ES2700230T3 - Variantes de albúmina - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Una variante de albúmina o fragmento de la misma que comprende dicha variante de albúmina o fragmento de la misma, que comprende una sustitución en una posición correspondiente a la posición 573 en la SEQ ID NO: 2, en la que: (i) la variante o fragmento tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2; (ii) la sustitución es a A, C, D, F, G, H, I, L, M, N, P, R, S, V, W o Y; y (iii) la variante o fragmento tiene una afinidad de unión a FcRn más fuerte y/o una semivida plasmática más prolongada que una albúmina original que comprende la SEQ ID NO: 2 o fragmento de la misma, en la que la afinidad de unión más fuerte se define como la variante de albúmina o fragmento que tiene un coeficiente de unión (KD) a FcRn inferior a 0,9X el coeficiente de unión de la SEQ ID NO: 2, o fragmento correspondiente de SEQ ID NO: 2, a FcRn.
Description
DESCRIPCIÓN
Variantes de albúmina
Referencia a un Listado de Secuencias
Esta solicitud contiene un Listado de Secuencias en forma legible por ordenador.
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere a variantes de albúmina o fragmentos de las mismas o polipéptidos de fusión que comprenden una albúmina variante o fragmentos de la misma que tienen un cambio en la semivida en comparación con la albúmina, fragmento de la misma o polipéptido de fusión que comprende albúmina o un fragmento de la misma.
Descripción de la técnica relacionada
La albúmina es una proteína que se encuentra naturalmente en el plasma sanguíneo de los mamíferos, donde es la proteína más abundante. Tiene funciones importantes en el mantenimiento de la presión osmótica deseada de la sangre y también en el transporte de diversas sustancias por el torrente sanguíneo.
Las albúminas se han caracterizado en muchas especies, incluido el ser humano, cerdo, ratón, rata, conejo y cabra, y comparten un alto grado de homología estructural y de secuencia.
La albúmina se une in vivo a su receptor, el receptor Fc neonatal (FcRn) "Brambell", y se sabe que esta interacción es importante para la semivida plasmática de la albúmina. El FcRn es una proteína unida a la membrana, expresada en muchos tipos de células y tejidos. Se ha encontrado que FcRn salva a la albúmina de la degradación intracelular (Roopenian D. C. y Akilesh, S. (2007), Nat. Rev. Immunol 7, 715-725). El FcRn es una molécula bifuncional que contribuye a mantener un alto nivel de IgG y albúmina en suero en mamíferos como los seres humanos.
Aunque la interacción FcRn-inmunoglobulina (IgG) se ha caracterizado en la técnica anterior, la interacción FcRnalbúmina está menos bien caracterizada. El principal sitio de unión de FcRn está localizado dentro de DIII (381-585). Andersen et al. (2010), Clinical Biochemistry 43, 367-372. Los datos indican que la IgG y la albúmina se unen de forma no cooperativa a sitios distintos en FcRn (Andersen et al. (2006), Eur. J. Immunol 36, 3044-3051; Chaudhury et al. (2006), Biochemistry 45, 4983-4990).
Se sabe que el FcRn de ratón se une a IgG de ratones y humanos, mientras que parece que el FcRn humano discrimina más (Ober et al. (2001) Int. Immunol 13, 1551-1559). Andersen et al. (2010), Journal of Biological Chemistry 285 (7):4826-36 describe la afinidad del FcRn humano y de ratón por cada albúmina humana y de ratón (todas las combinaciones posibles). No se observó unión de albúmina de ninguna de las especies a pH fisiológico a ninguno de los receptores. A pH ácido se observó una diferencia de factor 100 en la afinidad de unión. En todos los casos, la unión de albúmina e IgG de ambas especies a ambos receptores fue aditiva.
La albúmina sérica humana (HSA) se ha caracterizado bien como un polipéptido de 585 aminoácidos cuya secuencia se puede encontrar en Peters, T., Jr. (1996) All about Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical Applications, Academic Press, Inc., Orlando (ISBN 0-12-552110-3). Tiene una unión característica a su receptor FcRn, al que se une a pH 6,0 pero no a pH 7,4.
Se ha descubierto que la semivida plasmática de HSA es de aproximadamente 19 días. Se ha identificado una variante natural que tiene una semivida plasmática más baja (Peach, R. J. y Brennan, S. 0., (1991) Biochim Biophys Acta 1097:49-54) que tiene la sustitución D494N. Esta sustitución generó un sitio de N-glicosilación en esta variante, que no está presente en la albúmina natural. No se sabe si el responsable del cambio en la semivida plasmática es la glicosilación o el cambio de aminoácido.
La albúmina tiene una prolongada semivida plasmática y, debido a esta propiedad, se ha sugerido su uso en la administración de fármacos. La albúmina se ha conjugado con compuestos farmacéuticamente beneficiosos (documento WO 2000/69902A) y se descubrió que el conjugado mantenía la semivida plasmática prolongada de la albúmina. La semivida plasmática resultante del conjugado fue, en general, considerablemente más prolongada que la semivida plasmática del compuesto terapéutico beneficioso solo.
Además, la albúmina se ha fusionado con péptidos terapéuticamente beneficiosos (documentos WO 2001/79271 A y WO 2003/59934 A) con el resultado típico de que la fusión tiene la actividad del péptido terapéuticamente beneficioso y una semivida plasmática considerablemente más prolongada que la semivida plasmática de los péptidos terapéuticamente beneficiosos solos.
Otagiri et al. (2009), Biol. Pharm. Bull. 32(4), 527-534 divulga que se conocen 77 variantes de albúmina, de las cuales 25 se encuentran en el dominio III. Se ha demostrado que una variante natural que carece de los últimos 175
aminoácidos en el extremo carboxilo tiene una semivida reducida (Andersen et al. (2010), Clinical Biochemistry 43, 367-372). Iwao et al. (2007) estudiaron la semivida de variantes de albúmina humana naturales usando un modelo de ratón, y encontraron que K541E y K560E tenían semivida reducida, E501K y E570K tenían semivida aumentada y K573E casi no tenía efecto sobre la semivida (Iwao et al. (2007) B.B.A. Proteins and Proteomics 1774, 1582-1590). Galliano et al. (1993) Biochim. Biophys. Acta 1225, 27-32 divulga una variante E505K natural. Minchiotti et al. (1990) divulga una variante K536E natural. Minchiotti et al. (1987) Biochim. Biophys. Acta 916, 411-418 divulga una variante K574N natural. Takahashi et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4413-4417 divulga una variante D550G natural. Carlson et al. (1992), Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 8225-8229 divulga una variante D550A natural. Hillier (Uniprot A6NBZ8) divulgó una variante K573Q humana natural. Las variantes en especies en las que la albúmina tiene menos de un 98 % de identidad con la albúmina humana se divulgan en los documentos WO 2007/021494 y WO 2004/011499.
La albúmina tiene la capacidad de unirse a varios ligandos y estos se asocian (asociados) con la albúmina. Esta propiedad se ha utilizado para extender la semivida plasmática de los fármacos que tienen la capacidad de unirse no covalentemente a la albúmina. Esto también se puede lograr uniendo un compuesto farmacéuticamente beneficioso, que tiene pocas o ninguna propiedad de unión a la albúmina, a un resto que tiene propiedades de unión a la albúmina. Ver artículo de revisión y referencias en el mismo, Kratz (2008) Journal of Controlled Release 132, 171 183.
La albúmina se usa en preparaciones de compuestos farmacéuticamente beneficiosos, en los que dicha preparación puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse a, una nanopartícula o micropartícula de albúmina. En estos ejemplos, la administración de un compuesto farmacéuticamente beneficioso o una mezcla de compuestos se puede beneficiar de la alteración en la afinidad de la albúmina por su receptor cuando se ha demostrado que el compuesto beneficioso se asocia con la albúmina como medio de administración.
No está claro qué determina la semivida plasmática de los asociados formados (por ejemplo, pero no limitado a, Levemir®, Kurtzhals P. et al. Biochem. J. 1995; 312:725-731), conjugados o polipéptidos de fusión, pero parece ser un resultado de la combinación de la albúmina y el compuesto/polipéptido farmacéuticamente beneficioso seleccionado. Sería deseable poder controlar la semivida plasmática de conjugados de albúmina, asociados o polipéptidos de fusión de albúmina dados, de modo que se pueda lograr una semivida plasmática más prolongada o más reducida que la proporcionada por los componentes de la asociación, conjugación o fusión, para poder diseñar un medicamento en particular de acuerdo con los detalles de la indicación prevista que va a ser tratada.
Se sabe que la albúmina se acumula y se cataboliza en los tumores, y también se ha demostrado que se acumula en las articulaciones inflamadas de los pacientes con artritis reumatoide. Ver artículo de revisión y referencias en el mismo, Kratz (2008) Journal of Controlled Release 132, 171-183. Se prevé que las variantes de HSA con afinidad aumentada por FcRn serían ventajosas para la administración de compuestos farmacéuticamente beneficiosos. Sumario de la invención
La presente invención proporciona variantes de una albúmina original de acuerdo con la reivindicación 1.
La presente divulgación también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican las variantes; construcciones de ácido nucleico, vectores y células huésped que comprenden los polinucleótidos; y procedimientos de producción de las variantes.
La presente invención también se refiere a conjugados que comprenden la albúmina variante o fragmento de la misma de acuerdo con la invención y un resto terapéutico beneficioso, o a un polipéptido de fusión que comprende una albúmina variante o fragmento de la misma de la invención y un polipéptido asociado de fusión, o a una variante de la invención unida no covalentemente a un resto terapéutico beneficioso.
La invención se refiere además a composiciones que comprenden la albúmina variante, fragmento de la misma, polipéptido de fusión que comprende albúmina variante o fragmento de la misma o conjugados que comprenden la albúmina variante o fragmento de la misma, de acuerdo con la invención o asociados que comprenden la albúmina variante o fragmento de la misma, de acuerdo con la invención. Las composiciones son preferentemente composiciones farmacéuticas.
La invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende una albúmina variante, fragmento de la misma, polipéptido de fusión que comprende albúmina variante o fragmento de la misma o conjugados que comprenden la albúmina variante o fragmento de la misma, o asociados que comprenden la albúmina variante o fragmento de la misma, en la que dicha albúmina variante, fragmento de la misma, polipéptido de fusión que comprende albúmina variante o fragmento de la misma o conjugados que comprenden la albúmina variante o fragmento de la misma o asociados de albúmina variante o fragmento de la misma tiene una semivida plasmática alterada en comparación con la semivida plasmática correspondiente de la HSA o fragmento de la misma, polipéptido de fusión que comprende HSA o fragmento de la misma o conjugados o asociados de HSA, o fragmento de la misma, que comprende HSA o fragmento de la misma.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra un mapa de restricción del plásmido de expresión pDB4082.
La figura 2 muestra un mapa de restricción del plásmido de expresión pDB2305.
La figura 3 muestra un mapa de restricción del plásmido de expresión pDB4005.
La figura 4 muestra sensogramas de SPR de albúmina 10 pM inyectada sobre shFcRn HSA (JTA) = HSA libre de ácidos grasos obtenida de Sigma-Aldrich (A3782), HSA (Novozymes) = albúmina sérica humana recombinante comercial (RECOMBUMIN).
La figura 5 muestra la unión de ELISA de shFcRn-GST a variantes de albúmina sérica humana (HSA) (100 0,045 pg/ml). Unión de WT, D494N, D494Q y D494A a pH 6,0 y pH 7,4. Unión de WT, D494N, D494N/T496A y T496A a pH 6,0 y pH 7,4. Unión de WT, E495Q y E495A a pH 6,0 y pH 7,4.
La figura 6 muestra sensogramas representativos de la unión de variantes de HSA 0,2 pM a shFcRn inmovilizado (~4600 RU). WT, D494N, D494Q, D494A, D494N/T496A y T496A.
La figura 7 muestra sensogramas representativos de la unión de variantes de HSA 1 pM a shFcRn inmovilizado (~1400 RU). WT, D494N, D494Q, D494A, D494N/T496A y T496A.
La figura 8 muestra la unión relativa de las variantes de HSA en comparación con WT en base a dos experimentos de SPR independientes mostrados en (A), Figura 6 y (B) Figura 7.
La figure 9 muestra ELISA: (A) unión de shFcRn a albúminas de humano, burro, bovino, oveja, cabra y conejo a pH 6,0. (B) unión de shFcRn a albúmina de conejillo de indias, hámster, rata y pollo a pH 6,0. (C) unión de shFcRn a albúmina de humano, burro, bovino, oveja, cabra y conejo a pH 7,4. (D) unión de shFcRn a albúmina de cobaya, hámster, rata y pollo a pH 7,4. (E) unión relativa de las diferentes albúminas. La unión relativa de albúmina humana a shFcRn se define como 1,0. Los valores de ELISA representan la media de duplicados.
La figura 10 muestra SPR: Unión de shFcRn-GST a albúmina de varias especies a pH 6,0 y pH 7,4. Sensogramas representativos que muestran la unión de albúmina 5,0 pM de diferentes especies: (A) ser humano, (B) burro, (C) bovino, (D) cabra, (E) oveja, (F) conejo, (G) perro, (H) cobaya, (I) hámster, (J) rata, (K) ratón y (L) pollo. Las variantes de albúmina se inyectaron sobre shFcRn marcado con GST inmovilizado (~2100 RU). Las inyecciones se realizaron a 25 °C a un caudal de 40 pl/min.
La figura 11 muestra sensogramas de SPR de mutantes de HSA seleccionados en comparación con HSA natural. Se inyectó una concentración 20 pM de (A) WT y P499A, (B) WT y K500A, (C) WT y K536A, (D) WT y P537A, (E) WT y K538A y (F) WT y K537A sobre shFcRn inmovilizado a pH 6,0 (~1500 RU).
La figura 12 muestra sensogramas de SPR de mutantes de HSA en comparación con HSA natural (WT). Se inyectó una concentración 10 pM de (A) WT y K573A, (B) WT y K573C, (C) WT y K573F, (D) WT y K573G, (E) WT y K573L, (F) WT y K573M, (G) WT y K573Q, (H) WT y K573R, (I) WT y K573T y (J) WT y K573V sobre shFcRn inmovilizado a pH 5,5 y pH 7,4. Las inyecciones se realizaron a 25 °C a un caudal de 80 pl/min.
La figura 13 muestra sensogramas de SPR de mutantes de HSA en comparación con HSA natural. Se inyectó una concentración 10 pM de (A) WT y K573D, (B) WT y K573E, (C) WT y K573H, (D) WT y K573I, (E) WT y K573N, (F) WT y K573P, (G) WT y K573S, (H) WT y K573*, (I) WT y K573W y (J) WT y K573Y sobre shFcRn inmovilizado a pH 5,5 y pH 7,4. Las inyecciones se realizaron a 25 °C a un caudal de 80 pl/min.
