Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液でリンスする。これらを実体顕微鏡［Ｗｉｌｄ Ｍ８］を用いて写真撮影し、上記のように半薄層切片化および超薄層切片化の ために包埋する。コントロールは、キャリアディスク単独で行う。
【１１３０】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を
試験し得る。
【１１３１】 （実施例４３：マウスにおけるＭａｔｒｉｇｅｌ移植片を用いる新脈管形成ア
ッセイ） 本発明のポリペプチドのインビトロ新脈管形成アッセイは、既存の毛細管網様
構造の、マウス細胞外マトリックス物質（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の移植されたカプ
セル中に新しい脈管を形成する能力を測定する。このタンパク質を、４℃で液体
Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合し、次いでこの混合物を、マウスに皮下注射し、ここで
、固化される。７日後、Ｍａｔｒｉｇｅｌの固体「プラグ」を取り除き、そして
新しい血管の存在について試験する。Ｍａｔｒｉｇｅｌを、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ／Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄ
ｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入する。
【１１３２】 ４℃で解凍した時、Ｍａｔｒｉｇｅｌ物質は液体である。このＭａｔｒｉｇｅ
ｌを、４℃にて１５０ｎｇ／ｍｌで本発明のポリペプチドと混合し、冷３ｍｌシ
リンジ中に入れる。約８週齢の雌性Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、腹部の中腹側面の
２つの部位にＭａｔｒｉｇｅｌおよび実験タンパク質の混合物を注射する（０．
５ｍｌ／部位）。７日後、このマウスを頚椎脱臼により屠殺し、Ｍａｔｒｉｇｅ
ｌプラグを取り除きそして洗浄する（すなわち、全ての付着する膜および腺維組
織を取り除く）。複製の全プラグを中性緩衝化１０％ホルムアミド中で固定し、
パラフィン中に包埋し、そしてＭａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅで染色後
、組織学的試験のための切片を作製するために使用する。各プラグの３つの異な
る領域からの切片を、処理する。選択した切片をｖＷＦの存在について染色する
。このアッセイについての陽性コントロールは、ウシ塩基性ＦＧＦ（１５０ｎｇ
／ｍｌ）である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ単独を用いて、新脈管形成の基底レベルを決
定する。
【１１３３】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を
試験し得る。
【１１３４】 （実施例４４：ウサギ下肢モデルにおける虚血の救出） 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの虚血に対するインビボでの効
果を研究するため、ウサギ後肢虚血モデルを、以前に記載される（Ｔａｋｅｓｈ
ｉｔａら、Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ １４７：１６４９−１６６０（１９９５）
）ように１つの大腿動脈の外科的除去により作製する。大腿動脈の切除は、血栓
の逆行性伝播および外腸骨動脈の閉塞を生じる。結果として、虚血肢への血流は
、内腸骨動脈から生じる側副血管に依存する（Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ａｍ Ｊ
．Ｐａｔｈｏｌ １４７：１６４９−１６６０（１９９５））。１０日の間隔で
、ウサギの手術後の回復および内因性の側副血管の発達を可能にする。手術（０
日）後１０日目に、ベースライン血管造影を行った後、虚血肢の内腸骨動脈を、
本発明のポリヌクレオチドを含む５００ｍｇの裸の発現プラスミドを用いて、（
Ｒｉｅｓｓｅｎら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：７４９−７５８（１９９
３）；Ｌｅｃｌｅｒｃら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：９３６−９４４
（１９９２））に記載されるように、ヒドロゲル被覆バルーンカテーテルを用い
る動脈遺伝子移入技術により、トランスフェクトする。本発明のポリペプチドを
処置に用いる場合、５００ｍｇの本発明のポリペプチドまたはコントロールの単
回ボーラスを、注入カテーテルを通じて１分間にわたり、虚血肢の内腸骨動脈中
に送達する。３０日目に、種々のパラメーターを、これらのウサギで測定する：
（ａ）ＢＰ比−虚血肢の収縮期血圧 対 正常肢の収縮期血圧の比；（ｂ）血流
および逆流−停止ＦＬ：非拡張性状態の間の血流、および最大ＦＬ：完全な拡張
性状態の間の血流（これはまた、血管量の間接的測定）、そして逆流は、最大Ｆ
Ｌ：停止ＦＬの比に反映される；（ｃ）血管造影値（ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｃｏｒｅ）−これを側副血管の血管造影により測定する。スコアを、オーバ
ーレイグリッド（ｏｖｅｒｌａｙｉｎｇ ｇｒｉｄ）内の円の百分率（ウサギ大
腿の総数ｍで割った横断不透明化動脈を用いる）により決定する；（ｄ）毛細管
（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）密度−側副毛細血管の数は、後肢から得た光学顕微鏡用
切片において決定した。
【１１３５】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペ
プチド活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本
発明のアゴニストおよび／またはアンタゴニストの活性を試験し得る。
【１１３６】 （実施例４５：本発明のポリペプチドの血管拡張に対する効果） 血管内皮の拡張は、血圧の低下に重要であるので、自然発症高血圧ラット（Ｓ
ＨＲ）における、本発明のポリヌクレオチドの血圧に影響する能力を、試験する
。漸増用量（０，１０、３０、１００、３００、および９００ｍｇ／ｋｇ）の本
発明のポリペプチドを、１３〜１４週齢の自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）に投
与する。データを、平均＋／−ＳＥＭで表す。統計学的分析を、両側ｔ検定を用
いて行い、そして統計的な有意性を、ｐ＜０．０５対緩衝液単独への応答として
定義する。
【１１３７】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を
試験し得る。
【１１３８】 （実施例４６：ラット虚血皮膚弁モデル） 評価パラメーターとして、皮膚の血流、皮膚温度、および第ＶＩＩＩ因子の免
疫組織化学または内皮アルカリホスファターゼ反応が挙げられる。皮膚虚血の間
の本発明のポリペプチドの発現を、インサイチュハイブリダーゼーションを用い
て研究する。
【１１３９】 このモデルにおける研究を、以下の３つの部分に分ける： ａ）虚血皮膚 ｂ）虚血皮膚創傷 ｃ）通常の創傷。
【１１４０】 実験プロトコルは以下を含む： ａ）３×４ｃｍの単一茎全層無作為皮膚弁（ｓｉｎｇｌｅ ｐｅｄｉｃｌｅ
ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｒａｎｄｏｍ ｓｋｉｎ ｆｌａｐ）（動物の
下背部にわたる筋皮弁）を生じさせる。
【１１４１】 ｂ）虚血皮膚（皮膚弁）に切除創傷をつくる（直径４〜６ｍｍ） ｃ）次の種々の投薬範囲の本発明のポリペプチドによる、切除創傷（創傷後の
０、１、２、３、４日目）の局所的な処置：１〜１００ｍｇ ｄ）組織学的研究、免疫組織化学的研究、およびインサイチュ研究のために、
創傷後の３、５、７、１０、１４、および２１日目に創傷組織を収集する。
【１１４２】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を
試験し得る。
【１１４３】 （実施例４７：末梢動脈疾患モデル） 本発明のポリペプチドを用いる脈管形成治療は、末梢動脈疾患の場合の虚血の
周囲の血流の回復を得る新規の治療的ストラテジーである。実験プロトコルは以
下を含む： ａ）一方の片側の大腿動脈を、後肢の虚血筋肉を作製するために結紮し、他方
の片側の後肢は、コントロールの役割をする。
【１１４４】 ｂ）本発明のポリペプチドを、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲で、一週間あ
たり静脈内および／または筋肉内に３回（おそらくそれより多く）で２〜３週間
、送達する。
【１１４５】 ｃ）この虚血筋肉組織を、大腿動脈の結紮後、１、２、および３週間目に、本
発明のポリペプチドの発現の分析ならびに組織学のために収集する。生検もまた
、他方の片側の対側後肢の正常な筋肉において行う。
【１１４６】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を
試験し得る。
【１１４７】 （実施例４８：虚血性心筋疾患モデル） 本発明のポリペプチドを、側副血管の発達を刺激し得、かつ冠状動脈閉塞後の
新しい血管も再構成し得る強力なマイトジェンとして評価する。ポリペプチドの
発現の変化を、インサイチュで調査する。実験プロトコルは、以下を含む： ａ）心臓を、ラットの左側開胸術を介して露出する。直ちに、左冠状動脈を、
細い縫合糸（６−０）を用いて咬合し、そして胸郭を閉じる。
【１１４８】 ｂ）本発明のポリペプチドを、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲で、一週間あ
たり静脈内および／または筋肉内に３回（おそらくそれより多く）で２〜４週間
、送達する。
【１１４９】 ｃ）手術の３０日後、この心臓を、形態測定のために取り出しそして横断切片
化し、そしてインサイチュで分析する。
【１１５０】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を
試験し得る。
【１１５１】 （実施例４９：ラット角膜創傷治癒モデル） この動物モデルは、本発明のポリペプチドの、新生血管形成に対する効果を示
す。実験プロトコルは、以下を含む： ａ）角膜の中心から間質層へと１〜１．５ｍｍの長い切開を作る ｂ）目の外端に面する切開の唇縁の下にスパーテルを挿入する ｃ）ポケットを作る（その基底は、目の縁から１〜１．５ｍｍである） ｄ）５０ｎｇ〜５μｇの本発明のポリペプチドを含む小丸剤を、ポケット内に
配置する ｅ）本発明のポリペプチドでの処置をまた、２０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲の投
薬範囲内で（毎日の処置を５日間）角膜創傷に局所的に適用し得る。
【１１５２】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を
試験し得る。
【１１５３】 （実施例５０：糖尿病マウスおよび糖質コルチコイド障害性創傷治癒モデル） （Ａ．糖尿病ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスモデル） 本発明のポリペプチドが治癒プロセスを促進することを実証するために、創傷
治癒の遺伝的糖尿病マウスモデルを、使用する。ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスにおける
全層（ｆｕｌｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）創傷治癒モデルは、障害性の創傷治癒の
十分に特徴付けられた、臨床的に関連性のある、そして再現可能なモデルである
。糖尿病性創傷の治癒は、収縮よりむしろ肉芽組織の形成および再上皮形成に依
存する（Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５２：３８９（
１９９２）；Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１
３６：１２３５（１９９０））。
【１１５４】 この糖尿病動物は、ＩＩ型真性糖尿病において観察される特徴的な特性の多く
を有する。ホモ接合（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、それらの正常なヘテロ接合（
ｄｂ＋／＋ｍ）同腹仔と比較して肥満である。変異体糖尿病（ｄｂ＋／ｄｂ＋）
マウスは、第４染色体（ｄｂ＋）上の単一の常染色体性の劣性変異を有する（Ｃ
ｏｌｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２８
