ES2566487T3

ES2566487T3 - Método de identificación de compuestos que interaccionan con proteínas transmembrana

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Publication number: ES2566487T3
Application number: ES09150972.9T
Authority: ES
Inventors: Brian F. O'dowd; Susan R. George
Original assignee: Omeros Medical Systems Inc
Current assignee: Omeros Corp
Priority date: 2002-04-12
Filing date: 2003-04-11
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2023-04-11
Also published as: JP5187910B2; SI1495330T1; EP2339347A1; JP4542342B2; DE60325953D1; US7309576B2; CN100399028C; CN1646917A; AU2003218586B2; CY1108997T1; NZ536063A; AU2003218586A1; US9005905B2; ATE421697T1; MXPA04011134A; US20130084581A1; DK1495330T3; HK1073358A1; ES2321704T3; US20150377896A1

Abstract

Método para seleccionar un compuesto candidato por su capacidad de interaccionar con al menos una proteína transmembrana, que comprende: 5 poner en contacto una célula con un compuesto candidato, en donde la célula se transfecta con al menos una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que comprende una proteína transmembrana que contiene al menos una secuencia de localización nuclear (NLS) y una parte detectable, y la proteína codificada se expresa en la célula, y en donde la proteína transmembrana presenta transferencia, independiente del ligando, en alejamiento de la membrana celular y hacia el núcleo de la célula; y determinar la distribución de la proteína expresada en la célula detectando la distribución de la parte detectable en la célula; en donde la retención de la parte detectable en la membrana celular en células puestas en contacto con el compuesto candidato, con respecto a células de control no puestas en contacto con el compuesto candidato, indica interacción del compuesto candidato con la proteína transmembrana, y en donde la proteína transmembrana de tipo salvaje contiene una NLS.

Description

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43. Método de una cualquiera de las cláusulas 37 a 42 en el que la célula es una célula eucariota o una célula procariota.

5 44. Método de la cláusula 43 en el que la célula es una célula eucariota seleccionada del grupo compuesto por una célula de mamífero, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula de nematodo, una célula vegetal y una célula fúngica.

45. Método de la cláusula 44 en el que la célula es una célula de mamífero seleccionada del grupo compuesto por 10 células HEK, COS y CHO.

46. Método de una cualquiera de las cláusulas 37 a 45 en el que la proteína transmembrana se selecciona del grupo compuesto por un receptor acoplado a proteína G (GPCR), un transportador, un receptor de citoquinas, un receptor de tirosina quinasa y un receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL).

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47.: Método de la cláusula 46 en el que la proteína transmembrana es un GPCR.

48.: Método de la cláusula 47 en el que el GPCR se selecciona del grupo compuesto por receptor de dopamina D1, receptor de dopamina D2, receptor de dopamina D3, receptor de dopamina D5, receptor de histamina 1, receptor

20 de cisteinil leucotrienos 1, receptor de cisteinil leucotrienos 2, receptor opioide, receptor muscarínico, receptor de serotonina, receptor beta2-adrenérgico y receptor metabotrópico de glutamato 4.

49. Método de la cláusula 46 en el que la proteína transmembrana es un transportador.

25 50. Método de la cláusula 49 en el que el transportador se selecciona del grupo compuesto por transportador de dopamina y transportador de serotonina.

51. Método de la cláusula 46 en el que la proteína transmembrana es un receptor de citoquinas.

30 52. Método de la cláusula 51 en el que el receptor de citoquinas se selecciona del grupo compuesto por receptor de eritropoyetina y receptor de insulina.

53. Método de la cláusula 46 en el que la proteína transmembrana es un receptor de tirosina quinasa.

35 54. Método de la cláusula 53 en el que el receptor de tirosina quinasa se selecciona del grupo compuesto por receptor de factor de crecimiento epidérmico y receptor de insulina.

55. Método de la cláusula 46 en el que la proteína transmembrana es un receptor de lipoproteínas de baja

densidad. 40

56. Método de una cualquiera de las cláusulas 37 a 55 en el que la célula se transfecta con una pluralidad de secuencias nucleotídicas, codificando cada una de dichas secuencias una proteína que comprende una proteína transmembrana diferente que contiene por lo menos una NLS.

45 57. Método de la cláusula 56 en el que cada una de dichas secuencias nucleotídicas codifica una proteína que comprende una parte detectable diferente.

58. Método de la cláusula 56 en el que por lo menos una parte detectable es común para por lo menos dos

proteínas codificadas. 50

59. Método de las cláusulas 37 a 58 en el que la detección de una distribución alterada de la parte detectable comprende la detección de un nivel reducido de la parte detectable asociada a la membrana celular.

60. Método de las cláusulas 37 a 58 en el que la detección de una distribución alterada de la parte detectable 55 comprende la detección de un nivel aumentado de la parte detectable asociada a la membrana celular.

61. Célula aislada transfectada con por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que comprende una proteína transmembrana que contiene por lo menos una NLS y una parte detectable.

60 62. Célula de la cláusula 61, en la que la parte detectable es un péptido detectable que comprende una porción antigénica de la secuencia de aminoácidos de la proteína transmembrana.

63. Célula de la cláusula 61 en el que la secuencia nucleotídica codifica una proteína de fusión que comprende una proteína transmembrana que contiene por lo menos una NLS y una parte detectable.

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84. Célula de una cualquiera de las cláusulas 61 a 83 transfectada con una pluralidad de secuencias nucleotídicas, codificando cada una de dichas secuencias una proteína que comprende una proteína transmembrana diferente que contiene por lo menos una NLS.

5 85. Célula de la cláusula 84 en la que cada una de dichas secuencias nucleotídicas codifica una proteína que comprende una parte detectable diferente.

86. Célula de la cláusula 84 en la que por lo menos una parte detectable es común para por lo menos dos

proteínas codificadas. 10

87.: Célula de una cualquiera de las cláusulas 61 a 86 en la que la célula es una célula eucariota o una célula procariota.

88.: Célula de la cláusula 87 en la que la célula es una célula eucariota seleccionada del grupo compuesto por una

15 célula de mamífero, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula de nematodo, una célula vegetal y una célula fúngica.

89. Célula de la cláusula 88 en la que la célula es una célula de mamífero seleccionada del grupo compuesto por

células HEK, COS y CHO. 20

90.: Célula de la cláusula 88, en la que la célula es una célula neuronal.

91.: Compuesto identificado como capaz de interaccionar con una proteína transmembrana por el método de una

cualquiera de las cláusulas 1 a 60. 25

92. Método para determinar si una primera proteína y una segunda proteína pueden oligomerizarse, que comprende: transfectar una célula con una primera secuencia nucleotídica que codifica una primera proteína que contiene una NLS y una segunda secuencia nucleotídica que codifica una segunda proteína que comprende una parte detectable y permitir la expresión de la primera y la segunda proteínas codificadas en la célula; y determinar

30 la distribución de la parte detectable en la célula; en donde la detección de la parte detectable en el núcleo de la célula o adyacente al mismo o la detección de un nivel reducido de la parte detectable en la superficie celular, con respecto a una célula de control, indica que la primera y la segunda proteínas interaccionan.

93. Método de la cláusula 92 en el que la primera y la segunda proteínas son proteínas transmembrana diferentes. 35

94.: Método de la cláusula 92 en el que la primera y la segunda proteínas son la misma proteína transmembrana.

95.: Método de la cláusula 92 en el que una de la primera y la segunda proteínas es una proteína transmembrana y

la otra es una proteína que no es transmembrana. 40

96.: Método de una cualquiera de las cláusulas 92 a 94 en el que la primera y la segunda proteínas son GPCRs.

97.: Método de una cualquiera de las cláusulas 92 a 96 en el que la parte detectable es un péptido detectable que

comprende una porción antigénica de la secuencia de aminoácidos de la segunda proteína. 45

98. Método de la cláusula 92 en el que la segunda secuencia nucleotídica codifica una proteína de fusión que comprende la segunda proteína y una parte detectable.

99. Método de una cualquiera de las cláusulas 92 a 94 en el que la primera proteína de tipo salvaje contiene una 50 NLS.

100. Método de una cualquiera de las cláusulas 92 a 94 en el que la primera proteína de tipo salvaje carece de una NLS y la primera secuencia nucleotídica que codifica la primera proteína se modifica para codificar una NLS.

55 101. Método de la cláusula 100 en el que la primera secuencia nucleotídica se modifica para codificar una NLS seleccionada de la Tabla 1.

102. Método de la cláusula 100 en el que la primera secuencia nucleotídica se modifica para codificar una

secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por KKFKR, PKKKRKV y AFSAKKFKR. 60

103. Método de una cualquiera de las cláusulas 92 a 102 en el que la célula es una célula eucariota o una célula procariota.

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104. Método de la cláusula 103 en el que la célula es una célula eucariota seleccionada del grupo compuesto por una célula de mamífero, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula de nematodo, una célula vegetal y una célula fúngica.

5 105. Método de la cláusula 104 en el que la célula es una célula de mamífero seleccionada del grupo compuesto por células HEK, COS y CHO.

106. Método de la cláusula 92 en el que la parte detectable es un péptido antigénico y la distribución del péptido

antigénico en la célula se determina permitiendo su fijación a un sistema de detección basado en anticuerpos que 10 comprende un anticuerpo específico del péptido antigénico.

107. Método de la cláusula 106 en el que el sistema de detección basado en anticuerpos comprende un primer anticuerpo específico del péptido antigénico y un segundo anticuerpo que es portador de una etiqueta detectable y específico del primer anticuerpo.

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108. Método de la cláusula 106 en el que el sistema de detección basado en anticuerpos comprende un primer anticuerpo específico del péptido antigénico y que es portador de una etiqueta detectable.

109. Método de la cláusula 108 en el que el sistema de detección basado en anticuerpos comprende un primer 20 anticuerpo específico del péptido antigénico y que es portador de una etiqueta detectable.

