KR101874834B1 - 알부민 변이체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 모체 알부민과 비교하여 변경된 혈장내 반감기를 가지는 모체 알부민의 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그 알부민 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드 및 포합체에 관한 것이다.
Description
서열 목록에 대한 언급
본 출원은 본원에 참조로 삽입되는, 컴퓨터 판독가능 형태의 서열 목록을 포함한다.
기술분야
본 발명은 알부민, 그것의 단편 또는 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드와 비교하여 변화된 반감기를 가지는 알부민 변이체 또는 그것의 단편 또는 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드에 관한 것이다.
알부민은 포유류의 혈장에서 자연적으로 발견되는 단백질로, 혈장에서 가장 풍부한 단백질이다. 그것의 중요한 역할은 혈액의 원하는 삼투압 유지와 혈류 중의 다양한 물질의 수송이다.
알부민은 사람, 돼지, 마우스, 쥐, 토끼 및 염소를 포함하는 많은 종에서 특성이 확인되었고, 고도의 서열 및 구조적 상동성을 공유한다.
알부민은 생체 내에서 그것의 수용체인 신생 Fc 수용체 (FcRn) "Brambell"에 결합하고, 이 상호작용은 알부민의 혈장 내 반감기에 중요한 것으로 알려져 있다. FcRn은 많은 세포 및 조직 유형에서 발현되는 막 결합 단백질이다. FcRn은 세포내 분해로부터 알부민을 지키는 것으로 밝혀졌다 (Roopenian D.C. and Akilesh, S. (2007), Nat . Rev . Immunol 7, 715-725). FcRn은 사람과 같은 포유류에서 혈청 중의 IgG와 알부민을 고수준으로 유지하는 데 기여하는 이중기능성 분자이다.
FcRn-면역글로불린 (IgG) 상호작용은 이미 선행 기술에서 특성확인된 반면, FcRn-알부민 상호작용에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 주요 FcRn 결합 부위는 DIII (381-585) 내에 위치한다 (Andersen et al (2010), Clinical Biochemistry 43, 367-372). 데이터는 IgG와 알부민이 FcRn 상의 구별되는 부위에 협조적이지 않게 결합하는 것을 나타낸다 (Andersen et al. (2006), Eur J. Immunol . 36, 3044-3051; Chaudhury et al (2006), Biochemistry 45, 4983-4990).
마우스 FcRn은 마우스와 사람으로부터의 IgG에 결합하는 한편, 사람 FcRn은 보다 차별적인 것으로 알려져 있다 (Ober et al. (2001) Int . Immunol . 13, 1551-1559). 앤더슨 등은 사람 및 마우스 FcRn의 각 마우스 및 사람 알부민 (모든 가능한 조합)에 대한 친화성을 설명하였다 (Andersen et al. (2010) Journal of Biological Chemistry 285(7):4826-36). 생리적 pH에서 어느 하나의 종으로부터의 알부민은 어느 하나의 수용체에 대해 결합하지 않는 것으로 관찰되었다. 산성 pH에서, 결합 친화성의 100배 차이가 관찰되었다. 모든 경우에 두 가지 수용체에 대한 어느 한 종으로부터의 알부민과 IgG의 결합은 부가적이었다.
사람 혈청 알부민 (HSA)은 585 아미노산의 폴리펩티드로서 특성확인이 잘 되어 있고, 그 서열은 문헌에서 찾아볼 수 있다 (Peters, T., Jr. (1996) All about Albumin: Biochemistry , Genetics and Medical , Applications pp10, Academic Press, Inc., Orlando (ISBN 0-12-552110-3). 그것은 그것의 수용체 FcRn에 대해 특징적인 결합을 가지고, pH 7.4가 아닌 pH 6.0에서 결합한다.
HSA의 혈장 내 반감기는 대략 19일인 것으로 밝혀졌다. 더 낮은 혈장 내 반감기를 나타내는, 치환 D494N을 가지는 천연 변이체가 확인되었다 (Peach, R.J. and Brennan, S. O., (1991) Biochim Biophys Acta. 1097:49-54). 이 치환으로 이변이체에 N-글리코실화 부위가 생성되었는데, 그것은 야생형 알부민에는 존재하지 않는다. 글리코실화 또는 아미노산 변화가 혈장 내 반감기의 변화에 기여하는지의 여부에 대해서는 알려져 있지 않다.
알부민은 긴 혈장 내 반감기를 가지고 있고, 이런 특성 때문에 약물 전달에 사용되는 것이 제안되었다. 알부민은 약제학적으로 유익한 화합물에 포합되어 있고 (WO 2000/69902A), 그 포합체는 알부민의 긴 혈장 내 반감기를 유지하는 것으로 밝혀졌다. 그 결과의 포합체의 혈장 내 반감기는 일반적으로 유익한 치료적 화합물 단독의 혈장 내 반감기보다 상당히 더 길다.
나아가 알부민은 치료적으로 유익한 펩티드에 융합되었고 (WO 2001/79271 A 및 WO 2003/59934 A), 그 결과 전형적으로 융합물은 치료적으로 유익한 펩티드의 활성과 치료적으로 유익한 펩티드 단독의 혈장 내 반감기보다 상당히 더 긴 혈장 내 반감기를 가질 수 있다.
오타기리 등은 77개의 알부민 변이체가 알려져 있고, 그 중 25개가 도메인 III에서 발견된다고 개시하였다 (Otagiri et al (2009), Biol. Pharm, Bull. 32(4), 527-534). 카르복시 말단에서 마지막 175 아미노산이 결핍되어 있는 천연 변이체는 반감기가 감소된 것으로 나타났다 (Andersen et al (2010), Clinical Biochemistry 43, 367-372). 이와오 등은 자연 발생적인 사람 알부민 변이체의 반감기를 마우스 모델을 사용하여 연구하였고, 그 결과 K541E와 K560E의 반감기가 감소되었고, E501K와 E570K의 반감기는 증가되었으며, K573E의 반감기에는 거의 아무런 영향이 없었음을 발견하였다 (Iwao et al. (2007) B.B.A. Proteins and Proteomics 1774, 1582-1590).
갈리아노 등은 천연 변이체 E505K를 개시하였다 (Galliano et al (1993) Biochim. Biophys. Acta 1225, 27-32). 민치오티 등은 천연 변이체 K536E를 개시하였다 (Minchiotti et al. (1990)). 민치오티 등은 천연 변이체 K574N을 개시하였다 (Minchiotti et al (1987) Biochim. Biophys. Acta 916, 411-418). 타카하시 등은 천연 변이체 D550G를 개시하였다 (Takahashi et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4413-4417). 칼슨 등은 천연 변이체 D550A를 개시하였다 (Carlson et al (1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 8225-8229).
알부민은 많은 리간드와 결합하는 능력을 가지고 있고 리간드들은 알부민과 결합하게 된다 (결합한다). 이런 특성은 알부민과 비공유적으로 결합하는 능력을 가지고 있는 약물의 혈장 내 반감기를 연장시키기 위해 사용되었다. 이것은 또한 알부민 결합 특성을 거의 또는 전혀 가지고 있지 않은 약젝학적으로 유익한 화합물을 알부민 결합 특성을 가지고 있는 부분에 결합시킴으로써 이루어질 수 있다 (Kratz (2008), Journal of Controlled Release 132, 171-183).
알부민은 약제학적으로 유익한 화합물의 제제에 사용되는데, 이때 그런 제제는 예를 들면, 그것에 한정되는 것은 아니지만, 알부민의 나노 입자 또는 마이크로 입자일 수 있다. 이들 실례에서 약제학적으로 유익한 화합물 또는 화합물들의 혼합물의 전달은 그것의 수용체에 대한 알부민 친화성의 변경을 통해 유익해질 수 있고, 이때 유익한 화합물은 전달 수단에 대해 알부민과 회합하는 것으로 밝혀졌다.
어떤 것이 형성된 회합체 (예를 들면 그것에 한정되는 것은 아니지만 Levemir® (Kurtzhals P et al. Biochim. J. 1995, 312:725-731), 포합체 또는 융합 폴리펩티드의 혈장 내 반감기를 결정하는 것인지 명확하지는 않지만, 알부민과 선택된 약제학적으로 유익한 화합물/폴리펩티드의 조합의 결과인 것으로 보인다. 주어진 알부민 포합체, 회합체 또는 알부민 융합 폴리펩티드의 혈장 내 반감기를 조절할 수 있어서, 치료되도록 의도된 징후의 세부사항에 따라 특별한 약물을 디자인할 수 있도록 하기 위해, 회합, 포합 또는 융합의 성분에 의해 주어진 것보다 더 길거나 또는 더 짧은 혈장 내 반감기가 이루어질 수 있는 것이 바람직할 것이다.
알부민은 종양에서 축적되고 이화될 수 있는 것으로 알려져 있고, 또한 류머티스섬 관절염 환자의 염증이 생긴 관절에서 축적하는 것으로 알려져 있다 (Kratz (2008) Journal of Controlled Releases 132, 171-183). FcRn에 대한 증가된 친화성을 가지는 HSA 변이체는 약제학적으로 유익한 화합물의 전달에 유익할 것으로 예상된다.
문헌에 기재되어 있는 것과 같이 더 짧은 반감기 또는 제어된 혈청 약물동력학을 제공하기 위해 FcRn에 대한 결합력을 거의 갖지 않거나 없는 알부민의 변이체를 가지는 것이 또한 바람직할 것이다 (Kenanova et al (2009) J. Nucl . Med .; 50 (Supplement 2):1582).
발명의 개요
본 발명은 그것의 모체에 비하여 개선된 특성을 가지고 있는 원래의 알부민의 변이체를 제공한다. 특히 본 발명은 그것의 모체에 비하여 변경된 혈장 내 반감기를 가지는 모체 알부민의 변이체를 제공한다.
본 발명은 모체 알부민의 분리된 변이체 또는 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드에 관한 것으로, 그것은 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 위치 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584에 상응하는 하나 또는 그 이상의 (여러) 위치에서의 변경을 포함하며, 이때 변이체는 치환 D494N, E501K, K541E, D550G,A, K573E 또는 K574N을 가지는 SEQ ID NO:2로 구성되는 변이체는 아니다.
하나 또는 그 이상의 위치에서의 변경은 독립적으로 치환, 삽입 및 결실 중에서 선택될 수 있고, 그 중 치환이 바람직하다.
본 발명은 또한 변이체를 코드화하는 분리된 폴리뉴클레오티드; 그 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구성물, 벡터, 및 숙주 세포; 및 그 변이체를 생성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 그것의 단편과 유익한 치료적 부분을 포함하는 포합체 또는 회합체 또는 본 발명의 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드 및 융합 파트너 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 나아가 변이체 알부민, 그것의 단편, 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드 또는 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 포합체 또는 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 회합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 바람직하게는 약제학적 조성물이다.
본 발명은 나아가 변이체 알부민, 그것의 단편, 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 포합체 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 회합체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 이때 상기 변이체 알부민, 그것의 단편, 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 포합체 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 회합체는, HSA 또는 그것의 단편, HSA 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 HSA 또는 그것의 단편을 포함하는, HSA 또는 그것의 단편의 포합체 또는 회합체의 상응하는 혈장 내 반감기에 비교하여 변경된 혈장 내 반감기를 가진다.
도 1은 발현 플라스미드 pDB4082의 제한 지도를 도시한다.
도 2는 발현 플라스미드 pDB2305의 제한 지도를 도시한다.
도 3은 발현 플라스미드 pDB4005의 제한 지도를 도시한다.
도 4는 shFcRn에 대해 10μM 알부민이 주입된 SPR 센서그램을 도시한다. HSA (JTA)= Sigma-Aldrich로부터 얻어진 지방산 유리 HSA (A3782), HSA (Novozymes)= 상업적인 재조합 사람 혈청 알부민 (RECOMBUMIN).
도 5는 사람 혈청 알부민 (HSA) 변이체 (100-0.045 ㎍/ml)에 대한 shFcRn-GST의 ELISA 결합을 도시한다. pH 6.0 및 pH 7.4에서 WT, D494N, D494Q 및 D494A의 결합. pH 6.0 및 pH 7.4에서 WT, D494N, D494N/T496A 및 T496A의 결합. pH 6.0 및 pH 7.4에서 WT, E495Q 및 E495A의 결합.
도 6은 고정된 shFcRn (~4600 RU)에 대한 0.2μM HSA의 결합의 대표적인 센서그램을 도시한다. WT, D494N, D494Q, D494A, D494N/T496A 및 T496A.
도 7은 고정된 shFcRn (~1400 RU)에 대한 1μM HSA의 결합의 대표적인 센서그램을 도시한다. WT, D494N, D494Q, D494A, D494N/T496A 및 T496A.
도 8은 (A) 도 6 및 (B) 도 7에 도시된 것과 같은 2개의 독립적인 SPR 실험을 토대로 한, WT에 비교한 HSA 변이체의 상대적인 결합을 도시한다.
도 9는 다음의 ELISA를 도시한다: (A) pH 6.0에서, 사람, 당나귀, 소, 양, 염소 및 토끼로부터의 알부민에 대한 shFcRn의 결합. (B) pH 6.0에서, 기니아 피그, 햄스터, 쥐 및 닭으로부터의 알부민에 대한 shFcRn의 결합. (C) pH 7.4에서 사람, 당나귀, 소, 양, 염소 및 토끼로부터의 알부민에 대한 shFcRn의 결합. (D) pH 6.0에서, 기니아 피그, 햄스터, 쥐 및 닭으로부터의 알부민에 대한 shFcRn의 결합. (E) 상이한 알부민의 상대적인 결합. 사람 알부민의 shFcRn에 대한 상대적인 결합은 1.0으로서 규정된다. ELISA 값은 이중실험의 평균을 나타낸다.
도 10은 다음의 SPR을 나타낸다: pH 6.0 및 pH 7.4에서의 여러 종으로부터의 알부민에 대한 shFcRn-GST의 결합. 대표적인 센서그램은 다음과 같은 상이한 종: (A) 사람, (B) 당나귀, (C) 소, (D) 염소, (E) 양, (F) 토끼, (G) 개, (H) 기니아 피그, (I) 햄스터, (J) 쥐, (K) 마우스 및 (L) 닭으로부터의 0.5μM 알부민의 결합을 나타낸다. 알부민 변이체는 고정된 GST-태그 shFcRn (~2100 RU)에 대해 주입되었다. 주입은 25℃에서 40㎕/분의 속도로 수행되었다.
도 11은 야생형 HSA와 비교된 선택된 HSA 돌연변이체의 SPR 센서그램을 도시한다. 20μM의 (A) WT 및 P499A, (B) WT 및 K500A, (C) WT 및 K536A, (D) WT 및 P537A 및 (E) WT 및 K538A 및 (F) WT 및 K537A가 고정된 shFcRn에 대해 pH 6.0에서 주입되었다 (~1500 RU).
도 12는 HSA와 비교된 선택된 HSA 돌연변이체의 SPR 센서그램을 도시한다. 10μM의 (A) WT 및 K573A, (B) WT 및 K573C, (C) WT 및 K573F, (D) WT 및 K573G 및 (E) WT 및 K573L 및 (F) WT 및 K573M, (G) WT 및 K573Q, (H) WT 및 K573R 및 (I) WT 및 K573T 및 (J) WT 및 K573V가 고정된 shFcRn에 대해 pH 5.5 및 pH 7.4에서 주입되었다. 주입은 25℃에서 80㎕/분의 유속으로 수행되었다.
도 13은 야생형 HSA와 비교된 선택된 HSA 돌연변이체의 SPR 센서그램을 도시한다. 10μM의 (A) WT 및 K573D, (B) WT 및 K573E, (C) WT 및 K573H, (D) WT 및 K573I 및 (E) WT 및 K573N 및 (F) WT 및 K573P, (G) WT 및 K573S, (H) WT 및 K573* 및 (I) WT 및 K573W (J) WT 및 K573Y가 고정된 shFcRn에 대해 pH 5.5 및 pH 7.4에서 주입되었다. 주입은 25℃에서 80㎕/분의 유속으로 수행되었다.
도 14는 야생형 HSA와 비교된 선택된 HSA 돌연변이체의 SPR 센서그램을 도시한다. 10μM의 (A) WT 및 E492G+K538H+K541N+E542D, (B) WT 및 E492T+N503K+K541A, (C) WT 및 E492P+N503K+K541G+E542P, (D) WT 및 E492H+E501P+N503H+E505D+T506S+T540S+K541E 및 (E) WT 및 A490D+E492T+V493L+E501P+N503D+A504E+E505K+T506F+K541D 및 (F) WT 및 E492G+V493P+K538H+K541N+E542D가 고정된 shFcRn에 대해 pH 6.0에서 주입되었다. 주입은 25℃에서 80㎕/분의 유속으로 수행되었다.
도 15는 야생형 HSA에 비교된 HSA 돌연변이체의 SPR 센서그램을 도시한다. 20μM의 (A) WT, (B) H440Q, (C) H464Q 및 (D) H535Q가 고정된 shFcRn에 대해 pH 6.0에서 주입되었다. 주입은 25℃에서 80㎕/분의 유속으로 수행되었다.
도 16은 야생형 HSA에 비교된 HSA 돌연변이 K500E의 SPR 센서그램을 도시한다. 10μM의 HSA 돌연변이 K500E가 고정된 shFcRn에 대해 pH 5.75에서 주입되었다. 주입은 25℃에서 30㎕/분의 유속으로 수행되었다.
도 17은 발현 플라스미드 pDB3017의 제한 지도를 도시한다.
도 18은 발현 플라스미드 pDB3021의 제한 지도를 도시한다.
도 19는 발현 플라스미드 pDB3056의 제한 지도를 도시한다.
도 20은 발현 플라스미드 pDB3165의 제한 지도를 도시한다.
도 21은 발현 플라스미드 pDB4172의 제한 지도를 도시한다.
도 22는 발현 플라스미드 pDB4267의 제한 지도를 도시한다.
도 23은 발현 플라스미드 pDB4285의 제한 지도를 도시한다.
도 24는 sHFcRn 분석을 위한 WT HSA 및 돌연변이 K573P HRP 포합체의 GP-HPLC 크로마토그램을 도시한다. 25μL의 주입은 물질 및 방법에서 설명되는 것과 같이 TSK G3000SWXL 칼럼 (Tosoh Bioscience) 위에서 이루어졌다.
도 25는 플루오레신 포합된 알부민의 육안 (A) 및 자외선 (B) 검출 후의 SDS PAGE 분리를 도시하다. HSA::F5M (레인 1), K573P::F5M (레인 2) 및 rHA 표준 (레인 3).
도 26은 HSA 변이체의 shFcRn 결합 특성을 도시한다. 10μM의 WT rHA 및 E492T (A), WT rHA 및 D494N/E495Q/T496A (B), WT rHA 및 N503D (C), WT rHA 및 N503K (D), WT rHA 및 E492T/N503D (E), WT rHA 및 E495Q/T496A (F), WT rHA 및 K538H (G), WT rHA 및 E492D (H)가 고정된 shFcRn에 대해 pH 5.5에서 주입되었다.
도 27은 HSA 변이체의 shFcRn 결합 특성을 도시한다. 10μM의 WT rHA 및 K541A (I) 및 WT rHA 및 K541N (J)가 고정된 shFcRn에 대해 pH 5.5에서 주입되었다.
도 28은 고정된 HSA (~2500 RU) 상에 pH 6.0에서 shFcRn (100nM)이 단독으로 또는 상이한 양의 HSA K573A 및 K573P와 사전 인큐베이션되어 주입됨으로써 측정된 K573A 및 K573P의 경합성 결합을 도시한다.
도 29는 고정된 HSA (~2500 RU) 상에 pH 6.0에서 shFcRn (100nM)이 단독으로 또는 상이한 양의 HSA-FLAG와 함께 주입됨으로써 측정된 HSA-FLAG 변이체의 경합성 결합을 도시한다.
도 30은 고정된 HSA (~2500 RU) 상에 pH 6.0에서 shFcRn (100nM)이 단독으로 또는 상이한 양의 HSA-IL 1Ra와 함께 주입됨으로써 측정된 HSA-IL 1Ra 변이체의 경합성 결합을 도시한다.
도 31은 고정된 HSA (~2500 RU) 상에 pH 6.0에서 shFcRn (100nM)이 단독으로 또는 상이한 양의 (A) scFv-HSA-FLAG 변이체 또는 (B) HSA-scFv-FLAG 변이체와 함께 주입됨으로써 측정된 scFv-융합 HSA 변이체의 경합성 결합을 도시한다.
도 32는 shFcRn에 대한 HSA, 단일, 이중 및 삼중 돌연변이 변이체의 결합을 도시한다. 10μM의 각 HSA 변이체는 고정된 shFcRn에 pH 5.5 또는 pH 7.4에서 주입되었다.
도 2는 발현 플라스미드 pDB2305의 제한 지도를 도시한다.
도 3은 발현 플라스미드 pDB4005의 제한 지도를 도시한다.
도 4는 shFcRn에 대해 10μM 알부민이 주입된 SPR 센서그램을 도시한다. HSA (JTA)= Sigma-Aldrich로부터 얻어진 지방산 유리 HSA (A3782), HSA (Novozymes)= 상업적인 재조합 사람 혈청 알부민 (RECOMBUMIN).
도 5는 사람 혈청 알부민 (HSA) 변이체 (100-0.045 ㎍/ml)에 대한 shFcRn-GST의 ELISA 결합을 도시한다. pH 6.0 및 pH 7.4에서 WT, D494N, D494Q 및 D494A의 결합. pH 6.0 및 pH 7.4에서 WT, D494N, D494N/T496A 및 T496A의 결합. pH 6.0 및 pH 7.4에서 WT, E495Q 및 E495A의 결합.
도 6은 고정된 shFcRn (~4600 RU)에 대한 0.2μM HSA의 결합의 대표적인 센서그램을 도시한다. WT, D494N, D494Q, D494A, D494N/T496A 및 T496A.
도 7은 고정된 shFcRn (~1400 RU)에 대한 1μM HSA의 결합의 대표적인 센서그램을 도시한다. WT, D494N, D494Q, D494A, D494N/T496A 및 T496A.
도 8은 (A) 도 6 및 (B) 도 7에 도시된 것과 같은 2개의 독립적인 SPR 실험을 토대로 한, WT에 비교한 HSA 변이체의 상대적인 결합을 도시한다.
도 9는 다음의 ELISA를 도시한다: (A) pH 6.0에서, 사람, 당나귀, 소, 양, 염소 및 토끼로부터의 알부민에 대한 shFcRn의 결합. (B) pH 6.0에서, 기니아 피그, 햄스터, 쥐 및 닭으로부터의 알부민에 대한 shFcRn의 결합. (C) pH 7.4에서 사람, 당나귀, 소, 양, 염소 및 토끼로부터의 알부민에 대한 shFcRn의 결합. (D) pH 6.0에서, 기니아 피그, 햄스터, 쥐 및 닭으로부터의 알부민에 대한 shFcRn의 결합. (E) 상이한 알부민의 상대적인 결합. 사람 알부민의 shFcRn에 대한 상대적인 결합은 1.0으로서 규정된다. ELISA 값은 이중실험의 평균을 나타낸다.
도 10은 다음의 SPR을 나타낸다: pH 6.0 및 pH 7.4에서의 여러 종으로부터의 알부민에 대한 shFcRn-GST의 결합. 대표적인 센서그램은 다음과 같은 상이한 종: (A) 사람, (B) 당나귀, (C) 소, (D) 염소, (E) 양, (F) 토끼, (G) 개, (H) 기니아 피그, (I) 햄스터, (J) 쥐, (K) 마우스 및 (L) 닭으로부터의 0.5μM 알부민의 결합을 나타낸다. 알부민 변이체는 고정된 GST-태그 shFcRn (~2100 RU)에 대해 주입되었다. 주입은 25℃에서 40㎕/분의 속도로 수행되었다.
도 11은 야생형 HSA와 비교된 선택된 HSA 돌연변이체의 SPR 센서그램을 도시한다. 20μM의 (A) WT 및 P499A, (B) WT 및 K500A, (C) WT 및 K536A, (D) WT 및 P537A 및 (E) WT 및 K538A 및 (F) WT 및 K537A가 고정된 shFcRn에 대해 pH 6.0에서 주입되었다 (~1500 RU).
도 12는 HSA와 비교된 선택된 HSA 돌연변이체의 SPR 센서그램을 도시한다. 10μM의 (A) WT 및 K573A, (B) WT 및 K573C, (C) WT 및 K573F, (D) WT 및 K573G 및 (E) WT 및 K573L 및 (F) WT 및 K573M, (G) WT 및 K573Q, (H) WT 및 K573R 및 (I) WT 및 K573T 및 (J) WT 및 K573V가 고정된 shFcRn에 대해 pH 5.5 및 pH 7.4에서 주입되었다. 주입은 25℃에서 80㎕/분의 유속으로 수행되었다.
도 13은 야생형 HSA와 비교된 선택된 HSA 돌연변이체의 SPR 센서그램을 도시한다. 10μM의 (A) WT 및 K573D, (B) WT 및 K573E, (C) WT 및 K573H, (D) WT 및 K573I 및 (E) WT 및 K573N 및 (F) WT 및 K573P, (G) WT 및 K573S, (H) WT 및 K573* 및 (I) WT 및 K573W (J) WT 및 K573Y가 고정된 shFcRn에 대해 pH 5.5 및 pH 7.4에서 주입되었다. 주입은 25℃에서 80㎕/분의 유속으로 수행되었다.
도 14는 야생형 HSA와 비교된 선택된 HSA 돌연변이체의 SPR 센서그램을 도시한다. 10μM의 (A) WT 및 E492G+K538H+K541N+E542D, (B) WT 및 E492T+N503K+K541A, (C) WT 및 E492P+N503K+K541G+E542P, (D) WT 및 E492H+E501P+N503H+E505D+T506S+T540S+K541E 및 (E) WT 및 A490D+E492T+V493L+E501P+N503D+A504E+E505K+T506F+K541D 및 (F) WT 및 E492G+V493P+K538H+K541N+E542D가 고정된 shFcRn에 대해 pH 6.0에서 주입되었다. 주입은 25℃에서 80㎕/분의 유속으로 수행되었다.
