ES2321704T3 - Metodo de identificacion de compuestos que interactuan con proteinas transmembrana. - Google Patents

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Abstract

Método para seleccionar un compuesto candidato según su capacidad para interactuar con al menos una proteína transmembrana, comprendiendo dicho método los pasos de: transfectar una célula con al menos una secuencia nucleotídica que codifique una proteína que comprenda una proteína transmembrana que contenga al menos una secuencia de localización nuclear (NLS) y una mitad detectable y permitir la expresión de la proteína codificada en la célula; poner a la proteína en contacto con un compuesto candidato; y determinar la distribución de la proteína expresada en la célula detectando la distribución de la mitad detectable en la célula; donde la detección de una distribución alterada de la mitad detectable en la célula con respecto a la distribución de la mitad detectable en una célula de control no puesta en contacto con el compuesto candidato indica que el compuesto interactúa con la proteína transmembrana, y donde la proteína transmembrana de tipo salvaje carece de una NLS y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína transmembrana es modificada para codificar una NLS.

Description

Método de identificación de compuestos que interactúan con proteínas transmembrana.
Ámbito de la invención
Esta invención se refiere a los métodos de selección de compuestos según su capacidad para interactuar con las proteínas transmembrana. La invención se refiere adicionalmente a los métodos de selección de proteínas transmembrana según su capacidad para dimerizarse u oligomerizarse para así formar grupos de dos o más proteínas.
Antecedentes de la invención
En la siguiente descripción se hace referencia a determinadas citas bibliográficas que se enumeran al final de la memoria descriptiva y quedan todas ellas incorporadas a la presente por referencia.
Las proteínas transmembrana han sido clasificadas en varias clases principales entre las que se incluyen los receptores acoplados a proteína G, los transportadores, los receptores de tirosina quinasa, los receptores de citoquina y los receptores de LDL (LDL = lipoproteínas de baja densidad). Los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) pueden ser agrupados en varias familias sobre la base de la homología estructural y secuencial. La familia 1 (también llamada familia A o familia tipo rodopsina) es con mucho el subgrupo más grande y contiene receptores para pequeñas moléculas tales como las catecolaminas, la dopamina y la noradrenalina, péptidos tales como los opioides, la somatostatina y la vasopresina, hormonas glicoproteínicas tales como la hormona estimuladora de la tirotropina y toda la clase de moléculas odorantes (George et al., 2002). La familia 2 o familia B contiene los receptores tales como los que son para glucagón, hormona paratiroidea y secretina. Estos GPCRs están caracterizados por un largo terminal amino que contiene varias cisteínas que pueden formar puentes disulfuro. La familia 3 o familia C contiene receptores tales como los metabotrópicos de glutamato, los detectores de Ca2+ y los receptores del ácido gamma-aminobutírico (GABA)B. Estos receptores están también caracterizados por un terminal amino complejo. A pesar de que todos los GPCRs comparten
las siete hélices transmembranales, las distintas familias de GPCRs no presentan homología secuencial entre sí.
Los GPCRs son el mayor grupo conocido de mediadores de superficie celular de la transducción de señales y están presentes en cada célula del cuerpo. La acción de los GPCRs regula todo el espectro de las funciones fisiológicas tales como las que implican a los sistemas cerebral, cardíaco, renal, pulmonar, inmune y endocrino. Mediante extensivos esfuerzos durante la última década se ha identificado un gran número de nuevos GPCRs, incluyendo una pluralidad de subtipos de receptores para ligandos anteriormente conocidos, y numerosos receptores para los cuales no han sido aún identificados los ligandos endógenos, llamados receptores "huérfanos" u oGPCRs (Lee et al., 2001; Lee et al., 2002; Bailey et al., 2001).
Los GPCRs han venido siendo las exitosas dianas de numerosos fármacos que están actualmente en uso clínico para distintos trastornos, estimándose que los del 50% de los fármacos del mercado actual apuntan a estas moléculas. De entre los GPCRs conocidos, 335 receptores son potenciales dianas u objetivos del desarrollo de fármacos, teniendo 195 de ellos ligandos conocidos, y siendo los restantes 140 oGPCRs que están a la espera de que sean identificados sus ligandos. A pesar de que varios avances metodológicos han acelerado el ritmo del descubrimiento de nuevos receptores, sigue quedándose muy atrás el ritmo del descubrimiento de ligandos y fármacos. Inicialmente se usaron métodos de ensayo de selección farmacológica a pequeña escala para descubrir los ligandos y fármacos para muchos de los GPCRs, pero se buscan continuamente procedimientos de ensayo más novedosos.
Puesto que los GPCRs forman más del 80% de los receptores de la superficie celular, los mismos representan un importante recurso y constituyen un grupo altamente relevante de dianas proteicas para el descubrimiento de nuevos fármacos. Los fármacos que interactúan con los GPCRs tienen el potencial de ser altamente selectivos, puesto que las interacciones quedarán exclusivamente limitadas a la superficie celular y a los tejidos que llevan los receptores. La convergencia del descubrimiento de GPCRs con la constatación de que los mismos son importantes dianas de fármacos ha dado lugar a un intenso interés farmacéutico en idear mejores maneras de detectar y seleccionar compuestos que interactúen con los GPCRs. Por consiguiente, la creación de métodos de ensayo mejorados es una urgente necesidad con vistas a la consecución del objetivo de una más rápida selección y un más rápido descubrimiento de fármacos. Hay necesidad de optimizar la capacidad para detectar una interacción entre los compuestos de ensayo y los receptores, el cual es el paso inicial fundamental en el proceso de desarrollo de fármacos.
Mediante mejoradas estrategias de identificación de ligandos para acelerar la caracterización de todos los GPCRs se definirán sus funciones fisiológicas y se realizará su potencial para el descubrimiento de nuevos fármacos. Incluso con los GPCRs identificados, hay una escasez de descubrimientos de fármacos específicos de subtipos altamente selectivos, y las casas farmacéuticas están experimentando una escasez de prometedores compuestos principales, a pesar de la abundancia de dianas farmacológicas definidas. La lista de aprobaciones de nuevos productos farmacológicos por parte de las 20 primeras compañías farmacéuticas ha disminuido considerablemente a lo largo del periodo 1999-2001, en comparación con el periodo de los tres años anteriores (Smith, 2002). Así, hay una necesidad real de contar con mejorados y versátiles sistemas de ensayo con los que no solamente los ligandos endógenos, sino también nuevos compuestos que interactúen con los receptores puedan ser sometidos a ensayo e identificados de una manera rápida y eficaz que se preste a la automatización.
Puesto que no puede predecirse la vía de transducción de señales requerida para activar un oGPCR, se requiere un sistema de ensayo de compuestos interactuantes que sea independiente de las anteriores predicciones de qué sistema efector (tal como la actividad de adenilil ciclasa, PLC (PLC = fosfolipasa C), cGMP (cGMP = guanosina monofosfato cíclico) y fosfodiesterasa) es empleado por el receptor. La asignación de ligandos a los GPCRs y los oGPCRs es una tarea importante; si bien la diversidad tanto de ligandos de GPCR como de sistemas efectores puede limitar la utilidad de algunos ensayos de identificación de ligandos existentes, requiriendo nuevos enfoques para el descubrimiento de fármacos.
Recientemente, varios métodos que utilizan refinados sistemas de análisis que analizan extractos tisulares, grandes bibliotecas de ligandos y específicos ligandos de interés han descubierto exitosamente los ligandos endógenos para una serie de estos oGPCRs. Tales métodos han sido llamados colectivamente "Farmacología Inversa" (Howard et al., 2001). Han sido usados varios métodos para analizar la actividad celular inducida en respuesta a un compuesto agonista, incluyendo el ensayo del Lector de Placas de Generación de Imágenes por Fluorescencia (FLIPR, Molecular Devices Corp., Sunnyvale, Calif.) y Barak et al., (1997) y las Patentes U.S. Núms. 5.891.646 y 6.110.693, que dan a conocer el uso de una proteína de fusión fluorescente verde de \beta-arrestina para la obtención de imágenes de la translocación de arrestina a la superficie celular tras estimulación de un GPCR.
Las potenciales desventajas de tales métodos son las siguientes: 1) la visualización no es del receptor; 2) la translocación proteica requiere complejas tecnologías analíticas computerizadas; 3) es necesaria para la selección de los antagonistas la previa identificación del agonista; y 4) para generar una señal es necesario un acoplamiento a una proteína G específica.
Los mecanismos de fijación de ligandos y transducción de señales por parte de los GPCRs tradicionalmente han venido siendo modelizados sobre la base del supuesto de que participan en el proceso receptores monoméricos, y en general se ha aceptado un modelo monomérico para los GPCRs. Desde mediados de la década de 1990, sin embargo, numerosos informes han demostrado la oligomerización de muchos GPCRs (estudiado por George et al., 2002), y actualmente se tiene conocimiento de que la oligomerización es un aspecto inherente a la estructura y biología de los GPCRs. También ciertos subtipos de receptores formaron hetero-oligómeros, y estos receptores tienen características funcionales que se diferencian de las poblaciones de receptores homogéneas. En la actualidad, los estudios de la oligomerización de los GPCRs no hacen distinción alguna entre los dímeros y los complejos mayores, y el vocablo "dímero" es usado de manera intercambiable con los vocablos "oligómero" y "multímero". No hay datos concluyentes que indiquen cómo son de grandes los oligómeros de los GPCRs funcionales. Como aspecto importante, la generación de nuevas propiedades por medio de la hetero-oligomerización sugirió un mecanismo para generar diversidad de función entre los GPCRs. La homooligomerización de los GPCRs está aceptada como un acontecimiento universal, y se sabe de una serie de GPCRs que se ensamblan como complejos receptores heterooligoméricos (George et al., 2002). Por ejemplo, los receptores GABA-B1 y GABA-B2 no son funcionales individualmente y tan sólo forman un receptor funcional cuando son coexpresados (White et al., 1998). El ensamblaje de complejos receptores heterooligómeros puede redundar en nuevas propiedades de fijación receptor-ligando, señalización o tráfico intracelular. Por ejemplo, la co-transfección de los receptores de opioides mu y delta redundó en la formación de oligoméricos con propiedades funcionales que eran distintas de las de cada uno de los receptores individualmente (George et al., (2000)). La interacción de los receptores de opioides mu y delta para formar oligómeros generó nuevas propiedades de acoplamiento farmacológico y de proteína G. Cuando eran coexpresados receptores de opioides mu y delta, los agonistas altamente selectivos (DAMGO, DPDPE y morfina) presentaban una potencia reducida y un orden jerárquico alterado, mientras que ciertos ligandos endógenos tales como la endomorfina-1 y la leu-encefalina presentaban una afinidad acrecentada, sugiriendo la formación de una nueva bolsa de fijación de ligando (George et al., 2000). En contraste con los receptores mu y delta expresados individualmente, los receptores coexpresados presentaban una transducción de señales insensible a la toxina pertussis, probablemente debido a una interacción con un distinto subtipo de proteína G. Sería por consiguiente muy útil, desde el punto de vista de la identificación de potenciales dianas farmacológicas, contar con unos medios para determinar si los de un determinado par de GPCRs son capaces de formar
heterooligómeros.
En muchos informes, los heterooligómeros han sido provisionalmente identificados por medio de la capacidad para co-inmunoprecipitar. Cuando se comprueba que dos GPCRs co-inmunoprecipitan, sin embargo, hay dos posibles interpretaciones: puede ser que los receptores estén interactuando físicamente de manera directa, o bien que ambos estén interactuando por medio de un contacto con una tercera proteína (o proteínas) común (o comunes). Un enfoque alternativo para detectar oligómeros receptores ha sido el desarrollo de ensayos de transferencia de energía usando transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) o transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET). A pesar de que estos métodos detectan la transferencia de energía entre dos moléculas receptoras etiquetadas mediante fluoróforos con proximidades de menos de 100 angstroms, no está claro si los cambios conformacionales de los receptores pueden ser distinguidos con fiabilidad de la oligomerización de novo.
Los transportadores son bombas proteicas que trasladan moléculas, iones y otras sustancias químicas al interior y al exterior de las células y existen en virtualmente en todas las células. Los transportadores pueden ser agrupados en familias sobre la base de la estructura, la homología secuencial y las moléculas que transportan. Existen distintos transportadores para neurotransmisores monoamínicos tales como dopamina, serotonina, norepirefrina y GABA, para aminoácidos tales como glicina, taurina, prolina y glutamato, para monoaminas vesiculares, acetilcolina y GABA/glicina, para azúcares tales como glucosa y disacáridos, para cationes orgánicos y aniones orgánicos, para oligopéptidos y péptidos, para ácidos grasos, ácidos biliares, nucleósidos, para agua y para creatina. Las bombas que exportan grandes moléculas tales como drogas, toxinas y antibióticos hacia fuera de la célula están ejemplificadas por la familia de las P-glicoproteínas (proteínas de multirresistencia a fármacos). Hay también varios transportadores afines cuya función sigue siendo desconocida (Masson et al., 1999). Estos transportadores son proteínas de membrana que constan de un polipéptido generalmente con 12 dominios transmembrana. Los transportadores de glutamato y aspartato pertenecen a una familia distinta cuyos miembros tienen de 6 a 10 dominios transmembrana y no comparten homología con los otros transportadores (Masson et al., 1999). Los terminales tanto amino como carboxilo están situados en el lado intracelular de la membrana.
Se considera que implican a los transportadores monoamínicos los de un gran número de trastornos neurológicos y psiquiátricos entre los que se incluyen la depresión, la enfermedad de Parkinson, la esquizofrenia, la drogadicción, el síndrome de Tourette y los trastornos de déficit de atención. El transportador de dopamina (DAT) es la principal diana para psicoestimulantes tales como la cocaína y el metilfenidato. Los transportadores han venido siendo las exitosas dianas de numerosos fármacos para diversos trastornos en uso clínico en la actualidad, y en particular fármacos antidepresivos, incluyendo la fluoxetina, la sertralina y los otros inhibidores de la reabsorción selectiva de serotonina (SSRIs) afines. A pesar de que los avances en metodología molecular han servido para identificar los transportadores conocidos, va retrasado el ritmo de descubrimiento de ligandos y fármacos. Se usaron métodos de ensayo de selección farmacológica convencionales para descubrir los ligandos y fármacos para algunos de los transportadores, pero se buscan con urgencia procedimientos de ensayo más nuevos. Mejoradas estrategias de identificación de ligandos para acelerar la caracterización de todos los transportadores definirán adicionalmente sus funciones fisiológicas y realizarán su potencial para el descubrimiento de nuevos fármacos. Incluso con los transportadores identificados, hay una escasez de descubrimientos de fármacos específicos altamente selectivos.
Los miembros de la familia de los receptores de tirosina quinasa están caracterizados por su similitud estructural, con un dominio extracelular de fijación al ligando, un único dominio transmembrana y un dominio intracelular con actividad de tirosina quinasa para la transducción de señales. Hay muchas subfamilias de tirosina quinasas receptoras, ejemplificadas por el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (también llamado HER1 o erbB1), que es uno de cuatro miembros de una subfamilia de este tipo, que también incluye al HER2, al HER3 y al HER4. Los principales ligandos de EGF-R son el EGF, el TGF-\alpha, el EGF de unión a heparina, la anfirregulina, la betacelulina y la epirregulina (Shawver et al., 2002). La activación del EGF-R hace que el receptor se dimerice con otro monómero de EGF-R o con otro miembro de la subfamilia HER. La marcada diversidad de señalización y fijación de ligandos es generada por la formación de heterodímeros entre miembros de la familia (Yarden y Sliwkowski, 2001). El EGF-R es extensamente expresado en una variedad de tejidos y media funciones importantes tales como el crecimiento celular y la reparación tisular. Se produce sobreexpresión de EGF-R en muchos tipos de cáncer, tales como el de cabeza y cuello, de pulmón, de laringe, de esófago, gástrico, pancreático, de colon, renal, de vejiga, de mama, ovárico, cervical, de próstata, de tiroides, melanoma y glioma, y dicha sobreexpresión se correlaciona con un mal desenlace (Nicholson et al., 2001). Por consiguiente, es de gran interés y muy necesario desarrollar fármacos que tengan como diana el EGF-R y métodos que ayuden a identificar tales fármacos.
Otras subfamilias de tirosina quinasas receptoras están ejemplificadas por los receptores para el factor endotelial vascular (cuatro miembros) y el factor de crecimiento de fibroblastos (cuatro miembros). Éstos tienen importantes papeles en la angiogénesis y también tienen importantes papeles en la proliferación incontrolada de vasos que caracteriza la carcinogénesis (Hanahan y Folkman, 1996).
Los receptores de citoquina son proteínas que atraviesan la membrana con un dominio extracelular de fijación al ligando y un dominio intracelular con actividad de quinasa intrínseca o regiones adaptadoras capaces de interactuar con las quinasas intracelulares. Los receptores se dividen en subclases sobre la base de su complejidad estructural. Los receptores "simples" son aquéllos que incluyen a los receptores para la hormona del crecimiento, la eritropoyetina y las interleuquinas, y los receptores "complejos" incluyen a la familia de los receptores de los factores de necrosis tumoral, la familia de los receptores de citoquinas de 4 hélices, la familia de los receptores de insulina/tipo insulina y el receptor estimulante de colonias de granulocitos (Grotzinger, 2002).
La familia de receptores de insulina y de factor de crecimiento tipo insulina (IGF) controla el metabolismo, la reproducción y el crecimiento (Nakae et al., 2001). Hay nueve distintos péptidos tipo insulina conocidos y hay tres receptores conocidos que interactúan con ellos, que son el IR, el IGF-1R y el IGF-2R, y un receptor emparentado con los IR que es un miembro huérfano. Cada receptor existe en forma de homodímeros en la superficie celular, o en forma de heterodímeros. La subfamilia de los IR está también emparentada con la familia EGF-R.
El IR, producido a partir de un único mRNA, experimenta fragmentación y dimerización y translocación a la membrana plasmática. Cada componente monómero contiene un único dominio transmembrana; y todo el receptor consta de dos subunidades \alpha y dos subunidades \beta, unidas por puentes disulfuro. La subunidad \beta contiene la única región transmembrana y la región intracelular. Este receptor es una tirosina quinasa que cataliza la fosforilación de varios sustratos intracelulares.
Los de la familia de receptores de lipoproteínas de baja densidad (LDL) actúan como transportadores de carga, regulando los niveles de lipoproteínas y proteasas (Strickland et al., 2002). Hay nueve miembros reconocidos de la familia, todos los cuales comparten similitud estructural, incluyendo una región extracelular, una única región dominio transmembrana y una cola citoplásmica. El receptor de LDL desempeña un importante papel en la eliminación de las lipoproteínas, y los defectos genéticos en el receptor de LDL pueden redundar en la acumulación de LDL en la corriente sanguínea.
El primer motivo caracterizado del que se demostró que es capaz de dirigir la importación nuclear de proteínas fue ejemplificado por la secuencia de aminoácidos (PKKKRKV) contenida en la proteína antígeno T grande de SV40. Los motivos de la secuencia de localización nuclear (NLS) son reconocidos por el complejo receptor \alpha-\beta de la importina, el cual fija la NLS (Gorlich et al., 1996). Éstas son proteínas citosólicas que reconocen a las proteínas que contienen NLS y transportan estas proteínas para acoplarlas en el poro nuclear. Todo el complejo a continuación se acopla en el complejo del poro nuclear (Weis et al., 1998, Schlensted et al., 1996) contenido en la envoltura nuclear. La envoltura nuclear es un contorno que contiene poros que median el proceso de transporte nuclear (Weis et al.,
1998).
Ha habido muy pocos e infrecuentes informes de GPCRs que se localicen en el núcleo. Un ejemplo de este tipo es el del receptor GPCR de angiotensina tipo 1 (AT_{1}), que contiene una NLS endógena que sirve para dirigir al GPCR al interior del núcleo (Lu et al., 1998), proporcionando la evidencia de que esta secuencia NLS estaba implicada en el direccionamiento nuclear del receptor de AT1. Estos autores y Chen et al, (2000) informaron de que los receptores de AT1 se incrementaban en el núcleo en respuesta al agonista. Ha sido descrita (Watson et al., 2000) la localización nuclear del receptor de la hormona paratiroidea. Sin embargo, muy pocos de los de la superfamilia de los GPCRs contienen una NLS endógena que medie la translocación del receptor al núcleo.
Por consiguiente, sigue habiendo necesidad de nuevos métodos más cómodos para identificar compuestos que interactúen con proteínas transmembrana tales como GPCRs, transportadores, etc. También sigue habiendo necesidad de métodos mejorados y menos ambiguos para detectar la oligomerización de las proteínas transmembrana.
Breve exposición de la invención
Los inventores han demostrado que la incorporación de una secuencia de localización nuclear (NLS) a una proteína transmembrana (que no contenga una NLS funcional endógena) encamina a la proteína de la superficie celular al núcleo de una célula de manera dependiente del tiempo e independiente del ligando. A fin de visualizar este tráfico de proteínas transmembrana desde la superficie celular, las mismas llevan una mitad detectable para la visualización por una variedad de medios. Se ha demostrado que proteínas de membrana de diversas familias de proteínas que contienen una NLS incorporada sintéticamente son redistribuidas bajo condiciones basales de y desde la superficie celular a y hacia el núcleo.
Este proceso puede explotarse para identificar compuestos que interactúen con proteínas transmembrana determinando si los compuestos candidatos son capaces de modular esta transferencia ligando-independiente de una proteína transmembrana hacia fuera de la membrana celular.
Usando métodos basados en este proceso es también ahora posible determinar si moléculas proteicas son capaces de oligomerizarse.
Según una realización, la invención aporta un método para seleccionar un compuesto candidato según su capacidad para interactuar con al menos una proteína transmembrana, comprendiendo dicho método los pasos de:
transfectar una célula con al menos una secuencia nucleotídica que codifique una proteína que comprenda una proteína transmembrana que contenga al menos una secuencia de localización nuclear (NLS) y una mitad detectable y permitir la expresión de la proteína codificada en la célula;
poner a la proteína en contacto con un compuesto candidato; y
determinar la distribución de la proteína expresada en la célula detectando la distribución de la mitad detectable en la célula;
donde la detección de una distribución alterada de la mitad detectable en la célula con respecto a la distribución de la mitad detectable en una célula de control no puesta en contacto con el compuesto candidato indica que el compuesto interactúa con la proteína transmembrana, y (donde la proteína transmembrana de tipo salvaje carece de una NLS y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína transmembrana es modificada para codificar una NLS).
