JP2003506087A - 樹状富化分泌リンパ球活性化分子 - Google Patents

樹状富化分泌リンパ球活性化分子

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、分泌性リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）およびおよび関連するサイトカインに構造的に類似する、ならびに類似の生物学的効果および活性を有する、サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含むかまたはこれらからなる、単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、組換えベクター、この組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞を作製する方法、および組換え技術によるＤ−ＳＬＡＭポリペプチドの産生のためのこのようなベクターおよび宿主細胞の使用に関する。本発明はまた、本発明のＤ−ＳＬＡＭ核酸配列を含む組換え原核生物宿主細胞および/または組換え真核生物宿主細胞をこのようなポリペプチドの発現を促進する条件下で培養し、そして引き続きこのポリペプチド回収する工程を包含する組換え技術により、このポリペプチドを産生するためのプロセスを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、分泌リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリーのメンバーである
ポリペプチドをコードする、新規なヒト遺伝子に関する。より詳細には、本発明
は、樹状富化分泌リンパ球活性化分子または「Ｄ−ＳＬＡＭ」と名付けられた新
規なヒトポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、
Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド、ならびにベクター、宿主細胞、Ｄ−ＳＬＡＭポリペ
プチドに対する抗体、およびＤ−ＳＬＡＭポリペプチドを産生するための組換え
方法に関する。免疫系に関する障害を検出するための診断方法、およびこのよう
な障害を処置、診断、検出、および/または予防するための治療方法もまた提供
される。本発明はさらに、Ｄ−ＳＬＡＭ活性のアゴニストおよびアンタゴニスト
を同定するためのスクリーニング方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） 免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーである、ＳＬＡＭは、ネ
イティブのＴ細胞およびＢ細胞の活性化後に迅速に誘導される（Ｃｏｃｋｓ，Ｂ
．Ｇ．、「Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｔ−
Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ ３７６：２６０−２６３（
１９９５）；Ａｖｅｒｓａ，Ｇ．、「Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｓ
ｉｇｎａｌｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌｅ （ＳＬＡＭ） ｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｓ
ｕｌｔｓ ｉｎ Ｉｌ−２−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ
Ａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎ
ｄ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．４０３６
−４０４４（１９９７））。多機能性の７０ｋＤの糖タンパク質である、ＳＬＡ
Ｍは、免疫細胞の増殖および分化を引き起こす（Ｐｕｎｎｏｎｅｎ，Ｊ．、「Ｓ
ｏｌｕｂｌｅ ａｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ Ｆｏｒｍｓ ｏｆ Ｓ
ｉｇｎａｌｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌｅ （ＳＬＡＭ） Ｉｎｄｕｃｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｉｇ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｂ Ｌ
ｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：９９３−１００４（１
９９７））。免疫応答を誘発するために、分泌形態のＳＬＡＭ、ならびに膜結合
型ＳＬＡＭの両者は、相互作用すると考えられる。
【０００３】 樹状細胞（ＤＣ）は、初期免疫応答に関与する主要な抗原提示細胞であること
もまた公知であり；これらの主要な機能は、組織中の抗原を得ること、リンパ系
器官へ移動すること、およびＴ細胞を活性化することである（Ｍｏｈａｍａｄｚ
ａｄｅｈ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３１０２−３１０６（１９９
６））。実際に、ＤＣは通常、粘膜上の炎症部位に到達する最初の免疫細胞であ
る（例えば、Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４１１
１−４１１７（１９９５）を参照のこと）。ＤＣはまた、Ｂ細胞と相互作用する
ことが公知である。免疫細胞の活性化および／または増殖を導くＤＣとＴ細胞お
よび/またはＢ細胞との間の相互作用を媒介し得る、新規なポリペプチド因子を
同定する不断の必要性が存在する。しかし今日まで、ＳＬＡＭ分子はＤＣ細胞に
おいて同定されていない。
【０００４】 従って、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞）の増殖、活性化、生存、お
よび／または分化に影響するポリペプチドの必要性が存在する。なぜなら、この
ような調節の障害が、免疫系に関する障害に関与し得るからである。それゆえ、
このような障害の検出、予防、寛解、または矯正に役割を果たし得る、そのよう
なヒトポリペプチドの同定および特徴づけの必要性が存在する。
【０００５】 （発明の要旨） 本発明は、Ｄ−ＳＬＡＭの新規なポリヌクレオチドおよびそのコードされるポ
リペプチドに関する。さらに、本発明は、ベクター、宿主細胞、抗体、ならびに
そのポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するための組換え方法に関する
。そのポリペプチドに関する障害を検出および/または診断する診断方法、なら
びにこのような障害を処置および/または予防する治療方法もまた提供される。
本発明はさらに、Ｄ−ＳＬＡＭの結合パートナーを同定するためのスクリーニン
グ方法に関する。
【０００６】 本発明の1つの実施形態に従って、新規の成熟Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド、な
らびに生物学的に活性でかつ診断的または治療的に有用な、フラグメント、アナ
ログ、およびその誘導体が提供される。
【０００７】 本発明の別の実施形態に従って、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ
を含むヒトＤ−ＳＬＡＭをコードする単離された核酸分子、ならびにアナログ、
および生物学的に活性でかつ診断的または治療的に有用な、フラグメント、およ
びその誘導体が提供される。
【０００８】 本発明は、分泌性リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）およびおよび関連するサイ
トカインに構造的に類似する、ならびに類似の生物学的効果および活性を有する
、サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含むかまたはこれらからなる、
単離された核酸分子を提供する。このサイトカインは、Ｄ−ＳＬＡＭと呼ばれ、
そして本発明は、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄのアミノ酸配列（配列番号２
）の少なくとも一部、あるいは１９９８年、２月６日に寄託され、ＡＴＣＣ番号
２０９６２３を与えられたｃＤＮＡクローン（ＨＤＰＪＯ３９）によりコードさ
れるアミノ酸配列を有するＤ−ＳＡＬＭポリペプチドを含む。寄託されたＤ−Ｓ
ＬＡＭクローンを配列決定することにより決定されたヌクレオチド配列（これは
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄに示される（配列番号１））は、Ｎ末端メチオ
ニン（すなわち、配列番号２のアミノ酸残基１−２８５）を含む２８５アミノ酸
残基の完全ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、約２２ア
ミノ酸残基（すなわち、配列番号２のアミノ酸残基１−２２）の予想シグナルペ
プチド、約２６３アミノ酸（すなわち、配列番号２のアミノ酸残基２３−２８５
）の予想成熟形態、および約３４．２ｋＤａの完全タンパク質に関する推定分子
量を含む。
【０００９】 従って、本発明の１つの実施形態は、以下からなる群より選択されるヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはこれらからなる、単離された
核酸分子を提供する：（ａ）図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図１Ｄ（配列番号
２）の、またはＡＴＣＣ受諾番号２０９６２３を有する寄託物に含まれるｃＤＮ
Ａクローンによりコードされるような、完全アミノ酸配列を有する全長Ｄ−ＳＬ
ＡＭポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）図１Ａ、図１Ｂ、図１
Ｃ、および図１Ｄ（配列番号２）の、またはＡＴＣＣ受諾番号２０９６２３を有
する寄託物に含まれるクローンによりコードされるような、２３〜２３２位のア
ミノ酸配列を有するＤ−ＳＬＡＭポリペプチドの予想細胞外ドメインをコードす
るヌクレオチド配列；（ｃ）Ｄ−ＳＬＡＭ機能活性（例えば、生物学的活性）を
有する（ｂ）のポリペプチドのフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（
ｄ）（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図１Ｄ（配列番号２）の約２５６〜約２
８５のアミノ酸残基を構成することが予想される、またはＡＴＣＣ受諾番号２０
９６２３を有する寄託物に含まれるクローンによりコードされるような）Ｄ−Ｓ
ＬＡＭ細胞内ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ
）（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図１Ｄ（配列番号２）の約２３３〜約２５
５のアミノ酸残基を構成することが予想される、またはＡＴＣＣ受諾番号２０９
６２３を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるような）
Ｄ−ＳＬＡＭ膜貫通ドメインを含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列；（ｆ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを有するが膜貫通ドメインを欠
く、可溶性Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびに
（ｇ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）のヌクレオ
チド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００１０】 本発明のさらなる実施形態では、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（
ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）のヌクレオチド配列のいずれか、あるいは上記の（
ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）のポリヌクレオ
チドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする
ポリヌクレオチドに、少なくとも８０％、８５％、または９０％同一、そしてよ
り好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一で
あるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはこれらからなる
、単離された核酸分子を含む。ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、Ａ残基
のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない。
【００１１】 さらなる実施形態では、本発明の核酸分子は、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、
（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）のアミノ酸配列を有するＤ−ＳＬＡＭポ
リペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
を含むかまたはこれらからなる。本発明のさらなる核酸の実施形態は、少なくと
も１つのアミノ酸の付加、置換、および/または欠失を含むが、５０を超えない
アミノ酸の付加、置換、および/または欠失を含む、さらにより好ましくは、４
０を超えないアミノ酸の付加、置換、および/または欠失を含む、さらにより好
ましくは、３０を超えないアミノ酸の付加、置換、および/または欠失を含む、
さらにより好ましくは、２０を超えないアミノ酸の付加、置換、および/または
欠失を含む、アミノ酸配列を有するＤ−ＳＬＡＭポリペプチドのアミノ酸配列を
コードするポリヌクレオチドを含むかまたはこれらからなる、単離された核酸分
子に関する。もちろん、増加する優先度の順に、１０、９、８、７、６、５、４
、３、２、１、もしくは１、または１−１００、１−５０、１−２５、１−２０
、１−１５、１−１０、もしくは１−５を超えないのアミノ酸の付加、置換、お
よび/または欠失を含むアミノ酸配列を有することが、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチ
ドのアミノ酸配列をコードするポリペプチドに非常に好ましい。保存的置換は、
好ましい。
【００１２】 本発明はまた、組換えベクター（これは、本発明の単離された核酸分子を含む
）、この組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿
主細胞を作製する方法、および組換え技術によるＤ−ＳＬＡＭポリペプチドの産
生のためのこのようなベクターおよび宿主細胞の使用に関する。
【００１３】 本発明のさらなる実施形態に従って、本発明のＤ−ＳＬＡＭ核酸配列を含む、
組換え原核生物宿主細胞および/または組換え真核生物宿主細胞をこのようなポ
リペプチドの発現を促進する条件下で培養し、そして引き続きこのポリペプチド
回収する工程を包含する組換え技術により、このポリペプチドを産生するための
プロセスを提供する。
【００１４】 本発明は、さらに、以下からなる群より選択される、アミノ酸配列を含むか、
あるいは、そのようなアミノ酸配列から構成される、単離されたＤ−ＳＬＡＭポ
リペプチドを提供する：（ａ）図１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄに示される完全ア
ミノ酸配列を有する全長Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドのアミノ酸配列（すなわち、
配列番号２の１〜２８５位）、またはＡＴＣＣ受託番号２０９６２３の寄託物に
含まれるｃＤＮＡプラスミドによりコードされるようなアミノ酸配列；（ｂ）配
列番号２における完全なアミノ酸配列を有するが、Ｎ末端メチオニン残基を引い
た、全長Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドのアミノ酸配列（すなわち、配列番号２の２
〜２８５位）；（ｃ）Ｄ−ＳＬＡＭの機能的活性（例えば、生物学的活性）を有
する（ｂ）のポリペプチドのフラグメント；（ｄ）図１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１
Ｄ（配列番号２）の２３〜２３２位のアミノ酸配列を有するＤ−ＳＬＡＭポリペ
プチドの推定細胞外ドメインのアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９６
２３の寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミドによりコードされるようなアミノ酸
配列；（ｅ）Ｄ−ＳＬＡＭ細胞内ドメインのアミノ酸配列（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ
および１Ｄ（配列番号２）の約２５６〜約２８５のアミノ酸残基を構成すること
が予測される）またはＡＴＣＣ受託番号２０９６２３の寄託物に含まれるｃＤＮ
Ａプラスミドによりコードされるようなアミノ酸配列；（ｆ）Ｄ−ＳＬＡＭ膜貫
通ドメインのアミノ酸配列（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄ（配列番号２）の約
２３３〜約２５５のアミノ酸残基を構成することが予測される）またはＡＴＣＣ
受託番号２０９６２３の寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミドによりコードされ
るようなアミノ酸配列；（ｇ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを有するが
、膜貫通ドメインを欠き、これらのドメインのそれぞれは、上記で規定される、
可溶性Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドのアミノ酸配列；ならびに（ｈ）（ａ）、（ｂ
）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）のポリペプチドのフラグメ
ント。本発明のポリペプチドはまた、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、
（ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）に記載のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一、
より好ましくは少なくとも８５％または９０％同一、そしてなおより好ましくは
９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する
ポリペプチド、ならびに上記のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％または
９０％類似性、そしてより好ましくは、少なくとも９５％類似性であるアミノ酸
配列を有するポリペプチドを含む。本発明のさらなる実施形態は、上記の（ａ）
、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）に記載のアミ
ノ酸配列を有するＤ−ＳＬＡＭポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配
列を含むか、あるいはそのようなアミノ酸配列から構成される、ポリペプチドに
関する。本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドのエピトープ保有部位のアミノ酸配
列を有するポリペプチドは、約５０アミノ酸に対して、少なくとも４、少なくと
も５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、そして好ましくは少なくと
も９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少
なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも
３０、少なくとも４０、少なくとも５０、そしてより好ましくは少なくとも約３
０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの一部分を含むが、任意の長さまで
のエピトープ保有ポリペプチド、および上記の本発明のポリペプチドの全アミノ
酸配列を含むポリペプチドが、本発明に包含される。
【００１５】 本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合した上記のポリヌクレオチド
配列を包含する。これらのポリヌクレオチドおよび核酸分子によりコードされる
ポリペプチドがまた、本発明により包含される。
【００１６】 本発明の特定の非排他的実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）
、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）に記載のアミノ酸配列を有する
Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドに関する。他の実施形態において、本発明は、上記の（ａ）、（ｂ）、（
ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）に記載のアミノ酸
配列を有するＤ−ＳＬＡＭポリペプチドに特異的に（すなわち、特有に）結合す
る単離された抗体を提供する。
【００１７】 本発明はさらに、本明細書に記載のようなアミノ酸配列を有するＤ−ＳＬＡＭ
ポリペプチドに特異的に（すなわち、特有に）結合する抗体を単離する方法を提
供する。このような抗体は、下記のように、診断上または治療上、有用である。
【００１８】 本発明はまた、可溶性Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド、特にヒトＤ−ＳＬＡＭポリ
ペプチド、および／または抗Ｄ−ＳＬＡＭ抗体を含む薬学的組成物を提供する。
この薬学的組成物は、例えば、腫瘍および腫瘍転移、細菌、ウイルスおよび他の
寄生生物による感染、免疫不全、炎症性疾患、リンパ節腫脹症、自己免疫疾患、
移植片対宿主病を、処置、予防、予測、および／または診断するため、末梢耐性
（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を刺激するため、形質転換細胞
株を破壊するため、細胞の活性化、生存および増殖を媒介するため、免疫調節お
よび炎症性反応を媒介するため、そして免疫応答を増大または阻害するために使
用され得る。
【００１９】 特定の実施形態において、本発明の可溶性Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはそ
のアンタゴニストは、以下を処置、予防、予測および／または診断するために投
与される：免疫不全（例えば、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）−Ｘ連鎖、ＳＣ
ＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ不全症（ＡＤＡ不全症）、Ｘ連鎖無ガ
ンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、ブルートン病、先天性無ガンマグロブリン血症
、Ｘ連鎖乳児無ガンマグロブリン血症、後天性無ガンマグロブリン血症、成人発
症無ガンマグロブリン血症、遅発性無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリ
ン血症、高ガンマグロブリン血症、新生児期の一過性ガンマグロブリン血症、不
特定の高ガンマグロブリン血症、ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全（
ＣＩＶＤ）（後天性）、ヴィスコット−オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、高Ｉ
ｇＭ（ｈｙｐｅｒ ＩｇＭ）を伴うＸ連鎖免疫不全症、高ＩｇＭ（ｈｙｐｅｒ
ＩｇＭ）を伴う非Ｘ連鎖免疫不全症、選択的ＩｇＡ欠損症、ＩｇＧサブクラス欠
損症（ＩｇＡ欠損症を伴うまたは伴わない）、正常なまたは高められたＩｇｓを
伴う抗体欠損症、胸腺腫を伴う免疫不全、Ｉｇ重鎖欠損症、κ鎖欠損症、Ｂ細胞
リンパ球増殖障害（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫不全症、劣性無ガンマグロブ
リン血症（スイス型）、細網発育不全（ｒｅｔｉｃｕｌａｒ ｄｙｓｇｅｎｅｓ
ｉｓ）、新生児好中球減少症、重症先天性白血球減少症、胸腺リンパ形成不全症
または免疫不全を伴う形成異常症、毛細血管拡張性運動失調、短肢小人症、Ｘ連
鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、ネゼロフ症候群複合Ｉｇｓを伴う免疫不全症
、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラスＩＩ欠損
（不全リンパ球症候群）、および重症複合免疫不全症）または免疫不全と関連す
る状態。
【００２０】 特定の実施形態では、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドもしくはポリヌクレ
オチド、またはそのアンタゴニストは、分類不能型免疫不全を処置、予防、予測
、および／または診断するために投与される。
【００２１】 特定の実施形態では、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドもしくはポリヌクレ
オチド、またはそのアンタゴニストは、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症を処置、
予防、予測、および／または診断するために投与される。
【００２２】 別の特定の実施形態では、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドもしくはポリヌ
クレオチド、またはそのアンタゴニストは、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）を
処置、予防、予測、および／または診断するために投与される。
【００２３】 別の特定の実施形態では、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドもしくはポリヌ
クレオチド、またはそのアンタゴニストは、ヴィスコット−オールドリッチ症候
群を処置、予防、予測、および／または診断するために投与される。
【００２４】 別の特定の実施形態では、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドもしくはポリヌ
クレオチド、またはそのアンタゴニストは、高ＩｇＭ（ｈｙｐｅｒ ＩｇＭ）を
伴う非Ｘ連鎖免疫不全症を処置、予防、予測、および／または診断するために投
与される。
【００２５】 別の特定の実施形態では、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニストは、以下を処置、予防、
予測、および／または診断するために投与される：自己免疫疾患（例えば、慢性
関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫
溶血性貧血、自己免疫新生児血小板減少症、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血
、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟
骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡネフロパシー）、多発性
硬化症、神経炎、ブドウ膜炎眼炎、多発性内分泌腺症、紫斑（例えば、ヘノッホ
−シェーンライン（Ｈｅｎｌｏｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ）紫斑病）、ライター
病、Ｓｔｉｆｆ−Ｍａｎ症候群、自己免疫肺炎症、ギヤン−バレー症候群、イン
シュリン依存性糖尿病（ｍｅｌｌｉｔｉｓ）、および自己免疫炎症性眼、自己免
疫甲状腺炎、甲状腺機能低下症（すなわち、橋本甲状腺炎）、グッドパスチャー
症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫（例えば、（ａ）グレーヴズ病、（ｂ）重
症筋無力症、および（ｃ）インシュリン耐性など）、自己免疫溶血性貧血、自己
免疫血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅ
ｒｍａ）、混合結合組織病、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性貧血、特発性アディソ
ン病、不妊症、糸球体腎炎（原発性糸球体腎炎およびＩｇＡネフロパシーなど）
、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、糖尿病およびアドレナリン作用性薬剤
耐性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作用性薬剤耐性を含む）、慢
性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺不全、白斑、脈管炎、心筋梗
塞後（ｐｏｓｔ−ＭＩ）、心臓切開症候群、じんま疹、アトピー性皮膚炎、喘息
、炎症性ミオパシーならびに他の炎症性障害、肉芽腫性障害、変性障害および萎
縮性障害）または自己免疫疾患に関連する状態。特定の好ましい実施形態におい
て、慢性関節リウマチは、本発明のＤ−ＳＬＡＭおよび／または他のアゴニスト
を用いて、処置、予防、予後を判定および／または診断される。別の特定の好ま
しい実施形態において、全身性エリテマトーデスは、本発明のＤ−ＳＬＡＭおよ
び／または他のアゴニストを用いて、処置、予防、予後を判定および／または診
断される。別の特定の好ましい実施形態において、特発性血小板減少性紫斑病は
、本発明のＤ−ＳＬＡＭおよび／または他のアゴニストを用いて処置、予防、予
後の判定および／または診断される。別の特定の好ましい実施形態において、Ｉ
ｇＡネフロパシーは、本発明のＤ−ＳＬＡＭおよび／または他のアゴニストを用
いて、処置、予防、予後の判定および／または診断される。好ましい実施形態に
おいて、自己免疫疾患および自己免疫障害ならびに／または上記の疾患および障
害と関連する状態は、Ｄ−ＳＬＡＭを用いて、処置、予防、予後の判定および／
または診断される。
【００２６】 本発明はさらに、インビトロで細胞に、エキソビボで細胞におよびインビボで
細胞に、または多細胞器官に、投与するための、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド
、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドおよび／または抗Ｄ−ＳＬＡＭ抗体を含む組成物を
提供する。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、疾患の処置のために
宿主器官中でＤ−ＳＬＡＭポリペプチドを発現するための、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌ
クレオチドを含む。最も好ましい実施形態において、本発明の組成物は、免疫不
全および／または免疫不全と関連する状態の処置のために宿主器官中でＤ−ＳＬ
ＡＭポリペプチドを発現するための、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドを含む。こ
の点で特に好ましいのは、Ｄ−ＳＬＡＭ遺伝子の異常な内因性活性と関連する機
能不全の処置のためにヒト患者で発現することである。
【００２７】 本発明はまた、Ｄ−ＳＬＡＭレセプターによって誘導される細胞性応答を増強
または阻害し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この
方法は、Ｄ−ＳＬＡＭレセプターを発現する細胞を候補化合物と接触させる工程
、細胞性応答をアッセイする工程、および標準の細胞性応答に対してその細胞性
応答を比較する工程を包含し、この標準は、接触が候補化合物の非存在下でなさ
れた場合にアッセイされる。これにより、標準に対して増加した細胞性応答は、
その化合物がアゴニストであることを示し、そして標準に対して減少した細胞応
答は、その化合物がアンタゴニストであることを示す。
【００２８】 別の実施形態において、Ｄ−ＳＬＡＭレセプターを同定するための方法、なら
びにこのようなレセプターを用いるアゴニストおよびアンタゴニストについての
スクリーニングアッセイが提供される。このアッセイは、候補化合物が有する、
Ｄ−ＳＬＡＭレセプターに対するＤ−ＳＬＡＭの結合に対する効果を決定する工
程を包含する。特に、この方法は、Ｄ−ＳＬＡＭレセプターを本発明のＤ−ＳＬ
ＡＭポリペプチドおよび候補化合物と接触させる工程、ならびにＤ−ＳＬＡＭレ
セプターに対するＤ−ＳＬＡＭポリペプチドの結合が候補化合物の存在に起因し
て増加または減少されるか否かを決定する工程を包含する。このアゴニストは、
以下を予防するために使用され得る：敗血性ショック、炎症、大脳マラリア、Ｈ
ＩＶウイルスの活性化、移植片−宿主拒絶反応、骨吸収、慢性関節リウマチ、悪
液質（るいそうまたは栄養失調）、免疫系機能、リンパ腫、および自己免疫障害
（例えば、慢性関節リウマチ、および全身性エリテマトーデス）。
【００２９】 本発明者らは、Ｄ−ＳＬＡＭが、樹状細胞およびリンパ節において高度に発現
され、そして脾臓、胸腺、小腸、ＰＢＬ、骨髄、Ｔ細胞リンパ腫においてより少
ない程度で、そして胎盤および肺においてさらに少ない程度で発現されることを
発見した。これらの組織および細胞の多くの障害（例えば、腫瘍および腫瘍転移
、細菌、ウイルスおよび他の寄生生物の感染、免疫不全（例えば、慢性一般免疫
不全）、敗血性ショック、炎症、大脳マラリア、ＨＩＶウイルスの活性化、移植
片−宿主拒絶反応、骨吸収、慢性関節リウマチ、自己免疫障害（例えば、慢性関
節リウマチ、および全身性エリテマトーデス）、ならびに悪液質（るいそうまた
は栄養失調））について、「標準的」なＤ−ＳＬＡＭ遺伝子の発現レベル（すな
わち、障害を有さない個体由来の組織または体液におけるＤ−ＳＬＡＭの発現レ
ベル）に対して、有意により高いかまたはより低いレベルのＤ−ＳＬＡＭ遺伝子
の発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、骨
髄）または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液または髄液）中で、検出され得
る。従って、本発明は、障害の診断において有用な方法を提供し、この方法は、
以下：（ａ）個体の細胞または体液中のＤ−ＳＬＡＭ遺伝子の発現レベルをアッ
セイする工程；（ｂ）このＤ−ＳＬＡＭ遺伝子の発現レベルを標準的なＤ−ＳＬ
ＡＭ遺伝子の発現レベルと比較する工程を包含し、これによって、標準的な発現
レベルと比較して、アッセイされたＤ−ＳＬＡＭ遺伝子の発現レベルの増加また
は減少が、免疫系における障害を示す工程、を包含する。
【００３０】 本発明のさらなる実施形態は、身体中において上昇したかまたは構成的レベル
のＤ−ＳＬＡＭ活性を必要とする個体を処置するための方法に関し、この方法は
、治療的に有効量の本発明の単離されたＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはそのア
ゴニストを包含する組成物をこのような個体に投与する工程を包含する。
【００３１】 本発明のなおさらなる局面は、身体中において減少したレベルのＤ−ＳＬＡＭ
活性を必要とする個体を処置するための方法に関し、この方法は、治療的に有効
量のＤ−ＳＬＡＭアンタゴニストを含む組成物をこのような個体に投与する工程
を包含する。本発明における使用に好ましいアンタゴニストはＤ−ＳＬＡＭ特異
的抗体である。
【００３２】 （詳細な説明） （定義） 以下の定義は、本明細書を通して使用される特定の用語の理解を容易にするた
めに提供される。
【００３３】 本発明において、「単離された」とは、その本来の環境（例えば、それが天然
に存在する場合は天然の環境）から取り出された物質をいい、したがって、天然
の状態から「人間の手によって」変更されている。例えば、単離されたポリヌク
レオチドは、ベクターまたは物質の組成物の一部であり得るか、あるいは細胞中
に含まれ得、そしてなお「単離される」。なぜなら、ベクター、物質の組成物、
または特定の細胞は、ポリヌクレオチドの本来の環境ではないからである。単離
されたＤＮＡ分子のさらなる例は、異種宿主細胞中で維持される組換えＤＮＡ分
子、または溶液中の（部分的に、または実質に）精製されたＤＮＡ分子を含む。
単離されたＲＮＡ分子は、インビボまたはインビトロにおける本発明のＤＮＡ分
子のＲＮＡ転写産物を含む。しかし、ライブラリーの他のメンバーから単離され
ていない（例えば、クローンおよび他のライブラリーのメンバーを含む均一な溶
液の形態で）ライブラリー（例えば、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブ
ラリー）のメンバーであるクローン中に含まれる核酸、または細胞もしくは細胞
溶解物から単離されたかもしくは取り除かれた染色体（例えば、核型におけるよ
うな「染色体スプレッド」）、または無作為に共有されるゲノムＤＮＡの調製物
、もしくは１つ以上の制限酵素で切断されたゲノムＤＮＡの調製物は、本発明の
目的のためには「単離され」ていない。本明細書中でさらに議論するように、本
発明に従う単離された核酸分子は、天然に、組換え的に、または合成的に産生さ
れ得る。
【００３４】 本発明において、「分泌」Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質とは、ＥＲ、分泌小胞、ま
たは細胞外間隙にシグナル配列の結果として指向され得るタンパク質、ならびに
シグナル配列を必ずしも含まないが細胞外間隙に放出されるＤ−ＳＬＡＭタンパ
ク質をいう。Ｄ−ＳＬＡＭ分泌タンパク質が、細胞外間隙に放出される場合、こ
のＤ−ＳＬＡＭ分泌タンパク質は、「成熟」Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質を産生する
ために細胞外プロセシングを受け得る。細胞外間隙への放出は、エキソサイトー
シスおよびタンパク質分解切断を含む多くの機構によって生じ得る。
【００３５】 本明細書で使用される場合、Ｄ−ＳＬＡＭ「ポリヌクレオチド」とは、配列番
号１に含まれる核酸配列を有する分子、またはＡＴＣＣに寄託されたクローン内
に含まれるｃＤＮＡをいう。例えば、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、５’お
よび３’非翻訳配列、シグナル配列を含むかもしくは含まないコード領域、分泌
タンパク質コード領域を含む全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列、ならびにこ
の核酸配列のフラグメント、エピトープ、ドメイン、および改変体を含み得る。
さらに、本明細書で使用される場合、Ｄ−ＳＬＡＭ「ポリペプチド」とは、広く
定義される場合、ポリヌクレオチドから生じた翻訳されたアミノ酸配列を有する
分子をいう。
【００３６】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、３００ｋｂ、２００
ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、または７．５ｋｂより小さ
い長さである。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、Ｄ−
ＳＬＡＭコード配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含むが、任意の
Ｄ−ＳＬＡＭイントロンの全て、または一部を含まない。別の実施形態において
、Ｄ−ＳＬＡＭコード配列を含む核酸は、ゲノムの隣接遺伝子（すなわち、ゲノ
ムにおけるＤ−ＳＬＡＭ遺伝子の５’側または３’側）のコード配列を含まない
。
【００３７】 本発明において、配列番号１として同定される全長Ｄ−ＳＬＡＭ配列は、寄託
クローンの重複配列により生成された（コンティグ分析）。配列番号１の全ての
、またはほとんどの配列を含む代表的なクローンは、アメリカンタイプカルチャ
ーコレクション（「ＡＴＣＣ」）に１９８８年２月６日に寄託され、ＡＴＣＣ受
託番号２０９６２３を付与された。ＡＴＣＣは、アメリカ合衆国、バージニア２
０１１０−２２０９、マナサス、Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ大学 １０８０１に位置す
る。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続の目的のための微生物の寄託の国際承認に係るブ
ダペスト条約の条項によって行われた。
【００３８】 Ｄ−ＳＬＡＭ「ポリヌクレオチド」はまた、ストリンジェントハイブリダイゼ
ーション条件下で、配列番号１に含まれる配列、その相補体、または寄託クロー
ン内のｃＤＮＡにハイブリダイズし得るそれらのポリヌクレオチドを含む。「ス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５
×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン
、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃での一
晩インキュベーション、次いで０．１×ＳＳＣ中で約６５℃にてフィルターを洗
浄することをいう。
【００３９】 中程度に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件でＤ−ＳＬＡ
Ｍポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた意図される。ハイブリ
ダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は、主として、
ホルムアミド濃度（より低い割合のホルムアミドが、ストリンジェンシーの低下
を生じる）；塩条件、または温度の操作によって行われる。例えば、中程度に高
いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ
；０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％
ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ精子ブロッキングＤＮＡを
含む溶液中、３７℃で一晩のインキュベーション；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１
％ ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに、さらにより低いストリンジ
ェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に行
われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行われ得る。
【００４０】 上記の条件における変化が、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラ
ウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の包含および／ま
たは置換によって達成され得ることに留意すること。代表的なブロッキング試薬
としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、お
よび市販の製品処方物が挙げられる。特異的ブロッキング試薬の包含は、適合性
の問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし得る。
【００４１】 当然ながら、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡの任意の３’
末端ポリＡ＋領域（ｔｒａｃｔ））に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的ス
トレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレ
オチドが、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補体を含む任意の核酸分子（例え
ば、実際の任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするので、「ポリ
ヌクレオチド」の定義に包含されない。
【００４２】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドから構成され得、これは、非改変ＲＮＡもしくは非改変
ＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る。例えば、Ｄ−ＳＬＡＭ
ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混
合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領
域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより代表的には二本鎖もしくは一本鎖
および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分
子から構成され得る。さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしく
はＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。
Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドはまた、安定性のために、または他の理由のため
に改変された、１つ以上の改変された塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含
み得る。「改変された」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイ
ノシンのような普通でない塩基が挙げられる。種々の改変が、ＤＮＡおよびＲＮ
Ａに対して行われ得；従って、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、また
は代謝的に改変された形態を含む。
【００４３】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合、
すなわち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）によって互いに連結した
アミノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする２０個のアミノ酸以外のア
ミノ酸を含み得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような
天然のプロセスによって、または当該技術分野で周知の化学的改変技術によって
のいずれかで改変され得る。このような改変は、基本テキスト、およびより詳細
な研究論文、ならびに多くの研究文献に十分記載される。改変は、ペプチド骨格
、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含むＤ−ＳＬＡＭ
ポリペプチドのどこにでも生じ得る。同じ型の改変が、所定のＤ−ＳＬＡＭポリ
ペプチド中のいくつかの部位で同じまたは種々の程度で存在し得ることが理解さ
れる。また、所定のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドは多くの型の改変を含み得る。Ｄ
−ＳＬＡＭポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝状であり得
、そしてＤ−ＳＬＡＭポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない、環状であ
り得る。環状、分枝状および分枝した環状Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、天然の
翻訳後プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。改変と
しては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共
有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結
合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合
、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シス
テインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グ
リコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、抗体分子または
他の細胞リガンドへの結合、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（ｐｅｇ
ｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク質分解プロセシング（例えば、切断）、リン酸化、
プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク
質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介の付加、およびユビキチン化が挙げ
られる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥ
ＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ， 第２版， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏ
ｎ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ （１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ
ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓ
ｏｎ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １−１２頁
（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら， Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８２：６
２６−６４６ （１９９０）；Ｒａｔｔａｎら， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ ６６３：４８−６２ （１９９２）を参照のこと）。任意の多数の化学的
改変は、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：
臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、Ｎａ
ＢＨ4による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカ
マイシンの存在下での代謝合成；など。
【００４４】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙
げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロ
セシング）、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭
水化物鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオ
ニン残基の付加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標識（例え
ば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変して、こ
のタンパク質の検出および単離が可能にされ得る。さらに、本発明のポリペプチ
ドは、ヨウ素化によって改変され得る。
【００４５】 １つの実施形態において、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドはまた、ビオチ
ンで標識され得る。他の関連の実施形態において、本発明のビオチン化Ｄ−ＳＬ
ＡＭポリペプチドは、例えば、造影剤として、または１つ以上のＤ−ＳＬＡＭレ
セプターもしくは他の共レセプターもしくは共リガンド分子を同定する手段とし
て用いられ得る。
【００４６】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性およびインビボまたはインビトロの循環時間の増加、または免疫原性の減少
）を提供し得る、Ｄ−ＳＬＡＭのポリペプチドの化学修飾誘導体が提供される（
米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）。誘導体化のための化学部分は
、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プ
ロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、
ポリビニルアルコールなど）から選択され得る。このポリペプチドは、この分子
内のランダムな位置で、またはこの分子内の所定の位置で改変され得、そして１
、２、３以上の結合した化学部分を含み得る。
【００４７】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は示
した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）である
。所望の治療的プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間、ある場
合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または抗原
性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリ
コールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。例えば、ポ
リエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、
２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６
０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５
００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，００
０、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００
、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、
１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２
０，０００ 、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、５
０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５
，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または
１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。
【００４８】 上記のように、ポリエチレングリコールは、分枝構造を有していてもよい。分
枝ポリエチレングリコールは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，６４
３，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．５６：５９−７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏ
ｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８：２７４５−２７５０（１９９９）
；およびＣａｌｉｃｅｔｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−
６４６（１９９９）（これらの各々の開示は、本明細書中において参考として援
用される）。
【００４９】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してタンパク質に結合
されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、本
明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦにＰ
ＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−
１０３５（１９９２）（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙ
ｌａｔｉｏｎ）を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコ
ールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）によってア
ミノ酸残基を介して共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコ
ール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては
、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基
を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基および
Ｃ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、ポリエチレン
グリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療目的のため
に好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合で
ある。
【００５０】 上記で示唆されるように、ポリエチレングリコールは、多くのアミノ酸残基の
いずれかへの結合を介してタンパク質に結合され得る。例えば、ポリエチレング
リコールは、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸
残基、またはシステイン残基への共有結合を介してタンパク質に連結され得る。
１つ以上の反応化学系を用いて、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、リ
ジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステイン）またはタ
ンパク質の１つより多くの型のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、ア
スパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびそれらの組み合わせ）にポリエ
チレングリコールを結合し得る。
【００５１】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコ
ールを例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子から（分子量、分
枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール分子のタンパク質
（またはペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の型、および選択
されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端ペグ化調製物の
獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部分から分離する
こと）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物質の精製により
行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、特定のタンパク
質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リジン対Ｎ末端）
の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得る。適切な反応
条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタンパク質の実質
的に選択的な誘導体化が達成される。
【００５２】 上記のように、本発明のタンパク質のペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、か
なり多数の手段によって、達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、
直接的または介在性リンカーによってのいずれかによってタンパク質に結合され
得る。タンパク質にポリエチレングリコールを結合させるためのリンカーレス（
ｌｉｎｋｅｒｌｅｓｓ）系は、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ
ａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）；Ｆ
ｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１８（
１９９８）；米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第５，３４９，０５２
号；ＷＯ９５／０６０５８；およびＷＯ９８／３２４６６に記載される。これら
の各々の開示は、本明細書中に参考として援用される。
【００５３】 介在性リンカーを伴わずに、ポリエチレングリコールを直接、タンパク質のア
ミノ酸残基に結合させるための一つの系は、トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ
）されたＭＰＥＧを利用する。トレシル化されたＭＰＥＧは、塩化トレシル（Ｃ
ｌＳＯ2ＣＨ2ＣＦ3）を使用するモノメトキシ（ｍｏｎｍｅｔｈｏｘｙ）ポリエ
チレングリコール（ＭＰＥＧ）の改変によって生成される。トレシル化されたＭ
ＰＥＧを用いるタンパク質の反応の際に、ポリエチレングリコールは、タンパク
質のアミン基に直接結合される。従って、本発明は、２，２，２−トリフルオロ
エタン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｅｏｔｈａｎｅ）スルホニル基を有するポリエチレン
グリコール分子と本発明のタンパク質を反応させることによって産生されるタン
パク質−ポリエチレングリコール結合体を含む。
【００５４】 ポリエチレングリコールはまた、多数の異なる介在性リンカーを使用して、タ
ンパク質に結合され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（この全体
の開示は、本明細書中で参考として援用される）は、タンパク質に対してポリエ
チレングリコールを連結するためのウレタンリンカーを開示する。タンパク質−
ポリエチレングリコール結合体（ここで、ポリエチレングリコールは、リンカー
によってタンパク質に結合される）はまた、化合物（例えば、ＭＰＥＧ−スクシ
ンイミジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化された
ＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロペニルカーボネート、ＭＰＥＧ−
ｐ−ニトロフェノールカーボネート、および種々のＭＰＥＧスクシネート誘導体
）とタンパク質との反応によって、産生され得る。多数のさらなるポリエチレン
グリコール誘導体およびポリエチレングリコールをタンパク質に結合するための
反応化学は、ＷＯ９８／３２４６６に記載され、その開示全体は、本明細書中に
参考として援用される。本明細書中で示された反応化学を使用して産生されるペ
グ化タンパク質産物は、本発明の範囲内に含まれる。
【００５５】 本発明の各タンパク質に結合されるポリエチレングリコール部分の数（すなわ
ち、置換の程度）はまた、変動し得る。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、
平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２
０またはそれより多くのポリエチレングリコール分子と連結され得る。同様に、
タンパク質分子当たりの置換の平均程度は、例えば、１〜３、２〜４、３〜５、
４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１
３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１
９または１８〜２０のポリエチレングリコール部分の範囲内である。置換の程度
を決定するための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈ
ｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）
において議論される。
【００５６】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、
酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースク
ロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロ
マトグラフィーを含むがこれらに限定されない、公知の方法によって組換え細胞
培養物から回収され、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマト
グラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【００５７】 「配列番号１」は、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド配列をいい、一方、「配列
番号２」はＤ−ＳＬＡＭポリペプチド配列をいう。
【００５８】 「生物学的活性を有する」Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドとは、特定の生物学的ア
ッセイで測定した場合、用量依存性を伴なっても伴なわなくても、Ｄ−ＳＬＡＭ
ポリペプチド（成熟形態を含む）の活性と類似であるが、必ずしも同一ではない
活性を示すポリペプチドをいう。用量依存性が存在する場合、Ｄ−ＳＬＡＭポリ
ペプチドの用量依存性と同一である必要はないが、むしろＤ−ＳＬＡＭポリペプ
チドと比較した場合に、所定の活性における用量依存性に実質的に類似する（す
なわち、候補ポリペプチドは、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドと比較して、より大き
な活性を示すか、または約１／２５以上、そして好ましくは約１／１０以上の活
性、そして最も好ましくは約１／３以上の活性を示す）。
【００５９】 （Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドおよびＤ−ＳＬＡＭポリペプチド） クローンＨＤＰＪＯ３９を、樹状細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離した。こ
のクローンは、配列番号２として同定されるコード領域全体を含む。この寄託さ
れたクローンは、２８５アミノ酸残基の推定オープンリーディングフレームをコ
ードする、合計３２２０ヌクレオチドを有するｃＤＮＡを含む（図１Ａ〜図１Ｄ
を参照のこと）。このオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド位置９２
に位置するＮ末端メチオニンで始まり、そしてヌクレオチド位置９４７の停止コ
ドンで終わる。Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の推定分子量は、約３４．２ｋＤａであ
るはずである。
【００６０】 その後のノーザン分析はまた、樹状細胞、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ節、脾臓、
胸腺、小腸および子宮組織におけるＤ−ＳＬＡＭ発現を示し、そのパターンは、
造血特異的発現と一致した。発現は、免疫認識に関与する組織において最も高く
、これは、樹状細胞およびＡＰＣにおける富化された発現と一致する。約３．５
ｋｂ〜約４．０ｋｂの単一の一次転写産物が、プロセシングされていないＲＮＡ
前駆体を示すようである７ｋｂ〜９ｋｂの微量の転写産物とともに、観察される
。主な３．５ｋｂ〜４ｋｂの転写産物の発現は、リンパ節、脾臓、胸腺において
最も高く、そしてより低い程度では、小腸においてである。７ｋｂ〜９ｋｂの転
写産物の最大の発現は、子宮において観察される。
【００６１】 ＢＬＡＳＴ分析を用いて、配列番号２が、分泌リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ
）ファミリーのメンバーに相同であることが見出された。特に、配列番号２は、
ＳＬＡＭについてのヒトｍＲＮＡ（登録番号ｇｉ／９８４９６９）（図２）（配
列番号３）の翻訳産物に相同なドメインを含み、以下の保存されたドメインを含
む：（ａ）ほぼアミノ酸２３３〜２５５に位置する推定膜貫通ドメイン；（ｂ）
ほぼアミノ酸２３〜２３２に位置する推定細胞外ドメイン；および（ｃ）ほぼア
ミノ酸２５６〜２８５に位置する推定細胞内ドメイン。Ｄ−ＳＬＡＭのこれらの
ポリペプチドフラグメントは、本発明において特に意図される。ＳＬＡＭ（登録
番号ｇｉ／９８４９６９）は、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化および増殖において
重要であると考えられるので、ＳＬＡＭ（登録番号ｇｉ／９８４９６９）とＤ−
ＳＬＡＭとの間の相同性は、Ｄ−ＳＬＡＭがまた、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化
および増殖に関与し得ることを示唆する。
【００６２】 さらに、コードされるポリペプチドは、ほぼアミノ酸１〜２２に位置する推定
のリーダー配列を有する（図１Ａ〜図１Ｄを参照のこと）。図１Ａ〜図１Ｄにま
た示されるように、推定分泌形態のＤ−ＳＬＡＭは、ほぼアミノ酸２３〜２３２
を含む。Ｄ−ＳＬＡＭのこれらのポリペプチドフラグメントは、本発明において
特に意図される。
【００６３】 配列番号１として同定されるＤ−ＳＬＡＭヌクレオチド配列は、寄託されたク
ローンから得られた、そしていくつかの場合には、さらなる関連のＤＮＡクロー
ンから得られた、部分的な相同な（「重複する」）配列から組み立てられた。重
複する配列は、重複性の高い（通常、各ヌクレオチド位置において３〜５個の重
複配列）単一の連続した配列へと組み立てられて、配列番号１として同定される
最終的な配列となった。
【００６４】 それゆえ、配列番号１および翻訳された配列番号２は、十分に正確であり、そ
してそうでなければ、当該分野において周知の種々の用途および以下でさらに記
載される種々の用途に適切である。例えば、配列番号１は、配列番号１において
含まれる核酸配列または寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡを検出する核酸
ハイブリダイゼーションプローブを設計するために有用である。これらのプロー
ブはまた、生物学的サンプル中の核酸分子にハイブリダイズし、それによって、
本発明の種々の法医学的方法および診断方法を可能にする。同様に、配列番号２
から同定されるポリぺプチドは、Ｄ−ＳＬＡＭに特異的に結合する抗体を作製す
るために使用され得る。
【００６５】 それにもかかわらず、配列決定反応によって作製されるＤＮＡ配列は、配列決
定のエラーを含み得る。このエラーは、作製されたＤＮＡ配列において、誤って
同定されたヌクレオチドとして、またはヌクレオチドの挿入もしくは欠失として
存在する。誤って挿入されたか、または欠失されたヌクレオチドは、推定アミノ
酸配列のリーディングフレームにおいてフレームシフトを引き起こす。これらの
場合において、作製されるＤＮＡ配列が、実際のＤＮＡ配列と９９．９％（例え
ば、１０００塩基を超えるオープンリーディングフレームにおける１塩基の挿入
または欠失）を超えて同一であり得るとしても、推定アミノ酸配列は、実際のア
ミノ酸配列とは異なる。
【００６６】 従って、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における正確さを必要とする適
用のために、本発明は、配列番号１として同定される作製されたヌクレオチド配
列、および配列番号２として同定される推定の翻訳されたアミノ酸配列のみなら
ず、表１において記載されるような、ＡＴＣＣに寄託されたＤ−ＳＬＡＭのヒト
ｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡのサンプルもまた提供する。寄託されたＤ−Ｓ
ＬＡＭクローンに含まれるｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、公知の方法に従って
、寄託されたクローンを配列決定することによって容易に決定され得る。次いで
、推定Ｄ−ＳＬＡＭアミノ酸配列は、このような寄託物から証明され得る。さら
に、寄託されたクローンによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列はまた
、ペプチド配列決定によって、または寄託されたヒトＤ−ＳＬＡＭ ｃＤＮＡを
含む適切な宿主細胞中でタンパク質を発現させ、このタンパク質を収集し、そし
てその配列を決定することによって、直接的に決定され得る。
【００６７】 本発明はまた、配列番号１、配列番号２、または寄託されたクローンに対応す
るＤ−ＳＬＡＭ遺伝子に関する。Ｄ−ＳＬＡＭ遺伝子は、本明細書中に開示され
る配列情報を使用して、公知の方法に従って単離され得る。このような方法は、
開示された配列からプローブまたはプライマーを調製する工程、およびゲノム物
質の適切な供給源からＤ−ＳＬＡＭ遺伝子を同定または増幅する工程を包含する
。
【００６８】 本発明においてまた、Ｄ−ＳＬＡＭの種ホモログが提供される。種ホモログは
、本明細書中に提供される配列から適切なプローブまたはプライマーを作製し、
そして所望のホモログについて適切な核酸供給源をスクリーニングすることによ
って単離および同定され得る。
【００６９】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、任意の適切な様式で調製され得る。このような
ポリペプチドとしては、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え的に生
成されたポリペプチド、合成的に生成されたポリペプチド、またはこれらの方法
の組合せによって生成されたポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチ
ドを調製するための手段は、当該分野で十分に理解される。
【００７０】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、成熟形態を含めて、分泌タンパク質の形態であ
り得るか、または融合タンパク質のような、より大きなタンパク質の一部であり
得る（以下を参照のこと）。分泌配列もしくはリーダー配列、プロ配列、精製を
補助する配列（例えば、複数のヒスチジン残基）、または組換え生成の間の安定
のためのさらなる配列を含む、さらなるアミノ酸配列を含むことは、しばしば有
利である。
【００７１】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そし
て好ましくは実質的に精製される。分泌されたポリペプチドを含めて、Ｄ−ＳＬ
ＡＭポリペプチドの組換え的に生成されたバージョンは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏ
ｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８）に記載される１工程方法
を使用して実質的に精製され得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドはまた、当該分野
で周知の方法において、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質に対して惹起された本発明の抗
体を使用して天然の供給源または組換え供給源から精製され得る。
【００７２】 （ポリヌクレオチド改変体およびポリぺプチド改変体） 「改変体」とは、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはＤ−ＳＬＡＭポリぺプ
チドとは異なるが、それらの必須の特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリ
ぺプチドをいう。一般に、改変体は、全体的に密接に類似し、そして、多くの領
域において、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはＤ−ＳＬＡＭポリぺプチドに
同一である。
【００７３】 本発明の参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」である
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチドのヌク
レオチド配列が、このポリヌクレオチド配列がＤ−ＳＬＡＭポリぺプチドをコー
ドする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を
含み得ることを除いて、参照配列に対して同一であることを意図する。換言すれ
ば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列のヌクレオチドの５％までが、
欠失され得るか、または別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列中
の総ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る
。問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）配列は、配列番号１に示される配列全体、ＯＲＦ（
オープンリーディングフレーム）、または本明細書中で記載されるように指定さ
れる任意のフラグメントであり得る。
【００７４】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９
６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、公知のコンピューター
プログラムを使用して従来通りに決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列
）と対象配列との間の最も良好な全体的な適合性（全体的な配列整列としてもま
た参照される）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ
．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７−２４５）のアルゴリズムに
基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整
列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である。
ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較され得る。この全体的な配列
整列の結果は、同一性パーセントで示される。同一性パーセントを算定するため
にＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは、
以下である：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａ
ｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎ
ｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏ
ｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ
０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ
（どちらかより短い方）。
【００７５】 対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失のためではなく）問い合
わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなければならない。こ
れは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列
の５’切断および３’切断を考慮しないからである。５’末端または３’末端で
切断される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは、
問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されない対象配列の５’
および３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される
。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によ
って決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ
、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定され
、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本
発明の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示されるように
、問い合わせ配列と一致／整列されない、対象配列の５’塩基および３’塩基の
外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定され
る。
【００７６】 例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って
、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１
０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’末端および３’末端で
の塩基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、ＦＡＳ
ＴＤＢプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれ
る。残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０
％である。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と
比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致
／整列しない塩基は対象配列の５’にも３’にも存在しない。この場合、ＦＡＳ
ＴＤＢによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い
合わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’の塩基および３’の塩基のみが手
動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【００７７】 本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であ
るアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列
は、対象ポリぺプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸
あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に同
一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも
９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、対象配列に
おけるアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（消えない（ｉｎｄｅｌｓ））
または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸
配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置で生じ得るか、またはそれら
の末端位置の間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々に、または参照
配列内の１つ以上の連続する群においてのいずれかで、散在される。
【００７８】 実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、配列番号２に示され
るアミノ酸配列または寄託されたＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸
配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、
９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログ
ラムを使用して従来通りに決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対
象配列との間での最良の全体的な一致（全体的配列整列としても参照される）を
決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏ
ｓｃｉ．（１９９０）６：２３７−２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤ
Ｂコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い
合わせ配列および対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは両方と
もアミノ酸配列であるかのいずれかである。上記の全体的配列整列の結果は、同
一性パーセントで示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパ
ラメーターは、以下である：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、
Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２
０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆ
ｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａ
ｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓ
ｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）。
【００７９】 対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問
い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなければならな
い。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する
場合に、対象配列のＮ末端切断およびＣ末端切断を考慮しないからである。Ｎ末
端およびＣ末端で短縮されている対象配列について、問い合わせ配列に対して、
同一性パーセントは、対応する対象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端
およびＣ末端である問い合わせ配列の残基の数を、問い合わせ配列の総塩基のパ
ーセントとして計算することによって補正される。残基が一致／整列されている
か否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパー
セントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムに
よって指定されたパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセント
のスコアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的
で使用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない、対象配列の
Ｎ末端およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整す
る目的のために考慮される。すなわち、問い合わせ残基のみが、対象配列の最も
遠いＮ末端残基およびＣ末端残基の外側に位置する。
【００８０】 例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために
１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そ
してそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示
さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（Ｎ末端およびＣ末端での一致し
ていない残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、それゆえ、ＦＡＳ
ＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差
し引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセント
は９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合
わせ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、それゆえ、問い合
わせ配列と一致／整列しない残基は、対象配列のＮ末端にもＣ末端にも存在しな
い。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補
正されない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致
／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正さ
れる。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【００８１】 Ｄ−ＳＬＡＭ改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方における
変化を含み得る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠失を
生成するが、コードされるポリぺプチドの特性または活性を変化させない変化を
含むポリヌクレオチド改変体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレントな
置換によって生成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、任意の組合
せにおいて５〜１０、１〜５、もしくは１〜２アミノ酸が置換、欠失、または付
加される改変体もまた、好ましい。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド改変体は、種
々の理由（例えば、特定の宿主についてのコドン発現を至適化する（例えば、ヒ
トｍＲＮＡにおけるコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌宿主によって好ましい
コドンに変化させ得る））のために、生成され得る。
【００８２】 天然に存在するＤ−ＳＬＡＭ改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、そし
て生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態の
うちの１つをいう。（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編，Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子
改変体は、ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリぺプチドレベルのいずれ
かで変化し得る。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発技術によって
または直接的な合成によって生成され得る。
【００８３】 タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、改変体は、
Ｄ−ＳＬＡＭポリぺプチドの特徴を改善または変化させるために作製され得る。
例えば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実質的な欠損を伴わずに、分泌
タンパク質のＮ末端またはＣ末端から欠失され得る。Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３）の著者らは、アミノ末端の
３、８、または２７個のアミノ酸残基を欠失させた後でさえもヘパリン結合活性
を有する改変体ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンγは、
このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させた後
、１０倍までのより高い活性を示した（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８））。
【００８４】 さらに、豊富な証拠は、改変体が、天然に存在するタンパク質の生物学的活性
に類似する生物学的活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Ｇａｙｌ
ｅおよび共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２１０５−２２１
１１（１９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる変異分析
を行った。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって１改
変体当たり平均２．５アミノ酸の変化になる、３，５００個を超える個々のＩＬ
−１ａ変異体を作製した。複数の変異が、全ての可能なアミノ酸位置で試験され
た。この研究者らは、「分子の大部分は、［結合活性または生物学的活性］のい
ずれに対してもほとんど影響を伴わないで変更され得る」ことを見出した。（要
約を参照のこと）。実際、試験された３，５００個を超えるヌクレオチド配列の
うち、わずか２３個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタン
パク質を生成した。
【００８５】 さらに、ポリぺプチドのＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失
が、１つ以上の生物学的機能の改変または欠失を生じたとしても、他の生物学的
活性はなお保持され得る。例えば、分泌形態を認識する抗体を誘導および／また
は結合する、欠失改変体の能力は、分泌形態の大多数より少ない残基が、Ｎ末端
またはＣ末端から除去される場合に保持されるようである。タンパク質のＮ末端
またはＣ末端の残基を欠損する特定のポリぺプチドが、このような免疫原性活性
を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、およびそうでなけ
れば当該分野において公知の慣用的な方法によって容易に決定され得る。
【００８６】 従って、本発明はさらに、実質的な生物学的活性を示すＤ−ＳＬＡＭポリぺプ
チド改変体を含む。このような改変体としては、活性に対する影響をほとんど有
さないように、当該分野において公知の一般的な法則に従って選択される、欠失
、挿入、逆位、反復、および置換が挙げられる。
【００８７】 本出願は、本明細書中で開示される核酸配列（例えば、配列番号２のｍ〜ｎと
して以下に開示されるＮ末端欠失および／またはＣ末端欠失のアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードする）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、
９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の核酸分子に関し、
それらがＤ−ＳＬＡＭの機能活性を有するポリペプチドをコードするか否かに無
関係である。なぜならば、特定の核酸分子が、Ｄ−ＳＬＡＭの機能活性を有する
ポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、核酸分子を（例えば、ハイ
ブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー
として）使用する方法をなお知っているからである。Ｄ−ＳＬＡＭの機能活性を
有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用は、特に、以下を包
含する：（１）ｃＤＮＡライブラリーにおけるＤ−ＳＬＡＭ遺伝子またはその対
立遺伝子改変体もしくはそのスプライス改変体を単離する工程；（２）Ｖｅｒｍ
ａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓ
ｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ（１９８８）に記載されるように、Ｄ−ＳＬＡＭ遺伝子の正確な染色体位置を
提供する中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）にインサイチュハイブリダイゼ
ーションする工程（例えば「ＦＩＳＨ」）；および（３）特定の組織におけるＤ
−ＳＬＡＭのｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析。
【００８８】 しかし、本明細書中で開示される核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％
、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を
有する核酸分子が好ましく、これらの核酸分子は、実際に、Ｄ−ＳＬＡＭの機能
活性を有するポリペプチドをコードする。「Ｄ−ＳＬＡＭの機能的活性を有する
ポリペプチド」とは、例えば、特定の免疫アッセイまたは生物学的アッセイにお
いて測定した場合に、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチド（例えば、完全（全長
）Ｄ−ＳＬＡＭ、成熟Ｄ−ＳＬＡＭおよび可溶性Ｄ−ＳＬＡＭ（例えば、Ｄ−Ｓ
ＬＡＭの細胞外ドメインに含まれる配列を有する））の機能的活性と類似するが
必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドを意図する。例えば、Ｄ−ＳＬＡ
Ｍの機能的活性は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドがＤ−ＳＬＡＭリガンドに結合す
る能力を測定することによって慣用的に決定され得る。Ｄ−ＳＬＡＭの機能的活
性はまた、ポリペプチド（例えば、遊離しているかまたは細胞表面で発現された
同族リガンド）が、このポリペプチドを発現する細胞を誘導する能力を決定する
ことによって測定され得る。
【００８９】 当然のことながら、遺伝コードの縮重に起因して、例えば、寄託されたｃＤＮ
Ａの核酸配列、図１（配列番号１）中に示される核酸配列またはそれらのフラグ
メントに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、
９７％、９８％または９９％同一の配列を有する多数の核酸分子が、「Ｄ−ＳＬ
ＡＭの機能活性を有する」ポリペプチドをコードするということを、当業者は、
直ちに理解する。実際に、これらのヌクレオチド配列のいずれかの縮重改変体す
べてが、同じポリぺプチドをコードするので、多くの場合、このことは、上記の
比較アッセイを実行しなくても、当業者に明らかである。縮重改変体でないよう
な核酸分子について、合理的な数がまた、Ｄ−ＳＬＡＭの機能活性を有するポリ
ペプチドをコードすることが、当該分野でさらに理解される。なぜならば、当業
者が、さらに以下に記載されるように、タンパク質の機能にそれほど有意に影響
を与えそうにないかまたは機能に有意に影響を与えそうにないアミノ酸置換（例
えば、１つの脂肪族アミノ酸を第２の脂肪族アミノ酸で置換すること）を完全に
知っているからである。
【００９０】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する指針は
、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１
９９０）において提供され、ここで、著者らは変化に対するアミノ酸配列の寛容
性を研究するための２つの主要なストラテジーがあることを指摘する。
【００９１】 第１のストラテジーは、進化の過程の間の自然選択によるアミノ酸置換の寛容
を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較して、保存されるアミノ酸が
同定され得る。これらの保存されるアミノ酸は、タンパク質の機能について重要
であるようである。対照的に、置換が自然の選択によって寛容されたアミノ酸の
位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないことを示す。従って、
アミノ酸置換を寛容する位置は、タンパク質の生物学的活性をなおも維持しなが
ら、改変され得る。
【００９２】 第２のストラテジーは、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クロ
ーン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を
使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（
分子中のあらゆる残基での１つのアラニン変異の導入）が、使用され得る。（Ｃ
ｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１
０８５（１９８９））。次いで、得られた変異分子は生物学的活性について試験
され得る。
【００９３】 著者らが言及するように、これらの２つのストラテジーは、タンパク質がアミ
ノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミ
ノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示
す。例えば、（タンパク質の三次構造内に）ほとんど埋もれているアミノ酸残基
は、非極性側鎖を必要とし、一方、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存され
ない。さらに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ
酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基であ
るＳｅｒおよびＴｈｒの置換；酸性残基であるＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミ
ド残基であるＡｓｎおよびＧｌｎの置換、塩基性残基であるＬｙｓ、Ａｒｇ、お
よびＨｉｓの置換；芳香族残基であるＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、な
らびに小さなサイズのアミノ酸であるＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、および
Ｇｌｙの置換を含む。
【００９４】 例えば、Ｄ−ＳＬＡＭのアミノ酸レベルでの部位特異的変化は、特定のアミノ
酸を、保存的アミノ酸で置換することによって、なされ得る。好ましい保存的変
異としては、以下が挙げられる：Ｍ１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置
換される）；Ｖ２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｍ３（
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ｒ４（Ｈ、またはＫで置換
される）；Ｌ６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｗ７（Ｆ
、またはＹで置換される）；Ｓ８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換さ
れる）；Ｌ９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ１０（Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ１１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｗ１２（Ｆ、またはＹで置換される）；Ｅ１３
（Ｄで置換される）；Ａ１４（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される
）；Ｌ１５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ１６（Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｉ１８（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換される）；Ｔ１９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置
換される）；Ｖ２０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｔ２
１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｇ２２（Ａ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ２３（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換される）；Ｑ２４（Ｎで置換される）；Ｖ２５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｌ２６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換される）；Ｓ２７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｋ
２８（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｖ２９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、または
Ｍで置換される）；Ｇ３０（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）
；Ｇ３１（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ３２（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ３３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、またはＭで置換される）；Ｌ３４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
される）；Ｌ３５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ３６
（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ａ３７（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ３８（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖで置換される）；Ｒ３９（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｇ４２（Ａ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｆ４３（Ｗ、またはＹで置換される）
；Ｑ４４（Ｎで置換される）；Ｖ４５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置
換される）；Ｒ４６（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｅ４７（Ｄで置換される）
；Ａ４８（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｉ４９（Ａ、Ｇ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｗ５０（Ｆ、またはＹで置換され
る）；Ｒ５１（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｓ５２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ
、またはＶで置換される）；Ｌ５３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
される）；Ｗ５４（Ｆ、またはＹで置換される）；Ｓ５６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｅ５７（Ｄで置換される）；Ｅ５８（Ｄで置換
される）；Ｌ５９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ６０
（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ６１（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｔ６２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、または
Ｖで置換される）；Ｆ６３（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｆ６４（Ｗ、または
Ｙで置換される）；Ｒ６５（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｇ６６（Ａ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ６７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶで置換される）；Ｌ６８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｅ６９（Ｄで置換される）；Ｔ７０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶ
で置換される）；Ｌ７１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；
Ｙ７２（Ｆ、またはＷで置換される）；Ｈ７３（Ｋ、またはＲで置換される）；
Ｓ７４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｒ７５（Ｈ、また
はＫで置換される）；Ｆ７６（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｌ７７（Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｇ７８（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
またはＶで置換される）；Ｒ７９（Ｈ、またはＫで置換される）；Ａ８０（Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｑ８１（Ｎで置換される）；Ｌ
８２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｈ８３（Ｋ、または
Ｒで置換される）；Ｓ８４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）
；Ｎ８５（Ｑで置換される）；Ｌ８６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換される）；Ｓ８７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ８
８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｅ８９（Ｄで置換され
る）；Ｌ９０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｇ９１（Ａ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ９３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｅ９４（Ｄで置換される）；Ｓ９５（Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｇ９６（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
またはＶで置換される）；Ｄ９７（Ｅで置換される）；Ｓ９８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｇ９９（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖで置換される）；Ｎ１００（Ｑで置換される）；Ｆ１０１（Ｗ、またはＹで置
換される）；Ｓ１０２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ
１０３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｌ１０４（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｍ１０５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、またはＶで置換される）；Ｖ１０６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで
置換される）；Ｄ１０７（Ｅで置換される）；Ｔ１０８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｍ、またはＶで置換される）；Ｒ１０９（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｇ１１
０（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｑ１１１（Ｎで置換さ
れる）；Ｗ１１３（Ｆ、またはＹで置換される）；Ｔ１１４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｑ１１５（Ｎで置換される）；Ｔ１１６（Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ１１７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｑ１１８（Ｎで置換される）；Ｌ１１９（Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｋ１２０（Ｈ、またはＲで置
換される）；Ｖ１２１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｙ
１２２（Ｆ、またはＷで置換される）；Ｄ１２３（Ｅで置換される）；Ａ１２４
（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ１２５（Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｒ１２７（Ｈ、またはＫで置換される）
；Ｖ１２９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｖ１３０（Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｑ１３１（Ｎで置換される）
；Ｖ１３２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｆ１３３（Ｗ
、またはＹで置換される）；Ｉ１３４（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換される）；Ａ１３５（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ
１３６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｅ１３７（Ｄで置
換される）；Ｒ１３８（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｄ１３９（Ｅで置換され
る）；Ａ１４０（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｑ１４１
（Ｎで置換される）；Ｓ１４３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｋ１４４（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｔ１４５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｑ１４７（Ｎで置換される）；Ｖ１４８（Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｆ１４９（Ｗ、またはＹで置換
される）；Ｌ１５０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ１
５１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｗ１５３（Ｆ、また
はＹで置換される）；Ａ１５４（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｎ１５６（Ｑで置換される）；Ｉ１５７（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換される）；Ｓ１５８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｅ１５９（Ｄで置換される）；Ｉ１６０（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換される）；Ｔ１６１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｙ１６２（Ｆ、またはＷで置換される）；Ｓ１６３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｗ１６４（Ｆ、またはＹで置換される）；Ｒ１
６５（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｒ１６６（Ｈ、またはＫで置換される）；
Ｅ１６７（Ｄで置換される）；Ｔ１６８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで
置換される）；Ｔ１６９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；
Ｍ１７０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ｄ１７１（Ｅで
置換される）；Ｆ１７２（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｇ１７３（Ａ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｍ１７４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
またはＶで置換される）；Ｅ１７５（Ｄで置換される）；Ｈ１７７（Ｋ、または
Ｒで置換される）；Ｓ１７８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される
）；Ｌ１７９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｆ１８０（
Ｗ、またはＹで置換される）；Ｔ１８１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで
置換される）；Ｄ１８２（Ｅで置換される）；Ｇ１８３（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換される）；Ｑ１８４（Ｎで置換される）；Ｖ１８５（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｌ１８６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ１８７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで
置換される）；Ｉ１８８（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；
Ｓ１８９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ１９０（Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｇ１９１（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｇ１９３（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
で置換される）；Ｄ１９４（Ｅで置換される）；Ｒ１９５（Ｈ、またはＫで置換
される）；Ｄ１９６（Ｅで置換される）；Ｖ１９７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
またはＭで置換される）；Ａ１９８（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換
される）；Ｙ１９９（Ｆ、またはＷで置換される）；Ｓ２００（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｉ２０２（Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、また
はＶで置換される）；Ｖ２０３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換され
る）；Ｓ２０４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｎ２０５
（Ｑで置換される）；Ｖ２０７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換され
る）；Ｓ２０８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｗ２０９
（Ｆ、またはＹで置換される）；Ｄ２１０（Ｅで置換される）；Ｌ２１１（Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ２１２（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｔ２１３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶ
で置換される）；Ｖ２１４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）
；Ｔ２１５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｗ２１７（Ｆ
、またはＹで置換される）；Ｄ２１８（Ｅで置換される）；Ｓ２１９（Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｈ２２１（Ｋ、またはＲで置換され
る）；Ｈ２２２（Ｋ、またはＲで置換される）；Ｅ２２３（Ｄで置換される）；
Ａ２２４（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ａ２２５（Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｇ２２７（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｋ２２８（Ｈ、またはＲで置換される）；Ａ２
２９（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｓ２３０（Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｙ２３１（Ｆ、またはＷで置換され
る）；Ｋ２３２（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｄ２３３（Ｅで置換される）；
Ｖ２３４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｌ２３５（Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ２３６（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ２３７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭ
で置換される）；Ｖ２３８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）
；Ｖ２３９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｖ２４１（Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｓ２４２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｌ２４３（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖで置換される）；Ｌ２４４（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される
）；Ｌ２４５（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｍ２４６（
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶで置換される）；Ｌ２４７（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｖ２４８（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、また
はＭで置換される）；Ｔ２４９（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換され
る）；Ｌ２５０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｆ２５１
（Ｗ、またはＹで置換される）；Ｓ２５２（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
で置換される）；Ａ２５３（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）
；Ｗ２５４（Ｆ、またはＹで置換される）；Ｈ２５５（Ｋ、またはＲで置換され
る）；Ｗ２５６（Ｆ、またはＹで置換される）；Ｓ２６０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ
、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｇ２６１（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
で置換される）；Ｋ２６２（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｋ２６３（Ｈ、また
はＲで置換される）；Ｋ２６４（Ｈ、またはＲで置換される）；Ｋ２６５（Ｈ、
またはＲで置換される）；Ｄ２６６（Ｅで置換される）；Ｖ２６７（Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｈ２６８（Ｋ、またはＲで置換される
）；Ａ２６９（Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｄ２７０（
Ｅで置換される）；Ｒ２７１（Ｈ、またはＫで置換される）；Ｖ２７２（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｇ２７３（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶで置換される）；Ｅ２７５（Ｄで置換される）；Ｔ２７６（Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶで置換される）；Ｅ２７７（Ｄで置換される）；Ｎ
２７８（Ｑで置換される）；Ｌ２８０（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置
換される）；Ｖ２８１（Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭで置換される）；Ｑ
２８２（Ｎで置換される）；Ｄ２８３（Ｅで置換される）；Ｌ２８４（Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶで置換される）。
【００９５】 得られる構築物は、本明細書の全体にわたって記載される活性または機能、お
よび当該分野で公知の活性または機能について慣用的にスクリーニングされ得る
。好ましくは、得られる構築物は、増加したＤ−ＳＬＡＭの活性または機能を有
するが、残存するＤ−ＳＬＡＭの活性または機能は維持される。より好ましくは
、得られる構築物は、１つより多くの増加したＤ−ＳＬＡＭの活性または機能を
有するが、残存するＤ−ＳＬＡＭの活性または機能は維持される。
【００９６】 保存的なアミノ酸置換に加えて、Ｄ−ＳＬＡＭの改変体は、（ｉ）１つ以上の
非保存的なアミノ酸残基での置換（ここで、置換されるアミノ酸残基は、遺伝コ
ードによってコードされるアミノ酸残基であってもよく、もしくはそうでなくて
もよい）、または（ｉｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基での置換、ま
たは（ｉｉｉ）別の化合物（例えば、ポリぺプチドの安定性および／もしくは溶
解度を増加するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール））との成熟ポ
リぺプチドの融合、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融
合領域ペプチド、またはリーダーもしくは分泌配列、または精製を容易にする配
列）とのポリぺプチドの融合を含む。このような改変体ポリぺプチドは、本明細
書中の教示から、当業者の範囲内であると考えられる。
【００９７】 例えば、他の荷電されたアミノ酸または中性のアミノ酸での荷電されたアミノ
酸のアミノ酸置換を含むＤ−ＳＬＡＭポリぺプチド改変体は、改善された特性（
例えば、より少ない凝集性）を有するポリペプチドを生成し得る。薬学的処方物
の凝集は、凝集体の免疫原活性に起因して、活性の減少およびクリアランスの増
加の両方をもたらす。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ
３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３
０７−３７７（１９９３））。
【００９８】 例えば、Ｄ−ＳＬＡＭの好ましい非保存的な置換として、以下が挙げられる：
