JP4542342B2 - 膜貫通型タンパク質と相互作用する化合物の同定法 - Google Patents
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Description
本発明は、膜貫通型タンパク質と相互作用する能力に関して化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明はさらに、二量体を形成するか、またはオリゴマーを形成して、2個もしくはこれ以上のタンパク質のグループを作る能力に関して膜貫通型タンパク質をスクリーニングする方法に関する。
以後の説明では、本明細書の最後に挙げた、全体が参照として本明細書に組み入れられる引用文献を参照する。
発明者らは、(内在性の機能性NLSを含まない)膜貫通型タンパク質に核局在配列(NLS)を組み込むと、タンパク質が細胞表面から細胞核内へ、時間依存的でリガンド非依存的に運ばれることを報告した。こうした膜貫通型タンパク質の細胞表面を出発点とする輸送を可視化するために、このようなタンパク質に、さまざまな手段による可視化用の検出用部分をもたせる。NLSを合成的に組み込ませた多様なタンパク質ファミリーに由来する膜タンパク質は、基本的な条件下で、細胞表面から核へ、また核に向かって再分布することがわかっている。
細胞を、少なくとも1つの核局在配列(NLS)および検出用部分を含む膜貫通型タンパク質を含むタンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列でトランスフェクトし、コードされたタンパク質の細胞内発現を可能とする段階;
細胞に候補化合物を接触させる段階;ならびに
発現されたタンパク質の細胞内における分布を、細胞内における検出用部分の分布を検出することで決定する段階(候補化合物を接触させなかった対照細胞における検出用部分の分布に対して、細胞内における検出用部分の分布の変化が検出されることは、対象化合物が膜貫通型タンパク質と相互作用することを意味する)。
細胞に、NLS含有膜貫通型タンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列をトランスフェクトして、コードされたタンパク質の細胞内発現を可能とする段階;
細胞に候補化合物を接触させる段階;ならびに
細胞の細胞膜画分を単離し、同画分に、膜貫通型タンパク質の標識リガンドを接触させ、同画分に対するリガンドの結合レベルを決定することで、細胞膜上に残存するNLS含有膜貫通型タンパク質のレベルを決定する段階(候補化合物を接触させなかった対照細胞における細胞膜におけるレベルに対して、細胞膜における膜貫通型タンパク質のレベルの変化が検出されることは、対象化合物が膜貫通型タンパク質と相互作用することを意味する)。
細胞に、NLSを含む第1のタンパク質をコードする第1のヌクレオチド配列、および検出用部分を含む第2のタンパク質をコードする第2のヌクレオチド配列でトランスフェクトすることで、コードされた第1および第2のタンパク質の細胞内発現を可能とする段階;ならびに
細胞内における検出用部分の分布を決定する段階(細胞の核内または核の近傍で検出用部分が検出されること、または対照細胞に対して細胞表面における検出用部分のレベルの低下が検出されることは、第1のタンパク質と第2のタンパク質が相互作用することを意味する)。
本発明は、一つの態様では、候補化合物を対象とした、膜貫通型タンパク質と相互作用する能力に関する新規で簡便なスクリーニング法を提供する。
本発明の一つの態様では、有核細胞に、NLSおよび検出用部分を含む膜貫通型タンパク質を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列をトランスフェクトし、適切な時間インキュベートし、NLS-膜貫通型タンパク質の発現と、細胞膜における同タンパク質の蓄積開始を可能とする。例えばGPCRや輸送体に関しては、約6〜24時間が適している。当業者であれば、他の膜貫通型タンパク質に関する適切なインキュベーション時間を、細胞膜におけるタンパク質の蓄積を観察することで容易に決定することができる。発現された膜貫通型タンパク質のすべてが、候補化合物の添加時に細胞膜に至る必要はない。次に試験細胞に、膜貫通型タンパク質との相互作用の検討対象となる候補化合物を、NLS-膜貫通型タンパク質の実質的な部分、好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも50%、またさらにより好ましくは少なくとも90%の、化合物処理を行わなかった対照細胞では細胞膜から離れて核内もしくは核の近傍へ向かう転位を可能とするのに十分な時間接触させる。
GPCR、輸送体、チロシンキナーゼ受容体、インスリンに対するサイトカイン受容体、インスリン様成長因子、上皮成長因子、および血管内皮成長因子を含む、いくつかの膜貫通型タンパク質は、ホモオリゴマー形成能およびヘテロオリゴマー形成能をもつ(例えば、GeorgeらのGPCRに関する総説、2002を参照)。本明細書で用いる、タンパク質の「オリゴマー形成」という表現は、2個もしくはこれ以上のタンパク質分子が会合することを意味する。
蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)(Haileyら、2002)を利用する、本発明の別の局面では、有核細胞に、第1の光学的に検出可能なタンパク質を連結させた第1のNLS含有膜貫通型タンパク質をコードする第1のヌクレオチド配列と、第2の光学的に検出可能なタンパク質に連結させた第2の非NLS含有膜貫通型タンパク質をコードする第2のヌクレオチド配列を同時にトランスフェクトする(両分子が接近すると、第1の光学的に検出可能なタンパク質の発光によって蛍光が活性化される)。例えば第1のタンパク質にGFPを連結し、GFPのレーザー活性化発光スペクトルによって活性化可能な他の任意の第2の光学的に検出可能な部分に連結することができる。第2の光学的に検出可能な部分は、GFPによる活性化後に、異なる波長で光を放出する。オリゴマーが2つの膜貫通型タンパク質間で形成される場合、2つの標識は相互に近接しているのでFRET相互作用を検出することができる。このような物理的相互作用を、ドナーの選択的な蛍光活性化、およびFRET法、または光退色(photobreaching)FRET、FRAP、またはFLIMなどのこれに類する方法によるアクセプターによる発光の検出によって検出する。FRET相互作用がないことは、オリゴマーが形成されていないことを意味する。
実施例を説明目的で記載する。実施例には、本発明の範囲を制限する意図はない。
緑色蛍光タンパク質:オワンクラゲ(Aequoria victoria)の緑色蛍光タンパク質(Prasherら、1992)をコードするDNA配列はClontech(米国)から入手した。
GPCRまたは輸送体をコードするヌクレオチド配列は、国立科学図書館(National Library of Science)が設立したゲンバンクのウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez)から得た。選択された膜貫通型タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、選択した検出用シグナルタンパク質をコードするヌクレオチド配列に結合させた。このコンストラクトをベクター系pEGFP(Clontech)、またはpDsRed2-N1ベクターもしくはベクターpcDNA3にクローン化した。
以下の実験条件によるPCR法で、ベクターpcDNA3中にヒトD1ドーパミン受容体をコードするDNAを対象にPCRを行った。反応混合物は、水(32マイクロリットル)、10×Pfu緩衝液(Stratagene)(5マイクロリットル)、dNTP(2'-デオキシヌクレオシド5'-三リン酸、10 mM)(5マイクロリットル)、DMSO(5マイクロリットル)、オリゴヌクレオチドプライマー(100 ng)(各1マイクロリットル)、DNAテンプレート(100 ng)、Pfu酵素(5ユニット)を含むものとした。総容積は50マイクロリットルとした。PCR条件は、94℃で2分間を1サイクル、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で1分間を30〜35サイクル、また続いて72℃で5分間を1サイクルとした。