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Según una realización adicional, la invención aporta un método para seleccionar un compuesto candidato según su capacidad para interactuar con al menos una proteína transmembrana, comprendiendo dicho método los pasos de:
transfectar una célula con al menos una secuencia nucleotídica que codifique una proteína transmembrana que contenga NLS y permitir la expresión de la proteína codificada en la célula;
poner a la célula en contacto con un compuesto candidato; y
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determinar el nivel de proteína transmembrana con contenido de NLS que queda en la membrana celular aislando la fracción de membrana celular de la célula, poner a la fracción en contacto con un ligando etiquetado de la proteína transmembrana, y determinar el nivel de fijación del ligando a la fracción;
donde la detección de un nivel alterado de la proteína transmembrana en la membrana celular con respecto al nivel en la membrana celular en una célula de control no puesta en contacto con el compuesto candidato indica que el compuesto interactúa con la proteína transmembrana, y (donde la proteína transmembrana de tipo salvaje carece de una NLS y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína transmembrana es modificada para codificar una NLS).
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Según una realización adicional, la invención aporta una célula aislada transfectada con al menos una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que comprende una proteína transmembrana que contiene al menos una NLS y una mitad detectable, y (donde la proteína transmembrana de tipo salvaje carece de una NLS y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína transmembrana es modificada para codificar una NLS).
Según una realización adicional, la invención aporta un método para determinar si una primera proteína y una segunda proteína son capaces de oligomerizarse, comprendiendo dicho método los pasos de:
transfectar una célula con una primera secuencia nucleotídica que codifique una primera proteína que contenga una NLS y con una segunda secuencia nucleotídica que codifique una segunda proteína que comprenda una mitad detectable y permitir la expresión de las proteínas primera y segunda codificadas en la célula; y
determinar la distribución de la mitad detectable en la célula;
donde la detección de la mitad detectable en el núcleo de la célula o junto al mismo o la detección de un nivel reducido de la mitad detectable en la superficie celular, con respecto a una célula de control, indica que las proteínas primera y segunda interactúan, y (donde la proteína transmembrana de tipo salvaje carece de una NLS y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína transmembrana es modificada para codificar una NLS).
Resumen de los dibujos
Se describen a continuación ciertas realizaciones de la invención haciendo referencia a los dibujos acompañantes, en los cuales:
La Figura 1 muestra en forma esquemática la estructura de un típico GPCR, que es el receptor D1 de dopamina, modificado para contener una NLS.
La Figura 2 muestra la fluorescencia (unidades de fluorescencia relativa) en la superficie de células HEK transfectadas con receptor D1 de dopamina-NLS y tratadas con varias concentraciones de butaclamol.
La Figura 3 muestra la fluorescencia de la superficie celular de células HEK transfectadas con HA-receptor D1 de dopamina-NLS y tratadas con varias concentraciones de SCH23390 en solitario o con SKF81297 (100 nM).
La Figura 4 muestra la fluorescencia de la superficie celular de células HEK transfectadas con HA-receptor D1 de dopamina-NLS y tratadas con SCH23390 0,5 \muM en solitario o junto con varias concentraciones de SKF81297.
La Figura 5 muestra la cantidad de ^{3}H-SCH 23390 fijada a la fracción de membrana celular de células HEK transfectadas con receptor D1 de dopamina-NLS y tratadas con butaclamol (\ding{115}) o de células de control no tratadas (\blacksquare).
Descripción detallada de la invención
La invención aporta, en una realización, un nuevo y cómodo método para seleccionar compuestos candidatos según su capacidad para interactuar con una proteína transmembrana.
En el sentido en el que aquí se utiliza la expresión, cuando un compuesto candidato y una proteína transmembrana "interactúan", esto significa que el compuesto es un ligando de la proteína transmembrana y se fija a la proteína o es capaz de modular el tráfico de la proteína transmembrana hacia fuera de la membrana celular como aquí se describe.
La identificación de compuestos que interactúen con una proteína transmembrana es el primer paso importante del proceso de identificar compuestos principales para el desarrollo de fármacos.
Trabajando inicialmente con GPCRs, los inventores han descubierto que cuando una célula eucariótica nucleada es transfectada con una secuencia nucleotídica que codifica un GPCR que contiene una NLS incorporada sintéticamente, y cuando se le permite a la célula expresar la secuencia nucleotídica, el GPCR expresado se traslada primeramente a la membrana celular y luego es transferido al núcleo de la célula. Este proceso es independiente de la activación del ligando y lleva de aproximadamente 6 a aproximadamente 72 horas, en dependencia de la proteína transmembrana de que se trate, con un promedio de 24 a 48 horas. Esto está en contraste con la situación en la que un GPCR que no contiene una NLS es expresado en una célula, en cuyo caso el GPCR expresado permanece predominantemente en la superficie celular, apareciendo pequeñas cantidades en el citoplasma, pero sin que aparezcan cantidades detectables en el núcleo.
Los inventores han descubierto también que la transferencia o tráfico del GPCR con contenido de NLS expresado de o desde la membrana celular a o hacia el núcleo puede ser modulado tratando la célula transfectada con un compuesto que interactúe con el GPCR. La selección de compuestos candidatos según su capacidad para interactuar con un GPCR puede ser por consiguiente realizada detectando esta modulación de la transferencia del GPCR expresado de la membrana celular al núcleo.
Los inventores han descubierto además que estas observaciones son ampliamente aplicables a las proteínas transmembrana en general, y no quedan limitadas a los GPCRs.
En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión "proteína transmembrana" significa una proteína de cadena única que se encuentra en la membrana celular y tiene al menos un dominio que atraviesa la membrana celular.
Los inventores han demostrado que las de una extensa variedad de proteínas transmembrana de varias familias del grupo de los GPCRs, del grupo de los transportadores, del grupo de los receptores de citoquina, del grupo de las tirosina quinasas y del grupo de los receptores de lipoproteínas de baja densidad, si son expresadas en una célula nucleada conteniendo un grupo NLS, presentan todas ellas una acumulación inicial de la proteína expresada en la membrana celular, seguida por una transferencia independiente de la activación del ligando de la proteína expresada en el sentido de su paso de la membrana celular al núcleo de la célula.
La extensa aplicabilidad de los métodos de la invención la indica la inmensa variedad de estructuras de proteínas transmembrana que está representada por las proteínas transmembrana ejemplificadas que se usan en el método; habiéndose demostrado que la inserción de una NLS en una proteína transmembrana que redunda en una translocación de la proteína en el sentido de su paso de la superficie de la célula al núcleo es efectiva con proteínas de membrana que tienen un dominio transmembrana (TM), siete dominios TM y doce dominios TM y comparten poca o ninguna homología secuencial.
Se ha comprobado que el método de la invención es extensamente aplicable a la identificación de compuestos que interactúan con proteínas transmembrana.
Se ha comprobado que los compuestos que interactúan con proteínas transmembrana modulan su transferencia de la membrana celular al núcleo de distintas maneras, incluyendo la inhibición de la transferencia, la aceleración de la transferencia y la interferencia con la modulación producida por otros compuestos. Todo compuesto que interactúe es de interés como potencial candidato a ser un fármaco.
La modulación de la transferencia de la proteína transmembrana expresada se determina comparando la distribución de la proteína transmembrana dentro de la célula en las células de control y en las células tratadas con un compuesto candidato.
En una realización, el método proporciona una cómoda herramienta para seleccionar compuestos candidatos según su capacidad para interactuar con un GPCR y modular su tráfico. Los compuestos que interactúan específicamente con el GPCR pueden inhibir o impedir la transferencia del GPCR de la superficie celular al núcleo y pueden ser antagonistas para el GPCR, mientras que otros compuestos pueden acelerar la transferencia del GPCR al núcleo, con respecto a una célula de control, y pueden ser agonistas para el GPCR.
Para permitir la determinación de la distribución de la proteína transmembrana expresada dentro de la célula, con y sin exposición a un compuesto de ensayo, la proteína transmembrana expresada debe llevar una mitad detectable que pueda ser detectada en la célula. La mitad detectable puede ser cualquier mitad que se mantenga asociada a la proteína transmembrana a lo largo de toda su expresión y de todo su tráfico dentro de la célula y que pueda ser directa o indirectamente detectada para determinar su distribución dentro de la célula y para determinar una distribución alterada resultante de la exposición a un compuesto candidato.
En una primera realización, la célula es transfectada con una secuencia nucleotídica que codifica una proteína de fusión que comprende una proteína transmembrana que contiene al menos una NLS unida a una mitad detectable que comprende un péptido o polipéptido detectable. En el sentido en el que se le utiliza en la presente, el vocablo "péptido" significa una secuencia de dos a veinte residuos de aminoácidos, y preferiblemente una secuencia de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 residuos de aminoácidos, y el vocablo "polipéptido" significa una secuencia de más de 20 residuos de aminoácidos, incluyendo a proteínas completas de cualquier longitud. El péptido o polipéptido detectable puede ser directamente detectable o bien puede ser susceptible de experimentar una reacción para dar una señal detectable. El péptido detectable puede ser, por ejemplo, un péptido o epítope antigénico que sea expresado, por ejemplo, en el terminal amino de la proteína transmembrana. La distribución de la proteína transmembrana dentro de la célula es detectada mediante la detección del epítope usando un anticuerpo detectable específico para el epítope. Están disponibles comercialmente los de una serie de adecuados sistemas epítope/anticuerpo. Son ejemplos de los mismos los sistemas epítope/anticuerpo HA (Roche Diagnostics), FLAG (Sigma Chemical Co.), c-myc (Santa Cruz), hexámero de histidina (BD Biosciences Clontech), GST (ABR Affinity BioReagents), V5 (Abcm) y Xpress (Invitrogen).
Pueden adquirirse secuencias nucleotídicas que codifican estos epítopes, así como anticuerpos específicos para los epítopes. Estos anticuerpos pueden llevar una etiqueta detectable (como p. ej. isotiocianato de fluoresceína (FITC)) o bien pueden ser detectados en sí mismos mediante el uso de un segundo anticuerpo que lleve una etiqueta detectable, como entenderán los expertos en la materia. Esta realización de la invención es particularmente adaptable a un método automatizado o semiautomatizado, por ejemplo examinando placas de células tratadas con anticuerpos en un lector de placas automatizado, que permite una selección de alto rendimiento.
El polipéptido detectable puede ser un polipéptido ópticamente detectable tal como proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente roja (RFP), proteína fluorescente amarilla (YFP) y/o proteína fluorescente azul verdosa (CFP), o cualquiera de las variantes modificadas de estas proteínas, que están disponibles comercialmente. El polipéptido detectable puede también ser una enzima tal como luciferasa o \beta-galactosidasa, a la que puede hacerse reaccionar para dar un punto final detectable tal como emisión de luz o cambio de color. Las secuencias nucleotídicas que codifican tales polipéptidos pueden ser obtenidas fácilmente, por ejemplo de la Clontech, y quedan unidas a la secuencia nucleotídica que codifica la proteína transmembrana con contenido de NLS, preferiblemente en el extremo C-terminal de esa proteína.
En una realización adicional, la mitad detectable es un péptido antigénico que comprende una parte de la secuencia de aminoácidos de la propia proteína transmembrana, y preferiblemente una parte de una región extracelular de la proteína. Como se ha descrito anteriormente, la distribución de la proteína transmembrana dentro de la célula se determina usando un anticuerpo detectable específico para el epítope. Anticuerpos adecuados están disponibles comercialmente, como p. ej. el anticuerpo anti-D1 dirigido a los aminoácidos amino-terminales 9-21 del receptor de dopamina D1 humano, o bien pueden ser preparados por métodos convencionales.
En una realización adicional, que es aplicable a las proteínas transmembrana con ligandos conocidos, la célula es transfectada con una secuencia nucleotídica que codifica una proteína transmembrana que contiene al menos una NLS. Las células son puestas en contacto con un compuesto candidato e incubadas como se ha descrito anteriormente. Las células son luego recolectadas y la fracción de membrana celular es aislada y puesta en contacto con un ligando etiquetado de manera detectable de la proteína transmembrana, como por ejemplo un ligando radioetiquetado. La determinación de la cantidad de ligando etiquetado fijada a la fracción de membrana de las células tratadas, con respecto a la cantidad fijada a la fracción de membrana de células de control no puestas en contacto con el compuesto candidato, puede ser usada para cuantificar la proteína transmembrana que permanece en la superficie de la célula, e indica la interacción del compuesto candidato con la proteína transmembrana.
Las secuencias nucleotídicas que codifican proteínas transmembrana pueden ser obtenidas de bases de datos públicas tales como la Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez) o de bases de datos comerciales. Constructos adecuados pueden ser sintetizados por métodos convencionales, como se describe en los ejemplos que aquí se dan, o bien pueden ser obtenidos comercialmente.
"Una proteína transmembrana con contenido de NLS" incluye una proteína transmembrana cuya secuencia de aminoácidos ha sido modificada para contener una NLS.
Las NLSs convencionales son cortas secuencias peptídicas que facilitan la localización nuclear de las proteínas que las contienen (véase, por ejemplo, la Tabla 1, que enumera NLSs, y Jans et al., 2000). Hay tres clases principales de NLSs, y dos de estas clases constan de residuos de aminoácidos básicos, y son las NLSs monopartitas, ejemplificadas por el antígeno tumoral grande de SV40, la PKKKRKV, que consta de un único tramo de aminoácidos básicos, y las NLSs bipartitas, que contienen dos tramos de aminoácidos básicos separados por 10 a 22 aminoácidos (y a veces por hasta cientos de los mismos). Otros tipos de NLSs están ejemplificados por los de la NLS Mata2 de proteína de levadura, donde están contenidos residuos polares/cargados dentro del tramo de residuos apolares, o de la NLS del protooncogen c-myc, donde se requieren residuos de prolina y ácido aspártico flanqueando los residuos básicos (PAAKRVKLD) para el direccionamiento nuclear. Todas las clases de NLS son reconocidas específicamente por las importinas \alpha-\beta.
En los métodos de la invención puede emplearse cualquier NLS. Las secuencias nucleotídicas que codifican una NLS seleccionada pueden sacarse de la secuencia de aminoácidos de la NLS y son sintetizadas e incorporadas a la secuencia nucleotídica que codifica la proteína transmembrana por métodos convencionales, como aquí se describe. Muchas ubicaciones distintas dentro de cualesquiera de los bucles intracelulares o terminales intracelulares de la proteína transmembrana son adecuadas para la inserción de la NLS. Se prefiere la inserción de la NLS dentro de un dominio intracelular de la proteína. Por ejemplo, en un GPCR, la NLS podría ser colocada en cualesquiera de los bucles intracelulares o en la cola carboxilo intracelular. En un transportador TM 12, la NLS podría ser ubicada en los terminales carboxilo o amino intracelulares o en cualquiera de los bucles intracelulares.
Cuando una NLS es insertada en una proteína transmembrana para ser usada en los métodos de la invención, la eficacia de la inserción puede ser verificada mediante pruebas de selección confirmando que la proteína transmembrana con contenido de NLS sea considerablemente translocada de la membrana celular al núcleo de la célula dentro de un periodo de tiempo de 24 a 48 horas y que los ligandos de la proteína transmembrana interfieran en la translocación.
Las secuencias nucleotídicas que codifican proteínas transmembrana con contenido de NLS son unidas a las secuencias que codifican péptidos o polipéptidos detectables por métodos convencionales.
Una secuencia nucleotídica que codifica una proteína transmembrana con contenido de NLS seleccionada que contiene o está unida a una mitad detectable es transfectada a una célula nucleada clonando la secuencia en un sistema vector que contiene un adecuado promotor, usando técnicas convencionales como las que están descritas en la literatura científica, y por ejemplo en Current Protocols in Molecular Biology, (1987). Los vectores adecuados incluyen al pEGF-N1 (Clontech), que contiene el promotor del citomegalovirus (CMV) humano, y el vector pcDNA.
Puede usarse cualquier célula que sea capaz de expresar las secuencias nucleotídicas transfectadas y en la cual una NLS facilite la transferencia de una proteína transmembrana hacia fuera de la membrana celular. Las células adecuadas incluyen a las células procarióticas, incluyendo las células bacterianas, y a las células eucarióticas. Las adecuadas células eucarióticas incluyen a las células de mamífero, las células de levadura, las células vegetales, las células de insectos, las células de nematodos y las células fungales aisladas. Las adecuadas células de mamífero incluyen a las líneas celulares humanas, las líneas celulares de roedores, las líneas celulares de hámsters y las líneas celulares de primates no humanos.
En una realización, la célula es transfectada con una serie de secuencias nucleotídicas que codifican cada una una distinta proteína transmembrana con contenido de NLS y una distinta mitad detectable. La interferencia en el tráfico de la proteína transmembrana hacia fuera de la membrana celular por parte de un compuesto de ensayo puede ser relacionada con la interacción del compuesto con una determinada proteína transmembrana por medio de la identidad de la mitad detectable cuya separación de la superficie celular es interrumpida.
En una realización adicional, para una selección inicial de más alto rendimiento, la célula es transfectada con un mayor número de secuencias nucleotídicas que codifican cada una una distinta proteína transmembrana con contenido de NLS y una mitad detectable, siendo algunas de las mitades detectables comunes a más de una proteína transmembrana. Si la selección inicial indica que un compuesto candidato está interactuando con una o varias de las proteínas transmembrana, el compuesto es sometido nuevamente a pruebas de selección usando una célula que exprese menos proteí-
nas transmembrana, o solamente una, hasta que sea identificada la específica proteína transmembrana que interactúa.
En las células transfectadas con más de una proteína transmembrana, puede haber oligomerización entre pares de proteínas como aquí se ha expuesto, y esto puede afectar a la interpretación del efecto de un compuesto candidato. El posterior nuevo sometimiento del compuesto a pruebas de selección usando células transfectadas con solamente una proteína transmembrana permite aclarar la interacción del compuesto con una proteína específica.
Como alternativa, para las células transfectadas de manera múltiple, pueden seleccionarse proteínas transmembrana de las que se haya comprobado que no se oligomerizan unas con otras.
Identificación de los compuestos interactuantes
En una realización de la invención, células nucleadas son transfectadas con una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que comprende una proteína transmembrana que contiene una NLS y una mitad detectable y son incubadas por espacio de un adecuado periodo tiempo para permitir la expresión de la proteína transmembrana-NLS y el comienzo de su acumulación en la membrana celular. Para GPCRs y transportadores, por ejemplo, es adecuado un periodo de tiempo de aproximadamente 6 a 24 horas. Un experto en la materia puede determinar fácilmente un tiempo de incubación adecuado para otras proteínas transmembrana mediante la observación de la acumulación de la proteína en la membrana celular. No es necesario que toda la proteína transmembrana expresada haya alcanzado la membrana celular cuando se añade el compuesto candidato. Las células de ensayo son entonces puestas en contacto con un compuesto candidato que deba ser sometido a ensayo para determinar la interacción con la proteína transmembrana por espacio de un periodo de tiempo que sea suficiente para permitir la translocación de una parte considerable de la proteína transmembrana-NLS, preferiblemente al menos de un 20%, más preferiblemente al menos de un 50%, y aun más preferiblemente de al menos un 90%, en el sentido de su paso de o desde la membrana celular al o hacia el núcleo en una célula de control no tratada con compuesto.
En dependencia de la proteína transmembrana, este periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 72 horas; siendo un periodo de tiempo de aproximadamente 24 a aproximadamente 48 horas adecuado para la mayoría de las proteínas transmembrana que se examinan. Un experto en la materia puede determinar fácilmente un adecuado periodo de tiempo mediante observación de las células de control.
Los compuestos de ensayo son inicialmente sometidos a ensayo en general a una concentración de aproximadamente 1 a 10 micromolar.
Las células de ensayo y las células de control son entonces examinadas para determinar la distribución de la mitad detectable y con ello la distribución de la proteína transmembrana-NLS. La distribución de la mitad detectable puede determinarse por varios métodos. Por ejemplo, cuando la mitad detectable es una proteína detectable ópticamente, las células pueden ser examinadas por microscopía directa, y pueden compararse las cantidades de proteína en el núcleo de las células de ensayo y de las células de control. En otra realización se comparan las cantidades de proteína o péptido detectable que permanecen en la membrana de las células de control y de las células de ensayo. En varios campos microscópicos (5-10) que contienen cada uno 30-100 células, se determina y se cuenta para cada ubicación la ubicación de la mitad detectable en estas células. Entonces se calcula para las células tratadas y las células de control el porcentaje de células que tienen etiquetado nuclear o de la superficie celular y la suma de todos los campos.
En un ejemplo adicional, cuando la mitad detectable es un epítope antigénico, las células son puestas en contacto con un sistema anticuerpo detectable que contiene un anticuerpo específico para el epítope, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, puede usarse un primer anticuerpo específico para el epítope, seguido por un segundo anticuerpo con etiquetado fluorescente específico para el primer anticuerpo, siendo la señal fluorescente cuantificada mediante fluorómetro.
Donde las células de control presentan una parte considerable, y preferiblemente al menos un 50%, de la proteína transmembrana translocada fuera de la membrana celular y las células de ensayo presentan retención de la proteína transmembrana en la membrana celular, con respecto a las células de control, esto indica una interacción del compuesto de ensayo con la proteína transmembrana. En una realización preferida, la interacción es indicada cuando el nivel de proteína en la membrana celular es más alto en las células de ensayo en al menos un 10%, preferiblemente en al menos un 15%, y más preferiblemente en al menos un 20%.
La proporción de la mitad detectable que permanece en la membrana celular tras exposición al compuesto interactuante está en relación con la concentración y potencia del compuesto. Por ejemplo, el uso de un conocido y potente antagonista de GPCR a concentración micromolar redundó en una permanencia de un 50 a un 100% de la proteína en la superficie celular, con un 0-15% en el núcleo y con el resto en el citoplasma. Concentraciones nanomolares más bajas del mismo antagonista redundaron en una retención de un 20 a un 40% de la proteína en la superficie celular, con el resto de la proteína en el citoplasma y el núcleo. En las células de control no tratadas, era detectable en la superficie celular un 0-15% de la proteína, con el resto en el citoplasma y el núcleo.
