JP2003528580A - ヒトニューロペプチドレセプター - Google Patents

ヒトニューロペプチドレセプター

Info

Publication number
JP2003528580A
JP2003528580A JP2001521323A JP2001521323A JP2003528580A JP 2003528580 A JP2003528580 A JP 2003528580A JP 2001521323 A JP2001521323 A JP 2001521323A JP 2001521323 A JP2001521323 A JP 2001521323A JP 2003528580 A JP2003528580 A JP 2003528580A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
substituted
polypeptide
sequence
seq
polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2001521323A
Other languages
English (en)
Inventor
ダニエル アール． ソッペト，
イ リ，
クレイグ エイ． ローゼン，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Human Genome Sciences Inc
Original Assignee
Human Genome Sciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Human Genome Sciences Inc filed Critical Human Genome Sciences Inc
Publication of JP2003528580A publication Critical patent/JP2003528580A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/34—Tobacco-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/36—Opioid-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Addiction (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトニューロペプチドと呼ばれる新規なヒトタンパク質、およびこのタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。ベクター、宿主細胞、抗体、およびこのヒトタンパク質を作製するために組換え方法もまた、提供される。本発明は、さらに、この新規なヒトタンパク質に関連する障害を診断または処置するのに有用な診断方法および治療方法に関する。本発明はさらに、レセプターニューロペプチドポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、７膜貫通、Ｇタンパク質連結細胞表面レセプター（ＧＰＣＲ）ファ
ミリーのメンバーであるポリペプチドをコードする新規なヒト遺伝子に関する。
より詳細には、本発明は、ヒトニューロペプチドレセプター、またはニューロペ
プチドレセプターと名付けられた新規なヒトポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドに関する。本発明はまた、ニューロペプチドレセプターポリペプチド、
ならびにベクター、宿主細胞、ニューロペプチドレセプターポリペプチドに対す
る抗体、およびニューロペプチドレセプターポリペプチドを作製するための記，
組換え方法に関する。中枢神経系および末梢神経系に関連する疾患、障害、およ
び／または状態を検出するための診断方法、およびこのような疾患、障害、およ
び／または状態を処置、予防、検出、および／または診断するための治療方法も
また、提供される。本発明はさらに、レセプターニューロペプチドポリペプチド
のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関す
る。
【０００２】 （発明の背景） 本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチド
によってコードされたポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成
に関する。本発明のポリペプチドは、ヒト７膜貫通Ｇタンパク質連結レセプター
である。より具体的に、本発明のポリペプチドは、ニューロペプチドレセプター
ポリペプチドであり、しばしば、以後の本明細書中で、ニューロペプチドレセプ
ターポリペプチドといわれる。本発明は、このようなポリペプチドの作用を阻害
することに関する。
【０００３】 肥満は、西洋世界における最も一般的な栄養性障害である。１０人の成人アメ
リカ人のうちの３人より多くが、彼らの理想的体重より少なくとも２０％過剰で
ある（Ｂｕｒｒｏａ，Ｍ．，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｔｉｍｅｓ，１９９４
年７月１７日）。体重の増加は、重要な公衆衛生問題である。なぜなら、これは
ＩＩ型糖尿病、高血圧、高脂質血症、および特定の癌に関連するからである（Ｇ
ｒｕｎｄｙ，Ｓ．Ｍ．，およびＢａｒｎｅｔｔ，Ｊ．Ｐ．，Ｄｉｓｅａｓｅ−ａ
−Ｍｏｎｔｈ，３６：６４５−６９６（１９９０））。
【０００４】 肥満表現型を生じるマウス肥満遺伝子（ｏｂ）における５つの単一遺伝子変異
が記載されている（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｍ．およびＬｅｉｂｅｌ，Ｒ．Ｌ．
，Ｃｅｌｌ，６６：２１７−２２０（１９９０））。マウスｏｂ遺伝子のクロー
ニングならびに配列決定、およびそのヒトホモログが、報告されている（Ｚｈａ
ｎｇ，Ｙ．，ら，Ｎａｔｕｒｅ，３７２：４２５−４３１（１９９４））。ｏｂ
遺伝子は、高度に保存された１６７アミノ酸オープンリーディングフレームを有
する４．５−ｋｂの脂肪組織ｍＲＮＡをコードする。予測されたアミノ酸配列は
、ヒトとマウスとの間で８４％同一であり、そして分泌タンパク質の特徴を有す
る。ｏｂ遺伝子産物は、身体の脂肪蓄積のサイズを制御するように作用する脂肪
組織からのシグナル伝達経路の一部として機能し得る（同上、４２５）。
【０００５】 摂食行動の調節に関係する脳の領域について、視床下部腹内側核（ＶＭＨ）は
、中枢神経系（ＣＮＳ）における最も重要な満腹中枢であると考えられる。従っ
て、哺乳動物におけるエネルギーバランスは、貯蔵されたエネルギーの量が視床
下部によって感知されるフィードバックループによって制御されると推定され、
このフィードバックループは、一定の体重を維持するように、食物摂取およびエ
ネルギー消費を調節する（Ｏｍｂｅｃｋ，Ｊ．Ｒ．，Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｍｅｄ．，２０：５４５−５５２（１９４８）およびＫｅｎｎｅｄｙ，Ｇ．Ｃ．
，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．１４８：５７８−５９２（１９５３））。脂肪定常説
において、身体脂肪蓄積のサイズは、ＣＮＡによって調節され、身体脂肪代謝の
産物は、視床下部と相互作用することによってエネルギーバランスに影響する（
Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｇ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．１４８：５７８−５９（１
９５３））。
【０００６】 脂肪からの推定シグナルを同定することの不可能性は、脂肪定常説の確証を妨
げている。シグナル伝達系の少なくとも１つの成分が、血流中を循環する可能性
は、Ｈｅｒｖｅｙによって最初に示唆された（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｗ．，ら，Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ，１３１：４２３−４４７（１９９２））、血管移植片を横切る
ＶＭＨ損傷を有する動物からの処置されていない動物への血液の輸送（並体結合
実験）は、インタクトな動物における食物摂取の減少を引き起こすことを示した
。ここで、ｏｂ遺伝子が分泌される証拠が存在すること（ｏｂがこの循環因子を
コードし得ることを示唆する）は、重要である。
【０００７】 ｏｂシグナルは、食物摂取を阻害するため、および／または脂肪質量の一定性
を維持するための恒常的な機構の一部としてエネルギー消費を制御するために、
ＣＮＡに直接的にまたは間接的に作用し得る（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ら，Ｎａｔｕ
ｒｅ，３７２：４２５−４３１，４３１（１９９４））。ｏｂ遺伝子は、明らか
に、脂肪によって分泌されるタンパク質をコードし、そして変異は、明らかに、
この遺伝子の翻訳または発現を妨げる（Ｒｉｎｋ，Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７２
：４０６−４０７（１９９４））。
【０００８】 並体結合実験は、ｏｂレセプターが、マウスｄｂ（糖尿病）遺伝子によってコ
ードされることを示唆する（Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇ
ｉａ，１４：１４１−１４８（１９７８））。ｄｂ遺伝子の変異を有するマウス
もまた肥満であり、可能な欠失は、レセプター欠失である（同上の４０６）。
【０００９】 ニューロペプチドＹは、摂食応答を媒介するｏｂ遺伝子産物と類似する。ニュ
ーロペプチドＹは、ニューロペプチドＹレセプター（Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、および
異型のＹ１レセプター（これは、ニューロペプチドＹによって刺激される摂食応
答を媒介する）と呼ばれる）の少なくとも４つの型に作用する。
【００１０】 ニューロペプチドＹは、広範囲の生物学的機能を有する。ニューロペプチドＹ
は、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）に広く分布することが見
出されている。ＰＮＳにおいて、ニューロペプチドＹは、血管および他の平滑筋
組織のノルアドレナリン性交感神経性神経支配および腸の神経系において見出さ
れている。ニューロペプチドＹ免疫反応性繊維もまた、非脈管平滑筋に生じ、外
分泌腺および胚上皮を取り囲む。ニューロペプチドＹはまた、ニューロンの亜集
団に生じ、そして一般に、他の神経伝達物質（特定のノルアドレナリン）と共に
同時局在する。
【００１１】 ＣＮＳにおいて、ニューロペプチドＹは、高次の中枢においてＧＡＢＡ作動性
介在ニューロンに、そしてさらなる尾側に投射する主要なカテコールアミン性（
ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｒｇｉｃ）細胞に含まれる。例えば、ニューロペプ
チドＹは、皮質、海馬、扁桃、基底前脳、および線条における介在ニューロンに
含まれるが、脳幹において、ニューロペプチドＹは、髄質のＡ１およびＡ２群の
ノルアドレナリン性ニューロン、および青斑（ｌｏｃｕｓ ｃｏｅｒｕｌｅｕｓ
）（ＬＣ）に含まれる。視床下部において、ニューロペプチドＹは、視床弓状核
および視床下部外側部に主に見出される。
【００１２】 末梢神経系において、ニューロペプチドＹは、神経節後交感神経に存在し、そ
して上記のように他の神経伝達物質（カテコールアミンを含む）と同時局在化さ
れる。薬理学的に使用される場合、ニューロペプチドＹは、強力な血管収縮神経
活性を有し、そして多くの他の昇圧剤によって引き起こされる血管収縮を劇的に
増強することが示されている。特に高濃度のニューロペプチドＹは、冠状血管系
、大脳血管系、および腎臓血管系を提供する交感神経において見出され、そして
これらの血管ベッドに注入される場合、ニューロペプチドＹは、アドレナリン性
ブロッキング剤によって逆転される延長された血管収縮を引き起こす。これらの
観測は、ニューロペプチドＹが、病理学的な血管痙攣についての候補伝達物質で
あり、冠状血管および大脳血管が関係する場合に、病的状態および死亡の主要な
原因であるという提唱を導いている。
【００１３】 ニューロペプチドＹはまた、レニン−アンギオテンシン系との相互作用に関連
しているようである。交感神経末端を含むニューロペプチドＹは、腎皮質の傍糸
球体装置上に見出され、そしてニューロペプチドＹは、レニン放出に影響する。
これらのデータは、高血圧動物モデルにおけるニューロペプチドＹ濃度およびこ
のペプチドの注入に対する昇圧応答における全ての持続時間の立証と共に、高血
圧におけるこのペプチドの関連を生じる。
【００１４】 中枢神経系において、ニューロペプチドＹは、調節的役割を有するようである
介入ニューロン内に、主に配置される。従って、それは、広範かつ多様な効果（
記憶に対する効果）およびアルツハイマー病における可能な役割を有する。ニュ
ーロペプチドＹは、摂食の増加を引き起こす既知の最も強力な物質であり、そし
てＩＩ型真性糖尿病の遺伝的基礎における役割を果たし得る。ニューロペプチド
Ｙは、調節因子および下垂体機能ならびにストレス応答および生殖機能における
潜在的な神経調節機能としての役割を果たす。
【００１５】 （発明の要旨） 本発明の１つの局面に従って、新規な成熟レセプターポリペプチドならびに生
物学的に活性なフラグメント、診断的にまたは治療的に有用なフラグメント、そ
のアナログおよび誘導体が提供される。本発明のレセプターポリペプチドは、ヒ
ト起源である。
【００１６】 本発明の他の局面に従って、本発明のレセプターポリペプチドをコードする単
離された核酸が提供され、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびにそのアン
チセンスアナログおよびその生物学的に活性なフラグメントおよび診断的にまた
は治療的に有用なフラグメントを含む。
【００１７】 本発明のさらなる局面に従って、組換え技術によってこのようなレセプターポ
リペプチドを生成するためのプロセスが提供され、このプロセスは、組換え原核
生物および／または真核生物宿主細胞を培養する工程、本発明のレセプターポリ
ペプチドをコードする核酸配列を含む工程（このポリペプチドの発現を促進する
条件下で）、およびこのポリポリペプチドの回収を包含する。
【００１８】 本発明のなおさらなる局面に従って、このようなレセプターポリポリペプチド
に対する抗体を提供される。
【００１９】 本発明の別の局面に従って、本発明のレセプターポリペプチドに結合し、そし
てこのレセプターポリペプチドの活性化を活性化または阻害する化合物について
スクリーニングする方法が提供される。
【００２０】 本発明のなお別の局面に従って、本発明のレセプターポリペプチドに結合し、
そしてこのレセプターポリペプチドを活性化する化合物を宿主に投与するプロセ
スが提供され、このプロセスは、ニューロン増殖を刺激し、神経伝達を制御し、
活性レベルおよび摂取された食物の利用を増強させるために、肥満、高脂質血症
、特定の癌の予防および／または処置において有用である。
【００２１】 本発明の別の局面に従って、遺伝子治療を介して本発明のレセプターポリペプ
チドを投与して、このポリペプチドの発現不足（ｕｎｄｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ）またはこのレセプターポリペプチドに対するリガンドの発現不足に関連する
状態を処置する方法が提供される。
【００２２】 本発明のなお別の局面に従って、本発明のレセプターポリペプチドに結合し、
そしてこのレセプターポリペプチドを活性化する化合物を宿主に投与するプロセ
スが提供され、このプロセスは、ニューロペプチドＹによって引き起こされる、
アルツハイマー病、ＩＩ型真性糖尿病、癲癇、ストレス、不安、高血圧、心臓血
管疾患、精神病性状態および肥満の予防および／または処置において有用である
。
【００２３】 本発明のなお別の局面に従って、本発明のポリヌクレオチド配列に特異的にハ
イブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供される。
【００２４】 本発明のなお別の局面に従って、このようなポリペプチドをコードする核酸配
列における変異に関連する疾患を検出するための、およびレセプターポリペプチ
ドの可溶性形態の変更されたレベルを検出するための診断アッセイが提供される
。
【００２５】 本発明のなおさらなる別の局面に従って、科学的研究、ＤＮＡの合成、および
ＤＮＡベクターの製造に関連するインビトロでの目的のために、このようなレセ
プターポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを利用するプロセスが提供される。
【００２６】 本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであ
るべきである。
【００２７】 以下の図面は、本発明の実施形態の例示であり、そして特許請求の範囲によっ
て包含されるな本発明の範囲を制限することを意味しない。
【００２８】 （詳細な説明） （定義） 以下の定義は、本明細書を通じて使用される特定の用語の理解を容易にするた
めに提供される。
【００２９】 本発明において、「単離された」とは、その本来の環境（例えば、それが天然
に存在する場合は天然の環境）から取り出された物質をいい、したがって、天然
の状態から「人間の手によって」変更されている。例えば、単離されたポリヌク
レオチドは、ベクターまたは組成物の一部であり得るか、あるいは細胞中に含ま
れ得、そしてなお「単離される」。なぜなら、ベクター、組成物、または特定の
細胞は、ポリヌクレオチドの本来の環境ではないからである。用語「単離された
」とは、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー、全細胞調製物または
ｍＲＮＡ調製物、ゲノムＤＮＡ調製物（電気泳動によって分離され、そしてブロ
ッティング上に移されたものを含む）、共有された全細胞ゲノムＤＮＡ調製物、
または他の組成物（当業者には本発明のポリヌクレオチド／配列の特徴と識別不
能である）を言わない。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主
細胞内に保持された組換えＤＮＡ分子、または溶液中の（部分的にまたは実質的
に）精製されたＤＮＡ分子が挙げられる。単離されたＲＮＡ分子としては、本発
明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物が挙げられる。しかし
、ライブラリー（例えば、クローンまたはライブラリーの他のメンバーに含まれ
る均質な溶液の形態における）の他のメンバーから単離されていないライブラリ
ー（例えば、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）のメンバーであ
るクローンまたは細胞または溶解した細胞から取り出された染色体（例えば、核
型におけるような、「染色体スプレッド」）、もしくはランダムに共有されたゲ
ノムＤＮＡの調製物または１つ以上の制限酵素を用いて切断されたゲノムＤＮＡ
の調製物に含まれる核酸は、本発明の目的のために「単離」されない。本明細書
中でさらに議論されるように、本発明に従う単離された核酸分子は、天然に、組
換え的に、または合成的に、生成され得る。
【００３０】 本発明において、「分泌」ニューロペプチドレセプタータンパク質とは、ＥＲ
、分泌小胞、または細胞外間隙にシグナル配列の結果として指向され得るタンパ
ク質、ならびにシグナル配列を必ずしも含まないが細胞外間隙に放出されるニュ
ーロペプチドレセプタータンパク質をいう。ニューロペプチドレセプター分泌タ
ンパク質が、細胞外間隙に放出される場合、このニューロペプチドレセプター分
泌タンパク質は、「成熟」ニューロペプチドレセプタータンパク質を産生するた
めに細胞外プロセシングを受け得る。細胞外間隙への放出は、エキソサイトーシ
スおよびタンパク質分解切断を含む多くの機構によって生じ得る。
【００３１】 本明細書で使用される場合、ニューロペプチドレセプター「ポリヌクレオチド
」とは、配列番号１、３、または５に含まれる核酸配列、ＡＴＣＣに寄託された
クローン内に含まれるｃＤＮＡを有する分子をいう。例えば、ニューロペプチド
レセプターポリヌクレオチドは、５’および３’非翻訳配列、シグナル配列を含
むかもしくは含まないコード領域、分泌タンパク質コード領域を含む全長ｃＤＮ
Ａ配列のヌクレオチド配列、ならびにこの核酸配列のフラグメント、エピトープ
、ドメイン、および改変体を含み得る。さらに、本明細書で使用される場合、ニ
ューロペプチドレセプター「ポリペプチド」とは、広く定義される場合、このポ
リヌクレオチドから生成される翻訳されたアミノ酸配列を有する分子をいう（配
列番号２、４、または６）。
【００３２】 本発明のレセプターポリペプチドは、既知および未知の両方のリガンドに対す
るレセプターであり、これらは、中枢神経系および中枢神経系によって調節され
る末梢組織の両方において細胞の活性を調節する。このようなリガンドの例とし
ては、ニューロペプチドＹ、物質Ｐ、ヒトｏｂ遺伝子産物およびニューロキニン
Ｂが挙げられる。従って、本発明のレセプターポリペプチドの活性の調節は、広
範囲の治療適用および診断適用（特に、肥満の処置に関する）を有する。
【００３３】 本発明は、ヒトニューロペプチドレセプターポリペプチドをコードする全長ｃ
ＤＮＡクローンを単離した。本発明の全長ｃＤＮＡは、ヒト第１染色体位置ｐ３
４〜３４上の位置にマッピングされ、この位置は、ｄｂ遺伝子が見出されるマウ
ス第４染色体上の位置に対応する。このマウスｄｂ遺伝子は、肥満遺伝子産物に
対するレセプターをコードすると考えられる。
【００３４】 本発明において、配列番号１に規定される全長神経レセプター配列は、寄託さ
れたクローンの重複配列によって生成された（コンティグ分析）。配列番号１の
配列の全てまたはほとんどを含む代表的なクローンは、アメリカンタイプカルチ
ャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）に１９９５年４月２８日に寄託され、そして
ＡＴＣＣ寄託番号９７１２８を与えられた。ＡＴＣＣは、アメリカ合衆国、バー
ジニア２０１１０−２２０９、マナサス、Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ大学 １０８０１
に位置する。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブ
ダペスト条約の条項によって行われた。
【００３５】 本発明の局面に従って、図１Ａ〜Ｂの推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプ
チド（配列番号２）、またはＡＴＣＣ寄託番号９７１２８（１９９５年４月２８
日）として寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチ
ドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。
【００３６】 本発明のポリヌクレオチドは、ヒト成人視床下部由来のｃＤＮＡライブラリー
で発見された。これは、Ｇタンパク質連結レセプターファミリーに構造的に関連
する。ニューロペプチドレセプターポリペプチドは、４０２のアミノ酸残基の一
部をコードするオープンリーディングフレームを含む。ニューロペプチドレセプ
タータンパク質は、全アミノ酸配列に対して５２％の類似性および２６％の同一
性を有するヒトニューロペプチドＹレセプタータンパク質に対する高い程度の相
同性を示す。
【００３７】 本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得、こ
のＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含む。このＤＮＡは
、一本鎖がコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖である場合、二本鎖また
は一本鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１Ａ〜Ｂ
（配列番号１）に示されるコード配列に同一であり得るか、または寄託されたク
ローンのコード配列と同一であり得るか、または異なるコード配列であり得るか
、あるいは遺伝コードの縮重または縮退の結果としてのこのコード配列は、図１
Ａ〜Ｂ（配列番号１）のＤＮＡまたは寄託されたｃＤＮＡとして同じ成熟ポリペ
プチドをコードする。さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドは
、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成さ
れ得、これは、非改変ＲＮＡもしくは非改変ＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくは改
変ＤＮＡであり得る。例えば、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドは
、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、
一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲ
ＮＡ、一本鎖、またはより代表的には二本鎖もしくは一本鎖および二本鎖領域の
混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る
。さらに、このニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしく
はＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る
。ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドはまた、安定性のために、また
は他の理由のために改変された１つ以上の改変された塩基またはＤＮＡもしくは
ＲＮＡ骨格を含み得る。「改変された」塩基としては、例えば、トリチル化され
た塩基およびイノシンのような通常でない塩基が挙げられる。種々の改変が、Ｄ
ＮＡおよびＲＮＡに対してなされ得；従って、「ポリヌクレオチド」は、化学的
、酵素的、または代謝的に改変された形態を含む。
【００３８】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、長さが３００ｋｂ、
２００ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、または７．５ｋｂ未
満である。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ニューロ
ペプチドレセプターコード配列の少なくとも１５連続するネクレオチドを含むが
、任意のニューロペプチドレセプターイントロンの全てまたは一部を含まない。
別の実施形態において、ニューロペプチドレセプターコード配列を含む核酸は、
ゲノム隣接遺伝子（すなわち、ゲノムにおけるニューロペプチドレセプター遺伝
子に対して５’側または３’側）のコード配列を含まない。
【００３９】 図１Ａ〜Ｂ、２Ａ〜Ｂ、もしくは３Ａ〜Ｂの成熟ポリペプチド（配列番号２、
４、または６）をコードするポリヌクレオチド、または寄託されたｃＤＮＡによ
ってコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、以
下が挙げられ得る：この成熟ポリヌクレオチドのみのコード配列；この成熟ポリ
ヌクレオチドのコード配列（および必要に応じてさらなるコード配列）および非
コード配列（例えば、成熟ポリペプチドのコード配列のイントロンすなわち非コ
ード配列５’および／または３’）。従って、用語「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」とは、このポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレ
オチド、ならびにさらなるコード配列および／または非コード配列を含むポリヌ
クレオチドを含む。ニューロペプチドレセプター「ポリヌクレオチド」はまた、
配列番号１、３、もしくは５に含まれる配列、その相補体、または寄託されたク
ローン内のｃＤＮＡに対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
下で、ハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む。「ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０
μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃での一晩インキュベ
ーション、次いで０．１×ＳＳＣ中で約６５℃にてフィルターを洗浄することを
いう。
【００４０】 中程度に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件でこのニュー
ロペプチドレセプターポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた意
図される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の
変化は、主として、ホルムアミド濃度（ホルムアミドのパーセンテージが低いほ
ど、ストリンジェンシーが低下する）；塩条件、または温度の操作によって達成
される。例えば、中度に高いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×
ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ
、ｐＨ７．４）、０．５％ ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサ
ケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中での３７℃で一晩のインキュベーション
；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さら
に、さらになおより低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェン
トなハイブリダイゼーション後に実施される洗浄は、より高い塩濃度（例えば、
５×ＳＳＣ）で行われ得る。
【００４１】 上記の条件における変化が、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラ
ウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の包含および／ま
たは置換によって達成され得ることに留意すること。代表的なブロッキング試薬
としては、Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮ
Ａ、および市販の商業的処方物が挙げられる。特異的なブロッキング試薬の包含
は、適合性の問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要
とし得る。
【００４２】 もちろん、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡの任意の３’末
端ポリＡ＋領域（ｔｒａｃｔ））に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的スト
レッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の
定義に包含されない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ス
トレッチまたはその相補体（例えば、事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を
含む任意の核酸分子にハイブリダイズするからである。
【００４３】 本発明はさらに、図１Ａ〜Ｂ、２Ａ〜Ｂ、もしくは３Ａ〜Ｂの推定アミノ酸配
列（配列番号２、４、または６）を有するポリペプチド、または寄託されたクロ
ーンのｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログ、
および誘導体をコードする、本明細書中上記されたポリヌクレオチドの改変体に
関する。このポリヌクレオチドの改変体は、このポリヌクレオチドの天然に存在
する対立遺伝子改変体であっても、またはこのポリヌクレオチドの天然には存在
しない改変体であってもよい。
【００４４】 従って、本発明は、図１Ａ〜Ｂ、２Ａ〜Ｂ、もしくは３Ａ〜Ｂに示される同じ
成熟ポリペプチド（配列番号２、４、または６）をコードするポリヌクレオチド
、または寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされる同じ成熟ポリペプ
チド、ならびにこのようなポリヌクレオチドの改変体（この改変体は、図１Ａ〜
Ｂ、２Ａ〜Ｂ、もしくは３Ａ〜Ｂのポリペプチド（配列番号２、４、または６）
、または寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのフ
ラグメント、誘導体またはアナログをコードする）を包含する。このようなヌク
レオチド改変体は、欠失改変体、置換改変体、および付加改変体または挿入改変
体を含む。このような改変体の特異的な例としては以下が挙げられる：本発明の
ポリペプチドの、それぞれ、スプライス改変体１および２をコードする、配列番
号３および５に記載されるポリヌクレオチド配列。
【００４５】 本発明に上記されるように、このポリヌクレオチドは、図１Ａ〜Ｂ、２Ａ〜Ｂ
、もしくは３Ａ〜Ｂに示されるコード配列（配列番号１、３、または５）の天然
に存在する対立遺伝子改変体であるコード配列、または寄託されたクローンのコ
ード配列の天然に存在する対立遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該
分野で公知のように、対立遺伝子改変体は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠
失または付加（コードされたポリペプチドの機能を実質的に変更しない）を有し
得るポリヌクレオチド配列の代替形態である。
【００４６】 このポリヌクレオチドはまた、本発明の全長ポリペプチドのＴＭドメインおよ
び細胞内ドメインから切断された、ポリペプチドの細胞外部分であるニューロペ
プチドレセプターポリペプチドの可溶性形態をコードし得る。
【００４７】 本発明のポリヌクレオチドはまた本発明のポリペプチドの精製を可能にするマ
ーカー配列に対してインフレームで融合されたコード配列を有し得る。このマー
カー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精
製をもたらすように、ｐＱＥ−９ベクターによって供給されるヘキサ−ヒスチジ
ンタグであり得る。あるいは、例えば、このマーカー配列は、哺乳動物宿主（例
えば、ＣＯＳ−７細胞）が用いられる場合は、血球凝集素（ＨＡ）タグであり得
る。ＨＡタグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応
する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７（１９８４））。
【００４８】 本発明はさらに、配列の間で少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％
、そしてより好ましくは少なくとも９５％同一性が存在する場合に、本明細書中
において上記される配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発
明は、本明細書中上記されたポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件
下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに特に関する。本明細書において用い
る場合、用語「ストリンジェントな条件」とは、配列の間に少なくとも９５％、
そして好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在する場合にのみハイブリダイ
ゼーションが生じることを意味する。好ましい実施形態において、本明細書中に
上記されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１Ａ
〜Ｂ、２Ａ〜Ｂ、もしくは３Ａ〜ＢのｃＤＮＡ（配列番号１、３、または５）ま
たは寄託されたｃＤＮＡのいずれかによってコードされる成熟ポリペプチドと同
じ生物学的機能または生物学的活性を実質的に保持するポリペプチドをコードす
る。 （すなわち、このポリペプチドは、例えば、セカンドメッセンジャー応答を惹起
することによって、膜結合ニューロペプチドレセプターとして機能しないにもか
かわらず、レセプターのリガンドを結合する能力を保持することによって可溶性
ニューロペプチドレセプターとして機能する）。
【００４９】 あるいは、このポリヌクレオチドは、少なくとも２０塩基、好ましくは少なく
とも３０塩基、そしてより好ましくは少なくとも５０塩基を有し、本明細書中上
記のように、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、そしてそれに対し
て同一性を有し、そして活性を保持しないポリヌクレオチドであり得る。このよ
うなポリヌクレオチドは、配列番号１、３、もしくは５のポリヌクレオチド、ま
たはその改変体に対するプローブとして、例えば、このポリヌクレオチドの回収
のため、または診断プローブとして、もしくはＰＣＲプライマーとして、使用さ
れ得る。
【００５０】 本明細書に言及される寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関す
るブダペスト条約の条項のもとで維持される。これらの寄託物は、当業者の利便
性のためにのみ提供され、寄託が米国特許法第１１２条に基いて要求されること
を承認するものではない。寄託された物質に含まれるポリヌクレオチドの配列、
およびそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、参考として本
明細書に援用され、そして本明細書の配列のいずれかの記載とのいずれかの矛盾
の場合に、管理されている。寄託された物質を作成、使用、または販売するため
にはライセンスが要求され得るが、このようなライセンスは本明細書において認
可されない。
【００５１】 本発明はさらに、図１Ａ〜Ｂ、２Ａ〜Ｂ、もしくは３Ａ〜Ｂの推定アミノ酸配
列（配列番号２、４、または６）を有するポリペプチド、または寄託されたｃＤ
ＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにこのよ
うなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。
【００５２】 用語「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、図１Ａ〜Ｂ、２Ａ
〜Ｂ、もしくは３Ａ〜Ｂのポリペプチド（配列番号２、４、または６）、または
寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドについて言及する場合、
このようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリ
ペプチドを意味する。すなわち、このポリペプチドは、膜結合ニューロペプチド
レセプターとして機能しないにもかかわらず、レセプターのリガンドを結合する
能力を保持することによって可溶性ニューロペプチドレセプターとして機能する
。アナログは、プロタンパク質の切断によって活性化され、活性な成熟ポリペプ
チドを産生し得るプロプロテインを含む。特異的な例は、それぞれ、図２Ａ〜Ｂ
および３Ａ〜Ｂ（配列番号４および６）のスプライス改変体１および２である。
【００５３】 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合
成ポリペプチド、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
【００５４】 図１Ａ〜Ｂ、２Ａ〜Ｂ、もしくは３Ａ〜Ｂのポリペプチド（配列番号２、４、
または６）または寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのフラ
グメント、誘導体またはアナログは、以下であり得る（ｉ）１つ以上のアミノ酸
残基が、保存されたアミノ酸残基または保存されていないアミノ酸残基（好まし
くは、保存されたアミノ酸残基）で置換されており、そしてこのような置換され
たアミノ酸残基が遺伝子コードによってコードされたものであってもなくてもよ
い、もの（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、（ｉｉｉ）成熟
ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を延長する化合物のような別の化合物（
例えば、ポリエチレングリコール）と融合されているもの、（ｉｖ）さらなるア
ミノ酸残が、成熟ポリペプチドに融合されている、もの（成熟ポリペプチドの精
製のために使用される配列など）、または（ｉｖ）成熟ポリペプチドから１つ以
上のアミノ酸を欠失し得る成熟ポリペプチドのスプライス改変体であって、なお
成熟ポリペプチドに相当する活性を保持している改変体。このようなフラグメン
ト、誘導体およびアナログは、本明細書の教示から当業者の範囲内であるとみな
される。
【００５５】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離形態で提供
され、そして好ましくは均一に精製されている。
【００５６】 用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生するのに関与するＤＮＡのセグメン
トを意味する；これは、コード領域「リーダーおよびトレイラー（ｌｅａｄｅｒ
ａｎｄ ｔｒａｉｌｅｒ）」の前および後ろの領域、ならびに個々のコードセ
グメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。
【００５７】 ニューロペプチドレセプターポリペプチドは、ペプチド結合または改変された
ペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）によって
互いに連結したアミノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする２０個のア
ミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。ニューロペプチドレセプターポリペプチドは
、天然のプロセス（例えば、翻訳後プロセシング）、または化学修飾技術（当該
分野で周知である）のいずれかによって改変され得る。このような改変は、基本
的な教科書において、およびより詳細にはモノグラフにおいて、ならびに多くの
研究論文において、十分記載されている。改変は、ニューロペプチドレセプター
ポリペプチドのいずれの場所でも生じ得る。この場所としてはペプチド骨格、ア
ミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシ末端が挙げられる。所定のニュ
ーロペプチドレセプターポリペプチドにおいて、同じ型の改変が、いくつかの部
位で、同じかまたは種々の程度で存在し得ることが理解される。また、所定のニ
ューロペプチドレセプターポリペプチドは、多くの型の改変を含み得る。ニュー
ロペプチドレセプターポリペプチドは、例えば、ユビキチン結合の結果として、
分枝してもよく、そして分枝ありまたは分枝なしの、環状であってもよい。環状
、分枝状および分枝した環状のニューロペプチドレセプターポリペプチドは、翻
訳後の自然のプロセスから生じ得るか、または合成方法によって作成され得る。
改変としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アセチル化、アシル
化、ビオチン化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部
分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または
脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、
既知の保護基／ブロック基による誘導体化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化
、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル
化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素
化、抗体分子または他の細胞リガンドに対する連結、メチル化、ミリストイル化
、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク質分解プロセシング（例え
ば、切断）、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギ
ニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介の付加、お
よびユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵ
ＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ， 第２版， Ｔ．
Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡ
Ｌ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，
Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ， １−１２頁 （１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら， Ｍｅｔｈ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ １８２：６２６−６４６ （１９９０）；Ｒａｔｔａｎら， Ａｎ
ｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８−６２ （１９９２）を参照のこと
）。
【００５８】 「配列番号１」は、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド配列をいう
が、「配列番号２」は、ニューロペプチドレセプターポリペプチド配列をいう。
【００５９】 「生物学的活性を有する」ニューロペプチドレセプターポリペプチドフラグメ
ントとは、特定の生物学的アッセイで測定した場合、用量依存性を有しても有さ
なくても、ニューロペプチドレセプターポリペプチド（成熟形態を含む）の活性
と類似の（ただし、同一である必要はない）活性を示すポリペプチドをいう。用
量依存性が存在する場合、用量依存性は、ニューロペプチドレセプターポリペプ
チドの用量依存性と同一である必要はなく、むしろニューロペプチドレセプター
ポリペプチドと比較した所定の活性における用量依存性と実質的に類似である（
すなわち、候補ポリペプチドは、ニューロペプチドレセプターポリペプチドに対
してより高い活性、すなわち約１／２５以上、好ましくは１／１０以上、そして
最も好ましくは、約１／３以上の活性を示す。
【００６０】 （ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドおよびポリペプチド） 配列番号１〜６は、十分正確であり、そしてさもなければ、当該分野において
周知の種々の使用および以下にさらに記載される使用に適切である。例えば、配
列番号１、３、または５は、配列番号１、３、もしくは５、または寄託されたク
ローン中に含まれるｃＤＮＡに含まれる核酸配列を検出する、核酸ハイブリダイ
ゼーションプローブを設計するに有用である。これらのプローブはまた、生物学
的サンプル中の核酸分子にハイブリダイズし、これによって、本発明の種々の法
医学的方法および診断方法を可能にする。同様に、配列番号２、４または６より
同定されるポリペプチドを使用して、ニューロペプチドレセプターに対して特異
的に結合する抗体を作製し得る。
【００６１】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１５の、
少なくとも３０の、少なくとも５０の、少なくとも１００の、少なくとも１２５
の、少なくとも５００の、または少なくとも１０００の連続するヌクレオチドで
あるが、３００ｋｂ以下、２００ｋｂ以下、１００ｋｂ以下、５０ｋｂ以下、１
５ｋｂ以下、１０ｋｂ以下、７．５ｋｂ以下、５ｋｂ以下、２．５ｋｂ以下、２
．０ｋｂ以下、または１ｋｂ以下の長さである。さらなる実施形態においては、
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に開示されたコード配列の一部を含む
が、任意のイントロンの全てまたは一部を含むわけではない。別の実施形態にお
いては、コード配列を含むポリヌクレオチドは、ゲノムの隣接遺伝子のコード配
列（すなわち、ゲノムにおける目的のニューロペプチドレセプター遺伝子に対す
る５’または３’）を含まない。他の実施形態において、本発明のポリヌクレオ
チドは、１０００、５００、２５０、１００、５０、２５、２０、１５、１０、
５、４、３、２または１をこえるゲノム隣接遺伝子のコード配列を含まない。
【００６２】 それにもかかわらず、配列決定反応によって生成されるＤＮＡ配列は、配列決
定のエラーを含み得る。このエラーは、誤って同定されたヌクレオチドとして、
または生成されたＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの挿入または欠失として存在
する。誤って挿入されたか、または欠失されたヌクレオチドは、推定アミノ酸配
列のリーディングフレームにおいてフレームシフトを引き起こす。これらの場合
において、作製されるＤＮＡ配列は、実際のＤＮＡ配列と９９．９％（例えば、
１０００塩基を超えるオープンリーディングフレームにおける１塩基の挿入また
は欠失）を超えて同一であり得るにもかかわらず、推定アミノ酸配列は、実際の
アミノ酸配列とは異なる。
【００６３】 従って、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における正確さを必要とするこ
れらの適用のために、本発明は、配列番号１、３および５として同定され作製さ
れたヌクレオチド配列、および配列番号２、４および６として同定された推定の
翻訳されたアミノ酸配列のみではなく、ＡＴＣＣに寄託されたニューロペプチド
レセプターのヒトｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡのサンプルもまた提供する。
寄託されたニューロペプチドレセプタークローンのヌクレオチド配列は、公知の
方法に従って寄託されたクローンの配列決定によって容易に決定され得る。次い
で、推定のニューロペプチドレセプターアミノ酸配列は、このような寄託物から
証明され得る。さらに、寄託されるクローンによってコードされるタンパク質の
アミノ酸配列はまた、ペプチド配列決定によって、または寄託されたヒトニュー
ロペプチドレセプターｃＤＮＡを含む適切な宿主細胞中でタンパク質を発現させ
、このタンパク質を収集し、そしてその配列を決定することによって、直接的に
決定され得る。
【００６４】 本発明はまた、配列番号１、配列番号２、または寄託されたクローンに対応す
るニューロペプチドレセプター遺伝子に関する。ニューロペプチドレセプター遺
伝子は、本明細書中に開示される配列情報を使用して、公知の方法に従って単離
され得る。このような方法は、開示された配列からプローブまたはプライマーを
調製する工程、およびゲノム物質の適切な供給源からニューロペプチドレセプタ
ー遺伝子を同定または増幅する工程を包含する。
【００６５】 本発明においてまた提供されるものは、ニューロペプチドレセプターの種ホモ
ログである。種ホモログは、本明細書中に提供される配列から適切なプローブま
たはプライマーを作製し、そして所望のホモログについて適切な核酸供給源をス
クリーニングすることによって単離および同定され得る。
【００６６】 ニューロペプチドレセプターポリぺプチドは、任意の適切な様式で調製され得
る。このようなポリペプチドは、単離された天然に存在するポリペプチド、組換
え的に産生されたポリペプチド、合成的に産生されたポリペプチド、またはこれ
らの方法の組合せによって産生されたポリペプチドを含む。このようなポリペプ
チドを調製するための手段は、当該分野で十分に理解される。
【００６７】 ニューロペプチドレセプターポリぺプチドは、分泌タンパク質の形態（成熟形
態を含む）であり得るか、またはより大きいタンパク質（例えば、融合タンパク
質）の一部分であり得る（以下を参照のこと）。分泌配列もしくはリーダー配列
、プロ配列、精製を補助する配列（例えば、複数のヒスチジン残基）、または組
換え生成の間の安定性のためのさらなる配列を含むさらなるアミノ酸配列を含む
ことは、しばしば有利である。
【００６８】 ニューロペプチドレセプターポリぺプチドは、好ましくは、単離された形態で
提供され、そして好ましくは実質的に精製される。ニューロペプチドレセプター
ポリぺプチド（分泌ポリぺプチドを含む）の組換え的に生成されたバージョン（
ｖｅｒｓｉｏｎ）は、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１
−４０（１９８８）に記載される１工程の方法によって実質的に精製され得る。
ニューロペプチドレセプターポリぺプチドはまた、当該分野において周知の方法
で、ニューロペプチドレセプタータンパク質に対して惹起された本発明の抗体を
用いて天然供給源、または組換え供給源から精製され得る。
【００６９】 （ポリヌクレオチドおよびポリぺプチド改変体） 本発明は、配列番号１、３、もしくは５に開示されるポリヌクレオチド配列、
その相補鎖、および／または寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡ配列の改変
体に関する 本発明はまた、配列番号２、４、もしくは６に開示されるポリヌクレオチド配
列、および／または寄託されたクローンにコードされるポリヌクレオチド配列の
改変体を包含する。
【００７０】 「改変体」とは、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリぺ
プチドとは異なるが、それらの本質的な特性を保持するポリヌクレオチドまたは
ポリぺプチドをいう。一般に、改変体は、全体的に密接に類似し、そして、多く
の領域において、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリぺプ
チドに同一である。
【００７１】 本発明はまた、例えば配列番号１、３、もしくは５のヌクレオチドコード配列
、またはその相補鎖に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９
６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列、寄
託されたｃＤＮＡクローンに含まれるヌクレオチドコード配列、またはその相補
鎖、配列番号２、４、もしくは６のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
、寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列、および／またはこれらの核酸分子のいずれかのポ
リヌクレオチドフラグメント（例えば、本明細書に記載のフラグメント）を含む
か、あるいはこれらからなる、核酸分子に関する。これらの核酸分子に、ストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件下または低いストリンジェンシー条件
下でハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、これらのポリヌクレオチドに
よってコードされるポリペプチドがそうであるように、本発明によって含まれ得
る。
【００７２】 本発明はまた、例えば、配列番号２、４、または６に示されるポリペプチド配
列、寄託されたクローン中に含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチ
ド配列、および／またはこれらのポリペプチドのいずれかのポリペプチドフラグ
メント（例えば、本明細書中に記載されるこれらのフラグメント）に対して、少
なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから
なるポリペプチドに関する。
【００７３】 本発明の参照ヌクレオチド配列に対して、例えば、少なくとも９５％「同一」
であるヌクレオチドを有するポリヌクレオチドによって、そのポリヌクレオチド
のヌクレオチド配列が、そのポリヌクレオチド配列がニューロペプチドレセプタ
ーポリぺプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあた
り５つまでの点変異を含み得ることを除いて、参照配列に対して同一であること
を意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一
のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌク
レオチドの５％までが、欠失され得るか、または別のヌクレオチドで置換され得
るか、あるいは参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが参
照配列中に挿入され得る。問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）配列は、配列番号１に示さ
れる配列全体、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、または本明細書中で
記載されるように特定される任意のフラグメントであり得る。
【００７４】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９
６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるか否かは、公知のコン
ピュータープログラムを使用して従来的に決定され得る。問い合わせ配列（本発
明の配列）と対象配列との間の最も良好な全体的な適合性（全体的な配列整列と
も呼ばれる）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．
Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基
づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列
において、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である。Ｒ
ＮＡ配列は、ＵからＴに変換することによって比較され得る。この全体的な配列
整列の結果は、同一性パーセントである。同一性パーセントを算定するためにＤ
ＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａ
ｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａ
ｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉ
ｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ
Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎ
ｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらかより短
い方）である。
【００７５】 対象配列が、５’または３’欠失に起因して（内部欠失のためではなく）問い
合わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。
これは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配
列の５’および３’の短縮を考慮しないからである。５’末端または３’末端で
短縮されている対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセント
は、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されない対象配列の
５’および３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正さ
れる。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果
によって決定される。次いで、このパーセントは、特定のパラメーターを用いて
上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定された同一性パーセントから差し引
かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが
、本発明の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示されるよ
うに、問い合わせ配列と一致／整列されない、対象配列の５’および３’の塩基
の外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定さ
れる。
【００７６】 例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って
、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１
０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’末端での塩
基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、ＦＡＳＴＤ
Ｂプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。
残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％で
ある。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と比較
される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／整
列しない対象配列の５’または３’の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤ
Ｂによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合わ
せ配列と一致／整列しない対象配列の５’および３’の塩基のみが手動で補正さ
れる。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。
【００７７】 本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であ
るアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、対象ポリペプチドのアミノ酸配
列が（その対象ポリペプチド配列が問い合わせアミノ酸配列の各１００アミノ酸
あたり５つまでのアミノ酸変更を含み得ることを除いて）問い合わせ配列に対し
て同一であることを意図する。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に対して少
なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配
列のアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（インデル（ｉｎｄｅｌ））、ま
たは別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配
列のアミノ末端位もしくはカルボキシ末端位で生じ得るか、あるいはこれらの末
端位置間のどこかで生じ得、参照配列の残基間で個々にか、または参照配列内で
１個以上連続する群としてかのいずれかで間に散在する。
【００７８】 実際的な問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列番号２に示
されるアミノ酸配列、または寄託されたＤＮＡクローンによりコードされるアミ
ノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９
７％、９８％、９９％または１００％同一であるかどうかは、公知のコンピュー
タープログラムを用いて簡便に決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）
と対象の配列との間の最良の全体の一致を決定するための好ましい方法はまた（
包括的な配列整列とも呼ばれる）、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉ
ｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴ
ＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。問い合わせ配列と対象
配列の配列整列は、両方のヌクレオチド配列または両方のアミノ酸配列のいずれ
かである。包括的な配列整列の結果は、パーセント同一性である。ＦＡＳＴＤＢ
アミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０
、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎ
ｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎ
ｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝配列の
長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．
０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（どちら
かより短い方）である。
【００７９】 対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問
い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなければならな
い。これは、包括的な同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログ
ラムが対象配列のＮ末端およびＣ末端の短縮を考慮しないからである。問い合わ
せ配列に対する、Ｎ末端およびＣ末端で短縮されている対象配列についての、同
一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対象
残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配列
の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されているか
否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセ
ントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによ
って特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのスコ
アに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的で使用
されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端お
よびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的の
ために考慮される。すなわち、問い合わせ残基位置のみが、対象配列の最も遠い
Ｎ末端およびＣ末端残基の外側に位置する。
【００８０】 例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために
１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そ
してそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示
さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ
末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し
引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは
９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わ
せ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ
配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。こ
の場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正され
ない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示されるように、問い合わせ配列と一致
／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正さ
れる。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【００８１】 ニューロペプチドレセプター改変体は、コード領域、非コード領域、またはそ
の両方における変化を含み得る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加
、または欠失を生成するが、コードされるポリぺプチドの特性または活性を変化
させない変化を含むポリヌクレオチド改変体である。遺伝暗号の縮重に起因する
サイレントな置換によって生成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに
、任意の組合せにおいて５〜１０、１〜５、もしくは１〜２アミノ酸が置換、欠
失、または付加される改変体もまた、好ましい。ニューロペプチドレセプターポ
リヌクレオチド改変体は、種々の理由（例えば、特定の宿主についてのコドン発
現を至適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌宿
主によって好ましいコドンに変化させる））のために、生成され得る。
【００８２】 天然に存在するニューロペプチドレセプター改変体は、「対立遺伝子改変体」
と呼ばれ、そして生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつか
の代替の形態のうちの１つをいう。（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。こ
れらの対立遺伝子改変体は、ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリぺプチ
ドレベルのいずれかで変化し得る。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異
誘発技術によってまたは直接的な合成によって生成され得る。
【００８３】 タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、改変体は、
ニューロペプチドレセプターポリぺプチドの特性を改善または変化させるために
作製され得る。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実質的な欠損を
伴わずに、分泌タンパク質のＮ末端またはＣ末端から欠失され得る。Ｒｏｎら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３）の著者らは
、３、８、または２７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失させた後でさえもヘ
パリン結合活性を有する改変体ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インター
フェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基
を欠失させた後、１０倍までのより高い活性を示した（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８））。
【００８４】 さらに、豊富な証拠は、改変体が、天然に存在するタンパク質の生物学的活性
に類似する活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Ｇａｙｌｅおよび
共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５−２２１１１（１
９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる変異分析を行った
。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって改変体当たり
平均２．５アミノ酸の変化になる、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ変異
体を作製した。複数の変異が、全ての可能なアミノ酸の位置で試験された。この
研究者らは、「分子の大部分は、［結合活性または生物学的活性］のいずれに対
してもほとんど影響を伴わないで変化され得る」ことを見出した。（要約を参照
のこと）。実際、試験された３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、わ
ずか２３個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタンパク質を
生成した。
【００８５】 さらに、ポリぺプチドのＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失
が、１つ以上の生物学的機能の改変または欠失を生じたとしても、他の生物学的
活性はなお保持され得る。例えば、分泌される形態を認識する抗体を誘導および
／または結合する、欠失改変体の能力は、分泌される形態の大多数より少ない残
基が、Ｎ末端またはＣ末端から除去される場合に保持されるようである。タンパ
ク質のＮ末端またはＣ末端残基を欠損する特定のポリぺプチドが、このような免
疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、および
そうでなければ当該分野において公知の慣用的な方法によって容易に決定され得
る。
【００８６】 従って、本発明はさらに、実質的な生物学的活性を示すニューロペプチドレセ
プターポリぺプチド改変体を含む。このような改変体としては、活性に対する影
響をほとんど有さないように、当該分野において公知の一般的な法則に従って選
択される、欠失、挿入、逆位、反復、および置換が挙げられる。
【００８７】 本願は、本明細書中に開示される核酸配列（例えば、配列番号２、４または６
のｍ−ｎとして以下に開示されるＮおよび／またはＣ末端欠失のアミノ酸配列を
有するポリペプチドをコードする）に対して、それらがニューロペプチドレセプ
ター機能活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関わらず、少なくとも
８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ま
たは１００％同一である核酸分子に関する。なぜならば、特定の核酸分子が、ニ
ューロペプチドレセプター機能活性を有するポリペプチドをコードしない場合で
すら、当業者はこの核酸分子を使用する方法（例えば、ハイブリダイゼーション
プローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして）をなお知っ
ているからである。ニューロペプチドレセプター機能活性を有するポリペプチド
をコードしない本発明の核酸分子の使用としては、特に、（１）ｃＤＮＡライブ
ラリー中のニューロペプチドレセプター遺伝子またはその対立遺伝子またはその
改変体を単離すること；（２）Ｖｅｒｍａら（Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍ
ｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇ
ａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ．Ｙｏｒｋ．（１９８８））に記載されるような
、ニューロペプチドレセプター遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分
裂中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）に対するインサイチュハイブリダイゼ
ーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）；および（３）特定の組織におけるニューロ
ペプチドレセプターのｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析が挙
げられる。
【００８８】 しかし、本明細書中に開示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、８５
％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％
同一な配列を有する核酸分子が好ましい。これらは、事実、ニューロペプチドレ
セプター機能活性を有するポリペプチドをコードする。「ニューロペプチドレセ
プター機能活性を有するポリペプチド」によって、例えば、特に、免疫アッセイ
または生物学的アッセイにおいて測定されるように、本発明のニューロペプチド
レセプターポリペプチド（例えば、完全（全長）ニューロペプチドレセプター、
成熟ニューロペプチドレセプターおよび可溶性ニューロペプチドレセプター（例
えば、ニューロペプチドレセプターの細胞外ドメイン中に含まれる配列を有する
））の機能的活性と類似する活性（しかし、同一である必要はない）を示すポリ
ペプチドが意図される。例えば、ニューロペプチドレセプター機能活性は、ニュ
ーロペプチドレセプターリガンドを結合するニューロペプチドレセプターポリペ
プチドの能力を決定することにより慣用的に測定され得る。ニューロペプチドレ
セプター機能活性はまた、このポリペプチドを発現している細胞を誘導するため
に、遊離しているかまたは細胞表面上で発現している同属リガンドのようなポリ
ペプチドの能力を決定することにより測定され得る。
【００８９】 もちろん、遺伝暗号の縮重に起因して、当業者は、寄託されたｃＤＮＡの核酸
配列、図１Ａ−Ｂ、図２Ａ−Ｂ、図３Ａ−Ｂ（配列番号１、３または５）に示さ
れる核酸配列、またはそれらのフラグメントに対して、少なくとも８０％、８５
％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％
同一な配列を有する多くの核酸分子が「ニューロペプチドレセプター機能活性を
有する」ポリペプチドをコードすることを直ちに認識する。事実、これらのヌク
レオチド配列のいずれかの縮重改変体は全て、同じポリペプチドをコードするの
で、多くの場合において、これは、上記の比較アッセイを行うことなく、なお当
業者に明らかである。縮重改変体ではないこのような核酸分子については、妥当
な数がまた、ニューロペプチドレセプターの機能活性を有するポリペプチドをコ
ードすることは当該分野でさらに認識される。これは、以下でさらに記載される
ように、タンパク質機能を有意にあまりもたらさないかまたはもたらさないよう
であるかのいずれかであるアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸を第２
の脂肪族アミノ酸と置換すること）を、当業者が、十分認識しているからである
。
【００９０】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する指針は
、Ｂｏｗｉｅら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−
１３１０（１９９０）において提供され、ここで、著者らは変化に対するアミノ
酸配列の寛容性を研究するための２つの主要なストラテジーがあることを指摘す
る。
【００９１】 第１のストラテジーは、進化の過程の間の自然の選択によるアミノ酸置換の寛
容を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較して、保存されるアミノ酸
が同定され得る。これらの保存されるアミノ酸は、タンパク質の機能について重
要であるようである。対照的に、置換が自然の選択によって寛容されたアミノ酸
の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないことを示す。従って
、アミノ酸置換を寛容する位置は改変され得るが、タンパク質の生物学的活性を
なおも維持する。
【００９２】 第２のストラテジーは、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クロ
ーン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を
使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニン走査変異誘発（分子中の
各残基で１つのアラニン変異の導入）が、使用され得る。（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａ
ｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９
））。次いで、得られた変異分子は生物学的活性について試験され得る。
【００９３】 著者らが言及するように、これらの２つのストラテジーは、タンパク質がアミ
ノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミ
ノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示
す。例えば、（タンパク質の三次構造内に）ほとんど埋もれているアミノ酸残基
は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されな
い。さらに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸
のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基のＳｅｒお
よびＴｈｒの置換；酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基のＡｓｎ
およびＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香
族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズのアミノ
酸のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換を含む。
【００９４】 例えば、ニューロペプチドレセプターのアミノ酸レベルにおける部位特異的変
化は、特定のアミノ酸を保存的なアミノ酸で置換することによって実施され得る
。好ましい保存的な変異は、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｍ１
（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ｅ２（Ｄで置換される）
；Ｓ４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ５（Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｔ６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、また
はＶで置換される）；Ｇ８（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）
；Ａ９（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｑ１０（Ｎで置換
される）；Ｍ１１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ｇ１２
（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ１３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｇ１６（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖで置換される）；Ｓ１７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）
；Ｒ１８（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｅ１９（Ｄで置換される）；Ｓ２１（
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ２３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｄ２６（Ｅで置換される）；Ｙ２７（Ｆ、ま
たはＷで置換される）；Ｅ２８（Ｄで置換される）；Ｄ２９（Ｅで置換される）
；Ｅ３０（Ｄで置換される）；Ｆ３１（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｌ３２（
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｒ３３（Ｈ、またはＫで置
換される）；Ｙ３４（Ｆ、またはＷで置換される）；Ｌ３５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｗ３６（Ｆ、またはＹで置換される）；Ｒ３
７（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｄ３８（Ｅで置換される）；Ｙ３９（Ｆ、ま
たはＷで置換される）；Ｌ４０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｙ４１（Ｆ、またはＷで置換される）；Ｋ４３（Ｈ、またはＲで置換され
る）；Ｑ４４（Ｎで置換される）；Ｙ４５（Ｆ、またはＷで置換される）；Ｅ４
６（Ｄで置換される）；Ｗ４７（Ｆ、またはＹで置換される）；Ｖ４８（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｌ４９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、またはＶで置換される）；Ｉ５０（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
される）；Ａ５１（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ５２
（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｙ５３（Ｆ、またはＷで
置換される）；Ｖ５４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ａ
５５（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ５６（Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｆ５７（Ｗ、またはＹで置換される）
；Ｖ５８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｖ５９（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ａ６０（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、またはＶで置換される）；Ｌ６１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
される）；Ｖ６２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｇ６３
（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｎ６４（Ｑで置換される
）；Ｔ６５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ６６（Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ６７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、またはＭで置換される）；Ｌ６９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換される）；Ａ７０（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ７
１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｗ７２（Ｆ、またはＹ
で置換される）；Ｒ７３（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｎ７４（Ｑで置換され
る）；Ｈ７５（Ｋ、またはＲで置換される）；Ｈ７６（Ｋ、またはＲで置換され
る）；Ｍ７７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ｒ７８（Ｈ
、またはＫで置換される）；Ｔ７９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換
される）；Ｖ８０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｔ８１
（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｎ８２（Ｑで置換される
）；Ｙ８３（Ｆ、またはＷで置換される）；Ｆ８４（Ｗ、またはＹで置換される
）；Ｉ８５（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ８６（Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｎ８７（Ｑで置換される）；Ｌ
８８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ８９（Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ９０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶで置換される）；Ａ９１（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｄ９２（Ｅで置換される）；Ｖ９３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭ
で置換される）；Ｌ９４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；
Ｖ９５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｔ９（Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ９７（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶで置換される）；Ｉ９８（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｌ１００（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ１０２
（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ１０３（Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ１０４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶで置換される）；Ｌ１０５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れる）；Ｖ１０６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｄ１０
７（Ｅで置換される）；Ｉ１０８（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れる）；Ｔ１０９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｅ１１
０（Ｄで置換される）；Ｓ１１１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れる）；Ｗ１１２（Ｆ、またはＹで置換される）；Ｌ１１３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｆ１１４（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｇ
１１５（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｈ１１６（Ｋ、ま
たはＲで置換される）；Ａ１１７（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れる）；Ｌ１１８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｋ１２
０（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｖ１２１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、または
Ｍで置換される）；Ｉ１２２（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される
）；Ｙ１２４（Ｆ、またはＷで置換される）；Ｌ１２５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換される）；Ｑ１２６（Ｎで置換される）；Ａ１２７（Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ１２８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、またはＭで置換される）；Ｓ１２９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換される）；Ｖ１３０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；
Ｓ１３１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ１３２（Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ａ１３３（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ１３４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭ
で置換される）；Ｌ１３５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）
；Ｔ１３６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ１３７（Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ１３８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｆ１３９（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｉ
１４０（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ１４１（Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ１４２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換される）；Ｄ１４３（Ｅで置換される）；Ｒ１４４（Ｈ、ま
たはＫで置換される）；Ｗ１４５（Ｆ、またはＹで置換される）；Ｙ１４６（Ｆ
、またはＷで置換される）；Ａ１４７（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換される）；Ｉ１４８（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｈ
１５０（Ｋ、またはＲで置換される）；Ｌ１５２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶで置換される）；Ｌ１５３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れる）；Ｆ１５４（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｋ１５５（Ｈ、またはＲで置
換される）；Ｓ１５６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｔ
１５７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ１５８（Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｒ１５９（Ｈ、またはＫで置換さ
れる）；Ｒ１６０（Ｈ、またはＫで置換される）；Ａ１６１（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｒ１６２（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｇ
１６３（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ１６４（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｉ１６５（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ１６６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換される）；Ｇ１６７（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；
Ｉ１６８（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｗ１６９（Ｆ、
またはＹで置換される）；Ａ１７０（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
される）；Ｖ１７１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｓ１
７２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ１７３（Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ１７４（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、またはＶで置換される）；Ｉ１７５（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換される）；Ｍ１７６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ｖ
１７７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｑ１７９（Ｎで置
換される）；Ａ１８０（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ
１８１（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ１８２（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｍ１８３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、またはＶで置換される）；Ｅ１８４（Ｄで置換される）；Ｓ１８６（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ１８７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ１８８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで
置換される）；Ｌ１８９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；
Ｅ１９１（Ｄで置換される）；Ｌ１９２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換される）；Ａ１９３（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；
Ｎ１９４（Ｑで置換される）；Ｒ１９５（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｔ１９
６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｒ１９７（Ｈ、または
Ｋで置換される）；Ｌ１９８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される
）；Ｆ１９９（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｓ２００（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ２０１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで
置換される）；Ｄ２０３（Ｅで置換される）；Ｅ２０４（Ｄで置換される）；Ｒ
２０５（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｗ２０６（Ｆ、またはＹで置換される）
；Ａ２０７（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｄ２０８（Ｅ
で置換される）；Ｄ２０９（Ｅで置換される）；Ｌ２１０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｙ２１１（Ｆ、またはＷで置換される）；Ｋ２
１３（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｉ２１４（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換される）；Ｙ２１５（Ｆ、またはＷで置換される）；Ｈ２１６（Ｋ、
またはＲで置換される）；Ｓ２１７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
される）；Ｆ２１９（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｆ２２０（Ｗ、またはＹで
置換される）；Ｉ２２１（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；
Ｖ２２２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｔ２２３（Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｙ２２４（Ｆ、またはＷで置換
される）；Ｌ２２５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ２
２６（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ２２８（Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｇ２２９（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、またはＶで置換される）；Ｌ２３０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換される）；Ｍ２３１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ａ
２３２（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｍ２３３（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ａ２３４（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換される）；Ｙ２３５（Ｆ、またはＷで置換される）；Ｆ２３
６（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｑ２３７（Ｎで置換される）；Ｉ２３８（Ａ
、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｆ２３９（Ｗ、またはＹで置
換される）；Ｒ２４０（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｋ２４１（Ｈ、またはＲ
で置換される）；Ｌ２４２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）
；Ｗ２４３（Ｆ、またはＹで置換される）；Ｇ２４４（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、またはＶで置換される）；Ｒ２４５（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｑ２４６
（Ｎで置換される）；Ｉ２４７（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｇ２４９（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｔ２５０
（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｔ２５１（Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ２５２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶで置換される）；Ａ２５３（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れる）；Ｌ２５４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ２５
５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｒ２５６（Ｈ、または
Ｋで置換される）；Ｎ２５７（Ｑで置換される）；Ｗ２５８（Ｆ、またはＹで置
換される）；Ｋ２５９（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｒ２６０（Ｈ、またはＫ
で置換される）；Ｓ２６２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）
；Ｄ２６３（Ｅで置換される）；Ｑ２６４（Ｎで置換される）；Ｌ２６５（Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｇ２６６（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｄ２６７（Ｅで置換される）；Ｌ２６８（Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｅ２６９（Ｄで置換される）；
Ｑ２７０（Ｎで置換される）；Ｇ２７１（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換される）；Ｌ２７２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；
Ｓ２７３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｇ２７４（Ａ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｅ２７５（Ｄで置換される）；
Ｑ２７７（Ｎで置換される）；Ｒ２７９（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｇ２８
０（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｒ２８１（Ｈ、または
Ｋで置換される）；Ａ２８２（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される
）；Ｆ２８３（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｌ２８４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ２８５（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換される）；Ｅ２８６（Ｄで置換される）；Ｖ２８７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、またはＭで置換される）；Ｋ２８８（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｑ２８
９（Ｎで置換される）；Ｍ２９０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換さ
れる）；Ｒ２９１（Ｈ、またはＫで置換される）；Ａ２９２（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｒ２９３（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｒ
２９４（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｋ２９５（Ｈ、またはＲで置換される）
；Ｔ２９６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ２９７（Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｋ２９８（Ｈ、またはＲで置
換される）；Ｍ２９９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ｌ
３００（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｍ３０１（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ｖ３０２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、またはＭで置換される）；Ｖ３０３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで
置換される）；Ｌ３０４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；
Ｌ３０５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ３０６（Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｆ３０７（Ｗ、またはＹで置換
される）；Ａ３０８（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ３
０９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｙ３１１（Ｆ、また
はＷで置換される）；Ｌ３１２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｉ３１４（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ３１５
（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ３１６（Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｌ３１７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶで置換される）；Ｎ３１８（Ｑで置換される）；Ｖ３１９（Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｌ３２０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶで置換される）；Ｋ３２１（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｒ３２２（Ｈ
、またはＫで置換される）；Ｖ３２３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置
換される）；Ｆ３２４（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｇ３２５（Ａ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｍ３２６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ま
たはＶで置換される）；Ｆ３２７（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｒ３２８（Ｈ
、またはＫで置換される）；Ｑ３２９（Ｎで置換される）；Ａ３３０（Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ３３１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ
、またはＶで置換される）；Ｄ３３２（Ｅで置換される）；Ｒ３３３（Ｈ、また
はＫで置換される）；Ｅ３３４（Ｄで置換される）；Ａ３３５（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ３３６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、また
はＭで置換される）；Ｙ３３７（Ｆ、またはＷで置換される）；Ａ３３８（Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｆ３４０（Ｗ、またはＹで置換
される）；Ｔ３４１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｆ３
４２（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｓ３４３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換される）；Ｈ３４４（Ｋ、またはＲで置換される）；Ｗ３４５（Ｆ、
またはＹで置換される）；Ｌ３４６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
される）；Ｖ３４７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｙ３
４８（Ｆ、またはＷで置換される）；Ａ３４９（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換される）；Ｎ３５０（Ｑで置換される）；Ｓ３５１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ３５２（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換される）；Ａ３５３（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｎ３５４（Ｑで置換される）；Ｉ３５６（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換される）；Ｉ３５７（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｙ３５８（Ｆ、またはＷで置換される）；Ｎ３５９（Ｑで置換される）；
Ｆ３６０（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｌ３６１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
またはＶで置換される）；Ｓ３６２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
される）；またはＧ３６３（配列番号２、４、および／または６のＡ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）。
【００９５】 さらに好ましい保存的な変異は、以下が挙げられる：Ｋ３６４（Ｈ、またはＲ
で置換される）；Ｆ３６５（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｒ３６６（Ｈ、また
はＫで置換される）；Ｅ３６７（Ｄで置換される）；Ｑ３６８（Ｎで置換される
）；Ｆ３６９（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｋ３７０（Ｈ、またはＲで置換さ
れる）；Ａ３７１（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ３７
２（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｆ３７３（Ｗ、または
Ｙで置換される）；Ｓ３７４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される
）；Ｌ３７７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｇ３７９（
Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ３８０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｇ３８１（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換される）；Ｇ３８４（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｓ３８５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ３８６
（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｋ３８７（Ｈ、またはＲ
で置換される）；Ａ３８８（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）
；Ｓ３９０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｒ３９２（Ｈ
、またはＫで置換される）；Ｓ３９３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換される）；Ｓ３９４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ
３９５（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ３９６（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｈ３９７（Ｋ、またはＲで置換さ
れる）；Ｋ３９８（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｓ３９９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ４００（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖで置換される）；Ｓ４０１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される
）；Ｌ４０２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；またはＱ４
０３（Ｎで置換される）；Ｓ４０４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
される）；Ｒ４０５（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｓ４０７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ４０８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、また
はＭで置換される）；Ｓ４０９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｋ４１０（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｉ４１１（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ４１２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
で置換される）；Ｅ４１３（Ｄで置換される）；Ｈ４１４（Ｋ、またはＲで置換
される）；Ｖ４１５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｖ４
１６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｌ４１７（Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｔ４１８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ
、またはＶで置換される）；Ｓ４１９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換される）；Ｖ４２０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｔ
４２１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｔ４２２（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ４２３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、またはＭで置換される）；またはＬ４２４（配列番号２のＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）。
【００９６】 さらに好ましい保存的な変異にはまた、以下が挙げられる：Ｌ３６４（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｗ３６６（Ｆ、またはＹで置換さ
れる）；Ｓ３６７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ３６
８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；またはＬ３６９（配列
番号４のＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）。
【００９７】 さらに好ましい保存的な変異にはまた、以下が挙げられる：Ｋ３６５（Ｈ、ま
たはＲで置換される）；Ｅ３６６（Ｄで置換される）；Ｋ３６７（Ｈ、またはＲ
で置換される）；Ｓ３６８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）
；Ｌ３６９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ３７０（Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｌ３７１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；またはＳ３７２（配列番号６のＡ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）。
【００９８】 得られる構築物は、本明細書の全体にわたって記載される活性または機能、お
よび当該分野で公知の活性または機能について慣用的にスクリーニングされ得る
。好ましくは、得られる構築物は、増加したニューロペプチドレセプター活性ま
たは機能を有するが、残存するニューロペプチドレセプター活性または機能は維
持される。より好ましくは、得られる構築物は、１つより多く増加したニューロ
ペプチドレセプター活性または機能を有するが、残存するニューロペプチドレセ
プター活性または機能は維持される。
【００９９】 保存的なアミノ酸置換に加えて、ニューロペプチドレセプターの改変体は、（
ｉ）１つ以上の非保存的なアミノ酸残基での置換、ここでは置換されるアミノ酸
残基は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸残基であってもよく、もしく
はそうでなくてもよい、または（ｉｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基
での置換、または（ｉｉｉ）別の化合物（例えば、ポリペプチドの安定性および
／もしくは可溶性を増加するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール）
）との成熟ポリペプチドの融合、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、Ｉ
ｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチド、またはリーダーもしくは分泌配列、または精製を
容易にする配列）とのポリペプチドの融合を含む。このような改変体ポリペプチ
ドは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内であると考えられる。
【０１００】 例えば、他の荷電されたアミノ酸または中性のアミノ酸での荷電されたアミノ
酸のアミノ酸置換を含むニューロペプチドレセプターポリペプチド改変体は、改
善された特性（例えば、より少ない凝集性）を有するタンパク質を生成し得る。
薬学的処方物の凝集は、凝集体の免疫原活性に起因して、活性の減少およびクリ
アランスの増加の両方をもたらす。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａ
ｂｅｔｅｓ ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ
．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ １０：３０７−３７７（１９９３））。
【０１０１】 例えば、ニューロペプチドの好ましい非保存性置換としては、以下が挙げられ
る：配列番号２、４、および／または６のＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＭ１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＥ２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換
されたＰ３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れたＳ４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
たＡ５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
Ｔ６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、またはＣで置換されたＰ７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されたＧ８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換されたＡ９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＱ１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＭ１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＧ１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された
Ｐ１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、またはＣで置換されたＰ１５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＧ１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＳ１７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＲ１８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
Ｅ１９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、またはＣで置換されたＰ２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＳ２１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換されたＰ２２；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ２３；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣ
で置換されたＰ２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換されたＰ２５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＤ２６；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣ
で置換されたＹ２７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＥ２８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＤ２９；Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換されたＥ３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＦ３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ３２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＲ３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された
Ｙ３４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
Ｌ３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、
またはＣで置換されたＷ３６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＲ３７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＤ３８；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣ
で置換されたＹ３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換されたＬ４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＹ４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換されたＰ４２；Ｄ、
Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換されたＫ４３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＱ４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＹ４５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れたＥ４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｐ、またはＣで置換されたＷ４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されたＶ４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されたＬ４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されたＩ５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されたＡ５１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されたＡ５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＹ５３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ５５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＦ５７；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ５８；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ５９；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ６０；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ６１；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ６２；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＧ６３；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換されたＮ６４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換されたＴ６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換されたＬ６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換されたＶ６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換されたＣ６８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ６９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＷ７２；
Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換されたＲ７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＮ７４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＨ７５；Ｄ、Ｅ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れたＨ７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れたＭ７７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されたＲ７８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されたＴ７９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されたＶ８０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されたＴ８１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＮ８２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＹ８
３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、また
はＣで置換されたＦ８４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換されたＩ８５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換されたＶ８６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＮ８７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ８８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＳ８９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ９０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ９１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＤ９２；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ９３；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ９４；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ９５；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＴ９６；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ９７；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＩ９８；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
またはＰで置換されたＣ９９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換されたＬ１００；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換されたＰ１０１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ１０２；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＳ１０３；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ１０４；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ１０５；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ１０６；Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換されたＤ１０７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換されたＩ１０８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換されたＴ１０９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＥ１１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＳ１１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＷ１
１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ
１１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、
またはＣで置換されたＦ１１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換されたＧ１１５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＨ１１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ１１７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ１１８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換
されたＣ１１９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＫ１２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ１２１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＩ１２２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換されたＰ１２３；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣ
で置換されたＹ１２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換されたＬ１２５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＱ１２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ１２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ１２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＳ１２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ１３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＳ１３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ１３２；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ１３３；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ１３４；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ１３５；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＴ１３６；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ１３７；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＳ１３８
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、または
Ｃで置換されたＦ１３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換されたＩ１４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換されたＡ１４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換されたＬ１４２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＤ１４３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＲ１
４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、ま
たはＣで置換されたＷ１４５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＹ１４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ１４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＩ１４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換され
たＣ１４９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されたＨ１５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換されたＰ１５１；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ１５２；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ１５３；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置
換されたＦ１５４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＫ１５５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＳ１５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＴ１５７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ１５８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＲ１５９；Ｄ、
Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換されたＲ１６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換されたＡ１６１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＲ１６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＧ１６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＳ１６４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＩ１６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ１６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＧ１６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＩ１６８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＷ１６
９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ１
７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ
１７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
Ｓ１７２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
たＬ１７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れたＡ１７４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
されたＩ１７５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換されたＭ１７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換されたＶ１７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換されたＰ１７８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＱ１７
９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ１
８０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ
１８１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
Ｖ１８２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
たＭ１８３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＥ１８４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換されたＣ１８５；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＳ１８６；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＳ１８７；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ１８８
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ１８
９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、またはＣで置換されたＰ１９０；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＥ１９１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ１９２；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ１９３；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換されたＮ１９４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＲ１９５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＴ１９６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＲ１９７；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ１９８；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換
されたＦ１９９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換されたＳ２００；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換されたＶ２０１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換されたＣ２０２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＤ２０
３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換されたＥ２０４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＲ２０５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＷ２０６
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ２０
７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換されたＤ２０８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＤ２０９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ２１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＹ
２１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、またはＣで置換されたＰ２１２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＫ２１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＩ２１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換され
たＹ２１５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されたＨ２１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換されたＳ２１７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換されたＣ２１８；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換
されたＦ２１９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＦ２２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＩ２２１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ２２２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＴ２２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＹ２２４；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ２２５；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ２２６；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ま
たはＣで置換されたＰ２２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換されたＬ２２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換されたＧ２２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されたＬ２３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換されたＭ２３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ２３２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＭ２３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ２３４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＹ２３５；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換さ
れたＦ２３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＱ２３７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＩ２３８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＦ２３９；Ｄ、Ｅ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れたＲ２４０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換されたＫ２４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ２４２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＷ２４３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＧ２４４；Ｄ、Ｅ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
たＲ２４５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＱ２４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＩ２４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換されたＰ２４８；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＧ２４９；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＴ２５０
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＴ２５
１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＳ２
５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ
２５３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
Ｌ２５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
たＶ２５５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されたＲ２５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＮ２５７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された
Ｗ２５８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換されたＫ２５９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＲ２６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換され
たＰ２６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れたＳ２６２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＤ２６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＱ２６４；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ２６５；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＧ２６６；Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換されたＤ２６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換されたＬ２６８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＥ２６９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＱ２
７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＧ
２７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
Ｌ２７２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
たＳ２７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れたＧ２７４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＥ２７５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換されたＰ２７６；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換されたＱ２７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換されたＰ２７８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＲ２７
９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＧ２
８０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換されたＲ２８１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換されたＡ２８２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＦ２８３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ２８４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ２８５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
Ｅ２８６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
たＶ２８７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されたＫ２８８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＱ２８９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＭ２９０；Ｄ、Ｅ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