NLS配列KKFKRを、ヒトD1受容体の細胞内カルボキシ端のヘリックス8セグメントに、以下の手順でPCR法で挿入した。pcDNA3ベクター中にヒトD1をコードするDNAをテンプレートとして用いた、HD1-P1プライマーおよびHD1-NLSRプライマーによる第1のPCRで1 kbの産物を得た。HD1-P2プライマーおよびHD1-NLSFプライマーによる第2のPCRを行い、300 bpの産物を得た。PCR#1およびPCR#2の産物をテンプレートとして用いた、HD1-P1プライマーおよびHD1-P2プライマーによる最終PCRを行い、1.3 kbの産物を得た。
結果として得られた増幅後のcDNA(1.3 kb)を、pcDNA3ベクターのBamHI〜NotIにサブクローン化した。
D1-HAをコードするDNAをテンプレートとして用いた、D1-NLS(ヘリックス8)をコードするDNAのPCRによる増幅用プライマーセット。D1-HAをコードするDNAをテンプレートとして用いた、T7プライマーとHD1-NLSRプライマーによるPCR(PCR#1)で1000 bpのDNAを得た。D1-HAをコードするDNAをテンプレートとして用いた、Sp6プライマーとHD1-NLSRプライマーによるPCR(PCR#2)で300 bpのDNAを得た。T7プライマーとSp6プライマーを用いて、またPCR#1およびPCR#2の産物をテンプレートとして用いたPCR(PCR#3)で1300 bpのDNAを得た。
PCR#1:HD1-P1プライマーとD1-NLSR-IC3プライマー
PCR#2:HD1-P2プライマーとD1-NLSF-IC3プライマー(500 bp)
PCR#3:PCR#1およびPCR#2の産物をテンプレート(1.3 kb)として使用し、HD1-P1プライマーとHD1-P2プライマーを使用する。
結果として得られた、D1-NLS-IC3をコードするDNA断片を、ベクターpEGFPのEcoRI〜KpnIにサブクローン化した。
PCR法で、NLS配列PKKKRKVを、D1受容体中の天然の配列ADFRKAFと置き換える形で導入した。pcDNA3中にD1ドーパミン受容体をコードするDNAを対象に、HD1-P1プライマーとHD1-NLS2RプライマーによるPCR(PCR#1)で1 kbの産物を得た。pcDNA3中のD1を用いた、HD1-P2プライマーとHD1-NLS2Fプライマーによる別のPCR(PCR#2)で300 bpの産物を得た。PCR#1およびPCR#2の産物をテンプレートとした、HD1-P1プライマーとHD1-P2プライマーによる第3のPCRで1.3 kbの産物を得て、これをベクターpEGFPのEcoRI〜KpnIにサブクローン化した。
D2ドーパミン受容体をコードする、pcDNA3中のDNAの増幅用プライマーセット:
H1ヒスタミン受容体をコードする、ヒトゲノムDNAに由来するDNAの増幅用プライマーセット:
CysLT1受容体をコードする、pcDNA3中のDNA増幅用のプライマーセット:
CysLT2受容体をコードする、pcDNA3中のDNA増幅用のプライマーセット:
ヒトゲノムDNA由来のムスカリン受容体(M1)をコードするDNA増幅用のプライマーセット:
5HT1B受容体をコードするpcDNA3プラスミドから、5HT1B受容体をコードするDNAを増幅するためのプライマーセット:
pcDNA3から、β2-AR受容体をコードするDNAを増幅するためのプライマーセット:
NLS配列KKFKRを、β2-ARのカルボキシ端の近位セグメントの別の位置に挿入した。pcDNA3ベクター中にβ2ARをコードするDNAをテンプレートとして用いた、T7プライマーとB2-NLS3RプライマーによるPCRで1000 bpの産物を得た。β2-KpnプライマーとB2-NLS3FプライマーによるPCRで300 bpの産物を得た。PCR#1の産物およびPCR#2の産物をテンプレートとして用いた、T7プライマーとβ2-KpnプライマーによるPCRで1300 bpの産物(β2AR-NLS3)を得た。これをベクターpEGFPのEcoRI〜KpnI切断部位にサブクローン化した。
ヒトドーパミン輸送体(hDAT)をコードする完全長のcDNAを、pcDNA3中のDATをテンプレートとした、T7プライマーとDT-1プライマー
によるPCRで増幅した。停止コドンを含まない、このPCR産物を、ベクターpEGFP(Clontech)のEcoRI〜KpnI制限酵素切断部位に、GFPタンパク質の開始コドンとフレームを合わせて一方向的にサブクローン化した。
ヒトドーパミン輸送体(hDAT)をコードするcDNAを、1718プライマーとhDAT-NLSFプライマーによるPCRで増幅し、100 bpの断片を得た。ヒトドーパミン輸送体(hDAT)をコードするcDNAも、T7プライマーとhDAT-NLSRプライマーによるPCRで増幅し、1.7 kbの断片を得た。これら2つのPCR断片をテンプレートとして用いた、T7プライマーと1718プライマーによるPCRで1.8 kbの断片を得た。
NLS配列KKFKRを、ヒトDATの膜貫通12セグメントの下流の近位カルボキシ端に挿入した。pcDNA3中にヒトDATのcDNAをコードするDNAをテンプレートとして用いた、T7プライマーとhDAT-NLSRプライマーによる第1のPCRで1.7 kbの産物を得た。1718プライマーとhDAT-NLSFプライマーによる第2のPCRで100 bpの産物を得た。次にPCR#1およびPCR#2の産物をテンプレートとして用いた、T7プライマーと1718プライマーによる最終PCRで1.8 kbの産物(DAT-NLS)を得た。これをベクターpEGFP(Clontech)のEcoRI〜KpnI切断部位にサブクローン化してGFPと融合した。
LDLをコードする完全長のcDNAを対象に、LDLR-HINDプライマーとLDLR-KPNプライマーによるPCRを行った:
NLS配列KKFKRを、LDL受容体をコードするDNAに、天然のRLKNIをコードする配列を置き換えるようにPCRで挿入した。
NLS配列KKFKRを、SERTをコードするDNAに、GTFKEをコードする天然の配列と置き換えるようにPCRで挿入した。
mGluR4をコードするDNAを、以下のプライマーセットを用いてラットのcDNAから単離した:
プラスミドpRK5中のIRの完全長のcDNAを、以下の2種類のPCRプライマーを用いて単離した:
停止コドンを含まない、このPCR産物(4.2 kb)を、ベクターpEGFP(Clontech)のHindIII〜ApaI切断部位に一方向的にサブクローン化して、GFPタンパク質と融合させた。
NLS配列KKFKRをヒトインスリン受容体に導入し、配列LYASSと置き換えた。
HIR-NLS用のプライマー:
ヒトエリスロポイエチン受容体(EPO)をコードする、pc3.1ベクター中のcDNAをテンプレートとしたPCRで、完全長のcDNAを以下のプライマーにより単離した:
停止コドンを含まない、このPCR産物(1.6 kb)を、ベクターpEGFPのHindIII〜KpnI切断部位に一方向的にサブクローン化して、GFPタンパク質を融合させた。
NLS配列KKFKRを、EPO受容体をコードするDNAにPCRで挿入し、天然の配列RRALKと置き換えた。
プライマーの配列:
pRK5ベクター中のヒト上皮成長因子受容体のcDNAをテンプレートとして用いて、完全長のcDNAを、以下の2種類のプライマーによるPCRで単離した:
停止コドンを含まないこのPCR産物(3.6 kb)を、ベクターpEGFP(Clontech)のXhoI〜KpnI切断部位に一方向的にサブクローン化し、GFPタンパク質を融合させた。
NLS配列KKFKRを、ヒト上皮成長因子受容体の配列に、以下の手順によるPCR法で挿入した。pRK5中のヒトEGFRのcDNAをテンプレートとして用いた、HER-XHOプライマーとEGF-NLSRプライマーによる第1のPCRで2.1 kbの産物を得た。HER-KPNプライマーとEGF-NLSFプライマーによる第2のPCRで1.5 kbの産物を得た後に、PCR#1およびPCR#2の産物をテンプレートとして用いた、HER-XHOプライマーとHER-KPNプライマーによる最終PCRを行い、3.6 kbの産物(EGFR-NLS)を得た。これをベクターpEGFP(Clontech)のXhoI〜KpnI切断部位にサブクローン化し、GFPを融合させた。
プライマーの配列:
第2のNLS配列KKKRKを、ヒトD1-NLS-Helix 8のカルボキシ端セグメントに、以下の手順によるPCR法で挿入した。pDsRedベクター中のヒトD1-NLS-Helix 8をコードするDNAをテンプレートとして用いた、HD1-P1プライマーとHD1-NLSCRプライマーによる第1のPCRで1.2 kbの産物を得た。またHD1-P2プライマーとHD1-NLSCFプライマーによる第2のPCRで100 bpの産物を結果として得た。次に、PCR#1およびPCR#2の産物をテンプレートとして用いた、HD1-P1プライマーとHD1-P2プライマーによる最終PCRを行い、1.3 kbの産物(D1-NLS-Helix 8 and C-tail)を得た。これをpDsRedベクターのEcoRI〜KpnI切断部位にサブクローン化し、DsRedタンパク質を融合させた。
プライマーの配列:
pcDNA3ベクター中にMuオピオイド受容体をコードするDNAをテンプレートとして用いた、以下の2種類のプライマーによるPCRを行った:
RATMU-1プライマーにはEcoRI制限酵素切断部位が含まれるようにした。RATMU-2プライマーにはKpnI制限酵素切断部位が含まれるようにした。
NLS配列KKFKRを、Muオピオイド受容体の近位カルボキシ端セグメント(ヘリックス8)に、以下の手順によるPCRで挿入した。pcDNA3中のラットMuをコードするDNAをテンプレートとして用いた、RATMU1プライマーとMU-NLSRプライマーによる第1のPCRで1000 bpの産物を得た。そして第2のPCRを、RATMU-2プライマーとMU-NLSFプライマーを用いて実施し、200 bpの産物を得た。PCR#1およびPCR#2の産物をテンプレートとして用いた、RATMU1プライマーとRATMU2プライマーによる最終PCRで1200 bpの産物(Mu-NLS)を得た。これをベクターpEGFPのEcoRI〜KpnI切断部位にサブクローン化し、GFPを融合させた。
プライマーの配列:
COS-7サル腎細胞およびHEK293Tヒト胚性腎細胞(American Type Culture Collection、Manassa、VA)は、単層培養として37℃で5% CO2雰囲気中で、10%ウシ胎仔血清および抗生物質を添加した最小必須培地で維持した。細胞膜の回収では、100 mmの細胞プレートを、70〜80%のコンフルエンシーで、リポフェクタミン試薬(Life Technologies、Rockville、MD)を用いて一過的にトランスフェクトした。共焦点顕微鏡による観察用には、60 mmの細胞プレートを、10〜20%のコンフルエンシーで、リポフェクタミン試薬を用いて一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの6時間後に溶液を除去し、新鮮な培地を添加し、トランスフェクションの24時間後に、新鮮な培地に再び交換した。
細胞表面からの転位の遅延を決定するためのプロトコル
試験化合物を、1ミリモル濃度のストック溶液中に調製し、成長培地で希釈し、最終濃度を10ナノモル濃度〜10マイクロモル濃度として細胞プレートに添加した。新鮮な化合物含有培地を、トランスフェクションの6時間後、22時間後、30時間後、および42時間後の時点で細胞に添加した。
試験化合物を、1ミリモル濃度のストック溶液中に調製し、37℃で成長培地で希釈し、最終濃度を10マイクロモル濃度として細胞に添加した。細胞培養物を顕微鏡で観察し、1個の細胞に焦点をあて、検出用標識タンパク質の、表面における発現の存在を検出した。成長用培地を化合物含有培地と交換し、細胞を顕微鏡で、化合物を添加してから5分後、10分後、15分後、20分後、30分後、および35分後に、検出用部分の分布の変化をリアルタイムで観察した。
LSM510 Zeiss共焦点レーザー顕微鏡で細胞を可視化した。GFPは、アルゴンレーザー(励起波長、488 nm)で励起して可視化し、DsRedは、ヘリウムネオンレーザー(励起波長、543 nm)による励起して可視化した。共焦点像をディスクに記録して評価した。各実験において、複数の視野の細胞(各30〜90個の細胞を含むn=6〜8)をカウントし、細胞表面、細胞質内、および核内におけるシグナルの局在を評価した。
96ウェルプレートをポリ-L-オルニチン(PBS中に1/10)でコーティングし、1時間インキュベートした。50,000個の細胞を各ウェルに添加し、エピトープタグを付加した受容体をコードするcDNAを、リポフェクタミン(Invitrogen、米国)を用いてトランスフェクトした。培地(MEM)を12時間毎に交換し、さまざまな濃度の試験薬剤または培地を含むようにした。48時間後に細胞を洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、氷上で30分間インキュベートした。次に細胞を、エピトープに対する一次抗体とともにインキュベートした後に、FITC(フルオレセインイソチオシアネート)を結合させた二次抗体とインキュベートし、遮光下で保存した。過剰な抗体を洗浄して除き、Cytofluor 4000(PerSpective Biosystems、米国)でプレートを読み取ってシグナルを検出した。FITCを、488 nmの光で励起させて活性化させ、530 nmの放射波長におけるシグナルを読み取った。
D1-NLSをコードするDNAで細胞をトランスフェクトし、さまざまな濃度の拮抗物質剤で処理するか、または非処理のままとした。48時間後に細胞を洗浄し、回収し、溶解し、ポリトロン(polytron)でホモジナイズした。膜画分を遠心して回収した後に、35%ショ糖溶液に重層し、遠心(4℃、30,000 rpm、90分)して重い膜画分を回収した。上清を再び遠心(4℃、35,000 rpm、60分)して軽い膜画分を回収した。これらの膜を対象に、[3H]-SCH 23390を用いる放射リガンド結合アッセイ法を行い、10マイクロモル濃度の(+)ブタクラモールを用いて特異的結合を決定した。室温で2時間インキュベートした後に速やかに濾過し、シンチレーションカウンターで定量した。
10 mlのPBSで細胞を3回洗浄し、培養ディッシュから丁寧にかきとる。細胞をプールし、軽く遠心する(4℃、500 g、5分)。ペレット状の細胞を溶解緩衝液(Tris-HCl 10 mM、pH 7.4、NaCl 10 mM、MgCl2 3 mM)、および阻害剤カクテル(0.5%ロイペプチン、1%ダイズトリプシン、1%ベンズアミジン)に5000万個の細胞/mlの密度で再懸濁する。滅菌処理したガラス製のTeflon pestle B(タイトクリアランス20〜50 mm;Bellco Glass)を用いて、100回の上下運動でホモジナイズする。
NLSを含まないドーパミンD1受容体の配列を、TM7ドメインの基部のアミノ酸DFRKAがNLS配列KKFKR(ヒトAT1受容体のNLSに対応する)と置き換わるように上記の方法で修飾した(図1参照)。DNAコンストラクトは、D1ドーパミン受容体融合タンパク質であるD1-RFPおよびD1-NLS-RFPをコードするように作製した。COS細胞に、D1-NLS-RFPまたはD1-RFPをコードするDNA(2マイクログラム)をトランスフェクトし、24時間および48時間インキュベートした。これらの細胞を共焦点顕微鏡(100倍)で観察した。細胞数を8〜10個の顕微鏡視野を対象にマニュアルでカウントし、異なる細胞内区画で標識されたパーセンテージを算出した。
COS細胞に、D1-NLS-RFPをコードするコンストラクト、および野生型のD1(2マイクログラム)を48時間かけてトランスフェクトした。トランスフェクションの6時間後、22時間後、30時間後、および42時間後の時点で、細胞をドーパミンD1受容体拮抗物質SCH 23390(最終濃度10マイクロモル濃度)で処理した。またトランスフェクションの6時間後、22時間後、30時間後、および42時間後の時点で、細胞を拮抗物質(+)ブタクラモール(最終濃度10 μM)で処理した。対照細胞には拮抗物質処理を行わなかった。
HEK細胞に、D1-NLSをコードするDNAコンストラクト(3マイクログラム)、および/またはD1-GFP(1.5マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。この細胞をさらに、DsRed-NUCをコードするプラスミド(1マイクログラム)でトランスフェクトして、核における局在を検証した。
HEK細胞に、D1-NLS-GFPをコードするDNA(2マイクログラム)、およびD1-WTをコードするDNA(6マイクログラム)を48時間かけてトランスフェクトした。これらの細胞を、SCH-23390(10マイクロモル濃度)、または(+)ブタクラモール(10マイクロモル濃度)で、トランスフェクションの6時間後に処理した。拮抗物質を含む培地を、トランスフェクションの6時間後、22時間後、30時間後、および42時間後に交換した。対照細胞には拮抗物質処理を行わなかった。