En una variante de este método, que se usa en los casos en los que la proteína transmembrana tiene ligandos conocidos, se usa una proteína transmembrana con contenido de NLS expresada sin una mitad detectable y se determina la distribución de la proteína en la célula tras el tratamiento con un compuesto de ensayo mediante aislamiento de la fracción de membrana celular y determinación de su componente de proteína transmembrana usando ligando etiquetado de manera detectable, como se ha expuesto anteriormente.
En una realización adicional de la invención se usa un método similar para identificar los compuestos que interactúan con una proteína transmembrana-NLS para promover su translocación de o desde la superficie celular y al o hacia el núcleo. Las células son transfectadas e incubadas para permitir la expresión de la proteína transmembrana-NLS y su acumulación en la superficie de la célula. Preferiblemente, las células son incubadas hasta que se ha acumulado en la superficie de la célula al menos un porcentaje de aproximadamente un 70 a un 90% de la proteína transmembrana expresada. Para muchas proteínas transmembrana es adecuado un periodo de tiempo de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 horas desde la transfección.
Las células de ensayo son entonces puestas en contacto con un compuesto candidato, e inmediatamente se procede a observar células de ensayo y de control individuales en tiempo real por espacio de un periodo de tiempo de hasta 4 horas para observar la distribución de la mitad detectable. Una incrementada acumulación de mitad detectable en el núcleo de las células de ensayo en comparación con las células de control indica que el compuesto de ensayo ha promovido la translocación de la proteína transmembrana. En una realización preferida, la interacción es indicada cuando las células de ensayo presentan una acumulación nuclear incrementada en al menos un 5%, preferiblemente en al menos un 10%, y más preferiblemente en al menos un 20%.
Una realización adicional de la invención es un método para identificar compuestos que, a pesar de no impedir por sí mismos la translocación de una proteína transmembrana con contenido de NLS hacia fuera de la membrana celular, pueden sin embargo interferir en la interacción de la proteína transmembrana con un compuesto interactuante.
Los compuestos que hayan resultado ser negativos en el primer método de selección anteriormente descrito pueden ser sometidos a ensayo por este método adicional para determinar su capacidad para competir con un compuesto interactuante conocido.
En este método, las células son transfectadas como se ha descrito anteriormente e incubadas por espacio de un periodo de tiempo adecuado para permitir la expresión y acumulación de la proteína transmembrana en la superficie celular, o sea por ejemplo por espacio de un periodo de tiempo de aproximadamente 24 a aproximadamente 48 horas.
Las células de ensayo y las células de control son entonces puestas en contacto con un compuesto del que se sepa que interactúa con la proteína transmembrana, ya sea un ligando conocido o bien un compuesto interactuante identificado por el método anteriormente descrito, por espacio de un periodo de tiempo de aproximadamente 24 a aproximadamente 48 horas. Las células de ensayo son luego puestas en contacto con un compuesto candidato y las células de ensayo y las células de control son observadas tras haber transcurrido 1 hora, en uno o varios puntos en el tiempo, por espacio de hasta 24 horas, para determinar la distribución de la proteína transmembrana-NLS dentro de las células como se ha descrito anteriormente. En las células de control, el compuesto interactuante conocido hace que la proteína transmembrana sea retenida en la membrana celular. Si el compuesto candidato compite con el compuesto interactuante, las células de ensayo presentan una reducción de la proteína transmembrana en la superficie celular y una incrementada translocación de la proteína hacia fuera de la superficie celular. En una realización preferida, la interacción es indicada cuando las células de ensayo presentan una reducción de al menos un 10%, preferiblemente de un 15%, y más preferiblemente de un 20%.
En una realización adicional, puede emplearse una célula que de manera endógena exprese una proteína transmembrana con contenido de NLS, en conjunción con un primer compuesto del que se haya demostrado que interactúa con la proteína e inhibe su transferencia hacia fuera de la membrana celular, reteniendo así la proteína en la membrana celular. Cuando un sistema de este tipo es puesto en contacto con un compuesto candidato, si el compuesto interactúa con la proteína transmembrana y compite con el primer compuesto, se observa una incrementada transferencia de la proteína hacia fuera de la membrana celular.
Identificación de las interacciones de las proteínas transmembrana con otras proteínas
Las de una serie de proteínas transmembrana entre las que se incluyen GPCRs, transportadores, receptores de tirosina quinasa, los receptores de citoquina para insulina, factores de crecimiento tipo insulina, el factor de crecimiento epidérmico y el factor de crecimiento endotelial vascular, son capaces de experimentar tanto homo- como heterooligomerización (véase, por ejemplo, el estudio de los GPCRs en George et al., 2002). En el sentido en el que se la usa en la presente, la expresión "oligomerización" de una proteína significa una asociación de dos o más moléculas de la proteína.
Para unos hipotéticos receptores A y B, la superficie de la célula puede contener dímeros AA, BB y AB, y se cree que éstos pueden representar tres distintos complejos funcionales y por consiguiente tres distintas dianas farmacológicas. Es por consiguiente importante identificar qué proteínas transmembrana pueden interactuar entre sí o con otras proteínas por olegomerización.
En realizaciones adicionales, la invención aporta métodos para determinar si dos proteínas transmembrana son capaces de experimentar oligomerización o si una proteína transmembrana y una proteína no transmembrana son capaces de experimentar oligomerización.
En una realización, una célula nucleada es cotransfectada con una primera secuencia nucleotídica que codifica una primera proteína transmembrana que contiene una NLS y con una segunda secuencia nucleotídica que codifica una segunda proteína transmembrana que carece de una NLS pero lleva una mitad detectable o está unida a la misma. La creación de estas secuencias nucleotídicas es como se ha descrito anteriormente. Tras un intervalo de tiempo adecuado para permitir para expresión de las proteínas codificadas, la acumulación en la membrana celular y la subsiguiente translocación de la proteína con contenido de NLS de o desde la membrana celular a o hacia el núcleo, se determina la distribución de la mitad detectable en la célula, por ejemplo determinando un incremento de mitad detectable en el núcleo o una disminución de la mitad detectable en la superficie de la célula.
Se ha comprobado que cuando las células son doblemente transfectadas y cuando las proteínas transmembrana primera y segunda son iguales, exceptuando el hecho de que una proteína transmembrana contiene una NLS insertada y la otra no la contiene, hay un enlentecimiento de la transferencia de la proteína transmembrana con contenido de NLS al núcleo de la célula en comparación con la transferencia en una célula transfectada solamente con la proteína que contiene la NLS. El proceso de translocación de la proteína al núcleo puede ahora llevar de aproximadamente 24 a 48 horas. En este método, por consiguiente, las células son incubadas por espacio de un periodo de tiempo de aproximadamente 24 a 48 horas antes de proceder al examen de la distribución de proteína en la célula.
La translocación de la mitad detectable de o desde la superficie de la célula a o hacia el núcleo indica que la primera proteína transmembrana ha llevado a la segunda proteína transmembrana fuera de la superficie de la célula, indicando una oligomerización de las proteínas primera y segunda. La retención de la mitad detectable en la superficie de la célula indica una falta de interacción entre las proteínas.
Cuando las proteínas transmembrana primera y segunda son la misma proteína, el método permite la identificación de la capacidad de la proteína para homodimerizarse. Cuando las proteínas transmembrana primera y segunda son distintas, el método permite la identificación de la capacidad de dos proteínas distintas para heterodimerizarse, y permite la determinación de la especificidad de interacción entre dos proteínas transmembrana.
El método puede ser ejecutado ya sea en ausencia de activación del ligando o bien en presencia de un ligando de cualquier proteína.
Usando este método se ha demostrado la oligomerización tanto dentro como entre distintas clases GPCRs como dentro y entre otras clases de proteínas transmembrana.
Adicionalmente, han sido detectadas interacciones entre GPCRs y proteínas transmembrana no GPCR, o sea por ejemplo entre el receptor de dopamina D5 y el receptor de GABA-A y entre proteínas transmembrana y proteínas no transmembrana.
La invención por consiguiente aporta en general un método para detectar la oligomerización entre dos proteínas por el método anteriormente descrito, donde una célula es cotransfectada con una de las proteínas que contienen una NLS y con la otra proteína que lleva una señal detectable.
La cotransfección de una célula con una primera proteína transmembrana que contiene una NLS y una segunda proteína etiquetada de manera detectable, tal como una proteína transmembrana de un grupo distinto de la que se haya comprobado por el método de la invención que se oligomeriza con la primera proteína, proporciona una célula que puede ser usada para seleccionar compuestos candidatos según su interacción con la primera proteína o la segunda proteína. Un compuesto que interactúe con cualquier proteína influenciará la oligomerización o translocación de las proteínas oligomerizadas hacia fuera de la membrana celular. Pueden identificarse por este método compuestos que interactúen con un miembro del par de proteínas o con el oligómero para ocasionar la retención de la proteína detectable de la superficie de la célula o para ocasionar una translocación acelerada de la proteína detectable hacia fuera de la superficie de la célula.
En una realización adicional, una célula que expresa de manera endógena una proteína transmembrana con contenido de NLS es transfectada con una secuencia nucleotídica que codifica una segunda proteína transmembrana que lleva una mitad detectable pero carece de una NLS. La oligomerización de las dos proteínas es indicada por el tráfico de la mitad detectable de o desde la membrana celular al interior del núcleo o hacia el mismo.
En una realización adicional, puede usarse una proteína de membrana que contenga una NLS para identificar nuevas proteínas interactuantes. En este método, una proteína transmembrana con contenido de NLS es expresada en una célula y se la deja translocarse al núcleo. Los núcleos son entonces recolectados y sometidos a ensayo para detectar las bandas de proteína de nueva aparición mediante coloración con colorante Coomassie o coloración con plata y para luego proceder a la identificación por espectroscopia de masas. El control serán núcleos de células que expresen la proteína de membrana sin una NLS.
Uso de la FRET para la detección de la translocación nuclear
En un aspecto adicional de la invención, que incluye la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) (Hailey et al., 2002), una célula nucleada es cotransfectada con una primera secuencia nucleotídica que codifica una primera proteína transmembrana con contenido de NLS unida a una primera proteína ópticamente detectable y con una segunda secuencia nucleotídica que codifica una segunda proteína transmembrana que no contiene NLS unida a una segunda proteína ópticamente detectable, cuya fluorescencia puede ser activada por la emisión de la primera proteína ópticamente detectable cuando éstas están en estrecha proximidad. Por ejemplo, la primera proteína puede ser unida a GFP y la segunda puede ser unida a cualquier otra mitad ópticamente detectable que pueda ser activada por el espectro de emisión activada por láser de la GFP. Esta segunda mitad ópticamente detectable, tras la activación por parte de la GFP, emite a una longitud de onda distinta. Cuando se forman oligómeros entre las dos proteínas transmembrana, las dos etiquetas están en estrecha proximidad entre sí, y puede ser detectada su interacción por FRET. La interacción física es detectada por activación de fluorescencia selectiva del dador y detección de la emisión por parte del aceptor, usando el método FRET o sus variantes tales como la FRET de fotoblanqueo, la FRAP (FRAP = recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo) o la FLIM (FLIM = microscopía por visualización de la vida media de fluorescencia). La falta de una interacción por FRET indica la falta de oligomerización.
Puede llevarse a cabo microscopía confocal con FRET entre dos moléculas fluorescentes (como p. ej. los pares espectrales GFP y DsRed2, o CFP e YFP) para obtener una señal cuantificable que indique la translocación al núcleo. La FRET requiere un solapamiento entre los espectros de emisión y de excitación de las moléculas dadora y aceptora y una proximidad de menos de 100 angstroms (10-100), lo cual hace que la FRET sea un sistema altamente adecuado para la realización de ensayos para la detección de interacciones de proteína-proteína próximas específicas en las células. Las proteínas fluorescentes anteriormente enumeradas son excelentes socios espectrales. Un fluoróforo residente en el núcleo permitiría que se produjese FRET cuando una proteína transmembrana identificada con un segundo fluoróforo es translocada al núcleo. Esto facilitará una fácil lectura, usando un lector de placas de FRET. Este método es útil para detectar interacciones entre dos proteínas transmembrana o entre una proteína transmembrana y otra proteína y proporciona una lectura de señales que se presta más a la automatización.
Este método puede también ser usado en procedimientos de selección de antagonistas y antagonistas de GPCR. En el método de selección de antagonistas, una reducción de una señal de FRET entre un GPCR-NLS-GFP trasladado al núcleo con un fluoróforo en el núcleo de células tratadas en comparación con células no tratadas indicaría un efecto antagonista. En el método de selección de agonistas, el incremento de la señal de FRET entre un GPCR-NLS-GFP trasladado al núcleo con un fluoróforo en el núcleo de células tratadas en comparación con células no tratadas indicaría un efecto agonista. En una realización adicional, las células doblemente transfectadas pueden ser tratadas con un agonista antes del examen para detectar una evidencia de oligomerización, puesto que la misma puede verse acrecentada en presencia de un agonista. En la medición de interacciones de receptor:receptor, un GPCR-NLS-GFP es coexpresado con un segundo GPCR-DsRED. Si estos receptores interactúan entre sí y se trasladan juntamente al núcleo, será detectada una señal de FRET nuclear. Si los receptores no interactúan, no se obtendrá entonces en el núcleo señal de FRET alguna. También puede medirse la FRET entre dos anticuerpos conjugados con fluoróforos que reconozcan epítopes incorporados o nativos en los GPCRs.
Ejemplos
Los ejemplos se describen a efectos ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.
Los métodos de química, biología molecular, inmunología y bioquímica de proteínas y péptidos a los que se alude pero que no se describen explícitamente en esta publicación ni en los ejemplos están descritos en la literatura científica y son perfectamente conocidos para los expertos en la materia.
Materiales y Métodos
Proteína fluorescente verde: Fue obtenida de la Clontech, EE.UU., una secuencia de DNA que codifica la proteína fluorescente verde de Aequoria victoria (Prasher et al, 1992).
Proteína fluorescente roja: Fueron obtenidas de la Clontech, EE.UU., sendas secuencias de DNA que codifican las proteínas fluorescentes rojas (Matz et al., 1999) pDsRed2 y pDsRed2-nuc. Este constructo codifica una proteína sacada de Discosoma sp.
Las células COS y las células HEK fueron obtenidas de la Colección Americana de Cultivos Tipo, Washington, D.C. Los medios de cultivo de células fueron preparados por los servicios de laboratorio de la Universidad de Toronto.
Los compuestos antagonistas y agonistas fueron obtenidos de varios proveedores comerciales tales como la Sigma Chemical Company, EE.UU.
Los anticuerpos que se usaron para la inmunodetección de marcadores epítopes fueron obtenidos de las fuentes siguientes: El anticuerpo monoclonal anti-HA fue obtenido de la Roche Diagnostics, EE.UU. El anticuerpo monoclonal anti-FLAG fue obtenido de la Sigma Chemical Company, EE.UU. El anticuerpo monoclonal anti-c-myc fue obtenido de la Santa Cruz, EE.UU.
El radioligando^{3}H-SCH 23390 que se usó en el ensayo de fijación a receptores fue obtenido de la NEN Perkin Elmer, EE.UU.
Creación de constructos de DNA
Las secuencias nucleotídicas que codifican GPCRs o transportadores fueron obtenidas del sitio de la red Genbank (http://www.nc-bi.nlm.nih.gov:80/entrez), establecido por la National Library of Science (Biblioteca Nacional de la Ciencia). Una secuencia nucleotídica que codifica una proteína transmembrana seleccionada fue unida a una secuencia nucleotídica que codifica una proteína señal detectable seleccionada. Los constructos fueron clonados en el sistema vector pEGFP (Clontech) o en el vector pDsRed2-N1 o el vector pcDNA3.
1a. Construcción del receptor de dopamina D1 humano con una NLS en la cola carboxilo proximal (hélice 8) y fusionado con GFP (D1-GFP y D1-NLS-GFP)
Usando el método de la PCR (PCR = reacción en cadena de polimerasa) con las siguientes condiciones experimentales, fue sometido a PCR DNA que codifica el receptor de dopamina D1 humano en el vector pcDNA3. La mezcla de reacción contenía agua (32 microlitros), 10x tampón Pfu (Stratagene) (5 microlitros), dNTP (2'-desoxinucleosido 5'-trifosfato, 10 mM) (5 microlitros), DMSO (DMSO = sulfóxido de dimetilo) (5 microlitros), cebadores oligonucleotídicos (100 ng) (1 microlitro cada uno), plantilla de DNA (100 ng) y enzima Pfu (5 unidades). El volumen total era de 50 microlitros. Se usaron las siguientes condiciones de PCR: un ciclo a 94ºC por espacio de 2 min., 30-35 ciclos a 94ºC por espacio de 30 seg., 55ºC por espacio de 30 seg., 72ºC por espacio de 1 min., por ciclo, y luego un ciclo a 72ºC por espacio de 5 min.
Juego de cebadores para la amplificación del DNA que codifica el receptor de dopamina D1:
1
El sitio de restricción EcoR1 fue incorporado en el cebador HD1-P1, y el sitio de restricción Kpn1 fue incorporado al cebador HD1-P2. El producto de PCR, que no contenía condón de terminación, fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (de Clontech) en EcoR1 y Kpn1 y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.
La secuencia NLS, KKFKR del receptor de AT1 humano, fue insertada en DNA que codifica la base de TM7 (hélice 8) del receptor de dopamina D1 por PCR, sustituyendo a la secuencia natural que codifica para DFRKA.
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El juego de cebadores para la construcción de DNA que codifica D1-NLS:
2
Usando el DNA que codifica D1-GFP como plantilla, la PCR con los cebadores HD1-P1 y HD1-NLSF dio como resultado un producto de 1000 bp (bp = pares de bases) (PCR Nº1). Usando DNA que codifica D1-GFP, la PCR con los cebadores HD1-P2 y HD1-NLSR dio como resultado un producto de 300 bp (PCR Nº2). Una posterior PCR realizada con los cebadores HD1-P1 y HD1-P2 dio como resultado un producto de 1300 bp usando el producto de la PCR Nº1 y el producto de la PCR Nº2 como plantillas. El DNA resultante que codifica D1-NLS fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoR1 y Kpn1.
Todos los constructos adicionales que se describen a continuación fueron hechos usando el mismo método de PCR y las mismas condiciones experimentales que se han descrito anteriormente para el receptor de dopamina D1, pero con cebadores específicos como se describe a continuación.
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1b. Construcción del receptor de dopamina D1 humano que contiene una NLS y está fusionado con RFP (D1-NLS-RFP)
La secuencia NLS K K F K R fue insertada en el segmento de la hélice 8 de la cola de carboxilo intracelular del receptor D1 humano por el método de la PCR como se indica a continuación. Usando el DNA que codifica el D1 humano en el vector pcDNA3 como plantilla, fue efectuada la primera PCR con los cebadores HD1-P1 y HD1-NLSR, obteniéndose como resultado de ello un producto de 1 kb. Se hizo una segunda PCR usando los cebadores HD1-P2 y HD1-NLSF, obteniéndose como resultado de ello un producto de 300 bp. Usando los productos de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como plantillas, se hizo la PCR final con los cebadores HD1-P1 y HD1-P2, siendo con ello generado un producto de 1,3 kp.
NLS de D1 fue subclonada en el vector pDsRed (Clontech) en EcoRI y KpnI y fusionada con RFP.
3 
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1c. Construcción del receptor D1 de dopamina con un marcador epítope de hemaglutinina (HA) en el terminal amino
El marcador de HA es como sigue:
300
El marcador epítope de HA fue insertado en el terminal amino del receptor D1 humano usando D1-pcDNA3 como plantilla con los cebadores siguientes:
4
El cDNA amplificado resultante (1,3 kb) fue subclonado en el vector pcDNA3 en BamH I y Not I.
5 
\vskip1.000000\baselineskip
1d. Construcción del receptor D1 de dopamina humano con un epítope de HA y una NLS en la cola de carboxilo proximal (hélice 8) (D1 HA-NLS)
Juego de cebadores para la amplificación por PCR de DNA que codifica D1NLS (hélice 8), usando DNA que codifica D1-HA como plantilla.
Usando DNA D1-HA como plantilla con los cebadores T7 y HD1-NLSR, el DNA amplificado resultante era de 1000 bp (PCR Nº 1).
Usando DNA D1-HA como plantilla con los cebadores Sp6 y HD1-NLSR, el DNA resultante era de 300 bp, (PCR Nº 2). Usando los cebadores T7 y Sp6 y el producto de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como plantillas, el DNA resultante era de 1300 bp (PCR Nº 3).
6
El D1HA-NLS (hélice 8) obtenido como resultado de la PCR fue clonado en extremos romos en pcDNA3 en EcorV. Fue secuenciado el clon con la orientación correcta.
7 
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1e. Construcción del receptor D1 de dopamina con una NLS en el bucle intracelular 3, fusionado con GFP (D1-NLS-IC3-GFP)
Juego de cebadores para la construcción del D1-NLS-IC3-EGFP:
700
Usando la plantilla pcDNA3 de D1:
PCR Nº 1: cebadores HD1-P1 y D1NLSR-IC3
PCR Nº 2: cebadores HD1-P2 y D1NLSF-IC3 (500 bp)
PCR Nº 3: cebadores HD1-P1 y HD1-P2 usando PCR Nº 1 y PCR Nº 2 como plantillas (1,3 kb)
El fragmento de DNA resultante que codifica D1-NLS-IC3 fue subclonado en el vector pEGFP en EcoR1 y Kpn1.
8
La secuencia NLS KKFKR fue insertada en el segmento 3 del bucle IC del receptor D1 sustituyendo a la secuencia MFSKR, usando pcDNA3 de D1 como plantilla.
Usando el DNA que codifica D1 en pcDNA3 como plantilla, se efectuó PCR con los cebadores HD1-P1 y D1-NLSR-IC3, obteniéndose como resultado de ello un producto de 800 bp (PCR Nº 1). El uso de DNA que codifica D1 en pcDNA3 con los cebadores HD1-P2 y HD1-NLSF-IC3 dio como resultado un producto de 500 bp (PCR Nº 2). Una posterior PCR realizada con los cebadores HD1-P1 y HD1-P2 dio como resultado un producto de 1300 bp usando el producto de la PCR Nº 1 y el producto de la PCR Nº 2 como plantillas. El constructo resultante que codifica D1-NLS fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoR1 y Kpn1.