たＲ２９１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れたＡ２９２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換されたＲ２９３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＲ２９４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＫ
２９５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
Ｔ２９６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
たＡ２９７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換されたＫ２９８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換されたＭ２９９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ３００；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＭ３０１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ３０２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ３０３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ３０４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ３０５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ３０６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＦ３０７；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ３０８
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ３０
９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、またはＰで置換されたＣ３１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＹ３１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ３１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換
されたＰ３１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換されたＩ３１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換されたＳ３１５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換されたＶ３１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換されたＬ３１７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＮ３１８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ３１９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ３２０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＫ３２
１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換されたＲ３２２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換されたＶ３２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＦ３２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＧ３２５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＭ３２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＦ３２
７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換されたＲ３２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＱ３２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ３３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＳ３３１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
Ｄ３３２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換されたＲ３３３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＥ３３４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ３３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ３３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換され
たＹ３３７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れたＡ３３８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換されたＣ３３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＦ３４０；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＴ３４１；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置
換されたＦ３４２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換されたＳ３４３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＨ３４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＷ３４５；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ３４６；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＶ３４７；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置
換されたＹ３４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換されたＡ３４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＮ３５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＳ３５１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ３５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＡ３５３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＮ３
５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、またはＣで置換されたＰ３５５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＩ３５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＩ３５７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＹ３５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
されたＮ３５９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｐ、またはＣで置換されたＦ３６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＬ３６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＳ３６２；あるいはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換されたＧ３６３。
【０１０２】 さらなる好ましい非保存的変異体としては、以下が挙げられる：配列番号２の
Ｋ３６４（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｆ３６５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ３６６（Ｄ、Ｅ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｅ３６７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ３６８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ３６
９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｋ３７０（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ３７１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ３７２（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ３７３（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｓ３７４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｃ３７５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｃ３７６（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで
置換される）；Ｌ３７７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｐ３７８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｇ３７９（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ３８０（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ３８
１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｐ３８２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｃ３８３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｇ３
８４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｓ３８５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｌ３８６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｋ３８７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ３８８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ３８９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換さ
れる）；Ｓ３９０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｐ３９１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｒ３９２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｓ３９３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｓ３９４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ａ３９５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｓ３９６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｈ３９７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ３９８（Ｄ、Ｅ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｓ３９９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｌ４００（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｓ４０１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｌ４０２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ４０３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ４０４（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ４０
５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｃ４０６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｓ４０７（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ４０８（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ４０
９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｋ４１０（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｉ４１１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ４１２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ４１３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｈ４
１４（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｖ４１５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ４１６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ４１７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ４１８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ４１９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ４２０（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ４２１（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ４２２
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ
４２３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｌ４２４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；あるいはＰ４２５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）。
【０１０３】 さらなる好ましい非保存的変異体としては、以下が挙げられる：配列番号４の
Ｌ３６４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｐ３６５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｗ３６６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ３６
７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｌ３６８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；あるいはＬ３６９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）。
【０１０４】 さらなる好ましい非保存的変異体としては、以下が挙げられる：配列番号６の
Ｃ３６４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｋ３６５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ３６６（Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｋ３６７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ３６８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ３６９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ３７０（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ３７１（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；ある
いはＳ３７２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）。
【０１０５】 得られる構築物は、本明細書全体にわたって記載された、および当該分野で公
知の活性または機能について慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、得
られる構築物は、ニューロペプチドレセプター活性または機能の欠失を有するが
、残存しているニューロペプチドレセプターの活性または機能は、維持される。
より詳細には、得られる構築物は、ニューロペプチドレセプターの活性または機
能の１つより多くの喪失を有するが、残存しているニューロペプチドレセプター
の活性または機能は、維持される。
【０１０６】 さらに、１つより多くのアミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９
および１０）は、上記の置換アミノ酸（保存的か、または非保存的かのいずれか
）で置き換えられ得る。この置換アミノ酸は、全長の、神経レセプタータンパク
質の成熟形態またはプロタンパク質形態、ならびに以下に列挙した一般式ｍ−ｎ
を有するＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体において存在し得る。
【０１０７】 本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、５０
アミノ酸置換よりも多くない、さらにより好ましくは、４０アミノ酸置換よりも
多くない、なおより好ましくは、３０アミノ酸置換よりも多くない、そしてなお
さらにより好ましくは、２０アミノ酸置換よりも多くない、アミノ酸置換を含む
アミノ酸配列を有するニューロペプチドレセプターポリペプチドのアミノ酸配列
を含むか、またはこれからなるポリペプチドに関する。当然、好ましさの増大す
る順番に、ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸置換を含
むが、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個の
アミノ酸置換よりも多くないニューロペプチドレセプターポリペプチドのアミノ
酸配列を含むアミノ酸配列を有することが非常に好ましい。特定の実施形態にお
いて、図１Ａ〜Ｂ、２Ａ〜Ｂ、または３Ａ〜Ｂのアミノ酸配列あるいはそのフラ
グメント（例えば、本明細書中に記載された成熟形態および／または他のフラグ
メント）における付加、置換、および／または欠失の数は、１〜５個、５〜１０
個、５〜２５個、５〜５０個、１０〜５０個または５０〜１５０個であり、保存
的アミノ酸置換が好ましい。
【０１０８】 （ポリヌクレオチドおよびポリペプチドフラグメント） 本発明は、さらに本明細書中に記載された単離された核酸分子のフラグメント
に関する。例えば、寄託されたｃＤＮＡ（クローンＨＦＧＡＮ７２）のヌクレオ
チド配列、寄託されたｃＤＮＡによってコードされたポリペプチド配列をコード
するヌクレオチド配列、図１Ａ〜Ｂ、２Ａ〜Ｂ、または３Ａ〜Ｂ（配列番号２、
４、または６）に示されたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、図
１Ａ〜Ｂ、２Ａ〜Ｂ、または３Ａ〜Ｂ（配列番号１、２、または３）に示された
ヌクレオチド配列、またはそれに対する相補鎖を有する単離された核酸分子のフ
ラグメントによって、少なくとも１５ｎｔ、およびより好ましくは少なくとも約
２０ｎｔ、なおより好ましくは、少なくとも３０ｎｔ、およびさらにより好まし
くは、少なくとも約４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３
２５、３５０、３７５、４００、４５０、５００、５５０、または６００ｎｔ長
のフラグメントが意図される。
【０１０９】 本発明のヌクレオチドフラグメントは、好ましくは、少なくとも約１５ｎｔ、
そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも
約３０ｎｔ、そしてなおより好ましくは少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約５
０ｎｔ、少なくとも約７５ｎｔ、または少なくとも約１５０ｎｔの長さである。
例えば、「少なくとも約２０ｎｔの長さ」のフラグメントは、寄託されたクロー
ンに含まれるｃＤＮＡ配列または配列番号１、３、または５に示されるヌクレオ
チド配列由来の２０以上連続する塩基を含むことが意図される。この文脈におい
て「約（おおよそ）」は、特に記載された値（いずれかの末端もしくは両方の末
端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大
きいかまたは小さな値）を含む。これらのヌクレオチドフラグメントは、本明細
書中で議論されるように、診断プローブおよびプライマーとしての使用を含むが
、それらに限定されない使用を有する。もちろん、より大きなフラグメント（例
えば、５０、１５０、５００、６００、２０００ヌクレオチド）は好ましい。こ
れらのフラグメントは、本明細書中で議論されるように、診断プローブおよびプ
ライマーを含むが、これらに限定されない多数の用途を有する。もちろん、より
大きなフラグメント（例えば、５０１〜１５００ｎｔ長のフラグメント）がまた
、ほとんどであって、全てではないが、寄託されたｃＤＮＡ（クローンＨＦＧＡ
Ｎ７２）のヌクレオチド配列に対応するフラグメント、または図１Ａ〜Ｂ、２Ａ
〜Ｂ、もしくは３Ａ〜Ｂ（配列番号１、３、もしくは５）において示されるフラ
グメントように本発明に従って有用である。例えば、少なくとも２０ｎｔ長のフ
ラグメントによって、例えば、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または
図１Ａ〜Ｂ、２Ａ〜Ｂ、または３Ａ〜Ｂ（配列番号１、３、または５）において
示されるようなヌクレオチド配列由来の２０以上連続する塩基を含むフラグメン
トが意図される。
【０１１０】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドフラグメントの代表例
としては、例えば、以下のおおよそのヌクレオチド数の配列を有するフラグメン
トが挙げられる：配列番号１の１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５
１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４０
０、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６５
１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００〜８５０、８５１〜９０
０、９０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１
００、１１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５
１から末端、またはそれらの相補鎖、あるいは寄託されたクローンに含まれるｃ
ＤＮＡ。この文脈において、「約（おおよそ）」は、特に記載された範囲、およ
びいずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２
、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さい範囲を含む。
【０１１１】 好ましくは、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、ニューロペプチドレ
セプターの機能的活性を示すポリペプチドをコードする。ニューロペプチドレセ
プターの「機能的活性」を示すポリペプチドとは、全長（完全）のニューロペプ
チドレセプタータンパク質と関連した１つ以上の公知の機能的活性を示し得るポ
リペプチドを意味する。このような機能的活性としては、生物学的活性、抗原性
［抗ニューロペプチドレセプターポリペプチド抗体に結合する（または結合する
ことについて、ニューロペプチドレセプターポリペプチドと競合する）能力］、
免疫原性（ニューロペプチドレセプターポリペプチドに結合する抗体を生成する
能力）、本発明のニューロペプチドレセプターポリペプチドと多量体を形成する
能力、およびニューロペプチドレセプターポリペプチドについてのレセプターま
たはリガンドに結合する能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】 ニューロペプチドレセプターポリペプチド、ならびにそのフラグメント、改変
体、誘導体、およびアナログの機能的活性は、種々の方法によってアッセイされ
得る。
【０１１３】 例えば、抗ニューロペプチドレセプター抗体への結合について全長ニューロペ
プチドレセプターポリペプチドを結合するか、またはこのポリペプチドと競合す
る能力についてアッセイする１つの実施形態において、当該分野で公知の種々の
免疫アッセイが使用され得る。このようなアッセイとしては、以下が挙げられる
が、これらに限定されない：ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫
吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射分析アッセイ、ゲル
拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、コロイ
ド金、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応
、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合ア
ッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセ
イなどのような技術を用いる競合および非競合アッセイ系。１つの実施形態では
、抗体結合が、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施
形態では、この一次抗体は、この一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合を
検出することによって検出される。さらなる実施形態では、この二次抗体が標識
される。多くの手段が、免疫アッセイにおける結合の検出について当該分野で公
知であり、そして本発明の範囲内である。
【０１１４】 別の実施形態では、ニューロペプチドレセプターリガンドが同定される場合、
または本発明のポリペプチドフラグメント、改変体、もしくは誘導体が多量体化
する能力が評価される場合、結合が、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグ
ラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、ならびにアフィニテ
ィーブロッティングのような当該分野で周知の手段によって、アッセイされ得る
。一般には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ，Ｅ．ら、１９９５、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅ
ｖ．５９：９４−１２３を参照のこと。別の実施形態では、その基質へのニュー
ロペプチドレセプターの結合の生理学的相関（シグナル伝達）がアッセイされ得
る。
【０１１５】 さらに、本明細書中に記載のアッセイ（実施例を参照のこと）および当該分野
で公知の他のアッセイは、ニューロペプチドレセプターポリペプチドならびにそ
のフラグメント、改変体、誘導体、およびアナログが、ニューロペプチドレセプ
ターが関連する生物学的活性を（インビトロまたはインビボのいずれかで）誘発
する能力を測定するために、慣用的に適用され得る。他の方法は、当業者に公知
であり、そして本発明の範囲内である。
【０１１６】 本発明は、さらに、本明細書中に記載されるニューロペプチドレセプターポリ
ペプチドのフラグメントに関する。例えば、寄託されたｃＤＮＡ（クローンＨＦ
ＧＡＮ７２）によってコードされる単離されたニューロペプチドレセプターポリ
ペプチド、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド配列、図１Ａ
〜Ｂ、２Ａ〜Ｂ、または３Ａ〜Ｂ（配列番号２、４、または６）に示されるポリ
ペプチド配列のフラグメントによって、配列番号２、４、または６に含まれるポ
リペプチドフラグメント、あるいは寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによ
ってコードされるポリペプチドフラグメントが包含されることが意図される。タ
ンパク質フラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であり
得るか、あるいはより大きなポリぺプチド内（そのフラグメントが、部分または
領域を（最も好ましくは単一の連続した領域として）形成する）に含まれ得る。
本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、以下のおお
よそのアミノ酸数のフラグメントが挙げられる：１〜２０、２１〜４０、４１〜
６０、６１〜８０、８１〜１００、１０２〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜
１６０、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜２２０、２２１〜２４０、
２４１〜２６０、２６１〜２８０、または２８１からコード領域の末端まで。さ
らに、ポリペプチドフラグメントは、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０
、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０
アミノ酸長であり得る。この文脈において、「約（おおよそ）」とは、特に記載
された範囲、およびいずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個
（５、４、３、２、または１）のアミノ酸だけ大きいかまたは小さい範囲または
値を含む。
【０１１７】 タンパク質のＮ末端からの１つ以上の欠失が、このタンパク質の１つ以上の生
物学的機能の損失の変更を生じる場合でさえ、他の機能的活性（例えば、生物学
的活性、マルチマー化する能力、ニューロペプチドレセプターリガンドを結合す
る能力）は、なお保持され得る。例えば、短縮化されたニューロペプチドレセプ
タームテインが抗体（このポリペプチドの完全な形態または成熟形態を認識する
）を誘導および／または結合する能力は、一般的に、完全なポリペプチドまたは
成熟ポリペプチドの大多数の残基が、そのＮ末端から除去されていない場合に保
持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠失する特定のポリペプチドが、
このような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載の慣用的な方法
および当該分野で公知の他の方法によって容易に決定され得る。多分、多数の欠
失したＮ末端アミノ酸残基を有するニューロペプチドレセプタームテインは、い
くつかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し得る。実際に、わずか６つの
ニューロペプチドレセプターアミノ酸残基からなるペプチドは、しばしば免疫応
答を誘発し得る。
【０１１８】 従って、ペプチドフラグメントとしては、分泌したニューロペプチドレセプタ
ータンパク質ならびにその成熟形態が挙げられる。さらに好ましいポリペプチド
フラグメントとしては、アミノ末端もしくはカルボキシ末端、または両方の末端
から連続する一連の残基が欠失している分泌したニューロペプチドレセプタータ
ンパク質またはその成熟形態が挙げられる。例えば、かなり多数のアミノ酸（１
〜６０個の範囲）が、分泌したニューロペプチドレセプターポリペプチドまたは
この成熟形態のいずれかのアミノ末端から欠失され得る。同様に、かなり多数の
アミノ酸（１〜３０個の範囲）が、分泌したニューロペプチドレセプタータンパ
ク質または成熟形態のカルボキシ末端から欠失され得る。さらに、上記のアミノ
末端欠失およびカルボキシ末端欠失の任意の組み合わせが好ましい。同様に、こ
れらのニューロペプチドレセプターポリペプチドフラグメントをコードするポリ
ヌクレオチドフラグメントもまた好ましい。
【０１１９】 特に、このニューロペプチドレセプターポリペプチドのＮ末端欠失は、一般式
ｍ−４２５によって記載され得る。ここで、ｍは１〜４１９の整数であり、ここ
でｍは、配列番号２において同定されたアミノ酸残基の位置に対応する。
【０１２０】 さらなる実施形態において、このニューロペプチドレセプターポリペプチドの
Ｎ末端欠失は、一般式ｍ−３６９によって記載され得る。ここで、ｍは、１〜３
６３の整数であり、ここでｍは、配列番号４において同定されたアミノ酸残基の
位置に対応する。
【０１２１】 さらなる実施形態において、このニューロペプチドレセプターポリペプチドの
Ｎ末端欠失は、一般式ｍ−３７２によって記載され得る。ここで、ｍは１〜３６
６の整数であり、ここでｍは、配列番号６において同定されたアミノ酸残基の位
置に対応する。
【０１２２】 より詳細には、本発明は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む
か、またはこれらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含す
る：配列番号２、４、または６のＭ−１〜Ｇ３６３；Ｅ−２〜Ｇ−３６３；Ｐ−
３〜Ｇ−３６３；Ｓ−４〜Ｇ−３６３；Ａ−５〜Ｇ−３６３；Ｔ−６〜Ｇ−３６
３；Ｐ−７〜Ｇ−３６３；Ｇ−８〜Ｇ−３６３；Ａ−９〜Ｇ−３６３；Ｑ−１０
〜Ｇ−３６３；Ｍ−１１〜Ｇ−３６３；Ｇ−１２〜Ｇ−３６３；Ｖ−１３〜Ｇ−
３６３；Ｐ−１４〜Ｇ−３６３；Ｐ−１５〜Ｇ−３６３；Ｇ−１６〜Ｇ−３６３
；Ｓ−１７〜Ｇ−３６３；Ｒ−１８〜Ｇ−３６３；Ｅ−１９〜Ｇ−３６３；Ｐ−
２０〜Ｇ−３６３；Ｓ−２１〜Ｇ−３６３；Ｐ−２２〜Ｇ−３６３；Ｖ−２３〜
Ｇ−３６３；Ｐ−２４〜Ｇ−３６３；Ｐ−２５〜Ｇ−３６３；Ｄ−２６〜Ｇ−３
６３；Ｙ−２７〜Ｇ−３６３；Ｅ−２８〜Ｇ−３６３；Ｄ−２９〜Ｇ−３６３；
Ｅ−３０〜Ｇ−３６３；Ｆ−３１〜Ｇ−３６３；Ｌ−３２〜Ｇ−３６３；Ｒ−３
３〜Ｇ−３６３；Ｙ−３４〜Ｇ−３６３；Ｌ−３５〜Ｇ−３６３；Ｗ−３６〜Ｇ
−３６３；Ｒ−３７〜Ｇ−３６３；Ｄ−３８〜Ｇ−３６３；Ｙ−３９〜Ｇ−３６
３；Ｌ−４０〜Ｇ−３６３；Ｙ−４１〜Ｇ−３６３；Ｐ−４２〜Ｇ−３６３；Ｋ
−４３〜Ｇ−３６３；Ｑ−４４〜Ｇ−３６３；Ｙ−４５〜Ｇ−３６３；Ｅ−４６
〜Ｇ−３６３；Ｗ−４７〜Ｇ−３６３；Ｖ−４８〜Ｇ−３６３；Ｌ−４９〜Ｇ−
３６３；Ｉ−５０〜Ｇ−３６３；Ａ−５１〜Ｇ−３６３；Ａ−５２〜Ｇ−３６３
；Ｙ−５３〜Ｇ−３６３；Ｖ−５４〜Ｇ−３６３；Ａ−５５〜Ｇ−３６３；Ｖ−
５６〜Ｇ−３６３；Ｆ−５７〜Ｇ−３６３；Ｖ−５８〜Ｇ−３６３；Ｖ−５９〜
Ｇ−３６３；Ａ−６０〜Ｇ−３６３；Ｌ−６１〜Ｇ−３６３；Ｖ−６２〜Ｇ−３
６３；Ｇ−６３〜Ｇ−３６３；Ｎ−６４〜Ｇ−３６３；Ｔ−６５〜Ｇ−３６３；
Ｌ−６６〜Ｇ−３６３；Ｖ−６７〜Ｇ−３６３；Ｃ−６８〜Ｇ−３６３；Ｌ−６
９〜Ｇ−３６３；Ａ−７０〜Ｇ−３６３；Ｖ−７１〜Ｇ−３６３；Ｗ−７２〜Ｇ
−３６３；Ｒ−７３〜Ｇ−３６３；Ｎ−７４〜Ｇ−３６３；Ｈ−７５〜Ｇ−３６
３；Ｈ−７６〜Ｇ−３６３；Ｍ−７７〜Ｇ−３６３；Ｒ−７８〜Ｇ−３６３；Ｔ
−７９〜Ｇ−３６３；Ｖ−８０〜Ｇ−３６３；Ｔ−８１〜Ｇ−３６３；Ｎ−８２
〜Ｇ−３６３；Ｙ−８３〜Ｇ−３６３；Ｆ−８４〜Ｇ−３６３；Ｉ−８５〜Ｇ−
３６３；Ｖ−８６〜Ｇ−３６３；Ｎ−８７〜Ｇ−３６３；Ｌ−８８〜Ｇ−３６３
；Ｓ−８９〜Ｇ−３６３；Ｌ−９０〜Ｇ−３６３；Ａ−９１〜Ｇ−３６３；Ｄ−
９２〜Ｇ−３６３；Ｖ−９３〜Ｇ−３６３；Ｌ−９４〜Ｇ−３６３；Ｖ−９５〜
Ｇ−３６３；Ｔ−９６〜Ｇ−３６３；Ａ−９７〜Ｇ−３６３；Ｉ−９８〜Ｇ−３
６３；Ｃ−９９〜Ｇ−３６３；Ｌ−１００〜Ｇ−３６３；Ｐ−１０１〜Ｇ−３６
３；Ａ−１０２〜Ｇ−３６３；Ｓ−１０３〜Ｇ−３６３；Ｌ−１０４〜Ｇ−３６
３；Ｌ−１０５〜Ｇ−３６３；Ｖ−１０６〜Ｇ−３６３；Ｄ−１０７〜Ｇ−３６
３；Ｉ−１０８〜Ｇ−３６３；Ｔ−１０９〜Ｇ−３６３；Ｅ−１１０〜Ｇ−３６
３；Ｓ−１１１〜Ｇ−３６３；Ｗ−１１２〜Ｇ−３６３；Ｌ−１１３〜Ｇ−３６
３；Ｆ−１１４〜Ｇ−３６３；Ｇ−１１５〜Ｇ−３６３；Ｈ−１１６〜Ｇ−３６
３；Ａ−１１７〜Ｇ−３６３；Ｌ−１１８〜Ｇ−３６３；Ｃ−１１９〜Ｇ−３６
３；Ｋ−１２０〜Ｇ−３６３；Ｖ−１２１〜Ｇ−３６３；Ｉ−１２２〜Ｇ−３６
３；Ｐ−１２３〜Ｇ−３６３；Ｙ−１２４〜Ｇ−３６３；Ｌ−１２５〜Ｇ−３６
３；Ｑ−１２６〜Ｇ−３６３；Ａ−１２７〜Ｇ−３６３；Ｖ−１２８〜Ｇ−３６
３；Ｓ−１２９〜Ｇ−３６３；Ｖ−１３０〜Ｇ−３６３；Ｓ−１３１〜Ｇ−３６
３；Ｖ−１３２〜Ｇ−３６３；Ａ−１３３〜Ｇ−３６３；Ｖ−１３４〜Ｇ−３６
３；Ｌ−１３５〜Ｇ−３６３；Ｔ−１３６〜Ｇ−３６３；Ｌ−１３７〜Ｇ−３６
３；Ｓ−１３８〜Ｇ−３６３；Ｆ−１３９〜Ｇ−３６３；Ｉ−１４０〜Ｇ−３６
３；Ａ−１４１〜Ｇ−３６３；Ｌ−１４２〜Ｇ−３６３；Ｄ−１４３〜Ｇ−３６
３；Ｒ−１４４〜Ｇ−３６３；Ｗ−１４５〜Ｇ−３６３；Ｙ−１４６〜Ｇ−３６
３；Ａ−１４７〜Ｇ−３６３；Ｉ−１４８〜Ｇ−３６３；Ｃ−１４９〜Ｇ−３６
３；Ｈ−１５０〜Ｇ−３６３；Ｐ−１５１〜Ｇ−３６３；Ｌ−１５２〜Ｇ−３６
３；Ｌ−１５３〜Ｇ−３６３；Ｆ−１５４〜Ｇ−３６３；Ｋ−１５５〜Ｇ−３６
３；Ｓ−１５６〜Ｇ−３６３；Ｔ−１５７〜Ｇ−３６３；Ａ−１５８〜Ｇ−３６
３；Ｒ−１５９〜Ｇ−３６３；Ｒ−１６０〜Ｇ−３６３；Ａ−１６１〜Ｇ−３６
３；Ｒ−１６２〜Ｇ−３６３；Ｇ−１６３〜Ｇ−３６３；Ｓ−１６４〜Ｇ−３６
３；Ｉ−１６５〜Ｇ−３６３；Ｌ−１６６〜Ｇ−３６３；Ｇ−１６７〜Ｇ−３６
３；Ｉ−１６８〜Ｇ−３６３；Ｗ−１６９〜Ｇ−３６３；Ａ−１７０〜Ｇ−３６
３；Ｖ−１７１〜Ｇ−３６３；Ｓ−１７２〜Ｇ−３６３；Ｌ−１７３〜Ｇ−３６
３；Ａ−１７４〜Ｇ−３６３；Ｉ−１７５〜Ｇ−３６３；Ｍ−１７６〜Ｇ−３６
３；Ｖ−１７７〜Ｇ−３６３；Ｐ−１７８〜Ｇ−３６３；Ｑ−１７９〜Ｇ−３６
３；Ａ−１８０〜Ｇ−３６３；Ａ−１８１〜Ｇ−３６３；Ｖ−１８２〜Ｇ−３６
３；Ｍ−１８３〜Ｇ−３６３；Ｅ−１８４〜Ｇ−３６３；Ｃ−１８５〜Ｇ−３６
３；Ｓ−１８６〜Ｇ−３６３；Ｓ−１８７〜Ｇ−３６３；Ｖ−１８８〜Ｇ−３６
３；Ｌ−１８９〜Ｇ−３６３；Ｐ−１９０〜Ｇ−３６３；Ｅ−１９１〜Ｇ−３６
３；Ｌ−１９２〜Ｇ−３６３；Ａ−１９３〜Ｇ−３６３；Ｎ−１９４〜Ｇ−３６
３；Ｒ−１９５〜Ｇ−３６３；Ｔ−１９６〜Ｇ−３６３；Ｒ−１９７〜Ｇ−３６
３；Ｌ−１９８〜Ｇ−３６３；Ｆ−１９９〜Ｇ−３６３；Ｓ−２００〜Ｇ−３６
３；Ｖ−２０１〜Ｇ−３６３；Ｃ−２０２〜Ｇ−３６３；Ｄ−２０３〜Ｇ−３６
３；Ｅ−２０４〜Ｇ−３６３；Ｒ−２０５〜Ｇ−３６３；Ｗ−２０６〜Ｇ−３６
３；Ａ−２０７〜Ｇ−３６３；Ｄ−２０８〜Ｇ−３６３；Ｄ−２０９〜Ｇ−３６
３；Ｌ−２１０〜Ｇ−３６３；Ｙ−２１１〜Ｇ−３６３；Ｐ−２１２〜Ｇ−３６
３；Ｋ−２１３〜Ｇ−３６３；Ｉ−２１４〜Ｇ−３６３；Ｙ−２１５〜Ｇ−３６
３；Ｈ−２１６〜Ｇ−３６３；Ｓ−２１７〜Ｇ−３６３；Ｃ−２１８〜Ｇ−３６
３；Ｆ−２１９〜Ｇ−３６３；Ｆ−２２０〜Ｇ−３６３；Ｉ−２２１〜Ｇ−３６
３；Ｖ−２２２〜Ｇ−３６３；Ｔ−２２３〜Ｇ−３６３；Ｙ−２２４〜Ｇ−３６
３；Ｌ−２２５〜Ｇ−３６３；Ａ−２２６〜Ｇ−３６３；Ｐ−２２７〜Ｇ−３６
３；Ｌ−２２８〜Ｇ−３６３；Ｇ−２２９〜Ｇ−３６３；Ｌ−２３０〜Ｇ−３６
３；Ｍ−２３１〜Ｇ−３６３；Ａ−２３２〜Ｇ−３６３；Ｍ−２３３〜Ｇ−３６
３；Ａ−２３４〜Ｇ−３６３；Ｙ−２３５〜Ｇ−３６３；Ｆ−２３６〜Ｇ−３６
３；Ｑ−２３７〜Ｇ−３６３；Ｉ−２３８〜Ｇ−３６３；Ｆ−２３９〜Ｇ−３６
３；Ｒ−２４０〜Ｇ−３６３；Ｋ−２４１〜Ｇ−３６３；Ｌ−２４２〜Ｇ−３６
３；Ｗ−２４３〜Ｇ−３６３；Ｇ−２４４〜Ｇ−３６３；Ｒ−２４５〜Ｇ−３６
３；Ｑ−２４６〜Ｇ−３６３；Ｉ−２４７〜Ｇ−３６３；Ｐ−２４８〜Ｇ−３６
３；Ｇ−２４９〜Ｇ−３６３；Ｔ−２５０〜Ｇ−３６３；Ｔ−２５１〜Ｇ−３６
３；Ｓ−２５２〜Ｇ−３６３；Ａ−２５３〜Ｇ−３６３；Ｌ−２５４〜Ｇ−３６
３；Ｖ−２５５〜Ｇ−３６３；Ｒ−２５６〜Ｇ−３６３；Ｎ−２５７〜Ｇ−３６
３；Ｗ−２５８〜Ｇ−３６３；Ｋ−２５９〜Ｇ−３６３；Ｒ−２６０〜Ｇ−３６
３；Ｐ−２６１〜Ｇ−３６３；Ｓ−２６２〜Ｇ−３６３；Ｄ−２６３〜Ｇ−３６
３；Ｑ−２６４〜Ｇ−３６３；Ｌ−２６５〜Ｇ−３６３；Ｇ−２６６〜Ｇ−３６
３；Ｄ−２６７〜Ｇ−３６３；Ｌ−２６８〜Ｇ−３６３；Ｅ−２６９〜Ｇ−３６
３；Ｑ−２７０〜Ｇ−３６３；Ｇ−２７１〜Ｇ−３６３；Ｌ−２７２〜Ｇ−３６
３；Ｓ−２７３〜Ｇ−３６３；Ｇ−２７４〜Ｇ−３６３；Ｅ−２７５〜Ｇ−３６
３；Ｐ−２７６〜Ｇ−３６３；Ｑ−２７７〜Ｇ−３６３；Ｐ−２７８〜Ｇ−３６
３；Ｒ−２７９〜Ｇ−３６３；Ｇ−２８０〜Ｇ−３６３；Ｒ−２８１〜Ｇ−３６
３；Ａ−２８２〜Ｇ−３６３；Ｆ−２８３〜Ｇ−３６３；Ｌ−２８４〜Ｇ−３６
３；Ａ−２８５〜Ｇ−３６３；Ｅ−２８６〜Ｇ−３６３；Ｖ−２８７〜Ｇ−３６
３；Ｋ−２８８〜Ｇ−３６３；Ｑ−２８９〜Ｇ−３６３；Ｍ−２９０〜Ｇ−３６
３；Ｒ−２９１〜Ｇ−３６３；Ａ−２９２〜Ｇ−３６３；Ｒ−２９３〜Ｇ−３６
３；Ｒ−２９４〜Ｇ−３６３；Ｋ−２９５〜Ｇ−３６３；Ｔ−２９６〜Ｇ−３６
３；Ａ−２９７〜Ｇ−３６３；Ｋ−２９８〜Ｇ−３６３；Ｍ−２９９〜Ｇ−３６
３；Ｌ−３００〜Ｇ−３６３；Ｍ−３０１〜Ｇ−３６３；Ｖ−３０２〜Ｇ−３６
３；Ｖ−３０３〜Ｇ−３６３；Ｌ−３０４〜Ｇ−３６３；Ｌ−３０５〜Ｇ−３６
３；Ｖ−３０６〜Ｇ−３６３；Ｆ−３０７〜Ｇ−３６３；Ａ−３０８〜Ｇ−３６
３；Ｌ−３０９〜Ｇ−３６３；Ｃ−３１０〜Ｇ−３６３；Ｙ−３１１〜Ｇ−３６
３；Ｌ−３１２〜Ｇ−３６３；Ｐ−３１３〜Ｇ−３６３；Ｉ−３１４〜Ｇ−３６
３；Ｓ−３１５〜Ｇ−３６３；Ｖ−３１６〜Ｇ−３６３；Ｌ−３１７〜Ｇ−３６
３；Ｎ−３１８〜Ｇ−３６３；Ｖ−３１９〜Ｇ−３６３；Ｌ−３２０〜Ｇ−３６
３；Ｋ−３２１〜Ｇ−３６３；Ｒ−３２２〜Ｇ−３６３；Ｖ−３２３〜Ｇ−３６
３；Ｆ−３２４〜Ｇ−３６３；Ｇ−３２５〜Ｇ−３６３；Ｍ−３２６〜Ｇ−３６
３；Ｆ−３２７〜Ｇ−３６３；Ｒ−３２８〜Ｇ−３６３；Ｑ−３２９〜Ｇ−３６
３；Ａ−３３０〜Ｇ−３６３；Ｓ−３３１〜Ｇ−３６３；Ｄ−３３２〜Ｇ−３６
３；Ｒ−３３３〜Ｇ−３６３；Ｅ−３３４〜Ｇ−３６３；Ａ−３３５〜Ｇ−３６
３；Ｖ−３３６〜Ｇ−３６３；Ｙ−３３７〜Ｇ−３６３；Ａ−３３８〜Ｇ−３６
３；Ｃ−３３９〜Ｇ−３６３；Ｆ−３４０〜Ｇ−３６３；Ｔ−３４１〜Ｇ−３６
３；Ｆ−３４２〜Ｇ−３６３；Ｓ−３４３〜Ｇ−３６３；Ｈ−３４４〜Ｇ−３６
３；Ｗ−３４５〜Ｇ−３６３；Ｌ−３４６〜Ｇ−３６３；Ｖ−３４７〜Ｇ−３６
３；Ｙ−３４８〜Ｇ−３６３；Ａ−３４９〜Ｇ−３６３；Ｎ−３５０〜Ｇ−３６
３；Ｓ−３５１〜Ｇ−３６３；Ａ−３５２〜Ｇ−３６３；Ａ−３５３〜Ｇ−３６
３；Ｎ−３５４〜Ｇ−３６３；Ｐ−３５５〜Ｇ−３６３；Ｉ−３５６〜Ｇ−３６
３；またはＩ−３５７〜Ｇ−３６３。
【０１２３】 上記のＮ末端欠失変異体（ｍ−３６３）としてはまた、以下：配列番号２のＧ
−３６３：Ｋ−３６４；Ｋ−３６４〜Ｆ−３６５；Ｋ−３６４〜Ｒ−３６６；Ｋ
−３６４〜Ｅ−３６７；Ｋ−３６４〜Ｑ−３６８；Ｋ−３６４〜Ｆ−３６９；Ｋ
−３６４〜Ｋ−３７０；Ｋ−３６４〜Ａ−３７１；Ｋ−３６４〜Ａ−３７２；Ｋ
−３６４〜Ｆ−３７３；Ｋ−３６４〜Ｓ−３７４；Ｋ−３６４〜Ｃ−３７５；Ｋ
−３６４〜Ｃ−３７６；Ｋ−３６４〜Ｌ−３７７；Ｋ−３６４〜Ｐ−３７８；Ｋ
−３６４〜Ｇ−３７９；Ｋ−３６４〜Ｌ−３８０；Ｋ−３６４〜Ｇ−３８１；Ｋ
−３６４〜Ｐ−３８２；Ｋ−３６４〜Ｃ−３８３；Ｋ−３６４〜Ｇ−３８４；Ｋ
−３６４〜Ｓ−３８５；Ｋ−３６４〜Ｌ−３８６；Ｋ−３６４〜Ｋ−３８７；Ｋ
−３６４〜Ａ−３８８；Ｋ−３６４〜Ｐ−３８９；Ｋ−３６４〜Ｓ−３９０；Ｋ
−３６４〜Ｐ−３９１；Ｋ−３６４〜Ｒ−３９２；Ｋ−３６４〜Ｓ−３９３；Ｋ
−３６４〜Ｓ−３９４；Ｋ−３６４〜Ａ−３９５；Ｋ−３６４〜Ｓ−３９６；Ｋ
−３６４〜Ｈ−３９７；Ｋ−３６４〜Ｋ−３９８；Ｋ−３６４〜Ｓ−３９９；Ｋ
−３６４〜Ｌ−４００；Ｋ−３６４〜Ｓ−４０１；Ｋ−３６４〜Ｌ−４０２；Ｋ
−３６４〜Ｑ−４０３；Ｋ−３６４〜Ｓ−４０４；Ｋ−３６４〜Ｒ−４０５；Ｋ
−３６４〜Ｃ−４０６；Ｋ−３６４〜Ｓ−４０７；Ｋ−３６４〜Ｖ−４０８；Ｋ
−３６４〜Ｓ−４０９；Ｋ−３６４〜Ｋ−４１０；Ｋ−３６４〜Ｉ−４１１；Ｋ
−３６４〜Ｓ−４１２；Ｋ−３６４〜Ｅ−４１３；Ｋ−３６４〜Ｈ−４１４；Ｋ
−３６４〜Ｖ−４１５；Ｋ−３６４〜Ｖ−４１６；Ｋ−３６４〜Ｌ−４１７；Ｋ
−３６４〜Ｔ−４１８；Ｋ−３６４〜Ｓ−４１９；Ｋ−３６４〜Ｖ−４２０；Ｋ
−３６４〜Ｔ−４２１；Ｋ−３６４〜Ｔ−４２２；Ｋ−３６４〜Ｖ−４２３；Ｋ
−３６４〜Ｌ−４２４；およびＫ−３６４〜Ｐ−４２５に連結されたアミノ酸が
挙げられる。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発
明によって包含される。
【０１２４】 さらに、上記Ｎ末端欠失変異体（ｍ−３６３）はまた、Ｇ−３６３に結合した
、配列番号４の以下のアミノ酸を含み得る：Ｌ−３６４；Ｌ−３６４〜Ｐ−３６
５；Ｌ−３６４〜Ｗ−３６６；Ｌ−３６４〜Ｓ−３６７；Ｌ−３６４〜Ｌ−３６
８；またはＬ−３６４〜Ｌ−３６９。これらのポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドもまた、本発明により包含される。
【０１２５】 さらに、上記Ｎ末端欠失変異体（ｍ−３６３）はまた、Ｇ−３６３に結合した
、配列番号６の以下のアミノ酸を含み得る：Ｃ−３６４；Ｃ−３６４〜Ｋ−３６
５；Ｃ−３６４〜Ｅ−３６６；Ｃ−３６４〜Ｋ−３６７；Ｃ−３６４〜Ｓ−３６
８；Ｃ−３６４〜Ｌ−３６９；Ｃ−３６４〜Ｖ−３７０；Ｃ−３６４〜Ｌ−３７
１；またはＣ−３６４〜Ｓ−３７２。これらのポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドもまた、本発明により包含される。
【０１２６】 また、上記のように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が
、そのタンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じる場合において
さえも、他の機能的活性（例えば、生物学的活性、多量化する能力、ニューロペ
プチドレセプターリガンドに結合する能力）は、依然として維持され得る。例え
ば、短縮ニューロペプチドレセプタームテインが、ポリペプチドの完全型または
成熟形態を認識する抗体を誘導および／または結合する、能力は、この完全また
は成熟ポリペプチドの大多数より少ない残基が、Ｃ末端から除去される場合に一
般に保持される。完全ポリペプチドのＣ末端残基を欠損する特定のポリぺプチド
が、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用
的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の慣用的な方法によって
容易に決定され得る。多数のＣ末端アミノ酸残基が欠失しているニューロペプチ
ドレセプタームテインは、いくつかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し
得る可能性はある。実際に、６つ程度に少ないニューロペプチドレセプターアミ
ノ酸残基からなるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。
【０１２７】 従って、本発明はさらに、図１Ａ−Ｂ、２Ａ−Ｂ、および３Ａ−Ｂに示される
ニューロペプチドレセプターポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２、４、お
よび６）のカルボキシ末端から１つ以上の残基を欠失しているポリペプチドを提
供する。このポリペプチドは、一般式１−ｎで記載され、ここでｎは、６〜３６
３の整数であり、ここでｎは、配列番号２、４、および６に規定されるアミノ酸
残基の位置に相当する。より詳細には、本発明は、以下の残基のアミノ酸配列を
含むか、あるいはこれらのアミノ酸配列から構成されるポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを提供する：配列番号２、４、または６のＭ−１〜Ｇ−３６
３；Ｍ−１〜Ｓ−３６２；Ｍ−１〜Ｌ−３６１；Ｍ−１〜Ｆ−３６０；Ｍ−１〜
Ｎ−３５９；Ｍ−１〜Ｙ−３５８；Ｍ−１〜Ｉ−３５７；Ｍ−１〜Ｉ−３５６；
Ｍ−１〜Ｐ−３５５；Ｍ−１〜Ｎ−３５４；Ｍ−１〜Ａ−３５３；Ｍ−１〜Ａ−
３５２；Ｍ−１〜Ｓ−３５１；Ｍ−１〜Ｎ−３５０；Ｍ−１〜Ａ−３４９；Ｍ−
１〜Ｙ−３４８；Ｍ−１〜Ｖ−３４７；Ｍ−１〜Ｌ−３４６；Ｍ−１〜Ｗ−３４
５；Ｍ−１〜Ｈ−３４４；Ｍ−１〜Ｓ−３４３；Ｍ−１〜Ｆ−３４２；Ｍ−１〜
Ｔ−３４１；Ｍ−１〜Ｆ−３４０；Ｍ−１〜Ｃ−３３９；Ｍ−１〜Ａ−３３８；
Ｍ−１〜Ｙ−３３７；Ｍ−１〜Ｖ−３３６；Ｍ−１〜Ａ−３３５；Ｍ−１〜Ｅ−
３３４；Ｍ−１〜Ｒ−３３３；Ｍ−１〜Ｄ−３３２；Ｍ−１〜Ｓ−３３１；Ｍ−
１〜Ａ−３３０；Ｍ−１〜Ｑ−３２９；Ｍ−１〜Ｒ−３２８；Ｍ−１〜Ｆ−３２
７；Ｍ−１〜Ｍ−３２６；Ｍ−１〜Ｇ−３２５；Ｍ−１〜Ｆ−３２４；Ｍ−１〜
Ｖ−３２３；Ｍ−１〜Ｒ−３２２；Ｍ−１〜Ｋ−３２１；Ｍ−１〜Ｌ−３２０；
Ｍ−１〜Ｖ−３１９；Ｍ−１〜Ｎ−３１８；Ｍ−１〜Ｌ−３１７；Ｍ−１〜Ｖ−
３１６；Ｍ−１〜Ｓ−３１５；Ｍ−１〜Ｉ−３１４；Ｍ−１〜Ｐ−３１３；Ｍ−
１〜Ｌ−３１２；Ｍ−１〜Ｙ−３１１；Ｍ−１〜Ｃ−３１０；Ｍ−１〜Ｌ−３０
９；Ｍ−１〜Ａ−３０８；Ｍ−１〜Ｆ−３０７；Ｍ−１〜Ｖ−３０６；Ｍ−１〜
Ｌ−３０５；Ｍ−１〜Ｌ−３０４；Ｍ−１〜Ｖ−３０３；Ｍ−１〜Ｖ−３０２；
Ｍ−１〜Ｍ−３０１；Ｍ−１〜Ｌ−３００；Ｍ−１〜Ｍ−２９９；Ｍ−１〜Ｋ−
２９８；Ｍ−１〜Ａ−２９７；Ｍ−１〜Ｔ−２９６；Ｍ−１〜Ｋ−２９５；Ｍ−
１〜Ｒ−２９４；Ｍ−１〜Ｒ−２９３；Ｍ−１〜Ａ−２９２；Ｍ−１〜Ｒ−２９
１；Ｍ−１〜Ｍ−２９０；Ｍ−１〜Ｑ−２８９；Ｍ−１〜Ｋ−２８８；Ｍ−１〜
Ｖ−２８７；Ｍ−１〜Ｅ−２８６；Ｍ−１〜Ａ−２８５；Ｍ−１〜Ｌ−２８４；
Ｍ−１〜Ｆ−２８３；Ｍ−１〜Ａ−２８２；Ｍ−１〜Ｒ−２８１；Ｍ−１〜Ｇ−
２８０；Ｍ−１〜Ｒ−２７９；Ｍ−１〜Ｐ−２７８；Ｍ−１〜Ｑ−２７７；Ｍ−
１〜Ｐ−２７６；Ｍ−１〜Ｅ−２７５；Ｍ−１〜Ｇ−２７４；Ｍ−１〜Ｓ−２７
３；Ｍ−１〜Ｌ−２７２；Ｍ−１〜Ｇ−２７１；Ｍ−１〜Ｑ−２７０；Ｍ−１〜
Ｅ−２６９；Ｍ−１〜Ｌ−２６８；Ｍ−１〜Ｄ−２６７；Ｍ−１〜Ｇ−２６６；
Ｍ−１〜Ｌ−２６５；Ｍ−１〜Ｑ−２６４；Ｍ−１〜Ｄ−２６３；Ｍ−１〜Ｓ−
２６２；Ｍ−１〜Ｐ−２６１；Ｍ−１〜Ｒ−２６０；Ｍ−１〜Ｋ−２５９；Ｍ−
１〜Ｗ−２５８；Ｍ−１〜Ｎ−２５７；Ｍ−１〜Ｒ−２５６；Ｍ−１〜Ｖ−２５
５；Ｍ−１〜Ｌ−２５４；Ｍ−１〜Ａ−２５３；Ｍ−１〜Ｓ−２５２；Ｍ−１〜
Ｔ−２５１；Ｍ−１〜Ｔ−２５０；Ｍ−１〜Ｇ−２４９；Ｍ−１〜Ｐ−２４８；
Ｍ−１〜Ｉ−２４７；Ｍ−１〜Ｑ−２４６；Ｍ−１〜Ｒ−２４５；Ｍ−１〜Ｇ−
２４４；Ｍ−１〜Ｗ−２４３；Ｍ−１〜Ｌ−２４２；Ｍ−１〜Ｋ−２４１；Ｍ−
１〜Ｒ−２４０；Ｍ−１〜Ｆ−２３９；Ｍ−１〜Ｉ−２３８；Ｍ−１〜Ｑ−２３
７；Ｍ−１〜Ｆ−２３６；Ｍ−１〜Ｙ−２３５；Ｍ−１〜Ａ−２３４；Ｍ−１〜
Ｍ−２３３；Ｍ−１〜Ａ−２３２；Ｍ−１〜Ｍ−２３１；Ｍ−１〜Ｌ−２３０；
Ｍ−１〜Ｇ−２２９；Ｍ−１〜Ｌ−２２８；Ｍ−１〜Ｐ−２２７；Ｍ−１〜Ａ−
２２６；Ｍ−１〜Ｌ−２２５；Ｍ−１〜Ｙ−２２４；Ｍ−１〜Ｔ−２２３；Ｍ−
１〜Ｖ−２２２；Ｍ−１〜Ｉ−２２１；Ｍ−１〜Ｆ−２２０；Ｍ−１〜Ｆ−２１
９；Ｍ−１〜Ｃ−２１８；Ｍ−１〜Ｓ−２１７；Ｍ−１〜Ｈ−２１６；Ｍ−１〜
Ｙ−２１５；Ｍ−１〜Ｉ−２１４；Ｍ−１〜Ｋ−２１３；Ｍ−１〜Ｐ−２１２；
Ｍ−１〜Ｙ−２１１；Ｍ−１〜Ｌ−２１０；Ｍ−１〜Ｄ−２０９；Ｍ−１〜Ｄ−
２０８；Ｍ−１〜Ａ−２０７；Ｍ−１〜Ｗ−２０６；Ｍ−１〜Ｒ−２０５；Ｍ−
１〜Ｅ−２０４；Ｍ−１〜Ｄ−２０３；Ｍ−１〜Ｃ−２０２；Ｍ−１〜Ｖ−２０
１；Ｍ−１〜Ｓ−２００；Ｍ−１〜Ｆ−１９９；Ｍ−１〜Ｌ−１９８；Ｍ−１〜
Ｒ−１９７；Ｍ−１〜Ｔ−１９６；Ｍ−１〜Ｒ−１９５；Ｍ−１〜Ｎ−１９４；
Ｍ−１〜Ａ−１９３；Ｍ−１〜Ｌ−１９２；Ｍ−１〜Ｅ−１９１；Ｍ−１〜Ｐ−
１９０；Ｍ−１〜Ｌ−１８９；Ｍ−１〜Ｖ−１８８；Ｍ−１〜Ｓ−１８７；Ｍ−
１〜Ｓ−１８６；Ｍ−１〜Ｃ−１８５；Ｍ−１〜Ｅ−１８４；Ｍ−１〜Ｍ−１８
３；Ｍ−１〜Ｖ−１８２；Ｍ−１〜Ａ−１８１；Ｍ−１〜Ａ−１８０；Ｍ−１〜
Ｑ−１７９；Ｍ−１〜Ｐ−１７８；Ｍ−１〜Ｖ−１７７；Ｍ−１〜Ｍ−１７６；
Ｍ−１〜Ｉ−１７５；Ｍ−１〜Ａ−１７４；Ｍ−１〜Ｌ−１７３；Ｍ−１〜Ｓ−
１７２；Ｍ−１〜Ｖ−１７１；Ｍ−１〜Ａ−１７０；Ｍ−１〜Ｗ−１６９；Ｍ−
１〜Ｉ−１６８；Ｍ−１〜Ｇ−１６７；Ｍ−１〜Ｌ−１６６；Ｍ−１〜Ｉ−１６
５；Ｍ−１〜Ｓ−１６４；Ｍ−１〜Ｇ−１６３；Ｍ−１〜Ｒ−１６２；Ｍ−１〜
Ａ−１６１；Ｍ−１〜Ｒ−１６０；Ｍ−１〜Ｒ−１５９；Ｍ−１〜Ａ−１５８；
Ｍ−１〜Ｔ−１５７；Ｍ−１〜Ｓ−１５６；Ｍ−１〜Ｋ−１５５；Ｍ−１〜Ｆ−
１５４；Ｍ−１〜Ｌ−１５３；Ｍ−１〜Ｌ−１５２；Ｍ−１〜Ｐ−１５１；Ｍ−
１〜Ｈ−１５０；Ｍ−１〜Ｃ−１４９；Ｍ−１〜Ｉ−１４８；Ｍ−１〜Ａ−１４
７；Ｍ−１〜Ｙ−１４６；Ｍ−１〜Ｗ−１４５；Ｍ−１〜Ｒ−１４４；Ｍ−１〜
Ｄ−１４３；Ｍ−１〜Ｌ−１４２；Ｍ−１〜Ａ−１４１；Ｍ−１〜Ｉ−１４０；
Ｍ−１〜Ｆ−１３９；Ｍ−１〜Ｓ−１３８；Ｍ−１〜Ｌ−１３７；Ｍ−１〜Ｔ−
１３６；Ｍ−１〜Ｌ−１３５；Ｍ−１〜Ｖ−１３４；Ｍ−１〜Ａ−１３３；Ｍ−
１〜Ｖ−１３２；Ｍ−１〜Ｓ−１３１；Ｍ−１〜Ｖ−１３０；Ｍ−１〜Ｓ−１２
９；Ｍ−１〜Ｖ−１２８；Ｍ−１〜Ａ−１２７；Ｍ−１〜Ｑ−１２６；Ｍ−１〜
Ｌ−１２５；Ｍ−１〜Ｙ−１２４；Ｍ−１〜Ｐ−１２３；Ｍ−１〜Ｉ−１２２；
Ｍ−１〜Ｖ−１２１；Ｍ−１〜Ｋ−１２０；Ｍ−１〜Ｃ−１１９；Ｍ−１〜Ｌ−
１１８；Ｍ−１〜Ａ−１１７；Ｍ−１〜Ｈ−１１６；Ｍ−１〜Ｇ−１１５；Ｍ−
１〜Ｆ−１１４；Ｍ−１〜Ｌ−１１３；Ｍ−１〜Ｗ−１１２；Ｍ−１〜Ｓ−１１
１；Ｍ−１〜Ｅ−１１０；Ｍ−１〜Ｔ−１０９；Ｍ−１〜Ｉ−１０８；Ｍ−１〜
Ｄ−１０７；Ｍ−１〜Ｖ−１０６；Ｍ−１〜Ｌ−１０５；Ｍ−１〜Ｌ−１０４；
Ｍ−１〜Ｓ−１０３；Ｍ−１〜Ａ−１０２；Ｍ−１〜Ｐ−１０１；Ｍ−１〜Ｌ−
１００；Ｍ−１〜Ｃ−９９；Ｍ−１〜Ｉ−９８；Ｍ−１〜Ａ−９７；Ｍ−１〜Ｔ
−９６；Ｍ−１〜Ｖ−９５；Ｍ−１〜Ｌ−９４；Ｍ−１〜Ｖ−９３；Ｍ−１〜Ｄ
−９２；Ｍ−１〜Ａ−９１；Ｍ−１〜Ｌ−９０；Ｍ−１〜Ｓ−８９；Ｍ−１〜Ｌ
−８８；Ｍ−１〜Ｎ−８７；Ｍ−１〜Ｖ−８６；Ｍ−１〜Ｉ−８５；Ｍ−１〜Ｆ
−８４；Ｍ−１〜Ｙ−８３；Ｍ−１〜Ｎ−８２；Ｍ−１〜Ｔ−８１；Ｍ−１〜Ｖ
−８０；Ｍ−１〜Ｔ−７９；Ｍ−１〜Ｒ−７８；Ｍ−１〜Ｍ−７７；Ｍ−１〜Ｈ
−７６；Ｍ−１〜Ｈ−７５；Ｍ−１〜Ｎ−７４；Ｍ−１〜Ｒ−７３；Ｍ−１〜Ｗ
−７２；Ｍ−１〜Ｖ−７１；Ｍ−１〜Ａ−７０；Ｍ−１〜Ｌ−６９；Ｍ−１〜Ｃ
−６８；Ｍ−１〜Ｖ−６７；Ｍ−１〜Ｌ−６６；Ｍ−１〜Ｔ−６５；Ｍ−１〜Ｎ
−６４；Ｍ−１〜Ｇ−６３；Ｍ−１〜Ｖ−６２；Ｍ−１〜Ｌ−６１；Ｍ−１〜Ａ
−６０；Ｍ−１〜Ｖ−５９；Ｍ−１〜Ｖ−５８；Ｍ−１〜Ｆ−５７；Ｍ−１〜Ｖ
−５６；Ｍ−１〜Ａ−５５；Ｍ−１〜Ｖ−５４；Ｍ−１〜Ｙ−５３；Ｍ−１〜Ａ
−５２；Ｍ−１〜Ａ−５１；Ｍ−１〜Ｉ−５０；Ｍ−１〜Ｌ−４９；Ｍ−１〜Ｖ
−４８；Ｍ−１〜Ｗ−４７；Ｍ−１〜Ｅ−４６；Ｍ−１〜Ｙ−４５；Ｍ−１〜Ｑ
−４４；Ｍ−１〜Ｋ−４３；Ｍ−１〜Ｐ−４２；Ｍ−１〜Ｙ−４１；Ｍ−１〜Ｌ
−４０；Ｍ−１〜Ｙ−３９；Ｍ−１〜Ｄ−３８；Ｍ−１〜Ｒ−３７；Ｍ−１〜Ｗ
−３６；Ｍ−１〜Ｌ−３５；Ｍ−１〜Ｙ−３４；Ｍ−１〜Ｒ−３３；Ｍ−１〜Ｌ
−３２；Ｍ−１〜Ｆ−３１；Ｍ−１〜Ｅ−３０；Ｍ−１〜Ｄ−２９；Ｍ−１〜Ｅ
−２８；Ｍ−１〜Ｙ−２７；Ｍ−１〜Ｄ−２６；Ｍ−１〜Ｐ−２５；Ｍ−１〜Ｐ
−２４；Ｍ−１〜Ｖ−２３；Ｍ−１〜Ｐ−２２；Ｍ−１〜Ｓ−２１；Ｍ−１〜Ｐ
−２０；Ｍ−１〜Ｅ−１９；Ｍ−１〜Ｒ−１８；Ｍ−１〜Ｓ−１７；Ｍ−１〜Ｇ
−１６；Ｍ−１〜Ｐ−１５；Ｍ−１〜Ｐ−１４；Ｍ−１〜Ｖ−１３；Ｍ−１〜Ｇ
−１２；Ｍ−１〜Ｍ−１１；Ｍ−１〜Ｑ−１０；Ｍ−１〜Ａ−９；Ｍ−１〜Ｇ−
８；Ｍ−１〜Ｐ−７；またはＭ−１〜Ｔ−６。これらのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
【０１２８】 上記Ｃ末端欠失変異体（１−ｎ）はまた、以下を含み得る：配列番号２のＭ−
１〜Ｌ−４２４；Ｍ−１〜Ｖ−４２３；Ｍ−１〜Ｔ−４２２；Ｍ−１〜Ｔ−４２
１；Ｍ−１〜Ｖ−４２０；Ｍ−１〜Ｓ−４１９；Ｍ−１〜Ｔ−４１８；Ｍ−１〜
Ｌ−４１７；Ｍ−１〜Ｖ−４１６；Ｍ−１〜Ｖ−４１５；Ｍ−１〜Ｈ−４１４；
Ｍ−１〜Ｅ−４１３；Ｍ−１〜Ｓ−４１２；Ｍ−１〜Ｉ−４１１；Ｍ−１〜Ｋ−
４１０；Ｍ−１〜Ｓ−４０９；Ｍ−１〜Ｖ−４０８；Ｍ−１〜Ｓ−４０７；Ｍ−
１〜Ｃ−４０６；Ｍ−１〜Ｒ−４０５；Ｍ−１〜Ｓ−４０４；Ｍ−１〜Ｑ−４０
３；Ｍ−１〜Ｌ−４０２；Ｍ−１〜Ｓ−４０１；Ｍ−１〜Ｌ−４００；Ｍ−１〜
Ｓ−３９９；Ｍ−１〜Ｋ−３９８；Ｍ−１〜Ｈ−３９７；Ｍ−１〜Ｓ−３９６；
Ｍ−１〜Ａ−３９５；Ｍ−１〜Ｓ−３９４；Ｍ−１〜Ｓ−３９３；Ｍ−１〜Ｒ−
３９２；Ｍ−１〜Ｐ−３９１；Ｍ−１〜Ｓ−３９０；Ｍ−１〜Ｐ−３８９；Ｍ−
１〜Ａ−３８８；Ｍ−１〜Ｋ−３８７；Ｍ−１〜Ｌ−３８６；Ｍ−１〜Ｓ−３８
５；Ｍ−１〜Ｇ−３８４；Ｍ−１〜Ｃ−３８３；Ｍ−１〜Ｐ−３８２；Ｍ−１〜
Ｇ−３８１；Ｍ−１〜Ｌ−３８０；Ｍ−１〜Ｇ−３７９；Ｍ−１〜Ｐ−３７８；
Ｍ−１〜Ｌ−３７７；Ｍ−１〜Ｃ−３７６；Ｍ−１〜Ｃ−３７５；Ｍ−１〜Ｓ−
３７４；Ｍ−１〜Ｆ−３７３；Ｍ−１〜Ａ−３７２；Ｍ−１〜Ａ−３７１；Ｍ−
１〜Ｋ−３７０；Ｍ−１〜Ｆ−３６９；Ｍ−１〜Ｑ−３６８；Ｍ−１〜Ｅ−３６
７；Ｍ−１〜Ｒ−３６６；Ｍ−１〜Ｆ−３６５；またはＭ−１〜Ｋ−３６４； 配列番号４のＭ−１〜Ｌ−３６９；Ｍ−１〜Ｌ−３６８；またはＭ−１〜Ｓ−３
６７；Ｍ−１〜Ｗ−３６６；Ｍ−１〜Ｐ−３６５；またはＭ−１〜Ｌ−３６４；
あるいは 配列番号６のＭ−１〜Ｓ−３７２；Ｍ−１〜Ｌ−３７１；Ｍ−１〜Ｖ−３７０；
Ｍ−１〜Ｌ−３６９；Ｍ−１〜Ｓ−３６８；Ｍ−１〜Ｋ−３６７；Ｍ−１〜Ｅ−
３６６；Ｍ−１〜Ｋ−３６５；またはＭ−１〜Ｃ−３６４。さらに、Ｎ末端メチ
オニンは、これらのフラグメントから省略され得る。
【０１２９】 本願はまた、上記ニューロペプチドレセプターポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド配列と、少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９
８％、または９９％同一のポリヌクレオチド配列を含むか、またはこのポリヌク
レオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド
配列に融合した上記ポリヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸および／ま
たはポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドもまた、上記アミノ
酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％
、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含むかまたはこのアミノ酸配列から
なるポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドと同様に、本発明に含まれる。
【０１３０】 さらに、上に列挙したＮ末端またはＣ末端欠失のいずれかを組み合わせて、Ｎ
末端およびＣ末端欠失ニューロペプチドレセプターポリペプチドを産生し得る。
本発明はまた、アミノ末端とカルボキシル末端との両方から１つ以上のアミノ酸
が欠失したポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、配列番号２の残基ｍ
−ｎを有すると一般に記載され得、ここで、ｎおよびｍは、上記のような整数で
ある。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によ
り包含される。
【０１３１】 ＡＴＣＣ寄託番号９７１２８に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる
完全ニューロペプチドレセプターアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列もまた含まれ、ここで、この部分は、それぞれＡＴＣ
Ｃ寄託番号９７１２８に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全な
アミノ酸配列のアミノ末端から、１〜約４１９個の任意の整数のアミノ酸を除く
か、あるいは、ＡＴＣＣ寄託番号９７１２８に含まれるｃＤＮＡクローンによっ
てコードされる完全なアミノ酸配列のカルボキシ末端から、１〜約４１９個の任
意の整数のアミノ酸を除くか、あるいは、ＡＴＣＣ寄託番号９７１２８に含まれ
るｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列の、上記のアミノ
末端欠失およびカルボキシ末端欠失の任意の組合せを除く。上記欠失改変ポリペ
プチドの形態の全てをコードするポリヌクレオチドもまた、提供される。
【０１３２】 本願はまた、本明細書中でｍ−ｎと記載されるニューロペプチドレセプターポ
リペプチド配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９
９％同一のポリペプチドを含むタンパク質に関する。好ましい実施形態において
、本願は、本明細書中に記載される特定のニューロペプチドレセプターのＮ末端
およびＣ末端の欠失のアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも９０％、
９５％、９６％、９７％、９８または９９％同一のポリペプチドを含むタンパク
質に関する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発
明により包含される。
【０１３３】 さらなる好ましいポリペプチドフラグメントは、以下の群より選択されるアミ
ノ酸配列を含むか、またはこのアミノ酸配列からなる：配列番号２のＭ−１〜Ｐ
−１５；Ｅ−２〜Ｇ−１６；Ｐ−３〜Ｓ−１７；Ｓ−４〜Ｒ−１８；Ａ−５〜Ｅ
−１９；Ｔ−６〜Ｐ−２０；Ｐ−７〜Ｓ−２１；Ｇ−８〜Ｐ−２２；Ａ−９〜Ｖ
−２３；Ｑ−１０〜Ｐ−２４；Ｍ−１１〜Ｐ−２５；Ｇ−１２〜Ｄ−２６；Ｖ−
１３〜Ｙ−２７；Ｐ−１４〜Ｅ−２８；Ｐ−１５〜Ｄ−２９；Ｇ−１６〜Ｅ−３
０；Ｓ−１７〜Ｆ−３１；Ｒ−１８〜Ｌ−３２；Ｅ−１９〜Ｒ−３３；Ｐ−２０
〜Ｙ−３４；Ｓ−２１〜Ｌ−３５；Ｐ−２２〜Ｗ−３６；Ｖ−２３〜Ｒ−３７；
Ｐ−２４〜Ｄ−３８；Ｐ−２５〜Ｙ−３９；Ｄ−２６〜Ｌ−４０；Ｙ−２７〜Ｙ
−４１；Ｅ−２８〜Ｐ−４２；Ｄ−２９〜Ｋ−４３；Ｅ−３０〜Ｑ−４４；Ｆ−
３１〜Ｙ−４５；Ｌ−３２〜Ｅ−４６；Ｒ−３３〜Ｗ−４７；Ｙ−３４〜Ｖ−４
８；Ｌ−３５〜Ｌ−４９；Ｗ−３６〜Ｉ−５０；Ｒ−３７〜Ａ−５１；Ｄ−３８
〜Ａ−５２；Ｙ−３９〜Ｙ−５３；Ｌ−４０〜Ｖ−５４；Ｙ−４１〜Ａ−５５；
Ｐ−４２〜Ｖ−５６；Ｋ−４３〜Ｆ−５７；Ｑ−４４〜Ｖ−５８；Ｙ−４５〜Ｖ
−５９；Ｅ−４６〜Ａ−６０；Ｗ−４７〜Ｌ−６１；Ｖ−４８〜Ｖ−６２；Ｌ−
４９〜Ｇ−６３；Ｉ−５０〜Ｎ−６４；Ａ−５１〜Ｔ−６５；Ａ−５２〜Ｌ−６
６；Ｙ−５３〜Ｖ−６７；Ｖ−５４〜Ｃ−６８；Ａ−５５〜Ｌ−６９；Ｖ−５６
〜Ａ−７０；Ｆ−５７〜Ｖ−７１；Ｖ−５８〜Ｗ−７２；Ｖ−５９〜Ｒ−７３；
Ａ−６０〜Ｎ−７４；Ｌ−６１〜Ｈ−７５；Ｖ−６２〜Ｈ−７６；Ｇ−６３〜Ｍ
−７７；Ｎ−６４〜Ｒ−７８；Ｔ−６５〜Ｔ−７９；Ｌ−６６〜Ｖ−８０；Ｖ−
６７〜Ｔ−８１；Ｃ−６８〜Ｎ−８２；Ｌ−６９〜Ｙ−８３；Ａ−７０〜Ｆ−８
４；Ｖ−７１〜Ｉ−８５；Ｗ−７２〜Ｖ−８６；Ｒ−７３〜Ｎ−８７；Ｎ−７４
〜Ｌ−８８；Ｈ−７５〜Ｓ−８９；Ｈ−７６〜Ｌ−９０；Ｍ−７７〜Ａ−９１；
Ｒ−７８〜Ｄ−９２；Ｔ−７９〜Ｖ−９３；Ｖ−８０〜Ｌ−９４；Ｔ−８１〜Ｖ
−９５；Ｎ−８２〜Ｔ−９６；Ｙ−８３〜Ａ−９７；Ｆ−８４〜Ｉ−９８；Ｉ−
８５〜Ｃ−９９；Ｖ−８６〜Ｌ−１００；Ｎ−８７〜Ｐ−１０１；Ｌ−８８〜Ａ
−１０２；Ｓ−８９〜Ｓ−１０３；Ｌ−９０〜Ｌ−１０４；Ａ−９１〜Ｌ−１０
５；Ｄ−９２〜Ｖ−１０６；Ｖ−９３〜Ｄ−１０７；Ｌ−９４〜Ｉ−１０８；Ｖ
−９５〜Ｔ−１０９；Ｔ−９６〜Ｅ−１１０；Ａ−９７〜Ｓ−１１１；Ｉ−９８
〜Ｗ−１１２；Ｃ−９９〜Ｌ−１１３；Ｌ−１００〜Ｆ−１１４；Ｐ−１０１〜
Ｇ−１１５；Ａ−１０２〜Ｈ−１１６；Ｓ−１０３〜Ａ−１１７；Ｌ−１０４〜
Ｌ−１１８；Ｌ−１０５〜Ｃ−１１９；Ｖ−１０６〜Ｋ−１２０；Ｄ−１０７〜
Ｖ−１２１；Ｉ−１０８〜Ｉ−１２２；Ｔ−１０９〜Ｐ−１２３；Ｅ−１１０〜
Ｙ−１２４；Ｓ−１１１〜Ｌ−１２５；Ｗ−１１２〜Ｑ−１２６；Ｌ−１１３〜
Ａ−１２７；Ｆ−１１４〜Ｖ−１２８；Ｇ−１１５〜Ｓ−１２９；Ｈ−１１６〜
Ｖ−１３０；Ａ−１１７〜Ｓ−１３１；Ｌ−１１８〜Ｖ−１３２；Ｃ−１１９〜
Ａ−１３３；Ｋ−１２０〜Ｖ−１３４；Ｖ−１２１〜Ｌ−１３５；Ｉ−１２２〜
Ｔ−１３６；Ｐ−１２３〜Ｌ−１３７；Ｙ−１２４〜Ｓ−１３８；Ｌ−１２５〜
Ｆ−１３９；Ｑ−１２６〜Ｉ−１４０；Ａ−１２７〜Ａ−１４１；Ｖ−１２８〜
Ｌ−１４２；Ｓ−１２９〜Ｄ−１４３；Ｖ−１３０〜Ｒ−１４４；Ｓ−１３１〜
Ｗ−１４５；Ｖ−１３２〜Ｙ−１４６；Ａ−１３３〜Ａ−１４７；Ｖ−１３４〜
Ｉ−１４８；Ｌ−１３５〜Ｃ−１４９；Ｔ−１３６〜Ｈ−１５０；Ｌ−１３７〜
Ｐ−１５１；Ｓ−１３８〜Ｌ−１５２；Ｆ−１３９〜Ｌ−１５３；Ｉ−１４０〜
Ｆ−１５４；Ａ−１４１〜Ｋ−１５５；Ｌ−１４２〜Ｓ−１５６；Ｄ−１４３〜
Ｔ−１５７；Ｒ−１４４〜Ａ−１５８；Ｗ−１４５〜Ｒ−１５９；Ｙ−１４６〜
Ｒ−１６０；Ａ−１４７〜Ａ−１６１；Ｉ−１４８〜Ｒ−１６２；Ｃ−１４９〜
Ｇ−１６３；Ｈ−１５０〜Ｓ−１６４；Ｐ−１５１〜Ｉ−１６５；Ｌ−１５２〜
Ｌ−１６６；Ｌ−１５３〜Ｇ−１６７；Ｆ−１５４〜Ｉ−１６８；Ｋ−１５５〜
Ｗ−１６９；Ｓ−１５６〜Ａ−１７０；Ｔ−１５７〜Ｖ−１７１；Ａ−１５８〜
Ｓ−１７２；Ｒ−１５９〜Ｌ−１７３；Ｒ−１６０〜Ａ−１７４；Ａ−１６１〜
Ｉ−１７５；Ｒ−１６２〜Ｍ−１７６；Ｇ−１６３〜Ｖ−１７７；Ｓ−１６４〜
Ｐ−１７８；Ｉ−１６５〜Ｑ−１７９；Ｌ−１６６〜Ａ−１８０；Ｇ−１６７〜
Ａ−１８１；Ｉ−１６８〜Ｖ−１８２；Ｗ−１６９〜Ｍ−１８３；Ａ−１７０〜
Ｅ−１８４；Ｖ−１７１〜Ｃ−１８５；Ｓ−１７２〜Ｓ−１８６；Ｌ−１７３〜
Ｓ−１８７；Ａ−１７４〜Ｖ−１８８；Ｉ−１７５〜Ｌ−１８９；Ｍ−１７６〜
Ｐ−１９０；Ｖ−１７７〜Ｅ−１９１；Ｐ−１７８〜Ｌ−１９２；Ｑ−１７９〜
Ａ−１９３；Ａ−１８０〜Ｎ−１９４；Ａ−１８１〜Ｒ−１９５；Ｖ−１８２〜
Ｔ−１９６；Ｍ−１８３〜Ｒ−１９７；Ｅ−１８４〜Ｌ−１９８；Ｃ−１８５〜
Ｆ−１９９；Ｓ−１８６〜Ｓ−２００；Ｓ−１８７〜Ｖ−２０１；Ｖ−１８８〜
Ｃ−２０２；Ｌ−１８９〜Ｄ−２０３；Ｐ−１９０〜Ｅ−２０４；Ｅ−１９１〜
Ｒ−２０５；Ｌ−１９２〜Ｗ−２０６；Ａ−１９３〜Ａ−２０７；Ｎ−１９４〜
Ｄ−２０８；Ｒ−１９５〜Ｄ−２０９；Ｔ−１９６〜Ｌ−２１０；Ｒ−１９７〜
Ｙ−２１１；Ｌ−１９８〜Ｐ−２１２；Ｆ−１９９〜Ｋ−２１３；Ｓ−２００〜
Ｉ−２１４；Ｖ−２０１〜Ｙ−２１５；Ｃ−２０２〜Ｈ−２１６；Ｄ−２０３〜
Ｓ−２１７；Ｅ−２０４〜Ｃ−２１８；Ｒ−２０５〜Ｆ−２１９；Ｗ−２０６〜
Ｆ−２２０；Ａ−２０７〜Ｉ−２２１；Ｄ−２０８〜Ｖ−２２２；Ｄ−２０９〜
Ｔ−２２３；Ｌ−２１０〜Ｙ−２２４；Ｙ−２１１〜Ｌ−２２５；Ｐ−２１２〜
Ａ−２２６；Ｋ−２１３〜Ｐ−２２７；Ｉ−２１４〜Ｌ−２２８；Ｙ−２１５〜
Ｇ−２２９；Ｈ−２１６〜Ｌ−２３０；Ｓ−２１７〜Ｍ−２３１；Ｃ−２１８〜
Ａ−２３２；Ｆ−２１９〜Ｍ−２３３；Ｆ−２２０〜Ａ−２３４；Ｉ−２２１〜
Ｙ−２３５；Ｖ−２２２〜Ｆ−２３６；Ｔ−２２３〜Ｑ−２３７；Ｙ−２２４〜
Ｉ−２３８；Ｌ−２２５〜Ｆ−２３９；Ａ−２２６〜Ｒ−２４０；Ｐ−２２７〜
Ｋ−２４１；Ｌ−２２８〜Ｌ−２４２；Ｇ−２２９〜Ｗ−２４３；Ｌ−２３０〜
Ｇ−２４４；Ｍ−２３１〜Ｒ−２４５；Ａ−２３２〜Ｑ−２４６；Ｍ−２３３〜
Ｉ−２４７；Ａ−２３４〜Ｐ−２４８；Ｙ−２３５〜Ｇ−２４９；Ｆ−２３６〜
Ｔ−２５０；Ｑ−２３７〜Ｔ−２５１；Ｉ−２３８〜Ｓ−２５２；Ｆ−２３９〜
Ａ−２５３；Ｒ−２４０〜Ｌ−２５４；Ｋ−２４１〜Ｖ−２５５；Ｌ−２４２〜
Ｒ−２５６；Ｗ−２４３〜Ｎ−２５７；Ｇ−２４４〜Ｗ−２５８；Ｒ−２４５〜
Ｋ−２５９；Ｑ−２４６〜Ｒ−２６０；Ｉ−２４７〜Ｐ−２６１；Ｐ−２４８〜
Ｓ−２６２；Ｇ−２４９〜Ｄ−２６３；Ｔ−２５０〜Ｑ−２６４；Ｔ−２５１〜
Ｌ−２６５；Ｓ−２５２〜Ｇ−２６６；Ａ−２５３〜Ｄ−２６７；Ｌ−２５４〜
Ｌ−２６８；Ｖ−２５５〜Ｅ−２６９；Ｒ−２５６〜Ｑ−２７０；Ｎ−２５７〜
Ｇ−２７１；Ｗ−２５８〜Ｌ−２７２；Ｋ−２５９〜Ｓ−２７３；Ｒ−２６０〜
Ｇ−２７４；Ｐ−２６１〜Ｅ−２７５；Ｓ−２６２〜Ｐ−２７６；Ｄ−２６３〜
Ｑ−２７７；Ｑ−２６４〜Ｐ−２７８；Ｌ−２６５〜Ｒ−２７９；Ｇ−２６６〜
Ａ−２８０；Ｄ−２６７〜Ｒ−２８１；Ｌ−２６８〜Ａ−２８２；Ｅ−２６９〜
Ｆ−２８３；Ｑ−２７０〜Ｌ−２８４；Ｇ−２７１〜Ａ−２８５；Ｌ−２７２〜
Ｅ−２８６；Ｓ−２７３〜Ｖ−２８７；Ｇ−２７４〜Ｋ−２８８；Ｅ−２７５〜
Ｑ−２８９；Ｐ−２７６〜Ｍ−２９０；Ｑ−２７７〜Ｒ−２９１；Ｐ−２７８〜
Ａ−２９２；Ｒ−２７９〜Ｒ−２９３；Ａ−２８０〜Ｒ−２９４；Ｒ−２８１〜
Ｋ−２９５；Ａ−２８２〜Ｔ−２９６；Ｆ−２８３〜Ａ−２９７；Ｌ−２８４〜
Ｋ−２９８；Ａ−２８５〜Ｍ−２９９；Ｅ−２８６〜Ｌ−３００；Ｖ−２８７〜
Ｍ−３０１；Ｋ−２８８〜Ｖ−３０２；Ｑ−２８９〜Ｖ−３０３；Ｍ−２９０〜
Ｌ−３０４；Ｒ−２９１〜Ｌ−３０５；Ａ−２９２〜Ｖ−３０６；Ｒ−２９３〜
Ｆ−３０７；Ｒ−２９４〜Ａ−３０８；Ｋ−２９５〜Ｌ−３０９；Ｔ−２９６〜
Ｃ−３１０；Ａ−２９７〜Ｙ−３１１；Ｋ−２９８〜Ｌ−３１２；Ｍ−２９９〜
Ｐ−３１３；Ｌ−３００〜Ｉ−３１４；Ｍ−３０１〜Ｓ−３１５；Ｖ−３０２〜
Ｖ−３１６；Ｖ−３０３〜Ｌ−３１７；Ｌ−３０４〜Ｎ−３１８；Ｌ−３０５〜
Ｖ−３１９；Ｖ−３０６〜Ｌ−３２０；Ｆ−３０７〜Ｋ−３２１；Ａ−３０８〜
Ｒ−３２２；Ｌ−３０９〜Ｖ−３２３；Ｃ−３１０〜Ｆ−３２４；Ｙ−３１１〜
Ｇ−３２５；Ｌ−３１２〜Ｍ−３２６；Ｐ−３１３〜Ｆ−３２７；Ｉ−３１４〜
Ｒ−３２８；Ｓ−３１５〜Ｑ−３２９；Ｖ−３１６〜Ａ−３３０；Ｌ−３１７〜
Ｓ−３３１；Ｎ−３１８〜Ｄ−３３２；Ｖ−３１９〜Ｒ−３３３；Ｌ−３２０〜
Ｅ−３３４；Ｋ−３２１〜Ａ−３３５；Ｒ−３２２〜Ｖ−３３６；Ｖ−３２３〜
Ｙ−３３７；Ｆ−３２４〜Ａ−３３８；Ｇ−３２５〜Ｃ−３３９；Ｍ−３２６〜
Ｆ−３４０；Ｆ−３２７〜Ｔ−３４１；Ｒ−３２８〜Ｆ−３４２；Ｑ−３２９〜
Ｓ−３４３；Ａ−３３０〜Ｈ−３４４；Ｓ−３３１〜Ｗ−３４５；Ｄ−３３２〜
Ｌ−３４６；Ｒ−３３３〜Ｖ−３４７；Ｅ−３３４〜Ｙ−３４８；Ａ−３３５〜
Ａ−３４９；Ｖ−３３６〜Ｎ−３５０；Ｙ−３３７〜Ｓ−３５１；Ａ−３３８〜
Ａ−３５２；Ｃ−３３９〜Ａ−３５３；Ｆ−３４０〜Ｎ−３５４；Ｔ−３４１〜
Ｐ−３５５；Ｆ−３４２〜Ｉ−３５６；Ｓ−３４３〜Ｉ−３５７；Ｈ−３４４〜
Ｙ−３５８；Ｗ−３４５〜Ｎ−３５９；Ｌ−３４６〜Ｆ−３６０；Ｖ−３４７〜
Ｌ−３６１；Ｙ−３４８〜Ｓ−３６２；Ａ−３４９〜Ｇ−３６３；Ｎ−３５０〜
Ｋ−３６４；Ｓ−３５１〜Ｆ−３６５；Ａ−３５２〜Ｒ−３６６；Ａ−３５３〜
Ｅ−３６７；Ｎ−３５４〜Ｑ−３６８；Ｐ−３５５〜Ｆ−３６９；Ｉ−３５６〜
Ｋ−３７０；Ｉ−３５７〜Ａ−３７１；Ｙ−３５８〜Ａ−３７２；Ｎ−３５９〜
Ｆ−３７３；Ｆ−３６０〜Ｓ−３７４；Ｌ−３６１〜Ｃ−３７５；Ｓ−３６２〜
Ｃ−３７６；Ｇ−３６３〜Ｌ−３７７；Ｋ−３６４〜Ｐ−３７８；Ｆ−３６５〜
Ｇ−３７９；Ｒ−３６６〜Ｌ−３８０；Ｅ−３６７〜Ｇ−３８１；Ｑ−３６８〜
Ｐ−３８２；Ｆ−３６９〜Ｃ−３８３；Ｋ−３７０〜Ｇ−３８４；Ａ−３７１〜
Ｓ−３８５；Ａ−３７２〜Ｌ−３８６；Ｆ−３７３〜Ｋ−３８７；Ｓ−３７４〜
Ａ−３８８；Ｃ−３７５〜Ｐ−３８９；Ｃ−３７６〜Ｓ−３９０；Ｌ−３７７〜
Ｐ−３９１；Ｐ−３７８〜Ｒ−３９２；Ｇ−３７９〜Ｓ−３９３；Ｌ−３８０〜
Ｓ−３９４；Ｇ−３８１〜Ａ−３９５；Ｐ−３８２〜Ｓ−３９６；Ｃ−３８３〜
Ｈ−３９７；Ｇ−３８４〜Ｋ−３９８；Ｓ−３８５〜Ｓ−３９９；Ｌ−３８６〜
Ｌ−４００；Ｋ−３８７〜Ｓ−４０１；Ａ−３８８〜Ｌ−４０２；Ｐ−３８９〜
Ｑ−４０３；Ｓ−３９０〜Ｓ−４０４；Ｐ−３９１〜Ｒ−４０５；Ｒ−３９２〜
Ｃ−４０６；Ｓ−３９３〜Ｓ−４０７；Ｓ−３９４〜Ｖ−４０８；Ａ−３９５〜
Ｓ−４０９；Ｓ−３９６〜Ｋ−４１０；Ｈ−３９７〜Ｉ−４１１；Ｋ−３９８〜
Ｓ−４１２；Ｓ−３９９〜Ｅ−４１３；Ｌ−４００〜Ｈ−４１４；Ｓ−４０１〜
Ｖ−４１５；Ｌ−４０２〜Ｖ−４１６；Ｑ−４０３〜Ｌ−４１７；Ｓ−４０４〜
Ｔ−４１８；Ｒ−４０５〜Ｓ−４１９；Ｃ−４０６〜Ｖ−４２０；Ｓ−４０７〜
Ｔ−４２１；Ｖ−４０８〜Ｔ−４２２；Ｓ−４０９〜Ｖ−４２３；Ｋ−４１０〜
Ｌ−４２４；およびＩ−４１１〜Ｐ−４２５。これらのポリペプチドフラグメン
トは、本発明のニューロペプチドレセプターポリペプチドの生物学的活性を保持
し得、そして／または以下にさらに記載されるように、抗体の生成もしくは抗体
についてのスクリーニングのために、有用であり得る。これらのポリペプチドフ
ラグメントをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
【０１３４】 本願はまた、上記ニューロペプチドレセプターポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８
％、または９９％同一のポリヌクレオチド配列を含むか、またはこのポリヌクレ
オチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配
列に融合する上記ポリヌクレオチド配列を含む。
【０１３５】 さらに、本願はまた、上記ニューロペプチドレセプターポリペプチドフラグメ
ントと少なくとも９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、
９８％または９９％同一のポリペプチドを含むタンパク質に関する。これらのポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
【０１３６】 好ましくは、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、ニューロペプチドレ
セプター機能的活性を示すポリペプチドをコードする。ニューロペプチドレセプ
ター「機能的活性」を示すポリペプチドとは、全長（完全）ニューロペプチドレ
セプタータンパク質に関連する１つ以上の既知の機能的活性を示し得るポリペプ
チドを意味する。このような機能的活性としては、生物学的活性、抗原性［抗ニ
ューロペプチドレセプター抗体に結合する（または結合に関してニューロペプチ
ドレセプターポリペプチドと競合する）能力］、免疫原性（ニューロペプチドレ
セプターポリペプチドに結合する抗体を生成する能力）、本発明のニューロペプ
チドレセプターポリペプチドと多量体を形成する能力、およびニューロペプチド
レセプターポリペプチドに対するレセプターまたはリガンドに結合する能力が挙
げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】 ニューロペプチドレセプターポリペプチド、ならびにフラグメント、改変体、
誘導体、およびこれらのアナログの機能的活性は、種々の方法によってアッセイ
され得る。
【０１３８】 例えば、抗ニューロペプチドレセプター抗体を結合するか、または結合に関し
て全長ニューロペプチドレセプターポリペプチドと競合する能力をアッセイする
、１つの実施形態においては、当該分野で公知の種々のイムノアッセイ系が使用
され得、これらのアッセイ系には、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ
（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫ラジオ
メトリック測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュイムノ
アッセイ（例えば、コロイド状金、酵素標識または放射性同位元素標識を使用す
る）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセ
イ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡ
アッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどのような技術を使用する競合的およ
び非競合的アッセイ系が含まれるがこれらに限定されない。１つの実施形態にお
いて、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することにより検出される。別の実
施形態において、一次抗体は、二次抗体の結合または一次抗体に対する試薬を検
出することによって検出される。さらなる実施形態において、二次抗体が標識さ
れる。イムノアッセイにおける結合を検出するための多くの手段が当該分野にお
いて公知であり、そして本発明の範囲内にある。
【０１３９】 ニューロペプチドレセプターリガンドが同定されるか、または本発明のポリペ
プチドフラグメント、改変体または誘導体が多量体化する能力が評価される、別
の実施形態において、結合は、例えば、当該分野で周知の手段（例えば、還元ま
たは非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフ
ィー、およびアフィニティーブロッティングなど）によってアッセイされ得る。
一般的には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ，Ｅ．ら、１９９５、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅ
ｖ．５９：９４−１２３を参照のこと。別の実施形態において、その基質へのニ
ューロペプチドレセプターの結合の生理学的相関（シグナル伝達）がアッセイさ
れ得る。
【０１４０】 さらに、本明細書中に記載されるアッセイ（実施例を参照のこと）およびさも
なくば当該分野で公知のアッセイが、慣用的に、ニューロペプチドレセプターポ
リペプチドならびにそのフラグメント、改変体、誘導体、およびアナログの、ニ
ューロペプチドレセプター関連生物学的活性（インビトロまたはインビボのいず
れかにおいて）を誘発する能力を測定するために適用され得る。他の方法は、当
業者に公知であり、そして本発明の範囲にある。
【０１４１】 本発明の特に好ましいフラグメントは、ニューロペプチドレセプターの構造的
または機能的な寄与によって特徴付けられるフラグメントである。このようなフ
ラグメントは、完全（すなわち、全長）ニューロペプチドレセプター（配列番号
２）のαへリックスおよびαへリックス形成領域（「α領域」）、βシートおよ
びβシート形成領域（「β領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領
域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性
領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、表面形成領域、および高抗原性指標領
域（すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプログラムのデフォルトパラメータを
使用して同定した場合に、１．５以上の抗原性指標を有する４つ以上の連続する
アミノ酸を含む）を含むかまたはそれらからなるアミノ酸残基を含む。特定の好
ましい領域は、図８に示される領域であり、図１Ａ〜Ｂ（配列番号２）に示され
るアミノ酸配列の、分析によって同定される上述の型の領域を含むが、これらに
限定されない。このような好ましい領域には、以下が挙げられる：これらのコン
ピュータプログラムのデフォルトパラメーターを使用して予測されるような、Ｇ
ａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ予測α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領
域；Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ予測α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領
域；Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ予測親水性領域および疎水性領域；Ｅｉｓｅ
ｎｂｅｒｇのαおよびβ両親媒性領域；Ｅｍｉｎｉの表面形成領域；ならびにＪ
ａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ高抗原性指標領域。これらのポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドもまた、本発明に包含される。
【０１４２】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ニューロペプチド
レセプターの機能的寄与をコードする。この点に関して、本発明の好ましい実施
形態は、ニューロペプチドレセプターのαへリックスおよびαへリックス形成領
域（「α領域」）、βシートおよびβシート形成領域（「β領域」）、ターンお
よびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイ
ル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、フレ
キシブル領域、表面形成領域、および高抗原性指標領域を含むか、またはこれら
からなるフラグメントを含む。
【０１４３】 図１Ａ−Ｂおよび／または表Ｉに示す、ニューロペプチドレセプターの構造的
または機能的な寄与を表すデータは、上記のように、デフォルトパラメータに設
定したＤＮＡ＊ＳＴＡＲの種々のモジュールおよびアルゴリズムを使用して、生
成した。好ましい実施形態において、表Ｉの欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、およ
びＸＩＶに示すデータを使用して、ニューロペプチドレセプターの、高度な抗原
性の可能性を示す領域を決定し得る。抗原性の高い領域は、欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、
ＸＩＩＩ、および／またはＩＶに示すデータから、抗原認識が免疫応答の開始の
プロセスにおいて起こり得る環境において、ポリペプチドの表面に曝露されるよ
うであるポリペプチドの領域を示す値を選択することによって、決定される。
【０１４４】 これらの点に関する特定の好ましい領域を、図８に示すが、表Ｉに示すように
、これらは、図８に示すデータの表の表現を使用することによって表されるか、
または同定され得る。図８のデータを表の形式で与えるために、図８を作成する
ために使用したＤＮＡ＊ＳＴＡＲコンピュータアルゴリズム（最初のデフォルト
パラメータに設定された）を使用した（表Ｉを参照のこと）。表の形式の図８の
データを使用して、好ましい領域の特異的な境界を容易に決定し得る。
【０１４５】 図８および表Ｉに示す、上記好ましい領域としては、図１Ａ−Ｂに示すアミノ
酸配列の分析により同定された、上記型の領域が挙げられるが、これらに限定さ
れない。図８および表Ｉに示すように、このような好ましい領域としては、Ｇａ
ｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域；
Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα領域、β領域、およびコイル領域；Ｋｙｔｅ−Ｄｏ
ｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域および疎水性領域；Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ
のフレキシブル領域、；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのαおよびβ両親媒性領域；Ｅｍｉ
ｎｉの表面形成領域；ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ高抗原性指標領域が挙
げられる。
【０１４６】
【表１】 この点において非常に好ましいフラグメントには、いくつかの構造的特徴（例え
ば、上記に示される特徴のいくつか）を組み合わせるニューロペプチドレセプタ
ーの領域を含むフラグメントがある。
【０１４７】 他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性なニューロペプチドレセプター
フラグメントである。生物学的に活性なフラグメントは、そのニューロペプチド
レセプターポリペプチドの活性と類似するが必ずしも同一ではない、活性を示す
フラグメントである。そのフラグメントの生物学的活性には、改善した所望の活
性または減少した所望されない活性が挙げられ得る。
【０１４８】 しかし、多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可
能であり、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列
のいくつかは、配列番号１に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能で
あったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本
発明の範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従
って、好ましくは、本発明からは、一般式ａ１−ｂ１により記載されるヌクレオ
チド配列（ここで、ａ１は配列番号１の１〜１２６４の任意の整数であり、ｂ１
は１５〜１２７８の整数であり、ここでａ１およびｂ１の両方は配列番号１に示
されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂ１はａ１＋１４以上で
ある）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。
【０１４９】 さらに、多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可
能であり、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列
のいくつかは、配列番号３に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能で
あったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本
発明の範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従
って、好ましくは、本発明からは、一般式ａ２−ｂ２により記載されるヌクレオ
チド配列（ここで、ａ２は配列番号３の１〜１０９６の任意の整数であり、ｂ２
は１５〜１１１０の整数であり、ここでａ２およびｂ２の両方は配列番号３に示
されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂ２はａ２＋１４以上で
ある）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。
【０１５０】 さらに、多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可
能であり、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列
のいくつかは、配列番号５に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能で
あったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本
発明の範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従
って、好ましくは、本発明からは、一般式ａ３−ｂ３により記載されるヌクレオ
チド配列（ここで、ａ３は配列番号５の１〜１１１９の任意の整数であり、ｂ３
は１５〜１１３３の整数であり、ここでａ３およびｂ３の両方は配列番号５に示
されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂ３はａ３＋１４以上で
ある）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。
【０１５１】 （エピトープおよび抗体） 本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープ、ま
たはＡＴＣＣ受託番号９７１２８に含まれるポリヌクレオチド配列によりコード
されるポリペプチド配列のエピトープ、あるいは配列番号１、３、もしくは５の
配列の相補体またはＡＴＣＣ受託番号９７１２８に含まれる配列の相補体に上記
で規定されたようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下もしくは
より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ
するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列のエピトープを含む
かあるいはそれらからなる、ポリペプチドを含む。本発明はさらに、本発明のポ
リペプチド配列（例えば、配列番号１で開示された配列）のエピトープをコード
するポリヌクレオチド配列、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド
配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、および上記で定義されたストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件またはより低いストリンジェンシーのハイブリ
ダイゼーション条件でこの相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を
含む。
【０１５２】 本明細書中で使用される用語「エピトープ」とは、動物、好ましくは哺乳動物
、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または免疫原性活性を有するポ
リペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、本発明は、エピトープを
含むポリペプチド、ならびにこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
含む。本明細書で使用される場合、「免疫原性エピトープ」は、動物における抗
体応答を誘発するタンパク質の一部分として定義され、当該分野で公知の任意の
方法（例えば、以下に記載された抗体作製の方法）によって決定される。（例え
ば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：
３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。本明細書中で使用される場合
、用語「抗原性エピトープ」とは、当該分野で周知の任意の方法（例えば、本明
細書中に記載されたイムノアッセイ）によって決定される場合、抗体がその抗原
に免疫特異的に結合し得るタンパク質の一部として定義される。免疫特異的な結
合は、非特異的な結合を除外するが、必ずしも他の抗原との交差反応性を除外は
しない。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性であることを必要とはしない。
【０１５３】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の手段により作製され
得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）（米国特許第４，６３１，２１
１号にさらに記載される）を参照のこと）。
【０１５４】 本発明においては、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４アミノ酸
、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸の配列
を含み、より好ましくは、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少な
くとも１０アミノ酸、少なくとも１１アミノ酸、少なくとも１２アミノ酸、少な
くとも１３アミノ酸、少なくとも１４アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少な
くとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少な
くとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸の配列を含み、そして最も好まし
くは約１５アミノ酸〜約３０アミノ酸の配列を含む。免疫原性エピトープまたは
抗原性エピトープを含有する好ましいポリペプチドは、少なくとも１０アミノ酸
残基、１５アミノ酸残基、２０アミノ酸残基、２５アミノ酸残基、３０アミノ酸
残基、３５アミノ酸残基、４０アミノ酸残基、４５アミノ酸残基、５０アミノ酸
残基、５５アミノ酸残基、６０アミノ酸残基、６５アミノ酸残基、７０アミノ酸
残基、７５アミノ酸残基、８０アミノ酸残基、８５アミノ酸残基、９０アミノ酸
残基、９５アミノ酸残基または１００アミノ酸残基の長さである。さらに、非排
他的に好ましい抗原性エピトープとしては、本明細書中で開示される抗原性エピ
トープおよびその一部が挙げられる。抗原性エピトープは、例えば、そのエピト
ープに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するために、
有用である。好ましい抗原性エピトープとしては、本明細書中で開示される抗原
性エピトープ、およびこれらの抗原性エピトープのうちの２、３、４、５以上の
任意の組合わせが挙げられる。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおいて、
標的分子として使用され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ ３７：７
６７−７７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：
６６０−６６６（１９８３）を参照のこと）。
【０１５５】 同様に、当該分野で周知の方法に従って、免疫原性エピトープを使用して、例
えば、抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏ
ｎら，前出；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：
２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープ
として、本明細書中に開示される免疫原性エピトープ、およびこれらの免疫原性
エピトープのうちの２、３、４、５以上の任意の組み合わせが挙げられる。１つ
以上の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、キャリアタンパク質（例えば
、アルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に抗体応答を誘
発するために提示され得るか、あるいはこのポリペプチドが十分に長い場合（少
なくとも約２５アミノ酸）、このポリペプチドは、キャリアなしで動物系に提示
され得る。しかし、８アミノ酸〜１０アミノ酸程度の少ないアミノ酸を含む免疫
原性エピトープは、少なくとも変性ポリペプチド中の直鎖状エピトープに結合し
得る抗体を惹起するには十分であることが示されている（例えば、ウェスタンブ
ロッティングにおいて）。
【０１５６】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。これらの周知の方法としては、インビボ免疫、
インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定
されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；およ
びＢｉｔｔｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９
８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用い
て免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キー
ホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にそのペプ
チドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含む
ペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（
ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペ
プチドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリ
アに結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプ
チドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、エマルジョン（
約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質、およびフロイントアジュバ
ントまたは免疫応答を刺激するために公知の他の任意のアジュバントを含む）の
腹腔内注射および／または皮内注射により免疫される。いくつかのブースター注
射が、有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔
で、必要とされ得る。この抗ペプチド抗体は、例えば、固体表面に吸着した遊離
のペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来
の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野
で周知の方法に従う固体支持体上のペプチドの吸着および選択された抗体の溶出
による）により上昇し得る。
【０１５７】 当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピト
ープおよび／または抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、他のポリ
ペプチド配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリ
ン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（Ｃ
Ｈ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組み合わせ、およびそれらの部分
）あるいはアルブミン（組換えアルブミンを含むがこれに限定されない）（１９
９９年３月２日発行の米国特許第５，８７６，９６９号、欧州特許第０ ４１３
６２２号、および１９９８年６月１６日発行の米国特許第５，７６６，８８３
号（本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと）と融合され
得、これがキメラポリペプチドを生じる。このような融合タンパク質は、精製を
容易にし得、そしてインビボにおいて半減期を増加させ得る。これは、ヒトＣＤ
４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖
または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなる、キメラタンパク質について示
された。例えば、ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒ
ｅ，３３１：８４〜８６（１９８８）を参照のこと。上皮関門を横切る免疫系へ
の、抗原の増強された送達は、ＦｃＲｎ結合パートナー（例えば、ＩｇＧフラグ
メントまたはＦｃフラグメント（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ９６／２２０２４お
よびＷＯ ９９／０４８１３を参照のこと）に結合体化した抗原（例えば、イン
スリン）について実証されている。ＩｇＧ部分ジスルフィド結合に起因してジス
ルフィド結合二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、それらの単量体
ポリペプチドまたはフラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和におい
て効果的であることが見出されている。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８〜３９６４（１９９５）を参照のこと
。上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグ（例えば、血球凝
集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグタグ（ｆｌａｇ ｔａｇ））として目的の
遺伝子と組換えられ、発現されるポリペプチドの検出および精製を補助し得る。
例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載された系は、ヒト細胞株において発
現される非変性融合タンパク質の迅速な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ
ら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７
２−８９７）。この系において、目的の遺伝子は、遺伝子のオープンリーディン
グフレームが、６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグと翻訳により融合
されるように、ワクシニア組換えプラスミド中にサブクローンされる。このタグ
は、融合タンパク質についての基質結合ドメインとしてはたらく。組換えワクシ
ニアウイルスに感染した細胞由来の抽出物は、Ｎｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロー
スカラムに充填され、そしてヒスチジンタグ化したタンパク質が、イミダゾール
含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。
【０１５８】 本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを使用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、この
ような方法を用いて、変化した活性を有するポリペプチド、ならびにそのポリペ
プチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る。一般には、米国特許第
５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号
；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａ
ｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−
３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏおよびＢｌａ
ｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９９８）
（これらの特許および刊行物の各々は、本明細書によってその全体が参考として
援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号１、３、もしく
は５に対応するポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによってコー
ドされるポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、２つ以上の
ＤＮＡセグメントをアセンブリして、ポリヌクレオチド配列における変化を産生
することを含む。別の実施形態において、本発明のポリヌクオチドまたはコード
されるポリペプチドは、組換え前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオ
チド挿入または他の方法による、ランダムな変異誘発に供されることによって改
変され得る。別の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドの１つ以上の成分、モチーフ、セクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分
、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチ
ーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。
【０１５９】 免疫原性エピトープを含む例証的なアミノ酸配列の一覧表を、以下の表Ｉに示
す。表Ｉは、ＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ（１９８８）Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．
Ｂｉｏｓｃｉ．４：１８１〜１８６（この参考文献はその全体が参考として援用
される）のアルゴリズムを用いて、最高程度の抗原性を有すると予想されるエピ
トープを含むアミノ酸残基を単に列挙するのみであることが示される。Ｊａｍｅ
ｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性分析は、デフォルトパラメーターを用いる、コンピュー
タープログラムＰＲＯＴＥＡＮを用いて実行された（Ｐｏｗｅｒ ＭａｃＩｎｔ
ｏｓｈ用（バージョン３．１１），ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，１２２８ Ｓｏ
ｕｔｈ Ｐａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。表Ｉおよび表Ｉに
列挙されないポリペプチドの部分は、非免疫原性であるとは見なされない。表Ｉ
の免疫原性エピトープは、例示的列挙であるが、網羅的列挙ではない。なぜなら
、他の免疫原性エピトープは、使用される特定アルゴリズムによって単にそのよ
うには認識されないだけであるからである。他の免疫原性エピトープを含むアミ
ノ酸残基は、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析に類似のアルゴリズムを用いて、ま
たは当該分野で公知の方法を用いる抗原性応答についてのインビボ試験により、
慣用的に決定され得る。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、前出；米国特許第４，７０８
，７８１号；同第５，１９４，３９２号、同第４，４３３，０９２号；および同
第５，４８０，９７１号（これらの参考資料はその全体が参考として援用される
）を参照のこと。
【０１６０】 本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリ
ペプチドのアミノ酸配列内に含まれる少なくとも７アミノ酸、より好ましくは９
アミノ酸、そして最も好ましくは約１５アミノ酸〜約３０アミノ酸の配列を、好
ましくは含む。ニューロペプチドレセプター特異的抗体に対して使用され得る抗
原性ポリペプチドもしくはペプチドの非限定的例としては、ほぼニューロペプチ
ドレセプターからの配列中のアミノ酸残基を含むポリペプチドが、挙げられる。
これらのポリペプチドフラグメントは、上記図８に示されるように、Ｊａｍｅｓ
ｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標の分析により、そのニューロペプチドレセプタータン
パク質の抗原性エピトープを保有すると決定されている。
【０１６１】 表Ｉのアミノ酸配列は免疫原性エピトープを含むことが、特に示される。表Ｉ
は、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析により決定される免疫原性エピトープの重要
な残基のみを列挙する。従って、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の
両方に、さらなる隣接残基が、表Ｉの配列に付加され得、本発明のエピトープ保
有ポリペプチドが生成され得る。従って、表Ｉの免疫原性エピトープは、さらな
るＮ末端またはＣ末端のアミノ酸残基を含み得る。このさらなる隣接アミノ酸残
基は、本発明のポリペプチド由来の連続する隣接Ｎ末端配列もしくは隣接Ｃ末端
配列または異種配列であり得るか、あるいは本発明のポリペプチド由来の連続す
る隣接配列および異種ポリペプチド配列の両方を含み得る。
【０１６２】 免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、
少なくとも７アミノ酸残基長である。「少なくとも」とは、免疫原性エピトープ
または抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドが、７アミノ酸残基長であ
り得るか、７アミノ酸と本発明の完全長ポリペプチドのアミノ酸残基数との間の
任意の整数であり得ることを意味する。免疫原性エピトープまたは抗原性エピト
ープを含む好ましいポリペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基長、１５アミ
ノ酸残基長、２０アミノ酸残基長、２５アミノ酸残基長、３０アミノ酸残基長、
３５アミノ酸残基長、４０アミノ酸残基長、４５アミノ酸残基長、５０アミノ酸
残基長、５５アミノ酸残基長、６０アミノ酸残基長、６５アミノ酸残基長、７０
アミノ酸残基長、７５アミノ酸残基長、８０アミノ酸残基長、８５アミノ酸残基
長、９０アミノ酸残基長、９５アミノ酸残基長または１００アミノ酸残基長であ
る。しかし、７と完全長ポリペプチドのアミノ酸残基数との間のそれぞれの整数
およびあらゆる整数が本発明に含まれることが示される。
【０１６３】 免疫原性エピトープ保有フラグメントおよび抗原性エピトープ保有フラグメン
トは、上記のような連続するアミノ酸残基の数によって特定され得るか、または
配列番号２のアミノ酸配列上のこれらのフラグメントのＮ末端およびＣ末端位置
によりさらに特定され得るかのいずれかである。例えば、少なくとも７連続アミ
ノ酸残基長または少なくとも１５連続アミノ酸残基長のフラグメントが、配列番
号２，４、もしくは６のアミノ酸配列を占め得るＮ末端位置およびＣ末端位置の
あらゆる組み合わせが本発明に含まれる。再度、「少なくとも７連続アミノ酸残
基長」とは、７アミノ酸残基長または７アミノ酸と本発明の完全長ポリペプチド
のアミノ酸残基数との間の任意の整数を意味する。特に７と全長ポリペプチドの
アミノ酸残基数との間のそれぞれの整数およびあらゆる整数が本発明に含まれる
。
【０１６４】 本発明の免疫原性エピトープ保有ポリペプチドおよび抗原性エピトープ保有ポ
リペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドを特異的に結合する抗体を作製す
るため、および本発明のポリペプチドを検出するためのイムノアッセイにおいて
有用である。この抗体は、例えば、本発明のポリペプチドのアフィニティー精製
において有用である。この抗体はまた、当該分野で公知の方法を用いる、種々の
定性的イムノアッセイまたは定量的イムノアッセイにおいて（特に本発明のポリ
ペプチドのために）慣用的に用いられ得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；第２版、１９８８
）を参照のこと。
【０１６５】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で公知の合成方法および組
換え方法を含むポリペプチド作製のための任意の従来の手段により産生され得る
。例えば、エピトープ保有ペプチドは、化学合成の公知の方法を用いて合成され
得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、多数のペプチド（例えば、ＨＡＩポリペプ
チドのセグメントの単一アミノ酸改変体を示す、２４８個の個々の異なる１３残
基ペプチド１０〜２０ｍｇ（そのすべては、４週間未満で調製されそして特徴付
けられた（ＥＬＩＳＡ型の結合研究により））の合成のための簡易な方法を記載
している（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１〜５１３５（１９８５））。この「Ｓｉｍｕｌｔａ
ｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰ
Ｓ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎおよび共同研究者に対する米国特許第４，
６３１，２１１号（１９８６）にさらに記載される。この手順において、種々の
ペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ
、固相方法に関与する多数の同一反復工程の最適使用を可能にする。完全に手動
手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に実行されることを可能にする（Ｈ
ｏｕｇｈｔｅｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：
５１３１〜５１３５頁の５１３４頁）。
【０１６６】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、インビボ免疫、インビトロ免疫およ
びファージ提示方法を含むがこれらに限定されない、当該分野で周知の方法によ
り抗体を誘導するために用いられる。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗ
ｉｌｓｏｎら、前出、およびＢｉｔｔｌｅら（１９８５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６６：２３４７〜２３５４を参照のこと。インビボ免疫が用いられる場合、
動物は遊離のペプチドで免疫され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子
キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）または破傷風
毒素）へのそのペプチドの結合によりブーストされ得る。例えば、システイン残
基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得、一方、他の
ペプチドは、グルタルアルデヒドのような、より一般的な結合剤を用いてキャリ
アに結合され得る。ウサギ、ラットおよびマウスのような動物は、遊離のペプチ
ドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、約１００μｇのペ
プチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントを含有する乳濁
液の腹腔内および／または皮内注射によって免疫される。いくつかのブースター
注射は、有用な力価の抗ペプチド抗体（例えば、固相に吸着した遊離のペプチド
を用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る）を提供するために、例えば、
約２週間の間隔で、必要であり得る。免疫された動物由来の血清における抗ペプ
チド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により（例えば、当該分野で周知の方
法による、固体支持体上のペプチドへの吸着および選択した抗体の溶出により）
上昇され得る。
【０１６７】 当業者が理解するように、そして上記で考察したように、免疫原性エピトープ
または抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドが、異種のポリペプチド配
列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ
、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはその部分（ＣＨ１、ＣＨ２、
ＣＨ３、ドメイン全体およびドメインの部分の両方を含む、その任意の組み合わ
せ）と融合され、キメラポリペプチドを生じ得る。これらの融合タンパク質は、
精製を容易にし、そしてインビボにおける半減期の延長を示す。このことは、例
えば、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物免疫グ
ロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク
質について示されている。例えば、ＥＰＡ０，３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃ
ｋｅｒら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４〜８６を参照のこと。ＩｇＧ
部分に起因するジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単
量体ポリペプチドまたはそのフラグメント単独よりも他の分子を結合および中和
することにおいて効果的であり得る。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら（１
９９５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８〜３９６４を参照のこと。上記
のエピトープをコードする核酸はまた、発現されるポリペプチドの検出および精
製において補助するためのエピトープタグとして目的の遺伝子と組み換えられ得
る。
【０１６８】 （抗体） さらに、本発明のポリペプチドは、（特異的な抗体抗原結合をアッセイするた
めの当該分野で周知のイムノアッセイによって決定されるような）本発明の配列
番号２、４、または６の、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、または改
変体、および／またはエピトープに免疫特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原
レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖
抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリ
ーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば
、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトー
プ結合フラグメントを含むが、限定されない。本明細書中で使用される場合、用
語「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロリン分子の免疫学的に活性
な部分、すなわち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子をいう
。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、Ｉ
ｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例え
ば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）また
は任意のサブクラスであり得る。好ましい実施形態において、本発明の免疫グロ
ブリン分子は、ＩｇＧ１である。他の好ましい実施形態において、本発明の免疫
グロブリン分子は、ＩｇＧ４である。
【０１６９】 最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃ
Ｆｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶ
Ｈドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない
。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１ドメ
イン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗
原結合フラグメントがまた本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳
動物を含む任意の動物起点由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネ
ズミ（ｍｕｒｉｎｅ）（例えば、マウスおよびウサギ）、ロバ、シップウサギ（
ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ
である。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンの
アミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまた
は１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、そして内
因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離さた抗体（下に記載のように、そ
して例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８
号において記載のような）を含む。
【０１７０】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異性の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なる
エピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異
種のエピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）、の両方
に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；同ＷＯ ９
２／０８８０２；同ＷＯ ９１／００３６０；同ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕ
ｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４
，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、
同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０１７１】 本発明の抗体は、これらが認識または特異的に結合する、本発明のポリペプチ
ドのエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。このエピトープ
またはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、連続
するアミノ酸残基におけるサイズによって本明細書中に記載されるようか、また
は表および図面に列挙されるように、特定化され得る。本発明の好ましいエピト
ープは、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含む化か、あるいはこれらから
なる：配列番号２の約Ｍｅｔ−１〜約Ｔ−６、約Ｐ−１４〜約Ｄ−２９、約Ｔ−
１５７〜約Ｇ−１６３、約Ｎ−２５７〜約Ｌ−２６５、約Ｎ−２５７〜約Ａ−２
８０、約Ｌ−２７２〜約Ａ−２８０、Ｋ−３８７〜約Ｋ−３９８、約Ｃ−４０６
〜約Ｓ−４１２のアミノ酸配列、ならびにこれらのエピトープをコードするポリ
ヌクレオチド。この文脈において「約（おおよそ）」は、特に記載された値（い
ずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、ま
たは１）のアミノ酸だけ大きいかまたは小さな値）を含む。本発明の任意のエピ
トープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従っ
て、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そして本発明のポリペ
プチドの排除を可能にする抗体を含む。
【０１７２】 本発明の抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。本
発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログまたはホモログを結合し
ない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少な
くとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少な
くとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および
少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載され
る方法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた、
本発明に含まれる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトタンパク質
の、マウスホモログ、ラットホモログおよび／またはウサギホモログならびに対
応するそれらのエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドに対して９５
％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５
％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知の
方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算される場合）を有するポリ
ペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において
、上記の交差反応性は、本明細書中に開示された、任意の単一特異的な抗原性ま
たは免疫原性ポリペプチド、あるいは２、３、４、５以上の特異的抗原性および
／または免疫原生ポリペプチドの組み合わせに関する。さらに、ハイブリダイゼ
ーション条件下（本明細書中で記載されるような）で本発明のポリヌクレオチド
にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを結合
する抗体が、本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドに
対するそれらの結合親和性について記載または特定化され得る。好ましい結合親
和性としては、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１
０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１
０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１
０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１
０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未
満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−
１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５
×１０−１５Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親
和性が挙げられる。
【０１７３】 本発明はまた、競合性結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例
えば、本明細書中で記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、本
発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ま
しい実施形態において、この抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少
なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少
なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープへの結合を競合的に阻害
する。
【０１７４】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リ
ガンド相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。好まし
くは、本発明の抗体は、本明細書中で開示された抗原性エピトープ、またはその
部分を結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の
両方の特徴を有する。本発明はまた、リガンド結合を妨害しないがレセプター活
性化を妨害するレセプター特異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すな
わち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野
で公知の技術により決定され得る。例えば、レセプター活性化は、レセプターの
リン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）、または免疫沈降それ
に続くウェスタンブロット分析（例えば、上記のような）によってその基質を検
出することにより、決定され得る。特定の実施形態において、この抗体の非存在
下で、リガンド活性またはレセプター活性を、その活性の少なくとも９５％、少
なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少
なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が提
供される。
【０１７５】 本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプタ
ー特異的抗体、ならびにレセプターリガンド複合体を認識し、そして好ましくは
、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しな
い抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合し、そしてレセプタ
ーへのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結合し、それにより
レセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターを結合することを妨げない
抗体を含む。さらに、本発明は、レセプターを活性化する抗体を含む。これらの
抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、例えば、レセプター
の二量化を誘発することによってリガンド媒介レセプター活性化の生物学的活性
化の全てまたはサブセットのいずれかを増強するかまたは活性化し得る。この抗
体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特異的生物学的活性を含む生
物学的活性についてのアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストとして特
定化され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され
得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９
７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）
；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１
９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１
７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０
９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：
３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１
（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔ
ａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒ
ｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０
１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６
２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−
１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１
４−２０（１９９６）（これらは全て、その全体が参考として本明細書中に援用
される）を参照のこと。
【０１７６】 本発明の抗体は、例えば、これらに限定されないが、本発明のポリペプチドを
精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロ
およびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、この抗体は
、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的におよび定
量的に測定するためのイムノアッセイにおける用途を有する。例えば、Ｈａｒｌ
ｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
第２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される）を参照の
こと。
【０１７７】 以下にさらに詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独または他の化合
物との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体はさらに、ポリペプチド
または他の化合物へＮ末端でもしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融
合され得るか、または化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）され得
る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子およ
び異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素のようなエフェクター分子
へ組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９
５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９
９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。
【０１７８】 本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨げ
ないような、抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導体を含
む。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチ
ル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏ
ｎ）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）
による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質
への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が
、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成など
を含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘
導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０１７９】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マ
ウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与され得、抗原に対して
特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導する。種々のアジュバント
が、免疫学的応答を増加させるために使用され得、宿主種に依存し、そしてフロ
イント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（ｍｉ
ｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニック（ｐ
ｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホール
リンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−
ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのような強
力に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。このようなアジ
ュバントはまた、当該分野で周知である。
【０１８０】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（上記の参考文献は、その全体
が参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「
モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定
されない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、また
はファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてモノク
ローナル抗体が生成される方法ではない。
【０１８１】 ハイブリドーマ技術を用いて特定の抗体に対して産生およびスクリーニングす
る方法は、慣用的であり、そして当該分野において周知であり、実施例において
詳細に議論される。非限定な例において、マウスを、本発明のポリペプチドまた
はこのようなペプチドを発現する細胞を用いて免疫化し得る。一旦、免疫応答が
検出される（例えば、抗原に対して特異的な抗体がマウス血清中に検出される）
と、マウスの脾臓を回収し、そして脾細胞を単離する。次いで、脾細胞は、周知
の技術によって、任意の適切なミエローマ細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能
な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）へ融合される。ハイブリドーマを、限定希釈によ
り選択およびクローン化する。次いで、ハイブリドーマクローンを本発明のポリ
ペプチドを結合し得る抗体を分泌する細胞について、当該分野に公知の方法によ
ってアッセイする。一般的に高レベルの抗体を含む腹水を、ポジティブなハイブ
リドーマクローンを用いてマウスを免疫化することにより、産生し得る。
【０１８２】 従って、本発明は、モノクローナル抗体、および本発明の抗体を分泌するハイ
ブリドーマ細胞を培養する工程を含む方法によって産生される抗体を、産生する
方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、ミエローマ細胞を
有する本発明の抗原を用いて免疫化されたマウスから単離された脾細胞を融合す
ることにより、次いで、本発明のペプチドを結合し得る抗体を分泌するハイブリ
ドーマクローンについて、その融合から生じるハイブリドーマをスクリーニング
することにより、産生される。
【０１８３】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により産生し得
る。例えば、本発明のＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは
、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’
）２フラグメントを産生するため）のような酵素を使用して、免疫グロブリン分
子のタンパク質分解性切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメント
は、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１８４】 例えば、本発明の抗体はまた、当該分野に公知の種々のファージディスプレイ
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ方法において、機能的な抗体
ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子
の表面上に提示される。特定の実施形態において、このようなファージを、レパ
ートリー抗体ライブラリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、
ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために利用し得
る。目的の抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、抗原を用い
て、（例えば、標識化抗原、あるいは固体表面または固体ビーズへ結合または捕
捉された抗原を使用して）選択または同定し得る。これらの方法において使用さ
れるファージは、代表的に、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺
伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたは
ジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現された
ｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）ファージ
である。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法
の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１〜５０（１９９５）；Ａｍｅｓ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７〜１８６（１９９５
）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５
２〜９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９〜１８（１９
９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５
７：１９１〜２８０（１９９４）；ＰＣＴ公開 ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４
；ＰＣＴ公開 ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１
０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２
；ＷＯ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，
２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同
第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７
号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，
６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７
３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらのそれぞれは、その全
体が参考として援用される）。
【０１８５】 上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体
をコードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体、または任意の他の所望の抗原
結合フラグメントを作製するために単離および使用され得、そして例えば、以下
に詳細に記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細
菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’お
よびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該
分野で公知の方法を用いて使用され得る。この方法は、例えば、以下に開示され
る方法である：ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、Ｂｉｏ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａ
ｗａｉら、ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（上記の参考文献は
、その全体が参考として援用される）。
【０１８６】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビト
ロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体または
ヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体は、この抗体の異なる部分が異
なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域
およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体を産生す
るための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；および米国特許第５，８
０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号
を参照のこと（これらは、本明細書中でその全体が参照として援用される）。ヒ
ト化抗体は、非ヒト種由来の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫
グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する、非ヒ
ト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域におけるフ
レームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基と置換され、抗原結
合を改変（好ましくは、改善）する。これらのフレームワーク置換は、当該分野
で周知の方法により同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を
同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリング、ならび
に特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によ
る。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍ
ａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）（これらは本明細書中で
その全体が参考として援用される）を参照のこと）。抗体は、例えば、以下を含
む当該分野で公知の種々の技術を用いてヒト化され得る：ＣＤＲ−グラフティン
グ（ｇｒａｆｔｉｎｇ）（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開 ＷＯ９１
／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号お
よび同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または
リサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号
；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉ
ｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１
４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９
４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（
米国特許第５，５６５，３３２号）。
【０１８７】 完全なヒト抗体が、ヒト患者の治療的処置に対して特に望ましい。ヒト抗体は
、当該分野で公知の種々の方法によって作製され得、これらの方法としては、ヒ
ト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプ
レイ方法が挙げられる。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６
，１１１号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３
、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ
９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１（これらの各々は、その全体が
参考として本明細書中に援用される）もまた参照のこと。
【０１８８】 ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。この改変された胚性幹細胞を増殖させ、そして胚盤胞
に微量注入して、キメラマウスを産生する。次に、このキメラマウスを、ヒト抗
体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニッ
クマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または一部
）を用いて通常の様式で免疫する。その抗原に対するモノクローナル抗体は、従
来のハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ
得る。ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間のトランスジェニック
マウスの再編成によってかくまわれ（ｈａｒｂｏｒｅｄ）、そしてその後、クラ
ススイッチングおよび体細胞変異を受ける。従って、そのような技術の使用によ
って、治療的に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の
産生が可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、Ｌｏ
ｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５
−９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産
生するためのこの技術のならびにそのような抗体を産生するためのプロトコール
の詳細な議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２
／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０
５９８ ８７７；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号
；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０
１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８
５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８号を
参照のこと（これらは、その全体が本明細書中に参考として援用される）。さら
に、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａ
ｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のような企業は、上記の技術に類似した技術を
用いて選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し得る。
【０１８９】 選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉ
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される（Ｊｅｓｐｅｒｓら
、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０１９０】 さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて
、本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成するために
順々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥ
Ｂ Ｊ．７（５）：４３７−４４４（１９８９）；ならびにＮｉｓｓｉｎｏｆｆ
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照
のこと）。例えば、結合し、そしてポリペプチドのマルチマー化（ｍｕｌｔｉｍ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ）および／または本発明のポリペプチドのリガンドに対する
結合を競合的に阻害する抗体を用いて、このポリペプチドのマルチマー化および
／または結合ドメインを「模倣し」、そして結果として、ポリペプチドおよび／
またはそのリガンドに結合し、そして中和する抗イディオタイプを生成し得る。
このような中和抗イディオタイプまたはこのような抗イディオタイプのＦａｂフ
ラグメントは、治療レジメンにおいて使用されて、ポリペプチドリガンドを中和
し得る。例えば、このような抗イディオタイプ抗体を使用して、本発明のポリペ
プチドを結合し得るか、そして／またはそのリガンド／レセプターを結合し得、
それによって、その生物学的活性をブロックし得る。
【０１９１】 （抗体をコードするポリヌクレオチド） 本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な条件下またはより低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で（
例えば、上記のような）、抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドへ特異的に
結合する抗体）をコードするポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号２、４、
または６のアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドに結合する抗体をコードする
ポリヌクレオチド、に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【０１９２】 当該分野で公知の任意の方法によって、これらのポリヌクレオチドが得られ得
、そしてこれらポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、決定され得る。例えば
、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、この抗体をコードするポリヌクレ
オチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルされ得（例え
ば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９
４）に記載されるように）、これは、手短に言えば、抗体をコードする配列の部
分を含むオーバーラップするヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチド
のアニーリングおよび連結、ならびに次いでＰＣＲによるこの連結されたオリゴ
ヌクレオチドの増幅を含む。
【０１９３】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら作製され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、
化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブ
ラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の抗体
の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡライブ
ラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））を、例
えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定す
るために、その配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プラ
イマーを使用するＰＣＲ増幅によって、またはその特定の遺伝子配列に特異的な
オリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。ＰＣ
Ｒによって作製された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方法
を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０１９４】 一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位指向性変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を生成するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製
し得る。
【０１９５】 特定の実施形態では、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列
は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を同定するために、当該分野で周知の方法
、例えば、他の重鎖および軽鎖の可変領域の既知のアミノ酸配列を比較して、配
列超可変性領域を決定する方法、によって、調べられ得る。慣用的組換えＤＮＡ
技術を使用して、一つ以上のＣＤＲが、フレームワーク領域内、例えば、上記の
ように、非ヒト抗体をヒト化させるためにヒトフレームワーク領域内に挿入され
得る。このフレームワーク領域は、天然に存在、または共通するフレームワーク
領域であり得、そして好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（ヒトフレ
ームワーク領域の一覧については、例えばＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレ
ームワーク領域およびＣＤＲの組合せによって生成するポリヌクレオチドは、本
発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上で考
察したように、一つ以上のアミノ酸の置換は、フレームワーク領域内で起こり、
そして好ましくは、このアミノ酸置換は、その抗原への抗体の結合を改善する。
さらに、このような方法は、アミノ酸置換させるため、または鎖内ジスルフィド
結合に参加している一つ以上の可変領域システイン残基を欠失させて、一つ以上
の鎖内ジスルフィド結合が欠けた抗体分子を生成させるために、使用され得る。
ポリペプチドに対する他の改変は、本発明および当該分野の技術によって達成さ
れる。