La figura 14 muestra sensogramas de SPR de mutantes de HSA en comparación con HSA natural. Se inyectó una concentración 20 pM de (A) WT y E492G+K538H+K541N+E542D (B) WT y E492T+N503K+K541A, (C) WT y E492P+N503K+K541G+E542P, (D) WT y E492H+E501P+N503H+E505D+T506S+T540S+K541E, (E) WT y A490D+E492T+V493L+E501P+N503D+A504E+E505K+T506F+K541D y (F) WT y E492G+V493P+K538H+K541N+E542D sobre shFcRn inmovilizado a pH 6,0. Las inyecciones se realizaron a 25 °C a un caudal de 80 pl/min.
La figura 15 muestra sensogramas de SPR de mutantes de HSA en comparación con HSA natural. Se inyectó una concentración 20 pM de (A) WT, (B) H440Q, (C) H464Q y (D) H535Q sobre shFcRn inmovilizado a pH 6,0. Las inyecciones se realizaron a 25 °C a un caudal de 80 pl/min.
La figura 16 muestra sensogramas de SPR de mutante K500E de HSA en comparación con HSA natural. Se inyectó una concentración 10 pM de mutante K500E de HSA sobre shFcRn inmovilizado a pH 5,75. Las inyecciones se realizaron a 25 °C a un caudal de 30 pl/min.
La figura 17 muestra un mapa de restricción del plásmido de expresión pDB3017.
La figura 18 muestra un mapa de restricción del plásmido de expresión pDB3021.
La figura 19 muestra un mapa de restricción del plásmido de expresión pDB3056.
La figura 20 muestra un mapa de restricción del plásmido de expresión pDB3165.
La figura 21 muestra un mapa de restricción del plásmido de expresión pDB4172.
La figura 22 muestra un mapa de restricción del plásmido de expresión pDB4267.
La figura 23 muestra un mapa de restricción del plásmido de expresión pDB4285.
La figura 24 muestra un cromatograma de GP-HPLC de WT HSA y mutantes K573P de HSA conjugados con HRP para el análisis de shFcRn. Se realizaron inyecciones de 25 j l en una columna TSK G3000SWXL (Tosoh Bioscience) como se describe en Materiales y procedimientos.
La figura 25 muestra la separación con SDS PAGE, seguida de detección visual (A) y por ultravioleta (B) de la albúmina conjugada con fluoresceína. HSA::F5M (carril 1), K573P::F5M (carril 2) y estándar de rHA (carril 3).
La figura 26 muestra las propiedades de unión a shFcRn de las variantes de HSA. Se inyectó una concentración 10 jM de (A) WT rHA y E492T, (B) WT rHA y D494N/E495Q/T496A, (C) WT rHA y N503D, (D) WT rHA y N503K, (E) WT rHA y E492T/N503D, (F) WT rHA y E495Q/T496A, (G) WT rHA y K538H y (H) WT rHA y E492D sobre shFcRn inmovilizado a pH 5,5.
La figura 27 muestra las propiedades de unión a shFcRn de las variantes de HSA. Se inyectó una concentración 10 jM de (I) WT rHA y K541A y (J) WT rHA y K541N sobre shFcRn inmovilizado a pH 5,5.
La figura 28 muestra la unión competitiva de K573A y K573P medida inyectando shFcRn (100 nM) solo o preincubado con diferentes cantidades de HSA K573A y K573P sobre HSA inmovilizada (~2500 RU) a pH 6,0. La figura 29 muestra la unión competitiva de variantes de HSA-FLAG medida inyectando shFcRn (100 nM) solo o junto con diferentes cantidades de variantes de HSA-FLAG sobre HSA inmovilizada (~2500 RU) a pH 6,0.
La figura 30 muestra la unión competitiva de variantes de HSA-IL1Ra medida inyectando shFcRn (100 nM) solo o junto con diferentes cantidades de variantes de HSA-IL1Ra sobre HSA inmovilizada (~2500 RU) a pH 6,0.
La figura 31 muestra la unión competitiva de variantes de HSA fusionadas con scFv medida inyectando shFcRn (100 nM) solo o junto con diferentes cantidades de (A) variantes de scFv-HSA-FLAG o (B) variantes de HSA-scFv-FLAG sobre HsA inmovilizada (~2500 RU) a pH 6,0.
La figura 32 muestra la unión de HSA, variantes mutantes simples, dobles y triples a shFcRn. Se inyectaron muestras de cada variante de HSA 10 jM sobre shFcRn inmovilizado a pH 5,5 o pH 7,4.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación se refiere a variantes aisladas de albúmina o fragmentos de las mismas, o polipéptidos de fusión que comprenden albúmina variante o fragmentos de la misma, de una albúmina original, que comprenden una alteración en una o más (varias) posiciones correspondientes a las posiciones 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 y 584 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, en el que la variante no es la variante que consiste en la SEQ ID NO: 2 con la sustitución D494N, E501K, K541E, D550G,A, K573E o K574N.
La alteración en una o más posiciones se puede seleccionar independientemente entre sustituciones, inserciones y deleciones, siendo preferentes las sustituciones.
Definiciones
Variante: el término "variante" significa un polipéptido derivado de una albúmina original por una o más alteraciones, es decir, una sustitución, inserción y/o deleción, en una o más (varias) posiciones. Una sustitución significa un reemplazo de un aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; una deleción significa la eliminación de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa la adición de 1 o más, preferentemente 1-3 aminoácidos inmediatamente adyacentes a un aminoácido que ocupa una posición.
Mutante: el término "mutante" significa un polinucleótido que codifica una variante.
Albúmina natural: El término albúmina "natural" (WT) significa albúmina que tiene la misma secuencia de aminoácidos que se encuentra naturalmente en un animal o en un ser humano.
Original o albúmina original: el término "original" o "albúmina original" significa una albúmina a la que se realiza una alteración por la mano del hombre para producir las variantes de albúmina de la presente invención. El original puede ser un polipéptido natural o un alelo del mismo, o incluso una variante del mismo.
FcRn y shFcRn: el término "FcRn" significa el receptor Fc neonatal humano (FcRn). El término shFcRn es una forma recombinante soluble de FcRn.
smFcRn: el término "smFcRn" es una forma recombinante soluble del receptor Fc neonatal de ratón.
Variante aislada: el término "variante aislada" significa una variante que se modifica por la mano del hombre y se separa completa o parcialmente de al menos un componente con el que se produce naturalmente. En un aspecto, la variante es al menos un 1 % pura, por ejemplo, al menos un 5 % pura, al menos un 10 % pura, al menos un 20 % pura, al menos un 40 % pura, al menos un 60 % pura, al menos un 80 % pura y al menos un 90 % pura, conforme a lo determinado por SDS-PAGE o GP-HPLC.
Variante substancialmente pura: el término "variante sustancialmente pura" significa una preparación que contiene como máximo un 10 %, como máximo un 8 %, como máximo un 6 %, como máximo un 5 %, como máximo un 4 %, como máximo un 3 %, como máximo un 2 %, como máximo un 1 % y como máximo un 0,5 % en peso de otro material polipeptídico con el que se asocia de forma natural o recombinante. Preferentemente, la variante es al menos un 92 % pura, por ejemplo, al menos un 94 % pura, al menos un 95 % pura, al menos un 96 % pura, al menos un 97 % pura, al menos un 98 % pura, al menos un 99 % pura, al menos un 99,5 % pura y 100 % pura en peso del material polipeptídico total presente en la preparación. Las variantes de la presente invención están preferentemente en una forma sustancialmente pura. Esto se puede lograr, por ejemplo, preparando la variante mediante procedimientos recombinantes bien conocidos y mediante procedimientos de purificación.
Polipéptido maduro: el término "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final después de la traducción y cualquier modificación postraduccional, tal como procesamiento del extremo N, truncamiento del extremo C, glicosilación, fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro son los aminoácidos 1 a 585 de SEQ ID NO: 2, con la inclusión de cualquier modificación postraduccional.
Secuencia codificante de polipéptido maduro: el término "secuencia codificante de polipéptido maduro" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido de albúmina madura. En un aspecto, la secuencia codificante de polipéptido maduro son los nucleótidos 1 a 1758 de SEQ ID NO: 1.
Identidad de secuencia: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad de secuencia".
Para los fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferentemente la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales utilizados son una penalización por apertura de huecos de 10, una penalización por extensión de huecos de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). La salida de Needle etiquetada como "identidad más larga" (obtenida mediante la opción -nobrief) se utiliza como porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:
(Residuos idénticos x 100) / (Longitud de alineación - Número total de huecos en la alineación)
Para los fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferentemente la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales utilizados son una penalización por apertura de huecos de 10, una penalización por extensión de huecos de 0,5 y la matriz de sustitución EDNAFu Ll (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). La salida de Needle etiquetada como "identidad más larga" (obtenida mediante la opción -nobrief) se utiliza como porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:
(Desoxirribonucleótidos idénticos x 100) / (Longitud de alineación - Número total de huecos en la alineación) Fragmento: el término "fragmento" significa un polipéptido que tiene uno o más (varios) aminoácidos delecionados del extremo amino y/o carboxilo de una albúmina y/o una región interna de albúmina que ha conservado la capacidad de unirse a FcRn. Los fragmentos pueden consistir en una secuencia ininterrumpida derivada de HSA o pueden comprender dos o más secuencias derivadas de HSA. Los fragmentos de acuerdo con la invención tienen un tamaño de más de aproximadamente 20 residuos de aminoácidos, preferentemente más de 30 residuos de aminoácidos, más preferentemente más de 40 residuos de aminoácidos, más preferentemente más de 50 residuos de aminoácidos, más preferentemente más de 75 residuos de aminoácidos, más preferentemente más de 100 residuos de aminoácidos, más preferentemente más de 200 residuos de aminoácidos, más preferentemente más de 300 residuos de aminoácidos, incluso más preferentemente más de 400 residuos de aminoácidos y lo más preferentemente más de 500 residuos de aminoácidos.
Variante alélica: el término "variante alélica" significa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica se produce naturalmente a través de la mutación, y puede
dar lugar a un polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.
Secuencia codificante: el término "secuencia codificante" significa un polinucleótido que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto polipeptídico traducido. Los límites de la secuencia codificante están determinados en general por un marco de lectura abierto, que habitualmente comienza con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG y termina con un codón de parada tal como TAA, TAG y TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN, ADNc, polinucleótido sintético o recombinante.
ADNc: el término "ADNc" significa una molécula de ADN que se puede preparar mediante transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm madura, empalmada, obtenida de una célula eucariótica. El ADNc carece de secuencias de intrones que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito inicial de ARN primario es un precursor del ARNm que se procesa a través de una serie de etapas, que incluyen el corte y empalme, antes de aparecer como ARNm empalmado maduro.
Construcción de ácido nucleico: el término "construcción de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, de cadena sencilla o doble, que se aísla de un gen natural o se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que, de otro modo, no existiría en la naturaleza o que es sintético. El término construcción de ácido nucleico es sinónimo del término "casete de expresión" cuando la construcción de ácido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.
Secuencias de control: el término "secuencias de control" significa todos los componentes necesarios para la expresión de un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser natural o exógena para el polinucleótido que codifica la variante o natural o exógena entre sí. Dichas secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, un líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal y terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada de transcripción y traducción. Las secuencias de control se pueden proporcionar con conectores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la ligación de las secuencias de control dentro de la región codificante del polinucleótido que codifica una variante.
Enlazada de forma funcional: el término "enlazado de forma funcional" significa una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada con relación a la secuencia codificante de un polinucleótido, de modo que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante.
Expresión: el término "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción de la variante que incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.
Vector de expresión: el término "vector de expresión" significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica una variante y está enlazado de forma funcional a nucleótidos adicionales que posibilitan su expresión.
Célula huésped: el término "célula huésped" significa cualquier tipo de célula que sea susceptible de transformación, transfección, transducción y similares con una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. El término "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula original que no es idéntica a la célula original debido a mutaciones que se producen durante la replicación.
Semivida plasmática: La semivida plasmática se determina idealmente in vivo en individuos adecuados. Sin embargo, dado que consume mucho tiempo y es costoso e que inevitablemente existen preocupaciones éticas relacionadas con la realización de experimentos en animales o humanos, es deseable usar un ensayo in vitro para determinar si la semivida plasmática se amplía o reduce. Se sabe que la unión de la albúmina a su receptor FcRn es importante para la semivida plasmática y la correlación entre la unión al receptor y la semivida plasmática es que una mayor afinidad de la albúmina por su receptor conduce a una semivida plasmática más prolongada. Por lo tanto, para la presente invención, una mayor afinidad de albúmina por FcRn se considera indicativa de un aumento de la semivida plasmática y una menor afinidad de albúmina por su receptor se considera indicativa de una semivida plasmática reducida.
En esta solicitud y reivindica que la unión de la albúmina a su receptor FcRn se describe utilizando el término afinidad y las expresiones "más fuerte" o "más débil". Por lo tanto, se debe entender que una molécula que tiene una afinidad mayor por FcRn que HSA se considera que se une más fuertemente a FcRn que HSA y una molécula que tiene una afinidad menor por FcRn que HSA se considera que se une más débilmente a FcRn que HSA.
Se entiende que los términos "semivida plasmática más prolongada" o "semivida plasmática más reducida" y expresiones similares están relacionados con la molécula de albúmina original correspondiente. Por lo tanto, una semivida plasmática más prolongada con respecto a una albúmina variante de la invención significa que la variante
tiene una semivida plasmática más prolongada que la correspondiente albúmina que tiene las mismas secuencias, excepto por la alteración en la posición correspondiente a 573 en la SEQ ID NO: 2.
Convenios para la designación de variantes
Para los fines de la presente invención, el polipéptido maduro divulgado en la SEQ ID NO: 2 se usa para determinar el residuo de aminoácido correspondiente en otra albúmina. La secuencia de aminoácidos de otra albúmina se alinea con el polipéptido maduro divulgado en la SEQ ID NO: 2 y, en base a la alineación, el número de posición de aminoácido correspondiente a cualquier residuo de aminoácido en el polipéptido maduro divulgado en la SEQ ID NO: 2 se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 453) como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferentemente la versión 3.0.0 o posterior.
La identificación del residuo de aminoácido correspondiente en otra albúmina se puede confirmar mediante una alineación de múltiples secuencias polipeptídicas utilizando "ClustalW" (Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947 2948).
Cuando el otro polipéptido (o proteína) ha divergido del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 de modo que la comparación tradicional basada en secuencias no puede detectar su relación (Lindahl y Elofsson, 2000, J. Mol. Biol.
295: 613-615), se pueden usar otros algoritmos de comparación de secuencias por pares. Se puede lograr una mayor sensibilidad en la búsqueda basada en secuencias utilizando programas de búsqueda que utilizan representaciones probabilísticas de familias (perfiles) de polipéptidos para buscar en bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un procedimiento iterativo de búsqueda en bases de datos y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Se puede lograr una sensibilidad incluso mayor si la familia o superfamilia del polipéptido tiene uno o más representantes en las bases de datos de estructuras de proteínas. Programas tales como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información de una variedad de fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineación estructural y potenciales de solvatación) como entradas a una red neuronal que predice el pliegue estructural para una secuencia de consulta. Del mismo modo, el procedimiento de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919 se puede usar para alinear una secuencia de estructura desconocida dentro de los modelos de superfamilia presentes en la base de datos SCOP. Estas alineaciones se pueden usar, a su vez, para generar modelos de homología para el polipéptido, y la precisión de dichos modelos se pueden evaluar usando una variedad de herramientas desarrolladas para ese fin.