도 15는 야생형 HSA에 비교된 HSA 돌연변이체의 SPR 센서그램을 도시한다. 20μM의 (A) WT, (B) H440Q, (C) H464Q 및 (D) H535Q가 고정된 shFcRn에 대해 pH 6.0에서 주입되었다. 주입은 25℃에서 80㎕/분의 유속으로 수행되었다.
도 16은 야생형 HSA에 비교된 HSA 돌연변이 K500E의 SPR 센서그램을 도시한다. 10μM의 HSA 돌연변이 K500E가 고정된 shFcRn에 대해 pH 5.75에서 주입되었다. 주입은 25℃에서 30㎕/분의 유속으로 수행되었다.
도 17은 발현 플라스미드 pDB3017의 제한 지도를 도시한다.
도 18은 발현 플라스미드 pDB3021의 제한 지도를 도시한다.
도 19는 발현 플라스미드 pDB3056의 제한 지도를 도시한다.
도 20은 발현 플라스미드 pDB3165의 제한 지도를 도시한다.
도 21은 발현 플라스미드 pDB4172의 제한 지도를 도시한다.
도 22는 발현 플라스미드 pDB4267의 제한 지도를 도시한다.
도 23은 발현 플라스미드 pDB4285의 제한 지도를 도시한다.
도 24는 sHFcRn 분석을 위한 WT HSA 및 돌연변이 K573P HRP 포합체의 GP-HPLC 크로마토그램을 도시한다. 25μL의 주입은 물질 및 방법에서 설명되는 것과 같이 TSK G3000SWXL 칼럼 (Tosoh Bioscience) 위에서 이루어졌다.
도 25는 플루오레신 포합된 알부민의 육안 (A) 및 자외선 (B) 검출 후의 SDS PAGE 분리를 도시하다. HSA::F5M (레인 1), K573P::F5M (레인 2) 및 rHA 표준 (레인 3).
도 26은 HSA 변이체의 shFcRn 결합 특성을 도시한다. 10μM의 WT rHA 및 E492T (A), WT rHA 및 D494N/E495Q/T496A (B), WT rHA 및 N503D (C), WT rHA 및 N503K (D), WT rHA 및 E492T/N503D (E), WT rHA 및 E495Q/T496A (F), WT rHA 및 K538H (G), WT rHA 및 E492D (H)가 고정된 shFcRn에 대해 pH 5.5에서 주입되었다.
도 27은 HSA 변이체의 shFcRn 결합 특성을 도시한다. 10μM의 WT rHA 및 K541A (I) 및 WT rHA 및 K541N (J)가 고정된 shFcRn에 대해 pH 5.5에서 주입되었다.
도 28은 고정된 HSA (~2500 RU) 상에 pH 6.0에서 shFcRn (100nM)이 단독으로 또는 상이한 양의 HSA K573A 및 K573P와 사전 인큐베이션되어 주입됨으로써 측정된 K573A 및 K573P의 경합성 결합을 도시한다.
도 29는 고정된 HSA (~2500 RU) 상에 pH 6.0에서 shFcRn (100nM)이 단독으로 또는 상이한 양의 HSA-FLAG와 함께 주입됨으로써 측정된 HSA-FLAG 변이체의 경합성 결합을 도시한다.
도 30은 고정된 HSA (~2500 RU) 상에 pH 6.0에서 shFcRn (100nM)이 단독으로 또는 상이한 양의 HSA-IL 1Ra와 함께 주입됨으로써 측정된 HSA-IL 1Ra 변이체의 경합성 결합을 도시한다.
도 31은 고정된 HSA (~2500 RU) 상에 pH 6.0에서 shFcRn (100nM)이 단독으로 또는 상이한 양의 (A) scFv-HSA-FLAG 변이체 또는 (B) HSA-scFv-FLAG 변이체와 함께 주입됨으로써 측정된 scFv-융합 HSA 변이체의 경합성 결합을 도시한다.
도 32는 shFcRn에 대한 HSA, 단일, 이중 및 삼중 돌연변이 변이체의 결합을 도시한다. 10μM의 각 HSA 변이체는 고정된 shFcRn에 pH 5.5 또는 pH 7.4에서 주입되었다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 모체 알부민의 분리된 변이체 또는 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드에 관한 것으로, 그것은 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 위치 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584에 상응하는 하나 또는 그 이상의 (여러) 위치에서의 변경을 포함하며, 이때 변이체는 치환 D494N, E501K, K541E, D550G,A, K573E 또는 K574N을 가지는 SEQ ID NO:2로 구성되는 변이체는 아니다.
하나 또는 그 이상의 위치에서의 변경은 독립적으로 치환, 삽입 및 결실 중에서 선택될 수 있고, 그 중 치환이 바람직하다.
정의
변이체: 용어 "변이체"는 하나 또는 그 이상의 (여러) 위치에서 하나 또는 그 이상의 변경(들), 즉 치환, 삽입, 및/또는 결실에 의해 모체 알부민으로부터 유도된 폴리펩티드를 의미한다. 치환은 한 위치를 차지하는 아미노산의 상이한 아미노산으로의 대체를 의미하고; 결실은 한 위치를 차지하는 아미노산의 제거를 의미하며; 삽입은 한 위치를 차지하는 아미노산 옆에 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산을 첨가하는 것을 의미한다.
돌연변이: 용어 "돌연변이"는 변이체를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
야생형 알부민: 용어 "야생형" (WT) 알부민은 동물 또는 사람에서 자연적으로 발견되는 것과 동일한 아미노산 서열을 가지는 알부민을 의미한다.
모체 또는 모체 알부민: 용어 "모체" 또는 "모체 알부민"은 본 발명의 알부민 변이체를 생성하기 위하여 인공적으로 변경이 이루어지는 알부민을 의미한다. 모체는 자연발생적인 (야생형) 폴리펩티드 또는 그것의 대립형질, 또는 때로 그것의 변이체일 수 있다.
FcRn 및 shFcRn: 용어 "FcRn"은 사람 신생 Fc 수용체 (FcRn)을 의미한다. shFcRn은 FcRn의 가용성 재조합 형태이다.
smFcRn: 용어 "smFcRn"은 마우스 신생 Fc 수용체의 가용성 재조합 형태이다.
분리된 변이체: 용어 "분리된 변이체"는 인공적으로 변형되고, 그것과 함께 자연적으로 발생하는 최소한 한 성분으로부터 완전히 또는 부분적으로 분리된 변이체를 의미한다. 한 측면으로, 변이체는 SDS-PAGE 또는 GP-HPLC에 의해 측정되는 바, 최소한 1% 순수, 예컨대 최소한 5% 순수, 최소한 10% 순수, 최소한 20% 순수, 최소한 40% 순수, 최소한 60% 순수, 최소한 80% 순수, 최소한 90% 순수하다.
실질적으로 순수한 변이체: 용어 "실질적으로 순수한 변이체"는 그것이 자연적으로 또는 재조합적으로 결합되는 다른 폴리펩티드 물질의 최대 10 중량%, 최대 8 중량%, 최대 6 중량%, 최대 5 중량%, 최대 4 중량%, 최대 3 중량%, 최대 2 중량%, 최대 1 중량%, 최대 0.5 중량%를 함유하는 제제를 의미한다. 바람직하게는 변이체는 제제에 존재하는 총 폴리펩티드 물질의 중량의 최소한 92% 순수한데, 예컨대 최소한 94%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 최소한 99%, 최소한 99.5%, 그리고 최소한 100% 순수하다. 본 발명의 변이체는 바람직하게는 실질적으로 순수한 형태이다. 이것은 예를 들면 잘 알려져 있는 재조합 방법에 의해, 그리고 정제 방법에 의해 변이체를 제조함으로써 이루어질 수 있다.
성숙한 폴리펩티드: 용어 "성숙한 폴리펩티드"는 번역 및 어떠한 후-번역 변형, 예컨대 N-말단 프로세싱, C-말단 절단, 글리코실화, 인산화 등과 같은 변형 후의 최종 형태의 폴리펩티드를 의미한다. 한 측면으로 성숙한 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 585이고, 어떠한 후-번역 변형을 포함한다.
성숙한 폴리펩티드 코딩 서열: 용어 "성숙한 폴리펩티드 코딩 서열"은 성숙한 알부민 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 한 측면으로 성숙한 폴리펩티드 코딩 서열은 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 1 내지 1758이다.
서열 동일성: 두 개의 아미노산 서열 사이 또는 두 개의 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성은 매개변수 "서열 동일성"에 의해 설명된다.
본 발명의 목적에 대해, 두 개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성 정도는 EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet . 16:276-277), 바람직하게는 버전 3.0.0 또는 그 이후 버전으로 실행되는 것과 같은 니들만-분쉬 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol . Biol . 48:443-453)을 사용하여 측정된다. 사용된 임의의 매개변수는 10의 갭 오픈 페널티, 0.5의 갭 연장 페널티, 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. 니들 표지된 "가장 긴 동일성"의 결과 (-nobrief option을 사용하여 얻어짐)는 % 동일성으로서 사용되고, 다음과 같이 계산된다: (동일한 잔기 × 100)/(배열 길이 - 배열의 갭의 총 수).
본 발명의 목적에 대해, 두 개의 데옥시리보뉴클레오티드 사이의 서열 동일성 정도는 EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, 상기 동일), 바람직하게는 버전 3.0.0 또는 그 이후 버전으로 실행되는 것과 같은 니들만-분쉬 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, 상기 동일)을 사용하여 측정된다. 사용된 임의의 매개변수는 10의 갭 오픈 페널티, 0.5의 갭 연장 페널티, 및 EBLOSUM62 (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. 니들 표지된 "가장 긴 동일성"의 결과 (-nobrief option을 사용하여 얻어짐)는 % 동일성으로서 사용되고, 다음과 같이 계산된다:
(동일한 데옥시리보뉴클레오티드 × 100)/(배열 길이 - 배열의 갭의 총 수).
단편: 용어 "단편"은 FcRn에 결합하는 능력을 보유한 알부민 및/또는 알부민의 내부 영역의 아미노 및/또는 카르복실 말단으로부터 결실된 하나 또는 그 이상의 (여러) 아미노산을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 단편은 HSA로부터 유도된 하나의 연속된 서열로 구성되거나 HSA로부터 유도된 둘 또는 그 이상의 서열들을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르는 단편은 대략 20 이상의 크기의 아미노산 잔기, 바람직하게는 30 이상의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 40 이상의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 50 이상의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 75 이상의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 100 이상의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 200 이상의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 300 이상의 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게는 400 이상의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 500 이상의 아미노산 잔기를 가진다.
대립형질 변이체: 용어 "대립형질 변이체"는 동일한 염색체 유전자좌를 차지하는 유전자의 둘 또는 그 이상의 대체 형태 중 어느 것을 의미한다. 대립형질 변이는 돌연변이를 통해 자연적으로 일어나고, 집단 내에서 다형태를 유발할 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵이거나 (코드화된 폴리펩티드에 변화가 없음) 또는 변경된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코드화할 수 있다. 폴리펩티드의 대립형질 변이체는 유전자의 대립형질 변이체에 의해 코드화된 폴리펩티드이다.
코딩 서열: 용어 "코딩 서열"은 그것의 번역된 폴리펩티드 생성물의 아미노산 서열을 직접 특정하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 코딩 서열의 경계는 통상적으로 ATG 출발 코돈 또는 GTG 및 TTG와 같은 대체 출발 코돈으로 시작하고, TAA, TAG, 및 TGA와 같은 중지 코돈으로 끝나는 오픈 리딩 프레임에 의해 일반적으로 측정된다. 코딩 서열은 DNA, cDNA, 합성, 또는 재조합 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
cDNA: 용어 "cDNA"는 진핵 세포로부터 얻어지는 성숙하고 스플라이스된 mRNA 분자로부터 역전사에 의해 제조될 수 있는 DNA 분자를 의미한다. cDNA는 상응하는 게놈 DNA에 존재할 수 있는 인트론 서열이 결핍되어 있다. 초기의 일차 RNA 전사물은 mRNA의 전구체이고, 그것은 스플라이싱을 포함하는 일련의 단계를 통하여 프로세스된 후 성숙한 스플라이스된 mRNA로서 나타난다.
핵산 구성물: 용어 "핵산 구성물"은 단일- 또는 이중-가닥의 핵산 분자를 의미하는 것으로, 자연 발생하는 유전자로부터 분리되거나, 또는 그렇지 않다면 자연에 존재하지 않을 방식으로 핵산 절편을 함유하도록 변형되거나 합성된 것이다. 용어 핵산 구성물은 핵산 구성물이 본 발명의 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 서열을 함유한 때에는 용어 "발현 카세트"와 동의어이다.
조절 서열: 용어 "조절 서열"은 본 발명의 변이체를 코드화하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 모든 성분을 의미한다. 각각의 조절 서열은 천연이거나 또는 변이체를 코드화하는 폴리뉴클레오티드에 외래적이거나 또는 상호간에 천연이거나 외래의 것일 수 있다. 그런 조절 서열로는, 그것에 한정되는 것은 아니지만, 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열, 및 전사 터미네이터가 있다. 최소한으로 조절 서열은 프로모터, 전사 및 번역 중지 신호를 포함한다. 조절 서열에는 변이체를 코드화하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역 내에 있는 조절 서열의 결찰을 촉진하는 특이한 제한 부위를 도입할 목적에 대해 링커가 제공될 수 있다.
작동가능하게 연결된: 용어 "작동가능하게 연결된"은 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 특정하도록 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열과 관련하여 적절한 위치에 조절 서열이 위치하는 형태를 의미한다.
발현: 용어 "발현"은 이를테면 그것에 한정되는 것은 아니지만 전사, 후-전사 변형, 번역, 후-번역 변형 및 분비를 포함하는 변이체의 제조에 포함되는 어떠한 단계를 포함한다.
발현 벡터: 용어 "발현 벡터"는 변이체를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 선형 또는 원형 DNA 분자를 의미하고, 그것의 발현을 제공하는 추가의 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다.
숙주 세포: 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구성물 또는 발현 벡터로 형질전환, 형질유도 등을 할 수 있는 어떠한 세포 유형을 의미한다. 용어 "숙주 세포"는 복제 중에 일어나는 돌연변이로 인해 원래의 세포와 동일하지 않은 원래의 세포의 어떠한 자손을 포함한다.
혈장 내 반감기: 혈장내 반감기는 이상적으로 적당한 개체의 생체 내에서 측정된다. 그러나 그것은 시간 소모적이고 값비싸며 동물 또는 사람에게서 실험을 행하는 것과 관련된 불가피하고 윤리적인 문제가 있기 때문에, 혈장 내 반감기가 연장되는지 또는 감소되는 지를 측정하기 위한 시험관 내 분석을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 알부민의 수용체 FcRn에 대한 결합은 혈장 내 반감기에 중요하고, 수용체 결합과 혈장 내 반감기 사이의 상관관계는 알부민의 그것의 수용체에 대한 보다 높은 친화성이 더 긴 혈장 내 반감기를 유발한다는 것이다. 그러므로 본 발명에 대해 알부민의 FcRn에 대한 보다 큰 친화성은 증가된 혈장 내 반감기를 나타내고, 알부민의 그것의 수용체에 대한 보다 낮은 친화성은 감소된 혈장 내 반감기를 나타내는 것으로 간주된다.
본 출원서와 특허청구범위에서, 알부민의 그것의 수용체 FcRn에 대한 결합은 용어 친화성과 "더 강한" 또는 "더 약한" 표현을 사용하여 설명된다. 그러므로 FcRn에 대해 HSA보다 더 큰 친화성을 가지는 분자는 HSA보다 더 강력하게 FcRn에 결합하고, FcRn에 대해 HSA보다 낮은 친화성을 가지는 분자는 HSA보다 더 약하게 FcRn에 결합하는 것으로 여겨지는 것으로 인지되어야 한다.
용어 "더 긴 혈장 내 반감기" 또는 "더 짧은 혈장 내 반감기" 및 유사한 표현은 상응하는 원래 알부민 분자와 관련이 있을 것으로 인지된다. 그러므로 본 발명의 변이체 알부민과 관련하여 더 긴 혈장 내 반감기는 변이체가 SEQ ID NO:2의 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584에 상응하는 위치에서의 변경(들)을 제외한 동일한 서열을 가지는 상응하는 알부민보다 더 긴 혈장 내 반감기를 가지는 것을 의미한다.
변이체의
지정을 위한 관례
본 발명의 목적에 대해, SEQ ID NO:2에 나타낸 성숙한 폴리펩티드는 다른 알부민의 상응하는 아미노산 잔기를 측정하기 위해 사용된다. 다른 알부민의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2에 개시된 성숙한 폴리펩티드와 일렬 배열되고, 그것을 토대로, SEQ ID NO:2에 개시된 성숙한 폴리펩티드의 어떠한 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 위치 번호는 EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet . 16:276-277), 바람직하게는 버전 3.0.0 또는 그 이후 버전으로 실행되는 것과 같은 니들만-분쉬 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol . Biol . 48:443-453)을 사용하여 측정된다.
다른 알부민의 상응하는 아미노산 잔기의 확인은 "ClustalW"를 사용하여 다중 폴리펩티드 서열의 일렬배열에 의해 확인될 수 있다 (Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23:2947-2948).
다른 폴리펩티드 (또는 단백질)이 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드로부터 나누어져서 전통적인 서열-기초 비교가 그것들의 관계를 검출하지 못할 때 (Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol . Biol . 295:613-615), 다른 서열 쌍별 비교 알고리즘이 사용될 수 있다. 서열-기초 연구의 보다 큰 민감성은 데이터베이스를 연구하기 위하여 폴리펩티드 패밀리 (프로필)의 확률적 표현을 활용하는 연구 프로그램을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들어 PSI-BLAST 프로그램은 반복적인 데이터베이스 연구 과정을 통한 프로필을 생성하고 희박한 상동체를 검출할 수 있다 (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res . 25:3389-3402). 더 큰 민감성이라도 만약 폴리펩티드에 대한 패밀리 또는 슈퍼패밀리가 단백질 구조 데이터베이스에 하나 또는 그 이상의 대표성을 가진다면 이루어질 수 있다. GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol . Biol . 287:797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19:874-881)과 같은 프로그램들은 의문의 서열에 대한 구조적 접힘을 예측하는 신경 망에 대한 입력으로서 다양한 공급원으로부터의 정보 (PSI-BLAST, 이차 구조 예측, 구조적 배열 프로필, 및 용매화 가능성)를 활용한다. 유사하게, Gough 등의 방법 (Gough et al., 2000, J. Mol . Biol . 313:903-919)은 미지의 구조의 서열을 SCOP 데이터베이스에 존재하는 슈퍼패밀리 모델 내에 일렬 배열하기 위해 사용될 수 있다. 이런 일렬배열은 계속해서 폴리펩티드에 대한 상동성 모델을 제조하기 위해 사용될 수 있고, 그런 모델은 그 목적에 대해 개발된 다양한 도구를 사용하여 정확성에 대해 평가될 수 있다.
공지 구조의 단백질에 대해 여러 도구와 공급원이 구조적 일렬배열을 검색하고 생성하는 데 활용된다. 예를 들어 단백질의 SCOP 슈퍼패밀리는 구조적으로 일렬배열되었고, 그런 일렬배열은 접근가능하고 다운로드가 가능하다. 둘 또는 그 이상의 단백질 구조는 거리 일렬배열 매트릭스 (Holm and Sander, 1998, Proteins 33:88-96) 또는 조합 연장 (Shindyalov and Boume, 1998, Protein Engineering 11:739-747)과 같은 다양한 알고리즘을 사용하여 일렬배열될 수 있고, 이런 알고리즘의 실행은 추가적으로 가능한 구조적 상동체를 발견하기 위하여 관심의 구조를 가지는 의문의 구조 데이터베이스에 대해 활용될 수 있다 (예컨대 Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16:56-567).
본 발명의 알부민 변이체를 설명할 때에 아래에서 기술되는 명명법이 참조의 용이성을 위해 조정된다. 수용된 IUPAC 단일 기호 또는 세 문자 기호 아미노산 약어가 사용된다.
치환. 아미노산 치환에 대해 다음의 명명법이 사용된다: 원래의 아미노산, 위치, 치환된 아미노산. 따라서 예를 들어 위치 226에서 알라닌으로 트레오닌을 치환하는 것은 "Thr226Ala" 또는 "T226A"로 표시된다. 다중 돌연변이는 부호 ("+")를 첨가함으로써 구별되는데, 예를 들면 "Gly205Arg+Ser411Phe" 또는 "G205R+S411F"은 위치 205와 411에서 각각 글리신 (G)이 아르기닌 (R)으로, 세린 (S)이 페닐알라닌 (F)으로 치환된 것을 나타낸다. 표시는 또한 ("/")를 사용하는데, 예를 들면 "E492T/N530D"와 같이 표시하고, ("+")와 상호교환적인 것으로 볼 수 있어야 한다.
결실. 아미노산 결실에 대해, 다음의 명명법이 사용된다: 원래의 아미노산, 위치*. 따라서 위치 195에 있는 글리신의 결실은 "Gly195*" 또는 "G195*"로 표시된다. 다중 결실은 부호 ("+")를 첨가하여 구분되는데, 예를 들면 "Gly195*+Ser411**" 또는 "G195*+S411*"이다.
삽입. 아미노산 삽입에 대해 다음의 명명법이 사용된다: 원래의 아미노산, 위치, 원래의 아미노산, 삽입된 아미노산. 따라서 위치 195에서 글리신 다음에 라이신이 삽입되는 것은 "Gly195GlyLys" 또는 "G195GK"로 표시된다. 다중 아미노산의 삽입은 [원래의 아미노산, 위치, 원래의 아미노산, 삽입된 아미노산 #1, 삽입된 아미노산 #2, 등]으로 표시된다. 예를 들어 위치 195에서 글리신 다음에 라이신과 알라닌이 삽입되는 것은 "Gly195GlyLysAla" 또는 "G195GKA"로 표시된다.
그런 경우에 삽입된 아미노산 잔기(들)은 삽입된 아미노산 잔기(들) 앞에 있는 아미노산 잔기의 위치 번호에 그 아래에 있는 문자를 첨가함으로써 넘버링된다. 따라서 상기 실례에서 서열은 다음과 같아질 것이다:
모체: | 변이체: |
195 | 195 195a 195b |
G | G-K-A |
다중 변경. 다중 변경을 포함하는 변이체는 부호 ("+")를 첨가함으로써 구분되는데, 예를 들면 "Arg170Tyr+Gly195Glu" 또는 "R170Y+G195E"는 위치 170과 195에서 각각 티로신과 글루탐산이 아르기닌과 글리신 대신 치환된 것을 나타낸다.
상이한 치환. 상이한 치환이 한 위치에 도입될 수 있는 경우에, 상이한 치환은 쉼표로 구분되는데, 예를 들어 "Arg170Tyr,Glu"는 위치 170에서 아르기닌이 티로신 또는 글루탐산으로 치환된 것을 나타낸다. 그러므로 "Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala"는 다음의 변이체를 나타낸다: "Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly", 및 "Tyr167Ala+Arg170Ala".
모체 알부민
알부민은 단백질이고 포유류에서 혈장 내 가장 풍부한 단백질을 구성하며, 많은 종류의 포유류로부터의 알부민은 생화학적 방법 및/또는 서열 정보에 의해 특성확인되어 있다. 여러 알부민, 예컨대 사람 혈청 알부민 (HSA) 또한 결정학적으로 특성확인되었고, 구조가 측정되었다.
HSA는 본 발명에 따르는 바람직한 알부민이고, 585 아미노산 잔기로 구성되는 단백질이며 67kDa의 분자량을 가진다. HSA는 그것의 천연 형태로 글리코실화되지 않는다. HSA의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2에 도시된다. 당업자는 본질적으로 HSA와 동일한 특성을 갖지만 SEQ ID NO:2와 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 변화를 가지는 천연 대립형질이 존재할 수 있고, 본 발명자들은 또한 본 발명에 따르는 원래의 알부민과 같은 천연 대립형질의 사용을 포함한다는 것을 인지할 것이다.
알부민은 일반적으로 대략 20일 또는 그 이상의 긴 혈장 내 반감기를 가진다. 예를 들어 HSA는 19일의 혈장 내 반감기를 가진다. HSA의 긴 혈장 내 반감기는 그것의 수용체 FcRn과의 상호작용을 통해 중재되는 것으로 알려져 있지만, HSA의 긴 혈장 내 반감기에 숨어있는 정확한 메커니즘을 이해하거나 아는 것이 본 발명에 반드시 필요한 것은 아니다.
본 발명에 따르면, 용어 "알부민"은 HSA와 동일하거나 거의 유사한 3차원 구조와 긴 혈장 내 반감기를 가지는 단백질을 의미한다. 본 발명에 따르는 알부민 단백질의 실례는 사람 혈청 알부민, 영장류 혈청 알부민 (예컨대 침팬지 혈청 알부민, 고릴라 혈청 알부민), 설치류 혈청 알부민 (예컨대 햄스터 혈청 알부민, 기니아 피그 혈청 알부민, 마우스 알부민 및 쥐 혈청 알부민), 소 혈청 알부민, 말 혈청 알부민, 당나귀 혈청 알부민, 토끼 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민, 양 혈청 알부민, 개 혈청 알부민, 닭 혈청 알부민 및 돼지 혈청 알부민을 들 수 있다. SEQ ID NO:2에 개시된 것과 같은 HSA 또는 그것의 어떠한 자연 발생 대립형질은 본 발명에 따르는 바람직한 알부민이다.
본 발명에 따르는 모체 알부민, 또는 그것의 단편, 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 단백질의 알부민 부분은 일반적으로 SEQ ID NO:2에 도시된 HSA의 서열에 대해 최소한 60%, 바람직하게는 최소한 70%, 바람직하게는 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 바람직하게는 최소한 86%, 바람직하게는 최소한 87%, 바람직하게는 최소한 88%, 바람직하게는 최소한 89%, 바람직하게는 최소한 90%, 바람직하게는 최소한 91%, 바람직하게는 최소한 92%, 바람직하게는 최소한 93%, 바람직하게는 최소한 94%, 바람직하게는 최소한 95%, 보다 바람직하게는 최소한 96%, 보다 바람직하게는 최소한 97%, 보다 바람직하게는 최소한 98%, 가장 바람직하게는 최소한 99%의 서열 동일성을 가진다.
