JP2003532383A - ヒトポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体 - Google Patents

ヒトポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体

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polypeptide
sequence
antibody
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polypeptides
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スティーブン エム． ルーベン，
ヤング シ，
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Human Genome Sciences Inc
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なヒトポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする遺伝子のコード領域を含む単離された核酸に関する。また、ベクター、宿主細胞、抗体およびヒトポリペプチドを産生するための組換え方法が提供される。本発明はさらに、これらの新規なヒトポリペプチドに関する障害を診断および処置するために有用な診断方法および治療方法に関する。本発明は、被験体における病理学的状態、または病理学的状態に対する感受性を診断する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、新規ヒトタンパク質に関する。より詳細には、新規ヒトポリペプチ
ドをコードする、単離された核酸分子を提供する。新規ヒトポリペプチドおよび
これらのポリペプチドに結合する抗体を提供する。ベクター、宿主細胞ならびに
ヒトポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを生成するための組み換え方
法および合成方法もまた、提供する。本発明はさらに、これらの新規ヒトポリペ
プチドに関する障害の診断、処置、予防および／または予知のために有用な診断
方法および治療方法に関する。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドの、アゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリー
ニング方法に関する。本発明はさらに、本発明のこのポリペプチドの産生および
機能を阻害するための方法および／または組成物に関する。
【０００２】 （発明の背景） ヒトゲノムは、その各々が生命の維持において重要な機能を果たす約１００，
０００の遺伝子を含むと見積もられている。これらの約１００，０００の遺伝子
の各々は、その構造および／または機能に基づいて分類され得る対応するタンパ
ク質をコードする。いくつかのタンパク質は分泌され、一方、他のタンパク質は
膜結合タンパク質として存在するかまたは細胞内に存在する。タンパク質の配列
は実質的に変化するが、多くのパターンおよび全体的な特性は、例えば、アミノ
末端シグナル配列のように共有される。
【０００３】 例えば、分泌タンパク質のようないくつかのタンパク質は、タンパク質輸送を
容易にするアミノ末端シグナル配列を含む。このアミノ末端シグナル配列は、リ
ボソームのアセンブリ部位から特定の細胞の位置または細胞外の位置へこのタン
パク質を指向し、または標的化する。輸送は、以下の工程のいくつかの任意の組
み合わせを伴い得る：シャペロンとの接触、変性（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）、レセ
プターおよび／または孔複合体（ｐｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）との相互作用、エ
ネルギーの添加および再折り畳み。さらに、細胞外タンパク質は、不活性な前駆
体として産生され得る。一旦前駆体が外に輸送されると、シグナルペプチダーゼ
によるシグナル配列の除去が、このタンパク質を活性化する。シグナル配列を含
むいくつかのタンパク質ファミリーの例は、サイトカイン（ケモカイン）および
ホルモン（増殖因子および分化因子）を含む。コンピューターのアルゴリズムは
、アミノ末端シグナル配列の同定のために作製されうる。アミノ末端シグナル配
列を同定するために設計されたコンピュータープログラムの例としては、隠れＭ
ａｒｋｏｖモデル（ＨＭＭ）、共有されるパターン、特にコンセンサス配列を見
出すために最初に使用されたＦＡＳＴＡおよびＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎア
ルゴリズム（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．およびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，ＰＮＡＳ
，８５：２４４４−４８（１９９８）；Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．およびＭ．Ｓ．Ｗ
ａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７：１９５−９７（１９８１）
）に対する統計的代替物が挙げられる。これらのアルゴリズムは、これらがまさ
により成功したパターンを構築するために、新たに同定された配列から情報を取
り込むという点において、全く順応性がある。
【０００４】 タンパク質の他のファミリーは、膜結合タンパク質として存在する。これらの
膜結合タンパク質ファミリーのいくつかの例は、レセプター（核、４回膜貫通、
Ｇタンパク質共役、およびチロシンキナーゼ）、プロテインキナーゼ、ホスファ
ターゼ、神経ペプチドおよび血管伝達物質（ｖａｓｏｍｅｄｉａｔｏｒ）、Ｇタ
ンパク質、イオンチャネル（カルシウム、塩化物、カリウムおよびナトリウム）
、プロテアーゼ、輸送体／ポンプ（アミノ酸、糖、タンパク質、金属およびビタ
ミン；カルシウム、ホスフェート、カリウムおよびナトリウム）、マトリックス
分子（接着、カドヘリン、細胞外マトリックス分子、インテグリンおよびセレク
チン）、および調節タンパク質を含む。また、コンピュータープログラムは、こ
れらの分子の発見を補助し得る。例えば、Ｋｌｅｉｎらは、ポリペプチド中の可
能性のある膜貫通セグメントを検出するための方法（「ＡＬＯＭ」、ＫＫＤとも
呼ばれる）を開発した（Ｋｌｅｉｎ，Ｐ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｉｏｐｈｙｓ
．Ａｃｔａ．，８１５：４６８（１９８５））。これは、アミノ酸残基のある範
囲にわたる疎水性値の平均から、最も可能性のある膜貫通セグメントを同定しよ
うと試みる。これは、このセグメントが膜貫通セグメント（内在性（ＩＮＴＥＧ
ＲＡＬ））またはそうでない（周辺性（ＰＥＲＩＰＨＥＲＡＬ））かを予測し、
そしてそれによってポリペプチドの膜結合を示唆し得る。
【０００５】 さらに、いくつかのタンパク質は、細胞内で機能し、そして、それらの構造お
よび／または機能によって同定され得る。コンピューターアルゴリズムは、細胞
内タンパク質ファミリーの新規メンバーの同定を補助するために適合され得る。
細胞内タンパク質の例は、転写因子、種々のクラスの酵素、ミトコンドリアのタ
ンパク質およびシグナル伝達分子を含む。
【０００６】 これらのタンパク質のいくつか（例えば、レセプター、ホルモンおよびマトリ
ックスタンパク質）およびこれらの機能不全に関連する疾患の記載は、以下に続
く。
【０００７】 （発明の要旨） 本発明は、配列表に開示されたおよび／または表１に記載され、そしてＡｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に
寄託されたヒトｃＤＮＡプラスミドに含まれるポリヌクレオチド配列を含むかま
たはこれらから構成される、単離された核酸分子を含む。これらの核酸分子のフ
ラグメント、改変体および誘導体もまた、本発明によって含まれる。本発明はま
た、ヒトポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むかまたはこれらから
構成される単離された核酸分子を含む。本発明はさらに、これらのポリヌクレオ
チドによってコードされるヒトポリペプチドを含む。配列表に開示されたおよび
／または表１に記載され、そしてＡＴＣＣに寄託されたヒトｃＤＮＡプラスミド
にコードされたヒトポリペプチドを含むかまたはこれらから構成される、アミノ
酸配列がさらに提供される。これらのポリペプチドに結合する抗体はまた、本発
明に含まれる。これらのアミノ酸配列のポリペプチドフラグメント、改変体およ
び誘導体もまた、本発明によって含まれ、これらのポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドおよびこれらのポリペプチドに結合する抗体も同様に含まれる。
【０００８】 （詳細な記載） （表） 表１は、本出願に関連してＡＴＣＣで行った寄託物のＡＴＣＣ寄託物、寄託日
、およびＡＴＣＣ指定番号を要約する。表１はさらに、以下に記載される各「遺
伝子番号」に付随した情報を要約し、ｃＤＮＡクローンＩＤ、このｃＤＮＡクロ
ーンＩＤに含まれるベクターの型、ヌクレオチド配列ＩＤ番号、この開示された
配列に含まれるヌクレオチド、開示された配列の開始コドンの５’ヌクレオチド
の位置、アミノ酸配列識別番号およびこの開示された配列にコードされるＯＲＦ
の最後のアミノ酸を含む。
【０００９】 表２は、公開ＥＳＴを示し、任意の１以上のこれらの公開ＥＳＴ配列の少なく
とも１、２、３、４、５、１０、またはそれより多くは、本発明の特定の実施形
態から必要に応じて除外される。
【００１０】 表３は、表１に開示されたクローンに対応するポリヌクレオチドの発現プロフ
ァイルを要約する。第１列は、表１に開示された各コンティグ配列に関連するｃ
ＤＮＡクローンについての特有のクローンＩＤ「クローンＩＤ番号Ｖ」を提供す
る。第２列、「ライブラリーコード」は、本発明のポリヌクレオチドを発現する
組織および／または細胞株のライブラリーの発現プロファイルを示す。第２列の
各ライブラリーコードは、表４で提供されるライブラリーコードおよびライブラ
リーの説明に対応する組織／細胞供給源ＩＤコードを表す。これらのポリヌクレ
オチドの発現は、試験した他の組織および／または細胞ライブラリーでは、観察
されなかった。当業者は、本発明の対応するポリヌクレオチドの優勢な発現パタ
ーンを示す組織を同定するために、または優勢な発現および／もしくは特異的組
織発現を示すポリヌクレオチドを同定するためにこの情報を慣用的に利用し得る
。
【００１１】 表４の第１列は、表３の第２列に開示されたライブラリーコードを提供する。
第２列は、対応するライブラリーが由来する組織または細胞の供給源の説明を提
供する。罹患組織に対応するライブラリーコードは、３第列中に、「疾患」の語
で示される。第３列における「疾患」の語の使用は、非限定的である。このライ
ブラリーの組織供給源は、特異的（例えば、新生物）または疾患関連（例えば、
罹患器官の正常部分からの組織サンプル）であり得る。さらに、「疾患」表示な
しのライブラリーは、疾患状態または障害に直接的または間接的に関与する供給
源になお由来し得、そして、それゆえ、その疾患状態または障害においてさらな
る有用性を有し得る。
【００１２】 （定義） 以下の定義は、この明細書を通じて使用される特定の用語の理解を容易にする
ために提供される。
【００１３】 本発明において、「単離された」は、そのもともとの環境（例えば、それが天
然に存在するのであれば、天然の環境）から取り出された材料をいい、そして、
従って、「人の手によって」天然の状態から改変される。例えば、単離されたポ
リヌクレオチドは、ベクターもしくは組成物の一部であり得、または細胞に含ま
れ得、そして、そのベクター、組成物、または特定の細胞が、このポリヌクレオ
チドのもともとの環境ではないために、なお「単離された」ものであり得る。用
語「単離された」は、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー、細胞全
体の総ＤＮＡまたはｍＲＮＡ調製物、ゲノムＤＮＡ調製物（電気泳動によって分
離された、そしてブロットへ転写されたゲノムＤＮＡ調整物を含む）、剪断され
た細胞全体ゲノムＤＮＡ調製物または当該分野で本発明のポリヌクレオチド／配
列の顕著な特徴が実証されない、他の組成物をいわない。
【００１４】 本明細書中で使用されるように、「ポリヌクレオチド」は、配列番号Ｘ（表１
の第５列に記載されるような）またはｃＤＮＡプラスミドＶ（表１の第２列に記
載され、そしてＡＴＣＣ受託番号ＺにおいてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドの
プール内に含まれるような）に含まれる核酸配列を有する分子をいう。例えば、
このポリヌクレオチドは、５’および３’非翻訳配列、天然のまたは人工のシグ
ナル配列があるかまたはないコード領域、タンパク質コード領域を含む完全長の
ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列、ならびにこの核酸配列のフラグメント、エピ
トープ、ドメイン、および改変体を含み得る。さらに、本明細書中に使用される
場合、「ポリペプチド」は、広く定義されるような本発明のポリヌクレオチドに
コードされるアミノ酸配列を有する分子をいう（ｃＤＮＡに対応する配列のポリ
Ａテイルの翻訳によって生じるポリフェニルアラニンまたはポリリジンペプチド
配列は、明らかに除外する）。
【００１５】 本発明において、配列番号Ｘの配列を含む代表的プラスミドは、Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）に寄
託されおよび／または表１に記載された。表１に示すように、各プラスミドは、
ｃＤＮＡクローンＩＤ（識別名）およびＡＴＣＣ寄託番号（ＡＴＣＣ寄託番号Ｚ
）によって同定される。プールされ、そして単一の寄託物として寄託されたプラ
スミドは、同一のＡＴＣＣ寄託番号を有する。ＡＴＣＣは、１０８０１ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ
２０１１０−２２０９，ＵＳＡに位置する。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続上の微生
物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に拠って行われた。
【００１６】 本発明の「ポリヌクレオチド」はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下で、配列番号Ｘに含まれる配列、またはその相補体（例えば、本明
細書中に記載される本発明のポリヌクレオチドフラグメントの任意の１、２、３
、４、またはそれより多くの相補体）、および／またはｃＤＮＡプラスミドＶに
含まれる配列（例えば、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドフラグメント
の任意の１、２、３、４またはより多くの相補体）にハイブリダイズし得るポリ
ヌクレオチドを含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは
、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸
三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶
液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを
含む溶液中での４２℃での一晩のインキュベーション、続いて０．１×ＳＳＣ中
で約６５℃にてフィルターを洗浄することをいう。
【００１７】 本発明の「ポリヌクレオチド」にまた含まれるものは、より低いストリンジェ
ンシーのハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチドにハイブリ
ダイズする核酸分子である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよ
びシグナル検出の変化は、主として、ホルムアミド濃度（より低い百分率のホル
ムアミドが、低下したストリンジェンシーを生じる）；塩条件、または温度の操
作を通じて達成される。例えば、より低いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳ
ＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２
Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００
μｇ／ｍｌサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中、３７℃で一晩のインキュ
ベーション；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を
含む。さらに、さらにより低いストリンジェンシーを達成するために、ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション後に行われる洗浄は、より高い塩濃度（例え
ば、５×ＳＳＣ）で行われ得る。
【００１８】 上記の条件における変化が、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラ
ウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の含有および／ま
たは置換によって達成され得ることに留意のこと。代表的なブロッキング試薬と
しては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、およ
び市販の特許処方物が挙げられる。特異的ブロッキング試薬の含有は、適合性の
問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし得る。
【００１９】 もちろん、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡの任意の３’末
端ポリＡ＋領域（ｔｒａｃｔ））に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的スト
レッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の
定義に包含されない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ス
トレッチまたはその相補体を含む任意の核酸分子（例えば、プライマーとしてオ
リゴｄＴを用いて生成される、事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブ
リダイズするからである。
【００２０】 本発明のポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキ
シリボヌクレオチドから構成され得、これは、非改変ＲＮＡもしくは非改変ＤＮ
Ａまたは改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチド
は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ
、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物である
ＲＮＡ、一本鎖、またはより代表的には二本鎖もしくは一本鎖および二本鎖領域
の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得
る。さらに、このポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよ
びＤＮＡの両方を含む、三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチドはまた
、安定性のために、または他の理由のために改変された、１つ以上の改変された
塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含み得る。「改変された」塩基としては
、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンのような普通でない塩基が挙げ
られる。種々の改変が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ得；したがって、「
ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態を含む
。
【００２１】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１５、少
なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なく
とも５００または少なくとも１０００個の連続したヌクレオチドを含むが、長さ
が３００ｋｂ、２００ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、７．
５ｋｂ、５ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂまたは１ｋｂ以下である。さらなる実
施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に開示されるように
コード配列の一部を含むが、何れのイントロンの全ても一部も含まない。別の実
施形態において、このコード配列を含むポリヌクレオチドは、ゲノム中で隣接す
る遺伝子のコード配列（すなわち、ゲノム中の目的の遺伝子に対して５’または
３’）を含まない。他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１０
００、５００、２５０、１００、５０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、
２または１つより多くのゲノムで隣接する遺伝子のコード配列を含まない。
【００２２】 「配列番号Ｘ」は、表１の第５列に記載されるポリヌクレオチド配列をいい、
一方、「配列番号Ｙ」は、表１の第１０列に記載されるポリペプチド配列をいう
。配列番号Ｘは、表１の第６列に指定される整数で同定される。このポリペプチ
ド配列、配列番号Ｙは、ポリヌクレオチド配列番号Ｘによってコードされる翻訳
されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）である。このポリヌクレオチド
配列を配列表に示し、その直後に、全てのポリペプチド配列が続く。従って、配
列番号２のポリヌクレオチド配列に対応するポリペプチド配列は、配列表に示さ
れた第１のポリペプチド配列である。このポリヌクレオチド配列に対応する第２
のポリペプチド配列は、配列番号３として示される。以下同様。
【００２３】 本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合、すな
わち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）によって互いに連結したアミ
ノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする２０個のアミノ酸以外のアミノ
酸を含み得る。このポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然のプロセ
スによって、または当該技術分野で周知の化学改変技術によってのいずれかで、
改変され得る。このような改変は、基本テキスト、およびより詳細な研究論文、
ならびに多くの研究文献に十分記載される。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側
鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのどこにで
も生じ得る。同じ型の改変が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で同じま
たは種々の程度で存在し得ることが理解される。また、所定のポリペプチドは多
くの型の改変を含み得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として
分枝状であり得、そしてポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない、環状で
あり得る。環状、分枝状および分枝した環状のポリペプチドは、天然の翻訳後プ
ロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。改変としては、
アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、
ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質
または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔ
ｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、
脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成
、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸
化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏ
ｎ）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノ
イル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファ
ーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩ
ＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥ
Ｓ，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ
Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩ
ＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩ
ＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら，Ａｎｎ ＮＹ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【００２４】 本発明のポリぺプチドは、任意の適切な様式で調製され得る。このようなポリ
ぺプチドとしては、単離された天然に存在するポリぺプチド、組換え的に生成さ
れたポリぺプチド、合成的に生成されたポリぺプチド、またはこれらの方法の組
合せによって生成されたポリぺプチドが挙げられる。このようなポリぺプチドを
調製するための手段は、当該分野において十分に理解される。
【００２５】 ポリぺプチドは、分泌タンパク質の形態（成熟形態を含む）であり得るか、ま
たはより大きいタンパク質（例えば、融合タンパク質）の部分であり得る（以下
を参照のこと）。分泌配列もしくはリーダー配列、プロ配列、精製を補助する配
列（例えば、複数のヒスチジン残基）、または組換え生成の間の安定性のための
さらなる配列を含むさらなるアミノ酸配列を含むことは、しばしば有利である。
【００２６】 本発明のポリぺプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好
ましくは実質的に精製される。組換え的に生成されたバージョン（ｖｅｒｓｉｏ
ｎ）のポリぺプチド（分泌ポリぺプチドを含む）は、本明細書中に記載される技
術または当該分野で公知のそれ以外の技術（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎ
ｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８）に記載される１工程の方法に
よるような）を使用して実質的に精製され得る。本発明のポリぺプチドはまた、
本明細書中に記載される技術または当該分野において公知のそれ以外の技術（例
えば、当該分野において公知の方法で本発明のポリペプチドに対して惹起された
本発明の抗体）を使用して、天然供給源、合成供給源または組換え供給源から精
製され得る。
【００２７】 「機能的活性」を示すポリペプチドとは、本発明の全長（完全）タンパク質と
関連した１つ以上の公知の機能的活性を示し得るポリペプチドを意味する。この
ような機能的活性としては、生物学的活性、抗原性［抗ポリペプチド抗体に結合
する（または結合することについて、ポリペプチドと競合する）能力］、免疫原
性（本発明の特定のポリペプチドに結合する抗体を生成する能力）、本発明のポ
リペプチドと多量体を形成する能力、およびポリペプチドについてのレセプター
またはリガンドに結合する能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】 本発明のポリペプチドは、当該分野で公知のアッセイならびに本明細書中に記
載されたアッセイを使用するか、またはこれらのアッセイを慣用的に改変するこ
とによって、機能的活性（例えば、生物学的活性）についてアッセイされ得る。
特に、当業者は、以下の実施例部分に記載されるアッセイを使用して、本発明の
ヒトポリペプチド（フラグメントおよび改変体を含む）を活性について慣用的に
アッセイし得る。
【００２９】 「機能的活性を有するポリペプチド」とは、特定のアッセイ、例えば、生物学
的アッセイで測定した場合、用量依存性を伴なっても伴なわなくても、本発明の
ポリペプチド（成熟形態を含む）の活性と類似であるが、必ずしも同一ではない
活性を示すポリペプチドをいう。用量依存性が存在する場合、このポリペプチド
の用量依存性と同一である必要はなく、むしろ本発明のポリペプチドと比較した
場合に、所定の活性における用量依存性に実質的に類似する（すなわち、候補ポ
リペプチドは、本発明のポリペプチドと比較して、より大きな活性を示すか、ま
たは約１／２５以上、そして好ましくは約１／１０以上の活性、そして最も好ま
しくは約１／３以上の活性を示す）。
【００３０】 このポリペプチドならびにそのフラグメント、改変体、誘導体およびアナログ
の機能的活性は、種々の方法によってアッセイされ得る。
【００３１】 例えば、本発明のポリペプチドの抗体への結合について本発明の全長ポリペプ
チドに結合するかまたはそれと競合する能力についてアッセイする、１つの実施
形態では、当該分野で公知の種々の免疫アッセイが、用いられ得る。このような
アッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッ
セイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射分析アッセイ、ゲル拡散沈降
反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、コロイド金、酵
素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集ア
ッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、
免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどの
ような技術を用いる競合および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定
されない。１つの実施形態では、抗体結合が、一次抗体上の標識を検出すること
によって検出される。別の実施形態では、この一次抗体は、この一次抗体に対す
る二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施
形態では、この二次抗体が標識される。多くの手段が、免疫アッセイにおける結
合の検出について当該分野で公知であり、そして本発明の範囲内である。
【００３２】 リガンドが同定されるか、または本発明のポリペプチドフラグメント、改変体
または誘導体が多量体化する能力が評価される別の実施形態では、結合が、例え
ば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロ
マトグラフィー、ならびにアフィニティーブロッティングのような当該分野で周
知の手段によって、アッセイされ得る。一般には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ，Ｅ．ら、
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９５）を参照のこと。
別の実施形態では、その基質への本発明のポリペプチドの結合の生理学的相関（
シグナル伝達）がアッセイされ得る。
【００３３】 さらに、本明細書中に記載のアッセイ（実施例を参照のこと）および当該分野
で公知の他のアッセイは、本発明のポリペプチドならびにそのフラグメント、改
変体、誘導体、およびアナログが、そのポリペプチドに関連した生物学的活性を
（インビトロまたはインビボのいずれかで）惹起する能力を測定するために、慣
用的に適用され得る。他の方法は、当業者に公知であり、そして本発明の範囲内
である。
【００３４】 （発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド） （遺伝子番号１によってコードされるタンパク質の特徴） この遺伝子に対応する翻訳産物は、神経の伸長の阻害に関与すると考えられる
マウスのセマフォリン（ｓｅｍａｐｈｒｉｎ）ＶＩａタンパク質（Ｇｅｎｂａｎ
ｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＢ８６４０８を参照のこと）と配列の相同性を共
有する。この相同性に基づき、これらのタンパク質は、おそらく少なくともいく
つかの生物学的活性を共有する。
【００３５】 本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号１５における以下の残基として示
される免疫原性エピトープのうちの１、２、３、４、５またはそれより多くを含
むかまたはこれらから構成される：Ｌｙｓ−１からＧｌｕ−９、Ｃｙｓ−４８か
らＧｌｙ−５４、Ａｒｇ−１３２からＡｓｐ−１４０、Ｐｒｏ−１４７からＣｙ
ｓ−１５８、Ｐｒｏ−１９９からＶａｌ−２０６、Ｓｅｒ−２１８からＧｌｎ−
２２３。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に
よって包含され、これらのポリペプチドのうちの１以上に結合する抗体も同様に
包含される。さらに、これらのポリペプチドのフラグメントおよび改変体（例え
ば、本明細書中に記載のフラグメント、これらのポリペプチドに対して少なくと
も８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同
一であるポリペプチド、およびこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドまたはその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌ
クレオチドによってコードされるポリペプチド）は、本発明によって包含される
。本発明のこれらのフラグメントおよび改変体に結合する抗体もまた、本発明に
より包含される。これらのフラグメントおよび改変体をコードするポリヌクレオ
チドもまた、本発明によって包含される。
【００３６】 この遺伝子は、８週齢のヒト胚組織および前頭皮質組織で発現する。
【００３７】 従って、抗体を含めて、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生
物学的サンプル中に存在する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに発
生中の系、特に発生中の神経系の疾患および／または障害を含むがそれらに限定
されない疾患および状態の診断のための試薬として有用である。同様に、ポリペ
プチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の示差的
同定のための免疫学的プローブの提供に有用である。上記組織または細胞、特に
神経系および発生中の系の多くの障害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すな
わち、その障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の発現レベル）に対
して有意により高いか、またはより低いレベルのこの遺伝子の発現が、このよう
な障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型（例えば、神経組
織、発生中の組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、血
清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくはサンプルの中で、慣
用的に検出され得る。
【００３８】 ８週齢のヒト胚組織および前頭皮質組織におけるこの組織分布ならびにマウス
のセマフォリンＶＩａタンパク質に対する相同性は、この遺伝子に対応するポリ
ヌクレオチド、翻訳産物および抗体が、神経系および発生中の系、そして特に発
生中の神経系の疾患および／または障害の診断、検出および／または処置のため
に有用であることを示す。
【００３９】 この遺伝子の翻訳産物は、明らかにタンパク質のセマフォリンファミリーの新
規メンバーであり、そして神経の伸長の阻害に有用であり得る。さらに、この遺
伝子に対応する翻訳産物は、末梢神経の増殖を阻害に有用であり得る。あるいは
、この遺伝子の翻訳産物に対して指向されるアンタゴニストは、中枢神経系の再
増殖の促進または加速に有用であり得る。従って、この遺伝子に対応する翻訳産
物の一部を特異的に結合する抗体および／または低分子が、好ましい。
【００４０】 より一般的には、この組織分布および相同性は、このクローンのタンパク質産
物が神経変性疾患状態および行動障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソ
ン病、ハンチントン病、ツレット症候群、精神分裂病、躁病、痴呆、偏執症、強
迫性障害、恐慌性障害、学習障害、ＡＬＳ、精神病、自閉）、および行動変化（
栄養補給、睡眠パターン、平衡、および知覚の障害を含む）の検出／処置のため
に有用であることを示唆する。さらに、この遺伝子または遺伝子産物はまた、発
生中の胚に関連する発生障害、または伴性障害の処置および／または検出におい
て役割を果たし得る。タンパク質ならびにこのタンパク質に対する抗体は、上記
に挙げられた組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療の標的として有
用性を示し得る。
【００４１】 （遺伝子番号２によってコードされるタンパク質の特徴） この遺伝子に対応する翻訳産物は、ヒト心房性ナトリウム利尿ポリペプチド結
合ポリペプチド（日本国特許第ＪＰ６３０７９５９８号を参照のこと）と配列の
相同性を共有する。このポリペプチドは、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（
ＡＮＰ）に結合し、利尿作用（特にナトリウム排泄増加性の）および低血圧作用
を有すると考えられる。この相同性に基づき、これらのタンパク質は、少なくと
もいくつかの生物学的活性を共有すると期待される。本発明の好ましいポリペプ
チドは、以下のアミノ酸配列を含むかまたはこれらから構成される：ＶＮＧＦＮ
ＴＬＧＥＮＩＡＤＮＧＧＶＲＱＡＹＫＡＹＬＫＷＭＡＥＧＧＫＤＱＱＬＰＧＬＤ
ＬＴＨＥＱＬＦＦＩＮＹＡＱＶＷＣＧＳＹＲＰＥＦＡＩＱＳＩＫＴＤＶＨＳＰＬ
ＫＹＲＶＬＧＳＬＱＮＬＡＡＦＡＤＴＦＨＣＡＲＧＴＰＭＨＰＫＥＲＣＲＶＷ（
配列番号１９）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、
本発明によって包含され、これらのポリペプチドの１以上に結合する抗体も同様
に包含される。さらに、これらのポリペプチドのフラグメントおよび改変体（例
えば、本明細書中に記載のフラグメント、これらのポリペプチドに対して少なく
とも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％
同一であるポリペプチド、およびこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドまたはその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドによってコードされるポリペプチド）は、本発明によって包含され
る。本発明のこれらのフラグメントおよび改変体に結合する抗体もまた、本発明
により包含される。これらのフラグメントおよび改変体をコードするポリヌクレ
オチドもまた、本発明によって包含される。
【００４２】 本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号１６に残基：Ｐｈｅ−２８からＧ
ｌｎ−３５、Ｈｉｓ−５２からＡｓｎ−６６、Ｇｌｎ−８９からＴｒｐ−９５、
およびＰｒｏ−１１５からＰｒｏ−１２１として示された免疫原性エピトープの
１、２、３、４または４つ全てを含むかまたはこれらから構成される。これらの
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によって包含され、
これらのポリペプチドの１以上に結合する抗体も同様に包含される。さらに、こ
れらのポリペプチドのフラグメントおよび改変体（例えば、本明細書中に記載の
フラグメント、これらのポリペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０
％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド、
およびこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補体に
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコー
ドされるポリペプチド）は、本発明によって包含される。本発明のこれらのフラ
グメントおよび改変体に結合する抗体もまた、本発明により包含される。これら
のフラグメントおよび改変体をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によ
って包含される。
【００４３】 この遺伝子は、卵巣癌組織での発現に加えて、成人小腸組織および結腸腫瘍組
織で発現する。
【００４４】 従って、抗体を含む本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学
的サンプル中に存在する組織または細胞型の示差的同定のため、胃腸系の疾患お
よび／または障害、ならびに結腸癌および卵巣のような他の組織の癌を含むがそ
れらに限定されない疾患および／または状態の診断のための試薬として有用であ
る。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、組織ま
たは細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有用である。上記組
織または細胞、特に胃腸系の多くの障害に関して、標準の遺伝子発現レベル（す
なわち、その障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の発現レベル）に
対して有意により高いか、またはより低いレベルのこの遺伝子の発現が、このよ
うな障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型（例えば、胃腸
組織、小腸組織、結腸組織、卵巣組織、癌性組織および創傷組織）または体液（
例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくは
サンプルの中で、慣用的に検出され得る。
【００４５】 結腸腫瘍組織および小腸組織におけるこの組織分布、そしてヒト心房性ナトリ
ウム利尿ポリペプチド結合ポリペプチドに対する相同性は、この遺伝子に対応す
るポリヌクレオチドおよびポリペプチドが、胃腸系、特に小腸の疾患および／ま
たは障害の診断、検出および／または処置、ならびに結腸腫瘍の診断、検出およ
び／または処置に有用であることを示す。
【００４６】 この遺伝子の翻訳産物に対して指向されるアンタゴニストは、この遺伝子の翻
訳産物によって媒介される生物学的活性、例えば、利尿活性および低血圧活性の
予防または除去に有用であり得、そして結腸癌の検出および／または処置のため
に有用であり得る。従って、この遺伝子の翻訳産物の一部を特異的に結合する抗
体および／または低分子が、好ましい。結腸癌を検出するためのキットもまた、
提供される。このようなキットは、ひとつの実施形態において、固体支持上に結
合した，この遺伝子の翻訳産物に対して特異的である抗体を含む。個体からの体
液または生物学的サンプル、好ましくは血清にこの遺伝子の翻訳産物に特異的な
抗体を接触させる工程、この体液中に見出される抗原へ抗体が結合したか否かを
確認する工程を含む、個体における結腸癌の検出方法もまた、提供される。好ま
しくは、抗体は固体支持に結合しており、そして体液は血清である。上記の実施
形態ならびに他の処置および診断試験（キットおよび方法）は、本明細書の別の
場所により具体的に記載される。さらに、卵巣癌組織における発現は、この遺伝
子に対応するポリヌクレオチド、翻訳産物および抗体が、卵巣癌の診断、検出お
よび／または処置のために有用であることを示す。
【００４７】 （遺伝子番号３によってコードされるタンパク質の特徴） この遺伝子に対応する翻訳産物は、Ｔ細胞分化の中期および後期において発現
するヒトＭＡＬタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＡ３６
１９６を参照のこと）と配列の相同性を有する。このＭＡＬタンパク質は、Ｔ１
１またはＴ細胞レセプター経路を通じて活性化されたＴ細胞における膜シグナル
伝達に関与し得ると考えられる。この相同性に基づき、これらのタンパク質は同
じ生物学的活性のいくつかを共有すると予想される。本発明の好ましいポリペプ
チドは、この遺伝子の翻訳産物に対応する以下の推定膜貫通ドメインを含むかま
たはこれらから構成される：ＹＳＧＡＦＶＣＬＥＩＬＦＧＧＬＶＷＩＬＶＡＳＳ
（配列番号２０）；ＶＭＦＶＳＶＴＡＦＦＦＳＬＬＦＬＧＭＦＬＳＧＭＶＡＱ（
配列番号２１）；ＦＡＹＨＦＴＶＦＶＦＹＦＧＡＦＬＬＥＡＡ（配列番号２２）
；およびＩＦＡＦＭＴＴＡＣＹＧＣＳＬＧＬＡ（配列番号２３）。これらのポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に包含され、これらのポ
リペプチドの１以上に結合する抗体も同様に包含される。さらに、これらのポリ
ペプチドのフラグメントおよび改変体（例えば、本明細書中に記載のフラグメン
ト、これらのポリペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド、およびこれ
らのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補体にストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポ
リペプチド）は、本発明によって包含される。本発明のこれらのフラグメントお
よび改変体に結合する抗体もまた、本発明によって包含される。これらのフラグ
メントおよび改変体をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によって包含
される。
【００４８】 この遺伝子は、子宮内膜腫瘍組織、卵巣癌組織、肺癌組織および乳癌組織を含
む多種多様な癌性組織で発現する。
【００４９】 従って、抗体を含めて、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生
物学的サンプル中に存在する組織または細胞型の示差的同定のため、異常なＴ細
胞シグナル伝達に関与する疾患および／または障害、ならびに子宮内膜癌、卵巣
癌、肺癌および乳癌のような種々の癌を含むがそれらに限定されない疾患および
状態の診断のための試薬として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれら
のポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学
的プローブの提供に有用である。上記組織または細胞、特に免疫系の多くの障害
に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来の
健常組織または体液中の発現レベル）に対して有意により高いか、またはより低
いレベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取された特
定の組織もしくは細胞型（例えば、免疫組織、癌性組織および創傷組織）または
体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織も
しくはサンプルの中で、慣用的に検出され得る。
【００５０】 子宮内膜癌、卵巣癌、肺癌および乳癌組織のような種々の癌組織における組織
分布、ならびにヒトＭＡＬタンパク質とのこの相同性は、この遺伝子に対応する
ポリヌクレオチド、翻訳産物および抗体が、Ｔ細胞における異常な膜シグナル伝
達に関与する免疫系の疾患および／または障害の診断、検出および／または処置
に有用であることを示す。さらに、この組織分布は、この遺伝子に対応する翻訳
産物が、子宮内膜癌、卵巣癌、肺癌および乳癌組織のような種々の癌の診断、検
出および／または処置に有用であり得ることを示す。従って、この遺伝子の翻訳
産物の一部を特異的に結合する抗体および／または低分子が、好ましい。
【００５１】 （配列番号４によってコードされるタンパク質の特徴） この遺伝子の翻訳産物は、トルシン（Ｔｏｒｓｉｎ）Ａタンパク質（Ｇｅｎｂ
ａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＣ５１７３２を参照のこと）と配列の相同性
を共有する。運動障害は、一般的にいくつかの種類の異常な神経伝達を含む。こ
れらは、制御されない体の運動（例えば、ハンチントン病における舞踏症、パー
キンソン病における震顫および硬直、ねじれ失調症の歪んだ収縮）として、しば
しばそれ自体発現する。失調症状は、神経学的状態に対して二次的であり得るが
、一次的失調症またはねじれ失調症は、他の神経学的関与の欠如およびあらゆる
明確な神経病理の不在によって特徴付けられる。ねじれ失調症の臨床的兆候は、
多くの異なる体の領域に影響し得る。トルシン遺伝子およびその対応する翻訳産
物は、ねじれ失調症および関連する神経学的障害の診断、検出および／または処
置に有用であり得ることを示す。従って、神経学的障害に関与し得る新規トルシ
ン遺伝子の発見および特徴付けの必要性が、存在する。
【００５２】 本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号１８に残基：Ｌｅｕ−６からＶａ
ｌ−１４、Ｇｌｙ−８７からＴｙｒ−９２、Ａｒｇ−１０７からＨｉｓ−１１３
、およびＧｌｕ−１２７からＴｒｐ−１３３として示された免疫原性エピトープ
の１、２、３、４つかまたは４つ全てを含むかまたはこれらから構成される。こ
れらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によって包含
され、これらのポリペプチドの１以上を結合する抗体も同様に包含される。さら
に、これらのポリペプチドのフラグメントおよび改変体（例えば、本明細書中に
記載のフラグメント、これらのポリペプチドに対して少なくとも８０％、８５％
、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプ
チド、およびこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相
補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによっ
てコードされるポリペプチド）は、本発明によって包含される。本発明のこれら
のフラグメントおよび改変体を結合する抗体もまた、本発明によって包含される
。これらのフラグメントおよび改変体をコードするポリヌクレオチドもまた、本
発明によって包含される。
【００５３】 この遺伝子は、ヒト小脳組織で発現する。
【００５４】 従って、抗体を含む本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学
的サンプル中に存在する組織または細胞型の示差的同定のため、神経系の疾患お
よび／または障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断のための
試薬として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対
する抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に
有用である。上記組織または細胞、特に神経系の多くの障害に関して、標準の遺
伝子発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来の健常組織または体液
中の発現レベル）に対して有意により高いか、またはより低いレベルのこの遺伝
子の発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細
胞型（例えば、神経組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リン
パ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくはサンプルの中
で、慣用的に検出され得る。
【００５５】 ヒト小脳組織におけるこの組織分布、およびトルシンＡに対する相同性は、こ
の遺伝子に対応するポリヌクレオチド、翻訳産物および抗体が、神経系の疾患お
よび／または障害の診断、検出および／または処置のために有用であることを示
す。または、この遺伝子のこれらの翻訳産物に対する抗体は、この遺伝子の翻訳
産物によって惹起（ｉｌｌｉｃｉｔ）される活性の予防または除去に有用であり
得る。従って、この遺伝子の翻訳産物の一部を特異的に結合する抗体および／ま
たは低分子が、好ましい。
【００５６】 より一般的には、この組織分布は、このクローンのタンパク質産物が神経変性
疾患状態および行動障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチ
ントン病、ツレット症候群、精神分裂病、躁病、痴呆、偏執症、強迫性障害、恐
慌性障害、学習障害、ＡＬＳ、精神病、自閉）、および行動変化（栄養補給、睡
眠パターン、平衡、および知覚の障害を含む）の検出／処置のために有用である
ことを示唆する。さらに、この遺伝子または遺伝子産物はまた、発生中の胚に関
連する発生障害、または伴性障害の処置および／または検出において役割を果た
し得る。タンパク質ならびにこのタンパク質に対する抗体は、上記に挙げられた
組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療の標的として有用性を示し得
る。
【００５７】
【表１】 表１は、上記の各「遺伝子番号」に対応する情報を要約する。「ヌクレオチド
配列番号Ｘ」として同定されるヌクレオチド配列は、表１において同定される「
ｃＤＮＡクローンＩＤ番号Ｖ」から、およびいくつかの場合において、さらなる
関連のＤＮＡクローンから得られる部分的に相同な（「重複する」）配列からア
センブリされた。重複する配列は、高い重複性の単一の連続した配列にアセンブ
リされ（通常、各ヌクレオチド部位で３〜５個の重複する配列）、配列番号Ｘと
して同定される最終的な配列を得た。
【００５８】 ｃＤＮＡクローンＩＤ番号Ｖは、その日付に寄託され、そして「ＡＴＣＣ受託
番号Ｚおよび日付」において列挙される対応する受託番号が与えられた。寄託物
のいくつかは、同じ遺伝子に対応する複数の異なるクローンを含む。「ベクター
」とは、ｃＤＮＡクローンＩＤにおいて含まれるベクターの型をいう。
【００５９】 「総ヌクレオチド配列」は、「遺伝子番号」によって同定されるコンティグに
おけるヌクレオチドの総数をいう。寄託されたプラスミドは、これらの配列の全
てまたは大半を含み、これらは、配列番号Ｘの「クローン配列の５’ヌクレオチ
ド」および「クローン配列の３’ヌクレオチド」として示されるヌクレオチドの
位置によって反映される。推定メチオニン開始コドン（もし存在するなら）の配
列番号Ｘのヌクレオチドの位置は、「開始コドンの５’ヌクレオチド」として同
定される。同様に、推定シグナル配列（もし存在するなら）の配列番号Ｘのヌク
レオチドの位置は、「シグナルペプチドの最初のアミノ酸の５’ヌクレオチド」
として同定される。
【００６０】 翻訳されたアミノ酸配列は、このポリヌクレオチド配列の最初に翻訳されるコ
ドンで始まり、「アミノ酸配列番号Ｙ」として同定されるが、他のリーディング
フレームもまた、公知の分子生物学技術を使用して容易に翻訳され得る。これら
の代替のオープンリーディングフレームによって生成されるポリペプチドは、本
発明によって特に意図される。
【００６１】 配列番号Ｘ（ここで、Ｘは、配列表に開示されたポリヌクレオチド配列のいず
れかであり得る）および翻訳される配列番号Ｙ（ここで、Ｙは、配列表に開示さ
れたポリペプチド配列のいずれかであり得る）は、十分に正確であり、そしてそ
うでなければ、当該分野において周知でありかつ以下でさらに記載される種々の
使用に適切である。例えば、配列番号Ｘは、配列番号Ｘにおいて含まれる核酸配
列または寄託されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡを検出する核酸ハイブリダイ
ゼーションプローブを設計することを含む使用を有するが、これらに限定されな
い。これらのプローブはまた、生物学的サンプル中の核酸分子にハイブリダイズ
し、それによって本発明の種々の法医学の方法、および診断の方法を可能にする
。同様に、配列番号Ｙから同定されるポリぺプチドは、表１において同定された
ｃＤＮＡクローンによりコードされる分泌タンパク質に特異的に結合する抗体を
産生することを含むが、これらに限定されない使用を有する。
【００６２】 それにもかかわらず、配列決定反応によって生じるＤＮＡ配列は、配列決定の
エラーを含み得る。エラーは、誤って同定されたヌクレオチドとして、または生
じたＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの挿入または欠失として存在する。誤って
挿入されたか、または欠失されたヌクレオチドは、推定アミノ酸配列のリーディ
ングフレームにおいてフレームシフトを引き起こす。これらの場合において、生
じたＤＮＡ配列は、実際のＤＮＡ配列と９９．９％（例えば、１０００塩基を超
えるオープンリーディングフレームにおける１塩基の挿入または欠失）を超えて
同一であり得るにもかかわらず、推定アミノ酸配列は、実際のアミノ酸配列とは
異なる。
【００６３】 従って、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における正確さを必要とするこ
れらの適用のために、本発明は、配列番号Ｘとして同定された作製されたヌクレ
オチド配列、および配列番号Ｙとして同定された推定の翻訳されたアミノ酸配列
のみではなく、表１において記載されるような、ＡＴＣＣに寄託された本発明の
ヒトｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡのサンプルもまた提供する。各々の寄託さ
れたプラスミドのヌクレオチド配列は、公知の方法に従って寄託されたプラスミ
ドの配列決定により容易に決定され得る。 次いで、推定アミノ酸配列は、このような寄託物から証明され得る。さらに、特
定のプラスミドによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列はまた、ペプチド
配列決定により、または寄託されたヒトｃＤＮＡを含む適切な宿主細胞中でタン
パク質を発現し、このタンパク質を収集し、そしてその配列を決定することによ
り、直接的に決定され得る。
【００６４】 また、ｃＤＮＡプラスミドを含むベクターの名前を表１に提供する。各ベクタ
ーは、当該分野において、慣用的に使用される。以下のさらなる情報は、利便性
のために提供される。
【００６５】 ベクターＬａｍｂｄａ Ｚａｐ（米国特許第５，１２８，２５６号および同第
５，２８６，６３６号）、Ｕｎｉ−Ｚａｐ ＸＲ（米国特許第５，１２８，２５
６号および同第５，２８６，６３６号）、Ｚａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓ（米国特許第
５，１２８，２５６号および同第５，２８６，６３６号）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ（ｐＢＳ）（Ｓｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ． １６：７５８３−７６００（１９８８）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．
Ａ．およびＳｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １
７：９４９４（１９８９））ならびにｐＢＫ（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ
．ら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ５：５８−６１（１９９２））は、Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、１１０１１ Ｎ．Ｔｏ
ｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，９２０３７から市
販されている。ｐＢＳは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてｐＢＫはネオ
マイシン耐性遺伝子を含む。ファージミドｐＢＳは、λＺａｐベクターおよびＵ
ｎｉ−Ｚａｐ ＸＲベクターから切り出され得、そしてファージミドｐＢＫは、
Ｚａｐ発現ベクターから切り出され得る。両方のファージミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ
株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（これもまた、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である
）に形質転換され得る。
【００６６】 ベクターｐＳｐｏｒｔ１、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ １．０、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ ２．０およびｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ６００９、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ
２０８９７から得られた。全てのＳｐｏｒｔベクターはアンピシリン耐性遺伝
子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（これもまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である）に形質転換され得る。例えば、Ｇｒｕｂ
ｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｆｏｃｕｓ １５：５９（１９９３）を参照のこと。ベクタ
ーｌａｆｍｉｄ ＢＡ（Ｂｅｎｔｏ Ｓｏａｒｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ）は、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌ
ｉ株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅに形質転換され得る。ベクターｐＣＲ（登録商標）２．
１（これはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１６００ Ｆａｒａｄａｙ Ａｖｅｎｕｅ、
Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ９２００８から入手可能である）は、アンピシリン耐
性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓから入手可能である）に形質転換され得る。例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｊ
．Ｍ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：９６７７−９６８６（１９８８）
およびＭｅａｄ，Ｄ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：（１９９１）を
参照のこと。
【００６７】 本発明はまた、配列番号Ｘ、配列番号Ｙ、および／または寄託されたプラスミ
ド（ｃＤＮＡプラスミド：Ｖ）に対応する遺伝子に関する。対応する遺伝子は、
本明細書中に開示される配列情報を使用して、公知の方法に従って単離され得る
。このような方法は、開示された配列からプローブまたはプライマーを調製する
工程、およびゲノム物質の適切な供給源から対応する遺伝子を同定または増幅す
る工程を包含するが、これらに限定されない。
【００６８】 本発明においてまた提供されるものは、対立遺伝子改変体、オルトログ（ｏｒ
ｔｈｏｌｏｇ）、および／または種相同体である。当該分野において公知である
手順は、本明細書中で開示された配列またはＡＴＣＣに寄託されたクローンから
の情報を用いて、配列番号Ｘ、配列番号Ｙ、および／またはｃＤＮＡプラスミド
：Ｖに対応する遺伝子の全長遺伝子、対立遺伝子改変体、スプライス改変体、全
長コード部分、オルトログ、および／または種相同体を得るために使用され得る
。例えば、対立遺伝子改変体および／または種相同体は、本明細書中に提供され
る配列から適切なプローブまたはプライマーを作製し、そして対立遺伝子改変体
および／または所望の相同体について適切な核酸供給源をスクリーニングするこ
とにより単離および同定され得る。
【００６９】 本発明は、配列番号Ｘの核酸配列および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｖを含
むか、あるいはこれらからなるポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、配
列番号Ｙのポリペプチド配列、配列番号Ｘによりコードされるポリペプチド、お
よび／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｖ中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプ
チドを含むか、あるいはこれらからなるポリペプチドを提供する。配列番号Ｙの
ポリペプチド配列、配列番号Ｘによりコードされるポリペプチド、および／また
はｃＤＮＡプラスミド：Ｖ中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを含む
か、あるいはこれらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた
、本発明により包含される。本発明はさらに、配列番号Ｘの核酸配列の相補体、
および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｖ中のｃＤＮＡのコード鎖の相補体を含む
か、あるいはこれらからなるポリヌクレオチドを包含する。 多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり、
そして配列データベースを通してアクセス可能であり、そして本発明の着想の前
に公に利用可能であったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌ
クレオチドは、本発明の範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙するこ
とは、本出願の開示では非常に煩わしい。従って、好ましくは、配列番号Ｘから
、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここで、ａは配列番号Ｘの
１と配列番号Ｘの最終ヌクレオチド−１５との間の任意の整数であり、ｂは１５
〜配列番号Ｘの最終ヌクレオチドの整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列
番号Ｘに示されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４
以上である）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。
【００７０】 （全長遺伝子の回収のためのＲＡＣＥプロトコル） 部分的ｃＤＮＡクローンは、Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８９９８−９００２（１９８８）に記載
されたｃＤＮＡ末端の高速増幅（ＲＡＣＥ）手順を利用することにより全長を作
製し得る。５’末端または３’末端のいずれかが欠失しているｃＤＮＡクローン
は、翻訳の開始コドンまたは終止コドンのそれぞれに伸長する欠失塩基対を含む
ように再構築され得る。いくつかの場合において、ｃＤＮＡは、そのために翻訳
の開始を欠失している。以下に、この本来の５’ＲＡＣＥ手順の改変を簡単に記
載する。ポリＡ＋または全ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｇｉｂｃ
ｏ／ＢＲＬ）およびｃＤＮＡ配列に特異的なアンチセンスプライマーまたは相補
的プライマーを用いて逆転写する。そのプライマーを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ Ｃｏ
ｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて反応から除去する。次いで、第
１鎖ｃＤＮＡを、ｄＡＴＰおよび末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ
（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて、添付する。このように、アンカー配列を産生
し、これは、ＰＣＲ増幅のために必要である。第２鎖をｄＡ−テイル含有ＰＣＲ
緩衝液、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）
、５’末端で３つの隣接制限部位（ＸｈｏＩ、ＳａｌＩおよびＣｌａＩ）を含む
オリゴｄＴプライマーならびにこれらの制限部位を正しく含むプライマーから合
成する。この２本鎖ｃＤＮＡを同じプライマーならびにネスティッドｃＤＮＡ特
異的アンチセンスプライマーを用いて４０サイクルでＰＣＲ増幅する。このＰＣ
Ｒ産物を、エチジウムブロマイドアガロースゲル上でサイズ分離し、そして欠失
しているタンパク質コードＤＮＡの推定サイズのｃＤＮＡ産物を含むゲルの領域
を取り出す。ｃＤＮＡをＭａｇｉｃ ＰＣＲ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）を用いてアガロースゲルから精製し、ＸｈｏＩまたはＳａｌＩを用いて制限
消化し、そしてプラスミド（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ））にＸｈｏＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位で連結する。このＤ
ＮＡを細菌に形質転換し、そしてこのプラスミドクローンを配列決定して、正確
なタンパク質コード挿入物を同定する。正確な５’末端を、推定的に同定された
相同体を有するこの配列と部分的ｃＤＮＡクローンを有する重複を比較すること
により確認する。当該分野において公知の同様の方法および／または市販のキッ
トを使用して、増幅し、そして３’末端を回収する。
【００７１】 いくつかの、品質制御キットが購入のために市販されている。上記のそれらと
同様の試薬および方法は、全長遺伝子を回収をするための５’ＲＡＣＥおよび３
’ＲＡＣＥの両方について、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬからキットの形態で供給される
。第２のキットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である。このキットは、Ｄｕ
ｍａｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：５２２７−３２（１
９９１）により開発された、関連技術の改変（ＳＬＩＣ（一本鎖ｃＤＮＡへの、
一本鎖の連結））である。手順における主な違いは、ＲＮＡを、逆転写後にアル
カリ加水分解し、そしてＲＮＡリガーゼを使用して、第１鎖ｃＤＮＡに、制限部
位を含むアンカープライマーを連結することである。これは、過去に配列決定を
するのが困難なポリＴの伸長を生じるｄＡテーリング反応における必要性を除去
する。
【００７２】 ＲＮＡからの５’ｃＤＮＡまたは３’ｃＤＮＡを産生する代替は、ｃＤＮＡラ
イブラリー二本鎖ＤＮＡを使用することである。非対称性ＰＣＲ増幅アンチセン
スｃＤＮＡ鎖を、アンチセンスｃＤＮＡ特異的プライマーおよびプラスミドアン
カープライマーを用いて合成する。これらのプライマーを除去し、そして対称Ｐ
ＣＲ反応を、ネストしたｃＤＮＡ特異的アンチセンスプライマーおよびプラスミ
ドアンカープライマーを用いて実施する。
【００７３】 （５’末端配列または３’末端配列を産生し、全長遺伝子を得るための、ＲＮ
Ａリガーゼのプロトコル） 一旦、目的の遺伝子が同定されると、本来のｃＤＮＡプラスミド中には存在し
ないかもしれない遺伝子の５’部分または３’部分の同定のためのいくつかの方
法が利用可能になる。これらの方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フ
ィルタープローブ探索、特異的プローブを使用するクローン富化、５’ＲＡＣＥ
および３’ＲＡＣＥと類似および同一のプロトコル。全長遺伝子は、ライブラリ
ー中に存在し得、そして探索によって同定され得るが、一方、５’末端または３
’末端を生成するために有用な方法は、欠けている情報を生成するために、本来
のｃＤＮＡからの既存の配列情報を、使用することである。５’ＲＡＣＥに類似
する方法は、所望の全長遺伝子の欠けている５’末端を生成するために利用可能
である（この方法は、Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３）によって発表
された）。簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転
写物をおそらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結し、そして連結されたＲＮＡ
オリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特
異的なプライマーを含むプライマーセットを使用して、所望の全長遺伝子の５’
部分をＰＣＲ増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれ
を使用して全長遺伝子を生成し得る。この方法は、所望の供給源から単離された
総ＲＮＡを用いて開始し、この手順における必要条件ではないが、ポリＡ ＲＮ
Ａを使用し得る。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスファターゼで処理し
て、後のＲＮＡリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷ＲＮＡの５’リン酸基
を排除し得る。次いで、使用された場合、ホスファターゼを不活化し、そしてＲ
ＮＡをメッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を除去するため
に、タバコ酸性ピロホスファターゼを用いて処理する。この反応は、次いでＴ４
ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドに連結され得る、キャップ
切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残す。次いで、この改変型ＲＮＡ調製物
を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第一鎖ｃＤＮＡ合成のための
テンプレートとして使用し得る。次いで、第一鎖合成反応物を、連結されたＲＮ
Ａオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的のヒト遺伝子の公知の配
列に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のためのテンプ
レートとして使用し得る。次いで、得られた生成物を配列決定し、そして分析し
て５’末端配列が関連するヒト遺伝子に属することを確認する。
【００７４】 （ポリヌクレオチドフラグメントおよびポリペプチドフラグメント） 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド（核酸）の、ポリヌクレオチドフラ
グメントに関する。本発明において、「ポリヌクレオチドフラグメント」とは、
以下である核酸配列を有するポリヌクレオチドをいう：ｃＤＮＡプラスミド：Ｖ
に含まれるｃＤＮＡの一部か、もしくはｃＤＮＡプラスミド：Ｖに含まれるｃＤ
ＮＡによりコードされるポリペプチドをコードするｃＤＮＡの一部；配列番号Ｘ
もしくはその相補鎖におけるポリヌクレオチド配列の一部；配列番号Ｙのポリペ
プチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列；あるいは配列番号Ｘによりコ
ードされるポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列。本発明のヌ
クレオチドフラグメントは、好ましくは、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好
ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、
そしてなおより好ましくは少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少な
くとも約７５ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約１２５ｎｔ、または
少なくとも約１５０ｎｔの長さである。例えば、「少なくとも約２０ｎｔの長さ
」のフラグメントは、ｃＤＮＡプラスミド：ＶのｃＤＮＡ配列に含まれる配列ま
たは配列番号Ｘもしくはその相補鎖に示されるヌクレオチド配列由来の２０以上
の連続する塩基を含むことが意図される。この文脈において「約（おおよそ）」
は、特に記載された値、あるいはそれより数個（５、４、３、２、または１）の
ヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな値を含む。これらのヌクレオチドフラグ
メントは、本明細書中で議論されるように、診断プローブおよびプライマーとし
ての使用を含むが、それらに限定されない使用を有する。もちろん、より大きな
フラグメント（例えば、少なくとも１５０、１７５、２００、２５０、５００、
６００、１０００または２０００のヌクレオチドの長さ）もまた、本発明に含ま
れる。
【００７５】 さらに、本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例えば、
配列番号Ｘ、またはその相補鎖の以下のおおよそのヌクレオチド数の配列を含む
か、あるいはそれらからなるフラグメントが挙げられる：１〜５０、５１〜１０
０、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０
１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５
０、５５１〜６００、６０１〜６５０、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５
１〜８００、８０１〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１０
００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、１１０１〜１１５０、１１５
１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１３００、１３０１〜１３５０
、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４５１〜１５００、１５０１〜
１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５０、１６５１〜１７００、１
７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、１８０１〜１８５０、１８５１〜１９
００、１９０１〜１９５０、１９５１〜２０００、２００１〜２０５０、２０５
１〜２１００、２１０１〜２１５０、２１５１〜２２００、２２０１〜２２５０
、２２５１〜２３００、２３０１〜２３５０、２３５１〜２４００、２４０１〜
２４５０、２４５１〜２５００、２５０１〜２５５０、２５５１〜２６００、２
６０１〜２６５０、２６５１〜２７００、２７０１〜２７５０、２７５１〜２８
００、および／または２８０１〜２８０８。この文脈において、「おおよそ（約
）」は、特に記載された範囲、またはいずれかの末端もしくは両方の末端におい
て、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいか、
または小さな範囲を含む。好ましくは、これらのフラグメントは、その配列が一
部であるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの、機能的活性（例
えば、生物学的活性）を有するポリペプチドをコードする。より好ましくは、こ
れらのフラグメントは、本明細書中、上記で議論されるようにプローブまたはプ
ライマーとして使用され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
下またはより低いストリンジェンシー条件下でこれらのフラグメントの１つ以上
にハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれ、これらのポリヌ
クレオチドまたはフラグメントによりコードされるポリペプチドも同様に含まれ
る。
【００７６】 さらに、本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例えば、
ｃＤＮＡプラスミド：Ｖに含まれるｃＤＮＡヌクレオチド配列、またはその相補
鎖の以下のおおよそのヌクレオチド数の配列を含むか、あるいはそれらからなる
フラグメントが挙げられる：１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１
〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００
、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６０１
〜６５０、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８０１〜８５０
、８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、
１０５１〜１１００、１１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１
２５０、１２５１〜１３００、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４
０１〜１４５０、１４５１〜１５００、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６０
０、１６０１〜１６５０、１６５１〜１７００、１７０１〜１７５０、１７５１
〜１８００、１８０１〜１８５０、１８５１〜１９００、１９０１〜１９５０、
１９５１〜２０００、２００１〜２０５０、２０５１〜２１００、２１０１〜２
１５０、２１５１〜２２００、２２０１〜２２５０、２２５１〜２３００、２３
０１〜２３５０、２３５１〜２４００、２４０１〜２４５０、２４５１〜２５０
０、２５０１〜２５５０、２５５１〜２６００、２６０１〜２６５０、２６５１
〜２７００、２７０１〜２７５０、２７５１〜２８００、および／または２８０
１〜２８０８。この文脈において、「おおよそ（約）」は、特に記載された範囲
、あるいはいずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４
、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいか、または小さな範囲を含む。
好ましくは、これらのフラグメントは、ｃＤＮＡプラスミド：Ｖに含まれるｃＤ
ＮＡヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの機能的活性（例えば
、生物学的活性）を有するポリペプチドをコードする。より好ましくは、これら
のフラグメントは、本明細書中で議論されるように、プローブまたはプライマー
として使用され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下または
より低いストリンジェンシー条件下で１つ以上のこれらのフラグメントにハイブ
リダイズするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれ、これらのポリヌクレオチ
ドまたはフラグメントによりコードされるポリペプチドもまた、含まれる。
【００７７】 本発明において、「ポリペプチドフラグメント」とは、配列番号Ｙに含まれる
アミノ酸配列の一部、配列番号Ｘのポリヌクレオチド配列によってコードされる
アミノ酸配列の一部、および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｖ中のｃＤＮＡによ
ってコードされるアミノ酸配列の一部であるアミノ酸配列をいう。タンパク質（
ポリペプチド）フラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」
であり得るか、あるいはより大きなポリぺプチド（このフラグメントが、部分ま
たは領域（最も好ましくは単一の連続した領域として）を形成する）内に含まれ
得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表例としては、例えば、配列番号
Ｙのコード領域の、以下のおおよそのアミノ酸数のアミノ酸配列を含むか、ある
いはそれらからなるフラグメントが挙げられる：１〜２０、２１〜４０、４１〜
６０、６１〜８０、８１〜１００、１０１〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜
１６０、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜２２０、２２１〜２４０、
２４１〜２６０、および／または２６１〜２６５。さらに、本発明のポリペプチ
ドフラグメントは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、
４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１
０、１２０、１３０、１４０、または１５０のアミノ酸の長さであり得る。この
文脈において、「約（おおよそ）」とは、特に記載された範囲または値、あるい
はいずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２
、または１）のアミノ酸だけ大きいかまたは小さな、範囲または値を含む。これ
らのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に
含まれる。
【００７８】 タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以
上の生物学的機能の損失の改変を生じるとしても、他の機能的活性（例えば、生
物学的活性、多量体化する能力、リガンドに結合する能力）は、なお保持され得
る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘導す
るおよび／または抗体に結合する、短縮型ムテインの能力は、完全なポリペプチ
ド、または成熟ポリペプチドの大部分より少ない残基が、Ｎ末端から除去される
場合には、一般的に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定の
ポリペプチドが、このような免疫原性活性を保持するかどうかは、本明細書中に
記載される慣用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の別の方
法によって容易に決定され得る。多数の欠失したＮ末端アミノ酸残基を有するム
テインは、いくつかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し得るようである
。実際に、６つと同じくらい少ないアミノ酸残基からなるペプチドは、しばしば
免疫応答を惹起し得る。
【００７９】 従って、本発明のポリペプチドフラグメントとしては、分泌タンパク質および
成熟形態が挙げられる。さらに好ましいポリペプチドフラグメントとしては、ア
ミノ末端もしくはカルボキシ末端またはその両方から、連続した一連の欠失した
残基を有する分泌タンパク質、もしくは成熟形態が挙げられる。例えば、任意の
数のアミノ酸（１〜６０の範囲）は、分泌ポリペプチドもしくは成熟形態のいず
れかのアミノ末端から欠失され得る。同様に、任意の数のアミノ酸（１〜３０の
範囲）が、分泌タンパク質もしくは成熟形態のカルボキシ末端から欠失され得る
。さらに、上記のアミノ末端およびカルボキシ末端の欠失の任意の組み合わせは
好ましい。同様に、これらのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレ
オチドもまた好ましい。
【００８０】 本発明は、本明細書中で開示されるポリペプチド（例えば、配列番号Ｙのポリ
ペプチド、配列番号Ｘに含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリ
ペプチド、および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｖに含まれるｃＤＮＡによりコ
ードされるポリペプチド）のアミノ酸配列のアミノ末端から、１つ以上の欠失し
た残基を有するポリペプチドを、さらに提供する。特に、Ｎ末端の欠失は、一般
式ｍ−ｑによって記載され得、ここでｑは、本発明のポリペプチド（例えば、配
列番号Ｙに開示されるポリペプチド）におけるアミノ酸残基の総数を表す全整数
であり、そしてｍは、２〜ｑ−６の範囲の任意の整数として定義される。これら
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改
変体を含む）もまた、本発明に含まれる。
【００８１】 また、上記のように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が
、このタンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じるとしても、他
の機能的活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、リガンドに結合する
能力）は、なお保持され得る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または成熟形
態を認識する抗体を誘導するおよび／またはこの抗体に結合する、短縮型ムテイ
ンの能力は、完全なポリペプチド、または成熟ポリペプチドの大部分より少ない
残基が、Ｃ末端から除去される場合には、一般的に保持される。完全なポリペプ
チドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫原性活性を保持
するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、およびそうでなければ当
該分野において公知の他の方法によって容易に決定され得る。多数の欠失したＣ
末端アミノ酸残基を有するムテインは、いくつかの生物学的活性または免疫原性
活性を保持し得るようである。実際に、６つと同じくらい少ないアミノ酸残基か
らなるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。
【００８２】 従って、本発明は、本明細書中で開示されるポリペプチド（例えば、配列番号
Ｙのポリペプチド、配列番号Ｘに含まれるポリヌクレオチド配列によりコードさ
れるポリペプチド、および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｖに含まれるｃＤＮＡ
によりコードされるポリペプチド）のアミノ酸配列のカルボキシ末端からの１つ
以上の残基を有するポリペプチドを、さらに提供する。特に、Ｃ末端の欠失は、
一般式１−ｎによって記載され得、ここでｎは、６〜ｑ−１の範囲の任意の全整
数であり、そしてここでｎは、本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸残基の位
置に対応する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメ
ントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明により含まれる。
【００８３】 さらに、上記のＮ末端またはＣ末端の欠失のいずれかを組み合わせて、Ｎ末端
およびＣ末端欠失型ポリペプチドを産生し得る。本発明はまた、アミノ末端およ
びカルボキシ末端の両方から１つ以上の欠失したアミノ酸を有するポリペプチド
を提供する。このポリペプチドは、一般的に、配列番号Ｘ（例えば、好ましくは
配列番号Ｙとして開示されるポリペプチドを含むが、これに限定されない）およ
び／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｖ中のｃＤＮＡ、ならびに／あるいはそれらの
相補鎖によってコードされるポリペプチドの、残基ｍ−ｎを有する場合に記載さ
れ得、ここでｎおよびｍは、上記のような整数である。これらのポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もま
た、本発明に含まれる。
【００８４】 配列番号Ｙのポリペプチドに含まれる任意のポリペプチド配列、配列番号Ｘと
して記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、任意のポリペプチ
ド配列、またはｃＤＮＡプラスミド：Ｖ中のｃＤＮＡによってコードされる任意
のポリペプチド配列は、そのポリペプチドの特定の好ましい領域を決定するため
に、分析され得る。例えば、配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミド：Ｖ中のｃＤ
ＮＡのポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列
は、ＤＮＡＳＴＡＲコンピュータアルゴリズム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，１
２２８ Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１５ ＵＳＡ；
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍ／）のデフォルトパラメーター
を使用して、分析され得る。
【００８５】 ＤＮＡＳＴＡＲコンピューターアルゴリズムを使用して慣用的に得られ得るポ
リペプチドの領域としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：Ｇａ
ｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα−領域、β−領域、ターン領域、およびコイル領
域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα−領域、β−領域、およびターン領域、Ｋｙｔ
ｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの
α−両親媒性領域およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可
撓性領域、Ｅｍｉｎｉの表面形成領域ならびに高い抗原性指標のＪａｍｅｓｏｎ
−Ｗｏｌｆの領域。この点で、本発明の非常に好ましいポリヌクレオチドの中に
、いくつかの構造的特徴（例えば、上記の特徴のいくつか（例えば、１、２、３
または４））と組み合わされる領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドがある。
【００８６】 さらに、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性領域および疎水性領域、Ｅｍｉ
ｎｉ表面形成領域、ならびに高い抗原性指標のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域（
すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプログラムのデフォルトパラメターを使用
して同定されるような、１．５より大きいか、または１．５に等しい抗原性指標
を有する、４つ以上の連続するアミノ酸を含む）を慣用的に使用して、抗原性に
対する高い程度の潜在性を表すポリペプチドの領域を決定し得る。高い抗原性の
領域は、免疫応答の開始プロセスにおいて、抗原認識が生じ得る環境中のポリペ
プチドの表面上に曝されるようであるポリペプチドの領域を表す値を選択するこ
とによって、ＤＮＡＳＴＡＲ分析によるデータから決定される。
【００８７】 本発明の好ましいポリペプチドフラグメントは、そのアミノ酸配列がフラグメ
ントであるポリペプチド配列の、機能的活性（例えば、生物学的活性）を示すア
ミノ酸配列を含むか、またはあるいは、これらからなるフラグメントである。「
機能的活性」を示すポリペプチドとは、全長タンパク質と関連した１つ以上の公
知の機能的活性（例えば、前述のような、生物学的活性、抗原性、免疫原性、お
よび／または多量体化など）を示し得るポリペプチドを意味する。
【００８８】 他の好ましいポリペプチドフラグメントは、生物学的に活性なフラグメントで
ある。生物学的に活性なフラグメントとは、本発明のポリペプチドの活性に対し
て、同一である必要はないが、類似する活性を示すフラグメントである。このフ
ラグメントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または低下した望ましく
ない活性を含み得る。
【００８９】 好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号Ｙのポリペプ
チドの１、２、３、４、５以上の抗原性フラグメントか、またはその部分を含む
か、またはあるいはそれらからなる。これらのポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に含ま
れる。
【００９０】 本発明は、以下のポリペプチドを含むか、またはあるいは以下からなるポリペ
プチドを含む：配列番号Ｙに示されるポリペプチド配列のエピトープ、またはｃ
ＤＮＡプラスミド：Ｖ中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配列のエピ
トープ、あるいは前述で定義されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件下またはより低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件
下で、配列番号Ｘのエピトープコード配列またはｃＤＮＡプラスミド：Ｖに含ま
れるエピトープコード配列の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによ
ってコードされるポリペプチド配列のエピトープ。本発明はさらに、本発明のポ
リペプチド配列のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、配列
番号Ｘに開示される配列など）、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオ
チド配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、および前記で定義されるように、ス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェン
シー条ハイブリダイゼーション件下で、この相補鎖にハイブリダイズするポリヌ
クレオチド配列を含む。
【００９１】 用語「エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、動物において、好ま
しくは哺乳動物において、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または
免疫原性活性を有するポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、
本発明は、エピトープを含むポリペプチド、およびこのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む。「免疫原性エピトープ」とは、本明細書中で使用さ
れる場合、当該分野で公知の任意の方法によって決定されるような（例えば、下
記に記載される抗体を産生するための方法による）、動物における抗体応答を誘
発するタンパク質の一部として定義される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３
）を参照のこと）。用語「抗原性エピトープ」とは、本明細書中で使用される場
合、当該分野で周知の任意の方法（例えば、本明細書中に記載される免疫アッセ
イによる）によって決定されるような、抗体がその抗原に免疫特異的に結合し得
るタンパク質の一部として定義される。免疫特異的結合は、非特異的結合は除外
するが、他の抗原との交差反応を除外する必要はない。抗原性エピトープは、免
疫原性である必要はない。
【００９２】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の方法によって産生さ
れ得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。こ
れはさらに、米国特許第４，６３１，２１１号に記載される）。
【００９３】 本発明においては、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４、少なく
とも５、少なくとも６、少なくとも７アミノ酸配列を含み、より好ましくは、少
なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２
、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なく
とも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０アミノ酸配列を含
み、そして最も好ましくは約１５アミノ酸と約３０アミノ酸との間の配列を含む
。免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含有する好ましいポリペプチド
は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５
、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基
の長さである。さらなる非排他的に好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で
開示される抗原性エピトープおよびその一部を含む。抗原性エピトープは、有用
である（例えば、エピトープに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含
む）を惹起するため）。好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で開示される
抗原性エピトープ、および２、３、４、５以上のこれらの抗原性エピトープの任
意の組合わせを含む。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおいて、標的分子
として使用され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７
７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−
６６６（１９８３）を参照のこと）。
【００９４】 同様に、免疫原性エピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に従
う抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら
，前出；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：
９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３
４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープは、
本明細書で開示される免疫原性および２、３、４、５以上のこれらの免疫原性エ
ピトープの任意の組合せを含む。１つ以上の免疫原性エピトープを含むポリペプ
チドは、キャリアタンパク質（例えば、アルブミン）とともに動物系（例えば、
ウサギまたはマウス）に対する抗体応答を誘発するために提示され得るか、また
はこのポリペプチドが十分に長い場合（少なくとも約２５アミノ酸）、そのポリ
ペプチドはキャリアなしで提示され得る。しかし、８〜１０個程度の少なさのア
ミノ酸を含む免疫原性エピトープは、少なくとも変性ポリペプチド中の直鎖状エ
ピトープに結合し得る抗体を惹起するには十分であることが示されている（例え
ば、ウェスタンブロッティングにおいて）。
【００９５】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。これらの周知の方法としては、インビボ免疫、
インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定
されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出、およ
びＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：２３４７−２３５４（１
９８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用
いて免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キ
ーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチ
ドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペ
プチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｍ
ＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペプ
チドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリア
に結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチ
ドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、約１００μｇのペ
プチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントまたは免疫応答
を刺激することが公知である他のアジュバントを含むエマルジョンを腹腔内注射
および／または皮内注射することにより免疫される。いくつかのブースター注射
が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間隔で
、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプチドを
用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血清中の抗
ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の方法
に従う固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出による）に
より上昇し得る。
【００９６】 当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、本発明のポリペ
プチドおよびその免疫原性エピトープフラグメントおよび／または抗原性エピト
ープフラグメントは、他のポリペプチド配列に融合され得る。例えば、本発明の
ポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ド
メインまたはそれらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組
み合わせ、およびこれらの部分）と融合し得、これがキメラポリペプチドを生じ
る。このような融合タンパク質は、精製を容易にし得、そしてインビボにおける
半減期を増加し得る。このことは、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメ
インおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメ
インからなるキメラタンパク質について示された。例えば、ＥＰ ３９４，８２
７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４−８６（１９８８）
を参照のこと。上皮の関門を横切っての免疫系への抗原の増強された送達は、Ｆ
ｃＲｎ結合パートナー（例えば、ＩｇＧフラグメントまたはＦｃフラグメント（
例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ９６／２２０２４およびＷＯ ９９／０４８１３を参
照のこと）に結合体化した抗原（例えば、インスリン）について実証されている
。ジスルフィド架橋二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、そのＩｇ
Ｇ部分ジスルフィド結合に起因して、単量体ポリペプチドまたはそれらのフラグ
メント単独よりも、他の分子の結合および中和において効果的であることが見出
された。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０
：３９５８−３９６４（１９９５）を参照のこと。
【００９７】 同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ国対応出願２０４５８６９）
は、別のヒトタンパク質またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常領域
の種々の部分を含む、融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質
中のＦｃ部分は、治療および診断において有利であり、従って、例えば改善され
た薬物動態学的特性を生じ得る（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。あるいは、融
合タンパク質が発現、検出、および精製された後に、Ｆｃ部分が欠失され得るこ
とが望ましい。例えば、融合タンパク質が、免疫の抗原として使用される場合、
そのＦｃ部分は、治療および診断を妨げ得る。薬物探索において、例えばｈＩＬ
−５のようなヒトタンパク質が、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための
高処理能力スクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されている。
（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ
８：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。） さらに、本発明のポリペプチドは、融合されたポリペプチドの精製を容易にす
るペプチドのような、マーカー配列と融合され得る。好ましい実施形態において
、このマーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉ
ｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９
１３１１）において提供されるタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドであり
、それらの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載される
ように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製
に有用な他のペプチドタグである「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素
タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７
６７（１９８４））。
【００９８】 従って、これら上記の任意の融合物は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドを用いて操作され得る。
【００９９】 上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグ（例えば、血球凝
集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグタグ（ｆｌａｇ ｔａｇ））として目的の
遺伝子と組換えられ、発現されたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。
例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載された系は、ヒト細胞株において発
現される非変性融合タンパク質の迅速な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７
（１９９１））。この系において、目的の遺伝子は、遺伝子の読み取り枠が、６
つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグと翻訳で融合されるように、ワクシ
ニア組換えプラスミド中にサブクローンされる。このタグは、融合タンパク質に
ついての基質結合ドメインとしてはたらく。組換えワクシニアウイルスに感染し
た細胞由来の抽出物は、Ｎｉ２＋ニトリロ三酢酸アガロースカラムに充填され、
そしてヒスチジンタグ化したタンパク質が、イミダゾール含有緩衝液を用いて選
択的に溶出され得る。
【０１００】 本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを使用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、この
ような方法を用いて、変化した活性を有するポリペプチド、ならびにそのポリペ
プチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る。一般には、米国特許第
５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号
；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａ
ｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−
３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏおよびＢｌａ
ｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９９８）
（これらの特許および刊行物の各々は、本明細書によってその全体が参考として
援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号Ｘに対応するポ
リヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプ
チドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリン
グは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、２つ以上のＤＮＡセグメント
をアセンブリして、ポリヌクレオチド配列における変化を産生することを含む。
別の実施形態において、本発明のポリヌクオチドまたはコードされるポリペプチ
ドは、組換え前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他
の方法による、ランダムな変異誘発に供されることによって改変され得る。別の
実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ
以上の成分、モチーフ、セクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラ
グメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、セクション
、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。
【０１０１】 （ポリヌクレオチド改変体およびポリペプチド改変体） 本発明はまた、開示されるヒトポリヌクレオチドおよびポリペプチドの改変体
を含む。本発明は、配列番号Ｘに開示されるポリヌクレオチド配列の改変体また
はそれらに対する相補鎖の改変体、および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｖ中に
含まれるｃＤＮＡ配列の改変体に関する。
【０１０２】 本発明はまた、配列番号Ｙに開示されるポリペプチド配列の改変体、配列番号
Ｘのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列の改変体および／
またはｃＤＮＡプラスミド：Ｖ中のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド
配列の改変体を含む。
【０１０３】 「改変体」とは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが
それらの特性は保持している、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。一
般的に、改変体は全体的に非常に類似しており、そして、多くの領域において、
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である。
【０１０４】 従って、本発明の１つの局面は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれらからなる単離された核
酸分子を提供する：（ａ）配列番号Ｘに記載されるかまたはクローン番号Ｖのｃ
ＤＮＡに含まれるヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号Ｘまたは配列番号Ｙの完全
アミノ酸配列もしくはクローン番号ＶにおけるｃＤＮＡによってコードされる完
全アミノ酸配列をコードするクローン番号ＶにおけるｃＤＮＡのヌクレオチド配
列；（ｃ）配列番号Ｘまたは成熟ヒトポリペプチドをコードするクローン番号Ｖ
におけるｃＤＮＡのヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号Ｘまたはヒトポリペプチ
ドの生物学的に活性なフラグメントをコードするクローン番号ＶのｃＤＮＡ配列
のヌクレオチド配列；（ｅ）配列番号Ｘまたはヒトポリペプチドの抗原性フラグ
メントをコードするクローン番号ＶのｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列；（ｆ）
配列番号Ｙの完全アミノ酸配列またはクローン番号ＶにおけるｃＤＮＡによって
コードされる完全アミノ酸配列を含むヒトポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列；（ｇ）配列番号Ｙのアミノ酸配列またはクローン番号ＶにおけるｃＤＮ
Ａによってコードされるアミノ酸配列の成熟ヒトポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列；（ｈ）配列番号Ｙの完全アミノ酸配列またはクローン番号Ｖにお
けるｃＤＮＡによってコードされる完全アミノ酸配列を有するヒトポリペプチド
の生物学的に活性なフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｉ）配列番
号Ｙの完全アミノ酸配列またはクローン番号ＶにおけるｃＤＮＡによってコード
される完全アミノ酸配列を有するヒトポリペプチドの抗原性フラグメントをコー
ドするヌクレオチド配列；および（ｊ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）
、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）における任意のヌクレオチド配
列に相補的なヌクレオチド配列。
【０１０５】 本発明はまた、例えば上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ
）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、もしくは（ｊ）中の任意のヌクレオチド配列、配
列番号Ｘにおけるヌクレオチドコード配列もしくはそれに対する相補鎖、クロー
ン番号Ｖに含まれるｃＤＮＡのヌクレオチドコード配列もしくはそれに対する相
補鎖、配列番号Ｙのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、配列番号Ｘに
おけるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列をコードするヌ
クレオチド配列、配列番号Ｘにおけるポリヌクレオチド配列の相補体によってコ
ードされるポリペプチド配列、クローン番号Ｖに含まれるｃＤＮＡによってコー
ドされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、表１の列１０に規定され
るようなポリペプチド配列をコードする配列番号Ｘにおけるヌクレオチド配列も
しくはそれに対する相補鎖、表１の列１０に規定されるようなポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列もしくはそれに対する相補鎖、および／または任意の
これらの核酸分子のポリヌクレオチドフラグメント（例えば、本明細書中に記載
されるそれらのフラグメント）に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、
９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を
含むか、あるいはこれらからなる、核酸分子に関する。ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件下または低いストリンジェンシー条件下でこれらの核酸
分子の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、これらのポリヌク
レオチドおよび核酸によってコードされるポリペプチドと同様に、本発明によっ
て含まれる。
【０１０６】 本発明の好ましい実施形態は、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件下または低いストリンジェンシー条件下で上記の（ａ）、（ｂ）、
（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、もしくは（ｊ）に
おけるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むか、また
はこれらからなる核酸分子を、これらのポリヌクレオチドによってコードされる
ポリペプチドと同様に含む。別の好ましい実施形態において、ストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件下または低いストリンジェンシー条件下でこれら
の核酸分子の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、これらのポ
リヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同様に、本発明によって含
まれる。
【０１０７】 別の実施形態において、本発明は、以下からなる群より選択されたアミノ酸配
列を有するポリペプチドを含むか、またはそれらからなる精製タンパク質を提供
する：（ａ）配列番号Ｙの完全アミノ酸配列もしくはクローン番号Ｖにおけるｃ
ＤＮＡによってコードされる完全アミノ酸配列；（ｂ）配列番号Ｙのアミノ酸配
列もしくはクローン番号ＶにおけるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列
を有するヒトポリペプチドの成熟形態のアミノ酸配列；（ｃ）配列番号Ｙの完全
アミノ酸配列もしくはクローン番号ＶにおけるｃＤＮＡによってコードされる完
全アミノ酸配列を有するヒトポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントのア
ミノ酸配列；および（ｄ）配列番号Ｙの完全アミノ酸配列もしくはクローン番号
ＶにおけるｃＤＮＡによってコードされる完全アミノ酸配列を有するヒトポリペ
プチドの抗原性フラグメントのアミノ酸配列。
【０１０８】 本発明はまた、例えば、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）における
アミノ酸配列、配列番号Ｙに示されるアミノ酸配列、クローン番号Ｖに含まれる
ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、表１の列１０に規定されるような
アミノ酸配列、配列番号Ｘにおけるヌクレオチド配列によってコードされるアミ
ノ酸配列、および配列番号Ｘにおけるポリヌクレオチド配列の相補体によってコ
ードされるアミノ酸配列のいずれかに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列
を含むかまたはそれからなる、タンパク質に関する。これらのポリペプチドのフ
ラグメントもまた、提供される（例えば、本明細書中に記載されるそれらのフラ
グメント）。さらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下または
低いストリンジェンシー条件下でこれらのアミノ酸をコードする核酸分子の相補
体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質もま
た、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドと同様に本発明によって
含まれる。
【０１０９】 本発明の参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」である
ヌクレオチド配列を有する核酸によって、その核酸のヌクレオチド配列が、その
ヌクレオチド配列がポリぺプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００
ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を含み得ることを除いて、参照配列に対し
て同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少な
くとも９５％同一のヌクレオチド配列を有する核酸を得るために、参照配列のヌ
クレオチドの５％までが、欠失され得るか、または別のヌクレオチドで置換され
得るか、あるいは参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが
参照配列中に挿入され得る。問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）配列は、表１に示される
配列全体、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、または本明細書中で記載
されるように特定される任意のフラグメントであり得る。
【０１１０】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログ
ラムを使用して従来的に決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象
配列との間の最も良好な全体的な適合性（全体的な配列整列とも呼ばれる）を決
定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ． Ｂｉｏ
ｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤ
Ｂコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い
合わせ配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、Ｕ
からＴに変換することによって比較され得る。この全体的な配列整列の結果は、
同一性パーセント（％）で示される。同一性パーセントを算定するためにＤＮＡ
配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒ
ｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔ
ｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ
Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐ
ｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏ
ｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらかより短い方
）である。
【０１１１】 対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失のためではなく）問い合
わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。こ
れは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列
の５’および３’の短縮を考慮しないからである。５’末端または３’末端で短
縮されている対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは
、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されない対象配列の５
’および３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正され
る。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果に
よって決定される。次いで、このパーセントは、特定のパラメーターを用いて上
記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定された同一性パーセントから差し引か
れ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、
本発明の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示されるよう
に、問い合わせ配列と一致／整列されない、対象配列の５’および３’の塩基の
外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定され
る。
【０１１２】 例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失が、対象配列の５’末端で生じ、従って
、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１
０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’の末端の塩
基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％が、ＦＡＳＴＤ
Ｂプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。
残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％で
ある。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と比較
される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、対象配列の５’または
３’に問い合わせと一致／整列しない塩基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤ
Ｂによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合わ
せ配列と一致／整列しない対象配列の５’または３’の塩基のみが手動で補正さ
れる。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【０１１３】 本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であ
るアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列
は、その対象ポリぺプチド配列が問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ
酸あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に
同一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくと
も９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、対象配列
におけるアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（インデル（ｉｎｄｅｌｓ）
）または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ
酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端位置で生じ得るか、またはそれらの
末端位置の間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々にかまたは参照配
列内の１個以上連続する群の状態かのいずれかで、散在する。
【０１１４】 実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、表１に示されるアミ
ノ酸配列またはそのフラグメント、配列番号Ｘにおけるヌクレオチド配列により
コードされるアミノ酸配列またはそのフラグメント、あるいはｃＤＮＡプラスミ
ド：ＶにおけるｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列またはそのフラグメン
トに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９
８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使
用して従来のように決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列
との間での最良の全体的な一致（全体的配列整列とも呼ばれる）を決定するため
の好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：
２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュー
タープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせ配列お
よび対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは両方ともアミノ酸配
列であるかのいずれかである。上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセン
トで示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは
：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎ
ａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔ
ｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉ
ｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉ
ｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象
アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）である。
【０１１５】 対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問
い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならな
い。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する
場合に、対象配列のＮ末端短縮およびＣ末端短縮を考慮しないからである。Ｎ末
端およびＣ末端で短縮されている対象配列について、問い合わせ配列に対して、
同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対
象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配
列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されている
か否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパー
セントは、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定のパラメーターを使用し
て計算された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントのス
コアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアが、本発明の目的で使
用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端
側およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目
的のために考慮される。すなわち、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端残基
の外側の問い合わせ残基位置のみである。
【０１１６】 例えば、９０アミノ酸残基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために
１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そ
してそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示
さない。この１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およ
びＣ末端の残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳ
ＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差
し引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセント
は９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合
わせ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わ
せ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。
この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正さ
れない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整
列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外側の残基位置のみが手動で補正され
る。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【０１１７】 改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方における変化を含み得
る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠失を生成するがコ
ードされるポリぺプチドの特性または活性を変化させない変化を含む、ポリヌク
レオチド改変体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレントな置換によって
生成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、５０アミノ酸未満、４０
アミノ酸未満、３０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満、１０アミノ酸未満、ある
いは５〜５０アミノ酸、５〜２５アミノ酸、５〜１０アミノ酸、１〜５アミノ酸
、または１〜２アミノ酸が、任意の組合せで置換、欠失、または付加されている
改変体もまた、好ましい。ポリヌクレオチド改変体は、種々の理由（例えば、特
定の宿主についてのコドン発現を至適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを、
Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌宿主によって好ましいコドンに変化させる））のため
に、生成され得る。
【０１１８】 天然に存在する改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、そして生物の染色
体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態のうちの１つを
いう。（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子改変体は、
ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリぺプチドレベルのいずれかで変化し
得、そして本発明に含まれる。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発
技術によってまたは直接的な合成によって生成され得る。
【０１１９】 タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、改変体は、
本発明のポリぺプチドの特性を改善または変化させるために作製され得る。例え
ば、本明細書中に考察されるように、１つ以上のアミノ酸が、生物学的機能の実
質的な欠損を伴わずに、本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失さ
れ得る。Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１
９９３）の著者らは、３個、８個、または２７個のアミノ末端アミノ酸残基を欠
失させた後でさえもヘパリン結合活性を有する改変体ＫＧＦタンパク質を報告し
た。同様に、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜
１０個のアミノ酸残基を欠失させた後、１０倍までのより高い活性を示した（Ｄ
ｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８
８））。
【０１２０】 さらに、豊富な証拠は、改変体が、天然に存在するタンパク質の生物学的活性
に類似する活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Ｇａｙｌｅおよび
共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５−２２１１１（１
９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる変異分析を行った
。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって改変体当たり
平均２．５アミノ酸の変化になる、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ改変
体を作製した。複数の変異が、全ての潜在的なアミノ酸の位置で試験された。こ
の研究者らは、「分子の大部分は、［結合活性または生物学的活性］のいずれに
対してもほとんど影響を伴わないで変化され得る」ことを見出した。（要約を参
照のこと）。実際、試験された３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、
わずか２３個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタンパク質
を生成した。
【０１２１】 さらに、ポリぺプチドのＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失
が、１つ以上の生物学的機能の改変または欠失を生じたとしても、他の生物学的
活性はなお保持され得る。例えば、分泌される形態を認識する抗体を誘導および
／または結合する、欠失改変体の能力は、分泌される形態の大多数より少ない残
基が、Ｎ末端またはＣ末端から除去される場合に保持されるようである。タンパ
ク質のＮ末端またはＣ末端残基を欠損する特定のポリぺプチドが、このような免
疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、および
そうでなければ当該分野において公知の慣用的な方法によって容易に決定され得
る。
【０１２２】 従って、本発明はさらに、本発明のポリペプチド（それらが改変体である）の
機能的な活性（例えば、生物学的活性）を示すポリぺプチド改変体を含む。この
ような改変体としては、活性に対する影響をほとんど有さないように、当該分野
において公知の一般的な法則に従って選択される、欠失、挿入、逆位、反復、お
よび置換が挙げられる。
【０１２３】 本出願は、本明細書中に開示される核酸配列に対して少なくとも８０％、８５
％、９０％、９５％、９６％、９７、９８％、９９％または１００％同一の核酸
分子に関し（例えば、Ｎおよび／Ｃ末端欠失のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードする）、それらが機能的活性を有するポリペプチドをコードするかど
うかに関わらない。これは、特定の核酸分子が機能的活性を有するポリペプチド
をコードしないためであり、当業者は、例えば、ハイブリダイゼーションプロー
ブまたはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして核酸分子をどのように
して使用するかを知る。機能的活性を有するポリペプチドをコードしない本発明
の核酸分子の使用は、特に、（１）ｃＤＮＡライブラリー内で遺伝子または対立
遺伝子またはそれらのスプライス変異体を単離する工程；（２）Ｖｅｒｍａら、
Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１
９８８）に記載されるような、遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、中
期染色体拡散へのインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」
）；および（３）特定の組織内でｍＲＮＡ発現を検出するためのＮｏｒｔｈｅｒ
ｎ Ｂｌｏｔ分析。
【０１２４】 しかし、本明細書中に開示される核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％
、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列
を有する核酸分子が好ましく、これは、実際に本発明のポリペプチドの機能的活
性を有するポリペプチドをコードする。
【０１２５】 当然のことながら、遺伝子コードの縮重に起因して、例えば、ｃＤＮＡプラス
ミド：Ｖの核酸配列、表１（配列番号Ｘ）に示される核酸配列またはそのフラグ
メントに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、
９８％、９９％、または１００％同一の配列を有する多数の核酸分子が、「機能
活性を有する」ポリペプチドをコードするということを、当業者は、直ちに理解
する。実際に、これらのヌクレオチド配列のいずれかの縮重改変体すべてが、同
じポリぺプチドをコードするので、多くの場合、このことは、上記の比較アッセ
イを実行しなくても、当業者に明らかである。縮重改変体でないような核酸分子
について、合理的な数がまた、機能活性を有するポリペプチドをコードすること
が、当該分野でさらに理解される。なぜならば、当業者が、さらに以下に記載さ
れるように、タンパク質を有意に機能させるかまたは機能しそうにないアミノ酸
置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸を第２の脂肪族アミノ酸と置換すること）
を完全に知っているからである。
【０１２６】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換の作製方法に関する手引きは、
Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ
ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａ
ｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７
：１３０６−１３１０（１９９０）に提供され、ここにおいてこの著者らは、タ
ンパク質がアミノ酸配列の変化に対する寛容性を研究するための２つの主な戦略
を示す。
【０１２７】 第１のストラテジーは、進化の過程の間の自然の選択によるアミノ酸置換の寛
容を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較して、保存されるアミノ酸
が同定され得る。これらの保存されるアミノ酸は、タンパク質の機能について重
要であるようである。対照的に、置換が自然の選択によって寛容されたアミノ酸
の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないことを示す。従って
、アミノ酸置換を寛容する位置は改変され得るが、タンパク質の生物学的活性を
なおも維持する。
【０１２８】 第２のストラテジーは、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クロ
ーン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を
使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（
分子中の各残基で１つのアラニン変異の導入）が、使用され得る。（Ｃｕｎｎｉ
ｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（
１９８９））。次いで、得られた変異分子は生物学的活性について試験され得る
。
【０１２９】 著者らが言及するように、これらの２つのストラテジーは、タンパク質がアミ
ノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミ
ノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示
す。例えば、（タンパク質の三次構造内に）ほとんど埋もれているアミノ酸残基
は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されな
い。さらに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸
のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基のＳｅｒお
よびＴｈｒの置換；酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基のＡｓｎ
およびＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香
族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズのアミノ
酸のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換を含む。保存的なア
ミノ酸置換に加えて、本発明の改変体は、（ｉ）１つ以上の非保存的なアミノ酸
残基との置換、ここでは置換されるアミノ酸残基は、遺伝コードによってコード
されるアミノ酸残基であってもよく、もしくはそうでなくてもよい、または（ｉ
ｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基での置換、または（ｉｉｉ）別の化
合物（例えば、ポリぺプチドの安定性および／もしくは可溶性を増加するための
化合物（例えば、ポリエチレングリコール））との成熟ポリぺプチドの融合、ま
たは（ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチド、また
はリーダーもしくは分泌配列、または精製を容易にする配列のような）とのポリ
ぺプチドの融合、または（ｖ）別の化合物（例えば、アルブミン（組み換えアル
ブミン（例えば、米国特許第５，８７６，９６９号（１９９９年３月２日発行）
、欧州特許第０ ４１３ ６２２号および米国特許第５，７６６，８８３号（１
９９８年６月１６日発行）を参照のこと、その全体が参考として本明細書に援用
される）が挙げられるが、それに限定されない））との融合を含む。このような
改変体ポリぺプチドは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内であると考えら
れる。
【０１３０】 例えば、他の荷電されたアミノ酸または中性のアミノ酸での荷電されたアミノ
酸のアミノ酸置換を含むポリぺプチド改変体は、改善された特性（例えば、より
少ない凝集性）を有するタンパク質を産生し得る。薬学的処方物の凝集は、凝集
体の免疫原活性に起因して、活性の減少およびクリアランスの増加の両方をもた
らす。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１
−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−
８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（
１９９３））。
【０１３１】 本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つのアミノ酸置換であるが、５０
アミノ酸を超えない置換、なおさらに好ましくは、４０アミノ酸を超えない置換
、なおさらに好ましくは、３０アミノ酸を超えない置換、そして、なおさらによ
り好ましくは、２０アミノ酸を超えない置換、を含むアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。もちろん、配列番号Ｙの
ポリペプチドのアミノ酸配列、配列番号Ｘによってコードされるアミノ酸配列、
および／または、絶えず増加する優先順序で、少なくとも１つであるが、１０、
９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸を超えない置換を含むｃＤ
ＮＡプラスミド：Ｖ中のｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含むアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドについて大いに好ましい。特定の実施形態におい
て、配列番号Ｙまたはそのフラグメント（例えば、本明細書中に記載される成熟
形態および／または他のフラグメント）のアミノ酸配列、配列番号Ｘまたはその
フラグメントによってコードされるアミノ酸配列、および／またはｃＤＮＡプラ
スミドＶまたはそのフラグメントによってコードされるアミノ酸配列における付
加、置換、および／または欠失の数は、１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０
、１０〜５０または５０〜１５０であり、保存的なアミノ酸置換が好ましい。本
明細書中で考察されるように、本発明の任意のポリペプチドが、融合タンパク質
を作製するために使用され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、第２のタン
パク質に融合される場合、抗原性タグとして使用され得る。本発明のポリペプチ
ドに対して惹起された抗体は、このポリペプチドに結合することによって第２の
タンパク質を間接的に検出するために使用され得る。さらに、分泌タンパク質は
、輸送シグナルに基づいて細胞位置を標的化するので、分泌されることが示され
ている本発明のポリペプチドは、他のタンパク質に一旦融合された標的分子とし
て使用され得る。
【０１３２】 本発明のポリペプチドに融合され得るドメインの例としては、異種シグナル配
列だけでなく、他の異種機能領域もまた含む。融合は、必ずしも直接的である必
要はないが、リンカー配列を介して生じ得る。
【０１３３】 特定の好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、ポリペプチドが、
Ｎおよび／Ｃ末端欠失変異体である融合タンパク質を含む。好ましい実施形態に
おいて、本願は、特定のＮ末端およびＣ末端欠失変異体のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードする核酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０
％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸分子に関する
。フラグメントおよび／または改変体を含む、これらのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドはまた、本発明によって包含される。
【０１３４】 さらに、融合タンパク質はまた、本発明のポリペプチドの特徴を改善するため
に操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸の領域、特に荷電したアミノ酸は、
宿主細胞からの精製または引き続く取り扱いおよび貯蔵の間の安定性および持続
性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部
分は、精製を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。このような領域は
、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。ポリペプチドの取り扱いを容易
にするためのペプチド部分の付加は良く知られており、当該分野で慣例的な技術
である。
【０１３５】 当業者に理解されるように、本発明のポリペプチドおよび上記のそのエピトー
プ保有フラグメントは、異種ポリペプチド配列と組み合わされ得る。例えば、本
発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の
定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびそれらの任
意の組み合わせ（全ドメインおよびその部分の両方を含む）と融合され得、キメ
ラポリペプチドを生じる。このような融合タンパク質は、精製を容易にし得、そ
してインビボでの半減期を増大させ得る。これは、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの
最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常
領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載する例を報告する。（Ｅ
Ｐ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８
４〜８６（１９８８）を参照のこと。ジスルフィド結合二量体構造（ＩｇＧに起
因する）を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、単量体タンパク質またはそれら
のタンパク質単独よりも、他の分子の結合および中和においてより効果的である
ことが見出され得る。（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。
【０１３６】 （ベクター、宿主細胞、およびタンパク質産生） 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、および
組換え技術によるポリペプチドの産生に関連する。例えば、ベクターは、ファー
ジベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベ
クターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテント、または複製
欠損であり得る。後者の場合、一般的にウイルス増殖は、補完性（ｃｏｍｐｌｅ
ｍｅｎｔｉｎｇ）宿主細胞にのみ生じる。
【０１３７】 本発明のポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために選択マーカーを含む
ベクターに連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈
澱物のような沈澱物、または荷電脂質との複合体において導入される。ベクター
がウイルスである場合、ウィルスベクターは、適切なパッケージング細胞株を使
用してインビトロでパッケージングされ、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【０１３８】 ポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター（いくつか挙げれば、例えば
、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプ
ロモーター、ｐｈｏＡプロモーターおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プ
ロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲの
プロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは
当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開始、転写終結のための部位、
および転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物によ
って発現される転写物のコード部分は、好ましくは、始めに翻訳開始コドン、お
よび翻訳されるためのポリペプチドの末端に適切に位置される終結コドン（ＵＡ
Ａ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【０１３９】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカー
を含む。このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクター
ゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他
の細菌において培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシ
リン耐性遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ細胞）；酵母細胞のような真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣ
Ｃ受託番号２０１１７８））；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細
胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞のような動物細胞；ならびに植物細胞を含
むが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条
件は、当該分野で公知である。
【０１４０】 細菌における使用のために好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６
０およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６
ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；およびｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３
−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）を含む。好ましい真核生物ベクターの中
には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ
およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。酵母菌系における
使用のための好ましい発現ベクターは、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚ
ｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰ
ＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ
、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌ
ｂａｄ，ＣＡから入手可能）を含むが、これらに限定されない。他の適切なベク
ターは当業者に容易に明らかである。
【０１４１】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によっ
てもたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）のような多く
の標準的研究室マニュアルに記載される。本発明のポリペプチドは、実際、組換
えベクターを欠損する宿主細胞によって発現され得ることが特に意図される。
【０１４２】 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽
出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト
グラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され得、そして
精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）
が精製のために使用される。
【０１４３】 本発明のポリペプチドはまた、以下から回収され得る：直接単離されるかまた
は培養されるかにかかわらず、体液、組織および細胞を含む天然の供給源から精
製された産物；化学的合成手順の産物；ならびに、例えば、細菌細胞、酵母細胞
、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む、原核生物宿主または真
核生物宿主から組換え技術によって産生された産物。組換え産生手順に使用され
る宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもまたはグリ
コシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドもまた、宿主媒
介プロセスの結果として、いくつかの場合において、最初の改変されたメチオニ
ン残基を含み得る。従って、一般に、翻訳開始コドンによってコードされるＮ末
端メチオニンが、すべての真核生物細胞における翻訳後の任意のタンパク質から
高い効率で除去されることは当該分野において周知である。ほとんどのタンパク
質においてＮ末端メチオニンもまた、ほとんどの原核生物において効果的に除去
されるが、いくつかのタンパク質について、この原核生物除去プロセスは、Ｎ末
端メチオニンが共有結合するアミノ酸の性質に依存しており、非効率的である。
【０１４４】 １つの実施形態においては、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、真核生
物系において本発明のポリペプチドを発現するために用いられる。Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓは、メタノールをその唯一の炭素源として代謝し得るメチロ
トローフィック（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母である。メタノール代謝
経路における主なステップは、Ｏ２を用いてメタノールを酸化し、ホルムアルデ
ヒドにすることである。この反応は、酵素アルコールオキシダーゼにより触媒さ
れる。メタノールをその唯一の炭素源として代謝するために、Ｐｉｃｈｉａ ｐ
ａｓｔｏｒｉｓは、Ｏ２に対するアルコールオキシダーゼの相対的に低い親和性
にいくぶん起因して、高いレベルのアルコールオキシダーゼを産生しなければな
らない。従って、主要な炭素源としてのメタノールによる増殖培地において、２
つのアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）のうちの１つのプロモーター領
域は、非常に活性である。メタノールの存在下において、ＡＯＸ１遺伝子から産
生されるアルコールオキシダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ中の総可
溶性タンパク質のおよそ３０％までを構成する。Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１１１−２１（１９８５）；Ｋｏｕｔｚ，Ｐ．
Ｊ．ら、Ｙｅａｓｔ ５：１６７−７７（１９８９）；Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｆ
．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３８５９−７６（１９８７）を参
照のこと。従って、全体または一部のＡＯＸ１調節塩基配列の転写調節下で、異
種コード配列（例えば、本発明のポリヌクレオチド）は、メタノールの存在下で
増殖したＰｉｃｈｉａ酵母において例外的に高いレベルで発現される。
【０１４５】 １つの例においては、プラスミドベクターｐＰＩＣ９Ｋは、本明細書中に記述
されるように、本質的に以下に記載されるようなＰｉｃｈｅａ酵母系において本
発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現するために用いられる：「Ｐｉｃ
ｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ」、Ｄ．Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪ．Ｃｒｅｇｇ編、Ｔｈｅ Ｈ
ｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８。この発現ベクターは
、多重クローニング部位の上流に位置するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓアル
カリホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド（すなわち、リーダーペプ
チド）に連結した強いＡＯＸ１プロモーターの効力により、本発明のポリペプチ
ドの発現および分泌を可能にする。
【０１４６】 多くの他の酵母ベクターは、当業者が容易に理解するように、提案される発現
構築物が、転写、翻訳、分泌（所望される場合）などのために適切に配置された
シグナル（必要ならばインフレームＡＵＧを含む）を提供する限り、ｐＰＩＣ９
Ｋ（例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、
ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩ
Ｌ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、およびＰＡＯ８１５）の代わり
に用いられ得る。
【０１４７】 別の実施形態においては、異種コード配列（例えば、本発明のポリヌクレオチ
ドのような）の高レベルの発現は、本発明の異種ポリヌクレオチドを発現ベクタ
ー（例えば、ｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺαのような）にクローニングすること
により達成され得、そしてメタノールの非存在下で酵母培養物を増殖させる。
【０１４８】 本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加え
て、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次（ｐｒｉｍａｒ
ｙ）宿主細胞、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）宿主細胞、および不死化宿主細胞を
含む。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、コード配列）を欠失ま
たは置換するように操作されており、そして／または本発明のポリヌクレオチド
と作動可能に連結された遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含む
ように操作され、そして内因性のポリヌクレオチドを活性化、変更、および／ま
たは増幅する。例えば、当該分野で公知の技術は、相同組換えを介して、異種制
御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）および内因性ポリ
ヌクレオチド配列を作動可能に連結するために使用され得る（例えば、１９９７
年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２
６日に公開された国際公開第ＷＯ ９６／２９４１１号；１９９４年８月４日に
公開された国際公開第ＷＯ ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；
およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９
）を参照のこと。これらの開示の各々は、それら全体において参考として援用さ
れる）。
【０１４９】 さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成さ
れ得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．
Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら，Ｎａ
ｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、ポリ
ペプチドのフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチド合成機の使用によ
り合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸
アナログが、置換または付加としてこのポリペプチド配列に導入され得る。非古
典的アミノ酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：通常のアミ
ノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸
、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、
Ａｉｂ，２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイ
シン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトル
リン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリ
シン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナー
アミノ酸（例えば、ｂ−メチルアミノ酸）、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチ
ルアミノ酸、および一般のアミノ酸アナログ。さらにアミノ酸はＤ（右旋性）ま
たはＬ（左旋性）であり得る。
【０１５０】 本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リ
ン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質
分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改
変される本発明のポリペプチドを含む。任意の多数の化学的改変は、以下を含む
がこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シアン、トリプ
シン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的
化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下で
の代謝合成；など。
【０１５１】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙
げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロ
セシング）、アミノ酸バックボーンへの化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結
合型の炭水化物鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末
端メチオニン残基の付加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標
識（例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変
して、このタンパク質の検出および単離が可能にされ得る。
【０１５２】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、本発明のポ
リペプチドの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を
参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエ
チレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カ
ルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選
択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置で、またはこの
分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を
含み得る。
【０１５３】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状でまたは非
分枝状であり得る。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量は、取
り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間（用語
「約（およそ）」は、ポリエチレングリコールの調製物において、いくつかの分
子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）
である。所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間、存
在する場合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度ま
たは抗原性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチ
レングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。
【０１５４】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してこのタンパク質に
結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば
、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦ
にＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２
８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリ
エチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル
基）を介してアミノ酸残基により共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエ
チレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸
残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカ
ルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン
酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、
ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治
療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン
基での結合である。
【０１５５】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコ
ールを本組成物の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子から（
分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール分子の
タンパク質（ポリペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の型、お
よび選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端ペグ化
調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部分から
分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物質の精
製によるものであり得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、特
定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リジ
ン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得る
。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタン
パク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０１５６】 本発明のポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー（すなわち、ダイマー、
トリマー、テトラマーおよびより高度のマルチマー）であり得る。従って、本発
明は、モノマーおよびマルチマーの本発明のポリペプチド、それらの調製ならび
にそれらを含む組成物（好ましくは、治療剤（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ））に関
する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、モノマー、ダイマー、ト
リマーまたはテトラマーである。さらなる実施形態では、本発明のマルチマーは
、少なくともダイマー、少なくともトリマー、または少なくともテトラマーであ
る。
【０１５７】 本発明によって含まれるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る
。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、配列番号Ｙのアミノ酸配列ま
たは配列番号Ｘによってコードされるアミノ酸配列もしくは配列番号Ｘの相補体
、および／またはプラスミド：Ｖによってコードされるアミノ酸配列に対応する
ポリペプチド（本明細書中に記載されるポリペプチドの、フラグメント、改変体
、スプライス改変体、および融合タンパク質を含む）のみを含むマルチマーをい
う。これらのホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含み得る。特定の実施形態では、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配列を
有するポリペプチドのみを含むマルチマーである。別の特定の実施形態では、本
発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むマルチマー
である。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ホモダイマー（例えば、
同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む）あるいはホモトリ
マー（例えば、同一および／または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを
含む）である。さらなる実施形態では、本発明のホモマー性マルチマーは、少な
くともホモダイマー、少なくともホモトリマーまたは少なくともホモテトラマー
である。
【０１５８】 本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のポリペプチドに
加えて１以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質のポリペプチド
）を含むマルチマーをいう。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ヘテ
ロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーである。さらなる実施形態
では、本発明のヘテロマー性マルチマーは、少なくともヘテロダイマー、少なく
ともヘテロトリマーまたは少なくともヘテロテトラマーである。
【０１５９】 本発明のマルチマーは、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合
的な結合の結果であり得、そして／または例えば、リポソーム形成によって間接
連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明のマルチマー（例えば、ホ
モダイマーまたはホモトリマーなど）は、本発明のポリペプチドが溶液中で互い
に接触する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロマルチマー（
例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマー）は、本発明のポリペプチドが
、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質におけ
る異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触した場合に形成される。他
の実施形態では、本発明のマルチマーは、本発明のポリペプチドとの、および／
または本発明のポリペプチド間での共有結合によって形成される。このような共
有結合は、ポリぺプチド配列（例えば、配列番号Ｙに記載されるか、または配列
番号Ｘ、および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｖによってコードされるポリペプ
チドに含まれる）に含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、この
共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）ポリペプチドにおいて相
互作用するポリペプチド配列内に位置するシステイン残基間での架橋である。別
の例では、この共有結合は、化学的操作または組換え操作の結果である。あるい
は、このような共有結合は、融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列において
含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、共有結合は、本発明の融
合タンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特許第５，４７８，９
２５号を参照のこと）。特定の例では、この共有結合は、（本明細書中に記載さ
れるような）本発明のＦｃ融合タンパク質に含まれる異種配列間にある。別の特
定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、共有結合したマルチマーを
形成し得る別のタンパク質（例えば、オステオプロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐｒ
ｏｔｅｇｅｒｉｎ）など）由来の異種ポリペプチド配列間にある（例えば、国際
公開番号ＷＯ ９８／４９３０５号（この内容はその全体が本明細書中で参考と
して援用される）を参照のこと）。別の実施形態では、２以上の本発明のポリペ
プチドは、ペプチドリンカーを通して連結される。例としては、米国特許第５，
０７３，６２７号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるペプチド
リンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによって隔てられた複数の本発明のポ
リペプチドを含むタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて産生され得る
。
【０１６０】 本発明のマルチマーポリペプチドを調製するための別の方法は、ロイシンジッ
パーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合され
た本発明のポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインおよびイソロ
イシンジッパードメインは、そのドメインが見出されるタンパク質のマルチマー
形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは元々、いくつかのＤＮ
Ａ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１７５９、（１９８８））、そしてそれ以来種々の異なるタンパク質
において見出されている。とりわけ公知のロイシンジッパーは、ダイマー形成ま
たはトリマー形成をする、天然に存在するペプチドおよびその誘導体である。本
発明の可溶性マルチマータンパク質を生成するために適切なロイシンジッパード
メインの例は、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０
３０８に記載されるロイシンジッパードメインである。溶液中でダイマー形成ま
たはトリマー形成をするペプチド配列に融合された本発明のポリペプチドを含む
組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得られる可溶性
マルチマー融合タンパク質は、当該分野で公知の技術を用いて培養上清から回収
される。
【０１６１】 本発明のトリマーポリペプチドは、増強された生物学的活性の利点を提供し得
る。好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分は、トリマーを優先
的に形成する部分である。１例は、本明細書中に参考として援用されるＨｏｐｐ
ｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１，（１９９４））および米国
特許出願第０８／４４６，９２２号に記載されるような肺サーファクタントプロ
テインＤ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。天然に存在するトリマ
ータンパク質由来の他のペプチドは、本発明のトリマーポリペプチドの調製にお
いて用いられ得る。
【０１６２】 別の例では、本発明のタンパク質は、Ｆｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列
を含む本発明の融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配
列間の相互作用によって結合される。さらなる実施形態では、本発明のタンパク
質の結合は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）融合タンパク質に含まれる異種ポリ
ペプチド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によって結合する
。
【０１６３】 本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を使用して生成され得る。
例えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドは、当該
分野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を使用して、化学的
に架橋され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これはその全体が
本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。さらに、本発明のマルチ
マーは、当該分野で公知の技術を使用して生成されて、マルチマー中に含まれる
ことが所望されるポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基間に、１つ以
上の分子間架橋を形成し得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これ
は、本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと）。さらに、
本発明のポリペプチドは、このポリぺプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステイ
ンまたはビオチンの付加により慣用的に改変され得、そして当該分野で公知の技
術が、１つ以上のこれらの改変されたポリペプチドを含むマルチマーを生成する
ために適用され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これはその全
体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。さらに、当該分野で
公知の技術は、本発明のマルチマーに含まれることを所望されるポリペプチド成
分を含むリポソームを生成するために適用され得る（例えば、米国特許第５，４
７８，９２５号（これはその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照
のこと）。
【０１６４】 あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて
生成され得る。１つの実施形態では、本発明のマルチマーに含まれるポリペプチ
ドは、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の融合タンパク質技
術を用いて組換え生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用
される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態では
、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配
列に連結し、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端の方向とは逆方向でポリペプ
チドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）に連
結することによって生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援
用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形態では
、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して
、膜貫通ドメイン（または疎水性もしくはシグナルペプチド）を含み、そして膜
再構成技術によってリポソームに組み込まれ得る、本発明の組換えポリペプチド
を生成する（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許
第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１６５】 （抗体） さらに、本発明のポリペプチドは、（特異的な抗体抗原結合をアッセイするた
めの当該分野で周知のイムノアッセイによって決定されるような）本発明の、ポ
リペプチド、ポリペプチドフラグメント、または配列番号Ｙの改変体、および／
またはエピトープに免疫特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセプター（Ｔ
ＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、
多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフ
ラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生
されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体
に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメ
ントを含むが、限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは
、免疫グロブリン分子および免疫グロリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわ
ち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫
グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、
ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意のサブク
ラスであり得る。好ましい実施形態では、本発明の免疫グロブリン分子は、Ｉｇ
Ｇ１である。他の好ましい実施形態では、本発明の免疫グロブリンはＩｇＧ４で
ある。
【０１６６】 最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃ
Ｆｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶ
Ｈドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない
。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１ドメ
イン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗
原結合フラグメントがまた本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳
動物を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネ
ズミ（ｍｕｒｉｎｅ）（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、シップウサギ（
ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ
である。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンの
アミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまた
は１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、そして内
因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離さた抗体（下に記載のように、お
よび例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８
号において記載のような）を含む。
【０１６７】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異性の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なる
エピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異
種のエピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）、の両方
に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；同ＷＯ ９
２／０８８０２；同ＷＯ ９１／００３６０；同ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕ
ｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４
，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、
同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、
Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０１６８】 本発明の抗体は、これらが認識または特異的に結合する、本発明のポリペプチ
ドのエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。このエピトープ
またはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、連続
するアミノ酸残基におけるサイズによって本明細書中に記載されるように、特定
化され得る。本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合する
抗体はまた、排除され得る。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的
に結合し、そして本発明のポリペプチドの排除を可能にする抗体を含む。
【０１６９】 本発明の抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。本
発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オーソログまたはホモログを結合し
ない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少な
くとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少な
くとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および
少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載され
る方法を用いて計算されるように）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた
、本発明に含まれる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトタンパク
質の、マウスホモログ、ラットホモログおよび／またはウサギホモログならびに
対応するそれらのエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドに対して９
５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６
５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知
の方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算されるように）を有する
ポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態にお
いて、上記の交差反応性は、本明細書中に開示された、任意の単一特異的な抗原
性または免疫原性ポリペプチド、あるいは２、３、４、５以上の特異的抗原性お
よび／または免疫原生ポリペプチドの組み合わせに関する。さらに、ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件下（本明細書中で記載されるような）で本
発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードさ
れるポリペプチドを結合する抗体が、本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、
本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性について記載または特定化さ
れ得る。好ましい結合親和性としては、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、
５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、
５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、
５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、
５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未
満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０− １２ Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満
、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満の解離定数
すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。
【０１７０】 本発明はまた、競合性結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例
えば、本明細書中で記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、本
発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ま
しい実施形態において、この抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少
なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少
なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープへの結合を競合的に阻害
する。
【０１７１】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リ
ガンド相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。好まし
くは、本発明の抗体は、本明細書中で開示された抗原性エピトープ、またはその
部分を結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の
両方の特徴を有する。本発明はまた、リガンド結合を妨害しないがレセプター活
性化を妨害するレセプター特異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すな
わち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野
で公知の技術により決定され得る。例えば、レセプター活性化は、レセプターの
リン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）、または免疫沈降それ
に続いてウェスタンブロット分析（例えば、上記のような）によってその基質を
検出することにより、決定され得る。特定の実施形態において、この抗体の非存
在下で、リガンド活性またはレセプター活性を、その活性の少なくとも９５％、
少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、
少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が
提供される。
【０１７２】 本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプタ
ー特異的抗体、ならびにレセプターリガンド複合体を認識し、そして好ましくは
、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しな
いレセプター特異的抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合し
、そしてレセプターへのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結
合し、それによりレセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターを結合す
ることを妨げない抗体を含む。さらに、本発明は、レセプターを活性化する抗体
を含む。これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、例
えば、レセプターの二量化を誘発することによってリガンド媒介レセプター活性
化の生物学的活性化の全てまたはサブセットのいずれかを増強するかまたは活性
化し得る。この抗体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特異的生物
学的活性を含む生物学的活性についてのアゴニスト、アンタゴニストまたは逆ア
ゴニストとして特定化され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法
を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第
５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９
８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６
８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４
）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８
（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ
．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９
７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１
９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１
２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４
）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（
９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎ
ｅ ８（１）：１４−２０（１９９６）（上記の文献は、全て、その全体が参考
として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０１７３】 本発明の抗体は、例えば、これらに限定されないが、本発明のポリペプチドを
精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロ
およびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、この抗体は
、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的におよび定
量的に測定するためのイムノアッセイにおける使用を有する。例えば、Ｈａｒｌ
ｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
第２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される）を参照の
こと。
【０１７４】 以下にさらに詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独または他の化合
物との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体はさらに、Ｎ末端でもし
くはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融合され得るか、あるいはポリペプ
チドまたは他の組成物へ化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）され
得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子お
よび異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素のようなエフェクター分
子へ組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４
９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，
９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。
【０１７５】 本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨げ
ないような、抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導体を含
む。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチ
ル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏ
ｎ）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）
による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質
への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が
、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成など
を含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘
導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０１７６】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マ
ウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与されて、抗原に対して
特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。種々のアジュバン
トが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そして
フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（
ｍｉｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック
（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホ
ールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメッ
ト−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのよう
な潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。このよう
なアジュバントはまた、当該分野で周知である。
【０１７７】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が
参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モ
ノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定さ
れない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、または
ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、それが生成され
る方法のことではない。
【０１７８】 ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法
は、当該分野で慣用的かつ周知であり、そして実施例に詳細に議論される。非限
定的な実施例において、マウスは、本発明のポリペプチドまたはそのようなペプ
チドを発現する細胞を用いて免疫され得る。一旦免疫応答が検出される（例えば
、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）と、マウスの脾臓を収集
しそして脾細胞を単離する。次に、その脾細胞を周知の技術によって任意の適切
な骨髄腫細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）に
融合させる。ハイブリドーマを限界希釈によって選択およびクローン化する。次
に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドに結合し得る抗体を分泌
する細胞について、当該分野で公知の方法によってアッセイする。一般的に高い
レベルの抗体を含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ）が、陽性ハイブリドー
マクローンを用いてマウスを免疫することによって、産生され得る。
【０１７９】 従って、本発明は、モノクローナル抗体および本発明の抗体を分泌するハイブ
リドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、生成す
る方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本
発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させ、次いで本発明
のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、
融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される
。
【０１８０】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成さ
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するために）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。例えば、本発明の抗
体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ方法を用いて産生され
得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをコー
ドするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。特定
の実施形態において、そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリ
アル抗体ライブラリー（例えば、ヒトもしくはマウス）から発現される抗原結合
ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原に結合する抗原結合ドメイ
ンを発現するファージは、抗原を用いて選択または同定され得る（例えば、標識
した抗原あるいは固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原を使用する
）。これらの方法において用いられるファージは、代表的には、ファージ遺伝子
ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え
的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメイ
ンを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状フ
ァージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）である。本発明の抗体を作製す
るために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、以下に開示され
る方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇ
ｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅ
ｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄ
ｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４
）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ ９０／０
２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２／１
８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８２；ＷＯ ９５／２
０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９
号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，
９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５
７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第
５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号
および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、本明細書中でその全体が参
考として援用される）。
【０１８１】 上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコ
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、以下に詳
細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を
含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野
で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、以下に開示される：ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲ
Ｉ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、その全体が参
考として援用される）。
【０１８２】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用および
インビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗
体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部
分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の
可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体
を産生するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，
８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号
を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される）
。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒ
ト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結合
する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域内
のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させるため（好ましくは改善させるた
めに）ＣＤＲドナー抗体由来の対応残基と置換される。これらフレームワークの
置換は、当該分野で周知の方法によって同定され、例えば、抗原結合に重要なフ
レームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用
のモデリング、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定す
るための配列比較による。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０
８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を
参照のこと（これらはそれらの全体が参考として本明細書中に援用される）。）
抗体は、以下を含む当該分野で公知の種々の技術を用いてヒト化され得る：例え
ば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９
９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号および同
第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサー
フェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第
５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４
）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））、およ
びチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５
，５６５，３３２号）。
【０１８３】 完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体
は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファー
ジディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国
特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９３、Ｗ
Ｏ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３５、お
よびＷＯ ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本明細書
中に援用される）もまた参照のこと。
【０１８４】 ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を増殖させ、そしてキメラマウ
スを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次いで、キメラマウスを、ヒト抗
体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニッ
クマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分
）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来の
ハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る
。トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ
細胞分化の間に再構成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異
を受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体
、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産
生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、
Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと
。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびに
そのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば
、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０
９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０ ５９８ ８７７；米国特許第５，
４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同
第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６
号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，
７７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらはその全体が
本明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆ
ｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の
ような企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト
抗体を提供することに従事し得る。
【０１８５】 選択されたエピトープを認識する完全ヒト化抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉ
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを認識する完全ヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓら
、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０１８６】 さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて
本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために順
々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこ
と。）例えば、結合し、そしてポリペプチドのマルチマー化（ｍｕｌｔｉｍｅｒ
ｉｚａｔｉｏｎ）および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合
を競合的に阻害する抗体が、ポリペプチドのマルチマー化ドメインおよび／また
は結合ドメインを「模倣する」抗イディオタイプを産生するために使用され得、
そして結果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中
和する。このような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａ
ｂフラグメントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメ
ンに使用され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリ
ペプチドに結合するためおよび／またはそのリガンド／レセプターに結合するた
めに使用され得、そしてそれによってその生物学的活性がブロックされる。
【０１８７】 （抗体をコードするポリヌクレオチド） 本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、またはより低いストリジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で（例え
ば、上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異
的に結合する、好ましくは、配列番号Ｙのアミノ酸配列を有するポリペプチドに
結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドを含む。
【０１８８】 ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そして
そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレ
オチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅ
ｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるよ
うな）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする
配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリ
ゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリ
ゴヌクレオチドの増幅。
【０１８９】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸
は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡラ
イブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の
抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡラ
イブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））か
ら、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクロー
ンを同定するために、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合
成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的
なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。Ｐ
ＣＲによって生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方
法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０１９０】 一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成
し得る。
【０１９１】 特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得る
か、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフ
レームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域につい
ては、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１
９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み
合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的
に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上
のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そ
のアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方
法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、
鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ
酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変
更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。
【０１９２】 さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「
キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅ
ｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る
。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であ
り、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来
の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
【０１９３】 あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，
７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈ
ｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７
９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４
−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領
域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結され
ることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける機
能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋｅ
ｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０１９４】 （抗体を産生する方法） 本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって
、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生
され得る。
【０１９５】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、そ
の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とす
る。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの
部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポ
リヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で
周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク
質を調製するための方法は、本明細書中に記載される。当業者に周知の方法は、
抗体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナル
を含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例え
ば、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換え
が挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発
明の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変
ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する
。このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ８６
／０５８０７；ＰＣＴ公開 ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２
２，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこ
の抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベク
ターにクローニングされ得る。
【０１９６】 この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのト
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗
体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現につ
いての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクター
は、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞
中に同時発現され得る。
【０１９７】 種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラス
ミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードす
る配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換え
ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タ
バコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または抗体をコードする
配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転
換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（
例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来する
プロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス
７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例
えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。好ましくは、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組
換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のため
に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要前初期（ｍａｊｏ
ｒ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子プロモーターエレメントの
ようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ
）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉ
ｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
【０１９８】 細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子が発現されるのを意図する
使用に依存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産
生されるべき場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される
融合タンパク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。この
ようなベクターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコー
ドする配列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ
ｆｒａｍｅ）で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．
ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７
９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ
Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−
５５０９（１９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発
現させるために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であ
り、そして溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへ
の吸着および結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に
精製され得る。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアー
ゼ切断部位を含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝
子産物は、ＧＳＴ部分から放出され得る。
【０１９９】 昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体
病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用
される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に
おいて増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例え
ばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモ
ーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０２００】 哺乳動物宿主細胞においては、多数のウィルスに基づく発現系が利用され得る
。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体
をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロ
モーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、
このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウ
ィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１ま
たはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を
発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１
９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコード
する配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ
開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全
体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性
翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であ
り得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、な
どの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０２０１】 さらに、宿主細胞株は、選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、または
、所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。タ
ンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例
えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は、
タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特徴
的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された外来タン
パク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。この
目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の正
確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され得
る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、Ｃ
ＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８３
、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、なら
びに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細胞
株を含むが、これらに限定されない。
【０２０２】 組換えタンパク質の長期間の高収率産生、安定発現が好ましい。例えば、安定
に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウィルスの複製起点を含む発現ベ
クターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモー
ター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、など）
、および選択マーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得る。外来ＤＮ
Ａの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖させられ得、
次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択マーカーは
、選択に対する耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをその染色体内に安定に
組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、これを今度はクローニングし
得、増殖して細胞株になり得ることを可能にする。この方法は、抗体分子を発現
する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。このような操作された細胞
株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリーニングお
よび評価において、特に有用であり得る。
【０２０３】 多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウィルスチミジンキ
ナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサン
チン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚ
ｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０
２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗ
ｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが限定されず、こ
れらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ
使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の根拠として使
用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗｉｇ
ｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；
Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５
２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する耐性を与える（
Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８
に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−
５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９
１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉ
ｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄ
ｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９
３）；１９９３年５月、ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５）；な
らびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対する耐性を与える（Ｓａｎｔｅ
ｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術の分野で
周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に適用され得、
そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（
編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇ
ｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１
９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐ
ｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）（これらはその全体が
本明細書中に参考として援用される）。
【０２０４】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、
ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅ
ｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３
．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこ
と）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能である場合、宿
主細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝
子のコピーの数を増加する。増幅領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の
産生もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５
７（１９８３））。
【０２０５】 宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコード
する第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター
）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖
のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択マーカーを含み得る。あ
るいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方のポリペプチ
ドをコードし、そして発現することができる。このような状況において、過剰の
毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである（Ｐｒ
ｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８０））
。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る
。
【０２０６】 一旦本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成されるか
、または組換えにより発現されると、当該分野で公知の、免疫グロブリン分子の
精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、
アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対するアフィニティー