Ｍ１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｖ２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｍ３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｒ４（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｌ６（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｗ７（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｓ８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｌ９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｌ１０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｌ１１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｗ１２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ１３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ａ１４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｌ１５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｌ１６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｐ１７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｉ１８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ２０（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ２１（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ２２（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２３
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ
２４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｖ２５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ２６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ２７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ２８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ２９（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ３０
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ
３１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｓ３２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｖ３３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｌ３４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｌ３５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｖ３６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ａ３７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ａ３８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ３９（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ４０（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで
置換される）；Ｐ４１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｇ４２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ４３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｑ４４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ４５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ４６（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ４７（Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ａ４８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｉ４９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｗ５０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ５１（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ
５２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｌ５３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｗ５４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ５５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｓ５６（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ５７
（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｅ５８（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ５９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ６０（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ６１（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ６２（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ６３
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｆ６４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ６５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ６６
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ
６７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｌ６８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｅ６９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ７０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ７１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ７２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｈ７３
（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｓ７４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｒ７５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ７６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ
７７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｇ７８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｒ７９（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ８０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ８１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ８２（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｈ８３
（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｓ８４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｎ８５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ８６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ８７（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ８８（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ８９（Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｌ９０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｇ９１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｐ９２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｌ９３（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ９４（Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｓ９５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｇ９６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｄ９７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ９８（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ９９（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ１００（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｆ１０１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１０２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ１０３（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ１０４（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｍ１０５
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ
１０６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｄ１０７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１０８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ１０９（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ１１
０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｑ１１１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ１１２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｗ１１３
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｔ１１４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｑ１１５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ１１６（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ１１７（Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ１１
８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｌ１１９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ１２０（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ１２１（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ１２２（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｄ１２３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ１２４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ１２５（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ１２６（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、また
はＣで置換される）；Ｒ１２７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ１２８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換さ
れる）；Ｖ１２９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｖ１３０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｑ１３１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ１３２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ１３３（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｉ１３４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ａ１３５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｖ１３６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ１３７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ１３８（Ｄ、
Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｄ１３９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ１４０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ１４１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｐ１４２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｓ１４３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ１４４（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｔ１４５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｃ１４６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｑ１４７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ
１４８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｆ１４９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ１５０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１５１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ１５２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される
）；Ｗ１５３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ１５４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ１５５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｎ
１５６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｉ１５７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１５８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ１５９（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｉ
１６０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｔ１６１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｙ１６２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１６３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｗ１６４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ１
６５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｒ１６６（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ１６７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｔ１６８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｔ１６９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｍ１７０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換される）；Ｄ１７１（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ１７２（Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｇ１７３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｍ１７４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換される）；Ｅ１７５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ１７６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置
換される）；Ｈ１７７（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１７８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ１７９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｆ１８０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｔ１８１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｄ１８２（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ１８３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｑ１８４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される
）；Ｖ１８５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｌ１８６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｓ１８７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｉ１８８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ１８９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ１９０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ１９１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ１９２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換さ
れる）；Ｇ１９３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換される）；Ｄ１９４（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｒ１９５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ
１９６（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ１９７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ１９８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｙ１９９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ２０
０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｃ２０１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｉ２０２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ２０３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ２０４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｎ２０５（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｐ２０６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｖ２０７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ２０８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｗ２０９（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｄ２１０（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ２１１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２１２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ２１３（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ２１４（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ２１５
（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ
２１６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｗ２１７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ２１８（Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｓ２１９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｃ２２０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換される）；Ｈ２２１（Ｄ、Ｅ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
される）；Ｈ２２２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ２２３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２２
４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ａ２２５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｐ２２６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｇ２２７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ２２８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ａ２２９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｓ２３０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｙ２３１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ２３２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ２３３
（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｖ２３４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ２３５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ２３６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ２３７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ２３８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ２３９（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ２４０（Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、また
はＣで置換される）；Ｖ２４１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｓ２４２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ２４３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ２４４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ２４５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｍ２４６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ２４７（Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ２４８（
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ２
４９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｌ２５０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｆ２５１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｓ２５２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２５３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｗ２５４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｈ２５５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換される）；Ｗ２５６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｃ２５７（Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで
置換される）；Ｐ２５８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｃ２５９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換
される）；Ｓ２６０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換される）；Ｇ２６１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換される）；Ｋ２６２（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ２６３（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｋ２６４（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換される）；Ｋ２６５（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ２６６（Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換される）；Ｖ２６７（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換される）；Ｈ２６８（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ａ２６９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ２７０（Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れる）；Ｒ２７１（Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｖ２７２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｇ２７３（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ２７４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換さ
れる）；Ｅ２７５（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｔ２７６（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｅ２７７（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）
；Ｎ２７８（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｐ２７９（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）；Ｌ２８
０（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｖ２８１（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
る）；Ｑ２８２（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｄ２８３（Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；Ｌ２８
４（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換される）；
Ｐ２８５（Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換される）。
【００９９】 得られる構築物は、本明細書の全体にわたって記載された、および当該分野に
おいて公知の活性または機能を慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、
得られる構築物は、残存しているＤ−ＳＬＡＭ活性またはＤ−ＳＬＡＭ機能が維
持される一方、Ｄ−ＳＬＡＭ活性またはＤ−ＳＬＡＭ機能が損失している。さら
に好ましくは、得られる構築物は、残存しているＤ−ＳＬＡＭ活性またはＤ−Ｓ
ＬＡＭ機能が維持される一方、１つより多くのＤ−ＳＬＡＭ活性またはＤ−ＳＬ
ＡＭ機能が損失している。
【０１００】 さらに、１つより多くのアミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９
および１０）を、上記されたような置換アミノ酸（保存されたアミノ酸か、また
は保存されていないアミノ酸のどちらか）で置換し得る。
【０１０１】 本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、５０
アミノ酸置換を超えず、さらにより好ましくは、４０アミノ酸置換を超えず、な
おより好ましくは、３０アミノ酸置換を超えず、そしてなおさらにより好ましく
は、２０アミノ酸置換を超えないアミノ酸配列を有するＤ−ＳＬＡＭポリペプチ
ドのアミノ酸配列を含むかまたはこのアミノ酸配列からなるポリペプチドに関す
る。当然、好ましさの増大する順番に、ペプチドまたはポリペプチドが、少なく
とも１個のアミノ酸置換を含むが、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、ま
たは１個のアミノ酸置換を超えないＤ−ＳＬＡＭポリペプチドのアミノ酸配列を
含むかまたはこのアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有することは非常に好ま
しい。特定の実施形態において、図１Ａ〜１Ｄのアミノ酸配列またはそのフラグ
メント（例えば、本明細書に記載の成熟形態および／または他のフラグメント）
における付加、置換、および／または欠失の数は、１〜５、５〜１０、５〜２５
、５〜５０、１０〜５０、または５０〜１５０であり、保存的アミノ酸置換が好
ましい。
【０１０２】 （ポリヌクレオチドおよびポリペプチドフラグメント） 本発明は、さらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメン
トに関する。例えば、寄託されたｃＤＮＡ（クローンＨＤＰＪＯ３９）のヌクレ
オチド配列、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド配列をコー
ドするヌクレオチド配列、図１に示すポリペプチド配列（配列番号２）をコード
するヌクレオチド配列、図１に示すヌクレオチド配列（配列番号１）、またはこ
れらに対する相補鎖を有する、単離された核酸分子のフラグメントによって、少
なくとも１５ｎｔ長、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ長、なおより
好ましくは少なくとも３０ｎｔ長、そしてさらにより好ましくは、少なくとも約
４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３２５、３５０、３７
５、４００、４５０、５００、５５０、または６００ｎｔ長のフラグメントが意
図される。これらのフラグメントは、本明細書中で議論するような診断プローブ
およびプライマーが挙げられるがこれらに限定されない、多数の用途を有する。
もちろん、より大きなフラグメント（例えば、５０１〜１５００ｎｔ長のフラグ
メント）もまた、本発明に従って、有用である。なぜなら、寄託されたｃＤＮＡ
（クローンＨＤＰＪＯ３９）または図１（配列番号１）に示すようなヌクレオチ
ド配列の（全てでなければ）大部分に対応するフラグメントであるからである。
例えば、少なくとも２０ｎｔ長のフラグメントによって、例えば、寄託されたｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列、または図１（配列番号１）に示すようなヌクレオチ
ド配列由来の、２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。
【０１０３】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭのポリヌクレオチドフラグメントの代表的な例としては
、例えば、以下のおおよそのヌクレオチド数の配列を有するフラグメントまたは
それに対する相補鎖、あるいは寄託されたクローン中に含まれるｃＤＮＡが挙げ
られる：１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜
２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、
４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６５１〜７００、７０１〜
７５０、７５１〜８００、８００〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、
９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、１１０１〜１１
５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１３００、１３０
１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４５１〜１５００
、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５０、１６５１〜
１７００、１７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、１８０１〜１８５０、１
８５１〜１９００、１９０１〜１９５０、１９５１〜２０００および／または２
００１から配列番号１の末端。この文脈において、「おおよそ（約）」は、特に
記載された範囲、またはいずれかの末端もしくは両方の末端において、これより
数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きい範囲かまたは小さ
な範囲を含む。
【０１０４】 好ましくは、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、Ｄ−ＳＬＡＭ機能的
活性を示すポリペプチドをコードする。Ｄ−ＳＬＡＭ「機能的活性」を示すポリ
ペプチドによって、全長（完全）Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質に関連する１つ以上の
既知の機能的活性を示し得る、ポリペプチドを意味する。このような機能的活性
としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：生物学的活性、抗原性
［抗Ｄ−ＳＬＡＭ抗体に結合する（または結合に関してＤ−ＳＬＡＭポリペプチ
ドと競合する）能力］、免疫原性（Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドに結合する抗体を
生成する能力）、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドと多量体を形成する能力、
およびＤ−ＳＬＡＭポリペプチドに対するレセプターまたはリガンドと結合する
能力。
【０１０５】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド、およびそのフラグメント、改変体、誘導体、およ
びアナログの機能的活性は、種々の方法によって、アッセイされ得る。
【０１０６】 例えば、全長Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドを結合する能力、または抗Ｄ−ＳＬＡ
Ｍ抗体との結合に関して全長Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドと競合する能力をアッセ
イする、１つの実施形態においては、当該分野において公知の種々のイムノアッ
セイが使用され得る。このようなアッセイとしては、放射免疫アッセイ、ＥＬＩ
ＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射
分析アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセ
イ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタン
ブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッ
セイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および
免疫電気泳動アッセイなどのような技術を用いる競合および非競合アッセイ系が
挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、抗体結合が、一次
抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態では、この一次
抗体は、この一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合を検出することによっ
て検出される。さらなる実施形態では、この二次抗体が標識される。免疫アッセ
イにおける結合の検出のための多くの手段が、当該分野で公知であり、そして本
発明の範囲内である。
【０１０７】 Ｄ−ＳＬＡＭリガンドが同定されるか、または本発明のポリペプチドフラグメ
ント、改変体、または誘導体が多量体化する能力が評価される、別の実施形態で
は、結合が、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質ア
フィニティークロマトグラフィー、ならびにアフィニティーブロッティングのよ
うな当該分野で周知の手段によって、アッセイされ得る。 一般的には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ，Ｅ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：
９４−１２３を参照のこと。別の実施形態において、その基質に結合するＤ−Ｓ
ＬＡＭの生理学的な相関（シグナル伝達）がアッセイされ得る。
【０１０８】 さらに、本明細書中に記載されるアッセイ（実施例を参照のこと）およびさも
なくば当該分野で公知のアッセイが、慣用的に、Ｄ−ＳＬＡＭのポリペプチドな
らびにそのフラグメント、改変体、誘導体、およびアナログの、Ｄ−ＳＬＡＭ関
連生物学的活性（インビトロまたはインビボのいずれかにおいて）を誘発する能
力を測定するために適用され得る。他の方法は、当業者に公知であり、そして本
発明の範囲にある。
【０１０９】 本発明はさらに、本明細書中に記載されるＤ−ＳＬＡＭポリペプチドのフラグ
メントに関する。例えば、寄託されたｃＤＮＡ（クローンＨＤＰＪＯ３９）によ
ってコードされる単離されたＤ−ＳＬＡＭポリペプチドのフラグメントによって
、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド配列、図１に示される
ポリペプチド配列（配列番号２）が、配列番号２に含まれるポリペプチドフラグ
メントまたは寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリ
ペプチドフラグメントを含むことを意図する。タンパク質フラグメントは、「自
立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であり得るか、あるいはより大きなポ
リぺプチド内（そのフラグメントが、部分または領域を（最も好ましくは単一の
連続した領域として）形成する）に含まれ得る。本発明のポリペプチドフラグメ
ントの代表的な例としては、例えば、以下のおおよそのアミノ酸数を含む：１〜
２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０２〜１２０、
１２１〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜
２２０、２２１〜２４０、２４１〜２６０、２６１〜２８０、または２８１から
コード領域の末端まで。さらに、ポリペプチドフラグメントは、少なくとも２０
、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３
０、１４０、または１５０アミノ酸の長さであり得る。この文脈において、「約
（おおよそ）」とは、特に記載された範囲、いずれかの末端もしくは両方の末端
において、これより数個（５、４、３、２、または１）のアミノ酸だけ大きいか
または小さな範囲または値を含む。
【０１１０】 １以上のアミノ酸の、タンパク質のＮ末端からの欠失が、このタンパク質の１
以上の生物学的機能の欠失という改変を生じたとしても、他の機能活性（例えば
、生物学的活性、多量体化する能力、Ｄ−ＳＬＡＭリガンドを結合する能力）は
なお、維持され得る。例えば、ポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識す
る抗体を誘導および／またはこれに結合する短縮化Ｄ−ＳＬＡＭムテインの能力
は、完全ポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの過半数の残基より少ない残基が
、Ｎ末端から除去される場合、一般に維持される。完全ポリペプチドのＮ末端残
基を欠失する特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を維持するか否か
は、本明細書中で記載されるかそうでなければ当該分野で公知の慣用的な方法に
よって容易に決定され得る。多くの欠失されたＮ末端アミノ酸残基を有するＤ−
ＳＬＡＭムテインが、幾らかの生物学的活性または免疫学的活性を維持し得るこ
とは、ありそうにないわけではない。実際に、わずか６Ｄ−ＳＬＡＭアミノ酸残
基から構成されるペプチドは、しばしば、免疫応答を引き起こし得る。
【０１１１】 従って、ポリペプチドフラグメントは、分泌Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質ならびに
成熟形態を含む。さらに好ましいポリペプチドフラグメントは、アミノ末端また
はカルボキシ末端あるいはその両方から残基を欠失された連続した一連の残基を
有する分泌Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質または成熟形態を含む。例えば、１〜６０の
範囲の任意の数のアミノ酸は、分泌Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたは成熟形態の
いずれかのアミノ末端から欠失され得る。同様に、１〜３０の範囲の任意の数の
アミノ酸は、分泌Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質または成熟形態のカルボキシ末端から
欠失され得る。さらに、上記のアミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失の任意
の組合せが、好ましい。同様に、これらのＤ−ＳＬＡＭポリペプチドフラグメン
トをコードするポリヌクレオチドもまた、好ましい。本願はまた、上に記載され
るＤ−ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８
０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％
同一であるポリヌクレオチドを含むかあるいはこれらからなる核酸分子に関する
。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合された上記のポリヌクレオチ
ド配列を包含する。これらの核酸および／またはポリヌクレオチド配列によって
コードされるポリペプチドもまた本発明に含まれ、これは、上記アミノ酸配列と
少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％
または９９％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはこれらからなるポリペプチ
ドならびにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【０１１２】 詳細には、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドのＮ末端欠失は、一般式ｍ−２８５によ
って記載され得、ここで、ｍは、２〜２８０の整数であり、ここでｍは、配列番
号２において同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。さらに詳細には、本発
明は、以下の残基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかあるいはこれ
らからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：配列番号２
のＶ−２〜Ｐ−２８５；Ｍ−３〜Ｐ−２８５；Ｒ−４〜Ｐ−２８５；Ｐ−５〜Ｐ
−２８５；Ｌ−６〜Ｐ−２８５；Ｗ−７〜Ｐ−２８５；Ｓ−８〜Ｐ−２８５；Ｌ
−９〜Ｐ−２８５；Ｌ−１０〜Ｐ−２８５；Ｌ−１１〜Ｐ−２８５；Ｗ−１２〜
Ｐ−２８５；Ｅ−１３〜Ｐ−２８５；Ａ−１４〜Ｐ−２８５；Ｌ−１５〜Ｐ−２
８５；Ｌ−１６〜Ｐ−２８５；Ｐ−１７〜Ｐ−２８５；Ｉ−１８〜Ｐ−２８５；
Ｔ−１９〜Ｐ−２８５；Ｖ−２０〜Ｐ−２８５；Ｔ−２１〜Ｐ−２８５；Ｇ−２
２〜Ｐ−２８５；Ａ−２３〜Ｐ−２８５；Ｑ−２４〜Ｐ−２８５；Ｖ−２５〜Ｐ
−２８５；Ｌ−２６〜Ｐ−２８５；Ｓ−２７〜Ｐ−２８５；Ｋ−２８〜Ｐ−２８
５；Ｖ−２９〜Ｐ−２８５；Ｇ−３０〜Ｐ−２８５；Ｇ−３１〜Ｐ−２８５；Ｓ
−３２〜Ｐ−２８５；Ｖ−３３〜Ｐ−２８５；Ｌ−３４〜Ｐ−２８５；Ｌ−３５
〜Ｐ−２８５；Ｖ−３６〜Ｐ−２８５；Ａ−３７〜Ｐ−２８５；Ａ−３８〜Ｐ−
２８５；Ｒ−３９〜Ｐ−２８５；Ｐ−４０〜Ｐ−２８５；Ｐ−４１〜Ｐ−２８５
；Ｇ−４２〜Ｐ−２８５；Ｆ−４３〜Ｐ−２８５；Ｑ−４４〜Ｐ−２８５；Ｖ−
４５〜Ｐ−２８５；Ｒ−４６〜Ｐ−２８５；Ｅ−４７〜Ｐ−２８５；Ａ−４８〜
Ｐ−２８５；Ｉ−４９〜Ｐ−２８５；Ｗ−５０〜Ｐ−２８５；Ｒ−５１〜Ｐ−２
８５；Ｓ−５２〜Ｐ−２８５；Ｌ−５３〜Ｐ−２８５；Ｗ−５４〜Ｐ−２８５；
Ｐ−５５〜Ｐ−２８５；Ｓ−５６〜Ｐ−２８５；Ｅ−５７〜Ｐ−２８５；Ｅ−５
８〜Ｐ−２８５；Ｌ−５９〜Ｐ−２８５；Ｌ−６０〜Ｐ−２８５；Ａ−６１〜Ｐ
−２８５；Ｔ−６２〜Ｐ−２８５；Ｆ−６３〜Ｐ−２８５；Ｆ−６４〜Ｐ−２８
５；Ｒ−６５〜Ｐ−２８５；Ｇ−６６〜Ｐ−２８５；Ｓ−６７〜Ｐ−２８５；Ｌ
−６８〜Ｐ−２８５；Ｅ−６９〜Ｐ−２８５；Ｔ−７０〜Ｐ−２８５；Ｌ−７１
〜Ｐ−２８５；Ｙ−７２〜Ｐ−２８５；Ｈ−７３〜Ｐ−２８５；Ｓ−７４〜Ｐ−
２８５；Ｒ−７５〜Ｐ−２８５；Ｆ−７６〜Ｐ−２８５；Ｌ−７７〜Ｐ−２８５
；Ｇ−７８〜Ｐ−２８５；Ｒ−７９〜Ｐ−２８５；Ａ−８０〜Ｐ−２８５；Ｑ−
８１〜Ｐ−２８５；Ｌ−８２〜Ｐ−２８５；Ｈ−８３〜Ｐ−２８５；Ｓ−８４〜
Ｐ−２８５；Ｎ−８５〜Ｐ−２８５；Ｌ−８６〜Ｐ−２８５；Ｓ−８７〜Ｐ−２
８５；Ｌ−８８〜Ｐ−２８５；Ｅ−８９〜Ｐ−２８５；Ｌ−９０〜Ｐ−２８５；
Ｇ−９１〜Ｐ−２８５；Ｐ−９２〜Ｐ−２８５；Ｌ−９３〜Ｐ−２８５；Ｅ−９
４〜Ｐ−２８５；Ｓ−９５〜Ｐ−２８５；Ｇ−９６〜Ｐ−２８５；Ｄ−９７〜Ｐ
−２８５；Ｓ−９８〜Ｐ−２８５；Ｇ−９９〜Ｐ−２８５；Ｎ−１００〜Ｐ−２
８５；Ｆ−１０１〜Ｐ−２８５；Ｓ−１０２〜Ｐ−２８５；Ｖ−１０３〜Ｐ−２
８５；Ｌ−１０４〜Ｐ−２８５；Ｍ−１０５〜Ｐ−２８５；Ｖ−１０６〜Ｐ−２
８５；Ｄ−１０７〜Ｐ−２８５；Ｔ−１０８〜Ｐ−２８５；Ｒ−１０９〜Ｐ−２
８５；Ｇ−１１０〜Ｐ−２８５；Ｑ−１１１〜Ｐ−２８５；Ｐ−１１２〜Ｐ−２
８５；Ｗ−１１３〜Ｐ−２８５；Ｔ−１１４〜Ｐ−２８５；Ｑ−１１５〜Ｐ−２
８５；Ｔ−１１６〜Ｐ−２８５；Ｌ−１１７〜Ｐ−２８５；Ｑ−１１８〜Ｐ−２
８５；Ｌ−１１９〜Ｐ−２８５；Ｋ−１２０〜Ｐ−２８５；Ｖ−１２１〜Ｐ−２
８５；Ｙ−１２２〜Ｐ−２８５；Ｄ−１２３〜Ｐ−２８５；Ａ−１２４〜Ｐ−２
８５；Ｖ−１２５〜Ｐ−２８５；Ｐ−１２６〜Ｐ−２８５；Ｒ−１２７〜Ｐ−２
８５；Ｐ−１２８〜Ｐ−２８５；Ｖ−１２９〜Ｐ−２８５；Ｖ−１３０〜Ｐ−２
８５；Ｑ−１３１〜Ｐ−２８５；Ｖ−１３２〜Ｐ−２８５；Ｆ−１３３〜Ｐ−２
８５；Ｉ−１３４〜Ｐ−２８５；Ａ−１３５〜Ｐ−２８５；Ｖ−１３６〜Ｐ−２
８５；Ｅ−１３７〜Ｐ−２８５；Ｒ−１３８〜Ｐ−２８５；Ｄ−１３９〜Ｐ−２
８５；Ａ−１４０〜Ｐ−２８５；Ｑ−１４１〜Ｐ−２８５；Ｐ−１４２〜Ｐ−２
８５；Ｓ−１４３〜Ｐ−２８５；Ｋ−１４４〜Ｐ−２８５；Ｔ−１４５〜Ｐ−２
８５；Ｃ−１４６〜Ｐ−２８５；Ｑ−１４７〜Ｐ−２８５；Ｖ−１４８〜Ｐ−２
８５；Ｆ−１４９〜Ｐ−２８５；Ｌ−１５０〜Ｐ−２８５；Ｓ−１５１〜Ｐ−２
８５；Ｃ−１５２〜Ｐ−２８５；Ｗ−１５３〜Ｐ−２８５；Ａ−１５４〜Ｐ−２
８５；Ｐ−１５５〜Ｐ−２８５；Ｎ−１５６〜Ｐ−２８５；Ｉ−１５７〜Ｐ−２
８５；Ｓ−１５８〜Ｐ−２８５；Ｅ−１５９〜Ｐ−２８５；Ｉ−１６０〜Ｐ−２
８５；Ｔ−１６１〜Ｐ−２８５；Ｙ−１６２〜Ｐ−２８５；Ｓ−１６３〜Ｐ−２
８５；Ｗ−１６４〜Ｐ−２８５；Ｒ−１６５〜Ｐ−２８５；Ｒ−１６６〜Ｐ−２
８５；Ｅ−１６７〜Ｐ−２８５；Ｔ−１６８〜Ｐ−２８５；Ｔ−１６９〜Ｐ−２
８５；Ｍ−１７０〜Ｐ−２８５；Ｄ−１７１〜Ｐ−２８５；Ｆ−１７２〜Ｐ−２
８５；Ｇ−１７３〜Ｐ−２８５；Ｍ−１７４〜Ｐ−２８５；Ｅ−１７５〜Ｐ−２
８５；Ｐ−１７６〜Ｐ−２８５；Ｈ−１７７〜Ｐ−２８５；Ｓ−１７８〜Ｐ−２
８５；Ｌ−１７９〜Ｐ−２８５；Ｆ−１８０〜Ｐ−２８５；Ｔ−１８１〜Ｐ−２
８５；Ｄ−１８２〜Ｐ−２８５；Ｇ−１８３〜Ｐ−２８５；Ｑ−１８４〜Ｐ−２
８５；Ｖ−１８５〜Ｐ−２８５；Ｌ−１８６〜Ｐ−２８５；Ｓ−１８７〜Ｐ−２
８５；Ｉ−１８８〜Ｐ−２８５；Ｓ−１８９〜Ｐ−２８５；Ｌ−１９０〜Ｐ−２
８５；Ｇ−１９１〜Ｐ−２８５；Ｐ−１９２〜Ｐ−２８５；Ｇ−１９３〜Ｐ−２
８５；Ｄ−１９４〜Ｐ−２８５；Ｒ−１９５〜Ｐ−２８５；Ｄ−１９６〜Ｐ−２
８５；Ｖ−１９７〜Ｐ−２８５；Ａ−１９８〜Ｐ−２８５；Ｙ−１９９〜Ｐ−２
８５；Ｓ−２００〜Ｐ−２８５；Ｃ−２０１〜Ｐ−２８５；Ｉ−２０２〜Ｐ−２
８５；Ｖ−２０３〜Ｐ−２８５；Ｓ−２０４〜Ｐ−２８５；Ｎ−２０５〜Ｐ−２
８５；Ｐ−２０６〜Ｐ−２８５；Ｖ−２０７〜Ｐ−２８５；Ｓ−２０８〜Ｐ−２
８５；Ｗ−２０９〜Ｐ−２８５；Ｄ−２１０〜Ｐ−２８５；Ｌ−２１１〜Ｐ−２
８５；Ａ−２１２〜Ｐ−２８５；Ｔ−２１３〜Ｐ−２８５；Ｖ−２１４〜Ｐ−２
８５；Ｔ−２１５〜Ｐ−２８５；Ｐ−２１６〜Ｐ−２８５；Ｗ−２１７〜Ｐ−２
８５；Ｄ−２１８〜Ｐ−２８５；Ｓ−２１９〜Ｐ−２８５；Ｃ−２２０〜Ｐ−２
８５；Ｈ−２２１〜Ｐ−２８５；Ｈ−２２２〜Ｐ−２８５；Ｅ−２２３〜Ｐ−２
８５；Ａ−２２４〜Ｐ−２８５；Ａ−２２５〜Ｐ−２８５；Ｐ−２２６〜Ｐ−２
８５；Ｇ−２２７〜Ｐ−２８５；Ｋ−２２８〜Ｐ−２８５；Ａ−２２９〜Ｐ−２
８５；Ｓ−２３０〜Ｐ−２８５；Ｙ−２３１〜Ｐ−２８５；Ｋ−２３２〜Ｐ−２
８５；Ｄ−２３３〜Ｐ−２８５；Ｖ−２３４〜Ｐ−２８５；Ｌ−２３５〜Ｐ−２
８５；Ｌ−２３６〜Ｐ−２８５；Ｖ−２３７〜Ｐ−２８５；Ｖ−２３８〜Ｐ−２
８５；Ｖ−２３９〜Ｐ−２８５；Ｐ−２４０〜Ｐ−２８５；Ｖ−２４１〜Ｐ−２
８５；Ｓ−２４２〜Ｐ−２８５；Ｌ−２４３〜Ｐ−２８５；Ｌ−２４４〜Ｐ−２
８５；Ｌ−２４５〜Ｐ−２８５；Ｍ−２４６〜Ｐ−２８５；Ｌ−２４７〜Ｐ−２
８５；Ｖ−２４８〜Ｐ−２８５；Ｔ−２４９〜Ｐ−２８５；Ｌ−２５０〜Ｐ−２
８５；Ｆ−２５１〜Ｐ−２８５；Ｓ−２５２〜Ｐ−２８５；Ａ−２５３〜Ｐ−２
８５；Ｗ−２５４〜Ｐ−２８５；Ｈ−２５５〜Ｐ−２８５；Ｗ−２５６〜Ｐ−２
８５；Ｃ−２５７〜Ｐ−２８５；Ｐ−２５８〜Ｐ−２８５；Ｃ−２５９〜Ｐ−２
８５；Ｓ−２６０〜Ｐ−２８５；Ｇ−２６１〜Ｐ−２８５；Ｋ−２６２〜Ｐ−２
８５；Ｋ−２６３〜Ｐ−２８５；Ｋ−２６４〜Ｐ−２８５；Ｋ−２６５〜Ｐ−２
８５；Ｄ−２６６〜Ｐ−２８５；Ｖ−２６７〜Ｐ−２８５；Ｈ−２６８〜Ｐ−２
８５；Ａ−２６９〜Ｐ−２８５；Ｄ−２７０〜Ｐ−２８５；Ｒ−２７１〜Ｐ−２
８５；Ｖ−２７２〜Ｐ−２８５；Ｇ−２７３〜Ｐ−２８５；Ｐ−２７４〜Ｐ−２
８５；Ｅ−２７５〜Ｐ−２８５；Ｔ−２７６〜Ｐ−２８５；Ｅ−２７７〜Ｐ−２
８５；Ｎ−２７８〜Ｐ−２８５；Ｐ−２７９〜Ｐ−２８５；およびＬ−２８０〜
Ｐ−２８５。これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもま
た本発明によって含まれる。本願はまた、上に記載されるＤ−ＳＬＡＭポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、
９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオ
チド配列を含むかあるいはこれらからなる核酸分子に関する。本発明はまた、異
種ポリヌクレオチド配列に融合された上記のポリヌクレオチド配列を包含する。
これらの核酸および／またはポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペ
プチドもまた本発明に含まれ、これは、上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、
８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一で
あるアミノ酸配列を含むかまたはこれらからなるポリペプチドおよびこのような
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【０１１３】 また、上で述べたように、１以上のアミノ酸の、タンパク質のＣ末端からの欠
失が、このタンパク質の１以上の生物学的機能の欠失という改変を生じたとして
も、他の機能活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、Ｄ−ＳＬＡＭリ
ガンドを結合する能力）はなお、維持され得る。例えば、ポリペプチドの完全形
態または成熟形態を認識する抗体を誘導および／またはこれに結合する短縮化Ｄ
−ＳＬＡＭムテインの能力は、完全ポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの過半
数の残基より少ない残基が、Ｃ末端から除去される場合、一般に維持される。完
全ポリペプチドのＣ末端残基を欠失する特定のポリペプチドが、このような免疫
学的活性を維持するか否かは、本明細書中で記載されるかそうでなければ当該分
野で公知の慣用的な方法によって容易に決定され得る。多くの欠失されたＣ末端
アミノ酸残基を有するＤ−ＳＬＡＭムテインが、幾らかの生物学的活性または免
疫学的活性を維持し得ることは、ありそうにないわけではない。実際に、わずか
６Ｄ−ＳＬＡＭアミノ酸残基から構成されるペプチドは、しばしば、免疫応答を
引き起こす。
【０１１４】 従って、本発明は、さらに、図１に示されるＤ−ＳＬＡＭポリペプチドのアミ
ノ酸配列（配列番号２）のカルボキシ末端から欠失される一つ以上の残基を有す
るポリペプチドを提供し、これは、一般式１−ｎによって記載され、ここで、ｎ
は７〜２８４の整数であり、ここで、ｎは配列番号２において同定されるアミノ
酸残基の位置に対応する。さらに詳細には、本発明は、以下の残基からなる群よ
り選択されるアミノ酸配列を含むかあるいはこれらからなるポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを提供する：配列番号２のＭ−１〜Ｌ−２８４；Ｍ−１
〜Ｄ−２８３；Ｍ−１〜Ｑ−２８２；Ｍ−１〜Ｖ−２８１；Ｍ−１〜Ｌ−２８０
；Ｍ−１〜Ｐ−２７９；Ｍ−１〜Ｎ−２７８；Ｍ−１〜Ｅ−２７７；Ｍ−１〜Ｔ
−２７６；Ｍ−１〜Ｅ−２７５；Ｍ−１〜Ｐ−２７４；Ｍ−１〜Ｇ−２７３；Ｍ
−１〜Ｖ−２７２；Ｍ−１〜Ｒ−２７１；Ｍ−１〜Ｄ−２７０；Ｍ−１〜Ａ−２
６９；Ｍ−１〜Ｈ−２６８；Ｍ−１〜Ｖ−２６７；Ｍ−１〜Ｄ−２６６；Ｍ−１
〜Ｋ−２６５；Ｍ−１〜Ｋ−２６４；Ｍ−１〜Ｋ−２６３；Ｍ−１〜Ｋ−２６２
；Ｍ−１〜Ｇ−２６１；Ｍ−１〜Ｓ−２６０；Ｍ−１〜Ｃ−２５９；Ｍ−１〜Ｐ
−２５８；Ｍ−１〜Ｃ−２５７；Ｍ−１〜Ｗ−２５６；Ｍ−１〜Ｈ−２５５；Ｍ
−１〜Ｗ−２５４；Ｍ−１〜Ａ−２５３；Ｍ−１〜Ｓ−２５２；Ｍ−１〜Ｆ−２
５１；Ｍ−１〜Ｌ−２５０；Ｍ−１〜Ｔ−２４９；Ｍ−１〜Ｖ−２４８；Ｍ−１
〜Ｌ−２４７；Ｍ−１〜Ｍ−２４６；Ｍ−１〜Ｌ−２４５；Ｍ−１〜Ｌ−２４４
；Ｍ−１〜Ｌ−２４３；Ｍ−１〜Ｓ−２４２；Ｍ−１〜Ｖ−２４１；Ｍ−１〜Ｐ
−２４０；Ｍ−１〜Ｖ−２３９；Ｍ−１〜Ｖ−２３８；Ｍ−１〜Ｖ−２３７；Ｍ
−１〜Ｌ−２３６；Ｍ−１〜Ｌ−２３５；Ｍ−１〜Ｖ−２３４；Ｍ−１〜Ｄ−２
３３；Ｍ−１〜Ｋ−２３２；Ｍ−１〜Ｙ−２３１；Ｍ−１〜Ｓ−２３０；Ｍ−１
〜Ａ−２２９；Ｍ−１〜Ｋ−２２８；Ｍ−１〜Ｇ−２２７；Ｍ−１〜Ｐ−２２６
；Ｍ−１〜Ａ−２２５；Ｍ−１〜Ａ−２２４；Ｍ−１〜Ｅ−２２３；Ｍ−１〜Ｈ
−２２２；Ｍ−１〜Ｈ−２２１；Ｍ−１〜Ｃ−２２０；Ｍ−１〜Ｓ−２１９；Ｍ
−１〜Ｄ−２１８；Ｍ−１〜Ｗ−２１７；Ｍ−１〜Ｐ−２１６；Ｍ−１〜Ｔ−２
１５；Ｍ−１〜Ｖ−２１４；Ｍ−１〜Ｔ−２１３；Ｍ−１〜Ａ−２１２；Ｍ−１
〜Ｌ−２１１；Ｍ−１〜Ｄ−２１０；Ｍ−１〜Ｗ−２０９；Ｍ−１〜Ｓ−２０８
；Ｍ−１〜Ｖ−２０７；Ｍ−１〜Ｐ−２０６；Ｍ−１〜Ｎ−２０５；Ｍ−１〜Ｓ
−２０４；Ｍ−１〜Ｖ−２０３；Ｍ−１〜Ｉ−２０２；Ｍ−１〜Ｃ−２０１；Ｍ
−１〜Ｓ−２００；Ｍ−１〜Ｙ−１９９；Ｍ−１〜Ａ−１９８；Ｍ−１〜Ｖ−１
９７；Ｍ−１〜Ｄ−１９６；Ｍ−１〜Ｒ−１９５；Ｍ−１〜Ｄ−１９４；Ｍ−１
〜Ｇ−１９３；Ｍ−１〜Ｐ−１９２；Ｍ−１〜Ｇ−１９１；Ｍ−１〜Ｌ−１９０
；Ｍ−１〜Ｓ−１８９；Ｍ−１〜Ｉ−１８８；Ｍ−１〜Ｓ−１８７；Ｍ−１〜Ｌ
−１８６；Ｍ−１〜Ｖ−１８５；Ｍ−１〜Ｑ−１８４；Ｍ−１〜Ｇ−１８３；Ｍ
−１〜Ｄ−１８２；Ｍ−１〜Ｔ−１８１；Ｍ−１〜Ｆ−１８０；Ｍ−１〜Ｌ−１
７９；Ｍ−１〜Ｓ−１７８；Ｍ−１〜Ｈ−１７７；Ｍ−１〜Ｐ−１７６；Ｍ−１
〜Ｅ−１７５；Ｍ−１〜Ｍ−１７４；Ｍ−１〜Ｇ−１７３；Ｍ−１〜Ｆ−１７２
；Ｍ−１〜Ｄ−１７１；Ｍ−１〜Ｍ−１７０；Ｍ−１〜Ｔ−１６９；Ｍ−１〜Ｔ
−１６８；Ｍ−１〜Ｅ−１６７；Ｍ−１〜Ｒ−１６６；Ｍ−１〜Ｒ−１６５；Ｍ
−１〜Ｗ−１６４；Ｍ−１〜Ｓ−１６３；Ｍ−１〜Ｙ−１６２；Ｍ−１〜Ｔ−１
６１；Ｍ−１〜Ｉ−１６０；Ｍ−１〜Ｅ−１５９；Ｍ−１〜Ｓ−１５８；Ｍ−１
〜Ｉ−１５７；Ｍ−１〜Ｎ−１５６；Ｍ−１〜Ｐ−１５５；Ｍ−１〜Ａ−１５４
；Ｍ−１〜Ｗ−１５３；Ｍ−１〜Ｃ−１５２；Ｍ−１〜Ｓ−１５１；Ｍ−１〜Ｌ
−１５０；Ｍ−１〜Ｆ−１４９；Ｍ−１〜Ｖ−１４８；Ｍ−１〜Ｑ−１４７；Ｍ
−１〜Ｃ−１４６；Ｍ−１〜Ｔ−１４５；Ｍ−１〜Ｋ−１４４；Ｍ−１〜Ｓ−１
４３；Ｍ−１〜Ｐ−１４２；Ｍ−１〜Ｑ−１４１；Ｍ−１〜Ａ−１４０；Ｍ−１
〜Ｄ−１３９；Ｍ−１〜Ｒ−１３８；Ｍ−１〜Ｅ−１３７；Ｍ−１〜Ｖ−１３６
；Ｍ−１〜Ａ−１３５；Ｍ−１〜Ｉ−１３４；Ｍ−１〜Ｆ−１３３；Ｍ−１〜Ｖ
−１３２；Ｍ−１〜Ｑ−１３１；Ｍ−１〜Ｖ−１３０；Ｍ−１〜Ｖ−１２９；Ｍ
−１〜Ｐ−１２８；Ｍ−１〜Ｒ−１２７；Ｍ−１〜Ｐ−１２６；Ｍ−１〜Ｖ−１
２５；Ｍ−１〜Ａ−１２４；Ｍ−１〜Ｄ−１２３；Ｍ−１〜Ｙ−１２２；Ｍ−１
〜Ｖ−１２１；Ｍ−１〜Ｋ−１２０；Ｍ−１〜Ｌ−１１９；Ｍ−１〜Ｑ−１１８
；Ｍ−１〜Ｌ−１１７；Ｍ−１〜Ｔ−１１６；Ｍ−１〜Ｑ−１１５；Ｍ−１〜Ｔ
−１１４；Ｍ−１〜Ｗ−１１３；Ｍ−１〜Ｐ−１１２；Ｍ−１〜Ｑ−１１１；Ｍ
−１〜Ｇ−１１０；Ｍ−１〜Ｒ−１０９；Ｍ−１〜Ｔ−１０８；Ｍ−１〜Ｄ−１
０７；Ｍ−１〜Ｖ−１０６；Ｍ−１〜Ｍ−１０５；Ｍ−１〜Ｌ−１０４；Ｍ−１
〜Ｖ−１０３；Ｍ−１〜Ｓ−１０２；Ｍ−１〜Ｆ−１０１；Ｍ−１〜Ｎ−１００
；Ｍ−１〜Ｇ−９９；Ｍ−１〜Ｓ−９８；Ｍ−１〜Ｄ−９７；Ｍ−１〜Ｇ−９６
；Ｍ−１〜Ｓ−９５；Ｍ−１〜Ｅ−９４；Ｍ−１〜Ｌ−９３；Ｍ−１〜Ｐ−９２
；Ｍ−１〜Ｇ−９１；Ｍ−１〜Ｌ−９０；Ｍ−１〜Ｅ−８９；Ｍ−１〜Ｌ−８８
；Ｍ−１〜Ｓ−８７；Ｍ−１〜Ｌ−８６；Ｍ−１〜Ｎ−８５；Ｍ−１〜Ｓ−８４
；Ｍ−１〜Ｈ−８３；Ｍ−１〜Ｌ−８２；Ｍ−１〜Ｑ−８１；Ｍ−１〜Ａ−８０
；Ｍ−１〜Ｒ−７９；Ｍ−１〜Ｇ−７８；Ｍ−１〜Ｌ−７７；Ｍ−１〜Ｆ−７６
；Ｍ−１〜Ｒ−７５；Ｍ−１〜Ｓ−７４；Ｍ−１〜Ｈ−７３；Ｍ−１〜Ｙ−７２
；Ｍ−１〜Ｌ−７１；Ｍ−１〜Ｔ−７０；Ｍ−１〜Ｅ−６９；Ｍ−１〜Ｌ−６８
；Ｍ−１〜Ｓ−６７；Ｍ−１〜Ｇ−６６；Ｍ−１〜Ｒ−６５；Ｍ−１〜Ｆ−６４
；Ｍ−１〜Ｆ−６３；Ｍ−１〜Ｔ−６２；Ｍ−１〜Ａ−６１；Ｍ−１〜Ｌ−６０
；Ｍ−１〜Ｌ−５９；Ｍ−１〜Ｅ−５８；Ｍ−１〜Ｅ−５７；Ｍ−１〜Ｓ−５６
；Ｍ−１〜Ｐ−５５；Ｍ−１〜Ｗ−５４；Ｍ−１〜Ｌ−５３；Ｍ−１〜Ｓ−５２
；Ｍ−１〜Ｒ−５１；Ｍ−１〜Ｗ−５０；Ｍ−１〜Ｉ−４９；Ｍ−１〜Ａ−４８
；Ｍ−１〜Ｅ−４７；Ｍ−１〜Ｒ−４６；Ｍ−１〜Ｖ−４５；Ｍ−１〜Ｑ−４４
；Ｍ−１〜Ｆ−４３；Ｍ−１〜Ｇ−４２；Ｍ−１〜Ｐ−４１；Ｍ−１〜Ｐ−４０
；Ｍ−１〜Ｒ−３９；Ｍ−１〜Ａ−３８；Ｍ−１〜Ａ−３７；Ｍ−１〜Ｖ−３６
；Ｍ−１〜Ｌ−３５；Ｍ−１〜Ｌ−３４；Ｍ−１〜Ｖ−３３；Ｍ−１〜Ｓ−３２
；Ｍ−１〜Ｇ−３１；Ｍ−１〜Ｇ−３０；Ｍ−１〜Ｖ−２９；Ｍ−１〜Ｋ−２８
；Ｍ−１〜Ｓ−２７；Ｍ−１〜Ｌ−２６；Ｍ−１〜Ｖ−２５；Ｍ−１〜Ｑ−２４
；Ｍ−１〜Ａ−２３；Ｍ−１〜Ｇ−２２；Ｍ−１〜Ｔ−２１；Ｍ−１〜Ｖ−２０
；Ｍ−１〜Ｔ−１９；Ｍ−１〜Ｉ−１８；Ｍ−１〜Ｐ−１７；Ｍ−１〜Ｌ−１６
；Ｍ−１〜Ｌ−１５；Ｍ−１〜Ａ−１４；Ｍ−１〜Ｅ−１３；Ｍ−１〜Ｗ−１２
；Ｍ−１〜Ｌ−１１；Ｍ−１〜Ｌ−１０；Ｍ−１〜Ｌ−９；Ｍ−１〜Ｓ−８；お
よびＭ−１〜Ｗ−７。これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプ
チドもまた本発明によって含まれる。本願はまた、上に記載されるＤ−ＳＬＡＭ
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、
９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリ
ヌクレオチド配列を含むかあるいはこれらからなる核酸分子に関する。本発明は
また、異種ポリヌクレオチド配列に融合された上記のポリヌクレオチド配列を包
含する。これらの核酸および／またはポリヌクレオチド配列によってコードされ
るポリペプチドもまた本発明に含まれ、これは、上記アミノ酸配列と少なくとも
８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９
％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはこれらからなるポリペプチドおよびこ
のようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【０１１５】 さらに、上に列挙したＮ末端またはＣ末端の欠失のいずれかを組み合わせて、
Ｎ末端およびＣ末端欠失型Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドを産生し得る。本発明はま
た、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方から１つ以上の欠失したアミノ酸を
有するポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、一般的に、配列番号２の
残基ｍ−ｎを有するものとして記載され得、ここでｎおよびｍは、上記のような
整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発
明に含まれる。
【０１１６】 さらに、好ましいＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体は、予期されるＤ
−ＳＬＡＭの分泌形態を含むかあるいはこれらからなる。Ｄ−ＳＬＡＭの好まし
い分泌形態には、以下の残基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかあ
るいはこれらからなるポリペプチドが挙げられる：配列番号２のＭ−１〜Ｋ−２
３２；Ｖ−２〜Ｋ−２３２；Ｍ−３〜Ｋ−２３２；Ｒ−４〜Ｋ−２３２；Ｐ−５
〜Ｋ−２３２；Ｌ−６〜Ｋ−２３２；Ｗ−７〜Ｋ−２３２；Ｓ−８〜Ｋ−２３２
；Ｌ−９〜Ｋ−２３２；Ｌ−１０〜Ｋ−２３２；Ｌ−１１〜Ｋ−２３２；Ｗ−１
２〜Ｋ−２３２；Ｅ−１３〜Ｋ−２３２；Ａ−１４〜Ｋ−２３２；Ｌ−１５〜Ｋ
−２３２；Ｌ−１６〜Ｋ−２３２；Ｐ−１７〜Ｋ−２３２；Ｉ−１８〜Ｋ−２３
２；Ｔ−１９〜Ｋ−２３２；Ｖ−２０〜Ｋ−２３２；Ｔ−２１〜Ｋ−２３２；Ｇ
−２２〜Ｋ−２３２；Ａ−２３〜Ｋ−２３２；Ｑ−２４〜Ｋ−２３２；Ｖ−２５
〜Ｋ−２３２；Ｌ−２６〜Ｋ−２３２；Ｓ−２７〜Ｋ−２３２；Ｋ−２８〜Ｋ−
２３２；Ｖ−２９〜Ｋ−２３２；Ｇ−３０〜Ｋ−２３２；Ｇ−３１〜Ｋ−２３２
；Ｓ−３２〜Ｋ−２３２；Ｖ−３３〜Ｋ−２３２；Ｌ−３４〜Ｋ−２３２；Ｌ−
３５〜Ｋ−２３２；Ｖ−３６〜Ｋ−２３２；Ａ−３７〜Ｋ−２３２；Ａ−３８〜
Ｋ−２３２；Ｒ−３９〜Ｋ−２３２；Ｐ−４０〜Ｋ−２３２；Ｐ−４１〜Ｋ−２
３２；Ｇ−４２〜Ｋ−２３２；Ｆ−４３〜Ｋ−２３２；Ｑ−４４〜Ｋ−２３２；
Ｖ−４５〜Ｋ−２３２；Ｒ−４６〜Ｋ−２３２；Ｅ−４７〜Ｋ−２３２；Ａ−４
８〜Ｋ−２３２；Ｉ−４９〜Ｋ−２３２；Ｗ−５０〜Ｋ−２３２；Ｒ−５１〜Ｋ
−２３２；Ｓ−５２〜Ｋ−２３２；Ｌ−５３〜Ｋ−２３２；Ｗ−５４〜Ｋ−２３
２；Ｐ−５５〜Ｋ−２３２；Ｓ−５６〜Ｋ−２３２；Ｅ−５７〜Ｋ−２３２；Ｅ
−５８〜Ｋ−２３２；Ｌ−５９〜Ｋ−２３２；Ｌ−６０〜Ｋ−２３２；Ａ−６１
〜Ｋ−２３２；Ｔ−６２〜Ｋ−２３２；Ｆ−６３〜Ｋ−２３２；Ｆ−６４〜Ｋ−
２３２；Ｒ−６５〜Ｋ−２３２；Ｇ−６６〜Ｋ−２３２；Ｓ−６７〜Ｋ−２３２
；Ｌ−６８〜Ｋ−２３２；Ｅ−６９〜Ｋ−２３２；Ｔ−７０〜Ｋ−２３２；Ｌ−
７１〜Ｋ−２３２；Ｙ−７２〜Ｋ−２３２；Ｈ−７３〜Ｋ−２３２；Ｓ−７４〜
Ｋ−２３２；Ｒ−７５〜Ｋ−２３２；Ｆ−７６〜Ｋ−２３２；Ｌ−７７〜Ｋ−２
３２；Ｇ−７８〜Ｋ−２３２；Ｒ−７９〜Ｋ−２３２；Ａ−８０〜Ｋ−２３２；
Ｑ−８１〜Ｋ−２３２；Ｌ−８２〜Ｋ−２３２；Ｈ−８３〜Ｋ−２３２；Ｓ−８
４〜Ｋ−２３２；Ｎ−８５〜Ｋ−２３２；Ｌ−８６〜Ｋ−２３２；Ｓ−８７〜Ｋ
−２３２；Ｌ−８８〜Ｋ−２３２；Ｅ−８９〜Ｋ−２３２；Ｌ−９０〜Ｋ−２３
２；Ｇ−９１〜Ｋ−２３２；Ｐ−９２〜Ｋ−２３２；Ｌ−９３〜Ｋ−２３２；Ｅ
−９４〜Ｋ−２３２；Ｓ−９５〜Ｋ−２３２；Ｇ−９６〜Ｋ−２３２；Ｄ−９７
〜Ｋ−２３２；Ｓ−９８〜Ｋ−２３２；Ｇ−９９〜Ｋ−２３２；Ｎ−１００〜Ｋ
−２３２；Ｆ−１０１〜Ｋ−２３２；Ｓ−１０２〜Ｋ−２３２；Ｖ−１０３〜Ｋ
−２３２；Ｌ−１０４〜Ｋ−２３２；Ｍ−１０５〜Ｋ−２３２；Ｖ−１０６〜Ｋ
−２３２；Ｄ−１０７〜Ｋ−２３２；Ｔ−１０８〜Ｋ−２３２；Ｒ−１０９〜Ｋ
−２３２；Ｇ−１１０〜Ｋ−２３２；Ｑ−１１１〜Ｋ−２３２；Ｐ−１１２〜Ｋ
−２３２；Ｗ−１１３〜Ｋ−２３２；Ｔ−１１４〜Ｋ−２３２；Ｑ−１１５〜Ｋ
−２３２；Ｔ−１１６〜Ｋ−２３２；Ｌ−１１７〜Ｋ−２３２；Ｑ−１１８〜Ｋ
−２３２；Ｌ−１１９〜Ｋ−２３２；Ｋ−１２０〜Ｋ−２３２；Ｖ−１２１〜Ｋ
−２３２；Ｙ−１２２〜Ｋ−２３２；Ｄ−１２３〜Ｋ−２３２；Ａ−１２４〜Ｋ
−２３２；Ｖ−１２５〜Ｋ−２３２；Ｐ−１２６〜Ｋ−２３２；Ｒ−１２７〜Ｋ
−２３２；Ｐ−１２８〜Ｋ−２３２；Ｖ−１２９〜Ｋ−２３２；Ｖ−１３０〜Ｋ
−２３２；Ｑ−１３１〜Ｋ−２３２；Ｖ−１３２〜Ｋ−２３２；Ｆ−１３３〜Ｋ
−２３２；Ｉ−１３４〜Ｋ−２３２；Ａ−１３５〜Ｋ−２３２；Ｖ−１３６〜Ｋ
−２３２；Ｅ−１３７〜Ｋ−２３２；Ｒ−１３８〜Ｋ−２３２；Ｄ−１３９〜Ｋ
−２３２；Ａ−１４０〜Ｋ−２３２；Ｑ−１４１〜Ｋ−２３２；Ｐ−１４２〜Ｋ
−２３２；Ｓ−１４３〜Ｋ−２３２；Ｋ−１４４〜Ｋ−２３２；Ｔ−１４５〜Ｋ
−２３２；Ｃ−１４６〜Ｋ−２３２；Ｑ−１４７〜Ｋ−２３２；Ｖ−１４８〜Ｋ
−２３２；Ｆ−１４９〜Ｋ−２３２；Ｌ−１５０〜Ｋ−２３２；Ｓ−１５１〜Ｋ
−２３２；Ｃ−１５２〜Ｋ−２３２；Ｗ−１５３〜Ｋ−２３２；Ａ−１５４〜Ｋ
−２３２；Ｐ−１５５〜Ｋ−２３２；Ｎ−１５６〜Ｋ−２３２；Ｉ−１５７〜Ｋ
−２３２；Ｓ−１５８〜Ｋ−２３２；Ｅ−１５９〜Ｋ−２３２；Ｉ−１６０〜Ｋ
−２３２；Ｔ−１６１〜Ｋ−２３２；Ｙ−１６２〜Ｋ−２３２；Ｓ−１６３〜Ｋ
−２３２；Ｗ−１６４〜Ｋ−２３２；Ｒ−１６５〜Ｋ−２３２；Ｒ−１６６〜Ｋ
−２３２；Ｅ−１６７〜Ｋ−２３２；Ｔ−１６８〜Ｋ−２３２；Ｔ−１６９〜Ｋ
−２３２；Ｍ−１７０〜Ｋ−２３２；Ｄ−１７１〜Ｋ−２３２；Ｆ−１７２〜Ｋ
−２３２；Ｇ−１７３〜Ｋ−２３２；Ｍ−１７４〜Ｋ−２３２；Ｅ−１７５〜Ｋ
−２３２；Ｐ−１７６〜Ｋ−２３２；Ｈ−１７７〜Ｋ−２３２；Ｓ−１７８〜Ｋ
−２３２；Ｌ−１７９〜Ｋ−２３２；Ｆ−１８０〜Ｋ−２３２；Ｔ−１８１〜Ｋ
−２３２；Ｄ−１８２〜Ｋ−２３２；Ｇ−１８３〜Ｋ−２３２；Ｑ−１８４〜Ｋ
−２３２；Ｖ−１８５〜Ｋ−２３２；Ｌ−１８６〜Ｋ−２３２；Ｓ−１８７〜Ｋ
−２３２；Ｉ−１８８〜Ｋ−２３２；Ｓ−１８９〜Ｋ−２３２；Ｌ−１９０〜Ｋ
−２３２；Ｇ−１９１〜Ｋ−２３２；Ｐ−１９２〜Ｋ−２３２；Ｇ−１９３〜Ｋ
−２３２；Ｄ−１９４〜Ｋ−２３２；Ｒ−１９５〜Ｋ−２３２；Ｄ−１９６〜Ｋ
−２３２；Ｖ−１９７〜Ｋ−２３２；Ａ−１９８〜Ｋ−２３２；Ｙ−１９９〜Ｋ
−２３２；Ｓ−２００〜Ｋ−２３２；Ｃ−２０１〜Ｋ−２３２；Ｉ−２０２〜Ｋ
−２３２；Ｖ−２０３〜Ｋ−２３２；Ｓ−２０４〜Ｋ−２３２；Ｎ−２０５〜Ｋ
−２３２；Ｐ−２０６〜Ｋ−２３２；Ｖ−２０７〜Ｋ−２３２；Ｓ−２０８〜Ｋ
−２３２；Ｗ−２０９〜Ｋ−２３２；Ｄ−２１０〜Ｋ−２３２；Ｌ−２１１〜Ｋ
−２３２；Ａ−２１２〜Ｋ−２３２；Ｔ−２１３〜Ｋ−２３２；Ｖ−２１４〜Ｋ
−２３２；Ｔ−２１５〜Ｋ−２３２；Ｐ−２１６〜Ｋ−２３２；Ｗ−２１７〜Ｋ
−２３２；Ｄ−２１８〜Ｋ−２３２；Ｓ−２１９〜Ｋ−２３２；Ｃ−２２０〜Ｋ
−２３２；Ｈ−２２１〜Ｋ−２３２；Ｈ−２２２〜Ｋ−２３２；Ｅ−２２３〜Ｋ
−２３２；Ａ−２２４〜Ｋ−２３２；Ａ−２２５〜Ｋ−２３２；Ｐ−２２６〜Ｋ
−２３２；およびＧ−２２７〜Ｋ−２３２。これらのポリヌクレオチドによって
コードされるポリペプチドもまた本発明によって含まれる。本願はまた、上に記
載されるＤ−ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なく
とも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または
９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むかあるいはこれらからなる核酸分
子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合された上記のポリ
ヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸および／またはポリヌクレオチド配
列によってコードされるポリペプチドもまた本発明に含まれ、これは、上記アミ
ノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７
％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはこれらからなる
ポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであ
る。
【０１１７】 さらに、好ましいＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体は、予期されるＤ
−ＳＬＡＭのシグナル配列を欠失するフラグメントを含むかあるいはこれらから
なる。Ｄ−ＳＬＡＭの好ましいフラグメントには、以下の残基からなる群より選
択されるアミノ酸配列を含むかあるいはこれらからなるポリペプチドが挙げられ
る：配列番号２のＡ−２３〜Ｌ−２８４；Ａ−２３〜Ｄ−２８３；Ａ−２３〜Ｑ
−２８２；Ａ−２３〜Ｖ−２８１；Ａ−２３〜Ｌ−２８０；Ａ−２３〜Ｐ−２７
９；Ａ−２３〜Ｎ−２７８；Ａ−２３〜Ｅ−２７７；Ａ−２３〜Ｔ−２７６；Ａ
−２３〜Ｅ−２７５；Ａ−２３〜Ｐ−２７４；Ａ−２３〜Ｇ−２７３；Ａ−２３
〜Ｖ−２７２；Ａ−２３〜Ｒ−２７１；Ａ−２３〜Ｄ−２７０；Ａ−２３〜Ａ−
２６９；Ａ−２３〜Ｈ−２６８；Ａ−２３〜Ｖ−２６７；Ａ−２３〜Ｄ−２６６
；Ａ−２３〜Ｋ−２６５；Ａ−２３〜Ｋ−２６４；Ａ−２３〜Ｋ−２６３；Ａ−
２３〜Ｋ−２６２；Ａ−２３〜Ｇ−２６１；Ａ−２３〜Ｓ−２６０；Ａ−２３〜
Ｃ−２５９；Ａ−２３〜Ｐ−２５８；Ａ−２３〜Ｃ−２５７；Ａ−２３〜Ｗ−２
５６；Ａ−２３〜Ｈ−２５５；Ａ−２３〜Ｗ−２５４；Ａ−２３〜Ａ−２５３；
Ａ−２３〜Ｓ−２５２；Ａ−２３〜Ｆ−２５１；Ａ−２３〜Ｌ−２５０；Ａ−２
３〜Ｔ−２４９；Ａ−２３〜Ｖ−２４８；Ａ−２３〜Ｌ−２４７；Ａ−２３〜Ｍ
−２４６；Ａ−２３〜Ｌ−２４５；Ａ−２３〜Ｌ−２４４；Ａ−２３〜Ｌ−２４
３；Ａ−２３〜Ｓ−２４２；Ａ−２３〜Ｖ−２４１；Ａ−２３〜Ｐ−２４０；Ａ
−２３〜Ｖ−２３９；Ａ−２３〜Ｖ−２３８；Ａ−２３〜Ｖ−２３７；Ａ−２３
〜Ｌ−２３６；Ａ−２３〜Ｌ−２３５；Ａ−２３〜Ｖ−２３４；Ａ−２３〜Ｄ−
２３３；Ａ−２３〜Ｋ−２３２；Ａ−２３〜Ｙ−２３１；Ａ−２３〜Ｓ−２３０
；Ａ−２３〜Ａ−２２９；Ａ−２３〜Ｋ−２２８；Ａ−２３〜Ｇ−２２７；Ａ−
２３〜Ｐ−２２６；Ａ−２３〜Ａ−２２５；Ａ−２３〜Ａ−２２４；Ａ−２３〜
Ｅ−２２３；Ａ−２３〜Ｈ−２２２；Ａ−２３〜Ｈ−２２１；Ａ−２３〜Ｃ−２
２０；Ａ−２３〜Ｓ−２１９；Ａ−２３〜Ｄ−２１８；Ａ−２３〜Ｗ−２１７；
Ａ−２３〜Ｐ−２１６；Ａ−２３〜Ｔ−２１５；Ａ−２３〜Ｖ−２１４；Ａ−２
３〜Ｔ−２１３；Ａ−２３〜Ａ−２１２；Ａ−２３〜Ｌ−２１１；Ａ−２３〜Ｄ
−２１０；Ａ−２３〜Ｗ−２０９；Ａ−２３〜Ｓ−２０８；Ａ−２３〜Ｖ−２０
７；Ａ−２３〜Ｐ−２０６；Ａ−２３〜Ｎ−２０５；Ａ−２３〜Ｓ−２０４；Ａ
−２３〜Ｖ−２０３；Ａ−２３〜Ｉ−２０２；Ａ−２３〜Ｃ−２０１；Ａ−２３
〜Ｓ−２００；Ａ−２３〜Ｙ−１９９；Ａ−２３〜Ａ−１９８；Ａ−２３〜Ｖ−
１９７；Ａ−２３〜Ｄ−１９６；Ａ−２３〜Ｒ−１９５；Ａ−２３〜Ｄ−１９４
；Ａ−２３〜Ｇ−１９３；Ａ−２３〜Ｐ−１９２；Ａ−２３〜Ｇ−１９１；Ａ−
２３〜Ｌ−１９０；Ａ−２３〜Ｓ−１８９；Ａ−２３〜Ｉ−１８８；Ａ−２３〜
Ｓ−１８７；Ａ−２３〜Ｌ−１８６；Ａ−２３〜Ｖ−１８５；Ａ−２３〜Ｑ−１
８４；Ａ−２３〜Ｇ−１８３；Ａ−２３〜Ｄ−１８２；Ａ−２３〜Ｔ−１８１；
Ａ−２３〜Ｆ−１８０；Ａ−２３〜Ｌ−１７９；Ａ−２３〜Ｓ−１７８；Ａ−２
３〜Ｈ−１７７；Ａ−２３〜Ｐ−１７６；Ａ−２３〜Ｅ−１７５；Ａ−２３〜Ｍ
−１７４；Ａ−２３〜Ｇ−１７３；Ａ−２３〜Ｆ−１７２；Ａ−２３〜Ｄ−１７
１；Ａ−２３〜Ｍ−１７０；Ａ−２３〜Ｔ−１６９；Ａ−２３〜Ｔ−１６８；Ａ
−２３〜Ｅ−１６７；Ａ−２３〜Ｒ−１６６；Ａ−２３〜Ｒ−１６５；Ａ−２３
〜Ｗ−１６４；Ａ−２３〜Ｓ−１６３；Ａ−２３〜Ｙ−１６２；Ａ−２３〜Ｔ−
１６１；Ａ−２３〜Ｉ−１６０；Ａ−２３〜Ｅ−１５９；Ａ−２３〜Ｓ−１５８
；Ａ−２３〜Ｉ−１５７；Ａ−２３〜Ｎ−１５６；Ａ−２３〜Ｐ−１５５；Ａ−
２３〜Ａ−１５４；Ａ−２３〜Ｗ−１５３；Ａ−２３〜Ｃ−１５２；Ａ−２３〜
Ｓ−１５１；Ａ−２３〜Ｌ−１５０；Ａ−２３〜Ｆ−１４９；Ａ−２３〜Ｖ−１
４８；Ａ−２３〜Ｑ−１４７；Ａ−２３〜Ｃ−１４６；Ａ−２３〜Ｔ−１４５；
Ａ−２３〜Ｋ−１４４；Ａ−２３〜Ｓ−１４３；Ａ−２３〜Ｐ−１４２；Ａ−２
３〜Ｑ−１４１；Ａ−２３〜Ａ−１４０；Ａ−２３〜Ｄ−１３９；Ａ−２３〜Ｒ
−１３８；Ａ−２３〜Ｅ−１３７；Ａ−２３〜Ｖ−１３６；Ａ−２３〜Ａ−１３
５；Ａ−２３〜Ｉ−１３４；Ａ−２３〜Ｆ−１３３；Ａ−２３〜Ｖ−１３２；Ａ
−２３〜Ｑ−１３１；Ａ−２３〜Ｖ−１３０；Ａ−２３〜Ｖ−１２９；Ａ−２３
〜Ｐ−１２８；Ａ−２３〜Ｒ−１２７；Ａ−２３〜Ｐ−１２６；Ａ−２３〜Ｖ−
１２５；Ａ−２３〜Ａ−１２４；Ａ−２３〜Ｄ−１２３；Ａ−２３〜Ｙ−１２２
；Ａ−２３〜Ｖ−１２１；Ａ−２３〜Ｋ−１２０；Ａ−２３〜Ｌ−１１９；Ａ−
２３〜Ｑ−１１８；Ａ−２３〜Ｌ−１１７；Ａ−２３〜Ｔ−１１６；Ａ−２３〜
Ｑ−１１５；Ａ−２３〜Ｔ−１１４；Ａ−２３〜Ｗ−１１３；Ａ−２３〜Ｐ−１
１２；Ａ−２３〜Ｑ−１１１；Ａ−２３〜Ｇ−１１０；Ａ−２３〜Ｒ−１０９；
Ａ−２３〜Ｔ−１０８；Ａ−２３〜Ｄ−１０７；Ａ−２３〜Ｖ−１０６；Ａ−２
３〜Ｍ−１０５；Ａ−２３〜Ｌ−１０４；Ａ−２３〜Ｖ−１０３；Ａ−２３〜Ｓ
−１０２；Ａ−２３〜Ｆ−１０１；Ａ−２３〜Ｎ−１００；Ａ−２３〜Ｇ−９９
；Ａ−２３〜Ｓ−９８；Ａ−２３〜Ｄ−９７；Ａ−２３〜Ｇ−９６；Ａ−２３〜
Ｓ−９５；Ａ−２３〜Ｅ−９４；Ａ−２３〜Ｌ−９３；Ａ−２３〜Ｐ−９２；Ａ
−２３〜Ｇ−９１；Ａ−２３〜Ｌ−９０；Ａ−２３〜Ｅ−８９；Ａ−２３〜Ｌ−
８８；Ａ−２３〜Ｓ−８７；Ａ−２３〜Ｌ−８６；Ａ−２３〜Ｎ−８５；Ａ−２
３〜Ｓ−８４；Ａ−２３〜Ｈ−８３；Ａ−２３〜Ｌ−８２；Ａ−２３〜Ｑ−８１
；Ａ−２３〜Ａ−８０；Ａ−２３〜Ｒ−７９；Ａ−２３〜Ｇ−７８；Ａ−２３〜
Ｌ−７７；Ａ−２３〜Ｆ−７６；Ａ−２３〜Ｒ−７５；Ａ−２３〜Ｓ−７４；Ａ
−２３〜Ｈ−７３；Ａ−２３〜Ｙ−７２；Ａ−２３〜Ｌ−７１；Ａ−２３〜Ｔ−
７０；Ａ−２３〜Ｅ−６９；Ａ−２３〜Ｌ−６８；Ａ−２３〜Ｓ−６７；Ａ−２
３〜Ｇ−６６；Ａ−２３〜Ｒ−６５；Ａ−２３〜Ｆ−６４；Ａ−２３〜Ｆ−６３
；Ａ−２３〜Ｔ−６２；Ａ−２３〜Ａ−６１；Ａ−２３〜Ｌ−６０；Ａ−２３〜
Ｌ−５９；Ａ−２３〜Ｅ−５８；Ａ−２３〜Ｅ−５７；Ａ−２３〜Ｓ−５６；Ａ
−２３〜Ｐ−５５；Ａ−２３〜Ｗ−５４；Ａ−２３〜Ｌ−５３；Ａ−２３〜Ｓ−
５２；Ａ−２３〜Ｒ−５１；Ａ−２３〜Ｗ−５０；Ａ−２３〜Ｉ−４９；Ａ−２
３〜Ａ−４８；Ａ−２３〜Ｅ−４７；Ａ−２３〜Ｒ−４６；Ａ−２３〜Ｖ−４５
；Ａ−２３〜Ｑ−４４；Ａ−２３〜Ｆ−４３；Ａ−２３〜Ｇ−４２；Ａ−２３〜
Ｐ−４１；Ａ−２３〜Ｐ−４０；Ａ−２３〜Ｒ−３９；Ａ−２３〜Ａ−３８；Ａ
−２３〜Ａ−３７；Ａ−２３〜Ｖ−３６；Ａ−２３〜Ｌ−３５；Ａ−２３〜Ｌ−
３４；Ａ−２３〜Ｖ−３３；Ａ−２３〜Ｓ−３２；Ａ−２３〜Ｇ−３１；Ａ−２
３〜Ｇ−３０；およびＡ−２３〜Ｖ−２９。これらのポリヌクレオチドによって
コードされるポリペプチドもまた本発明によって含まれる。本願はまた、上に記
載されるＤ−ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なく
とも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または
９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むかあるいはこれらからなる核酸分
子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合された上記のポリ
ヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸および／またはポリヌクレオチド配
列によってコードされるポリペプチドもまた本発明に含まれ、これは、上記アミ
ノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７
％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはこれらからなる
ポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであ
る。
【０１１８】 本発明はまた、ｍ−ｎで記載されるＤ−ＳＬＡＭポリペプチド配列と少なくと
も８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９
９％同一であるポリペプチドを含むタンパク質に関する。好ましい実施形態にお
いて、本出願は、本明細書中に記載される特定のＤ−ＳＬＡＭ Ｎ末端欠失およ
びＣ末端欠失のアミノ酸を有するポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９
０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリペ
プチドを含むタンパク質に関する。これらのポリペプチドによってコードされる
ポリヌクレオチドもまた本発明に含まれる。本発明はまた、上記Ｄ−ＳＬＡＭポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９
０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌ
クレオチドを含むかまたはこれらからなる核酸に関する。本発明はまた、異種ポ
リヌクレオチド配列に融合された上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これ
らの核酸および／またはポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチ
ドもまた本発明に含まれ、これは、上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５
％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である
アミノ酸配列を含むかまたはこれらからなるポリペプチドおよびこのようなポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【０１１９】 とりわけ、本発明の特に好ましいフラグメントは、Ｄ−ＳＬＡＭの構造的なま
たは機能的属性により特徴付けられるフラグメントである。このようなフラグメ
ントは、完全な（すなわち、全長の）Ｄ−ＳＬＡＭ（配列番号２）のαヘリック
ス領域およびαヘリックス形成領域（「α領域」）、βシート領域およびβシー
ト形成領域（「β領域」）、ターン領域およびターン形成領域（「ターン領域」
）、コイル領域およびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性
領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、表面形成領域および高抗原性指標領域
（すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプログラムのデフォルトパラメーターを
使用して同定される場合、１．５以上の抗原性指数を有する４つ以上の連続した
アミノ酸残基を含む）を含むかまたはこれらからなるアミノ酸残基を含む。特定
の好ましい領域は、図３に開示される領域であり、そして図１に示されるアミノ
酸配列（配列番号２）の分析によって同定される上記の型の領域を含むが、これ
らに限定されない。このような好ましい領域は、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ
の推定α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ
の推定α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔ
ｔｌｅの推定親水性領域、および疎水性領域；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのα両親媒性
領域およびβ両親媒性領域；Ｅｍｉｎｉ表面形成領域；ならびにＪａｍｅｓｏｎ
−Ｗｏｌｆ高抗原性指標領域（これらのコンピュータープログラムのデフォルト
パラメーターを使用して予測されるような）を含む。これらのポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０１２０】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、Ｄ−ＳＬＡＭの機
能的属性をコードする。これに関して本発明の好ましい実施形態は、Ｄ−ＳＬＡ
Ｍのαヘリックス領域およびαヘリックス形成領域（「α領域」）、βシート領
域およびβシート形成領域（「β領域」）、ターン領域およびターン形成領域（
「ターン領域」）、コイル領域およびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水
性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成
領域および高抗原性指標領域を含むかまたはこれらからなるフラグメントを含む
。
【０１２１】 上記のように、図１および／または表Ｉに記載されるＤ−ＳＬＡＭの構造的な
または機能的属性を表すデータは、デフォルトパラメータに記載されるＤＮＡ*
ＳＴＡＲの種々のモジュールおよびアルゴリズムを使用して作製した。好ましい
実施形態において、表Ｉの欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、およびＸＩＶに提示さ
れるデータを使用して抗原性についての高い程度の可能性を示すＤ−ＳＬＡＭの
領域を決定し得る。高抗原性の領域を抗原認識が免疫応答の開始のプロセスにお
いて生じ得る環境で、ポリペプチドの表面におそらく曝露されるポリペプチドの
領域を示す値を選択することによって、欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、および／
またはＩＶに示されるデータから決定される。
【０１２２】 これらに関して特定の好ましい領域は、図３にて示されるが、表Ｉに示される
ように、図３に提示されるデータの表形式において表され得るか、または同定さ
れ得る。図３（最初のデフォルトパラメータに対して設定される）を作製するた
めに使用されるＤＮＡ*ＳＴＡＲコンピュータアルゴリズムを使用して、表形式
（表Ｉを参照のこと）の図３においてデータを示した。図３におけるデータの表
形式を使用して、好ましい領域の特定の境界を容易に決定し得る。
【０１２３】 図３および表Ｉに示される上記の好ましい領域は、図１に示されるアミノ酸配
列の分析によって同定される上記の型の領域を含むが、これらに限定されない。
図３および表Ｉに示されるように、そのような好ましい領域は、Ｇａｒｎｉｅｒ
−Ｒｏｂｓｏｎ α−領域、β−領域、ターン−領域、およびコイル−領域、Ｃ
ｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ α−領域、β−領域、およびコイル−領域、Ｋｙｔｅ−
Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性領域、疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ α−両親媒
性領域およびＥｉｓｅｎｂｅｒｇ β−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈ
ｕｌｚ可撓性領域、Ｅｍｉｎｉ表面形成領域、および高抗原性指標のＪａｍｅｓ
ｏｎ−Ｗｏｌｆ領域を含む。
【０１２４】 この点について、非常に好ましいフラグメントには、表１において記載された
いくつかの特徴のような、いくつかの構造的特徴を組み合わせるＤ−ＳＬＡＭの
領域を含むかあるいはこれらからなるフラグメントがある。
【０１２５】 他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性なＤ−ＳＬＡＭフラグメントで
ある。生物学的に活性なフラグメントは、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの活性に類
似するが必ずしも同一ではない活性を示すフラグメントである。このフラグメン
トの生物学的活性は、改善された所望の活性または減少された望ましくない活性
を含み得る。
【０１２６】 しかし、多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可
能であり、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列
のいくつかは、配列番号１に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能で
あったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本
発明の範囲から特に除外される。例えば、以下のＥＳＴは、好ましくは本発明か
ら除外される：ＡＡ９１７３３５；ＡＩ０９４８１８、ＡＩ２９８４１３；Ｎ６
２５２２；ＡＡ６２７５２２；Ｒ１１６３５；ＡＡ３２０４０８；ＡＡ３７９１
１２；Ｒ０９８４１；Ｚ２０３２０；Ｎ７９４２１；Ｄ４５８００；Ｔ９８９５
９；ＡＡ２１７２９０；Ｎ３０１９７；ＡＡ２８６１３２；およびＡＡ６３３９
８３（本明細書によってその全体において参考として援用される）。しかし、全
ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好ましくは、本発明からは、
一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここで、ａは配列番号１の１
〜３２０６の間の任意の整数であり、ｂは１５〜３２２０の整数であり、ここで
ａおよびｂの両方は配列番号１に示されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そ
してここでｂはａ＋１４以上である）を含むかあるいはこれらからなる１つ以上
のポリヌクレオチドが除外される。
【０１２７】 （エピトープ保有ペプチド） 本発明は、以下のポリペプチドを含むか、またはあるいは以下からなるポリペ
プチドを含む：配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド配列のエピトー
プ、または寄託されたクローンＨＤＰＪＯ３９（ＡＴＣＣ寄託番号２０９６２３
）に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされるか、あるいは前述で定
義されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより
低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１の配列（
すなわち、寄託されたクローンＨＤＰＪＯ３９に含まれる）の相補鎖にハイブリ
ダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド配列のエピト
ープ。本発明はさらに、本発明のポリペプチド配列のエピトープをコードするポ
リヌクレオチド配列（例えば、配列番号１に開示される配列など）、本発明のエ
ピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、
および前記で定義されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下またはより低いストリンジェンシー条ハイブリダイゼーション件下で、相補
鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１２８】 用語「エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、動物において、好ま
しくは哺乳動物において、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または
免疫原性活性を有するポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、
本発明は、エピトープを含むポリペプチド、およびこのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む。「免疫原性エピトープ」とは、本明細書中で使用さ
れる場合、当該分野で公知の任意の方法によって決定されるような（例えば、下
記に記載される抗体を産生するための方法による）、動物における抗体応答を誘
発するタンパク質の一部として定義される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３
）を参照のこと）。用語「抗原性エピトープ」とは、本明細書中で使用される場
合、当該分野で周知の任意の方法（例えば、本明細書中に記載される免疫アッセ
イによる）によって決定されるような、抗体がその抗原に免疫特異的に結合し得
るタンパク質の一部として定義される。免疫特異的結合は、非特異的結合は除外
するが、他の抗原との交差反応を除外する必要はない。抗原性エピトープは、免
疫原性である必要はない。
【０１２９】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の方法によって産生さ
れ得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。これはさらに
、米国特許第４，６３１，２１１号に記載される）。
【０１３０】 本発明においては、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４、少なく
とも５、少なくとも６、少なくとも７アミノ酸配列を含み、より好ましくは、少
なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０
、少なくとも２５のアミノ酸配列を含み、そして最も好ましくは約１５アミノ酸
と約３０アミノ酸との間の配列を含む。免疫原性エピトープまたは抗原性エピト
ープを含有する好ましいポリペプチドは、少なくとも１０、１５、２０、２５、
３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、
９０、９５または１００アミノ酸残基の長さである。抗原性エピトープは、有用
である（例えば、エピトープに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含
む）を惹起するため）。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおいて、標的分
子として使用され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−
７７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０
−６６６（１９８３）を参照のこと）。
【０１３１】 同様に、免疫原性エピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に従
う抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら
，前出；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：
９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３
４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。１つ以上の免疫原性エピトープを
含むポリペプチドは、キャリアタンパク質（例えば、アルブミン）とともに動物
系（例えば、ウサギまたはマウスのような）に対する抗体応答を誘発するために
提示され得るか、またはこのポリペプチドが十分に長い場合（少なくとも約２５
アミノ酸）、そのポリペプチドはキャリアなしで提示され得る。しかし、８〜１
０個程度の少なさのアミノ酸を含む免疫原性エピトープは、少なくとも変性ポリ
ペプチド中の直鎖状エピトープに結合し得る抗体を惹起するには十分であること
が示されている（例えば、ウェスタンブロッティングにおいて）。
【０１３２】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。これらの周知の方法としては、インビボ免疫、
インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定
されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出、およ
びＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：２３４７−２３５４（１
９８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用
いて免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キ
ーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチ
ドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペ
プチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｍ
ＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペプ
チドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリア
に結合され得る。例えば、ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離
のペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、約１００
マイクログラムのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバ
ントまたは免疫応答を刺激することが公知である他のアジュバントを含むエマル
ジョンを腹腔内注射および／または皮内注射することにより免疫される。いくつ
かのブースター注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば
、約２週間の間隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着し
た遊離のペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動
物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当
該分野で周知の方法に従う固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗
体の溶出による）により上昇し得る。
【０１３３】 当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピト
ープフラグメントまたは抗原性エピトープフラグメントを含む本発明のポリペプ
チドは、他のポリペプチド配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチド
は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたは
それらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組み合わせ、お
よびこれらの部分）と融合し得、これがキメラポリペプチドを生じる。このよう
な融合タンパク質は、精製を容易にし得、そしてインビボにおける半減期を増加
し得る。このことは、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺
乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなる
キメラタンパク質について示された。例えば、ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕ
ｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４−８６（１９８８）を参照のこと
。ジスルフィド架橋二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、そのＩｇ
Ｇ部分ジスルフィド結合に起因して、単量体ポリペプチドまたはそれらのフラグ
メント単独よりも、他の分子の結合および中和において効果的であることが見出
された。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０
：３９５８−３９６４（１９９５）を参照のこと。上記のエピトープをコードす
る核酸はまた、エピトープタグ（例えば、血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフ
ラッグタグ（ｆｌａｇ ｔａｇ））として目的の遺伝子と組換えられ、発現され
たポリペプチドの検出および精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら
によって記載された系は、ヒト細胞株において発現される非変性融合タンパク質
の迅速な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７）。この系において
、目的の遺伝子は、遺伝子の読み取り枠が、６つのヒスチジン残基からなるアミ
ノ末端タグと翻訳で融合されるように、ワクシニア組換えプラスミド中にサブク
ローンされる。このタグは、融合タンパク質についての基質結合ドメインとして
はたらく。組換えワクシニアウイルスに感染した細胞由来の抽出物は、Ｎｉ２＋
ニトリロ三酢酸アガロースカラムに充填され、そしてヒスチジンタグ化したタン
パク質が、イミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。
【０１３４】 本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを使用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、この
ような方法を用いて、変化した活性を有するポリペプチド、ならびにそのポリペ
プチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る。一般には、米国特許第
５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号
；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａ
ｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−
３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏおよびＢｌａ
ｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９９８）
（これらの特許および刊行物の各々は、本明細書によってその全体が参考として
援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号１に対応するポ
リヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプ
チドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリン
グは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、２つ以上のＤＮＡセグメント
をアセンブリして、ポリヌクレオチド配列における変化を産生することを含む。
別の実施形態において、本発明のポリヌクオチドまたはコードされるポリペプチ
ドは、組換え前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他
の方法による、ランダムな変異誘発に供されることによって改変され得る。別の
実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ
以上の成分、モチーフ、セクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラ
グメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、セクション
、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。
【０１３５】 （抗体） さらに、本発明のポリペプチドは、（特異的な抗体抗原結合をアッセイするた
めの当該分野で周知のイムノアッセイによって決定されるような）本発明の配列
番号Ｙの、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、または改変体、および／
またはエピトープに免疫特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセプター（Ｔ
ＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、
多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフ
ラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生
されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体
に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメ
ントを含むが、限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは
、免疫グロブリン分子および免疫グロリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわ
ち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫
グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、
ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意のサブク
ラスであり得る。免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖の両方を有し得る。ＩｇＧ
、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹの重鎖は、κまたはλ形態の
軽鎖と対になり得る。特定の実施形態において、本発明の免疫グロブリンは、Ｉ
ｇＧである。別の実施形態において、本発明の免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ４
である。
【０１３６】 最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃ
Ｆｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶ
Ｈドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない
。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１ドメ
イン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗
原結合フラグメントがまた本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳
動物を含む任意の動物起点由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネ
ズミ（ｍｕｒｉｎｅ）（例えば、マウスおよびウサギ）、ロバ、シップウサギ（
ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ
である。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンの
アミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまた
は１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、そして内
因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離さた抗体（下に記載のように、そ
して例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８
号において記載のような）を含む。
【０１３７】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異性の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なる
エピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異
種のエピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）、の両方
に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；同ＷＯ ９
２／０８８０２；同ＷＯ ９１／００３６０；同ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕ
ｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４
，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、
同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０１３８】 本発明の抗体は、これらが認識または特異的に結合する、本発明のポリペプチ
ドのエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。このエピトープ
またはポリペプチドの部分は、本明細書中（例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置に
よって、アミノ酸残基におけるサイズによって、または表もしくは図に列挙され
ることによって）に記載されるように、特定化され得る。本発明の任意のエピト
ープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って
、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そして本発明のポリペプ
チドの排除を可能にする抗体を含む。
【０１３９】 好ましい非排他的実施形態において、本発明の抗体は、特定の結合を介して本
発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドの１以上の生物学的活性を阻害する。より好ま
しい実施形態において、本発明の抗体は、Ｂ細胞増殖のＤ−ＳＬＡＭ媒介阻害を
阻害する。さらに好ましい実施形態において、本発明の公知あのは、Ｂ細胞の増
殖を刺激する。さらに好ましい実施形態において、本発明の抗体は、１以上のさ
らなる抗体および／またはポリペプチドおよび／またはＢ細胞増殖を制御するた
めの他の薬剤および／またはこれらに関連生物学的現象と組合せて使用される。
【０１４０】 本発明の抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。本
発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログまたはホモログを結合し
ない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少な
くとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少な
くとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および
少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載され
る方法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた、
本発明に含まれる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトタンパク質
の、マウスホモログ、ラットホモログおよび／またはウサギホモログならびに対
応するそれらのエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドに対して９５
％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５
％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知の
方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算される場合）を有するポリ
ペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において
、上記の交差反応性は、本明細書中に開示された、任意の単一特異的な抗原性ま
たは免疫原性ポリペプチド、あるいは２、３、４、５以上の特異的抗原性および
／または免疫原生ポリペプチドの組み合わせに関する。さらに、ハイブリダイゼ
ーション条件下（本明細書中で記載されるような）で本発明のポリヌクレオチド
にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを結合
する抗体が、本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドに
対するそれらの結合親和性について記載または特定化され得る。好ましい結合親
和性としては、５×１０-2Ｍ未満、１０-2Ｍ未満、５×１０-3Ｍ未満、１０-3Ｍ
未満、５×１０-4Ｍ未満、１０-4Ｍ未満、５×１０-5Ｍ未満、１０-5Ｍ未満、５
×１０-6Ｍ未満、１０-6Ｍ未満、５×１０-7Ｍ未満、１０-7Ｍ未満、５×１０-8 Ｍ未満、１０-8Ｍ未満、５×１０-9Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、５×１０-10Ｍ未満
、１０-10Ｍ未満、５×１０-11Ｍ未満、１０-11Ｍ未満、５×１０-12Ｍ未満、１
０-12Ｍ未満、５×１０-13Ｍ未満、１０-13Ｍ未満、５×１０-14Ｍ未満、１０-1 4 Ｍ未満、５×１０-15Ｍ未満または１０-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有
する親和性が挙げられる。
【０１４１】 本発明はまた、競合性結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例
えば、本明細書中で記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、本
発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ま
しい実施形態において、この抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少
なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少
なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープへの結合を競合的に阻害
する。
【０１４２】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リ
ガンド相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。好まし
くは、本発明の抗体は、本明細書中で開示された抗原性エピトープ、またはその
部分を結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の
両方の特徴を有する。本発明はまた、リガンド結合を妨害しないがレセプター活
性化を妨害するレセプター特異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すな
わち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野
で公知の技術により決定され得る。例えば、レセプター活性化は、レセプターの
リン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）、または免疫沈降それ
に続くウェスタンブロット分析（例えば、上記のような）によってその基質を検
出することにより、決定され得る。特定の実施形態において、この抗体の非存在
下で、リガンド活性またはレセプター活性を、その活性の少なくとも９５％、少
なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少
なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が提
供される。
【０１４３】 本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプタ
ー特異的抗体、ならびにレセプターリガンド複合体を認識し、そして好ましくは
、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しな
い抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合し、そしてレセプタ
ーへのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結合し、それにより
レセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターを結合することを妨げない
抗体を含む。さらに、本発明は、レセプターを活性化する抗体を含む。これらの
抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、例えば、レセプター
の二量化を誘発することによってリガンド媒介レセプター活性化の生物学的活性
化の全てまたはサブセットのいずれかを増強するかまたは活性化し得る。この抗
体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特異的生物学的活性を含む生
物学的活性についてのアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストとして特
定化され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され
得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９
７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）
；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１
９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１
７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０
９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：
３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１
（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔ
ａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒ
ｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０
１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６
２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−
１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１
４−２０（１９９６）（これらは全て、その全体が参考として本明細書中に援用
される）を参照のこと。
【０１４４】 本発明の抗体は、例えば、これらに限定されないが、本発明のポリペプチドを
精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロ
およびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、この抗体は
、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的におよび定
量的に測定するためのイムノアッセイにおける用途を有する。例えば、Ｈａｒｌ
ｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
第２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される）を参照の
こと。
【０１４５】 以下にさらに詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独または他の化合
物との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体はさらに、ポリペプチド
または他の化合物へＮ末端でもしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融
合され得るか、または化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）され得
る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子およ
び異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素のようなエフェクター分子
へ組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９
５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９
９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。
【０１４６】 本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨げ
ないような、抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導体を含
む。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチ
ル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏ
ｎ）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）
による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質
への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が
、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成など
を含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘
導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０１４７】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マ
ウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与され得、抗原に対して
特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導する。種々のアジュバント
が、免疫学的応答を増加させるために使用され得、宿主種に依存し、そしてフロ
イント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（ｍｉ
ｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニック（ｐ
ｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホール
リンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−
ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのような強
力に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。このようなアジ
ュバントはまた、当該分野で周知である。
【０１４８】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（上記の参考文献は、その全体
が参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「
モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定
されない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、また
はファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてモノク
ローナル抗体が生成される方法ではない。
【０１４９】 「モノクローナル抗体」は、２個のタンパク質（すなわち、重鎖および軽鎖）
を含むか、またはそれからなり得る。
【０１５０】 ハイブリドーマ技術を用いて特定の抗体に対して産生およびスクリーニングす
る方法は、慣用的であり、そして当該分野において周知であり、実施例（実施例
１１）において詳細に議論される。非限定な例において、マウスを、本発明のポ
リペプチドまたはこのようなペプチドを発現する細胞を用いて免疫化し得る。一
旦、免疫応答が検出される（例えば、抗原に対して特異的な抗体がマウス血清中
に検出される）と、マウスの脾臓を回収し、そして脾細胞を単離する。次いで、
脾細胞は、周知の技術によって、任意の適切なミエローマ細胞（例えば、ＡＴＣ
Ｃから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）へ融合される。ハイブリドーマを
、限定希釈により選択およびクローン化する。次いで、ハイブリドーマクローン
を本発明のポリペプチドを結合し得る抗体を分泌する細胞について、当該分野に
公知の方法によってアッセイする。一般的に高レベルの抗体を含む腹水を、ポジ
ティブなハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫化することにより、産生
し得る。
【０１５１】 従って、本発明は、モノクローナル抗体、および本発明の抗体を分泌するハイ
ブリドーマ細胞を培養する工程を含む方法によって産生される抗体を、産生する
方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、ミエローマ細胞を
有する本発明の抗原を用いて免疫化されたマウスから単離された脾細胞を融合す
ることにより、次いで、本発明のペプチドを結合し得る抗体を分泌するハイブリ
ドーマクローンについて、その融合から生じるハイブリドーマをスクリーニング
することにより、産生される。