Para proteínas de estructura conocida, varias herramientas y recursos están disponibles para recuperar y generar alineaciones estructurales. Por ejemplo, las superfamilias de proteínas SCOP se han alineado estructuralmente, y dichas alineaciones son accesibles y descargables. Dos o más estructuras de proteínas se pueden alinear usando una variedad de algoritmos, tales como la matriz de alineación de distancia (Holm y Sander, 1998, Proteins 33: 88 96) o extensión combinatoria (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), y las implementaciones de estos algoritmos se pueden utilizar adicionalmente para consultar bases de datos de estructuras con una estructura de interés para descubrir posibles homólogos estructurales (por ejemplo, Holm y Park, 2000, Bioinformática 16: 566-567).
Al describir las variantes de albúmina de la presente invención, la nomenclatura que se describe a continuación se adapta para facilitar la referencia. Se emplea la abreviatura aceptada de la IUPAC de una sola letra o de tres letras para describir los aminoácidos.
Sustituciones. Para una sustitución de aminoácidos se usa la siguiente nomenclatura: Aminoácido original, posición, aminoácido por el que se sustituye. En consecuencia, por ejemplo, el reemplazo de treonina por alanina en la posición 226 se designa como "Thr226Ala" o "T226A". Las mutaciones múltiples se separan por marcas de adición ("+"), por ejemplo, "Gly205Arg Ser411Phe" o "G205R S411F", que representan reemplazos en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) por arginina (R) y serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente. Las figuras también usan ("/"), por ejemplo, "E492T/N503D"; esto se debe considerar como intercambiable con ("+").
Deleciones. Para una deleción de aminoácidos se usa la siguiente nomenclatura: Aminoácido original, posición*. En consecuencia, la deleción de glicina en la posición 195 se designa como "Gly195*" o "G195*". Las deleciones múltiples se separan por marcas de adición ("+"), por ejemplo, "Gly195* Ser411*" o "G195* S411*".
Inserciones. Para una inserción de aminoácidos se usa la siguiente nomenclatura: Aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado. Por consiguiente, la inserción de lisina después de la glicina en la posición 195 se denomina "Gly195GlyLys" o "G195GK". Una inserción de múltiples aminoácidos se designa [aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado n.° 1, aminoácido insertado n.° 2; etc.]. Por ejemplo, la inserción de lisina y alanina después de glicina en la posición 195 se indica como "Gly195GlyLysAla" o "G195GKA".
En dichos casos, el residuo o residuos de aminoácido insertados se numeran mediante la adición de letras minúsculas al número de posición del residuo de aminoácido que precede al residuo o residuos de aminoácido insertados. En el ejemplo anterior, la secuencia sería así:
Original: Variante:
195 195195a 195b
G G -K -A
Múltiples alteraciones. Las variantes que comprenden múltiples alteraciones se separan por marcas de adición ("+"), por ejemplo, "Arg170Tyr+Gly195Glu" o "R170Y+G195E" que representan una sustitución de tirosina y ácido glutámico por arginina y glicina en las posiciones 170 y 195, respectivamente.
Diferentes sustituciones. Cuando se pueden introducir diferentes sustituciones en una posición, las diferentes sustituciones se separan por una coma, por ejemplo, "Arg170Tyr,Glu" representa un reemplazo de arginina por tirosina o ácido glutámico en la posición 170. Por tanto, "Tyr167Gly,Ala Arg170Gly,Ala" designa las siguientes variantes:"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly" y "Tyr167Ala+Arg170Ala". Albúmina original
Las albúminas son proteínas y constituyen la proteína más abundante en plasma en mamíferos. Las albúminas de muchos mamíferos se han caracterizado por procedimientos bioquímicos y/o por información de secuencia. Varias albúminas, por ejemplo, albúmina sérica humana (HSA), también se han caracterizado cristalográficamente y se ha determinado la estructura.
HSA es una proteína que consiste en 585 residuos de aminoácidos y tiene un peso molecular de 67 kDa. En su forma natural, no está glicosilada. La secuencia de aminoácidos de HSA se muestra en la SEQ ID NO: 2.
Las albúminas tienen en general una semivida plasmática prolongada de aproximadamente 20 días o más, por ejemplo, la HSA tiene una semivida plasmática de 19 días. Se sabe que la semivida plasmática prolongada de HSA está mediada por la interacción con su receptor FcRn; sin embargo, la comprensión o el conocimiento del mecanismo exacto que explica la prolongada semivida de HSA no es esencial para la presente invención.
La albúmina original, un fragmento de la misma o la parte de albúmina de un polipéptido de fusión que comprende albúmina o un fragmento de la misma de acuerdo con la invención tiene una identidad de secuencia con la secuencia de HSA mostrada en la SEQ ID NO: 2 de al menos un 98 % y lo más preferentemente de al menos un 99 %.
El original comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2. En otro aspecto, el original comprende o consiste en el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
Los polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o una subsecuencia de la misma, así como la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma, se pueden usar para diseñar sondas de ácidos nucleicos para identificar y clonar ADN que codifica un original de cepas de diferentes géneros o especies de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. En particular, dichas sondas se pueden usar para la hibridación con el ADN genómico o ADNc del género o especie de interés, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern convencionales, con el fin de identificar y aislar el gen correspondiente en el mismo. Dichas sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia completa, pero deberían tener al menos 14, por ejemplo, al menos 25, al menos 35 o al menos 70 nucleótidos de longitud. Preferentemente, la sonda de ácido nucleico tiene al menos 100 nucleótidos de longitud, por ejemplo, al menos 200 nucleótidos, al menos 300 nucleótidos, al menos 400 nucleótidos, al menos 500 nucleótidos, al menos 600 nucleótidos, al menos 700 nucleótidos, al menos 800 nucleótidos o al menos 900 nucleótidos de longitud. Se pueden usar sondas de ADN y de ARN. Las sondas típicamente están marcadas para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina). Dichas sondas están englobadas en la presente invención.
Una colección de ADN genómico o ADNc preparada a partir de dichos otros organismos se puede explorar en cuanto a ADN que se hibrida con las sondas descritas anteriormente y codifica un original. El ADN genómico u otro ADN de dichos otros organismos se puede separar mediante electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida u otras técnicas de separación. El ADN de las colecciones o el ADN separado se pueden transferir e inmovilizar sobre nitrocelulosa u otro material de vehículo adecuado. Para identificar un clon o ADN que sea homólogo con la SEQ ID NO: 1 o una subsecuencia de la misma, el material de vehículo se usa en una transferencia de Southern.
Para los fines de la presente invención, la hibridación indica que el polinucleótido hibrida con una sonda de nucleótidos marcada correspondiente al polinucleótido mostrado en la SEQ ID NO: 1, su cadena complementaria o una subsecuencia de la misma, en condiciones de rigurosidad baja a muy alta. Las moléculas a las que hibrida la sonda se pueden detectar utilizando, por ejemplo, una película de rayos X o cualquier otro medio de detección conocido en la técnica.
En un aspecto, la sonda de ácido nucleico es la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico son los nucleótidos 1 a 1785 de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es la SEQ ID NO: 1.
Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, las condiciones de rigurosidad muy baja a muy alta se definen como prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, SDS al 0,3 %, 200 pg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y formamida al 25 % para rigurosidades muy bajas y bajas, formamida al 35 % para rigurosidades medias y medias-altas o formamida al 50 % para rigurosidades altas y muy altas, siguiendo procedimientos estándar de transferencia de Southern durante 12 a 24 horas de manera óptima. El material de vehículo se lava finalmente tres veces cada uno durante 15 minutos usando 2X SSC, s Ds al 0,2% a 45 °C (rigurosidad muy baja), 50 °C (rigurosidad baja), 55 °C (rigurosidad media), 60 °C (rigurosidad media-alta), 65 °C (rigurosidad alta) o 70 °C (rigurosidad muy alta).
Para sondas cortas que tienen aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de rigurosidad se definen como prehibridación e hibridación a aproximadamente 5 °C a aproximadamente 10 °C por debajo de la Tm calculada usando el cálculo de acuerdo con Bolton y McCarthy (1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 1390) en NaCl 0,9 M, Tris-HCl 0,09 M, pH 7,6, EDTA 6mM, NP-400,5 %, 1X solución de Denhardt, pirofosfato de sodio 1 mM, fosfato de sodio monobásico 1 mM, ATP 0,1 mM, y 0,2 mg de ARN de levadura por ml siguiendo los procedimientos estándar de transferencia de Southern durante 12 a 24 horas de manera óptima. El material de vehículo se lava finalmente una vez en 6X SCC más SDS al 0,1 % durante 15 minutos y dos veces cada uno durante 15 minutos usando 6X SSC a 5 °C a 10 °C por debajo de la Tm calculada. En un tercer aspecto, el original está codificado por un polinucleótido con una identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 de al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 %, que codifica un polipéptido que puede funcionar como una albúmina. En un modo de realización, el original está codificado por un polinucleótido que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 1.
Preparación de variantes
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento para preparar una albúmina variante, fragmento de la misma o polipéptido de fusión que comprende una albúmina variante o un fragmento de la misma que comprende las etapas de:
a. Proporcionar un ácido nucleico que codifica dicha albúmina, el fragmento de la misma o la parte de albúmina de un polipéptido de fusión que comprende albúmina o el fragmento de la misma;
b. Expresar el ácido nucleico modificado en una célula huésped adecuada; y
c. Recuperar la albúmina variante, el fragmento de la misma o el polipéptido de fusión que comprende la albúmina variante o el fragmento de la misma.
La identificación de una o más posiciones de residuos de aminoácidos que son importantes para la unión de albúmina a FcRn, en albúmina, fragmento de la misma o la parte de albúmina de un polipéptido de fusión se puede realizar de varias maneras, que incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis aleatoria seguida de análisis de los mutantes generados y comparación con la molécula original no mutada, e identificación basada en consideraciones estructurales opcionalmente seguida por generación de variantes que tienen las alteraciones identificadas y comparación con la molécula original no mutada.
Un procedimiento preferente para la identificación de una o más posiciones de residuos de aminoácidos que se van a cambiar a fin de preparar una variante de HSA que tiene una unión alterada a FcRn en comparación con HSA natural, comprende las siguientes etapas:
i) Identificar una albúmina no humana que tiene una propiedad de unión diferente a FcRn;
ii) Identificar los residuos de aminoácidos de la albúmina sérica humana que interactúan con FcRn;
iii) Comparar la estructura primaria y/o terciaria de la albúmina no humana identificada y de la albúmina sérica humana con respecto a los residuos de aminoácidos identificados en la etapa ii) e identificar los residuos de aminoácidos que difieren entre dicha albúmina no humana y la albúmina sérica humana como responsables de la diferencia de unión observada; y
iv) Opcionalmente, preparar variantes de HSA en las posiciones identificadas en la etapa iii) y confirmar que las variantes preparadas tienen una unión alterada a FcRn en comparación con HSA.
La etapa i) anterior se puede hacer usando el ensayo de SPR descrito a continuación.
En un modo de realización preferente, la albúmina no humana identificada tiene una unión más fuerte a FcRn que HSA. Los ejemplos de albúminas no humanas que tienen unión más fuerte a FcRn que HSA incluyen albúmina de suero de burro, albúmina de suero de conejo, albúmina de suero de perro, albúmina de suero de hámster, albúmina de suero de cobaya, albúmina de suero de ratón y albúmina de suero de rata. La etapa ii) se puede lograr considerando la estructura de FcRn, HSA y el complejo de unión de estos dos. En ausencia de una estructura disponible del complejo de unión, es posible usar un modelo en el que la estructura de HSA se acople a la estructura de FcRn y, de este modo, identificar los residuos de aminoácidos de HSA que interactúan con FcRn.
En la presente invención y en las reivindicaciones, un residuo de aminoácido de HSA que interacciona con FcRn se considera cualquier residuo de aminoácido de HSA que está situado a menos de 10 A de un aminoácido del FcRn o cualquier residuo de aminoácido que esté implicado en un enlace de hidrógeno, una sal puente o una interacción polar o no polar con un residuo de aminoácido que está situado a menos de 10 A de un aminoácido del FcRn. Preferentemente, los aminoácidos de los residuos de HSA están situados a menos de 10 A de los aminoácidos del FcRn, más preferentemente a menos de 6 A de los aminoácidos del FcRn y lo más preferentemente a menos de 3 A de los aminoácidos del FcRn.
Las etapas iii) y iv) se pueden realizar usando técnicas bien conocidas por el experto.
Las variantes se pueden preparar por los expertos que usen cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio, construcción genética sintética, construcción génica semisintética, mutagénesis aleatoria, barajado, etc.
La mutagénesis dirigida al sitio es una técnica en la que se crean una o más (varias) mutaciones en uno o más sitios definidos de un polinucleótido que codifica el original.
La mutagénesis dirigida al sitio se puede lograr in vitro mediante PCR que implica el uso de cebadores oligonucleotídicos que contienen la mutación deseada. La mutagénesis dirigida al sitio también se puede realizar in vitro mediante mutagénesis en casete que implica la escisión mediante una enzima de restricción en un sitio del plásmido que comprende un polinucleótido que codifica el original y posterior ligación de un oligonucleótido que contiene la mutación en el polinucleótido. Normalmente, la enzima de restricción que se digiere en el plásmido y el oligonucleótido es la misma, lo que permite la ligación del plásmido y la inserción entre sí. Véase, por ejemplo, Scherer y Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; y Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349 4966.
La mutagénesis dirigida al sitio también se puede realizar in vivo mediante procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; y Calissano y Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.
En la presente invención se puede usar cualquier procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio. Hay muchos kits comerciales disponibles que se pueden usar para preparar variantes.
La construcción de genes sintéticos implica la síntesis in vitro de una molécula de polinucleótido diseñada para codificar un polipéptido de interés. La síntesis de genes se puede realizar utilizando una serie de técnicas, tales como la tecnología basada en microchip multiplexada descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) y tecnologías similares en las que los oligonucleótidos se sintetizan y ensamblan a partir de chips microfluídicos fotoprogramables.
Se pueden realizar y someter a prueba sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos simples o múltiples usando procedimientos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o barajado, seguido de un procedimiento de cribado relevante, tal como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; documento WO 95/17413; o documento WO 95/22625. Otros procedimientos que se pueden usar incluyen la PCR propensa a errores, la presentación en fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; la patente de EE. UU. n.° 5.223.409; el documento Wo 92/06204) y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127). Los procedimientos de mutagénesis/barajado se pueden combinar con procedimientos de cribado automatizado de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos clonados y mutagenizados expresadospor células huésped (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology l7 : 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar de las células huésped y secuenciar rápidamente usando procedimientos estándar en la técnica. Estos procedimientos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido.