３−２９３（１９８２））。動物は、多食症、多渇症、および多尿症を示す。変
異体糖尿病マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋）は、上昇した血中グルコース、増加したま
たは正常なインスリンレベル、および抑制された細胞媒介性免疫を有する（Ｍａ
ｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５（１９７８）；Ｄｅｂｒａ
ｙ−Ｓａｃｈｓ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１（１）：１
−７（１９８３）；Ｌｅｉｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１１４：
４６−５５（１９８５））。末梢神経障害、心筋合併症、および微小血管損傷、
基底膜肥厚、および糸球体濾過異常は、これらの動物において記載されている（
Ｎｏｒｉｄｏ，Ｆ．ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．８３（２）：２２１−２３２（
１９８４）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２９（１）：６０−６
７（１９８０）；Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．４０（４）
：４６０−４７３（１９７９）；Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ
３１（補遺）：１−６（１９８２））。これらのホモ接合糖尿病マウスは、高血
糖症を発症し、そしてこれは、ヒトＩＩ型糖尿病に類似してインスリンに対して
耐性である（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５−１３７
７（１９７８））。
【１１５５】 これらの動物において観察した特徴は、このモデルにおける治癒が、ヒト糖尿
病において観察した治癒に類似し得ることを示す（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈら、Ａ
ｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５−１２４６（１９９０））。
【１１５６】 遺伝的糖尿病の雌性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウス、およびそ
れらの非糖尿病（ｄｂ＋／＋ｍ）へテロ接合性同腹仔を、この研究に用いた（Ｊ
ａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。これらの動物を６週齢で購入する
。研究の開始時は８週齢である。動物を個別に飼育し、そして自由に食物と水を
与える。全ての操作を、無菌操作を用いて行う。この実験を、Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｃのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍ
ａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｕ
ｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って行う。
【１１５７】 創傷プロトコルを、以前に報告された方法（Ｔｓｕｂｏｉ，Ｒ．およびＲｉｆ
ｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：２４５−２５１（１９９０）
）に従って行う。簡単には、創傷させる日に、動物を、脱イオン水に溶解したＡ
ｖｅｒｔｉｎ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、２，２，２−トリブロモエタノールおよ
び２−メチル−２−ブタノールの腹腔内注射で麻酔する。この動物の背面領域を
剃毛し、そして皮膚を７０％エタノール溶液およびヨウ素で洗浄する。手術範囲
を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。次いで、８ｍｍの全層の創傷を、
Ｋｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。創傷させた直後に、周囲の皮膚を、創
傷の拡大を取り除くために穏やかに伸ばす。実験の間この創傷の左を開放する。
処置の適用は、創傷させた日から５日間連続で、局所的に受ける。処置の前に、
創傷を、滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。
【１１５８】 創傷を視覚的に検査し、そして手術の日およびその後２日間隔で、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目および８日目の日々の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎ測径器（ｃ
ａｌｉｐｅｒ）を用いて水平および垂直に測定する。創傷を、肉芽組織がもはや
目に見えずかつ創傷を連続した上皮が覆う場合に治癒したとみなす。
【１１５９】 本発明のポリペプチドを、ビヒクル中で８日間、異なる用量の範囲（１日あた
り創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。ビヒクルコントロール群
は、５０ｍＬのビヒクル溶液を与えた。
【１１６０】 動物は、ペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射に
よって、８日目に安楽死させられる。創傷および取り囲む皮膚を、次いで、組織
学および免疫組織学のために収集する。組織標本を、さらなる処理のために生検
スポンジの間の組織カセットの１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【１１６１】 それぞれ１０の動物（５の糖尿病コントロールおよび５の非糖尿病コントロー
ル）の３つの群を評価する：１）ビヒクルプラシーボコントロール、２）非処理
群、３）処理群。
【１１６２】 創傷閉鎖を垂直軸および水平軸中の範囲を測定し、そして創傷の全四角形範囲
を得ることによって分析する。次いで、収縮を、初期の創傷面積（０日目）と処
理後の創傷面積（８日目）との間の差を確かめることによって評価する。１日目
の創傷面積は６４ｍｍ2であり、皮膚パンチの対応するサイズである。計算を以
下の式を用いて行う： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］ 標本を１０％緩衝化ホルマリンに固定し、そしてパラフィン包埋ブロックを創
傷表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミクロ
トームを使用して切断した。通常のヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を
、二分された創傷の断面において実施する。創傷の組織学的試験を使用して、修
復した皮膚の治癒プロセスおよび形態的な外見が、本発明のポリペプチドでの処
置によって変化するかどうかを評価する。この評価は、細胞蓄積、炎症性細胞、
毛細管、線維芽細胞、上皮形成および表皮成熟の確認を含んだ（Ｇｒｅｅｎｈａ
ｌｇｈ、Ｄ．Ｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９６））
。目盛りを付けられたレンズマイクロメーターが、盲検観察者（ｂｌｉｎｄｅｄ
ｏｂｓｅｒｖｅｒ）によって使用される。
【１１６３】 組織断片をまた、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ検出システムを使用して、ポリクローナ
ルネズミ抗ヒトケラチン抗体で、免疫組織化学的に染色する。人間の皮膚は、正
の組織コントロールとして使用されるが、一方、非免疫ＩｇＧが負のコントロー
ルとして使用される。ケラチン合成細胞増殖は、目盛り付きレンズマイクロメー
ターを使用することによって創傷の再上皮形成の程度を評価することによって決
定される。
【１１６４】 皮膚サンプル中の増殖性細胞核抗原／サイクリン（ＰＣＮＡ）は、ＡＢＣ Ｅ
ｌｉｔｅ検出システムを用いる抗ＰＣＮＡ抗体（１：５０）を使用することに よって立証される。ヒト大腸癌は、陽性組織コントロールとして作用し得、そし
てヒト脳組織は、陰性組織コントロールとして使用される。各標本は、１次抗体
の脱落および非免疫マウスＩｇＧとの置換を有する切片を含む。これらの切片の
順位は、０〜８のスケール（わずかな増殖を反映するより低い側のスケール〜激
しい増殖を反映するより高い側）の増殖の程度に基づく。
【１１６５】 実験データは、片側（ｕｎｐａｉｒｅｄ）ｔ検定を使用して分析する。＜０．
０５のｐ値は、有意であると考えられる。
【１１６６】 （Ｂ．ステロイド障害性ラットモデル） ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々のインビトロおよびインビボ系にお
いて、十分に実証されている（Ｗａｈｌ，Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａ
ｎｄ Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ：Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓ
ｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐ
ｅｃｔｓ．２８０−３０２（１９８９）； Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１１５：４７６−４８１（１９７５）；Ｗｅｒｂら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４
７：１６８４−１６９４（１９７８））。グルココルチコイドは、新脈管形成を
阻害し、脈管透過性（Ｅｂｅｒｔら、Ａｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．３７：７０
１−７０５（１９５２））、線維芽細胞増殖、およびコラーゲン合成（Ｂｅｃｋ
ら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａｙ
ｎｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８））
を低下させ、そして循環する単球の一過性の減少を生じること（Ｈａｙｎｅｓら
、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）；Ｗａｈｌ
、「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ」
：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓ
ｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２８０−３０２頁（１９８９））によって創傷治癒を
遅延させる。障害性創傷治癒に対するステロイドの全身性投与は、ラットにおい
て十分に確立された現象である（Ｂｅｃｋら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．
５：２９５−３０４（１９９１）； Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８） ；Ｗａｈｌ、「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔ
ｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍ
ｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎ
ｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
、２８０−３０２頁（１９８９）；Ｐｉｅｒｃｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２２２９−２２３３（１９８９））。
【１１６７】 本発明のポリペプチドが治癒プロセスを促進し得ることを実証するために、治
癒が、メチルプレドニゾロンの全身性投与により損なわれる、ラットの全層切除
皮膚創傷に対する本発明のポリペプチドの複数の局所適用の効果を評価する。
【１１６８】 若年成体の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（体重２５０〜３００ｇ
