CN104768571B - 多价异多聚体支架设计和构建体 - Google Patents

多价异多聚体支架设计和构建体 Download PDF

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Abstract

本文提供多功能性异多聚体蛋白。在具体实施方案中是一种异多聚体，其包含：至少两个多肽构建体，每个多肽构建体包含连接至转运蛋白多肽的至少一个货物多肽，所述转运蛋白多肽源自单体天然蛋白质，以使得所述单体构建体缔合以形成所述异多聚体，并且所述转运蛋白多肽缔合以形成所述单体天然蛋白质或其类似物的准天然单体结构。这些治疗上新颖的分子包含异多聚体，所述异多聚体包含充当用于缀合或融合治疗性分子实体(货物多肽)的支架，从而产生双特异性或多价分子物质。本文提供一种用于产生双特异性或多价分子物质的方法。

Description

多价异多聚体支架设计和构建体
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年7月13日提交的美国申请序列号61/671,640；2012年9月5日提交的美国申请序列号61/697,245；2013年1月30日提交的美国申请序列号61/758,701；以及2013年7月12日提交的美国申请序列号61/845,945的权益，所述申请特此以引用的方式整体并入。
发明领域
本发明的领域是合理设计用于生物治疗剂的定制开发的支架。
相关技术说明
在治疗性蛋白领域中，具有其多价靶标结合特征的抗体是用于设计药物候选物的优异支架。进一步推进这些特征，设计的双特异性抗体和其它特融合的多特异性治疗剂表现出双重或多重靶标特异性和产生具有新颖的作用模式的药物的机会。这类具有有利的药物代谢动力学和功能活性的多价和多特异性治疗性蛋白的开发一直是挑战。
人血清白蛋白(HSA或HA)(呈其成熟形式的585个氨基酸的蛋白质)负责大部分的血清渗透压并且还充当内源性和外源性配体的载体。白蛋白作为载体分子的作用及其稳定性质是在体内用作多肽的载体和转运蛋白所需的特性。
人血清白蛋白具有许多合乎需要的特征。HSA遍布于体内，但更具体的在间隙空间和血液中，血清浓度为40g/L(相当于0.7mM)(Yeh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：1904-1908(1992))。HSA被认为 是最丰富的血清蛋白并且负责维持摩尔渗透压浓度。HSA具有有利的药物代谢动力学特性并且通过肝和肾非常缓慢地清除，从而展示长达几周的体内半衰期(Yeh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：1904-1908(1992)；Waldmann，T.A.，AlbuminStructure，Function and Uses，第255-273页(1977)；Sarav等，J Am Soc Nephrol 20：1941-1952(2009))。HSA缺乏酶活性和抗原性，从而消除潜在的不良副作用。HSA充当内源性以及外源性配体的载体。HSA还已知渗透并保留在肿瘤间质中(参见Elsadek和Kratz，J.Control.Release(2012)157：4-28)。总之，这些特征可以至少部分地扩展至基于白蛋白的融合蛋白上。由治疗性蛋白展示的较差药物代谢动力学特性然后可被规避。
发明概述
本发明的一个目的是提供多价异多聚体支架和设计所述多价异多聚体支架的方法。在本发明的一方面，提供一种异多聚体，其包含：第一多肽构建体，其包含(i)第一转运蛋白多肽；以及第二多肽构建体，其包含(ii)第二转运蛋白多肽；其中所述第一和第二转运蛋白多肽中的每个包含与白蛋白多肽的区段具有至少90％同一性的氨基酸序列；并且其中所述第一和第二转运蛋白多肽通过所述白蛋白多肽在节段化位点处的节段化获得，以使得所述节段化导致所述节段化位点处0至3个氨基酸残基的缺失，其中所述转运蛋白多肽自组装以形成所述白蛋白多肽的单体形式的准天然结构。
在本发明的另一方面，提供一种异多聚体，其包含：第一多肽构建体，其包含(i)第一转运蛋白多肽；以及第二多肽构建体，其包含(ii)第二转运蛋白多肽；其中所述第一和第二转运蛋白多肽中的每个包含与白蛋白多肽的区段具有至少90％同一性的氨基酸序列；并且其中所述第一和第二转运蛋白多肽通过所述白蛋白多肽在节段化位点处的节段化获得，并且其中所述第一和第二转运蛋白多肽中的至少一个包含氨基酸残基至半胱氨酸或其类似物的至少一个突变，以使得所述半胱氨酸与另一转运蛋白多肽形成二硫键，这样使得所述转运蛋白多肽 自组装以形成所述白蛋白多肽的单体形式的准天然结构。
在本发明的另一个方面，提供一种异多聚体，其包含：第一多肽构建体，其包含(i)第一转运蛋白多肽和(ii)至少一个第一货物多肽，其是结合CD3、CD19、CD20、HER2或HER3的抗原结合多肽构建体；以及第二多肽构建体，其包含(iii)第二转运蛋白多肽和(iv)至少一个第二货物多肽，其中所述第一和第二转运蛋白多肽中的每个包含与白蛋白多肽的区段具有至少90％同一性的氨基酸序列；并且其中所述第一和第二转运蛋白多肽通过所述白蛋白多肽在节段化位点处的节段化获得，其中所述转运蛋白多肽自组装以形成所述白蛋白多肽的单体形式的准天然结构。
在本发明的另一个方面，提供一种宿主细胞，其包含编码本发明的异多聚体的核酸。
在本发明的另一个方面，提供一种药物组合物，其包含本发明的异多聚体和佐剂。
在本发明的另一个方面，提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者提供有效量的本发明的药物组合物。
在本发明的另一个方面，提供一种抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括使所述肿瘤与有效量的本发明的异多聚体相接触。
在本发明的另一个方面，提供一种缩小肿瘤的方法，所述方法包括使所述肿瘤与有效量的本发明的异多聚体相接触。
在本发明的另一个方面，提供一种从目标蛋白质设计自缔合多肽的方法，所述方法包括：使所述蛋白质在至少一个节段化位点处节段化以获得至少两个多肽区段，以使得所述多肽区段自组装以形成异多聚体，其中所述异多聚体形成所述蛋白质的准天然单体结构，所述方法包括以下步骤：选择所述目标蛋白质的至少一个环，所述至少一个环具有高溶剂可及表面积和与所述蛋白质的结构的剩余部分的有限 接触；以及每个选定环引入一个节段化位点，从而在所述至少两个多肽区段之间产生互补界面，其中所述界面是非极性的、广泛的和相互交叉的。
在本发明的另一个方面，提供一种通过本发明的方法设计的异多聚体。
在本发明的另一个方面，提供一种包含通过本发明的方法设计的异多聚体的治疗性支架。
本文提供多功能异多聚体和设计所述多功能异多聚体的方法。在某些实施方案中是异多聚体，每个异多聚体包含：至少一个第一多肽构建体，其包含至少一个货物分子和第一转运蛋白多肽；以及至少一个第二多肽构建体，其包含至少一个货物分子和第二转运蛋白多肽；其中所述转运蛋白多肽通过一种蛋白质的节段化获得，以使得所述转运蛋白多肽自组装以形成所述蛋白质或其类似物的准天然结构。在某些实施方案中，至少一个货物分子是药物或治疗剂。在某些实施方案中，具有相同性质的多于一个货物分子存在于所述转运蛋白多肽上。在某些实施方案中，至少一个货物分子是生物分子。在一个实施方案中，所述至少一种生物分子是DNA、RNA、PNA或多肽。在一个实施方案中，至少一个货物分子是多肽。在某些实施方案中，每个转运蛋白多肽是不稳定的，并且优先与至少一个其它转运蛋白多肽一起形成异多聚体。在某些实施方案中，每个转运蛋白多肽是稳定的，并且优先与至少一个其它转运蛋白多肽一起形成异多聚体。在某些实施方案中，所述异多聚化界面包含至少一个二硫键。在某些实施方案中，所述异多聚化界面不包含二硫键。
在某些实施方案中是一种异多聚体，其包含：至少两个多肽构建体，每个多肽构建体包含连接至转运蛋白多肽的至少一个货物多肽，其中所述转运蛋白多肽通过一种蛋白质的节段化而源自所述蛋白质，每个转运蛋白多肽包含与所述蛋白质的区段具有至少90％同一性的 氨基酸序列，并且其中所述转运蛋白多肽自组装以形成所述蛋白质或其类似物的准天然单体结构。在某些实施方案中，所述异多聚体是异二聚体。在一个实施方案中，所述异多聚体是双特异性的。在一个实施方案中，所述异多聚体是多特异性的。在某些实施方案中，所述异多聚体是二价的。在一个实施方案中，所述异多聚体是多价的。在一个实施方案中，所述异多聚体是多功能性的。在某些实施方案中，至少一个转运蛋白多肽不是源自抗体。在某些实施方案中，所述转运蛋白多肽不是源自抗体。在某些实施方案中，所述转运蛋白多肽是白蛋白的衍生物。在本文所描述的异多聚体的某些实施方案中，所述转运蛋白多肽源自SEQ ID No.1的人血清白蛋白(HSA或HA)。在本文所描述的异多聚体的某些实施方案中，所述转运蛋白多肽源自异白蛋白(HAA)。在本文所描述的异多聚体的某些实施方案中，所述转运蛋白多肽源自与SEQ ID No.1的人血清白蛋白(HSA或HA)同源的序列。在某些实施方案中，所述转运蛋白多肽源自人血清白蛋白(HSA或HA)的片段，其中所述HAS包含如SEQID No.1中所示的序列。
在本文所描述的异多聚体的一些实施方案中，所述转运蛋白多肽是膜联蛋白(annexin)的衍生物。在一个实施方案中，所述转运蛋白多肽源自不同的膜联蛋白。在某些实施方案中，所述转运蛋白多肽源自相同的膜联蛋白。在一个实施方案中，至少一个转运蛋白多肽源自膜联蛋白A1或脂皮质蛋白(lipocortin)I。在所述异多聚体的某些实施方案中，所有转运蛋白多肽源自SEQ ID NO：14的膜联蛋白A1。在所述异多聚体的某些实施方案中，至少一个转运蛋白多肽源自与SEQ ID NO：14同源的序列。在一个实施方案中，至少一个转运蛋白多肽源自膜联蛋白A2或膜联蛋白II。在所述异多聚体的某些实施方案中，所有转运蛋白多肽源自膜联蛋白A2或脂皮质蛋白II。在一个实施方案中，至少一个转运蛋白多肽源自膜联蛋白样蛋白质。在所述异多聚体的某些实施方案中，所有转运蛋白多肽源自膜联蛋白样蛋白质。在一个实施方案中，至少一个转运蛋白多肽源自包括膜联蛋白A1-膜联蛋白A7的组。在本文所描述的异多聚体的一个实施方案中，所有转 运蛋白多肽源自包括膜联蛋白A1-膜联蛋白A7的组。SEQ ID No.-14。在某些实施方案中，基于第一膜联蛋白的转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：15的序列，并且基于第二膜联蛋白的转运蛋白多肽具有包含SEQ IDNO：16的序列。
在本文所描述的异多聚体的一些实施方案中，所述转运蛋白多肽是转铁蛋白的衍生物。在一个实施方案中，至少一个转运蛋白多肽源自转铁蛋白。在所述异多聚体的某些实施方案中，至少一个转运蛋白多肽源自SEQ ID NO：19的转铁蛋白或其类似物。在所述异多聚体的某些实施方案中，至少一个转运蛋白多肽源自与所述转铁蛋白同源的多肽序列。在本文所描述的异多聚体的某些实施方案中，至少一个转运蛋白多肽源自脱铁转铁蛋白(apo-transferrin)。在某些实施方案中，基于第一转铁蛋白的转运蛋白多肽具有包含SEQID NO：15的序列，并且基于第二转铁蛋白的转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：16的序列。
在所述异多聚体的某些实施方案中，至少一个货物分子是货物多肽。在本文所描述的异多聚体的一个实施方案中，所有货物分子是货物多肽。在某些实施方案中，所述货物多肽是治疗性蛋白或其片段或变体。在某些实施方案中，所述货物多肽是抗原或其片段或变体。在某些实施方案中，所述货物多肽是抗原受体或其片段或变体。在一些实施方案中，所述货物多肽是结合靶多肽的抗体、抗体结构域、配体或受体。在一些实施方案中，至少一个货物多肽与转运蛋白多肽融合。在某些实施方案中，至少一个货物多肽连接至转运蛋白多肽的N末端。在一些实施方案中，至少一个货物多肽连接至转运蛋白多肽的C末端。在一些实施方案中，至少一个货物多肽化学连接至转运蛋白多肽。在本文所描述的异多聚体的一些实施方案中，至少一个货物多肽包含GLP-1或其片段或变体。在一些实施方案中，至少一个货物多肽包含胰高血糖素或其片段或变体。在一个实施方案中，至少一个货物多肽包含EGF-A样结构域。
本文提供异多聚体，每个异多聚体包含：至少一个第一多肽构建体，其包含至少一个货物多肽和第一转运蛋白多肽；以及至少一个第二多肽构建体，其包含至少一个货物多肽和第二转运蛋白多肽。在某些实施方案中，所述异多聚体是异二聚体。在一个实施方案中，所述异多聚体是多特异性的。在一个实施方案中，所述异多聚体是双特异性的。在所述异多聚体的某些实施方案中，所述转运蛋白多肽是相同蛋白质的衍生物。在某些实施方案中，所述转运蛋白多肽是白蛋白的衍生物。在本文所描述的异多聚体的某些实施方案中，所述转运蛋白多肽源自SEQ ID No.1的人血清白蛋白。在某些实施方案中，所述转运蛋白多肽是膜联蛋白的衍生物。在一个实施方案中，所述转运蛋白多肽是膜联蛋白A2的衍生物。在一些实施方案中，所述转运蛋白多肽是转铁蛋白的衍生物。
在某些实施方案中是异多聚体，每个异多聚体包含：至少一个第一多肽构建体，其包含至少一个货物多肽和含有人血清白蛋白的第一区段的第一转运蛋白多肽；以及至少一个第二多肽构建体，其包含至少一个货物多肽和含有人血清白蛋白的第二区段的第二转运蛋白多肽；其中所述转运蛋白多肽自组装以形成白蛋白或其类似物的准天然结构。在某些实施方案中，人血清白蛋白的所述第一区段和第二区段是来自所述蛋白质的非重叠区。在某些实施方案中，在人血清白蛋白的所述第一区段和第二区段的序列之间存在重叠。在一些实施方案中，所述重叠是5％重叠。在一个实施方案中，所述重叠是10％重叠。在某些实施方案中，人血清白蛋白的所述第一区段包含SEQ ID NO：2的序列，并且人血清白蛋白的所述第二区段包含SEQ ID NO：3的序列。在某些实施方案中，人血清白蛋白的所述第一区段包含SEQ ID NO：8的序列，并且人血清白蛋白的所述第二区段包含SEQ ID NO：10的序列。
在某些实施方案中是异多聚体，每个异多聚体包含：至少一个第一多肽构建体，其包含至少一个货物多肽和含有SEQ ID NO：2的序列的第一转运蛋白多肽；以及至少一个第二多肽构建体，其包含至少一 个货物多肽和含有SEQ ID NO：3的序列的第二转运蛋白多肽。在某些实施方案中是异多聚体，每个异多聚体包含：至少一个第一多肽构建体，其包含至少一个货物多肽和含有SEQ ID NO：8的序列的第一转运蛋白多肽；以及至少一个第二多肽构建体，其包含至少一个货物多肽和含有SEQ ID NO：10的序列的第二转运蛋白多肽。在本文所描述的异多聚体的某些实施方案中，至少一个转运蛋白多肽源自异白蛋白。在某些实施方案中，两个转运蛋白多肽均源自异白蛋白。在某些实施方案中，所有转运蛋白多肽是相同异白蛋白的衍生物。在一些其它实施方案中，所述转运蛋白多肽是不同异白蛋白的衍生物。在一些实施方案中，每个转运蛋白多肽是基于选自表2的异白蛋白的白蛋白衍生物。在某些实施方案中，所述第一多肽构建体包含两个货物多肽。在一些实施方案中，所述第二多肽构建体包含两个货物多肽。在一些实施方案中，所述多肽构建体中的至少一个通过引入突变进行工程化。在某些实施方案中，与所述多肽构建体的非突变形式相比，所引入的突变改进所述构建体的功能性。在某些实施方案中，所引入的突变改进所述转运蛋白多肽的稳定性、半衰期和异多聚体形成中的一项或多项。
本文提供一种异多聚体，其包含：至少一个第一多肽构建体，其包含(i)第一转运蛋白多肽和(ii)至少一个货物多肽；以及至少一个第二多肽构建体，其包含(iii)第二转运蛋白多肽和(iv)至少一个货物多肽；其中所述转运蛋白多肽通过一种蛋白质的节段化而源自所述蛋白质，每个转运蛋白多肽包含与所述蛋白质的区段具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中所述转运蛋白多肽自组装以形成所述蛋白质的准天然结构。
在某些实施方案中是一种本文所描述的异多聚体，其中所述转运蛋白多肽通过一种蛋白质的节段化而源自所述蛋白质，每个转运蛋白多肽包含与所述蛋白质的区段具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中是一种本文所描述的异多聚体，其中所述转运 蛋白多肽通过一种蛋白质的节段化而源自所述蛋白质，每个转运蛋白多肽包含与所述蛋白质的区段具有至少99％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述异多聚体是异二聚体。在一些实施方案中，至少一个转运蛋白多肽不是源自抗体。在示例性实施方案中，每个转运蛋白多肽是白蛋白衍生物。在一些实施方案中，所述第一和第二转运蛋白多肽中的至少一个包含氨基酸残基至半胱氨酸的至少一个突变，以使得所述半胱氨酸与另一个转运蛋白多肽上的半胱氨酸残基形成二硫键。在某些实施方案中，所述第一和第二转运蛋白多肽中包含氨基酸残基至半胱氨酸的至少一个突变，以使得所述半胱氨酸与另一个转运蛋白多肽上的半胱氨酸残基形成二硫键。在一些实施方案中提供异多聚体，其中每个转运蛋白多肽是白蛋白衍生物，所述第一转运蛋白多肽包含选自A194C、L198C、W214C、A217C、L331C以及A335C的至少一个突变。在一些实施方案中，所述第二转运蛋白多肽是包含选自L331C、A335C、V343C、L346C、A350C、V455C以及N458C的至少一个突变的白蛋白衍生物。
在一些实施方案中提供本文所描述的异多聚体，其中所述第一转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：35的序列或其类似物或变体，并且其中所述第二转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：36的序列或其类似物或变体。在一些实施方案中，所述第一转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：37的序列或其类似物或变体，并且其中所述第二转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：38的序列或其类似物或变体。在某些实施方案中，所述第一转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：39的序列或其类似物或变体，并且其中所述第二转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：40的序列或其类似物或变体。在示例性实施方案中，所述第一转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：41的序列或其类似物或变体，并且其中所述第二转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：42的序列或其类似物或变体。在某些实施方案中，所述第一转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：43的序列或其类似物或变体，并且其中所述第二转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：44的序列或其类似物或变体。在一个实施方案中， 所述第一转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：45的序列或其类似物或变体，并且其中所述第二转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：46的序列或其类似物或变体。在一个实施方案中，所述第一转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：47的序列或其类似物或变体，并且其中所述第二转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：48的序列或其类似物或变体。在某些实施方案中，所述第一转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：49的序列或其类似物或变体，并且其中所述第二转运蛋白多肽具有包含SEQ ID NO：50的序列或其类似物或变体。
在本文所描述的异多聚体的某些实施方案中，至少一个货物多肽结合靶抗原，并且其中所述靶抗原是IL-2R的a-链(CD25)、淀粉样蛋白β、抗-EpCAM、抗-CD3、CD16、CD20、CD22、CD23、CD3、CD4、CD52、CD80、CTLA-4、EGFR、EpCAM、RSV的F蛋白、G250、糖蛋白IIB/IIIaR、HER2、HER2/neu R、HSP90、IgE抗体、IL-12、IL-23、IL-1b、IL-5、IL-6、RANKL、TNFα、TNFR、VEGF-A、胰高血糖素受体、GLP受体以及LDL受体中的至少一个。
本文提供异多聚体，每个异多聚体包含：至少一个第一多肽构建体，其包含至少一个货物多肽和第一转运蛋白多肽；以及至少一个第二多肽构建体，其包含至少一个货物多肽和第二转运蛋白多肽。在某些实施方案中，至少一个货物多肽选自表2中所列出的蛋白质或其片段、变体或衍生物。在某些实施方案中，至少一个货物多肽选自表2中所列出的一种或多种蛋白质的配体、受体或抗体，或所述配体、受体或抗体的片段、变体或衍生物。在某些实施方案中，至少一个货物多肽靶向来自下组的细胞表面抗原，该组由以下各项组成：CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD40、CD56、CD64、CD70、CD74、CD79、CD105、Cd138、CD174、CD205、CD227、CD326、CD340、MUC16、GPNMB、PSMA、Cripto、ED-B、TMEFF2、EphB2、EphA2、FAP、整联蛋白、间皮素、EGFR、TAG-72、GD2、CAIX、5T4。在某些实施方案中是异多聚体，每个异多聚体包含：至少一个第一多肽构建体，其包含至少一个货物多肽和第一转运蛋白多肽；以 及至少一个第二多肽构建体，其包含至少一个货物多肽和第二转运蛋白多肽，其中至少一个货物多肽是抗体或其片段或变体。在某些实施方案中，所有货物多肽是抗原或其片段或变体。在一些实施方案中，所述货物多肽是结合表2中所列出的蛋白质的抗体。在一些实施方案中，所述抗体片段包含抗体Fc或Fab或Fv区。在一些实施方案中，所述货物多肽是非抗体蛋白质样纳米抗体、亲和体(affibody)、maxibody、adnectin、结构域抗体、evibody、锚蛋白重复序列蛋白、抗运载蛋白(anticalin)、camlid或与治疗相关靶标结合的配体蛋白或多肽。在一些实施方案中，所述抗体或其片段源自选自由以下各项组成的组的免疫球蛋白：IgG、IgA、IgD、IgE以及IgM。在某些实施方案中，所述IgG具有选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3以及IgG4的亚型。在某些实施方案中，所述抗体是多特异性的。
本文提供异多聚体，每个异多聚体包含：至少一个第一多肽构建体，其包含至少一个货物多肽和第一转运蛋白多肽；以及至少一个第二多肽构建体，其包含至少一个货物多肽和第二转运蛋白多肽，其中至少一个货物多肽是治疗性抗体。在本文所描述的异多聚体的一些实施方案中，至少一个货物种多肽是治疗性抗体或其片段或变体，其中所述抗体选自阿巴伏单抗(abagovomab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、aurograb、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、布雷奴单抗(briakinumab)、卡那单抗(canakinumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗(certuximab)、达利珠单抗(daclizumab)、地诺单抗(denosumab)、依法利珠单抗(efalizumab)，加利昔单抗(galiximab)、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozagamicin)、戈利木单抗(golimumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、英夫利昔单抗(infliximab)，伊匹单抗(ipilimumab)、鲁西单抗(Lumiliximab)、美泊利单抗(mepolizumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、莫罗单抗(muromonab)、穆罗单抗(mycograb)、那他珠单抗(natalizumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、奥瑞珠单抗 (ocrelizumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、培妥珠单抗(pertuzumab)、雷珠单抗(ranizumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、替利珠单抗(teplizumab)、托珠单抗(toclizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、Proxinium、Rencarex、优特克单抗(ustekinumab)以及扎芦木单抗(zalutumumab)。在某些实施方案中，所述治疗性抗体结合疾病相关靶抗原，如癌症抗原、炎性疾病抗原或代谢疾病抗原。在某些实施方案中，所述靶抗原可以是在细胞表面上的蛋白质，并且所述细胞可以属于B细胞、T细胞、间质细胞、内皮细胞、血管细胞、骨髓细胞、造血细胞或癌细胞的组。
本文提供异多聚体，每个异多聚体包含：至少一个第一多肽构建体，其包含至少一个货物分子、片段；以及至少一个第二多肽构建体，其包含至少一个货物分子和第二转运蛋白多肽，其中至少一个货物多肽是酶、酶抑制剂、激素、治疗性多肽、抗原、放射性毒素和化学毒素，包括但不限于神经毒素、干扰素、细胞因子融合毒素和趋化因子融合毒素，细胞因子、抗体融合蛋白或其变体或片段。在本文所描述的异多聚体的一些实施方案中，至少一个货物多肽包含GLP-1或其片段或变体。在一些实施方案中，至少一个货物多肽包含胰高血糖素或其片段或变体。在一个实施方案中，至少一个货物多肽包含EGF-A样结构域。在某些实施方案中，所述毒素是免疫毒素如地尼白介素2(Denileukin diftitox)和抗-CD22免疫毒素如CAT-3888和CAT-8015。在某些实施方案中，所述毒素是皂草素(saporin)。在一些实施方案中，所述毒素是有丝分裂毒素(mitotoxin)。在一些实施方案中，所述毒素是白喉毒素。在一些实施方案中，所述毒素是A型肉毒杆菌毒素。在一些实施方案中，所述毒素是蓖麻毒蛋白或其片段。在一些实施方案中，所述毒素是来自RTX毒素家族的毒素。
本文提供异多聚体，每个异多聚体包含：至少一个第一多肽构建体，其包含至少一个货物多肽和第一转运蛋白多肽；以及至少一个第 二多肽构建体，其包含至少一个货物多肽和第二转运蛋白多肽，其中所述货物多肽通过化学缀合、天然连接、化学连接、二硫键或直接融合或经由接头的融合连接至所述转运蛋白多肽。在某些实施方案中，用于将货物分子如货物多肽连接至转运蛋白多肽的接头选自在US5482858、US5258498和US5856456、US2009060721、US6492123、US4946778、US5869620、US7385032、US5073627、US5108910、US7977457、US5856456、US7138497、US5837846、US5990275、EP1088888(通过引用并入本文)中描述的接头。
本文提供包含编码本文所描述的异多聚体的核酸的宿主细胞。在某些实施方案中，编码所述第一多肽构建体的核酸和编码所述第二多肽构建体的核酸存在于单一载体中。在某些实施方案中，编码所述第一多肽构建体的核酸和编码所述第二多肽构建体的核酸存在于单独的载体中。
本文提供一种制备异多聚体的方法，其中所述方法包括：培养本文所描述的宿主细胞，以使得表达编码本文所描述的异多聚体的核酸；以及从所述细胞培养物回收所述异多聚体。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。在某些实施方案中，所述宿主细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，所述酵母是酿酒酵母。在一些实施方案中，所述酵母是毕赤酵母属。在某个实施方案中，所述酵母是巴斯德毕赤酵母。在一些实施方案中，所述酵母是糖基化缺陷型和/或蛋白酶缺陷型。在一些实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，表达本文所描述的异多聚体的宿主细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、COS细胞或人细胞。
提供一种包含本文所描述的异多聚体和药学上可接受的佐剂的药物组合物。还提供治疗患有疾病或病症的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文所描述的制剂或药物组合物。在某些 实施方案中是一种治疗患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本文所描述的异多聚体。在一些实施方案中是一种治疗患者中的免疫病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本文所描述的异多聚体。还提供一种治疗患者中的传染性疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本文所描述的异多聚体。在某些实施方案中是一种治疗患者中的心血管病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本文所描述的异多聚体。在某些实施方案中是一种治疗患者中的呼吸病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本文所描述的异多聚体。在某些实施方案中是一种治疗患者中的代谢病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本文所描述的异多聚体。在某些实施方案中是一种治疗患者中的先天性肾上腺增生症、高歇氏病(Gaucher′s disease)、亨特氏综合征(Huntersyndrome)、克拉伯病(Krabbe disease)、异染性脑白质营养不良(Metachromaticleukodystrophy)、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、苯酮尿症(PKU)、卟啉症(Porphyria)、泰-萨二氏病(Tay-Sachs disease)以及威尔逊氏病(Wilson′s disease)中的一种或多种的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本文所描述的异多聚体。提供治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者提供有效量的本文所描述的药物组合物。在某些实施方案中是一种抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括使所述肿瘤与有效量的本文所描述的异多聚体相接触。在一些实施方案中是一种缩小肿瘤的方法，所述方法包括使所述肿瘤与有效量的本文所提供的异多聚体相接触。