La construcción de genes semisintéticos se lleva a cabo combinando aspectos de la construcción de genes sintéticos y/o mutagénesis dirigida al sitio y/o mutagénesis aleatoria y/o barajado. La construcción semisintética se tipifica mediante un proceso que utiliza fragmentos de polinucleótidos que se sintetizan, en combinación con técnicas de PCR. Las regiones definidas de genes se pueden así sintetizar de novo, mientras que otras regiones se pueden amplificar usando cebadores mutagénicos específicos del sitio, mientras que otras regiones se pueden
someter a PCR propensa a errores o amplificación por PCR no propensa a errores. Las subsecuencias de polinucleótidos se pueden barajar a continuación.
Variantes
La presente divulgación también se refiere a albúminas variantes o fragmentos de las mismas, o polipéptidos de fusión que comprenden la albúmina variante o fragmentos de la misma, de una albúmina original, que comprende una alteración en una o más (varias) posiciones correspondientes a las posiciones 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 y 584 de la SEQ ID NO: 2, en la que cada alteración es independientemente una sustitución, inserción o deleción, siempre que la variante no sea la SEQ ID NO: 2 que tiene la sustitución K573E.
La albúmina variante, un fragmento de la misma o la parte de albúmina de un polipéptido de fusión que comprende albúmina variante o un fragmento de la misma de acuerdo con la invención tiene una identidad de secuencia con la secuencia de HSA mostrada en la SEQ ID NO: 2 de al menos un 98 % y lo más preferentemente de al menos un 99 %. En un aspecto, el número de alteraciones en las variantes de la presente invención es, por ejemplo, de 1-10 o 1-5, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 alteraciones.
En un modo de realización preferente particular, la albúmina original es HSA y la albúmina variante, un fragmento de la misma o polipéptido de fusión que comprende la albúmina variante o fragmento de la misma tiene una semivida plasmática más prolongada en comparación con la HSA, el correspondiente fragmento o el polipéptido de fusión que comprende HSA o fragmento de la misma.
Los autores de la presente invención han realizado la correlación entre la unión de la albúmina a su receptor y la semivida plasmática basándose en el alelo natural de HSA D494N. Los autores de la invención han analizado este alelo y han encontrado que tiene una afinidad menor por su receptor FcRn.
Además, se ha divulgado que un ratón transgénico que tiene el FcRn natural de ratón reemplazado por FcRn humano tiene un nivel de albúmina sérica más alto que el ratón normal; véase J Exp Med. (2003) l97(3):315-22. Los autores de la invención han descubierto que el FcRn humano tiene una afinidad más alta por la albúmina sérica de ratón que el FcRn de ratón por la albúmina sérica de ratón y, por lo tanto, el aumento observado en el nivel de albúmina sérica en los ratones transgénicos se corresponde con una mayor afinidad entre la albúmina sérica y su receptor, confirmando la correlación entre la unión de albúmina a FcRn y la semivida plasmática. Además, se ha demostrado que las variantes de albúmina que tienen poca o ninguna unión a FcRn tienen una semivida reducida en un modelo de ratón (Kenanova et al., (2009) J. Nucl. Med.; 50 (Suplemento 2):1582).
Una forma de determinar si la afinidad de una albúmina variante por FcRn es mayor o menor que la de la albúmina original es usar el ensayo de Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) como se describe a continuación. El experto comprenderá que otros procedimientos podrían ser útiles para determinar si la afinidad de una albúmina variante por FcRn es mayor o menor que la afinidad de la albúmina original por FcRn, por ejemplo, determinación y comparación de las constantes de unión KD. Por tanto, se considera que las albúminas variantes que tienen una k D menor que la KD para la HSA natural tienen una semivida plasmática mayor que la HSA y se considera que las albúminas variantes que tienen una KD mayor que la KD para la HSA natural tienen una semivida plasmática menor que la HSA.
Las variantes de albúmina o fragmentos de las mismas o polipéptidos de fusión que comprenden albúmina o fragmentos de la misma comprenden una o más alteraciones, tales como sustituciones, deleciones o inserciones en una o más (varias) posiciones correspondientes a las posiciones en HSA seleccionadas del grupo que consiste en 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 y 584. La sustitución puede ser cualquier sustitución en la que el aminoácido de la secuencia de albúmina natural se sustituye por un aminoácido diferente seleccionado entre los 19 aminoácidos naturales restantes.
En un aspecto, una variante comprende una alteración en una o más (varias) posiciones correspondientes a las posiciones 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 y 584 de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, una variante comprende una alteración en dos posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 y 584 de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, una variante comprende una alteración en tres posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 y 584 de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende la sustitución Q417A,H del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución H440Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución H464Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución A490D del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución E492G,T,P,H del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la
sustitución V493P,L del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución D494N,Q,A,E,P del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución E495Q,A del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución T496A del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución P499A del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución K500E,G,D,A,S,C,P,H,F,N,W,T,M,Y,V,Q,L,I,R del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución E501A,P,Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución N503K,D,H del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución A504E del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución E505K,D del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución T506F,S del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución H510Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución H535Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución K536A del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución P537A del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución K538A,H del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución T540S del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución K541A,D,G,N,E del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución E542P,D del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución D550N del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En todos los aspectos, la variante comprende la sustitución K573Y,W,P,H,F,V,I,N,S,G,M,C,A,R,L,D del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución K574N del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución Q580K del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución L575F del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución A577T,E del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución A578R,S del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución S579C,T del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución Q580K del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución A581D del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución A582T del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución G584A del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En un aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 417. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 417 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Ala o His. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución Q417A,H del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 440. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 440 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Ala. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución H440Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 464. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 464 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Ala. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución H464Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 490. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 490 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución A490G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 492. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 492 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Gly. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución E492G del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 493. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 493 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Pro. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución V493P del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 494. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 494 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Asn, Gln o Ala. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución D494N,Q,A del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 495. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 495 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Gln o Ala. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución E495Q o A del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 496. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 496 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Ala. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución T496A del polipéptido maduro de la s Eq ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 499. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 499 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Ala. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución P499A del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 500. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 500 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Ala. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución K500E,G,D,A,S,C,P,H,F,N,W,T,M,Y,V,Q,L,I,R del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 501. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 501 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Ala o Gln para reducir la afinidad y Pro para aumentar la afinidad. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución E501A,Q,P del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 503. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 503 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Asp o Lys o His. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución N503D,K,H del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 504. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 504 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución A504 del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 505. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 505 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución E505D del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 506. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 506 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución T506S,F del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 510. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 510 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Gln. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución H510Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 535. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 535 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Gln. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución H535Q del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 536. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 536 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Ala. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución K536A del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 537. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 537 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Ala. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución P537A del polipéptido maduro de la s Eq ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 538. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 538 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Ala. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución K538H, A del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 540. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 540 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución T540S del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 541. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 541 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Gly, Asp o Ala. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución K541G,D A,N del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 542. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 542 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Asp o Pro. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución E542D,P del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 550. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 550 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Asn para reducir la afinidad, preferentemente por Glu para aumentar la afinidad.
En otro aspecto, y de acuerdo con la invención, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 573. De acuerdo con la invención, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 573 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Tyr, Trp, Pro, His, Phe, Val, Ile, Asn, Ser, Gly, Met, Cys, Ala, Arg, Leu o Asp. De acuerdo con la invención, la variante comprende la sustitución K573Y,W,P,H,F,V,I,N,S,G,M,C,A,R,L,D del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 574. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 574 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Asn. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución K574N del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 575. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 575 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Phe. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución L575F del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 577. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 577 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Thr o Glu. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución A577TE del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 578. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 578 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Arg o Ser. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución A578R,S del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 579. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 579 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Cys o Thr. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución S579C,T del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 580. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 580 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Lys. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución Q580K del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 581. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 581 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Asp. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución A581D del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 582. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 582 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Thr. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución A582T del polipéptido maduro de la sEq ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en una posición correspondiente a la posición 584. En otro aspecto, el aminoácido en una posición correspondiente a la posición 584 se reemplaza por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferentemente por Ala. En otro aspecto, la variante comprende la sustitución G584A del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la variante comprende una alteración en las posiciones correspondientes a las posiciones 494 y 496 en la SEQ ID NO: 2, tales como las descritas anteriormente.
En otro aspecto, la variante comprende alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 492 y 493 en la SEQ ID NO: 2, tales como las descritas anteriormente.
En otro aspecto, la variante comprende alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 494 y 417 en la SEQ ID NO: 2, tales como las descritas anteriormente.
En otro aspecto, la variante comprende alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 492 y 503 en la SEQ ID NO: 2, tales como las descritas anteriormente.
En otro aspecto, la variante comprende alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 492 y 573 en la SEQ ID NO: 2, tales como las descritas anteriormente.
En otro aspecto, la variante comprende alteraciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 492, 503 y 573 en la SEQ ID NO: 2, tales como las descritas anteriormente.
En un modo de realización, la albúmina variante o fragmentos de la misma o polipéptidos de fusión que comprenden la albúmina variante o fragmentos de la misma de acuerdo con la invención contienen una sustitución en una posición correspondiente a una posición en HSA seleccionada del grupo que consiste en las posiciones 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 y 584 en la SEQ ID NO: 2, siempre que la albúmina variante no sea la variante que consiste en la SEQ ID NO: 2 con la sustitución D494N, E501K, K541E, D550G,A o K574N. La albúmina variante, fragmento de la misma o polipéptidos de fusión que comprenden albúmina variante o un fragmento de la misma de acuerdo con la invención pueden comprender sustituciones, inserciones o deleciones adicionales en una o más (varias) posiciones correspondientes a otras posiciones en HSA.
En otro modo de realización, la albúmina variante o fragmentos de la misma o polipéptidos de fusión que comprenden la albúmina variante o fragmentos de la misma de acuerdo con la invención contienen dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o incluso más sustituciones en posiciones correspondientes a posiciones en HSA seleccionados del grupo que consiste en las posiciones 417, 440, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 y 584 de SEQ ID NO: 2. La albúmina variante o fragmentos de la misma o polipéptidos de fusión que comprenden albúmina variante o fragmentos de la misma de acuerdo con la invención pueden comprender sustituciones, inserciones o deleciones adicionales en posiciones correspondientes a otras posiciones en HSA.
En un modo de realización adicional, las variantes de albúmina o fragmentos de las mismas o polipéptidos de fusión que comprenden albúmina variante o un fragmento de la misma de acuerdo con la invención tienen una semivida plasmática que es más prolongada que la semivida plasmática del fragmento de albúmina original de la misma o polipéptido de fusión que comprende la albúmina principal o un fragmento de la misma. Los ejemplos de acuerdo con este modo de realización incluyen variantes de albúmina o fragmentos de las mismas o polipéptidos de fusión que comprenden albúmina variante o un fragmento de la misma que comprenden una sustitución en la posición correspondiente a 492, 503, 542, 550, 573, 574, 580, 581, 582 o 584 en la SEQ ID NO: 2. Las sustituciones preferentes incluyen el reemplazo del residuo de aminoácido en la posición correspondiente a 492 en la SEQ ID NO: 2 por un residuo de G, reemplazo del residuo de aminoácido en la posición correspondiente a 503 en la SEQ ID NO: 2 por un residuo de H o K, reemplazo del residuo de aminoácido en la posición correspondiente a 550 en la SEQ ID NO: 2 por un residuo de E, el reemplazo del residuo de aminoácido en una posición correspondiente a 574 en la SEQ ID NO: 2 por un residuo de N o el reemplazo del residuo de aminoácido en la posición correspondiente a 580 en la SEQ ID NO: 2 por un residuo de K. Otras variantes preferentes tienen un reemplazo en la posición correspondiente a 492 en la SEQ ID NO: 2 por un residuo de G y un reemplazo en la posición correspondiente a 573 en la SeQ ID NO: 2 por un residuo de A o P.
Otras variantes preferentes tienen un reemplazo en la posición correspondiente a 492 en la SEQ ID NO: 2 por un residuo G y un reemplazo en la posición correspondiente a la posición 503 en la SEQ ID NO: 2 correspondiente a un residuo H o un residuo K y un reemplazo en la posición 573 en la SEQ ID NO: 2 por un residuo de A o P.
Además de la una o más sustituciones en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 417, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574, 580581, 582 y 584 en la SEQ ID NO: 2, la albúmina variante o fragmentos de la misma o polipéptidos de fusión que comprenden albúmina variante o fragmentos de la misma de acuerdo con la invención pueden contener sustituciones, deleciones o inserciones adicionales en otras posiciones de las moléculas. Dichas sustituciones, deleciones o inserciones adicionales pueden ser útiles para alterar otras propiedades de las moléculas tales como, pero sin limitarse a, glicosilación alterada; introducción de grupos reactivos de la superficie tales como grupos tiol; eliminación/generación de un sitio de carbamoilación; etc.
Los residuos que se podrían alterar para proporcionar residuos reactivos en la superficie y que se podrían aplicar ventajosamente a la presente invención se han divulgado en la solicitud de patente WO 2010/092135.
Ejemplos de alteraciones que se pueden hacer en la SEQ ID NO: 2 o en posiciones correspondientes de otras albúminas con el fin de proporcionar un grupo tiol reactivo en la superficie incluyen alteraciones correspondientes a las siguientes alteraciones en la SEQ ID NO: 2: L585C, D1C, A2C, D562C, A364C, A504C, E505C, T79C, E86C, D129C, D549C, A581C, D121C, E82C, S270C, A578C, L595LC, D1DC, A2AC, D562DC, A364AC, A504AC, E505EC, T79TC, E86EC, D129DC, D549DC, A581AC, A581AC, D121DC, E82EC, S270SC, A579AC, C360*, C316*, C75*, C168*, C558*, C361*, C91*, C124*, C169* y C567*. De forma alternativa, se puede añadir un residuo de cisteína al extremo N o C de la albúmina.
Polinucleótidos
La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican cualquiera de las variantes de la presente invención.
Construcciones de ácido nucleico
La presente invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención enlazada de forma funcional a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control.
Un polinucleótido se puede manipular en una variedad de maneras para proporcionar la expresión de una variante. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos que utilizan procedimientos de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica.
La secuencia de control puede ser una secuencia promotora, que es reconocida por una célula huésped para la expresión del polinucleótido. La secuencia promotora contiene secuencias de control de la transcripción que median en la expresión de la variante. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad transcripcional en la célula huésped, incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y se puede obtener a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares homólogos o heterólogos a la célula huésped.
En un huésped de levadura, promotores útiles se obtienen de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, proteasa A (PRA1) de Saccharomyces cerevisiae, proteasa B (PRB1) de Saccharomyces cerevisiae, factor de elongación de la traducción (TEF1) de Saccharomyces cerevisiae, factor de elongación de la traducción (TEF2) de Saccharomyces cerevisiae, galactocinasa (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, alcohol deshidrogenasa / gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, isomerasa de triosa fosfato (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae y 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huésped de levadura se describen en Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
La secuencia de control también puede ser una secuencia de terminación de la transcripción adecuada, que es reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia del terminador está enlazada de forma funcional al extremo 3' del polinucleótido que codifica la variante. Se puede usar cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped.