【０１５２】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により産生し得
る。例えば、本発明のＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは
、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’
）２フラグメントを産生するため）のような酵素を使用して、免疫グロブリン分
子のタンパク質分解性切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメント
は、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１５３】 例えば、本発明の抗体はまた、当該分野に公知の種々のファージディスプレイ
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ方法において、機能的な抗体
ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子
の表面上に提示される。特定の実施形態において、このようなファージを、レパ
ートリー抗体ライブラリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、
ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために利用し得
る。目的の抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、抗原を用い
て、（例えば、標識化抗原、あるいは固体表面または固体ビーズへ結合または捕
捉された抗原を使用して）選択または同定し得る。これらの方法において使用さ
れるファージは、代表的に、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺
伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたは
ジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現された
ｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）ファージ
である。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法
の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１〜５０（１９９５）；Ａｍｅｓ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７〜１８６（１９９５
）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５
２〜９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９〜１８（１９
９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５
７：１９１〜２８０（１９９４）；ＰＣＴ公開 ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４
；ＰＣＴ公開 ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１
０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２
；ＷＯ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，
２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同
第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７
号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，
６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７
３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらのそれぞれは、その全
体が参考として援用される）。
【０１５４】 上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体
をコードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体、または任意の他の所望の抗原
結合フラグメントを作製するために単離および使用され得、そして例えば、以下
に詳細に記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細
菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’お
よびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該
分野で公知の方法を用いて使用され得る。この方法は、例えば、以下に開示され
る方法である：ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、Ｂｉｏ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａ
ｗａｉら、ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（上記の参考文献は
、その全体が参考として援用される）。
【０１５５】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビト
ロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体または
ヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体は、この抗体の異なる部分が異
なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域
およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体を産生す
るための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；および米国特許第５，８
０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号
を参照のこと（これらは、本明細書中でその全体が参照として援用される）。ヒ
ト化抗体は、非ヒト種由来の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫
グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する、非ヒ
ト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域におけるフ
レームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基と置換され、抗原結
合を改変（好ましくは、改善）する。これらのフレームワーク置換は、当該分野
で周知の方法により同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を
同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリング、ならび
に特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によ
る。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍ
ａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）（これらは本明細書中で
その全体が参考として援用される）を参照のこと）。抗体は、例えば、以下を含
む当該分野で公知の種々の技術を用いてヒト化され得る：ＣＤＲ−グラフティン
グ（ｇｒａｆｔｉｎｇ）（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開 ＷＯ９１
／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号お
よび同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または
リサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号
；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉ
ｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１
４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９
４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（
米国特許第５，５６５，３３２号）。
【０１５６】 完全なヒト抗体が、ヒト患者の治療的処置に対して特に望ましい。ヒト抗体は
、当該分野で公知の種々の方法によって作製され得、これらの方法としては、ヒ
ト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプ
レイ方法が挙げられる。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６
，１１１号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３
、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ
９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１（これらの各々は、その全体が
参考として本明細書中に援用される）もまた参照のこと。
【０１５７】 ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。この改変された胚性幹細胞を増殖させ、そして胚盤胞
に微量注入して、キメラマウスを産生する。次に、このキメラマウスを、ヒト抗
体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニッ
クマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または一部
）を用いて通常の様式で免疫する。その抗原に対するモノクローナル抗体は、従
来のハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ
得る。ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間のトランスジェニック
マウスの再編成によってかくまわれ（ｈａｒｂｏｒｅｄ）、そしてその後、クラ
ススイッチングおよび体細胞変異を受ける。従って、そのような技術の使用によ
って、治療的に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の
産生が可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、Ｌｏ
ｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５
−９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産
生するためのこの技術のならびにそのような抗体を産生するためのプロトコール
の詳細な議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２
／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０
５９８ ８７７；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号
；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０
１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８
５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８号を
参照のこと（これらは、その全体が本明細書中に参考として援用される）。さら
に、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａ
ｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のような企業は、上記の技術に類似した技術を
用いて選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し得る。
【０１５８】 選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉ
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される（Ｊｅｓｐｅｒｓら
、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０１５９】 さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて
、本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成するために
順々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥ
Ｂ Ｊ．７（５）：４３７−４４４（１９８９）；ならびにＮｉｓｓｉｎｏｆｆ
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照
のこと）。例えば、結合し、そしてポリペプチドのマルチマー化（ｍｕｌｔｉｍ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ）および／または本発明のポリペプチドのリガンドに対する
結合を競合的に阻害する抗体を用いて、このポリペプチドのマルチマー化および
／または結合ドメインを「模倣し」、そして結果として、ポリペプチドおよび／
またはそのリガンドに結合し、そして中和する抗イディオタイプを生成し得る。
このような中和抗イディオタイプまたはこのような抗イディオタイプのＦａｂフ
ラグメントは、治療レジメンにおいて使用されて、ポリペプチドリガンドを中和
し得る。例えば、このような抗イディオタイプ抗体を使用して、本発明のポリペ
プチドを結合し得るか、そして／またはそのリガンド／レセプターを結合し得、
それによって、その生物学的活性をブロックし得る。
【０１６０】 （抗体をコードするポリヌクレオチド） 本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、またはより低いストリジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で（例え
ば、上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異
的に結合する、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに
結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドを含む。
【０１６１】 ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そして
そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレ
オチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅ
ｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるよ
うな）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする
配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリ
ゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリ
ゴヌクレオチドの増幅。
【０１６２】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸
は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡラ
イブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の
抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡラ
イブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））か
ら、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクロー
ンを同定するために、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合
成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的
なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。Ｐ
ＣＲによって生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方
法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０１６３】 一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成
し得る。
【０１６４】 特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得る
か、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフ
レームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域につい
ては、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１
９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み
合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的
に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上
のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そ
のアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方
法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、
鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ
酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変
更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。
【０１６５】 さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「
キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅ
ｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る
。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であ
り、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来
の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
【０１６６】 あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，
７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈ
ｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７
９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４
−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領
域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結され
れることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける
機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０１６７】 （抗体を産生する方法） 本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって
、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生
され得る。
【０１６８】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、そ
の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とす
る。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの
部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポ
リヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で
周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク
質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗
体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを
含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば
、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが
挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明
の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ド
メインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。
このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ８６／
０５８０７；ＰＣＴ公開 ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２
，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの
抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクタ
ーにクローニングされ得る。
【０１６９】 この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのト
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗
体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現につ
いての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクター
は、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞
中に同時発現され得る。
【０１７０】 種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラス
ミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードす
る配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換え
ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タ
バコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または抗体をコードする
配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転
換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（
例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来する
プロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス
７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例
えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。好ましくは、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組
換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のため
に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要即時性初期（ｍａ
ｊｏｒ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子プロモーターエレメン
トのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（Ｃ
ＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃ
ｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
【０１７１】 細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
べき場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タン
パク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベ
クターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配
列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍ
ｅ）で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ
発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１
９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅ
ｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９
（１９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させる
ために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そし
て溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着お
よび結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され
得る。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部
位を含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は
、ＧＳＴ部分から放出され得る。
【０１７２】 昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体
病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用
される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に
おいて増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例え
ばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモ
ーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０１７３】 哺乳動物宿主細胞においては、多数のウィルスに基づく発現系が利用され得る
。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体
をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロ
モーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、
このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウ
ィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１ま
たはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を
発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１
９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコード
する配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ
開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全
体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性
翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であ
り得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、な
どの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０１７４】 さらに、宿主細胞系統は、選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、また
は、所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。
タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（
例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は
、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特
徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された異種タ
ンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。こ
の目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の
正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され
得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、
ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８
３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、な
らびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細
胞株を含むが、これらに限定されない。
【０１７５】 組換えタンパク質の長期間の高収率産生、安定発現が好ましい。例えば、安定
に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウィルスの複製起点を含む発現ベ
クターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモー
ター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、など）
、および選択マーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得る。異種ＤＮ
Ａの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖させられ得、
次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択マーカーは
、選択に対する耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをその染色体内に安定に
組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、これを今度はクローニングし
得、増殖して細胞株になり得ることを可能にする。この方法は、抗体分子を発現
する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。このような操作された細胞
株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリーニングお
よび評価において、特に有用であり得る。
【０１７６】 多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウィルスチミジンキ
ナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサン
チン−グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓ
ｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２
０２（１９９２））、およびアデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌ
ｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが限定されず
、これらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれ
ぞれ使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の根拠とし
て使用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗ
ｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０
）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：
１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸にに対する耐性を与
える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−
４１８に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４
８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（
１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔ
ｏｘｉｃｏｌ． ３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ ａｎ
ｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１
７（１９９３）；１９９３年５月、ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２
１５）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンにに対する耐性を与える
（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ
技術の分野で周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に
適用され得、そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓ
ｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）
；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓ
ｓ、ＮＹ（１９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（
編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ
−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５０：１（１９８１）（これ
らはその全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０１７７】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、
ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅ
ｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３
．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこ
と）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能であると、宿主
細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子
のコピーの数を増加する。増幅領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産
生もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７
（１９８３））。
【０１７８】 宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコード
する第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター
）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖
のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択マーカーを含み得る。あ
るいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方のポリペプチ
ドをコードし、そして発現することができる。このような状況において、過剰の
毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである（Ｐｒ
ｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８０））
。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る
。
【０１７９】 一旦本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成されるか
、または組換えにより発現されると、当該分野で公知の、免疫グロブリン分子の
精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、
アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対するアフィニティー
による）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、ま
たはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるかま
たはそうでなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合され
得、精製を容易にする。
【０１８０】 本発明は、融合タンパク質を生成するために、本発明のポリペプチド（もしく
はその部分、好ましくはこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０
、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）に、組換えに
より融合されるかまたは化学的に結合される（共有結合および非共有結合の両方
を含む）、抗体、を含む。この融合は、直接的である必要はないが、リンカー配
列を介して起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはその部分、
好ましくはこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０
、７０、８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり
得る。例えば、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペ
プチドを特定の細胞表面のレセプターに特異的な抗体に融合または結合させるこ
とによって、特定の細胞のタイプに対して、本発明のポリペプチドを標的にする
ために、抗体が使用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または結合される抗
体はまた、インビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製
方法において使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、前記、およびＰＣＴ公開
ＷＯ９３／２１２３２；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８
１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；
Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）を
参照のこと。これらは、その全体が参考として援用される。
【０１８１】 本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメインに融合または結合された、本
発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗
体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。本発明のポリぺプチ
ドに融合されたこの抗体の部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは部分の
任意の組合せを含み得る。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融
合または結合され得、多量体を形成する。例えば、本発明のポリぺプチドに融合
されたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結合を通して二量体を形成
し得る。より高度の多量体形態は、ポリぺプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に
融合させることによって作製され得る。本発明のポリぺプチドを抗体部分に融合
または結合させるための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特
許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４
６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２
，９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ９
６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１
）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９
５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９
：１１３３７−１１３４１（１９９２）（前記の参考文献はその全体が参考とし
て援用される）を参照のこと。
【０１８２】 上で考察されたように、ポリぺプチド、ポリぺプチドフラグメント、または配
列番号２の改変体に対応するポリぺプチドは、このポリぺプチドのインビボ半減
期を増大させるため、または当該分野で公知の方法を使用する免疫学的アッセイ
において使用するために、上記の抗体部分に融合または結合され得る。さらに、
配列番号２に対応するポリぺプチドを、上記の抗体部分に融合または結合して、
精製を容易にし得る。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の
２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域
の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している（ＥＰ ３９４，８
２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８
））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合ま
たは結合される、本発明のポリぺプチドもまた、単量体分泌タンパク質またはタ
ンパク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合しそして中和するのにさらに
効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０
：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分
は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良された薬物動態
学的な特性を生じ得る（ＥＰ Ａ ２３２，２６２）。あるいは、融合タンパク
質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失させることが
望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合
、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発見において、ｈ
ＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するた
めのハイスループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合さ
れてきた（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏ
ｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。
【０１８３】 さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするペプチド
のような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカー
アミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクタ
ー（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多
くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に
記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を
提供する。精製のために有用な別のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集
素タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅ
ｌｌ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグを含むが、これに限
定されない。
【０１８４】 本発明は、診断剤または治療剤に結合される、抗体またはそのフラグメントを
さらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所定の処置レジメン
（ｒｅｇｉｍｅｎ）の効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生または進
行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物
質と連結させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種
々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々
の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イ
オン、が挙げられる。この検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメント）
に対して、直接的または間接的のいずれかで、当該分野で公知の技術を使用する
媒介物（例えば、当該分野で公知のリンカーなど）を介して、連結または結合さ
れ得る。例えば、本発明に従う診断薬としての使用のための抗体に結合され得る
金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な
酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β
−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補
欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／
ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオ
レセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジ
ニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げら
れ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては
、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；ならびに、適切
な放射性物質の例としては、125Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎまたは99Ｔｃが挙げられる
。
【０１８５】 さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば
細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン
（例えば、α−エミッタ−（例えば２１３Ｂｉ）など）に結合され得る。細胞毒
または細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パ
クリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、
臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎ
ｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈ
ｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオ
ン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロ
ン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グル
ココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、
およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログ、が挙げられる
。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン
、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆ
ｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例えば、
メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、
カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド
（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール
、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン
白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アンスラサイクリン（例えば、ダウノ
ルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば
、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイ
シン、およびアンスラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、なら
びに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、を含むが、
それらに限定されない。
【０１８６】 本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤
または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば
、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであ
り得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、
腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、
血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス薬（例
えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９
号を参照のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照の
こと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６
：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１
０５号を参照のこと））、ＣＤ４０リガンド、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（
例えば、アンジオスタチン、エンドスタチンもしくはＶＥＧＩ）（国際公開番号
ＷＯ ９９／２３１０５を参照のこと）；または生物学的応答改変剤（例えばリ
ンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（
「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファー
ジコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−Ｃ
ＳＦ」）、または他の増殖因子など）、が挙げられ得る。
【０１８７】 抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免
疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラ
ス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１８８】 このような治療部分を抗体に結合する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ
ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔ
ａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆ
ｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃ
ｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８
５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓ
ｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａ
ｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３
−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら
、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐ
ｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」
、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
【０１８９】 あるいは、抗体は２次抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（こ
れは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによる
記載のような抗体の異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得
る。
【０１９０】 単独、あるいは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与
される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬とし
て使用され得る。
【０１９１】 （免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）） 本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利
用され得る。本発明の遺伝子の翻訳生成物は、細胞特異的マーカーとして、ある
いはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で差示
的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、または
エピトープの組み合わせに対して指向されるモノクロナール抗体は、マーカーを
発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発
現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体を用いて利用
され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁
気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パン
ニング」、ならびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６
６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９
）を参照のこと）が挙げられる。
【０１９２】 これらの技術は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における最少
残留疾患（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））
および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己
」細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にす
る。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖お
よび／または分化を受け得る、造血幹細胞および先祖細胞のスクリーニングを可
能にする。
【０１９３】 （抗体結合についてのアッセイ） 本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の方法により、免疫特異的結合
についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、いくつかのも
のについてだけ名称を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免
疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセ
イ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテイン
Ａ免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が
挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、そ
して当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参考として
援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的な免疫ア
ッセイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが意図
されない）。
【０１９４】 免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼインヒビターおよ
び／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチ
ニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０ま
たはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％
ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２
）、１％ Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する
工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間
）４℃でインキュベートする工程、プロテインＡセファロースビーズおよび／ま
たはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以
上４℃でインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、およ
びＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。目的の抗体
の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析により
、アッセイされ得る。当業者は、抗体の抗原への結合を増加するように、そして
バックグラウンドを減少させるように改変され得るパラメータ（例えば、セファ
ロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれいにする工程）に関して、知識が
あり得る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕ
ｓｕｂｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、
Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。
【０１９５】 ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、ポ
リアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％ ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）中でのそのタンパク質サンプルの電気泳動、そのタンパク質サンプル
をそのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン
のような膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱脂粉
乳を有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希
釈された一次抗体（目的の抗体）を用いてその膜をブロックする工程、洗浄緩衝
液中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質（例
えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるいは放
射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した二次抗体（一次抗体を認
識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いて、その膜をブロックする工程、洗浄緩衝
液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を包含す
る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバックグラウン
ドノイズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、知識があり得る
。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａ
ｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。
【０１９６】 ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合
した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程
、およびその抗原の存在を検出する工程を包含する。ＥＬＩＳＡにおいて、目的
の抗体は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能
な化合物に結合した第二の抗体（目的の抗体を認識する）が、ウェルに添加され
得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコー
ティングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した第二の抗体が、コー
ティングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は
、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該
分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、知識があり得る
。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，
１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１１．２．１を参照のこと。
【０１９７】 抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆ
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識抗原
（例えば、3Ｈまたは125Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での、目的の抗体
を用いるインキュベーション、および標識抗原に結合した抗体の検出を含む。特
定の抗原に対する目的の抗体の親和性、および結合オフレートは、スキャッチャ
ードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合はまた、
ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量の非標
識の第二の抗体の存在下で、標識化合物（例えば、3Ｈまたは125Ｉ）に結合した
目的の抗体とともにインキュベートされる。
【０１９８】 （治療用途） 本発明はさらに、抗体ベースの治療に関し、この治療は、１つ以上の開示され
た疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そし
て最も好ましくはヒトの患者に、本発明の抗体を投与する工程を包含する。本発
明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載されるような、それ
らのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコー
ドする核酸（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログ
および誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、これらに
限定されない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／ま
たは活性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載される任意の１つ
以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）（例えば、自己
免疫疾患、障害または以下を含むが、これらに限定されないこのような疾患もし
くは障害に関連する状態：自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性新生児血小板減少
、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質
症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、外傷性
心臓病、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡ腎症）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜
炎性眼炎、多発性内分泌腺症、紫斑（例えば、ヘーノホ（ヘノッホ）−シェーン
ライン紫斑病（Ｈｅｎｌｏｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ ｐｕｒｐｕｒａ））、ラ
イター病、スティッフマン症候群、自己免疫肺炎症（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｐ
ｕｌｍｏｎａｒｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｅｙｅ）、ギヤン−バレー症候
群、インスリン依存性真性糖尿病、および自己免疫炎症眼（ａｕｔｏｉｍｍｕｎ
ｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｅｙｅ）、自己免疫性甲状腺炎、甲状腺機能低
下症（すなわち、橋本甲状腺炎）、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー
症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫（例えば、（ａ）グレーヴズ病、（ｂ）筋
無力症、および（ｃ）インスリン抵抗性）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性
血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、抗コラーゲン抗体による強皮症、混合
結合組織病、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性貧血、特発性アディソン病、不妊症、
糸球体腎炎（例えば、原発性糸球体腎炎およびＩｇＡ腎症）、水疱性類天疱瘡、
シェーグレン症候群、真性糖尿病、およびアドレナリン薬物抵抗性（喘息または
嚢胞性線維症によるアドレナリン薬抵抗性を含む）、慢性活性肝炎、原発性胆汁
性肝硬変、他の内分泌性不全、ＭＩ後、心臓切開（ｃａｒｄｉｏｔｏｍｙ）症候
群、じんま疹、アトピー性皮膚炎、ぜん息、炎症性ミオパシー、ならびに他の炎
症性の、肉芽腫性の、変性の、および萎縮性の障害）を処置、阻害または予防す
るために使用され得る。
【０１９９】 特定の実施形態において、本発明の抗体は、慢性関節リウマチを処置、阻害、
予知、診断または予防するために使用される。
【０２００】 別の実施形態において、本発明の抗体は、全身性エリテマトーデスを処置、阻
害、予知、診断または予防するために使用される。
【０２０１】 本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害
または状態の処置および／または予防は、それらの疾患、障害または状態に関連
した症状を緩和する工程を含むが、これに限定されない。本発明の抗体はまた、
表面でＤ−ＳＬＡＭを発現している細胞および／または表面に結合しているＤ−
ＳＬＡＭを有する細胞を標的し、かつ殺傷するために使用される。本発明の抗体
は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載されるように、薬学的に
受容可能な組成物中に提供され得る。
【０２０２】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の要約は、身体内で局所的にまたは
全身的に、あるいは抗体の直接的細胞傷害性（例えば、補体による媒介（ＣＤＣ
）、またはエフェクター細胞による媒介（ＡＤＣＣ））により、本発明のポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これらのアプローチの
いくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供される教示を与え
られれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタリングの目的あ
るいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわかる。
【０２０３】 本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、ある
いはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７のような）と組み合わせて有利に利用され得る。
【０２０４】 本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療、抗腫瘍剤、抗体、および免疫グロブリン）との組
み合わせで投与され得る。一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種であ
る種起源または種反応性の生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態
においては、ヒトの抗体、フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療
または予防のために、ヒトの患者に投与される。
【０２０５】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に
関する免疫アッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために、本発
明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／または強
力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメント、
またはそれらの領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント
、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（
そのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性として
は、５×１０-2Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×１０-4Ｍ、１０-4 Ｍ、５×１０-5Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7 Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０- 10 Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ
、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍよ
り小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０２０６】 （遺伝子治療） 特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０２０７】 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。
【０２０８】 遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；および
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ
，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０２０９】 好ましい実施形態において、化合物は、抗体をコードする核酸配列を含有し、
上記核酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくは
キメラタンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一
部である。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結した
プロモーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、
そして必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体を
コードする配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組
換えを促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、従って抗体をコードする核
酸の染色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８
９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９
））。特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるい
はこの核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはそ
のフラグメントを含む。
【０２１０】 核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロ
で核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これ
らの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子
治療としてそれぞれ公知である。
【０２１１】 特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた生成物を産生する。これは、当該分野で公知
の多数の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部分として構築し
、そしてそれを（例えば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウ
イルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いる感染
により）細胞内になるように投与することにより、あるいは、裸のＤＮＡの直接
注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌ
ｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質または細胞表面のレセ
プターでコーティングするか、もしくは薬剤をトランスフェクトすることにより
、あるいは、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル中へのカプセル化に
より、あるいは、それらを核に入ることが公知であるペプチドと結合させて投与
することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合
させて投与することにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプターを特異
的に発現する細胞の型を標的にするために用いられ得る）などのいずれかにより
達成され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、こ
こで、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎ
ｉｃ）ウイルス性ペプチドを含み、この核酸がリソソーム分解を回避することを
可能にする。さらに別の実施形態において、核酸は、特定のレセプターを標的化
することにより、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的化さ
れ得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６
３５号；同第ＷＯ９２／２０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ
９３／２０２２１号を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内部に導入され得
、そして相同組換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（
ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
【０２１２】 特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルス
ベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）
を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正確
なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの正確な組込みのために必要な構成要
素を含む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ以
上のベクター中にクローニングされ、これは、患者内への遺伝子の送達を容易に
する。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉ
ｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細胞を化学療
法に対してより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を造血性幹細胞に送達するた
めの、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療
におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である
：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９
９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓ
ａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓ
ｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３
：１１０−１１４（１９９３）。
【０２１３】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスベースの送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮
細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができ
るという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子治療の概
説を示す。Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０
（１９９４）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移すためのアデノウイルスベ
クターの使用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、
Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）
；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａ
ｓｔｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（
１９９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。好まし
い実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
【０２１４】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されて
きた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：
２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０２１５】 遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を包含する。通常、移入
の方法は、選択マーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入された遺
伝子を取り込みそして発現する細胞を単離するために選沢下に置かれる。次いで
、それらの細胞は患者に送達される。
【０２１６】 この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクショ
ン、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感
染、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル媒介の遺伝子移入、スフ
ェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野におい
て多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，
Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８５）を参照のこと）、
そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないなら
ば、本発明に従って使用され得る。この技術は、細胞への核酸の安定した移入を
提供するべきであり、その結果、この核酸は、細胞により発現可能であり、好ま
しくは、遺伝性でかつその細胞の子孫により発現可能である。
【０２１７】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、当業者により決定され得る。
【０２１８】 遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、
ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単
球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；様々な幹
細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍
帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
【０２１９】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。
【０２２０】 遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、そして次いで組換え細胞は、治療的効果のためにインビボで
投与される。特定の実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる。イ
ンビトロで単離され得、そしてインビトロで維持され得る任意の幹細胞および／
または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（例え
ば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓ
ｏｎ，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｍ
ｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔｔｅ
ｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７７１
（１９８６）を参照のこと）。
【０２２１】 特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、コード
領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発
現は、適切な転写誘導因子の存在または不在を制御することにより制御可能であ
る。
【０２２２】 （治療活性または予防活性の証明） 本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試
験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性
を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプル
に対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対す
る化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセ
イおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決
定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定する
ために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイ
が挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養物において増殖し、そ
して化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サン
プルに対するそのような化合物の効果が観察される。
【０２２３】 （治療的および／または予防的な投与および組成物） 本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい
実施形態において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限する
かまたは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被験体としては、
好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられる
がそれらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして
最も好ましくはヒトである。
【０２２４】 化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方および投与
方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で
以下に記載されたものの中から選択され得る。
【０２２５】 様々な送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ
得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発現が可
能な組換え細胞中でのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば
、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１
９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核
酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔
内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物また
は組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射によ
り、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通
しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与
され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化
合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し
；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けら
れた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入すること
が望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化剤を用
いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【０２２６】 特定の実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要
な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが
、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合
わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラ
ント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよう
な膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成
され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパク
質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。
【０２２７】 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
【０２２８】 さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出系におい
て送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅ
ｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎ
ｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：
５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５
７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いら
れ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ
．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅ
ｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ
（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅ
ｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２
８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５
１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１
９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出系
は、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要
とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜
１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
【０２２９】 他の制御された放出系は、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０２３０】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、特定の実施形態におい
て、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そしてそ
れが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクター
の使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接注
射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔ
ｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプターも
しくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入ること
が公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、Ｊ
ｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６
４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタンパ
ク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細胞
内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に組
み込まれ得る。
【０２３１】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。特定の実施形態において、
用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにおけ
る使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または米
国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。用
語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦形
剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石油
起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆
油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬学
的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水溶
液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可能
な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤として
は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、
フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸
グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、
グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるなら
ば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成
物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物な
どの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのよう
なキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級のマ
ンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナ
トリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得る
。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔ
ｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。
このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、適
切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供する
。処方物は、投与形態に適するべきである。
【０２３２】 好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混
合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓ
ａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない
濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物
は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る
。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、
注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２３３】 本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの
のようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモ
ニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、
２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののよ
うなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０２３４】 この処置（本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する
疾患または障害の抑制および予防）において効果的である本発明の化合物の量は
、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要
に応じて、使用して最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において
使用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さ
に依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきであ
る。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線
から外挿され得る。
【０２３５】 抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期
を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可
能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例えば、
脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよび組織浸
透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。
【０２３６】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。
【０２３７】 （診断および画像化） 目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患および／または障害を検出、診断また
はモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出について
提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用し
て、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、
および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工
程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイさ
れたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。
【０２３８】 本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これ
によって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺
伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来
の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を
示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供
し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること
、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらな
る進行を予防する。
【０２３９】 本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用し
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８
５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３
０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有
用な、抗体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫
吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））が挙げら
れる。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標
識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；および放射性同位体（例えば、ヨウ素
（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（ 3 Ｈ）、インジウム（115mＩｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、およびテクネ
チウム（99Ｔｃ、99mＴｃ）、タリウム（201Ｔｉ）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ
）、パラジウム（103Ｐｄ）、モリブデン（99Ｍｏ）、キセノン（133Ｘｅ）、フ
ッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ，177Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140Ｌａ、175Ｙｂ、166
Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ、97Ｒｕ）；発光標
識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよび
ローダミン）、ならびにビオチンが挙げられる。
【０２４０】 当該分野で公知の技術を適用して、本発明の抗体を標識し得る。このような技
術は、二官能性結合剤の使用が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、
米国特許第５，７５６，０６５号；同５，７１４，６３１号；同５，６９６，２
３９号；同５，６５２，３６１号；同５，５０５，９３１号；同５，４８９，４
２５号；５，４３５，９９０号；同５，４２８，１３９号；同５，３４２，６０
４号；同５，２７４，１１９号；同４，９９４，５６０号；および同５，８０８
，００３号（これらの各々の内容は、本明細書によってその全体が参考として援
用される）を参照のこと）。
【０２４１】 本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒ
トにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出
および診断である。１つの実施形態において、診断は、（ａ）目的のポリペプチ
ドに特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮
下に、または腹腔内に）投与する工程；（ｂ）このポリペプチドが発現する被験
体内の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（およ
び結合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）
投与後、時間間隔を待つ工程；（ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；
および（ｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、
このバックグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的の
ポリペプチドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す
。バックグラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と
、検出された標識化分子の量とを比較する工程を包含する種々の方法により決定
され得る。本明細書中に記載されるように、本発明の特定の実施形態は、Ｂ細胞
株の細胞または単球株の細胞の濃度を定量または定性するための、抗体の使用に
関する。
【０２４２】 また本明細書中に記載されるように、本発明の抗体を使用して、免疫欠損を有
する個体を、処置、診断、または予後判定し得る。特定の実施形態において、本
発明の抗体を使用して、分類不能型免疫不全疾患（ＣＶＩＤ）またはこの疾患の
サブセットを有する個体を、処置、診断、および／または予後判定する。別の実
施形態において、本発明の抗体を使用して、血清（ｓｅｒｉｕｍ）免疫グロブリ
ン産生の欠損、再発性の感染、および／または免疫系機能不全により特徴付けら
れる障害を、診断、予後判定、処置または予防する。
【０２４３】 また本明細書中に記載されるように、本発明の抗体を使用して、自己免疫疾患
または障害を有する個体を、処置、診断、または予後判定し得る。特定の実施形
態において、本発明の抗体を使用して、全身性エリテマトーデス、またはこの疾
患のサブセットを有する個体を、処置、診断、および／または予後判定する。別
の特定の実施形態において、本発明の抗体を使用して、慢性関節リウマチ、また
はこの疾患のサブセットを有する個体を、処置、診断、および／または予後判定
する。
【０２４４】 被験体の大きさおよび使用される画像化システムは、診断画像を作成するため
に必要とされる画像化部分の品質を決定することが、当該分野において理解され
る。放射性同位体部分の場合には、ヒト被験体に対して、注入される放射能の量
は、通常、99mＴｃの約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識され
た抗体または抗体フラグメントは、優先的に、特定のタンパク質を含む細胞の位
置に蓄積する。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍ
ｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏ
ｒ Ｉｍａｇｉｎｇの第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔ
ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．
Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２）
）に記載される。
【０２４５】 いくつかの変数（使用される標識の型および投与の様式を含む）に依存して、
標識化分子が優先的に被験体のある部位において濃縮されることを可能にし、か
つ結合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで排除されるための、
投与に続く時間間隔は、６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間で
ある。別の実施形態において、投与に続く時間間隔は、５〜２０日間または５〜
１０日間である。
【０２４６】 １つの実施形態において、疾患または障害のモニタリングは、その疾患または
疾患を診断するための方法を、例えば、最初の診断の１ヵ月後、最初の診断の６
ヶ月後、最初の診断の１年後などに、繰り返すことによって、実施される。
【０２４７】 標識化分子の存在は、インビボ走査にに関する当該分野において公知の方法を
使用して、患者において検出され得る。これらの方法は、使用される標識の型に
依存する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本
発明の診断方法において使用され得る方法およびデバイスとしては、コンピュー
タ断層撮影（ＣＴ）、陽電子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）放出断層撮影法（ＰＥＴ）の
ような全身走査、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、および超音波検査が挙げられるが
、これらに限定されない。
【０２４８】 特定の実施形態において、分子は放射性同位体で標識され、そして放射応答性
の外科用器具を使用して、患者において検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国
特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態において、分子は蛍光化合物で標
識され、そして蛍光応答性の走査機器を使用して、患者において検出される。別
の実施形態において、分子は陽電子放射金属で標識され、そして陽電子放出断層
撮像法を使用して、患者において検出される。なお別の実施形態において、分子
は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）を使用して患者にお
いて検出される。
【０２４９】 （キット） 本発明は、上記の方法において使用され得るキットを提供する。１つの実施形
態において、キットは、１つ以上の容器中に、本発明の抗体、好ましくは精製し
た抗体を備える。特定の実施形態において、本発明のキットは、エピトープを含
む実質的に単離されたポリペプチドを備える。このエピトープは、キット中に含
まれる抗体と特異的に免疫反応する。好ましくは、本発明のキットは、目的のポ
リペプチドと反応しないコントロール抗体をさらに備える。別の特定の実施形態
において、本発明のキットは、本発明のポリペプチドの同一および／または異な
る配列または領域を認識する、２つ以上の抗体（モノクローナルおよび／または
ポリクローナル）を備える。別の特定の実施形態において、本発明のキットは、
目的のポリペプチドへの抗体の結合を検出するための手段を備える（例えば、こ
の抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物もし
くは発光化合物）に結合体化され得るか、または一次抗体を認識する二次抗体が
、検出可能な基質と結合体化され得る）。
【０２５０】 本発明の別の特定の実施形態において、キットは、増殖性および／または癌性
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清のスク
リーニングに使用するための診断キットである。このようなキットは、目的のポ
リペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、エ
ピトープを含む実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。このエピトー
プは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応する。さら
に、このようなキットは、抗原に対する上記の抗体の結合を検出するための手段
を備える（例えば、抗体は、蛍光化合物（例えば、フローサイトメトリーにより
検出され得るフルオレセインまはたローダミン）に結合体化され得る）。特定の
実施形態において、キットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化
学的に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。キットのポリペプチド抗原はま
た、固体支持体に付着され得る。
【０２５１】 より特定の実施形態において、上記のキットの検出手段は、上記のポリペプチ
ド抗原が付着される固体支持体を備える。このようなキットはまた、非付着レポ
ーター標識化抗ヒト抗体を備え得る。この実施形態において、ポリペプチド抗原
への抗体の結合は、上記のレポーター標識化抗体の結合によって検出され得る。
【０２５２】 さらなる実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含有する血
清をスクリーニングする際に使用するための診断用キットを含む。この診断用キ
ットは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である
実質的に単離された抗体、およびこの抗体に対するポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチド抗原の結合を検出するための手段を含む。１つの実施形態では、この抗
体は、固体支持体に付着される。特定の実施形態では、この抗体は、モノクロー
ナル抗体であり得る。キットの検出手段は、第二の標識化されたモノクローナル
抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識化された競合
抗原を含み得る。
【０２５３】 １つの診断形態において、試験血清は、本発明の方法により得られる表面結合
抗原を有する固相試薬と反応される。試薬への特異的抗原抗体の結合および洗浄
による非結合血清成分の除去後、この試薬は、レポーター標識抗ヒト抗体と反応
され、固体支持体上の結合された抗抗原抗体の量に比例してレポーターを試薬に
結合する。試薬は、再度、非結合標識抗体を除去するために洗浄され、そして、
試薬と会合したレポーターの量が決定される。代表的には、このレポーターは、
適切な比蛍光（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）基質、発光基質または比色基質（Ｓ
ｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で固相をインキュベートすること
により検出される酵素である。
【０２５４】 上記アッセイにおける固体表面試薬は、固体支持材料（例えば、ポリマー性ビ
ーズ、ディップスティック、９６ウェルプレート、またはフィルター材料）にタ
ンパク質材料を付着するための公知の技術によって調製される。これらの付着方
法は、一般に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着、または固体支持体上の化
学反応基（例えば、活性型カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド
基）へのタンパク質（代表的には、遊離アミン基を介する）の共有結合を包含す
る。あるいは、ストレプトアビジンコーティングプレートは、ビオチン化抗原と
組み合わせて使用され得る。
【０２５５】 従って、本発明は、本診断方法を実施するためのアッセイ系またはキットを提
供する。このキットは、一般に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、お
よび表面結合抗抗原抗体を検出するためのレポーター標識化抗ヒト抗体を含む。
【０２５６】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用する抗体に関する。例えば、本発明は、部分的にまたは完全にのいずれ
かで、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を破壊する、抗
体を含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれる。
リガンドの結合を妨げないが、レセプター活性化を妨げるレセプター特異的抗体
が含まれる。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に記
載されるかまたはさもなければ当該分野において公知の技術によって、決定され
得る。また、リガンドの結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプター
特異的抗体が含まれる。同様に、リガンドに結合し、そしてリガンドのレセプタ
ーへの結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それによってレセプ
ター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターを結合することは妨げない抗体が
含まれる。さらに、レセプターを活性化する抗体が含まれる。これらの抗体は、
リガンドにより媒介されるレセプター活性化によって影響を受ける生物学的活性
のすべてまたは一部のいずれかに対するアゴニストとして作用し得る。これらの
抗体は、本明細書中に開示される特定の活性を含む生物学的活性に対するアゴニ
ストまたはアンタゴニストとして特定され得る。さらに、Ｄ−ＳＬＡＭがＤ−Ｓ
ＬＡＭレセプターに結合するか否かにかかわらず、Ｄ−ＳＬＡＭに結合する抗体
が含まれる。これらの抗体は、Ｄ−ＳＬＡＭの、これらの抗体の存在下でのＤ−
ＳＬＡＭレセプターへの結合に応答した細胞増殖の増加に反映されるように、Ｄ
−ＳＬＡＭのアゴニストとして作用する。上記の抗体アゴニストは、当該分野で
公知の方法を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ ＷＯ９６／４０２８１；米
国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇ，Ｂ．ら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：
１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕ
，Ｚ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９
８）；Ｙｏｏｎ，Ｄ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−
３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐ
ｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕ
ｔａｒｄ，Ｊ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｄｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９７
）；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：
１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｎｅｕｒ
ｏｎ １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ．ら、
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕ
ｎｅｋ，Ｐ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４−２０（１９９６）（上記
の文献は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０２５７】 本発明は、Ｄ−ＳＬＡＭがＤ−ＳＬＡＭレセプターにインビトロおよび／また
はインビボで結合する能力を阻害または減少させる抗体を含む。特定の実施形態
において、本発明の抗体は、Ｄ−ＳＬＡＭが、Ｄ−ＳＬＡＭレセプターを、イン
ビトロで結合する能力を、阻害または減少する。別の非排他的な特定の実施形態
において、本発明の抗体は、Ｄ−ＳＬＡＭが、Ｄ−ＳＬＡＭレセプターを、イン
ビボで結合する能力を阻害または減少する。このような阻害は、本明細書中に記
載されるかまたはさもなければ当該分野において公知の技術を使用して、アッセ
イされ得る。
【０２５８】 本発明はまた、Ｄ−ＳＬＡＭに特異的に結合するが、Ｄ−ＳＬＡＭが、Ｄ−Ｓ
ＬＡＭレセプターに、インビトロおよび／またはインビボで結合する能力を阻害
しない、抗体を含む。特定の実施形態において、本発明の抗体は、Ｄ−ＳＬＡＭ
が、Ｄ−ＳＬＡＭレセプターを、インビトロで結合する能力を、阻害も減少もし
ない。別の非排他的な特定の実施形態において、本発明の抗体は、Ｄ−ＳＬＡＭ
が、Ｄ−ＳＬＡＭレセプターを、インビボで結合する能力を、阻害も減少もしな
い。
【０２５９】 上述のように、本発明は、Ｄ−ＳＬＡＭにより媒介される生物学的活性を、イ
ンビトロおよび／またはインビボで阻害または減少する抗体を含む。特定の実施
形態において、本発明の抗体は、Ｄ−ＳＬＡＭにより媒介されるＢ細胞増殖を、
インビトロで阻害または減少する。このような阻害は、本明細書中に記載される
かまたはさもなければ当該分野において公知の、Ｂ細胞の増殖アッセイを慣用的
に改変することによって、アッセイされ得る。別の非排他的な特定の実施形態に
おいて、本発明の抗体は、Ｄ−ＳＬＡＭにより媒介されるＢ細胞増殖を、インビ
ボで阻害または減少する。
【０２６０】 あるいは、本発明はまた、Ｄ−ＳＬＡＭに特異的に結合するが、Ｄ−ＳＬＡＭ
により媒介される生物学的活性を、インビトロおよび／またはインビボで阻害も
減少（例えば、Ｂ細胞増殖阻害）もしない、抗体を含む。特定の実施形態におい
て、本発明の抗体は、Ｄ−ＳＬＡＭにより媒介される生物学的活性を、インビト
ロで阻害も減少もしない。別の非排他的な実施形態において、本発明の抗体は、
Ｄ−ＳＬＡＭにより媒介される生物学的活性を、インビボで阻害も減少もしない
。
【０２６１】 上述のように、本発明は、インビトロおよび／またはインビボで、本明細書中
で特に参照される抗体の少なくとも１つと同じエピトープに特異的に結合する抗
体を含む。
【０２６２】 本発明の抗体はまた、治療薬および／または予防薬としての用途を有する。こ
れらの用途としては、細胞表面上でＤ−ＳＬＡＭの膜結合型形態を発現する、単
球の活化、または単球活性化のブロック、および／または特定の細胞型の殺傷（
例えば、白血病、リンパ腫、慢性関節リウマチ、およびこれらの細胞型に関連す
る他の疾患または状態を、処置、予防、および／または診断するため）が挙げら
れるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の抗体は、補
体を結合する。他の特定の実施形態において、本明細書中にさらに記載されるよ
うに、本発明の抗体（またはそのフラグメント）は、異種ポリペプチドまたは核
酸（例えば、内因性細胞傷害性エフェクター系に結合してこれを活性化する化合
物、および放射性同位体；ならびに細胞傷害性プロドラッグのような、毒素）と
会合する。
【０２６３】 上記で議論されるように、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドに対する抗体は
、次に、当業者に周知の技術を使用して、Ｄ−ＳＬＡＭを「模倣する」抗イデオ
タイプ抗体を生成するために利用され得る（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎおよび
Ｂｏｎａ、ＦＡＳＥＢ Ｊ．７（５）：４３７−４４４（１９８９）、ならびに
Ｎｉｓｓｉｎｏｆｆ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８
（１９９１）を参照のこと）。抗イデオタイプまたはこのような抗イデオタイプ
のＦａｂフラグメントのこのような中和は、Ｄ−ＳＬＡＭリガンドを中和するた
めの治療レジメンにおいて使用され得る。例えば、このような抗イデオタイプ抗
体を使用して、Ｄ−ＳＬＡＭを結合し得るか、またはＢ細胞株の細胞表面上のＤ
−ＳＬＡＭレセプターを結合し得、これによってＢ細胞活性化のＤ−ＳＬＡＭに