110. Método de la cláusula 109 en el que la etiqueta detectable es una etiqueta ópticamente detectable o fluorescente.

25 111. Método de la cláusula 110 en el que la etiqueta detectable es una etiqueta luminiscente o una etiqueta fluorescente.

112. Método de la cláusula 92 en el que la parte detectable es un polipéptido seleccionado del grupo compuesto

por proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja y variantes modificadas de las mismas. 30

113. Método de una cualquiera de las cláusulas 93 a 112 en el que la primera y la segunda proteínas son proteínas transmembrana seleccionadas del grupo compuesto por un receptor acoplado a proteína G (GPCR), un transportador, un receptor de citoquinas, un receptor de tirosina quinasa y un receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL).

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114. Método de la cláusula 113 en el que la por lo menos una proteína transmembrana es un GPCR seleccionado del grupo compuesto por receptor de dopamina D1, receptor de dopamina D2, receptor de dopamina D3, receptor de dopamina D5, receptor de histamina 1, receptor de cisteinil leucotrienos 1, receptor de cisteinil leucotrienos 2, receptor opioide, receptor muscarínico, receptor de serotonina, receptor beta2-adrenérgico y receptor

40 metabotrópico de glutamato 4.

115. Método de la cláusula 113 en el que la por lo menos una proteína transmembrana es un transportador.

116. Método de la cláusula 115 en el que la por lo menos una proteína transmembrana es un transportador 45 seleccionado del grupo compuesto por transportador de dopamina y transportador de serotonina.

117. Método de la cláusula 113 en el que la por lo menos una proteína transmembrana es un receptor de citoquinas.

50 118. Método de la cláusula 117 en el que la por lo menos una proteína transmembrana es un receptor de citoquinas seleccionado del grupo compuesto por receptor de eritropoyetina y receptor de insulina.

119. Método de la cláusula 113 en el que por lo menos una proteína transmembrana es un receptor de tirosina

quinasa. 55

120. Método de la cláusula 119 en el que la por lo menos una proteína transmembrana es un receptor de tirosina quinasa seleccionado del grupo compuesto por receptor de factor de crecimiento epidérmico y receptor de insulina.

121. Método de la cláusula 113 en el que por lo menos una proteína transmembrana es un receptor de 60 lipoproteínas de baja densidad.

122. Método de la cláusula 92 en el que la primera secuencia nucleotídica codifica una primera proteína que comprende además una parte detectable diferente de la parte detectable de la segunda proteína, en donde la detección de una interacción de transferencia de energía entre la parte detectable de la primera proteína y la parte

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[0070] Cuando las células de control presentan una porción considerable, preferiblemente al menos un 50%, de la proteína transmembrana translocada en alejamiento de la membrana celular y las células de ensayo presentan retención de la proteína transmembrana en la membrana celular, con respecto a células de control, esto indica una interacción del compuesto de ensayo con la proteína transmembrana. En una realización preferida, la interacción queda indicada cuando el nivel de proteína en la membrana celular es más alto en las células de ensayo en al menos un 10%, preferiblemente en al menos un 15%, y más preferiblemente en al menos un 20%.

[0071] La proporción de la parte detectable que permanece en la membrana celular tras exposición al compuesto que interacciona está en relación con la concentración y potencia del compuesto. Por ejemplo, el uso de un conocido y potente antagonista de GPCR a concentración micromolar redundó típicamente en una permanencia de un 50 a un 100% de la proteína en la superficie celular, con entre un 0 y un 15% en el núcleo y el resto en el citoplasma. Concentraciones nanomolares más bajas del mismo antagonista redundaron en una retención de un 20 a un 40% de la proteína en la superficie celular, con el resto de la proteína en el citoplasma y el núcleo. En las células de control no tratadas, era detectable en la superficie celular un 0-15% de la proteína, con el resto en el citoplasma y el núcleo.

[0072] En una variante de este método, que se usa en los casos en los que la proteína transmembrana tiene ligandos conocidos, se usa una proteína transmembrana con contenido de NLS expresada sin una parte detectable y se determina la distribución de la proteína en la célula tras tratamiento con un compuesto de ensayo, mediante aislamiento de la fracción de membrana celular y determinación de su componente de proteína transmembrana usando ligando etiquetado de manera detectable, como se ha expuesto anteriormente.

[0073] En una realización adicional de la invención se usa un método similar para identificar compuestos que interaccionan con una proteína transmembrana-NLS para promover su translocación en alejamiento desde la superficie celular y al o hacia el núcleo. Las células son transfectadas e incubadas para permitir la expresión de la proteína transmembrana-NLS y su acumulación en la superficie de la célula. Preferiblemente, las células son incubadas hasta que se ha acumulado en la superficie de la célula al menos un porcentaje de aproximadamente un 70 a un 90% de la proteína transmembrana expresada. Para muchas proteínas transmembrana es adecuado un periodo de tiempo de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 horas desde la transfección.

[0074] Las células de ensayo son entonces puestas en contacto con un compuesto candidato, e inmediatamente se procede a observar células de ensayo y de control individuales en tiempo real por espacio de un periodo de tiempo de hasta 4 horas con el fin de observar la distribución de la parte detectable. Una acumulación incrementada de parte detectable en el núcleo de células de ensayo en comparación con células de control indica que el compuesto de ensayo ha promovido la translocación de la proteína transmembrana. En una realización preferida, la interacción queda indicada cuando las células de ensayo presentan una acumulación nuclear incrementada en al menos un 5%, preferiblemente en al menos un 10%, y más preferiblemente en al menos un 20%.

[0075] Una realización adicional de la invención es un método para identificar compuestos que, a pesar de no impedir por sí mismos la translocación de una proteína transmembrana con contenido de NLS hacia en alejamiento desde la membrana celular, pueden sin embargo interferir con la interacción de la proteína transmembrana con un compuesto que interaccione.

[0076] Los compuestos que hayan resultado ser negativos en el primer método de selección anteriormente descrito pueden ser sometidos a ensayo por este método adicional para determinar su capacidad de competir con un compuesto que interaccione conocido.

[0077] En este método, las células son transfectadas como se ha descrito anteriormente e incubadas por espacio de un periodo de tiempo adecuado para permitir la expresión y acumulación de la proteína transmembrana en la superficie celular, por ejemplo por espacio de un periodo de tiempo de aproximadamente 24 a aproximadamente 48 horas.

[0078] Las células de ensayo y las células de control son entonces puestas en contacto con un compuesto del que se sepa que interacciona con la proteína transmembrana, ya sea un ligando conocido o bien un compuesto de interacción identificado por el método anteriormente descrito, por espacio de un periodo de tiempo de aproximadamente 24 a aproximadamente 48 horas. Las células de ensayo son luego puestas en contacto con un compuesto candidato y las células de ensayo y las células de control son observadas tras 1 hora, en uno o más instantes de tiempo, hasta 24 horas, para determinar la distribución de la proteína transmembrana-NLS dentro de las células como se ha descrito anteriormente. En células de control, el compuesto de interacción conocido provoca que la proteína transmembrana sea retenida en la membrana celular. Si el compuesto candidato compite con el compuesto de interacción, las células de ensayo presentan una reducción de la proteína transmembrana en la superficie celular y una translocación incrementada de la proteína en alejamiento desde la superficie celular. En una realización preferida, la interacción queda indicada cuando las células de ensayo presentan una reducción de al menos un 10%, preferiblemente de un 15%, y más preferiblemente de un 20%.

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[0079] En una realización adicional, puede emplearse una célula que de manera endógena exprese una proteína transmembrana con contenido de NLS, en conjunción con un primer compuesto del que se haya demostrado que interacciona con la proteína e inhibe su transferencia desde la membrana celular, reteniendo así la proteína en la membrana celular. Cuando un sistema de este tipo es puesto en contacto con un compuesto candidato, si el compuesto interacciona con la proteína transmembrana y compite con el primer compuesto, se observa una transferencia incrementada de la proteína en alejamiento desde la membrana celular.

Identificación de interacciones de proteínas transmembrana con otras proteínas

[0080] Varias proteínas transmembrana entre las que se incluyen GPCRs, transportadores, receptores de tirosina quinasa, los receptores de citoquina para insulina, factores de crecimiento tipo insulina, el factor de crecimiento epidérmico y el factor de crecimiento endotelial vascular, son capaces de experimentar tanto homo-como heterooligomerización (véase, por ejemplo, el estudio de GPCRs en George et al., 2002). En el sentido en el que se usa en la presente, la expresión "oligomerización" de una proteína significa asociación de dos o más moléculas de la proteína.

[0081] Para unos hipotéticos receptores A y B, la superficie de la célula puede contener dímeros AA, BB y AB, y se cree que éstos pueden representar tres complejos funcionales distintos y por consiguiente tres dianas farmacológicas distintas. Es por lo tanto importante identificar qué proteínas transmembrana pueden interaccionar entre sí o con otras proteínas por oligomerización.

[0082] En realizaciones adicionales, la invención aporta métodos para determinar si dos proteínas transmembrana son capaces de experimentar oligomerización o si una proteína transmembrana y una proteína no transmembrana son capaces de experimentar oligomerización.

[0083] En una realización, una célula nucleada es cotransfectada con una primera secuencia nucleotídica que codifica una primera proteína transmembrana que contiene una NLS y con una segunda secuencia nucleotídica que codifica una segunda proteína transmembrana que carece de una NLS pero es portadora de una parte detectable o está unida a la misma. La creación de estas secuencias nucleotídicas es como se ha descrito anteriormente. Tras un intervalo de tiempo adecuado para permitir la expresión de las proteínas codificadas, la acumulación en la membrana celular y la subsiguiente translocación de la proteína con contenido de NLS en alejamiento desde la membrana celular a o hacia el núcleo, se determina la distribución de la parte detectable en la célula, por ejemplo determinando un incremento de parte detectable en el núcleo o por una disminución de la parte detectable en la superficie de la célula.