Los terminadores preferentes para células huésped de levadura se obtienen de genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, alcohol deshidrogenasa (ADH1) de Saccharomyces cerevisiae y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huésped de levadura se describen en Romanos et al., 1992, supra.
La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder está enlazada de forma funcional al extremo 5' del polinucleótido que codifica la variante. Se puede usar cualquier secuencia líder que sea funcional en la célula huésped.
Líderes adecuados para células huésped de levadura se obtienen de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa / gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.
La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia enlazada de forma funcional al extremo 3' de la secuencia codificante de la variante y, cuando se transcribe, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Se puede usar cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped.
Las secuencias de poliadenilación útiles para células huésped de levadura se describen en Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.
La secuencia de control también puede ser una región codificante del péptido señal que codifica un péptido señal unido al extremo N de una variante y que dirige la variante a la ruta secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener de manera inherente una región codificante del péptido señal enlazada naturalmente en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región codificante que codifica la variante. De forma alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante del péptido señal que es exógena a la secuencia codificante. La región codificante del péptido señal exógena se puede requerir cuando la secuencia codificante no contiene naturalmente una región codificante del péptido señal. De forma alternativa, la región codificante del péptido señal exógena puede simplemente reemplazar la región codificante del péptido señal natural para potenciar la secreción de la variante. Sin embargo, se puede usar cualquier región codificante de péptidos señal que dirija la variante expresada a la ruta secretora de una célula huésped.
Péptidos señal útiles para células huésped de levadura se obtienen de los genes para factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras secuencias codificantes de péptidos señal útiles se describen en Romanos et al., 1992, supra.
Cuando ambas regiones del péptido señal y del propéptido están presentes en el extremo N de una variante, la región del propéptido se posiciona próxima al extremo N de la variante y la región del péptido señal se coloca próxima al extremo N de la región del propéptido.
Procedimientos de producción
Las variantes se pueden preparar usando técnicas bien conocidas por el experto. Una manera conveniente es clonar ácido nucleico que codifica la albúmina original o un fragmento de la misma o polipéptido de fusión que comprende albúmina o un fragmento de la misma, modificar dicho ácido nucleico para introducir la sustitución o sustituciones deseadas en una o más (varias) posiciones correspondientes a las posiciones 417, 464, 490, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 541, 542, 550, 573, 574 y 580 en la SEQ ID NO: 2, en el que la variante no es la variante que consiste en la SEQ ID NO: 2 con la sustitución D494N, E501K, K541E, D550G,A, K573E o K574N, preparar una construcción genética adecuada en la que el ácido nucleico modificado se coloca en conexión operativa con elementos genéticos reguladores adecuados, tales como promotor, terminador, sitios de activación, sitios de unión a ribosomas, etc., introducir la construcción genética en un organismo huésped adecuado, cultivar el organismo huésped transformado en condiciones que conducen a la expresión de la variante y recuperar la variante. Todas estas técnicas son conocidas en la técnica y está dentro de las habilidades del profesional medio para diseñar un procedimiento adecuado para preparar una variante particular de acuerdo con la invención.
El polipéptido variante de la invención también puede estar conectado a una secuencia señal para tener el polipéptido variante secretado en el medio de cultivo durante el cultivo del organismo huésped transformado. En general, es ventajoso tener el polipéptido variante secretado en el medio de cultivo para facilitar la recuperación y la purificación.
Las técnicas para preparar polipéptidos variantes también se han descrito en el documento WO 2009019314 y estas técnicas también se pueden aplicar a la presente invención.
Las albúminas se han expresado con éxito como proteínas recombinantes en una gama de huéspedes que incluyen hongos (incluyendo, pero sin limitarse a, Aspergillus (documento WO06066595), Kluyveromyces (Fleer 1991, Bio/technology 9, 968-975), Pichia (Kobayashi 1998 Therapeutic Afheresis 2, 257 -262) y Saccharomyces (Sleep 1990, Bio/technology 8, 42-46)), bacterias (Pandjaitab 2000, J. Allergy Clin. Immunol. 105, 279-285)), animales (Barash 1993, Transgenic Research 2, 266-276) y plantas (incluyendo, pero sin limitarse a, patata y tabaco (Sijmons 1990, Bio/technology 8, 217 y Farran 2002, Transgenic Research 11, 337-346)). El polipéptido variante de la invención se produce preferentemente de forma recombinante en una célula huésped adecuada. En principio, se puede usar cualquier célula huésped capaz de producir un polipéptido en cantidades adecuadas y está dentro de las habilidades del profesional medio seleccionar una célula huésped adecuada de acuerdo con la invención. Un organismo huésped preferente es una levadura, preferentemente seleccionada entre las Saccharomycacae, más preferentemente Saccharomyces cerevisiae.
Los polipéptidos variantes de la invención se pueden recuperar y purificar del medio de cultivo usando una combinación de técnicas de separación conocidas tales como filtración, centrifugación, cromatografía y técnicas de separación por afinidad, etc. Está dentro de las habilidades del profesional medio purificar las variantes de la invención usa una combinación particular de dichas etapas de separación conocidas. Como un ejemplo de técnicas de purificación que se pueden aplicar a las variantes de la presente invención, se pueden mencionar las enseñanzas del documento WO0044772.
Los polipéptidos variantes de la invención se pueden usar para administrar un compuesto terapéuticamente beneficioso a un animal o un humano que lo necesite. Dichos compuestos terapéuticamente beneficiosos incluyen, pero no se limitan a, marcadores y compuestos fácilmente detectables para uso en diagnósticos, tales como diversas técnicas de formación de imágenes; compuestos activos farmacéuticos tales como fármacos, o restos específicos de unión tales como anticuerpos. Las variantes de la invención pueden incluso estar conectadas a dos o más compuestos terapéuticamente beneficiosos diferentes, por ejemplo, un anticuerpo y un fármaco, que proporciona a la molécula combinada la capacidad de unirse específicamente a una diana deseada y de ese modo proporcionar una alta concentración del fármaco conectado a esa diana particular.
Polipéptidos de fusión
Las variantes de albúmina o fragmentos de las mismas de acuerdo con la invención también se pueden fusionar con un socio de fusión de polipéptido no derivado de albúmina. El socio de fusión puede ser, en principio, cualquier polipéptido, pero en general es preferente el socio de fusión sea un polipéptido que tenga propiedades terapéuticas o de diagnóstico. Los polipéptidos de fusión que comprenden albúmina o fragmentos de la misma son conocidos en la técnica. Se ha descubierto que dichos polipéptidos de fusión que comprenden albúmina o un fragmento de la misma y un polipéptido asociado de fusión tienen una semivida plasmática más prolongada en comparación con el polipéptido asociado de fusión no fusionado. De acuerdo con la invención, es posible alterar la semivida plasmática de los polipéptidos de fusión de acuerdo con la invención en comparación con los correspondientes polipéptidos de fusión de la técnica anterior.
Uno o más polipéptidos terapéuticos se pueden fusionar al extremo N o al extremo C de la albúmina, insertar en un bucle de la estructura de albúmina o cualquier combinación de los mismos. Puede o no comprender secuencias conectoras que separen los diversos componentes del polipéptido de fusión.
Las enseñanzas relacionadas con fusiones de albúmina o un fragmento de la misma son conocidas en la técnica y el experto apreciará que dichas enseñanzas también se pueden aplicar a la presente invención. Los documentos Wo 2001/79271 A y WO 2003/59934 A también contienen ejemplos de polipéptidos terapéuticos que se pueden fusionar con albúmina o fragmentos de la misma, y estos ejemplos se aplican también a la presente invención.
Conjugados
Las variantes de albúmina o fragmentos de las mismas de acuerdo con la invención se pueden conjugar con una segunda molécula usando técnicas conocidas en la técnica. Dicha segunda molécula puede comprender un resto de diagnóstico y, en este modo de realización, el conjugado puede ser útil como herramienta de diagnóstico tal como en formación de imágenes; o la segunda molécula puede ser un compuesto terapéutico y, en este modo de realización, el conjugado se puede usar con fines terapéuticos en los que el conjugado tendrá las propiedades terapéuticas del compuesto terapéutico, así como la prolongada semivida plasmática de la albúmina. Los conjugados de albúmina y una molécula terapéutica son conocidos en la técnica y se ha verificado que dichos conjugados tienen una semivida plasmática prolongada en comparación con la molécula terapéutica libre no conjugada como tal. Los conjugados se pueden unir convenientemente a través de un grupo tio libre presente en la superficie de HSA (residuo de aminoácido 34 de HSA madura) usando química bien conocida.
En un aspecto preferente particular, la albúmina variante o fragmento de la misma se conjuga con un compuesto terapéutico beneficioso y el conjugado se usa para el tratamiento de una afección en un paciente que lo necesita, respondiendo la afección al compuesto terapéutico seleccionado particular. Las técnicas para conjugar dicho compuesto terapéutico a la albúmina variante o fragmento de la misma son conocidas en la técnica. El documento WO 2009/019314 divulga ejemplos de técnicas adecuadas para conjugar un compuesto terapéutico a un polipéptido, pudiendo aplicarse también las técnicas a la presente invención. Además, el documento WO 2009/019314 divulga ejemplos de compuestos y restos que se pueden conjugar con transferrina sustituida y estos ejemplos también se pueden aplicar a la presente invención.
HSA contiene en su forma natural un grupo tiol libre que se puede usar convenientemente para la conjugación. Como un modo de realización particular en este aspecto, la albúmina variante o fragmento de la misma puede comprender modificaciones adicionales proporcionadas para generar grupos tiol libres adicionales en la superficie. Esto tiene el beneficio de que la carga útil de la albúmina variante o fragmento de la misma aumenta de modo que más de una molécula del compuesto terapéutico se pueda conjugar con cada molécula de albúmina variante o fragmento de la misma, o dos o más compuestos terapéuticos diferentes se puedan conjugar con cada molécula de albúmina variante o fragmento de la misma, por ejemplo, un compuesto que tiene propiedades de direccionamiento tales como un anticuerpo específico, por ejemplo, un tumor; y un fármaco citotóxico conjugado con la albúmina
variante o fragmento del mismo creando de este modo un fármaco altamente específico contra un tumor. La enseñanza de residuos particulares que se pueden modificar para proporcionar otros grupos tiol libres en la superficie se puede encontrar en la solicitud de patente en tramitación WO 2010/092135.
Asociados
Las variantes de albúmina o fragmentos de las mismas se pueden usar adicionalmente en forma de "asociados". A este respecto, se pretende que el término "asociado" signifique un compuesto que comprende una variante de albúmina o un fragmento de la misma y otro compuesto unido o asociado a la albúmina variante o fragmento de la misma mediante unión no covalente. Como ejemplo de dicho asociado se puede mencionar un asociado que consiste en una albúmina variante y un lípido asociado a la albúmina mediante una interacción hidrófoba. Dichos asociados son conocidos en la técnica y se pueden preparar usando técnicas bien conocidas. Como ejemplo de un asociado preferente de acuerdo con la invención se puede mencionar un asociado que comprende albúmina variante y paclitaxel.
Otros usos
Para un conjugado, un asociado o polipéptido de fusión que comprende un compuesto terapéutico eficaz para tratar o aliviar una afección particular en un paciente que necesita dicho tratamiento sería ventajoso usar la albúmina variante o fragmento de la misma que tiene una semivida plasmática más prolongada que la albúmina original o fragmento de la misma, para proporcionar asociados o conjugados o polipéptidos de fusión que tengan semividas plasmáticas más prolongadas que tendrían el beneficio de que la administración del asociado o conjugado o polipéptido de fusión de la invención sería necesaria con menos frecuencia o a dosis reducida con menos efectos secundarios en comparación con la situación en la que se utilizó la albúmina original o asociados de la misma o un fragmento de la misma.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a composiciones que comprenden la albúmina variante, asociados de la misma o fragmento de la misma, fragmento de albúmina variante o asociados de la misma o polipéptido de fusión que comprende albúmina variante o fragmento de la misma de acuerdo con la invención. Las composiciones son preferentemente composiciones farmacéuticas. La composición se puede preparar usando técnicas conocidas en el área tal como se divulga en manuales reconocidos dentro del campo farmacéutico.
En un modo de realización particular, las composiciones comprenden una albúmina variante o un fragmento de la misma de acuerdo con la invención y un compuesto que comprende un resto farmacéuticamente beneficioso y un dominio de unión a albúmina (ABD). De acuerdo con la invención, ABD significa un sitio, resto o dominio capaz de unirse a la albúmina circulante in vivo y de ese modo conferir transporte en la circulación del ABD y cualquier compuesto o resto unido a dicho ABD. Los ABD son conocidos en la técnica y se ha demostrado que se unen muy fuertemente a la albúmina, por lo que un compuesto que comprende un ABD unido a la albúmina se comportará en cierta medida como una sola molécula. Los autores de la invención han comprendido que el uso de la albúmina variante o fragmento de la misma de acuerdo con la invención junto con un compuesto que comprende un resto farmacéuticamente beneficioso y un ABD permite alterar la semivida plasmática del compuesto que comprende un resto farmacéuticamente beneficioso y un ABD en comparación con la situación en la que dicho compuesto se inyectó como tal en un paciente que tiene necesidad del mismo o se administró en una formulación que comprende albúmina natural o un fragmento de la misma.
La albúmina variante o fragmentos de la misma, conjugados que comprenden albúmina variante o un fragmento de la misma o polipéptido de fusión que comprende albúmina variante o un fragmento de la misma, o un asociado que comprende albúmina variante o un fragmento de la misma de acuerdo con la invención también se pueden incorporar en nanopartículas o micropartículas usando técnicas bien conocidas en la técnica. Un procedimiento preferente para preparar nanopartículas o micropartículas que se pueden aplicar a las albúminas variantes o fragmentos de las mismas de acuerdo con la invención se divulga en el documento WO 2004/071536.
Composiciones
La presente invención también se refiere al uso de una variante de albúmina o un fragmento de la misma o polipéptidos de fusión que comprenden albúmina variante o fragmentos de la misma, o un conjugado que comprende una variante de albúmina o un fragmento de la misma, o un asociado que comprende una variante de albúmina o un fragmento de la misma para la fabricación de una composición farmacéutica, en la que la variante de albúmina o un fragmento de la misma o polipéptidos de fusión que comprenden albúmina variante o fragmentos de la misma, o un conjugado que comprende una variante de albúmina o un fragmento de la misma, o un asociado que comprende una variante de albúmina o un fragmento de la misma tiene una semivida plasmática alterada en comparación con HSA o el fragmento correspondiente de la misma o un polipéptido de fusión que comprende HSA o fragmento de la misma o conjugado que comprende HSA.