より媒介される阻害、増殖、および／または分化のＤ−ＳＬＡＭにより媒介され
る阻害をブロックし得る。
【０２６４】 （融合タンパク質） 任意のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドを使用して、融合タンパク質を作成し得る。
例えば、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、第２のタンパク質に融合される場合、抗
原性タグとして使用され得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドに対して誘起された抗
体を使用して、Ｄ−ＳＬＡＭに結合することにより、第２のタンパク質を間接的
に検出し得る。さらに、分泌タンパク質標的細胞に位置が、シグナルの輸送に基
づいたので、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、一旦他のタンパク質に融合された標
的化分子として使用され得る。
【０２６５】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドに融合され得るドメインの例は、異種シグナル配列
だけではなく、他の異種機能領域をも含む。融合は、直接的である必要はないが
、リンカー配列を介して生じ得る。
【０２６６】 特定の好ましい実施形態では、本発明のＤ−ＳＬＡＭタンパク質は、上記のよ
うな融合タンパク質を含むか、またはこれらからなる。ここで、融合タンパク質
のＤ−ＳＬＡＭポリペプチド成分は、ｍ−ｎとして本明細書中に示されるポリペ
プチド配列の１つである。好ましい実施形態では、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペ
プチドに相同である融合タンパク質のポリペプチド配列成分は、本明細書中に列
挙される特定のＮ末端欠失および/またはＣ末端欠失のアミノ酸配列を有するポ
リペプチドに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、
９８％または９９％同一なポリペプチドである。
【０２６７】 さらに、融合タンパク質はまた、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの特徴を改善する
ために操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸領域（特に、荷電したアミノ酸
）は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドのＮ末端に付加されて、宿主細胞からの精製の
間または引き続く取り扱いおよび貯蔵の間の安定性および持続性を改善し得る。
また、ペプチド部分は、精製を容易にするためにＤ−ＳＬＡＭポリペプチドに付
加され得る。このような領域は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの最終的な調製の前
に取り除かれ得る。ポリペプチドの取り扱いを容易にするペプチド部分の付加は
、当該分野で周知かつ慣用的な技術である。
【０２６８】 さらに、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチド（そのフラグメントおよび詳細に
は、エピトープ結合フラグメントを含む）は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ
、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ
３、およびそれらの任意の組み合わせ（ドメイン全体およびそれらの部分を含む
））の一部と組み合わせられ、キメラポリペプチドを生じ得る。これらの融合タ
ンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボでの半減期の増大を示す。１つの
報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動
物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラ
タンパク質を報告する（ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、
Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ジスルフィド結合したダイ
マー構造（ＩｇＧに起因する）を有する融合タンパク質はまた、モノマーの分泌
タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子を結合し、そし
て中和するにより効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。これらの融合タンパク
質をコードする核酸をふくむか、あるいはこれらからなるポリヌクレオチドもま
た、本発明により包含される。
【０２６９】 同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ対応出願第２０４５８６９号
）は、別のヒトタンパク質、またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常
領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク
質中のＦｃ部分は、治療および診断において有利であり、従って、例えば改善さ
れた薬物動態学的特性を生じ得る（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。あるいは、
融合タンパク質が、発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠
失することが望ましい。例えば、Ｆｃ部分は、融合タンパク質が免疫化のための
抗原として使用される場合、治療および診断を妨げ得る。薬物探索において、例
えば、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同
定するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的で、Ｆｃ部分と融
合されている（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎ
ｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。
【０２７０】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、例えば、Ｄ−ＳＬＡＭの精製を容易に
するペプチドのようなマーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において
、このマーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ヘキサヒスチジンペプチド（例えば
、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕ
ｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）に提供されるタグ）であり、多
くのものは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記述されるように
、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な別
のペプチドタグである「ＨＡ」タグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に
由来するエピトープと対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１
９８４））。
【０２７１】 従って、これらの上記の融合体のいずれも、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドま
たはポリペプチドを使用して操作され得る。
【０２７２】 （組換え産生および合成生産） 本発明はまた、本発明の単離されたＤ−ＳＬＡＭ ＤＮＡを含むベクター、こ
の組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、ならびに組換え技術および合成
技術によるポリヌクレオチドまたはそのフラグメントの生成物に関する。ベクタ
ーは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ま
たはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製能が
あるかまたは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、相補
的な宿主細胞においてのみ起こる。 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを
含むベクターに結合され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウ
ム沈澱のような沈澱、または荷電した脂質との複合体において導入される。この
ベクターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞株を使用してインビ
トロでパッケージングされ得、そして宿主細胞に形質導入され得る。
【０２７３】 そのＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド挿入物は、いくつかの名前を挙げると、フ
ァージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ
ｔｒｐプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｈｏＡプロモーター、およびＥ．ｃｏ
ｌｉ ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロ
モーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターのような、適切なプロ
モーターに作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業
者に公知である。発現構築物は、転写開始のための部位、転写終結のための部位
、および転写された領域において翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む
。構築物によって発現される転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポ
リペプチドの始めの翻訳開始コドンおよび翻訳されるポリペプチドの末端に適切
に配置される終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【０２７４】 示されたように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ
葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉ
および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイ
シン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代
表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真
菌細胞（例えば酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ 受託番号２０１１
７８）））；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏ
ｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、
２９３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；ならびに植物細胞が挙げられ
るが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条
件は当該分野で公知である。
【０２７５】 細菌における使用に好ましいベクターとしては、ｐＨＥ４（ＡＴＣＣ受託番号
２０９３１１；およびそのバリエーション）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、および
ｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮ
Ｈ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、
ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）が含まれる。酵母系における使用のための好ま
しい発現ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹ
ＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ
３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、
およびＰＡＯ８１５（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから
入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい真核生物ベクター
の中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭ
ＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。酵母系にお
ける使用のための好ましい発現ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴ
ＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、
ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．
５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒ
ｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。他の
適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。他の適切なベクターは、当業
者に容易に明らかである。
【０２７６】 １つの実施形態において、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが、真核細胞
系において、Ｓ−ＤＬＡＭタンパク質を発現するために使用される。Ｐｉｃｈｉ
ａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、その唯一の炭素供給源として、メタノールを代謝し得
るメチル栄養性（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母である。メタノール代謝
経路における主な工程は、Ｏ2を用いるメタノールのホルムアルデヒドへの酸化
である。この反応は、酵素アルコールオキシダーゼにより触媒される。その唯一
の炭素供給源としてのメタノールを代謝するために、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｉｓは、Ｏ2についてアルコールオキシダーゼの比較的低い親和性に部分的に
起因して、高いレベルのアルコールオキシダーゼを生成しなけらばならない。結
果として、主な炭素供給源としてメタノールに依存した増殖培地において、２つ
のアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）の１つのプロモーター領域が、非
常に活性化される。メタノールの存在下で、ＡＯＸ１遺伝子から産生されたアル
コールオキシダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける総可溶性タン
パク質のおよそ３０％までを構成する。Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１１１−２１（１９８５）；Ｋｏｕｔｚ，Ｐ．Ｊら、Ｙ
ｅａｓｔ ５：１６７−７７（１９８９）；Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３８５９−７６（１９８７）を参照のこと。
従って、全てまたは一部のＡＯＸ１調節配列の転写調節下における異種コード配
列（例えば、本発明のＳ−ＤＬＡＭポリヌクレオチドのような）は、メタノール
の存在下において増殖するＰｉｃｈｉａ酵母において、例外的に高いレベルで発
現される。
【０２７７】 １つの例において、プラスミドベクターｐＰＩＣ９Ｋは、「Ｐｉｃｈｉａ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ」Ｄ．Ｒ．Ｈｉｇｇｉｎｓ およびＪ．Ｃｒｅｇｇ、編、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ
ａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ、１９９８において本質的に記載されるよ
うなＰｉｃｈｅａ酵母系において、本明細書中で示されるように、本発明のＤ−
ＳＬＡＭポリペプチドをコードするＤＮＡを発現するために使用される。この発
現ベクターは、多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）クローニング部位の上流に位置するＰ
ｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓアルカリホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナル
ペプチド（すなわち、リーダー）に連結された強力なＡＯＸ１プロモーターによ
って、本発明のＤ−ＳＬＡＭタンパク質の発現および分泌を可能にする。
【０２７８】 当業者が容易に理解するようなｐＰＩＣ９Ｋの代わりに使用され得る多くの他
の酵母ベクター（例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥ
Ｓ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３
．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５ＫおよびＰＡＯ８１５
）は、提案された発現構築物が、転写、翻訳および（所望ならば）分泌について
の適切に配置されたシグナルを提供する限り、必要とされるように、インフレー
ムＡＵＧを含む。
【０２７９】 １つの実施形態では、異種コード配列（例えば、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌ
クレオチド）の高レベルの発現は、本発明の異種ポリヌクレオチドを発現ベクタ
ー（例えば、ｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺα）にクローン化し、そしてメタノー
ルの非存在下で酵母培養物を増殖させることにより達成され得る。
【０２８０】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって
もたらされ得る。このような方法は、多くの標準的研究室マニュアルに記載され
る（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。本発明のポリペプチドは、実際、組換
えベクターを欠損する宿主細胞によって発現され得ることが特に意図される。
【０２８１】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、
酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースク
ロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロ
マトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され得、そ
して精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ
」）が精製のために使用される。
【０２８２】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド、および好ましくは分泌形態はまた、以下から回収
され得る：直接単離されるかまたは培養されるかにかかわらず、体液、組織およ
び細胞を含む天然の供給源から精製された産物；化学的合成手順の生成物；なら
びに、例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物
細胞を含む、原核生物宿主または真核生物宿主から組換え技術によって産生され
た産物。組換え産生手順に使用される宿主に依存して、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチ
ドは、グリコシル化されていてもまたはグリコシル化されていなくてもよい。さ
らに、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドはまた、宿主媒介プロセスの結果としてのいく
つかの場合において、最初の改変されたメチオニン残基を含み得る。従って、一
般に、翻訳開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンが、すべての真核
生物細胞における翻訳後の任意のタンパク質から高い効率で除去されることは当
該分野において周知である。ほとんどのタンパク質においてＮ末端メチオニンも
また、ほとんどの原核生物において効果的に除去されるが、いくつかのタンパク
質について、この原核生物除去プロセスは、Ｎ末端メチオニンが共有結合するア
ミノ酸の性質に依存しており、非効率的である。
【０２８３】 本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加え
て、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次（ｐｒｉｍａｒ
ｙ）宿主細胞、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）宿主細胞、および不死化宿主細胞を
含む。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、Ｄ−ＳＬＡＭコード配
列）を欠失または置換するように操作されており、そして／または本発明のＤ−
ＳＬＡＭポリヌクレオチドと作動可能に連結された遺伝物質（例えば、異種ポリ
ヌクレオチド配列）を含むように操作され、そして内因性のＤ−ＳＬＡＭポリヌ
クレオチドを活性化、変更、および／または増幅する。例えば、当該分野で公知
の技術は、相同組換えを介して、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／
またはエンハンサー）ならびに内因性Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド配列を作動
可能に連結するために使用され得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行され
た米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際公
開第ＷＯ ９６／２９４１１号；１９９４年８月４日に公開された国際公開第Ｗ
Ｏ ９４／１２６５０号；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒ
ａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）（これらの開示の各
々は、それら全体において参考として援用される）を参照のこと）。
【０２８４】 さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成さ
れ得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．
Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら
，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１を参照のこと）。例えば、
本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドのフラグメントに対応するペプチドは、ペプ
チド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸
または化学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてＤ−ＳＬＡＭポリペプ
チド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が挙げられるがこれ
らに限定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−ア
ミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａ
ｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピ
オン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコ
シン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−
ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、
フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、ｂ−メチルアミノ酸）、Ｃａ
−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般のアミノ酸アナログ。さ
らに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０２８５】 本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リ
ン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質
分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改
変されるＤ−ＳＬＡＭポリペプチドを含む。任意の多数の化学的改変は、以下を
含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シアン、ト
リプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4による特
異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在
下での代謝合成；など。
【０２８６】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙
げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロ
セシング）、アミノ酸バックボーンへの化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結
合型の炭水化物鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末
端メチオニン残基の付加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標
識（例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変
され、このタンパク質の検出および単離が可能にされ得る。
【０２８７】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、Ｄ−ＳＬＡ
Ｍの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこ
と）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレング
リコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシ
メチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選択され得
る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置で、またはこの分子内の
所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を含み得る
。
【０２８８】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は示
した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）である
。所望の治療的プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間、ある場
合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または抗原
性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリ
コールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。
【０２８９】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してタンパク質に結合
されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、本
明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦにＰ
ＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−
１０３５（１９９２）（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙ
ｌａｔｉｏｎ）を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコ
ールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）によってア
ミノ酸残基を介して共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコ
ール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては
、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基
を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基および
Ｃ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、ポリエチレン
グリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療目的のため
に好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合で
ある。
【０２９０】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質を具体的に所望し得る。ポリエチレングリ
コールを本発明の組成の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子
から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール
分子のタンパク質（またはペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応
の型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末
端ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化
部分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化
物質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は
、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（
リジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され
得る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端での
タンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０２９１】 本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー（すなわち
、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高度のマルチマー）であり得る。
従って、本発明は、モノマーおよびマルチマーの本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプ
チド、それらの調製ならびにそれらを含む組成物（好ましくは薬学的組成物）に
関する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、モノマー、ダイマー、
トリマーまたはテトラマーである。さらなる実施形態では、本発明のマルチマー
は、少なくともダイマー、少なくともトリマー、または少なくともテトラマーで
ある。
【０２９２】 本発明によって含まれるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る
。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、（本明細書中に記載されるポ
リペプチドの、フラグメント、改変体、スプライス改変体および融合タンパク質
を含む）本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドのみを含むマルチマーをいう。これ
らのホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有するＤ−ＳＬＡＭポリペプ
チドを含み得る。特定の実施形態では、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配
列を有するＤ−ＳＬＡＭポリペプチドのみを含むマルチマーである。別の特定の
実施形態では、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するＤ−ＳＬＡＭ
ポリペプチドを含むマルチマーである。特定の実施形態では、本発明のマルチマ
ーは、ホモダイマー（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するＤ−ＳＬ
ＡＭポリペプチドを含む）あるいはホモトリマー（例えば、同一または異なるア
ミノ酸配列を有するＤ−ＳＬＡＭポリペプチドを含む）である。さらなる実施形
態では、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモダイマー、少なくと
もホモトリマーまたは少なくともホモテトラマーである。
【０２９３】 本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のＤ−ＳＬＡＭポ
リペプチドに加えて１以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質の
ポリペプチド）を含むマルチマーをいう。特定の実施形態では、本発明のマルチ
マーは、ヘテロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーである。さら
なる実施形態では、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモダイマー
、少なくともホモトリマーまたは少なくともホモテトラマーである。
【０２９４】 本発明のマルチマーは、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合
的な結合の結果であり得、そして／または例えば、リポソーム形成によって間接
連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明のマルチマー（例えば、ホ
モダイマーまたはホモトリマーなど）は、本発明のポリペプチドが溶液中で互い
に接触する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロマルチマー（
例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーなど）は、本発明のタンパク質
が、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質にお
ける異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触した場合に形成される。
他の実施形態では、本発明のマルチマーは、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチド
との、および／または本発明のポリペプチド間での共有結合によって形成される
。このような共有結合は、ポリぺプチド配列（例えば、配列番号２に記載される
か、またはクローンＨＤＰＪＯ３９によってコードされるポリペプチド）に含ま
れる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、この共有結合は、ネイティブ
（すなわち、天然に存在する）ポリペプチドにおいて相互作用するポリペプチド
配列内に存在するシステイン残基間での架橋である。別の例では、この共有結合
は、化学的操作または組換え操作の結果である。あるいは、このような共有結合
は、Ｄ−ＳＬＡＭ融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列において含まれる１
以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、共有結合は、本発明の融合タンパク
質に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参
照のこと）。特定の例では、この共有結合は、（本明細書中に記載されるような
）本発明のＤ−ＳＬＡＭ−Ｆｃ融合タンパク質に含まれる異種配列間にある。別
の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、共有結合したマルチマ
ーを形成し得る別のＳｅｃｒｅｔｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔ
ｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＳＬＡＭ）ファミリーメンバー（例えば、オステオ
プロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）など）由来の異種ポリペプ
チド配列間にある（例えば、国際公開番号ＷＯ ９８／４９３０５号（この内容
はその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。別の実施形
態では、２以上の本発明のポリペプチドは、ペプチドリンカーを通して連結され
る。例としては、米国特許第５，０７３，６２７号（本明細書中に参考として援
用される）に記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによ
って隔てられた本発明の複数のポリペプチドを含むタンパク質は、従来の組換え
ＤＮＡ技術を用いて生成され得る。
【０２９５】 本発明のマルチマーポリペプチドを調製するための別の方法は、ロイシンジッ
パーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合され
た本発明のポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインおよびイソロ
イシンジッパードメインは、そのドメインが見出されるタンパク質のマルチマー
形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは元々、いくつかのＤＮ
Ａ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１７５９、（１９８８））、そしてそれ以来種々の異なるタンパク質
において見出されている。とりわけ公知のロイシンジッパーは、ダイマー形成ま
たはトリマー形成をする、天然に存在するペプチドおよびその誘導体である。本
発明の可溶性マルチマータンパク質を生成するために適切なロイシンジッパード
メインの例は、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０
３０８に記載されるロイシンジッパードメインである。溶液中でダイマー形成ま
たはトリマー形成をするポリペプチド配列に融合された本発明のポリペプチドを
含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得られる可
溶性マルチマー融合タンパク質は、当該分野で公知の技術を用いて培養上清から
回収される。
【０２９６】 本発明のトリマーポリペプチドは、増強された生物学的活性の利点を提供し得
る。好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分は、トリマーを優先
的に形成する部分である。１例は、本明細書中に参考として援用されるＨｏｐｐ
ｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１，（１９９４））および米国
特許出願第０８／４４６，９２２号に記載される通りの肺サーファクタントプロ
テインＤ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。天然に存在するトリマ
ータンパク質由来の他のペプチドは、本発明のトリマーポリペプチドの調製にお
いて用いられ得る。
【０２９７】 別の例では、本発明のタンパク質は、Ｆｌａｇ（登録商標）ポリぺプチド配列
を含む本発明の融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配
列間の相互作用によって結合される。さらなる実施形態では、本発明のタンパク
質は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチ
ド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によって結合する。
【０２９８】 本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を使用して生成され得る。
例えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドは、当該
分野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を使用して、化学的
に架橋され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは本明細書中
で参考として援用される）を参照のこと）さらに、本発明のマルチマーは、当該
分野で公知の技術を使用して生成されて、マルチマー中に含まれることが所望さ
れるポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基間に、１つ以上の分子間架
橋を形成し得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは、本明細書
中にその全体が参考として援用される）を参照のこと）。さらに、本発明のタン
パク質は、このポリぺプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチ
ンの付加により慣用的に改変され得、当該分野で公知の技術が、１つ以上のこれ
らの改変されたポリペプチドを含むマルチマーを生成するために適用され得る（
例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これはその全体が本明細書中で参考
として援用される）を参照のこと）。さらに、当該分野で公知技術は、本発明の
マルチマーに含まれることを所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを生
成するために適用され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは
その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０２９９】 あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて
生成され得る。１つの実施形態では、本発明のマルチマーに含まれるポリペプチ
ドは、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の融合タンパク質技
術を用いて組換え生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用
される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態では
、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配
列に連結し、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端の方向とは逆方向でポリペプ
チドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）に連
結することによって生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援
用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形態では
、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して
、膜貫通ドメイン（または疎水性もしくはシグナルペプチド）を含み、そして膜
再構成技術によってリポソームに取り込まれ得る、本発明の組換えポリペプチド
を生成する（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許
第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０３００】 （Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドの使用） 本明細書中で同定されたＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、試薬として多数の
方法において使用され得る。以下の説明は例示的であるとみなされるべきであり
、そして公知の技術を利用する。
【０３０１】 実際の配列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在ほとん
ど利用可能ではないため、新しい染色体マーカーを同定する必要性が存在するま
まである。
【０３０２】 簡単に言うと、配列は、配列番号１で示される配列からＰＣＲプライマー（好
ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製することによって染色体にマッピングされ得
る。プライマーが、ゲノムＤＮＡ中の１つより多くの予測されたエキソンにまた
がらないように、プライマーは、コンピューター分析を使用して選択され得る。
次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドの
ＰＣＲスクリーニングのために使用される。配列番号１に対応するヒトＤ−ＳＬ
ＡＭ遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを産生する。
【０３０３】 同様に、体細胞ハイブリッドは、特定の染色体に対してポリヌクレオチドをＰ
ＣＲマッピングする迅速な方法を提供する。単一のサーマルサイクラーを使用し
て１日あたり３つ以上のクローンが割り当てられ得る。さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポ
リヌクレオチドの下位位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の
染色体フラグメントのパネルを用いて達成され得る。使用され得る他の遺伝子マ
ッピング戦略は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フローソート（ｌ
ａｂｅｌｅｄ ｆｌｏｗ ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリーニング、およ
び染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーション
による前選択を含む。
【０３０４】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドの正確な染色体位置はまた、中期染色体スプレ
ッド（ｓｐｒｅａｄ）の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
を使用して獲得され得る。この技術は５００または６００塩基ほどの短さのポリ
ヌクレオチドを使用する；しかし２，０００〜４，０００ｂｐのポリヌクレオチ
ドが好ましい。この技術の総説に関しては、Ｖｅｒｍａら、「Ｈｕｍａｎ Ｃｈ
ｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ」，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）を参
照のこと。
【０３０５】 染色体マッピングについては、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、個々に（単
一染色体またはその染色体上の単一部位をマークするために）またはパネルで（
複数部位および／または複数染色体をマークするために）使用され得る。コード
配列のためにｃＤＮＡの非コード領域に対応する好ましいポリヌクレオチドは、
遺伝子ファミリー内でより保存されるようであり、従って、染色体マッピングの
間の交差ハイブリダイゼーションの機会を増加する。
【０３０６】 一旦、ポリヌクレオチドが正確な染色体位置にマップされると、ポリヌクレオ
チドの物理的位置は、連鎖分析において使用され得る。連鎖分析は、染色体位置
と特定の疾患の提示との間の同時遺伝（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）を確立す
る。（疾患マッピングデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌ
ｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通し
てオンラインで利用可能である）において見い出される）。１メガベースマッピ
ング解像度および２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定すると、疾患と関連する染色体
領域に正確に位置決定されるｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在的な原因遺伝子の
うちの１つであり得る。
【０３０７】 従って、一旦、同時遺伝が確立されると、罹患個体と非罹患個体との間でのＤ
−ＳＬＡＭポリヌクレオチドおよび対応する遺伝子における差異が試験され得る
。まず、染色体中の可視的構造変化（例えば、欠失または転座）は染色体スプレ
ッドにおいて、またはＰＣＲによって試験される。構造的変化が存在しない場合
、点変異の存在が確認される。何人かのまたは全ての罹患個体で観察されたが、
正常な個体では観察されなかった変異は、この変異がこの疾患を引き起こし得る
ことを示す。しかし、いくつかの正常な個体由来のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドお
よび対応する遺伝子の完全な配列決定は、変異を多型性と区別するために要求さ
れる。新しい多型性が同定される場合、この多型ポリペプチドはさらなる連鎖分
析のために使用され得る。
【０３０８】 さらに、非罹患個体と比較した、罹患個体の遺伝子の増加または減少した発現
が、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドを使用して評価され得る。任意のこれらの変
化（変化した発現、染色体再配置、または変異）は、診断マーカーまたは予後マ
ーカーとして使用され得る。
【０３０９】 前記に加えて、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、三重らせん形成を通して、
またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するために
使用され得る。両方の方法は、相補的ＤＮＡまたは相補的ＲＮＡへのポリヌクレ
オチドの結合に依存する。これらの技術に関して、好ましいポリヌクレオチドは
通常、２０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチドであり、そして転写に関与する遺
伝子領域（三重らせん−Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３０７
３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８
）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１）を
参照のこと）またはｍＲＮＡ自体（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ
ｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−ｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（
１９８８））のいずれかに相補的である。三重らせん形成は、最適にはＤＮＡか
らのＲＮＡ転写の遮断を生じるが、アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーション
は、ポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止する。両方の技術は、モデル系
において効果的であり、そして本明細書に開示される情報は、疾患を処置、診断
、検出および／または予防するための試みにおいて、アンチセンスまたは三重ら
せんポリヌクレオチドを設計するために使用され得る。
【０３１０】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療において有用である。遺伝
子治療の１つの目標は、遺伝欠損を修正する試みにおいて、欠損遺伝子を有する
生物へ正常遺伝子を挿入することである。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、高
度に正確な様式でこのような遺伝欠損を標的とする手段を提供する。別の目標は
、宿主ゲノム中には存在しなかった新しい遺伝子を挿入し、それによって宿主細
胞中に新しい形質を生成することである。
【０３１１】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドはまた、微小な生物学的サンプルから個体を同
定するために有用である。例えば、米国軍は、その職員を同定するために制限フ
ラグメント長の多型性（ＲＦＬＰ）の使用を考慮している。この技術において、
個体のゲノムＤＮＡは１つ以上の制限酵素で消化され、そして職員を同定するた
め固有なバンドを生じるためのサザンブロットについてプローブされる。この方
法は、「認識票（Ｄｏｇ ｔａｇ）」（これは、失われたり、交換されたり、ま
たは盗まれたりすることにより、ポジティブな同定を困難にし得る）の現在の限
界を受けない。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、ＲＦＬＰのためのさらなるＤ
ＮＡマーカーとして使用され得る。
【０３１２】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドはまた、個体のゲノムの選択された部分の実際
の塩基ごとのＤＮＡ配列を決定することによって、ＲＦＬＰに対する代替物とし
て使用され得る。これらの配列は、このような選択されたＤＮＡを増幅しそして
単離するためにＰＣＲプライマーを調製するために使用され得、次いで、この選
択されたＤＮＡは、配列決定され得る。各個体が固有のセットのＤＮＡ配列を有
するので、この技術を使用して、個体が同定され得る。一旦、固有のＩＤデータ
ベースが個体について確立されると、その個体が生存していようとまたは死亡し
ていようとにかかわらず、その個体のポジティブ同定が、極めて小さな組織サン
プルからなされ得る。
【０３１３】 法医学生物学もまた、本明細書に開示されるようなＤＮＡに基づく同定技術を
使用して利益を得る。組織（例えば、髪または皮膚）、または体液（例えば、血
液、唾液、精液など）のような非常に小さな生物学的サンプルから得られたＤＮ
Ａ配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。ある先行技術において、ＤＱａクラ
スＩＩ ＨＬＡ遺伝子のような多型性遺伝子座から増幅された遺伝子配列は、個
体を同定するための法医学生物学において使用される。（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．，
ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．（１９９２）
）。一旦、これらの特異的多型性遺伝子座が増幅されると、これらは１つ以上の
制限酵素で消化される。これは、ＤＱａクラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子に対応するＤ
ＮＡでプローブされたサザンブロットについてのバンドの同定セットを生じる。
同様に、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、法医学的目的のための多型性マーカ
ーとして使用され得る。
【０３１４】 また、特定の組織の供給源を同定し得る試薬についての必要性が存在する。例
えば、未知の起源の組織が提供される場合、法医学においてこのような必要性が
生じる。適切な試薬は、例えば、Ｄ−ＳＬＡＭ配列から調製される、特定の組織
に特異的なＤＮＡプローブまたはプライマーを含み得るか、またはこれらからな
り得る。このような試薬のパネルは、種および／または器官型によって組織を同
定し得る。同様の様式で、これらの試薬は、夾雑物について組織培養物をスクリ
ーニングするために使用され得る。
【０３１５】 Ｄ−ＳＬＡＭの、樹状細胞、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ節、脾臓、胸腺、小腸、
および子宮での発現が見出されるので、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、生物
学的サンプル中に存在する組織または細胞型の示差的同定のためのハイブリダイ
ゼーションプローブとして有用である。同様に、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドに関
するポリペプチドおよび抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学
的プローブを提供するのに有用である。さらに、「標準」Ｄ−ＳＬＡＭ遺伝子発
現レベル（すなわち、免疫系障害を有しない個体からの健康組織のＤ−ＳＬＡＭ
発現レベル）と比較して、上記の組織または細胞（特に免疫系）の多くの障害に
対して、有意に高いかまたは低いレベルのＤ−ＳＬＡＭ遺伝子発現が、例えば、
障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、癌性組織および創傷組織
）または体液（例えば、漿液、血漿、尿、滑液または髄液）において検出され得
る。
【０３１６】 従って、本発明は、以下の工程を含む障害の診断方法を提供する：（ａ）個体
の細胞または体液中のＤ−ＳＬＡＭ遺伝子発現レベルをアッセイする工程；（ｂ
）標準的なＤ−ＳＬＡＭ遺伝子発現レベルと、このＤ−ＳＬＡＭ遺伝子発現レベ
ルを比較し、それにより、標準の発現レベルと比較して、アッセイされたＤ−Ｓ
ＬＡＭ遺伝子発現レベルの増加または減少が免疫系における障害を示す、工程。
【０３１７】 少なくとも、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオドは、サザンブロットのゲル上の分子
量マーカーとして、特定の細胞型における特異的ｍＲＮＡの存在についての診断
プローブとして、新規のポリヌクレオドを発見するプロセスにおける「減算した
（ｓｕｂｔｒａｃｔ−ｏｕｔ）」公知の配列に対するプローブとして、「遺伝子
チップ」または他の支持体に付着するためのオリゴマーを選択および作製するた
めに、ＤＮＡ免疫技術を用いて抗ＤＮＡ抗体を惹起するために、および免疫応答
を惹起する抗原として使用され得る。
【０３１８】 （Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの使用） Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、多くの方法において使用され得る。以下の記述
は、例示として考慮されるべきであり、そして公知の技術を利用する。
【０３１９】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドを使用して、抗体ベースの技術を用いて、生物学的
サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る。例えば、組織におけるタンパ
ク質発現は、当業者に公知の古典的な免疫組織学的な方法で研究され得る。（Ｊ
ａｌｋａｎｅｎ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（
１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３
０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質の遺伝子発現を検出
するのに有用な、他の抗体に基づく方法には、イムノアッセイ（例えば、酵素結
合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ））が含まれる。適切な抗体アッセイの標識は、当該分野で公知であり、そし
て酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；および放射性同位体（例えば
、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）
、インジウム（112Ｉｎ）、およびテクネチウム（99mＴｃ）；発光標識（例えば
、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン
）ならびにビオチンが挙げられる。
【０３２０】 生物学的サンプル中の分泌されたタンパク質のレベルをアッセイすることに加
えて、タンパク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質の
インビボ画像化のための抗体の標識またはマーカーは、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、ま
たはＥＳＲにより検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法のために適切な標識は、放
射性同位体（例えば、バリウムまたはセシウム）を含み、これは検出可能な放射
線を放射するが、被験体に対して明らかに有害ではない。ＮＭＲおよびＥＳＲの
ための適切なマーカーは、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカー（例えば
、重水素）を含み、これは、関連するハイブリドーマのための栄養分を標識する
ことにより抗体中に取り込まれ得る。
【０３２１】 放射性同位体（例えば、131Ｉ、112Ｉｎ、99mＴｃ）、放射線不透過性物質、
または核磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像化部分で
標識された、タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、哺乳動物に（例
えば、非経口的、皮下、または腹腔内に）導入される。被験体のサイズおよび用
いられる画像化システムは、診断画像を生成するために必要な画像化部分の量を
決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、ヒト被験
体について、注射される放射能の量は、通常、99mＴｃの約５〜２０ミリキュリ
ーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは、特定のタ
ンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．
Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ
ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ
Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒの第１３章、Ｓ．Ｗ
．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。
【０３２２】 従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、これは以下を含む：（ａ）個体
の細胞または体液におけるＤ−ＳＬＡＭポリペプチドの発現レベルをアッセイす
る工程；（ｂ）遺伝子発現レベルを標準の遺伝子発現レベルと比較し、それによ
って標準の発現レベルと比較してアッセイされたＤ−ＳＬＡＭポリペプチド遺伝
子の発現レベルにおける増加または減少が障害を示す工程。
【０３２３】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドを用いて疾患を処置、診断、検出、および
／または予防し得る。例えば、患者は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの非存在また
はレベルの減少を元に戻すこと（例えば、インスリン）、異なるポリペプチドの
不在またはレベルの減少を補充すること（例えば、ヘモグロビンＢに対するヘモ
グロビンＳ）、ポリペプチドの活性を阻害すること（例えば、癌遺伝子または腫
瘍抑制因子）、ポリペプチドの活性を活性化すること（例えば、レセプターに結
合することによって）、遊離リガンドについて膜結合レセプターと競合させるこ
とによって膜結合レセプターの活性を減少させること（例えば、炎症を低減させ
る際に用いられる可溶性ＴＮＦレセプター）、または所望の応答をもたらすこと
（例えば、血管の成長）の試みにおいて、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドが投与され
得る。
【０３２４】 同様に、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドに対して指向される抗体もまた用いられ、
疾患を処置、診断、検出および／または予防し得る。例えば、Ｄ−ＳＬＡＭポリ
ペプチドに対して指向される抗体の投与には、ポリペプチドを結合して、そして
ポリペプチドの過剰産生を低減し得る。同様に、抗体の投与は、例えば、膜に結
合したポリペプチド（レセプター）へ結合することにより、ポリペプチドを活性
化し得る。
【０３２５】 少なくとも、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用
され得る。宿主細胞の形質転換を評価する方法として、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチ
ドがまた用いられ、抗体を惹起し得、次いで、この抗体が使用され、組換え細胞
からのタンパク質発現を測定する。さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドが使用さ
れ、以下の生物学的活性を試験し得る。
【０３２６】 （遺伝子治療方法） 本発明の別の局面は、障害、疾患および状態を処置、診断、検出および／また
は予防するための遺伝子治療方法である。この遺伝子治療方法は、本発明のＤ−
ＳＬＡＭポリペプチドの発現を達成するための、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびア
ンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列の動物への導入に関する。この方法は、標
的組織によるこのポリペプチドの発現のために必要なプロモータおよび他の任意
の遺伝因子と、作動可能に連結したＤ−ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドを必要とする。このような遺伝子治療および送達技術は当該分野に
おいて公知である（例えば、本明細書中に参考として援用される、ＷＯ９０／１
１０９２を参照のこと）。
【０３２７】 従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボでＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオ
チドと作動可能に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）を用いて操作され得、次いで、操作された細胞は、処置される患者に提
供され（治療的および／または予防的に）、そして／またはポリペプチドを用い
て診断される。このような方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｂｅ
ｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８５：１
０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ５３：１１０７−１１１２（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎ
ｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：４６０４−４６１５（１９９
４）；Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６０：２２１−２２９
（１９９５）；Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：
５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら、Ｈｕｍａ
ｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１−１０（１９９６）；Ｓａｎｔｏｄｏｎ
ａｔｏ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２４６−１２５５（１９９
７）；およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａ
ｐｙ ３：３１−３８（１９９６）を参照のこと。これらは、本明細書中に参考
として援用される。１つの実施形態においては、操作される細胞は、動脈細胞で
ある。この動脈細胞は、動脈、動脈の周囲の組織への直接的な注射を介して、ま
たはカテーテル注入を介して患者に再導入され得る。
【０３２８】 以下により詳細に考察されるように、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド構築物は
、注射可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋
肉、皮膚、肺、肝臓など）の間質空間への注射）により送達され得る。Ｄ−ＳＬ
ＡＭポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性のキャリア
中で送達され得る。
【０３２９】 １つの実施形態においては、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、裸のポリヌク
レオチドとして送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａとは、細胞への侵入を補助し、促進し、または容易にするために作用するいか
なる送達ビヒクル（ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェ
クチンまたは沈殿剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、Ｄ−ＳＬＡＭ
ポリヌクレオチドはまた、当業者に周知の方法により調製され得るリポソーム処
方物中およびリポフェクチン処方物中などで送達され得る。このような方法は、
例えば、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号および同
第５，５８０，８５９号（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記
載される。
【０３３０】 遺伝子治療方法において使用されるＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドベクター構
築物は、好ましくは、宿主ゲノム中に組み込まれないかまたは複製を可能にする
配列を含まない構築物である。適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
から入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐ
ＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよ
びｐＳＶＬ；ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐ
ｃＤＮＡ３．１、およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは
、当業者に容易に明らかである。
【０３３１】 当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、Ｄ−ＳＬＡＭ ＤＮＡの発現を
駆動するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプ
ロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロ
モーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイ
ルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプ
ロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチ
ミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモー
ター）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホ
ルモンプロモーターが挙げられる。このプロモーターはまた、Ｄ−ＳＬＡＭにつ
いてネイティブなプロモーターであり得る。
【０３３２】 他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主
要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研
究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの期間の間、所
望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０３３３】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺
、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢
、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を含む）
の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、器官組織の細網線維間の細
胞間の液体、ムコ多糖類基質、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織
のコラーゲン線維、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔ
ｉｓｓｕｅ ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）内または骨の
裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャネ
ルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以
下で議論される理由のために好ましい。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド構築物は
、これらの細胞を含む組織への注射によって、好都合に送達され得る。Ｄ−ＳＬ
ＡＭポリヌクレオチド構築物は、好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送
達され、そしてその細胞において発現されるが、送達および発現は、非分化細胞
または完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細
胞）において達成され得る。インビボでの筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り
込み、そして発現するその能力において、特に適格である。
【０３３４】 裸の核酸配列注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５
ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬量
は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好ましくは
約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識するよ
うに、この投薬量は、注射の組織部位に応じて変化する。核酸配列の適切かつ有
効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される（治療的お
よび／または予防的に）状態および投与経路に依存し得る。
【０３３５】 好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注射経路による。しかし、他
の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に、肺または気管支の組
織、咽喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる
。さらに、裸のＤ−ＳＬＡＭ ＤＮＡ構築物が、血管形成術の間にこの手順にお
いて用いられるカテーテルによって動脈に送達され得る。
【０３３６】 裸のポリヌクレオチドは、送達部位での直接の針注射、静脈内注射、局所投与
、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない
、当該分野で公知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該
分野で公知である。
【０３３７】 実施例において証明されるように、裸のＤ−ＳＬＡＭ核酸配列は、インビボで
投与され得、ウサギの大腿動脈においてＤ−ＳＬＡＭポリペプチドの好首尾の発
現を生じる。
【０３３８】 この構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフ
ェクチン、沈殿剤などのような送達ビヒクルを用いて送達され得る。このような
送達方法は、当該分野で公知である。
【０３３９】 特定の実施形態において、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド構築物は、リポソー
ム調製物中で複合体化している。本発明にて使用するためのリポソーム調製物は
、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製
物を包含する。しかしながら、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との
間で強固な荷電複合体を形成し得るので、カチオン性リポソームが特に好ましい
。カチオン性リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（本明細書
中で参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６）；ｍＲＮＡ（本明細
書中で参考として援用される、Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７〜６０８１）；および精製された
転写因子（本明細書中で参考として援用される、Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９〜１０１９２）の細胞内送達を媒介す
ることが示されている。
【０３４０】 カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジ
オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは特に有用であり、そして商標ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎのもとにＧ
ＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．より入手可能である（
本明細書中で参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６をもまた参照
のこと）。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓ
ｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。
【０３４１】 当該分野で周知の技術を使用して、他のカチオン性リポソームを、容易に入手
可能な物質より調製し得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−
３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記述に関して、例
えばＰＣＴ公開第ＷＯ ９０／１１０９２号（本明細書中で参考として援用され
る）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献にて説明されており、例
えば、本明細書中で参考として援用される、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７を参照のこと
。類似した方法を使用して、他のカチオン性脂質物質よりリポソームを調製し得
る。
【０３４２】 同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔ
ｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に
入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して簡単に調製され得る。
そのような物質としてはとりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホ
スファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ
）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホス
ファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｈａｔｉｄｙｌ ｅｔ
ｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、ＤＯ
ＴＭＡ出発物資およびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な比率で混合され得る。これら
の物質を使用してリポソームを生成する方法は、当該分野で周知である。
【０３４３】 例えば、商業的に、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレ
オイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせにおいて使用し、コレ
ステロールを添加してもしなくても、従来のリポソームを生成し得る。従って、
例えば、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、各５０ｍｇのＤＯＰＧおよ
びＤＯＰＣを乾燥することにより、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製し得る。この
サンプルを一晩真空ポンプ下に置き、そして次の日、脱イオン水で水和する。次
いで、浴を、１５ＥＣで循環させながら、最大設定にて、逆位カップ（浴タイプ
）プローブを装備したＨｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ モデル３５０超音波処理器を
使用して、このサンプルを栓をしたバイアル中にて２時間超音波処理する。ある
いは、負に荷電した小胞を、超音波処理なしで調製して多重膜小胞を生成し得る
か、または核孔膜（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して押し出
すことにより別々の大きさの単膜小胞を生成し得る。他の方法は、当業者に公知
でありそして利用可能である。
【０３４４】 このリポソームとしては、多重膜小胞（ＭＬＶ）、小さな単膜小胞（ＳＵＶ）
または大きな単膜小胞（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶが好ましい。当該分野で
周知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体が調製される。例えば、
本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３）、１０１：５１２〜５２７を参照
のこと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラスチューブの壁面にリン脂質の
薄膜を堆積させ、そしてその後、カプセル化される物質の溶液で水和することに
よって調製され得る。ＳＵＶはＭＬＶの長期超音波処理により調製され、単膜リ
ポソームの均質集団を生成する。封入されるべき物質を、予め形成されたＭＬＶ
の懸濁液に添加し、次いで、超音波処理する。カチオン性脂質を含むリポソーム
を使用する場合、乾燥した脂質膜を、滅菌水または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＮａＣ
ｌのような等張性緩衝溶液のような適切な溶液中に再懸濁し、超音波処理し、次
いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと直接混合する。正に荷電したリポソ
ームのカチオン性ＤＮＡへの結合に起因して、リポソームおよびＤＮＡは非常に
安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸フラグメントを用いての用途を見出
す。ＬＵＶは、当該分野で周知の多くの方法により調製される。一般に使用され
る方法としては、Ｃａ2+−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏ
ｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３
；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；エーテル注入（Ｄｅａ
ｍｅｒ，Ｄ．およびＢａｎｇｈａｍ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８
）；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．およびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐ．
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）
；および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；Ｓｚｏｋａ，Ｆ．およびＰａｐａｈ
ａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
（１９７８）７５：１４５；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ（１９８２）２１５：１６６）が挙げられ、これらの文献は本明細書中で参考
として援用される。
【０３４５】 一般に、ＤＮＡのリポソームに対する割合は約１０：１から約１：１０までで
ある。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は約５：１から約１：５までであ
る。より好ましくは、その割合は約３：１から約１：３までである。さらにより
好ましくは、その割合は約１：１である。
【０３４６】 米国特許第５，６７６，９５４号（本明細書中で参考として援用される）はカ
チオン性リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウスへの注入につい
て報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同
第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６
号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，
０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考と
して援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に
使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、
同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５
５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として
援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提
供する。
【０３４７】 特定の実施形態において、Ｄ−ＳＬＡＭをコードする配列を含むＲＮＡを含む
レトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。
レトロウイルスプラスミドベクターが誘導され得るレトロウイルスとしては、モ
ロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベ
イ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免
疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げられるが
、これらに限定されない。
【０３４８】 このレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を
形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッ
ケージング細胞株の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される
、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１：５〜１４（１９
９０）にて記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ
１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ
＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これら
に限定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッケ
ージング細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーシ
ョン、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈殿が挙げられるが、それらに限定
されない。１つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターをリ
ポソームにカプセル化するか、または脂質に結合して、次いで宿主に投与し得る
。
【０３４９】 このプロデューサー細胞株は、Ｄ−ＳＬＡＭをコードするポリヌクレオチドを
含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのようなレトロ
ウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのどちらかにおい
て、真核生物細胞を形質導入し得る。この形質導入された真核生物細胞は、Ｄ−
ＳＬＡＭを発現する。
【０３５０】 特定の他の実施形態において、アデノウイルスベクター中に含まれるＤ−ＳＬ
ＡＭポリヌクレオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。
アデノウイルスは、それがＤ−ＳＬＡＭをコードし、そして発現し、それと同時
に通常の溶解性ウイルス生活環にて複製するその能力に関して不活性化されるよ
うに操作され得る。アデノウイルス発現は、そのウイルスＤＮＡの宿主細胞染色
体への組み込み無しに達成され、その結果、挿入性変異誘発についての心配が軽
減される。さらに、アデノウイルスは、何年もの間、腸の生ワクチンとして優れ
た安全プロフィールを伴って使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ａ．Ｒ．ら、
（１９７４）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．、１０９：２３３−２３８
）。最終的に、アデノウイルス媒介性遺伝子移入が、コトン（ｃｏｔｔｏｎ）ラ
ットの肺へのα−１−アンチトリプシンおよびＣＦＴＲの移入を含む多くの例に
おいて実証されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
５２：４３１〜４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：
１４３〜１５５（１９９２））。さらに、ヒト癌における原因物質としてアデノ
ウイルスを確立しようとする広範な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ
，Ｍ．ら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：６６０６（
１９７９））。
【０３５１】 本発明において有用である適切なアデノウイルスベクターが、例えば、Ｋｏｚ
ａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ
．、３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８
：１４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅｔ．Ｔｈｅｒ．、４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｇｅｎｅｔ、７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３６５：６９１〜６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２
２４号に記載されており、これらは本明細書中で参考として援用される。例えば
、アデノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞にて増殖
され得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そして構成的に
ＥｌａおよびＥｌｂを発現し、このことは、このベクターから欠失している遺伝
子の産物を提供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加え
て、他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もま
た、本発明において有用である。
【０３５２】 好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは、複製欠損性である
。複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルス
および／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは
、細胞に感染する能力があり、そしてプロモーター（例えば、本発明のＨＡＲＰ
プロモーター）に作動可能に連結された目的のポリヌクレオチドを発現し得るが
、ほとんどの細胞にて複製し得ない。複製欠損アデノウイルスは、次の遺伝子：
Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａまたはＬ１〜Ｌ５のすべてまたは一部のう
ちの１つ以上にて欠失され得る。
【０３５３】 特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、エ
キソビボまたはインビボでこの細胞を操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を生成す
るためにヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（
Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７（１９９２））。ＡＡＶはまた、分裂中では
ない細胞の中にそのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。
３００塩基対程度の小さいＡＡＶを含むベクターがパッケージされ得、そして組
み込み得るが、外来性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限られる。その
ようなＡＡＶの生成および使用の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特
許第５，１３９，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７
８号、同第５，４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８
，７４５号および同第５，５８９，３７７号を参照のこと。
【０３５４】 例えば、本発明において使用するために適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製
、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みに必要な配列すべてを含む。Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９
８９）において見い出される方法のような、標準的クローニング方法を使用して
、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド構築物を、このＡＡＶベクターに挿入する。次
いで、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿など
を含む、任意の標準的技術を使用して、この組み換えＡＡＶベクターを、ヘルパ
ーウイルスに感染しているパッケージング細胞にトランスフェクトする。適切な
ヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニ
アウイルス、またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッケージング細胞が
トランスフェクトそして感染されると、それらはＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド
構築物を含む感染性ＡＡＶウイルス粒子を生成する。次いで、エキソビボまたは
インビボのいずれかで、これらのウイルス粒子を使用して真核生物細胞を形質導
入する。この形質導入細胞は、そのゲノムに組み込まれたＤ−ＳＬＡＭポリヌク
レオチド構築物を含み、そしてＤ−ＳＬＡＭを発現する。
【０３５５】 遺伝子治療の別の方法は、相同組み換え（例えば、米国特許第５，６４１，６
７０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、１９
９６年９月２６日公開；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４
日公開；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）を介して、異種制御領
域および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、Ｄ−ＳＬＡＭ配列をコードして
いる配列）を作動可能に連結する工程を含む。この方法は、標的細胞中に存在し
ているが、通常はその細胞中で発現しないかまたは所望するよりも低いレベルで
発現する、遺伝子の活性化を含む。
【０３５６】 当該分野で既知の標準的技術を使用して、ポリヌクレオチド構築物を作製する
。この構築物は、プロモーターを、そのプロモーターに隣接した標的化配列とと
もに含む。適切なプロモーターが、本明細書中に記載されている。標的化配列は
、内在性配列に対して十分に相補的であり、プロモーター−標的化配列と内在性
配列との相同組換えを可能にする。標的化配列は、所望される内在性ポリヌクレ
オチド配列のＤ−ＳＬＡＭの５’末端の十分近くに存在し、それゆえ、相同組換
えに際して、プロモーターは、内在性配列に作動可能に連結される。
【０３５７】 このプロモーターおよび標的化配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。好ま
しくは、この増幅されたプロモーターは、５’末端および３’末端に別の制限酵
素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されたプロモ
ーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末
端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されたプ
ロモーターおよび標的化配列を消化し、そしてともに連結する。
【０３５８】 裸のポリヌクレオチドとしてか、もしくは上記により詳細に記載されるような
リポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクション、
沈殿剤などのようなトランスフェクション促進剤と一緒にかのいずれかで、この
プロモーター−標的化配列構築物を細胞に送達する。直接針注射、静脈内注射、
局所投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法により、Ｐプロモ
ーター−標的化配列を送達し得る。この方法を、下記により詳細に記載する。
【０３５９】 プロモーター−標的化配列構築物は、細胞により取り込まれる。この構築物と
内在性配列との間に相同組換えが起こり、その結果、内在性Ｄ−ＳＬＡＭ配列は
、このプロモーターの制御下に配置される。次いで、このプロモーターは、内在
性Ｄ−ＳＬＡＭ配列の発現を駆動する。
【０３６０】 Ｄ−ＳＬＡＭをコードするポリヌクレオチドは、他の脈管形成タンパク質をコ
ードする他のポリヌクレオチドと共に投与され得る。脈管形成タンパク質として
は、酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、上皮成長因子αお
よびβ、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子、腫瘍壊死因子α、
肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、コロニー刺激因子、マクロファージコ
ロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、および一酸化窒素
シンセターゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６１】 好ましくは、Ｄ−ＳＬＡＭをコードするポリヌクレオチドは、そのタンパク質
の分泌を促進する分泌シグナル配列を含む。代表的に、このシグナル配列は、ポ
リヌクレオチドのコード領域の５’末端に向かってかまたは５’末端で発現され
る、そのポリヌクレオチドのコード領域に位置する。このシグナル配列は、目的
のポリヌクレオチドに対して同種または異種であり得、そしてトランスフェクト
される細胞に対して同種または異種であり得る。さらに、当該分野で公知の方法
を使用して、このシグナル配列は化学合成され得る。
【０３６２】 その投与様式によって、治療効果を提供するのに十分な量にて１つ以上の分子
が発現される限り、上記の任意のポリヌクレオチド構築物の任意の投与様式が使
用され得る。これは、直接針注入、全身注射、カテーテル注入、バイオリスティ
ック（ｂｉｏｌｙｓｔｉｃ）注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、
ゲルフォームスポンジデポット（ｄｅｐｏｔ）、他の市販デポット物質、浸透圧
ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口用または坐剤用の固形（錠剤また
は丸剤）薬学的処方物、および手術中のデカンティングまたは局所適用を含む。
例えば、ラット肝臓およびラット脾臓へのリン酸カルシウム沈殿した裸のプラス
ミドの直接注入、または門脈へのタンパク質被覆プラスミド直接注入は、ラット
肝臓における外来遺伝子の遺伝子発現をもたらした（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、２４３：３７５（１９８９））。
【０３６３】 局所投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達ビ
ヒクルと複合体を形成した本発明の組換え分子は、動脈領域中に直接注入により
投与されるか、または動脈領域内部に局所投与される。動脈領域内部での組成物
の局所投与とは、その組成物を動脈内に数センチメートル、好ましくは数ミリメ
ートルで注射することをいう。
【０３６４】 局所投与の別の方法は、外科的創傷内またはその周辺に本発明のポリヌクレオ
チド構築物を接触させることである。例えば、患者は手術を経験し得、そしてこ
のポリヌクレオチド構築物を創傷内部の組織表面上に被覆され得るか、またはそ
の構築物を創傷内部の組織領域に注射され得る。
【０３６５】 全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクルと複合体
を形成した本発明の組換え分子を含む。全身投与で使用するために適切な送達ビ
ヒクルは、特定部位に対してそのビヒクルを標的化するリガンドを含むリポソー
ムを含む。
【０３６６】 全身投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口および経皮
（局所的）送達が挙げられる。当該分野で標準的な方法を使用して、静脈内注射
が実行され得る。当該分野で標準的な方法を使用して、エアロゾル送達もまた実
行され得る（例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １８９：１１２７７〜１
１２８１（１９９２）を参照のこと）。動物の腸内の消化酵素による分解に耐え
得るキャリアに対して本発明のポリヌクレオチド構築物が複合体を形成すること
により、経口送達は実行され得る。そのようなキャリアの例としては、当該分野
で公知であるもののような、プラスチックカプセルまたは錠剤が挙げられる。皮
膚内へ通過可能な親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と本発明のポリヌクレオチド
構築物を混合することによって、局所的送達は実行され得る。
【０３６７】 送達される物質の有効量を決定することは、例えば、その物質の化学構造およ
び生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびそ
の重症度、ならびに投与経路を含む、多数の因子に依存し得る。処置の頻度は、
１用量あたりの投与されるポリヌクレオチド構築物の量ならびに被験体の健康お
よび病歴のような多くの因子に依存する。正確な量、投薬回数および投薬のタイ
ミングは、主治医または主治獣医により決定される。
【０３６８】 本発明の治療的組成物は、任意の動物に、好ましくは哺乳動物および鳥類に投
与され得る。好ましい哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、
ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが挙げられ、ヒトが特に好ましい。
【０３６９】 （Ｄ−ＳＬＡＭの生物学的活性） Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＤ−ＳＬＡＭの
アゴニストもしくはアンタゴニストは、１つ以上の生物学的活性に関して試験す
るためにアッセイに使用され得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、またはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストが、特定の
アッセイにおいて活性を示す場合、Ｄ−ＳＬＡＭは、その生物学的活性と関連す
る疾患におそらく関与し得る。従って、Ｄ−ＳＬＡＭを使用して、この関連疾患
を処置、診断、検出、および／または予防し得る。
【０３７０】 Ｄ−ＳＬＡＭは、Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔ
ｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＳＬＡＭ）ファミリーのメンバーに相同な細胞表面
レセプターであり、従って、他のＳＬＡＭファミリーのメンバーと類似した活性
を有するはずである。文献における最近の研究は、ＳＬＡＭが、それ自身と関与
し得ること、およびこのホモタイプの相互作用が、Ｂ細胞およびＴ細胞を活性化
し得ることを示した。従って、Ｄ−ＳＬＡＭは、特異的にＳＬＡＭ、Ｄ−ＳＬＡ
Ｍ（ホモタイプ相互作用）と相互作用するか、またはＢ細胞およびＴ細胞の表面
上の他のＢ細胞レセプター分子およびＴ細胞レセプター分子と相互作用して、免
疫細胞の活性化、増殖、生存、および／または分化に影響を与え得る。同様に、
可溶性Ｄ−ＳＬＡＭは、治療用途または免疫調節に関して重要な同時刺激分子で
あり得る。抗体のようなリガンドは、Ｄ−ＳＬＡＭ、ＳＬＡＭ、または他の樹状
細胞レセプターへの結合によって可溶性Ｄ−ＳＬＡＭの作用を模倣し得る。
【０３７１】 Ｄ−ＳＬＡＭの結合は、他の細胞型、特にＴ細胞およびＢ細胞からのインター
フェロンγの産生を誘導する（データは示さず）。この結合は、膜結合Ｄ−ＳＬ
ＡＭとのホモタイプの結合、ＳＬＡＭとの結合、または他のＴ細胞レセプターも
しくはＢ細胞レセプターとの結合を介して生じ得る。抗体のようなリガンドは、
Ｄ−ＳＬＡＭ、ＳＬＡＭ、または他の樹状細胞レセプターへの結合によって可溶
性Ｄ−ＳＬＡＭによるインターフェロンγの誘導を模倣し得る。
【０３７２】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭの組織分布に起因して、このタンパク質はまた、樹状細
胞または抗原提示細胞を刺激する際に役割を果たし得る。例えば、分泌形態のＤ
−ＳＬＡＭ（細胞外ドメインまたは全長形態を含む）は、樹状細胞または抗原提
示細胞の表面上に位置したＤ−ＳＬＡＭ分子に、ホモタイプ様式で結合し、そし
て刺激し得る。結合はまた、ＳＬＡＭ、または他の樹状細胞表面レセプターに対
して生じ得る。この結合は、樹状細胞または抗原提示細胞の、生存、増殖、分化
、活性化もしくは成熟を調節し得、抗原認識および免疫応答をもたらす。さらに
、抗体のようなリガンドは、Ｄ−ＳＬＡＭ、ＳＬＡＭ、または他の樹状細胞レセ
プターへの結合によって可溶性Ｄ−ＳＬＡＭの作用を模倣し得る。
【０３７３】 従って、Ｄ−ＳＬＡＭは、治療分子として有用であり得る。Ｄ−ＳＬＡＭは、
造血細胞（特にＢ細胞およびＴ細胞）の、増殖、活性化、成熟、生存、および／
または分化を制御するために使用され得る。詳細には、Ｄ−ＳＬＡＭは、免疫調
節を媒介するために有用な治療剤であり得、そして患者の免疫系のＴｈ０−ＴＨ
１−ＴＨ２プロフィールに影響を与え得る。例えば、Ｄ−ＳＬＡＭは、Ｔｈ０−
ＴＨ１経路への免疫応答を駆動し得る。免疫細胞のこの制御は、免疫障害（例え
ば、自己免疫疾患または免疫抑制）の処置、診断、検出、および／または予防に
特に重要である（下記を参照のこと）。好ましくは、免疫障害の処置、診断、検
出、および／または予防は、分泌形態のＤ−ＳＬＡＭ、遺伝子治療、またはエキ
ソビボ適用を用いて実施され得る。さらに、Ｄ−ＳＬＡＭの阻害（抗体のブロッ
キングまたは変異形態のいずれか）は、Ｄ−ＳＬＡＭの発現を調節し得る。これ
らのインヒビターは、Ｄ−ＳＬＡＭの誤った調節と関連する疾患（例えば、Ｔリ
ンパ腫）を処置、診断、検出、および／または予防することに有用であり得る。
【０３７４】 １つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合する
本発明のポリペプチド（例えば、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドおよび／または抗Ｄ
−ＳＬＡＭ抗体）を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特異的な送
達のための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治療タンパク質を標
的化細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本
鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または二本鎖核酸（例えば、
細胞のゲノムに組み込み得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写さ
れ得るＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供する。
【０３７５】 別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグに関連
する本発明のポリペプチド（例えば、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたは抗Ｄ−Ｓ
ＬＡＭ抗体）を投与することによる細胞の特異的な破壊（例えば、腫瘍細胞の破
壊）のための方法を提供する。
【０３７６】 「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクタ系、放射性同位体、ホロ毒素（
ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、細胞毒（細胞毒
性薬剤）または規定の条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には
通常存在しない任意の分子もしくは酵素を、結合および活性化する化合物を意味
する。本発明の方法に従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、
これらに限定されない：当該分野で公知の放射性同位体、化合物（例えば、固有
のまたは誘導された内因性の細胞傷害性エフェクタ系に結合する抗体（またはそ
の補体固定含有部分）など）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡ
ｓｅ、α毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリ
ア毒素、サポリン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉ
ｎ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコ
レラ毒素。「毒素」としてはまた、細胞分裂停止剤もしくは細胞破壊剤、治療薬
または放射活性金属イオン（例えば、α−放射体（例えば、213Ｂｉなど）もし
くは他の放射性同位体（例えば、103Ｐｄ、133Ｘｅ、131Ｉ、68Ｇｅ、57Ｃｏ、6 5 Ｚｎ、85Ｓｒ、32Ｐ、35Ｓ、90Ｙ、153Ｓｍ、153Ｇｄ、169Ｙｂ、51Ｃｒ、54Ｍ
ｎ、75Ｓｅ、113Ｓｎ、90イットリウム、117スズ、186レニウム、166ホルミウム
、および188レニウムなど））；発光標識（例えば、ルミノール）；および蛍光
標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチンが挙げら
れる。
【０３７７】 当該分野において公知の技術は、本発明の抗体を標識化するために適用され得
る。このような技術としては、二官能性結合剤の使用（例えば、米国特許第５，
７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６９６，２３９号；同
第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第５，４８９，４２５
号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号；同第５，３４２，
６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５６０号；および５，
８０８，００３号を参照のこと；これら各々の内容は、本明細書中に参考として
その全体を援用される）が挙げられるが、これに限定されない。細胞毒または細
胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキ
セル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチ
ジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓ
ｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダ
ウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔ
ｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマ
イシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テ
トラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならび
にこれらのアナログまたはホモログ、が挙げられる。治療剤としては、代謝拮抗
物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、
シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、ク
ロルメチン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）
クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（
ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブス
ルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、な
らびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アン
トラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキ
ソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン
）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａ
ｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチンお
よびビンブラスチン）、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７８】 「細胞傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞
傷害性化合物へと変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って
使用され得る細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化
剤のグルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シ
トシンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセ
トアミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７９】 個体における標準的または正常なレベルのＤ−ＳＬＡＭ活性の減少によっても
たらされる状態（特に、免疫系の障害）は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド（可溶性
細胞外ドメインの形態または完全なタンパク質を発現する細胞で）またはＤ−Ｓ
ＬＡＭアゴニストの投与によって処置され得ることが、理解される。従って、本
発明はまた、増加したレベルのＤ−ＳＬＡＭ活性が必要である個体の処置方法を
提供し、この方法は、このような個体に、このような個体におけるＤ−ＳＬＡＭ
活性レベルを増加するのに有効な量の本発明の単離されたＤ−ＳＬＡＭポリペプ
チドまたはそのアゴニストを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【０３８０】 個体における標準的または正常なレベルのＤ−ＳＬＡＭ活性の増加によっても
たらされる状態（特に、免疫系の障害）は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド（可溶性
細胞外ドメインの形態または完全なタンパク質を発現する細胞で）またはＤ−Ｓ
ＬＡＭアンタゴニスト（例えば、拮抗性のＤ−ＳＬＡＭ抗体）の投与によって処
置され得ることもまた、理解される。従って、本発明はまた、減少したレベルの
Ｄ−ＳＬＡＭ活性が必要である個体の処置方法を提供し、この方法は、このよう
な個体に、このような個体におけるＤ−ＳＬＡＭ活性レベルを減少するのに効果
的な量の本発明の単離されたＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはそのアゴニストを
含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【０３８１】 ウイルスは、Ｄ−ＳＬＡＭのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいは
Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニストにより処置され得る疾患または症状を引き起こし得る
感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤＮＡウイルスおよびＲ
ＮＡウイルスならびにウイルス科が挙げられるがこれらに限定されない：アルボ
ウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス（Ａｒｔｅ
ｒｉｖｉｒｕｓ）、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カリシウイルス科、
シルコウイルス科、コロナウイルス科、デング熱、ＥＢＶ、ＨＩＶ、フラビウイ
ルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例えば、サイトメ
ガロウイルス、単純ヘルペス、帯状疱疹）、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇ
ａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、モルビリウイルス、ラブドウ
イルス科）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザＡ、インフルエ
ンザＢ、およびパラインフルエンザ）、パピローマウイルス、パポバウイルス科
、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、痘瘡
または痘疹）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（
ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およびトガウイルス科（例
えば、ルビウイルス属）。これらの科内に入るウイルスは、以下を含むがこれら
に限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：関節炎、細気管支炎（
ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、呼吸性シンシチウムウイルス、脳炎、眼性感
染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、
Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、日本脳炎、アルゼンチン出血熱（Ｊｕｎｉｎ）、
チンクグニヤ（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）、リフトバレー熱、黄熱病、髄膜炎、
日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱
、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病
、風疹、性感染症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。
Ｄ−ＳＬＡＭのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＤ−ＳＬＡＭの
アゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、これらの症状または疾患のいずれ
かが処置、予防、診断および／または検出され得る。特定の実施形態において、
Ｄ−ＳＬＡＭのポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストは、以下の
処置、予防、および／または診断に使用される：髄膜炎、デング熱、ＥＢＶおよ
び／または肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）。さらなる特定の実施形態において、Ｄ−
ＳＬＡＭのポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはアゴニストは、１以上の他の
市販の肝炎ワクチンに非応答性の患者を処置するために使用される。さらなる特
定の実施形態において、Ｄ−ＳＬＡＭのポリヌクレオチド、ポリペプチド、また
はアゴニストは、ＡＩＤＳを処置、予防および／または診断するために使用され
る。さらなる特定の実施形態において、Ｄ−ＳＬＡＭのポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、アゴニストおよび／またはアンタゴニストは、クリプトスポリジウム
症を有する患者を処置、予防、および／または診断するために使用される。
【０３８２】 同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつＤ−ＳＬＡＭのポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチド、あるいはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストまたはアンタゴニス
トによって処置され得る細菌性因子または真菌性因子は、以下のグラム陰性細菌
および細菌科ならびにグラム陽性細菌および細菌科、ならびに真菌を含むがこれ
らに限定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ｃｒ
ｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、
Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）
、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔ
ｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ
ｒｉ）、Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂ
ａｃｔｅｒ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏ
ｓｉｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏ
ｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ
Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉおよ
びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓ
ｉｎｉａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅ
ｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例
えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ
ａｔａｌｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃ
ｈｏｌｅｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍｅｉｓｓｅｒｉ
ａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａの感染症（Ｐａ
ｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）（例えば、Ａｃｔｉｎｏｂ
ａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ
ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｔｙｐｅ Ｂ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、
Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａ
ｌ、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃａｌ、ＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌおよびＳｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃａｌ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅおよびＢ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。これらの細菌または真菌の科は
、以下を含むがこれらに限定されない疾患または症状を引き起こし得る：菌血症
、心内膜炎、眼性感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症
（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、ラ
イター病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血症、ライム病、ネ