HEK細胞に、D1-NLS-GFPをコードするDNAコンストラクト(1.5マイクログラム)をトランスフェクトし、D1作動物質SKF-81297(10マイクロモル濃度)とともに48時間インキュベートした。トランスフェクションの6時間後、22時間後、30時間後、および42時間後の時点で、細胞を、SKF-81297(最終濃度10マイクロモル濃度)を含む新鮮な培地で処理した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
COS細胞に、D1-NLS-RFPをコードするDNAコンストラクト(1マイクログラム)と、天然のドーパミンD1受容体をコードするDNA配列(D1-WT、7マイクログラム)を同時にトランスフェクトし、24時間または48時間インキュベートした。
COS細胞に、D1-NLS-RFPをコードするコンストラクト(4マイクログラム)、およびドーパミンD1-GFP(4マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、D1-IC3-NLS-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。核をDsRED-NUC(2マイクログラム)で可視化した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、D1-IC1-NLS-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。核をDsRED-NUC(2マイクログラム)で可視化した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、D1-IC1-NLS-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトし、ブタクラモール(最終濃度1マイクロモル濃度)またはSCH-23390(1マイクロモル濃度)のいずれかで48時間処理した。核をDsRED-NUC(2マイクログラム)で可視化した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、D1-IC3-NLS-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトし、4通りの異なる濃度のSCH-23390(10マイクロモル濃度、1マイクロモル濃度、500ナノモル濃度、および100ナノモル濃度)で48時間処理した。核をDsRED-NUC(2マイクログラム)で可視化した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、D1-IC2-NLS-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。核をDsRED-NUC(2マイクログラム)で可視化した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、D1-RFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトし、24時間のインキュベーション後に、細胞に、D1-NLS-GFPをコードする第2のDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトした。対照細胞にD1-RFPコンストラクト(2マイクログラム)だけをトランスフェクトした。この細胞を、第2のトランスフェクション後に48時間インキュベートし、共焦点顕微鏡で観察した。
ドーパミンD5受容体-GFP(D5-GFP)をコードするコンストラクトを調製し、COS細胞のトランスフェクトに使用した(4マイクログラム)。
HEK細胞に、2種類のDNAコンストラクト(D1-NLSをコードするもの(7マイクログラム)と、D5-GFPをコードするもの(1.5マイクログラム))をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。
D1-NLS-RFPをコードするコンストラクトを修飾することでDNAコンストラクト(D1-2NLS-RFP)を作製し、第2のNLSを、ドーパミンD1受容体のカルボキシ端に、野生型のD1ドーパミン受容体KKEEA配列を、NLSのKKKRKと置き換えるように導入した。
HEK細胞に、D2-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)、およびDsRed-NUCをコードするDNAコンストラクト(1マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、D1-NLSをコードするDNAコンストラクト(7マイクログラム)、およびD2-GFPをコードするDNAコンストラクト(1.5マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。この細胞にさらにDs-Red-NUC(1マイクログラム)をトランスフェクトし、核における局在を検証した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、D2S-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)、およびD2L-NLSをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。核をDsRED-NUC(2マイクログラム)で可視化した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、D2S-RFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)、およびD2L-NLS-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、D2-NLS-GFPをコードするDNAをトランスフェクトし、この細胞をD2ドーパミン受容体拮抗物質である(+)ブタクラモール(10マイクロモル濃度)、またはラクロプリド(raclopride)(10マイクロモル濃度)で処理した。トランスフェクションの6時間後、22時間後、30時間後、および42時間後の時点で、細胞を拮抗物質で処理した。細胞を薬剤処理後に48時間インキュベートし、共焦点顕微鏡で観察した。
ヒトβ2-アドレナリン受容体とGFPを含む融合タンパク質(β2-AR-GFP)をコードするDNAコンストラクトを作製した。β2-AR-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)を細胞にトランスフェクトし、24時間インキュベートし、共焦点顕微鏡で観察した。
ヒトβ2-AR-NLS3-GFPを含む融合タンパク質をコードするDNAコンストラクトを作製した。HEK細胞に、β2-AR-NLS3-GFPをコードするDNA(2マイクログラム)、およびDs-Red-NUCをコードするDNA(1マイクログラム)をトランスフェクトし、細胞を48時間インキュベートした。
HEK細胞に、β2-AR-NLS3-GFPをコードするDNA(1マイクログラム)、およびDs-Red-NUCをコードするDNA(1マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。細胞を間隔をおいて、アドレナリン受容体の拮抗物質であるアテノロール(10マイクロモル濃度)で処理した。トランスフェクションの6時間後、22時間後、30時間後、および42時間後の時点で、拮抗物質を含む培地を交換した。
HEK細胞に、β2-AR-GFPをコードするDNAコンストラクト(1.5マイクログラム)、およびD1-NLSをコードするDNAコンストラクト(3マイクログラム)を48時間かけてトランスフェクトした。
HEK細胞に、β2-AR-GFPをコードするDNAコンストラクト(1.5マイクログラム)、およびD1-NLSをコードするDNAコンストラクト(3マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。これらの細胞を、アドレナリン拮抗物質であるプロプラノロール(5マイクロモル濃度)で処理した。トランスフェクションの6時間後、22時間後、30時間後、および42時間後の時点で、拮抗物質を含む培地を交換した。対照細胞には拮抗物質を加えなかった。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、β2-AR-NLS3-GFPをコードする、NLSを含むDNAコンストラクト(8マイクログラム)を48時間かけてトランスフェクトした。さらにこの細胞に、Ds-Red-NUC(1マイクログラム)をトランスフェクトして、核における局在を検証した。