\vskip1.000000\baselineskip
1f. Construcción del receptor de dopamina D1 humano con una NLS en el bucle intracelular 2 fusionado con GFP (D1-NLS-IC2-GFP)
El conjunto de cebadores para la construcción de DNA que codifica D1 NLS-IC2
9
Usando DNA que codifica receptor de dopamina D1 en pcDNA3 como plantilla, la PCR con los cebadores HD1-P1 y D1-NLSR-IC2 (PCR Nº 1) dio como resultado un producto de 500 bp. El uso de DNA que codifica receptor de dopamina D1 en pcDNA3 como plantilla con los cebadores HD1-P2 y D1NLSF-IC2 (PCR Nº 2) dio como resultado un producto de 800 bp. Una posterior PCR realizada con los cebadores HD1-P1 y HD1-P2 usando PCR Nº 1 y PCR Nº 2 como plantillas dio como resultado un producto de 1300 bp.
El DNA resultante que codifica D1NLS-IC2 PCR fue subclonado en el vector EGFP en EcoR1 y Kpn1.
10 
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1g. Construcción del receptor de dopamina D1 humano con una NLS en el bucle intracelular 1 fusionado con GFP (D1-NLS-IC1-GFP)
El juego de cebadores para la construcción de DNA que codifica D1-NLS-IC1.
11
Usando el DNA que codifica receptor de dopamina D1 en pcDNA3 como plantilla, la PCR con los cebadores HD1-P1 y D1-NLSR-IC1 (PCR Nº 1) dio como resultado un producto de 300 bp. Usando DNA que codifica receptor de dopamina D1 en pcDNA3 como plantilla, la PCR con los cebadores HD1-P2 y D1NLSF-IC1 dio como resultado un producto de 1000 bp (PCR Nº 2). Una posterior PCR realizada con los cebadores HD1-P1 y HD1-P2 usando PCR Nº 1 y PCR Nº 2 como plantillas dio como resultado un producto de 1300 bp.
El DNA resultante que codifica D1-NLS-IC1 fue subclonado en el vector pEGFP en EcoR1 y Kpn1.
12 
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1h. Construcción del receptor D1 de dopamina humano con una NLS alternativa en la cola carboxilo proximal y fusionado con GFP (D1-NLS21-GFP)
Se usó el método de la PCR para introducir la secuencia NLS PKKKRKV en sustitución de la secuencia natural ADFRKAF en el receptor D1.
El DNA que codifica el receptor de dopamina D1 en pcDNA3 fue sometido a PCR con los cebadores HD1-P1 y HD1-NLS2R, obteniéndose como resultado de ello un producto de 1 kb (PCR Nº 1). Otra PCR usando D1 en pcDNA3 con los cebadores HD1-P2 y HD1-NLS2F dio como resultado un producto de 300 bp (PCR Nº 2). La tercera PCR usando PCR Nº 1 y PCR Nº 2 como plantillas y los cebadores HD1-P1 y HD1-P2 dio como resultado un producto de 1,3 kb, que fue subclonado en el vector pEGFP en EcoR1 y Kpn1.
13 
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2. Construcción de los receptores D2 de dopamina y de dopamina D2-NLS fusionados con GFP (D2-GFP y D2-NLS-GFP)
Juego de cebadores para la amplificación del DNA en pcDNA3 que codifica el receptor de dopamina D2.
14
El sitio de restricción EcoR1 fue incorporado al cebador HD2-P1, y el sitio de restricción Kpn1 fue incorporado al cebador HD2-P2. El producto D2-PCR, que no contenía codón de terminación, fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en EcoR1 y Kpn1 y en marco con el codón de iniciación de la proteína
GFP.
Juego de cebadores para la construcción del D2-NLS-GFP
15
La secuencia NLS KKFKR fue insertada en la base del segmento TM7 del receptor D2 sustituyendo a la secuencia IEFRK, usando el constructo de DNA D2-GFP como plantilla.
Usando el DNA que codifica D2-GFP como plantilla, se efectuó PCR con los cebadores HD2-P1 y HD2-NLSR, obteniéndose como resultado de ello un producto de 1300 bp (PCR Nº 1). Usando DNA que codifica D2-GFP, la PCR con los cebadores HD2-P2 y HD1-NLSF dio como resultado un producto de 100 bp (PCR Nº 2). Una posterior PCR realizada con los cebadores HD2-P1 y HD2-P2 dio como resultado un producto de 1400 bp usando el producto de la PCR Nº 1 y el producto de la PCR Nº 2 como plantillas. El constructo resultante que codifica D2-NLS fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoR1 y Kpn1.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Construcción del DNA que codifica los receptores de dopamina D3 y D5 fusionados con GFP (D3-GFP y D5-GFP)
Juego de cebadores para la amplificación del DNA en pcDNA3 que codifica el receptor de dopamina D3.
16
El sitio de restricción HindIII fue incorporado al cebador HD3-Hind, y el sitio de restricción KpnI fue incorporado al cebador HD3-Kpn. El producto D3-PCR, que no contenía codón de terminación, fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP en HindIII y KpnI y en marco con el codón de iniciación S de la proteína GFP.
Juego de cebadores para la amplificación del DNA en pcDNA3 que codifica el receptor de dopamina D5.
17
El sitio de restricción KpnI fue incorporado al cebador HD5-Kpn. El producto D5-PCR, que no contenía codón de terminación, fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP en EcoRI y KpnI y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Construcción de los receptores de histamina 1 y de histamina 1-NLS fusionados con GFP (H1-GFP y H1-NLS-GFP)
Juego de cebadores para la amplificación del DNA, de DNA genómico humano, que codifica el receptor de histamina H1.
170
Este producto H1-PCR fue usado como plantilla para el posterior experimento de PCR.
Juego de cebadores para la amplificación del DNA que codifica el constructo H1-GFP.
171
El sitio de restricción PstI fue incorporado al cebador H1-PST, y el sitio de restricción ApaI fue incorporado al cebador H1-APA. Este producto H1-PCR, que no contenía codón de terminación, fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP en PstI y ApaI y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.
Juego de cebadores para la amplificación del DNA que codifica el H1-NLS-GFP.
18
La secuencia NLS KKFKR fue insertada en el DNA que codifica el segmento TM7 del receptor H1 por el método de la PCR, usando la plantilla H1-GFP, sustituyendo a la secuencia ENFKK. La PCR con los cebadores H1-PST y H1-NLSR dio un producto de 1500 bp. El fragmento resultante que codifica H1-NLS fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción PstI y ApaI.
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5. Construcción del receptor 1 de cisteinil-leucotrieno y CysLT1-NLS fusionado con GFP (CysLT1-GFP y CysLT1-NLS-GFP)
Juego de cebadores para la amplificación del DNA en pcDNA3 que codifica el receptor CysLT1.
181
El sitio de restricción EcoR1 fue incorporado al cebador LT1-EcoRI, y el sitio de restricción Kpn1 fue incorporado al cebador LT1-KpnI. El producto de DNA CysLT1-PCR, que no contenía codón de terminación, fue subclonado unidireccionalmente en el vector PGFP enEcoR1 y Kpn1 y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.
Juego de cebadores para la amplificación del DNA que codifica el CysLT1-NL-GFP
182
La secuencia NLS KKFKR fue insertada en el DNA que codifica el segmento TM7 del CysLT1 por PCR, usando DNA que codifica el CysLT1-GFP como plantilla, sustituyendo a la secuencia GNFRK. Usando el DNA que codifica CysLT1-GFP como plantilla, la PCR con los cebadores LT1-EcoRI y LT1-NLSR dio como resultado un fragmento de 900 bp (PCR Nº 1). Usando DNA que codifica CysLT1-GFP, la PCR con los cebadores LT1-KpnI y LT1-NLSF dio como resultado un fragmento de 100 bp (PCR Nº 2). Una posterior PCR realizada con los cebadores LT1-EcoRI y LT1-KpnI dio como resultado un producto de 1000 bp usando el producto de la PCR Nº 1 y el producto de la PCR Nº 2 como plantillas. El DNA resultante que codifica CysLT1-NLS fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoR1 y Kpn1.
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6. Construcción del receptor de cisteinil-leucotrieno CysLT2 y CysLT2-NLS fusionado con GFP (CysLT2-GFP y CysLT2-NLS-GFP)
Juego de cebadores para la amplificación del DNA en pcDNA3 que codifica el receptor CysLT2.
19
El sitio de restricción EcoR1 fue incorporado al cebador LT2-EcoRI, y el sitio de restricción Kpn1 fue incorporado al cebador LT2-KpnI. El producto CysLT2, que no contenía codón de terminación, fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP en EcoR1 y Kpn1 y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.
Juego de cebadores para la amplificación del CysLT2-NLS-GFP
1900
La secuencia NLS KKFKR fue insertada en el segmento TM7 del CysLT2 por el método de la PCR sustituyendo a la secuencia ENFKD. Usando el DNA que codifica CysLT2-EGFP como plantilla, una PCR con los cebadores LT2-EcoR1 y LT2-NLSR dio como resultado un fragmento de 900 bp (PCR Nº 1). Usando DNA que codifica los cebadores LT2-KpnI y LT2-NLSR, una PCR dio como resultado un fragmento de 200 bp (PCR Nº 2). Una posterior PCR realizada con los cebadores T2-EcoR1 y LT2-KpnI usando el producto de la PCR Nº 1 y el producto de la PCR Nº 2 como plantillas dio como resultado un producto de 1100 bp. El DNA resultante que codificaba CysLT2-NLS fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoR1 y Kpn1.
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7. Construcción del receptor muscarínico M1 y del receptor NLS muscarínico fusionados con GFP (M1-GFP y M1-NLS-GFP)
Juego de cebadores para la amplificación del DNA que codifica el receptor muscarínico (M1) de DNA genómico humano.
190
Juego de cebadores para MR1-EGFP
191
El sitio de restricción PstI fue incorporado al cebador M1-PST, y el sitio de restricción BamHI fue incorporado al cebador M1-BAMH. El producto de PCR M1, que no contenía codón de terminación, fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP en PstI y BamH y en marco con el codón de iniciación de la proteína EGFP.
Juego de cebadores para M1-NLS EGFP
192
La secuencia NLS KKFKR fue insertada en el segmento TM7 del M1 por PCR, usando la plantilla MR1, sustituyendo a la secuencia KAFRD. Usando el DNA que codifica MR1 como plantilla, la PCR con los cebadores M1-PST y M1-NLSR dio como resultado un producto de 1200 bp (PCR Nº 1). Usando DNA que codifica MR1, una PCR con reacción por cebadores usando los cebadores M1-BAMH y M1-NLSF dio como resultado un producto de 100 bp (PCR Nº 2). Una posterior PCR realizada con los cebadores M1-PST y M1-BAMH dio como resultado un producto de 1300 bp usando el producto de la PCR Nº 1 y el producto de la PCR Nº 2 como plantillas. Este fragmento que codifica MR1-NLS fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción PstI y BamHI.
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8. Construcción de los receptores de serotonina (5HT1B) y NLS de serotonina fusionados con GFP (5HT1B-GFP y 5HT1B-NLS-GFP)
Juego de cebadores para la amplificación del DNA que codifica el receptor 5HT1 B del plásmido pcDNA3 que codifica el receptor 5HT1 B.
200
El sitio de restricción EcoR1 fue incorporado al cebador 5HT1B-E1 y el sitio de restricción Kpn1 fue incorporado al cebador 5HT1B-KPN. El producto de PCR 5HT1 B, que no contenía codón de terminación, fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP en EcoR1 y Kpn1 y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.
Juego de cebadores para 5HT1 B-NLS EGFP
20
La secuencia NLS KKFKR fue insertada en el segmento TM7 del 5HT1 B por PCR usando la plantilla 5HT1 B-EGFP, sustituyendo a la secuencia EDFKQ. Usando el DNA que codifica 5HT1 B-EGFP como plantilla, una PCR con los cebadores 5HT1B-E1 y HD1-NLSF dio como resultado un producto de 1100 bp (PCR Nº 1). Usando DNA que codifica 5HT1 B-EGFP con los cebadores 5HT1 B-KPN y HD1-NLSR fue obtenido como resultado de ello un producto de 100 bp (PCR Nº 2). Una posterior PCR realizada con los cebadores 5HT1 B-E1 y 5HT1 B-KPN dio como resultado un producto de 1200 bp usando el producto de la PCR Nº 1 y el producto de la PCR Nº 2 como plantillas. El DNA resultante que codificaba 5HT1 B-NLS fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoR1 y Kpn1.
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9. Construcción de los receptores beta2-adrenérgico (beta2-AR) y beta2-AR-NLS1 fusionados con GFP (beta2-AR-GFP y beta2-AR-NLS-GFP)
Juego de cebadores para la amplificación del DNA que codifica el receptor beta2-AR de pcDNA3.
21
El sitio de restricción Kpn1 fue incorporado al cebador beta2-Kpn. El producto beta2-AR, que no contenía codón de terminación, fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP en EcoR1 y Kpn1 y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.
La secuencia NLS KKFKR fue insertada en el segmento TM7 del beta2-AR por PCR usando la plantilla beta2-AR-EGFP, sustituyendo a la secuencia PDFRI. Usando el DNA que codifica beta2-AR-EGFP como plantilla, una PCR con los cebadores T7 y B2-NLSR dio como resultado un producto de 1100 bp (PCR Nº 1). Usando DNA que codifica beta2-AR-EGFP con los cebadores beta2-Kpn y B2-NLSF, se obtuvo como resultado de ello un producto de 300 bp (PCR Nº 2). Una posterior PCR realizada con los cebadores T7 y beta2-Kpn dio como resultado un producto de 1300 bp usando el producto de la PCR Nº 1 y el producto de la PCR Nº 2 como plantillas. El DNA resultante que codificaba beta2-NLS fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoR1 y Kpn1.
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10. Construcción del receptor beta 2-adrenérgico con una NLS alternativa y fusionado con GFP (beta2-NLS2-GFP)
Juego de cebadores para la amplificación del DNA que codifica el receptor beta2-NLS2 de pcDNA3.
22
Usando el DNA que codifica beta2-AR-GFP como plantilla, una PCR con los cebadores T7 y B2D1 NLSR dio como resultado un producto de 1000 bp (PCR Nº 1). Usando DNA que codifica beta2-AR-GFP con los cebadores beta2-Kpn y B2D1 NLSF se obtuvo como resultado de ello un producto de 300 bp (PCR Nº 2). Una posterior PCR realizada con los cebadores T7 y beta2-Kpn usando PCR Nº 1 y PCR Nº 2 como plantillas dio como resultado un producto de 1300 bp. El DNA resultante que codificaba beta2-NLS2 fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoR1 y Kpn1.
La secuencia NLS AFSAKKFKR fue insertada en el segmento TM7 del beta2-AR por PCR usando la plantilla beta2-GFP, sustituyendo a la secuencia CRSPDFRIA.
El DNA resultante que codifica beta2-NLS2 fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoR1 y Kpn1.
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11. Construcción del receptor beta 2-adrenérgico con una NLS alternativa y fusionado con GFP (beta2-NLS3-GFP)
La secuencia NLS K K F K R fue insertada en otra ubicación del segmento proximal de la cola de carboxilo del beta2-AR. Usando el DNA que codifica el beta2AR en el vector pcDNA3 como plantilla, se efectuó PCR con los vectores T7 y B2-NLS3R, siendo obtenido como resultado de ello un producto de 1000 bp. Una PCR usando los cebadores Beta2-Kpn y B2-NLS3F dio como resultado un producto de 300 bp. Usando los productos de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como plantillas, una PCR con los cebadores T7 y Beta2-Kpn generó un producto de 1300 bp (beta2AR-NLS3) que fue subclonado en el vector pEGFP en EcoR1 y Kpn1.
Juego de cebadores para Beta2-NLS3-GFP
23
12. Construcción del transportador de dopamina fusionado con GFP (DAT-GFP)
El cDNA de longitud completa que codifica el transportador de dopamina humano (hDAT) fue amplificado usando DAT en pcDNA3 como plantilla por PCR con el cebador T7 y el cebador DT-1 (5' CGTCTCTGCTCCCTGGTACCGCCACCTTGAGCCAGTGG 3'). Este producto de PCR no contenía codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (de Clontech) en los sitios de restricción EcoR1 y Kpn1 y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.
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13a. Construcción del transportador de dopamina humano que contiene una NLS y está fusionado con RFP (DAT-NLS-RFP)
El cDNA que codifica el transportador de dopamina humano (hDAT) fue amplificado por PCR con los cebadores 1718 y hDAT-NLSF, produciendo un fragmento de 100 bp. El cDNA que codifica el transportador de dopamina humano (hDAT) fue también amplificado por PCR con los cebadores T7 y hDAT-NLSR, produciendo un fragmento de 1,7 kB. Estos dos fragmentos de PCR fueron usados como plantillas con los cebadores T7 y 1718, obteniéndose como resultado de ello un fragmento de 1,8 kB.
230
Este producto de PCR fue subclonado unidireccionalmente en el vector pRFP en EcoR1 y Kpn1 y en marco con el codón de iniciación de la proteína RFP.
El fragmento de PCR resultante codificaba la secuencia NLS K K F K R tras TM12 como sigue:
24
13b. Construcción del transportador de dopamina humano con una NLS y fusionado con GFP (DAT-NLS-GFP)
La secuencia NLS K K F K R fue insertada en la cola de carboxilo proximal a continuación del segmento 12 transmembrana del DAT humano. Usando el DNA que codifica el cDNA del DAT humano en pcDNA3 como plantilla, la primera PCR fue realizada con los cebadores T7 y hDAT-NLSR, obteniéndose como resultado de ello un producto de 1,7 kb. Se hizo una segunda PCR usando los cebadores 1718 y hDAT-NLSF, como resultado de lo cual se obtuvo un producto de 100 bp, y luego usando los productos de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como plantillas se hizo la PCR final con los cebadores T7 y 1718, con lo cual fue generado un producto de 1,8 kp (DAT-NLS) que fue subclonado en el vector pEGFP (Clontech) en EcoR1 y Kpn1 y fusionado con GFP.
Secuencias de los cebadores:
25
14. Construcción del transportador de serotonina humano fusionado con GFP (SERT-GFP)
El cDNA de longitud completa del SERT humano fue aislado por PCR de pcDNA3 que contenía el cDNA del SERT, usando los cebadores siguientes:
26
Este producto de PCR no contenía codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en HindIII y KpnI y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.
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15. Construcción del Receptor de Lipoproteínas de Baja Densidad humano fusionado con GFP (LDL-4-GFP)
El cDNA de longitud completa que codifica LDL fue sometido a PCR con los cebadores LDLR-HIND y LDLR-KPN:
27
Este producto de PCR (2600 bp) no contenía codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en HindIII y KpnI y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.
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16. Construcción del Receptor de Lipoproteínas de Baja Densidad humano con una NLS y fusionado con GFP (LDLR-NLS-GFP)
La secuencia NLS KKFKR fue insertada en DNA que codifica el receptor de LDL por PCR, sustituyendo a la secuencia natural que codifica para RLKNI.
Juego de cebadores para la construcción de DNA que codifica LDL-NLS:
28
Usando el DNA humano que codifica cDNA de LDL en pcDV1 como plantilla, la PCR con los cebadores LDLR-HIND y LDL-NLSR dio como resultado un producto de 2450 bp (PCR Nº 1). Usando DNA que codifica LDL como plantilla con los cebadores LDLR-KPN y LDL-NLSF fue obtenido como resultado de ello un producto de 150 bp (PCR Nº 2). Una posterior PCR realizada con los cebadores LDLR-HIND y LDLR-KPN usando el producto de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como plantilla dio como resultado un producto de 2600 bp.
El producto de PCR resultante contenía la mutación de la secuencia NLS K K F K R como se indica a continuación:
29
Este producto de PCR no contenía codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en HindIII y KpnI y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.
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17. Construcción del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico fusionado con GFP (EGFR-GFP)
El cDNA de longitud completa del EGFR humano en el vector Prkf fue aislado por PCR con los dos cebadores siguientes:
30
Este producto de PCR (3600 bp) no contenía codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en XhoI y KpnI y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.
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18. Construcción del transportador de serotonina humano con una NLS y fusionado con GFP (SERT-NLS-GFP)
La secuencia NLS KKFKR fue insertada en DNA que codifica el SERT por PCR, sustituyendo a la secuencia natural que codifica para GTFKE.
Juego de cebadores para la amplificación del DNA que codifica SERT-NLS:
31
Usando el cDNA del SERT humano en pcDNA3 como plantilla, una PCR con los cebadores SERT-HIND y SERT-NLSR dio como resultado un producto de 1800 bp (PCR Nº 1). Usando DNA que codifica SERT como plantilla con los cebadores SERT-KPN y SERT-NLSF se obtuvo como resultado de ello un producto de 100 bp (PCR Nº 2). Una posterior PCR realizada con los cebadores SERT-HIND y SERT-KPN usando el producto de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como plantilla dio como resultado un producto de 1900 bp.
El producto de PCR resultante codificó la mutación de la secuencia NLS K K F K R tras TM12 del SERT como se indica a continuación:
32
Este producto de PCR no contenía codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en HindIII y KpnI y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.
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19. Construcción del receptor metabotrópico de glutamato tipo 4 fusionado con GFP, con y sin NLS (mGluR4-GFP y mGluR4-NLS-GFP)
El DNA que codifica mGluR4 fue aislado de un cDNA de rata usando el juego de cebadores
330
Un sitio de restricción HindIII fue incorporado al cebador GLUR4-HIND, y un sitio de restricción EcoRI fue incorporado al cebador GLUR4-ECORI. El producto de PCR mGluR4, que no contenía codón de terminación, fue subclonado unidireccionalmente en el vector EGFP (Clontech) en HindIII y EcorI y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.
La NLS KKFKR fue introducida en el DNA que codifica el mGluR4 sustituyendo a la secuencia natural KRKRS.