コ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎（
例えば、髄膜炎Ａ型およびＢ型）、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ハンセン病
、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱
、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃ
ｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。Ｄ−ＳＬＡＭのポリヌク
レオチドまたはポリペプチド、あるいはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストまたはアンタ
ゴニストを用いて、これらの症状または疾患のいずれかを処置、予防、診断およ
び／または検出し得る。特定の実施形態において、Ｄ−ＳＬＡＭのポリヌクレオ
チド、ポリペプチド、またはそのアンタゴニストは、以下を処置、予防および／
または診断するために使用される：破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、およ
び／または髄膜炎Ｂ型。
【０３８３】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＤ−
ＳＬＡＭのアンタゴニストにより処置され得る、寄生生物性因子が引き起こす疾
患または症状としては以下のファミリーまたはクラスが挙げられるがこれらに限
定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム
症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交疫、外部寄生生物
（Ｅｃｔｏｐａｒａｓｉｔｉｃ）、ジアルジア鞭毛虫病、蠕虫病、リーシュマニ
ア症、タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、およびトリコモナ
ス症（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、ならびに胞子虫症（Ｓｐｏｒｏｚｏａｎ）（
例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｒａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃ
ｉｐａｒｉｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌａｓｍｏ
ｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定され
ない種々の疾患または症状を引き起こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症
、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感
染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ
症。Ｄ−ＳＬＡＭのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＤ−ＳＬＡ
Ｍのアゴニストまたはアンタゴニストを用いて、これらの症状または疾患のいず
れかを処置、予防、診断および／または検出し得る。特定の実施形態において、
Ｄ−ＳＬＡＭのポリヌクレオチド、ポリペプチド、あるいはそのアンタゴニスト
は、マラリアの処置、予防、および／または診断のために使用される。
【０３８４】 別の実施形態において、本発明のＤ−ＳＬＡＭのポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは
、内耳感染（例えば、中耳炎）、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅおよび他の病原性生物の感染によって特徴付けられる他の感染を
処置、予防、および／または診断するために使用される。
【０３８５】 特定の実施形態において、Ｄ−ＳＬＡＭのポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ド、あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗Ｄ−ＳＬＡＭ抗
体）は、欠乏した血清免疫グロブリン産生、再発性感染、および／または免疫系
機能不全によって特徴付けられる障害を処置または予防するために使用される。
さらに、Ｄ−ＳＬＡＭのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはそのア
ゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗Ｄ−ＳＬＡＭ抗体）は、関節、骨、
皮膚、および／または耳下腺の感染、血液媒介性感染（例えば、敗血症、髄膜炎
、敗血症性関節炎（ｓｅｐｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、および／または骨髄
炎）、自己免疫疾患（例えば、本明細書中に開示されるもの）、炎症性障害、お
よび悪性疾患、ならびに／あるいはこれらの感染、疾患、障害および／または悪
性疾患に関連する任意の疾患または障害または状態（ＣＶＩＤ、他の第一次免疫
不全、ＨＩＶ疾患、ＣＬＬ、再発性気管支炎、副鼻腔炎、中耳炎、結膜炎、肺炎
、肝炎、髄膜炎、帯状疱疹（例えば、重症帯状疱疹）、およびまたはニューモシ
スチスカリニ（ｐｈｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｎｉｉ）を含むが、これらに
限定されない）を処置または予防するために使用され得る。
【０３８６】 本発明のＤ−ＳＬＡＭのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはその
アゴニストまたはアンタゴニストは、以下に関連する疾患または障害または状態
の１つ以上を診断、予後の判断、処置、または予防するために使用され得る：第
一次免疫不全、免疫媒介血小板減少症、川崎病、骨髄移植（例えば、成人または
子供における最近の骨髄移植）、慢性Ｂ細胞リンパ性白血病、ＨＩＶ感染（例え
ば、成人性または小児のＨＩＶ感染）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、および
輸血後紫斑病。
【０３８７】 さらに、本発明のＤ−ＳＬＡＭのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ある
いはそのアゴニストまたはアンタゴニストは、以下に関連する疾患、障害または
状態の１つ以上を診断、予後の判断、処置、または予防するために使用され得る
：ギャン−バレー症候群、貧血症（例えば、パルボウイルスＢ１９関連貧血症、
感染（例えば、再発性感染）の高い危険にある安定多発性骨髄腫（ｓｔａｂｌｅ
ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ）を有する患者、自己免疫溶血性貧血（例
えば、温型（ｗａｒｍ−ｔｙｐｅ）自己免疫溶血性貧血）、血小板減少症（例え
ば、新生児血小板減少症）および免疫媒介好中球減少症）、移植（例えば、サイ
トメガロウイルス（ｃｙｔａｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）−陽性器官の
ＣＭＶ−陰性レシピエント）、低ガンマグロブリン血症（例えば、感染または罹
患の危険因子を有する低ガンマグロブリン血症新生児）、癲癇（例えば、難治性
癲癇）、全身性血管炎症候群（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｃ ｓｙ
ｎｄｒｏｍｅ）、重症筋無力症（例えば、重症筋無力症における代償不全）、皮
膚筋炎、および多発性筋炎。
【０３８８】 本発明のさらに好ましい実施形態は、以下の用途におけるＤ−ＳＬＡＭのポリ
ペプチド、Ｄ−ＳＬＡＭのポリヌクレオチド、ならびにその機能的アゴニストの
使用を含むが、これらに限定されない： １つ以上の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）の量の減少
を生じるための免疫系を阻害するための、より高い親和性抗体の産生（例えば、
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）を阻害するための、そして／または免疫
応答を減少させるための、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター
、モルモット、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワトリ、ラクダ、ヤ
ギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ヒト以外の霊長類、およびヒト（最も好
ましくはヒト）への投与。特定の非限定的実施形態では、本発明のＤ−ＳＬＡＭ
ポリペプチド、および／またはそのアゴニストは、ＩｇＧの減少した量を生じる
ための免疫系を阻害するために投与される。別の特定の非限定的な実施形態にお
いて、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチド、および／またはそのアゴニストは、
ＩｇＡの減少した量を生じるための免疫系をブーストするために投与される。別
の特定の非限定的な実施形態において、本発明のＤ−ＳＬＡＭのポリペプチド、
および／またはそのアゴニストは、ＩｇＭの減少した量を生じるための免疫系を
阻害するために投与される。
【０３８９】 免疫抑制治療を受ける前に個体の免疫状態を低減させる試薬として。
【０３９０】 血清免疫グロブリン濃度を減少するための試薬として。
【０３９１】 骨髄移植および／または他の移植の前、その間、またはその後の免疫系インヒ
ビターとして（例えば、同種器官移植または異種器官移植）。移植に関して、本
発明の組成物は、移植の前に、移植と同時に、そして／または移植の後に投与さ
れ得る。
【０３９２】 免疫応答性を低減するための試薬として。本発明のＤ−ＳＬＡＭアンタゴニス
トを投与することにより寛解または処置され得るＢ細胞免疫不全には、以下が挙
げられるがこれらに限定されない：重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）−Ｘ連鎖性、
ＳＣＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ不全（ＡＤＡ不全）、Ｘ連鎖性無
ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、ブルートン疾患（Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ ｄｉｓ
ｅａｓｅ）、先天性無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖性乳児無ガンマグロブリン
血症、後天性無ガンマグロブリン血症、成体発症性無ガンマグロブリン血症、遅
発性無ガンマグロブリン血症、異常ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン
血症、乳児の一過性低ガンマグロブリン血症、特定されない低ガンマグロブリン
血症、無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）（後天性）、
ヴィスコット−オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖性免
疫不全、過剰ＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖性免疫不全、選択的ＩｇＡ不全、ＩｇＧサブ
クラス不全（ＩｇＡ不全を伴うかまたは伴わない）、正常または増大したＩｇを
伴う抗体不全、胸腺腫を伴う免疫不全、Ｉｇ重鎖欠失、κ鎖不全、Ｂ細胞リンパ
球増殖性障害（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫不全、劣性無ガンマグロブリン血
症（スイス型）、細網発育不全（ｒｅｔｉｃｕｌａｒ ｄｙｓｇｅｎｅｓｉｓ）
、新生児好中球減少症、重症先天性白血球減少症、免疫不全を伴う胸腺リンパ形
成不全症−形成不全または異形成、毛細管拡張性運動失調、短肢小人症（ｓｈｏ
ｒｔ ｌｉｍｂｅｄ ｄｗａｒｆｉｓｍ）、Ｘ連鎖性リンパ球増殖性症候群（Ｘ
ＬＰ）、Ｉｇを伴うネゼロフ症候群複合免疫不全、プリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼ不全（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラスＩＩ不全（不全リンパ球症候群）および重
症複合免疫不全。
【０３９３】 Ｄ−ＳＬＡＭアンタゴニストは、Ｂ細胞機能の後天的欠損を有する個体の間で
免疫応答性をブーストするための因子として使用され得る。本発明のＤ−ＳＬＡ
Ｍアンタゴニストを投与することによって改善または処置され得る、Ｂ細胞機能
の後天的欠損を生じる状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、骨髄移植、およびＢ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬ
Ｌ）。
【０３９４】 Ｄ−ＳＬＡＭアンタゴニストは、一時的な免疫不全を有する個体の間で免疫応
答性をブーストするための因子として使用され得る。Ｄ−ＳＬＡＭアンタゴニス
トを投与することによって改善または処置され得る、一時的な免疫不全を生じる
状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ウイルス感染（例
えば、インフルエンザ）からの回復、栄養失調に関連する状態、感染性単核細胞
症からの回復、またはストレスに関連する状態、麻疹からの回復、輸血からの回
復、手術からの回復。
【０３９５】 ＴＨ１細胞応答の反対としての体液性応答（すなわち、ＴＨ２）の発生に対す
る、個体の免疫系を指向する因子として。
【０３９６】 腫瘍増殖を阻害する手段として。
【０３９７】 手術、外傷または遺伝子欠損の後のリンパ組織の生成および／または再生のた
めの治療として。
【０３９８】 ＳＣＩＤ患者の間で観察されるような免疫不全を生じる、遺伝的に受け継がれ
た障害のための、遺伝子に基づく治療として。
【０３９９】 Ｄ−ＳＬＡＭ媒介応答を阻害または増強する抗体の産生のための抗原として。
【０４００】 単球（例えば、Ｌｅｓｈｍａｎｉａ）をもたらす寄生虫症を防御するために、
単球／マクロファージを阻害する手段として。
【０４０１】 移植の前の骨髄サンプルの前処理として。このような処理は、Ｂ細胞提示を減
少させ、従って回復を調節する。
【０４０２】 Ｄ−ＳＬＡＭによって誘発される、分泌サイトカインを調節する手段として。
【０４０３】 本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはアンタゴ
ニストを使用して、インビボまたはインビトロでＩｇＥ濃度を調節し得る。
【０４０４】 さらに、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるい
はそのアンタゴニストを使用して、ＩｇＥ媒介アレルギー反応を処置、予防およ
び／または診断し得る。このようなアレルギー反応としては、喘息、鼻炎、およ
び湿疹が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０５】 特定の実施形態においては、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌ
クレオチド、あるいはそれらのアンタゴニストは、選択的ＩｇＡ欠損を処置、予
防、診断、および／または改善するために投与される。
【０４０６】 別の特定の実施形態においては、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポ
リヌクレオチド、あるいはそれらのアンタゴニストは、毛細管拡張性運動疾患を
処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０４０７】 別の特定の実施形態においては、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポ
リヌクレオチド、あるいはそれらのアンタゴニストは、分類不能型免疫不全を処
置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０４０８】 別の特定の実施形態においては、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポ
リヌクレオチド、あるいはそれらのアンタゴニストは、Ｘ連鎖無ガンマグロブリ
ン血症を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０４０９】 別の特定の実施形態においては、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポ
リヌクレオチド、あるいはそれらのアンタゴニストは、重症複合型免疫不全（Ｓ
ＣＩＤ）を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０４１０】 別の特定の実施形態においては、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポ
リヌクレオチド、あるいはそれらのアンタゴニストは、ヴィスコット−オールド
リッチ症候群を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０４１１】 別の特定の実施形態においては、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポ
リヌクレオチド、あるいはそれらのアンタゴニストは、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖
Ｉｇ欠損を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０４１２】 別の特定の実施形態においては、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポ
リヌクレオチド、あるいはそれらのアンタゴニストまたはアンタゴニスト（例え
ば、抗Ｄ−ＳＬＡＭ抗体）は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、白血病、
組織球性白血病、単球性白血病（例えば、急性単球性白血病）、白血病性細網症
、Ｓｈｉｌｌｉｎｇ型単球性白血病、ならびに／あるいは単球および／または単
球細胞および／または組織から誘導される他の白血病を処置、予防、および／ま
たは診断するために投与される。
【０４１３】 別の特定の実施形態においては、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポ
リヌクレオチド、あるいはそれらのアンタゴニストは、例えば、結核と共に見ら
れるような単球性類白血病反応を処置、予防、診断、および／または改善するた
めに投与される。
【０４１４】 別の特定の実施形態においては、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポ
リヌクレオチド、あるいはそれらのアンタゴニストは、単球性白血球増加症、単
球性白血球減少症、単球減少症、および／または単球増加症を処置、予防、診断
、および／または改善するために投与される。
【０４１５】 特定の実施形態においては、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくは
ポリペプチドおよび／または抗Ｄ−ＳＬＡＭ抗体および／またはそれらのアゴニ
ストもしくはアンタゴニストを使用して、原発性Ｂリンパ球障害および／もしく
は疾患、ならびに／またはそれに付随する状態を処置、予防、検出および／また
は診断する。
【０４１６】 好ましい実施形態においては、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド、ポリペプチド
、および／またはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを使用して
、身体の種々の粘膜の任意の１以上に影響する疾患もしくは障害または身体の種
々の粘膜の任意の１以上に関連する状態を処置、予防、および／または診断する
。このような疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）、粘膜破壊、粘膜性結腸炎、粘膜
性リーシュマニア症（例えば、アメリカリーシュマニア症、皮膚フランベシア、
鼻咽頭リーシュマニア症、および新世界リーシュマニア症）、粘膜皮膚リンパ節
症候群（例えば、川崎病）、小腸粘膜炎、粘膜性類表皮癌、粘膜性類上皮腫、粘
膜上皮形成異常、ムコイド腺癌、ムコイド変性、ミクソイド変性；粘膜腫変性；
粘膜腫症、ムコイド中膜変性（例えば、嚢胞性中膜壊死）、ムコリピドーシス（
例えば、ムコリピドーシスＩ、ムコリピドーシスＩＩ、ムコリピドーシスＩＩＩ
、ムコリピドーシスＩＶを含む）、粘液溶解障害、粘液性膜性腸炎、小腸粘膜炎
、ムコ多糖体沈着症（例えば、Ｉ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、ハーラー症候
群）、ＩＳ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、シャイエ症候群またはＶ型ムコ多糖
体沈着症）、ＩＩ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、ハンター症候群）、ＩＩＩ型
ムコ多糖体沈着症（すなわち、サンフィリポ症候群）、ＩＶ型ムコ多糖体沈着症
（すなわち、モルキオ症候群）、ＶＩ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、マロトー
−ラミー症候群）、ＶＩＩ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、βグルクロニダーゼ
欠損に起因するムコ多糖体沈着症）、およびムコスルファチドーシス）、ムコ多
糖尿、粘液膿性結膜炎、膿様粘液、ムコール症（すなわち、接合真菌症、粘膜病
（すなわち、ウシウイルス性下痢）、粘液性大腸炎（例えば、粘液性結腸炎およ
び粘膜性大腸炎）、ならびにムコビシドーシス（例えば、嚢胞性線維症、膵嚢胞
性線維症、クラーク−ハッドフィールド症候群、膵臓の線維嚢胞病、ムコビシド
ーシス、および粘液過剰症）。非常に好ましい実施形態においては、Ｄ−ＳＬＡ
Ｍポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはそれらのアゴニストおよび／
またはアンタゴニストを使用して、粘膜炎（特に化学療法に関連するような）を
処置、予防、および／または診断する。
【０４１７】 好ましい実施形態においては、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド、ポリペプチド
および／またはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを使用して、
静脈洞炎に影響する疾患もしくは障害または静脈洞炎に関連する状態を、処置、
予防、および／または診断する。
【０４１８】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＤ−ＳＬＡＭの
アンタゴニストによって処置、予防、および／または診断され得る、さらなる状
態、疾患または症状は、骨髄炎である。
【０４１９】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＤ−ＳＬＡＭの
アンタゴニストによって処置、予防、および／または診断され得る、さらなる状
態、疾患または症状は、心内膜炎である。
【０４２０】 上記のすべての適用は、獣医学に適用され得る。
【０４２１】 Ｄ−ＳＬＡＭアンタゴニストは、Ｂ細胞悪性疾患（例えば、ＡＬＬ、ホジキン
病、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、プラズマ細胞腫、多発性骨髄
腫、バーキットリンパ腫、およびＥＢＶ形質転換病）のための治療、ならびに非
定量有意性の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、ヴァルデン
ストレーム病、関連特発性単一クローン性高ガンマグロブリン血症、およびプラ
ズマ細胞腫などの疾患において明らかな、慢性高ガンマグロブリン血症のための
治療として使用され得る。
【０４２２】 免疫抑制剤。
【０４２３】 本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはアンタ
ゴニストを使用して、インビトロまたはインビボにおけるＩｇＥ濃度を調節し得
る。
【０４２４】 別の実施形態においては、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌク
レオチド、あるいはそれらのアンタゴニストの投与を使用して、ＩｇＥ媒介性ア
レルギー反応（喘息、鼻炎、および湿疹が挙げられるが、これらに限定されない
）を処置、予防、および／または診断し得る。
【０４２５】 上記に列挙した適用は、広範な種々の宿主における使用を有する。このような
宿主としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒト、ネズミ、ウ
サギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、
ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ
、非ヒト霊長類、およびヒト。特定の実施形態においては、宿主は、マウス、ウ
サギ、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌ
またはネコである。好ましい実施形態においては、宿主は哺乳動物である。最も
好ましい実施形態においては、宿主はヒトである。
【０４２６】 アゴニストおよびアンタゴニストは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、
本明細書中で記載されるような）と共に、組成物中で使用され得る。
【０４２７】 上記の適用のすべては、獣医学に適用され得る。さらに、本明細書中に記載さ
れたすべての適用はまた、獣医学に適用され得る。
【０４２８】 本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／または
それらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを使用して、哺乳動物（好ま
しくは、ヒト）における種々の免疫系関連障害および／またはこれらの障害に関
連する状態を、処置、予防、および／または診断し得る。多くの自己免疫障害は
、免疫細胞による、自己を外来物質とみなす不適切な認識によって生じる。この
不適切な認識は、宿主組織の破壊を引き起こす免疫応答を生じる。従って、免疫
応答（特に、Ｂ細胞の増殖および／または免疫グロブリンの産生）を阻害し得る
本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／または
それらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストの投与は、自己免疫障害の処
置および／または予防における効果的な治療であり得る。従って、好ましい実施
形態においては、本発明のＤ−ＳＬＡＭアゴニストを使用して、自己免疫障害を
処置、予防、および／または診断し得る。
【０４２９】 本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはアゴ
ニストを用いて処置、予防、および／または診断され得る、自己免疫障害および
これらの障害に関連する状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定され
ない：自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性新生児血小板減少、特発性血小板減少
性紫斑病、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、ア
レルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体
腎炎（例えば、ＩｇＡ腎症）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎性眼炎、多発
性内分泌腺症、紫斑病（例えば、ヘンノッホ−シェーンライン紫斑病）、ライタ
ー病、スティッフマン症候群、自己免疫性肺炎、ギャン−バレー症候群、インス
リン依存性糖尿病、および自己免疫性炎症性眼病。
【０４３０】 本発明の組成物を用いて処置、予防、および／または診断され得る、さらなる
自己免疫性障害（これらは非常にあり得る）としては、以下が挙げられるが、こ
れらに限定されない：自己免疫性甲状腺炎、甲状腺機能低下症（すなわち、橋本
甲状腺炎）（例えば、細胞媒介性および体液性甲状腺細胞障害性によってしばし
ば特徴付けられる）、全身性エリテマトーデス（例えば、循環および局所的に産
生される免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）、グッドパスチャー症候
群（例えば、抗基底膜抗体によってしばしば特徴付けられる）、天疱瘡（例えば
、表皮棘融解抗体によってしばしば特徴付けられる）、レセプター自己免疫（例
えば、（ａ）グレーブス病（例えば、ＴＳＨレセプター抗体によってしばしば特
徴付けられる）、（ｂ）重症筋無力症（例えば、アセチルコリンレセプター抗体
によってしばしば特徴付けられる）、および（ｃ）インスリン抵抗性（例えば、
インスリンレセプター抗体によってしばしば特徴付けられる））、自己免疫性溶
血性貧血（例えば、抗体感受性ＲＢＣの食作用によってしばしば特徴付けられる
）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（例えば、抗体感受性血小板の食作用によっ
てしばしば特徴付けられる）。
【０４３１】 本発明の組成物を用いて処置、予防、および／または診断され得る、さらなる
自己免疫性障害（これらはあり得る）としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：慢性関節リウマチ（例えば、関節における免疫複合体によってし
ばしば特徴付けられる）、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅ
ｒｍａ）（例えば、核小体抗体および他の核抗体によってしばしば特徴付けられ
る）、混合結合組織病（例えば、可溶性核抗原（例えば、リボ核タンパク質）に
対する抗体によってしばしば特徴付けられる）、多発性筋症／皮膚筋炎（例えば
、非ヒストンＡＮＡによってしばしば特徴付けられる）、悪性貧血（例えば、抗
壁細胞、ミクロソーム、および内因子抗体によってしばしば特徴付けられる）、
特発性アジソン病（例えば、体液および細胞媒介性副腎細胞傷害性によってしば
しば特徴付けられる）、不妊症（例えば、抗精子抗体によってしばしば特徴付け
られる）、糸球体腎炎（例えば、原発性糸球体腎炎およびＩｇＡ腎症）（例えば
、糸球体基底膜抗体または免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）、水疱
性類天疱瘡（例えば、基底膜中のＩｇＧおよび補体によってしばしば特徴付けら
れる）、シェーグレン症候群（例えば、多重組織抗体、および／または特定の非
ヒストンＡＮＡ（ＳＳ−Ｂ）によってしばしば特徴付けられる）、糖尿病（例え
ば、細胞媒介性および体液性島細胞抗体によってしばしば特徴付けられる）、な
らびにアドレナリン作動性薬剤抵抗性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナ
リン作動性薬剤抵抗性を含む）（例えば、βアドレナリンレセプター抗体によっ
てしばしば特徴付けられる）。
【０４３２】 本発明の組成物を用いて処置、予防、および／または診断され得る、さらなる
自己免疫性障害（これらはあり得る）としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：慢性活性肝炎（例えば、平滑筋抗体によってしばしば特徴付けら
れる）、原発性胆汁性肝硬変（例えば、ミトコンドリア抗体によってしばしば特
徴付けられる）、他の内分泌腺不全（例えば、いくつかの場合は、特定の組織抗
体によってしばしば特徴付けられる）、白斑（例えば、メラノサイト抗体によっ
てしばしば特徴付けられる）、脈管炎（例えば、脈管壁におけるＩｇおよび補体
ならびに／または低血清補体によってしばしば特徴付けられる）、ＭＩ後（例え
ば、心筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、心臓切開症候群（例えば、心
筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、じんま疹（例えば、ＩｇＥに対する
ＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、アトピー性皮
膚炎（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特
徴付けられる）、喘息（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体に
よってしばしば特徴付けられる）、炎症性筋障害、ならびに多くの他の炎症性障
害、肉芽種性障害、変性障害、および萎縮性障害。
【０４３３】 好ましい実施形態においては、自己免疫性疾患および障害ならびに／または上
記に列挙された疾患および障害に関連する状態は、抗Ｄ−ＳＬＡＭ抗体を用いて
、処置、予防、および／または診断される。
【０４３４】 特定の好ましい実施形態においては、Ｄ−ＳＬＡＭおよび／または他の本発明
のアゴニストを用いて、慢性関節リウマチが処置、予防、および／または診断さ
れる。
【０４３５】 特定の好ましい実施形態においては、Ｄ−ＳＬＡＭおよび／または他の本発明
のアゴニストを用いて、狼瘡が処置、予防、および／または診断される。
【０４３６】 特定の好ましい実施形態においては、Ｄ−ＳＬＡＭおよび／または他の本発明
のアゴニストを用いて、狼瘡に関連する腎炎が処置、予防、および／または診断
される。
【０４３７】 同様に、アレルギー反応および状態（例えば、喘息（特にアレルギー性喘息）
または他の呼吸性の問題）もまた、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアン
タゴニストによって処置され得る。さらに、これらの分子を使用して、アナフィ
ラキシー、抗原性分子に対する過敏症、または血液型不適合を処置、予防、およ
び／または診断し得る。
【０４３８】 本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチドならびに／ある
いはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストをまた使用して、器官拒
絶または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）および／またはそれに関連する状態を処
置、予防、および／または診断し得る。器官拒絶は、免疫応答を通した移植され
た組織の宿主免疫細胞破壊によって起こる。同様に、免疫応答もまた、ＧＶＨＤ
に関与するが、この場合、外来性の移植された免疫細胞は、宿主組織を破壊する
。本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびに／あ
るいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストの投与（これは、免疫
応答（特にＴ細胞の増殖、分化、または走化性）を阻害する）は、器官拒絶また
はＧＶＨＤの予防における効果的な治療であり得る。
【０４３９】 同様に、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、なら
びに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストをまた使用し
て、炎症を調節し得る。例えば、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタ
ゴニストは、炎症性応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これら
の分子を使用して、炎症状態（慢性状態および急性状態の両方）を処置、予防、
および／または診断し得、これらの炎症状態としては以下が挙げられる：慢性前
立腺炎、肉芽種性前立腺炎およびマラコプラキア、感染に関連する炎症（例えば
、敗血症性ショック、敗血症、または全身性炎症性応答症候群（ＳＩＲＳ））、
虚血再灌流障害、エンドトキシン致死性、関節炎、補体媒介性超急性拒絶、腎炎
、サイトカインまたはケモカイン誘導性肺損傷、炎症性腸疾患、クローン病、ま
たはサイトカインの過剰産生の結果（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）。
【０４４０】 特定の実施形態においては、本発明の抗Ｄ−ＳＬＡＭ抗体を使用して、炎症を
処置、予防、調節、検出、および／または診断する。
【０４４１】 特定の実施形態においては、本発明の抗Ｄ−ＳＬＡＭ抗体を使用して、炎症性
障害を処置、予防、調節、検出、および／または診断する。
【０４４２】 別の特定の実施形態においては、本発明の抗Ｄ−ＳＬＡＭ抗体を使用して、ア
レルギーおよび／または過敏症を処置、予防、調節、検出、および／または診断
する。
【０４４３】 特定の実施形態においては、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくは
ポリペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴ
ニストを使用して、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を処置、予防、および／また
は診断する。
【０４４４】 別の実施形態においては、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニ
ストを使用して、線維症および線維症に関連する状態（例えば、嚢胞性線維症（
膵臓の嚢胞性線維症、クラーク−ハッドフィールド症候群、膵線維嚢胞症、ムコ
ビシドーシス、および粘液過剰症のような線維症を含む）、心内膜心筋線維症、
特発性腹膜後線維症、軟膜線維症、縦隔線維症、結節性表皮下線維組織増殖症、
中心静脈周囲線維化、筋周囲線維化、パイプ軸線維症、置換性線維形成、外膜下
線維症、シンマーズ陶製パイプ柄状線維症があるが、これらに限定されない）を
、処置、予防、および／または診断する。
【０４４５】 本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにそれ
らのアゴニストおよびアンタゴニストを用いて、診断、処置、または予防され得
る、増加した細胞生存またはアポトーシスの阻害に関連する疾患としては、以下
が挙げられる：癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌、およびホル
モン依存性腫瘍（大腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽
細胞腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、
内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、
カポジ肉腫および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない））；自己免疫
障害（例えば、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎性慢性関節リ
ウマチ）；ウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよび
アデノウイルス）；炎症；対宿主性移植片病；急性移植片拒絶および慢性移植片
拒絶。従って、好ましい実施形態においては、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストまたはア
ンタゴニストは、自己免疫疾患を処置、予防、および／または診断するため、な
らびに／あるいは癌の増殖、進行、および／または転移を阻害するために使用さ
れ、このような癌としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：本明細
書中に記載された癌（例えば、リンパ球性白血病（例えば、ＭＬＬおよび慢性リ
ンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含む）および濾胞性リンパ腫）。別の実施形態にお
いては、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチドを使用して
、癌細胞または癌組織（例えば、Ｂ細胞系関連癌（例えば、ＣＬＬおよびＭＬＬ
）、リンパ球性白血病、またはリンパ腫）を活性化、分化または増殖させ、そし
てそれによって細胞を、癌治療（例えば、化学療法または放射線療法）に対して
より脆弱にする。
【０４４６】 さらに、他の実施形態において、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまた
はポリペプチド、あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニストを使用して、以
下のような悪性疾患および関連疾患の成長、進行および／または転移を阻害する
：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄
芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）なら
びに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性
白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキ
ン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、
ならびに固形腫瘍（以下を含むが、これらに限定されない：肉腫および癌腫（例
えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉
腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ
管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌
腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌
、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞
癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸
部癌、精巣の腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状
細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、
聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽
細胞腫、および網膜芽細胞腫））。
【０４４７】 本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにそのア
ゴニストまたはアンタゴニストによって診断、処置または予防され得る、アポト
ーシスの増大に関連する疾患には、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経変性障害
（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網
膜炎、小脳変性）；脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、虚血性損
傷（例えば、心筋梗塞、発作および再灌流損傷によって生じるようなもの）；毒
物誘導性肝臓疾患（アルコールによって生じるようなもの）、敗血症性ショック
、悪液質ならびに食欲不振。従って、好ましい実施形態において、本発明のＤ−
ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはそのアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、上記に列挙される疾患および障害を処置、予防およ
び／または診断するために使用される。
【０４４８】 本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそ
れらのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、広範囲の疾患および／ま
たは状態の診断および処置または予防において有用である。このような疾患およ
び状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：癌（例えば、免
疫細胞関連癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、濾胞性リンパ腫、ｐ５３の変異または
変化に関連する癌、脳腫瘍、膀胱癌、子宮頸部癌、大腸癌、結腸直腸癌、肺の非
小細胞癌、肺の小細胞癌、胃癌など）、リンパ増殖性障害（例えば、リンパ節症
）、微生物（例えば、ウイルス、細菌など）感染（例えば、ＨＩＶ−１感染、Ｈ
ＩＶ−２感染、ヘルペスウイルス感染（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＶＺ
Ｖ、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ＥＢＶを含むが、これらに限定されない）、アデ
ノウイルス感染、ポックスウイルス感染、ヒトパピローマウイルス感染、肝炎ウ
イルス（例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶなど）、ヘリコバクターピロリ感染、
侵襲性ブドウ球菌感染など）、寄生生物感染、腎炎、骨疾患（例えば、骨粗鬆症
）、アテローム性動脈硬化症、疼痛、心臓血管障害（例えば、新生血管形成、低
脈管形成または減少した循環（例えば、虚血性疾患（例えば、心筋梗塞、発作な
ど））、ＡＩＤＳ、アレルギー、炎症、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー
病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜症、小脳変性など）、移
植片拒絶（急性および慢性）、対宿主性移植片病、骨髄形成異常による疾患（例
えば、再生不良性貧血など）、リウマチにおける関節組織破壊、肝疾患（例えば
、急性肝炎および慢性肝炎、肝傷害ならびに肝硬変）、自己免疫疾患（例えば、
多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、免疫複合体性糸球
体腎炎、自己免疫性糖尿病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グレーヴス病、橋
本甲状腺炎など）、心筋症（例えば、拡張型心筋症）、糖尿病、糖尿病合併症（
例えば、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症）、インフルエンザ
、喘息、乾癬、糸球体腎炎、敗血症性ショック、ならびに潰瘍性大腸炎。
【０４４９】 本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそ
れらのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、新脈管形成の促進、創傷
治癒（例えば、傷、火傷、および骨折）において有用である。本発明のポリヌク
レオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそれらのアゴニストお
よび／もしくはアンタゴニストはまた、特定の抗原、抗ウイルス性免疫応答に対
する免疫応答性を増強するためのアジュバントとして有用である。
【０４５０】 より一般的には、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドな
らびに／またはそれらのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、免疫応
答の調節（すなわち、増強および減少）において有用である。例えば、本発明の
ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、手術、外傷、放射線療法、化
学療法、および移植の準備または手術、外傷、放射線療法、化学療法、および移
植からの回復において有用であり得るか、あるいは高齢者および免疫無防備状態
の個体における免疫応答および／または免疫回復をブーストするために使用され
得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドなら
びに／またはそれらのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、例えば、
自己免疫性障害の処置または予防における、免疫抑制剤として有用である。特定
の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド
は、慢性炎症、アレルギーまたは自己免疫状態（例えば、本明細書中に記載され
るか、そうでなければ、当該分野において公知の自己免疫状態）を処置または予
防するために使用され得る。
【０４５１】 好ましくは、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／ま
たはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニスト（例えば、抗Ｄ−ＳＬＡ
Ｍ抗体）を使用する処置は、有効量の本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドまたは
アゴニストもしくはアンタゴニストを患者へ投与することによって、あるいは患
者から細胞を取り出し、この細胞にＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドを供給し、そ
してこの操作した細胞をこの患者に戻すこと（エキソビボ治療）によってのいず
れかであり得る。さらに、本明細書においてさらに議論されるように、Ｄ−ＳＬ
ＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、ワクチン中のアジュバントとして
使用され、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。
【０４５２】 （免疫活性） １つの実施形態では、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペ
プチドまたはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニスト（例えば、抗Ｄ
−ＳＬＡＭ抗体）は、免疫不全を有する個体を処置、予防、診断、または予知す
るために使用される。
【０４５３】 本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはＤ−ＳＬ
ＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニスト（例えば、抗Ｄ−ＳＬＡＭ抗体）を使
用して、処置、予防、診断、および／または予知され得る免疫不全としては、以
下から選択される１つ以上の免疫不全が挙げられるが、これらに限定されない：
重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）Ｘ連鎖、ＳＣＩＤ常染色体、アデノシンデアミ
ナーゼ不全（ＡＤＡ不全）、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、ブルト
ン病、先天性無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖乳児無ガンマグロブリン血症、後
天性無ガンマグロブリン血症、成人発症無ガンマグロブリン血症、遅発性無ガン
マグロブリン血症、異常ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、新生
児の一過性低ガンマグロブリン血症、非特異的異常ガンマグロブリン血症、無ガ
ンマグロブリン血症、共通可変性免疫不全（ＣＶＩＤ）（後天性）、ヴィスコッ
ト−オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、ハイパーＩｇＭを有するＸ連鎖免疫不全
、ハイパーＩｇＭを有する非Ｘ連鎖免疫不全、選択的ＩｇＡ不全、ＩｇＧサブク
ラス不全（ＩｇＡ不全を有するかまたは有さない）、正常または増加したＩｇを
有する抗体不全、胸腺腫を有する免疫不全、Ｉｇ重鎖欠失、κ鎖不全、Ｂ細胞リ
ンパ増殖障害（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫不全、劣性無ガンマグロブリン血
症（スイス型）、細網発育不全、新生児好中球減少、重症先天性白血球減少、免
疫不全を有する胸腺リンパ形成不全または形成異常、毛細管拡張性運動失調、短
肢小人症、Ｘ連鎖リンパ増殖性症候群（ＸＬＰ）、Ｉｇを有するネゼロフ症候群
複合型免疫不全、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ不全（ＰＮＰ）、ＭＨＣク
ラスＩＩ不全（不全リンパ球症候群）および重症複合型免疫不全。
【０４５４】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはＤ−ＳＬ
ＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストは、免疫細胞の増殖、分化、または動
員（走化性）を活性化または阻害することによって、免疫系の不全または障害を
処置、診断、検出および／または予防する際に有用であり得る。免疫細胞は、多
能性幹細胞から骨髄性細胞（血小板、赤血球、好中球、およびマクロファージ）
およびリンパ系細胞（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）を産生する、造血と呼ばれ
るプロセスを介して発生する。これらの免疫不全または障害の病因は、遺伝性、
体細胞性（例えば、癌またはいくつかの自己免疫障害）、後天性（例えば、化学
療法または毒素による）、または感染性であり得る。さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリ
ヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストも
しくはアンタゴニストは、特定の免疫系疾患または障害のマーカーまたは検出因
子として使用され得る。
【０４５５】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはＤ−ＳＬ
ＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストは、造血細胞の不全または障害を処置
、診断、検出および／または予防する際に有用であり得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌ
クレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもし
くはアンタゴニストは、特定（または多くの）型の造血細胞の減少に関連する障
害を処置、診断、検出および／または予防する試みにおいて、多能性幹細胞を含
む造血細胞の分化および増殖を増加させるために使用され得る。免疫学的不全症
候群の例には以下が挙げられるが、それらに限定されない：血液タンパク質障害
（例えば、無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症）、毛細血管拡張
性運動失調、分類不能型免疫不全、ディジョージ症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ
−ＢＬＶ感染、白血球接着不全症候群、リンパ球減少症、食細胞殺菌機能不全、
重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、ヴィスコット‐オールドリッチ障害、貧血、
血小板減少症、または血色素尿症。
【０４５６】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／または
Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、止血活性（出血の停
止）または血栓崩壊活性（血餅形成）を調節するために使用され得る。例えば、
止血活性または血栓崩壊活性を増加させることによって、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌク
レオチドもしくはポリペプチドおよび／またはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしく
はアンタゴニストは、血液凝固障害（例えば、無線維素原血症、因子不全（ｆａ
ｃｔｏｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ））、血小板障害（例えば、血小板減少症）、
または外傷、手術、もしくは他の原因から生じる創傷を処置、診断、検出および
／または予防するために使用され得る。あるいは、止血活性または血栓崩壊活性
を低減し得るＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／また
はＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストは、心臓発作（梗塞）、発
作、または瘢痕の処置、診断、検出および／または予防において重要な凝固を阻
害または溶解するために使用され得る。
【０４５７】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはＤ−ＳＬ
ＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、自己免疫障害を処置、診断、
検出および／または予防する際に有用であり得る。多くの自己免疫障害は、免疫
細胞による、自己の外来物質としての不適切な認識から生じる。この不適切な認
識は、宿主組織の崩壊を導く免疫応答を生じる。従って、免疫応答、特にＴ細胞
の増殖、分化、または走化性を阻害し得るＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしく
はポリペプチドおよび／またはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニス
トの投与は、自己免疫障害を予防する際の有効な治療であり得る。
【０４５８】 処置、診断、検出および／または予防され得る自己免疫障害の例には、以下が
挙げられるがそれらに限定されない：アディソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症
候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッド
パスチャー症候群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、眼炎
、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑、ライター病、スティッフ
マン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺炎、
ギヤン‐バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫炎症眼病。
【０４５９】 同様に、喘息（特に、アレルギー性喘息）または他の呼吸器問題のようなアレ
ルギー反応および状態はまた、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チドおよび／またはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストによって
処置、診断、検出および／または予防され得る。さらに、これらの分子は、アナ
フィラキシー、抗原性分子に対する過敏症、または血液型群不適合を処置、診断
、検出および／または予防するために使用され得る。
【０４６０】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはＤ−ＳＬ
ＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、器官拒絶または対宿主性移植
片病（ＧＶＨＤ）を診断、検出および／または予防するために使用され得る。器
官拒絶は、免疫応答を介する移植された組織の宿主免疫細胞崩壊によって生じる
。同様に、免疫応答はまたＧＶＨＤに関与するが、この場合において外来の移植
された免疫細胞は、宿主組織を崩壊する。免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化、
または走化性を阻害するＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチドお
よび／またはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストの投与は、器官
拒絶またはＧＶＨＤを予防する際に有効な治療であり得る。
【０４６１】 同様に、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはＤ−ＳＬ
ＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、炎症を調節するために使用さ
れ得る。例えば、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはＤ
−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストは、炎症応答に関与する細胞の
増殖および分化を阻害し得る。これらの分子は、以下を含む炎症状態（慢性状態
および急性状態の両方）を処置、診断、検出および／または予防するために使用
され得る：感染と関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全
身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血性再灌流傷害、内毒素致死、関節炎、
補体媒介超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導肺傷害、炎症性
腸疾患、クローン病、またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の
過剰産生から生じる状態。
【０４６２】 （過剰増殖性障害） Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはＤ−ＳＬＡＭのア
ゴニストもしくはアンタゴニストは、新生物を含む過剰増殖性障害を処置、診断
、検出および／または予防するために使用され得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド
もしくはポリヌクレオチドまたはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニ
ストは、直接的相互作用または間接的相互作用を介して、障害の増殖を阻害し得
る。あるいはＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはＤ−Ｓ
ＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストは、過剰増殖性障害を阻害し得る他
の細胞を増殖し得る。
【０４６３】 例えば、免疫応答を増加させること、特に過剰増殖性障害の抗原性質を増加さ
せることによって、またはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員させることによっ
て、過剰増殖性障害を処置、診断、検出、および／または予防し得る。この免疫
応答は、存在する免疫応答を増強させることによって、または新しい免疫応答を
開始させることによってのいずれかで増加され得る。あるいは、免疫応答を低減
させることもまた、化学療法剤のような過剰増殖性障害を処置、診断、検出、お
よび／または予防する方法であり得る。
【０４６４】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはＤ−ＳＬＡＭのア
ゴニストもしくはアンタゴニストによって処置、診断、検出、および／または予
防され得る過剰増殖性障害の例としては、以下に位置する新生物が挙げられるが
それらに限定されない：腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌
腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部および頸
部、神経（中枢神経および末梢神経）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、
胸部、および泌尿器。
【０４６５】 同様に、他の過剰増殖性障害はまた、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくは
ポリペプチドまたはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストによって
処置、診断、検出、および／または予防され得る。そのような過剰増殖性障害の
例には、以下が挙げられるがそれらに限定されない：高ガンマグロブリン血症、
リンパ増殖性（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）障害、パラプロテイ
ン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｎマ
クログロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および上記で列挙した器官系に
位置される新形成以外の任意の他の過剰増殖性疾患。
【０４６６】 （心臓血管障害） Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＤ−ＳＬＡＭを
コードするＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して、四肢
虚血のような末梢動脈疾患を含む、心臓血管障害を処置、診断、検出、および／
または予防し得る。
【０４６７】 心臓血管障害としては、動動脈瘻（ａｒｔｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ ｆｉ
ｓｔｕｌａ）、動静脈瘻、大脳動静脈先天異常、先天性心欠陥（ｃｏｎｇｅｎｉ
ｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｅｆｅｃｔｓ）、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候
群のような心臓血管異常が挙げられる。先天性心欠陥としては、大動脈縮窄、三
房心、冠状脈管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｖｅｓｓｅｌ ａｎｏｍａｌｉｅｓ）
、交差心、右胸心、開存性動脈管（ｐａｔｅｎｔ ｄｕｃｔｕｓ ａｒｔｅｒｉ
ｏｓｕｓ）、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合体、左心室発育不全症候
群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖
症、動脈管遺残、および心中隔欠損症（ｈｅａｒｔ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃ
ｔｓ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損症（ａｏｒｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓ
ｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔ）、心内膜床欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファ
ロー三徴症、心室心中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｈｅａｒｔ ｓｅｐ
ｔａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ））が挙げられる。
【０４６８】 心臓血管障害としてはまた、不整脈、カルチノイド心臓病、高心拍出量（ｈｉ
ｇｈ ｃａｒｄｉａｃ ｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出量（ｌｏｗ ｃａｒｄｉａｃ
ｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、
心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心臓水腫、心肥大
、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆ
ａｒｃｔｉｏｎ ｈｅａｒｔ ｒｕｐｔｕｒｅ）、心室中隔破裂、心臓弁疾患、
心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗塞性および結核性を含む）、
気心膜症、心膜切開後症候群、右心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充
血、心臓血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ
ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管
結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような心
臓病が挙げられる。
【０４６９】 不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダ
ムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、長ＱＴ症候群（ｌｏｎｇ
ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群
、マヘーム型早期興奮症候群（Ｍａｈａｉｍ−ｔｙｐｅ ｐｒｅ−ｅｘｃｉｔａ
ｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不
全症候群、頻拍、および心室性細動が挙げられる。頻拍としては、発作性頻拍、
上室性頻拍、心室固有調律促進、房室結節性再入頻拍（ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉ
ｃｕｌａｒ ｎｏｄａｌ ｒｅｅｎｔｒｙ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、異所心
房性頻拍、異所接合部頻拍、洞房結節性再入頻拍（ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ ｎｏ
ｄａｌ ｒｅｅｎｔｒｙ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、洞性頻拍、トルサード・
ド・ポワント、および心室性頻拍が挙げられる。
【０４７０】 心臓弁疾患としては、大動脈弁機能不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音（ｈｅａ
ｒ ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁
機能不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁機能不全、肺動脈弁狭窄症
、三尖閉鎖症、三尖弁機能不全、および三尖弁狭窄症が挙げられる。
【０４７１】 心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、弁
下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャーガス心筋症
、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、お
よび心筋炎が挙げられる。
【０４７２】 心筋性虚血としては、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈
血管痙攣、心筋梗塞、および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｓｔｕｎｎｉｎ
ｇ）のような冠動脈疾患が挙げられる。
【０４７３】 心臓血管疾患としてはまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫
症状、ヒッペル−リンダラ疾患（Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ Ｄｉｓｅａｓｅ
）、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、
血管運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、
動脈閉塞疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性
動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、先
端紅痛症、痔、肝静脈閉塞障害、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管障害、静脈炎
、肺静脈閉塞疾患、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、肺静脈閉塞
疾患、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞、シミター症候群、上大静
脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張性運動失調（ａｔａｃｉａ ｔｅｌａ
ｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静
脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈機能不全のような血管疾患が挙げられる
。
【０４７４】 動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染した動脈瘤、破裂した動脈瘤
、大動脈性動脈瘤、大脳性動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨性動脈瘤が
挙げられる。
【０４７５】 動脈閉塞疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形
成異常、腸間膜性血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉
塞性血栓性血管炎が挙げられる。
【０４７６】 脳血管障害としては、頸動脈疾患、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈
瘤、大脳無酸素症、大脳動脈硬化、大脳動静脈先天異常、大脳動脈疾患、大脳の
塞栓症および血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、大脳出
血、硬膜上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎｏｉｄ ｈｅ
ｍｏｒｒｈａｇｅ）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症
候群、室周白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｅｕｋｏｍａｌａｃ
ｉａ）、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨基部（ｖｅｒｔｅｂｒｏ
ｂａｓｉｌａｒ）機能不全が挙げられる。
【０４７７】 塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チア
ノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられる。血
栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、
洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられる。
【０４７８】 虚血としては、大脳虚血、虚血性大腸炎、仕切り症候群（ｃｏｍｐａｒｔｍｅ
ｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、前仕切り症候群（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｏｍｐａｒ
ｔｍｅｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋虚血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血
が挙げられる。脈管炎としては、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅ
ｔ）症候群、チャーグ−ストラウス症候群、粘膜皮膚リンパ節症候群、閉塞性血
栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライン−ヘーノホ紫斑病（Ｓｃｈｏｅｎｌ
ｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ ｐｕｒｐｕｒａ）、アレルギー性皮膚血管炎およびヴェ
ーゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０４７９】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもし
くはアンタゴニストは、危険な四肢虚血および冠状動脈疾患の処置、診断、検出
、および／または予防に対して特に有効である。実施例に示されるように、Ｄ−
ＳＬＡＭポリヌクレオチドおよびポリペプチドの実験的に誘導された虚血ウサギ
後肢への投与は、血圧比率、血流、血管造影的スコア、および毛細管密度を回復
させ得る。
【０４８０】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、当該分野で公知である任意の方法を使用して投
与され得、これらの方法としては、送達部位における直接的針注射、静脈内注射
、局所投与、カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子加速
器、ゲルフォームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経口ま
たは坐剤の固形薬学的処方物、手術中のデカンティングまたは局所適用、エアロ
ゾル送達が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法は当該分野で
公知である。Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、下記でより詳細に記載される、薬学
的組成物の一部として投与され得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドを送達する
方法は本明細書中でより詳細に記載される。
【０４８１】 （抗新脈管形成活性） 新脈管形成の内因性の、刺激因子とインヒビターとの間の天然に存在する平衡
は、阻害影響が優勢である平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ ５
６：３４５〜３５５（１９８９）。新生血管形成が正常な生理学的条件下におい
て生じるまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プ
ロセス）において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的
に定められる。病的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける）
の下において、これらの調節の制御はできない。調節されていない新脈管形成は
病的になり、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する
。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼
の障害および乾癬を含む、異常な新生血管形成により支配される。例えば、Ｍｏ
ｓｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋｍａｎ
ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜１７６３（１９９５）；
Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜４１１
（１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、Ａｍ
．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；およびＦｏｌ
ｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７１９〜７２５（１９８３）による概説
を参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状
態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する
有意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。
【０４８２】 本発明は、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチ
ド、ならびにＤ−ＳＬＡＭのアゴニストまたはアンタゴニストの投与による新生
血管形成に関連する疾患または障害の処置、診断、検出、および／または予防を
提供する。本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドおよびポリペプチド、または
アゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置、診断、検出、および／または
予防し得る悪性状態および転移性状態には、本明細書に記載の悪性疾患、固形腫
瘍、および癌、ならびに当該分野で公知の他のもの（このような障害の総説につ
いては、Ｆｉｓｈｍａｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎ
ｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）が挙
げられるが、これらに限定されない。
【０４８３】 本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドおよびポリペプチド（Ｄ−ＳＬＡＭア
ゴニストおよび／またはアンタゴニストを含む）で処置、診断、検出、および／
または予防され得る新生脈管形成に関係する眼の障害としては、以下が挙げられ
るがこれらに限定されない：血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、網膜芽細胞腫、
水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植、新生血
管形成、ならびに脈絡膜または虹彩の新生脈管形成に関係する、他の眼の炎症疾
患、眼の腫瘍および疾患。例えば、Ｗａｌｔｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａ
ｌ．８５：７０４〜７１０（１９７８）およびＧａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏ
ｐｈｔｈａｌ．２２．２９１〜３１２（１９７８）による概説を参照のこと。
【０４８４】 さらに、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドおよびポリペプチド（Ｄ−Ｓ
ＬＡＭアゴニストおよび／またはＤ−ＳＬＡＭアンタゴニストを含む）で処置、
診断、検出、および／または予防され得る障害としては、以下が挙げられるがこ
れらに限定されない：血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム硬化性斑
、創傷治癒の遅延、肉芽形成、血友病性関節、過形成性瘢痕、偽関節骨折、オー
スラー−ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、および血管癒
着。
【０４８５】 さらに、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドおよびポリペプチド（Ｄ−Ｓ
ＬＡＭアゴニストおよび／またはアンタゴニストを含む）で処置、診断、検出、
および／または予防され得る障害および／または状態としては、以下が挙げられ
るが、それらに限定されない：固形腫瘍、血液由来の（ｂｌｏｏｄ ｂｏｒｎ）
腫瘍（例えば、白血病）、腫瘍転移、カポージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫
、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマ
チ、乾癬、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変
性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜
芽細胞腫、およびブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ））、遅延型創傷治癒、子宮内膜
症、脈管形成、顆粒化、過形成性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラ
コーマ、血管接着、心筋の新脈管形成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌ
ｌａｔｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新脈管形成、オース
ラー−ウェーバー症候群、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関
節、血管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆粒化、クローン病、アテローム性動
脈硬化症、産児制限薬剤（月経を制御する、胎芽着床のために必要な血管新生を
予防することによる）、病原性の結果（例えば、引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ
ｍｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙ
ｌｏｒｉ）、バルトネラ症および細菌性血管腫症状）のような新脈管形成を有す
る疾患。
【０４８６】 （細胞レベルでの疾患） Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにＤ−ＳＬＡＭの
アンタゴニストまたはアゴニストによって、処置、診断、検出、および／または
予防され得る、細胞生存の増大またはアポトーシスの阻害に関連する疾患には、
以下が挙げられる：癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌腫、およ
びホルモン依存性腫瘍。これらは以下を含むが、これらに限定されない：結腸癌
、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸の癌、
精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、
破骨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫および卵
巣癌）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状
腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテ
マトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、ならびにウ
イルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイル
ス）、炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶。好
ましい実施形態において、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド、ポリペプチ
ドおよび／またはアンタゴニストは、特に上記に列挙されたものにおいて、癌の
増殖、進行、および／または転移（ｍｅｔａｓｉｓ）を阻害するために使用され
る。
【０４８７】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＤ−ＳＬＡＭの
アゴニストまたはアンタゴニストによって処置、診断、検出、および／または予
防され得る、細胞生存の増大に関連するさらなる疾患または状態には、悪性疾患
の進行および／または転移ならびに以下のような関連する障害が挙げられるが、
これらに限定されない：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急
性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病
を含む）を含む）ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病
および慢性リンパ球性白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジ
キン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロ
ブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固形腫瘍（以下を含むが、これらに限定されない
：肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性
肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、
リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫
、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底
細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、
気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌
、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣の腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、
神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果
体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍ
ａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫））。
【０４８８】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにＤ−ＳＬＡＭの
アゴニストまたはアンタゴニストによって処置、診断、検出、および／または予
防され得る、アポトーシスの増大に関連する疾患には、以下が挙げられる：ＡＩ
ＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側
索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性および脳腫瘍または先の関連した疾患）；自
己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁
性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス
および免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常症候群（
例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性損傷（心筋梗塞、発作お
よび再灌流損傷によって生じるようなもの）、肝臓損傷（例えば、肝炎関連肝臓
損傷、虚血／再灌流損傷、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管損傷）
および肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコールによって生じるようなもの）
、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。
【０４８９】 （創傷治癒および上皮細胞増殖） 本発明のなおさらなる局面に従って、Ｄ−ＳＬＡＭＡポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭアゴニストもしくはアンタゴニストを、治
療目的のため、例えば、創傷治癒の目的のために上皮細胞増殖および基底ケラチ
ノサイトを刺激するため、ならびに毛包産生および皮膚創傷の治癒を刺激するた
めに、利用するためのプロセスが提供される。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドも
しくはポリペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニスト
は、以下を含む創傷治癒を刺激することにおいて臨床的に有用であり得る：外科
的創傷、切除の創傷、深い創傷（真皮および表皮の損傷を含む）、眼組織の創傷
、歯の組織の創傷、口腔の創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚の潰瘍、肘の潰瘍、動脈性
の潰瘍、静脈うっ滞潰瘍、熱への曝露または化学物質による熱傷、および他の異
常な創傷治癒状態（例えば、尿毒症、栄養失調、ビタミン欠乏、ならびにステロ
イド、放射能療法および抗腫瘍性薬物および代謝拮抗物質を用いる全身性処置に
関連する合併症）。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およ
びＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストは、皮膚の欠失後の皮膚の
回復を促進するために使用され得る。
【０４９０】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭの
アゴニストもしくはアンタゴニストは、創傷床（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）への皮膚
移植片の付着を増大するため、および創傷床からの再上皮形成を刺激するために
使用され得る。以下は、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチド、Ｄ
−ＳＬＡＭのアゴニストまたはアンタゴニストが創傷床への付着を増大するため
に使用され得る、移植片の型である：自家移植片、人工皮膚、同種移植片（ａｌ
ｌｏｇｒａｆｔ）、自己植皮片、自己表皮移植片（ａｕｔｏｅｐｄｅｒｍｉｃ
ｇｒａｆｔ）、無血管性（ａｖａｃｕｌａｒ）移植片、ブレア−ブラウン移植片
、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移植片、遅延移植片、皮膚移植片、表皮移植
片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、異種移植片（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇ
ｒａｆｔ）、異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）、同種移植片（ｈｏｍｏｌｏｇ
ｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、増殖性移植片、層板状の移植片、網状移植片、粘膜移植
片、オリエ−ティールシュ移植片、大網移植片（ｏｍｅｎｐａｌ ｇｒａｆｔ）
、パッチの移植片、茎状移植片、全層移植片（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｇｒａ
ｆｔ）、分層植皮片、分層皮膚移植片。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくは
ポリペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストは、皮
膚の強度を助長するため、および高齢の皮膚の外見を改善するために使用され得
る。
【０４９１】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭの
アゴニストもしくはアンタゴニストはまた、肝細胞増殖、および肺、乳房、膵臓
、胃、小腸（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｇ）、および大腸における上皮細胞
増殖における変化を生じると考えられる。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストは、
上皮細胞（例えば、皮脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、毛包、肝実質細胞、肺胞上
皮細胞ＩＩ型（ｔｙｐｅ ＩＩ ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅ）、ムチン産生杯細胞、
および他の上皮細胞、ならびに皮膚、肺、肝臓、および胃腸管内に含まれるそれ
らの先祖）の増殖を促進し得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペ
プチド、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストは、内皮細胞、ケラ
チノサイト、および基底ケラチノサイトの増殖を促進し得る。
【０４９２】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭの
アゴニストもしくはアンタゴニストはまた、照射、化学療法処置またはウイルス
感染から生じる腸の毒性の副作用を低減するために使用され得る。Ｄ−ＳＬＡＭ
ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもし
くはアンタゴニストは、小腸粘膜上で細胞保護的な効果を有し得る。Ｄ−ＳＬＡ
Ｍポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭのアゴニストも
しくはアンタゴニストはまた、化学療法およびウイルス感染から生じる粘膜炎（
ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）（口粘膜）の治癒を刺激し得る。
【０４９３】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭの
アゴニストもしくはアンタゴニストは、熱傷を含む、完全なおよび部分的な厚さ
の皮膚欠損における皮膚の十分な再生（すなわち、毛包、汗腺、および皮脂腺の
再増殖）、乾癬のような他の皮膚欠損の処置、診断、検出、および／または予防
においてさらに使用され得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、およびＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストは、表皮水疱症
、これらの損傷の再上皮形成を促進することによる頻繁な開放性かつ疼痛性の水
疱を生じる内在的な真皮への表皮の接着における欠損を処置、診断、検出および
／または予防するために使用され得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくは
ポリペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストはまた
、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を処置、診断、検出および／または予防し、そして
粘膜の内層の瘢痕形成ならびにより迅速な腺の粘膜および十二指腸の粘膜の内層
の再生による治癒を助けるために使用され得る。炎症性腸疾患（例えば、クーロ
ン病および潰瘍性大腸結腸炎）は、それぞれ、小腸または大腸の粘膜表面の崩壊
を生じる疾患である。従って、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、およびＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストは、粘膜表面の
再表面化（ｒｅｓｕｌｆａｃｉｎｇ）を促進して、より迅速な治癒を助けるため
、および炎症性腸疾患の進行を予防するために、使用され得る。Ｄ−ＳＬＡＭポ
リヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしく
はアンタゴニストを用いる処置、診断、検出、および／または予防は、胃腸管全
体の粘膜の産生に対して有意な効果を有することが予測され、そして腸粘膜を、
摂取されたかまたは外科手術後の有害な物質から保護するために使用され得る。
Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭのア
ゴニストもしくはアンタゴニストは、Ｄ−ＳＬＡＭの発現下に関連する疾患を処
置、診断、検出、および／または予防するために使用され得る。
【０４９４】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびＤ−Ｓ
ＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストは、種々の病的状態に起因する肺へ
の損傷を予防および治癒するために使用され得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチドのような増殖因子、およびＤ−ＳＬＡＭのアゴニストも
しくはアンタゴニストは、急性または慢性の肺損傷を予防または処置、診断、検
出、および／または予防するために、増殖および分化を刺激し得、そして肺胞お
よび気管支（ｂｒｏｃｈｉｏｌａｒ）上皮の修復を促進し得る。例えば、気管支
上皮および肺胞（ａｖｅｏｌｉ）の壊死を生じる、気腫（これは、肺胞の進行性
の損失を生じる）および吸入損傷（すなわち、煙の吸入および熱傷から生じる）
は、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴ
ニストまたはアンタゴニストを使用して効果的に処置、診断、検出、および／予
防され得る。また、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およ
びＤ−ＳＬＡＭアゴニストもしくはアンタゴニストは、肺胞上皮細胞ＩＩ型の増
殖および分化を刺激するために使用され得、これは、未熟な乳児における硝子膜
疾患（例えば、乳児呼吸窮迫症候群および気管支肺異形成症）のような疾患を処
置、診断、検出、および／または予防することを助け得る。
【０４９５】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭの
アゴニストもしくはアンタゴニストは、肝実質細胞の増殖および分化を刺激し得
、そして従って、肝臓疾患および病状（例えば、肝硬変により生じる劇症肝不全
、肝炎ウイルスおよび毒性物質（すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素（
ｃａｒｂｏｎ ｔｅｔｒａｈｏｌｏｒｉｄｅ）、および他の当該分野で公知の肝
臓毒素）により生じる肝臓損傷）を緩和、処置、診断、検出、および／または予
防するために使用され得る。
【０４９６】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびＤ−Ｓ
ＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストは、真性糖尿病の発症を処置、診断
、検出、および／または予防するために使用され得る。新たにＩ型糖尿病および
ＩＩ型糖尿病と診断された患者において、いくつかの島細胞機能が残っている場
合、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭ
のアゴニストもしくはアンタゴニストは、その疾患の持続性の発現を緩和、遅延
または予防するように、その島機能を維持するために使用され得る。また、Ｄ−
ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくポリペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭのアゴニス
トまたはアンタゴニストは、島細胞機能を改善または促進するための島細胞移植
における補助として使用され得る。
【０４９７】 （感染性疾患） Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭの
アゴニストもしくはアンタゴニストは、感染因子を処置、診断、検出、および／
または予防するために用いられ得る。例えば、免疫応答を上昇させることによっ
て、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を増加させることによっ
て、感染性疾患が処置、診断、検出および／または予防され得る。免疫応答は、
既存の免疫応答を上昇させるか、または新たな免疫応答を開始させるかのいずれ
かにより上昇され得る。あるいは、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、およびＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、必
ずしも免疫応答を誘発することなく、感染因子を直接阻害し得る。
【０４９８】 ウイルスは、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＤ
−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置、診断、検出、およ
び／または予防され得る疾患または症状を引き起こし得る感染因子の一例である
。ウイルスの例としては、以下のＤＮＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス
科が挙げられるがこれらに限定されない：アルボウイルス、アデノウイルス科、
アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、
カルシウイルス科、サルコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウ
イルス科、デング熱、ＥＢＶ、ＨＩＶ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科
（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス
、ヘルペス帯状疱疹）、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例
えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミク
ソウイルス科（例えば、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、およびパライン
フルエンザ）、パピローマウイルス、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピ
コルナウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、痘瘡またはワクシニア）、レ
オウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、Ｈ
ＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイル
ス属）。これらの科内に入るウイルスは、以下を含むがこれらに限定されない種
々の疾患または症状を引き起こし得る：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏ
ｌｌｉｔｉｓ）、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候
群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、髄膜炎、日和見感
染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、
流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、
性感染症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。Ｄ−ＳＬ
ＡＭポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはＤ−ＳＬＡＭのアゴニスト
もしくはアンタゴニストを用いて、任意のこれらの症状または疾患が処置、診断
、検出および／または予防され得る。
【０４９９】 同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド
もしくはポリペプチド、またはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニス
トによって処置または検出され得る細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下のグ
ラム陰性およびグラム陽性細菌および細菌科ならびに真菌を含むがこれらに限定
されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉ
ｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ、Ｃａ
ｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍ
ｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ
、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈ
ｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏ
ｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｎｅ
ｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒ
ｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔ
ｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａの感染症（例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ
、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、ならびにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ（例えば、Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＢ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ）。これらの細菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに限定されない
疾患または症状を引き起こし得る：菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核
、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）
、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳
または蓄膿症）、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食
中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ライ病
、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱
、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃ
ｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチ
ドもしくはポリヌクレオチド、またはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタ
ゴニストを用いて、任意のこれらの症状もしくは疾患を処置、診断、検出、およ
び／または予防し得る。
【０５００】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＤ−Ｓ
ＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置、診断、検出、および／
または予防され得る、寄生生物性因子が引き起こす疾患または症状としては以下
のファミリーまたはクラスが挙げられるがこれらに限定されない：アメーバ症、
バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉ
ｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交疫、外部寄生生物性、ジアルジア鞭毛虫症、
蠕虫症、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ
症、およびトリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）症。これらの寄生生物は、
以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：疥
癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）
、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠
合併症、およびトキソプラスマ症。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、またはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、
任意のこれらの症状または疾患を処置、診断、検出および／または予防し得る。
【０５０１】 好ましくは、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＤ
−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストを使用する処置、診断、検出、
および／または予防は、患者に有効量のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドを投与するか
、または患者から細胞を取り出して、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドをこの細胞
に供給し、そして操作した細胞を患者に戻す（エキソビボ治療）かのいずれかに
よるものであり得る。さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ドはワクチン中の抗原として用いられて、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し
得る。
【０５０２】 （再生） Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＤ−ＳＬＡＭの
アゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、細胞を分化させ、増殖させ、そし
て誘引して、組織の再生を導き得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：５９−８７（１
９９７）を参照のこと）。組織の再生を用いて、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷
、切開、または潰瘍）、加齢、疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性関節炎（ｏｓｔ
ｅｏｃａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、歯周病、肝不全）、美容形成手術を含む手術、線
維症、再灌流傷害、もしくは全身性サイトカイン損傷により損傷を受けた組織を
修復、置換、または保護し得る。
【０５０３】 本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる：器官（例えば、
膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、
血管系（血管およびリンパ管を含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱
、および靭帯）の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減され
て生じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。
【０５０４】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＤ−Ｓ
ＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストは、治癒するのが困難な組織の再生
を増加させ得る。例えば、腱／靭帯の再生を増大させることによって、損傷後の
回復時間が早まる。本発明の、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、損傷を
回避する試みにおいて予防的に使用され得る。処置、診断、検出、および予防さ
れ得る特定の疾患は、腱炎、手根管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損を
含む。非治癒創傷の組織再生のさらなる例としては、褥瘡性潰瘍、脈管不全、外
科的創傷、および外傷性創傷に関連する潰瘍が挙げられる。
【０５０５】 同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるためにＤ
−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＤ−ＳＬＡＭのアゴ
ニストもしくはアンタゴニストを使用することによって再生され得る。本方法を
用いて処置、診断、検出、および／または予防され得る疾患としては、中枢神経
系疾患および末梢神経系疾患、神経障害、または機械的および外傷性障害（例え
ば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および発作（ｓｔｏｋｅ））が挙げられ
る。詳細には、末梢神経傷害と関連する疾患、末梢神経障害（例えば、化学療法
または他の医学的療法から生じる）、局在神経障害、および中枢神経系疾患（例
えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化
症、およびシャイ−ドレーガー症候群）はすべて、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチド、またはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニ
ストを用いて処置、診断、検出および／または予防され得る。
【０５０６】 （走化性） Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＤ−ＳＬＡＭの
アゴニストもしくはアンタゴニストは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、
細胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細
胞および／または内皮細胞）を、身体中の特定の部位（例えば、炎症、感染、ま
たは過剰増殖の部位）に誘引または動員する。次いで、動員された細胞は、特定
の外傷または異常性を撃退および／または治癒し得る。
【０５０７】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＤ−ＳＬＡＭの
アゴニストもしくはアンタゴニストは、特定の細胞の走化性活性を増大し得る。
次いで、これらの走化性分子を使用して、身体中の特定の位置に標的化した細胞
の数を増加させることによって、炎症、感染、過剰増殖性障害、または任意の免
疫系障害を処置、診断、検出、および／または予防し得る。例えば、走化性分子
を使用して、傷害を受けた位置に免疫細胞を誘引することによって、組織に対す
る創傷および他の外傷を処置、診断、検出、および／または予防し得る。走化性
分子として、Ｄ−ＳＬＡＭはまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を処置、
診断、検出、および／または予防するために使用され得る。
【０５０８】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＤ−ＳＬＡＭの
アゴニストもしくはアンタゴニストが走化性活性を阻害し得ることもまた意図さ
れる。これらの分子はまた、障害を処置、診断、検出、および／または予防する
ために使用され得る。従って、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストもしくはアンタゴニストは、走化性のイ
ンヒビターとして使用され得る。
【０５０９】 （結合活性） Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、Ｄ−ＳＬＡＭに結合する分子、またはＤ−ＳＬ
ＡＭが結合する分子についてスクリーニングするために使用され得る。Ｄ−ＳＬ
ＡＭとこの分子との結合は、結合したＤ−ＳＬＡＭまたは分子の活性を活性化（
アゴニスト）、増大、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。そのよう
な分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、レセプ
ター）、または低分子が挙げられる。
【０５１０】 好ましくは、この分子は、Ｄ−ＳＬＡＭの天然のリガンド（例えば、リガンド
のフラグメント）、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物、もしくは機能
的模倣物に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）：第５章（１９９１）を参照の
こと）。同様に、この分子は、Ｄ−ＳＬＡＭが結合する天然のレセプター、また
は少なくとも、Ｄ−ＳＬＡＭによって結合され得るレセプターのフラグメント（
例えば、活性部位）に密接に関連し得る。いずれの場合においても、この分子は
、公知の技術を用いて合理的に設計され得る。
【０５１１】 好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、分泌タンパク質とし
てかまたは細胞膜上のいずれかでＤ−ＳＬＡＭを発現する適切な細胞を産生する
工程を包含する。好ましい細胞としては、哺乳動物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ
ａ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる。次いで、Ｄ−ＳＬＡＭを発現
する細胞（または、発現されたポリペプチドを含む細胞膜）を、好ましくは、Ｄ
−ＳＬＡＭまたはこの分子のいずれかの結合、活性の刺激、または活性の阻害を
観察するための分子を潜在的に含む試験化合物と接触させる。
【０５１２】 アッセイは、Ｄ−ＳＬＡＭへの候補化合物の結合を単純に試験し得、ここで結
合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセイにおい
て検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がＤ−ＳＬＡＭへの結合によっ
て生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。
【０５１３】 あるいは、アッセイは、無細胞調製物、固体支持体に接着されたポリペプチド
／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され得る。ア
ッセイはまた、候補化合物を、Ｄ−ＳＬＡＭを含む溶液と混合する工程、Ｄ−Ｓ
ＬＡＭ／分子の活性または結合を測定する工程、およびＤ−ＳＬＡＭ／分子の活
性または結合を、標準と比較する工程を単純に包含し得る。
【０５１４】 好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体を用いて、サンプル（例えば、生物学的サンプル）におけるＤ−ＳＬＡＭ
のレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、Ｄ−ＳＬＡＭへの直接的もしくは間
接的のいずれかの結合、または基質についてのＤ−ＳＬＡＭとの競合によって、
ポリペプチドのＤ−ＳＬＡＭまたは活性を測定し得る。
【０５１５】 さらに、本発明のＤ−ＳＬＡＭが結合するレセプターは、当業者に公知の多く
の方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａ
ｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２）、
第５章（１９９１））によって同定され得る。例えば、発現クローニングは、ポ
リアデニル化ＲＮＡがこのポリペプチドに応答する細胞から調製される場合に用
いられ、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（これは、ＦＧＦファミリータンパク質に対
する複数のレセプターを含むことが公知である）、およびＳＣ−３細胞、および
このＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーは、プールに分けられ、そして
このポリペプチドに応答性でないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェクト
するために使用される。ガラススライド上で増殖しているトランスフェクトされ
た細胞は、それらを標識化した後に、本発明のポリペプチドに曝露される。この
ポリペプチドは、種々の手段（部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位
のヨウ素化または封入を含む）によって標識化され得る。
【０５１６】 固定化およびインキュベーション後、スライドは、オートラジオグラフィー分
析に供される。陽性プールを同定し、そしてサブプールを、反復性のサププール
化および再スクリーニングプロセスを使用して調製および再びトランスフェクト
して、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生じる。
【０５１７】 レセプター同定のための代替のアプローチとして、標識ポリペプチドは、レセ
プター分子を発現する調製物を、細胞膜と光親和性に連結し得るか、または抽出
し得る。架橋された材料は、ＰＡＧＥ分析によって分離され、そしてＸ線フィル
ムに曝露される。ポリペプチドのレセプターを含む標識複合体が切り出され得、
ペプチドフラグメントへと分離され得、そしてタンパク質微小配列決定に供され
得る。微小配列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、１組の縮重オリゴヌ
クレオチドプローブを設計してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定
レセプターをコードする遺伝子を同定する。
【０５１８】 さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフ
リング、および／またはコドンシャッフリングの技術（集合的に「ＤＮＡシャッ
フリング」という）を利用して、Ｄ−ＳＬＡＭの活性を調節し得、それによって
Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニストおよびアンタゴニストを効果的に生成する。一般に、
米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０
，７２１号、同第５，８３４，２５２号、および同第５，８３７，４５８号、な
らびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．８：７２４〜３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６〜８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏ
ｎ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５〜７６（１９９９）；
ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ，Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８〜１３（１９９８）（これらの特許および刊行
物の各々は、本明細書において参考として援用される）を参照のこと。１つの実
施形態において、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドの
変更は、ＤＮＡシャッフリングによって達成され得る。ＤＮＡシャッフリングは
、相同組換えまたは部位特異的な組換えによる、２つ以上のＤＮＡセグメントの
、Ｄ−ＳＬＡＭ分子の所望のポリヌクレオチド配列への構築を含む。別の実施形
態において、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドは、組
換えの前に、誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオ
チド挿入または他の方法によるランダム変異誘発に供することによって、変更さ
れ得る。別の実施形態において、Ｄ−ＳＬＡＭの１つ以上の成分、モチーフ、切
片、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成
分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどと組換えられ得る。好
ましい実施形態において、この異種分子は、分泌リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ
）ファミリーのメンバーである。さらに好ましい実施形態において、この異種分
子は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧ
Ｆ−Ｉ）、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）−α、表皮増殖因子（ＥＧＦ
）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）
−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、アクチビンＡおよび
アクチビンＢ、デカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ｄ
ｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２、ドーサリン（ｄｏｒｓａｌｉｎ）、増殖分化因子（
ＧＤＦ）、結節（ｎｏｄａｌ）、ＭＩＳ、インヒビン−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧ
Ｆ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５、および神経膠由来神経栄養因子（ＧＤ
ＮＦ）のような増殖因子である。
【０５１９】 他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性なＤ−ＳＬＡＭラグメントであ
る。生物学的に活性なフラグメントは、このＤ−ＳＬＡＭポリぺプチドの活性に
類似の活性を示すが、必ずしも同一ではないフラグメントである。このフラグメ
ントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または減少した所望されない活
性を含み得る。
【０５２０】 さらに、本発明は、本発明のポリペプチドの作用を調節する化合物を同定する