모체는 바람직하게는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하거나 그것으로 구성된다. 다른 측면으로, 모체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드를 포함하거나 그것으로 구성된다.
다른 구체예에서, 모체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 대립형질 변이체이다.
두 번째 측면으로, 모체는 매우 낮은 엄격성 조건 하에서, 낮은 엄격성 조건 하에서, 중간 엄격성 조건 하에서, 중-상 엄격성 조건 하에서, 높은 엄격성 조건 하에서, 또는 매우 높은 엄격성 조건하에서 (i) SEQ ID NO:1의 성숙한 폴리펩티드 코딩 서열, (ii) SEQ ID NO:1의 성숙한 폴리펩티드 코딩 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 전-길이 상보 가닥과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드화된다 (J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York).
SEQ ID NO:1의 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 하위서열, 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 또는 그것의 단편은 해당 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따르는 상이한 속 또는 종의 스트레인으로부터의 모체를 코드화하는 DNA를 확인하고 클론하기 위한 핵산 프로브를 디자인하기 위해 사용될 수 있다. 특히 그런 프로브는 표준 서던 블로팅 과정 후에 그 안의 상응하는 유전자를 확인하고 분리하기 위해, 관심의 속 또는 종의 게놈 또는 cDNA와의 혼성화를 위해 사용될 수 있다. 그런 프로브는 전체 서열보다 상당히 더 짧을 수 있지만, 최소한 14, 예컨대 최소한 25, 최소한 35, 또는 최소한 70 뉴클레오티드 길이를 가져야 한다. 바람직하게는 핵산 프로브는 최소한 100 뉴클레오티드 길이, 예컨대 최소한 200 뉴클레오티드, 최소한 300 뉴클레오티드, 최소한 400 뉴클레오티드, 최소한 500 뉴클레오티드, 최소한 600 뉴클레오티드, 최소한 700 뉴클레오티드, 최소한 800 뉴클레오티드, 또는 최소한 900 뉴클레오티드 길이를 가진다. DNA 및 RNA 프로브가 둘 다 사용될 수 있다. 프로브는 전형적으로 상응하는 유전자를 검출하기 위해 표지된다 (예를 들어 32P, 3H, 35S, 비오틴, 또는 아비딘으로). 그런 프로브는 본 발명에 포함된다.
그런 다른 유기체로부터 제조된 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리는 상기에서 설명된 프로브와 혼성화하고 모체를 코드화하는 DNA에 대해 선별될 수 있다. 그런 다른 유기체로부터의 게놈 또는 다른 DNA는 아가로오스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 또는 다른 분리 기법에 의해 분리될 수 있다. 라이브러리로부터의 DNA 또는 분리된 DNA는 니트로셀룰로오스 또는 다른 적당한 담체 물질에 전달되고 그 위에 고정될 수 있다. SEQ ID NO:1 또는 그것의 하위서열과 상동하는 클론 또는 DNA를 확인하기 위하여, 담체 물질이 서던 블롯에 사용된다.
본 발명의 목적에 대해 혼성화는 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:1에 도시된 폴리뉴클레오티드, 그것의 상보하는 가닥, 또는 그것의 하위서열에 상응하는 표지된 뉴클레오티드에, 낮은 내지 매우 높은 엄격성 조건 하에서 혼성화하는 것을 나타낸다. 프로브가 혼성화하는 분자는 예를 들면 X-선 필름 또는 해당 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 다른 검출 수단을 사용하여 검출될 수 있다.
한 측면으로 핵산 프로브는 SEQ ID NO:1의 성숙한 폴리펩티드 코딩 서열이다. 다른 측면으로 핵산 프로브는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 1 내지 1785이다. 또 다른 측면으로 핵산 프로브는 SEQ ID NO:2의 폴리펩티드 또는 그것의 단편을 코드화하는 폴리뉴클레오티드이다. 또 다른 측면으로 핵산 프로브는 SEQ ID NO:1이다.
최소한 100 뉴클레오티드 길이의 긴 프로브에 대해, 매우 낮은 내지 매우 높은 엄격성 조건은 가장 적합하게는 12 내지 24시간 동안의 표준 서던 블로팅 과정 후에 42℃에서 5X SSPE, 0.3% SDS, 200㎍/ml의 전단되고 변성된 연어 정자 DNA, 및 매우 낮은 및 낮은 엄격성에 대해서는 25% 포름알데히드에서, 중간 및 중-상 엄격성에 대해서는 35% 포름알데히드에서, 또는 높은 및 매우 높은 엄격성에 대해서는 50% 포름알데히드에서의 예비혼성화 및 혼성화로서 규정된다. 담체 물질은 최종적으로 각 15분 동안 2X SSC, 0.2% SDS를 사용하여 45℃에서 (매우 낮은 엄격성), 50℃에서 (낮은 엄격성), 55℃에서 (중간 엄격성). 60℃에서 (중-상 엄격성), 65℃에서 (높은 엄격성), 또는 70℃에서 (매우 높은 엄격성) 3회 세척된다.
약 15 뉴클레오티드 내지 약 70 뉴클레오티드 길이의 짧은 프로브에 대해서, 엄격성 조건은 가장 적절하게는 12 내지 24시간 동안 표준 서던 블로팅 과정 후에 0.9M NaCl, 0.09M 트리스-HCl pH 7.6, 6mM EDTA, 0.5% NP-40, 1X 덴하르드트 용액, 1mM 피로인산 나트륨, 1mM 1염기성 인산 나트륨, 0.1mM ATP, 및 ml당 0.2mg의 효모 RNA 중에서 볼튼과 맥카티에 따르는 계산 (Bolton and McCarthy, 1962, Proc . Natl. Acad . Sci . USA 48:1390)을 사용하여 계산된 Tm 아래의 약 5℃ 내지 약 10℃에서 예비혼성화 및 혼성화하는 것으로서 규정된다. 담체 물질은 0.1% SDS가 첨가된 6X SSC 중에서 15분 동안 1회 세척된 후 6X SSC를 사용하여 계산된 Tm 아래의 약 5℃ 내지 약 10℃에서 각 15분씩 2회 세척된다.
세 번째 측면으로, 모체는 SEQ ID NO:1의 성숙한 폴리펩티드 코딩 서열에 대해 최소한 60%, 예컨대 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 가지고, 알부민으로서 기능할 수 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드화된다. 한 구체예에서, 모체는 SEQ ID NO:1을 포함하거나 그것으로 구성되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드화된다.
변이체의
제조
추가의 측면으로, 본 발명은 변이체 알부민, 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이고, 그 방법은
a. 알부민 또는 그것의 단편 또는 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 알부민 부분 중에서, 알부민의 FcRn에 대한 결합에 중요한 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 위치를 확인하는 단계;
b. 상기 알부민, 그것의 단편 또는 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 알부민 부분을 코드화하는 핵산을 제공하는 단계;
c. 상기 b.에서 제공된 핵산을 변형하여 상기 a.에서 확인된 위치에 위치한 하나 또는 그 이상의 (여러) 아미노산 잔기가 결실되거나 상이한 아미노산으로 치환되거나 또는 삽입되는 단계;
d. 적당한 숙주 세포에서 변형된 핵산을 발현시키는 단계; 그리고
e. 알부민 또는 그것의 단편 또는 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 알부민 부분을 회수하는 단계로 이루어진다.
알부민 또는 그것의 단편 또는 융합 폴리펩티드의 알부민 부분에서, FcRn에 대한 알부민의 결합에 대해 중요한 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 위치의 확인은, 그것에 해당하는 것은 아니지만 무작위 돌연변이생성과, 이어서 생성된 돌연변이의 분석 및 비-돌연변이 모체 분자와의 비교, 및 구조적 고려사항을 토대로 한 확인과, 임의로 이어지는 확인된 변경을 가지는 변이체의 생성과 비-돌연변이 모체 분자와의 비교를 포함하는 여러 방식으로 행해질 수 있다.
천연 HSA와 비교하여 FcRn에 대해 변경된 결합을 나타내는 변이체 HSA를 제조하기 위해 변형될 수 있는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 위치를 확인하는 방법은 다음 단계들로 이루어진다:
i) FcRn에 대해 상이한 결합 특성을 가지는 비-사람 알부민을 확인하는 단계;
ii) FcRn과 상호작용하는 사람 혈청 알부민의 아미노산 잔기를 확인하는 단계;
iii) 상기 단계 ii)에서 확인된 아미노산 잔기와 관련하여 확인된 비-사람 알부민 및 사람 혈청 알부민의 일차 및/또는 삼차 구조를 비교하고, 상기 비-사람 알부민과 사람 혈청 알부민 사이에서 상이한 아미노산 잔기를 관찰된 결합 차이에 기여하는 것으로 확인하는 단계; 그리고
iv) 임의로 단계 iii)에서 확인된 위치에서 HSA의 변이체를 제조하고, 그 제조된 변이체가 A와 비교하여 FcRn에 대해 변경된 결합을 가지는 것을 확인하는 단계.
상기 단계 i)은 아래에서 설명되는 SPR 분석을 사용하여 행해질 수 있다. 그러나 숙련된 사람은 다른 방법도 HSA와는 상이한 FcRn에 대한 결합 특성을 가지는 비-사람 알부민을 확인하기 위해 사용할 수 있고, 그 방법은 FcRn에 대해 상이한 결합 특성을 가지는, 비-사람 알부민이 확인되는 방법에 좌우되지 않는다는 것을 인지할 것이다.
한 바람직한 구체예에서, 확인된 비-사람 알부민은 FcRn에 대해 HSA보다 더 강한 결합을 나타낸다. HSA보다 더 강한 결합을 나타내는 비-사람 알부민의 실례는 당나귀 혈청 알부민, 토끼 혈청 알부민, 개 혈청 알부민, 햄스터 혈청 알부민, 기니아 피그 혈청 알부민, 마우스 혈청 알부민 및 쥐 혈청 알부민이 있다. 단계 ii)는 FcRn, HSA 및 이들 두 가지의 결합 복합체의 구조를 고려함으로써 이루어질 수 있다. 결합 복합체의 활용가능한 구조가 없을 때 HSA 구조가 FcRn 구조 안으로 도킹되고, 그로써 FcRn과 상호작용하는 HSA의 아미노산 잔기를 확인하게 되는 모델을 사용하는 것이 가능하다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 확인된 비-사람 알부민은 FcRn에 대해 HSA보다 더 약한 결합을 나타낸다. FcRn에 대해 HSA보다 더 약한 결합을 나타내는 비-사람 알부민의 실례로는 소 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민, 양 혈청 알부민 및 닭 혈청 알부민이 있다. 단계 ii)는 FcRn, HSA 및 이들 두 가지의 결합 복합체의 구조를 고려함으로써 이루어질 수 있다. 결합 복합체의 활용가능한 구조가 없을 때 HSA 구조가 FcRn 구조 안으로 도킹되고, 그로써 FcRn과 상호작용하는 HSA의 아미노산 잔기를 확인하게 되는 모델을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명과 청구범위에서 FcRn과 상호작용하는 HSA의 아미노산 잔기는 FcRn의 아미노산으로부터 10Å보다 적은 거리에 위치하고 있는 HSA의 어떠한 아미노산 잔기 또는 FcRn의 아미노산으로부터 10Å보다 적은 거리에 위치한 아미노산 잔기와의 수소 결합, 염 가교 또는 극성 또는 비극성 상호작용에 포함된 어떠한 아미노산 잔기인 것으로 고려된다. 바람직하게도 HSA 잔기의 아미노산은 FcRn의 아미노산으로부터 10Å보다 적은 거리에 위치하고, 보다 바람직하게는 FcRn의 아미노산으로부터 6Å보다 적은 거리에 위치하고, 가장 바람직하게는 FcRn의 아미노산으로부터 3Å보다 적은 거리에 위치한다.
상기 단계 iii) 및 iv)는 숙련자에게 잘 알려져 있는 기법들을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 변이체 알부민 또는 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편의 회합체를 얻기 위한 방법에 관한 것으로, 그 방법은 (a) 모체 알부민 또는 그것의 단편, 또는 모체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드 안에 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 위치 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584에 상응하는 하나 또는 그 이상의 (여러) 위치에서 변경을 도입하는 단계와; (b) 변이체 알부민 또는 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계로 이루어진다.
변이체는 해당 기술분야에 알려져 있는 어떠한 돌연변이 발생 과정, 예를 들면 부위-특정 돌연변이생성, 합성효소 유전자 구성, 반-합성 유전자 구성, 무작위 돌연변이생성, 셔플링 등을 사용하여 당업자들에 의해 제조될 수 있다.
부위-특정 돌연변이생성은 하나 또는 그 이상의 (여러) 돌연변이가 모체를 코드화하는 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 규정된 부위에서 생성되는 기법이다.
부위-특정 돌연변이생성은 시험관 내에서 원하는 돌연변이를 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용을 포함하는 PCR에 의해 이루어질 수 있다. 부위-특정 돌연변이생성은 또한 시험관 내에서 모체를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드의 부위에서 제한 효소에 의한 절단을 포함하는 카세트 돌연변이생성에 의해, 그리고 계속해서 폴리뉴클레오티드의 돌연변이를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 결찰에 의해 수행될 수 있다. 보통 플라스미드와 올리고뉴클레오티드에서 소화시키는 제한 효소는 동일하여 플라스미드의 결찰과 상호간의 삽입이 가능하다 (예컨대 Scherer and Davis, 1979, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 76:4949-4955; Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res . 18:7349-4966).
부위-특정 돌연변이생성은 또한 생체 내에서 해당 기술분야에 공지되어 있는 방법에 의해 이루어질 수 있다 (미국 특허 출원 공보 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol . 19:773-776; Kren et al., 1998, Nat . Med . 4:285-290; 및 Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet . Newslett . 43:15-16).
어떠한 부위-특정 돌연변이생성 과정도 본 발명에 사용될 수 있다. 변이체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 많은 상업적인 키트가 활용될 수 있다.
합성 유전자 구성은 관심의 폴리펩티드를 코드화하기 위해 디자인된 폴리뉴클레오티드 분자의 시험관 내 합성을 수반한다. 유전자 합성은 많은 기법, 예를 들면 복합적인 마이크로칩-기초 기법 (Tian et al., 2004, Nature 432:1050-1054) 및 올리고뉴클레오티드가 합성되고 광-프로그램화된 미세유동성 칩 상에서 조립되는 유사한 기법을 활용하여 수행될 수 있다.
단일 또는 다중 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입은 돌연변이생성, 재조합, 및/또는 셔플링과, 이어지는 관련 선별 과정, 예컨대 문헌에 개시되어 있는 과정을 사용하여 만들어지고 시험될 수 있다 (Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241:53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:2152-2156; WO 95/17413; 또는 WO 95/22625). 사용될 수 있는 다른 방법으로는 실수하기 쉬운 PCR, 파지 디스플레이 (Lowman et al., 1991, Biochemistry 30:10832-10837; 미국 특허 5,223,409호; WO 92/06204) 및 영역-특정 돌연변이생성 (Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127)이 있다.
돌연변이생성/셔플링 방법은 숙주 세포에 의해 발현된 클론되고 돌연변이된 폴리펩티드의 활성을 검출하기 위하여 고출력, 자동화 선별 방법과 조합될 수 있다 (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17:893-896). 활성 폴리펩티드를 코드화하는 돌연변이된 DNA 분자는 숙주 세포로부터 회수될 수 있고, 기술분야의 표준 방법을 사용하여 빠르게 서열화된다. 이들 방법은 폴리펩티드의 중요한 개별적인 아미노산 잔기의 신속한 측정을 가능하게 한다.
반-합성 유전자 구성은 합성 유전자 구성, 및/또는 부위-특정 돌연변이생성, 및/또는 무작위 돌연변이생성, 및/또는 셔플링의 측면들을 조합함으로써 이루어진다. 반-합성 구성은 PCR 기법과 조합하여 합성되는 폴리뉴클레오티드 단편을 활용하는 과정에 의해 전형화된다. 그러므로 유전자의 규정된 영역은 새롭게 합성될 수 있는 한편, 다른 영역들은 부위-특정 돌연변이생성 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있고, 한편으로 또 다른 영역들은 실수하기 쉬운 PCR 또는 비-실수하기 쉬운 PCR에 의해 증폭되기 쉽다. 그런 다음 폴리뉴클레오티드 하위 서열은 셔플될 수 있다.
변이체
본 발명은 또한 SEQ ID NO:2의 위치 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584에 상응하는 하나 또는 그 이상의 (여러) 위치에서 변경을 포함하는 모체 알부민의 변이체 알부민 또는 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공하는데, 이때 각 변경은 독립적으로 치환, 삽입 또는 결실이고, 단 변이체는 치환 D494N, E501K, K541E, D550G,A, K573E 또는 K574N을 가지는 SEQ ID NO:2가 아니다.
본 발명에 따르는 변이체 알부민, 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 알부민 부분은 일반적으로 SEQ ID NO:2에 도시된 HSA의 서열에 대해 최소한 60%, 바람직하게는 최소한 70%, 바람직하게는 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 바람직하게는 최소한 90%, 보다 바람직하게는 최소한 95%, 보다 바람직하게는 최소한 96%, 보다 바람직하게는 최소한 97%, 보다 바람직하게는 최소한 98%, 가장 바람직하게는 최소한 99%의 서열 동일성을 가진다.
한 측면으로 본 발명의 변이체의 변경의 수는 1 내지 20, 예컨대 1 내지 10, 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 변경이다.
변이체 알부민, 그것의 단편 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 상응하는 모체 알부민, 그것의 단편, 또는 모체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드와 비교하여 변경된 혈장 내 반감기를 가진다.
특히 바람직한 구체예에서, 모체 알부민은 HSA이고, 변이체 알부민, 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 HSA, 상응하는 단편 또는 HSA 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드와 비교하여 변경된 혈장 내 반감기를 가진다.
알부민의 그것의 수용체에 대한 결합과 혈장 내 반감기 사이의 상관관계는 본 발명자들에 의해 HSA D494N의 자연 발생 대립형질을 토대로 하여 실현될 수 있다. 발명자들은 이 대립형질을 분석하였고, 그 결과 그것이 그것의 수용체인 FcRn에 대해 더 낮은 친화성을 가지는 것을 발견하였다.
나아가 사람 FcRn으로 대체된 천연 마우스 FcRn을 가지는 유전자도입 마우스는 정상 마우스보다 더 높은 수준의 혈청 알부민을 가지는 것이 발견되었다 (J Exp Med. (2003) 197(3):315-22). 본 발명자들은 사람 FcRn은 마우스 FcRn이 마우스 혈청 알부민에 대해 가지는 것보다 더 높은 마우스 혈청 알부민에 대한 친화성을 가지는 것과, 그러므로, 유전자도입 마우스에서 혈청 알부민의 관찰된 증가는 혈청 알부민과 그것의 수용체 사이의 더 높은 친화성에 상응한다는 것을 발견하였고, 그것은 FcRn에 대한 알부민 결합과 혈장 내 반감기 사이의 상관관계를 확증해준다. 또한 FcRn에 대해 거의 없거나 없는 알부민의 변이체는 마우스 모델에서 감소된 반감기를 가지는 것으로 밝혀졌다 (Kenanova et al (2009) J. Nucl . Med .;50 (Supplement 2):1582).
FcRn에 대한 변이체 알부민의 친화성이 모체 알부민보다 높은지 낮은지를 측정하기 위한 한 가지 방법은 아래에서 기술되는 바와 같이 표면 플라즈몬 공명 분석 (SPR)을 사용하는 것이다. 숙련된 사람은 FcRn에 대한 변이체 알부민의 친화성이 모체 알부민의 FcRn에 대한 친화성보다 높은지 또는 낮은지를 측정하기 위해 다른 방법들, 예컨대 결합 상수 KD의 측정 및 비교가 유용할 것이라는 것을 인지할 것이다. 그러므로 본 발명에 따르면, 천연 HSA에 대한 KD보다 낮은 KD를 가지는 변이체 알부민은 HSA보다 더 높은 혈장 내 반감기를 가지는 것으로 여겨지고, 천연 HSA에 대한 KD보다 높은 KD를 가지는 변이체 알부민은 HSA보다 더 낮은 혈장 내 반감기를 가지는 것으로 여겨진다.
알부민의 변이체 또는 그것의 단편 또는 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 이루어지는 군으로부터 선택된 HSA의 위치에 상응하는 하나 또는 그 이상의 (여러) 위치에서 하나 또는 그 이상의 변경, 예컨대 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 치환은 천연 알부민 서열의 아미노산이 나머지 19개의 천연 발생 아미노산 중에서 선택된 상이한 아미노산으로 치환되는 모든 치환일 수 있다.
한 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 위치 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584에 상응하는 하나 또는 그 이상의 (여러) 위치에서의 변경을 포함한다. 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584 중 어느 것에 상응하는 2개의 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 위치 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584 중 어느 것에 상응하는 세 개의 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 위치 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584에 상응하는 각 위치에서의 변경을 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 Q417A,H를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 H440Q를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 H464Q를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 A490D를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 E492G, T,P,H를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 V493P,L을 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 D494N,Q,A,E,P를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 E495Q,A를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 T496A를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 P499A를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 K500E,G,D,A,S,C,P,H,F,N,W,T,M,Y,V,Q,L,I,R을 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 E501A,P,Q를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 N503K,D,H를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 A504E를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 E505K,D를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 T506F,S를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 H510Q를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 H535Q를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 K536A를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 P537A를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 K538A,H를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 T540S를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 K541A,D,G,N,E를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 E542P,D를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 D550N을 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 K573Y,W,P,H,F,V,I,T,N,S,G,M,C,A,E,Q,R,L,D를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 K574N을 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 Q580K를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 L575F를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 A577T,E를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 A578R,S를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 S579C,T를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 Q580K를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 A581D를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 A582T를 포함한다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 G584A를 포함한다.
한 측면으로 변이체는 위치 417에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 다른 측면으로, 위치 417에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Ala 또는 His로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 Q417A,H를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 440에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 440에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Ala으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 H440Q를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 464에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 464에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Ala으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 H464Q를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 490에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 490에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 A490G를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 492에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 492에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Gly으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 E492G를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 493에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 493에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Pro으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 V493P를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 494에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 494에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Asn, Gln 또는 Ala으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 D494N,Q,A를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 495에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 495에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Gln 또는 Ala으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 E495Q 또는 A를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 496에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 496에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Ala으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 T496A를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 499에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 499에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Ala으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 P499A를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 500에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 500에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Ala으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 K500E,G,D,A,S,C,P,H,F,N,W,T,M,Y,V,Q,L,I,R을 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 501에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 501에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 친화성을 감소시키기 위하여 Ala 또는 Gln으로, 그리고 친화성을 증가시키기 위하여 Pro으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 E501A,Q,P를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 503에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 503에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Asp 또는 Lys 또는 His으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 N503D,K,H를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 504에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 504에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 A504를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 505에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 505에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 E505D를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 506에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 506에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 T506S,F를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 510에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 510에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Gln으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 H510Q를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 535에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 535에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Gln으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 H535Q를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 536에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 536에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Ala으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 K536A를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 537에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 537에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Ala으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 P537A를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 538에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 538에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Ala으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 K538H,A를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 540에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 540에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 T540S를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 541에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 541에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Gly, Asp 또는 Ala으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 K541G,D,A,N을 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 542에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 542에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Asp 또는 Pro으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 E542D,P를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 550에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 550에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 친화성을 감소시키기 위하여 Asn으로, 친화성을 증가시키기 위하여 Glu으로 치환된다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 573에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 573에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Tyr, Trp, Pro, His, Phe, Val, Ile, Thr, Asn, Ser, Gly, Met, Cys, Ala, Glu, Gln, Arg, Leu, Asp으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 K573Y,W,P,H,F,V,I,T,N,S,G,M,C,A,E,Q,R,L,D를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 574에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 574에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Asn으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 K574N을 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 575에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 575에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Phe으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 L575F를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 577에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 577에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Thr 또는 Glu으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 A577TE를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 578에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 578에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Arg 또는 Ser으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 A578R,S를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 579에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 579에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Cys 또는 Thr으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 S579C,T를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 580에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 580에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Lys으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 Q580K를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 581에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 581에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Asp으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 A581D를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 582에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 582에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Thr으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 A582T를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 위치 584에 상응하는 위치에서의 변경을 포함한다. 또 다른 측면으로, 위치 584에 상응하는 위치에 있는 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val으로, 바람직하게는 Ala으로 치환된다. 또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 성숙한 폴리펩티드의 치환 G584A를 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 위치 494와 496에 상응하는 위치에서의 변경, 예컨대 상기에서 기술된 것들을 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 위치 492와 493에 상응하는 위치에서의 변경, 예컨대 상기에서 기술된 것들을 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 위치 494와 417에 상응하는 위치에서의 변경, 예컨대 상기에서 기술된 것들을 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 위치 492와 503에 상응하는 위치에서의 변경, 예컨대 상기에서 기술된 것들을 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 위치 492와 573에 상응하는 위치에서의 변경, 예컨대 상기에서 기술된 것들을 포함한다.