提供一种用于检测个体中目标生物标志物的存在的试剂盒，所述试剂盒包含(a)一定量的本文所描述的异多聚体，其中所述异多聚体包含至少一个货物多肽，以使得所述货物多肽能够结合所述目标生物标志物；以及(b)使用说明书。
本文提供包含至少两个多肽构建体的异多聚体蛋白，其中每个多肽构建体包含至少一个货物多肽和一个基于白蛋白的多肽，以使得所述多肽构建体自组装以形成异多聚体。
在某些实施方案中，所述货物多肽与基于白蛋白或异白蛋白的转运蛋白多肽融合。在一些实施方案中，所述货物多肽与基于转铁蛋白的转运蛋白多肽融合。在某些实施方案中，所述货物多肽与基于膜联蛋白的转运蛋白多肽融合。在一些实施方案中，所述融合是在转运蛋白多肽的N末端处。在某些实施方案中，所述融合是在转运蛋白多肽的C末端处。在一些实施方案中，所述融合涉及桥联接头或间隔区分子。在一些实施方案中，所述货物多肽与所述转运蛋白多肽化学缀合。在某些实施方案中，所述货物多肽通过化学连接或二硫键与所述转运蛋白多肽连接。
本文提供包含至少两个多肽构建体的异多聚体蛋白，其中每个多肽构建体包含至少一个货物多肽和一个转运蛋白的多肽，以使得所述转运蛋白多肽自组装以形成所述异多聚体。在一些实施方案中，每个转运蛋白多肽是基于异白蛋白的多肽，以使得所述基于异白蛋白的多肽自组装以形成异多聚体。在一些实施方案中，每个转运蛋白多肽是基于转铁蛋白的多肽。在一些实施方案中，每个转运蛋白多肽是基于膜联蛋白的多肽。在某些实施方案中，每个单体转运蛋白多肽是不稳定的，并且优先与至少一个其它转运蛋白多肽一起形成异多聚体。
在一些实施方案中，本文所描述的异多聚体是异二聚体。在一些实施方案中，货物多肽是抗体、酶、激素、治疗性多肽、抗原、化学毒素、放射性毒素、细胞因子或其变体或片段。在一些实施方案中，一个多肽构建体的货物多肽与另一个多肽构建体的货物多肽协同起作用。
本文提供包含至少两个多肽构建体的异多聚体蛋白，其中每个多肽构建体包含至少一个货物多肽和一个基于膜联蛋白的多肽，以使得所述基于膜联蛋白的多肽自组装以形成具有单体膜联蛋白或其类似物的准天然结构的异多聚体。在一些实施方案中，所述膜联蛋白是膜联蛋白A1。在一些实施方案中，本文所描述的异多聚体是异二聚体。在一些实施方案中，货物多肽是抗体、酶、激素、治疗性多肽、抗原、 化学毒素、放射性毒素、细胞因子、受体的配体、受体或其变体或片段。在一些实施方案中，一个多肽构建体的货物多肽与另一个多肽构建体的货物多肽协同起作用。在一些实施方案中，所述货物多肽可以是另一个多肽构建体的货物多肽的激动剂或拮抗剂。
本文提供包含至少两个单体融合蛋白的异多聚体蛋白，其中每个单体融合蛋白包含至少一个与白蛋白衍生的多肽融合的货物多肽，以使得所述白蛋白衍生的多肽自组装以形成多功能异二聚体。在某些实施方案中是异二聚体蛋白，其包含：第一单体，其包含至少一个与白蛋白衍生的多肽融合的货物多肽；以及第二单体，其包含至少一个与白蛋白衍生的多肽融合的货物多肽。在某些实施方案中，所述第一单体的至少一个货物多肽不同于所述第二单体的至少一个货物多肽。在某些实施方案中，所述第一单体的至少一个货物多肽与所述第二单体的至少一个货物多肽相同。
在某些实施方案中是包含至少两个单体融合蛋白的异多聚体蛋白，其中每个单体融合蛋白包含至少一个与异白蛋白衍生的多肽融合的货物多肽，以使得所述异白蛋白衍生的多肽自组装以形成多功能异多聚体。在某些实施方案中是包含至少两个单体融合蛋白的异多聚体蛋白，其中每个单体融合蛋白包含至少一个与转铁蛋白衍生的多肽融合的货物多肽，以使得所述转铁蛋白衍生的多肽自组装以形成异多聚体。在某些实施方案中是包含至少两个单体融合蛋白的异多聚体蛋白，其中每个单体融合蛋白包含至少一个与膜联蛋白衍生的多肽融合的货物多肽，以使得所述膜联蛋白衍生的多肽自组装以形成异多聚体。在某些实施方案中，所述膜联蛋白是膜联蛋白A2。
在某些实施方案中是异二聚体蛋白，其包含：第一多肽构建体，其包含至少一个与异白蛋白衍生的多肽融合的货物多肽；以及第二多肽构建体，其包含至少一个与异白蛋白衍生的多肽融合的货物多肽。在某些实施方案中，所述第一多肽构建体的至少一个货物多肽不同于所述第二多肽构建体的至少一个货物多肽。在某些实施方案中，所述 第一多肽构建体的至少一个货物多肽与所述第二多肽构建体的至少一个货物多肽相同。
本文提供一种异多聚体，其包含：至少两个单体，每个单体包含转运多肽和任选的至少一个与所述转运多肽连接的货物分子，其中每个转运多肽通过完整蛋白的节段化获得，以使得所述转运蛋白多肽自组装以形成准天然完整蛋白。在某些实施方案中，所述异多聚体是多特异性的。在某些实施方案中，所述转运蛋白多肽不是源自抗体。在一些实施方案中，与单体或同多聚体相比，每个单体优先形成异多聚体。在所述异多聚体的一个实施方案中，至少一个货物分子是治疗剂或生物分子。在某些实施方案中，至少一个货物分子是选自多肽、DNA、PNA或RNA的生物分子。在一些实施方案中，每个转运蛋白多肽是白蛋白或异白蛋白的衍生物。在一个实施方案中，每个转运蛋白多肽是膜联蛋白的衍生物。在某些实施方案中，每个转运蛋白多肽是转铁蛋白的衍生物。
在某些实施方案中是药物制剂，其包含本文所描述的基于白蛋白和/或基于异白蛋白的异多聚体蛋白和药学上可接受的稀释剂或载体。在某些实施方案中是药物制剂，其包含本文所描述的基于转铁蛋白的异多聚体蛋白和药学上可接受的稀释剂或载体。在某些实施方案中是药物制剂，其包含本文所描述的基于膜联蛋白的异多聚体蛋白和药学上可接受的稀释剂或载体。在某些实施方案中是药物制剂，其包含本文所描述的基于膜联蛋白-A2的异多聚体蛋白和药学上可接受的稀释剂或载体。在某些实施方案中，将本文所描述的制剂提供为试剂盒或容器的一部分。在某些实施方案中，所述试剂盒或容器与关于治疗性蛋白的延长保质期的说明书一起包装。在一些实施方案中，将本文所描述的异多聚体用于一种治疗(例如，改善)、预防或诊断个体中的疾病或疾病症状的方法中，所述方法包括以下步骤：向所述个体施用所述制剂。
本文提供一种基于任何目标转运蛋白而获得融合蛋白支架的方法，所述融合蛋白支架具有已知数目的缀合位点。
还提供转基因生物体，其被修饰成含有本文所描述的核酸分子以编码和表达本文所描述的单体融合蛋白。
本领域普通技术人员在结合附图回顾本发明的具体实施方案的以下描述之后将清楚本发明的其它方面和特征。
附图简述
在说明本发明的实施方案的附图中，在说明本发明的实施方案的附图中，
图1示出人血清白蛋白(HSA)分子的结构。连同表示为棒的键一起，示意性地使出了二级结构的α螺旋部分。
图2是在两个基于白蛋白的多肽的界面处的包埋的溶剂可及表面积的曲线图。ABH1由左侧的结构表示，而ABH2由右侧结构表示。
图3示出单独表达的两个基于白蛋白的多肽。所述两个多肽分别以浅灰色和深灰色示出。每个多肽包含功能性货物蛋白质的两个融合位点，并且这些位点表示为球体。结构中的二硫键残基作为棒示出。
图4是基于本文所描述的多特异性异多聚体的双特异性和其它多功能治疗剂的示意性图示。基于白蛋白或基于异白蛋白的多肽被指代为A1和Α2。通过使抗原结合基序、细胞因子和其它形式的信号传导分子、化学毒素、放射性毒素或其它功能上相关的免疫缀合物缀合至A1和Α2上的N末端和/或C末端位点来获得多功能异多聚体，并且这由□符号来表示。
图5是源自异二聚体Fc结构域的双特异性抗体的示意图。基于白蛋白或异白蛋白的多肽被连接至Fc的C末端，以选择性地驱动异二聚体的形成。
图6B示出全长HSA和通过基于HSA的转运蛋白多肽的共表达而形成的异二聚体支架基于白蛋白的异多聚体-1(ABH1)和基于白蛋白的异多聚体-2(ABH2)的非变性凝胶电泳图谱。图6A示出ABH2、ABH1和WT HSA的非还原SDS-PAGE凝胶图谱。ABH1和ABH2的两个片段多肽以不同的DNA比例共表达，如在图的顶端处的比例所指示的。作为对照并且为了观察同二聚化，独立地表达片段A和B。
图6C是在WT-HSA(v225)和ABH2(v221)的蓝色琼脂糖凝胶纯化之后初始、流过、洗涤和最终洗脱的非变性凝胶。
图7示出使用差示扫描量热法研究的野生型HSA和异二聚体支架ABH1和ABH2的稳定性。
图8A-8B示出在3000 RU上的平衡结合等温线3000 nM FcRN 3倍稀释系列。图8B示出白蛋白，并且图8A示出异多聚体支架ABH1。
图9示出基于多价白蛋白的异多聚体的方案，所述异多聚体包含抗-Her2/neu和抗-CD16 scFv生物活性融合体。
图10A-10B包含在表8中描述的异多聚体ABH2融合体的非还原SDS PAGE分析。凝胶指示，所有构建体形成具有预期MW的正确复合物。
图11示出基于PDB结构1MCX的膜联蛋白分子的结构。通过分裂膜联蛋白分子将衍生的两个单体用颜色代码表示为浅灰色和深灰色单元。货物蛋白质的融合位点被表示为球体。
图12示出在基于膜联蛋白的转运多肽-1和基于膜联蛋白的转运多肽-2的界面处的包埋的溶剂可及表面积的曲线图。
图13示出基于PDB结构1H76的转铁蛋白分子的结构。通过分裂转铁蛋白分子而衍生的两个单体用颜色代码表示为浅灰色和深灰色单元。货物蛋白质的融合位点被表示为球体。
图14示出在本文所描述的两个基于转铁蛋白的转运蛋白多肽的界面处的包埋的溶剂可及表面积的曲线图。如本文所设计的在残基位置330附近的分裂转铁蛋白形成具有约的包埋表面积的异二聚体。
图15A-15P示出包含基于白蛋白的转运蛋白多肽的异多聚体，所述转运蛋白多肽自缔合以形成准天然单体白蛋白。每对转运蛋白多肽是通过白蛋白在彼此不同的独特位点处的节段化而获得。
图16A和16B分别提供ABH2和ABH1的结构。两个图包括a)WT-HSA中的切割位点的位置以便产生基于白蛋白蛋白质，b)新的C’和N’切割位点的位置，以及c)在不同后续实施例中使用的ABH1和ABH2的简化的圆形绘图。
图17示出可被连接至ABH2的抗-Her2 scFv的不同单价、二价、三价和四价构型。对照包括ABH2支架、抗-HER2 scFV、单臂Fc和二价Fc。另外，用所述表内的KD值指示不同ABH2构建体结合表达Her2的SKOV细胞的能力。
图18A示出四种负载抗-Her3 x Her2的构建体(v1087、v1088、v1089和v1090)与MALME-3M细胞的结合曲线。使用FITC标记的抗-HSA抗体，使用FACS评估细胞的亲和力。左下图显示线性标度的浓度，而右下图是按对数标度。图18B示出上述四种构建体与SKOV-3细胞的结合曲线。左下图显示线性标度，而右下图显示对数标度。
图19A-19D展示四种负载抗-Her2的ABH2(v519、v520、v518和v517)在人血清中的稳定性。使用FITC标记的抗-HSA抗体，使用 FACS评定与SKOV-3细胞的结合亲和力。
图20A和20B示出与v1087(MM-111)对照相比，双特异性抗-Her2 x Her3 ABH2(v1378)与FcRn的结合亲和力。所述图表示以随时间推移的Resp.Diff.表示的两种化合物的表面等离子体共振(SPR)曲线。
图21示出在三种温度下(37℃、室温和4℃)下孵育五天的ABH2支架(v221)和单价抗-Her2 ABH2(v517)两者的非变性凝胶图谱。
图22A示出在蓝色琼脂糖凝胶纯化之后WT HSA的总、流过、洗涤以及洗脱级分的非变性凝胶图谱。图22B是在蓝色琼脂糖凝胶纯化施加于凝胶过滤柱之后WT-HSA的色谱图。不同的峰表示不同的蛋白质产物。图22C是在AlbuPure纯化之后通过施加至凝胶过滤柱分级分离WT-HSA的色谱图。
图23A是在AlbuPure纯化和凝胶过滤之后WT-HSA(v225)的液相色谱法分析的色谱图。图23B-23E分别是在AlbuPure纯化之后，分离成不同级分并通过凝胶过滤LC分析的AlbuCORE支架1(v225)、3(v1636)、6(v1638)和9(v1640)的色谱图。
图24A表示在AlbuPure纯化之后，白蛋白支架(v221)的凝胶过滤LC分析。表达产物通过在CHO细胞中瞬时共表达放大。图24B示出同一变体的非还原(由-DTT指示)和还原(由+DTT指示)SDS-PAGE凝胶图谱。
图25A表示在Albupure纯化之后WT HSA和AlbuCORE-A的总、流过、洗涤以及最终洗脱级分的非变性凝胶图谱。图25B表示相同的两种蛋白质的LC/MS分析。
图26A是指示ABH2中的四个末端之间的空间间隔程度的图。图26B是展示标准抗体分子的可变区之间的空间间隔程度的对比图。图26C示出用于替代抗原结合的四种Albucore支架，其具有不同的和可变的末端间距离。
图27示出AlbuCORE支架1、3、6和9的DSC解链曲线。在每个图中，将每种基于白蛋白的支架的曲线和熔点与WT HSA的曲线和75℃熔点进行比较。
图28A是WT-HSA或剪接的白蛋白支架上的抗-CD3xCD19双特异性二价异多聚体的示意性呈现。图28B表示另外的单价抗-CD3异多聚体构建体以及单价和多价抗-CD19异多聚体构建体的示意性呈现。图28C表示在各自在悬浮生长的人CHO系统中表达之后前述构建体的非还原PAGE凝胶。
图29提供WT-HSA或剪接的白蛋白支架上的四种抗-CD3xCD19双特异性二价异多聚体的Ka和Hill斜率测量值。结合测试评定了变体结合Jurkat或Raji细胞的嗯呢管理，如使用FACS所分析。
图30A展示BiTE-样对照(v891)、基于抗-CD3xCD19的白蛋白的异多聚体(v1092)以及基于抗-CD3xCD19Het-Fc的异多聚体(v873)的FACS细胞群体图。评定了与Raji和Jurkat细胞的结合。图30B示出三种上述构建体的另外FACS图并且针对白蛋白对照(v221)进行比较。
图31A示出使用Co2+亲和纯化之前、期间和之后v218表达产物的SDS-PAGE。图31B是在通过凝胶过滤的另外纯化之后同一构建体的色谱图。
图32由源自其3维结构的人血清白蛋白中的残基的子集进行的残基接触的图表。
图33通过人血清白蛋白中的选择热点残基实现的接触和相互作用的性质的图表。
图34人血清白蛋白中的热点残基或热点残基的聚簇(贴片)的图形表示。
图35示出展示包含引入的半胱氨酸残基的几种基于白蛋白的异多聚体的表达的凝胶。
图36A提供显示异多聚体变体1635、1638、1639和1641的表达的非还原凝胶；图36B提供显示异多聚体变体1634、1636、1637、1640和221的表达的非还原凝胶。将CHO细胞用以下DNA比例进行转染：比例A＝质粒A∶质粒B 100％∶0％；比例D＝质粒A∶质粒B66％∶34％；比例B＝质粒A∶质粒B 50％∶50％；比例H＝质粒A∶质粒B 34％∶66％；并且比例F＝质粒A∶质粒B 0％/100％。
详述
在治疗性蛋白领域中，双特异性分子表现出双重靶标特异性，或者能够通过提供药物作用所必需的必要时空组构而同时执行多种功能作用。一方面，当治疗作用模式涉及效应细胞或分子向靶标(如肿瘤细胞)的再靶向时，双特异性分子是特别令人感兴趣的[Muller D.and Kontermann R.E.(2010)Biodrugs24，89-98]。在稳定的和均匀的条件下具有有利的药物代谢动力学和功能活性的双特异性治疗性蛋白的开发一直是挑战。已经尝试使用多种方法从多个抗原结合结构域组装双特异性单元。这些技术已经涉及使用异二聚体抗体IgG分子，使用亮氨酸拉链蛋白质如Fos/Jun对或从抗体中的可变结构域的轻链和重链的交替组构组装的其它支架。Kipriyanov和Le Gall已经综述了多种双特异性构建体的设计[Kipriyanov S.M.&Le Gall F.(2004)Curr Opin Drug Discov Dev 7，233-242]。非常有吸引力的是这样的异二聚体抗体IgG分子的使用：其中在抗体的CH3结构域中引入突变以实现所述异二聚体，并且由此将两个独特的抗原结合位点引入一个分子中，这是由于这种构建体的天然免疫球蛋白样结构。此外，抗体的Fc部分参与与介导胞吞补救途径的新生Fc受体(FcRn)的相互作用，并且这归因于抗体分子的改进的血清半衰期[Roopenian D.&Akilesh S.(2007)Nature Rev Immunol7，715-725]。另一方面，因为通过双特异性抗体的Fc部分诱导的同时发生的效应子活性所造成的强烈细胞因 子应答，基于抗体的双特异性分子在临床试验中一直是有问题的[Weiner L.M.；Alpaugh R.K.等(1996)Cancer ImmunolImmunother42，141-150]。这突出了对可辅助双特异性分子和免疫缀合物分子的设计的新颖支架的需求。
人血清白蛋白(HSA)蛋白质是血液的最丰富组分，占血清中的总蛋白质的接近60％，浓度为约40mg/ml。白蛋白还是循环系统中寿命最长的蛋白质之一，具有约19天的半衰期。令人感兴趣的是，已知相同胞吞补救途径(其依赖于防止抗体降解的FcRn分子)也与HSA分子相互作用[Chaudhary C.；Mehnaz S.等(2003)J Exp Med197，315-322]。
HSA(在图1中示出)是未糖基化的585-残基单多肽蛋白，并且Carter和同事使用X-射线晶体学首先观察到了所述蛋白的3维结构[综述在Carter，D.C.&Ho，J.X.(1994)AdvProt Chem45，153-203中]。HSA蛋白由三个同源结构域：DI、DII、DIII组成，其归因于基因复制，这也是其它物种中的血清白蛋白共有的一个特征[Gray J.E.&Doolittle R.F.(1992)Protein Sci1，289-302]。已经单独地表达和表征了所述三个结构域中的每个，并且显示是独立地稳定的[Dockal M.，Carter D.C.& Ruker F.(1999)J Biol Chem274，29303-29310]。每个结构域由10个螺旋区段构成，并且基于螺旋间组构，可以将每个结构域进一步分类成2个分别包含螺旋1-6和7-10的子结构域。HSA共具有17个二硫键，并且所有这些形成键联的半胱氨酸对是在单独结构域内。一般而言，由于二硫键的大数目以及占优势的螺旋折叠，HSA是非常稳定的。白蛋白分子在许多物种之间的序列同一性是非常大的，大于70％的白蛋白cDNA源自人、马、牛、大鼠等[Carter，D.C.& Ho，J.X.(1994)Adv Prot Chem45，153-203]。
在功能性蛋白组学领域中，分裂的蛋白质对已经被用作理解蛋白质-蛋白质相互作用的传感器。该方法包括：从可以重构以形成活性天然样蛋白质的蛋白质中鉴别出合适的区段。在技术上需要产生新的 分裂蛋白质。对于待以功能上有用的方式分裂的蛋白质，节段化位点必须产生两个区段，所述区段当彼此缔合时，可有效地重构成准天然蛋白质。此外，组分蛋白区段应当具有足够的溶解度以停留在溶液中，并选择性地与配偶体区段缔合，以使得制备收率和纯化将是经济的。衍生可重组以形成类似单体天然蛋白质的准天然结构的分裂的蛋白质区段是巨大挑战[Tafelmeyer P.，Johnsson N.& Johnsson K.Chem &Biol11，681-689]。在过去，这类分裂的蛋白质尚未用于设计蛋白质治疗剂或用作货物递送媒介物。
本发明提供异多聚体，其包含：第一单体，其包含(i)第一转运蛋白多肽；以及第二单体，其包含(ii)第二转运蛋白多肽；其中所述第一和第二转运蛋白多肽中的每个包含与白蛋白多肽的区段具有至少90％同一性的氨基酸序列；并且其中所述第一和第二转运蛋白多肽通过所述白蛋白多肽在节段化位点处的节段化获得，其中所述转运蛋白多肽自组装以形成所述白蛋白多肽的单体形式的准天然结构。在一个实施方案中，所述节段化位点被选择为使得它驻留在白蛋白多肽的一个环上，所述环具有高溶剂可及表面积(SASA)和与所述白蛋白结构的其余部分的有限接触，b)在所述转运蛋白多肽之间产生互补界面，其中所述界面是非极性的、广泛的和相互交叉的。这类异多聚体表现出可比得上野生型白蛋白的稳定性的稳定性。所述第一和第二单体还可包含至少一个货物多肽。包含所述至少一个货物多肽的异多聚体可用作用于治疗疾病的治疗剂。
定义
应当理解，本发明不限于本文所描述的具体方案、细胞系、构建体和试剂，并且因此可变化。还应了解，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的而不意图限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。
如本文中和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个”、“一种” 和“所述”包括复数提及物，除非上下文另外清楚地指示。因此，例如，对“HSA”、“HA”、“白蛋白”、“人血清白蛋白”和各种以大写字母书写的、带连字符和不带连字符的形式的提及是对一种或多种此类蛋白质的提及，并且包括本领域普通技术人员已知的其变体、衍生物、片段、等效物等。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然可以在本发明的实践或测试中使用类似或等效于本文所描述的那些方法、装置和材料的任何方法、装置和材料，但现在描述优选的方法、装置和材料。
本文所提及的所有公布和专利出于描述和公开例如在所述公布中描述的构建体和方法的目的以引用的方式并入本文，所述构建体和方法可与本文描述的发明结合使用。本文所论述的公布仅因其公开内容在本申请的提交日期之前而提供。本文的任何内容都不应解释为认可由于先前发明或出于任何其它原因而使本发明者无权先于所述公开。
“异多聚体”或“异多聚体多肽”是这样的分子：其至少包含含有第一转运蛋白多肽的第一单体和包含第二转运蛋白多肽的第二单体，其中所述第二多肽的氨基酸序列与所述第一多肽相差至少一个氨基酸残基。所述异多聚体可以包含由第一和第二转运蛋白多肽形成的“异二聚体”。在某些实施方案中，所述异多聚体可以形成更高阶三级结构，如但不限于，三聚体和四聚体。在一些实施方案中，存在除了所述第一和第二转运蛋白多肽以外的转运蛋白多肽。在某些实施方案中，形成异多聚体的转运蛋白多肽的组装是由表面区域埋藏驱动。在一些实施方案中，所述转运蛋白多肽借助于静电相互作用和/或盐桥相互作用而彼此相互作用，所述静电相互作用和/或盐桥相互作用通过有利于异多聚体形成和/或不利于同多聚体形成而驱动异多聚体形成。在一些实施方案中，所述转运蛋白多肽借助于疏水相互作用而彼此相 互作用，所述疏水相互作用通过有利于异多聚体形成和/或不利于同多聚体形成而驱动异多聚体形成。在某些实施方案中，所述转运蛋白多肽借助于共价键形成而彼此相互作用。在某些实施方案中，共价键在天然地存在的或引入的半胱氨酸之间形成，其驱动异多聚体形成。在本文所描述的异多聚体的某些实施方案中，在单体之间没有形成共价键。在一些实施方案中，所述转运蛋白多肽借助于包装/尺寸-互补性/把手在孔中/突起-空腔型相互作用而彼此相互作用，所述包装/尺寸-互补性/钮入孔(knob-into-hole)/突起-空腔型相互作用通过有利于异多聚体形成和/或不利于同多聚体形成而驱动异多聚体形成。在一些实施方案中，所述转运蛋白多肽借助于阳离子-π相互作用而彼此相互作用，所述阳离子-π相互作用通过有利于异多聚体形成和/或不利于同多聚体形成而驱动异多聚体形成。在某些实施方案中，所述单独转运蛋白多肽不能作为分离的单体存在于溶液中。在某些实施方案中，与单体相比，所述异多聚体是单独转运蛋白多肽的优选状态。
术语“双特异性”意图包括具有两种不同的结合特异性的任何试剂，例如，异多聚体、单体、蛋白质、肽、或蛋白质或肽复合物。例如，在一些实施方案中，所述分子可以与以下各项结合或相互作用：(a)细胞表面靶分子和(b)效应细胞表面上的Fc受体。在本文所描述的异多聚体的某些实施方案中，至少一个单体是双特异性的，其通过向相同的转运蛋白多肽连接两个具有不同结合特异性的货物分子而形成。在本文所描述的异多聚体的某些实施方案中，所述异多聚体本身是双特异性的，其通过向转运蛋白多肽连接至少两个具有不同特异性的货物分子而形成。术语“多特异性分子”或“异种特异性分子”意图包括具有超过两种不同结合特异性的任何试剂，例如，蛋白质、肽、或蛋白质或肽复合物。例如，所述分子可以与以下各项结合或相互作用：(a)细胞表面靶分子如但不限于细胞表面抗原，(b)效应细胞表面上的Fc受体，以及(c)至少一种其它组分。因此，本文所描述的异多聚体的实施方案包括但不限于双特异性、三特异性、四特异性以及其它多特异性分子。在某些实施方案中，这些分子针对细胞表面抗原(如 CD30)和其它靶标(如效应细胞上的Fc受体)。
除非另外指出，否则表述“多价”在本说明书中用于表示包含至少两个靶分子连接位点的异多聚体。所述多价异多聚体被设计成具有针所需靶标的多个结合位点。在某些实施方案中，所述结合位点是在至少一个与转运蛋白多肽连接的货物分子上。在某些实施方案中，至少一个结合位点是在转运蛋白多肽上。表述“二价”在本说明书中用于表示包含两个靶标结合位点的异多聚体。在二价异多聚体的某些实施方案中，两个结合位点是在相同单体上。表述“三价”在本说明书中用于表示包含三个靶标结合位点的异多聚体。表述“四价”在本说明书中用于表示包含四个靶标结合位点的异多聚体。
通过连接两个或更多个最初编码单独多肽的基因，产生“融合蛋白”和多肽。这种融合基因的翻译产生单个多肽，所述多肽具有源自每种原始多肽的功能特性。在本文所描述的异多聚体的实施方案中，至少一个单体可以包含通过至少一个货物多肽与转运蛋白多肽的N末端或C末端的融合而形成的融合蛋白。
术语“基本上纯化的”是指本文所描述的异多聚体或其变体，所述异多聚体或其变体可基本上或实质上不含有通常伴随在其天然存在环境(即天然细胞，或者在重组产生的异多聚体的情况下的宿主细胞)中存在的蛋白质或与所述蛋白质相互作用的组分，在某些实施方案中所述异多聚体或其变体基本上不含有细胞物质，包括具有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(按干重计)的污染蛋白质的蛋白质制剂。当异多聚体或其变体是由宿主细胞重组产生时，在某些实施方案中，所述蛋白质是以细胞干重的约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更低的量存在。当异多聚体或其变体是由宿主细胞重组产生时，在某些实施方案中，所述蛋白质是以约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、 约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更低的细胞干重存在于培养基中。在某些实施方案中，通过本文所描述的方法产生的“基本上纯化的”异多聚体具有至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度水平，具体地，至少约75％、80％、85％的纯度水平，并且更具体地，至少约90％的纯度水平，至少约95％的纯度水平，至少约99％或更大的纯度水平，所述纯度水平通过适当的方法如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC以及毛细管电泳来确定。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包括外源多核苷酸的细胞，不管使用何种方法插入(例如，直接摄取、转导、f交配(f-mating)或本领域已知的用于产生重组宿主细胞的其它方法)。外源多核苷酸可保持为非整合载体，例如质粒，或者可替代地，可以整合到宿主基因组中。
如本文使用，术语“培养基(medium/media)”包括可支持或包含任何宿主细胞的任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性支持物，所述宿主细胞包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核宿主细胞、大肠杆菌、或假单胞菌属宿主细胞以及细胞内含物。因此，所述术语可涵盖宿主细胞已在其中生长的培养基，例如在其中已分泌蛋白质的培养基，包括在增殖步骤之前或之后的培养基。如在细胞内产生本文所描述的异多聚体并且裂解或破裂宿主细胞以释放异多聚体的情况下，所述术语也可涵盖含有宿主细胞裂解物的缓冲液或试剂。
如本文所用的“重折叠”描述将含有二硫键的多肽从不当折叠的状态或解折叠状态转化为关于二硫键的天然构象或适当折叠的构象的任何过程、反应或方法。
如本文所用的“共折叠”具体地是指使用至少两种彼此相互作用的单体多肽并使得解折叠的或不当折叠的多肽转化为天然的、适当折叠的多肽的重折叠过程、反应或方法。
如本文所用，术语“受调节的血清半衰期”意指被本文所描述的异多聚体包含的货物多肽的循环半衰期相对于其天然形式的正变化或负变化。通过在施用异多聚体之后的不同时间点取得血液样品，并测定每一样品中所述分子的浓度来测量血清半衰期。血清浓度与时间的相关性允许计算血清半衰期。血清半衰期的增加期望地为至少约两倍，但是例如当较小的增加能够实现令人满意的给药方案或避免毒性作用时，较小的增加也可能是有用的。在一些实施方案中，所述增加是至少约三倍、至少约五倍或至少约十倍。
如本文所用的术语“受调节的治疗半衰期”意指治疗有效量的被本文所描述的异多聚体包含的货物多肽的半衰期相对于其未经修饰的形式的正变化或负变化。通过在施用后的不同时间点测量分子的药物代谢动力学和/或药效动力学特性来测量治疗半衰期。增加的治疗半衰期期望能够实现特定有益的给药方案、特定有益的总剂量，或者避免不希望的作用。在一些实施方案中，增加的治疗半衰期源自效力增加，经修饰的分子与其靶标的结合增加或减少，如蛋白酶等酶对所述分子的分解增加或减少，或未经修饰分子的另一参数或作用机制的增加或减少，或受体介导的所述分子的清除增加或减少。