[0084] Se ha observado que cuando las células son doblemente transfectadas, y las proteínas transmembrana primera y segunda son iguales, exceptuando el hecho de que una proteína transmembrana contenga una NLS insertada y la otra no, se produce un enlentecimiento de la transferencia de la proteína transmembrana con contenido de NLS al núcleo de la célula en comparación con la transferencia en una célula transfectada solamente con la proteína que contiene la NLS. El proceso de translocación de la proteína al núcleo puede ahora llevar de aproximadamente 24 a 48 horas. En este método, por consiguiente, las células son incubadas por espacio de un periodo de tiempo de aproximadamente 24 a 48 horas antes de proceder al examen de la distribución de proteína en la célula.

[0085] La translocación de la parte detectable desde la superficie de la célula a o hacia el núcleo indica que la primera proteína transmembrana ha transportado la segunda proteína transmembrana en alejamiento desde la superficie de la célula, indicando una oligomerización de las proteínas primera y segunda. La retención de la parte detectable en la superficie de la célula indica una ausencia de interacción entre las proteínas.

[0086] Cuando las proteínas transmembrana primera y segunda son la misma proteína, el método permite la identificación de la capacidad de la proteína para homodimerizarse. Cuando las proteínas transmembrana primera y segunda son distintas, el método permite la identificación de la capacidad de dos proteínas distintas para heterodimerizarse, y permite la determinación de la especificidad de interacción entre dos proteínas transmembrana.

[0087] El método puede ser ejecutado ya sea en ausencia de activación del ligando o bien en presencia de un ligando de cualquier proteína.

[0088] Usando este método se ha demostrado la oligomerización tanto dentro de y entre clases distintas de GPCRs como dentro de y entre otras clases de proteínas transmembrana.

[0089] Adicionalmente, han sido detectadas interacciones entre GPCRs y proteínas transmembrana no GPCR, por ejemplo entre el receptor de dopamina D5 y el receptor de GABA-A, y entre proteínas transmembrana y proteínas no transmembrana.

[0090] La invención por consiguiente aporta en general un método para detectar la oligomerización entre dos proteínas por el método anteriormente descrito, donde una célula es cotransfectada con una de las proteínas que contienen una

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NLS y con la otra proteína que es portadora de una señal detectable.

[0091] La cotransfección de una célula con una primera proteína transmembrana que contiene una NLS y una segunda proteína etiquetada de manera detectable, tal como una proteína transmembrana de un grupo distinto, de la que se haya comprobado por el método de la invención que se oligomeriza con la primera proteína, proporciona una célula que puede ser usada para seleccionar compuestos candidatos en relación con su interacción o bien con la primera proteína o bien con la segunda proteína. Un compuesto que interaccione con cualquier proteína influirá en la oligomerización o translocación de las proteínas oligomerizadas en alejamiento desde la membrana celular. Pueden identificarse por este método compuestos que interaccionan con un miembro del par de proteínas o con el oligómero para ocasionar la retención de la proteína detectable en la superficie de la célula o para ocasionar una translocación acelerada de la proteína detectable en alejamiento desde la superficie de la célula.

[0092] En una realización adicional, una célula que expresa de manera endógena una proteína transmembrana con contenido de NLS es transfectada con una secuencia nucleotídica que codifica una segunda proteína transmembrana que es portadora de una parte detectable pero carece de una NLS. La oligomerización de las dos proteínas queda indicada por el tráfico de la parte detectable en alejamiento de la membrana celular al interior del núcleo o hacia el mismo.

[0093] En una realización adicional, puede usarse una proteína de membrana que contenga una NLS para identificar proteínas que interaccionan novedosas. En este método, una proteína transmembrana con contenido de NLS es expresada en una célula y se deja que la misma efectúe una translocación al núcleo. Los núcleos son entonces recolectados y sometidos a ensayo para detectar bandas de proteína de nueva aparición mediante tinción con colorante Coomassie o tinción con plata y para luego proceder a la identificación por espectroscopia de masas. El control será núcleos de células que expresen la proteína de membrana sin una NLS.

Uso de la FRET para la detección de la translocación nuclear

[0094] En un aspecto adicional de la invención, que implica transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) (Hailey et al., 2002), una célula nucleada es cotransfectada con una primera secuencia nucleotídica que codifica una primera proteína transmembrana con contenido de NLS unida a una primera proteína ópticamente detectable y con una segunda secuencia nucleotídica que codifica una segunda proteína transmembrana que no contiene NLS unida a una segunda proteína ópticamente detectable, cuya fluorescencia puede ser activada por la emisión de la primera proteína ópticamente detectable cuando éstas están en estrecha proximidad. Por ejemplo, la primera proteína puede estar unida a GFP y la segunda puede estar unida a cualquier otra parte ópticamente detectable que pueda ser activada por el espectro de emisión activada por láser de la GFP. Esta segunda parte ópticamente detectable, tras la activación por parte de la GFP, emite a una longitud de onda distinta. Cuando se forman oligómeros entre las dos proteínas transmembrana, las dos etiquetas están en estrecha proximidad entre sí, y puede ser detectada su interacción por FRET. La interacción física es detectada por activación de fluorescencia selectiva del dador y detección de la emisión por parte del aceptor, usando el método FRET o sus variantes tales como FRET de fotoblanqueo, FRAP o FLIM. La ausencia de una interacción por FRET indica ausencia de oligomerización.

[0095] Puede llevarse a cabo una microscopía confocal con FRET entre dos moléculas fluorescentes (como p. ej. los pares espectrales GFP y DsRed2, o CFP e YFP) para obtener una señal cuantificable que indique la translocación al núcleo. La FRET requiere un solapamiento entre los espectros de emisión y de excitación de moléculas dadora y aceptora y una proximidad de menos de 100 angstroms (10-100), lo cual hace que la FRET sea un sistema altamente adecuado para la realización de ensayos para la detección de interacciones de proteína-proteína próximas específicas en células. Las proteínas fluorescentes anteriormente enumeradas son excelentes socios espectrales. Un fluoróforo residente en el núcleo permitiría que se produjese una FRET cuando una proteína transmembrana identificada con un segundo fluoróforo se translocase al núcleo. Esto facilitará una lectura sencilla, usando un lector de placas de FRET. Este método es útil para detectar interacciones entre dos proteínas transmembrana o entre una proteína transmembrana y otra proteína y proporciona una lectura de señales que se presta más a la automatización.

[0096] Este método puede también usarse en procedimientos de selección de agonistas y antagonistas de GPCR. En el método de selección de antagonistas, una reducción de una señal de FRET entre un GPCR-NLS-GFP del cual se ha producido un tráfico al núcleo con un fluoróforo en el núcleo de células tratadas en comparación con células no tratadas indicaría un efecto antagonista. En el método de selección de agonistas, el incremento de la señal de FRET entre un GPCR-NLS-GFP del cual se ha producido un tráfico al núcleo con un fluoróforo en el núcleo de células tratadas en comparación con células no tratadas indicaría un efecto agonista. En una realización adicional, las células doblemente transfectadas pueden ser tratadas con un agonista antes del examen para detectar una evidencia de oligomerización, puesto que la misma puede verse acrecentada en presencia de un agonista. En la medición de interacciones de receptor:receptor, un GPCR-NLS-GFP se coexpresa con un segundo GPCR-DsRED. Si estos receptores interaccionan entre sí y se produce un tráfico de los mismos conjuntamente al núcleo, se detectará una señal de FRET nuclear. Si los receptores no interaccionan, no se obtendrá entonces en el núcleo señal de FRET alguna. También puede medirse la FRET entre dos anticuerpos conjugados con fluoróforos, que reconozcan epítopos incorporados o nativos en los

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GPCRs.

Ejemplos

5 [0097] Los ejemplos se describen con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.

[0098] Los métodos de química, biología molecular, inmunología y bioquímica de proteínas y péptidos a los que se alude pero que no se describen explícitamente en esta publicación ni en los ejemplos están descritos en la literatura científica y son bien conocidos para los expertos en la materia.

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Materiales y Métodos

[0099] Proteína fluorescente verde: Fue obtenida de Clontech, EE.UU., una secuencia de DNA que codifica la proteína fluorescente verde de Aequoria victoria (Prasher et al, 1992).

15 [0100] Proteína fluorescente roja: Fueron obtenidas de Clontech, EE.UU, secuencias de DNA que codifican las proteínas fluorescentes rojas (Matz et al., 1999) pDsRed2 y pDsRed2-nuc. Este constructo codifica una proteína obtenida a partir de Discosoma sp.

20 [0101] Se obtuvieron células COS y células HEK a partir de la Colección Americana de Cultivos Tipo, Washington,

D.C. Los medios de cultivo de células fueron preparados por los servicios de laboratorio de la Universidad de Toronto.

[0102] Se obtuvieron compuestos antagonistas y agonistas de varios proveedores comerciales tales como Sigma Chemical Company, EE.UU.

25 [0103] Se obtuvieron anticuerpos utilizados para la inmunodetección de marcadores epítopos a partir de las fuentes siguientes: El anticuerpo monoclonal anti-HA fue obtenido de Roche Diagnostics, EE.UU. El anticuerpo monoclonal anti-FLAG fue obtenido de Sigma Chemical Company, EE.UU. El anticuerpo monoclonal anti-c-myc fue obtenido de Santa Cruz, EE.UU.

30 [0104] El radioligando 3H-SCH 23390 que se usó en el ensayo de fijación a receptores fue obtenido de NEN Perkin Elmer, EE.UU.

Creación de constructos de DNA

35 [0105] Del sitio web de Genbank (http://www.nc-bi.nlm.nih.gov:80/entrez), establecido por la National Library of Science (Biblioteca Nacional de la Ciencia), se obtuvieron secuencias nucleotídicas que codifican GPCRs o transportadores. Una secuencia nucleotídica que codifica una proteína transmembrana seleccionada fue unida a una secuencia nucleotídica que codifica una proteína de señal detectable seleccionada. Los constructos fueron clonados en el sistema vector,

40 pEGFP (Clontech) o el vector pDsRed2-N1 ó el vector pcDNA3.