）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこの実験に用
いる。この動物を、８週齢で購入し、研究の開始は９週齢である。ラットの治癒
応答は、創傷の時点で、メチルプレドニゾロンの全身性投与（１７ｍｇ／ｋｇ／
ラット、筋肉内）により損なわれる。動物を個別に飼育し、そして自由に食物と
水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて実施する。この研究を、Ｈｕｍａ
ｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｃのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ
Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔｈ
ｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って行
う。
【１１６９】 創傷プロトコルは、上記Ａ節に従う。創傷させる日に、動物をケタミン（５ｍ
ｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔する。この動
物の背面領域を剃毛し、そして皮膚を７０％エタノールおよびヨウ素溶液で洗浄
する。手術範囲を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。８ｍｍの全層創傷
をＫｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。実験の間、この創傷の左を開放する
。試験物質の適用を、創傷させ、次いでメチルメチルプレドニゾロン投与を行っ
た日から開始して、７日間連続で、１日１回、局所的に与える。処置の前に、創
傷を滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。
【１１７０】 創傷を視覚的に検査し、そして創傷させた日および処置の終りに、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目の毎日および８日目の測定により決
定する。創傷を目盛り付きＪａｍｅｓｏｎノギスを用いて水平および垂直に測定
する。創傷を、肉芽組織がもはや目に見えずかつ創傷を連続した上皮が覆う場合
に、治癒したとみなす。
【１１７１】 本発明のポリペプチドを、ビヒクル中で８日間、異なる用量の範囲（１日あた
り創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。ビヒクルコントロール群
は、５０ｍＬのビヒクル溶液を受けた。
【１１７２】 動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学のために収集
する。組織標本を、さらなる処理のために、生検スポンジの間の組織カセット内
で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【１１７３】 各々１０匹の動物（メチルメチルプレドニゾロンを用いる５匹およびグルココ
ルチコイドを用いない５匹）の４つの群を評価する：１）非処置群、２）ビヒク
ルプラシーボコントロール、および３）処置群。
【１１７４】 創傷閉鎖を、垂直軸および水平軸で範囲を測定すること、および創傷の面積の
合計を得ることにより分析する。次いで、閉鎖を、最初の創傷の面積（０日目）
と処置後（８日目）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目
のこの創傷面積は、６４ｍｍ2（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を
以下の式を用いて行う： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］ 標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＯｌｙｍｐｕｓミクロトームを
用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、二等分
した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験は、修復した皮膚の治癒プロセ
スおよび形態的な外見を、本発明のポリペプチドを用いる処置によって改善した
かどうかを評価することを可能にする。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲
検観察者が用いて、創傷の隙間の距離を決定する。
【１１７５】 実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみな
す。
【１１７６】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリヌクレオチド活性を試験し
た。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリペプチド
（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を
試験し得る。
【１１７７】 （実施例５１：リンパ水腫（ｌｙｍｐｈａｄｅｍａ）動物モデル） この実験アプローチの目的は、ラット後肢におけるリンパ管形成（ｌｙｍｐｈ
ａｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）およびリンパの循環系の再確立における本発明のポリ
ペプチドの治療的効果を試験するための、適切かつ一貫したリンパ水腫モデルを
作製することである。有効性は、罹患した肢の腫脹体積、リンパの脈管構造の量
の定量、総血漿タンパク質、および組織病理学により測定される。急性リンパ水
腫は、７〜１０日間観察される。恐らくより重要なことには、水腫の慢性進行は
、３〜４週間まで続く。
【１１７８】 手術を始める前に、血液サンプルを、タンパク質濃度分析のために採血する。
雄性ラット（体重約３５０ｇ）に、ペントバルビタールを投薬する。次いで、右
肢を膝から股関節部まで剃毛する。この剃毛した範囲を７０％ＥｔＯＨに浸した
ガーゼで拭く。血液を、血清総タンパク質試験のために採血する。周径測定およ
び体積測定を行った後に、２つの測定レベル（踵の０．５ｃｍ上、足背の中間点
）に印をつけた後、足へと色素を注射する。右足背および左足の両方の内皮背に
、０．０５ｍｌの１％Ｅｖａｎ’ｓ Ｂｌｕｅを注射する。次いで、足への色素
の注射の後、周径測定および体積測定を行う。
【１１７９】 目印として膝関節を用いて、中肢鼡径部切開を、大腿血管の位置を確認できる
ように環状に行う。鉗子および止血鉗子を用いて、皮膚弁を切開し、そして分離
する。大腿血管の位置確認後、血管の横に沿ってかつ血管の下に走るリンパ管を
位置確認する。次いで、この範囲の主要なリンパ管を、電気凝固縫合結紮（ｅｌ
ｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｓｕｔｕｒｅ ｌｉｇａｔｅ）する。
【１１８０】 顕微鏡を用いて、肢の背の筋肉（半腱様筋（ｓｅｍｉｔｅｎｄｉｎｏｓｉｓ）
および内転筋の付近）を平滑に切開する。次いで、膝窩リンパ節の位置を確認す
る。次いで、２つの近位リンパ管および２つの遠位リンパ管、ならびに膝窩節の
遠位血液供給部を縫合により結紮する。次いで、膝窩リンパ節および任意の付随
する脂肪組織を、結合組織を切断することによって取り除く。
【１１８１】 この手順で生じるいかなる軽度の出血をも管理するように注意すること。リン
パ管を咬合した後、皮膚弁を、液体皮膚（Ｖｅｔｂｏｎｄ）（ＡＪ Ｂｕｃｋ）
を使用することによって密封する。別々の皮膚縁を、その下の筋肉組織に、脚の
周囲に約０．５ｃｍのギャップを残しながら密封する。皮膚はまた、必要なとき
にその下の筋肉に縫合することによって係留してもよい。
【１１８２】 感染を回避するために、動物を、メッシュを用いて個別に収容する（床敷きな
し）。回復した動物を、最適な水腫ピークを通して毎日チェックする。このピー
クは、代表的には５〜７日まで生じる。次いで、プラトーの水腫ピークを観察す
る。リンパ水腫の強度を評価するために、各肢上の２つの指定した場所の周径お
よび体積を、操作の前および７日間毎日測定する。リンパ水腫に対する血漿タン
パク質の効果を決定し、そしてタンパク質分析が有用な試験周界であるか否かも
また調査する。コントロール肢および水腫肢の両方の重量を、２箇所で評価する
。分析を盲目様式（ｂｌｉｎｄ ｍａｎｎｅｒ）で行う。
【１１８３】 周径測定：肢の動きを防止するための短期気体麻酔のもとで、布巻尺を使用し
て、肢の周径を測定する。測定を、距骨および背面の足にて、２人の異なる人物
によって行い、次いで、これらの２つの読み取りを平均する。読み取りを、コン
トロールおよび水腫肢の両方から得る。
【１１８４】 体積測定：手術の日に、動物をペントバルビタールで麻酔し、そして手術の前
に試験する。毎日の体積測定のために、動物を短期ハロタン麻酔（迅速な固定化
およびすばやい回復）のもとにおき、両方の脚を剃毛し、そして耐水性マーカー
を用いて脚に等しく印をつける。脚を、最初に水に漬け、次いで各々顕著なレベ
ルまで装置に漬け、次いでＢｕｘｃｏ水腫ソフトウェア（Ｃｈｅｎ／Ｖｉｃｔｏ
ｒ）によって測定する。データを１人の人物によって記録し、一方他者は、脚を
しるしを付けた領域まで漬ける。
【１１８５】 血液−血漿タンパク質測定：手術の前に血液を取り出し、遠心分離し、そして
血清を分離し、次いで、全タンパク質およびＣａ２＋比較について結論付ける。
【１１８６】 肢重量比較：血液を取り出した後、この動物を、組織収集のために準備する。
この肢を、キリチン（ｑｕｉｌｌｉｔｉｎｅ）を用いて切断し、次いで、実験用
脚とコントロール脚の両方を、結紮して切断し、そして秤量する。２回目の秤量
を、脛踵（ｔｉｂｉｏ−ｃａｃａｎｅａｌ）関節を外し、そして足を秤量して行
う。
【１１８７】 組織学的調製：膝（膝窩）領域の後ろに位置する横筋を切り出し、そして金属
鋳型に配置し、ｆｒｅｅｚｅＧｅｌで満たし、冷メチルブタンに漬け、標識した
サンプルバッグに切断するまで−８０ＥＣにて置く。切断の際に、筋肉を、蛍光
顕微鏡のもとで、リンパ管について観察する。
【１１８８】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を
試験し得る。
【１１８９】 （実施例５２：ＴＮＦα誘導性接着分子発現の本発明のポリペプチドによる抑
制） 炎症および新脈管形成の領域に対するリンパ球の漸増は、リンパ球上の細胞表
面接着分子（ＣＡＭ）と血管内皮との間の特異的なレセプター−リガンド相互作
用に関する。この接着プロセスは、通常の設定および病理学的設定の両方におい
て、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−
１）、および内皮細胞（ＥＣ）における内皮白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチ
ン）発現を含む、多段階カスケードに続く。これらの分子および他の分子の血管
内皮における発現は、炎症応答の発生の間に白血球が局所血管系に接着し、そし
て局所組織に溢出し得る効率を決定する。サイトカインの局所濃度および増殖因
子は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。
【１１９０】 腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）（強力な炎症誘発性サイトカイン）は、内皮細
胞における３つ全てのＣＭＡの刺激因子であり、そして広範な種々の炎症応答に
関与し得、しばしば病理学的結果をもたらす。
【１１９１】 ＴＮＦ−α誘導性ＣＡＭ発現の抑制を媒介する本発明のポリペプチドの潜在能
力を試験し得る。改変型ＥＬＩＳＡアッセイ（これは、固相吸着剤としてＥＣを
使用する）を使用して、ＦＧＦファミリーのタンパク質のメンバーを用いて同時
刺激した場合に、ＴＮＦ−α処理ＥＣにおけるＣＡＭ発現の量を測定する。
【１１９２】 この実験を行うために、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）培養物を、プール
した索採取物から得、そして１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマ
イシンを補充した増殖培地（ＥＧＭ−２；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，ＣＡ）中で、５％ＣＯ2を含む３７℃の加湿インキュベーターにおいて維
持する。ＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ培地中１×１０4細胞／ウェルの濃度で、９６ウ
ェルプレート中に、３７℃で１８〜２４時間またはコンフルエントになるまで播