【０１９６】 さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともに、スプライシングすることによる、「
キメラ抗体」（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３
１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：
４５２−４５４（１９８５））の産生のために開発された技術が、使用され得る
。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物の種に由来する分子（
例えばマウスｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有
する分子）であり、例えばヒト化抗体である。
【０１９７】 あるいは、一本鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第４，９４６
，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９９８）；
Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８
７９−５８８３（１９９８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４
４−５４（１９８９））は、一本鎖抗体を産生するために適合され得る。一本鎖
抗体は、アミノ酸架橋を介して、Ｆｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントを連結
し、一本鎖ポリペプチドを生じることによって形成される。Ｅ．ｃｏｌｉにおけ
る機能的Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９９８））。
【０１９８】 （抗体産生の方法） 本発明の抗体は、抗体の合成について当該技術分野で公知の方法によって、特
に化学合成によって、または好ましくは組換え発現技術によって、産生され得る
。
【０１９９】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖、または本発明の一本鎖抗体）の組換え発現は
、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を必要とする。
本発明の、抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはそれらの部分（好ま
しくは重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインを含む）をコードするポリヌクレオチド
が一旦得られれば、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術
を使用する組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。従って、ヌクレオチド配列
をコードする抗体を含むポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製する
ための方法は、本明細書中に記載される。当業者に周知の方法は、抗体コード配
列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するた
めに使用され得る。これらの方法は、例えば，インビトロ組換えＤＮＡ技術、合
成技術、およびインビボ遺伝子組換えを含む。従って、本発明は、本発明の抗体
分子をコードするヌクレオチド配列、またはその重鎖もしくは軽鎖、またはプロ
モーターに作動可能に連結された、重鎖もしくは軽鎖の可変ドメイン、を含む複
製可能ベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコー
ドするヌクレオチド配列を含み（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ ８６／０５８
０７号；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２
２，４６４号を参照のこと。）、そして、この抗体の可変領域は、重鎖または軽
鎖の全体の発現のためにこのようなベクター内にクローニングされ得る。
【０２００】 発現ベクターは、従来の技術によって宿主細胞に移入され、次いでトランスフ
ェクト細胞は、従来の技術によって本発明の抗体を産生するために培養される。
従って、本発明は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、またはその重
鎖もしくは軽鎖、または異種のプロモーターに作動可能に連結された、本発明の
一本鎖抗体を含む宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現のための好ましい実施形態
では、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、下記の詳細のように、免
疫グロブリン分子全体の発現のための宿主細胞において共発現され得る。
【０２０１】 種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベク
ター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用い
て形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のよう
な微生物；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換され
た酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコード
する配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感
染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイ
クウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞
系または抗体をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、
Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノム
に由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳
動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモー
ター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保
有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞
）。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そして
より好ましくは、特に、組換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組
換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由
来の主要最初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わされ
た、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗
体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０
１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（
１９９０））。
【０２０２】 細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タンパク
質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベクタ
ーには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配列が
ｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）
で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ発現
ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１９８
３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ
＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１
９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させるため
に使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そして溶
解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および
結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され得る
。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を
含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は、Ｇ
ＳＴ部分から放出され得る。
【０２０３】 昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体
病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用
される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に
おいて増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例え
ばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモ
ーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０２０４】 哺乳動物宿主細胞においては、多数のウィルスに基づく発現系が利用され得る
。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体
をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロ
モーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、
このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウ
ィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１ま
たはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を
発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１
９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコード
する配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ
開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全
体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性
翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であ
り得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネータ
ー、などの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０２０５】 さらに、宿主細胞系統は、選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、また
は、所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。
タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（
例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は
、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特
徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された外来タ
ンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。こ
の目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の
正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され
得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、
ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８
３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、な
らびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細
胞株を含むが、これらに限定されない。
【０２０６】 組換えタンパク質の長期間の高収率産生、安定発現が好ましい。例えば、安定
に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウィルスの複製起点を含む発現ベ
クターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プ
ロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、
など）、および選択マーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得る。外
来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖させら
れ得、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択マー
カーは、選択に対する耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをその染色体内に
安定に組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、これを今度はクローニ
ングし得、細胞株に拡大され得ることを可能にする。この方法は、抗体分子を発
現する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。このような操作された細
胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリーニング
および評価において、特に有用であり得る。
【０２０７】 多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウィルスチミジンキ
ナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサン
チン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚ
ｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０
２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗ
ｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが限定されず、こ
れらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ
使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の根拠として使
用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗｉｇ
ｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；
Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５
２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する耐性を与える（
Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８
に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−
５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９
１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉ
ｃｏｌ． ３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａ
ｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１
９９３）；Ｍａｙ、１９９３年、ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１
５）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対する耐性を与える（Ｓ
ａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術
の分野で周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に適用
され得、そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋ
ｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、
ＮＹ（１９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）
、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇ
ａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５０：１（１９８１）（これらは
その全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０２０８】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、
ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅ
ｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３
．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこ
と）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能であると、宿主
細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子
のコピーの数を増加する。増幅領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産
生もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７
（１９８３））。
【０２０９】 宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコード
する第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター
）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖
のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択マーカーを含み得る。あ
るいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方のポリペプチ
ドをコードし、そして発現することができる。このような状況において、過剰の
毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである（Ｐｒ
ｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８０））
。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る
。
【０２１０】 一旦本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成されるか
、または組換えにより発現されると、当該分野で公知の、免疫グロブリン分子の
精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、
アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対するアフィニティー
による）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、ま
たはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるかま
たはそうでなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合され
得、精製を容易にする。
【０２１１】 本発明は、本発明のポリペプチド（もしくはその部分、好ましくはこのポリペ
プチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、
もしくは１００個のアミノ酸）に、組換えにより融合されるかまたは化学的に結
合されて（共有結合および非共有結合の両方を含む）、融合タンパク質を生成す
る抗体、を含む。この融合は、直接的である必要はないが、リンカー配列を介し
て起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましく
はこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、
８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例
えば、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチドを
特定の細胞表面のレセプターに特異的な抗体に融合または結合させることによっ
て、特定の細胞型に対して、本発明のポリペプチドを標的にするために、抗体が
使用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または結合される抗体はまた、イン
ビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製方法において使
用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、上記、およびＰＣＴ公開ＷＯ９３／２１
２３２；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ
．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌ
ｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）を参照のこと。こ
れらは、その全体が参考として援用される。
【０２１２】 本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメインに融合または結合された、本
発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗
体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。本発明のポリぺプチ
ドに融合されたこの抗体の部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは部分の
任意の組合せを含み得る。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融
合または結合され得、多量体を形成する。例えば、本発明のポリぺプチドに融合
されたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結合を通して二量体を形成
し得る。より高度の多量体形態は、ポリぺプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に
融合させることによって作製され得る。本発明のポリぺプチドを抗体部分に融合
または結合させるための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特
許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４
６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２
，９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ９
６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１
）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９
５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９
：１１３３７−１１３４１（１９９２）（前記の参考文献はその全体が参考とし
て援用される）を参照のこと。
【０２１３】 上記で考察されたように、ポリぺプチド、ポリぺプチドフラグメント、または
配列番号２の改変体、に対応するポリぺプチドは、このポリぺプチドのインビボ
半減期を増大させるため、または当該分野で公知の方法を使用する免疫学的アッ
セイにおいて使用するために、上記の抗体部分に融合または結合体化され得る。
さらに、配列番号２に対応するポリぺプチドを、上記の抗体部分に融合または結
合体化させて、精製を容易にし得る。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペ
プチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または
軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している（Ｅ
Ｐ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−
８６（１９８８））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有す
る抗体に融合または結合体化される本発明のポリぺプチドもまた、単量体分泌タ
ンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合しそして中
和するのにさらに効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合、融合タン
パク質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改
良された薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ Ａ ２３２，２６２）。あるい
は、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を
欠失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原とし
て使用される場合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の
発見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニ
ストを同定するための高スループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦ
ｃ部分と融合されてきた（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃ
ｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。
【０２１４】 さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするペプチド
のような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカー
アミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクタ
ー（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多
くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に
記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を
提供する。精製のために有用な別のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集
素タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅ
ｌｌ ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグを含むが、これに
限定されない。
【０２１５】 本発明は、診断剤または治療剤に結合体化される、抗体またはそのフラグメン
トをさらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所定の処置レジ
メン（ｒｅｇｉｍｅｎ）の効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生また
は進行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能
な物質と連結させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては
、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、
種々の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金
属イオン、が挙げられる。この検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメン
ト）に対して、直接的または間接的のいずれかで、当該分野で公知の技術を使用
する媒介物（例えば、当該分野で公知のリンカーなど）を介して、連結または結
合体化され得る。例えば、本発明に従う診断薬としての使用のための抗体に結合
体化され得る金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照の
こと。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げら
れ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよ
びアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェ
ロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジク
ロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリト
リンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質
の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；な
らびに、適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまた
は９９Ｔｃが挙げられる。
【０２１６】 さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば
細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン
（例えば、α−エミッタ−（例えば２１３Ｂｉ）など）に結合体化され得る。細
胞毒または細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては
、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジン
Ｄ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔ
ｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌ
ｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン
ジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサン
トロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、
グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロー
ル、およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログ、が挙げら
れる。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプ
リン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５
−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例え
ば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラ
ン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファ
ミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニト
ール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジア
ミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダ
ウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例
えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラ
マイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、
ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、を含む
が、それらに限定されない。
【０２１７】 本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤
または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば
、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであ
り得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、
腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、
血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス性薬剤
（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８
９９号を参照のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参
照のこと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２
３１０５号を参照のこと））、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（例えば、アンジ
オスタチンもしくはエンドスタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリン
ホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「
ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージ
コロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳ
Ｆ」）、または他の増殖因子など）、が挙げられ得る。
【０２１８】 抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免
疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラ
ス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２１９】 このような治療部分を抗体に結合体化する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎ
ｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎ
ｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌ
ｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄ
ｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａ
ｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１
９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒ
ｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ
Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３
０３−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐ
ｅら、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒ
ｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
ｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと
。
【０２２０】 あるいは、抗体は第二の抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（
これは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによ
る記載のような抗体異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得
る。
【０２２１】 単独、あるいは細胞傷害性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投
与される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬と
して使用され得る。
【０２２２】 （免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）） 本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利
用され得る。本発明の遺伝子の翻訳生成物は、細胞特異的マーカーとして、ある
いはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で差示
的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、または
エピトープの組み合わせに対して指向されるモノクロナール抗体は、マーカーを
発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発
現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体を用いて利用
され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁
気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パン
ニング」、ならびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６
６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９
）を参照のこと）が挙げられる。
【０２２３】 これらの技術は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における最少
残留疾患（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））
および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己
」細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にす
る。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖お
よび／または分化を受け得る、造血幹細胞および先祖細胞のスクリーニングを可
能にする。
【０２２４】 （抗体結合についてのアッセイ） 本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の方法により、免疫特異的結合
についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、いくつかのも
のについてだけ名称を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免
疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセ
イ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテイン
Ａ免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が
挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、そ
して当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参考として
援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的な免疫ア
ッセイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが意図
されない）。
【０２２５】 免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼインヒビターおよ
び／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチ
ニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０ま
たはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％
ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２
）、１％ Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する
工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間
）４℃でインキュベートする工程、プロテインＡセファロースビーズおよび／ま
たはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以
上４℃でインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、およ
びＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。目的の抗体
の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析により
、アッセイされ得る。当業者は、抗体の抗原への結合を増加するように、そして
バックグラウンドを減少させるように改変され得るパラメータ（例えば、セファ
ロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれいにする工程）に関して、認め得
る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ
．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。
【０２２６】 ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、ポ
リアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％ ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）中でのそのタンパク質サンプルの電気泳動、そのタンパク質サンプル
をそのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン
のような膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱脂粉
乳を有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希
釈された一次抗体（目的の抗体）を用いてその膜をブロックする工程、洗浄緩衝
液中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質（例
えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるいは放
射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した二次抗体（一次抗体を認
識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いて、その膜をブロックする工程、洗浄緩衝
液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を包含す
る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバックグラウン
ドノイズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、認め得る。ウエ
スタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕ
ｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。
【０２２７】 ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合
した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程
、およびその抗原の存在を検出する工程を包含する。ＥＬＩＳＡにおいて、目的
の抗体は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能
な化合物に結合した第二の抗体（目的の抗体を認識する）が、ウェルに添加され
得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコー
ティングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した第二の抗体が、コー
ティングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は
、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該
分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、認め得る。ＥＬ
ＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９
４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，１１．２．１を参照のこと。
【０２２８】 抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆ
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識抗原
（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での、目的の
抗体を用いるインキュベーション、および標識抗原に結合した抗体の検出を含む
。特定の抗原に対する目的の抗体の親和性、および結合オフレートは、スキャッ
チャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合はま
た、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量の
非標識の第二の抗体の存在下で、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に
結合した目的の抗体とともにインキュベートされる。
【０２２９】 （治療用途） 本発明はさらに、抗体ベースの治療に関し、この治療は、１つ以上の開示され
た疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そし
て最も好ましくはヒトの患者に、本発明の抗体を投与する工程を包含する。本発
明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載されるような、それ
らのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコー
ドする核酸（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログ
および誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、これらに
限定されない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／ま
たは活性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載される任意の１つ
以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害ま
たは予防するために使用され得る。本発明のポリペプチドの異常な発現および／
または活性に関連した疾患、障害または状態の処置および／または予防は、それ
らの疾患、障害または状態に関連した症状を緩和する工程を含むが、これに限定
されない。本発明の抗体は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載
されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０２３０】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の要約は、身体内で局所的にまたは
全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクター細胞
（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、本発明
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これらのアプ
ローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供される教
示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタリング
の目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわかる。
【０２３１】 本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、ある
いはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７のような）と組み合わせて有利に利用され得る。
【０２３２】 本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、
フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト
の患者に投与される。
【０２３３】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に
関する免疫アッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために、本発
明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／または強
力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメント、
またはそれらの領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント
、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（
そのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性として
は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４
Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、
５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、
１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１
Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×
１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、および１０−１５Ｍより小さ
い解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０２３４】 （遺伝子治療） 特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０２３５】 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。
【０２３６】 遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；および
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ
，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０２３７】 好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核
酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラ
タンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、従って抗体をコードする核酸の染
色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；
Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいはこの
核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはそのフラ
グメントを含む。
【０２３８】 核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロ
で核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これ
らの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子
治療としてそれぞれ公知である。
【０２３９】 特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた生成物を産生する。これは、当該分野で公知
の多数の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部分として構築し
、そしてそれを（例えば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウ
イルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いる感染
により）細胞内になるように投与することにより、あるいは、裸のＤＮＡの直接
注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌ
ｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質または細胞表面のレセ
プターでコーティングするか、もしくは薬剤をトランスフェクトすることにより
、あるいは、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル中へのカプセル化に
より、あるいは、それらを核に入ることが公知であるペプチドと結合させて投与
することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合
させて投与することにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプターを特異
的に発現する細胞の型を標的にするために用いられ得る）などのいずれかにより
達成され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、こ
こで、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎ
ｉｃ）ウイルス性ペプチドを含み、この核酸がリソゾーム分解を回避することを
可能にする。さらに別の実施形態において、核酸は、特定のレセプターを標的化
することにより、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的化さ
れ得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６
３５号；同第ＷＯ９２／２０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ
９３／２０２２１号を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内部に導入され得
、そして相同組換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（
ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
【０２４０】 特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルス
ベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）
を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正確
なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの正確な組込みのために必要な構成要
素を含む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ以
上のベクター中にクローニングされ、これは、患者内への遺伝子の送達を容易に
する。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉ
ｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細胞を化学療
法に対してより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を造血性幹細胞に送達するた
めの、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療
におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である
：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９
９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓ
ａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓ
ｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３
：１１０−１１４（１９９３）。
【０２４１】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスベースの送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系
、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞を感染すること
ができるという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ ３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子治
療の概説を示す。Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３
−１０（１９９４）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移すためのアデノウイ
ルスベクターの使用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の
例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９
９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）
；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２
３４（１９９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。
好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
【０２４２】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されて
きた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：
２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０２４３】 遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を包含する。通常、移入
の方法は、選択可能なマーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入さ
れた遺伝子を取り込みそして発現する細胞を単離するために選沢下に置かれる。
次いで、それらの細胞は患者に送達される。
【０２４４】 この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクショ
ン、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感
染、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル媒介の遺伝子移入、スフ
ェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野におい
て多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，
Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８５）を参照のこと）、
そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないなら
ば、本発明に従って使用され得る。この技術は、細胞への核酸の安定した移入を
提供するべきであり、その結果、この核酸は、細胞により発現可能であり、好ま
しくは、その細胞の子孫により遺伝性でかつ発現可能である。
【０２４５】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、当業者により決定され得る。
【０２４６】 遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、
ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単
球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；様々な幹
細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍
帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
【０２４７】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。
【０２４８】 遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、そして次いで組み換え細胞は、治療的効果のためにインビボ
で投与される。具体的な実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる
。インビトロで単離され得、そしてインビトロで維持され得る任意の幹細胞およ
び／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（
例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅ
ｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ
，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔ
ｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７
７１（１９８６）を参照のこと）。
【０２４９】 特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、コード
領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発
現は、適切な転写誘導因子の存在または不在を制御することにより制御可能であ
る。
【０２５０】 本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試
験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性
を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプル
に対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対す
る化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセ
イおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決
定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定する
ために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイ
が挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養物において増殖し、そ
して化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サン
プルに対するそのような化合物の効果が観察される。
【０２５１】 （治療的／予防的な投与および組成物） 本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい
局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかま
たは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被験体は好ましくは、
ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限
定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましく
はヒトである。
【０２５２】 化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方および投与
方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で
以下に記載されたものの中から選択され得る。
【０２５３】 様々な送達システムが公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用
いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発
現が可能な組換え細胞中でのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（
例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３
２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部とし
ての核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下
、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合
物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注
射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など
）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒
に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬
学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を
包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り
付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入す
ることが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化
剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【０２５４】 具体的な実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必
要な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではない
が、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み
合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプ
ラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよ
うな膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達
成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパ
ク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。
【０２５５】 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
【０２５６】 さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出システム
中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇ
ｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅ
ｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８
：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：
５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用い
られ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌ
ｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰ
ｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３
５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（
１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出
システムは、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部の
みを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，
１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
【０２５７】 他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０２５８】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態にお
いて、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そして
それが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクタ
ーの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接
注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプター
もしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入るこ
とが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、
Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８
６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタン
パク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細
胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に
組み込まれ得る。
【０２５９】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において
、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにお
ける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または
米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。
用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦
形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石
油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大
豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬
学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水
溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可
能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤とし
ては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ
、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン
酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン
、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるな
らば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組
成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物
などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのよ
うなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級の
マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン
ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得
る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される
。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、
適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供す
る。処方物は、投与形態に適するべきである。
【０２６０】 好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混
合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓ
ａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない
濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物
は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る
。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、
注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２６１】 本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの
のようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモ
ニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、
２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののよ
うなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０２６２】 この処置（本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する
疾患または障害の抑制および予防）において効果的である本発明の化合物の量は
、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要
に応じて、使用して最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において
使用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さ
に依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきであ
る。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線
から外插され得る。
【０２６３】 抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期
を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可
能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例えば、
脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよび組織浸
透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。
【０２６４】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。
【０２６５】 （診断および画像化） 目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患および／または障害を検出、診断また
はモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出について
提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用し
て、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、
および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工
程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイさ
れたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。
【０２６６】 本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これ
によって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺
伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来
の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を
示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供
し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること
、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらな
る進行を予防する。
【０２６７】 本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用し
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；
Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（
１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗
体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベ
ント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙げられる。適
切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例え
ば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１
２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム
（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミ
ノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、な
らびにビオチンが挙げられる。
【０２６８】 本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒ
トにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出
および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチド
に特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下
に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現する被験体内
の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結
合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与
後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；および
ｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、このバッ
クグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペプ
チドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バック
グラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と、検出さ
れた標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され得る。
【０２６９】 被験体の大きさおよび使用される画像化システムが、診断の画像を産生するた
めに必要である画像化部分の量を決定するということは、当該分野において理解
される。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注入される放射能の量
は、通常、約５〜２０ｍキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。次いで、標識化抗
体または標識化抗体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置で優先
的に蓄積する。インビボでの腫瘍の画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「
Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌ
ｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔ
ｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ、第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ
．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９
８２）において、記載される。
【０２７０】 使用する標識の型および投与の様式を含む、いくつかの変動に依存して、標識
化分子が被験体中の部位に優先的に濃縮することを可能にするため、および結合
していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるための投与後の
時間間隔は、６〜４８時間もしくは６〜２４時間または６〜１２時間である。別
の実施形態において、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間で
ある。
【０２７１】 １つの実施形態において、疾患および障害をモニターすることは、疾患または
障害（ｄｉｓｅａｓｅ）を診断するための方法を繰り返すことによって実施され
る（例えば、最初の診断から１ヶ月後、最初の診断から６ヶ月後、最初の診断か
ら１年後、など）。
【０２７２】 標識化分子の存在は、インビボスキャニングについての当該分野で公知の方法
を使用して患者中で検出され得る。これらの方法は、使用される標識の型に依存
する。当業者は、特定の標識を決定するための適切な方法を決定することができ
る。本発明の診断方法において使用され得る方法およびデバイスは、コンピュー
タ連動断層撮影法（ＣＴ）、体全体のスキャン（例えば、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏ
ｎ）放射断層撮影法（ＰＥＴ））、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波診
断法を含むが、これらに限定されない。
【０２７３】 特定の実施形態において、分子を放射性同位体で標識し、そして放射応答外科
的機器（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔ）（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）
を使用して患者中で検出する。別の実施形態において、分子を蛍光化合物で標識
し、そして蛍光応答スキャニング機器を使用して患者中で検出する。別の実施形
態において、分子を陽電子射出金属で標識し、そして陽電子射出断層撮影法を使
用して患者中で検出する。さらに別の実施形態において、分子を常磁性標識で標
識し、そして磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して患者中で検出する。
【０２７４】 （キット） 本発明は、上記の方法において使用され得るキットを提供する。１つの実施形
態において、キットは、１つ以上の容器において、本発明の抗体、好ましくは精
製した抗体を備える。特定の実施形態において、本発明のキットは、エピトープ
を含む実質的に単離されたポリペプチドを備える。このエピトープは、キット中
に含まれる抗体と特異的に免疫反応する。好ましくは、本発明のキットは、目的
のポリペプチドと反応しないコントロール抗体をさらに備える。別の特定の実施
形態において、本発明のキットは、目的のポリペプチドへの抗体の結合を検出す
るための手段を備える（例えば、この抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍光化
合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物）に結合体化され得るか、ま
たは一次抗体を認識する二次抗体が、検出可能な基質と結合体化され得る）。
【０２７５】 本発明の別の特定の実施形態において、キットは、増殖性および／または癌性
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清のスク
リーニングに使用するための診断キットである。このようなキットは、目的のポ
リペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、エ
ピトープを含む実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。このエピトー
プは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応する。さら
に、このようなキットは、抗原に対する上記の抗体の結合を検出するための手段
を備える（例えば、抗体は、蛍光化合物（例えば、フローサイトメトリーにより
検出され得るフルオレセインまはたローダミン）と結合体化され得る）。特定の
実施形態において、キットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化
学的に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。キットのポリペプチド抗原はま
た、固体支持体に付着され得る。
【０２７６】 より特定の実施形態において、上記のキットの検出手段は、上記のポリペプチ
ド抗原が付着する固体支持体を備える。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識化抗ヒト抗体を備え得る。この実施形態において、ポリペプチド抗原へ
の抗体の結合は、上記のレポーター標識化抗体の結合によって検出され得る。
【０２７７】 さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む血
清のスクリーニングにおいて使用するための、診断キットを含む。この診断キッ
トは、ポリペプチド抗原またはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応する実
質的に単離された抗体、およびこの抗体へのこのポリヌクレオチド抗原またはポ
リペプチド抗原の結合を検出するための手段を備える。１つの実施形態において
、抗体は、固体支持体に付着される。特定の実施形態において、抗体は、モノク
ロナール抗体であり得る。キットのこの検出手段は、二次標識化モノクロナール
抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識化競合抗原を
含み得る。
【０２７８】 １つの診断構成において、試験血清を、本発明の方法により得られる表面結合
抗原を有する固相試薬と反応させる。特定の抗原抗体とこの試薬との結合、およ
び洗浄することによる結合していない血清成分の除去の後、この試薬をレポータ
ー標識化抗ヒト抗体と反応させて、固体支持体上に、結合した抗抗原抗体の量に
比例して、この試薬にレポーターを結合させる。この試薬を再び洗浄して、結合
していない標識化抗体を除去し、そしてこの試薬と会合するレポーターの量を決
定する。代表的に、レポーターは、酵素であり、この酵素は、適切な蛍光性基質
、発光性基質または比色用基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在
下で固相をインキュベートすることにより検出される。
【０２７９】 上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料（
例えば、高分子ビーズ、計深棒、９６ウェルプレートまたは濾過材料）に付着さ
せるための公知の技術により調製される。これらの付着方法としては、一般的に
、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化学的に活性な
基（例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基）と
のタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）（代表的
には、遊離アミン基を介する）が挙げられる。あるいは、ストレプトアビジンで
コートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され得る。
【０２８０】 従って、本発明は、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供
する。このキットは、一般的に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、お
よび表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒト
抗体を備える。
【０２８１】 （融合タンパク質） ニューロペプチドレセプターポリペプチドは、融合タンパク質を産生するため
に使用され得る。例えば、ニューロペプチドレセプターポリペプチドは、第２の
タンパク質と融合される場合、抗原性タグとして使用され得る。ニューロペプチ
ドレセプターポリペプチドに対して惹起される抗体は、ニューロペプチドレセプ
ターに結合することによって、第２のタンパク質を間接的に検出するために使用
され得る。さらに、分泌されるタンパク質は、細胞位置を輸送シグナルに基づい
て標的化するので、ニューロペプチドレセプターポリペプチドは、他のタンパク
質に一旦融合されると標的化分子として使用され得る。
【０２８２】 ニューロペプチドレセプターポリペプチドと融合され得るドメインの例は、異
種シグナル配列のみならず、また他の異種機能性領域をも含む。融合は、必ずし
も直接的である必要はないが、リンカー配列を介して起こり得る。
【０２８３】 特定の好ましい実施形態において、ニューロペプチドレセプタータンパク質は
、このニューロペプチドレセプターポリペプチドがｍ−ｎとして先に記載される
ペプチドである、融合ポリペプチドを含む。好ましい実施形態において、本出願
は、本明細書中に引用される特定のＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体の
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列に対して、少なくとも
９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の核酸分子に関する
。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／
または改変体を含む）はまた、本発明により含まれる。
【０２８４】 さらに、融合タンパク質はまた、ニューロペプチドレセプターポリペプチドの
特徴を改良するために操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミ
ノ酸の領域が、宿主細胞からの精製または続く取り扱いおよび貯蔵の間の安定性
および持続性を改良するためにニューロペプチドレセプターポリペプチドのＮ末
端へ付加され得る。また、ペプチド部分は精製を容易にするためにニューロペプ
チドレセプターポリペプチドへ付加され得る。このような領域は、ニューロペプ
チドレセプターポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。ポリペプチドの取
り扱いを容易にするためのペプチド部分の付加は、当該分野でよく知られる慣用
の技術である。
【０２８５】 当業者に理解されるように、本発明のポリペプチドおよび上記のエピトープ保
有フラグメントは、異種ポリペプチド配列と組み合わされ得る。例えば、本発明
のポリペプチドは、異種ポリペプチド配列に融合され得る。例えば、本発明のポ
リペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメ
インまたはそれらの部分（ドメイン全体もしくはその部分の両方を含む、ＣＨ１
、ＣＨ２、ＣＨ３、およびそれらの任意の組み合わせ）と融合され得、キメラポ
リペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてイン
ビボでの半減期の増大を示す。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４−ポリペプチ
ドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の
定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載する（ＥＰ ３９４
，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４〜８６（１９
８８））。ジスルフィド結合二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する融合タン
パク質はまた、単量体ポリペプチドまたはそれらのタンパク質フラグメント単独
よりも、他の分子の結合および中和においてより効果的であり得る（Ｆｏｕｎｔ
ｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８−３９６４（１９
９５））。これらの融合タンパク質をコードする核酸を含むかまたはそれらから
なるポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２８６】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリペプチド（フラグメントを含む）お
よび特異的エピトープは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの部分と組
み合わされ、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を
容易にし、そしてインビボでの半減期の増大を示す。１つの報告された例は、ヒ
トＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリ
ンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記
載する（ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３
１：８４〜８６（１９８８））。ジスルフィド結合二量体構造（ＩｇＧに起因す
る）を有する融合タンパク質はまた、単量体ポリペプチドまたはそれらのタンパ
ク質フラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和においてより効果的で
あり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９
５８−３９６４（１９９５））。
【０２８７】 同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ国対応特許第２０４５８６９
号）は、別のヒトタンパク質またはその部分とともに免疫グロブリン分子の定常
領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク
質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良さ
れた薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。あるいは
、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠
失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として
使用される場合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発
見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニス
トを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦ
ｃ部分と融合されてきた（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒ
ｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照の
こと）。
【０２８８】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリペプチドはマーカー配列（例えば、
融合されたニューロペプチドレセプターの精製を容易にするペプチド）に融合さ
れ得る。好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけｐＱＥ
ベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈ
ａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグのような、ヘキ
サ−ヒスチジンペプチドであり、これらの多くのベクターは市販されている。例
えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：
８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合
タンパク質の都合の良い精製を提供する。精製のために有用な別のペプチドタグ
である「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトー
プに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））。
【０２８９】 従って、任意のこれら上記の融合物は、ニューロペプチドレセプターポリヌク
レオチドまたはポリペプチドを使用して操作され得る。
【０２９０】 （ニューロペプチドレセプターの組換え産生および合成産生） 本発明はまた、本発明の単離されたニューロペプチドレセプターＤＮＡ分子を
含むベクター、そのベクターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術お
よび合成技術によるそのポリペプチドまたはフラグメントの産生に関する。例え
ば、ベクターは、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、
またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コ
ンピテント、または複製欠損であり得る。後者の場合、一般にウイルス増殖は、
宿主細胞を補完する（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）際にのみ生じる。
【０２９１】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために
選択マーカーを含むベクターに連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、
リン酸カルシウム沈澱物のような沈澱物、または荷電脂質との複合体において導
入される。ベクターがウイルスである場合、ウイルスベクターは、適切なパッケ
ージング細胞株を使用してインビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞
に形質導入され得る。
【０２９２】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター
（いくつか挙げれば、例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌ
ａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｐｈｏＡプロモーターおよびｔａｃプ
ロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーター、なら
びにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである
。他の適切なプロモーターは当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開
始、転写終結のための部位、および転写領域において、翻訳のためのリボソーム
結合部位を含む。構築物によって発現される転写物のコード部分は、好ましくは
、始めに翻訳開始コドン、および翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置さ
れる終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【０２９３】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカー
を含む。このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクター
ゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌
において培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐
性遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ
、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉ
ｕｍ細胞）；酵母細胞のような真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ登録
番号２０１１７８））；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およ
びＢｏｗｅｓメラノーマ細胞のような動物細胞；ならびに植物細胞を含むが、こ
れらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は、当
該分野で公知である。
【０２９４】 細菌における使用のために好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６
０およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６
ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２
３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）を含む。好ましい真核生物ベクターの
中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳ
ＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。酵母系における
使用のために好ましいベクターは、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ
、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ
９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐ
ＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂａｄ
，ＣＡから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なベク
ターは当業者に容易に明らかである。
【０２９５】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によっ
てもたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）のような多く
の標準的な研究室マニュアルに記載される。ニューロペプチドレセプターポリペ
プチドは、実際、組換えベクターを欠損する宿主細胞によって発現され得ること
が特に意図される。
【０２９６】 ニューロペプチドレセプターポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエ
タノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホス
ホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよ
びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から
回収され得、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィ
ー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために使用される。
【０２９７】 ニューロペプチドレセプターポリペプチド（および好ましくは、分泌形態）は
また、以下から回収され得る：直接単離されるかまたは培養されるかにかかわら
ず、体液、組織および細胞を含む天然の供給源から精製される産物；化学的合成
手順の産物；ならびに、例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞
、および哺乳動物細胞を含む、原核生物宿主または真核生物宿主から組換え技術
によって産生された産物。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、
ニューロペプチドレセプターポリペプチドは、グリコシル化されてもよく、また
はグリコシル化されていなくてもよい。さらに、ニューロペプチドレセプターポ
リペプチドはまた、宿主媒介プロセスの結果として、いくつかの場合において、
最初の改変されたメチオニン残基を含み得る。従って、一般に、翻訳開始コドン
によってコードされるＮ末端メチオニンが、すべての真核生物細胞における翻訳
後の任意のタンパク質から高い効率で除去されることが、当該分野において周知
である。ほとんどのタンパク質においてＮ末端メチオニンはまた、ほとんどの原
核生物において効率的に除去されるが、いくつかのタンパク質について、この原
核生物除去プロセスは、Ｎ末端メチオニンが共有結合するアミノ酸の性質に依存
して、非効率的である。
【０２９８】 １つの実施形態において、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、真核細胞
系において、ニューロペプチドレセプタータンパク質を発現させるために使用さ
れる。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、メタノールをその唯一の炭素供給源
として代謝し得るメチル栄養性（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母である。
メタノール代謝経路における主要な工程は、Ｏ２を使用してのホルムアルデヒド
へのメタノールの酸化である。この反応は、酵素アルコールオキシダーゼによっ
て触媒される。その唯一の炭素供給源としてメタノールを代謝するために、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｏ２に対するアルコールオキシダーゼの比較的
低い親和性に部分的に起因して、高レベルのアルコールオキシダーゼを生成する
。結果的に、主要な炭素供給源としてメタノールに依存する増殖培地において、
２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）のうちの１つのプロモーター
領域は、非常に活性である。メタノールの存在下で、ＡＯＸ１遺伝子から産生さ
れるアルコールオキシダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける総可
溶性タンパク質のうちのおよそ３０％までを含む。Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１１１〜２１（１９８５）；Ｋｏｕｔｚ，Ｐ
．Ｊ．ら、Ｙｅａｓｔ ５：１６７〜７７（１９８９）；Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．
Ｆ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３８５９〜７６（１９８７）。
従って、ＡＯＸ１調節配列の全てまたは一部の転写調節下の異種コード配列（例
えば、本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドなど）は、メタノ
ールの存在下で増殖したＰｉｃｈｉａ酵母において、非常に高レベルで発現され
る。
【０２９９】 １つの例において、プラスミドベクターｐＰＩＣ９Ｋは、「Ｐｉｃｈｉａ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ」，Ｄ．Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪ．Ｃｒｅｇｇ編（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ
Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８）において本質的に記載されるよ
うに、Ｐｉｃｈｅａ酵母系において、本明細書中に示されるように本発明のニュ
ーロペプチドレセプターポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させるために使
用される。この発現ベクターは、マルチクローニング部位の上流に位置するＰｉ
ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓアルカリホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペ
プチド（すなわち、リーダー）に連結された強力なＡＯＸ１プロモーターによっ
て、本発明のニューロペプチドレセプタータンパク質の発現および分泌を可能に
する。
【０３００】 多くの他の酵母ベクター（例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅ
ｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈａ、ｐＰ
ＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ
、およびＰＡＯ８１５）は、当業者が容易に理解するように、提案された発現構
築物が必要とされる場合インフレームのＡＵＧを含む転写、翻訳、分泌（所望さ
れる場合）などの適切に配置されたシグナルを提供する限り、ｐＰＩＣ９Ｋの代
わりに使用され得る。
【０３０１】 別の実施形態において、異種コード配列（例えば、本発明のニューロペプチド
レセプターポリヌクレオチドなど）の高レベルの発現は、本発明の異種ポリヌク
レオチドを発現ベクター（例えば、ｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺａｌｐｈａなど
）中にクローニングし、そしてメタノールの非存在下で酵母培養物を増殖させる
ことによって達成され得る。
【０３０２】 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター
で遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの
産生に関する。
【０３０３】 宿主細胞は、本発明のベクター（これは、例えば、クローニングベクターまた
は発現ベクターであり得る）で遺伝子操作（形質導入または形質転換またはトラ
ンスフェクト）されている。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、
ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化
するために、形質転換体を選択するために、またはニューロペプチドレセプター
遺伝子を増幅するために適切に改変された従来の栄養培地中で培養され得る。
【０３０４】 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によってポリペプチドを産生するた
めに使用される。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現す
るための種々の発現ベクターの任意の１つに含まれ得る。このようなベクターと
しては、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列（例えば
、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵
母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせ由来のベクター、
ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮
性狂犬病ウイルス））が挙げられる。しかし、任意の他のベクターが、宿主にお
いて複製可能かつ生存可能である限り、使用され得る。
【０３０５】 適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によってベクターに挿入され得る。一般に、
ＤＮＡ配列は、当該分野で公知の手順によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部
位に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内にあるとみ
なされる。
【０３０６】 発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡの合成を指向する適切な発現制
御配列（プロモーター）と作動可能に連結される。このようなプロモーターの代
表的な例として、以下が挙げられ得る：ＬＴＲのプロモーターまたはＳＶ４０プ
ロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージλＰＬプロモーター
、および原核生物細胞もしくは真核生物細胞またはそれらのウイルスにおいて遺
伝子の発現を制御することが公知の他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻
訳の開始のためのリボゾーム結合部位、および転写ターミネーターを含む。ベク
ターはまた、発現を増幅するために適切な配列を含み得る。
【０３０７】 さらに、発現ベクターは、好ましくは１つ以上の選択マーカー遺伝子（例えば
、真核生物細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、あ
るいは例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性
）を含み、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型の特徴を提供する。
【０３０８】 上記のような適切なＤＮＡ配列を含むベクターおよび適切なプロモーターまた
は制御配列は、宿主がタンパク質を発現することを可能にするために適切な宿主
を形質転換するために使用され得る。
【０３０９】 適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのよう
な細菌細胞；酵母細胞のような真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳ
ｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９のような昆虫細胞；ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、また
はＢｏｗｅｓ黒色腫細胞のような動物細胞；アデノウイルス；植物細胞など。適
切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると見なされる。
【０３１０】 より詳細には、本発明はまた、上に広範に記載されるように一つ以上の配列を
含む組換え構築物を含む。この構築物は、正方向または逆方向で、本発明の配列
が挿入されたベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）を含む。
この実施形態の好ましい局面において、この構築物は、例えば、この配列と作動
可能に連結されたプロモーターを含む調節配列をさらに含む。多数の適切なベク
ターおよびプロモーターが当業者に公知であり、そして市販されている。以下の
ベクターが、例示のために提供される。細菌：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ
−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ
１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６
ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、
ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）。真核生物：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１
、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶ
Ｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、任意の他のプラスミドまたはベクターは、
それらが宿主において複製可能かつ生存可能である限り使用され得る。
【０３１１】 プロモーター領域は、選択マーカーを有するＣＡＴ（クロラムフェニコールト
ランスフェラーゼ）ベクターまたは他のベクターを用いて任意の所望の遺伝子か
ら選択され得る。２つの適切なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７で
ある。特定の名づけられた細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ
７、ｇｐｔ、λ ＰＲ、ＰＬ、ｔｒｐが含まれる。真核生物プロモーターは、以
下を含む：ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、
ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、レトロウイルス由来の
ＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター。適切なベクターおよ
びプロモーターの選択は、十分に当該分野の通常のレベル内である。
【０３１２】 さらなる実施形態において、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する
。この宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核
生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は、原核生物細
胞（例えば、細菌細胞）であり得る。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カル
シウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクショ
ン、またはエレクトロポレーションにより達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．、Ｄ
ｉｂｎｅｒ，Ｍ．、Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【０３１３】 宿主細胞中のこの構築物を従来の様式で使用して、組換え配列によりコードさ
れる遺伝子産物を産生する。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチ
ド合成機により合成的に産生され得る。
【０３１４】 本発明のポリペプチドのフラグメントは、対応する全長ポリペプチドを、ペプ
チド合成によって作製するために使用され得、それによって、これらのフラグメ
ントは、全長ポリペプチドを作製するための中間体として使用され得る。本発明
のポリペプチドのフラグメントは、類似の様式で、本発明の全長ポリヌクレオチ
ドを合成するために使用される。
【０３１５】 成熟タンパク質が、適切なプロモーターの制御下で哺乳動物細胞、酵母、細菌
、または他の細胞において発現され得る。細胞を含まない翻訳系もまた利用して
、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用してそのようなタンパク質を産
生し得る。原核生物宿主および真核生物宿主で用いる適切なクローニングベクタ
ーおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８９）（この開示は、本明細書中に参
考として援用される）に記載されている。
【０３１６】 高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベク
ターへのエンハンサー配列の挿入により増加される。エンハンサーは、その転写
を増加するためにプロモーター上で作用する、通常、約１０〜３００ｂｐのＤＮ
Ａのｃｉｓ作用性のエレメントである。例としては、１００〜２７０ｂｐの複製
起点の後側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエ
ンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルス
エンハンサーが挙げられる。
【０３１７】 一般的に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点
および選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＲＰ１遺伝子）ならびに下流の構造配列の転写を指
向する高発現遺伝子に由来するプロモーターを含む。このようなプロモーターは
、例えば、とりわけ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ａ−因子、酸
性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質のような糖分解酵素をコードす
るオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳の開始配列および終結配列、お
よび好ましくは細胞周辺腔または細胞外の培地中への翻訳されたタンパク質の分
泌を指向し得るリーダー配列と適切な段階で構築される。必要に応じて、異種配
列は、所望の特性（例えば、安定化、または発現された組換え産物の精製の単純
化）を与えるＮ末端識別ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
【０３１８】 細菌を使用するための有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターを用いて
読むことが可能な段階（ｏｐｅｒａｂｌｅ ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にお
いて適切な翻訳の開始および終結のシグナルとともに所望のタンパク質をコード
する構造ＤＮＡ配列を挿入することにより構築される。ベクターは、一つ以上の
表現型選択マーカー、およびベクターの保持を保証し、そして必要であれば、宿
主中での増幅を提供する複製起点を含む。形質転換に適切な真核生物宿主は、Ｅ
．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種々の種が含まれるが、選
択のために他の宿主もまた利用され得る。
【０３１９】 限定することなく、代表的な例として、細菌を使用するための有用な発現ベク
ターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺
伝的エレメントを含む市販のプラスミド由来の選択マーカーおよび細菌の複製起
点を含み得る。このような市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄ
ｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ
、ＵＳＡ）を含む。これらのｐＢＲ３２２の「骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）」部分
は、適切なプロモーターおよび発現される構造配列と組み合わされる。
【０３２０】 適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主細胞の増殖に続いて、
選択されたプロモーターが、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導
）によって誘導され、そして細胞が、さらなる期間培養される。
【０３２１】 細胞は、典型的に、遠心分離によって収集され、物理的または化学的手段によ
って破壊され、そして得られる粗抽出物が、さらなる精製のために保持される。
【０３２２】 タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、任意の簡便な方法（凍結−解凍
のサイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む）により
破壊され得、このような方法は当業者に周知である。
【０３２３】 種々の哺乳動物細胞培養系もまた使用され、組換えタンパク質を発現し得る。
哺乳動物発現系の例は、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株（Ｇｌｕｚｍａｎ
（Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１））により記載される）、および適合可能
なベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、Ｃ１２７細胞株、３Ｔ３細胞株、
ＣＨＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、およびＢＨＫ細胞株）を含む。哺乳動物発現ベ
クターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサーを含み、そして任
意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよび
アクセプター部位、転写終結配列、および５’隣接非転写配列もまた含む。ＳＶ
４０スプライス部位およびポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を使用して
、要求される非転写遺伝エレメントを提供し得る。
【０３２４】 本発明のニューロペプチドレセプターポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱
またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー
、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む方法によって組換え細胞培養物か
ら回収され、そして精製され得る。必要ならば、タンパク質の再折り畳み工程が
、成熟タンパク質の配置を完全にする際に、使用され得る。最後に、高速液体ク
ロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が最後の精製工程のために用いられ得る。
【０３２５】 本発明のニューロペプチドレセプターポリペプチドは、天然の産物であり得る
か、化学合成手順の産物であり得るか、原核生物または真核生物の宿主（例えば
、培養中の細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞に
よって）から組換え技術によって、産生され得る。組換え産生手順において用い
られる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていてもよ
く、またはグリコシル化されていなくてもよい。本発明のポリペプチドはまた、
開始メチオニン残基を含み得る。
【０３２６】 本発明はまた、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドを含むベクター
、宿主細胞、および組換え技術によるポリペプチドの産生に関連する。例えば、
ベクターは、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、また
はレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピ
テント、または複製欠損であり得る。後者の場合、一般的にウイルス増殖は、補
完性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）宿主細胞にのみ生じる。
【０３２７】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために
選択マーカーを含むベクターに連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、
リン酸カルシウム沈澱物のような沈澱物、または荷電脂質との複合体において導
入される。ベクターがウイルスである場合、このベクターは、適切なパッケージ
ング細胞株を使用してインビトロでパッケージングされ、次いで宿主細胞に形質
導入され得る。
【０３２８】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター
（いくつか挙げれば、例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌ
ａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｐｈｏＡプロモーターおよびｔａｃプ
ロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーター、なら
びにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである
。他の適切なプロモーターは当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開
始、転写終結のための部位、および転写領域において、翻訳のためのリボソーム
結合部位を含む。この構築物によって発現される転写物のコード部分は、好まし
くは、始めに翻訳開始コドン、および翻訳されるべきポリペプチドの末端に適切
に位置される終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【０３２９】 示されたように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ
葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉ
および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイ
シン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代
表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真
菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細
胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞
、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植物細胞
が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培
地および条件は当該分野で公知である。
【０３３０】 細菌における使用のために好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６
０およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６
ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；およびｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３
−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）を含む。好ましい真核生物ベクターの中
には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ
およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。他の適切なベクタ
ーは、当業者に容易に明らかである。
【０３３１】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によっ
てもたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）のような多く
の標準的研究室マニュアルに記載される。ニューロペプチドレセプターポリペプ
チドは、実際、組換えベクターを欠損する宿主細胞によって発現され得ることが
特に意図される。
【０３３２】 ニューロペプチドレセプターポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエ
タノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホス
ホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよ
びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から
回収され得、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィ
ー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために使用される。
【０３３３】 ニューロペプチドレセプターポリペプチド、および好ましくは分泌形態はまた
、以下から回収され得る：直接単離されるかまたは培養されるかにかかわらず、
体液、組織および細胞を含む天然の供給源から精製された産物；化学的合成手順
の産物；ならびに、例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、お
よび哺乳動物細胞を含む、原核生物宿主または真核生物宿主から組換え技術によ
って産生された産物。組換え産生手順に使用される宿主に依存して、ニューロペ
プチドレセプターポリペプチドは、グリコシル化されてもまたはグリコシル化さ
れていなくてもよい。さらに、ニューロペプチドレセプターポリペプチドはまた
、宿主媒介プロセスの結果として、いくつかの場合において、最初の改変された
メチオニン残基を含み得る。従って、一般に、翻訳開始コドンによってコードさ
れるＮ末端メチオニンが、すべての真核生物細胞における翻訳後の任意のタンパ
ク質から高い効率で除去されることは当該分野において周知である。ほとんどの
タンパク質においてＮ末端メチオニンもまた、ほとんどの原核生物において効果
的に除去されるが、いくつかのタンパク質について、この原核生物除去プロセス
は、Ｎ末端メチオニンが共有結合するアミノ酸の性質に依存しており、非効率的
である。
【０３３４】 本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加え
て、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次（ｐｒｉｍａｒ
ｙ）宿主細胞、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）宿主細胞、および不死化宿主細胞を
含む。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、ニューロペプチドレセ
プターコード配列）を欠失または置換するように操作されており、そして／また
は本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドと作動可能に連結され
た遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含むように操作され、そし
て内因性のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドを活性化、変更、およ
び／または増幅する。例えば、当該分野で公知の技術は、相同組換えを介して、
異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）ならびに内
因性ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド配列を作動可能に連結するた
めに使用され得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，
６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際公開第ＷＯ ９６／
２９４１１号；１９９４年８月４日に公開された国際公開第ＷＯ ９４／１２６
５０号；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと。これらの開示の各々は
、それら全体において参考として援用される）。
【０３３５】 さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成さ
れ得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．
Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍら，
１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１を参照のこと）。例えば、本
発明のニューロペプチドレセプターポリペプチドのフラグメントに対応するペプ
チドは、ペプチド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古
典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてこのニュ
ーロペプチドレセプターポリヌクレオチド配列に導入され得る。非古典的アミノ
酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：通常のアミノ酸のＤ異
性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、
２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２
−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノル
バリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、シス
テイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シク
ロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（
例えば、ｂ−メチルアミノ酸）、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸
、および一般のアミノ酸アナログ。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（
左旋性）であり得る。
【０３３６】 本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リ
ン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質
分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改
変されるニューロペプチドレセプターポリペプチドを含む。任意の多数の化学的
改変は、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：
臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、Ｎａ
ＢＨ４による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカ
マイシンの存在下での代謝合成；など。
【０３３７】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙
げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロ
セシング）、アミノ酸バックボーンへの化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結
合型の炭水化物鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末
端メチオニン残基の付加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標
識（例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変
して、このタンパク質の検出および単離が可能にされ得る。
【０３３８】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、ニューロペ
プチドレセプターの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３
７号を参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、
ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマ
ー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）
から選択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置で、また
はこの分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学
部分を含み得る。
【０３３９】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は示
した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）である
。所望の治療的プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間、ある場
合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または抗原
性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリ
コールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。例えば、こ
のポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２００
０、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００
、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、
９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，
０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５
００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，００
０、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００
、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、
５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７
５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００また１
０，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。
【０３４０】 上記のように、ポリエチレングリコールは、分岐構造を有し得る。分岐したポ
リエチレングリコールは、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号；Ｍｏｒｐ
ｕｒｇｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：５９−
７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅｓ １８：２７４５〜２７５０（１９９０）；およびＣａｌｉｃｅｔ
ｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８〜６４６（１９９９）（こ
れらの各々の開示は、本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０３４１】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してタンパク質に結合
されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、本
明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦにＰ
ＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−
１０３５（１９９２）（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙ
ｌａｔｉｏｎ）を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコ
ールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）によってア
ミノ酸残基を介して共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコ
ール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては
、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基
を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基および
Ｃ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、ポリエチレン
グリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療目的のため
に好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合で
ある。
【０３４２】 上記で示唆されたように、ポリエチレングリコールは、多くのアミノ酸残基の
いずれかへの結合を介してタンパク質に付着し得る。例えば、ポリエチレングリ
コールは、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステイ
ン残基に対する共有結合を介してタンパク質に結合され得る。１以上の反応化学
は、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラ
ギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）あるいはタンパク質のアミノ酸残基
（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインお
よびその組合せ）の１より多くの型にポリエチレングリコールを付着させるため
に使用され得る。
【０３４３】 特に、Ｎ末端で化学的に改変されたタンパク質を所望し得る。本組成物の例示
としてポリエチレングリコールを用いて、種々のポリエチレングリコール分子（
分子量、分岐などによる）、反応混合物中のタンパク質（またはペプチド）分子
に対するポリエチレングリコール分子の割合、実行されるべきペグ化反応の型、
および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質を得る方法から選択し得る。Ｎ末端ペ
グ化調製物を得る（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部分から
分離する）方法は、ペグ化タンパク質分子の集団からのＮ末端ペグ化物質の精製
により得る。Ｎ末端改変位で化学的に改変された選択的タンパク質は、還元的ア
ルキル化によって達成され得、この還元的アルキル化は、特定のタンパク質にお
ける誘導体化に利用可能な第１級アミノ基（リジン対Ｎ末端）の異なる型の異な
る反応性を利用する。適切な反応条件下で、カルボニル基含有ポリマーを用いた
、Ｎ末端でのタンパク質の実質的な選択的誘導体化が、達成される。
【０３４４】 上記のように、本発明のタンパク質のペグ化は、かなり多数の手段により達成
され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、直接的か、または介入リンカー
によってかのいずれかで、タンパク質に連結され得る。タンパク質ヘポリエチレ
ングリコールを結合させるためのリンカーのない系は、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒ
ｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−
３０４（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ Ｈｅｍａｔ
ｏｌ．６８：１−１８（１９９８）；米国特許第４，００２，５３１号；米国特
許第５，３４９，０５２号；ＷＯ９５／０６０５８；およびＷＯ９８／３２４６
６（これらの各々の開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載される
。
【０３４５】 介入リンカーなしでタンパク質のアミノ酸残基に直接ポリエチレングリコール
を結合させるための１つの系は、トレシル化ＭＰＥＧを使用し、このトレシル化
ＭＰＥＧは、塩化トレシル（ＣｌＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３）を用いるモノメトキシ（
ｍｏｎｍｅｔｈｏｘｙ）ポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）の改変により生成
される。トレシル化ＭＰＥＧとのタンパク質の反応の際に、ポリエチレングリコ
ールは、そのタンパク質のアミノ基に直接結合される。従って、本発明は、本発
明のタンパク質と、２，２，２−トリフルオロエタン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｅｏｔ
ｈａｎｅ）スルホニル基を有するポエチレングリコール分子との反応により生成
される、タンパク質−ポリエチレングリコール結合体を含む。
【０３４６】 ポリエチレングリコールはまた、多数の異なる介入リンカーを用いてタンパク
質に結合され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（この全体の開示
は本明細書中に参考として援用される）は、ポリエチレングリコールをタンパク
質に結合させるためのウレタンリンカーを開示する。ポリエチレングリコールが
タンパク質にリンカーによって結合されている、タンパク質−ポリエチレングリ
コール結合体はまた、タンパク質と以下のような化合物との反応により生成され
得る：ＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミ
ダゾールで活性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロフェニル
カーボネート（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｅｎｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＭＰＥＧ
−ｐ−ニトロフェノールカーボネート、および種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘
導体。多数のさらなるポリエチレングリコール誘導体、およびポリエチレングリ
コールをタンパク質に結合させるための反応化学は、ＷＯ９８／３２４６６（そ
の開示全体が本明細書中に参考として援用される）に記載される。本明細書中に
述べられる反応化学を使用して生成されるペグ化タンパク質生成物は、本発明の
範囲内に包含される。
【０３４７】 本発明の各タンパク質に結合されるポリエチレングリコール部分の数（すなわ
ち、置換の程度）はまた、変化し得る。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、
平均で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０
個、またはそれより多くのポリエチレングリコール分子に連結され得る。同様に
、置換の平均の程度は、タンパク質分子１つ当たり、例えば１〜３、２〜４、３
〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１
１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１
７〜１９、または１８〜２０個のポリエチレングリコール部分の範囲内である。
置換の程度を決定するための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒ
ｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（
１９９２）において考察される。
【０３４８】 本発明のニューロペプチドレセプターポリペプチドは、モノマーまたはマルチ
マー（すなわち、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高度のマルチマー
）であり得る。従って、本発明は、モノマーおよびマルチマーの本発明のニュー
ロペプチドレセプターポリペプチド、それらの調製ならびにそれらを含む組成物
（好ましくは薬学的組成物）に関する。特定の実施形態では、本発明のポリペプ
チドは、モノマー、ダイマー、トリマーまたはテトラマーである。さらなる実施
形態では、本発明のマルチマーは、少なくともダイマー、少なくともトリマー、
または少なくともテトラマーである。