1a. Construcción del receptor de dopamina D1 humano con una NLS en la cola carboxilo proximal (hélice 8) y fusionado con GFP (D1-GFP y D1-NLS-GFP)

45 [0106] Usando el método de la PCR con las siguientes condiciones experimentales, fue sometido a PCR DNA que codifica el receptor de dopamina D1 humano en el vector pcDNA3. La mezcla de reacción contenía agua (32 microlitros), 10x tampón Pfu (Stratagene) (5 microlitros), dNTP (2'-desoxinucleosido 5'-trifosfato, 10mM) (5 microlitros), DMSO (5 microlitros), cebadores oligonucleotídicos (100 ng) (1 microlitro cada uno), DNA molde (100 ng) y enzima Pfu (5 unidades). El volumen total era de 50 microlitros. Se usaron las siguientes condiciones de PCR, un ciclo a 94ºC por

50 espacio de 2 min., 30-35 ciclos a 94ºC por espacio de 30 seg., 55ºC por espacio de 30 seg., 72ºC por espacio de 1 min., por ciclo, y a continuación un ciclo a 72ºC por espacio de 5 min.

[0107] Juego de cebadores para la amplificación del DNA que codifica el receptor de dopamina D1:

imagen13

EP 2073013

[0108] El sitio de restricción EcoR1 fue incorporado en el cebador HD1-P1, y el sitio de restricción Kpn1 fue incorporado al cebador HD1-P2. El producto de PCR, que no contenía codón de terminación, fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (de Clontech) en EcoR1 y Kpn1 y en marco (inframe) con el codón de iniciación de la proteína GFP.

[0109] La secuencia NLS, KKFKR del receptor de AT1 humano, fue insertada en DNA que codifica la base de TM7 (hélice 8) del receptor de dopamina D1 por PCR, sustituyendo la secuencia natural que codifica DFRKA.

[0110] El juego de cebadores para la construcción de DNA que codifica D1-NLS:

imagen14

[0111] Usando el DNA que codifica D1-GFP como molde, la PCR con los cebadores HD1-P1 y HD1-NLSF dio como

15 resultado un producto de 1.000 bp (PCR Nº1). Usando DNA que codifica D1-GFP, la PCR con los cebadores HD1-P2 y HD1-NLSR dio como resultado un producto de 300 bp (PCR Nº2). Una posterior PCR realizada con los cebadores HD1-P1 y HD1-P2 dio como resultado un producto de 1.300 bp usando el producto de la PCR Nº1 y el producto de la PCR Nº2 como moldes. El DNA resultante que codifica D1-NLS fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoR1 y Kpn1.

20 [0112] Todos los constructos adicionales que se describen a continuación se llevaron a cabo usando el mismo método de PCR y las mismas condiciones experimentales que se han descrito anteriormente para el receptor de dopamina D1, pero con cebadores específicos como se describe a continuación.

25 1b. Construcción del receptor de dopamina D1 humano que contiene una NLS y está fusionado con RFP (D1-NLS-RFP)

[0113] La secuencia NLS K K F K R fue insertada en el segmento de la hélice 8 de la cola de carboxilo intracelular del receptor D1 humano por el método de la PCR como se indica a continuación. Usando el DNA que codifica el D1

30 humano en el vector pcDNA3 como molde, se llevó a cabo la primera PCR con cebadores HD1-P1 y HD1-NLSR, obteniéndose como resultado de ello un producto de 1 kb. Se llevó a cabo una segunda PCR usando los cebadores HD1-P2 y HD1-NLSF, obteniéndose como resultado un producto de 300 bp. Usando los productos de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como moldes, se llevó a cabo la PCR final con los cebadores HD1-P1 y HD1-P2, lo cual generó un producto de 1,3 kp.

35 [0114] Se subclonó NLS de D1 en el vector pDsRed (Clontech) en EcoRI y Kpnl y se fusionó con RFP.

imagen15

D1 tipo salvaje: N P I I Y A F N A D F R K A F S T L L EP 2073013

Hélice 8 de D1NLS: N P I I Y A F N A K K F K R F S T L L

1c. Construcción del receptor D1 de dopamina con un marcador epítopo de hemaglutinina (HA) en el extremo amino-terminal

5 [0115] El marcador de HA es como sigue:

Secuencia nucleotídica: TACCCTTACGACGTGCCGGATTACGCC

Secuencia de aminoácidos de la HA: Y P Y D V P D Y A

10 [0116] El marcador epítopo de HA fue insertado en el extremo amino-terminal del receptor D1 humano usando D1pcDNA3 como molde con los cebadores siguientes:

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P2-Notl: 5’ ggccgccagctgcgagTTCAGGTTGGGTGCTGACCG 3’

20 El cDNA amplificado resultante (1,3 kb) fue subclonado en el vector pcDNA3 en BamH I y Not I.

D1 tipo salvaje: MRTLNTSAMDGTGLVV D1-marcador de HA: MGYPYDVPDYARTLNTSAMDGTGLVV

25 1d. Construcción del receptor D1 de dopamina humano con un epítopo de HA y una NLS en la cola de carboxilo proximal (hélice 8) (D1 HA-NLS)

[0117] Juego de cebadores para la amplificación por PCR de DNA que codifica D1NLS (hélice 8), usando DNA que codifica D1-HA como molde. Usando DNA D1-HA como molde con los cebadores T7 y HD1-NLSR, el DNA amplificado

30 resultante fue de 1.000 bp (PCR Nº 1). Usando DNA D1-HA como molde con los cebadores Sp6 y HD1-NLSR, el DNA resultante fue de 300 bp, (PCR Nº 2). Usando los cebadores T7 y Sp6 y el producto de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como moldes, el DNA resultante fue de 1.300 bp (PCR Nº 3).

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[0118] El D1 HA-NLS (hélice 8) obtenido como resultado de la PCR fue clonado con extremos romos en pcDNA3 en EcorV. Se secuenció el clon con la orientación correcta.

40 D1-HA tipo salvaje: NPIIYAFNADFRKAFSTLL D1HA-NLS (hélice 8): NPIIYAFNAKKFKRFSTLL

1e. Construcción del receptor D1 de dopamina con una NLS en el bucle intracelular 3, fusionado con GFP (D145 NLS-IC3-GFP) [0119] Juego de cebadores para la construcción del D1-NLS-IC3-EGFP: D1NLSF-IC3: 5’ GGAAAGTTCTTTTAAGAAGAAGTTCAAAAGAGAAAC 3’ 50 D1-NLSR-IC3: 5’ GTTTCTCTTTTGAACTTCTTCTTAAAAGAACTTTCC 3’ [0120] Usando el molde pcDNA3 de D1: PCR Nº 1: cebadores HD1-P1 y D1NLSR-IC3

EP 2073013

PCR Nº 2: cebadores HD1-P2 y D1 NLSF-IC3 (500 bp) PCR Nº 3: cebadores HD1-P1 y HD1-P2 usando PCR Nº 1 y PCR Nº 2 como moldes (1,3 kb)

El fragmento de DNA resultante que codifica D1-NLS-IC3 fue subclonado en el vector pEGFP en EcoR1 y Kpn1.

5 D1 tipo salvaje: Q P E S S F K M S F K R E T K V L D1-NLS-IC3: Q P E S S F K K K F K R E T K V L

[0121] La secuencia NLS KKFKR fue insertada en el segmento 3 del bucle IC del receptor D1 sustituyendo la secuencia 10 MFSKR, con el uso de pcDNA3 de D1 como molde.

[0122] Usando el DNA que codifica D1 en pcDNA3 como molde, se efectuó una PCR con los siguientes cebadores HD1-P1 y D1-NLSR-IC3, obteniéndose como resultado de ello un producto de 800 bp (PCR Nº 1). El uso de DNA que codifica D1 en pcDNA3 con los cebadores HD1-P2 y HD1-NLSF-IC3 dio como resultado un producto de 500 bp (PCR Nº

15 2). Una posterior PCR realizada con los cebadores HD1-P1 y HD1-P2 dio como resultado un producto de 1.300 bp usando el producto de la PCR Nº 1 y el producto de la PCR Nº 2 como moldes. El constructo resultante que codifica D1-NLS fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoR1 y Kpn1.

1f. Construcción del receptor de dopamina D1 humano con una NLS en el bucle intracelular 2 fusionado con 20 GFP (D1-NLS-IC2-GFP)

[0123] El conjunto de cebadores para la construcción de DNA que codifica D1 NLS-IC2 D1NLSF-IC2: 5’ CCGGTATGAGAAAAAGTTTAAACGCAAGGCAGCCTTC 3’

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[0124] Usando DNA que codifica el receptor de dopamina D1 en pcDNA3 como molde, la PCR con los cebadores HD1-P1 y D1-NLSR-IC2 (PCR Nº 1) dio como resultado un producto de 500 bp. El uso de DNA que codifica receptor de dopamina D1 en pcDNA3 como molde con los cebadores HD1-P2 y D1 NLSF-IC2 (PCR Nº 2) dio como resultado un

30 producto de 800 bp. Una posterior PCR realizada con los cebadores HD1-P1 y HD1-P2 usando PCR Nº 1 y PCR Nº 2 como moldes dio como resultado un producto de 1.300 bp.

[0125] El DNA resultante que codifica D1 NLS-IC2 PCR fue subclonado en el vector EGFP en EcoR1 y Kpn1.

35 D1 tipo salvaje: N P F R Y E R K M T P K A A F I L I D1-NLS-IC2: N P F R Y E K K F K R K A A F I L I

1g. Construcción del receptor de dopamina D1 humano con una NLS en el bucle intracelular 1 fusionado con GFP (D1-NLS-IC1-GFP)

40 [0126] El juego de cebadores para la construcción de DNA que codifica D1-NLS-IC1.