HEK細胞に、セロトニン5HT1B-NLS-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトした。この細胞にDs-red-NUC(1マイクログラム)をトランスフェクトし、核における局在を検証した。細胞を、セロトニン受容体拮抗物質であるメチセルジド(methysergide)(10マイクロモル濃度)で処理した。トランスフェクションの6時間後、22時間後、30時間後、および42時間後の時点で、拮抗物質を含む培地を交換した。対照細胞には拮抗物質を加えなかった。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、CysLT2-NLS-GFPをコードするDNAコンストラクト(8マイクログラム)を48時間かけてトランスフェクトした。この細胞にさらにDs-RED-NUC(1マイクログラム)をトランスフェクトし、核における局在を検証した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
Cys-LT2-NLS-GFPをコードするDNA(3マイクログラム)を用いてHEK細胞をトランスフェクトした。これらの細胞を、システイニルロイコトリエン受容体拮抗物質であるモンテルカスト(montelukast)(10マイクロモル濃度)で処理した。トランスフェクションの6時間後、22時間後、30時間後、および42時間後の時点で、拮抗物質を含む培地を交換した。対照細胞には拮抗物質を加えなかった。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、muオピオイド-NLS-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)を48時間かけてトランスフェクトした。さらにこの細胞にDs-Red-NUC(1マイクログラム)をトランスフェクトして、核における局在を検証した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、muオピオイド-NLS-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、Muオピオイドの拮抗物質であるナロキソン(naloxone)(10マイクロモル濃度)、またはナルトレキソン(naltrexone)(10マイクロモル濃度)で処理した。トランスフェクションの6時間後、22時間後、30時間後、および42時間後の時点で、拮抗物質を含む培地を交換した。対照細胞には拮抗物質を加えなかった。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、M1-NLS-GFPをコードするDNA(1マイクログラム)、およびDs-Red-NUC(1マイクログラム)をコードするDNAを48時間かけてトランスフェクトした。これらの細胞を、臭化イプラトロピウム(iprotropium bromide;10マイクロモル濃度)で処理した。トランスフェクション後の6時間、22時間、30時間、および42時間の時点で、拮抗物質を含む培地を交換した。対照細胞には拮抗物質処理を行わなかった。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、ヒスタミンH1-NLS-GFP受容体をコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)、およびDs-Red-NUCをコードするコンストラクト(1マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。
HEK細胞に、H1-NLS-GFP(2マイクログラム)、およびDsRED-NUC(2マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。この細胞をプロメタジン(10マイクロモル濃度)で48時間処理した。核をDsRED-NUCで可視化した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
DNAコンストラクト(AT1R-RFP)を、NLS含有ヒトアンジオテンシンAT1受容体とDsRed2(RFP)を含む融合タンパク質をコードするように作製した。
HEK細胞に、D1-NLS-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)、およびD1-WTをコードするDNAコンストラクト(4マイクログラム)をトランスフェクトし、細胞を24時間インキュベートした。この細胞を、ドーパミンD1作動物質であるSKF 81297(10マイクロモル濃度)で35分間処理した。1つのグループの細胞を、共焦点顕微鏡でリアルタイムで可視化した。
HEK細胞に、DAT-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)を48時間かけてトランスフェクトした。核をDsRED-NUC(2マイクログラム)を用いて共焦点顕微鏡で可視化した。
HEK細胞に、DAT-NLS-RFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。トランスフェクションの6時間後、22時間後、30時間後、および42時間後の時点で、細胞をコカインまたはアンフェタミン(最終濃度10マイクロモル濃度)で処理するか、処理せずにおいた。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、DAT-NLS-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。トランスフェクションの6時間後、22時間後、30時間後、および42時間後の時点で、細胞をGBR-12909(最終濃度1マイクロモル濃度)で処理した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、DAT-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトし、この24時間後にDAT-NLS-RFPをコードするDNAコンストラクト(0.5、1、および2マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。対照として、細胞にDAT-GFPのみをトランスフェクトした。第2のトランスフェクション後に、細胞を48時間インキュベートした。総インキュベーション時間は72時間とした。
HEK細胞に、mGluR4-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。核をDsRED-NUC(2マイクログラム)で可視化した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、mGluR4-NLS-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。さらにこの細胞にDs-Red-NUC(2マイクログラム)をトランスフェクトし、核における局在を検証した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、M1-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)、またはM1-NLS-GFPをコードするコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。核をDsRED-NUC(2マイクログラム)で可視化した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、H1-GFPをコードするDNAコンストラクト(1.5マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。核をDsRED-NUC(2マイクログラム)で可視化した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、CysLT1-NLS-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。核をDsRED-NUC(2マイクログラム)で可視化した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、SERT-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。91%の細胞が、細胞表面および細胞質で輸送体を発現していた。