【０３４９】 本発明によって含まれるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る
。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、本発明のニューロペプチドレ
セプターポリペプチド（本明細書中に記載されるニューロペプチドレセプターの
フラグメント、改変体および融合タンパク質を含む）のみを含むマルチマーをい
う。これらのホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有するニューロペプ
チドレセプターポリペプチドを含み得る。特定の実施形態では、本発明のホモマ
ーは、同一のアミノ酸配列を有するニューロペプチドレセプターポリペプチドの
みを含むマルチマーである。別の特定の実施形態では、本発明のホモマーは、異
なるアミノ酸配列を有するニューロペプチドレセプターポリペプチドを含むマル
チマーである。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ホモダイマー（例
えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するニューロペプチドレセプターポリ
ペプチドを含む）あるいはホモトリマー（例えば、同一または異なるアミノ酸配
列を有するニューロペプチドレセプターポリペプチドを含む）である。さらなる
実施形態では、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモダイマー、少
なくともホモトリマーまたは少なくともホモテトラマーである。
【０３５０】 本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のニューロペプチ
ドレセプターポリペプチドに加えて１以上の異種ポリペプチド（すなわち、異な
るタンパク質のポリペプチド）を含むマルチマーをいう。特定の実施形態では、
本発明のマルチマーは、ヘテロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマ
ーである。さらなる実施形態では、本発明のヘテロマー性マルチマーは、少なく
ともヘテロダイマー、少なくともヘテロトリマーまたは少なくともヘテロテトラ
マーである。
【０３５１】 本発明のマルチマーは、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合
的な結合の結果であり得、そして／または例えば、リポソーム形成によって間接
連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明のマルチマー（例えば、ホ
モダイマーまたはホモトリマーなど）は、本発明のポリペプチドが溶液中で互い
に接触する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロマルチマー（
例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーなど）は、本発明のタンパク質
が、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質にお
ける異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触した場合に形成される。
他の実施形態では、本発明のマルチマーは、本発明のニューロペプチドレセプタ
ーポリペプチドとの、および／または本発明のニューロペプチドレセプターポリ
ペプチド間での共有結合によって形成される。このような共有結合は、ポリぺプ
チド配列（例えば、配列番号２に記載されるか、またはクローンＨＦＧＡＮ７２
にコードされるポリペプチドに含まれる）に含まれる１以上のアミノ酸残基を含
み得る。１例では、この共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）
ポリペプチドにおいて相互作用するポリペプチド配列内に存在するシステイン残
基間での架橋である。別の例では、この共有結合は、化学的操作または組換え操
作の結果である。あるいは、このような共有結合は、ニューロペプチドレセプタ
ー融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列において含まれる１以上のアミノ酸
残基を含み得る。１例では、共有結合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異
種配列間にある（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特
定の例では、この共有結合は、（本明細書中に記載されるような）本発明のニュ
ーロペプチドレセプターＦｃ融合タンパク質に含まれる異種配列間にある。別の
特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、共有結合したマルチマー
を形成し得る別のニューロペプチドレセプターファミリーメンバー（例えば、オ
ステオプロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）など）由来の異種ポ
リペプチド配列間にある（例えば、国際公開番号ＷＯ ９８／４９３０５号（こ
の内容はその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。別の
実施形態では、２以上の本発明のポリペプチドは、ペプチドリンカーを通して連
結される。例としては、米国特許第５，０７３，６２７号（本明細書中に参考と
して援用される）に記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカ
ーによって隔てられた本発明の複数のポリペプチドを含むタンパク質は、従来の
組換えＤＮＡ技術を用いて生成され得る。
【０３５２】 本発明のマルチマーポリペプチドを調製するための別の方法は、ロイシンジッ
パーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合され
た本発明のポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインおよびイソロ
イシンジッパードメインは、そのドメインが見出されるタンパク質のマルチマー
形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは元々、いくつかのＤＮ
Ａ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１７５９、（１９８８））、そしてそれ以来種々の異なるタンパク質
において見出されている。とりわけ公知のロイシンジッパーは、ダイマー形成ま
たはトリマー形成をする、天然に存在するペプチドおよびその誘導体である。本
発明の可溶性マルチマータンパク質を生成するために適切なロイシンジッパード
メインの例は、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０
３０８に記載されるロイシンジッパードメインである。溶液中でダイマー形成ま
たはトリマー形成をするポリペプチド配列に融合された本発明のポリペプチドを
含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得られる可
溶性マルチマー融合タンパク質は、当該分野で公知の技術を用いて培養上清から
回収される。
【０３５３】 本発明のトリマーポリペプチドは、増強された生物学的活性の利点を提供し得
る。好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分は、トリマーを優先
的に形成する部分である。１例は、本明細書中に参考として援用されるＨｏｐｐ
ｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１，（１９９４））および米国
特許出願第０８／４４６，９２２号に記載される通りの肺サーファクタントプロ
テインＤ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。天然に存在するトリマ
ータンパク質由来の他のペプチドは、本発明のトリマーポリペプチドの調製にお
いて用いられ得る。
【０３５４】 別の例では、本発明のタンパク質は、Ｆｌａｇ（登録商標）ポリぺプチド配列
を含む本発明の融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配
列間の相互作用によって結合される。さらなる実施形態では、本発明のタンパク
質は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチ
ド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によって結合する。
【０３５５】 本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を使用して生成され得る。
例えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドは、当該
分野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を使用して、化学的
に架橋され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは本明細書中
で参考として援用される）を参照のこと）。さらに、本発明のマルチマーは、マ
ルチマー中に含まれることが所望されるポリペプチドの配列内に位置するシステ
イン残基間の１つ以上の分子間架橋を形成するように、当該分野で公知の技術を
使用して生成され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは、本
明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと）。さらに、本発明
のタンパク質は、このポリぺプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたは
ビオチンの付加により慣用的に改変され得、当該分野で公知の技術が、１つ以上
のこれらの改変されたポリペプチドを含むマルチマーを生成するために適用され
得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これはその全体が本明細書中
で参考として援用される）を参照のこと）。さらに、当該分野で公知技術は、本
発明のマルチマーに含まれることを所望されるポリペプチド成分を含むリポソー
ムを生成するために適用され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（
これはその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０３５６】 あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて
生成され得る。１つの実施形態では、本発明のマルチマーに含まれるポリペプチ
ドは、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の融合タンパク質技
術を用いて組換え生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用
される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態では
、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配
列に連結し、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端の方向とは逆方向でポリペプ
チドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）に連
結することによって生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援
用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形態では
、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して
、膜貫通ドメイン（または疎水性もしくはシグナルペプチド）を含み、そして膜
再構成技術によってリポソームに取り込まれ得る、本発明の組換えポリペプチド
を生成する（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許
第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０３５７】 （ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドの使用） 本発明のポリヌクレオチドは、ヒト疾患の処置および診断の発見のための試験
試薬および材料として使用され得る。本明細書中で同定された神経レセプターポ
リヌクレオチドは、試薬として多くの方法において使用され得る。以下の説明は
、例示とみなされるべきであり、そして公知技術を使用する。
【０３５８】 新規な染色体マーカーを同定する継続した必要性が存在する。なぜなら、実際
の配列データ（反復多型性）に基づく染色体マーカー試薬で現在利用可能なもの
はほとんどないからである。クローンＨＦＧＡＮ７２は、第１染色体ｐ３１−３
４にマッピングされた。従って、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド
は、第１染色体についてのマーカーとして連鎖分析において使用され得る。
【０３５９】 簡単に言うと、配列は、配列番号１で示される配列からＰＣＲプライマー（好
ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することによって染色体にマッピングされ得る
。プライマーが、ゲノムＤＮＡ中の１つより多くの予測されたエキソンにまたが
らないように、プライマーは、コンピューター分析を使用して選択され得る。次
いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰ
ＣＲスクリーニングのために使用される。配列番号１に対応するヒトニューロペ
プチドレセプター遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを
産生する。
【０３６０】 同様に、体細胞ハイブリッドは、特定の染色体に対してポリヌクレオチドをＰ
ＣＲマッピングする迅速な方法を提供する。単一のサーマルサイクラーを使用し
て１日あたり３つ以上のクローンが割り当てられ得る。さらに、ポリヌクレオチ
ドの二次位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体フラグ
メントのパネルを用いて達成され得る。使用され得る他の遺伝子マッピングスト
ラテジーとしては、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フローソート（
ｌａｂｅｌｅｄ ｆｌｏｗ ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリーニング、お
よび染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーショ
ンによる前選択、ならびにコンピューターマッピング技術（例えば、Ｓｈｕｌｅ
ｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：４５６−４５９（１９９８）
（その全体が参考として本明細書によって援用される）が挙げられる。
【０３６１】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドの正確な染色体位置はまた、中
期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）の蛍光インサイチュハイブリダイゼーショ
ン（ＦＩＳＨ）を使用して獲得され得る。この技術は５００または６００塩基ほ
どの短さのポリヌクレオチドを使用する；しかし２，０００〜４，０００ｂｐの
ポリヌクレオチドが好ましい。この技術の総説に関しては、Ｖｅｒｍａら、「Ｈ
ｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８８）を参照のこと。
【０３６２】 染色体マッピングについては、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド
は、個々に（単一染色体またはその染色体上の単一部位をマークするために）ま
たはパネルで（複数部位および／または複数染色体をマークするために）使用さ
れ得る。好ましいポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡの非コード領域に対応する。な
ぜなら、コード配列は、遺伝子ファミリー内でより保存される傾向があり、これ
により、染色体マッピングの間の交叉ハイブリダイゼーションの機会が増加する
からである。
【０３６３】 本発明のポリヌクレオチドは、放射線ハイブリッドマッピング、ＨＡＰＰＹマ
ッピング、および長範囲制限マッピングに同様に有用である。これらの技術およ
び当該分野で公知の他の技術の概説について、例えば、Ｄｅａｒ「Ｇｅｎｏｍｅ
Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬ Ｐｒ
ｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏ
ｎ（１９９７）；Ａｙｄｉｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：６９１〜６９４（１
９９９）；Ｈａｃｉａら、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ３：４８３〜４９２
（１９９８）；Ｈｅｒｒｉｃｋら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．７：４０９
〜４２３（１９９９）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ．６２：２６５〜２８０（２０００）；および／またはＯｔｔ、Ｊ．Ｈｅｒ
ｅｄ．９０：６８〜７０（１９９９）（これらの各々は、その全体が参考として
本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０３６４】 一旦、ポリヌクレオチドが正確な染色体位置にマップされると、ポリヌクレオ
チドの物理的位置は、連鎖分析において使用され得る。連鎖分析は、染色体位置
と特定の疾患の提示との間の同時遺伝（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）を確立す
る。（疾患マッピングデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌ
ｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通し
てオンラインで利用可能である）において見い出される）。１メガベースマッピ
ング解像度および２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定すると、疾患と関連する染色体
領域に正確に位置決定されるｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在的な原因遺伝子の
うちの１つであり得る。
【０３６５】 従って、一旦、同時遺伝が確立されると、罹患個体と非罹患個体との間でのニ
ューロペプチドレセプターポリヌクレオチドおよび対応する遺伝子における差異
が試験され得る。まず、染色体中の可視的構造変化（例えば、欠失または転座）
は染色体スプレッドにおいて、またはＰＣＲによって試験される。構造的変化が
存在しない場合、点変異の存在が確認される。何人かのまたは全ての罹患個体で
観察されたが、正常な個体では観察されなかった変異は、この変異がこの疾患を
引き起こし得ることを示す。しかし、いくつかの正常な個体由来のポリペプチド
および対応する遺伝子の完全な配列決定は、変異を多型性と区別するために要求
される。新しい多型性が同定される場合、この多型ポリペプチドはさらなる連鎖
分析のために使用され得る。
【０３６６】 さらに、非罹患個体と比較した、罹患個体の遺伝子の増加または減少した発現
が、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドを使用して評価され得る。任
意のこれらの変化（変化した発現、染色体再配置、または変異）は、診断マーカ
ーまたは予後マーカーとして使用され得る。
【０３６７】 従って、本発明はまた、障害の診断の間に有用な診断方法を提供し、この方法
は、個体由来の細胞または体液中の本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測
定する工程、および測定された遺伝子発現レベルをポリヌクレオチド発現レベル
の標準レベルと比較する工程を包含し、これによって、標準と比較して、遺伝子
発現レベルの増加または減少が、障害の指標になる。
【０３６８】 なお別の実施形態では、本発明は、サンプルを、試験被験体に由来する増殖性
および／または癌性のポリヌクレオチドの存在について分析するためのキットを
含む。一般的実施形態において、このキットは、本発明のポリヌクレオチドと特
異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのポリヌクレ
オチドプローブ、および適切な容器を備える。この特定の実施形態では、このキ
ットは、本発明のポリヌクレオチドの内部領域を規定する２つのポリヌクレオチ
ドプローブを含み、ここで各プローブは、この領域に対して内部に３１’マー末
端を含む１つの鎖を有する。さらなる実施形態では、このプローブは、ポリメラ
ーゼ連鎖反応増幅のためのプライマーとして有用であり得る。
【０３６９】 障害の診断が既に従来方法によって行われている場合、本発明は、予後のイン
ジケーター（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）として有用であり、それによって増強または
抑制された本発明のポリヌクレオチド発現を示す患者が、標準レベルにより近い
レベルでこの遺伝子を発現する患者と比較して悪い臨床結果を経験する。
【０３７０】 「本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する（こと）」によって、本
発明のポリペプチドのレベルまたはこのポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレ
ベルを、第１の生物学的サンプルにおいて直接的（例えば、絶対のタンパク質レ
ベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または評価することによって）または相対的（
例えば、第２の生物学的サンプル中のポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベル
に対して比較することによって）のいずれかで定性的または定量的に測定または
評価することが意図される。好ましくは、第１の生物学的サンプル中のポリペプ
チドレベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または評価され、そして標準のポリペプ
チドレベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較され、この標準は、障害を有さな
い個体から得られる第２の生物学的サンプルから得られるかまたは障害を有さな
い個体の集団由来のレベルを平均することによって決定される。当該分野で認識
されるように、一旦標準的なポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが認識さ
れれば、これを、比較のための標準として反復して用い得る。
【０３７１】 「生物学的サンプル」によって、本発明のポリペプチドまたはｍＲＮＡを含む
、個体、体液、細胞株、組織培養物または他の供給源から得られる任意の生物学
的サンプルが意図される。示されるように、生物学的サンプルは、本発明のポリ
ペプチドを含む体液（例えば、精液、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液
）、および本発明のポリペプチドを発現することが見出された他の組織供給源を
含む。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は、当該分野で周知で
ある。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源であ
る。
【０３７２】 上記で提供された方法は好ましくは、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペ
プチドが固体支持体に結合される、診断方法および／またはキットに適用され得
る。１つの例示的な方法では、この支持体は、米国特許第５，８３７，８３２号
、同第５，８７４，２１９号および同第５，８５６，１７４号に記載される、「
遺伝子チップ」または「生物学的チップ」であり得る。さらに、本発明のポリヌ
クレオチドが結合されたこのような遺伝子チップを使用して、試験被験体から単
離されたポリヌクレオチドを用いて、このポリヌクレオチド配列間の多型性を同
定し得る。このような多型性の知見（すなわち、それらの位置ならびにそれらの
存在）は、癌性の疾患および状態を含む多くの障害についての疾患の遺伝子座を
同定する際に有益である。このような方法は、米国特許第５，８５８，６５９号
および同第５，８５６，１０４号に記載される。上記に参照した米国特許は、そ
の全体が本明細書中に参考として援用される。
【０３７３】 本発明は、化学的に合成された（すなわち、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として再
現された）または当該分野で公知の他の方法に従って合成された、ニューロペプ
チドレセプターポリヌクレオチドを包含する。ＰＮＡの使用は、ニューロペプチ
ドレセプターポリヌクレオチドが固体支持体、すなわち、遺伝子チップに取り込
まれる場合、好ましい形態として役立つ。本発明の目的のために、ペプチド核酸
（ＰＮＡ）は、ポリアミド型のＤＮＡアナログであり、そしてアデニン、グアニ
ン、チミンおよびシトシンについてのモノマー単位が市販されている（Ｐｅｒｃ
ｅｐｔｉｃｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＤＮＡの特定の成分（例えば、リン、
酸化リンまたはデオキシリボース誘導体）は、ＰＮＡ中に存在しない。Ｐ．Ｅ．
Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｒ．Ｈ．ＢｅｒｇおよびＯ．Ｂｕｃｈａｒ
ｄｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１４９７（１９９１）；ならびにＭ．Ｅｇｈｏ
ｌｍ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂｅｈｒｅｎ
ｓ，Ｓ．Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｄｒｉｖｅｒ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ、Ｓ．Ｋ
．Ｋｉｍ，Ｂ．ＮｏｒｄｅｎおよびＰ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３
６５，６６６（１９９３）によって開示されるように、ＰＮＡは、相補的なＤＮ
Ａ鎖に対して特異的かつ緊密に結合し、そしてヌクレアーゼによって分解されな
い。実際、ＰＮＡは、ＤＮＡ自体が結合するよりも強力にＤＮＡに結合する。こ
れはおそらく、２つの鎖の間に静電斥力が存在せず、そしてまたポリアミド骨格
がより可撓性が高いことによる。これによって、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＤＮ
Ａ／ＤＮＡ二重鎖よりも広範囲のストリンジェンシー条件下で結合し、多重鎖ハ
イブリダイゼーションを行うのをより容易にする。強力な結合に起因して、ＤＮ
Ａを用いてよりも小さいプローブが用いられ得る。さらに、おそらく、単一の塩
基ミスマッチが、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションを用いて決定され得る
。なぜなら、ＰＮＡ／ＤＮＡの１５マーにおける単一のミスマッチは、ＤＮＡ／
ＤＮＡの１５マー二重鎖については４℃〜１６℃であるのに対して、融点（Ｔ．
ｓｕｂ．ｍ）を８〜２０℃低下させるからである。また、ＰＮＡ中に電荷基が存
在しないことは、ハイブリダイゼーションが、低いイオン強度で行われ得、そし
て分析の間の塩によって可能な妨害を減少させることを意味する。
【０３７４】 本発明は、哺乳動物におけるガンの検出を含むがこれらに限定されない用途を
有する。特に、本発明は、以下を含むがこれらに限定されない、病理学的細胞増
殖新形成の診断の間に有用である：急性骨髄性白血病（急性単球性白血病、急性
骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性赤白血
病、急性巨核球性白血病、および急性未分化白血病などを含む）；および慢性骨
髄性白血病（慢性骨髄単球性白血病、慢性顆粒球性白血病などを含む）。好まし
い哺乳動物としては、有尾猿（ｍｏｎｋｅｙ）、無尾猿（ａｐｅ）、ネコ、イヌ
、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギおよびヒトが挙げられる。特に好ましいのは、ヒト
である。
【０３７５】 病理学的細胞増殖障害はしばしば、原癌遺伝子の不適切な活性化に関連する（
Ｇｅｌｍａｎｎ，Ｅ．Ｐ．ら，「Ｔｈｅ Ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｃｕｔｅ
Ｌｅｕｋｅｍｉａ：Ｍｏｌｅｖｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｖｉｒ
ａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」，Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ，第１巻，Ｗｉｅｒｎｉｋ、Ｐ．Ｈ．ら編，１６１−１８２
（１９８５））。新形成は現在、ウイルス配列の染色体への挿入、より活性に転
写される領域への遺伝子の染色体転座、または何らかの他の機構による、正常な
細胞遺伝子産物の定性的変化から、または遺伝子発現の定量的改変から生じると
考えられている（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。特定の遺伝子の変異または変更さ
れた発現が、他の組織および他の細胞型の中でも、いくつかの白血病の病因と関
与するようである（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。実際、いくつかの動物新形成に
関与する癌遺伝子のヒト対応物は、ヒトの白血病および癌のいくつかの症例にお
いて増幅または転座されている（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。
【０３７６】 例えば、ｃ−ｍｙｃ発現は、非リンパ球性白血病細胞株ＨＬ−６０において高
度に増幅される。ＨＬ−６０細胞が増幅を止めるように化学的に誘導される場合
、ｃ−ｍｙｃのレベルは、ダウンレギュレートされることが見出される（国際公
開番号ＷＯ９１／１５５８０号）。しかし、ｃ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｂの５’
末端に相補的であるＤＮＡ構築物へのＨＬ−６０細胞の暴露が、ｃ−ｍｙｃタン
パク質またはｃ−ｍｙｂタンパク質の発現をダウンレギュレートする対応するｍ
ＲＮＡの翻訳をブロックし、処理した細胞の細胞増殖および分化の停止を引き起
こすことが示されている（国際公開番号ＷＯ９１／１５５８０号；Ｗｉｃｋｓｔ
ｒｏｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：１０２８（１９８８
）；Ａｎｆｏｓｓｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３３７
９（１９８９））。しかし、当業者は、増殖表現型を示すことが公知である種々
の起源の多数の細胞および細胞型を考慮すれば、本発明の有用性が造血性の細胞
および組織の増殖性障害の処置に限定されないことを認識する。
【０３７７】 前記に加えて、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドは、三重らせん
形成を通して、またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して遺伝子発現を
制御するために使用され得る。これらの技術に関して、好ましいポリヌクレオチ
ドは通常、２０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチドであり、そして転写に関与す
る遺伝子領域（三重らせん−Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３
０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９
８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１
）を参照のこと）またはｍＲＮＡ自体（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕ
ｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−ｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅ
ｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆ
Ｌ（１９８８））のいずれかに相補的である。三重らせん形成は、最適にはＤＮ
ＡからのＲＮＡ転写の遮断を生じるが、アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーシ
ョンは、ポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止する。両方の技術は、モデ
ル系において効果的であり、そして本明細書に開示される情報は、疾患を処置す
るための試みにおいて、特に、増殖性疾患および／または状態の処置のために、
アンチセンスまたは三重らせんポリヌクレオチドを設計するために使用され得る
。
【０３７８】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療において有
用である。遺伝子治療の１つの目標は、遺伝欠損を修正する試みにおいて、欠損
遺伝子を有する生物へ正常遺伝子を挿入することである。本発明に開示されるポ
リヌクレオチドは、高度に正確な様式でこのような遺伝欠損を標的とする手段を
提供する。別の目標は、宿主ゲノム中には存在しなかった新しい遺伝子を挿入し
、それによって宿主細胞中に新しい形質を生成することである。
【０３７９】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドはまた、微小な生物学的サンプ
ルから個体を同定するために有用である。例えば、米国軍は、その職員を同定す
るために制限フラグメント長の多型性（ＲＦＬＰ）の使用を考慮している。この
技術において、個体のゲノムＤＮＡは１つ以上の制限酵素で消化され、そして職
員を同定するため固有なバンドを生じるためのサザンブロットについてプローブ
される。この方法は、「認識票（Ｄｏｇ ｔａｇ）」（これは、失われたり、交
換されたり、または盗まれたりすることにより、ポジティブな同定を困難にし得
る）の現在の限界を受けない。ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドは
、ＲＦＬＰのためのさらなるＤＮＡマーカーとして使用され得る。
【０３８０】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドはまた、個体のゲノムの選択さ
れた部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を決定することによって、ＲＦＬＰに対
する代替物として使用され得る。これらの配列は、このような選択されたＤＮＡ
を増幅しそして単離するためにＰＣＲプライマーを調製するために使用され得、
次いで、この選択されたＤＮＡは、配列決定され得る。各個体が固有のセットの
ＤＮＡ配列を有するので、この技術を使用して、個体が同定され得る。一旦、固
有のＩＤデータベースが個体について確立されると、その個体が生存していよう
とまたは死亡していようとにかかわらず、その個体のポジティブ同定が、極めて
小さな組織サンプルからなされ得る。
【０３８１】 法医学生物学もまた、本明細書に開示されるようなＤＮＡに基づく同定技術を
使用して利益を得る。組織（例えば、髪または皮膚）、または体液（例えば、血
液、唾液、精液など）のような非常に小さな生物学的サンプルから得られたＤＮ
Ａ配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。ある先行技術において、ＤＱａクラ
スＩＩ ＨＬＡ遺伝子のような多型性遺伝子座から増幅された遺伝子配列は、個
体を同定するための法医学生物学において使用される。（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．，
ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．（１９９２）
）。一旦、これらの特異的多型性遺伝子座が増幅されると、これらは１つ以上の
制限酵素で消化される。これは、ＤＱａクラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子に対応するＤ
ＮＡでプローブされたサザンブロットについてのバンドの同定セットを生じる。
同様に、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドは、法医学的目的のため
の多型性マーカーとして使用され得る。
【０３８２】 また、特定の組織の供給源を同定し得る試薬についての必要性が存在する。例
えば、未知の起源の組織が提供される場合、法医学においてこのような必要性が
生じる。適切な試薬は、例えば、本発明の配列から調製される、前立腺または前
立腺癌ポリヌクレオチドに特異的なＤＮＡプローブまたはプライマーを含み得る
。このような試薬のパネルは、種および／または器官型によって組織を同定し得
る。同様の様式で、これらの試薬は、夾雑物について組織培養物をスクリーニン
グするために使用され得る。
【０３８３】 ニューロペプチドレセプターが視床下部において発現されることが見出されて
いるので、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドは、生物学的サンプル
中に存在する組織または細胞型の示差的同定のためのハイブリダイゼーションプ
ローブとして有用である。同様に、本発明のポリペプチドに関するポリペプチド
および抗体は、組織（例えば、免疫組織化学アッセイ）または細胞型（例えば、
免疫細胞学アッセイ）の示差的同定のための免疫学的プローブを提供するのに有
用である。さらに、「標準」遺伝子発現レベル（すなわち、障害を有しない個体
からの健康組織の発現レベル）と比較して、上記の組織または細胞の多くの障害
に対して、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド／ポリペプチドの有意
に高いかまたは低いレベルの遺伝子発現が、例えば、障害を有する個体から採取
された特定の組織（例えば、本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオ
チドを発現する組織、および／または癌性組織および／または創傷組織）または
体液（例えば、漿液、血漿、尿、滑液または髄液）において検出され得る。
【０３８４】 従って、本発明は、以下の工程を含む障害の診断方法を提供する：（ａ）個体
の細胞または体液中の遺伝子発現レベルをアッセイする工程；（ｂ）標準的な遺
伝子発現レベルと、この遺伝子発現レベルを比較し、それにより、標準の発現レ
ベルと比較して、アッセイされた遺伝子発現レベルの増加または減少が障害を示
す、工程。
【０３８５】 少なくとも、ニューロペプチドレセプターは、サザンブロットのゲル上の分子
量マーカーとして、特定の細胞型における特異的ｍＲＮＡの存在についての診断
プローブとして、新規のポリヌクレオドを発見するプロセスにおける「減算した
（ｓｕｂｔｒａｃｔ−ｏｕｔ）」公知の配列に対するプローブとして、「遺伝子
チップ」または他の支持体に付着するためのオリゴマーを選択および作製するた
めに、ＤＮＡ免疫技術を用いて抗ＤＮＡ抗体を惹起するために、および免疫応答
を惹起する抗原として使用され得る。
【０３８６】 （ニューロペプチドレセプターポリペプチドの使用） 本発明のポリペプチドは、ヒト疾患の処置および診断の発見のための研究用試
薬および材料として使用され得る。ニューロペプチドレセプターポリペプチドは
、多くの方法において使用され得る。以下の記述は、例示として考慮されるべき
であり、そして公知の技術を利用する。
【０３８７】 ニューロペプチドレセプターポリペプチドを使用して、抗体ベースの技術を用
いて、生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る。例えば、組織
におけるタンパク質発現は、古典的な免疫組織学的な方法で研究され得る。（Ｊ
ａｌｋａｎｅｎ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（
１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３
０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質の遺伝子発現を検出
するのに有用な、他の抗体に基づく方法には、イムノアッセイ（例えば、酵素結
合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ））が含まれる。適切な抗体アッセイの標識は、当該分野で公知であり、そし
て酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；および放射性同位体（例えば
、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウ
ム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）；
発光標識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセイン
およびローダミン）ならびにビオチンが挙げられる。
【０３８８】 生物学的サンプル中の分泌されたタンパク質のレベルをアッセイすることに加
えて、タンパク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質の
インビボ画像化のための抗体の標識またはマーカーは、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、ま
たはＥＳＲにより検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法のために適切な標識は、放
射性同位体（例えば、バリウムまたはセシウム）を含み、これは検出可能な放射
線を放射するが、被験体に対して明らかに有害ではない。ＮＭＲおよびＥＳＲの
ための適切なマーカーは、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカー（例えば
、重水素）を含み、これは、関連するハイブリドーマのための栄養分を標識する
ことにより抗体中に取り込まれ得る。
【０３８９】 放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線不透過
性物質、または核磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像
化部分で標識された、タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、哺乳動
物に（例えば、非経口的、皮下、または腹腔内に）導入される。被験体のサイズ
および用いられる画像化システムは、診断画像を生成するために必要な画像化部
分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、
ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、９９ｍＴｃの約５〜２０
ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは
、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像
化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅ
ｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ
Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒ
ａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒの第１３
章、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。
【０３９０】 従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、これは以下を含む：（ａ）個体
の細胞または体液におけるニューロペプチドレセプターポリペプチドの発現レベ
ルをアッセイする工程；（ｂ）遺伝子発現レベルを標準の遺伝子発現レベルと比
較し、それによって標準の発現レベルと比較してアッセイされたニューロペプチ
ドレセプターポリペプチド遺伝子の発現レベルにおける増加または減少が障害を
示す工程。癌に関して、個体由来の生体組織中の比較的多い量の転写物の存在は
、疾患の発症の素因を示すか、または実際の臨床的症状の発症より前に、疾患を
検出するための手段を提供する。このタイプのより決定的な診断によって、保健
専門家は、予防的測定または侵襲的処置をより早く用い得、それにより癌の発生
またはさらなる進行を予防し得る。
【０３９１】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリペプチドを用いて疾患を処置、診断
、検出、および／または予防し得る。例えば、患者は、ニューロペプチドレセプ
ターポリペプチドの非存在またはレベルの減少を元に戻すこと（例えば、インス
リン）、異なるポリペプチドの不在またはレベルの減少を補充すること（例えば
、ヘモグロビンＢに対するヘモグロビンＳ、ＳＤＳ、カタラーゼ、ＤＮＡ反復タ
ンパク質）、ポリペプチドの活性を阻害すること（例えば、癌遺伝子または腫瘍
抑制因子）、ポリペプチドの活性を活性化すること（例えば、レセプターに結合
することによって）、遊離リガンドについて膜結合レセプターと競合させること
によって膜結合レセプターの活性を減少させること（例えば、炎症を低減させる
際に用いられる可溶性ＴＮＦレセプター）、または所望の応答をもたらすこと（
例えば、血管の成長阻害、増殖細胞または組織に対する免疫応答の増大）の試み
において、ニューロペプチドレセプターポリペプチドが投与され得る。
【０３９２】 同様に、本発明のポリペプチドに対して指向される抗体もまた用いられ、疾患
を処置、予防および／または診断し得る。例えば、ニューロペプチドレセプター
ポリペプチドに対して指向される抗体の投与には、ポリペプチドを結合して、そ
してポリペプチドの過剰産生を低減し得る。同様に、抗体の投与は、例えば、膜
に結合したポリペプチド（レセプター）へ結合することにより、ポリペプチドを
活性化し得る。
【０３９３】 本発明のヒトニューロペプチドレセプターポリペプチドは、レセプターポリペ
プチドに結合して活性化する化合物、および本発明のレセプターポリペプチドに
結合しその活性化を阻害する化合物をスクリーニングするためのプロセスにおい
て用いられ得る。
【０３９４】 一般的に、ニューロペプチドレセプターが単離され、固定化されるか、または
細胞結合形態が複数の化合物、およびレセプターに結合し相互作用するよう選択
された化合物と接触される。結合または相互作用は、放射標識した本発明の化合
物を使用することによってか、または候補化合物の相互作用または結合から生じ
る第２のメッセンジャー効果によって直接測定され得る。あるいは、候補化合物
は、競合スクリーニングアッセイに供され得、ここで、好ましくは、分析的に検
出可能な試薬で標識され、最も好ましくは放射標識された既知のリガンドは、試
験される化合物と共に導入され、そして標識リガンドの結合を阻害または増大す
る化合物の能力が測定される。化合物は、本発明のレセプターポリペプチドに対
する増加した親和性および選択性についてスクリーニングされる。
【０３９５】 １つのこのようなスクリーニング手順は、トランスフェクトされて本発明のニ
ューロペプチドレセプターを発現するメラニン保有細胞の使用を包含する。この
ようなスクリーニング技術は、１９９２年２月６日に公開された、国際出願公開
番号ＷＯ９２／０１８１０に記載される。
【０３９６】 例えば、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物について
スクリーニングするために、この化合物およびレセプターに結合することが知ら
れているリガンドの両方を、メラニン保有細胞と接触させる。このリガンドよっ
て生成されるシグナルの阻害は、この化合物がレセプターの活性化を阻害するこ
とを示す。
【０３９７】 このような細胞をスクリーンニングされる化合物と接触させて、このような化
合物がシグナルを生成するか（すなわち、レセプターを活性化するか）否かを決
定することによって、本発明のレセプターポリペプチドに結合して活性化する化
合物を決定するために、スクリーニングが用いられ得る。
【０３９８】 他の例には、レセプター活性化によって引き起こされる細胞外ｐＨ変化を測定
する系において本発明のニューロペプチドレセプターを発現する細胞（例えば、
トランスフェクトしたＣＨＯ細胞）の使用が含まれる（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４６：１８１−２９６（１９８９）に記載されるように）。例えば、化合物
は、本発明のレセプターポリペプチドを発現する細胞と接触され得、そしてセカ
ンドメッセンジャー応答（例えば、シグナル伝達またはｐＨ変化）が測定され得
、潜在的な化合物がレセプターを活性化するかまたは阻害するかを決定し有る。
【０３９９】 別の例は、そのレセプターをコードするＲＮＡをＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞に導
入して、そのレセプターを一過性に発現する工程を包含する。次いで、その卵母
細胞は、レセプターリガンドと接触され得、そして化合物がスクリーニングされ
得、細胞内カルシウムの増加のまたはその阻害の検出が行われる。
【０４００】 別の例には、本発明のニューロペプチドレセプターポリペプチドを細胞の表面
上で発現することが含まれ、ここでそのレセプターは、ホスホリパーゼＣまたは
Ｄに連結されている。例示的な細胞には、内皮細胞、平滑筋細胞、胚腎臓細胞な
とが含まれる。このスクリーニングは、本明細書中上記のように、ホスホリパー
ゼシグナルから、レセプターの活性化またはレセプターの活性化の阻害の検出に
よって達成され得る。
【０４０１】 別の方法は、その表面上にレセプターを有する細胞に対する標識されたリガン
ドの結合の阻害を決定する工程を包含する。このような方法は、本発明のニュー
ロペプチドレセプターポリペプチドをコードするＤＮＡで真核生物細胞をトラン
スフェクトして、その結果その細胞がその表面でそのレセプターを発現する工程
、および標識した形態の既知のリガンドの存在下で細胞を化合物と接触させる工
程を包含する。そのリガンドは、例えば、放射能によって標識され得る。レセプ
ターに結合した標識されたリガンドの量は、例えば、レセプターの放射能を測定
することによって測定される。その化合物が、レセプターに結合する標識された
リガンドの減少によって決定されるようにレセプターに結合する場合、そのレセ
プターに対する標識されたリガンドの結合は阻害される。
【０４０２】 別のスクリーニング技術は、細胞の表面上でニューロペプチドレセプターポリ
ペプチドを発言する工程を包含し、ここでこのレセプターは、第２のメッセンジ
ャーに結合して、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞における細胞質ゾルカルシ
ウムレベルを増加させる。このような方法の例は、本発明のレセプターをコード
する核酸配列を有するＣＨＯ細胞をトランスフェクトする工程を包含し、その結
果、このレセプターはその表面上で発現される。次いで、トランスフェクトされ
た細胞は、スクリーニングされる化合物の存在下で、標識されたカルシウムと共
に反応混合物中でインキュベートされる。この化合物のカルシウム取込みを増加
する能力またはカルシウム取込みを阻害する能力は、この標識（例えば、放射能
）を使用することによって細胞に輸送された標識カルシウムの量を測定すること
によって決定され得る。
【０４０３】 化合物はまた上記の方法によって同定され得、ここでこの化合物はＣＮＳ内の
特定の小領域に結合し、これは本発明のニューロペプチドレセプターポリペプチ
ドとの間接的な相互作用にわたる特定の挙動のために重要である。
【０４０４】 細胞内サイクリックＡＭＰレベルを測定するために、１００μＭのイソブチル
メチルキサンチン（ＩＢＭＸ；Ｓｉｇｍａ）で、３７℃で１５分間処理した全細
胞中で、サイクリックＡＭＰをアッセイする。トランスフェクトした細胞（１×
１０６／０．５ｍｌ反応）を、１０μＭのフォルスコリン、およびそのレセプタ
ーに対する様々な濃度の既知またま未知のリガンドと共にインキュベートする。
０．１ＭまでＨＣｌを添加して反応を終結し、室温で１５分間インキュベートし
、中和し、そしてサンプルを５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．２）で希釈す
る。サイクリックＡＭＰは、放射免疫測定（Ｄｕｐｏｎｔ／ＮＥＮ）を使用する
ことによって定量する。
【０４０５】 細胞内カルシウムのレベルを測定するために、トランスフェクトした細胞を負
荷培養液（改変ＲＰＭＩ １６４０培地／１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／１％新生児ウ
シ血清）に懸濁し、そして１×１０６細胞／ｍｌで、３７℃で２．５時間スピナ
ーフラスコ中でインキュベートする。次いで細胞を、１μＭのＦｕｒａ−２アセ
トキシメチルエステル（ｆｕｒａ−２ ＡＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ
ｓ）で、３７℃で３０分間処理し、負荷培養液で２回洗浄し、そして５×１０６
細胞／ｍｌで再懸濁する。蛍光分光法の直前に、細胞を１０００ｒｐｍで遠心分
離することによって回収し、そしてスルフィンピラゾンを含有する改変Ｋｒｅｂ
ｓ緩衝液（１３５ｍＭ ＮａＣｌ／４．７ｍＭ ＫＣｌ／１．２ｍＭ ＭｇＳＯ
４／１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／５ｍＭ ＮａＨＣＯ３／１ｍＭ ＣａＣｌ２／
２．８ｍＭ グルコース／１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４））に、１×１０
細胞／ｍｌで再懸濁する。ボンベシンをＳｉｇｍａおよびＡｕｓｐｅｐから購入
する。蛍光記録を、５ｎｍのスリット幅および２秒の応答時間で、Ｈｉｔａｃｈ
ｉ蛍光分光計（Ｆ４０１０）を用いて、３４０ｎｍ（励起）および５０５ｎｍ（
発光）で、１０分間にわたって行う。細胞内カルシウムを、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉ
ｃｚら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６０：３４４０〜３４５０，１９８５により
記載される式を使用することによって定量する。
【０４０６】 非常に少なくとも、ニューロペプチドレセプターポリペプチドは、当業者に周
知の方法を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、または分子ふるいゲル濾過カラム
の分子量マーカーとして使用され得る。ニューロペプチドレセプターポリペプチ
ドはまた、抗体を惹起するために使用され得、次いで、組換え細胞からのタンパ
ク質発現を、宿主細胞の形質転換を評価する方法として測定するために使用され
る。さらに、ニューロペプチドレセプターポリペプチドを使用して、以下の生物
学的活性を試験し得る。
【０４０７】 （遺伝子治療方法） 本発明の別の局面は、障害、疾患および状態を処置するための遺伝子治療方法
である。この遺伝子治療方法は、本発明のニューロペプチドレセプターポリペプ
チドの発現を達成するための、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡ
またはＲＮＡ）配列の動物への導入に関する。この方法は、標的組織によるこの
ポリペプチドの発現のために必要なプロモータおよび他の任意の遺伝因子と、作
動可能に連結したニューロペプチドレセプターポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを必要とする。このような遺伝子治療および送達技術は当該分野にお
いて公知である（例えば、本明細書中に参考として援用される、ＷＯ９０／１１
０９２を参照のこと）。
【０４０８】 従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボでニューロペプチドレセプタ
ーポリヌクレオチドと作動可能に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチド
（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて操作され得、次いで、操作された細胞は、処置
される患者に提供される。このような方法は、当該分野において周知である。例
えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ
．８５：１０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：１１０７−１１１２（１９９３）；Ｆｅｒｒ
ａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：４６０４−４６１
５（１９９４）；Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６０：２２
１−２２９（１９９５）；Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ ５０：５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら
、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１−１０（１９９６）；Ｓａｎ
ｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２４６−１２５
５（１９９７）；およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ３：３１−３８（１９９６）を参照のこと。これらは、本明細
書中に参考として援用される。１つの実施形態においては、操作される細胞は、
動脈細胞である。この動脈細胞は、動脈、動脈の周囲の組織への直接的な注射を
介して、またはカテーテル注入を介して患者に再導入され得る。
【０４０９】 以下により詳細に考察されるように、ニューロペプチドレセプターポリヌクレ
オチド構築物は、注射可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方法（例えば、
組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓など）の間質空間への注射）により送達され
得る。ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可
能な液体または水性のキャリア中で送達され得る。
【０４１０】 １つの実施形態においては、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドは
、裸のポリヌクレオチドとして送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡとは、細胞への侵入を補助し、促進し、または容易にするため
に作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処
方物、リポフェクチンまたは沈殿剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし
、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドはまた、当業者に周知の方法に
より調製され得るリポソーム処方物中およびリポフェクチン処方物中などで送達
され得る。このような方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号、同第
５，５８９，４６６号および同第５，５８０，８５９号（これらは、本明細書中
に参考として援用される）に記載される。
【０４１１】 遺伝子治療方法において使用されるニューロペプチドレセプターポリヌクレオ
チドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノム中に組み込まれないかまたは複
製を可能にする配列を含まない構築物である。適切なベクターとしては、Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐ
ＸＴ１およびｐＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ
、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ；ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥ
Ｆ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．１、およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適
切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【０４１２】 当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、ニューロペプチドレセプター
ＤＮＡの発現を駆動するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、ア
デノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；
または異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ー）；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、Ｍ
ＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター
；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモータ
ー；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキ
ナーゼプロモーター）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；お
よびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられる。このプロモーターはまた、ニ
ューロペプチドレセプターについてネイティブなプロモーターであり得る。
【０４１３】 他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主
要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研
究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの期間の間、所
望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０４１４】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉
、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵
臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結
合組織を含む）の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、器官組織の
細網線維間の細胞間の液体、ムコ多糖類基質、血管または室の壁における弾性線
維、線維性組織のコラーゲン線維、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞（ｃｏｎｎｅ
ｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ
）内または骨の裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およ
びリンパチャネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間
への送達は、以下で議論される理由のために好ましい。ニューロペプチドレセプ
ターポリヌクレオチド構築物は、これらの細胞を含む組織への注射によって、好
都合に送達され得る。ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド構築物は、
好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞において
発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化していない細
胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。イン
ビボでの筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現するその能力に
おいて、特に適格である。
【０４１５】 裸の核酸配列注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５
ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬量
は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好ましくは
約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識するよ
うに、この投薬量は、注射の組織部位に応じて変化する。核酸配列の適切かつ有
効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状態および
投与経路に依存し得る。
【０４１６】 好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注射経路による。しかし、他
の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に、肺または気管支の組
織、咽喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる
。さらに、裸のニューロペプチドレセプターＤＮＡ構築物が、血管形成術の間に
この手順において用いられるカテーテルによって動脈に送達され得る。
【０４１７】 裸のポリヌクレオチドは、送達部位での直接の針注射、静脈内注射、局所投与
、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない
、当該分野で公知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該
分野で公知である。
【０４１８】 実施例において証明されるように、裸のニューロペプチドレセプター核酸配列
は、インビボで投与され得、ウサギの大腿動脈においてニューロペプチドレセプ
ターポリペプチドの好首尾の発現を生じる。
【０４１９】 この構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフ
ェクチン、沈殿剤などのような送達ビヒクルを用いて送達され得る。このような
送達方法は、当該分野で公知である。
【０４２０】 特定の実施形態において、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド構築
物は、リポソーム調製物中で複合体化している。本発明にて使用するためのリポ
ソーム調製物は、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）お
よび中性の調製物を包含する。しかしながら、カチオン性リポソームとポリアニ
オン性核酸との間で強固な荷電複合体を形成し得るので、カチオン性リポソーム
が特に好ましい。カチオン性リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤ
ＮＡ（本明細書中で参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６）；ｍ
ＲＮＡ（本明細書中で参考として援用される、Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７〜６０８１）；お
よび精製された転写因子（本明細書中で参考として援用される、Ｄｅｂｓら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９〜１０１９２）の細胞
内送達を媒介することが示されている。
【０４２１】 カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジ
オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは特に有用であり、そして商標ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎのもとにＧ
ＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．より入手可能である（
本明細書中で参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６をもまた参照
のこと）。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓ
ｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。
【０４２２】 当該分野で周知の技術を使用して、他のカチオン性リポソームを、容易に入手
可能な物質より調製し得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−
３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記述に関して、例
えばＰＣＴ公開第ＷＯ ９０／１１０９２号（本明細書中で参考として援用され
る）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献にて説明されており、例
えば、本明細書中で参考として援用される、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７を参照のこと
。類似した方法を使用して、他のカチオン性脂質物質よりリポソームを調製し得
る。
【０４２３】 同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔ
ｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に
入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して簡単に調製され得る。
そのような物質としてはとりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホ
スファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ
）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホス
ファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｈａｔｉｄｙｌ ｅｔ
ｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、ＤＯ
ＴＭＡ出発物資およびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な比率で混合され得る。これら
の物質を使用してリポソームを生成する方法は、当該分野で周知である。
【０４２４】 例えば、商業的に、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレ
オイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせにおいて使用し、コレ
ステロールを添加してもしなくても、従来のリポソームを生成し得る。従って、
例えば、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、各５０ｍｇのＤＯＰＧおよ
びＤＯＰＣを乾燥することにより、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製し得る。この
サンプルを一晩真空ポンプ下に置き、そして次の日、脱イオン水で水和する。次
いで、浴を、１５ＥＣで循環させながら、最大設定にて、逆位カップ（浴タイプ
）プローブを装備したＨｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ モデル３５０超音波処理器を
使用して、このサンプルを栓をしたバイアル中にて２時間超音波処理する。ある
いは、負に荷電した小胞を、超音波処理なしで調製して多重膜小胞を生成し得る
か、または核孔膜（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して押し出
すことにより別々の大きさの単膜小胞を生成し得る。他の方法は、当業者に公知
でありそして利用可能である。
【０４２５】 このリポソームとしては、多重膜小胞（ＭＬＶ）、小さな単膜小胞（ＳＵＶ）
または大きな単膜小胞（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶが好ましい。当該分野で
周知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体が調製される。例えば、
本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３）、１０１：５１２〜５２７を参照
のこと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラスチューブの壁面にリン脂質の
薄膜を堆積させ、そしてその後、カプセル化される物質の溶液で水和することに
よって調製され得る。ＳＵＶはＭＬＶの長期超音波処理により調製され、単膜リ
ポソームの均質集団を生成する。封入されるべき物質を、予め形成されたＭＬＶ
の懸濁液に添加し、次いで、超音波処理する。カチオン性脂質を含むリポソーム
を使用する場合、乾燥した脂質膜を、滅菌水または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＮａＣ
ｌのような等張性緩衝溶液のような適切な溶液中に再懸濁し、超音波処理し、次
いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと直接混合する。正に荷電したリポソ
ームのカチオン性ＤＮＡへの結合に起因して、リポソームおよびＤＮＡは非常に
安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸フラグメントを用いての用途を見出
す。ＬＵＶは、当該分野で周知の多くの方法により調製される。一般に使用され
る方法としては、Ｃａ２＋−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌ
ｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８
３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；エーテル注入（Ｄｅ
ａｍｅｒ，Ｄ．およびＢａｎｇｈａｍ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４
８）；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．およびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐ
．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５
）；および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；Ｓｚｏｋａ，Ｆ．およびＰａｐａ
ｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ（１９７８）７５：１４５；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ（１９８２）２１５：１６６）が挙げられ、これらの文献は本明細書中で参
考として援用される。
【０４２６】 一般に、ＤＮＡのリポソームに対する割合は約１０：１から約１：１０までで
ある。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は約５：１から約１：５までであ
る。より好ましくは、その割合は約３：１から約１：３までである。さらにより
好ましくは、その割合は約１：１である。
【０４２７】 米国特許第５，６７６，９５４号（本明細書中で参考として援用される）はカ
チオン性リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウスへの注入につい
て報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同
第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６
号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，
０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考と
して援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に
使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、
同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５
５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として
援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提
供する。
【０４２８】 特定の実施形態において、ニューロペプチドレセプターをコードする配列を含
むＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで細
胞を操作する。レトロウイルスプラスミドベクターが誘導され得るレトロウイル
スとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウ
イルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウ
イルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルス
が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４２９】 このレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を
形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッ
ケージング細胞株の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される
、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１：５〜１４（１９
９０）にて記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ
１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ
＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これら
に限定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッケ
ージング細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーシ
ョン、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈殿が挙げられるが、それらに限定
されない。１つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターをリ
ポソームにカプセル化するか、または脂質に結合して、次いで宿主に投与し得る
。
【０４３０】 このプロデューサー細胞株は、ニューロペプチドレセプターをコードするポリ
ヌクレオチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そ
のようなレトロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボの
どちらかにおいて、真核生物細胞を形質導入し得る。この形質導入された真核生
物細胞は、ニューロペプチドレセプターを発現する。
【０４３１】 特定の他の実施形態において、アデノウイルスベクター中に含まれるニューロ
ペプチドレセプターポリヌクレオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで細
胞を操作する。アデノウイルスは、それがニューロペプチドレセプターをコード
し、そして発現し、それと同時に通常の溶解性ウイルス生活環にて複製するその
能力に関して不活性化されるように操作され得る。アデノウイルス発現は、その
ウイルスＤＮＡの宿主細胞染色体への組み込み無しに達成され、その結果、挿入
性変異誘発についての心配が軽減される。さらに、アデノウイルスは、何年もの
間、腸の生ワクチンとして優れた安全プロフィールを伴って使用されている（Ｓ
ｃｈｗａｒｔｚ，Ａ．Ｒ．ら、（１９７４）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉ
ｓ．、１０９：２３３−２３８）。最終的に、アデノウイルス媒介性遺伝子移入
が、コトン（ｃｏｔｔｏｎ）ラットの肺へのα−１−アンチトリプシンおよびＣ
ＦＴＲの移入を含む多くの例において実証されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ
．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：４３１〜４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎ
ｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：１４３〜１５５（１９９２））。さらに、ヒト癌
における原因物質としてアデノウイルスを確立しようとする広範な研究は、一様
に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７６：６６０６（１９７９））。
【０４３２】 本発明において有用である適切なアデノウイルスベクターが、例えば、Ｋｏｚ
ａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ
．、３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８
：１４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅｔ．Ｔｈｅｒ．、４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｇｅｎｅｔ、７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３６５：６９１〜６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２
２４号に記載されており、これらは本明細書中で参考として援用される。例えば
、アデノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞にて増殖
され得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そして構成的に
ＥｌａおよびＥｌｂを発現し、このことは、このベクターから欠失している遺伝
子の産物を提供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加え
て、他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もま
た、本発明において有用である。
【０４３３】 好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは、複製欠損性である
。複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルス
および／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは
、細胞に感染する能力があり、そしてプロモーター（例えば、本発明のＨＡＲＰ
プロモーター）に作動可能に連結された目的のポリヌクレオチドを発現し得るが
、ほとんどの細胞にて複製し得ない。複製欠損アデノウイルスは、次の遺伝子：
Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａまたはＬ１〜Ｌ５のすべてまたは一部のう
ちの１つ以上にて欠失され得る。
【０４３４】 特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、エ
キソビボまたはインビボでこの細胞を操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を生成す
るためにヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（
Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７（１９９２））。ＡＡＶはまた、分裂中では
ない細胞の中にそのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。
３００塩基対程度の小さいＡＡＶを含むベクターがパッケージされ得、そして組
み込み得るが、外来性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限られる。その
ようなＡＡＶの生成および使用の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特
許第５，１３９，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７
８号、同第５，４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８
，７４５号および同第５，５８９，３７７号を参照のこと。
【０４３５】 例えば、本発明において使用するために適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製
、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みに必要な配列すべてを含む。Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９
８９）において見い出される方法のような、標準的クローニング方法を使用して
、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド構築物を、このＡＡＶベクター
に挿入する。次いで、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カル
シウム沈殿などを含む、任意の標準的技術を使用して、この組み換えＡＡＶベク
ターを、ヘルパーウイルスに感染しているパッケージング細胞にトランスフェク
トする。適切なヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイ
ルス、ワクシニアウイルス、またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッケ
ージング細胞がトランスフェクトそして感染されると、それらはニューロペプチ
ドレセプターポリヌクレオチド構築物を含む感染性ＡＡＶウイルス粒子を生成す
る。次いで、エキソビボまたはインビボのいずれかで、これらのウイルス粒子を
使用して真核生物細胞を形質導入する。この形質導入細胞は、そのゲノムに組み
込まれたニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド構築物を含み、そしてニ
ューロペプチドレセプターを発現する。
【０４３６】 遺伝子治療の別の方法は、相同組み換え（例えば、米国特許第５，６４１，６
７０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、１９
９６年９月２６日公開；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４
日公開；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）を介して、異種制御領
域および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、ニューロペプチドレセプター配
列をコードしている配列）を作動可能に連結する工程を含む。この方法は、標的
細胞中に存在しているが、通常はその細胞中で発現しないかまたは所望するより
も低いレベルで発現する、遺伝子の活性化を含む。
【０４３７】 当該分野で既知の標準的技術を使用して、ポリヌクレオチド構築物を作製する
。この構築物は、プロモーターを、そのプロモーターに隣接した標的化配列とと
もに含む。適切なプロモーターが、本明細書中に記載されている。標的化配列は
、内在性配列に対して十分に相補的であり、プロモーター−標的化配列と内在性
配列との相同組換えを可能にする。標的化配列は、所望される内在性ポリヌクレ
オチド配列のニューロペプチドレセプターの５’末端の十分近くに存在し、それ
ゆえ、相同組換えに際して、プロモーターは、内在性配列に作動可能に連結され
る。
【０４３８】 このプロモーターおよび標的化配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。好ま
しくは、この増幅されたプロモーターは、５’末端および３’末端に別の制限酵
素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されたプロモ
ーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末
端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されたプ
ロモーターおよび標的化配列を消化し、そしてともに連結する。
【０４３９】 裸のポリヌクレオチドとしてか、もしくは上記により詳細に記載されるような
リポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクション、
沈殿剤などのようなトランスフェクション促進剤と一緒にかのいずれかで、この
プロモーター−標的化配列構築物を細胞に送達する。直接針注射、静脈内注射、
局所投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法により、Ｐプロモ
ーター−標的化配列を送達し得る。この方法を、下記により詳細に記載する。
【０４４０】 プロモーター−標的化配列構築物は、細胞により取り込まれる。この構築物と
内在性配列との間に相同組換えが起こり、その結果、内在性ニューロペプチドレ
セプター配列は、このプロモーターの制御下に配置される。次いで、このプロモ
ーターは、内在性ニューロペプチドレセプター配列の発現を駆動する。
【０４４１】 ニューロペプチドレセプターをコードするポリヌクレオチドは、他の脈管形成
タンパク質をコードする他のポリヌクレオチドと共に投与され得る。脈管形成タ
ンパク質としては、酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、上
皮成長因子αおよびβ、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子、腫
瘍壊死因子α、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、コロニー刺激因子、マ
クロファージコロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、お
よび一酸化窒素シンセターゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４２】 好ましくは、ニューロペプチドレセプターをコードするポリヌクレオチドは、
そのタンパク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含む。代表的に、このシグ
ナル配列は、ポリヌクレオチドのコード領域の５’末端に向かってかまたは５’
末端で発現される、そのポリヌクレオチドのコード領域に位置する。このシグナ
ル配列は、目的のポリヌクレオチドに対して同種または異種であり得、そしてト
ランスフェクトされる細胞に対して同種または異種であり得る。さらに、当該分
野で公知の方法を使用して、このシグナル配列は化学合成され得る。
【０４４３】 その投与様式によって、治療効果を提供するのに十分な量にて１つ以上の分子
が発現される限り、上記の任意のポリヌクレオチド構築物の任意の投与様式が使
用され得る。これは、直接針注入、全身注射、カテーテル注入、バイオリスティ
ック（ｂｉｏｌｙｓｔｉｃ）注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、
ゲルフォームスポンジデポット（ｄｅｐｏｔ）、他の市販デポット物質、浸透圧
ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口用または坐剤用の固形（錠剤また
は丸剤）薬学的処方物、および手術中のデカンティングまたは局所適用を含む。
例えば、ラット肝臓およびラット脾臓へのリン酸カルシウム沈殿した裸のプラス
ミドの直接注入、または門脈へのタンパク質被覆プラスミド直接注入は、ラット
肝臓における外来遺伝子の遺伝子発現をもたらした（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、２４３：３７５（１９８９））。
【０４４４】 局所投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達ビ
ヒクルと複合体を形成した本発明の組換え分子は、動脈領域中に直接注入により
投与されるか、または動脈領域内部に局所投与される。動脈領域内部での組成物
の局所投与とは、その組成物を動脈内に数センチメートル、好ましくは数ミリメ
ートルで注射することをいう。
【０４４５】 局所投与の別の方法は、外科的創傷内またはその周辺に本発明のポリヌクレオ
チド構築物を接触させることである。例えば、患者は手術を経験し得、そしてこ
のポリヌクレオチド構築物を創傷内部の組織表面上に被覆され得るか、またはそ
の構築物を創傷内部の組織領域に注射され得る。
【０４４６】 全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクルと複合体
を形成した本発明の組換え分子を含む。全身投与で使用するために適切な送達ビ
ヒクルは、特定部位に対してそのビヒクルを標的化するリガンドを含むリポソー
ムを含む。
【０４４７】 全身投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口および経皮
（局所的）送達が挙げられる。当該分野で標準的な方法を使用して、静脈内注射
が実行され得る。当該分野で標準的な方法を使用して、エアロゾル送達もまた実
行され得る（例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １８９：１１２７７〜１
１２８１（１９９２）を参照のこと）。動物の腸内の消化酵素による分解に耐え
得るキャリアに対して本発明のポリヌクレオチド構築物が複合体を形成すること
により、経口送達は実行され得る。そのようなキャリアの例としては、当該分野
で公知であるもののような、プラスチックカプセルまたは錠剤が挙げられる。皮
膚内へ通過可能な親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と本発明のポリヌクレオチド
構築物を混合することによって、局所的送達は実行され得る。
【０４４８】 送達される物質の有効量を決定することは、例えば、その物質の化学構造およ
び生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびそ
の重症度、ならびに投与経路を含む、多数の因子に依存し得る。処置の頻度は、
１用量あたりの投与されるポリヌクレオチド構築物の量ならびに被験体の健康お
よび病歴のような多くの因子に依存する。正確な量、投薬回数および投薬のタイ
ミングは、主治医または主治獣医により決定される。
【０４４９】 本発明の治療的組成物は、任意の動物に、好ましくは哺乳動物および鳥類に投
与され得る。好ましい哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、
ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが挙げられ、ヒトが特に好ましい。
【０４５０】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリペプチドおよび、ポリペプチドであ
る上で同定された化合物は、このようなポリペプチドのインビボにおける発現に
よって、本発明に従って用いられ得、これはしばしば「遺伝子治療」と称される
。
【０４５１】 従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボで、ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）と共に操作され得、この操作された
細胞は、次いで、このポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このよ
うな方法は、当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドを
コードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子を使用することにより、当該分
野で公知の手順によって操作され得る。
【０４５２】 同様に、細胞は、例えば、当該分野で公知の手順によって、インビボのポリペ
プチドの発現についてインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発
明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子を産生する
ためのプロデューサー細胞は、インビトロおける細胞の操作、およびインビボに
おけるポリペプチドの発現のために、患者に投与され得る。このような方法によ
って本発明のポリペプチドを投与するためのこれらおよび他の方法は、本発明の
教示から当業者に明らかでなければならない。例えば、細胞を操作するための発
現ビヒクルは、レトロウイルス以外（例えば、適切な送達ビヒクルと組み合わせ
た後に、インビボで細胞を操作するために使用され得るアデノウイルス）であり
得る。
【０４５３】 上記のレトロウイルスプラスミドベクターが誘導され得るレトロウイルスには
、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス、例えば
、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナ
ガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉
腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一実
施形態において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病
ウイルスから誘導される。
【０４５４】 ベクターは、１つ以上のプロモーターを含む。用いられ得る適切なプロモータ
ーには、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびＭｉｌｌｅｒら
、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第７巻、Ｎｏ．９、９８０〜９９０（１９８９
）に記載されるヒトサイトメガロウイルス（ＤＭＶ）プロモーターまたは任意の
他のプロモーター（例えば、真核生物細胞プロモーターのような細胞プロモータ
ー（例えば、ヒストン、ｐｏｌ ＩＩＩおよびアクチンプロモーターが挙げられ
るがこれらに限定されない））が挙げられるが、これらに限定されない。用いら
れ得る他のウイルスプロモーターには、アデノウイルスプロモーター、チミジン
キナーゼ（ＴＫ）プロモーターｌおよびＢ１９パルボウイルスプロモーターが挙
げられるが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中
に含まれる教示から、当業者に明らかである。
【０４５５】 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下
にある。用いられ得る適切なプロモーターには、アデノウイルスプロモーター（
例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロモーター（例
えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；呼吸器合胞体ウイルス
（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター、
メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモ
ーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；ウイルスチミ
ジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ
ー）；レトロウイルスＬＴＲ（上記の改変レトロウイルスＬＴＲを含む）；アク
チンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるが、これ
らに限定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制
御するネイティブのプロモーターであり得る。
【０４５６】 このレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を
形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッ
ケージング細胞株の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される
、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅａｐｙ、１：５〜１４（１９９
０）にて記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１
２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋
Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに
限定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッケー
ジング細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーショ
ン、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈殿が挙げられるが、それらに限定さ
れない。１つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターをリポ
ソームにカプセル化するか、または脂質に結合して、次いで宿主に投与し得る。
【０４５７】 このプロデューサー細胞株は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのよう
なレトロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのどちら
かにおいて、真核生物細胞を形質導入し得る。形質転換され得る真核生物細胞と
しては、胚幹細胞、胎生期癌細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、
筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞が挙げられるが、
これらに限定されない。
【０４５８】 （ニューロペプチドレセプターの生物学的活性） ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または
ニューロペプチドレセプターのアゴニストもしくはアンタゴニストは、１つ以上
の生物学的活性について試験するためのアッセイにおいて使用され得る。ニュー
ロペプチドレセプターポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはニューロ
ペプチドレセプターのアゴニストもしくはアンタゴニストが特定のアッセイにお
いて活性を示す場合、おそらく、ニューロペプチドレセプターは、この生物学的
活性に関連する疾患に関与し得る。従って、ニューロペプチドレセプターは、関
連する疾患を処置するために使用され得る。
【０４５９】 ニューロペプチドレセプターは、治療分子として有用であり得る。これは、造
血細胞（特に、Ｂ細胞およびＴ細胞）の増殖、活性化、成熟、生存、および／ま
たは分化を制御するために使用され得る。特に、ニューロペプチドレセプターは
、免疫の調節を媒介するための有用な治療剤であり得る。免疫細胞のこの制御は
、免疫障害（例えば、自己免疫疾患または免疫抑制（以下を参照のこと））の処
置、診断、検出、および／または予防のために特に重要である。好ましくは、免
疫障害の処置、診断、検出、および／または予防は、ニューロペプチドレセプタ
ーの分泌形態、遺伝子治療、またはエキソビボ適用を使用して行われ得る。さら
に、阻止抗体または変異形態のいずれかのニューロペプチドレセプターの阻害は
、ニューロペプチドレセプターの発現を調節し得る。これらのインヒビターは、
ニューロペプチドレセプターの調節の誤りに関連する疾患を処置、診断、検出、
および／または予防するために有用であり得る。
【０４６０】 １つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合する
本発明のポリペプチド（例えば、ニューロペプチドレセプターポリペプチドまた
は抗ニューロペプチドレセプター抗体）を投与することによる、本発明の組成物
の細胞への特異的な送達のための方法を提供する。１つの例において、本発明は
、治療タンパク質を標的化細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例にお
いて、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または
二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込み得るか、またはエピソームにて複
製し得、そして転写され得るＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提
供する。
【０４６１】 別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグに関連
する本発明のポリペプチド（例えば、ニューロペプチドレセプターポリペプチド
または抗ニューロペプチドレセプター抗体）を投与することによる細胞の特異的
な破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
【０４６２】 「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクタ系、放射性同位体、ホロ毒素（
ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、細胞毒素（細胞
傷害剤）または規定の条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には
通常存在しない任意の分子もしくは酵素を結合および活性化する化合物を意味す
る。本発明の方法に従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、こ
れらに限定されない：当該分野で公知の放射性同位体、固有のまたは誘導された
内因性の細胞傷害性エフェクタ系に結合する化合物（例えば、抗体（またはその
補体固定含有部分））、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、
α毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素
、サポリン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、
ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒
素。「毒素」はまた、細胞分裂停止剤もしくは細胞破壊剤、治療薬または放射活
性金属イオン（例えば、α−放射体（例えば、２１３Ｂｉ））もしくは他の放射
性同位体（例えば、１０３Ｐｄ、１３３Ｘｅ、１３１Ｉ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、
６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、３５Ｓ、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１５３Ｇｄ、１６
９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、９０イットリウム、１１
７スズ、１８６レニウム、１６６ホルミウム、および１８８レニウム）；発光標
識（例えば、ルミノール）；および蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびロ
ーダミン）、ならびにビオチンを含む。
【０４６３】 当該分野において公知の技術は、本発明の抗体を標識化するために適用され得
る。このような技術としては、二官能性結合剤の使用（例えば、米国特許第５，
７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６９６，２３９号；同
第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第５，４８９，４２５
号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号；同第５，３４２，
６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５６０号；および同第
５，８０８，００３号を参照のこと；これら各々の内容は、本明細書中に参考と
してその全体を援用する）が挙げられるが、これに限定されない。細胞毒または
細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタ
キセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エ
チジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏ
ｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉ
ｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄ
ｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミ
トラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココル
チコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、および
ピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログ、が挙げられる。治療
剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−
チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆｌｕｏ
ｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例えば、メクロ
レタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルム
スチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙ
ｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、スト
レプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（
ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシ
ン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダク
チノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、
およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗
有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、を含むがそれらに
限定されない。
【０４６４】 「細胞傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞
傷害性化合物へと変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って
使用され得る細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化
剤のグルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シ
トシンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセ
トアミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６５】 個体におけるニューロペプチドレセプターの標準レベルまたは通常のレベルに
おける減少によって引き起こされる状態（特に、免疫系の障害）は、ニューロペ
プチドレセプターポリペプチド（例えば、可溶性細胞外ドメインの形態またはこ
の完全タンパク質を発現する細胞において）またはアゴニストの投与によって処
置され得ることが理解される。従って、本発明はまた、ニューロペプチドレセプ
ター活性の増加したレベルを必要とする個体の処置方法を提供し、この方法は、
このような個体におけるニューロペプチドレセプター活性レベルを増加するため
に有効な本発明の単離されたニューロペプチドレセプターポリペプチドまたはそ
のアゴニスト（例えば、アゴニストニューロペプチドレセプター抗体）のある程
度の量を含む薬学的組成物を、このような個体に投与する工程を包含する。
【０４６６】 個体におけるニューロペプチドレセプター活性の標準レベルまたは通常のレベ
ルにおける増加によって引き起こされる状態（特に、免疫系の障害）は、ニュー
ロペプチドレセプターポリペプチド（例えば、可溶性細胞外ドメインの形態また
はこの完全タンパク質を発現する細胞において）またはアンタゴニスト（例えば
、アンタゴニストニューロペプチドレセプター抗体）の投与によって処置され得
ることがまた、理解される。従って、本発明はまた、ニューロペプチドレセプタ
ー活性の減少したレベルを必要とする個体の処置方法を提供し、この方法は、こ
のような個体におけるニューロペプチドレセプター活性レベルを減少するために
有効な本発明の単離されたニューロペプチドレセプターポリペプチド、またはそ
のアゴニストのある程度の量を含む薬学的組成物を、このような個体に投与する
工程を包含する。
【０４６７】 （免疫活性） 本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体
、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、例えば、免疫細胞の増
殖、分化、もしくは動員（走化性）を活性化または阻害することにより、免疫系
の疾患、障害および／または状態を、処置、予防、および／または診断するのに
有用であり得る。免疫細胞は、造血と呼ばれるプロセスを介して発達し、多能性
幹細胞から骨髄性細胞（血小板、赤血球、好中球およびマクロファージ）および
リンパ系細胞（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）を生成する。これら免疫疾患、障
害および／または状態の病因は、遺伝的、身体的（ｓｏｍａｔｉｃ）（例えば、
癌またはいくつかの自己免疫性障害）、後天的（例えば、化学療法もしくは毒素
による）または感染的であり得る。さらに、本発明のニューロペプチドレセプタ
ーポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはアゴニストもしくは
アンタゴニストは、特定の免疫系の疾患または障害のマーカーまたは検出物質（
ｄｅｔｅｃｔｏｒ）として使用され得る。
【０４６８】 本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチド、およ
び／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、造血細胞の疾患、障害および
／または状態の処置、予防および／または診断において有用であり得る。本発明
のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／また
はアゴニストもしくはアンタゴニストは、特定の（または多くの）型の造血細胞
の減少に関連した疾患、障害および／または状態を処置または予防する試みにお
いて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増殖を増加させるために用いら
れ得る。免疫不全症候群の例としては、血液タンパク質の疾患、障害および／ま
たは状態（例えば、無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症）、毛細
血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不全、ディ・ジョージ症候群、ＨＩＶ感染
、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着不全症候群、リンパ球減少、食細胞殺細菌
機能不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、ヴィスコット−オールドリッチ障
害、貧血、血小板減少、またはヘモグロビン尿症が挙げられるが、それらに限定
されない。
【０４６９】 さらに、本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストをまた使用して、止血性
活性（出血を止めること）または血栓崩壊活性（血餅形成）を調節し得る。例え
ば、止血活性または血栓崩壊活性を増大させることにより、本発明のニューロペ
プチドレセプターポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴ
ニストもしくはアンタゴニストを使用し、血液凝固の疾患、障害および／または
状態（例えば、無線維素原血症、因子欠損症）、血液血小板の疾患、障害および
／または状態（例えば、血小板減少症）、あるいは外傷、手術または他の原因か
ら生じる創傷を処置し得る。あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を減少させ
得る本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチド、お
よび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストを使用し、凝血を阻害または溶
解し得る。心臓発作（梗塞）、発作（ｓｔｒｏｋｅ）または瘢痕の処置において
、これらの分子は重要であり得る。
【０４７０】 自己免疫障害の処置、予防および／または診断において、本発明のニューロペ
プチドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストはまた、有用であり得る。多くの自己免疫障害は、免疫
細胞によって外来性物質として不適切に自己認識することから生じる。この不適
切な認識は、宿主組織の破壊をもたらす免疫応答を引き起こす。従って、免疫応
答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性を阻害し得る本発明のニューロペプチ
ドレセプターポリヌクレオチドおよびポリペプチドの投与は、自己免疫障害の防
止において効果的な治療であり得る。
【０４７１】 本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体
、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストによって処置、予防および
／または診断され得る自己免疫疾患および障害の例としては、以下の１つ以上が
挙げられるがこれらに限定されない：自己免疫溶血性貧血、自己免疫新生児血小
板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗
リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎
、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡネフロパシー）、多発性硬化
症、神経炎、ブドウ膜炎眼炎、多発性内分泌腺症、紫斑（例えば、ヘノッホ−シ
ェーンライン（Ｈｅｎｌｏｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ）紫斑病）、ライター病、
Ｓｔｉｆｆ−Ｍａｎ症候群、自己免疫肺炎症、ギヤン−バレー症候群、インシュ
リン依存性糖尿病（ｍｅｌｌｉｔｉｓ）、および自己免疫炎症性眼、自己免疫甲
状腺炎、甲状腺機能低下症（すなわち、橋本甲状腺炎）、グッドパスチャー症候
群、天疱瘡、レセプター自己免疫（例えば、（ａ）グレーヴズ病、（ｂ）重症筋
無力症、および（ｃ）インシュリン耐性など）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫
血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（ｓｃ
ｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、混合結合組織病、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性貧血、
特発性アディソン病、不妊症、糸球体腎炎（原発性糸球体腎炎およびＩｇＡネフ
ロパシーなど）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、糖尿病およびアドレナ
リン作用性薬剤耐性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作用性薬剤耐
性を含む）、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺不全、白斑、
脈管炎、心筋梗塞後（ｐｏｓｔ−ＭＩ）、心臓切開症候群、じんま疹、アトピー
性皮膚炎、喘息、炎症性ミオパシーならびに他の炎症性障害、肉芽腫性障害、変
性障害および萎縮性障害。
【０４７２】 本発明の組成物によって処置、予防および／または診断され得る、さらなる、
自己免疫障害（起こり得る）としては、以下が挙げられるがこれらに限定されな
い：慢性関節リウマチ（例えば、関節における免疫複合体によってしばしば特徴
付けられる）、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ）（
例えば、核小体抗体および他の核抗体によってしばしば特徴付けられる）、混合
結合組織病（例えば、可溶性核抗原（例えば、リボ核タンパク質）に対する抗体
によってしばしば特徴付けられる）、多発性筋炎（例えば、非ヒストンＡＮＡに
よってしばしば特徴付けられる）、悪性貧血（例えば、抗壁細胞、ミクロソーム
、および内因子抗体によってしばしば特徴付けられる）、特発性アジソン病（例
えば、体液および細胞媒介性副腎細胞傷害性によってしばしば特徴付けられる）
、不妊症（例えば、抗精子抗体によってしばしば特徴付けられる）、糸球体腎炎
（例えば、糸球体基底膜抗体または免疫複合体によってしばしば特徴付けられる
）、水疱性類天疱瘡（例えば、基底膜中のＩｇＧおよび補体によってしばしば特
徴付けられる）、シェーグレン症候群（例えば、多重組織抗体、および／または
特定の非ヒストンＡＮＡ（ＳＳ−Ｂ）によってしばしば特徴付けられる）、糖尿
病（例えば、細胞媒介性および体液性島細胞抗体によってしばしば特徴付けられ
る）、ならびにアドレナリン作動性薬剤抵抗性（喘息または嚢胞性線維症を伴う
アドレナリン作動性薬剤抵抗性を含む）（例えば、βアドレナリンレセプター抗
体によってしばしば特徴付けられる）。
【０４７３】 本発明の組成物を用いて処置、予防、および／または診断され得る、さらなる
自己免疫性障害（これらはあり得る）としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：慢性活性肝炎（例えば、平滑筋抗体によってしばしば特徴付けら
れる）、原発性胆汁性肝硬変（例えば、ミトコンドリア抗体によってしばしば特
徴付けられる）、他の内分泌腺不全（例えば、いくつかの場合は、特定の組織抗
体によってしばしば特徴付けられる）、白斑（例えば、メラノサイト抗体によっ
てしばしば特徴付けられる）、脈管炎（例えば、脈管壁におけるＩｇおよび補体
ならびに／または低血清補体によってしばしば特徴付けられる）、ＭＩ後（例え
ば、心筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、心臓切開症候群（例えば、心
筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、じんま疹（例えば、ＩｇＥに対する
ＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、アトピー性皮
膚炎（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特
徴付けられる）、喘息（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体に
よってしばしば特徴付けられる）、ならびに多くの他の炎症性障害、肉芽種性障
害、変性障害、および萎縮性障害。
【０４７４】 好ましい実施形態においては、自己免疫性疾患および障害ならびに／または上
記に列挙された疾患および障害に関連する状態は、例えば、本発明のアンタゴニ
スト、またはアゴニスト、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、処置
、予防、および／または診断される。
【０４７５】 好ましい実施形態においては、本発明のニューロペプチドレセプターポリヌク
レオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニ
ストが、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の免疫不全個体の中で免疫反応性をブース
トするための薬剤として用いられ得る。
【０４７６】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストを投与することにより回復されるかまたは処置され得る
Ｂ細胞免疫不全としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：重篤な複
合型免疫欠損（ＳＣＩＤ）−Ｘ連鎖、ＳＣＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナ
ーゼ欠損（ＡＤＡ欠損）、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、Ｂｒｕｔ
ｏｎ’ｓ病、先天性無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖乳児無ガンマグロブリン血
症、後天性無ガンマグロブリン血症、成人発症無ガンマグロブリン血症、後期発
症無ガンマグロブリン血症、異常ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血
症、一過性乳児低ガンマグロブリン血症、非特異的低ガンマグロブリン血症、無
ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全（ＣＶＩ）（後天性）、ヴィスコッ
ト−オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫欠損、過剰
ＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖免疫欠損、選択的ＩｇＡ欠損、ＩｇＧサブクラス欠損（Ｉ
ｇＡ欠損を伴うかまたは伴わない）、正常なＩｇまたは上昇したＩｇを伴う抗体
欠損、胸腺腫を伴う免疫欠損、Ｉｇ重鎖欠失、κ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ球増殖性
障害（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫欠損、退縮無ガンマグロブリン血症（Ｓｗ
ｉｓｓ型）、網様発育不全、新生児好中球減少症、重篤な先天性白血球減少症、
免疫欠損を伴う胸腺リンパ形成不全症−発育不全症または形成異常症、毛細血管
拡張性運動失調、短肢（ｓｈｏｒｔ ｌｉｍｂｅｄ）小人症、Ｘ連鎖リンパ球増
殖症候群（ＸＬＰ）、Ｉｇを伴うネゼロフ症候群複合免疫欠損、プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼ欠損（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラスＩＩ欠失（不全リンパ球症候
群）および重症複合型免疫不全。
【０４７７】 本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、および／またはそのアゴニス
トを投与することによって、緩和または処置され得るＴ細胞不全としては、以下
が挙げられるがこれらに限定されない：例えば、ディジョージ奇形、胸腺発育不
全、第３および第４咽頭嚢症候群、２２ｑ１１．２欠損、慢性粘膜皮膚カンジダ
症、ナチュラルキラー細胞欠損（ＮＫ）、特発性ＣＤ４＋ Ｔリンパ球減少、顕
著なＴ細胞欠損を伴う免疫欠損（不特定）、および細胞媒介免疫の不特定の免疫
欠損が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、ディジョ
ージ奇形またはディジョージ奇形に関連する状態は、例えば、本発明のポリペプ
チドもしくはポリヌクレオチド、またはそのアンタゴニストもしくはアゴニスト
を投与することによって、緩和されるか処置される。
【０４７８】 本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、および／またはそれらのア
ゴニストもしくはアンタゴニストを投与することによって寛解または処置され得
る他の免疫不全症としては、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ；例えば、Ｘ連鎖Ｓ
ＣＩＤ、常染色体ＳＣＩＤ、およびアデノシンデアミナーゼ不全症）、毛細血管
拡張性運動失調、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、短肢性（ｓｈｏｒｔ−
ｌｉｍｂｅｒ）小人症、Ｘ連鎖リンパ球増多症症候群（ＸＬＰ）、ネゼロフ症候
群（例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ不全症）、ＭＨＣクラスＩＩ不
全症が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、毛細血
管拡張性運動失調または毛細血管拡張性運動失調に関連する状態が、本発明のポ
リペプチドもしくはポリヌクレオチド、および／またはそれらのアゴニストもし
くはアンタゴニストを投与することによって寛解または処置され得る。
【０４７９】 特定の好ましい実施形態において、本発明のニューロペプチドレセプターポリ
ヌクレオチド、ポリペプチド、抗体および／またはそれらのアゴニストもしくは
アンタゴニストを用いて、慢性関節リウマチが処置、予防、および／または診断
される。別の特定の実施形態において、全身性エリテマトーデスが、本発明のニ
ューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体および／また
はそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置、予防および／また
は診断される。別の特定の好ましい実施形態において、本発明のニューロペプチ
ドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体および／またはそれらのア
ゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、特発性血小板減少性紫斑病が処置、
予防および／または診断される。別の特定の好ましい実施形態において、ＩｇＡ
ネフロパシーは、本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、抗体、および／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストを
用いて、処置、予防および／または診断される。好ましい実施形態において、自
己免疫疾患および自己免疫障害ならびに／または上記の疾患および障害と関連す
る状態は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはそ
れらのアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、処置、予防、および／また
は診断される。
【０４８０】 同様に、アレルギー反応および状態（例えば、喘息（特にアレルギー性喘息）
または他の呼吸障害）はまた、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体
、および／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、処置、
予防および／または診断され得る。さらに、これらの分子は、アナフィラキシー
、抗原性分子に対する過敏性、または血液型不適合を処置、予防および／または
診断するために用いられ得る。
【０４８１】 さらに、本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、抗体、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストをまた用いて、炎
症状態を処置、診断、および／または予防し得る。このような炎症性状態として
は、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えば、呼吸器障害（例えば、
喘息およびアレルギーなど）；胃腸障害（例えば、炎症性腸疾患など）；癌（例
えば、胃癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、肝臓癌、および乳癌など）；ＣＮＳ障害（
例えば、多発性硬化症、血液脳関門透過性、虚血性脳損傷、および／または脳梗
塞、外傷性脳損傷、神経変性性障害（例えば、パーキンソン病およびアルツハイ
マー病など）、ＡＩＤＳ関連痴呆、およびプリオン病）；心血管障害（例えば、
アテローム性動脈硬化症、心筋炎、心血管疾患、および心肺バイパス合併症など
）；ならびに炎症によって特徴付けられる多くのさらなる疾患、状態、および障
害（例えば、慢性肝炎（ＢおよびＣ）、慢性関節リウマチ、痛風、外傷、敗血性
ショック、膵炎、サルコイドーシス、皮膚炎、腎虚血再還流障害、グレーヴス病
、全身性エリテマトーデス、真性糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病）、および同種異
系移植拒絶など）。
【０４８２】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、
および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、移植拒絶、対宿主性移植
片病、自己免疫および炎症性疾患（例えば、免疫複合体誘導血管炎、糸球体腎炎
、溶血性貧血、重症筋無力症、ＩＩ型コラーゲン誘導動脈炎、実験アレルギー性
および超急性異種移植変拒絶、慢性関節リウマチ、および全身性エリテマトーデ
ス（ＳＬＥ）を処置、診断、および／または予防するのに有用である。器官拒絶
は、免疫反応による、移植された組織の宿主免疫細胞破壊によって生じる。同様
に、免疫反応はまた、ＧＶＨＤに関するが、この場合、外来の移植された免疫細
胞が、宿主組織を破壊する。本発明のポリペプチド、抗体、もしくはポリヌクレ
オチドおよび／またはそのアゴニストもしくはアンタゴニスト（免疫応答、特に
Ｔ細胞の増殖、分化、または走化性を阻害する）は、器官拒絶またはＧＶＨＤを
予防するのに有効な治療であり得る。
【０４８３】 同様に、本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、抗体および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストをまた使用し、炎症
を調節および／または診断し得る。例えば、本発明のポリペプチド、抗体、もし
くはポリヌクレオチド、および／または本発明のアゴニストもしくはアンタゴニ
ストは、炎症応答に関与する細胞の活性化、増殖および／または分化を阻害し得
る。これらの分子を使用して、感染に関連する炎症（例えば、敗血症性ショック
、敗血症、または全身炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血再灌流傷害に関連す
る炎症、内毒素致死に関連する炎症、関節炎に関連する炎症、補体媒介性超急性
拒絶に関連する炎症、腎炎に関連する炎症、サイトカインまたはケモカインが誘
導する肺傷害に関連する炎症、炎症性腸疾患に関連する炎症、クローン病に関連
する炎症またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰生成から
生じる炎症を含む、慢性および急性の両方の状態の炎症状態を処置し得る。
【０４８４】 本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチドおよび／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストは、感染性因子を処置、検出、および／または予防するた
めに用いられ得る。例えば、免疫応答を増大することによって、特にＢ細胞およ
び／またはＴ細胞の増殖、活性化および／または分化を増大することによって、
感染性疾患は、処置、検出、および／または予防され得る。免疫応答は、既存の
免疫応答を増大するか、または新しい免疫応答を惹起するかのいずれかによって
、増大され得る。あるいは、本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオ
チド、ポリペプチド、抗体および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは
また、免疫応答の必然的な惹起なしに、感染性因子（感染性因子の適用列挙の節
などで述べる）を直接阻害し得る。
【０４８５】 本発明のさらなる好ましい実施形態としては、以下の適用におけるポリペプチ
ド、抗体、ポリヌクレオチドおよび／またはアゴニストもしくはアンタゴニスト
の使用が挙げられるがこれらに限定されない： 免疫系をブーストし、１つ以上の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、お
よびＩｇＥ）の量の増大を生じ、高い親和性の抗体産生（例えば、ＩｇＧ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）を誘導し、および／または免疫応答を増大するための
動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニ
ブタ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長
類、およびヒト、最も好ましくはヒト）への投与。
【０４８６】 機能的な内因性抗体分子を産生できないか、さもなければ易感染性の内因性免
疫系を有するが、別の動物由来の再構成されたか、または部分的に再構成された
免疫系の手段によってヒト免疫グロブリン分子を産生し得る、動物（上記に列挙
した動物を含むがこれに限定されず、またトランスジェニック動物も含む）への
投与（例えば、ＰＣＴ公開番号、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９６／３４０９６
、ＷＯ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１を参照のこと）。
【０４８７】 特定の抗原に対する免疫応答性を増強するワクチンアジュバント。
【０４８８】 腫瘍特異的免疫応答を増強するためのアジュバント。
【０４８９】 抗ウイルス免疫応答を増強するアジュバント。アジュバントとして本発明の組
成物を用いて増強され得る抗ウイルス免疫応答としては、ウイルスおよび本明細
書において記載されるかさもなければ当該分野で公知のウイルス関連疾患および
症状が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下：ＡＩＤ
Ｓ、髄膜炎、デング、ＥＢＶ、および肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）からなる群より
選択される、ウイルス、疾患または症状に対する免疫応答を増強するためのアジ
ュバントとして用いられる。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、
以下：ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ＲＳウイルス、デング、ロタウイルス、日本脳炎、イ
ンフルエンザＡおよびＢ、パラインフルエンザ、麻疹、サイトメガロウイルス、
狂犬病、Ｊｕｎｉｎウイルス、チクングニヤウイルス、リフトバレー熱、単純疱
疹、および黄熱病からなる群より選択されるウイルス、疾患または症状に対する
免疫応答を増強するアジュバントとして用いられる。
【０４９０】 抗細菌免疫応答または抗真菌免疫応答を増大するためのアジュバント。アジュ
バントとして本発明の組成物を使用して増大され得る抗細菌免疫応答または抗真
菌免疫応答としては、細菌または真菌、および本明細書中に記載されるか、また
はさもなくば当該分野で公知の疾患または症状に関連する細菌または真菌が挙げ
られる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、細菌または真菌、疾患、
または症状（これは、破傷風、ジフテリア、ボツリスム、およびＢ型髄膜炎から
なる群から選択される）に対する免疫応答を増大するためのアジュバントとして
使用される。特定の好ましい実施形態において、本発明の組成物は、細菌または
真菌、疾患、または症状（これは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉ
ｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｇｒｏｕｐ
Ｂ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒ
ｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｈｅ
ｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ
ｉ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ（マラリア）からなる群から選択される）に対
する免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。
【０４９１】 抗寄生生物免疫応答を増大するためのアジュバント。アジュバントとして本発
明の組成物を使用して増大され得る抗寄生生物免疫応答としては、寄生生物、お
よび本明細書中に記載されるかまたはさもなくば当該分野で公知の疾患または症
状に関連する寄生生物が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の組成物
は、寄生生物に対する免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される
。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（マ
ラリア）に対する免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。
【０４９２】 病原に対するＢ細胞応答性の刺激物質として。
【０４９３】 Ｔ細胞のアクチベーターとして。
【０４９４】 免疫抑制性治療を受ける前の、個体の免疫状態を増大させる薬剤として。
【０４９５】 より高い親和性抗体を誘導するための薬剤として。
【０４９６】 血清免疫グロブリン濃度を増加するための薬剤として。
【０４９７】 免疫無防備状態の個体の回復を促進するための薬剤として。
【０４９８】 高齢の集団の間の免疫応答性をブーストするための薬剤として。
【０４９９】 骨髄移植および／または他の移植（例えば、同種異系または外因性の器官移植
）の前、間、または後の免疫系エンハンサーとして。移植に関して、本発明の組
成物は、移植の前、同時、および／または後に投与され得る。特定の実施形態に
おいて、本発明の組成物は、移植の後、Ｔ細胞集団の回復の開始前に投与される
。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、移植の後、Ｔ細胞集団の回
復の開始後であるが、Ｂ細胞集団の完全な回復の前に最初に投与される。
【０５００】 Ｂ細胞機能の後天的欠損を有する個体間で免疫応答性をブーストするための薬
剤として。ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチドおよび／またはそれらのアゴ
ニストもしくはアンタゴニストを投与することによって寛解または処置され得る
、Ｂ細胞機能の後天的欠損を生じる状態としては、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、骨髄
移植、およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）が挙げられるが、これらに
限定されない。
【０５０１】 一時的な免疫不全を有する個体間で免疫応答性をブーストするための薬剤とし
て。ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチドおよび／またはそれらのアゴニスト
もしくはアンタゴニストを投与することによって寛解または処置され得る、一時
的な免疫不全を生じる状態としては、ウイルス感染（例えば、インフルエンザ）
からの回復、栄養失調に関連する状態、感染性単核細胞症からの回復、またはス
トレスに関連する状態、麻疹からの回復、輸血からの回復、手術からの回復が挙
げられるが、これらに限定されない。
【０５０２】 単球、樹状細胞および／またはＢ細胞による抗原提示のレギュレーターとして
。１つの実施形態において、本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオ
チド、ポリペプチド、抗体、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニスト
は、インビトロまたはインビボで抗原提示を増強するかまたは抗原提示をアンタ
ゴナイズする。さらに、関連する実施形態において、この抗原提示の増強または
アンタゴナイズは、抗腫瘍処置としてかまたは免疫系を調節するために有用であ
り得る。
【０５０３】 個体の免疫系を、ＴＨ１細胞性応答とは反対に、体液性応答（すなわち、ＴＨ
２）の発生に指向するための薬剤として。
【０５０４】 腫瘍増殖を誘導し、従って、腫瘍を抗腫瘍性薬剤に対してより感受性にするた
めの手段として。例えば、多発性骨髄腫は、緩慢な細胞分裂（ｄｉｖｉｄｉｎｇ
）の疾患であり、従って、実質的に全ての抗腫瘍性レジメンに対して不応性であ
る。これらの細胞は、より迅速に増殖させた場合、これらの感受性プロフィール
は、おそらく変化するであろう。
【０５０５】 ＡＩＤＳ、慢性リンパ球障害および／または分類不能性免疫不全症（Ｃｏｍｍ
ｏｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｉｃｉｅｎｃｙ）のような病理に
おけるＢ細胞の産生の刺激因子として。
【０５０６】 手術、外傷または遺伝的欠陥後のリンパ組織の生成および／または再生のため
の治療として。
【０５０７】 ＳＣＩＤ患者の間で観察されるような免疫不全を生じる遺伝性の障害のための
遺伝子ベースの治療として。
【０５０８】 本発明のポリペプチドに対する免疫媒介応答を阻害または増強するための抗体
を生成するための抗原として。
【０５０９】 Ｔ細胞を活性化する手段として。
【０５１０】 単球に影響を及ぼす寄生生物疾患（リーシュマニア属（Ｌｅｓｈｍａｎｉａ）
）に対して防御するために単球／マクロファージを活性化する手段として。
【０５１１】 移植前の骨髄サンプルの前処理として。このような処理は、Ｂ細胞提示を増加
し、従って回復を加速する。
【０５１２】 本発明のポリペプチドによって誘発される分泌サイトカインを調節する手段と
して。
【０５１３】 さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、および／またはその
アゴニストは、ＩｇＥ媒介アレルギー応答を処置または予防するために使用され
得る。このようなアレルギー反応としては、ぜん息、鼻炎および湿疹が挙げられ
るが、これらに限定されない。
【０５１４】 上記の適用の全ては、獣医学的医療に適用され得る。
【０５１５】 本発明のアンタゴニストとしては、例えば、結合および／または阻害性の抗体
、アンチセンス核酸、またはリボザイムが挙げられる。これらは、上記のリガン
ドの活性の多くを無効にし、そして以下のような臨床的または実用的な適用を見
い出すことが予測される。
【０５１６】 外来因子または自己に対する種々の局面の免疫応答をブロックする手段として
。例としては、狼瘡および関節炎のような自己免疫障害、ならびに皮膚アレルギ
ー、炎症、腸疾患、損傷および病原体に対する免疫応答が挙げられる。
【０５１７】 自己免疫疾患（例えば、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス
およびＭＳ）に関連するＢ細胞増殖およびＩｇ分泌を妨げるための治療として。
【０５１８】 内皮細胞におけるＢ細胞および／またはＴ細胞の遊走のインヒビターとして。
この活性は、組織構造または同属の応答を破壊し、そして例えば、免疫応答の破
壊および敗血症のブロックにおいて有用である。
【０５１９】 対宿主性移植片病または移植片拒絶のインヒビターとして。
【０５２０】 ＡＬＬ、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、プラスマ
細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫およびＥＢＶ変換性（ＥＢＶ−ｔｒ
ａｎｓｆｏｒｍｅｄ）疾患のようなＢ細胞および／またはＴ細胞の悪性疾患のた
めの治療。
【０５２１】 未定量有意性の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌｇａｍｍｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃ
ａｎｃｅ）（ＭＧＵＳ）、ヴァルデンストレーム疾患、関連する特発性単一クロ
ーン性高ガンマグロブリン血症、およびプラスマ細胞腫のような疾患における、
慢性の高ガンマグロブリン血症事象のための治療。
【０５２２】 ラージＢ細胞リンパ腫の細胞増殖を減少するための治療。
【０５２３】 慢性骨髄性白血病に関連するＢ細胞およびＩｇの関与を減少する手段。
【０５２４】 免疫抑制剤。
【０５２５】 本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体
および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、インビトロまたはインビ
ボでのＩｇＥ濃度を調節するために使用され得る。
【０５２６】 別の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチドおよ
び／またはアゴニストもしくはアンタゴニストの投与は、ぜん息、鼻炎および湿
疹を含むがこれらに限定されない、ＩｇＥ媒介アレルギー反応を処置または予防
するために使用され得る。
【０５２７】 アゴニストおよびアンタゴニストは、例えば、上記のような、薬学的に受容可
能なキャリアを含む組成物において使用され得る。
【０５２８】 アゴニストまたはアンタゴニストは、例えば、特定の自己免疫疾患および慢性
炎症疾患および感染性疾患における、マクロファージおよびその前駆体、ならび
に好中球、好塩基球、Ｂリンパ球およびいくつかのＴ細胞サブセット（例えば、
活性化Ｔ細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞ならびにナチュラルキラー細胞）の
、ポリペプチド走化性および活性化を阻害するために使用され得る。自己免疫疾
患の例としては、多発性硬化症およびインスリン依存性糖尿病が挙げられる。ア
ンタゴニストまたはアゴニストはまた、例えば、単核食細胞の補充および活性化
を妨げることによって、珪肺症、サルコイドーシス、特発性肺線維症を含む、感
染性疾患を処置するために使用され得る。これらはまた、例えば、好酸球の産生
および遊走を妨げることによって、特発性好酸球増多症候群を処置するために使
用され得る。アンタゴニストまたはアゴニストはまた、例えば、動脈壁における
単球浸潤を妨げることによって、アテローム性動脈硬化症を処置するために使用
され得る。
【０５２９】 本発明のポリペプチドに対する抗体は、ＡＲＤＳを処置するために使用され得
る。
【０５３０】 本発明のアゴニストおよび／またはアンタゴニストはまた、創傷および組織の
修復の刺激、新脈管形成の刺激、血管またはリンパの疾患または障害の修復の刺
激における用途を有する。さらに、本発明のアゴニストおよびアンタゴニストは
、粘膜表面の再生を刺激するために使用され得る。
【０５３１】 特定の実施形態において、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、および／またはそれらのアゴニストは、原発性または後天性
の免疫不全、欠損性の血清免疫グロブリン産生、再発性の感染および／または免
疫系機能不全によって特徴付けられる障害を処置または予防するために使用され
る。さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドもしくはポリペプチ
ド、および／またはそれらのアゴニストは、関節、骨、皮膚および／または耳下
腺の感染、血液由来の感染（例えば、敗血症、髄膜炎、敗血症性関節炎および／
または骨髄炎）、自己免疫疾患（例えば、本明細書中に開示されるような自己免
疫疾患）、炎症性障害、および悪性疾患、ならびに／あるいはこれらの感染、疾
患および／または悪性疾患に関連する任意の疾患または障害または状態（ＣＶＩ
Ｄ、他の原発性免疫不全、ＨＩＶ疾患、ＣＬＬ、再発性気管支炎、静脈洞炎、中
耳炎、結膜炎、肺炎、肝炎、髄膜炎、帯状ヘルペス（例えば、重篤な帯状ヘルペ
ス）および／またはニューモシスティスを含むが、これらに限定されない）を処
置または予防するために使用され得る。
【０５３２】 別の実施形態において、本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチ
ド、ポリペプチド、抗体、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは
、分類不能性免疫不全症（Ｃｏｍｍｏｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｄｉ
ｆｉｃｉｅｎｃｙ）（「ＣＶＩＤ」；「後天性無ガンマグロブリン血症」および
「後天性低ガンマグロブリン血症」としても公知である）またはこの疾患のサブ
セットを有する個体を、処置および／または診断するために使用される。
【０５３３】 特定の実施形態において、本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオ
チド、ポリペプチド、抗体および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは
、（１）癌または新生物、および（２）自己免疫細胞または組織関連癌または新
生物を処置、診断、および／または予防するために用いられ得る。好ましい実施
形態において、本明細書中に記載されるように、毒素または放射性同位体に結合
体化された本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、抗体および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、急性骨髄性白血
病を処置、診断、および／または予防するために用いられ得る。さらに好ましい
実施形態において、本明細書中に記載されるように、毒素または放射活性同位体
に結合体化された本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、抗体、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、慢性骨
髄性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、および／またはホジキン病を
処置、診断、診断、および／または予防するために用いられ得る。
【０５３４】 別の特定の実施形態において、本発明のニューロペプチドレセプターポリヌク
レオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニ
ストを使用して、選択的ＩｇＡ欠損、ミエロペルオキシダーゼ欠損、Ｃ２欠損、
毛細管拡張性運動失調、ＤｉＧｅｏｒｇｅ奇形、分類不能型免疫不全（ＣＶＩ）
、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、慢性肉芽腫症
（ＣＧＤ）、およびＷｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群を処置、診断、予測
、および／または予防し得る。
【０５３５】 処置または検出され得る自己免疫障害の例としては、アディソン病、溶血性貧
血、抗リン脂質症候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸
球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力
症、神経炎、眼炎痛、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑病、ラ
イター病、スティッフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデ
ス、自己免疫性の肺の炎症、ギヤン−バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、
および自己免疫炎症性眼疾患が挙げられるが、それらに限定されない。
【０５３６】 好ましい実施形態において、自己免疫疾患および障害ならびに／または上記の
疾患および障害に関連する状態は、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて
、処置、予後判定、および／または診断される。
【０５３７】 Ｂ細胞免疫不全個体（例えば、部分的または完全な脾臓摘出術をうけた個体な
ど）の間で免疫応答性をブーストするための因子として。
【０５３８】 さらに、本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチ
ドおよび／またはアンタゴニストは、アポトーシスに影響し得、従って、本発明
のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または
アンタゴニストは、細胞生存の増大またはアポトーシスの阻害に関連する多くの
疾患を処置するのに有用である。例えば、本発明のニューロペプチドレセプター
ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはアンタゴニストによって処置ま
たは検出され得る、細胞生存の増大またはアポトーシスの阻害に関連する疾患と
しては、以下が挙げられる：癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌
、およびホルモン依存性腫瘍（大腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞
腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫
、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌
、前立腺癌、カポジ肉腫および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない）
）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎
、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クロ
ーン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならび
に慢性関節リウマチ）およびウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポック
スウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶
、ならびに慢性移植片拒絶。好ましい実施形態において、本発明のニューロペプ
チドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはアンタゴニス
トは、特に上記に列挙される、癌の増殖、進行、および／または転移（ｍｅｔａ
ｓｉｓ）を阻害するために使用される。
【０５３９】 本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび
／またはアンタゴニストによって処置または検出され得る細胞生存に関連したさ
らなる疾患または状態としては、以下のような悪性腫瘍および関連する障害の増
殖および／または転移が挙げられるがこれらに限定されない：白血病（急性白血
病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前
骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病を含む））
、および慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ
球性白血病）を含む）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病およ
び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクロ大グロブリン血
症、Ｈ鎖病、および固形腫瘍（肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、
脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫
、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉
腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌
、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌
、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍
、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞
腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神
経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞
腫、および網膜芽細胞腫。
【０５４０】 本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチド、およ
び／またはアンタゴニストによって処置または検出され得る、増加したアポトー
シスに関連する疾患としては、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例
えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎
、小脳変性および脳腫瘍または以前に関連した疾患）；自己免疫障害（例えば、
多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェッ
ト病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性
エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、脊髄
形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性傷害（
心筋梗塞、発作および再灌流傷害によって生じるようなもの）、肝臓傷害（例え
ば、肝炎関連肝臓傷害、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉ
ｓ）（胆管傷害）および肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコールによって引
き起こされるようなもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。
【０５４１】 本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポリペプチド、およ
び／またはアンタゴニストによって検出および／または処置され得る過剰増殖性
の疾患および／または障害としては、以下に位置する新生物が挙げられるがこれ
らに限定されない：肝臓、腹部、乳房、消化器系、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎
、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部および頸部、神経
（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、ならびに泌
尿生殖器。
【０５４２】 同様に、他の過剰増殖性障害もまた、本発明のニューロペプチドレセプターポ
リヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはアンタゴニストによって処置ま
たは検出され得る。このような過剰増殖性障害の例としては、以下が挙げられる
がこれらに限定されない：高ガンマグロブリン血症、リンパ球増殖性障害、パラ
プロテイン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンストレ
ームマクログロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および任意の他の過剰増
殖性疾患、加えて上記に列挙した器官系に見出される新生物。
【０５４３】 （過剰増殖障害） ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または
ニューロペプチドレセプターのアゴニストもしくはアンタゴニストを使用し、新
生物を含む過剰増殖性の疾患、障害、および／または状態を処置、予防および／
または検出し得る。ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、またはニューロペプチドレセプターのアゴニストもしくはアンタゴニ
ストは、直接的または間接的な相互作用を介してこの障害の増殖を阻害し得る。
あるいは、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドもしくはポリペプチド
、またはニューロペプチドレセプターのアゴニストもしくはアンタゴニストは、
過剰増殖障害を阻害し得る他の細胞を増殖し得る。
【０５４４】 例えば、免疫応答を増大させること、特に過剰増殖障害の抗原性の質を増大さ
せることによって、またはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員することによって
、過剰増殖の疾患、障害、および／または状態を処置、予防、および／または診
断し得る。既存の免疫応答を増強するか、または新たな免疫応答を開始するかの
いずれかによって、この免疫応答を増大させ得る。あるいは、免疫応答を減少さ
せることもまた、化学療法剤のような、過剰増殖性の疾患、障害、および／また
は状態を処置、予防、および／または診断する方法であり得る。
【０５４５】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または
ニューロペプチドレセプターのアゴニストもしくはアンタゴニストによって処置
、予防、および／または診断され得る過剰増殖性の疾患、障害、および／または
状態の例としては、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分
泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部および
頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、
ならびに泌尿生殖器に位置する新生物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５４６】 同様に、他の過剰増殖の疾患、障害、および／または状態もまた、ニューロペ
プチドレセプターポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはニューロペプ
チドレセプターのアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置、予防、および
／または診断され得る。このような過剰増殖性の疾患、障害、および／または状
態の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：高ガンマグロブリ
ン血症、リンパ球増殖性の疾患、障害、および／または状態、パラプロテイン血
症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログ
ロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および任意の他の過剰増殖性疾患、加
えて上記に列挙した器官系に見出される新生物。
【０５４７】 本発明のポリヌクレオチドを利用する１つの好ましい実施形態は、本発明およ
び／または融合タンパク質もしくはそのフラグメントを用いる遺伝子治療によっ
て、異常な細胞分裂を阻害することである。
【０５４８】 従って、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを異常に増殖している細胞に挿
入することによって、細胞増殖性の疾患、障害、および／または状態を処置する
ための方法を提供し、ここでこのポリヌクレオチドはこの発現を抑制する。
【０５４９】 本発明の別の実施形態は、個体における細胞増殖性の疾患、障害、および／ま
たは状態を処置する方法を提供し、この方法は、本発明の１以上の活性遺伝子コ
ピーを異常に増殖している１つの細胞または複数の細胞に投与することを包含す
る。好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、このポリヌク
レオチドをコードするＤＮＡ配列の発現において有効な組換え発現ベクターを含
むＤＮＡ構築物である。本発明の別の好ましい実施形態においては、本発明のポ
リヌクレオチドをコードするＤＮＡ構築物は、レトロウイルスベクター、または
より好ましくは、アデノウイルスベクターを用いて、処理されるべき細胞に挿入
される（Ｇ Ｊ．Ｎａｂｅｌら、ＰＮＡＳ １９９９ ９６：３２４〜３２６（
これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。最も好ましい実
施形態においては、ウイルスベクターは不完全であり、非増殖性細胞ではなく増
殖性細胞のみを形質転換する。さらに、好ましい実施形態においては、単独、ま
たは他のポリヌクレオチドと組み合わされたかもしくは融合されたかのいずれか
で増殖性細胞に挿入される本発明のポリヌクレオチドは、次いで外部刺激（すな
わち、磁気、特異的小分子、化学的、または薬物投与など）を介して調節され得
、これはこのポリヌクレオチドの上流のプロモーターに作用し、コードされたタ
ンパク質産物の発現を誘導する。このように、本発明の有益な治療効果は、この
外部刺激に基づいて明確に調節され得る（すなわち、本発明の発現を増加、減少
、または阻害する）。
【０５５０】 本発明のポリヌクレオチドは、発癌遺伝子または抗原の発現の抑制において有
用であり得る。「発癌遺伝子の発現の抑制」によって、遺伝子の転写の抑制、遺
伝子転写物の分解（プレメッセージ（ｐｒｅ−ｍｅｓｓａｇｅ）ＲＮＡ）、スプ
ライシングの阻害、メッセンジャーＲＮＡの破壊、タンパク質の翻訳後改変の予
防、タンパク質の破壊、またはタンパク質の正常な機能の阻害が意図される。
【０５５１】 異常に増殖している細胞への局所的投与のために、本発明のポリヌクレオチド
は当業者に公知の任意の方法によって投与され得、この方法としては、トランス
フェクション、エレクトロポレーション、細胞の微量注入、またはビヒクル（例
えば、リポソーム、リポフェクチン）中で、または裸のポリヌクレオチドとして
、または本明細書を通して記載される任意の他の方法が挙げられるが、これらに
限定されない。本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子送達系（例えば、レ
トロウイルスベクター（Ｇｉｌｂｏａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：８４５（
１９８２）；Ｈｏｃｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ ３２０：２７５（１９８６）；Ｗｉｌ
ｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：３０１
４）、ワクシニアウイルス系（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．５：３４０３（１９８５））または当業者に公知の他の有効なＤＮＡ
送達系（Ｙａｔｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１２（１９８５））があるが
、これらに限定されない）によって送達され得る。これらの参考文献は、例示の
みであり、本明細書中に参考として援用される。異常に増殖している細胞を特異
的に送達またはトランスフェクトし、そして非分裂細胞を使わないために、当業
者に公知のレトロウイルス、またはアデノウイルス（当該分野および本明細書中
のいずれかに記載のような）送達系を使用することが好ましい。宿主ＤＮＡ複製
は、組み込みのためにレトロウイルスＤＮＡを必要とし、レトロウイルスはその
ライフサイクルに必要なレトロウイルス遺伝子を欠くために自己複製できないか
らである。このようなレトロウイルス送達系を本発明のポリヌクレオチドのため
に用いることによって、この遺伝子および構築物は異常に増殖している細胞を標
的とし、そして非分裂正常細胞を使用しない。
【０５５２】 本発明のポリヌクレオチドは、注射針を疾患部位に直接導くために使用される
画像化デバイスの使用によって、内部器管、体腔などにおける細胞増殖性障害／
疾患部位へ直接送達され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、外科的処置の
ときに疾患部位へ投与され得る。
【０５５３】 「細胞増殖性疾患」によって、器管、腔、または身体の部分の任意の１つまた
は任意の組み合わせに影響を与える、任意のヒトまたは動物の疾患もしくは障害
が意味され、これは良性であるか悪性であるかに関わらず、細胞、細胞の群、ま
たは組織の単一または複数の局所的異常増殖によって特徴付けられる。
【０５５４】 本発明のポリヌクレオチドが処置される細胞の増殖に対して生物学的に阻害す
る効果を有する限り、本発明のポリヌクレオチドの任意の量が投与され得る。さ
らに、本発明のポリヌクレオチドの１つより多くを、同じ部位へ同時に投与する
ことが可能である。「生物学的に阻害する」によって、細胞の部分的または全体
的な増殖阻害および細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）または成長（ｇ
ｒｏｗｔｈ）の速度における減少が意味される。生物学的阻害用量は、組織培養
物における標的悪性細胞増殖もしくは異常増殖細胞増殖、動物および細胞培養物
における腫瘍増殖に対する本発明のポリヌクレオチドの効果を評価することによ
って、または当業者に公知の任意の他の方法によって決定され得る。
【０５５５】 本発明はさらに、抗体に基づく治療に関し、この治療は、１以上の記載された
疾患、障害、および／または状態を処置するために、抗ポリペプチド抗体および
抗ポリヌクレオチド抗体を哺乳動物（好ましくは、ヒト）患者に投与する工程を
包含する。抗ポリペプチド抗体および抗ポリヌクレオチド抗体のポリクロナール
抗体およびモノクロナール抗体を生成するための方法は、本明細書中のいずれか
に詳細に記載される。このような抗体は、当該分野において公知であるかまたは
本明細書中に記載されるような薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０５５６】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の要旨は、本発明のポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドを、身体中で局所的もしくは全体的に、または抗体の直接
的な細胞傷害性によって（例えば、相補細胞（ＣＤＣ）またはエフェクター細胞
（ＡＤＣＣ）によって媒介されるように）結合させる工程を包含する。これらの
アプローチのいくつかは、以下により詳細に記載される。本明細書中に提供され
る教示によって、当業者は過度の実験なしで、本発明の抗体を診断目的、モニタ
リング目的または治療目的のために使用する方法を理解する。
【０５５７】 特に、本発明の抗体、フラグメントおよび誘導体は、本明細書中に記載される
ような細胞増殖性および／または細胞分化性の疾患、障害、および／または状態
を有しているかまたは発症している被験体を処置するために有用である。このよ
うな処置は、抗体もしくはフラグメント、誘導体またはそれらの結合体の単一ま
たは複数の用量を投与する工程を包含する。
【０５５８】 本発明の抗体は、例えば、他のモノクロナール抗体もしくはキメラ抗体と組み
合わせて、またはリンホカインもしくは造血成長因子と組み合わせて有利に使用
され得、例えば、これは抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を
増加させるために役立つ。
【０５５９】 本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して高親和性および／また
は強力なインビボ阻害および／または中和抗体、それらのフラグメントもしくは
領域を、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメント
を含む）に関するイムノアッセイおよびそれらに関連する障害、疾患および／ま
たは症状の治療の両方のために使用することが好ましい。このような抗体、フラ
グメントまたは領域は、好ましくは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そ
れらのフラグメントを含む）に対する親和性を有する。好ましい結合親和性とし
ては、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−
８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１
０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５
×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−
１５Ｍおよび１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを伴う結合親和性が挙げ
られる。
【０５６０】 さらに、本明細書中のいずれかに記載されるように、本発明のポリペプチドは
、単独で、融合タンパク質として、または他のポリペプチドと組み合わせて、直
接的または間接的のいずれかで、増殖性細胞または組織の新脈管形成の阻害にお
いて有用である。最も好ましい実施形態においては、この抗新脈管形成効果は、
例えば造血性細胞、腫瘍特異的細胞（例えば、腫瘍関連マクロファージ）の阻害
を通して、間接的に達成され得る（Ｊｏｓｅｐｈ ＩＢら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，９０（２１）：１６４８−５３（１９９８）（これは本明
細書中に参考として援用される）を参照のこと）。本発明のポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドを指向する抗体はまた、直接的または間接的に新脈管形成の阻
害を生じ得る（Ｗｉｔｔｅ Ｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅ
ｖ．１７（２）：１５５−６１（１９９８）（これは本明細書中に参考として援
用される）を参照のこと）。
【０５６１】 本発明のポリペプチド（融合タンパク質を含む）またはそのフラグメントは、
アポトーシスの誘導を通した増殖性細胞または組織の阻害において有用であり得
る。このポリペプチドは、デスドメインレセプター（例えば、腫瘍壊死因子（Ｔ
ＮＦ）レセプター１、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）、ＴＮＦレセプター関連
アポトーシス媒介タンパク質（ＴＲＡＭＰ）およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導
リガンド（ＴＲＡＩＬ）レセプター１およびレセプター２）の活性化において、
直接的または間接的のいずれかで、増殖性細胞および組織のアポトーシスを誘導
するために作用し得る（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ Ｋら、Ｅｕｒ Ｊ
Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５４（３）：４３９−５９（１９９８）（これは本明細書中
に参考として援用される）を参照のこと）。さらに、本発明の別の好ましい実施
形態においては、このポリペプチドは、他の機構を通して（例えば、アポトーシ
スを活性化する他のタンパク質の活性化において）、あるいは単独または小分子
薬物もしくはアジュバント（例えば、アポプトニン（ａｐｏｐｔｏｎｉｎ）、ガ
レクチン、チオレドキシン、抗炎症タンパク質）との組み合わせのいずれかで、
このタンパク質の発現の刺激を通して、アポトーシスを誘導し得る（例えば、Ｍ
ｕｔａｔ Ｒｅｓ ４００（１−２）：４４７−５５（１９９８）、Ｍｅｄ Ｈ
ｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．５０（５）：４２３−３３（１９９８）、Ｃｈｅｍ Ｂｉ
ｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．Ａｐｒ ２４；１１１−１１２：２３−３４（１９９
８）、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．７６（６）：４０２−１２（１９９８）、Ｉｎｔ
Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔ；２０（１）：３−１５（１９９８）（これらは
すべて本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０５６２】 本発明のポリペプチド（それとの融合タンパク質もしくはそのフラグメントを
含む）は、増殖性細胞または組織の転移の阻害において有用である。阻害は、ポ
リペプチド、または本明細書中のいずれかに記載されるようなこのポリペプチド
を指向する抗体の投与の直接的な結果として、あるいは間接的に（例えば、転移
を阻害することが知られているタンパク質（例えば、α４インテグリン）の発現
の活性化）生じ得る（例えば、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ １９９８；２３１：１２５−４１（これは本明細書中に参考として援
用される）を参照のこと）。本発明のこのような治療的効果は、単独、または小
分子薬物もしくはアジュバントとの組み合わせのいずれかで達成され得る。
【０５６３】 別の実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドを含有する組成物
（例えば、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグに会合する
ポリペプチドまたはポリペプチド抗体を含有する組成物）を、本発明のポリペプ
チドを発現する標的細胞に送達する方法を提供する。本発明のポリペプチドまた
はポリペプチド抗体は、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合性相
互作用を介して、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグに会
合し得る。
【０５６４】 本発明のポリペプチド、それらとの融合タンパク質またはそれらのフラグメン
トは、直接的（例えば、本発明のポリペプチドが増殖性抗原および免疫原に応答
するために、免疫応答を「ワクチン接種した」場合に起こるように）、または間
接的（例えば、この抗原および免疫原に対する免疫応答を増強することが知られ
ているタンパク質（例えば、ケモカイン）の発現の活性化におけるように）のい
ずれかで、増殖細胞または組織の免疫原性および／または抗原性の増強において
有用である。
【０５６５】 （心臓血管障害） ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または
神経ペプチレセプターをコードするニューロペプチドレセプターのアゴニストも
しくはアンタゴニストを使用して、四肢虚血のような末梢動脈疾患を含む、心臓
血管障害を処置し得る。
【０５６６】 心臓血管障害としては、動動脈瘻（ａｒｔｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ ｆｉ
ｓｔｕｌａ）、動静脈瘻、大脳動静脈先天異常、先天性心欠陥（ｃｏｎｇｅｎｉ
ｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｅｆｅｃｔｓ）、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候
群のような心臓血管異常が挙げられる。先天性心欠陥としては、大動脈縮窄、三
房心、冠状脈管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｖｅｓｓｅｌ ａｎｏｍａｌｉｅｓ）
、交差心、右胸心、開存性動脈管（ｐａｔｅｎｔ ｄｕｃｔｕｓ ａｒｔｅｒｉ
ｏｓｕｓ）、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合体、左心室発育不全症候
群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖
症、動脈管遺残、および心中隔欠損症（ｈｅａｒｔ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃ
ｔｓ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損症（ａｏｒｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓ
ｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔ）、心内膜床欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファ
ロー三徴症、心室心中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｈｅａｒｔ ｓｅｐ
ｔａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ））が挙げられる。
【０５６７】 心臓血管障害としてはまた、不整脈、カルチノイド心臓病、高心拍出量（ｈｉ
ｇｈ ｃａｒｄｉａｃ ｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出量（ｌｏｗ ｃａｒｄｉａｃ
ｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、
心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心臓水腫、心肥大
、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆ
ａｒｃｔｉｏｎ ｈｅａｒｔ ｒｕｐｔｕｒｅ）、心室中隔破裂、心臓弁疾患、
心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗塞性および結核性を含む）、
気心膜症、心膜切開後症候群、右心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充
血、心臓血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ
ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管
結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような心
臓病が挙げられる。
【０５６８】 不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダ
ムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、長ＱＴ症候群（ｌｏｎｇ
ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群
、マヘーム型早期興奮症候群（Ｍａｈａｉｍ−ｔｙｐｅ ｐｒｅ−ｅｘｃｉｔａ
ｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不
全症候群、頻拍、および心室性細動が挙げられる。頻拍としては、発作性頻拍、
上室性頻拍、心室固有調律促進、房室結節性再入頻拍（ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉ
ｃｕｌａｒ ｎｏｄａｌ ｒｅｅｎｔｒｙ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、異所心
房性頻拍、異所接合部頻拍、洞房結節性再入頻拍（ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ ｎｏ
ｄａｌ ｒｅｅｎｔｒｙ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、洞性頻拍、トルサード・
ド・ポワント、および心室性頻拍が挙げられる。
【０５６９】 心臓弁疾患としては、大動脈弁機能不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音（ｈｅａ
ｒ ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁
機能不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁機能不全、肺動脈弁狭窄症
、三尖閉鎖症、三尖弁機能不全、および三尖弁狭窄症が挙げられる。
【０５７０】 心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、弁
下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャーガス心筋症
、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、お
よび心筋炎が挙げられる。
【０５７１】 心筋性虚血としては、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈
血管痙攣、心筋梗塞、および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｓｔｕｎｎｉｎ
ｇ）のような冠動脈疾患が挙げられる。
【０５７２】 心臓血管疾患としてはまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫
症状、ヒッペル−リンダラ疾患（Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ Ｄｉｓｅａｓｅ
）、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、
血管運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、
動脈閉塞疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性
動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、先
端紅痛症、痔、肝静脈閉塞障害、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管障害、静脈炎
、肺静脈閉塞疾患、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、肺静脈閉塞
疾患、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞、シミター症候群、上大静
脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張性運動失調（ａｔａｃｉａ ｔｅｌａ
ｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静
脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈機能不全のような血管疾患が挙げられる
。
【０５７３】 動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染した動脈瘤、破裂した動脈瘤
、大動脈性動脈瘤、大脳性動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨性動脈瘤が
挙げられる。
【０５７４】 動脈閉塞疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形
成異常、腸間膜性血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉
塞性血栓性血管炎が挙げられる。
【０５７５】 脳血管障害としては、頸動脈疾患、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈
瘤、大脳無酸素症、大脳動脈硬化、大脳動静脈先天異常、大脳動脈疾患、大脳の
塞栓症および血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、大脳出
血、硬膜上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎｏｉｄ ｈｅ
ｍｏｒｒｈａｇｅ）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症
候群、室周白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｅｕｋｏｍａｌａｃ
ｉａ）、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨基部（ｖｅｒｔｅｂｒｏ
ｂａｓｉｌａｒ）機能不全が挙げられる。
【０５７６】 塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チア
ノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられる。血
栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、
洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられる。
【０５７７】 虚血としては、大脳虚血、虚血性大腸炎、仕切り症候群（ｃｏｍｐａｒｔｍｅ
ｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、前仕切り症候群（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｏｍｐａｒ
ｔｍｅｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋虚血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血
が挙げられる。脈管炎としては、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅ
ｔ）症候群、チャーグ−ストラウス症候群、粘膜皮膚リンパ節症候群、閉塞性血
栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライン−ヘーノホ紫斑病（Ｓｃｈｏｅｎｌ
ｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ ｐｕｒｐｕｒａ）、アレルギー性皮膚血管炎およびヴェ
ーゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０５７８】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または
ニューロペプチドレセプターのアゴニストもしくはアンタゴニストは、危険な四
肢虚血および冠状動脈疾患の処置に対して特に有効である。
【０５７９】 ニューロペプチドレセプターポリペプチドは、当該分野で公知である任意の方
法を使用して投与され得、これらの方法としては、送達部位における直接的針注
射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）
注射、粒子加速器、ゲルフォームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧
ポンプ、経口または坐剤の固形薬学的処方物、手術中のデカンティングまたは局
所適用、エアロゾル送達が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方
法は当該分野で公知である。ニューロペプチドレセプターポリペプチドは、下記
でより詳細に記載される、薬学的組成物の一部として投与され得る。ニューロペ
プチドレセプターポリヌクレオチドを送達する方法は本明細書中でより詳細に記
載される。
【０５８０】 （肥満および摂食行動障害） 本発明はまた、本発明のレセプターポリペプチドに結合しそして活性化する化
合物を宿主に投与することによって、肥満を処置および／または防止する方法を
提供する。このような化合物は、ｏｂ遺伝子産物（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ
、３７２：４２５−４３１（１９９４）に開示される）以外である。本発明のレ
セプターポリペプチドは、ｏｂ遺伝子のレセプターに対してコードするマウス染
色体の位置に対応する、ヒト染色体をマッピングする。ヒトｏｂ遺伝子は、本発
明のレセプターポリペプチドに結合し、そして活性化する「満腹中枢因子」をコ
ードする。従って、本発明のレセプターを活性化する化合物は、食欲を減少させ
そして肥満を防ぐ。
【０５８１】 上記の化合物はまた、活性レベルを増強し、摂食行動を変え、消化される食物
の利用を増強し、そして脂肪貯蔵の蓄積を調製するために、利用され得る。肥満
に関連する症状はまた、本発明のレセプターポリペプチド（これは、高脂肪血症
、ＩＩ型糖尿病および特定の癌を含むが、これらに限定されない）に結合し、そ
して活性化する化合物によって処置され得る。
【０５８２】 これらの化合物はまた、例えば、神経の成長を刺激するために、本発明のレセ
プターポリペプチドまたはそれらに結合するリガンドを発現しないことに関連す
る他の症状を処置および／または防止するために、利用され得る。
【０５８３】 本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物の特定の例として
は、レセプターに結合するが、レセプターの活性を妨げるような第２のメッセン
ジャー応答を誘発しない、抗体、またはいくつかの場合オリゴヌクレオチドが挙
げられる。別の例は、レセプターのリガンドに密接に関連するタンパク質、すな
わち、そのリガンドのフラグメント、であり、これは、生物的機能を失っており
、そしてレセプターに結合する場合、何の反応も誘発しない。
【０５８４】 別の例としては、アンチセンス技術の使用を通じて調製されるアンチセンス構
築物が挙げられる。アンチセンス技術は、３本鎖らせん（ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌ
ｉｘ）構造、あるいはアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを通じて遺
伝子発現を制御するために使用され得、この方法はどちらも、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａのポリヌクレオチドの結合に基づいている。例えば、ポリヌクレオチド配列の
５’コード部分（これは、本発明の完成したポリペプチドに対してコードする）
は、長さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計
するために使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子領
域に対して相補的に設計され（三本鎖らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．、６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：
１３６０（１９９１）を参照のこと）、それによって、転写を妨げ、そして本発
明のヌクレオチドレセプターポリペプチドの産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡ
オリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてレセプ
ターへのｍＲＮＡ分子の翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．
Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏ
ｎ、ＦＬ（１９８８））。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮ
ＡまたはアンチセンスＤＮＡがインビボで発現し、レセプターの産生を妨げ得る
ように、細胞へ運ばれ得る。
【０５８５】 別の例は、本発明のニューロペプチドレセプターポリペプチドに結合する低分
子であり、通常の細胞活性が妨げられるように、この低分子をリガンドにアクセ
ス不可能とする。低分子の例としては、小さいポリペプチドまたはポリペプチド
様分子およびニューロペプチドＹフラグメントおよび／または誘導体が挙げられ
るが、これらに限定されない。
【０５８６】 本発明のニューロペプチドレセプターポリペプチドの可溶形態（例えば、この
レセプターのフラグメント）は、リガンドに結合し、そしてリガンドが膜結合レ
セプターと相互作用するのを妨げるが、また、本発明のレセプターポリペプチド
の活性を阻害し得る。
【０５８７】 本発明は、さらに、肥満を処置するタンパク質の本発明のニューロペプチドレ
セプターポリペプチドの過剰な活性に関連する異常な症状を処置するために、活
性を阻害するこのような化合物を利用する方法を提供する。なぜなら、本発明の
ニューロペプチドレセプターポリペプチドは、ニューロペプチドＹに結合し得る
からであり、このニューロペプチドＹは、摂食行動において増加を引き起こし、
そしてニューロペプチドＹは、この疾患の遺伝的な基礎において役割を果たし得
るので、ＩＩ型糖尿病を引き起こす最も強力な公知の基質である。
【０５８８】 （神経系疾患） 本発明のニューロペプチドレセプター組成物（例えば、ニューロペプチドレセ
プターポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／またはアゴニストもしくはアン
タゴニスト）を用い手処置され得る神経系の疾患、障害および／または症状には
、軸索の切断、ニューロンの減少もしくは変性、または脱髄のいずれかを引き起
こす、神経系損傷および、疾患、障害および／または症状が挙げられるが、これ
らに限定されない。本発明に従って、患者（ヒト患者および非ヒト哺乳動物患者
を含む）において処置され得る神経系病変には、以下の中枢神経系（脊髄、脳を
含む）もしくは末梢神経系のいずれかの病変が挙げられるが、これらに限定され
ない：（１）虚血病変（ここで、神経系の一部における酸素不足により、ニュー
ロンの損傷または死が生じ、これには大脳梗塞もしくは虚血、または脊髄梗塞も
しくは虚血が挙げられる）；（２）外傷病変（身体的損傷により生じるかまたは
手術に関連する病変、例えば、神経系の一部分を切断する病変、または圧縮損傷
を含む）；（３）悪性病変（ここで、神経系の一部分は、神経系関連悪性疾患も
しくは非神経系組織由来の悪性疾患のいずれかである悪性組織により破壊または
損傷される）；（４）感染性病変（ここで、神経系の一部分は、例えば、膿瘍に
よる感染の結果として、破壊または損傷されるか、あるいはヒト免疫不全ウイル
ス、帯状ヘルペスもしくは単純ヘルペスウイルスによる感染と関連するか、ライ
ム病、結核、梅毒に関連する）；（５）変性病変（ここで、神経系の一部分は、
変性プロセスの結果として破壊または損傷され、これには、パーキンソン病、ア
ルツハイマー病、ハンティングトン病または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関
連する変性が挙げられるが、これらに限定されない）；（６）ニューロン疾患、
障害および／または症状に関連する病変（ここで、神経系の一部分は、ニューロ
ン障害または代謝障害によって破壊または損傷され、これには、ビタミンＢ１２
欠乏症、葉酸欠乏症、ヴェルニッケ病、タバコ−アルコール弱視、マルキアファ
ーヴァ−ビニャーミ病（脳梁の一次変性）およびアルコール小脳変性が挙げられ
るが、これらに限定されない）；（７）全身性疾患に関連する神経性病変（糖尿
病（糖尿病性ニューロパシー、ベル麻痺）、全身性エリテマトーデス、癌または
類肉腫症が挙げられるが、これらに限定されない）；（８）毒性物質（アルコー
ル、鉛または特定の神経毒を含む）により生じる病変；ならびに（９）脱髄性病
変（ここで、神経系の一部分は、脱髄性執権によって破壊または損傷され、これ
には、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連脊髄障害、横断脊髄障害または
種々の病因、進行性多病巣性白質脳障害、および橋中央ミエリン溶解が挙げられ
るが、これらに限定されない）。
【０５８９】 好ましい実施形態において、本発明のニューロペプチドレセプターポリペプチ
ド、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、大脳底酸
素症の損傷効果から神経細胞を保護するために用いられる。この実施形態による
と、本発明のニューロペプチドレセプター組成物は、大脳底酸素症に関連する神
経細胞損傷を処置、予防および／または診断ために用いられる。この実施形態の
１つの局面において、本発明のニューロペプチドレセプターポリペプチド、ポリ
ヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、大脳虚血と関連す
る神経細胞損傷を処置、予防および／または診断するために用いられる。この実
施形態の別の局面において、本発明のニューロペプチドレセプターポリペプチド
、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、大脳梗塞に
関連する神経細胞損傷を処置、予防および／または診断するために用いられる。
この実施形態の別の局面において本発明のニューロペプチドレセプターポリペプ
チド、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、発作に
関連する神経細胞損傷を処置、予防および／または診断するために用いられる。
この実施形態のさらなる局面において、本発明のニューロペプチドレセプターポ
リペプチド、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、
心臓発作に関連する神経細胞損傷を処置、予防および／または診断するために用
いられる。
【０５９０】 神経系障害を処置、予防および／または診断するのに有用な本発明の組成物は
、ニューロンの生存または分化の促進における生物学的活性について試験するこ
とによって、選択され得る。例えば、制限する目的ではないが、以下の効果のい
ずれかを誘発する本発明のニューロペプチドレセプター組成物は、本発明による
と有用であり得る：（１）培地におけるニューロンの増加した生存時間；（２）
培地またはインビボにおけるニューロンの増加した出芽；（３）培地またはイン
ビボにおけるニューロン関連分子（例えば、運動ニューロンに関して、コリンア
セチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンステラーゼ）の増加した産生；
あるいは（４）インビボにおけるニューロン機能障害の軽減した症状。このよう
な効果は、当該分野で公知の任意の方法によって測定され得る。好ましくは、非
制限的な実施形態において、ニューロンの増加した生存時間は、本明細書中に記
載される方法、またはそうでなければ当該分野で公知の方法（例えば、Ａｒａｋ
ａｗａら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０：３５０７〜３５１５（１９９０））に
記載される方法）を使用して慣用的に測定され得；ニューロンの増加した出芽は
、当該分野で公知の方法（例えば、Ｐｅｓｔｒｏｎｋら（Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ
．７０：６５〜８２（１９８０））またはＢｒｏｗｎら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉ．４：１７〜４２（１９８１））に記載される方法）によって検出
され得；ニューロン関連分子の増加した産生は、当該分野で公知の技術を使用し
、測定されるべき分子に基づいて、バイオアッセイ、酵素アッセイ、抗体結合、
ノザンブロットアッセイなどによって、測定され得；そして運動ニューロンの機
能障害は、運動ニューロン障害の物理的発現（例えば、弱さ、運動ニューロンの
伝導速度、または機能障害）を評価することによって、測定され得る。
【０５９１】 特定の実施形態において、本発明に従って処置され得る運動ニューロン疾患、
障害および／または症状には、運動ニューロンおよび神経系の他の成分に影響を
与え得る疾患、障害および／または症状（例えば、梗塞、感染、毒素への暴露、
外傷、外科的損傷、変性疾患、または悪性疾患）、ならびにニューロンに選択的
に影響する疾患、障害および／または症状（例えば、筋萎縮性側索硬化症）が挙
げられるが、これらに限定されず、そしてこれには、進行性脊髄性筋萎縮症、進
行性球延髄麻痺、原発性側索硬化症、小児筋萎縮および若年性筋萎縮、小児期の
進行性球麻痺（ファチオ−ロンデ病）、ポリオおよびポリオ後症状、ならびに遺
伝性運動感覚性神経障害（シャルコー−マリー−トゥース病）が挙げられるが、
これらに限定されない。
【０５９２】 神経系の疾患および障害としては、例えば、脳障害のような中枢神経系疾患（
例えば、無動無言症、脳幹神経節障害、脳膿瘍、中枢聴覚疾患（例えば、聴覚知
覚障害または中枢性難聴）、脳性小児麻痺、代謝性または慢性脳疾患、脳水腫、
脳新生物、カバナン病、小脳の疾患、びまん性脳硬化症、脳血管疾患、痴呆、脳
炎、脳軟化症（例えば、白質軟化症）、てんかん、Ｈａｌｌｅｒｖｏｒｄｅｎ−
Ｓｐａｔｚ病、水頭症（例えば、Ｄａｎｄｙ−Ｗａｌｋｅｒ症候群または正常圧
水頭症）、視床下部疾患（例えば、視床下部新生物）、大脳マラリア、睡眠発作
、脱力発作、延髄急性灰白髄炎、偽脳腫瘍、レット症候群、ライ症候群、視床障
害、トキソプラスマ脳症、頭蓋内結核腫（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ｔｕｂｅ
ｒｃｕｌｏｍａ）、またはツェルヴェーガー症候群）が挙げられる。
【０５９３】 より具体的には、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペ
プチド、あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニス
トによって処置され得る脳幹神経節疾患の型としては、例えば、薬物誘導静座不
能、アルツハイマー病、舞踏病、ハンティングトン病、クロイツフェルト−ヤコ
ブ病、薬物性ジスキネジー、変形性筋失調症、Ｈａｌｌｅｒｖｏｒｄｅｎ−Ｓｐ
ａｔｚ病肝レンズ核変性症、メージ病、神経弛緩薬悪性症候群、パーキンソン病
（例えば、症候性または脳炎後）、進行性核上性麻痺、あるいはトゥーレット症
候群が挙げられる。
【０５９４】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る代謝性脳疾患の型としては、例えば、無β−リポ蛋白血症、ガン
グリオシドーシス（例えば、ＧＭ１ガングリオシドーシス、サンドホフ病、また
はテイ−ザックス病）、ハートナップ病、肝性脳障害、肝レンズ核変性症、ホモ
シスチン尿症、核黄疸、縮れ毛症候群、ライ病、レッシュナイハン症候群、．カ
エデシロップ病、ミトコンドリア脳筋症（例えば、ＭＥＬＡＳ症候群またはＭＥ
ＲＲＦ症候群）、橋中央ミエリン溶解、神経細胞セロイド脂褐素沈着症、ニーマ
ンピック病、フェニルケトン尿症、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠乏症、ピルビ
ン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠乏症、またはヴェルニッケ脳障害が挙げられる。
【０５９５】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る脳新生物の型としては、例えば、小脳新生物、テント下新生物、
脳室新生物、脈絡叢新生物、視床下部新生物、またはテント上方新生物が挙げら
れる。
【０５９６】 さらなる実施形態において、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドま
たはポリペプチド、あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはア
ンタゴニストによって処置され得る小脳の疾患の型としては、例えば、小脳性運
動失調、脊髄小脳性退化、毛細血管拡張性運動失調、小脳性共同運動障害、フリ
ートライヒ運動失調、マシャド−ジョセフ病、オリーブ橋小脳萎縮、または小脳
新生物（例えば、テント下新生物）が挙げられる。
【０５９７】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得るびまん性脳硬化症の型としては、例えば、軸索周囲性脳炎、球様
細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症、または亜急性硬化性汎脳炎が挙げられる。
【０５９８】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る脳血管疾患の型としては、例えば、頸動脈疾患（例えば、頸動脈
血栓症、頸動脈狭窄症、またはモヤモヤ病）、脳アミロイドアンギオパチー、大
脳の動脈瘤、大脳の無酸素症、冠動脈硬化、脳動静脈奇形症、大脳動脈の疾患、
脳卒中または脳血栓（例えば、頚動脈の血栓症、洞の血栓症、またはヴァレンベ
ルク症候群）、脳出血（例えば、硬膜上血腫または硬膜下血腫、あるいはクモ膜
下出血）、脳梗塞、脳虚血（例えば、一時的脳虚血、鎖骨下動脈盗血症候群、ま
たは椎骨脳底動脈循環不全）、血管性痴呆（例えば、多発脳梗塞性痴呆）、白質
軟化症、室周性頭痛もしくは血管性頭痛（例えば、群発性頭痛または片頭痛)が
挙げられる。
【０５９９】 さらなる実施形態において、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドま
たはポリペプチド、あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはア
ンタゴニストによって処置され得る痴呆の型としては、例えば、ＡＩＤＳ痴呆複
合症、初老期痴呆（例えば、アルツハイマー病またはクロイツフェルトヤコブ病
）、老年痴呆（例えば、アルツハイマー病または進行性核上性麻痺）、あるいは
血管性痴呆が挙げられる。
【０６００】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る脳炎の型としては、例えば、軸周辺の（ｐｅｒｉａｘｉａｌｉｓ
）脳炎、ウイルス性脳炎、（例えば、流行性脳炎、日本脳炎、セントルイス脳炎
、Ｔｉｃｋ−Ｂｏｒｎｅ脳炎、または西ナイル熱脳炎）、脳脊髄炎、急性播種性
髄膜脳炎（例えば、ブドウ膜髄膜脳炎性症候群（Ｕｖｅｏｍｅｎｉｎｇｏｅｎｃ
ｅｐｈａｌｉｔｉｃ Ｓｙｎｄｒｏｍ））、脳炎後のパーキンソン病、あるいは
亜急性硬化性汎脳炎が挙げられる。
【０６０１】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得るてんかんの型としては、例えば、全身てんかん（例えば、失神て
んかん、ミオクローヌ性てんかん（例えば、ＭＥＲＲＦ症候群）、強直−間代性
（ｔｏｎｉｃ−ｃｌｏｎｉｃ）てんかん、または点頭痙攣）および部分てんかん
（例えば、複雑部分発作、前頭葉てんかん、側頭葉てんかん、外傷性てんかん、
またはてんかん重積持続状態（例えば、持続性部分てんかん）が挙げられる。
【０６０２】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいは
ニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによって処置さ
れ得る神経系疾患および障害としてはまた、例えば、中枢神経系感染、中枢神経
新生物、脱髄疾患、脳脊髄炎、高圧神経症候群、髄膜症、脊髄疾患、スティッフ
マン症候群、精神遅滞、神経系の異常、脳神経新生物、末梢神経新生物、脳神経
性の症状発現（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ）、
または神経筋の疾患が挙げられる。
【０６０３】 より具体的には、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペ
プチド、あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニス
トによって処置され得る中枢神経系感染の型としては、例えば、エイズ痴呆複合
症、脳腫瘍、硬膜下蓄膿、脳炎（例えば、軸周囲性脳炎、ウイルス性脳炎、流行
性脳炎、日本脳炎、セントルイス脳炎、Ｔｉｃｋ−Ｂｏｒｎｅ脳炎、または西ナ
イル熱脳炎）、急性播種性脳脊髄炎、髄膜脳炎（例えば、ブドウ膜髄膜脳炎性症
候群）、脳炎後のパーキンソン病、亜急性硬化性汎脳炎、脳脊髄炎（例えば、ウ
マの脳脊髄炎またはベネズエラウマ脳脊髄炎）、壊死性出血性脳脊髄炎、ビスナ
、大脳マラリア、髄膜炎（例えば、クモ膜炎、無菌性髄膜炎、あるいはウイルス
性髄膜炎（例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎）、細菌性髄膜炎（例えば、．ヘモフ
ィルス属、リステリア属、髄膜炎菌性（例えば、ウォーターハウスフリードリク
セン症候群）、肺炎球菌、または髄膜の結核症）、真菌性髄膜炎（例えば、新菌
性（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｌ））、硬膜下滲出、髄膜脳炎（例えば、ブドウ膜
髄膜脳炎性症候群）、脊髄炎（例えば、横断脊髄炎）、神経梅毒（例えば、脊髄
ろう）、ポリオ（例えば、延髄性ポリオまたはポリオ後遅発性筋萎縮症）、プリ
オン疾患（例えば、クロイツフェルト−ヤコブ病、ウシの海綿状脳症、ゲルスト
マン−ストロイスラー症候群、クールー、またはスクラピー）あるいはトキソプ
ラスマ脳症が挙げられる。
【０６０４】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る中枢神経系新生物の型としては、例えば、脳新生物（例えば、大
脳新生物、テント下新生物、脳室新生物、脈絡叢新生物、視床下部新生物、テン
ト上方新生物、髄膜新生物、または脊髄新生物（例えば、硬膜上新生物））が挙
げられる。
【０６０５】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る脱髄疾患の型としては、例えば、カナバン病、びまん性脳硬化症
、副腎脳白質ジストロフィー、性軸索周囲性脳炎、球様細胞白質萎縮症、びまん
性脳硬化症、異染性白質萎縮症、アレルギー性脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎
、進行性多病巣性白質脳障害、多発性硬化症、橋中央ミエリン溶解、横断脊髄炎
、視神経脊髄炎、スクラピー、または脊柱前弯症が挙げられる。 さらなる実施形態において、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまた
はポリペプチド、あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアン
タゴニストによって処置され得る脳脊髄炎の型としては、例えば、アレルギー性
、ウマの、つまりベネズエラウマ脳脊髄炎、壊死性虚血性脳脊髄炎、ビスナ、あ
るいは慢性疲労症候群が挙げられる。
【０６０６】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る脊髄疾患の型としては、例えば、先天性筋無緊張症、筋萎縮性側
索硬化症、脊髄筋萎縮症、ウェルドリッヒ−ホフマン病、脊髄炎（例えば、横断
脊髄炎）、ポリオ（例えば、延髄性およびポリオ後遅発性筋萎縮症）、脊髄圧縮
、脊髄新生物、硬膜上新生物、脊髄空洞症、または脊髄ろうが挙げられる。
【０６０７】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る精神遅滞の型としては、例えば、アンジェルマン症候群、ネコ鳴
き症候群、ド ランジュ症候群、ダウン症候群、ガングリオシドーシス（例えば
、ＧＭ１ガングリオシドーシス、サンドホフ病、テイ−ザックス病、ハートナッ
プ病、ホモシスチン尿症、ローレンス−ムーン−ビードル症候群、レッシュ−ナ
イハン症候群、カエデシロップ病、ムコリピドーシス、フコース蓄積症、神経細
胞セロイド脂褐素沈着症、眼脳腎症候群、フェニルケトン尿症、フェニルケトン
尿症（例えば、母系の）、プラーダー−ヴィリ（Ｐｒａｄｅｒ−ＷｉＨ）症候群
、レット症候群、ルビンスタイン−テイビー症候群、結節硬化症、またはＷＡＧ
Ｒ症候群が挙げられる。
【０６０８】 さらなる実施形態において、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドま
たはポリペプチド、あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはア
ンタゴニストによって処置され得る神経系の異常の型としては、例えば、全前脳
症、神経管欠損症（例えば、無脳症、水無脳症、ａｍｏｌｄ−ｃｈｉａｄ変形、
脳ヘルニア、髄膜瘤、髄膜脊髄瘤、脊髄破裂症（例えば、嚢胞性二分脊椎または
潜在性二分脊椎））、遺伝性の運動性および知覚性ニューロパシー（例えば、シ
ャルコー−マリー病、遺伝性視神経萎縮、レフサム病、ヒト遺伝性疾患、または
ウィルドニッヒ−ホフマン病）、遺伝性の知覚性または自律性ニューロパシー（
例えば、先天性無痛覚症あるいは家族性自律神経障害が挙げられる。
【０６０９】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る中枢神経系新生物の型としては、例えば、脳新生物（例えば、小
脳新生物、テント内新生物、脳室新生物、脈絡叢新生物、視床下部新生物または
テント上方新生物）、脳脊髄膜新生物、脊髄新生物（例えば、硬膜上新生物）、
末梢神経新生物（例えば、脳神経新生物、聴神経腫または２型神経線維腫症が挙
げられる。
【０６１０】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る精神症状の型としては、例えば、認知不能症（例えば、ゲルスト
マン症候群）、健忘症（例えば、逆行性の）、失行症、神経因性膀胱障害、脱力
発作、コミュニケーション障害（例えば、難聴、部分的な聴力損失、ラウドネス
補償処理（ｌｏｕｄｎｅｓｓ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）、または耳鳴のような
聴覚障害）、言語障害、失語症（例えば、失書症、名称失語症、ブロカ失語症、
またはウェルニッケ失語症）、失読症、後天的失読症、言語発達障害、言語障害
（例えば、失語症、失書症、名称失語症、ブロカ失語症、ウェルニッケ失語症、
構音障害、構語障害、反響言語、無言症、またはどもり）あるいは音声障害（例
えば、失声症、嗄声））、除脳硬直状態、せん妄、線維束性攣縮、幻覚、髄膜症
、運動障害（例えば、アンジェルマン症候群、運動失調、アテトーシス、舞踏病
、ジストニア、運動低下症、筋肉の低血圧症、筋クローヌス、チック、斜頚、ま
たは振せん）、筋肉の高血圧症、筋肉の硬直、シュバッハマン症候群、筋肉の痙
性、疼痛（例えば、関節痛、背痛、顔面痛、頭痛、緊張性頭痛、神経痛、または
難治性疼痛)、完全麻痺、顔面筋麻痺、耳帯状疱疹、胃不全麻痺、片麻痺、眼筋
麻痺（例えば、複視、デュエーン症候群、ホルナー症候群、慢性進行性外眼筋麻
痺症、またはＫｅａｒｎｓ症候群）、完全麻痺（例えば、延髄の、局所的痙攣性
不全対麻痺、対麻痺、Ｂｒｏｗｎ−Ｓｅｑｕａｒｄ症候群、四肢麻痺、呼吸の完
全麻痺、または声帯の完全麻痺）、不全麻痺、幻影肢、異常反射、発作、痙攣、
感覚障害（例えば、無嗅覚症、めまい感、幻覚、知覚過敏、痛覚過敏、知覚減退
、錯覚、感覚異常症、不穏下肢症候群、幻影肢、味覚障害（例えば、無味覚症ま
たは味覚不全）、視覚障害（例えば、弱視、盲、色覚異常、複視、半盲、視野暗
点、または正常以下の視覚）、睡眠障害（例えば、過眠症、Ｋｌｅｉｎｅ−Ｌｅ
ｖｉｎ症候群、ナルコレプシー、不眠症、または夢遊症)、痙縮、開口障害、意
識消失（例えば、昏睡、永続的植物状態、または失神）、あるいはめまいが挙げ
られる。
【０６１１】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る神経筋疾患の型としては、例えば、先天性筋無緊張症、筋萎縮性
側索硬化症、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ筋無力症候群、運動ニューロン疾患、
筋萎縮（例えば、シャルコー−マリー病、棘筋萎縮、またはウェルドニッヒ−ホ
フマン病）、ポリオ後遅発性筋萎縮症、筋ジストロフィー、重症筋無力症、萎縮
性ミオトニー、先天性ミオトニー、ネマリンミオパシー、家族性周期性四肢麻痺
、多発性パラミオクローヌス（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｐａｒａｍｙｏｃｌｏｎｕ
ｓ）、局所的痙攣性不全対麻痺、あるいはＳｔｉｆｆ−Ｍａｎ症候群が挙げられ
る。
【０６１２】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る神経系疾患および障害としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない；先端疼痛症のような末梢神経系疾患、アミロイドニューロパシー
、自律神経系疾患、中枢神経系疾患、顔面神経疾患、眼球運動障害、視神経疾患
、三叉神経痛、声帯（ｖｏｃａｌ ｃｏｒ）完全麻痺、脱髄疾患、糖尿病性ニュ
ーロパシー、神経圧挫症候群、神経痛、神経炎、遺伝性の運動性および知覚性ニ
ューロパシー、遺伝性の知覚性および自律神経性ニューロパシー、もしくは末梢
神経新生物。
【０６１３】 さらなる実施形態において、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドま
たはポリペプチド、あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはア
ンタゴニストによって処置され得る自律神経系疾患の型としては、例えば、アー
ディー症候群、Ｂａｒｒｅ−Ｌｉｅｏｕ症候群、家族性自律神経障害、ホルナー
症候群、反射性交感神経性ジストロフィー、またはシャイ−ドレーガー症候群が
挙げられる。
【０６１４】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る脳神経疾患の型としては、例えば、内耳神経疾患、内耳神経腫、
２型神経線維腫症、脳神経新生物、聴神経腫、または２型神経線維腫症が挙げら
れる。
【０６１５】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る顔面神経の疾患の型としては、例えば、顔面神経痛、顔面神経麻
痺（例えば、耳帯状疱疹またはＭｅｌｋｅｒｓｓｏｎ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ症候
群）あるいは眼球運動障害（例えば、弱視、眼振、動眼神経完全麻痺、眼筋麻痺
（例えば、デュエーン症候群、ホルナー症候群、慢性進行性外眼筋麻痺症、また
はＫｅａｒｎｓ症候群）、斜視、内斜視、あるいは外斜視が挙げられる。
【０６１６】 さらに具体的に、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペ
プチド、あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニス
トによって処置され得る神経の疾患の型として、例えば、視神経萎縮、遺伝性の
視神経萎縮、視神経円板ドルーゼ、視神経炎、視神経脊髄炎、乳頭水腫が挙げら
れる。
【０６１７】 さらなる実施形態において、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドま
たはポリペプチド、あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはア
ンタゴニストによって処置され得る脱髄疾患の型として、例えば、視神経脊髄炎
または脊柱前弯症が挙げられる。
【０６１８】 さらに具体的には、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチド、あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニ
ストによって処置され得る神経圧挫症候群の型としては、例えば、手根管症候群
、足根管症候群、胸郭出口症候群、頸肋症候群、および尺骨神経圧挫症候群が挙
げられる。
【０６１９】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る神経痛の型としては、例えば、カウザルギー、頸部−上腕の神経
痛（ｃｅｒｖｉｃｏ−ｂｒａｃｈｉａｌ ｎｅｕｒａｌｇｉａ）、顔面神経痛、
または三叉神経痛が挙げられる。
【０６２０】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る神経炎の型としては、例えば、実験的アレルギー性脳脊髄炎、視
神経炎、多発性神経炎、多発性神経根神経炎（ｐｏｌｙｒａｄｉｃｕｌｏｎｅｕ
ｒｉｔｉｓ）、神経根炎、または多発性神経根炎が挙げられる。
【０６２１】 さらなる実施形態において、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドま
たはポリペプチド、あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはア
ンタゴニストによって処置され得る遺伝性の運動および感覚神経の壊疽の型とし
ては、例えば、シャルコー−マリー病、遺伝性の視神経萎縮、レフサム病、遺伝
性痙性対麻痺、またはウェルドニッヒ−ホフマン病が挙げられる。
【０６２２】 より具体的に、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプ
チド、あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニスト
によって処置され得る遺伝性の感覚および自立性ニューロパシーの型としては、
例えば、無痛覚症、先天性無痛覚症、または家族性自律神経障害が挙げられる。
【０６２３】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る末梢神経新生物の型としては、例えば、脳神経新生物（聴神経腫
または２型神経線維腫症）、ＰＯＥＭＳ症候群、坐骨神経痛、味覚性発汗、また
はテタニーが挙げられる。
【０６２４】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによっ
て処置され得る症状としては、例えば、ショック、術後のトラウマおよび疼痛、
うつ病、不安障害、精神分裂病、慢性の背痛および／または頸痛、慢性関節リウ
マチおよび他の慢性の炎症性の病気に起因する疼痛が挙げられる。 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あ
るいはニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストによって
処置され得る独特の症状としては、薬物中毒が挙げられる。例えば、アルコール
症、ニコチン中毒、ヘロイン中毒、コカイン中毒、および「鎮痛剤」に対する中
毒。
【０６２５】 （抗新脈管形成活性） 新脈管形成の内因性の、刺激因子とインヒビターとの間の天然に存在する平衡
は、阻害影響が優勢である平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ ５
６：３４５〜３５５（１９８９）。新生血管形成が正常な生理学的条件下におい
て生じるまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プ
ロセス）において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的
に定められる。病的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける）
の下において、これらの調節の制御はできない。調節されていない新脈管形成は
病的になり、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する
。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼
の障害および乾癬を含む、異常な新生血管形成により支配される。例えば、Ｍｏ
ｓｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋｍａｎ
ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜１７６３（１９９５）；
Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜４１１
（１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、Ａｍ
．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；およびＦｏｌ
ｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７１９〜７２５（１９８３）による概説
を参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状
態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する
有意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。
【０６２６】 本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに
本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの投与による新生血管形成に関連する
疾患、障害および／または症状の処置を提供する。本発明のポリヌクレオチドお
よびポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置し得
る悪性状態および転移性状態には、本明細書に記載の悪性疾患、固形腫瘍、およ
び癌、ならびに当該分野で公知の他のもの（このような障害の総説については、
Ｆｉｓｈｍａｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ
Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）が挙げられる
が、これらに限定されない。従って、本発明は、新脈管形成関連疾患および／ま
たは障害の処置の方法を提供し、この方法は、治療有効量の、本発明のポリヌク
レオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを、その処
置の必要な個体に投与する工程を包含する。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペ
プチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストは、癌または腫瘍を治療的に
処置または予防するために、種々のさらなる方法で利用され得る。ポリヌクレオ
チド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストで処置され得る
癌としては、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、
精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、頸部癌、子宮癌、子宮内
膜癌、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌を含む固形腫瘍；原発性腫瘍および転移；黒色
腫；膠芽腫；カポージ肉腫；平滑筋肉腫；非小細胞肺癌；結腸直腸癌；進行性（
ａｄｖａｎｃｅｄ）悪性疾患；および血液から生じる腫瘍（例えば、白血病）が
挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストは、皮膚癌、頭頸部腫瘍、乳房腫
瘍およびカポージ肉腫のような癌を処置または予防するために、局所送達され得
る。
【０６２７】 なお他の局面において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストお
よび／またはアゴニストは、例えば膀胱内投与によって膀胱癌の表面形態を処置
、予防および／または診断するために利用され得る。ポリヌクレオチド、ポリペ
プチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストは、腫瘍に直接的に、または
注射もしくはカテーテルを介して腫瘍部位付近に送達され得る。当然のことなが
ら、当業者が理解するように、適切な投与様式は、処置されるべき癌によって変
化する。他の送達様式は本明細書中において議論される。
【０６２８】 ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニスト
は、癌に加えて、他の疾患、障害および／または症状（新脈管形成を含む）を処
置する際に有用であり得る。これらの疾患、障害および／または症状としては、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神
経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）；動脈硬化プラーク；眼
の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植拒
絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、ブドウ
膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ）および眼の翼状片（Ｐｔｅｒｙｇｉａ）（異常な血管増
殖））；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延型創傷治癒；子宮内膜症；脈管形成；顆
粒化；過形成性瘢痕（ケロイド）；偽関節骨折；強皮症；トラコーマ；血管接着
；心筋の新脈管形成；冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ
）；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性四肢新脈管形成；オースラー−ウェーバー
（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群；プラーク新生血管形成；毛細血管拡張症
；血友病性関節；血管線維腫；線維筋性形成異常；創傷顆粒化；クローン病；お
よびアテローム性動脈硬化症。
【０６２９】 例えば、本発明の１つの局面において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプ
チド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを過形成性瘢痕またはケロイド
に投与する工程を包含する、過形成性瘢痕およびケロイドを処置するための方法
が提供される。
【０６３０】 本発明の１つの実施形態において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタ
ゴニストおよび／またはアゴニストは、過形成性瘢痕またはケロイドに、これら
の病変の進行を妨げるために直接注射される。この治療は、過形成性瘢痕および
ケロイド（例えば、やけど）の発生を生じることが知られている状態の予防処置
において特に価値があり、そして好ましくは、増殖期が進行する時間（最初の傷
害の約１４日後）を有した後であるが、過形成性瘢痕またはケロイドの発生の前
に開始される。上述のように、本発明はまた、眼の新生血管形成疾患（例えば、
角膜新生血管形成、血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖お
よび黄斑変性を含む）を処置するための方法を提供する。
【０６３１】 さらに、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（アゴニストおよび／
またはアンタゴニストを含む）を用いて処置され得る新生血管形成に関連する眼
の疾患、障害および／または症状としては、以下が挙げられるが、これらに限定
されない：血管新生緑内障、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症
、ブドウ膜炎、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植新生血管形成、ならびに他の眼
の炎症性疾患、眼の腫瘍、および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾
患。例えば、Ｗａｌｔｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４〜７
１０（１９７８）およびＧａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：
２９１〜３１２（１９７８）による総説を参照のこと。
【０６３２】 従って、本発明の１つの局面において、治療有効量の化合物（上記）を患者に
対して、血管の形成が阻害されるように角膜に投与する工程を包含する、角膜新
生血管形成（角膜移植新生血管形成を含む）のような眼の新生血管形成疾患を処
置するための方法が、提供される。簡潔には、角膜は、通常には血管を欠く組織
である。しかし、特定の病的状態において、毛細血管は、縁の角膜周囲脈管叢か
ら角膜に伸長し得る。角膜が血管化されるようになる場合、角膜はまた混濁され
るようになり、患者の視力の衰えを生じる。角膜が完全に不透明になる（ｏｐａ
ｃｉｔａｔｅ）場合に、視力喪失が完全になり得る。広範な種々の疾患、障害お
よび／または症状は、例えば、以下を含む角膜新生血管形成を生じ得る：角膜感
染（例えば、トラコーマ、単純ヘルペス角膜炎、リーシュマニア症およびオンコ
セルカ症）、免疫学的プロセス（例えば、移植片拒絶およびスティーヴンズ−ジ
ョンソン症候群）、アルカリやけど、外傷、炎症（任意の原因による）、毒性お
よび栄養欠乏状態、ならびにコンタクトレンズを装着することの合併症として。
【０６３３】 特に好ましい実施形態において、本発明は、生理食塩水（眼に用いる調製物に
おいて一般に使用される任意の保存剤および抗菌剤と組合せて）中で局所投与の
ために調製され得、そして点眼剤形態で投与され得る。溶液または懸濁液は、そ
の純粋な形態で調製され得、そして１日に数回投与され得る。あるいは、上記の
ように調製される抗脈管形成組成物はまた、角膜に直接投与され得る。好ましい
実施形態において、抗脈管形成組成物は、角膜に結合する粘膜接着性ポリマーと
ともに調製される。さらなる実施形態において、抗脈管形成因子または抗脈管形
成組成物は、従来のステロイド治療に対する補助剤として利用され得る。局所治
療はまた、脈管形成応答（例えば、化学的やけど）を誘導する高い可能性を有す
ることが公知である角膜病変において予防的に有用であり得る。これらの場合に
おいて、処置（おそらくステロイドと組み合わせられる）は、その後の合併症を
予防するのを補助するために直ちに開始され得る。
【０６３４】 他の実施形態において、上記の化合物は、角膜支質に直接、顕微鏡の案内の下
で眼科医によって注入され得る。好ましい注射部位は、個々の病巣の形態で変化
し得るが、投与の目標は、脈管構造の前進している面に組成物を置くこと（すな
わち、血管と正常な角膜との間に分散される）である。ほとんどの場合において
、これは、前進している血管から角膜を「防御」するための縁周囲（ｐｅｒｉｌ
ｉｍｂｉｃ）角膜注射を含む。この方法はまた、角膜新生血管形成を予防的に防
ぐために、角膜傷害の直後に利用され得る。この状況において、この物質は、角
膜病巣とその所望されない潜在的な血液供給の縁との間に分散して縁周囲角膜に
注射され得る。このような方法はまた、類似の様式で、移植された角膜の毛細血
管浸潤を予防するために利用され得る。徐放形態において、注入は、１年に２〜
３回のみ必要とされ得る。ステロイドもまた、注入溶液に添加され、その注射自
体から生じる炎症を低減し得る。
【０６３５】 本発明の別の局面において、患者に、血管の形成を阻害するように、治療有効
量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニス
トを眼に投与する工程を包含する、血管新生緑内障を処置するための方法が提供
される。１つの実施形態において、化合物は、血管新生緑内障の早期形態を処置
または予防するために、眼に局所投与され得る。他の実施形態において、化合物
は、前方角（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｈａｍｂｅｒ ａｎｇｌｅ）の領域に注入に
よって移植され得る。他の実施形態において、化合物はまた、化合物が眼房水に
連続的に放出されるように、任意の位置に置かれ得る。本発明の別の局面におい
て、患者に、血管の形成が阻害されるように、治療有効量のポリヌクレオチド、
ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを患者に投与する工程
を包含する、増殖性糖尿病性網膜症を処置するための方法が提供される。
【０６３６】 本発明の特に好ましい実施形態において、増殖性糖尿病性網膜症は、網膜にお
けるポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニス
トの局所濃度を増加させるために、眼房水または硝子体への注入によって処置さ
れ得る。好ましくは、この処置は、光凝固を必要とする重篤な疾患の獲得の前に
開始されるべきである。
【０６３７】 本発明の別の局面において、血管の形成が阻害されるように、患者に、治療有
効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニ
ストを眼に投与する工程を包含する、水晶体後線維増殖症を処置するための方法
が、提供される。化合物は、硝子体内注射を介して、および／または眼内移植を
介して局所投与され得る。
【０６３８】 さらに、このポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはア
ゴニストで処置され得る疾患、障害および／または症状としては、以下が挙げら
れるが、それらに限定されない：血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテロー
ム性プラーク、遅延型創傷治癒、顆粒化、血友病性関節、過形成性瘢痕、偽関節
骨折、オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群、化膿性肉芽
腫、強皮症、トラコーマ、および血管接着。
【０６３９】 さらに、このポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはア
ゴニストで処置され得る疾患、障害および／または症状としては、以下が挙げら
れるが、それらに限定されない：固形腫瘍、血液由来の（ｂｌｏｏｄ ｂｏｒｎ
）腫瘍（例えば、白血病）、腫瘍転移、カポージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管
腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウ
マチ、乾癬、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変
性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜
芽細胞腫、およびブドウ膜炎）、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、脈管形成、顆粒
化、過形成性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラコーマ、血管接着、
心筋の新脈管形成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）
、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新脈管形成、オースラー−ウェーバー症
候群、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、線
維筋性形成異常、創傷顆粒化、クローン病、アテローム性動脈硬化症、産児制限
薬剤（月経を制御する、胎芽着床のために必要な血管新生を予防することによる
）、病原性の結果（例えば、ネコ引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍｉｎａｌｉａ
ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、バ
ルトネラ症および細菌性血管腫症状）のような新脈管形成を有する疾患。
【０６４０】 出産を制御する方法の１つの局面において、胎芽着床をブロックするに十分な
化合物の量は、性交および受精が起こる前またはその後に投与され、従って産児
制限の有効な方法、おそらく「事後用（ｍｏｒｎｉｎｇ ａｆｔｅｒ）」方法を
提供する。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニ
ストはまた、月経を制御することにおいて使用され得るか、または子宮内膜症の
処置における腹膜洗浄液として、もしくは腹膜移植のためのいずれかで投与され
得る。
【０６４１】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニ
ストは、縫合（ｓｔｉｔｃｈ）肉芽腫を予防するために、外科縫合に組み込まれ
得る。
【０６４２】 ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストは、
広範な種々の外科手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの局面にお
いて、組成物（例えば、スプレーまたはフィルムの形態において）は、悪性組織
から正常な周囲の組織を分離するため、そして／または周囲の組織への疾患の広
がりを予防するために、腫瘍の除去の前に、領域をコートまたはスプレーするた
めに利用され得る。本発明の他の局面において、組成物（例えば、スプレーの形
態において）は、腫瘍をコートするため、または所望の場所において新脈管形成
を阻害するために、内視鏡手順を介して送達され得る。本発明のなお他の局面に
おいて、本発明の抗脈管形成組成物でコートされている外科メッシュが、外科メ
ッシュが利用され得る任意の手順において利用され得る。例えば、本発明の１つ
の実施形態において、抗脈管形成組成物を有した外科メッシュレーデン（ｌａｄ
ｅｎ）は、構造に対する支持を提供するため、そして一定の量の抗脈管形成因子
を放出するために、腹部癌切除手術の間（例えば、結腸切除の後）に利用され得
る。
【０６４３】 本発明のさらなる局面において、癌の局所的再発およびその部位での新しい血
管の形成が阻害されるように、切除後にポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴ
ニストおよび／またはアゴニストを腫瘍の切除縁に投与する工程を包含する、腫
瘍切除部位を処置するための方法が提供される。本発明の１つの実施形態におい
て、抗脈管形成化合物は、腫瘍切除部位に直接投与される（例えば、塗布、ブラ
ッシング（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）、または他の方法で抗脈管形成化合物で腫瘍の切
除縁をコートすることによって適用される）。あるいは、抗脈管形成化合物は、
投与前に公知の外科ペーストに組み込まれ得る。本発明の特に好ましい実施形態
において、抗脈管形成化合物は、悪性疾患についての肝切除後および神経外科手
術後に適用される。
【０６４４】 本発明の１つの局面において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト
および／またはアゴニストは、広範な種々の腫瘍（例えば、乳房腫瘍、結腸腫瘍
、脳腫瘍および肝腫瘍を含む）の切除縁に投与され得る。例えば、本発明の１つ
の実施形態において、抗脈管形成化合物は、切除後に、神経学的腫瘍の部位に、
その部位での新しい血管の形成が阻害されるように投与され得る。
【０６４５】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニ
ストはまた、他の抗脈管形成因子とともに投与され得る。他の抗脈管形成因子の
代表的な例としては以下が挙げられる：抗侵襲性因子、レチノイン酸およびその
誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビ
ター、メタロプロテイナーゼ−２の組織インヒビター、プラスミノーゲン活性化
インヒビター−１、プラスミノーゲン活性化インヒビター−２および種々の形態
のより軽い「ｄ群」遷移金属。
【０６４６】 より軽い「ｄ群」遷移金属には、例えばバナジウム、モリブデン、タングステ
ン、チタン、ニオブおよびタンタル種が挙げられる。そのような遷移金属種は、
遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の適切な錯体としては、オキソ遷
移金属錯体が挙げられる。
【０６４７】 バナジウム錯体の代表的な例としては、バナデート錯体およびバナジル錯体の
ようなオキソバナジウム錯体が挙げられる。適切なバナデート錯体としては、例
えばメタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウムおよびオルトバナ
ジン酸ナトリウムのようなメタバナデート錯体およびオルトバナデート錯体が挙
げられる。適切なバナジル錯体としては、例えばバナジルアセチルアセトネート
および硫酸バナジル（硫酸バナジル一水和物および硫酸バナジル三水和物のよう
な硫酸バナジル水和物を含む）が挙げられる。
【０６４８】 タングステン錯体およびモリブデン錯体の代表的な例としてはまた、オキソ錯
体が挙げられる。適切なオキソタングステン錯体としては、タングステート錯体
およびタングステンオキシド錯体が挙げられる。適切なタングステート錯体とし
ては、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン
酸ナトリウム二水和物およびタングステン酸が挙げられる。適切なタングステン
オキシドとしては、タングステン（ＩＶ）オキシドおよびタングステン（ＶＩ）
オキシドが挙げられる。適切なオキソモリブデン錯体としては、モリブデート、
モリブデンオキシドおよびモリブデニル錯体が挙げられる。適切なモリブデート
錯体としては、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナト
リウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙
げられる。適切なモリブデンオキシドとしては、モリブデン（ＶＩ）オキシド、
モリブデン（ＶＩ）オキシドおよびモリブデン酸が挙げられる。適切なモリブデ
ニル錯体としては、例えばモリブデニルアセチルアセトネートが挙げられる。他
の適切なタングステン錯体およびモリブデン錯体としては、例えばグリセロール
、酒石酸および糖由来のヒドロキソ誘導体が挙げられる。
【０６４９】 広範な種々の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の状況において利用され得る
。代表的な例としては、以下が挙げられる：血小板因子４；硫酸プロタミン；硫
酸化キチン誘導体（クイーンクラブ（ｑｕｅｅｎ ｃｒａｂ）の殻から調製され
る）（Ｍｕｒａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：２２〜２６、１９９１）
；硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、ス
テロイド（例えば、エストロゲン）およびクエン酸タモキシフェンの存在によっ
て、増強され得る）；スタウロスポリン；基質代謝の調節因子（例えば、プロリ
ンアナログ、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チ
アプロリン、α，α−ジピリジル，アミノプロピオニトリルフマレートを含む）
；４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトト
レキサート；ミトザントロン；ヘパリン；インターフェロン；２マクログロブリ
ン−血清；ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７
：１７３２１〜１７３２６、１９９２）；キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら
、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２８６：４７５〜４８０、１９９２）；シクロデキスト
リンテトラデカサルフェート；エポネマイシン；カンプトテシン；フマギリン（
Ｉｎｇｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５５〜５５７、１９９０）；チオリ
ンゴ酸金ナトリウム（「ＧＳＴ」；ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ、Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０〜１４４６、１９８７）；アンチコラゲ
ナーゼ−血清；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６２（４）：１６５９〜１６６４、１９８７）；ビサントレン（Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリット二ナトリウム（
Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸（ｃｈｌｏｒｏａ
ｎｔｈｒｏｎｉｌｉｃ ａｃｉｄ）二ナトリウム、すなわち「ＣＣＡ」；Ｔａｋ
ｅｕｃｈｉら、Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ ３６：３１２〜３１６、１９９
２）；サリドマイド；Ａｎｇｏｓｔａｔｉｃステロイド；ＡＧＭ−１４７０；カ
ルボキシアミノイミダゾール（ｃａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｍｉｄａｚｏｌｅ
）；およびメタロプロテイナーゼインヒビター（例えば、ＢＢ９４）。
【０６５０】 （細胞レベルでの疾患） ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならび
にニューロペプチドレセプターのアンタゴニストもしくはアゴニストによって処
置または検出され得る細胞生存の増大あるいはアポトーシスの阻害に関連する疾
患には、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を有する癌腫、およびホルモ
ン依存性腫瘍、これらは以下：結腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞
腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸の癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋
腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳
癌、前立腺癌、カポージ肉腫および卵巣癌を含むが、これらに限定されない）；
自己免疫性の疾患、障害および／または状態（例えば、多発性硬化症、シェーグ
レン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ
ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび
免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）およびウイルス感染（例えば、
ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、対宿主性
移植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶、が挙げられる。好ましい
実施形態において、本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド、ポ
リペプチド、および／またはアンタゴニストは、特に上記に列挙される、癌の増
殖、進行、および／または転移（ｍｅｔａｓｉｓ）を阻害するために使用される
。
【０６５１】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならび
にニューロペプチドレセプターのアンタゴニストもしくはアゴニストによって処
置または検出され得る細胞生存の増大に関連するさらなる疾患または状態には、
悪性疾患の進行および／または転移ならびに以下のような関連する障害が挙げら
れるが、これらに限定されない：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白
血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および
赤白血病を含む）を含む）ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性
）白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例え
ば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマ
クログロブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固形腫瘍（肉腫および癌腫（例えば、線
維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮
肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫
、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓
癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺
癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細
胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精
巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄
芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、
乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、お
よび網膜芽細胞腫）を含むが、これらに限定されない）。
【０６５２】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならび
にニューロペプチドレセプターのアンタゴニストもしくはアゴニストによって処
置または検出され得るアポトーシスの増大に関連する疾患には、以下が挙げられ
る：ＡＩＤＳ；神経変性疾患、障害および／または状態（例えば、アルツハイマ
ー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性および脳
腫瘍または以前に関連した疾患）；自己免疫性の疾患、障害および／または状態
（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、
ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋
炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマ
チ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚
血性傷害（心筋梗塞、発作および再灌流傷害によって生じるようなもの）、肝臓
傷害（例えば、肝炎関連肝臓傷害、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅ
ｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害）および肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコール
によって引き起こされるようなもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲
不振。
【０６５３】 （創傷治癒および上皮細胞増殖） 本発明のなおさらなる局面に従って、ニューロペプチドレセプターポリヌクレ
オチドまたはポリペプチド、ならびにニューロペプチドレセプターのアゴニスト
またはアンタゴニストを、治療目的のため、例えば、創傷治癒の目的のために上
皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを刺激するため、ならびに毛包産生および
皮膚創傷の治癒を刺激するために、利用するためのプロセスが提供される。ニュ
ーロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにニュー
ロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、以下を含む創傷治
癒を刺激することにおいて臨床的に有用であり得る：外科的創傷、切除の創傷、
深い創傷（真皮および表皮の損傷を含む）、眼組織の創傷、歯の組織の創傷、口
腔の創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚の潰瘍、肘の潰瘍、動脈性の潰瘍、静脈うっ滞潰
瘍、熱への曝露または化学物質による熱傷、および他の異常な創傷治癒状態（例
えば、尿毒症、栄養失調、ビタミン欠乏、ならびにステロイド、放射能療法およ
び抗腫瘍性薬物および代謝拮抗物質を用いる全身性処置に関連する合併症）。ニ
ューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにニュ
ーロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、皮膚の欠失後の
皮膚の回復を促進するために使用され得る。
【０６５４】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに
ニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、創傷床（ｗ
ｏｕｎｄ ｂｅｄ）への皮膚移植片の付着を増大するため、および創傷床からの
再上皮形成を刺激するために使用され得る。以下は、ニューロペプチドレセプタ
ーポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにニューロペプチドレセプター
のアゴニストまたはアンタゴニストが創傷床への付着を増大するために使用され
得る、移植片の型である：自家移植片、人工皮膚、同種移植片（ａｌｌｏｇｒａ
ｆｔ）、自己植皮片、自己表皮移植片（ａｕｔｏｅｐｄｅｒｍｉｃ ｇｒａｆｔ
）、無血管性（ａｖａｃｕｌａｒ）移植片、ブレア−ブラウン移植片、骨移植片
、胚胎組織移植片、真皮移植片、遅延移植片、皮膚移植片、表皮移植片、筋膜移
植片、全層皮膚移植片、異種移植片（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）
、異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）、同種移植片（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇ
ｒａｆｔ）、増殖性移植片、層板状の移植片、網状移植片、粘膜移植片、オリエ
−ティールシュ移植片、大網移植片（ｏｍｅｎｐａｌ ｇｒａｆｔ）、パッチの
移植片、茎状移植片、全層移植片（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｇｒａｆｔ）、分
層植皮片、分層皮膚移植片。ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまた
はポリペプチド、ならびにニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアン
タゴニストは、皮膚の強度を助長するため、および高齢の皮膚の外見を改善する
ために使用され得る。
【０６５５】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに
ニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストはまた、肝細胞
増殖、および肺、乳房、膵臓、胃、小腸（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｇ）、
および大腸における上皮細胞増殖における変化を生じると考えられる。ニューロ
ペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにニューロペ
プチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、上皮細胞（例えば、皮
脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、毛包、肝実質細胞、肺胞上皮細胞ＩＩ型（ｔｙｐ
ｅ ＩＩ ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅ）、ムチン産生杯細胞、および他の上皮細胞、
ならびに皮膚、肺、肝臓、および胃腸管内に含まれるそれらの先祖）の増殖を促
進し得る。ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
ならびにニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、内
皮細胞、ケラチノサイト、および基底ケラチノサイトの増殖を促進し得る。
【０６５６】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに
ニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストはまた、照射、
化学療法処置またはウイルス感染から生じる腸の毒性の副作用を低減するために
使用され得る。ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ド、ならびにニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは
、小腸粘膜上で細胞保護的な効果を有し得る。ニューロペプチドレセプターポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにニューロペプチドレセプターのアゴ
ニストまたはアンタゴニストはまた、化学療法およびウイルス感染から生じる粘
膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）（口粘膜）の治癒を刺激し得る。
【０６５７】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに
ニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、熱傷を含む
、完全なおよび部分的な厚さの皮膚欠損における皮膚の十分な再生（すなわち、
毛包、汗腺、および皮脂腺の再増殖）、乾癬のような他の皮膚欠損の処置におい
てさらに使用され得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およ
び／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、表皮水疱症、これらの損傷の
再上皮形成を促進することによる頻繁な開放性かつ疼痛性の水疱を生じる内在的
な真皮への表皮の接着における欠損を処置するために使用され得る。ニューロペ
プチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにニューロペプ
チドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストもしくはアンタゴニストはま
た、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を処置し、そして粘膜の内層の瘢痕形成ならびに
より迅速な腺の粘膜および十二指腸の粘膜の内層の再生による治癒を助けるため
に使用され得る。炎症性腸疾患（例えば、クーロン病および潰瘍性大腸結腸炎）
は、それぞれ、小腸または大腸の粘膜表面の崩壊を生じる疾患である。従って、
ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにニ
ューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、粘膜表面の再
表面化（ｒｅｓｕｌｆａｃｉｎｇ）を促進して、より迅速な治癒を助けるため、
および炎症性腸疾患の進行を予防するために、使用され得る。ニューロペプチド
レセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにニューロペプチドレ
セプターのアゴニストまたはアンタゴニストを用いる処置は、胃腸管全体の粘膜
の産生に対して有意な効果を有することが予測され、そして腸粘膜を、摂取され
たかまたは外科手術後の有害な物質から保護するために使用され得る。ニューロ
ペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにニューロペ
プチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、本発明のポリヌクレオ
チドの発現下に関連する疾患を処置するために使用され得る。
【０６５８】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
ならびにニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、種
々の病的状態に起因する肺への損傷を予防および治癒するために使用され得る。
ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにニ
ューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、急性または慢
性の肺損傷を予防または処置するために、増殖および分化を刺激し得、そして肺
胞および気管支（ｂｒｏｃｈｉｏｌａｒ）上皮の修復を促進し得る。例えば、気
管支上皮および肺胞（ａｖｅｏｌｉ）の壊死を生じる、気腫（これは、肺胞の進
行性の損失を生じる）および吸入損傷（すなわち、煙の吸入および熱傷から生じ
る）は、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、な
らびにニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストを使用し
て効果的に処置、予防および／または診断され得る。また、ニューロペプチドレ
セプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにニューロペプチドレセ
プターのアゴニストまたはアンタゴニストは、肺胞上皮細胞ＩＩ型の増殖および
分化を刺激するために使用され得、これは、未熟な乳児における硝子膜疾患（例
えば、乳児呼吸窮迫症候群および気管支肺異形成症）のような疾患を処置または
予防することを助け得る。
【０６５９】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに
ニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、肝実質細胞
の増殖および分化を刺激し得、そして従って、肝臓疾患および病状（例えば、肝
硬変により生じる劇症肝不全、肝炎ウイルスおよび毒性物質（すなわち、アセト
アミノフェン、四塩化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｔｅｔｒａｈｏｌｏｒｉｄｅ）、お
よび他の当該分野で公知の肝臓毒素）により生じる肝臓損傷）を緩和または処置
するために使用され得る。
【０６６０】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
ならびにニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、真
性糖尿病の発症を処置または予防するために使用され得る。新たにＩ型糖尿病お
よびＩＩ型糖尿病と診断された患者において、いくつかの島細胞機能が残ってい
る場合、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、な
らびにニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、その
疾患の持続性の発現を緩和、遅延または予防するように、その島機能を維持する
ために使用され得る。また、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまた
はポリペプチド、ならびにニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアン
タゴニストは、島細胞機能を改善または促進するための島細胞移植における補助
として使用され得る。
【０６６１】 （感染性疾患） ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに
ニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、感染因子を
処置、予防および／または診断するために用いられ得る。例えば、免疫応答を上
昇させることによって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を増
加させることによって、感染性疾患が処置、予防および／または診断され得る。
免疫応答は、既存の免疫応答を上昇させるか、または新たな免疫応答を開始させ
るかのいずれかにより上昇され得る。あるいは、ニューロペプチドレセプターポ
リヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにニューロペプチドレセプターのア
ゴニストまたはアンタゴニストはまた、必ずしも免疫応答を誘発することなく、
感染因子を直接阻害し得る。
【０６６２】 ウイルスは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／また
はアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置、予防および／または診断され
得る疾患または症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例とし
ては、以下のＤＮＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス科が挙げられるがこ
れらに限定されない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、
アルテリウイルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、
サルコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科、デング熱
、ＥＢＶ、ＨＩＶ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペス
ウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、ヘルペス帯状疱疹
）、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウ
イルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例え
ば、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、およびパラインフルエンザ）、パピ
ローマウイルス、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、
ポックスウイルス科（例えば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例え
ば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レン
チウイルス）、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらの科
内に入るウイルスは、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状
を引き起こし得る：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、呼
吸性シンシチウムウイルス、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢
性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、日本脳
炎Ｂ型、アルゼンチン出血熱、チングニア、リフトバレー熱、黄熱病、髄膜炎、
日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱
、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病
、風疹、性感染症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。
本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはア
ンタゴニストを用いて、任意のこれらの症状または疾患が処置、予防および／ま
たは診断され得る。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、以下の処置、予防およ
び／または診断に使用される：髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および／または肝炎
（例えば、Ｂ型肝炎）。さらなる具体的な実施形態において、本発明のポリヌク
レオチド、ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、１以上
の他の市販の肝炎ワクチンに非応答性の患者を処置するために使用される。さら
に具体的な実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、また
はアゴニストもしくはアンタゴニストは、ＡＩＤＳを処置、予防および／または
診断するために使用される。
【０６６３】 同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつ本発明のポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストによって
処置、予防および／または診断され得る細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下
のグラム陰性およびグラム陽性細菌および細菌科ならびに真菌を含むがこれらに
限定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ｃｒｙｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａ
ｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂ
ａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌ
ｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ
）、Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃ
ｔｅｒ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉ
ｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｔｏ
ｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ
．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、および
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉ
ｎｉａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇ
ｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙ
ｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｖ
ｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉ
ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍ
ｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａ
の感染症（例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（
例えば、ＨｅａｍｏｐｈｉｌｕｓインフルエンザＢ型）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌ
ａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙ
ｄｉａｃｅａｅ、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃａｌ、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃａｌ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａ
ｌならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＢ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。これらの細
菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに限定されない疾患または症状を引き
起こし得る：菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉
炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、爪周囲炎、プロテー
ゼ関連感染症、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血
症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎
、淋病、髄膜炎（例えば、髄膜炎Ａ型およびＢ型）、クラミジア、梅毒、ジフテ
リア、ライ病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹
、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅ
ｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。本発明のポ
リペプチドもしくはポリヌクレオチド、アゴニストもしくはアンタゴニストを用
いて、任意のこれらの症状もしくは疾患を処置、予防および／または診断し得る
。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニ
ストまたはアンタゴニストは、以下を処置、予防および／または診断するために
使用される：破傷風、ジフテリア、ボツリヅム、および／またはＢ型髄膜炎。
【０６６４】 さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストにより処置、予防および／または診断され得る
、寄生生物性因子が引き起こす疾患または症状としては以下のファミリーまたは
クラスが挙げられるがこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシ
ジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉ
ａｓｉｓ）、交疫、外部寄生生物性、ジアルジア鞭毛虫症、蠕虫症、リーシュマ
ニア症、タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、およびトリコモ
ナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）症、ならびに胞子虫症（Ｓｐｏｒｏｚｏａｎ）
（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｒａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌ
ｃｉｐａｒｉｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌａｓｍ
ｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定さ
れない種々の疾患または症状を引き起こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染
症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見
感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラス
マ症。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもし
くはアンタゴニストを用いて、任意のこれらの症状または疾患を処置、予防およ
び／または診断し得る。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、
ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、マラリアを処置、
予防および／または診断するために使用される。
【０６６５】 好ましくは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／また
はアゴニストもしくはアンタゴニストは、患者に有効量のポリペプチドを投与す
るか、または患者から細胞を取り出して、本発明のポリヌクレオチドをこの細胞
に供給し、そして操作した細胞を患者に戻す（エキソビボ治療）かのいずれかに
よるものであり得る。さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは
ワクチン中の抗原として用いられて、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る
。
【０６６６】 （再生） ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに
ニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストを用いて、細胞
を分化させ、増殖させ、そして誘引して、組織の再生を導き得る（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２７６：５９−８７（１９９７）を参照のこと）。組織の再生を用いて、先
天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、または潰瘍）、加齢、疾患（例えば、骨粗
鬆症、変形性関節炎（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、歯周病、肝不全）、
美容形成手術を含む手術、線維症、再灌流傷害、もしくは全身性サイトカイン損
傷により損傷を受けた組織を修復、置換、または保護し得る。
【０６６７】 本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる：器官（例えば、
膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、
血管系（血管およびリンパ管を含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱
、および靭帯）の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減され
て生じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。
【０６６８】 さらに、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
ならびにニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、治
癒するのが困難な組織の再生を増加させ得る。例えば、腱／靭帯の再生を増大さ
せることによって、損傷後の回復時間が早まる。ニューロペプチドレセプターポ
リヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにニューロペプチドレセプターのア
ゴニストまたはアンタゴニストはまた、損傷を回避する試みにおいて予防的に使
用され得る。処置、予防および／または診断され得る特定の疾患は、腱炎、手根
管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損を含む。非治癒創傷の組織再生のさ
らなる例としては、褥瘡性潰瘍、脈管不全、外科的創傷、および外傷性創傷に関
連する潰瘍が挙げられる。
【０６６９】 同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるためにニ
ューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにニュ
ーロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストを使用することによ
って再生され得る。本方法を用いて処置、予防および／または診断され得る疾患
としては、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患、神経障害、または機械的およ
び外傷性の疾患、障害および／または状態（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血
管疾患、および発作（ｓｔｏｋｅ））が挙げられる。詳細には、末梢神経傷害と
関連する疾患、末梢神経障害（例えば、化学療法または他の医学的療法から生じ
る）、局在神経障害、および中枢神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パー
キンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー
症候群）はすべて、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペ
プチド、ならびにニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニス
トを用いて処置、予防および／または診断され得る。
【０６７０】 （走化性） ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに
ニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、走化性活性
を有し得る。走化性分子は、細胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞
、肥満細胞、好酸球、上皮細胞および／または内皮細胞）を、身体中の特定の部
位（例えば、炎症、感染、または過剰増殖の部位）に誘引または動員する。次い
で、動員された細胞は、特定の外傷または異常性を撃退および／または治癒し得
る。
【０６７１】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに
ニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、特定の細胞
の走化性活性を増大し得る。次いで、これらの走化性分子を使用して、身体中の
特定の位置に標的化した細胞の数を増加させることによって、炎症、感染、過剰
増殖性の疾患、障害および／もしくは状態、または任意の免疫系障害を処置、予
防および／または診断し得る。例えば、走化性分子を使用して、傷害を受けた位
置に免疫細胞を誘引することによって、組織に対する創傷および他の外傷を処置
、予防および／または診断し得る。走化性分子として、ニューロペプチドレセプ
ターはまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を処置、予防および／または診
断するために使用され得る。
【０６７２】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに
ニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストが走化性活性を
阻害し得ることもまた意図される。これらの分子はまた、障害を処置するために
使用され得る。従って、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドまたはポ
リペプチド、ならびにニューロペプチドレセプターのアゴニストまたはアンタゴ
ニストは、走化性のインヒビターとして使用され得る。
【０６７３】 （結合活性） ニューロペプチドレセプターポリペプチドは、ニューロペプチドレセプターに
結合する分子、またはニューロペプチドレセプターが結合する分子についてスク
リーニングするために使用され得る。ニューロペプチドレセプターとこの分子と
の結合は、結合したニューロペプチドレセプターまたは分子の活性を活性化（ア
ゴニスト）、増大、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。そのような
分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、レセプタ
ー）、または低分子が挙げられる。
【０６７４】 好ましくは、この分子は、ニューロペプチドレセプターの天然のリガンド（例
えば、リガンドのフラグメント）、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物
、もしくは機能的模倣物に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）：第５章（１９
９１）を参照のこと）。同様に、この分子は、ニューロペプチドレセプターが結
合する天然のレセプター、または少なくとも、ニューロペプチドレセプターによ
って結合され得るレセプターのフラグメント（例えば、活性部位）に密接に関連
し得る。いずれの場合においても、この分子は、公知の技術を用いて合理的に設
計され得る。
【０６７５】 好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、分泌タンパク質とし
てかまたは細胞膜上のいずれかでニューロペプチドレセプターを発現する適切な
細胞を産生する工程を包含する。好ましい細胞としては、哺乳動物、酵母、Ｄｒ
ｏｓｏｐｈｉｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる。次いで、ニュ
ーロペプチドレセプターを発現する細胞（または、発現されたポリペプチドを含
む細胞膜）を、好ましくは、ニューロペプチドレセプターまたはこの分子のいず
れかの結合、活性の刺激、または活性の阻害を観察するための分子を潜在的に含
む試験化合物と接触させる。
【０６７６】 アッセイは、ニューロペプチドレセプターへの候補化合物の結合を単純に試験
し得、ここで結合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関する
アッセイにおいて検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がニューロペプ
チドレセプターへの結合によって生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得
る。
【０６７７】 あるいは、アッセイは、無細胞調製物、固体支持体に接着されたポリペプチド
／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され得る。ア
ッセイはまた、候補化合物を、ニューロペプチドレセプターを含む溶液と混合す
る工程、ニューロペプチドレセプター／分子の活性または結合を測定する工程、
およびニューロペプチドレセプター／分子の活性または結合を、標準と比較する
工程を単純に包含し得る。
【０６７８】 好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体を用いて、サンプル（例えば、生物学的サンプル）におけるニューロペプ
チドレセプターのレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、ニューロペプチドレ
セプターへの直接的もしくは間接的のいずれかの結合、または基質についてのニ
ューロペプチドレセプターとの競合によって、ニューロペプチドレセプターのレ
ベルまたは活性を測定し得る。
【０６７９】 さらに、ニューロペプチドレセプターが結合するレセプターは、当業者に公知
の多くの方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌ
ｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（
２）、第５章（１９９１））によって同定され得る。例えば、発現クローニング
は、ポリアデニル化ＲＮＡがこのポリペプチドに応答する細胞から調製される場
合に用いられ、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（これは、ＦＧＦファミリータンパク
質に対する複数のレセプターを含むことが公知である）、およびＳＣ−３細胞、
およびこのＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーは、プールに分けられ、
そしてこのポリペプチドに応答性でないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフ
ェクトするために使用される。ガラススライド上で増殖しているトランスフェク
トされた細胞は、それらを標識化した後に、本発明のポリペプチドに曝露される
。このポリペプチドは、種々の手段（部位特異的プロテインキナーゼに対する認
識部位のヨウ素化または封入を含む）によって標識化され得る。
【０６８０】 固定化およびインキュベーション後、スライドは、オートラジオグラフィー分
析に供される。陽性プールを同定し、そしてサブプールを、反復性のサププール
化および再スクリーニングプロセスを使用して調製および再びトランスフェクト
して、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生じる。
【０６８１】 レセプター同定のための代替のアプローチとして、標識ポリペプチドは、レセ
プター分子を発現する調製物を、細胞膜と光親和性に連結し得るか、または抽出
し得る。架橋された材料は、ＰＡＧＥ分析によって分離され、そしてＸ線フィル
ムに曝露される。ポリペプチドのレセプターを含む標識複合体が切り出され得、
ペプチドフラグメントへと分離され得、そしてタンパク質微量配列決定に供され
得る。微量配列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、１組の縮重オリゴヌ
クレオチドプローブを設計してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定
レセプターをコードする遺伝子を同定する。
【０６８２】 さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフ
リング、および／またはコドンシャッフリングの技術（集合的に「ＤＮＡシャッ
フリング」という）を利用して、ニューロペプチドレセプターの活性を調節し得
、それによってニューロペプチドレセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト
を効果的に生成する。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１
１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、および
同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏ
ｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４〜３３（１９９７）；Ｈａｒ
ａｙａｍａ，Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６〜８
２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７
：２６５〜７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａ
ｓｃｏ，Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８〜１３（１９９
８）（これらの特許および刊行物の各々は、本明細書において参考として援用さ
れる）を参照のこと。１つの実施態様において、ニューロペプチドレセプターお
よび対応するポリペプチドの変更は、ＤＮＡシャッフリングによって達成され得
る。ＤＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的な組換えによる、２
つ以上のＤＮＡセグメントの、ニューロペプチドレセプター分子への構築を含む
。別の実施態様において、ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドおよび
対応するポリペプチドは、組換えの前に、誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ
）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によるランダム変異誘発に
供することによって、変更され得る。別の実施態様において、ニューロペプチド
レセプターの１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメント
などは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイ
ン、フラグメントなどと組換えられ得る。好ましい実施態様において、この異種
分子は、ニューロペプチドレセプターファミリーのメンバーである。さらに好ま
しい実施態様において、この異種分子は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧ
Ｆ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスホーミング増殖因子（Ｔ
ＧＦ）−α、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ
−β、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６
、ＢＭＰ−７、アクチビンＡおよびアクチビンＢ、デカペンタプレジック（ｄｅ
ｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２、ドーサリン（ｄ
ｏｒｓａｌｉｎ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、結節（ｎｏｄａｌ）、ＭＩＳ、イ
ンヒビン−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５、お
よび神経膠由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のような増殖因子である。
【０６８３】 他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性なニューロペプチドレセプター
フラグメントである。生物学的に活性なフラグメントは、ニューロペプチドレセ
プターポリぺプチドの活性に類似の活性を示すが、必ずしも同一ではないフラグ
メントである。このフラグメントの生物学的活性は、改善された所望の活性、ま
たは減少した所望されない活性を含み得る。
【０６８４】 さらに、本発明は、本発明のポリペプチドの作用を調節する化合物を同定する
ために化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイの例は
、哺乳動物線維芽細胞、本発明のポリペプチド、スクリーニングされるべき化合
物および３［Ｈ］チミジンを、線維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で合わ
せる工程を包含する。コントロールアッセイは、スクリーニングされるべき化合
物の非存在下で実施され得、そしてこの化合物の存在下での線維芽細胞の増殖の
量と比較して、各々の場合における３［Ｈ］チミジンの取り込みの決定によって
、この化合物が増殖を刺激するか否かを決定し得る。線維芽細胞の増殖の量は、
３［Ｈ］チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィ
ーによって測定される。アゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物の両方が
、この手順により同定され得る。
【０６８５】 別の方法において、本発明のポリペプチドに対するレセプターを発現する哺乳
動物細胞または膜調製物は、この化合物の存在下において標識化した本発明のポ
リペプチドとともにインキュベートされる。次いで、この化合物がこの相互作用
を増強またはブロックする能力が、測定され得る。あるいは、スクリーニングさ
れるべき化合物の相互作用に従う既知のセカンドメッセンジャー系の応答および
ニューロペプチドレセプターが測定され、そしてこの化合物がこのレセプターに
結合し、そしてセカンドメッセンジャー応答を誘発する能力を測定して、この化
合物が潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する。この
ようなセカンドメッセンジャー系には、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオン
チャネルまたはホスホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限定されな
い。
【０６８６】 これらの上記のアッセイの全ては、診断マーカーまたは予後マーカーとして使
用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、ニューロペプチドレ
セプター／分子を活性化または阻害することによって、疾患を処置、予防および
／または診断するか、あるいは患者に特定の結果（例えば、血管増殖）をもたら
すために使用され得る。さらに、アッセイは、適切に操作された細胞または組織
からのニューロペプチドレセプターの産生を阻害または増強し得る因子を発見し
得る。従って、本発明は、以下の工程を含むニューロペプチドレセプターに結合
する化合物を同定する方法を包含する：（ａ）候補結合化合物をニューロペプチ
ドレセプターとともにインキュベートする工程；および（ｂ）結合が生じたか否
かを決定する工程。さらに、本発明は、以下の工程を含むアゴニスト／アンタゴ
ニストを同定する方法を包含する：（ａ）候補化合物をニューロペプチドレセプ
ターとともにインキュベートする工程、（ｂ）生物学的活性をアッセイする工程
、および（ｂ）ニューロペプチドレセプターの生物学的活性が改変されているか
否かを決定する工程。
【０６８７】 また、図８および表Ｉに開示されるβプリーツシート領域を使用することによ
って、実験的にニューロペプチドレセプターを結合する分子を同定し得る。従っ
て、本発明の特定の実施形態は、図８／表Ｉに開示される各々のβプリーツシー
ト領域のアミノ酸配列を含むか、あるいは図８／表Ｉに開示される各々のβプリ
ーツシート領域のアミノ酸配列からなる、ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドに関する。本発明のさらなる実施形態は、図８／表Ｉに開示されるβプリ
ーツシート領域の任意の組合せもしくは全てを含むか、あるいは図８／表Ｉに開
示されるβプリーツシート領域の任意の組合せもしくは全てからなる、ニューロ
ペプチドレセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発
明のさらなる好ましい実施形態は、図８／表Ｉに開示されるβプリーツシート領
域の各々のニューロペプチドレセプターアミノ酸配列を含むか、あるいは図８／
表Ｉに開示されるβプリーツシート領域の各々のニューロペプチドレセプターア
ミノ酸配列からなる、ポリペプチドに関する。本発明のさらなる実施形態は、図
８／表Ｉに開示されるβプリーツシート領域の任意の組合せもしくは全てを含む
か、または図８および表Ｉに開示されるβプリーツシート領域の任意の組合せも
しくは全てからなる、ニューロペプチドレセプターポリペプチドに関する。
【０６８８】 （標的化された送達） 別の実施形態において、本発明は、組成物を、本発明のポリペプチドについて
のレセプターを発現する標的化細胞、または本発明のポリペプチドの細胞結合形
態を発現する細胞に送達する方法を提供する。
【０６８９】 本明細書中で議論される場合、本発明のポリペプチドまたは抗体は、異種ポリ
ペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグと、疎水性、親水性、イオン性お
よび／または共有結合性の相互作用を介して会合し得る。１つの実施形態におい
て、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合した本発明のポリペプチド（
抗体を含む）を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特異的な送達の
ための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治療タンパク質を標的化
細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核
酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）あるいは二本鎖核酸（例えば、細
胞のゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写さ
れ得る、ＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供する。
【０６９０】 別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会合
した本発明のポリペプチド（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体
）を投与することによる細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための
方法を提供する。
【０６９１】 「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクター系、放射性同位体、ホロ毒素
（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の
条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の
分子もしくは酵素を、結合および活性化する化合物を意味する。本発明の方法に
従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない
：当該分野で公知の放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性の細胞傷害性
エフェクター系を結合する化合物（例えば、抗体（またはその一部を含む補体固
定）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン、
アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモ
ルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヨウシュヤマゴボ
ウ抗ウイルスタンパク質、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素。「
細胞傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞傷害
性化合物へと変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用
され得る細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化剤の
グルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシ
ンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトア
ミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６９２】 （薬物スクリーニング） 本発明のポリペプチドの活性を改変する分子についてスクリーニングするため
の、本発明のポリペプチド、またはこれらのポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドの使用が、さらに意図される。このような方法は、本発明のポリペプチ
ドを、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性を有することが疑われる選択さ
れた化合物と接触させる工程、および結合に続いてこれらのポリペプチドの活性
をアッセイする工程を包含する。
【０６９３】 本発明は、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて、本発明のポリ
ペプチド、またはそれらの結合フラグメントを使用することによって治療用化合
物をスクリーニングするために特に有用である。このような試験に用いられるポ
リペプチドまたはフラグメントは、固体支持体に固定化され得、細胞表面上に発
現され得、溶液中で遊離であり得、または細胞内に局在化され得る。薬物スクリ
ーニングの１つの方法は、ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換え核
酸を用いて安定に形質転換される真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を利
用する。薬物は、競合結合アッセイにおいて、このような形質転換細胞に対して
スクリーニングされる。例えば、試験されている薬剤と本発明のポリペプチドと
の間の複合体の形成（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｎ）を測定し得る。
【０６９４】 従って、本発明は、本発明のポリペプチドによって媒介される活性に影響を及
ぼす薬物または任意の他の薬剤についてのスクリーニング方法を提供する。これ
らの方法は、当該分野で周知の方法によって、このような薬剤を本発明のポリペ
プチドもしくはそのフラグメントと接触させる工程、およびこの薬剤とこのポリ
ペプチドもしくはそのフラグメントとの間の複合体の存在についてアッセイする
工程を包含する。このような競合結合アッセイにおいて、スクリーニングされる
薬剤は、代表的に、標識化される。インキュベーション後に、遊離の薬剤は、結
合形態中に存在する薬剤から分離され、そして遊離または複合体化されていない
標識の量は、特定の薬剤が本発明のポリペプチドに結合する能力の尺度である。
【０６９５】 薬物スクリーニングについての別の技術は、本発明のポリペプチドに対する適
切な結合親和性を有する化合物に対するハイスループットスクリーニングを提供
し、そして欧州特許出願８４／０３５６４（１９８４年９月１３日公開）（これ
は、本明細書中で参考として援用される）に非常に詳細に記載される。簡潔にい
うと、大量の異なる小さなペプチド試験化合物は、固体基材（例えば、プラスチ
ックピンまたはいくつかの他の表面）上で合成される。ペプチド試験化合物を、
本発明のポリペプチドと反応させ、そして洗浄する。次いで、結合したポリペプ
チドは、当該分野で周知の方法によって検出される。精製されたポリペプチドは
、前述の薬物スクリーニング技術での使用のためにプレート上に直接コーディン
グされる。さらに、非中和抗体を使用して、このペプチドを捕捉し得、そして固
体支持体上にそれを固定し得る。
【０６９６】 本発明はまた、競合薬物スクリーニングアッセイの使用を意図し、ここで、本
発明のポリペプチドを結合し得る中和抗体は、ポリペプチドまたはそのフラグメ
ントに対する結合について試験化合物と特異的に競合する。この様式において、
抗体を使用して、本発明のポリペプチドと１つ以上の抗原性エピトープを共有す
る任意のペプチドの存在を検出する。
【０６９７】 （ニューロペプチドレセプター結合ペプチドおよび他の分子） 本発明はまた、ニューロペプチドレセプターに結合するポリペプチドおよび非
ポリペプチドを同定するためのスクリーニング方法、ならびにそれによって同定
されたニューロペプチドレセプターに結合する分子を含む。これらの結合分子は
、例えば、ニューロペプチドレセプタータンパク質のアゴニストおよびアンタゴ
ニストとして有用である。そのようなアゴニストおよびアンタゴニストは、本発
明に従って、以下に詳細に記載される治療実施形態において使用され得る。
【０６９８】 この方法は、以下の工程を包含する： ａ．ニューロペプチドレセプタータンパク質またはニューロペプチドレセプタ
ー様タンパク質を複数の分子と接触させる工程；および ｂ．ニューロペプチドレセプタータンパク質またはニューロペプチドレセプタ
ー様タンパク質に結合する分子を同定する工程。
【０６９９】 ニューロペプチドレセプタータンパク質またはニューロペプチドレセプター様
タンパク質を複数の分子と接触させる工程は、多数の方法によってもたらされ得
る。例えば、当業者は、ニューロペプチドレセプタータンパク質またはニューロ
ペプチドレセプター様タンパク質を固体支持体上に固定化させ、そして複数の分
子の溶液を固定したニューロペプチドレセプタータンパク質またはニューロペプ