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[0127] Usando el DNA que codifica receptor de dopamina D1 en pcDNA3 como molde, la PCR con los cebadores HD1-P1 y D1-NLSR-IC1 (PCR Nº 1) dio como resultado un producto de 300 bp. Usando DNA que codifica receptor de dopamina D1 en pcDNA3 como molde, la PCR con los cebadores HD1-P2 y D1NLSF-IC1 dio como resultado un

50 producto de 1.000 bp (PCR Nº 2). Una posterior PCR realizada con los cebadores HD1-P1 y HD1-P2 usando la PCR Nº 1 y la PCR Nº 2 como moldes dio como resultado un producto de 1.300 bp.

[0128] El DNA resultante que codifica D1-NLS-IC1 fue subclonado en el vector pEGFP en EcoR1 y Kpn1.

55 D1 tipo salvaje: L V C A A V I R F R H L R S K V T N

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EP 2073013

humano.

M1-MET: 5’ CCCCACCTAGCCACCATGAACACTTC 3’ M1-STOP: 5’ GGGGACTATCAGCATTGGCGGGAGG 3’ 5 [0154] Juego de cebadores para MR1-EGFP

M1-PST: 5’ CCCCACCTGCAGCCACCATGAACACTTCAGCC 3’ M1-BAMH: 5’ GGGGAGGATCCGCGCATTGGCGGGAGGGAGTGC 3’

10 [0155] El sitio de restricción Pstl fue incorporado al cebador M1-PST, y el sitio de restricción BamHI fue incorporado al cebador M1-BAMH. El producto de PCR M1, que no contenía codón de terminación, fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP en Pstl y BamHI y en marco con el codón de iniciación de la proteína EGFP.

15 [0156] Juego de cebadores para M1-NLS EGFP

M1-NLSF: 5’ CGCACTCTGCAACAAAAAATTCAAACGCACCTTTCGCC 3’ M1-NLSR: 5’ GGCGAAAGGTGCGTTTGAATTTTTTGTTGCAGAGTGCG 3’

20 [0157] La secuencia NLS KKFKR fue insertada en el segmento TM7 del M1 por PCR, con el uso del molde MR1, sustituyendo la secuencia KAFRD. Usando el DNA que codifica MR1 como molde, la PCR con los siguientes cebadores M1-PST y M1-NLSR dio como resultado un producto de 1.200 bp (PCR Nº 1). Usando DNA que codifica MR1, una PCR con reacción por cebadores usando los cebadores M1-BAMH y M1-NLSF dio como resultado un producto de 100 bp (PCR Nº 2). Una posterior PCR realizada con los cebadores M1-PST y M1-BAMH dio como resultado un producto de

25 1.300 bp usando el producto de la PCR Nº 1 y el producto de la PCR Nº 2 como moldes. Este fragmento que codifica MR1-NLS fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción Pstl y BamHI.

8. Construcción de los receptores de serotonina (5HT1B) y NLS de serotonina fusionados con GFP (5HT1B-GFP y 5HT1B-NLS-GFP)

30 [0158] Juego de cebadores para la amplificación del DNA que codifica el receptor 5HT1 B a partir del plásmido pcDNA3 que codifica el receptor 5HT1 B.

5HT1B-E1: 5’GGGGCGAATTCGCCGCCATGGAGGAACCGGGTGC 3’ 35 5HT1B-KPN: 5’ GCAAACGGTACCGCACTTGTGCACTTAAAACGTA 3’

[0159] El sitio de restricción EcoR1 fue incorporado al cebador 5HT1B-E1 y el sitio de restricción Kpn1 fue incorporado al cebador 5HT1B-KPN. El producto de PCR 5HT1B, que no contenía codón de terminación, fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP en EcoR1 y Kpn1 y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.

40 [0160] Juego de cebadores para 5HT1 B-NLS EGFP

imagen23

45

[0161] La secuencia NLS KKFKR fue insertada en el segmento TM7 del 5HT1 B por PCR con el uso del molde 5HT1 B-EGFP, sustituyendo la secuencia EDFKQ. Usando el DNA que codifica 5HT1 B-EGFP como molde, una PCR con los siguientes cebadores 5HT1B-E1 y HD1-NLSF dio como resultado un producto de 1.100 bp (PCR Nº 1). Usando DNA

50 que codifica 5HT1 B-EGFP con los cebadores 5HT1 B-KPN y HD1-NLSR se obtuvo como resultado de ello un producto de 100 bp (PCR Nº 2). Una posterior PCR realizada con los cebadores 5HT1 B-E1 y 5HT1 B-KPN dio como resultado un producto de 1.200 bp usando el producto de la PCR Nº 1 y el producto de la PCR Nº 2 como moldes. El DNA resultante que codificaba 5HT1 B-NLS fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoR1 y Kpn1.

55 9. Construcción de los receptores beta2-adrenérgico (beta2-AR) y beta2-AR-NLS1 fusionados con GFP (beta2-AR-GFP y beta2AR-NLS-GFP)

[0162] Juego de cebadores para la amplificación del DNA que codifica el receptor beta2-AR de pcDNA3.

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T7: 5’ AATACGACTCACTATAG 3’

imagen24

5 [0163] El sitio de restricción Kpn1 fue incorporado al cebador beta2-Kpn. El producto beta2-AR, que no contenía codón de terminación, fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP en EcoR1 y Kpn1 y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.

10 [0164] La secuencia NLS KKFKR fue insertada en el segmento TM7 del beta2-AR por PCR con el uso del molde beta2-AR-EGFP, sustituyendo la secuencia PDFRI. Usando el DNA que codifica beta2-AR-EGFP como molde, una PCR con los siguientes cebadores T7 y B2-NLSR dio como resultado un producto de 1.100 bp (PCR Nº 1). Usando DNA que codifica beta2-AR-EGFP con los cebadores beta2-Kpn y B2-NLSF, se obtuvo como resultado de ello un producto de 300 bp (PCR Nº 2). Una posterior PCR realizada con los cebadores T7 y beta2-Kpn dio como resultado un producto de

15 1.300 bp usando el producto de la PCR Nº 1 y el producto de la PCR Nº 2 como moldes. El DNA resultante que codificaba beta2-NLS fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoR1 y Kpn1.

10. Construcción del receptor beta 2-adrenérgico con una NLS alternativa y fusionado con GFP (beta2-NLS2-GFP)

20 [0165] Juego de cebadores para la amplificación del DNA que codifica el receptor beta2-NLS2 de pcDNA3.

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[0166] Usando el DNA que codifica beta2-AR-GFP como molde, una PCR con los siguientes cebadores T7 y B2D1NLSR dio como resultado un producto de 1.000 bp (PCR Nº 1). Usando DNA que codifica beta2-AR-GFP con los cebadores beta2-Kpn y B2D1NLSF se obtuvo como resultado de ello un producto de 300 bp (PCR Nº 2). Una posterior

30 PCR realizada con los cebadores T7 y beta2-Kpn usando la PCR Nº 1 y la PCR Nº 2 como moldes dio como resultado un producto de 1.300 bp. El DNA resultante que codificaba beta2-NLS2 fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoR1 y Kpn1.

[0167] La secuencia NLS AFSAKKFKR fue insertada en el segmento TM7 del beta2-AR por PCR usando el molde 35 beta2-GFP, sustituyendo la secuencia CRSPDFRIA.

[0168] El DNA resultante que codifica beta2-NLS2 fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoR1 y Kpn1.

40 11. Construcción del receptor beta 2-adrenérgico con una NLS alternativa y fusionado con GFP (beta2-NLS3-GFP)

[0169] La secuencia NLS K K F K R fue insertada en otra ubicación del segmento proximal de la cola de carboxilo del beta2-AR. Usando el DNA que codifica el beta2AR en el vector pcDNA3 como molde, se efectuó una PCR con los

45 vectores T7 y r B2-NLS3R, siendo obtenido como resultado de ello un producto de 1.000 bp. Una PCR usando los cebadores Beta2-Kpn y B2-NLS3F dio como resultado un producto de 300 bp. Usando los productos de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como moldes, una PCR con los cebadores T7 y Beta2-Kpn generó un producto de 1.300 bp (beta2AR-NLS3) que fue subclonado en el vector pEGFP en EcoR1 y Kpn1.

50 [0170] Juego de cebadores para Beta2-NLS3-GFP

B2-NLS3F: 5’ CTGCCGGAGCAAAAAATTCAAAAGAGCCTTCCAGGAGC 3’ B2-NLS3R: 5’ CCTGGAAGGCTCTTTTGAATTTTTTGCTCCGGCAGTAG 3’

55

EP 2073013

Beta2 tipo salvaje: N P L I Y C R S P D F I R A F Q E L L Beta2AR-NLS3: N P L I Y C R S K K F K R A F Q E L L

12. Construcción del transportador de dopamina fusionado con GFP (DAT-GFP)

5 [0171] El cDNA de longitud completa que codifica el transportador de dopamina humano (hDAT) fue amplificado usando DAT en pcDNA3 como molde por PCR con el cebador T7 y el cebador DT-1 (5' CGTCTCTGCTCCCTGGTACCGCCACCTTGAGCCAGTGG 3'). Este producto de PCR no contenía codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (de Clontech) en los sitios de restricción EcoR1 y

10 Kpn1 y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.

13a. Construcción del transportador de dopamina humano que contiene una NLS y fusionado con RFP (DAT-NLS-RFP)

15 [0172] El cDNA que codifica el transportador de dopamina humano (hDAT) fue amplificado por PCR con los cebadores 1718 y hDAT-NLSF, produciendo un fragmento de 100 bp. El cDNA que codifica el transportador de dopamina humano (hDAT) fue también amplificado por PCR con los cebadores T7 y hDAT-NLSR, produciendo un fragmento de 1,7 kB. Estos dos fragmentos de PCR fueron usados como moldes con los cebadores T7 y 1718, obteniéndose como resultado de ello un fragmento de 1,8 kB.