種する。続いて、単層を、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌス
トレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０の無血清溶液で３回洗浄し、そ
して所定のサイトカインおよび／または増殖因子を用いて、２４時間３７℃にて
処理する。インキュベーション後、次いで、この細胞を、ＣＡＭ発現について評
価する。
【１１９３】 ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、標準的な９６ウェルプレートにおいて
コンフルエントになるまで増殖させる。増殖培地を、細胞から取り除き、そして
９０ｕｌの１９９培地（１０％ＦＢＳ）に置き換える。試験のためのサンプルお
よびポジティブまたはネガティブコントロールを、このプレートに三連で添加す
る（１０ｕｌ容量）。プレートを、３７℃にて、５時間（セレクチンおよびイン
テグリン発現）または２４時間（インテグリン発現のみ）のいずれかでインキュ
ベートする。プレートを吸引して、培地を除去し、そして１００μｌの０．１％
パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を有する）を各ウェル
に添加する。プレートを、４℃にて３０分間保持する。
【１１９４】 次いで、固定液をウェルから除去し、そしてウェルをＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）
＋０．５％ＢＳＡを用いて１回洗浄し、そして排水する。このウェルを乾燥させ
ないこと。１０μｌの希釈した一次抗体を、試験ウェルおよびコントロールウェ
ルに添加する。抗ＩＣＡＭ−１−ビオチン、抗ＶＡＣＭ−１−ビオチンおよび抗
Ｅ−セレクチン−ビオチンを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ／ｍｌストッ
ク抗体の１：１０希釈）で使用する。細胞を、加湿した環境において、３７℃に
て３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％
ＢＳＡを用いて３回洗浄する。
【１１９５】 次いで、２０μｌの希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈ
ｏｓｐｈｏｔａｓｅ（１：５，０００希釈）を各ウェルに添加し、そして３７℃
にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５
％ＢＳＡを用いて３回洗浄する。１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐ
ＮＰＰ）を、５ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ１０．４）に溶解させる。グリシン
緩衝液中のｐＮＰＰ基質１００μｌを、各試験ウェルに添加する。三連の標準ウ
ェルを、グリシン緩衝液中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏ
ｓｐｈｏｔａｓｅの操作希釈（ｗｏｒｋｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（１：５，
０００（１０0）＞１０-0.5＞１０-1＞１０-1.5）から調製する。５μｌの各希
釈物を、三連のウェルに添加し、そして各ウェル中の得られたＡＰ含量は、５．
５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇである。次いで、１００
μｌのｐＮＮＰ試薬を、標準ウェルの各々に添加しなければならない。このプレ
ートを、３７℃にて４時間インキューベートしなければならない。３Ｍ ＮａＯ
Ｈの５０μｌの容量を全てのウェルに添加する。この結果を、プレートリーダー
において４０５ｎｍにて定量する。バックグラウンド減算オプションを、グリシ
ン緩衝液のみで満たしたブランクウェルにおいて使用する。このテンプレートを
、各々の標準ウェルにおけるＡＰ結合体の濃度を示すように設定する［５．５０
ｎｇ；１．７４ｎｇ；０．５５ｎｇ；０．１８ｎｇ］。結果を、各サンプル中の
結合したＡＰ結合体の量として示す。
【１１９６】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を
試験し得る。
【１１９７】 本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得
ることは、明らかである。本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の
教示を考慮して可能であり、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内に
ある。
【１１９８】 発明の背景、詳細な説明および実施例において引用された各文書の全開示（特
許、特許出願、学術文献、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示を含む）
は、本明細書中に参考として援用される。さらに、本明細書にとともに提出され
た配列表のハードコピーおよび対応するコンピュ−ター読み出し形態は、両方と
も本明細書中にその全体が参考として援用される。
【１１９９】 （実施例５３：新規のヒトインテグリンα１１サブユニットのクローニング、
配列分析、および染色体の位置決定） 要約 インテグリンは、非共有結合的に会合したαβヘテロダイマーからなる大きな
細胞接着分子のファミリーである。発明者らは、新規のヒトインテグリンα−サ
ブユニットｃＤＮＡ（α１１と称される）をクローン化し、そして配列決定した
。このα１１ ｃＤＮＡは、２２個のアミノ酸のシグナルペプチド、２０７残基
のＩ−ドメインを含み、そして膜貫通ドメインによって２４個のアミノ酸の短い
細胞質ドメインに連結されている、大きい１１２０残基の細胞外ドメインを有す
るタンパク質をコードする。推定α１１タンパク質は、インテグリンα−サブユ
ニットの典型的な構造の特徴を示し、そしてコラーゲン結合インテグリン由来の
独特の群のα−サブユニットに類似している。しかし、推定のタンパク質は、不
完全に保存された細胞質ＧＦＦＫＲモチーフによって、ほとんどのインテグリン
α鎖とは異なる。ヒトＩＴＧＡ１１遺伝子は、第１５染色体上のバンドｑ２２．
３〜２３に位置し、そしてその転写物は、主に骨、軟骨ならびに心筋および骨格
筋中に見出された。５．５キロベースα１１ ｍＲＮＡの発現はまた、卵巣およ
び小腸において検出可能であった。
【１２００】 （序論） 全ての脊椎動物細胞は、細胞接着分子のインテグリンファミリーのメンバーを
発現する。これは、他の細胞および細胞外基層（ｓｕｂｔｒａｔｕｍ）に対する
細胞接着（細胞移動）を媒介し、かつシグナル伝達から細胞増殖および細胞分化
への重要な生理学的プロセスに関与する（Ｈｙｎｃｓ，９２；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
，９２）。インテグリンは、８のβサブユニットの１つと、現在までに記載され
ている１７の異なるαサブユニットの１つとの非共有結合により形成され、少な
くとも２２の異なるαβ複合体を生じる、ヘテロ二量体Ｉ型膜糖タンパク質に、
構造的に相同である。細胞リガンドおよび細胞外リガンドに対するそれらの結合
特異性は、両方のサブユニットにより決定され、そして細胞環境および細胞の発
達状態および活性化状態により、細胞型特異的様式で動的に調節される（Ｄｉａ
ｍｏｎｄおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ，９４）。インテグリンαサブユニットにおい
て、大きな細胞外ドメインのアミノ末端領域は、βプロペラドメインへと折り畳
まれることが予測される、７回折り畳み反復構造から構成される（Ｃｏｒｂｉら
、１９８７；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９７）。この３または４のＣ末端反復は、
リガンド結合およびサブユニット会合に重要であると考えられる推定の二価カチ
オン性結合モチーフを含む。α1サブユニット、α2サブユニット、α10サブユニ
ット、αDサブユニット、αEサブユニット、αLサブユニット、αMサブユニット
、およびαXサブユニットは、他のα鎖には存在しない第２の反復と第３の反復
との間に挿入された約２００アミノ酸Ｉドメインを含む（Ｌａｒｓｏｎら、１９
８９）。いくつかの単離されたＩドメインは、親インテグリンヘテロ二量体のリ
ガンドに独立して結合することを示されている（ＫａｍａｔａおよびＴａｋｅｄ
ａ，１９９４；ＲａｎｄｉおよびＨｏｇｇ，１９９４）。α3サブユニット、α5 〜8サブユニット、αIIbサブユニット、およびαVサブユニットは、保存された
部位にて、ジスルフィド結合した重鎖および軽鎖中へとタンパク質分解的にプロ
セスされるが、α4サブユニットは、より多くのアミノ末端部分にて、非共有結
合されたままの２つのフラグメントへと分解される（Ｈｅｍｌｅｒら、９０）。
さらなるαサブユニット改変体は、一次転写物の選択的スプライシングにより生
成される（Ｚｉｏｂｅｒら、９３；Ｄｅｌｗｅｌら、９５；Ｌｅｕｎｇら、９８
）。αインテグリンサブユニットの細胞外ドメインは、唯一の保存された特性が
、膜近位ＫＸＧＦＦ（Ｋ／Ｒ）Ｒモチーフである、短い、多様な細胞質ドメイン
に、単一の膜貫通ドメインにより連結される（ＳａｓｔｒｙおよびＨｏｒｗｉｚ
、１９９３）。この細胞質ドメインは、インテグリンアフィニティー状態の細胞
型特異的調節に関与している（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９９４）。
【１２０１】 本明細書中で、本発明者らは、ヒトαインテグリンサブユニットの、ｃＤＮＡ
クローニング、配列分析、発現、および染色体局在を報告する。
【１２０２】 （材料および方法） （ライブラリースクリーニングおよびＤＮＡ配列決定） λｇｔ１０中のヒト胎児心臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、標
準的な技術を用いて、α１１ｃＤＮＡの４７３〜７４９および２３９４〜３１８
９の領域に対応する32Ｐ標識された（ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｌｔｄ．Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ
）プローブを用いてスクリーニングした。挿入物を、λｇｔ１０からｐＵＣ２１
へとサブクローン化し、そして自動配列決定機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ ３７３Ａ，Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔ
ｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｕｃｋｌａｎｄ）において、逐次的な特
異的プライマーストラテジーに従って、両方の鎖について配列決定した。
【１２０３】 （ノーザンブロット分析および組織分布） αｃＤＮＡの領域３５１〜１６９２に対応する１３４１ｂｐのＰＣＲフラグメ
ントを、32Ｐ標識し（ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ）、そしてヒト複数組織ノーザンブロ
ット（ＭＴＮ ＩおよびＭＴＮ ＩＩ，Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）と、Ｅｘｐｒｅｓ
ｓＨｙｂ溶液（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）中で６０℃にて１６時間、ハイブリダイズ
させた。フィルターを、５０℃にて３０分間、０．１×ＳＳＣ／１％ ＳＤＳを
用いて２回洗浄し、そしてオートラジオグラフを行った。６３組織特異的ｃＤＮ
Ａライブラリー（Ｅｘｐｒｅｓｓ−ＣｈｅｃｋTM，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ
）由来のヒトＤＮＡを、製造者の説明書に従って、プライマーＫＬ１２０（５’
−ＧＣＡＧＧＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＣ）およびＫＬ１１９（５’ＧＡＴＧＡ
ＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＧＴＣＧＡＡＧＧ）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ア
ガロースゲル電気泳動により分離し、そしてＨｙｂｏｎｄ Ｃ＋（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）に転移した。フィルターを、標準的な手順（Ａｕｓｕｂｅｌら、９８）に
より、同じオリゴヌクレオチドを用いてクローン化した"11ｃＤＮＡから得られ