ために化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイの例は
、哺乳動物線維芽細胞、本発明のポリペプチド、スクリーニングされるべき化合
物および3[Ｈ]チミジンを、線維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で合わせ
る工程を包含する。コントロールアッセイは、スクリーニングされるべき化合物
の非存在下で実施され得、そしてこの化合物の存在下での線維芽細胞の増殖の量
と比較して、各々の場合における3[Ｈ]チミジンの取り込みの決定によって、こ
の化合物が増殖を刺激するか否かを決定し得る。線維芽細胞の増殖の量は、3[Ｈ
]チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーによ
って測定される。アゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物の両方が、この
手順により同定され得る。
【０５２１】 別の方法において、本発明のポリペプチドに対するレセプターを発現する哺乳
動物細胞または膜調製物は、この化合物の存在下において標識化した本発明のポ
リペプチドとともにインキュベートされる。次いで、この化合物がこの相互作用
を増強またはブロックする能力が、測定され得る。あるいは、スクリーニングさ
れるべき化合物の相互作用に従う既知のセカンドメッセンジャー系の応答および
Ｄ−ＳＬＡＭレセプターが測定され、そしてこの化合物がこのレセプターに結合
し、そしてセカンドメッセンジャー応答を誘発する能力を測定して、この化合物
が潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する。このよう
なセカンドメッセンジャー系には、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャ
ネルまたはホスホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５２２】 これらの上記のアッセイの全ては、診断マーカーまたは予後マーカーとして使
用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、Ｄ−ＳＬＡＭ／分子
を活性化または阻害することによって、疾患を処置、診断、検出、および／また
は予防するか、または患者における特定の結果（例えば、血管増殖）をもたらす
ために使用され得る。さらに、アッセイは、適切に操作された細胞または組織か
らのＤ−ＳＬＡＭの産生を阻害または増強し得る因子を発見し得る。従って、本
発明は、以下の工程を含むＤ−ＳＬＡＭに結合する化合物を同定する方法を包含
する：（ａ）候補結合化合物をＤ−ＳＬＡＭとともにインキュベートする工程；
および（ｂ）結合が生じたか否かを決定する工程。さらに、本発明は、以下の工
程を含むアゴニスト／アンタゴニストを同定する方法を包含する：（ａ）候補化
合物をＤ−ＳＬＡＭとともにインキュベートする工程、（ｂ）生物学的活性をア
ッセイする工程、および（ｂ）Ｄ−ＳＬＡＭの生物学的活性が改変されているか
否かを決定する工程。
【０５２３】 また、図３および表１に開示されるβプリーツシート領域を使用することによ
って、実験的にＤ−ＳＬＡＭを結合する分子を同定し得る。従って、本発明の特
定の実施形態は、図３／表１に開示されたの各々のβプリーツシート領域のアミ
ノ酸配列を含むか、あるいは開示された各々のβプリーツシート領域のアミノ酸
配列からなる、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の
さらなる実施形態は、図３／表１に開示されるβプリーツシート領域の任意の組
合せもしくは全てを含むか、または任意の組合せまたは全てからなる、Ｄ−ＳＬ
ＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のさらなる好
ましい実施形態は、図３／表１に開示されるβプリーツシート領域の各々のＤ−
ＳＬＡＭアミノ酸配列を含むか、あるいはＤ−ＳＬＡＭアミノ酸配列からなる、
ポリペプチドに関する。本発明のさらなる実施形態は、図３／表１に開示される
βプリーツシート領域の任意の組合せもしくは全てを含むか、またはβプリーツ
シート領域の任意の組合せもしくは全てからなる、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドに
関する。
【０５２４】 （アンチセンスおよびリボザイム（アンタゴニスト）） 特定の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、配列番号１に含ま
れる配列またはその相補鎖に対応する核酸および／または寄託されたクローン２
０９６２３に含まれるヌクレオチド配列に対応する核酸である。１つの実施形態
において、アンチセンス配列は、生物体により内部で生成され、別の実施形態に
おいて、アンチセンス配列は別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｎ
ｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）を参照のこと）。Ｏｌｉｇｏｄｅ
ｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）。アンチセンス技術を使用して、アンチセンス
ＤＮＡもしくはＲＮＡを通してか、または３重らせんの形成を通して遺伝子発現
を制御し得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ
．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）
に考察される。３重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ、２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２５１：１３００（１９９１）において考察される。これらの方法は、相補
的なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。
【０５２５】 例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コー
ド部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域
に相補的であるように設計され、それにより転写およびレセプターの産生を阻害
する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブ
リダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロック
する。
【０５２６】 １つの実施形態において、本発明のＤ−ＳＬＡＭアンチセンス核酸は、外来の
配列からの転写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部が
転写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベクタ
ーは、Ｄ−ＳＬＡＭアンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベク
ターは、それが転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生し得る限り、エピソ
ームを保持し得るか、または染色体に組込まれ得る。このようなベクターは、当
該分野において標準的な組換えＤＮＡ技術方法により構築され得る。ベクターは
、脊椎動物細胞において複製および発現のために使用される、当該分野で公知の
プラスミド、ウイルスなどであり得る。Ｄ−ＳＬＡＭをコードする配列またはそ
のフラグメントの発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用する、当
該分野で公知の任意のプロモーターにより得る。そのようなプロモーターは、誘
導性または構成性であり得る。このようなプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモ
ーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９：３
０４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれる
プロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９７（１９８
０））、ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５（１９８１））、
メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９
６：３９−４２（１９８２））などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５２７】 本発明のアンチセンス核酸は、Ｄ−ＳＬＡＭ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくと
も一部に相補的な配列を含むか、あるいはこれらからなる。しかし、完全に相補
的であることは好ましいが、必要ではない。本明細書中で言及される「ＲＮＡの
少なくとも一部に相補的な」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分な相
補性を有し、安定な二重鎖を形成する配列を意味し；従って、二本鎖Ｄ−ＳＬＡ
Ｍアンチセンス核酸の場合において、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が試験され得るか、
または三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程
度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズ
する核酸が長いほど、Ｄ−ＳＬＡＭ ＲＮＡとのより多くの塩基ミスマッチを含
み得、これは、安定な二重鎖（または三重鎖の場合もあり得る）を含み得、そし
てなお形成し得る。当業者は、ハイブリダイズ複合体の融点を決定するために標
準的な手順を使用することによりミスマッチの許容の程度を確認し得る。
【０５２８】 メッセージの５’末端に相補的なオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開始コ
ドンまでのおよびＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳を阻害する
際に最も効率的に働くはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的
な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示されてきた
。一般的には、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３５（
１９９４）を参照のこと。従って、図１Ａ〜Ｂに示されるＤ−ＳＬＡＭの５’非
翻訳、非コード領域または３’ 非翻訳、非コード領域のいずれかに相補的なオ
リゴヌクレオチドは、内因性Ｄ−ＳＬＡＭ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するためのア
ンチセンスアプローチにおいて使用され得る。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補
的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補物を含むべきである。ｍＲ
ＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、より効率的でな
い翻訳のインヒビターであるが、本発明に従って使用され得る。Ｄ−ＳＬＡＭ
ｍＲＮＡの５’、３’、またはコード領域にハイブリダイズするように設計され
たかどうかに関わらず、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であ
るべきであり、そして好ましくは、６〜約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌ
クレオチドである。特定の局面において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約
１０ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオ
チド、または少なくとも約５０ヌクレオチドである。
【０５２９】 本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡま
たはそのキメラ混合物または誘導体または修飾バージョンであり得る。オリゴヌ
クレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾されて、例えば、分
子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善し得る。オリゴヌクレオチドは
、ペプチドのような他の付加された基（例えば、インビボで宿主細胞レセプター
を標的化するために）または細胞膜を横切る輸送を容易にするための薬剤（例え
ば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４．６４８−６５２（１９８７）
；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）を参照
のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４（
１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーションによって
誘発される切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９
５８−９７６（１９８８）を参照のこと）または挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉ
ｎｇ）薬剤（例えば、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９
８８）を参照のこと）を含み得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、
別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションによって誘発される架橋
剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションによって誘発される切断剤など）と結合体
化され得る。
【０５３０】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を含む群から選択されるがこれらに
限定されない、少なくとも１つの修飾塩基部分を含み得る：５−フルオロウラシ
ル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサ
ンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチ
ル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カ
ルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシ
ルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニ
ン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２
−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン
、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ
メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシ
カルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イ
ソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（
ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシト
シン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、
５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５
−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−
Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジア
ミノプリン。
【０５３１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２−フルオロアラビ
ノース、キシルロース、およびヘキソースから選択されるがこれらに限定されな
い、少なくとも１つの修飾された糖部分を含む。
【０５３２】 なお別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチ
オエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデ
ート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタ
ールまたはそれらのアナログを含む群から選択されるがこれらに限定されない、
少なくとも１つの修飾されたリン酸骨格を含む。
【０５３３】 なお別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマ
ー性オリゴヌクレオチドである。α−アノマー性オリゴヌクレオチドは、相補的
ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のβユニットとは反
対に、その鎖は互いに平行に走る（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。そのオリゴヌクレオチドは
、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．
Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８（１９８７））またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ
アナログ（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０（１９
８７））である。
【０５３４】 本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的な方法によって（例え
ば、自動ＤＮＡシンセサイザー（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されているようなもの）の使用によって）
合成され得る。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉ
ｎら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８））の方法に
よって合成され得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御されたポア
のガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１（１９８８））などの使用によって
調製され得る。
【０５３５】 Ｄ−ＳＬＡＭコード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが使用され
得るが、転写された非翻訳領域に相補的なものが最も好ましい。
【０５３６】 本発明に従う潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、１９９０年１０月４日に公開された国際出願公開番号ＷＯ
９０／１１３６４；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２−１２
２５（１９９０）を参照のこと）。部位特異的な認識配列でｍＲＮＡを切断する
リボザイムはＤ−ＳＬＡＭ ｍＲＮＡを破壊するために使用され得るが、ハンマ
ーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的
ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接境域によって指示される位置において
ｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基配列：５
’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および
作製は、当該分野において周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌ
ａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１（１９８８）においてより十分
に記載される。Ｄ−ＳＬＡＭ（図１Ａ〜Ｂ）のヌクレオチド配列中において、多
数の潜在的なハンマーヘッド型リボザイム切断部位が存在する。好ましくは、リ
ボザイムは、切断認識部位がＤ−ＳＬＡＭ ｍＲＮＡの５’末端の近傍に位置す
るように；すなわち、効率を増大させ、そして非機能的なＲＮＡ転写物の細胞内
蓄積を最小化するように操作される。
【０５３７】 アンチセンスアプローチにおけるのと同様に、本発明のリボザイムは、修飾さ
れたオリゴヌクレオチドから構成され得（例えば、安定性の改善、標的化などの
ために）、そしてインビボでＤ−ＳＬＡＭを発現する細胞に送達されるべきであ
る。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンス
の導入についての上記と同様の様式で細胞に導入され得る。送達の好ましい方法
は、強力な構成的プロモーター（例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーターまたはｐｏ
ｌＩＩプロモーター）の制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使
用して、その結果、トランスフェクトされた細胞は、内因性のＤ−ＳＬＡＭメッ
セージを破壊し、そして翻訳を妨害するのに十分な量のリボザイムを産生するこ
とを包含する。このようなリボザイムは、アンチセンスとは違って触媒性であり
、より低い細胞内濃度が効率のために必要である。
【０５３８】 アンタゴニスト／アゴニスト化合物を利用して、腫瘍性の細胞および組織に対
する本発明のポリペプチドの細胞成長（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉ
ｆｅｒａｔｉｏｎ）効果を阻害し得る。すなわち、腫瘍の新脈管形成を刺激し、
それにより異常な細胞成長および増殖を（例えば、腫瘍の形成または成長におい
て）遅延または防止する。
【０５３９】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、血管過多の疾患を予防し得、そ
して嚢外白内障（ｅｘｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ ｃａｔａｒａｃｔ）手術後の上
皮水晶体細胞の増殖を予防する。本発明のポリペプチドのマイトジェン活性の予
防はまた、例えば、バルーン血管形成術後の再狭窄のような場合に要求され得る
。
【０５４０】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、創傷治癒の間の瘢痕組織の増殖
予防し得る。
【０５４１】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、本明細書中に記載される疾患を
処置、診断、検出および／または予防し得る。
【０５４２】 （他の活性） 本発明のポリペプチドは、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、種
々の疾患状態（例えば、血栓症、動脈硬化、および他の心臓血管の状態）に起因
する虚血組織の血管再生を刺激するための処置、診断、検出および／または予防
において利用され得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニスト
またはアンタゴニストをまた利用して、上記で議論されるように新脈管形成およ
び肢の再生を刺激し得る。
【０５４３】 本発明のポリペプチドを、傷害、火傷、手術後組織修復、および潰瘍に起因す
る創傷の処置にもまた利用し得る。なぜなら、それらは異なる起源の種々の細胞
（例えば、線維芽細胞および骨格筋細胞）に対してマイトジェン性であり、それ
ゆえ損傷を受けた組織または疾患組織の修復または置換を促進するからである。
【０５４４】 本発明のポリペプチドはまた、ニューロンの成長を刺激し、そして特定のニュ
ーロンの障害または神経変性状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病
、およびエイズ関連複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ））において生じるニューロンの損
傷を処置、診断、検出および／または予防するために利用され得る。本発明のポ
リペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストは、軟骨細胞
増殖を刺激する能力を有し得、それゆえ、これらは骨および歯周の再生を増強し
、そして組織移植片または骨の移植片における補助のために利用され得る。
【０５４５】 本発明のポリペプチドをまた利用して、ケラチノサイト増殖を刺激することに
より、日焼けに起因する皮膚の加齢を予防し得る。
【０５４６】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドをまた、抜け毛を予防するために利用し得る。なぜ
なら、ＦＧＦファミリーのメンバーは、髪形成細胞を活性化し、そしてメラノサ
イト増殖を促進するからである。同じ系列にそって、本発明のポリペプチドを利
用して、他のサイトカインと組み合わせて使用した場合、造血細胞および骨髄細
胞の増殖および分化を刺激し得る。
【０５４７】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドをまた、移植の前に器官を維持するため、または一
次組織の細胞培養を支持するために利用し得る。
【０５４８】 本発明のポリペプチドをまた、中胚葉器官の組織を誘発して、早期胚において
分化するために利用し得る。
【０５４９】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはＤ−ＳＬＡＭの
アゴニストまたはアンタゴニストはまた、胚幹細胞、さらに、上記のように、造
血系の分化または増殖を増加または減少し得る。
【０５５０】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはＤ−ＳＬＡＭの
アゴニストまたはアンタゴニストはまた、身長、体重、髪の色、眼の色、皮膚、
脂肪組織の割合、色素沈着、サイズ、および形のような哺乳動物の特徴を調節す
るため（例えば、美容手術）に使用され得る。同様に、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチド、あるいはＤ−ＳＬＡＭのアゴニストまたはアンタゴ
ニストは、異化作用、同化作用、プロセシング、利用、およびエネルギー貯蔵に
影響を及ぼす哺乳動物代謝を調節するために使用され得る。
【０５５１】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはＤ−ＳＬＡＭの
アゴニストまたはアンタゴニストは、バイオリズム、概日リズム（ｃａｒｉｃａ
ｄｉｃ ｒｈｙｔｈｍ）、うつ病（抑うつ性障害を含む）、暴力の傾向、痛みに
対する耐性、生殖能力（好ましくは、アクチビン様活性またはインヒビン様活性
による）、ホルモンレベルまたは内分泌レベル、食欲、性欲、記憶、ストレス、
または他の認識の質に影響を及ぼすことによって、哺乳動物の精神状態または身
体的状態を変化させるために使用され得る。
【０５５２】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、例えば、貯蔵能力
、脂肪含量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子、また
は他の栄養成分を増加または低減するための、食物添加剤または保存剤として使
用され得る。
【０５５３】 上記に列挙された適用は、広範な種々の宿主において用途を有する。そのよう
な宿主としては、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マ
ウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミクロピッグ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワ
トリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒトが挙げられ
るが、これらに限定されない。特定の実施形態において、宿主は、マウス、ウサ
ギ、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌま
たはネコである。好ましい実施形態において、宿主は、哺乳動物である。最も好
ましい実施形態において、宿主は、ヒトである。
【０５５４】 本発明を一般的に記載したが、本発明は、以下の実施例を参照してより容易に
理解される。この実施例は、例示の目的で提供され、そして限定を意図されない
。
【０５５５】 （実施例） （実施例１：Ｄ−ＳＬＡＭ ｃＤＮＡクローンの寄託されたサンプルからの
単離） Ｄ−ＳＬＡＭについてのｃＤＮＡを、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ ３．０（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ． Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ６００９、Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ２０８９７）のＳａｌＩ／ＮｏｔＩマルチクローニング
部位に挿入する。ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ ３．０はアンピシリン耐性遺伝子を含み
、そしてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからも入手可能であるＥ．ｃｏｌ
ｉ ＤＨ１０Ｂ株に形質転換し得る。（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｆ
ｏｃｕｓ １５：５９−（１９９３）を参照のこと）。
【０５５６】 寄託されたサンプルからＤ−ＳＬＡＭを単離するために２つのアプローチが使
用され得る。第一に、３０〜４０ヌクレオチドを有する配列番号１の特定のポリ
ヌクレオチドを、報告されている配列に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓのＤＮＡ合成装置を使用して合成する。オリゴヌクレオチドを、例えば
、32Ｐ−γ−ＡＴＰで、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識し、そして
慣用の方法に従って精製する。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ、ＮＹ（１
９８２））。プラスミド混合物を、当業者に公知の技術（例えば、ベクター供給
業者によって提供される技術または関連の刊行物もしくは特許において提供され
る技術）を用いて、適切な宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ））に形質転換する。形質転換体を１．５％寒天プレート（適切な選択薬
剤、例えば、アンピシリンを含む）に、１プレートあたり約１５０の形質転換体
（コロニー）の密度でプレートする。これらのプレートを、細菌コロニースクリ
ーニングについての慣用の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、（
１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、１．９３〜１．１０４頁）または当業者に公知の他の技術に従って
、ナイロンメンブレンを使用してスクリーニングする。
【０５５７】 あるいは、配列番号１の両端（すなわち、クローンの５’ＮＴおよび３’ＮＴ
によって囲まれる配列番号１の領域内）に由来する、１７〜２０ヌクレオチドの
２つのプライマーを合成し、そしてこれらを使用して、寄託されたｃＤＮＡプラ
スミドを鋳型として用いて、Ｄ−ＳＬＡＭ ｃＤＮＡを増幅する。ポリメラーゼ
連鎖反応を、慣用の条件下で、例えば、０．５μｇの上記ｃＤＮＡ鋳型との反応
混合物の２５μｌ中で実施する。簡便な反応混合物は、１．５〜５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、それぞれ２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ
、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマーおよび０．２５ユニットの
Ｔａｑポリメラーゼである。３５サイクルのＰＣＲ（９４℃での変性を１分間；
５５℃でのアニーリングを１分間；７２℃での伸長を１分間）を、Ｐｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ自動化サーマルサイクラーを用いて実施する。増幅産
物をアガロースゲル電気泳動により分析し、そして予想される分子量のＤＮＡバ
ンドを切り出し、そして精製する。ＰＣＲ産物を、ＤＮＡ産物をサブクローニン
グおよび配列決定することによって選択された配列であることを確認する。
【０５５８】 寄託されたクローンに存在しないかもしれないＤ−ＳＬＡＭ遺伝子の５’非コ
ード部分または３’非コード部分の同定のために、いくつかの方法が利用可能で
ある。これらの方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フィルタープロー
ビング、特異的プローブを使用するクローン富化、および当該分野で周知である
５’および３’「ＲＡＣＥ」プロトコルと類似するかまたは同一のプロトコル。
例えば、５’ＲＡＣＥに類似する方法は、所望の全長転写物の５’末端の欠失を
生成するために利用可能である（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３））
。
【０５５９】 簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転写物をお
そらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結する。連結されたＲＮＡオリゴヌクレ
オチドに特異的なプライマーおよび目的のＤ−ＳＬＡＭ遺伝子の公知の配列に特
異的なプライマーを含むプライマーセットを使用して、Ｄ−ＳＬＡＭの全長遺伝
子の５’部分をＰＣＲ増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そ
してこれを使用して全長遺伝子を生成し得る。
【０５６０】 この上記の方法は、ポリＡ＋ＲＮＡを使用し得るが、所望の供給源から単離さ
れた総ＲＮＡを用いて開始する。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスファ
ターゼで処理して、後のＲＮＡリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷ＲＮＡ
の５’リン酸基を排除し得る。次いで、ホスファターゼを不活化するべきであり
、そしてＲＮＡをメッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を除
去するために、タバコ酸ピロホスファターゼを用いて処理するべきである。この
反応は、次いでＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドに連結
され得る、キャップ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残す。
【０５６１】 この改変型ＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第
一鎖ｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用する。第一鎖合成反応物を、連結され
たＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の
配列に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のための鋳型
として使用する。次いで、得られた生成物を配列決定し、そして分析して５’末
端配列がＤ−ＳＬＡＭ遺伝子に属することを確認する。
【０５６２】 （実施例２：Ｄ−ＳＬＡＭゲノムクローンの単離） ヒトゲノムＰ１ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）
を、実施例１に記載される方法に従って、配列番号１に対応するｃＤＮＡ配列に
ついて選択されたプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングする（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋもまた参照のこと）。
【０５６３】 （実施例３：Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの組織分布） Ｄ−ＳＬＡＭのｍＲＮＡ発現の組織分布を、とりわけ、Ｓａｍｂｒｏｏｋらに
よって記載されるノーザンブロット分析についてのプロトコルを用いて決定する
。例えば、実施例１に記載される方法によって生成されるＤ−ＳＬＡＭプローブ
を、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅTM ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、製造者の指示に従って、Ｐ 32 で標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００TMカラム
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して、製造
者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って精製する。次いで、精製した標識
プローブを使用して、種々のヒト組織をｍＲＮＡ発現について試験する。
【０５６４】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン
（ＭＴＮ）ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリ
ダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造者のプロトコル番号Ｐ
Ｔ１１９０−１に従って、標識プローブで試験する。ハイブリダイゼーションお
よび洗浄後、ブロットをマウントして、そして−７０℃で一晩フィルムに曝露し
、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。
【０５６５】 （実施例４：Ｄ−ＳＬＡＭの染色体マッピング） オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、配列番号１の５’末端の配列に従
って設計する。このプライマーは、好ましくは約１００ヌクレオチドにわたる。
次いで、このプライマーセットを、以下のセットの条件下でポリメラーゼ連鎖反
応に使用する：９５℃で３０秒；５６℃で１分；７０℃で１分。このサイクルを
３２回反復し、次いで１回、７０℃で５分間のサイクルを行う。個々の染色体ま
たは染色体フラグメントを含む体細胞ハイブリッドパネル（Ｂｉｏｓ，Ｉｎｃ）
に加えて、ヒト、マウス、およびハムスターのＤＮＡを鋳型として使用する。反
応物を、８％ポリアクリルアミドゲルまたは３．５％アガロースゲルのいずれか
で分析する。染色体マッピングを、特定の体細胞ハイブリッドにおける約１００
ｂｐのＰＣＲフラグメントの存在によって決定する。
【０５６６】 （実施例５：Ｄ−ＳＬＡＭの細菌性発現） 本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドをコードするＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチ
ドを、実施例１に概説するように、ＤＮＡ配列の５’および３’末端に対応する
ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅し、挿入フラグメントを合
成する。ｃＤＮＡ挿入物を増幅するために使用されるプライマーは、発現ベクタ
ーに増幅産物をクローニングするために、好ましくはプライマーの５’末端にＢ
ａｍＨＩおよびＸｂａＩのような制限部位を含むべきである。例えば、ＢａｍＨ
ＩおよびＸｂａＩは、細菌性発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．
， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）の制限酵素部位に対応する。このプラスミド
ベクターは、抗生物質耐性（Ａｍｐr）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ
で調節可能なプロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（Ｒ
ＢＳ）、６−ヒスチジンタグ（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位
をコードする。
【０５６７】 ｐＱＥ−９ベクターをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして、増幅され
たフラグメントを細菌性ＲＢＳにおいて開始されるリーディングフレームを維持
しながらｐＱＥ−９ベクターに連結する。次いで、連結混合物を、ｌａｃＩリプ
レッサーを発現し、またカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を与えるプラスミドｐＲ
ＥＰ４の多重コピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，
Ｉｎｃ．）を形質転換するために使用する。形質転換体を、それらのＬＢプレー
ト上で生育できる能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性
コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって確認
する。
【０５６８】 あるいは、配列番号２のアミノ酸Ｑ２４−Ｄ２３３をコードするＤＮＡを含む
構築物は、ｐＱＥ７０に挿入され得る。この構築物は、Ｄ−ＳＬＡＭの予測され
る細胞外ドメインのＣ末端にＨＩＳタグ（６個のヒスチジン）を配置する。使用
され得るプライマーとしては、以下が挙げられる。太字で示されるＳｐｈ制限部
位を含む５’プライマー：
【０５６９】
【化１】 および太字で示されるＢｇ１ＩＩを含む３’プライマー：
【０５７０】
【化２】 この構築物は、ＳｐｈＩ部位内に含まれる開始コドンとしてＡＴＧを使用し、次
いで、配列番号２のＱ２４に読み込まれ、そして配列番号２のＤ２３３まで続く
。この構築物によってコードされるアミノ酸配列は以下のとおりである： ＭＱＶＬＳＫＶＧＧＳＶＬＬＶＡＡＲＰＰＧＦＱＶＲＥＡＩＷＲＳＬＷＰＳＥＥ
ＬＬＡＴＦＦＲＧＳＬＥＴＬＹＨＳＲＦＬＧＲＡＱＬＨＳＮＬＳＬＥＬＧＰＬＥ
ＳＧＤＳＧＮＦＳＶＬＭＶＤＴＲＧＱＰＷＴＱＴＬＱＬＫＶＹＤＡＶＰＲＰＶＶ
ＱＶＦＩＡＶＥＲＤＡＱＰＳＫＴＣＱＶＦＬＳＣＷＡＰＮＩＳＥＩＴＹＳＷＲＲ
ＥＴＴＭＤＦＧＭＥＰＨＳＬＦＴＤＧＱＶＬＳＩＳＬＧＰＧＤＲＤＶＡＹＳＣＩ
ＶＳＮＰＶＳＷＤＬＡＴＶＴＰＷＤＳＣＨＨＥＡＡＰＧＫＡＳＹＫＤＱＶＬＳＫ
ＶＧＧＳＶＬＬＶＡＡＲＰＰＧＦＱＶＲＥＡＩＷＲＳＬＷＰＳＥＥＬＬＡＴＦＦ
ＲＧＳＬＥＴＬＹＨＳＲＦＬＧＲＡＱＬＨＳＮＬＳＬＥＬＧＰＬＥＳＧＤＳＧＮ
ＦＳＶＬＭＶＤＴＲＧＱＰＷＴＱＴＬＱＬＫＶＹＤＡＶＰＲＰＶＶＱＶＦＩＡＶ
ＥＲＤＡＱＰＳＫＴＣＱＶＦＬＳＣＷＡＰＮＩＳＥＩＴＹＳＷＲＲＥＴＴＭＤＦ
ＧＭＥＰＨＳＬＦＴＤＧＱＶＬＳＩＳＬＧＰＧＤＲＤＶＡＹＳＣＩＶＳＮＰＶＳ
ＷＤＬＡＴＶＴＰＷＤＳＣＨＨＥＡＡＰＧＫＡＳＹＫＤＨＨＨＨＨＨ （配列番
号１６）。
【０５７１】 あるいは、Ｈｉｓタグは、Ｄ−ＳＬＡＭの細胞外ドメイン（例えば、配列番号
２のＡ２３−Ｄ２３２に相当する）のみを含む予測される成熟形態のＮ末端に配
置され得る。この例において、太字で示されるＢａｍＨＩ制限部位を含む５’プ
ライマー：
【０５７２】
【化３】 および、太字で示されるＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む３’プライマー：
【０５７３】
【化４】 が使用され得る。これらのプライマーを使用して、Ａ２３−Ｄ２３３をコードす
るＤＮＡを増幅し得、次いで、生成した産物を、ｐＱＥ９に挿入し得る。この構
築物は、ＨｉｓタグをＤ−ＳＬＡＭの予測される成熟細胞外ドメインのＮ末端上
に配置する。このＨｉｓタグＢａｍＨＩ部位のＧｌｙ−ｓｅｒに続き、そしてこ
れは次いで、配列番号２のＡ２３に続く。この構築物は、配列番号２のＤ２３３
にわたって続き、そしてＴＡＡ終止コドンに続く。この構築物によってコードさ
れるアミノ酸配列は以下のとおりである： ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＡＱＶＬＳＫＶＧＧＳＶＬＬＶＡＡＲＰＰＧＦＱＶＲ
ＥＡＩＷＲＳＬＷＰＳＥＥＬＬＡＴＦＦＲＧＳＬＥＴＬＹＨＳＲＦＬＧＲＡＱＬ
ＨＳＮＬＳＬＥＬＧＰＬＥＳＧＤＳＧＮＦＳＶＬＭＶＤＴＲＧＱＰＷＴＱＴＬＱ
ＬＫＶＹＤＡＶＰＲＰＶＶＱＶＦＩＡＶＥＲＤＡＱＰＳＫＴＣＱＶＦＬＳＣＷＡ
ＰＮＩＳＥＩＴＹＳＷＲＲＥＴＴＭＤＦＧＭＥＰＨＳＬＦＴＤＧＱＶＬＳＩＳＬ
ＧＰＧＤＲＤＶＡＹＳＣＩＶＳＮＰＶＳＷＤＬＡＴＶＴＰＷＤＳＣＨＨＥＡＡＰ
ＧＫＡＳＹＫＤ （配列番号１９）。
【０５７４】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭの細胞外ドメイン（配列番号２のアミノ酸Ａ２３〜Ｄ２
３３）のみを含む成熟形態もまた、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクター（例えば、ｐＨＥ
４（以下に示す））に挿入され得る。この例において、太字で示されるＮｄｅ制
限部位を含む５’プライマー：
【０５７５】
【化５】 および太字で示されるＡｓｐ７１８制限部位を含む３’プライマー：
【０５７６】
【化６】 が使用され得る。
【０５７７】 所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（
２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）
増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を、１：１００〜１：２５０の比で大量培養に接種す
るために使用する。細胞を、０．４〜０．６の間の吸光度６００（Ｏ．Ｄ．600
）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド）を最終濃度１ｍＭになるように加える。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレ
ッサーの不活化によりＰ／Ｏの明確化を誘導し、遺伝子発現の増加を導く。
【０５７８】 細胞を、さらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離（６０００×
ｇで２０分間）によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック剤である６
ＭグアニジンＨＣｌ中に、４℃で３〜４時間攪拌することによって可溶化させる
。細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてポリペプチドを含む上清を、ニ
ッケル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラムにロ
ードする（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（前出）より入手可能）。６×Ｈｉｓタグを
有するタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高い親和性で結合し、そして単純な１
工程手順で精製され得る（詳細には、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（１９
９５）ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，（前出）を参照のこと）。
【０５７９】 手短に言えば、上清を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ ８のカラムにロード
し、カラムを、最初に１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ ８で洗浄し、
次いで１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ ６で洗浄し、最後にポリペプ
チドを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ ５で溶出する。
【０５８０】 次いで、精製したＤ−ＳＬＡＭタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）または５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ ６の緩衝液および２００ｍＭ Ｎ
ａＣｌに対して透析することにより再生させる。あるいは、Ｄ−ＳＬＡＭタンパ
ク質はＮｉ−ＮＴＡカラムに固定化している間に、首尾よく再折り畳みされ得る
。推奨条件は以下の通りである：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ｍＭ
ＮａＣｌ、２０％ グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ７．
４中の６Ｍ〜１Ｍ尿素の直線勾配を使用する再生。再生は１．５時間以上の時間
にわたって行うべきである。再生後、タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールの添
加によって溶出する。イミダゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ 酢酸ナトリウム
、ｐＨ ６の緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最終の透析工程によっ
て除去する。精製したＤ−ＳＬＡＭタンパク質を、４℃で保存するか、または−
８０℃で凍結する。
【０５８１】 上記の発現ベクターに加えて、本発明はさらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチ
ドに作動可能に連結されたファージオペレーターおよびプロモーターエレメント
を含み、ｐＨＥ４ａと呼ばれる発現ベクターを含む（ＡＴＣＣ寄託番号２０９６
４５、１９９８年２月２５日に寄託。）。このベクターは以下を含む：１）選択
マーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏ
ｌｉ複製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレー
ター配列、５）シャイン−ダルガーノ配列、および６）ラクトースオペロンリプ
レッサー遺伝子（ｌａｑＩｑ）。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ
，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）に由来する。プロモーター配列およびオ
ペレーター配列を合成的に作製する。
【０５８２】 ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８によっ
てベクターを制限処理し、制限生成物をゲルで泳動し、そしてより大きなフラグ
メント（スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントは約３１０塩基対である
べきである）を単離することによって、ＤＮＡをｐＨＥａに挿入し得る。ＤＮＡ
挿入物を、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ
、またはＡｓｐ７１８（３’プライマー）に対する制限部位を有するＰＣＲプラ
イマーを使用して、実施例１に記載されるＰＣＲプロトコールに従って生成する
。ＰＣＲ挿入物を、ゲル精製し、そして適合する酵素で制限処理する。挿入物お
よびベクターを標準的なプロトコールに従って連結する。
【０５８３】 操作されたベクターは、上記のプロトコールにおいて、細菌系でタンパク質を
発現させるために容易に置換され得る。
【０５８４】 （実施例６：封入体からのＤ−ＳＬＡＭポリペプチドの精製） 以下の別の方法は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドが封入体の形態で存在する場合
に、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されたＤ−ＳＬＡＭポリペプチドを精製するために使
用され得る。他に指定されない場合には、以下のすべての工程は４〜１０℃で行
われる。
【０５８５】 Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生産期の完了後、細胞培養物を４〜１０℃に冷却し、そし
て１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）に
よって細胞を採集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想され
る収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切
な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を含む緩衝溶液中に懸濁する。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸濁
液に分散させる。
【０５８６】 次いで、細胞をマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（
Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ
．）に２回、４０００〜６０００ｐｓｉで溶液を通すことによって溶解させる。
次いでホモジネートを、最終濃度０．５Ｍ ＮａＣｌになるようにＮａＣｌ溶液
と混合し、続いて７０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。得られたペレットを
、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を使用して再度洗浄する。
【０５８７】 得られた洗浄した封入体を、１．５Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜
４時間可溶化する。７０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄し
、そしてポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートしてさらなるＧｕ
ＨＣｌ抽出を可能にする。
【０５８８】 不溶性粒子を除去するための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）に続き、Ｇｕ
ＨＣｌ可溶化タンパク質を、ＧｕＨＣｌ抽出物と、５０ｍＭ ナトリウム、ｐＨ
４．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝液とを
、激しい攪拌で迅速に混合することによって、再折畳みさせる。再折畳みした希
釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合しないで４℃で保
つ。
【０５８９】 再折畳みされたポリペプチド溶液を清澄化するために、予め準備した４０ｍＭ
酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化した、適切な表面積を有する０．１６μｍ
メンブレンフィルターを備える接触濾過ユニット（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｉ
ｌｔｒａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）（例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎ）を使用する。濾過し
たサンプルを、陽イオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ−５０，Ｐｅｒｓ
ｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にロードする。カラムを４０ｍＭ 酢
酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄し、そして同じ緩衝液中の２５０ｍＭ 、５０
０ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ ＮａＣｌで、段階的な様式で溶出
する。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を継続的にモニターする。画分を収集
し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析する。
【０５９０】 次いでＤ−ＳＬＡＭポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量の水と
混合する。次いで希釈されたサンプルを、あらかじめ準備した強アニオン（Ｐｏ
ｒｏｓ ＨＱ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および弱
アニオン（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ）交換樹脂の直列カラムのセットにロードする。カラムを４０ｍＭ 酢酸ナ
トリウム、ｐＨ６．０で平衡化する。両方のカラムを、４０ｍＭ 酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ６．０、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いでＣＭ−２０カラムを
１０カラム容量の直線的勾配（０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム
、ｐＨ６．０から１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．５
の範囲）を用いて溶出させる。画分を、溶出液の定常Ａ280モニタリング下で収
集する。次いで、（例えば、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した）ポリペ
プチドを含む画分をプールする。
【０５９１】 得られたＤ−ＳＬＡＭポリペプチドは、上記の再折畳み工程および精製工程の
後で９５％より高い純度を示すべきである。５μｇの精製タンパク質がロードさ
れる場合、いかなる主たる夾雑バンドも、クマシーブルー染色した１６％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲルから観察されないはずである。精製Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質はま
た、エンドトキシン／ＬＰＳ夾雑物について試験され得、そして代表的には、Ｌ
ＰＳ含量はＬＡＬアッセイに従って、０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。
【０５９２】 （実施例７：バキュロウイルス発現系におけるＤ−ＳＬＡＭのクローニングお
よび発現） この実施例では、Ｄ−ＳＬＡＭを発現するために、プラスミドシャトルベクタ
ーｐＡ２を使用してＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドをバキュロウイルスに挿入す
る。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多
核体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてＢ
ａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８のような便利な制限部位を含む。シミ
アンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデ
ニル化のために使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、プラスミドは
、同方向にある弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下でＥ．ｃｏｌｉ
由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル
化シグナルを含む。挿入された遺伝子は両方の側で、クローン化したＤ−ＳＬＡ
Ｍポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを生成する、野生型ウイルス
ＤＮＡとの細胞媒介性の相同組換えのためのウイルス配列と隣接する。
【０５９３】 他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌など（必要とされる場合、シグナルペプチドおよびインフレームなＡＵ
Ｇを含む）のために適切に配置されたシグナルを提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。
【０５９４】 具体的には、寄託されたクローンに含まれるＤ−ＳＬＡＭ ｃＤＮＡ配列（こ
れは、ＡＵＧ開始コドンおよび天然に付随する任意のリーダー配列を含む）を、
実施例１に記載されるＰＣＲプロトコルを使用して増幅させる。天然に存在する
シグナル配列を使用して分泌タンパク質を産生する場合、ｐＡ２ベクターは第２
のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、ベクターは、Ｓｕｍｍｅｒｓら
（「Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕ
ｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒ
ｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）
）に記載される標準的な方法を用いて、バキュロウイルスリーダー配列を含むよ
うに改変し得る（ｐＡ２ ＧＰ）。
【０５９５】 Ｄ−ＳＬＡＭのフラグメントは、バキュロウイルス系から発現され得る。例え
ば、推定細胞外ドメイン（配列番号２のＭ１−Ｋ２３２）は、実施例の節を通し
て記載されるプライマーを用いてｐＡ２に挿入され得る。
【０５９６】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲル
から単離する。次いでフラグメントを適切な制限酵素で消化し、そして再び１％
アガロースゲルで精製する。
【０５９７】 プラスミドを対応する制限酵素で消化し、そして必要に応じて、当該分野で公
知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化し得る。
次いでＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎ
ｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲルから単離する
。
【０５９８】 フラグメントおよび脱リン酸化したプラスミドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用
いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ
ａ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合液で形質転換し、そ
して培養プレート上に拡げる。プラスミドを含む細菌を、個々のコロニー由来の
ＤＮＡを消化し、そして消化産物をゲル電気泳動によって分析することにより同
定する。クローン化したフラグメントの配列をＤＮＡ配列決定によって確認する
。
【０５９９】 このポリヌクレオチドを含む５μｇのプラスミドを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９
８７）によって記載されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市販の
線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共に
同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルスＤＮＡお
よび５μｇのプラスミドを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイ
クロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポ
フェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で１５分間
インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清グレース
培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細胞（ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加える。次いでプレートを２７℃で５時間
インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をプレートから除去し
、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。
次いで培養を２７℃で４日間継続する。
【０６００】 ４日後上清を収集し、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によって記載
されたようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むアガロー
スゲルを、ｇａｌ発現クローン（青色に着色したプラークを生ずる）の容易な同
定および単離を可能にするために使用する。（この型の「プラークアッセイ」の
詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ，（９−１０頁）によって配布される、昆虫細胞培養およびバ
キュロウイルス学のための使用者ガイドの中に見出され得る）。適切なインキュ
ベーションの後、青色に着色したプラークをマイクロピペッター（例えば、Ｅｐ
ｐｅｎｄｏｒｆ）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２０
０μｌのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁させ、そして組換
えバキュロウイルスを含む懸濁液を、３５ｍｍディッシュに播種したＳｆ９細胞
に感染させるために使用する。４日後、これらの培養ディッシュの上清を採集し
、次いで４℃で貯蔵する。
【０６０１】 ポリペプチドの発現を確認するために、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレ
ース培地中でＳｆ９細胞を増殖させる。細胞を、約２の感染多重度（「ＭＯＩ」
）でポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスに感染させる。放射性標識
したタンパク質を所望する場合には、６時間に後培地を除去し、そしてメチオニ
ンおよびシステインを含まないＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能）に置き換え
る。４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの35Ｓ−システイ
ン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに１６時間インキ
ュベートし、次いで遠心分離によって採集する。上清中のタンパク質および細胞
内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで（放射性標識した場合）オートラジ
オグラフィーによって分析する。
【０６０２】 精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定法を使用して、産
生されたＤ−ＳＬＡＭタンパク質のアミノ末端配列を決定し得る。
【０６０３】 （実施例８：哺乳動物細胞におけるＤ−ＳＬＡＭの発現） Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドを、哺乳動物細胞中で発現させ得る。代表的な哺乳
動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を仲介するプロモーターエレメント
、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポリアデニル化に
必要なシグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コザック配列、
および、ＲＮＡスプライシングのドナーおよびアクセプター部位に隣接する介在
配列を含む。非常に効率的な転写は、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモータ
ー、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来の長末端反復
（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用い
て達成される。しかし、細胞内エレメント（例えば、ヒトアクチンプロモーター
）もまた、使用され得る。
【０６０４】 本発明を実施する際の使用に適切な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよび
ｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃ
ａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、
ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、ならび
にｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０のようなベクターを含む。使用され得る哺乳動物宿
主細胞は、ヒトＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞、
マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１細胞、Ｃｏｓ７細胞およ
びＣＶ１細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、ならびにチャイニーズハ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。
【０６０５】 あるいは、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、染色体に組み込まれたＤ−ＳＬＡＭ
ポリヌクレオチドを含む、安定な細胞株中で発現され得る。ＤＨＦＲ、ｇｐｔ、
ネオマイシン、ハイグロマイシンのような選択マーカーを用いる同時トランスフ
ェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
【０６０６】 トランスフェクトされたＤ−ＳＬＡＭ遺伝子はまた、大量のコードされたタン
パク質を発現するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）
マーカーは、目的の遺伝子の数百または数千ものコピーを有する細胞株の開発に
有用である。（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３
：１３５７−１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．
、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：１０７−１４
３（１９９０）：Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｎｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８（１９９１）を参照のこと）。別の
有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈ
ｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉ
ｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（１９９
２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させ、
そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組み
込まれた、増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）お
よびＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。
【０６０７】 プラスミドｐＳＶ２−ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ寄託番号３７１４６）の誘導体であ
る、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴ
ＣＣ受託番号２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７（
１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）およびＣＭＶエンハンサー
（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））のフラグ
メントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８の制限酵素切
断部位を有するマルチクローニングサイトは、Ｄ−ＳＬＡＭのクローニングを容
易にする。ベクターはまた、３’イントロン、ラットプレプロインシュリン遺伝
子のポリアデニル化および終結シグナル、ならびにＳＶ４０初期プロモーターの
制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【０６０８】 具体的には、プラスミドｐＣ６またはｐＣ４は、適切な制限酵素によって消化
され、次いで当該分野で公知の手順よって、仔ウシ腸ホスファターゼ（ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ）を使用して脱リン酸化する。次いで、ベクターを１％アガロースゲ
ルから単離する。
【０６０９】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、実施例１に概説するプロトコルに従って増
幅される。天然に存在するシグナル配列が、分泌タンパク質を産生するために使
用される場合、ベクターは、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは
、天然に存在するシグナル配列が使用されない場合には、細胞からこのタンパク
質を分泌させるために、ベクターは異種シグナル配列を含むように改変され得る
（例えば、ＷＯ９６／３４８９１を参照のこと）。
【０６１０】 詳細には、全長Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質は、哺乳動物ベクター（例えば、ｐＣ
４）から以下のプライマーを用いて発現され得る：太字のＢａｍＨＩを含む５’
プライマーは、以下の通りである：
【０６１１】
【化７】 一方、３’プライマーは、太字で示されるＸｂａ部位を含む：
【０６１２】
【化８】 この構築物は、外部細胞表面上に発現される膜貫通タンパク質を生成するべきで
ある。
【０６１３】 あるいは、Ｄ−ＳＬＡＭの可溶性タンパク質のみを含む構築物は、Ｄ−ＳＬＡ
Ｍの推定細胞外ドメインをｐＣ４に挿入することによって作製され得る。例えば
、配列番号２のＭ１−Ｋ２３２をコードするＤＮＡは、太字で示されるＢａｍＨ
Ｉ制限部位を含む５’プライマー：
【０６１４】
【化９】 および太字で示されるＸｂａ制限部位を含む３’プライマー：
【０６１５】
【化１０】 を用いて、ｐＣ４に挿入され得る。
【０６１６】 増幅フラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０
１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲルから
単離する。次いで、フラグメントを適切な制限酵素で消化し、そして再び１％ア
ガロースゲル上で精製する。
【０６１７】 次いで、増幅フラグメントを同じ制限酵素で消化し、そして１％アガロースゲ
ルで精製する。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化したベクター
を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１また
はＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＣ６またはｐＣ４
に挿入されたフラグメントを含む細菌を、例えば、制限酵素分析を用いて同定す
る。
【０６１８】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠失するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ６またはｐＣ４を、リ
ポフェクチンを用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏと共に同時トラン
スフェクトする（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、
優性選択マーカーである、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐性を付与する
酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ
４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理
し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ
／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニング
プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種する。約１０〜１４日後
、単一のクローンをトリプシン処理し、次いでメトトレキサートの異なる濃度（
５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して、６
ウェルのペトリ皿または１０ｍｌのフラスコに播種する。次いで、メトトレキサ
ートの最高濃度で増殖するクローンを、さらに高い濃度（１μＭ、２μＭ、５μ
Ｍ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）のメトトレキサートを含む新たな６ウェルプレートに
移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるま
で繰り返す。Ｄ−ＳＬＡＭの発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタ
ンブロットによって、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０６１９】 （実施例９：Ｎ末端および／またはＣ末端欠失変異体の構築） 以下の一般的な方法を使用して、Ｎ末端またはＣ末端欠失Ｄ−ＳＬＡＭ欠失変
異体をクローン化し得る。一般に、約１５〜２５ヌクレオチドの２つのオリゴヌ
クレオチドプライマーは、配列番号１のポリヌクレオチドの所望の５’および３
’位置に由来する。プライマーの５’および３’の位置を、所望のＤ−ＳＬＡＭ
ポリヌクレオチドフラグメントに基づいて決定する。開始コドンおよび終止コド
ンを、必要ならば、ポリヌクレオチドフラグメントによってコードされるＤ−Ｓ
ＬＡＭポリぺプチドフラグメントを発現するように、５’および３’プライマー
にそれぞれ加える。好ましいＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドフラグメントは、本
明細書中の「ポリヌクレオチドフラグメントおよびポリぺプチドフラグメント」
の節において上記に開示される、Ｎ末端およびＣ末端の欠失変異体をコードする
フラグメントである。
【０６２０】 所望のベクター中でＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドフラグメントのクローニン
グを容易にするための制限部位を含む、さらなるヌクレオチドもまた、５’およ
び３’プライマー配列に加え得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドフラグメント
を、適切なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーならびに本明細書中で議論され
る条件もしくは当該分野に公知の条件を使用して、ゲノムＤＮＡからまたは寄託
されたｃＤＮＡクローンから増幅する。本発明のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド
フラグメントによってコードされるＤ−ＳＬＡＭポリペプチドフラグメントは、
同様の一般的な様式で、完全長のポリぺプチドとして発現され得、そして精製さ
れ得るが、特定のフラグメントと完全長のポリぺプチドとの間の化学的特徴およ
び物理的特徴の相違に起因して、慣用的な改変が必要とされ得る。
【０６２１】 本発明を限定しない例示的な手段としては、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドフラグ
メント（Ｌｅｕ−３５〜Ｔｈｒ−２７６）をコードするポリヌクレオチドを、以
下のように増幅し、そしてクローン化する：Ｌｅｕ−３５で始まるポリぺプチド
フラグメントのＮ末端部分をコードするポリヌクレオチド配列を用いて、インフ
レームで制限部位に続いて開始コドンを含む５’プライマーを生成する。Ｔｈｒ
−２７６で終了するＤ−ＳＬＡＭポリぺプチドフラグメントのＣ末端部分をコー
ドするポリヌクレオチド配列を用いて、インフレームで制限酵素部位に続いて終
止コドンを含む相補的な３’プライマーを生成する。
【０６２２】 増幅したポリヌクレオチドフラグメントおよび発現ベクターを、プライマー中
の部位を認識する制限酵素で消化する。次いで、消化したポリヌクレオチドを共
に連結する。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドフラグメントを、好ましくは、プロ
モーターから下流に、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドフラグメントコード領域を配置
する様式で、制限された発現ベクターに挿入する。連結混合液を、標準的な手順
を用いて、および本明細書の実施例に記載されるようにコンピテントＥ．ｃｏｌ
ｉ細胞中に形質転換する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そして
クローン化されたＤＮＡの同一性を制限分析、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によ
って確認する。
【０６２３】 （実施例１０：Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質融合物） Ｄ−ＳＬＡＭポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。こ
れらの融合タンパク質を、種々の適用について使用し得る。例えば、Ｄ−ＳＬＡ
Ｍポリぺプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、お
よびマルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（実施例５を参照
のこと；ＥＰ Ａ ３９４，８２７もまた参照のこと；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら
、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。同様に、ＩｇＧ−１、Ｉ
ｇＧ−３、およびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大させる。Ｄ
−ＳＬＡＭポリぺプチドに融合した核局在化シグナルは、タンパク質を特定の細
胞局在に標的化し得、一方、共有結合ヘテロダイマーまたはホモダイマーは、融
合タンパク質の活性を増大または減少させ得る。融合タンパク質もまた、１つよ
り多い機能を有するキメラ分子を生成し得る。最後に、融合タンパク質は、非融
合タンパク質と比較して、融合タンパク質の可溶性および／または安定性を増大
させ得る。上記の融合タンパク質の全ての型を、ポリぺプチドのＩｇＧ分子への
融合を概説する以下のプロトコル、または実施例５に記載されるプロトコルを改
変することによって作製し得る。
【０６２４】 手短に言えば、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分を、以下に記載の配列の５’および
３’末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅し得る。これらのプライマー
もまた、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクローニング
を容易にする都合の良い制限酵素部位を有するべきである。
【０６２５】 例えば、ｐＣ４（受託番号第２０９６４６号）を使用する場合、ヒトＦｃ部分
を、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結し得る。３’ＢａｍＨＩ部位を破壊する
べきであることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターを、Ｂａ
ｍＨＩによって再び制限処理し、ベクターを線状化し、そして実施例１に記載す
るＰＣＲプロトコルによって単離されたＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドを、この
ＢａｍＨＩ部位に連結する。終止コドンを有さないポリヌクレオチドが、クロー
ン化され、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意のこと。
【０６２６】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド（例えば、Ｄ−ＳＬＡＭの推定細胞外ドメイン）を
増幅するために使用され得るプライマーの例は、以下を含む：太字で示されるＢ
ａｍＨＩ制限部位を含む５’プライマー：
【０６２７】
【化１１】 および太字で示されるＸｂａ制限部位を含む３’プライマー：
【０６２８】
【化１２】 これらのプライマーを用いて、この構築物は、ｐＣ４中のＦｃに融合したＤ−Ｓ
ＬＡＭの推定細胞外ドメインを発現する。
【０６２９】 天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される場
合、ｐＣ４は、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列を使用としない場合、ベクターを、異種シグナル配列を含むよ
うに改変し得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。
【０６３０】
【化１３】 あるいは、この同じ領域はｐＡ２に挿入され得、Ｄ−ＳＬＡＭの推定細胞外ド
メインとの融合物を作製する。Ｄ−ＳＬＡＭの推定細胞外ドメインを増幅するた
めに使用され得るプライマーの例は、以下を含む：太字で示されるＢａｍＨＩ制
限部位を含む５’プライマー：
【０６３１】
【化１４】 および太字で示されるＸｂａ制限部位を含む３’プライマー：
【０６３２】
【化１５】 この構築物は、ｐＡ２中のＦｃと融合したＤ−ＳＬＡＭの推定細胞外ドメインを
発現する。
【０６３３】 上記のこれら２つの構築物を、それらの適切な宿主細胞（例えば、哺乳動物系
においてはｐＣ４であるが、バキュロウイルス系においてはｐＡ２）において発
現させ、両方の系は、推定シグナル配列を欠き、かつ配列番号２のＡ２３で始ま
る短縮型タンパク質を生じる。従って、予測されたように、バキュロウイルス系
および哺乳動物系の両方は、Ｄ−ＳＬＡＭを配列番号２のアミノ酸Ａ２３にプロ
セスする。しかし、グリコシル化における差異により、バキュロウイルス系は、
還元条件下で、６０ｋＤ付近で移動するタンパク質を生成するが、哺乳動物系は
、５５ｋＤ付近で移動するタンパク質を生じる。
【０６３４】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの融合タンパク質（Ｄ−ＳＬＡＭの推定細
胞外ドメインまたは成熟形態を含む）は、哺乳動物細胞発現のためにＦＬＡＧに
融合され得る。例えば、細胞外ドメインは、以下のプライマーを用いて増幅され
得る：太字で示されるＢａｍＨＩ制限部位を含む５’プライマー：
【０６３５】
【化１６】 および太字で示されるＸｂａ制限部位を含む３’プライマー：
【０６３６】
【化１７】 。
【０６３７】 （実施例１１：抗体の産生） （ａ）ハイブリドーマ技術） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ、第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例としては、Ｄ
−ＳＬＡＭを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導する
ために動物に投与される。好ましい方法において、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の調
製物が調製され、そして精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないようにさ
れる。次いで、このような調製物は、より大きな比活性のポリクローナル抗血清
を生成するために動物に導入される。
【０６３８】 最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（または、
そのタンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、
ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る（Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， Ｅｌ
ｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、このよう
な手順は、動物（好ましくは、マウス）をＤ−ＳＬＡＭポリぺプチドで免疫化す
ること、またはより好ましくは、分泌Ｄ−ＳＬＡＭポリぺプチド発現細胞を用い
る免疫化を含む。このような細胞は、任意の適切な組織培養培地において培養さ
れ得る；しかし、１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化した）を補充し、そし
て約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および
約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変Ｅａｇｌｅ
培地において細胞を培養することが好ましい。
【０６３９】 このようなマウスの脾細胞が抽出され、そして適切なミエローマ細胞株と融合
される。任意の適切なミエローマ細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しか
し、ＡＴＣＣから入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好
ましい。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に
維持し、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２
５−２３２ （１９８１））に記載されるように限界希釈によってクローニング
する。次いで、このような選択を通して得られるハイブリドーマ細胞は、Ｄ−Ｓ
ＬＡＭポリぺプチドに結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッ
セイされる。
【０６４０】 あるいは、Ｄ−ＳＬＡＭポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディ
オタイプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法
は、抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第２の抗体に結合する抗体を得ること
が可能であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体
が使用されて、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動
物の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、ハイブリドー
マ細胞は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質特異的抗体に結合するその能力がＤ−ＳＬＡ
Ｍによってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリー
ニングされる。このような抗体は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質特異的抗体に対する
抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるＤ−ＳＬＡＭタン
パク質特異的抗体の形成を誘導するために使用され得る。
【０６４１】 ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明の抗体の他のフラグメントは、本
明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが理解される。このような
フラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）
またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため）のような酵素を
使用して、タンパク質分解性切断によって産生される。あるいは、分泌Ｄ−ＳＬ
ＡＭタンパク質結合フラグメントが、組換えＤＮＡ技術の適用により、または合
成化学を通して産生され得る。
【０６４２】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル
抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用すること
によって産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法は当該分野で公知であ
る（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（
１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；
Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、
ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒ
ｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１
；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕ
ｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。
【０６４３】 （ｂ）ｓｃＦｖｓのライブラリー由来のＤ−ＳＬＡＭに対する抗体フラグメン
トの単離） ヒトＰＢＬから単離された天然に生じるＶ遺伝子は、抗体フラグメントの大き
なライブラリー内に構築される。この抗体フラグメントは、ドナーが曝露されて
も、されなくてもよいＤ−ＳＬＡＭに対する反応性を含む（例えば、本明細書中
にその全体が参考として援用される米国特許第５，８８５，７９３号を参照のこ
と）。
【０６４４】 （ライブラリーのレスキュー） ｓｃＦｖｓのライブラリーは、ＷＯ９２／０１０４７に記載されるヒトＰＢＬ
のＲＮＡより構築される。ファージディスプレイ抗体フラグメントをレスキュー
するために、ファージミドを含む約１０9のＥ．ｃｏｌｉを使用して、１％グル
コースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を
含む５０ｍｌの２×ＴＹに播種し、振とうしながら０．８のＯ．Ｄ．まで増殖さ
せる。５ｍｌのこの培地を使用して、５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵに播
種し、２×１０8ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ、ＷＯ９２
／０１０４７を参照のこと）を添加し、そして培養物を３７℃で４５分間、振と
うしないでインキュベートし、次いで３７℃で４５分間振とうしながらインキュ
ベートする。培養物を、４０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離し、そしてペ
レットを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシ
ンを含む２リットルの２×ＴＹに再懸濁し、一晩増殖させる。ＷＯ９２／０１０
４７に記載されるようにファージを調製した。
【０６４５】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードせず、それ故、抗体フラグメン
トを示すファージ（ミド）は、抗体への結合のより大きな結合活性を有する。感
染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を、ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩ
タンパク質を供給するｐＵＣ１９誘導体を有する細胞内にヘルパーファージを増
殖させることによって作製する。培養物を、１時間３７℃で振とうしないでイン
キュベートし、次いでさらに１時間３７で振とうしてインキュベートする。細胞
をスピンダウン（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ８，４００回転／分で１０分）し、１０
０μｇアンピシリン／ｍｌ、および２５μｇカナマイシン／ｍｌを含む３００ｍ
ｌの２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）に再懸濁し、３７℃で振とう
しながら一晩増殖させる。ファージ粒子を、２回のＰＥＧ沈澱によって培養培地
より精製し、そして濃縮し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）、２ｍｌのＰＢＳ
に再懸濁し、そして０．４５μｍフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａ
ｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０13形質転換単位／ｍｌの最終濃度（アンピ
シリン耐性クローン）を得る。
【０６４６】 （ライブラリーパニング） Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明のポリペプチドの１００μｇ
／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜す
る。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし、
次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０13ＴＵのファージをチューブに適用し、
そして、回転盤で上下に傾けながら室温で３０分間インキュベートし、次いでさ
らに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１
０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンを
添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることによりファージを溶出
し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で
直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃で３０分間イ
ンキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数増殖中期のＥ
．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを１％グルコースおよ
び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプレートする。
次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝子３ヘルパーファー
ジでレスキューし、次の回の選択のためのファージを調製する。次いで、このプ
ロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復し、３回目および４回目に
はチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２０倍、そしてＰＢＳで
２０倍に増加する。
【０６４７】 （結合剤の特徴付け） 第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．
６中の本発明のポリペプチドの１０ピコグラム／ｍｌのいずれかで被膜したマイ
クロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ中の陽性クロ
ーンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＷＯ９２／０１０４７を参照
のこと）、次に配列決定することによりさらに特徴付ける。
【０６４８】 （実施例１２：高処理能力スクリーニングアッセイのためのＤ−ＳＬＡＭタン
パク質の産生） 以下のプロトコルは、試験されるＤ−ＳＬＡＭポリぺプチドを含有する上清を
産生する。次いで、この上清は、実施例１４〜２１に記載されるスクリーニング
アッセイにおいて使用され得る。
【０６４９】 第一に、ポリ−Ｄ−リジン（６４４ ５８７ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）ストック溶液（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（カルシウム
もマグネシウムも含まない１７−５１６Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で１
：２０に希釈して、作用溶液５０μｇ／ｍｌにする。２００μｌのこの溶液を、
各ウェル（２４ウェルプレート）に添加し、そして室温で２０分間インキュベー
トする。その溶液を各ウェルにわたって分配させることを確実にする（注：１２
チャンネルピペッターが、１つおきのチャンネルにチップをつけて使用され得る
）。ポリ−Ｄ−リジン溶液を吸引除去し、そして１ｍｌ ＰＢＳ（リン酸緩衝化
生理食塩水）でリンスする。ＰＢＳは、細胞をプレートする直前までウェル中に
残すべきであり、そしてプレートは２週間前までに予めポリリジンでコーティン
グし得る。
【０６５０】 ２９３Ｔ細胞（Ｐ＋２０を過ぎて細胞を保有しない）を、２×１０5細胞／ウ
ェルで、０．５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）（４．
５Ｇ／ＬのグルコースおよびＬ−グルタミン（１２−６０４Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔ
ｔａｋｅｒ）／１０％熱非働化ＦＢＳ（１４−５０３Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋ
ｅｒ）／１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（１７−６０２Ｅ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）
を含む）中にプレートする。細胞を一晩増殖させる。
【０６５１】 翌日、滅菌溶液容器（ｂａｓｉｎ）中で、３００μｌリポフェクトアミン（１
８３２４−０１２ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）および５ｍｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ（
３１９８５０７０ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）／９６ウェルプレートを、一緒に混合
する。小容量のマルチチャンネルピペッターを用いて、実施例８〜１０に記載す
る方法によって産生されたポリヌクレオチド挿入物を含有する約２μｇの発現ベ
クターを、適切に標識された９６ウェルの丸底プレート中にアリコートする。マ
ルチチャンネルピペッターを用いて、５０μｌのリポフェクトアミン／Ｏｐｔｉ
ｍｅｍ Ｉ混合物を各ウェルに添加する。ピペットで緩やかに吸い上げたり下げ
たりして混合する。室温で１５〜４５分間インキュベートする。約２０分後、マ
ルチチャンネルピペッターを使用して１５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ Ｉを各ウェ
ルに添加する。コントロールとして、挿入物を欠失するベクターＤＮＡの１つの
プレートは、トランスフェクションの各セットでトランスフェクトされるべきで
ある。
【０６５２】 好ましくは、トランスフェクションは、以下の作業をタッグチームを組んで（
ｔａｇ−ｔｅａｍｉｎｇ）行うべきである。タッグチームを組むことによって、
時間に関する労力は半減され、そして細胞にはＰＢＳ上であまり多くの時間を過
ごさせない。まず、Ａさんは、培地を細胞の４つの２４ウェルプレートから吸引
除去し、次いでＢさんが０．５〜１ｍｌのＰＢＳで各ウェルをリンスする。次い
で、Ａさんは、ＰＢＳリンスを吸引除去し、そしてＢさんは、チャンネル１つお
きにチップのついた１２チャンネルピペッターを使用して、２００μｌのＤＮＡ
／リポフェクトアミン／Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ複合体を、まず奇数のウェルに、次
いで偶数のウェルにと、２４ウェルプレート上の各列に添加する。３７℃で６時
間インキュベートする。
【０６５３】 細胞をインキュベートする間に、１×ペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）を
有するＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡか、またはＨＧＳ ＣＨＯ−５培地（１１６．６
ｍｇ／ＬのＣａＣｌ2（無水物）；０．００１３０ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ4−５Ｈ2
Ｏ；０．０５０ｍｇ／ＬのＦｅ（ＮＯ3）3−９Ｈ2Ｏ；０．４１７ｍｇ／ＬのＦ
ｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏ；３１１．８０ｍｇ／ＬのＫＣｌ；２８．６４ｍｇ／ＬのＭｇ
Ｃｌ2；４８．８４ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ4；６９９５．５０ｍｇ／ＬのＮａＣｌ；
２４００．０ｍｇ／ＬのＮａＨＣＯ3；６２．５０ｍｇ／ＬのＮａＨ2ＰＯ4−Ｈ2 Ｏ；７１．０２ｍｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4；０．４３２０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ4−
７Ｈ2Ｏ；０．００２ｍｇ／Ｌのアラキドン酸；１．０２２ｍｇ／Ｌのコレステ
ロール；０．０７０ｍｇ／ＬのＤＬ−α−酢酸トコフェロール；０．０５２０ｍ
ｇ／Ｌのリノール酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのリノレン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌの
ミリスチン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのオレイン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのｐａｌ
ｍｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミチン酸；１００ｍｇ／Ｌ
のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；０．０１０ｍｇ／Ｌのステアリン酸；２．２０
ｍｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０；４５５１ｍｇ／ＬのＤ−グルコース；１３０．８５
ｍｇ／ｍｌのＬ−アラニン；１４７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アルギニン−ＨＣｌ
；７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン−Ｈ2Ｏ；６．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−
アスパラギン酸；２９．５６ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン２ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ；３１
．２９ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン−２ＨＣｌ；７．３５ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタ
ミン酸；３６５．０ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン；１８．７５ｍｇ／ｍｌのグリ
シン；５２．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン−ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ；１０６．９７
ｍｇ／ｍｌのＬ−イソロイシン；１１１．４５ｍｇ／ｍｌのＬ−ロイシン；１６
３．７５ｍｇ／ｍｌのＬ−リジンＨＣｌ；３２．３４ｍｇ／ｍｌのＬ−メチオニ
ン；６８．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−フェニルアラニン；４０．０ｍｇ／ｍｌのＬ−
プロリン；２６．２５ｍｇ／ｍｌのＬ−セリン；１０１．０５ｍｇ／ｍｌのＬ−
スレオニン；１９．２２ｍｇ／ｍｌのＬ−トリプトファン；９１．７９ｍｇ／ｍ
ｌのＬ−チロシン（Ｔｒｙｒｏｓｉｎｅ）−２Ｎａ−２Ｈ2Ｏ；および９９．６
５ｍｇ／ｍｌのＬ−バリン；０．００３５ｍｇ／Ｌのビオチン；３．２４ｍｇ／
ＬのＤ−Ｃａパントテン酸塩；１１．７８ｍｇ／Ｌの塩化コリン；４．６５ｍｇ
／Ｌの葉酸；１５．６０ｍｇ／Ｌのｉ−イノシトール；３．０２ｍｇ／Ｌのナイ
アシンアミド；３．００ｍｇ／ＬのピリドキサールＨＣｌ；０．０３１ｍｇ／Ｌ
のピリドキシンＨＣｌ；０．３１９ｍｇ／Ｌのリボフラビン；３．１７ｍｇ／Ｌ
のチアミンＨＣｌ；０．３６５ｍｇ／Ｌのチミジン；および０．６８０ｍｇ／Ｌ
のビタミンＢ12；２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤；２．３９ｍｇ／ＬのＮａヒポキ
サンチン塩；０．１０５ｍｇ／Ｌのリポ酸；０．０８１ｍｇ／Ｌのプトレシンナ
トリウム−２ＨＣｌ；５５．０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム；０．００６７
ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム；２０μＭのエタノールアミン；０．１２２ｍ
ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄；リノール酸と複合体化した４１．７０ｍｇ／Ｌのメチ
ル−Ｂ−シクロデキストリン；３３．３３ｍｇ／Ｌのオレイン酸と複合体化した
メチル−Ｂ−シクロデキストリン；酢酸レチナールと複合体化した１０ｍｇ／Ｌ
のメチル−Ｂ−シクロデキストリン）のいずれかの適切な培地を調製する。浸透
圧モル濃度を、２ｍＭグルタミンおよび１×ペンストレップを用いて３２７ｍＯ
ｓｍに調整する。（１０％ＢＳＡストック溶液のために、１Ｌ ＤＭＥＭ中にＢ
ＳＡ（８１−０６８−３ Ｂａｙｅｒ） １００ｇを溶解する）。培地を濾過し
、そして５０μｌを内毒素アッセイのために１５ｍｌポリスチレンコニカル中に
収集する。
【０６５４】 トランスフェクション反応を、好ましくはタッグチームを組んでインキュベー
ション時間の終わりに終結させる。Ａさんは、トランスフェクション培地を吸引
除去し、その間Ｂさんは、１．５ｍｌの適切な培地を各ウェルに添加する。使用
された培地に依存して４５または７２時間、３７℃でインキュベートする：１％
ＢＳＡは４５時間、またはＣＨＯ−５は７２時間。
【０６５５】 ４日目に、３００μｌのマルチチャンネルピペッターを使用して、６００μｌ
を１ｍｌの深底ウェルプレート１枚にアリコートし、そして残りの上清を２ｍｌ
の深底ウェルにアリコートする。次いで、各ウェルからの上清を実施例１４〜２
１に記載するアッセイにおいて使用し得る。
【０６５６】 活性が、上清を使用して以下に記載する任意のアッセイにおいて得られる場合
、この活性は、Ｄ−ＳＬＡＭポリぺプチドから直接に（例えば、分泌タンパク質
として）か、またはＤ−ＳＬＡＭによって誘導される他のタンパク質の発現（こ
れは、次いで上清中に分泌される）のいずれかに由来することが特に理解される
。従って、本発明はさらに、特定のアッセイにおける活性によって特徴づけられ
る上清中のタンパク質を同定する方法を提供する。
【０６５７】 （実施例１３：ＧＡＳレポーター構築物の構築） 細胞の分化および増殖に関与する１つのシグナル伝達経路は、Ｊａｋ−ＳＴＡ
Ｔ経路と呼ばれる。Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路の活性化タンパク質は、多くの遺伝子
のプロモーターに位置する、γ活性化部位「ＧＡＳ」エレメントまたはインター
フェロン感受性応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）に結合する。これらのエレメン
トに対するタンパク質の結合は、関連する遺伝子の発現を変化させる。
【０６５８】 ＧＡＳおよびＩＳＲＥエレメントは、転写のシグナルトランスデューサーおよ
びアクチベーター、すなわち「ＳＴＡＴ」と呼ばれる転写因子のクラスによって
認識される。ＳＴＡＴファミリーには６つのメンバーが存在する。Ｓｔａｔ１お
よびＳｔａｔ３は、Ｓｔａｔ２と同様に（ＩＦＮαに対する応答が広範であるよ
うに）、多くの細胞型において存在する。Ｓｔａｔ４は、より限定されており、
そして多くの細胞型には存在しないが、ＩＬ−１２での処理後のＴヘルパークラ
スＩ細胞に見出されている。Ｓｔａｔ５は、元々は乳房成長因子と呼ばれたが、
骨髄細胞を含む他の細胞においてより高い濃度で見出されている。それは、多く
のサイトカインによって組織培養細胞において活性化され得る。
【０６５９】 ＳＴＡＴは活性化されて、Ｊａｎｕｓ Ｋｉｎａｓｅ（「Ｊａｋ」）ファミリ
ーとして知られる１セットのキナーゼによるチロシンリン酸化に際して細胞質か
ら核へ移動する。Ｊａｋは、可溶性のチロシンキナーゼの独特のファミリーを表
し、そしてＴｙｋ２、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＪａｋ３を含む。これらのキ
ナーゼは、有意な配列類似性を示し、そして一般には休止細胞において触媒的に
不活性である。
【０６６０】 Ｊａｋは、以下の表によって要約されるように広範なレセプターによって活性
化される（ＳｃｈｉｄｌｅｒおよびＤａｒｎｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．６４：６２１−５１（１９９５）による総説から改変）。Ｊａｋを活性
化し得るサイトカインレセプターファミリーは、２つの群に分けられる：（ａ）
クラス１は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、
ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｅｐｏ、ＰＲＬ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびトロンボポエチンについてのレセプター
を含み；そして（ｂ）クラス２は、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−ｇ、およびＩＬ−１０
を含む。クラス１レセプターは、保存されたシステインモチーフ（４つの保存さ
れたシステインおよび１つのトリプトファンのセット）、およびＷＳＸＷＳモチ
ーフ（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（配列番号５）をコードする膜
近接領域）を共有する。
【０６６１】 従って、リガンドのレセプターへの結合の際に、Ｊａｋは活性化され、これは
次いでＳＴＡＴを活性化し、これは、次いで移動し、そしてＧＡＳエレメントに
結合する。この全プロセスは、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に包含される
。
【０６６２】 それゆえ、ＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントの結合によって反映されるＪａｋ
−ＳＴＡＴ経路の活性化は、細胞の増殖および分化に関与するタンパク質を示す
ために使用され得る。例えば、成長因子およびサイトカインは、Ｊａｋ−ＳＴＡ
Ｔ経路を活性化することが知られている（以下の表を参照のこと）。従って、レ
ポーター分子に連結したＧＡＳエレメントを使用することにより、Ｊａｋ−ＳＴ
ＡＴ経路のアクチベーターが同定され得る。
【０６６３】
【表１】 実施例１４〜１５に記載される生物学的アッセイにおいて使用されるプロモー
ターエレメントを含む合成ＧＡＳを構築するために、ＰＣＲに基づいたストラテ
ジーを用いてＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター配列を産生する。５’プライマーは
、ＩＲＦ１プロモーターにおいて見出され、そして一定の範囲のサイトカインを
用いる誘導の際にＳＴＡＴに結合することが以前に証明されたＧＡＳ結合部位の
４つの直列のコピーを含むが（Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４５
７−４６８（１９９４））、他のＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントを代わりに使
用し得る。５’プライマーはまた、ＳＶ４０初期プロモーター配列に対して相補
的な１８ｂｐの配列も含み、そしてＸｈｏＩ部位に隣接する。５’プライマーの
配列は以下である：
【０６６４】
【化１８】 下流プライマーはＳＶ４０プロモーターに対して相補的であり、そしてＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位に隣接する：５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧ
ＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列番号７）。
【０６６５】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したＢ−ｇａｌ：プロモータープラ
スミド中に存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを用いて実施する。得
られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いて消化し、そし
てＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。正方向およ
び逆方向のプライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むこと
を確認する：
【０６６６】
【化１９】 次に、ＳＶ４０プロモーターに結合したこのＧＡＳプロモーターエレメントを
用いて、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ２レポーター構築物を操作する。ここで、レポーター
分子は、分泌アルカリホスファターゼ、すなわち「ＳＥＡＰ」である。しかし、
明らかに、この実施例または他の実施例のいずれにおいても、任意のレポーター
分子が、ＳＥＡＰの代わりとなり得る。ＳＥＡＰの代わりに使用され得る周知の
レポーター分子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（
ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、
グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または抗体により検出可能な任意のタンパ
ク質が挙げられる。
【０６６７】 合成ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーターエレメントと確認された上記の配列を、Ｇ
ＡＳ−ＳＥＡＰベクターを作製するために、ＳＶ４０プロモーターを、増幅した
ＧＡＳ：ＳＶ４０プロモーターエレメントで効率的に置換し、ＨｉｎｄＩＩＩお
よびＸｈｏＩを用いて、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＳＥＡＰ−プロモータ
ーベクターにサブクローニングする。しかし、このベクターはネオマイシン耐性
遺伝子を含まず、それゆえ、哺乳動物の発現系には好ましくない。
【０６６８】 従って、ＧＡＳ−ＳＥＡＰレポーターを発現する哺乳動物の安定な細胞株を作
製するために、ＧＡＳ−ＳＥＡＰカセットを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて
ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターから取り出し、そしてＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベク
ターを作製するために、マルチクローニング部位におけるこれらの制限部位を用
いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含むバックボーンベクター（例えば、ｐＧＦＰ
−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に挿入する。一旦、このベクターを哺乳動物細胞に
トランスフェクトすれば、次いでこのベクターは、実施例１４〜１５に記載され
るようにＧＡＳ結合についてのレポーター分子として使用され得る。
【０６６９】 他の構築物を、上記の記載を使用し、そしてＧＡＳを異なるプロモーター配列
で置換して、作製し得る。例えば、ＮＦＫ−ＢおよびＥＧＲプロモーター配列を
含むレポーター分子の構築を、実施例１６および１７に記載する。しかし、多く
の他のプロモーターをこれらの実施例に記載のプロトコルを使用して置換し得る
。例えば、ＳＲＥ、ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、またはオステオカルシンのプロモータ
ーを単独で、または組み合わせて（例えば、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ／ＥＧＲ、ＧＡ
Ｓ／ＮＦ−ＫＢ、Ｉｌ−２／ＮＦＡＴ、もしくはＮＦ−ＫＢ／ＧＡＳ）置換し得
る。同様に、他の細胞株（例えば、ＨＥＬＡ（上皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（内皮細
胞）、Ｒｅｈ（Ｂ細胞）、Ｓａｏｓ−２（骨芽細胞）、ＨＵＶＡＣ（大動脈細胞
）、または心筋細胞）を、レポーター構築物の活性を試験するために使用し得る
。
【０６７０】 （実施例１４：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを、Ｄ−ＳＬＡＭ上清がＴ細胞を増殖および／または分化さ
せるかどうかを決定することにより、Ｄ−ＳＬＡＭのＴ細胞の活性を評価するた
めに使用する。Ｔ細胞の活性を実施例１３で作製したＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ
構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋ−
ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化する能力を示す。このアッセイに使用したＴ
細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ−１５２）であるが、
Ｍｏｌｔ−３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５５２）およびＭｏｌｔ−４細
胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８２）細胞もまた使用し得る。
【０６７１】 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、リンパ芽球性ＣＤ４＋ Ｔｈ１ヘルパー細胞である
。安定な細胞株を作製するために、およそ２００万のＪｕｒｋａｔ細胞をＤＭＲ
ＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ
／ｎｅｏベクターでトランスフェクト（以下に記載のトランスフェクション手順
）する。トランスフェクトした細胞を、およそ２０，０００細胞／ウェルの密度
で播種し、そして１ｍｇ／ｍｌのゲンチシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）に対して耐性
であるトランスフェクト体を選択する。耐性コロニーを増殖させ、次いで、漸増
する濃度のインターフェロンγに対するそれらの応答について試験する。選択し
たクローンの用量応答を示す。
【０６７２】 詳細には、以下のプロトコルにより、２００μｌの細胞を含む７５のウェルに
ついて十分な細胞を得る。従って、複数の９６ウェルプレートについて十分な細
胞を産生するために、スケールアップするか、または複数で実施するかのいずれ
かである。Ｊｕｒｋａｔ細胞を１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを有するＲＰＭＩ＋１
０％血清中で維持する。Ｔ２５フラスコ中で２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０μｇのプラスミドＤＮＡとを組み合
わせる。５０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃを含む２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを添加
し、そして、室温で１５〜４５分間インキュベートする。
【０６７３】 インキュベート時間の間、細胞濃度をカウントし、必要な細胞数（トランスフ
ェクションあたり１０7個）をスピンダウンし、そして最終濃度が１０7細胞／ｍ
ｌとなるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で再懸濁する。次いで、１ｍｌのＯＰＴＩ−
ＭＥＭ中の１×１０7個の細胞をＴ２５フラスコに加え、そして３７℃で６時間
インキュベートする。インキュベーションの後、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％の
血清を添加する。
【０６７４】 Ｊｕｒｋａｔ：ＧＡＳ−ＳＥＡＰ安定レポーター株をＲＰＭＩ＋１０％血清、
１ｍｇ／ｍｌゲンチシン、および１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。これ
らの細胞を実施例１２に記載されるプロトコルにより産生されるようなＤ−ＳＬ
ＡＭポリペプチドまたはＤ−ＳＬＡＭ誘導ポリペプチドを含む上清で処理する。
【０６７５】 上清での処理日に細胞を洗浄すべきであり、そして１ｍｌあたり５００，００
０個の細胞密度となるように新鮮なＲＰＭＩ＋１０％血清中に再懸濁するべきで
ある。必要な細胞の正確な数は、スクリーニングされる上清の数に依存する。１
枚の９６ウェルプレートについて、およそ１０００万個の細胞（１０枚のプレー
トについて１億個の細胞）を必要とする。
【０６７６】 細胞を、１２チャンネルのピペットを用いて９６ウェルのディッシュに分与す
るために、三角のリザーバーボートに細胞を移す。２００μｌの細胞を、１２チ
ャンネルのピペットを用いて、それぞれのウェルに移す（従って、ウェル当たり
１００，０００個の細胞を添加する）。
【０６７７】 全てのプレートに播種した後、５０μｌの上清を、１２チャンネルピペットを
用いて、上清を含む９６ウェルプレートから各ウェルに直接的に移す。さらに、
外来性のインターフェロンγの用量（０．１、１．０、１０ｎｇ）を、ウェルＨ
９、ウェルＨ１０、およびウェルＨ１１に添加し、アッセイについてのさらなる
陽性コントロールとして供する。
【０６７８】 上清で処理したＪｕｒｋａｔ細胞を含む９６ウェルディッシュをインキュベー
ター中に４８時間置く（注：この時間は４８〜７２時間の間で変更可能である）
。次いで、各ウェルから３５μｌのサンプルを、１２チャンネルのピペットを用
いて、不透明な９６ウェルプレートに移す。不透明なプレートを（セロファンの
カバーを用いて）覆うべきであり、そして実施例１８に従うＳＥＡＰアッセイを
行うまで、−２０℃で保存する。残存する処理した細胞を含むプレートを４℃に
置き、そして、所望するならば、特定のウェル上でのアッセイを繰り返すための
物質の供給源として供する。
【０６７９】 陽性コントロールとして、１００ユニット／ｍｌのインターフェロンγを使用
し得、これは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を活性化することが公知である。代表的に
は、３０倍を超える誘導が、陽性コントロールのウェルにおいて観察される。
【０６８０】 （実施例１５：骨髄性の活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを、Ｄ−ＳＬＡＭが骨髄性細胞を増殖または分化させるかど
うかを決定することによりＤ−ＳＬＡＭの骨髄性の活性を評価するために使用す
る。骨髄性細胞の活性を実施例１３において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅ
ｏ構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋ
−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化させる能力を示す。このアッセイに使用さ
れた骨髄性細胞は、Ｕ９３７（前単球（ｐｒｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ）細胞株）で
あるが、ＴＦ−１、ＨＬ６０、またはＫＧ１も使用し得る。
【０６８１】 Ｕ９３７細胞を、実施例１３において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構
築物で、一過性にトランスフェクトするために、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（