による）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、ま
たはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるかま
たはそうでなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合され
得、精製を容易にする。
【０２０７】 本発明は、本発明のポリペプチド（もしくはその部分、好ましくはこのポリペ
プチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、
もしくは１００個のアミノ酸）に、組換えにより融合されるかまたは化学的に結
合されて（共有結合および非共有結合の両方を含む）、融合タンパク質を生成す
る抗体、を含む。この融合は、直接的である必要はないが、リンカー配列を介し
て起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましく
はこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、
８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例
えば、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチドを
特定の細胞表面のレセプターに特異的な抗体に融合または結合させることによっ
て、特定の細胞のタイプに対して、本発明のポリペプチドを標的にするために、
抗体が使用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または結合される抗体はまた
、インビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製方法にお
いて使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、上記、およびＰＣＴ公開ＷＯ９３
／２１２３２；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌ
ｅｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇ
ｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）を参照のこ
と。これらは、その全体が参考として援用される。
【０２０８】 本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメインに融合または結合された、本
発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗
体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。本発明のポリぺプチ
ドに融合されたこの抗体の部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは部分の
任意の組合せを含み得る。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融
合または結合され得、多量体を形成する。例えば、本発明のポリぺプチドに融合
されたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結合を通してニ量体を形成
し得る。より高度の多量体形態は、ポリぺプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの一部に
融合させることによって作製され得る。本発明のポリぺプチドを抗体部分に融合
または結合させるための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特
許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４
６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２
，９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ９
６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１
）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９
５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９
：１１３３７−１１３４１（１９９２）（前記の参考文献はその全体が参考とし
て援用される）を参照のこと。
【０２０９】 上で考察されたように、ポリぺプチド、ポリぺプチドフラグメント、または配
列番号Ｙの改変体に対応するポリぺプチドは、このポリぺプチドのインビボ半減
期を増大させるため、または当該分野で公知の方法を使用する免疫学的アッセイ
において使用するために、上記の抗体部分に融合または結合され得る。さらに、
配列番号Ｙに対応するポリぺプチドを、上記の抗体部分に融合または結合して、
精製を容易にし得る。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の
２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域
の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している（ＥＰ ３９４，８
２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８
））。ジスルフィド連結ニ量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合ま
たは結合される、本発明のポリぺプチドもまた、単量体分泌タンパク質またはタ
ンパク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合しそして中和するのにさらに
効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０
：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分
は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良された薬物動態
学的な特性を生じ得る（ＥＰ Ａ ２３２，２６２）。あるいは、融合タンパク
質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失させることが
望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合
、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発見において、ｈ
ＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するた
めの高スループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合され
てきた（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ
８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。
【０２１０】 さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするペプチド
のような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカー
アミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクタ
ー（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多
くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に
記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を
提供する。精製のために有用な別のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集
素タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅ
ｌｌ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグを含むが、これに限
定されない。
【０２１１】 本発明は、診断剤または治療剤に結合される、抗体またはそのフラグメントを
さらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所定の処置レジメン
（ｒｅｇｉｍｅｎ）の効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生または進
行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物
質と連結させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種
々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々
の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イ
オン、が挙げられる。この検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメント）
に対して、直接的または間接的のいずれかで、当該分野で公知の技術を使用する
媒介物（例えば、当該分野で公知のリンカーなど）を介して、連結または結合さ
れ得る。例えば、本発明に従う診断薬としての使用のための抗体に結合され得る
金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な
酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β
−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補
欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／
ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオ
レセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジ
ニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げら
れ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては
、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；ならびに、適切
な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが
挙げられる。
【０２１２】 さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば
細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン
（例えば、α−エミッタ−（例えば２１３Ｂｉ）など）に結合され得る。細胞毒
または細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パ
クリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、
臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎ
ｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈ
ｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオ
ン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロ
ン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グル
ココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、
およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログ、が挙げられる
。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン
、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆ
ｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例えば、
メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、
カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド
（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール
、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン
白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アンスラサイクリン（例えば、ダウノ
ルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば
、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイ
シン、およびアンスラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、なら
びに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、を含むが、
それらに限定されない。
【０２１３】 本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤
または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば
、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであ
り得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、
腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、
血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス薬（例
えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９
号を参照のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照の
こと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６
：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１
０５号を参照のこと））、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（例えば、アンジオス
タチンもしくはエンドスタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリンホカ
イン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ
−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロ
ニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」
）、または他の増殖因子など）、が挙げられ得る。
【０２１４】 抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免
疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラ
ス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２１５】 このような治療部分を抗体に結合する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ
ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔ
ａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆ
ｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃ
ｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８
５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓ
ｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａ
ｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３
−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら
、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐ
ｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」
、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
【０２１６】 あるいは、抗体は２次抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（こ
れは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによる
記載のような抗体の異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得
る。
【０２１７】 単独、あるいは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与
される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬とし
て使用され得る。
【０２１８】 （免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）） 本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利
用され得る。本発明の遺伝子の翻訳生成物は、細胞特異的マーカーとして、ある
いはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で示差
的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、または
エピトープの組み合わせに対して指向されるモノクロナール抗体は、マーカーを
発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発
現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体を用いて利用
され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁
気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パン
ニング」、ならびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６
６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９
）を参照のこと）が挙げられる。
【０２１９】 これらの技術は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における微小
残存病変（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））
および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己」
細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にする
。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖およ
び／または分化を引き起こす造血幹細胞および前駆細胞のスクリーニングを可能
にする。
【０２２０】 （抗体結合アッセイ） 本発明の抗体は、免疫特異的結合について、当該分野で公知の任意の方法によ
ってアッセイされ得る。使用され得る免疫アッセイは、競合的および非競合的ア
ッセイ系を含むがこれに限定されない。このアッセイ系は以下のような技術を使
用する：少し例を挙げると、ウェスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩ
ＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降
アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ
、補体結合アッセイ、免疫放射分析アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ
免疫アッセイ。このようなアッセイは、当該分野で、慣習的および周知である（
例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。これはその全体が
本明細書中で参考として援用される）。典型的な免疫アッセイは、以下に簡単に
記載される（しかし限定として意図されない）。
【０２２１】 免疫沈降プロトコルは、一般に、ＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０またはＴｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０
．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％Ｔｒａ
ｓｙｌｏｌ）のような、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ
インヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジウム酸ナト
リウム）を補充した溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する工程、目的の抗体を
細胞溶解物に添加する工程、４℃である時間（例えば１〜４時間）インキュベー
トする工程、プロテインＡおよび／またはプロテインＧのセファロースビーズを
細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上、４℃でインキュベートする工程、ビ
ーズを溶解緩衝液で洗浄する工程およびビーズをＳＤＳ／サンプル緩衝液中に再
懸濁する工程、を包含する。目的の抗体が特定の抗原を免疫沈降する能力は、例
えば、ウェスタンブロット分析によって評価され得る。当業者は、抗原に対する
抗体の結合を増加し、そしてバックグラウンドを減少する（例えば、セファロー
スビーズとともに細胞溶解物を予め洗浄する）ように改変され得るパラメータに
関して、熟知している。免役沈降プロトコルに関するさらなる考察については、
例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１０．１６．１）を参照の
こと。
【０２２２】 ウェスタンブロット分析は一般的に、タンパク質サンプルを調製する工程、タ
ンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲルでの電気泳動（例えば抗原の分子量
によって８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、タンパク質サンプルをポリアクリ
ルアミドゲルからメンブレン（例えばニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロ
ン）へ移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％のＢＳＡまたは脱脂乳を含む
ＰＢＳ）中でメンブレンをブロッキングする工程、メンブレンを洗浄緩衝液（例
えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液で希釈
された１次抗体（目的の抗体）を用いてメンブレンをブロッキングする工程、洗
浄緩衝液中でメンブレンを洗浄する工程、ブロッキング緩衝液で希釈された、酵
素基質（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）
または放射性分子（例えば３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した２次抗体（これは
１次抗体（例えば抗ヒト抗体）を認識する）でメンブレンをブロッキングする工
程、洗浄緩衝液中でメンブレンを洗浄する工程、および抗原の存在を検出する工
程、を包含する。当業者は、検出されるシグナルを増加し、そしてバックグラン
ドノイズを減少するように改変され得るパラメータに熟知している。ウェスタン
ブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉ
ｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１０．８．１）を参照のこと。
【０２２３】 ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスフォターゼ）のような検出可能な化合物に結合
した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程
、および抗原の存在を検出する工程を含む。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は
、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能な化合物
に結合した第二の抗体（目的の抗体を認識する）がウェルに添加され得る。さら
に、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコーティングさ
れ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した第二の抗体が、コーティングさ
れたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は、検出され
るシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該分野におい
て公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して熟知している。ＥＬＩＳＡに
関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
，１１．２．１を参照のこと。
【０２２４】 抗体の抗原に対する結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆ
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識した
抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での目的
の抗体とのインキュベーション、および標識した抗原に結合した抗体の検出を含
む。目的の抗体の、特定の抗原に対する親和性、および結合オフレートは、スキ
ャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合
はまた、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増
量の非標識第二抗体の存在下で、標識した化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ
）に結合した目的の抗体とともにインキュベートされる。
【０２２５】 （治療用途） 本発明はさらに、抗体を基礎とした治療に関し、この治療は、本発明の抗体を
、１つ以上の開示された疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ま
しくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に投与する工程を含む。本発
明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載するような、それら
のフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコード
する核酸（本明細書中に記載するような、それらのフラグメント、アナログおよ
び誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるがこれらに限定さ
れない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活
性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載する任意の１つ以上の疾
患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害または予防
するために使用され得る。本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活
性に関連した疾患、障害または状態の処置および／または予防は、それらの疾患
、障害または状態に関連した症状を緩和する工程を含むがこれに限定されない。
本発明の抗体は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載されるよう
に、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０２２６】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の１つの要約は、身体内で局所的に
または全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクタ
ー細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これら
のアプローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供さ
れる教示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタ
リングの目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法を理
解する。
【０２２７】 本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、ある
いはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７）と組み合わせて有利に利用され得る。
【０２２８】 本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、
フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト
の患者に投与される。
【０２２９】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む
）に関するイムノアッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために
、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／ま
たは強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメ
ント、またはその領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメン
ト、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
（それらのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性
としては、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１
０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０− ６ Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０− ９ Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１ Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ
、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、および１０−１５Ｍよ
り小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０２３０】 （遺伝子治療） 特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連する疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０２３１】 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。
【０２３２】 遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；お
よびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０２３３】 好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核
酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラ
タンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、それにより抗体をコードする核酸
の染色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９
）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）
）。特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいは
この核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはその
フラグメントを含む。
【０２３４】 核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロ
で核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これ
らの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子
治療としてそれぞれ公知である。
【０２３５】 特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた産物を産生する。これは、当該分野で公知の
多数の方法のいずれかにより（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部
として構築し、そしてそれを細胞内になるように投与することにより（例えば、
欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター（米国特許
第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いた感染により）、あるいは、裸の
ＤＮＡの直接注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子
銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質もしくは
細胞表面のレセプターでコーティングするか、または薬剤をトランスフェクトす
ることにより、リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセル中へのカプセル
化により、あるいは、それらを核に進入することが公知であるペプチドと結合さ
せて投与することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガン
ドとそれを結合させて投与すること（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプタ
ーを特異的に発現する細胞型を標的にするために用いられ得る）などにより達成
され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、ここで
、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ
）ウイルス性ペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避するようにする。さ
らに別の実施形態において、核酸は、特異的なレセプターを標的とすることによ
り、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的とされ得る（例え
ば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６３５号；同第
ＷＯ９２／２０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ９３／２０２
２１号を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして相同組
換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（Ｋｏｌｌｅｒお
よびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６
：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４
２：４３５−４３８（１９８９））。
【０２３６】 特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルス
ベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）
を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正確
なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組込みのために必要な構成要素を含
む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ以上のベ
クター中にクローン化され、これは、患者内への遺伝子の送達を容易にする。レ
トロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉｏｔｈｅ
ｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細胞を化学療法に対し
てより耐性にするために、ｍｄｒＩ遺伝子を造血性幹細胞に送達するための、レ
トロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療における
レトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である。：Ｃｌ
ｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）
；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓａｌｍ
ｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：
１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓｏｎ，
Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１
０−１１４（１９９３）。
【０２３７】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮
細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染し得るという利
点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ
ｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９
９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の概説を示す。
Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１９９４
）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移入するためのアデノウイルスベクター
の使用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏ
ｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒ
ｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔ
ｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９
９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。好ましい実
施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
【０２３８】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用について提案
されてきた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２
０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０２３９】 遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を含む。通常、移入の方
法は、選択マーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入された遺伝子
を取り込みそして発現している細胞を単離するために選沢下に置かれる。それら
の細胞は次いで、患者に送達される。
【０２４０】 この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるがこれらに限定されない
：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション
、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感染
、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ）媒
介の遺伝子移入、スフェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入につい
ては、当該分野において多数の技術が公知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒお
よびＢｅｈｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３
）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９
９３）；Ｃｌｉｎｅ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８
５）を参照のこと）、そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機
能が破壊されない場合、本発明に従って使用され得る。この技術は、核酸の細胞
への安定した移入を提供するはずであり、その結果、核酸は、細胞により発現可
能であり、そして好ましくは、遺伝性であり、そしてその細胞の子孫により発現
可能である。
【０２４１】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、そして当業者により決定され得る。
【０２４２】 遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、そして以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮
細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ
球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；種
々の幹細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨
髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
【０２４３】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。
【０２４４】 遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、次いで組換え細胞は、治療的効果のためにインビボで投与さ
れる。特定の実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる。インビト
ロで単離され、かつインビトロで維持され得る任意の幹細胞および／または前駆
細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（例えば、ＰＣＴ
公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃｅ
ｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｍｅｔｈ．Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔｔｅｌｋｏｗお
よびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７７１（１９８６
）を参照のこと）。
【０２４５】 特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、コード
領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発
現は、適切な転写誘導因子の存在または非存在を制御することにより制御可能で
ある。治療的または予防的な活性の実証。
【０２４６】 本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験され
る。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性を証明
するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対す
る化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合
物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセイおよ
び細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され
得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるかどうかを決定するため
に用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙
げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養において増殖され、そして
化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプル
に対するそのような化合物の効果が観察される。
【０２４７】 （治療的／予防的な投与および組成物） 本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明のポリペプチドまたは抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を
提供する。好ましい局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その
効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）
。被験体は好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどのような
動物が挙げられるがそれらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動
物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【０２４８】 化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方および投与
方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で
以下に記載されたものの中から選択され得る。
【０２４９】 種々の送達システムが公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用
いられ得る（例えば、リポソーム中でのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル
、この化合物の発現が可能な組換え細胞、レセプター媒介エンドサイトーシス（
例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３
２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部とし
ての核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下
、鼻腔内、硬膜外、および経口の経路が挙げられるがそれらに限定されない。化
合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス
注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜な
ど）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一
緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の
薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射
を包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取
り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入
することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール
化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【０２５０】 特定の実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要
な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが
、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合
わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラ
ント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよう
な膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成
され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する場合、タンパ
ク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。
【０２５１】 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
【０２５２】 さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出システム
中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇ
ｅｒ（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎ
ｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：
５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５
７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、ポリマー材料が用い
られ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌ
ｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰ
ｅｐｐａｓ，Ｊ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：
３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５
（１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放
出システムは、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部
のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（前出），第２巻，
１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
【０２５３】 他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０２５４】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態にお
いて、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そして
それが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクタ
ーの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接
注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプター
もしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入るこ
とが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、
Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８
６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタン
パク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細
胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に
組み込まれ得る。
【０２５５】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において
、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにお
ける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または
米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。
用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦
形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石
油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大
豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬
学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水
溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可
能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤とし
ては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ
、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン
酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン
、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるな
らば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組
成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物
などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのよ
うなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級の
マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン
ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得
る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される
。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、
適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供す
る。処方物は、投与形態に適するべきである。
【０２５６】 好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混
合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓ
ａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない
濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物
は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る
。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、
注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２５７】 本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの
のようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモ
ニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、
２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののよ
うなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０２５８】 本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連する疾患または
障害の処置、阻害、および予防に有効な本発明の化合物の量は、標準的な臨床技
術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じて、使用し
て最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において使用されるべき正
確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに依存し、そして
開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、
インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外插され得る
。
【０２５９】 抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期
を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可
能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例えば、
脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよび組織浸
透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。
【０２６０】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。
【０２６１】 （診断および画像化） 目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患、障害および／または状態を検出、診
断またはモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出を
提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用し
て、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、
および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工
程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイさ
れたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。
【０２６２】 本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これ
によって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺
伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来
の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を
示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供
し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること
、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらな
る進行を予防する。
【０２６３】 本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用し
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；
Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（
１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗
体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベ
ント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙げられる。適
切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例え
ば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１
２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム
（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミ
ノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、な
らびにビオチンが挙げられる。
【０２６４】 本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒ
トにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出
および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチド
に特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下
に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現する被験体内
の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結
合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与
後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；および
ｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、このバッ
クグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペプ
チドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バック
グラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と、検出さ
れた標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され得る。
【０２６５】 被験体の大きさおよび使用される画像化システムが、診断の画像を産生するた
めに必要である画像化部分の量を決定するということは、当該分野において理解
される。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注入される放射能の量
は、通常、約５〜２０ｍキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。次いで、標識化抗
体または標識化抗体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置で優先
的に蓄積する。インビボでの腫瘍の画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「
Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌ
ｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔ
ｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ、第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ
．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９
８２）において、記載される。
【０２６６】 使用する標識の型および投与の様式を含む、いくつかの変動に依存して、標識
化分子が被験体中の部位に優先的に濃縮することを可能にするため、および結合
していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるための投与後の
時間間隔は、６〜４８時間もしくは６〜２４時間または６〜１２時間である。別
の実施形態において、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間で
ある。
【０２６７】 １つの実施形態において、疾患および障害をモニターすることは、疾患または
障害（ｄｉｓｅａｓｅ）を診断するための方法を繰り返すことによって実施され
る（例えば、最初の診断から１ヶ月後、最初の診断から６ヶ月後、最初の診断か
ら１年後、など）。
【０２６８】 標識化分子の存在は、インビボスキャニングについての当該分野で公知の方法
を使用して患者中で検出され得る。これらの方法は、使用される標識の型に依存
する。当業者は、特定の標識を決定するための適切な方法を決定することができ
る。本発明の診断方法において使用され得る方法およびデバイスは、コンピュー
タ連動断層撮影法（ＣＴ）、体全体のスキャン（例えば、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏ
ｎ）放射断層撮影法（ＰＥＴ））、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波診
断法を含むが、これらに限定されない。
【０２６９】 特定の実施形態において、分子を放射性同位体で標識し、そして放射応答外科
的機器（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔ）（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）
を使用して患者中で検出する。別の実施形態において、分子を蛍光化合物で標識
し、そして蛍光応答スキャニング機器を使用して患者中で検出する。別の実施形
態において、分子を陽電子射出金属で標識し、そして陽電子射出断層撮影法を使
用して患者中で検出する。さらに別の実施形態において、分子を常磁性標識で標
識し、そして磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して患者中で検出する。 （キット） 本発明は、上記の方法において使用され得るキットを提供する。１つの実施形
態において、キットは、１つ以上の容器において、本発明の抗体、好ましくは精
製した抗体を備える。特定の実施形態において、本発明のキットは、エピトープ
を含む実質的に単離されたポリペプチドを備える。このエピトープは、キット中
に含まれる抗体と特異的に免疫反応する。好ましくは、本発明のキットは、目的
のポリペプチドと反応しないコントロール抗体をさらに備える。別の特定の実施
形態において、本発明のキットは、目的のポリペプチドへの抗体の結合を検出す
るための手段を備える（例えば、この抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍光化
合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物）に結合体化され得るか、ま
たは一次抗体を認識する二次抗体が、検出可能な基質と結合体化され得る）。
【０２７０】 本発明の別の特定の実施形態において、キットは、増殖性および／または癌性
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清のスク
リーニングに使用するための診断キットである。このようなキットは、目的のポ
リペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、エ
ピトープを含む実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。このエピトー
プは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応する。さら
に、このようなキットは、抗原に対する上記の抗体の結合を検出するための手段
を備える（例えば、抗体は、蛍光化合物（例えば、フローサイトメトリーにより
検出され得るフルオレセインまはたローダミン）と結合体化され得る）。特定の
実施形態において、キットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化
学的に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。キットのポリペプチド抗原はま
た、固体支持体に付着され得る。
【０２７１】 より特定の実施形態において、上記のキットの検出手段は、上記のポリペプチ
ド抗原が付着する固体支持体を備える。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識化抗ヒト抗体を備え得る。この実施形態において、ポリペプチド抗原へ
の抗体の結合は、上記のレポーター標識化抗体の結合によって検出され得る。
【０２７２】 さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む血
清のスクリーニングにおいて使用するための、診断キットを含む。この診断キッ
トは、ポリペプチド抗原またはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応する実
質的に単離された抗体、およびこの抗体へのこのポリヌクレオチド抗原またはポ
リペプチド抗原の結合を検出するための手段を備える。１つの実施形態において
、抗体は、固体支持体に付着される。特定の実施形態において、抗体は、モノク
ロナール抗体であり得る。キットのこの検出手段は、二次標識化モノクロナール
抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識化競合抗原を
含み得る。
【０２７３】 １つの診断構成において、試験血清を、本発明の方法により得られる表面結合
抗原を有する固相試薬と反応させる。特定の抗原抗体とこの試薬との結合、およ
び洗浄することによる結合していない血清成分の除去の後、この試薬をレポータ
ー標識化抗ヒト抗体と反応させて、固体支持体上に、結合した抗抗原抗体の量に
比例して、この試薬にレポーターを結合させる。この試薬を再び洗浄して、結合
していない標識化抗体を除去し、そしてこの試薬と会合するレポーターの量を決
定する。代表的に、レポーターは、酵素であり、この酵素は、適切な蛍光性基質
、発光性基質または比色用基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在
下で固相をインキュベートすることにより検出される。
【０２７４】 上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料（
例えば、高分子ビーズ、計深棒、９６ウェルプレートまたは濾過材料）に付着さ
せるための公知の技術により調製される。これらの付着方法としては、一般的に
、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化学的に活性な
基（例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基）と
のタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）（代表的
には、遊離アミン基を介する）が挙げられる。あるいは、ストレプトアビジンで
コートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され得る。
【０２７５】 従って、本発明は、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供
する。このキットは、一般的に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、お
よび表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒト
抗体を備える。
【０２７６】 （ポリヌクレオチドの使用） 本明細書中で同定された各々のポリヌクレオチドは、試薬として多数の方法に
おいて使用され得る。以下の説明は例示的であるとみなされるべきであり、そし
て公知の技術を利用する。
【０２７７】 本発明のポリヌクレオチドは、染色体同定のために有用である。実際の配列デ
ータ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在ほとんど利用可能では
ないため、新しい染色体マーカーを同定する必要性が存在するままである。各々
の配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特に標的化され、そしてこの位置
にハイブリダイズされ得る。従って、本発明の各々のポリヌクレオチドは、当該
分野で公知の技術を用いて染色体マーカーとして慣用的に使用され得る。
【０２７８】 簡単に言うと、配列は、配列番号Ｘで示される配列からＰＣＲプライマー（好
ましくは、少なくとも１５ｂｐ（例えば、１５〜２５ｂｐ））を調製することに
よって染色体にマッピングされ得る。プライマーが、ゲノムＤＮＡ中の１つより
多くの予測されたエキソンにまたがらないように、プライマーは、コンピュータ
ー分析を使用して必要に応じて選択され得る。次いで、これらのプライマーは、
個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使
用される。配列番号Ｘに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅さ
れたフラグメントを産生する。
【０２７９】 同様に、体細胞ハイブリッドは、特定の染色体に対してポリヌクレオチドをＰ
ＣＲマッピングする迅速な方法を提供する。単一のサーマルサイクラーを使用し
て１日あたり３つ以上のクローンが割り当てられ得る。さらに、ポリヌクレオチ
ドの下位位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体フラグ
メントのパネルを用いて達成され得る。使用され得る他の遺伝子マッピング戦略
は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フローソート（ｌａｂｅｌｅｄ
ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリーニング、染色体特異的ｃＤ
ＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択、およ
びコンピューターマッピング技術（例えば、その全体が本明細書中に参考として
援用される、Ｓｈｕｌｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：４５
６−４５９（１９９８）など）を含む。
【０２８０】 ポリヌクレオチドの正確な染色体位置はまた、中期染色体スプレッド（ｓｐｒ
ｅａｄ）の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して獲
得され得る。この技術は５００または６００塩基ほどの短さのポリヌクレオチド
を使用する；しかし２，０００〜４，０００ｂｐのポリヌクレオチドが好ましい
。この技術の総説に関しては、Ｖｅｒｍａら、「Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏ
ｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｐｅ
ｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）を参照のこと。
【０２８１】 染色体マッピングについては、ポリヌクレオチドは、個々に（単一染色体また
はその染色体上の単一部位をマークするために）またはパネルで（複数部位およ
び／または複数染色体をマークするために）使用され得る。
【０２８２】 従って、本発明はまた、染色体の位置決定のための方法も提供し、この方法は
、（ａ）表１におけるポリヌクレオチド配列および配列番号ＸからＰＣＲプライ
マーを調製する工程、ならびに（ｂ）個々の染色体を含む体細胞ハイブリッドを
スクリーニングする工程を包含する。
【０２８３】 本発明のポリヌクレオチドは、同様に、放射線ハイブリッドマッピング、ＨＡ
ＰＰＹマッピング、および長範囲制限マッピングに有用である。これらの技術お
よび当該分野で公知の他の技術の概説について、例えば、Ｄｅａｒ「Ｇｅｎｏｍ
ｅ Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬ Ｐ
ｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄ
ｏｎ（１９９７）；Ａｙｄｉｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：６９１〜６９４（
１９９９）；Ｈａｃｉａら、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ３：４８３〜４９
２（１９９８）；Ｈｅｒｒｉｃｋら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．７：４０
９〜４２３（１９９９）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ．６２：２６５〜２８０（２０００）；および／またはＯｔｔ、Ｊ．Ｈｅ
ｒｅｄ．９０：６８〜７０（１９９９）（これらの各々は、その全体が参考とし
て本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０２８４】 一旦、ポリヌクレオチドが正確な染色体位置にマップされると、ポリヌクレオ
チドの物理的位置は、連鎖分析において使用され得る。連鎖分析は、染色体位置
と特定の疾患の提示との間の同時遺伝（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）を確立す
る。（疾患マッピングデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌ
ｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通し
てオンラインで利用可能である）において見い出される）。１メガベースマッピ
ング解像度および２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定すると、疾患と関連する染色体
領域に正確に位置決定されるｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在的な原因遺伝子の
うちの１つであり得る。
【０２８５】 従って、一旦、同時遺伝が確立されると、罹患個体と非罹患個体との間での本
発明のポリヌクレオチドおよび対応する遺伝子における差異が試験され得る。ま
ず、染色体中の可視的構造変化（例えば、欠失または転座）は染色体スプレッド
において、またはＰＣＲによって試験される。構造的変化が存在しない場合、点
変異の存在が確認される。何人かのまたは全ての罹患個体で観察されたが、正常
な個体では観察されなかった変異は、この変異がこの疾患を引き起こし得ること
を示す。しかし、いくつかの正常な個体由来のポリペプチドおよび対応する遺伝
子の完全な配列決定は、変異を多型性と区別するために要求される。新しい多型
性が同定される場合、この多型ポリペプチドはさらなる連鎖分析のために使用さ
れ得る。
【０２８６】 さらに、非罹患個体と比較した、罹患個体の遺伝子の増加または減少した発現
が、本発明のポリヌクレオチドを使用して評価され得る。任意のこれらの変化（
変化した発現、染色体再配置、または変異）は、診断マーカーまたは予後マーカ
ーとして使用され得る。
【０２８７】 従って、本発明はまた、障害の診断の間に有用な診断方法を提供し、この方法
は、個体由来の細胞または体液中の本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測
定する工程、および測定された遺伝子発現レベルを標準のポリヌクレオチド発現
レベルと比較する工程を包含し、これによって、標準と比較して、遺伝子発現レ
ベルの増加または減少が、障害の指標になる。
【０２８８】 なお別の実施形態では、本発明は、サンプルを、試験被験体に由来する増殖性
および／またはガン性のポリヌクレオチドの存在について分析するためのキット
を含む。一般的実施形態において、このキットは、本発明のポリヌクレオチドと
特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのポリヌク
レオチドプローブ、および適切な容器を備える。この特定の実施形態では、この
キットは、本発明のポリヌクレオチドの内部領域を規定する２つのポリヌクレオ
チドプローブを含み、ここで各プローブは、この領域に対して内部に３１’マー
末端を含む１つの鎖を有する。さらなる実施形態では、このプローブは、ポリメ
ラーゼ連鎖反応増幅のためのプライマーとして有用であり得る。
【０２８９】 例えば、腫瘍の診断を含む、関連障害の診断が既に従来方法によって行われて
いる場合、本発明は、予後インジケーターとして有用であり、それによって増強
または抑制された本発明のポリヌクレオチドの発現を示す患者が、標準レベルに
より近いレベルでこの遺伝子を発現する患者と比較して悪い臨床結果を経験する
。
【０２９０】 「本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する（こと）」によって、本
発明のポリペプチドのレベルまたは本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
のレベルを、第１の生物学的サンプルにおいて直接的（例えば、絶対のタンパク
質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または評価することによって）または相対
的（例えば、第２の生物学的サンプル中のポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレ
ベルに対して比較することによって）のいずれかで定性的または定量的に測定ま
たは評価することが意図される。好ましくは、第１の生物学的サンプル中のポリ
ペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または評価され、そして標準のポリ
ペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較され、この標準は、関連障害
を有さない個体から得られる第２の生物学的サンプルから得られるかまたは関連
障害を有さない個体の集団由来のレベルを平均することによって決定される。当
該分野で認識されるように、一旦標準的なポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレ
ベルが公知になれば、これを、比較のための標準として反復して用い得る。
【０２９１】 「生物学的サンプル」によって、本発明のポリペプチドまたは対応するｍＲＮ
Ａを含む、個体、体液、細胞株、組織培養物または他の供給源から得られる任意
の生物学的サンプルが意図される。示されるように、生物学的サンプルは、本発
明のポリペプチドを含む体液（例えば、精液、リンパ、血清、血漿、尿、滑液お
よび髄液）、本発明のポリペプチドを発現することが見出された組織供給源を含
む。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は、当該分野で周知であ
る。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源である
。
【０２９２】 上記で提供された方法は好ましくは、本発明のポリヌクレオチドおよび／また
はポリペプチドが固体支持体に結合される、診断方法および／またはキットに適
用され得る。１つの例示的な方法では、この支持体は、米国特許第５，８３７，
８３２号、同第５，８７４，２１９号および同第５，８５６，１７４号に記載さ
れる、「遺伝子チップ」または「生物学的チップ」であり得る。さらに、本発明
のポリヌクレオチドが結合されたこのような遺伝子チップを用いて、単離された
本発明のポリヌクレオチド配列と、試験被験体から単離されたポリヌクレオチド
との間の多型性を同定し得る。このような多型の知識（すなわち、その多型の位
置、およびその多型の存在）は、多くの障害（例えば、神経障害、免疫系障害、
筋肉障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎障害、増殖性障害、な
らびに／または癌性疾患および癌性状態）について、疾患遺伝子座を同定する際
に有益である。このような方法は、米国特許第５，８５８，６５９号および同第
５，８５６，１０４号に記載される。上記に参照した米国特許は、その全体が本
明細書中に参考として援用される。
【０２９３】 本発明は、化学的に合成された、または、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として再現
された）または当該分野で公知の他の方法に従って、本発明のポリヌクレオチド
を包含する。ＰＮＡの使用は、本発明のポリヌクレオチドが固体支持体、または
、遺伝子チップに取り込まれる場合、好ましい形態として役立つ。本発明の目的
のために、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ポリアミド型のＤＮＡアナログであり、
そしてアデニン、グアニン、チミンおよびシトシンについてのモノマー単位が市
販されている（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＤＮＡの特定
の成分（例えば、リン、酸化リンまたはデオキシリボース誘導体）は、ＰＮＡ中
に存在しない。Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ
およびＯ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１４９７（１９９７）
；ならびにＭ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓ
ｅｎ，Ｃ．Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｓ．Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｄｒｉｖｅｒ，Ｒ
．Ｈ．Ｂｅｒｇ、Ｓ．Ｋ．Ｋｉｍ，Ｂ．ＮｏｒｄｅｎおよびＰ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓ
ｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６５，６６６（１９９３）によって開示されるように、
ＰＮＡは、相補的なＤＮＡ鎖に対して特異的かつ緊密に結合し、そしてヌクレア
ーゼによって分解されない。実際、ＰＮＡは、ＤＮＡ自体が結合するよりも強力
にＤＮＡに結合する。これはおそらく、２つの鎖の間に静電斥力が存在せず、そ
してまたポリアミド骨格がより可撓性が高いことによる。これによって、ＰＮＡ
／ＤＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖よりも広範囲のストリンジェンシー条
件下で結合し、多重鎖ハイブリダイゼーションを行うのをより容易にする。強力
な結合に起因して、ＤＮＡを用いてよりも小さいプローブが用いられ得る。さら
に、おそらく、単一の塩基ミスマッチが、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ンを用いて決定され得る。なぜなら、ＰＮＡ／ＤＮＡの１５マーにおける単一の
ミスマッチは、ＤＮＡ／ＤＮＡの１５マー二重鎖については４℃〜１６℃である
のに対して、融点（Ｔ．ｓｕｂ．ｍ）を８〜２０℃低下させるからである。また
、ＰＮＡ中に電荷基が存在しないことは、ハイブリダイゼーションが、低いイオ
ン強度で行われ得、そして分析の間の塩によって可能な妨害を減少させることを
意味する。
【０２９４】 本発明は、哺乳動物におけるガンの検出を含むがこれらに限定されない用途を
有する。特に、本発明は、以下を含むがこれらに限定されない、病理学的細胞増
殖新形成の診断の間に有用である：急性骨髄性白血病（急性単球性白血病、急性
骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性赤白血
病、急性巨核球性白血病、および急性未分化白血病などを含む）；および慢性骨
髄性白血病（慢性骨髄単球性白血病、慢性顆粒球性白血病などを含む）。好まし
い哺乳動物としては、有尾猿（ｍｏｎｋｅｙ）、無尾猿（ａｐｅ）、ネコ、イヌ
、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギおよびヒトが挙げられる。特に好ましいのは、ヒト
である。
【０２９５】 病理学的細胞増殖障害はしばしば、原癌遺伝子の不適切な活性化に関連する（
Ｇｅｌｍａｎｎ，Ｅ．Ｐ．ら，「Ｔｈｅ Ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｃｕｔｅ
Ｌｅｕｋｅｍｉａ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｖｉｒ
ａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」，Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ，第１巻，Ｗｉｅｒｎｉｋ、Ｐ．Ｈ．ら編，１６１−１８２
（１９８５））。新形成は現在、ウイルス配列の染色体への挿入、より活性に転
写される領域への遺伝子の染色体転座、または何らかの他の機構による、正常な
細胞遺伝子産物の定性的変化から、または遺伝子発現の定量的改変から生じると
考えられている（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。特定の遺伝子の変異または変更さ
れた発現が、他の組織および他の細胞型の中でも、いくつかの白血病の病因と関
与するようである（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。実際、いくつかの動物新形成に
関与する癌遺伝子のヒト対応物は、ヒトの白血病および癌のいくつかの症例にお
いて増幅または転座されている（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。
【０２９６】 例えば、ｃ−ｍｙｃ発現は、非リンパ球性白血病細胞株ＨＬ−６０において高
度に増幅される。ＨＬ−６０細胞が増幅を止めるように化学的に誘導される場合
、ｃ−ｍｙｃのレベルは、ダウンレギュレートされることが見出される（国際公
開番号ＷＯ９１／１５５８０）。しかし、ｃ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｂの５’末
端に相補的であるＤＮＡ構築物へのＨＬ−６０細胞の暴露が、ｃ−ｍｙｃタンパ
ク質またはｃ−ｍｙｂタンパク質の発現をダウンレギュレートする対応するｍＲ
ＮＡの翻訳をブロックし、処理した細胞の細胞増殖および分化の停止を引き起こ
すことが示されている（国際公開番号ＷＯ９１／１５５８０；Ｗｉｃｋｓｔｒｏ
ｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：１０２８（１９８８）；
Ａｎｆｏｓｓｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３３７９（
１９８９））。しかし、当業者は、増殖表現型を示すことが公知である種々の起
源の多数の細胞および細胞型を考慮すれば、本発明の有用性が造血性の細胞およ
び組織の増殖性障害の処置に限定されないことを認識する。
【０２９７】 前記に加えて、本発明のポリヌクレオチドは、三重らせん形成を通して、また
はアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するために使用
され得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ
．５６：５６０（１９９１），「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ」，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８
８）において考察される。三重らせん形成は例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１）において考察される。両方の方法は
、相補的ＤＮＡまたは相補的ＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に依存する。こ
れらの技術に関して、好ましいポリヌクレオチドは通常、２０〜４０塩基長のオ
リゴヌクレオチドであり、そして転写に関与する遺伝子領域（三重らせん−Ｌｅ
ｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅ
ｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）またはｍＲＮＡ
自体（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１
９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓ
ｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃ
ＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））のいずれかに相
補的である。三重らせん形成は、最適にはＤＮＡからのＲＮＡ転写の遮断を生じ
るが、アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーションは、ポリペプチドへのｍＲＮ
Ａ分子の翻訳を阻止する。上記に記載のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセン
スＲＮＡまたはＤＮＡが、インビボで発現されて本発明の抗原のポリペプチド産
生を阻害し得るように細胞に送達され得る。両方の技術は、モデル系において効
果的であり、そして本明細書に開示される情報は、疾患を処置するための試みに
おいて、特に、増殖性疾患および／または状態の処置のために、アンチセンスま
たは三重らせんポリヌクレオチドを設計するために使用され得る。
【０２９８】 本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療において有用である。遺伝子治
療の１つの目標は、遺伝欠損を修正する試みにおいて、欠損遺伝子を有する生物
へ正常遺伝子を挿入することである。本発明に開示されるポリヌクレオチドは、
高度に正確な様式でこのような遺伝欠損を標的とする手段を提供する。別の目標
は、宿主ゲノム中には存在しなかった新しい遺伝子を挿入し、それによって宿主
細胞中に新しい形質を生成することである。
【０２９９】 ポリヌクレオチドはまた、微小な生物学的サンプルから個体を同定するために
有用である。例えば、米国軍は、その職員を同定するために制限フラグメント長
の多型性（ＲＦＬＰ）の使用を考慮している。この技術において、個体のゲノム
ＤＮＡは１つ以上の制限酵素で消化され、そして職員を同定するため固有なバン
ドを生じるためのサザンブロットについてプローブされる。この方法は、「認識
票（Ｄｏｇ ｔａｇ）」（これは、失われたり、交換されたり、または盗まれた
りすることにより、ポジティブな同定を困難にし得る）の現在の限界を受けない
。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＦＬＰのためのさらなるＤＮＡマーカーとし
て使用され得る。
【０３００】 本発明のポリヌクレオチドはまた、個体のゲノムの選択された部分の実際の塩
基ごとのＤＮＡ配列を決定することによって、ＲＦＬＰに対する代替物として使
用され得る。これらの配列は、このような選択されたＤＮＡを増幅しそして単離
するためにＰＣＲプライマーを調製するために使用され得、次いで、この選択さ
れたＤＮＡは、配列決定され得る。各個体が固有のセットのＤＮＡ配列を有する
ので、この技術を使用して、個体が同定され得る。一旦、固有のＩＤデータベー
スが個体について確立されると、その個体が生存していようとまたは死亡してい
ようと、その個体のポジティブ同定が、極めて小さな組織サンプルからなされ得
る。
【０３０１】 法医学生物学もまた、本明細書に開示されるようなＤＮＡに基づく同定技術を
使用して利益を得る。組織（例えば、髪または皮膚）、または体液（例えば、血
液、唾液、精液、滑液、羊水、乳汁、リンパ、肺痰（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓｐ
ｕｔｕｍ）またはサーファクタント、尿、糞便物質など）のような非常に小さな
生物学的サンプルから得られたＤＮＡ配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。
ある先行技術において、ＤＱａクラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子のような多型性遺伝子
座から増幅された遺伝子配列は、個体を同定するための法医学生物学において使
用される。（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍ
ａｎ ａｎｄ Ｃｏ．（１９９２））。一旦、これらの特異的多型性遺伝子座が
増幅されると、これらは１つ以上の制限酵素で消化される。これは、ＤＱａクラ
スＩＩ ＨＬＡ遺伝子に対応するＤＮＡでプローブされたサザンブロットについ
てのバンドの同定セットを生じる。同様に、本発明のポリヌクレオチドは、法医
学的目的のための多型性マーカーとして使用され得る。
【０３０２】 また、特定の組織の供給源を同定し得る試薬についての必要性が存在する。例
えば、未知の起源の組織が提供される場合、法医学においてこのような必要性が
生じる。適切な試薬は、例えば、本発明の配列から調製される、ＤＮＡプローブ
またはプライマーを含み得る。このような試薬のパネルは、種および／または器
官型によって組織を同定し得る。同様の様式で、これらの試薬は、夾雑物につい
て組織培養物をスクリーニングするために使用され得る。
【０３０３】 本発明のポリヌクレオチドはまた、生物学的サンプル中に存在する組織または
細胞型の示差的同定のためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である
。同様に、本発明のポリペプチドに関するポリペプチドおよび抗体は、組織（例
えば、免疫組織化学アッセイ）または細胞型（例えば、免疫細胞学アッセイ）の
示差的同定のための免疫学的プローブを提供するのに有用である。さらに、「標
準」遺伝子発現レベル（すなわち、障害を有しない個体由来の健康組織の発現レ
ベル）と比較して、上記の組織または細胞の多くの障害に対して、本発明のポリ
ヌクレオチド／ポリペプチドの有意に高いかまたは低いレベルの遺伝子発現が、
このような障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、本発明のポリ
ペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを発現する組織、および／または癌性
組織および／または創傷組織）または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液また
は髄液）において検出され得る。
【０３０４】 従って、本発明は、以下の工程を含む障害の診断方法を提供する：（ａ）個体
の細胞または体液中の遺伝子発現レベルをアッセイする工程；（ｂ）標準的な遺
伝子発現レベルと、この遺伝子発現レベルを比較し、それにより、標準の発現レ
ベルと比較して、アッセイされた遺伝子発現レベルの増加または減少が障害を示
す、工程。
【０３０５】 少なくとも、本発明のポリヌクレオドは、サザンブロットのゲル上の分子量マ
ーカーとして、特定の細胞型における特異的ｍＲＮＡの存在についての診断プロ
ーブとして、新規のポリヌクレオドを発見するプロセスにおける「減算した（ｓ
ｕｂｔｒａｃｔ−ｏｕｔ）」公知の配列に対するプローブとして、「遺伝子チッ
プ」または他の支持体に付着するためのオリゴマーを選択および作製するために
、ＤＮＡ免疫技術を用いて抗ＤＮＡ抗体を惹起するために、および免疫応答を惹
起する抗原として使用され得る。
【０３０６】 （ポリペプチドの使用） 本明細書中で同定される各々のポリペプチドは、多くの方法において使用され
得る。以下の記述は、例示として考慮されるべきであり、そして公知の技術を利
用する。
【０３０７】 本発明のポリペプチドに対して指向されるポリペプチドおよび抗体は、組織（
例えば、ＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼのような免疫組織化学アッセイ（Ｈｓｕら
、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２９：５７７−５８０（１９８
１））または細胞型（例えば、免疫細胞化学アッセイ）の差次的同定のための免
疫学的プローブを提供するために有用である。
【０３０８】 抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的な方法を用いて、生物
学的サンプル中の本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの
レベルをアッセイし得る。（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タン
パク質の遺伝子発現を検出するのに有用な、他の抗体に基づく方法には、免疫学
的検定（例えば、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ））が含まれる。適切な抗体アッセイの標識は、当該分野
で公知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同
位体（例えば、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１ ４ Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１ １３ｍ Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ、９９ ｍ Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジ
ウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ
素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ
、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４ ２ Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ；発光標識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍
光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）ならびにビオチンが挙げら
れる。
【０３０９】 生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドのレベルをアッセイすることに加
えて、タンパク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質の
インビボ画像化のための抗体の標識またはマーカーは、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、ま
たはＥＳＲにより検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法のために適切な標識は、放
射性同位体（例えば、バリウムまたはセシウム）を含み、これは検出可能な放射
線を放射するが、被験体に対して明らかに有害ではない。ＮＭＲおよびＥＳＲの
ための適切なマーカーは、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカー（例えば
、重水素）を含み、これは、関連するハイブリドーマのための栄養分を標識する
ことにより抗体中に取り込まれ得る。
【０３１０】 放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ、（１３１Ｉ、１ ２５ Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム
（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ
）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）、
ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９ ９ Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌ
ｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７ Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ）、放
射線不透過性物質、または核磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出
可能な画像化部分で標識された、タンパク質特異的抗体または抗体フラグメント
は、免疫系の障害について検査されるべき哺乳動物に（例えば、非経口的、皮下
、または腹腔内に）導入される。被験体のサイズおよび用いられる画像化システ
ムは、診断画像を生成するために必要な画像化部分の量を決定することが当該分
野で理解される。放射性同位体部分の場合には、ヒト被験体について、注射され
る放射能の量は、通常、９９ｍＴｃの約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次
いで、標識された抗体または抗体フラグメントは、本発明のポリヌクレオチドに
よりコードされるポリペプチドを発現する細胞の位置に優先的に蓄積される。イ
ンビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ
ａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎ
ｇの第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏ
ｆ Ｃａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、
Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。
【０３１１】 １つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合する
本発明のポリペプチド（例えば、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる
ポリペプチドおよび／または抗体）を投与することによる、本発明の組成物の細
胞への特異的な送達のための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治
療タンパク質を標的化細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において
、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または二本
鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込み得るか、またはエピソームにて複製し
得、そして転写され得るＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供す
る。
【０３１２】 別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグに関連
する本発明のポリペプチドを投与することによる細胞の特異的な破壊（例えば、
腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
【０３１３】 「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクタ系、放射性同位体、ホロ毒素（
ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の条
件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の分
子もしくは酵素を結合および活性化する１つ以上の化合物を意味する。本発明の
方法に従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：当該分野で公知の放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性の細胞
傷害性エフェクタ系に結合する化合物（例えば、抗体（またはその補体固定含有
部分））、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシ
ン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、
モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヤマゴボウ抗
ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素。「毒素」
はまた、細胞分裂停止剤もしくは細胞破壊剤、治療薬または放射活性金属イオン
（例えば、α−放射体（例えば、２１３Ｂｉ））もしくは他の放射性同位体（例
えば、１０３Ｐｄ、１３３Ｘｅ、１３１Ｉ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８ ５ Ｓｒ、３２Ｐ、３５Ｓ、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１ Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、９０イットリウム、１１７スズ、１８ ６ レニウム、１６６ホルミウム、および１８８レニウム）；発光標識（例えば、
ルミノール）；および蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、
ならびにビオチンを含む。
【０３１４】 当該分野において公知の技術は、本発明のポリペプチド（抗体を含む）を標識
化するために適用され得る。このような技術としては、二官能性結合剤の使用（
例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５
，６９６，２３９号；同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；
同第５，４８９，４２５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３
９号；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４
，５６０号；および同第５，８０８，００３号を参照のこと；これら各々の内容
は、本明細書中に参考としてその全体を援用する）が挙げられるが、これに限定
されない。
【０３１５】 従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、これは以下を含む：（ａ）個体
の細胞または体液における本発明のポリペプチドの発現レベルをアッセイする工
程；および（ｂ）アッセイされたポリペプチドの発現レベルを標準のポリペプチ
ドの発現レベルと比較し、それによって標準の発現レベルと比較してアッセイさ
れたポリペプチドの発現レベルにおける増加または減少が障害を示す工程。癌に
関しては、個体由来の生検された組織中の相対的に高い量の転写物の存在は、疾
患の発症の素因を示し得るか、または実際の臨床的な症状が明らかとなる前に疾
患を検出するための手段を提供し得る。より決定的なこのタイプの診断は、保健
専門家がより早く予防策または積極的な処置を使用し、それによって癌の発症ま
たはさらなる進行を防ぐことを可能にし得る。
【０３１６】 さらに、本発明のポリペプチドを用いて疾患または状態（例えば、神経障害、
免疫系障害、筋肉障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎臓障害、
増殖障害ならびに／または癌性疾患および状態など）を処置または予防し得る。
例えば、患者は、ポリペプチドの非存在またはレベルの減少を元に戻すこと（例
えば、インスリン）、異なるポリペプチドの不在またはレベルの減少を補充する
こと（例えば、ヘモグロビンＢに対するヘモグロビンＳ、ＳＯＤ、カタラーゼ、
ＤＮＡ修復タンパク質）、ポリペプチドの活性を阻害すること（例えば、癌遺伝
子または腫瘍抑制因子）、ポリペプチドの活性を活性化すること（例えば、レセ
プターに結合することによって）、遊離リガンドについて膜結合レセプターと競
合させることによって膜結合レセプターの活性を減少させること（例えば、炎症
を低減させる際に用いられる可溶性ＴＮＦレセプター）、または所望の応答をも
たらすこと（例えば、血管の成長の阻害、増殖細胞または組織に対する免疫応答
の増強）の試みにおいて、本発明のポリペプチドが投与され得る。
【０３１７】 同様に、本発明のポリペプチドに対して指向される抗体もまた用いられ、疾患
（上記、および本明細書中のどこかに記載されるような）を処置し得る。例えば
、本発明のポリペプチドに対して指向される抗体の投与には、ポリペプチドを結
合して、そして／またはポリペプチドを中和し、そして／またはポリペプチドの
過剰産生を低減し得る。同様に、抗体の投与は、例えば、膜に結合したポリペプ
チド（レセプター）へ結合することにより、ポリペプチドを活性化し得る。
【０３１８】 少なくとも、本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用され
得る。宿主細胞の形質転換を評価する方法として、ポリペプチドがまた用いられ
、抗体を惹起し得、次いで、この抗体が使用され、組換え細胞からのタンパク質
発現を測定する。さらに、本発明のポリペプチドが使用され、以下の生物学的活
性を試験し得る。
【０３１９】 （診断アッセイ） 本発明の化合物は、哺乳動物（好ましくはヒト）における種々の障害の診断、
処置、予防および／または予測のために有用である。このような障害は、本明細
書中、以下の節「生物学的活性」に記載されるものを含むが、これらに限定され
ない。
【０３２０】 多数の障害について、ヒト遺伝子発現の実質的に変更した（増大または減少し
た）レベルが、このような障害を有する個体から得た細胞または体液（例えば、
血清、血漿、尿、精液、滑液または髄液）で、「標準」のヒト遺伝子発現レベル
、すなわち、障害を有さない個体由来の組織または体液中のヒト発現レベルに比
較して、検出され得る。従って、本発明は、障害の診断中に有用な診断方法を提
供し、この方法は、個体由来の組織、細胞または体液でのヒトポリペプチドをコ
ードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、および測定した遺伝子発現レベル
を標準ヒト遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、そのことにより、標準と
比較される遺伝子発現レベルの増加または減少が、ヒト関連障害の指標となる。
これらの診断アッセイは、例えば、血液サンプル、生検組織、または剖検組織な
どにおいて、インビボまたはインビトロで実施され得る。
【０３２１】 本発明はまた、予想指標として有用であり、これによりヒト遺伝子発現の上昇
または低下を示す患者は、標準レベルに近いレベルで遺伝子を発現する患者に対
して悪い臨床結果を被る。
【０３２２】 「ヒトポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」とは、
ヒトポリペプチドのレベル、またはヒトポリペプチドをコードするｍＲＮＡレベ
ルを、第一の生物学的サンプルで、直接的（例えば、絶対タンパク質レベルまた
はｍＲＮＡレベルの決定または評価によって）または相対的（例えば、第二の生
物学的サンプルのヒトポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルに対する比較に
よって）に、定性または定量的に測定または評価することを意図する。好ましく
は、第一の生物学的サンプル中のヒトポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベル
は、測定または評価され、そして標準ヒトポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレ
ベルと比較され、この標準は、障害を有さない個体から得た第二の生物学的サン
プルから得られるか、または免疫系の障害を有さない個体集団からのレベルを平
均して決定される。当該分野で理解されるように、一旦、標準ヒトポリペプチド
レベルまたはｍＲＮＡレベルが判明すると、比較のための標準として繰り返し使
用され得る。
【０３２３】 「生物学的サンプル」とは、ヒトポリペプチド（その一部を含む）またはｍＲ
ＮＡを含有する、個体、細胞株、組織培養物、またはその他の供給源から得られ
た、任意の生物学的サンプルを意図する。示されるように、生物学的サンプルと
しては、ヒトポリペプチドの全長またはそのフラグメントを発現することが見出
された体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）および組織供給源が
挙げられる。哺乳動物から組織生検および体液を得る方法は、当該分野で周知で
ある。生物学的サンプルが、ｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源で
ある。
【０３２４】 全細胞ＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７））により記載される一段階
グアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム方法のような任意の
適切な技術を用いて生物学的サンプルから単離され得る。次いで、ヒトポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡのレベルが、任意の適切な方法を用いてアッセイされ
る。これらは、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−
ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）を包
含する。
【０３２５】 本発明はまた、ポリペプチドの正常なレベルおよび異常なレベルの決定を含む
、生物学的サンプル（例えば、細胞および組織）中のヒトポリペプチドのレベル
を検出する定量アッセイおよび診断アッセイのような診断アッセイに関する。従
って、例えば、正常なコントロール組織サンプルと比較した、ヒトポリペプチド
の過剰発現を検出するための本発明に従う診断アッセイは、腫瘍の存在を検出す
るために使用され得る。宿主由来のサンプルにおいて、本発明のヒトポリペプチ
ドのようなポリペプチドのレベルを決定するために使用され得るアッセイ技術は
、当業者に周知である。このようなアッセイ方法としては、放射性免疫アッセイ
、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡアッセイが挙
げられる。生物学的サンプルにおけるヒトポリペプチドレベルのアッセイは、任
意の当該分野に公知の方法を用いて可能である。
【０３２６】 生物学的サンプル中のヒトポリペプチドレベルをアッセイすることは、抗体に
基づく技術を用いて可能である。例えば、組織におけるヒトポリペプチド発現は
、古典的な免疫組織学的方法（Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７））を用いて研究され得
る。ヒトポリペプチド遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体に基づく方法
は、免疫アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）および放射性免
疫アッセイ（ＲＩＡ））を包含する。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野で公
知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）および放射性同
位元素（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５ Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍ Ｔｃ）および蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、な
らびにビオチンを包含する。
【０３２７】 分析されるべき組織または細胞型としては、一般的には、ヒト遺伝子を発現す
ることが公知であるか、またはそのことが予測される組織または細胞型（例えば
、癌など）が挙げられる。本明細書中で使用されるタンパク質単離方法は、例え
ば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．，
１９８８「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」
、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（これは、その全
体が本明細書中で参考として援用される））に記載される方法であり得る。単離
された細胞は、細胞培養物または患者由来であり得る。培養物から採取された細
胞の分析は、細胞ベースの遺伝子治療技術の一部として、あるいはヒト遺伝子の
発現に対する化合物の効果を試験するために使用され得る細胞の評価において必
須の工程であり得る。
【０３２８】 例えば、抗体または抗体のフラグメント（例えば、本明細書中に記載される）
を使用して、ヒト遺伝子産物あるいは保存された改変体もしくはそのペプチドフ
ラグメントの存在を定量的にまたは定性的に検出し得る。これは、例えば、光学
顕微鏡検出、フローサイトメトリー検出、または蛍光比色検出と一緒に蛍光的に
標識された抗体を使用する免疫蛍光技術によって達成され得る。
【０３２９】 好ましい実施形態において、ヒトポリペプチドの推定エピトープドメインの全
てまたはいずれか１つに対する抗体、または抗体のフラグメントは、ヒト遺伝子
産物、またはその保存された改変体もしくはペプチドフラグメントの存在を定量
的にまたは定性的に検出するために用いられ得る。これは、例えば、光学顕微鏡
、フローサイトメトリー、または蛍光定量検出と組み合わせた、蛍光標識した抗
体を使用する免疫蛍光技術によって達成され得る。
【０３３０】 さらに好ましい実施形態において、ヒトポリペプチドの立体配置エピトープに
対する抗体、または抗体のフラグメントは、ヒト遺伝子産物、またはその保存さ
れた改変体もしくはペプチドフラグメントの存在を定量的にまたは定性的に検出
するために用いられ得る。これは、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー
、または蛍光定量検出と組み合わせた、蛍光標識した抗体を使用する免疫蛍光技
術によって達成され得る。
【０３３１】 本発明の抗体（またはそのフラグメント）、および／または本発明のヒトポリ
ペプチドは、ヒト遺伝子産物またはその保存された改変体もしくはそのペプチド
フラグメントのインサイチュ検出のために、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡または非
免疫学的アッセイとしてさらに組織学的に使用され得る。インサイチュ検出は、
患者由来の組織学的標本を除去すること、およびそれに本発明の標識した抗体ま
たはヒトポリペプチドを適用することによって達成され得る。抗体（またはフラ
グメント）またはヒトポリペプチドは、好ましくは、生物学的サンプル上に標識
した抗体（またはフラグメント）を覆うことによって適用される。このような手
順の使用を通して、ヒト遺伝子産物、または保存された改変体もしくはペプチド
フラグメント、あるいはヒトポリペプチド結合の存在だけでなく、試験した組織
におけるその分布も決定することが可能である。本発明を使用して、当業者は、
広範種々の組織学的方法のいずれか（例えば、染色手順）が、例えば、インサイ
チュ検出を達成するために変更され得ることを容易に理解する。
【０３３２】 ヒト遺伝子産物または保存された改変体もしくはそのペプチドフラグメントに
ついての免疫アッセイおよび非免疫アッセイは、代表的に、ヒト遺伝子産物また
は保存された改変体もしくはそのペプチドフラグメントを結合し得る検出可能に
標識された抗体の存在下で、サンプル（例えば、生物学的液体、組織抽出物、新
鮮な収集された細胞、または細胞培養においてインキュベートされた細胞の溶解
物）をインキュベートする工程、ならびに当該分野で周知の多数の技術のいずれ
かによって結合した抗体を検出する工程を包含する。
【０３３３】 生物学的サンプルは、固相支持体またはキャリア（例えば、ニトロセルロース
）あるいは細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定し得る他の固体支持
体と接触させられ得る。次いで、この支持体を、適切な緩衝液で洗浄し、続いて
、検出可能に標識された抗ヒトポリペプチド抗体または検出可能なヒトポリペプ
チドで処理し得る。この固相支持体を、次いで、緩衝液で２回洗浄し、非結合の
抗体またはポリペプチドを除去し得る。必要に応じて、この抗体は、その後標識
される。次いで、固体支持体上の固定された標識の量は、従来の方法によって検
出され得る。
【０３３４】 「固相支持体またはキャリア」とは、抗原または抗体を結合し得る任意の支持
体を意図する。周知の支持体またはキャリアとしては、ガラス、ポリスチレン、
ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然の
および改変したセルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱が挙げ
られる。キャリアの性質は、本発明の目的のためにある程度可溶性であるかまた
は不溶性のいずれかであり得る。支持体材料は、結合した分子が、抗原または抗
体に結合し得る限り、実質的に任意の可能な構造配置を有し得る。従って、支持
体の構造は、ビーズの場合は球状、あるいは試験管の内表面またはロッドの外表
面の場合は円筒形であり得る。あるいは、表面は、平面（例えば、シート、試験
ストリップなど）であり得る。好ましい支持体は、ポリスチレンビーズを含む。
当業者には、抗体または抗原を結合し得る多くの他の適切なキャリアが公知であ
るか、または慣用的な実験の使用によって同一か確認することができる。
【０３３５】 抗ヒトポリペプチド抗体またはヒト抗原ポリペプチドの所定のロットの結合活
性は、周知の方法に従って決定され得る。当業者は、慣用的な実験を使用するこ
とによって各々の決定のための有効でかつ最適のアッセイ条件を決定し得る。
【０３３６】 個体から得られた生物学的サンプルにおいてヒトのポリペプチドレベルまたは
ポリヌクレオチドレベルをアッセイすることに加えて、ヒトのポリペプチドまた
はポリヌクレオチドは、画像化によってインビボでも検出され得る。例えば、本
発明の１つの実施形態において、ヒトのポリペプチドおよび／または抗ヒト抗原
抗体は、疾患の細胞（例えば、新生物）を画像化するために使用される。別の実
施形態において、本発明のヒトのポリヌクレオチド（例えば、特定のヒト ｍＲ
ＮＡ転写物の、全体または部分に相補的なポリヌクレオチド）ならびに／あるい
は抗ヒト抗体（例えば、本発明のヒトポリペプチドのエピトープのいずれか１つ
または組み合わせに対する抗体、本発明のヒトポリペプチドの構成的エピトープ
に対する抗体、または哺乳動物細胞の細胞表面上で発現された全長ポリペプチド
に対する抗体）は、疾患細胞または新生物細胞を画像化するために使用される。
【０３３７】 ヒトポリペプチドをインビボで画像化するための抗体標識またはマーカーは、
Ｘ線撮影、ＮＭＲ、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャンもしくはＥＳＲにより検出可能なも
のが挙げられる。Ｘ線撮影のために、適切な標識としては、検出可能な放射線を
放射するが被験体に対して明らかに有害でない、放射線同位元素（例えば、バリ
ウムまたはセシウム）が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカ
ーとしては、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカー（例えば、重水素）が
挙げられ、これらは、関連のハイブリドーマのための栄養素の標識化により抗体
に取り込まれ得る。インビボ画像化がヒトにおける診断のためにヒトのポリペプ
チドの増強されたレベルを検出するために使用される場合、ヒト抗体または「ヒ
ト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましくあり得る。そのよう
な抗体は、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の技術を用いて
産生され得る。例えば、キメラ抗体を作製するための方法は、当該分野で公知で
ある。総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２
（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）
；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら
、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅ
ｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７
１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅ
ｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと。
【０３３８】 さらに、存在が検出され得る任意のヒトのポリペプチドが、投与され得る。例
えば、放射性不透過性（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）化合物または他の適切な化
合物で標識されたヒトポリペプチドは、投与され、標識抗体に関して上記に記載
されるようにインビボで画像化され得る。さらにこのようなヒトポリペプチドは
、インビトロ診断手順のために使用され得る。
【０３３９】 適切な検出可能な画像化部分（例えば、放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ、１１２ Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴により検出
可能な材料）で標識されたヒトの、ポリペプチド特異的抗体または抗体フラグメ
ントが、免疫系障害について試験される哺乳動物に（例えば、非経口で、皮下で
、もしくは腹腔内で）導入される。被験体および使用される画像化システムの大
きさが、診断画像を生じるのに必要とされる画像化部分の量を決定することは、
当該分野で理解される。放射線同位元素部分の場合、ヒト被験体については、注
入される放射能の量は、通常、約５〜２０ミリキュリーの９９ｍＴｃの範囲であ
る。標識された抗体または抗体フラグメントは、次いで、ヒトタンパク質を含む
細胞の位置に優先的に蓄積する。インビボ腫瘍イメージングは、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒ
ｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａ
ｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇ
ｍｅｎｔ」により記載される（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．Ｂｕ
ｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２）の１３章）。
【０３４０】 抗体に関して、抗ヒトポリペプチド抗体が検出可能に標識され得る１つの方法
は、これらをレポーター酵素へ連結し、そしてこの連結された産物を酵素免疫ア
ッセイ（ＥＩＡ）に用いることによる（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．「Ｔｈｅ Ｅｎｚｙ
ｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）
」１９７８、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ ２：１−７、Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｐｕｂ
ｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）；Ｖｏｌｌｅｒら、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，
Ｊ．Ｅ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍ
ａｇｇｉｏ，Ｅ．（編）１９８０、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ヒ
トＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ら（
編）１９８１、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｋｇａｋｕ Ｓｈｏｉ
ｎ、Ｔｏｋｙｏ）。抗体に結合する酵素は、適切な基質（好ましくは色素基質）
と、例えば、分光光度法、蛍光法または可視手段によって検出され得る化学部分
を生成するような様式で反応する。抗体を検出可能に標識するために使用される
酵素としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−
ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホス
フェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース
オキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラ
ーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセ
チルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、この
検出は、この酵素に対する色素基質を用いる比色方法によって達成され得る。検
出はまた、同様に調製された標準物質と比較して、基質の酵素反応の程度を視覚
的に比較することによって達成され得る。
【０３４１】 検出はまた、種々の他の免疫アッセイのいずれかを用いて達成され得る。例え
ば、抗体または抗体フラグメントを放射性標識することによって、ラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ）の使用を介してヒトポリペプチドを検出することが可能であ
る（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄ
ｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒ
ｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔ
ｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６を参照のこ
と（これは、本明細書中に参考として援用される））。放射性同位元素は、γカ
ウンター、シンチレーションカウンター、またはオードラジオグラフィーを含む
手段によって検出され得るが、これらに限定されない。
【０３４２】 抗体を蛍光化合物で標識することもまた可能である。蛍光標識された抗体が適
切な波長の光に曝露される場合、次いでその存在は、蛍光に起因して検出され得
る。最も一般的に使用される蛍光標識化合物の間では、フルオレセインイソチオ
シアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシア
ニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｏｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）およびフルオレサ
ミンがある。
【０３４３】 抗体はまた、１５２Ｅｕまたは他のランタニド系列のような蛍光発光金属を用
いて検出可能に標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢
酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＴＤＡ）のような金属キ
レート群を用いて抗体に結合され得る。
【０３４４】 抗体はまた、化学発光化合物に結合することによって検出可能に標識され得る
。次いで、化学発光タグ化抗体の存在は、化学反応の経過の間に生じる発光の存
在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、
ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅ
ｒｏｍａｔｉｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリ
ジニウム塩およびオキサレートエステルである。
【０３４５】 同様に、生物発光化合物を使用して、本発明の抗体を標識し得る。生物発光は
、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加する生物系において見出される化
学発光の型である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することに
よって決定される。標識目的のための重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、
ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【０３４６】 （疾患を検出するための方法） 概して、疾患は、患者から得られた生物学的サンプル（例えば、血液、血清、
尿、および／または腫瘍生検）中の本発明のヒトタンパク質および／またはこの
ようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの１つ以上の存在に基づき患者
において検出され得る。言い換えれば、このようなタンパク質は、疾患または障
害（癌および／または本明細書のいずれかに記載のものを含む）の存在または非
存在を示すマーカーとして用いられ得る。さらに、このようなタンパク質は、他
の疾患および癌の検出に有用であり得る。本明細書に提供される結合剤は、概し
て生物学的サンプル中でこの薬剤に結合する抗原のレベルの検出を可能にする。
ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、ヒトポリペプチドをコードする
ｍＲＮＡ（これは、また癌を含む疾患または障害の存在または非存在の指標であ
る）のレベルを検出するために用いられ得る。一般に、ヒトポリペプチドは、正
常組織よりも疾患組織で少なくとも３倍高いレベルで存在するはずである。
【０３４７】 サンプル中でポリペプチドマーカーを検出するための結合剤を用いるための当
業者に公知の種々のアッセイ形式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａ
ｎｅ（前出）を参照のこと。概して、患者における疾患の存在または非存在は、
以下（ａ）患者から得た生物学的サンプルを結合剤と接触させる工程；（ｂ）こ
の結合剤に結合するポリペプチドのレベルをサンプル中で検出する工程；および
（ｃ）ポリペプチドのレベルを事前に決定したカットオフ値と比較する工程、に
より検出され得る。
【０３４８】 好ましい実施形態において、このアッセイは、サンプルの残りの部分から、本
発明のヒトポリペプチドに結合し、そしてそれを取り除くために、固体支持体上
に固定された結合剤の使用を含む。次いでこの結合されたポリペプチドは、レポ
ーター基を含み、そして結合剤／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試
薬を用いて検出され得る。このような検出試薬は、例えば、このポリペプチドに
特異的に結合する結合剤、またはこの結合剤に特異的に結合する抗体もしくは他
の薬剤（例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチ
ン）を含み得る。あるいは、競合アッセイが利用され得（ここでは、ポリペプチ
ドがレポーター基で標識される）、そして結合剤とサンプルとのインキュベーシ
ョンの後に、固定された結合剤への結合を可能にし得る。サンプルの成分が結合
剤に対する標識ポリペプチドの結合を阻害する程度は、サンプルと固定された結
合剤との反応性の指標である。このようなアッセイでの使用に適切なポリペプチ
ドとしては、上記のように、ヒトポリペプチドおよびその部分、または抗体（こ
こに結合剤が結合する）が挙げられる。
【０３４９】 固体支持体は、本発明のヒトポリペプチドが結合し得る、当業者に公知の物質
であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレートにおける試験ウ
ェル、またはニトロセルロースフィルターまたは他の適切なメンブレンであり得
る。あるいは、この支持体は、ビースまたはディスク（例えば、ガラスファイバ
ーガラス）、ラテックスまたはプラスチック材料（例えばポリスチレンまたはポ
リビニルクロリドン）であり得る。この支持体はまた、例えば、米国特許第５，
３５９，６８１号に記載のような、磁気粒子または光ファイバーセンサーであり
得る。結合剤は、当業者に公知の種々の技術を用いて、固体支持体に結合され得
る。これは、特許および科学文献に十分に記載されている。本発明の文脈では、
用語「固定（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」とは、非共有結合（例えば、吸
着）および共有結合（支持体上の薬剤と官能基との間の直接連結であり得るか、
または架橋剤による連結であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレート
中のウェルへの、またはメンブレンへの吸着による固定が好ましい。このような
場合、吸着は、適切な緩衝液中での、結合剤と固体支持体との、適切な時間の接
触によって達成され得る。接触時間は温度で変化するが、代表的には、約１時間
と約１日との間である。一般に、プラスチックのマイクロタイタープレート（例
えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）のウェルと十分な量（これは、約１
０ｎｇ〜約１０μｇ、そして好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇにわたる）の結
合剤との接触は、十分な量の結合剤を固定するのに十分である。
【０３５０】 固体支持体に対する結合剤の共有結合は、一般にこの支持体と二機能性試薬（
結合剤上で、支持体および官能基（例えば、水酸基またはアミノ基）の両方と反
応する）との最初の反応によって達成され得る。例えば、この結合剤は、ベンゾ
キノンを用いて、または結合パートナー上のアミンおよび活性水素と、支持体上
のアルデヒド基の縮合により、適切なポリマーコーティングを有する支持体に共
有結合され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１ Ａ１２〜Ａ１３を参照
のこと）。
【０３５１】 （遺伝子治療方法） 本発明の別の局面は、障害、疾患および状態を処置または予防するための遺伝
子治療方法である。この遺伝子治療方法は、本発明のポリペプチドの発現を達成
するための、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配
列の動物への導入に関する。この方法は、標的組織によるこのポリペプチドの発
現のために必要なプロモータおよび他の任意の遺伝因子と、作動可能に連結した
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを必要とする。このような
遺伝子治療および送達技術は当該分野において公知である（例えば、本明細書中
に参考として援用される、ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと）。
【０３５２】 従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボで本発明のポリヌクレオチド
と作動可能に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ）を用いて操作され得、次いで、操作された細胞は、本発明のポリペプチドを
用いて処置される患者に提供される。このような方法は、当該分野において周知
である。例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｎｓｔ．８５：２０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．
ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：１１０７−１１１２（１９９３）
；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：４６０
４−４６１５（１９９４）；Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
６０：２２１−２２９（１９９５）；Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ ５０：５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔ
ｏ，Ｌ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１−１０（１９９６
）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２４
６−１２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：３１−３８（１９９６）を参照のこと。これら
は、本明細書中に参考として援用される。１つの実施形態においては、操作され
る細胞は、動脈細胞である。この動脈細胞は、動脈、動脈の周囲の組織への直接
的な注射を介して、またはカテーテル注入を介して患者に再導入され得る。
【０３５３】 以下により詳細に考察されるように、このポリヌクレオチド構築物は、注射可
能な物質を動物の細胞に送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚
、肺、肝臓など）の間質空間への注射）により送達され得る。このポリヌクレオ
チド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性のキャリア中で送達され得る
。
【０３５４】 １つの実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオ
チドとして送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡと
は、細胞への侵入を補助し、促進し、または容易にするために作用するいかなる
送達ビヒクル（ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチ
ンまたは沈殿剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、本発明のポリヌク
レオチドはまた、当業者に周知の方法により調製され得るリポソーム処方物中お
よびリポフェクチン処方物中などで送達され得る。このような方法は、例えば、
米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号および同第５，５
８０，８５９号（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記載される
。
【０３５５】 遺伝子治療方法において使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、好ま
しくは、宿主ゲノム中に組み込まれないかまたは複製を可能にする配列を含まな
い構築物である。適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能
なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ；
ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．
１、およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容
易に明らかである。
【０３５６】 当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、ポリヌクレオチド配列の発現を
駆動するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプ
ロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロ
モーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイ
ルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプ
ロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチ
ミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモー
ター）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホ
ルモンプロモーターが挙げられる。このプロモーターはまた、本発明のポリヌク
レオチドについてネイティブなプロモーターであり得る。
【０３５７】 他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主
要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研
究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの期間の間、所
望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０３５８】 ポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓
、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精
巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）の間隙空
間に送達され得る。この組織の間隙空間は、器官組織の細網線維間の、細胞間の
液体ムコ多糖類基質、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織のコラー
ゲン線維、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕ
ｅ ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）内または骨の裂孔中の
同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャンネルのリ
ンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下で議
論される理由のために好ましい。本発明のポリヌクレオチド構築物は、これらの
細胞を含む組織への注射によって、好都合に送達され得る。本発明のポリヌクレ
オチド構築物は、好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送達され、そして
その細胞において発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全には
分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達
成され得る。インビボでの筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発
現する能力において、特に適格である。
【０３５９】 裸の核酸配列注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５
ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬
量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好まし
くは約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識
するように、この投薬量は、注射の組織部位に応じて変化する。核酸配列の適切
かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状態
および投与経路に依存し得る。
【０３６０】 好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注射経路による。しかし、他
の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に、肺または気管支の組
織、咽喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる
。さらに、裸のＤＮＡ構築物が、血管形成術の間にこの手順において用いられる
カテーテルによって動脈に送達され得る。
【０３６１】 裸のポリヌクレオチドは、送達部位での直接の針注射、静脈内注射、局所投与
、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない
、当該分野で公知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該
分野で公知である。
【０３６２】 この構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフ
ェクチン、沈殿剤などのような送達ビヒクルを用いて送達され得る。このような
送達方法は、当該分野で公知である。
【０３６３】 特定の実施形態において、ポリヌクレオチド構築物は、リポソーム調製物中で
複合体化している。本発明にて使用するためのリポソーム調製物は、カチオン性
（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を包含する
。しかしながら、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間で強固な荷
電複合体を形成し得るので、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性
リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（本明細書中で参考とし
て援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６）；ｍＲＮＡ（本明細書中で参考と
して援用される、Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ（１９８９）８６：６０７７〜６０８１）；および精製された転写因子（本
明細書中で参考として援用される、Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１
９９０）２６５：１０１８９〜１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示さ
れている。
【０３６４】 カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジ
オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは特に有用であり、そして商標ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎのもとにＧ
ＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参考と
して援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６をもまた参照のこと、）より入手
可能である。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒａｎ
ｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。
【０３６５】 当該分野で周知の技術を使用して、他のカチオン性リポソームを、容易に入手
可能な物質より調製し得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−
３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記述に関して、例
えばＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１０９２（本明細書中で参考として援用される
）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献にて説明されており、例え
ば、本明細書中で参考として援用される、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７を参照のこと。
類似した方法を使用して、他のカチオン性脂質物質よりリポソームを調製し得る
。
【０３６６】 同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔ
ｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に
入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して簡単に調製され得る。
そのような物質としてはとりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホ
スファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ
）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホス
ファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、
ＤＯＴＭＡ出発物資およびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な割合において混合され得
る。これらの物質を使用してリポソームを生成する方法は、当該分野で周知であ
る。
【０３６７】 例えば、商業的に、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレ
オイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせにおいて使用し、コレ
ステロールを添加してもしなくても、従来のリポソームを生成し得る。従って、
例えば、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、各５０ｍｇのＤＯＰＧおよ
びＤＯＰＣを乾燥することにより、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製し得る。この
サンプルを一晩真空ポンプ下に置き、そして次の日、脱イオン水で水和する。次
いで、浴を、１５ＥＣで循環させながら、最大設定にて、逆位カップ（浴タイプ
）プローブを装備したＨｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ モデル３５０超音波処理器を
使用して、このサンプルを栓をしたバイアル中にて２時間超音波処理する。ある
いは、負に荷電した小胞を、超音波処理なしで調製して多重膜小胞を生成し得る
か、または核孔膜（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して押し出
すことにより別々の大きさの単膜小胞を生成し得る。他の方法は、当業者に公知
でありそして利用可能である。
【０３６８】 このリポソームとしては、多重膜小胞（ＭＬＶ）、小さな単膜小胞（ＳＵＶ）
または大きな単膜小胞（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶが好ましい。当該分野で
周知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体が調製される。例えば、
本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３）、１０１：５１２〜５２７を参照
のこと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラスチューブの壁面にリン脂質の
薄膜を堆積させ、そしてその後、カプセル化されるべき物質の溶液で水和するこ
とによって調製され得る。ＳＵＶはＭＬＶの長期超音波処理により調製され、単
膜リポソームの均質集団を生成する。封入されるべき物質を、予め形成されたＭ
ＬＶの懸濁液に添加し、次いで、超音波処理する。カチオン性脂質を含むリポソ
ームを使用する場合、乾燥した脂質膜を、滅菌水または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｎ
ａＣｌのような等張性緩衝溶液のような適切な溶液中に再懸濁し、超音波処理し
、次いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと直接混合する。正に荷電したリ
ポソームのカチオン性ＤＮＡへの結合に起因して、リポソームおよびＤＮＡは非
常に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸フラグメントを用いての用途を
見出す。ＬＵＶは、当該分野で周知の多くの方法により調製される。一般に使用
される方法としては、Ｃａ２＋−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏ
ｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：
４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９））１７：７７）；エーテル注入
（Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．およびＢａｎｇｈａｍ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａ
ｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：
３３４８）；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．およびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅ
ｒ，Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：
１４５）；および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；Ｓｚｏｋａ、Ｆ．およびＰ
ａｐａｈａｄｊｏｐｕｏｌｏｓ，Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６）が挙げられ、これらの文献は本明細書
中で参考として援用される。
【０３６９】 一般に、ＤＮＡのリポソームに対する割合は約１０：１から約１：１０までで
ある。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は約５：１から約１：５までであ
る。より好ましくは、その割合は約３：１から約１：３までである。さらにより
好ましくは、その割合は約１：１である。
【０３７０】 米国特許第５，６７６，９５４号（本明細書中で参考として援用される）はカ
チオン性リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウスへの注入につい
て報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同
第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６
号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，
０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考と
して援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に
使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、
同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５
５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として
援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提
供する。
【０３７１】 特定の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする配列を含むＲＮ
Ａを含むレトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで細胞を操
作する。レトロウイルスプラスミドベクターを誘導し得るレトロウイルスとして
は、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、
ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、
ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げら
れるが、これらに限定されない。
【０３７２】 このレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を
形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッ
ケージング細胞株の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される
、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅａｐｙ、１：５〜１４（１９９
０）にて記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１
２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋
Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに
限定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッケー
ジング細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーショ
ン、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈殿が挙げられるが、それらに限定さ
れない。１つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターをリポ
ソームにカプセル化するか、または脂質に結合して、次いで宿主に投与し得る。
【０３７３】 このプロデューサー細胞株は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのよう
なレトロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのどちら
かにおいて、真核生物細胞を形質導入し得る。この形質導入された真核生物細胞
は、本発明のポリペプチドを発現する。
【０３７４】 特定の他の実施形態において、アデノウイルスベクター中に含まれるポリヌク
レオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。アデノウイル
スは、それが本発明のポリペプチドをコードし、そして発現し、それと同時に通
常の溶解性ウイルス生活環にて複製するその能力に関して不活性化されるように
操作され得る。アデノウイルス発現は、そのウイルスＤＮＡの宿主細胞染色体へ
の組み込み無しに達成され、その結果、挿入性変異誘発についての心配が軽減さ
れる。さらに、アデノウイルスは、何年もの間、腸の生ワクチンとして優れた安
全側面を伴って使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ａ．Ｒ．ら（１９７４）Ａ
ｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．、１０９：２３３−２３８）。最終的に、
アデノウイルス媒介性遺伝子移入が、コットンラットの肺へのα−１−アンチト
リプシンおよびＣＦＴＲの移入を含む多くの例において実証されている（Ｒｏｓ
ｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：４３１−４３
４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ、６８：１４３−１５５）。さ
らに、ヒト癌における原因物質としてアデノウイルスを確立しようとする広範な
研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：６６０６）。
【０３７５】 本発明において有用である適切なアデノウイルスベクターが、例えば、Ｋｏｚ
ａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ
．、３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８
：１４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅｔ．Ｔｈｅｒ．、４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｇｅｎｅｔ、７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３６５：６９１〜６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２
２４号に記載されており、これらは本明細書中で参考として援用される。例えば
、アデノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞にて増殖
され得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そして構成的に
ＥｌａおよびＥｌｂを発現し、このことは、このベクターから欠失している遺伝
子の産物を提供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加え
て、他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もま
た、本発明において有用である。
【０３７６】 好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは、複製欠損性である
。複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルス
および／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは
、細胞に感染する能力があり、そしてプロモーターに作動可能に連結された目的
のポリヌクレオチドを発現し得るが、ほとんどの細胞にて複製し得ない。複製欠
損アデノウイルスは、次の遺伝子：Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａまたは
Ｌ１からＬ５までのすべてまたは一部のうちの１つ以上にて欠失され得る。
【０３７７】 特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、エ
キソビボまたはインビボでこの細胞を操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を生成す
るためにヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（
Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７（１９９２））。ＡＡＶはまた、非分裂細胞の
中にそのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。３００塩基
対程度の小さいＡＡＶを含むベクターがパッケージされ得、そして組み込み得る
が、外来性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限られる。そのようなＡＡ
Ｖの生成および使用の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，１
３９，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７８号、同第
５，４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８，７４５号
および同第５，５８９，３７７号を参照のこと。
【０３７８】 例えば、本発明において使用するために適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製
、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みに必要な配列すべてを含む。Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９
８９）において見出される方法のような、標準的クローニング方法を使用して、
このポリヌクレオチド構築物を、このＡＡＶベクターに挿入する。次いで、リポ
フェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む、任
意の標準的技術を使用して、この組換えＡＡＶベクターを、ヘルパーウイルスに
感染しているパッケージング細胞にトランスフェクトする。適切なヘルパーウイ
ルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、
またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッケージング細胞がトランスフェ
クトおよび感染されると、それらはこのポリヌクレオチド構築物を含む感染性Ａ
ＡＶウイルス粒子を生成する。次いで、エキソビボまたはインビボのいずれかで
、これらのウイルス粒子を使用して真核生物細胞を形質導入する。この形質導入
細胞は、そのゲノムに組み込まれたポリヌクレオチド構築物を含み、そして本発
明のポリペプチドを発現する。
【０３７９】 遺伝子治療の別の方法は、相同組換え（例えば、米国特許第５，６４１，６７
０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、１９９
６年９月２６日公開；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４日
公開；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６
：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ
、３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）を介して、異種制御領域
および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、本発明のポリペプチドをコードし
ている配列）を作動可能に連結する工程を含む。この方法は、標的細胞中に存在
しているが、通常はその細胞中で発現しないかまたは所望するよりも低いレベル
で発現する、遺伝子の活性化を含む。
【０３８０】 当該分野で既知の標準的技術を使用して、ポリヌクレオチド構築物を作製する
。この構築物は、プロモーターを、そのプロモーターに隣接した標的化配列とと
もに含む。適切なプロモーターが、本明細書中に記載されている。標的化配列は
、内在性配列に対して十分に相補的であり、プロモーター−標的化配列と内在性
配列との相同組換えを可能にする。標的化配列は、所望される内在性ポリヌクレ
オチド配列の５’末端の十分近くに存在し、それゆえ、相同組換えに際して、プ
ロモーターは、内在性配列に作動可能に連結される。
【０３８１】 このプロモーターおよび標的化配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。好ま
しくは、この増幅されたプロモーターは、５’末端および３’末端に別の制限酵
素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されたプロモ
ーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末
端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されたプ
ロモーターおよび標的化配列を消化し、そしてともに連結する。
【０３８２】 裸のポリヌクレオチドとしてか、もしくは上記により詳細に記載されるような
リポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクション、
沈殿剤などのようなトランスフェクション促進剤と一緒にかのいずれかで、この
プロモーター−標的化配列構築物を細胞に送達する。直接針注射、静脈内注射、
局所投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法により、Ｐプロモ
ーター−標的化配列を送達し得る。この方法を、下記により詳細に記載する。
【０３８３】 プロモーター−標的化配列構築物は、細胞により取り込まれる。この構築物と
内在性配列との間に相同組換えが起こり、その結果、内在性配列は、このプロモ
ーターの制御下に配置される。次いで、このプロモーターは、内在性配列の発現
を駆動する。
【０３８４】 好ましくは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、そのタ
ンパク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含む。代表的に、このシグナル配
列は、ポリヌクレオチドのコード領域の５’末端に向かってかまたは５’末端で
発現される、そのポリヌクレオチドのコード領域に位置する。このシグナル配列
は、目的のポリヌクレオチドに対して同種または異種であり得、そしてトランス
フェクトされる細胞に対して同種または異種であり得る。さらに、当該分野で公
知の方法を使用して、このシグナル配列は化学合成され得る。
【０３８５】 その投与形態によって、治療効果を提供するのに十分な量にて１つ以上の分子
が発現される限り、上記のポリヌクレオチド構築物のうちのいずれかの任意の投
与形態が使用され得る。これは、直接針注射、全身注射、カテーテル注入、バイ
オリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝
子銃」）、ゲルフォームスポンジデポー（ｄｅｐｏｔ）、他の市販デポー（ｄｅ
ｐｏｔ）物質、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口用または坐
剤用の固形（錠剤または丸剤）薬学的処方物、および手術中のデカンティングま
たは局所適用を含む。例えば、ラット肝臓およびラット脾臓へのリン酸カルシウ
ム沈澱した裸のプラスミドの直接注射、または門脈へのタンパク質被覆プラスミ
ド直接注射は、ラット肝臓における外来遺伝子の遺伝子発現をもたらした（Ｋａ
ｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：３７５（１９８９））。
【０３８６】 局所投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達ビ
ヒクルと複合体を形成した本発明の組換え分子は、動脈領域内部に直接注射によ
り投与されるか、または動脈領域内部に局所投与される。動脈領域内部での組成
物の局所投与とは、その組成物を動脈内に数センチメートル、好ましくは数ミリ
メートルで注射することを言う。
【０３８７】 局所投与の別の方法は、外科的創傷内またはその周辺に本発明のポリヌクレオ
チド構築物を接触させることである。例えば、患者は手術を経験し得、そしてこ
のポリヌクレオチド構築物を創傷内部の組織表面上に被覆され得るか、またはそ
の構築物を創傷内部の組織領域に注射され得る。
【０３８８】 全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクルと複合体
を形成した本発明の組換え分子を含む。全身投与で使用するために適切な送達ビ
ヒクルは、特定部位に対してそのビヒクルを標的化するリガンドを含むリポソー
ムを含む。
【０３８９】 全身投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口および経皮
（局所的）送達が挙げられる。当該分野で標準的な方法を使用して、静脈内注射
が実行され得る。当該分野で標準的な方法を使用して、エアロゾル送達もまた実
行され得る（例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １８９：１１２７７〜１
１２８１、１９９２を参照のこと）。動物の腸内の消化酵素による分解に耐える
能力をもつキャリアに対して本発明のポリヌクレオチド構築物が複合体を形成す
ることにより、経口送達は実行され得る。そのようなキャリアの例としては、当
該分野で公知であるもののような、プラスチックカプセルまたは錠剤が挙げられ
る。皮膚内へ通過可能な親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と本発明のポリヌクレ
オチド構築物を混合することによって、局所的送達は実行され得る。
【０３９０】 送達される物質の有効量を決定することは、例えば、その物質の化学構造およ
び生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびそ
の重症度、ならびに投与経路を含む、多数の因子に依存し得る。処置の頻度は、
１用量あたりの投与されるポリヌクレオチド構築物の量ならびに被験体の健康お
よび病歴のような多くの因子に依存する。正確な量、投薬回数および投薬のタイ
ミングは、主治医または主治獣医により決定される。
【０３９１】 本発明の治療的組成物は、任意の動物に、好ましくは哺乳動物および鳥類に投
与され得る。好ましい哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、
ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが挙げられ、特ヒトが好ましい。
【０３９２】 （生物学的活性） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストをアッセイに使用し、１つ以上の生物学的活性について試験し得
る。これらのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいは本発明のアゴニス
トまたはアンタゴニストが特定のアッセイにおいて活性を示す場合、これらの分
子はその生物学的活性に関連した疾患に関与し得るようである。従って、このポ
リヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニス
トを使用し、関連した疾患を診断、予測、予防および／または処置し得る。
【０３９３】 ヒトタンパク質は、種々の生物学的プロセス（例えば、細胞シグナル伝達）に
関連する生物学的活性に関与すると考えられる。従って、本発明の組成物（本発
明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体、ならびにそのフラグメント
および改変体を含む）は、ヒトポリペプチドの異常活性に関連する疾患および／
または障害の診断、予測、予防および／または処置において使用され得る。
【０３９４】 好ましい実施形態において、本発明の組成物（本発明のポリヌクレオチド、ポ
リペプチド、および抗体、ならびにそのフラグメントおよび改変体を含む）は、
内分泌系、神経系（例えば、以下の「神経学的障害」の節を参照のこと）、およ
び免疫系（例えば、以下の「免疫活性」の節を参照のこと）の疾患および障害に
関連する疾患および／または障害の、診断、予測、予防および／または処置に使
用され得る。
【０３９５】 特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、あるいはそのポリペプチド
に対応するポリヌクレオチド、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストは、本発
明のポリペプチドが発現される組織（「本発明のポリヌクレオチドおよびポリペ
プチド」の節に開示される、または表３に開示されるような、１、２、３、４、
５またはそれ以上の組織を含む）に関連する疾患および／または障害を、診断お
よび／または予測するために使用され得る。
【０３９６】 従って、本発明のポリヌクレオチド、翻訳産物および抗体は、以下を含むがこ
れに限定されない活性に関連する疾患および／または障害の、診断、予測、予防
および／または処置に有用である：プロホルモン活性化、神経刺激伝達活性、細
胞シグナル伝達、細胞増殖、細胞分化、および細胞移動。
【０３９７】 より一般的には、この遺伝子に対応するポリヌクレオチド、翻訳産物および抗
体は、以下の系に関連する疾患および／または障害の診断、予測、予防および／
または処置のために有用であり得る。
【０３９８】 （免疫活性） 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、例えば、免疫細胞の増殖、分化、もしくは動員（走
化性）を活性化または阻害することにより、免疫系の疾患、障害および／または
状態を、処置、予防、および／または診断するのに有用であり得る。免疫細胞は
、造血と呼ばれるプロセスを介して発達し、多能性幹細胞から骨髄性細胞（血小
板、赤血球、好中球およびマクロファージ）およびリンパ系細胞（Ｂリンパ球お
よびＴリンパ球）を生成する。これら免疫疾患、障害および／または状態の病因
は、遺伝的、身体的（ｓｏｍａｔｉｃ）（例えば、癌またはいくつかの自己免疫
性障害）、後天的（例えば、化学療法もしくは毒素による）または感染的であり
得る。さらに、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／また
はアゴニストもしくはアンタゴニストは、特定の免疫系の疾患または障害のマー
カーまたは検出物質（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）として使用され得る。
【０３９９】 別の実施形態において、本発明のポリペプチド、またはこのポリペプチドに対
応するポリヌクレオチド、抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストは、免疫系
の疾患および障害を処置するために、そして／または本発明のポリペプチドが発
現される組織（表３、第２列（ライブラリーコード）に開示される組織を含む）
に関する細胞によって生成される免疫応答を阻害または増大するために、使用さ
れ得る。
【０４００】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、免疫不全（先天性および後天性の免疫不全の両方を
含む）の処置、予防、および／または診断において有用であり得る。免疫グロブ
リンレベルＢ細胞機能および／またはＢ細胞数が減少するＢ細胞免疫不全の例と
しては、以下が挙げられる：Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（Ｂｒｕｔｏｎ病）
、Ｘ連鎖乳児無ガンマグロブリン血症、過剰のＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫欠損、過
剰のＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖免疫欠損、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、先
天性および後天性の無ガンマグロブリン血症を含む無ガンマグロブリン血症、成
人発症無ガンマグロブリン血症、後期発症無ガンマグロブリン血症、異常ガンマ
グロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、非特異的低ガンマグロブリン血症、
退縮無ガンマグロブリン血症（Ｓｗｉｓｓ型）、選択的ＩｇＭ欠損、選択的Ｉｇ
Ａ欠損、選択的ＩｇＧサブクラス欠損、ＩｇＧサブクラス欠損（ＩｇＡ欠損を伴
うかまたは伴わない）、増加したＩｇＭを伴うＩｇ欠損、増加したＩｇＭを伴う
ＩｇＧおよびＩｇＡ欠損、正常または上昇したＩｇを伴う抗体欠損、Ｉｇ重鎖欠
損、κ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ球増殖性障害（ＢＬＰＤ）、分類不能型免疫不全（
ＣＶＩＤ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩ）（後天性）、および一過性乳児低ガ
ンマグロブリン血症。
【０４０１】 特定の実施形態において、毛細血管拡張性運動失調または毛細血管拡張性運動
失調に関連する状態は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、および
／またはそのアゴニストを投与することによって寛解または処置される。
【０４０２】 Ｔ細胞および／またはＢ細胞の機能および／または数が減少する先天性免疫不
全の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＤｉＧｅｏｒｇｅ
奇形、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）（Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、常染色体退縮ＳＣＩ
Ｄ、アデノシンデアミナーゼ欠損、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ
）欠損、クラスＩＩ ＭＨＣ欠損（不全リンパ球症候群）、ヴィスコット−オー
ルドリッチ症候群、および毛細血管拡張性運動失調が挙げられるがこれらに限定
されない）、胸腺発育不全、第３および第４咽頭嚢症候群、２２ｑ１１．２欠損
、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ナチュラルキラー細胞欠損（ＮＫ）、特発性ＣＤ４
＋ Ｔ−リンパ球減少、顕著なＴ細胞欠損を伴う免疫欠損（不特定）、および細
胞媒介免疫の不特定の免疫欠損。
【０４０３】 特定の実施形態において、ＤｉＧｅｏｒｇｅ奇形またはＤｉＧｅｏｒｇｅ奇形
に関する状態は、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、ある
いはそのアンタゴニストまたはアゴニストを投与することによって寛解または処
置される。
【０４０４】 本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、および／またはそのアゴニス
トを投与することによって寛解または処置され得る他の免疫不全としては、以下
が挙げられるがこれらに限定されない：慢性肉芽腫症、チェディアック−東症候
群、ミエロペルオキシダーゼ欠損、白血球グルコース−６−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼ欠損、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、白血球接着不全、補体
成分欠損（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８および／またはＣ
９欠損を含む）、細網発育不全、胸腺リンパ形成不全−発育不全、胸腺腫を伴う
免疫欠損、重篤な先天性白血球減少症、免疫欠損を伴う形成異常、新生児好中球
減少、短肢小人症、およびＩｇを伴うネゼロフ症候群−複合免疫欠損。
【０４０５】 好ましい実施形態において、上記に列挙される免疫欠損および／または免疫欠
損に関連する状態は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および
／またはアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して、処置、予防および／ま
たは診断される。
【０４０６】 好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体
、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、免疫不全個体の間の免
疫応答性をブーストするための因子として使用され得る。特定の実施形態におい
て、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞免疫不全個体の間の免
疫応答性をブーストするための因子として使用され得る。
【０４０７】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体および／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストはまた、自己免疫障害の処置、予防および／または診断に
おいて、有用であり得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって外来性物質
として不適切に自己認識することから生じる。この不適切な認識は、宿主組織の
破壊をもたらす免疫応答を引き起こす。従って、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、
分化または走化性を阻害し得る本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
投与は、自己免疫障害の予防において効果的な治療であり得る。
【０４０８】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストによって処置、予防および／または診断され得る自己免
疫疾患および障害の例としては、以下の１つ以上が挙げられるがこれらに限定さ
れない：全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬
化症、自己免疫甲状腺炎、橋本甲状腺炎、自己免疫溶血性貧血、溶血性貧血、血
小板減少症、自己免疫血小板減少性紫斑症、自己免疫新生児血小板減少症、特発
性血小板減少性紫斑病、紫斑（例えば、ヘノッホ−シェーンライン（Ｈｅｎｌｏ
ｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ）紫斑病）、自己免疫性血球減少症、グッドパスチャ
ー症候群、尋常性類天疱瘡、重症筋無力症、グレーヴス病（甲状腺機能亢進症）
、およびインシュリン抵抗性糖尿病（ｍｅｌｌｉｔｕｓ）。
【０４０９】 本発明の組成物によって処置、予防および／または診断され得る、自己免疫成
分をおそらく有するさらなる障害としては、以下が挙げられるがこれらに限定さ
れない：ＩＩ型コラーゲン誘導性関節炎、抗リン酸脂質症候群、皮膚炎、アレル
ギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、神経炎、ブ
ドウ膜眼炎、多発性内分泌腺症、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫
肺動脈炎症、自閉症、ギヤン−バレー症候群、インシュリン依存性糖尿病（ｍｅ
ｌｌｉｔｉｓ）、および自己免疫炎症性眼障害。
【０４１０】 本発明の組成物によって処置、予防および／または診断され得る、自己免疫成
分をおそらく有するさらなる障害としては、以下が挙げられるがこれらに限定さ
れない：抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（例えば、核小体抗体および他の核抗体
によってしばしば特徴付けられる）、混合結合組織病（例えば、可溶性核抗原（
例えば、リボ核タンパク質）に対する抗体によってしばしば特徴付けられる）、
多発性筋炎（例えば、非ヒストンＡＮＡによってしばしば特徴付けられる）、悪
性貧血（例えば、抗壁細胞、ミクロソーム、および内因子抗体によってしばしば
特徴付けられる）、特発性アジソン病（例えば、体液および細胞媒介性副腎細胞
傷害性によってしばしば特徴付けられる）、不妊症（例えば、抗精子抗体によっ
てしばしば特徴付けられる）、糸球体腎炎（例えば、糸球体基底膜抗体または免
疫複合体によってしばしば特徴付けられる）、水疱性類天疱瘡（例えば、基底膜
中のＩｇＧおよび補体によってしばしば特徴付けられる）、シェーグレン症候群
（例えば、多重組織抗体、および／または特定の非ヒストンＡＮＡ（ＳＳ−Ｂ）
によってしばしば特徴付けられる）、糖尿病（例えば、細胞媒介性および体液性
島細胞抗体によってしばしば特徴付けられる）、ならびにアドレナリン作動性薬
剤抵抗性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作動性薬剤抵抗性を含む
）（例えば、βアドレナリンレセプター抗体によってしばしば特徴付けられる）
。
【０４１１】 本発明の組成物を用いて処置、予防および／または診断され得る、自己免疫成
分を有し得るさらなる障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：慢性活性肝炎（例えば、平滑筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、原
発性胆汁性肝硬変（例えば、ミトコンドリア抗体によってしばしば特徴付けられ
る）、他の内分泌腺不全（例えば、いくつかの場合は、特定の組織抗体によって
しばしば特徴付けられる）、白斑（例えば、メラノサイト抗体によってしばしば
特徴付けられる）、脈管炎（例えば、脈管壁におけるＩｇおよび補体ならびに／
または低血清補体によってしばしば特徴付けられる）、ＭＩ後（例えば、心筋抗
体によってしばしば特徴付けられる）、心臓切開症候群（例えば、心筋抗体によ
ってしばしば特徴付けられる）、じんま疹（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体
およびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、アトピー性皮膚炎（例え
ば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられ
る）、喘息（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってしば
しば特徴付けられる）、ならびに多くの他の炎症性障害、肉芽種性障害、変性障
害、および萎縮性障害。
【０４１２】 好ましい実施形態においては、自己免疫性疾患および障害ならびに／または上
記に列挙された疾患および障害に関連する状態は、例えば、本発明のアンタゴニ
スト、またはアゴニスト、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたは抗体を用
いて、処置、予防および／または診断される。特定の好ましい実施形態において
は、慢性関節リウマチは、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体およ
び／またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、処置、予防および／ま
たは診断される。別の特定の好ましい実施形態において、全身性エリテマトーデ
スが、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体および／またはアゴニス
トもしくはアンタゴニストを用いて処置、予防および／または診断される。別の
特定の好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、
抗体および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、特発性血小板
減少性紫斑病が処置、予防および／または診断される。別の特定の好ましい実施
形態において、ＩｇＡネフロパシーは、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、抗体、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、処置、
予防および／または診断される。
【０４１３】 好ましい実施形態において、自己免疫疾患および自己免疫障害ならびに／また
は上記の疾患および障害と関連する状態は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペ
プチド、抗体および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、処置
、予防および／または診断される。
【０４１４】 好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド
および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、免疫抑制剤として使用さ
れる。
【０４１５】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、造血細胞の疾患、障害および／または状態の処置、
予防および／または診断において有用であり得る。本発明のポリヌクレオチド、
ポリペプチド、抗体、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、白
血病、好中球減少症、貧血、および血小板減少症が挙げられるが、それらに限定
されない、特定の（または多くの）型の造血細胞の減少に関連した疾患、障害お
よび／または状態を処置または予防する試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血
細胞の分化および増殖を増加させるために用いられ得る。あるいは、本発明のポ
リヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはアゴニストもしくはアン
タゴニストは、組織球増殖症が挙げられるが、それらに限定されない、特定の（
または多くの）型の造血細胞の減少に関連した疾患、障害および／または状態を
処置または予防する試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増
殖を増加させるために用いられ得る。
【０４１６】 アレルギー反応および状態（例えば、喘息（特にアレルギー性喘息）または他
の呼吸障害）はまた、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、および
／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、処置、予防およ
び／または診断され得る。さらに、これらの分子は、アナフィラキシー、抗原性
分子に対する過敏性、または血液型不適合を処置、予防および／または診断する
ために用いられ得る。
【０４１７】 さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、および／またはその
アゴニストは、ＩｇＥ媒介アレルギー応答を処置または予防するために使用され
得る。このようなアレルギー反応としては、喘息、鼻炎および湿疹が挙げられる
が、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチ
ド、ポリペプチド、抗体および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、
インビトロまたはインビボにおいてＩｇＥ濃度の調節に使用され得る。
【０４１８】 さらに、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体および／またはアゴ
ニストもしくはアンタゴニストは、炎症状態の診断、予測、予防および／または
処置に使用される。例えば、本発明のポリペプチド、抗体、もしくはポリヌクレ
オチド、および／または本発明のアゴニストもしくはアンタゴニストは、炎症応
答に関与する細胞の活性化、増殖および／または分化を阻害し得る。これらの分
子を使用して、慢性および急性の状態の炎症状態を、診断、予測、予防および／
または処置を判断し得る。このような炎症状態は以下を含むがこれらに限定され
ない。例えば、感染に関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、また
は全身炎症応答症候群）、虚血再灌流傷害に関連する炎症、内毒素致死に関連す
る炎症、補体媒介超急性拒絶に関連する炎症、腎炎に関連する炎症、サイトカイ
ンまたはケモカインが誘導する肺傷害に関連する炎症、炎症性腸疾患に関連する
炎症、クローン病に関連する炎症またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩ
Ｌ−１）の過剰生成から生じる炎症、呼吸器障害（例えば、喘息およびアレルギ
ー）；胃腸障害（例えば、炎症性腸疾患）；癌（例えば、胃癌、卵巣癌、肺癌、
膀胱癌、肝臓癌、および乳癌）；ＣＮＳ障害（例えば、多発性硬化症、虚血性脳
損傷、および／または脳梗塞、外傷性脳損傷、神経変性性障害（例えば、パーキ
ンソン病およびアルツハイマー病）、ＡＩＤＳ関連痴呆、およびプリオン病）；
心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、心筋炎、心血管疾患、および心
肺バイパス合併症）；ならびに炎症によって特徴付けられる多くのさらなる疾患
、状態、および障害（例えば、肝炎、慢性関節リウマチ、痛風、外傷、膵炎、サ
ルコイドーシス、皮膚炎、腎虚血再還流障害、グレーヴス病、全身性エリテマト
ーデス、真性糖尿病、および同種異系移植拒絶）。
【０４１９】 炎症は、基礎的な防御機構なので、炎症障害は、実質的に体の任意の組織に影
響を与え得る。従って、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体、
ならびにそのアゴニストもしくはアンタゴニストは、以下を挙げられるがこれら
に限定されない、組織特異的炎症障害の処置に使用される。副腎炎、肺胞炎、胆
管炎、虫垂炎、亀頭炎、眼瞼炎、気管支炎、滑液胞炎、心臓炎、蜂巣炎、子宮管
炎、胆嚢炎、声帯炎、蝸牛炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、皮膚炎、憩室炎、脳炎
、心内膜炎、食道炎、耳管炎、結合組織炎、毛胞炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、舌
炎、肝脾炎、角膜炎、迷路炎、喉頭炎、リンパ管炎、乳腺炎、中耳炎（ｍｅｄｉ
ａ ｏｔｉｔｉｓ）、髄膜炎、子宮炎、粘膜炎、心筋炎、筋炎（ｍｙｏｓｉｔｉ
ｔｉｓ）、鼓膜炎、腎炎、神経炎、精巣炎、骨軟骨炎、耳炎、心膜炎、腱周囲炎
、腹膜炎、喉頭炎、静脈炎、灰白髄炎、前立腺炎、歯髄炎、網膜炎、鼻炎、卵管
炎、強膜炎、強膜脈絡膜炎、陰嚢炎、静脈洞炎、脊椎炎（ｓｐｏｎｙｌｉｔｉｓ
）、脂肪組織炎、口内炎、滑膜炎、耳管炎、腱炎、扁桃炎、尿道炎、および膣炎
。
【０４２０】 特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、もしくはポリヌクレ
オチド、および／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストは、器官移
植拒絶および対宿主性移植片病の処置、診断および／または予防に有用である。
器官拒絶は、免疫応答を通した移植された組織の宿主免疫細胞破壊によって起こ
る。同様に、免疫反応はまた、ＧＶＨＤに関するが、この場合、外来の移植され
た免疫細胞が、宿主組織を破壊する。本発明のポリペプチド、抗体、もしくはポ
リヌクレオチドおよび／またはそのアゴニストもしくはアンタゴニスト（免疫応
答、特にＴ細胞の活性化、増殖、分化、または走化性を阻害する）は、器官拒絶
またはＧＶＨＤを予防するのに有効な治療であり得る。特定の実施形態において
、本発明のポリペプチド、抗体、もしくはポリヌクレオチドおよび／またはその
アゴニストもしくはアンタゴニスト（免疫応答、特にＴ細胞の活性化、増殖、分
化、または走化性を阻害する）は、実験的アレルギー拒絶および超急性異種移植
拒絶を予防するのに有効な治療であり得る。
【０４２１】 他の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、もしくはポリヌクレオ
チド、および／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストは、以下に挙
げられるが、それらに限定されない、免疫複合疾患の処置、診断および／または
予防に有用であり得る。血清病、後連鎖球菌性糸球体腎炎（ｐｏｓｔ ｓｔｅｐ
ｔｏｃｏｃｃａｌ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）および結節性多発
動脈炎（ｐｏｌｙａｔｅｒｉｔｉｓ ｎｏｄｏｓａ）、免疫複合誘導性脈管炎。
【０４２２】 本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、感染性因子の処置、検出および／または予防に有用
であり得る。例えば、免疫応答を増大することによって、特にＢ細胞および／ま
たはＴ細胞の増殖、活性化および／または分化を増大することによって、感染性
疾患は、処置、検出、および／または予防され得る。免疫応答は、既存の免疫応
答を増大するか、または新しい免疫応答を惹起するかのいずれかによって、増大
され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体および／
またはアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、免疫応答の必然的な惹起なし
に、感染性因子（感染性因子の適用列挙の節などで述べる）を直接阻害し得る。
【０４２３】 別の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、お
よび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、特定の抗原に対する免疫応
答を増大するワクチンアジュバントとして使用される。特定の実施形態において
、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、組織特異的な免疫応答を増大するアジュバントとし
て使用される。
【０４２４】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、抗ウイルス免疫応答
を増大するためのアジュバントとして使用される。アジュバントとして本発明の
組成物を用いて増強され得る抗ウイルス免疫応答としては、ウイルスおよび本明
細書において記載されるかさもなければ当該分野で公知のウイルス関連疾患およ
び症状が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下：ＡＩ
ＤＳ、髄膜炎、デング、ＥＢＶ、および肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）からなる群よ
り選択される、ウイルス、疾患または症状に対する免疫応答を増強するためのア
ジュバントとして用いられる。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は
、以下：ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ＲＳウイルス、デング、ロタウイルス、日本脳炎、
インフルエンザＡおよびＢ、パラインフルエンザ、麻疹、サイトメガロウイルス
、狂犬病、Ｊｕｎｉｎウイルス、チクングニヤウイルス、リフトバレー熱、単純
疱疹、および黄熱病からなる群より選択されるウイルス、疾患または症状に対す
る免疫応答を増強するアジュバントとして用いられる。
【０４２５】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、抗細菌免疫応答また
は抗真菌免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。アジュバン
トとして本発明の組成物を使用して増大され得る抗細菌免疫応答または抗真菌免
疫応答としては、細菌または真菌、および本明細書中に記載されるか、または、
さもなくば当該分野で公知の疾患または症状に関連する細菌または真菌が挙げら
れる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、細菌または真菌、疾患、ま
たは症状（これは、破傷風、ジフテリア、ボツリスム、およびＢ型髄膜炎からな
る群から選択される）に対する免疫応答を増大するためのアジュバントとして使
用される。
【０４２６】 別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、細菌または真菌、疾患、ま
たは症状（これは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｇｒｏｕｐ Ｂ ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅ
ｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇ
ｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉからなる
群から選択される）に対する免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用
される。
【０４２７】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、抗寄生生物免疫応答
を増大するためのアジュバントとして使用される。アジュバントとして本発明の
組成物を使用して増大され得る抗寄生生物免疫応答としては、寄生生物、および
本明細書中に記載されるかまたはさもなくば、当該分野で公知の疾患または症状
に関連する寄生生物が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の組成物は
、寄生生物に対する免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（マラ
リア）またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａに対する免疫応答を増大するためのアジュバ
ントとして使用される。
【０４２８】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、例えば、単核性
食細胞の漸増および活性化を予防することによって、珪胚症、サイコイドーシス
、特発性肺線維症を含む感染疾患の処置に使用され得る。
【０４２９】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、本発明のポリペプチ
ドに対する免疫介在応答を阻害または増大する、抗体の産生のための抗体として
使用される。
【０４３０】 １つの実施形態として、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、お
よび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、免疫系をブーストし、１つ
以上の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）の量の増大を生
じ、より高い親和性の抗体産生および免疫グロブリンクラス転換（例えば、Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）を誘導し、および／または免疫応答を増大す
るための動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブ
タ、ミニブタ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非
ヒト霊長類、およびヒト、最も好ましくはヒト）に投与される。
【０４３１】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、病原体に対するＢ細
胞応答性の刺激物質として使用される。
【０４３２】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、Ｔ細胞のアクチベー
ターとして使用される。
【０４３３】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、免疫抑制性治療を受
ける前の、個体の免疫状態を増大させる薬剤として使用される。
【０４３４】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、より高い親和性抗体
を誘導するための薬剤として使用される。
【０４３５】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、血清免疫グロブリン
濃度を増加するための薬剤として使用される。
【０４３６】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、免疫無防備状態の個
体の回復を促進するための薬剤として使用される。
【０４３７】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、高齢の集団の間の免
疫応答性をブーストするための薬剤として使用される。
【０４３８】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、骨髄移植および／ま
たは他の移植（例えば、同種異系または外因性の器官移植）の前、間、または後
の免疫系エンハンサーとして使用される。移植に関して、本発明の組成物は、移
植の前、同時、および／または後に投与され得る。特定の実施形態において、本
発明の組成物は、移植の後、Ｔ細胞集団の回復の開始前に投与される。別の特定
の実施形態において、本発明の組成物は、移植の後、Ｔ細胞集団の回復の開始後
であるが、Ｂ細胞集団の完全な回復の前に最初に投与される。
【０４３９】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、Ｂ細胞機能の後天的
欠損を有する個体間で免疫応答性をブーストするための薬剤として使用される。
ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチドおよび／またはそれらのアゴニストもし
くはアンタゴニストを投与することによって寛解または処置され得る、Ｂ細胞機
能の後天的欠損を生じる状態としては、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、骨髄移植、およ
びＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）が挙げられるが、これらに限定されな
い。
【０４４０】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、一時的な免疫不全を
有する個体間で免疫応答性をブーストするための薬剤として使用される。ポリペ
プチド、抗体、ポリヌクレオチドおよび／またはそれらのアゴニストもしくはア
ンタゴニストを投与することによって寛解または処置され得る、一時的な免疫不
全を生じる状態としては、ウイルス感染（例えば、インフルエンザ）からの回復
、栄養失調に関連する状態、感染性単核細胞症からの回復、またはストレスに関
連する状態、麻疹からの回復、輸血からの回復、および手術からの回復が挙げら
れるが、これらに限定されない。
【０４４１】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、単球、樹状細胞およ
び／またはＢ細胞による抗原提示のレギュレーターとして使用される。１つの実
施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／ま
たはアゴニストもしくはアンタゴニストは、インビトロまたはインビボで抗原提
示を増強するかまたは抗原提示をアンタゴナイズする。さらに、関連する実施形
態において、この抗原提示の増強またはアンタゴナイズは、抗腫瘍処置としてか
または免疫系を調節するために有用であり得る。
【０４４２】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、個体の免疫系を、Ｔ
Ｈ１細胞性応答とは反対に、体液性応答（すなわち、ＴＨ２）の発生に指向する
ための薬剤として使用される。
【０４４３】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、腫瘍増殖を誘導し、
従って、腫瘍を抗腫瘍性薬剤に対してより感受性にするための手段として使用さ
れる。例えば、多発性骨髄腫は、緩慢な細胞分裂（ｄｉｖｉｄｉｎｇ）の疾患で
あり、従って、実質的に全ての抗腫瘍性レジメンに対して不応性である。これら
の細胞は、より迅速に増殖させた場合、これらの感受性プロフィールは、おそら
く変化するであろう。
【０４４４】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、ＡＩＤＳ、慢性リン
パ球障害および／または分類不能性免疫不全症（Ｃｏｍｍｏｎ Ｖａｒｉａｂｌ
ｅ Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｉｃｉｅｎｃｙ）のような病理におけるＢ細胞の産生の
刺激因子として使用される。
【０４４５】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、手術、外傷または遺
伝的欠陥後のリンパ組織の生成および／または再生のための治療として使用され
る。別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオ
チド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、移植前の骨髄サン
プルの前処理として使用される。
【０４４６】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、ＳＣＩＤ患者の間で
観察されるような免疫不全症／免疫欠損を生じる遺伝性の障害のための遺伝子ベ
ースの治療として使用される。
【０４４７】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、単球に影響を及ぼす
寄生生物疾患（例えば、リーシュマニア属（Ｌｅｓｈｍａｎｉａ））に対して防
御するために単球／マクロファージを活性化する手段として使用される。
【０４４８】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、本発明のポリペプチ
ドによって誘発される分泌サイトカインを調節する手段として使用される。
【０４４９】 上記の全ての適用は、獣医学に適用し得るものである。
【０４５０】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、外来因子または自己
に対する種々の局面の免疫応答をブロックする手段として使用される。免疫応答
の特定の局面の遮断が所望され得る疾患または状態の例としては、狼瘡および関
節炎のような自己免疫障害、ならびに皮膚アレルギー、炎症、腸疾患、損傷に対
する免疫応答性および病原体に関する疾患／障害が挙げられる。
【０４５１】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、自己免疫疾患（例え
ば、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデスおよびＭＳ）に関連す
るＢ細胞増殖およびＩｇ分泌を妨げるための治療として使用される。
【０４５２】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、内皮細胞におけるＢ
細胞および／またはＴ細胞の遊走のインヒビターとして使用される。この活性は
、組織構造または同属の応答を破壊し、そして例えば、免疫応答の破壊および敗
血症のブロックにおいて有用である。
【０４５３】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、未定量有意性の単一
クローン性高ガンマグロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｇａｍｍｏｐａｔｈ
ｙ ｏｆ ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）（ＭＧＵＳ
）、ヴァルデンストレーム疾患、関連する特発性単一クローン性高ガンマグロブ
リン血症、およびプラスマ細胞腫のような疾患における、慢性の高ガンマグロブ
リン血症事象のための治療として使用される。
【０４５４】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、例えば、特定の自己
免疫疾患および慢性炎症疾患および感染性疾患における、マクロファージおよび
その前駆体、ならびに好中球、好塩基球、Ｂリンパ球およびいくつかのＴ細胞サ
ブセット（例えば、活性化Ｔ細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞ならびにナチュ
ラルキラー細胞）の、ポリペプチド走化性および活性化を阻害するために使用さ
れる。自己免疫疾患の例は、本明細書中に記載され、その自己免疫疾患の例とし
ては、多発性硬化症およびインスリン依存性糖尿病が挙げられる。
【０４５５】 本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストはまた、例えば、好酸球の産生および遊走を妨げること
によって、特発性好酸球増多症候群を処置するために使用される。
【０４５６】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、相補的介在細胞溶解
を増大する、または阻害するために使用される。
【０４５７】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、抗体依存性細胞性細
胞毒性を増大する、または阻害するために使用される。
【０４５８】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、例えば、動脈壁
における単球浸潤を妨げることによって、アテローム性動脈硬化症を処置するた
めに使用され得る。
【０４５９】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、成人呼吸促進症候群
（ＡＲＤＳ）を処置するために使用され得る。
【０４６０】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、創傷および組織の修
復の刺激、新脈管形成の刺激、血管またはリンパの疾患または障害の修復の刺激
において有用であり得る。さらに、本発明のアゴニストおよびアンタゴニストは
、粘膜表面の再生を刺激するために使用され得る。
【０４６１】 特定の実施形態において、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／
またはそれらのアゴニストは、原発性または後天性の免疫不全、欠損性の血清免
疫グロブリン産生、再発性の感染および／または免疫系機能不全によって特徴付
けられる障害を処置または予防するために使用される。さらに、ポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチド、および／またはそれらのアゴニストは、関節、骨、皮
膚および／または耳下腺の感染、血液由来の感染（例えば、敗血症、髄膜炎、敗
血症性関節炎および／または骨髄炎）、自己免疫疾患（例えば、本明細書中に開
示されるような自己免疫疾患）、炎症性障害、および悪性疾患、ならびに／ある
いはこれらの感染、疾患、障害および／または悪性疾患に関連する任意の疾患ま
たは障害または状態（ＣＶＩＤ、他の原発性免疫不全、ＨＩＶ疾患、ＣＬＬ、再
発性気管支炎、静脈洞炎、中耳炎、結膜炎、肺炎、肝炎、髄膜炎、帯状ヘルペス
（例えば、重篤な帯状ヘルペス）および／またはニューモシスティスを含むが、
これらに限定されない）を処置または予防するために使用され得る。本発明のポ
リヌクレオチドまたはポリペプチド、および／またはアゴニストによって予防、
診断、または処置され得る他の疾患および傷害として、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−
ＢＬＶ感染、リンパ球減少、食細胞殺細菌機能不全、血小板減少、およびヘモグ
ロビン尿症が挙げられるが、それらに限定されない。
【０４６２】 別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、お
よび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、分類不能性免疫不全症（Ｃ
ｏｍｍｏｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｉｃｉｅｎｃｙ）（「ＣＶ
ＩＤ」；「後天性無ガンマグロブリン血症」および「後天性低ガンマグロブリン
血症」としても公知である）またはこの疾患のサブセットを有する個体を、処置
および／または診断するために使用される。
【０４６３】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、
および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、自己免疫細胞あるいは、
組織関連性の癌または新生物を含む癌または新生物の処置、診断および／または
予防に使用され得る。本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および
／またはアゴニストもしくはアンタゴニストによって、予防、診断または処置さ
れ得る癌または新生物の例が本明細書中に記載され、以下に挙げられる。急性骨
髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ
性貧血（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、プラスマ細胞腫、多発性骨髄腫、バー
キットリンパ腫、およびＥＢＶ変換性（ＥＢＶ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）疾患
。好ましい実施形態において、毒素または放射活性同位元素を結合させた本発明
のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはアゴニストもしくは
アンタゴニストは、本明細書中に記載されるように、癌および新生物の処置、診
断、および／または予防に使用され得る。さらに好ましい実施形態において、毒
素または放射活性同位元素を結合させた本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、抗体、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、本明細書中に
記載されるように、急性骨髄性白血病の処置、診断、および／または予防に使用
され得る。
【０４６４】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、ラージＢ細胞リンパ
腫の細胞増殖を減少するための治療として使用される。
【０４６５】 別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、慢性骨髄性白血病に
関連するＢ細胞およびＩｇの関与を減少する手段として使用される。
【０４６６】 特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞免疫不全個体（例えば、
部分的または完全な脾臓摘出術をうけた個体など）の間で免疫応答性をブースト
するための因子として使用される。
【０４６７】 例えば、本発明のアンタゴニストとしては、結合抗体および／または阻害抗体
、アンチセンス核酸、リボザイムあるいは可溶性形態の本発明のポリペプチド（
例えば、Ｆｃ融合タンパク質；例えば、実施例９を参照のこと）が挙げられる。
例えば、本発明のアゴニストとしては、結合抗体または刺激抗体、および可溶性
形態のポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合タンパク質；例えば、実施例９を参照の
こと）が挙げられる。本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、および
／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、本明細書中に記載されるように
、薬学的に受容可能なキャリアを備える組成物において使用され得る。
【０４６８】 別の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、お
よび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、機能的な内因性抗体分子を
産生できないか、さもなければ易感染性の内因性免疫系を有するが、別の動物由
来の再構成されたか、または部分的に再構成された免疫系の手段によってヒト免
疫グロブリン分子を産生し得る、動物（上記に列挙した動物を含むがこれに限定
されず、またトランスジェニック動物も含む）へ投与される（例えば、ＰＣＴ公
開番号、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５
、およびＷＯ９１／１０７４１を参照のこと）。このような動物への本発明のポ
リペプチド、抗体、ポリヌクレオチドおよび／またはアゴニスト、もしくはアン
タゴニストの投与は、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチドおよび／
またはアゴニスト、もしくはアンタゴニストに対するモノクローナル抗体の産生
に有用である。
【０４６９】 さらに、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはアンタゴニ
ストは、アポトーシスに影響し得、したがって細胞生存の増大またはアポトーシ
スの阻害に関する多くの疾患を処置する際に有用である。例えば、本発明のポリ
ヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはアンタゴニストを用いて処置または
検出され得る細胞生存の増大またはアポトーシスの阻害に関する疾患としては、
以下が挙げられる：癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌腫、およ
びホルモン依存性腫瘍（以下を含むが、これらに限定されない：結腸癌、心臓性
腫瘍（ｃａｒｄｉａｃ ｔｕｍｏｒｓ）、膵臓癌、黒色腫、網膜芽腫、神経膠芽
腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、
骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ
肉腫、および卵巣癌））；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン
症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄ
ｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス、ならびに
免疫性糸球体腎炎（ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐ
ｈｒｉｔｉｓ）および慢性関節リウマチ）ならびにウイルス感染（例えば、ヘル
ペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）炎症、対宿主性移植片
病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶。
【０４７０】 好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび
／またはアンタゴニストを用いて、癌（特に上に列挙したもの）の増殖、進行、
および／または転移を阻害するのに使用され得る。
【０４７１】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはアンタゴニストに
よって、処置または検出され得る、細胞の生存を増大させることに関するさらな
る疾患または状態としては、以下の進行および／または転移が挙げられるが、こ
れらに限定されない：悪性腫瘍および関連する障害（例えば、白血病（急性白血
病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨
髄性白血病（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）、骨髄単球性白血病、単球性白血病
および赤白血病を含む））、ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（
顆粒球性白血病）および慢性リンパ性白血病）を含む）、真性赤血球増加、リン
パ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンス
トレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、および固形腫瘍（これらは、以下が挙
げられるが、これらに限定されない：肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液
肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮性肉腫（ｅｎ
ｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、
中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓、乳癌、卵巣癌
、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌
、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管
癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫、頚部癌、精巣癌、肺癌、小
細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室
上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫（ｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、聴
神経鞘腫（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｎｅｕｒｏｍａ）、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍ
ｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽腫、ならびに網膜芽腫））。
【０４７２】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはアンタゴニストによ
って、処置または検出され得る、アポトーシスを増大させることに関する疾患は
、以下を含む：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキン
ソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、および脳腫瘍または原
発性関連疾患（ｐｒｉｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ））；自己
免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性
肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、
多発性筋炎、全身性エリテマトーデス、および免疫関連糸球体腎炎（ｉｍｍｕｎ
ｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）および慢性関節
リウマチ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片
病、虚血性障害（例えば、心筋梗塞、発作、および再灌流障害に起因するもの）
、肝障害（例えば、肝炎に関連する肝障害、虚血／再灌流障害、胆汁うっ滞（ｃ
ｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管障害）、および肝癌）；毒素誘導性肝疾患（例え
ば、アルコールに起因するもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振
。
【０４７３】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはアンタゴニストに
よって、検出および／または処置され得る、過剰増殖性の疾患および／または障
害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：肝、腹部、骨、胸、
消化器系、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺
、甲状腺）、眼、頭、および首、神経系（中枢神経および末梢神経）、リンパ系
、骨盤、皮膚、柔組織、脾臓、胸郭および泌尿性器路に位置する新生物。
【０４７４】 同様に、他の過剰増殖障害もまた、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド
、および／またはアンタゴニストによって、処置または検出され得る。このよう
な過剰増殖障害の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：高
ガンマグロブリン血症、リンパ球増殖障害、パラプロテイン血症、紫斑病、サル
コイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、
ゴシェ病、組織球増殖症、および新形成に加えて、上に列挙した器官系に位置す
る他の任意の過剰増殖障害。
【０４７５】 （過剰増殖性障害） 本発明のポリヌクレオチド、もしくはポリペプチド、またはアゴニストもしく
はアンタゴニストは、過剰増殖性障害（新生物を含む）を処置または検出するた
めに使用され得る。本発明のポリヌクレオチド、もしくはポリペプチド、または
アゴニストもしくはアンタゴニストは、直接的相互作用または間接的相互作用を
通して、障害の増殖を阻害し得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチド、もし
くはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、過剰増殖性障
害を阻害し得る他の細胞を増殖し得る。
【０４７６】 例えば、免疫応答を増加させることによって、特に、過剰増殖性障害の抗原性
の質を増加させることかまたはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員することによ
って、過剰増殖性障害は処置され得る。この免疫応答は、既存の免疫応答を増強
することか、または新たな免疫応答を開始することのいずれかによって増加され
得る。あるいは、免疫応答を減少させることはまた、過剰増殖性障害を処置する
方法であり得る（例えば、化学療法剤）。
【０４７７】 本発明のポリヌクレオチド、もしくはポリペプチド、またはアゴニストもしく
はアンタゴニストによって処置または検出され得る過剰増殖性障害の例としては
、以下が挙げられるが、これらに限定されない：結腸、腹部、骨、乳房、消化器
系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（腎上体、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸
腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、
軟組織、脾臓、胸郭、および泌尿性器管に位置づけられる新生物。
【０４７８】 同様に、他の過剰増殖障害もまた、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペ
プチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストによって、処置または検出さ
れ得る。このような過剰増殖障害の例としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：高ガンマグロブリン血症、リンパ球増殖障害、パラプロテイン血
症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクロ
グロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および新形成に加えて、上に列挙し
た器官系に位置する他の任意の過剰増殖障害。
【０４７９】 別の好ましい実施形態は、本発明および／またはそのタンパク質融合物または
そのフラグメントを使用する遺伝子治療によって、異常な細胞分裂を阻害するた
めに本発明のポリヌクレオチドを利用する。
【０４８０】 従って、本発明は、異常に増殖する細胞中に、本発明のポリヌクレオチドを挿
入することによって細胞増殖性障害を処置するための方法を提供し、ここでこの
ポリヌクレオチドは、その発現を抑制する。
【０４８１】 本発明の別の実施形態は、個体において細胞増殖性障害を処置する方法を提供
し、この方法は、異常な増殖する細胞（単数または複数）に本発明の１つ以上の
活性遺伝子コピーを投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、本発
明のポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を発現
する際に有効な、組換え発現ベクターを含むＤＮＡ構築物である。本発明の別の
好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ構築
物は、レトロウイルス（またはより好ましくは、アデノウイルスベクター）を利
用して処置されるべき細胞中に、挿入される（Ｇ．Ｊ．Ｎａｂｅｌら、ＰＮＡＳ
１９９９ ９６：３２４〜３２６（本明細書により参考として援用される）を
参照のこと）。最も好ましい実施形態においては、ウイルスベクターは不完全で
あり、非増殖性細胞ではなく増殖性細胞のみを形質転換する。さらに、好ましい
実施形態においては、単独、または他のポリヌクレオチドと組み合わされたかも
しくは融合されたかのいずれかで増殖性細胞に挿入される本発明のポリヌクレオ
チドは、次いで外部刺激（すなわち、磁気、特異的小分子、化学的、または薬物
投与など）を介して調節され得、これはこのポリヌクレオチドの上流のプロモー
ターに作用し、コードされたタンパク質産物の発現を誘導する。このように、本
発明の有益な治療効果は、この外部刺激に基づいて明確に調節され得る（すなわ
ち、本発明の発現を増加、減少、または阻害する）。
【０４８２】 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、脈管形成タンパク質
をコードする他のポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る。脈管形成タン
パク質の例としては、酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、
ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−３、上皮増殖因子αおよび表皮増殖因子β、血小板由
来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子α、肝細胞増殖因子、
インスリン様増殖因子、コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ならびに一酸化窒素シンターゼが挙げ
られるがこれらに限定されない。
【０４８３】 本発明のポリヌクレオチドは、発癌性遺伝子または抗原の発現を抑制する際に
有用であり得る。「発癌性遺伝子の発現を抑制する」により、遺伝子の転写の抑
制、遺伝子転写物（前メッセンジャー（ｐｒｅ−ｍａｓｓａｇｅ）ＲＮＡ）の分
解、スプライシングの阻害、メッセンジャーＲＮＡの破壊、タンパク質の翻訳後
修飾の妨げ、タンパク質の破壊、またはタンパク質の正常機能の阻害を意図する
。
【０４８４】 異常に増殖する細胞に対する局所的な投与に関しては、本発明のポリヌクレオ
チドは、当業者に公知の任意の方法により投与され得、この方法としては、トラ
ンスフェクション、エレクトロポレーション、細胞のマイクロインジェクション
、または、例えば、リポソームのようなビヒクルにおいて、リポフェクチン、ま
たは裸のポリヌクレオチド、または本明細書中全体を通して記載される任意の他
の方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドは、
公知の遺伝子送達系（例えば、当業者に公知のレトロウイルスベクター（Ｇｉｌ
ｂｏａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：８４５（１９８２）；Ｈｏｃｋｅ，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２０：２７５（１９８６）；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：３０１４）；ワクシニアウイルス系（Ｃｈ
ａｋｒａｂａｒｔｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：３４０３（１９８５
））または他の効率的なＤＮＡ送達系（Ｙａｔｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：
８１２（１９８５））に限定されない）により送達され得る。これらの参考文献
は、例示にすぎず、そして本明細書中に参考として援用される。異常に増殖して
いる細胞に特異的に送達するか、またはそれをトランスフェクトし、そして非分
裂細胞を残す（ｓｐａｒｅ）ために、当業者に公知のレトロウイルスまたはアデ
ノウイルス（当該分野および本明細書中の他の箇所で記載されるような）送達系
を利用することが好ましい。宿主ＤＮＡ複製は組み込むためにレトロウイルスＤ
ＮＡが必要であるので、このレトロウイルスは、その生活環についての必要とさ
れるレトロウイルス遺伝子の欠如に起因して自己複製できない。本発明のポリヌ
クレオチドのために、このようなレトロウイルス送達系を利用して、上記の遺伝
子および構築物を、異常に増殖している細胞に標的化し、そして非分裂性の正常
細胞を残す。
【０４８５】 本発明のポリヌクレオチドは、疾患部位に直接注射針を導くために使用される
画像化デバイスの使用によって、内部器官、体腔などにおける細胞増殖性障害／
疾患部位に直接送達され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、手術介入時に
疾患部位に投与され得る。
【０４８６】 「細胞増殖性疾患」により、任意のヒトもしくは動物の疾患または障害が、器
官、腔、または身体部分のいずれか１つもしくはいずれかの組み合わせを冒して
いることを意味される。この疾患は、良性または悪性に拘わらず、細胞、細胞群
、もしくは組織の単一または複数の局所的な異常な増殖により特徴づけられる。
【０４８７】 本発明のポリヌクレオチドの任意の量は、この量が、処置細胞の増殖に対して
生物学的に阻害性の効果を有する限り、投与され得る。さらに、本発明の１つよ
り多くのポリヌクレオチドを、同時に同じ部位に投与することが可能である。「
生物学的に阻害性の」により、部分的または全体的な成長阻害ならびに細胞の増
殖または成長の速度における減少を意味する。生物学的に阻害性の用量は、標的
の悪性または組織培養において異常に増殖している細胞の成長、動物および細胞
培養物における腫瘍成長に対する本発明のポリヌクレオチドの効果を評価するこ
と、あるいは当業者に公知の任意の他の方法により決定され得る。
【０４８８】 本発明はさらに、抗体に基づく治療に関し、この方法は、障害の１つ以上を処
置するために、哺乳動物（好ましくはヒト）の患者に抗ポリペプチド抗体および
抗ポリヌクレオチド抗体を投与する工程を包含する。抗ポリペプチド抗体および
抗ポリヌクレオチド抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体）を生
成するための方法は、本明細書中の他の箇所に詳細に記載される。このような抗
体は、当該分野で公知のように、または本明細書中に記載されるように薬学的に
受容可能な組成物中に提供され得る。
【０４８９】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の概要は、本発明のポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドを、身体において局所的もしくは全身的に、または抗体の
直接的な細胞傷害性（例えば、補体による媒介（ＣＤＣ）もしくはエフェクター
細胞による媒介（ＡＤＣＣ））により結合させる工程を包含する。これらのアプ
ローチのいくつかは、以下により詳細に記載される。本明細書中に提供される教
示があれば、当業者は、本発明の抗体を、過度の実験なくして、診断、モニタリ
ングまたは治療の目的のために使用する方法を知る。
【０４９０】 詳細には、本発明の抗体、フラグメントおよび誘導体は、本明細書中に記載さ
れるように、細胞増殖および／または分化の障害を有するか、または発症してい
る被験体を処置するために有用である。このような処置は、単一用量または複数
用量の抗体、あるいはそのフラグメント、誘導体、または結合体を投与する工程
を包含する。
【０４９１】 本発明の抗体は、他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体と組み合わせて
、またはリンホカインもしくは造血増殖因子（例えば、これは、抗体と相互作用
するエフェクター細胞の数または活性が増加するように作用する）と組み合わせ
て、有利に利用され得る。
【０４９２】 本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、そのフラグメントもしくは
領域に対して、高親和性および／または強力なインビボ阻害抗体および／または
中和抗体を使用することは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（
そのフラグメントを含む）に関する障害に関するイムノアッセイおよびその治療
の両方のために好ましい。このような抗体、フラグメント、または領域は、好ま
しくは、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に
対する親和性を有する。好ましい結合親和性は、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、
５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、
１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１ Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×
１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、および１０−１５Ｍ未満の解
離定数すなわちＫｄを有する親和性を含む。
【０４９３】 さらに、本発明のポリペプチドは、本明細書中の他の箇所に記載されるように
、単独で、融合タンパク質として、または直接的にもしくは間接的に他のポリペ
プチドとの組み合わせでかのいずれかで、増殖性細胞もしくは組織の脈管形成を
阻害する際に有用である。最も好ましい実施形態において、上記の抗脈管形成効
果は、例えば、造血性の腫瘍特異的細胞（例えば、腫瘍関連マクロファージ）の
阻害を通じて、間接的に達成され得る（本明細書中に参考として援用される、Ｊ
ｏｓｅｐｈ ＩＢら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，９０（２１）：
１６４８−５３（１９９８）を参照のこと）。本発明のポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドに対する抗体はまた、脈管形成の直接的または間接的な阻害を生じ