또 다른 측면으로, 변이체는 SEQ ID NO:2의 위치 492, 503, 및 573에 상응하는 위치에서의 변경, 예컨대 상기에서 기술된 것들을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 이루어지는 군으로부터 선택된 HSA의 위치에 상응하는 위치에서 하나의 치환을 함유하는데, 이때 변이체 알부민은 치환 D494N, E501K, K541E, D550G,A, K573E 또는 K574N을 포함하는 SEQ ID NO:2로 구성되는 변이체가 아니어야 한다. 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 HSA의 다른 위치에 상응하는 하나 또는 그 이상의 (여러) 위치에서 추가의 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 및 584로 이루어지는 군으로부터 선택된 HSA의 위치에 상응하는 위치에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 치환을 함유한다. 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 HSA의 다른 위치에 상응하는 위치에서 추가의 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 발명에 따르는 알부민 변이체 또는 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 모체 알부민 또는 그것의 단편 또는 모체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 혈장 내 반감기보다 더 긴 혈장 내 반감기를 가진다. 이 구체예에 따르는 실례로는 SEQ ID NO:2의 492, 503, 542, 550, 573, 574, 580, 581, 582 또는 584에 상응하는 위치에서 치환을 포함하는 알부민 변이체 또는 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 이 구체예를 따르는 바람직한 치환은 SEQ ID NO:2의 492에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 G 잔기로 치환되는 것, SEQ ID NO:2의 503에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 H 또는 K 잔기로 치환되는 것, SEQ ID NO:2의 550에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 E 잔기로 치환되는 것, SEQ ID NO:2의 573에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 Y, W, P, H, F, V, I, T, N, S, G, M, C, A, E, Q, R, L 또는 D로 치환되는 것, SEQ ID NO:2의 574에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 N 잔기로 치환되는 것, 또는 SEQ ID NO:2의 580에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 K 잔기로 치환되는 것을 포함한다. 다른 바람직한 변이체는 SEQ ID NO:2의 492에 상응하는 위치에서 G 잔기로 치환되는 것과 SEQ ID NO:2의 573에 상응하는 위치에서 A 또는 P 잔기로 치환되는 것을 포함한다. 다른 바람직한 변이체는 SEQ ID NO:2의 위치 492에 상응하는 많은 치환과 SEQ ID NO:2의 위치 503에서 H 잔기를 가진다.
다른 바람직한 변이체는 SEQ ID NO:2의 492에 상응하는 위치에서 G 잔기로의 치환과, SEQ ID NO:2의 위치 503에 상응하는 위치에서 H 또는 K에 상응하는 치환 및 SEQ ID NO:2의 위치 573에서 A 또는 P 잔기로의 치환을 포함한다.
추가의 구체예에서, 본 발명에 따르는 알부민 변이체 또는 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 모체 알부민 또는 그것의 단편 또는 모체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 혈장 내 반감기보다 더 짧은 혈장 내 반감기를 가진다. 이 구체예에 따르는 실례는 SEQ ID NO:2의 417, 440, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 536, 537, 538, 541, 494+496 또는 492+493에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 알부민 변이체 또는 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 바람직한 치환은 SEQ ID NO:2의 Q417A, H440Q, D494E+Q417H, D494N,Q,A, E495Q,A, T496A, D494N+T496A 또는 P499A, K500A, E501A, E501Q, K536A, P537A, K538A, K541G, K541A, K541D 또는 D550N에 상응하는 치환을 포함한다.
또 다른 본 발명의 구체예에서, 본 발명에 따르는 알부민 변이체 또는 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 FcRn에 결합하는 능력을 잃어버린다. 이런 맥락에서 알부민 변이체 또는 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는, 만약 아래에서 기술되는 SPR 분석에서 변이체에 대해 측정된 공명 유닛이 상응하는 모체 알부민 또는 그것의 단편에 대해 측정된 공명 유닛의 10%보다 적다면 FcRn에 결합하는 능력을 잃어버린 것으로 여겨진다. 이 구체예에 따르는 실례로는 SEQ ID NO:2의 464, 500, 510 또는 535에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하는 알부민 변이체 또는 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 바람직한 치환은 SEQ ID NO:2의 H464Q, K500A,P,C,S,A,D,G, H510Q 또는 H535Q에 상응하는 치환을 포함한다.
SEQ ID NO:2의 위치 417, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 580, 581, 582 및 584에 상응하는 하나 또는 그 이상의 위치에서의 하나 또는 그 이상의 치환 외에, 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 분자의 다른 위치에서 추가의 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다. 그런 추가의 치환, 결실 또는 삽입은 분자의 다른 특성, 예를 들면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 변경된 글리코실화; 티올 기와 같은 표면의 반응성 기의 도입, 카바모일화 부위의 제거/생성; 등을 변경시키기 위해 유용할 수 있다.
표면에 반응성 잔기를 제공하기 위해 변경될 수 있고, 본 발명에 유익하게 적용될 수 있는 잔기들은 미공개된 특허 출원 WO 2010/092135 (본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있다. 특히 바람직한 잔기는 SEQ ID NO:2의 위치들에 상응하는 위치를 포함한다.
SEQ ID NO:2에 만들어질 수 있거나 또는 표면에 반응성 티올기를 제공하기 위하여 다른 알부민의 상응하는 위치에서의 변경의 실례를 들면 SEQ ID NO:2에서의 다음의 변경에 상응하는 변경을 포함한다: L585C, D1C, A2C, D562C, A364C, A504C, E505C, T79C, E86C, D129C, D549C, A581C, D121C, E82C, S270C, A578C, L595LC, D1DC, A2AC, D562DC, A364AC, A504AC, E505EC, T79TC, E86EC, D129DC, D549DC, A581AC, A581AC, D121DC, E82EC, S270SC, A579AC, C360*, C316*, C75*, C168*, C558*, C361*, C91*, C124*, C169* 및 C567*. 또는 다르게는 시스테인 잔기가 알부민의 N 또는 C 말단에 첨가될 수 있다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 본 발명의 변이체 중 어느 것을 코드화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
핵산 구성물
본 발명은 또한 조절 서열과 부합하는 조건 하에서 적당한 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 지시하는 하나 또는 그 이상의 (여러) 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 변이체를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구성물에 관한 것이다.
폴리뉴클레오티드는 변이체의 발현을 제공하기 위하여 다양한 방법으로 조작될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 그것의 벡터 안으로의 삽입 전에 조작하는 것은 발현 벡터에 따라 바람직하거나 필요할 수 있다. 재조합 DNA 방법을 활용하여 폴리뉴클레오티드를 변형시키기 위한 기법은 기술분야에 잘 알려져 있다.
조절 서열은 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 숙주 세포에 의해 인지되는 프로모터 서열일 수 있다. 프로모터 서열은 변이체의 발현을 중재하는 전사 조절 서열을 함유한다. 프로모터는 돌연변이체, 절단된 형태, 및 하이브리드 프로모터를 포함하여 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 어떠한 핵산 서열일 수 있고, 숙주 세포에 동종성이거나 이종성인 세포외재성 또는 세포내 폴리펩티드를 코드화하는 유전자로부터 얻어질 수 있다.
효모 숙주에서, 유용한 프로모터는 사카로마이세스 세레비시아에 에놀라제 (ENO-1), 사카로마이세스 세레비시아에 프로테아제 A (PRA1), 사카로마이세스 세레비시아에 프로테아제 B (PRB1), 사카로마이세스 세레비시아에 번역 신장 인자 (TEF1), 사카로마이세스 세레비시아에 번역 신장 인자 (TEF2), 사카로마이세스 세레비시아에 갈락토키나제 (GAL1), 사카로마이세스 세레비시아에 알코올 데히드로게나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (ADH1, ADH2/GAP), 사카로마이세스 세레비시아에 트리오스 포스페이트 이소메라제 (TP1), 사카로마이세스 세레비시아에 메탈로티오네인 (CUP1), 및 사카로마이세스 세레비시아에 3-포스포글리세레이트 키나아제에 대한 유전자로부터 얻어진다. 효모 숙주 세포에 대한 다른 유용한 프로모터는 문헌에 기술된다 (Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488).
조절 서열은 또한 전사를 종결하기 위해 숙주 세포에 의해 인지되는 적당한 전사 터미네이터 서열일 수 있다. 터미네이터 서열은 변이체를 코드화하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 작동가능하게 연결된다. 어떠한 터미네이터든지 숙주 세포에서 기능할 수 있는 것이 사용될 수 있다.
효모 숙주 세포에 대한 바람직한 터미네이터는 사카로마이세스 세레비시아에 에놀라제, 사카로마이세스 세레비시아에 시토크롬 C (CYC1), 사카로마이세스 세레비시아에 알코올 데히드로게나제 (ADH1) 및 사카로마이세스 세레비시아에 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제에 대한 유전자로부터 얻어진다. 효모 숙주 세포에 대한 다른 유용한 터미네이터는 문헌에 기술된다 (Romanos et al., 1992, 상기 동일).
조절 서열은 또한 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 미번역 영역인 적당한 리더 서열일 수 있다. 리더 서열은 변이체를 코드화하는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 작동가능하게 연결된다. 어떠한 리더 서열이든지 숙주 세포에서 기능할 수 있는 것이 사용될 수 있다.
효모 숙주 세포에 적당한 리더는 사카로마이세스 세레비시아에 에놀라제 (ENO-1), 사카로마이세스 세레비시아에 3-포스포글리세레이트 키나아제, 사카로마이세스 세레비시아에 알파-인자, 및 사카로마이세스 세레비시아에 알코올 데히드로게나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (ADH2/GAP)에 대한 유전자로부터 얻어진다.
조절 서열은 또한 변이체-코드화 서열의 3'-말단에 작동가능하게 연결된 서열이고, 전사될 때 숙주 세포에 의해 전사된 mRNA에 폴리아데노신 잔기를 첨가하기 위한 신호로서 인지되는 폴리아데닐화 서열일 수 있다. 어떠한 폴리아데닐화 서열이든지 숙주 세포에서 기능할 수 있는 것이 사용될 수 있다.
효모 숙주 세포에 대한 유용한 폴리아데닐화 서열은 구오와 셔먼에 의해 기술된다 (Guo and Sherman, 1995, Mol . Cellualr Biol . 15:5983-5990).
조절 서열은 또한 변이체의 N-말단에 연결된 신호 펩티드를 코드화하고, 세포의 분비 경로 안으로 변이체를 지시하는 신호 펩티드 코딩 영역일 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 5'-단부는 변이체를 코드화하는 코딩 영역의 절편을 포함하는 번역 리딩 프레임에 자연적으로 연결된 신호 펩티드 코딩 영역을 원래부터 함유할 수 있다. 또는 달리 코딩 서열의 5'-단부는 코딩 서열에 외래인 신호 펩티드 코딩 영역을 함유할 수 있다. 외래 신호 펩티드 코딩 영역은 코딩 서열이 자연적으로 신호 펩티드 코딩 영역을 함유하지 않는 경우에 필요할 것이다. 또는 달리 외래 신호 펩티드 코딩 영역은 변이체의 분비를 증강시키기 위하여 단순히 천연 신호 펩티드 코딩 영역을 대체할 수 있다. 그러나 숙주의 분비 경로 안으로 발현된 변이체를 지시하는 어떠한 신호 펩티드 코딩 영역이 사용될 수 있다.
효모 숙주 세포에 대한 유용한 신호 펩티드는 사카로마이세스 세레비시아에 알파-인자 및 사카로마이세스 세레비시아에 전화효소에 대한 유전자로부터 얻어진다. 다른 유용한 신호 펩티드 코딩 서열은 로마노스 등에 의해 기술된다 (Romanos et al., 1992, 상기 동일).
신호 펩티드와 프로펩티드 영역이 둘 다 변이체의 N-말단에 존재하는 경우, 프로펩티드 영역은 변이체의 N-말단 다음에 위치하고, 신호 펩티드 영역은 프로펩티드 영역의 N-말단 다음에 위치한다.
제조 방법
본 발명의 변이체는 숙련자에게 잘 알려져 있는 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 한 가지 편리한 방법은 모체 알부민 또는 그것의 단편 또는 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 클로닝하고, 상기 핵산을 변형하여 원하는 치환(들)을 SEQ ID NO:2의 위치 417, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574 및 580에 상응하는 하나 또는 그 이상의 (여러) 위치에 도입하고, 이때 변이체는 치환 D494N, E501K, K541E, D550G,A, K573E 또는 K574N을 포함하는 SEQ ID NO:2으로 구성되는 변이체가 아니고, 변형된 핵산이 적당한 조절성 유전자 요소, 예컨대 프로모터, 터미네이터, 활성화 부위, 리보솜 결합 부위 등과 작동가능하게 연결되도록 놓인 적당한 유전자 구성물을 제조하고, 그 유전자 구성물을 적당한 숙주 유기체 안에 도입하고, 형질전환된 숙주 유기체를 변이체의 발현을 유도하는 조건 하에서 배양하고, 그 변이체를 회수하는 것이다. 이런 모든 기법은 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명에 따르는 특정 변이체를 제조하기 위한 적당한 방법을 디자인할 수 있는 평균적인 실시자의 기술 내에 있다.
본 발명의 변이체 폴리펩티드는 또한 형질전환된 숙주 유기체의 배양 중에 변이체 폴리펩티드가 성장 배지 안으로 분비되기 위해 신호 서열에 연결될 수 있다. 일반적으로 회수 및 정제를 용이하게 하기 위해 변이체 폴리펩티드가 성장 배지 안으로 분비되는 것이 유리하다.
변이체 폴리펩티드의 제조 기법은 또한 WO 2009/019314 (본원에 참조로 포함된)에 개시되어 있고, 이들 기법은 또한 본 발명에도 적용될 수 있다.
알부민은 다음과 같은 숙주를 포함하는 다양한 숙주에서 재조합 단백질로서 성공적으로 발현되었다: 진균 (그것들에 한정되는 것은 아니지만 아스페르길루스 (WO06066595), 클루이베로마이세스 (Fleer 1991, Bio / technology 9, 968-975), 피치아 (Kobayashi 1998 Therapeutic Apheresis 2, 257-262) 및 사카로마이세스 (Sleep 1990, Bio / technology 8, 42-46)을 포함한다), 박테리아 (Pandjaitab 2000, J. Allergy Clin . Immunol . 105, 279-285), 동물 (Barash 1993, Transgenic Research 2, 266-276) 및 식물 (그것들에 한정되는 것은 아니지만 감자와 담배를 포함한다 (Sijmons 1990, Bio / technology 8, 217 및 Farran 2002, Transgenic Research 11, 337-346). 본 발명의 변이체 폴리펩티드는 바람직하게는 적당한 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된다. 원칙적으로, 적당한 양으로 폴리펩티드를 생성할 수 있는 숙주 세포라면 어느 것이든지 사용될 수 있고, 본 발명에 따르는 적당한 숙주 세포를 선택하는 것은 평균적인 실시자의 기술범위 내에 있다. 바람직한 숙주 유기체는 효모이고, 바람직하게는 사카로마이카카에 중에서 선택하며, 보다 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아에이다.
본 발명의 변이체 폴리펩티드는 공지된 분리 기법, 예컨대 여과, 원심분리, 크로마토그래피, 및 친화성 분리 기법 등을 조합하여 사용함으로써 성장 배지로부터 회수되고 정제될 수 있다. 그런 공지된 분리 단계를 특별히 조합하여 사용하여 본 발명의 변이체를 정제하는 것은 평균적인 실시자의 기술 범위 내에 있다. 본 발명의 변이체에 적용될 수 있는 정제 기법의 실례로서 WO0044772의 교시를 들 수 있다.
본 발명의 변이체 폴리펩티드는 필요에 따라 동물 또는 사람 개체에게 치료적으로 유익한 화합물을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 그런 치료적으로 유익한 화합물로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만 진단에 사용하기 위한 표지 및 쉽게 검출될 수 있는 화합물, 예컨대 다양한 영상화 기법; 약제학적으로 활성인 화합물, 예컨대 약물, 또는 항체와 같이 특수하게 결합하는 부분이 있다. 본 발명의 변이체는 둘 또는 그 이상의 치료적으로 유익한 화합물, 예컨대 항체와 약물에 연결될 수 있고, 그것은 조합된 분자에 원하는 표적에 특이하게 결합할 수 있는 능력을 제공하고, 그로써 특정 표적에서 고농도의 연결된 약물을 제공한다.
융합 폴리펩티드
본 발명에 따르는 알부민 변이체 또는 그것의 단편은 또한 비-알부민 폴리펩티드 융합 파트너와 융합될 수 있다. 융합 파트너는 원칙적으로 어떠한 폴리펩티드일 수 있지만, 일반적으로는 융합 파트너는 치료적 또는 진단적 특성을 가지는 폴리펩티드인 것이 바람직하다. 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 기술분야에 공지되어 있다. 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 그런 융합 폴리펩티드와 융합 파트너 폴리펩티드는 융합되지 않은 융합 파트너 폴리펩티드와 비교하여 더 긴 혈장 내 반감기를 가지는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 따르면, 발명에 따르는 융합 폴리펩티드의 혈장 내 반감기를 선행 기술의 상응하는 융합 폴리펩티드와 비교하여 변경시키는 것이 가능하다.
하나 또는 그 이상의 치료적 폴리펩티드가 알부민의 N-말단, C-말단에 융합되거나, 알부민 구조의 루프 안에 삽입되거나, 또는 그것의 조합일 수 있다. 융합 폴리펩티드의 다양한 성분을 분리하는 링커 서열을 포함할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
알부민 또는 그것의 단편의 융합과 관련된 교시는 기술분야에 공지되어 있고, 숙련자는 그런 교시가 또한 본 발명에도 적용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. WO 2001/79271 A 및 WO 2003/59934 A는 또한 알부민 또는 그것의 단편에 융합될 수 있는 치료적 폴리펩티드의 실례를 포함하고, 그런 실례는 본 발명에도 적용된다.
포합체
본 발명에 따르는 알부민 변이체 또는 그것의 단편은 기술분야에 공지되어 있는 기법들을 사용하여 두 번째 분자에 포합될 수 있다. 상기 두 번째 분자는 진단용 부분을 포함할 수 있고, 이런 구체예에서 포합체는 영상화 기법에서와 같은 진단용 도구로서 유용할 수 있으며, 또는 두 번째 분자는 치료 화합물일 수 있고, 이런 구체예에서 포합체는 그 포합체가 치료 화합물의 치료적 특성뿐 아니라 알부민의 긴 혈장 내 반감기를 가지는 경우에는 치료적 목적에 대해 사용될 수 있다. 알부민과 치료적 분자의 포합체는 기술분야에 알려져 있고, 그런 포합체는 포합되지 않은, 유리 치료 분자 자체와 비교하여 긴 혈장 내 반감기를 가지는 것으로 증명된 바 있다. 포합체는 편리하게도 HSA의 표면에 존재하는 유리 티올기 (성숙한 HSA의 아미노산 잔기 34)를 경유하여 잘 알려져 있는 화학을 사용하여 연결될 수 있다.
바람직한 한 특정 측면으로, 변이체 알부민 또는 그것의 단편은 유익한 치료 화합물에 포합되고, 그 포합체는 그럴 필요가 있는 환자에게서 특정한 선택된 치료 화합물에 대해 반응하는 질환의 치료를 위해 사용된다. 그런 치료적인 화합물을 변이체 알부민 또는 그것의 단편에 포합하기 위한 기법은 기술분야에 알려져 있다. WO 2009/019314에는 치료적인 화합물을 폴리펩티드에 포합하기 위해 적당한 기법의 실례가 개시되었고, 그런 기법은 또한 본 발명에도 적용될 수 있다. 나아가 WO 2009/019314에는 치환된 트랜스페린에 포합될 수 있는 화합물 및 부분의 실례가 개시되어 있고, 그런 실례는 또한 본 발명에 적용될 수 있다. WO 2009/019314의 교시는 본원에 참조로 포함된다.
HSA는 그것의 천연 형태로 하나의 유리 티올기를 함유하고, 그것은 편리하게도 포합에 사용될 수 있다. 이런 측면에 포함되는 한 특별한 구체예로서, 변이체 알부민 또는 그것의 단편은 표면에 추가의 유리 티올기를 생성하기 위해 제공된 추가의 변형을 포함할 수 있다. 이것은 변이체 알부민 또는 그것의 단편의 탑재 (payload)가 증가되어 치료 화합물, 예컨대 종양에 특이적인 항체와 같은 표적화 특성을 가지는 화합물의 하나 이상의 분자가 변이체 알부민 또는 그것의 단편의 각 분자와 포합될 수 있고, 또는 둘 또는 그 이상의 상이한 치료 화합물이 변이체 알부민 또는 그것의 단편의 각 분자와 포합될 수 있으며, 그로써 변이체 알부민 또는 그것의 단편에 포합된 세포독성 약물이 종양에 대해 고도로 특이한 약물을 생성하게 되는 혜택이 있다. 표면에 추가의 유리 티올기를 제공하기 위해 변형될 수 있는 특정 잔기에 대한 교시는 본원에 참조로 포함된, 공동계류중인 특허 출원 WO 2010/092135에서 찾아볼 수 있다.
회합체
알부민 변이체 또는 그것의 단편은 추가로 "회합체" 형태로 사용될 수 있다. 이 맥락에서 용어 "회합체"는 알부민 변이체 또는 그것의 단편과 그 변이체 알부민 또는 그것의 단편에 비-공유 결합에 의해 결합되어 있거나 회합되어 있는 다른 화합물을 포함하는 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 그런 회합체의 실례로서 변이체 알부민과 알부민에 소수성 상호작용에 의해 회합되어 있는 지질로 구성되는 회합체를 들 수 있다. 그런 회합체는 기술분야에 공지되어 있고, 그것은 잘 알려져 있는 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명에 따르는 바람직한 회합체의 실례로는 변이체 알부민과 파클리탁셀을 포함하는 회합체를 들 수 있다.
기타 용도
본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 그것의 단편 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는, 그것들의 혈장 내 반감기가 모체 알부민 또는 그것의 단편 또는 모체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드와 비교하여 변경된다는 이점을 가진다. 이것은 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 그것의 단편 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 포합체, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 회합체의 혈장 내 반감기가 특별한 치료적 목적에 따라 선택될 수 있다는 장점을 가진다.
예를 들어 동물 또는 사람에게서 영상화 목적에 대해 사용된 포합체, 회합체 또는 융합 폴리펩티드에 대해, 영상화 부분이 매우 짧은 반감기를 가지고 HSA를 포함하는 포합체 또는 융합 폴리펩티드가 영상화 목적에 대해 요구되는 것보다 훨씬 더 혈장 내 반감기를 가지는 경우라면, 영상화 목적에 대해서는 충분히 길지만 그것이 적용될 특정 환자의 신체로부터 제거되기에 충분히 짧은 혈장 내 반감기를 가지는 융합 폴리펩티드의 포합체를 제공하기 위하여, 모체 알부민 또는 그것의 단편보다 더 짧은 혈장 내 반감기를 가지는 본 발명의 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 사용하는 것이 유익할 것이다.
치료가 필요한 환자에게서 특정 질환을 치료하거나 완화시키기에 효과적인 치료 화합물을 포함하는 포합체, 회합체 또는 융합 폴리펩티드에 대한 다른 실례로, 모체 알부민 또는 그것의 회합체 또는 그것의 단편이 사용된 경우의 상황과 비교하여 부작용이 적어지면서 본 발명의 포합체, 회합체 또는 융합 폴리펩티드의 투여가 덜 자주 또는 감소된 투약량이 필요하게 되는 이득을 나타낼 수 있는, 더 긴 혈장 내 반감기를 가지는 회합체 또는 포합체 또는 융합 폴리펩티드를 제공하기 위하여, 모체 알부민 또는 그것의 단편보다 더 긴 혈장 내 반감기를 가지는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 사용하는 것이 유익할 것이다.
추가의 측면으로, 본 발명은 본 발명에 따르는 변이체 알부민, 그것의 회합체 또는 단편, 변이체 알부민 단편 또는 그것의 회합체 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 바람직하게는 약제학적 조성물이다. 조성물은 제약 분야 내에서 공인된 편람에 개시된 것과 같은 영역에서 알려져 있는 기법들을 사용하여 제조될 수 있다.
특정 구체예에서, 조성물은 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 그것의 단편과 약제학적으로 유익한 부분과 알부민 결합 도메인 (ABD)을 포함하는 화합물을 포함한다. 본 발명에 따르면, ABD는 생체 내에서 순환하는 알부민과 결합할 수 있고, 그로써 ABD의 순환과 상기 ABD에 결합된 어떠한 화합물 또는 부분을 수송할 수 있는 부위, 부분 또는 도메인을 의미한다. ABD는 기술분야에 알려져 있고, 알부민에 매우 간단하게 결합하여서 알부민에 결합된 ABD를 포함하는 화합물은 특정 정도까지 단일 분자로서 행동할 것이라고 밝혀졌다. 본 발명자들은 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 약제학적으로 유익한 부분 및 ABD를 포함하는 화합물과 함께 사용함으로써, 약제학적으로 유익한 부분과 ABD를 포함하는 화합물의 혈장 내 반감기를, 상기 화합물이 그 자체로서 치료의 필요가 있는 환자에게 주입되거나 천연 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 제형으로 투여된 경우의 상황과 비교하여 변경시키는 것이 가능해진다.
본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 그것의 단편, 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 포합체 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 회합체는 또한 기술 분야에 잘 알려져 있는 기법들을 사용하여 나노- 또는 마이크로입자로 혼입될 수 있다. 본 발명에 따르는 변이체 알부민 또는 그것의 단편에 적용될 수 있는 나노- 또는 마이크로입자를 제조하기 위한 바람직한 방법은 본원에 참조로 포함된 WO 2004/071536에 개시되어 있다.
조성물
본 발명은 또한 변이체 알부민 또는 그것의 단편 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 포합체, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 회합체를 약제학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도에 관한 것으로, 이때 변이체 알부민 또는 그것의 단편 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 포합체, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 회합체는 HSA 또는 그것의 상응하는 단편 또는 HSA 또는 그것의 상응하는 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드 또는 HSA를 포함하는 포합체와 비교하여 변경된 혈장 내 반감기를 가진다.
이런 맥락에서 HSA의 상응하는 단편은 그것과 비교되는 변이체 알부민의 단편과 동일한 아미노산 번호를 가지고 그것과 일렬배열되는 HSA의 단편을 의미하는 것으로 의도된다. 유사하게 HSA를 포함하는 상응하는 융합 폴리펩티드 또는 HSA를 포함하는 포합체는 그것과 비교되는 변이체 알부민을 포함하는 포합체의 융합 폴리펩티드와 동일한 크기와 아미노산 서열을 가지는 분자를 의미하는 것으로 의도된다.
바람직하게는 변이체 알부민 또는 그것의 단편 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 가지는 포합체는 HSA 또는 그것의 상응하는 단편 또는 HSA 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 혈장 내 반감기보다 높은 혈장 내 반감기를 가진다.