た５０２ｂｐの32Ｐ標識化（ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ）プローブフラグメントとハイ
ブリダイズさせた。
【１２０４】 （染色体割当） ２１のヒト齧歯類体細胞ハイブリッドのパネルから、またはヒト細胞、マウス
細胞、およびハムスター細胞（ｋｅｌｓｅｌｌら、９５）から調製した５００ｍ
ｇのゲノムＤＮＡを、３０サイクルの標準的なＰＣＲ反応（９４℃１分間、５５
℃１分間、７２℃２分間）において、オリゴヌクレオチドＫＬ１７５（５’−Ｇ
ＧＴＧＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＣ）およびオリゴヌクレオチドＫＬ１８
９（５’−ＣＧＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＴＧＣＣＡＡＡＴＧＣＣ）を用いて増幅
した。全てのＰＣＲ反応物を、２％アガロースゲルにおいて分離した。サザンハ
イブリダイゼーションを、プローブフラグメントを、オリゴヌクレオチドＫＬ１
７５およびオリゴヌクレオチドＫＬ１８９を用いて、クローンＨＯＨＢ Ｙ６９
から得た以外、上記のように行った。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション
のために、分裂中期スプレッドを、標準的な細胞遺伝学的手順を用いて、４６、
ＸＹの男性ドナーのフィトヘマグルチニン刺激した末梢血リンパ球から調製した
。クローンＨＯＨＢＹ６９のコード領域の全体を表す精製した３．７ｋＢフラグ
メントを、Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ標識キット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ａｕｓｃｋｌａｎｄ，ＮＺ）を用いて、ビオチン
−１６−ｄＵＴＰを用いて標識した。ハイブリダイゼーションおよび免疫蛍光検
出についての条件は、Ｃ0ｔ−１抑制を必要とせず、スライドをハイブリダイゼ
ージョン後に０．１×ＳＳＣ／６０℃のストリンジェンシーで洗浄し、そして小
さいサイズのプローブのために、さらなる増幅工程を必要としないこと以外は、
本質的に記載される（Ｍｏｒｒｉｓら、９３）条件である。正確な染色体バンド
局在のために、ＤＡＰＩイメージおよびＦＩＴＣイメージを、Ｐｈｏｔｏｍｅｔ
ｒｉｃｓ ＫＡＦ１４００ ＣＣＤカメラおよびＱＵＩＰＳ Ｓｍａｒｔｃａｐ
ｕｔｕｒｅ ＦＩＳＨソフトウェア、バージョン１．３（Ｖｉｓｙｓ Ｉｎｃ．
Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ．ＵＳＡ）を用いて取込んだ。ＱＵＩＰＳ
ＣＧＨ／Ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇソフトウェア（バージョン３．０．２）は、核
型分析を補助した。
【１２０５】 （結果） （新規ヒトα−インテグリンサブユニットｃＤＮＡのクローニング） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のヒト発現遺伝子配
列断片（ＥＳＴ）データベース（Ｎｉら、９７）、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＫｉｒｋｎｅｓｓおよびＫｅｒｌ
ａｖａｇｅ，９７）のタンパク質相同性検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、９０）は、
新規のインテグリンα−サブユニットｃＤＮＡの候補として、クローンＨＲＤＡ
Ｆ８３およびＨＯＥＡＭ３４を同定した。クローンＨＲＤＡＦ８３を、ヒト横紋
筋肉腫ｃＤＮＡライブラリーから単離し、そして両方の鎖について配列決定した
。１２２３ｂｐ挿入物は、大部分が不完全にプロセスされたｈｎＲＮＡ、および
α１−インテグリンＩドメインのアミノ末側の半分に対する相同性を示した２７
７ｂｐ領域を含む。クローンＨＯＥＡＭ３４の２５１７ｂｐ挿入物は、ヒト骨芽
細胞ｃＤＮＡライブラリーに由来した。それは、ヒトα１−サブユニットのＣ末
端部分に相同であり、かつ３’−非翻訳領域の１３２４ヌクレオチドを含む。こ
れらのインテグリンα−サブユニットについての全長ｃＤＮＡを単離するために
、λｇｔ１０におけるヒト胎児心臓から調製されたｃＤＮＡライブラリーを、α
１−Ｉ−ドメインに相同なクローンＨＲＤＡＦ８３由来の２７７ｂｐフラグメン
トを用いてスクリーニングした。２つのクローン（λ８３１およびλ８３２）を
単離し、そしてそれらの挿入物の両方の鎖を配列決定した。クローンλ８３２は
、新規のα−サブユニットｃＤＮＡの５’側の全体の半分を含む。クローンλ８
３１は、同じ領域をカバーするが、クローンλ８３２は、その５’および３’末
端で、それぞれ、λ８３１よりも３５８ｂｐおよび１７３ｂｐより短い。クロー
ンＨＯＥＡＭ３４の最終的な５’末端由来の７９５ｂｐフラグメントを用いる、
同じライブラリーのスクリーニングは、クローンλ３４２を同定した。このクロ
ーンλ３４２は、本質的に、クローンＨＯＥＡＭ３４と同じ領域を含んでいたが
、３１７ｂｐのより短い３’非翻訳領域を有する。ヒト胎児心臓ライブラリー由
来の配列を有するＥＳＴデータベースを再スクリーニングすることによって、ク
ローンＨＯＨＢＹ６９の同定を導いた。クローンＨＯＨＢＹ６９を、骨芽細胞ｃ
ＤＮＡライブラリーから単離した。クローンＨＯＨＢＹ６９の４６８１ｂｐ挿入
物の両鎖を配列決定した。ＨＯＨＢＹ６９の５’領域は、ＨＲＤＡＦ８３／λ８
３２／λ８３１−群と同一であったが、ＨＯＨＢＹ６９の３’領域は、ＨＯＥＡ
Ｍ３４およびλ３４２に大部分が同一であった。これによって、部分ｃＤＮＡの
２つの群が、同じｃＤＮＡの５’および３’部分を表したことを実証する。ＨＯ
ＨＢＹ６９とＨＯＥＡＭ３４／λ３４２との間の１つの主要な差異は、ＨＯＨＢ
Ｙ６９における３０８８位でのさらなるＧＴＡ−トリプレットの存在である。重
複クローンから、合計４９８６ｂｐのｃＤＮＡが、図２に示す配列を含むように
構築され、そして受諾番号ＡＦ１０９６８１で、ＧｅｎＢａｎｋTMに提出された
。このｃＤＮＡは、α１１と名付けられた、以前に同定されていないヒトインテ
グリンα−サブユニットをコードする。
【１２０６】 （ヒトα１１−サブユニットの構造） α１１ｃＤＮＡは、７２ヌクレオチドの５’非翻訳領域、および＋１位の予測
された翻訳開始コドンから３５７０位のＴＧＡ終止コドンにのびる、単一のオー
プンリーディングフレームを含む。これは、ポリ（Ａ）ストレッチの１２ヌクレ
オチド上流の、ＡＡＴＴＡＡＡポリアデニル化シグナル（ＷａｈｌｅおよびＫｅ
ｌｌｅｒ，１９９６）を含む３’非翻訳領域の１３２４ヌクレオチドに続いてい
る。推定のアミノ酸配列は、切断されたシグナルペプチドの特徴を有する２２残
基のＮ末端領域（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｉｎｅ，８３；Ｎｉｅｌｓｅｎら、９７）、
膜貫通ドメインに類似する２３アミノ酸疎水性ストレッチに続く１１２０アミノ
酸の大きな細胞外ドメイン、および短い２４残基の細胞質ドメインを含む。成熟
１１６７アミノ酸α１１−サブユニットの分子量は、１３１ｋＤａと予想される
が、細胞外ドメイン内の１５の潜在的Ｎ−グリコシル化配列［ＮＸ（Ｓ／Ｔ）］
のいずれかへの糖鎖の付加は、ネイティブタンパク質の分子量を増加させるよう
である。２０７アミノ酸のＩドメインは、第２と第３反復との間に挿入される。
代表的なＩドメイン含有インテグリンα−サブユニットの構造との一致して、そ
れは、細胞外ドメインのＣ末端領域における潜在的二塩基切断部位を欠く。
【１２０７】 α１１−サブユニットは、最近発見されたα１０−サブユニット（Ｃａｍｐｅ
ｒら、９８，Ｌｅｈｎｅｒｔら、準備中）、ならびにα１−サブユニットおよび
α２−サブユニットに最も密接に関係する。全体的に、成熟α１１−タンパク質
は、α１０鎖に４５％同一であるが、α１−サブユニットおよびα２−サブユニ
ットに対する相同性は、それぞれ、４１％および３９％である。いっそうより高
い相同性は、お互いに６０％同一であるα１０−サブユニットとα１１−サブユ
ニットとのＩドメインの間に存在する。サブユニットの細胞外ドメインにおいて
見られている相同性の高い程度は、それらの細胞質ドメインの低い類似性と対照
的である。興味深いことに、他の全てのα−サブユニット細胞質ドメインにおい
て絶対的に保存されている、ＫＸＧＦＦ（Ｋ／Ｒ）Ｒモチーフは、両方のサブユ
ニットにおいて、部分的にのみ保存される。α１１における配列はＫＬＧＦＦＲ
Ｓであるが、α１０−サブユニットは、ＫＬＧＦＦＡＨモチーフを含む。全ての
インテグリンα−サブユニットの間の類似性の図の比較を、図３に示す。コラー
ゲン結合インテグリンα１β１、α２β１、およびα１０β１由来のα−サブユ
ニットと共に、α１１−サブユニットは、他のＩ−ドメイン含有インテグリンサ
ブユニットと異なる群を形成する。
【１２０８】 （インテグリンα１１−サブユニットの組織分布および発現） α１１ｍＲＮＡの組織分布を、α１１ ｃＤＮＡの領域３５１〜１６９２に対
応するプローブを用いる複数のヒト組織ノーザンブロットをスクリーニングする
ことにより評価した。約５．５ｋｂの単一転写物は、卵巣および小腸においての
み弱く見出された。インテグリンα１１−サブユニット発現物を、組織特異的ヒ
トｃＤＮＡライブラリー由来のα１１ｃＤＮＡにおける領域１９８８〜２４９０
に対応する５０２ｂｐフラグメントの増幅およびサザーンハイブリダイゼージョ
ンにより、さらに分析した。α１１ｃＤＮＡを、２つの胎児脳ライブラリーにお
ける、胎児心臓（５７〜７５日）から調製した５つの異なるｃＤＮＡライブラリ
ー、および大腸由来のｃＤＮＡライブラリー（示さず）において検出した。Ｈｕ
ｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅの分析は、ヒト骨
芽細胞ライブラリーにおけるα１１に関連した８つの異なるＥＳＴ、ヒト軟骨肉
腫ｃＤＮＡライブラリーおける３つのＥＳＴ、およびヒト間質骨巨細胞腫ライブ
ラリーにおける２つのＥＳＴを示した。
【１２０９】 （インテグリンα１１−サブユニットの染色体局在） ２１のヒト−齧歯類体細胞ハイブリッド（Ｋｅｌｓｅｌｌら、９５）の収集物
由来のゲノムＤＮＡを、ヒトα１１ｃＤＮＡの領域４７３〜７４９に関するオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。サザーンハイブリダ
イゼージョンにおいて、１，４ｋｂフラグメントに対応するシグナルは、ヒト第
１５染色体を含むハイブリッド細胞株由来のＤＮＡを用いてのみ、検出可能であ
った。同じサイズのフラグメントはまた、ヒトゲノムＤＮＡから増幅されたが、
マウスＤＮＡまたはハムスターＤＮＡからは増幅されなかった（図５Ｃ）。第１
５染色体からのＰＣＲ産物のクローニングおよび配列は、ｃＤＮＡの６００位の
後に挿入した１１５４ｂｐイントロンの存在を示し、従って１４３１ｂｐのＰＣ
Ｒ産物を生じた。ＩＴＧＡ１１遺伝子はまた、分裂中期の染色体の、クローンＨ
ＯＢＹ６９由来のコード領域全体との蛍光インサイチュハイブリダイゼーション
により、位置決定した。分析した２０の分裂中期の細胞の全てが、両方の第１５
染色体上で（特にバンドｑ２２．３〜ｑ２３わたって）蛍光シグナルを示した。
他のいずれの染色体上でもさらなるシグナルを、検出しなかった（図５Ａ）。
【１２１０】 （考察） 本発明者らは、インテグリンα−鎖と広範な構造的相同性を共有する、タンパ
ク質コードする新規ｃＤＮＡをクローン化および配列決定した。推定のタンパク
質配列のアミノ末端側の２２アミノ酸は、疎水性リーダーペプチドの特徴的特性
示す。疎水性リーダーペプチドは、−３位および−１でのシグナルペプチド認識
モチーフ（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｉｎｅ ８３）を含む。この位置での前駆体タンパ
ク質のタンパク質分解切断は、ＦＮＭＤの成熟α１１−鎖につてのアミノ末端配
列を生じる。この配列は、他の全てのインテグリンα１１−サブユニット（Ｔｕ
ｃｋｗｅｌｌら、９４）のコンセンサス配列［（Ｆ／Ｙ）Ｎ（Ｌ／Ｖ）Ｄ］に類
似する。α１１の大きな細胞外領域のＮ末端側の半分は、ＦＧ−−ＧＡＰ−−Ｇ
ｘｘＹコンセンサスモチーフ（ＦＧ−ＧＡＰ反復）を各々含む、７つの反復から
構成される。これらの反復は、インテグリンα１−サブユニットにおいて見出さ
れ得、そしてβ−プロペラドメイン（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，９７）へと折り畳まれ
ると予想される。第２のＦＧ−ＧＡＰ反復と第３のＦＧ−ＧＡＰ反復との間に挿
入されるものは、グアニジン138からメチオニン344までの２０７アミノ酸Ｉ−ド
メインである。それは、αＭサブユニットにおいてＭｇ2+イオンを直接結合する
ことを示した二価カチオン配位モチーフ（Ｍｉｃｈｉｓｈｉｔａら、９６）を含