Juego de cebadores para la amplificación del DNA para introducir la NLS en el mGluR4-EGFP de rata
33
Usando el DNA de rata que codifica GluR4 como plantilla, una PCR con los cebadores GLUR4-HIND y GLUR4-NLSR dio como resultado un producto de 2600 bp (PCR Nº 1). Usando DNA que codifica GluR4 con los cebadores GLUR4-ECORI y GLUR4-NLSF fue obtenido como resultado de ello un producto de 160 bp (PCR Nº 2). Una posterior PCR realizada usando el producto de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como plantilla, con los cebadores GLUR4-HIND y GLUR4-ECORI, dio como resultado un producto de 2760 bp.
El producto de PCR resultante contenía la mutación de la secuencia NLS K K F K R como se indica a continuación:
34
Este producto de PCR fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en HindIII y EcoRI y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.
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20. Construcción del Receptor de Insulina Humano fusionado con GFP (IR-GFP)
El cDNA de longitud completa del IR en el plásmido pRK5 fue aislado con los dos siguientes cebadores de PCR:
35
El producto de PCR (4,2 kb) no contenía codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en HindIII y ApaI y fusionado con la proteína GFP.
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21. Construcción del Receptor de Insulina Humano con una NLS y fusionado con GFP (IR-NLS-GFP)
La secuencia NLS KKFKR fue introducida en el receptor de insulina humano para sustituir a la secuencia LYASS.
Usando el cDNA del receptor de insulina humano en el vector pRK5 como plantilla, la primera PCR Nº 1 con los cebadores HIR-HIND y HIR-NLSR generó un producto de 2,9 kb, la segunda PCR Nº 2 con los cebadores HIR-APA y HIR-NLSF generó un producto de 1,3 kb, y luego usando los productos de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como plantillas, la tercera PCR Nº 3 produjo un fragmento con los cebadores HIR-HIND y HIR-APA (4,2 kb). Este fragmento no contenía codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP en HindIII y ApaI y quedó así fusionado con la proteína GFP.
Cebadores para HIR-NLS:
36
22. Construcción del receptor Eritropoyetina humano fusionado con GFP (EPO-GFP)
Usando el método de la PCR y el cDNA en vector pc3.1 que codifica el receptor de Eritropoyetina humano (EPO) como plantilla, el cDNA de longitud completa fue aislado con los cebadores siguientes:
360
37
Este producto de PCR (1,6 kb) no contenía codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP en HindIII y KpnI y fusionado con la proteína GFP.
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23. Construcción del receptor de Eritropeyetina humano con una NLS y fusionado con GFP (EPO-NLS-GFP)
La secuencia NLS KKFKR fue insertada en el DNA que codifica el receptor de EPO por PCR, sustituyendo a su secuencia natural RRALK.
Usando el cDNA del EPO humano en pc3.1 como plantilla, la primera PCR Nº 1 con los cebadores T7 y EPO-NLSR generó un producto de 900 bp, la segunda PCR Nº 2 con los cebadores EPO-KPN y EPO-NLSF generó un producto de 700 bp, y luego usando los productos de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como plantillas, la tercera PCR Nº 3 con los cebadores T7 y EPO-KPN produjo un fragmento de 1,6 kb. Este producto de PCR (1,6 kb) no contenía codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP en HindIII y KpnI y quedó así fusionado con la proteína GFP. Secuencias de los cebadores:
38
24. Construcción del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano fusionado con GFP (EGFR-GFP)
Usando el cDNA del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano en vector Prk5 como plantilla, el cDNA de longitud completa fue aislado por PCR con los dos cebadores siguientes:
39
Este producto de PCR (3,6 kb) no contenía codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en XhoI y KpnI y fusionado con la proteína GFP.
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25. Construcción del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano con una NLS y fusionado con GFP (EGFR-NLS-GFP)
La secuencia NLS K K F K R fue insertada en la secuencia del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano por el método de la PCR como se indica a continuación. Usando el cDNA del EGFR humano en vector Prk5 como plantilla, la primera PCR fue efectuada con los cebadores HER-XHO y EGF-NLSR y dio como resultado un producto de 2,1 kb. Se hizo una segunda PCR usando los cebadores HER-KPN y EGF-NLSF y dio como resultado un producto de 1,5 kb, y luego usando los productos de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como plantillas, la PCR final fue efectuada con los cebadores HER-XHO y HER-KPN, con lo cual fue generado un producto de 3,6 kp (HGFR-NLS) que fue subclonado en el vector pEGFP (Clontech) en Xho1 y Kpn1 y fusionado con GFP.
Secuencias de los cebadores:
40
26. Construcción del receptor de dopamina D1 humano que contiene 2 NLSs y está fusionado con RFP (D1-NLS(Hélice 8 y Cola C)-RFP)
Una segunda secuencia NLS K K K R K fue insertada en el segmento de la cola de carboxilo del D1-NLS-Hélice 8 humano por el método de la PCR como se indica a continuación. Usando el DNA que codifica el D1-NLS-Hélice 8 humano en vector pDsRed como plantilla, la primera PCR fue realizada con los cebadores HD1-P1 y HD1-NLSCR y dio como resultado un producto de 1,2 kb, y se hizo una segunda PCR usando los cebadores HD1-P2 y HD1-NLSCF y la misma dio como resultado un producto de 100 bp. Luego, usando los productos de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como plantillas, se hizo la PCR final con los cebadores HD1-P1 y HD1-P2, con lo cual fue generado un producto de 1,3 kp (D1-NLS-Hélice 8 y cola C) que fue subclonado en el vector pDsRed en EcoRI y KpnI y fusionado con la proteína DsRed.
Secuencias de los cebadores:
41
27. Construcción del receptor de opioides Mu fusionado con GFP (Mu-GFP)
Usando el DNA que codifica el receptor de opiodes Mu en vector pcDNA3 como plantilla, se efectuó PCR con los dos cebadores siguientes:
42
El sitio de restricción EcoRI fue incorporado al cebador RATMU-1. El sitio de restricción KpnI fue incorporado al cebador RATMU-2.
El producto de PCR (1,2 kb) que no contenía codón de terminación fue luego subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en EcoR1 y Kpn1 y fue así fusionado con GFP.
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28. Construcción del receptor de opioides Mu que contiene una NLS y está fusionado con GFP (Mu-NLS-GFP)
La secuencia NLS K K F K R fue insertada en el segmento de la cola de carboxilo proximal (hélice 8) del receptor de opioides Mu por PCR como se indica a continuación. Usando el DNA que codifica Mu de rata en pcDNA3 como plantilla, la primera PCR fue realizada con los cebadores RATMU1 y MU-NLSR, siendo obtenido como resultado de ello un producto de 1000 bp, y se hizo otra segunda PCR usando los receptores RATMU-2 y MU-NLSF, como resultado de lo cual fue obtenido un producto de 200 bp. Usando los productos de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como plantillas, se hizo la PCR final con los cebadores RATMU-1 y RATMU2, con lo cual fue generado un producto de 1200 bp (Mu-NLS) que fue subclonado en el vector pEGFP en EcoR1 y Kpn1 y fusionado con GFP.
Secuencias de los cebadores:
43
Cultivo y transfección celular
Células de riñón de mono COS-7 y células de riñón embrionario humano HEK293T (Colección Americana de Cultivos Tipo, Manssa, VA) fueron mantenidas en cultivo monocapa a 37ºC y con un 5% de CO_{2} en medio esencial mínimo suplementado con un 10% de suero bovino fetal y antibióticos. Para la recolección de las membranas celulares, placas de 100 mm de células fueron transfectadas transitoriamente con una confluencia de un 70-80% usando reactivo de lipofectamina (Life Technologies, Rockwille, MD). Para los estudios de microscopía confocal, placas de 60 mm de células fueron transfectadas transitoriamente con una confluencia de un 10-20% usando reactivo de lipofectamina. Seis horas después de la transfección, la solución fue retirada y se añadió medio nuevo, que fue nuevamente sustituido por medio nuevo 24 horas después de la transfección.
El medio de transfección fue preparado mezclando 120 microlitros de medio sin antibióticos y/o suero bovino fetal (FBS) y 15 microlitros de lipofectamina en un tubo de 14 ml. 2 microgramos de constructo de DNA que codifica la deseada proteína de fusión y 120 microlitros de medio fueron mezclados y añadidos al tubo de 14 ml, siendo ello mezclado lentamente e incubado a temperatura ambiente por espacio de 25 minutos. Fueron añadidos y mezclados otros 4 ml de medio. Si se transfectan múltiples proteínas transmembrana, se mezclan y transfectan juntamente los cDNAs. El medio de crecimiento fue retirado de una placa de células y sustituido por la mezcla de transfección del tubo de 14 ml. Las células fueron incubadas con la mezcla de transfección por espacio de un periodo de tiempo de 5-6 horas, después de lo cual la mezcla fue retirada y sustituida por medio de crecimiento regular que contenía FBS y antibióticos. Las células fueron incubadas con una carga de medio de crecimiento regular el segundo día.
Tratamiento con Compuestos de Ensayo Protocolo para determinar el retardo de la translocación hacia fuera de la superficie celular
Los compuestos de ensayo fueron preparados en una solución concentrada de una concentración 1 milimolar y fueron diluidos en medio de crecimiento para alcanzar una concentración final situada entre 10 nanomolar y 10 micromolar al ser añadidos a las placas de células. Fue añadido a las células medio nuevo con contenido de compuesto al haber transcurrido 6 horas, 22 horas, 30 horas y 42 horas después de la transfección.
Protocolo para determinar la estimulación de la translocación hacia fuera de la superficie celular
Los compuestos de ensayo fueron preparados en una solución concentrada de una concentración 1 milimolar y fueron diluidos en medio de crecimiento a 37ºC para alcanzar una concentración final de 10 micromolar al ser añadidos a las células. Los cultivos celulares fueron examinados microscópicamente para enfocar una célula individual y para detectar la presencia de expresión superficial de la proteína etiqueta detectable. El medio de crecimiento fue sustituido por medio con contenido de compuesto y las células fueron examinadas microscópicamente en tiempo real al haber transcurrido 5, 10, 15, 20, 30 y 35 min. después de la adición del compuesto para detectar los cambios en la distribución de la mitad detectable.
Microscopía
Las células fueron visualizadas usando el microscopio láser confocal Zeiss LSM510. La GFP fue visualizada a continuación de una excitación con el láser de argón a una longitud de onda de excitación de 488 nm, y la DsRed fue visualizada a continuación de una excitación con el láser de helio y neón a una longitud de onda de 543 nm para la excitación. Las imágenes confocales fueron capturadas en disco y evaluadas. En cada experimento fueron contados y evaluados los de una pluralidad de campos de células (n=6-8 con 30-90 células cada uno) para determinar la localización de la señal en la superficie celular, en el citoplasma y en el núcleo.
Fluorocitometría
Una placa de 96 pocillos fue recubierta con poli-L-ornitina (1/10 en PBS) e incubada por espacio de una hora. 50.000 células fueron añadidas a cada pocillo y transfectadas con cDNA que codifica el receptor marcado por epítope, usando Lipofectamina (Invitrogen, EE.UU.). El medio (MEM) fue cambiado cada 12 horas y contenía fármaco de ensayo a concentraciones variables o vehículo. 48 horas después, las células fueron lavadas y fijadas con paraformaldehído al 4% e incubadas por espacio de 30 min. sobre hielo. Las células fueron luego incubadas con el anticuerpo primario dirigido contra el epítope y luego con el anticuerpo secundario conjugado con FITC (isotiocianato de fluoresceína), y se las mantuvo protegidas de la luz. El exceso de anticuerpo fue retirado por lavado y la señal fue detectada leyendo la placa en un Cytofluor 4000 (Perspective Biosystems, EE.UU.). El FITC fue activado usando una luz de 488 nm para la excitación, y la señal fue leída a su longitud de onda de emisión de 530 nm.
Fijación del Radioligando
Las células fueron transfectadas con DNA que codifica D1-NLS y fueron tratadas con concentraciones variables de fármaco antagonista, o se las dejó sin tratar. Tras haber transcurrido 48 horas, las células fueron lavadas, recolectadas, lisadas y homogeneizadas con un politrón. La fracción de membrana fue recogida por centrifugación y luego estratificada con solución de sucrosa al 35% y centrifugada a 30.000 rpm a 4 grados C por espacio de 90 min. para recoger la fracción pesada de membrana. El supernatante fue centrifugado de nuevo a 35.000 rpm a 4 grados C por espacio de 60 min. para recoger la fracción ligera de membrana. Las membranas fueron sometidas a ensayo de fijación del radioligando usando [^{3}H]-SCH23390 con (+)butaclamol 10 micromolar usado para definir la fijación específica. La incubación fue a temperatura ambiente por espacio de 2 horas, seguida por filtración rápida y cuantificación mediante contaje de escintilación.
Aislamiento de los Núcleos de las Células Cultivadas
Lavar las células con PBS 3 veces usando 10 ml y retirarlas de las placas de cultivo mediante raspado suave. Reunir y centrifugar las células a 500g por espacio de 5 min., a 4 grados C. Poner las células pelletizadas nuevamente en suspensión en tampón de lisis (Tris HCl 10 mM, pH 7,4, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM) y cóctel inhibidor (0,5% de leupeptina, 1% de tripsina de soja, 1% de benzamidina) con una densidad de 50 millones de células por ml. Homogeneizar con mano de mortero B de teflón y vidrio estéril (de 20-50 mm con huelgo estrecho; BellcoGlass) usando 100 carreras ascendentes y descendentes.
Centrifugar a 4 grados C a 700g por espacio de 10 min., y luego centrifugar secuencialmente el supernatante a 10.000 g por espacio de 15 min. a 4ºC (para retirar las mitocondrias) y a 120.000g por espacio de 60 min. y a 4 grados C (para retirar la membrana plasmática).
El pellet nuclear es puesto nuevamente en suspensión en tampón de lisis (con inhibidores) y un 0,1% de NP-40, y se le mantiene en hielo por espacio de 5 min. y luego se le centrifuga a 700g por espacio de 10 min. a 4 grados C. Se desecha el supernatante y se repite 3 veces el proceso de lavado con 15 ml de tampón de lisis. El pellet nuclear es puesto nuevamente en suspensión en 2 ml de tampón de lisis y es cargado sobre un gradiente de sucrosa discontinuo hecho mediante estratificación sucesiva de 4,5 ml de sucrosa 2,0 y 1,6M que contiene MgCl2 1 mM, y es centrifugado a 100.000g por espacio de 60 min. a 4 grados C. El pellet en el fondo del tubo es recogido y contendrá núcleos puros.
Ejemplo 1 Receptor D1 de dopamina fusionado con la proteína fluorescente roja (D1-RFP) o que contiene una NLS y está fusionado con la proteína fluorescente roja (D1-NLS-RFP)
La secuencia del receptor D1 de dopamina, que no contiene una NLS, fue modificada para sustituir los aminoácidos DFRKA en la base del dominio TM7 por la secuencia NLS KKFKR (que corresponde a la NLS del receptor de AT1 humano), como se describe en los métodos (véase la Figura 1). Fueron creados constructos de DNA que codifican las proteínas de fusión del receptor de dopamina D1 D1-RFP y D1-NLS-RFP. Células COS fueron transfectadas con DNA que codifica D1-NLS-RFP o D1-RFP (2 microgramos) e incubadas por espacio de 24 y 48 horas. Las células fueron examinadas por microscopía confocal con 100 aumentos. Las células fueron contadas manualmente en 8 a 10 campos microscópicos y se calculó el etiquetado porcentual en distintos compartimentos subcelulares.
Al haber transcurrido 24 y 48 horas, las células transfectadas con D1-RFP presentaban expresión en la superficie celular en la mayoría de las células, mientras que las células transfectadas con D1-NLS-RFP presentaban poca expresión del receptor en la superficie celular, con localización nuclear en un 60% de las células a las 24 horas, y en un 80% de las células a las 48 horas.
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Ejemplo 2 Proteína de fusión del receptor D1 de dopamina que contiene una NLS (D1-NLS-RFP) y es tratada con antagonista
Células COS fueron transfectadas con un constructo que codifica D1-NLS-RFP y con D1 de tipo salvaje (2 microgramos) por espacio de 48 horas. A las 6, 22, 30 y 42 horas de la transfección, las células fueron tratadas con el antagonista del receptor D1 de dopamina SCH23390 (concentración final 10 micromolar). Asimismo, a las 6, 22, 30 y 42 horas de la transfección, las células fueron tratadas con el antagonista (+)butaclamol (concentración final 10 \muM). Las células de control no recibieron tratamiento con el antagonista.
A las 48 horas, las células de control tenían en su mayoría D1-NLS-RFP detectable en el núcleo. En contraste con ello, las células tratadas con antagonista tenían en su mayoría fluorescencia solamente en la superficie de la célula, mientras que las de un 42% tenían fluorescencia tanto en la superficie como en el núcleo.
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Ejemplo 3 Receptor D1 de dopamina (D1-GFP) coexpresado con receptor D1 que contiene una NLS (D1-NLS)
Células HEK fueron transfectadas con constructos de DNA que codifican D1-NLS (3 microgramos) y/o D1-GFP (1,5 microgramos), y fueron incubadas por espacio de 48 horas. Las células fueron también transfectadas con un plásmido que codifica DsRed-NUC para verificar la localización del núcleo (1 microgramo).
Las células fueron también transfectadas con DNA que codifica D1-GFP (2 microgramos), y fueron incubadas por espacio de 48 horas y examinadas por microscopía confocal.
El D1-GFP expresado en solitario puso de manifiesto que las de un 90% de las células presentaban etiquetado en la superficie celular y las de un 10% presentaban etiquetado tanto nuclear como en la superficie celular. Con cualquier DNA que codifica una trasfección de GPCR (GPCR = receptores acoplados a proteínas G), en hasta un 10% de las células puede observarse una localización nuclear.
Las células que expresaron D1-GFP y D1-NLS presentaron un 35% de las células con etiquetado tanto nuclear como en la superficie celular, y un 70% con expresión del receptor en la superficie celular solamente. Este experimento indicó que tenía lugar juntamente un tráfico de D1-GFP junto con D1-NLS como resultado de la oligomerización de D1-NLS y D1-GFP.
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Ejemplo 4 El receptor D1 de dopamina que contenía una NLS (D1-NLS-GFP) fue tratado con un antagonista en un estudio de la respuesta a la dosis
Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica D1-NLS-GFP (2 microgramos) y D1-WT (6 microgramos) por espacio de 48 horas. Estas células fueron tratadas a las 6 horas de la transfección con SCH-23390 (10 micromolar) o (+)butaclamol (10 micromolar). El medio que contenía al antagonista fue cambiado al haber transcurrido 6, 22, 30 y 42 horas después de la transfección. Las células de control no recibieron tratamiento con el
antagonista.
A continuación del tratamiento con SCH-23390 por espacio de 48 horas, las de un 58% de las células presentaban expresión de D1-NLS-GFP en la superficie celular, menos de las de un 10% de las células presentaban expresión del receptor en el núcleo, y las de un 32% de las células presentaban expresión del receptor tanto en la superficie de la célula como en el núcleo.
A continuación del tratamiento con (+)butaclamol por espacio de 48 horas, las de un 62% de las células presentaban expresión del receptor D1-NLS-GFP en la superficie de la célula, las de un 10% presentaban expresión del receptor en el núcleo, y las de un 28% de las células presentaban expresión del receptor en la superficie de la célula y en el
núcleo.
Las células de control a las 48 horas presentaban aproximadamente en un 65% de las mismas expresión del receptor D1-NLS-GFP en el núcleo, y en un 35% de las mismas expresión del receptor en el citoplasma. No se encontró expresión del receptor D1-NLS-GFP en la superficie celular de las células de control
La incorporación de una NLS a la secuencia del receptor ocasionó una muy eficaz remoción del receptor D1-NLS-GFP hacia fuera de la superficie de la célula y localización en el núcleo.
Se hicieron estudios similares con varias dosis de SCH-23390 o (+)butaclamol. Los resultados están indicados en las Tablas 2 y 3. Las de un 32% a un 35% de las células de control presentaban receptor en el citoplasma.
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TABLA 2
44
TABLA 3
45
La incorporación de una NLS a la secuencia del receptor ocasionó una muy eficaz remoción del receptor de dopamina D1 hacia fuera de la superficie celular y su localización en el núcleo. El tratamiento con antagonistas selectivos para D1 impidió la translocación de este receptor en respuesta a la dosis.
Ejemplo 4a
Expresión del receptor D1 de dopamina con una NLS insertada (D1-NLS-GFP) y tratamiento con agonistas
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica D1-NLS-GFP (1,5 microgramos), y fueron incubadas con el agonista de D1 SKF-81297 (10 micromolar) por espacio de 48 horas. A las 6, 22, 30 y 42 horas de la transfección, las células fueron tratadas con medio nuevo que contenía SKF-81297 (concentración final 10 micromolar). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica D1-NLS-GFP (1,5 microgramos de DNA), y fueron incubadas con el agonista pergolida (10 micromolar) por espacio de 48 horas. A las 6, 22, 30 y 42 horas de la transfección, las células fueron tratadas con medio nuevo que contenía SKF-81297 (concentración final 10 micromolar). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Células HEK de control fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica D1-NLS-GFP (1,5 microgramos de DNA), y se dejaron sin tratar.
En las células no tratadas, tras haber transcurrido 48 horas no se detectaba receptor alguno en la superficie de la célula. Con las células tratadas con SKF-81297, las de un 59% de las células presentaban expresión del receptor en la superficie celular. Con las células tratadas con pergolida había expresión superficial del receptor en un 59% de las células. Así, el tratamiento a largo plazo con agonistas impidió que el receptor D1 modificado pasase al núcleo.
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Ejemplo 5 Receptor D1 de dopamina con una NLS incorporada (D1-NLS-RFP) coexpresada con el receptor D1 de tipo salvaje
Células COS fueron cotransfectadas con un constructo de DNA que codifica D1-NLS-RFP (1 microgramo) y con una secuencia de DNA que codifica el receptor D1 de dopamina nativo (D1-WT, 7 microgramos) y fueron incubadas por espacio de 24 o 48 horas.