得る（本明細書中に参考として援用される、Ｗｉｔｔｅ Ｌ．ら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１７（２）：１５５−６１（１９９８）を参
照のこと）。
【０４９４】 本発明のポリペプチド（タンパク質融合物を含む）、またはそのフラグメント
は、アポトーシスの誘導を通じて増殖性細胞または組織を阻害する際に有用であ
り得る。上記のポリペプチドは、直接的または間接的のいずれかで、増殖性の細
胞および組織のアポトーシスを誘導するように、例えば、死ドメインレセプター
（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター１、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−
１）、ＴＮＦレセプター関連アポトーシス媒介タンパク質（ＴＲＡＭＰ）ならび
にＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）レセプター１および２（
本明細書中に参考として援用されるＳｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ Ｋ，ら、
Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５４（３）：４３９−５９（１９９８）を参照
のこと））の活性化において作用し得る。さらに、本発明の別の好ましい実施形
態において、上記のポリペプチドは、他の機構を通じて（例えば、アポトーシス
を活性化する他のタンパク質の活性化において）あるいは上記タンパク質の発現
を単独でまたは低分子薬物もしくはアジュバント（例えば、アポプトニン、ガレ
クチン、チオレドキシン、抗炎症性タンパク質）と組み合わせてかのいずれかで
刺激することを通じて、アポトーシスを誘導し得る（例えば、本明細書中に参考
として援用される、Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ４００（１−２）：４４７−５５（１
９９８），Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．５０（５）：４２３−３３（１９９
８），Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．Ａｐｒ ２４；１１１−１１２
；２３−３４（１９９８））、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．７６（６）：４０２−１２
（１９９８），Ｉｎｔ Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔ；２０（１）：３−１５
（１９９８）を参照のこと）。
【０４９５】 本発明のポリペプチド（それに対するタンパク質融合物を含む）、またはその
フラグメントは、増殖性細胞または組織の転移を阻害する際に有用である。阻害
は、本明細書中他の箇所に記載されるように、ポリペプチドまたは上記ポリペプ
チドに対する抗体を投与する工程の直接的結果として、または間接的に（例えば
、転移を阻害することが公知のタンパク質（例えば、α４インテグリン）の発現
を活性化する）生じ得る（例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｃｕｒ
ｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；２３１：１２５
−４１を参照のこと）。本発明のこのような治療的影響は、単独で、または低分
子薬物もしくはアジュバントと組み合わせてかのいずれかで達成され得る。
【０４９６】 別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、ポリペプ
チドまたは異種ポリペプチドに関連するポリペプチド抗体、異種核酸、毒素、ま
たはプロドラッグを含む組成物）を含む組成物を、本発明のポリペプチドを発現
する、標的とされた細胞に送達する方法を提供する。本発明のポリペプチドまた
はポリペプチド抗体は、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッ
グと、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合的な相互作用を通じて
結合され得る。
【０４９７】 本発明のポリペプチド、それに対するタンパク質融合物、またはそのフラグメ
ントは、増殖性抗原および免疫原に対して、直接的（例えば、本発明のポリペプ
チドが「ワクチン接種」された場合、上記の抗原および免疫原に対して応答する
ように免疫応答を生じる）または間接的（例えば、免疫応答を増強することが公
知のタンパク質（例えば、ケモカイン）の発現を活性化することにおいて）のい
ずれかで、増殖している細胞または組織の免疫原性および／または抗原性を増強
する際に有用である。
【０４９８】 （心臓血管障害） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストを使用して、四肢虚血のような末梢動脈疾患を含む、心臓血管障
害を処置し得る。
【０４９９】 心臓血管障害としては、動動脈瘻（ａｒｔｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ ｆｉ
ｓｔｕｌａ）、動静脈瘻、大脳動静脈先天異常、先天性心欠陥（ｃｏｎｇｅｎｉ
ｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｅｆｅｃｔｓ）、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候
群のような心臓血管異常が挙げられる。先天性心欠陥としては、大動脈縮窄、三
房心、冠状脈管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｖｅｓｓｅｌ ａｎｏｍａｌｉｅｓ）
、交差心、右胸心、開存性動脈管（ｐａｔｅｎｔ ｄｕｃｔｕｓ ａｒｔｅｒｉ
ｏｓｕｓ）、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合体、左心室発育不全症候
群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖
症、動脈管遺残、および心中隔欠損症（ｈｅａｒｔ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃ
ｔｓ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損症（ａｏｒｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓ
ｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔ）、心内膜床欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファ
ロー三徴症、心室心中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｈｅａｒｔ ｓｅｐ
ｔａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ））が挙げられる。
【０５００】 心臓血管障害としてはまた、不整脈、カルチノイド心臓病、高心拍出量（ｈｉ
ｇｈ ｃａｒｄｉａｃ ｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出量（ｌｏｗ ｃａｒｄｉａｃ
ｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、
心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心臓水腫、心肥大
、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆ
ａｒｃｔｉｏｎ ｈｅａｒｔ ｒｕｐｔｕｒｅ）、心室中隔破裂、心臓弁疾患、
心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗塞性および結核性を含む）、
気心膜症、心膜切開後症候群、右心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充
血、心臓血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ
ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管
結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような心
臓病が挙げられる。
【０５０１】 不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダ
ムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、長ＱＴ症候群（ｌｏｎｇ
ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群
、マヘーム型早期興奮症候群（Ｍａｈａｉｍ−ｔｙｐｅ ｐｒｅ−ｅｘｃｉｔａ
ｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不
全症候群、頻拍、および心室性細動が挙げられる。頻拍としては、発作性頻拍、
上室性頻拍、心室固有調律促進、房室結節性再入頻拍（ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉ
ｃｕｌａｒ ｎｏｄａｌ ｒｅｅｎｔｒｙ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、異所心
房性頻拍、異所接合部頻拍、洞房結節性再入頻拍（ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ ｎｏ
ｄａｌ ｒｅｅｎｔｒｙ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、洞性頻拍、トルサード・
ド・ポワント、および心室性頻拍が挙げられる。
【０５０２】 心臓弁疾患としては、大動脈弁機能不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音（ｈｅａ
ｒ ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁
機能不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁機能不全、肺動脈弁狭窄症
、三尖閉鎖症、三尖弁機能不全、および三尖弁狭窄症が挙げられる。
【０５０３】 心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、弁
下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャーガス心筋症
、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、お
よび心筋炎が挙げられる。
【０５０４】 心筋性虚血としては、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈
血管痙攣、心筋梗塞、および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｓｔｕｎｎｉｎ
ｇ）のような冠動脈疾患が挙げられる。
【０５０５】 心臓血管疾患としてはまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫
症状、ヒッペル−リンダラ疾患（Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ Ｄｉｓｅａｓｅ
）、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、
血管運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、
動脈閉塞疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性
動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、先
端紅痛症、痔、肝静脈閉塞病、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、
肺静脈閉塞病、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞、シミター症候群
、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張性運動失調（ａｔａｃｉａ
ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡
張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈機能不全のような血管疾患が挙
げられる。
【０５０６】 動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染した動脈瘤、破裂した動脈瘤
、大動脈性動脈瘤、大脳性動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨性動脈瘤が
挙げられる。
【０５０７】 動脈閉塞疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形
成異常、腸間膜性血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉
塞性血栓性血管炎が挙げられる。
【０５０８】 脳血管障害としては、頸動脈疾患、脳アミロイド脈管障害、大脳動脈瘤、大脳
無酸素症、大脳動脈硬化、大脳動静脈先天異常、大脳動脈疾患、大脳の塞栓症お
よび血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、大脳出血、硬膜
上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎｏｉｄ ｈｅｍｏｒｒ
ｈａｇｅ）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症候群、室
周白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、
血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨基部（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉ
ｌａｒ）機能不全が挙げられる。
【０５０９】 塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チア
ノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられる。血
栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、
洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられる。
【０５１０】 虚血としては、大脳虚血、虚血性大腸炎、仕切り症候群（ｃｏｍｐａｒｔｍｅ
ｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、前仕切り症候群（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｏｍｐａｒ
ｔｍｅｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋虚血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血
が挙げられる。脈管炎としては、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅ
ｔ）症候群、チャーグ−ストラウス症候群、粘膜皮膚リンパ節症候群、閉塞性血
栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライン−ヘーノホ紫斑病（Ｓｃｈｏｅｎｌ
ｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ ｐｕｒｐｕｒａ）、アレルギー性皮膚血管炎およびヴェ
ーゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０５１１】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストは、危険な四肢虚血および冠状動脈疾患の処置に対して特に有効
である。
【０５１２】 ポリペプチドは、当該分野で公知である任意の方法を使用して投与され得、こ
れらの方法としては、送達部位における直接的針注射、静脈内注射、局所投与、
カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子加速器、ゲルフォ
ームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経口または坐剤の固
形薬学的処方物、手術中のデカンティングまたは局所適用、エアロゾル送達が挙
げられるが、これらに限定されない。そのような方法は当該分野で公知である。
ポリペプチドは、下記でより詳細に記載される、治療剤（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉ
ｃ）の一部として投与され得る。ポリヌクレオチドを送達する方法は本明細書中
でより詳細に記載される。
【０５１３】 （抗新脈管形成活性） 新脈管形成の内因性の、刺激因子とインヒビターとの間の天然に存在する平衡
は、阻害影響を支配する平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ ５６
：３４５〜３５５（１９８９）。新生血管形成が通常の生理学的条件下において
生じるまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プロ
セス）において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的に
定められる。病理学的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける
）下において、これらの調節の制御はできない。調節されていない新脈管形成は
病的になり、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する
。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼
の障害および乾癬を含む、異常な新生血管形成により支配される。例えば、Ｍｏ
ｓｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋｍａｎ
ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜１７６３（１９９５）；
Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜４１１
（１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、Ａｍ
．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；およびＦｏｌ
ｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７１９〜７２５（１９８３）による概説
を参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状
態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する
有意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。
【０５１４】 本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに
本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの投与による新生血管形成に関連する
疾患あるいは障害の処置を提供する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置し得る悪性状態お
よび転移性状態には、本明細書に記載の悪性腫瘍、固形腫瘍、および癌、ならび
に当該分野で公知の他のもの（このような障害の総説については、Ｆｉｓｈｍａ
ｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐ
ｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）が挙げられるが、これらに
限定されない。従って、本発明は、治療有効量の、本発明のポリヌクレオチド、
ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを、それが必要な個体
に投与する工程を包含する、新脈管形成関連疾患および／または障害の処置の方
法を提供する。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよ
び／またはアゴニストは、癌または腫瘍を治療的に処置するために、種々のさら
なる方法で利用され得る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストお
よび／またはアゴニストで処置され得る癌としては、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵
巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結
腸癌、直腸癌、頸部癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌を含む
固形腫瘍；原発性腫瘍および転移；黒色腫；グリア芽細胞腫；カポージ肉腫；平
滑筋肉腫；非小細胞肺癌；結腸直腸癌；進行性（ａｄｖａｎｃｅｄ）悪性疾患；
および血液から生じる腫瘍（例えば、白血病）が挙げられるが、これらに限定さ
れない。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／ま
たはアゴニストは、皮膚癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍およびカポージ肉腫のような
癌を処置するために、局所送達され得る。
【０５１５】 なお他の局面において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストお
よび／またはアゴニストは、例えば膀胱内投与によって膀胱癌の表面形態を処置
するために利用され得る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストお
よび／またはアゴニストは、注射もしくはカテーテルを介して、腫瘍に直接的に
、または腫瘍部位付近に送達され得る。当然のことながら、当業者が理解するよ
うに、適切な投与様式は、処置されるべき癌によって変化する。他の送達様式は
本明細書中において議論される。
【０５１６】 ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニスト
は、癌に加えて、他の障害（新脈管形成を含む）を処置する際に有用であり得る
。これらの障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：良性腫
瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫
）；動脈硬化斑；眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄
斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス、網
膜芽細胞腫、ブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ）および眼の翼状片（Ｐｔｅｒｙｇｉ
ａ）（異常な血管増殖））；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延型創傷治癒；子宮内
膜症；脈管形成；顆粒化；過形成性瘢痕（ケロイド）；偽関節骨折；強皮症；ト
ラコーマ；血管接着；心筋の新脈管形成；冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏ
ｌｌａｔｅｒａｌｓ）；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性四肢新脈管形成；オー
スラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群；プラーク新生血管形
成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；線維筋性形成異常；創傷顆粒
化；クローン病；およびアテローム性動脈硬化症。
【０５１７】 例えば、本発明の１つの局面において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプ
チド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを過形成性瘢痕またはケロイド
に投与する工程を包含する、過形成性瘢痕およびケロイドを処置するための方法
が提供される。
【０５１８】 本発明の１つの実施形態において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタ
ゴニストおよび／またはアゴニストは、過形成性瘢痕またはケロイドに、これら
の病変の進行を妨げるために直接注射される。この治療は、過形成性瘢痕および
ケロイド（例えば、やけど）の発生を生じることが知られている状態の予防処置
において特に価値があり、そして好ましくは、増殖期が進行する時間（最初の傷
害の約１４日後）を経た後であるが、過形成性瘢痕またはケロイドの発生の前に
開始される。上述のように、本発明はまた、眼の新生血管形成疾患（例えば、角
膜新生血管形成、血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖およ
び黄斑変性を含む）を処置するための方法を提供する。
【０５１９】 さらに、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（アゴニストおよび／
またはアンタゴニストを含む）を用いて処置され得る新生血管形成に関連する眼
の障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血管新生緑内障
、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟児網膜
症、黄斑変性、角膜移植新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍
、および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾患。例えば、Ｗａｌｔｍ
ａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４〜７１０（１９７８）および
Ｇａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１〜３１２（１９７
８）による総説を参照のこと。
【０５２０】 従って、本発明の１つの局面において、治療有効量の化合物（上記）を患者に
対して、血管の形成が阻害されるように角膜に投与する工程を包含する、角膜新
生血管形成（角膜移植新生血管形成を含む）のような眼の新生血管形成疾患を処
置するための方法が提供される。簡潔には、角膜は、通常には血管を欠く組織で
ある。しかし、特定の病的状態において、毛細血管は、縁の角膜周囲脈管叢から
角膜に伸長し得る。角膜が血管化される場合、角膜はまた混濁され、患者の視力
の衰えを生じる。角膜が完全に不透明になる（ｏｐａｃｉｔａｔｅ）場合に、完
全に視力喪失になり得る。広範な種々の障害は、例えば、以下を含む角膜新生血
管形成を生じ得る：角膜感染（例えば、トラコーマ、単純ヘルペス角膜炎、リー
シュマニア症およびオンコセルカ症）、免疫学的プロセス（例えば、移植片拒絶
およびスティーヴンズ−ジョンソン症候群）、アルカリやけど、外傷、炎症（任
意の原因による）、毒性および栄養欠乏状態、ならびにコンタクトレンズを装着
することの合併症として。
【０５２１】 本発明の特に好ましい実施形態において、生理食塩水（眼科用調製物において
一般に使用される任意の保存剤および抗菌剤と組合せて）中で局所投与のために
調製され得、そして点眼剤形態で投与され得る。溶液または懸濁液は、純粋な形
態で調製され、そして１日に数回投与され得る。あるいは、上記のように調製さ
れる抗脈管形成組成物はまた、角膜に直接投与され得る。好ましい実施形態にお
いて、抗脈管形成組成物は、角膜に結合する粘膜接着性ポリマーとともに調製さ
れる。さらなる実施形態において、抗脈管形成因子または抗脈管形成組成物は、
従来のステロイド治療に対する補助剤として利用され得る。局所治療はまた、脈
管形成応答（例えば、化学的やけど）を誘導する高い可能性を有することが公知
の角膜病変において予防的に有用であり得る。これらの場合において、処置（お
そらくステロイドと組み合わされる）は、その後の合併症を予防するのを補助す
るために直ちに開始され得る。
【０５２２】 他の実施形態において、上記の化合物は、角膜支質に直接、顕微鏡下での誘導
のもとで眼科医によって注入され得る。好ましい注射部位は、個々の病巣の形態
で変化し得るが、投与の目標は、脈管構造の前進している面に組成物を置くこと
（すなわち、血管と正常な角膜との間に分散される）である。ほとんどの場合に
おいて、これは、前進している血管から角膜を「防御」するための縁周囲（ｐｅ
ｒｉｌｉｍｂｉｃ）角膜注射を含む。この方法はまた、角膜新生血管形成を予防
的に防ぐために、角膜傷害の直後に利用され得る。この状況において、この物質
は、角膜病巣とその所望されない潜在的な血液供給の縁との間に分散して縁周囲
角膜に注射され得る。このような方法はまた、類似の様式で、移植された角膜の
毛細血管侵入を予防するために利用され得る。徐放形態において、注入は、１年
に２〜３回のみ必要とされ得る。ステロイドもまた、注入溶液に添加され、その
注射自体から生じる炎症を低減し得る。
【０５２３】 本発明の別の局面において、患者に、血管の形成を阻害するように、治療有効
量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニス
トを眼に投与する工程を包含する、血管新生緑内障を処置するための方法が提供
される。１つの実施形態において、化合物は、血管新生緑内障の早期形態を処置
するために、眼に局所投与され得る。他の実施形態において、化合物は、前眼房
角（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｈａｍｂｅｒ ａｎｇｌｅ）の領域への注入によって
移植され得る。他の実施形態において、化合物はまた、化合物が眼房水に連続的
に放出されるように、任意の位置に配置され得る。本発明の別の局面において、
患者に、血管の形成が阻害されるように、治療有効量のポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを眼に投与する工程を包含
する、増殖性糖尿病性網膜症を処置するための方法が提供される。
【０５２４】 本発明の特に好ましい実施形態において、増殖性糖尿病性網膜症は、網膜にお
けるポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニス
トの局所濃度を増加させるために、眼房水または硝子体への注入によって処置さ
れ得る。好ましくは、この処置は、光凝固を必要とする重篤な疾患の獲得の前に
開始されるべきである。
【０５２５】 本発明の別の局面において、患者に、血管の形成が阻害されるように、治療有
効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニ
ストを眼に投与する工程を包含する、水晶体後線維増殖症を処置するための方法
が、提供される。化合物は、硝子体内注射を介して、および／または眼内移植を
介して局所投与され得る。
【０５２６】 さらに、このポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはア
ゴニストで処置され得る障害としては、以下が挙げられるが、それらに限定され
ない：血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム性動脈硬化症斑、遅延型
創傷治癒、顆粒化、血友病性関節、過形成性瘢痕、偽関節骨折、オースラー−ウ
ェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコー
マ、および血管接着。
【０５２７】 さらに、このポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはア
ゴニストで処置され得る障害および／または状態としては、以下が挙げられるが
、それらに限定されない：固形腫瘍、血液由来の（ｂｌｏｏｄ ｂｏｒｎ）腫瘍
（例えば、白血病）、腫瘍転移、カポージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴
神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、
乾癬、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、
角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細
胞腫、およびブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ））、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、
脈管形成、顆粒化、過形成性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラコー
マ、血管接着、心筋の新脈管形成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａ
ｔｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新脈管形成、オースラー
−ウェーバー症候群、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、
血管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆粒化、クローン病、アテローム性動脈硬
化症、産児制限薬剤（月経を制御する、胎芽着床のために必要な血管新生を予防
することによる）、病原性の結果（例えば、引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍｉ
ｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏ
ｒｉ）、バルトネラ症および細菌性血管腫症状）のような新脈管形成を有する疾
患。
【０５２８】 出産制限方法の１つの局面において、胎芽着床をブロックするに十分な化合物
の量は、性交および受精が起こる前またはその後に投与され、このようにして出
産制限の有効な方法、おそらく「事後用（ｍｏｒｎｉｎｇ ａｆｔｅｒ）」方法
を提供する。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴ
ニストはまた、月経を制御することにおいて使用され得るか、または子宮内膜症
の処置における腹膜洗浄液として、もしくは腹膜移植のためのいずれかで投与さ
れ得る。
【０５２９】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニ
ストは、縫合（ｓｔｉｔｃｈ）肉芽腫を予防するために、外科縫合に組み込まれ
得る。
【０５３０】 ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストは、
広範な種々の外科手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの局面にお
いて、組成物（例えば、スプレーまたはフィルムの形態において）は、悪性組織
から正常な周囲の組織を分離するため、そして／または周囲の組織への疾患の広
がりを予防するために、腫瘍の除去の前に、領域をコートまたはスプレーするた
めに利用され得る。本発明の他の局面において、組成物（例えば、スプレーの形
態において）は、腫瘍をコートするため、または所望の場所において新脈管形成
を阻害するために、内視鏡手順を介して送達され得る。本発明のなお他の局面に
おいて、本発明の抗脈管形成組成物でコートされている外科メッシュが、外科メ
ッシュが利用され得る任意の手順において利用され得る。例えば、本発明の１つ
の実施形態において、抗脈管形成組成物を有した外科メッシュレーデン（ｌａｄ
ｅｎ）は、構造に対する支持を提供するため、そして一定の量の抗脈管形成因子
を放出するために、腹部癌切除手術の間（例えば、結腸切除の後）に利用され得
る。
【０５３１】 本発明のさらなる局面において、腫瘍切除部位を処置するための方法が提供さ
れる。この方法は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニスト、および
／またはアゴニストを、切除後に腫瘍の切除縁に投与して、その部位での、癌の
局所的再発および新血管形成を阻害するようにする工程を包含する。本発明の１
つの実施形態において、この抗脈管形成化合物は、腫瘍切除部位に直接投与され
る（例えば、この抗脈管形成化合物を用いて、腫瘍の切除縁に綿棒で塗るか、ブ
ラシで塗るか、または他の方法でコーティングすることによって塗布される）。
あるいは、この抗脈管形成化合物は、投与の前に、公知の手術用ペーストに組み
込まれ得る。本発明の特に好ましい実施形態において、この抗脈管形成化合物は
、悪性疾患の肝切除の後、および神経外科的手術の後に塗布される。
【０５３２】 本発明の１つの局面において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ア
ゴニストおよび／またはアンタゴニストは、広範な種類の腫瘍（例えば、胸部腫
瘍、結腸腫瘍、脳腫瘍、および肝腫瘍を含む）の切除縁に投与され得る。例えば
、本発明１つの実施形態において、抗脈管形成化合物が、神経学的腫瘍の部位に
、切除の後に投与され得、その結果、その部位での新規な血管の形成が阻害され
る。
【０５３３】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアンタ
ゴニストはまた、他の抗脈管形成因子とともに投与され得る。他の抗脈管形成因
子の代表例としては、以下が挙げられる：抗侵襲性（ｉｎｖａｓｉｖｅ）因子、
レチン酸およびその誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ
−１の組織インヒビター、メタロプロテイナーゼ２の組織インヒビター、プラス
ミノゲン活性化因子インヒビター１、プラスミノゲン活性化因子インヒビター２
、および種々の形態の軽い方の（ｌｉｇｈｔｅｒ）「ｄ群」遷移金属。
【０５３４】 軽い方の「ｄ群」遷移金属としては、例えば、バナジウム、モリブデン、タン
グステン、チタン、ニオブ、およびタンタル種が、挙げられる。このような遷移
金属種は、遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の適切な錯体は、オキ
ソ遷移金属錯体を含む。
【０５３５】 バナジウム錯体の代表的例は、オキソバナジウム錯体（例えば、バナジン酸塩
錯体およびバナジル錯体）を含む。適切なバナジン酸塩錯体は、メタバナジン酸
塩錯体およびオルトバナジウム酸塩錯体（例えば、メタバナジン酸アンモニウム
、メタバナジン酸ナトリウム、およびオルトバナジン酸ナトリウム）を含む。適
切なバナジル錯体は、例えば、バナジルアセチルアセトネートおよび硫酸バナジ
ル（硫酸バナジル水和物（例えば、硫酸バナジル一水和物および硫酸バナジル三
水和物）を含む）を含む。
【０５３６】 タングステン錯体およびモリブデン錯体の代表的例もまた、オキソ錯体を含む
。適切なオキソタングステン錯体は、タングステン酸塩錯体および酸化タングス
テン錯体を含む。適切なタングステン酸塩錯体は、タングステン酸アンモニウム
、タングステン酸カルシウム、タングステン酸ナトリウム二水和物、およびタン
グステン酸を含む。適切な酸化タングステンは、酸化タングステン（ＩＶ）およ
び酸化タングステン（ＶＩ）を含む。適切なオキソモリブデン錯体は、モリブデ
ン酸塩錯体、酸化モリブデン錯体、およびモリブデニル錯体を含む。適切なモリ
ブデン酸塩錯体は、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸
ナトリウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物
を含む。適切な酸化モリブデンは、酸化モリブデン（ＶＩ）、酸化モリブデン（
ＶＩ）、およびモリブデン酸を含む。適切なモリブデニル錯体は、例えば、モリ
ブデニルアセチルアセトネートを含む。他の適切なタングステン錯体およびモリ
ブデン錯体は、例えば、グリセロール、酒石酸および糖から誘導された、ヒドロ
キソ誘導体を含む。
【０５３７】 広範な種類の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の状況において利用され得る
。代表的例は、以下を含む：血小板第４因子；硫酸プロタミン；硫酸化キチン誘
導体（クイーンクラブ（ｑｕｅｅｎ ｃｒａｂ）の殻から調製される）（Ｍｕｒ
ａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：２２〜２６、１９９１）；硫酸化多糖
ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、ステロイド（例
えば、エストロゲンおよびクエン酸タモキシフェン）の存在によって、増強され
得る）；スタウロスポリン；基質代謝の調節因子（例えば、プロリンアナログ、
シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チアプロリン、
α，α−ジピリジル、アミノプロピオニトリルフマレートを含む）；４−プロピ
ル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトトレキサート；
ミトザントロン；ヘパリン；インターフェロン；２マクログロブリン−血清；Ｃ
ｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７３２１
〜１７３２６、１９９２）；キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ Ｊ．２８６：４７５〜４８０、１９９２）；シクロデキストリンテトラデ
カサルフェート；エポネマイシン；カンプトテシン；フマギリン（Ｉｎｇｂｅｒ
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５５〜５５７、１９９０）；チオリンゴ酸金ナト
リウム（「ＧＳＴ」；ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．７９：１４４０〜１４４６、１９８７）；アンチコラゲナーゼ−血清
；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（４
）：１６５９〜１６６４、１９８７）；ビサントレン（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリット二ナトリウム（Ｎ−（２）−
カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸（ｃｈｌｏｒｏａｎｔｈｒｏｎ
ｉｌｉｃ ａｃｉｄ）二ナトリウム、または「ＣＣＡ」；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、
Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ ３６：３１２〜３１６、１９９２）；サリドマ
イド；Ａｎｇｏｓｔａｔｉｃステロイド；ＡＧＭ−１４７０；カルボキシアミノ
イミダゾール（ｃａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）；およびメ
タロプロテイナーゼインヒビター（例えば、ＢＢ９４）。
【０５３８】 （細胞レベルでの疾患） 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、およびアンタゴニストまたは
アゴニストによって、処置または検出され得る、細胞生存の増大またはアポトー
シスの阻害に関連する疾患には、以下が挙げられる：癌（例えば、濾胞性リンパ
腫、ｐ５３変異を伴う癌腫、およびホルモン依存性腫瘍。これらは以下を含むが
、これらに限定されない：結腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、
神経膠芽細胞腫、肺癌、腸の癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、
リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、破骨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、
前立腺癌、カポージ肉腫および卵巣癌）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症
、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クロー
ン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに
慢性関節リウマチ）、ならびにウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポッ
クスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒
絶、ならびに慢性移植片拒絶。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレ
オチド、ポリペプチドおよび／またはアンタゴニストは、特に上記に列挙された
ものにおいて、癌の増殖、進行、および／または転移（ｍｅｔａｓｉｓ）を阻害
するために使用される。
【０５３９】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストまたはア
ンタゴニストによって処置あるいは検出され得る、細胞生存の増大に関連するさ
らなる疾患または状態には、悪性疾患の進行および／または転移ならびに以下の
ような関連する障害が挙げられるが、これらに限定されない：白血病（急性白血
病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性
、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）ならびに慢性白血病（例
えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤
血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄
腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固形腫瘍（
以下を含むが、これらに限定されない：肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘
液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎ
ｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、
中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、
卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状
癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆
管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣の腫瘍、
肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫
、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神
経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜
芽細胞腫））。
【０５４０】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、およびアゴニストまたはアン
タゴニストによって処置あるいは検出され得る、アポトーシスの増大に関連する
疾患には、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハイマ
ー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性および脳
腫瘍または先の関連した疾患）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェー
グレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多
発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節
リウマチ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片
病、虚血性損傷（心筋梗塞、発作および再灌流損傷によって生じるようなもの）
、肝臓損傷（例えば、肝炎関連肝臓損傷、虚血／再灌流損傷、胆汁うっ滞（ｃｈ
ｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管損傷）および肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アル
コールによって生じるようなもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不
振。
【０５４１】 （創傷治癒および上皮細胞増殖） 本発明のなおさらなる局面に従って、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペ
プチド、およびアゴニストまたはアンタゴニストを、治療目的のため、例えば、
創傷治癒の目的のために上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを刺激するため
、ならびに毛包産生および皮膚創傷の治癒を刺激するために、利用するためのプ
ロセスが提供される。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、およびア
ゴニストまたはアンタゴニストは、以下を含む創傷治癒を刺激することにおいて
臨床的に有用であり得る：外科的創傷、切除の創傷、深い創傷（真皮および表皮
の損傷を含む）、眼の組織の創傷、歯の組織の創傷、口腔の創傷、糖尿病性潰瘍
、皮膚の潰瘍、肘の潰瘍、動脈性の潰瘍、静脈うっ滞潰瘍、熱への曝露または化
学物質から生じる熱傷、および他の異常な創傷治癒状態（例えば、尿毒症、栄養
失調、ビタミン欠乏およびステロイド、放射能療法および抗腫瘍性薬物および代
謝拮抗物質を用いる全身性処置に関連する合併症。本発明のポリヌクレオチドま
たはポリペプチド、およびアゴニストまたはアンタゴニストは、皮膚の損失の後
の皮膚の回復を促進するために使用され得る。
【０５４２】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびアゴニストまたはアンタ
ゴニストは、創傷床（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）への皮膚移植片の付着を増大するた
め、および創傷床からの再上皮形成を刺激するために使用され得る。以下は、本
発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
が創傷床への付着を増大するために使用され得る、移植片の型である：自家移植
片、人工皮膚、同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）、自己植皮片、自己表皮移植
片（ａｕｔｏｅｐｄｅｒｍｉｃ ｇｒａｆｔ）、無血管性（ａｖａｃｕｌａｒ）
移植片、ブレア−ブラウン移植片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移植片、遅
延移植片、皮膚移植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、異種移植片
（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ
）、同種移植片（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、増殖性移植片、層板状
の移植片、網状移植片、粘膜移植片、オリエ−ティールシュ移植片、大網移植片
（ｏｍｅｎｐａｌ ｇｒａｆｔ）、パッチの移植片、茎状移植片、全層移植片（
ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｇｒａｆｔ）、分層植皮片（ｓｐｌｉｔ ｓｋｉｎ
ｇｒａｆｔ）、分層植皮片（ｔｈｉｃｋ ｓｐｌｉｔ ｇｒａｆｔ）。本発明の
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびアゴニストまたはアンタゴニストは
、皮膚の強度を助長するため、および高齢の皮膚の外見を改善するために使用さ
れ得る。
【０５４３】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびアゴニストまたはアンタ
ゴニストはまた、肝細胞増殖、および肺、乳房、膵臓、胃、小腸（ｓｍａｌｌ
ｉｎｔｅｓｔｉｎｇ）、および大腸における上皮細胞増殖における変化を生じる
と考えられる。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、およびアゴニス
トまたはアンタゴニストは、上皮細胞（例えば、皮脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）
、毛包、肝実質細胞、肺胞上皮細胞ＩＩ型（ｔｙｐｅ ＩＩ ｐｎｅｕｍｏｃｙ
ｔｅ）、ムチン産生杯細胞、および他の上皮細胞、ならびに皮膚、肺、肝臓、お
よび胃腸管内に含まれるそれらの先祖）の増殖を促進し得る。本発明のポリヌク
レオチドまたはポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストは、内皮細胞、
ケラチノサイト、および基底ケラチノサイトの増殖を促進し得る。
【０５４４】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびアゴニストまたはアンタ
ゴニストはまた、照射、化学療法処置またはウイルス感染から生じる腸の毒性の
副作用を低減するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドおよびアゴニストまたはアンタゴニストは、小腸粘膜上で細胞保護的な効
果を有し得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびアゴニスト
またはアンタゴニストはまた、化学療法およびウイルス感染から生じる粘膜炎（
ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）（口粘膜）の治癒を刺激し得る。
【０５４５】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびアゴニストまたはアンタ
ゴニストは、熱傷を含む、完全なおよび部分的な厚さの皮膚欠損における皮膚の
十分な再生（すなわち、毛包、汗腺、および皮脂腺の再増殖）、乾癬のような他
の皮膚欠損の処置においてさらに使用され得る。本発明のポリヌクレオチドまた
はポリペプチド、およびアゴニストまたはアンタゴニストは、表皮水疱症、これ
らの損傷の再上皮形成を促進することによる頻繁な開放性かつ疼痛性の水疱を生
じる内在的な真皮への表皮の接着における欠損を処置するために使用され得る。
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、およびアゴニストまたはアンタ
ゴニストはまた、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を処置し、そして粘膜の内層の瘢痕
形成ならびにより迅速な腺の粘膜および十二指腸の粘膜の内層の再生による治癒
を助けるために使用され得る。炎症性（ｉｎｆｌａｍａｍａｔｏｒｙ）腸疾患（
例えば、クーロン病および潰瘍性大腸結腸炎）は、それぞれ、小腸または大腸の
粘膜表面の崩壊を生じる疾患である。従って、本発明のポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドおよびアゴニストまたはアンタゴニストは、粘膜表面の再表面化（
ｒｅｓｕｌｆａｃｉｎｇ）を促進して、より迅速な治癒を助けるため、および炎
症性腸疾患の進行を予防するために、使用され得る。本発明のポリヌクレオチド
またはポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストを用いる処置は、胃腸管
全体の粘膜の産生に対して有意な効果を有することが予測され、そして腸粘膜を
、摂取されたかまたは外科手術後の有害な物質から保護するために使用され得る
。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびアゴニストまたはアンタ
ゴニストは、本発明のポリヌクレオチドの発現下に関連する疾患を処置するため
に使用され得る。
【０５４６】 さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびアゴニストまた
はアンタゴニストは、種々の病的状態に起因する肺への損傷を予防および治癒す
るために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、および
アゴニストまたはアンタゴニストは、急性または慢性の肺損傷を予防または処置
するために、増殖および分化を刺激し得、そして肺胞および気管支（ｂｒｏｃｈ
ｉｏｌａｒ）上皮の修復を促進し得る。例えば、気管支上皮および肺胞（ａｖｅ
ｏｌｉ）の壊死を生じる、気腫（これは、肺胞の進行性の損失を生じる）および
吸入損傷（すなわち、煙の吸入および熱傷から生じる）は、本発明のポリヌクレ
オチドまたはポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストを使用して効果的
に処置され得る。また、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびア
ゴニストまたはアンタゴニストは、肺胞上皮細胞ＩＩ型の増殖および分化を刺激
するために使用され得、これは、未熟な乳児における硝子膜疾患（例えば、乳児
呼吸窮迫症候群および気管支肺異形成症）のような疾患を処置または予防するこ
とを助け得る。
【０５４７】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびアゴニストまたはアンタ
ゴニストは、肝実質細胞の増殖および分化を刺激し得、そして従って、肝臓疾患
および病状（例えば、肝硬変により生じる劇症肝不全、肝炎ウイルスおよび毒性
物質（すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｔｅｔｒａ
ｈｏｌｏｒｉｄｅ）、および他の当該分野で公知の肝臓毒素）により生じる肝臓
損傷）を緩和または処置するために使用され得る。
【０５４８】 さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびアゴニストまた
はアンタゴニストは、真性糖尿病の発症を処置または予防するために使用され得
る。新たにＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病と診断された患者において、いくつか
の島細胞機能が残っている場合、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
およびアゴニストまたはアンタゴニストは、その疾患の持続性の発現を緩和、遅
延または予防するように、その島機能を維持するために使用され得る。また、本
発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、およびアゴニストまたはアンタゴ
ニストは、島細胞機能を改善または促進するための島細胞移植における補助とし
て使用され得る。
【０５４９】 （ニューロン活性および神経学的疾患） 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびアゴニストまたはアンタゴニ
ストは、脳および／または神経系の疾患、障害、損傷（ｄａｍａｇｅ）または損
傷（ｉｎｊｕｒｙ）の診断および／または処置のために使用され得る。本発明の
組成物（例えば、ヒトポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／またはアゴニス
トもしくはアンタゴニスト）を用いて処置され得る神経系障害には、軸索の切断
、ニューロンの減少もしくは変性、または脱髄のいずれかを引き起こす、神経系
損傷および疾患または障害が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方
法に従って、患者（ヒト患者および非ヒト哺乳動物患者を含む）において処置さ
れ得る神経系病変には、以下の中枢神経系（脊髄、脳を含む）または末梢神経系
のいずれかの病変が挙げられるが、これらに限定されない：（１）虚血病変（こ
こで、神経系の一部における酸素不足により、ニューロンの損傷または死が生じ
、これには大脳梗塞もしくは虚血、または脊髄梗塞もしくは虚血が挙げられる）
；（２）外傷病変（身体的損傷により生じるかまたは手術に関連する病変、例え
ば、神経系の一部分を切断する病変、または圧縮損傷を含む）；（３）悪性病変
（ここで、神経系の一部分は、神経系関連悪性疾患もしくは非神経系組織由来の
悪性疾患のいずれかである悪性組織により破壊または損傷される）；（４）感染
性病変（ここで、神経系の一部分は、例えば、膿瘍による感染の結果として、破
壊または損傷されるか、あるいはヒト免疫不全ウイルス、帯状ヘルペスもしくは
単純ヘルペスウイルスによる感染と関連するか、またはライム病、結核もしくは
梅毒に関連する）；（５）変性病変（ここで、神経系の一部分は、変性プロセス
の結果として破壊または損傷され、これには、パーキンソン病、アルツハイマー
病、ハンティングトン病または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連する変性が
挙げられるが、これらに限定されない）；（６）栄養性の疾患または障害に関連
する病変（ここで、神経系の一部分は、栄養障害または代謝障害によって破壊ま
たは損傷され、これには、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ヴェルニッケ病
、タバコ−アルコール弱視、マルキアファーヴァ−ビニャーミ病（脳梁の一次変
性）およびアルコール小脳変性が挙げられるが、これらに限定されない）；（７
）全身性疾患に関連する神経性病変（糖尿病（糖尿病性ニューロパシー、ベル麻
痺）、全身性エリテマトーデス、癌または類肉腫症が挙げられるが、これらに限
定されない）；（８）毒性物質（アルコール、鉛または特定の神経毒を含む）に
より生じる病変；ならびに（９）脱髄性病変（ここで、神経系の一部分は、脱髄
疾患によって破壊または損傷され、これには、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイ
ルス関連脊髄障害、横断脊髄障害または種々の病因、進行性多病巣性白質脳障害
、および橋中央ミエリン溶解が挙げられるが、これらに限定されない）。
【０５５０】 １つの実施形態において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または
アゴニストもしくはアンタゴニストは、低酸素症の損傷効果から神経細胞を保護
するために用いられる。さらに好ましい実施形態において、本発明のポリペプチ
ド、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、大脳低酸
素症の損傷効果から神経細胞を保護するために用いられる。この実施形態による
と、本発明の組成物は、大脳低酸素症に関連する神経細胞損傷を処置または予防
するために用いられる。この実施形態の１つの非限定的局面において、本発明の
ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは
、大脳虚血と関連する神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。こ
の実施形態の別の非限定的局面において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオ
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、大脳梗塞に関連する神経細
胞損傷を処置または予防するために用いられる。
【０５５１】 別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、
またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、発作に関連する神経細胞損傷を処
置または予防するために用いられる。特定の実施形態において、本発明のポリペ
プチド、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、発作
に関連する大脳神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。
【０５５２】 別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、
またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、心臓発作に関連する神経細胞損傷
を処置または予防するために用いられる。特定の実施形態において、本発明のポ
リペプチド、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、
心臓発作に関連する大脳神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。
【０５５３】 神経系障害を処置または予防するのに有用な本発明の組成物は、ニューロンの
生存または分化の促進における生物学的活性について試験することによって、選
択され得る。例えば、制限する目的ではないが、以下の効果のいずれかを誘発す
る本発明の組成物は、本発明によると有用であり得る：（１）低酸素症または低
酸素性状態の存在または非存在下のいずれかの培地におけるニューロンの増加し
た生存時間；（２）培地またはインビボにおけるニューロンの増加した出芽；（
３）培地またはインビボにおけるニューロン関連分子（例えば、運動ニューロン
に関して、コリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンステラーゼ
）の増加した産生；あるいは（４）インビボにおけるニューロン機能障害の軽減
した症状。このような効果は、当該分野で公知の任意の方法によって測定され得
る。好ましくは、非制限的な実施形態において、ニューロンの増加した生存時間
は、本明細書中に記載される方法、またはそうでなければ当該分野で公知の方法
（例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９
７：３６３７−４２（２０００）、またはＡｒａｋａｗａら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓ
ｃｉ．１０：３５０７〜３５１５（１９９０）））を使用して慣用的に測定され
得；ニューロンの増加した出芽は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｐｅｓｔｒ
ｏｎｋら（Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７０：６５〜８２（１９８０））またはＢｒ
ｏｗｎら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：１７〜４２（１９８１））
に記載される方法）によって検出され得；ニューロン関連分子の増加した産生は
、当該分野で公知の技術を使用し、そして測定されるべき分子に基づいて、バイ
オアッセイ、酵素アッセイ、抗体結合、ノザンブロットアッセイなどによって、
測定され得；そして運動ニューロンの機能障害は、運動ニューロン障害の物理的
発現（例えば、弱さ、運動ニューロンの伝導速度、または機能障害）を評価する
ことによって、測定され得る。
【０５５４】 特定の実施形態において、本発明に従って処置され得る運動ニューロンの障害
には、運動ニューロンおよび神経系の他の成分に影響を与え得る障害（例えば、
梗塞、感染、毒素への暴露、外傷、外科的損傷、変性疾患、または悪性疾患）、
ならびにニューロンに選択的に影響する障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症）が
挙げられるが、これらに限定されず、そしてこれには、進行性脊髄性筋萎縮症、
進行性球麻痺、原発性側索硬化症、小児筋萎縮および若年性筋萎縮、小児期の進
行性球延髄麻痺（ファチオ−ロンデ症候群）、ポリオおよびポリオ後症状、なら
びに遺伝性運動感覚性神経障害（シャルコー−マリー−トゥース病）が挙げられ
るが、これらに限定されない。
【０５５５】 さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、ニューロン生存、
シナプス形成；伝達；神経分化などにおいて役割を果たし得る。従って、本発明
の組成物（ヒトポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびアゴニストまたはアン
タゴニストを含む）は、学習および/または認識の障害を含むがこれに限定され
ない、これらの役割に関連する疾患または障害を、診断、および/または処置ま
たは予防するのに用いられ得る。本発明の組成物はまた、神経変性性疾患状態お
よび/または行動障害の処置または予防において有用であり得る。このような神
経変性性疾患状態および/または行動障害としては以下が挙げられるがこれらに
限定されない：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ツレット
症候群、精神分裂病、躁病、痴呆、偏執症、強迫性障害、恐慌性障害、学習障害
、ＡＬＳ、精神病、自閉、および行動変化（栄養補給、睡眠パターン、平衡、お
よび知覚の障害を含む）。さらに、本発明の組成物はまた、発生中の胚、または
伴性障害に関連する発生の障害の処置、予防および/または検出において役割を
果たし得る。
【０５５６】 さらに、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および/またはアゴニス
トまたはアンタゴニストは、以下を含むがこれらに限定されない脳血管障害に関
連する、疾患、傷害、障害または、損傷から、神経細胞を防御するのに有用であ
り得る：頸動脈疾患（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄またはモヤモヤ病）、
脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、脳低酸素症、大脳動脈硬化症、大
脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、脳塞栓症および血栓症（例えば、頸動脈血栓症、
洞血栓症またはヴァレンベルク症候群）、脳出血（例えば、硬膜上血腫もしくは
硬膜下血腫、またはクモ膜下出血）、大脳梗塞形成、脳虚血（例えば、一過性脳
虚血、鎖骨下動脈盗血症候群、または椎骨脳底不全（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉ
ｌａｒ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ））、血管性痴呆（たとえば、多発脳梗塞
性痴呆）、脳室周囲白質軟化症（ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ，ｐｅｒｉｖｅｎｔ
ｒｉｃｕｌａｒ）、ならびに血管性頭痛（例えば、群発性頭痛または片頭痛）。
【０５５７】 本発明のなおさらなる局面によれば、治療目的で、例えば神経学的細胞増殖お
よび/または分化を刺激するために、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストを利用するためのプロセスが提
供される。従って、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよ
び/またはアンタゴニストは、神経学的疾患を処置、および/または検出するため
に用いられ得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ま
たはアゴニストもしくはアンタゴニストは、特定の神経系疾患または傷害のマー
カーまたは検出因子として用いられ得る。
【０５５８】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび/またはアンタ
ゴニストを用いて処置または検出され得る神経学的疾患の例としては、以下が挙
げられる：脳疾患（例えば、母系フェニルケトン尿症のようなフェニルケトン尿
症を含む代謝性脳疾患）、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠乏症、ピルビン酸デヒ
ドロゲナーゼ複合体欠乏症、ヴェルニッケ脳障害、脳水腫、テント下（ｉｎｆｒ
ａｔｅｎｔｏｒｉａｌ）新生物を含む小脳性新生物のような脳新生物、脈絡叢新
生物のような脳室新生物、視床下部性新生物、テント上新生物、キャナヴァン病
、毛細血管拡張性運動失調のような脊髄小脳性退化を含む小脳性運動失調のよう
な小脳疾患、小脳性共同運動障害、フリードライヒ失調症、マチャド−ジョセフ
病、オリーブ橋小脳萎縮、テント下新生物のような小脳性新生物、びまん性軸周
囲脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｐｅｒｉａｘｉａｌｉｓ）、球様細胞白質
萎縮症、異染性白質萎縮症および亜急性硬化性汎脳炎のようなびまん性脳硬化。
【０５５９】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび/またはアンタ
ゴニストを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下
が挙げられる：脳血管障害（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄およびモヤモヤ
病を含む頸動脈疾患）、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、脳無酸素
症、大脳動脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、頸動脈血栓症、洞血栓症
およびヴァレンベルク症候群のような脳塞栓症および血栓症、硬膜上血腫、硬膜
下血腫およびクモ膜下出血のような脳出血、大脳梗塞形成、一過性脳虚血、鎖骨
下動脈盗血症候群および椎骨脳底不全（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ ｉｎ
ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）のような脳虚血、多発脳梗塞性痴呆のような血管性痴
呆、脳室周囲白質軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｅｕｋｏｍａｌ
ａｃｉａ）、群発性頭痛および片頭痛のような血管性頭痛。
【０５６０】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび/またはアンタ
ゴニストを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては以下が
挙げられる：エイズ痴呆複合症のような痴呆症、アルツハイマー病およびクロイ
ツフェルト−ヤーコプ病のような初老期痴呆、アルツハイマー病および進行性核
上性麻痺のような老年痴呆、多発脳梗塞性痴呆のような血管性痴呆、びまん性軸
周囲性脳炎を含む脳炎、流行性脳炎、日本脳炎、セントルイス脳炎、マダニ媒介
性脳炎および西ナイル熱のようなウイルス性脳炎、急性播種性脳脊髄炎、ブドウ
膜髄膜炎症候群、脳炎後パーキンソン病および亜球性硬化性汎脳炎のような髄膜
脳脊髄炎、脳室周囲白質軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｅｕｋｏ
ｍａｌａｃｉａ）のような脳軟化症、点頭痙攣を含む全身てんかんのようなてん
かん、アプサンスてんかん（ａｂｓｅｎｃｅ ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、ＭＥＲＲＦ
症候群を含むミオクローヌスてんかん、強直・間代てんかん、複雑部分てんかん
、前頭葉てんかんおよび側頭葉てんかんのような部分てんかん、外傷後てんかん
、持続性部分てんかんのようなてんかん重積持続状態、ならびにハレルフォルデ
ン−シュパッツ症候群。
【０５６１】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび/またはアンタ
ゴニストを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下
が挙げられる：ダンディ−ウォーカー症候群および正常圧水頭症のような水頭症
、視床下部性新生物のような視床下部性疾患、大脳マラリア、脱力発作を含むナ
ルコレプシー、延髄ポリオ（ｂｕｌｂａｒ ｐｏｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、大脳
偽腫瘍、レット症候群、ライ症候群、視床疾患、大脳トキソプラスマ症、頭蓋内
結核腫およびツェルヴェーガー症候群、エイズ痴呆複合症のような中枢神経系感
染、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、ウマの脳脊髄炎のような脳脊髄炎、ベネズエラウマ
脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、ビスナ、ならびに大脳マラリア。
【０５６２】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび/またはアン
タゴニストを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以
下が挙げられる：クモ膜炎のような髄膜炎、リンパ球性脈絡髄膜炎を含むウイル
ス性髄膜炎のような無菌性髄膜炎、ヘモフィルス髄膜炎を含む細菌性髄膜炎、リ
ステリア髄膜炎、ウォーターハウス−フリーデリックセン症候群のような髄膜炎
菌性脳脊髄膜炎、肺炎球菌髄膜炎および髄膜結核症、クリプトコックス髄膜炎の
ような真菌性髄膜炎、硬膜下滲出、ブドウ膜髄膜脳炎症候群のような髄膜脳炎、
横行脊髄炎（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｍｙｅｌｉｔｉｓ）のような脊髄炎、脊髄
ろうのような神経梅毒、延髄ポリオおよびポリオ後症候群を含むポリオ、プリオ
ン病（例えば、クロイツフェルト−ヤーコプ症候群、ウシの海綿状脳症、ゲルス
トコン−シュトロイスラー症候群、クールー、スクラピー）、ならびに大脳トキ
ソプラスマ症。
【０５６３】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび/またはアンタ
ゴニストを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下
が挙げられる：テント下新生物のような小脳性新生物を含む脳新生物のような中
枢神経系新生物、脈絡叢新生物、視床下部性新生物およびテント上新生物のよう
な脳室新生物、髄膜新生物、硬膜外新生物を含む脊髄新生物、キャナヴァン病の
ような脱髄疾患、副腎脳白質ジストロフィーを含むびまん性大脳硬化症（ｄｉｆ
ｆｕｓｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｓｃｅｌｏｒｉｓ）、びまん性軸周囲性脳炎、球
様細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症のようびまん性大脳硬化症、アレルギー性
脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、進行性多病巣性白質脳障害、多発性硬化症、
橋中央ミエリン溶解、横行脊髄炎、視神経脊髄炎、スクラピー、脊柱前弯症、慢
性疲労症候群、ビスナ、高圧神経質症候群（Ｈｉｇｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｎｅ
ｒｖｏｕｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、髄膜症、先天性筋無緊張症のような脊髄疾患
、筋萎縮性側索硬化症、ヴェルドニッヒ−ホフマン病のような棘筋萎縮、脊髄圧
搾、硬膜外新生物のような脊髄新生物、脊髄空洞症、脊髄ろう、スティッフマン
症候群、母親由来１５ ｑ‐１３微少欠損のような精神遅滞、ネコ鳴き症候群、
ド・ランゲ症候群、ダウン症候群、ガングリオシドーシスＧ（Ｍ１）のようなガ
ングリオシドーシス、ザントホフ病、テイ−サックス病、ハートナップ病、ホモ
シスチン尿症、ローレンス−ムーン−ビードル症候群、レッシュ−ナイハン症候
群、カエデシロップ病、フコース蓄積症のようなムコリピドーシス、ニューロン
セロイド脂褐素沈着症、眼脳腎症候群、母系フェニルケトン尿のようなフェニル
ケトン尿症、プラーダー−ヴィリ症候群、レット症候群、ルービンスタイン−テ
ービ症候群、結節硬化症、ＷＡＧＲ症候群、全前脳症のような神経系異常、水無
能症（ｈｙｄｒａｎｇｅｎｃｅｐｈａｌｙ）を含む無能症のような神経管不全、
アルノルト−キアーリ奇形、脳ヘルニア、髄膜瘤、髄膜脊髄瘤、嚢胞性二分脊椎
および潜在性二分脊椎のような脊髄癒合不全。
【０５６４】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアンタ
ゴニストを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下
が挙げられる：シャルコー−マリー疾患を含む遺伝性の運動および感覚ニューロ
ン障害、視覚萎縮症、レフスム病、遺伝性痙性対麻痺、ヴェルドニッヒ−ホフマ
ン病、先天性痛覚脱失症および家族性自律神経障害のような遺伝性感覚および自
律性ニューロパシー、神経学的症状発現（例えば、ゲルストマン症候群を含む失
認）、逆向性健忘症のような健忘症、失行症、神経因性膀胱、脱力発作、難聴、
部分聴覚欠失、大声、レクルートメントおよび耳鳴を含む聴覚障害のような情報
伝達障害、失書症、名称失語症、ブロカ失語症およびヴェルニッケ失語症を含む
失語症のような言語障害、後天性失読症のような失読症、言語発達障害、名称失
語症、ブロカ失語症およびヴェルニッケ失語症を含む失語症のような発語障害、
蓄積障害、構語障害、反響言語、無言症およびどもりを含む発語障害のような情
報伝達障害、失声症および嗄声のような発声障害、除脳硬直状態、せん妄、線維
束性攣縮、幻覚、髄膜症、母親由来１５ ｑ‐１３微少欠損、運動失調、アテト
ーシス、舞踏病、失調症、運動低下症、筋肉緊張低下、ミオクローヌス、チック
、斜頸および振せんのような運動障害、スティッフマン症候群のような筋肉硬直
のような筋肉緊張亢進、筋肉痙性、耳帯状疱疹を含む顔面神経麻痺のような神経
麻痺、胃不全麻痺、片麻痺、複視のような眼筋麻痺、デュエーン症候群、ホルナ
ー症候群、キーンズ症候群のような慢性進行性外眼筋麻痺症、球麻痺、熱帯性痙
攣不全対麻痺、ブラウン−セカール症候群、四肢麻痺、呼吸麻痺および声帯麻痺
のような対麻痺、不全麻痺、幻肢、無味覚症および味覚不全のような味覚障害、
弱視、失明、色覚異常、複視、半盲、視野暗点および準正常視覚（ｓｕｂｎｏｒ
ｍａｌ ｖｉｓｉｏｎ）のような視覚障害、クライネ−レヴィン症候群、不眠症
および夢遊症を含む過眠症のような睡眠障害、開口障害のような痙縮、昏睡、持
続性植物状態および失神およびめまいのような意識消失、先天性筋無緊張症のよ
うな神経筋疾患、筋萎縮性側索硬化症、ランバート−イートン筋無力症症候群、
運動神経疾患、棘筋萎縮、シャルコー−マリー疾患およびヴェルドニッヒ−ホフ
マン病のような筋萎縮、後ポリオ症候群、筋ジストロフィー、重症筋無力症、萎
縮性筋緊張症、先天性筋緊張症、ネマリンミオパシー、家族性期性四肢麻痺、多
発性パラミロクローヌス（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｐａｒａｍｙｌｏｃｌｏｎｕｓ
）、熱帯性痙攣不全対麻痺およびスティッフマン症候群、先端肢端疼痛症のよう
な末梢神経系疾患、腎アミロイドーシス、アーディー症候群、Ｂａｒｒｅ−Ｌｉ
ｅｏｕ症候群、家族性自律神経障害、ホルナー症候群、反射性交感神経性ジスト
ロフィーおよびシャイ−ドレーガー症候群のような自律神経系疾患、神経線維腫
症２を含む聴神経腫のような内耳神経疾患のような脳神経疾患、顔面神経痛のよ
うな顔面神経疾患、メルカーソン−ローゼンタール症候群、弱視を含む眼球運動
性障害、眼振、眼球運動麻痺、デュエーン症候群のような眼筋麻痺、ホルナー症
候群、キーンズ症候群を含む慢性進行性外眼筋麻痺症、内斜視および外斜視のよ
うな斜視、動眼神経麻痺、遺伝性眼萎縮症を含む眼萎縮症のような眼神経疾患、
視神経円板結晶腔、視神経脊髄炎のような視神経炎、乳頭水腫、三叉神経痛、声
帯麻痺、視神経脊髄炎および脊柱前弯症のような脱髄疾患、糖尿病性足のような
糖尿病性ニューロパシー。
【０５６５】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアンタ
ゴニストを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下
が挙げられる：手根管症候群のような神経圧搾症候群、足根管症候群、頸肋症候
群のような胸郭出口症候群、尺骨神経圧搾症候群、カウザルギー、頸腕神経痛、
顔面神経痛および三叉神経痛のような神経痛、実験的アレルギー性神経炎、眼神
経炎、多発性神経炎、多発性神経根神経炎および神経根炎（例えば、多発性神経
根炎、遺伝性運動および感覚ニューロパシー（例えば、シャルコー−マリエ疾患
、遺伝性眼萎縮症、レフサム病、遺伝性痙性対麻痺およびヴェルドニッヒ‐ホフ
マン病、遺伝性感覚および自律神経ニューロパシー（先天性痛覚脱失および．家
族性自律神経障害を含む）、ＰＯＥＭＳ症候群、坐骨神経痛、味覚性発汗症候群
およびテタニー））のような神経炎。
【０５６６】 （感染性疾患） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニストもしくは
アンタゴニストは、感染因子を処置または検出するために用いられ得る。例えば
、免疫応答を上昇させることによって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖
および分化を増加させることによって、感染性疾患が処置され得る。免疫応答は
、既存の免疫応答を上昇させるか、または新たな免疫応答を開始させるかのいず
れかにより上昇され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペ
プチド、およびアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、必ずしも免疫応答を
誘発することなく、感染因子を直接阻害し得る。
【０５６７】 ウイルスは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／また
はアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置または検出され得る疾患または
症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤ
ＮＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス科が挙げられるがこれらに限定され
ない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイル
ス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、サルコウイルス
科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科、デング熱、ＥＢＶ、ＨＩ
Ｖ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例
えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、ヘルペス帯状疱疹）、モノネガウ
イルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、麻疹
ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエ
ンザＡ、インフルエンザＢ、およびパラインフルエンザ）、パピローマウイルス
、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイル
ス科（例えば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロタウイル
ス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、
およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらの科内に入るウイル
スは、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得
る：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、呼吸性シンシチウ
ムウイルス、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、
肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ（Ｄ型））、日本脳炎Ｂ型
、アルゼンチン出血熱、チングニア、リフトバレー熱、黄熱病、髄膜炎、日和見
感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹
、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹
、性感染症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。本発明
のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴ
ニストを用いて、任意のこれらの症状または疾患が処置または検出され得る。特
定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴ
ニストもしくはアンタゴニストは、以下の処置に使用される：髄膜炎、デング熱
、ＥＢＶ、および／または肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）。さらなる具体的な実施形
態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストもし
くはアンタゴニストは、１以上の他の市販の肝炎ワクチンに非応答性の患者を処
置するために使用される。さらに特定の実施形態において、本発明のポリヌクレ
オチド、ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、ＡＩＤＳ
を処置するために使用される。
【０５６８】 同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつ本発明のポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストによって
処置または検出され得る細菌性因子および真菌性因子は、以下のグラム陰性細菌
およびグラム陽性細菌、細菌科、ならびに真菌を含むがこれらに限定されない：
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａ
ｓｉｓ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａ
ｇｉｌｉｓ）、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒ
ｅｌｉａ（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｂｒｕｃｅ
ｌｌａ、Ｃａｎｄｉｄｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ
、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎ
ｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、Ｃｏｃｃ
ｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅ
ｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅ
ｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒ
ｏｇｅｎｅｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ
ａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈ
ｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、Ｅｒｙｓｉ
ｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ
ｓインフルエンザＢ型）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ（
例えば、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉ
ｒａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎ
ｅｓ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｍｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒ
ａｅ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏ
ｒｒｈｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｐａｓｔｅｕ
ｒｅｌｌａｃｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、
Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ（例えば、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐｐ．、Ｌｅｐｔｏ
ｓｐｉｒａ ｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐｐ．）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓ
ｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ ａｕｒｅｕｓ）、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕ
ｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＡ群、Ｂ群、ならびにＣ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｉ）、そしてＵｒｅａｐｌａｓｍａｓ。これらの細菌、寄生生物、および真菌の
科は、以下を含むがこれらに限定されない疾患または症状を引き起こし得る：抗
生物質耐性の感染（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ）、菌血症、心内膜炎、敗血症、眼感染症（例えば、結膜炎）、ブドウ膜
炎、結核症、歯肉炎、細菌性下痢、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した
感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、虫歯、ライター病、気道感染症（
例えば、百日咳または蓄膿症）、セプシス、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、
パラチフス熱、食中毒、レジオネラ疾患、慢性炎症および急性炎症、紅斑、酵母
感染、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎（例えば、髄膜炎Ａ型およびＢ型）、クラ
ミジア、梅毒、ジフテリア、ライ病、ブルセラ症、消化性潰瘍、炭疽、自然流産
、出生時欠損、肺炎、肺感染、耳感染、難聴、盲、嗜眠、倦怠、嘔吐、慢性下痢
、クローン病、大腸炎、腟の病気、生殖不能、骨盤炎症性疾患、カンジダ症、パ
ラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩
紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃ
ｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症、院内感染（ｎｏｓｃｏｍｉａ
ｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）。本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、
アゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、任意のこれらの症状もしくは疾患
を処置または検出し得る。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド
、ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストは、以下を処置するために使
用される：破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、および／またはＢ型髄膜炎。
【０５６９】 さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストにより処置、予防および／または診断され得る
、寄生生物性因子が引き起こす疾患または症状としては以下のファミリーまたは
クラスが挙げられるがこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシ
ジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉ
ａｓｉｓ）、交疫、外部寄生生物性、ジアルジア鞭毛虫症、蠕虫症、リーシュマ
ニア症、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｉｓｏｍａ）、タイレリア症、トキソプラス
マ症、トリパノソーマ症、およびトリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）症、
ならびに胞子虫症（Ｓｐｏｒｏｚｏａｎ）（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖ
ｉｒａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉ
ｕｍ ｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）。これらの
寄生生物は、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起
こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジ
ア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マ
ラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。本発明のポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、任意の
これらの症状または疾患を処置、予防および／または診断し得る。特定の実施形
態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストもし
くはアンタゴニストを用いて、マラリアを処置、予防および／または診断し得る
。
【０５７０】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニストもしくは
アンタゴニストは、患者に有効量のポリペプチドを投与するか、または患者から
細胞を取り出して、本発明のポリヌクレオチドをこの細胞に供給し、そして操作
した細胞を患者に戻す（エキソビボ治療）かのいずれかによるものであり得る。
さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドはワクチン中の抗原とし
て用いられて、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。
【０５７１】 （再生） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストを用いて、細胞を分化させ、増殖させ、そして誘引して、組織
の再生を導き得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：５９−８７（１９９７）を参照の
こと）。組織の再生を用いて、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、または潰
瘍）、加齢、疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性関節症（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒ
ｉｔｉｓ）、歯周病、肝不全）、美容形成手術を含む手術、線維症、再灌流傷害
、もしくは全身性サイトカイン損傷により損傷を受けた組織を修復、置換、また
は保護し得る。
【０５７２】 本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる：器官（例えば、
膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、
血管系（血管およびリンパ管を含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱
、および靭帯）の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減され
て生じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。
【０５７３】 さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニス
トもしくはアンタゴニストは、治癒するのが困難な組織の再生を増加させ得る。
例えば、腱／靭帯の再生を増大させることによって、損傷後の回復時間が早まる
。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストはまた、損傷を回避する試みにおいて予防的に使用され得る。
処置され得る特定の疾患は、腱炎、手根管症候群、および他の腱欠損または靭帯
欠損を含む。非治癒創傷の組織再生のさらなる例としては、褥瘡性潰瘍（ｐｒｅ
ｓｓｕｒｅ ｕｌｃｅｒ）、脈管不全、外科的創傷、および外傷性創傷に関連す
る潰瘍が挙げられる。
【０５７４】 同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるために本
発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはア
ンタゴニストを使用することによって再生され得る。本方法を用いて処置され得
る疾患としては、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患、神経障害、または機械
的および外傷性障害（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および発作（
ｓｔｏｋｅ））が挙げられる。詳細には、末梢神経傷害と関連する疾患、末梢神
経障害（例えば、化学療法または他の医学的療法から生じる）、局在神経障害、
および中枢神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティ
ングトン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群）はすべて
、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストを用いて処置され得る。
【０５７５】 （走化性） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、細胞（例えば、単
球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞および／または
内皮細胞）を、身体内の特定の部位（例えば、炎症、感染、または過剰増殖の部
位）に誘引または動員する。次いで、動員された細胞は、特定の外傷または異常
性を撃退および／または治癒し得る。
【０５７６】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、特定の細胞の走化性活性を増大し得る。次いで、これらの
走化性分子を使用して、身体内の特定の位置に標的化した細胞の数を増加させる
ことによって、炎症、感染、過増殖障害、または任意の免疫系障害を処置し得る
。例えば、走化性分子を使用して、傷害を受けた位置に免疫細胞を誘引すること
によって、組織に対する創傷および他の外傷を処置し得る。本発明の走化性分子
はまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を処置するために使用され得る。
【０５７７】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストが走化性活性を阻害し得ることもまた意図される。これらの分
子はまた、障害を処置するために使用され得る。従って、本発明のポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、走
化性のインヒビターとして使用され得る。
【０５７８】 （結合活性） 本発明のポリペプチドは、このポリペプチドに結合する分子、またはこのポリ
ペプチドが結合する分子についてスクリーニングするために使用され得る。この
ポリペプチドとこの分子との結合は、結合したポリペプチドまたは分子の活性を
活性化（アゴニスト）、増大、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。
そのような分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば
、レセプター）、または低分子が挙げられる。
【０５７９】 好ましくは、この分子は、このポリペプチドの天然のリガンド（例えば、リガ
ンドのフラグメント）、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物、もしくは
機能的模倣物に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）：第５章（１９９１）を参
照のこと）。同様に、この分子は、このポリペプチドが結合する天然のレセプタ
ー、または少なくとも、このポリペプチドによって結合され得るレセプターのフ
ラグメント（例えば、活性部位）に密接に関連し得る。いずれの場合においても
、この分子は、公知の技術を用いて合理的に設計され得る。
【０５８０】 好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、このポリペプチドを
発現する適切な細胞を産生する工程を包含する。好ましい細胞としては、哺乳動
物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる
。次いで、このポリペプチドを発現する細胞（または、発現されたポリペプチド
を含む細胞膜）を、好ましくは、このポリペプチドまたはこの分子のいずれかの
結合、刺激、または活性の阻害を観察するための分子を潜在的に含む試験化合物
と接触させる。
【０５８１】 アッセイは、このポリペプチドへの候補化合物の結合を単純に試験し得、ここ
で結合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセイに
おいて検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がこのポリペプチドへの結
合によって生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。
【０５８２】 あるいは、アッセイは、無細胞調製物、固体支持体に接着されたポリペプチド
／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され得る。ア
ッセイはまた、候補化合物を、ポリペプチドを含む溶液と混合する工程、ポリペ
プチド／分子の活性または結合を測定する工程、およびポリペプチド／分子の活
性または結合を、標準と比較する工程を単純に包含し得る。
【０５８３】 好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体を用いて、サンプル（例えば、生物学的サンプル）におけるポリペプチド
のレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、ポリペプチドへの直接的もしくは間
接的のいずれかの結合、または基質についてのポリペプチドとの競合によって、
ポリペプチドのレベルまたは活性を測定し得る。
【０５８４】 さらに、本発明のポリペプチドが結合するレセプターは、当業者に公知の多く
の方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａ
ｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２）、
第５章（１９９１）））によって同定され得る。例えば、ポリアデニル化ＲＮＡ
がこのポリペプチドに応答する細胞から調製される発現クローニングが用いられ
、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（これは、ＦＧＦファミリータンパク質に対する複
数のレセプターを含むことが公知である）、およびＳＣ−３細胞、およびこのＲ
ＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーは、プールに分けられ、そしてこのポ
リペプチドに応答性でないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェクトするた
めに使用される。ガラススライド上で増殖しているトランスフェクトされた細胞
は、それらを標識化した後に、本発明のポリペプチドに曝露される。このポリペ
プチドは、種々の手段（部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位のヨウ
素化または封入を含む）によって標識化され得る。
【０５８５】 固定化およびインキュベーション後、スライドは、オートラジオグラフィー分
析に供される。陽性プールを同定し、そしてサブプールを、反復性のサブプール
化および再スクリーニングプロセスを使用して調製および再びトランスフェクト
して、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生じる。
【０５８６】 レセプター同定のための代替のアプローチとして、標識ポリペプチドは、細胞
膜と光親和性に連結し得るか、またはレセプター分子を発現する調製物を抽出し
得る。架橋された材料は、ＰＡＧＥ分析によって分離され、そしてＸ線フィルム
に曝露される。ポリペプチドのレセプターを含む標識複合体が切り出され得、ペ
プチドフラグメントへと分離され得、そしてタンパク質微量配列決定に供され得
る。微量配列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、１組の縮重オリゴヌク
レオチドプローブを設計してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定レ
セプターをコードする遺伝子を同定する。
【０５８７】 さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフ
リング、および／またはコドンシャッフリングの技術（集合的に「ＤＮＡシャッ
フリング」という）を利用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、それ
によって本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを効果的に生
成する。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号
、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、および同第５，８３
７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４〜３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，
Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６〜８２（１９９８
）；Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５〜７
６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ，Ｒ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８〜１３（１９９８）（これら
の特許および刊行物の各々は、本明細書において参考として援用される）を参照
のこと。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチ
ドの変更は、ＤＮＡシャッフリングによって達成され得る。ＤＮＡシャッフリン
グは、相同組換えまたは部位特異的な組換えによる、２つ以上のＤＮＡセグメン
トの、本発明の分子の所望の分子への構築を含む。別の実施形態において、本発
明のポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドは、組換えの前に、誤りがち
な（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方
法によるランダム変異誘発に供することによって、変更され得る。別の実施形態
において、本発明のポリペプチドの１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ド
メイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ
、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどと組換えられ得る。好ましい実施形
態において、この異種分子は、ファミリーのメンバーである。さらに好ましい実
施形態において、この異種分子は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）
−α、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭ
Ｐ−７、アクチビンＡおよびアクチビンＢ、デカペンタプレジック（ｄｅｃａｐ
ｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２、ドーサリン（ｄｏｒｓ
ａｌｉｎ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、結節（ｎｏｄａｌ）、ＭＩＳ、インヒビ
ン−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５、および神
経膠由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のような増殖因子である。
【０５８８】 他の好ましいフラグメントは、本発明のポリペプチドの生物学的に活性なフラ
グメントである。生物学的に活性なフラグメントは、本発明のポリぺプチドの活
性に類似の活性を示すが、必ずしも同一ではないフラグメントである。このフラ
グメントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または減少した所望されな
い活性を含み得る。
【０５８９】 さらに、本発明は、本発明のポリペプチドの作用を調節する化合物を同定する
ために化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイの例は
、哺乳動物線維芽細胞、本発明のポリペプチド、スクリーニングされるべき化合
物および３［Ｈ］チミジンを、線維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で合わ
せる工程を包含する。コントロールアッセイは、スクリーニングされるべき化合
物の非存在下で実施され得、そしてこの化合物の存在下での線維芽細胞の増殖の
量と比較して、各々の場合における３［Ｈ］チミジンの取り込みの決定によって
、この化合物が増殖を刺激するか否かを決定し得る。線維芽細胞の増殖の量は、３ ［Ｈ］チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィ
ーによって測定される。アゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物の両方が
、この手順により同定され得る。
【０５９０】 別の方法において、本発明のポリペプチドに対するレセプターを発現する哺乳
動物細胞または膜調製物は、この化合物の存在下において標識化した本発明のポ
リペプチドとともにインキュベートされる。次いで、この化合物がこの相互作用
を増強またはブロックする能力が、測定され得る。あるいは、スクリーニングさ
れるべき化合物とレセプターとの相互作用に続く既知のセカンドメッセンジャー
系の応答が測定され、そしてこの化合物がこのレセプターに結合し、そしてセカ
ンドメッセンジャー応答を誘発する能力を測定して、この化合物が潜在的なアゴ
ニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する。このようなセカンドメッ
センジャー系には、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルまたはホス
ホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５９１】 これらの上記のアッセイの全ては、診断マーカーまたは予後マーカーとして使
用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、ポリペプチド／分子
を活性化または阻害することによって、疾患を処置するか、あるいは患者に特定
の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用され得る。さらに、アッセイ
は、適切に操作された細胞または組織からの本発明のポリペプチドの産生を阻害
または増強し得る因子を発見し得る。
【０５９２】 従って、本発明は、以下の工程を含む本発明のポリペプチドに結合する化合物
を同定する方法を包含する：（ａ）候補結合化合物を本発明のポリペプチドとと
もにインキュベートする工程；および（ｂ）結合が生じたか否かを決定する工程
。さらに、本発明は、以下の工程を含むアゴニスト／アンタゴニストを同定する
方法を包含する：（ａ）候補化合物を本発明のポリペプチドとともにインキュベ
ートする工程、（ｂ）生物学的活性をアッセイする工程、および（ｂ）ポリペプ
チドの生物学的活性が改変されているか否かを決定する工程。 （標的化された送達） 別の実施形態において、本発明は、組成物を、本発明のポリペプチドについて
のレセプターを発現する標的化細胞、または本発明のポリペプチドの細胞結合形
態を発現する細胞に送達する方法を提供する。
【０５９３】 本明細書中で議論される場合、本発明のポリペプチドまたは抗体は、異種ポリ
ペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグと、疎水性、親水性、イオン性お
よび／または共有結合性の相互作用を介して会合し得る。１つの実施形態におい
て、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合した本発明のポリペプチド（
抗体を含む）を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特異的な送達の
ための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治療タンパク質を標的化
細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核
酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）あるいは二本鎖核酸（例えば、細
胞のゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写さ
れ得る、ＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供する。
【０５９４】 別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会合
した本発明のポリペプチド（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体
）を投与することによる細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための
方法を提供する。
【０５９５】 「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクター系、放射性同位体、ホロ毒素
（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の
条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の
分子もしくは酵素を、結合および活性化する化合物を意味する。本発明の方法に
従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない
：当該分野で公知の放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性の細胞傷害性
エフェクター系を結合する化合物（例えば、抗体（またはその補体固定を含む部
分））、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン
、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モ
モルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヨウシュヤマゴ
ボウ抗ウイルスタンパク質、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素。
「細胞傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞傷
害性化合物へと変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って使
用され得る細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化剤
のグルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シト
シンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセト
アミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。 （薬物スクリーニング） 本発明のポリペプチドの活性を改変する分子についてスクリーニングするため
の、本発明のポリペプチド、またはこれらのポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドの使用が、さらに意図される。このような方法は、本発明のポリペプチ
ドを、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性を有することが疑われる選択さ
れた化合物と接触させる工程、および結合に続いてこれらのポリペプチドの活性
をアッセイする工程を包含する。
【０５９６】 本発明は、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて、本発明のポリ
ペプチド、またはそれらの結合フラグメントを使用することによって治療用化合
物をスクリーニングするために特に有用である。このような試験に用いられるポ
リペプチドまたはフラグメントは、固体支持体に固定化され得、細胞表面上に発
現され得、溶液中で遊離であり得、または細胞内に局在化され得る。薬物スクリ
ーニングの１つの方法は、ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換え核
酸を用いて安定に形質転換される真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を利
用する。薬物は、競合結合アッセイにおいて、このような形質転換細胞に対して
スクリーニングされる。例えば、試験されている薬剤と本発明のポリペプチドと
の間の複合体の形成（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を測定し得る。
【０５９７】 従って、本発明は、本発明のポリペプチドによって媒介される活性に影響を及
ぼす薬物または任意の他の薬剤についてのスクリーニング方法を提供する。これ
らの方法は、当該分野で周知の方法によって、このような薬剤を本発明のポリペ
プチドもしくはそのフラグメントと接触させる工程、およびこの薬剤とこのポリ
ペプチドもしくはそのフラグメントとの間の複合体の存在についてアッセイする
工程を包含する。このような競合結合アッセイにおいて、スクリーニングされる
薬剤は、代表的に、標識化される。インキュベーション後に、遊離の薬剤は、結
合形態で存在する薬剤から分離され、そして遊離または複合体化されていない標
識の量は、特定の薬剤が本発明のポリペプチドに結合する能力の尺度である。
【０５９８】 薬物スクリーニングについての別の技術は、本発明のポリペプチドに対する適
切な結合親和性を有する化合物に対するハイスループットスクリーニングを提供
し、そして欧州特許出願８４／０３５６４（１９８４年９月１３日公開）（これ
は、本明細書中で参考として援用される）に非常に詳細に記載される。簡潔にい
うと、大量の異なる小さなペプチド試験化合物は、固体基材（例えば、プラスチ
ックピンまたは何らかの他の表面）上で合成される。ペプチド試験化合物を、本
発明のポリペプチドと反応させ、そして洗浄する。次いで、結合したポリペプチ
ドは、当該分野で周知の方法によって検出される。精製されたポリペプチドは、
前述の薬物スクリーニング技術での使用のためにプレート上に直接コーディング
される。さらに、非中和抗体を使用して、このペプチドを捕捉し得、そして固体
支持体上にそれを固定し得る。
【０５９９】 本発明はまた、競合薬物スクリーニングアッセイの使用を意図し、ここで、本
発明のポリペプチドを結合し得る中和抗体は、ポリペプチドまたはそのフラグメ
ントに対する結合について試験化合物と特異的に競合する。この様式において、
抗体を使用して、本発明のポリペプチドと１つ以上の抗原性エピトープを共有す
る任意のペプチドの存在を検出する。
【０６００】 （アンチセンスおよびリボザイム（アンタゴニスト）） 特定の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、配列番号Ｘに含ま
れる配列またはその相補鎖に対応する核酸、および／あるいは表１で同定するｃ
ＤＮＡプラスミドＶに含まれるヌクレオチド配列に対応する核酸である。１つの
実施形態において、アンチセンス配列は、生物体により内部で生成され、別の実
施形態において、アンチセンス配列は別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎ
ｏｒ，Ｊ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）、Ｏｌｉｇｏｄｅ
ｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）を参照のこと）。アンチセンス技術を使用して
、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通してか、または３重らせんの形成を通
して遺伝子発現を制御し得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．
，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏ
ｎ，ＦＬ（１９８８）に考察される。３重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃ
ｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖ
ａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３００（１９９１）において考察される。
これらの方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基
づく。
【０６０１】 例えば、非リンパ性白血病細胞株ＨＬ−６０および他の細胞株の増殖を阻害す
るためのｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｍｙｂアンチセンスＲＮＡ構築物の使用は、以前
に記載された（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（１９８８）；Ａｎｆｏｓｓｉら（１９８
９））。これらの実験は、細胞をオリゴリボヌクレオチドとインキュベーション
することによってインビトロで行われた。インビボ用途のための類似の手順は、