当应用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”表示所述核酸或蛋白质不含其在天然状态下缔合的细胞组分中的至少一些，或所述核酸或蛋白质已浓缩至高于其活体内或活体外产生浓度的水平。它可以是均质状态。分离的物质可以是干燥或半干燥状态，或是包括但不限于水溶液的溶液形式。它可以是包含另外的药学上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物的组分。通常使用如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱的分析化学技术来测定纯度和同质性。作为制剂中存在的主要种类的蛋白质是基本上纯化的。具体而言，分离的基因是从侧接所述基因并编码除感兴趣基因以外的蛋白质的开放阅读框分离。术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一个条带。具体而言，其可能意指核酸或蛋白质是至少85％纯、至少90％纯、至少95％纯、至少99％纯或更高的纯度。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸以及其聚合物。除非具体限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且是以类似于天然存在核苷酸的方式代谢。除非另外具体地限制，否则所述术语还是指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、反义技术中使用的DNA类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)。除非另外指出，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(包括但不限于简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。具体而言，可通过产生其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等，Nucleic AcidRes.19：5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来指氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于对肽的描述和对蛋白质的描述，并且反之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然编码的氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所用，所述术语涵盖包括全长蛋白质在内的任何长度的氨基酸链，其中氨基酸残基通过共价肽键相连接。
术语“氨基酸”是指天然存在和非天然存在的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。所述类似物具有经修饰的R基团(如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相 同的基本化学结构。提及氨基酸包括，例如天然存在的蛋白质性L-氨基酸；D-氨基酸；化学修饰的氨基酸，如氨基酸变体和衍生物；天然存在的非蛋白质性氨基酸，如β-丙氨酸、鸟氨酸等；以及具有本领域已知的作为氨基酸的特征的特性的化学合成的化合物。非天然存在的氨基酸的实例包括但不限于，α-甲基氨基酸(例如α甲基丙氨酸)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(例如，2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸)、在侧链中具有额外亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)、以及其中侧链中的羧酸官能团被磺酸基团置换的氨基酸(例如，半胱氨酸)。将非天然氨基酸，包括合成的非天然氨基酸、取代的氨基酸或一种或多种D-氨基酸并入本发明的蛋白质中可以是以多种不同的方式有利的。含有D-氨基酸的肽等与含有L-氨基酸的对应物相比表现出增加的体外或体内稳定性。因此，当需要或要求较高的细胞内稳定性时，构建并入D-氨基酸的肽等可以是特别有用的。更具体地说，D-肽等是对内源性肽酶和蛋白酶抗性的，从而在需要改进的分子生物利用度以及延长的体内寿命时，提供这类特性。另外，不能有效加工D-肽等以用于对T辅助细胞的II类主要组织相容性复合体限制呈递，并且因此不太可能诱导完整生物体中的体液免疫应答。
在本文中，氨基酸可以其通常已知的三字母符号或以由国际纯化学与应用化学联合会生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可以其通常公认的单字母代码来表示。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。关于特定核酸序列，“保守修饰的变体”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或当核酸并不编码氨基酸序列时，是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG以及GCU皆编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每一位置处，可以在不改变所编码多肽的情况下将密码子更改为所描述的相应密码子中的任一个。所述核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰的变异中的一种。本文中编码多 肽的每一核酸序列还描述核酸的每一种可能的沉默变异。本领域的普通技术人员将认识到核酸中的各密码子(除了通常为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常为色氨酸的唯一密码子的TGG以外)均可被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异均隐含在每个所描述的序列中。
关于氨基酸序列，本领域的普通技术人员将认识到改变、添加或缺失所编码序列中的单一氨基酸或少量氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或氨基酸被化学上类似的氨基酸取代。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域中的普通技术人员已知的。所述保守性修饰的变体附加于并且不排除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因。
提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域中的普通技术人员已知的。以下八组各自含有为彼此的保守性取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及[0139]8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W H Freeman&Co.；第2版(1993年12月)
在两种或更多种核酸或多肽序列的背景下的术语“相同”或“同一 性”百分比是指相同的两个或更多个序列或子序列。当通过比较窗比较和比对最大对应性时，或如使用以下序列比较算法(或对于本领域中的普通技术人员来说可供使用的其它算法)中的一种或通过手动比对和目视检查来测量指定区时，如果序列具有一定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即在指定区上约60％同一性、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％同一性)，那么所述序列是“大致上相同的”。此定义还指测试序列的互补序列。同一性可存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区上，或长度为75至100个氨基酸或核苷酸的区上，或者在未指定的情况下可存在于多核苷酸或多肽的整个序列上。编码本发明的多肽的多核苷酸(包括来自除人以外的物种的同系物)可通过包括以下步骤的方法来获得：在严格杂交条件下使用具有本发明的多核苷酸序列或其片段的标记的探针来筛选文库，以及分离全长cDNA和含有所述多核苷酸序列的基因组克隆。这类杂交技术是熟练的技术人员众所周知的。
对于序列比较而言，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。在使用序列比较算法时，将测试序列与参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用的“比较窗”包括参考选自由20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150组成的组的连续位置数中的任一个的区段，其中可在将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列最佳比对后对这两个序列进行比较。本领域普通技术人员已知用于比较的序列比对方法。可通过包括但不限于以下的方法进行用于比较的最佳序列比对：Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源比对算法；对Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444的相似方法的搜索；这些算法的计算机化实施(WisconsinGenetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或通过手动比对和目视检查(参见，例如，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1995年增刊))。
适用于测定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的一个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等(1997)Nuc.Acids Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。用于执行BLAST分析的软件可通过经由万维网在ncbi.nlm.nih.gov上访问的美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开获得。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列而言)使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列而言，BLASTP程序使用字长3和期望值(E)10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比对数(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。BLAST算法通常在“低复杂性”过滤器关闭的情况下进行。
BLAST算法也执行两个序列之间相似性的统计学分析(Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。由BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小和概率(P(N))，其提供关于两个核苷酸或氨基酸序列之间将偶然发生匹配的概率的指标。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率小于约0.2、或小于约0.01、或小于约0.001，那么认为所述核酸与参考序列相似。
短语“与......选择性地(或特异性地)杂交”是指当特定核苷酸序列存在于复合混合物(包括但不限于，总细胞或文库DNA或RNA)中时，在严格杂交条件下分子仅与所述序列结合、形成双链体(duplexing)或杂交。
短语“严格杂交条件”是指在如本领域中已知的低离子强度和高 温条件下，DNA、RNA或其它核酸、或其组合的序列的杂交。通常，在严格条件下，探针将与其在核酸的复合混合物(包括但不限于，总细胞或文库DNA或RNA)中的靶标子序列杂交，但不与所述复合混合物中的其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下将是不同的。较长序列在较高温度下特异性地杂交。有关核酸杂交的广泛指导见于Tijssen，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with NucleicProbes，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid assays″(1993)。
如本文所用的术语“真核生物”是指属于系统发育结构域(phylogenetic domain)真核生物域(Eucarya)的生物体，如动物(包括但不限于哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括但不限于单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。
如本文所用，术语“原核生物”是指原核生物体。例如，非真核生物体可属于真细菌属(Eubacteria)(包括但不限于大肠杆菌、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermop hilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseu domonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)等)、系统发育结构域、或古生菌(Archaea)(包括但不限于詹氏甲烷球菌(Methano coccusjannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautot rophicum)、盐杆菌属(Halobacterium)如沃尔卡尼极嗜盐菌(Haloferax volcanii)和盐杆菌属种NRC-1、闪烁古球菌(Archaeoglobus fulgidus)、强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、堀越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrum pernix)等)系统发育结构域。
如本文所用的术语“受试者”是指动物，在某些实施方案中示哺乳动物，并且在其它实施方案中是人，其为治疗、观察或实验的对象。动物可以是伴侣动物(例如，狗、猫等)、家畜(例如，牛、绵羊、猪、马等)或实验室动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠等)。
如本文所用的术语“有效量”是指所施用的异多聚体的量，所述量将在一定程度上缓解所治疗的疾病、病状或病症的一种或多种症状。可施用含有本文所描述的异多聚体的组合物以用于预防性、增强性和/或治疗性治疗。
术语“增强(enhance/enhancing)”意指增加或延长所需作用的效力或持续时间。因此，对于增强治疗剂的作用而言，术语“增强”是指增加或延长其它治疗剂对系统的作用的效力或持续时间的能力。如本文所用的“增强有效量”是指足以增强另一种治疗剂在所需系统中的作用的量。当用于患者中时，对于此用途的有效量将取决于以下因素：疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及主治医师的判断。
如本文所用的术语“修饰的”是指对给定多肽作出的任何变化，如多肽长度、多肽的胺基酸序列、化学结构、共翻译修饰、或翻译后修饰的变化。形式“(修饰的)”术语意指所讨论的多肽任选地进行修饰，也就是说，所讨论的多肽可以是修饰的或未修饰的。
术语“翻译后修饰的”是指在天然或非天然氨基酸已被并入到多肽链中之后相对此种氨基酸发生的任何修饰。仅举例而言，所述术语涵盖共翻译体内修饰、共翻译体外修饰(如在不含细胞的翻译系统中)、翻译后体内修饰以及翻译后体外修饰。
术语“节段化”是指原始蛋白质序列的精确内部剪接，其产生优先缔合为异多聚体以形成准天然蛋白质结构的蛋白质序列的“区段”。或者，节段化可包括缺失多于一个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述缺失是一个氨基酸残基。在另一个实施方案中，所述缺失是两个氨基酸残基。在另一个实施方案中，所述缺失是三个氨基酸残基。
准天然结构：
关于单体天然蛋白质或其结构，准天然蛋白质和/或“准天然结构” 或准天然单体结构是源自所述单体天然蛋白质的区段的多肽的异多聚体组装，以使得所述异多聚体组装呈现可比得上所述单体天然蛋白质的功能和结构特征。在一些实施方案中，所述区段是还包含其它分子实体的多肽构建体的组分。蛋白质是天然动力学分子并且展示结构构型的系综，但是将一种天然结构归属于它，如通过X射线晶体学所获得的一种天然结构。所述准天然结构可被视为相类似该系综中的替代结构构型之一。在一个不同的方面，属于共同结构家族的同源蛋白质序列或蛋白质倾向于折叠成类似的结构几何学。属于所述家族的成员蛋白质可以视作实现相对于彼此的准天然结构。在蛋白质家族中的一些独特序列也可表现出类似的功能属性，并且因此可以被称作相对于彼此的准天然蛋白质。在在此所描述的包含两个或更多个多肽构建体(各自具有转运蛋白多肽组分)的异多聚体的情况下，所述转运蛋白多肽组装以形成与所述转运蛋白多肽所源自的蛋白质的天然单体形式类似的准天然结构。在这种情况下参考天然蛋白质是每个转运蛋白多肽所源自的单体蛋白质并且参考天然结构是所述转运蛋白多肽所源自的蛋白质的结构。描述了一种情况，其中两个或更多个不同的多肽自组装以形成异多聚体，所述异多聚体具有可比得上天然蛋白质(其本身是单体实体)的功能特征。在一些实施方案中，所述组装的异多聚体具有所述单体天然蛋白质的至少50％活性。在一些实施方案中，所述组装的异多聚体具有所述单体天然蛋白质的至少60％活性。在具体实施方案中，所述组装的异多聚体具有所述单体天然蛋白质的至少75％活性。在一些实施方案中，所述组装的异多聚体具有所述单体天然蛋白质的至少80％活性。在具体实施方案中，所述组装的异多聚体具有所述单体天然蛋白质的至少90％活性。在一些实施方案中，所述组装的异多聚体具有所述单体天然蛋白质的至少95％活性。在一些实施方案中，所述组装的异多聚体具有所述单体天然蛋白质的至少99％活性。在某些实施方案中提供包含源自白蛋白或异白蛋白的转运蛋白多肽的异多聚体，以使得所述转运蛋白多肽自组装以形成异多聚体，所述异多聚体表现出天然白蛋白样结构和/或功能特征，如FcRn、SPARC和/或gp60结合。在某些实施方案中是包含转运蛋白多肽的异 多聚体，每个转运蛋白多肽包含与从天然单体蛋白获得的氨基酸区段具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中是包含转运蛋白多肽的异多聚体，每个转运蛋白多肽包含与从天然单体蛋白获得的氨基酸区段具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在示例性实施方案中是包含转运蛋白多肽的异多聚体，每个转运蛋白多肽包含与从天然单体蛋白获得的氨基酸区段具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在具体实施方案中是包含转运蛋白多肽的异多聚体，每个转运蛋白多肽包含与从天然单体蛋白获得的氨基酸区段具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中是包含转运蛋白多肽的异多聚体，每个转运蛋白多肽包含与从天然单体蛋白获得的氨基酸区段具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中是包含转运蛋白多肽的异多聚体，每个转运蛋白多肽包含与从天然单体蛋白获得的氨基酸区段具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述天然单体蛋白是哺乳动物白蛋白或其衍生物或类似物。在某些实施方案中，所述天然单体蛋白是人血清白蛋白。在某些实施方案中，提出源自转铁蛋白的多肽区段，所述多肽区段自组装以形成异多聚体，所述异多聚体表现出天然转铁蛋白样结构和功能特征。在某些实施方案中，提出源自膜联蛋白的多肽区段，所述多肽区段自组装以形成异多聚体，所述异多聚体表现出天然膜联蛋白样结构和功能特征。这些异多聚体被称为是准天然的。
转运蛋白多肽
如本文所用，术语“转运蛋白多肽”或“转运蛋白多肽”或“转运蛋白肽”或“转运蛋白”是指多肽，以使得所述转运蛋白多肽能够与其它这类转运蛋白多肽在溶液中形成异多聚体蛋白，并且其中所述异多聚体蛋白具有从其衍生至少一个转运蛋白多肽的单体蛋白的准天然结构。在本文所描述的异多聚体的某些实施方案中，所有转运蛋白多肽是源自相同的白蛋白或异白蛋白蛋白质。在某些其它实施方案中，所述异多聚体由源自不同白蛋白和异白蛋白蛋白质的转运蛋白多肽形成。在本文所描述的异多聚体的某些实施方案中，所述转运蛋白多肽 是源自转铁蛋白。在本文所描述的异多聚体的某些实施方案中，所有转运蛋白多肽是源自膜联蛋白蛋白质。在某些实施方案中，所述异多聚体由源自相同膜联蛋白蛋白质的转运蛋白多肽形成。在一些实施方案中，所述异多聚体由源自不同膜联蛋白蛋白质的转运蛋白多肽形成。在一个实施方案中，所述异多聚体由源自膜联蛋白A2的转运蛋白多肽形成。
在某些实施方案中，转运蛋白多肽是单体全蛋白的区段，其中所述区段能够组装以形成异多聚体，以使得所述异多聚体形成与所述天然单体全蛋白类似的准天然结构。在一个实施方案中，所述转运蛋白多肽是来自β-桶蛋白的区段。在某些实施方案中提供包含转运蛋白多肽的异多聚体，所述转运蛋白多肽自组装以形成类似于天然单体蛋白的准天然结构，每个转运蛋白多肽包含与所述天然单体蛋白的区段具有至少50％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中提供包含转运蛋白多肽的异多聚体，所述转运蛋白多肽自组装以形成类似于天然单体蛋白的准天然结构，每个转运蛋白多肽包含与所述天然单体蛋白的区段具有至少60％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中提供包含转运蛋白多肽的异多聚体，所述转运蛋白多肽自组装以形成类似于天然单体蛋白的准天然结构，每个转运蛋白多肽包含与所述天然单体蛋白的区段具有至少75％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中提供包含转运蛋白多肽的异多聚体，所述转运蛋白多肽自组装以形成类似于天然单体蛋白的准天然结构，每个转运蛋白多肽包含与所述天然单体蛋白的区段具有至少80％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中提供包含转运蛋白多肽的异多聚体，所述转运蛋白多肽自组装以形成类似于天然单体蛋白的准天然结构，每个转运蛋白多肽包含与所述天然单体蛋白的区段具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中提供包含转运蛋白多肽的异多聚体，所述转运蛋白多肽自组装以形成类似于天然单体蛋白的准天然结构，每个转运蛋白多肽包含与所述天然单体蛋白的区段具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中提供包含转运蛋白多肽的异多聚体，所述转运蛋白多肽自组装 以形成类似于天然单体蛋白的准天然结构，每个转运蛋白多肽包含与所述天然单体蛋白的区段具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述天然单体蛋白是β-螺旋桨蛋白。在一些实施方案中，所述天然单体蛋白是螺旋束蛋白。在实施方案中，所述转运蛋白多肽源自，例如但不限于，包含锌指基序、螺旋-转角-螺旋基序或β-发夹基序的蛋白质。在一些实施方案中，所述转运蛋白多肽包含从非免疫原性蛋白质获得的区段，所述非免疫原性蛋白质是结构上稳定的且具有有利的生物学特性。
转运蛋白多肽通过一种蛋白质在节段化位点处的节段化而源自所述蛋白质。所述节段化位点是基于以下两种判定标准来设计。
首先，选择所述节段化位点以使得它驻留在所述蛋白质内的一个环上，所述环具有较高的相对SASA和与所述蛋白质结构的剩余部分的有限接触。在一个实施方案中，所述节段化位点驻留在灵活且可及的一个环中。在另一个实施方案中，所述节段化位点驻留在不太可能促进蛋白质核心稳定性且因此影响所述组装的准天然蛋白质结构相对于完整蛋白质结构的稳定性的环中。
第二，选择所述节段化位点以使得它在所述转运蛋白多肽之间产生互补界面，其中所述界面是非极性的、广泛地和相互交叉的。所述界面的非极性与所述界面中非极性氨基酸的数目相关。如本领域中已知，氨基酸可以被广义地分类为极性和非极性残基。极性残基有利地与溶剂环境中的水相互作用，而非极性残基不在能量方面有利地与水相接触。出于这一原因，蛋白质中的非极性残基倾向于与其它非极性残基聚簇并且从其局部环境中排除水分子，并且这是在能量方面有利的。涉及非极性残基的这类相互作用还被称为疏水相互作用。
所述界面处的包埋表面积源自两个相互作用的多肽的未缔合状态与缔合状态之间的分子或溶剂可及表面的损失。在一个实施方案中，所述界面包埋面积在约与约之间。在另一个实施方案 中，所述界面包埋面积在约与约之间。在另一个实施方案中，所述界面包埋面积在约与约之间。在一个实施方案中，对所述界面包埋面积的非极性贡献大于在所述界面处的净包埋表面积的50％。
相对于界面及其交叉，驱动任何蛋白质-蛋白质相互作用和复合物形成的一个重要因素是在两个接触蛋白质之间形成的界面处的表面残基的接触。呈缔合形式的两个接触蛋白质表面的生理-化学和结构互补性是有利的和稳定的复合物形成的标志。生理-化学互补性由优选的相互作用定义并且可包含在相互作用的蛋白质表面上的氢键、基于电荷的盐桥、不同类型的静电相互作用、疏水和范德华接触。在三维水平下蛋白质表面由由于构成表面区域的不同氨基酸的大小和取向的差异所致而形成的凸起和凹陷限定。在一个有利的蛋白质-蛋白质界面中，来自两个相互作用的蛋白质表面的突起和凹陷相互交叉以产生结构互补性。相互作用的蛋白质之间的的界面越大和越广泛，蛋白质-蛋白质相互作用就可能更稳定。
在一个实施方案中，两个转运多肽之间的界面富含热点残基，即涉及良好连接的相互作用网络的单个残基或残基的组。所述相互作用可以是基于在蛋白质中观察到的典型相互作用，如氢键，带电荷的残基相互作用如盐桥，显示较强结构互补性和疏水性残基聚簇的范德华接触。这最大化界面稳定性并防止复合物解离。
在一个实施方案中，选择节段化位点以在所节段化的部分上保留从其衍生转运蛋白多肽的蛋白质中存在的天然二硫键，以便共价连接两个区段。这意味着进一步增加异二聚体化准天然蛋白质样结构的稳定性，所述结构从节段化之后的两个衍生区段自组装。在这个实施方案中，选择蛋白质序列中的环区域，所述环区域满足这里所描述的二硫键标准，即具有非常接近于环区域中的节段化位点的二硫键。除了共价交联所述两条链的功能外，这种二硫键还可充当开放环的替代。
在另一个实施方案中，跨两个区段的二硫键通过在两个衍生的区段中的每个上的选定位置处引入单个氨基酸至半胱氨酸突变来进行工程化。
在另一个实施方案中，工程化在两个区段的界面处的氨基酸以进一步增加或改善所述界面处的热点或增强所组装的准天然白蛋白结构中的两个区段之间的结构和物理-化学互补性。
白蛋白
如本文所用，“白蛋白”统指具有白蛋白的一种或多种功能活性(例如生物活性)的白蛋白蛋白或氨基酸序列、或白蛋白区段或变体。具体地说，“白蛋白”是指人白蛋白或其区段(参见例如，EP 201 239、EP 322 094、WO 97/24445、WO95/23857)，尤其是如图1中所示的人白蛋白的成熟形式，或来自其它脊椎动物的白蛋白或其区段，或这些分子或其片段的类似物或变体。在某些实施方案中，白蛋白是指白蛋白的截短型式。
术语“准白蛋白”是指具有类似于全白蛋白的结构和/或功能的异多聚体分子，并且其中所述异多聚体分子是由基于全白蛋白的序列而设计的两个或更多个单体多肽的组装形成。在某些实施方案中，在此的目标多肽包含优先缔合为异多聚体对以形成准蛋白质的“区段”。在一些实施方案中，这种准天然蛋白质是准天然白蛋白。在一些实施方案中，所述准天然白蛋白具有全白蛋白活性的90％。在一些实施方案中，所述准天然白蛋白具有全白蛋白活性的75％。在一个实施方案中，所述准天然白蛋白具有全白蛋白活性的50％。在一些实施方案中，所述准天然白蛋白具有全白蛋白活性的50％-75％。在一个实施方案中，准天然白蛋白具有全白蛋白活性的80％。在一些实施方案中，所述准天然白蛋白保留全白蛋白的结构特征的约90％，如通过分子建模所确定。在一些实施方案中，所述准天然白蛋白保留全白蛋白的结构特征的约80％，如通过分子建模所确定。在一些实施方案中，所述准天然白蛋白保留全白蛋白的结构特征的约70％，如通过分子建模所确定。在一些实施方案中，所述准天然白蛋白保留全白蛋白的结构特征的约50％，如通过分子建模所确定。在一些实施方案中，所述准天然白蛋白保留全白蛋白的结构特征的约50％-75％，如通过分子建模所确定。
术语人血清白蛋白(HSA)和人白蛋白(HA)在本文中可互换使用。术语“白蛋白和血清白蛋白”范围更广，并且涵盖人血清白蛋白(及其片段和变体)以及来自其它物种的白蛋白(及其片段和变体)。
在某些实施方案中，本文所描述的异多聚体蛋白的每个基于白蛋白的单体是基于标准HA的变体。本发明的异多聚体蛋白的每个货物多肽部分也可以是如本文所描述的治疗性蛋白的变体。术语“变体”包括保守的或非保守的插入、缺失和取代，其中这类变化不会实质上改变以下中的一项或多项：白蛋白的抗肿瘤(oncotic)特性、有用的配体结合特性和非免疫原性特性，或赋予治疗性蛋白治疗活性的活性位点或活性结构域。在某些实施方案中，变体还可意指通过使白蛋白在其一级序列中的替代位置处节段化而衍生的替代异多聚体种类。
在某些实施方案中，本文所描述的异多聚体蛋白包括人白蛋白的天然存在的多态变体和人白蛋白的片段，例如EP 322 094中所公开的那些片段(即HA(Pn)，其中n是369至419)。
在某些实施方案中，白蛋白源自任何脊椎动物，尤其是包括但不限于人、牛、绵羊、大鼠、小鼠、兔、马、狗或猪的任何哺乳动物。在某些实施方案中，白蛋白源自非哺乳动物白蛋白，包括但不限于母鸡和鲑鱼