A las 24 horas, se detectó D1-NLS-RFP solamente en la superficie de las células, mientras que a las 48 horas las de un 80% de las células tenían D1-NLS-RFP en el núcleo. El receptor de tipo salvaje retardó el desplazamiento del D1-NLS-RFP al núcleo por homooligomerización.
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Ejemplo 6 Receptor de dopamina D1 con una NLS incorporada (D1-NLS-RFP) coexpresado con D1-GFP
Células COS fueron transfectadas con un constructo que codifica D1-NLS-RFP (4 microgramos) y el D1-GFP de dopamina (4 microgramos) y fueron incubadas por espacio de 48 horas. Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Se detectó D1-GFP en la superficie de las células y fue detectada una fluorescencia amarilla en los núcleos, indicando ésta última una colocalización tanto de D1-NLS-RFP como de D1-NGFP en el núcleo, confirmando la oligomerización de D1-NLS-RFP y D1-GFP, que condujo a la importación de D1-GFP al interior del núcleo.
Ejemplo 6a
Expresión del receptor de dopamina D1 con una NLS insertada en el tercer bucle citoplásmico intracelular (D1-IC3-NLS-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica D1-IC3-NLS-GFP (2 microgramos), y fueron incubadas por espacio de 48 horas. Los núcleos fueron visualizados con DsRED-NUC (2 microgramos). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
En las células transfectadas con D1-IC3-NLS-GFP, el receptor fue detectado en el núcleo de las de un 85% de las células. Así, la inserción de una NLS en el tercer bucle intracelular permitió el paso del receptor al núcleo.
Ejemplo 6b
Expresión del receptor de dopamina D1 con una NLS insertada en el primer bucle citoplásmico intracelular (D1-IC1-NLS-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica D1-IC1-NLS-GFP (2 microgramos), y fueron incubadas por espacio de 48 horas. Los núcleos fueron visualizados con DsRED-NUC (2 microgramos). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
En las células transfectadas con D1-IC1-NLS-GFP, el receptor fue detectado en el núcleo de las de un 85% de las células. Así, la inserción de una NLS en el primer bucle intracelular permitió el paso del receptor al núcleo.
Ejemplo 6c
Efecto del antagonista butaclamol o SCH-23390 en el tráfico del receptor de dopamina D1 con una NLS insertada en el primer bucle citoplásmico (D1-IC1-NLS-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica D1-IC1-NLS-GFP (2 microgramos), y fueron tratadas con butaclamol (concentración final 1 micromolar) o SCH-23390 (1 micromolar) por espacio de 48 horas. Los núcleos fueron visualizados con DsRED-NUC (2 microgramos). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Con las células tratadas con butaclamol, las de un 82% tenían receptor en la superficie de la célula o en el citoplasma. Las de un 18% de las células tenían receptor en el núcleo. Así, el tratamiento con butaclamol redujo el tráfico de D1-IC1-NLS-GFP dirigido al núcleo.
Con las células tratadas con SCH-23390, las de un 77% de las células tenían receptor en la superficie de las células o en el citoplasma. Las de un 23% de las células tenían receptor en el núcleo. Así, el tratamiento con SCH-23390 redujo el tráfico de receptor dirigido al núcleo.
Con las células no tratadas, las de un 76% de las mismas presentaban expresión del receptor en el núcleo y en el citoplasma.
Ejemplo 6d
Efecto del antagonista SCH-23390 en el tráfico del receptor de dopamina D1 con una NLS insertada en el tercer bucle citoplásmico (D1-IC3-NLS-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica D1-IC3-NLS-GFP (2 microgramos), y fueron tratadas con cuatro concentraciones distintas de SCH-23390 (10 micromolar, 1 micromolar, 500 nanomolar y 100 nanomolar) por espacio de 48 horas. Los núcleos fueron visualizados con DsRED-NUC (2 microgramos). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Las de un 86% de las células transfectadas con D1-IC3-NLS-GFP tenían el receptor en el núcleo, y las de un 0% tenían receptor en la superficie. Con las células tratadas con SCH-23390, las de un 84% de las mismas tenían receptor en el núcleo, y las de un 15% de las células tenían receptor en la superficie. La inserción de una NLS en esta posición en el GPCR translocará eficazmente el receptor al núcleo, pero no responde al fármaco.
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Ejemplo 6e
Expresión del receptor de dopamina D1 con una NLS insertada en el segundo bucle citoplásmico intracelular (D1-IC2-NLS-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica D1-IC2-NLS-GFP (2 microgramos), y fueron incubadas por espacio de 48 horas. Los núcleos fueron visualizados con DsRED-NUC (2 microgramos). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
En las células transfectadas con D1-IC2-NLS-GFP, el receptor fue detectado en el núcleo de las de 51% de las células.
Ejemplo 6f
Capacidad del receptor D1 de dopamina para homodimerizarse, con transfección escalonada
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica D1-RFP (2 microgramos), y tras 24 horas de incubación las células fueron transfectadas con un segundo constructo de DNA que codifica D1-NLS-GFP (2 microgramos). Células de control fueron transfectadas con el constructo D1-RFP (2 microgramos) en solitario. Las células fueron incubadas por espacio de 48 horas a continuación de la segunda transfección, y fueron examinadas por microscopía confocal.
Las de un 90% de las células transfectadas con D1-RFP en solitario expresaron el receptor en la superficie celular, y las de un 6% de las células expresaron el receptor en el núcleo. En contraste con ello, las de un 97% de las células que expresaban ambas formas del receptor expresaron ambos receptores (la roja más verde es igual a fluorescencia amarilla) en el núcleo. Así, el receptor D1 sin la NLS interactuó con el receptor D1 con la NLS a fin de pasar al
núcleo.
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Ejemplo 7 Receptor D5 de dopamina (D5-GFP)
Un constructo que codificaba el receptor D5 de dopamina-GFP (D5-GFP) fue preparado y usado para transfectar células COS (4 microgramos).
Las células transfectadas con D5 de dopamina-GFP presentaban a las 48 horas principalmente una localización citoplásmica del receptor, con localización en la superficie celular en tan sólo unas pocas células y sin casos de localización nuclear.
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Ejemplo 8 Receptor D1 de dopamina con una NLS incorporada (D1-NLS) coexpresado con el receptor de dopamina D5 (D5-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con dos constructos de DNA, uno que codifica D1-NLS (7 microgramos) y el otro que codifica D5-GFP (1,5 microgramos), y fueron incubadas por espacio de 48 horas.
Las de aproximadamente un 70% de las células transfectadas con D1-NLS y D5-GFP presentaban expresión en la superficie celular de D5-GFP, las de un 20% de las células presentaban expresión tanto superficial como citoplásmica de D5-GFP, y las de un 10% presentaban expresión nuclear de D5-GFP. No hubo translocación nuclear del receptor de dopamina D5 coexpresado con D1-NLS, lo cual indicaba que los receptores D1 y D5 no se oligomerizaron.
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Ejemplo 9 Receptor de dopamina D1 que contiene dos motivos de NLS (D1-2NLS-RFP) y es tratado con antagonista
Modificando el constructo que codifica D1-NLS-RFP, fue creado un constructo de DNA (D1-2NLS-RFP) para introducir una segunda NLS en la cola de carboxilo del receptor D1 de dopamina sustituyendo la secuencia KKEEA del receptor de dopamina D1 de tipo salvaje por la NLS KKKRK.
Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica este constructo (D1-2NLS-RFP), y fueron tratadas a intervalos con el antagonista SCH-23390 (10 \muM) como se ha descrito anteriormente. A las 6, 22, 30 y 42 horas de la transfección, se sustituyó el medio de cultivo que contenía antagonista. Las células de control no recibieron antagonista.
En las células tanto COS como HEK transfectadas con D1-2NLS-RFP, el receptor estaba situado en el núcleo en el 100% de las células tras haber transcurrido 24 horas, lo cual indicaba una translocación nuclear acrecentada cuando estaba presente una segunda NLS.
A las 48 horas, las de un 90% de las células no tratadas con antagonista presentaban fluorescencia en el núcleo, y las de un 0% de las células presentaban fluorescencia en la superficie de la célula. En las células tratadas con antagonista, las de un 51% de las células presentaban etiqueta en la superficie celular y las de un 49% de las células presentaban etiqueta nuclear.
La incorporación de una segunda NLS redundó en un más eficaz transporte del receptor al núcleo, y este evento era aún retardado por el tratamiento con el antagonista.
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Ejemplo 10 Receptor de dopamina D2 (D2-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con constructos de DNA que codifican D2-GFP (2 microgramos) y DsRed-NUC (1 microgramo), y fueron incubadas por espacio de 48 horas. Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Las de aproximadamente un 90% de las células que expresaron D2-GFP tenían expresión en la superficie celular, y las de un 10% tenían expresión nuclear o citoplásmica. El receptor de dopamina D2, que no tiene NLS endógena, es predominantemente expresado en la superficie de la célula.
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Ejemplo 11a Receptor D1 de dopamina con una NLS incorporada (D1-NLS) y receptor D2 de dopamina (D2-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con constructos de DNA que codifican D1-NLS (7 microgramos) y D2-GFP (1,5 microgramos), y fueron incubadas por espacio de 48 horas. Las células fueron también transfectadas con Ds-Red-NUC para verificar la localización del núcleo (1 microgramo). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
En las células transfectadas con D1-NLS y D2-GFP, las de un 33% de las células tenían expresión de D2-GFP en el núcleo, lo cual indicaba un transporte tanto de D1-NLS como de D2-GFP al núcleo, debido a la oligomerización entre los receptores D1 y D2. Las de un 67% de las células tenían receptores D2-GFP en la superficie celular solamente o bien en la superficie y en el citoplasma.
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Ejemplo 11b Capacidad del receptor de dopamina D2 D2 corto (D2S) para dimerizarse con el receptor D2 de dopamina largo (D2L)
Células HEK fueron transfectadas con constructos de DNA que codifican D2S-GFP (2 microgramos) y D2L-NLS (2 microgramos), y fueron incubadas por espacio de 48 horas. Los núcleos fueron visualizados con Ds-Red-NUC (2 microgramos). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
El receptor D2S-GFP fue visualizado en los núcleos de un 29% de las células. Esto indicaba que el D2S se dimerizó con el D2L y fue transportado al núcleo.
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Ejemplo 11c Capacidad del receptor de dopamina D2S para dimerizarse con el receptor de dopamina D2L.
Células HEK fueron transfectadas con constructos de DNA que codifican D2S-RFP (2 microgramos) y D2L-NLS-GFP (2 microgramos) y fueron incubadas por espacio de 48 horas. Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Las de un 40% de las células tenían un color amarillo (superposición de rojo más verde) en el núcleo, indicando que el D2L-NLS se dimerizó con el D2S-RFP y lo transportó al núcleo.
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Ejemplo 12 Receptor de dopamina D2 con una NLS incorporada (D2-NLS-GFP) tratado con antagonistas.
Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica D2-NLS-GFP, y las células fueron tratadas con los antagonistas del receptor de dopamina D2 (+)butaclamol (10 micromolar) o racloprida (10m micromolar). A las 6, 22, 30 y 42 horas de la transfección, las células fueron tratadas con los antagonistas. Las células fueron incubadas por espacio de 48 horas tras el tratamiento farmacológico, y fueron examinadas por microscopía confocal.
En ausencia de antagonista, las células que expresaron D2-NLS-GFP presentaban etiqueta nuclear en el 70% de las células y etiquetado citoplásmico en el 20% y etiquetado citoplásmico y superficial en el 10% de las células. Con el tratamiento con (+)butaclamol, un etiquetado nuclear apareció en tan sólo un 5% de las células, las de un 5% de las células tenían etiqueta citoplásmica, y las de un 90% de las células tenían etiquetado en la superficie celular. Con el tratamiento con racloprida, las de un 5% de las células presentaban etiquetado nuclear, las de un 15% de las células tenían etiquetado citoplásmico, y las de un 80% de las células tenían etiquetado en la superficie celular. Ambos antagonistas del receptor D2 impedían la translocación del receptor en el sentido de su paso de la superficie celular al núcleo.
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Ejemplo 13 Receptor beta2-adrenérgico-GFP (beta2-AR-GFP)
Fue creado un constructo de DNA que codifica una proteína de fusión que comprende el receptor beta2-adrenérgico humano y GFP (beta2-AR-GFP). Las células fueron transfectadas con el constructo de DNA que codifica beta2-AR-GFP (2 microgramos), y fueron incubadas por espacio de 24 horas y examinadas por microscopía confocal.
En las células que expresaron beta2-AR-GFP, las de un 42% de las células tenían expresión del receptor en el citoplasma solamente, y las de un 58% de las células tenían expresión del receptor en el citoplasma y en la superficie de la célula. No se observó localización nuclear del receptor.
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Ejemplo 14 Receptor beta2-adrenérgico con una NLS incorporada (beta2-AR-NLS3-GFP)
Fue creado un constructo de DNA que codifica una proteína de fusión que comprende el beta2-AR-NLS3-GFP humano. Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica beta2-AR-NLS3-GFP-3 (2 microgramos), y Ds-Red-NUC (1 microgramo), y las células fueron incubadas por espacio de 48 horas.
Las de un 45% de las células transfectadas con beta2-AR-NLS3-GFP presentaban localización nuclear del receptor, y las de un 55% de las células tenían expresión superficial y citoplásmica. La incorporación de una NLS al beta2-AR indujo la translocación del receptor al núcleo.
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Ejemplo 15 Receptor beta2-adrenérgico con una NLS incorporada (beta2-AR-NLS3-GFP), tratado con antagonista
Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica beta2-AR-NLS3-GFP-3 (1 microgramo) y Ds-Red-NUC (1 microgramo) y fueron incubadas por espacio de 48 horas. Las células fueron tratadas a intervalos con atenolol (10 micromolar), que es un antagonista de los receptores adrenérgicos. A las 6, 22, 30 y 42 horas de la transfección, se procedió a sustituir el medio de cultivo que contenía el antagonista.
Las células de control no recibieron antagonista. En las células de control, las de un 60% de las mismas tenían expresión del receptor en el núcleo, las de un 21% tenían expresión del receptor en la superficie celular, y las de un 19% tenían expresión del receptor en el citoplasma.
En las células tratadas con el atenolol antagonista, las de un 70% de las células tenían expresión del receptor en la superficie celular, las de un 14% tenían expresión del receptor en el núcleo, y las de un 16% tenían expresión del receptor en el citoplasma. El tratamiento con el antagonista atenolol impidió el paso del beta2-AR-NLS3-GFP al núcleo y retuvo al receptor en la superficie celular.
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Ejemplo 16 Receptor beta2-adrenérgico (beta2-AR-GFP) coexpresado con receptor D1 de dopamina con una NLS incorporada (D1-NLS)
Células HEK fueron transfectadas con constructos de DNA que codifican el beta2-AR-GFP (1,5 microgramos) y D1-NLS (3 microgramos) por de espacio de 48 horas.
Aproximadamente las de un 40% de las células presentaban expresión del receptor beta2-AR-GFP en el núcleo, demostrando que el beta2-AR que no contenía una NLS había pasado al núcleo. Esto indicaba que se había producido oligomerización entre el receptor beta2-AR y el receptor de dopamina D1 que contenía la NLS. Las de un 45% de las células presentaban beta2-AR-GFP en el citoplasma, y las de un 15% lo presentaban en el citoplasma y en la superficie celular.
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Ejemplo 17 Receptor beta2-adrenérgico (beta2-AR-GFP) y receptor D1 de dopamina con una NLS incorporada (D1-NLS) tratados con antagonista
Células HEK fueron transfectadas con constructos de DNA que codifican beta2-AR-GFP (1,5 microgramos) y D1-NLS (3 microgramos) y fueron incubadas por de espacio de 48 horas. Estas células fueron tratadas con el antagonista adrenérgico propranolol (5 micromolar). A las 5, 22, 30 y 42 horas de la transfección se procedió a sustituir el medio de cultivo que contenía el antagonista. Las células de control no recibieron antagonista. Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Las de un 25% de las células de control presentaban expresión nuclear de beta2-AR-GFP y las de un 75% de las células presentaban la etiqueta en el citoplasma y en la superficie celular.
En las células tratadas con propranolol, la expresión nuclear de beta2-AR-GFP fue de un 10%, y las de un 90% de las células presentaban etiqueta citoplásmica y en superficie. La formación de un heterooligómero entre beta2-AR-GFP y D1-NLS redundó en el paso del beta2-AR-GFP al núcleo. Este tráfico fue atenuado por la presencia del antagonista para el receptor adrenérgico.
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Ejemplo 18 Receptor beta2-adrenérgico con una NLS incorporada (beta2-AR-NLS3-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que contenía una NLS codificando beta2-AR-NLS3-GFP (8 microgramos) por espacio de 48 horas. Las células fueron también transfectadas con Ds-Red-NUC para verificar la localización del núcleo (1 microgramo).
Las de un 80% de las células presentaron receptor beta2-AR-NLS3-GFP en el núcleo. La eficiencia de la NLS se vio mejorada, redundando en una mayor localización de receptor en el núcleo
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Ejemplo 19 Receptor 1B de serotonina con una NLS incorporada (5HT1 B-NLS-GFP) y tratamiento con antagonista
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica el 5HT1B-NLS-GFP de serotonina (2 microgramos). Las células fueron transfectadas con Ds-red-NUC para verificar la localización del núcleo (1 microgramo). Las células fueron tratadas con metisergida (10 micromolar), que es un antagonista de los receptores de serotonina. A las 6, 22, 30 y 42 horas de la transfección se procedió a sustituir el medio de cultivo que contenía antagonista. Las células de control no recibieron antagonista. Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Las células de control, no tratadas con antagonista, presentaban en un 55% de las mismas receptor localizado en el núcleo, y en un 20% de las mismas receptor localizado en la superficie celular. A las 48 horas, las células tratadas con metisergida pusieron de manifiesto que las de un 25% de las células tenían receptor en el núcleo y las de un 62% de las células presentaban localización en la superficie celular.
El receptor 5HT1 B de serotonina fue eficientemente translocado de la superficie celular al núcleo por la inserción de la NLS. El tratamiento con el antagonista para la serotonina metisergida impidió la translocación del receptor.
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Ejemplo 20 Receptor 2 de cisteninil-leucotrieno con una NLS incorporada (CysLT2-NLS-GFP)
Células HEK fueron transfectadas por espacio de 48 horas con un constructo de DNA que codifica CysLT2-NLS-GFP (8 microgramos). Las células fueron también transfectadas con Ds-RED-NUC para verificar la localización del núcleo (1 microgramo). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Las de un 83% de las células que expresaron Cys-LT2-NLS-GFP presentaron expresión del receptor en el núcleo y las de un 0% de las células tenían expresión del receptor en la superficie celular, indicando la localización del receptor Cys-LT2-NLS-GFP en el núcleo.
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Ejemplo 21 Receptor 2 de cisteinil-leucotrieno con una NLS incorporada (Cys-LT2-NLS-GFP) tratado con antagonista
El DNA que codifica Cys-LT2-NLS-GFP (3 microgramos) fue usado para transfectar células HEK. Estas células fueron tratadas con el antagonista de los receptores de cisteinil-leucotrieno montelucast (10 micromolar). A las 6, 22, 30 y 42 horas de la transfección se procedió a sustituir el medio de cultivo que contenía antagonista. Las células de control no recibieron antagonista. Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
En ausencia de antagonista, las de un 70% de las células que expresaron Cys-LT2-NLS-GFP tenían localización del receptor en el núcleo, y las de un 30% de las células presentaron una localización citoplásmica, con un 0% de las células presentando receptor en la superficie celular. Para las células tratadas con antagonista, solamente las de un 10% de las mismas presentaron localización nuclear del receptor, mientras que las de un 90% de las mismas presentaron expresión del receptor en la superficie celular. Así, el antagonista de los receptores de cisteinil-leucotrieno montelucast impidió el transporte del receptor Cys-LT2-NLS-GFP de la superficie de la célula al núcleo.
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Ejemplo 22 Receptor opioide mu con una NLS incorporada (opioide mu-NLS-GFP)
Células HEK fueron transfectadas por espacio de 48 horas con un constructo de DNA que codifica el opioide mu-NLS-GFP (2 microgramos). Las células fueron también transfectadas con Ds-Red-NUC (1 microgramo) para verificar la localización del núcleo. Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Las de un 65% de las células transfectadas con opioide mu-NLS-GFP presentaron expresión del receptor en el núcleo. Las de un 15% de las células presentaron localización superficial del receptor, y las de un 20% de las células tenían etiquetado citoplásmico. Así, la inserción de la NLS permitió el paso del receptor de opioides mu al núcleo.
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Ejemplo 23 Receptor de opioides mu con una NLS incorporada (mu-NLS-GFP) tratado con antagonista
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica el opioide mu-NLS-GFP (2 microgramos). Las células transfectadas fueron tratadas con los antagonistas opioides mu naloxona (10 micromolar) o naltrexona (10 micromolar). A las 6, 22, 30 y 42 horas de la transfección se procedió a sustituir el medio de cultivo que contenía el antagonista. Las células de control no recibieron antagonista. Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Cuando no estaban tratadas, las de un 62% de las células tenían Mu-NLS-GFP en el núcleo, y las de un 20% de las células tenían receptor detectable en la superficie celular. Con el tratamiento con naloxona, las de un 21 de las células tenían expresión del receptor en el núcleo y las de un 66% de las células tenían receptor en la superficie celular. Con el tratamiento con naltrexona, las de un 22% de las células tenían expresión del receptor en el núcleo y las de un 58% de las células tenían receptor en la superficie celular. Así, los antagonistas opioides mu naloxona y naltrexona redujeron la translocación del receptor de la superficie celular al núcleo.
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Ejemplo 24 Receptor M1 muscarínico con una NLS incorporada (M1-NLS-GFP) tratado con antagonista
Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica M1-NLS-GFP (1 microgramo) y Ds-Red-NUC (1 microgramo) por espacio de 48 horas. Estas células fueron tratadas con bromuro de iprotropio (10 micromolar). El medio que contenía antagonista fue sustituido a las 6, 22, 30 y 42 horas de la transfección. Las células de control no recibieron tratamiento con antagonista. Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
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A continuación del tratamiento con bromuro de iprotropio, las de un 72% de las células tenían expresión del receptor en la superficie celular, las de un 17% tenían expresión del receptor en el citoplasma solamente, y las de un 11% de las células tenían expresión del receptor en el núcleo.