チドレセプター様タンパク質と接触させることを考え得る。このような手順は、
固定したニューロペプチドレセプタータンパク質またはニューロペプチドレセプ
ター様タンパク質から構成される親和性マトリックスを用いるアフィニティーク
ロマトグラフィープロセスに類似している。次いで、ニューロペプチドレセプタ
ータンパク質またはニューロペプチドレセプター様タンパク質に対して選択的な
親和性を有する分子が、親和性選択によって精製され得る。固体支持体の性質、
ニューロペプチドレセプタータンパク質またはニューロペプチドレセプター様タ
ンパク質のこの固体支持体への付着に関するプロセス、溶媒、および親和性単離
または親和性選択の条件は、大部分が慣用的であり、そして当業者に周知である
。
【０７００】 あるいは、複数のポリペプチドはまた、ポリペプチドのサブセットまたは個々
のポリペプチドを含む実質的に別々の分画へ分離され得る。例えば、複数のポリ
ペプチドは、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィーなどポリペプチドの分離
に関して当業者に公知の方法によって、分離され得る。個々のポリペプチドはま
た、宿主細胞の外部表面上またはほぼ外部表面に発現されるような様式で、形質
転換された宿主細胞（例えば、組換えファージ）によって産生され得る。次いで
、個々の単離物は、ニューロペプチドレセプタータンパク質またはニューロペプ
チドレセプター様タンパク質によって「プローブ化」され得、必要に応じて発現
に必要とされるであろうインデューサーの存在下で、ニューロペプチドレセプタ
ータンパク質またはニューロペプチドレセプター様タンパク質と個々のクローン
との間で任意の選択的親和性相互作用が起こったか否かが決定される。ニューロ
ペプチドレセプタータンパク質またはニューロペプチドレセプター様タンパク質
を個々のポリペプチドを含む各分画と接触させる前に、これらのポリペプチドは
まず、さらなる簡便性のために固体支持体に移され得る。そのような固体支持体
は、単に、例えばニトロセルロースまたはナイロンでできたフィルター膜の断片
であり得る。この様式において、陽性クローンは、形質転換宿主細胞の発現ライ
ブラリーの集団（これらは、ニューロペプチドレセプタータンパク質またはニュ
ーロペプチドレセプター様タンパク質に対して選択的親和性を有するポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ構築物を持つ）から同定され得る。さらに、ニューロペプ
チドレセプタータンパク質またはニューロペプチドレセプター様タンパク質に対
して選択的親和性を有するポリペプチドのアミノ酸配列が、従来の手段によって
直接決定され得るか、またはこのポリペプチドをコードするＤＮＡのコード配列
が、頻繁により簡便に決定され得る。次いで、一次配列が、対応するＤＮＡ配列
から推定され得る。アミノ酸配列がポリペプチド自身から決定されるものである
場合、微小配列決定技術を使用し得る。この配列決定技術は、質量分析法を含み
得る。
【０７０１】 特定の状況において、選択的親和性相互作用の存在を決定または検出しようと
試みる前に、未結合のニューロペプチドレセプタータンパク質またはニューロペ
プチドレセプター様タンパク質あるいは未結合ポリペプチドのいずれかを、ニュ
ーロペプチドレセプタータンパク質またはニューロペプチドレセプター様タンパ
ク質および複数のポリペプチドの混合物から洗浄除去することが望ましくあり得
る。このような洗浄工程は、ニューロペプチドレセプタータンパク質またはニュ
ーロペプチドレセプター様タンパク質または複数のポリペプチドが固体支持体に
結合している場合に、特に望ましくあり得る。
【０７０２】 本方法に従って提供される複数の分子は、多様性ライブラリー（例えば、ニュ
ーロペプチドレセプターへ特異的に結合する分子をスクリーニングし得る無作為
またはコンビナトリアルの、ペプチドライブラリーまたは非ペプチドライブラリ
ー）として提供され得る。使用され得る多くのライブラリー（例えば、化学合成
ライブラリー、組換えライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリ
ー）、およびインビトロ翻訳ベースのライブラリー）が、当該分野で公知である
。化学合成ライブラリーの例は、以下に記載される：Ｆｏｄｏｒら、１９９１、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９１、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６；Ｌａｍら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３５４
：８２−８４；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ、１９９４、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１２：７０９−７１０；Ｇａｌｌｏｐら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７（９）：１２３３−１２５１；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら、
１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０９２２
−１０９２６；Ｅｒｂら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９２，Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、１９９
４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１６１４−１６１
８；Ｓａｌｍｏｎら、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９０：１１７０８−１１７１２；ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２０２４２；ならび
にＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５３８１−５３８３。
【０７０３】 ファージディスプレイライブラリーの例は、以下に記載される：Ｓｃｏｔｔお
よびＳｍｉｔｈ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖ
ｌｉｎら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：４０４−４０６；Ｃｈｒｉｓｔ
ｉａｎ，Ｒ．Ｂ．ら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１−７１
８）；Ｌｅｎｓｔｒａ、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：１
４９−１５７；Ｋａｙら、１９９３、Ｇｅｎｅ １２８：５９−６５；ならびに
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１８（１９９４年８月１８日）。
【０７０４】 インビトロ翻訳ベースのライブラリーとしては、以下：ＰＣＴ公開番号ＷＯ９
１／０５０５８（１９９１年４月１８日）；およびＭａｔｔｈｅａｋｉｓら、１
９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９０２２−９
０２６に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７０５】 非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば
、Ｂｕｎｉｎら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９１：４７０８−４７１２を参照のこと）が、使用のために適応され得る。ペプ
トイドライブラリー（Ｓｉｍｏｎら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３６７−９３７１）がまた使用され得る。使用され
得るライブラリーの別の例は、Ｏｓｔｒｅｓｈら（１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１１３８−１１１４２）によって記載
され、ここでは、ペプチド中のアミド官能基が、過剰にメチル化（ｐｅｒｍｅｔ
ｈｙｌａｔｅ）されて、化学的に形質転換されたコンビナトリアルライブラリー
を生成する。
【０７０６】 本発明において有用である種々の非ペプチドライブラリーは、大きい。例えば
、ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ（１９９５，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１３：３５１−３６０）は、種々のライブラリーの基礎を形成する化学種の間と
して、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ピペラジンジオン、ビフェニル、糖ア
ナログ、β−メルカプトケトン、アリール酢酸、アシルピペラジン、ベンゾピラ
ン、キューバン（ｃｕｂａｎｅ）、キサンチン、アミンイミドおよびオキサゾロ
ンを列挙している。
【０７０７】 非ペプチドライブラリーは、２つの型に多きく分類され得る：修飾されたモノ
マーおよびオリゴマー。修飾モノマーライブラリーは、比較的単純な骨格構造を
使用し、この上に種々の官能基が付加される。しばしば、骨格は、既知の有用な
薬理学的活性を有する分子である。例えば、骨格は、ベンゾジアゼピン構造であ
り得る。
【０７０８】 非ペプチドオリゴマーライブラリーは、モノマーの順序に依存して新規な形状
を作製する様式で共にアセンブルされる、多数のモノマーを使用する。使用され
るモノマー単位の間には、カルバメート、ピロリノン（ｐｙｒｒｏｌｉｎｏｎｅ
）およびモルホリノがある。ペプトイド（側鎖がα炭素よりもαアミノ基に結合
するペプチド様オリゴマー）は、非ペプチドオリゴマーライブラリーの別のバー
ジョンの基礎を形成する。最初の非ペプチドオリゴマーライブラリーは、単一型
のモノマーを使用し、従って、反復骨格を含む。近年のライブラリーは、１つよ
り多くのモノマーを使用し、自由度が添加されたライブラリーを与える。
【０７０９】 ライブラリーをスクリーニングすることは、多様な一般的に公知の方法のいず
れかによって達成され得る。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを
開示する以下の参考文献：ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ、１９８９、Ａｄｖ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５−２１８；ＳｃｏｔｔおよびＳｍ
ｉｔｈ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓ
ら、１９９２；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７；Ｏｌｄｅ
ｎｂｕｒｇら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
９：５３９３−５３９７；Ｙｕら、１９９４、Ｃｅｌｌ ７６：９３３−９４５
；Ｓｔａｕｄｔら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５７７−５８０；Ｂｏ
ｃｋら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋら、１
９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６９８８−６
９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８５０−８
５２；米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号、お
よび米国特許第５，１９８，３４６号（全てＬａｄｎｅｒらに対して）；Ｒｅｂ
ａｒおよびＰａｂｏ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３；な
らびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１８を参照のこと。
【０７１０】 特定の実施形態において、本発明のポリペプチドを結合する分子を同定するた
めのスクリーニングは、ライブラリーのメンバーを固相に固定化された本発明の
ポリペプチドと接触させ、そしてニューロペプチドレセプタータンパク質または
ニューロペプチドレセプター様タンパク質に結合するこれらのライブラリーメン
バーを収集することによって実行され得る。そのようなスクリーニング方法の例
の、「パニング」と呼ばれる技術は、例として、ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔ
ｈ，１９８８，Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８；Ｆｏｗｌｋｅｓら、１９９２
，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９
４／１８３１８；ならびにその中に引用される参考文献に記載される。
【０７１１】 別の実施形態において、酵母中の相互作用タンパク質を選択するためのツーハ
イブリッドシステム（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ
３４０：２４５−２４６；Ｃｈｉｅｎら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：９５７８−９５８２）が、ニューロペプチドレセ
プタータンパク質またはニューロペプチドレセプター様タンパク質に特異的に結
合する分子を同定するために使用され得る。
【０７１２】 ニューロペプチドレセプター結合分子がポリペプチドである場合、このポリペ
プチドは、任意のペプチドライブラリー（ランダムペプチドライブラリー、コン
ビナトリアルペプチドライブラリー、またはバイアスペプチドライブラリーを含
む）から簡便に選択され得る。用語「バイアス（ｂｉａｓｅｄ）」は、この場合
のペプチドにおいて、ライブラリーを作製する方法が、生じる分子収集の多様性
を支配する１つ以上のパラメーターを制限するように操作されることを意味する
ために本明細書中に使用される。
【０７１３】 従って、本当にランダムなペプチドライブラリーは、ペプチドの所定の位置に
特定のアミノ酸を見出す可能性が全て２０のアミノ酸に関して同じである、ペプ
チドの収集物を作製する。しかし、例えば、リジンが５番目のアミノ酸毎に生じ
ることを特定するかまたはデカペプチドライブラリーの４位、８位および９位が
アルギニンのみを含むように固定して特定することによって、バイアスがライブ
ラリーに導入され得る。ライブラリー中へ導入され得る。明らかに、バイアスの
多くの型は、意図され得、そして本発明は、任意の特定のバイアスに制限されな
い。さらに、本発明は、特定の型のペプチドライブラリー（例えば、ファージデ
ィスプレイペプチドライブラリーおよびＤＮＡ挿入物と共にλファージベクター
を含むＤＮＡ構築物を使用するライブラリー）を意図する。
【０７１４】 上記のように、本発明のポリペプチドを結合する分子（ポリペプチドである）
の場合、このポリペプチドは、約６から約６０より少ないアミノ酸残基を有し、
好ましくは約６〜約１０アミノ酸残基、そしてより好ましくは約６〜約２２アミ
ノ酸であり得る。別の実施形態において、ニューロペプチドレセプターに結合す
るポリペプチドは、１５〜１００の範囲のアミノ酸、または２０〜５０の範囲の
アミノ酸を有する。
【０７１５】 選択された神経レセプターに結合するポリペプチドは、化学合成または組換え
発現によって得られ得る。
【０７１６】 （アンチセンスおよびリボザイム（アンタゴニスト）） 特定の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、配列番号１に含ま
れる配列またはその相補鎖に対応する核酸および／もしくは寄託されたクローン
９７１２８に含まれるヌクレオチド配列に対応する核酸である。１つの実施形態
において、アンチセンス配列は、生物により内部で生成され、別の実施形態にお
いて、アンチセンス配列は別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｎｅ
ｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）を参照のこと）。Ｏｌｉｇｏｄｅｏ
ｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）。アンチセンス技術を使用して、アンチセンスＤ
ＮＡもしくはＲＮＡを通してか、または３重らせんの形成を通して遺伝子発現を
制御し得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅ
ｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８
）に考察される。３重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ、２５１：１３００（１９９１）において考察される。これらの方法は、相
補的なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。
【０７１７】 例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コー
ド部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域
に相補的であるように設計され、それにより転写およびレセプターの産生を阻害
する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブ
リダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロック
する。
【０７１８】 １つの実施形態において、本発明のニューロペプチドレセプターアンチセンス
核酸は、外来の配列からの転写により細胞内で産生される。例えば、ベクターま
たはその一部が転写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。こ
のようなベクターは、本発明のアンチセンス核酸をコードする配列を含む。この
ようなベクターは、それが転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生し得る限
り、エピソームを保持し得るか、または染色体に組込まれ得る。このようなベク
ターは、当該分野において標準的な組換えＤＮＡ技術方法により構築され得る。
ベクターは、脊椎動物細胞において複製および発現のために使用される、当該分
野で公知のプラスミド、ウイルスなどであり得る。本発明のポリペプチドをコー
ドする配列またはそのフラグメントの発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞に
おいて作用する、当該分野で公知の任意のプロモーターにより得る。そのような
プロモーターは、誘導性または構成性であり得る。このようなプロモーターは、
ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａ
ｔｕｒｅ、２９：３０４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長
末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８
７−７９７（１９８０））、ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４
５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、
Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９−４２（１９８２））などが挙げられるが、これら
に限定されない。
【０７１９】 本発明のアンチセンス核酸は、少なくともニューロペプチドレセプターの遺伝
子のＲＮＡ転写物の一部に相補的な配列を含む。しかし、完全に相補的であるこ
とは好ましいが、必要ではない。本明細書中で言及される「少なくともＲＮＡの
一部に相補的な」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分な相補性を有し
、安定な二重鎖を形成する配列を意味し；従って、本発明の二本鎖アンチセンス
核酸の場合において、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が試験され得るか、または三重鎖形
成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチ
センス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長い
ほど、本発明のＲＮＡ配列とのより多くの塩基ミスマッチを含み得、これは、安
定な二重鎖（または三重鎖の場合もあり得る）を含み得、そしてなおその安定な
二重鎖を形成し得る。当業者は、ハイブリダイズ複合体の融点を決定するために
標準的な手順を使用することによりミスマッチの許容の程度を確認し得る。
【０７２０】 メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開
始コドンまででかつＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害の
際に最も効率的に働くべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的
な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示された。一
般的に、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３
３５を参照のこと。従って、図１〜３に示されるニューロペプチドレセプターの
５’−または３’−の非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオ
チドは、内因性ニューロペプチドレセプターｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセ
ンスアプローチに使用され得る。ニューロペプチドレセプターｍＲＮＡの５’非
翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補物を含むべ
きである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
翻訳のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明に従って使用され得る
。ｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域にハイブリダイズするように
設計されるか否かにかかわらず、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチ
ド長であるべきであり、そして好ましくは６〜約５０ヌクレオチド長にわたるオ
リゴヌクレオチドである。特定の局面において、このオリゴヌクレオチドは、少
なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌク
レオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０７２１】 本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、またはキメラ混合物
、あるいはそれらの誘導体もしくは改変バージョン、一本鎖、または二本鎖であ
り得る。このオリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で改
変されて、例えば、分子の安定性、ハイブリダーゼーションなどを改善し得る。
このオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビボに
おいて宿主細胞レセプターを標的化するために）、または細胞膜を通した輸送を
促進する因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔ
ｒｅら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−
６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）
を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１
３４（１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘
引切断剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｃｌｅａｖａｇ
ｅ ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｋｒｏｌら、（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ、６：９５８−９７６を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば
、Ｚｏｎ，（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと
）を含み得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、
ペプチド、ハイブリダーゼーション誘引架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーショ
ン誘引切断剤など）に結合体化され得る。
【０７２２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された塩基部分を
含み得、この塩基部分は、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される
：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨー
ドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カル
ボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２
−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシ
ル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデ
ニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、
２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシ
トシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシ
ル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュー
オシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２
−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ
）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キュ
ーオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシ
ル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチル
エステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、
３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）
ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【０７２３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下を含むがそれらに限定されない
群から選択される少なくとも１つの改変された糖部分を含み得る：アラビノース
、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。
【０７２４】 さらなる別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を
含むがそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変されたリン
酸骨格を含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチ
オエート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロ
ジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホル
ムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）またはそれらのアナログ。
【０７２５】 さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ−アノ
マーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的な
ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のｂ−ユニットとは反対に
、その鎖は互いに平行にする（Ｇａｕｔｉｅｒら、（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオチドは、
２−０−メチルリボヌクレオチドであるか（Ｉｎｏｕｅら、（１９８７）Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ
−ＤＮＡアナログである（Ｉｎｏｕｅら、（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２
１５：３２７−３３０）。
【０７２６】 本発明のポリヌクレオチドは当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動Ｄ
ＮＡ合成機により（このような装置はＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されている）の使用により）合成され得る。例
えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（（１９
８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：３２０９）により合成され得、
メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、コントロールドポアガラス（ｃｏｎ
ｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）ポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：７４４８−７４５１
（１９８８））などの使用により調製され得る。
【０７２７】 本発明のコード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが、使用され得
るが、転写された非翻訳領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好まし
い。
【０７２８】 本発明による潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４
日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９
９０）を参照のこと）。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを
使用して、本発明のポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡを破壊し得るが、ハン
マーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標
的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域により決定される位置で、ｍＲ
ＮＡを切断する。たった１つの必要条件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基配
列を有することである：５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッド型リボザイムの構築
および生成は当該分野で周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａ
ｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５−５９１（１９８８）により十分に記載さ
れる。配列表に開示された各ヌクレオチド配列内に多くの潜在的なハンマーヘッ
ド型リボザイム切断部位が存在する（図１〜３）。好ましくは、このリボザイム
は、切断認識部位がニューロペプチドレセプターｍＲＮＡの５’末端付近に位置
するように；すなわち、効率を増大し、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内
蓄積を最小化するように、操作される。
【０７２９】 アンチセンスアプローチの場合、本発明のリボザイムは、改変されたオリゴヌ
クレオチド（例えば、安定性、標的化などについて改良された）から構成され得
、そしてインビボにおいて本発明のポリヌクレオチドを発現する細胞に送達され
るべきである。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするア
ンチセンスの導入のための上記と同じ様式において細胞中に導入され得る。送達
の好ましい方法は、強力な構成性プロモーター（例えば、ｐｏｌ ＩＩＩまたは
ｐｌ ＩＩプロモーターのような）の制御下で、リボザイムを「コードする」Ｄ
ＮＡ構築物を使用することを含み、その結果トランスフェクトした細胞が内因性
ニューロペプチドレセプターメッセージを破壊し、そして翻訳を阻害するに十分
な量のリボザイムを生成する。リボザイムはアンチセンス分子と異なり触媒性で
あるので、より低い細胞内濃度が効率のために必要とされる。
【０７３０】 アンタゴニスト／アゴニスト化合物を利用して、腫瘍性の細胞および組織に対
する本発明のポリペプチドの細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉ
ｆｅｒａｔｉｏｎ）効果を阻害し得る。すなわち、腫瘍のアゴニストを刺激し、
それにより異常な細胞成長および増殖を（例えば、腫瘍形成または増殖において
）遅延または防止する。
【０７３１】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、血管過多の疾患を阻害し得、そ
して水晶体嚢外白内障（ｅｘｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ ｃａｔａｒａｃｔ）手術
後の上皮レンズ細胞の増殖を防止する。本発明のポリペプチドのマイトジェン活
性の防止はまた、例えば、バルーン血管形成術後の再狭窄のような場合に要求さ
れ得る。
【０７３２】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、創傷治癒の間の瘢痕組織の増殖
防止し得る。
【０７３３】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、本明細書中に記載される疾患を
処置し得る。
【０７３４】 （他の活性） 本発明のポリペプチドは、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、種
々の疾患状態（例えば、血栓症、動脈硬化、および他の心臓血管の状態）に起因
する虚血組織の血管再生を刺激するための処置において利用され得る。これらの
ポリペプチドをまた利用して、上記で議論されるように新脈管形成および肢の再
形成を刺激し得る。
【０７３５】 このポリペプチドを、傷害、火傷、手術後組織修復、および瘢痕に起因する創
傷の処置にもまた利用し得る。なぜなら、それらは異なる起源の種々の細胞（例
えば、線維芽細胞および骨格筋細胞）に対してマイトジェン性であり、それゆえ
ダメージを受けた組織または疾患組織の修復または置換を促進するからである。
【０７３６】 本発明のポリペプチドはまた、ニューロンの成長を刺激し、そして特定のニュ
ーロンの障害または神経変性状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病
、およびＡＩＤＳ関連合併症）において生じるニューロンの損傷を処置および予
防するために用いられ得る。ニューロペプチドレセプターは、軟骨細胞増殖を刺
激する能力を有し得、それゆえ、骨および歯周の再形成を増強し、そして組織移
植片または骨の移植片における補助のために利用され得る。
【０７３７】 本発明のポリペプチドをまた利用して、ケラチノサイト増殖を刺激することに
より、日焼けに起因する皮膚の老化を予防し得る。
【０７３８】 本発明のポリペプチドをまた、抜け毛を予防するために利用し得る。なぜなら
、ＦＧＦファミリーのメンバーは、髪形成細胞を活性化し、そしてメラノサイト
増殖を促進するからである。同じ系列にそって、本発明のポリペプチドを利用し
て、他のサイトカインと組み合わせて使用した場合、造血細胞および骨髄細胞の
増殖および分化を刺激し得る。
【０７３９】 ニューロペプチドレセプターのポリペプチドをまた利用して、移植前の器官を
維持し得るか、または始原組織の細胞培養を支持するために使用し得る。
【０７４０】 本発明のポリペプチドはまた、初期胚における分化のための中胚葉起源の組織
を誘導するために利用され得る。
【０７４１】 ニューロペプチドレセプターのポリペプチドもしくはニューロペプチドレセプ
ターのポリヌクレオチドまたはアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、先に
議論されるように造血系統に加えて、胚性幹細胞の分化もしくは増殖を増加また
は減少し得る。
【０７４２】 ニューロペプチドレセプターのポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたは
ニューロペプチドレセプターのアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、哺乳
動物の特徴（例えば、身長、体重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪組織の割合、色
素沈着、大きさ、および形（例えば、美容外科））を調節するために使用され得
る。同様に、ニューロペプチドレセプターのポリペプチドもしくはポリヌクレオ
チドまたはニューロペプチドレセプターのアゴニストもしくはアンタゴニストは
、異化作用、同化作用、プロセシング、利用、およびエネルギーの貯蔵に影響を
及ぼす哺乳動物の代謝を調節するために使用され得る。
【０７４３】 ニューロペプチドレセプターのポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたは
ニューロペプチドレセプターのアゴニストもしくはアンタゴニストは、バイオリ
ズム、カリカディック（ｃａｒｉｃａｄｉｃ）リズム、うつ病（抑うつ性の障害
を含む）、暴力の傾向、痛みへの耐性、生殖能力（好ましくは、アクチビンまた
はインヒビン様活性によって）、ホルモンレベルもしくは内分泌レベル、食欲、
性欲、記憶、ストレス、または他の認知の質に影響を及ぼすことによって、哺乳
動物の精神状態または身体状態を変更するために使用され得る。
【０７４４】 ニューロペプチドレセプターのポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたは
ニューロペプチドレセプターのアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、ヒト
および他の動物におけるナルコレプシーおよび／または他の睡眠障害を処置する
ために使用され得る。
【０７４５】 ニューロペプチドレセプターのポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたは
ニューロペプチドレセプターのアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、骨粗
鬆症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｅｓｉｓ）、過食症、急性心不全、ぜん息、アレルギー
、良性前立腺肥大、変形性関節症、神経ダメージ、疼痛、麻痺および顔面神経麻
痺を処置するために使用され得る。
【０７４６】 ニューロペプチドレセプターのポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたは
ニューロペプチドレセプターのアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、例え
ば、貯蔵能力、脂肪含有量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル
、補因子、または他の栄養成分を増加または減少させるような食品添加物または
保存剤として使用され得る。
【０７４７】 本発明のニューロペプチドレセプターポリペプチドの活性を阻害する化合物は
、高血圧症を処置および／または阻害するために使用され得る。なぜなら、ニュ
ーロペプチドＹは、レニンの放出を刺激し、そしてニューロペプチドＹは、環状
血管（ｖｅｓｓｅｌ）および大脳血管にふくまれる場合、潜在的な血管拡張活性
を有することが公知であるからである。
【０７４８】 この化合物はまた、アルツハイマー病を処置するために使用され得る。なぜな
らば、ニューロペプチドＹレセプターは、中枢神経系において有効であり、そし
てこれは、介在ニューロン内に主に位置し、そこでは、ニューロペプチドＹレセ
プターは、記憶およびアルツハイマー病において調節的な役割を有するようであ
るからである。
【０７４９】 この化合物はまた、海馬においてニューロペプチドＹによる興奮性伝達を抑制
するために使用され得、従って、てんかん発作、ストレスおよび不安を処置する
ために使用され得る。
【０７５０】 中枢神経系におけるニューロペプチドＹレセプターの有病率は、本発明のニュ
ーロペプチドレセプターポリペプチドを阻害する化合物が、神経伝達を調節する
ことにより高神経病薬として使用され得ることを示す。
【０７５１】 本発明のレセプターポリペプチドを阻害する化合物はまた、環状血管および大
脳血管を含む病理学的血管痙攣を処置するために使用され得る。
【０７５２】 本発明はまた、本発明のニューロペプチドレセプターに結合し得ることが公知
ではないリガンドが、ニューロペプチドレセプターに結合するか否かを決定する
ために方法を提供し、この方法は、同定されるリガンドとニューロペプチドレセ
プターのコード配列を含む細胞とを接触させる工程、ならびにこのようなレセプ
ターに結合すると事前に同定されたリガンドの結合に十分な条件下で、その細胞
表面上にニューロペプチドレセプターを発現させる工程を包含する。他の実施形
態においては、このレセプターまたは単離されたレセプターを含む細胞膜画分は
、遊離しているか、または試験されるリガンドの結合を測定するために使用され
得る固体支持体上に固定されている。組換え細胞が、そのレセプターの発現の目
的のたえに使用される場合、わずかしかまたは全く内在性レセプター活性を有さ
ない細胞を使用するこをが好ましく、その結果、結合が、もしあるならば、発現
された目的のレセプターの存在に起因する。好ましい細胞としては、ヒト胚腎細
胞、サル腎臓（ＨＥＫ−２９３細胞）、線維芽細胞（ＣＯＳ）、チャイニーズハ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａまたはマウスのＬ−細胞が
挙げられる。宿主細胞として、レセプター応答性二次メッセンジャー系が存在す
る細胞を使用することも好ましい。周知の二次メッセンジャー系としては、細胞
外レセプタードメインへのリガンド結合に応答した、ホスホイノシチド加水分解
、アデニルシクラーゼシクラーゼ、グアニレートシクラーゼまたはイオンチャネ
ル活性の増加または減少が挙げられる。さらなる実施形態では、レセプター結合
の特別に設計された指標が、構築され得る。例えば、融合タンパク質は、本発明
のレセプターと、リガンドが結合しているレセプターに対して感受性であるタン
パク質ドメインとを融合することにより作製され得る。本明細書では、このよう
なドメインは、それ自体またはアクセサリー分子と共に、レセプターリガンド結
合を示す分析的に検出可能なシグナルまたはレセプターリガンド結合を生成し得
る指標ドメインといわれる。
【０７５３】 本発明はまた、このレセプターをコードするｍＲＮＡの存在を検出することに
より細胞の表面上の本発明のニューロペプチドレセプターポリメラーゼの発現を
検出する方法を提供し、この方法は、細胞から全ｍＲＮＡを得る工程、およびこ
のようにして得られたｍＲＮＡと、核酸分子プローブにハイブリダイズしたｍＲ
ＮＡの存在を検出し、これによりこの細胞によるレセプターの発現を検出するハ
イブリダイジング条件下でこのレセプターをコードする核酸分子の配列内に含ま
れる配列と特異的にハイブリダイズし得る少なくとも１０個のヌクレオチドの核
酸分子を含む核酸分子プローブとを接触させる工程を包含する。
【０７５４】 本発明はまた、本発明のニューロペプチドレセプターポリペプチドに関連する
レセプターを同定するための方法を提供する。これらの関連するレセプターは、
本発明のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドに対する相同性によるか
、低ストリンジェンシー交差ハイブリダイゼーションによるか、または関連の天
然リガンドまたは合成リガンドと相互作用するか、または本発明のニューロペプ
チドレセプターポリペプチドの遺伝的遮断または薬学的遮断の後に同様の挙動を
誘起するレセプターを同定することにより、同定され得る。
【０７５５】 この遺伝子のフラグメントはまた、本発明の遺伝子に対して高い配列類似性を
有するか、または類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するための、ｃ
ＤＮＡライブラリーについてのハイブリダイゼーションプローブとして使用され
得る。このタイプのプローブは、好ましくは５０塩基以上を有する。このプロー
ブはまた、全長転写物およびゲノムクローンに対応するｃＤＮＡクローンを同定
するために使用され得るか、または調節領域およびプロモーター領域、エキソン
およびイントロンを含む本発明の完全遺伝子を含むゲノムクローンを同定するた
めに使用される。このタイプのスクリーニングの一例は、オリゴヌクレオチドプ
ローブを合成するために、公知のＤＮＡ配列を使用することにより、遺伝子のコ
ード領域を単離することを含む。本発明の遺伝子のオリゴヌクレオチドに相補的
な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドは、ライブラリーのいずれのメンバー
がこのポリペプチドがハイブリダイズするのかを決定するために、ヒトｃＤＮＡ
、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするために使用
される。
【０７５６】 本発明のレセプターに結合しそして活性化するかまたはその活性を阻害する、
可溶性ニューロペプチドレセプターポリペプチドおよび化合物はまた、適切な薬
学的キャリアと組み合わせて使用され得る。このような組成物は、治療有効量の
可溶性ニューロペプチドレセプターポリペプチドまたは化合物、および薬学的に
受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食
塩水、緩衝化生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノールおよびそれ
らの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方物は、投与の様式
に適合すべきである。
【０７５７】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１以上の成分で充填された１以上の容
器を含む、薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的産物の
製造、使用または販売を規制する行政機関により支持される通知が、このような
容器に貼りつけられ得、この通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の
業者による承認を反映する。さらに、本発明の可溶性ニューロペプチドレセプタ
ーポリペプチドまたは化合物は、他の治療化合物と共に使用され得る。
【０７５８】 薬学的組成物は、例えば、局所経路、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、
皮下経路、経鼻経路、または皮内経路により従来様式で投与され得る。薬学的組
成物は、特定の指標の処置および／または予防の有効な量で投与される。一般に
、薬学的組成物は、少なくとも約１０ｇ／ｋｇ体重の量で投与され、そしてほと
んどの場合、これらは、１日あたり約８ｍｇ／Ｋｇ体重を超えない量で投与され
る。ほとんどの場合、投与量は、投与経路、症状などを考慮して、毎日約１０ｇ
／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０７５９】 本発明はまた、例えば、遺伝された欠損遺伝子から生じるいくつかの疾患を診
断する場合の本発明の遺伝子の使用を意図する。これらの遺伝子は、欠損遺伝子
の配列を正常な遺伝子の配列と比較することにより決定され得る。引き続き、「
変異」遺伝子が異常なレセプター活性と関連することを確認し得る。さらに、変
異を確認または同定するためのなお別の手段として、機能アッセイシステム（例
えば、ＨＥＫ２９３細胞のレセプター欠損株における、比色アッセイ、ＭａｃＣ
ｏｎｋｅｙプレート上での発現、相補性実験）における発現のための適切なベク
ター中へ変異レセプター遺伝子を挿入し得る。一旦、「変異」遺伝子が同定され
ると、次いで、「変異」レセプター遺伝子のキャリアについて集団をスクリーニ
ングし得る。
【０７６０】 本発明の遺伝子に変異を有する個体は、種々の技術によってＤＮＡレベルで検
出され得る。診断に使用される核酸は、例えば、血液、尿、唾液、組織生検およ
び剖検材料が挙げられるがこれらに限定されない、患者の細胞から得られ得る。
ゲノムＤＮＡが、検出のために直接使用され得るか、または、分析の前に、ＰＣ
Ｒ（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３２４：１６３−１６６（１９８６））を用
いて酵素的に増幅され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、同じ目的に使用され
得る。例として、この発明の核酸に相補的なＰＣＲプライマーが、本発明の遺伝
子における変異を同定および分析するために使用され得る。例えば、欠失および
挿入が、正常遺伝子型との比較での増幅産物の大きさの変化によって検出され得
る。点変異は、増幅ＤＮＡを、放射標識ＲＮＡと、あるいは本発明の放射標識ア
ンチセンスＤＮＡ配列とハイブリダイズさせることによって同定され得る。完全
にマッチした配列は、ＲＮａｓｅ Ａ消化または融解温度差によって、ミスマッ
チ二重鎖から区別され得る。このような診断は、特に、出生前テストにおいてま
たは新生児テストにおいてさえも有用である。
【０７６１】 参照遺伝子と「変異体」との間の配列の相違は、直接ＤＮＡ配列決定法によっ
て明らかにされ得る。さらに、クローン化ＤＮＡセグメントが、特定ＤＮＡセグ
メントを検出するためのプローブとして使用され得る。この方法の感度は、ＰＣ
Ｒと組み合わされたときに大きく増強される。例えば、配列決定プライマーは、
二本鎖ＰＣＲ産物または改変ＰＣＲ産物によって生成された一本鎖鋳型分子と共
に使用される。配列決定は、放射標識ヌクレオチドを使用した従来の手順、また
は蛍光タグを使用した自動配列決定手順によって実施される。
【０７６２】 ＤＮＡ配列差異に基づく遺伝子試験は、変性剤を用いるかまたは用いないゲル
中のＤＮＡフラグメントの電気泳動的移動性における変更の検出により達成され
得る。特定の位置での配列の変化は、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮ
ａｓｅおよびＳ１保護または化学切断法（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ， ８５：４３９７−４４０１ （１９８５）））によって明らかにされ得る。
【０７６３】 さらに、いくつかの疾患が、ｍＲＮＡにおける変化により検出され得る結果で
あるか、またはその遺伝子発現における変化により特徴付けられる。あるいは、
本発明の遺伝子は、このタイプのレセプターに結合する機能の減少を示す個体を
同定するための参照として使用され得る。
【０７６４】 本発明はまた、種々の組織のおける本発明のニューロペプチドレセプターポリ
メラーゼの可溶性形態の変更されたレベルを検出するための診断アッセイに関す
る。宿主由来のサンプル中の可溶性レセプターポリペプチドのレベルを検出する
ために使用されるアッセイは、当業者に周知であり、それらとしては、ラジオイ
ムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、および好ましくは
、ＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。
【０７６５】 ＥＬＩＳＡアッセイは、初めに、ニューロペプチドレセプターポリペプチドこ
抗原に対して特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製する工程を包
含する。さらに、レポーター抗体は、モノクローナル抗体に対して調製される。
レポーター抗体は、検出可能な試薬（例えば、放射活性、蛍光、または本実施例
においてはセイヨウワサビペルオキシダーゼ）に結合される。ここで、サンプル
が、宿主から取り出され、そしてサンプル中のタンパク質を結合する固体支持体
（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次いで、この
ディッシュ上の任意の遊離タンパク質結合部位を、比特異的なタンパク質（例え
ば、ウシ血清アルブミン）とインキュベートすることによりカバーする。次に、
モノクローナル抗体を、モノクローナル抗体がこのポリスチレンディッシュに結
合した任意のニューロペプチドレセプタータンパク質に付着する時間の間、この
ディッシュ中でインキュベートする。全ての非結合モノクローナル抗体は、緩衝
液で洗い流される。ここで、セイヨウワサビペルオキシダーゼと連結したレポー
ター抗体を、このディッシュ内に置き、ニューロペプチドレセプタータンパク質
に結合する任意のモノクローナル抗体へのレポーター抗体の結合を生じる。次い
で、非結合レポーター抗体を洗い流す。次いでペルオキシダーゼ基質をこのディ
ッシュに添加し、そして所定期間柱に発色する色の量は、検量線に対して比較し
た場合に、所定量の患者サンプルにおけるニューロペプチドレセプタータンパク
質の存在の量の尺度である。
【０７６６】 本発明の配列はまた、染色体同定について有用である。この配列は、個々のヒ
ト染色体上の特定の位置を標的化し得、そしてその位置とハイブリダイズし得る
。さらに、染色体上の特定の部位を同定する現在の必要性が存在する。実際の配
列データ（反復多型）に基づく少ない染色体マーキング試薬は、染色体位置をマ
ーキングするために現在利用可能である。本発明に対応する染色体に対してＤＮ
Ａをマッピングすることは、疾患に関連する遺伝子とこれらの配列とを相関づけ
ることにおける重要な第１の工程である。
【０７６７】 簡単には、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５
ｂｐ）を調製することにより染色体にマッピングされ得る。３’非翻訳領域のコ
ンピューター分析は、ゲノムＤＮＡにおける１つのエキソンよりも広がらずに、
従って増幅プロセエスを複雑にするプライマーを容易似選択するために使用され
る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッ
ドのＰＣＲスクリーニングのために使用される。このプライマーに対応するヒト
遺伝子を含むこれらのハイブリッドのみが増幅されたフラグメントを生じる。
【０７６８】 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に対する特定のＤＮ
Ａを割り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いて本発明を使用して、亜局在化（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を、類
似の様式で特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたはラージゲノムクロー
ンのプールを用いて達成し得る。その染色体へのマッピングに同様に使用され得
る他のマッピングストラテジーとしては、インサイチュハイブリダイゼーション
、標識化されたフローソート（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体を用いてプレス
クリーニングすること、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するた
めに、ハイブリダイゼーションによる前選択（ｐｒｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）が挙
げられる。
【０７６９】 分裂中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）へのｃＤＮＡクローンの蛍光イン
サイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、１工程で正確な染色
体位置を提供し得る。この技術は、５０または６０塩基程度に短いｃＤＮＡと共
に使用され得る。この技術の概説については、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈ
ｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ，Ｐｅｒｇｏｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照の
こと。
【０７７０】 上記技術は、本発明のニューロペプチドレセプターに対応する遺伝子をマッピ
ングするために使用された。
【０７７１】 一旦、ポリヌクレオチドが正確な染色体位置にマップされると、ポリヌクレオ
チドの物理的位置は、マッピングデータと関連付けられ得る。このようなデータ
は、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎ
ｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗ
ｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通してオンラインで利用可能であ
る）において見い出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子
と疾患との間の関係は、連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝（ｃｏｉ
ｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ））を介して同定される。
【０７７２】 次に、罹患した患者と罹患していない患者との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列
における差異を決定することが必要である。変異が、いくらかまたは全ての罹患
した患者において観察されるが、いかなる正常な個体においても観察されない場
合、この変異は、この疾患の原因因子のようである。
【０７７３】 物理的マッピングおよびゲノムマッピング技術の現在の解像度を考慮すると、
疾患と関連する染色体領域に正確に位置決定されるｃＤＮＡは、５０と５００と
の間の原因因子うちの１つであり得る。（これは、１メガベースマッピング解像
度および２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定する）。
【０７７４】 ポリペプチド、これらのフラグメントもしくは他の誘導体、またはそのアナロ
グ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生するために免
疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体または
モノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒ
ト化抗体、あらびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物
を含む。当該分野で公知の種々の手順を、このような抗体およびフラグメントの
産生のために使用され得る。
【０７７５】 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して産生された抗体は、動物へのポ
リペプチドの直接注射によるか、または動物（好ましくは、ヒト）へのポリペプ
チドの投与により得られ得る。次いで、このようにして得られたこの抗体は、こ
のポリペプチド自体に結合する。この様式では、このポリペプチドのフラグメン
トのみをコードする配列でさえも、ネイティブな全ポリペプチドを結合する抗体
を産生するために使用され得る。次いで、このような抗体は、このポリペプチド
を発現する組織からこのポリペプチドを単離するために使用され得る。
【０７７６】 モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養物により産生される
抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術（
ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６〜４９
７）、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏ
ｚｂｏｒら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）および
ヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌ
ｅら，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７〜９６頁
）が挙げられる。
【０７７７】 単鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）
は、本発明の免疫原ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を産生するために適用さ
れ得る。また、トランスジェニックマウスは、本発明の免疫原ポリペプチド産物
に対するヒト化抗体を発現するために使用され得る。
【０７７８】 本発明は、以下の実施例を参照してさらに記載されるが、本発明が、このよう
な実施例に限定されないことは、理解されるべきである。他に特定されない限り
、全ての部または量は重量による。
【０７７９】 以下の実施例の理解を促進するために、特定の頻繁に出てくる方法および／ま
たは用語を記載する。
【０７８０】 「プラスミド」は、先頭のならびに／または大文字および／もしくは数字の前
の小文字ｐにより表される。本明細書中で、開始時のプラスミドは、市販される
か、制限されてないベースで公的に入手可能であるか、または公開された手順に
従って利用可能なプラスミドから構築され得るかのいずれかであり得る。さらに
、記載されるプラスミドに等価なプラスミドは、当該分野で公知であり、そして
当業者に明らかでる。
【０７８１】 ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配列のみで作用する制限酵素を用いる
ＤＮＡの触媒的切断をいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市販さ
れており、そしてそれらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に公
知であるように使用された。分析的目的のために、代表的に１μｇのプラスミド
またはＤＮＡフラグメントを約２０μｌの緩衝溶液中の約２ユニットの酵素と共
に使用した。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントの単離の目定のために
、代表的に５〜５０μｇのＤＮＡを２０〜２５０ユニットの大量の酵素で消化す
る。特定の制限酵素についての適切な緩衝液および基質量は、製造業者により特
定される。３７℃での約１時間のインキュベーション時間は、本来使用されるが
、これは、業者の指示に従って変化し得る。消化後、反応は、消化したフラグメ
ントを単離するためにポリアクリルアミドゲル上で直接電気泳動される。
【０７８２】 切断されたフラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．ら，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）により記載されるよ
うに８パーセントアクリルアミドゲルを使用して行われる。
【０７８３】 「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成され得る一本鎖ポリクローナルデオ
キシポリヌクレオチドまたは２つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれ
かをいう。このような合成オリゴヌクレオチドは、５’ホスフェートを有さず、
従って、キナーゼの存在下でＡＴＰと一緒のホスフェートの添加無しでは、別の
オリゴヌクレオチドに連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化され
たフラグメントに連結される。
【０７８４】 「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間を結合するホスホジエステル
形成するプロセスをいう（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，Ｉｄ．，１４６頁）。他
に条件付けられない場合、連結は、連結されるＤＮＡフラグメントのおよそ棟梁
の、０．５μｇあたり１０ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を
用いて、公知の緩衝液および条件を使用して達成され得る。
【０７８５】 他に記載がない場合、形質転換を、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒ
Ｅｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６〜４５７（１９７３）の方法に
記載されるように実施した。
【０７８６】 上記の適用は、広範な宿主において用途を有する。このような宿主としては、
ヒト、ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）、ウザギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マ
ウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット、ハムスター、ブタ、ミクロ−ブタ（ｍｉｃｒｏ−
ｐｉｇ）、ニワトリ、ヒツジ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類および
ヒトが挙げられる。特定の実施形態では、宿主は、マウス、ウサギ、ヤギ、モル
モット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌまたはネコである
。好ましい実施形態では、宿主は、哺乳動物である、最も好ましい実施形態では
、宿主はヒトである。
【０７８７】 本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、例示の目的で提供されかつ限定
を意図しない以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。
【０７８８】 本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、例示の目的で提供されかつ限定
を意図しない以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。
【０７８９】 （実施例） （実施例１：寄託されたサンプルからのニューロペプチドレセプターｃＤＮＡ
クローンの単離） ２つのアプローチが寄託されたサンプルからニューロペプチドレセプターを単
離するために使用され得る。第１に、寄託されたクローン（ＨＦＧＡＮ７２）を
、当業者に公知の技術（例えば、ベクター供給者によって提供される技術または
上記で引用された関連の刊行物もしくは特許において提供される技術）を用いて
、適切な宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に形質
転換する。形質転換体を１．５％寒天プレート（適切な選択薬剤、例えば、アン
ピシリンを含む）に、１プレートあたり約１５０の形質転換体（コロニー）の密
度でプレートする。これらのプレートを、細菌コロニースクリーニングについて
の慣用の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、（１９８９）、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に従
って、ナイロンメンブレンを使用してスクリーニングする。
【０７９０】 あるいは、配列番号１の両端（すなわち、クローンの５’ＮＴおよび３’ＮＴ
によって囲まれる配列番号１の領域内）に由来する、１７〜２０ヌクレオチドの
２つのプライマーを合成し、そしてこれらを使用して、寄託されたｃＤＮＡプラ
スミドを鋳型として用いて、所望のｃＤＮＡを増幅する。ポリメラーゼ連鎖反応
を、慣用の条件下で、例えば、０．５ｕｇの上記ｃＤＮＡ鋳型との反応混合物の
２５ｕｌ中で実施する。簡便な反応混合物は、１．５〜５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０
．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、それぞれ２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマーおよび０．２５ユニットのＴａｑポ
リメラーゼである。３５サイクルのＰＣＲ（９４℃での変性を１分間；５５℃で
のアニールを１分間；７２℃での伸長を１分間）を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ自動化サーマルサイクラーを用いて実施する。増幅産物をアガロー
スゲル電気泳動により分析し、そして予想される分子量のＤＮＡバンドを切り出
し、そして精製する。ＰＣＲ産物を、ＤＮＡ産物をサブクローニングおよび配列
決定することによって選択された配列であることを確認する。
【０７９１】 寄託されたクローンに存在し得ない遺伝子の５’非コード部分または３’非コ
ード部分の同定のために、いくつかの方法が利用可能である。これらの方法は、
以下を含むがこれらに限定されない：フィルタープローブ探索、特異的プローブ
を使用するクローン富化、および当該分野で周知である５’および３’「ＲＡＣ
Ｅ」プロトコルと類似するかまたは同一のプロトコル。例えば、５’ＲＡＣＥに
類似する方法は、ニューロペプチドレセプターの全長転写物の５’末端の欠失を
生成するために利用可能である（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３））
。
【０７９２】 簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転写物をお
そらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結する。連結されたＲＮＡオリゴヌクレ
オチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライ
マーを含むプライマーセットを使用して、所望の全長遺伝子の５’部分をＰＣＲ
増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれを使用して全
長遺伝子を生成し得る。
【０７９３】 この上記の方法は、所望の供給源から単離された全ＲＮＡを用いて開始するが
、ポリＡ＋ＲＮＡをも使用し得る。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスフ
ァターゼで処理して、後のＲＮＡリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷ＲＮ
Ａの５’リン酸基を排除し得る。次いで、ホスファターゼを不活化するべきであ
り、そしてＲＮＡをメッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を
除去するために、タバコ酸ピロホスファターゼを用いて処理するべきである。こ
の反応は、次いでＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドに連
結され得る、キャップ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残す。
【０７９４】 この改変型ＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第
一鎖ｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用する。第一鎖合成反応物を、連結され
たＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の
配列に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のための鋳型
として使用する。次いで、得られた生成物を配列決定し、そして分析して５’末
端配列がニューロペプチドレセプターの遺伝子に属することを確認する。
【０７９５】 （実施例２：ニューロペプチドレセプターゲノムクローンの単離） ヒトゲノムＰ１ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）
を、実施例１に記載される方法に従って、配列番号Ｘに対応するｃＤＮＡ配列に
ついて選択されたプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングする（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋもまた参照のこと）。
【０７９６】 （実施例３：ニューロペプチドレセプターポリペプチドの組織分布） ニューロレセプターのｍＲＮＡ発現の組織分布を、とりわけ、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋらによって記載されるノーザンブロット分析についてのプロトコルを用いて決
定する。例えば、実施例１に記載される方法によって生成されるｃＤＮＡプロー
ブを、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅＴＭ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、製造者の指示に従って
、Ｐ３２で標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００Ｔ
Ｍカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用し
て、製造者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って精製する。次いで、この
精製した標識プローブを使用して、種々のヒト組織をｍＲＮＡ発現について試験
する。
【０７９７】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン
（ＭＴＮ）ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＴＭハイブ
リダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造者のプロトコル番号
ＰＴ１１９０−１に従って、標識プローブで試験する。ハイブリダイゼーション
および洗浄後、ブロットをマウントして、そして−７０℃で一晩フィルムに曝露
し、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。
【０７９８】 （実施例４：ニューロペプチドレセプターのポリヌクレオチドの染色体マッピ
ング） オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、配列番号１の５’末端の配列に従
って設計する。このプライマーは、好ましくは約１００ヌクレオチドにわたる。
次いで、このプライマーセットを、以下のセットの条件下でポリメラーゼ連鎖反
応に使用する：９５℃で３０秒；５６℃で１分；７０℃で１分。このサイクルを
３２回反復し、次いで１回、７０℃で５分間のサイクルを行う。個々の染色体ま
たは染色体フラグメントを含む体細胞ハイブリッドパネル（Ｂｉｏｓ，Ｉｎｃ）
に加えて、ヒト、マウス、およびハムスターのＤＮＡを鋳型として使用する。反
応物を、８％ポリアクリルアミドゲルまたは３．５％アガロースゲルのいずれか
で分析する。染色体マッピングを、特定の体細胞ハイブリッドにおける約１００
ｂｐのＰＣＲフラグメントの存在によって決定する。
【０７９９】 （実施例５：ニューロペプチドレセプターの細菌発現） 本発明のニューロペプチドレセプターポリペプチドをコードするニューロペプ
チドレセプターポリヌクレオチドを、実施例１に概説するように、ＤＮＡ配列の
５’および３’末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して
増幅し、挿入フラグメントを合成する。ｃＤＮＡ挿入物を増幅するために使用さ
れるプライマーは、発現ベクターに増幅産物をクローニングするために、好まし
くはＢａｍＨＩおよびＸｂａＩのような制限部位をプライマーの５’末端に含む
べきである。例えば、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩは、細菌発現ベクターｐＱＥ−
９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）の制限酵素部位に
対応する。このプラスミドベクターは、抗生物質耐性（Ａｍｐｒ）、細菌の複製
起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧで調節可能なプロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）
、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−ヒスチジンタグ（６−Ｈｉｓ）、および
制限酵素クローニング部位をコードする。
【０８００】 ｐＱＥ−９ベクターをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして、増幅され
たフラグメントを細菌性ＲＢＳにおいて開始されるリーディングフレームを維持
するｐＱＥ−９ベクターに連結する。次いで、連結混合物を、ｌａｃＩリプレッ
サーを発現し、またカナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）を与えるプラスミドｐＲＥＰ
４の多重コピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎ
ｃ．）を形質転換するために使用する。形質転換体を、それらのＬＢプレート上
で生育できる能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロ
ニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって確認する
。
【０８０１】 所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（
２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）
増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を、１：１００〜１：２５０の比で大量培養に接種す
るために使用する。細胞を、０．４〜０．６の間の吸光度６００（Ｏ．Ｄ．６０
０）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクト
ピラノシド）を最終濃度１ｍＭになるように加える。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプ
レッサーの不活化によりＰ／Ｏの活性化（ｃｌｅａｒｉｎｇ）を誘導し、遺伝子
発現の増加を導く。
【０８０２】 細胞を、さらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離（６０００×
ｇで２０分間）によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック試薬である
６ＭグアニジンＨＣｌ中に、４℃で３〜４時間攪拌することによって可溶化させ
る。細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてポリペプチドを含む上清を、
ニッケル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラムに
ロードする（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（前出）より入手可能）。６×Ｈｉｓタグ
を有するタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高い親和性で結合し、そして単純な
１工程手順で精製され得る（詳細については、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎｉｓｔ（１９９５）ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（前出）を参照のこと）。
【０８０３】 手短に言えば、上清を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８のカラムにロードし
、カラムを、最初に１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８で洗浄し、次い
で１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ６で洗浄し、最後にポリペプチドを
、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ５で溶出する。
【０８０４】 次いで、精製したニューロペプチドレセプタータンパク質を、リン酸緩衝化生
理食塩水（ＰＢＳ）または５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６の緩衝液および２０
０ｍＭ ＮａＣｌに対して透析することにより再生させる。あるいは、ニューロ
ペプチドレセプタータンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラムに固定化している間に、首
尾よく再折り畳みされ得る。推奨条件は以下の通りである：プロテアーゼインヒ
ビターを含む、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４中の６Ｍ〜１Ｍ尿素の直線勾配を使用する再生。再生は
１．５時間以上の時間をかけて行うべきである。再生後、タンパク質を２５０ｍ
Ｍイミダゾールの添加によって溶出する。イミダゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ６の緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最終の透
析工程によって除去する。精製したニューロペプチドレセプタータンパク質を、
４℃で保存するか、または−８０℃で凍結する。
【０８０５】 上記の発現ベクターに加えて、本発明はさらに、ニューロペプチドレセプター
ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたファージオペレーターおよびプロモー
ターエレメントを含み、ｐＨＥ４ａと呼ばれる発現ベクターを含む（ＡＴＣＣ受
託番号２０９６４５、１９９８年２月２５日に寄託）。このベクターは以下を含
む：１）選択マーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、
２）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌ
ａｃオペレーター配列、５）シャイン−ダルガーノ配列、および６）ラクトース
オペロンリプレッサー遺伝子（ｌａｑＩｑ）。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ
１９（ＬＴＩ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に由来する。プロモーター配
列およびオペレーター配列を合成的に作製する。
【０８０６】 ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８によっ
てベクターを制限処理し、制限生成物をゲルで泳動し、そしてより大きな方のフ
ラグメント（スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントは約３１０塩基対で
あるべきである）を単離することによって、ＤＮＡをｐＨＥａに挿入し得る。Ｄ
ＮＡ挿入物を、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘｈ
ｏＩ、またはＡｓｐ７１８（３’プライマー）に対する制限部位を有するＰＣＲ
プライマーを使用して、実施例１に記載のＰＣＲプロトコルに従って生成する。
ＰＣＲ挿入物を、ゲル精製し、そして適合する酵素で制限処理する。挿入物およ
びベクターを標準的なプロトコルに従って連結する。
【０８０７】 操作されたベクターは、上記のプロトコルにおいて、細菌系でタンパク質を発
現させるために容易に置換され得る。
【０８０８】 あるいは、ニューロペプチドレセプターをコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ
９７１２８）を、プロセスされたニューロペプチドレセプター遺伝子の５’末端
配列および３’末端配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー（シグ
ナルペプチド配列を含まない）およびこの遺伝子に対するベクター配列３’を用
いてまず増幅する。ニューロペプチドレセプターヌクレオチド配列に対応するさ
らなるヌクレオチドを、５’配列および３’配列にそれぞれ加える。この５’オ
リゴヌクレオチドプライマーは、配列５’ＣＡＣＴＡＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＧＡ
ＧＣＣＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣ３’（配列番号７）を有し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限
酵素部位、続いてプロセスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から始ま
る１８ヌクレオチドのニューロペプチドレセプターコード配列を含む。３’配列
５’ＡＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣ３’（配列番号８）
は、Ｘｂａ１部位を含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉ
ａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）の制限酵素部位に対応する。
ｐＱＥ−９は、抗生物質耐性（Ａｍｐｒ）、細菌複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ
で調節可能なプロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（Ｒ
ＢＳ）、６−ヒスチジンタグ（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位
をコードする。次いで、ｐＱＥ−９をＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｂａ１で消化す
る。増幅された配列を、ｐＱＥ−９に連結し、ヒスチジンタグおよびＲＢＳをコ
ードする配列にインフレームで挿入する。次いで、連結混合物を使用して、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載される手順によって、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／
ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を形質転換する。Ｍ１５／ｒｅｐ４は、プ
ラスミドｐＲＥＰ４の多重コピーを含み、これは、ｌａｃＩリプレッサーを発現
し、そしてまたカナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）を与える。形質転換体を、ＬＢプ
レート上で増殖するそれらの能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナマ
イシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析に
よって確認する。所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）
およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で
一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を、１：１００〜１：２５０の比で大
量培養に接種するために使用する。細胞を、０．４〜０．６の間の吸光度６００
（Ｏ．Ｄ．６００）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−
Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を最終濃度１ｍＭになるように加える。ＩＰＴ
Ｇは、ｌａｃＩリプレッサーの不活化によりＰ／Ｏの活性化（ｃｌｅａｒｉｎｇ
）を誘導し、遺伝子発現の増加を導く。細胞を、さらに３〜４時間増殖させる。
次いで、細胞を遠心分離によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック試
薬である６ＭグアニジンＨＣｌ中に可溶化させる。清澄後、可溶化したニューロ
ペプチドレセプターを、６−Ｈｉｓタグを含むタンパク質による固い結合を可能
にするような条件下でのニッケル−キレートカラム上のクロマトグラフィーによ
って、この溶液から精製する（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７−１８４（１９８４））。このタンパク質を、６
Ｍ グアニジンＨＣｌ（ｐＨ５．０）中でカラムから溶出し、そして再生の目的
で、３Ｍ グアニジンＨＣｌ、１００ｍＭ リン酸ナトリウム、１０ｍＭ グル
タチオン（還元型）および２ｍＭ グルタチオン（酸化型）に適応させる。この
溶液中で１２時間のインキュベーション後、このタンパク質を１０ｍＭ リン酸
ナトリウムに対して透析する。
【０８０９】 （実施例６：封入体からのニューロペプチドレセプターポリペプチドの精製） 以下の別の方法は、ニューロペプチドレセプターポリペプチドが封入体の形態
で存在する場合に、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されたニューロペプチドレセプターポ
リペプチドを精製するために使用され得る。他に指定されない場合には、以下の
すべての工程は４〜１０℃で行われる。
【０８１０】 Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生産期の完了後、細胞培養物を４〜１０℃に冷却し、そし
て１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）に
よって細胞を採集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想され
る収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切
な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を含む緩衝溶液に懸濁させる。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸濁
液に分散させる。
【０８１１】 次いで、細胞をマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（
Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ
．）に２回、４０００〜６０００ｐｓｉで溶液を通すことによって溶解させる。
次いでホモジネートを、最終濃度０．５Ｍ ＮａＣｌになるようにＮａＣｌ溶液
と混合し、続いて７０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。得られたペレットを
、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を使用して再度洗浄する。
【０８１２】 得られた洗浄した封入体を、１．５Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜
４時間可溶化する。７０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄し
、そしてポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートしてさらなるＧｕ
ＨＣｌ抽出を可能にする。
【０８１３】 不溶性粒子を除去するための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）に続き、Ｇｕ
ＨＣｌ可溶化タンパク質を、ＧｕＨＣｌ抽出物と、５０ｍＭ ナトリウム、ｐＨ
４．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝液とを
、激しい攪拌で迅速に混合することによって、再折畳みさせる。再折畳みした希
釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合しないで４℃で保
つ。
【０８１４】 再折畳みされたポリペプチド溶液を清澄にするために、４０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ６．０で平衡化した、適切な表面積を有する０．１６μｍメンブレンフ
ィルターを備えるあらかじめ準備した接線濾過ユニット（例えば、Ｆｉｌｔｒｏ
ｎ）を使用する。濾過したサンプルを、カチオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ
ＨＳ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にロードする
。カラムを４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄し、そして同じ緩衝液
中の２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ ＮａＣｌで
、段階的な様式で溶出する。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を連続的にモニ
ターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析する。
【０８１５】 次いでニューロペプチドレセプターポリペプチドを含む画分をプールし、そし
て４容量の水と混合する。次いで希釈されたサンプルを、あらかじめ準備した強
アニオン（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ）交換樹脂および弱アニオン（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉ
ｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）交換樹脂の直列カラムのセットにロードする。カ
ラムを４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化する。両方のカラムを、
４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次
いでＣＭ−２０カラムを１０カラム容量の直線勾配（０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０
ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０から１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナ
トリウム、ｐＨ６．５の範囲）を用いて溶出させる。画分を、溶出液の定常Ａ２
８０モニタリング下で収集する。次いで、（例えば、１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって判明した）ポリペプチドを含む画分をプールする。
【０８１６】 得られたニューロペプチドレセプターポリペプチドは、上記の再折畳みおよび
精製工程の後で９５％より高い純度を示すはずである。５μｇの精製タンパク質
がロードされる場合、いかなる主たる混在バンドも、クマシーブルー染色した１
６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから観察されないはずである。精製ニューロペプチ
ドレセプタータンパク質はまた、エンドトキシン／ＬＰＳ混在について試験され
得、そして代表的には、ＬＰＳ含量はＬＡＬアッセイに従って、０．１ｎｇ／ｍ
ｌ未満である。
【０８１７】 （実施例７：バキュロウイルス発現系におけるニューロペプチドレセプターの
クローニングおよび発現） この実施例では、ニューロペプチドレセプターを発現するために、プラスミド
シャトルベクターｐＡ２を使用してニューロペプチドレセプターポリヌクレオチ
ドをバキュロウイルスに挿入する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ
ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘド
リンプロモーター、続いてＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８のような
便利な制限部位を含む。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル
化部位を、効率的なポリアデニル化のために使用する。組換えウイルスの容易な
選択のために、プラスミドは、同方向にある弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモー
ターの制御下でＥ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘ
ドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。挿入された遺伝子は両方の側で
、クローン化したニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドを発現する生存
可能なウイルスを生成する、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性の相同組換え
のためのウイルス配列と隣接する。
【０８１８】 他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、必要とされる場合
、構築物が転写、翻訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル（シグナル
ペプチドおよびインフレームなＡＵＧを含む）を提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。
【０８１９】 具体的には、寄託されたクローンに含まれるニューロペプチドレセプターｃＤ
ＮＡ配列（これは、ＡＵＧ開始コドンおよび任意の天然に付随するリーダー配列
を含む）を、実施例１に記載されるＰＣＲプロトコルを使用して増幅させる。天
然に存在するシグナル配列を使用して分泌タンパク質を産生する場合、ｐＡ２ベ
クターは第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、ベクターは、Ｓｕ
ｍｍｅｒｓら（「Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕ
ｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５
（１９８７））に記載される標準的な方法を用いて改変して、バキュロウイルス
リーダー配列を含ませ得る（ｐＡ２ ＧＰ）。
【０８２０】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」，ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲ
ルから単離する。次いでフラグメントを適切な制限酵素で消化し、そして再び１
％アガロースゲルで精製する。
【０８２１】 プラスミドを対応する制限酵素で消化し、そして必要に応じて、当該分野で公
知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化し得る。
次いでＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎ
ｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲルから単離する
。
【０８２２】 フラグメントおよび脱リン酸化したプラスミドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用
いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ
ａ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合液で形質転換し、そ
して培養プレート上に拡げる。プラスミドを含む細菌を、個々のコロニー由来の
ＤＮＡを消化し、そして消化産物をゲル電気泳動によって分析することにより同
定する。クローニングしたフラグメントの配列をＤＮＡ配列決定によって確認す
る。
【０８２３】 このポリヌクレオチドを含む５μｇのプラスミドを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９
８７）によって記載されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市販の
線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭ ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とと
もに同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイルスＤ
ＮＡおよび５μｇのプラスミドを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含
む、マイクロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０μ
ｌのリポフェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で
１５分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清
グレース培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細
胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加える。次いでプレートを２７℃
で５時間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をプレートか
ら除去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添
加する。次いで培養を２７℃で４日間継続する。
【０８２４】 ４日後上清を収集し、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出によって記載さ
れたようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むアガロース
ゲルを、ｇａｌが発現しているクローン（青色に着色したプラークを生ずる）の
容易な同定および単離を可能にするために使用する。（この型の「プラークアッ
セイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇによって配布される、昆虫細胞培養およびバキュロ
ウイルス学のための使用者ガイドの中の９−１０頁に見出され得る）。適切なイ
ンキュベーションの後、青色に着色したプラークをマイクロピペッター（例えば
、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を
、２００μｌのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁させ、そし
て組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を、３５ｍｍディッシュに播種したＳｆ
９細胞に感染させるために使用する。４日後、これらの培養ディッシュの上清を
採集し、次いで４℃に貯蔵する。
【０８２５】 ポリペプチドの発現を確認するために、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレ
ース培地中でＳｆ９細胞を増殖させる。細胞を、約２の感染多重度（「ＭＯＩ」
）でポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスで感染させる。放射性標識
したタンパク質を所望する場合には、６時間後に培地を除去し、そしてメチオニ
ンおよびシステインを含まないＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能）に置き換え
る。４２時間後、５μＣｉの３５Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの３５Ｓ−シス
テイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに１６時間イ
ンキュベートし、次いで遠心分離によって採集する。上清中のタンパク質および
細胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで（放射性標識した場合）オート
ラジオグラフィーによって分析する。
【０８２６】 精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定法を使用して、産
生されたニューロペプチドレセプタータンパク質のアミノ末端配列を決定し得る
。
【０８２７】 あるいは、全長ニューロペプチドレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ配
列（ＡＴＣＣ ９７１２８）を、この遺伝子の５’配列および３’配列に対応す
るＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅させる。
【０８２８】 この５’プライマーは、配列５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＧ
ＣＣＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣ３’（配列番号１１）を有し、そしてＢａｍＨＩ制限
酵素部位（太字）、続いて真核生物細胞における翻訳開始のために有効なシグナ
ルに似ている６個のヌクレオチドを含む（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７，１
９６，９４７−９５０，Ｋｏｚａｋ，Ｍ．）。翻訳開始コドン「ＡＴＧ」に下線
を付した）。
【０８２９】 ３’プライマーは、配列５’ＡＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＣＴＡＧＡＧ
ＧＧＣ３’（配列番号１２）を有し、そして制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩの
ための切断部位、およびニューロペプチドレセプター遺伝子の３’非翻訳配列に
相補的な５個のヌクレオチドを含む。増幅された配列を、市販のキット（「Ｇｅ
ｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を
用いて１％アガロースゲルから単離する。次いで、このフラグメントを、エンド
ヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、次いで、実施例１に記
載されるように精製する。このフラグメントを、Ｆ２と命名する。
【０８３０】 ベクターｐＡ２（以下で考察されるｐＶＬ９４１ベクターの改変体）を、バキ
ュロウイルス発現系を用いて、ニューロペプチドレセプタータンパク質の発現の
ために使用する（概説については、以下を参照のこと：Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ
．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．１９８７，Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｃ
ｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔ
ｉｎ ＮＯ：１，３および５５５５）。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐ
ｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポ
リヘドリンプロモーター、続いて制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂ
ａＩのための認識部位を含む。シミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化
部位を、効率的なポリアデニル化のために使用する。組換えウイルスの容易な選
択のために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプ
ロモーターとして、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを、同
方向で挿入する。ポリヘドリン配列は、同時トランスフェクトされた野生型ウイ
ルスＤＮＡの細胞媒介性の相同組換えのためのウイルス配列と両側で隣接する。
多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、
およびｐＡｃＩＭ１）は、ｐＲＧ１の代わりに使用され得る（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ
．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３
９）。
【０８３１】 このプラスミドを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、次い
で当該分野において公知の手順によって、ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン
酸化する。次いで、実施例１に記載されるように、ＤＮＡを１％アガロースゲル
から単離する。このベクターＤＮＡを、Ｖ２と命名する。
【０８３２】 フラグメントＦ２および脱リン酸化したプラスミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結する。次いで、ＤＨ５αを形質転換し、酵素ＢａｍＨＩおよび
ＸｂａＩを用いて、ニューロペプチドレセプター遺伝子とともにプラスミド（ｐ
Ｂａｃニューロペプチドレセプター）を含む細菌を同定した。クローン化したフ
ラグメントの配列をＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０８３３】 ５μｇのプラスミドｐＢａｃニューロペプチドレセプターを、リポフェクショ
ン法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
４：７４１３−７４１７（１９８７））を使用して、１．０μｇの市販の線状化
バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ
ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共に同時トラ
ンスフェクトする。
【０８３４】 １μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢ
ａｃニューロペプチドレセプターを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を
含むマイクロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０μ
ｌのリポフェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で
１５分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清
グレース培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細
胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加える。このプレートを、新しく
加えた溶液を混合するために前後に揺らす。５時間後、プレートを２７℃で５時
間インキュベートする。プレートをインキュベーターに戻し、トランスフェクシ
ョン溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌの
グレース昆虫培地を添加する。次いで培養を２７℃で４日間継続する。
【０８３５】 ４日後上清を収集し、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によって記載
されたようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むアガロー
スゲルを、青色に着色したプラークの容易な同定および単離を可能にするために
使用する。（「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，（９−１０頁）によっ
て配布される、昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学のための使用者ガイドの
中に見出され得る）。
【０８３６】 連続的な希釈の４日後、細胞にウイルスを加え、青色に着色したプラークをＥ
ｐｐｅｎｄｏｒｆのチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２０
０μｌのグレース培地を含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中で再懸濁させる。短
い遠心分離によって観点を除去し、組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を、３
５ｍｍディッシュに播種したＳｆ９細胞に感染させるために使用する。４日後、
これらの培養ディッシュの上清を採集し、次いで４℃で貯蔵する。
【０８３７】 １０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレース培地中でＳｆ９細胞を増殖させる。
細胞を、約２の感染多重度（ＭＯＩ）で組換えバキュロウイルスＶ−ニューロペ
プチドレセプターに感染させる。６時間に後培地を除去し、そしてメチオニンお
よびシステインを含まないＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能）に置き換える。
４２時間後、５μＣｉの３５Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの３５Ｓ−システイ
ン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加する。細胞をさらに１６時間インキュベートし、
次いで遠心分離によって採集し、標識したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びオートラジオグラフィーによって分析する。
【０８３８】 （実施例８：哺乳動物細胞におけるニューロペプチドレセプターの発現） ニューロペプチドレセプターポリペプチドを、哺乳動物細胞中で発現させ得る
。代表的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモー
ターエレメント、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポ
リアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、
コザック配列、および、ＲＮＡスプライシングのドナー部位およびアクセプター
部位に隣接する介在配列を含む。非常に効率的な転写は、ＳＶ４０由来の初期お
よび後期プロモーター、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ
）由来の長末端反復（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期
プロモーターを用いて達成される。しかし、細胞エレメント（例えば、ヒトアク
チンプロモーター）もまた、使用され得る。
【０８３９】 本発明を実施する際の使用に適切な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよび
ｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃ
ａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、
ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、ならび
にｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０のようなベクターを含む。使用され得る哺乳動物宿
主細胞は、ヒトＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞、
マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １細胞、Ｃｏｓ ７細胞
およびＣＶ１細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、ならびにチャイニー
ズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。
【０８４０】 あるいは、ニューロペプチドレセプターポリペプチドは、染色体に組み込まれ
たニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドを含む、安定な細胞株中で発現
され得る。ＤＨＦＲ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシンのような選択可
能なマーカーを用いる同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた細
胞の同定および単離を可能にする。
【０８４１】 トランスフェクトされたニューロペプチドレセプター遺伝子はまた、大量のコ
ードされたタンパク質を発現するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸
還元酵素）マーカーは、目的の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する
細胞株の開発に有用である。（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．お
よびＭａ，Ｃ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７
：１０７−１４３（１９９０）：Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，
Ｍ．Ａ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８（１９９１）を参照の
こと）。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である
（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）
；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１
７５（１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中
で増殖させ、そしてもっとも高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株
は、染色体に組み込まれた、増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用さ
れる。
【０８４２】 プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体であ
る、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴ
ＣＣ受託番号２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７（
１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）、およびＣＭＶエンハンサ
ー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））のフラ
グメントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８の制限酵
素切断部位を有するマルチプルクローニングサイトは、ニューロペプチドレセプ
ターのクローニングを容易にする。ベクターはまた、ラットプレプロインスリン
遺伝子の３’イントロン、ポリアデニル化および終結シグナル、ならびに、ＳＶ
４０初期プロモーターの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【０８４３】 天然に存在するシグナル配列を選択されたタンパク質を生成するために使用す
る場合、このベクターは第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天
然に存在するシグナル配列を使用しない場合、このベクターは、細胞からタンパ
ク質を分泌する目的で、異種シグナル配列を含むように改変され得る（例えば、
ＷＯ９６／３４８９１を参照のこと）。
【０８４４】 次いで、増幅フラグメントを適切な制限酵素を使用して消化し、市販のキット
（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ
ａ．）を使用して、１％アガロースゲルから単離する。次いで、単離されたフラ
グメントおよび脱リン酸したベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次
いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換
し、そしてプラスミドｐＣ６またはｐＣ４に挿入されたフラグメントを含む細菌
を、例えば、制限酵素分析を用いて同定する。
【０８４５】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ６またはｐＣ４を、リ
ポフェクチン（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐ
ＳＶｎｅｏと同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性
で選択可能なマーカーであるところの、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐
性を付与する酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。この細胞を、
１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、この
細胞をトリプシン処理し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレ
キサートおよび１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブ
リドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種す
る。約１０〜１４日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度
のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００
ｎＭ）を使用して、６ウェルのペトリ皿または１０ｍｌのフラスコに播種する。
次いで、最高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高い濃度の
メトトレキサート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新た
な６ウェルプレートに移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖する
クローンが得られるまで繰り返す。ニューロペプチドレセプターの発現を、例え
ば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって、または逆相ＨＰＬＣ
分析によって分析する。
【０８４６】 あるいは、プラスミド、ニューロペプチドレセプターＨＡの発現を、以下を含
むベクターｐｃＤＮＡ３／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から誘導する：１）
ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、
４）ＣＭＶプロモーター、続いてポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよび
ポリアデニル化部位。ニューロペプチドレセプター前駆体全体およびその３’末
端にインフレームで融合されたＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメントを、ベ
クターのポリリンカー領域にクローン化し、従って組換えタンパク質発現をＣＭ
Ｖプロモーターのもとで指向させる。先に記載されるように、ＨＡタグは、イン
フルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｉ．Ｗｉｌｓ
ｏｎ，Ｈ．Ｎｉｍａｎ，Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ，Ａ Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ，Ｍ．
ＣｏｎｎｏｌｌｙおよびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ，１９８４，Ｃｅｌｌ ３７，７６７
）。ＨＡタグの標的タンパク質への注入は、ＨＡエピトープを認識する抗体を用
いた組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。
【０８４７】 プラスミド構築ストラテジーは、以下に記載される： ニューロペプチドレセプターをコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ ９７１２８
）を、以下の２つのプライマーを用いてＰＣＲによって構築する：ＢａｍＨＩ部
位を含む５’プライマー ５’ＣＣＴＡＧＧＡＴＧＣＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＣＡ
ＧＣＧＧ３’（配列番号９）；ＸｂａＩ部位に相補的な配列、翻訳停止コドン、
およびニューロペプチドレセプターコード配列の少なくとも１７個のヌクレオチ
ド（停止コドンを含まない）を含む３’配列 ５’ＡＣＡＡＧＴＣＣＴＴＧＴＣ
ＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣ３’（配列番号１０）。従って、ＰＣＲ生成物は、Ｂ
ａｍＨＩ部位、コード配列、翻訳終結停止コドンおよびＸｂａＩ部位を含む。Ｐ
ＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントおよびベクター（ｐｃＤＮＡ３／Ａｍｐ）を
、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限酵素を用いて消化し、連結する。連結混合物を
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に形質転換し、形質転換された培養物を、アン
ピシリン培地プレートにプレートし、そして耐性コロニーを選択する。プラスミ
ドＤＮＡを、形質転換体から単離し、そして正確なフラグメントの存在について
制限分析により試験する。組換えニューロペプチドレセプターの発現のために、
ＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法によって発現ベクターでトランスフェ
クトする（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ
，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８
９））。ニューロペプチドレセプターＨＡタンパク質の発現を、放射標識および
免疫沈降法によって検出する（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８））。細胞を
、トランスフェクションの２日前に３５Ｓ−システインで８時間標識する。次い
で、培養培地を収集し、細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ Ｄ
ＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））で溶解する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら
、同書、３７：７６７（１９８４））。細胞溶解物および培養培地の両方を、Ｈ
Ａ特異的モノクロナール抗体を用いて沈殿させる。沈殿したタンパク質を、１５
％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析する。
【０８４８】 （実施例９：Ｎ末端および／またはＣ末端欠失変異体の構築） 以下の一般的アプローチを使用して、Ｎ末端またはＣ末端欠失ニューロペプチ
ドレセプター欠失変異体をクローン化し得る。一般的に、約１５〜２５ヌクレオ
チドの２つのオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１のポリヌクレオチド
の所望の５’位および３’位由来である。プライマーの５’位および３’位を、
所望のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドフラグメントに基づいて決
定する。必要な場合、開始コドンおよび停止コドンを、それぞれ５’プライマー
および３’プライマーに加え、このポリヌクレオチドフラグメントによってコー
ドされるニューロペプチドレセプターポリペプチドフラグメントを発現させる。
好ましいニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドフラグメントは、上記の
明細書の「ポリヌクレオチドおよびポリペプチドフラグメント」の節で開示され
たＮ末端およびＣ末端欠失変異体をコードするフラグメントである。
【０８４９】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチドフラグメントの所望のベクター
へのクローン化を容易にするために、さらなるヌクレオチド含有制限部位がまた
、５’および３’プライマー配列に加えられ得る。このニューロペプチドレセプ
ターポリヌクレオチドフラグメントを、適切なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マーおよび本明細書中で考察されるかまたは当該分野で公知の条件を用いて、ゲ
ノムＤＮＡまたは寄託されたｃＤＮＡクローンから増幅させる。本発明のニュー
ロペプチドレセプターポリヌクレオチドフラグメントによりコードされるニュー
ロペプチドレセプターポリペプチドフラグメントは、全長ポリペプチドと同じ一
般的な様式で発現および生成され得るが、特定のフラグメントと全長ポリペプチ
ドとの間の化学的特性および物理的特性における違いに起因して、慣用的な変更
が必要であり得る。
【０８５０】 本発明を限定するのではなく例示する手段として、ニューロペプチドレセプタ
ーポリペプチドフラグメントＳ−１７〜Ｌ−３８０をコードするポリヌクレオチ
ドを増幅し、そして以下のようにクローン化する：制限酵素部位、続いて開始コ
ドンをインフレームで含む５’プライマーを、Ｓ−１７で始まるこのポリペプチ
ドフラグメントのＮ末端部分をコードするポリヌクレオチド配列を用いて生成す
る。制限酵素部位、続いて停止コドンをインフレームで含む相補的３’プライマ
ーを、Ｌ−３８０で終わるニューロペプチドレセプターポリペプチドフラグメン
トのＣ−末端部分をコードするポリヌクレオチド配列を用いて生成する。
【０８５１】 増幅されたポリヌクレオチドフラグメントおよび発現ベクターを、このプライ
マーにおけるこれらの部位を認識する制限酵素で消化する。次いで、消化したポ
リヌクレオチドを、共に連結する。ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチ
ドフラグメントを、好ましくはニューロペプチドレセプターポリペプチドフラグ
メントコード領域をプロモーターより下流に配置する様式で、制限された発現ベ
クターにに挿入する。標準的な手順をもちいて、そして本明細書中の実施例に記
載されるように、連結混合物をコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換する
。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてクローン化されたＤＮＡ
の正体を、制限分析、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０８５２】 （実施例１０：ニューロペプチドレセプターのタンパク質融合物） ニューロペプチドレセプターポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に
融合される。これらの融合タンパク質は、種々の適用に使用され得る。例えば、
ニューロペプチドレセプターポリぺプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテイ
ンＡ、ＩｇＧドメイン、およびマルトース結合タンパク質への融合は、精製を容
易にする（実施例５を参照のこと；ＥＰ Ａ ３９４，８２７もまた参照のこと
；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：８４−８６（１９８８））
。同様に、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−３、およびアルブミンへの融合は、インビボで
の半減期を増大させる。ニューロペプチドレセプターポリぺプチドに融合した核
局在化シグナルは、タンパク質を特定の細胞内局在に標的化し得る。一方、共有
結合ヘテロ二量体またはホモ二量体は、融合タンパク質の活性を増大または減少
させ得る。融合タンパク質はまた、１つより多い機能を有するキメラ分子を作製
し得る。最後に、融合タンパク質は、非融合タンパク質と比較して、融合タンパ
ク質の可溶性および／または安定性を増大させ得る。上記の融合タンパク質の全
ての型は、ＩｇＧ分子へのポリぺプチドの融合を概説する以下のプロトコル、ま
たは実施例５に記載されるプロトコルを改変することによって作製され得る。
【０８５３】 簡単には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載の配列の５’末端および
３’末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマ
ーはまた、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクローニン
グを容易にする都合の良い制限酵素部位を有するべきである。
【０８５４】 例えば、ｐＣ４（受託番号２０９６４６）が使用される場合、ヒトＦｃ部分は
、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨＩ部位が破壊され
るべきであることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターが、Ｂ
ａｍＨＩを用いて再び制限され、ベクターを線状化し、そして実施例１に記載さ
れるＰＣＲプロトコルによって単離されたニューロペプチドレセプターポリヌク
レオチドが、このＢａｍＨＩ部位に連結される。ポリヌクレオチドは、終止コド
ンなしにクローニングされ、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないこ
とに注意すること。
【０８５５】 天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される場
合、ｐＣ４は、第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、ベクターは、異種シグナル配列を含むよ
うに改変され得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。 ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域： ＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡ
ＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＧＧＴＧ
ＣＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧ
ＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴ
ＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＡＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧ
ＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣ
ＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡ
ＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣ
ＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴ
ＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧ
ＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧ
ＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧ
ＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧ
ＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＡＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴ
ＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡ
ＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴ
ＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴ
ＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣ
ＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣ
ＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡＧＴＧＣＧＡＣＧＧＣＣＧＣ
ＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴ（配列番号１３）。
【０８５６】 （実施例１１：抗体の産生） 本発明の抗体を、種々の方法によって調製し得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ、第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、ニュ
ーロペプチドレセプターポリペプチドを発現する細胞を、ポリクローナル抗体を
含む血清の産生を誘導するために、動物に投与する。好ましい方法において、ニ
ューロペプチドレセプターポリペプチドの調製物を調製し、そしてその調製物が
、天然の夾雑物を実質的に含まないようにするために精製する。ついで、このよ
うな調製物を、より大きな比活性のポリクローナル抗体を産生するために、動物
に導入する。
【０８５７】 ニューロペプチドレセプタータンパク質に特異的なモノクローナル抗体を、ハ
イブリドーマ技術を使用して調製する（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６
：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５
１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２
（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、
Ｎ．Ｙ．、５６３〜６８１頁（１９８１））。一般的に、動物（好ましくは、マ
ウス）を、ニューロペプチドレセプターポリペプチドまたはより好ましくは分泌
ニューロペプチドレセプターポリペプチド発現細胞で、免疫する。このようなポ
リペプチド発現細胞を、適切な任意の組織培養培地（好ましくは、１０％ウシ胎
仔血清（約５６℃にて不活化）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸
、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプト
マイシンを補充した、Ｅａｒｌｅ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地）にて培養する。
【０８５８】 このようなマウスの脾細胞を抽出し、そして適切な骨髄腫細胞株と融合させる
。適切な任意の骨髄腫細胞株を、本発明に従って使用し得るが、しかし、親骨髄
腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）（ＡＴＣＣから入手可能）を使用することが好ましい。融
合後、生じたハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地にて選択的に維持し、ついで、
Ｗａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５〜２３２（１
９８１））により記載されるように、限界希釈によってクローン化する。ついで
、このような選択を介して得たハイブリドーマ細胞をアッセイして、ニューロペ
プチドレセプターポリペプチドを結合し得る抗体を分泌するクローンを同定する
。
【０８５９】 あるいは、ニューロペプチドレセプターポリペプチドに結合し得るさらなる抗
体を、抗イディオタイプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。
このような方法は、抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する
抗体を得ることが可能であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパ
ク質特異的抗体を使用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、
このような動物の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、
このハイブリドーマ細胞は、ニューロペプチドレセプタータンパク質特異的抗体
に結合する能力がニューロペプチドレセプターによってブロックされ得る抗体を
産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、
ニューロペプチドレセプタータンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗
体を含み、そして動物を免疫してさらなるニューロペプチドレセプタータンパク
質特異的抗体の形成を誘導するために使用される。
【０８６０】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、抗体は、「ヒト化」される。この
ような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来
する遺伝的構築物を使用することによって産生され得る。キメラ抗体およびヒト
化抗体を産生するための方法は当該分野で公知であり、そして本明細書に議論さ
れる（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２
（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）
；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら
、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅ
ｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７
１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅ
ｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）
。
【０８６１】 （ｂ）ｓｃＦｖのライブラリーからのニューロペプチドレセプターポリペプチ
ドに対して指向される抗体フラグメントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、ニューロペプチドレセプ
ター（ドナーは、これらに対して曝露されていても曝露されていなくともよい）
に対する反応性を含む抗体フラグメントのライブラリーに構築する（例えば、米
国特許第５，８８５，７９３号（その全体が参考として本明細書に援用される）
を参照のこと）。
【０８６２】 （ライブラリーのレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）） ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／０１０４７に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡから
ｓｃＦｖのライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージをレ
スキューするため、ファージミドを保有する約１０９個のＥ．ｃｏｌｉを用いて
、５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を接種し、そして振盪しながら０．
８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ
−ＡＭＰ−ＧＬＵに接種し、２×１０８ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３Δ遺
伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を添加し、そして
培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しながら３
７℃で４５分間インキュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ
．で遠心分離し、そしてペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌア
ンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し、そし
て一晩増殖させる。ファージをＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７に記載のように
調製する。
【０８６３】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質
を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖さ
せることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪な
しで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時
間インキュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００ｒ
．ｐ．ｍ．で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／
ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）３
００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファージ
粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培地か
ら精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフィル
ター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０１
３形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。
【０８６４】 （ライブラリーのパニング） Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明のポリペプチドの１００μｇ
／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩コーテ
ィングする。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロ
ックし、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０１３ＴＵのファージをチューブ
に適用し、そして、回転盤上で上下にタンブリングしながら室温で３０分間イン
キュベートし、次いでさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ ０．
１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１０
０ｍＭトリエチルアミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させる
ことによりファージを溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌と
ともに３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１
０ｍｌの対数増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏ
ｌｉを１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプ
レート上にプレーティングする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記の
ようにΔ遺伝子３ヘルパーファージでレスキューし、次の回の選択のためのファ
ージを調製する。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回につい
て反復し、３回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ
−２０で２０回、そしてＰＢＳで２０回に増加する。
【０８６５】 （バインダーの特徴付け） 第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．
６中の本発明のポリペプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかでコーティングしたマ
イクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実施する。ＥＬＩＳＡにおける陽
性クローンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／
０１０４７を参照のこと）、次に配列決定することによりさらに特徴付ける。こ
れらのＥＬＩＳＡ陽性クローンはまた、当業者に公知の技術によってさらに特徴
付けされ得る（例えば、エピトープマッピング、結合アフィニティー、レセプタ
ーシグナル変換、抗体／抗原結合をブロックするか、または競合的に阻害する能
力、および競合的なアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性）。
【０８６６】 （実施例１２：ハイスループットスクリーニングアッセイのためのニューロペ
プチドレセプタータンパク質の産生） 以下のプロトコルは、試験されるべきニューロペプチドレセプターポリぺプチ
ドを含有する上清を産生する。次いで、この上清は、実施例１４〜２１記載され
るスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。
【０８６７】 第一に、ポリ−Ｄ−リジン（６４４ ５８７ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）ストック溶液（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（カルシウム
もマグネシウムも含まない１７−５１６Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で１
：２０に希釈して、作業溶液５０μｇ／ｍｌにする。２００μｌのこの溶液を、
各ウェル（２４ウェルプレート）に添加し、そして室温で２０分間インキュベー
トする。溶液を各ウェルにわたって分配させることを確実にする（注：１２チャ
ンネルピペッターは、１つおきのチャンネルにチップをつけて使用され得る）。
ポリ−Ｄ−リジン溶液を吸引除去し、そして１ｍｌ ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理
食塩水）でリンスする。ＰＢＳは、細胞をプレートする直前までウェル中に残す
べきであり、そしてプレートは２週間前までに予めポリリジンでコーティングし
得る。
【０８６８】 ２９３Ｔ細胞（Ｐ＋２０を過ぎて細胞を保有しない）を、２×１０５細胞／ウ
ェルで、０．５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）（４．
５Ｇ／ＬのグルコースおよびＬ−グルタミン（１２−６０４Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔ
ｔａｋｅｒ）を含む）／１０％熱非働化ＦＢＳ（１４−５０３Ｆ Ｂｉｏｗｈｉ
ｔｔａｋｅｒ）／１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（１７−６０２Ｅ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａ
ｋｅｒ）中にプレートする。細胞を一晩増殖させる。
【０８６９】 翌日、滅菌溶液容器（ｂａｓｉｎ）中で、３００μｌリポフェクトアミン（１
８３２４−０１２ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）および５ｍｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ（
３１９８５０７０ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）／９６ウェルプレートを、一緒に混合
する。小容量のマルチチャンネルピペッターを用いて、実施例８〜１０に記載す
る方法によって産生されたポリヌクレオチド挿入物を含有する約２μｇの発現ベ
クターを、適切に標識された９６ウェルの丸底プレート中にアリコートする。マ
ルチチャンネルピペッターを用いて、５０μｌのリポフェクトアミン／Ｏｐｔｉ
ｍｅｍ Ｉ混合物を各ウェルに添加する。ピペットで緩やかに吸い上げたり下げ
たりして混合する。室温で１５〜４５分間インキュベートする。約２０分後、マ
ルチチャンネルピペッターを使用して１５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ Ｉを各ウェ
ルに添加する。コントロールとして、挿入物を欠失するベクターＤＮＡの１つの
プレートは、トランスフェクションの各セットでトランスフェクトされるべきで
ある。
【０８７０】 好ましくは、トランスフェクションは、以下の作業をタッグチームを組んで（
ｔａｇ−ｔｅａｍｉｎｇ）行うべきである。タッグチームを組むことによって、
時間に関する労力は半減され、そして細胞にはＰＢＳ上であまり多くの時間を過
ごさせない。まず、Ａさんは、培地を細胞の４つの２４ウェルプレートから吸引
除去し、次いでＢさんが０．５〜１ｍｌのＰＢＳで各ウェルをリンスする。次い
で、Ａさんは、ＰＢＳリンスを吸引除去し、そしてＢさんは、チャンネル１つお
きにチップのついた１２チャンネルピペッターを使用して、２００μｌのＤＮＡ
／リポフェクトアミン／Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ複合体を、まず奇数のウェルに、次
いで偶数のウェルにと、２４ウェルプレート上の各列に添加する。３７℃で６時
間インキュベートする。
【０８７１】 細胞をインキュベートする間に、１×ペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）を
有するＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡか、またはＣＨＯ−５培地（１１６．６ｍｇ／Ｌ
のＣａＣｌ２（無水物）；０．００１３０ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ；０
．０５０ｍｇ／ＬのＦｅ（ＮＯ３）３−９Ｈ２Ｏ；０．４１７ｍｇ／ＬのＦｅＳ
Ｏ４−７Ｈ２Ｏ；３１１．８０ｍｇ／ＬのＫＣｌ；２８．６４ｍｇ／ＬのＭｇＣ
ｌ２；４８．８４ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ４；６９９５．５０ｍｇ／ＬのＮａＣｌ；
２４００．０ｍｇ／ＬのＮａＨＣＯ３；６２．５０ｍｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４−
Ｈ２Ｏ；７１．０２ｍｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４；０．４３２０ｍｇ／ＬのＺｎＳ
Ｏ４−７Ｈ２Ｏ；０．００２ｍｇ／Ｌのアラキドン酸；１．０２２ｍｇ／Ｌのコ
レステロール；０．０７０ｍｇ／ＬのＤＬ−α−酢酸トコフェロール；０．０５
２０ｍｇ／Ｌのリノール酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのリノレン酸；０．０１０ｍｇ
／Ｌのミリスチン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのオレイン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌの
パルミトオレイン酸（ｐａｌｍｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）；０．０１０ｍｇ／Ｌの
パルミチン酸；１００ｍｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；０．０１０ｍｇ
／Ｌのステアリン酸；２．２０ｍｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０；４５５１ｍｇ／Ｌの
Ｄ−グルコース；１３０．８５ｍｇ／ｍｌのＬ−アラニン；１４７．５０ｍｇ／
ｍｌのＬ−アルギニン−ＨＣｌ；７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン−Ｈ２
Ｏ；６．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン酸；２９．５６ｍｇ／ｍｌのＬ−シ
スチン２ＨＣｌ−Ｈ２Ｏ；３１．２９ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン−２ＨＣｌ；７
．３５ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン酸；３６５．０ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン
；１８．７５ｍｇ／ｍｌのグリシン；５２．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン−
ＨＣｌ−Ｈ２Ｏ；１０６．９７ｍｇ／ｍｌのＬ−イソロイシン；１１１．４５ｍ
ｇ／ｍｌのＬ−ロイシン；１６３．７５ｍｇ／ｍｌのＬ−リジンＨＣｌ；３２．
３４ｍｇ／ｍｌのＬ−メチオニン；６８．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−フェニルアラニ
ン；４０．０ｍｇ／ｍｌのＬ−プロリン；２６．２５ｍｇ／ｍｌのＬ−セリン；
１０１．０５ｍｇ／ｍｌのＬ−スレオニン；１９．２２ｍｇ／ｍｌのＬ−トリプ
トファン；９１．７９ｍｇ／ｍｌのＬ−チロシン（Ｔｒｙｒｏｓｉｎｅ）−２Ｎ