A este respecto, se pretende que el fragmento correspondiente de HSA signifique un fragmento de HSA que se alinea con y tiene el mismo número de aminoácidos que el fragmento de la albúmina variante con la que se compara. De manera similar, el polipéptido de fusión correspondiente que comprende HSA o conjugado que
comprende HSA pretende significar moléculas que tienen el mismo tamaño y secuencia de aminoácidos que el polipéptido de fusión o conjugado que comprende albúmina variante con el que se compara.
Preferentemente, la variante de albúmina o un fragmento de la misma o polipéptidos de fusión que comprenden albúmina variante o fragmentos de la misma, fragmento de la misma o un conjugado que comprende una variante de albúmina o un fragmento de la misma tiene una semivida plasmática que es mayor que la semivida plasmática de HSA o el fragmento correspondiente de la misma o polipéptido de fusión que comprende HSA o fragmento de la misma.
De forma alternativa, esto se puede expresar como la variante de albúmina o un fragmento de la misma o polipéptidos de fusión que comprenden albúmina variante o fragmentos de la misma, fragmento de la misma o un conjugado que comprende una variante de albúmina o un fragmento de la misma tiene una KD por FcRn que es menor que la KD correspondiente para HSA o el fragmento correspondiente de la misma o polipéptido de fusión que comprende HSA o fragmento de la misma. Preferentemente, la KD para la variante de albúmina o un fragmento de la misma o polipéptidos de fusión que comprenden albúmina variante o fragmentos de la misma, fragmento de la misma o un conjugado que comprende una variante de albúmina o un fragmento de la misma es inferior a 0,9X KD para HSA, más preferentemente inferior a 0,5X KD para HSA, más preferentemente inferior a 0,1X KD para HSA, incluso más preferentemente inferior a 0,05X KD para HSA, incluso más preferentemente inferior a 0,02X KD para HSA y lo más preferentemente inferior a 0,01X KD para HSA.
La variante de albúmina o un fragmento de la misma o polipéptido de fusión que comprende albúmina variante o fragmentos de la misma, o un conjugado que comprende una variante de albúmina o un fragmento de la misma es preferentemente la variante de albúmina o un fragmento de la misma o polipéptidos de fusión que comprenden albúmina variante o fragmentos de la misma, fragmento de la misma o un conjugado que comprende una variante de albúmina o un fragmento de la misma de acuerdo con la invención.
La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención.
Ejemplos (no todos los ejemplos incluyen una sustitución en la posición 573, como es requerido por las reivindicaciones)
Materiales y procedimientos
ELISA:
Los pocillos se recubrieron con HSA natural o variantes diluidas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a las concentraciones indicadas, se incubaron durante la noche a 4 °C y, a continuación, se bloquearon con leche desnatada al 4 % (Acumedia) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron entonces cuatro veces con PBS / TWEEN® 20 al 0,005 % (PBS/T) a pH 6,0 antes de preincubar el shFcRn fusionado con glutatión-S-transferasa (GST) (0,5 pg/ml) como se describe en FEBS J. 2008 Ago;275(16):4097-4110 con un anti-GST policlonal conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) de cabra (1:5000; GE Healthcare), diluido en leche desnatada al 4%. Se añadió PBS / TWEEN® 20 al 0,005 % (PBS/T) a pH 6,0 a cada pocillo y se incubó durante 1,5 h a temperatura ambiente seguido de lavado cuatro veces con PBS/T a pH 6,0. Se añadieron 100 pl del sustrato tetrametilbenzidina (TMB) (Calbiochem) a cada pocillo y se incubaron durante 45 min antes de que se añadieran 100 pl de HCl 0,25 M. La absorbancia se midió a 450 nm usando un espectrofotómetro Sunrise TECAN (TECAN, Maennedorf, Suiza).
Se repitió el mismo ELISA con PBS/T a pH 7,4.
Resonancia de plasmón superficial (SPR):
Los experimentos de SPR se llevaron a cabo usando un instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare). Las celdas de flujo de los chips del sensor CM5 se acoplaron con shFcRn-GST (~1400-5000 RU) usando química de acoplamiento de amina como se describe en el protocolo proporcionado por el fabricante. El acoplamiento se realizó inyectando 10 pg/ml de la proteína en acetato de sodio 10 mM, pH 5,0 (GE Healthcare). Se usó tampón de fosfato (tampón de fosfato 67 mM, NaCl 0,15 M, TWEEN® 20 al 0,005 %) a pH 6,0 como tampón de migración y tampón de dilución. La regeneración de las superficies se logró usando inyecciones de tampón HBS-EP (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %) a pH 7,4 (Biacore AB). Para la unión a shFcRn-GST inmovilizado, se inyectó cada variante de HSA a una concentración de 1,0-0,5 pM sobre la superficie a caudal constante (40 pl/ml) a 25 °C. En todos los experimentos, los datos se ajustaron a cero y se restaron las células de referencia. La evaluación de los datos se realizó utilizando el software BIAevaluation 4.1 (BIAcore AB).
Se repitió el mismo ensayo de SPR con tampón HBS-EP a pH 7,4.
Se usó albúmina sérica humana recombinante comercialmente disponible con la marca comercial registrada RECOMBUMIN (disponible en Novozymes Biopharma UK Ltd, Nottingham, Reino Unido) para los ejemplos.
Albúmina sérica de otras especies: las albúminas eran recombinantes cuando se indicaba, se produjeron usando secuencias proporcionadas a partir de bases de datos disponibles públicamente o se compraron a proveedores comerciales.
FcRn: Expresión y purificación de FcRn humano (shFcRn) y de ratón (smFcRn) soluble: los procedimientos para la generación de plásmidos de expresión de shFcRn y smFcRn, la expresión y la purificación de cada heterodímero se pueden encontrar en Berntzen et al. (2005) J. Immunol. Methods 298:93-104). De forma alternativa, el heterodímero shFcRn FcRn fue producido por GeneArt AG (Alemania). Las secuencias para las dos subunidades del heterodímero se pueden encontrar en la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. El receptor soluble se expresó en células HEK293 y se purificó del sobrenadante de cultivo usando columnas de cromatografía Ni-HiTrap.
Ejemplo 1. Preparación de variantes
Preparación de plásmidos de expresión de muteína específicos de HSA
Los procedimientos para la expresión de variantes mutantes de HSA y variantes de fusión de HSA se produjeron usando varias técnicas. Se emplearon técnicas estándar de biología molecular en todo el procedimiento, como se describe en Sambrook, J. y D. W. Russell, 2001. Molecular Cloning: a laboratory manual, 3a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
Procedimiento 1: Sustituciones de aminoácidos en HSA detalladas en la tabla 1
Los fragmentos de ADN sintético NcoI/SacI (859 pb) se generaron mediante ensamblaje de genes (GeneArt AG, Alemania) que contenían mutaciones puntuales dentro del gen que codifica HSA (SEQ ID NO: 1) para introducir la sustitución de aminoácidos deseada en la proteína traducida. La tabla 2 detalla los codones usados para introducir las sustituciones de aminoácidos en el gen que codifica la HSA. La secuencia de nucleótidos del fragmento sintético que codifica aminoácidos inalterados (es decir, naturales) fue idéntica a la de pDB2243 (descrita en el documento Wo 00/44772). Los fragmentos de nucleótidos sintéticos se ligaron en pDB2243 digerido con NcoI/SacI para producir los plásmidos pDB3876 a pDB3886 (tabla 1). Para la producción de plásmidos de expresión, cada uno de los plásmidos pDB3876 a pDB3886 (véase la tabla 1) se digirió con NotI y PvuI, los fragmentos de ADN se separaron a través de un gel TAE al 0,7 % (p/v) y fragmentos de 2992 pb ("casetes NotI" que incluían el promotor PRB1, ADN que codifica la secuencia líder de fusión (FL) (divulgada en el documento WO 2010/092135), la secuencia de nucleótidos que codifica HSA y el terminador ADH1, véase la figura 1) se purificaron del gel de agarosa usando un kit de extracción de gel Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante. Los "casetes NotI" se ligaron en un plásmido pSAC35 de "desintegración" tratado con fosfatasa alcalina de gamba / NotI (Roche), divulgado en el documento EP-A-286 424 y descrito por Sleep, D., et al. (1991) Bio/Technology 9, 183-187. Se usaron mezclas de ligación para transformar E. coli DH5a químicamente competente. Los plásmidos de expresión pDB3887 a pDB3897, derivados de pSAC35 que contienen los "casetes NotI", se identificaron usando técnicas estándar. Los plásmidos de desintegración pDB3887 a pDB3897 y pDB2244 (para la expresión de HSA natural, descritos en el documento WO 00/44772) (tabla 1) se usaron para transformar S. cerevisiae BXP10 cir0 (como se describió previamente en el documento WO 2001/079480) como se describe a continuación.
Tabla 1: Plásmido, sustitución de aminoácidos introducida en HSA
Plásmido Construcción
pDB2244 HSA
pDB3876 HSA D494N
pDB3877 HSA D494A
pDB3878 HSA E495Q
pDB3879 HSA E495A
pDB3880 HSA D494Q
pDB3881 HSA D494N, T496A
pDB3882 HSA T496A
pDB3883 HSA E492G
pDB3884 HSA E492G, V493P
pDB3885 HSA E492P
pDB3886 HSA E492H
pDB3887 HSA D494N
Plásmido Construcción
pDB3888 HSA D494A
pDB3889 HSA E495Q
pDB3890 HSA E495A
pDB3891 HSA D494Q
pDB3892 HSA D494N, T496A
pDB3893 HSA T496A
pDB3894 HSA E492G
pDB3895 HSA E492G, V493P
pDB3896 HSA E492P
pDB3897 HSA E492H
pDB3876-pDB3886 son plásmidos de subclonación.
Tabla 2: Codones usados para introducir sustituciones de aminoácidos en HSA
Aminoácido Codón
Gly GGT
Glu GAA
Asp GAT
Val GTT
Ala GCT
Arg AGA
Lys AAA
Asn AAT
Met ATG
Ile ATT
Thr ACT
Trp TGG
Cys TGT
Tyr TAT
Leu TTG
Phe TTT
Ser TCT
Gln CAA
His CAT
Pro CCA
Stop TAA
Procedimiento 2: Producción de variantes de HSA D494N+E495Q+T496A y E495Q+T496A
Se empleó un procedimiento basado en PCR, que utiliza un QuikChange Lightning Kit (Stratagene), para introducir mutaciones puntuales en HSA. Los pares de oligonucleótidos xAP094 (SEQ ID NO: 5) / xAP095 (SeQ ID NO: 6) y xAP096 (sEq ID NO: 7) / xAP097 (SEQ ID NO: 8) se utilizaron para generar dos variantes de hSA (D494N+E495Q+T496A y E495Q+T496A, respectivamente). El plásmido pDB3927 (divulgado en el documento WO 2010/092135) se usó como ADN molde y se siguió la metodología recomendada por el fabricante del kit. Los plásmidos resultantes se denominaron pDB3995 y pDB3996 (que contenían casetes de expresión HSA
D494N+E495Q+T496A y E495Q+T496A, respectivamente). Se digirieron pDB3995 y pDB3996 con SstEII/SsrBI y las moléculas de ADN linealizadas se purificaron usando técnicas estándar. Se mezclaron individualmente 100 ng de cada ADN digerido con SsfEN/SsrBI, purificado usando un kit de purificación por PCR Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante, con 100 ng de pDB3936 digerido con Acc65I/SamHI (divulgado en el documento WO 2010/092135) y se usaron para transformar directamente S. cerevisiae BXP10 cir0 usando el kit de transformación de levadura Sigma descrito a continuación.
Procedimiento 3: Sustituciones de aminoácidos en HSA detalladas en la tabla 3
El plásmido pDB3927 (divulgado en el documento WO 2010/092135) (que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica HSA idéntica a la de pDB2243) se manipuló para realizar sustituciones de aminoácidos dentro de la proteína HSA madura. Se generaron fragmentos de ADN sintéticos (GeneArt AG, Alemania o DNA2.0 Inc, EE. UU.) (fragmentos NcoI/Ssu36I, AvrII/SphI o SacI/SphI) que contienen mutaciones puntuales dentro del gen que codifica la HSA para introducir la sustitución o sustituciones de aminoácidos deseadas en la secuencia de proteína traducida. La tabla 2 detalla los codones usados para introducir las sustituciones de aminoácidos en el gen que codifica la HSA. La secuencia de nucleótidos del fragmento sintético que codifica aminoácidos inalterados (es decir, naturales) era idéntica a la de pDB3927. Los fragmentos de ADN sintético se subclonaron en pDB3927 digerido con NcoI/Ssu36I, AvrII/SphI, SacI/Sph para generar pDB4006-pDB4010, pDB4083-pDB4101 y pDB4103-pDB4111 y pDB4194, pDB4200, pDB4202 (véase la tabla 3).
Del mismo modo, se generaron los fragmentos de SamHI/SalI que contienen mutaciones puntuales en la secuencia de nucleótidos que codifica HSA mediante ensamblaje de genes (DNA2.0 Inc, EE. UU.) y se ligaron en pDB3964 digerido con SamHI/SalI (descrito en el documento WO 2010/092135) para producir los plásmidos pDB3986-pDB3989 (tabla 3).
La cadena C terminal de aminoácidos de las posiciones 573-585 (KKLVAASQAALGL) (SEQ ID NO: 9) de HSA se mutaron a los aminoácidos de albúmina sérica de macaco (PKFVAASQAALA) (SEQ ID NO: 10), de ratón (PNLVTRCKDALA) (SEQ ID NO: 11), de conejo (PKLVESSKATLG) (SEQ ID NO: 12) y de oveja (PKLVASTQAALA) (SEQ ID NO: 13). Los codones utilizados para introducir cada sustitución de aminoácidos se proporcionan en la tabla 2. Se generaron fragmentos de ADN sintéticos (SecI/SphI) (DNA2.0 Inc, EE. UU.) mediante ensamblaje de genes (la secuencia de nucleótidos del fragmento sintético que codifica aminoácidos inalterados (es decir, naturales) era idéntica a la de pDB3927) y se subclonaron en pDB3927 digerido con SacI/SphI para producir los plásmidos pDB4114-pDB4117 (tabla 3).
Los plásmidos pDB3883 (tabla 1), pDB4094 y pDB4095 (tabla 3) se digirieron con NcoI/SacI y los fragmentos de 857 pb de cada digestión se purificaron antes de ligarse en pDB4006 o pDB4110 (8688 kb) digeridos con NcoI/SacI (tabla 3) para producir los plásmidos pDB4156-pDB4161.
Los plásmidos de expresión se generaron in vivo (es decir, mediante recombinación homóloga en S. cerevisiae, una técnica denominada reparación de huecos o clonación in vivo, véase Orr-Weaver & Szostak. 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4417-4421). Los plásmidos modificados enumerados en la tabla 3 se digirieron con SstEII/SsrBI y las moléculas de ADN linealizadas se purificaron usando técnicas estándar. Se mezclaron individualmente 100 ng de cada ADN digerido con SstEII/SsrBI, purificado usando un kit de purificación por PCR Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante, con 100 ng de pDB3936 digerido con Acc65I/SamHI (divulgado en el documento WO 2010/092135) y se usaron para transformar directamente S. cerevisiae BXP10 cir0 usando el kit de transformación de levadura Sigma descrito a continuación.