또는 달리 이것은 알부민 변이체 또는 그것의 단편 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 가지는 포합체가 HSA 또는 그것의 상응하는 단편 또는 HSA 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드에 대한 상응하는 KD보다 더 낮은 FcRn에 대한 KD를 가지는 것으로서 표시될 수 있다. 바람직하게는 알부민 변이체 또는 그것의 단편 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 가지는 포합체에 대한 KD는 HSA에 대한 KD의 0.9배보다 적고, 바람직하게는 HSA에 대한 KD의 0.5배보다 적고, 보다 바람직하게는 HSA에 대한 KD의 0.1배보다 적고, 보다 더 바람직하게는 HSA에 대한 KD의 0.05배보다 적고, 보다 더 바람직하게는 HSA에 대한 KD의 0.02배보다 적고, 가장 바람직하게는 HSA에 대한 KD의 0.01배보다 적다.
알부민 변이체 또는 그것의 단편 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 가지는 포합체는 바람직하게는 본 발명에 따르는 알부민 변이체 또는 그것의 단편 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그것의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그것의 단편을 가지는 포합체이다.
본 발명은 본 발명의 범주를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안되는 다음의 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예
물질 및 방법
ELISA:
웰을 인산염 완충된 식염수 (PBS)에 표시된 농도로 희석한 야생형 HSA 또는 변이체로 코팅하여 4℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, 4% 탈지유 (Acumedia)로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 그런 다음 웰을 PBS/0.005% TWEEN® 20 (PBS/T) pH 6.0으로 4회 세척한 후, 문헌에 기술된 것과 같이 (FEBS J. 2008 Aug;275(16):4097-110) 염소로부터의 양고추냉이 과산화효소 (HRP)-포합된 다중클론 항-GST (1:5000; GE Healthcare)와 예비 인큐베이션되고, 4% 탈지유 PBS/0.005% TWEEN® 20 (PBS/T) pH 6.0에 희석된 글루타티온-S-트란스페라제 (GST)-융합된 shFcRn (0.5㎍/ml)을 각 웰에 첨가하고 1.5시간 동안 실온에서 인큐베이션한 다음 PBS/T pH 6.0으로 4회 세척하였다. 100㎕의 기질 테트라메틸벤지딘 (TMB)(Calbiochem)을 각 웰에 첨가하고, 45분 동안 인큐베이션한 후, 100㎕의 0.25M HCl을 첨가하였다. 흡광도를 450nm에서 Sunrise TECAN 분광계 (TECAN, Maennedorf, Switzerland)를 사용하여 측정하였다. 동일한 ELISA를 PBS/T pH 7.4를 사용하여 반복하였다.
표면 플라스몬 공명 ( SPR ):
SPR 실험을 Biacore 3000 기기 (GE Healthcare)를 사용하여 수행하였다. CM5 센서 칩의 흐름 세포를 shFcRn-GST (~1400-5000 RU)와, 제조업체에 의해 제공된 프로토콜에 설명된 대로 아민 결합 화학을 사용하여 커플링시켰다. 커플링을 10mM 아세트산 나트륨 pH 5.0 (GE Healthcare) 중의 10㎍/ml의 단백질을 주입함으로써 수행하였다. pH 6.0의 인산염 완충액 (67mM 인산염 완충액, 0.15M NaCl, 0.005% TWEEN® 20)을 작동 완충액 및 희석 완충액으로서 사용하였다. 표면의 재생은 pH 7.4에서 HBS-EP 완충액 (0.01M HEPES, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20) (Biacore AB)의 주입을 사용하여 이루었다. 고정된 shFcRn-GST에의 결합을 위해, 1.0 내지 0.5μM의 각 HSA 변이체를 일정한 유속으로 (40㎕/ml) 25℃에서 표면에 주입하였다. 모든 실험에서 데이터는 0점으로 조정하였고 참조 세포를 뺐다. 데이터 평가는 BIAevaluation 4.1 소프트웨어 (BIAcore AB)를 사용하여 수행하였다.
동일한 SPR 분석을 pH 7.4의 HBS-EP를 사용하여 반복하였다.
다르게 표시되지 않는 한 본 특허의 목적에 대해 HSA , WT HSA , rHA 는 실시예에 대해 등록된 상표명 RECOMBUMIN (Novozymes Biopharma UK Ltd, Nottingham UK로부터 구할 수 있다)하에 활용할 수 있는 재조합 사람 혈청 알부민을 사용한 것을 나타낸다.
다른 종으로부터의 혈청 알부민: 알부민은 재조합된 것이지만, 대중적으로 활용할 수 있는 데이터베이스로부터 제공된 서열을 사용하여 표시하고 제조하였다. 또는 상업적인 공급체로부터 구매하였다.
FcRn 가용성 사람 (shFcRn) 및 마우스 (smFcRn) FcRn의 발현 및 정제: shFcRn 및 smFcRn 발현 플라스미드의 생성, 각 이종이량체의 발현 및 정제 방법은 Berntzen et al. (2005) J. Immunol. Methods 298:93-104에서 알 수 있다. 또는 달리 shFcRn FcRn 이종이량체는 HeneArt AG (독일)에 의해 제조되었다. 이종이량체의 두 개의 하위 단위에 대한 서열은 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4에서 볼 수 있다. 가용성 수용체를 HEK293 세포에서 발현시키고 Ni-HiTrap 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 배양 상층액으로부터 정제하였다.
실시예
1.
변이체의
제조
특이한
HSA
뮤테인
발현 플라스미드의 제조
HSA 돌연변이 변이체와 HSA 융합 변이체의 발현 방법을 여러 기법을 사용하여 만들었다. 전체적으로 샘브룩 등에 의해 기술된 것과 같은 표준 분자 생물학 기법들을 사용하였다: Sambrook, J. and D.W. Russell, 2001. Molecular Cloning: A laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
방법 1. 표 2에 열거한
HSA
의 아미노산 치환
합성 DNA NcoI/SacI 단편 (859bp)을, 번역된 단백질에 원하는 아미노산 치환을 도입하기 위한 HSA-코드화 유전자 (SEQ ID NO:1) 내에 점 돌연변이를 함유하고 있는 유전자 어셈블리 (GeneArt AG, Germany)에 의해 제조하였다. 아래의 표 3은 HSA-코드화 유전자 안에 아미노산 치환을 도입하기 위해 사용된 코돈을 나타낸다. 변화하지 않은 아미노산 (즉 야생형)을 코드화하는 합성 단편의 뉴클레오티드 서열은 pDB2243 (WO 00/44772에 기재됨)의 그것과 동일하였다. 합성 뉴크레오티드 단편을 NcoI/SacI-소화된 pDB2243에 결찰시켜서 플라스미드 pDB3876-pDB3886을 만들었다 (표 2). 발현 플라스미드를 제조하기 위하여, pDB3876-pDB3886 (표 2 참조)을 각각 NotI과 PvuI으로 소화시키고, DNA 단편을 0.7% (w/v) TAE 겔을 통해 분리한 다음, 2992bp의 단편 ('NotI 카세트', PRB1 프로모터, 융합 리더 (FL) 서열을 코드화하는 DNA (WO 2010/092135에 개시됨), HSA를 코드화하는 뉴클레오티드 서열 및 ADH1 터미네이터를 포함한다; 도 1 참조)을 아가로오스 겔로부터 Qiagen 겔 추출 키트를 사용하여 제조헙체의 지시를 따라 정제하였다. 'NotI 카세트'를 NotI/새우 알칼리성 포스파타제 (Roche)-처리된 "붕괴" 플라스미드 pSAC35 (EP-A-286 424에서 개시되고, Sleep, D., et al. (1991) Bio/Technology 9, 183-187에 설명됨) 안에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 화학적으로 경합하는 대장균 DH5α를 형질전환하였다. "NotI 카세트"를 함유하는 발현 플라스미드 pDB3887 - pDB3897, pSAC35-유도체를 표준 기법을 사용하여 확인하였다. 붕괴 플라스미드 pDB3887-pDB3897과 pDB2244 (야생형 HSA의 발현을 위한 것, WO 00/44772에 설명됨)(표 2)을 사용하여 S.cerevisiae BXP10cir0 (WO/2001/079840에서 설명된 것과 같이)를 아래에서 설명되는 것과 같이 형질전환하였다.
플라스미드 | 구성물 |
pDB2244 | HSA |
pDB3876 | HSA D494N |
pDB3877 | HSA D494A |
pDB3878 | HSA E495Q |
pDB3879 | HSA E495A |
pDB3880 | HSA D494Q |
pDB3881 | HSA D494N, T496A |
pDB3882 | HSA T496A |
pDB3883 | HSA E492G |
pDB3884 | HSA E492G, V493P |
pDB3885 | HSA E492P |
pDB3886 | HSA E492H |
pDB3887 | HSA D494N |
pDB3888 | HSA D494A |
pDB3889 | HSA E495Q |
pDB3890 | HSA E495A |
pDB3891 | HSA D494Q |
pDB3892 | HSA D494N, T496A |
pDB3893 | HSA T496A |
pDB3894 | HSA E492G |
pDB3895 | HSA E492G, V493P |
pDB3896 | HSA E492P |
pDB3897 | HSA E492H |
n/a = 적용할 수 없음. pDB3876-pDB3886은 하위-클로닝 플라스미드이다.
아미노산 | 코돈 | 아미노산 | 코돈 | 아미노산 | 코돈 | 아미노산 | 코돈 |
Gly | GGT | Lys | AAA | Cys | TGT | His | CAT |
Glu | GAA | Asn | AAT | Tyr | TAT | Pro | CCA |
Asp | GAT | Met | ATG | Leu | TTG | 중지 | TAA |
Val | GTT | Ile | ATT | Phe | TTT | ||
Ala | GCT | Thr | ACT | Ser | TCT | ||
Arg | AGA | Trp | TGG | Gln | CAA |
방법 2.
HSA
변이체
D94N
+
E495Q
+
T496A
및
E495Q
+
T496A
의 제조
QuickChange Lightening 키트 (Statagene)를 사용하는 PCR-기초 방법을 사용하여 점 돌연변이를 HSA 안에 도입하였다. 올리고뉴클레오티드 쌍 xAP094 (SEQ ID NO:5)/xAP095 (SEQ ID NO:6) 및 xAP096 (SEQ ID NO:7)/xAP097 (SEQ ID NO:8)을 사용하여 2개의 HSA 변이체 (각각 D494N+E495Q+T496A 및 E495Q+T496A)를 제조하였다. 플라스미드 pDB3927 (WO 2010/092135에 개시됨)을 주형 DNA로서 사용하였고, 키트의 제조업체에 의해 권장된 방법을 사용하였다. 그 결과의 플라스미드를 pDB3995 및 pDB3996 (각각 HSA D494N+E495Q+T496A 및 E495Q+T496A 발현 벡터를 함유한다)으로 명명하였다. pDB3995와 pDB3996을 BstEII/BsrBI으로 소화하고, 선형화된 DNA 분자를 표준 기법을 사용하여 정제하였다. Qiagen PCR-정제 키트를 사용하여, 제조업체의 지시사항을 따라 정제된 각각의 BstEII/BsrBI 소화된 DNA 100ng을 개별적으로 100ng의 Acc651/BamHI-소화된 pDB3936 (WO 2010/092135에 개시됨)과 혼합하고, 아래에서 설명되는 시그마 효모 형질전환 키트를 사용하여 직접 S. cerevisiae BXP10cir0을 형질전환하는 데 사용하였다.
방법 3. 표 4에 열거한
HSA
의 아미노산 치환
플라스미드 pDB3927 (WO 2010/092135에 개시됨)(pDB2243에서와 같이 HSA를 코드화하는 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유한다)을 성숙한 HSA 단백질 내의 아미노산 치환을 위해 조작하였다. 합성 DNA 단편을 제조하였고 (GeneArt AG, Germany 또는 DNA2.0 Inc, USA)(NcoI/Bsu36I, AvrII/SphI 또는 SacI/SphI 단편), 그것은 번역된 단백질 서열 안에 원하는 아미노산 치환(들)을 도입하기 위해 HSA-코드화 유전자 내에 점 돌연변이를 함유한다. 표 3은 HSA-코드화 유전자 안에 아미노산 치환을 도입하기 위해 사용되는 코돈을 열거한다. 변화하지 않은 아미노산을 코드화하는 합성 단편의 뉴클레오티드 서열 (즉 야생형)은 pDB3927의 서열과 동일하였다. 합성 DNA 단편을 NcoI/Bsu36I, AvrII/SphI-, SacI/Sph-소화된 pDB3927 (PCT 11527.204-WO에서 설명됨)에 하위 클론하여 pDB4006-pDB4010, pDB4083-pDB4101 및 pDB4103-pDB4111 및 pDB4194, pDB4200, pDB4202 (표 4 참조)를 생성하였다.
유사하게, HSA를 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 점 돌연변이를 함유한 BamHI/SalI 단편을 유전자 어셈블리 (DNA2.0 Inc, USA)에 의해 생성하고, BamHI/SalI-소화된 pDB3964 (WO 2010/092135에 설명됨) 안에 결찰하여 플라스미드 pDB3986-pDB3989 (표 4)를 제조한다.
HSA위 위치 573 내지 585 (KKLVAASQAALGL)(SEQ ID NO:9)로부터의 아미노산의 C-말단 가닥을 다음의 아미노산에 대해 돌연변이시켰다: 마카크 원숭이 혈청 알부민 (PKFVAASQAALA)(SEQ IDNO:10), 마우스 혈청 알부민 (PNLVTRCKDALA)(SEQ ID NO:11), 토끼 혈청 알부민 (PKLVESSKATLG)(SEQ ID NO:12) 및 양 혈청 알부민 (PKLVASTQAALA)(SEQ IDNO:13). 각 아미노산 치환을 도입하기 위해 사용된 코돈은 표 3에 제시된다. 합성 DNA 단편 (SacI/SphI)을 유전자 어셈블리 (변화하지 않은 아미노산 (즉 야생형)을 코드화하는 합성 단편의 뉴클레오티드 서열은 pDB3927의 그것과 동일하였다)에 의해 제조하고 (DNA2.0 Inc, USA), SacI/SphI-소화된 pDB3927에 하위클론하여 플라스미드 pDB4114-4117 (표 4)을 제조하였다.
플라스미드 pDB3883 (표 2), pDB4094 및 pDB4095 (표 4)를 NcoI/SacI으로 소화하고, 각 소화물로부터의 857bp 단편을 정제한 후, NcoI/SacI-소화된 pDB4006 또는 pDB4110 (8.688kb)(표 4)에 결찰하여 pDB4156-pDB4161을 제조하였다.
발현 플라스미드를 생체 내에서 제조하였다 (즉 S.cerevisiae에서의 동종 재조합을 경유하여; 갭 수복으로서 언급되는 기법 또는 생체 내 클로닝 - Orr-Weaver & Szostak. 1983. Proc . Natl . Acad . Sci . USA . 80:4417-4421). 표 4에 열거된 변형된 플라스미드를 BstEII/BsrBI으로 소화하고, 선형화된 DNA 분자를 표준 과정을 사용하여 정제하였다. 제조업체의 지시를 따라 Qiagen PCR-정제 키트를 사용하여 정제된, 각각의 BstEII/BsrBI 소화된 DNA 100ng을 개별적으로 100ng의 Acc65I/BamHI-소화된 pDB3936 (WO 2010/092135에 개시됨)과 혼합하여 아래에서 설명되는 시그마 효모 형질전환 키트를 사용하여 직접 S. cerevisiae BXP10cir0을 형질전환하는 데 사용하였다.
플라스미드 | HSA의 아미노산 치환 |
pDB3986 | HSA H440Q |
pDB3987 | HSA H464Q |
pDB3988 | HSA H510Q |
pDB3989 | HSA H535Q |
pDB4006 | HSA K573A |
pDB4007 | HSA E492T/N503K/K541A |
pDB4008 | HSA K541G |
pDB4009 | HSA K541D |
pDB4010 | HSA D550N |
pDB4083 | HSA D494E/Q417H |
pDB4084 | HSA Q417A |
pDB4085 | HSA P499A |
pDB4086 | HSA K500A |
pDB4087 | HSA K536A |
pDB4088 | HSA P537A |
pDB4089 | HSA K538A |
pDB4090 | HSA E492G/V493P/K538H/K541N/E542D |
pDB4091 | HSA E492P/N503K/K541G/E542P |
pDB4092 | HSA N503K |
pDB4093 | HSA N503H |
pDB4094 | HSA E492G/N503K |
pDB4095 | HSA E492G/N503H |
pDB4096 | HSA E492T |
pDB4097 | HSA N503D |
pDB4098 | HSA E492T/N503D |
pDB4099 | HSA K538H |
pDB4100 | HSA K541A |
pDB4101 | HSA K541N |
pDB4103 | HSA E542D |
pDB4104 | HSA E542P |
pDB4105 | HSA D550E |
pDB4106 | HSA E492H/E501P/N503H/E505D/T506S/T540S/K541E |
pDB4107 | HSA A490D/E492T/V493L/E501P/N503D/A504E/E505K/T506F/K541D |
pDB4108 | HSA E501A |
pDB4109 | HSA E501Q |
pDB4110 | HSA K573P |
pDB4111 | HSA E492G/K538H/K541N/E542D |
pDB4114 | HSA K573P/L575F/G584A |
pDB4115 | HSA K573P/K574N/A577T/A578R/S579C/Q580K/A581D/G584A |
pDB4116 | HSA K573P/A577E/A578S/Q580K/A582T |
pDB4117 | HSA K573P/A578S/S579T/G584A |
pDB4156 | HSA E492G K573A |
pDB4157 | HSA E492G N503K K573A |
pDB4158 | HSA E492G N503H K573A |
pDB4159 | HSA E492G K573P |
pDB4160 | HSA E492G N503K K573P |
pDB4161 | HSA E492G N503H K573P |
pDB4194 | HSA D550E |
pDB4200 | HSA K574N |
pDB4202 | HSA Q580K |
원래의 프라이머 | 사용된 코돈 |
||
xAP216 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCAGGTGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 14) | Gly | GGT |
xAP217 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCAGAAGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 15) | Glu | GAA |
xAP218 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCAGACGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 16) | Asp | GAC |
xAP219 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCAGTTGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 17) | Val | GTT |
xAP220 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCAAGAGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 18) | Arg | AGA |
xAP221 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCAAACGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 19) | Asn | AAC |
xAP222 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCAATGGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 20) | Met | ATG |
xAP223 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCAATTGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 21) | Ile | ATT |
xAP224 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCAACCGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 22) | Thr | ACC |
xAP225 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCATGGGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 23) | Trp | TGG |
xAP226 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCATGTGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 24) | Cys | TGT |
xAP227 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCATACGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 25) | Tyr | TAC |
xAP228 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCATTGGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 26) | Leu | TTG |
xAP229 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCATTCGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 27) | Phe | TTC |
xAP230 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCATCTGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 28) | Ser | TCT |
xAP231 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCACAAGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 29) | Gln | CAA |
xAP232 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCACACGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 30) | His | CAC |
xAP233 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCACCAGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 31) | Pro | CCA |
xAP234 | CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCATAAGAATTCAACGCTG (SEQ ID NO: 32) | STOP | taa |
xAP235 | GAATT AAGCTT ATTACAAACCCAAAGCAGCTTGGGAAGC (SEQ ID NO: 33) |
원래의 프라이머 |
사용된 코돈
|
||
xAP187 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTACCACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 34) | Gly | GGT |
xAP188 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTTTCACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 35) | Glu | GAA |
xAP189 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTATCACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 36) | Asp | GAT |
xAP190 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTAACACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 37) | Val | GTT |
xAP191 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTTCTACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 38) | Arg | AGA |
xAP192 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTATTACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 39) | Asn | AAT |
xAP193 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTCATACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 40) | Met | ATG |
xAP194 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTAATACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 41) | Ile | ATT |
xAP195 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTAGTACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 42) | Thr | ACT |
xAP196 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTCCAACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 43) | Trp | TGG |
xAP197 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTACAACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 44) | Cys | TGT |
xAP198 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTATAACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 45) | Tyr | TAT |
xAP199 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTCAAACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 46) | Leu | TTG |
xAP200 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTAAAACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 47) | Phe | TTT |
xAP201 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTAGAACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 48) | Ser | TCT |
xAP202 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTTTGACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 49) | Gln | CAA |
xAP203 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTATGACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 50) | His | CAT |
xAP204 | ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTTTAACCCTCCTCG (SEQ ID NO: 51) | STOP | taa |
xAP205 | AATGCTG CCATGG AGATCTGCTTGAATGTGCTGATG (SEQ ID NO: 52) |
방법 4.
HSA
K500
및
K573
순열 라이브러리
PCR을 사용하여 성숙한 HSA의 아미노산 500 또는 573을 코드화하는 코돈이 또 다른 비-야생형 아미노산 및 종결 코돈 (K5XXSTOP)으로 변화된 (돌연변이된) 2개의 순열 라이브러리를 제조하였다. 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드 (표 5 및 표 5)를 HSA-코드화 DNA를 증폭시키기 위하여 디자인하여 원하는 변화를 통합시켰다. 즉, 위치 500에서의 변화에 대해서는 pDB4082 (도 1)를 주형 DNA로서 사용하였다. pDB4082는 pDB2305 (EP 1788084에서 개시됨)의 유도체로, 다음과 같이 제조하였다. pDB2305 (도 2)를 NsiI/SpeI으로 소화시키고, 생성된 8.77kb의 NsiI 단편을 자체 결찰하여 pDB4005 (도 3)을 만들었다. 합성 DNA 단편 (BsaI/SphI)을 유전자 어셈블리 (DNA2.0 Inc, USA)(SEQ ID NO:1)에 의해 제조하고 (PRB1 프로모터의 3' 영역, 변형된 융합 리더 서열, HSA를 코드화하는 뉴클레오티드 서열 및 변형된 ADH1 터미네이터의 5' 영역을 함유한다), HindIII/Sph1-소화된 pDB4005 (도 3)에 결찰시켜서 pDB4082를 제조하였다. 주. PRB1 프로모터 부위의 HindIII 부위는 제거되었고, HSA를 코드화하는 뉴클레오티드 서열 내의 SacI 부위가 도입되었다.
HSA의 위치 500에 대한 순열 라이브러리에 대해, SalI/HindIII 부위 (플라스미드 지도 pDB4082, 도 1) 사이의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 HSA를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 New England Biolabs Phusion 키트 (표 7)와 표 5에 열거된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제조하였다. 표 8은 사용된 PCR 방법을 설명한다.
HSA의 아미노산 위치 573에서의 순열 라이브러리는 주형으로서 pDB3927을 사용하여 제조하였고, 표 6에 열거한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 NcoI과 Bsu36I 부위 사이의 것에 상응하는 알부민-코드화 DNA를 증폭시키는 것을 포함하였다.
500 라이브러리 | 573 라이브러리 | |
20□l 완충액 HF (5X) | ||
2□l dNTP 혼합물 (10mM) | ||
2□l 올리고뉴클레오티드 (10□M) | xAP235 | xAP205 |
2□l 올리고뉴클레오티드 (10□M) | xAP216-xAP234 | xAP187-xAP204 |
1□l 융합 중합효소 | ||
1□l 주형 DNA (~5ng) | pDB4082 | pDB3927 |
72□l dH2O |
98℃에서 2분 동안 | 1 사이클 |
98℃에서 10초 동안 | 35 사이클 |
57℃에서 30초 동안 | |
72℃에서 20초 동안 | |
72℃에서 5분 동안 | 1 사이클 |
위치 500 및 573에서 기초한 알부민 변이체에 대해, 각각의 PCR-생성물을 Qiagen PCR-클린 업 키트를 사용하여 (제조업체 지시사항을 따라) 정제하고, SalI/HindIII (위치 500 라이브러리) 또는 NcoI/Bsu36I (위치 573 라이브러리)로 소화시켰다. 그런 다음 소화된 DNA를 Qiagen PCR-클린 업 키트를 사용하여 정제하고 각각 SalI/HindIII- 또는 NcoI/Bsu36I-소화된 pDB4082 또는 pDB3927에 결찰하여 동등한 천연 서열을 대체하였다. 결찰물을 대장균 DH5α에 형질전환하고, 계속해서 Qiagen miniprep 키트 (제조업체의 지시사항을 따름)를 사용하여 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하고, 정확한 구성물을 제한 분석에 의해 확인하였다. 이것으로 위치 500 또는 573에서의 아미노산에 대한 코돈에 상응하는 그것들의 서열에서만 상이한 알부민 유전자를 함유하는 (각각 표 5와 6) 플라스미드 pDB4204-pDB4222 (위치 500 라이브러리) pDB4173 내지 pDB4190 (위치 573 라이브러리)의 모음이 생성되었다. 각 플라스미드의 특정 변화를 서열화에 의해 확인하였다.
그 결과의 플라스미드를 사용하여 상기에서 설명된 바와 같은 생체 내 클로닝에 의해 발현 플라스미드 및 알부민 융합 생성 효모를 제조하였다. 즉, S.cerevisiae를 시그마 효모 형질전환 키트 (아래에서 설명됨)를 사용하여, 100ng의 BstEII/BsrBI-소화된 HSA 변이체 함유 플라스미드와 100ng의 Acc65I/BamHI 소화된 pDB3936의 혼합물을 사용하여 형질전환하였다.