む。マグネシウムイオンおよびマンガンイオンの配位に関与する非連続アミノ酸
側鎖を、単離されたα2−サブユニットＩ−ドメイン、αL−サブユニットＩ−ド
メイン、およびαM−サブユニットＩ−ドメイン（Ｅｍｓｌｅｙら、９７；Ｑｕ
およびＬｅａｈｙ、９５；Ｌｅｅら、９５）の変異誘発分析によって、および結
晶構造から同定した。これらのサブユニットにおける二価カチオンの配位を必要
とする全ての残基は、α１１−ドメインにおいて保存される。１４８位および２
４９位にアスパラギン、１５０位および１５２位にセリン残基、および２１８位
にスレオニンが存在する。
【１２１１】 α２−サブユニットの結晶構造は、β２−会合α−サブユニットのＩドメイン
に存在しない小Ｃ−ヘリックスを示した。ＭＩＤＡＳ球と共に、このＣ−ヘリッ
クスおよび隣接するターン領域由来のアミノ酸残基は、コラーゲン三重鎖に物理
的に対して物理的接触をさせることが提唱されている（Ｅｍｓｌｅｙら、９７）
。興味深いことに、小Ｃ−ヘリックスは、コラーゲン結合インテグリンα１β１
、α２β１、およびα１０β１のαサブユニットにおいて構造的に保存され、そ
してまたα１１Ｉドメイン（Ｇ279ＹＹＮＲ283）に存在する。さらに、α２−Ｉ
−ドメインのアスパラギン154およびヒスチジン258は、コラーゲン三重鎖に接触
すると予想され、そしてこれらの両方は、α１−Ｉ−ドメイン、α１０−Ｉ−ド
メイン、およびα１１−Ｉ−ドメインにおいて保存されるが、他のインテグリン
α１１−サブユニットにおいては保存されない。コラーゲン結合に必要とされる
構造モチーフの保存は、コラーゲンがα１１インテグリンについてのリガンドで
あり得ることを示唆する。α１１−サブユニットの反復の５〜７の各々は、配列
Ｄｘ（Ｄ／Ｎ）ｘＤｘｘｘＤに適応する。これらの推定の二価カチオン結合部位
の３つまたは４つのコピーは、インテグリンα−サブユニット中に保存され、そ
してそれらの存在は、インテグリンの接着機能に必要とされる二価カチオン（Ｌ
ａｒｓｏｎら、８９；ＦｕｊｉｍｕｒａおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ、８３；Ｈｙｎ
ｅｓ、９２）と一致する。インテグリンα１１−サブユニットの細胞外ドメイン
は、２０システイン残基を含む。"11bサブユニットにおける分子間ジスルフィド
結合のみが、生化学的に特徴付けられている（Ｃａｌｖｅｔｅら、８９）が、多
くのシステインの位置は、インテグリンα−サブユニット中に保存される。α１
１−サブユニットにおいて、システイン残基６３７および６４６、６５２および
７０７、７５９および７６５、ならびに８５９および８７１は、"11bの重鎖にお
ける４つのカルボキシ末端ジスルフィド結合（Ｃａｌｅｖｅら、８９）を形成す
る残基と相同である。インテグリンα−サブユニットプロペラドメインの提唱さ
れた構造（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、９７）に基づいて、α１１サブユニット内のさ
らなるジスルフィド結合は、システイン残基５４と６１との間、９９と１１７と
の間、および１０７と１３７との間に予想され得る。２つのさらなるシステイン
残基は、α１１−サブユニットに固有である短いセグメント（残基７８３〜７９
８）内に見出される。
【１２１２】 インテグリン細胞質ドメインは、インテグリン親和性モジュールおよび細胞シ
グナル伝達において、中心的な役割を果たす。膜近位配列ＫｘＧＦＦ（Ｋ／Ｒ）
Ｒは、インテグリンα−サブユニット細胞質ドメイン（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、９
４）の間で厳密に保存される。このモチーフ内で、フェニルアラニン残基および
最後のアルギニンの両方は、インテグリンαＬβ２およびαIIbβ３のデフォル
トの低親和性状態を維持することを意味する。なぜならば、それらの置換または
欠失は、構成的な活性化リガンド結合において生じたからである（Ｏ’Ｔｏｏｌ
ｅら、９４、ＬｕおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ、９７）。興味深いことに、最後のア
ルギニン残基は、α１１細胞質ドメインにおけるセリンによって、およびα１０
サブユニットにおけるヒスチジンと置換される。このことは、両方のインテグリ
ンが、デフォルトの「高い」親和性状態にあるであろうことを示唆する。これら
の残基の保存されたアルギニンとの置換が、それらの親和性状態に影響するか否
かを分析することは興味深い。本発明者らは、破骨細胞ライブラリー、骨芽細胞
ライブラリー、筋肉腫ライブラリー、および胎児心臓ライブラリーからα１１ｃ
ＤＮＡを単離した。ＨＧＳ ＥＳＴデータベースの間で、インテグリンα１１転
写物は、破骨細胞、骨芽細胞、軟骨肉腫細胞から調製したライブラリーにおいて
主に見出された。ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＥＳＴ区画におけるさらなる"1 1 関連配列についての検索は、始原ヒト筋芽細胞由来の２つのクローン（受諾番
号Ｚ５０１５７およびＺ５０１６７）（Ｇｅｎｉｎｉら、９６）、ヒト海綿質細
胞由来の２つの細胞（ＡＡ８５２６１４およびＡＡ８５２６１５）、ならびに線
維芽細胞（Ｗ４５０７８）、膵臓腫瘍（Ｕ５３０９１）、および胸部組織（Ｈ１
６１１２）由来のクローンを示した。対照的に、ノーザンブロット分析は、α１
１−発現を卵巣および小腸においてのみ胎児心臓、胎児脳および大腸の組織のみ
検出した。組織特異的ｃＤＮＡライブラリーにおいて表した組織のうち、胎児心
臓、胎児脳および大腸の組織のみが、検出可能なα１１−発現を示した。しかし
、骨−由来組織および筋肉由来組織は、ノーザンブロットにおいて含まれず、そ
してこれらの組織から調製したｃＤＮＡライブラリーはまた、組織特異的ｃＤＮ
Ａパネルにおいて表されなかった。
【１２１３】 ＩＴＧＡ１１遺伝子は、ヒト−齧歯類体細胞ハイブリッドのＦＩＳＨおよびＰ
ＣＲ分析により、第１５染色体（バンドｑ２２．３〜２３）に位置決定された。
このセグメントは、扁平上皮細胞癌腫において過剰発現される（Ｗｏｌｆｆら、
１９９８）が、まれに他の癌の影響をうけるようである。この領域で遺伝子は、
ネオゲニン（ｎｅｏｇｅｎｉｎ）（ヒト組織において広範に発現されるタンパク
質）（Ｍｅｙｅｒｈａｒｄｔら、９７）；トロポミオシン１（これは、軟骨組織
および骨格組織において発現される）（Ｔｉｓｏら、９７）；およびメタロプロ
テアーゼ崩壊クズバニアン（ｋｕｚｂａｎｉａｎ）（これは交感神経副腎起源の
腫瘍において過剰発現される）のヒトホモログ（Ｙａｖａｒｉら、９８）をコー
ドする。さらに、１５ｑ２２．３〜ｑ２３領域は、バルデー−ビードル症候群４
（肥満により特徴付けられ、そして心血管異常と関連する異種常染色体障害）（
Ｃａｒｍｉら、９５）に関連する。
【１２１４】 結論として、本発明らは、新規のα１１サブユニットについてのｃＤＮＡをク
ローン化し、そして配列決定した。この新規のインテグリンα１１サブユニット
は、コラーゲン結合インテグリンのα１β１、α２β１およびα１０β１の" −サブユニットに密接に関連する。これらのサブユニットに対するα１１の高
い程度の相同性は、それがインテグリンβ１−サブユニットと関連し、そしてさ
らなるコラーゲンレセプターとして機能し得ることを示唆する。
【１２１５】 上記の参考文献、および以下に示される参考文献は、本明細書中で参考として
援用される：
【１２１６】
【表１７】
【１２１７】
【表１８】
【１２１８】
【表１９】
【１２１９】
【表２０】
【１２２０】
【表２１】
【１２２１】
【表２２】 ＡＴＣＣ受託番号２０３４８４ （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（国立特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）に
より）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による
決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる
旨を、請求する。 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルは専門家に対してのみ利用可能にさ
れる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が
完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。 ＡＴＣＣ受託番号２０３４８４ （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ出願人ガイド第Ｉ巻の付属文書Ｚに
記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人により
なされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用
される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成
された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅ
ｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により
承認された任意の者であり得る。 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜Ｃは、このタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１１）および推
定アミノ酸配列（配列番号２９）を示す。
【図２】 図２は、配列番号２９のアミノ酸配列、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ尾吸収
タンパク質（ｇｉ｜１２３４７８７）（配列番号４８）、とヘッジホッグ相互作
用タンパク質（「ＨＩＰ」；ｇｉ｜ＡＡＤ３１１７２．１）（配列番号４９）の
間の類似性の領域を示す。
【図３】 図３は、配列番号２９のアミノ酸配列の分析を示す。α領域、β領域、ターン
領域およびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原
性指数および表面確率を示す。
【図４】 図４Ａ〜Ｃは、ＴＩＤＥのヌクレオチド配列（配列番号１２）および推定アミ
ノ酸配列（配列番号３０）を示す。約１〜約２３の推定アミノ酸は、推定シグナ
ルペプチド（配列番号３０における約１〜約２３のアミノ酸残基）を構成し、そ
して下線を付したアミノ酸領域によって示され；約１０８〜約１３６、約１９５
〜約２２３、約２９１〜約３１９、約３７９〜約４０７および／または約４６５
〜約４９３のアミノ酸は、推定ＥＧＦ様ドメインシグネチャー１および２ドメイ
ン（配列番号３０における約１０８〜約１３６、約１９５〜約２２３、約２９１
〜約３１９、約３７９〜約４０７および／または約４６５〜約４９３のアミノ酸
）を構成し、そして二重下線を付したアミノ酸によって示され；約５５〜約８９
、約９７〜約１２９、約１４２〜約１７５、約１８６〜約２１６、約２２８〜約
２６１、約２８１〜約３１４、約３２７〜約３５９、約３６８〜約３９８、約４
１７〜約４４８および／または約４５５〜約４８７のアミノ酸は、推定インテグ
リンβ鎖システインリッチドメイン（配列番号３０における約５５〜約８９、約
９７〜約１２９、約１４２〜約１７５、約１８６〜約２１６、約２２８〜約２６
１、約２８１〜約３１４、約３２７〜約３５９、約３６８〜約３９８、約４１７
〜約４４８および／または約４５５〜約４８７のアミノ酸）を構成し、そして影
を付したアミノ酸によって示される。
【図５】 図５は、ＥＧＦ相同性を有する１０のインテグリンドメイン（ＴＩＤＥ）タン
パク質（配列番号３０）のアミノ酸配列と、ヒトインテグリンβ−８サブユニッ
ト（配列番号６７）との間に類似性領域を示す。
【図６】 図６は、ＥＧＦ相同性を有する１０のインテグリンドメイン（ＴＩＤＥ）アミ
ノ酸配列の分析を示す。α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；親水性
および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数および表面確率を示す。
【図７】 図７Ａ〜Ｂは、腸由来の細胞外タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１３
）および推定アミノ酸配列（配列番号３１）を示す。約１から約２７までの推定
アミノ酸は、推定シグナルペプチドを構築し（配列番号３１の約１から約２７ま
でのアミノ酸残基）、そして下線を付したアミノ酸領域によって示され；そして
約１２２から約１３８までのアミノ酸は、推定膜貫通ドメインを構築し（配列番
号３１の約１２２から約１３８のアミノ酸残基）、そして二重下線を付したアミ