Para las células de control, las de un 64% tenían expresión del receptor en el núcleo, las de un 23% tenían expresión del receptor en la superficie celular, y las de un 13% de las células tenían expresión del receptor en el citoplasma.
El tratamiento con antagonista muscarínico impidió la translocación del M1-NLS-GFP de la superficie celular al núcleo.
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Ejemplo 25 Receptor H1 de histamina con una NLS incorporada (H1-NLS-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica el receptor H1-NLS-GFP de histamina (2 microgramos) y con un constructo que codifica Ds-Red-NUC (1 microgramo), y fueron incubadas por espacio de 48 horas.
Aproximadamente las de un 65% de las células tenían expresión del receptor en el núcleo, y las de un 35% de las células tenían expresión del receptor tanto en la superficie como en citoplasma. La inserción de la NLS en el receptor de histamina H1 redundó en una translocación del receptor de la superficie al núcleo.
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Ejemplo 26 Efecto del antagonista prometacina en el tráfico del receptor de histamina H1 con una NLS insertada (H1-NLS-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con H1-NLS-GFP (2 microgramos) y DsRED-Nuc (2 microgramos) e incubadas por espacio de 48 horas. Las células fueron tratadas con prometacina (10 micromolar) por espacio de 48 horas. Los núcleos fueron visualizados con DsRED-Nuc. Las células fueron examinadas con microscopía confocal.
Con las células tratadas con prometacina, las de un 88% de las células tenían receptor en la superficie de la célula, y las de un 10% de las células tenían receptor en el núcleo. Con las células no tratadas, las de un 85% de las mismas tenían expresión del receptor en el núcleo y en el citoplasma. Así, el tratamiento con prometacina redujo el tráfico de H1-NLS-GFP al núcleo.
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Ejemplo 26 Receptor AT1 de angiotensina (AT1 R)
Fue creado un constructo de DNA (AT1 R-RFP) que codifica una proteína de fusión que comprende el receptor AT1 de angiotensina humano que contiene NLS y DsRed2 (RFP).
Células COS fueron transfectadas con el constructo de DNA AT1 R-RFP (4 microgramos) e incubadas por espacio de 48 horas a 37ºC.
Las células fueron examinadas por microscopía confocal y se comprobó que el receptor estaba situado exclusivamente dentro de los núcleos de las células, lo cual indicaba una translocación basal agonista-independiente del AT1 R al núcleo.
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Ejemplo 27 Receptor de dopamina (D1-NLS-GFP) tratado con agonista por espacio de un corto periodo
Células HEK fueron transfectadas con los constructos de DNA que codifican D1-NLS-GFP (2 microgramos) y D1-WT (4 microgramos), y las células fueron incubadas por de espacio de 24 horas. Las células fueron tratadas con el agonista D1 de dopamina SKF 81297 (10 micromolar) por espacio de 35 min. Las de un único grupo de células fueron visualizadas por microscopía confocal en tiempo real.
Quedó demostrada una incrementada expresión del receptor en el núcleo, dándose un máximo incremento a los 20 minutos, lo cual indicaba un efecto agonista a corto plazo.
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Ejemplo 28 Transportador de dopamina con una NLS, fusionado con GFP y RFP (DAT-NLS-GFP y DAT-NLS-RFP)
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica DAT-GFP (2 microgramos) por espacio de 48 horas. Los núcleos fueron visualizados con DsRED-nuc (2 microgramos) usando microscopía confocal.
A las 48 horas fue detectado DAT-GFP en la superficie celular o en el citoplasma en las de un 86% de las células. En las de un 14% de las células, el transportador estaba en el núcleo.
Células HEK fueron transfectadas con un constructo que codifica DAT-NLS-RFP (2 microgramos) y visualizadas por microscopía confocal a las 48 horas. Se detectó DAT-NLS-RFP en los núcleos en las de un 85% de las células. En las de un 18% de las células, el transportador estaba en la superficie o en el citoplasma.
Células HEK fueron entonces transfectadas con DNA que codifica DAT-NLS-GFP (2 microgramos) y visualizadas por microscopía confocal a las 48 horas. Los núcleos fueron visualizados con DsRED-nuc (2 microgramos). Fue detectado DAT-NLS-GFP en el núcleo de las de un 77% de las células.
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Ejemplo 29 Co-tráfico de DAT-GFP con DAT-NLS-RFP
Células HEK fueron transfectadas con constructos de DNA que codifican DAT-NLS-RFP (2 microgramos) y DAT-GFP (2 microgramos), y fueron incubadas por espacio de 48 horas. Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Fue detectada una fluorescencia amarilla en los núcleos de las de un 56% de las células, indicando la colocalización de DAT-NLS-RFP y DAT-GFP en el núcleo, confirmando la oligomerización de DAT-NLS-RFP y DAT-GFP.
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Ejemplo 30 Efecto de la cocaína en el tráfico de DAT-NLS-RFP al núcleo
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica DAT-NLS-RFP (2 microgramos) e incubadas por espacio de 48 horas. A las 6, 22, 30 y 42 horas de la transfección, las células fueron tratadas con cocaína o anfetamina (concentración final 10 micromolar), o bien se dejaron sin tratar. Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
En las células HEK no tratadas, las de un 77% de las células tenían expresión de DAT-NLS-RFP en el núcleo.
A continuación del tratamiento con cocaína, las de un 75% de las células tenían expresión superficial o citoplásmica de DAT-NLS-RFP, mientras que las de un 25% de las células tenían expresión del transportador en el núcleo y en el citoplasma. El tratamiento con cocaína redujo el tráfico del DAT-NLS-RFP al núcleo.
A continuación del tratamiento con anfetamina, las de un 34% de las células tenían expresión en la superficie de la célula/en el citoplasma, y las de un 66% de las células tenían expresión del transportador en el núcleo/citoplasma. El tratamiento con una anfetamina (que no tiene como diana al DAT, sino que tiene como diana al transportador de monoaminas vesiculares, VMAT) no tuvo efecto inhibitorio alguno en el tráfico del DAT-NLS-RFP en el sentido de su paso al núcleo.
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Ejemplo 31 Expresión del transportador de dopamina con una NLS (DAT-NLS-GFP) y tratamiento con antagonistas
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica DAT-NLS-GFP (2 microgramos) e incubadas por espacio de 48 horas. A las 6, 22, 30 y 42 horas de la transfección, las células fueron tratadas con GBR-12909 (concentración final 1 micromolar). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Células HEK fueron transfectadas con un constructo que codifica DAT-NLS-GFP (2 microgramos) e incubadas por espacio de 48 horas. A las 6, 22, 30 y 42 horas de la transfección, las células fueron tratadas con macindol (concentración final 1 micromolar). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Células HEK de control fueron transfectadas con DAT-NLS-GFP e incubadas por espacio de 48 horas, y no fueron tratadas con fármaco.
En las células HEK no tratadas transfectadas con DAT-NLS-GFP, las de un 77% de las células tenían expresión del transportador en el núcleo y el citoplasma, las de un 23% la tenían solamente en el citoplasma, y las de un 0% la tenían en la superficie celular.
A continuación del tratamiento con GBR-12909, las de un 62% de las células tenían expresión del transportador en la superficie de la célula y en el citoplasma, y las de un 38% de las células tenían expresión del transportador en el núcleo y en el citoplasma. El tratamiento con GBR-12909 redujo la translocación del DAT-NLS-GFP de la superficie celular al núcleo.
A continuación del tratamiento con macindol, las de un 61% de las células tenían expresión del transportador en la superficie celular y en el citoplasma, y las de un 39% de las células tenían expresión del transportador en el núcleo y en el citoplasma. El tratamiento con macindol redujo la translocación del DAT-NLS-GFP de la superficie celular al núcleo.
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Ejemplo 32 Capacidad del transportador de dopamina para homooligomerizarse, usando expresión escalonada de DAT-GFP y DAT-NLS-RFP
Células HEK fueron transfectadas con el constructo de DNA que codifica DAT-GFP (2 microgramos) y 24 h después con el constructo de DNA que codifica DAT-NLS-RFP (0,5, 1 y 2 microgramos), y fueron incubadas por espacio de 48 horas. Las células fueron también transfectadas con DAT-GFP en solitario como control. Las células fueron incubadas durante 48 horas después de la segunda transfección. El periodo de incubación total fue de 72 horas.
Las de un 85% de las células transfectadas con DAT-GFP en solitario contenían transportador en el citoplasma, y las de un 7% lo contenían en el núcleo. En el experimento escalonado (proporción 1:0,5), las de un 97% de las células tenían fluorescencia amarilla (= roja + verde) en el núcleo. En el experimento escalonado (proporción 1:1), las de un 94% de las células tenían fluorescencia amarilla en el núcleo. En el experimento escalonado (proporción 1:2), las de un 94% de las células tenían fluorescencia amarilla en el núcleo. Por consiguiente, el DAT-GFP interactuó y se dimerizó con DAT-NLS-RFP a fin de pasar al núcleo.
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Ejemplo 33 Expresión del receptor metabotrópico 4 de glutamato (mGluR4-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica mGluR4-GFP (2 microgramos) e incubadas por espacio de 48 horas. Los núcleos fueron visualizados con DsRED-NUC (2 microgramos). Las células fueron examinados por microscopía confocal.
Los de un 89% de los receptores fueron expresados en la superficie celular. Así, el receptor mGluR4 estaba localizado en gran medida en la superficie celular.
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Ejemplo 34 Expresión del receptor metabotrópico 4 de glutamato con una NLS insertada (mGluR4-NLS-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica mGluR4-NLS-GFP (2 microgramos) e incubadas por espacio de 48 horas. Las células fueron también transfectadas con Ds-RED-NUC (2 microgramos) para verificar la localización del núcleo. Las células fueron examinados por microscopía confocal.
Las de un 60% de las células que expresaron mGluR4-NLS-GFP presentaban expresión del receptor en el núcleo.
Así, la inserción de una NLS en el receptor mGluR4 incrementó la localización nuclear del receptor.
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Ejemplo 35 Expresión del receptor M1 muscarínico con o sin incorporación de NLS (M1-GFP y M1-NSL-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica el M1-GFP (2 microgramos) o con un constructo que codifica el M1-NLS-GFP (2 microgramos) e incubadas por espacio de 48 horas. Los núcleos fueron visualizados con DsRED-NUC (2 microgramos). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Tras la transfección con M1-GFP, las de un 67% de las células tenían expresión del receptor en la superficie celular o en el citoplasma.
Con transfección con M1-NLS-GFP se observó que las de un 92% de las células tenían expresión nuclear del receptor, lo cual indicaba que la NLS dirigió el receptor al núcleo.
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Ejemplo 36 Expresión del receptor de histamina H1 (H1-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica H1-GFP (1,5 microgramos) e incubadas por espacio de 48 horas. Los núcleos fueron visualizados con DsRED-NUC (2 microgramos). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Las de un 97% de las células expresaron receptor en la superficie celular. Así, el receptor no modificado no pasó al núcleo.
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Ejemplo 37 Expresión del receptor de cisteinil-leucotrieno con NLS insertada (CysLT1-NLS-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica CysLT1-NLS-GFP (2 microgramos) e incubadas por espacio de 48 horas. Los núcleos fueron visualizados con DsRED-NUC (2 microgramos). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Con las células no tratadas de control, las de un 0% de las células tenían expresión del receptor en la superficie celular, y las de un 100% de las células tenían expresión nuclear, lo cual indicaba que el receptor era fuertemente retirado de la superficie celular.
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Ejemplo 38 Expresión del transportador de serotonina fusionado con GFP (SERT-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con un constructo de DNA que codifica SERT-GFP (2 microgramos) e incubadas por espacio de 48 horas. Las de un 91% de las células expresaron transportador en la superficie celular y en el citoplasma.
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Ejemplo 39 Expresión del transportador de serotonina con una NLS insertada y tratamiento con fluoxetina (SERT-NLS-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica SERT-NLS-GFP (2 microgramos de DNA) y tratadas con fluoxetina (concentración final 1 micromolar) por espacio de 48 horas. A las 6, 22, 30 y 42 horas de la transfección, las células fueron tratadas con fluoxetina (concentración final 1 micromolar). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
En las células no tratadas que expresaron SERT-NLS-GFP, las de un 0% de las células tenían expresión del transportador en la superficie celular, las de un 26% tenían expresión del transportador en el citoplasma, y las de un 60% de las células tenían expresión del transportador en el núcleo y en el citoplasma.
A continuación del tratamiento con fluoxetina, las de un 68% de las células tenían expresión del transportador SERT-NLS-GFP en la superficie de la célula y en el citoplasma, y las de un 27% de las células tenían expresión del transportador en el núcleo y en el citoplasma. Así, el tratamiento con fluoxetina inhibió la translocación del SERT-NLS-GFP en el sentido de su paso de la superficie celular al núcleo.
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Ejemplo 40 Evaluación de la capacidad de dos distintas proteínas de membrana de la superficie celular para interactuar entre sí (D2-GFP y DAT-NLS-RFP)
Células HEK fueron cotransfectadas con constructos de DNA que codifican el D2-GFP (2 microgramos) y el DAT-NLS-RFP (2 microgramos) e incubadas por espacio de 48 horas. Las células fueron también transfectadas por separado con D2-GFP y DAT-NLS-RFP en solitario como controles. Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Las de un 85% de las células transfectadas con DAT-NLS-RFP contenían transportador en el núcleo. Las de un 97% de las células transfectadas con D2-GFP contenían el receptor en la superficie celular, y las de un 4% de las células contenían receptor en el núcleo. Las de un 86% de las células cotransfectadas contenían fluorescencia amarilla (roja más verde) en el núcleo, lo cual indicaba la presencia de ambas proteínas D2 y DAT en el núcleo y confirmaba la dimerización de las proteínas coexpresadas.
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Ejemplo 41 Evaluación de la capacidad de una proteína de membrana y una proteína no de membrana para asociarse en un complejo e interactuar entre sí (D1-NLS y beta-arrestina1-GFP)
Células HEK fueron cotransfectadas con constructos de DNA que codifican D1-NLS (2 microgramos) y beta-arrestina1-GFP (2 microgramos) e incubadas por espacio de 48 horas. También fueron transfectadas células con beta-arrestina1-GFP en solitario. Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Las de un 100% de las células transfectadas con beta-arrestina1-GFP en solitario expresaron proteína fluorescente en el citoplasma. De estas células, las de un 15% de las mismas también tenían fluorescencia en el núcleo. Las de un 89% de las células transfectadas con ambas proteínas expresaron proteína fluorescente en el núcleo, y de éstas, las de un 16% tenían expresión en el citoplasma. Así, la interacción entre el GPCR y la proteína no de membrana permitió el paso de la proteína beta-arrestina que no contenía NLS al núcleo.
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Ejemplo 42 Expresión del receptor D1 de dopamina con una NLS insertada (HA-D1-NLS), tratamiento con antagonista y detección con fluorometría
Los pocillos de una placa multipocillos fueron recubiertos con poli-L-ornitina y fueron luego plaqueados con 50.000 células por pocillo. Las células fueron transfectadas con DNA que codifica un receptor D1-NLS marcado con epítope de HA y tratadas con (+)butaclamol (de 10 nanomolar a 10 micromolar) a lo largo de un periodo de tiempo de 48 horas. A continuación de esto, las células fueron fijadas con paraformaldehído, y los receptores de superficie celular fueron detectados con un anticuerpo anti-HA de rata y luego con un anticuerpo anti-rata de cabra conjugado con FITC. La señal fluorescente fue detectada por fluorometría (Cytofluor). Los resultados son el promedio de cinco pocillos por condición experimental, y están indicados en la Figura 2. Hubo un efecto dosis-dependiente del butaclamol para retener al receptor en la superficie celular, indicando que este antagonista reducía el tráfico del receptor desde la superficie celular. Así, puede utilizarse fluorometría para detectar el receptor retenido en la superficie celular.
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Ejemplo 43 Expresión del receptor D1 de dopamina con una NLS insertada (HA-D1-NLS), y bloqueo del efecto de respuesta a la dosis de antagonista por parte del agonista y detección con fluorometría
Los pocillos de una placa multipocillos fueron recubiertos con poli-L-ornitina y fueron luego plaqueados con 50.000 células por pocillo. Las células fueron transfectadas con DNA que codifica un receptor D1-NLS marcado con epítope de HA y tratadas con el antagonista SCH 23390 (de 1 nanomolar a 1 micromolar) con o sin el agonista SKF 81297 (1 micromolar) a lo largo de un periodo de tiempo de 48 horas. A continuación de esto, las células fueron fijadas con paraformaldehído, y los receptores de superficie celular fueron detectados con un anticuerpo anti-HA de rata y luego con un anticuerpo anti-rata de cabra conjugado con FITC. La señal fluorescente fue detectada por fluorometría (Cytofluor). Los resultados son el promedio de cinco pocillos por condición experimental. Hubo un efecto dosis-dependiente del SCH 23390 para retener al receptor en la superficie celular, indicando que este antagonista redujo el tráfico del receptor desde la superficie celular. La concomitante adición de agonista redujo el efecto del antagonista (Figura 3). Así, la acción del agonista puede ser detectada por medio del bloqueo del efecto del antagonista, y puede utilizarse fluorometría para cuantificar el efecto del agonista.
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Ejemplo 43b Expresión del receptor D1 de dopamina con una NLS insertada (HA-D1-NLS), y bloqueo del efecto antagonista mediante la respuesta a la dosis de agonista y detección con fluorometría
Células HEK fueron transfectadas con HA-D1-NLS en una placa multipocillos que fue recubierta con poli-L-ornitina con una concentración de 50.000 células por pocillo. Las células fueron tratadas con el antagonista SCH 23390 (0,5 micromolar) por espacio de 48 horas. Durante la última hora de incubación fue añadido el agonista SKF 81297 (de 100 nanomolar a 1 micromolar) junto con SCH 23390. A continuación de esto, las células fueron fijadas con paraformaldehído, y los receptores de superficie celular fueron detectados con un anticuerpo anti-HA de rata y luego con un anticuerpo anti-rata de cabra conjugado con FITC. La señal fluorescente fue detectada por fluorometría (Cytofluor). Los resultados son el promedio de cinco pocillos por condición experimental.
El tratamiento con SCH 23390 retuvo al HA-D1-NLS en la superficie celular (Figura 4, Barra 1 frente a Barra 6). La adición por espacio de un corto periodo del agonista redundó en un bloqueo dosis-dependiente del efecto del SCH 23390. Al haber sido el SCH 23390 retirado de las células durante la última hora de incubación (y en ausencia de agonista), ello redundó en una pérdida de un 33% de los receptores HA-D1-NLS de la superficie celular (Figura 4, Barra 5 frente a Barra 6), mientras que la adición de agonista SKF 81297 100 nanomolar continuamente en presencia de SCH 23390 redundó en una pérdida de un 66% de los receptores de la superficie celular (Figura 4, Barra 4 frente a Barra 6), y en una pérdida de hasta un 78% de los receptores con la adición de SKF 81297 1 micromolar (Figura 4, Barra 2 frente a Barra 6).
El efecto del antagonista SCH 23390 redundó en una retención del receptor en la superficie celular, indicando que este antagonista redujo el tráfico de receptor desde la superficie celular. La concomitante adición de agonista redujo el efecto antagonista y aceleró la remoción del receptor hacia fuera de la superficie celular de la manera propia de la respuesta a la dosis. Así, los compuestos interactuantes pueden ser detectados por medio del bloqueo del efecto de compuestos que retienen al receptor que contiene NLS en la superficie celular, y puede utilizarse fluorometría para cuantificar el efecto.
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Ejemplo 44 Expresión del receptor D1 de dopamina con una NLS insertada (D1-NLS), tratamiento con (+)butaclamol 10 micromolar y detección con fijación del radioligando
Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica D1-NLS y tratadas con (+)butaclamol (10 micromolar), o se dejaron sin tratar. Tras haber transcurrido 48 horas, las células fueron lavadas, recolectadas, lisadas y homogeneizadas con un politrón. La fracción de membrana fue recogida por centrifugación y fue luego estratificada con solución de sucrosa al 35% y centrifugada a 30.000 rpm a 4 grados C por espacio de 90 min. para recoger la fracción pesada de membrana.
Las fracciones de membrana fueron sometidas a ensayo de fijación del radioligando usando [^{3}H]-SCH23390 con (+)butaclamol (10 micromolar) usado para definir la fijación específica. La incubación fue a temperatura ambiente por espacio de 2 horas, efectuándose a continuación filtración rápida y cuantificación por contaje de escintilación.
El tratamiento con antagonista del D1-NLS impidió su translocación de la superficie celular al núcleo, y el receptor retenido en la superficie celular fue cuantificado mediante ensayo de fijación del radioligando (Figura 5).
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Ejemplo 45 Expresión del receptor D1 de dopamina con una NLS insertada (D1-NLS), tratamiento con (+)butaclamol 500 nanomolar y detección con fijación del radioligando
Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica D1-NLS y tratadas con (+)butaclamol 500 nanomolar, o bien se las dejó sin tratar. Tras 48 horas, las células fueron lavadas, recolectadas, lisadas y homogeneizadas con un politrón. La fracción de membrana fue recogida por centrifugación y luego estratificada con solución de sucrosa al 35% y centrifugada a 30.000 rpm a 4 grados C por espacio de 90 min. para recoger la fracción pesada de
membrana.
Las membrana fueron sometidas al ensayo de fijación del radioligando usando [^{3}H]-SCH23390 con (+)butaclamol 10 micromolar usado para definir la fijación específica. La incubación fue a temperatura ambiente por espacio de 2 horas, a continuación de lo cual se efectuó filtración rápida y cuantificación por contaje de escintilación. Los resultados están indicados en las Tablas 4 y 5.
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TABLA 4 Fracción de membrana plásmica de control
46
TABLA 5 Fracción de membrana plásmica tratada con butaclamol
47
El tratamiento antagonista con (+)butaclamol del D1-NLS impidió su translocación al núcleo, y el receptor retenido en la superficie celular fue cuantificado mediante el ensayo de fijación del radioligando.