S.
cerevisiae
의 형질전환
S.cerevisiae BXP10 cir0 (WO/2001/079480에서 이미 기술됨) 또는 스트레인 A cir0 (WO/2005/061718)을 YEPD 플레이트 (1% (w/v) 효모 추출물, 2% (w/v) 박토펩톤, 2% (w/v) 글루코오스), 1.5% 아가) 위에 스트리킹하고, 4일 동안 30℃에서 성장시킨 후 형질전환시켰다. 1㎍의 전체 플라스미드 (즉 원형 플라스미드) 또는, 갭 수복을 위해서는 플라스미드를 함유하는 100ng의 BstEII/BsrBI- 또는 NsiI/PvuI-소화된 HSA 변이체 또는 HSA 변이체 융합물 및 100ng의 Acc65I/BamHI 소화된 pDB3936을 사용하여 시그마 효모 형질전환 키트를 사용하고, 변형된 리튬 아세테이트 방법 (Sigma 효모 형질전환 키트, YEAST-1, 프로토콜 2; Ito et미. (1983) J. Bacteriol., 153, 16; Elble, (1992) Biotechniques, 13, 18)을 사용하여 S.cerevisiae를 형질전환시켰다. 프로토콜을 실온에서 4시간 동안 형질전환체를 인큐베이션한 후에 열 충격을 가하는 것으로 약간 수정하였다. 열 충격 후에 세포를 간단하게 원심분리한 다음, 200㎕의 1M 소르비톨에 재현탁한 후, BMMD 아가 플레이트 위에 번지게 하였는데, BMMD의 조성은 문헌에 기술되어 있다 (Sleep et al., (2001), Yeast, 18, 403). 플레이트를 30℃에서 4일 동안 인큐베이션한 후 개별적인 콜로니를 새로운 BMMD 플레이트 위에 패치하였다. 효모 스트레인 번호는 표 2에 열거된다.
각 효모 스트레인에 대한 스톡을 다음과 같이 제조하였다: BMMD 육즙을 각 효모 패치의 무거운 루프로 접종하고 24시간 동안 30℃에서 200rpm에서 궤도에 따라 진동하면서 성장시켰다. 세포를 1900×g에서 5분 동안 Sorval RT600 원심분리기에서 원심분리에 의해 수득하고, 15mL의 상층액을 제거한 후 트레할로오스 40% (w/v)에 의해 대체하였다. 세포를 재현탁하고, 한냉 바이알 (1mL)에 옮겨서 -80℃에서 보관하였다.
S.
cerevisiae
의 진동 플라스크 성장
BMMD (레시피, 아미노산과 황산 암모늄 (Difco)이 없는 0.17% (w/v)) 효모 질소 베이스, 37.8mM 황산 암모늄, 29mM 시트르산, 142mM 이나트륨 수소 오르토포스페이트 탈수화물 pH 6.5, 2% (w/v) 글루코오스) 배지 (10mL)를 각 효모 스트레인으로 접종하고 12시간 동안 30℃에서 200rpm에서 궤도에 따라 진동하면서 성장시켰다. 각 출발 배양의 일정액 (4mL)을 사용하여 2×200mL BMMD 배지를 접종하고, 36시간 동안 30℃에서 200rpm에서 궤도에 따라 진동하면서 성장시켰다. 세포를 GF-D 예비필터 (Whatman)를 포함하는 0.2㎛ 진공 필터 막 (Stericup, Millipore)을 통해 여과하여 수득하고, 상층액은 정제를 위해 보유하였다.
일차 농축
보유한 배양 상층액을 Omega 10KD (0.093sq.m2) 필터 (LV Centramate TM 카세트, Pall Filtron)가 장착되어 있는 Pall Filtron LV 시스템을 사용하는 Tangential Flow Filtration을 사용하여, 20psi의 경막 압력 및 180mL.분-1의 순환 속도를 사용하여 농축하였다.
여과
유가식 배양을 10L Sartorius Biostat C 발효기에서 30℃에서 수행하였다; pH를 모니터하고 필요에 따라 암모니아 또는 황산을 첨가함으로써 조정하였다. 암모니아는 배양에 대한 질소 공급원을 제공하였다. 용해된 산소 수준을 모니터하고, 교반기 속도에 연결하여 20%보다 큰 포화 수준을 유지하였다. 접종물을 진동 플라스크에서 완충된 최소 배지 (레시피)중에서 성장시켰다. 배치 단계에 대해, 배양을 2% (w/v) 슈크로오스를 함유하고 있는 발효기 배지 (발효기 부피의 대략 50%) 안으로 접종하였다. 공급 단계는 자동적으로 용해된 산소의 양이 급속히 상승함으로써 야기되었다. 슈크로오스를 설정된 명목상의 성장 속도로 공급 속도를 조절함으로써 성장-제한 농도에서 유지하였다. 속도는 전체가 본질적으로 콜린스에 의해 설명된 것과 같이 50% (w/v) 슈크로오스를 함유하는 발현 배지로 구성되었다 (Collins, S.H., (1990) Production of secreted proteins in yeast, in: T.J.R. Harris (Ed.) Protein production by biotechnology, Elsevier, London, pp.61-77).
GP
-
HPLC
정량
정제된 알부민 변이체, 융합물 및 포합체를 다음과 같이 GP-HPLC 및 정량에 의해 분석하였다. 25μL의 주입액을 6.0mm 폭×40mm 길이 TSK SW 가드 칼럼 (Tosoh Bioscience)이 부착되어 있는 7.8mm 폭×300mm 길이 TSK G3000SWXL 칼럼 (Tosoh Bioscience) 위에 만들었다. 샘플을 25mM 인산 나트륨, 100mM 황산 나트륨, 0.05% (w/v) 아지드화 나트륨, pH 7.0 중에서 1mL/분으로 크로마토그래피하였다. 샘플을, 농도를 알고 있는 (10mg/mL) 재조합 사람 알부민 표준에 비교한 피크 면적에 의해 280nm에서 UV 검출에 의해 정량하고, 그것의 상대 소멸 계수에 대해 보정하였다.
진동 플라스크로부터의 알부민
변이체의
정제
알부민 변이체를 진동 플라스크로부터 (배양 상층액 또는 농축된 배양 상층액 중 하나), 알부민 친화성 매트릭스 (AlbuPureTM-ProMetic BioSciences, Inc.)를 사용하는 단일 크로마토그래피 단계를 사용하여 정제하였다. 크로마토그래피는 처음부터 끝까지 240cm/h의 일정한 선속도로 수행하였다. 배양 상층액을 50mM 아세트산 나트륨 pH 5.3으로 예비-평형화되어 있는 6cm 상 높이, 2.0mL 충전된 상에 적용하였다. 로딩 후에 칼럼을 10 칼럼 부피 (CV)의 평형화 완충액으로 세척한 다음, 50mM 아세트산 암모늄 pH 8.0 (10CV)으로 세척하였다. 생성물을 50mM 아세트산 암모늄 10mM 옥타노에이트 pH 8.0, 50mM 아세트산 암모늄 30mM 옥타노산 나트륨 200mM 염화 나트륨 pH7.0 또는 200mM 티오시안산 칼륨으로 용출하였다. 칼럼을 0.5M NaOH (3cv) 및 20mM NaOH (3.5cv)로 세정하였다. 각 알부민 변이체로부터의 용출 분획을 농축하고 10부피의 50mM 염화 나트륨에 대해 다이아필터하였다 (임의로 다이아필터 컵이 장착되어 있는 Vivaspin20 10,000 MWCO PES, Sartorius). 정제된 알부민 변이체를 상기에서 설명한 것과 같이 GP-HPLC에 의해 정량하였다.
진동 플라스크로부터 알부민-융합
변이체의
정제
알부민-융합 변이체를 진동 플라스크 배양 상층액으로부터 알부민 친화성 매트릭스 (AlbuPureTM-ProMetic BioSciences, Inc.)를 사용하는 단일 크로마토그래피 단계를 사용하여 정제하였다. 크로마토그래피는 처음부터 끝까지 240cm/h의 일정한 선속도로 수행하였다. 배양 상층액 또는 농축된 배양 상층액을 50mM 아세트산 나트륨 pH 5.3으로 예비-평형화되어 있는 6cm 상 높이, 2.0mL 충전된 상에 적용하였다. 로딩 후에 칼럼을 10 칼럼 부피 (cv)의 평형화 완충액으로 세척한 다음, 50mM 아세트산 암모늄 pH 8.0 (10cv)으로 세척하였다. 생성물을 50mM 아세트산 암모늄 10mM 옥타노에이트 pH 8.0, 50mM 아세트산 암모늄 30mM 옥타노산 나트륨 200mM 염화 나트륨 pH7.0, 50mM 아세트산 암모늄 100mM 옥타노산 나트륨 pH 9.0 또는 200mM 티오시안산 칼륨으로 용출하였다. 칼럼을 0.5M NaOH (3cv) 및 20mM NaOH (3.5cv)로 세정하였다. 각 알부민 변이체-융합물로부터의 용출 분획을 농축하고 10부피의 25mM 트리스, 150mM NaCl, 2mM KCl, pH 7.4에 대해 다이아필터하였다 (임의로 다이아필터 컵이 장착되어 있는 Vivaspin20 10,000 MWCO PES, Sartorius). 정제된 알부민-융합 변이체를 상기에서 설명한 것과 같이 GP-HPLC에 의해 정량하였다.
발효로부터 알부민
변이체의
정제
알부민 변이체를 고세포 밀도 유가식 배양 상층액으로부터 Sorvall RC 3C 원심분리기 (DuPont)를 사용하는 원심분리에 의한 분리 후에 정제하였다. 배양 상층액을 수탁 합성된 알부민 친화성 매트릭스 (AlbuPureTM-ProMetic BioSciences, Inc.)로 충전된 11cm 상 높이 칼럼 8.6mL 충전된 상을 통해 상기에서 설명된 것과 같이 크로마토그래피하였다. 생성물을 상기에서 설명한 용출 완충액을 사용하여 120cm/h의 유속으로 용출하였다. 용출 분획(들)을 GP-HPLC와 순도에 대해 환원 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 필요에 따라 농축하고 (Vivaspin20 10,000 MWCO PES), Superdex 75가 충전된 2.4×96cm 칼럼에 적용하여 25mM 트리스, 150mM NaCl, 2mM KCl, pH 7.4중에서 39cm/h의 유속으로 작동시켰다. 피크를 분획화하고, GP-HPLC에 의해 분석한 다음 모아서 관심의 단량체 단백질을 생성하였다. 모아진 분획을 농축하였다 (Vivaspin20 10,000 MWCO PES, Sartorius).
수용체 (FcRn) 결합 특성에 대해 분석하고자 하는 및 다른 분석을 위한 모든 단백질을 상기에서 설명한 것과 같이 GP-HPLC에 의해 정량하였고 그것의 상대 소멸 계수에 대해 보정하였다.
실시예
2. 혈액 유도된
HSA
및 재조합 사람 알부민의 수용체 (
shFcRn
) 결합 특성의 측정
본질적으로 지방산이 없는 HSA (Sigma-Aldrich)를 추가로 문헌에 설명되어 있는 것과 같이 크기 축출 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (Andersen et al (2010). J. Biol. Chem. 285, (7),4826-4836). 10μM의 단량체 HSA와 rHA를 상기에서 설명된 것과 같이 SPR에 의해 분석하고 그 데이터를 도 4에 나타낸다.
HSA (혈액 유도된)와 재조합 사람 알부민 (Recombumin)을 동일 농도 (10μM)에서 고정된 shFcRn에 대한 샘플 결합에 대해 (각각 pH 6.0, pH 7.4) 직접 비교한 결과 둘 다 가역적이었고 pH 의존적이었다. 또한 HSA 대 재조합 사람 알부민의 비교 (Bosse et al (2005). J. Clin. Pharmacol. 45;57-67)는 생체 내 사람 연구에서 동등한 반감기를 증명하였다.
실시예
3. 알부민
변이체의
수용체 (
shFcRn
) 결합 특성의 측정
두 개의 수립된 FcRn 결합 분석, ELISA 및 SPR을 사용하였다. 이들 두 분석 사이에는 다음과 같은 주요한 차이가 있다: ELISA 시스템에서 HSA는 웰에 직접 코팅되고 shFcRn-GST가 용액으로 첨가되는 한편, SPR 분석에서 shFcRn-GST가 CM5 칩에 고정되고 HSA가 용액으로 주입된다. pH는 두 시스템에서 모두 변할 수 있다.
변이체를 ELISA를 사용하여 pH 6.0과 pH 7.4에서 분석하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다. ELISA 값은 이중실험의 평균으로서 나타낸다.
변이체를 SPR을 사용하여 pH 6.0과 pH 7.4에서 분석하였다. 그 결과를 도 6에서 0.2μM의 변이체의 농도를 사용하여, 도 7에서 1μM의 변이체의 농도를 사용하여 변이체의 대표적인 수로 나타낸다.
도 6 및 7에 제시된 SPR 데이터를 표준화하고, 각 농도에서의 상대적인 변이체 결합을 각각 도 8A 및 B에 나타낸다.
분석 결과는 시험된 모든 변이체가 pH 6.0에서 수용체에 대해 특징적인 결합을 나타내지만, pH 7.4에서는 결합이 없음을 나타낸다. 변이체 D494N,Q,A, E495Q,A, T496A, 및 D494N+T496A는 HSA에 비교하여 수용체에 대한 감소된 결합을 나타낸다.
실시예
4. 알부민
변이체의
수용체 (
shFcRn
/
smFcRn
) 결합 특성의 측정
아래의 SPR 분석 방법을 사용하여 결합 상수 Ka, 분해 상수 Kd 및 결합 상수 KD를 사람 및 마우스 FcRn에 대한 HSA 및 마우스 혈청 알부민 (MSA) 결합에 대해 계산하였다 (표 9).
SPR 분석 - SPR 분석을 CM5 칩을 사용하여 BIAcore 3000 기기 (GEHealthcare) 상에서 수행하고, smFcRn-GST 및 shFcRn-GST 변이체 또는 smFcRn의 고정을 아민 결합 키트 (GE Healthcare)를 사용하여 수행하였다. 단백질 샘플 (10㎍/ml)을 10mM 아세트산 나트륨 pH 4.5 (GE Healthcare)에 주입하였다. (모든 과정은 제조업체에 의해 설명된 것과 같다). 표면 상의 미반응 부분을 1M 에탄올아민으로 차단하였다. 모든 실험에 대해 인산염 완충액 (67mM 인산염 완충액, 0.15M NaCl, 0.005% TWEEN®20), pH 6.0 또는 pH 7.4 또는 HBS-P 완충액 (0.01M HEPES, 0.15M NaCl, 0.05% 계면활성제 P20), pH 7.4를 작동 완충액 또는 희석 완충액으로서 사용하였다. 동역학적 측정을 저밀도 고정화된 표면 (100-200 공명 유닛 (RU))을 사용하여 수행하였다. 연속적으로 희석한 hIgG1 (2000.0-31.2nM), mIgG1 (1000.0-15.6nM), MSA (20.0-0.3μM) 및 HSA (200.0-3.1μM)를 pH 6.0 또는 pH 7.4에서, 50㎕/분의 유속에서, 25℃에서 주입하였다. 추가의 결합을, HSA (10μM), MSA (5μM), hIgG1 (100nM) 또는 mIgG1 (100nM)을 단독으로 또는 한 번에 두 가지를 25℃에서 20㎕/분의 유속으로, pH 6.0에서 고정된 shFcRn (~600 RU) 또는 smFcRn (~600 RU) 상에 주입함으로써 기록하였다. 경합성 결합을 shFcRn (50nM) 또는 smFcRn (100nM)을 단독으로 또는 상이한 양의 HSA 또는 MSA (10.0-0.05μM)와 함께 고정된 HSA (~2600 RU) 또는 MSA (~2000 RU) 상에 주입함으로써 측정하였다. 모든 경우에, 비특이적 결합과 벌크 완충액 효과를 보정하기 위하여, 대조 표면과 블랭크 주입으로부터 얻어진 반응을 각 상호작용 곡선으로부터 뺐다. 동역학적 속도 값을 BIAevaluation 4.1 소프트웨어에 의해 제공된 미리 규정된 모델 (Langmuir 1:1 리간드 모델, 이종성 리간드 모델 및 고정상 친화성 모델)을 사용하여 계산하였다. 평균 제곱을 나타내는 통계값 χ2에 의해 기술되는 조정 근사치는 모든 친화성 평가에서 2.0보다 아래였다.
알부민 종 | FcRn 종 | Ka (103/MS) | Kd (103/s) | KD (μM) | KD Req. (μM) |
MSA | 마우스 | 4.2±0.5 | 39.4±3.1 | 9.3±0.4 | NDd |
MSA | 사람 | 3.8±0.0 | 3.1±0.1 | 0.8±0.2 | ND |
HSA | 마우스 | NA | NA | NA | 86.2±4.1 |
HSA | 사람 | 2.7±1.3 | 12.2±5.9 | 4.5±0.1 | 4.6±0.5 |
KD는 BIAevaluation 4.1 소프트웨어를 사용하여 생성하였다. 처음부터 끝까지 Langmuir 1:1 리간드 모델을 사용하였다. 동역학적 값은 삼중 실험의 평균을 나타낸다. ND는 측정되지 않는 것을 의미한다. NA는 획득되지 않은 것을 의미한다.
실시예
5. 사람
FcRn
에 대한 다른 종으로부터의 알부민의 결합
상업적으로 활용할 수 있는 동물 알부민 (Sigma-Aldrich 또는 Calbiochem 중 어느 하나)을 추가로 문헌에 설명된 것과 같이 정제하였다 (Andersen et al (2010), J. Biol. Chem. 285 (7),4826-4836). 당나귀 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민, 양 혈청 알부민, 토끼 혈청 알부민, 개 혈청 알부민, 햄스터 혈청 알부민, 기니아 피그 알부민, 쥐 혈청 알부민 및 닭 혈청 알부민의 shFcRn에 대한 결합을 상기 물질 및 방법에서 설명한 기법을 사용하여 측정하였다. ELISA 결과를 도 9A-D에 도시하고, 상대 결합은 도 9E에 나타낸다.
SPR 결과를 도 10에 나타내는데, 각 알부민 종에 대한 pH 6.0 및 pH 7.4에서의 결합을 나타낸다. 아래의 표 10은 ELISA 및 SPR을 사용하여 측정된 상대 결합 반응을 개략적으로 나타낸다.
알부민 종 |
shFcRn | |||
ELISA | SPR | |||
pH 6.0 | pH 7.4 | pH 6.0 | pH 7.4 | |
사람 | ++(+) | - | ++(+) | - |
당나귀 | +++ | - | ++ | - |
소 | ++ | - | ++ | - |
양 | +/- | - | - | - |
염소 | +/- | - | - | - |
토끼 | ++++ | - | +++ | - |
개 | NDa | ND | +++ | - |
기니아 피그 | ++++ | + | ++++ | + |
햄스터 | +++ | - | +++ | - |
쥐 | +++ | - | +++ | - |
마우스 | +++ | - | +++ | - |
닭 | - | - | - | - |
상대 결합 반응은 가장 강한 것 (++++)으로부터 가장 약한 것 (+)과 결합이 없는 것 (-)으로 범주화된다.
a: 측정되지 않음 (ND).
가장 강한 결합으로부터 가장 약한 결합의 등급 범위는 다음과 같다: 기니아 피그=/>토끼>햄스터/개>쥐/마우스>당나귀>사람>소>염소/양>닭. 이 데이터는 동물 알부민이 shFcRn에 대해 상이한 친화성을 가지고 있음을 나타낸다.
실시예
6.
shFcRn
에 대한
HSA
변이체의
동역학
본 발명에 따르는 변이체에 대한 결합 상수를 물질 및 방법에서 설명된 방법에 따라 측정하였다.
알부민
변이체 |
Ka
(10 3 /Ms) |
kd
(10 -3 /s) |
KD
(μM) |
KD Req
(μM) |
WT | 3.2±0.2 | 15.5±2.5 | 4.8 | 5.4 |
D494N | 1.7±0.0 | 18.6±0.0 | 10.9 | 11.8 |
D494A | 2.3±0.1 | 53.4±0.3 | 23.2 | 17.0 |
D494Q | 2.1±0.0 | 58.2±3.8 | 27.7 | ND |
E495Q | 2.5±0.0 | 24.1±0.2 | 9.6 | 10.9 |
E495A | 2.1±0.0 | 14.0±0.0 | 7.0 | 8.6 |
D494N+T496A | 2.5±0.0 | 11.0±0.0 | 4.4 | 5.5 |
T496A | 2.3±0.0 | 11.7±0.5 | 5.1 | 7.1 |
E492G | 4.1±0.0 | 11.0±0.0 | 2.7 | ND |
KD는 BIAevaluation 4.1 소프트웨어를 사용하여 생성하였다. 처음부터 끝까지 Langmuir 1:1 리간드 모델을 사용하였다. 동역학적 값은 삼중 실험의 평균을 나타낸다. ND는 측정되지 않는 것을 의미한다.
결과는 SPR 및 ELISA 데이터를 토대로 실시예 3에서의 결론과 일치하지만 또한 E492G가 그것의 수용체에 대해 증가된 친화성을 나타내는 것을 보여준다.
실시예
7.
HSA
변이체의
경합 분석
실시예 1에서 제조한 HSA 변이체와 WT HSA의 경합 분석을 실시예 4에서 설명한 방법을 사용하여 수행하였다. 그 결과를 도 15에 나타낸다. 결과는 변이체 E492G가 E492H E492P 및 E492G+V493P와는 달리, shFcRn에 대해 HSA보다 더 강력한 결합을 가지는 것을 나타낸다.
실시예
8.
Q417
치환의 분석
실시예 1의 방법을 사용하여 치환 Q417A와 D494E+Q417H를 가지는 HSA 변이체를 구성하였다. 이들 변이체의 동역학적 특성을 물질 및 방법에서 설명한 방법을 사용하여 시험하고 그 결과를 표 12에 나타낸다.
알부민 변이체a | ka (103/Ms) | kd (10-3/s) | KDb (μM) | KD Reqc (μM) |
WT | 3.2±0.2 | 15.5±2.5 | 4.8 | 5.4 |
Q417A | 3.2±0.1 | 26.0±0.0 | 8.1 | ND |
D494E+Q417H | 3.1±0.1 | 20.5±0.5 | 6.6 | ND |
a: HSA 변이체의 희석물을 고정된 shFcRn (~1500 RU) 상에 주입하였다.
b: 동역학적 속도 상수를 간단한 1차수 (1:1) 이중분자 상호작용 모델을 사용하여 얻었다.
c: 고정상 친화성 상수를 BIAevaluation 4.1 소프트웨어에 의해 공급된 평형 (Req) 결합 모델을 사용하여 얻었다. 동역학적 값은 삼중실험의 평균을 나타낸다.
d: 측정되지 않음 (ND).
데이터는 변이체 Q417A와 D494E+Q417H가 야생형 HSA보다 약하게 수용체에 결합하는 것을 보여준다.
실시예
9. 위치 499, 500, 536, 537, 538 및 573에서의
HSA
변이체의
분석
실시예 1의 방법을 사용하여 치환 P499A, K500A, K536A, P537A, K538A 및 K573A를 가지는 HSA 변이체를 제조히였다. 이들 변이체의 수용체 결합 특성을 물질 및 방법에서 설명한 것과 같이 시험하였다. 그 결과를 도 11에 나타낸다.
데이터는 변이체 P499A, K536A, P537A 및 K538A가 shFcRn에 대해 HSA에 비해 감소된 결합 친화성을 가졌음을 증명하였다. 변이체 K500A는 shFcRn에 대한 그것의 결합 능력을 거의 완전하게 잃어버렸고, K573A는 shFcRn에 대해 HSA에 비해 증가된 결합 친화성을 나타냈다.
실시예
10.
HSA
의 위치 501에서의
변이체의
분석
실시예 1의 방법을 사용하여 치환 E501A와 E501Q를 가지는 HSA 변이체를 제조하였다. 이들 변이체의 동역학적 특성을 물질 및 방법에서 설명한 것과 같이 시험하였다.
알부민 변이체a | ka (103/Ms) | kd (10-3/s) | KDb (μM) | KD Reqc (μM) |
WT | 3.2±0.2 | 15.5±2.5 | 4.8 | 5.4 |
E501A | 3.3±0.0 | 26.0±0.0 | 7.8 | ND |
E501Q | 2.7±0.1 | 15.5±0.5 | 5.7 | ND |
a: HSA 변이체의 희석물을 고정된 shFcRn (~1500 RU) 상에 주입하였다.
b: 동역학적 속도 상수를 간단한 1차수 (1:1) 이중분자 상호작용 모델을 사용하여 얻었다.
c: 고정상 친화성 상수를 BIAevaluation 4.1 소프트웨어에 의해 공급된 평형 (Req) 결합 모델을 사용하여 얻었다. 동역학적 값은 삼중실험의 평균을 나타낸다.
d: 측정되지 않음 (ND).
데이터는 변이체 E501A 및 E501Q가 HSA에 비해 약간 더 감소된 shFcRn에 대한 결합 친화성을 가지는 것을 보여준다.
실시예
11. 위치 573에서의
HSA
변이체의
분석
실시예 1의 방법을 사용하여 위치 573에서 치환을 가지는 HSA 변이체를 제조하였다. 위치 573에서의 모든 변이체를 제조하였고, 이들 변이체의 수용체 결합 특성을 물질 및 방법에서 설명한 것과 같이 시험하되, SPR 분석은 pH 5.5에서 수행하였다. 그 결과를 아래의 표 14 및 도 12와 13에 나타낸다.
알부민 변이체 a |
ka
(10 3 /Ms) |
kd
(10 -3 /s) |
KD
b
(nM) |
WT | 9.0±0.0 | 6.9±0.1 | 766 |
K573A | 7.4±0.0 | 2.2±0.0 | 297 |
K573C | 4.2±0.0 | 1.1±0.2 | 262 |
K573D | 7.9±0.2 | 4.1±0.3 | 518 |
K573E | 9.0±0.0 | 2.9±0.0 | 322 |
K573F | 7.8±0.1 | 0.5±0.1 | 74 |
K573G | 8.5±0.0 | 1.8±0.1 | 212 |
K573H | 12.0±0.2 | 0.8±0.0 | 68 |
K573I | 8.6±0.0 | 0.8±0.2 | 99 |
K573L | 5.1±0.2 | 2.3±0.1 | 451 |
K573M | 8.6±0.0 | 1.9±0.0 | 221 |
K573N | 7.3±0.2 | 1.1±0.3 | 151 |
K573P | 9.8±0.0 | 0.6±0.1 | 61 |
K573Q | 7.7±0.2 | 2.6±0.0 | 338 |
K573R | 8.5±0.0 | 3.0±0.2 | 353 |
K573S | 7.9±0.2 | 1.2±0.2 | 152 |
K573T | 8.7±0.2 | 1.1±0.1 | 126 |
K573V | 8.1±0.0 | 0.6±0.2 | 80 |
K573W | 15.0±0.2 | 0.4±0.3 | 29 |
K573Y | 22.0±0.1 | 0.5±0.1 | 23 |
K573STOP | ND | ND | 141000 |
a: HSA 변이체의 희석물을 고정된 shFcRn (~1500 RU) 상에 주입하였다.
b: 동역학적 속도 상수를 간단한 1차수 (1:1) 이중분자 상호작용 모델을 사용하여 얻었다.
c: 고정상 친화성 상수를 BIAevaluation 4.1 소프트웨어에 의해 공급된 평형 (Req) 결합 모델을 사용하여 얻었다. 동역학적 값은 삼중실험의 평균을 나타낸다.
d: 측정되지 않음 (ND).