ノ酸によって示される。
【図８】 図８は、腸由来の細胞外タンパク質である配列番号３１のアミノ酸配列とＲＡ
ＭＰ３タンパク質（ｇｉ｜４５８７０９９）（配列番号７５）との間の類似性領
域を示す。
【図９】 図９は、配列番号３１のアミノ酸配列の分析を示す。 α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒
性領域；可撓性領域；抗原性指標および表面可能性を示す。
【図１０】 図１０Ａ〜Ｂは、ヌクレオチド（配列番号１４）および網膜特異的タンパク質
の推定のアミノ酸配列（配列番号３２）を示す。約１〜約２１由来の予期される
アミノ酸は、予想されたシグナルペプチド（配列番号３２の約１〜約２１由来の
アミノ酸残基）を構成し、下線の引かれたアミノ酸領域によって表される。
【図１１】 図１１は、網膜特異的タンパク質のアミノ酸配列である配列番号３２とＧａｌ
ｌｕｓ ｇａｌｌｕｓプロテオグリカン（配列番号７９）との間の類似性の領域
を示す。
【図１２】 図１２は、配列番号３２のアミノ酸配列の分析を示す。 α、β、ターンおよびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓
性領域；抗原性指標および表面確率が示される。
【図１３】 図１３Ａ〜Ｃは、ＣＤ３３様タンパク質のヌクレオチド（配列番号１５）およ
び推定アミノ酸配列（配列番号３３）を示す。約１〜約１６の推定アミノ酸が、
推定シグナルペプチド（配列番号３３における約１〜約１６のアミノ酸残基）を
構成し、そして下線を付したアミノ酸領域によって示され；そして約４９６〜約
５１２のアミノ酸が、推定貫通膜ドメイン（配列番号３３における約４９６〜約
５１２のアミノ酸残基）を構成し、そして二重下線を付したアミノ酸領域によっ
て表される。
【図１４】 図１４は、ＣＤ３３様タンパク質アミノ酸配列、配列番号３３と、ＣＤ３３Ｌ
１タンパク質のアミノ酸配列（ｇｉ｜８８１７８）（配列番号９２）との同一性
の領域を示す。
【図１５】 図１５は、配列番号３３のアミノ酸配列の分析を示す。 α、β、ターンおよびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓
性領域；抗原性指標および表面可能性が示される。
【図１６】 図１６Ａ〜Ｂは、ＣＤ３３様３のヌクレオチド配列（配列番号１６）および推
定アミノ酸配列（配列番号３４）を示す。約１から約１８までの予測したアミノ
酸は、予測したシグナルペプチド（配列番号３４における約１から約１８までの
アミノ酸残基）を構成し、そして下線を引いたアミノ酸領域により表される；そ
して約３６０から約３７６までのアミノ酸は、予測した膜貫通ドメイン（配列番
号３４における約３６０から約３７６までのアミノ酸）を構成し、そして二重下
線を引いたアミノ酸により表される。
【図１７】 図１７は、ＣＤ３３様３タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３４）とヒトＣ
Ｄ３３Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９９）との間の類似する領域を
示す。
【図１８】 図１８は、ＣＤ３３様３アミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターンおよびコ
イル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数および
表面確率が示される。
【図１９】 図１９Ａ〜Ｆは、α１１のヌクレオチド配列（配列番号１７）および推定アミ
ノ酸配列（配列番号３５）を示す。約１〜約２２の推定アミノ酸は、予測される
シグナルペプチドを構成し（配列番号３５において約１〜約２２のアミノ酸残基
）、そして下線を付したアミノ酸領域により表される；約６６６〜約６８２のア
ミノ酸および／または約１１４５〜約１１６１のアミノ酸は、推定膜貫通領域（
配列番号３５において約６６６〜約６８２のアミノ酸および／または約１１４５
〜約１１６１のアミノ酸）を構成し、そして二重下線を付したアミノ酸により表
され；そして約６４〜約９６のアミノ酸は、推定免疫グロブリンおよび主要組織
適合性複合体タンパク質ドメイン（配列番号３５における約６４〜約９６のアミ
ノ酸）を構成し、そして太字のアミノ酸により表される。
【図２０】 図２０は、インテグリンα１１サブユニット（ａ１１）タンパク質のアミノ酸
配列（配列番号３５）とヒトインテグリンα１サブユニットのアミノ酸配列（配
列番号１０３）との間の類似性の領域を示す。
【図２１】 図２１は、インテグリンα１１サブユニット（ａ１１）アミノ酸配列の分析を
示す。α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；親水性領域および疎水性
領域；両親媒性領域；可撓性領域；するポリヌクレオチドは、ヒト卵巣、小腸、
胎児心臓、胎児脳、大腸、骨芽細胞抗原性指数および表面確率が示される。
【図２２】 図２２Ａ〜Ｄは、ＢＢＩＲ ＩＩのヌクレオチド（配列番号１９）および推定
アミノ酸配列（配列番号３７）を示す。約１〜約１７の予測されたアミノ酸は、
予測されたシグナルペプチド（配列番号３７の約１〜約１７のアミノ酸残基）を
構成し、下線を引いたアミノ酸領域によって表される。
【図２３】 図２３は、ＢｕｔｙｒｏｐｈｉｌｉｎおよびＢ７様ＩｇＧスーパーファミリー
レセプター（ＢＢＩＲ ＩＩ）タンパク質（配列番号３７）とウシブチロフィリ
ン前駆体（配列番号１２１）のアミノ酸配列間の類似性の領域を示す。
【図２４】 図２４は、インテグリンαＩＩサブニット（ＢＢＩＲ ＩＩ）アミノ酸配列の
分析を示す。α、β、ターンおよびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性
領域；可撓性領域；抗原性指数および表面確率が示される。
【図２５】 図２５Ａ〜Ｂは、本発明のヌクレオチド（配列番号２０）および推定アミノ酸
配列（配列番号３８）を示す。推定アミノ酸およそ１〜およそ１９は、推定シグ
ナルペプチド（配列番号３８のアミノ酸残基およそ１〜およそ１９）を構成し、
下線を引いたアミノ酸領域によって表される；アミノ酸およそ１６２〜およそ１
８８は、推定セリンプロテアーゼヒスチジン活性部位ドメイン（配列番号３８の
アミノ酸残基およそ１６２〜およそ１８８）を構成し、二重下線を引いたアミノ
酸領域によって表される。そしてアミノ酸残基１７５（配列番号３８のアミノ酸
残基１７５）は、推定ヒスチジン活性部位残基を構成し、太字のアミノ酸により
表される。
【図２６】 図２６は、本発明のアミノ酸配列の配列番号３８とヒト膵臓エラスターゼ２タ
ンパク質（ｇｉ│２１９６２０）（配列番号１２７）とのアミノ酸配列間の類似 性領域を示す。
【図２７】 図２７は、配列番号３８のアミノ酸配列の分析を示す。α領域、β領域、ター
ン領域およびコイル領域；親水性領域および疎水性領域；両親媒性領域；可撓性
領域；抗原性指標および表面確率が示される。
【図２８】 図２８Ａ〜Ｂは、本発明のヌクレオチド配列（配列番号２１）および推定アミ
ノ酸配列（配列番号３９）を示す。推定アミノ酸およそ１〜およそ４４は、推定
シグナルペプチド（配列番号３９のアミノ酸残基およそ１〜およそ４４）を構成
し、そして下線のアミノ酸領域により示される。
【図２９】 図２９は、本発明の配列番号３９、ヒトポリオウイルスレセプタータンパク質
（ｇｉ｜１５２４０８８）（配列番号１３８）、ヒトクラスＩ ＭＨＣ拘束Ｔ細
胞関連分子（ＷＯ９６３４１０２）（配列番号１４４）、ならびにＧａｌｌｕｓ
ｇａｌｌｕｓ胸腺細胞活性化および発達タンパク質（ｇｂ｜ＡＡＢ８８４９１
．１）（配列番号１４５）のアミノ酸配列間の類似性の領域を示す。
【図３０】 図３０は、配列番号３９のアミノ酸配列の分析を示す。α領域、β領域、ター
ン領域およびコイル領域；親水性領域および疎水性領域；両親媒性領域；可撓性
領域；抗原性指標および表面確率が示される。
【図３１】 図３１は、本発明のヌクレオチド（配列番号２２）および推定アミノ酸（配列
番号４０）を示す。約１〜約２３の推定アミノ酸は、推定のシグナルペプチド（
配列番号の４０の約１〜約２３のアミノ酸残基）を構成し、そして下線のアミノ
酸領域によって示される。
【図３２】 図３２は、本発明配列番号４０のアミノ酸配列とヒトＦＡＰタンパク質（ｇｉ
｜１８９０６４７）（配列番号１４６）との間の類似性の領域を示す。
【図３３】 図３３は、配列番号４０のアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターンおよび
コイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指標およ
び表面確率を示す。
【図３４】 図３４は、ｈｔａｇ７のヌクレオチド配列（配列番号１８）および推定された
アミノ酸配列（配列番号３６）を示す。約１〜約２１の推定アミノ酸は推定シグ
ナルペプチドを構成し（配列番号３６における約１〜約２１のアミノ酸残基）、
そして下線のアミノ酸領域によって表され、ならびに約３４〜約１１７のアミノ
酸は、推定ＰＧＲＰ様ドメインを構成し（配列番号３６の約３４〜約１１７のア
ミノ酸）、そして二重下線のアミノ酸によって表される。
【図３５】 図３５は、ｈｔａｇ７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３６）とマウスｔ
ａｇ７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１４）との間の類似する領域を示
す。
【図３６】 図３６は、ｈｔａｇ７アミノ酸配列の分析を示す。α領域、β領域、ターン領
域およびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性
指標および表面確率が示される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 3/10 ４Ｃ０８５ 48/00 7/00 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 3/10 7/06 ４Ｃ０８７ 7/00 9/10 ４Ｈ０４５ 7/06 11/06 9/10 17/02 11/06 17/06 17/02 19/02 17/06 25/16 19/02 25/18 25/16 25/22 25/18 25/24 25/22 25/28 25/24 27/02 25/28 27/06 27/02 29/00 27/06 １０１ 29/00 31/04 １０１ 31/18 31/04 33/02 31/18 33/04 33/02 33/06 33/04 35/00 33/06 35/02 35/00 37/02 35/02 37/04 37/02 37/06 37/04 43/00 １０５ 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０５ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/566 1/68 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｒ 1:19） 33/566 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ルーベン， スティーブン エム． アメリカ合衆国 メリーランド 20832， オルニー， ヘリテイジ ヒルズ ドラ イブ 18525 (72)発明者 オルセン， ヘンリク エス． アメリカ合衆国 メリーランド 20878， ゲイザーズバーグ， ケンドリック プ レイス ナンバー24 182 (72)発明者 ヤング， ポール イー． アメリカ合衆国 メリーランド 20878， ゲイザーズバーグ， ベックウィズ ス トリート 122 (72)発明者 ケニー， ジョセフ ジェイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20872， ダマスカス， ショウ ポニー プレイ ス 10804 (72)発明者 ムーア， ポール エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20874， ジャーマンタウン， レザーバーク ド ライブ 19005 (72)発明者 ウェイ， イン−フェイ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94705， バークレー， グラバット ドライブ 242 (72)発明者 グリーン， ジョン エム． アメリカ合衆国 メリーランド 20878， ゲイザーズバーグ， ダイアモンド ド ライブ 872 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 HA12 HA17 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ03 QQ08 QQ13 QQ42 QQ53 QQ79 QR32 QR56 QR62 QR77 QR80 QS25 QS34 QS38 4B064 AG01 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA90X AA91X AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 BA01 BA02 BA22 CA53 NA14 ZA022 ZA082 ZA122 ZA162 ZA182 ZA332 ZA362 ZA452 ZA512 ZA552 ZA592 ZA662 ZA812 ZA892 ZA962 ZB072 ZB082 ZB092 ZB112 ZB152 ZB262 ZB272 ZB322 ZB332 ZB352 ZC352 ZC552 4C085 AA13 AA14 DD62 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA02 ZA08 ZA12 ZA16 ZA18 ZA33 ZA36 ZA45 ZA51 ZA55 ZA59 ZA66 ZA81 ZA89 ZA96 ZB07 ZB08 ZB09 ZB11 ZB15 ZB26 ZB27 ZB32 ZB33 ZB35 ZC35 ZC41 ZC55 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 NA14 ZA02 ZA08 ZA12 ZA15 ZA16 ZA18 ZA33 ZA36 ZA45 ZA51 ZA55 ZA59 ZA66 ZA81 ZA89 ZA96 ZB07 ZB08 ZB09 ZB11 ZB15 ZB26 ZB27 ZB32 ZB33 ZB35 ZC35 ZC41 ZC55 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 EA20 FA72 FA73 FA74