Ｋｈａｒｂａｎｄａら、１９９４，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ，５：２５９−２６５）を用いる。最初に、２×１０ｅ7個
のＵ９３７細胞を収集し、そしてＰＢＳで洗浄する。Ｕ９３７細胞を、通常、１
００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン
を補充した１０％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培
地中で増殖させる。
【０６８２】 次に、０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、８μｇのＧＡＳ−ＳＥ
ＡＰ２プラスミドＤＮＡ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３７５μＭ
Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、および６７５μＭ ＣａＣｌ2
を含む１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液に細胞を懸
濁する。３７℃で４５分間インキュベートする。
【０６８３】 １０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を洗浄し、次いで、１０
ｍｌの完全培地に再懸濁し、そして３７℃で３６時間インキュベートする。
【０６８４】 ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｕ９３７安定細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細
胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を使用して、慣用的に
増殖させるが、１〜２ヶ月毎に細胞を二継代の間、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８
中で再増殖させるべきである。
【０６８５】 これらの細胞を１×１０8個の細胞を収集すること（これは１０枚の９６ウェ
ルプレートアッセイのために十分である）により試験し、そしてＰＢＳで洗浄す
る。上記の２００ｍｌの増殖培地中に、５×１０5細胞／ｍｌの最終密度で細胞
を懸濁する。９６ウェルプレートにおいてウェルあたり２００μｌの細胞をプレ
ートする（すなわち、１×１０5細胞／ウェル）。
【０６８６】 実施例１２に記載されるプロトコルにより調製された上清を５０μｌ添加する
。３７℃で４８〜７２時間インキュベートする。陽性コントロールとして、１０
０ユニット／ｍｌのインターフェロンγを使用し得、これはＵ９３７細胞を活性
化させることが公知である。代表的には、３０倍を超える誘導が、陽性コントロ
ールウェルにおいて観察される。ＳＥＡＰは、実施例１８に記載のプロトコルに
従って上清をアッセイする。
【０６８７】 （実施例１６：ニューロン活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ
） 細胞が分化および増殖を経る場合、一群の遺伝子が多くの異なるシグナル伝達
経路を介して活性化される。これらの遺伝子の１つであるＥＧＲ１（初期増殖応
答遺伝子１）は、活性化時に種々の組織および細胞型において誘導される。ＥＧ
Ｒ１のプロモーターはこのような誘導を担う。レポーター分子に連結したＥＧＲ
１プロモーターを使用して、Ｄ−ＳＬＡＭによって細胞の活性化を評価し得る。
【０６８８】 詳細には、以下のプロトコルをＰＣ１２細胞株におけるニューロン活性を評価
するために使用する。ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫（ｐｈｅｎｏｃｈｒｏｍ
ｏｃｙｔｏｍａ）の細胞）は、多くのマイトジェン（例えば、ＴＰＡ（テトラデ
カノイルホルボールアセテート）、ＮＧＦ（神経発育因子）、およびＥＧＦ（上
皮増殖因子））での活性化により増殖および／または分化することが公知である
。この処理の間にＥＧＲ１遺伝子発現を活性化する。従って、ＳＥＡＰレポータ
ーに連結したＥＧＲプロモーターを含む構築物でＰＣ１２細胞を安定にトランス
フェクトすることにより、Ｄ−ＳＬＡＭによってＰＣ１２細胞の活性化を評価し
得る。
【０６８９】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰレポーター構築物を以下のプロトコルにより組み立て得る。
ＥＧＲ−１プロモーター配列（−６３３〜＋１）（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋら、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ ６：８６７−８７１（１９９１））を以下のプライマーを用い
て、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し得る：
【０６９０】
【化２０】 次いで、実施例１３において作製したＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを使
用して、ＥＧＲ１増幅産物をこのベクターに挿入し得る。制限酵素ＸｈｏＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩを使用してＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを線状化し、ＧＡＳ
／ＳＶ４０スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を取り除く。これらの同じ酵素を用
いて、ＥＧＲ１増幅産物を制限処理する。ベクターとＥＧＲ１プロモーターとを
連結する。
【０６９１】 細胞培養のための９６ウェルプレートを調製するために、コーティング溶液（
コラーゲンＩ型（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ． カタログ番号０
８−１１５）の、３０％エタノール（滅菌濾過）での１：３０希釈）を、１つの
１０ｃｍプレートあたり２ｍｌ、または９６ウェルプレートの１ウェルあたり５
０ｍｌ添加し、そして２時間風乾させる。
【０６９２】 ＰＣ１２細胞を、予めコートした１０ｃｍ組織培養ディッシュ上で、ペニシリ
ン（１００ユニット／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を
補充した、１０％ウマ血清（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カタログ番号１
２４４９−７８Ｐ）、５％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１
６４０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で慣用的に増殖させる。１つから
４つへの分割を３〜４日毎に行う。細胞を掻き取ることによりプレートから取り
出し、そして１５回より多く上下にピペッティングして再懸濁する。
【０６９３】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を、実施例１２に記載のリポフェクタミン（
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）プロトコルを使用して、ＰＣ１２にトランスフェ
クトする。ＥＧＲ−ＳＥＡＰ／ＰＣ１２の安定な細胞を、３００μｇ／ｍｌのＧ
４１８中で細胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を慣用的
増殖のために使用するが、１〜２ヶ月毎に、細胞を２継代の間、３００μｇ／ｍ
ｌのＧ４１８中で再増殖させるべきである。
【０６９４】 ニューロン活性をアッセイするために、およそ７０〜８０％コンフルエントで
ある細胞を有する１０ｃｍプレートを、古い培地を除去することによりスクリー
ニングする。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）を用いて１回洗浄する。
次いで、細胞を低血清培地（抗生物質とともに１％ウマ血清および０．５％ Ｆ
ＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）中で一晩、飢餓させる。
【０６９５】 翌朝、培地を除去し、そしてＰＢＳで細胞を洗浄する。プレートから細胞を掻
き取り、細胞を２ｍｌの低血清培地中でよく懸濁する。細胞数をカウントし、そ
してより低血清の培地に添加し、５×１０5細胞／ｍｌの最終細胞密度に到達さ
せる。
【０６９６】 ２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加する（１×１
０5細胞／ウェルに等しい）。実施例１２により産生された５０μｌの上清を、
３７℃で４８〜７２時間加える。陽性コントロールとして、ＥＧＲを通してＰＣ
１２細胞を活性化することが公知の増殖因子（例えば、５０ｎｇ／μｌの神経発
育因子（ＮＧＦ））を使用し得る。代表的には、５０倍を超えるＳＥＡＰ誘導が
陽性コントロールウェルにおいて見られる。ＳＥＡＰは実施例１８に従って、上
清をアッセイする。
【０６９７】 （実施例１７：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） ＮＦ−ΚＢ（核因子κＢ）は、広範な種々の薬剤（炎症性サイトカインである
ＩＬ−１およびＴＮＦ、ＣＤ３０およびＣＤ４０、リンホトキシン−αおよびリ
ンホトキシン−βを含む）により、ＬＰＳまたはトロンビンへの曝露により、な
らびに特定のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される転写因子である。転
写因子として、ＮＦ−κＢは免疫細胞の活性化に関与する遺伝子の発現、アポト
ーシスの制御（ＮＦ−κＢは、アポトーシスから細胞を保護すると思われる）、
Ｂ細胞およびＴ細胞の発生、抗ウイルス応答および抗菌応答、ならびに複数のス
トレス応答を調節する。
【０６９８】 刺激されない条件において、ＮＦ−κＢは、Ｉ−κＢ（インヒビターκＢ）を
有する細胞質に保持される。しかし、刺激の際に、Ｉ−κＢはリン酸化され、そ
して分解（ｄｅｇｒａｄｅ）され、ＮＦ−κＢの核への往復（ｓｈｕｔｔｌｅ）
を引き起こし、これにより標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−κＢにより活
性化される標的遺伝子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ
−１およびクラス１ＭＨＣが挙げられる。
【０６９９】 その中心的な役割および一定の範囲の刺激に応答する能力に起因して、ＮＦ−
κＢプロモーターエレメントを利用するレポーター構築物を、実施例１２におい
て産生された上清をスクリーニングするために使用する。ＮＦ−κＢのアクチベ
ーターまたはインヒビターは、疾患の処置、診断、検出、および／または予防の
際に有用である。例えば、ＮＦ−κＢのインヒビターを、急性または慢性的なＮ
Ｆ−κＢの活性化に関連するこれらの疾患（例えば、慢性関節リウマチ）を処置
、診断、検出、および／または予防するために使用し得る。
【０７００】 ＮＦ−κＢプロモーターエレメントを含むベクターを構築するために、ＰＣＲ
に基づいたストラテジーを用いる。上流のプライマーは、ＮＦ−κＢ結合部位（
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ）（配列番号１１）の４つの縦列コピー、ＳＶ４０初
期プロモーター配列の５’末端に対して相補的な１８ｂｐの配列を含み、そして
ＸｈｏＩ部位に隣接する：
【０７０１】
【化２１】 下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターの３’末端に対して相補的であり、
そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列
番号７）。
【０７０２】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＢ−ｇａｌ：プロモータープ
ラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを使用して実行する。
得られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして
ＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。Ｔ７およびＴ
３プライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むことを確認す
る：
【０７０３】
【化２２】 次に、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＳＥＡＰ２−プロモータ
ープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＳＶ４０最小プロモーターエレメ
ントをこのＮＦ−κＢ／ＳＶ４０フラグメントと置換する。しかし、このベクタ
ーはネオマイシン耐性遺伝子を含まず、従って哺乳動物の発現系には好ましくな
い。
【０７０４】 安定な哺乳動物細胞株を作製するために、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカ
セットを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用して上記のＮＦ−κＢ／ＳＥＡ
Ｐベクターから取り出し、そしてネオマイシン耐性を含むベクターに挿入する。
特に、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を制限処理
した後に、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットをｐＧＦＰ−１に挿入し、
ＧＦＰ遺伝子を置換した。
【０７０５】 一旦、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製した後は、実
施例１４に記載のプロトコルに従って、安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を作製し、
そして維持する。同様に、これらの安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を含む上清をア
ッセイするための方法がまた、実施例１４に記載される。陽性コントロールとし
て、外因性のＴＮＦα（０．１、１、１０ｎｇ）をウェルＨ９、Ｈ１０、および
Ｈ１１に添加し、代表的には、５〜１０倍の活性化が観察される。
【０７０６】 （実施例１８：ＳＥＡＰ活性についてのアッセイ） 実施例１４〜１７に記載されるアッセイのためのレポーター分子として、ＳＥ
ＡＰ活性を、以下の一般的な手順に従ってＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉ
ｇｈｔ Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＰ−４００）を用いてアッセイする。Ｔｒｏｐ
ｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔは、以下で使用される希釈緩衝液、
アッセイ緩衝液、および反応緩衝液を供給する。
【０７０７】 ディスペンサーに２．５×希釈緩衝液を満たし、そして１５μｌの２．５×希
釈緩衝液を３５μｌの上清を含むオプティプレート（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）に分
与する。プラスチックシーラーでプレートをシールし、そして６５℃で３０分間
インキュベートする。一様でない加温を避けるためにオプティプレートを離して
おく。
【０７０８】 サンプルを室温まで１５分間冷却する。ディスペンサーを空にし、そしてアッ
セイ緩衝液で満たす。５０μｌのアッセイ緩衝液を添加し、そして室温で５分間
インキュベートする。ディスペンサーを空にし、そして反応緩衝液で満たす（以
下の表を参照のこと）。５０μｌの反応緩衝液を添加し、そして室温で２０分間
インキュベートする。化学発光シグナルの強度は時間依存的であり、そしてルミ
ノメーターで５つのプレートを読み取るために約１０分間を費やすので、各回で
５つのプレートを処理し、そして１０分後に２つ目のセットを開始するべきであ
る。
【０７０９】 ルミノメーターにおける相対的な光の単位（ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を読み取
る。ブランクとしてＨ１２をセットし、そして結果を印字する。化学発光の増加
は、レポーター活性を示す。
【０７１０】
【表２】 （実施例１９：低分子の濃度および膜透過性における変化を同定する高処理能
力スクリーニングアッセイ） レセプターへのリガンドの結合が、カルシウム、カリウム、ナトリウムのよう
な低分子およびｐＨの細胞内レベルを変化させ、ならびに膜電位を変化させるこ
とは公知である。これらの変化を特定細胞のレセプターに結合する上清の同定を
行うアッセイで測定し得る。以下のプロトコルは、カルシウムについてのアッセ
イを記載するが、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位、ま
たは蛍光プローブにより検出可能な任意の他の低分子における変化を検出するよ
うに容易に改変され得る。
【０７１１】 以下のアッセイは、蛍光定量画像化プレートリーダー（「ＦＬＩＰＲ」）を使
用して低分子と結合する蛍光分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）におけ
る変化を測定する。明らかに、低分子を検出する任意の蛍光分子が、本明細書で
用いられるカルシウム蛍光分子であるｆｌｕｏ−３の代わりに使用され得る。
【０７１２】 接着細胞については、細胞を１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルで、底
が清澄なＣｏ−ｓｔａｒ黒色９６ウェルプレートに播種する。プレートをＣＯ2
インキュベーター内で２０時間インキュベートする。接着細胞をＢｉｏｔｅｋ洗
浄器内で２００μｌのＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）で二回洗浄し、最後の
洗浄後、１００μｌの緩衝液を残す。
【０７１３】 １ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３のストック溶液を１０％プルロン酸（ｐｌｕｒｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）ＤＭＳＯ中に作製する。細胞にｆｌｕｏ−３を負荷するため
、１２μｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３（５０μｌ）を各ウェルに添加する。このプレ
ートをＣＯ2インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベートする。プレ
ートをＢｉｏｔｅｋ洗浄器で、ＨＢＳＳを用いて４回洗浄し、１００μｌの緩衝
液を残す。
【０７１４】 非接着細胞については、細胞を培養培地からスピンダウンする。細胞を、５０
ｍｌの円錐チューブ内でＨＢＳＳを用いて２〜５×１０6細胞／ｍｌに再懸濁す
る。細胞懸濁液１ｍｌにつき、１０％プルロン酸ＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｍｌのｆ
ｌｕｏ−３溶液４μｌを加える。次いで、チューブを３７℃の水浴中に３０〜６
０分間置く。細胞をＨＢＳＳで二回洗浄し、１×１０6細胞／ｍｌに再懸濁し、
そしてマイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分配する。プレートを１００
０ｒｐｍで５分間遠心分離する。次いで、プレートをＤｅｎｌｅｙ ＣｅｌｌＷ
ａｓｈ中で２００μｌで一回洗浄した後、吸引工程により最終容量を１００μｌ
にする。
【０７１５】 非細胞ベースのアッセイについては、各ウェルは、ｆｌｕｏ−３のような蛍光
分子を含有する。上清をウェルに添加し、そして蛍光変化を検出する。
【０７１６】 細胞内カルシウムの蛍光を測定するため、ＦＬＩＰＲを以下のパラメーターに
ついて設定する：（１）システムゲインは、３００〜８００ｍＷ；（２）曝露時
間は、０．４秒間；（３）カメラＦ／ストップは、Ｆ／２；（４）励起は４８８
ｎｍ；（５）放射は５３０ｎｍ；および（６）サンプル添加は５０μｌ。５３０
ｎｍにおける放射の増加は、細胞内Ｃａ++濃度の増加を生じる、分子（Ｄ−ＳＬ
ＡＭまたはＤ−ＳＬＡＭによって誘導される分子のいずれか）によって生じる細
胞外シグナル伝達事象を示す。 （実施例２０：チロシンキナーゼ活性を同定する高処理能力スクリーニングアッ
セイ） プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、多様な群の膜貫通キナーゼおよび
細胞質キナーゼを表す。レセプタープロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）群
内に、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦおよびインスリンレセプター
サブファミリーを含む、一定の範囲のマイトジェン因子および代謝性増殖因子の
レセプターがある。さらに、対応するリガンドが未知である大きなＲＰＴＫファ
ミリーが存在する。ＲＰＴＫのリガンドは、主として分泌される低分子量タンパ
ク質を含むが、膜結合型および細胞外マトリックスタンパク質も含む。
【０７１７】 リガンドによるＲＰＴＫの活性化は、リガンド媒介レセプター二量体化に関与
し、レセプターサブユニットのリン酸基転移および細胞質チロシンキナーゼの活
性化を生じる。細胞質チロシンキナーゼとしては、ｓｒｃファミリー（例えば、
ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）のレセプター関連チロシンキナーゼ
、ならびにＪａｋファミリーのような非レセプター結合型および細胞質ゾルプロ
テインチロシンキナーゼが挙げられる。これらのメンバーは、サイトカインスー
パーファミリー（例えば、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ
およびレプチン）のレセプターによって誘発されるシグナル伝達を媒介する。
【０７１８】 チロシンキナーゼ活性を刺激し得る公知の因子は広範であるため、Ｄ−ＳＬＡ
ＭまたはＤ−ＳＬＡＭによって誘導される分子が、チロシンキナーゼシグナル伝
達経路を活性化し得るか否かの同定は興味深い。従って、以下のプロトコルを設
計して、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化し得るそのような分子を同
定する。
【０７１９】 標的細胞（例えば、初代ケラチノサイト）を約２５，０００細胞／ウェルの密
度で、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入した９６
ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅに播種す
る。プレートを１００％エタノールで２回、３０分間リンスして滅菌し、水でリ
ンスし、そして一晩乾燥させる。いくつかのプレートを、１００ｍｌの細胞培養
グレードＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）またはポリリジ
ン（５０ｍｇ／ｍｌ）（これらは全て、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る）で、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した１０％マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇ
ｅｌ）、あるいは仔ウシ血清で２時間コーティングし、ＰＢＳでリンスし、そし
て４℃で保存する。増殖培地に５，０００細胞／ウェルを播種し、製造業者のＡ
ｌａｍａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ
）が記載するように、ａｌａｍａｒＢｌｕｅを使用して４８時間後に細胞数を間
接的に定量することにより、これらのプレート上の細胞増殖をアッセイする。Ｂ
ｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＦａｌｃｏｎプレ
ートカバー＃３０７１を使用し、Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅ
ｅｎ Ｐｌａｔｅを被覆する。Ｆａｌｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ ＩＩＩ細胞
培養プレートはまた、いくつかの増殖実験において使用され得る。
【０７２０】 抽出物を調製するため、Ａ４３１細胞をＬｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイロ
ン膜上に播種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、そして完全培地内で一
晩培養する。細胞を無血清基本培地中で２４時間インキュベートして静止させる
。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）または実施例１２で生成した上清５０μｌで５〜２
０分間処理した後、培地を除去し、１００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０
．１％ＳＤＳ、２ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、２ｍＭ Ｎａ4Ｐ2Ｏ7およびＢｏｅｈｅｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手し
たプロテアーゼインヒビターの混合物（＃１８３６１７０））を各ウェルに添加
し、そしてプレートを回転振盪器上にて４℃で５分間振盪する。次いで、プレー
トを真空トランスファーマニホルド（ｖａｃｕｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍａｎ
ｉｆｏｌｄ）に置き、そしてハウスバキュームを使用して抽出物を各ウェルの底
の０．４５ｍｍ膜を通して濾過する。抽出物をバキュームマニホルドの底の９６
ウェル捕獲／アッセイプレートに回収し、そして直ちに氷上に置く。遠心分離に
より明澄化した抽出物を得るため、界面活性剤で５分間可溶化した後、各ウェル
の含有物を取り出し、そして４℃、１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。
【０７２１】 濾過抽出物をチロシンキナーゼ活性のレベルについて試験する。チロシンキナ
ーゼ活性を検出する多数の方法が公知であるが、本明細書においては１つの方法
を記載する。
【０７２２】 一般的に、特定の基質（ビオチン化ペプチド）上のチロシン残基をリン酸化す
る能力を決定することにより、上清のチロシンキナーゼ活性を評価する。この目
的に使用され得るビオチン化ペプチドとしては、ＰＳＫ１（細胞分裂キナーゼｃ
ｄｃ２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に対応）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミ
ノ酸１〜１７に対応）が挙げられる。両ペプチドは、一連のチロシンキナーゼの
基質であり、そしてＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能であ
る。
【０７２３】 以下の成分を順に添加することにより、チロシンキナーゼ反応を設定する。ま
ず、５μＭビオチン化ペプチド１０μｌを添加し、次いでＡＴＰ／Ｍｇ2+（５ｍ
Ｍ ＡＴＰ／５０ｍＭ ＭｇＣｌ2）１０μｌ、次いで５×アッセイ緩衝液（４
０ｍＭ塩酸イミダゾール、ｐＨ７．３、４０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍ
Ｍ ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．５ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ）１０μｌ、次いでバナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）５μｌ、最後に水
５μｌを加える。成分を穏やかに混合し、そして反応混合物を３０℃で２分間プ
レインキュベートする。コントロール酵素または濾過上清１０μｌを加えること
によって反応を開始させる。
【０７２４】 次いで、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ１０μｌを添加して反応物を氷上に置くことに
より、チロシンキナーゼアッセイ反応を停止させる。
【０７２５】 反応混合物の５０μｌのアリコートをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モ
ジュールに移し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、チロシンキ
ナーゼ活性を決定する。これにより、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａ
ｄｉｎ）コーティング９６ウェルプレートをビオチン化ペプチドと会合させる。
ＭＴＰモジュールを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、西洋ワ
サビペルオキシダーゼに結合した抗ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｏｔｙｒｏｓｉ
ｎｅ）抗体（抗Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））７５μｌを、各ウェル
に添加し、そして３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記のように洗
浄する。
【０７２６】 次に、ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）１００μｌを加え、室温で少なくとも５分間（最長３０分間）インキュベート
する。ＥＬＩＳＡリーダーを使用することにより、４０５ｎｍでのサンプルの吸
光度を測定する。結合したペルオキシダーゼ活性のレベルを、ＥＬＩＳＡリーダ
ーを使用して定量し、これはチロシンキナーゼ活性のレベルを反映する。
【０７２７】 （実施例２１：リン酸化活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 実施例２０に記載のプロテインチロシンキナーゼ活性のアッセイに可能性のあ
る代替物および／または補完物（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）として、主要な細胞内
シグナル伝達中間体の活性化（リン酸化）を検出するアッセイもまた使用し得る
。例えば、下記のように、一つの特定のアッセイは、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−
２キナーゼのチロシンリン酸化を検出し得る。しかし、Ｒａｆ、ＪＮＫ、ｐ３８
ＭＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ、筋肉
特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＩＲＡＫ、ＴｅｃおよびＪａｎｕｓのような他の
分子、ならびに他の任意のホスホセリン、ホスホチロシンまたはホスホトレオニ
ン分子のリン酸化を、以下のアッセイにおいてこれらの分子をＥｒｋ−１または
Ｅｒｋ−２について置換することにより検出し得る。
【０７２８】 詳細には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルをプロテインＧ（１μｇ／
ｍｌ）０．１ｍｌにより室温（ＲＴ）で２時間コーティングしてアッセイプレー
トを作製する。次いでプレートをＰＢＳでリンスし、そして３％ＢＳＡ／ＰＢＳ
によりＲＴで１時間ブロックする。次いでプロテインＧプレートをＥｒｋ−１お
よびＥｒｋ−２に対する２つの市販のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル
）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理（ＲＴで１時
間）する。（他の分子を検出するために、上記の任意の分子を検出するモノクロ
ーナル抗体を置換することにより、この工程を容易に改変し得る）。ＰＢＳで３
〜５回リンスした後、使用時まで、プレートを４℃で保存する。
【０７２９】 Ａ４３１細胞を２０，０００／ウェルで９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィル
タープレートに播種し、そして増殖培地中で一晩培養する。次いで、細胞を基本
培地（ＤＭＥＭ）中で４８時間飢餓させた後、次いでＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）
または実施例１２で得た上清５０μｌで５〜２０分間処理する。次いで、細胞を
可溶化し、そして抽出物をアッセイプレート内に直接濾過する。
【０７３０】 抽出物を用いてＲＴで１時間インキュベートした後、ウェルを再度リンスする
。陽性コントロールとして、市販のＭＡＰキナーゼ調製物（１０ｎｇ／ウェル）
をＡ４３１抽出物の代わりに使用する。次いで、プレートを、Ｅｒｋ−１および
Ｅｒｋ−２キナーゼのリン酸化エピトープを特異的に認識する市販のポリクロー
ナル（ウサギ）抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理する（ＲＴで１時間）。この抗体を
標準的な手順によりビオチン化する。次いで、結合したポリクローナル抗体をＷ
ａｌｌａｃ ＤＥＬＦＩＡ装置内でユーロピウムストレプトアビジンおよびユー
ロピウム蛍光増強剤と共に連続的にインキュベートする（時間分解性蛍光）こと
によって定量する。バックグラウンドを超える蛍光シグナルの増加は、Ｄ−ＳＬ
ＡＭまたはＤ−ＳＬＡＭによって誘導される分子によるリン酸化を示す。
【０７３１】 （実施例２２：Ｄ−ＳＬＡＭ遺伝子における変化の決定方法） 目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者から単離
されるＲＮＡを単離する。次いでｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分
野で公知のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。
次いでこのｃＤＮＡを、配列番号１における目的の領域を取り囲むプライマーを
用いるＰＣＲのテンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄ
ｒａｎｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）に記載の
緩衝溶液を使用し、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；およ
び７０℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルからなる。
【０７３２】 次いで、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐ
ｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、５’末端にＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。Ｄ−ＳＬＡ
Ｍの選択したエキソンのイントロン−エキソン境界をまた決定し、そしてゲノム
ＰＣＲ産物を分析してその結果を確認する。次いでＤ−ＳＬＡＭについて疑わし
い変異を有するＰＣＲ産物をクローン化および配列決定し、直接配列決定の結果
を確認する。
【０７３３】 Ｄ−ＳＬＡＭのＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎ，Ｔ．Ａ．およびＧｒａｈａｍ，
Ｍ．Ｗ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１１５６（
１９９１）に記載のようにＴテール（Ｔ−ｔａｉｌｅｄ）ベクターにクローン化
し、そしてＴ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ）で配列決定する。罹患個体を、非罹患個体には存在しないＤ−ＳＬＡＭ
における変異により同定する。
【０７３４】 ゲノム再配置もまた、Ｄ−ＳＬＡＭ遺伝子における改変を決定する方法として
観察する。実施例２に従って単離したゲノムクローンを、ジゴキシゲニンデオキ
シ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を用い
てニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃｇ．ら、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３５：７３−９９（１９９１）に記載のようにＦ
ＩＳＨを行う。Ｄ−ＳＬＡＭのゲノムの遺伝子座への特異的ハイブリダイゼーシ
ョンのために、大過剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて標識プローブとのハイ
ブリダイゼーションを行う。
【０７３５】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ｐｈｅｎｙｌｉｄｏ
ｌｅ）およびヨウ化プロピジウムで対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組合
せを生成する。正確なマッピングのための整列イメージを、三重バンドフィルタ
ーセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，Ｖ
Ｔ）と冷却電荷結合素子カメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａ
Ｚ）および可変励起波長フィルター（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃｖ．ら、Ｇｅｎｅｔ．
Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８：７５（１９９１））とを組合せて用いて
得る。ＩＳｅｅ Ｇｒａｐｈｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎ
ｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ．）を使用して
、画像収集、分析および染色体部分長測定を行う。Ｄ−ＳＬＡＭ（プローブによ
りハイブリダイズされた）のゲノム領域の染色体変化を、挿入、欠失および転座
として同定する。これらＤ−ＳＬＡＭの変化を関連疾患の診断マーカーとして使
用する。
【０７３６】 （実施例２３：生物学的サンプル中のＤ−ＳＬＡＭの異常レベルを検出する方
法） Ｄ−ＳＬＡＭのポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてＤ−
ＳＬＡＭレベルの上昇または低下が検出される場合、このポリペプチドは、特定
表現型のマーカーである。検出方法は数多くあり、従って当業者は以下のアッセ
イをそれらの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解される。
【０７３７】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、サンプル中、好ましくは、生
物学的サンプル中のＤ−ＳＬＡＭを検出する。マイクロタイタープレートのウェ
ルを、Ｄ−ＳＬＡＭに対する特異的抗体を最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌでコ
ーティングする。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれか
であって、実施例１１に記載の方法により産生される。ウェルに対するＤ−ＳＬ
ＡＭの非特異的結合が減少するように、このウェルをブロックする。
【０７３８】 次に、コーティングしたウェルを、Ｄ−ＳＬＡＭ含有サンプルと共にＲＴで２
時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系列希釈を使用して
結果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水で三回洗浄
し、結合していないＤ−ＳＬＡＭを除去する。
【０７３９】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イオン水
または蒸留水で三回洗浄し、結合していないの結合体を除去する。
【０７４０】 ４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートする。反応物をマイクロタイタープレートリーダーにより測定する。コ
ントロールサンプルの系列希釈を使用して検量線を作成し、そしてＸ軸（対数ス
ケール）にＤ−ＳＬＡＭポリペプチド濃度を、そしてＹ軸（直線スケール）に蛍
光または吸光度をプロットする。検量線を用いてサンプル中のＤ−ＳＬＡＭ濃度
を補間する。
【０７４１】 （実施例２４：ポリペプチドの処方） Ｄ−ＳＬＡＭ組成物を、個々の患者の臨床状態（特に、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプ
チド単独処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の
他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的
とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される。
【０７４２】 一般的提案として、用量当り、非経口的に投与されるＤ−ＳＬＡＭの合計薬学
的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあ
るが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、このホ
ルモンについて、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好まし
くはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である
。連続投与する場合、代表的には、Ｄ−ＳＬＡＭを約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５
０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（
例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液も
また使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置
後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。
【０７４３】 本発明の組成物の、投与されるべき有効量は、当業者に周知である手順を介し
て決定され得、この手順は、生物学的半減期、生物学的利用能、および毒性のよ
うなパラメータに向けられる。このような決定は、特に本明細書中で提供される
詳細な開示を鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０７４４】 治療の間のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドに対する生物体の生体曝露はまた、治療
的有効量養成法および／または薬学的有効量養成法を決定することにおいて重要
な役割を果たし得る。比較的長期間での、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの比較的低
用量の反復投与のような種々の投薬は、比較的短期間でＤ−ＳＬＡＭの比較的高
用量の反復投与を用いて達成された用量と、治療的および／または薬学的に識別
可能な効果を有する。
【０７４５】 Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ，Ｅ．Ｊ．ら、（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐ
ｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５０（４）：２１９−４４（１９６６））によって供給さ
れる等表面積用量転換係数（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ
ｄｏｓａｇｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）は、所与の実験系にお
けるＤ−ＳＬＡＭの使用により得られるデータを、別の実験系において１用量あ
たり投与されるＤ−ＳＬＡＭポリペプチドの正確な推定値の薬学的有効量に都合
良く転換し得る。Ｄ−ＳＬＡＭの投与を介して得られた実験データは、ラット、
サル、イヌ、およびヒトにおけるＤ−ＳＬＡＭの薬学的有効量を正確に見積るた
めに、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈらによって供給される転換係数を介して転換され得る
。以下の転換表（表ＩＩＩ）はＦｒｅｉｒｅｉｃｈらにより提供されたデータの
概要である。表ＩＩＩは、１つの種の、ｍｇ／ｋｇにより表現される用量を、表
にした別の種において、ｍｇ／ｋｇとして表現される等表面積用量へ転換するた
めにおよその係数を所与する。
【０７４６】
【表３】 従って、例えば、表ＩＩＩに示される転換係数を用いて、マウスにおける５０
ｍｇ／ｋｇの用量は、（５０ｍｇ／ｋｇ）×（１／４）＝１２．５ｍｇ／ｋｇに
より、サルにおいて適切な用量の１２．５ｍｇ／ｋｇへ転換される。さらなる例
として、マウスにおける０．０２、０．０８、０．８、２および８ｍｇ／ｋｇの
用量は、ヒトにおいて、それぞれ１．６６７μｇ／ｋｇ、６．６７μｇ／ｋｇ、
６６．７μｇ／ｋｇ、１６６．７μｇ／ｋｇおよび０．６６７ｍｇ／ｋｇの有効
量に等しい。
【０７４７】 Ｄ−ＳＬＡＭを含む薬学的組成物を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎ
ｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点
滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーと
して投与する。１つの実施形態では、「薬学的に受容可能なキャリア」とは、任
意の型の非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または製剤
補助剤を意味する。特定の実施形態において、「薬学的に受容可能」とは、合衆
国もしくは州政府の管理機関により認可されている、または米国薬局方において
もしくは動物、およびさらに好適にはヒトにおいて使用するために一般的に認識
されている他の薬局方において収載されていることを意味する。本実施形態に従
う適切な薬学的キャリアの非限定な例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍ
ｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」により
提供され、そして水および油のような、石油、動物、野菜、または合成起源（例
えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ごま油など）の油を含む、無菌（ｓｔｅ
ｒｉｌｅ）液を含む。薬学的組成物を静脈内に投与する場合、水が好ましいキャ
リアである。生理食塩水および水溶性ブドウ糖ならびにグリセロール溶液を、液
体キャリアとして、特に注入溶液のために使用し得る。所望される場合、この組
成物はまた、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これ
らの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、徐放性処
方などの形態を取り得る。
【０７４８】 本明細書中で使用される用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸
骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０７４９】 好ましい実施形態では、本発明のＤ−ＳＬＡＭ組成物（ポリペプチド、ポリヌ
クレオチドおよび抗体、ならびにそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニ
ストを含む）は、皮下的に投与される。
【０７５０】 別の好ましい実施形態では、本発明のＤ−ＳＬＡＭ組成物（ポリペプチド、ポ
リヌクレオチドおよび抗体、ならびにそれらのアゴニストおよび／またはアンタ
ゴニストを含む）は、静脈的に投与される。
【０７５１】 本発明のＤ−ＳＬＡＭ組成物はまた、徐放性システムにより適切に投与される
。徐放性組成物の適切な例としては、適切なポリマー性材料（例えば、成形品（
例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態にある、半透過性ポリマーマ
トリックスなど）、適切な疎水性材料（例えば、受容可能な油中のエマルジョン
）、またはイオン交換樹脂、および時折可溶性の誘導体（例えば、時折可溶性の
塩など）が挙げられる。
【０７５２】 徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９
号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメー
トのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ， Ｕ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５
４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（
Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−
２７７（１９８１）、およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９
８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、
前出）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が
挙げられる。
【０７５３】 徐放性組成物はまた、リポソームに封入された本発明の組成物を包含する（一
般的に、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９
０）；Ｔｒｅａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏ
ｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ、Ｌｏｐｅ
ｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（編）、Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ、３１７−３２７頁、および３５３−３６５頁（１９８９）を参照のこと
）。Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドを含有するリポソームは、それ自体が公知である
方法により調製され得る：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８
５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：
４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ
８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８
３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，
５４５号ならびにＥＰ特許第１０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（
約２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モ
ル％コレステロールよりも多く、選択された割合が、最適Ｄ−ＳＬＡＭポリペプ
チド治療のために調整される。
【０７５４】 別の実施形態では、本発明の徐放性組成物は、当該分野において公知の結晶処
方物を含む。
【０７５５】 さらに別の実施形態において、本発明の組成物はポンプによって送達される（
Ｌａｎｇｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍ
ｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒ
ｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．
３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
【０７５６】 他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０７５７】 非経口投与のために、１つの実施形態において、一般に、Ｄ−ＳＬＡＭは、そ
れを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量
および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合す
るものと、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合す
ることにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、および
ポリペプチドに対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【０７５８】 一般に、Ｄ−ＳＬＡＭを液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはそ
の両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、
生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア
、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャ
リアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロー
ス溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒク
ルもまた、リポソームと同様に本発明において有用である。
【０７５９】 キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩
、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸の
ような抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポ
リアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロ
ブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グ
リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セ
ルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、
単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニト
ールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；
および／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン
性界面活性剤が挙げられる。
【０７６０】 Ｄ−ＳＬＡＭは、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好まし
くは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に
処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することによ
り、ポリペプチド塩が形成されることが理解される。
【０７６１】 治療的投与に用いられるＤ−ＳＬＡＭは無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例
えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成さ
れる。一般に、治療用ポリペプチド組成物は、滅菌アクセスポートを有する容器
、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたは
バイアルに配置される。
【０７６２】 Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドは、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、
密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物
として保存される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾
過した１％（ｗ／ｖ）Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチド水溶液５ｍｌを充填し、そして
得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥したＤ−ＳＬＡＭポリペプチドを注射
用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。
【０７６３】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を満たした一つ以上の
容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品
の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような
容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関
する政府機関による承認を表す。さらに、Ｄ−ＳＬＡＭを他の治療用化合物と組
合せて使用し得る。
【０７６４】 本発明の組成物は、単独で投与されても、または他の治療剤と組合せて投与さ
れてもよい。本発明の組成物と組合せて投与され得る治療剤としては、以下が挙
げられるが、これらに限定されない：ＴＮＦファミリーのメンバー（例えば、Ｎ
ｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αおよび／またはＮｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αＳＶ（国際出
願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／１７９５７）またはそれらのアンタゴニスト）、化学
療法剤、抗生物質、ステロイド性および非ステロイド性の抗炎症剤、従来の免疫
療法剤、サイトカインおよび／または増殖因子。組合せは、共存して（ｃｏｎｃ
ｏｍｉｔａｎｔｌｙ）（例えば、混合物として）、別々であるが同時（ｓｉｍｕ
ｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）もしくは同時発生的（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）；ま
たは、逐次的のいずれかで投与され得る。これは、組合せられた薬剤が、治療的
混合物として一緒に投与されるという提示、そしてまた、組合せられた薬剤が、
別々であるが同時に、例えば、同一個体に別個の静脈内ラインを通してのように
、投与されるという手順を包含する。「組合せにおける」投与はさらに、最初に
与えられた化合物または薬剤の１つ、次いで２番目、という別々の投与を包含す
る。
【０７６５】 別の特定の実形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TM と組合せて使用され、それらと関連する、感染および／または任意の疾患、障害
、および／または状態を処置、予防、および／または診断する。１つの実施形態
において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMと組み合わされて使
用され、それらと関連する、任意のグラム陽性細菌感染および／または任意の疾
患、障害、および／または状態を、処置、予防、そして／または診断する。別の
実施形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMと組み合わ
されて使用され、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属および／またはＳｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ属の１つ以上のメンバーと関連する、感染および／または任意の疾患
、障害、および／または状態を、処置、予防、および／または診断する。別の実
施形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMと任意に組み
合わされて使用され、Ｂ群連鎖球菌の一つ以上のメンバーと関連する感染および
／または任意の疾患、障害、および／または状態を、処置、予防、および／また
は診断する。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−
２３TMと組み合わされて使用され、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅと関連する、感染および／または任意の疾患、障害、および／または状
態を、処置、予防、および／または診断する。
【０７６６】 本発明の組成物は、単独または他の治療剤（化学療法剤、抗生物質、抗ウイル
ス薬剤、ステロイド性および非ステロイド性の抗炎症剤、従来の免疫治療剤なら
びにサイトカイン）と組合せて投与され得る。組合せは、共存して（ｃｏｎｃｏ
ｍｉｔａｎｔｌｙ）（例えば、混合物として）、別々であるが同時（ｓｉｍｕｌ
ｔａｎｅｏｕｓｌｙ）もしくは同時発生的（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）；また
は、逐次的のいずれかで投与され得る。これは、組合せられた薬剤が、治療的混
合物として一緒に投与されるという提示、そしてまた、組合せられた薬剤が、別
々であるが同時に、例えば、同一個体に別個の静脈内ラインを通してのように、
投与されるという手順を包含する。「組合せにおける」投与はさらに、最初に与
えられた化合物または薬剤の１つ、次いで２番目、という別々の投与を包含する
。
【０７６７】 特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞のコアクチベーターのア
ンタゴニスト（例えば、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン
−αＳＶ（国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／１７９５７）、ＢＬｙＳ、ＢＡＦＦ
、ＴＡＬＬ−１、ＴＨＡＮＫおよび／またはｚＴＮＦ４）と組み合わせて投与さ
れる。さらなる実施形態において、アンタゴニストとしては、ニュートロカイン
−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶレセプター、ＢＬｙＳレセプター
、ＢＡＦＦレセプター、ＴＡＬＬ−１レセプター、ＴＨＡＮＫレセプター、ＴＡ
ＣＩおよび／またはＢＣＭＡに対する抗体ならびに／あるいはこれらの可溶性細
胞外部分に対する抗体が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０７６８】 １つの実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦファミリーの他のメンバ
ーと組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得るＴＮＦ分子
、ＴＮＦ関連分子、またはＴＮＦ様分子としては、以下が挙げられるが、これら
に限定されない：可溶性形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α、（ＬＴ−α、
ＴＮＦ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマーＬＴ−α２−βの状
態で見出された）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ
、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／
１４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、エンドカイ
ン（ｅｎｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ニュート
ロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ（国際出願番号ＰＣＴ／
ＵＳ９６／１７９５７）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＯＰ
Ｇ、ＯＸ４０、および神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ、
可溶性形態のＣＤ３０、可溶性形態のＣＤ２７、可溶性形態のＣＤ４０および可
溶性形態の４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３
（国際公開番号ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２
８５６）、ＴＲ５（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番
号ＷＯ９８／３０６９４）、ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、Ｔ
ＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開
番号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２
）、およびＴＲ１２、ならびに可溶性形態のＣＤ１５４、可溶性形態のＣＤ７０
、および可溶性形態のＣＤ１５３。
【０７６９】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０
Ｌ）、可溶性形態のＣＤ４０Ｌ（例えば、ＡＶＲＥＮＤTM）、ＣＤ４０Ｌの生物
学的に活性なフラグメント、改変体または誘導体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（例えば、
アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体）、および／または抗ＣＤ４０抗体（
例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体）とともに投与される。
【０７７０】 別の実施形態において、本発明の組成物は、抗凝固剤と組み合わせて投与され
る。本発明の組成物とともに投与され得る抗凝固剤としては、ヘパリン、ワルフ
ァリンおよびアスピリンが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形
態において、本発明の組成物は、ヘパリンおよび／またはワルファリンと組み合
わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ワルファ
リンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物
は、ワルファリンおよびアスピリンと組み合わせて投与される。別の特定の実施
形態において、本発明の組成物は、ヘパリンと組み合わせて投与される。別の特
定の実施形態において、本発明の組成物は、ヘパリンおよびアスピリンと組み合
わせて投与される。
【０７７１】 別の実施形態において、本発明の組成物は、抗カルジオリピン抗体の産生を抑
制する薬剤と組み合わせて投与される。特定の実施形態において、本発明のポリ
ヌクレオチドは、リン脂質結合血漿タンパク質β２−糖タンパク質Ｉ（ｂ２ＧＰ
Ｉ）に結合する抗カルジオリピン抗体の能力をブロックおよび／または減少する
薬剤と組み合わせて投与される。
【０７７２】 特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレ
オシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤および／またはプロ
テアーゼインヒビターと組み合わせて投与される。本発明の組成物と組み合わせ
て投与され得るヌクレオシド逆転写酵素阻害剤としては、以下が挙げられるが、
これらに限定されない：ＲＥＴＲＯＶＩＲTM（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥ
ＺTM（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤTM（ザルシタビン／ｄｄＣ）、ＺＥＲ
ＩＴTM（スタブジン／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲTM（ラミブジン／３ＴＣ）、およ
びＣＯＭＢＩＶＩＲTM（ジドブジン／ラミブジン）。本発明の組成物と組み合わ
せて投与され得る非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤としては、以下が挙げられる
が、これらに限定されない：ＶＩＲＡＭＵＮＥTM（ネビラピン）、ＲＥＳＣＲＩ
ＰＴＯＲTM（デラビルジン）、およびＳＵＳＴＩＶＡTM（エファビレンツ）。本
発明の組成物と組み合わせて投与され得るプロテアーゼインヒビターとしては、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＲＩＸＩＶＡＮTM（インディナ
ビル）、ＮＯＲＶＩＲTM（リトナビル）、ＩＮＶＩＲＡＳＥTM（サキナビル）、
およびＶＩＲＡＣＥＰＴTM（ネルフィナビル）。特定の実施形態において、抗レ
トロウイルス薬剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素
阻害剤、および／またはプロテアーゼインヒビターは、ＡＩＤＳを処置、予防お
よび／または診断するため、ならびに／あるいは、ＨＩＶ感染を処置、予防およ
び／または診断するために、本発明の組成物との任意の組み合わせで使用され得
る。
【０７７３】 他の実施形態において、本発明の組成物は、抗日和見感染症薬剤と組み合わせ
て投与され得る。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗日和見感染症薬
剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＴＲＩＭＥＴＨＯＰ
ＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡ
ＭＩＤＩＮＥTM、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTM、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡＭ
ＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬTM、ＲＩＦＡＢ
ＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、ＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、
ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、ＣＩＤＯＦＯＶＩＲTM、Ｆ
ＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯ
ＬＥTM、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTM、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲTM、ＰＹＲＩＭＥＴＨ
ＡＭＩＮＥTM、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTM、ＮＥＵＰＯＧＥＮTM（フィルグラスチ
ム／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥＵＫＩＮＥTM（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａ
ｍｏｓｔｉｍ）／ＧＭ−ＣＳＦ）。特定の実施形態において、本発明の組成物は
、日和見Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に処置す
るため、予防するためおよび／または診断するために、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩ
Ｍ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡＭＩ
ＤＩＮＥTM、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTMとの任意の組み合わせで使
用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、日和見Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ複合感染を予防的に処置するため、予防するため
および／または診断するために、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡＭＰＩＮTM、
ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、および／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬTMとの任意
の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、
日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を予防的に
処置するため、予防するためおよび／または診断するために、ＲＩＦＡＢＵＴＩ
ＮTM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、および／またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣ
ＩＮTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発
明の組成物は、日和見サイトメガロウイルス感染を予防的に処置するため、予防
するためおよび／または診断するために、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣ
ＡＲＮＥＴTM、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲTMとの任意の組み合わせで使
用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、日和見真菌感染を
予防的に処置するため、予防するためおよび／または診断するために、ＦＬＵＣ
ＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、および／またはＫＥＴＯＣＯ
ＮＡＺＯＬＥTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態におい
て、本発明の組成物は、日和見単純ヘルペスウイルスＩ型および／またはＩＩ型
感染を予防的に処置するため、予防するためおよび／または診断するために、Ａ
ＣＹＣＬＯＶＩＲTMおよび／またはＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲTMとの任意の組み合
わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、日和見Ｔ
ｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ感染を予防的に処置するため、予防するため
および／または診断するために、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥTMおよび／または
ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形
態において、本発明の組成物は、日和見細菌感染を予防的に処置するため、予防
するためおよび／または診断するために、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMおよび／また
はＮＥＵＰＯＧＥＮTMとの任意の組み合わせで使用される。
【０７７４】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗ウイルス薬剤と組み合わせ
て投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗ウイルス薬剤としては、
アシクロビル、リバビリン、アマンタジン、およびレマンチジン（ｒｅｍａｎｔ
ｉｄｉｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７５】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗生物質と組合わせて投与さ
れる。本発明の組成物とともに投与され得る抗生物質としては、アモキシシリン
、アミノ配糖体、β−ラクタム（グリコペプチド）、β−ラクタマーゼ、クリン
ダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、
シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン類、マクロライド系
抗生物質、メトロニダゾル、ペニシリン、キノロン類、リファンピン、ストレプ
トマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリム、トリメトプ
リム−スルファメトキサゾール、およびバンコマイシンが挙げられるが、これら
に限定されない。
【０７７６】 本発明の組成物と組合わせて投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤としては
、ステロイド類、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミ
ドＩＶ、メチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、
１５−デオキシスペルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、お
よび応答Ｔ細胞の機能を抑制することによって作用する他の免疫抑制剤が挙げら
れるが、これらに限定されない。
【０７７７】 特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫抑制剤と組み合わせて投与
される。本発明の組成物と共に投与され得る免疫抑制剤調製物としては、ＯＲＴ
ＨＯＣＬＯＮＥTM（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥTM／ＮＥＯＲＡＬTM／Ｓ
ＡＮＧＤＹＡTM（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦTM（タクロリムス）、ＣＥ
ＬＬＣＥＰＴTM（ミコフェノール酸塩）、アザチオプリン、グルコルチコステロ
イド類（ｇｌｕｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、およびＲＡＰＡＭＵＮＥTM （シロリムス）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態におい
て、免疫抑制剤は、器官または骨髄の移植の拒絶を予防するために使用され得る
。
【０７７８】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ステロイド治療と組み合わせ
て投与される。本発明の組成物と組み合わせて投与され得るステロイドとしては
、経口コルチコステロイド、プレドニゾン、およびメチルプレドニゾン（例えば
、ＩＶメチルプレドニゾン）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実
施形態において、本発明の組成物は、プレドニゾンと組み合わせて投与される。
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、プレドニゾンおよび免疫抑制剤
と組み合わせて投与される。本発明の組成物およびプレドニゾンとともに投与さ
れ得る免疫抑制剤は、本明細書中に記載される免疫抑制剤であり、これらとして
は、アザチオプリン、シクロフォスファミド、およびシクロフォスファミドＩＶ
が挙げられるが、これらに限定されない。別の特定の実施形態において、本発明
の組成物は、メチルプレドニゾンと組み合わせて投与される。さらなる特定の実
施形態において、本発明の組成物は、メチルプレドニゾンおよび免疫抑制剤と組
み合わせて投与される。本発明の組成物およびメチルプレドニゾンとともに投与
され得る免疫抑制剤は、本明細書中に記載される免疫抑制剤であり、これらとし
ては、アザチオプリン、シクロフォスファミド、およびシクロフォスファミドＩ
Ｖが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７９】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア剤と組み合わせて
投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗マラリア剤としては、ヒド
ロキシクロロキン、クロロキンおよび／またはキナクリンが挙げられるが、これ
らに限定されない。
【０７８０】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ＮＳＡＩＤと組み合わせて投
与される。
【０７８１】 非限定的な実施形態において、本発明の組成物は、以下の薬物のうちの１つ、
２つ、３つ、４つ、５つ、１０またはそれ以上との組み合わせで投与される：Ｎ
ＲＤ−１０１（Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ）、ジクロフェ
ナク（Ｄｉｍｅｔｈａｉｄ）、オキサプロジンカリウム（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、
メカセルミン（ｍｅｃａｓｅｒｍｉｎ）（Ｃｈｉｒｏｎ）、Ｔ−６１４（Ｔｏｙ
ａｍａ）、ペントレキセド二ナトリウム（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ ｄｉｓｏｄｉ
ｕｍ）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、アトレロイコン（ａｔｒｅｌｅｕｔｏｎ）（Ａ
ｂｂｏｔｔ）、バルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）
、エルテナック（ｅｌｔｅｎａｃ）（Ｂｙｋ Ｇｕｌｄｅｎ）、カンパス（ｃａ
ｍｐａｔｈ）、ＡＧＭ−１４７０（Ｔａｋｅｄａ）、ＣＤＰ−５７１（Ｃｅｌｌ
ｔｅｃｈ Ｃｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＭ−１０１（ＣａｒｂｏＭｅｄ）、
ＭＬ−３０００（Ｍｅｒｃｋｌｅ）、ＣＢ−２４３１（ＫＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ
）、ＣＢＦ−ＢＳ２（ＫＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）、ＩＬ−１Ｒａ遺伝子治療（Ｖ
ａｌｅｎｔｉｓ）、ＪＴＥ−５２２ （Ｊａｐａｎ Ｔｏｂａｃｃｏ）、パクリ
タキセル（Ａｎｇｉｏｔｅｃｈ）、ＤＷ−１６６ＨＣ（Ｄｏｎｇ Ｗｈａ）、ダ
ルブフェロンメシレート（ｄａｒｂｕｆｅｌｏｎｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ）（Ｗａ
ｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）、可溶性ＴＮＦレセプター１（ｓｙｎｅｒｇｅｎ；
Ａｍｇｅｎ）、ＩＰＲ−６００１（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、トロケード（ｔｒｏｃａｄｅ）（Ｈ
ｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）、ＥＦ−５（Ｓｃｏｔｉａ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＩＩＬ−２８４（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈ
ｅｉｍ）、ＢＩＩＦ−１１４９（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）
、ＬｅｕｋｏＶａｘ（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｃｓ）、ＭＫ−６６３（Ｍｅｒｃｋ
）、ＳＴ−１４８２（Ｓｉｇｍａ−Ｔａｕ）、およびプロピオン酸ブチキソコー
ト（ｂｕｔｉｘｏｃｏｒｔ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＷａｒｎｅｒＬａｍｂｅ
ｒｔ）。
【０７８２】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、以下の薬物のうちの１つ、２
つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上との組み合わせで投与される：メトトレキ
サート、スルファサラジン、金チオリンゴ酸ナトリウム、オーラノフィン、シク
ロスポリン、ペニシラミン、アザチオプリン、抗マラリア薬（例えば、本明細書
中で記載のような）、シクロホスファミド、クロラムブシル、金、ＥＮＢＲＥＬ TM （Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、抗ＴＮＦ抗体、ＬＪＰ３９４（Ｌａ Ｊｏｌｌａ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ）、およびプレドニゾン。
【０７８３】 より好ましい実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア薬、メトトレ
キサート、抗ＴＮＦ抗体、ＥＮＢＲＥＬTMおよび／またはスルファサラジンと組
み合わせて投与される。１つの実施形態において、本発明の組成物は、メトトレ
キサートと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は
、抗ＴＮＦ抗体と組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組
成物は、メトトレキサートおよび抗ＴＮＦ抗体と組み合わせて投与される。別の
実施形態において、本発明の組成物は、スルファサラジンと組み合わせて投与さ
れる。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、メトトレキサート、抗
ＴＮＦ抗体およびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の実施形態に
おいて、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬTMと組み合わせて投与される。別の実
施形態において、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬTMおよびメトトレキサートと
組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＥＮＢＲ
ＥＬTM、メトトレキサートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与される。
他の実施形態において、１以上の抗マラリア剤が、上記の組み合わせのうちの１
つと組み合わせられる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリ
ア剤（例えば、ヒドロキシクロロキン）、ＥＮＢＲＥＬTM、メトトレキサートお
よびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において
、本発明の組成物は、抗マラリア剤（例えば、ヒドロキシクロロキン）、スルフ
ァサラジン、抗ＴＮＦ抗体およびメトトレキサートおよびと組み合わせて投与さ
れる。
【０７８４】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独でかまたは１以上の静脈
内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投
与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲTM、ＩＶＥＥＧ
ＡＭTM、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮTM、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ Ｓ／ＤTMおよび
ＧＡＭＩＭＵＮＥTMが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態に
おいて、本発明の組成物は、移植治療（例えば、骨髄移植）において静脈内免疫
グロブリン調製物と組み合わせて投与される。
【０７８５】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗生物質と組合わせて投与さ
れる。本発明の組成物とともに投与され得る抗生物質としては、テトラサイクリ
ン、メトロニダゾル、アモキシシリン、β−ラクタマーゼ、アミノ配糖体、マク
ロライド系抗生物質、キノロン類、フルオロキノロン類、セファロスポリン、エ
リスロマイシン、シプロフロキサシンおよびストレプトマイシンが挙げられるが
、これらに限定されない。
【０７８６】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独でかまたは抗炎症剤と組
み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗炎症剤としては
、グルココルチコイドおよび非ステロイド性抗炎症剤、アミノアリールカルボン
酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、ア
リールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類、ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、
チアジンカルボキサミド類、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチ
オニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉ
ｎｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾ
ール、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイ
ン、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール
、ピフオキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプが挙げられるが
、これらに限定されない。
【０７８７】 別の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与さ
れる。本発明の組成物とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導
体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチ
ノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば
、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インタ
ーフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）
、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルム
スチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホス
ファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイ
シン、ブスルファン、シス−プラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン
（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エ
チニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテス
トステロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン
、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファ
レン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メ
クロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイド類お
よび組み合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；ならびにその他（
例えば、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトー
テン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げら
れるが、これらに限定されない。
【０７８８】 特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＣＨＯＰ（シクロフォスファミ
ド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）と組み合わせて投
与されるか、ＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせで投与される。別の実施形態に
おいて、本発明の組成物は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与される。さ
らなる実施形態において、本発明の組成物は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰ
と共に、またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせと共
に投与される。
【０７８９】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、サイトカインと組み合わせて
投与される。本発明の組成物とともに投与され得るサイトカインとしては、ＧＭ
−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、Ｉ
Ｌ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−α
、、ＩＮＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βが挙げられるが、こ
れらに限定されない。別の実施形態において、本発明の組成物は、任意のインタ
ーロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−
５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ
−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ
−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１およびＩＬ−２２を含むが、これ
らに限定されない）と共に投与され得る。好ましい実施形態において、本発明の
組成物は、ＩＬ４およびＩＬ１０と組み合わせて投与される。ＩＬ４およびＩＬ
１０の両方は、Ｄ−ＳＬＡＭ媒介Ｂ細胞増殖を増強することが本発明者らによっ
て観察された。
【０７９０】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、ケモカインと組み合わせて投
与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、ケモカインβ−８、ケモ
カインβ−１、および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−４とともに投
与される。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ケモカインβ−８と
ともに投与される。
【０７９１】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、Ｉｌ−４アンタゴニストと組
み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得るＩＬ−４アンタゴ
ニストとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：可溶性ＩＬ−４
レセプターポリペプチド、可溶性ＩＬ−４レセプターポリペプチドのマルチマー
形態；ＩＬ−４によって誘発される生物学的シグナルを伝達を伴わずにＩＬ−４
レセプターを結合する、抗ＩＬ−４レセプター抗体、１以上のＩＬ−４レセプタ
ーへのＩＬ−４の結合をブロックする、抗ＩＬ４抗体、およびＩＬ−４レセプタ
ーを結合するがＩＬ−４によって誘発される生物学的シグナルを伝達しない、Ｉ
Ｌ−４のムテイン。好ましくは、この方法によって使用される抗体は、モノクロ
ーナル抗体（抗体フラグメント（例えば、本明細書中に記載される抗体フラグメ
ントのような）を含む）である。
【０７９２】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、造血増殖因子と組み合わせて
投与される。本発明の組成物とともに投与され得る造血増殖因子としては、ＬＥ
ＵＫＩＮＥTM（ＳＡＲＧＲＡＭＯＳＴＩＭTM）およびＮＥＵＰＯＧＥＮTM（ＦＩ
ＬＧＲＡＳＴＩＭTM）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７９３】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、脈管形成タンパク質と組み合
わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る脈管形成タンパク質と
しては、欧州特許番号ＥＰ−３９９８１６に開示されるようなグリオーム由来増
殖因子（ＧＤＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小
板由来増殖因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許番号ＥＰ−２８２３１７に開示さ
れるような血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号ＷＯ９２／０
６１９４号に開示されるような胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇ
ｏｒｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるよ
うな胎盤増殖因子２（ＰｌＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に
開示されるような血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−５０６４
７７に開示されるような血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号Ｗ
Ｏ９６／３９５１５号に開示されるような血管内皮増殖因子２（ＶＥＧＦ−２）
；血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−３）；国際公開番号ＷＯ９６／２６７３６号
に開示されるような血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際
公開番号ＷＯ９８／０２５４３号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥ
ＧＦ−Ｄ）；国際公開番号ＷＯ９８／０７８３２号に開示されるような血管内皮
増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびドイツ国特許番号ＤＥ１９６３９６０１に
開示されるような血管内皮増殖因子Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が挙げられるが、これら
に限定されない。上記の参考文献は、本明細書で参考として援用される。
【０７９４】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、線維芽細胞増殖因子と組み合
わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子と
しては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧ
Ｆ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、
ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられる
が、これらに限定されない。
【０７９５】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、他の治療レジメまたは予防レ
ジメ（例えば、放射線治療）と組み合わせて投与される。このような組み合わせ
の治療は、連続的におよび／または同時に投与され得る。
【０７９６】 （実施例２５：Ｄ−ＳＬＡＭのレベルの低下を処置する方法） 本発明は、身体におけるＤ−ＳＬＡＭ活性のレベルの低下を必要とする個体を
処置するための方法に関し、この方法は、そのような個体に治療学的有効量のＤ
−ＳＬＡＭアンタゴニストを含む組成物を投与する工程を包含する。本発明にお
ける使用のための好ましいアンタゴニストは、Ｄ−ＳＬＡＭ特異的抗体である。
【０７９７】 さらに、個体におけるＤ−ＳＬＡＭの標準または正常の発現レベルの低下によ
り引き起こされる状態は、Ｄ−ＳＬＡＭ（好ましくは分泌形態の）を投与するこ
とにより処置され得ることが理解される。従って、本発明はまた、Ｄ−ＳＬＡＭ
ポリペプチドのレベルの増加が必要な個体の処置方法を提供する。この方法は、
このような個体に、このような個体においてＤ−ＳＬＡＭの活性レベルを増加さ
せる量のＤ−ＳＬＡＭを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【０７９８】 例えば、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドのレベルが低下した患者は、このポリペプ
チドを、１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好ましくは
、このポリペプチドは分泌形態である。投与および処方に基づく投薬計画の正確
な詳細は、実施例２４に提供されている。
【０７９９】 （実施例２６：Ｄ−ＳＬＡＭのレベルの上昇を処置する方法） 本発明はまた、身体におけるＤ−ＳＬＡＭ活性のレベルの上昇を必要とする個
体を処置するための方法に関し、この方法は、そのような個体に治療学的有効量
のＤ−ＳＬＡＭまたはそのアゴニストを含む組成物を投与する工程を包含する。
【０８００】 アンチセンス技術を使用してＤ−ＳＬＡＭの産生を阻害する。この技術は、ガ
ンのような様々な病因に起因するＤ−ＳＬＡＭポリペプチド（好ましくは分泌形
態の）のレべルを低下させる方法の１つの例である。
【０８０１】 例えば、Ｄ−ＳＬＡＭのレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチ
センスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ
／ｋｇ／日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性があれば
、７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。このアンチセンスポリヌクレオ
チドの処方は、実施例２４に提供されている。
【０８０２】 （実施例２７：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドを発現し得る線維芽細
胞を患者に移植する方法である。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験者
から得られる。得られた組織を組織培養培地中に配置し、小片に分割する。組織
の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、ほぼ１０片を各フラスコに置く。
このフラスコを倒置し、しっかりと閉めた後、室温で一晩放置する。室温で２４
時間後、フラスコを反転させ、組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、そ
して新鮮培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを
含有するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次に、フラスコを３７℃で約１週間
インキュベートする。
【０８０３】 この時点で、新鮮培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間
培養した後に単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、さらに大
きなフラスコにスケールアップする。
【０８０４】 Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉ
ｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理
する。この線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用
して精製する。
【０８０５】 Ｄ−ＳＬＡＭをコードするｃＤＮＡを、実施例１に記載のそれぞれ５’および
３’末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得る。好ましくは、
５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位を含む。等量の、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線状骨格およびこの
増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を二つのフラグメントを連結するの
に適した条件下で維持する。次に、連結混合物を使用し、細菌ＨＢ１０１を形質
転換する。次に、それを、カナマイシンを含む寒天上にプレーティングし、ベク
ターが正確に挿入された目的のＤ−ＳＬＡＭを有することを確認する。
【０８０６】 アンフォトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、
１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤｕｌ
ｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな
密度まで増殖させる。次に、Ｄ−ＳＬＡＭ遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に
加え、パッケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パッケージン
グ細胞はＤ−ＳＬＡＭ遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、パ
ッケージング細胞をプロデューサー細胞という）。
【０８０７】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、次いで培地を１０ｃ
ｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地をミリポアーフィルターを通して濾過し、はがれたプ
ロデューサー細胞を除去した後、この培地を使用して、線維芽細胞を感染させる
。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そしてプロデ
ューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そして新鮮
培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽細胞が
感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまたはｈｉｓの
ような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必要であ
る。一旦、線維芽細胞が効率的に感染したなら、線維芽細胞を分析し、Ｄ−ＳＬ
ＡＭタンパク質が産生されているか否かを決定する。
【０８０８】 次に、この操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイク
ロキャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで宿主に移植す
る。
【０８０９】 （実施例２８：内因性Ｄ−ＳＬＡＭ遺伝子を使用する遺伝子治療） 本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、本発明の内因性Ｄ−ＳＬＡＭ配列を、
例えば、米国特許番号５，６４１，６７０（１９９７年６月２４日発行）；国際
公開番号ＷＯ ９６／２９４１１（１９９６年９月２６日公開）；国際公開番号
ＷＯ ９４／１２６５０（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２〜８９３５（１９８
９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８（１
９８９）に記載されるように、相同組換えを介してプロモーターに作動可能に結
合する工程を包含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが、その細胞中
では発現されないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝子の
活性化を包含する。
【０８１０】 プロモーターおよび標的化配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製する。こ
の標的化配列は、プロモーターに隣接する、内因性Ｄ−ＳＬＡＭの５’非コード
配列に相同である。この標的化配列は、Ｄ−ＳＬＡＭの５’末端に十分に近く、
その結果、このプロモーターは、相同組換えの際にこの内因性配列に作動可能に
連結される。このプロモーターおよび標的化配列を、ＰＣＲを使用して増幅し得
る。好ましくは、この増幅したプロモーターは、５’末端および３’末端に異な
る制限酵素部位を含む。好ましくは、この第１の標的化配列の３’末端は、増幅
したプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配
列の５’末端は、増幅したプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。
【０８１１】 この増幅したプロモーターおよび増幅した標的化配列を、適切な制限酵素で消
化し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消
化した標的化配列を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。得られた
混合物を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構
築物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノー
ル沈殿により精製する。
【０８１２】 この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーショ
ンを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチ
ド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス
配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）とともに投与され得る。送達のこのような方
法は、当該分野で公知である。
【０８１３】 一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが生じて、このプロモータ
ーがこの内因性Ｄ−ＳＬＡＭ配列に作動可能に連結される。これは、この細胞中
におけるＤ−ＳＬＡＭの発現を生じる。発現は、免疫学的染色または当該分野で
公知の他の任意の方法により、検出され得る。
【０８１４】 線維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋
１０％ウシ胎仔血清中に配置する。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を
、トリプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細
胞懸濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離
に供する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩
衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。この
細胞を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブミ
ン１ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終細
胞懸濁物は、約３×１０6細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再懸
濁直後に実施すべきである。
【０８１５】 プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、本発明のＤ−Ｓ
ＬＡＭ遺伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために、プラスミドｐ
ＵＣ１８（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化する。ＣＭＶプロモーターを、５’末端にＸｂａＩ部位および３’末
端にＢａｍＨＩ部位を備えてＰＣＲにより増幅する。２つのＤ−ＳＬＡＭ非コー
ド配列をＰＣＲを介して増幅する：一方のＤ−ＳＬＡＭ非コード配列（Ｄ−ＳＬ
ＡＭフラグメント１）を、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端にＸｂ
ａＩ部位を備えて増幅する；他方のＤ−ＳＬＡＭ非コード配列（Ｄ−ＳＬＡＭフ
ラグメント２）を、５’末端にＢａｍＨＩ部位および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ
部位を備えて増幅する。このＣＭＶプロモーターおよびＤ−ＳＬＡＭフラグメン
トを、適切な酵素（ＣＭＶプロモーター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；Ｄ−ＳＬ
ＡＭフラグメント１−ＸｂａＩ；Ｄ−ＳＬＡＭフラグメント２−ＢａｍＨＩ）で
消化し、そしてともに連結する。得られた連結生成物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し
、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する。
【０８１６】 プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０6細胞
を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を
、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ
、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生
存が減少するが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割
合が劇的に増加する。これらのパラメーターを与えると、パルス時間約１４〜２
０ｍＳｅｃが観察されるはずである。
【０８１７】 エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキ
ュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞
を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤ
ＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この
培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４
時間インキュベートする。
【０８１８】 次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで、宿主に注射する
。ここで、この繊維芽細胞は、タンパク質産物を産生する。次いで、この繊維芽
細胞は、上記のように患者に導入され得る。
【０８１９】 （実施例２９：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置、診断、検出、および／
または予防するためにインビボ遺伝子治療方法を使用することである。遺伝子治
療法は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの発現を増大または減少させるために、裸の
核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）Ｄ−ＳＬＡＭ
配列の動物への導入に関する。このＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、プロモー
ターまたは標的組織によるＤ−ＳＬＡＭポリペプチドの発現に必要な任意の他の
遺伝子エレメントに作動可能に連結され得る。このような遺伝子治療および送達
の技術および方法は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９２、
ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５，６９３，６２２号、同第５，７０５，１
５１号、同第５，５８０，８５９号；Ｔａｂａｔａ Ｈ．ら、（１９９７）Ｃａ
ｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−４７９，Ｃｈａｏ Ｊら、（
１９９７）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５（６）：５１７−５２２，Ｗｏｌ
ｆｆ Ｊ．Ａ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）
：３１４−３１８，Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｂ．ら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
．３（５）：４０５−４１１，Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ．ら、（１９９６）Ｃｉｒｃ
ｕｌａｔｉｏｎ ９４（１２）：３２８１−３２９０（本明細書中に参考として
援用される）を参照のこと。
【０８２０】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド構築物は、注射可能な物質を動物の細胞に送達
する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙
空間への注射）によって送達され得る。Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド構築物は
、薬学的に受容可能な液体または水性キャリア中で送達され得る。
【０８２１】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、またはＲＮＡは、細胞への侵入を補
助、促進または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドはまた、当業
者に周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅ
ｒ Ｐ．Ｌ．ら （１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２
６−１３９およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂら、（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ
８５（１）：１−７で教示されたもの）中で送達され得る。
【０８２２】 遺伝子治療方法において使用されたＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドベクター構
築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず複製を可能にする配列を含まな
い、構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、ＤＮＡの発現
を駆動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列
を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、細胞におけるポリヌクレオチド合成
の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、
６ヶ月までの間の期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された
。
【０８２３】 Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺
、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢
、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含す
る）の間隙空間に送達され得る。組織の間隙空間は、細胞間液、器官組織の細網
線維間のムコ多糖マトリクス、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織
のコラーゲン線維、あるいは筋肉細胞を囲む結合組織内の同じマトリクス（ｔｈ
ａｔ ｓａｍｅ ｍａｔｒｉｘ）または骨の裂孔中の結合組織内の同じマトリク
ス（ｔｈａｔ ｓａｍｅ ｍａｔｒｉｘ）を含む。これは、同様に、循環の血漿
およびリンパチャンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間
隙空間への送達は、以下に記載の理由のために好ましい。それらは、これらの細
胞を含む組織への注射によって、好都合に送達され得る。それらは、好ましくは
、分化した持続性の非分裂細胞に送達され、その細胞において発現されるが、送
達および発現は、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液
の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボ筋肉細胞は、
ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現する能力において、特に適格である。
【０８２４】 裸のＤ−ＳＬＡＭポリヌクレオチド注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効
投薬量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好
ましくは、投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そ
してより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろ
ん、当業者が認識するように、この投薬量は、注射の組織部位に従って変化する
。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そし
て処置される状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間
隙空間への非経口注射経路によってである。しかし、他の非経口経路もまた用い
られ得、これには、例えば、特に肺または気管支組織、咽喉または鼻の粘膜への
送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のＤ−ＳＬＡＭ
ポリヌクレオチド構築物が、血管形成術の間にこの手順において用いられるカテ
ーテルによって動脈に送達され得る。
【０８２５】 インビボでの筋肉における注入Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドの用量応答効果
を、以下のようにして決定する。Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドをコードするｍＲＮ
Ａの生成のための適切なＤ−ＳＬＡＭ鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法
論に従って調製する。鋳型ＤＮＡ（これは環状または直鎖状のいずれかであり得
る）を裸のＤＮＡとして使用するか、またはリポソームと複合体化するかのいず
れかである。次いで、マウスの四頭筋に、多様な量の鋳型ＤＮＡを注射する。
【０８２６】 ５〜６週齢の雌および雄Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％Ａｖｅ
ｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿前部で
行い、そして四頭筋を直接可視化する。Ｄ−ＳＬＡＭ鋳型ＤＮＡを、０．１ｍｌ
のキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわたって、
筋肉の遠位挿入部位から膝に約０．５ｃｍで、そして約０．２ｃｍの深さで注射
する。縫合を、将来的な位置決定のために注射部位の上で行い、そして皮膚をス
テンレス鋼クリップで閉じる。
【０８２７】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、Ｄ
−ＳＬＡＭタンパク質発現について組織化学的に染色する。Ｄ−ＳＬＡＭタンパ
ク質発現についての時間経過は、異なるマウスからの四頭筋を異なる時間で採取
すること以外は、同様な様式で行い得る。注射後の筋肉中のＤ−ＳＬＡＭ ＤＮ
Ａの持続性を、注射マウスおよびコントロールマウスからの全細胞性ＤＮＡおよ
びＨＩＲＴ上清を調製した後、サザンブロット分析によって決定し得る。マウス
における上記実験の結果は、裸のＤ−ＳＬＡＭ ＤＮＡを用いて、ヒトおよび他
の動物において適切な投薬量および他の処置パラメーターを推定するために使用
し得る。
【０８２８】 （実施例３０：Ｄ−ＳＬＡＭトランスジェニック動物） Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドはまた、トランスジェニック動物において発現され
得る。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ（ｍ
ｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば、ヒ
ヒ、サルおよびチンパンジー）を含むがこれらに限定されない任意の種の動物を
、トランスジェニック動物を作製するために用い得る。特定の実施形態において
、本明細書に記載されるかまたはさもなければ当該分野で公知の技術を、遺伝子
治療プロトコルの一部として、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発現のため
に用いる。
【０８２９】 当該分野で公知の任意の技術を、導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレ
オチド）の動物への導入に用いて、トランスジェニック動物の創始系統（ｆｏｕ
ｎｄｅｒ ｌｉｎｅ）を生成し得る。このような技術は、前核マイクロインジェ
クション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；お
よびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖系列
へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９８
５））、胚盤胞または胚へのレトロウイルス媒介遺伝子移入；胚幹細胞における
遺伝子ターゲッティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２
１（１９８９））；細胞または胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ、１９８３、
Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３））；遺伝子
銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を参照のこと）；胚多能性（ｐｌｅｕｒ
ｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞への核酸構築物の導入および胚盤胞へのこの幹細胞の再
移入；ならびに精子媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７：
７１７−７２３（１９８９））；などを含むがこれらに限定されない。このよう
な技術の総説については、本明細書中にその全体が参考として援用される、Ｇｏ
ｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃ
ｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９）を参照のこと。
【０８３０】 当該分野で公知の任意の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトラ
ンスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された、静止状態に誘導さ
れた胚細胞、胎児細胞または成体の細胞由来の核の除核した卵母細胞への核移入
（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌ
ｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）））。
【０８３１】 本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ）を提供する。導入遺伝子は、１つ
の導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−
尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子は
また、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定
の細胞型に選択的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異