HEK細胞に、SERT-NLS-GFPをコードするDNA(2マイクログラムのDNA)をトランスフェクトし、フルオキセチン(最終濃度1マイクロモル濃度)で48時間処理した。トランスフェクションの6時間後、22時間後、30時間後、および42時間後の時点で、細胞をフルオキセチン(最終濃度1マイクロモル濃度)で処理した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、D2-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)と、DAT-NLS-RFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)を同時にトランスフェクトし、48時間インキュベートした。また対照として細胞を、D2-GFP単独、またDAT-NLS-RFP単独で別個にトランスフェクトした。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、D1-NLSをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)と、β-アレスチン1-GFPをコードするDNAコンストラクト(2マイクログラム)を同時にトランスフェクトし、48時間インキュベートした。さらに細胞に、β-アレスチン1-GFPのみをトランスフェクトした。これらの細胞を共焦点顕微鏡で調べた。
マルチウェルプレートのウェルをポリ-L-オルニチンでコーティングし、50,000個の細胞を各ウェルにプレーティングした。次にこの細胞に、HAエピトープタグを付加したD1-NLS受容体をコードするDNAをトランスフェクトし、(+)ブタクラモール(10ナノモル濃度〜10マイクロモル濃度)で48時間以上処理した。続いて、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、細胞表面の受容体を、ラット抗HA抗体で検出し、次にFITC結合ヤギ抗ラット抗体で検出した。蛍光シグナルを蛍光定量法(Cytofluor)で検出した。結果は、1回の実験条件につき5個のウェルの平均である(図2)。ブタクラモールは、受容体を細胞表面に用量依存的に保持する作用を示したことから、同拮抗物質が細胞表面からの受容体の輸送を低下させることがわかる。したがって、蛍光定量法で、細胞表面に保持された受容体を検出することができる。
マルチウェルプレートのウェルをポリ-L-オルニチンでコーティングし、50,000個の細胞を各ウェルにプレーティングした。この細胞に、HAエピトープタグを付加したD1-NLS受容体をコードするDNAをトランスフェクトし、作動物質SKF 81297(1マイクロモル濃度)を添加または非添加して、拮抗物質SCH 23390(1ナノモル濃度〜1マイクロモル濃度)で48時間処理した。これに続いて、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、細胞表面の受容体を、ラット抗HA抗体で検出し、次にFITCを結合させたヤギ抗ラット抗体で検出した。蛍光シグナルを蛍光定量法で検出した(Cytofluor)。結果は、1回の実験条件につき5個のウェルの平均である。SCH 23390には、受容体を細胞表面に保持する用量依存的な作用を示したので、同拮抗物質が細胞表面からの受容体の輸送を低下させることがわかる。作動物質を同時に添加すると、拮抗物質の作用は低下した(図3)。したがって、作動物質の作用は、拮抗物質の作用を遮断することで検出可能であり、また蛍光定量法で作動物質の作用を定量することができる。
HEK細胞に、1個のウェルあたり50,000個の細胞となるように、ポリ-L-オルニチンでコーティングしたマルチウェルプレート上でHA-D1-NLSをトランスフェクトした。この細胞を、拮抗物質SCH 23390(0.5マイクロモル濃度)で48時間かけて処理した。作動物質SKF 81297(100ナノモル濃度〜1マイクロモル濃度)とSCH 23390を、インキュベーションの最後の1時間共存させた。続いて、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、細胞表面の受容体をラット抗HA抗体で、次にFITCを結合させたヤギ抗ラット抗体で検出した。蛍光シグナルを蛍光定量法で検出した(Cytofluor)。結果は、1回の実験条件につき5個のウェルの平均である。
HEK細胞に、D1-NLSをコードするDNAをトランスフェクトし、(+)ブタクラモール(10マイクロモル濃度)で処理するか、または未処理のままとした。48時間後に細胞を洗浄し、回収し、溶解し、ポリトロンでホモジナイズした。膜画分を遠心して回収後、35%ショ糖溶液上に重層し、遠心(4℃、30,000 rpm、90分)して重膜画分を回収した。
HEK細胞に、D1-NLSをコードするDNAをトランスフェクトし、(+)ブタクラモール(500ナノモル濃度)で処理するか、または未処理のままとした。48時間後に細胞を洗浄し、回収し、溶解し、ポリトロンでホモジナイズした。膜画分を遠心して回収後、35%ショ糖溶液上に重層し、遠心(4℃、30,000 rpm、90分)して重膜画分を回収した。
NSB:非特異的結合 SB:特異的結合
(+)ブタクラモールによるD1-NLSの拮抗物質処理は、核への転位を妨げ、細胞表面に保持された受容体を放射リガンド結合アッセイ法で定量した。
HEK細胞に、D1-NLSをコードするDNAをトランスフェクトし、(+)ブタクラモール(100ナノモル濃度)で処理するか、または未処理のままとした。48時間後に細胞を洗浄し、回収し、溶解し、ポリトロンでホモジナイズした。膜画分を遠心して回収後、35%ショ糖溶液上に重層し、遠心(4℃、30,000 rpm、90分)して重膜画分を回収した。
HEK細胞に、EGFR-NLS-GFPをコードするDNA(2マイクログラム)をトランスフェクトした。HEK細胞に、EGFR-GFPをコードするDNA(2マイクログラム)もトランスフェクトし、24時間インキュベートした。
HEK細胞に、LDL-GFPをコードするDNA(2マイクログラム)をトランスフェクトし、24時間インキュベートした。この受容体は、67%の細胞で細胞表面で、また8%の細胞で核内に発現されていた。
HEK細胞に、LDL-NLS-GFPをコードするDNA(2マイクログラム)、およびDsRED-NUCをコードするDNA(2マイクログラム)をトランスフェクトし、48時間インキュベートした。細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、EPO-NLS-GFPをコードするDNA(2マイクログラム)をトランスフェクトした。HEK細胞にEPO-GPF(2マイクログラム)をトランスフェクトした。さらにこの細胞にDsRED-NUC(2マイクログラム)をトランスフェクトした。これらの細胞を48時間インキュベートし、共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、SERT-NLS-GFPをコードするDNA(2マイクログラムのDNA)をトランスフェクトし、セルトラリン(最終濃度500ナノモル濃度)で48時間処理した。トランスフェクションの6時間後、22時間後、30時間後、および42時間後の時点で、細胞をセルトラリンで処理した。これらの細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
HEK細胞に、D1-NLS2-GFPをコードするDNA(2マイクログラム)をトランスフェクトし、(+)ブタクラモールまたはSCH 23390(1マイクロモル濃度)で48時間処理した。核をDsRED-NUC(2マイクログラム)で可視化した。細胞を共焦点顕微鏡で観察した。
Claims (56)
- 以下の段階を含む、少なくとも1種類の膜貫通型タンパク質と相互作用する能力に関して候補化合物をスクリーニングする方法:
細胞に、少なくとも1つの核局在配列(NLS)および検出用部分を含む膜貫通型タンパク質を含むタンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列(ここで、野生型の膜貫通型タンパク質はNLSを含まず、該膜貫通型タンパク質をコードするヌクレオチド配列がNLSをコードするように修飾されている。)をトランスフェクトして、コードされたタンパク質の、細胞内における発現を可能とする段階;
細胞に候補化合物を接触させる段階;ならびに
細胞内における検出用部分の分布を検出することで、細胞内における発現されたタンパク質の分布を決定する段階;
ここで、候補化合物を接触させなかった対照細胞における検出用部分の分布に対して、細胞内における検出用部分の分布の変化が検出されることは、化合物が膜貫通型タンパク質と相互作用することを意味する。 - 検出用部分が、膜貫通型タンパク質の抗原部分のアミノ酸配列を含む検出用ペプチドである、請求項1記載の方法。
- ヌクレオチド配列が、少なくとも1つのNLSおよび検出用部分を含む膜貫通型タンパク質を含む融合タンパク質をコードする、請求項1記載の方法。
- ヌクレオチド配列が、RRR-(11 aa)-KRRK、KK-(15 aa)-KKRK、KRKRRP、PKKNRLRRK、KRQR-(20 aa)-KKSKK、PAAKRVKLD、QRKRQK、HRIEEKRKRTYETFKSI、KKKYKLK、KSKKKAQ、PKKKRKV、KKKKRKREK、LKRPRSPSS、KRK-(22 aa)-KELQKQITK、GKKKYKLKH、EED-(350 aa)-KKKRERLD、CYFQKKAANMLQQSGSKNTGAKKRK、DILRR-(323 aa)-PKQKRK、SSDDEATADSQHSTPPKKKRKV、RKKRK-(9 aa)KAKKSK、KR-(11 aa)-KKLR、RRPS-(22 aa)-RRKRQK、KR-(10 aa)-KKKL、RKRK-(7 aa)-RRSRYRKおよびMISEALRKAから選択されるNLSをコードするように修飾されている、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- ヌクレオチド配列が、KKFKR、PKKKRKV、およびAFSAKKFKRからなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするように修飾されている、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 細胞が真核細胞または原核細胞である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 細胞が、哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞、線虫細胞、植物細胞、および真菌細胞からなる群より選択される真核細胞である、請求項6記載の方法。
- 細胞が、HEK細胞、COS細胞、およびCHO細胞からなる群より選択される哺乳類細胞である、請求項7記載の方法。
- 検出用部分が抗原ペプチドであり、細胞内における抗原ペプチドの分布が、抗原ペプチドに特異的な抗体を含む抗体ベースの検出系に対する結合を可能とすることで決定される、請求項3記載の方法。
- 抗体ベースの検出系が、抗原ペプチドに特異的な第1の抗体、および検出用標識を有し、第1の抗体に特異的な第2の抗体を含む、請求項9記載の方法。
- 抗体ベースの検出系が、抗原ペプチドに特異的で、検出用標識を有する第1の抗体を含む、請求項9記載の方法。
- 検出用標識が、光学的に検出可能な標識である、請求項10または11記載の方法。
- 検出用標識が、発光標識または蛍光標識である、請求項12記載の方法。
- 検出用部分が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、およびこれらの修飾型異型からなる群より選択されるポリペプチドである、請求項3記載の方法。
- 膜貫通型タンパク質が、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)、輸送体、サイトカイン受容体、チロシンキナーゼ受容体、および低密度リポタンパク質(LDL)受容体からなる群より選択される、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- 膜貫通型タンパク質がGPCRである、請求項15記載の方法。
- GPCRが、ドーパミンD1受容体、ドーパミンD2受容体、ドーパミンD3受容体、ドーパミンD5受容体、ヒスタミン1受容体、システイニルロイコトリエン受容体1、システイニルロイコトリエン受容体2、オピオイド受容体、ムスカリン受容体、セロトニン受容体、β2-アドレナリン受容体、および代謝共役型グルタミン酸4受容体からなる群より選択される、請求項16記載の方法。
- 膜貫通型タンパク質が輸送体である、請求項15記載の方法。
- 輸送体が、ドーパミン輸送体およびセロトニン輸送体からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
- 膜貫通型タンパク質がサイトカイン受容体である、請求項15記載の方法。
- サイトカイン受容体が、エリスロポイエチン受容体およびインスリン受容体からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
- 膜貫通型タンパク質がチロシンキナーゼ受容体である、請求項15記載の方法。
- チロシンキナーゼ受容体が、上皮成長因子受容体およびインスリン受容体からなる群より選択される、請求項22記載の方法。
- 膜貫通型タンパク質が低密度リポタンパク質受容体である、請求項15記載の方法。
- 細胞に複数のヌクレオチド配列をトランスフェクトする方法であって、個々の配列が、少なくとも1つのNLSを含む、さまざまな膜貫通型タンパク質を含むタンパク質をコードする、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
- 個々のヌクレオチド配列が、さまざまな検出用部分を含むタンパク質をコードする、請求項25記載の方法。
- 少なくとも1つの検出用部分が、少なくとも2種類のコードされたタンパク質で共通である、請求項25記載の方法。
- 細胞に、少なくとも1種類の膜貫通型タンパク質と相互作用することがわかっている化合物を接触させてから、細胞に候補化合物を接触させる、請求項1記載の方法であって、
ここで、膜貫通型タンパク質と相互作用することがわかっている化合物を接触させたが候補化合物を接触させなかった対照細胞における検出用部分の分布に対して、細胞内における検出用部分の分布の変化が検出されることは、候補化合物が膜貫通型タンパク質と相互作用することを意味する、方法。 - 細胞内における検出用部分の分布の変化の検出が、細胞膜に結合した検出用部分のレベルの変化の検出を含む、請求項1〜28のいずれか一項記載の方法。
- 検出用部分の分布の変化の検出が、細胞膜に結合した検出用部分のレベルの低下の検出を含む、請求項29記載の方法。
- 検出用部分の分布の変化の検出が、細胞膜に結合した検出用部分のレベルの上昇の検出を含む、請求項30記載の方法。
- 細胞内における検出用部分の分布の変化の検出が、細胞の核内における検出用部分のレベルの変化の検出を含む、請求項1〜28のいずれか一項記載の方法。
- 検出用部分の分布の変化の検出が、細胞の核内における検出用部分のレベルの低下の検出を含む、請求項32記載の方法。
- 検出用部分の分布の変化の検出が、細胞の核内における検出用部分のレベルの上昇の検出を含む、請求項29記載の方法。
- 以下の段階を含む、少なくとも1つの膜貫通型タンパク質と相互作用する能力に関して候補化合物をスクリーニングする方法:
細胞に、NLS含有膜貫通型タンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列(ここで、野生型の膜貫通型タンパク質はNLSを含まず、該膜貫通型タンパク質をコードするヌクレオチド配列がNLSをコードするように修飾されている。)をトランスフェクトすることで、コードされたタンパク質の細胞内における発現を可能とする段階;
細胞に候補化合物を接触させる段階;ならびに
細胞膜に残存したNLS含有膜貫通型タンパク質のレベルを、細胞の膜画分を単離し、同画分に膜貫通型タンパク質の標識リガンドを接触させ、同画分とリガンドの結合のレベルを決定することで決定する段階;
ここで、候補化合物を接触させなかった対照細胞の細胞膜におけるレベルに対して、細胞膜における膜貫通型タンパク質のレベルの変化が検出されることは、化合物が膜貫通型タンパク質と相互作用することを意味する。 - 標識リガンドが放射標識リガンドである、請求項35記載の方法。