人白蛋白的序列是如具有N末端信号传导残基MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR的前蛋白形式中所示：
SEQ ID NO：1
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAFTFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
异白蛋白
异白蛋白是白蛋白的遗传变体。在某些实施方案中，所述异白蛋白是人异白蛋白(HAA)。通过临床电泳过程中的群体遗传学调查或在血液供体调查中，已鉴别了与白蛋白存在电泳迁移率差异的异白蛋白。作为突变和迁移的标志物，异白蛋白是遗传学家、生物化学家和人类学家的兴趣所在，但这些异白蛋白中的大多数与疾病无关(Minchioti等HumanMutations 29(8)，1007-1016(2008))。
袁1：与SEQ ID NO：1的HA相比，不同的异白蛋白所包含的取代的列表。热稳定性、半衰期信息以及其它HAA提供于Krogh-hansen等Biochim Biophys Acta 1747，81-88(2005)；和WO2011051489(以引用的方式并入本文)中。
膜联蛋白：
如本文所用，“膜联蛋白”是指在真核生物体中发现的一组细胞蛋白质。膜联蛋白还被称作脂皮质蛋白。如本文所用，“膜联蛋白”可以是指任何膜联蛋白蛋白质，或特定膜联蛋白蛋白质如“膜联蛋白A1”、“膜联蛋白A2”和“膜联蛋白A5”。膜联蛋白的特征在于它们的钙依赖性的结合带负电荷的磷脂(即膜壁)的能力。膜联蛋白的特征在于限于30-50 kDa大小的重复蛋白支架，具有相当普遍存在的组织分布。膜联蛋白的基础结构由两个结构域组成：结构上保守的C端“核心”区域和相异的N末端结构域。所述核心区域以Ca2+依赖性方式结合磷脂细胞膜。所述N末端区域结合细胞质蛋白质。膜联蛋白在不同的细 胞学和生理学过程中是重要的，并提供膜支架。所述C末端核心由四个膜联蛋白重复序列组成。膜联蛋白的特征在于它的柔性的重复序列样性质，所述性质影响它的固有膜感知能力。例如，可以通过重复序列的数目控制对特定生物膜的亲和力。利用特征性磷脂感知，膜联蛋白可适用于感知/靶向肠连接部以用于药物递送。膜联蛋白的另一种潜在应用是靶向肠紧密连接部和闭锁小带区域(ZO-1)，已知所述闭锁小带区域对于较大的蛋白质治疗剂而言是特别难以通过的，从而显著减少药物吸收。
术语“准膜联蛋白”是指具有类似于全膜联蛋白的结构和/或功能的异多聚体分子，并且其中所述异多聚体分子是由基于全膜联蛋白的序列而设计的两个或更多个单体多肽的组装形成。在某些实施方案中，所述单体多肽是优先缔合为异多聚体对以形成准天然蛋白质的“区段”。在一些实施方案中，所述准膜联蛋白具有全膜联蛋白活性的90％。在一些实施方案中，所述准膜联蛋白具有全膜联蛋白活性的75％。在一个实施方案中，所述准膜联蛋白具有全膜联蛋白活性的50％。在一些实施方案中，所述准膜联蛋白具有全膜联蛋白活性的50％-75％。在一个实施方案中，准膜联蛋白具有全膜联蛋白活性的80％。在一些实施方案中，所述准膜联蛋白具有全膜联蛋白的结构的90％，如通过分子建模所确定。在一些实施方案中，所述准膜联蛋白具有全膜联蛋白的结构的80％，如通过分子建模所确定。在一些实施方案中，所述准膜联蛋白具有全膜联蛋白的结构的70％，如通过分子建模所确定。在一些实施方案中，所述准膜联蛋白具有全膜联蛋白的结构的50％，如通过分子建模所确定。在一些实施方案中，所述准膜联蛋白具有全膜联蛋白的结构的50％-75％，如通过分子建模所确定。
人野生型膜联蛋白A2的序列如下所示：
SEQ ID NO：14
GSAVSPYPTFNPSSDVAALHKAIMVKGVDEATIIDILTKRNNAQRQQIKAAYLQETGKPLDETLKKALTGHLEEVVLALLKTPAQFDADELRAAMKGLGTDEDTLIEILASRTNKEIRDINRVYREELKRDLAKDITSDTSGDFRNALLSLAKGDRSEDFGVNEDLADSDARALYEAGERRKGTDVNVFNTILTTRSYPQLRRVFQKYTKYSKHDMNKVLDLELKGDIEKCLTAIVKCATSKPAFFAEKLHQAMKGVGTRHKALIRIMVSRSEIDMNDIKAFYQKMYGISLCQAILDETKGDYEKILVALCGGN
转铁蛋白：
转铁蛋白是存在于所有脊椎动物中的约76kDa分子量的单体蛋白，并且起铁结合和转运蛋白质的作用。重组人转铁蛋白和它的融合体被考虑用于控制多种疾病，包括地中海贫血、无转铁蛋白血症、年龄相关的黄斑变性、2型糖尿病；用于干细胞移植过程中以及用于治疗由炭疽细菌引起的急性传染性疾病。转铁蛋白在胃肠环境中是稳定的，并且许多研究已证实完整的蛋白质-转铁蛋白缀合物可以口服地递送且保留生物活性。
术语“准转铁蛋白”是指具有类似于全转铁蛋白的结构和/或功能的异多聚体分子，并且其中所述异多聚体分子是由基于全转铁蛋白的序列而设计的两个或更多个单体多肽的组装形成。在某些实施方案中，所述单体多肽是优先缔合为异多聚体对以形成准天然蛋白质的“区段”。在一些实施方案中，所述准转铁蛋白具有全转铁蛋白活性的90％。在一些实施方案中，所述准转铁蛋白具有全转铁蛋白活性的75％。在一个实施方案中，所述准转铁蛋白具有全转铁蛋白活性的50％。在一些实施方案中，所述准转铁蛋白具有全转铁蛋白活性的50％-75％。在一个实施方案中，准转铁蛋白具有全转铁蛋白活性的80％。在一些实施方案中，所述准转铁蛋白具有全转铁蛋白的结构的90％，如通过分子建模所确定。在一些实施方案中，所述准转铁蛋白具有全转铁蛋白的结构的80％，如通过分子建模所确定。在一些实施方案中，所述准转铁蛋白具有全转铁蛋白的结构的70％，如通过分子建模所确定。在一些实施方案中，所述准转铁蛋白具有全转铁蛋白的结构的50％，如通过分子建模所确定。在一些实施方案中，所述准转铁蛋白具有全转铁蛋白的结构的50％-75％，如通过分子建模所确定。
野生型人转铁蛋白的序列是如下所示：
SEQ ID NO:19
货物分子：
本文所描述的异多聚体包含含有至少一个货物分子和至少一个转运蛋白多肽的单体，所述货物分子和转运蛋白多肽借助于(包括但不限于)基因融合或化学缀合而彼此缔合。在一些实施方案中，所述货物多肽与所述转运蛋白多肽的N末端或C末端融合。在一些实施方案中，所述货物多肽与所述转运蛋白多肽的N末端和C末端两者融合。在一些实施方案中，所述货物多肽缀合至通过使人白蛋白节段化而衍生的转运蛋白多肽的半胱氨酸34位置。在某些实施方案中，至少一个货物分子是治疗剂。在某些药剂中，所述货物分子是毒素。在某些实施方案中，所述货物分子是抗原或其类似物。在一个实施方案中，所述货物分子是天然产物、其类似物或前药。在某些实施方案中，所述货物分子是治疗剂如细胞毒素(例如，细胞生长抑制剂或杀细胞剂)、治疗剂或放射性金属离子(例如，α-发射体，例如，213Bi)。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何药剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普罗卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌罗霉素及其类似物或同系物。治疗剂包括但不限于，抗代谢药(例如，甲氨蝶呤、6巯基嘌呤、6硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)，烷化剂(例如，氮芥、thioepa、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C、以及顺-二氯二氨铂(cis-dichlorodiamine platinum)(II)(DDP)顺铂)，蒽环类(例如，柔红霉素(原来是道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，更生霉素(原来是放线菌素)、博来霉素、光辉霉素、以及安曲霉素(AMC))，以及抗有丝分裂试剂(例如，长春新碱和长春碱)。
在某些实施方案中，所述货物分子是生物分子。在一个实施方案中，所述货物分子是天然的或合成的核酸。在某些实施方案中，至少一个货物分子是DNA、PNA和/或RNA寡聚体中的一种或多种。在某些实施方案中，本文所描述的异多聚体包含以下单体蛋白：其含有至少一个货物多肽或其片段或变体以及至少一个转运蛋白多肽，所述货物多肽和转运蛋白多肽借助于(包括但不限于)基因融合或化学缀合而彼此缔合。
如本文所用的“货物多肽”是指具有一种或多种治疗和/或生物活性的蛋白质、多肽、抗体、肽或其片段或变体。本发明所涵盖的货物多肽包括但不限于：蛋白质、多肽、肽、抗体、治疗上相关的靶蛋白质的底物或配体以及生物制品。(术语肽、蛋白质和多肽在本文中可互换地使用。)具体地，术语“货物多肽”涵盖抗体及其片段和变体。因此，本文所描述的异多聚体可含有货物多肽的至少一个片段或变体、和/或抗体的至少一个片段或变体。另外，在某些实施方案中，术语“货物多肽”是指货物多肽的内源性或天然存在的相关物。
作为一个非限制性实例，“货物生物分子”是适用于治疗、预防或改善疾病、病状或病症的生物分子，如但不限于，蛋白质、DNA或RNA。作为一个非限制性实例，“货物多肽”可以是一种多肽：其特异性地结合特定细胞类型(正常的(例如，淋巴细胞)或异常的(例如，癌细胞))，并且因此可以用于将化合物(药物或细胞毒性剂)特异性地靶向所述细胞类型。
在另一个非限制性实例中，“货物分子”是以下分子：其具有生物活性，并且具体地说适用于治疗、预防或改善疾病的生物活性。货物分子(例如货物多肽)可具有的生物活性的非穷尽性列表包括：增强免疫应答、促进血管生成、抑制血管生成、调节造血功能、刺激神经生长、增强免疫应答、抑制免疫应答，或本文所描述的任何一种或多种生物活性。
与本文所描述的异多聚体蛋白的货物多肽部分相对应的货物多肽(如细胞表面蛋白和分泌蛋白)经常通过连接一个或多个寡糖基团而被修饰。所述修饰(被称为糖基化)可显著地影响蛋白质的物理特性，并且可以在蛋白质稳定性、分泌和定位中是重要的。糖基化沿着多肽主链的特定位置发生。通常存在两种主要类型的糖基化：以O-连接的寡糖为特征的糖基化，所述寡糖连接至丝氨酸或苏氨酸残基；和以N-连接的寡糖为特征的糖基化，所述寡糖连接至Asn-X-Ser/Thr序列中的天冬酰胺残基，其中X可以是除了脯氨酸以外的任何氨基酸。N-乙酰基神经氨酸(还被称为唾液酸)通常是N-连接的和B-连接的寡糖的末端残基。如蛋白质结构和细胞类型等的变量会影响链内在不同的糖基化位点处的碳水化合物单元的数目和性质。糖基化异构体在给定的细胞类型内的相同位点处也是常见的。
表2提供与本文所描述的异多聚体的货物多肽部分相对应的货物多肽的非穷尽列表。“货物多肽”列公开了货物多肽分子，其后面的括弧含有包含所述货物多肽分子或其片段或变体、或者可替代地由所述货物多肽分子或其片段或变体组成的科学名称和商标名称。在一个 实施方案中，所述货物分子是结合在“货物多肽”列中或在已以引用地方式并入本文的Zhu等(Nucleic Acids Res.38(1)，D787-D791(2009))；Wishart等(Nucleic AcidsRes 36，D901-D906(2008))；Ahmed等(Nucleic Acids Res 39，D960-D967(2011))中公开的蛋白质的分子，或者属于治疗性靶分子类别的蛋白质。
如本文所用的“货物多肽”可以指单个货物多肽分子(由可从CAS和Genbank登录号获得的氨基酸序列定义)，或者指与在所述列中公开的给定货物多肽分子相关的整组货物多肽，或者表示与在所述列中公开的多肽分子结合的货物多肽。
表2：与异多聚体的货物多肽部分相对应的货物多肽的非穷尽列表
在一个实施方案中，所述货物多肽是抗原结合多肽构建体。在另一个实施方案中，所述货物多肽是为抗体或其片段或变体的抗原结合多肽构建体。在一个实施方案中，所述抗原结合多肽构建体是抗体的Fab片段、或scFv、或单结构域抗体或其片段。
在一个实施方案中，所述货物多肽选自结合CD3、CD19、CD20、HER2或HER3的抗原结合多肽构建体。抗原结合多肽构建体的适合实例是本领域中已知的并且包括源自抗-CD3、抗-CD19、抗-HER2以 及抗-HER3抗体的那些。
功能活性：
“具有功能活性的多肽”是指能够展示与全长、前蛋白和/或成熟形式的货物多肽相关的一种或多种已知的功能活性的多肽。这类功能活性包括但不限于生物活性、抗原性[结合(或与多肽竞争结合)抗多肽抗体的能力]、免疫原性(产生结合本文所描述的特定多肽的抗体的能力)、与本文所描述的多肽形成多聚体的能力以及结合多肽的受体或配体的能力。在某些实施方案中，所述功能活性包括改进配偶体蛋白质的表达和稳定性的能力。
“具有生物活性的多肽”是指如在特定生物测定中测量的表现出与本文所描述的治疗性蛋白(包括成熟形式)的活性类似但不一定相同的活性的多肽，所述活性具有或不具有剂量依赖性。在剂量依赖性确实存在的情况下，与本文所描述的多肽相比，不必与所述多肽的剂量依赖性相同，而是基本上类似于给定活性的剂量依赖性(即，相对于本文所描述或表2中所呈现的多肽，候选多肽将表现出更大的活性或不超过约25倍更少或不超过约10倍更少的活性，或不超过约三倍更少的活性)。
在某些实施方案中，当货物分子未与转运蛋白多肽连接时，本文所描述的异多聚体具有至少一种与所述货物分子相关的生物活性和/或治疗活性。在某些实施方案中，当货物多肽未与转运蛋白多肽连接时，本文所描述的异多聚体具有至少一种与所述货物多肽相关的生物活性和/或治疗活性。在某些实施方案中，当货物多肽未与基于白蛋白或异白蛋白的多肽连接时，本文所描述的异多聚体蛋白具有至少一种与所述货物多肽部分(或其片段或变体)相关的生物活性和/或治疗活性。
使用或常规地改进本领域中已知的测定、以及本文所描述的测定，可以测定本文所描述的异多聚体蛋白的功能活性(例如，生物活性)。 另外，本领域技术人员可以使用在表2的对应行(例如，表2的第3列)中提及的测定，常规地测定与基于白蛋白或异白蛋白的单体多肽的货物蛋白部分相对应的蛋白质片段的活性。在某些实施方案中，使用本领域已知的和/或在下面的实施例部分中描述的测定，测定与异多聚体的白蛋白蛋白质部分相对应的白蛋白蛋白质片段的活性。
例如，在一个实施方案中，当测定本文描述的异多聚体蛋白结合抗货物多肽抗体和/或抗白蛋白抗体或者与货物多肽竞争结合抗货物多肽抗体和/或抗白蛋白抗体的能力时，可以使用本领域中已知的各种免疫测定，包括但不限于，使用以下技术的竞争性的和非竞争性测定系统：如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定(例如，使用胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测定(例如，凝胶凝集测定、血凝测定)、补体结合测定、免疫突光测定、蛋白A测定以及免疫电泳测定等。在一个实施方案中，通过检测第一抗体上的标记来检测抗体结合。在另一个实施方案中，通过检测第二抗体或试剂与第一抗体的结合来检测第一抗体。在另一实施方案中，标记第二抗体。用于检测免疫测定中结合的许多方式是本领域中已知的并且在本发明的范围内。
在某些实施方案中，当鉴别由本文所描述的异多聚体包含的货物分子的结合配偶体(例如受体或配体)时，测定本文所描述的异多聚体与所述结合配偶体的结合，例如通过本领域中熟知的方式例如像还原和非还原凝胶色谱法、蛋白质亲和色谱法以及亲和印迹。通常参见Phizicky等，Microbiol.Rev.59：94-123(1995)。在另一个实施方案中，可以使用本领域中已知的技术常规地测定异多聚体蛋白的生理学相关物与异多聚体的货物蛋白质部分相对应的多肽的一种或多种底物结合的能力。
生物活性
在某些实施方案中，将本文所描述的异多聚体用于测定一种或多种生物活性的测试中。如果异多聚体在特定测定中表现出活性，很可能由所述异多聚体的一个或多个单体包含的至少一个货物蛋白质涉入与所述生物活性相关的疾病中。因此，所述异多聚体可用于治疗所述相关疾病。
在某些实施方案中，提供一种治疗疾病或病症的方法，所述方法包括：以有效地治疗、预防或改善所述疾病或病症的量，向需要这种治疗、预防或改善的患者施用本文所描述的异多聚体。
本文提供由细胞产生的基于白蛋白或异白蛋白的单体融合蛋白，其中所述蛋白质由多核苷酸编码，其中所述单体蛋白包含至少一个货物蛋白质和一个白蛋白或异白蛋白衍生的多肽，以使得所述单体在溶液中形成异多聚体。在某些实施方案中，当使用多核苷酸来从细胞表达编码的蛋白质时，所述细胞的天然分泌和加工步骤产生缺乏至少一个信号序列的蛋白质。信号序列的具体氨基酸序列是本领域中熟知的。
在某些实施方案中，本文所描述的异多聚体被用于内分泌系统的疾病和/或病症的诊断、预后、预防和/或治疗中。在某些实施方案中，本文所描述的异多聚体被用于神经系统的疾病和/或病症的诊断、预后、预防和/或治疗中。
在某些实施方案中，本文所描述的异多聚体被用于免疫系统的疾病和/或病症的诊断、预后、预防和/或治疗中。在某些实施方案中，本文所描述的异多聚体被用于呼吸系统的疾病和/或病症的诊断、预后、预防和/或治疗中。
在某些实施方案中，本文所描述的异多聚体被用于心血管系统的疾病和/或病症的诊断、预后、预防和/或治疗中。在某些实施方案中，本文所描述的异多聚体被用于生殖系统的疾病和/或病症的诊断、预后、预防和/或治疗中。
在某些实施方案中，本文所描述的异多聚体被用于消化系统的疾病和/或病症的诊断、预后、预防和/或治疗中。在某些实施方案中，本文所描述的异多聚体蛋白被用于与血液有关的疾病和/或病症的诊断、预后、预防和/或治疗中。
在某些实施方案中，本文所描述的异多聚体被用于与至少一种或多种组织相关的疾病和/或病症的诊断和/或预后中，其中表达至少一个目标基因，其中本文所描述的异多聚体包含结合所述至少一个目标基因的货物分子。
在某些实施方案中，本文所描述的异多聚体和/或编码基于白蛋白/异白蛋白的单体(其缔合以形成本文所描述的异多聚体)的多核苷酸被用于与以下活性相关的疾病和/或病症的诊断、检测和/或治疗中，所述活性包括但不限于激素原活化、神经递质活性、细胞信号传导、细胞增殖、细胞分化和细胞迁移。
治疗用途：
一方面，本文所描述的异多聚体涉及基于抗体的疗法，所述疗法涉及向患者施用所描述的包含一个或多个货物多肽(其是抗体、抗体的片段或变体)的异多聚体以用于治疗一种或多种所公开的疾病、病症或病状。本文所描述的治疗性化合物包括但不限于本文所描述的异多聚体、编码本文所描述的异多聚体的核酸。
在一个具体实施方案中是基于抗体的疗法，所述疗法涉及向患者施用包含抗体的至少一个片段或变体的本文所描述的异多聚体，以用于治疗一种或多种疾病、病症或病状，所述疾病、病症或病状包括但不限于：神经病症、免疫系统病症、肌肉病症、生殖病症、胃肠病症、肺病症、心血管病症、肾病症、增生性病症和/或癌性疾病和病状和/或如本文其它地方所描述的疾病、病症或病状。
在治疗上使用本发明的包含抗体的至少一个片段或变体的异多 聚体蛋白的方式的总结包括在身体中局部地或全身性地结合，或通过抗体的直接细胞毒性，例如通过补体(CDC)或通过效应细胞(ADCC)来介导。这些途径中的一些在以下更详细地描述。根据本文所提供的教义，本领域的普通技术人员将知道如何出于诊断、监测或治疗目的来使用本文所描述的异多聚体而无需过多实验。
本文所描述的包含抗体的至少一个片段或变体的异多聚体可单独或与其它类型的治疗(例如，放射疗法、化学疗法、激素疗法、免疫疗法以及抗肿瘤剂)组合施用。一般来说，优选的是施用具有与所述患者相同的物种的物种起源或物种反应性(在抗体的情况下)的产物。因此，在一个实施方案中，为了治疗或预防将人抗体、片段衍生物、类似物或核酸施用至人患者。
基因疗法：
在一个具体实施方案中，通过基因疗法，施用包含编码本文所描述的异多聚体蛋白的序列的核酸以治疗、抑制或预防与蛋白质的异常表达和/或活性相关的疾病或病症。基因疗法是指通过向受试者施用表达的或可表达的核酸所进行的疗法。在本发明的这个实施方案中，所述核酸产生其编码的介导治疗作用的蛋白质。可使用本领域中可用的任何基因疗法方法。
治疗或预防活性的证明：
在用于人中之前，在体外测试本文所描述的异多聚体或药物组合物，并且然后在体内测试所需的治疗或预防活性。例如，用于证明化合物或药物组合物的治疗或预防效用的体外测定包括化合物对细胞系或患者组织样品的作用。所述化合物或组合物对所述细胞系和/或组织样品的作用可使用本领域技术人员已知的技术进行测定，所述技术包括但不限于玫瑰花结(rosette)形成测定和细胞溶解测定。根据本发明，可用于确定是否指示施用特定化合物的体外测定包括体外细胞培养测定，其中将患者组织样品生长在培养物中并且暴露于异多聚体 或以另外的方式施用异多聚体，并且观察所述异多聚体对所述组织样品的作用。
治疗性/预防性施用和组合物
提供通过向受试者施用有效量的本文所描述的异多聚体或药物组合物来治疗、抑制和预防的方法。在一个实施方案中，所述异多聚体是大体上纯化的(即，大体上不含限制其作用或产生所不希望的副作用的物质)。在某些实施方案中，所述受试者是动物，包括但不限于动物如牛、猪、马、鸡、猫、狗等，并且在某些实施方案中是哺乳动物，并且最优选人。
不同递送系统是已知的并且可用于施用本文所描述的异多聚体制剂，例如封装在脂质体、微颗粒、微胶囊中，能够表达所述化合物的重组细胞，受体介导的内吞作用(参见，例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))、构建作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸等。引入方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述化合物或组合物可通过任何适宜途径施用，例如通过输注或弹丸注射，通过经上皮或粘膜皮肤衬层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。此外，在某些实施方案中，希望通过任何适合的途径(包括心室内和鞘内注射)将本文所描述的异多聚体组合物引入中枢神经系统中；心室内注射可通过例如附接至储库(如Ommaya储库)的心室内导管来促进。还可以采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器，并与雾化剂一起配制。
在一个具体实施方案中，希望将本文所描述的异多聚体或组合物局部施用至需要治疗的区域；这可通过例如但不限于以下的方式来实现：在外科手术过程中局部输注、局部应用例如在外科手术之后结合伤口敷料、通过注射、借助于导管、借助于栓剂或借助于植入物，所述植入物是多孔或无孔或凝胶状材料，包括膜如硅橡胶膜(sialastic membrane)或纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质(包括抗体)时，必须注意使用所述蛋白质不会吸收的材料。
在另一个实施方案中，所述异多聚体或组合物可以囊泡、具体地说脂质体的形式递送(参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat等，于Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein和Fidler(编著)，Liss，New York，第353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同上，第317-327页；通常参见同上)。
在另一实施方案中，可以控制释放系统来递送异多聚体或组合物。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer，同上；Sefton，CRC Cr it.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald等，Surgery 88：507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321：574(1989))。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料(参见Medical Applications of Controlled R elease，Langer和Wise(编)，CRC Pres.，Boca Raton，Fla.(1974)；Con trolled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(编著)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61(1983)；还参见Levy等，Science 228：190(1985)；During等，Ann.Neurol.25：351(1989)；How ard等，J.Neurosurg.71：105(1989))。在另一实施方案中，控制释放系统可邻近治疗靶标(例如脑)置放，由此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson，Medical Applications ofControlled Release，同上，第2卷，第115-138页(1984))。
其它控制释放系统在Langer(Science 249：1527-1533(1990))的综述中论述。
在包含编码本文所描述的异多聚体的核酸的一个具体实施方案中，所述核酸可通过将其构建为适当核酸表达载体的一部分并且施用它以使得它变成细胞内核酸来体内施用以促进它所编码的蛋白质的表达，此举的实现是例如通过使用反转录病毒载体(参见美国专利号 4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包覆，或通过将它与已知会进入核的同源盒样肽(homeobox-like peptide)连接来施用(参见例如Joliot等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：1864-1868(1991))。或者，可细胞内引入核酸并且通过同源重组并入宿主细胞DNA内以进行表达。
本文还提供药物组合物。所述组合物包含治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体。在一个具体实施方案中，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的监管机构批准、或在美国药典中列出，或在用于动物并且更具体地说人的其它一般公知的药典中列出。术语“载体”是指使用其来施用治疗剂的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可用作液体载体，尤其用于可注射溶液。适合的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。必要时，组合物还可含有少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等的形式。所述组合物可用传统粘合剂和载体(如甘油三酯)配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体，如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药物载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中。所述组合物将包含治疗有效量的所述化合物(优选呈纯化形式)连同适合量的载体，以便提供适于施用至患者的形式。所述制剂应该符合施用方式的要求。
在某些实施方案中，将包含所述异多聚体的组合物根据常规工序配制为适用于静脉内施用至人类的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包 含增溶剂和局部麻醉剂(如利多卡因)以减轻注射部位的疼痛。一般来说，所述成分是单独或混合在一起以单位剂型(例如作为干燥冻干粉末或无水浓缩物)提供于指示活性剂的量的密闭容器(如安瓿或药囊)中。在组合物有待通过输注施用的情况下，所述组合物可用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶分配。在组合物通过注射施用的情况下，可提供含注射用无菌水或盐水的安瓿以便可在施用前混合各成分。
在某些实施方案中，本文所描述的组合物被配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些盐，如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐；和与阳离子形成的那些盐，如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
可通过标准临床技术来确定本文所描述的组合物的将有效于治疗、抑制和预防与治疗性蛋白的异常表达和/或活性相关的疾病或病症的量。另外，可任选地采用体外测定以帮助鉴别最佳剂量范围。待用于所述制剂中的精确剂量还将取决于给药途径，和疾病或病症的严重程度，并且应该根据从业者的判断和每位患者的状况决定。由来源于体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推有效剂量。
异多聚体蛋白的重组和合成产生方法：
在某些实施方案中是通过从酵母、微生物如细菌、或人或动物细胞系分泌而作为重组分子产生的异多聚体。在实施方案中，所述多肽是从宿主细胞分泌的。
实施方案包括细胞，如被转化以表达本文所描述的异多聚体蛋白的酵母细胞。除了转化的宿主细胞自身以外，提供那些细胞在营养培养基中的培养物，优选地单克隆(同源克隆地)培养物，或源自单克隆培养物的培养物。如果分泌多肽，则所述培养基将包含所述多肽与所述细胞，或无所述细胞(如果它们已经被过滤或离心掉)。许多表达系统是已知的并且可以使用，包括细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)、 酵母(例如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母以及巴斯德毕赤酵母)、丝状真菌(例如曲霉)、植物细胞、动物细胞以及昆虫细胞。
本文所描述的异多聚体以常规方式产生，例如从插入宿主染色体中或游离质粒上的编码序列产生。所述酵母以任何通常方式例如电穿孔用所需蛋白质的编码序列进行转化。用于通过电穿孔转化酵母的方法公开于Becker & Guarente(1990)MethodsEnzymol.194，182中。