20 Cebador T7: 5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’ Cebador 1718: 5’ CGTCTCTGCTCCCTGGTACCGCCACCTTGAGCCAGTGG 3’ hDAT-NLSF: 5’ CTATGCGGCCAAAAAGTTCAAAAGACTGCCTGGGTCC 3’ hDAT-NLSR: 5’ CAGGCAGTCTTTTGAACTTTTTGGCCGCATAGATGGGC 3’

25 [0173] Este producto de PCR fue subclonado unidireccionalmente en el vector pRFP en EcoR1 y Kpn1 y en marco con el codón de iniciación de la proteína RFP.

[0174] El fragmento de PCR resultante codificaba la secuencia NLS K K F K R tras TM12 como sigue:

30 DAT tipo salvaje: S S M A M V P I Y A A Y K F C S L P G S F R E K DAT-NLS: S S M A M V P I Y A A K K F K R L P G S F R E K

13b. Construcción del transportador de dopamina humano con una NLS y fusionado con GFP (DAT-NLS-GFP)

35 [0175] La secuencia NLS K K F K R fue insertada en la cola de carboxilo proximal a continuación del segmento 12 transmembrana del DAT humano. Usando el DNA que codifica el cDNA del DAT humano en pcDNA3 como molde, la primera PCR fue realizada con los cebadores T7 y hDAT-NLSR, obteniéndose como resultado de ello un producto de 1,7 kb. Se llevó a cabo una segunda PCR usando los cebadores 1718 y hDAT-NLSF, como resultado de lo cual se

40 obtuvo un producto de 100 bp, y luego usando los productos de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como moldes se llevó a cabo la PCR final con los cebadores T7 y 1718, con lo cual fue generado un producto de 1,8 kp (DAT-NLS) que fue subclonado en el vector pEGFP (Clontech) en EcoR1 y Kpn1 y fusionado con GFP.

Secuencias de los cebadores:

45 hDAT-NLSF: 5’ CTATGCGGCCAAAAAGTTCAAAAGACTGCCTGGGTCC 3’ hDAT-NLSR: 5’ CAGGCAGTCTTTTGAACTTTTTGGCCGCATAGATGGGC 3’

DAT humano tipo salvaje: S S M A M V P I Y A A Y K F C S L P G S F R E K 50 NLS-DAT humano: S S M A M V P I Y A A K K F K R L P G S F R E K

14. Construcción del transportador de serotonina humano fusionado con GFP (SERT-GFP)

[0176] El cDNA de longitud completa del SERT humano fue aislado por PCR de pcDNA3 que contenía el cDNA del 55 SERT, usando los dos cebadores siguientes:

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SERT-KPN: 5’ CCTCTCGGTGAGTGGTACCGCCACAGCATTCAAGCGG 3’

[0177] Este producto de PCR no contenía codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en HindIII y KpnI y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.

imagen27

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[0186] Este producto de PCR (3.600 bp) no contenía codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en Xhol y Kpnl y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.

5 18. Construcción del transportador de serotonina humano con una NLS y fusionado con GFP (SERT-NLS-GFP) [0187] La secuencia NLS KKFKR fue insertada en DNA que codifica el SERT por PCR, sustituyendo la secuencia natural que codifica GTFKE.

10 [0188] Juego de cebadores para la amplificación del DNA que codifica SERT-NLS: SERT-NLSF: 5’ GATCATCACTCCAAAGAAATTTAAAAGACGTATTATT 3’

imagen28

15 [0189] Usando el cDNA del SERT humano en pcDNA3 como molde, una PCR con los cebadores SERT-HIND y SERT-NLSR dio como resultado un producto de 1.800 bp (PCR Nº 1). Usando DNA que codifica SERT como molde con los cebadores SERT-KPN y SERT-NLSF se obtuvo como resultado de ello un producto de 100 bp (PCR Nº 2). Una posterior PCR realizada con los cebadores SERT-HIND y SERT-KPN usando el producto de la PCR Nº 1 y de la PCR

20 Nº 2 como molde dio como resultado un producto de 1.900 bp.

[0190] El producto de PCR resultante codificó la mutación de la secuencia NLS K K F K R tras TM12 del SERT como se indica a continuación:

25 SERT humano tipo salvaje: R L I I T P G T F K E R I I K S I T SERT humano: R L I I T P K K F K R R I I K S I T

[0191] Este producto de PCR no contenía codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en HindIII y Kpnl y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP. 30

19. Construcción del receptor metabotrópico de glutamato tipo 4 fusionado con GFP, con y sin NLS (mGluR4-GFP y mGluR4-NLS-GFP)

[0192] El DNA que codifica mGluR4 fue aislado de un cDNA de rata usando el juego de cebadores

35 GLUR4-HIND: 5’ GGGTCTCTAAGCTTGCCGCCATGTCCGGGAAGGG 3’ GLUR4-ECORI: 5’ CCGCGGCCCGGAATTCGGATGGCATGGTTGGTG 3’

[0193] Un sitio de restricción HindIII fue incorporado al cebador GLUR4-HIND, y un sitio de restricción EcoRI fue

40 incorporado al cebador GLUR4-ECORI. El producto de PCR mGluR4, que no contenía codón de terminación, fue subclonado unidireccionalmente en el vector EGFP (Clontech) en HindIII y Ecorl y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP.

[0194] La NLS KKFKR fue introducida en el DNA que codifica el mGluR4 sustituyendo la secuencia natural KRKRS. 45 [0195] Juego de cebadores para la amplificación del DNA para introducir la NLS en el mGluR4-EGFP de rata

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50

[0196] Usando el DNA de rata que codifica GluR4 como molde, una PCR con los cebadores GLUR4-HIND y GLUR4-NLSR dio como resultado un producto de 2.600 bp (PCR Nº 1). Usando DNA que codifica GluR4 con los cebadores GLUR4-ECORI y GLUR4-NLSF fue obtenido como resultado de ello un producto de 160 bp (PCR Nº 2). Una posterior 55 PCR realizada usando el producto de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como molde, con los cebadores GLUR4-HIND y

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GLUR4-ECORI, dio como resultado un producto de 2.760 bp.

[0197] La PCR resultante contenía la mutación de la secuencia NLS K K F K R como se indica a continuación:

5 mGluR4 tipo salvaje de rata: F H P E Q N V P K R K R S L K A V V T A A T mGluR4 de rata: F H P E Q N V P K K F K R L K A V V T A A T

[0198] Este producto de PCR fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en HindIII y EcoRI y en marco con el codón de iniciación de la proteína GFP. 10

20. Construcción del Receptor de Insulina Humano fusionado con GFP (IR-GFP) [0199] El cDNA de longitud completa del IR en el plásmido pRK5 fue aislado con los dos cebadores de PCR:

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[0200] El producto de PCR (4,2 kb) no contenía codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el vector 20 pEGFP (Clontech) en HindIII y Apal y fusionado con la proteína GFP.

21. Construcción del Receptor de Insulina Humano con una NLS y fusionado con GFP (IR-NLS-GFP)

[0201] La secuencia NLS KKFKR fue introducida en el receptor de insulina humano para sustituir la secuencia LYASS.

25 [0202] Usando el cDNA del receptor de insulina humano en el vector pRK5 como molde, la primera PCR Nº 1 con los cebadores HIR-HIND y HIR-NLSR generó un producto de 2,9 kb, la segunda PCR Nº 2 con los cebadores HIR-APA y HIR-NLSF generó un producto de 1,3 kb, y luego usando los productos de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como moldes, la tercera PCR Nº 3 produjo un fragmento con los cebadores HIR-HIND y HIR-APA (4,2 kb). Este fragmento no contenía

30 codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP en HindIII y Apal y quedó así fusionado con la proteína GFP.

Cebadores para HIR-NLS:

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22. Construcción del receptor Eritropoyetina humano fusionado con GFP (EPO-GFP)

40 [0203] Usando el método de la PCR y el cDNA en el vector pc3.1 que codifica el receptor de Eritropoyetina humano (EPO) como molde, el cDNA de longitud completa fue aislado con los cebadores siguientes:

T7: 5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’ 45

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[0204] Este producto de PCR (1,6 kb) no contenía codón de terminación y fue subclonado unidireccionalmente en el

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EGF-NLSF: 5’ CACATCGTTCGGAAGAAGTTTAAGCGGAGGCTGCTGC 3’

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5 EGFR humano tipo salvaje: R R R H I V R K R T L R R L L Q E R E EGFR-NLS humano: R R R H I V R K K F K R R L L Q E R E

26. Construcción del receptor de dopamina D1 humano que contiene 2 NLSs y está fusionado con RFP (D110 NLS(Hélice 8 y Cola C)-RFP)

[0209] Una segunda secuencia NLS K K K R K fue insertada en el segmento de la cola de carboxilo del D1-NLS-Hélice 8 humano por el método de la PCR como se indica a continuación. Usando el DNA que codifica el D1-NLS-Hélice 8 humano en vector pDsRed como molde, se llevó a cabo la primera PCR con los cebadores HD1-P1 y HD1-NLSCR

15 dando como resultado un producto de 1,2 kb, y se llevó a cabo una segunda PCR usando los cebadores HD1-P2 y HD1-NLSCF y la misma dio como resultado un producto de 100 bp. Luego, usando los productos de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como moldes, se llevó a cabo la PCR final con los cebadores HD1-P1 y HD1-P2, con lo cual fue generado un producto de 1,3 kp (D1-NLS-Hélice 8 y cola C) que fue subclonado en el vector pDsRed en EcoRI y Kpnl y fusionado con la proteína DsRed.