- ヌクレオチド配列が、RRR-(11 aa)-KRRK、KK-(15 aa)-KKRK、KRKRRP、PKKNRLRRK、KRQR-(20 aa)-KKSKK、PAAKRVKLD、QRKRQK、HRIEEKRKRTYETFKSI、KKKYKLK、KSKKKAQ、PKKKRKV、KKKKRKREK、LKRPRSPSS、KRK-(22 aa)-KELQKQITK、GKKKYKLKH、EED-(350 aa)-KKKRERLD、CYFQKKAANMLQQSGSKNTGAKKRK、DILRR-(323 aa)-PKQKRK、SSDDEATADSQHSTPPKKKRKV、RKKRK-(9 aa)KAKKSK、KR-(11 aa)-KKLR、RRPS-(22 aa)-RRKRQK、KR-(10 aa)-KKKL、RKRK-(7 aa)-RRSRYRKおよびMISEALRKAから選択されるNLSをコードするように修飾されている、請求項35または36記載の方法。
- ヌクレオチド配列が、KKFKR、PKKKRKV、およびAFSAKKFKRからなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするように修飾されている、請求項35または36記載の方法。
- 細胞が真核細胞または原核細胞である、請求項35〜38のいずれか一項記載の方法。
- 細胞が、哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞、線虫細胞、植物細胞、および真菌細胞からなる群より選択される真核細胞である、請求項39記載の方法。
- 細胞が、HEK細胞、COS細胞、およびCHO細胞からなる群より選択される哺乳類細胞である、請求項40記載の方法。
- 膜貫通型タンパク質が、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)、輸送体、サイトカイン受容体、チロシンキナーゼ受容体、および低密度リポタンパク質(LDL)受容体からなる群より選択される、請求項35〜41のいずれか一項記載の方法。
- 膜貫通型タンパク質がGPCRである、請求項42記載の方法。
- GPCRが、ドーパミンD1受容体、ドーパミンD2受容体、ドーパミンD3受容体、ドーパミンD5受容体、ヒスタミン1受容体、システイニルロイコトリエン受容体1、システイニルロイコトリエン受容体2、オピオイド受容体、ムスカリン受容体、セロトニン受容体、β2-アドレナリン受容体、および代謝共役型グルタミン酸4受容体からなる群より選択される、請求項43記載の方法。
- 膜貫通型タンパク質が輸送体である、請求項42記載の方法。
- 輸送体が、ドーパミン輸送体およびセロトニン輸送体からなる群より選択される、請求項45記載の方法。
- 膜貫通型タンパク質がサイトカイン受容体である、請求項42記載の方法。
- サイトカイン受容体が、エリスロポイエチン受容体およびインスリン受容体からなる群より選択される、請求項47記載の方法。
- 膜貫通型タンパク質がチロシンキナーゼ受容体である、請求項42記載の方法。
- チロシンキナーゼ受容体が、上皮成長因子受容体およびインスリン受容体からなる群より選択される、請求項49記載の方法。
- 膜貫通型タンパク質が低密度リポタンパク質受容体である、請求項42記載の方法。
- 細胞に複数のヌクレオチド配列をトランスフェクトする方法であって、個々の配列が、少なくとも1つのNLSを含む、さまざまな膜貫通型タンパク質を含むタンパク質をコードする、請求項35〜51のいずれか一項記載の方法。
- 個々のヌクレオチド配列が、さまざまな検出用部分を含むタンパク質をコードする、請求項52記載の方法。
- 少なくとも1つの検出用部分が、少なくとも2種類のコードされたタンパク質に共通である、請求項52記載の方法。
- 検出用部分の分布の変化の検出が、細胞膜に結合した検出用部分のレベルの低下の検出を含む、請求項35〜54のいずれか一項記載の方法。
- 検出用部分の分布の変化の検出が、細胞膜に結合した検出用部分のレベルの上昇の検出を含む、請求項35〜54のいずれか一項記載の方法。
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KR102329302B1 (ko) * | 2019-09-30 | 2021-11-22 | 한국과학기술연구원 | 도파민 d1형 수용체의 활성 측정용 적색 형광 단백질 기반 바이오센서 |
WO2023105244A1 (en) | 2021-12-10 | 2023-06-15 | Pig Improvement Company Uk Limited | Editing tmprss2/4 for disease resistance in livestock |
WO2024013514A2 (en) | 2022-07-15 | 2024-01-18 | Pig Improvement Company Uk Limited | Gene edited livestock animals having coronavirus resistance |
WO2024118876A1 (en) | 2022-12-01 | 2024-06-06 | Genencor International Bv | Iterative multiplex genome engineering in microbial cells using a recombinant self-excisable selection marker system |
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WO2024118882A1 (en) | 2022-12-01 | 2024-06-06 | Genencor International Bv | Iterative multiplex genome engineering in microbial cells using a selection marker swapping system |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030022277A1 (en) * | 1995-05-05 | 2003-01-30 | Daniel R. Soppet | Human neuropeptide receptor |
US6004808A (en) * | 1996-06-21 | 1999-12-21 | Aurora Biosciences Corporation | Promiscuous G-protein compositions and their use |
US5891646A (en) | 1997-06-05 | 1999-04-06 | Duke University | Methods of assaying receptor activity and constructs useful in such methods |
WO1999005177A1 (en) | 1997-07-28 | 1999-02-04 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for identifying modulators of g-protein-coupled receptors |
AU2001243145A1 (en) * | 2000-02-09 | 2001-08-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Human g-protein chemokine receptor (ccr5) hdgnr10 |
AU2001284974A1 (en) | 2000-08-16 | 2002-02-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Quantitative assessment of erbb/her receptors in biological fluids |
AU2003218586B2 (en) * | 2002-04-12 | 2009-01-08 | Omeros Corporation | Method of identifying transmembrane protein-interacting compounds |
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