的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれ
らは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染
色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子ターゲッティングが好ま
しい。
【０８３２】 手短に言えば、このような技術が、利用されるべきである場合、内在性遺伝子
に対して相同ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との
相同な組換えを介して内在性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌク
レオチド配列の機能を破壊することを目的として設計される。導入遺伝子はまた
、特定の細胞型に選択的に導入され得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、導入され
た細胞型においてのみ内在性遺伝子が不活化される。そのような細胞型特異的不
活化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは
当業者に明らかである。この段落にて引用される文献の各々の内容は、本明細書
中でその全体が参考として援用される。
【０８３３】 本願を通して開示されるＤ−ＳＬＡＭポリペプチドのいずれもを、トランスジ
ェニック動物を作製するために使用し得る。例えば、配列番号２のアミノ酸Ｍ１
〜Ｋ２３２をコードするＤＮＡを、挿入されたフラグメントを遍在的に発現する
プロモーター（例えば、アクチンプロモーター）を含むベクターに挿入し得る。
そのようなフラグメントを生成するために使用し得るプライマーは、太字で示さ
れるＢａｍＨＩ制限部位を含む５’プライマー：
【化２３】 および太字で示されるＸｂａＩ制限部位を含む３’プライマー：
【化２４】 を含む。この構築物は、遍在的発現のためのアクチンプロモーターの制御下でＤ
−ＳＬＡＭの推定細胞外ドメインを発現する。この構築物に含まれＤ−ＳＬＡＭ
の領域は、配列番号２のＭ１〜Ｋ２３に広がる。
【０８３４】 同様に、全長Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質をコードするＤＮＡもまた、以下のプラ
イマーを使用するベクターに挿入し得る。太字で示されるＢａｍＨＩ制限部位を
含む５’プライマー：
【０８３５】
【化２５】 および太字で示されるＸｂａＩ制限部位を含む３’プライマー：
【化２６】 。これら２つの例に加えて、Ｄ−ＳＬＡＭの他のフラグメントもまた、遍在的発
現を有するトランスジェニックを生成するためにベクターに挿入し得る。
【０８３６】 あるいは、本発明のポリヌクレオチドを、組織特異的プロモーターを介して組
織特異的発現を制御するベクターに挿入し得る。例えば、トランスフェリンプロ
モーターを有する構築物は、トランスジェニック動物の肝臓でＤ−ＳＬＡＭポリ
ペプチドを発現する。従って、配列番号２のアミノ酸Ｍ１〜Ｋ２３２をコードす
ＤＮＡを、太字で示されるＢａｍＨＩ制限部位を含む５’プライマー：
【０８３７】
【化２７】 および太字で示されるＸｂａＩ制限部位を含む３’プライマー：
【０８３８】
【化２８】 を使用して増幅し得る。
【０８３９】 同様に、全長Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質をコードするＤＮＡもまた、以下のプラ
イマーを使用して組織特異的発現のためにベクターに挿入し得る：太字で示され
るＢａｍＨＩ制限部位を含む５’プライマー：
【０８４０】
【化２９】 および太字で示されるＸｂａＩ制限部位を含む３’プライマー：
【化３０】 。
【０８４１】 一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイし得る。最初のスクリーニングは、サザンブロッ
ト分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、動物組織の分析により導入遺伝子
の組み込みが起きたことを確認し得る。トランスジェニック動物の組織における
導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザン
ブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素ＰＣ
Ｒ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価し得る。ト
ランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異的な
抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価し得る。
【０８４２】 一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配され、同系交配され、異系交
配されるかまたは交雑されて、特定の動物の群落を生成し得る。そのような交配
戦略の例は、以下を含むがそれらに限定されない：別々の系統を樹立するための
１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相加
的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジェ
ニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析に
よる動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部位
に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニック動物の交
雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々のホモ接合系
統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切である異なるバックグラウンド上に
導入遺伝子を配置するための交配。
【０８４３】 本発明のトランスジェニック動物は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの生物学的機
能の精巧化、異常なＤ−ＳＬＡＭ発現に関連する状態および／または障害の研究
、ならびにこのような状態および／または障害の改善に有効な化合物についての
スクリーニングに有用な動物モデル系を含むがこれらに限定されない使用を有す
る。
【０８４４】 （実施例３１：Ｄ−ＳＬＡＭノックアウト動物） 内因性Ｄ−ＳＬＡＭ遺伝子発現はまた、標的化された相同性組換えを使用して
Ｄ−ＳＬＡＭ遺伝子および／またはそのプロモーターを不活性化あるいは「ノッ
クアウトする」ことによって減少し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１７：２３０−２３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃ
ｃｈｉ、Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、
Ｃｅｌｌ ５：３１３−３２１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、本
明細書中でその全体が参考として援用される）。例えば、内因性ポリヌクレオチ
ド配列（この遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）と相同性のＤＮＡ
に隣接される、本発明の非機能的な変異体ポリヌクレオチド（または完全に関連
のないＤＮＡ配列）を、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーと
共にあるいはこれらを用いずに使用し、インビボで本発明のポリペプチドを発現
する細胞をトランスフェクトし得る。別の実施形態において、当該分野で公知の
技術を、目的の遺伝子を含むが、発現しないノックアウトを細胞中で生じるため
に使用する。標的化された相同性組換えを介した、このＤＮＡ構築物の挿入は、
標的化遺伝子の不活性化を生じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対す
る改変が不活性な標的化遺伝子を有する動物子孫を作製するために使用され得る
研究および農業分野に特に適する（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈ
ｉ １９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ １９８９、前出を参照のこと）。しかし
、このアプローチは、当業者に明白な、適切なウイルスベクターを使用して、組
換えＤＮＡ構築物がインビボで要求された部位に直接投与または標的化される場
合、ヒトにおける使用に慣用的に適合され得る。
【０８４５】 例えば、ネオマイシンカセットに隣接するマウスＤ−ＳＬＡＭ遺伝子座のフラ
グメントを組み込む標的化ベクターを作製し得る。その２つの隣接領域は、以下
のプライマーを使用して生成する。５’ＡＲＭ隣接領域について： ５’ ＡＲＭプライマーＦ：５’ＡＧＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＣＧＡＴＧＴＧＣＡ
ＴＡＡＴＣＡＧＧＣＴ ３’（配列番号２７）（Ａｓｐ７１８制限部位に下線を
付す）；および ５’ ＡＲＭプライマーＲ：５’ ＧＣＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＴＧＧＴＴＡ
ＧＴＣＴＧＣＣＴＡＴＧＴＡ ３’（配列番号２８）（ＢｓｓＨ ＩＩ制限部位
に下線を付す）。３’ ＡＲＭ隣接領域について： ３’ ＡＲＭプライマーＦ：５’ＡＴＣＣＡＴＣＧＡＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＴＴ
ＣＡＣＡＧＧＣＴＴＧ ３’（配列番号２９）（Ｃｌａ Ｉ制限部位に下線を付
す）；および ３’ ＡＲＭプライマーＲ：５’ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＧ
ＣＴＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴ ３’（配列番号３０）（Ｎｏｔ Ｉ制限部
位に下線を付す）。
【０８４６】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するように
遺伝的に操作された細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺
伝的に操作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する
。このような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ド
ナーから入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）
、脂肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この
細胞を、例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に
導入遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順
（プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポ
ソームなどの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明
のポリペプチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および
／または本発明のポリペプチドに関連する内因性の制御配列を破壊するために、
組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝的に操作する。本発明のポリペプ
チドのコード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまた
はプロモーター／エンハンサーの制御下に配置し、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの
発現および好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好
ましくは分泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患
者中へ全身的に導入し得る。
【０８４７】 あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（
例えば、遺伝的に操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；
遺伝的に操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し
得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号ならびに
ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照
のこと。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０８４８】 投与される細胞が非自己細胞または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを
、この導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投
与し得る。例えば、この細胞をカプセル化形態で導入し得、この形態は、すぐ細
胞外の環境との成分の交換が可能である間は、導入細胞が宿主免疫系によって認
識されるのを可能にしない。
【０８４９】 本発明の「ノックアウト」動物は、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドの生物学的機能
の精巧化、異常なＤ−ＳＬＡＭ発現に関連する状態および／または障害の研究、
ならびにこのような状態および／または障害を改善させる場合に有効な化合物に
ついてのスクリーニングにおいて有用な動物モデル系を含むが、それらに限定さ
れない使用を有する。
【０８５０】 （実施例３２：Ｂ細胞増殖および分化の刺激または阻害を検出するアッセイ） 機能的体液性免疫応答の生成は、Ｂ系列の細胞とそれらの微小環境との間での
、可溶性のシグナル伝達および同族のシグナル伝達の両方を必要とする。シグナ
ルは、陽性の刺激（Ｂ系列の細胞がプログラムされた発生を持続するようにさせ
る）、または陰性の刺激（細胞が電流発生経路を阻止するように指示する）を付
与し得る。現在までに、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、
ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４およびＩＬ−１５を含む、多数の刺激シグ
ナルおよび阻害シグナルがＢ細胞応答性に影響することが見出されている。興味
深いことに、これらのシグナルはそれ自体は弱いエフェクターであるが、種々の
補助的刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）タンパク質と組み合わせて、Ｂ細
胞集団中の活性化、増殖、分化、ホーミング、寛容性、および死を誘導し得る。
【０８５１】 Ｂ細胞補助的刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）タンパク質の最も研究さ
れたクラスの１つがＴＮＦスーパーファミリーである。このファミリー内で、Ｃ
Ｄ４０、ＣＤ２７およびＣＤ３０は、そのそれぞれのリガンドである、ＣＤ１５
４、ＣＤ７０およびＣＤ１５３と共に種々の免疫応答を調節することが見出され
ている。樹状細胞は、Ｂ細胞と直接相互作用し、その分化の種々の段階で成熟Ｂ
細胞の応答を調節することが公知である。従って、本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペ
プチドを、Ｂ細胞増殖に影響する能力について試験した。これらのＢ細胞集団お
よびそれらの前駆細胞の増殖および分化の検出および／または観察を可能にする
アッセイは、種々のタンパク質がこれらのＢ細胞集団に対して増殖および分化の
点で有し得る効果を決定する際に価値のあるツールである。以下に列挙するのは
、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体の分化、増殖、または阻害の検出を可能にす
るように設計された２つのアッセイである。
【０８５２】 （インビトロアッセイ）−精製Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質、あるいはその短縮形
態を、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体において活性化、増殖、分化もしくは阻
害および／または死を誘導する能力について評価する。詳細には、精製組換えＤ
−ＳＬＡＭを、標準的補助的刺激アッセイにおいてＢ細胞の増殖を阻害する能力
について評価した。このアッセイにおいて、精製扁桃Ｂ細胞を、プライミング因
子として抗ヒトＩｇＭもしくはパンソルビン（ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）の存在下で
培養する（Ｓｉｅｃｋｍａｎｎ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：８
１４〜２９（１９７８）；Ｒｉｎｇｄｅｎ，Ｏ．ら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．６：１１５９〜６９（１９７７））。精製したヒト扁桃Ｂ細胞へのＤ−
ＳＬＡＭタンパク質の活性（定性的に０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの用量範
囲にわたって測定した）を、標準的なＢリンパ球同時刺激アッセイにおいて評価
する。このアッセイでは、精製した扁桃Ｂ細胞を、プライミング因子として、ホ
ルマリン固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ（
ＳＡＣ）、または固定した抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかの存在下で培養する。Ｉ
Ｌ−２およびＩＬ−１５のような第２のシグナルは、トリチウムチミジン取り込
みにより測定した場合、ＳＡＣ（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）およびＩｇＭ架橋と相乗
作用してＢ細胞増殖を惹起する。新規な相乗作用剤を、このアッセイを使用して
容易に同定し得る。このアッセイは、ＣＤ３陽性細胞の磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）
枯渇によりヒト扁桃Ｂ細胞を単離する工程を包含する。得られる細胞集団は、Ｃ
Ｄ４５Ｒ（Ｂ２２０）の発現により評価する場合、９５％より多くのＢ細胞であ
る。
【０８５３】 各サンプルの種々の希釈物を９６ウェルプレートの個々のウェルに配置し、こ
こへ、培養培地（１０％ＦＢＳ、５×１０-5Ｍ ２ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌペニシ
リン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０-5希釈のＳＡＣを含有す
るＲＰＭＩ １６４０）中で懸濁した、総量１５０μｌ中の、１０5Ｂ細胞を添
加する。増殖または阻害を、因子の添加後７２時間から開始して、3Ｈ−チミジ
ン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）での２０時間パルス（１μＣｉ／ウェル）により定量す
る。陽性コントロールおよび陰性コントロールは、それぞれＩＬ２および培地で
ある。
【０８５４】 （Ｄ−ＳＬＡＭのＢリンパ球増殖アッセイ）−ヒト扁桃Ｂ細胞を、ＣＤ３陽性
細胞の磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）枯渇により精製した。生じた細胞集団は、ＣＤ１
９およびＣＤ２０の発現により評価した場合、ほぼ９５％より多くのＢ細胞であ
った。ヒト組換えＤ−ＳＬＡＭもしくはＤ−ＳＬＡＭ．Ｆｃ（Ｆｃ部分と融合し
た配列番号２のＭ１〜Ｄ２３３）の種々の希釈物を、９６ウェルプレートの個々
のウェルに配置し、そこに培養培地（１０％ ＦＢＳ、５×１０-5Ｍ ２ＭＥ、
１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、およびＰａｎ
ｓｏｒｂｉｎ（ＳＡＣ）もしくは抗ＩｇＭの１０-5希釈物を含む、ＲＰＭＩ １
６４０）に懸濁した１０5個のＢ細胞を、総体積１５０μｌにて添加した。増殖
を、因子添加の７２時間後から開始して、3Ｈ−チミジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）
の２０時間のパルス（１μＣｉ／ウェル）により定量した。
【０８５５】 （結果）−抗ヒトＩｇＭもしくはパンソルビンのいずれかで増殖するように刺
激されたＢ細胞培養物の組換えＤ−ＳＬＡＭもしくはＤ−ＳＬＡＭ．Ｆｃでの処
理は、扁桃Ｂ細胞増殖の用量依存性阻害を生じた。用量依存性応答は、固定濃度
の組換えＤ−ＳＬＡＭの存在下で、架橋剤の量の増加につれて容易に観察される
。同じアッセイ条件下で、ＴＲ９．Ｆｃ（未処理Ｆｃ融合タンパク質）は、何の
阻害も示さなかった。
【０８５６】 本発明のＤ−ＳＬＡＭアゴニストはまた、このＢリンパ球増殖アッセイにおい
て試験し得る。さらに、当業者は、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドの活性（例え
ば、遺伝子治療）および／またはＤ−ＳＬＡＭのアンタゴニストの活性を試験す
るために、例示された研究を容易に改変し得る。
【０８５７】 本発明に従うアンタゴニスト（例えば、Ｄ−ＳＬＡＭポリペプチドフラグメン
ト、Ｄ−ＳＬＡＭもしくはそのフラグメントに対する抗体を含むが、これらに限
定されない）は、同じ数のＢ細胞および同じ濃度のプライミング因子、ならびに
そのアンタゴニストの非存在下でＢ細胞増殖活性の増加を誘発する同じ濃度の可
溶性形態の因子を含むコントロールと比較した場合、Ｂ細胞増殖の増加を示す。
アゴニスト（Ｄ−ＳＬＡＭに対する抗体もしくはそのフラグメントを含むが、こ
れらに限定されない）は、同じ数のＢ細胞を同じ濃度のプライミング因子と接触
した場合に観察される増殖と比較した場合に、Ｂ細胞増殖の減少を示す。
【０８５８】 （インビボアッセイ）−ＢＡＬＢ／ｃマウスに、緩衝液単独、あるいは２ｍｇ
／ＫｇのＤ−ＳＬＡＭタンパク質またはそれらの短縮形態を、１日２回（ｉ．ｐ
．）注射する。マウスに、この処置を連続４日間与え、その時点でマウスを屠殺
し、そして種々の組織および血清を分析用に収集する。正常な脾臓ならびにＤ−
ＳＬＡＭタンパク質で処理した脾臓由来のヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）
切片の比較により、脾細胞に対するＤ−ＳＬＡＭタンパク質の活性の結果（例え
ば、動脈周囲リンパ鞘の拡散、および／または赤脾髄領域の有核細胞性の有意な
増加（これは、Ｂ細胞集団の分化および増殖の活性化を示し得る））を同定する
。Ｂ細胞マーカー（抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０））を使用する免疫組織化学研究を
使用して、脾細胞に対するなんらかの生理的変化（例えば、脾組織崩壊）が、確
立されたＴ細胞領域を浸潤する大まかに規定されたＢ細胞域におけるＢ細胞提示
の増加に起因するか否かを決定する。
【０８５９】 Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質で処理したマウス由来の脾臓のフローサイトメトリー
分析を使用して、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質が、コントロールマウスにて観察され
たものに対して、ＴｈＢ＋，ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ダルＢ細胞の比率を特異的
に増加させるか否かを示す。
【０８６０】 同様に、インビボでの成熟Ｂ細胞提示の増加の予測された結果は、血清Ｉｇ力
価における相対的増加である。従って、血清ＩｇＭレベルおよびＩｇＡレベルを
、緩衝液で処理したマウスと、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質で処理したマウスとの間
で比較する。
【０８６１】 本実施例において記載する試験は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験する
。しかし、当業者は、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治
療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニストの活性ならびに／あるいはＤ−ＳＬＡＭのアン
タゴニストの活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。
【０８６２】 （実施例３３：Ｄ−ＳＬＡＭは、ＢＬｙＳの存在下でＢ細胞増殖のインヒビタ
ーとして機能する） Ｂ細胞に対するＤ−ＳＬＡＭの阻害活性をさらに試験するために、ＢＬｙＳ活
性化Ｂ細胞に対するＤ−ＳＬＡＭの効果を試験した。
【０８６３】 ヒト扁桃Ｂ細胞を、ＣＤ３陽性細胞の磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）枯渇により精製
した。生じた細胞集団は、ＣＤ１９およびＣＤ２０の発現により評価した場合、
ほぼ９５％より多くのＢ細胞であった。ヒト組換えＤ−ＳＬＡＭもしくはＤ−Ｓ
ＬＡＭ．Ｆｃ（Ｆｃ部分と融合した配列番号２のＭ１〜Ｄ２３３）の種々の希釈
物を、９６ウェルプレートの個々のウェルに配置し、そこに培養培地（１０％
ＦＢＳ、５×１０-5Ｍ ２ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌス
トレプトマイシン、ならびにＰａｎｓｏｒｂｉｎ（ＳＡＣ）の１０-5希釈物また
はＰａｎｓｏｒｂｉｎ（ＳＡＣ）の１０-5希釈物＋ＢＬｙＳ（１００ｎｇ／ｍｌ
）を含む、ＲＰＭＩ １６４０）に懸濁した１０5個のＢ細胞を、総体積１５０
μｌにて添加した。ＳＡＣおよびＳＡＣ＋ＢＬｙＳで刺激されたＢ細胞を、漸増
濃度のＤ−ＳＬＡＭ．ＦｃもしくはＯＸ４０．Ｆｃとともにかまたはこれらを含
まずに、インキュベートする。増殖を、因子添加の７２時間後から開始して、3
Ｈ−チミジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）の２０時間のパルス（１μＣｉ／ウェル）に
より定量した。
【０８６４】 （結果）−細胞培養物へＤ−ＳＬＡＭの添加は、ＢＬｙｓ誘導細胞増殖活性の
強力な用量依存性阻害を誘導した。ＯＸ４０．Ｆｃでの処理は、何の阻害効果も
示さなかった。
【０８６５】 （実施例３４：Ｔ細胞増殖アッセイ） ＣＤ３誘導性の増殖アッセイをＰＢＭＣに対して実行し、そして3Ｈ−チミジ
ンの取り込みにより測定する。このアッセイを以下のように実行する。９６ウェ
ルプレートを、１００μｌ／ウェルの、ＣＤ３に対するｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ，Ｐ
ｈａｒｍｉｎｇｅｎ）またはアイソタイプが一致するコントロールｍＡｂ（Ｂ３
３．１）（０．０５Ｍ 炭酸水素塩緩衝液、ｐＨ９．５中、１ｍｇ／ｍｌ）で４
℃で１晩、コートし、次いでＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣをヒト末梢血から
、Ｆ／Ｈ勾配遠心分離により単離し、そして種々の濃度のＤ−ＳＬＡＭタンパク
質の存在下で、１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有するＲＰＭＩ中、ｍＡｂでコー
トしたプレートの４連のウェル（５×１０4／ウェル）に添加する（総量２００
μｌ）。関連するタンパク質緩衝液および培地単独がコントロールである。３７
℃での培養の４８時間後、プレートを１０００ｒｐｍで２分間回転させ、そして
１００μｌの上清を取り出し、そして、増殖に対する効果が観察される場合、Ｉ
Ｌ−２（または他のサイトカイン）の測定のために−２０℃で貯蔵する。ウェル
に０．５μＣｉの3Ｈ−チミジンを含有する１００μｌの培地を補充し、そして
３７℃で１８〜２４時間培養する。ウェルを収集し、そして3Ｈ−チミジンの取
り込みを増殖の指標として用いた。抗ＣＤ３単独が増殖の陽性コントロールであ
る。ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）をまた、増殖を増強するコントロールとして用
いる。Ｔ細胞の増殖を誘導しないコントロール抗体をＤ−ＳＬＡＭタンパク質の
効果についての陰性コントロールとして用いる。
【０８６６】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験し
た。しかし、当業者は、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子
治療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニストの活性ならびに／あるいはＤ−ＳＬＡＭのア
ンタゴニストの活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。
【０８６７】 （実施例３５：ＭＨＣクラスＩＩ、補助的刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ
ｙ）分子および接着分子の発現、ならびに単球および単球由来ヒト樹状細胞の細
胞分化に対するＤ−ＳＬＡＭの効果） 樹状細胞を末梢血において見出される増殖前駆体の増殖により生成する：接着
性ＰＢＭＣまたは溶出（ｅｌｕｔｒｉａｔｅｄ）単球画分を、ＧＭ−ＣＳＦ（５
０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）とともに７〜１０日間培養す
る。これらの樹状細胞は、未成熟細胞の特徴的表現型（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ
８６、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現）を有する。ＴＮＦ−αのよ
うな活性化因子での処理は、表面表現型の迅速な変化（ＭＨＣクラスＩおよびＩ
Ｉ、補助的刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）分子および接着分子の発現の
増加、ＦＣγＲＩＩの下方制御、ＣＤ８３の上方制御）を生じる。これらの変化
は抗原提示能力の増加、および樹状細胞の機能的成熟と関連する。
【０８６８】 表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下の様に実施する。細胞を、Ｄ−ＳＬＡＭまたは
ＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜３日処理し、１％ＢＳＡおよ
び０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで１：２０希
釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モノクローナル抗体
とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄後、標識した細胞
をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメト
リーにより分析する。
【０８６９】 （サイトカインの産生に対する効果） 樹状細胞により生成されるサイトカイ
ン、特にＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性免疫応答の開始において重要である。ＩＬ
−１２は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応答の発生に強力に影響し、そして細胞傷
害性Ｔ細胞機能およびＮＫ細胞機能を誘導する。ＥＬＩＳＡを用いて以下のよう
にＩＬ−１２放出を測定する。樹状細胞（１０6／ｍｌ）を、Ｄ−ＳＬＡＭの漸
増する濃度で２４時間処理する。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロ
ールとして細胞培養に添加する。次いで、細胞培養からの上清を収集し、そして
市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏ
ｌｉｓ，ＭＮ））を用いてＩＬ−１２含量について分析する。キットに備えられ
た標準的プロトコルを用いる。
【０８７０】 （ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現への効果） 細胞表
面抗原の３つの主なファミリー：接着分子、抗原提示に関与する分子、およびＦ
ｃレセプター、が、単球上で同定され得る。ＭＨＣクラスＩＩ抗原および他の同
時刺激分子（例えば、Ｂ７およびＩＣＡＭ−１）の発現の調節は、単球の抗原提
示能力、およびＴ細胞活性化を誘導する能力に変化を生じ得る。Ｆｃレセプター
の発現増加は、単球細胞傷害性活性、サイトカイン放出および食菌作用の改善と
相関し得る。
【０８７１】 ＦＡＣＳ分析は、以下のように表面抗原を試験するために用いられる。単球を
、Ｄ−ＳＬＡＭまたはＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜５日処
理し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄
し、次いで１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標
識モノクローナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる
洗浄後、標識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）
でのフローサイトメトリーにより分析する。
【０８７２】 （単球活性化および／または生存の増加） 単球を活性化する（あるいは、不
活化する）および／または単球の生存を増加する（あるいは、単球生存を低下さ
せる）分子についてのアッセイは、当該分野で公知であり、そして本発明の分子
が単球のインヒビターまたはアクチベーターとして機能するか否かを決定するた
めに慣用的に適用され得る。Ｄ−ＳＬＡＭ、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニストまたはア
ンタゴニストは、以下に記載の３つのアッセイを用いてスクリーニングされ得る
。これらのアッセイのそれぞれについて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉ
ｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）を通じた遠心分離により、単一のドナーｌ
ｅｕｋｏｐａｃｋ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒ
ｅ，ＭＤ）から精製する。単球を向流遠心性エルトリエーション（ｃｏｕｎｔｅ
ｒｆｌｏｗ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）によりＰＢＭ
Ｃから単離する。
【０８７３】 （単球生存アッセイ） ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激の非存在下で
培養した場合、次第に生存度を失う。それらの死は、内部調節されたプロセス（
アポトーシス）から生じる。活性化因子、例えばＴＮＦαの培養への添加は、劇
的に、細胞生存を改善し、そしてＤＮＡの断片化を妨げる。プロピジウムヨード
（ＰＩ）染色を用いて、以下のようにアポトーシスを測定する。単球を、１００
ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（陰性コントロール）の存在下、および試験される種々
の濃度の化合物の存在下で、ポリプロピレンチューブ中の無血清培地（陽性コン
トロール）中で、４８時間培養する。細胞を、最終濃度５μｇ／ｍｌでＰＩを含
有するＰＢＳ中で２×１０6／ｍｌの濃度に懸濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎ分析
の前に５分間室温でインキュベートする。ＰＩ取り込みは、この試験パラダイム
におけるＤＮＡの断片化と相関することを示している。
【０８７４】 （サイトカイン放出への影響） 単球／マクロファージの重要な機能は、刺激
後のサイトカインの放出を通じた免疫系の他の細胞集団へのそれらの調節活性で
ある。サイトカイン放出を測定するためのＥＬＩＳＡは、以下のように実施する
。ヒト単球を、５×１０5細胞／ｍｌの密度で、Ｄ−ＳＬＡＭの漸増する濃度と
ともに、および同じ条件下でＤ−ＳＬＡＭの非存在下で、インキュベートする。
ＩＬ−１２の生成については、この細胞を、Ｄ−ＳＬＡＭの存在下でＩＦＮ（１
００Ｕ／ｍｌ）で１晩プライムする。次いで、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加
する。馴化培地を２４時間後に収集し、そして使用するまで凍結保存する。次い
で、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の測定を市販のＥＬＩ
ＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ
）を用い、そしてキットに提供される標準的プロトコールを適用して実施する。
【０８７５】 （酸化的バースト（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ）） 精製した単球を９
６ウェルプレートに２〜１×１０5細胞／ウェルでプレートする。Ｄ−ＳＬＡＭ
の漸増濃度をウェルの総量０．２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％
ＦＣＳ、グルタミンおよび抗生物質）に添加する。３日間のインキュベーション
後、このプレートを遠心分離し、そして培地をウェルから除く。マクロファージ
の単層に、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（１４０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、５．５ｍＭデキストロー
ス、０．５６ｍＭフェノールレッドおよび１９Ｕ／ｍｌのＨＲＰＯ）を、刺激物
質（２００ｎＭ ＰＭＡ）とともに添加する。このプレートを３７℃で２時間イ
ンキュベートし、そして１ウェルあたり２０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを添加して反
応を停止する。吸収を６１０ｎｍで読む。マクロファージにより生成されるＨ2
Ｏ2の量を算出するため、既知のモル濃度のＨ2Ｏ2溶液の標準曲線をそれぞれの
実験について実施する。
【０８７６】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験し
た。しかし、当業者は、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子
治療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニストの活性、および／またはアンタゴニストの活
性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。
【０８７７】 （結果） 以下に示されるように、Ｄ−ＳＬＡＭは、単球由来の樹状細胞を特異的に結合
するようであるが、この実験において、Ｄ−ＳＬＡＭは、単球、Ｔ細胞、または
種々の細胞株には結合しなかった。
【０８７８】
【表４】 さらに、Ｄ−ＳＬＡＭとともに樹状細胞をインキュベートした後に、樹状細胞
成熟または活性化の指標である、多くの細胞表面マーカーのアップレギュレーシ
ョンが観察される（以下を参照のこと）。従って、Ｄ−ＳＬＡＭは、樹状細胞活
性化および成熟に関与し得る。
【０８７９】
【表５】 さらなるデータにより、Ｄ−ＳＬＡＭが、単球によるＴＮＦ−α生成を誘導し
得、そしてＤ−ＳＬＡＭがホモタイプ会合でそれ自体に結合し得ることが示唆さ
れる。従って、Ｄ−ＳＬＡＭは、細胞表面でＤ−ＳＬＡＭが発現された非造血細
胞を含む任意の細胞（例えば、間質細胞）を活性化するようである。
【０８８０】 従って、患者におけるＤ−ＳＬＡＭの量を増加させることにより樹状細胞を活
性化すること／成熟させることは、癌の処置、診断、検出、および／または予防
、ならびに免疫応答の調節において有用であり得る。例えば、Ｄ−ＳＬＡＭの量
が増加し、樹状細胞マーカー（例えば、ＣＤ８３）の細胞表面での発現が上昇す
ると、腫瘍に対する免疫応答が活性化され得る。このような場合において、腫瘍
を有する患者を可溶性バージョンのＤ−ＳＬＡＭで処置することは、樹状細胞上
のＣＤ８３のアップレギュレーションをもたらし得、そして腫瘍の拒絶／殺傷の
増強をもたらす腫瘍認識の増強を生じ得る。
【０８８１】 （実施例３６：Ｄ−ＳＬＡＭの生物学的効果） （星状細胞および神経アッセイ） 上記のように発現され、そして精製された組換えＤ−ＳＬＡＭを、皮質ニュー
ロン細胞の生存、神経突起成長または表現形分化を促進する活性について、およ
びグリア線維性酸性タンパク質免疫陽性細胞、星状細胞の増殖の誘導について試
験し得る。バイオアッセイのための皮質細胞の選択は、皮質構造中のＦＧＦ−１
およびＦＧＦ−２の広く行き渡っている発現、ならびにＦＧＦ−２処理から生じ
る皮質ニューロン生存の以前に報告された増強に基づく。チミジン取り込みアッ
セイを用いて、例えば、これらの細胞へのＤ−ＳＬＡＭの活性を解明し得る。
【０８８２】 さらに、インビトロにおける皮質ニューロンまたは海馬ニューロンへのＦＧＦ
−２（塩基性ＦＧＦ）の生物学的効果を記載する以前のレポートは、ニューロン
生存および神経突起成長の両方における増大を実証している（Ｗａｌｉｃｋｅ，
Ｐ．ら、「Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔ
ｅｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｉｐｐｏｃａｍｐ
ａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎｅｕｒｉｔｅ ｅｘｔｅ
ｎｓｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：３０１２
〜３０１６（１９８６）、アッセイは、本明細書でその全体が参考として援用さ
れる）。しかし、ＰＣ−１２細胞で実行される実験からの報告は、これらの２つ
の応答が必ずしも同義でないこと、そしてどのＦＧＦを試験しているかだけでな
く、どのレセプターが標的細胞で発現されているかにも依存し得ることを示唆す
る。神経突起成長を誘導するＤ−ＳＬＡＭの能力を、一次の皮質ニューロン培養
パラダイムを用いて、例えば、チミジン取り込みアッセイを用いてＦＧＦ−２で
得られた応答と比較し得る。
【０８８３】 （線維芽細胞および内皮細胞アッセイ） ヒト肺線維芽細胞をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入
手し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓからの増殖培地で維持する。真皮性微小血管内
皮細胞をＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）か
ら得る。増殖アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞および真皮性微小血管内皮
細胞を、９６ウェルプレートの増殖培地中で１日間、５，０００細胞／ウェルで
培養し得る。次いでこの細胞を０．１％ＢＳＡ基礎培地中で１日間インキュベー
トする。新鮮な０．１％ＢＳＡ培地で培地を置換した後、細胞を試験タンパク質
と３日間インキュベートする。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ａｌｍａｒ Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）を１０％の最終濃度になるよう
に各ウェルに添加する。この細胞を４時間インキュベートする。細胞生存度をＣ
ｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーでの読取りにより測定する。ＰＧＥ2アッセイに
ついては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で１日間、５，０００細
胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地を変換した後、細胞をＩ
Ｌ−１αとともに、またはそれをともなわずに、ＦＧＦ−２またはＤ−ＳＬＡＭ
と２４時間インキュベートする。上清を収集し、そしてＥＩＡキット（Ｃａｙｍ
ａｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によりＰＧＥ2についてアッセイする。ＩＬ
−６アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で１日間
、５，０００細胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地を変換し
た後、細胞をＩＬ−１αとともに、またはそれをともなわずに、ＦＧＦ−２また
はＤ−ＳＬＡＭと２４時間インキュベートする。上清を収集し、そしてＥＬＩＳ
Ａキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によりＩＬ−６につい
てアッセイする。
【０８８４】 ヒト肺線維芽細胞をＦＧＦ−２またはＤ−ＳＬＡＭとともに基礎培地中で３日
間培養し、その後、線維芽細胞の増殖への効果を評価するためＡｌａｍａｒ Ｂ
ｌｕｅを添加する。ＦＧＦ−２は、Ｄ−ＳＬＡＭでの刺激に匹敵して用いられ得
る１０〜２５００ｎｇ／ｍｌの刺激を示すはずである。
【０８８５】 （パーキンソンモデル） パーキンソン病における運動機能の喪失は、黒質線条体のドーパミン作動性投
射ニューロンの変性から生じる線条体ドーパミンの欠乏に起因する。広範に特徴
付けされたパーキンソン病の動物モデルは、１−メチル−４フェニル１，２，３
，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の全身投与を含む。ＣＮＳにおいて、
ＭＰＴＰは、星状細胞に取り込まれ、そしてモノアミンオキシダーゼＢにより１
−メチル−４−フェニルピリジン（ＭＰＰ+）に異化され、そして放出される。
引き続き、ＭＰＰ+は、ドーパミンの高親和性再取り込みトランスポーターによ
りドーパミン作動性ニューロンに能動的に蓄積する。次いで、ＭＰＰ+は、電気
化学勾配によりミトコンドリア中で濃縮され、そしてニコチン酸アミド二リン酸
：ユビキノン酸化還元酵素（複合体Ｉ）を選択的に阻害し、これにより電子伝達
を妨害し、そして最終的に活性酸素を生成する。
【０８８６】 ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）が黒質のドーパミン作動性ニューロンへの栄養活
性を有することが組織培養パラダイムにおいて実証されている（Ｆｅｒｒａｒｉ
ら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９８９）。近年、Ｕｎｓｉｃｋｅｒ博士のグループは
、線条体のゲル型インプラントでのＦＧＦ−２投与がＭＰＴＰ曝露と関連する毒
性から黒質のドーパミン作動性ニューロンのほぼ完全な防御を生じることを実証
している（ＯｔｔｏおよびＵｎｓｉｃｋｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，
１９９０）。
【０８８７】 ＦＧＦ−２を用いたデータに基づいて、Ｄ−ＳＬＡＭは、インビトロにおける
ドーパミン作動性ニューロン生存を増強する際において、Ｄ−ＳＬＡＭがＦＧＦ
−２の作用と類似の作用を有するか否かを決定するために評価され得、そして、
Ｄ−ＳＬＡＭはまた、線条体におけるドーパミン作動性ニューロンを、ＭＰＴＰ
処理と関連する損傷からの防御についてインビボで試験され得る。Ｄ−ＳＬＡＭ
の潜在的効果を、まずドーパミン性ニューロン細胞培養パラダイムにおいてイン
ビトロで試験する。妊娠１４日のＷｉｓｔａｒラット胚由来の中脳底板を解剖す
ることにより、培養物を調製する。組織をトリプシンで分離し、そしてポリオル
チニン−ラミニンでコートしたカバーガラスに２００，０００細胞／ｃｍ2の密
度で播いた。この細胞をダルベッコ改変イーグル培地およびホルモン補充物（Ｎ
Ｉ）を含有するＦ１２培地中で維持する。インビトロで８日後培養物をパラホル
ムアミドで固定し、そしてチロシンヒドロキシラーゼ（ドーパミン作動性ニュー
ロンについての特異的マーカー）での免疫組織化学染色のために処理する。分離
した細胞培養物を胚性ラットから調製する。培養培地を３日ごとに変化させ、そ
してこの因子をまたその時点ごとに添加する。
【０８８８】 ドーパミン作動性ニューロンを妊娠１４日（この発生時間は、ドーパミン作動
性前駆細胞が増殖する段階を過ぎる）で動物から単離するので、チロシンヒドロ
キシラーゼ免疫陽性ニューロンの数の増加は、インビトロで生存しているドーパ
ミン作動性ニューロンの数の増加を示す。従って、もしＤ−ＳＬＡＭがドーパミ
ン作動性ニューロンの生存を延長するように作用するならば、このＤ−ＳＬＡＭ
がパーキンソン病に関与し得ることを示唆する。
【０８８９】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験し
た。しかし、当業者は、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子
治療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験する
ために、例示する研究を容易に改変し得る。
【０８９０】 （実施例３７：血管内皮細胞の増殖へのＤ−ＳＬＡＭの効果） １日目に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、４％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ
）、１６ユニット／ｍｌ ヘパリン、および５０ユニット／ｍｌ 内皮細胞増殖
補充物（ＥＣＧＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含有するＭ１９９
培地中で、３５ｍｍシャーレあたり２〜５×１０4細胞の密度で播種する。２日
目、この培地を、１０％ＦＢＳ、８ユニット／ｍｌヘパリンを含有するＭ１９９
で置換する。配列番号２のＤ−ＳＬＡＭタンパク質および陽性コントロール（例
えば、ＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））を種々の濃度で添加する。４
日目および６日目に、培地を交換する。８日目、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅ
ｒを用いて細胞数を決定する。
【０８９１】 ＨＵＶＥＣ細胞数の増加は、Ｄ−ＳＬＡＭが血管内皮細胞を増殖し得ることを
示す。
【０８９２】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験し
た。しかし、当業者は、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子
治療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験する
ために、例示する研究を容易に改変し得る。
【０８９３】 （実施例３８：血管内皮細胞の増殖へのＤ−ＳＬＡＭの刺激効果） 増殖因子の有糸分裂促進活性の評価のために、電子共役試薬ＰＭＳ（フェナジ
ンメトスルフェート）を用いる、比色分析ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチア
ゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−ス
ルホフェニル）２Ｈ−テトラゾリウム）アッセイを実行した（ＣｅｌｌＴｉｔｅ
ｒ ９６ ＡＱ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞を０．１ｍＬの血清補充培地中で９６
ウェルプレートに播種し（５，０００細胞／ウェル）、そして一晩付着させる。
０．５％ＦＢＳ中、１２時間の血清飢餓後、Ｈｅｐａｒｉｎ（８Ｕ／ｍｌ）を伴
うかまたは伴わない、条件（０．５％ＦＢＳ中のｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ165または
Ｄ−ＳＬＡＭ）をウェルに４８時間添加する。２０ｍｇのＭＴＳ／ＰＭＳ混合物
（１：０．０５）を１ウェルあたりに添加し、そして３７℃で１時間インキュベ
ートさせ、その後ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９０ｎｍの吸収を測定する。
コントロールウェル（培地あり、細胞なし）のバックグラウンドの吸収を差し引
きし、そしてそれぞれの条件について７つのウェルを並行して実施する。Ｌｅａ
ｋら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０Ａ：５１２〜５１
８（１９９４）を参照のこと。
【０８９４】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験し
た。しかし、当業者は、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子
治療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験する
ために、例示する研究を容易に改変し得る。
【０８９５】 （実施例３９：ＰＤＧＦ誘導性血管平滑筋細胞増殖刺激効果の阻害） ＨＡｏＳＭＣ増殖を、例えば、ＢｒｄＵｒｄ組み込みにより測定し得る。手短
には、４チャンバスライド上で増殖するコンフルエント未満の静止期細胞を、Ｃ
ＲＰまたはＦＩＴＣ標識化ＡＴ２−３ＬＰでトランスフェクトする。次いで、こ
の細胞に１０％ウシ血清および６ｍｇ／ｍｌのＢｒｄＵｒｄをパルスする。２４
時間後、ＢｒｄＵｒｄ染色キット（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を
用いることにより免疫細胞化学を実施する。簡略には、この細胞を、変性溶液へ
の曝露後、ビオチン化マウス抗−ＢｒｄＵｒｄ抗体と４℃で２時間インキュベー
トし、次いでストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジン
とともにインキュベートする。ヘマトキシリンでの対比染色後、この細胞を顕微
鏡試験のために標本にし、そしてＢｒｄＵｒｄ−陽性細胞を計数する。ＢｒｄＵ
ｒｄ係数は、総細胞数に対するＢｒｄＵｒｄ−陽性細胞の割合として計算される
。さらに、個々の細胞について、明野照明および暗野ＵＶ蛍光照明の同時使用に
より、ＢｒｄＵｒｄ染色（核）およびＦＩＴＣ取り込み（細胞質）の同時検出を
実行する。Ｈａｙａｓｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６：２７１（３６
）：２１９８５〜２１９９２（１９９６）を参照のこと。
【０８９６】 本実施例において記載した研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験した
。しかし、当業者は、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治
療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験するた
めに、例示する研究を容易に改変し得る。
【０８９７】 （実施例４０：内皮遊走の刺激） 本実施例は、Ｄ−ＳＬＡＭがリンパ性の内皮細胞遊走を刺激し得る可能性を探
索するために用いられ得る。
【０８９８】 内皮細胞遊走アッセイは、４８ウェルの微小走化性チャンバを用いて実行され
る（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ，ＭＤ；Ｆａｌｋ
，Ｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８０；３３：
２３９〜２４７）。ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルタ
ー（これは８μｍの孔径を備える）（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を室温で少なくとも６時間０．１％ゼラチンでコートし、
そして滅菌空気のもとで乾燥する。０．２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を
補充したＭ１９９中で試験物質を適切な濃度に希釈し、そして２５μｌの最終希
釈を改変Ｂｏｙｄｅｎ装置の底部チャンバに置く。コンフルエント未満の、早期
継代（２〜６）のＨＵＶＥＣまたはＢＭＥＣ培養物を洗浄し、そして細胞の脱離
に必要な最小の時間トリプシン処理する。底部チャンバと上部チャンバとの間に
フィルターを配置した後、１％ＦＢＳを含有する５０μｌ Ｍ１９９中に懸濁し
た２．５×１０5細胞を上部コンパートメントに播種する。次いでこの装置を、
５％ＣＯ２を用いて湿潤にしたチャンバ中で３７℃で５時間インキュベートして
細胞を遊走させた。インキュベーション期間後、このフィルターを取り出し、そ
して非遊走細胞を有するフィルターの上部側をゴム性のポリスマン（ｐｏｌｉｃ
ｅｍａｎ）でかきとる。このフィルターをメタノールで固定し、そしてＧｉｅｍ
ｓａ溶液で染色する（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ，Ｂａｘｔｅｒ，ＭｃＧｒａｗ Ｐ
ａｒｋ，ＩＬ）。遊走は、それぞれのウェルにおいて、３つの無作為の高倍率視
野（４０×）の細胞を計数することにより定量する。そしてすべての群を４連で
実行する。
【０８９９】 本実施例において記載した研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験した
。しかし、当業者は、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治
療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニスト、および／またはアンタゴニストを試験するた
めに、例示する研究を容易に改変し得る。
【０９００】 （実施例４１：内皮細胞による一酸化窒素生成の刺激） 血管内皮により放出された一酸化窒素は、血管内皮弛緩の介在物質であると考
えられている。従って、Ｄ−ＳＬＡＭの活性は、Ｄ−ＳＬＡＭに応答する内皮細
胞による一酸化窒素産生を測定することによってアッセイされ得る。
【０９０１】 一酸化窒素を、２４時間の飢餓、次いで、様々なレベルの陽性コントロール（
例えば、ＶＥＧＦ−１）およびＤ−ＳＬＡＭへの４時間の曝露の後のコンフルエ
ントな微小血管内皮細胞の９６ウェルプレート中で測定する。培地中の一酸化窒
素を、Ｇｒｉｅｓｓ試薬の使用により測定して、硝酸還元酵素による一酸化硝酸
由来の硝酸の還元後の亜硝酸の総量を測定する。一酸化窒素放出に対するＤ−Ｓ
ＬＡＭの効果を、ＨＵＶＥＣにおいて試験する。
【０９０２】 簡単には、培養したＨＵＶＥＣ単層からのＮＯ放出は、ＮＯメーター（Ｉｓｏ
−ＮＯ，Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．
）（１０４９）に接続したＮＯ特異的なポーラログラフ電極を用いて測定する。
ＮＯエレメントの較正を、以下の式に従って行う： ２ＫＮＯ2＋２ＫＩ＋２Ｈ2ＳＯ4６２ＮＯ＋Ｉ2＋２Ｈ2Ｏ＋２Ｋ2ＳＯ4 検量線を、ＫＩおよびＨ2ＳＯ4を含む較正溶液中に段階的な濃度のＫＮＯ2（
０、５、１０、２５、５０、１００、２５０、および５００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添
加することによって得る。ＮＯに対するＩｓｏ−ＮＯ電極の特異性を、オーセン
ティックなＮＯ気体からのＮＯを測定することにより、事前に決定する（１０５
０）。この培養培地を取り除き、そしてＨＵＶＥＣを、ダルベッコリン酸緩衝化
生理食塩水で２回洗浄する。次いで、細胞を、６ウェルプレート中で５ｍｌの濾
過したＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液に浸し、そしてこの細胞プレートを
、３７℃に温度を維持するために、スライドウォーマー（Ｌａｂ Ｌｉｎｅ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）で保持する。ＮＯセンサープローブをウェル
に垂直に挿入して、異なる条件の追加の前に、電極の先端を溶液の表面の２ｍｍ
下で保持する。Ｓ−ニトロソアセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）を、陽性コント
ロールとして用いる。放出したＮＯの量を、１×１０6内皮細胞あたりのピコモ
ル濃度として表す。全ての報告した値は、各群（細胞培養ウェルの数）における
４〜６の測定値の平均である。Ｌｅａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１７：９６−１０５（１９９５）を参照のこと。
【０９０３】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験し
た。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌク
レオチド（例えば、遺伝子治療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニスト、および／または
アンタゴニストの活性を試験し得る。
【０９０４】 （実施例４２：新脈管形成における索形成に対するＤ−ＳＬＡＭの効果） 新脈管形成における別の工程は、内皮細胞の分化により特徴付けられる索（ｃ
ｏｒｄ）形成である。このバイオアッセイは、インビトロで培養した場合に微小
血管内皮細胞の毛細管様構造（中空構造）を形成する能力を測定する。
【０９０５】 ＣＡＤＭＥＣ（微小血管内皮細胞）を、増殖細胞（２継代目）としてＣｅｌｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．から購入し、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ’ＣＡＤＭＥＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ中で培養し、そして５
継代目で使用する。インビトロ新脈管形成アッセイのために、４８ウェル細胞培
養プレートのウェルをＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’Ａｔｔａｃｈｍｅ
ｎｔ Ｆａｃｔｏｒ Ｍｅｄｉｕｍ（２００ｍｌ／ウェル）を用いて、３７℃に
て３０分間コートする。ＣＡＤＭＥＣを、コートしたウェルに７，５００細胞／
ウェルで播種し、Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ中で一晩培養する。次いで、この
Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍを、コントロール緩衝液またはＤ−ＳＬＡＭ（０．
１〜１００ｎｇ／ｍｌ）を含む３００ｍｇのＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ’Ｃｈｏｒｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍと交換し、そしてこの細胞
をさらに４８時間培養する。毛細管様索の数および長さを、Ｂｏｅｃｋｅｌｅｒ
ＶＩＡ−１７０ビデオ画像分析装置の使用を通じて定量する。全てのアッセイ
を三連で行なう。
【０９０６】 市販の（Ｒ＆Ｄ）ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロールとして用
いる。β−エストラジオール（１ｎｇ／ｍｌ）を、陰性コントロールとして用い
る。適切な緩衝液（タンパク質なし）もまた、コントロールとして利用する。
【０９０７】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験し
た。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌク
レオチド（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニスト
の活性を試験し得る。
【０９０８】 （実施例４３：ニワトリ漿尿膜に対する脈管形成効果） ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）は、新脈管形成を試験するために十分に確立した系
である。ＣＡＭにおける血管形成は、容易に可視化および定量可能である。Ｄ−
ＳＬＡＭの、ＣＡＭにおける新脈管形成を刺激する能力を試験し得る。
【０９０９】 Ｗｈｉｔｅ Ｌｅｇｈｏｒｎニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）の受精
卵および日本ウズラ（ｑｕａｌ）（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ ｃｏｔｕｒｎｉｘ）を、
３７．８℃および湿度８０％でインキュベートする。１６日齢のニワトリの分化
したＣＡＭおよび１３日齢のウズラの胚を以下の方法で研究する。
【０９１０】 発生の４日目に、ニワトリ卵の卵殻に窓を作る。この胚を正常な発生について
調べ、そしてこの卵をセロテープ（登録商標）で封着する。これらを、さらに１
３日目までインキュベートする。Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバーガラス（Ｎｕｎｃ，
Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を、直径約５ｍｍのディスクに切る。滅菌かつ無
塩成長因子を蒸留水に溶解し、そして約３．３ｍｇ／５ｍｌをディスクにピペッ
トで移す。風乾後、逆さにしたディスクをＣＡＭに適用する。３日後、標本を３
％グルタルアルデヒドおよび２％ホルムアルデヒド中に固定し、そして０．１２
Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液ですすぐ。これらを実体顕微鏡［Ｗｉｌｄ Ｍ８
］を用いて写真撮影し、上記のように半薄層切片化および超薄層切片化のために
包埋する。コントロールを、キャリアディスクのみで行う。
【０９１１】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験し
た。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌク
レオチド（例えば、遺伝子治療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニスト、および／または
アンタゴニストの活性を試験し得る。
【０９１２】 （実施例４４：マウスにおけるＭａｔｒｉｇｅｌ移植片を用いる新脈管形成ア
ッセイ） Ｄ−ＳＬＡＭのインビボ新脈管形成アッセイは、既存の毛細管網様構造の、マ
ウス細胞外マトリックス物質（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の移植したカプセル中に新し
い脈管を形成する能力を測定する。このタンパク質を、４℃で液体Ｍａｔｒｉｇ
ｅｌと混合し、次いでこの混合物を、マウスに皮下（ここで、この混合物は凝固
する）注射する。７日後、Ｍａｔｒｉｇｅｌの固体「プラグ」を取り除き、そし
て新しい血管の存在について試験する。Ｍａｔｒｉｇｅｌを、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ／Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅ
ｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入する。
【０９１３】 ４℃で解凍した時、Ｍａｔｒｉｇｅｌ物質は液体である。このＭａｔｒｉｇｅ
ｌを、４℃にて１５０ｎｇ／ｍｌでＤ−ＳＬＡＭと混合し、冷３ｍｌシリンジ中
に入れる。約８週齢の雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、腹部の中腹側面の２つの部
位にＭａｔｒｉｇｅｌおよび実験タンパク質の混合物を注射する（０．５ｍｌ／
部位）。７日後、このマウスを頚椎脱臼により屠殺し、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグ
を取り除きそして洗浄する（すなわち、全ての付着する膜および腺維組織を取り
除く）。複製のプラグ全体を中性緩衝化１０％ホルムアミド中で固定し、パラフ
ィン中に包埋し、そしてＭａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅで染色後、組織
学的試験のための切片を作製するために使用する。各プラグの３つの異なる領域
からの切片を、処理する。選択した切片をｖＷＦの存在について染色する。この
アッセイについての陽性コントロールは、ウシ塩基性ＦＧＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ
）である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ単独を用いて、新脈管形成の基底レベルを決定する
。
【０９１４】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験し
た。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌク
レオチド（例えば、遺伝子治療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニスト、および／または
アンタゴニストの活性を試験し得る。
【０９１５】 （実施例４５：ウサギ下肢モデルにおける虚血の救出） Ｄ−ＳＬＡＭの虚血に対するインビボでの効果を研究するため、ウサギ後肢虚
血モデルを、以前に記載される（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ａｍ Ｊ．Ｐａ
ｔｈｏｌ １４７：１６４９−１６６０（１９９５））ように１つの大腿動脈の
外科的除去により作製する。大腿動脈の切除は、血栓の逆行性伝播および外腸骨
動脈の閉塞を生じる。結果として、虚血肢への血流は、内腸骨動脈から生じる側
副血管に依存する（Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ １４７：
１６４９−１６６０（１９９５））。１０日の間隔で、ウサギの手術後の回復お
よび内因性の側副血管の発達を可能にする。手術後１０日目（０日目）に、ベー
スライン血管造影を行った後、虚血肢の内腸骨動脈を、５００ｍｇの裸のＤ−Ｓ
ＬＡＭ発現プラスミドを用いて、（Ｒｉｅｓｓｅｎ，Ｒ．ら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．４：７４９−７５８（１９９３）；Ｌｅｃｌｅｒｃ，Ｇ．ら、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：９３６−９４４（１９９２））に記載されるよ
うに、ヒドロゲル被覆バルーンカテーテルを用いる動脈遺伝子移入技術により、
トランスフェクトする。Ｄ−ＳＬＡＭを処置に用いる場合、５００ｍｇのＤ−Ｓ
ＬＡＭまたはコントロールの単回ボーラスを、注入カテーテルを通じて１分間に
わたり、虚血肢の内腸骨動脈中に送達する。３０日目に、種々のパラメーターを
、これらのウサギで測定する：（ａ）ＢＰ比−虚血肢の収縮期血圧 対 正常肢
の収縮期血圧の比；（ｂ）血流および逆流−停止ＦＬ：非拡張状態の間の血流、
および最大ＦＬ：完全拡張状態の間の血流（また、血管量の間接的測定）、そし
て逆流は、最大ＦＬ：停止ＦＬの比に反映される；（ｃ）血管造影値（ａｎｇｉ
ｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｃｏｒｅ）−これを側副血管の血管造影により測定する。
値を、かぶせたグリッド内の円の百分率（ウサギ大腿の総数ｍで割った横断不透
明化動脈を用いる）により決定する；（ｄ）毛細管（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）密度
−後肢から得た光学顕微鏡用切片において決定した側副毛細血管の数。
【０９１６】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験し
た。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌク
レオチド（例えば、遺伝子治療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニストおよび／またはア
ンタゴニストを試験し得る。
【０９１７】 （実施例４６：Ｄ−ＳＬＡＭの血管拡張に対する効果） 血管内皮の拡張は、血圧の低下に重要であるので、高血圧自然発症ラット（Ｓ
ＨＲ）において、Ｄ−ＳＬＡＭが血圧に影響を与える能力を、試験する。漸増用
量（０、１０、３０、１００、３００、および９００ｍｇ／ｋｇ）のＤ−ＳＬＡ
Ｍを、１３〜１４週齢の高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）に投与する。データを
、平均＋／−ＳＥＭで表す。統計学的分析を、両側ｔ検定を用いて行い、そして
統計的な有意性を、緩衝液単独への応答に対するｐ＜０．０５として定義する。
【０９１８】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験し
た。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌク
レオチド（例えば、遺伝子治療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニスト、および／または
アンタゴニストの活性を試験し得る。
【０９１９】 （実施例４７：ラット虚血皮膚弁モデル） 評価パラメーターは、皮膚の血流、皮膚温度、および第ＶＩＩＩ因子の免疫組
織化学または内皮アルカリホスファターゼ反応を含む。皮膚虚血の間のＤ−ＳＬ
ＡＭの発現を、インサイチュハイブリダーゼーションを用いて研究する。
【０９２０】 このモデルにおける研究を、以下の３つの部分に分ける： ａ）虚血皮膚 ｂ）虚血皮膚創傷 ｃ）通常の創傷。
【０９２１】 実験プロトコルは以下を含む： ａ）３×４ｃｍの単一茎全層無作為皮膚弁（ｓｉｎｇｌｅ ｐｅｄｉｃｌｅ
ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｒａｎｄｏｍ ｓｋｉｎ ｆｌａｐ）（動物の
下背部にわたる筋皮弁）を生じさせる ｂ）虚血皮膚（皮膚弁）に切除創傷をつくる（直径４〜６ｍｍ） ｃ）次の種々の投薬範囲のＤ−ＳＬＡＭを用いる、切除創傷（創傷後の０、１
、２、３、４日目）の局所的な処置：１ｍｇ〜１００ｍｇ ｄ）組織学的研究、免疫組織化学的研究、およびインサイチュ研究のために、
創傷後の３、５、７、１０、１４、および２１日目に創傷組織を収集する。
【０９２２】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験す
る。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌク
レオチド（例えば、遺伝子治療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニスト、および／または
Ｄ−ＳＬＡＭのアンタゴニストの活性を試験し得る。
【０９２３】 （実施例４８：末梢動脈疾患モデル） Ｄ−ＳＬＡＭを用いる脈管形成治療は、末梢動脈疾患の場合の虚血の周囲の血
流の回復を得る新規の治療的ストラテジーである。実験プロトコルは以下を含む
： ａ）一方の片側の大腿動脈を、後肢の虚血筋肉を作製するために結紮する。他
方の片側の後肢は、コントロールの役割をする ｂ）Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質を、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲で、静脈内
および／または筋肉内に一週間あたり３回（おそらくより多く）で２〜３週間、
送達する ｃ）この虚血筋肉組織を、大腿動脈の結紮後、１、２、および３週間目に、Ｄ
−ＳＬＡＭの発現の分析ならびに組織学のために収集する。生検もまた、他方の
片側の対側後肢の正常な筋肉において行う。
【０９２４】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験す
る。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌク
レオチド（例えば、遺伝子治療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニスト、および／または
Ｄ−ＳＬＡＭのアンタゴニストの活性を試験し得る。
【０９２５】 （実施例４９：虚血心筋疾患モデル） Ｄ−ＳＬＡＭを、側副血管の発達を刺激し得、かつ冠状動脈閉塞後の新しい血
管も修復し得る強力なマイトジェンとして評価する。Ｄ−ＳＬＡＭの発現の変化
を、インサイチュで研究する。実験プロトコルは、以下を含む： ａ）心臓を、ラットの左側開胸術を介して露出する。直ちに、左冠状動脈を、
細い縫合糸（６−０）を用いて咬合し、そして胸郭を閉じる ｂ）Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質を、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲で、静脈内
および／または筋肉内に一週間あたり３回（おそらくより多く）で２〜４週間、
送達する ｃ）手術の３０日後、この心臓を、形態測定およびインサイチュ分析のために
取り出しそして横断切片化する。
【０９２６】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験す
る。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌク
レオチド（例えば、遺伝子治療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニスト、および／または
Ｄ−ＳＬＡＭのアンタゴニストの活性を試験し得る。
【０９２７】 （実施例５０：ラット角膜創傷治癒モデル） この動物モデルは、新生血管形成に対するＤ−ＳＬＡＭの効果を示す。実験プ
ロトコルは、以下を含む： ａ）角膜の中心から間質層へと１〜１．５ｍｍの長い切開を作る ｂ）目の外端に面する切開の唇縁の下にスパーテルを挿入する ｃ）ポケットを作る（その基底は、目の縁から（ｆｏｒｍ）１〜１．５ｍｍで
ある） ｄ）５０ｎｇ〜５μｇのＤ−ＳＬＡＭを含む小丸剤を、ポケット内に配置する ｅ）Ｄ−ＳＬＡＭでの処置をまた、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲内で（毎
日の処置を５日間）角膜創傷に局所的に適用し得る。
【０９２８】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験す
る。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌク
レオチド（例えば、遺伝子治療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニスト、および／または
Ｄ−ＳＬＡＭのアンタゴニストの活性を試験し得る。
【０９２９】 （実施例５１：糖尿病マウスおよび糖質コルチコイド障害性創傷治癒モデル） （Ａ．糖尿病ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスモデル） Ｄ−ＳＬＡＭが治癒プロセスを促進することを実証するために、創傷治癒の遺
伝的糖尿病マウスモデルを使用する。ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスにおける全層（ｆｕ
ｌｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）創傷治癒モデルは、障害性の創傷治癒の十分に特徴
付けられた、臨床的に関連性のある、そして再現可能なモデルである。糖尿病性
創傷の治癒は、収縮よりむしろ肉芽組織の形成および再上皮形成に依存する（Ｇ
ａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５２：３８９（１９９２）
；Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２
３５（１９９０））。
【０９３０】 この糖尿病動物は、ＩＩ型真性糖尿病において観察される多くの特徴的な特性
を有する。ホモ接合（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、それらの正常なヘテロ接合（
ｄｂ＋／＋ｍ）同腹仔と比較して肥満である。変異体糖尿病（ｄｂ＋／ｄｂ＋）
マウスは、第４染色体（ｄｂ＋）上の単一の常染色体性の劣性変異を有する（Ｃ
ｏｌｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２８
３−２９３（１９８２））。動物は、多食症、多渇症、および多尿症を示す。変
異体糖尿病マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋）は、上昇した血中グルコース、増加したま
たは正常なインスリンレベル、および抑制された細胞媒介免疫を有する（Ｍａｎ
ｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５（１９７８）；Ｄｅｂｒａｙ
−Ｓａｃｈｓ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１（１）：１−
７（１９８３）；Ｌｅｉｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１１４：４
６−５５（１９８５））。末梢神経障害、心筋合併症、および微小血管病変、基
底膜肥厚、および糸球体濾過異常は、これらの動物において記載されている（Ｎ
ｏｒｉｄｏ，Ｆ．ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．８３（２）：２２１−２３２（１
９８４）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２９（１）：６０−６７
（１９８０）；Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．４０（４）：
４６０−４７３（１９７９）；Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．、Ｄｉａｂｅｔｅｓ
３１（補遺）：１−６（１９８２））。これらのホモ接合糖尿病マウスは、高血
糖症を発症し、そしてこれは、ヒトＩＩ型糖尿病に類似してインスリンに対して
耐性である（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５−１３７
７（１９７８））。
【０９３１】 これらの動物において観察した特徴は、このモデルにおける治癒が、ヒト糖尿
病において観察した治癒に類似し得ることを示す（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈら、Ａ
ｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５−１２４６（１９９０））。
【０９３２】 遺伝的糖尿病の雌性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウス、およびそ
れらの非糖尿病（ｄｂ＋／＋ｍ）へテロ接合性同腹仔を、この研究に用いた（Ｊ
ａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。これらの動物を６週齢で購入し、
研究の開始時は８週齢である。動物を個別に飼育し、そして自由に食物と水を与
える。全ての操作を、無菌操作を用いて行う。この実験を、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍ
ａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｕ
ｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って行う。
【０９３３】 創傷プロトコルを、以前に報告された方法に従って行う（Ｔｓｕｂｏｉ，Ｒ．
およびＲｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：２４５−２５１
（１９９０））。簡単には、創傷させる日に、動物を、脱イオン水に溶解したＡ
ｖｅｒｔｉｎ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、２，２，２−トリブロモエタノールおよ
び２−メチル−２−ブタノールの腹腔内注射で麻酔する。動物の背面領域を剃毛
し、そして皮膚を７０％エタノール溶液およびヨウ素で洗浄する。手術範囲を、
創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。次いで、８ｍｍの全層創傷を、Ｋｅｙ
ｅｓ組織パンチを用いて作製する。創傷させたすぐ後に、周囲の皮膚を、創傷の
拡大を取り除くために穏やかに伸ばす。実験の間、この創傷を開放しておく。処
置の適用は、創傷させた日から５日間連続で、局所的に受ける。処置の前に、創
傷を、滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。
【０９３４】 創傷を視覚的に検査し、そして手術の日およびその後２日間隔で、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目の毎日および８日目の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎノギスを用
いて水平および垂直に測定する。肉芽組織がもはや目に見えずかつ創傷を連続し
た上皮が覆う場合に、創傷を治癒したとみなす。
【０９３５】 Ｄ−ＳＬＡＭを、ビヒクル中で８日間、異なる用量のＤ−ＳＬＡＭの範囲（１
日あたり創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。ビヒクルコントロ
ール群は、５０ｍＬのビヒクル溶液を受けた。
【０９３６】 動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学および免疫組
織化学のために収集する。組織標本を、さらなるプロセシングのために、生検ス
ポンジの間の組織カセット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【０９３７】 各々１０匹の動物（５匹の糖尿病および５匹の非糖尿病コントロール）の３つ
の群：１）ビヒクルプラシーボコントロール、２）Ｄ−ＳＬＡＭを、評価する。
【０９３８】 創傷閉鎖を、垂直軸および水平軸で面積を測定すること、および創傷の面積の
合計を得ることにより分析する。次いで、収縮を、最初の創傷の面積（０日）と
処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこ
の創傷面積は、６４ｍｍ2（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下
の式を用いて行う： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］ 標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミ
クロトームを用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染
色を、二等分した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験を用いて、修復し
た皮膚の治癒プロセスおよび形態的な外見を、Ｄ−ＳＬＡＭを用いる処置によっ
て改変したかどうかを評価する。この評価は、細胞蓄積、炎症細胞、毛細管、線
維芽細胞、再上皮形成、および表皮成熟の存在の検証を含む（Ｇｒｅｅｎｈａｌ
ｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９０））
。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲検観察者（ｂｌｉｎｄｅｄ ｏｂｓｅ
ｒｖｅｒ）が用いる。
【０９３９】 組織切片をまた、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ検出システムを使用してポリクローナル
ウサギ抗ヒトケラチン抗体で免疫組織化学的に染色する。ヒト皮膚を陽性組織コ
ントロールとして用いる一方、非免疫ＩｇＧを陰性コントロールとして用いる。
ケラチノサイト増殖を、目盛り付きレンズマイクロメーターを用いて創傷の再上
皮形成の程度を評価することによって決定する。
【０９４０】 皮膚標本における増殖細胞核抗原／サイクリン（ＰＣＮＡ）を、ＡＢＣ Ｅｌ
ｉｔｅ検出システムを用いて抗ＰＣＮＡ抗体（１：５０）を使用することにより
実証する。ヒト結腸癌は、陽性組織コントロールとして役割を果たし、そしてヒ
ト脳組織を、陰性組織コントロールとして用いる。各標本は、１次抗体の脱落お
よび非免疫マウスＩｇＧとの置換を有する切片を含む。これらの切片の順位は、
０〜８のスケール（わずかな増殖を反映するより低い側のスケール〜激しい増殖
を反映するより高い側）の増殖の程度に基づく。
【０９４１】 実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみな
す。
【０９４２】 （Ｂ．ステロイド障害性ラットモデル） ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々のインビトロ系およびインビボ系に
おいて十分に実証されている（Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉ
ｄｓ ａｎｄ Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ：Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏ
ｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ａｓｐｅｃｔｓ．２８０−３０２（１９８９）； Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：４７６−４８１（１９７５）；Ｗｅｒｂ，Ｚ．ら、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：１６８４−１６９４（１９７８））。糖質コルチ
コイドは、新脈管形成を阻害すること、血管透過性（Ｅｂｅｒｔ，Ｒ．Ｈ．ら、
Ａｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．３７：７０１−７０５（１９５２））、線維芽細
胞増殖、およびコラーゲン合成（Ｂｅｃｋ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃ
ｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．ら、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８））を低下させるこ
と、ならびに循環する単球の一過性の減少を生じること（Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ
．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）；Ｗａ
ｈｌ，Ｓ．Ｍ．、「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈ
ｅａｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔ
ｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９））によ
って創傷治癒を遅延させる。障害性創傷治癒に対するステロイドの全身性投与は
、ラットにおいて十分に確立された現象である（Ｂｅｃｋ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｇｒｏ
ｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）； Ｈａｙｎｅｓ，
Ｂ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）
；Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．、「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎ
ｄ ｈｅａｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ
Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９）
；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｇ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：２２２９−２２３３（１９８９））。
【０９４３】 Ｄ−ＳＬＡＭが治癒プロセスを促進し得ることを実証するために、治癒がメチ
ルプレドニゾロンの全身性投与により損なわれる、ラットの全層切除皮膚創傷に
対するＤ−ＳＬＡＭの複数の局所適用の効果を評価する。
【０９４４】 若年成体の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（体重２５０〜３００ｇ
）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、この実施例
に用いる。この動物を、８週齢で購入し、研究の開始時は９週齢である。ラット
の治癒応答は、創傷の時点で、メチルプレドニゾロンの全身性投与（１７ｍｇ／
ｋｇ／ラット、筋肉内）により損なわれる。動物を個別に飼育し、そして自由に
食物と水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて行う。この研究を、Ｈｕｍ
ａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａ
ｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ
ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ
ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従っ
て行う。
【０９４５】 創傷プロトコルは、上記Ａ節に従う。創傷させる日に、動物をケタミン（５０
ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔する。この
動物の背面領域を剃毛し、そして皮膚を７０％エタノールおよびヨウ素溶液で洗
浄する。手術範囲を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。８ｍｍの全層創
傷をＫｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。実験の間、この創傷を開放してお
く。創傷させ、次いでメチルプレドニゾロン投与した日から試験物質の適用を開
始して、１日１回、７日間連続で、局所的に与える。処置の前に、創傷を滅菌生
理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。
【０９４６】 創傷を視覚的に検査し、そして創傷させた日および処置の終りに、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目の毎日および８日目の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎノギスを用
いて水平および垂直に測定する。肉芽組織がもはや目に見えずかつ創傷を連続し
た上皮が覆う場合に、創傷を、治癒したとみなす。
【０９４７】 Ｄ−ＳＬＡＭを、ビヒクル中で８日間、異なる用量のＤ−ＳＬＡＭの範囲（１
日あたり創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。ビヒクルコントロ
ール群は、５０ｍＬのビヒクル溶液を受けた。
【０９４８】 動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学のために収集
する。組織標本を、さらなるプロセシングのために、生検スポンジの間の組織カ
セット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【０９４９】 各々１０匹の動物（メチルプレドニゾロンを用いる５匹および糖質コルチコイ
ドを用いない５匹）の４つの群を評価する：１）非処置群、２）ビヒクルプラシ
ーボコントロール、３）Ｄ−ＳＬＡＭ処置群。
【０９５０】 創傷閉鎖を、垂直軸および水平軸で面積を測定すること、および創傷の面積の
合計を得ることにより分析する。次いで、閉鎖を、最初の創傷の面積（０日）と
処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこ
の創傷面積は、６４ｍｍ2（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下
の式を用いて行う： ［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］ 標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＯｌｙｍｐｕｓミクロトームを
用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、二等分
した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験は、修復した皮膚の治癒プロセ
スおよび形態的な外見がＤ−ＳＬＡＭを用いる処置によって改善したかどうかを
評価することを可能にする。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲検観察者が
用いて、創傷の隙間の距離を決定する。
【０９５１】 実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみな
す。
【０９５２】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験す
る。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌク
レオチド（例えば、遺伝子治療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニスト、および／または
Ｄ−ＳＬＡＭのアンタゴニストの活性を試験し得る。
【０９５３】 （実施例５２：リンパ水腫（ｌｙｍｐｈａｄｅｍａ）動物モデル） この実験アプローチの目的は、ラット後肢におけるリンパ管形成（ｌｙｍｐｈ
ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）およびリンパの循環系の再確立におけるＤ−ＳＬＡ
Ｍの治療的効果を試験するための、適切かつ一貫したリンパ水腫モデルを作製す
ることである。有効性は、罹患した肢の腫脹体積の量、リンパの脈管構造の量の
定量、総血漿タンパク質、および組織病理学により測定される。急性リンパ水腫
は、７〜１０日間観察される。恐らくより重要なことは、水腫の慢性進行は、３
〜４週間まで続く。
【０９５４】 手術を始める前に、血液サンプルを、タンパク質濃度分析のために採血する。
雄性ラット（体重約３５０ｇ）に、ペントバルビタールを投薬する。次いで、右
肢を膝から股関節部まで剃毛する。この剃毛した範囲を、７０％ＥｔＯＨに浸し
たガーゼで拭く。血液を、血清総タンパク質試験のために採血する。周径測定お
よび体積測定を行った後に、２つの測定レベル（踵の０．５ｃｍ上、足背の中間
点）に印をつけた後、足へと色素を注射する。右足背および左足背の両方の内皮
に、０．０５ｍｌの１％Ｅｖａｎ’ｓ Ｂｌｕｅを注射する。次いで、足への色
素の注射の後、周径測定および体積測定を行う。
【０９５５】 目印として膝関節を用いて、中肢鼡径部切開を、大腿血管の位置を確認できる
ように環状に行う。鉗子および止血鉗子を用いて、皮膚弁を切開し、そして分離
する。大腿血管の位置確認後、血管の横に沿ってかつ血管の下に走るリンパ管を
位置確認する。次いで、この範囲の主要なリンパ管を、電気凝固または縫合結紮
する。
【０９５６】 顕微鏡を用いて、肢の背部の筋肉（半腱様筋（ｓｅｍｉｔｅｎｄｉｎｏｓｉｓ
）および内転筋の付近）を平滑に切開する。次いで、膝窩リンパ節の位置を確認
する。次いで、２つの近位リンパ管および２つの遠位リンパ管、ならびに膝窩節
の遠位血液供給部を縫合糸により結紮する。次いで、膝窩リンパ節および任意の
付随する脂肪組織を、結合組織を切断することによって取り除く。
【０９５７】 この手順より生じるいかなる軽度の出血をも管理するように注意すること。リ
ンパ管を咬合した後、皮膚弁を、液体皮膚（Ｖｅｔｂｏｎｄ）（ＡＪ Ｂｕｃｋ
）を使用することによって密封する。別々の皮膚縁を、その下の筋肉組織に、脚
の周囲に約０．５ｃｍのギャップを残しながら密封する。皮膚はまた、必要なと
きにその下の筋肉に縫合することによって係留し得る。
【０９５８】 感染を回避するために、動物を、メッシュを用いて個別に収容する（床敷きな
し）。回復した動物を、最適な水腫ピークを通して毎日チェックする。このピー
クは、代表的には５〜７日まで生じる。次いで、プラトーの水腫ピークを観察す
る。リンパ水腫の強度を評価するために、各肢上の２つの指定した場所の周径お
よび体積を、操作の前および７日間毎日測定する。リンパ水腫に対する血漿タン
パク質の効果を決定し、そしてタンパク質分析が有用な試験周界であるか否かも
また調査する。コントロール肢および水腫肢の両方の重量を、２箇所で評価する
。分析を盲目様式（ｂｌｉｎｄ ｍａｎｎｅｒ）で行う。
【０９５９】 周径測定：肢の動きを防止するための短期気体麻酔のもとで、布巻尺を使用し
て、肢の周径を測定する。測定を、距骨および背面の足にて、２人の異なる人物
によって行い、次いで、これらの２つの読み取りを平均する。読み取りを、コン
トロール肢および水腫肢の両方から得る。
【０９６０】 体積測定：手術の日に、動物をペントバルビタールで麻酔し、そして手術の前
に試験する。毎日の体積測定のために、動物を短期ハロタン麻酔（迅速な固定化
およびすばやい回復）のもとにおき、両方の脚を剃毛し、そして耐水性マーカー
を用いて脚に等しく印をつける。脚を、最初に水に漬け、次いで各々印をつけた
レベルまで装置に漬け、次いでＢｕｘｃｏ水腫ソフトウェア（Ｃｈｅｎ／Ｖｉｃ
ｔｏｒ）によって測定する。データを１人の人物によって記録し、一方他者は、
脚を印をつけた領域まで漬ける。
【０９６１】 血液−血漿タンパク質測定：手術の前に血液を取り出し、遠心分離し、そして
血清を分離し、次いで、全タンパク質およびＣａ２＋比較について結論付ける。
【０９６２】 肢重量比較：血液を取り出した後、この動物を、組織収集のために調製する。
この肢を、キリチン（ｑｕｉｌｌｉｔｉｎｅ）を用いて切断し、次いで、実験用
脚とコントロール脚の両方を、結紮して切断し、そして秤量する。２回目の秤量
を、脛踵（ｔｉｂｉｏ−ｃａｃａｎｅａｌ）関節を外し、そして足を秤量して行
う。
【０９６３】 組織学的調製：膝（膝窩）領域の後ろに位置する横筋を切り出し、そして金属
型に配置し、ｆｒｅｅｚｅＧｅｌで満たし、冷メチルブタンに漬け、切断するま
で−８０ＥＣに、標識したサンプルバッグ中に置く。切断の際に、筋肉を、蛍光
顕微鏡のもとで、リンパ管について観察する。
【０９６４】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質の活性を試験す
る。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌク
レオチド（例えば、遺伝子治療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニスト、および／または
Ｄ−ＳＬＡＭのアンタゴニストの活性を試験し得る。
【０９６５】 （実施例５３：Ｄ−ＳＬＡＭによるＴＮＦα誘導性接着分子発現の抑制） 炎症および新脈管形成の領域に対するリンパ球の漸増は、リンパ球上の細胞表
面接着分子（ＣＡＭ）と血管内皮との間の特異的なレセプター−リガンド相互作
用に関する。この接着プロセスは、通常の設定および病理学的設定の両方におい
て、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−
１）、および内皮細胞（ＥＣ）における内皮白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチ
ン）の発現を含む、多段階カスケードに続く。血管内皮におけるこれらの分子お
よび他の分子の発現は、白血球が局所血管系に接着し得、そして炎症応答の発生
の間に局所組織に溢出し得る効率を決定する。サイトカインおよび増殖因子の局
所濃度は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。
【０９６６】 腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−ａ）（強力なプロ炎症性サイトカイン）は、内皮細
胞における３つ全てのＣＡＭの刺激因子であり、そして広範な種々の炎症応答に
関与し得、しばしば病理学的結果をもたらす。
【０９６７】 ＴＮＦ−ａ誘導性ＣＡＭ発現の抑制を媒介するＤ−ＳＬＡＭの潜在能力を試験
し得る。改変型ＥＬＩＳＡアッセイ（これは、固相吸着剤としてＥＣを使用する
）を使用して、ＦＧＦファミリーのタンパク質のメンバーを用いて同時刺激した
場合に、ＴＮＦ−ａ処理ＥＣにおけるＣＡＭ発現の量を測定する。
【０９６８】 この実験を行うために、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）培養物を、プール
した索採取物から得、そして１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマ
イシンを補充した増殖培地（ＥＧＭ−２；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ、ＣＡ）中で、５％ＣＯ2を含む３７℃の加湿インキュベーターにおいて維
持する。ＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ培地中１×１０4細胞／ウェルの濃度で、９６ウ
ェルプレート中に、３７℃で１８〜２４時間またはコンフルエントになるまで播
種する。続いて、単層を、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌス
トレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０の無血清溶液で３回洗浄し、そ
して所定のサイトカインおよび／または増殖因子を用いて、３７℃にて２４時間
処理する。インキュベーション後、次いで、この細胞を、ＣＡＭ発現について評
価する。
【０９６９】 ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、標準的な９６ウェルプレートにおいて
コンフルエントになるまで増殖させる。増殖培地を、細胞から取り除き、そして
９０μｌの１９９培地（１０％ＦＢＳ）に置き換える。試験のためのサンプルお
よびポジティブコントロールまたはネガティブコントロールを、このプレートに
三連で添加する（１０μｌ容量で）。プレートを、３７℃にて、５時間（セレク
チンおよびインテグリン発現）または２４時間（インテグリン発現のみ）のいず
れかでインキュベートする。プレートを吸引して、培地を除去し、そして１００
μｌの０．１％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を有す
る）を各ウェルに添加する。プレートを、４℃にて３０分間保持する。
【０９７０】 次いで、固定液をウェルから除去し、そしてウェルをＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）
＋０．５％ ＢＳＡを用いて１回洗浄し、そして排水する。このウェルを乾燥さ
せないこと。１０μｌの希釈した一次抗体を、試験ウェルおよびコントロールウ
ェルに添加する。抗ＩＣＡＭ−１−ビオチン、抗ＶＣＡＭ−１−ビオチンおよび
抗Ｅ−セレクチン−ビオチンを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ／ｍｌスト
ック抗体の１：１０希釈）で使用する。細胞を、加湿した環境において、３７℃
にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５
％ ＢＳＡを用いて３回洗浄する。
【０９７１】 次いで、２０μｌの希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈ
ｏｓｐｈｏｔａｓｅ（１：５，０００希釈）を各ウェルに添加し、そして３７℃
にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５
％ ＢＳＡを用いて３回洗浄する。１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェート（
ｐＮＰＰ）を、５ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ１０．４）に溶解させる。グリシ
ン緩衝液中のｐＮＰＰ基質１００μｌを、各試験ウェルに添加する。三連の標準
ウェルを、グリシン緩衝液中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈ
ｏｓｐｈｏｔａｓｅの操作希釈（ｗｏｒｋｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（１：５
，０００（１０0）＞１０-0.5＞１０-1＞１０-1.5）から調製する。５μｌの各
希釈物を、三連のウェルに添加し、そして各ウェル中の得られたＡＰ含量は、５
．５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇである。次いで、１０
０μｌのｐＮＰＰ試薬を、標準ウェルの各々に添加しなければならない。このプ
レートを、３７℃にて４時間インキュベートしなければならない。３Ｍ ＮａＯ
Ｈの５０μｌの容量を、全てのウェルに添加する。この結果を、プレートリーダ
ーにおいて４０５ｎｍにて定量する。バックグラウンド減算オプションを、グリ
シン緩衝液のみで満たしたブランクウェルにおいて使用する。このテンプレート
を、各々の標準ウェルにおけるＡＰ結合体の濃度を示すように設定する［５．５
０ｎｇ；１．７４ｎｇ；０．５５ｎｇ；０．１８ｎｇ］。結果を、各サンプル中
の結合したＡＰ結合体の量として示す。
【０９７２】 本実施例において記載される研究は、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質活性を試験した
。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、Ｄ−ＳＬＡＭポリヌクレ
オチド（例えば、遺伝子治療）、Ｄ−ＳＬＡＭのアゴニスト、および／またはア
ンタゴニストの活性を試験し得る。
【０９７３】 （実施例５４：マウスのリンパ萎縮症および発育不全に関連する対宿主性移植
片病の処置におけるＤ−ＳＬＡＭおよびそのアンタゴニストおよびそのアゴニス
トの効果） 対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）に関連するリンパ萎縮症／発育不全の処置、予
防、検出、および／または診断のためのＤ−ＳＬＡＭのアンタゴニスト（例えば
、抗Ｄ−ＳＬＡＭ抗体）の使用の分析を、（ＢＡＬＢ／ｃ Ｘ Ｃ５７ＢＬ／６
）Ｆ１（ＣＢＦ１）マウスモデルへのＣ５７ＢＬ／６親の使用を介して行う。Ｆ
１マウスモデルへの、この親はよく特徴付けられており、そして骨髄移植患者に
おける生殖可能なＧＶＨＤの動物モデルである。この親は、当業者には周知であ
る（Ｇｌｅｉｃｈｅｍａｎｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ５：３２４，１
９８４を参照のこと）。可溶性Ｄ−ＳＬＡＭアンタゴニストは、Ｂリンパ球の増
殖および分化を誘導し、そしてＧＶＨＤのこの動物モデルにおいて観察されるリ
ンパ萎縮症および発育不全を矯正すると予期される（Ｐｉｇｕｅｔら、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１６６：１２８０（１９８７）；Ｈａｔｔｏｒｉら、Ｂｌｏｏｄ
９０：５４２（１９９７））。
【０９７４】 ＧＶＨＤ条件の開始は、（ＢＡＬＢ／ｃ Ｘ Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆ１マウスへ
のＣ５７ＢＬ／６マウス由来の約１〜５×１０8の脾臓細胞の静脈内注射によっ
て誘導される（両方は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａ
ｉｎｅより入手可能である）。６〜８匹のマウスの群は、０．１〜５．０ｍｇ／
ｋｇのＤ−ＳＬＡＭアンタゴニストまたは緩衝液コントロールのいずれかを、腹
腔内、筋内または皮内に毎日受ける。それは親細胞の注入の後、リンパ萎縮症お
よび発育不全が軽症（約５日）、中程度（約１２日）、または重症（約２０日）
である日より始まる。リンパ萎縮症および脾臓の発育不全におけるＤ−ＳＬＡＭ
アンタゴニストの効果は、１０〜３０日の間の複数の時点（３〜４）でＦＡＣＳ
および組織病理学よって分析される。簡単には、脾細胞は、正常ＣＢＦ１、ＧＶ
ＨＤ、またはＤ−ＳＬＡＭアンタゴニスト処理されたマウスより調製され、そし
てフルオレセインフィコエリトリン結合抗Ｈ−２Ｋｂ、ビオチン結合抗Ｈ−２Ｋ
ｄ、およびＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、または抗Ｂ２２０、続いてＣｙＣ
ｈｒｏｍｅ結合アビジンで染色される。これらの結合抗体のすべては、Ｐｈａｒ
Ｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より購入され得る。次いで、細胞を
ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ
）で分析する。受容者およびドナーのリンパ球を、それぞれＨ−２Ｋｂ＋Ｋｄ＋
およびＨ−２Ｋｂ＋Ｋｄ−細胞として同定する。受容者またはドナー由来のＣＤ
＋４Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＢ２２０＋Ｂ細胞の細胞数は、回復された脾
細胞の総数から計算し、そして各々の亜集団の百分率は、３色分析によって決定
される。他のＧＶＨＤ関連器官（肝臓、皮膚、および腸）組織損傷の相対的な程
度の組織学的評価は、動物を屠殺した後、行われ得る。
【０９７５】 最後に、Ｄ−ＳＬＡＭアンタゴニストおよび緩衝処理された動物は、悪液質、
体重、および死亡率を評価するために１日おきに臨床的評価を受ける。
【０９７６】 本発明のＤ−ＳＬＡＭポリペプチドおよび／またはＤ−ＳＬＡＭアゴニストは
また、この急性ＧＶＨＤマウスモデルにおいて試験され得る。
【０９７７】 本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得
ることは、明らかである。本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の
教示を考慮して可能であり、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内に
ある。
【０９７８】 発明の背景、詳細な説明および実施例において引用された各文書の全開示（特
許、特許出願、学術文献、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示を含む）
は、本明細書中に参考として援用される。さらに、配列表が、本明細書中に参考
として援用される。
【０９７９】 さらに、本明細書とともに提出された配列表、ならびに２０００年３月１７日
に出願された同時係属出願番号第６０／１９０，０６２号、１９９９年８月５日
に出願された同第０９／３６９，２４８号、１９９９年２月４日に出願された米
国特許第０９／２４４，１１０号、１９９８年２月６日に出願された米国特許第
６０／０７３，９６２号および１９９９年２月４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９
９／０２４１５に提出された配列表（両方とも、コンピューター読み出し可能な
形式および文書の形式（各々の場合において））は、本明細書中にその全体が参
考として援用される。
【０９８０】
【表６】 ＡＴＣＣ寄託番号２０９６２３ 第２頁 （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０９８１】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９８２】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９８３】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０９８４】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルは専門家に対してのみ利用可能にさ
れる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が
完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。 ＡＴＣＣ寄託番号２０９６２３ 第３頁 （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９８５】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局Temp
Tempに対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ
ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／Ｒ
Ｏ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者に
よるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するも
のとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト
（ｌｉｓｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意
の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり
得る。
【０９８６】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜１Ｄは、Ｄ−ＳＬＡＭのヌクレオチド配列（配列番号１）および推定
アミノ酸配列（配列番号２）を示す。約アミノ酸１〜２２に位置する、予想され
るリーダー配列に下線を付している。
【図２】 図２は、ＢＬＡＳＴ分析により決定された、Ｄ−ＳＬＡＭタンパク質のアミノ
酸配列とヒトＳＬＡＭの翻訳産物（受託番号ｇｉ／９８４９６９）（配列番号３
）との間の同一の領域を示す。２つのポリペプチド間の同一アミノ酸は、影付き
で示され、一方保存アミノ酸は、四角で囲まれる。影付きにされた、および／ま
たは四角で囲まれたアミノ酸領域を試験することにより、当業者は、２つのポリ
ペプチド間の保存ドメインを容易に同定し得る。これらの保存ドメインは、本発
明の好ましい実施形態である。
【図３】 図３は、Ｄ−ＳＬＡＭアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、およびコ
イル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数および
表面の可能性を示し、全てはデフォルト設定を使用して作成された。「抗原性指
数またはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフにおいて、正のピークは、Ｄ−ＳＬ
ＡＭタンパク質の高度な抗原性領域（すなわち、本発明のエピトープ含有ペプチ
ドが得られ得る領域）の位置を示す。これらのグラフに規定されるドメインは、
本発明によって意図される。図３にグラフで要約されたデータの表示は、表１に
見出され得る。 この列は、表題の「Ｒｅｓ（残基）」、「Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（位置）」および
ローマ数字Ｉ〜ＸＩＶで表示される。この列の表題は、図３および表１に示され
るアミノ酸配列の以下の特徴をいう：「Ｒｅｓ」：配列番号２ならびに図１Ａお
よび１Ｂのアミノ酸残基；「位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」：配列番号２ならびに
図１Ａおよび１Ｂ内の対応する残基の位置；Ｉ：Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｉｎｓ
ｏｎα領域；ＩＩ：Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎα領域；ＩＩＩ：Ｇａｒｎｉｅｒ−
Ｒｏｂｓｏｎβ領域；ＩＶ：Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎβ領域；Ｖ：Ｇａｒｎｉｅ
ｒ−Ｒｏｂｓｏｎターン領域；ＶＩ：Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎターン領域；ＶＩ
Ｉ：Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎコイル領域；ＶＩＩＩ：Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌ
ｉｔｔｌｅ親水性プロット；ＩＸ：Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ疎水性プロット；Ｘ：
Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇα両親媒性領域；ＸＩ：Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇβ両親媒性領域
；ＸＩＩ：Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可塑性領域；ＸＩＩＩ：Ｊａｍｅｓｏ
ｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標、ならびにＸＩＶ：Ｅｍｉｎｉ表面可能性プロット。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/02 Ａ６１Ｐ 3/10 ４Ｃ０８４ 1/04 9/00 ４Ｈ０４５ 3/10 11/00 9/00 17/00 11/00 17/02 17/00 17/06 17/02 19/00 17/06 25/00 19/00 31/00 25/00 31/04 31/00 31/10 31/04 31/12 31/10 35/00 31/12 37/02 35/00 37/04 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 37/04 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ルーベン， スティーブン エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20832， オルネイ， ヘリテイジ ヒルズ ドラ イブ 18528 (72)発明者 ヤング， ポール イー． アメリカ合衆国 メリーランド 20878， ゲイザースバーグ， ベックウィズ ス トリート 122 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ42 QQ52 QQ79 QR56 QR59 QR62 QR77 QR80 QS24 QS25 QS34 4B064 AG01 AG27 AG31 CA02 CA10 CA19 DA01 DA13 4B065 AA26X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA23 CA17 CA18 CA53 CA56 CA59 NA01 NA13 NA14 ZA022 ZA362 ZA892 ZB072 ZB262 ZB322 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 DA86 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号１のポリヌクレオチドフラグメントまたはＡＴＣＣ寄託番号２
    ０９６２３に含まれるｃＤＮＡ配列のポリヌクレオチドフラグメント； （ｂ）配列番号２のポリペプチドフラグメントまたはＡＴＣＣ寄託番号２０９
    ６２３に含まれるｃＤＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号２のポリペプチドドメインまたはＡＴＣＣ寄託番号２０９６２
    ３に含まれるｃＤＮＡ配列をコードする、ポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号２のポリペプチドエピトープまたはＡＴＣＣ寄託番号２０９６
    ２３に含まれるｃＤＮＡ配列をコードする、ポリヌクレオチド； （ｅ）生物学的活性を有する、配列番号２のポリペプチドまたはＡＴＣＣ寄託
    番号２０９６２３に含まれるｃＤＮＡ配列をコードする、ポリヌクレオチド； （ｆ）配列番号１の改変体であるポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号１の対立遺伝子改変体であるポリヌクレオチド； （ｈ）配列番号２の種相同体をコードするポリヌクレオチド； （ｉ）（ａ）〜（ｈ）において特定されるポリヌクレオチドのいずれか１つに
    ストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、こ
    こで、該ポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみのヌクレオチド配列
    を有する核酸分子に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズしない、ポリヌ
    クレオチド、 からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有
    するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、成熟形態または分泌
    タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された
    核酸分子。
  3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号２として同
    定される配列をコードするヌクレオチド配列、またはＡＴＣＣ寄託番号２０９６
    ２３に含まれるコード配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号１の全体の
    ヌクレオチド配列、またはＡＴＣＣ寄託番号２０９６２３に含まれるｃＤＮＡ配
    列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  5. 【請求項５】 前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかか
    らの連続するヌクレオチド欠失を含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。
  6. 【請求項６】前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかから
    の連続するヌクレオチド欠失を含む、請求項３に記載の単離された核酸分子。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組換えベクタ
    ー。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組換え宿主細
    胞を作製する方法。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法によって産生される、組換え宿主細胞
    。
  10. 【請求項１０】 ベクター配列を含む、請求項９に記載の組換え宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 単離されたポリペプチドであって、以下： （ａ）配列番号２またはＡＴＣＣ寄託番号２０９６２３に含まれるコードされ
    た配列の、ポリペプチドフラグメント； （ｂ）生物学的活性を有する、配列番号２またはＡＴＣＣ寄託番号２０９６２
    ３に含まれるコードされた配列の、ポリペプチドフラグメント； （ｃ）配列番号２またはＡＴＣＣ寄託番号２０９６２３に含まれるコードされ
    た配列の、ポリペプチドドメイン； （ｄ）配列番号２またはＡＴＣＣ寄託番号２０９６２３に含まれるコードされ
    た配列の、ポリペプチドエピトープ； （ｅ）分泌タンパク質の成熟形態； （ｆ）全長分泌タンパク質； （ｇ）配列番号２の改変体； （ｈ）配列番号２の対立遺伝子改変体；または （ｉ）配列番号２の種相同体、 からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、
    単離されたポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 前記成熟形態または前記全長分泌タンパク質が、Ｃ末端ま
    たはＮ末端のいずれかからの連続するアミノ酸欠失を含む、請求項１１に記載の
    単離されたポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドに特異的に結
    合する、単離された抗体。
  14. 【請求項１４】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドを発現する、
    組換え宿主細胞。
  15. 【請求項１５】 単離されたポリペプチドを作製する方法であって、 （ａ）該ポリペプチドが発現されるような条件下で、請求項１４に記載の組換
    え宿主細胞を培養する工程；および （ｂ）該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する、方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法によって産生される、ポリペプチ
    ド。
  17. 【請求項１７】 医学的状態を予防、処置、または緩和する方法であって、
    請求項１１に記載のポリペプチドの治療有効量を、哺乳動物被験体に投与する工
    程を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 分泌タンパク質の発現または活性に関係付けられる被験体
    における病理学的状態、または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であ
    って、 （ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドにおいて変異の存在または非存在を
    決定する工程；および （ｂ）該変異の存在または非存在に基づいて病理学的状態、または病理学的状
    態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  19. 【請求項１９】 分泌タンパク質の発現または活性に関係付けられる被験体
    における病理学的状態、または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であ
    って、 （ａ）生物学的サンプルにおいて請求項１１に記載のポリペプチドの発現の存
    在または量を決定する工程、および （ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて病理学的状態、または
    病理学的状態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１１に記載のポリペプチドに対する結合パートナー
    を同定する方法であって、 （ａ）請求項１１に記載のポリペプチドを結合パートナーと接触させる工程；
    および （ｂ）該結合パートナーが該ポリペプチドの活性をもたらすかどうかを決定す
    る工程、 を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 配列番号２のｃＤＮＡ配列に対応する、遺伝子。
  22. 【請求項２２】 生物学的アッセイにおいて活性を同定する方法であって、
    ここで該方法が、以下： （ａ）細胞において配列番号１を発現させる工程； （ｂ）その上清を単離する工程； （ｃ）生物学的アッセイにおいて活性を検出する工程；および （ｄ）該活性を有する該上清においてタンパク質を同定する工程、 を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の方法によって産生される、産物。
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