20 Secuencias de los cebadores:

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30 D1 tipo salvaje: N P I I Y A F N A D F R K A F S T L L...........S S E D L K K E E A A G I A 35 D1-NLS (Hélice 8 y cola C): N P I I Y A F N A K K F K R F S T L L............S S E D L K K K R K A G I A

27. Construcción del receptor de opioides Mu fusionado con GFP (Mu-GFP) 40

[0210] Usando el DNA que codifica el receptor de opioides Mu en vector pcDNA3 como molde, se efectuó una PCR con

los dos cebadores siguientes:

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El sitio de restricción EcoRI fue incorporado al cebador RATMU-1. El sitio de restricción Kpnl fue incorporado al cebador RATMU-2.

5 [0211] El producto de PCR (1,2 kb) que no contenía codón de terminación fue luego subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en EcoR1 y Kpn1 y fue así fusionado con GFP.

28. Construcción del receptor de opioides Mu que contiene una NLS y está fusionado con GFP (Mu-NLS-GFP)

10 [0212] La secuencia NLS K K F K R fue insertada en el segmento de la cola de carboxilo proximal (hélice 8) del receptor de opioides Mu por PCR como se indica a continuación. Usando el DNA que codifica el Mu de rata en pcDNA3 como molde, se llevó a cabo la primera PCR con los cebadores RATMU1 y MU-NLSR, siendo obtenido como resultado de ello un producto de 1.000 bp, y se llevó a cabo otra segunda PCR usando los receptores RATMU-2 y MU-NLSF, como

15 resultado de lo cual fue obtenido un producto de 200 bp. Usando los productos de la PCR Nº 1 y de la PCR Nº 2 como moldes, se llevó a cabo la PCR final con los cebadores RATMU1 y RATMU2, con lo cual fue generado un producto de

1.200 bp (Mu-NLS) que fue subclonado en el vector pEGFP en EcoR1 y Kpn1 y fusionado con GFP.

Secuencias de los cebadores: 20

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25 MU-NLSF: 5’GCCTTCCTGGATAAAAAATTCAAGCGATGC 3’ MU-NLSR: 5’ GCATCGCTTGAATTTTTTATCCAGGAAGGCG 3’

Cultivo y transfección celular

30 [0213] Células de riñón de mono COS-7 y células de riñón embrionario humano HEK293T (Colección Americana de Cultivos Tipo, Manssa, VA) fueron mantenidas en cultivo monocapa a 37ºC y con un 5% de CO2 en medio esencial mínimo suplementado con un 10% de suero bovino fetal y antibióticos. Para la recolección de las membranas celulares, placas de 100 mm de células fueron transfectadas transitoriamente con una confluencia de un 70-80% usando reactivo de lipofectamina (Life Technologies, Rockwille, MD). Para los estudios de microscopía confocal, placas de 60 mm de

35 células fueron transfectadas transitoriamente con una confluencia de un 10-20% usando reactivo de lipofectamina. Seis horas después de la transfección, la solución fue retirada y se añadió medio nuevo, que fue nuevamente sustituido por medio nuevo 24 horas después de la transfección.

[0214] El medio de transfección fue preparado mezclando 120 microlitros de medio sin antibióticos y/o suero bovino fetal

40 (FBS) y 15 microlitros de lipofectamina en un tubo de 14 ml. 2 microgramos de constructo de DNA que codifica la proteína de fusión deseada y 120 microlitros de medio fueron mezclados y añadidos al tubo de 14 ml, lo cual se mezcló lentamente y se incubó a temperatura ambiente por espacio de 25 minutos. Fueron añadidos y mezclados otros 4 ml de medio. Si se transfectan múltiples proteínas transmembrana, los cDNAs se mezclan y transfectan juntamente. El medio de crecimiento fue retirado de una placa de células y sustituido por la mezcla de transfección del tubo de 14 ml. Se

45 incubaron células con la mezcla de transfección por espacio de un periodo de tiempo de 5 -6 horas, después de lo cual la mezcla fue retirada y sustituida por medio de crecimiento regular que contenía FBS y antibióticos. Las células fueron incubadas con un cambio de medio de crecimiento regular el segundo día.

Tratamiento con Compuestos de Ensayo

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Protocolo para determinar el retardo de la translocación hacia fuera de la superficie celular

[0215] Los compuestos de ensayo fueron preparados en una solución concentrada de concentración 1 milimolar y fueron diluidos en medio de crecimiento para alcanzar una concentración final situada entre 10 nanomolar y 10 55 micromolar al ser añadidos a placas de células. Se adicionó a las células medio nuevo con contenido de compuesto a

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núcleos puros.

Ejemplo 1: Receptor D1 de dopamina fusionado con la proteína fluorescente roja (D1-RFP) o que contiene una NLS y está fusionado con la proteína fluorescente roja (D1-NLS-RFP)

[0223] La secuencia del receptor D1 de dopamina, que no contiene una NLS, fue modificada para sustituir los aminoácidos DFRKA en la base del dominio TM7 por la secuencia NLS KKFKR (que se corresponde con la NLS del receptor de AT1 humano), como se describe en los métodos (véase la Figura 1). Fueron creados constructos de DNA que codifican las proteínas de fusión del receptor de dopamina D1 D1-RFP y D1-NLS-RFP. Células COS fueron transfectadas con DNA que codifica D1-NLS-RFP o D1-RFP (2 microgramos) e incubadas por espacio de 24 y 48 horas. Las células fueron examinadas por microscopía confocal con 100 aumentos. Las células fueron contadas manualmente en 8 a 10 campos microscópicos y se calculó el etiquetado porcentual en distintos compartimentos subcelulares.

[0224] A las 24 y 48 horas, las células transfectadas con D1-RFP presentaban expresión en la superficie celular en la mayoría de las células, mientras que las células transfectadas con D1-NLS-RFP presentaban poca expresión del receptor en la superficie celular, con localización nuclear en un 60% de las células a las 24 horas, y en un 80% de las células a las 48 horas.

Ejemplo 2: Proteína de fusión del receptor D1 de dopamina que contiene una NLS (D1-NLS-RFP) y tratada con antagonista

[0225] Células COS fueron transfectadas con un constructo que codifica D1-NLS-RFP y con D1 de tipo salvaje (2 microgramos) por espacio de 48 horas. A las 6, 22, 30 y 42 horas tras la transfección, las células fueron tratadas con el antagonista del receptor D1 de dopamina SCH23390 (concentración final 10 micromolar). Asimismo, a las 6, 22, 30 y 42 horas tras la transfección, las células fueron tratadas con el antagonista (+)butaclamol (concentración final 10μM). Las células de control no recibieron tratamiento con el antagonista.

[0226] A las 48 horas, la mayor parte de células de control tenía D1-NLS-RFP detectable en el núcleo. En contraste con ello, las células tratadas con antagonista tenían en su mayoría fluorescencia solamente en la superficie de la célula, mientras que el 42% tenía fluorescencia tanto en la superficie como en el núcleo.

Ejemplo 3: Receptor D1 de dopamina (D1-GFP) coexpresado con receptor D1 que contiene una NLS (D1-NLS)

[0227] Células HEK fueron transfectadas con constructos de DNA que codifican D1-NLS (3 microgramos) y/o D1-GFP (1,5 microgramos), y fueron incubadas por espacio de 48 horas. Las células fueron también transfectadas con un plásmido que codifica DsRed-NUC para verificar la localización del núcleo (1 microgramo).

[0228] Las células fueron también transfectadas con DNA que codifica D1-GFP (2 microgramos), y fueron incubadas por espacio de 48 horas y examinadas por microscopía confocal.

[0229] El D1-GFP expresado en solitario puso de manifiesto que el 90% de las células presentaba etiquetado en la superficie celular y el 10% presentaba etiquetado tanto nuclear como en la superficie celular. Con cualquier DNA que codifica una transfección de GPCR, en hasta un 10% de las células puede observarse una localización nuclear.

[0230] Las células que expresaron D1-GFP y D1-NLS presentaron un 35% de células con etiquetado tanto nuclear como en la superficie celular, y un 70% con expresión del receptor en la superficie celular solamente. Este experimento indicó que tenía lugar juntamente un tráfico de D1-GFP junto con D1-NLS como resultado de la oligomerización del D1-NLS y el D1-GFP.

Ejemplo 4: El receptor D1 de dopamina que contenía una NLS (D1-NLS-GFP) fue tratado con un antagonista en un estudio de la respuesta a la dosis

[0231] Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica D1-NLS-GFP (2 microgramos) y D1-WT (6 microgramos) por espacio de 48 horas. Estas células fueron tratadas a las 6 horas tras la transfección con SCH-23390 (10 micromolar) o (+)butaclamol (10 micromolar). El medio que contenía antagonista fue cambiado a las 6, 22, 30 y 42 horas tras la transfección. Las células de control no recibieron tratamiento con antagonista.

[0232] A continuación del tratamiento con SCH-23390 por espacio de 48 horas, un 58% de las células presentaba expresión de D1-NLS-GFP en la superficie celular, menos de un 10% de las células presentaba expresión del receptor en el núcleo, y un 32% de las células presentaba expresión del receptor tanto en la superficie de la célula como en el núcleo.

[0233] A continuación del tratamiento con (+)butaclamol por espacio de 48 horas, un 62% de las células presentaba expresión del receptor D1-NLS-GFP en la superficie de la célula, un 10% presentaba expresión del receptor en el

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condición experimental, y se muestran en la Figura 2. Se produjo un efecto, dependiente de la dosis, del butaclamol para retener receptor en la superficie celular, indicando que este antagonista reducía el tráfico del receptor desde la superficie celular. Así, puede utilizarse fluorometría para detectar el receptor retenido en la superficie celular.