成功转化的细胞，即包含本发明的DNA构建体的细胞可通过熟知技术来鉴别。例如，可生长由引入表达构建体产生的细胞以产生所需多肽。可收获并溶解细胞并且使用方法如由Southern(1975)J.Mol.Biol.98，503或Berent等.(1985)Biotech.3，208所描述的方法将其DNA内容物针对所述DNA的存在进行检查。或者，可使用抗体来检测上清液中蛋白质的存在。
有用的酵母质粒载体包括pRS403-406和pRS413-416并且通常可从StratageneCloning Systems，La Jolla，Calif.92037，USA获得。质粒pRS403、pRS404、pRS405以及pRS406是酵母整合质粒(YIp)并且并入酵母选择性标记物HIS3、7RP1、LEU2以及URA3。质粒pRS413-416是酵母着丝粒质粒(Ycp)。
已发展多种方法用于通过互补粘性末端将DNA可操作地连接至载体。例如，互补同聚物序列(tracts)可以被添加至有待插入至载体DNA的DNA区段。所述载体和DNA区段然后通过所述互补同聚尾部之间的氢键合连接以形成重组DNA分子。
含有一个或多个限制性位点的合成接头提供将DNA区段连接至载体的替代方法。将通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶1进行处理，所述酶用其3′5′外切核酸酶活性去除突出的_-单链末端，并且用其聚合活性填充3′-凹端。
这些活性的组合因此产生平末端DNA区段。平末端区段然后在能够催化平末端DNA分子的连接的酶(如噬菌体T4 DNA连接酶)存在下与大量摩尔过量的接头分子一起孵育。因此，反应产物是在其端处携带聚合物接头序列的DNA区段。这些DNA区段然后用适当的限制性酶裂解并且连接至表达载体，所述表达载体已用产生与所述DNA区段的末端相容的末端的酶裂解。
含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头可自多个来源商购，包括International Biotechnologies Inc，New Haven，Conn.，USA。
预期作为用于表达白蛋白融合蛋白的宿主适用于实施本发明的示例性酵母属是毕赤酵母属(Pichua)(以前被分类为汉逊酵母属(Hans enula))、酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、曲霉属、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、固囊酵母属(Citero myces)、管囊酵母属(Pachysolen)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴里酵母属(Debaromyces)、木霉属(Trichoderma)、头孢酶属(Cepha losporium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neuros pora)、亚罗酵母属(Yarrowia)、梅奇酵母属(Metschunikowia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、白冬孢酵母属(Leucosporidium)、葡状子囊菌属(Botryoascus)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、拟内孢霉属(Endomy copsis)等。优选的属是选自由酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属以及有孢圆酵母属组成的组的那些。酵母属菌种的实例是酿酒酵母、意大利糖酵母(S.italicus)以及鲁氏糖酵母(S.rouxii)。
克鲁维酵母属菌种的实例是胞壁克鲁维酵母(K.fragilis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)以及马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)。适合的有孢圆酵母属菌种是德布尔有孢酵母(T.delbrueckii)。毕赤酵母属(汉逊酵母属)菌种的实例是安格斯毕赤酵母(P.angusta)(之前多形汉逊酵母(H.polymorpha))、异常毕赤酵母(P.anomala)(之前异常汉逊酵母(H.anomala))以及巴斯德毕赤酵母。用于转化酿酒酵母的方法是EP 251 744、EP258 067以及WO 90/01063中通常所教导的，所述专利以引用的方式并入本文。
优选的示例性酵母属菌种包括酿酒酵母、意大利糖酵母、糖化酵母(S.diastaticus)以及鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)。优选的示例性克鲁维酵母属菌种包括胞壁克鲁维酵母和乳酸克鲁维酵母。优选的示例性汉逊酵母属菌种包括多形汉逊酵母(现在安格斯毕赤酵母)、异常汉逊酵母(现在异常毕赤酵母)以及荚膜毕赤氏酵母(Pichia capsul ata)。另外优选的示例性毕赤酵母菌种包括巴斯德毕赤酵母。优选的示例性曲霉属菌种包括黑曲霉和构巢曲霉。优选的示例性亚罗酵母属菌种包括解脂亚罗酵母(Y.lipolytica)。许多优选的酵母菌种可从ATCC获得。例如，以下优选的酵母菌种可从ATCC获得并且适用于表达白蛋白融合蛋白：酿酒酵母Hansen、有性型菌株(teleomorph strain)BY4743 yap3突变体(ATCC登录号4022731)；酿酒酵母Hansen，有性型菌株BY4743 hsp150突变体(ATCC登录号4021266)；酿酒酵母Hansen，有性型菌株BY4743 pmt1突变体(ATCC登录号4023792)；酿酒酵母Hansen，有性型(ATCC登录号20626；44773；44774；以及62995)；糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)Andrews和Gilliland不包括van der Walt，有性型(ATCC登录号62987)；乳酸克鲁维酵母(D ombrowski)van der Walt，有性型(ATCC登录号76492)；安格斯毕赤酵母(Teunisson等)Kurtzman，保藏为多形汉逊酵母(Hansenula polymo rpha)de Morais和Maia的有性型，有性型(ATCC登录号26012)；黑曲霉van Tieghem，无性型(ATCC登录号9029)；黑曲霉van Tieghe m，无性型(ATCC登录号16404)；构巢曲霉(Eidam)Winter，无性型(A TCC登录号48756)；以及解脂耶氏酵母(Wickerham等)van der Wal t和von Arx，有性型(ATCC登录号201847)。
酿酒酵母的适合启动子包括与以下相关的那些：PGKI基因、GAL1或GAL10基因，CYCI、PH05、TRP1、ADH1、ADH2，甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡糖异构酶、葡萄糖激酶、α-交配因子信息素[一种 交配因子信息素]的基因，PRBI启动子、GUT2启动子、GPDI启动子、以及涉及5′调控区的部分与其它启动子的5′调控区的部分或与上游活化位点的杂合体的杂合启动子(例如EP-A-258 067的启动子)。
用于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的方便可调控启动子是如由Maundrell(1990)J.Biol.Chem.265，10857-10864所描述的来自nmt基因的硫胺素可抑制启动子和如由Hoffman & Winston(1990)Genetics 124，807-816所描述的葡萄糖可抑制jbpl基因启动子。
转化用于表达外源基因的毕赤酵母的方法在例如Cregg等(1993)和不同Phillips专利(例如美国专利号4,857,467，以引用的方式并入本文)中教导，并且毕赤酵母表达试剂盒可从Invitrogen BV，Leek，Net herlands和Invitrogen Corp.，San Diego，Calif商购。适合的启动子包括AOX1和AOX2。Gleeson等(1986)J.Gen.Microbiol.132，3459-3465包括关于汉逊酵母载体和转化的信息，适合的启动子是MOX1和FMD1；而EP 361 991，Fleer等(1991)和来自Rhone-Poulenc Ror er的其它公布教导如何在克鲁维酵母属菌种中表达外源蛋白质，适合的启动子是PGKI。
转录终止信号优选地是真核基因的3′侧翼序列，所述序列包含转录终止和多腺苷酸化的正确信号。适合的3′侧翼序列可以是例如与所使用的表达控制序列天然地连接的基因的那些，即可与启动子相对应。或者，它们可以是不同的，在这种情况下优选酿酒酵母ADHI基因的终止信号。
在某些实施方案中，所需异多聚体蛋白最初使用分泌性前导序列表达，所述前导序列可以是所选择的酵母中有效的任何前导序列。适用于酿酒酵母中的前导序列包括来自交配因子α多肽(MFα-1)的前导序列和EP-A-387 319的杂合前导序列。所述前导序列(或信号)在成熟白蛋白释放到周围培养基中之前被酵母裂解。此外，所述前导序列包括JP 62-096086(授权号为911036516)中所公开的酿酒酵母转化酶 (SUC2)、酸性磷酸酶(PH05)、MFα-1的前序列、0葡聚糖酶(BGL2)和杀伤毒素；糖化酵母葡糖淀粉酶Il；卡尔酵母α-半乳糖苷酶(MEL1)；乳酸克鲁维酵母杀伤毒素；以及假丝酵母属葡萄糖淀粉酶的前导序列。
提供含有编码本文所描述的异多聚体蛋白的多核苷酸的载体、宿主细胞、以及通过合成和重组技术产生异多聚体蛋白。载体可以是例如噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以是复制感受态型或复制缺陷型的。在后者情况下，病毒繁殖通常将仅发生于互补宿主细胞中。
在某些实施方案中，编码本文所描述的异多聚体蛋白的多核苷酸连接至含有用于在宿主中繁殖的选择性标记物的载体。一般来说，将质粒载体引入沉淀物如磷酸钙沉淀物中，或引入具有带电荷脂质的复合物中。如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装并且然后转导至宿主细胞中。
在某些实施方案中，多核苷酸插入片段(insert)可操作地连接至适当的启动子，如噬菌体λPL启动子，大肠杆菌lac、trp、phoA和rac启动子，SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子等。其它合适的启动子是本领域技术人员已知的。所述表达构建体将还包含转录起始、终止位点，以及在转录区中用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的转录物的编码部分将优选包括在待翻译的多肽的起始处的翻译起始密码子和适当地位于待翻译多肽的末端处的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
如所指示，所述表达载体将优选包括至少一种选择性标记物。所述标记物包括二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或用于真核细胞培养的新霉素抗性，以及用于在大肠杆菌和其它细菌中培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。适当宿主的代表性实例包括但不限于细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌属和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)细胞；真菌细胞，如酵母细胞(例如酿酒酵母 或巴斯德毕赤酵母(ATCC登录号201178))；昆虫细胞如果蝇属S2和夜蛾属Sf9细胞；动物细胞如CHO、COS、NSO、293以及人黑色素瘤细胞；以及植物细胞。用于上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域中已知的。
优选用于细菌的载体包括可从QIAGEN，Inc.获得的pQE70、pQ E60和pQE-9；可从Stratagene Cloning Systems，Inc.获得的pBluescr ipt载体、Phagescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；以及可从Pharmacia Biotech，Inc.获得的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。优选的真核载体是可从Stratagene获得的pW LNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及可从Pharmacia获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。用于酵母系统的优选表达载体包括但不限于pYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pG APZ、pGAPZalph、pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K以及PAO815(全部可从Invitrogen，Carlbad，CA获得)。其它适合的载体对于本领域的技术人员将是显而易见的。
在一个实施方案中，将编码本文所描述的异多聚体蛋白的多核苷酸与信号序列融合，所述信号序列将指导本发明的蛋白质定位至原核或真核细胞的特定隔室和/或指导本发明的蛋白质自原核或真核细胞的分泌。举例来说，在大肠杆菌中，可能希望指导所述蛋白质表达至周质间隙。所述异多聚体蛋白与其融合以便指导所述多肽表达至细菌的周质间隙的信号序列或蛋白质(或其片段)的实例包括但不限于pelB信号序列、麦芽糖结合蛋白(MBP)信号序列、MBP、ompA信号序列、周质大肠杆菌热不稳定肠毒素B-亚基的信号序列、以及碱性磷酸酶的信号序列。几种载体可商购用于构建将指导蛋白质的定位的融合蛋白，如可从New England Biolabs获得的pMAL系列载体(具体地是pMAL-.rho.系列)。在一个具体实施方案中，本发明的多核苷酸白蛋白融合蛋白可与pelB果胶酸裂解酶信号序列融合以增加所述多肽在革兰氏阴性细菌中的表达和纯化效率。参见美国专利号5,576,195和5,846,818，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
与异多聚体蛋白融合以便指导其在哺乳动物细胞中的分泌的信号肽的实例包括但不限于MPIF-1信号序列(例如GenBank登录号AAB51134的氨基酸1-21)、司腺钙蛋白(stanniocalcin)信号序列(MLQNSAVLLLLVISASA)以及共有信号序列(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG)。可与杆状病毒表达系统结合使用的适合信号序列是gp67信号序列(例如，GenBank登录号AAA72759的氨基酸1-19)。
使用谷氨酰胺合酶(GS)或DHFR作为选择性标记物的载体可分别在药物甲硫氨酸砜亚胺(methionine sulphoximine)或甲氨蝶呤存在下扩增。基于谷氨酰胺合酶的载体的优点是可利用为谷氨酰胺合酶阴性的细胞系(例如，鼠类骨髓瘤细胞系，NSO)。谷氨酰胺合酶表达系统还可通过提供另外抑制剂来防止内源性基因的作用而在表达谷氨酰胺合酶的细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中起作用。谷氨酰胺合酶表达系统及其组分在以下PCT公布中详述：WO87/04462；WO86/05807；WO89/10036；WO89/10404；以及WO91/06657，所述公布特此以引用的方式整体并入本文。另外，谷氨酰胺合酶表达载体可从LonzaBiologics，Inc.(Portsmouth，N.H.)获得。使用GS表达系统在鼠类骨髓瘤细胞中表达和产生单克隆抗体描述于Bebbington等，Bio/technology 10：169(1992)以及Biblia和Robinson Biotechnol.Prog.11：1(1995)中，所述文献以引用的方式并入本文。
还提供含有本文所描述的载体构建体的宿主细胞，并且另外提供含有核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列使用本领域中已知的技术与一个或多个异源调控区(例如，启动子和/或增强子)可操作地缔合。所述宿主细胞可以是高等真核细胞如哺乳动物细胞(例如，源于人的细胞)或低等真核细胞如酵母细胞，或所述宿主细胞可以是原核细胞如细菌细胞。可选择调节插入基因序列的表达或以所需特定方式修饰并加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物存在下可提高从某些启动子的表达，从而可控制遗传工程化的多肽的表达。此外，不同宿主细胞具有翻译和翻译后加工和修饰(例如，磷酸化、裂解)蛋白质的特征和特定机制。可选择适当细胞系以确保对所表达的外来蛋白质的所需 修饰和加工。
将本发明的核酸和核酸构建体引入宿主细胞中可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法来实现。所述方法描述于许多标准实验室手册中，如Davis等Basic Methods In Molecular Biology(1986)。具体考虑本发明的多肽可事实上由缺乏重组载体的宿主细胞表达。
除涵盖本文讨论的载体构建体的宿主细胞外，本发明还涵盖已被工程化为缺失或取代内源性遗传物质(例如，对应于货物多肽的编码序列被对应于货物多肽的异多聚体蛋白取代)和/或包括遗传物质的脊椎动物来源、特别是哺乳动物来源的原代、传代和无限增殖化宿主细胞。与内源多核苷酸可操作缔合的遗传物质可活化、改变和/或扩增内源多核苷酸。
此外，本领域中已知的技术可用于通过同源重组将异源多核苷酸(例如编码白蛋白蛋白的多核苷酸或其片段或变体)和/或异源调控区(例如启动子和/或增强子)与编码治疗性蛋白的内源多核苷酸可操作地缔合(参见例如1997年6月24日发布的美国专利号5,641,670；国际公布号WO 96/29411；国际公布号WO 94/12650；Koller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；以及Zijlstra等，Nature342：435-438(1989)，所述文献各自的公开内容以引用的方式整体并入)。
本文所描述的异多聚体蛋白可通过熟知的方法从重组细胞培养物中回收并纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法、疏水电荷相互作用色谱法以及凝集素色谱法。最优选地，高效液相色谱法(“HPLC”)用于纯化。
在某些实施方案中，本发明的异多聚体蛋白使用阴离子交换色谱法进行纯化，所述阴离子交换色谱法包括但不限于Q-琼脂糖、DEAE 琼脂糖、poros HQ、poros DEAF、Toyopearl Q、Toyopearl QAE、Toyopearl DEAE、Resource/Source Q和DEAE、Fractogel Q以及DEAE柱色谱法。
在具体实施方案中，本文所描述的蛋白质使用阳离子交换色谱法进行纯化，所述阳离子色谱法包括但不限于SP-琼脂糖、CM琼脂糖、poros HS、poros CM、Toyopearl SP、Toyopearl CM、Resource/Source S和CM、Fractogel S和CM柱以及其等效物和可比物。
此外，本文所描述的异多聚体蛋白可使用本领域中已知的技术化学地合成(例如，参见Creighton，1983，Proteins：Structures and Molecular Principles，W.H.Freeman&Co.，N.Y和Hunkapiller等，Nature，310：105-111(1984))。例如，对应于多肽的片段的多肽可通过使用肽合成仪来合成。此外，如果需要，非经典氨基酸或化学氨基酸类似物可作为取代或添加引入多肽序列中。一般来说，非经典氨基酸包括但不限于，常见氨基酸的D型异构体、2，4二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计产生氨基酸(designer amino acid)，如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸，以及氨基酸类似物。此外，氨基酸可以是D(右旋的)或L(左旋的)。
提供在翻译过程中或之后不同地修饰的异多聚体，例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化，蛋白水解裂解以及与抗体分子或其它细胞配体的键联等。多种化学修饰中的任何一种可以通过已知技术进行，所述技术包括但不限于通过澳化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4进行特异性化学裂解；乙酰化、甲酰化、氧化、还原；以及在衣霉素存在下代谢合成等。
本文所涵盖的另外翻译后修饰包括例如，N-连接或O-连接的碳水化合物链、N-末端或C-末端的加工)、化学部分附接至氨基酸主链、N-连接或O-连接的碳水化合物链的化学修饰、以及由于原核宿主细胞表达而产生的N-末端甲硫氨酸残基的添加或缺失。所述异多聚体蛋白用可检测的标记进行修饰，所述标记如酶、荧光、同位素或亲和标记，以允许检测和分离蛋白质。
适合酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合荧光物质的实例包括伞酮(umbelliferone)、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光物质的实例包括鲁米诺(luminol)；生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；并且适合放射性物质的实例包括碘、碳、硫、氚、铟、锝、铊、镓、钯、钼、氙、氟。
在具体实施方案中，异多聚体蛋白或其片段或变体被附接至与放射性金属离子缔合的大环螯合剂。
如所提及，本文所描述的异多聚体通过自然过程(如翻译后加工)或通过本领域熟知的化学修饰技术进行修饰。应理解相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定多肽中的若干位点处。本发明的多肽可以是支链的，例如由于泛素化所致；并且它们可以是环状的，有或无分支。环状、支链和支链环状多肽可来源于翻译后自然过程或可通过合成方法制备。修饰包括例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素(flavin)的共价附接、原血红素(heme)部分的共价附接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附接、脂质或脂质衍生物的共价附接、磷脂酰肌醇的共价附接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、 转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸(如精氨酰化)以及泛素化。(参见，例如PROTEINS--STRUCTUREAND MOLECULAR PROPERT IES，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，NewYork(1993)；POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，编辑，Academic Press，New York，第1-12页(1983)；Seifter等，Meth.Enzymol.182：626-646(1990)；Rattan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62(1992))。
在某些实施方案中，异多聚体蛋白还可以被附接至固相支持体，所述固相支持体特别适用于通过本发明的白蛋白融合蛋白结合、与本发明的白蛋白融合蛋白结合或缔合的多肽的免疫测定或纯化。所述固相支持体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
在其中异多聚体蛋白仅包含抗体的VH结构域的实施方案中，可能必须和/或需要将所述蛋白与相同抗体的VL结构域共表达，以使得VH-白蛋白融合蛋白和VL蛋白将在翻译后缔合(共价地或非共价地)。
在其中异多聚体蛋白仅包含抗体的VL结构域的实施方案中，可能必须和/或需要将所述融合蛋白与相同抗体的VH结构域共表达，以使得VL-白蛋白融合蛋白和VH蛋白将在翻译后缔合(共价地或非共价地)。
本文还提供异多聚体蛋白的化学修饰衍生物，其可提供额外的优点，如多肽的可溶性、稳定性和循环时间增加或免疫原性降低(参见美国专利号4,179,337)。用于衍生化的化学部分可选自水溶性聚合物，如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇等。所述蛋白质可在分子内的随机位置处或在分子内的预定位置处进行修饰，并且可包含一个、两个、三个或更多个连接的化学部分。
聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分支的或不分支的。对于聚乙二醇，为了易于操作和制造，优选的分子量是在约1kDa与约 100kDa之间(术语“约”指示，在聚乙二醇制剂中，一些分子将比规定的分子量大或小)。可以使用其它大小，这取决于期望的治疗特性(例如，期望的持续释放时间、如果有的话对生物活性的影响、操作的容易程度、抗原性的程度或缺乏、以及聚乙二醇对治疗性蛋白或类似物的其它已知影响)。例如，聚乙二醇可以具有约200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、105,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000kDa的平均分子量。
可以使用ELISA(一种本领域中已知的熟知免疫测定法)来确定本文所描述的异多聚体蛋白的存在和量。在将适用于检测/定量本文所描述的异多聚体的一种ELISA方案中，包括以下步骤：用抗-人血清白蛋白抗体包被ELISA板，将板封闭以阻止非特异性结合，洗涤ELISA板，加入含有本文所描述的蛋白质的溶液(以一种或多种不同浓度)，加入与可检测标记(如本文所述的或本领域另外已知的)偶联的第二抗-货物多肽特异性抗体，并检测所述第二抗体的存在。在此方案的一个替代型式中，可用抗-货物多肽特异性抗体包被ELISA板，并且标记的第二试剂可以是抗-人白蛋白特异性抗体。
本文所引用的所有公布均特此以引用的方式整体并入。本文中引用了不同出版物，其公开内容以引用的方式整体并入。
实施例
给出以下实施例以便说明本发明的实践。它们不意图限制或限定本发明的整个范围。
实施例1：蛋白质分裂方法
特定的蛋白质-蛋白质缔合是由相互作用的配偶体之间的强表面互补性和伴随的结构和热力学变化驱动。所述表面互补性提供形成接触的机会，所述接触支持有利的静电和疏水相互作用的产生。静电相互作用涉及盐桥、氢键和广泛分散相互作用的形成。在界面处的非极性原子基团周围的溶剂排除和重组构以及它的相关的熵效应在结合热力学的疏水组分中起作用。具有针对彼此疏水相互作用优化的几何形状的残基将形成接触(即有利于稳定蛋白质-蛋白质界面的堆叠、π-π、阳离子-π接触)。类似的热力学效应控制多步蛋白质折叠过程，所述过程涉及二级结构单元和三级结构域的前组构，然后它们缔合以形成蛋白质的折叠的四级状态。蛋白质折叠和结合的一种替代性机制涉及偶联的蛋白质折叠和结合过程，所述过程最终产生蛋白质的四级状态。可以合理地假设将存在所述两种过程均在复合蛋白质的四级结构形成过程中起作用的方面。在一些蛋白质-蛋白质缔合的背景下，单独蛋白组分需要共表达或者存在于相同的介质中，并且每个组分或单体将仅在与它的专性配偶体缔合以后才稳定地折叠成它的最终结构状态。(图6)
如在此所描述，分裂的蛋白质的产生涉及使用来自序列、二级结构和折叠的信息来识别天然蛋白质中的节段化位点，其将产生至少两个转运蛋白多肽，所述转运蛋白多肽通过一起自组装以形成异多聚体而有效地形成准天然蛋白质结构。例如，这些分裂的蛋白质转运蛋白多肽在共表达时选择性地自组装并形成准天然状态。尽管以某种方式产生了转运蛋白多肽的分裂的蛋白质互补对，所述尝试是为了模拟许多天然存在的专性蛋白质-蛋白质复合物，所述复合物表现出它们的作为复合物的功能性，而在它们的未复合状态是无功能的。所述策略的成功实现产生以下多肽：所述多肽选择性地彼此自组装以形成异多聚体，作为单个实体是可溶性的，并且具有功能相关性，不会损害环境中的其它组分的折叠、结合和活性。所述多肽彼此重构的固有性质可应用于产生具有货物分子的异多聚体融合实体的领域中，所述货物分子自身不能有效地形成多聚体。在一些实施方案中，分裂的蛋白质区段的功能作用是充当转运蛋白多肽，所述转运蛋白多肽驱动与所述转运蛋白多肽融合的多个货物分子的异多聚化和空间定位。
在此发明的人血清白蛋白内的节段化位点是基于以下判定标准来设计。(1)所述节段化位点应位于具有较高的相对SASA和与蛋白质的剩余部分的有限残基接触计数的环上。这是旨在使发现柔性和可及的环的机会最大化，所述环不太可能促进蛋白质核心稳定性，并且因此影响所组装的准天然白蛋白结构相对于人血清白蛋白的稳定性。(2)所述界面应富含热点残基。热点意指涉及良好连接的相互作用网络的单个残基或残基的组。所述相互作用可以是基于在蛋白质中观察到的典型相互作用如氢键、带电荷的残基相互作用如盐桥、显示较强结构互补性和疏水性残基聚簇的范德华接触。即最大化界面稳定性并防止复合物解离。(3)所述界面应是尽可能非极性的、广泛的和相互交叉的。再次，即使两个链作为永久复合物存在并且不会解离成其单个组分的机会最大化。(4)在一个实施方案中旨在在所节段化的部分上保留存在于人血清白蛋白中的天然二硫键，以便共价连接两个链。这意味着进一步增加异二聚体化准天然白蛋白样结构的稳定性，所述结构从节段化之后的两个衍生区段自组装。定位人血清白蛋白结构/序列中的环区域，所述环区域满足在此所描述的二硫键标准，即具有非常接近于所述环区域中的节段化位点的二硫键。除了共价交联所述两个链的明显优点外，这种二硫键还可充当在节段化之后开放的环的替代。(5)在一个实施方案中，通过在两个衍生的区段中的每个上的选定位置处引入单个氨基酸至半胱氨酸突变来工程化跨两个区段的二硫键。(6)在一个实施方案中，工程化在两个区段的界面处的氨基酸以进一步增加或改进所述界面处的热点或增强所组装的准天然白蛋白结构中的两个区段之间的结构和物理-化学互补性。