Tabla 3.
Plásmido Sustitución de aminoácidos en HSA
pDB3986 HSA H440Q
pDB3987 HSA H464Q
pDB3988 HSA H510Q
pDB3989 HSA H535Q
pDB4006 HSA K573A
pDB4007 HSA E492T/N503K/K541A
pDB4008 HSA K541G
pDB4009 HSA K541D
pDB4010 HSA D550N
pDB4083 HSA D494E/Q417H
Plásmido Sustitución de aminoácidos en HSA
pDB4084 HSA Q417A
pDB4085 HSA P499A
pDB4086 HSA K500A
pDB4087 HSA K536A
pDB4088 HSA P537A
pDB4089 HSA K538A
pDB4090 HSA E492G/V493P/K538H/K541N/E542D
pDB4091 HSA E492P/N503K/K541G/E542P
pDB4092 HSA N503K
pDB4093 HSA N503H
pDB4094 HSA E492G/N503K
pDB4095 HSA E492G/N503H
pDB4096 HSA E492T
pDB4097 HSA N503D
pDB4098 HSA E492T/N503D
pDB4099 HSA K538H
pDB4100 HSA K541A
pDB4101 HSA K541N
pDB4103 HSA E542D
pDB4104 HSA E542P
pDB4105 HSA D550E
pDB4106 HSA E492H/E501P/N503H/E505D/T506S/T540S/K541E pDB4107 HSA A490D/E492T/V493L/E501P/N503D/A504E/E505K/T506F/K541D pDB4108 HSA E501A
pDB4109 HSA E501Q
pDB4110 HSA K573P
pDB4111 HSA E492G/K538H/K541N/E542D
pDB4114 HSA K573P/L575F/G584A
pDB4115 HSA K573P/K574N/A577T/A578R/S579C/Q580K/A581D/G584A pDB4116 HSA K573P/A577E/A578S/Q580K/A582T
pDB4117 HSA K573P/A578S/S579T/G584A
pDB4156 HSA E492G K573A
pDB4157 HSA E492G N503K K573A
pDB4158 HSA E492G N503H K573A
pDB4159 HSA E492G K573P
pDB4160 HSA E492G N503K K573P
pDB4161 HSA E492G N503H K573P
pDB4194 HSA D550E
pDB4200 HSA K574N
pDB4202 HSA Q580K
Tabla 4: Cebadores K500 y plásmidos
Cebadores originales CODONES UTILIZADOS
CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCAGGTGAATTCAACGCTG
xAP216 (SEQ ID NO: 14) Gly GGT
CTTTGGAAGT CG ACG AAACTT ACGTTCCAGAAG AATTCAAC GCT G
xAP217 (SEQ ID NO: 15) Glu GAA
CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCAGACGAATTCAACGCTG
xAP218 (SEQ ID NO: 16) Asp GAC
CTTT GG AAGT CGACGAAACTT ACGTT CCAGTT GAATT CAACGCT G
xAP219 (SEQ ID NO: 17) Val GTT
CTTTGGAAGT CGACGAAACTTACGTTCCAAGAG AATT CAACGCT G
xAP220 (SEQ ID NO: 18) Arg AGA
CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCAAACGAATTCAACGCTG
xAP221 (SEQ ID NO: 19) Asn AAC
CTTTGGAAGT CGACGAAACTT ACGTT CCAAT GGAATT CAACGCT G
xAP222 (SEQ ID NO: 20) Met ATG
CTTTGG AAGT CGACGAAACTTACGTTCCAATT GAATT CAACGCT G
xAP223 (SEQ ID NO: 21) Ile ATT
CTTTGGAAGT CGACGAAACTTACGTTCCAACCGAATT CAACGCT G
xAP224 (SEQ ID NO: 22) Thr ACC
CTTT GG AAGT CGACGAAACTT ACGTTCCATGG GAATT CAACGCT G
xAP225 (SEQ ID NO: 23) Trp TGG
CTTT GGAAGT CGACGAAACTTACGTTCCAT GT GAATT CAACGCT G
xAP226 (SEQ ID NO: 24) Cys TGT
CTTTGGAAGT CGACGAAACTTACGTTCCAT ACGAATT CAACGCT G
xAP227 (SEQ ID NO: 25) Tyr TAC
CTTT GGAAGT CGACG AAACTTACGTTCCATT GGAATT CAACGCT G
xAP228 (SEQ ID NO: 26) Leu TTG
CTTTGGAAGT CGACGAAACTT ACGTT CCATT CG AATT CA ACGCTG
xAP229 (SEQ ID NO: 27) Phe TTC
CTTTGGAAGT CGACGAAACTT ACGTTCCATCT GAATT CAACGCT G
xAP230 (SEQ ID NO: 28) Ser TCT
CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCACAAGAATTCAACGCTG
xAP231 (SEQ ID NO: 29) Gln CAA
CTTTGGAAGTCGACGAAACTTACGTTCCACACGAATTCAACGCTG
xAP232 (SEQ ID NO: 30) His CAC
CTTTGGAAGT CGACGAAACTT ACGTT CCACCAG AATT CAACGCT G
xAP233 (SEQ ID NO: 31) Pro CCA
CTTT GGAAGT CGACGAAACTT ACGTTCCATAAG AATT CAACGCT G
xAP234 (SEQ ID NO: 32) STOP taa G A A TTA A G C 7TATT ACA A A C C C AAAG CAG CTTG G G AA G C /qpo
xAP235 ID NO: 33)
Tabla 5: Cebadores K573 y plásmidos
Cebadores originales CODONES
UTILIZADOS
Cebadores originales CODONES UTILIZADOS
ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTAOCACCCTCCTC.G
xAP187 (SEQ ID NO: 34) Gly GGT
ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTTTCACCCTOOTCG
xAP188 (SEQ ID NO: 35) Glu GAA
ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTATCACCCTCCTCG
xAP189 (SEQ ID NO: 36) Asp GAT
ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTAACACCCTCCTCG
xAP190 (SEQ ID NO: 37) Val GTT
ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTTCTACCCTCCTCG
xAP191 (SEQ ID NO: 38) Arg AGA
ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTATTACCCTCCTCG
xAP192 (SEQ ID NO: 39) Asn AAT
ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTCATACCCTCCTCG
xAP193 (SEQ ID NO: 40) Met ATG
AT A AG C CT AA GG C AG CTT GACTTGCAG CAA CAA GTTTA AT ACCCTCCTC G
xAP194 (SEQ ID NO: 41) \ le ATT
AT AAGCCT AAGGCAGCTT GACTT GCAGCAACAAGTTTAGT ACCCT CCT CG
xAP195 (SEQ ID NO: 42) Thr ACT
ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTCCAACCCTCCTCG
xAP196 (SEQ ID NO: 43) Trp TGG
AT AAGCCT AAGGCAGCTT GACTTGCAGCAAC AAGTTTACAACCCT CCT CG
xAP197 (SEQ ID NO: 44) Cys TGT
ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTATAACCCTCCTCG
xAP198 (SEQ ID NO: 45) Tyr TAT
ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTCAAACCCTCCTCG
xAP199 (SEQ ID NO: 46) Leu TTG
ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTAAAACCCTCCTCG
xAP200 (SEQ ID NO: 47) Phe TTT
ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTAGAACCCTCCTCG
xAP201 (SEQ ID NO: 48) Ser TCT
ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTTTGACCCTCCTCG
xAP202 (SEQ ID NO: 49) Gln CAA
ATAAGCCTAAGGCAGCTT GACTT GCAGCAACAAGTTT AT GACCCT CCT CG
xAP203 (SEQ ID NO: 50) His CAT
ATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAAGTTTTTAACCCTCCTCG
xAP204 (SEQ ID NO: 51) STOP taa
xAP205 AAT GCTG CCATGGAG AT CT GCTT GAAT GT GCTGATG (qpo m wn. ^
Procedimiento 4: Colecciones de permutación HSA K500 y K573
La PCR se usó para producir dos colecciones de permutación en las que los codones que codifican el aminoácido 500 o 573 de HsA madura se cambiaron (mutaron) por aminoácidos no naturales alternativos y codones de terminación (K5XXSTOP). Los oligonucleótidos mutagénicos (tabla 4 y tabla 5) se diseñaron para amplificar el ADN que codifica HSA e incorporar los cambios deseados. Es decir, para los cambios en la posición 500 se usó pDB4082 (figura 1) como un ADN molde. El pDB4082 es un derivado de pDB2305 (divulgado en el documento EP1788084) y se produjo como sigue. El pDB2305 (figura 2) se digirió con Nsi\/Spe\ y el fragmento Nsi\ de 8779 kb obtenido se autoligó para producir pDB4005 (figura 3). Se generó un fragmento de ADN sintético (Bsa\/Sph\) mediante ensamblaje de genes (DNA2.0 \nc, EE. UU.) (SEQ \D NO: 1) (que contiene la región 3' del promotor PRB1, secuencia líder de fusión modificada, secuencia de nucleótidos que codifica HSA y región 5' del terminador ADH1 modificado), y se ligó en pDB4005 digerido con Hind\\\/Sph\ (figura 3) para producir pDB4082. Nota: El sitio Hind\\\ en el sitio del promotor PRB1 se ha eliminado y se ha introducido un sitio Sac\\ dentro de la secuencia de nucleótidos que codifica la HSA.
Para la colección de permutación para la posición 500 de HSA, la secuencia de nucleótidos que codifica HSA correspondiente a la existente entre los sitios SalI y HindlII (véase el mapa del plásmido pDB4082, figura 1) se generó utilizando el kit New England Biolabs Phusion (tabla 6) y los oligonucleótidos enumerados en la tabla 4. La tabla 7 describe el procedimiento de PCR empleado.
La colección de permutación en la posición de aminoácido 573 de HSA se generó usando pDB3927 como ADN molde e implicaba amplificar el ADN que codifica la albúmina correspondiente al que está entre los sitios NcoI y Bsu36I usando los oligonucleótidos detallados en la tabla 5.
Tabla 6: Ingredientes de PCR
Colección para la Colección para la posición
posición 500 573
20 pl de tampón HF (5X)
2 pl de mezcla dNTP (10 mM)
2 j l de oligonucleótido (10 jM) xAP235 xAP205
2 j l de oligonucleótido (10 jM) xAP216 - xAP234 xAP187 - xAP204
1 pl de polimerasa Phusion
1 pl de ADN molde (~5 ng) pDB4082 pDB3927
72 j l de dH2O
Tabla 7: Condiciones de PCR
98 °C durante 2 min 1 ciclo
98 °C durante 10 s 35 ciclos
57 °C durante 30 s
72 °C durante 20 s
72 °C durante 5 min 1 ciclo
Para las variantes de albúmina basadas en las posiciones 500 y 573, cada producto de PCR se purificó usando un kit de limpieza PCR Qiagen (de acuerdo con las instrucciones del fabricante), digirió con SalI/HindIII (colección para posición 500) o NcoI/Bsu36I (colección para posición 573). Los ADN digeridos se purificaron usando un kit de limpieza PCR Qiagen y se ligaron en pDB4082 o pDB3927 digeridos con SailI/HindIII o NcoI/Bsu36I, respectivamente, en sustitución de la secuencia natural equivalente. Las ligaciones se transformaron en E. coli DH5a, los plásmidos posteriores se aislaron de los transformantes usando un kit Qiagen miniprep (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) y las construcciones correctas se identificaron por análisis de restricción. Esto produjo una colección de plásmidos, pDB4204 a pDB4222 (colección para posición 500) y pDB4173 a pDB4190 (colección para posición 573), que contenían genes de albúmina que diferían solo en su secuencia correspondiente al codón para el aminoácido en la posición 500 o 573 (tabla 4 y 5, respectivamente). Los cambios específicos en cada plásmido se confirmaron mediante secuenciación.
Los plásmidos resultantes se usaron para generar plásmidos de expresión y levadura productora de albúmina mediante clonación in vivo como se describe anteriormente. Es decir, se transformó S. cerevisiae usando el kit de transformación de levadura Sigma (descrito a continuación), usando una mezcla de 100 ng del plásmido que contiene la variante de HSA digerida con BstEII/BsrBI y 100 ng de pDB3936 digerido con ^cc65I/BamHI.
Transformación de S.
cerevisiae
S. cerevisiae BXP10 cir0 (como se describió previamente en el documento WO 2001/079480) o cepa A cir0 (descrita en el documento WO 2005/061718) se extendió sobre placas YEPD (extracto de levadura al 1 % (p/v), bactopeptona al 2 % (p/v), glucosa al 2 % (p/v), agar al 1,5 %) y se cultivó durante 4 días a 30 °C antes de la transformación. Se usó 1 |jg del plásmido entero (es decir, plásmidos circulares) o, para la reparación de huecos, 100 ng de plásmido que contiene la variante de HSA o fusión de variante de HSA digerido con BstEII/BsrBI o NsiI/PvuI y 100 ng del plásmido pDB3936 digerido con ^cc65I/BamHI para transformar S. cerevisiae usando un kit de transformación de levadura Sigma usando un procedimiento de acetato de litio modificado (kit de transformación de levadura Sigma, YEAST-1, protocolo 2; Ito et al. (1983) J. Bacteriol., 153, 16; Elble, (1992) Biotechniques, 13, 18). El protocolo se modificó ligeramente incubando la transformación a temperatura ambiente durante 4 h antes del choque térmico. Después del choque térmico, las células se centrifugaron brevemente antes de volver a suspenderse en 200 pl de sorbitol 1 M y, a continuación, se extendieron sobre placas de agar BMMD; la composición de BMMD se describe en
Sleep et al., (2001), Yeast, 18, 403. Las placas se incubaron a 30 °C durante 4 días antes de parchear las colonias individuales en placas BMMD frescas. Los números de cepas de levadura se detallan en la tabla 1.
Las existencias se prepararon para cada cepa de levadura de la siguiente manera: el caldo de BMMD se inoculó con un bucle pesado de cada parche de levadura y se cultivó durante 24 h a 30 °C con agitación orbital a 200 rpm. Las células se recogieron por centrifugación a 1900 xg durante 5 min en una centrífuga Sorval RT600, se eliminaron 15 ml de sobrenadante y se sustituyeron por trehalosa al 40 % (p/v). Las células se resuspendieron y se transfirieron a crioviales (1 ml) para su almacenamiento a -80 °C.
Cultivo en matraces de agitación de S.
cerevisiae
Se inocularon 10 ml de medio BMMD (receta: base nitrogenada de levadura sin aminoácidos ni sulfato de amonio (Difco) al 0,17% (p/v), sulfato de amonio 37,8 mM, ácido cítrico 29 mM, hidrógeno ortofosfato de disodio deshidratado 142 mM a pH 6,5, glucosa al 2 % (p/v)) con cada cepa de levadura y se cultivaron durante 12 h a 30 °C con agitación orbital a 200 rpm. Se usó una alícuota de cada cultivo iniciador (4 ml) para inocular 2x200ml de medio BMMD y se cultivó durante 36 h a 30 °C con agitación orbital a 200 rpm. Las células se recogieron mediante filtración a través de membranas de filtro de vacío de 0,2 pm (Stericup, Millipore) que incluían un prefiltro GF-D (Whatman) y el sobrenadante se conservó para la purificación.