Ejemplo 43: Expresión del receptor D1 de dopamina con una NLS insertada (HA-D1-NLS), y bloqueo del efecto de respuesta a la dosis de antagonista por parte del agonista y detección con fluorometría

[0358] Los pocillos de una placa multipocillo fueron recubiertos con poli-L-ornitina y fueron luego plaqueados con 50.000 células por pocillo. Las células fueron transfectadas con DNA que codifica un receptor D1-NLS marcado con epítopo de HA y tratadas con el antagonista SCH 23390 (de 1 nanomolar a 1 micromolar) con o sin el agonista SKF 81297 (1 micromolar) a lo largo de un periodo de tiempo de 48 horas. A continuación de esto, las células fueron fijadas con paraformaldehído, y se detectaron receptores de superficie celular con un anticuerpo anti-HA de rata y luego con un anticuerpo anti-rata de cabra conjugado con FITC. La señal fluorescente fue detectada por fluorometría (Cytofluor). Los resultados son el promedio de cinco pocillos por condición experimental. Se produjo un efecto, dependiente de la dosis, del SCH 23390 para retener receptor en la superficie celular, indicando que este antagonista redujo el tráfico del receptor desde la superficie celular. La adición concomitante de agonista redujo el efecto del antagonista (Figura 3). Así, la acción del agonista puede ser detectada por medio del bloqueo del efecto del antagonista, y puede utilizarse fluorometría para cuantificar el efecto del agonista.

Ejemplo 43b: Expresión del receptor D1 de dopamina con una NLS insertada (HA-D1-NLS), y bloqueo del efecto antagonista mediante la respuesta a la dosis de agonista y detección con fluorometría

[0359] Células HEK fueron transfectadas con HA-D1-NLS en una placa multipocillo que fue recubierta con poli-L-ornitina con una concentración de 50.000 células por pocillo. Las células fueron tratadas con el antagonista SCH 23390 (0,5 micromolar) por espacio de 48 horas. Durante la última hora de incubación fue añadido el agonista SKF 81297 (de 100 nanomolar a 1 micromolar) junto con SCH 23390. A continuación de esto, las células fueron fijadas con paraformaldehído, y los receptores de superficie celular fueron detectados con un anticuerpo anti-HA de rata y luego con un anticuerpo anti-rata de cabra conjugado con FITC. La señal fluorescente fue detectada por fluorometría (Cytofluor). Los resultados son el promedio de cinco pocillos por condición experimental.

[0360] El tratamiento con SCH 23390 retuvo HA-D1-NLS en la superficie celular (Figura 4, Barra 1 frente a Barra 6). La adición a corto plazo del agonista redundó en un bloqueo, dependiente de la dosis, del efecto del SCH 23390. Al haber sido el SCH 23390 retirado de las células durante la última hora de incubación (y en ausencia de agonista), ello redundó en una pérdida de un 33% de receptores HA-D1-NLS de la superficie celular (Figura 4, Barra 5 frente a Barra 6), mientras que la adición de agonista SKF 81297 100 nanomolar en presencia continuada de SCH 23390 redundó en una pérdida de un 66% de receptores de la superficie celular (Figura 4, Barra 4 frente a Barra 6), y hasta una pérdida de un 78% de receptores con la adición de SKF 81297 1 micromolar (Figura 4, Barra 2 frente a Barra 6).

[0361] El efecto del antagonista SCH 23390 redundó en una retención del receptor en la superficie celular, indicando que este antagonista reducía el tráfico de receptor desde la superficie celular. La adición concomitante de agonista redujo el efecto antagonista y aceleró la retirada del receptor fuera de la superficie celular de una manera sensible a la dosis. Así, los compuestos que interaccionan pueden ser detectados por medio del bloqueo del efecto de compuestos que retienen el receptor que contiene NLS en la superficie celular, y puede utilizarse fluorometría para cuantificar el efecto.

Ejemplo 44: Expresión del receptor D1 de dopamina con una NLS insertada (D1-NLS), tratamiento con (+)butaclamol 10 micromolar y detección con fijación del radioligando

[0362] Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica D1-NLS y tratadas con (+)butaclamol (10 micromolar), o se dejaron sin tratar. Tras haber transcurrido 48 horas, las células fueron lavadas, recolectadas, lisadas y homogeneizadas con un politrón. La fracción de membrana fue recogida por centrifugación y fue luego estratificada con solución de sacarosa al 35% y centrifugada a 30.000 rpm a 4 grados C por espacio de 90 min. para recoger la fracción pesada de membrana.

[0363] Las fracciones de membrana fueron sometidas a ensayo de fijación del radioligando usando [3H]-SCH23390 con (+)butaclamol (10 micromolar) usado para definir la fijación específica. La incubación fue a temperatura ambiente por espacio de 2 horas, efectuándose a continuación una filtración rápida y una cuantificación por recuento de centelleo.

[0364] El tratamiento con antagonista del D1-NLS impidió su translocación fuera de la superficie celular al núcleo, y el receptor retenido en la superficie celular fue cuantificado mediante ensayo de fijación del radioligando (Figura 5).

Ejemplo 45: Expresión del receptor D1 de dopamina con una NLS insertada (D1-NLS), tratamiento con (+)butaclamol 500 nanomolar y detección con fijación del radioligando

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[0375] El LDL-NLS-GFP se expresó en el núcleo en un 22% de las células, y en la superficie celular en un 67%. La incorporación de una NLS al receptor de LDL indujo translocación del receptor al núcleo.

5 Ejemplo 50: Expresión del receptor de eritropoyetina (receptor de citoquina) EPO-GFP y EPO-NLS-GFP

[0376] Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica EPO-NLS-GFP (2 microgramos). Células HEK fueron transfectadas con EPO-GFP (2 microgramos). Las células fueron también transfectadas con DsRed-NUC (2 microgramos). Las células fueron incubadas por espacio de 48 horas y fueron examinadas por microscopía confocal.

10 [0377] El EPO-NLS-GFP estaba situado en el núcleo de un 72% de células y en la superficie celular en un 0% de células. El EPO-GFP estaba situado en la superficie celular en un 79% de las células, y un 28% de las células tenía expresión del receptor en el núcleo. La incorporación de una NLS a la secuencia del receptor de EPO indujo una translocación desde la superficie celular al núcleo.

15 Ejemplo 51: Expresión del transportador de serotonina con una NLS (SERT-NLS-GFP) y tratamiento con sertralina

[0378] Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica SERT-NLS-GFP (2 microgramos de DNA) y tratadas con sertralina (concentración final 500 nanomolar) por espacio de 48 horas. A las 6, 22, 30 y 42 horas tras la 20 transfección, las células fueron tratadas con sertralina. Las células fueron examinadas por microscopía confocal.

[0379] En las células no tratadas que expresaron SERT-NLS-GFP, un 0% de las células tenía expresión del transportador en la superficie celular, y un 75% de las células tenía expresión del transportador en el núcleo y en el citoplasma.

25 [0380] A continuación del tratamiento con sertralina, un 69% de las células tenía expresión del transportador SERT-NLS-GFP en la superficie celular y en el citoplasma, y un 21% de las células tenía expresión del transportador en el núcleo y en el citoplasma. Así, el tratamiento con sertralina inhibió la translocación del SERT-NLS-GFP desde la superficie celular y su tráfico al núcleo.

30 Ejemplo 52: Expresión del receptor de dopamina D1 con una NLS alternativa (D1-NLS2-GFP) y tratamiento con antagonistas

[0381] Células HEK fueron transfectadas con DNA que codifica D1-NLS2-GFP (2 microgramos) y tratadas con 35 (+)butaclamol o SCH 23390 (1 micromolar) por espacio de 48 horas. Los núcleos fueron visualizados con DsRed-nuc (2 microgramos). Las células fueron examinadas por microscopía confocal.

[0382] Con tratamiento con butaclamol, un 81% de las células tenía receptor en la superficie celular o en el citoplasma, y un 19% de las células tenía expresión del receptor en el núcleo. Con tratamiento con SCH 23390, un 78% de las 40 células tenía receptor en la superficie celular o en el citoplasma, y un 22% de las células tenía expresión del receptor en el núcleo.

[0383] En las células no tratadas, un 89% de las células tenía expresión del receptor en el núcleo y en el citoplasma.

45 [0384] Así, el tratamiento con los antagonistas D1 de dopamina impidió la translocación del receptor D1-NLS2-GFP desde la superficie y su tráfico al o hacia el núcleo.

[0385] La presente invención no queda limitada a las características de las realizaciones que aquí se han descrito, sino que incluye todas las variaciones y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones. 50

REFERENCIAS:

[0386]

55 Bailey et al., (2001), Expert Opinion in Therapeutics, v.11, p. 1861-1887;. Barak et al., (1997), J. Biol. Chem., v.272, p. 27497-27500; Chen et al., (2000), Am. J. Physiol. Renal Physiol., v.279, F440-F448; George et al., (2000), J. Biol. Chem., v.275, p. 26128-26135; George et al., (2002), Nature Reviews (2002), v.1, p. 808-820;

60 Gorlich et al., (1996), Science, v.271, p. 1513-1518; Grotzinger, (2002), Biochim. Biophys. Acta, v. 1592, p. 215-223; Hailey et al., (2002), Methods in Enzymology, v. 351, p.34-41; Hanahan et al., (1996), Cell, v. 86, p. 353-364; Howard et al., (2001), Trends in Pharmacol. Sci., v.22, p.132-140;

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Proteína Secuencia de Localización Nuclear

HIV-1 IN KRK-(22 aa)-KELQKQITK a1 T-ag vegetal PKKKRKV T-agáCK2 SSDDEATADSQHSTPPKKKRKV Opaco-2 RKRK-(7 aa)-RRSRYRK Proteína R (Maíz) MISEALRKA N1N2 RKKRK-(9 aa)-KAKKSK RAG-1, proteína 1 activadora de la recombinación; RCP, proteína de los glóbulos rojos; RB, proteína del retinoblastoma; STAT, transductor de señales y activador de la transcripción (TF); CBP80, proteína de unión a la caperuza; LEF, factor estimulador linfoide; EBNA, antígeno nuclear del virus de Epstein-Barr; IN, HIV-1 integrasa; tTG, transglutaminasa tisular; ECP, proteína de célula infectada.

Claims

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