以下表3示出AlbuCORE支架的界面参数和缔合自由能。源自来自HSA的第一和第二区段的组装的准天然结构之间的包埋界面面积可使用本领域中已知的算法使用基于结构的计算来进行计算(例如H.Edelsbrunner和P.Koehl.The weighted volume derivativeof a space filling diagram.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)100，2203-2208(2003))。所计算的面积可被进一步分类成极性和非极性表面积。非极性面积是在所述界面处的包埋的疏水氨基酸侧链的指示。ΔΔGassoc是指两个区段结构的缔合状态与非缔合状态之间的计算自由能差异。理论上计算的自由能代表两个接触区段表面之间的氢键和其它静电相互作用、范德华接触、去溶剂化作用和表面互补性。用于计算缔合自由能的方法是本领域中已知的(例如Simonson T， Archontis G，Karplus M.Free energy simulations come of age：protein-ligand recognition.Acc Chem Res.(2002)35，430-7)
表3：AlbuCORE支架的界面参数和缔合自由能
图32示出由源自其3维结构的人血清白蛋白中的残基的子集进行的残基接触的图表。残基接触可由残基间或某些残基内原子-原子相互作用定义，所述原子-原子相互作用在指定距离范围内并且具有某些物理-化学性质。具有强残基接触的残基或残基的组可被识别为热点。这种残基接触分析还可用于确定环(或3D蛋白质结构中非结构化的二级结构区域)残基，如进行有限残基接触那些残基。所述图表还示出逐残基溶剂可及表面积(SASA)，其可使用本领域中已知的算 法进行计算(例如H.Edelsbrunner和P.Koehl.Theweighted volume derivative of a space filling diagram.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)100，2203-2208(2003))。
图33示出通过人血清白蛋白中的选择热点残基实现的接触和相互作用的性质的图表。图34是人血清白蛋白中的热点残基或热点残基的聚簇(贴片)的图形表示。
表4.HSA(AlbuCORE)中的新节段化位点和其中引入节段化的环的性质列“环长度”是指连接两个最接近的二级结构元件的环的长度(在氨基酸残基中)，并且列“二级结构距离”显示那些相同二级结构元件(在这种情况下所有α-螺旋)的N末端和C末端的Cα碳之间的距离。界面S-S指示在所衍生的区段(转运蛋白多肽)的界面处的二硫键。
实施例2：基于HA/异白蛋白的异多聚体蛋白的制备
示出了一种沿着HSA序列和结构确定节段化位点的方法，所述节段化位点将产生以下单体多肽链：其稳定地折叠和自组装以形成原始蛋白质的准天然四级结构这样的稳定缔合的关键要求之一是在多肽链之间的界面处形成具有表面互补性的较大包埋区域。原始蛋白质的天然折叠提供在蛋白质内的区域的天然互补性的指示。
图2示出当节段化位点沿着蛋白质序列移动时，在两个基于白蛋白的多肽的界面处包埋的溶剂可及表面积，所述多肽可理想地折叠成HSA的准天然结构。分析指示，当在残基30与520之间的任意位置引入分裂节段化时，除了少数例外以外，包埋约或更大的量级的大表面积，从而保留疏水界面。在一些实施方案中，采用计算的分子表面积代替溶剂可及表面积。在一些实施方案中，包埋的表面积是在至的范围内。对于非共价ABH1，观察到较大的包埋界面。另外，所述分析还揭示一些环区域是相对表面暴露的。白蛋白具有特别大数目的二硫桥，其促进天然蛋白质结构的稳定性。在残基110、190、300、390和500附近的蛋白质段提供以下节段化位点：其不会分裂参与两个转运蛋白多肽之间的二硫键连接的残基。在其它区域中的节段化将产生异二聚体，其具有在两个转运蛋白多肽对之间的交联二硫键。图3呈现一种这样的准天然白蛋白结构的模型表示，所述结构通过从HSA序列中的残基294至303除去环而衍生。本文中所示的两种基于白蛋白的SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3的多肽的总包埋表面积是大约这落入在许多蛋白质-蛋白质异二聚体和同二聚体共复合结构中观察到的的平均值范围内[BahadhurR.P.&Zacharias M.(2008)Cell Mol Life Sci 65,1059-1072]。这表明如果两个多肽的折叠途径适当地彼此独立，存在两个多肽选择性地彼此缔合的强可能性。
在本发明的一方面，具有两个多肽的稳定准天然结构的选择性形成(由SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3形成的对，或由SEQ ID No.8和SEQ ID No.10形成的转运蛋白对)提供采用这些多肽来驱动双特异性或其它多功能的分子的形成的机会，所述分子的形成是在将适当的目标货物蛋白融合至基于白蛋白的多肽(用作转运蛋白多肽)的N或C末端之后。可以设计产生转运蛋白多肽对异二聚体的许多其它替代性节段化模式。融合的货物蛋白可为抗原结合结构域或其他的有效载荷，如化学毒素、放射性毒素或细胞因子(如图4所示)。所得到的异二聚体具有HSA所固有的许多有利特性，包括像半衰期、血清稳定性、 组织穿透性转运特征以及低免疫原性。传统接头如(Gly4Ser)x可用于货物蛋白与转运蛋白多肽的融合。
在本发明的另一方面，将每个基于HSA的转运蛋白多肽独立地融合至双特异性Fc分子的两个重链的C末端(如图5中所示)。两个转运蛋白多肽(如SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3)的较强和选择性配对驱动Fc的选择性异二聚化，并且还促进它的稳定性和其它有价值的药物代谢动力学特性。
来自NM_000477.5的血清白蛋白前蛋白NP_000468.1 GI 45020 27mRNA序列，共有CDS(CCDS)ID 3555.1
SEQ ID No.4：残基1-29(EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAG)是被裂解的N-末端输出信号序列区域。这一序列实现与天然信号序列相同的作用，但是针对哺乳动物和CHO细胞系进行了优化。
SEQ ID No.1：gi|4502027|ref|NP_000468.1|血清白蛋白前蛋白原[智人]圆括号中是被裂解从而产生血清白蛋白的N末端输出序列。
(EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAG)DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID No.5：人血清白蛋白核苷酸CCDS序列(1852个核苷酸)
GAATTCGCCACTATGGCTGTGATGGCCCCTAGGACCCTGGTGCTGCTGCTGTCCGGAGCTCTGGCTCTGACTCAGACCTGGGCTGGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTATGA
适用作转运蛋白多肽的基于白蛋白的多肽的蛋白质和核苷酸序列是如下：
基于白蛋白的异多聚体1：
基于白蛋白的转运蛋白多肽1-Ver 1：SEQ ID No.2：
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEV
编码基于白蛋白的转运蛋白多肽1-Ver 1的核苷酸序列：SEQ ID No.6：
GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGTGA
基于白蛋白的转运蛋白多肽2-Ver 1：SEQ ID No.3：
SLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
编码基于白蛋白的转运蛋白多肽2-Ver1的核苷酸序列：SEQ ID No.7：
TCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTATGA
基于白蛋白的异多聚体2：
基于白蛋白的转运蛋白多肽1-Ver 2：SEQ ID No.8：
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARA
编码基于白蛋白的转运蛋白多肽1-Ver 2的核苷酸序列：SEQ ID No.9：
GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAGCATGA
基于白蛋白的转运蛋白多肽2-Ver 2：SEQ ID No.10：
SVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
编码基于白蛋白的转运蛋白多肽2-Ver 2的核苷酸序列：SEQ ID No.11：
TCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTATGA
基于HA或HAA的异多聚体的产生和表达
使用针对人/哺乳动物表达优化的密码子，通过基因合成构建了编码全长WT HA和基于HA的转运蛋白多肽单体的基因。在排除信号序列EFATMAVMAPRTLVLLLSGALALTQTWAG之后，从已知的全长人血清白蛋白前蛋白(GENEBANK：NP_000468.1)设计构建体。将最终的基因产物亚克隆至哺乳动物表达载体pTT5(NRC-BRI，加拿大)中(Durocher等)。通过瞬时转染悬浮生长的人CHO-3E7，进行高水平和高通量重组蛋白生产。关于在此描述的两个支架的构建体边界，参见表3：基于白蛋白的异多聚体1(ABH1)和基于白蛋白的异多聚体2(ABH2)。基于白蛋白的异多聚体2包含在两个转运蛋白多肽之间的一个二硫键，而基于白蛋白的异多聚体1完全通过非共价相互作用形成。图16A和16B分别示出ABH1和ABH2的蛋白质结构和符号呈现。如所述两幅图展示，两种ABH构建体均由两个转运蛋白多肽A和B(表3中所描述的序列)组成。图6A提供在共表达(示出不同的DNA转染比)之后，两个异多聚体构建体(ABH1和ABH2)的SDS-PAGE(非还原)凝胶分析。示出WT全长HSA作为对照。如预期的，ABH2在非还原SDS-PAGE中保留二硫键，其分子量为非二硫键连接的ABH1的大约两倍。图6A还展示ABH2中的异二聚体的形成依赖于DNA转染比，其中1∶1产生最多的异二聚体产物。最后，6A展示ABH2的片段当表达为独立分子时更易于形成同二聚体并保持单体状态，在图6B中也观察到这种结果。图6B提供在共表达(1∶1DNA水平)之后，两个基于白蛋白的异多聚体构建体(ABH1和ABH2) 的非变性凝胶分析。示出WT全长HSA作为对照。ABH1和ABH2两者形成预期质量的复合物，其可与全长WT HSA相比。此外，在表达后，形成ABH1的转运蛋白多肽和形成ABH2的转运蛋白多肽都未同二聚化；相反，它们优选形成稳定的杂复合物。关于细节，参见以下表5。
表5：基于白蛋白的异多聚体构建体
在CHO-3E7细胞系中表达WT-HSA和两个基于白蛋白的异多聚体(ABH1和ABH2)，所述CHO-3E7细胞系悬浮生长在补充有0.1％w/v普朗尼克和4mM谷氨酰胺的FreeStyle F17培养基(Invitrogen)中。转染当天的细胞密度应为约150-200万个细胞/ml，并且存活力必须大于97％。使用由5％pTTo-GFP质粒(绿色荧光蛋白用于确定转染效率，表4)、15％pTT22-AKT质粒、21％HSA质粒(各自10.63％)、68.37％的鲑鱼精子DNA制成的质粒DNA的混合物，如专利申请WO2009/137911中所描述进行转染。转染后，然后将含有细胞的摇瓶放在设定至120rpm的定轨振荡器上，所述定轨振荡器在具有5％CO2、在37℃的增湿培养箱中。转染后24小时，将1％w/v TN1和0.5mM VPA(丙戊酸)添加至培养物。然后将培养物转移到定轨振荡器(120rpm)上，所述定轨振荡器放在设定在32℃的具有5％CO2的增湿培养箱中。在24-48小时，如通过流式细胞术测定，GFP阳性细胞应在30％-60％之间。在转染后7天收获细胞，并在4,000rpm下旋转20分钟。使用0.45μm过滤器(Millipore)，将上清液过滤除菌(澄清)。将 上清液储存在4℃(对于短期储存)和-80℃(对于长期储存)。在纯化之前，在37℃下融化冷冻的上清液，并在真空下穿过0.45μm膜滤器再过滤和脱气5-10分钟。
表6：在WT和ABH1构建体的不同表达阶段的细胞存活力。
ABH2、HSA和异多聚体的纯化
如从图6A中观察到，两个转运蛋白多肽的1∶1DNA转染比产生最高水平的异二聚体ABH2产物。如以上所描述来培养瞬时共表达这种比例的两个多肽的CHO细胞。如下进行随后的异二聚体纯化。将野生型人白蛋白转染至CHO细胞中并与ABH2类似地进行纯化。
使用填充有Blue Sepharose基质(GE Healthcare)的台式QIAGEN-tip 500柱，通过重力流动进行纯化。用20ml PBS(pH 7.2)平衡所述Blue Sepharose基质。以5ml/分钟的流速加载样品，并且随后用20ml PBS洗涤。用补充有1M NaCl的0.1M Na2HPO4(pH 7.2)洗脱蛋白质，并收集在1ml级分中(共20ml)。合并含有HSA的级分(按照Bradford蛋白质测定)，并使用1ml/ml的流速应用于与AKTA Express系统(GE Healthcare)联接的HiLoad16/60Superdex 200制备级凝胶过滤柱。收集具有＞85％纯度的蛋白质；汇集含有纯样品的级分，并使用具有10 000MWCO的截留重量的Amicon Ultra膜，通过离心进行浓缩。图6C示出ABH2异多聚体和WT HSA的SDS-PAGE(非还原)分析，两者均是在最终纯化阶段之后。两种构建体显示预期分子量。
纯化产率是与野生型全长HSA可比的，在约10mg/L。这一结果还是与由在HEK细胞中进行的V1087对照产生的9mg/L可比的。 产率是在Blue Sepharose和尺寸排阻色谱法之后通过nanodrop A280测量确定的。
使用差示扫描量热法(DSC)确定基于白蛋白的异多聚体的稳定性
使用GE或MicroCal VP-Capillary仪器进行所有DSC实验。将蛋白质缓冲液更换为PBS(pH 7.4)并且稀释至0.3至0.7mg/mL，其中0.137mL负载至样品细胞中，并且以1℃/分钟的扫描速率从20℃至100℃进行测量。使用Origin软件(GE Healthcare)分析数据，其中减去PBS缓冲液背景。关于所得到的测定的解链温度，参见表7和图7。
表7：基于白蛋白的异多聚体的解链温度
分子 测量的质量(Da) 理论分子量MW(Da) Tm℃
HSA野生型 66620 66470 75
ABH2 66100 65880 63
ABH1 未测定 未测定 60
使用表面等离子体共振评价HSA和ABH2的FcRn结合
如图8A-8B中所示，当将HSA和基于HSA的异多聚体固定在SPR表面上时，对FcRn的亲和力在全长WT HSA与ABH2之间似乎是可比较的，从而指示通过基于白蛋白的转运蛋白多肽的自组装而形成的异多聚体保留了白蛋白的FcRn结合功能性。以下表8说明FcRn结合数据。在括号中的值表示标准偏差。
表8：使用表面等离子体共振得到的HSA和ABH2的FcRn结合的动力学和平衡拟合
实施例3：包含抗-Her2/neu和抗-CD16scFv生物活性融合体的基于白蛋白的单价和四价异多聚体的产生和表达。
通过以下方式产生多价异多聚体ABH2：表达它的单个单体转运蛋白多肽SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：10，其在一个或两个末端处与货物多肽融合，所述货物多肽是抗Her2scFv(4D5)和/或抗-CD16scFv(NM3E)。如本文中使用的术语4D5是指4D5抗体的人源化序列，并且对应于曲妥珠单抗抗体中的可变结构域的氨基酸序列，连同scFv分子形式中的V1结构域与Vh结构域之间的接头区域。这些形成8个基于转运蛋白多肽1的基础构建体单体和8个基于转运蛋白多肽2的基础构建体单体的集合。这些基础构建体的不同组合在共表达之后相组合以形成异多聚体，所述异多聚体展示在两个转运蛋白多肽的四个末端位置处的任一个处的两个货物多肽的所有组合，从单价至四价。
如图9中所示，将生物活性的货物多肽与异多聚体转运蛋白多肽经由GGSG接头(对于一个单体的N末端)和更长的(GGS)4GG接头(对于其它单体中的所有其它末端)融合。
表9示出通过将4D5和NM3E货物多肽融合至转运蛋白多肽1(F1)或转运蛋白多肽2(F2)的N末端或C末端而产生的16个基础构建体(基础构建体#1至基础构建体#16)。F1：对应于SEQID 8并且F2对应于SEQ ID 10。
表9：
使用异多聚体ABH2，如实施例2中所述来产生多价构建体。将最终的基因产物亚克隆至哺乳动物表达载体pTT5(NRC-BRI，加拿大)中(Durocher等)。通过瞬时转染悬浮生长的人CHO-3E7，进行高水平和高通量重组蛋白生产。关于这些构建体的制备和表达的另外细节见于实施例11中。
通过以下方式进行纯化：使用1ml/ml的流速，将具有表达的蛋白质的细胞上清液应用至填充有Blue Sepharose基质(GE Healthcare)的QIAGEN-tip 500柱，所述柱联接至AKTA Express系统(GE Healthcare)。用由20ml PBS(pH 7.2)、300mM NaCl组成的样品缓冲液平衡所述柱。以5ml/分钟的流速加载样品，并且随后用样品缓冲液洗涤。通过施加从300mM至2000mM范围的NaCl梯度来洗脱蛋白质。以较高盐浓度洗脱的级分是最纯的，并且将其汇集、浓缩并随后使用1ml/ml的流速应用于与AKTAExpress系统(GE Healthcare)联接的HiLoad 16/60Superdex 200制备级凝胶过滤柱。收集具有＞85％ 纯度的蛋白质；汇集含有纯样品的级分，并使用具有10 000MWCO的截留重量的Amicon Ultra膜，通过离心进行浓缩。图10A-10B示出与不同货物多肽融合的ABH2异多聚体的SDS-PAGE(非还原)分析。在以下表10中概述异多聚体中的那些多肽相对于转运蛋白多肽的位置。所有构建体显示出预期的分子量。
表10：通过将4D5和NM3货物多肽融合至ABH2的转运蛋白多肽1或转运蛋白多肽2的N末端或C末端而产生的单价、多价和多特异性构建体。
与单个抗CD16scFv融合的单价ABH2的SPR结合
使用表面等离子体共振(SPR)，在结合实验中使用纯化的、将单个抗CD16scFv融合至转运蛋白多肽SEQ ID 10的N末端的异多聚体ABH2(构建体v515)。将可溶性CD16共价地固定化到CM5表面上，并且捕获与抗CD16scFv融合的ABH2，并测定结合动力学。
SPR供给。GLM传感器芯片、Biorad ProteOn胺偶联试剂盒(EDC、sNHS和乙醇胺)和10mM乙酸钠缓冲剂是购自Bio-Rad Laboratories(加拿大)Ltd.(Mississauga，ON)。重组Her-2蛋白质是购自eBioscience(San Diego，CA)。HEPES缓冲液、EDTA和NaCl是购自Sigma-Aldrich(Oakville，ON)。10％吐温20溶液是购自Teknova(Hollister，CA)。
SPR生物传感器测定。所有表面等离子体共振测定如下进行：使用BioRad ProteOnXPR36仪器(Bio-Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON))，在25℃的温度下使用HBST运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3.4mM EDTA以及0.05％吐温20pH 7.4)。使用GLM传感器芯片来产生CD16捕获表面，所述芯片通过以下方式活化：用标准BioRad sNHS/EDC溶液的1∶5稀释液，在分析物(水平)方向以30μL/分钟注射300秒。在所述活化之后，立即在配体(垂直)方向上以25μL/分钟的流速注射4.0μg/mL的CD16在10mM NaOAc pH 4.5中的溶液，直到固定大约3000个共振单位(RU)。通过在分析物方向上以30μL/分钟注射1M乙醇胺300秒来淬灭剩余的活性基团，并且这还确保形成模拟活化的中间点(interspot)用于空白参考。
与空白(L5)相比，在3000RU CD16aWT(L6)上注射500nM的V515的3倍稀释系列。50uL/分钟的流速持续120秒，具有240秒的解离期。在标准运行缓冲液(DPBS/3.4mM EDTA/0.05％吐温20)和具有额外350mM NaCl的运行缓冲液中重复注射。将传感图进行比对并且使用缓冲液空白注射和中间点进行双重参考，并且使用ProteOn Manager软件v3.0对所得到的传感图进行分析。通常，使用平衡拟合模型，从结合等温线确定KD值。对于具有缓慢解离速率的高亲和力相互作用，另外通过以下方式来确定动力学和亲和力值：使用局部Rmax，将参考传感图拟合至1∶1Langmuir结合模型，并且亲和常数(KD M)是从所得到的速率常数(kds-1/kaM-1s-1)导出。将所有KD值报告为来自三个独立运行的平均值和标准偏差。
如表11中所示，与单个抗CD16scFv融合的ABH2异多聚体具有完全活性，并且以与游离抗CD16scFv(NM3E)类似的良好再现性和KD结合其靶标。
表11：与单个抗CD16scFv融合的单价ABH2的SPR数据。
实施例4基于HA或HAA的异多聚体蛋白的制备，其中一个或多个货物蛋白包含一个或多个EGF-A样结构域。
通过测序或从数据库如GenBank导出PCSK9蛋白中的EGF-A结构域的肽序列或与所述EGF-A结构域同源的另一个多肽序列，所述序列能够特异性地结合低密度脂蛋白受体(LDL-R)。通过多种方式分离包含EGF-A样结构域的货物多肽的cDNA，所述方式非排它地包括：从cDNA文库、通过RT-PCR以及通过使用重叠合成寡核苷酸引物系列的PCR，这些都使用标准方法。在某些实施例中，所述货物蛋白被工程化以提高稳定性、靶标结合特征或其它生物物理学特性或治疗上相关的特性。所述多肽用作货物蛋白，用于产生在高胆固醇血症的治疗中应用的异多聚体。通过使货物蛋白序列与基于HA或HAA的转运蛋白多肽(如SEQ IDNo：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10)的N末端和/或C末端直接地或者经由中间接头肽融合而衍生出第一和第二单体融合多肽序列。将所述单体融合蛋白序列反向翻译成其待引入表达载体中的对应DNA序列，即针对在特定目标细胞系中表达而优化的序列。在目标细胞系中转染并共表达第一和第二单体融合蛋白。在某些情况下，所述转染是在1∶1比例的两种载体中。在一些实施例中，所述比例选自1.5∶1、2∶1、1∶1.5、1∶2等。
实施例5基于HA或HAA的异多聚体蛋白的制备，其中一个或多个货物蛋白是GLP-1和/或胰高血糖素。
通过测序或从数据库如GenBank导出GLP-1的肽序列或与所述肽同源的另一个多肽序列，所述序列能够特异性地结合GLP-1受体或充当GLP-1激动剂。可替代地，通过测序或从数据库如GenBank导出胰高血糖素的肽序列或与所述肽同源的另一个多肽序列，所述序列能够特异性地结合胰高血糖素受体或充当胰高血糖素受体激动剂。通过多种方式分离包含GLP-1或胰高血糖素的每个货物多肽的cDNA，所述方式非排它地包括：从cDNA文库、通过RT-PCR以及通过使用重叠合成寡核苷酸引物系列的PCR，这些都使用标准方法。 在某些实施例中，，这些基于GLP-1或胰高血糖素的货物多肽被工程化以提高稳定性、靶标结合特征或其它生物物理学特性或治疗上相关的特性。这些基于GLP-1和胰高血糖素的多肽被用作一个或多个货物分子，用于产生在2型糖尿病或与葡萄糖代谢有关的其它疾病的治疗中应用的异多聚体。通过使货物蛋白序列与基于HA或HAA的转运蛋白多肽(如SEQ ID No：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10)的N末端和/或C末端直接地或者经由中间接头肽融合而衍生出第一和第二单体融合多肽序列。所述融合蛋白可以是对GLP-1或胰高血糖素样多肽单特异性的，或者是对GLP-1和胰高血糖素样多肽两者双特异性的(共激动剂)。将每个单体融合蛋白序列反向翻译成其待引入表达载体中的对应DNA序列，即针对在特定目标细胞系中表达而优化的序列。在目标细胞系中转染并共表达第一和第二单体融合蛋白。在某些情况下，所述转染是在1∶1比例的两种载体中。在一些实施例中，所述比例选自1.5∶1、2∶1、1∶1.5、1∶2等。
货物分子GLP-1的序列
SEQ ID No：12：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG
货物分子胰高血糖素的序列
SEQ ID NO：13：HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT
实施例6：作为膜感知多价支架的膜联蛋白蛋白重复序列
将膜联蛋白分裂为具有广泛界面，以产生包含两个转运蛋白多肽的多价异多聚体支架。膜联蛋白是一种346残基蛋白质(PDB ID1MCX)。在图11中示出包含两个转运蛋白多肽的异多聚体，所述转运蛋白多肽基于在残基186与194之间的区域中分裂的膜联蛋白。当在溶液中共表达时，两个转运蛋白多肽之间的大界面面积导致异二聚体的自组装。两个单元的自组装允许用基于膜联蛋白核心的转运蛋白多肽设计多价构建体。可得到两种结构：猪和人。所述两种结构以0.6A的均方根偏差(rmsd)重叠。可以从人膜联蛋白序列DRSEDF(残基160至165)中去除以下序列段。截短不会断裂任何二级结构元件，并且不会涉及引入或除去任何脯氨酸残基。
人膜联蛋白WT序列
SEQ ID NO：14：
GSAVSPYPTFNPSSDVAALHKAIMVKGVDEATIIDILTKRNNAQRQQIKAAYLQETGKPLDETLKKALTGHLEEVVLALLKTPAQFDADELRAAMKGLGTDEDTLIEILASRTNKEIRDINRVYREELKRDLAKDITSDTSGDFRNALLSLAKGDRSEDFGVNEDLADSDARALYEAGERRKGTDVNVFNTILTTRSYPQLRRVFQKYTKYSKHDMNKVLDLELKGDIEKCLTAIVKCATSKPAFFAEKLHQAMKGVGTRHKALIRIMVSRSEIDMNDIKAFYQKMYGISLCQAILDETKGDYEKILVALCGGN
基于膜联蛋白的转运蛋白多肽-1的序列：
SEQ ID NO：15：
SAVSPYPTFNPSSDVAALHKAIMVKGVDEATIIDILTKRNNAQRQQIKAAYLQETGKPLDETLKKALTGHLEEVVLALLKTPAQFDADELRAAMKGLGTDEDTLIEILASRTNKEIRDINRVYREELKRDLAKDITSDTSGDFRNALLSLAKG
基于膜联蛋白的转运蛋白多肽-2的序列：
SEQ ID NO：16：
GVNEDLADSDARALYEAGERRKGTDVNVFNTILTTRSYPQLRRVFQKYTKYSKHDMNKVLDLELKGDIEKCLTAIVKCATSKPAFFAEKLHQAMKGVGTRHKALIRIMVSRSEIDMNDIKAFYQKMYGISLCQAILDETKGDYEKILVALCGGN
图12示出在基于膜联蛋白的转运多肽-1(ABT-1)和基于膜联蛋白的转运多肽-2(ABT-2)的界面处的包埋的溶剂可及表面积的图。在残基位置186附近的分裂膜联蛋白形成具有约的包埋表面积的异二聚体。使用与上文关于基于白蛋白的转运蛋白多肽所描述相同的方法，可以使用转运蛋白多肽(如基于ABT-1和ABT-2的膜联蛋白)来连接货物生物分子。
实施例7：作为多价支架的转铁蛋白
基于转铁蛋白的大量治疗上相关的性能，所述蛋白将其自身呈现为令人感兴趣的用于设计多价蛋白融合体药物的支架分子，这发生在产生自组装蛋白及其分裂组分部分之后。在图13中示出转铁蛋白的结构，其基于在蛋白数据库中可得到的晶体结构(1H76)[HallDR等Acta Crystallogr D 2002，58，70-80]。转铁蛋白分子由两个结构上类似的裂片组成：N末端和C末端裂片，所述裂片通过残基333和342之间的短肽接头连接。
设计了基于转铁蛋白蛋白质的异二聚体，所述异二聚体包含：含有转铁蛋白的残基1-333的第一转运蛋白多肽，以及由原始转铁蛋白序列的残基342至C末端组成的第二转运蛋白多肽。当共表达时，两个转运蛋白多肽独立地折叠，并且配对以形成能够维持其治疗上相关的特性的准转铁蛋白支架。此外，这种转铁蛋白支架允许产生多价融合分子，例如具有基于转运的转运蛋白多肽的多价GLP-1融合体。这些融合体可以类似于具有基于白蛋白的转运蛋白多肽的GLP-1-融合多肽。
图13提供基于PDB结构1H76的转铁蛋白分子的结构。通过分裂转铁蛋白分子而衍生出的两个单体转运蛋白多肽用颜色代码表示为浅灰色和深灰色单元。货物分子的融合位点被表示为球体。图14示出在两个基于转铁蛋白的多肽的界面处的包埋的溶剂可及表面积的图。在残基位置330附近的分裂的转铁蛋白(如以下所示的两个转运蛋白多肽)形成具有约的包埋表面积的异二聚体。
基于转铁蛋白的转运蛋白多肽-1的序列：
SEQ ID NO：17：
MRLAVGALLV CAVLGLCLAV PDKTVRWCAV SEHEATKCQS FRDHMKSVIPSDGPSVACVKKASYLDCIRA IAANEADAVT LDAGLVYDAY LAPNNLKPVVAEFYGSKEDP QTFYYAVAVV KKDSGFQMNQLRGKKSCHTG LGRSAGWNIP IGLLYCDLPE PRKPLEKAVA NFFSGSCAPC ADGTDFPQLCQLCPGCGCSTLNQYFGYSGA FKCLKDGAGD VAFVKHSTIF ENLANKADRD QYELLCLDNTRKPVDEYKDCHLAQVPSHTV VARSMGGKED LIWELLNQAQ EHFGKDKSKEFQLFSSPHGK DLLFKDSAHG FLKVPPRMDAKMYLGYEYVT AIRNLREG.