ａ−２Ｈ２Ｏ；９９．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−バリン；０．００３５ｍｇ／Ｌのビ
オチン；３．２４ｍｇ／ＬのＤ−Ｃａパントテン酸；１１．７８ｍｇ／Ｌの塩化
コリン；４．６５ｍｇ／Ｌの葉酸；１５．６０ｍｇ／Ｌのｉ−イノシトール；３
．０２ｍｇ／Ｌのナイアシンアミド；３．００ｍｇ／ＬのピリドキサールＨＣｌ
；０．０３１ｍｇ／ＬのピリドキシンＨＣｌ；０．３１９ｍｇ／Ｌのリボフラビ
ン；３．１７ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌ；０．３６５ｍｇ／Ｌのチミジン；およ
び０．６８０ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２；２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤；２．３
９ｍｇ／ＬのＮａヒポキサンチン；０．１０５ｍｇ／Ｌのリポ酸；０．０８１ｍ
ｇ／Ｌのプトレシンナトリウム−２ＨＣｌ；５５．０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナト
リウム；０．００６７ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム；２０μＭのエタノール
アミン；０．１２２ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄；４１．７０ｍｇ／Ｌのリノール
酸と複合体化したメチル−Ｂ−シクロデキストリン；３３．３３ｍｇ／Ｌのオレ
イン酸と複合体化したメチル−Ｂ−シクロデキストリン；ならびに１０ｍｇ／Ｌ
のレチナールと複合体化したメチル−Ｂ−シクロデキストリン）のいずれかの適
切な培地を調製する。２ｍＭグルタミンおよび１×ペンストレップを用いて、浸
透圧を３２０ｍＯｓｍに調整する。（１０％ＢＳＡストック溶液のために、１Ｌ
ＤＭＥＭ中にＢＳＡ（８１−０６８−３ Ｂａｙｅｒ）１００ｇを溶解した）
。培地を濾過し、そして５０μｌを内毒素アッセイのために１５ｍｌポリスチレ
ンコニカル中に収集する。
【０８７２】 トランスフェクション反応を、好ましくはタッグチームを組んでインキュベー
ション時間の終わりに終結させる。Ａさんは、トランスフェクション培地を吸引
除去し、その間Ｂさんは、１．５ｍｌの適切な培地を各ウェルに添加する。使用
された培地に依存して４５時間または７２時間、３７℃でインキュベートする：
１％ＢＳＡは４５時間、またはＣＨＯ−５は７２時間。
【０８７３】 ４日目に、３００μｌのマルチチャンネルピペッターを使用して、６００μｌ
を１ｍｌの深底ウェルプレート１枚にアリコートし、そして残りの上清を２ｍｌ
の深底ウェルにアリコートする。次いで、各ウェルからの上清を実施例１４〜２
１に記載するアッセイにおいて使用し得る。
【０８７４】 活性が、上清を使用して以下に記載する任意のアッセイにおいて得られる場合
、この活性は、ニューロペプチドレセプターポリぺプチドから直接に（例えば、
分泌タンパク質として）か、または他のタンパク質の発現を誘導するニューロペ
プチドレセプターによって（これは、次いで上清中に分泌される）のいずれかに
由来することが特に理解される。従って、本発明はさらに、特定のアッセイにお
ける活性によって特徴づけられる上清中のタンパク質を同定する方法を提供する
。
【０８７５】 （実施例１３：ＧＡＳレポーター構築物の構築） 細胞の分化および増殖に関与する１つのシグナル伝達経路は、Ｊａｋ−ＳＴＡ
Ｔ経路と呼ばれる。Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路の活性化タンパク質は、多くの遺伝子
のプロモーターに位置する、γ活性化部位「ＧＡＳ」エレメントまたはインター
フェロン感受性応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）に結合する。これらのエレメン
トに対するタンパク質の結合は、関連する遺伝子の発現を変化させる。
【０８７６】 ＧＡＳおよびＩＳＲＥエレメントは、転写のシグナルトランスデューサーおよ
びアクチベーター、すなわち「ＳＴＡＴ」と呼ばれる転写因子のクラスによって
認識される。ＳＴＡＴファミリーには６つのメンバーが存在する。Ｓｔａｔ１お
よびＳｔａｔ３は、Ｓｔａｔ２と同様に（ＩＦＮαに対する応答が広範であるよ
うに）、多くの細胞型において存在する。Ｓｔａｔ４は、より限定されており、
そして多くの細胞型には存在しないが、ＩＬ−１２での処理後のＴヘルパークラ
スＩ細胞に見出されている。Ｓｔａｔ５は、元々は乳房成長因子と呼ばれたが、
骨髄細胞を含む他の細胞においてより高い濃度で見出されている。それは、多く
のサイトカインによって組織培養細胞において活性化され得る。
【０８７７】 ＳＴＡＴは活性化されて、Ｊａｎｕｓ Ｋｉｎａｓｅ（「Ｊａｋ」）ファミリ
ーとして知られる１セットのキナーゼによるチロシンリン酸化に際して細胞質か
ら核へ移動する。Ｊａｋは、可溶性のチロシンキナーゼの独特のファミリーを表
し、そしてＴｙｋ２、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＪａｋ３を含む。これらのキ
ナーゼは、有意な配列類似性を示し、そして一般には休止細胞において触媒的に
不活性である。
【０８７８】 Ｊａｋは、以下の表によって要約されるように広範なレセプターによって活性
化される（ＳｃｈｉｄｌｅｒおよびＤａｒｎｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．６４：６２１−５１（１９９５）による総説から改変）。Ｊａｋを活性
化し得るサイトカインレセプターファミリーは、２つの群に分けられる：（ａ）
クラス１は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、
ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｅｐｏ、ＰＲＬ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびトロンボポエチンについてのレセプター
を含み；そして（ｂ）クラス２は、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−ｇ、およびＩＬ−１０
を含む。クラス１レセプターは、保存されたシステインモチーフ（４つの保存さ
れたシステインおよび１つのトリプトファンのセット）、およびＷＳＸＷＳモチ
ーフ（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（配列番号１４）をコードする
膜近接領域）を共有する。
【０８７９】 従って、リガンドのレセプターへの結合の際に、Ｊａｋは活性化され、これは
次いでＳＴＡＴを活性化し、これは、次いで移動し、そしてＧＡＳエレメントに
結合する。この全プロセスは、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に包含される
。
【０８８０】 それゆえ、ＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントの結合によって反映されるＪａｋ
−ＳＴＡＴ経路の活性化は、細胞の増殖および分化に関与するタンパク質を示す
ために使用され得る。例えば、成長因子およびサイトカインは、Ｊａｋ−ＳＴＡ
Ｔ経路を活性化することが知られている（以下の表を参照のこと）。従って、レ
ポーター分子に連結したＧＡＳエレメントを使用することにより、Ｊａｋ−ＳＴ
ＡＴ経路のアクチベーターが同定され得る。
【０８８１】
【表２】 実施例１４〜１５に記載される生物学的アッセイにおいて使用されるプロモー
ターエレメントを含む合成ＧＡＳを構築するために、ＰＣＲに基づいたストラテ
ジーを用いてＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター配列を産生する。５’プライマーは
、ＩＲＦ１プロモーターにおいて見出され、そして一定の範囲のサイトカインを
用いる誘導の際にＳＴＡＴに結合することが以前に証明されたＧＡＳ結合部位の
４つの直列のコピーを含むが（Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４５
７−４６８（１９９４））、他のＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントを代わりに使
用し得る。５’プライマーはまた、ＳＶ４０初期プロモーター配列に対して相補
的な１８ｂｐの配列も含み、そしてＸｈｏＩ部位に隣接する。５’プライマーの
配列は以下である： ５’：ＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＴＣＣ
ＣＣＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＡ
ＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧ：３’（配列番号１５）。
【０８８２】 下流プライマーはＳＶ４０プロモーターに対して相補的であり、そしてＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列
番号１６）。
【０８８３】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したＢ−ｇａｌ：プロモータープラ
スミド中に存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを用いて実施する。得
られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いて消化し、そし
てＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。正方向およ
び逆方向のプライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むこと
を確認する： ５’：ＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡ
ＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＡＴＣＴＧ
ＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＡＧＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴ
ＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣ
ＣＧＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＡＴＴＴＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡ
ＧＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧ
ＣＣＴＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴ：３’（配列番号１７）。
【０８８４】 次に、ＳＶ４０プロモーターに結合したこのＧＡＳプロモーターエレメントを
用いて、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ２レポーター構築物を操作する。ここで、レポーター
分子は、分泌アルカリホスファターゼ、すなわち「ＳＥＡＰ」である。しかし、
明らかに、この実施例または他の実施例のいずれにおいても、任意のレポーター
分子が、ＳＥＡＰの代わりとなり得る。ＳＥＡＰの代わりに使用され得る周知の
レポーター分子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（
ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、
グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または抗体により検出可能な任意のタンパ
ク質が挙げられる。
【０８８５】 合成ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーターエレメントと確認された上記の配列を、Ｇ
ＡＳ−ＳＥＡＰベクターを作製するために、ＳＶ４０プロモーターを、増幅した
ＧＡＳ：ＳＶ４０プロモーターエレメントで効率的に置換し、ＨｉｎｄＩＩＩお
よびＸｈｏＩを用いて、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＳＥＡＰ−プロモータ
ーベクターにサブクローニングする。しかし、このベクターはネオマイシン耐性
遺伝子を含まず、それゆえ、哺乳動物の発現系には好ましくない。
【０８８６】 従って、ＧＡＳ−ＳＥＡＰレポーターを発現する哺乳動物の安定な細胞株を作
製するために、ＧＡＳ−ＳＥＡＰカセットを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて
ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターから取り出し、そしてＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベク
ターを作製するために、マルチクローニング部位におけるこれらの制限部位を用
いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含むバックボーンベクター（例えば、ｐＧＦＰ
−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に挿入する。一旦、このベクターを哺乳動物細胞に
トランスフェクトすれば、次いでこのベクターは、実施例１４〜１５に記載され
るようにＧＡＳ結合についてのレポーター分子として使用され得る。
【０８８７】 他の構築物を、上記の記載を使用し、そしてＧＡＳを異なるプロモーター配列
で置換して、作製し得る。例えば、ＮＦＫ−ＢおよびＥＧＲプロモーター配列を
含むレポーター分子の構築を、実施例１６および１７に記載する。しかし、多く
の他のプロモーターをこれらの実施例に記載のプロトコルを使用して置換し得る
。例えば、ＳＲＥ、ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、またはオステオカルシンのプロモータ
ーを単独で、または組み合わせて（例えば、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ／ＥＧＲ、ＧＡ
Ｓ／ＮＦ−ＫＢ、Ｉｌ−２／ＮＦＡＴ、もしくはＮＦ−ＫＢ／ＧＡＳ）置換し得
る。同様に、他の細胞株（例えば、ＨＥＬＡ（上皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（内皮細
胞）、Ｒｅｈ（Ｂ細胞）、Ｓａｏｓ−２（骨芽細胞）、ＨＵＶＡＣ（大動脈細胞
）、または心筋細胞）を、レポーター構築物の活性を試験するために使用し得る
。
【０８８８】 （実施例１４：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを、ニューロペプチドレセプター上清がＴ細胞を増殖および
／または分化させるかどうかを決定することにより、ニューロペプチドレセプタ
ーのＴ細胞の活性を評価するために使用する。Ｔ細胞の活性を実施例１３で作製
したＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性
を増加させる因子は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化する能力を示
す。このアッセイに使用したＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番
号ＴＩＢ−１５２）であるが、Ｍｏｌｔ−３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１
５５２）およびＭｏｌｔ−４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８２）細胞も
また使用し得る。
【０８８９】 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、リンパ芽球性ＣＤ４＋ Ｔｈ１ヘルパー細胞である
。安定な細胞株を作製するために、およそ２００万のＪｕｒｋａｔ細胞をＤＭＲ
ＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ
／ｎｅｏベクターでトランスフェクト（以下に記載のトランスフェクション手順
）する。トランスフェクトした細胞を、およそ２０，０００細胞／ウェルの密度
で播種し、そして１ｍｇ／ｍｌのゲンチシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）に対して耐性
であるトランスフェクト体を選択する。耐性コロニーを増殖させ、次いで、漸増
する濃度のインターフェロンγに対するそれらの応答について試験する。選択し
たクローンの用量応答を示す。
【０８９０】 詳細には、以下のプロトコルにより、２００μｌの細胞を含む７５のウェルに
ついて十分な細胞を得る。従って、複数の９６ウェルプレートについて十分な細
胞を産生するために、スケールアップするか、または複数で実施するかのいずれ
かである。Ｊｕｒｋａｔ細胞を１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを有するＲＰＭＩ＋１
０％血清中で維持する。Ｔ２５フラスコ中で２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０μｇのプラスミドＤＮＡとを組み合
わせる。５０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃを含む２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを添加
し、そして、室温で１５〜４５分間インキュベートする。
【０８９１】 インキュベート時間の間、細胞濃度をカウントし、必要な細胞数（トランスフ
ェクションあたり１０７個）をスピンダウンし、そして最終濃度が１０７細胞／
ｍｌとなるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で再懸濁する。次いで、１ｍｌのＯＰＴＩ
−ＭＥＭ中の１×１０７個の細胞をＴ２５フラスコに加え、そして３７℃で６時
間インキュベートする。インキュベーションの後、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％
の血清を添加する。
【０８９２】 Ｊｕｒｋａｔ：ＧＡＳ−ＳＥＡＰ安定レポーター株をＲＰＭＩ＋１０％血清、
１ｍｇ／ｍｌゲンチシン、および１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。これ
らの細胞を実施例１２に記載されるプロトコルにより産生されるようなニューロ
ペプチドレセプターポリペプチドまたはニューロペプチドレセプター誘導ポリペ
プチドを含む上清で処理する。
【０８９３】 上清での処理日に細胞を洗浄すべきであり、そして１ｍｌあたり５００，００
０個の細胞密度となるように新鮮なＲＰＭＩ＋１０％血清中に再懸濁するべきで
ある。必要な細胞の正確な数は、スクリーニングされる上清の数に依存する。１
枚の９６ウェルプレートについて、およそ１０００万個の細胞（１０枚のプレー
トについて１億個の細胞）を必要とする。
【０８９４】 細胞を、１２チャンネルのピペットを用いて９６ウェルのディッシュに分与す
るために、三角のリザーバーボートに細胞を移す。２００μｌの細胞を、１２チ
ャンネルのピペットを用いて、それぞれのウェルに移す（従って、ウェル当たり
１００，０００個の細胞を添加する）。
【０８９５】 全てのプレートに播種した後、５０μｌの上清を、１２チャンネルピペットを
用いて、上清を含む９６ウェルプレートから各ウェルに直接的に移す。さらに、
外来性のインターフェロンγの用量（０．１、１．０、１０ｎｇ）を、ウェルＨ
９、ウェルＨ１０、およびウェルＨ１１に添加し、アッセイについてのさらなる
陽性コントロールとして供する。
【０８９６】 上清で処理したＪｕｒｋａｔ細胞を含む９６ウェルディッシュをインキュベー
ター中に４８時間置く（注：この時間は４８〜７２時間の間で変更可能である）
。次いで、各ウェルから３５μｌのサンプルを、１２チャンネルのピペットを用
いて、不透明な９６ウェルプレートに移す。不透明なプレートを（セロファンの
カバーを用いて）覆うべきであり、そして実施例１８に従うＳＥＡＰアッセイを
行うまで、−２０℃で保存する。残存する処理した細胞を含むプレートを４℃に
置き、そして、所望するならば、特定のウェル上でのアッセイを繰り返すための
物質の供給源として供する。
【０８９７】 陽性コントロールとして、１００ユニット／ｍｌのインターフェロンγを使用
し得、これは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を活性化することが公知である。代表的に
は、３０倍を超える誘導が、陽性コントロールのウェルにおいて観察される。
【０８９８】 （実施例１５：骨髄性の活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを、ニューロペプチドレセプターが骨髄性細胞を増殖または
分化させるかどうかを決定することによりニューロペプチドレセプターの骨髄性
の活性を評価するために使用する。骨髄性細胞の活性を実施例１３において産生
されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活
性を増加させる因子は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化させる能力
を示す。このアッセイに使用された骨髄性細胞は、Ｕ９３７（前単球（ｐｒｅ−
ｍｏｎｏｃｙｔｅ）細胞株）であるが、ＴＦ−１、ＨＬ６０、またはＫＧ１も使
用し得る。
【０８９９】 Ｕ９３７細胞を、実施例１３において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構
築物で、一過性にトランスフェクトするために、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（
Ｋｈａｒｂａｎｄａら、１９９４，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ，５：２５９−２６５）を用いる。最初に、２×１０ｅ７個
のＵ９３７細胞を収集し、そしてＰＢＳで洗浄する。Ｕ９３７細胞を、通常、１
００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン
を補充した１０％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培
地中で増殖させる。
【０９００】 次に、０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、８μｇのＧＡＳ−ＳＥ
ＡＰ２プラスミドＤＮＡ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３７５μＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および６７５μＭ ＣａＣ
ｌ２を含む１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液に細胞
を懸濁する。３７℃で４５分間インキュベートする。
【０９０１】 １０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を洗浄し、次いで、１０
ｍｌの完全培地に再懸濁し、そして３７℃で３６時間インキュベートする。
【０９０２】 ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｕ９３７安定細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細
胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を使用して、慣用的に
増殖させるが、１〜２ヶ月毎に細胞を二継代の間、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８
中で再増殖させるべきである。
【０９０３】 これらの細胞を１×１０8個の細胞を収集すること（これは１０枚の９６ウェ
ルプレートアッセイのために十分である）により試験し、そしてＰＢＳで洗浄す
る。上記の２００ｍｌの増殖培地中に、５×１０5細胞／ｍｌの最終密度で細胞
を懸濁する。９６ウェルプレートにおいてウェルあたり２００μｌの細胞をプレ
ートする（すなわち、１×１０5細胞／ウェル）。
【０９０４】 実施例１２に記載されるプロトコルにより調製された上清を５０μｌ添加する
。３７℃で４８〜７２時間インキュベートする。陽性コントロールとして、１０
０ユニット／ｍｌのインターフェロンγを使用し得、これはＵ９３７細胞を活性
化させることが公知である。代表的には、３０倍を超える誘導が、陽性コントロ
ールウェルにおいて観察される。ＳＥＡＰは、実施例１８に記載のプロトコルに
従って上清をアッセイする。
【０９０５】 （実施例１６：ニューロン活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ
） 細胞が分化および増殖を経る場合、一群の遺伝子が多くの異なるシグナル伝達
経路を介して活性化される。これらの遺伝子の１つであるＥＧＲ１（初期増殖応
答遺伝子１）は、活性化時に種々の組織および細胞型において誘導される。ＥＧ
Ｒ１のプロモーターはこのような誘導を担う。レポーター分子に連結したＥＧＲ
１プロモーターを使用して、ニューロペプチドレセプターによって細胞の活性化
を評価し得る。
【０９０６】 詳細には、以下のプロトコルをＰＣ１２細胞株におけるニューロン活性を評価
するために使用する。ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫（ｐｈｅｎｏｃｈｒｏｍ
ｏｃｙｔｏｍａ）の細胞）は、多くのマイトジェン（例えば、ＴＰＡ（テトラデ
カノイルホルボールアセテート）、ＮＧＦ（神経発育因子）、およびＥＧＦ（上
皮増殖因子））での活性化により増殖および／または分化することが公知である
。この処理の間にＥＧＲ１遺伝子発現を活性化する。従って、ＳＥＡＰレポータ
ーに連結したＥＧＲプロモーターを含む構築物でＰＣ１２細胞を安定にトランス
フェクトすることにより、ニューロペプチドレセプターによってＰＣ１２細胞の
活性化を評価し得る。
【０９０７】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰレポーター構築物を以下のプロトコルにより組み立て得る。
ＥＧＲ−１プロモーター配列（−６３３〜＋１）（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋら、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ ６：８６７−８７１（１９９１））を以下のプライマーを用い
て、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し得る： ５’ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＡＴＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧ−３
’（配列番号１８） ５’ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＣＴＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣ−３’
（配列番号１９）。
【０９０８】 次いで、実施例１３において作製したＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを使
用して、ＥＧＲ１増幅産物をこのベクターに挿入し得る。制限酵素ＸｈｏＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩを使用してＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを線状化し、ＧＡＳ
／ＳＶ４０スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を取り除く。これらの同じ酵素を用
いて、ＥＧＲ１増幅産物を制限処理する。ベクターとＥＧＲ１プロモーターとを
連結する。
【０９０９】 細胞培養のための９６ウェルプレートを調製するために、コーティング溶液（
コラーゲンＩ型（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ． カタログ番号０
８−１１５）の、３０％エタノール（滅菌濾過）での１：３０希釈）を、１つの
１０ｃｍプレートあたり２ｍｌ、または９６ウェルプレートの１ウェルあたり５
０ｍｌ添加し、そして２時間風乾させる。
【０９１０】 ＰＣ１２細胞を、予めコートした１０ｃｍ組織培養ディッシュ上で、ペニシリ
ン（１００ユニット／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を
補充した、１０％ウマ血清（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カタログ番号１
２４４９−７８Ｐ）、５％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１
６４０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で慣用的に増殖させる。１つから
４つへの分割を３〜４日毎に行う。細胞を掻き取ることによりプレートから取り
出し、そして１５回より多く上下にピペッティングして再懸濁する。
【０９１１】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を、実施例１２に記載のリポフェクタミン（
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）プロトコルを使用して、ＰＣ１２にトランスフェ
クトする。ＥＧＲ−ＳＥＡＰ／ＰＣ１２の安定な細胞を、３００μｇ／ｍｌのＧ
４１８中で細胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を慣用的
増殖のために使用するが、１〜２ヶ月毎に、細胞を２継代の間、３００μｇ／ｍ
ｌのＧ４１８中で再増殖させるべきである。
【０９１２】 ニューロン活性をアッセイするために、およそ７０〜８０％コンフルエントで
ある細胞を有する１０ｃｍプレートを、古い培地を除去することによりスクリー
ニングする。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）を用いて１回洗浄する。
次いで、細胞を低血清培地（抗生物質とともに１％ウマ血清および０．５％ Ｆ
ＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）中で一晩、飢餓させる。
【０９１３】 翌朝、培地を除去し、そしてＰＢＳで細胞を洗浄する。プレートから細胞を掻
き取り、細胞を２ｍｌの低血清培地中でよく懸濁する。細胞数をカウントし、そ
してより低血清の培地に添加し、５×１０５細胞／ｍｌの最終細胞密度に到達さ
せる。
【０９１４】 ２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加する（１×１
０５細胞／ウェルに等しい）。実施例１２により産生された５０μｌの上清を、
３７℃で４８〜７２時間加える。陽性コントロールとして、ＥＧＲを通してＰＣ
１２細胞を活性化することが公知の増殖因子（例えば、５０ｎｇ／μｌの神経発
育因子（ＮＧＦ））を使用し得る。代表的には、５０倍を超えるＳＥＡＰ誘導が
陽性コントロールウェルにおいて見られる。ＳＥＡＰは実施例１８に従って、上
清をアッセイする。
【０９１５】 （実施例１７：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） ＮＦ−ΚＢ（核因子κＢ）は、広範な種々の薬剤（炎症性サイトカインである
ＩＬ−１およびＴＮＦ、ＣＤ３０およびＣＤ４０、リンホトキシン−αおよびリ
ンホトキシン−βを含む）により、ＬＰＳまたはトロンビンへの曝露により、な
らびに特定のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される転写因子である。転
写因子として、ＮＦ−κＢは免疫細胞の活性化に関与する遺伝子の発現、アポト
ーシスの制御（ＮＦ−κＢは、アポトーシスから細胞を保護すると思われる）、
Ｂ細胞およびＴ細胞の発生、抗ウイルス応答および抗菌応答、ならびに複数のス
トレス応答を調節する。
【０９１６】 刺激されない条件において、ＮＦ−κＢは、Ｉ−κＢ（インヒビターκＢ）を
有する細胞質に保持される。しかし、刺激の際に、Ｉ−κＢはリン酸化され、そ
して分解（ｄｅｇｒａｄｅ）され、ＮＦ−κＢの核への往復（ｓｈｕｔｔｌｅ）
を引き起こし、これにより標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−κＢにより活
性化される標的遺伝子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ
−１およびクラス１ＭＨＣが挙げられる。
【０９１７】 その中心的な役割および一定の範囲の刺激に応答する能力に起因して、ＮＦ−
κＢプロモーターエレメントを利用するレポーター構築物を、実施例１２におい
て産生された上清をスクリーニングするために使用する。ＮＦ−κＢのアクチベ
ーターまたはインヒビターは、疾患の処置、診断、検出、および／または予防の
際に有用である。例えば、ＮＦ−κＢのインヒビターを、急性または慢性的なＮ
Ｆ−κＢの活性化に関連するこれらの疾患（例えば、慢性関節リウマチ）を処置
、診断、検出、および／または予防するために使用し得る。
【０９１８】 ＮＦ−κＢプロモーターエレメントを含むベクターを構築するために、ＰＣＲ
に基づいたストラテジーを用いる。上流のプライマーは、ＮＦ−κＢ結合部位（
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ）（配列番号２０）の４つの縦列コピー、ＳＶ４０初
期プロモーター配列の５’末端に対して相補的な１８ｂｐの配列を含み、そして
ＸｈｏＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡ
ＴＴＡＧ：３’（配列番号２１）。
【０９１９】 下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターの３’末端に対して相補的であり、
そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列
番号１６）。
【０９２０】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＢ−ｇａｌ：プロモータープ
ラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを使用して実行する。
得られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして
ＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。Ｔ７およびＴ
３プライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むことを確認す
る： ５’：ＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡ
ＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＣ
ＡＧＣＡＡＣＣＡＴＡＧＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＴＣＣＣ
ＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣ
ＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣ
ＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡ
ＧＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡ
ＡＡＡＧＣＴＴ：３’（配列番号２２）。
【０９２１】 次に、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＳＥＡＰ２−プロモータ
ープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＳＶ４０最小プロモーターエレメ
ントをこのＮＦ−κＢ／ＳＶ４０フラグメントと置換する。しかし、このベクタ
ーはネオマイシン耐性遺伝子を含まず、従って哺乳動物の発現系には好ましくな
い。
【０９２２】 安定な哺乳動物細胞株を作製するために、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカ
セットを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用して上記のＮＦ−κＢ／ＳＥＡ
Ｐベクターから取り出し、そしてネオマイシン耐性を含むベクターに挿入する。
特に、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を制限処理
した後に、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットをｐＧＦＰ−１に挿入し、
ＧＦＰ遺伝子を置換した。
【０９２３】 一旦、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製した後は、実
施例１４に記載のプロトコルに従って、安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を作製し、
そして維持する。同様に、これらの安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を含む上清をア
ッセイするための方法がまた、実施例１４に記載される。陽性コントロールとし
て、外因性のＴＮＦα（０．１、１、１０ｎｇ）をウェルＨ９、Ｈ１０、および
Ｈ１１に添加し、代表的には、５〜１０倍の活性化が観察される。
【０９２４】 （実施例１８：ＳＥＡＰ活性についてのアッセイ） 実施例１４〜１７に記載されるアッセイのためのレポーター分子として、ＳＥ
ＡＰ活性を、以下の一般的な手順に従ってＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉ
ｇｈｔ Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＰ−４００）を用いてアッセイする。Ｔｒｏｐ
ｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔは、以下で使用される希釈緩衝液、
アッセイ緩衝液、および反応緩衝液を供給する。
【０９２５】 ディスペンサーに２．５×希釈緩衝液を満たし、そして１５μｌの２．５×希
釈緩衝液を３５μｌの上清を含むオプティプレート（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）に分
与する。プラスチックシーラーでプレートをシールし、そして６５℃で３０分間
インキュベートする。一様でない加温を避けるためにオプティプレートを離して
おく。
【０９２６】 サンプルを室温まで１５分間冷却する。ディスペンサーを空にし、そしてアッ
セイ緩衝液で満たす。５０μｌのアッセイ緩衝液を添加し、そして室温で５分間
インキュベートする。ディスペンサーを空にし、そして反応緩衝液で満たす（以
下の表を参照のこと）。５０μｌの反応緩衝液を添加し、そして室温で２０分間
インキュベートする。化学発光シグナルの強度は時間依存的であり、そしてルミ
ノメーターで５つのプレートを読み取るために約１０分間を費やすので、各回で
５つのプレートを処理し、そして１０分後に２つ目のセットを開始するべきであ
る。
【０９２７】 ルミノメーターにおける相対的な光の単位（ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を読み取
る。ブランクとしてＨ１２をセットし、そして結果を印字する。化学発光の増加
は、レポーター活性を示す。
【０９２８】
【表３】 （実施例１９：低分子の濃度および膜透過性における変化を同定する高処理能
力スクリーニングアッセイ） レセプターへのリガンドの結合が、カルシウム、カリウム、ナトリウムのよう
な低分子およびｐＨの細胞内レベルを変化させ、ならびに膜電位を変化させるこ
とは公知である。これらの変化を特定細胞のレセプターに結合する上清の同定を
行うアッセイで測定し得る。以下のプロトコルは、カルシウムについてのアッセ
イを記載するが、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位、ま
たは蛍光プローブにより検出可能な任意の他の低分子における変化を検出するよ
うに容易に改変され得る。
【０９２９】 以下のアッセイは、蛍光定量画像化プレートリーダー（「ＦＬＩＰＲ」）を使
用して低分子と結合する蛍光分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）におけ
る変化を測定する。明らかに、低分子を検出する任意の蛍光分子が、本明細書で
用いられるカルシウム蛍光分子であるｆｌｕｏ−３の代わりに使用され得る。
【０９３０】 接着細胞については、細胞を１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルで、底
が清澄なＣｏ−ｓｔａｒ黒色９６ウェルプレートに播種する。プレートをＣＯ２
インキュベーター内で２０時間インキュベートする。接着細胞をＢｉｏｔｅｋ洗
浄器内で２００μｌのＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）で二回洗浄し、最後の
洗浄後、１００μｌの緩衝液を残す。
【０９３１】 １ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３のストック溶液を１０％プルロン酸（ｐｌｕｒｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）ＤＭＳＯ中に作製する。細胞にｆｌｕｏ−３を負荷するため
、１２μｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３（５０μｌ）を各ウェルに添加する。このプレ
ートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベートする。プレ
ートをＢｉｏｔｅｋ洗浄器で、ＨＢＳＳを用いて４回洗浄し、１００μｌの緩衝
液を残す。
【０９３２】 非接着細胞については、細胞を培養培地からスピンダウンする。細胞を、５０
ｍｌの円錐チューブ内でＨＢＳＳを用いて２〜５×１０６細胞／ｍｌに再懸濁す
る。細胞懸濁液１ｍｌにつき、１０％プルロン酸ＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｍｌのｆ
ｌｕｏ−３溶液４μｌを加える。次いで、チューブを３７℃の水浴中に３０〜６
０分間置く。細胞をＨＢＳＳで二回洗浄し、１×１０６細胞／ｍｌに再懸濁し、
そしてマイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分配する。プレートを１００
０ｒｐｍで５分間遠心分離する。次いで、プレートをＤｅｎｌｅｙ ＣｅｌｌＷ
ａｓｈ中で２００μｌで一回洗浄した後、吸引工程により最終容量を１００μｌ
にする。
【０９３３】 非細胞ベースのアッセイについては、各ウェルは、ｆｌｕｏ−３のような蛍光
分子を含有する。上清をウェルに添加し、そして蛍光変化を検出する。
【０９３４】 細胞内カルシウムの蛍光を測定するため、ＦＬＩＰＲを以下のパラメーターに
ついて設定する：（１）システムゲインは、３００〜８００ｍＷ；（２）曝露時
間は、０．４秒間；（３）カメラＦ／ストップは、Ｆ／２；（４）励起は４８８
ｎｍ；（５）放射は５３０ｎｍ；および（６）サンプル添加は５０μｌ。５３０
ｎｍにおける放射の増加は、細胞内Ｃａ＋＋濃度の増加を生じる、分子（ニュー
ロペプチドレセプターまたはニューロペプチドレセプターによって誘導される分
子のいずれか）によって生じる細胞外シグナル伝達事象を示す。
【０９３５】 （実施例２０：チロシンキナーゼ活性を同定する高処理能力スクリーニングア
ッセイ） プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、多様な群の膜貫通キナーゼおよび
細胞質キナーゼを表す。レセプタープロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）群
内に、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦおよびインスリンレセプター
サブファミリーを含む、一定の範囲のマイトジェン因子および代謝性増殖因子の
レセプターがある。さらに、対応するリガンドが未知である大きなＲＰＴＫファ
ミリーが存在する。ＲＰＴＫのリガンドは、主として分泌される低分子量タンパ
ク質を含むが、膜結合型および細胞外マトリックスタンパク質も含む。
【０９３６】 リガンドによるＲＰＴＫの活性化は、リガンド媒介レセプター二量体化に関与
し、レセプターサブユニットのリン酸基転移および細胞質チロシンキナーゼの活
性化を生じる。細胞質チロシンキナーゼとしては、ｓｒｃファミリー（例えば、
ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）のレセプター関連チロシンキナーゼ
、ならびにＪａｋファミリーのような非レセプター結合型および細胞質ゾルプロ
テインチロシンキナーゼが挙げられる。これらのメンバーは、サイトカインスー
パーファミリー（例えば、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ
およびレプチン）のレセプターによって誘発されるシグナル伝達を媒介する。
【０９３７】 チロシンキナーゼ活性を刺激し得る公知の因子は広範であるため、ニューロペ
プチドレセプターまたはニューロペプチドレセプターによって誘導される分子が
、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化し得るか否かの同定は興味深い。
従って、以下のプロトコルを設計して、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活
性化し得るそのような分子を同定する。
【０９３８】 標的細胞（例えば、初代ケラチノサイト）を約２５，０００細胞／ウェルの密
度で、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入した９６
ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅに播種す
る。プレートを１００％エタノールで２回、３０分間リンスして滅菌し、水でリ
ンスし、そして一晩乾燥させる。いくつかのプレートを、１００ｍｌの細胞培養
グレードＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）またはポリリジ
ン（５０ｍｇ／ｍｌ）（これらは全て、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る）で、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した１０％マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇ
ｅｌ）、あるいは仔ウシ血清で２時間コーティングし、ＰＢＳでリンスし、そし
て４℃で保存する。増殖培地に５，０００細胞／ウェルを播種し、製造業者のＡ
ｌａｍａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ
）が記載するように、ａｌａｍａｒＢｌｕｅを使用して４８時間後に細胞数を間
接的に定量することにより、これらのプレート上の細胞増殖をアッセイする。Ｂ
ｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＦａｌｃｏｎプレ
ートカバー＃３０７１を使用し、Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅ
ｅｎ Ｐｌａｔｅを被覆する。Ｆａｌｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ ＩＩＩ細胞
培養プレートはまた、いくつかの増殖実験において使用され得る。
【０９３９】 抽出物を調製するため、Ａ４３１細胞をＬｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイロ
ン膜上に播種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、そして完全培地内で一
晩培養する。細胞を無血清基本培地中で２４時間インキュベートして静止させる
。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）または実施例１２で生成した上清５０μｌで５〜２
０分間処理した後、培地を除去し、１００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０
．１％ＳＤＳ、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、２ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７およびＢｏｅｈ
ｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入
手したプロテアーゼインヒビターの混合物（＃１８３６１７０））を各ウェルに
添加し、そしてプレートを回転振盪器上にて４℃で５分間振盪する。次いで、プ
レートを真空トランスファーマニホルド（ｖａｃｕｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍ
ａｎｉｆｏｌｄ）に置き、そしてハウスバキュームを使用して抽出物を各ウェル
の底の０．４５ｍｍ膜を通して濾過する。抽出物をバキュームマニホルドの底の
９６ウェル捕獲／アッセイプレートに回収し、そして直ちに氷上に置く。遠心分
離により明澄化した抽出物を得るため、界面活性剤で５分間可溶化した後、各ウ
ェルの含有物を取り出し、そして４℃、１６，０００×ｇで１５分間遠心分離す
る。
【０９４０】 濾過抽出物をチロシンキナーゼ活性のレベルについて試験する。チロシンキナ
ーゼ活性を検出する多数の方法が公知であるが、本明細書においては１つの方法
を記載する。
【０９４１】 一般的に、特定の基質（ビオチン化ペプチド）上のチロシン残基をリン酸化す
る能力を決定することにより、上清のチロシンキナーゼ活性を評価する。この目
的に使用され得るビオチン化ペプチドとしては、ＰＳＫ１（細胞分裂キナーゼｃ
ｄｃ２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に対応）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミ
ノ酸１〜１７に対応）が挙げられる。両ペプチドは、一連のチロシンキナーゼの
基質であり、そしてＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能であ
る。
【０９４２】 以下の成分を順に添加することにより、チロシンキナーゼ反応を設定する。ま
ず、５μＭビオチン化ペプチド１０μｌを添加し、次いでＡＴＰ／Ｍｇ２＋（５
ｍＭ ＡＴＰ／５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）１０μｌ、次いで５×アッセイ緩衝液（
４０ｍＭ塩酸イミダゾール、ｐＨ７．３、４０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１
ｍＭ ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．５ｍｇ／
ｍｌ ＢＳＡ）１０μｌ、次いでバナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）５μｌ、最後
に水５μｌを加える。成分を穏やかに混合し、そして反応混合物を３０℃で２分
間プレインキュベートする。コントロール酵素または濾過上清１０μｌを加える
ことによって反応を開始させる。
【０９４３】 次いで、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ１０μｌを添加して反応物を氷上に置くことに
より、チロシンキナーゼアッセイ反応を停止させる。
【０９４４】 反応混合物の５０μｌのアリコートをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モ
ジュールに移し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、チロシンキ
ナーゼ活性を決定する。これにより、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａ
ｄｉｎ）コーティング９６ウェルプレートをビオチン化ペプチドと会合させる。
ＭＴＰモジュールを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、西洋ワ
サビペルオキシダーゼに結合した抗ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｏｔｙｒｏｓｉ
ｎｅ）抗体（抗Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））７５μｌを、各ウェル
に添加し、そして３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記のように洗
浄する。
【０９４５】 次に、ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）１００μｌを加え、室温で少なくとも５分間（最長３０分間）インキュベート
する。ＥＬＩＳＡリーダーを使用することにより、４０５ｎｍでのサンプルの吸
光度を測定する。結合したペルオキシダーゼ活性のレベルを、ＥＬＩＳＡリーダ
ーを使用して定量し、これはチロシンキナーゼ活性のレベルを反映する。
【０９４６】 （実施例２１：リン酸化活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 実施例２０に記載のプロテインチロシンキナーゼ活性のアッセイに可能性のあ
る代替物および／または補完物（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）として、主要な細胞内
シグナル伝達中間体の活性化（リン酸化）を検出するアッセイもまた使用し得る
。例えば、下記のように、一つの特定のアッセイは、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−
２キナーゼのチロシンリン酸化を検出し得る。しかし、Ｒａｆ、ＪＮＫ、ｐ３８
ＭＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ、筋肉
特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＩＲＡＫ、ＴｅｃおよびＪａｎｕｓのような他の
分子、ならびに他の任意のホスホセリン、ホスホチロシンまたはホスホトレオニ
ン分子のリン酸化を、以下のアッセイにおいてこれらの分子をＥｒｋ−１または
Ｅｒｋ−２について置換することにより検出し得る。
【０９４７】 詳細には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルをプロテインＧ（１μｇ／
ｍｌ）０．１ｍｌにより室温（ＲＴ）で２時間コーティングしてアッセイプレー
トを作製する。次いでプレートをＰＢＳでリンスし、そして３％ＢＳＡ／ＰＢＳ
によりＲＴで１時間ブロックする。次いでプロテインＧプレートをＥｒｋ−１お
よびＥｒｋ−２に対する２つの市販のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル
）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理（ＲＴで１時
間）する。（他の分子を検出するために、上記の任意の分子を検出するモノクロ
ーナル抗体を置換することにより、この工程を容易に改変し得る）。ＰＢＳで３
〜５回リンスした後、使用時まで、プレートを４℃で保存する。
【０９４８】 Ａ４３１細胞を２０，０００／ウェルで９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィル
タープレートに播種し、そして増殖培地中で一晩培養する。次いで、細胞を基本
培地（ＤＭＥＭ）中で４８時間飢餓させた後、次いでＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）
または実施例１２で得た上清５０μｌで５〜２０分間処理する。次いで、細胞を
可溶化し、そして抽出物をアッセイプレート内に直接濾過する。
【０９４９】 抽出物を用いてＲＴで１時間インキュベートした後、ウェルを再度リンスする
。陽性コントロールとして、市販のＭＡＰキナーゼ調製物（１０ｎｇ／ウェル）
をＡ４３１抽出物の代わりに使用する。次いで、プレートを、Ｅｒｋ−１および
Ｅｒｋ−２キナーゼのリン酸化エピトープを特異的に認識する市販のポリクロー
ナル（ウサギ）抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理する（ＲＴで１時間）。この抗体を
標準的な手順によりビオチン化する。次いで、結合したポリクローナル抗体をＷ
ａｌｌａｃ ＤＥＬＦＩＡ装置内でユーロピウムストレプトアビジンおよびユー
ロピウム蛍光増強剤と共に連続的にインキュベートする（時間分解性蛍光）こと
によって定量する。バックグラウンドを超える蛍光シグナルの増加は、ニューロ
ペプチドレセプターまたはニューロペプチドレセプターによって誘導される分子
によるリン酸化を示す。
【０９５０】 （実施例２２：ニューロペプチドレセプター遺伝子における変化の決定方法） 目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者から単離
されるＲＮＡを単離する。次いでｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分
野で公知のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。
次いでこのｃＤＮＡを、配列番号１における目的の領域を取り囲むプライマーを
用いるＰＣＲのテンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄ
ｒａｎｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）に記載の
緩衝溶液を使用し、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；およ
び７０℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルからなる。
【０９５１】 次いで、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐ
ｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、５’末端にＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。ニューロペ
プチドレセプターの選択したエキソンのイントロン−エキソン境界をまた決定し
、そしてゲノムＰＣＲ産物を分析してその結果を確認する。次いでニューロペプ
チドレセプターについて疑わしい変異を有するＰＣＲ産物をクローン化および配
列決定し、直接配列決定の結果を確認する。
【０９５２】 ニューロペプチドレセプターのＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎ，Ｔ．Ａ．および
Ｇｒａｈａｍ，Ｍ．Ｗ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１
９：１１５６（１９９１）に記載のようにＴテール（Ｔ−ｔａｉｌｅｄ）ベクタ
ーにクローン化し、そしてＴ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で配列決定する。罹患個体を、非罹患個体には存在しな
いニューロペプチドレセプターにおける変異により同定する。
【０９５３】 ゲノム再配置もまた、ニューロペプチドレセプター遺伝子における改変を決定
する方法として観察する。実施例２に従って単離したゲノムクローンを、ジゴキ
シゲニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈ
ｅｉｍ）を用いてニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃｇ．
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３５：７３−９９（１９９１）に
記載のようにＦＩＳＨを行う。ニューロペプチドレセプターのゲノムの遺伝子座
への特異的ハイブリダイゼーションのために、大過剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡ
を用いて標識プローブとのハイブリダイゼーションを行う。
【０９５４】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ｐｈｅｎｙｌｉｄｏ
ｌｅ）およびヨウ化プロピジウムで対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組合
せを生成する。正確なマッピングのための整列イメージを、三重バンドフィルタ
ーセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，Ｖ
Ｔ）と冷却電荷結合素子カメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａ
Ｚ）および可変励起波長フィルター（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃｖ．ら、Ｇｅｎｅｔ．
Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８：７５（１９９１））とを組合せて用いて
得る。ＩＳｅｅ Ｇｒａｐｈｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎ
ｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ．）を使用して
、画像収集、分析および染色体部分長測定を行う。ニューロペプチドレセプター
（プローブによりハイブリダイズされた）のゲノム領域の染色体変化を、挿入、
欠失および転座として同定する。これらニューロペプチドレセプターの変化を関
連疾患の診断マーカーとして使用する。
【０９５５】 （実施例２３：生物学的サンプル中のニューロペプチドレセプターの異常レベ
ルを検出する方法） ニューロペプチドレセプターのポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され
得、そしてニューロペプチドレセプターレベルの上昇または低下が検出される場
合、このポリペプチドは、特定表現型のマーカーである。検出方法は数多くあり
、従って当業者は以下のアッセイをそれらの特定の必要性に適合するように改変
し得ることが理解される。
【０９５６】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、サンプル中、好ましくは、生
物学的サンプル中のニューロペプチドレセプターを検出する。マイクロタイター
プレートのウェルを、ニューロペプチドレセプターに対する特異的抗体を最終濃
度０．２〜１０μｇ／ｍｌでコーティングする。この抗体は、モノクローナルま
たはポリクローナルのいずれかであって、実施例１１に記載の方法により産生さ
れる。ウェルに対するニューロペプチドレセプターの非特異的結合が減少するよ
うに、このウェルをブロックする。
【０９５７】 次に、コーティングしたウェルを、ニューロペプチドレセプター含有サンプル
と共にＲＴで２時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系列
希釈を使用して結果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸
留水で三回洗浄し、結合していないニューロペプチドレセプターを除去する。
【０９５８】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イオン水
または蒸留水で三回洗浄し、結合していないの結合体を除去する。
【０９５９】 ４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートする。反応物をマイクロタイタープレートリーダーにより測定する。コ
ントロールサンプルの系列希釈を使用して検量線を作成し、そしてＸ軸（対数ス
ケール）にニューロペプチドレセプターポリペプチド濃度を、そしてＹ軸（直線
スケール）に蛍光または吸光度をプロットする。検量線を用いてサンプル中のニ
ューロペプチドレセプター濃度を補間する。
【０９６０】 （実施例２４：処方） 本発明はまた、有効量の治療剤を被験体に投与することによって、疾患または
障害（例えば、本明細書中で開示される疾患または障害の１つ以上）を処置およ
び／または予防する方法を提供する。治療剤とは、薬学的に受容可能なキャリア
型（例えば、滅菌キャリア）と組み合わせた、本発明のポリヌクレオチドまたは
ポリペプチド（フラグメントおよび改変体を含む）、それらのアゴニストまたは
アンタゴニスト、および／またはそれらに対する抗体を意味する。
【０９６１】 治療剤を、個々の患者（特に、治療剤単独処置の副作用）、送達部位、投与方
法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ｇｏ
ｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬す
る。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行っ
て決定される。
【０９６２】 一般的提案として、用量当り、非経口的に投与されるニューロペプチドの合計
薬学的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲
にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、こ
のホルモンについて、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好
ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間で
ある。連続投与する場合、代表的には、ニューロペプチドを約１μｇ／ｋｇ／時
間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮
下注入（例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッ
グ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生
じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。
【０９６３】 本発明の組成物の、投与されるべき有効量は、当業者に周知である手順を介し
て決定され得、この手順は、生物学的半減期、生物学的利用能、および毒性のよ
うなパラメータに向けられる。このような決定は、特に本明細書中で提供される
詳細な開示を鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０９６４】 治療の間のニューロペプチドレセプターポリペプチドに対する生物体の生体曝
露はまた、治療的有効量養成法および／または薬学的有効量養成法を決定するこ
とにおいて重要な役割を果たし得る。比較的長期間での、ニューロペプチドレセ
プターポリペプチドの比較的低用量の反復投与のような種々の投薬は、比較的短
期間でニューロペプチドレセプターの比較的高用量の反復投与を用いて達成され
た用量と、治療的および／または薬学的に識別可能な効果を有する。
【０９６５】 Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ，Ｅ．Ｊ．ら、（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐ
ｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５０（４）：２１９−４４（１９６６））によって供給さ
れる等表面積用量転換係数（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ
ｄｏｓａｇｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）は、所与の実験系にお
けるニューロペプチドレセプターの使用により得られるデータを、別の実験系に
おいて１用量あたり投与されるニューロペプチドレセプターポリペプチドの正確
な推定値の薬学的有効量に都合良く転換し得る。ニューロペプチドレセプターの
投与を介して得られた実験データは、ラット、サル、イヌ、およびヒトにおける
ニューロペプチドレセプターの薬学的有効量を正確に見積るために、Ｆｒｅｉｒ
ｅｉｃｈらによって供給される転換係数を介して転換され得る。以下の転換表（
表ＩＩＩ）はＦｒｅｉｒｅｉｃｈらにより提供されたデータの概要である。表Ｉ
ＩＩは、１つの種の、ｍｇ／ｋｇにより表現される用量を、表にした別の種にお
いて、ｍｇ／ｋｇとして表現される等表面積用量へ転換するためにおよその係数
を所与する。
【０９６６】
【表４】 従って、例えば、表ＩＩＩに提供された変換係数を使用すると、マウスにおけ
る５０ｍｇ／ｋｇの用量は、サルにおける１２．５ｍｇ／ｋｇの適切な用量に変
換される（なぜなら、（５０ｍｇ／ｋｇ）×（１／４）＝１２．５ｍｇ／ｋｇ）
。さらなる例として、マウスにおける０．０２、０．０８、０．８、２および８
ｍｇ／ｋｇの用量は、それぞれ、ヒトにおける１．６６７μｇ／ｋｇ、６．６７
μｇ／ｋｇ、６６．７μｇ／ｋｇ、１６６．７μｇ／ｋｇ、および０．６６７ｍ
ｇ／ｋｇの有効用量に等しい。
【０９６７】 ニューロペプチドレセプターを含む薬学的組成物を、経口的、直腸内、非経口
的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉末、
軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口腔内あるいは経口また
は鼻腔スプレーとして投与する。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性
の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包剤または任意の製剤補助剤を
いう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨
内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０９６８】 本発明の治療剤（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）はまた、徐放系により適切に投与
される。徐放性治療剤の適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔ
ｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉末、軟膏、ゲル、点滴
剤、または経皮パッチによるなど）、口腔内あるいは経口または鼻腔スプレーと
して投与される。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体
または液体の充填剤、希釈剤、被包剤または任意の型の製剤補助剤をいう。本明
細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下お
よび関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０９６９】 本発明の治療剤はまた、徐放系により適切に投与される。徐放性治療剤の適切
な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまたはマイク
ロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性物質（例
えば、受容可能な油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、および可
溶性に乏しい誘導体（例えば、可溶性に乏しい塩など）を包含する。１つの実施
形態では、「薬学的に受容可能なキャリア」は、非毒性の固体、半固体または液
体の充填剤、希釈剤、被包剤または任意の型の製剤補助剤を意味する。特定の実
施形態では、「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒ
トにおける使用のために、連邦政府規制当局もしくは州政府により認可されたか
、または米国薬局方もしくは他の一般に認知されている薬局方に目録記載された
ことを意味する。この実施形態に従う適切な薬学的キャリアの非制限的な例は、
Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に提供され、これには、水および油（石油起源、
動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱
油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体が含まれる。水は、薬学的組成
物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水溶液、な
らびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液は、特に注射可能な溶液のた
めに、液体キャリアとして使用され得る。組成物はまた、所望されるならば、少
量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は、
液剤、懸濁剤、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、徐放性処方物な
どの形態を取り得る。
【０９７０】 本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、
皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０９７１】 好ましい実施形態では、本発明のニューロペプチドレセプター組成物（ポリペ
プチド、ポリヌクレオチド、および抗体、ならびにこれらのアゴニストおよび／
またはアンタゴニストを含む）は、皮下的に投与される。
【０９７２】 別の好ましい実施形態では、本発明のニューロペプチドレセプター組成物（ポ
リペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体、ならびにこれらのアゴニストおよ
び／またはアンタゴニストを含む）は、静脈内に投与される。
【０９７３】 本発明の治療剤はまた、徐放系により適切に投与される。徐放性治療剤の適切
な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまたはマイク
ロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックスなど）、適切な疎水性物質
（例えば、受容可能な油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、およ
び可溶性に乏しい誘導体（例えば、可溶性に乏しい塩など）を包含する。
【０９７４】 徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９
号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメー
トのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５
５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇ
ｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９
８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９
８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ
−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【０９７５】 徐放性治療剤はまた、リポソームに包括された本発明の組成物を含む（一般に
、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；
Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃｅｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂ
ｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３
１７−３２７頁および３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）。治療剤を含
有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製される：ＤＥ３，２
１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；Ｅ
Ｐ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；
ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，
４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ第１０２，３２
４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）単層型であり、そこ
では、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも高く、選択された割合
が、最適な治療剤のために調整される。
【０９７６】 別の実施形態では、本発明の徐放性組成物は、当該分野において公知の結晶処
方物を含む。
【０９７７】 なおさらなる実施形態において、本発明の治療剤は、ポンプにより送達される
（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅ
ｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ
８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３
２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
【０９７８】 他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５
３３（１９９０））による総説において議論される。
【０９７９】 非経口投与のために、１つの実施形態において、一般に、治療剤は、それを所
望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および
濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するもの
と、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液またはエマルジョン）で混合す
ることにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、および
治療剤に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【０９８０】 一般に、治療剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方
と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物
を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より
好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビ
ヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液
が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもま
た、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【０９８１】 キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩
、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のよう
な抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリア
ルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリ
ンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシ
ン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロ
ースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖
類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール
またはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；およ
び／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界
面活性剤が挙げられる。
【０９８２】 治療剤は、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１
〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に処方さ
れる。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、ポ
リペプチド塩が形成されることが理解される。
【０９８３】 治療的投与に用いられる任意の治療剤は無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例
えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成さ
れる。一般に、治療剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注
射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置され
る。
【０９８４】 治療剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたは
バイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として保存される。
凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ
）治療剤水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾
燥した治療剤を、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。
【０９８５】 本発明はまた、本発明の治療剤の１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を
備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造
、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に
付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政
府機関による承認を表す。さらに、治療剤を他の治療用化合物と組み合わせて使
用し得る。
【０９８６】 本発明の治療剤は、単独で、またはアジュバントと組み合わせて投与され得る
。本発明の治療剤とともに投与され得るアジュバントとしては、以下が挙げられ
るが、これらに限定されない：ミョウバン、ミョウバンおよびデオキシコール酸
（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ Ｃｏｒｐ．）、ＱＳ２
１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ、ならびにＭＰＬ。特定の実施形
態において、本発明の治療剤は、ミョウバンと組み合わせて投与される。別の特
定の実施形態において、本発明の治療剤は、ＱＳ２１と組み合わせて投与される
。本発明の治療剤とともに投与され得るさらなるアジュバントとしては、以下が
挙げられるが、これらに限定されない：モノホスホリル脂質免疫調節剤、Ａｄｊ
ｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム
塩、ＭＦ−５９、およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術。本発明の治療剤
とともに投与され得るワクチンとしては、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：ＭＭＲ（麻疹、流行性耳下腺炎，風疹）、ポリオ（ｐｏｌｉｏ）、水痘
、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエンザ、百日咳（ｗ
ｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ）、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイル
ス、コレラ、黄熱病、日本脳炎、灰白髄炎（ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、狂
犬病、腸チフス、および百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に対する防御に指向する
ワクチン。組み合わせは、併用して（例えば、混合物として、別々であるが同時
にもしくは並行して）；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、
組み合わされた薬剤が治療混合物としてともに投与されるプレゼンテーション（
ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが
同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じてのように）投与される手
順もまた含む。「組み合わせ」投与はさらに、第一に与えられる化合物または薬
剤の１つ、続いて第二、という別々の投与を包含する。
【０９８７】 本発明の治療剤（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）は、単独で、または他の治療的薬
剤と組み合わせて投与され得る。本発明の治療剤とともに投与され得る治療的薬
剤としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＴＮＦファミリーの
他のメンバー、化学療法剤、抗生物質、ステロイド性および非ステロイド性の抗
炎症剤、従来の免疫療法剤、サイトカインならびに／または増殖因子。組み合わ
せは、例えば、混合物として併用して、別々であるが同時にもしくは並行して；
または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、
治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別
々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じてのように）投
与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与はさらに、第一に与えられる化合
物または薬剤の１つ、続いて第二、という別々の投与を包含する。
【０９８８】 別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３
ＴＭと組み合わせて使用され、それらと関連する、感染および／または任意の疾
患、障害、および／または状態を処置、予防、および／または診断する。１つの
実施形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３ＴＭと組み合
わされて使用され、それらと関連する、任意のグラム陽性細菌感染および／また
は任意の疾患、障害、および／または状態を、処置、予防、そして／または診断
する。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３Ｔ
Ｍと組み合わされて使用され、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属および／またはＳｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１つ以上のメンバーと関連する、感染および／また
は任意の疾患、障害、および／または状態を、処置、予防、および／または診断
する。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３Ｔ
Ｍと任意に組み合わされて使用され、Ｂ群連鎖球菌の一つ以上のメンバーと関連
する感染および／または任意の疾患、障害、および／または状態を、処置、予防
、および／または診断する。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥ
ＵＭＯＶＡＸ−２３ＴＭと組み合わされて使用され、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと関連する、感染および／または任意の疾患、障害、
および／または状態を、処置、予防、および／または診断する。
【０９８９】 １つの実施形態において、本発明の治療剤は、ＴＮＦファミリーのメンバーと
組み合わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得るＴＮＦ分子、Ｔ
ＮＦ関連分子、またはＴＮＦ様分子としては、以下が挙げられるが、これらに限
定されない：可溶性形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α、（ＬＴ−α、ＴＮ
Ｆ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロ三量体ＬＴ−α２−βの状態で見
出された）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−
１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３
２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、エンドカイン（ｅ
ｎｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＴＲ６（国際公
開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＯＰＧ、およびニュートロカイン（ｎｅｕｔｒ
ｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／１８９２１）、ＯＸ４０、および神
経成長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ、可溶性形態のＣＤ３０、
可溶性形態のＣＤ２７、可溶性形態のＣＤ４０および可溶性形態の４−ＩＢＢ、
ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７
／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際
公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４
）、ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際
公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４２０
２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、およびＴＲ１２、な
らびに可溶性形態のＣＤ１５４、可溶性形態のＣＤ７０、および可溶性形態のＣ
Ｄ１５３。
【０９９０】 別の実施形態では、本発明の組成物は、抗血液凝固薬と組み合わせて投与され
る。本発明の組成物と共に投与され得る抗血液凝固薬としては、ヘパリン、ワル
ファリン、およびアスピリンが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実
施形態では、本発明の組成物は、ヘパリンおよび／またはワルファリンと組み合
わせて投与される。別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、ワルファリン
と組み合わせて投与される。別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、ワル
ファリンおよびアスピリンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態では
、本発明の組成物は、ヘパリンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態
では、本発明の組成物は、ヘパリンおよびアスピリンと組み合わせて投与される
。
【０９９１】 別の実施形態では、本発明の組成物は、抗カルジオリピン抗体の産生を抑制す
る薬剤と組み合わせて投与される。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオ
チドは、抗カルジオリピン抗体が、リン脂質結合血漿タンパク質β２−糖タンパ
ク質Ｉ（ｂ２ＧＰＩ）に結合する能力をブロックおよび／または減少する薬剤と
組み合わせて投与される。
【０９９２】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレ
オシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターおよび
／またはプロテアーゼインヒビターと組み合わせて投与される。本発明の治療剤
と組み合わせて投与され得るヌクレオシド逆転写酵素インヒビターとしては、以
下が挙げられるが、これらに限定されない：ＲＥＴＲＯＶＩＲＴＭ（ジドブジン
／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥＸＴＭ（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤＴＭ（ザルシ
タビン／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴＴＭ（スタブジン／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲＴＭ
（ラミブジン／３ＴＣ）、およびＣＯＭＢＩＶＩＲＴＭ（ジドブジン／ラミブジ
ン）。本発明の治療剤と組み合わせて投与され得る非ヌクレオシド逆転写酵素イ
ンヒビターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＶＩＲＡＭ
ＵＮＥＴＭ（ネビラピン）、ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲＴＭ（デラビルジン）、およ
びＳＵＳＴＩＶＡＴＭ（エファビレンツ）。本発明の治療剤と組み合わせて投与
され得るプロテアーゼインヒビターとしては、以下が挙げられるが、これらに限
定されない：ＣＲＩＸＩＶＡＮＴＭ（インディナビル）、ＮＯＲＶＩＲＴＭ（リ
トナビル）、ＩＮＶＩＲＡＳＥＴＭ（サキナビル））、およびＶＩＲＡＣＥＰＴ
ＴＭ（ネルフィナビル）。特定の実施形態において、抗レトロウイルス薬剤、ヌ
クレオシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、
および／またはプロテアーゼインヒビターは、ＡＩＤＳを処置するため、および
／またはＨＩＶ感染を予防もしくは処置するために、本発明の治療剤との任意の
組み合わせで使用され得る。
【０９９３】 徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９
号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメー
トのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５
５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇ
ｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９
８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９
８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ
−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【０９９４】 徐放性治療剤はまた、リポソームに包括された本発明の組成物を包含する（一
般に、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０
）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃｅｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ
−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
，３１７−３２７頁および３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）。治療剤
を含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製される：ＤＥ３
，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０−４０３４（１９８０）
；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４
９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第
４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ第１０２，
３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）単層型であり、
そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも高く、選択された
割合が、最適な治療剤のために調整される。
【０９９５】 なおさらなる実施形態において、本発明の治療剤は、ポンプにより送達される
（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅ
ｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ
８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３
２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
【０９９６】 他の制御された放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７
−１５３３（１９９０）による概説で考察される）。
【０９９７】 非経口投与のために、１つの実施形態において、一般に、治療剤は、それを所
望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および
濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するもの
と、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液またはエマルジョン）で混合す
ることにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、および
治療剤に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【０９９８】 一般に、治療剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方
と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物
を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より
好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビ
ヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液
が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもま
た、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【０９９９】 キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩
、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のよう
な抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリア
ルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリ
ンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシ
ン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロ
ースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖
類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール
またはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；およ
び／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界
面活性剤が挙げられる。
【１０００】 治療剤は、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１
〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に処方さ
れる。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、ポ
リペプチド塩が形成されることが理解される。
【１００１】 治療的投与に用いられる任意の医薬品は無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例
えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成さ
れる。一般に、治療剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注
射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置され
る。
【１００２】 治療剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたは
バイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として保存される。
凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ
）治療剤水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾
燥した治療剤を、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。
【１００３】 本発明はまた、本発明の治療剤の１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を
備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造
、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に
付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政
府機関による承認を表す。さらに、治療剤を他の治療用化合物と組み合わせて使
用し得る。
【１００４】 本発明の治療剤は、単独で、またはアジュバントと組み合わせて投与され得る
。本発明の治療剤とともに投与され得るアジュバントとしては、以下が挙げられ
るが、これらに限定されない：ミョウバン、ミョウバンおよびデオキシコール酸
（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ Ｃｏｒｐ．）、ＱＳ２
１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ、ならびにＭＰＬ。特定の実施形
態において、本発明の治療剤は、ミョウバンと組み合わせて投与される。別の特
定の実施形態において、本発明の治療剤は、ＱＳ２１と組み合わせて投与される
。本発明の治療剤とともに投与され得るさらなるアジュバントとしては、以下が
挙げられるが、これらに限定されない：モノホスホリル脂質免疫調節剤、Ａｄｊ
ｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム
塩、ＭＦ−５９、およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術。本発明の治療剤
とともに投与され得るワクチンとしては、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：ＭＭＲ（麻疹、流行性耳下腺炎，風疹）、ポリオ（ｐｏｌｉｏ）、水痘
、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエンザ、百日咳（ｗ
ｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ）、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイル
ス、コレラ、黄熱病、日本脳炎、灰白髄炎（ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、狂
犬病、腸チフス、および百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に対する防御に指向する
ワクチン。組み合わせは、併用して（例えば、混合物として、別々であるが同時
にもしくは並行して）；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、
組み合わされた薬剤が治療混合物としてともに投与されるプレゼンテーション（
ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが
同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じてのように）投与される手
順もまた含む。「組み合わせ」投与はさらに、第一に与えられる化合物または薬
剤の１つ、続いて第二、という別々の投与を包含する。
【１００５】 本発明の治療剤（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）は、単独で、または他の治療的薬
剤と組み合わせて投与され得る。本発明の治療剤とともに投与され得る治療的薬
剤としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＴＮＦファミリーの
他のメンバー、化学療法剤、抗生物質、ステロイド性および非ステロイド性の抗
炎症剤、従来の免疫療法剤、サイトカインならびに／または増殖因子。組み合わ
せは、例えば、混合物として併用して、別々であるが同時にもしくは並行して；
または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、
治療混合物としてともに投与されるプレゼンテーションを含み、そして組み合わ
せた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じ
てのように）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与はさらに、第一に
与えられる化合物または薬剤の１つ、続いて第二、という別々の投与を包含する
。
【１００６】 １つの実施形態において、本発明の治療剤は、ＴＮＦファミリーのメンバーと
組み合わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得るＴＮＦ分子、Ｔ
ＮＦ関連分子、またはＴＮＦ様分子としては、以下が挙げられるが、これらに限
定されない：可溶性形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α、（ＬＴ−α、ＴＮ
Ｆ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロ三量体ＬＴ−α２−βの状態で見
出された）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−
１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３
２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、エンドカイン（ｅ
ｎｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＴＲ６（国際公
開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＯＰＧ、およびニュートロカイン（ｎｅｕｔｒ
ｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／１８９２１）、ＯＸ４０、および神
経成長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ、可溶性形態のＣＤ３０、
可溶性形態のＣＤ２７、可溶性形態のＣＤ４０および可溶性形態の４−ＩＢＢ、
ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７
／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際
公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４
）、ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際
公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４２０
２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、およびＴＲ１２、な
らびに可溶性形態のＣＤ１５４、可溶性形態のＣＤ７０、および可溶性形態のＣ
Ｄ１５３。
【１００７】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレ
オシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターおよび
／またはプロテアーゼインヒビターと組み合わせて投与される。本発明の治療剤
と組み合わせて投与され得るヌクレオシド逆転写酵素インヒビターとしては、以
下が挙げられるが、これらに限定されない：ＲＥＴＲＯＶＩＲＴＭ（ジドブジン
／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥＸＴＭ（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤＴＭ（ザルシ
タビン／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴＴＭ（スタブジン／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲＴＭ
（ラミブジン／３ＴＣ）、およびＣＯＭＢＩＶＩＲＴＭ（ジドブジン／ラミブジ
ン）。本発明の治療剤と組み合わせて投与され得る非ヌクレオシド逆転写酵素イ
ンヒビターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＶＩＲＡＭ
ＵＮＥＴＭ（ネビラピン）、ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲＴＭ（デラビルジン）、およ
びＳＵＳＴＩＶＡＴＭ（エファビレンツ）。本発明の治療剤と組み合わせて投与
され得るプロテアーゼインヒビターとしては、以下が挙げられるが、これらに限
定されない：ＣＲＩＸＩＶＡＮＴＭ（インディナビル）、ＮＯＲＶＩＲＴＭ（リ
トナビル）、ＩＮＶＩＲＡＳＥＴＭ（サキナビル））、およびＶＩＲＡＣＥＰＴ
ＴＭ（ネルフィナビル）。特定の実施形態において、抗レトロウイルス薬剤、ヌ
クレオシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、
および／またはプロテアーゼインヒビターは、ＡＩＤＳを処置するため、および
／またはＨＩＶ感染を予防もしくは処置するために、本発明の治療剤との任意の
組み合わせで使用され得る。
【１００８】 他の実施形態において、本発明の治療剤は、抗日和見感染症薬剤と組み合わせ
て投与され得る。本発明の治療剤と組み合わせて投与され得る抗日和見感染症薬
剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＴＲＩＭＥＴＨＯＰ
ＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥＴＭ、ＤＡＰＳＯＮＥＴＭ、ＰＥＮ
ＴＡＭＩＤＩＮＥＴＭ、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥＴＭ、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤＴＭ、
ＲＩＦＡＭＰＩＮＴＭ、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥＴＭ、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬ
ＴＭ、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮＴＭ、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮＴＭ、ＡＺＩＴ
ＨＲＯＭＹＣＩＮＴＭ、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲＴＭ、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴＴＭ
、ＣＩＤＯＦＯＶＩＲＴＭ、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭ、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺ
ＯＬＥＴＭ、ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭ、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲＴＭ、ＦＡＭ
ＣＩＣＯＬＶＩＲＴＭ、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥＴＭ、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩ
ＮＴＭ、ＮＥＵＰＯＧＥＮＴＭ（フィルグラスチム／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥ
ＵＫＩＮＥＴＭ（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）／ＧＭ−ＣＳ
Ｆ）。特定の実施形態において、本発明の治療剤は、日和見Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓ
ｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に処置または予防するために、ＴＲＩ
ＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥＴＭ、ＤＡＰＳＯＮＥ
ＴＭ、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥＴＭ、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥＴＭ
との任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の治
療剤は、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ複合感染を予防的に処
置または予防するために、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤＴＭ、ＲＩＦＡＭＰＩＮＴＭ、Ｐ
ＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥＴＭ、および／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬＴＭとの任
意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の治療剤は
、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を予防的
に処置または予防するために、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮＴＭ、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭ
ＹＣＩＮＴＭ、および／またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮＴＭとの任意の組み合
わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の治療剤は、日和見サ
イトメガロウイルス感染を予防的に処置または予防するために、ＧＡＮＣＩＣＬ
ＯＶＩＲＴＭ、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴＴＭ、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲＴ
Ｍとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の
治療剤は、日和見真菌感染を予防的に処置または予防するために、ＦＬＵＣＯＮ
ＡＺＯＬＥＴＭ、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭ、および／またはＫＥＴＯＣＯ
ＮＡＺＯＬＥＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態にお
いて、本発明の治療剤は、日和見単純ヘルペスウイルスＩ型および／またはＩＩ
型感染を予防的に処置または予防するために、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲＴＭおよび／
またはＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特
定の実施形態において、本発明の治療剤は、日和見Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏ
ｎｄｉｉ感染を予防的に処置または予防するために、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮ
ＥＴＭおよび／またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮＴＭとの任意の組み合わせで使用さ
れる。別の特定の実施形態において、本発明の治療剤は、日和見細菌感染を予防
的に処置または予防するために、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮＴＭおよび／またはＮＥ
ＵＰＯＧＥＮＴＭとの任意の組み合わせで使用される。
【１００９】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、抗ウイルス薬剤との組み合わ
せで投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る抗ウイルス薬剤としては
、アシクロビル、リバビリン、アマンタジン、およびレマンチジン（ｒｅｍａｎ
ｔｉｄｉｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【１０１０】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、抗生物質とともに投与される
。本発明の治療剤とともに投与され得る抗生物質としては、アモキシシリン、β
−ラクタマーゼ、アミノ配糖体、β−ラクタム（グリコペプチド）、β−ラクタ
マーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロ
フロキサシン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン類、
マクロライド系抗生物質、メトロニダゾル、ペニシリン、キノロン類、リファン
ピン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリ
ム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、およびバンコマイシンが挙げら
れるが、これらに限定されない。
【１０１１】 本発明の治療剤とともに投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤としては、ス
テロイド類、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミドメ
チルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオ
キシスペルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、および応答Ｔ
細胞の機能を抑制することによって作用する他の免疫抑制剤が挙げられるが、こ
れらに限定されない。
【１０１２】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、免疫抑制剤と組み合わせて投与
される。本発明の治療剤と共に投与され得る免疫抑制剤調製物としては、ＯＲＴ
ＨＯＣＬＯＮＥＴＭ（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥＴＭ／ＮＥＯＲＡＬＴ
Ｍ／ＳＡＮＧＤＹＡＴＭ（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦＴＭ（タクロリム
ス）、ＣＥＬＬＣＥＰＴＴＭ（ミコフェノール酸塩）、アザチオプリン、グルコ
ルチコステロイド類（ｇｌｕｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ）、およびＲＡＰＡ
ＭＵＮＥＴＭ（シロリムス）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実
施形態において、免疫抑制剤は、器官または骨髄の移植の拒絶を予防するために
使用され得る。
【１０１３】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、単独でかまたは１以上の静脈
内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の治療剤と組み合わ
せて投与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲＴＭ、Ｉ
ＶＥＥＧＡＭＴＭ、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮＴＭ、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ Ｓ
／ＤＴＭおよびＧＡＭＩＭＵＮＥＴＭが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本発明の治療剤は、移植治療（例えば、骨髄移植）に
おいて静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。
【１０１４】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、単独でかまたは抗炎症剤と組
み合わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る抗炎症剤としては
、グルココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸
誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリ
ールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類、ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チ
アジンカルボキサミド類、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオ
ニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎ
ｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾー
ル、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン
、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、
ピフオキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプが挙げられるが、
これらに限定されない。
【１０１５】 別の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与さ
れる。本発明の治療剤とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導
体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチ
ノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば
、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インタ
ーフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）
、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルム
スチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホス
ファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイ
シン、ブスルファン、シス−プラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン
（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エ
チニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテス
トステロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン
、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファ
レン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メ
クロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイド類お
よび組み合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；ならびにその他（
例えば、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトー
テン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げら
れるが、これらに限定されない。
【１０１６】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、ＣＨＯＰ（シクロフォスファミ
ド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）と組み合わせて投
与されるか、ＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせで投与される。別の実施形態に
おいて、本発明の治療剤は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与される。さ
らなる実施形態において、本発明の治療剤は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰ
と共に、またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの任意の成分と共に投与される
。
【１０１７】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、サイトカインと組み合わせて
投与される。本発明の治療剤とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ
２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３
、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられ
るが、これらに限定されない。別の実施形態において、本発明の治療剤は、任意
のインターロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４
、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１
１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１
７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０およびＩＬ−２１を含むが、これらに
限定されない）と共に投与され得る。
【１０１８】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、脈管形成タンパク質と組み合
わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る脈管形成タンパク質と
しては、欧州特許番号ＥＰ−３９９８１６に開示されるようなグリオーム由来増
殖因子（ＧＤＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小
板由来増殖因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許番号ＥＰ−２８２３１７に開示さ
れるような血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号ＷＯ９２／０
６１９４号に開示されるような胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇ
ｏｒｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるよ
うな胎盤増殖因子２（ＰｌＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に
開示されるような血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−５０６４
７７に開示されるような血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号Ｗ
Ｏ９６／３９５１５号に開示されるような血管内皮増殖因子２（ＶＥＧＦ−２）
；血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−３）；国際公開番号ＷＯ９６／２６７３６号
に開示されるような血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際
公開番号ＷＯ９８／０２５４３号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥ
ＧＦ−Ｄ）；国際公開番号ＷＯ９８／０７８３２号に開示されるような血管内皮
増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびドイツ国特許番号ＤＥ１９６３９６０１に
開示されるような血管内皮増殖因子Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が挙げられるが、これら
に限定されない。上記の参考文献はここに、本明細書で参考として援用される。
【１０１９】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、造血増殖因子と組み合わせて
投与される。本発明の治療剤と共に投与され得る造血増殖因子としては、ＬＥＵ
ＫＩＮＥＴＭ（ＳＡＲＧＲＡＭＯＳＴＩＭＴＭ）およびＮＥＵＰＯＧＥＮＴＭ（
ＦＩＬＧＲＡＳＴＩＭＴＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【１０２０】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、線維芽細胞増殖因子と組み合
わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子と
しては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧ
Ｆ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、
ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられる
が、これらに限定されない。
【１０２１】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、他の治療レジメまたは予防レ
ジメ（例えば、放射線治療など）と組み合わせて投与される。このような組み合
わせ療法は、逐次的および／または併用して投与され得る。
【１０２２】 （実施例２５：ニューロペプチドレセプターのレベル低下を処置する方法） 本発明は、身体内におけるニューロペプチドレセプター活性のレベルを減少さ
せる必要のある個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量のニ
ューロペプチドレセプターアンタゴニストを含む組成物をそのような個体に投与
する工程を包含する。本発明における使用のために好ましいアンタゴニストは、
ニューロペプチドレセプター特異的抗体である。
【１０２３】 さらに、個体におけるニューロペプチドレセプターの標準または正常発現レベ
ルの低下により引き起こされる状態は、ニューロペプチドレセプターを、好まし
くは分泌形態で投与することにより処置され得ることが理解される。従って、本
発明はまた、ニューロペプチドレセプターポリペプチドのレベルの増加が必要な
個体の処置方法を提供する。この方法は、このような個体に、このような個体で
ニューロペプチドレセプター活性レベルを増加させる量のニューロペプチドレセ
プターを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【１０２４】 例えば、ニューロペプチドレセプターポリペプチドのレベルが低下した患者は
、ポリペプチドを、１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。
好ましくは、ポリペプチドは分泌形態である。投与および処方に基づく投薬スキ
ームの正確な詳細を、実施例２４に提供する。
【１０２５】 （実施例２６：ニューロペプチドレセプターのレベル上昇を処置する方法） 本発明はまた、身体内におけるニューロペプチドレセプター活性のレベルを増
加させる必要のある個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量
のニューロペプチドレセプターまたはそのアゴニストを含む組成物をそのような
個体に投与する工程を包含する。
【１０２６】 アンチセンス技術を使用してニューロペプチドレセプターの産生を阻害する。
この技術は、癌のような様々な病因に起因するニューロペプチドレセプターポリ
ペプチド、好ましくは分泌形態のポリペプチドのレベルを低下させる方法の１つ
の例である。
【１０２７】 例えば、ニューロペプチドレセプターのレベルが異常に上昇したと診断された
患者に、アンチセンスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０お
よび３．０ｍｇ／ｋｇ／日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分
な耐性があれば、７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。アンチセンスポ
リヌクレオチドの処方を、実施例２４に提供する。
【１０２８】 （実施例２７：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、ニューロペプチドレセプターポリペプチドを発現
し得る線維芽細胞を患者に移植する方法である。一般に、線維芽細胞は、皮膚生
検により被験者から得られる。得られた組織を組織培養培地中に配置し、小片に
分割する。組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、約１０片を各フラ
スコに置く。このフラスコを倒置し、しっかりと閉め、そして室温で一晩放置す
る。室温で２４時間後、フラスコを反転させ、組織塊をフラスコの底に固定させ
たままにし、そして新鮮培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレ
プトマイシンを含有するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次に、フラスコを３
７℃で約１週間インキュベートする。
【１０２９】 この時点で、新鮮培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間
培養した後、単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてさ
らに大きなフラスコにスケールアップする。
【１０３０】 Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉ
ｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理
する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して
精製する。
【１０３１】 ニューロペプチドレセプターをコードするｃＤＮＡを、実施例１に示されるよ
うに、それぞれ５’および３’末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して
増幅し得る。好ましくは、５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’
プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量の、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウ
イルス線状骨格および増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを
、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を二つのフラ
グメントの連結に適切な条件下で維持する。次に、連結混合物を使用し、細菌Ｈ
Ｂ１０１を形質転換する。次に、それを、カナマイシン含有寒天上にプレーティ
ングし、ベクターが適切に挿入されたニューロペプチドレセプターを有すること
を確認する。
【１０３２】 両種向性ｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％仔ウ
シ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ
改変Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな密度まで増
殖させる。次に、ニューロペプチドレセプター遺伝子を含むＭＳＶベクターを培
地に加え、そしてパッケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パ
ッケージング細胞はニューロペプチドレセプター遺伝子を含む感染性ウイルス粒
子を産生する（ここで、パッケージング細胞をプロデューサー細胞という）。
【１０３３】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、次いで培地を１０ｃ
ｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過して、はがれ
たプロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を使用して、線維芽細胞を感染
させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そして
プロデューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そし
て新鮮培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽
細胞が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまたはｈ
ｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必
要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染すると、線維芽細胞を分析し、ニュ
ーロペプチドレセプタータンパク質が産生されているか否かを決定する。
【１０３４】 次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス（ｃｙｔｏｄ
ｅｘ）３マイクロキャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれか
で、宿主に移植する。
【１０３５】 （実施例２８：内因性ニューロペプチドレセプター遺伝子を使用する遺伝子治
療） 本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、内因性ニューロペプチドレセプター配
列を、例えば、米国特許第５，６４１，６７０（１９９７年６月２４日発行）；
国際公開番号ＷＯ ９６／２９４１１（１９９６年９月２６日公開）；国際公開
番号ＷＯ ９４／１２６５０（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２〜８９３５（１
９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８
（１９８９）に記載されるように、相同組換えを介してプロモーターに作動可能
に結合する工程を包含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが、その細
胞中では発現されないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝
子の活性化を包含する。
【１０３６】 プロモーターおよび標的化配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製する。こ
の標的配列は、プロモーターに隣接する、内因性ニューロペプチドレセプター配
列の５’非コード配列に相同である。この標的化配列は、このニューロペプチド
レセプターの５’末端に十分に近く、その結果、このプロモーターは、相同組換
えの際にこの内因性配列に作動可能に連結される。このプロモーターおよび標的
化配列を、ＰＣＲを使用して増幅し得る。好ましくは、この増幅したプロモータ
ーは、５’末端および３’末端上に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第
１の標的化配列の３’末端は、増幅したプロモーターの５’末端と同じ制限酵素
部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末端は、増幅したプロモーターの３
’末端と同じ制限部位を含む。
【１０３７】 この増幅したプロモーターおよび増幅した標的化配列を、適切な制限酵素で消
化し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび
消化した標的化配列を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。生じた
混合物を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構
築物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノー
ル沈殿により精製する。
【１０３８】 この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーショ
ンを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチ
ド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス
配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）とともに投与され得る。送達のこのような方
法は、当該分野で公知である。
【１０３９】 一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが生じて、このプロモータ
ーがこの内因性ニューロペプチドレセプター配列に作動可能に連結される。これ
は、この細胞中におけるこのニューロペプチドレセプターの発現を生じる。発現
は、免疫学的染色または当該分野で公知の他の任意の方法により、検出され得る
。
【１０４０】 線維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋
１０％ウシ胎仔血清中に配置する。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を
、トリプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細
胞懸濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離
に供する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩
衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、０．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。こ
の細胞を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブ
ミン１ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終
細胞懸濁物は、約３×１０６細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再
懸濁直後に実施すべきである。
【１０４１】 プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、ニューロペプチ
ドレセプター遺伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために、プラス
ミドｐＵＣ１８（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉ
ｎｄＩＩＩで消化する。ＣＭＶプロモーターを、５’末端のＸｂａＩ部位および
３’末端のＢａｍＨＩ部位を用いてＰＣＲにより増幅する。２つのニューロペプ
チドレセプター非コード配列をＰＣＲを介して増幅する：一方のニューロペプチ
ドレセプター非コード配列（ニューロペプチドレセプターフラグメント１）を、
５’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端のＸｂａＩ部位を用いて増幅する
；他方のニューロペプチドレセプター非コード配列（フラグメント２）を、５’
末端のＢａｍＨＩ部位および３’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて増幅する。
このＣＭＶプロモーターおよびニューロペプチドレセプターフラグメントを、適
切な酵素（ＣＭＶプロモーター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；ニューロペプチド
レセプターフラグメント１−ＸｂａＩ；ニューロペプチドレセプターフラグメン
ト２−ＢａｍＨＩ）で消化し、そしてともに連結する。生じた連結生成物をＨｉ
ｎｄＩＩＩで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと
連結する。
【１０４２】 プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０６細胞
を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を
、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ
、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生
存が減少するが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割
合が劇的に増加する。これらのパラメーターを考慮すると、パルス時間約１４〜
２０ｍＳｅｃが観察される。
【１０４３】 エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキ
ュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞
を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％仔ウシ血清を含む
ＤＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、こ
の培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２
４時間インキュベートする。
【１０４４】 次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か、またはサイトデックス
（ｃｙｔｏｄｅｘ）３マイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）ビーズ上
でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいずれかで、注入する。ここで、
この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次いで、この線維芽細胞を、上
記のような患者に導入し得る。
【１０４５】 （実施例２９：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、ニューロペプチドレセ
プターポリペプチドの発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（
ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）ニューロペプチドレ
セプター配列の導入に関する。このニューロペプチドレセプターポリヌクレオチ
ドは、プロモーター、または標的組織によるそのニューロペプチドレセプターポ
リペプチドの発現に必要な任意の他の遺伝子エレメントに、作動可能に連結され
得る。このような遺伝子治療ならびに送達の技術および方法は、当該分野で公知
であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５
６９３６２２号、同第５７０５１５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａ
Ｈ．ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−４７９（１９
９７）；Ｃｈａｏ Ｊ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５（６）：５１７
−５２２（１９９７）；Ｗｏｌｆｆ Ｊ．Ａ．、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉ
ｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８（１９９７）、Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｂ．ら
、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３（５）：４０５−４１１（１９９６）；Ｔｓｕｒｕ
ｍｉ Ｙ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（１２）：３２８１−３２９０（
１９９６）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【１０４６】 ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド構築物は、注入可能な物質を動
物の細胞に送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、
腸など）の間隙空間への注入）によって送達され得る。このニューロペプチドレ
セプターポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリ
ア中で送達され得る。
【１０４７】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助
、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、このニューロペプチドレセプターポリヌクレ
オチドはまた、当業者に周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例
えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ Ｐ．Ｌ．ら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．７７２：１２６−１３９およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ．ら（１９９５）Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ ８５（１）：１−７で教示されたもの）中で送達され得る。
【１０４８】 この遺伝子治療方法において使用されるニューロペプチドレセプターポリヌク
レオチドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可
能にする配列も含まない構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモータ
ーが、ＤＮＡの発現を駆動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異
なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけ
るポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配
列が細胞に導入されて、６ヶ月までの間の期間、所望のポリペプチドの産生を提
供し得ることが示された。
【１０４９】 このニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（
筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨
、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、およ
び結合組織を包含する）の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、細
胞間液、ムコ多糖基質（器官組織の細網線維、血管または腔（ｃｈａｍｂｅｒ）
の壁における弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維に間にある）、あるいは結
合組織鞘性筋肉細胞内または骨の裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に
、循環の血漿およびリンパチャンネルのリンパ液により占められた空間である。
筋肉組織の間隙空間への送達は、以下に考察する理由のために好ましい。それら
は、これらの細胞を含む組織への注入によって、好都合に送達され得る。それら
は、好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞にお
いて発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化していな
い細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。
インビボで、筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現するそれら
の能力において、特に適格である。
【１０５０】 裸のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド注入について、ＤＮＡまた
はＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の
範囲にある。好ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍ
ｇ／ｋｇであり、そしてより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／
ｋｇである。もちろん、当業者が認識するように、この投薬量は、注入の組織部
位に従って変化する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易
に決定され得、そして処置される状態および投与経路に依存し得る。好ましい投
与経路は、組織の間隙空間への非経口注入経路によってである。しかし、他の非
経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に肺または気管支組織、咽喉
、または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さら
に、裸のニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド構築物が、血管形成術の
間に、この手順において用いられるカテーテルによって動脈に送達され得る。
【１０５１】 インビボでの筋肉における注入ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド
の用量応答効果を、以下のようにして決定する。ニューロペプチドレセプターポ
リペプチドをコードするｍＲＮＡの産生のための適切なニューロペプチドレセプ
ター鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。鋳型ＤＮＡ
（これは環状または線状のいずれかであり得る）を裸のＤＮＡとして使用するか
、またはリポソームと複合体化するかのいずれかである。次いで、マウスの四頭
筋に、種々の量の鋳型ＤＮＡを注入する。
【１０５２】 ５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。ニューロペプチドレセプター鋳型
ＤＮＡを、０．１ｍｌのキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通し
て１分間にわたって、筋肉の遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約
０．２ｃｍの深さで注入する。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上で
行い、そしてその皮膚をステンレス鋼クリップで閉じる。
【１０５３】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、ニ
ューロペプチドレセプタータンパク質発現について組織化学的に染色する。ニュ
ーロペプチドレセプタータンパク質発現についてのタイムコースを、異なるマウ
スからの四頭を異なる時間で採取すること以外は、同様な様式で行い得る。注入
後の筋肉中のニューロペプチドレセプターＤＮＡの持続性を、注入したマウスお
よびコントロールマウスからの全細胞性ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後
、サザンブロット分析によって決定し得る。マウスにおける上記実験の結果を、
裸のニューロペプチドレセプターＤＮＡを用いて、ヒトおよび他の動物において
適切な投薬量および他の処置パラメーターを外挿するために使用し得る。
【１０５４】 （実施例３０：ニューロペプチドレセプタートランスジェニック動物） このニューロペプチドレセプターポリペプチドはまた、トランスジェニック動
物において発現され得る。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、
ブタ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、