ＷＯ９１／１５５８０に記載される。簡単には、所定のアンチセンスＲＮＡにつ
いてのオリゴヌクレオチドの対は、以下のように生成される：オープンリーディ
ングフレームの最初の１５塩基に相補的な配列を、５末端のＥｃｏＲＩ部位およ
び３末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接させる。次に、オリゴヌクレオチドの対は
、９０℃で１分間加熱され、次いで２×連結緩衝液（２０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣ
ｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）および０．２ｍＭ ＡＴＰ）中でアニーリングされ、次いで、レトロウイル
スベクターＰＭＶ７のＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結される（ＷＯ９１
／１５５８０）。
【０６０２】 例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コード部
分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド
を設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相
補的であるように設計され、それにより転写およびレセプターの産生を阻害する
。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダ
イズし、そしてｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロックする
。
【０６０３】 １つの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、外来の配列からの転
写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部が転写され、本
発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベクターは、本発明
のアンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターは、それが転
写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生し得る限り、エピソームを保持し得る
か、または染色体に組込まれ得る。このようなベクターは、当該分野において標
準的な組換えＤＮＡ技術方法により構築され得る。ベクターは、脊椎動物細胞に
おいて複製および発現のために使用される、当該分野で公知のプラスミド、ウイ
ルスなどであり得る。本発明のポリペプチドをコードする配列またはそのフラグ
メントの発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用することが当該分
野で公知の任意のプロモーターにより得る。そのようなプロモーターは、誘導性
または構成性であり得る。このようなプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロ
モーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９：
３０４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれ
るプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９７（１９
８０））、ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５（１９８１））
、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２
９６：３９−４２（１９８２））などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６０４】 本発明のアンチセンス核酸は、少なくとも本発明の遺伝子のＲＮＡ転写物の一
部に相補的な配列を含む。しかし、完全に相補的であることは好ましいが、必要
ではない。本明細書中で言及される「少なくともＲＮＡの一部に相補的な」配列
は、ＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分な相補性を有し、安定な二重鎖を形成
する配列を意味し；従って、本発明の二本鎖アンチセンス核酸の場合において、
二重鎖ＤＮＡの一本鎖が試験され得るか、または三重鎖形成がアッセイされ得る
。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両
方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、ＲＮＡとのより
多くの塩基ミスマッチを含み得、これは、安定な二重鎖（または三重鎖の場合も
あり得る）を含み得、そしてなお形成し得る。当業者は、ハイブリダイズ複合体
の融点を決定するために標準的な手順を使用することによりミスマッチの許容の
程度を確認し得る。
【０６０５】 メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開
始コドンまででかつＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害の
際に最も効率的に働くべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的
な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示された。一
般的に、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３５（１９９
４）を参照のこと。従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列の５
’−または３’−の非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチ
ドは、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチに使用され得る
。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コド
ンの相補物を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドは、翻訳のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明に
従って使用され得る。本発明のｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域
にハイブリダイズするように設計されるか否かにかかわらず、アンチセンス核酸
は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、そして好ましくは６〜約５
０ヌクレオチド長にわたるオリゴヌクレオチドである。特定の局面において、こ
のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレ
オチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである
。
【０６０６】 本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、またはキメラ混合物
、あるいはそれらの誘導体もしくは改変バージョン、一本鎖、または二本鎖であ
り得る。このオリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で改
変されて、例えば、分子の安定性、ハイブリダーゼーションなどを改善し得る。
このオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビボに
おいて宿主細胞レセプターを標的化するために）、または細胞膜を通した輸送を
促進する因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔ
ｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２（１９
８７）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）
を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１
３４（１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘
引切断剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｃｌｅａｖａｇ
ｅ ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：９
５８−９７６（１９８８）を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば
、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと
）を含み得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、
ペプチド、ハイブリダーゼーション誘引架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーショ
ン誘引切断剤など）に結合体化され得る。
【０６０７】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された塩基部分を
含み得、この塩基部分は、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される
：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨー
ドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カル
ボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２
−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシ
ル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデ
ニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、
２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシ
トシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシ
ル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュー
オシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２
−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ
）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キュ
ーオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシ
ル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチル
エステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、
３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）
ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【０６０８】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下を含むがそれらに限定されない
群から選択される少なくとも１つの改変された糖部分を含み得る：アラビノース
、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。
【０６０９】 さらなる別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を
含むがそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変されたリン
酸骨格を含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチ
オエート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロ
ジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホル
ムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）またはそれらのアナログ。
【０６１０】 さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ−アノ
マーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的な
ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のｂ−ユニットとは反対に
、その鎖は互いに平行にする（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、１５：６６２５−６６４１（１９８７））。このオリゴヌクレオチドは、
２’−０−メチルリボヌクレオチドであるか（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮ
Ａ−ＤＮＡアナログである（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２
７−３３０（１９８７））。
【０６１１】 本発明のポリヌクレオチドは当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動Ｄ
ＮＡ合成機（このような装置はＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓなどから市販されている））の使用により合成され得る。例えば、
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：３２０９（１９８８））により合成され得、メチル
ホスホネートオリゴヌクレオチドは、コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏ
ｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）ポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：７４４８−７４５１（１９
８８））などの使用により調製され得る。
【０６１２】 コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが使用され得るが、転写
された非翻訳領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ましい。
【０６１３】 本発明による潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４
日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９
９０）を参照のこと）。一方、部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザ
イムを使用して、ｍＲＮＡを破壊し得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用
が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を
形成する隣接領域により決定される位置で、ｍＲＮＡを切断する。たった１つの
必要条件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基配列を有することである：５’−
ＵＧ−３’。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および生成は当該分野で周知で
あり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：
５８５−５９１（１９８８）により十分に記載される。配列番号Ｘのヌクレオチ
ド配列内に多くの潜在的なハンマーヘッド型リボザイム切断部位が存在する。好
ましくは、このリボザイムは、切断認識部位がｍＲＮＡの５’末端付近に位置す
るように；すなわち、効率を増大し、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄
積を最小化するように、操作される。
【０６１４】 アンチセンスアプローチの場合、本発明のリボザイムは、改変されたオリゴヌ
クレオチド（例えば、安定性、標的化などを改良するために）から構成され得、
そしてインビボにおいて本発明のポリペプチドを発現する細胞に送達されるべき
である。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセ
ンスの導入のための上記と同じ様式において細胞中に導入され得る。送達の好ま
しい方法は、強力な構成性プロモーター（例えば、ｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｌ
ＩＩプロモーターのような）の制御下で、リボザイムを「コードする」ＤＮＡ構
築物を使用することを含み、その結果トランスフェクトした細胞が、内因性メッ
セージを破壊し、そして翻訳を阻害するに十分な量のリボザイムを生成する。リ
ボザイムはアンチセンス分子と異なり触媒性であるので、より低い細胞内濃度が
効率のために必要とされる。
【０６１５】 アンタゴニスト／アゴニスト化合物を利用して、腫瘍性の細胞および組織に対
する本発明のポリペプチドの細胞成長（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉ
ｆｅｒａｔｉｏｎ）効果を阻害し得る。すなわち、腫瘍の脈管形成を刺激し、そ
れにより異常な細胞成長および増殖を（例えば、腫瘍形成または増殖において）
遅延または防止する。
【０６１６】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、血管過多の疾患を予防し得、そ
して水晶体嚢外白内障（ｅｘｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ ｃａｔａｒａｃｔ）手術
後の上皮レンズ細胞の増殖を防止し得る。本発明のポリペプチドのマイトジェン
活性の防止はまた、例えば、バルーン血管形成術後の再狭窄のような場合に要求
され得る。
【０６１７】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、創傷治癒の間の瘢痕組織の増殖
防止し得る。
【０６１８】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、本明細書中に記載される疾患を
処置し得る。
【０６１９】 従って、本発明は、障害または疾患（本発明のポリヌクレオチドの過剰発現に
関連する、本願の全体に渡って列挙される障害または疾患が含まれるが、これら
に限定されない）を処置する方法であって、（ａ）本発明のポリヌクレオチドに
関するアンチセンス分子、および／または（ｂ）本発明のポリヌクレオチドに関
するリボザイムを、患者に投与することによって処置する方法を提供する。
【０６２０】 （結合ペプチドおよび他の分子） 本発明はまた、ヒトポリペプチドに結合するポリペプチドおよび非ポリペプチ
ドを同定するためのスクリーニング方法、ならびにそれによって同定されたヒト
結合分子を含む。これらの結合分子は、例えば、本発明のヒトポリペプチドのア
ゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。そのようなアゴニストおよび
アンタゴニストは、本発明に従って、以下に詳細に記載される治療上の実施形態
において使用され得る。
【０６２１】 この方法は、以下の工程を包含する： ヒトポリペプチドを多数の分子と接触させる工程；および ヒトポリペプチドに結合する分子を同定する工程。
【０６２２】 ヒトポリペプチドを多数の分子と接触させる工程は、多数の方法によってもた
らされ得る。例えば、当業者は、ヒトポリペプチドを固体支持体上に固定化させ
、そして多数の分子の溶液を固定したヒトポリペプチドと接触させることを考え
得る。このような手順は、固定したヒトポリペプチドから構成される親和性マト
リックスを用いるアフィニティークロマトグラフィープロセスに類似している。
次いで、ヒトポリペプチドに対して選択的な親和性を有する分子が、親和性選択
によって精製され得る。固体支持体の性質、ヒトポリペプチドのこの固体支持体
への付着に関するプロセス、溶媒、および親和性単離または親和性選択の条件は
、大部分が慣用的であり、そして当業者に周知である。
【０６２３】 あるいは、多数のポリペプチドはまた、ポリペプチドのサブセットまたは個々
のポリペプチドを含む実質的に別々の画分へ分離され得る。例えば、多数のポリ
ペプチドは、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィーなどポリペプチドの分離
に関して当業者に公知の方法によって、分離され得る。個々のポリペプチドはま
た、宿主細胞の外部表面上またはほぼ外部表面に発現されるような様式で、形質
転換された宿主細胞（例えば、組換えファージ）によって産生され得る。次いで
、個々の単離物は、本発明のヒトポリペプチドによって「プローブ化」され得、
必要に応じて発現に必要とされるであろうインデューサーの存在下で、ヒトポリ
ペプチドと個々のクローンとの間で任意の選択的親和性相互作用が起こったか否
かが決定される。ヒトポリペプチドを個々のポリペプチドを含む各画分と接触さ
せる前に、これらのポリペプチドはまず、さらなる簡便性のために固体支持体に
移され得る。そのような固体支持体は、単に、例えばニトロセルロースまたはナ
イロンでできたフィルター膜の断片であり得る。この様式において、陽性クロー
ンは、形質転換宿主細胞の発現ライブラリーの集団（これらは、ヒトポリペプチ
ドに対して選択的親和性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を持つ
）から同定され得る。さらに、ヒトポリペプチドに対して選択的親和性を有する
ポリペプチドのアミノ酸配列が、従来の手段によって直接決定され得るか、また
はこのポリペプチドをコードするＤＮＡのコード配列が、頻繁により簡便に決定
され得る。次いで、一次配列が、対応するＤＮＡ配列から推定され得る。アミノ
酸配列がポリペプチド自身から決定されるものである場合、微小配列決定技術を
使用し得る。この配列決定技術は、質量分析法を含み得る。
【０６２４】 特定の状況において、選択的親和性相互作用の存在を決定または検出しようと
試みる前に、未結合のヒトポリペプチド、あるいは、未結合ポリペプチドのいず
れかを、ヒトポリペプチドと多数のポリペプチドの混合物から洗浄除去すること
が望ましくあり得る。このような洗浄工程は、ヒトポリペプチドまたは多数のポ
リペプチドが固体支持体に結合している場合に、特に望ましくあり得る。
【０６２５】 本方法に従って提供される多数の分子は、多様性ライブラリー（例えば、本発
明のヒトポリペプチドへ特異的に結合する分子をスクリーニングし得る無作為ま
たはコンビナトリアルの、ペプチドライブラリーまたは非ペプチドライブラリー
）として提供され得る。使用され得る多くのライブラリー（例えば、化学合成ラ
イブラリー、組換えライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー
）、およびインビトロ翻訳ベースのライブラリー）が、当該分野で公知である。
化学合成ライブラリーの例は、以下に記載される：Ｆｏｄｏｒら、１９９１、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９１、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３５４：８４−８６；Ｌａｍら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：
８２−８４；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ、１９９４、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １
２：７０９−７１０；Ｇａｌｌｏｐら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７（９）：１２３３−１２５１；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら、１
９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０９２２−
１０９２６；Ｅｒｂら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９２，Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、１９９４
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１６１４−１６１８
；Ｓａｌｍｏｎら、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９０：１１７０８−１１７１２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２；なら
びにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５３８１−５３８３。
【０６２６】 ファージディスプレイライブラリーの例は、以下に記載される：Ｓｃｏｔｔお
よびＳｍｉｔｈ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖ
ｌｉｎら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：４０４−４０６；Ｃｈｒｉｓｔ
ｉａｎ，Ｒ．Ｂ．ら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１−７１
８）；Ｌｅｎｓｔｒａ、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：１
４９−１５７；Ｋａｙら、１９９３、Ｇｅｎｅ １２８：５９−６５；ならびに
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１８（１９９４年８月１８日）。
【０６２７】 インビトロ翻訳ベースのライブラリーとしては、以下：ＰＣＴ公開番号ＷＯ９
１／０５０５８（１９９１年４月１８日）；およびＭａｔｔｈｅａｋｉｓら、１
９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９０２２−９
０２６に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６２８】 非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば
、Ｂｕｎｉｎら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９１：４７０８−４７１２を参照のこと）が、使用のために適応され得る。ペプ
トイドライブラリー（Ｓｉｍｏｎら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３６７−９３７１）がまた使用され得る。使用され
得るライブラリーの別の例は、Ｏｓｔｒｅｓｈら（１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１１３８−１１１４２）によって記載
され、ここでは、ペプチド中のアミド官能基が、過剰にメチル化（ｐｅｒｍｅｔ
ｈｙｌａｔｅ）されて、化学的に形質転換されたコンビナトリアルライブラリー
を生成する。
【０６２９】 本発明において有用である種々の非ペプチドライブラリーは、大きい。例えば
、ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ（１９９５，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１３：３５１−３６０）は、種々のライブラリーの基礎を形成する化学種の間と
して、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ピペラジンジオン、ビフェニル、糖ア
ナログ、β−メルカプトケトン、アリール酢酸、アシルピペラジン、ベンゾピラ
ン、キューバン（ｃｕｂａｎｅ）、キサンチン、アミンイミドおよびオキサゾロ
ンを列挙している。
【０６３０】 非ペプチドライブラリーは、２つの型に大きく分類され得る：修飾されたモノ
マーおよびオリゴマー。修飾モノマーライブラリーは、比較的単純な骨格構造を
使用し、この上に種々の官能基が付加される。しばしば、骨格は、既知の有用な
薬理学的活性を有する分子である。例えば、骨格は、ベンゾジアゼピン構造であ
り得る。
【０６３１】 非ペプチドオリゴマーライブラリーは、モノマーの順序に依存して新規な形状
を作製する様式で共にアセンブルされる、多数のモノマーを使用する。使用され
るモノマー単位の間には、カルバメート、ピロリノン（ｐｙｒｒｏｌｉｎｏｎｅ
）およびモルホリノがある。ペプトイド（側鎖がα炭素よりもαアミノ基に結合
するペプチド様オリゴマー）は、非ペプチドオリゴマーライブラリーの別のバー
ジョンの基礎を形成する。最初の非ペプチドオリゴマーライブラリーは、単一型
のモノマーを使用し、従って、反復骨格を含む。近年のライブラリーは、１つよ
り多くのモノマーを使用し、自由度が加えられたライブラリーを与える。
【０６３２】 ライブラリーをスクリーニングすることは、多様な一般的に公知の方法のいず
れかによって達成され得る。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを
開示する以下の参考文献：ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ、１９８９、Ａｄｖ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５−２１８；ＳｃｏｔｔおよびＳｍ
ｉｔｈ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓ
ら、１９９２；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７；Ｏｌｄｅ
ｎｂｕｒｇら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
９：５３９３−５３９７；Ｙｕら、１９９４、Ｃｅｌｌ ７６：９３３−９４５
；Ｓｔａｕｄｔら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５７７−５８０；Ｂｏ
ｃｋら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋら、１
９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６９８８−６
９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８５０−８
５２；米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号、お
よび米国特許第５，１９８，３４６号（全てＬａｄｎｅｒらに対して）；Ｒｅｂ
ａｒおよびＰａｂｏ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３；な
らびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１８を参照のこと。
【０６３３】 特定の実施形態において、本発明のヒトポリペプチドを結合する分子を同定す
るためのスクリーニングは、ライブラリーのメンバーを固相に固定化されたヒト
ポリペプチドと接触させ、そしてヒトポリペプチドに結合するこれらのライブラ
リーを収集することによって実行され得る。そのようなスクリーニング方法の例
の、「パニング」と呼ばれる技術は、例として、ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔ
ｈ，１９８８，Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８；Ｆｏｗｌｋｅｓら、１９９２
，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９
４／１８３１８；ならびにその中に引用される参考文献に記載される。
【０６３４】 別の実施形態において、酵母中の相互作用タンパク質を選択するためのツーハ
イブリッドシステム（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ
３４０：２４５−２４６；Ｃｈｉｅｎら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：９５７８−９５８２）が、ヒトポリペプチドに特
異的に結合する分子を同定するために使用され得る。
【０６３５】 ヒト結合分子がポリペプチドである場合、このポリペプチドは、任意のペプチ
ドライブラリー（ランダムペプチドライブラリー、コンビナトリアルペプチドラ
イブラリー、またはバイアスペプチドライブラリーを含む）から簡便に選択され
得る。用語「バイアス（ｂｉａｓｅｄ）」は、この場合のペプチドにおいて、ラ
イブラリーを作製する方法が、生じる分子収集の多様性を支配する１つ以上のパ
ラメーターを制限するように操作されることを意味するために本明細書中に使用
される。
【０６３６】 従って、本当にランダムなペプチドライブラリーは、ペプチドの所定の位置に
特定のアミノ酸を見出す可能性が全て２０のアミノ酸に関して同じである、ペプ
チドの収集物を作製する。しかし、例えば、リジンが５番目のアミノ酸毎に生じ
ることを特定するかまたはデカペプチドライブラリーの４位、８位および９位が
アルギニンのみを含むように固定して特定することによって、バイアスがライブ
ラリーに導入され得る。ライブラリー中へ導入され得る。明らかに、バイアスの
多くの型は、意図され得、そして本発明は、任意の特定のバイアスに制限されな
い。さらに、本発明は、特定の型のペプチドライブラリー（例えば、ファージデ
ィスプレイペプチドライブラリーおよびＤＮＡ挿入物と共にλファージベクター
を含むＤＮＡ構築物を使用するライブラリー）を意図する。
【０６３７】 上記のように、ポリペプチドである結合分子（ポリペプチドである）の場合、
このポリペプチドは、約６から約６０より少ないアミノ酸残基を有し、好ましく
は約６〜約１０アミノ酸残基、そして最も好ましくは約６〜約２２アミノ酸であ
り得る。別の実施形態において、ヒト結合ポリペプチドは、１５〜１００の範囲
のアミノ酸、または２０〜５０の範囲のアミノ酸を有する。
【０６３８】 選択されたヒト結合ポリペプチドは、化学合成または組換え発現によって得ら
れ得る。
【０６３９】 （他の活性） 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニスト、またはアンタゴニス
トは、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、種々の疾患状態（例えば
、血栓症、動脈硬化、および他の心臓血管の状態）に起因する虚血組織の血管再
生を刺激するための処置において利用され得る。本発明のポリペプチド、ポリヌ
クレオチド、アゴニスト、またはアンタゴニストをまた利用して、上記で議論さ
れるように新脈管形成および肢の再形成を刺激し得る。
【０６４０】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニスト、またはアンタゴニス
トを、傷害、火傷、手術後組織修復、および瘢痕に起因する創傷の処置にもまた
利用し得る。なぜなら、それらは異なる起源の種々の細胞（例えば、線維芽細胞
および骨格筋細胞）に対してマイトジェン性であり、それゆえ損傷組織または疾
患組織の修復または置換を促進するからである。
【０６４１】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
はまた、ニューロンの成長を刺激し、そして特定のニューロンの障害または神経
変性状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびＡＩＤＳ関連複
合体）において生じるニューロンの損傷を処置および予防するために用いられ得
る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニス
トは、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し得、それゆえ、骨および歯周の再形成
を増強し、そして組織移植片または骨の移植片における補助のために利用され得
る。
【０６４２】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
をまた利用して、ケラチノサイト増殖を刺激することにより、日焼けに起因する
皮膚の老化を予防し得る。
【０６４３】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
をまた、抜け毛を予防するために利用し得る。なぜなら、ＦＧＦファミリーのメ
ンバーは、髪形成細胞を活性化し、そしてメラノサイト増殖を促進するからであ
る。同じ方針で、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたは
アンタゴニストを利用して、他のサイトカインと組み合わせて使用した場合、造
血細胞および骨髄細胞の増殖および分化を刺激し得る。
【０６４４】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
をまた、移植前の器官を維持するためか、または初代組織の細胞培養を支持する
ために使用し得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまた
はアンタゴニストはまた、初期胚において分化するように中胚葉起源の組織を誘
導するために利用され得る。
【０６４５】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストもしくはアンタゴニス
トはまた、先に議論されるような造血系統に加えて、胚性幹細胞の分化もしくは
増殖を増加または減少し得る。
【０６４６】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストもしくはアンタゴニス
トはまた、哺乳動物の特徴（例えば、身長、体重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪
組織の割合、色素沈着、大きさ、および形（例えば、美容外科））を調節するた
めに使用され得る。同様に、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニ
ストもしくはアンタゴニストは、異化作用、同化作用、プロセシング、利用、お
よびエネルギーの貯蔵に影響を及ぼす哺乳動物の代謝を調節するために使用され
得る。
【０６４７】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストもしくはアンタゴニス
トは、バイオリズム、心臓（ｃａｒｉｃａｄｉｃ）リズム、うつ病（抑うつ性の
障害を含む）、暴力の傾向、痛みへの耐性、生殖能力（好ましくは、アクチビン
またはインヒビン様活性によって）、ホルモンレベルもしくは内分泌レベル、食
欲、性欲、記憶、ストレス、または他の認知の質に影響を及ぼすことによって、
哺乳動物の精神状態または身体状態を変更するために使用され得る。
【０６４８】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストもしくはアンタゴニス
トはまた、例えば、貯蔵能力、脂肪含有量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタ
ミン、ミネラル、補因子、または他の栄養成分を増加または減少させるような食
品添加物または保存剤として使用され得る。
【０６４９】 上記の適用は、広範な種類の宿主における用途を有する。このような宿主とし
ては、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マウス、ラッ
ト、ハムスター、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワトリ、ヤギ、ウ
シ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒトが挙げられるが、これらに
限定されない。特定の実施形態において、この宿主は、マウス、ウサギ、ヤギ、
モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌまたはネコで
ある。好ましい実施形態において、この宿主は哺乳動物である。最も好ましい実
施形態において、この宿主はヒトである。
【０６５０】 （他の好ましい実施形態） 本願発明の他の好ましい実施形態は、配列番号Ｘのヌクレオチド配列またはそ
の相補鎖および／もしくはｃＤＮＡプラスミドＶのヌクレオチド配列中の少なく
とも約５０個連続したヌクレオチドの配列と少なくとも９５％同一であるヌクレ
オチド配列を含む、単離された核酸分子を含む。
【０６５１】 上記連続したヌクレオチドの配列が、表１中の配列番号Ｘについて同定された
位置の範囲で、配列番号Ｘのヌクレオチド配列に含まれる、核酸分子もまた好ま
しい。
【０６５２】 配列番号Ｘのヌクレオチド配列またはその相補鎖および／もしくはｃＤＮＡプ
ラスミドＶのヌクレオチド配列中の少なくとも約１５０個連続したヌクレオチド
の配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸
分子もまた好ましい。
【０６５３】 配列番号Ｘのヌクレオチド配列またはその相補鎖および／もしくはｃＤＮＡプ
ラスミドＶのヌクレオチド配列中の少なくとも約５００個連続したヌクレオチド
の配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸
分子はさらに好ましい。
【０６５４】 さらに好ましい実施形態は、表１中の配列番号Ｘについて同定された位置の範
囲で配列番号Ｘのヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド
配列を含む核酸分子である。
【０６５５】 さらに好ましい実施形態は、配列番号Ｘの完全なヌクレオチド配列またはその
相補鎖および／もしくはｃＤＮＡプラスミドＶのヌクレオチド配列と少なくとも
９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子である。
【０６５６】 ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号Ｘのヌクレオチ
ド配列またはその相補鎖および／もしくはｃＤＮＡプラスミドＶのヌクレオチド
配列を含む核酸分子にハイブリダイズする単離された核酸分子もまた好ましく、
ここで上記のハイブリダイズする核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下で、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を
有する核酸分子にハイブリダイズしない。
【０６５７】 ｃＤＮＡプラスミドＶを含むＤＮＡ分子を含む組成物もまた好ましい。
【０６５８】 ｃＤＮＡプラスミドＶのヌクレオチド配列中の少なくとも５０個連続したヌク
レオチドの配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離され
た核酸分子もまた好ましい。
【０６５９】 上記の少なくとも５０個連続したヌクレオチドの配列が、ｃＤＮＡプラスミド
Ｖによってコードされるオープンリーディングフレームの配列のヌクレオチド配
列中に含まれる、単離された核酸分子もまた好ましい。
【０６６０】 ｃＤＮＡプラスミドＶによってコードされるヌクレオチド配列中の少なくとも
１５０個連続したヌクレオチドの配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチ
ド配列を含む、単離された核酸分子もまた好ましい。
【０６６１】 さらに好ましい実施形態は、ｃＤＮＡプラスミドＶによってコードされるヌク
レオチド配列中の少なくとも５００個連続したヌクレオチドの配列と少なくとも
９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子である。
【０６６２】 さらに好ましい実施形態は、ｃＤＮＡプラスミドＶによってコードされる完全
なヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単
離された核酸分子である。
【０６６３】 さらに好ましい実施形態は、以下：配列番号Ｘのヌクレオチド配列またはその
相補鎖およびｃＤＮＡプラスミドＶによりコードされるヌクレオチド配列からな
る群から選択される配列中の少なくとも５０個連続したヌクレオチドの配列と少
なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を、生物学的サンプ
ルにおいて検出するための方法であって、上記の方法は、上記の群から選択され
る配列と、上記のサンプル中の少なくとも１つの核酸分子のヌクレオチド配列と
を比較する工程、および上記サンプル中の上記核酸分子の配列が、上記の選択さ
れた配列に対して少なくとも９５％同一であるか否かを決定する工程を包含する
。
【０６６４】 上記の配列を比較する工程が、上記サンプル中の核酸分子と、上記の群から選
択される上記の配列を含む核酸分子との間の核酸ハイブリダイゼーションの程度
を決定する工程を包含する、上記方法もまた好ましい。同様に、上記の配列を比
較する工程が、上記サンプル中の核酸分子から決定されるヌクレオチド配列と、
上記の群から選択される配列とを比較する工程によって実施される、上記方法も
また好ましい。核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含み得る。
【０６６５】 さらに好ましい実施形態は、生物学的サンプルの種、組織、または細胞型を同
定するための方法であって、この方法は、以下からなる群から選択される配列中
の少なくとも５０個連続したヌクレオチドの配列と少なくとも９５％同一である
ヌクレオチド配列を含む上記サンプル中の核酸分子を（もしあれば）検出する工
程を包含する：配列番号Ｘのヌクレオチド配列またはその相補鎖およびｃＤＮＡ
プラスミドＶによりコードされるヌクレオチド配列。
【０６６６】 生物学的サンプルの種、組織、または細胞型を同定するための方法は、少なく
とも２つのヌクレオチド配列のパネル中のヌクレオチド配列を含む核酸分子を検
出する工程を包含し得、ここで上記パネル中の少なくとも１つの配列は、上記の
群から選択される配列中の少なくとも５０個連続したヌクレオチドの配列と少な
くとも９５％同一である。
【０６６７】 タンパク質をコードする、配列番号Ｘのヌクレオチド配列もしくはその相補鎖
またはｃＤＮＡプラスミドＶのヌクレオチド配列の、異常な構造または発現と関
連する病理学的状態を、被験体において診断するための方法もまた好ましく、こ
の方法は、以下からなる群から選択される配列中の少なくとも５０個連続したヌ
クレオチドの配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、核酸
分子を、（もしあれば）上記被験体から得られる生物学的サンプルにおいて検出
する工程を包含する：配列番号Ｘのヌクレオチド配列またはその相補鎖およびｃ
ＤＮＡプラスミドＶのヌクレオチド配列。
【０６６８】 病理学的状態を診断するための方法は、少なくとも２つのヌクレオチド配列の
パネル中のヌクレオチド配列を含む核酸分子を検出する工程を包含し得、ここで
、上記パネル中の少なくとも１つの配列は、上記群から選択される配列中の少な
くとも５０個連続したヌクレオチドの配列と少なくとも９５％同一である。
【０６６９】 上記の核酸分子のヌクレオチド配列が、少なくとも２つのヌクレオチド配列の
パネルを含む、単離された核酸分子を含む組成物もまた好ましく、ここで上記の
パネル中の少なくとも１つの配列は、以下からなる群から選択される配列中の少
なくとも５０個連続したヌクレオチドの配列と少なくとも９５％同一である：配
列番号Ｘのヌクレオチド配列またはその相補鎖およびｃＤＮＡプラスミドＶによ
りコードされるヌクレオチド配列。この核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分
子を含み得る。
【０６７０】 配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘもしくはその相補鎖によりコード
されるポリペプチドおよび／またはｃＤＮＡプラスミドＶによりコードされるポ
リペプチド中の少なくとも約１０個連続したアミノ酸の配列と少なくとも９０％
同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０６７１】 配列番号Ｙのアミノ酸配列；配列番号Ｘもしくはその相補鎖によりコードされ
るポリペプチドのアミノ酸配列および／またはｃＤＮＡプラスミドＶによりコー
ドされるポリペプチドのアミノ酸配列中の少なくとも約３０個連続したアミノ酸
の配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド
もまた好ましい。
【０６７２】 配列番号Ｙのアミノ酸配列；配列番号Ｘもしくはその相補鎖によりコードされ
るポリペプチドのアミノ酸配列および／またはｃＤＮＡプラスミドＶによりコー
ドされるポリペプチドのアミノ酸配列中の少なくとも約１００個連続したアミノ
酸の配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチ
ドはさらに好ましい。
【０６７３】 配列番号Ｙの完全アミノ酸配列；配列番号Ｘもしくはその相補鎖によりコード
されるポリペプチドの完全アミノ酸配列および／またはｃＤＮＡプラスミドＶに
よりコードされるポリペプチドの完全アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のア
ミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
【０６７４】 ｃＤＮＡプラスミドＶによりコードされるポリペプチドの完全アミノ酸配列中
の少なくとも約１０個連続したアミノ酸の配列と少なくとも９０％同一のアミノ
酸配列を含む、単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
【０６７５】 上記の連続したアミノ酸の配列が、ｃＤＮＡプラスミドＶによってコードされ
るポリペプチド；配列番号Ｘもしくはその相補鎖によりコードされるポリペプチ
ドおよび／または配列番号Ｙのポリペプチド配列の一部のアミノ酸配列に含まれ
る、ポリペプチドもまた好ましい。
【０６７６】 ｃＤＮＡプラスミドＶによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列中の
少なくとも約３０個連続したアミノ酸の配列と少なくとも９５％同一であるアミ
ノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０６７７】 ｃＤＮＡプラスミドＶによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列中の
少なくとも約１００個連続したアミノ酸の配列と少なくとも９５％同一であるア
ミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０６７８】 ｃＤＮＡプラスミドＶによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少
なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた
好ましい。
【０６７９】 以下からなる群から選択される配列中の、少なくとも１０個連続したアミノ酸
の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して
特異的に結合する単離された抗体は、さらに好ましい：配列番号Ｙのポリペプチ
ド；配列番号Ｘもしくはその相補鎖によりコードされるポリペプチド配列および
ｃＤＮＡプラスミドＶによりコードされるポリペプチド。
【０６８０】 以下：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘもしくはその相補鎖により
コードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミドＶによりコードされるポリ
ペプチドからなる群から選択された配列中の、少なくとも１０個連続したアミノ
酸の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを、生
物学的サンプルにおいて検出する方法はさらに好ましく；この方法は、このサン
プル中における少なくとも１つのポリペプチド分子のアミノ酸配列をこの群から
選択された配列と比較する工程およびこのサンプル中におけるこのポリペプチド
分子の配列が、少なくとも１０個連続したアミノ酸のこの配列と少なくとも９０
％同一であるかどうかを決定する工程を含む。
【０６８１】 このサンプル中における少なくとも１つのポリペプチド分子のアミノ酸配列を
、この群から選択された配列と比較するこの工程が、このサンプル中のポリペプ
チドの、以下：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘもしくはその相補鎖
によりコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミドＶによりコードされ
るポリペプチドからなる群から選択された配列中の少なくとも１０個連続したア
ミノ酸の配列に対して、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペ
プチドと特異的に結合する抗体に対する特異的な結合の程度を決定することを含
む、上記の方法もまた好ましい。
【０６８２】 配列を比較する工程が、このサンプル中のポリペプチド分子から決定されたア
ミノ酸配列を、この群から選択されたこの配列と比較することによって行われる
、上記の方法もまた好ましい。
【０６８３】 生物学的サンプルの種、組織または細胞型を同定する方法もまた好ましく、こ
こでこの方法は、もし存在するならば、以下からなる群から選択される配列にお
ける少なくとも１０個連続したアミノ酸の配列と少なくとも９０％同一であるア
ミノ酸配列を含むポリペプチド分子をこのサンプル中で検出する工程を含む：配
列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘもしくはその相補鎖によりコードされ
るポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミドＶによりコードされるポリペプチド。
【０６８４】 生物学的サンプルの種、組織または細胞型を同定する上記の方法もまた好まし
く、ここでこの方法は、少なくとも２つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ
酸配列を含むポリペプチド分子を検出する工程を含み、ここでこのパネル中の少
なくとも１つの配列は、上記の群から選択された配列における少なくとも１０個
連続したアミノ酸の配列と少なくとも９０％同一である。
【０６８５】 被験体において、表１において同定された、ポリペプチドをコードする核酸配
列の異常な構造または発現に関連する病的状態を診断する方法もまた、好ましく
、ここで、この方法は、この被験体から得られた生物学的サンプルにおいて、少
なくとも２つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ酸配列を含むポリペプチド
分子を検出する工程を含み、ここでこのパネル中の少なくとも１つの配列は、以
下からなる群から選択される配列における少なくとも１０個連続したアミノ酸の
配列と少なくとも９０％同一である：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号
Ｘもしくはその相補鎖によりコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミ
ドＶによりコードされるポリペプチド。
【０６８６】 これらの方法のいずれかにおいて、上記ポリペプチド分子を検出する工程は、
抗体を使用することを包含する。
【０６８７】 以下からなる群から選択された配列中の、少なくとも１０個連続したアミノ酸
の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列と、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む
、単離された核酸分子もまた好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番
号Ｘもしくはその相補鎖によりコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラス
ミドＶによりコードされるポリペプチド。
【０６８８】 上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、原核生物宿主でのこのポ
リペプチドの発現について最適化されている、単離された核酸分子もまた好まし
い。
【０６８９】 上記ポリペプチドが以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離
された核酸分子もまた好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘも
しくはその相補鎖によりコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミドＶ
によりコードされるポリペプチド。
【０６９０】 上記の単離された核酸分子のいずれかをベクター中に挿入する工程を含む、組
換えベクターの作製方法はさらに好ましい。この方法によって生成された組換え
ベクターも、好ましい。宿主細胞中にベクターを導入する工程を含む、組換え宿
主細胞を作製する方法、ならびにこの方法によって生成された組換え宿主細胞も
また好ましい。
【０６９１】 単離されたポリペプチドを作製する方法であって、このポリペプチドが発現さ
れるような条件下でこの組換え宿主細胞を培養する工程、およびこのポリペプチ
ドを回収する工程を包含する方法もまた好ましい。この組換え宿主細胞が真核生
物細胞であり、そしてこのポリペプチドが以下からなる群から選択されたアミノ
酸配列を含むヒトタンパク質である、単離されたポリペプチドを作製するこの方
法もまた好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘもしくはその相
補鎖によりコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミドＶによりコード
されるポリペプチド。この方法によって生成された単離されたポリペプチドもま
た好ましい。
【０６９２】 増加したレベルのタンパク質活性を必要とする個体を処置する方法もまた、好
ましく、ここで、この方法は、このような個体に、この個体においてこのタンパ
ク質の活性のレベルを増加させるのに有効な量の、本願発明の単離されたポリペ
プチド、ポリヌクレオチド、その免疫原性フラグメントもしくはアナログ、結合
因子、抗体、あるいは抗原結合フラグメントを含む治療剤を投与する工程を包含
する。
【０６９３】 減少したレベルのタンパク質活性を必要とする個体を処置する方法もまた、好
ましく、ここで、この方法は、このような個体に、この個体においてこのタンパ
ク質の活性のレベルを減少させるのに有効な量の、本願発明の単離されたポリペ
プチド、ポリヌクレオチド、その免疫原性フラグメントもしくはアナログ、結合
因子、抗体、あるいは抗原結合フラグメントを含む治療剤を投与する工程を包含
する。
【０６９４】 本発明の特定の実施形態では、表２の４番目の列に列挙される各「コンティグ
ＩＤ」について、好ましくは、表２の５番目の列で参照されるヌクレオチド配列
、および一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここでａおよびｂは
、表２の列３で参照される対応する配列番号Ｘについて独自に決定される）を含
むか、またはそのようなヌクレオチド配列からなる、１つ以上のポリヌクレオチ
ドが除外される。さらに特定の実施形態は、表２の５列目において言及される特
定のポリヌクレオチド配列の１、２、３、４個、またはそれ以上を除外するポリ
ヌクレオチド配列に関する。
【０６９５】 好ましくは、一般式ｃ−ｄによって記載されるヌクレオチド配列を含む１つ以
上のポリヌクレオチドが本発明から除外され、ここでｃおよびｄの両方は、配列
番号Ｘに示されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてｄは、ｃ＋１４以上
である。
【０６９６】 この列挙は、この一般式により除外され得る配列の全てを含むことを決して意
味せず、この表は、単に例示的な例である。これらの登録を通じて利用可能な全
ての文献は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０６９７】
【表２】
【０６９８】
【表３】
【０６９９】
【表４】 概して、本発明を記載してきたが、例示の目的のために提供されかつ限定するこ
とを意図しない、以下の実施例を参照することによって、本発明はより容易に理
解される。
【０７００】 （実施例） （実施例１：選択されたｃＤＮＡクローンの寄託されたサンプルからの単離） 引用されるＡＴＣＣ寄託物中の各ｃＤＮＡクローンは、プラスミドベクター中
に含まれる。表１は、各クローンが単離されたｃＤＮＡライブラリーを構築する
ために用いられたベクターを同定する。多くの場合において、ライブラリーを構
築するために使用されたベクターは、プラスミドが切り出されたファージベクタ
ーである。すぐ下の表は、ｃＤＮＡライブラリーを構築する際に使用される各フ
ァージベクターについて関連するプラスミドを相関づける。例えば、特定のクロ
ーンがベクター「Ｌａｍｂｄａ Ｚａｐ」中に単離されていると表１に同定され
る場合、対応する寄託クローンは、「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ」である。
【０７０１】
【表５】 ベクターＬａｍｂｄａ Ｚａｐ（米国特許第５，１２８，２５６号および同第
５，２８６，６３６号）、Ｕｎｉ−Ｚａｐ ＸＲ（米国特許第５，１２８，２５
６号および同第５，２８６，６３６号）、Ｚａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓ（米国特許第
５，１２８，２５６号および同第５，２８６，６３６号）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ（ｐＢＳ）（Ｓｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１６：７５８３−７６００（１９８８）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ
．およびＳｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７
：９４９４（１９８９））ならびにｐＢＫ（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ．
ら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ５：５８−６１（１９９２））は、Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、１１０１１ Ｎ．Ｔｏｒ
ｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，９２０３７から市販
されている。ｐＢＳは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてｐＢＫはネオマ
イシン耐性遺伝子を含む。両方とも、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（これ
もまた、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）に形質転換され得る。ｐＢ
Ｓは、ＳＫ＋、ＳＫ−、ＫＳ＋およびＫＳの４形態で入荷する。ＳおよびＫとは
、ポリリンカー領域（「Ｓ」とはＳａｃＩであり、そして「Ｋ」とは、ＫｐｎＩ
のことであり、これらは、リンカーのそれぞれの各末端での最初の部位である）
に隣接するＴ７およびＴ３プライマー配列に対するポリリンカーの配向をいう。
「＋」または「−」とは 、ある方向においてｆ１ ｏｒｉから開始される一本
鎖レスキューがセンス鎖ＤＮＡを生成し、そして他方においてアンチセンスであ
るようなｆ１複製起点（「ｏｒｉ」）の配向をいう。
【０７０２】 ベクターｐＳｐｏｒｔ１、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ ２．０およびｐＣＭＶＳｐｏ
ｒｔ３．０をＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ
６００９、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ２０８９７から入手した。全ての
Ｓｐｏｒｔベクターはアンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株Ｄ
Ｈ１０Ｂ（これもまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能であ
る）に形質転換され得る。（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｆｏｃｕｓ
１５：５９（１９９３）を参照のこと）。ベクターｌａｆｍｉｄ ＢＡ（Ｂｅｎ
ｔｏ Ｓｏａｒｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ）は、ア
ンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅに形質
転換され得る。ベクターｐＣＲ（登録商標）２．１（これはＩｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ、１６００ Ｆａｒａｄａｙ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ９２
００８から入手可能である）は、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃ
ｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である
）に形質転換され得る（例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１６：９６７７−９６８６（１９８８）およびＭｅａｄ，Ｄ．ら、Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：（１９９１）を参照のこと）。好ましくは、本
発明のポリヌクレオチドは、表１における特定のクローンについて同定されたフ
ァージベクター配列、ならびに上記に示された対応するプラスミドベクター配列
を含まない。
【０７０３】 表１に引用される、任意の所定のｃＤＮＡクローンについてＡＴＣＣ受託番号
を与えられたサンプルにおける寄託された物質はまた、１つ以上のさらなるプラ
スミド（これは各々、その所定のクローンとは異なるｃＤＮＡクローンを含む）
を含み得る。従って、同じＡＴＣＣ受託番号を共有する寄託物は、表１に同定さ
れる各ｃＤＮＡクローンのためのプラスミドを少なくとも含む。代表的には、表
１に引用される各ＡＴＣＣ寄託物のサンプルは、ほぼ等量（重量で）の約５０個
のプラスミドＤＮＡ（これは各々、異なるｃＤＮＡクローンを含む）の混合物を
含む；しかし、このような寄託サンプルは、５０個よりも多いかまたは少ないｃ
ＤＮＡクローン（約５００個までのｃＤＮＡクローン）のためのプラスミドを含
み得る。
【０７０４】 表１における特定のクローンについて引用されるプラスミドＤＮＡの寄託サン
プルからそのクローンを単離するために２つのアプローチが使用され得る。第一
に、プラスミドを、配列番号Ｘに対応するポリヌクレオチドプローブを使用して
、クローンをスクリーニングすることによって直接単離する。
【０７０５】 特に、３０〜４０ヌクレオチドを有する特定のポリヌクレオチドを、報告され
ている配列に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＤＮＡ合成装置
を使用して合成する。オリゴヌクレオチドを、例えば、３２Ｐ−γ−ＡＴＰで、
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識し、そして慣用的な方法に従って精
製する。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ、ＮＹ（１９８２））。プラスミ
ド混合物を、当業者に公知の技術（例えば、ベクター供給者によって提供される
技術または上記で引用された関連の刊行物もしくは特許において提供される技術
）を用いて、上記のような適切な宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ））に形質転換する。形質転換体を１．５％寒天プレート（適切な
選択薬剤、例えば、アンピシリンを含む）に、１プレートあたり約１５０の形質
転換体（コロニー）の密度でプレーティングする。これらのプレートを、細菌コ
ロニースクリーニングについての慣用的な方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ、第２版、（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１．９３〜１．１０４頁）または当業者に公知の他
の技術に従って、ナイロンメンブレンを使用してスクリーニングする。
【０７０６】 あるいは、配列番号Ｘの両端（すなわち、表１に規定されるクローンの５’Ｎ
Ｔおよび３’ＮＴによって囲まれる配列番号Ｘの領域内）に由来する、１７〜２
０ヌクレオチドの２つのプライマーを合成し、そしてこれらを使用して、寄託さ
れたｃＤＮＡプラスミドをテンプレートとして使用して、所望のｃＤＮＡを増幅
する。ポリメラーゼ連鎖反応を、慣用的な条件下で、例えば、０．５μｇの上記
ｃＤＮＡテンプレートとの反応混合物の２５μｌ中で実施する。便利な反応混合
物は、１．５〜５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、それぞれ
２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライ
マーおよび０．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼである。３５サイクルのＰＣ
Ｒ（９４℃での変性を１分間；５５℃でのアニールを１分間；７２℃での伸長を
１分間）を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ自動化サーマルサイクラー
を用いて実施する。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、そして予
想される分子量のＤＮＡバンドを切り出し、そして精製する。ＰＣＲ産物を、Ｄ
ＮＡ産物をサブクローニングおよび配列決定することによって、選択された配列
であることを確認する。
【０７０７】 寄託されたクローンに存在しないかもしれない遺伝子の５’非コード部分また
は３’非コード部分の同定のために、いくつかの方法が利用可能である。これら
の方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フィルタープローブ探索、特異
的プローブを使用するクローン富化、および当該分野で周知である５’および３
’「ＲＡＣＥ」プロトコルと類似するかまたは同一のプロトコル。例えば、５’
ＲＡＣＥに類似する方法は、所望の全長転写物の欠けている５’末端を生成する
ために利用可能である（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３））。
【０７０８】 簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転写物をお
そらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結する。連結されたＲＮＡオリゴヌクレ
オチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライ
マーを含むプライマーセットを使用して、所望の全長遺伝子の５’部分をＰＣＲ
増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれを使用して全
長遺伝子を生成し得る。
【０７０９】 この上記の方法は、所望の供給源から単離された総ＲＮＡを用いて開始するが
、ポリＡ＋ＲＮＡをも使用し得る。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスフ
ァターゼで処理して、後のＲＮＡリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷ＲＮ
Ａの５’リン酸基を排除し得る。次いで、ホスファターゼを不活化するべきであ
り、そしてＲＮＡをメッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を
除去するために、タバコ酸性ピロホスファターゼを用いて処理するべきである。
この反応は、次いでＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドに
連結され得る、キャップ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残す。
【０７１０】 この改変型ＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第
一鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用する。第一鎖合成反応物を、
連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子
の公知の配列に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のた
めのテンプレートとして使用する。次いで、得られた生成物を配列決定し、そし
て分析して５’末端配列が所望の遺伝子に属することを確認する。
【０７１１】 （実施例２：ポリヌクレオチドに対応するゲノムクローンの単離） ヒトゲノムＰ１ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）
を、実施例１に記載される方法に従って、配列番号Ｘに対応するｃＤＮＡ配列に
ついて選択されたプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングする（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋもまた参照のこと）。
【０７１２】 （実施例３：ポリペプチドの組織分布） 本発明のポリヌクレオチドのｍＲＮＡ発現の組織分布を、とりわけ、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋらによって記載されるノーザンブロット分析についてのプロトコルを用
いて決定する。例えば、実施例１に記載される方法によって生成されるｃＤＮＡ
プローブを、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅＴＭ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅ
ｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、製造者の指示に
従って、Ｐ３２で標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１
００ＴＭカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を
使用して、製造者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って精製する。次いで
、精製した標識プローブを使用して、種々のヒト組織をｍＲＮＡ発現について試
験する。
【０７１３】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン
（ＭＴＮ）ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＴＭハイブ
リダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造者のプロトコル番号
ＰＴ１１９０−１に従って、標識プローブで試験する。ハイブリダイゼーション
および洗浄後、ブロットをマウントして、そして−７０℃で一晩フィルムに露出
し、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。
【０７１４】 （実施例４：ポリヌクレオチドの染色体マッピング） オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、配列番号Ｘの５’末端の配列に従
って設計する。このプライマーは、好ましくは約１００ヌクレオチドにわたる。
次いで、このプライマーセットを、以下のセットの条件下でポリメラーゼ連鎖反
応に使用する：９５℃で３０秒；５６℃で１分；７０℃で１分。このサイクルを
３２回反復し、次いで１回、７０℃で５分間のサイクルを行う。個々の染色体ま
たは染色体フラグメントを含む体細胞ハイブリッドパネル（Ｂｉｏｓ，Ｉｎｃ）
に加えて、ヒト、マウス、およびハムスターのＤＮＡを鋳型として使用する。反
応物を、８％ポリアクリルアミドゲルまたは３．５％アガロースゲルのいずれか
で分析する。染色体マッピングを、特定の体細胞ハイブリッドにおける約１００
ｂｐのＰＣＲフラグメントの存在によって決定する。
【０７１５】 （実施例５：ポリペプチドの細菌性発現） 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、実施例１に概説する
ように、ＤＮＡ配列の５’および３’末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド
プライマーを使用して増幅して挿入フラグメントを合成する。ｃＤＮＡ挿入物を
増幅するために使用されるプライマーは、発現ベクターに増幅産物をクローニン
グするために、プライマーの５’末端にＢａｍＨＩおよびＸｂａＩのような制限
部位を好ましくは含むべきである。例えば、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩは、細菌
性発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，
ＣＡ）の制限酵素部位に対応する。このプラスミドベクターは、抗生物質耐性（
Ａｍｐｒ）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧで調節可能なプロモーター／
オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−ヒスチジンタグ
（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位をコードする。
【０７１６】 ｐＱＥ−９ベクターをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして、増幅され
たフラグメントを細菌性ＲＢＳにおいて開始されるリーディングフレームを維持
しながらｐＱＥ−９ベクターに連結する。次いで、連結混合物を、ｌａｃＩリプ
レッサーを発現し、またカナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）を与えるプラスミドｐＲ
ＥＰ４の多重コピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，
Ｉｎｃ．）を形質転換するために使用する。形質転換体を、ＬＢプレート上で生
育するそれらの能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コ
ロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって確認す
る。
【０７１７】 所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（
２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）
増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を、１：１００〜１：２５０の比で大量培養物に接種
するために使用する。細胞を、０．４と０．６との間の光学密度６００（Ｏ．Ｄ
．６００）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド）を最終濃度１ｍＭになるように加える。ＩＰＴＧは、ｌａｃ
Ｉリプレッサーの不活化により誘導され、Ｐ／Ｏの障害物を除去し、遺伝子発現
の増加を導く。
【０７１８】 細胞を、さらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離（６０００×
ｇで２０分間）によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック剤である６
ＭグアニジンＨＣｌ中に、４℃で３〜４時間攪拌することによって溶解させる。
細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてポリペプチドを含む上清を、ニッ
ケル−ニトリロ三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（ＱＩＡ
ＧＥＮ，Ｉｎｃ．前出より入手可能）にロードする。６×Ｈｉｓタグを有するタ
ンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高い親和性で結合し、そして単純な１工程手順
で精製され得る（詳細には、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（１９
９５）ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出を参照のこと）。
【０７１９】 手短に言えば、上清を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８のカラムにロードし
、そのカラムを、最初に１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８で洗浄し、
次いで１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ６で洗浄し、最後にポリペプチ
ドを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ５で溶出する。
【０７２０】 次いで、精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または５
０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６の緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌに対して
透析することにより再生させる。あるいは、タンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラムに
固定化している間に、首尾よく再折畳みされ得る。推奨条件は以下の通りである
：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロー
ル、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４中の６Ｍ〜１Ｍ尿素の直線勾配を
使用する再生。再生は１．５時間以上の時間をかけて行うべきである。再生後、
タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールの添加によって溶出させる。イミダゾール
を、ＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ６の緩衝液および２００ｍＭ
ＮａＣｌに対する最終の透析工程によって除去する。精製したタンパク質を、４
℃で保存するか、または−８０℃で凍結する。
【０７２１】 上記の発現ベクターに加えて、本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドに
作動可能に連結されたファージオペレーターおよびプロモーターエレメントを含
み、ｐＨＥ４ａと呼ばれる発現ベクターを含む（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４５
、１９９８年２月２５日に寄託）。このベクターは以下を含む：１）選択マーカ
ーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏｌｉ複
製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配
列、５）シャイン−ダルガーノ配列、および６）ラクトースオペロンリプレッサ
ー遺伝子（ｌａｑＩｑ）。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ，Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に由来する。プロモーター配列およびオペレータ
ー配列を合成的に作製する。
【０７２２】 ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８によっ
てベクターを制限処理し、制限生成物をゲルで泳動し、そしてより大きな方のフ
ラグメント（スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントは約３１０塩基対で
あるべきである）を単離することによって、ＤＮＡをｐＨＥａに挿入し得る。Ｄ
ＮＡ挿入物を、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘｈ
ｏＩ、またはＡｓｐ７１８（３’プライマー）に対する制限部位を有するＰＣＲ
プライマーを使用して、実施例１に記載のＰＣＲプロトコルに従って生成する。
ＰＣＲ挿入物を、ゲル精製し、そして適合する酵素で制限処理する。挿入物およ
びベクターを標準的なプロトコルに従って連結する。
【０７２３】 操作されたベクターは、上記のプロトコルにおいて、細菌系でタンパク質を発
現させるために容易に置換され得る。
【０７２４】 （実施例６：封入体からのポリペプチドの精製） 以下の別の方法は、ポリペプチドが封入体の形態で存在する場合に、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ中で発現されたポリペプチドを精製するために使用され得る。他に指定され
ない場合には、以下のすべての工程は４〜１０℃で行われる。
【０７２５】 Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生産期の完了後、細胞培養物を４〜１０℃に冷却し、そし
て１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）に
よって細胞を採集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想され
る収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切
な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を含む緩衝溶液に懸濁させる。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸濁
液に分散させる。
【０７２６】 次いで、細胞をマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（
Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ
．）に２回、４０００〜６０００ｐｓｉで溶液を通すことによって溶解させる。
次いでホモジネートを、最終濃度０．５Ｍ ＮａＣｌになるようにＮａＣｌ溶液
と混合し、続いて７０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。得られたペレットを
、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を使用して再度洗浄する。
【０７２７】 得られた洗浄した封入体を、１．５Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜
４時間可溶化する。７０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄し
、そしてポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートしてさらなるＧｕ
ＨＣｌ抽出を可能にする。
【０７２８】 不溶性粒子を除去するための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）に続き、Ｇｕ
ＨＣｌ可溶化タンパク質を、ＧｕＨＣｌ抽出物と、５０ｍＭ ナトリウム、ｐＨ
４．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝液とを
、激しい攪拌で迅速に混合することによって、再折畳みさせる。再折畳みした希
釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合しないで４℃で保
つ。
【０７２９】 再折畳みされたポリペプチド溶液を清澄にするために、４０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ６．０で平衡化した、適切な表面積を有する０．１６μｍメンブレンフ
ィルターを備えるあらかじめ準備した接線濾過ユニット（例えば、Ｆｉｌｔｒｏ
ｎ）を使用する。濾過したサンプルを、カチオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ
ＨＳ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にロードする
。このカラムを４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄し、そして同じ緩
衝液中の２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ ＮａＣ
ｌで、段階的な様式で溶出する。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を連続的に
モニターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析する
。
【０７３０】 次いでポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量の水と混合する。次
いで希釈されたサンプルを、あらかじめ準備した強アニオン（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ
−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）交換樹脂および弱アニ
オン（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）交換樹脂の直列カラムのセットにロードする。カラムを４０ｍＭ 酢酸ナトリ
ウム、ｐＨ６．０で平衡化する。両方のカラムを、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、
ｐＨ６．０、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いでＣＭ−２０カラムを１０
カラム容量の直線勾配（０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ
６．０から１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．５の範囲
）を用いて溶出させる。画分を、溶出液の定常Ａ２８０モニタリング下で収集す
る。次いで、（例えば、１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判明した）ポリペプ
チドを含む画分をプールする。
【０７３１】 得られたポリペプチドは、上記の再折畳みおよび精製工程の後で９５％より高
い純度を示すはずである。５μｇの精製タンパク質がロードされる場合、いかな
る主たる混在バンドも、クマシーブルー染色した１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
から観察されないはずである。精製タンパク質はまた、エンドトキシン／ＬＰＳ
混在について試験され得、そして代表的には、ＬＰＳ含量はＬＡＬアッセイに従
って、０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。
【０７３２】 （実施例７：バキュロウイルス発現系におけるポリペプチドのクローニングお
よび発現） この実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２を使用して、ポリヌ
クレオチドをバキュロウイルスに挿入し、ポリペプチドを発現する。この発現ベ
クターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体ウイルス（
ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてＢａｍＨＩ、Ｘｂａ
Ｉ、およびＡｓｐ７１８のような簡便な制限部位を含む。シミアンウイルス４０
（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために使
用する。組換えウイルスの容易な選択のために、このプラスミドは、同方向の弱
いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含
む。挿入された遺伝子は、クローン化したポリヌクレオチドを発現する生存可能
なウイルスを生成する、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性の相同組換えのた
めのウイルス配列と両方の側で隣接する。
【０７３３】 他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル（必要とされる場合、シグナル
ペプチドおよびインフレームなＡＵＧを含む）を提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。
【０７３４】 具体的には、ＡＵＧ開始コドンを含み、そして表１に同定されたリーダー配列
に天然に結合した寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡ配列を、実施例１に記
載されるＰＣＲプロトコルを使用して増幅させる。天然に存在するシグナル配列
を使用してヒトタンパク質を産生する場合、ｐＡ２ベクターは第２のシグナルペ
プチドを必要としない。あるいは、Ｓｕｍｍｅｒｓら、「Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏ
ｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎ
ｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｔｅ
ｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏ
ｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＮＯ．：１５５５（１９８７）に記載される標準的な方
法を用いて、このベクターを、バキュロウイルスリーダー配列を含むように改変
し得る（ｐＡ２ＧＰ）。
【０７３５】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロース
ゲルから単離する。次いで、このフラグメントを適切な制限酵素で消化し、そし
て再び１％アガロースゲル上で精製する。
【０７３６】 このプラスミドを対応する制限酵素で消化し、そして必要に応じて、当該分野
で公知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸し得る
。次いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０
１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロースゲルか
ら単離する。
【０７３７】 このフラグメントおよび脱リン酸したプラスミドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを
用いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞またはＸＬ−１ Ｂｌｕ
ｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ，ＣＡ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合液で形質転換
し、そして培養プレート上に拡げる。このプラスミドを含む細菌を、個々のコロ
ニー由来のＤＮＡを消化し、そしてゲル電気泳動によって消化産物を分析するこ
とにより同定する。クローニングしたフラグメントの配列を、ＤＮＡシーケンス
によって確認する。
【０７３８】 このポリヌクレオチドを含む５μｇのプラスミドを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９
８７）によって記載されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市販の
線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭ ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と同
時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭ ウイルスＤＮＡ
および５μｇのプラスミドを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む、
マイクロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０μｌの
リポフェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で１５
分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清のグ
レース培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細胞
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下する。次いで、このプレートを２７℃で
５時間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をこのプレート
から除去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を
添加する。次いで、培養を２７℃で４日間継続する。
【０７３９】 ４日後上清を収集し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によっ
て記載されるようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むア
ガロースゲルを使用して、ｇａｌが発現しているクローン（青色に染色したプラ
ークを生ずる）の容易な同定および単離を可能にする（この型の「プラークアッ
セイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，９−１０頁によって頒布される、昆虫細胞培養およ
びバキュロウイルス学のための使用者ガイドの中に見出され得る）。適切なイン
キュベーションの後、青色に染色したプラークを、マイクロピペッターのチップ
（例えば、エッペンドルフ）で拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２
００μｌのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁させ、そして組
換えバキュロウイルスを含む懸濁液を使用して、３５ｍｍディッシュに播種した
Ｓｆ９細胞を感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を採集し、次
いで４℃に貯蔵する。
【０７４０】 ポリペプチドの発現を確認するために、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレ
ース培地中で、Ｓｆ９細胞を増殖させる。この細胞を、約２の感染効率（「ＭＯ
Ｉ」）で、このポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスで感染させる。
放射性標識したタンパク質を所望する場合には、６時間後に培地を除去し、そし
てメチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤから入手可
能）に置き換える。４２時間後、５μＣｉの３５Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉ
の３５Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさ
らに１６時間インキュベートし、次いで遠心分離によって採集する。上清中のタ
ンパク質ならびに細胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、次いでオー
トラジオグラフィーによって（放射性標識した場合）分析する。
【０７４１】 精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定法を使用して、産
生されたタンパク質のアミノ末端配列を決定し得る。
【０７４２】 （実施例８：哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現） 本発明のポリペプチドを、哺乳動物細胞において発現させ得る。代表的な哺乳
動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモーターエレメント
、タンパク質コード配列、および転写の終結および転写物のポリアデニル化に必
要なシグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コザック（Ｋｏｚ
ａｋ）配列、ならびに、ＲＮＡスプライシングのためのドナー部位およびアクセ
プター部位に隣接する介在配列を含む。非常に効率的な転写は、ＳＶ４０由来の
初期および後期プロモーター、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、Ｈ
ＩＶＩ）由来の長末端反復（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
の初期プロモーターを用いて達成される。しかし、細胞内エレメント（例えば、
ヒトアクチンプロモーター）もまた、使用され得る。
【０７４３】 本発明を実施する際の使用に適切な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよび
ｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃ
ａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、
ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、ならび
にｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０のようなベクターを含む。使用され得る哺乳動物宿
主細胞としては、ヒトのＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞およびＪｕｒｋａ
ｔ細胞、マウスのＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １細胞、Ｃｏ
ｓ ７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラのＱＣ１−３細胞、マウスのＬ細胞、およ
びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
【０７４４】 あるいは、ポリペプチドは、染色体に組み込まれたポリヌクレオチドを含む、
安定な細胞株中で発現され得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマ
イシンのような選択マーカーを用いる同時トランスフェクションは、トランスフ
ェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
【０７４５】 トランスフェクトされた遺伝子はまた、大量のコードされたタンパク質を発現
するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、
目的の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する細胞株の開発に有用であ
る（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７
−１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：１０７−１４３（１９９
０）；Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．ら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、９：６４−６８（１９９１）を参照のこと）。別の有用な選択
マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ
ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６９−１７５（１９９２））。こ
れらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させ、そしてもっ
とも高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組み込まれ
た、増幅した遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳ
Ｏ細胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。
【０７４６】 プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体であ
る、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴ
ＣＣ受託番号２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３８−４４７（
１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）、およびＣＭＶ−エンハン
サー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ （１９８５））の
フラグメントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８の制
限酵素切断部位を有するマルチプルクローニングサイトは、目的の遺伝子のクロ
ーニングを容易にする。このベクターはまた、３’イントロン、ラットプレプロ
インスリン遺伝子のポリアデニル化シグナルおよび終結シグナル、ならびに、Ｓ
Ｖ４０初期プロモーターの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【０７４７】 具体的には、例えば、プラスミドｐＣ６を、適切な制限酵素を用いて消化し、
次いで当該分野で公知の手順によって、仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リ
ン酸する。次いで、ベクターを１％アガロースゲルから単離する。
【０７４８】 本発明のポリヌクレオチドは、実施例１に概説するプロトコルに従って増幅さ
れる。ヒトタンパク質の産生のために天然に存在するシグナル配列が用いられる
場合、このベクターは、第２のシグナルペプチドを含む必要はない。あるいは、
天然に存在するシグナル配列が用いられない場合、このベクターは、異種シグナ
ル配列を含むように改変され得る（例えば、ＷＯ９６／３４８９１を参照のこと
）。
【０７４９】 増幅フラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０
１ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロースゲルか
ら単離する。次いで、このフラグメントを、適切な制限酵素で消化し、そして再
び１％アガロースゲルで精製する。
【０７５０】 次いで、増幅フラグメントを同じ制限酵素で消化し、そして１％アガロースゲ
ルで精製する。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化したベクター
を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１また
はＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＣ６に挿入された
フラグメントを含む細菌を、例えば、制限酵素分析を用いて同定する。
【０７５１】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ６ ａ ｐＣ４を、リ
ポフェクチン（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を使用して、０．５μｇのプラスミド
ｐＳＶｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏ
は、優性選択マーカーである、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐性を付与
する酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌ
のＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン
処理し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１
ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニ
ングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種する。約１０〜１４
日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いでメトトレキサートの異なる濃
度（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して
、６ウェルのペトリ皿または１０ｍｌのフラスコに播種する。次いで、メトトレ
キサートの最高濃度で増殖するクローンを、さらに高い濃度（１μＭ、２μＭ、
５μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）のメトトレキサートを含む新たな６ウェルプレー
トに移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られ
るまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび
ウエスタンブロットによって、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０７５２】 （実施例９：タンパク質融合物） 本発明のポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。これら
の融合タンパク質は、種々の適用に使用され得る。例えば、本発明のポリぺプチ
ドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマルトー
ス結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（実施例５を参照のこと；ＥＰ
Ａ ３９４，８２７もまた参照のこと；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３３１：８４−８６（１９８８））。同様に、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−３、お
よびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大させる。本発明のポリぺ
プチドに融合した核局在化シグナルは、タンパク質を特定の細胞内局在に標的化
し得る。一方、共有結合ヘテロニ量体またはホモニ量体は、融合タンパク質の活
性を増大または減少させ得る。融合タンパク質はまた、１つより多い機能を有す
るキメラ分子を作製し得る。最後に、融合タンパク質は、非融合タンパク質と比
較して、融合タンパク質の可溶性および／または安定性を増大させ得る。上記の
融合タンパク質の全ての型は、ＩｇＧ分子へのポリぺプチドの融合を概説する以
下のプロトコル、または実施例５に記載されるプロトコルを改変することによっ
て作製され得る。
【０７５３】 簡単には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載の配列の５’末端および
３’末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマ
ーはまた、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクローニン
グを容易にする都合の良い制限酵素部位を有するべきである。
【０７５４】 例えば、ｐＣ４（受託番号２０９６４６）が使用される場合、ヒトＦｃ部分は
、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨＩ部位が破壊され
るべきであることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターが、Ｂ
ａｍＨＩを用いて再び制限され、ベクターを線状化し、そして実施例１に記載さ
れるＰＣＲプロトコルによって単離された本発明のポリヌクレオチドが、このＢ
ａｍＨＩ部位に連結される。ポリヌクレオチドは、終止コドンなしにクローニン
グされ、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意すること。
【０７５５】 天然に存在するシグナル配列がヒトタンパク質を産生するために使用される場
合、ｐＣ４は、第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、ベクターは、異種シグナル配列を含むよ
うに改変され得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと） ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域： ＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡ
ＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＧＧＴＧ
ＣＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧ
ＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴ
ＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＡＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧ
ＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣ
ＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡ
ＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣ
ＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴ
ＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧ
ＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧ
ＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧ
ＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧ
ＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＡＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴ
ＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡ
ＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴ
ＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴ
ＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣ
ＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣ
ＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡＧＴＧＣＧＡＣＧＧＣＣＧＣ
ＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴ （配列番号１）。
【０７５６】 （実施例１０：ポリペプチドからの抗体の産生） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、本
発明のポリペプチドを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を
誘導するために動物に投与される。好ましい方法において、ヒトタンパク質の調
製物が調製され、そして精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないようにさ
れる。次いで、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するために、こ
のような調製物は、動物に導入される。
【０７５７】 最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（またはそ
のタンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、ハ
イブリドーマ技術を使用して調製される（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５
６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：
５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９
２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
，Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、このような手順は、動
物（好ましくはマウス）を、ポリペプチドで、またはより好ましくは分泌ポリペ
プチド発現細胞で免疫する工程を包含する。このような細胞は、任意の適切な組
織培養培地において培養され得る；しかし、好ましくは１０％ウシ胎仔血清（約
５６℃で非働化した）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，
０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン
を補充したＥａｒｌｅ改変イーグル培地において培養される。
【０７５８】 このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合され
る。任意の適切な骨髄腫細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しかし、ＡＴ
ＣＣから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好ましい。融合
後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次い
でＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（
１９８１））により記載されるように限界希釈によってクローニングする。次い
で、このような選択を通して得られるハイブリドーマ細胞を、このポリぺプチド
に結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイする。
【０７５９】 あるいは、このポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタイプ
抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は、抗体
それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可能で
あるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使用し
て、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾細胞
を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ細胞
は、抗体のタンパク質特異的抗体に結合する能力がこのポリペプチドによってブ
ロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる
。このような抗体は、タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含
み、そして動物を免疫してさらなるタンパク質特異的抗体の形成を誘導するため
に使用される。
【０７６０】 本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに他のフラグメントは、本
明細書において開示される方法に従って用いられ得ることが明白である。このよ
うなフラグメントは代表的に、（Ｆａｂフラグメントを生成するために）パパイ
ン、または（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するために）ペプシンのような
酵素を使用して、タンパク質分解性切断により生成される。あるいは、ヒトタン
パク質−結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学により生
成され得る。
【０７６１】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル
抗体を使用することが好適であり得る。このような抗体は、上記のモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用することに
よって産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野で公知であ
る。（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２
（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）
；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら
、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅ
ｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７
１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅ
ｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）
。
【０７６２】 （実施例１１：ハイスループットスクリーニングアッセイのためのヒトタンパ
ク質の産生） 以下のプロトコルは、試験されるべきポリぺプチドを含有する上清を産生する
。この上清は、実施例１３〜２０に記載されるスクリーニングアッセイにおいて
使用され得る。
【０７６３】 第一に、ポリ−Ｄ−リジン（６４４ ５８７ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）ストック溶液（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（カルシウム
もマグネシウムも含まない１７−５１６Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で１
：２０に希釈して、作業溶液５０μｇ／ｍｌにする。２００μｌのこの溶液を、
各ウェル（２４ウェルプレート）に添加し、そして室温で２０分間インキュベー
トする。溶液を各ウェルにわたって分配させることを確実にする（注：１２チャ
ンネルピペッターは、１つおきのチャンネルにチップをつけて使用され得る）。
ポリ−Ｄ−リジン溶液を吸引除去し、そして１ｍｌ ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理
食塩水）でリンスする。ＰＢＳは、細胞をプレートする直前までウェル中に残す
べきであり、そしてプレートは２週間前までに予めポリリジンでコーティングし
得る。
【０７６４】 ２９３Ｔ細胞（Ｐ＋２０を過ぎて細胞を保有しない）を、２×１０５細胞／ウ
ェルで、０．５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）（４．
５Ｇ／ＬのグルコースおよびＬ−グルタミン（１２−６０４Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔ
ｔａｋｅｒ）を含む）／１０％熱非働化ＦＢＳ（１４−５０３Ｆ Ｂｉｏｗｈｉ
ｔｔａｋｅｒ）／１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（１７−６０２Ｅ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａ
ｋｅｒ）中にプレートする。細胞を一晩増殖させる。
【０７６５】 翌日、滅菌溶液容器（ｂａｓｉｎ）中で、３００μｌリポフェクトアミン（１
８３２４−０１２ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）および５ｍｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ（
３１９８５０７０ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）／９６ウェルプレートを、一緒に混合
する。小容量のマルチチャンネルピペッターを用いて、実施例８または９に記載
する方法によって産生されたポリヌクレオチド挿入物を含有する約２μｇの発現
ベクターを、適切に標識された９６ウェルの丸底プレート中にアリコートする。
マルチチャンネルピペッターを用いて、５０μｌのリポフェクトアミン／Ｏｐｔ
ｉｍｅｍ Ｉ混合物を各ウェルに添加する。ピペットで緩やかに吸い上げたり下
げたりして混合する。室温で１５〜４５分間インキュベートする。約２０分後、
マルチチャンネルピペッターを使用して１５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ Ｉを各ウ
ェルに添加する。コントロールとして、挿入物を欠失するベクターＤＮＡの１つ
のプレートは、トランスフェクションの各セットでトランスフェクトされるべき
である。
【０７６６】 好ましくは、トランスフェクションは、以下の作業をタッグチームを組んで（
ｔａｇ−ｔｅａｍｉｎｇ）行うべきである。タッグチームを組むことによって、
時間に関する労力は半減され、そして細胞にはＰＢＳ上であまり多くの時間を過
ごさせない。まず、Ａさんは、培地を細胞の４つの２４ウェルプレートから吸引
除去し、次いでＢさんが０．５〜１ｍｌのＰＢＳで各ウェルをリンスする。次い
で、Ａさんは、ＰＢＳリンスを吸引除去し、そしてＢさんは、チャンネル１つお
きにチップのついた１２チャンネルピペッターを使用して、２００μｌのＤＮＡ
／リポフェクトアミン／Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ複合体を、まず奇数のウェルに、次
いで偶数のウェルにと、２４ウェルプレート上の各列に添加する。３７℃で６時
間インキュベートする。
【０７６７】 細胞をインキュベートする間に、２ｍｍのグルタミンおよび１×ペンストレッ
プ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）を有するＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡか、またはＣＨＯ−５
培地（１１６．６ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２（無水物）；０．００１３０ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ；０．０５０ｍｇ／ＬのＦｅ（ＮＯ３）３−９Ｈ２Ｏ；０
．４１７ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ；３１１．８０ｍｇ／ＬのＫＣｌ；２
８．６４ｍｇ／ＬのＭｇＣｌ２；４８．８４ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ４；６９９５．