基于转铁蛋白的转运蛋白多肽-2的序列：
SEQ ID NO：18：ECKPVKWCALSHHE RLKCDEWSVN SVGKIECVSAETTEDCIAKIMNGEADAMSL DGGFVYIAGK CGLVPVLAEN YNKSDNCEDT PEAGYFAVAVVKKSASDLTWDNLKGKKSCH TAVGRTAGWN IPMGLLYNKI NHCRFDEFFSEGCAPGSKKD SSLCKLCMGS GLNLCEPNNKEGYYGYTGAF RCLVEKGDVAFVKHQTVPQN TGGKNPDPWA KNLNEKDYEL LCLDGTRKPVEEYANCHLARAPNHAVVTRK DKEACVHKIL RQQQHLFGSN VTDCSGNFCL FRSETKDLLFRDDTVCLAKLHDRNTYEKYL GEEYVKAVGN LRKCSTSSLL EACTFRRP
实施例8：基于二硫键稳定化的HA或HAA的异多聚体蛋白的设计
设计了基于白蛋白的转运蛋白多肽，其中与白蛋白相比，在每个转运蛋白多肽中特定位置被突变为半胱氨酸以实现两个转运蛋白多肽之间的二硫键的选择性形成，从而产生具有准天然白蛋白单体结构的稳定异二聚体。
选择用于引入半胱氨酸的残基，将以下因素考虑在内：
a.在两个转运蛋白多肽之间形成共价键，从而增加所述异多聚体和所得准天然单体形式的稳定性。
b.必须在特定CA-CA和CB-CB限制被以形成二硫键
c.相容的局部环境(通常优选部分溶剂暴露区域中的较短疏水侧链)不太可能干扰现有极性接触。
通过QuickChange进行诱变，并且如以上实施例1和实施例2中所呈现来进行表达和纯化。
以下表12鉴别了所设计的多种包含引入的半胱氨酸的基于白蛋 白的异多聚体。ABH3-8是基于ABH2设计而设计的，而ABH9-12是基于ABH1设计而设计的。
表12：包含引入的半胱氨酸的基于白蛋白的异多聚体
在小规模2mL CHO培养物中以DNA比例1∶1(片段1∶片段2)表达变体ABH3、ABH4、ABH5、ABH6、ABH7以及ABH8。表达的凝胶在图35中示出。还表达WT-白蛋白(v225)连同先前变体AlbuCORE 1和AlbuCORE 2作为对照。变体ABH3、ABH5和ABH7与ABH2类似地表达，而剩余的变体展示较低表达和可能的二硫键混杂(可通过非还原SDS-PAGE中的多个条带觉察)，这可能是由于存在天然二硫键位置以及所引入的半胱氨酸突变。表达的恢复可通过改变切割位点(参见实施例9)或与以不同的DNA比例转染来实现。在这些构建体的末端处不存在接头。变体如ABH9、ABH10、ABH11以及ABH12中二硫键键合半胱氨酸突变的引入预期解决这一问题，因为它们缺乏原始界面中的天然二硫键键合位置。
实施例9：基于不同节段化位点设计基于HA或HAA的异多聚体蛋白
以下表13提供如本文所描述的异多聚体构建体，所述异多聚体 构建体包含通过如图15A-15P中所示和表1中所列出在不同位点处节段化白蛋白而设计的转运蛋白多肽。与实施例8中所描述的先前构建体和后续构建体不同，实施例9中的所有AlbuCORE构建体是用融合至片段1的C末端和片段2的N末端的GGGGS接头产生的。出于多种原因进行这一点：1)短接头的存在重新产生典型的融合分子并且允许理解一个或多个切割位点与接头的存在的相容性。2)接头的存在还可帮助稳定切割位点周围的局部环境，包括屏蔽一些暴露的疏水碎片。3)接头的存在减少后续阶段中变量的数目，当弹头融合至分子时。关于表达结果，参见表13。在小规模CHO培养物中初始测试表达，其中每个AlbuCORE变体中的两个片段以不同比例的组合进行。图35A和35B中的凝胶说明表达结果。
表13：基于不同白蛋白区段的基于白蛋白的异多聚体构建体。
如实施例2中所描述进行所选择的变体的表达，同时如实施例17中所描述进行纯化。在表14中示出这些分子相对于所使用的接头二硫键交联的特征以及表达结果的总结。
表14：表13中所列出的变体的表达结果：
实施例10：多个货物蛋白
本文所描述的异多聚体蛋白(例如，含有与转运蛋白白蛋白区段或其变体融合的货物多肽(或其片段或变体))可以另外与其它蛋白质融合，以产生“多融合蛋白”。这些多融合蛋白可以用于多种用途。例如，本文所描述的蛋白质与His-标签IgG结构域和麦芽糖结合蛋白的融合促进纯化。(参见例如EP A 394,827；Traunecker等，Nature331：84-86(1988))。与多肽融合的核定位信号可以将蛋白质靶向特定的亚细胞定位。此外，额外蛋白质序列与本文所描述的蛋白质的融合可以进一步增加异多聚体的可溶性和/或稳定性。可以使用或常规地改进本领域中已知的技术和/或通过改进下述方案(其概述多肽与IgG分子的融合)来制备上述异多聚体蛋白。
简言之，使用跨下述序列的5′端和3′端的引物，可以PCR扩增IgG分子的人Fc部分。这些引物还应具有方便的限制性酶位点，所述位点将有助于克隆至表达载体(优选哺乳动物或酵母表达载体)中。
例如，如果使用pC4(ATCC登录号209646)，可以将人Fc部分连接至BamHI克隆位点中。应当指出，应破坏3′BamHI位点。接着，用BamHI重新限制酶切含有人Fc部分的载体，从而使所述载体线性化，并将编码本文描述的异多聚体蛋白的多核苷酸(使用本领域中已知的技术制备和分离的)连接至所述BamHI位点中。应当指出，在没有终止密码子的情况下，克隆编码本发明的融合蛋白的多核苷酸；否则将不会产生含有Fc的融合蛋白。
如果使用天然存在的信号序列来产生本文所描述的异多聚体蛋白，pC4不需要第二信号肽。或者，如果未使用天然存在的信号序列，可以修饰载体以包括异源信号序列。(参见，例如国际公布号WO96/34891。)
实施例11.抗-Her2单特异性、单价至四价的基于负载货物的白蛋白的多肽；抗-Her2 x Her3双特异性、二价的基于负载货物的白蛋白的多肽；以及不同对照的制备。
如这一实施例中所描述来制备多种不同的基于负载货物的白蛋白的转运蛋白多肽。如下制备实施例3的表8中所描述的抗-HER2scFv。简言之，根据在此所描述的方法将ABH2负载呈不同顺式和反式构型的抗-Her2 scFv。最终单特异性多肽在单价至四价的范围内。组分多肽的氨基酸序列和核酸序列的细节也在表8中示出。以类似的方式，还将ABH2负载呈顺式构和反式构型两者的抗-Her2和抗-Her3scFv，从而产生双特异性、二价分子。因为在不同实施例中使用对照，所以还产生了V1087、单一scFv、单臂Fc以及二价Fc。
负载有抗-Her2 4D5 scFv的ABH2。在图17中示意性地示出负载抗-Her2的ABH2的不同的可能构型。如所述图所示，取决于scFv是连接至ABH2的片段A或B的N末端还是C末端而制备多种顺式和反式变型。在ABH2片段1的天然N末端处设计短GGSG接头，并且在ABH2片段1的C末端和ABH2片段2的N末端和C末端处设计较长(GGS)4GG接头。将最终的基因产物亚克隆至哺乳动物表达载体pTT5(NRC-BRI，加拿大)中(Durocher等)。通过瞬时转染悬浮生长的人CHO-3E7，进行高水平和高通量重组蛋白生产。通过以下方式进行纯化：使用1ml/ml的流速，将具有表达的蛋白质的细胞上清液应用至填充有Blue Sepharose基质(GEHealthcare)的QIAGEN-tip500柱，所述柱联接至AKTA Express系统(GE Healthcare)。用由20ml PBS(pH 7.2)、300mM NaCl组成的样品缓冲液平衡所述柱。以5ml/分钟的流速加载样品，并且随后用样品缓冲液洗涤。通过施加从300 mM至2000mM范围的NaCl梯度来洗脱蛋白质。以较高盐浓度洗脱的级分是最纯的，并且将其汇集、浓缩并随后使用1ml/ml的流速应用于与AKTA Express系统(GE Healthcare)联接的HiLoad 16/60Superdex 200制备级凝胶过滤柱。收集具有＞85％纯度的蛋白质；汇集含有纯样品的级分，并使用具有10 000 MWCO的截留重量的Amicon Ultra膜，通过离心进行浓缩。图10A-10B示出与不同货物多肽融合的ABH2异多聚体的SDS-PAGE(非还原)分析。在表8和图17中概述异多聚体中的那些多肽相对于转运蛋白多肽的位置。所有构建体显示出预期的分子量。
与一个抗-Her2 4D5 scFv融合体融合的单价ABH2由如表8中所描述的变体517、518、519、520例示。与两个或三个抗-Her2 4D5 scFv融合体融合的二价和三价ABH2由如表8中所描述的变体525、526、527、528、531、532、540例示。所有这些变体是如以下段落中所描述通过共表达两个白蛋白片段来产生。最后，将抗-Her2 scFv连接至所有四个可能的末端形成被称为变体542的四价融合蛋白。
负载有抗-Her2 x抗-Her3 scFv的ABH2(变体1377、1378和1090)。
制备与抗-HER2和抗-HER3融合的不同型式的基于白蛋白的异多聚体。所使用的抗-HER2和抗-HER3弹头靶向相同受体如MM-111，其中主要差异在于抗-HER2弹头，所述抗-HER2弹头是用于MM-111中的非中和B1D2弹头、或中和4D5弹头。
将AlbuCORE_1(ABH2)片段1在N末端处通过GGGS接头融合至抗-HER3，并且与通过位于片段2的N末端(产生变体1378，其中弹头呈反式)或片段2的C末端(产生v1377，其中弹头呈顺式)处的(G GSG)4GG接头融合至抗HER2(4D5)的片段2复合。第三类型的Al buCORE_1(ABH2)分子是通过组合在其N末端处通过GGGS接头融合至抗HER3的片段1与在其C末端处通过GGGS接头融合至抗HE R2(B1D2)的片段2而形成(变体编号1090)。这种分子具有呈顺式的弹头并且几乎与MM-111相同。MM-111多肽与基于ABH2的多肽之间的主要差异在于1)MM-111多肽中所使用的接头是疏水性更强的，而基于ABH2的多肽上所使用的接头是聚GLY)(S)，以及2)基于AB H2的多肽缺乏最初通过Merrimack引入的C34S/N504Q突变。
MM-111和衍生物(变体1087、1088和1089)
MM-111分子是具有分别连接至修饰的人血清白蛋白蛋白质的C末端和N末端的两个scFv，抗-Her2(B1D2)和抗-Her3(H3)的单一多肽融合蛋白并且通过Merrimack产生。所得到的分子是双特异性和二价的。作为对照，构建了MM-111分子的变体，其中将抗-Her3(H3)弹头通过短AAS接头融合至白蛋白的N末端，同时将抗-Her2(B1D2)通过AAAL接头融合至C末端以产生基准对照变体1087。这种对照变体缺乏最初通过Merrimack引入其MM-111分子中的C34S/N504Q突变。构建了另外的MM-111相关的分子：1)在N末端仅融合至抗-Her3(H3)弹头的白蛋白(v1088)和2)融合至C末端的抗-Her2(B1D2)(v1089)。在这两种情况下，所使用的接头是与MM-111相同的。所有分子在CHO细胞中以1∶1比例表达并且如针对多聚体4D5融合体所描述进行纯化。
单一抗-Her2 scFv
在1L CHO3E7细胞(v218)中表达游离抗-Her2人scFv(v218)。将(His)6标签通过含有TEV蛋白酶位点的可裂解接头融合至C末端。将蛋白质通过联接至一个fractogel系统的金属(Co2+)亲和(柱体积＝1mL)、接着Superdex 200尺寸排阻色谱法进行纯化。纯化后产率是在Co2+亲和之后3.6mg的4D5 scFv并且在尺寸排阻之后1.38mg。
图31A是示出在Co2+亲和之后v218的纯化的SDS-PAGE。提供表达产物后洗涤、柱洗脱和脱盐。图31B是在通过尺寸排阻柱第二纯化之后变体的色谱图谱。
对照Fc分子(878、628和630)：
将单一抗-Her2(4D5)人scFv融合至Fc片段以产生单价、单特异性抗体产物。为了确保异二聚体Fc的形成，将异驱动突变包括在Fc链中。
V878：OA4-scFv-B1D2，单价抗-Her2抗体，其中Her2结合结构域是链A上的scFv，并且Fc区是具有链A中的突变L351Y_F405A_Y407V和链B中的突变T366L_K392M_T394W的异二聚体。
V628：二价抗-Her2抗体，其中两个Her2结合结构域均是呈scFv形式，并且Fc区是具有链A中的突变L351Y_S400E_F405A_Y407V和链B中的突变T366I_N390R_K392M_T394W的异二聚体。
V630：单价抗-Her2抗体，其中Her2结合结构域是scFv，并且Fc区是具有链A中的突变L351Y_S400E_F405A_Y407V和链B中的突变T366I_N390R_K392M_T394W的异二聚体。
表15提供在这一部分中描述的变体的多肽序列的列表。
表15：
实施例12.通过融合至呈多价构型的抗-Her2 4D5 scFv的ABH2与SKOV细胞靶结合。
在这一实施例中检查了ABH2抗-Her2融合蛋白对Her2+细胞的亲和力。不同scFv连接构型提供于图17中。单独ABH2(AlbuCORETM)、单独抗-Her2 scFv、单价单臂Fc分子和二价双臂Fc分子用作对照。这些总结在图17的“对照”图中。按照实施例2构建ABH2蛋白并且按照实施例11产生融合蛋白。
FACS结合评定
通过FACS评定了不同抗-Her2ABH2构建体和对照与表达Her2的SKOV细胞的结合亲和力。使用抗-HSA多克隆(FITC标记的)进行检测。所测得的所有KD是表观的。
通过FACS方案进行全细胞结合：
一旦细胞已达到足够存活力(即2x106细胞/ml细胞(＞80％存活力))，就将培养基从T75培养瓶中抽出并且用冷PBS洗涤，随后将其抽出。添加每烧瓶3mL解离缓冲液并且对细胞进行计数。然后将悬浮液在1050rpm下离心5分钟，并且将细胞再悬浮于含有5％FBS@1X10e5细胞/100μl的RPMI培养基中。将100ul细胞悬浮液添加至埃彭道夫管(eppendorftube)中，随后添加10μl/管的第一抗体(山羊抗 人HSA)。然后将细胞在4℃下在旋转支持体上孵育2小时。然后将管在2000rpm下在室温下离心两分钟。将培养基抽出，并且将沉淀用含有5％FBS的500ul RPMI培养基洗涤并再次离心。将第二抗体(Alexa Fluor 488-缀合的抗山羊IgG)添加至2ug/样品的终浓度。将沉淀再悬浮于100ul溶液中，在4C下在旋转支持体上孵育1小时并且在2000rpm下离心2分钟。然后将细胞用含有5％FBS的500ul RPMI培养基洗涤，再次离心并再悬浮于500ul/沉淀中以用于流式细胞术分析。
每个构建体的KD值在下文提供，在图17中示例性地呈现。所有测定的KD是表观的并且值表示每分子所测试的六种浓度的平均值，高达3μM。如图所展示，增加效价倾向于增加结合亲和力，通过表观KD值的降低所指示。通常，连接至任一片段多肽的N末端的抗-Her2scFv表现出大于连接至C末端的抗-Her2 scFv的对Her2的亲和力。在一些实施方案中，多特异性多价种类降低对特定位置处的融合体的有效亲和力的这种特性可用于减弱一些融合配偶体种类的亲和力和活性。
实例13.融合至抗-Her2和抗-Her 3 scFv的ABH2的双特异性结合。
对呈顺式构型负载有抗-Her2和抗-Her3 scFv的ABH2对MALME-3M细胞的结合亲和力进行评定并且将其与v1087对照进行比较。按照实施例11来构建融合蛋白和对照两者。
双特异性结合的FACS分析
如实施例12中所描述，用FITC标记的抗-HSA抗体使用FACS对示例性基于白蛋白的异多聚体变体1090(抗-Her2 x抗-Her3 ABH2)与MALME-3M和SKOV细胞的结合亲和力进行评估。如实施例11中所描述，v1090包含B1D2/H3融合体、Merrimack接头长度和较弱疏水性接头聚GLY)(S)。
图18A示出在SKOV细胞中，与对照1087相比，变体1088、1089和1090的结合。图18B示出在MALME-3M细胞中，与对照1087相比，变体1088、1089和1090的结合。以下表16提供关于这些变体在两种细胞类型中的结合的表征的数据。除非另外指示，否则表16中的所有单位是nM。
对于1087和1090，与MALME-3M细胞的结合分别是5-55nM和200-10,000nM。对于1087和1090，与SKOV细胞的结合分别是10nM和9.4nM。
表16：变体在SKOV和MALME-3M细胞中的结合数据。
实施例14.与抗-Her2融合的ABH2的血清稳定性。
进行负载有抗-Her2的ABH2在人血清中的稳定性以便评定接头的潜在蛋白水解裂解。测试了五种变体：v517、v518、v519以及v520
人血清孵育和随后的FACS分析。
将上述抗-Her2 ABH2融合蛋白针对结合SKOV细胞进行测试，并且然后以100μg/ml在之前冷冻的人血清(Sigma#H4522)中在室温下孵育24小时，之后针对与相同的SKOV细胞储备液进行再测试。使用山羊FITC标记的多克隆抗-HSA抗体进行检测。在预孵育蛋白质用作对照的情况下，使用FACS评定融合蛋白与SKOV-3细胞的结合亲和力。
图19A至19D示出所测试的变体的预孵育样品和后孵育样品两者的结合曲线。
如图19A至19D中所示，所有融合体在血清孵育之后似乎是稳定的并且能够结合靶抗原。
实例15.融合至抗-Her2和抗-Her3 scFv的ABH2的FcRn结合。
对呈反式构型负载有抗-Her2和抗-Her3 scFv的ABH2结合FcRn的亲和力进行评定并且将其与野生型HSA和1087对照两者进行比较。
对于这一实验，使用基准对照v1087和AlbuCORE HER2/HER3融合体中的一种(v1378)。图20A示出v1378融合体的反式构型。
FcRn结合。
将人FcRn(hFcRn)固定在SPR表面上并且使纯化的抗-Her3 x Her2 ABH2(v1378)和v1087在pH 6.0下流过。方法与实例2相同，除了测定的方向性相反。
图20A和20B分别示出抗-Her2 x Her3 ABH2和V1087的不同结合曲线。抗-Her2 xHer3 ABH2以0.97μM的KD结合hFcRn，而V1087分子以2.76μM的KD结合hFcRn。从所述图，可以看出两种融合体ABH2和v1087在FcRn结合亲和力方面是与野生型HSA可比的(在pH 5.5下Kd＝1.4μM，如Chaudhury，C等Biochemistry 2006，45，4983-4990中所描述)。
实施例16.ABH2和单价抗-Her2 ABH2的台式稳定性。
在一段五天的时期内在三种不同温度下评定了ABH2支架和单价ABH2抗-Her2融合蛋白(v517)两者的台式稳定性。
台式稳定性
将来自每种分子的样品分到九个管中，其中每个管含有约10μg的蛋白质。将对应于10μg蛋白质的初始量的材料以1mg/mL放置在PBS中并且在37℃(浴)、室温(RT)或4℃(冰箱)下孵育；在五天时间内评定蛋白质稳定性。在每个时间点将等分试样用负载考马斯蓝的缓冲液萃取并1∶1混合，随后冷冻。在最后一次时间步骤中，所有等分试样解冻并负载到非变性凝胶上，以及还原和非还原SDS-PAGE。
图21是在第1、第3和第5天ABH2支架和抗-Her2 ABH2融合体的非变性凝胶。如所述图所示，ABH2支架和抗-Her2 ABH2两者5天时期内保持稳定。针对融合蛋白可见的双峰条带很可能表示二硫键的两种不同还原状态。在还原剂的存在下，两个条带实际上塌陷成一个。
实施例17.使用工艺的纯化优化
作为实施例2中所描述的蓝色琼脂糖凝胶纯化的替代，所述纯化导致在洗脱中一定量的残余污染物并且需要高盐洗脱，采用了基于 的亲和力纯化方法。优化工序包括以批模式和直接模式两者测试与蓝色琼脂糖凝胶基质的结合，尝试了不同的洗脱方案连同不同的pH和温度。最后对针对白蛋白和白蛋白融合体的纯化定制的特定树脂(即)进行了测试。使用测试了不同的结合和洗脱条件，涉及在不同盐存在下结合和使用pH梯度或竞争性洗涤剂洗脱。
野生型HSA的纯化：蓝色琼脂糖凝胶与的比较
按照实施例2中所描述的方法对野生型HSA进行蓝色琼脂糖凝胶纯化。图22A是在蓝色琼脂糖凝胶纯化过程中获得的总、流过、洗涤以及洗脱级分的非还原SDS-PAGE凝胶图谱。图22B表示在凝胶过滤(SEC)之后蓝色琼脂糖凝胶洗脱级分的LC分析。如可从色谱图中的多个峰看出，即使在纯化之后仍存在显著的蛋白质和离子污染。
如下对野生型HSA进行纯化。将含有野生型HSA的细胞上清液溶解于PBS中。将预装柱(柱体积：1mL)在50mM乙酸钠(pH 5.3)中平衡。在负载上清液之后，将柱用含有50mM乙酸钠但增加的pH(即第1次是pH 6；第2洗涤pH 7)的溶液洗涤三次。最终洗涤在乙酸铵(pH 8.0)中进行。然后使用补充有10mM辛酸钠的含有50mM乙酸铵(pH7.0)的溶液洗脱目标蛋白质。方法仅需要一个步骤来获得与蓝色琼脂糖凝胶方法可比量的蛋白质。在以下表17中示出来自500mL初始CHO培养物的蛋白质产率。
表17：纯化之后的蛋白质产率
图22C表示在凝胶过滤(SEC)之后AlbuPure亲和柱洗脱级分的LC分析。图22B和22C的比较展示AlbuPure方法产生具有比来自蓝色琼脂糖凝胶的纯度水平更高纯度水平的最终溶液，连同更低量的较高分子量聚集蛋白质。
工程化AlbuCORE的纯化：使用进行的野生型HSA和工程化AlbuCORE的比较
使用单独的载体在CHO细胞中瞬时共表达表11中描述的AlbuCORE-1A、3、6和9的两个片段肽。用于表达构成不同AlbuCORE分子的两个片段的最佳DNA比例是(片段1∶片段2)AlbuCORE-1＝1∶1；AlbuCORE-3＝1∶2；AlbuCORE-6＝1∶1；AlbuCORE-9＝2∶1。所有表 达是瞬时的并且以与先前AlbuCORE分子相同的方式进行。野生型HSA也在CHO细胞中瞬时表达。融合蛋白的表达产率在WT-HSA75％的内(约50-70mg/L)。在albupure纯化之后通过A280测定物质的量。
在共表达之后，使用上述方案纯化AlbuCORE支架。为了评定纯度，将来自亲和柱的洗脱穿过凝胶过滤系统(S EC)并使用LC分析流过级分。对野生型HSA相同地进行。图23A表示野生型HSA的色谱图，而图23B、23C、23D和23E分别是AlbuCORE1、3、6和9的色谱图。如这些图展示，纯化产率在野生型与工程化AlbuCORE之间是可比的结果。就在纯化之后来自500mL初始CHO培养物的mg的纯化蛋白质而言的产率被测定为：AlbuCORE-1＝16mg；AlbuCORE-3＝25mg；AlbuCORE-6＝27；AlbuCORE-9＝25mg。
AlbuCORE-1的放大表达和纯化
用pTT5载体以1∶1片段A∶B的比例在CHO中瞬时共表达AlbuCORE-1，参见实施例2。CHO细胞中的AlbuCORE-1的纯化产率是约10mg/L，其是与从相同量的起始材料计算的CHO细胞中的v1087的9mg/L产率可比的。
使用上述AlbuPURE方案纯化AlbuCORE-1。将亲和柱洗脱液应用于凝胶过滤-LC分析系统。图24A表示AlbuPure纯化的色谱。主峰表示目标蛋白质。