サルおよびチンパンジー）を含むがこれらに限定されない任意の種の動物は、ト
ランスジェニック動物を作製するために用いられ得る。特定の実施形態において
、本明細書に記載されるかまたはさもなければ当該分野で公知の技術が、遺伝子
治療プロトコルの一部として、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発現のため
に用いられる。
【１０５５】 当該分野で公知の任意の技術を、導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレ
オチド）の動物への導入に用いて、トランスジェニック動物の創始系統（ｆｏｕ
ｎｄｅｒ ｌｉｎｅ）を生成し得る。このような技術は、前核マイクロインジェ
クション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；お
よびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖細胞
系へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９
８５））、胚盤胞または胚；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏ
ｎら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレク
トロポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０
３−１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導
入（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を
参照のこと）；胚性多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞への核酸構築物
の導入および胚盤胞へのこの幹細胞の移入；ならびに精子媒介遺伝子移入（Ｌａ
ｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８９））；などを含
むがこれらに限定されない。このような技術の総説については、本明細書中にそ
の全体が参考として援用される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎ
ｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９
８９）を参照のこと。
【１０５６】 当該分野で公知の任意の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトラ
ンスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された、静止状態に誘導さ
れた胚細胞、胎児細胞または成体の細胞由来の除核した卵母細胞の核への核移入
（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌ
ｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）））。
【１０５７】 本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ）を提供する。導入遺伝子は、１つ
の導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−
尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子は
また、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定
の細胞型に選択的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異
的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれ
らは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染
色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。
【１０５８】 手短に言えば、このような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同
ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同な組換え
を介して内在性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列
の機能を破壊することを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞
型に選択的に導入され得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、導入された細胞型にお
いてのみ内在性遺伝子が不活化される。そのような細胞型特異的不活化に必要と
される調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明ら
かである。この段落において示された文献の各々の文脈は、その全体が本明細書
中で参考として援用される。
【１０５９】 一旦、トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、
標準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブ
ロット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起き
たことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織にお
ける導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノー
ザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素
ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得
る。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特
異的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。
【１０６０】 一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配され、同系交配され、異系交
配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そのような
交配戦略の例は、以下を含むがそれらに限定されない：別の系統を樹立するため
の１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相
加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジ
ェニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析
による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部
位に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニック動物の
交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々のホモ接合
系統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導
入遺伝子を配置するための交配。
【１０６１】 本発明のトランスジェニック動物は、ニューロペプチドレセプターポリペプチ
ドの生物学的機能の詳述、異常なニューロペプチドレセプター発現に関連する状
態および／または障害の研究、ならびにこのような状態および／または障害の改
善に有効な化合物についてのスクリーニングに有用な動物モデル系を含むが、こ
れらに限定されない用途を有する。
【１０６２】 （実施例３１：ニューロペプチドレセプターノックアウト動物） 内因性のニューロペプチドレセプター遺伝子発現もまた、標的化された相同組
換えを使用してニューロペプチドレセプター遺伝子および／またはそのプロモー
ターを不活性化あるいは「ノックアウトする」ことによって減少し得る（例えば
、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０−２３４（１９８５）；
ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２（１９
８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５：３１３−３２１（１９８９）を参
照のこと；これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
例えば、内因性ポリヌクレオチド配列（この遺伝子のコード領域または調節領域
のいずれか）と相同性のＤＮＡに隣接される、本発明の改変体、非機能的なポリ
ヌクレオチド（または完全に関連のないＤＮＡ配列）を、選択マーカーおよび／
またはネガティブ選択マーカーを用いてまたは用いずに使用し、インビボで本発
明のポリペプチドを発現する細胞をトランスフェクトし得る。別の実施形態にお
いて、当該分野で公知の技術を、目的の遺伝子を含むが、発現しない細胞中でノ
ックアウトを作製するために使用する。標的化された相同組換えを介した、この
ＤＮＡ構築物の挿入は、標的化された遺伝子の不活性化を生じる。このようなア
プローチは、胚性幹細胞に対する改変が不活性な標的化された遺伝子を有する動
物の子孫を作製するために使用され得る研究および農業分野に特に適する（例え
ば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ １９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ
１９８９、前出を参照のこと）。しかし、このアプローチは、当業者に明白な適
切なウイルスベクターを使用して、組換えＤＮＡ構築物がインビボで要求された
部位に直接投与されるか、または標的化される場合、ヒトにおける使用に慣用的
に適合され得る。
【１０６３】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するために
遺伝子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝
子操作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。こ
のような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナー
から入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂
肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞
を、例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入
遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プ
ラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソー
ムなどの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポ
リペプチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／ま
たは本発明のポリペプチドに結合している内因性の調節配列を破壊するために、
組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチ
ドのコード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたは
プロモーター／エンハンサーの制御下に配置し、ニューロペプチドレセプターポ
リペプチドの発現および好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを
発現および好ましくは分泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、また
は腹腔内で患者中へ全身的に導入し得る。
【１０６４】 あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（
例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；遺
伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る
（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号ならびにＭｕ
ｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこ
と。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【１０６５】 投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞をカプセル性の形態で導入し得、この形態は、構成成分
と即時の細胞外環境との交換を可能にしつつ、導入細胞が宿主免疫系によって認
識されることを可能にしない。
【１０６６】 本発明のノックアウト動物は、ニューロペプチドレセプターポリペプチドの生
物学的機能の詳述、異常なニューロペプチドレセプター発現に関連する状態およ
び／または障害の研究、ならびにこのような状態および／または障害を改善させ
るに有効な化合物のスクリーニングにおいて有用な動物モデル系を含むが、それ
らに限定されない用途を有する。
【１０６７】 （実施例３２：Ｂ細胞増殖および分化の刺激または阻害を検出するアッセイ） 機能的体液性免疫応答の生成は、Ｂ系列の細胞とそれらの微小環境との間に、
可溶性のシグナル伝達および同族のシグナル伝達の両方を必要とする。シグナル
は、陽性の刺激（Ｂ系列の細胞がプログラムされた発生を持続するようにさせる
）、または陰性の刺激（細胞が電流発生経路を阻止するように指示する）を伝え
得る。現在までに、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ
−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４およびＩＬ−１５を含む、多数の刺激シグナル
および阻害シグナルがＢ細胞応答性に影響することが見出されている。興味深い
ことに、これらのシグナルはそれ自体は弱いエフェクターであるが、種々の同時
刺激タンパク質と組み合わせて、Ｂ細胞集団中の活性化、増殖、分化、ホーミン
グ、耐性、および死を誘導し得る。
【１０６８】 Ｂ細胞同時刺激タンパク質の最も研究されたクラスの１つがＴＮＦスーパーフ
ァミリーである。このファミリー内で、ＣＤ４０、ＣＤ２７およびＣＤ３０は、
そのそれぞれのリガンドである、ＣＤ１５４、ＣＤ７０およびＣＤ１５３と共に
種々の免疫応答を調節することが見出されている。これらのＢ細胞集団およびそ
れらの前駆細胞の増殖および分化の検出および／または観察を可能にするアッセ
イは、種々のタンパク質がこれらのＢ細胞集団上に、増殖および分化の点で有し
得る効果を決定する際に価値のあるツールである。以下に列挙するのは、Ｂ細胞
集団およびそれらの前駆体の分化、増殖、または阻害の検出を可能にするように
設計された２つのアッセイである。
【１０６９】 （インビトロアッセイ）−精製されたニューロペプチドレセプタータンパク質
、またはそれらの短縮化形態を、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体において活性
化、増殖、分化もしくは阻害および／または死を誘導する能力について評価する
。精製したヒト扁桃腺Ｂ細胞に対するニューロペプチドレセプタータンパク質の
活性（定性的に０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの用量範囲にわたって測定した
）を、標準的なＢリンパ球同時刺激アッセイにおいて評価する。このアッセイで
は、精製した扁桃腺Ｂ細胞を、プライミング因子として、ホルマリン固定Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ（ＳＡＣ）、または固
定した抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかの存在下で培養する。ＩＬ−２およびＩＬ−
１５のような第２のシグナルは、トリチウム化チミジン取り込みにより測定した
場合、ＳＡＣおよびＩｇＭ架橋と協同してＢ細胞増殖を誘発する。新規な協同因
子を、このアッセイを用いて容易に同定し得る。このアッセイは、ＣＤ３陽性細
胞の磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）枯渇によりヒト扁桃腺Ｂ細胞を単離する工程を包含
する。得られる細胞集団は、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の発現により評価する場合
、９５％のＢ細胞より大きい。
【１０７０】 種々の希釈のそれぞれのサンプルを９６ウェルプレートの個々のウェルに配置
し、ここへ、培養培地（１０％ＦＢＳ、５×１０−５Ｍ ２ＭＥ、１００Ｕ／ｍ
ｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０−５希釈のＳＡ
Ｃを含有するＲＰＭＩ １６４０）中で懸濁した、総量１５０μｌ中の、１０５
Ｂ細胞を添加する。増殖または阻害を、因子の添加後７２時間から開始して、３
Ｈ−チミジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）で２０ｈパルス（１μＣｉ／ウェル）により
定量する。陽性コントロールおよび陰性コントロールは、それぞれＩＬ２および
培地である。
【１０７１】 （インビボアッセイ）−ＢＡＬＢ／ｃマウスに、緩衝液のみ、または２ｍｇ／
ｋｇのニューロペプチドレセプタータンパク質、またはそれらの短縮形態を、１
日２回注射（腹腔内）する。マウスにこの処置を４日間連続して与え、この時点
でそれらを屠殺し、そして分析のために種々の組織および血清を収集した。正常
な脾臓およびニューロペプチドレセプタータンパク質で処理した脾臓由来のＨ＆
Ｅ切片の比較により、脾臓細胞でのニューロペプチドレセプタータンパク質の活
性の結果、例えば、動脈周囲リンパ性鞘の拡散および／または赤色脾髄領域の有
核の細胞充実性の有意な増加（これは、Ｂ細胞集団の分化および増殖の活性化を
示し得る）が確認される。Ｂ細胞マーカーである、抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）を
用いる免疫組織化学的研究を用いて、脾臓細胞への任意の生理的な変化（例えば
、脾臓組織崩壊）が、樹立されたＴ細胞領域に浸潤する漠然と規定されたＢ細胞
区画内のＢ細胞提示の増加に起因するか否かを決定する。
【１０７２】 ニューロペプチドレセプタータンパク質で処置したマウス由来の脾臓のフロー
サイトメトリー分析を用いて、ニューロペプチドレセプタータンパク質が、Ｔｈ
Ｂ＋であるＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ｄｕｌｌ Ｂ細胞の比を、コントロールマウ
スで観察される比よりも特異的に増加するか否かを示す。
【１０７３】 さらに、増加した成熟Ｂ細胞のインビボでの提示の推定される結果は、血清Ｉ
ｇ力価の相対的な増加である。従って、血清ＩｇＭおよびＩｇＡレベルを緩衝液
で処置したマウスとニューロペプチドレセプタータンパク質で処置したマウスと
の間で比較する。
【１０７４】 本実施例において記載する試験は、ニューロペプチドレセプタータンパク質に
おける活性を試験した。しかし、当業者は、ニューロペプチドレセプターポリヌ
クレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニューロペプチドレセプターのアゴニスト
、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示する研究を容易
に改変し得る。
【１０７５】 （実施例３３：Ｔ細胞増殖アッセイ） ＣＤ３誘導性の増殖アッセイをＰＢＭＣで実行し、そして３Ｈ−チミジンの取
り込みにより測定する。このアッセイを以下のように実行する。９６ウェルプレ
ートを、ＣＤ３に対するｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の１００
μｌ／ウェル、またはアイソタイプ適合のコントロールｍＡｂ（Ｂ３３．１）（
０．０５Ｍ 炭酸水素塩緩衝液、ｐＨ９．５中、１μｇ／ｍｌ）で４℃で１晩、
コートし、次いでＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣをヒト末梢血から、Ｆ／Ｈ勾
配遠心分離により単離し、そしてニューロペプチドレセプタータンパク質の種々
の濃度での存在下で、１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有するＲＰＭＩ中、ｍＡｂ
でコートしたプレートの４通りのウェル（５×１０４／ウェル）に添加する（総
量２００μｌ）。関連するタンパク質緩衝液および培地単独がコントロールであ
る。３７℃での培養の４８時間後、プレートを１０００ｒｐｍで２分間回転させ
、そして１００μｌの上清を除去し、そして、増殖に対する効果が観察される場
合、ＩＬ−２（または他のサイトカイン）の測定のために−２０℃で貯蔵した。
ウェルに０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンを含有する１００μｌの培地を補充し、
そして３７℃で１８〜２４時間培養する。ウェルを収集し、そして３Ｈ−チミジ
ンの取り込みを増殖の指標として用いた。抗ＣＤ３単独が増殖の陽性コントロー
ルである。ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）をまた、増殖を増強するコントロールと
して用いる。Ｔ細胞の増殖を誘導しないコントロール抗体をニューロペプチドレ
セプタータンパク質の効果についての陰性コントロールとして用いる。
【１０７６】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
における活性を試験した。しかし、当業者は、ニューロペプチドレセプターポリ
ヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニューロペプチドレセプターのアゴニス
ト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示する研究を容
易に改変し得る。
【１０７７】 （実施例３４：ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現、なら
びに単球および単球由来ヒト樹状細胞の細胞分化に対するニューロペプチドレセ
プターの効果） 樹状細胞を末梢血において見出される増殖前駆体の増殖により生成する：接着
性ＰＢＭＣまたは清浄化単球画分を、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩ
Ｌ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）とともに７〜１０日間培養する。これらの樹状細胞は
、非成熟細胞の特徴的表現型（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭ
ＨＣクラスＩＩ抗原の発現）を有する。ＴＮＦ−αのような活性化因子での処理
は、表面表現形に迅速な変化（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、同時刺激分子および
接着分子の発現の増加、ＦＣγＲＩＩの下方制御、ＣＤ８３の上方制御）を生じ
る。これらの変化は抗原提示能力の増加、および樹状細胞の機能的成熟と関連す
る。
【１０７８】 表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下のように実施する。細胞を、ニューロペプチド
レセプターまたはＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜３日処理し
、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、
次いで１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モ
ノクローナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄
後、標識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）での
フローサイトメトリーにより分析する。
【１０７９】 （サイトカインの産生に対する効果）樹状細胞により生成されるサイトカイン
、特にＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性免疫応答の開始において重要である。ＩＬ−
１２は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応答の発生に強力に影響し、そして細胞傷害
性Ｔ細胞機能およびＮＫ細胞機能を誘導する。ＥＬＩＳＡを用いて以下のように
ＩＬ−１２放出を測定する。樹状細胞（１０６／ｍｌ）を、ニューロペプチドレ
セプターの漸増する濃度で２４時間処理する。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を、
陽性コントロールとして細胞培養に添加する。次いで、細胞培養からの上清を収
集し、そして市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉ
ｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を用いてＩＬ−１２含量について分析する。キッ
トに提供される標準的プロトコールを用いる。
【１０８０】 ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現に対する効果。細胞表
面抗原の３つの主なファミリー：接着分子、抗原提示に関与する分子、およびＦ
ｃレセプター、が、単球上で同定され得る。ＭＨＣクラスＩＩ抗原および他の同
時刺激分子（例えば、Ｂ７およびＩＣＡＭ−１）の発現の調節は、単球の抗原提
示能力、およびＴ細胞活性化を誘導する能力に変化を生じ得る。Ｆｃレセプター
の発現増加は、単球細胞傷害性活性、サイトカイン放出および食菌作用の改善と
相関し得る。
【１０８１】 ＦＡＣＳ分析は、以下のように表面抗原を試験するために用いられる。単球を
、ニューロペプチドレセプターまたはＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃
度で１〜５日処理し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有す
るＰＢＳで洗浄し、次いで１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗
体またはＰＥ標識モノクローナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベート
する。さらなる洗浄後、標識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーにより分析する。
【１０８２】 （単球活性化および／または生存の増加）単球を活性化する（あるいは、不活
化する）および／または単球の生存を増加する（あるいは、単球生存を低下させ
る）分子についてのアッセイは、当該分野で公知であり、そして本発明の分子が
単球のインヒビターまたはアクチベーターとして機能するか否かを決定するため
に慣用的に適用され得る。ニューロペプチドレセプター、ニューロペプチドレセ
プターのアゴニストまたはアンタゴニストは、以下に記載の３つのアッセイを用
いてスクリーニングされ得る。これらのアッセイのそれぞれについて、末梢血単
核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）を通じた遠心
分離により、単一のドナーｌｅｕｋｏｐａｃｋ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃ
ｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から精製する。単球を向流遠心性エルト
リエーション（ｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏｗ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｕｔｒ
ｉａｔｉｏｎ）によりＰＢＭＣから単離する。
【１０８３】 （単球生存アッセイ）ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激の非存在下で培
養した場合、次第に生存度を失う。それらの死は、内部調節されたプロセス（ア
ポトーシス）から生じる。活性化因子、例えばＴＮＦαの培養への添加は、劇的
に、細胞生存を改善し、そしてＤＮＡの断片化を妨げる。プロピジウムヨード（
ＰＩ）染色を用いて、以下のようにアポトーシスを測定する。単球を、１００ｎ
ｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（陰性コントロール）の存在下、および試験される種々の
濃度の化合物の存在下で、ポリプロピレンチューブ中の無血清培地（陽性コント
ロール）中で、４８時間培養する。細胞を、最終濃度５μｇ／ｍｌでＰＩを含有
するＰＢＳ中で２×１０６／ｍｌの濃度に懸濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎ分析の
前に５分間室温でインキュベートする。ＰＩ取り込みは、この試験パラダイムに
おけるＤＮＡの断片化と相関することを示している。
【１０８４】 （サイトカイン放出に対する効果）単球／マクロファージの重要な機能は、刺
激後のサイトカインの放出を通じた免疫系の他の細胞集団へのそれらの調節活性
である。サイトカイン放出を測定するためのＥＬＩＳＡは、以下のように実施す
る。ヒト単球を、５×１０５細胞／ｍｌの密度で、ニューロペプチドレセプター
の漸増する濃度とともに、および同じ条件下でニューロペプチドレセプターの非
存在下で、インキュベートする。ＩＬ−１２の産生については、この細胞を、ニ
ューロペプチドレセプターの存在下でＩＦＮ（１００Ｕ／ｍｌ）で１晩プライム
する。次いで、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。馴化培地を２４時間後に
収集し、そして使用するまで凍結保存する。次いで、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、
ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の測定を市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用い、そしてキットに提供
される標準的プロトコールを適用して実施する。
【１０８５】 （酸化的バースト（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ））精製した単球を９６
ウェルプレートに２〜１×１０５細胞／ウェルでプレートする。ニューロペプチ
ドレセプターの漸増濃度を、ウェルの総量０．２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ １
６４０＋１０％ＦＣＳ、グルタミンおよび抗生物質）に添加する。３日間のイン
キュベーション後、このプレートを遠心分離し、そして培地をウェルから除く。
マクロファージの単層に、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（
１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５．
５ｍＭデキストロース、０．５６ｍＭフェノールレッドおよび１９Ｕ／ｍｌのＨ
ＲＰＯ）を、刺激物質（２００ｎＭ ＰＭＡ）とともに添加する。このプレート
を３７℃で２時間インキュベートし、そして１ウェルあたり２０μｌの１Ｎ Ｎ
ａＯＨを添加して反応を停止する。吸収を６１０ｎｍで読む。マクロファージに
より生成されるＨ２Ｏ２の量を算出するため、既知のモル濃度のＨ２Ｏ２溶液の
標準曲線をそれぞれの実験について実施する。
【１０８６】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
における活性を試験した。しかし、当業者は、ニューロペプチドレセプターポリ
ヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、ニューロペプチドレセプターのア
ゴニストの活性、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示
する研究を容易に改変し得る。
【１０８７】 （実施例３５：ニューロペプチドレセプターの生物学的効果） （星状細胞および神経アッセイ） 上記のように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで発現され、そして精製さ
れた組換えニューロペプチドレセプターを、皮質ニューロン細胞の生存、神経突
起成長または表現形分化を促進する活性について、およびグリア線維性酸性タン
パク質免疫陽性細胞、星状細胞の増殖の誘導について試験し得る。バイオアッセ
イのための皮質細胞の選択は、皮質構造中のＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２の広く
行き渡っている発現、ならびにＦＧＦ−２処理から生じる皮質ニューロン生存の
以前に報告された増強に基づく。チミジン取り込みアッセイを用いて、例えば、
これらの細胞に対するニューロペプチドレセプターの活性を解明し得る。
【１０８８】 さらに、インビトロにおける皮質ニューロンまたは海馬ニューロンへのＦＧＦ
−２（塩基性ＦＧＦ）の生物学的効果を記載する以前のレポートは、ニューロン
生存および神経突起成長の両方における増大を実証している（Ｗａｌｉｃｋｅ，
Ｐ．ら、「Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔ
ｅｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｉｐｐｏｃａｍｐ
ａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎｅｕｒｉｔｅ ｅｘｔｅ
ｎｓｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：３０１２
〜３０１６（１９８６）、アッセイは、本明細書でその全体が参考として援用さ
れる）。しかし、ＰＣ−１２細胞で実行される実験からの報告は、これらの２つ
の応答が必ずしも同義でないこと、そしてどのＦＧＦを試験しいるかだけでなく
、どのレセプターが標的細胞で発現されているかにも依存し得ることを示唆する
。神経突起成長を誘導するニューロペプチドレセプターの能力を、一次の皮質ニ
ューロン培養パラダイムを用いて、例えば、チミジン取り込みアッセイを用いて
ＦＧＦ−２で得られた応答と比較し得る。
【１０８９】 （線維芽細胞および内皮細胞アッセイ） ヒト肺線維芽細胞をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入
手し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓからの増殖培地で維持する。真皮性微小血管内
皮細胞をＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）か
ら得る。増殖アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞および真皮性微小血管内皮
細胞を、９６ウェルプレートの増殖培地中で１日間、５，０００細胞／ウェルで
培養し得る。次いでこの細胞を０．１％ＢＳＡ基礎培地中で１日間インキュベー
トする。新鮮な０．１％ＢＳＡ培地で培地を置換した後、細胞を試験タンパク質
と３日間インキュベートする。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ａｌｍａｒ Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）を１０％の最終濃度になるよう
に各ウェルに添加する。この細胞を４時間インキュベートする。細胞生存度をＣ
ｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーでの読取りにより測定する。ＰＧＥ２アッセイに
ついては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で１日間、５，０００細
胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地を変換した後、細胞をＩ
Ｌ−１αとともに、またはそれをともなわずに、ＦＧＦ−２またはニューロペプ
チドレセプターと２４時間インキュベートする。上清を収集し、そしてＥＩＡキ
ット（Ｃａｙｍａｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によりＰＧＥ２についてアッ
セイする。ＩＬ−６アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレ
ート中で１日間、５，０００細胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地
に培地を変換した後、細胞をＩＬ−１αとともに、またはそれをともなわずに、
ＦＧＦ−２あるいはニューロペプチドレセプターと２４時間インキュベートする
。上清を収集し、そしてＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇ
ｅ，ＭＡ）によりＩＬ−６についてアッセイする。
【１０９０】 ヒト肺線維芽細胞をＦＧＦ−２またはニューロペプチドレセプターとともに基
礎培地中で３日間培養し、その後、線維芽細胞の増殖に対する効果を評価するた
めＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを添加する。ＦＧＦ−２は、ニューロペプチドレセプ
ターでの刺激に匹敵して用いられ得る１０〜２５００ｎｇ／ｍｌの刺激を示すは
ずである。
【１０９１】 （パーキンソンモデル） パーキンソン病における運動機能の喪失は、黒質線条体のドーパミン作動性投
射ニューロンの変性から生じる線条体ドーパミンの欠乏に起因する。広範に特徴
付けされたパーキンソン病の動物モデルは、１−メチル−４フェニル１，２，３
，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の全身投与を含む。ＣＮＳにおいて、
ＭＰＴＰは、星状細胞に取り込まれ、そしてモノアミンオキシダーゼＢにより１
−メチル−４−フェニルピリジン（ＭＰＰ＋）に異化され、そして放出される。
引き続き、ＭＰＰ＋は、ドーパミンの高親和性再取り込みトランスポーターによ
りドーパミン作動性ニューロンに能動的に蓄積する。次いで、ＭＰＰ＋は、電気
化学勾配によりミトコンドリア中で濃縮され、そしてニコチン酸アミド二リン酸
：ユビキノン酸化還元酵素（複合体Ｉ）を選択的に阻害し、これにより電子伝達
を妨害し、そして最終的に活性酸素を生成する。
【１０９２】 ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）が黒質のドーパミン作動性ニューロンへの栄養活
性を有することが組織培養パラダイムにおいて実証されている（Ｆｅｒｒａｒｉ
ら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９８９）。近年、Ｕｎｓｉｃｋｅｒ博士のグループは
、線条体のゲル型インプラントでのＦＧＦ−２投与がＭＰＴＰ曝露と関連する毒
性から黒質のドーパミン作動性ニューロンのほぼ完全な防御を生じることを実証
している（ＯｔｔｏおよびＵｎｓｉｃｋｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，
１９９０）。
【１０９３】 ＦＧＦ−２を用いたデータに基づいて、ニューロペプチドレセプターは、イン
ビトロにおけるドーパミン作動性ニューロン生存を増強する際において、ニュー
ロペプチドレセプターがＦＧＦ−２の作用と類似の作用を有するか否かを決定す
るために評価され得、そして、ニューロペプチドレセプターはまた、線条体にお
けるドーパミン作動性ニューロンを、ＭＰＴＰ処理と関連する損傷からの防御に
ついてインビボで試験され得る。ニューロペプチドレセプターの潜在的効果を、
まずドーパミン性ニューロン細胞培養パラダイムにおいてインビトロで試験する
。妊娠１４日のＷｉｓｔａｒラット胚由来の中脳底板を解剖することにより、培
養物を調製する。組織をトリプシンで分離し、そしてポリオルチニン−ラミニン
でコートしたカバーガラスに２００，０００細胞／ｃｍ２の密度で播いた。この
細胞をダルベッコ改変イーグル培地およびホルモン補充物（ＮＩ）を含有するＦ
１２培地中で維持する。インビトロで８日後培養物をパラホルムアミドで固定し
、そしてチロシンヒドロキシラーゼ（ドーパミン作動性ニューロンについての特
異的マーカー）での免疫組織化学染色のために処理する。分離した細胞培養物を
胚性ラットから調製する。培養培地を３日ごとに変化させ、そしてこの因子をま
たその時点ごとに添加する。
【１０９４】 ドーパミン作動性ニューロンを妊娠１４日（この発生時間は、ドーパミン作動
性前駆細胞が増殖する段階を過ぎる）で動物から単離するので、チロシンヒドロ
キシラーゼ免疫陽性ニューロンの数の増加は、インビトロで生存しているドーパ
ミン作動性ニューロンの数の増加を示す。従って、もしニューロペプチドレセプ
ターがドーパミン作動性の生存を延長するように作用するならば、このニューロ
ペプチドレセプターがパーキンソン病に関与し得ることを示唆する。
【１０９５】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
における活性を試験した。しかし、当業者は、ニューロペプチドレセプターポリ
ヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニューロペプチドレセプターのアゴニス
ト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示する研究を容
易に改変し得る。
【１０９６】 （実施例３６：血管内皮細胞の増殖に対するニューロペプチドレセプターの効
果） １日目に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、４％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ
）、１６ユニット／ｍｌ ヘパリン、および５０ユニット／ｍｌ 内皮細胞増殖
補充物（ＥＣＧＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含有するＭ１９９
培地中で、３５ｍｍシャーレあたり２〜５×１０４細胞の密度で播種する。２日
目、この培地を、１０％ＦＢＳ、８ユニット／ｍｌヘパリンを含有するＭ１９９
で置換する。配列番号２のニューロペプチドレセプタータンパク質および陽性コ
ントロール（例えば、ＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））を種々の濃度
で添加する。４日目および６日目に、培地を交換する。８日目、Ｃｏｕｌｔｅｒ
Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて細胞数を決定する。
【１０９７】 ＨＵＶＥＣ細胞数の増加は、ニューロペプチドレセプターが血管内皮細胞を増
殖し得ることを示す。
【１０９８】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
における活性を試験した。しかし、当業者は、ニューロペプチドレセプターポリ
ヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニューロペプチドレセプターのアゴニス
ト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示する研究を容
易に改変し得る。
【１０９９】 （実施例３７：血管内皮細胞の増殖に対するニューロペプチドレセプターの刺
激効果） 増殖因子の分裂促進活性の評価のために、電子共役試薬ＰＭＳ（フェナジンメ
トサルフェート）を用いる、比色分析ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾー
ル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフ
ォフェニル）２Ｈ−テトラゾリウム）アッセイを実行した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ
９６ ＡＱ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞を０．１ｍＬの血清補充培地中で９６ウ
ェルプレートに播種し（５，０００細胞／ウェル）、そして一晩付着させる。０
．５％ＦＢＳ中、１２時間の血清飢餓後、Ｈｅｐａｒｉｎ（８Ｕ／ｍｌ）を伴う
かまたは伴わない、条件（ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ１６５または０．５％ＦＢＳ中の
ニューロペプチドレセプター）をウェルに４８時間添加する。２０ｍｇのＭＴＳ
／ＰＭＳ混合物（１：０．０５）を１ウェルあたりに添加し、そして３７℃で１
時間インキュベートさせ、その後ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９０ｎｍの吸
収を測定する。コントロールウェル（培地あり、細胞なし）のバックグラウンド
の吸収を差し引きし、そしてそれぞれの条件について７つのウェルを並行して実
施する。Ｌｅａｋら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０Ａ
：５１２〜５１８（１９９４）を参照のこと。
【１１００】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
における活性を試験した。しかし、当業者は、ニューロペプチドレセプターポリ
ヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニューロペプチドレセプターのアゴニス
ト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示する研究を容
易に改変し得る。
【１１０１】 （実施例３８：ＰＤＧＦ誘導性血管平滑筋細胞増殖刺激効果の阻害） ＨＡｏＳＭＣ増殖を、例えば、ＢｒｄＵｒｄ組み込みにより測定し得る。手短
には、４チャンバスライド上で増殖するコンフルエント未満の静止期細胞を、Ｃ
ＲＰまたはＦＩＴＣ標識化ＡＴ２−３ＬＰでトランスフェクトする。次いで、こ
の細胞に１０％ウシ血清および６ｍｇ／ｍｌのＢｒｄＵｒｄをパルスする。２４
時間後、ＢｒｄＵｒｄ染色キット（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を
用いることにより免疫細胞化学を実施する。簡略には、この細胞を、変性溶液へ
の曝露後、ビオチン化マウス抗−ＢｒｄＵｒｄ抗体と４℃で２時間インキュベー
トし、次いでストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジン
とともにインキュベートする。ヘマトキシリンでの対比染色後、この細胞を顕微
鏡試験のために標本にし、そしてＢｒｄＵｒｄ−陽性細胞を計数する。ＢｒｄＵ
ｒｄ係数は、総細胞数に対するＢｒｄＵｒｄ−陽性細胞の割合として計算される
。さらに、個々の細胞について、明野照明および暗野ＵＶ蛍光照明の同時使用に
より、ＢｒｄＵｒｄ染色（核）およびＦＩＴＣ取り込み（細胞質）の同時検出を
実行する。（Ｈａｙａｓｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６：２７１（３
６）：２１９８５〜２１９９２（１９９６）を参照のこと）。
【１１０２】 本実施例において記載した研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質に
おける活性を試験した。しかし、当業者は、ニューロペプチドレセプターポリヌ
クレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニューロペプチドレセプターのアゴニスト
、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示する研究を容易
に改変し得る。
【１１０３】 （実施例３９：内皮遊走の刺激） 本実施例は、ニューロペプチドレセプターがリンパ性の内皮細胞遊走を刺激し
得る可能性を探索するために用いられる。
【１１０４】 内皮細胞遊走アッセイは、４８ウェルの微小走化性チャンバを用いて実行され
る（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ，ＭＤ；Ｆａｌｋ
，Ｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８０；３３：
２３９〜２４７）。ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルタ
ー（これは８μｍの孔径を備える）（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を室温で少なくとも６時間０．１％ゼラチンでコートし、
そして滅菌空気のもとで乾燥する。０．２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を
補充したＭ１９９中で試験物質を適切な濃度に希釈し、そして２５μｌの最終希
釈を改変Ｂｏｙｄｅｎ装置の底部チャンバに置く。コンフルエント未満の、早期
継代（２〜６）のＨＵＶＥＣまたはＢＭＥＣ培養物を洗浄し、そして細胞の脱離
に必要な最小の時間トリプシン処理する。底部チャンバと上部チャンバとの間の
フィルターを配置した後、１％ＦＢＳを含有する５０μｌ Ｍ１９９中に懸濁し
た２．５×１０５細胞を上部コンパートメントに播種する。次いでこの装置を、
５％ＣＯ２を用いて湿潤にしたチャンバ中で３７℃で５時間インキュベートして
細胞を遊走させた。インキュベーション期間後、このフィルターを取り出し、そ
して非遊走細胞を有するフィルターの上部側をゴム性のポリスマン（ｐｏｌｉｃ
ｅｍａｎ）でかきとる。このフィルターをメタノールで固定し、そしてＧｉｅｍ
ｓａ溶液で染色する（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ，Ｂａｘｔｅｒ，ＭｃＧｒａｗ Ｐ
ａｒｋ，ＩＬ）。遊走は、それぞれのウェルにおいて、３つの無作為の高出力視
野（４０×）の細胞を計数することにより定量する。そしてすべての群を４連で
実行する。
【１１０５】 本実施例において記載した研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質に
おける活性を試験した。しかし、当業者は、ニューロペプチドレセプターポリヌ
クレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニューロペプチドレセプターのアゴニスト
、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示する研究を容易
に改変し得る。
【１１０６】 （実施例４０：内皮細胞による一酸化窒素産生の刺激） 血管内皮により放出された一酸化窒素は、血管内皮弛緩の介在物質であると考
えられてる。従って、ニューロペプチドレセプター活性は、ニューロペプチドレ
セプターに応答する内皮細胞による一酸化窒素産生を測定することによってアッ
セイされ得る。
【１１０７】 一酸化窒素を、２４時間の飢餓、次いで、様々なレベルの陽性コントロール（
例えば、ＶＥＧＦ−１）およびニューロペプチドレセプターへの４時間の曝露の
後のコンフルエントな微小血管内皮細胞の９６ウェルプレート中で測定する。培
地中の一酸化窒素を、Ｇｒｉｅｓｓ試薬の使用により測定して、硝酸還元酵素に
よる一酸化硝酸由来の硝酸の還元後の亜硝酸の総量を測定する。一酸化窒素放出
に対するニューロペプチドレセプターの効果を、ＨＵＶＥＣにおいて試験する。
【１１０８】 簡単には、培養したＨＵＶＥＣ単層からのＮＯ放出は、ＮＯメーター（Ｉｓｏ
−ＮＯ，Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．
）（１０４９）に接続したＮＯ特異的なポーラログラフ電極を用いて測定する。
ＮＯエレメントの較正を、以下の式に従って行う： ２ＫＮＯ2＋２ＫＩ＋２Ｈ2ＳＯ4６２ＮＯ＋Ｉ2＋２Ｈ2Ｏ＋２Ｋ2ＳＯ4 検量線を、ＫＩおよびＨ2ＳＯ4を含む較正溶液中に段階的な濃度のＫＮＯ2（
０、５、１０、２５、５０、１００、２５０、および５００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添
加することによって得る。ＮＯに対するＩｓｏ−ＮＯ電極の特異性を、オーセン
ティックなＮＯ気体からのＮＯを測定することにより、事前に決定する（１０５
０）。この培養培地を取り除き、そしてＨＵＶＥＣを、Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸
緩衝化生理食塩水で２回洗浄する。次いで、細胞を、６ウェルプレート中で５ｍ
ｌの濾過したＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液に浸し、そしてこの細胞プレ
ートを、３７℃に温度を維持するために、スライドウォーマー（Ｌａｂ Ｌｉｎ
ｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）で保持する。ＮＯセンサープローブを
ウェルに垂直に挿入して、異なる条件の追加の前に、電極の先端を溶液の表面の
２ｍｍ下で保持する。Ｓ−ニトロソアセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）を、陽性
コントロールとして用いる。放出したＮＯの量を、１×１０６内皮細胞あたりの
ピコモル濃度として表す。全ての報告した値は、各群（細胞培養ウェルの数）に
おける４〜６の測定値の平均である。Ｌｅａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１７：９６−１０５（１９９５）を参照の
こと。
【１１０９】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
における活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、
ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニュー
ロペプチドレセプターのアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試
験し得る。
【１１１０】 （実施例４１：新脈管形成における索形成に対するニューロペプチドレセプタ
ーの効果） 新脈管形成における別の工程は、内皮細胞の分化により特徴付けられる索（ｃ
ｏｒｄ）形成である。このバイオアッセイは、インビトロで培養した場合に微小
血管内皮細胞の毛細管様構造（中空構造）を形成する能力を測定する。
【１１１１】 ＣＡＤＭＥＣ（微小血管内皮細胞）を、増殖細胞（２継代目）としてＣｅｌｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．から購入し、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ’ＣＡＤＭＥＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ中で培養し、そして５
継代目で使用する。インビトロ新脈管形成アッセイのために、４８ウェル細胞培
養プレートのウェルをＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’Ａｔｔａｃｈｍｅ
ｎｔ Ｆａｃｔｏｒ Ｍｅｄｉｕｍ（２００ｍｌ／ウェル）を用いて、３７℃に
て３０分間コートする。ＣＡＤＭＥＣを、コートしたウェルに７，５００細胞／
ウェルで播種し、Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ中で一晩培養する。次いで、この
Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍを、コントロール緩衝液またはニューロペプチドレ
セプター（０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ）を含む３００ｍｇのＣｅｌｌ Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ’Ｃｈｏｒｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍと交換し、
そしてこの細胞をさらに４８時間培養する。毛細管様索の数および長さを、Ｂｏ
ｅｃｋｅｌｅｒ ＶＩＡ−１７０ビデオ画像分析装置の使用を通じて定量する。
全てのアッセイを三連で行なう。
【１１１２】 市販の（Ｒ＆Ｄ）ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロールとして用
いる。β−エストラジオール（１ｎｇ／ｍｌ）を、陰性コントロールとして用い
る。適切な緩衝液（タンパク質なし）もまた、コントロールとして利用する。
【１１１３】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
における活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、
ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニュー
ロペプチドレセプターのアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試
験し得る。
【１１１４】 （実施例４２：ニワトリ漿尿膜に対する脈管形成効果） ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）は、新脈管形成を試験するために十分に確立した系
である。ＣＡＭにおける血管形成は、容易に可視化および定量可能である。ニュ
ーロペプチドレセプターの、ＣＡＭにおける新脈管形成を刺激する能力を試験し
得る。
【１１１５】 Ｗｈｉｔｅ Ｌｅｇｈｏｒｎニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）の受精
卵および日本ウズラ（ｑｕａｌ）（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ ｃｏｔｕｒｎｉｘ）を、
３７．８℃および湿度８０％でインキュベートする。１６日齢のニワトリの分化
したＣＡＭおよび１３日齢のウズラの胚を以下の方法で研究する。
【１１１６】 発生の４日目に、ニワトリ卵の卵殻に窓を作る。この胚を正常な発生について
調べ、そしてこの卵をセロテープ（登録商標）で封着する。これらを、さらに１
３日目までインキュベートする。Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバーガラス（Ｎｕｎｃ，
Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を、直径約５ｍｍのディスクに切る。滅菌かつ無
塩成長因子を蒸留水に溶解し、そして約３．３ｍｇ／５ｍｌをディスクにピペッ
トで移す。風乾後、逆さにしたディスクをＣＡＭに適用する。３日後、標本を３
％グルタルアルデヒドおよび２％ホルムアルデヒド中に固定し、そして０．１２
Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液ですすぐ。これらを実体顕微鏡［Ｗｉｌｄ Ｍ８
］を用いて写真撮影し、上記のように半薄層切片化および超薄層切片化のために
包埋する。コントロールを、キャリアディスクのみで行う。
【１１１７】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
における活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、
ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニュー
ロペプチドレセプターのアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試
験し得る。
【１１１８】 （実施例４３：マウスにおけるＭａｔｒｉｇｅｌ移植片を用いる新脈管形成ア
ッセイ） ニューロペプチドレセプターのインビボ新脈管形成アッセイは、既存の毛細管
網様構造の、マウス細胞外マトリックス物質（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の移植したカ
プセル中に新しい脈管を形成する能力を測定する。このタンパク質を、４℃で液
体Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合し、次いでこの混合物を、マウスに皮下（ここで、こ
の混合物は凝固する）注射する。７日後、Ｍａｔｒｉｇｅｌの固体「プラグ」を
取り除き、そして新しい血管の存在について試験する。Ｍａｔｒｉｇｅｌを、Ｂ
ｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ／Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖ
ｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入する。
【１１１９】 ４℃で解凍した時、Ｍａｔｒｉｇｅｌ物質は液体である。このＭａｔｒｉｇｅ
ｌを、４℃にて１５０ｎｇ／ｍｌでニューロペプチドレセプターと混合し、冷３
ｍｌシリンジ中に入れる。約８週齢の雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、腹部の中腹
側面の２つの部位にＭａｔｒｉｇｅｌおよび実験タンパク質の混合物を注射する
（０．５ｍｌ／部位）。７日後、このマウスを頚椎脱臼により屠殺し、Ｍａｔｒ
ｉｇｅｌプラグを取り除きそして洗浄する（すなわち、全ての付着する膜および
腺維組織を取り除く）。複製のプラグ全体を中性緩衝化１０％ホルムアミド中で
固定し、パラフィン中に包埋し、そしてＭａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ
で染色後、組織学的試験のための切片を作製するために使用する。各プラグの３
つの異なる領域からの切片を、処理する。選択した切片をｖＷＦの存在について
染色する。このアッセイについての陽性コントロールは、ウシ塩基性ＦＧＦ（１
５０ｎｇ／ｍｌ）である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ単独を用いて、新脈管形成の基底レ
ベルを決定する。
【１１２０】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
における活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、
ニューロペプチドレセプターポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニュー
ロペプチドレセプターのアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試
験し得る。
【１１２１】 （実施例４４：ウサギ下肢モデルにおける虚血の救出） ニューロペプチドレセプターの虚血に対するインビボでの効果を研究するため
、ウサギ後肢虚血モデルを、以前に記載される（Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ａｍ
Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ １４７：１６４９−１６６０（１９９５））ように１つの大
腿動脈の外科的除去により作製する。大腿動脈の切除は、血栓の逆行性伝播およ
び外腸骨動脈の閉塞を生じる。結果として、虚血肢への血流は、内腸骨動脈から
生じる側副血管に依存する（Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ
１４７：１６４９−１６６０（１９９５））。１０日の間隔で、ウサギの手術後
の回復および内因性の側副血管の発達を可能にする。手術後１０日目（０日目）
に、ベースライン血管造影を行った後、虚血肢の内腸骨動脈を、５００ｍｇの裸
のニューロペプチドレセプター発現プラスミドを用いて、（Ｒｉｅｓｓｅｎら、
Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：７４９−７５８（１９９３）；Ｌｅｃｌｅｒ
ｃら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：９３６−９４４（１９９２））に記
載されるように、ヒドロゲル被覆バルーンカテーテルを用いる動脈遺伝子移入技
術により、トランスフェクトする。ニューロペプチドレセプターを処置に用いる
場合、５００ｍｇのニューロペプチドレセプタータンパク質またはコントロール
の単回ボーラスを、注入カテーテルを通じて１分間にわたり、虚血肢の内腸骨動
脈中に送達する。３０日目に、種々のパラメーターを、これらのウサギで測定す
る：（ａ）ＢＰ比−虚血肢の収縮期血圧 対 正常肢の収縮期血圧の比；（ｂ）
血流および逆流−停止ＦＬ：非拡張状態の間の血流、および最大ＦＬ：完全拡張
状態の間の血流（また、血管量の間接的測定）、そして逆流は、最大ＦＬ：停止
ＦＬの比に反映される；（ｃ）血管造影値（ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｃｏ
ｒｅ）−これを側副血管の血管造影により測定する。値を、かぶせたグリッド内
の円の百分率（ウサギ大腿の総数ｍで割った横断不透明化動脈を用いる）により
決定する；（ｄ）毛細管（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）密度−後肢から得た光学顕微鏡
用切片において決定した側副毛細血管の数。
【１１２２】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
の活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ニュー
ロペプチドレセプターヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニューロペプチド
レセプターのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを試験し得る。
【１１２３】 （実施例４５：ニューロペプチドレセプターの血管拡張に対する効果） 血管内皮の拡張は、血圧の低下に重要であるので、自然高血圧ラット（ＳＨＲ
）において、ニューロペプチドレセプターが血圧に影響を与える能力を、試験す
る。漸増用量（０、１０、３０、１００、３００、および９００ｍｇ／ｋｇ）の
ニューロペプチドレセプターを、１３〜１４週齢の自然高血圧ラット（ＳＨＲ）
に投与する。データを、平均＋／−ＳＥＭで表す。統計学的分析を、両側ｔ検定
を用いて行い、そして統計的な有意性を、緩衝液単独への応答に対するｐ＜０．
０５として定義する。
【１１２４】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
の活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ニュー
ロペプチドレセプターポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニューロペプ
チドレセプターのアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験し得
る。
【１１２５】 （実施例４６：ラット虚血皮膚弁モデル） 評価パラメーターとして、皮膚の血流、皮膚温度、および第ＶＩＩＩ因子の免
疫組織化学または内皮アルカリホスファターゼ反応が挙げられる。皮膚虚血の間
のニューロペプチドレセプターの発現を、インサイチュハイブリダーゼーション
を用いて研究する。
【１１２６】 このモデルにおける研究を、以下の３つの部分に分ける： ａ）虚血皮膚、 ｂ）虚血皮膚創傷、 ｃ）通常の創傷。
【１１２７】 実験プロトコルは以下を含む： ａ）３×４ｃｍの単一茎全層無作為皮膚弁（ｓｉｎｇｌｅ ｐｅｄｉｃｌｅ
ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｒａｎｄｏｍ ｓｋｉｎ ｆｌａｐ）（動物の
背下部におよぶ筋皮弁）を生じさせること、 ｂ）虚血皮膚（皮膚弁）に切除創傷をつくること（直径４〜６ｍｍ）、 ｃ）１ｍｇ〜１００ｍｇの種々の投薬量範囲でニューロペプチドレセプターを
用いて、（創傷後の０、１、２、３、４日目に）切除創傷の局所的な処置をする
こと、 ｄ）組織学的研究、免疫組織化学的研究、およびインサイチュ研究のために、
創傷後の３、５、７、１０、１４、および２１日目に創傷組織を収集すること。
【１１２８】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ニューロ
ペプチドレセプターポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニューロペプチ
ドレセプターのアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験し得る
。
【１１２９】 （実施例４７：末梢動脈疾患モデル） ニューロペプチドレセプターを用いる新脈管形成治療は、末梢動脈疾患の場合
、虚血周囲の血流の回復を得る新規の治療的ストラテジーである。実験プロトコ
ルは以下を含む： ａ）一方の側の大腿動脈を、後肢の虚血筋肉を作製するために結紮し、他方の
側の後肢は、コントロールの役割をする。
【１１３０】 ｂ）ニューロペプチドレセプタータンパク質を、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬
量範囲で、一週間あたり静脈内および／または筋肉内に３回（おそらくそれより
多く）で２〜３週間、送達する。
【１１３１】 ｃ）この虚血筋肉組織を、大腿動脈の結紮後、１、２、および３週間目に、ニ
ューロペプチドレセプターの発現の分析ならびに組織学のために収集する。生検
もまた、他方の側の対側後肢の正常な筋肉において行う。
【１１３２】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
の活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ニュー
ロペプチドレセプターポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニューロペプ
チドレセプターのアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験し得
る。
【１１３３】 （実施例４８：虚血性心筋疾患モデル） ニューロペプチドレセプターを、側副血管の発達を刺激し得、かつ冠状動脈閉
塞後の新しい血管を再構成し得る強力なマイトジェンとして評価する。ニューロ
ペプチドレセプターの発現の変化を、インサイチュで調査する。実験プロトコル
は、以下を含む： ａ）心臓を、ラットの左側開胸術を介して露出する。直ちに、左冠状動脈を、
細い縫合糸（６−０）を用いて咬合し、そして胸郭を閉じる。
【１１３４】 ｂ）ニューロペプチドレセプタータンパク質を、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬
範囲で、一週間あたり静脈内および／または筋肉内に３回（おそらくそれより多
く）で２〜４週間、送達する。
【１１３５】 ｃ）手術の３０日後、この心臓を、形態測定のために取り出しそして横断切片
化し、そしてインサイチュで分析する。
【１１３６】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
の活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ニュー
ロペプチドレセプターポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニューロペプ
チドレセプターのアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験し得
る。
【１１３７】 （実施例４９：ラット角膜創傷治癒モデル） この動物モデルは、ニューロペプチドレセプターの、新生血管形成に対する効
果を示す。実験プロトコルは、以下を含む： ａ）角膜の中心から支質層へと１〜１．５ｍｍの長さの切開を作ること。
【１１３８】 ｂ）眼の外側の角に面する切開の唇縁の下にへらを挿入すること。
【１１３９】 ｃ）ポケットを作ること（その基底は、眼の縁から（ｆｏｒｍ）１〜１．５ｍ
ｍである）。
【１１４０】 ｄ）５０ｎｇ〜５μｇの本発明のポリペプチドを含む小丸剤を、ポケット内に
配置すること。
【１１４１】 ｅ）ニューロペプチドレセプターでの処置をまた、２０ｍｇ〜５００ｍｇの範
囲の投薬量範囲内で（毎日の処置を５日間）角膜創傷に局所的に適用し得ること
。
【１１４２】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
の活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ニュー
ロペプチドレセプターポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニューロペプ
チドレセプターのアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験し得
る。
【１１４３】 （実施例５０：糖尿病マウスおよび糖質コルチコイド損傷創傷治癒モデル） （Ａ．糖尿病ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスモデル） ニューロペプチドレセプターが治癒プロセスを促進することを実証するために
、創傷治癒の遺伝的糖尿病マウスモデルを、使用する。ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスに
おける全層（ｆｕｌｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）創傷治癒モデルは、損傷創傷治癒
の十分に特徴付けられた、臨床的に関連性のある、そして再現可能なモデルであ
る。糖尿病性創傷の治癒は、収縮よりむしろ肉芽組織の形成および再上皮形成に
依存する（Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５２：３８９
（１９９２）；Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．
１３６：１２３５（１９９０））。
【１１４４】 この糖尿病動物は、ＩＩ型真性糖尿病において観察される特徴的な特性の多く
を有する。ホモ接合（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、それらの正常なヘテロ接合（
ｄｂ＋／＋ｍ）同腹仔と比較して肥満である。変異糖尿病（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マ
ウスは、第４染色体上に単一の常染色体性の劣性変異（ｄｂ＋）を有する（Ｃｏ
ｌｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２８３
−２９３（１９８２））。動物は、多食症、多渇症、および多尿症を示す。変異
糖尿病マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋）は、上昇した血中グルコース、増加したまたは
正常なインスリンレベル、および抑制された細胞媒介性免疫を有する（Ｍａｎｄ
ｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５（１９７８）；Ｄｅｂｒａｙ−
Ｓａｃｈｓ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１（１）：１−７
（１９８３）；Ｌｅｉｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１１４：４６
−５５（１９８５））。末梢神経障害、心筋合併症、および微小血管損傷、基底
膜肥厚、および糸球体濾過異常は、これらの動物において記載されている（Ｎｏ
ｒｉｄｏ，Ｆ．ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．８３（２）：２２１−２３２（１９
８４）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２９（１）：６０−６７（
１９８０）；Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．４０（４）：４
６０−４７３（１９７９）；Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３
１（補遺）：１−６（１９８２））。これらのホモ接合糖尿病マウスは、高血糖
症を発症し、そしてこれは、ヒトＩＩ型糖尿病に類似してインスリンに対して耐
性である（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５−１３７７
（１９７８））。
【１１４５】 これらの動物において観察された特徴は、このモデルにおける治癒が、ヒト糖
尿病において観察される治癒に類似し得ることを示す（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈら
、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５−１２４６（１９９０））
。
【１１４６】 遺伝的糖尿病の雌性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウス、およびそ
れらの非糖尿病（ｄｂ＋／＋ｍ）へテロ接合性同腹仔を、この研究に用いる（Ｊ
ａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。これらの動物を６週齢で購入し、
そしてこれらの動物は研究の開始時に８週齢である。動物を個別に飼育し、そし
て自由に食物および水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて行う。この実
験を、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｃのＩｎｓｔｉｔｕ
ｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ
ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ
Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラ
インに従って行う。
【１１４７】 創傷プロトコルを、以前に報告された方法（Ｔｓｕｂｏｉ，Ｒ．およびＲｉｆ
ｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：２４５−２５１（１９９０）
）に従って行う。簡単には、創傷させる日に、動物を、脱イオン水に溶解したＡ
ｖｅｒｔｉｎ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、２，２，２−トリブロモエタノールおよ
び２−メチル−２−ブタノールの腹腔内注射で麻酔する。この動物の背面領域を
剃毛し、そして皮膚を７０％エタノール溶液およびヨウ素で洗浄する。手術範囲
を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。次いで、８ｍｍの全層の創傷を、
Ｋｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。創傷させた直後に、周囲の皮膚を、創
傷の拡大を取り除くために穏やかに伸ばす。実験の間この創傷を開放させる。処
置の適用を、創傷させた日から開始して５日間連続で、局所的に与える。処置の
前に、創傷を、滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する
。
【１１４８】 創傷を視覚的に検査し、そして手術の日およびその後２日間隔で、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目および８日目の毎日の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎカリパスを
用いて水平および垂直に測定する。創傷を、肉芽組織がもはや目に見えずかつ創
傷を連続した上皮が覆う場合に治癒したとみなす。
【１１４９】 ニューロペプチドレセプターを、ビヒクル中で８日間、ニューロペプチドレセ
プターの異なる用量の範囲（１日あたり創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用い
て投与する。ビヒクルコントロール群には、５０ｍＬのビヒクル溶液を与えた。
【１１５０】 動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学および免疫組
織化学のために収集する。組織標本を、さらなる処理のために、生検スポンジの
間の組織カセット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【１１５１】 各々１０匹の動物（５匹の糖尿病および５匹の非糖尿病コントロール）の３つ
の群：１）ビヒクルプラシーボコントロール、２）ニューロペプチドレセプター
を、評価する。
【１１５２】 創傷閉鎖を、水平軸および垂直軸で面積を測定すること、および創傷の面積の
合計を得ることにより分析する。次いで、収縮を、最初の創傷の面積（０日）と
処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこ
の創傷面積は、６４ｍｍ２（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下
の式を用いて行う： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］ 標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミ
クロトームを用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染
色を、二等分した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験を用いて、修復し
た皮膚の治癒プロセスおよび形態的な外見を、ニューロペプチドレセプターを用
いる処置によって改変したかどうかを評価する。この評価は、細胞蓄積、炎症細
胞、毛細管、線維芽細胞、再上皮形成、および表皮成熟の存在の検証を含む（Ｇ
ｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５
（１９９０））。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲検観察者（ｂｌｉｎｄ
ｅｄ ｏｂｓｅｒｖｅｒ）が用いる。
【１１５３】 組織切片をまた、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ検出システムを使用してポリクローナル
ウサギ抗ヒトケラチン抗体で免疫組織化学的に染色する。ヒト皮膚を陽性組織コ
ントロールとして用いる一方、非免疫ＩｇＧを陰性コントロールとして用いる。
ケラチノサイト増殖を、目盛り付きレンズマイクロメーターを用いて創傷の再上
皮形成の程度を評価することによって決定する。
【１１５４】 皮膚標本における増殖細胞核抗原／サイクリン（ＰＣＮＡ）を、ＡＢＣ Ｅｌ
ｉｔｅ検出システムを用いて抗ＰＣＮＡ抗体（１：５０）を使用することにより
実証する。ヒト結腸癌は、陽性組織コントロールとして役割を果たし、そしてヒ
ト脳組織を、陰性組織コントロールとして用いる。各標本は、１次抗体の脱落お
よび非免疫マウスＩｇＧとの置換を有する切片を含んだ。これらの切片の順位は
、０〜８のスケール（わずかな増殖を反映するより低い側のスケール〜激しい増
殖を反映するより高い側）の増殖の程度に基づく。
【１１５５】 実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみな
す。
【１１５６】 （Ｂ．ステロイド障害性ラットモデル） ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々のインビトロおよびインビボ系にお
いて十分に実証されている（Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ
ｓ ａｎｄ Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ：Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒ
ｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ａｓｐｅｃｔｓ．２８０−３０２（１９８９）； Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：４７６−４８１（１９７５）；Ｗｅｒｂ，Ｚら、Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：１６８４−１６９４（１９７８））。糖質コルチコイ
ドは、新脈管形成を阻害すること、血管透過性（Ｅｂｅｒｔ，Ｒ．Ｈ．ら、Ａｎ
．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．３７：７０１−７０５（１９５２））、線維芽細胞増
殖、およびコラーゲン合成（Ｂｅｃｋ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｇｒｏｗｓ Ｆａｃｔｏｒ
ｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８））を低下させること、な
らびに循環する単球の一過性の減少を生じること（Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．ら、
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）；Ｗａｈｌ，
Ｓ．Ｍ．「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉ
ｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：
Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９））によって創傷
治癒を遅延させる。障害性創傷治癒に対するステロイドの全身性投与は、ラット
において十分に確立された現象である（Ｂｅｃｋ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｇｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）； Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．
ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８） ；Ｗａ
ｈｌ，Ｓ．Ｍ．「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅ
ａｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉ
ｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９）；Ｐｉｅ
ｒｃｅ，Ｇ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：
２２２９−２２３３（１９８９））。
【１１５７】 ニューロペプチドレセプターが治癒プロセスを促進し得ることを実証するため
に、治癒が、メチルプレドニゾロンの全身性投与により損なわれる、ラットの全
層切除皮膚創傷に対するニューロペプチドレセプターの複数の局所適用の効果を
評価する。
【１１５８】 若年成体の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（体重２５０〜３００ｇ
）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこの実験に用
いる。この動物を、８週齢で購入する。研究の開始時は９週齢である。ラットの
治癒応答は、創傷の時点で、メチルプレドニゾロンの全身性投与（１７ｍｇ／ｋ
ｇ／ラット、筋肉内）により損なわれる。動物を個別に飼育し、そして自由に食
物と水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて行う。この研究を、Ｈｕｍａ
ｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｃのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ
Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔｈ
ｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って行
う。
【１１５９】 創傷プロトコルは、上記Ａ節に従う。創傷させる日に、動物をケタミン（５ｍ
ｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔する。この動
物の背面領域を剃毛し、そして皮膚を７０％エタノールおよびヨウ素溶液で洗浄
する。手術範囲を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。８ｍｍの全層創傷
をＫｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。実験の間、この創傷の左を開放する
。試験物質の適用を、創傷させ、次いでメチルメチルプレドニゾロン投与した日
から開始して、７日間連続で、１日１回、局所的に与える。処置の前に、創傷を
滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。
【１１６０】 創傷を視覚的に検査し、そして創傷させた日および処置の終りに、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目の毎日および８日目の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎノギスを用
いて水平および垂直に測定する。創傷を、肉芽組織がもはや目に見えずかつ創傷
を連続した上皮が覆う場合に、治癒したとみなす。
【１１６１】 ニューロペプチドレセプターを、ビヒクル中で８日間、ニューロペプチドレセ
プターの異なる用量の範囲（１日あたり創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用い
て投与する。ビヒクルコントロール群は、５０ｍＬのビヒクル溶液を受けた。
【１１６２】 動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学のために収集
する。組織標本を、さらなるプロセシングのために、生検スポンジの間の組織カ
セット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【１１６３】 各々１０匹の動物（メチルプレドニゾロンを用いる５匹および糖質コルチコイ
ドを用いない５匹）の４つの群を評価する：１）非処置群、２）ビヒクルプラシ
ーボコントロール、および３）ニューロペプチドレセプター処置群。
【１１６４】 創傷閉鎖を、垂直軸および水平軸で面積を測定すること、および創傷の面積の
合計を得ることにより分析する。次いで、閉鎖を、最初の創傷の面積（０日）と
処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこ
の創傷面積は、６４ｍｍ２（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下
の式を用いて行う： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］ 標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＯｌｙｍｐｕｓミクロトームを
用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、二等分
した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験は、修復した皮膚の治癒プロセ
スおよび形態的な外見を、本発明のポリペプチドを用いる処置によって改善した
かどうかを評価することを可能にする。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲
検観察者（ｂｌｉｎｄｅｄ ｏｂｓｅｒｖｅｒ）が用いて、創傷の隙間の距離を
決定する。
【１１６５】 実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみな
す。
【１１６６】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
の活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ニュー
ロペプチドレセプターポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニューロペプ
チドレセプターのアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験し得
る。
【１１６７】 （実施例５１：リンパ水腫（ｌｙｍｐｈａｄｅｍａ）動物モデル） この実験アプローチの目的は、ラット後肢におけるリンパ管形成（ｌｙｍｐｈ
ａｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）およびリンパの循環系の再確立におけるニューロペプ
チドレセプターの治療的効果を試験するための、適切かつ一貫したリンパ水腫モ
デルを作製することである。有効性は、罹患した肢の腫脹体積、リンパの脈管の
量の定量、総血漿タンパク質の量、および組織病理学により測定される。急性リ
ンパ水腫は、７〜１０日間観察される。恐らくより重要なことは、水腫の慢性進
行は、３〜４週間まで続く。
【１１６８】 手術を始める前に、血液サンプルを、タンパク質濃度分析のために採血する。
雄性ラット（体重約３５０ｇ）に、ペントバルビタールを投薬する。次いで、右
肢を膝から股関節部まで剃毛する。この剃毛した範囲を７０％ＥｔＯＨに浸した
ガーゼで拭く。血液を、血清総タンパク質試験のために採血する。周径測定およ
び体積測定を行った後に、２つの測定レベル（踵の０．５ｃｍ上、足背の中間点
）に印をつけた後、足へ色素を注射する。右足背および左足背の両方の内皮に、
０．０５ｍｌの１％Ｅｖａｎ’ｓ Ｂｌｕｅを注射する。次いで、足への色素の
注射の後、周径測定および体積測定を行う。
【１１６９】 目印として膝関節を用いて、中肢鼡径部切開を、大腿血管の位置を確認できる
ように環状に行う。鉗子および止血剤を用いて、皮膚弁を切開し、そして分離す
る。大腿血管の位置確認後、血管の横に沿ってかつ血管の下に走るリンパ管を位
置確認する。次いで、この範囲の主要なリンパ管を、電気凝固または縫合結紮す
る。
【１１７０】 顕微鏡を用いて、肢の背の筋肉（半腱様筋（ｓｅｍｉｔｅｎｄｉｎｏｓｉｓ）
および内転筋の付近）を平滑に切開する。次いで、膝窩リンパ節の位置を確認す
る。次いで、２つの近位リンパ管および２つの遠位リンパ管、ならびに膝窩節の
遠位血液供給部を縫合糸により結紮する。次いで、膝窩リンパ節および任意の付
随する脂肪組織を、結合組織を切断することによって取り除く。
【１１７１】 この手順で生じるいかなる軽度の出血をも管理するように注意すること。リン
パ管を咬合した後、皮膚弁を、液体皮膚（Ｖｅｔｂｏｎｄ）（ＡＪ Ｂｕｃｋ）
を使用することによって密封する。別々の皮膚縁を、その下の筋肉組織に、脚の
周囲に約０．５ｃｍのギャップを残しながら密封する。皮膚はまた、必要なとき
にその下の筋肉に縫合することによって係留してもよい。
【１１７２】 感染を回避するために、動物を、メッシュを用いて個別に収容する（床敷きな
し）。回復した動物を、最適な水腫ピークを通して毎日チェックする。このピー
クは、代表的には５〜７日まで生じる。次いで、プラトーの水腫ピークを観察す
る。リンパ水腫の強度を評価するために、各肢上の２つの指定した場所の周径お
よび体積を、操作の前および７日間毎日測定する。リンパ水腫に対する血漿タン
パク質の効果を決定し、そしてタンパク質分析が有用な試験周界であるか否かも
また調査する。コントロール肢および水腫肢の両方の重量を、２箇所で評価する
。分析を盲目様式（ｂｌｉｎｄ ｍａｎｎｅｒ）で行う。
【１１７３】 周径測定：肢の動きを防止するための短期気体麻酔のもとで、布巻尺を使用し
て、肢の周径を測定する。測定を、距骨および背面の足にて、２人の異なる人物
によって行い、次いで、これらの２つの読み取りを平均する。読み取りを、コン
トロールおよび水腫肢の両方から得る。
【１１７４】 体積測定：手術の日に、動物をペントバルビタールで麻酔し、そして手術の前
に試験する。毎日の体積測定のために、動物を短期ハロタン麻酔（迅速な固定化
およびすばやい回復）のもとにおき、両方の脚を剃毛し、そして耐水性マーカー
を用いて脚に等しく印をつける。脚を、最初に水に漬け、次いで各々印をしたレ
ベルまで装置に漬け、次いでＢｕｘｃｏ水腫ソフトウェア（Ｃｈｅｎ／Ｖｉｃｔ
ｏｒ）によって測定する。データを１人の人物によって記録し、一方他者は、脚
をしるしを付けた領域まで漬ける。
【１１７５】 血液−血漿タンパク質測定：手術の前に血液を取り出し、遠心分離し、そして
血清を分離し、次いで、全タンパク質およびＣａ２＋比較について結論付ける。
【１１７６】 肢重量比較：血液を取り出した後、この動物を、組織収集のために調製する。
この肢を、キリチン（ｑｕｉｌｌｉｔｉｎｅ）を用いて切断し、次いで、実験用
脚とコントロール脚の両方を、結紮して切断し、そして秤量する。２回目の秤量
を、脛踵（ｔｉｂｉｏ−ｃａｃａｎｅａｌ）関節を外し、そして足を秤量して行
う。
【１１７７】 組織学的調製：膝（膝窩）領域の後ろに位置する横筋を切り出し、そして金属
型に配置し、ｆｒｅｅｚｅＧｅｌで満たし、冷メチルブタンに漬け、標識したサ
ンプルバッグに切断するまで−８０ＥＣにて配置する。切断の際に、筋肉を、蛍
光顕微鏡のもとで、リンパ管について観察する。
【１１７８】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
の活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ニュー
ロペプチドレセプターポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニューロペプ
チドレセプターのアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験し得
る。
【１１７９】 （実施例５２：ＴＮＦα誘導性接着分子発現のニューロペプチドレセプターに
よる抑制） 炎症および新脈管形成の領域に対するリンパ球の漸増は、リンパ球上の細胞表
面接着分子（ＣＡＭ）と血管内皮との間の特異的なレセプター−リガンド相互作
用に関する。この接着プロセスは、通常の設定および病理学的設定の両方におい
て、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−
１）、および内皮細胞（ＥＣ）における内皮白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチ
ン）発現を含む、多段階カスケードに続く。これらの分子および他の分子の血管
内皮における発現は、白血球が局所血管系に接着し得、そして炎症応答の発生の
間に局所組織に溢出し得る効率を決定する。サイトカインおよび増殖因子の局所
濃度は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。
【１１８０】 腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）（強力なプロ炎症性サイトカイン）は、内皮細
胞における３つ全てのＣＡＭの刺激因子であり、そして広範な種々の炎症応答に
関与し得、しばしば病理学的結果をもたらす。
【１１８１】 ＴＮＦ−α誘導性ＣＡＭ発現の抑制を媒介するニューロペプチドレセプターの
潜在能力を試験し得る。改変型ＥＬＩＳＡアッセイ（これは、固相吸着剤として
ＥＣを使用する）を使用して、ＦＧＦファミリーのタンパク質のメンバーを用い
て同時刺激した場合に、ＴＮＦ−α処理タンパク質ＥＣにおけるＣＡＭ発現の量
を測定する。
【１１８２】 この実験を行うために、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）培養物を、プール
した索採取物から得、そして１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマ
イシンを補充した増殖培地（ＥＧＭ−２；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，ＣＡ）中で、５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーターにおいて維
持する。ＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ培地中１×１０４細胞／ウェルの濃度で、９６ウ
ェルプレート中に、３７℃で１８〜２４時間またはコンフルエントになるまで播
種する。続いて、単層を、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌス
トレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０の無血清溶液で３回洗浄し、そ
して所定のサイトカインおよび／または増殖因子を用いて、２４時間３７℃にて
処理した。インキュベーション後、次いで、この細胞を、ＣＡＭ発現について評
価する。
【１１８３】 ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、標準的な９６ウェルプレートにおいて
コンフルエントになるまで増殖させる。増殖培地を、細胞から取り除き、そして
９０μｌの１９９培地（１０％ＦＢＳ）に置き換える。試験のためのサンプルお
よびポジティブまたはネガティブコントロールを、このプレートに三連で添加す
る（１０μｌ容量）。プレートを、３７℃にて、５時間（セレクチンおよびイン
テグリン発現）または２４時間（インテグリン発現のみ）のいずれかでインキュ
ベートする。プレートを吸引して、培地を除去し、そして１００μｌの０．１％
パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を有する）を各ウェル
に添加する。プレートを、４℃にて３０分間保持する。
【１１８４】 次いで、固定液をウェルから除去し、そしてウェルをＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）
＋０．５％ＢＳＡを用いて１回洗浄し、そして排水する。このウェルを乾燥させ
ないこと。１０μｌの希釈した一次抗体を、試験ウェルおよびコントロールウェ
ルに添加する。抗ＩＣＡＭ−１−Ｂｉｏｔｉｎ、抗ＶＡＣＭ−１−Ｂｉｏｔｉｎ
および抗Ｅ−セレクチン−Ｂｉｏｔｉｎを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ
／ｍｌストック抗体の１：１０希釈）で使用する。細胞を、加湿した環境におい
て、３７℃にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ
）＋０．５％ＢＳＡを用いて３回洗浄する。
【１１８５】 次いで、２０μｌの希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈ
ｏｓｐｈｏｔａｓｅ（１：５，０００希釈）を各ウェルに添加し、そして３７℃
にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５
％ＢＳＡを用いて３回洗浄する。１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐ
ＮＰＰ）を、５ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ１０．４）に溶解させる。グリシン
緩衝液中のｐＮＰＰ基質１００μｌを、各試験ウェルに添加する。三連の標準ウ
ェルを、グリシン緩衝液中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏ
ｓｐｈｏｔａｓｅの操作希釈（ｗｏｒｋｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（１：５，
０００（１００）＞１０−０．５＞１０−１＞１０−１．５）から調製する。５
μｌの各希釈物を、三連のウェルに添加し、そして各ウェル中の得られたＡＰ含
量は、５．５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇである。次い
で、１００μｌのｐＮＰＰ試薬を、標準ウェルの各々に添加しなければならない
。このプレートを、３７℃にて４時間インキューベートしなければならない。３
Ｍ ＮａＯＨの５０μｌの容量を全てのウェルに添加する。この結果を、プレー
トリーダーにおいて４０５ｎｍにて定量する。バックグラウンド減算オプション
を、グリシン緩衝液のみで満たしたブランクウェルにおいて使用する。このテン
プレートを、各々の標準ウェルにおけるＡＰ結合体の濃度を示すように設定する
［５．５０ｎｇ；１．７４ｎｇ；０．５５ｎｇ；０．１８ｎｇ］。結果を、各サ
ンプル中の結合したＡＰ結合体の量として示す。
【１１８６】 （実施例５３：骨髄ＣＤ４３＋細胞増殖の刺激についてのアッセイ） このアッセイは、ヒトＣＤ３４＋が、造血増殖因子の存在下で増殖する能力に
基づき、そしてこのアッセイは、哺乳動物細胞において発現された単離ポリペプ
チドが、ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する能力を評価する。
【１１８７】 最も熟成した前駆体は、単一シグナルのみに応答することが以前に示されてい
る。より未熟な前駆体は、応答するために少なくとも２つのシグナルを必要とす
る。従って、ポリペプチドの広範な先祖細胞の造血活性に対する効果を試験する
ために、このアッセイは、他の造血増殖因子の存在下または非存在下において、
所定のポリペプチドを含む。単離された細胞を、試験サンプルと組み合わせて、
幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で、５日間培養する。ＳＣＦのみは、骨髄（ＢＭ
）細胞の増殖に対して、非常に制限された効果を有し、「生存」因子としてのみ
、このような条件下で作用する。しかし、これらの細胞（例えば、ＩＬ−３）に
対する刺激効果を示す任意の因子と組み合わせると、ＳＣＦは、相乗効果を生じ
る。従って、試験されたポリペプチドが、造血祖先に対する刺激効果を有する場
合、このような活性は、容易に検出され得る。正常なＢＭ細胞は、低レベルの細
胞周期（ｃｙｃｌｉｎｇ ｃｅｌｌ）を有するので、所望のポリペプチド、ある
いはそのアゴニストまたはアンタゴニストのいかなる阻害効果も検出されないよ
うである。従って、先祖に対する阻害効果のためのアッセイが、好ましくは、Ｓ
ＣＦ＋ＩＬ＋３でのインビトロ刺激に最初に供され、次いで、このような誘起増
殖の阻害のために評価される化合物と接触させられる細胞において試験される。
【１１８８】 簡潔には、ＣＤ３４＋細胞は、当該分野で公知の方法を使用して単離される。
これらの細胞は、解凍され、そして、培地（１％ Ｌ−グルタミンを有するＱＢ
ＳＦ ６０ 血清のない培地（５００ｍｌ）（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ Ｃａｔ＃ １６０−２０
４−１０１））に再懸濁される。２００×ｇでのいくらか穏やかな遠心分離の後
、細胞は、１時間静置される。細胞数を２．５×１０５細胞／ｍｌに調節する。
この時間の間、１００μｌの滅菌水を９６ウェルプレートの周辺ウェルに添加す
る。このアッセイにおいて、所定のポリペプチドで試験され得るサイトカインは
、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌ
ｉｓ，ＭＮ，Ｃａｔ＃ ２５５−ＳＣ）のみであり、そして３０ｎｇ／ｍｌのｒ
ｈＳＣＦとｒｈＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，
ＭＮ，Ｃａｔ＃ ２０３−ＭＬ）との組み合わせである。１時間後、１０μｌの
調製されたサイトカイン、５０μｌの上清（実施例３１で調製された）（１：２
希釈での上清＝５０μｌ）および２０μｌの希釈された細胞を、培地に添加し、
この培地は、１００μｌの最終全体積にするためにすでにウェル中に存在する。
次いで、このプレートを３７℃／５％ ＣＯ２インキュベータに５日間置く。
【１１８９】 アッセイを行う（ｈａｒｖｅｓｔ）１８時間前に、０．５μＣｉ／ウェルの［
３Ｈ］チミジンを、各ウェルに１０μｌの体積で添加し、増殖率を決定する。こ
の実験は、Ｔｏｍｔｅｃ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ ９６を使用して、細胞を、各９
６ウェルプレートからフィルターマットに収集することによって終結される。収
集後、フィルターマットを乾燥し、トリムし、そして１つのＯｍｎｉｆｉｌｔｅ
ｒプレートおよび１つのＯｍｎｉＦｉｌｔｅｒトレイからなるＯｍｎｉｆｉｌｔ
ｅｒアセンブリに置く。６０μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔを各ウェルに添加し、
そしてプレートをＴｏｐＳｅａｌ-Ａプレスオンフィルムで密閉する。バーコー
ド１５ステッカーを計数のために、第１のプレートに固定する。次いで、密閉さ
れたプレートを充填し、そして放射能のレベルを、Ｐａｒｃｋａｒｄ Ｔｏｐ
Ｃｏｕｎｔを介して決定し、プリントされたデータを分析のために収集する。放
射能レベルは、細胞増殖の量を反映する。
【１１９０】 本実施例に記載される研究は、骨髄ＣＤ３４＋細胞増殖を刺激する、所定のポ
リペプチドの活性を試験する。当業者は、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治
療）、抗体、アゴニスト、および／またはアンタゴニスト、ならびにそれらのフ
ラグメントおよび改変体の活性を試験するために、例示された実施例を容易に改
変し得る。非限定的な実施例として、このアッセイで試験される可能性のあるア
ンタゴニストは、サイトカインの存在下で細胞増殖を阻害すること、および／ま
たはサイトカインおよび所定のポリペプチドの存在下で細胞増殖の阻害を増加さ
せることが期待される。対照的に、このアッセイで試験される可能性のあるアゴ
ニストは、細胞増殖を増強し、そして／またはサイトカインおよび所定のポリペ
プチドの存在下で、細胞増殖の阻害を減少させることが期待される。
【１１９１】 骨髄ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する遺伝子の能力は、この遺伝子に対応する
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが、診断および免疫系および造血に影響す
る障害の処置に有用であることを示す。代表的な用途は、上記の「免疫活性」お
よび「感染疾患」の節、ならびに本明細書中の他の箇所に記載される。
【１１９２】 （実施例５４：細胞外マトリックス増強細胞応答（ＥＭＥＣＲ）についてのア
ッセイ） 細胞外マトリックス増強細胞応答（ＥＭＥＣＲ）アッセイの目的は、細胞外マ
トリックス（ＥＣＭ）誘導シグナルに関連して、造血幹細胞に作用する遺伝子産
物（例えば、単離されたポリペプチド）を同定することである。
【１１９３】 周囲のミクロ環境から受けるシグナルに関連して、細胞は、調節因子に応答す
る。例えば、線維芽細胞、ならびに内皮幹細胞および上皮幹細胞は、ＥＣＭから
のシグナルの非存在下で、複製することができない。造血幹細胞は、骨髄中で自
己再生を起こし得るが、インビトロ懸濁液培養ではそうではない。インビトロで
自己再生を起こす幹細胞の能力は、間質（ｓｔｒｏｍａｌ）細胞およびＥＣＭタ
ンパク質フィブロネクチン（ｆｎ）とのそれらの相互作用に依存する。細胞のｆ
ｎへの吸着は、α５．β１およびα４．β１インテグリンレセプターによって媒
介され、これらのレセプターは、ヒトおよびマウス造血幹細胞によって発現され
る。ＥＣＭ環境で組み込み、そして幹細胞の自己再生の刺激の原因である因子は
未だ同定されていない。このような因子の発見は、遺伝子治療および脊髄移植適
用における重要な目的である。
【１１９４】 簡潔には、ポリスチレンの組織培養処理されていない９６ウェルプレートは、
０．２μｌ／ｃｍ２のコーティング濃度でｆｎフラグメントでコートされる。マ
ウス骨髄細胞を、０．２ｍｌの血清のない培地（１，０００細胞／ウェル）にプ
レートする。ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）＋ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で
培養された細胞は、幹細胞の自己再生が期待されず、明確な分化が期待される条
件で、ポジティブコントロールとして作用する。本発明の遺伝子産物（本発明の
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびに実施例３１で作製された上清を
含むが、これらに限定されない）は、ＳＣＦ（５．０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、ま
たは非存在下で適切なネガティブコントロールとともに試験され、ここで、試験
因子の上清は、全アッセイ体積の１０％を示す。次いで、プレートされた細胞を
、低酸素環境（５％ＣＯ２、７％Ｏ２および８８％Ｎ２）の組織培養インキュベ
ータで７日間インキュベートすることによって増殖させる。次いで、ウェル内の
増殖細胞の数を、細胞ＤＮＡへのチミジン組込みを測定することによって定量す
る。アッセイにおけるポジティブヒットの確認は、細胞の表現型の特徴付けを必
要とし、この特徴付けは、培養系をスケールアップし、そして細胞表面抗原およ
びＳＣＦＳｃａｎに対する適切な抗体試薬を使用することによって達成される。
【１１９５】 当業者は、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、抗体、アゴニスト、お
よび／またはアンタゴニストならびにそのフラグメントおよび改変体の活性を試
験するための例示的な研究を容易に改変し得る。
【１１９６】 本発明の特定のポリペプチドは、造血祖先の刺激薬であることが見出される場
合、このポリペプチドをコードする遺伝子に対応するポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドは、診断、ならびに免疫系および造血に影響する障害の処置に有用で
あり得る。代表的な用途は、上記の「免疫活性」および「感染疾患」の節、なら
びに本明細書の他の箇所に記載される。遺伝子産物はまた、種々の血液連鎖の幹
細胞および先駆細胞（ｃｏｍｍｉｔｅｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）の拡張におい
て、そして種々の細胞の型の分化および／または増殖において有用であり得る。
【１１９７】 さらに、目的の遺伝子のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、なら
びに／またはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストはまた、造血細胞の
増殖および分化を阻害するために使用され、そしてそれによって、化学療法の間
に、化学療法薬剤から骨髄幹細胞を保護するために使用され得る。この抗増殖効
果は、より高い用量の化学療法薬剤の投与、従って、より有効な化学治療処置を
可能にし得る。
【１１９８】 さらに、目的の遺伝子に対応するポリヌクレオチドおよびポリペプチドもまた
、造血関連障害（例えば、貧血、汎血球減少症、白血球減少症、血小板減少症、
または白血病）の処置および診断に有用であり得る。なぜなら、間質細胞は、造
血系列の細胞の生成において重要であるからである。これらの用途としては、骨
髄細胞エキソビボ培養、骨髄移植、骨髄再形成、新形成の放射線療法または化学
療法が、挙げられる。
【１１９９】 （実施例５５：ヒト皮膚線維芽細胞および大動脈平滑筋細胞の増殖） 目的のポリペプチドを、正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）およびヒト大
動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭＣ）の培養物に添加し、そして２つの同時アッセイを
各サンプルを用いて実施する。第１のアッセイは、正常なヒト線維芽細胞（ＮＨ
ＤＦ）または大動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭＣ）の増殖に対する、目的のポリペプ
チドの効果を試験する。線維芽細胞または平滑筋細胞の異常な増殖は、いくつか
の病理学的プロセス（繊維症および再狭窄を含む）の一部である。第２のアッセ
イは、ＮＨＤＦおよびＳＭＣの両方によるＩＬ６産生を試験する。ＩＬ６産生は
、機能的活性化の指標である、活性化細胞は、多数のサイトカインおよび他の因
子の産生の増加を有し、これは、炎症誘発性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
）または免疫調節性の結果を生じ得る。アッセイは、同時刺激活性または阻害活
性をチェックするために、同時ＴＮＦ刺激とともに行い、そして同時ＴＮＦ刺激
なしで行う。
【１２００】 簡単に述べると、１日目に、９６ウェルの黒いプレートに、１００μｌ培養培
地中に１０００細胞／ウェル（ＮＨＤＦ）または２０００細胞／ウェル（ＡｏＳ
ＭＣ）を配置する。ＮＨＤＦ培養培地は、以下：Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ ＦＢ基礎
培地、１ｍｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ、５ｍｇ／ｍｌインスリン、５０μｇ／ｍｌゲン
タマイシン、２％ ＦＢＳを含み、一方ＡｏＳＭＣ培養培地は、Ｃｌｏｎｅｔｉ
ｃｓ ＳＭ基礎培地、０．５μｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ、５ｍｇ／ｍｌインスリン、
１μｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０μｇ／ｍｌ Ａ
ｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ、５％ ＦＢＳを含む。３７℃で少なくとも４〜５
時間のインキュベーション後、培養培地を吸引し、増殖停止培地で置換する。Ｎ
ＨＦＤ用の増殖停止培地は、線維芽細胞基礎培地、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシ
ン、２％ ＦＢＳを含み、一方ＡｐＳＭＣ用の増殖停止培地は、ＳＭ基礎培地、
５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０μｇ／ｍｌ Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ
Ｂ、０．４％ ＦＢＳを含む。３７℃で２日目までインキュベートする。
【１２０１】 ２日目、目的のポリペプチドの系列希釈物およびテンプレートを、それらが常
に、培地コントロールおよび既知のタンパク質コントロールを含むように、設計
する。刺激実験および阻害実験の両方について、タンパク質を増殖停止培地で希
釈する、阻害実験について、ＴＮＦａを、最終濃度２ｎｇ／ｍｌ（ＮＨＤＦ）ま
たは５ｎｇ／ｍｌ（ＡｏＳＭＣ）まで添加する。コントロールまたは本発明のポ
リペプチドを含む１／３容量の培地を添加し、そして５日目まで、３７℃／５％
ＣＯ2にてインキュベートする。
【１２０２】 各ウェルから６０μｌを別の標識９６ウェルプレートに移し、プレートシーラ
ーで覆い、そして６日目まで４℃で（ＩＬ６ ＥＬＩＳＡのために）保存する。
細胞培養プレート中の残りの１００μｌに、その培養物容量の１０％に等しい量
（１０μｌ）のＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを無菌的に添加する。プレートを３〜４
時間の間インキュベーターに戻す。次いで、５３０ｎｍでの励起および５９０ｎ
ｍでの放射を伴う蛍光を、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒを使用して測定する。これにより
、増殖刺激／阻害のデータを得る。
【１２０３】 ５日目、ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈した５０〜１
００μ／ウェルの抗ヒトＩＬ−６モノクローナル抗体で９６ウェルプレートをコ
ーティングすることによって実施し、室温でＯＮをインキュベートする。
【１２０４】 ６日目、プレートの中身を流しに空け、そしてペーパータオル上で吸い取る。
４％ ＢＳＡを含むＰＢＳを含むアッセイ緩衝液を調製する。プレートを、ＰＢ
Ｓ中の２００μ／ウェルのＰｉｅｒｃｅ Ｓｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋブロッキング
緩衝液で１〜２時間ブロックし、次いで、洗浄緩衝液（ＰＢＳ，０．０５％ Ｔ
ｗｅｅｎ−２０）でプレートを洗浄する。プレートをペーパータオル上で吸い取
る。次いで、０．５０ｍｇ／ｍｌに希釈した抗ヒトＩＬ−６モノクローナルビオ
チン標識抗体５０μｌ／ウェルを添加する。ＩＬ−６ストックの培地中の希釈物
を作製する（３０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、
０．３ｎｇ／ｍｌ、０ｎｇ／ｍｌ）。二連のサンプルをプレートの最上列に添加
する。プレートを覆い、そして振盪機上で室温で２時間インキュベートする。プ
レートを洗浄緩衝液で洗浄し、ペーパータオル上で吸い取る。ＥＵ標識ストレプ
トアビジンをアッセイ緩衝液中に１：１０００希釈し、そして１００μｌ／ウェ
ルを添加する。プレートを覆い、そして室温で１時間インキュベートする。プレ
ートを再び洗浄緩衝液で洗浄し、そしてペーパータオル上で吸い取る。１００μ
ｌ／ウェルの増強溶液を添加し、そして５分間振盪する。Ｗａｌｌａｃ ＤＥＬ
ＦＩＡ蛍光測定器でプレートを読み取る。各アッセイでの三連のサンプルからの
読み取りを、表にして平均をとる。
【１２０５】 このアッセイにおける陽性の結果は、ＡｏＳＭＣ細胞増殖を示唆し、そして本
発明のポリペプチドが皮膚線維芽細胞増殖および／または平滑筋細胞増殖に関与
し得ることを示唆する。陽性の結果はまた、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、
陽性の結果を与える本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドのアゴニストおよ
び／またはアンタゴニストの多くの潜在的な使用を示唆する。例えば、本明細書
の全体にわたって記載されるように、炎症および免疫応答、創傷の治癒、ならび
に新脈管形成。特に、本発明のポリペプチドおよび本発明のポリヌクレオチドは
、創傷の治癒および皮膚の再生、ならびに脈管形成（血管およびリンパ管の両方
）の促進に使用され得る。脈管の成長は、例えば、心臓血管疾患の処置において
使用され得る。さらに、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドのアンタ
ゴニストは、抗脈管（例えば、抗新脈管形成）として作用することによって、新
脈管形成を含む、疾患、障害、および／または状態を処置する際に有用であり得
る。これらの疾患、障害、および／または状態、例えば以下：悪性腫瘍、固形腫
瘍、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化
膿性肉芽腫）；関節硬化性斑（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｉｃ ｐｌａｑｕｅ）
；眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜障害、未熟児の網膜障害、黄斑変性
、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、皮膚潮紅、網膜芽細胞
腫、ぶどう膜炎、および眼の翼状片（異常な血管の成長））；慢性関節リウマチ
；乾癬；遅延性の創傷の治癒；子宮内膜症；脈管形成；顆粒形成；過形成性瘢痕
（ケロイド）；非結合性骨折（ｎｏｎｕｎｉｏｎ ｆｒａｃｔｕｒｅ）；強皮症
；トラコーマ；脈管接着；心筋新脈管形成；冠状側副枝；大脳側副枝；動静脈奇
形；虚血性の肢の新脈管形成；Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ症候群；斑の新生血管
形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；線維性筋性形成異常症；創
傷肉芽化；クローン病；およびアテローム性硬化症などは、当該分野において公
知でありそして／または本明細書中で記載される。さらに、本発明のポリペプチ
ドおよびポリヌクレオチドのアンタゴニストは、当該分野において公知でありそ
して／または本明細書中で記載される、抗過増殖性疾患および／または抗炎症性
疾患を処置する際に有用であり得る。
【１２０６】 当業者は、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、抗体、アゴニスト、お
よび／またはアンタゴニスト、ならびにそのフラグメントおよび改変体の活性を
試験するために例示された研究を容易に改変し得る。
【１２０７】 （実施例５６：内皮細胞上での細胞接着分子（ＣＡＭ）の発現） リンパ球の、炎症および新脈管形成の領域に対する漸増は、リンパ球上の細胞
表面接着分子（ＣＡＭ）と脈管内皮との間の特異的なレセプター−リガンド相互
作用を含む。接着プロセスは、通常の環境および病的な環境の両方において、多
段階のカスケードに続き、このカスケードは、内皮細胞（ＥＣ）上での細胞内接
着分子１（ＩＣＡＭ−１）、脈管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）、および内皮
性白血球接着分子１（Ｅ−セレクチン）の発現を含む。脈管内皮上でのこれらの
分子などの発現は、白血球が局所的な脈環構造と接着し、そして炎症性応答の進
行の間に局所的な組織へと溢出し得る効率を決定する。サイトカインおよび増殖
因子の局所的濃度は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。
【１２０８】 簡単には、内皮細胞（例えば、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））は、標準
９６ウェルプレート中でコンフルエンスまで増殖する。増殖培地を、細胞から除
去し、そして１００μｌの１９９ Ｍｅｄｉｕｍ（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ
））で置き換える。試験のためのサンプルおよび陽性または陰性のコントロール
を、３部構成（１０μｌの容量ずつ）のプレートに添加する。次いで、プレート
を、３７℃で、５時間（セレクチンおよびインテグリンの発現）かまたは２４時
間（インテグリンの発現のみ）のいずれかの間インキュベートする。プレートを
、培地を除去するために吸引し、そして１００μｌの０．１％パラホルムアルデ
ヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋含有）を各ウェルに添加する。プレート
を４℃で３０分間保持する。固定剤をウェルから除去し、そしてウェルをＰＢＳ
（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡで１回洗浄し、そして水気を切る。１０μｌ
の希釈した第１抗体を、試験ウェルおよびコントロールウェルに添加する。抗Ｉ
ＣＡＭ−１−ビオチン、抗ＶＣＡＭ−１−ビオチン、および抗Ｅ−セレクチン−
ビオチンを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ／ｍｌの貯蔵抗体の１：１０希
釈）で使用する。細胞を３７℃で３０分間、加湿された環境においてインキュベ
ートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡで３回洗浄する
。２０μｌの希釈されたＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐ
ｈｏｔａｓｅ（１：５，０００希釈、本明細書中で実用的な希釈液といわれる）
を各ウェルに添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートする。ウェルを、
ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡで３回洗浄する。５ｍｌのグリシン緩
衝液（ｐＨ１０．４）につき１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐＮＰ
Ｐ）を溶解する。グリシン緩衝液中の１００μｌのｐＮＰＰ基質を各試験ウェル
に添加する。３部構成の標準ウェルを、グリシン緩衝液中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉ
ｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ；１：５，０００（１００）＞
１０−０．５＞１０−１＞１０−１．５の実用的な希釈液から調製する。各希釈
液の５μｌを３部構成のウェルに添加すると、各ウェル中の得られるＡＰ含有量
は、５．５ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇ、である。次いで
、１００μｌのｐＮＮＰ試薬を標準ウェルの各々に添加する。このプレートを、
３７℃で４時間インキュベートする。５０μｌの容量の３Ｍ ＮａＯＨを、全て
のウェルに添加する。このプレートを、グリシン緩衝液のみを充填したブランク
ウェルでのバックグラウンド除去オプションを使用して、４０５ｎｍのプレート
リーダーで読む。さらに、テンプレートを、各標準ウェル［５．５０ｎｇ；１．
７４ｎｇ；０．５５ｎｇ；０．１８ｎｇ］中のＡＰ共重合体の濃度を示すように
セットアップする。結果を、各サンプル中の結合したＡＰ共重合体の量として示
す。
【１２０９】 （実施例５７：Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ内皮細胞増殖アッセイ） このアッセイを使用して、ウシリンパ内皮細胞（ＬＥＣ）、ウシ大動脈内皮細
胞（ＢＡＥＣ）、またはヒト微小血管子宮筋細胞（ＵＴＭＥＣ）のｂＦＧＦ誘導
増殖のタンパク質媒介性阻害を定量的に決定し得る。このアッセイは、代謝活性
の検出に基づいて、蛍光定量的な増殖インジケーターを組み込む。標準Ａｌａｍ
ａｒ Ｂｌｕｅ増殖アッセイを、内皮細胞刺激の供給源として添加した１０ｎｇ
／ｍｌのｂＦＧＦを含むＥＧＭ−２ＭＶ中で調整する。このアッセイは、増殖培
地および細胞濃度がわずかに変化した様々な内皮細胞と共に使用され得る。試験
されるべきタンパク質バッチの希釈物を、適切に希釈する。ｂＦＧＦなしの血清
を含有しない培地（ＢＩＢＣＯ ＳＦＭ）を、非刺激コントロールとして使用し
、そしてＡｎｇｉｏｓｔａｔｉｎまたはＴＳＰ−１は、既知の阻害コントロール
として含まれる。
【１２１０】 簡単には、ＬＥＣ、ＢＡＥＣまたはＵＴＭＥＣを、９６ウェルプレートに、５
０００〜２０００細胞／ウェルの密度で、増殖培地に播種し、そして３７℃で一
晩放置する。この細胞の一晩のインキュベーションの後、増殖培地を除去し、そ
してＧＩＢＣＯ ＥＣ−ＳＦＭで置き換える。この細胞を、追加のｂＦＧＦを含
む３つのウェル中で、目的のタンパク質またはコントロールタンパク質サンプル
の適切な希釈物（ＳＦＭ中で調製）で、１０ｎｇ／ｍｌの濃度まで処理する。一
旦、細胞をサンプルで処理すると、プレート（単数または複数）を、３７℃のイ
ンキュベーターに３日間戻す。３日後、１０ｍｌのストックＡｌａｍａｒ Ｂｌ
ｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃａｔ＃ ＤＡＬ１１００）を、各ウェルに添加し
、そしてプレート（単数または複数）を、３７℃のインキュベーターに４時間戻
す。次いで、このプレート（単数または複数）を、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リー
ダーを使用して、５３０ｎｍ励起および５９０ｎｍ発光で読みとる。直接出力を
、相対蛍光単位で記録する。
【１２１１】 Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅは、細胞増殖から生じる増殖培地の化学的還元に応答
して、蛍光を発しかつ色を変化する、酸化−還元指示薬である。培地中で細胞が
増殖するにつれて、生得代謝活性によりすぐ周辺の環境の化学的還元が生じる。
増殖に関する還元により、この指示薬は、酸化（非蛍光性の青色）形態から還元
（蛍光性赤色）形態に変化し得る。すなわち、刺激された増殖は、より強いシグ
ナルを生成し、そして阻害された増殖は、より弱いシグナルを生成し、そして全
シグナルは細胞の総数ならびにそれらの代謝活性に比例する。活性のバックグラ
ウンドレベルは、飢餓性培地のみを用いて観察される。これを陽性コントロール
サンプル（増殖培地中のｂＦＧＦ）およびタンパク質希釈物から観察される出力
と比較する。
【１２１２】 （実施例５８：混合リンパ球反応の阻害の検出） このアッセイを使用して、遺伝子産物（例えば、単離されたポリペプチド）に
よる混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の阻害を検出および評価し得る。ＭＬＲの阻害
は、細胞増殖および生存度、相互作用する細胞における同時刺激分子の変調、リ
ンパ球と副細胞との間の接着の変調、または副細胞によるサイトカイン産生の変
調に対する直接効果に起因し得る。複数の細胞は、これらのポリペプチドによっ
て標的化され得る。なぜなら、このアッセイで使用される末梢血液単核画分は、
Ｔ、Ｂおよびナチュラルキラーリンパ球、ならびに単球および樹状細胞を含むた
めである。
【１２１３】 ＭＬＲを阻害することが見出された目的のポリペプチドは、リンパ球および単
球の活性化または増殖に関する疾患における用途を見出し得る。これには、喘息
、関節炎、糖尿病、炎症性の皮膚状態、乾癬、湿疹、全身性エリテマトーデス、
多発性硬化症、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、動脈硬
化症、肝硬変、対宿主性移植片病、対移植片性宿主病、肝炎、白血病およびリン
パ腫のような疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【１２１４】 簡単には、ヒトドナー由来のＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒ
ａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＬＳＭ（登録商標）、密度 １．００７０ｇ／ｍｌ
、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｅｓｔ Ｃｈ
ｅｓｔｅｒ、ＰＡ）を使用する密度勾配遠心分離によって精製する。２つのドナ
ー由来のＰＢＭＣを、１０％ ＦＣＳおよび２ｍＭ グルタミンを補ったＲＰＭ
Ｉ−１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎ
ｄ、ＮＹ）中、２×１０６細胞／ｍｌに調整する。第３のドナー由来のＰＢＭＣ
を、２×１０５細胞／ｍｌに調整する。各ドナー由来の５０μｌのＰＢＭＣを、
９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェルに添加する。試験材料の希釈
物（５０μｌ）を、三連でマイクロタイターウェルに添加する。（目的のタンパ
ク質の）試験サンプル１：４の最終希釈になるまで添加し；ｒｈｕＩＬ−２（Ｒ
＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、カタログ番号 ２０２
−ＩＬ）を、１μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで添加し；抗−ＣＤ４ ｍＡｂ（
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、クローン ３４９３０．１１、カタログ番号 ＭＡＢ
３７９）を１０μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで添加する。細胞を、５％ ＣＯ
２中、３７℃で７〜８時間培養し、そして１μＣの［３Ｈ］チミジンを、培養の
最後の１６時間でウェルに添加する。細胞を収集し、そしてチミジンの取込みを
、Ｐａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔを使用して決定する。データを、３つの測
定値の平均および標準偏差として表す。
【１２１５】 目的のタンパク質のサンプルを、別個の実験でスクリーンし、そして陰性コン
トロール処理、抗−ＤＣ４ ｍＡＢ（これはリンパ球の増殖を阻害する）、およ
び陽性コントロール処理、ＩＬ−２（組換え物質または上清として）（これは、
リンパ球の増殖を促進する）と比較する。
【１２１６】 本実施例において記載される研究は、ニューロペプチドレセプタータンパク質
の活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、ニュー
ロペプチドレセプターポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、ニューロペプ
チドレセプターのアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験し得
る。
【１２１７】 本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得
ることは、明らかである。本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の
教示を考慮して可能であり、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内に
ある。
【１２１８】 発明の背景、詳細な説明および実施例において引用された各文書の全開示（特
許、特許出願、学術文献、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示を含む）
は、本明細書中に参考として援用される。さらに、本明細書にとともに提出され
た配列表のハードコピーおよび対応するコンピュ−ター読み出し形態は、両方と
も本明細書中にその全体が参考として援用される。さらに、米国出願第ＵＳ０８
／４６２，５０９号、同第ＵＳ０９／３９３，６９６号、およびＰＣＴ公開ＷＯ
９６／３４８７７からの配列表は、参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜Ｂは、本発明のニューロペプチドレセプターポリペプチドのｃＤＮＡ
配列（配列番号１）および対応する推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。ア
ミノ酸について標準的な１文字表記を使用する。配列決定を、３７３自動ＤＮＡ
シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用し
て実施した。
【図２】 図２Ａ〜Ｂは、本発明のニューロペプチドレセプタースプライス改変体１ポリ
ペプチドのｃＤＮＡ配列（配列番号３）および対応する推定アミノ酸配列（配列
番号４）を示す。アミノ酸について標準的な１文字表記を使用する。
【図３】 図３Ａ〜Ｂは、本発明のニューロペプチドレセプタースプライス改変体２ポリ
ペプチドのｃＤＮＡ配列（配列番号５）および対応する推定アミノ酸配列（配列
番号６）を示す。アミノ酸について標準的な１文字表記を使用する。
【図４】 図４は、ニューロペプチドレセプター（配列番号２）のアミノ酸配列および７
つの膜貫通領域を示す。膜貫通領域は、下線が引かれ、そしてＴＭで示される。
【図５】 図５は、ニューロペプチドレセプタースプライス改変体１（配列番号４）のア
ミノ酸配列および７つの膜貫通領域を示す。膜貫通領域は、下線が引かれ、そし
てＴＭで示される。
【図６】 図６は、ニューロペプチドレセプタースプライス改変体２（配列番号６）のア
ミノ酸配列および７つの膜貫通領域を示す。膜貫通領域は、下線が引かれ、そし
てＴＭで示される。
【図７】 図７Ａおよび７Ｂは、ＢＬＡＳＴ分析によって決定された、ニューロペプチド
レセプタータンパク質（配列番号２）のアミノ酸配列とヒトニューロペプチドＹ
レセプタータンパク質（配列番号２３）の翻訳産物との間の同一領域を示す。保
存領域を調べることによって、当業者は、２つのポリペプチドの間の保存された
ドメインを容易に同定し得る。これらの保存されたドメインは、本発明の好まし
い実施形態である。
【図８】 図８は、ニューロペプチドレセプターアミノ酸配列（配列番号２）の分析を示
す。α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；親水性および疎水性；両親
媒性領域；ブレキシブル領域；抗原性指標および表面確率が示され、そして全て
は、デフォルト設定を使用して生成された。「抗原性指標またはＪａｍｅｓｏｎ
−Ｗｏｌｆ」グラフにおいて、正のピークは、ニューロペプチドレセプタータン
パク質の高度に抗原性の領域（すなわち、本発明のエピトープ保有ペプチドが得
られ得る領域）の位置を示す。これらのグラフによって規定されるドメインは、
本発明によって考慮される。 図８に示されるデータはまた、表Ｉで、表形態において示される。表Ｉ中の縦
列は、見出し「Ｒｅｓ」、「Ｐｏｓｉｔｉｏｎ」およびローマ数字Ｉ〜ＸＩＶを
用いて表示される。縦列の見出しは、図８および表Ｉにおいて示されるアミノ酸
配列の以下の特徴をいう：「Ｒｅｓ」：配列番号２ならびに図１Ａ〜Ｂのアミノ
酸残基；「Ｐｏｓｉｔｉｏｎ」：配列番号２ならびに図１Ａ〜Ｂ中の対応する残
基の位置；Ｉ：α、領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＩＩ：α、領域−Ｃ
ｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；ＩＩＩ：β、領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；Ｉ
Ｖ：β、領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；Ｖ：ターン、領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−
Ｒｏｂｓｏｎ；ＶＩ：ターン、領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；ＶＩＩ：コイル
、領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＶＩＩＩ：親水性プロット−Ｋｙｔｅ
−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ；ＩＸ：疎水性プロット−Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ；Ｘ：α
、両親媒性領域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；ＸＩ：β、両親媒性領域−Ｅｉｓｅｎｂ
ｅｒｇ；ＸＩＩ：フレキシブル領域−Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ；ＸＩＩＩ
：抗原性指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ；およびＸＩＶ：表面確率プロット−
Ｅｍｉｎｉ。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/18 Ａ６１Ｐ 25/32 ４Ｈ０４５ 25/22 25/34 25/32 25/36 25/34 29/00 25/36 Ｃ０７Ｋ 14/72 29/00 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/72 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｍ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ａ６１Ｋ 37/02 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ソッペト， ダニエル アール． アメリカ合衆国 バージニア 22020， センタービル， スティルフィールド プ レイス 15050 (72)発明者 リ， イ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94086， サニーベイル， アルパイン テラス 990−６ (72)発明者 ローゼン， クレイグ エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20882， レイトンズビル， ローリング ヒル ロード 22400 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA41 BA63 CA04 DA02 DA03 DA06 EA02 EA04 GA11 GA18 GA19 HA03 HA17 4B063 QA01 QA12 QA18 QA19 QQ02 QQ42 QQ53 QR32 QR38 QR56 QR59 QR80 QR82 QS24 QS25 QS28 QS34 QS39 QX02 4B064 AG20 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA90X AA93Y AB01 AC14 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 CA59 NA14 ZA02 ZA05 ZA08 ZA18 ZA70 ZC39 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 DA76 DA86 EA21 EA50 FA72 FA74

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号１、３、または５のポリヌクレオチドフラグメント、またはＡ
    ＴＣＣ寄託番号９７１２８に含まれるｃＤＮＡ配列のポリヌクレオチドフラグメ
    ント； （ｂ）配列番号２、４、または６、もしくはＡＴＣＣ寄託番号９７１２８に含
    まれるｃＤＮＡ配列のポリペプチドフラグメントをコードする、ポリヌクレオチ
    ド； （ｃ）配列番号２、４、または６、もしくはＡＴＣＣ寄託番号９７１２８に含
    まれるｃＤＮＡ配列のポリペプチドドメインをコードする、ポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号２、４、または６、もしくはＡＴＣＣ寄託番号９７１２８に含
    まれるｃＤＮＡ配列のポリペプチドエピトープをコードする、ポリヌクレオチド
    ； （ｅ）生物学的活性を有する、配列番号２、４、または６のポリペプチド、も
    しくはＡＴＣＣ寄託番号９７１２８に含まれるｃＤＮＡ配列をコードするポリヌ
    クレオチド； （ｆ）配列番号１、３、または５の改変体であるポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号１、３、または５の対立遺伝子改変体であるポリヌクレオチド
    ； （ｈ）配列番号２、４、または６の種相同体をコードするポリヌクレオチド； （ｉ）（ａ）〜（ｈ）において特定されるポリヌクレオチドのいずれか１つに
    ストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、こ
    こで、該ポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみのヌクレオチド配列
    を有する核酸分子に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズしない、ポリヌ
    クレオチド、 からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有
    するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、成熟形態または分泌
    タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された
    核酸分子。
  3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号２、４、ま
    たは６として同定される配列をコードするヌクレオチド配列、またはＡＴＣＣ寄
    託番号９７１２８に含まれるｃＤＮＡ配列に含まれるコード配列を含む、請求項
    １に記載の単離された核酸分子。
  4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号１、３、ま
    たは５の全体のヌクレオチド配列、またはＡＴＣＣ寄託番号９７１２８に含まれ
    るｃＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  5. 【請求項５】 前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかか
    らの連続するヌクレオチド欠失を含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。
  6. 【請求項６】前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかから
    の連続するヌクレオチド欠失を含む、請求項３に記載の単離された核酸分子。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組換えベクタ
    ー。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む組換え宿主細胞
    を、作製する方法。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法によって産生される、組換え宿主細胞
    。
  10. 【請求項１０】 ベクター配列を含む、請求項９に記載の組換え宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 単離されたポリペプチドであって、以下： （ａ）配列番号２、４、または６、もしくはＡＴＣＣ寄託番号９７１２８に含
    まれるコードされた配列の、ポリペプチドフラグメント； （ｂ）生物学的活性を有する、配列番号２、４、または６、もしくはＡＴＣＣ
    寄託番号９７１２８に含まれるコードされた配列の、ポリペプチドフラグメント
    ； （ｃ）配列番号２、４、または６、もしくはＡＴＣＣ寄託番号９７１２８に含
    まれるコードされた配列の、ポリペプチドドメイン； （ｄ）配列番号２、４、または６、もしくはＡＴＣＣ寄託番号９７１２８に含
    まれるコードされた配列の、ポリペプチドエピトープ； （ｅ）分泌タンパク質の成熟形態； （ｆ）全長分泌タンパク質； （ｇ）配列番号２、４、または６の改変体； （ｈ）配列番号２、４、または６の対立遺伝子改変体；もしくは （ｉ）配列番号２、４、または６の種相同体、 からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、
    単離されたポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 前記成熟形態または前記全長分泌タンパク質が、Ｃ末端ま
    たはＮ末端のいずれかからの連続するアミノ酸欠失を含む、請求項１１に記載の
    単離されたポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドに特異的に結
    合する、単離された抗体。
  14. 【請求項１４】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドを発現する、
    組換え宿主細胞。
  15. 【請求項１５】 単離されたポリペプチドを作製する方法であって、 （ａ）該ポリペプチドが発現されるような条件下で、請求項１４に記載の組換
    え宿主細胞を培養する工程；および （ｂ）該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する、方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法によって産生される、ポリペプチ
    ド。
  17. 【請求項１７】 医学的状態を予防、処置、または緩和する方法であって、
    治療有効量の請求項１１に記載のポリペプチドを、哺乳動物被験体に投与する工
    程を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 分泌タンパク質の発現または活性に関連する、被験体にお
    いて病理学的状態、または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって
    、 （ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドにおいて変異の存在または非存在を
    決定する工程； （ｂ）該変異の存在または非存在に基づいて病理学的状態、または病理学的状
    態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  19. 【請求項１９】 分泌タンパク質の発現または活性に関連する、被験体にお
    いて病理学的状態、または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって
    、 （ａ）生物学的サンプルにおいて請求項１１に記載のポリペプチドの発現の存
    在または量を決定する工程； （ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて病理学的状態、または
    病理学的状態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１１に記載のポリペプチドに対する結合パートナー
    を同定する方法であって、 （ａ）請求項１１に記載のポリペプチドを結合パートナーと接触させる工程；
    および （ｂ）該結合パートナーが該ポリペプチドの活性をもたらすかどうかを決定す
    る工程、 を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 配列番号２、４、または６のｃＤＮＡ配列に対応する、遺
    伝子。
  22. 【請求項２２】 生物学的アッセイにおいて活性を同定する方法であって、
    ここで該方法が、以下： （ａ）細胞において配列番号１、３、または５を発現させる工程； （ｂ）その上清を単離する工程； （ｃ）生物学的アッセイにおいて活性を検出する工程；および （ｄ）該活性を有する該上清においてタンパク質を同定する工程、 を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の方法によって産生される、産物。
  24. 【請求項２４】 医学的状態を予防、処置、または緩和する方法であって、
    治療有効量の請求項１に記載のポリヌクレオチドを、哺乳動物被験体に投与する
    工程を包含する、方法。
  25. 【請求項２５】 前記被験体が、以下： （ａ）肥満； （ｂ）ナルコレプシー； （ｃ）神経性疾患； （ｄ）麻薬中毒； （ｅ）ニコチン中毒； （ｆ）アルコール中毒； （ｇ）慢性疼痛； （ｈ）急性疼痛； （ｉ）片頭痛；および （ｊ）不安障害、 からなる群から選択される状態を有する、請求項２４に記載の方法。
JP2001521323A 1999-09-10 2000-09-07 ヒトニューロペプチドレセプター Withdrawn JP2003528580A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/393,696 US20030022277A1 (en) 1995-05-05 1999-09-10 Human neuropeptide receptor
US09/393,696 1999-09-10
PCT/US2000/024518 WO2001017532A1 (en) 1999-09-10 2000-09-07 Human neuropeptide receptor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003528580A true JP2003528580A (ja) 2003-09-30

Family

ID=23555850

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001521323A Withdrawn JP2003528580A (ja) 1999-09-10 2000-09-07 ヒトニューロペプチドレセプター

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20030022277A1 (ja)
EP (1) EP1223946A4 (ja)
JP (1) JP2003528580A (ja)
AU (1) AU7354700A (ja)
CA (1) CA2384083A1 (ja)
WO (1) WO2001017532A1 (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2321704T3 (es) * 2002-04-12 2009-06-10 Brian F. O'dowd Metodo de identificacion de compuestos que interactuan con proteinas transmembrana.
WO2004071395A2 (en) * 2003-02-17 2004-08-26 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with g protein-coupled receptor ox1r (ox1r)
UA102432C2 (ru) * 2009-02-20 2013-07-10 Іпсен Фарма С.А.С. Цитотоксичные конъюгаты с соединением, которое связывает рецептор нейропептиду y
KR101933620B1 (ko) * 2012-09-18 2018-12-28 삼성전자주식회사 소포를 검출하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 분석하는 방법
US20150140015A1 (en) * 2013-11-15 2015-05-21 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of pancreatic cancer
EP3490542A4 (en) * 2016-07-26 2020-07-08 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. NEUROMODULATING COMPOSITIONS AND RELATED THERAPEUTIC METHODS FOR TREATING CANCER BY MODULATING AN IMMUNE REACTION AGAINST CANCER

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996034877A1 (en) * 1995-05-05 1996-11-07 Human Genome Sciences, Inc. Human neuropeptide receptor
US6020157A (en) * 1997-04-30 2000-02-01 Smithkline Beecham Corporation Polynucleotides encoding HFGAN72X receptor
US5935814A (en) * 1997-04-30 1999-08-10 Smithkline Beecham Corporation Polynucleotides encoding HFGAN72Y receptor
EP1190089A4 (en) * 1999-06-25 2002-10-16 Smithkline Beecham Corp LIG 72A TREATMENT PROCESS AND VARIANTS THEREOF

Also Published As

Publication number Publication date
US20030022277A1 (en) 2003-01-30
EP1223946A1 (en) 2002-07-24
AU7354700A (en) 2001-04-10
EP1223946A4 (en) 2003-05-07
CA2384083A1 (en) 2001-03-15
WO2001017532A1 (en) 2001-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5583308B2 (ja) ２１個のヒト分泌タンパク質
JP2003514510A (ja) ヒト膵臓および膵臓癌関連遺伝子配列およびポリペプチド
JP2003511012A (ja) ３２個のヒト分泌タンパク質
JP2003514541A (ja) １８個のヒト分泌タンパク質
JP2003528587A (ja) ２７個のヒト分泌タンパク質
JP2002532083A (ja) ４７個のヒト分泌タンパク質
JP2003507030A (ja) １８個のヒト分泌タンパク質
JP2003513662A (ja) １５個のヒト分泌タンパク質
JP2003513622A (ja) １９個のヒト分泌タンパク質
JP2003528586A (ja) ３２個のヒト分泌タンパク質
JP2003535570A (ja) ５０個のヒト分泌タンパク質
JP2003501072A (ja) ２６個のヒト分泌タンパク質
JP2003510028A (ja) ２５個のヒト分泌タンパク質
JP2002539814A (ja) ５０個のヒト分泌タンパク質
JP2003528580A (ja) ヒトニューロペプチドレセプター
JP2003502017A (ja) ４９個のヒト分泌タンパク質
JP2002534972A (ja) ３３個のヒト分泌タンパク質
JP2003510074A (ja) ２６個のヒト分泌タンパク質
JP2003520030A (ja) ２８個のヒト分泌タンパク質
JP2003526337A (ja) ２９個のヒト分泌タンパク質
JP2003532383A (ja) ヒトポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体
JP2003520031A (ja) ２８個のヒト分泌タンパク質
JP2002539776A (ja) ４９個のヒト分泌タンパク質
JP2003500012A (ja) ４７個のヒト分泌タンパク質
JP2002539847A (ja) ４９個のヒト分泌タンパク質

Legal Events

Date Code Title Description
A300 Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300

Effective date: 20071204