결과는 위치 573에 치환을 가지는 모든 변이체가 WT HSA에 비교하여 shFcRn에 대한 개선된 결합을 가지는 것을 나타낸다. 특히 변이체 K573F, K573H, K573P, K573Q 및 K573Y는 shFcRn에 대해 모체 HSA보다 10배 더 낮은 KD를 가진다. 변이체 K573STOP는 위치 573에 중지 코돈을 가지는 절단된 알부민다. K573STOP 변이체에 대한 센서그램은 WT HSA에 비하여 상당히 감소된 결합을 나타내고 높은 KD를 유발하였다. 오타기리에 의해 특성확인된 (Otagiri (2009), Biol. Pharm. Bull. 32(4)527-534) 천연 변이체인 변이체 K573E에 대해 본 발명자들이 나타낸 증가된 친화성은 증가된 생체 내 반감기를 가지는 것으로 예측된다.
실시예
12. 추가의
HSA
변이체의
분석
실시예 1의 방법을 사용하여, 치환 E492G, E492G+N503H, N503H, D550E, E492G+N503K, E542P, H440Q, K541G, K541D, D550N, E492G+K538H+K541N+E542D, E492T+N503K+K541A, E492P+N503K+K541G+E542P, E492H+E501P+N503H+E505D+T506S+T540S+K541E, E492G+V493P+K538H+K541N+E542D, A490D+E492T+V493L+E501P+N503D+A504E+E505K+T506F+K541D를 가지는 HSA 변이체를 제조하였다. 이들 변이체의 수용체 결합 특성을 물질 및 방법에서 설명한 것과 같이 시험하고, 그 결과를 표 15 및 도 14에 나타낸다.
알부민 변이체 a |
Ka
(10 3 /Ms) |
kd
(10 -3 /s) |
KD
b
(μM) |
KD Req
c
(μM) |
WT | 3.2±0.2 | 15.5±2.5 | 4.8 | 5.4 |
E492G | 4.1±0.0 | 11.0±0.0 | 2.7 | ND |
E492G/N503H | 6.9±0.1 | 14.5±0.5 | 2.1 | ND |
N503H | 5.4±0.0 | 24.0±0.1 | 4.4 | ND |
D550E | 3.2±0.4 | 11.8±0.0 | 3.6 | ND |
E492G/N503K | 5.9±0.1 | 16.0±0.0 | 2.7 | ND |
E542P | 3.4±0.0 | 15.7±0.2 | 4.7 | ND |
H440Q | 3.2±0.1 | 20.8±0.0 | 6.5 | ND |
K541G | 3.2±0.0 | 23.0±0.0 | 7.1 | ND |
K541D | 2.6±0.0 | 24.0±0.0 | 9.2 | ND |
D550N | 2.5±0.0 | 30.0±0.0 | 12.0 | ND |
a: HSA 변이체의 희석물을 고정된 shFcRn (~1500 RU) 상에 주입하였다.
b: 동역학적 속도 상수를 간단한 1차수 (1:1) 이중분자 상호작용 모델을 사용하여 얻었다.
c: 고정상 친화성 상수를 BIAevaluation 4.1 소프트웨어에 의해 공급된 평형 (Req) 결합 모델을 사용하여 얻었다. 동역학적 값은 삼중실험의 평균을 나타낸다.
d: 측정되지 않음 (ND).
결과는 위치 550에 대해, E으로의 치환이 pH 6.0에서 shFcRn에 대해 증가된 친화성을 유발한 한편, N으로의 치환은 감소된 친화성을 유발했음을 나타낸다. 그러나 이 분석을 pH 5.5에서 D550E 치환에 대해 반복했을 때 친화성의 증가는 관찰되지 않았다. 아미노산 (E)에 대한 치환은 결합을 유지하고 개선한다. 그러나 변화되지 않은 아미노산에 대한 치환은 pH 6.0에서 결합을 감소시킨다. 이런 관찰을 토대로 본 발명자들은 이 위치에 대해 염기성 아미노산 (H, K 및 R)으로의 치환이 결합의 추가의 감소를 유발할 것이라고 예측하였다.
실시예
13.
His
잔기의
돌연변이
다음의 변이체들을 실시예 1에서 설명한 방법을 사용하여 제조하였다: H440Q, H464Q, H510Q 및 H535Q. 도 15는 물질 및 방법에서 설명된 것과 같이 shFcRn과 상호작용하는 이들 변이체의 센서그램을 도시한다.
변이체 H440Q는 HSA와 경합할만한 친화성으로 결합하는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로 H464Q, H510Q 및 H535Q는 sHFcRn에 대해 상당히 감소된 친화성을 나타냈다. 이것은 이들 히스티딘 잔기의 돌연변이생성이 shFcRn에 대한 HSA 결합을 상당히 감소시켰다는 이전에 공개된 관찰을 지지한다 (Wu et al (2010), PEDS, 23(10)789-798). Wu 등은 마우스에서 다이아바디(diabody) 융합 단백질 (scFv-DIII)에 대한 감소된 반감기를 보여주었고, 가장 느린 것으로부터 가장 빠른 것까지 제거 순서는 다음과 같았다: Db-DIII WT>H535A>H510A>H464A>Db. shFcRn에 대한 친화성을 토대로, 그리고 smFcRn에 비교할 때 (실시예 5), 본 발명자들은 사람에서의 제거 순서는 (글루타민 (Q) 치환의 경우) WT>H440Q>H510Q>H464Q>H535Q일 것으로 예측하였다.
실시예
14. 추가의
변이체
다음의 변이체들을 실시예 1에서 설명한 방법을 사용하여 제조하였다: HSA 의 K574N 및 Q580K. FcRn에 대한 변이체의 결합을 물질 및 방법에서 설명한 것과 같이 SPR 분석을 사용하여 시험하였고, 그 결과를 표 16에 나타낸다.
알부민 변이체 | ka (103/Ms) | kd (10-3/s) | KDb (μM) |
WT | 9.7±0.0 | 30.0±0.1 | 3.1 |
K574N | 4.9±0.1 | 8.4±0.1 | 1.7 |
Q580K | 6.0±0.0 | 9.3±0.0 | 1.5 |
실시예
15. 위치 500에서의
HSA
변이체의
분석
실시예 1의 방법을 사용하여 위치 500에서 치환을 가지는 HSA의 변이체를 제조하였다. 위치 500에서의 모든 변이체를 제조하고 이들 변이체의 수용체 결합 특성을 시험하였다. Biacore X, Biacore X100 및 센서 칩 CM5를 모든 분석에 사용하였고, 두 가지 모두 GE Healthcare에 의해 공급되었다. GeneArt AG (독일)에 의해 제조된 shFcRn (10mM 아세트산 나트륨 pH 5.0 (GE Healthcare)중에 10㎍/mL로 희석됨)을 흐름 세포 2 (FC2) 위에, 제조업체 (GE Healthcare)의 지시대로 표준 아민 결합을 통해 1600 내지 2200 반응 유닛 (RU)의 수준으로 고정시켰다. 블랭크 고정화를 참조 세포로서 작용하기 위해 그것에 대해 흐름 세포 1 (FC1) 상에 수행하였다. 분석을 안정화하기 위해, 3 내지 5의 착수 사이클을 먼저 작동시켰다. 단 재생 후 작동 완충액 (67mM 인산염 완충액, 0.15M NaCl, 0.005% 트윈 20 pH 5.75±0.25에서)을 사용하였다. WT rHA와 K500 라이브러리 변이체를 다양한 농도 (1μM 내지 150μM)에서 90초 동안 일정한 유속 (30㎕/분)으로 25℃에서 주입한 후, HBS-EP 완충액 pH 7.4 (GE Healthcare)를 사용하여 대략 초기의 기준선 RU가 회복될 때까지 (통상 12 펄스로 충분할 것이다) 표면을 재생시켰다.
그 결과를 아래의 표 17과 도 16에 나타낸다.
알부민 변이체 |
ka
(10 3 /Ms) |
kd
(10 -3 /s) |
KD
b
(μM) |
KD Req
c
(μM) |
K500R | 4.42 | 7.21 | 1.63 | |
K500I | 5.18 | 10.9 | 2.1 | |
WT | 4.24 | 9.2 | 2.2a | |
K500L | 3.73 | 11.9 | 3.2 | |
K500Q | 1.07 | 3.4 | 3.2 | |
K500V | 3.29 | 11.0 | 3.3 | |
K500Y | 3.97 | 14.6 | 3.7 | |
K500M | 2.48 | 21.5 | 8.7 | |
K500T | 1.2 | 13.4 | 11.2 | |
K500W | 0.5 | 5.4 | 11.7 | |
K500N | 1.3 | 18.2 | 14 | |
K500F | 5.17 | 73.7 | 14.3 | |
K500H | 4 | 63.8 | 16 | |
K500P | ND | ND | ND | 51* |
K500C | 2.38 | 124 | 52 | |
K500S | ND | ND - | ND | 70.2* |
K500A | 2.61 | 208 | 79.9 | |
K500D | ND | ND | ND | 83.3* |
K500G | ND | ND | ND | 95.4* |
K500E | KD 계산불가능 도 16 참조 | |||
K500 STOP | 제로 바인더 |
a. 4개 값의 평균.
b. 동역학 속도 상수는 간단한 1차수 (1:1) 이중분자 상호작용 모델을 사용하여 얻었다.
c. 안정상 친화성 상수는 BIAevaluation 4.1 소프트웨어에 의해 공급된 평형 (Req) 결합 모델을 사용하여 얻었다.
결과는 변이체 K500R 및 K500I가 shFcRn에 대하여 각각 WT HSA에 비교하여 증가되고 비교할만한 친화성을 나타낸 것을 보여준다. 변이체 K500E는 고정된 shFcRn에 단단하게 결합되었지만, 여전히 FcRn 상호작용의 특징적인 pH-의존성을 증명하였다. 이 복합체는 매우 안정하여 동역학적 분석이 가능하지 않았다 (도 16). 다른 변이체는 모두 shFcRn에 대해 WT HSA보다 감소된 결합을 나타냈다.
모든 변이체는 pH 5.5에서 shFcRn에 결합하였다 (어느 정도까지). K500 라이브러리 변이체의 shFcRn에 대한 결합은 pH 7.4에서 검출되지 않았다.
실시예
16. 융합 폴리펩티드
알부민
뮤테인을
함유하는 알부민
융합물의
제조
N- 또는 C-말단 중 어느 하나 또는 둘 다에서 HSA에 유전자-융합된 scFv (vHvL)의 제조를 위해 발현 카세트를 함유하고 있는 플라스미드 (Evans et al., 2010. Protein Expression and Purification. 73,113-124)를 변형시켜서 생체 내 클로닝 (상기에서 설명됨)을 사용하여 알부민 융합물의 제조를 가능하게 하였다. 즉 pDB3017 (도 17), pDB3021 (도 18), pDB3056 (도 19)을 NsiI/SpeI으로 소화시키고, 각각 9.511kb, 9.569kb 및 8.795kb에 상응하는 NsiI 단편을 표준 기법을 사용하여 정제하였다. 정제된 NsII 단편을 자체-결찰하고, 그것을 화학적으로 경합하는 대장균 DH5α를 형질전환하는 데 사용하여 각각 pDB4168, pDB4169 및 pDB4170을 제조하였다.
유사하게, pDB3165 (2가 융합물 함유)(도 20)를 NotI으로 소화시키고, 발현 카세트 (4,506kb 단편)를 정제한 후 NotI-소화된 pDB3927에 결찰시켜서 pDB4172를 제조하였다 (도 21, 표 18).
번역된 알부민 단백질 서열 안에 K500A, 또는 D550N 또는 K573P에 상응하는 아미노산 치환을 도입하기 위하여 알부민 코드화 뉴클레오티드 서열 내에 점 돌연변이를 함유하는 합성 SalI/Bsu36I DNA 단편 (269bp)을 유전자 어셈블리에 의해 제조하였다 (GeneArt AG, Germany). SalI/Bsu36I 단편을 개별적으로 SalI/Bsu36I-소화된 pDB4168-pDB4170 및 pDB4172에 결찰시키고, 표준 기법을 사용하여 화학적으로 경합하는 대장균 DH5α를 형질전환하는 데 사용하여 플라스미드 pDB4265-pDB4276을 제조하였다 (표 18).
플라스미드 | 구성물 |
pDB3017 | scFv (항-FITC)-HSA-FLAG |
pDB3021 | HSA-GS 링커-scFc (항-FITC)-FLAG |
pDB3056 | HSA-FLAG |
pDB3165 | scFv (항-FITC)-HSA-GS 링커-scFv (항-FITC)-FLAG |
pDB4168 | scFv (항-FITC)-HSA-FLAG |
pDB4169 | HSA-GS 링커-scFv (항-FITC)-FLAG |
pDB4170 | HSA-FLAG |
pDB4172 | scFv (항-FITC)-HSA-GS 링커-scFv (항-FITC)-FLAG |
pDB4265 | scFv (항-FITC)-HSA K500A-FLAG |
pDB4266 | scFv (항-FITC)-HSA D550N-FLAG |
pDB4267 | scFv (항-FITC)-HSA K573P-FLAG |
pDB4268 | HSA K500A-GS 링커-scFv (항-FITC)-FLAG |
pDB4269 | HSA D550N-GS 링커-scFv (항-FITC)-FLAG |
pDB4270 | HSA K573P-GS 링커-scFv (항-FITC)-FLAG |
pDB4271 | HSA K500A-FLAG |
pDB4272 | HSA D550N-FLAG |
pDB4273 | HSA K573P-FLAG |
pDB4274 | scFv (항-FITC)-HSA K500A-GS 링커-scFv (항-FITC)-FLAG |
pDB4275 | scFv (항-FITC)-HSA D550N-GS 링커-scFv (항-FITC)-FLAG |
pDB4276 | scFv (항-FITC)-HSA K573P-GS 링커-scFv (항-FITC)-FLAG |
pDB4277 | scFv (항-FITC)-HSA K573A-FLAG |
pDB4278 | HSA K573A-GS 링커-scFv (항-FITC)-FLAG |
pDB4279 | HSA K573A-FLAG |
pDB4280 | scFv (항-FITC)-HSA K573A-GS 링커-scFv (항-FITC)-FLAG |
pDB4281 | HSA K500A-GS 링커-scFv (항-FITC) |
pDB4282 | HSA D550N-GS 링커-scFv (항-FITC) |
pDB4283 | HSA K573P-GS 링커-scFv (항-FITC) |
pDB4284 | HSA-GS 링커-scFv (항-FITC) |
pDB2613 | HSA-GS 링커-IL 1RA (N84Q) |
pDB4285 | HSA K573A-GS 링커-IL 1RA (N84Q) |
pDB4286 | HSA D550N-GS 링커-IL 1RA (N84Q) |
pDB4287 | HSA K500A-GS 링커-IL 1RA (N84Q) |
pDB4288 | HSA K573P-GS 링커-IL 1RA (N84Q) |
유사하게, 번역된 알부민 단백질 서열에 K573A를 도입하기 위하여 PCR에 의해 DNA 단편을 생성하였다 (표준 기법을 사용함). PCR을 pDB4267 (도 22)을 주형 DNA로서 사용하고 New England Biolabs Phusion 키트를 사용하여, 올리고뉴클레오티드 xAP238 (SEQ ID NO:53) 및 xAP239 (SEQ ID NO:54)를 사용하여 수행하였다. 표 19는 PCR 사이클링을 나타낸다.
98℃에서 2분 동안 | 1 사이클 |
98℃에서 10초 동안 | 35 사이클 |
57℃에서 30초 동안 | |
72℃에서 10초 동안 | |
72℃에서 5분 동안 | 1 사이클 |
PCR-생성물을 정제하고, SalI/Bsu36I로 소화한 후, 분리된 단편 (269bp)을 SalI/Bsu36I-소화된 pDB4168-pDB4170 및 pDB4172에 결찰시키고, 표준 기법을 사용하여 화학적으로 경합하는 대장균 DH5α를 형질전환하는 데 사용하였다. 그 결과의 플라스미드 (pDB4277-pDB4280)을 표 18에 열거한다.
FLAG 태그를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 플라스미드 pDB4168 및 pDB4268-4270 (각각 HSA 및 HSA 뮤테인 K500A, D550N 및 K573P에 N-말단으로 융합된 scFv의 발현을 위한 플라스미드)로부터 제거하였다. pDB4168과 pDB4268-4270 (표 18)을 Bsu36I/SphI로 소화시켜서 HSA-코드화 유전자의 3' 영역, FLAG 태그를 코드화하는 뉴클레오티드 서열 및 ADH1 터미네이터의 5' 영역을 포함하는 231bp 생성물을 제거하였다. pDB4181로부터의 HSA-코드화 유전자의 3' 영역 및 mADH1 터미네이터의 5' 영역 (SEQ ID1)을 포함하는 Bsu36I/SphI 단편 (207bp)을 Bsu36I/SphI-소화된 pDB4168 및 pDB4268-4270에 표준 기법을 사용하여 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 화학적으로 경합하는 대장균 DH5α를 형질전환하여 플라스미드 pDB4281-pDB4284를 제조하였다 (표 18).
pDB4265-pDB4284를 BstEII/BsrBI으로 소화시키고, 선형화된 DNA 분자를 표준 기법을 사용하여 정제하였다. 100ng의 BstEII/BsrBI DNA 샘플을 100ng의 Acc65I/BamHI-소화된 pDB3936과 혼합하여 S.cerevisiae BXP 10cir0을 아래에서 설명되는 Sigma Yeast 형질전환 키트를 사용하여 형질전환하는데 사용하였다. 각 경우에 발현 플라스미드는 알부민-융합물 함유 플라스미드 (pDB4265-pDB4280)(표 18)와 pDB3936 사이의 동종 재조합 (생체 내 클로닝)에 의해 효모에서 생성되었다.
플라스미드 pDB3017, pDB3021, pDB3056 및 pDB3165 (야생형 HSA 융합물, Evans et al., 2010. Protein Expression and Purification. 73,113-124)을 사용하여 아래에서 설명되는 Sigma 효모 형질전환 키트를 사용하여 S.cerevisiae BXP 10cir0을 형질전환하였다 (WO/2005/061718에 설명됨).
사람 IL-1RA (인터류킨-1 수용체 길항체)(승인 번호: CAA59087)를 코드화하는 뉴클레오티드 서열은 유전자 어셈블리에 의해 합성 제조될 수 있었다. 708bp의 합성 단편 (Bsu36I/SphI 단편)의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:55에 제시하며, HSA를 코드화하는 유전자의 3' 영역, GS 링커를 코드화하는 뉴클레오티드 서열, 사람 IL-1RA를 코드화하는 뉴클레오티드 서열 (N-연결된 글리코실화 모티프를 없애기 위한 N84Q) 및 ADH1 터미네이터의 5' 영역을 포함한다. 합성 DNA 단편은 Bsu36I/SphI-소화된 pDB3927에 결찰되어 pDB2588을 생성할 수 있다.
HSA 및 HSA 변이체 K500A, D550N, K573A 및 K573P의 C-말단에 유전적으로 융합된 IL-1RA의 제조를 위한 발현 카세트를 함유하고 있는 플라스미드를 다음과 같이 제조하였다. pDB2588을 Bsu36I/SphI으로 소화시키고, HSA를 코드화하는 유전자의 3' 영역, GS 링커를 코드화하는 뉴클레오티드 서열, 사람 IL-1RA를 코드화하는 뉴클레오티드 서열 (N84Q) 및 변형된 S.cerevisiae ADH1 터미네이터 (SEQ ID3)의 5' 영역을 함유하는 705bp 단편을 표준 기법을 사용하여 정제한 후, Bsu36I/SphI-소화된 pDB4006 (HSA K573A 발현 카세트를 함유함), pDB4010 (HSA D550N 발현 카세트를 함유함), pDB4086 (HSA K500A 발현 카세트를 함유함), pDB4110 (HSA K573P 발현 카세트를 함유함)에 결찰시켜서 각각 pDB4287, pDB4286, pDB4285 및 pDB4288을 제조하였다 (예컨대 도 23 참조). pDB4285-pDB4288을 NsiI/PvuI으로 소화시키고 선형화된 DNA 분자를 표준 기법을 사용하여 정제하였다. 100ng의 NsiI/PvuI-소화된 DNA 샘플을 100ng의 Acc65I/BamHI-소화된 pDB3936 (9721bp)과 혼합하여 (즉 생체 내 클로닝), 아래에서 설명되는 Sigma 효모 형질전환 키트를 사용하여 S.cerevisiae를 형질전환하였다 (즉 생체 내 클로닝에 의해).
GS 링커 및 IL1-RA (N84Q)에 유전적으로 융합된 야생형 HSA를 발현하는 S.cerevisiae 스트레인의 제제는 또한 상기에서 설명한 방법을 따라 제조할 수 있었다.
융합 폴리펩티드를 상기에서 설명된 SPR 방법을 사용하여 FcRn에 대한 그것들의 결합에 대해 분석하였고, 그 결과를 다음과 같이 얻었다.
알부민 변이체 a |
ka
(10 3 /Ms) |
kd
(10 -3 /s) |
KD
b
(μM) |
HSAWT | 9.7±0.0 | 30.0±0.1 | 3.1 |
K574N | 4.9±0.1 | 8.4±0.1 | 1.7 |
Q580K | 6.0±0.0 | 9.3±0.0 | 1.5 |
K573P | 2.8±0.0 | 0.4±0.0 | 0.1 |
HSA-WT-FLAG | 8.2±0.2 | 24.0±0.2 | 2.9 |
HSA-D550N-FLAG | 5.9±0.0 | 49.0±0.1 | 8.3 |
HSA-K500A-FLAG | NDc | ND | ND |
HSA-K573A-FLAG | 6.1±0.1 | 7.1±0.1 | 1.1 |
HSA-K573P-FLAG | 6.2±0.1 | 1.2±0.1 | 0.2 |
HSA-WT-IL1RA | 6.2±0.0 | 25.0±0.2 | 4.0 |
HSA-K500A-IL1RA | ND | ND | ND |
HSA-D550N-IL1RA | 7.3±0.2 | 38.0±0.0 | 5.2 |
HSA-K573A-IL1RA | 6.1±0.0 | 7.1±0.1 | 1.1 |
HSA-K573P-IL1RA | 6.2±0.1 | 1.3±0.1 | 0.2 |
scFv-HSA-K500A-FLAG | ND | ND | ND |
scFv-HSA-D550N-FLAG | 6.2±0.0 | 18.0±0.0 | 2.9 |
scFv-HSA-K573A-FLAG | 6.4±0.1 | 5.7±0.2 | 0.9 |
scFv-HSA-K573P-FLAG | 5.8±0.0 | 1.1±0.1 | 0.2 |
scFv-HSA-WT-scFv-FLAG | 7.5±0.0 | 15.0±0.2 | 2.0 |
scFv-HSA-K500A-scFv-FLAG | ND | ND | ND |
scFv-HSA-D550N-scFv-FLAG | 4.1±0.1 | 27.0±0.2 | 6.6 |
scFv-HSA-K573P-scFv-FLAG | 6.0±0.2 | 0.7±0.1 | 0.1 |
HSA-K500A-scFv-FLAG | ND | ND | ND |
HSA-D550N-scFv-FLAG | 7.3±0.1 | 42.0±0.3 | 5.8 |
HSA-K573A-scFv-FLAG | 6.4±0.1 | 5.7±0.1 | 0.9 |
HSA-K573P-scFv-FLAG | 4.7±0.1 | 0.7±0.1 | 0.1 |
scFv-HSA-K500A | ND | ND | ND |
scFv-HSA-D550N | 7.5±0.1 | 19.0±0.2 | 2.5 |
scFv-HSA-K573P | 7.4±0.1 | 0.8±0.1 | 0.1 |
a: HSA 변이체의 희석물을 고정된 shFcRn (~1500 RU) 상에 주입하였다.
b: 동역학적 속도 상수를 간단한 1차수 (1:1) 이중분자 상호작용 모델을 사용하여 얻었다. 동역학적 값은 이중실험의 평균을 나타낸다.
c: 약한 결합으로 인해 측정되지 않음 (ND).
실시예 8에서 K500A 변이체는 shFcRn에 유의미하게 결합하지 않는 것을 알 수 있었고, 실시예 10에서는 K573P 및 K573A 변이체가 HSA보다 강력하게 shFcRn에 결합하는 것을 알 수 있었으며, 실시예 11에서는 D550N 변이체가 HSA보다 약하게 FcRn에 결합하는 것을 알 수 있었다.
본 실시예에서는, 결합 특성에서 관찰된 세 가지 차이가 상이한 형태의 융합 폴리펩티드를 반영하는 것임을 알 수 있다. 작은 부분과의 C-말단 융합 (HSA-FLAG), 더 큰 폴리펩티드와 C-말단 융합 (HSA-IL 1RA); 폴리펩티드와 N-말단 융합 (scFv-HSA); N- 및 C-말단 융합 (scFv-HSA-FLAG 및 scFv-HSA-scFv-FLAG).
실시예
17. 알부민 및
K573P
변이체에
대한
양고추냉이
과산화효소 단백질의 포합
포합 분석을 위해, 상업적으로 활용가능한 재조합 알부민 (RecombuminTM)을 대조 분자로서 사용하였다. 이 실시예에 대하여 본 발명의 최종 200mg/mL 알부민 K573P 변이체를 유가식 배양으로부터 물질 및 방법에 설명된 방법에 의해 정제하였다. 두 단계 정제를 수행하였다.