还通过还原和非还原SDS-PAGE凝胶分析纯化的样品，在图24B中示出。如图所展示，在非还原条件下，关键洗脱产物是全AlbuCORE-1蛋白；在还原条件下，AlbuCORE-1蛋白分离成先前所描述的两个片段。显著地，纯在很少污染，尤其是与图22A比较时。
AlbuCORE-1和WTHSA的SDS-PAGE和LC/MS分析
收集野生型HSA和AlbuCORE-1纯化的总、流过、洗涤和洗脱 级分并且通过非还原SDS-PAGE进行分析。如表示上述凝胶图谱的图25A中所示，展示在AlbuPure方法之后存在很少污染(比较图25A和图22A)并且也不存在同二聚体形成。
然后使用LC/MS分析纯化的蛋白质。使用通过高流量电喷雾接口连接至LTQ-Orbitrap XL混合型质谱仪(ThermoFisher Scientific)上的Agilent 1100HPLC系统将蛋白质样品通过LC-MS进行分析。将样品(2.5μg)注入到2.1x 10mm Poros R2柱(AppliedBiosystems)上并且使用2mL/分钟20％-90％ACN、0.1％FA梯度经3分钟洗脱。将流柱后分裂以便引导100μL/分钟至电喷雾接口中。将柱和溶剂加热至80℃以便改进蛋白质峰形。将LTQ-Orbitrap XL使用ThermoFisher Scientific的LTQ正离子ESI校准溶液(咖啡因，MRFA和Ultramark1621)进行校准，并使用25ug/uL BSA溶液调整。锥电压(源分级分离设置)是40V，FT分辨率是7,500并且扫描范围是m/z 400-4,000。使用ThermoFisher的Promass软件去卷积蛋白质光谱(输入范围：m/z2500-3050；输出质量范围：100,000-160,000Da；峰宽：1.5；合并宽度：0.5；基线去除：0.5(低))。直接从所得到的分子量图谱确定异二聚体和同二聚体抗体种类的丰度。使用限定的抗体混合物确认响应线性。检测限是约2％。图25B提供纯化的AlbuCORE-1和WT-HSA的光谱图。如AlbuCORE-1的光谱图所展示，不存在同二聚体形成(如A∶A或B∶B)。从理论分子量的变化可能是由于离子结合、其它配体或糖化。
实施例18.基于白蛋白的多肽的末端的空间组构
基于白蛋白的多肽提供用于递送货物分子的抗体的替代支架。如图26A与26B之间的差异展示，工程化的基于白蛋白的多肽具有与常规抗体相比更大程度的位置自由，因为四个末端之间的空间间隔更显著地变化。在将AlbuCORE分子建模到可用的晶体结构之一上之后测定距离：PDBID＝4EMX。此外，四个末端还以不同的平面角度取向。
最后，可以通过选择不同的节段化位点、结合结构域和/或接头进一步调节所述末端之间的距离和角度。图26C示出替代AlbuCORE支架可用于针对多价结合模式中的抗原结合优化而改变末端间距离。
实施例19.通过DSC测量的另外基于白蛋白的多肽的稳定性
为了测定另外的AlbuCORE多肽的稳定性和熔点，对AlbuCORE-3、6和9以及对照WT-白蛋白和AlbuCORE-1进行了DSC实验。如实施例2中所阐述进行DSC实验。图27示出相较于WT-HSA的解链曲线，四种支架的解链曲线。如图所示，支架3、6和9具有非常类似于由野生型展示的75℃的熔点。此外，据发现在76℃下AlbuCORE-6热稳定性高于野生型HSA。对AlbuCORE 1A和4进行另外DSC实验。AlbuCORE 1A的Tm是66℃并且AlbuCORE-4的Tm是70℃。AlbuCORE-1A使AlbuCORE 1(ABH1)中的两个片段之间的空位变窄至仅一个残基并且添加GGGGS接头至N和C非天然末端。这同样适用于AlbuCORE 2(ABH2)和AlbuCORE-2A。
实施例20：抗-CD3x CD19异多聚体构建体的制备。
将抗-CD3和抗-CD19scFv连接至如下的几种不同的抗体平台。基于白蛋白的多肽平台是AlbuCORE-1；对照包括WT-HSA、不对称支架(v873)和抗-CD3x CD19BiTE对照v891。
负载有抗-CD19 x抗-CD3 scFv的ABH2(1092、1093、1094和1095)：抗-CD19和抗-CD3scFv的序列选自两种分子，所述分子目前处于临床试验并且被充分证明且针对稳定性和产生进行了测试。抗-CD19和抗-CD3scFv直接从BiTE分子兰妥莫单抗采用。与BiTE中所使用的一致，以VH-VL取向选择抗CD3scFv。基准分子是BiTE通过使抗CD3弹头连接至片段1的天然N末端并且使抗CD19连接至片段2的C末端来产生AlbuCORE_1(ABH2)CD3/CD19融合体(v1092)。产生第二分子，其中将弹头进行反转(即抗-CD19弹头在片段1的天然N末端处并且抗-CD3在片段2的C末端处，v1093)。所 使用的接头与用于多价HER2 AlbuCORE实验的接头相同：在片段1的N末端处GGGS并且在片段2的C末端处(GGSG)4GG。如之前针对多价HER2所描述进行表达和纯化。分子1093和1094被设计成在其天然末端处容纳两种不同的融合体。scFv融合体通过在N末端处的GGS接头和在C末端处的GGSG接头连接至白蛋白分子。接头的长度反映MM-111分子中所使用的接头，尽管具有不同的序列类型。在图29中示出这些分子的示意性图示。
设计了基于ABH2的另外单价和多价CD19异多聚体和单价CD3异多聚体(其中货物多肽的相对位置改变)，这些异多聚体中的一些的示意性图示在图28B中示出。通过以下方式产生这些异多聚体：表达它的单个单体转运蛋白多肽SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10，所述多肽在一个或两个末端处与货物多肽融合，所述货物多肽是抗CD19scFv(CD19)和/或抗-CD3scFv(CD3)。这些基础构建体的不同组合在共表达之后相组合以形成异多聚体，所述异多聚体展示在两个转运蛋白多肽的四个末端位置处的任一个处的两个货物多肽的所有组合，从单价至四价。表18示出通过将CD3和/或CD19货物多肽融合至转运蛋白多肽1(F1)或转运蛋白多肽2(F2)的N末端或C末端而产生的基础构建体。F1：对应于SEQID 8并且F2对应于SEQ ID 10。
表18：CD3和CD19单价和多价构建体的基础构建体
如图28B中所示，将生物活性的货物多肽与异多聚体转运蛋白多肽经由GGSG接头(对于一个单体的N末端)和更长的(GGS)4GG接头(对于其它单体中的所有其它末端)融合。此外，产生每种融合蛋白的变型，其中在其非天然末端的较短接头(即片段1的C’和片段2的N’)由序列GGSGGSG形成，从而置换(GGS)4GG。
所制备的异多聚体的总结在表19中示出。
表19：通过将CD3和CD19货物多肽融合至ABH2的转运蛋白多肽1或转运蛋白多肽2的N末端或C末端而产生的单价、多价和多特异性构建体。
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使用异多聚体ABH2，如实施例2中所概述来产生多价构建体。将最终的基因产物亚克隆至哺乳动物表达载体pTT5(NRC-BRI，加拿大)中(Durocher等)。如实施例2所述，通过瞬时转染悬浮生长的人 CHO-3E7，进行高水平和高通量重组蛋白生产。
图28C中示出表达结果。单价CD3和CD19融合体以类似的水平表达。单价CD3和CD19的表达具有与HER2融合体所观察到的模式相同的模式(就分子量而言)，从而指示在非还原凝胶上迁移的变化与弹头类型无关。
实施例21：负载抗-CD3x CD19的基于白蛋白的多肽结合B细胞和T细胞的能力。
使用FACS对负载抗-CD3x CD19的AlbuCORE-1(v1092和1093)结合CD3+和CD19+细胞的能力进行评定并且将其与负载有相同抗-CD scFv的WT-HSA(1094和1095)进行比较。如下针对AzymetricTM和BiTE MT-103对AlbuCORE-1构建体的B细胞和T细胞结合进行另外测试。如实施例13中所描述进行方法，但是在MALME-3M细胞和SKOV细胞中。
结果在图29中示出，其示出Jurkat和Raji细胞中所测试的变体的KD和Hill斜率数据。
实施例22：负载抗-CD13x CD19的基于白蛋白的多肽结合B细胞和T细胞的能力。
如下测定变体1092和1093桥联B细胞和T细胞的能力。
通过FACS进行的全细胞桥联
将悬浮在RPMI中的1x 106个细胞/ml用0.3μM的适当□CellTrace标记进行标记并混合，并且在水浴中在37℃下孵育25分钟。将沉淀再悬浮于2ml的L10+GS1+NaN3中至终浓度5x x106个细胞/ml。通过流式细胞术对细胞悬浮液进行分析(1/5稀释)以验证适当的细胞标记和激光设置。Flow-check和flow-set荧光团用于验证仪器标准化、光学对准和流体学。
在流式细胞术验证之后并且在桥联之前，将各细胞系以所需比例、以1x106个细胞/ml的最终浓度混合在一起。
用Jurkat-紫色+Jurkat-远红色评定T:T桥联，□用RAJI-紫色+RAJI-远红色评定B:B桥联，□并且用Jurkat-紫色+RAJI-远红色评定T:B桥联。
将抗体变体在室温下在L10+GS1+NaN3中稀释至2x，然后添加至细胞，接着轻轻混合并且孵育30分钟。
在30分钟孵育之后，添加2μl的碘化丙啶并缓慢混合，并且立即通过流式细胞术进行分析。
桥联％被计算为同时标记紫色和远红色的事件的百分比。□
图30A通过FACS比较v1092、一种双特异性CD3/CD19抗体(v873)以及BiTE-样对照v891桥联Jurkat CD3 T细胞(右下象限)与Raji CD19 B细胞(左上象限)的能力。桥联的T-B细胞出现在右上象限。这一结果证明在低至0.3nM的浓度下，v1092能够以与BiTE(总细胞的21％)和具有异二聚体Fc的双特异性CD3/CD19抗体(25％)类似的程度(总细胞的31％)特异性地桥联Jurkat T细胞与Raji B细胞。
图30B将v1092的能力与对照v891、v873和v221进行比较。这一图示出v1092能够以与v891(BITE)类似的程度桥联Jurkat T细胞和Raji B细胞。
本说明书中所提及的所有出版物、专利以及专利申请在本文以引用的方式并入本说明书中，其引用的程度犹如每个独立的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出以引用的方式并入本文。

Claims (58)

1.一种异多聚体，其包含:
包含第一转运蛋白多肽和至少一个第一货物多肽的第一多肽构建体；以及
包含第二转运蛋白多肽的第二多肽构建体；
其中所述第一转运蛋白多肽包含白蛋白多肽的第一区段的氨基酸序列和所述第二转运蛋白多肽包含白蛋白多肽的第二区段的氨基酸序列；
其中所述白蛋白多肽的第一区段和所述白蛋白多肽的第二区段是通过所述白蛋白多肽在节段化位点处的节段化获得，以使得所述节段化导致所述节段化位点处0个氨基酸残基的缺失，以及
其中所述转运蛋白多肽自组装以形成所述白蛋白多肽的单体形式的准天然结构，其中所述白蛋白多肽的所述单体形式的所述准天然结构具有大于65℃的解链温度。
2.如权利要求l所述的异多聚体，其中a)所述节段化位点驻留在所述白蛋白多肽的一个环上，所述环具有高溶剂可及表面积(SASA)和与所述白蛋白结构的剩余部分的有限接触，或b)所述节段化在所述转运蛋白多肽之间产生互补界面，其中所述界面是非极性的、广泛的和相互交叉的。
3.如权利要求2所述的异多聚体，其中所述节段化位点的位置在所述白蛋白多肽序列SEQ ID NO:1的残基339和340之间、残基300和301之间、残基364和365之间、残基441和442之间、残基171和172之间、残基281和282之间、或残基114和115之间，其中所述残基的编号从信号序列后的第一个残基开始。
4.一种异多聚体，其包含:
a.包含第一转运蛋白多肽和至少一个第一货物多肽的第一多肽构建体；以及
b.包含第二转运蛋白多肽的第二多肽构建体；
其中所述第一转运蛋白多肽包含白蛋白多肽的第一区段的氨基酸序列和所述第二转运蛋白多肽包含白蛋白多肽的第二区段的氨基酸序列；
其中所述白蛋白多肽的第一区段和所述白蛋白多肽的第二区段是通过所述白蛋白多肽在节段化位点处的节段化获得，以使得所述节段化导致所述节段化位点处1个氨基酸残基的缺失，以及
其中所述转运蛋白多肽自组装以形成所述白蛋白多肽的单体形式的准天然结构，其中所述白蛋白多肽的所述单体形式的所述准天然结构具有大于65℃的解链温度。
5.如权利要求4所述的异多聚体，其中所述节段化位点在对应于所述白蛋白多肽序列SEQ ID NO:1的残基84的位置使得残基缺失，其中所述残基的编号从信号序列后的第一个残基开始。
6.如权利要求1-5中任一项所述的异多聚体，其中所述第一转运蛋白多肽和所述第二转运蛋白多肽中的至少一个还包含接头。
7.如权利要求6所述的异多聚体，其中所述接头是GGGGS接头。
8.如权利要求1-5中任一项所述的异多聚体，其中至少一个二硫键在来自所述第一转运蛋白多肽和所述第二转运蛋白多肽的残基上形成并且还在所述白蛋白多肽中观察到所述二硫键。
9.如权利要求1-5中任一项所述的异多聚体，其中所述白蛋白多肽是具有排除在位置1至29的信号序列的SEQ ID NO:1的序列的人血清白蛋白或其类似物或变体。
10.权利要求l所述的异多聚体，其中所述第一转运蛋白多肽具有包含排除在位置1至27的信号序列的SEQ ID NO:39的序列或其类似物或变体，并且其中所述第二转运蛋白多肽具有包含排除在位置1至27的信号序列的SEQ ID NO:40的序列或其类似物或变体。
11.权利要求l所述的异多聚体，其中所述第一转运蛋白多肽具有包含排除在位置1至27的信号序列的SEQ ID NO:41的序列或其类似物或变体，并且其中所述第二转运蛋白多肽具有包含排除在位置1至27的信号序列的SEQ ID NO:42的序列或其类似物或变体。
12.权利要求l所述的异多聚体，其中所述第一转运蛋白多肽具有包含排除在位置1至27的信号序列的SEQ ID NO:43的序列或其类似物或变体，并且其中所述第二转运蛋白多肽具有包含排除在位置1至27的信号序列的SEQ ID NO:44的序列或其类似物或变体。
13.权利要求l所述的异多聚体，其中所述第一转运蛋白多肽具有包含排除在位置1至27的信号序列的SEQ ID NO:45的序列或其类似物或变体，并且其中所述第二转运蛋白多肽具有包含排除在位置1至27的信号序列的SEQ ID NO:46的序列或其类似物或变体。
14.权利要求4所述的异多聚体，其中所述第一转运蛋白多肽具有包含排除在位置1至27的信号序列的SEQ ID NO:47的序列或其类似物或变体，并且其中所述第二转运蛋白多肽具有包含排除在位置1至27的信号序列的SEQ ID NO:48的序列或其类似物或变体。
15.权利要求l所述的异多聚体，其中所述第一转运蛋白多肽具有包含排除在位置1至27的信号序列的SEQ ID NO:49的序列或其类似物或变体，并且其中所述第二转运蛋白多肽具有包含排除在位置1至27的信号序列的SEQ ID NO:50的序列或其类似物或变体。
16.权利要求l所述的异多聚体，其中所述第一转运蛋白多肽具有包含排除在位置1至27的信号序列的SEQ ID NO:51的序列或其类似物或变体，并且其中所述第二转运蛋白多肽具有包含排除在位置1至27的信号序列的SEQ ID NO:52的序列或其类似物或变体。
17.权利要求l所述的异多聚体，其中所述第一转运蛋白多肽具有包含排除在位置1至27的信号序列的SEQ ID NO:53的序列或其类似物或变体，并且其中所述第二转运蛋白多肽具有包含排除在位置1至27的信号序列的SEQ ID NO:54的序列或其类似物或变体。
18.如权利要求l-5中任一项所述的异多聚体，其中所述第一转运蛋白多肽和所述第二转运蛋白多肽中的至少一个包含氨基酸残基至半胱氨酸或其类似物的至少一个突变，以使得所述半胱氨酸与另一个转运蛋白多肽上的对应半胱氨酸残基形成二硫键。
19.如权利要求18所述的异多聚体，所述第一转运蛋白多肽和所述第二转运蛋白多肽包含氨基酸残基至半胱氨酸的至少一个突变，以使得所述半胱氨酸与另一个转运蛋白多肽上的半胱氨酸残基形成二硫键。
20.如权利要求1-5和10-17中任一项所述的异多聚体，其中所述第一多肽构建体还包含两个第一货物多肽。
21.如权利要求1-5和10-17中任一项所述的异多聚体，其中所述至少一个第一货物多肽是抗原结合多肽构建体。
22.如权利要求21所述的异多聚体，其中所述抗原结合多肽构建体结合CD3、CD19、CD20、HER2或HER3。
23.如权利要求1-5和10-17中任一项所述的异多聚体，其中所述第二多肽构建体还包含至少一个第二货物多肽。
24.如权利要求23所述的异多聚体，其中所述第二多肽构建体还包含两个第二货物多肽。
25.如权利要求23所述的异多聚体，其中所述至少一个第二货物多肽是抗原结合多肽构建体。
26.如权利要求25所述的异多聚体，其中所述至少一个第二货物多肽是结合CD3、CD19、CD20、HER2或HER3的抗原结合多肽构建体。
27.如权利要求23所述的异多聚体，其中所述第一货物多肽是结合CD3的抗原结合多肽构建体，并且所述第二货物多肽是结合CD19或CD20的抗原结合多肽构建体。
28.如权利要求27所述的异多聚体，其中所述第一货物多肽是结合HER2的抗原结合多肽构建体，并且所述第二货物多肽是结合HER3的抗原结合多肽构建体。
29.如权利要求1-5和10-17中任一项所述的异多聚体，其中所述至少一个第一货物多肽通过接头融合至所述第一转运蛋白多肽。
30.如权利要求23所述的异多聚体，其中所述至少一个第二货物多肽通过接头融合至所述第二转运蛋白多肽。
31.如权利要求1-5和10-17中任一项所述的异多聚体，其中所述异多聚体结合FcRn。
32.如权利要求1、2或4中任一项所述的异多聚体，其中至少一个转运蛋白多肽是异白蛋白衍生物。
33.如权利要求1、2或4中任一项所述的异多聚体，其中所述转运蛋白多肽源自相同类型的白蛋白多肽。
34.如权利要求l、2或4中任一项所述的异多聚体，其中所述转运蛋白多肽源自不同类型的白蛋白多肽。
35.如权利要求1-5和10-17中任一项所述的异多聚体，其中所述第一多肽构建体包含至少一个结合靶抗原的第一货物多肽，并且所述第二多肽构建体还包含至少一个为毒素部分的第二货物多肽。
36.如权利要求1-5和10-17中任一项所述的异多聚体，其中所述第一多肽构建体包含至少一个结合靶抗原的第一货物多肽，并且其中所述靶抗原是IL-2受体α-链、淀粉样蛋白β、抗-EpCAM、抗-CD3、CD16、CD20、CD22、CD23、CD3、CD4、CD52、CD80、CTLA-4、EGFR、EpCAM、RSV的F蛋白、G250、糖蛋白IIB/IIla R、HER2、HER3、IGF1R、HSP90、IgE抗体、IL-12、IL-23、IL-lb、IL-5、IL-6、RANKL、TNFα、TNFR、TRAIL、VEGF-A、胰高血糖素受体、GLP受体以及LDL受体中的至少一个。
37.如权利要求1-5和10-17中任一项所述的异多聚体，其中至少一个货物多肽是酶、激素、治疗性多肽、抗原、化学毒素、放射性毒素、细胞因子或其变体或片段。
38.一种宿主细胞，其包含编码如权利要求1至37中任一项所述的异多聚体的核酸。
39.如权利要求38所述的宿主细胞，其中编码所述第一多肽构建体的所述核酸和编码所述第二多肽构建体的所述核酸存在于单一载体中。
40.如权利要求38所述的宿主细胞，其中编码所述第一多肽构建体的所述核酸和编码所述第二多肽构建体的所述核酸存在于单独的载体中。
41.一种药物组合物，其包含如权利要求1至37中任一项所述的异多聚体和佐剂。
42.有效量的如权利要求41所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
43.有效量的如权利要求1至37中任一项所述的异多聚体在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的用途。
44.有效量的如权利要求1至37中任一项所述的异多聚体在制备用于缩小肿瘤生长的药物中的用途。
45.如权利要求1-5和10-17中任一项所述的异多聚体，其中所述货物多肽的活性在融合至所述转运蛋白多肽之后相对于其未融合的形式选择性地改变。
46.如权利要求1-5和10-17中任一项所述的异多聚体，其中所述货物多肽的活性在融合至所述转运蛋白多肽之后相对于其未融合的形式选择性地减弱。
47.如权利要求l-5中任一项所述的异多聚体，其中在所述节段化位点处引入的C末端和N末端的至少一个与GGGGS肽序列融合。
48.如权利要求1-5中任一项所述的异多聚体，其中所述第一转运戴白多肽或所述第二转运蛋白多肽包含改善所述异多聚体的稳定性或半衰期的突变。
49.如权利要求1、2或4中任一项所述的异多聚体，其中
a)所述白蛋白多肽的第一区段和所述白蛋白多肽的第二区段来自哺乳动物白蛋白；
b)所述白蛋白多肽的第一区段和所述白蛋白多肽的第二区段来自非哺乳动物白蛋白；
c)所述白蛋白多肽的第一区段和所述白蛋白多肽的第二区段来自异白蛋白；或
d)所述白蛋白多肽的第一区段和所述白蛋白多肽的第二区段中的一个来自人血清白蛋白且另一个来自异白蛋白。
50.如权利要求19所述的异多聚体，其中
a)所述第一转运蛋白多肽包含A217C且所述第二转运蛋白多肽包含V343C；
b)所述第一转运蛋白多肽包含L331C且所述第二转运蛋白多肽包含A350C；
c)所述第一转运蛋白多肽包含A217C且所述第二转运蛋白多肽包含L346C；
d)所述第一转运蛋白多肽包含W214C且所述第二转运蛋白多肽包含V343C；
e)所述第一转运蛋白多肽包含A335C且所述第二转运蛋白多肽包含L346C；
f)所述第一转运蛋白多肽包含L198C且所述第二转运蛋白多肽包含V455C；
g)所述第一转运蛋白多肽包含A217C且所述第二转运蛋白多肽包含V335C；
h)所述第一转运蛋白多肽包含A217C且所述第二转运蛋白多肽包含L331C；
i)所述第一转运蛋白多肽包含L198C且所述第二转运蛋白多肽包含N458C；或
j)所述第一转运蛋白多肽包含A194C且所述第二转运蛋白多肽包含V455C。
51.一种或多种核酸，其编码如权利要求1-50中任一项所述的异多聚体。
52.一种制备如权利要求1至50中任一项所述的异多聚体的方法，包括用一种或多种如权利要求51所述的核酸转染宿主细胞并且在适于表达所述异多聚体的条件下培养所述宿主细胞。
53.一种由白蛋白制备异多聚体的方法，其通过节段化白蛋白多肽以使得0或1个氨基酸残基缺失来获得白蛋白区段，所述白蛋白区段自组装形成所述异多聚体。
54.如权利要求53所述的方法，其中进行所述节段化以使得所述异多聚体在所述多肽之间不包含共价键。
55.如权利要求53所述的方法，其中进行所述节段化以使得所述异多聚体在所述白蛋白区段之间包含至少一个共价键。
56.如权利要求53所述的方法，其还包括将接头序列与在所述节段化位点处引入的C末端和N末端融合的步骤。
57.一种异多聚体，其通过权利要求53-56中任一项所述的方法制备。
58.一种治疗性支架，其包含通过权利要求53-56中任一项所述的方法制备的异多聚体。
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