５０ｍｇ／ＬのＮａＣｌ；２４００．０ｍｇ／ＬのＮａＨＣＯ３；６２．５０ｍ
ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ；７１．０２ｍｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４；０．
４３２０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ；０．００２ｍｇ／Ｌのアラキドン酸
；１．０２２ｍｇ／Ｌのコレステロール；０．０７０ｍｇ／ＬのＤＬ−α−酢酸
トコフェロール；０．０５２０ｍｇ／Ｌのリノール酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのリ
ノレン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのミリスチン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのオレイン
酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミトオレイン酸（ｐａｌｍｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ
）；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミチン酸；１００ｍｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ
Ｆ−６８；０．０１０ｍｇ／Ｌのステアリン酸；２．２０ｍｇ／ＬのＴｗｅｅｎ
８０；４５５１ｍｇ／ＬのＤ−グルコース；１３０．８５ｍｇ／ｍｌのＬ−アラ
ニン；１４７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アルギニン−ＨＣｌ；７．５０ｍｇ／ｍｌ
のＬ−アスパラギン−Ｈ２Ｏ；６．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン酸；２９
．５６ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン２ＨＣｌ−Ｈ２Ｏ；３１．２９ｍｇ／ｍｌのＬ
−シスチン−２ＨＣｌ；７．３５ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン酸；３６５．０ｍ
ｇ／ｍｌのＬ−グルタミン；１８．７５ｍｇ／ｍｌのグリシン；５２．４８ｍｇ
／ｍｌのＬ−ヒスチジン−ＨＣｌ−Ｈ２Ｏ；１０６．９７ｍｇ／ｍｌのＬ−イソ
ロイシン；１１１．４５ｍｇ／ｍｌのＬ−ロイシン；１６３．７５ｍｇ／ｍｌの
Ｌ−リジンＨＣｌ；３２．３４ｍｇ／ｍｌのＬ−メチオニン；６８．４８ｍｇ／
ｍｌのＬ−フェニルアラニン；４０．０ｍｇ／ｍｌのＬ−プロリン；２６．２５
ｍｇ／ｍｌのＬ−セリン；１０１．０５ｍｇ／ｍｌのＬ−スレオニン；１９．２
２ｍｇ／ｍｌのＬ−トリプトファン；９１．７９ｍｇ／ｍｌのＬ−チロシン（Ｔ
ｒｙｒｏｓｉｎｅ）−２Ｎａ−２Ｈ２Ｏ；９９．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−バリン；
０．００３５ｍｇ／Ｌのビオチン；３．２４ｍｇ／ＬのＤ−Ｃａパントテン酸；
１１．７８ｍｇ／Ｌの塩化コリン；４．６５ｍｇ／Ｌの葉酸；１５．６０ｍｇ／
Ｌのｉ−イノシトール；３．０２ｍｇ／Ｌのナイアシンアミド；３．００ｍｇ／
ＬのピリドキサールＨＣｌ；０．０３１ｍｇ／ＬのピリドキシンＨＣｌ；０．３
１９ｍｇ／Ｌのリボフラビン；３．１７ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌ；０．３６５
ｍｇ／Ｌのチミジン；および０．６８０ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２；２５ｍＭの
ＨＥＰＥＳ緩衝剤；２．３９ｍｇ／ＬのＮａヒポキサンチン；０．１０５ｍｇ／
Ｌのリポ酸；０．０８１ｍｇ／Ｌのプトレシンナトリウム−２ＨＣｌ；５５．０
ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム；０．００６７ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウ
ム；２０μＭのエタノールアミン；０．１２２ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄；４１
．７０ｍｇ／Ｌのリノール酸と複合体化したメチル−Ｂ−シクロデキストリン；
３３．３３ｍｇ／Ｌのオレイン酸と複合体化したメチル−Ｂ−シクロデキストリ
ン；ならびに１０ｍｇ／Ｌのレチナールと複合体化したメチル−Ｂ−シクロデキ
ストリン）のいずれかの適切な培地を調製する。（１０％ＢＳＡストック溶液の
ために、１Ｌ ＤＭＥＭ中にＢＳＡ（８１−０６８−３ Ｂａｙｅｒ）１００ｇ
を溶解した）。培地を濾過し、そして５０μｌを内毒素アッセイのために１５ｍ
ｌポリスチレンコニカル中に収集する。
【０７６８】 トランスフェクション反応を、好ましくはタッグチームを組んでインキュベー
ション時間の終わりに終結させる。Ａさんは、トランスフェクション培地を吸引
除去し、その間Ｂさんは、１．５ｍｌの適切な培地を各ウェルに添加する。使用
された培地に依存して４５時間または７２時間、３７℃でインキュベートする：
１％ＢＳＡは４５時間、またはＣＨＯ−５は７２時間。
【０７６９】 ４日目に、３００μｌのマルチチャンネルピペッターを使用して、６００μｌ
を１ｍｌの深底ウェルプレート１枚にアリコートし、そして残りの上清を２ｍｌ
の深底ウェルにアリコートする。次いで、各ウェルからの上清を実施例１３〜２
０に記載するアッセイにおいて使用し得る。
【０７７０】 活性が、上清を使用して以下に記載する任意のアッセイにおいて得られる場合
、この活性は、ポリぺプチドから直接に（例えば、分泌タンパク質として）か、
または他のタンパク質の発現を誘導するポリぺプチドのいずれかによって（この
タンパク質は、次いで上清中に分泌される）のいずれかに由来することが特に理
解される。従って、本発明はさらに、特定のアッセイにおける活性によって特徴
づけられる上清中のタンパク質を同定する方法を提供する。
【０７７１】 （実施例１２：ＧＡＳレポーター構築物の構築） 細胞の分化および増殖に関与する１つのシグナル伝達経路は、Ｊａｋｓ−ＳＴ
ＡＴ経路と呼ばれる。Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴ経路において活性化されたタンパク質
は、多くの遺伝子のプロモーターに位置する、γ活性化部位「ＧＡＳ」エレメン
トまたはインターフェロン感受性応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）に結合する。
これらのエレメントに対するタンパク質の結合は、関連する遺伝子の発現を変化
させる。
【０７７２】 ＧＡＳエレメントおよびＩＳＲＥエレメントは、転写のシグナルトランスデュ
ーサーおよびアクチベーター、すなわち「ＳＴＡＴ」と呼ばれるクラスの転写因
子によって認識される。ＳＴＡＴファミリーには６つのメンバーが存在する。Ｓ
ｔａｔ１およびＳｔａｔ３は、Ｓｔａｔ２と同様に（ＩＦＮαに対する応答が広
範であるように）、多くの細胞型において存在する。Ｓｔａｔ４は、より限定さ
れており、そして多くの細胞型には存在しないが、ＩＬ−１２での処理後のＴヘ
ルパークラスＩ細胞に見出されている。Ｓｔａｔ５は、元々は乳房成長因子と呼
ばれたが、骨髄細胞を含む他の細胞においてより高い濃度で見出されている。そ
れは、多くのサイトカインによって組織培養細胞において活性化され得る。
【０７７３】 ＳＴＡＴは活性化されて、Ｊａｎｕｓ Ｋｉｎａｓｅ（「Ｊａｋｓ」）ファミ
リーとして知られる１セットのキナーゼによるチロシンリン酸化に際して細胞質
から核へ移動する。Ｊａｋｓは、可溶性のチロシンキナーゼの独特のファミリー
の代表であり、そしてＴｙｋ２、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＪａｋ３を含む。
これらのキナーゼは、有意な配列類似性を示し、そして一般には休止細胞におい
て触媒的に不活性である。
【０７７４】 Ｊａｋｓは、以下の表によって要約されるように広範なレセプターによって活
性化される。（ＳｃｈｉｄｌｅｒおよびＤａｒｎｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．６４：６２１−５１（１９９５）による総説から改変）。Ｊａｋｓ
を活性化し得るサイトカインレセプターファミリーは、２つの群に分けられる：
（ａ）クラス１は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ
−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｅｐｏ、ＰＲＬ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳ
Ｆ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびトロンボポエチンに対するレセプ
ターを含み；そして（ｂ）クラス２は、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−ｇ、およびＩＬ−
１０を含む。クラス１レセプターは、保存されたシステインモチーフ（４つの保
存されたシステインおよび１つのトリプトファンのセット）、およびＷＳＸＷＳ
モチーフ（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（配列番号２）をコードす
る膜近接領域）を共有する。
【０７７５】 従って、リガンドのレセプターへの結合の際に、Ｊａｋｓは活性化され、これ
は次いでＳＴＡＴを活性化し、これは、次いで移動し、そしてＧＡＳエレメント
に結合する。この全プロセスは、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に包含さ
れる。
【０７７６】 それゆえ、ＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントの結合によって反映されるＪａｋ
ｓ−ＳＴＡＴ経路の活性化は、細胞の増殖および分化に関与するタンパク質を示
すために使用され得る。例えば、増殖因子およびサイトカインは、Ｊａｋｓ−Ｓ
ＴＡＴ経路を活性化することが知られている。（以下の表を参照のこと）。従っ
て、レポーター分子に連結したＧＡＳエレメントを使用することにより、Ｊａｋ
ｓ−ＳＴＡＴ経路のアクチベーターが同定され得る。
【０７７７】
【表６】 実施例１３〜１４に記載される生物学的アッセイにおいて使用されるプロモー
ターエレメントを含む合成ＧＡＳを構築するために、ＰＣＲに基づいたストラテ
ジーを用いてＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター配列を生成する。５’プライマーは
、ＩＲＦ１プロモーターにおいて見出され、そして一定の範囲のサイトカインで
の誘導の際にＳＴＡＴに結合することが以前に実証されたＧＡＳ結合部位の４つ
の直列のコピーを含むが（Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４５７−
４６８（１９９４））、他のＧＡＳエレメントまたはＩＳＲＥエレメントを代わ
りに使用し得る。５’プライマーはまた、ＳＶ４０初期プロモーター配列に対し
て相補的な１８ｂｐの配列も含み、そしてＸｈｏＩ部位に隣接する。５’プライ
マーの配列は以下である：
【０７７８】
【化１】 下流プライマーはＳＶ４０プロモーターに対して相補的であり、そしてＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位に隣接する：５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧ
ＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列番号４）。
【０７７９】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したＢ−ｇａｌ：プロモータープラ
スミド中に存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを用いて実施する。得
られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いて消化し、そし
てＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。正方向およ
び逆方向のプライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むこと
を確認する：
【０７８０】
【化２】 このＧＡＳプロモーターエレメントがＳＶ４０プロモーターに結合されると、
次に、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ２レポーター構築物を操作する。ここで、レポーター分
子は、分泌アルカリホスファターゼ、すなわち「ＳＥＡＰ」である。しかし、明
らかに、この実施例または他の実施例のいずれにおいても、任意のレポーター分
子が、ＳＥＡＰの代わりとなり得る。ＳＥＡＰの代わりに使用され得る周知のレ
ポーター分子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑
蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または抗体により検出可能な任意のタンパク質が挙
げられる。
【０７８１】 上記の配列により確認された合成ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーターエレメントを
、ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターを作製するために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ
を用いて、増幅したＧＡＳ：ＳＶ４０プロモーターエレメントでＳＶ４０プロモ
ーターを有効に置換し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＳＥＡＰ−プロモータ
ーベクターにサブクローニングする。しかし、このベクターはネオマイシン耐性
遺伝子を含まず、それゆえ、哺乳動物の発現系には好ましくない。
【０７８２】 従って、ＧＡＳ−ＳＥＡＰレポーターを発現する哺乳動物の安定な細胞株を作
製するために、ＧＡＳ−ＳＥＡＰカセットを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて
ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターから取り出し、そしてＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベク
ターを作製するために、マルチクローニング部位におけるこれらの制限部位を用
いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含む骨格ベクター（例えば、ｐＧＦＰ−１（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ））に挿入する。一旦、このベクターを哺乳動物細胞にトランス
フェクトすれば、次いでこのベクターは、実施例１３〜１４に記載されるように
ＧＡＳ結合についてのレポーター分子として使用され得る。
【０７８３】 他の構築物を、上記の説明を使用し、そしてＧＡＳを異なるプロモーター配列
で置換して、作製し得る。例えば、ＮＦＫ−ＢおよびＥＧＲプロモーター配列を
含むレポーター分子の構築を、実施例１５および１６に記載する。しかし、多く
の他のプロモーターを、これらの実施例に記載のプロトコルを使用して置換し得
る。例えば、ＳＲＥ、ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、またはオステオカルシンのプロモー
ターを単独で、または組み合わせて（例えば、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ／ＥＧＲ、Ｇ
ＡＳ／ＮＦ−ＫＢ、Ｉｌ−２／ＮＦＡＴ、またはＮＦ−ＫＢ／ＧＡＳ）置換し得
る。同様に、他の細胞株（例えば、ＨＥＬＡ（上皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（内皮細
胞）、Ｒｅｈ（Ｂ細胞）、Ｓａｏｓ−２（骨芽細胞）、ＨＵＶＡＣ（大動脈細胞
）、または心筋細胞）を、レポーター構築物の活性を試験するために使用し得る
。
【０７８４】 （実施例１３：Ｔ細胞の活性についてのハイスループットスクリーニングアッ
セイ） 以下のプロトコルを使用して、因子を同定すること、および本発明のポリペプ
チドを含有する上清がＴ細胞を増殖および／または分化するか否かを決定するこ
とによって、Ｔ細胞活性を評価する。Ｔ細胞の活性を実施例１２で作製したＧＡ
Ｓ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加さ
せる因子は、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化する能力を示す。
このアッセイに使用したＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号Ｔ
ＩＢ−１５２）であるが、Ｍｏｌｔ−３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５５
２）およびＭｏｌｔ−４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８２）細胞もまた
使用し得る。
【０７８５】 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、リンパ芽球性ＣＤ４＋ Ｔｈ１ヘルパー細胞である
。安定な細胞株を作製するために、およそ２００万のＪｕｒｋａｔ細胞をＤＭＲ
ＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ
／ｎｅｏベクターでトランスフェクトする（以下に記載のトランスフェクション
手順）。トランスフェクトした細胞を、およそ２０，０００細胞／ウェルの密度
で播種し、そして１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）に対して
耐性であるトランスフェクト体を選択する。耐性コロニーを増殖させ、次いで、
漸増する濃度のインターフェロンγに対するそれらの応答について試験する。選
択したクローンの用量応答を示す。
【０７８６】 詳細には、以下のプロトコルにより、２００μｌの細胞を含む７５のウェルに
ついて十分な細胞を得る。従って、複数の９６ウェルプレートについて十分な細
胞を産生するために、これをスケールアップするか、または複数で実施するかの
いずれかを行う。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＲＰＭＩ＋１０％血清および１％のＰｅｎ
−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。Ｔ２５フラスコ中で２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０μｇのプラスミドＤＮＡとを組
み合わせる。５０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃを含む２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを
添加し、そして、室温で１５〜４５分間インキュベートする。
【０７８７】 インキュベート時間の間、細胞濃度をカウントし、必要な細胞数（トランスフ
ェクションあたり１０７個）をスピンダウンし、そして最終濃度が１０７細胞／
ｍｌとなるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で再懸濁する。次いで、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ
中の１×１０７個の細胞の１ｍｌをＴ２５フラスコに加え、そして３７℃で６時
間インキュベートする。インキュベーションの後、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％
の血清を添加する。
【０７８８】 Ｊｕｒｋａｔ：ＧＡＳ−ＳＥＡＰ安定レポーター株をＲＰＭＩ＋１０％血清、
１ｍｇ／ｍｌジェネティシン、および１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。
これらの細胞は、本発明のポリペプチドを含む上清で処理されるか、および／ま
たは実施例１１に記載のプロトコールにより産生されるよう本発明のポリペプチ
ドを誘導される。
【０７８９】 上清での処理日に細胞を洗浄すべきであり、そして１ｍｌあたり５００，００
０個の細胞の密度となるように新鮮なＲＰＭＩ＋１０％血清中に再懸濁するべき
である。必要な細胞の正確な数は、スクリーニングされる上清の数に依存する。
１枚の９６ウェルプレートについて、およそ１０００万個の細胞（１０枚のプレ
ートについて１億個の細胞）を必要とする。
【０７９０】 １２チャンネルのピペットを用いて９６ウェルのディッシュに細胞を分与する
ために、三角のリザーバーボートに細胞を移す。２００μｌの細胞を、１２チャ
ンネルのピペットを用いて、それぞれのウェルに移す（従って、ウェル当たり１
００，０００個の細胞を添加する）。
【０７９１】 全てのプレートに播種した後、５０μｌの上清を、１２チャンネルピペットを
用いて、上清を含む９６ウェルプレートから各ウェルに直接的に移す。さらに、
外来性のインターフェロンγの用量（０．１、１．０、１０ｎｇ）を、ウェルＨ
９、ウェルＨ１０、およびウェルＨ１１に添加し、アッセイについてのさらなる
陽性コントロールとして使用する。
【０７９２】 上清で処理したＪｕｒｋａｔ細胞を含む９６ウェルディッシュをインキュベー
ターに４８時間置く（注記：この時間は４８〜７２時間の間で変更可能である）
。次いで、各ウェルから３５μｌのサンプルを１２チャンネルのピペットを用い
て、不透明な９６ウェルプレートに移す。不透明なプレートを（セロファン（ｓ
ｅｌｌｏｐｈｅｎｅ）（登録商標）のカバーを用いて）覆うべきであり、そして
実施例１７に記載のＳＥＡＰアッセイを実施するまで、−２０℃で保存するべき
である。残存する処理した細胞を含むプレートを４℃に置き、そして、所望する
ならば、特定のウェル上でのアッセイを繰り返すための物質の供給源として供す
る。
【０７９３】 陽性コントロールとして、１００ユニット／ｍｌのインターフェロンγを使用
し得、これは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を活性化することが公知である。代表的に
は、３０倍を超える誘導が、陽性コントロールのウェルにおいて観察される。
【０７９４】 上述のプロトコルは、一過性および安定性の両方のトランスフェクト細胞の作
製に用いられ得、このことは当業者に明らかである。
【０７９５】 （実施例１４：骨髄性の活性を同定するハイスループットスクリーニングアッ
セイ） 以下のプロトコルを使用して、本発明のポリペプチドが骨髄性細胞を増殖およ
び／または分化させるか否かを決定することにより骨髄性の活性を評価する。骨
髄性細胞の活性を実施例１２において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築
物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋｓ−Ｓ
ＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化させる能力を示す。このアッセイに使用した
骨髄性細胞は、Ｕ９３７（前単球（ｐｒｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ）細胞株）である
が、ＴＦ−１、ＨＬ６０、またはＫＧ１も使用し得る。
【０７９６】 Ｕ９３７細胞を、実施例１２において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構
築物で、一過性にトランスフェクトするために、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（
Ｋｈａｒｂａｎｄａら、１９９４，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ，５：２５９−２６５）を用いる。最初に、２×１０ｅ７個
のＵ９３７細胞を回収し、そしてＰＢＳで洗浄する。Ｕ９３７細胞を、通常、１
００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補
充した１０％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地中
で増殖させる。
【０７９７】 次に、０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、８μｇのＧＡＳ−ＳＥ
ＡＰ２プラスミドＤＮＡ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３７５μＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および６７５μＭ ＣａＣ
ｌ２を含む１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液に細胞
を懸濁する。３７℃で４５分間インキュベートする。
【０７９８】 １０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を洗浄し、次いで、１０
ｍｌの完全培地に再懸濁し、そして３７℃で３６時間インキュベートする。
【０７９９】 ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｕ９３７安定細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細
胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を使用して、慣用的に
増殖させるが、１〜２ヶ月毎に細胞を二継代の間、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８
中で再増殖させるべきである。
【０８００】 これらの細胞を１×１０８個の細胞（これは１０枚の９６ウェルプレートアッ
セイのために十分である）を回収することにより試験し、そしてＰＢＳで洗浄す
る。上記の２００ｍｌの増殖培地中に、５×１０５細胞／ｍｌの最終密度で細胞
を懸濁する。９６ウェルプレートにおいてウェルあたり２００μｌの細胞（すな
わち、１×１０５細胞／ウェル）をプレートする。
【０８０１】 実施例１１に記載されるプロトコルにより調製された上清の５０μｌを添加す
る。３７℃で４８〜７２時間インキュベートする。陽性コントロールとして、１
００単位／ｍｌのインターフェロンγを使用し得、これはＵ９３７細胞を活性化
させることが公知である。代表的には、３０倍を超える誘導が、陽性コントロー
ルウェルにおいて観察される。実施例１７に記載のプロトコルに従って上清をＳ
ＥＡＰアッセイする。
【０８０２】 （実施例１５：ニューロン活性を同定するハイスループットスクリーニングア
ッセイ） 細胞が分化および増殖を経る場合、一群の遺伝子が多くの異なるシグナル伝達
経路を介して活性化される。これらの遺伝子の１つであるＥＧＲ１（初期増殖応
答遺伝子１）は、活性化時に種々の組織および細胞型において誘導される。ＥＧ
Ｒ１のプロモーターはこのような誘導を担う。レポーター分子に結合したＥＧＲ
１プロモーターを使用して、細胞の活性化を評価し得る。
【０８０３】 詳細には、以下のプロトコルをＰＣ１２細胞株におけるニューロン活性を評価
するために使用する。ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫（ｐｈｅｎｏｃｈｒｏｍ
ｏｃｙｔｏｍａ）細胞）は、多くのマイトジェン（例えば、ＴＰＡ（テトラデカ
ノイルホルボールアセテート）、ＮＧＦ（神経成長因子）、およびＥＧＦ（上皮
増殖因子））での活性化により、増殖および／または分化することが公知である
。この処理の間にＥＧＲ１遺伝子発現を活性化する。従って、ＳＥＡＰレポータ
ーに結合したＥＧＲプロモーターを含む構築物でＰＣ１２細胞を安定にトランス
フェクトすることにより、ＰＣ１２細胞の活性化を評価し得る。
【０８０４】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰレポーター構築物を以下のプロトコルにより組み立て得る。
ＥＧＲ−１プロモーター配列（−６３３〜＋１）（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋら、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ ６：８６７−８７１（１９９１））を以下のプライマーを用い
て、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し得る： ５’ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＡＴＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧ−
３’（配列番号６） ５’ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＣＴＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣ−３
’（配列番号７）。
【０８０５】 次いで、実施例１２において作製したＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを使
用して、ＥＧＲ１増幅産物をこのベクターに挿入し得る。制限酵素ＸｈｏＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩを使用してＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを直鎖状化し、ＧＡ
Ｓ／ＳＶ４０スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を取り除く。これらと同じ酵素を
用いて、ＥＧＲ１増幅産物を制限処理する。ベクターとＥＧＲ１プロモーターと
を連結する。
【０８０６】 細胞培養のための９６ウェルプレートを調製するために、コーティング溶液（
コラーゲンＩ型（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．カタログ番号０８
−１１５）の３０％エタノール（滅菌濾過）での１：３０希釈）を１つの１０ｃ
ｍプレートあたり２ｍｌ、または９６ウェルプレートのウェルあたり５０ｍｌ添
加し、そして２時間風乾させる。
【０８０７】 ＰＣ１２細胞を、予めコートした１０ｃｍ組織培養ディッシュ上で、ペニシリ
ン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充
した、１０％ウマ血清（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カタログ番号１２４
４９−７８Ｐ）、５％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４
０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で慣用的に増殖させる。１つから４つ
への分割を３〜４日毎に行う。細胞を掻き取ることによりプレートから取り出し
、そして１５回より多く上下にピペッティングして再懸濁する。
【０８０８】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を、実施例１１に記載のＬｉｐｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅプロトコルを使用して、ＰＣ１２にトランスフェクトする。ＥＧＲ−Ｓ
ＥＡＰ／ＰＣ１２安定細胞を、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を増殖させ
ることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を慣用的な増殖のために使用するが
、１〜２ヶ月毎に、細胞を２継代の間、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で再増殖
させるべきである。
【０８０９】 ニューロン活性をアッセイするために、およそ７０〜８０％コンフルエントで
細胞を有する１０ｃｍプレートを、古い培地を除去することによりスクリーニン
グする。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）を用いて１回洗浄する。次い
で、細胞を低血清培地（抗生物質とともに１％ウマ血清および０．５％ ＦＢＳ
を含むＲＰＭＩ−１６４０）中で一晩、飢餓（ｓｔａｒｖｅ）させる。
【０８１０】 翌朝、培地を除去し、そしてＰＢＳで細胞を洗浄する。プレートから細胞を掻
き取り、細胞を２ｍｌの低血清培地中で懸濁する。細胞数をカウントし、そして
より低血清の培地を添加し、５×１０５細胞／ｍｌの最終細胞密度に到達させる
。
【０８１１】 ２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加する（１×１
０５細胞／ウェルに等しい）。実施例１１により産生された５０μｌの上清を添
加し、３７℃で４８時間〜７２時間インキュベートする。陽性コントロールとし
て、ＥＧＲを介してＰＣ１２細胞を活性化することが公知の成長因子（例えば、
５０ｎｇ／μｌの神経成長因子（ＮＧＦ））を使用し得る。代表的には、５０倍
を超えるＳＥＡＰ誘導が陽性コントロールウェルにおいて見られる。実施例１７
に従って、上清をＳＥＡＰアッセイする。
【０８１２】 （実施例１６：Ｔ細胞の活性についてのハイスループットスクリーニングアッ
セイ） ＮＦ−ＫＢ（核因子ＫＢ）は、広範な種々の薬剤（炎症性サイトカインである
ＩＬ−１およびＴＮＦ、ＣＤ３０およびＣＤ４０、リンホトキシン−αおよびリ
ンホトキシン−βを含む）により、ＬＰＳまたはトロンビンへの曝露により、な
らびに特定のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される転写因子である。転
写因子として、ＮＦ−ＫＢは免疫細胞の活性化に関与する遺伝子の発現、アポト
ーシスの制御（ＮＦ−ＫＢは、アポトーシスから細胞を保護するようである）、
Ｂ細胞およびＴ細胞の発生、抗ウイルス応答および抗菌応答、ならびに複数のス
トレス応答を調節する。
【０８１３】 刺激されない条件において、ＮＦ−ＫＢは、Ｉ−ＫＢ（インヒビターＫＢ）を
有する細胞質に保持される。しかし、刺激の際に、Ｉ−ＫＢはリン酸化され、そ
して分解され、ＮＦ−ＫＢの核への往復（ｓｈｕｔｔｌｅ）を引き起こし、これ
により標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−ＫＢにより活性化される標的遺伝
子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ−１およびクラス１
ＭＨＣが挙げられる。
【０８１４】 その中心的な役割および一定の範囲の刺激に応答する能力に起因して、ＮＦ−
ＫＢプロモーターエレメントを利用するレポーター構築物を、実施例１１におい
て産生された上清をスクリーニングするために使用する。ＮＦ−ＫＢのアクチベ
ーターまたはインヒビターは、疾患の処置に有用である。例えば、ＮＦ−ＫＢの
インヒビターを、急性または慢性的なＮＦ−ＫＢの活性化に関連する疾患（例え
ば、慢性関節リウマチ）を処置するために使用し得る。
【０８１５】 ＮＦ−ＫＢプロモーターエレメントを含むベクターを構築するために、ＰＣＲ
に基づいたストラテジーを用いる。上流のプライマーは、ＮＦ−ＫＢ結合部位（
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ）（配列番号８）の４つの直列のコピー、ＳＶ４０初
期プロモーター配列の５’末端に対して相補的な１８ｂｐの配列を含み、そして
ＸｈｏＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡ
ＴＴＡＧ：３’（配列番号９）。
【０８１６】 下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターの３’末端に対して相補的であり、
そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列
番号４）。
【０８１７】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＢ−ｇａｌ：プロモータープ
ラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを使用して実施する。
得られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして
ＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。Ｔ７およびＴ
３プライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むことを確認す
る：
【０８１８】
【化３】 次に、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＳＥＡＰ２−プロモータ
ープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＳＶ４０最小プロモーターエレメ
ントをこのＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０フラグメントで置換する。しかし、このベクタ
ーはネオマイシン耐性遺伝子を含まず、そしてそれゆえ哺乳動物の発現系には好
ましくない。
【０８１９】 安定な哺乳動物細胞株を作製するために、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカ
セットを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用して上記のＮＦ−ＫＢ／ＳＥＡ
Ｐベクターから取り出し、そしてネオマイシン耐性を含むベクターに挿入する。
詳細には、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでｐＧＦＰ−１を制限処理した後に、ＮＦ−
ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットをｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入
し、ＧＦＰ遺伝子を置換した。
【０８２０】 一旦、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製した後は、実
施例１３に記載のプロトコルに従って、安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を作製し、
そして維持する。同様に、これらの安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を含む上清をア
ッセイするための方法がまた、実施例１３に記載される。陽性コントロールとし
て、外因性のＴＮＦα（０．１、１、１０ｎｇ）をウェルＨ９、Ｈ１０、および
Ｈ１１に添加し、代表的には、５〜１０倍の活性化が観察される。
【０８２１】 （実施例１７：ＳＥＡＰ活性についてのアッセイ） 実施例１３〜１６に記載されるアッセイのためのレポーター分子として、ＳＥ
ＡＰ活性を、以下の一般的な手順に従ってＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉ
ｇｈｔ Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＰ−４００）を用いてアッセイする。Ｔｒｏｐ
ｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔは、以下で使用される希釈緩衝液、
アッセイ緩衝液、および反応緩衝液を供給する。
【０８２２】 ディスペンサーに２．５×希釈緩衝液を満たし、そして１５μｌの２．５×希
釈緩衝液を３５μｌの上清を含むオプティプレート（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）に分
与する。プラスチックシーラーでプレートをシールし、そして６５℃で３０分間
インキュベートする。一様でない加温を避けるためにオプティプレートを離して
おく。
【０８２３】 サンプルを室温まで１５分間冷却する。ディスペンサーを空にし、そしてアッ
セイ緩衝液を満たす。５０ｍｌのアッセイ緩衝液を添加し、そして室温で５分間
インキュベートする。ディスペンサーを空にし、そして反応緩衝液を満たす（以
下の表を参照のこと）。５０μｌの反応緩衝液を添加し、そして室温で２０分間
インキュベートする。化学発光シグナルの強度は時間依存的であり、そしてルミ
ノメーターで５つのプレートを読み取るために約１０分間を費やすので、１回に
５つのプレートを処理し、１０分後に２つ目のセットを開始するべきである。
【０８２４】 ルミノメーターにおける相対的な光の単位（ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を読み取
る。ブランクとしてＨ１２をセットし、そして結果を印字する。化学発光の増加
は、レポーター活性を示す。
【０８２５】 （反応緩衝処方物：）
【０８２６】
【表７】 （実施例１８：低分子の濃度および膜透過性における変化を同定するハイスル
ープットスクリーニングアッセイ） レセプターへのリガンドの結合は、カルシウム、カリウム、ナトリウムのよう
な低分子およびｐＨの細胞内レベルを変化させ、ならびに膜電位を変化させるこ
とは公知である。これらの変化を特定細胞のレセプターに結合する上清の同定を
行うアッセイで測定し得る。以下のプロトコルは、カルシウムについてのアッセ
イを記載するが、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位、ま
たは蛍光プローブにより検出可能な任意の他の低分子における変化を検出するよ
うに容易に改変し得る。
【０８２７】 以下のアッセイは、蛍光測定画像化プレートリーダー（「ＦＬＩＰＲ」）を使
用して低分子と結合する蛍光分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）におけ
る変化を測定する。明らかに、低分子を検出する任意の蛍光分子を本明細書で用
いるカルシウム蛍光分子、ｆｌｕｏ−４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，
Ｉｎｃ．；カタログ番号Ｆ−１４２０２）の代わりに使用し得る。
【０８２８】 接着細胞については、細胞を１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルで、底
が透明なＣｏ−ｓｔａｒ黒色９６ウェルプレートに播種する。プレートをＣＯ２ インキュベーター内で２０時間インキュベートする。接着細胞をＢｉｏｔｅｋ洗
浄器内で２００μｌのＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で二回洗浄し、最後の洗浄後、緩衝液１００μｌを残す。
【０８２９】 １ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−４のストック溶液を１０％プルロニック酸（ｐｌｕ
ｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ＤＭＳＯで作製する。細胞にｆｌｕｏ−４を負荷するた
め、１２μｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−４（５０μｌ）を各ウェルに添加する。このプ
レートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベートする。プ
レートをＢｉｏｔｅｋ洗浄器で、ＨＢＳＳにより４回洗浄し、緩衝液１００μｌ
を残す。
【０８３０】 非接着細胞については、細胞を培養培地からスピンダウンする。細胞を、５０
ｍｌのコニカルチューブ内でＨＢＳＳを用いて２〜５×１０６細胞／ｍｌに再懸
濁する。細胞懸濁液１ｍｌあたり、１ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−４の１０％プルロ
ニック酸ＤＭＳＯ溶液４μｌを加える。次に、チューブを３７℃の水浴中に３０
〜６０分間置く。細胞をＨＢＳＳで二回洗浄し、１×１０６細胞／ｍｌに再懸濁
し、そしてマイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分配する。プレートを１
０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。次に、プレートをＤｅｎｌｅｙ Ｃｅｌｌ
Ｗａｓｈ中で２００μｌで一回洗浄した後、吸引工程により最終容量を１００μ
ｌにする。
【０８３１】 非細胞ベースのアッセイについては、各ウェルは、ｆｌｕｏ−４のような蛍光
分子を含有する。上清をウェルに添加し、そして蛍光変化を検出する。
【０８３２】 細胞内カルシウムの蛍光を測定するため、ＦＬＩＰＲを以下のパラメーターに
ついて設定する：（１）システムゲインは、３００〜８００ｍＷであり；（２）
曝露時間は、０．４秒間であり；（３）カメラＦ／ストップは、Ｆ／２であり；
（４）励起は４８８ｎｍであり；（５）発光は５３０ｎｍであり；そして（６）
サンプル添加は５０μｌである。５３０ｎｍにおける発光の増加は、細胞内Ｃａ＋＋ 濃度の増加を生じる、細胞外シグナル伝達事象を示す。
【０８３３】 （実施例１９：チロシンキナーゼ活性を同定するハイスループットスクリーニ
ングアッセイ） プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、多様な群の膜貫通キナーゼおよび
細胞質キナーゼを表す。レセプタープロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）群
内に、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦおよびインスリンレセプター
サブファミリーを含む、一定の範囲の有糸分裂促進性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）お
よび代謝性成長因子のレセプターがある。さらに、対応するリガンドが未知であ
る大きなＲＰＴＫファミリーがある。ＲＰＴＫのリガンドは、主として分泌され
る低分子量タンパク質を含むが、膜結合型および細胞外マトリックスタンパク質
も含む。
【０８３４】 リガンドによるＲＰＴＫの活性化は、リガンド媒介レセプター二量体化を含み
、これはレセプターサブユニットのリン酸基転移および細胞質チロシンキナーゼ
の活性化を生じる。細胞質チロシンキナーゼとしては、ｓｒｃファミリー（例え
ば、ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）のレセプター関連チロシンキナ
ーゼ、ならびにＪａｋファミリーのような非レセプター結合型および細胞質ゾル
プロテインチロシンキナーゼが挙げられる。これらのメンバーは、サイトカイン
スーパーファミリー（例えば、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ−Ｃ
ＳＦおよびレプチン）のレセプターによって誘発されるシグナル伝達を媒介する
。
【０８３５】 チロシンキナーゼ活性を刺激し得る公知の因子は広範であるため、チロシンキ
ナーゼシグナル伝達経路を活性化し得るこれらの新規なヒト分泌タンパク質の同
定は興味深い。従って、以下のプロトコルを設計して、チロシンキナーゼシグナ
ル伝達経路を活性化し得る新規なヒト分泌タンパク質を同定する。
【０８３６】 標的細胞（例えば、初代ケラチノサイト）を約２５，０００細胞／ウェルの密
度で、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入した９６
ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅに播種す
る。プレートを１００％エタノールで３０分間、二回リンスして滅菌し、水でリ
ンスした後、一晩乾燥させる。幾つかのプレートを、１００ｍｌの細胞培養グレ
ードＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）またはポリリジン（
５０ｍｇ／ｍｌ）（これらは全て、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る）で、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した１０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ、あるいは仔
ウシ血清で２時間コートし、ＰＢＳでリンスした後、４℃で保存する。増殖培地
に５，０００細胞／ウェルを播種し、製造業者のＡｌａｍａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）が記載するように、ａｌａ
ｍａｒＢｌｕｅを使用して４８時間後に細胞数を間接定量することにより、これ
らのプレート上の細胞増殖をアッセイする。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＦａｌｃｏｎプレートカバー＃３０７１を使用し、
Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅを覆う。Ｆａｌ
ｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ ＩＩＩ細胞培養プレートもまた、いくつかの増殖
実験において使用し得る。
【０８３７】 抽出物を調製するため、Ａ４３１細胞をＬｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイロ
ン膜上に播種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、そして完全培地中で一
晩培養する。細胞を無血清基本培地中で２４時間インキュベートして静止させる
。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）または実施例１１で生成した上清５０μｌで５〜２
０分間処理した後、培地を除去し、１００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．
１％ＳＤＳ、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、２ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７およびＢｏｅｈｅ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手
したプロテアーゼインヒビターの混合物（＃１８３６１７０））を各ウェルに添
加し、そしてプレートを回転振盪器上、４℃で５分間振盪する。次に、プレート
を真空トランスファーマニホルド（ｖａｃｕｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍａｎｉ
ｆｏｌｄ）に設置し、そしてハウスバキュームを使用して抽出物を各ウェルの底
の０．４５ｍｍ膜で濾過する。抽出物をバキュームマニホールドの底の９６ウェ
ル捕獲／アッセイプレートに集め、そして直ちに氷上に置く。遠心分離により明
澄化した抽出物を得るため、界面活性剤で５分間可溶化した後、各ウェルの含有
物を取り出し、４℃、１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。
【０８３８】 濾過抽出物をチロシンキナーゼ活性のレベルについて試験する。チロシンキナ
ーゼ活性を検出する多数の方法が公知であるが、本明細書においては方法の一つ
を記載する。
【０８３９】 一般的に、特定の基質（ビオチン化ペプチド）上のチロシン残基をリン酸化す
る能力を決定することにより、上清のチロシンキナーゼ活性を評価する。この目
的に使用し得るビオチン化ペプチドとしては、ＰＳＫ１（細胞分裂キナーゼｃｄ
ｃ２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に相当）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミノ
酸１〜１７に相当）が挙げられる。両ペプチドは、一連のチロシンキナーゼの基
質であり、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能である。
【０８４０】 以下の成分を順に添加することにより、チロシンキナーゼ反応を設定する。ま
ず、５μＭビオチン化ペプチド１０μｌを添加した後、順に、ＡＴＰ／Ｍｇ２＋ （５ｍＭ ＡＴＰ／５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）１０μｌ、５×アッセイ緩衝液（４
０ｍＭ塩酸イミダゾール、ｐＨ７．３、４０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍ
Ｍ ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．５ｍｇ／ｍ
ｌ ＢＳＡ）１０μｌ、バナジウム酸ナトリウム（１ｍＭ）５μｌ、最後に水５
μｌを加える。成分を穏やかに混合し、反応混合物を３０℃で２分間プレインキ
ュベートする。コントロール酵素または濾過上清１０μｌを加えて反応を開始さ
せる。
【０８４１】 次に、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ １０μｌを添加することによりチロシンキナー
ゼアッセイ反応を停止し、その反応物を氷上に置く。
【０８４２】 反応混合物の５０μｌのアリコートをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モ
ジュールに移し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、チロシンキ
ナーゼ活性を測定する。これにより、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａ
ｄｉｎ）コーティング９６ウェルプレートをビオチン化ペプチドと会合させる。
ＭＴＰモジュールを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、西洋ワ
サビペルオキシダーゼに結合体化した抗ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｏｔｙｒｏ
ｓｉｎｅ）抗体（抗Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））７５μｌを、各ウ
ェルに添加した後、３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記のように
洗浄する。
【０８４３】 次に、ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）１００μｌを加え、室温で少なくとも５分間（最長３０分間）インキュベート
する。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４０５ｎｍにおけるサンプルの吸光度を
測定する。結合したペルオキシダーゼ活性のレベルをＥＬＩＳＡリーダーを使用
して定量し、これは、チロシンキナーゼ活性のレベルを反映する。
【０８４４】 （実施例２０：リン酸化活性を同定するハイスループットスクリーニングアッ
セイ） 実施例１９に記載のプロテインチロシンキナーゼ活性アッセイの可能性のある
代替物および／または補完物（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）として、主要な細胞内シ
グナル伝達中間体の活性化（リン酸化）を検出するアッセイもまた使用し得る。
例えば、下記のように、一つの特定のアッセイは、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２
キナーゼのチロシンリン酸化を検出し得る。しかし、Ｒａｆ、ＪＮＫ、ｐ３８Ｍ
ＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ、筋肉特異
的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＩＲＡＫ、ＴｅｃおよびＪａｎｕｓのような他の分子
、ならびに他の任意のホスホセリン、ホスホチロシンまたはホスホスレオニン分
子のリン酸化を、以下のアッセイにおいてこれらの分子でＥｒｋ−１またはＥｒ
ｋ−２を置き換えることにより検出し得る。
【０８４５】 詳細には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルをプロテインＧ（１μｇ／
ｍｌ）０．１ｍｌにより室温（ＲＴ）で２時間コーティングしてアッセイプレー
トを作製する。次に、プレートをＰＢＳでリンスし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳにより
ＲＴで１時間ブロックする。次に、プロテインＧプレートをＥｒｋ−１およびＥ
ｒｋ−２に対する二つの市販のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル）（Ｓ
ａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理（ＲＴで１時間）す
る。（他の分子を検出するために、上記の任意の分子を検出するモノクローナル
抗体を交換することにより、この工程を容易に改変し得る）。ＰＢＳで３〜５回
リンスした後、使用時まで、プレートを４℃で貯蔵する。
【０８４６】 Ａ４３１細胞を２０，０００／ウェルで９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィル
タープレートに播種し、増殖培地中で一晩培養する。次に、細胞を基本培地（Ｄ
ＭＥＭ）中で４８時間飢餓させた後、ＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）または実施例１
１で得た上清５０μｌで５〜２０分間処理する。次に、細胞を可溶化し、抽出物
を濾過して直接アッセイプレート中に入れる。
【０８４７】 抽出物を用いてＲＴで１時間インキュベートした後、ウェルを再度リンスする
。陽性コントロールとして、市販のＭＡＰキナーゼ調製物（１０ｎｇ／ウェル）
をＡ４３１抽出物の代わりに使用する。次に、プレートを、Ｅｒｋ−１およびＥ
ｒｋ−２キナーゼのリン酸化エピトープを特異的に認識する市販のポリクローナ
ル（ウサギ）抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理する（ＲＴで１時間）。この抗体を標
準的な手順によりビオチン化する。次に、結合ポリクローナル抗体をユーロピウ
ムストレプトアビジンおよびユーロピウム蛍光増強剤とＷａｌｌａｃ ＤＥＬＦ
ＩＡ装置内で連続的にインキュベートする（時間分解性蛍光）ことによって定量
する。バックグラウンドを超える蛍光シグナルの増加は、リン酸化を示す。
【０８４８】 （実施例２１：ポリヌクレオチドに対応する遺伝子における変化の決定方法） 目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者から単離
されたＲＮＡを単離する。次に、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分
野で公知のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。
次に、このｃＤＮＡを、配列番号Ｘにおける目的の領域を取り囲むプライマーを
用いるＰＣＲのテンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄ
ｒａｎｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）に記載の
緩衝溶液を使用し、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；およ
び７０℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルからなる。
【０８４９】 次に、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐｉ
ｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、５’末端にＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。選択したエキソ
ンのイントロン−エキソン境界もまた決定し、ゲノムＰＣＲ産物を分析してその
結果を確認する。次に、疑わしい変異を有するＰＣＲ産物のクローン化および配
列決定を行い、直接配列決定の結果を確認する。
【０８５０】 ＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ，１９：１１５６（１９９１）に記載のようにＴ尾部を有するベクターにク
ローン化し、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ）で配列決定する。罹患個体を、非罹患個体には存在しない変異により
同定する。
【０８５１】 ゲノム再配置もまた、ポリヌクレオチドに対応する遺伝子における改変を決定
する方法として観察する。実施例２に従って単離したゲノムクローンを、ジゴキ
シゲニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈ
ｅｉｍ）を用いてニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎ， Ｃｇ
．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３５： ７３−９９（１９９１
）に記載のようにＦＩＳＨを行う。対応するゲノムの遺伝子座への特異的ハイブ
リダイゼーションのために、大過剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて標識プロ
ーブとのハイブリダイゼーションを行う。
【０８５２】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウム
で対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピ
ングのための整列イメージを、三重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）と冷却電荷結合素子カメ
ラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および可変励起波長フィ
ルター（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８
：７５（１９９１））とを組み合わせて用いて得る。ＩＳｅｅ Ｇｒａｐｈｉｃ
ａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ， Ｄｕｒｈａｍ， ＮＣ）を使用して、イメージ収集、分析および染
色体部分長測定を行う。プローブがハイブリダイズしたゲノム領域の染色体変化
を、挿入、欠失および転座として同定する。これらの変化を関連疾患の診断マー
カーとして使用する。
【０８５３】 （実施例２２：生物学的サンプル中のポリペプチドの異常レベルを検出する方
法） 本発明のポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてポリペプチ
ドレベルの上昇または低下が検出されるなら、このポリペプチドは、特定表現型
のマーカーである。検出方法は数多くあり、そしてそれ故、当業者は以下のアッ
セイをそれらの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解される。
【０８５４】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、サンプル中、好ましくは、生
物学的サンプル中のポリペプチドを検出する。マイクロタイタープレートのウェ
ルを、特異的抗体を最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌで用いてコーティングする
。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであって、実施
例１０に記載の方法により産生される。ウェルに対するポリペプチドの非特異的
結合が減少するように、このウェルをブロックする。
【０８５５】 次に、コーティングしたウェルを、ポリペプチド含有サンプルを用いてＲＴで
２時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの連続希釈を使用し
て結果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水で三回洗
浄し、非結合ポリペプチドを除去する。
【０８５６】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イオン水
または蒸留水で三回洗浄し、未結合の結合体を除去する。
【０８５７】 ４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートする。反応物をマイクロタイタープレートリーダーにより測定する。コ
ントロールサンプルの連続希釈を使用して標準曲線を作成し、そしてＸ軸（対数
スケール）にポリペプチド濃度を、そしてＹ軸（直線スケール）に蛍光または吸
光度をプロットする。標準曲線を用いてサンプル中のポリペプチド濃度を補間す
る。
【０８５８】 （実施例２３：処方） 本発明はまた、有効量の治療剤を被験体に投与することによって、疾患、障害
および／または状態（例えば、本明細書中に開示される任意の１以上の疾患など
）を処置および／または予防する方法を提供する。治療剤は、薬学的に受容可能
なキャリア型（例えば、滅菌キャリア）と組み合わせた、本発明のポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチド（フラグメントおよび改変体を含む）、それらのアゴ
ニストまたはアンタゴニスト、ならびに／あるいはそれらに対する抗体を意味す
る。
【０８５９】 治療剤を、個々の患者の臨床状態（特に、分泌ポリペプチド単独処置の副作用
）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ
、医療実施基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方
式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、
このような考慮を行って決定される。
【０８６０】 一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効
量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、
上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、このホルモン
について、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒ
トに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続
投与する場合、代表的には、治療剤を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ
／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポ
ンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得
る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、
所望の効果に応じて変化するようである。
【０８６１】 治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌ
ｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチに
よるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与する。「薬学的に
受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤
、被包材または任意の型の製剤補助剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｕｘｉｌｉ
ａｒｙ）をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹
腔内、胸骨下、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０８６２】 本発明の治療剤はまた、徐放性系により適切に投与される。治療剤は、経口的
、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内
、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あ
るいは経口または鼻腔スプレーとして投与される。「薬学的に受容可能なキャリ
ア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任
意の型の製剤補助剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｕｘｉｌｉａｒｙ）をいう。
本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨下、皮
下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０８６３】 本発明の治療剤はまた、徐放性系により適切に投与される。徐放性治療剤の適
切な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまたはマイ
クロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性物質（
例えば、許容品質油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、および貧
可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩）を包含する。
【０８６４】 徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９
号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメー
トのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５
５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇ
ｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９
８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９
８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ
−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【０８６５】 徐放性治療剤はまた、リポソームに包括された本発明の組成物を包含する（一
般に、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０
）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃｅｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ
−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）。治
療剤を含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製され得る：
ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０−４０３４（１９
８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３
，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国
特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ第１
０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）単層型で
あり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択
された割合が、最適な治療剤のために調整される。
【０８６６】 なおさらなる実施形態において、本発明の治療剤は、ポンプにより送達される
（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅ
ｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ
８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３
２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
【０８６７】 他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５
３３（１９９０））による総説において議論される。
【０８６８】 非経口投与のために、１つの実施形態において、一般に、治療剤は、それを所
望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および
濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するもの
と、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合すること
により処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、および治療剤
に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【０８６９】 一般に、治療剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方
と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物
を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より
好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビ
ヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液
が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもま
た、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【０８７０】 キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、このような物質としては、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸
および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸
化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニ
ンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのよ
うなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グ
ルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースま
たはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二
糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたは
ソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／ま
たはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性
剤が挙げられる。
【０８７１】 治療剤は、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１
〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に処方さ
れる。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、ポ
リペプチド塩が形成されることが理解される。
【０８７２】 治療的投与に用いられる任意の治療剤は無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例
えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成さ
れる。一般に、治療剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注
射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置され
る。
【０８７３】 治療剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたは
バイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。
凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ
）水性治療剤溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結
乾燥した水性治療剤溶液を、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製す
る。
【０８７４】 本発明はまた、本発明の治療剤の１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を
備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造
、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に
付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政
府機関による承認を表す。さらに、治療剤を他の治療用化合物と組み合わせて使
用し得る。
【０８７５】 本発明の治療剤は、単独で、またはアジュバントと組み合わせて投与され得る
。本発明の治療剤とともに投与され得るアジュバントとしては、以下が挙げられ
るが、それらに限定されない：ミョウバン、ミョウバンおよびデオキシコール酸
（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ Ｃｏｒｐ．）、ＱＳ２
１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ、ならびにＭＰＬ。特定の実施形
態において、本発明の治療剤は、ミョウバンと組み合わせて投与される。別の特
定の実施形態において、本発明の治療剤は、ＱＳ２１と組み合わせて投与される
。本発明の治療剤とともに投与され得るさらなるアジュバントとしては、以下が
挙げられるが、これらに限定されない：モノホスホリル脂質免疫調節剤、Ａｄｊ
ｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム
塩、ＭＦ−５９、およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術。本発明の治療剤
とともに投与され得るワクチンとしては、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：ＭＭＲ（麻疹、流行性耳下腺炎，風疹）、ポリオ（ｐｏｌｉｏ）、水痘
、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆ
ｌｕｅｎｚａｅ Ｂ、百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ）、肺炎、インフ
ルエンザ、ライム病、ロタウイルス、コレラ、黄熱病、日本脳炎、急性灰白髄炎
（ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、狂犬病、腸チフス、および百日咳（ｐｅｒｔ
ｕｓｓｉｓ）に対する防御に指向するワクチン。組み合わせは、付随的にか（例
えば、混合物として、別々であるが同時にもしくは並行して）；または逐次的に
かのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が治療混合物として
ともに投与されるプレゼンテーション（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を含み、そ
して組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈
ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第
１に、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与する
ことをさらに含む。
【０８７６】 本発明の治療剤（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）は、単独で、または他の治療的薬
剤と組み合わせて投与され得る。本発明の治療剤とともに投与され得る治療的薬
剤としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＴＮＦファミリーの
他のメンバー、化学療法剤、抗生物質、ステロイド性および非ステロイド性の抗
炎症剤、従来の免疫療法剤、サイトカインならびに／または増殖因子。組み合わ
せは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；ま
たは逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治
療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々
であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与さ
れる手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与
えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。１
つの実施形態において、本発明の治療剤は、ＴＮＦファミリーのメンバーと組み
合わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得るＴＮＦ分子、ＴＮＦ
関連分子、またはＴＮＦ様分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：可溶性形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α、（ＬＴ−α、ＴＮＦ−
βとしても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロ三量体ＬＴ−α２−βの状態で見出さ
れた）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１Ｂ
ＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３２８
）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、エンドカイン（ｅｎｄ
ｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＴＲ６（国際公開番
号ＷＯ９８／３０６９４）、ＯＰＧ、およびニュートロカイン（ｎｅｕｔｒｏｋ
ｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／１８９２１）、ＯＸ４０、および神経成
長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ、可溶性形態のＣＤ３０、可溶
性形態のＣＤ２７、可溶性形態のＣＤ４０および可溶性形態の４−ＩＢＢ、ＴＲ
２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７／３
３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際公開
番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、
ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開
番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４２０２）
、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、およびＴＲ１２、ならび
に可溶性形態のＣＤ１５４、可溶性形態のＣＤ７０、および可溶性形態のＣＤ１
５３。
【０８７７】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレ
オシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤および／またはプロ
テアーゼインヒビターと組み合わせて投与される。本発明の治療剤と組み合わせ
て投与され得るヌクレオシド逆転写酵素阻害剤としては、以下が挙げられるが、
これらに限定されない：ＲＥＴＲＯＶＩＲＴＭ（ジドブジン（ｚｉｄｏｖｕｄｉ
ｎｅ）／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥＺＴＭ（ジダノシン(ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ)／ｄｄ
Ｉ）、ＨＩＶＩＤＴＭ（ザルシタビン(ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ)／ｄｄＣ）、Ｚ
ＥＲＩＴＴＭ（スタブジン（ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲＴ Ｍ （ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）／３ＴＣ）、およびＣＯＭＢＩＶＩＲＴＭ （ジドブジン／ラミブジン）。本発明の治療剤と組み合わせて投与され得る
非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定
されない：ＶＩＲＡＭＵＮＥＴＭ（ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ））、Ｒ
ＥＳＣＲＩＰＴＯＲＴＭ（デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ））、および
ＳＵＳＴＩＶＡＴＭ（エファビレンツ（ｅｆａｖｉｒｅｚ））。本発明の治療剤
と組み合わせて投与され得るプロテアーゼインヒビターとしては、以下が挙げら
れるが、これらに限定されない：ＣＲＩＸＩＶＡＮＴＭ（インジナビル（ｉｎｄ
ｉｎａｖｉｒ））、ＮＯＲＶＩＲＴＭ（リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ））、
ＩＮＶＩＲＡＳＥＴＭ（サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）））、およびＶＩ
ＲＡＣＥＰＴＴＭ（ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ））。特定の実施形
態において、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレ
オシド逆転写酵素阻害剤、および／またはプロテアーゼインヒビターは、ＡＩＤ
Ｓを処置するため、および／またはＨＩＶ感染を予防もしくは処置するために、
本発明の治療剤との任意の組み合わせで使用され得る。
【０８７８】 他の実施形態において、本発明の治療剤は、抗日和見感染症薬剤と組み合わせ
て投与され得る。本発明の治療剤と組み合わせて投与され得る抗日和見感染症薬
剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＴＲＩＭＥＴＨＯＰ
ＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥＴＭ、ＤＡＰＳＯＮＥＴＭ、ＰＥＮ
ＴＡＭＩＤＩＮＥＴＭ、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥＴＭ、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤＴＭ、
ＲＩＦＡＭＰＩＮＴＭ、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥＴＭ、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬＴＭ 、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮＴＭ、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮＴＭ、ＡＺＩＴ
ＨＲＯＭＹＣＩＮＴＭ、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲＴＭ、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴＴＭ 、ＣＩＤＯＦＯＶＩＲＴＭ、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭ、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺ
ＯＬＥＴＭ、ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭ、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲＴＭ、ＦＡＭ
ＣＩＣＯＬＶＩＲＴＭ、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥＴＭ、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩ
ＮＴＭ、ＮＥＵＰＯＧＥＮＴＭ（フィルグラスチム／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥ
ＵＫＩＮＥＴＭ（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）／ＧＭ−ＣＳ
Ｆ）。特定の実施形態において、本発明の治療剤は、日和見Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓ
ｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に処置または予防するために、ＴＲＩ
ＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥＴＭ、ＤＡＰＳＯＮＥＴＭ 、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥＴＭ、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥＴＭ との任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の治
療剤は、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ複合感染を予防的に処
置または予防するために、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤＴＭ、ＲＩＦＡＭＰＩＮＴＭ、Ｐ
ＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥＴＭ、および／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬＴＭとの任
意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の治療剤は
、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を予防的
に処置または予防するために、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮＴＭ、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭ
ＹＣＩＮＴＭ、および／またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮＴＭとの任意の組み合
わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の治療剤は、日和見サ
イトメガロウイルス感染を予防的に処置または予防するために、ＧＡＮＣＩＣＬ
ＯＶＩＲＴＭ、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴＴＭ、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲＴ Ｍ との任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の
治療剤は、日和見真菌感染を予防的に処置または予防するために、ＦＬＵＣＯＮ
ＡＺＯＬＥＴＭ、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭ、および／またはＫＥＴＯＣＯ
ＮＡＺＯＬＥＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態にお
いて、本発明の治療剤は、日和見単純ヘルペスウイルスＩ型および／またはＩＩ
型感染を予防的に処置または予防するために、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲＴＭおよび／
またはＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特
定の実施形態において、本発明の治療剤は、日和見Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏ
ｎｄｉｉ感染を予防的に処置または予防するために、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮ
ＥＴＭおよび／またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮＴＭとの任意の組み合わせで使用さ
れる。別の特定の実施形態において、本発明の治療剤は、日和見細菌感染を予防
的に処置または予防するために、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮＴＭおよび／またはＮＥ
ＵＰＯＧＥＮＴＭとの任意の組み合わせで使用される。
【０８７９】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、抗ウイルス薬剤との組み合わ
せで投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る抗ウイルス薬剤としては
、アシクロビル、リバビリン、アマンタジン、およびレマンチジン（ｒｅｍａｎ
ｔｉｄｉｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８８０】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、抗生物質とともに投与される
。本発明の治療剤とともに投与され得る抗生物質としては、アモキシシリン、β
−ラクタマーゼ、アミノ配糖体、β−ラクタム（グリコペプチド）、β−ラクタ
マーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロ
フロキサシン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン類、
マクロライド系抗生物質、メトロニダゾル、ペニシリン、キノロン類、リファン
ピン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリ
ム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、およびバンコマイシンが挙げら
れるが、これらに限定されない。
【０８８１】 本発明の治療剤とともに投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤としては、ス
テロイド類、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミドメ
チルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオ
キシスペルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、および応答Ｔ
細胞の機能を抑制することによって作用する他の免疫抑制剤が挙げられるが、こ
れらに限定されない。
【０８８２】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、免疫抑制剤と組み合わせて投与
される。本発明の治療剤と共に投与され得る免疫抑制剤調製物としては、ＯＲＴ
ＨＯＣＬＯＮＥＴＭ（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥＴＭ／ＮＥＯＲＡＬＴ Ｍ ／ＳＡＮＧＤＹＡＴＭ（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦＴＭ（タクロリム
ス）、ＣＥＬＬＣＥＰＴＴＭ（ミコフェノール酸塩）、アザチオプリン、グルコ
ルチコステロイド類（ｇｌｕｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、およびＲＡＰ
ＡＭＵＮＥＴＭ（シロリムス）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の
実施形態において、免疫抑制剤は、器官または骨髄の移植の拒絶を予防するため
に使用され得る。
【０８８３】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、単独でかまたは１以上の静脈
内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の治療剤と組み合わ
せて投与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲＴＭ、Ｉ
ＶＥＥＧＡＭＴＭ、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮＴＭ、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ Ｓ
／ＤＴＭおよびＧＡＭＩＭＵＮＥＴＭが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本発明の治療剤は、移植治療（例えば、骨髄移植）に
おいて静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。
【０８８４】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、単独でかまたは抗炎症剤と組
み合わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る抗炎症剤としては
、グルココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸
誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリ
ールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類、ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チ
アジンカルボキサミド類、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオ
ニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎ
ｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾー
ル、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン
、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、
ピフオキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプが挙げられるが、
これらに限定されない。
【０８８５】 別の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与さ
れる。本発明の治療剤とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導
体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチ
ノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば
、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インタ
ーフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）
、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルム
スチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホス
ファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイ
シン、ブスルファン、シス−プラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン
（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エ
チニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテス
トステロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン
、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファ
レン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メ
クロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイド類お
よび組み合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；ならびにその他（
例えば、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトー
テン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げら
れるが、これらに限定されない。
【０８８６】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド
、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）と組み合わせて投与
されるか、ＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせで投与される。別の実施形態にお
いて、本発明の治療剤は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与される。さら
なる実施形態において、本発明の治療剤は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰと
共に、またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせと共に
投与される。
【０８８７】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、サイトカインと組み合わせて
投与される。本発明の治療剤とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ
２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３
、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられ
るが、これらに限定されない。別の実施形態において、本発明の治療剤は、任意
のインターロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４
、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１
１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１
７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０およびＩＬ−２１を含むが、これらに
限定されない）と共に投与され得る。
【０８８８】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、脈管形成タンパク質と組み合
わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る脈管形成タンパク質と
しては、欧州特許番号ＥＰ−３９９８１６に開示されるようなグリオーム由来増
殖因子（ＧＤＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小
板由来増殖因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許番号ＥＰ−２８２３１７に開示さ
れるような血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号ＷＯ９２／０
６１９４号に開示されるような胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇ
ｏｒｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるよ
うな胎盤増殖因子２（ＰＩＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に
開示されるような血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−５０６４
７７に開示されるような血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号Ｗ
Ｏ９６／３９５１５号に開示されるような血管内皮増殖因子２（ＶＥＧＦ−２）
；血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−３）；国際公開番号ＷＯ９６／２６７３６号
に開示されるような血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際
公開番号ＷＯ９８／０２５４３号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥ
ＧＦ−Ｄ）；国際公開番号ＷＯ９８／０７８３２号に開示されるような血管内皮
増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびドイツ国特許番号ＤＥ１９６３９６０１に
開示されるような血管内皮増殖因子Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が挙げられるが、これら
に限定されない。上記の参考文献は、本明細書で参考として援用される。
【０８８９】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、造血増殖因子と組み合わせて
投与される。本発明の治療剤と共に投与され得る造血増殖因子としては、ＬＥＵ
ＫＩＮＥＴＭ（ＳＡＲＧＲＡＭＯＳＴＩＭＴＭ）およびＮＥＵＰＯＧＥＮＴＭ（
ＦＩＬＧＲＡＳＴＩＭＴＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８９０】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、線維芽細胞増殖因子と組み合
わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子と
しては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧ
Ｆ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、
ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられる
が、これらに限定されない。
【０８９１】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、他の治療レジメまたは予防レ
ジメ（例えば、放射線治療）と組み合わせて投与される。
【０８９２】 （実施例２４：ポリペプチドのレベル低下を処置する方法） 本発明は、体内における本発明のポリペプチドのレベルを増大させる必要のあ
る個体を処置するための方法に関し、この方法は、治療有効量の本発明のアゴニ
スト（本発明のポリペプチドを含む）を含む組成物をそのような個体に投与する
工程を包含する。さらに、個体におけるヒトタンパク質の標準の発現レベルまた
は正常発現レベルの低下により引き起こされる状態は、本発明のポリペプチドを
、好ましくは分泌形態で投与することにより処置し得ることが理解される。従っ
て、本発明はまた、このポリペプチドのレベルの増加が必要な個体の処置方法を
提供する。この方法は、このような個体に、このような個体でこのポリペプチド
の活性レベルを増加させる量のこのポリペプチドを含む治療剤を投与する工程を
包含する。
【０８９３】 例えば、ポリペプチドのレベルが低下した患者は、そのポリペプチドを、１日
用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好ましくは、このポリペ
プチドは分泌形態である。投与および処方物に基づく投薬計画の正確な詳細は、
実施例２３に提供されている。
【０８９４】 （実施例２５：ポリペプチドのレベル上昇を処置する方法） 本発明はまた、体内における本発明のポリペプチドのレベルを減少させる必要
のある個体を処置するための方法に関し、この方法は、治療有効量の本発明のア
ンタゴニスト（本発明のポリペプチドおよび抗体を含む）を含む組成物をそのよ
うな個体に投与する工程を包含する。
【０８９５】 １つの例において、アンチセンス技術を使用して本発明のポリペプチドの産生
を阻害する。この技術は、癌のような様々な病因に起因するポリペプチド（好ま
しくは分泌形態のポリペプチド）のレベルを低下させる方法の１つの例である。
例えば、ポリペプチドのレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチセ
ンスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ／
ｋｇ／日で２１日間、静脈内投与する。この処置に対して十分に寛容化された場
合は、７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。このアンチセンスポリヌク
レオチドの処方は、実施例２３に提供されている。
【０８９６】 （実施例２６：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、ポリペプチドを発現し得る線維芽細胞を患者に移
植する。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験者から得られる。得られた
組織を組織培養培地中に配置し、小片に分割する。組織の小塊を組織培養フラス
コの湿潤表面に置き、約１０片を各フラスコに置く。このフラスコを倒置し、し
っかりと閉めた後、室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを反転さ
せ、組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、そして新鮮な培地（例えば、
１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＨａｍのＦ１２
培地）を添加する。次に、フラスコを３７℃で約１週間インキュベートする。
【０８９７】 この時点で、新鮮な培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週
間培養した後に、単層の線維芽細胞が出現する。この単層をトリプシン処理し、
さらに大きなフラスコにスケールアップする。
【０８９８】 モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃ
ｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））をＥｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。
線状ベクターをアガロースゲル上で分画し、そしてガラスビーズを使用して精製
する。
【０８９９】 本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、必要な場合、プライマーを用
いそして適切な制限部位および開始／終止コドンを有する、実施例１に記載のそ
れぞれ５’末端配列および３’末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して
増幅し得る。好ましくは、この５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして
この３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量の、モロニーマウス肉腫
ウイルスの線状骨格および増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメン
トを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を、この
２つのフラグメントを連結するのに適した条件下で維持する。次に、連結混合物
を使用し、細菌ＨＢ１０１を形質転換する。次に、それを、カナマイシンを含む
寒天上にプレーティングし、ベクターが正確に挿入された目的の遺伝子を有する
ことを確認する。
【０９００】 アンホトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１
０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッ
コ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな密度まで増殖
させる。次に、その目的の遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加え、そしてパ
ッケージング細胞をこのベクターで形質導入する。このとき、このパッケージン
グ細胞は、その遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、このパッ
ケージング細胞をプロデューサー細胞という）。
【０９０１】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮な培地を添加し、次いでこの培地を
１０ｃｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性
ウイルス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過し、は
がれたプロデューサー細胞を除去した後、この培地を使用して、線維芽細胞を感
染させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そし
てプロデューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そ
して新鮮な培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線
維芽細胞が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまた
はｈｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用すること
が必要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染したなら、その線維芽細胞を分
析し、タンパク質が産生されているか否かを決定する。
【０９０２】 次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで、宿主に移植する
。
【０９０３】 （実施例２７：本発明のポリヌクレオチドに対応する内因性遺伝子を使用する
遺伝子治療） 本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、本発明の内因性ポリヌクレオチド配列
を、例えば、米国特許番号５，６４１，６７０（１９９７年６月２４日発行）；
国際公開番号ＷＯ ９６／２９４１１（１９９６年９月２６日公開）；国際公開
番号ＷＯ ９４／１２６５０（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２〜８９３５（１
９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８
（１９８９）に記載されるように、相同組換えを介してプロモーターに作動可能
に結合する工程を包含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが、その細
胞中では発現されないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝
子の活性化を包含する。
【０９０４】 プロモーターおよび標的化配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製する。こ
の標的配列は、プロモーターに隣接する、内因性ポリヌクレオチド配列の５’非
コード配列に相同である。この標的化配列は、このポリヌクレオチド配列の５’
末端に十分に近く、その結果、このプロモーターは、相同組換えの際にこの内因
性配列に作動可能に連結される。このプロモーターおよび標的化配列を、ＰＣＲ
を使用して増幅し得る。好ましくは、この増幅したプロモーターは、５’末端お
よび３’末端上に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の
３’末端は、増幅したプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そし
て第２の標的化配列の５’末端は、増幅したプロモーターの３’末端と同じ制限
部位を含む。
【０９０５】 この増幅したプロモーターおよび増幅した標的化配列を、適切な制限酵素で消
化し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消
化した標的化配列を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。生じた混
合物を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構築
物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール
沈殿により精製する。
【０９０６】 この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーショ
ンを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチ
ド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス
配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）とともに投与され得る。送達のこのような方
法は、当該分野で公知である。
【０９０７】 一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが生じて、このプロモータ
ーがこの内因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結される。これは、この細
胞中におけるこのポリヌクレオチドに対応するポリヌクレオチドの発現を生じる
。発現は、免疫学的染色または当該分野で公知の他の任意の方法により、検出さ
れ得る。
【０９０８】 線維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋
１０％ウシ胎仔血清中に配置する。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を
、トリプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細
胞懸濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離
に供する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩
衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、０．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。こ
の細胞を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブ
ミン１ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終
細胞懸濁物は、約３×１０６細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再
懸濁直後に実施すべきである。
【０９０９】 プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、本発明のポリヌ
クレオチドに対応する遺伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために
、プラスミドｐＵＣ１８（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ
）をＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＣＭＶプロモーターを、５’末端にＸｂａＩ部
位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を備えてＰＣＲにより増幅する。２つの非コ
ード配列をＰＣＲを介して増幅する：一方の非コード配列（フラグメント１）を
、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端にＸｂａＩ部位を備えて増幅す
る；他方の非コード配列（フラグメント２）を、５’末端にＢａｍＨＩ部位およ
び３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を備えて増幅する。このＣＭＶプロモーターお
よびこれらのフラグメント（１および２）を、適切な酵素（ＣＭＶプロモーター
−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；フラグメント１−ＸｂａＩ；フラグメント２−Ｂ
ａｍＨＩ）で消化し、そしてともに連結する。生じた連結生成物をＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する
。
【０９１０】 プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０６細胞
を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を
、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ
、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生
存が減少するが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割
合が劇的に増加する。これらのパラメーターを与えると、パルス時間約１４〜２
０ｍＳｅｃが観察されるはずである。
【０９１１】 エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキ
ュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞
を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤ
ＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この
培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４
時間インキュベートする。
【０９１２】 次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か、またはサイトデックス
（ｃｙｔｏｄｅｘ）３マイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）ビーズ上
でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいずれかで、注入する。ここで、
この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次いで、この線維芽細胞を、上
記のような患者に導入し得る。
【０９１３】 （実施例２８：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、ポリペプチドの発現を
増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアン
チセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列の導入に関する。本発明のポリヌクレオチド
は、プロモーター、または標的組織によるそのポリペプチドの発現に必要な任意
の他の遺伝子エレメントに、作動可能に連結され得る。このような遺伝子治療お
よび送達の技術および方法は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９０／１１
０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５６９３６２２号、同第５７０５１
５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅ
ｓ．３５（３）：４７０−４７９（１９９７）；Ｃｈａｏら、Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌ．Ｒｅｓ．３５（６）：５１７−５２２（１９９７）；Ｗｏｌｆｆ、Ｎｅｕｒ
ｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８（１９９７）、Ｓｃ
ｈｗａｒｔｚら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３（５）：４０５−４１１（１９９６
）；Ｔｓｕｒｕｍｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（１２）：３２８１−３
２９０（１９９６）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０９１４】 ポリヌクレオチド構築物は、注入可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方
法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙空間への注入
）によって送達され得る。このポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な
液体または水性キャリア中で送達され得る。
【０９１５】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助
、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、本発明のポリヌクレオチドはまた、当業者に
周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ
Ｐ．Ｌ．ら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１
３９およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ．ら（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ８５（
１）：１−７で教示されたもの）中で送達され得る。
【０９１６】 この遺伝子治療方法において使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、
好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列も含まない構築
物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、ＤＮＡの発現を駆動す
るために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細
胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一
過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ
月までの間の期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０９１７】 このポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、
脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸
、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）の間
隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、細胞間液、ムコ多糖基質（器官
組織の細網線維、血管または腔（ｃｈａｍｂｅｒ）の壁における弾性線維、線維
性組織のコラーゲン線維に間にある）、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞内または
骨の裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチ
ャンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達
は、以下に考察する理由のために好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織
への注入によって、好都合に送達され得る。それらは、好ましくは、分化した持
続性の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞において発現されるが、送達およ
び発現は、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細
胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボで、筋肉細胞は、ポ
リヌクレオチドを取り込み、そして発現するそれらの能力において、特に適格で
ある。
【０９１８】 裸のポリヌクレオチド注入のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約
０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、こ
の投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより
好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業
者が認識するように、この投薬量は、注入の組織部位に従って変化する。核酸配
列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置さ
れる状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間隙空間へ
の非経口注入経路によってである。しかし、他の非経口経路もまた用いられ得、
これには、例えば、特に肺または気管支組織、咽喉、または鼻の粘膜への送達の
ためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のポリヌクレオチド構
築物が、血管形成術の間に、この手順において用いられるカテーテルによって動
脈に送達され得る。
【０９１９】 インビボでの筋肉における注入ポリヌクレオチドの用量応答効果を、以下のよ
うにして決定する。本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生成のための
適切な鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。鋳型ＤＮ
Ａ（これは環状または線状のいずれかであり得る）を裸のＤＮＡとして使用する
か、またはリポソームと複合体化するかのいずれかである。次いで、マウスの四
頭筋に、種々の量の鋳型ＤＮＡを注入する。
【０９２０】 ５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。鋳型ＤＮＡを、０．１ｍｌのキャ
リアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわたって、筋肉の
遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約０．２ｃｍの深さで注入する
。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上で行い、そしてその皮膚をステ
ンレス鋼クリップで閉じる。
【０９２１】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、タ
ンパク質発現について組織化学的に染色する。タンパク質発現についてのタイム
コースを、異なるマウスからの四頭を異なる時間で採取すること以外は、同様な
様式で行い得る。注入後の筋肉中のＤＮＡの持続性を、注入したマウスおよびコ
ントロールマウスからの全細胞性ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後、サザ
ンブロット分析によって決定し得る。マウスにおける上記実験の結果を、裸のＤ
ＮＡを用いて、ヒトおよび他の動物において適切な投薬量および他の処置パラメ
ーターを外挿するために使用し得る。
【０９２２】 （実施例２９：トランスジェニック動物） 本発明のポリペプチドはまた、トランスジェニック動物において発現され得る
。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、
ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、サルおよびチンパンジー
）を含むがこれらに限定されない任意の種の動物は、トランスジェニック動物を
作製するために用いられ得る。特定の実施形態において、本明細書に記載される
かまたはさもなければ当該分野で公知の技術が、遺伝子治療プロトコルの一部と
して、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発現のために用いられる。
【０９２３】 当該分野で公知の任意の技術を、導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレ
オチド）の動物への導入に用いて、トランスジェニック動物の創始系統（ｆｏｕ
ｎｄｅｒ ｌｉｎｅ）を生成し得る。このような技術は、前核マイクロインジェ
クション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；お
よびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖細胞
系へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９
８５））、胚盤胞または胚；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏ
ｎら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレク
トロポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０
３−１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導
入（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を
参照のこと）；胚性多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞への核酸構築物
の導入および胚盤胞へのこの幹細胞の移入；ならびに精子媒介遺伝子移入（Ｌａ
ｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８９））；などを含
むがこれらに限定されない。このような技術の総説については、本明細書中にそ
の全体が参考として援用される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎ
ｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９
８９）を参照のこと。
【０９２４】 当該分野で公知の任意の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトラ
ンスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された、静止状態に誘導さ
れた胚細胞、胎児細胞または成体の細胞由来の除核した卵母細胞の核への核移入
（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌ
ｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）））。
【０９２５】 本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ）を提供する。導入遺伝子は、１つ
の導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−
尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子は
また、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定
の細胞型に選択的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異
的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれ
らは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染
色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。手
短に言えば、このような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同ない
くつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同な組換えを介
して内在性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列の機
能を破壊することを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞型に
選択的に導入され得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６
５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、導入された細胞型において
のみ内在性遺伝子が不活化される。そのような細胞型特異的不活化に必要とされ
る調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明らかで
ある。
【０９２６】 一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きた
ことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザ
ンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素Ｐ
ＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得る
。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異
的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。
【０９２７】 一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配され、同系交配され、異系交
配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そのような
交配戦略の例は、以下を含むがそれらに限定されない：別の系統を樹立するため
の１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相
加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジ
ェニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析
による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部
位に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニック動物の
交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々のホモ接合
系統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導
入遺伝子を配置するための交配。
【０９２８】 本発明のトランスジェニック動物は、本発明のポリペプチドの生物学的機能の
詳述、異常な発現に関連する状態および／または障害の研究、ならびにこのよう
な状態および／または障害の改善に有効な化合物についてのスクリーニングに有
用な動物モデル系を含むがこれらに限定されない用途を有する。
【０９２９】 （実施例３０：ノックアウト動物） 内因性遺伝子発現もまた、標的化された相同組換えを使用して遺伝子および／
またはそのプロモーターを不活性化あるいは「ノックアウトする」ことによって
減少し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０−２
３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ ５１：５
０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５：３１３−３２
１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、本明細書中でその全体が参考と
して援用される）。例えば、内因性ポリヌクレオチド配列（この遺伝子のコード
領域または調節領域のいずれか）と相同性のＤＮＡに隣接される、本発明の改変
体、非機能的なポリヌクレオチド（または完全に関連のないＤＮＡ配列）を、選
択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを用いてまたは用いずに使用
し、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞をトランスフェクトし得る
。別の実施形態において、当該分野で公知の技術を、目的の遺伝子を含むが、発
現しない細胞中でノックアウトを作製するために使用する。標的化された相同組
換えを介した、このＤＮＡ構築物の挿入は、標的化された遺伝子の不活性化を生
じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改変が不活性な標的化され
た遺伝子を有する動物の子孫を作製するために使用され得る研究および農業分野
に特に適する（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ １９８７および
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ １９８９、前出を参照のこと）。しかし、このアプローチは
、当業者に明白な適切なウイルスベクターを使用して、組換えＤＮＡ構築物がイ
ンビボで要求された部位に直接投与されるか、または標的化される場合、ヒトに
おける使用に慣用的に適合され得る。
【０９３０】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するために
遺伝子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝
子操作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。こ
のような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナー
から入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂
肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞
を、例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入
遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プ
ラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソー
ムなどの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポ
リペプチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／ま
たは本発明のポリペプチドに結合している内因性の調節配列を破壊するために、
組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチ
ドのコード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたは
プロモーター／エンハンサーの制御下に配置し、本発明のポリペプチドの発現お
よび好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好ましく
は分泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患者中へ
全身的に導入し得る。
【０９３１】 あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（
例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；遺
伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る
（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号ならびにＭｕ
ｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこ
と。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０９３２】 投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞をカプセル性の形態で導入し得、この形態は、構成成分
と即時の細胞外環境との交換を可能にしつつ、導入細胞が宿主免疫系によって認
識されることを可能にしない。
【０９３３】 本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物は、本発明のポリペ
プチドの生物学的機能の詳述、異常な発現に関連する疾患、障害および／または
状態の研究、ならびにこのような疾患、障害および／または状態を寛解させるに
有効な化合物のスクリーニングにおいて有用な動物モデル系を含むが、それらに
限定されない用途を有する。
【０９３４】 （実施例３１：抗体の産生） （ハイブリドーマ技術） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、ヒ
トタンパク質を発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導す
るために動物に投与される。好ましい方法において、ヒトタンパク質の調製物が
調製され、そして精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないようにされる。
次いで、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するために、このよう
な調製物は、動物に導入される。
【０９３５】 ヒトタンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術
を使用して調製される（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９
７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６
）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；
Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎ
ｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、５６
３−６８１頁（１９８１））。一般に、動物（好ましくはマウス）は、本発明の
ポリペプチドで、またはより好ましくは分泌ポリペプチド発現細胞で免疫される
。このようなポリペプチド発現細胞は、任意の適切な組織培養培地において、好
ましくは１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化した）を補充し、そして約１０
ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００
μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変イーグル培地におい
て培養される。
【０９３６】 このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合され
る。任意の適切な骨髄腫細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しかし、ＡＴ
ＣＣから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好ましい。融合
後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次い
でＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（
１９８１））により記載されるように限界希釈によってクローニングする。次い
で、このような選択によって得られるハイブリドーマ細胞は、ヒトタンパク質を
結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる。
【０９３７】 あるいは、ヒトタンパク質に結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタイプ抗
体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は、抗体そ
れ自体が抗原であり、それ故第二の抗体に結合する抗体を得ることが可能である
という事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使用して、
動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾細胞を使
用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ細胞は、
タンパク質特異的抗体に結合する能力が本発明のポリペプチドによってブロック
され得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。この
ような抗体は、タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そ
して動物を免疫してさらなるタンパク質特異的抗体の形成を誘導するために使用
される。
【０９３８】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、抗体は、「ヒト化」される。この
ような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来
する遺伝的構築物を使用することによって産生され得る。キメラ抗体およびヒト
化抗体を産生するための方法は当該分野で公知であり、そして本明細書中に議論
される（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０
２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６
）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ
ら、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６
７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎ
ｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと
）。
【０９３９】 （ｓｃＦｖｓのライブラリーからのポリペプチドに対して指向される抗体フラ
グメントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、ドナーが曝され得たかま
たは曝され得なかった本発明のポリペプチドに対する反応性を含む抗体フラグメ
ントのライブラリーに構築する（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（そ
の全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０９４０】 ライブラリーのレスキュー。 ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／０１０４７に記載のよ
うに、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓｃＦｖｓのライブラリーを構築する。抗体フラ
グメントを提示するファージをレスキューするため、ファージミドを保有する約
１０９個のＥ．ｃｏｌｉを用いて、５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を
接種し、そして振盪しながら０．８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５
ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵに接種し、２×１０８ＴＵの
Δ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７
を参照のこと）を添加し、そして培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュ
ベートし、次いで振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートする。この培養
物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、そしてペレットを２リットル
の２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシン
を含有する）中に再懸濁し、そして一晩増殖させる。ファージをＰＣＴ公開ＷＯ
９２／０１０４７に記載のように調製する。
【０９４１】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質
を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖さ
せることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪な
しで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時
間インキュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００ｒ
．ｐ．ｍ．／分で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μ
ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ
）３００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファ
ージ粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培
地から精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフ
ィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１
０１３形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。
【０９４２】 ライブラリーのパニング。Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明の
ポリペプチドの１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用
いてＰＢＳ中で一晩被膜する。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３
７℃で２時間ブロックし、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０１３ＴＵのフ
ァージをチューブに適用し、そして、回転盤上で上下にタンブリングしながら室
温で３０分間インキュベートし、次いでさらに１．５時間静置しておく。チュー
ブをＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する
。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上
下に回転させることによりファージを溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１
．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したフ
ァージを細菌とともに３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ファー
ジを用いて、１０ｍｌの対数増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次
いで、Ｅ．ｃｏｌｉを１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含
有するＴＹＥプレート上にプレートする。次いで、得られる細菌ライブラリーを
、上記のようにΔ遺伝子３ヘルパーファージでレスキューし、次の回の選択のた
めのファージを調製する。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４
回について反復し、３回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔ
ｗｅｅｎ−２０で２０倍、そしてＰＢＳで２０倍に増加する。
【０９４３】 結合剤の特徴付け。第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用い
て、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセ
イのために単一コロニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭
酸水素塩、ｐＨ９．６中の本発明のポリペプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで
被膜したマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ
中の陽性クローンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ
９２／０１０４７を参照のこと）、次に配列決定することによりさらに特徴付け
る。これらのＥＬＩＳＡ陽性クローンはまた、当該分野において公知の技術（例
えば、エピトープマッピング、結合親和性、レセプターシグナル形質導入、抗体
／抗原結合をブロックするかまたは競合的に阻害する能力、および競合的アゴニ
スト活性または競合的アンタゴニスト活性など）によりさらに特徴付けられ得る
。
【０９４４】 （実施例３２：Ｂ細胞増殖および分化の刺激または阻害を検出するアッセイ） 機能的体液性免疫応答の生成は、Ｂ系列の細胞とそれらの微小環境との間に、
可溶性のシグナル伝達および同族のシグナル伝達の両方を必要とする。シグナル
は、陽性の刺激（Ｂ系列の細胞がプログラムされた発生を持続するようにさせる
）、または陰性の刺激（細胞が電流発生経路を阻止するように指示する）を伝え
得る。現在までに、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ
−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４およびＩＬ−１５を含む、多数の刺激シグナル
および阻害シグナルがＢ細胞応答性に影響することが見出されている。興味深い
ことに、これらのシグナルはそれ自体は弱いエフェクターであるが、種々の同時
刺激タンパク質と組み合わせて、Ｂ細胞集団中の活性化、増殖、分化、ホーミン
グ、耐性、および死を誘導し得る。
【０９４５】 Ｂ細胞同時刺激タンパク質の最も研究されたクラスの１つがＴＮＦスーパーフ
ァミリーである。このファミリー内で、ＣＤ４０、ＣＤ２７およびＣＤ３０は、
そのそれぞれのリガンドである、ＣＤ１５４、ＣＤ７０およびＣＤ１５３と共に
種々の免疫応答を調節することが見出されている。これらのＢ細胞集団およびそ
れらの前駆細胞の増殖および分化の検出および／または観察を可能にするアッセ
イは、種々のタンパク質がこれらのＢ細胞集団上に、増殖および分化の点で有し
得る効果を決定する際に価値のあるツールである。以下に列挙するのは、Ｂ細胞
集団およびそれらの前駆体の分化、増殖、または阻害の検出を可能にするように
設計された２つのアッセイである。
【０９４６】 （インビトロアッセイ）−本発明の精製されたポリペプチド、またはそれらの
短縮化形態を、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体において活性化、増殖、分化も
しくは阻害および／または死を誘導する能力について評価する。精製したヒト扁
桃腺Ｂ細胞への本発明のポリペプチドの活性（定性的に０．１〜１０，０００ｎ
ｇ／ｍＬの用量範囲にわたって測定した）を、標準的なＢリンパ球同時刺激アッ
セイにおいて評価する。このアッセイでは、精製した扁桃腺Ｂ細胞を、プライミ
ング因子として、ホルマリン固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ
Ｃｏｗａｎ Ｉ（ＳＡＣ）、または固定した抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかの存
在下で培養する。ＩＬ−２およびＩＬ−１５のような第２のシグナルは、トリチ
ウム化チミジン取り込みにより測定した場合、ＳＡＣおよびＩｇＭ架橋と協同し
てＢ細胞増殖を誘発する。新規な協同因子を、このアッセイを用いて容易に同定
し得る。このアッセイは、ＣＤ３陽性細胞の磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）枯渇により
ヒト扁桃腺Ｂ細胞を単離する工程を包含する。得られる細胞集団は、ＣＤ４５Ｒ
（Ｂ２２０）の発現により評価する場合、９５％のＢ細胞より大きい。
【０９４７】 種々の希釈のそれぞれのサンプルを９６ウェルプレートの個々のウェルに配置
し、ここへ、培養培地（１０％ＦＢＳ、５×１０−５Ｍ ２ＭＥ、１００Ｕ／ｍ
ｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０−５希釈のＳＡ
Ｃを含有するＲＰＭＩ １６４０）中で懸濁した、総量１５０μｌ中の、１０５ Ｂ細胞を添加する。増殖または阻害を、因子の添加後７２時間から開始して、３
Ｈ−チミジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）で２０ｈパルス（１μＣｉ／ウェル）により
定量する。陽性コントロールおよび陰性コントロールは、それぞれＩＬ２および
培地である。
【０９４８】 （インビボアッセイ）−ＢＡＬＢ／ｃマウスに、緩衝液のみ、または本発明の
２ｍｇ／ｋｇのポリペプチド、またはそれらの短縮形態を、１日２回注射（腹腔
内）する。マウスにこの処置を４日間連続して与え、この時点でそれらを屠殺し
、そして分析のために種々の組織および血清を収集した。正常な脾臓および本発
明のポリペプチドで処理した脾臓由来のＨ＆Ｅ切片の比較により、脾臓細胞での
このポリペプチドの活性の結果、例えば、動脈周囲リンパ性鞘の拡散および／ま
たは赤色脾髄領域の有核の細胞充実性の有意な増加（これは、Ｂ細胞集団の分化
および増殖の活性化を示し得る）が確認される。Ｂ細胞マーカーである、抗ＣＤ
４５Ｒ（Ｂ２２０）を用いる免疫組織化学的研究を用いて、脾臓細胞への任意の
生理的な変化（例えば、脾臓組織崩壊）が、樹立されたＴ細胞領域に浸潤する漠
然と規定されたＢ細胞区画内のＢ細胞提示の増加に起因するか否かを決定する。
【０９４９】 ポリペプチドで処置したマウス由来の脾臓のフローサイトメトリー分析を用い
て、このポリペプチドが、ＴｈＢ＋であるＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ｄｕｌｌ Ｂ
細胞の比を、コントロールマウスで観察される比よりも特異的に増加するか否か
を示す。
【０９５０】 さらに、増加した成熟Ｂ細胞のインビボでの提示の推定される結果は、血清Ｉ
ｇ力価の相対的な増加である。従って、血清ＩｇＭおよびＩｇＡレベルを緩衝液
処置マウスとポリペプチド処置マウスとの間で比較する。
【０９５１】 本実施例において記載する試験は、本発明のポリペプチドの活性を試験した。
しかし、当業者は、本発明のポリペプチドの活性（例えば、遺伝子治療）、本発
明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニスト、および／またはアン
タゴニストを試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。
【０９５２】 （実施例３３：Ｔ細胞増殖アッセイ） ＣＤ３誘導性の増殖アッセイをＰＢＭＣで実行し、そして３Ｈ−チミジンの取
り込みにより測定する。このアッセイを以下のように実行する。９６ウェルプレ
ートを、ＣＤ３に対するｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の１００
μｌ／ウェル、またはアイソタイプ適合のコントロールｍＡｂ（Ｂ３３．１）（
０．０５Ｍ 炭酸水素塩緩衝液、ｐＨ９．５中、１μｇ／ｍｌ）で４℃で１晩、
コートし、次いでＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣをヒト末梢血から、Ｆ／Ｈ勾
配遠心分離により単離し、そして本発明のポリペプチドの種々の濃度での存在下
で、１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有するＲＰＭＩ中、ｍＡｂでコートしたプレ
ートの４通りのウェル（５×１０４／ウェル）に添加する（総量２００μｌ）。
関連するタンパク質緩衝液および培地単独がコントロールである。３７℃での培
養の４８時間後、プレートを１０００ｒｐｍで２分間回転させ、そして１００μ
ｌの上清を除去し、そして、増殖への効果が観察される場合、ＩＬ−２（または
他のサイトカイン）の測定のために−２０℃で貯蔵した。ウェルに０．５μＣｉ
の３Ｈ−チミジンを含有する１００μｌの培地を補充し、そして３７℃で１８〜
２４時間培養する。ウェルを収集し、そして３Ｈ−チミジンの取り込みを増殖の
指標として用いた。抗ＣＤ３単独が増殖の陽性コントロールである。ＩＬ−２（
１００Ｕ／ｍｌ）をまた、増殖を増強するコントロールとして用いる。Ｔ細胞の
増殖を誘導しないコントロール抗体を本発明のポリペプチドの効果についての陰
性コントロールとして用いる。
【０９５３】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、本発明のポリペプチドの活性（例えば、遺伝子治療）、本
発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニスト、および／またはア
ンタゴニストを試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。
【０９５４】 （実施例３４：ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現、なら
びに単球および単球由来ヒト樹状細胞の細胞分化への本発明のポリペプチドの効
果） 樹状細胞を末梢血において見出される増殖前駆体の増殖により生成する：接着
性ＰＢＭＣまたは清浄化単球画分を、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩ
Ｌ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）とともに７〜１０日間培養する。これらの樹状細胞は
、非成熟細胞の特徴的表現型（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭ
ＨＣクラスＩＩ抗原の発現）を有する。ＴＮＦ−αのような活性化因子での処理
は、表面表現形に迅速な変化（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、同時刺激分子および
接着分子の発現の増加、ＦＣγＲＩＩの下方制御、ＣＤ８３の上方制御）を生じ
る。これらの変化は抗原提示能力の増加、および樹状細胞の機能的成熟と関連す
る。
【０９５５】 表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下の様に実施する。細胞を、本発明のポリペプチ
ドまたはＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜３日処理し、１％Ｂ
ＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで１
：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モノクロー
ナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄後、標識
した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサ
イトメトリーにより分析する。
【０９５６】 （サイトカインの生成への効果）樹状細胞により生成されるサイトカイン、特
にＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性免疫応答の開始において重要である。ＩＬ−１２
は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応答の発生に強力に影響し、そして細胞傷害性Ｔ
細胞機能およびＮＫ細胞機能を誘導する。ＥＬＩＳＡを用いて以下のようにＩＬ
−１２放出を測定する。樹状細胞（１０６／ｍｌ）を、本発明のポリペプチドの
漸増する濃度で２４時間処理する。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コント
ロールとして細胞培養に添加する。次いで、細胞培養からの上清を収集し、そし
て市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐ
ｏｌｉｓ，ＭＮ））を用いてＩＬ−１２含量について分析する。キットに提供さ
れる標準的プロトコールを用いる。
【０９５７】 ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現への効果。細胞表面抗
原の３つの主なファミリー：接着分子、抗原提示に関与する分子、およびＦｃレ
セプター、が、単球上で同定され得る。ＭＨＣクラスＩＩ抗原および他の同時刺
激分子（例えば、Ｂ７およびＩＣＡＭ−１）の発現の調節は、単球の抗原提示能
力、およびＴ細胞活性化を誘導する能力に変化を生じ得る。Ｆｃレセプターの発
現増加は、単球細胞傷害性活性、サイトカイン放出および食菌作用の改善と相関
し得る。
【０９５８】 ＦＡＣＳ分析は、以下のように表面抗原を試験するために用いられる。単球を
、本発明のポリペプチドまたはＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１
〜５日処理し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢ
Ｓで洗浄し、次いで１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体また
はＰＥ標識モノクローナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。
さらなる洗浄後、標識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ）でのフローサイトメトリーにより分析する。
【０９５９】 （単球活性化および／または生存の増加）単球を活性化する（あるいは、不活
化する）および／または単球の生存を増加する（あるいは、単球生存を低下させ
る）分子についてのアッセイは、当該分野で公知であり、そして本発明の分子が
単球のインヒビターまたはアクチベーターとして機能するか否かを決定するため
に慣用的に適用され得る。本発明のポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニ
ストは、以下に記載の３つのアッセイを用いてスクリーニングされ得る。これら
のアッセイのそれぞれについて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐ
ａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）を通じた遠心分離により、単一のドナーｌｅｕｋｏ
ｐａｃｋ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ
）から精製する。単球を向流遠心性エルトリエーション（ｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏ
ｗ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）によりＰＢＭＣから単
離する。
【０９６０】 （単球生存アッセイ）ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激の非存在下で培
養した場合、次第に生存度を失う。それらの死は、内部調節されたプロセス（ア
ポトーシス）から生じる。活性化因子、例えばＴＮＦαの培養への添加は、劇的
に、細胞生存を改善し、そしてＤＮＡの断片化を妨げる。プロピジウムヨード（
ＰＩ）染色を用いて、以下のようにアポトーシスを測定する。単球を、１００ｎ
ｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（陰性コントロール）の存在下、および試験される種々の
濃度の化合物の存在下で、ポリプロピレンチューブ中の無血清培地（陽性コント
ロール）中で、４８時間培養する。細胞を、最終濃度５μｇ／ｍｌでＰＩを含有
するＰＢＳ中で２×１０６／ｍｌの濃度に懸濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎ分析の
前に５分間室温でインキュベートする。ＰＩ取り込みは、この試験パラダイムに
おけるＤＮＡの断片化と相関することを示している。
【０９６１】 （サイトカイン放出への影響）単球／マクロファージの重要な機能は、刺激後
のサイトカインの放出を通じた免疫系の他の細胞集団へのそれらの調節活性であ
る。サイトカイン放出を測定するためのＥＬＩＳＡは、以下のように実施する。
ヒト単球を、５×１０５細胞／ｍｌの密度で、本発明のポリペプチドの漸増する
濃度とともに、および同じ条件下でこのポリペプチドの非存在下で、インキュベ
ートする。ＩＬ−１２の生成については、この細胞を、本発明のポリペプチドの
存在下でＩＦＮ（１００Ｕ／ｍｌ）で１晩プライムする。次いで、ＬＰＳ（１０
ｎｇ／ｍｌ）を添加する。馴化培地を２４時間後に収集し、そして使用するまで
凍結保存する。次いで、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の
測定を市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅ
ａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用い、そしてキットに提供される標準的プロトコールを
適用して実施する。
【０９６２】 （酸化的バースト（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ））精製した単球を９６
ウェルプレートに２〜１×１０５細胞／ウェルでプレートする。本発明のポリペ
プチドの漸増濃度をウェルの総量０．２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ １６４０＋
１０％ＦＣＳ、グルタミンおよび抗生物質）に添加する。３日間のインキュベー
ション後、このプレートを遠心分離し、そして培地をウェルから除く。マクロフ
ァージの単層に、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（１４０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、５．５ｍＭデキス
トロース、０．５６ｍＭフェノールレッドおよび１９Ｕ／ｍｌのＨＲＰＯ）を、
刺激物質（２００ｎＭ ＰＭＡ）とともに添加する。このプレートを３７℃で２
時間インキュベートし、そして１ウェルあたり２０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを添加
して反応を停止する。吸収を６１０ｎｍで読む。マクロファージにより生成され
るＨ２Ｏ２の量を算出するため、既知のモル濃度のＨ２Ｏ２溶液の標準曲線をそ
れぞれの実験について実施する。
【０９６３】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、本発明のポリペプチドの活性、ポリヌクレオチドの活性（
例えば、遺伝子治療）、アゴニストの活性、および／またはアンタゴニストの活
性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。
【０９６４】 （実施例３５：本発明のポリペプチドの生物学的効果） （星状細胞および神経アッセイ） 上記のように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで発現され、そして精製さ
れた本発明の組換えポリペプチドを、皮質ニューロン細胞の生存、神経突起成長
または表現形分化を促進する活性について、およびグリア線維性酸性タンパク質
免疫陽性細胞、星状細胞の増殖の誘導について試験し得る。バイオアッセイのた
めの皮質細胞の選択は、皮質構造中のＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２の広く行き渡
っている発現、ならびにＦＧＦ−２処理から生じる皮質ニューロン生存の以前に
報告された増強に基づく。チミジン取り込みアッセイを用いて、例えば、これら
の細胞への本発明のポリペプチドの活性を解明し得る。
【０９６５】 さらに、インビトロにおける皮質ニューロンまたは海馬ニューロンへのＦＧＦ
−２（塩基性ＦＧＦ）の生物学的効果を記載する以前のレポートは、ニューロン
生存および神経突起成長の両方における増大を実証している（Ｗａｌｉｃｋｅら
、「Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｓ
ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ
ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎｅｕｒｉｔｅ ｅｘｔｅｎｓｉ
ｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：３０１２〜３０
１６（１９８６）、アッセイは、本明細書でその全体が参考として援用される）
。しかし、ＰＣ−１２細胞で実行される実験からの報告は、これらの２つの応答
が必ずしも同義でないこと、そしてどのＦＧＦを試験しいるかだけでなく、どの
レセプターが標的細胞で発現されているかにも依存し得ることを示唆する。神経
突起成長を誘導する本発明のポリペプチドの能力を、一次の皮質ニューロン培養
パラダイムを用いて、例えば、チミジン取り込みアッセイを用いてＦＧＦ−２で
得られた応答と比較し得る。
【０９６６】 （線維芽細胞および内皮細胞アッセイ） ヒト肺線維芽細胞をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入
手し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓからの増殖培地で維持する。真皮性微小血管内
皮細胞をＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）か
ら得る。増殖アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞および真皮性微小血管内皮
細胞を、９６ウェルプレートの増殖培地中で１日間、５，０００細胞／ウェルで
培養し得る。次いでこの細胞を０．１％ＢＳＡ基礎培地中で１日間インキュベー
トする。新鮮な０．１％ＢＳＡ培地で培地を置換した後、細胞を試験タンパク質
と３日間インキュベートする。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ａｌｍａｒ Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）を１０％の最終濃度になるよう
に各ウェルに添加する。この細胞を４時間インキュベートする。細胞生存度をＣ
ｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーでの読取りにより測定する。ＰＧＥ２アッセイに
ついては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で１日間、５，０００細
胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地を変換した後、細胞をＩ
Ｌ−１αとともに、またはそれをともなわずに、ＦＧＦ−２または本発明のポリ
ペプチドと２４時間インキュベートする。上清を収集し、そしてＥＩＡキット（
Ｃａｙｍａｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によりＰＧＥ２についてアッセイす
る。ＩＬ−６アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中
で１日間、５，０００細胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地
を変換した後、細胞を本発明のポリペプチドＩＬ−１αとともに、またはそれを
ともなわずに、ＦＧＦ−２と２４時間インキュベートする。上清を収集し、そし
てＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によりＩＬ
−６についてアッセイする。
【０９６７】 ヒト肺線維芽細胞をＦＧＦ−２または本発明のポリペプチドとともに基礎培地
中で３日間培養し、その後、線維芽細胞の増殖への効果を評価するためＡｌａｍ
ａｒ Ｂｌｕｅを添加する。ＦＧＦ−２は、本発明のポリペプチドでの刺激に匹
敵して用いられ得る１０〜２５００ｎｇ／ｍｌの刺激を示すはずである。
【０９６８】 （パーキンソンモデル） パーキンソン病における運動機能の喪失は、黒質線条体のドーパミン作動性投
射ニューロンの変性から生じる線条体ドーパミンの欠乏に起因する。広範に特徴
付けされたパーキンソン病の動物モデルは、１−メチル−４フェニル１，２，３
，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の全身投与を含む。ＣＮＳにおいて、
ＭＰＴＰは、星状細胞に取り込まれ、そしてモノアミンオキシダーゼＢにより１
−メチル−４−フェニルピリジン（ＭＰＰ＋）に異化され、そして放出される。
引き続き、ＭＰＰ＋は、ドーパミンの高親和性再取り込みトランスポーターによ
りドーパミン作動性ニューロンに能動的に蓄積する。次いで、ＭＰＰ＋は、電気
化学勾配によりミトコンドリア中で濃縮され、そしてニコチン酸アミドアデニン
二リン酸：ユビキノン酸化還元酵素（複合体Ｉ）を選択的に阻害し、これにより
電子伝達を妨害し、そして最終的に活性酸素を生成する。
【０９６９】 ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）が黒質のドーパミン作動性ニューロンへの栄養活
性を有することが組織培養パラダイムにおいて実証されている（Ｆｅｒｒａｒｉ
ら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９８９）。近年、Ｕｎｓｉｃｋｅｒ博士のグループは
、線条体のゲル型インプラントでのＦＧＦ−２投与がＭＰＴＰ曝露と関連する毒
性から黒質のドーパミン作動性ニューロンのほぼ完全な防御を生じることを実証
している（ＯｔｔｏおよびＵｎｓｉｃｋｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，
１９９０）。
【０９７０】 ＦＧＦ−２を用いたデータに基づいて、本発明のポリペプチドは、インビトロ
におけるドーパミン作動性ニューロン生存を増強する際において、本発明のポリ
ペプチドがＦＧＦ−２の作用と類似の作用を有するか否かを決定するために評価
され得、そして、本発明のポリペプチドはまた、線条体におけるドーパミン作動
性ニューロンを、ＭＰＴＰ処理と関連する損傷からの防御についてインビボで試
験され得る。本発明のポリペプチドの潜在的効果を、まずドーパミン作動性ニュ
ーロン細胞培養パラダイムにおいてインビトロで試験する。妊娠１４日のＷｉｓ
ｔａｒラット胚由来の中脳底板を解剖することにより、培養物を調製する。組織
をトリプシンで分離し、そしてポリオルチニン−ラミニンでコートしたカバーガ
ラスに２００，０００細胞／ｃｍ２の密度で播いた。この細胞をダルベッコ改変
イーグル培地およびホルモン補充物（ＮＩ）を含有するＦ１２培地中で維持する
。インビトロで８日後、培養物をパラホルムアルデヒドで固定し、そしてチロシ
ンヒドロキシラーゼ（ドーパミン作動性ニューロンについての特異的マーカー）
での免疫組織化学染色のために処理する。分離した細胞培養物を胚性ラットから
調製する。培養培地を３日ごとに変化させ、そしてこの因子はまたその時点で添
加される。
【０９７１】 ドーパミン作動性ニューロンを妊娠１４日（この発生時間は、ドーパミン作動
性前駆細胞が増殖する段階を過ぎる）で動物から単離するので、チロシンヒドロ
キシラーゼ免疫陽性ニューロンの数の増加は、インビトロで生存しているドーパ
ミン作動性ニューロンの数の増加を示す。従って、もし本発明のポリペプチドが
ドーパミン作動性ニューロンの生存を延長するように作用するならば、このポリ
ペプチドがパーキンソン病に関与し得ることを示唆する。
【０９７２】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）
、本発明のアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために
、例示する研究を容易に改変し得る。
【０９７３】 （実施例３６：血管内皮細胞の増殖への本発明のポリペプチドの効果） １日目に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、４％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ
）、１６ユニット／ｍｌ ヘパリン、および５０ユニット／ｍｌ 内皮細胞増殖
補充物（ＥＣＧＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含有するＭ１９９
培地中で、３５ｍｍシャーレあたり２〜５×１０４細胞の密度で播種する。２日
目、この培地を、１０％ＦＢＳ、８ユニット／ｍｌヘパリンを含有するＭ１９９
で置換する。配列番号Ｙのアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび陽性コント
ロール（例えば、ＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））を種々の濃度で添
加する。４日目および６日目に、培地を交換する。８日目、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃ
ｏｕｎｔｅｒを用いて細胞数を決定する。
【０９７４】 ＨＵＶＥＣ細胞数の増加は、本発明のポリペプチドが血管内皮細胞を増殖し得
ることを示す。
【０９７５】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）
、本発明のアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために
、例示する研究を容易に改変し得る。
【０９７６】 （実施例３７：血管内皮細胞の増殖への本発明のポリペプチドの刺激効果） 増殖因子の分裂促進活性の評価のために、電子共役試薬ＰＭＳ（フェナジンメ
トサルフェート）を用いる、比色分析ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾー
ル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフ
ォフェニル）２Ｈ−テトラゾリウム）アッセイを実行した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ
９６ ＡＱ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞を０．１ｍＬの血清補充培地中で９６ウ
ェルプレートに播種し（５，０００細胞／ウェル）、そして一晩付着させる。０
．５％ＦＢＳ中、１２時間の血清飢餓後、Ｈｅｐａｒｉｎ（８Ｕ／ｍｌ）を伴う
かまたは伴わない、条件（ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ１６５または０．５％ＦＢＳ中の
本発明のポリペプチド）をウェルに４８時間添加する。１ウェルあたり２０ｍｇ
のＭＴＳ／ＰＭＳ混合物（１：０．０５）を添加し、そして３７℃で１時間イン
キュベートさせ、その後ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測
定する。コントロールウェル（培地あり、細胞なし）のバックグラウンドの吸光
度を差し引きし、そしてそれぞれの条件について７つのウェルを並行して実施す
る。Ｌｅａｋら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０Ａ：５
１２〜５１８（１９９４）を参照のこと。
【０９７７】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）
、本発明のアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために
、例示する研究を容易に改変し得る。
【０９７８】 （実施例３８：ＰＤＧＦ誘導性血管平滑筋細胞増殖刺激効果の阻害） ＨＡｏＳＭＣ増殖を、例えば、ＢｒｄＵｒｄ組み込みにより測定し得る。手短
には、４チャンバスライド上で増殖するコンフルエント未満の静止期細胞を、Ｃ
ＲＰまたはＦＩＴＣ標識化ＡＴ２−３ＬＰでトランスフェクトする。次いで、こ
の細胞に１０％ウシ血清および６ｍｇ／ｍｌのＢｒｄＵｒｄをパルスする。２４
時間後、ＢｒｄＵｒｄ染色キット（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を
用いることにより免疫細胞化学を実施する。簡略には、この細胞を、変性溶液へ
の曝露後、ビオチン化マウス抗−ＢｒｄＵｒｄ抗体と４℃で２時間インキュベー
トし、次いでストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジン
とともにインキュベートする。ヘマトキシリンでの対比染色後、この細胞を顕微
鏡試験のために標本にし、そしてＢｒｄＵｒｄ−陽性細胞を計数する。ＢｒｄＵ
ｒｄ係数は、総細胞数に対するＢｒｄＵｒｄ−陽性細胞のパーセントとして計算
される。さらに、個々の細胞について、明野照明および暗野ＵＶ蛍光照明の同時
使用により、ＢｒｄＵｒｄ染色（核）およびＦＩＴＣ取り込み（細胞質）の同時
検出を実行する。（Ｈａｙａｓｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６：２７
１（３６）：２１９８５〜２１９９２（１９９６）を参照のこと）。
【０９７９】 本実施例において記載した研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した。
しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
本発明のアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、
例示する研究を容易に改変し得る。
【０９８０】 （実施例３９：内皮遊走の刺激） 本実施例は、本発明のポリペプチドがリンパ性の内皮細胞遊走を刺激し得る可
能性を探索するために用いられ得る。
【０９８１】 内皮細胞遊走アッセイは、４８ウェルの微小走化性チャンバを用いて実行され
る（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ，ＭＤ；Ｆａｌｋ
，Ｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８０；３３：
２３９〜２４７）。ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルタ
ー（これは８μｍの孔径を備える）（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を室温で少なくとも６時間０．１％ゼラチンでコートし、
そして滅菌空気のもとで乾燥する。０．２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を
補充したＭ１９９中で試験物質を適切な濃度に希釈し、そして２５μｌの最終希
釈を改変Ｂｏｙｄｅｎ装置の底部チャンバに置く。コンフルエント未満の、早期
継代（２〜６）のＨＵＶＥＣまたはＢＭＥＣ培養物を洗浄し、そして細胞の脱離
を実行するために必要な最小の時間トリプシン処理する。底部チャンバと上部チ
ャンバとの間のフィルターを配置した後、１％ＦＢＳを含有する５０μｌ Ｍ１
９９中に懸濁した２．５×１０５細胞を上部コンパートメントに播種する。次い
でこの装置を、５％ＣＯ２を用いて湿潤にしたチャンバ中で３７℃で５時間イン
キュベートして細胞を遊走させる。インキュベーション期間後、このフィルター
を取り出し、そして非遊走細胞を有するフィルターの上部側をゴム性のポリスマ
ン（ｐｏｌｉｃｅｍａｎ）でかきとる。このフィルターをメタノールで固定し、
そしてＧｉｅｍｓａ溶液で染色する（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ，Ｂａｘｔｅｒ，Ｍ
ｃＧｒａｗ Ｐａｒｋ，ＩＬ）。遊走は、それぞれのウェルにおいて、３つの無
作為の高出力視野（４０×）の細胞を計数することにより定量する。そしてすべ
ての群を４連で実行する。
【０９８２】 本実施例において記載した研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した。
しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
本発明のアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、
例示する研究を容易に改変し得る。
【０９８３】 （実施例４０：内皮細胞による一酸化窒素生成の刺激） 血管内皮による一酸化窒素の放出は、血管内皮弛緩の介在物質であると考えら
れる。従って、本発明のポリペプチドの活性は、このポリペプチドに応答する内
皮細胞による一酸化窒素産生を測定することによってアッセイされ得る。
【０９８４】 一酸化窒素を、２４時間の飢餓、次いで、様々なレベルの陽性コントロール（
例えば、ＶＥＧＦ−１）および本発明のポリペプチドへの４時間の曝露の後のコ
ンフルエントな微小血管内皮細胞の９６ウェルプレート中で測定する。培地中の
一酸化窒素を、Ｇｒｉｅｓｓ試薬の使用により定量して、硝酸還元酵素による一
酸化硝酸由来の硝酸塩の還元後の亜硝酸の総量を測定する。一酸化窒素放出の際
の本発明のポリペプチドの効果を、ＨＵＶＥＣにおいて試験する。
【０９８５】 簡単には、培養したＨＵＶＥＣ単層からのＮＯ放出は、ＮＯメーター（Ｉｓｏ
−ＮＯ，Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．
）（１０４９）に接続したＮＯ特異的なポーラログラフ電極を用いて測定する。
ＮＯエレメントの較正を、以下の式に従って行う： ２ＫＮＯ２＋２ＫＩ＋２Ｈ２ＳＯ４６２ＮＯ＋Ｉ２＋２Ｈ２Ｏ＋２Ｋ２Ｓ
Ｏ４ 検量線を、ＫＩおよびＨ２ＳＯ４を含む較正溶液中に段階的な濃度のＫＮＯ２ （０、５、１０、２５、５０、１００、２５０、および５００ｎｍｏｌ／Ｌ）を
添加することによって得る。ＮＯに対するＩｓｏ−ＮＯ電極の特異性を、オーセ
ンティックなＮＯ気体からのＮＯを測定することにより、事前に決定する（１０
５０）。この培養培地を取り除き、そしてＨＵＶＥＣを、ダルベッコのリン酸緩
衝化生理食塩水で２回洗浄する。次いで、細胞を、６ウェルプレート中で５ｍｌ
のろ過したＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液に浸し、そしてこの細胞プレー
トを、３７℃に温度を維持するために、スライドウォーマー（Ｌａｂ Ｌｉｎｅ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）で保持する。ＮＯセンサープローブをウ
ェルに垂直に挿入して、異なる条件の追加の前に、電極の先端を溶液の表面の２
ｍｍ下で保持する。Ｓ−ニトロソアセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）を、陽性コ
ントロールとして用いる。放出したＮＯの量を、１×１０６内皮細胞あたりのピ
コモル濃度として表す。全ての報告した値は、各群（細胞培養ウェルの数）にお
ける４〜６の測定値の平均である。Ｌｅａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１７：９６−１０５（１９９５）を参照のこ
と。
【０９８６】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
の活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの
活性を試験し得る。
【０９８７】 （実施例４１：新脈管形成における索形成に対する本発明のポリペプチドの効
果） 新脈管形成における別の工程は、内皮細胞の分化により特徴付けられる索（ｃ
ｏｒｄ）形成である。このバイオアッセイは、インビトロで培養した場合の微小
血管内皮細胞の毛細管様構造（中空構造）を形成する能力を測定する。
【０９８８】 ＣＡＤＭＥＣ（微小血管内皮細胞）を、増殖細胞（２継代）としてＣｅｌｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．から購入し、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ’ＣＡＤＭＥＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ中で培養し、そして５継
代で使用する。インビトロ新脈管形成アッセイのために、４８ウェル細胞培養プ
レートのウェルをＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ
Ｆａｃｔｏｒ Ｍｅｄｉｕｍ（２００ｍｌ／ウェル）を用いて、３７℃にて３
０分間コートする。ＣＡＤＭＥＣを、７，５００細胞／ウェルでコートしたウェ
ルに播種し、Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ中で一晩培養する。次いで、このＧｒ
ｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍを、コントロール緩衝液または本発明のポリペプチド（
０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ）を含む３００ｍｇのＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ’Ｃｈｏｒｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍと交換し、そしてこの
細胞をさらに４８時間培養する。毛細管様索の数および長さを、Ｂｏｅｃｋｅｌ
ｅｒ ＶＩＡ−１７０ビデオ画像分析装置の使用を通じて定量する。全てのアッ
セイを三連で行った。
【０９８９】 市販の（Ｒ＆Ｄ）ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロールとして用
いる。ｂ−エストラジオール（１ｎｇ／ｍｌ）を、陰性コントロールとして用い
る。適切な緩衝液（タンパク質なし）もまた、コントロールとして利用する。
【０９９０】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチ
ドの活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニスト
の活性を試験し得る。
【０９９１】 （実施例４２：ニワトリ漿尿膜に対する脈管形成効果） ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）は、新脈管形成を試験するために十分に確立した系
である。ＣＡＭにおける血管形成は、容易に可視化および定量可能である。本発
明のポリペプチドのＣＡＭにおける新脈管形成を刺激する能力を試験し得る。
【０９９２】 ハクショクレグホンニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）の受精卵および
日本ウズラ（ｑｕａｌ）（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ ｃｏｔｕｒｎｉｘ）を、３７．８
℃および湿度８０％でインキュベートする。１６日齢のニワトリの分化したＣＡ
Ｍおよび１３日齢のウズラの胚を以下の方法で研究する。
【０９９３】 発生の４日目に、ニワトリ卵の卵殻に窓を作る。この胚を正常な発生について
調べ、そしてこの卵をセロテープ（登録商標）で封着する。これらを、さらに１
３日目までインキュベートする。Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバーガラス（Ｎｕｎｃ，
Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を、直径約５ｍｍのディスクに切る。滅菌かつ無
塩成長因子を蒸留水に溶解し、そして約３．３ｍｇ／５ｍｌをディスクにピペッ
トで移す。風乾後、逆さにしたディスクをＣＡＭに適用する。３日後、標本を３
％グルタルアルデヒドおよび２％ホルムアルデヒド中に固定し、そして０．１２
Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液ですすぐ。これらを実体顕微鏡［Ｗｉｌｄ Ｍ８
］を用いて写真撮影し、上記のように半薄層切片化および超薄層切片化のために
包埋する。コントロールを、キャリアディスクのみを用いて行う。
【０９９４】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
の活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの
活性を試験し得る。
【０９９５】 （実施例４３：マウスにおけるＭａｔｒｉｇｅｌ移植片を用いる新脈管形成ア
ッセイ） 本発明のポリペプチドのインビボ新脈管形成アッセイは、既存の毛細管網様構
造の、マウス細胞外マトリックス物質（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の移植したカプセル
中に新しい脈管を形成する能力を測定する。このタンパク質を、４℃で液体Ｍａ
ｔｒｉｇｅｌと混合し、次いでこの混合物を、マウスに皮下（ここで、この混合
物は凝固する）注射する。７日後、Ｍａｔｒｉｇｅｌの固体「プラグ」を取り除
き、そして新しい血管の存在について試験する。Ｍａｔｒｉｇｅｌを、Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ／Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂ
ｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入する。
【０９９６】 ４℃で解凍した時、Ｍａｔｒｉｇｅｌ物質は液体である。このＭａｔｒｉｇｅ
ｌを、４℃にて１５０ｎｇ／ｍｌで本発明のポリペプチドと混合し、冷３ｍｌシ
リンジ中に引き抜く。約８週齢の雌性Ｃ５７Ｂ１／６マウスの腹部の中腹側面の
２つの部位にＭａｔｒｉｇｅｌおよび実験タンパク質の混合物を注射する（０．
５ｍｌ／部位）。７日後、このマウスを頚椎脱臼により屠殺し、Ｍａｔｒｉｇｅ
ｌプラグを取り除きそして洗浄する（すなわち、全ての付着する膜および腺維組
織を取り除く）。全複製プラグを中性緩衝化１０％ホルムアミド中に固定し、パ
ラフィン中に包埋し、そしてＭａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅで染色後、
組織学的試験のための切片を作製するために使用する。各プラグの３つの異なる
領域由来の断面を処理する。選択した切片をｖＷＦの存在について染色する。こ
のアッセイについての陽性コントロールは、ウシ塩基性ＦＧＦ（１５０ｎｇ／ｍ
ｌ）である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ単独を用いて、新脈管形成の基礎レベルを決定す
る。
【０９９７】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
の活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの
活性を試験し得る。
【０９９８】 （実施例４４：ウサギ下肢モデルにおける虚血の救出） 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの虚血に対するインビボでの効
果を研究するため、ウサギ後肢虚血モデルを、以前に記載されるように１つの大
腿動脈の外科的除去により作製する（Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ａｍ Ｊ．Ｐａｔ
ｈｏｌ １４７：１６４９−１６６０（１９９５））。大腿動脈の切除は、血栓
の逆行性伝播および外腸骨動脈の閉塞を生じる。結果として、虚血肢への血流は
、内腸骨動脈から生じる側副血管に依存する（Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ａｍ Ｊ
．Ｐａｔｈｏｌ １４７：１６４９−１６６０（１９９５））。１０日の間隔で
、ウサギの手術後の回復および内因性の側副血管の発達を可能にさせた。手術後
１０日目（０日）に、ベースライン血管造影を行った後、虚血肢の内腸骨動脈を
、本発明のポリヌクレオチドを含む５００ｍｇの裸の発現プラスミドを用いて、
記載されるように、ヒドロゲル被覆バルーンカテーテルを用いる動脈遺伝子移入
技術により、トランスフェクトする（Ｒｉｅｓｓｅｎら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒ．４：７４９−７５８（１９９３）；Ｌｅｃｌｅｒｃら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．９０：９３６−９４４（１９９２））。本発明のポリペプチドを
処置に用いる場合、５００ｍｇの本発明のポリペプチドまたはコントロールの単
回ボーラスを、注入カテーテルを通じて１分間にわたり、虚血肢の内腸骨動脈中
に送達する。３０日目に、種々のパラメーターを、これらのウサギで測定する：
（ａ）ＢＰ比−虚血肢の収縮期血圧 対 正常肢の収縮期血圧の比；（ｂ）血流
および逆流−停止ＦＬ：非拡張性状態の間の血流、および最大ＦＬ：完全な拡張
性状態の間の血流（これはまた、血管量の間接的測定）、そして逆流は、最大Ｆ
Ｌ：停止ＦＬの比に反映される；（ｃ）血管造影値（ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｉｃ
Ｓｃｏｒｅ）−これを側副血管の血管造影により測定する。スコアを、オーバ
ーレイグリッド（ｏｖｅｒｌａｙｉｎｇ ｇｒｉｄ）内の円の百分率（ウサギ大
腿の総数ｍで割った横断不透明化動脈を用いる）により決定する；（ｄ）毛細管
（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）密度−側副毛細血管の数は、後肢から得た光学顕微鏡用
切片において決定した。
【０９９９】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペ
プチド活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本
発明のアゴニストおよび／またはアンタゴニストを試験し得る。
【１０００】 （実施例４５：本発明のポリペプチドの血管拡張に対する効果） 血管内皮の拡張は、血圧の低下に重要であるので、自然発症高血圧ラット（Ｓ
ＨＲ）における、本発明のポリヌクレオチドの血圧に影響する能力を、試験する
。漸増用量（０、１０、３０、１００、３００、および９００ｍｇ／ｋｇ）の本
発明のポリペプチドを、１３〜１４週齢の自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）に投
与する。データを、平均＋／−ＳＥＭで表す。統計学的分析を、両側ｔ検定を用
いて行い、そして統計的な有意性を、ｐ＜０．０５ 対 緩衝液単独への応答と
して定義する。
【１００１】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
の活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの
活性を試験し得る。
【１００２】 （実施例４６：ラット虚血皮膚弁モデル） 評価パラメーターとして、皮膚の血流、皮膚温度、および第ＶＩＩＩ因子の免
疫組織化学または内皮アルカリホスファターゼ反応が挙げられる。皮膚虚血の間
の本発明のポリペプチドの発現を、インサイチュハイブリダーゼーションを用い
て研究する。
【１００３】 このモデルにおける研究を、以下の３つの部分に分ける： 虚血皮膚 虚血皮膚創傷 通常の創傷。
【１００４】 実験プロトコルは以下を含む： ３×４ｃｍの単一茎全層無作為皮膚弁（ｓｉｎｇｌｅ ｐｅｄｉｃｌｅ ｆｕ
ｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｒａｎｄｏｍ ｓｋｉｎ ｆｌａｐ）（動物の下背
部にわたる筋皮弁）を生じさせる。
【１００５】 虚血皮膚（皮膚弁）に切除創傷をつくる（直径４〜６ｍｍ） 次の種々の投薬範囲の本発明のポリペプチドによる、切除創傷（創傷後の０、
１、２、３、４日目）の局所的な処置：１ｍｇ〜１００ｍｇ 組織学的研究、免疫組織化学的研究、およびインサイチュ研究のために、創傷
後の３、５、７、１０、１４、および２１日目に創傷組織を収集する。
【１００６】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
の活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの
活性を試験し得る。
【１００７】 （実施例４７：末梢動脈疾患モデル） 本発明のポリペプチドを用いる脈管形成治療は、末梢動脈疾患の場合の虚血の
周囲の血流の回復を得る新規の治療的ストラテジーである。実験プロトコルは以
下を含む： 一方の片側の大腿動脈を、後肢の虚血筋肉を作製するために結紮し、他方の片
側の後肢は、コントロールの役割をする。
【１００８】 ｂ）本発明のポリペプチドを、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲で、一週間あ
たり静脈内および／または筋肉内に３回（おそらくそれより多く）、２〜３週間
で送達する。
【１００９】 この虚血筋肉組織を、大腿動脈の結紮後、本発明のポリペプチドの発現の分析
ならびに組織学のために、１、２、および３週間目に収集する。生検もまた、他
方の片側の対側後肢の正常な筋肉において行う。
【１０１０】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
の活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの
活性を試験し得る。
【１０１１】 （実施例４８：虚血性心筋疾患モデル） 本発明のポリペプチドを、側副血管の発達を刺激し得、かつ冠状動脈閉塞後の
新しい血管を再構成し得る強力なマイトジェンとして評価する。ポリペプチドの
発現の変化を、インサイチュで調査する。実験プロトコルは、以下を含む： 心臓を、ラットの左側開胸術を介して露出する。直ちに、左冠状動脈を、細い
縫合糸（６−０）を用いて咬合し、そして胸郭を閉じる。
【１０１２】 本発明のポリペプチドを、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲で、一週間あたり
静脈内および／または筋肉内に３回（おそらくそれより多く）、２〜４週間で送
達する。
【１０１３】 手術の３０日後、この心臓を、形態測定のために取り出しそして横断切片化し
、そしてインサイチュで分析する。
【１０１４】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
の活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの
活性を試験し得る。
【１０１５】 （実施例４９：ラット角膜創傷治癒モデル） この動物モデルは、本発明のポリペプチドの、新生血管形成に対する効果を示
す。実験プロトコルは、以下を含む： 角膜の中心から間質層へと１〜１．５ｍｍの長い切開を作る 目の外端に面する切開の唇縁の下にスパーテルを挿入する ポケットを作る（その基底は、目の縁から（ｆｏｒｍ）１〜１．５ｍｍである
） ５０ｎｇ〜５μｇ（ｕｇ）の本発明のポリペプチドを含むペレットを、ポケッ
ト内に配置する 本発明のポリペプチドでの処置をまた、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲内で
（毎日の処置を５日間）角膜創傷に局所的に適用し得る。
【１０１６】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
の活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの
活性を試験し得る。
【１０１７】 （実施例５０：糖尿病マウスおよび糖質コルチコイド障害性創傷治癒モデル） （糖尿病ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスモデル） 本発明のポリペプチドが治癒プロセスを促進することを実証するために、創傷
治癒の遺伝的糖尿病マウスモデルを、使用する。ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスにおける
全層（ｆｕｌｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）創傷治癒モデルは、障害性の創傷治癒の
十分に特徴付けられた、臨床的に関連性のある、そして再現可能なモデルである
。糖尿病性創傷の治癒は、収縮よりむしろ肉芽組織の形成および再上皮形成に依
存する（Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５２：３８９（
１９９２）；Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１
３６：１２３５（１９９０））。
【１０１８】 この糖尿病動物は、ＩＩ型真性糖尿病において観察される特徴的な特性の多く
を有する。ホモ接合（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、それらの正常なヘテロ接合（
ｄｂ＋／＋ｍ）同腹仔と比較して肥満である。変異体糖尿病（ｄｂ＋／ｄｂ＋）
マウスは、第４染色体（ｄｂ＋）上の単一の常染色体性の劣性変異を有する（Ｃ
ｏｌｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２８
３−２９３（１９８２））。動物は、多食症、多渇症、および多尿症を示す。変
異体糖尿病マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋）は、上昇した血中グルコース、増加したま
たは正常なインスリンレベル、および抑制された細胞媒介性免疫を有する（Ｍａ
ｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５（１９７８）；Ｄｅｂｒａ
ｙ−Ｓａｃｈｓ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１（１）：１
−７（１９８３）；Ｌｅｉｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１１４：
４６−５５（１９８５））。末梢神経障害、心筋合併症、および微小血管損傷、
基底膜肥厚および糸球体濾過異常は、これらの動物において記載されている（Ｎ
ｏｒｉｄｏ，Ｆ．ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．８３（２）：２２１−２３２（１
９８４）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２９（１）：６０−６７
（１９８０）；Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．４０（４）：
４６０−４７３（１９７９）；Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３
１（補遺）：１−６（１９８２））。これらのホモ接合糖尿病マウスは、高血糖
症を発症し、そしてこれは、ヒトＩＩ型糖尿病に類似してインスリンに対して耐
性である（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５−１３７７
（１９７８））。
【１０１９】 これらの動物において観察された特徴は、このモデルにおける治癒が、ヒト糖
尿病において観察される治癒に類似し得ることを示唆する（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇ
ｈら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５−１２４６（１９９０
））。
【１０２０】 遺伝的糖尿病の雌性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウス、およびそ
れらの非糖尿病（ｄｂ＋／＋ｍ）へテロ接合性同腹仔を、この研究に用いた（Ｊ
ａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。これらの動物を６週齢で購入する
。研究の開始時は８週齢である。動物を個別に飼育し、そして自由に食物と水を
与える。全ての操作を、無菌操作を用いて行う。この実験を、Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉ
ｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｇ
ｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って行う。
【１０２１】 創傷プロトコルを、以前に報告された方法（Ｔｓｕｂｏｉ，Ｒ．およびＲｉｆ
ｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：２４５−２５１（１９９０）
）に従って行う。簡単には、創傷させる日に、動物を、脱イオン水に溶解したＡ
ｖｅｒｔｉｎ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、２，２，２−トリブロモエタノールおよ
び２−メチル−２−ブタノールの腹腔内注射で麻酔する。この動物の背面領域を
剃毛し、そして皮膚を７０％エタノール溶液およびヨウ素で洗浄する。手術範囲
を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。次いで、８ｍｍの全層の創傷を、
Ｋｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。創傷させた直後に、周囲の皮膚を、創
傷の拡大を排除するために穏やかに伸ばす。実験の間、この創傷を開放しておく
。処置の適用を、創傷させた日から５日間連続で、局所的に受ける。処置の前に
、創傷を、滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。
【１０２２】 創傷を視覚的に検査し、そして手術の日およびその後２日間隔で、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目および８日目の日々の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎ測径器（ｃ
ａｌｉｐｅｒ）を用いて水平および垂直に測定する。肉芽組織がもはや目に見え
ず、そして創傷を連続した上皮が覆う場合に、創傷を治癒したとみなす。
【１０２３】 本発明のポリペプチドを、ビヒクル中で８日間、異なる投薬範囲（１日あたり
創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。ビヒクルコントロール群に
、５０ｍＬのビヒクル溶液を与えた。
【１０２４】 動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学および免疫組
織化学のために収集する。組織標本を、さらなる処理のために、生検スポンジの
間の組織カセット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【１０２５】 各々１０匹の動物（５匹の糖尿病および５匹の非糖尿病コントロール）の３つ
の群：１）ビヒクルプラセボコントロール、２）非処置群、および３）処置群を
、評価する。
【１０２６】 創傷閉鎖を、水平軸および垂直軸で面積を測定すること、および創傷の面積の
合計を得ることにより分析する。次いで、収縮を、最初の創傷の面積（０日）と
処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこ
の創傷面積は、６４ｍｍ２（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下
の式を用いて行う： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］ 標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミ
クロトームを用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染
色を、二等分した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験を用いて、修復し
た皮膚の治癒プロセスおよび形態的な外見を、本発明のポリペプチドを用いる処
置によって改変したかどうかを評価する。この評価は、細胞蓄積、炎症細胞、毛
細管、線維芽細胞、再上皮形成、および表皮成熟の存在の検証を含む（Ｇｒｅｅ
ｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９
９０））。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲検観察者（ｂｌｉｎｄｅｄ
ｏｂｓｅｒｖｅｒ）が用いる。
【１０２７】 組織切片をまた、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ検出システムを使用してポリクローナル
ウサギ抗ヒトケラチン抗体で免疫組織化学的に染色する。ヒト皮膚を陽性組織コ
ントロールとして用いる一方、非免疫ＩｇＧを陰性コントロールとして用いる。
ケラチノサイト増殖を、目盛り付きレンズマイクロメーターを用いて創傷の再上
皮形成の程度を評価することによって決定する。
【１０２８】 皮膚標本における増殖細胞核抗原／サイクリン（ＰＣＮＡ）を、ＡＢＣ Ｅｌ
ｉｔｅ検出システムを用いて抗ＰＣＮＡ抗体（１：５０）を使用することにより
実証する。ヒト結腸癌は、陽性組織コントロールとして役割を果たし得、そして
ヒト脳組織を、陰性組織コントロールとして用い得る。各標本は、１次抗体の脱
落および非免疫マウスＩｇＧとの置換を有する切片を含む。これらの切片の順位
は、０〜８のスケール（わずかな増殖を反映するより低い側のスケール〜激しい
増殖を反映するより高い側）の増殖の程度に基づく。
【１０２９】 実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみな
す。
【１０３０】 （ステロイド障害性ラットモデル） ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々のインビトロおよびインビボ系にお
いて十分に実証されている（Ｗａｈｌ，Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎ
ｄ Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ：Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔ
ｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅ
ｃｔｓ．２８０−３０２（１９８９）； Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
１５：４７６−４８１（１９７５）；Ｗｅｒｂら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７
：１６８４−１６９４（１９７８））。糖質コルチコイドは、新脈管形成を阻害
すること、血管透過性（Ｅｂｅｒｔら、Ａｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．３７：７
０１−７０５（１９５２））、線維芽細胞増殖、およびコラーゲン合成（Ｂｅｃ
ｋら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａ
ｙｎｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）
）を低下させること、ならびに循環する単球の一過性の減少を生じること（Ｈａ
ｙｎｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）
；Ｗａｈｌ，「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａ
ｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏ
ｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９））によって
創傷治癒を遅延させる。障害性創傷治癒に対するステロイドの全身性投与は、ラ
ットにおいて十分に確立された現象である（Ｂｅｃｋら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃ
ｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）； Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８） ；Ｗａｈｌ，「Ｇｌｕｃ
ｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉ
ｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９）；Ｐｉｅｒｃｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２２２９−２２３３（１９８９））。
【１０３１】 本発明のポリペプチドが治癒プロセスを促進し得ることを実証するために、治
癒が、メチルプレドニゾロンの全身性投与により損なわれる、ラットの全層切除
皮膚創傷に対するポリペプチドの複数の局所適用の効果を評価する。
【１０３２】 若年成体の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（体重２５０〜３００ｇ
）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこの実験に用
いる。この動物を、８週齢で購入する。そして研究の開始時は９週齢である。ラ
ットの治癒応答は、創傷の時点で、メチルプレドニゾロンの全身性投与（１７ｍ
ｇ／ｋｇ／ラット、筋肉内）により損なわれる。動物を個別に飼育し、そして自
由に食物と水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて行う。この研究を、Ｈ
ｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｃのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ
ａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ
ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ
ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従
って行う。
【１０３３】 創傷プロトコルは、上記Ａ節に従う。創傷させる日に、動物をケタミン（５０
ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔する。この
動物の背面領域を剃毛し、そして皮膚を７０％エタノールおよびヨウ素溶液で洗
浄する。手術範囲を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。８ｍｍの全層創
傷をＫｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。実験の間、この創傷の左を開放す
る。試験物質の適用を、創傷させ、次いでメチルメチルプレドニゾロン投与した
日から開始して、７日間連続で、１日１回、局所的に与える。処置の前に、創傷
を滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。
【１０３４】 創傷を視覚的に検査し、そして創傷させた日および処置の終りに、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目の毎日および８日目の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎノギスを用
いて水平および垂直に測定する。創傷を、肉芽組織がもはや目に見えずかつ創傷
を連続した上皮が覆う場合に、治癒したとみなす。
【１０３５】 本発明のポリペプチドを、ビヒクル中で８日間、異なる用量の範囲（１日あた
り創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。ビヒクルコントロール群
は、５０ｍＬのビヒクル溶液を受けた。
【１０３６】 動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学のために収集
する。組織標本を、さらなるプロセシングのために、生検スポンジの間の組織カ
セット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【１０３７】 各々１０匹の動物（メチルプレドニゾロンを用いる５匹および糖質コルチコイ
ドを用いない５匹）の４つの群を評価する：１）非処置群、２）ビヒクルプラシ
ーボコントロール、３）処置群。
【１０３８】 創傷閉鎖を、垂直軸および水平軸で面積を測定すること、および創傷の面積の
合計を得ることにより分析する。次いで、閉鎖を、最初の創傷の面積（０日）と
処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこ
の創傷面積は、６４ｍｍ２（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下
の式を用いて行う： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］ 標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＯｌｙｍｐｕｓミクロトームを
用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、二等分
した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験は、修復した皮膚の治癒プロセ
スおよび形態的な外見を、本発明のポリペプチドを用いる処置によって改善した
かどうかを評価することを可能にする。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲
検観察者（ｂｌｉｎｄｅｄ ｏｂｓｅｒｖｅｒ）が用いて、創傷の隙間の距離を
決定する。
【１０３９】 実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみな
す。
【１０４０】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を
試験し得る。
【１０４１】 （実施例５１：リンパ水腫（ｌｙｍｐｈａｄｅｍａ）動物モデル） この実験アプローチの目的は、ラット後肢におけるリンパ管形成およびリンパ
の循環系の再確立における本発明のポリペプチドの治療的効果を試験するための
、適切かつ一貫したリンパ水腫モデルを作製することである。有効性は、罹患し
た肢の腫脹体積、リンパの脈管の量の定量、総血漿タンパク質の量、および組織
病理学により測定される。急性リンパ水腫は、７〜１０日間観察される。恐らく
より重要なことは、水腫の慢性進行は、３〜４週間まで続く。
【１０４２】 手術を始める前に、血液サンプルを、タンパク質濃度分析のために採血する。
雄性ラット（体重約３５０ｇ）に、ペントバルビタールを投薬する。次いで、右
肢を膝から股関節部まで剃毛する。この剃毛した範囲を７０％ＥｔＯＨに浸した
ガーゼで拭く。血液を、血清総タンパク質試験のために採血する。周径測定およ
び体積測定を行った後に、２つの測定レベル（踵の０．５ｃｍ上、足背の中間点
）に印をつけた後、足へ色素を注射する。右足背および左足背の両方の内皮に、
０．０５ｍｌの１％Ｅｖａｎ’ｓ Ｂｌｕｅを注射する。次いで、足への色素の
注射の後、周径測定および体積測定を行う。
【１０４３】 目印として膝関節を用いて、中肢鼡径部切開を、大腿血管の位置を確認できる
ように環状に行う。鉗子および止血剤を用いて、皮膚弁を切開し、そして分離す
る。大腿血管の位置確認後、血管の横に沿ってかつ血管の下に走るリンパ管を位
置確認する。次いで、この範囲の主要なリンパ管を、電気凝固縫合結紮する。
【１０４４】 顕微鏡を用いて、肢の背の筋肉（半腱様筋（ｓｅｍｉｔｅｎｄｉｎｏｓｉｓ）
および内転筋の付近）を平滑に切開する。次いで、膝窩リンパ節の位置を確認す
る。次いで、２つの近位リンパ管および２つの遠位リンパ管、ならびに膝窩節の
遠位血液供給部を縫合糸により結紮する。次いで、膝窩リンパ節および任意の付
随する脂肪組織を、結合組織を切断することによって取り除く。
【１０４５】 この手順で生じるいかなる軽度の出血をも管理するように注意すること。リン
パ管を咬合した後、皮膚弁を、液体皮膚（Ｖｅｔｂｏｎｄ）（ＡＪ Ｂｕｃｋ）
を使用することによって密封する。別々の皮膚縁を、その下の筋肉組織に、脚の
周囲に約０．５ｃｍのギャップを残しながら密封する。皮膚はまた、必要なとき
にその下の筋肉に縫合することによって係留してもよい。
【１０４６】 感染を回避するために、動物を、メッシュを用いて個別に収容する（床敷きな
し）。回復した動物を、最適な水腫ピークを通して毎日チェックする。このピー
クは、代表的には５〜７日まで生じる。次いで、プラトーの水腫ピークを観察す
る。リンパ水腫の強度を評価するために、各肢上の２つの指定した場所の周径お
よび体積を、操作の前および７日間毎日測定する。リンパ水腫に対する血漿タン
パク質の効果を決定し、そしてタンパク質分析が有用な試験周界であるか否かも
また調査する。コントロール肢および水腫肢の両方の重量を、２箇所で評価する
。分析を盲目様式（ｂｌｉｎｄ ｍａｎｎｅｒ）で行う。
【１０４７】 周径測定：肢の動きを防止するための短期気体麻酔のもとで、布巻尺を使用し
て、肢の周径を測定する。測定を、距骨および背面の足にて、２人の異なる人物
によって行い、次いで、これらの２つの読み取りを平均する。読み取りを、コン
トロールおよび水腫肢の両方から得る。
【１０４８】 体積測定：手術の日に、動物をペントバルビタールで麻酔し、そして手術の前
に試験する。毎日の体積測定のために、動物を短期ハロタン麻酔（迅速な固定化
およびすばやい回復）のもとにおき、両方の脚を剃毛し、そして耐水性マーカー
を用いて脚に等しく印をつける。脚を、最初に水に漬け、次いで各々印をしたレ
ベルまで装置に漬け、次いでＢｕｘｃｏ水腫ソフトウェア（Ｃｈｅｎ／Ｖｉｃｔ
ｏｒ）によって測定する。データを１人の人物によって記録し、一方他者は、脚
をしるしを付けた領域まで漬ける。
【１０４９】 血液−血漿タンパク質測定：手術の前に血液を取り出し、遠心分離し、そして
血清を分離し、次いで、全タンパク質およびＣａ２＋比較について結論付ける。
【１０５０】 肢重量比較：血液を取り出した後、この動物を、組織収集のために調製する。
この肢を、キリチン（ｑｕｉｌｌｉｔｉｎｅ）を用いて切断し、次いで、実験用
脚とコントロール脚の両方を、結紮して切断し、そして秤量する。２回目の秤量
を、脛踵（ｔｉｂｉｏ−ｃａｃａｎｅａｌ）関節を外し、そして足を秤量して行
う。
【１０５１】 組織学的調製：膝（膝窩）領域の後ろに位置する横筋を切り出し、そして金属
型に配置し、ｆｒｅｅｚｅＧｅｌで満たし、冷メチルブタンに漬け、標識したサ
ンプルバッグに切断するまで−８０ＥＣにて配置する。切断の際に、筋肉を、蛍
光顕微鏡のもとで、リンパ管について観察する。
【１０５２】 本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を
試験し得る。
【１０５３】 （実施例５２：ＴＮＦα誘導性接着分子発現の本発明のポリペプチドによる抑
制） 炎症および新脈管形成の領域に対するリンパ球の漸増は、リンパ球上の細胞表
面接着分子（ＣＡＭ）と血管内皮との間の特異的なレセプター−リガンド相互作
用に関する。この接着プロセスは、通常の設定および病理学的設定の両方におい
て、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−
１）、および内皮細胞（ＥＣ）における内皮白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチ
ン）発現を含む、多段階カスケードに続く。これらの分子および他の分子の血管
内皮における発現は、白血球が局所血管系に接着し得、そして炎症応答の発生の
間に局所組織に溢出し得る効率を決定する。サイトカインおよび増殖因子の局所
濃度は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。
【１０５４】 腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）（強力なプロ炎症性サイトカイン）は、内皮細
胞における３つ全てのＣＡＭの刺激因子であり、そして広範な種々の炎症応答に
関与し得、しばしば病理学的結果をもたらす。
【１０５５】 ＴＮＦ−α誘導性ＣＡＭ発現の抑制を媒介する本発明のポリペプチドの潜在能
力を試験し得る。改変型ＥＬＩＳＡアッセイ（これは、固相吸着剤としてＥＣを
使用する）を使用して、ＦＧＦファミリーのタンパク質のメンバーを用いて同時
刺激した場合に、ＴＮＦ−α処理タンパク質ＥＣにおけるＣＡＭ発現の量を測定
する。
【１０５６】 この実験を行うために、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）培養物を、プール
した索採取物から得、そして１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマ
イシンを補充した増殖培地（ＥＧＭ−２；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，ＣＡ）中で、５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーターにおいて維
持する。ＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ培地中１×１０４細胞／ウェルの濃度で、９６ウ
ェルプレート中に、３７℃で１８〜２４時間またはコンフルエントになるまで播
種する。続いて、単層を、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌス
トレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０の無血清溶液で３回洗浄し、そ
して所定のサイトカインおよび／または増殖因子を用いて、２４時間３７℃にて
処理する。インキュベーション後、次いで、この細胞を、ＣＡＭ発現について評
価する。
【１０５７】 ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、標準的な９６ウェルプレートにおいて
コンフルエントになるまで増殖させる。増殖培地を、細胞から取り除き、そして
９０μｌの１９９培地（１０％ＦＢＳ）に置き換える。試験のためのサンプルお
よびポジティブまたはネガティブコントロールを、このプレートに三連で添加す
る（１０μｌ容量で）。プレートを、３７℃にて、５時間（セレクチンおよびイ
ンテグリン発現）または２４時間（インテグリン発現のみ）のいずれかでインキ
ュベートする。プレートを吸引して、培地を除去し、そして１００μｌの０．１
％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を有する）を各ウェ
ルに添加する。プレートを、４℃にて３０分間保持する。
【１０５８】 次いで、固定液をウェルから除去し、そしてウェルをＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）
＋０．５％ＢＳＡを用いて１回洗浄し、そして排水する。このウェルを乾燥させ
ないこと。１０μｌの希釈した一次抗体を、試験ウェルおよびコントロールウェ
ルに添加する。抗ＩＣＡＭ−１−Ｂｉｏｔｉｎ、抗ＶＣＡＭ−１−Ｂｉｏｔｉｎ
および抗Ｅ−セレクチン−Ｂｉｏｔｉｎを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ
／ｍｌストック抗体の１：１０希釈）で使用する。細胞を、加湿した環境におい
て、３７℃にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ
）＋０．５％ＢＳＡを用いて３回洗浄する。
【１０５９】 次いで、２０μｌの希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈ
ｏｓｐｈｏｔａｓｅ（１：５，０００希釈）を各ウェルに添加し、そして３７℃
にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５
％ＢＳＡを用いて３回洗浄する。１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐ
ＮＰＰ）を、５ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ１０．４）に溶解させる。グリシン
緩衝液中のｐＮＰＰ基質１００μｌを、各試験ウェルに添加する。三連の標準ウ
ェルを、グリシン緩衝液中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏ
ｓｐｈｏｔａｓｅの操作希釈（ｗｏｒｋｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（１：５，
０００（１００）＞１０−０．５＞１０−１＞１０−１．５）から調製する。５
μｌの各希釈物を、三連のウェルに添加し、そして各ウェル中の得られたＡＰ含
量は、５．５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇである。次い
で、１００μｌのｐＮＰＰ試薬を、標準ウェルの各々に添加しなければならない
。このプレートを、３７℃にて４時間インキューベートしなければならない。３
Ｍ ＮａＯＨの５０μｌの容量を全てのウェルに添加する。この結果を、プレー
トリーダーにおいて４０５ｎｍにて定量する。バックグラウンド減算オプション
を、グリシン緩衝液のみで満たしたブランクウェルにおいて使用する。このテン
プレートを、各々の標準ウェルにおけるＡＰ結合体の濃度を示すように設定する
［５．５０ｎｇ；１．７４ｎｇ；０．５５ｎｇ；０．１８ｎｇ］。結果を、各サ
ンプル中の結合したＡＰ結合体の量として示す。
【１０６０】 本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得
ることは、明らかである。本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の
教示を考慮して可能であり、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内に
ある。
【１０６１】 発明の背景、詳細な説明および実施例において引用された各文書の全開示（特
許、特許出願、学術文献、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示を含む）
は、本明細書中に参考として援用される。さらに、本明細書にとともに提出され
た配列表のハードコピーおよび対応するコンピュ−ター読み出し形態は、両方と
も本明細書中にその全体が参考として援用される。
【１０６２】 抗体を含む、本発明の特定のヒトポリヌクレオチドおよびヒトポリペプチドは
、その全体が参考として本明細書中にて援用される米国仮出願第６０／１７６，
３０７号に開示された。さらに、米国仮出願第６０／１７６，３０７号の配列表
のハードコピーおよびコンピュータ読み出し可能な形態もまた、その全体が参考
として本明細書中にて援用される。
【１０６３】
【表８】 （ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２０１） （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【１０６４】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０６５】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【１０６６】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【１０６７】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【１０６８】 （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０６９】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１０７０】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/14 Ａ６１Ｐ 3/10 ４Ｃ０８４ 1/16 7/00 ４Ｈ０４５ 3/10 7/02 7/00 9/00 7/02 9/10 9/00 １０１ 9/10 9/12 １０１ 9/14 9/12 13/08 9/14 13/12 13/08 15/00 13/12 17/00 15/00 17/02 17/00 17/06 17/02 19/00 17/06 19/02 19/00 19/06 19/02 21/00 19/06 25/00 21/00 １０１ 25/00 25/04 １０１ 25/14 25/04 25/16 25/14 25/18 25/16 25/22 25/18 25/28 25/22 27/02 25/28 27/06 27/02 27/16 27/06 29/00 27/16 １０１ 29/00 31/00 １０１ 31/10 31/00 31/12 31/10 31/18 31/12 33/00 31/18 35/00 33/00 35/02 35/00 35/04 35/02 37/00 35/04 37/04 37/00 39/00 37/04 41/00 39/00 43/00 １０１ 41/00 １０５ 43/00 １０１ １１１ １０５ １７１ １１１ Ｃ０７Ｋ 14/47 １７１ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ａ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ルーベン， スティーブン エム． アメリカ合衆国 メリーランド 20832， オルネイ， ヘリテイジ ヒルズ ドラ イブ 18528 (72)発明者 シ， ヤング アメリカ合衆国 メリーランド 20878， ゲイザースバーグ， ウエスト サイド ドライブ 437， アパートメント 102 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BA13 BB03 BB20 CA26 CB01 CB03 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB04 4B024 AA01 AA11 BA41 BA61 BA80 CA04 DA01 DA02 DA05 DA06 DA11 EA02 EA04 GA01 GA11 HA08 HA11 4B063 QA01 QA17 QA18 QQ02 QQ08 QQ42 QQ79 QR08 QR14 QR31 QR42 QR48 QR55 QR62 QR72 QR77 4B064 AG01 AG26 CA02 CA05 CA10 CA11 CA19 CA20 CC24 DA03 DA13 4B065 AA01X AA26X AA57X AA87X AA93Y AB01 AB02 BA01 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA07 AA13 BA02 BA08 BA21 BA22 BA23 CA18 DC50 NA14 ZA011 ZA021 ZA081 ZA151 ZA161 ZA181 ZA221 ZA331 ZA341 ZA361 ZA421 ZA441 ZA451 ZA511 ZA541 ZA551 ZA591 ZA661 ZA671 ZA681 ZA751 ZA811 ZA891 ZA941 ZA961 ZB011 ZB021 ZB051 ZB071 ZB091 ZB111 ZB131 ZB151 ZB211 ZB212 ZB261 ZB271 ZB311 ZB321 ZB331 ZB351 ZC021 ZC022 ZC311 ZC351 ZC411 ZC541 ZC551 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA09 CA40 DA75 DA76 EA20 EA50 FA72 FA73 FA74

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号Ｘとして示されるポリヌクレオチド、またはＡＴＣＣ受託番号Ｚ
    に含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号Ｙの生物学的活性を有するポリペプチドフラグメントをコードす
    るポリヌクレオチド、またはＡＴＣＣ受託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列により
    コードされる生物学的活性を有するポリペプチドフラグメントをコードするポリ
    ヌクレオチド； （ｃ）配列番号Ｙのポリペプチドエピトープをコードするポリヌクレオチド、ま
    たはＡＴＣＣ受託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチ
    ドエピトープをコードするポリヌクレオチド； （ｄ）ストリンジェントな条件下において、（ａ）〜（ｃ）で特定されるいずれ
    か１つのポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、
    該ポリヌクレオチドが、ストリンジェントな条件下において、Ａ残基のみまたは
    Ｔ残基のみのヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズしない、ポリ
    ヌクレオチド、 からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、核酸分子。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の単離された核酸分子であって、前記ポリヌ
    クレオチドが、可溶性のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核
    酸分子。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の単離された核酸分子であって、前記ポリヌ
    クレオチドが、配列番号Ｙとして同定される配列をコードするヌクレオチド配列
    、またはＡＴＣＣ受託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列によりコードされるポリペ
    プチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の単離された核酸分子であって、前記ポリヌ
    クレオチドが、配列番号Ｘのヌクレオチド配列全体またはＡＴＣＣ受託番号Ｚに
    含まれるｃＤＮＡのヌクレオチド配列全体を含む、核酸分子。
  5. 【請求項５】 請求項２に記載の単離された核酸分子であって、前記ポリヌ
    クレオチドがＤＮＡである、核酸分子。
  6. 【請求項６】 請求項３に記載の単離された核酸分子であって、前記ポリヌ
    クレオチドがＲＮＡである、核酸分子。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  9. 【請求項９】 遺伝子の発現を制御する異種調節エレメントに作動可能に連
    結されている請求項１に記載の核酸分子を含む、組換え宿主細胞。
  10. 【請求項１０】 ポリペプチドを生成する方法であって、請求項９に記載の
    宿主細胞からコードされるポリペプチドを発現させる工程、および該ポリペプチ
    ドを回収する工程を包含する、方法。
  11. 【請求項１１】 単離されたポリペプチドであって、以下： （ａ）配列番号Ｙとして示されるポリペプチド、またはｃＤＮＡよりコードされ
    る該ポリペプチド； （ｂ）配列番号Ｙのポリペプチドフラグメント、またはｃＤＮＡよりコードされ
    る該ポリペプチド； （ｃ）配列番号Ｙのポリペプチドエピトープ、またはｃＤＮＡよりコードされる
    該ポリペプチド；および （ｄ）配列番号Ｙの改変体、 からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、
    ポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドであって、配
    列番号Ｙを有するポリペプチドを含む、ポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドと特異的に結
    合する、単離された抗体。
  14. 【請求項１４】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドを発現する、
    組換え宿主細胞。
  15. 【請求項１５】 単離されたポリペプチドを作製する方法であって、以下： （ａ）該ポリペプチドが発現されるような条件下で請求項１４に記載の組換え宿
    主細胞を培養する工程；および （ｂ）該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する、方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法により産生される、ポリペプチド
    。
  17. 【請求項１７】 医学的状態を予防、処置または改善するための方法であっ
    て、治療有効量の請求項１に記載のポリヌクレオチドを哺乳動物被験体に投与す
    る工程を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 被験体における病理学的状態または病理学的状態に対する
    感受性を診断する方法であって、以下： （ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドにおける変異の存在または非存在を決
    定する工程；および （ｂ）該変異の存在または非存在に基いて、病理学的状態または病理学的状態に
    対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  19. 【請求項１９】 被験体における病理学的状態または病理学的状態に対する
    感受性を診断する方法であって、以下： （ａ）生物学的サンプルにおける請求項１１に記載のポリペプチドの発現の存在
    、または発現量を決定する工程；および （ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または発現量に基いて、病理学的状態または
    病理学的状態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１１に記載のポリペプチドに対する結合パートナー
    を同定するための方法であって、以下： （ａ）請求抗１１に記載のポリペプチドと結合パートナーとを接触させる工程；
    および （ｂ）該結合パートナーが、該ポリペプチドの活性をもたらすか否かを決定する
    工程、 を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１１に記載のポリペプチドの活性を改変する分子に
    ついてスクリーニングする方法であって、以下： （ａ）該ポリペプチドと、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有すると
    推測される化合物とを接触させる工程；および （ｂ）該ポリペプチドの活性についてアッセイする工程、 を包含する、方法。
  22. 【請求項２２】 医学的状態を予防、処置、または改善するための方法であ
    って、治療有効量の請求項１１に記載のポリペプチドを哺乳動物被験体に投与す
    る工程を包含する、方法。
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