첫 번째 단계는 AlbuPureTM 매트릭스 (ProMetic)으로 충전된 칼럼 (상 부피는 대략 400mL, 상 높이는 11cm)을 사용하였다. 이 칼럼은 50mM 아세트산 나트륨, pH 5.3으로 평형화되었고, 대략 pH 5.5 내지 6.5에서, 대략 20mg/mL 매트릭스로 순수한 배양 상층액을 로딩하였다. 그런 다음 칼럼을 대략 5 칼럼 부피의 각각 50mM 아세트산 나트륨, pH 5.3, 50mM 인산 나트륨, pH 6.0, 50mM 인산 나트륨, pH 7.0 및 50mM 아세트산 나트륨, pH 8.0으로 세척하였다. 결합 단백질을 대략 2 칼럼 부피의 50mM 아세트산 나트륨, 10mM 옥타노에이트, PH 7.0을 사용하여 용출하였다. 전체 정제에 대한 유속은 154mL/분이었다.
두 번째 단계에 대하여, 첫 번째 단계로부터의 용출물을 물로 대략 2배로 희석하고, 아세트산을 사용하여 pH 5.5±0.3으로 조정한 후에 2.5±0.5mS/cm의 전도성을 얻었다. 이것을 80mM 아세트산 나트륨, 5mM 옥타노에이트, pH 5.5로 평형화되어 있는 DEAE-세파로스 패스트 플로우 (GE Healthcare) 칼럼 (상 부피는 대략 400mL, 상 높이는 11cm)에 로딩하였다. 로딩은 대략 30mg 단백질/mL 매트릭스였다. 칼럼을 대략 5 칼럼 부피의 80mM 아세트산 나트륨, 5 mM 옥타노에이트, pH 5.5로 세척하였다. 그런 다음 대략 10 칼럼 부피의 15.7mM 4붕산 칼륨, pH 9.2로 세척하였다. 결합 단백질을 2 칼럼 부피의 110mM 4붕산 칼륨, 200mM 염화나트륨, 대략 pH 9.0을 사용하여 용출하였다. 유속은 로딩과 세척 단계 중에는 183mL/분이었고, 용출 단계 중에는 169mL/분이었다.
용출물을 농축하고 145mM NaCl에 대하여, Pall Centramate Omega 10,000 Nominal MWCO 막을 사용하여 다이아필터하여 대략 200mg/mL의 최종 단백질 농도를 얻었다.
rHA 및 K573P 변이체 알부민 두 가지의 200mg/mL 스톡 용액을 인산염 완충 식염수 (PBS)를 사용하여 5mg/mL로 희석하고, pH를 pH 6.5 내지 6.7로 조정하였다. 이 과정으로 EZ-Link® 말레이미드 활성화된 양고추냉이 과산화효소 (Thermo Scientific)의 말레이미드 반응성 기가 유리 술프히드릴과 반응하여 안정한 티오에스테르 결합을 형성하기에 유리한 pH 환경이 보장된다. 2mg의 EZ-Link® 말레이미드 활성화된 양고추냉이 과산화효소 (HRP)를 1mL의 5mg/ML rHA 또는 K573P 변이체 알부민과 혼합하였다. 이 혼합물은 알부민, 또는 K573P 변이체 알부민의 대략 2배 몰 과잉을 보장하였다. 이 혼합물을 최소한으로 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 반응 혼합물을 GP-HPLC를 사용하여 포합에 대해 조사하였다.
포합되지 않은 종 (rHA, 또는 알부민 변이체 K573P 및 미반응 HRP)을 상응하는 포합된 종으로부터 분리하기 위하여, 샘플을 먼저 농축하고 (Vivaspin20, 10,000 MWCO PES, Sartorius), 그런 다음 개별적으로 Tricorn SuperdexTM 200, 10/300 GL 칼럼 (GE Healthcare)에 적용하여, 45cm/시간의 유속으로 PBS 중에서 작동시켰다. 용출 피크를 분별하고, GP-HPLC에 의해 분석하였다. 포합된 종을 함유하고 있는 분획을 모으고, 농축하고 50mM NaCl에 대해 다이아필터한 후 GP-HPLC에 의해 분석하여 증명하였다 (도 24).
그런 다음 이들 샘플을 본원에서 설명된 Biacore 방법을 사용하여 분석하였다 (표 21). 이 실시예는 K573P가 WT HSA에 비교하여 shFcRn에 대한 그것의 증가된 친화성을 유지한다는 것을 증명한다.
실시예
18. 알부민 및
K573P
변이체에
대한
플루오레신의
포합
실시예 17에서 사용한 두 가지 동일한 알부민 샘플, 즉 대략 200mg/mL의 rHA 또는 K573P 알부민 변이체는 또한 이 실시예에 대한 출발 물질이기도 하다.
플루오레신-5-말레이미드 (Thermo Scientific, F5M)를 디메틸포름아미드에 녹여서 25mg/mL의 최종 농도를 얻었다. 그런 다음 이것을 18ml의 HBS로 더 희석하고, pH를 대략 pH 6.5로 조정하였다. 이 용액에 1ml의 200mg/mL rHA 또는 1mL의 200mg/mL K573P 변이체를 첨가하였다. 이것은 F5M의 대략 20배 최종 몰 과잉량을 유발한다. 이들 샘플을 인큐베이션하고, 암실에서 4℃에서 포합체를 형성하도록 놓아둠으로써, F5M의 말레이미드 기가 우선적으로 두 가지 알부민 종에 모두 존재하는 유리 술프히드릴과 반응하도록 하였다.
밤새 인큐베이션한 후에, 반응 혼합물의 일정액을 50mM NaCl에 대하여 집중적으로 다이아필터함으로써 포합되지 않은 F5M을 제거하였다 (Vivaspin20, 10,000 MWCO PES, Sartorius). 포합은 표준 SDS-PAGE 후에 포합된 플루오레신::알부민의 자외선 가시화에 의해 확인하였다 (도 25).
그런 다음 이들 다이아필터된 샘플을 본원에서 설명되는 Biacore 방법을 사용하여 분석하였다 (표 21). 이 실시예는 작은 분자가 rHA 또는 변이체, 예컨대 K573P에 포합되는 것이 shFcRn에 대한 결합 친화성의 경향에 영향을 미치지 않는다는 것을 증명한다.
분석물 | KD (μM) |
rHA::HRP | 3.6 |
K573P::HRP | 0.02 |
rHA::F5M | 7.3 |
K573P::F5M | 2.5 |
실시예
19. 추가의 알부민
변이체
다음의 변이체들을 실시예 1에서 설명한 방법을 사용하여 제조하였다: E492T, N503D, E492T+N503D, K538H, E542D, D494N+E495Q+T496A, E495Q+T496A, N403K, K541A 및 K541N. SPR 분석을 실시예 15에서 설명한 것과 같이 수행하였고, 그 결과를 도 26 및 도 27에 도시한다.
도 30A와 30B는 알부민 변이체에 대한 shFcRn 결합에 미치는 영향을 도시한다. HSA 내의 치환 N503D, D494N+E495Q+T496A, E492T+N503D, E495Q+T496A는 pH 5.5에서 shFcRn에 대한 결합에 부정적 영향을 나타냈다.
실시예
20. C-말단의 알부민
변이체
다음의 변이체들을 실시예 1에서 설명한 방법을 사용하여 제조하였다. shFcRn에 대한 결합 특성을 물질 및 방법에서 설명한 것처럼 측정하였고, 그 결과를 표 22에 나타낸다.
알부민 변이체a | ka (103/MS) | kd (10-3/s) | KDb (μM) |
HSA | 4.4±0.0 | 24.0±0.1 | 5.4 |
MacSA | 3.1±0.1 | 8.6±0.1 | 2.7 |
HSA-MacC | 4.1±0.1 | 5.6±0.0 | 1.3 |
MouseSAc | 3.8±0.0 | 3.1±0.1 | 0.8 |
HSA-MouseC | 3.7±0.1 | 1.3±0.0 | 0.3 |
RabbitSAd | 1.9±0.3 | 1.7±0.1 | 0.9 |
HSA-RabC | 3.5±0.0 | 1.6±0.0 | 0.4 |
SheepSA | ND | ND | ND |
HSA-SheepC | 3.3±0.0 | 2.1±0.0 | 0.6 |
a: HSA 변이체의 희석물을 고정된 shFcRn (~1500 RU) 상에 주입하였다.
b: 동역학적 속도 상수를 간단한 1차수 (1:1) 이중분자 상호작용 모델을 사용하여 얻었다.
c: 표 3으로부터의 데이터
d: 표 4으로부터의 데이터
ND: 약한 결합으로 인해 측정되지 않음
이 실시예는 시험된 사람 알부민에 대한 모든 C-말단 치환에 대해 공여체 알부민을 능가하는 결합의 증가가 관찰되었음을 보여준다. 모든 공여체 서열은 K573P 치환을 함유하고, 그것은 상당히 증가된 결합을 보여주지만 K573P 단독으로는 그렇지 못하였다 (표 20).
실시예
21.
변이체
알부민
융합물의
경합성
결합 분석
변이체 알부민 융합물과 실시예 1에서 설명한 것과 같이 제조한 변이체 알부민의 선택을 사용하는 경합성 결합 연구를 실시예 4에서 설명한 것과 같이 수행하였다. 그 결과를 도 28 내지 31에 나타낸다.
경합성 결합 등급은 HSA-FLAG의 변이체 융합물 및, 개별적인 HSA 변이체 (미융합 및 융합) 친화성 데이터의 등급에 대한 N+C-말단 scFv HSA-FLAG에 대해 동일하였다. IL1Ra 변이체에 대해서는 K573P, K573A 및 K500A가 예측한 대로였지만, D550N은 WT 융합물보다 더 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다.
실시예
22. 추가의
HSA
변이체
다음의 변이체들을 실시예 1에 설명된 방법을 사용하여 제조하였다: HSA E492G+K573A, HSA E492G+N503K+K573A, HSA E492G+N503H+K573A, HSA E492G+K573P, HSA E492G+N503K+K573P, HSA E492G+N503H+K573P. SPR 분석을 물질 및 방법에 설명한 것과 같이 수행하였다. 그 결과 (도 32)는 모든 HSA 변이체가 pH 5.5에서 야생형 HSA에 비교하여 shFcRn에 더 강력하게 결합하였음을 나타냈다. pH 7.4에서는 결합이 관찰되지 않았다.
HSA E492G+K573A, HSA E492G+N503K+K573A는 HSA E492G+N503H+K573A와는 달리, HSA K573A의 결합을 약간 넘는 아주 조금 개선된 결합을 나타냈다. K573P를 함유하는 변이체 조합은 K573P 단일 변이체를 능가하는 개선된 결합을 나타내지 않았다.
SEQUENCE LISTING
<110> Novozymes A/S
University of Oslo
Novozymes Biopharma UK Limited.
<120> Albumin variants
<130> 11644.PCT
<160> 55
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1758
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1758)
<223> Human serum albumin (mature protein)
<400> 1
gat gca cac aag agt gag gtt gct cat cgg ttt aaa gat ttg gga gaa 48
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
gaa aat ttc aaa gcc ttg gtg ttg att gcc ttt gct cag tat ctt cag 96
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
cag tgt cca ttt gaa gat cat gta aaa tta gtg aat gaa gta act gaa 144
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
ttt gca aaa aca tgt gtt gct gat gag tca gct gaa aat tgt gac aaa 192
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
tca ctt cat acc ctt ttt gga gac aaa tta tgc aca gtt gca act ctt 240
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
cgt gaa acc tat ggt gaa atg gct gac tgc tgt gca aaa caa gaa cct 288
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
gag aga aat gaa tgc ttc ttg caa cac aaa gat gac aac cca aac ctc 336
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
ccc cga ttg gtg aga cca gag gtt gat gtg atg tgc act gct ttt cat 384
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
gac aat gaa gag aca ttt ttg aaa aaa tac tta tat gaa att gcc aga 432
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
aga cat cct tac ttt tat gcc ccg gaa ctc ctt ttc ttt gct aaa agg 480
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
tat aaa gct gct ttt aca gaa tgt tgc caa gct gct gat aaa gct gcc 528
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
tgc ctg ttg cca aag ctc gat gaa ctt cgg gat gaa ggg aag gct tcg 576
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
tct gcc aaa cag aga ctc aag tgt gcc agt ctc caa aaa ttt gga gaa 624
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
aga gct ttc aaa gca tgg gca gta gct cgc ctg agc cag aga ttt ccc 672
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
aaa gct gag ttt gca gaa gtt tcc aag tta gtg aca gat ctt acc aaa 720
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
gtc cac acg gaa tgc tgc cat gga gat ctg ctt gaa tgt gct gat gac 768
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
agg gcg gac ctt gcc aag tat atc tgt gaa aat caa gat tcg atc tcc 816
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
agt aaa ctg aag gaa tgc tgt gaa aaa cct ctg ttg gaa aaa tcc cac 864
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
tgc att gcc gaa gtg gaa aat gat gag atg cct gct gac ttg cct tca 912
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
tta gct gct gat ttt gtt gaa agt aag gat gtt tgc aaa aac tat gct 960
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
gag gca aag gat gtc ttc ctg ggc atg ttt ttg tat gaa tat gca aga 1008
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
agg cat cct gat tac tct gtc gtg ctg ctg ctg aga ctt gcc aag aca 1056
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
tat gaa acc act cta gag aag tgc tgt gcc gct gca gat cct cat gaa 1104
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
tgc tat gcc aaa gtg ttc gat gaa ttt aaa cct ctt gtg gaa gag cct 1152
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
cag aat tta atc aaa caa aat tgt gag ctt ttt gag cag ctt gga gag 1200
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
tac aaa ttc cag aat gcg cta tta gtt cgt tac acc aag aaa gta ccc 1248
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
caa gtg tca act cca act ctt gta gag gtc tca aga aac cta gga aaa 1296
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
gtg ggc agc aaa tgt tgt aaa cat cct gaa gca aaa aga atg ccc tgt 1344
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
gca gaa gac tat cta tcc gtg gtc ctg aac cag tta tgt gtg ttg cat 1392
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
gag aaa acg cca gta agt gac aga gtc acc aaa tgc tgc aca gaa tcc 1440
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
ttg gtg aac agg cga cca tgc ttt tca gct ctg gaa gtc gat gaa aca 1488
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
tac gtt ccc aaa gag ttt aat gct gaa aca ttc acc ttc cat gca gat 1536
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
ata tgc aca ctt tct gag aag gag aga caa atc aag aaa caa act gca 1584
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
ctt gtt gag ctc gtg aaa cac aag ccc aag gca aca aaa gag caa ctg 1632
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
aaa gct gtt atg gat gat ttc gca gct ttt gta gag aag tgc tgc aag 1680
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
gct gac gat aag gag acc tgc ttt gcc gag gag ggt aaa aaa ctt gtt 1728
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
gct gca agt caa gct gcc tta ggc tta taa 1758
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 2
<211> 585
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 3
<211> 290
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr
20 25 30
His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp
35 40 45
Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu
50 55 60
Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val
65 70 75 80
Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys
85 90 95
Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr
100 105 110
Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val
115 120 125
Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp
130 135 140
Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile
145 150 155 160
Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr
165 170 175
Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg
180 185 190
Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys
195 200 205
Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe
210 215 220
Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser
245 250 255
Phe His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His
260 265 270
Tyr Cys Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val
275 280 285
Glu Leu
290
<210> 4
<211> 125
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg
20 25 30
His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser
35 40 45
Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu
50 55 60
Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp
65 70 75 80
Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp
85 90 95
Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile
100 105 110
Val Lys Trp Asp Arg Asp Met His His His His His His
115 120 125
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP094
<400> 5
ccatgctttt cagctctgga agtcaatcaa gcttacgttc ccaaagagtt taatg 55
<210> 6
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP095
<400> 6
cattaaactc tttgggaacg taagcttgat tgacttccag agctgaaaag catgg 55
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP096
<400> 7
gcttttcagc tctggaagtc gatcaagctt acgttcccaa agagtttaat g 51
<210> 8
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP097
<400> 8
cattaaactc tttgggaacg taagcttgat cgacttccag agctgaaaag c 51
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapeins
<400> 9
Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
1 5 10
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> macaque albumin fragment
<400> 10
Pro Lys Phe Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mouse albumin fragment
<400> 11
Pro Asn Leu Val Thr Arg Cys Lys Asp Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> rabbit albumin fragment
<400> 12
Pro Lys Leu Val Glu Ser Ser Lys Ala Thr Leu Gly
1 5 10
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> sheep albumin fragment
<400> 13
Pro Lys Leu Val Ala Ser Thr Gln Ala Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP216
<400> 14
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccag gtgaattcaa cgctg 45
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP217
<400> 15
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccag aagaattcaa cgctg 45
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP218
<400> 16
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccag acgaattcaa cgctg 45
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP219
<400> 17
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccag ttgaattcaa cgctg 45
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP220
<400> 18
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccaa gagaattcaa cgctg 45
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP221
<400> 19
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccaa acgaattcaa cgctg 45
<210> 20
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP220
<400> 20
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccaa tggaattcaa cgctg 45
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP223
<400> 21
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccaa ttgaattcaa cgctg 45
<210> 22
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP224
<400> 22
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccaa ccgaattcaa cgctg 45
<210> 23
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP225
<400> 23
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccat gggaattcaa cgctg 45
<210> 24
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP226
<400> 24
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccat gtgaattcaa cgctg 45
<210> 25
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP227
<400> 25
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccat acgaattcaa cgctg 45
<210> 26
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP229
<400> 26
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccat tggaattcaa cgctg 45
<210> 27
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP229
<400> 27
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccat tcgaattcaa cgctg 45
<210> 28
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP230
<400> 28
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccat ctgaattcaa cgctg 45
<210> 29
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP231
<400> 29
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccac aagaattcaa cgctg 45
<210> 30
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP232
<400> 30
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccac acgaattcaa cgctg 45
<210> 31
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP233
<400> 31
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccac cagaattcaa cgctg 45
<210> 32
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP234
<400> 32
ctttggaagt cgacgaaact tacgttccat aagaattcaa cgctg 45
<210> 33
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP235
<400> 33
gaattaagct tattacaaac ccaaagcagc ttgggaagc 39
<210> 34
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP187
<400> 34
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagtttacc accctcctcg 50
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP188
<400> 35
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagtttttc accctcctcg 50
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP189
<400> 36
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagtttatc accctcctcg 50
<210> 37
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Priner xAP190
<400> 37
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagtttaac accctcctcg 50
<210> 38
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP191
<400> 38
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagttttct accctcctcg 50
<210> 39
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP192
<400> 39
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagtttatt accctcctcg 50
<210> 40
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP193
<400> 40
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagtttcat accctcctcg 50
<210> 41
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP194
<400> 41
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagtttaat accctcctcg 50
<210> 42
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP195
<400> 42
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagtttagt accctcctcg 50
<210> 43
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP196
<400> 43
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagtttcca accctcctcg 50
<210> 44
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP197
<400> 44
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagtttaca accctcctcg 50
<210> 45
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP198
<400> 45
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagtttata accctcctcg 50
<210> 46
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP199
<400> 46
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagtttcaa accctcctcg 50
<210> 47
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP200
<400> 47
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagtttaaa accctcctcg 50
<210> 48
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP201
<400> 48
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagtttaga accctcctcg 50
<210> 49
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP202
<400> 49
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagtttttg accctcctcg 50
<210> 50
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP203
<400> 50
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagtttatg accctcctcg 50
<210> 51
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP204
<400> 51
ataagcctaa ggcagcttga cttgcagcaa caagttttta accctcctcg 50
<210> 52
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP205
<400> 52
aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatg 36
<210> 53
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP238
<400> 53
gaattaagct tattacaaac ctaaggcagc ttgggaagca gcgaccaact tagcaccttc 60
ttcagcg 67
<210> 54
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer xAP239
<400> 54
gtttctctgc tttggaagtc gacgaaactt acg 33
<210> 55
<211> 708
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic IL-1RA
<400> 55
ccttaggctt aggtggttct ggtggttccg gtggttctgg tggatccggt ggtcgaccct 60
ctgggagaaa atccagcaag atgcaagcct tcagaatctg ggatgttaac cagaagacct 120
tctatctgag gaacaaccaa ctagttgctg gatacttgca aggaccaaat gtcaatttag 180
aagaaaagat agatgtggta cccattgagc ctcatgctct gttcttggga atccatggag 240
ggaagatgtg cctgtcctgt gtcaagtctg gtgatgagac cagactccag ctggaggcag 300
ttcaaatcac tgacctgagc gagaacagaa agcaggacaa gcgcttcgcc ttcatccgct 360
cagacagcgg ccccaccacc agttttgagt ctgccgcctg ccccggttgg ttcctctgca 420
cagcgatgga agctgaccag cccgtcagcc tcaccaatat gcctgacgaa ggcgtcatgg 480
tcaccaaatt ctacttccag gaggacgagt aataagctta attcttatga tttatgattt 540
ttattattaa ataagttata aaaaaaataa gtgtatacaa attttaaagt gactcttagg 600
ttttaaaacg aaaattctta ttcttgagta actctttcct gtaggtcagg ttgctttctc 660
aggtatagca tgaggtcgct cttattgacc acacctctac cggcatgc 708
Claims (18)
- 알부민 변이체 또는 상기 알부민 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 상기 방법은 다음 단계들:
a. SEQ ID NO:2의 서열을 가지는 모체 알부민을 코드화하는 핵산을 제공하는 단계;
b. 단계 a.의 서열을, 다음 중에서 선택된 SEQ ID NO:2의 하나 또는 그 이상의 치환을 가지는 알부민 변이체 또는 상기 알부민 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드를 코드화하도록 변형시키는 단계;
Q417A,H;
H440Q;
H464Q;
A490D;
E492A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T;
V493L,P;
D494A,E,N,Q;
E495A,Q;
T496A;
P499A;
K500A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y;
E501A,P,Q;
N503D,H,K;
A504E;
E505Q;
T506F;
H510D,Q;
H535Q;
K536A;
P537A;
K538A,H;
K541A,D,G,N;
E542D;
D550C,E,H,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y;
K573A,C,D,F,G,H,I,L,M,N,P,R,S,V,W,Y;
K574D,F,G,H,I,L,M,P,R,S,T,V,W,Y;
Q580A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,V,W,Y;
c. 단계 b.의 변형된 서열을 적당한 숙주 세포에 도입하는 단계;
d. 세포를 적당한 성장 배지 중에서 알부민 변이체 또는 상기 알부민 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드의 발현을 유도하는 조건하에서 성장시키는 단계; 그리고
e. 알부민 변이체 또는 상기 알부민 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드를 성장 배지로부터 회수하는 단계로 이루어지며,
상기 알부민 변이체 또는 상기 알부민 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드는 모체 알부민 또는 상기 모체 알부민을 포함하는 융합 폴리펩티드와 비교하여 변경된 혈장 내 반감기를 가지는 것을 특징으로 하는 제조 방법. - 치료적 폴리펩티드 및 알부민 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드로서, 알부민 변이체는 SEQ ID NO: 2에서 다음 치환의 하나 이상을 가지고, 상기 치료적 폴리펩티드 및 모체 알부민의 융합 폴리펩티드와 비교하여 변경된 반감기를 가지는 융합 폴리펩티드:
Q417A,H;
H440Q;
H464Q;
A490D;
E492C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T;
V493L,P;
D494A,E,Q;
E495A,Q;
T496A;
P499A;
K500A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y;
E501A,P,Q;
N503D,H,K;
A504E;
E505Q;
T506F;
H510D,Q;
H535Q;
K536A;
P537A;
K538A,H;
K541A,D,G,N;
E542D;
D550C,E,H,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y;
K573A,C,D,F,G,H,I,L,M,N,P,R,S,V,W,Y;
K574D,F,G,H,I,L,M,P,R,S,T,V,W,Y;
Q580A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,V,W,Y. - 제 2항에 있어서, 상기 치료적 폴리펩티드 및 상기 모체 알부민을 포함하는 융합 폴리펩티드보다 더 긴 혈장 내 반감기를 가지는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
- 제 3항에 있어서, SEQ ID NO:2의 다음 치환의 하나 또는 치환의 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 알부민 변이체를 포함하는 융합 폴리펩티드:
K573P+K574N+A577T+A578R+S579C+Q580K+A581D+G584A,
K573Y,W,P,H,F,V,I,T,N,S,G,M,C,A,E,Q,R,L,D,
K573P+A577E+A578S+Q580K+A582T,
K573P+A578S+S579T+G584A,
K573P+L575F+G584A,
E492G, N503K, K500R, N503H, D550E, Q580K,
E492G+N503K, E492G+N503H,
E492H+E501P+N503H+E505D+T506S+T540S+K541E,
E492G+K573A, E492G+N503K+K573A,
E492G+N503H, E492G+K573P, E492G+N503K+K573P, 및
E492G+N503H+K573P. - 제 2항에 있어서, 상기 치료적 폴리펩티드 및 상기 모체 알부민을 포함하는 융합 폴리펩티드보다 더 짧은 혈장 내 반감기를 가지는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
- 제 5항에 있어서, 다음 중에서 선택된 SEQ ID NO:2의 치환 또는 치환의 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드:
K500E,G,D,A,S,C,P,H,F,N,W,T,M,Y,V,Q,L,R,
D550N, H464Q, H510Q, H535Q, D494Q,A,
E495Q,A, T496A, E492G+V493P, K541G,D,
D494N+E495Q+T496A, E495Q+T496A,
E492G+V493P+K538H+K541N+E542D,
N503K,D, P499A, K541A,N,
D494E+Q417H, Q417A, E492T+N503D,
A490D+E492T+V493L+E501P+N503D+A504E+E505K+T506F+K541D,
K536A, P537A, E501A,Q,
E492G+K538H+K541N+E542D. - 제 2항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 표면에 티올기를 생성하는 하나 또는 그 이상의 추가의 변경을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
- 제 2항의 융합 폴리펩티드를 코드화하는 핵산.
- 제2항의 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서, FcRn에 대한 결합은 HSA의 FcRn에 대한 결합보다 더 강한 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
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