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号Ｘのポリヌクレオチドフラグメント、またはＡＴＣＣ寄託番号
    Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列のポリヌクレオチドフラグメントであって、配列番号
    Ｘにハイブリダイズし得る、ポリヌクレオチドフラグメント； （ｂ）配列番号Ｙのポリペプチドフラグメント、またはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに
    含まれるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドフラグメントをコード
    する、ポリヌクレオチドであって、配列番号Ｘにハイブリダイズし得る、ポリヌ
    クレオチド； （ｃ）配列番号Ｙのポリペプチドドメイン、またはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含ま
    れるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドドメインをコードする、ポ
    リヌクレオチドであって、配列番号Ｘにハイブリダイズし得る、ポリヌクレオチ
    ド； （ｄ）配列番号Ｙのポリペプチドエピトープ、またはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含
    まれるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドエピトープをコードする
    、ポリヌクレオチドであって、配列番号Ｘにハイブリダイズし得る、ポリヌクレ
    オチド； （ｅ）配列番号Ｙのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはＡＴ
    ＣＣ寄託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列であって、配列番号Ｘにハイブリダイズ
    し得る、生物学的活性を有する、ポリヌクレオチドまたはｃＤＮＡ配列； （ｆ）配列番号Ｘの改変体である、ポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号Ｘの対立遺伝子改変体である、ポリヌクレオチド； （ｈ）配列番号Ｙの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド； （ｉ）（ａ）〜（ｈ）において特定されるポリヌクレオチドのいずれか１つに
    ストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、こ
    こで、該ポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみのヌクレオチド配列
    を有する核酸分子に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズしない、ポリヌ
    クレオチド、 からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有
    するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、分泌タンパク質をコ
    ードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号Ｙとして同
    定される配列をコードするヌクレオチド配列、またはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含ま
    れるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド
    配列であって、配列番号Ｘにハイブリダイズし得る、ヌクレオチド配列を含む、
    請求項１に記載の単離された核酸分子。
  4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号Ｘの全体の
    ヌクレオチド配列、またはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列であって
    、配列番号Ｘにハイブリダイズし得る配列を含む、請求項１に記載の単離された
    核酸分子。
  5. 【請求項５】 前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかか
    らの連続するヌクレオチド欠失を含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。
  6. 【請求項６】前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかから
    の連続するヌクレオチド欠失を含む、請求項３に記載の単離された核酸分子。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組換えベクタ
    ー。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組換え宿主細
    胞を作製する方法。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法によって産生される、組換え宿主細胞
    。
  10. 【請求項１０】 ベクター配列を含む、請求項９に記載の組換え宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 単離されたポリペプチドであって、以下： （ａ）配列番号Ｙ、またはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるコードされた配列の
    、ポリペプチドフラグメント； （ｂ）生物学的活性を有する、配列番号Ｙ、またはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含ま
    れるコードされた配列の、ポリペプチドフラグメント； （ｃ）配列番号Ｙ、またはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるコードされた配列の
    、ポリペプチドドメイン； （ｄ）配列番号Ｙ、またはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるコードされた配列の
    、ポリペプチドエピトープ； （ｅ）配列番号Ｙ、またはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるコードされた配列の
    、分泌形態； （ｆ）配列番号Ｙ、またはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるコードされた配列の
    、全長タンパク質； （ｇ）配列番号Ｙの改変体； （ｈ）配列番号Ｙの対立遺伝子改変体；あるいは （ｉ）配列番号Ｙの種相同体、 からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、
    単離されたポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 前記分泌形態または前記全長タンパク質が、Ｃ末端または
    Ｎ末端のいずれかからの連続するアミノ酸欠失を含む、請求項１１に記載の単離
    されたポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドに特異的に結
    合する、単離された抗体。
  14. 【請求項１４】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドを発現する、
    組換え宿主細胞。
  15. 【請求項１５】 単離されたポリペプチドを作製する方法であって、以下： （ａ）該ポリペプチドが発現されるような条件下で、請求項１４に記載の組換
    え宿主細胞を培養する工程；および （ｂ）該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する、方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法によって産生される、ポリペプチ
    ド。
  17. 【請求項１７】 医学的状態を予防、処置、または緩和する方法であって、
    請求項１１に記載のポリペプチドまたは請求項１に記載のポリヌクレオチドの治
    療有効量を、哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 被験体における病理学的状態、または病理学的状態に対す
    る感受性を診断する方法であって、以下： （ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドにおいて変異の存在または非存在を
    決定する工程；および （ｂ）該変異の存在または非存在に基づいて病理学的状態、または病理学的状
    態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  19. 【請求項１９】 被験体において病理学的状態、または病理学的状態に対す
    る感受性を診断する方法であって、以下： （ａ）生物学的サンプルにおいて、請求項１１に記載のポリペプチドの発現の
    存在または量を決定する工程、および （ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて病理学的状態、または
    病理学的状態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１１に記載のポリペプチドに対する結合パートナー
    を同定する方法であって、以下： （ａ）請求項１１に記載のポリペプチドを、結合パートナーと接触させる工程
    ；および （ｂ）該結合パートナーが該ポリペプチドの活性をもたらすか否かを決定する
    工程、 を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 配列番号ＹのｃＤＮＡ配列に対応する、遺伝子。
  22. 【請求項２２】 生物学的アッセイにおいて活性を同定する方法であって、
    ここで該方法が、以下： （ａ）細胞において配列番号Ｘを発現させる工程； （ｂ）その上清を単離する工程； （ｃ）生物学的アッセイにおいて活性を検出する工程；および （ｄ）該活性を有する該上清においてタンパク質を同定する工程、 を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 請求項２０に記載の方法によって産生される、産物。
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