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Ejemplo 46 Expresión del receptor D1 de dopamina con una NLS insertada (D1-NLS), tratamiento con (+)butaclamol 100 nanomolar y detección con fijación del radioligando
Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica D1-NLS y tratadas con (+)butaclamol 100 nanomolar, o se dejaron sin tratar. Tras 48 horas, las células fueron lavadas, recolectadas, lisadas y homogeneizadas con un politrón. La fracción de membrana fue recogida por centrifugación y luego estratificada con solución de sucrosa al 35% y centrifugada a 30.000 rpm a 4 grados C por espacio de 90 min. para recoger la fracción pesada de membrana.
Las membrana fueron sometidas a ensayo de fijación del radioligando usando [^{3}H]-SCH23390 con (+)butaclamol (10 micromolar) para definir la fijación específica. La incubación fue a temperatura ambiente por espacio de 2 horas, seguida por filtración rápida y cuantificación por contaje de escintilación.
El tratamiento antagonista con (+)butaclamol (100 nanomolar) impidió la translocación del D1-NLS al núcleo, y el receptor retenido en la superficie celular fue cuantificado mediante ensayo de fijación del radioligando. En ausencia de tratamiento con butaclamol, fueron detectados en las membranas de superficie de celular 0,03 pmol/mg de proteína del receptor, y con tratamiento con butaclamol, fueron detectados en las membranas de superficie celular 0,09 pmol/mg de proteína del receptor.
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Ejemplo 47 Expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (receptor de tirosina quinasa) EGFR-GFP y EGFR-NLS-GFP
Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica EGFR-NLS-GFP (2 microgramos). Células HEK fueron también transfectadas con DNA que codifica EGFR-GFP (2 microgramos) e incubadas por espacio de 24 horas.
El EGFR-GFP fue expresado en la superficie celular en las de un 73% de las células, y las de un 12% de las células tenían receptor en el núcleo. El EGFR-NLS-GFP fue expresado en el núcleo en las de un 91% de las células, y las de un 0% de las células tenían receptor en la superficie celular. La incorporación de una NLS a la secuencia del receptor del EGF indujo una fuerte translocación dirigida de la superficie celular al núcleo.
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Ejemplo 48 Expresión del receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica el LDL-GFP (2 microgramos) e incubadas por espacio de 24 horas. El receptor fue expresado en la superficie celular en las de un 67% de las células y en el núcleo en las de un 8% de las células.
El receptor de LDL es expresado en la superficie celular en la mayoría de las células, no siendo muchas las células que contienen receptor en el núcleo.
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Ejemplo 49 Expresión del receptor de LDL con una NLS (LDL-NLS-GFP)
Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica LDL-NLS-GFP (2 microgramos) y DsRED-NUC (2 microgramos) e incubadas por espacio de 48 horas. Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
El LDL-NLS-GFP fue expresado en el núcleo en las de un 22% de las células, y en la superficie celular en las de un 67%. La incorporación de una NLS al receptor de LDL indujo translocación del receptor al núcleo.
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Ejemplo 50 Expresión del receptor de eritropoyetina (receptor de citoquina) EPO-GFP y EPO-NLS-GFP
Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica EPO-NLS-GFP (2 microgramos). Células HEK fueron transfectadas con EPO-GFP (2 microgramos). Las células fueron también transfectadas con DsRed-NUC (2 microgramos). Las células fueron incubadas por espacio de 48 horas y fueron examinadas por microscopía confocal.
El EPO-NLS-GFP estaba situado en el núcleo en las de un 72% de las células y en la superficie celular en las de un 0% de las células. El EPO-GFP estaba situado en la superficie celular en las de un 79% de las células, y las de un 28% de las células tenían expresión del receptor en el núcleo. La incorporación de una NLS a la secuencia del receptor de EPO indujo una translocación dirigida de la superficie celular al núcleo.
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Ejemplo 51 Expresión del transportador de serotonina con una NLS (SERT-NLS-GFP) y tratamiento con sertralina
Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica SERT-NLS-GFP (2 microgramos de DNA) y tratadas con sertralina (concentración final 500 nanomolar) por espacio de 48 horas. A las 6, 22, 30 y 42 horas de la transfección, las células fueron tratadas con sertralina. Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
En las células no tratadas que expresaron SERT-NLS-GFP, las de un 0% de las células tenían expresión del transportador en la superficie celular, y las de un 75% de las células tenían expresión del transportador en el núcleo y en el citoplasma.
A continuación del tratamiento con sertralina, las de un 69% de las células tenían expresión del transportador SERT-NLS-GFP en la superficie celular y en el citoplasma, y las de un 21% de las células tenían expresión del transportador en el núcleo y en el citoplasma. Así, el tratamiento con sertralina inhibió la translocación del SERT-NLS-GFP en el sentido de su paso de la superficie celular al núcleo.
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Ejemplo 52 Expresión del receptor de dopamina D1 con una NLS sustitutiva (D1-NLS2-GFP) y tratamiento con antagonistas
Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica D1-NLS2-GFP (2 microgramos) y tratadas con (+)butaclamol o SCH 23390 (1 micromolar) por espacio de 48 horas. Los núcleos fueron visualizados con DsRed-nuc (2 microgramos). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.
Con tratamiento con butaclamol, las de un 81% de las células tenían receptor en la superficie celular o en el citoplasma, y las de un 19% de las células tenían expresión del receptor en el núcleo. Con tratamiento con SCH 23390, las de un 78% de las células tenían receptor en la superficie celular o en el citoplasma, y las de un 22% de las células tenían expresión del receptor en el núcleo.
En las células no tratadas, las de un 89% de las células tenían expresión del receptor en el núcleo y en el citoplasma.
Así, el tratamiento con los antagonistas D1 de dopamina impidió la translocación del receptor D1-NLS2-GFP en el sentido de su paso de la superficie al núcleo.
La presente invención no queda limitada a las características de las realizaciones que aquí se han descrito, sino que incluye todas las variaciones y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones.
Referencias
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Schlenstedt et al., (1996), FEBS Lett., v. 389, p. 75-79;
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Smith, (2002), Nature v. 418, p. 453-459;
Strickland et al., (2002) Trends Endo. Metab., v. 13, p 66-74;
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White et al., Nature, v. 396, p. 679-682 (1998);
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TABLA 1 Ejemplos de secuencias de localización nuclear (adaptación de Jans et al. 2002)
48
49
50
RAG-1, proteína 1 activadora de la recombinación; RCP, proteína de las células rojas; RB, proteína del retinoblastoma; STAT, transductor de señales
y
activador de la transcripción (TF); CBP80, proteína de unión a la caperuza; LEF, factor estimulador linfoide; EBNA, antígeno nuclear del virus de Epstein-Barr; IN, HIV-1 integrasa; tTG, transglutaminasa tisular; ECP, proteína de célula infectada.
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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias que cita el solicitante se aporta solamente en calidad de información para el lector y no forma parte del documento de patente europea. A pesar de que se ha procedido con gran esmero al compilar las referencias, no puede excluirse la posibilidad de que se hayan producido errores u omisiones, y la OEP se exime de toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patente citados en la descripción
\bullet US 5891646 A [0009]
\bullet US 6110693 A [0009]
Literatura no de patentes que se cita en la descripción
\bulletCurrent Protocols in Molecular Biology. 1987 [0056]
\bulletGEORGE et al. GPCRs, 2002 [0077]
\bulletBAILEY et al. Expert Opinion in Therapeutics, 2001, vol. 11, 1861-1887 [0379]
\bulletBARAK et al. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, 27497-27500 [0379]
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\bulletGORLICH et al. Science, 1996, vol. 271, 1513-1518 [0379]
\bulletGROTZINGER. Biochim. Biophys. Acta, 2002, vol. 1592, 215-223 [0379]
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\bulletHOWARD et al. Trends in Pharmacol. Sci., 2001, vol. 22, 132-140 [0379]
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\bulletWHITE et al. Nature, 1998, vol. 396, 679-682 [0379]

Claims (29)

1. Método para seleccionar un compuesto candidato según su capacidad para interactuar con al menos una proteína transmembrana, comprendiendo dicho método los pasos de:
transfectar una célula con al menos una secuencia nucleotídica que codifique una proteína que comprenda una proteína transmembrana que contenga al menos una secuencia de localización nuclear (NLS) y una mitad detectable y permitir la expresión de la proteína codificada en la célula;
poner a la proteína en contacto con un compuesto candidato; y
determinar la distribución de la proteína expresada en la célula detectando la distribución de la mitad detectable en la célula;
donde la detección de una distribución alterada de la mitad detectable en la célula con respecto a la distribución de la mitad detectable en una célula de control no puesta en contacto con el compuesto candidato indica que el compuesto interactúa con la proteína transmembrana, y
donde la proteína transmembrana de tipo salvaje carece de una NLS y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína transmembrana es modificada para codificar una NLS.
2. El método de la reivindicación 1, donde la mitad detectable es un péptido detectable que comprende una parte antigénica de la secuencia de aminoácidos de la proteína transmembrana y/o la secuencia nucleotídica codifica una proteína de fusión que comprende una proteína transmembrana que contiene al menos una NLS y una mitad detectable.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, donde la NLS es seleccionada de entre las de la Tabla 1 o de entre las del grupo que consta de KKFKR (ID. SEC. Nº: 158), PKKKRKV (ID. SEC. Nº: 154) y AFSAKKFKR (ID. SEC. Nº: 159).
4. El método de la reivindicación 1, 2 o 3, donde la célula es una célula procariótica o una célula eucariótica, preferiblemente seleccionada de entre las del grupo que consta de una célula de mamífero, preferiblemente seleccionada de entre las del grupo que consta de células HEK, COS y CHO, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula de nematodo, una célula vegetal y una célula fungal.
5. El método de la reivindicación 1, donde la mitad detectable es un péptido antigénico y donde la distribución del péptido antigénico en la célula se determina dejándole fijarse a un sistema de detección basado en anticuerpos que comprende un anticuerpo específico para el péptido antigénico, preferiblemente a un sistema de detección basado en anticuerpos que comprende un primer anticuerpo específico para el péptido antigénico y un segundo anticuerpo que lleva una etiqueta detectable y es específico para el primer anticuerpo, o a un sistema de detección basado en anticuerpos que comprende un primer anticuerpo específico para el péptido antigénico y que lleva una etiqueta detectable, preferiblemente una etiqueta ópticamente detectable, y más preferiblemente una etiqueta luminescente o fluorescente, o donde la mitad detectable es un polipéptido seleccionado de entre los del grupo que consta de proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja y variantes modificadas de las mismas.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la proteína transmembrana es seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de un receptor acoplado a proteína G (GPCR), y preferiblemente de un receptor D1 de dopamina, un receptor D2 de dopamina, un receptor D3 de dopamina, un receptor D5 de dopamina, un receptor de histamina 1, un receptor 1 de cisteinil-leucotrieno, un receptor 2 de cisteinil-leucotrieno, un receptor de opioides, un receptor muscarínico, un receptor de serotonina, un receptor beta2-adrenérgico y un receptor metabotrópico 4 de glutamato; un transportador, y preferiblemente un transportador de dopamina o un transportador de serotonina; un receptor de citoquina, y preferiblemente un receptor de eritropoyetina o un receptor de insulina; y un receptor de tirosina quinasa, y preferiblemente un receptor del factor de crecimiento epidérmico o un receptor de insulina y un receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL).
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la célula es transfectada con una pluralidad de secuencias nucleotídicas, codificando cada una de dichas secuencias una proteína que comprende una distinta proteína transmembrana que contiene al menos una NLS, preferiblemente donde cada una de dichas secuencias nucleotídicas codifica una proteína que comprende una distinta mitad detectable, o donde al menos una mitad detectable es común a al menos dos proteínas codificadas.
8. El método de la reivindicación 1, donde la célula es puesta en contacto con un compuesto del que se sabe que interactúa con la proteína transmembrana que es al menos una antes de poner a la célula en contacto con el compuesto candidato, y donde la detección de una distribución alterada de la mitad detectable en la célula con respecto a la distribución de la mitad detectable en una célula de control puesta en contacto con el compuesto del que se sabe que interactúa con la proteína transmembrana pero no puesta en contacto con el compuesto candidato indica que el compuesto candidato interactúa con la proteína transmembrana.
9. El método de la cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la detección de una distribución alterada de la mitad detectable en la célula comprende la detección de un nivel reducido o un nivel incrementado de la mitad detectable asociada a la membrana celular o en el núcleo de la célula.
10. Método que es para seleccionar un compuesto candidato según su capacidad para interactuar con al menos una proteína transmembrana y comprende los pasos de:
transfectar una célula con al menos una secuencia nucleotídica que codifique una proteína transmembrana que contenga NLS y permitir la expresión de la proteína codificada en la célula;
poner a la célula en contacto con un compuesto candidato; y
determinar el nivel de proteína transmembrana con contenido de NLS que queda en la membrana celular aislando la fracción de membrana celular de la célula, poner a la fracción en contacto con un ligando etiquetado de la proteína transmembrana, y determinar el nivel de fijación del ligando a la fracción;
donde la detección de un nivel alterado de la proteína transmembrana en la membrana celular con respecto al nivel en la membrana celular en una célula de control no puesta en contacto con el compuesto candidato indica que el compuesto interactúa con la proteína transmembrana, y
donde la proteína transmembrana de tipo salvaje carece de una NLS y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína transmembrana es modificada para codificar una NLS.
11. El método de la reivindicación 10, donde el ligando etiquetado es un ligando radioetiquetado y donde la NLS es seleccionada de entre las secuencias de la Tabla 1 o de entre los miembros del grupo que consta de KKFKR (ID. SEC. Nº: 158), PKKKRKV (ID. SEC. Nº: 154) y AFSAKKFKR (ID. SEC. Nº: 159).
12. El método de la reivindicación 10 u 11, donde la célula es una célula procariótica o una célula eucariótica preferiblemente seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de una célula de mamífero, y preferiblemente seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de células HEK, COS y CHO, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula de nematodo, una célula vegetal y una célula fungal.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, donde la proteína transmembrana es seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de un receptor acoplado a proteína G (GPCR), y preferiblemente un receptor D1 de dopamina, un receptor D2 de dopamina, un receptor D3 de dopamina, un receptor D5 de dopamina, un receptor de histamina 1, un receptor 1 de cisteinil-leucotrieno, un receptor 2 de cisteinil-leucotrieno, un receptor de opioides, un receptor muscarínico, un receptor de serotonina, un receptor beta2-adrenérgico y un receptor metabotrópico 4 de glutamato; un transportador, y preferiblemente un transportador de dopamina o un transportador de serotonina; un receptor de citoquina, y preferiblemente un receptor de eritropoyetina o un receptor de insulina; un receptor de tirosina quinasa, y preferiblemente un receptor del factor de crecimiento epidérmico o un receptor de insulina y un receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL).
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, donde la célula es transfectada con una pluralidad de secuencias nucleotídicas, codificando cada una de dichas secuencias una proteína que comprende una distinta proteína transmembrana que contiene al menos una NLS, preferiblemente donde cada una de dichas secuencias nucleotídicas codifica una proteína que comprende una distinta mitad detectable, o donde al menos una mitad detectable es común a al menos dos proteínas codificadas.
15. El método de la cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, donde la detección de una distribución alterada de la mitad detectable comprende la detección de un nivel reducido o un nivel incrementado de la mitad detectable asociada a la membrana celular.
16. Célula aislada transfectada con al menos una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que comprende una proteína transmembrana que contiene al menos una NLS y una mitad detectable, donde la proteína transmembrana de tipo salvaje carece de una NLS y la secuencia nucleotídica que codifica la proteína transmembrana es modificada para codificar una NLS.
17. La célula de la reivindicación 16, donde la mitad detectable es un péptido detectable que comprende una parte antigénica de la secuencia de aminoácidos de la proteína transmembrana y/o donde la secuencia nucleotídica codifica una proteína de fusión que comprende una proteína transmembrana que contiene al menos una NLS y una mitad detectable.
18. La célula de la reivindicación 17, donde la NLS es seleccionada de entre las secuencias de la Tabla 1 o de entre los miembros del grupo que consta de KKFKR (ID. SEC. Nº: 158), PKKKRKV (ID. SEC. Nº: 154) y AFSAKKFKR (ID. SEC. Nº: 159).
19. La célula de la reivindicación 17 o 18, donde la mitad detectable es un péptido antigénico y donde la distribución del péptido antigénico en la célula se determina dejándole fijarse a un sistema de detección basado en anticuerpos que comprende un anticuerpo específico para el péptido antigénico, preferiblemente a un sistema de detección basado en anticuerpos que comprende un primer anticuerpo específico para el péptido antigénico y un segundo anticuerpo que lleva una etiqueta detectable y es específico para el primer anticuerpo, o a un sistema de detección basado en anticuerpos que comprende un primer anticuerpo que es específico para el péptido antigénico y lleva una etiqueta detectable, preferiblemente una etiqueta ópticamente detectable, y más preferiblemente una etiqueta luminiscente o fluorescente, o donde la mitad detectable es un polipéptido seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja y variantes modificadas de las mismas.
20. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, donde la proteína transmembrana es seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de un receptor acoplado a proteína G (GPCR), y preferiblemente un receptor D1 de dopamina, un receptor D2 de dopamina, un receptor D3 de dopamina, un receptor D5 de dopamina, un receptor de histamina 1, un receptor 1 de cisteinil-leucotrieno, un receptor 2 de cisteinil-leucotrieno, un receptor de opioides, un receptor muscarínico, un receptor de serotonina, un receptor beta2-adrenérgico y un receptor metabotrópico 4 de glutamato, un transportador, y preferiblemente un transportador de dopamina o un transportador de serotonina, un receptor de citoquina, y preferiblemente un receptor de eritropoyetina o un receptor de insulina, y un receptor de tirosina quinasa, y preferiblemente un receptor del factor de crecimiento epidérmico o un receptor de insulina y un receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL).
21. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, donde la célula es transfectada con una pluralidad de secuencias nucleotídicas, codificando cada una de dichas secuencias una proteína que comprende una distinta proteína transmembrana que contiene al menos una NLS, preferiblemente donde cada una de dichas secuencias nucleotídicas codifica una proteína que comprende una distinta mitad detectable, o donde al menos una mitad detectable es común a al menos dos proteínas codificadas.
22. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, donde la célula es una célula procariótica o una célula eucariótica preferiblemente seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de una célula de mamífero, preferiblemente seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de células HEK, COS y CHO y una célula neuronal, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula de nematodo, una célula vegetal y una célula fungal.
23. Método que es para determinar si una primera proteína y una segunda proteína son capaces de oligomerizarse y comprende los pasos de:
transfectar una célula con una primera secuencia nucleotídica que codifica una primera proteína que contiene una NLS y con una segunda secuencia nucleotídica que codifica una segunda proteína que comprende una mitad detectable y permitir la expresión de las proteínas primera y segunda codificadas en la célula; y
determinar la distribución de la mitad detectable en la célula;
donde la detección de la mitad detectable en el núcleo de la célula o junto al mismo o la detección de un nivel reducido de la mitad detectable en la superficie celular, con respecto a una célula de control, indica que las proteínas primera y segunda interactúan, donde las proteínas primera y segunda son distintas proteínas transmembrana, y preferiblemente GPCR's, o son la misma proteína transmembrana, o una de las proteínas primera y segunda es una proteína transmembrana y la otra es una proteína no transmembrana, y donde la primera proteína de tipo salvaje carece de una NLS y la secuencia génica que codifica la proteína transmembrana es modificada para codificar una NLS.
24. El método de reivindicación 23, donde la mitad detectable es un péptido detectable que comprende una parte antigénica de la secuencia de aminoácidos de la segunda proteína y/o donde la segunda secuencia nucleotídica codifica una proteína de fusión que comprende la segunda proteína y una mitad detectable.
25. El método de reivindicación 23 o 24, donde la NLS que es una es seleccionada de entre las secuencias de la Tabla 1 o de entre los miembros del grupo que consta de KKFKR (ID. SEC. Nº: 158), PKKKRKV (ID. SEC. Nº: 154) y AFSAKKFKR (ID. SEC. Nº: 159).
26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, donde la célula es una célula procariótica o una célula eucariótica preferiblemente seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de una célula de mamífero, preferiblemente seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de células HEK, COS y CHO, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula de nematodo, una célula vegetal y una célula fungal.
27. El método de la reivindicación 23, donde la mitad detectable es un péptido antigénico y la distribución del péptido antigénico es la célula se determina dejándole fijarse a un sistema de detección basado en anticuerpos que comprende un anticuerpo específico para el péptido antigénico, preferiblemente a un sistema de detección basado en anticuerpos que comprende un primer anticuerpo específico para el péptido antigénico y un segundo anticuerpo que lleva una etiqueta detectable y es específico para el primer anticuerpo, o a un sistema de detección basado en anticuerpos que comprende un primer anticuerpo que es específico para el péptido antigénico y lleva una etiqueta detectable, preferiblemente una etiqueta ópticamente detectable, y más preferiblemente una etiqueta luminiscente o fluorescente, o donde la mitad detectable es un polipéptido seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja y variantes modificadas de las mismas.
28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, donde las proteínas primera y segunda son proteínas transmembrana seleccionadas de entre los miembros del grupo que consta de un receptor acoplado a proteína G (GPCR), y preferiblemente un receptor D1 de dopamina, un receptor D2 de dopamina, un receptor D3 de dopamina, un receptor D5 de dopamina, un receptor de histamina 1, un receptor 1 de cisteinil-leucotrieno, un receptor 2 de cisteinil-leucotrieno, un receptor de opioides, un receptor muscarínico, un receptor de serotonina, un receptor beta2-adrenérgico y un receptor metabotrópico 4 de glutamato, un transportador, y preferiblemente un transportador de dopamina o un transportador de serotonina, un receptor de citoquina, y preferiblemente un receptor de eritropoyetina o un receptor de insulina, un receptor de tirosina quinasa, y preferiblemente un receptor del factor de crecimiento epidérmico o un receptor de insulina y un receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL).
29. El método de la reivindicación 23, donde la primera secuencia nucleotídica codifica una primera proteína que comprende adicionalmente una mitad detectable distinta de la mitad detectable de la segunda proteína, donde la detección de una interacción de transferencia de energía entre la mitad detectable de la primera proteína y la mitad detectable de la segunda proteína indica que las proteínas primera y segunda se oligomerizan.
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