Concentración primaria
El sobrenadante de cultivo conservado se concentró usando filtración de flujo tangencial utilizando un sistema Pall Filtron LV equipado con un filtro Omega 10KD (0,093 m2) (casete LV Centramate™, Pall Filtration) con una presión transmembrana de 20 psi (138 kPa) y una tasa de recirculación de 180 ml.min-1.
Fermentación
Se llevaron a cabo fermentaciones discontinuas alimentadas en un fermentador Sartorius Biostat C de 10 l a 30 °C; el pH se monitorizó y se ajustó mediante la adición de amoniaco o ácido sulfúrico según fuera apropiado. El amoniaco también proporcionó la fuente de nitrógeno para los cultivos. El nivel de oxígeno disuelto se monitorizó y se vinculó a la velocidad del agitador para mantener un nivel > 20 % de saturación. Los inóculos se cultivaron en matraces de agitación en medio mínimo tamponado (receta). Para la fase discontinua, los cultivos se inocularon en medio de fermentación (aproximadamente 50 % del volumen del fermentador) que contenía sacarosa al 2 % (p/v). La etapa de alimentación se activó automáticamente por un fuerte aumento del nivel de oxígeno disuelto. La sacarosa se mantuvo en concentraciones limitantes del crecimiento controlando la tasa de alimentación a una tasa de crecimiento nominal establecida. La alimentación consistió en medio de fermentación que contenía sacarosa al 50 % (p/v), todos esencialmente como los describe Collins. (Collins, S. H., (1990) Production of secreted proteins in yeast, en: T.J.R. Harris (Ed.) Protein production by biotechnology, Elsevier, Londres, pp. 61-77).
Cuantificación por GP-HPLC
Las variantes, fusiones y conjugados de albúmina purificados se analizaron mediante GP-HPLC y cuantificación de la siguiente manera. Se realizaron inyecciones de 25 pl en una columna TSK G3000SWXL de 7,8 mm de diámetro interior x 300 mm de longitud (Tosoh Bioscience), con una columna de protección TSK SW de 6,0 mm de diámetro interior x 40 mm de longitud (Tosoh Bioscience). Las muestras se cromatografiaron en fosfato de sodio 25 mM, sulfato de sodio 100 mM, azida de sodio al 0,05 % (p/v), pH 7,0 a 1 ml/min. Las muestras se cuantificaron mediante detección UV a 280 nm, por área de pico, con respecto a un estándar de albúmina humana recombinante de concentración conocida (10 mg/ml) y se corrigieron para sus coeficientes de extinción relativos.
Purificación de variantes de albúmina procedentes de matraz de agitación
Las variantes de albúmina se purificaron del matraz de agitación (sobrenadante de cultivo o sobrenadante de cultivo concentrado) usando una sola etapa cromatográfica usando una matriz de afinidad por albúmina (AlbuPure™ -ProMetic BioSciences, Inc.). La cromatografía se realizó a una velocidad lineal constante de 240 cm/h en todo momento. El sobrenadante de cultivo se aplicó a una altura de lecho de 6 cm, el lecho empaquetado de 2,0 ml preequilibrado con acetato de sodio 50 mM a pH 5,3. Después de la carga, la columna se lavó con 10 volúmenes de columna (vc) de tampón de equilibrado y, a continuación, con acetato de amonio 50 mM, pH 8,0 (10 vc). El producto se eluyó con acetato de amonio 50 mM, octanoato 10 mM a pH 8,0, con acetato de amonio 50 mM, octanoato de sodio 30 mM y cloruro de sodio 200 mM a pH 7,0 o con tiocianato de potasio 200 mM. La columna se limpió con NaOH 0,5 M (3 vc) y NaOH 20 mM (3,5 vc). Las fracciones de eluato de cada variante de albúmina se concentraron y diafiltraron frente a 10 volúmenes de cloruro de sodio 50 mM (PES Vivaspin20 10000 MWCO con copas de diafiltración opcionales, Sartorius). Las variantes de albúmina purificadas se cuantificaron mediante GP-HPLC como se describe anteriormente.
Purificación de variantes de fusión de albúmina procedentes de matraz de agitación
Las variantes de fusión de albúmina se purificaron del sobrenadante de cultivo del matraz de agitación usando una sola etapa cromatográfica usando una matriz de afinidad por albúmina (AlbuPure™ - ProMetic BioSciences, Inc.). La
cromatografía se realizó a una velocidad lineal constante de 240 cm/h en todo momento. El sobrenadante de cultivo o sobrenadante de cultivo concentrado se aplicó a una altura de lecho de 6 cm, el lecho empaquetado de 2,0 ml preequilibrado con acetato de sodio 50 mM a pH 5,3. Después de la carga, la columna se lavó con 10 volúmenes de columna (vc) de tampón de equilibrado y, a continuación, con acetato de amonio 50 mM, pH 8,0 (10 vc). El producto se eluyó con acetato de amonio 50 mM, octanoato 10 mM a pH 8,0, con acetato de amonio 50 mM, octanoato de sodio 30 mM, cloruro de sodio 200 mM a pH 7,0, con acetato de amonio 50 mM, octanoato de sodio 100 mM a pH 9,0 o con tiocianato de potasio 200 mM. La columna se limpió con NaOH 0,5 M (3 vc) y NaOH 20 mM (3,5 vc). La fracción de eluato de cada fusión de variante de albúmina se concentró y se diafiltró frente a 10 volúmenes de Tris 25 mM, NaCl 150 mM, KCl 2 mM, pH 7,4 (PES Vivaspin20 10000 MWCO con copas de diafiltración opcionales, Sartorius). Las variantes de fusiones de albúmina purificadas se cuantificaron mediante GP-HPLC como se describe anteriormente.
Purificación de variantes de albúmina procedentes de fermentación
Las variantes de albúmina se purificaron de los sobrenadantes de fermentación discontinua alimentado con alta densidad celular después de la separación por centrifugación, usando una centrífuga Sorvall RC 3C (DuPont). El sobrenadante del cultivo se cromatografió a través de una columna de 11 cm de altura de lecho y un lecho empaquetado de 8,6 ml empaquetado con una matriz de afinidad por albúmina sintetizada a medida (AlbuPure™ -ProMetic BioSciences, Inc.) como se describe anteriormente. El producto se eluyó utilizando tampones de elución descritos anteriormente a un caudal de 120 cm/h. Las fracciones de eluato se analizaron mediante GP-HPLC (arriba) y reduciendo con SDS-PAGE para pureza y, si se requirió, se concentraron (PES Vivaspin20 10000 MWCO) y se aplicaron a una columna de 2,4 x 96 cm empaquetada con Superdex 75 con un caudal de 39 cm/h en Tris 25 mM, NaCl 150 mM, KCl 2 mM, pH 7,4. El pico se fraccionó, se analizó mediante GP-HPLC y se combinó para generar la proteína monomérica de interés. Las fracciones reunidas se concentraron (PES Vivaspin20 10000 MWCO, Sartorius).
Todas las proteínas en las que se deseaban analizar las propiedades de unión al receptor (FcRn) y/u otro análisis se cuantificaron mediante GP-HPLC como se describe anteriormente, con corrección para sus coeficientes relativos de extinción.
Ejemplo 2. Determinación de las propiedades de unión al receptor (shFcRn) de HSA derivada de sangre y albúmina humana recombinante
La HSA esencialmente libre de ácidos grasos (Sigma-Aldrich) se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño como se describe en Andersen et al. (2010). J. Biol. Chem. 285, (7),4826-4836. Se analizaron HSA monomérica y rHA 10 pM usando SPR como se describe anteriormente y los datos se presentan en la figura 4. La comparación directa de HSA (derivada de sangre) con albúmina humana recombinante (Recombumin) a la misma concentración (10 pM) (figura 4A y 4B) muestra que, para ambas muestras, la unión a shFcRn inmovilizado (pH 6,0 y pH 7,4, respectivamente) era reversible y dependiente de pH. Además, la comparación de HSA frente a albúmina humana recombinante de Bosse et al. (2005), J. Clin. Pharmacol. 45; 57-67 demostró una semivida equivalente en estudio in vivo en humanos.
Ejemplo 3. Determinación de las propiedades de unión al receptor (shFcRn) de las variantes de albúmina Se usaron dos ensayos de unión a FcRn establecidos, ELISA y SPR. Hay grandes diferencias entre los ensayos: en el sistema ELISA se recubre HSA directamente en pocillos y se agrega shFcRn-GST en solución, mientras que en el ensayo de SPR se inmoviliza shFcRn-GST en un chip CM5 y se inyecta HSA en solución. El pH se puede variar en ambos sistemas.
Las variantes se analizaron usando ELISA a pH 6,0 y pH 7,4. Los resultados se divulgan en la figura 5. Los valores de ELISA representan la media de duplicados.
Las variantes se analizaron usando un análisis por SPR a pH 6,0 y pH 7,4. Los resultados se divulgan para un número representativo de variantes en la figura 6 usando una concentración de las variantes de 0,2 pM y en la figura 7 usando una concentración de las variantes de 1 pM.
Los datos de SPR divulgados en las figuras 6 y 7 se normalizaron y la unión relativa de variantes en cada concentración se muestra en la figura 8 A y B, respectivamente.
Las conclusiones del análisis son que todas las variantes sometidas a prueba tienen la unión característica al receptor a pH 6,0, pero no se unen a pH 7,4. Las variantes D494N,Q,A, E495Q,A, T496A y D494N+T496A muestran una unión reducida al receptor en comparación con HSA.
Ejemplo 4. Determinación de las propiedades de unión al receptor (shFcRn/smFcRn) de las variantes de albúmina
Usando el procedimiento de análisis por SPR siguiente, se calcularon la constante de asociación Ka, la constante de disociación Kd y la constante de unión KD para la unión de HSA y albúmina sérica de ratón (MSA) a FcRn humano y de ratón (tabla 8).
Análisis por SPR: los análisis por SPR se realizaron en un instrumento BIAcore 3000 (GE Healthcare) usando chips CM5 y la inmovilización de las variantes smFcRn-GST y shFcRn-GST o de smFcRn se realizó utilizando el kit de acoplamiento de aminas (GE Healthcare). Se inyectaron muestras de proteína (10 pg/ml) en acetato de sodio 10 mM a pH 4,5 (GE Healthcare), todo como lo describe el fabricante. Los restos no reaccionados en la superficie se bloquearon con etanolamina 1 M. Para todos los experimentos, se usaron tampón fosfato (tampón fosfato 67 mM, NaCl 0,15 M, TWEEN® 20 al 0,005 %) a pH 6,0 o pH 7,4, o tampón HBS-P (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, tensioactivo P20 al 0,005 %) a pH 7,4 como tampón de migración o tampón de dilución. Las mediciones cinéticas se realizaron usando una superficie inmovilizada de baja densidad (100-200 unidades de resonancia (RU)). Se inyectaron diluciones seriadas de hIgG1 (2000,0-31,2 nM), mIgG1 (1000,0-15,6 nM), MSA (20,0-0,3 pM) y HSA (200,0-3,1 pM) a pH 6,0 o pH 7,4, a un caudal de 50 pl/minuto a 25 °C. La unión aditiva se registró inyectando HSA (10 pM), MSA (5 pM), hIgG1 (100 nM) o mIgG1 (100 nM) solo o dos a la vez a 25 °C a 20 pl/minuto a pH 6,0 sobre shFcRn inmovilizado (~600 RU) o smFcRn (~600 RU). La unión competitiva se midió inyectando shFcRn (50 nM) o smFcRn (100 nM) solo o junto con diferentes cantidades de HSA o MSA (10,0-0,05 pM) sobre HSA inmovilizada (~2600 RU) o MSA (~2000 RU). En todos los casos, para corregir los efectos de unión no específica y del tampón global, las respuestas obtenidas de las superficies de control y las inyecciones en blanco se restaron de cada curva de interacción. Los valores de velocidad cinética se calcularon usando modelos predefinidos (modelo de ligando Langmuir 1:1, modelo de ligando heterogéneo y modelo de afinidad de estado estacionario) proporcionados por el software BIAevaluation 4.1. La cercanía del ajuste, descrita por el valor estadístico x2 que representa la media cuadrática, fue inferior a 2,0 en todas las estimaciones de afinidad.
Tabla 8: Constantes de unión de HSA y MSA a shFcRn y smFcRn.
Especie de albúmina Especie de FcRn Ka (103/Ms) Kd (103/s) KD (pM) KD Req. (pM) MSA Ratón 4,2 ± 0,5 39,4 ± 3,1 9,3 ± 0,4 NDd
MSA Humano 3,8 ± 0,0 3,1 ± 0,1 0,8 ± 0,2 ND
HSA Ratón NA NA NA 86,2 ± 4,1 HSA Humano 2,7 ± 1,3 12,2 ± 5,9 4,5 ± 0,1 4,6 ± 0,5
Las KD se generaron utilizando el software BIAevaluation 4.1. Se utilizó un modelo de ligando Langmuir 1:1 en todas partes. Los valores cinéticos representan el promedio de triplicados. ND significa no determinado. NA significa no adquirido.
Ejemplo 5. Unión de albúminas de otras especies al FcRn humano
Las albúminas de animales comercialmente disponibles (Sigma-Aldrich o Calbiochem) se purificaron adicionalmente como se describe en Andersen et al. (2010). J. Biol. Chem. 285, (7),4826-4836. La unión de albúmina sérica de burro, albúmina sérica bovina, albúmina sérica de cabra, albúmina sérica de oveja, albúmina sérica de conejo, albúmina sérica de perro, albúmina sérica de hámster, albúmina de cobaya, albúmina sérica de rata y albúmina sérica de pollo a shFcRn se determinó utilizando las técnicas descritas en Materiales y procedimientos. Los resultados de ELISA se divulgan en la figura 9 A-D y las uniones relativas se resumen en la figura 9 E.
Los resultados de SPR se muestran en la figura 10, donde se muestra la unión a pH 6,0 y pH 7,4 para cada especie de albúmina. La tabla 10 muestra una descripción general de las respuestas de unión relativas medidas usando ELISA y SPR.
Tabla 10: Unión albúmina-FcRn de diferentes especies
Especie de albúmina shFcRn
ELISA SPR
pH 6,0 pH 7,4 pH 6,0 pH 7,4
Humano +(+) - +(+) -Burro - -Vaca - -Oveja /- - - -Cabra /- - - -
Especie de albúmina shFcRn
ELISA SPR
pH 6,0 pH 7,4 pH 6,0 pH 7,4
Conejo + - -Perro NDa ND -Cobaya +
Hámster + - -Rata + - -Ratón + - -Pollo - - - -
Las respuestas de unión relativas se clasifican desde las más fuertes (++++) a las más débiles (+) y ausencia de unión (-). a: No determinado (ND).
Una clasificación que va de la unión más fuerte a la más débil es la siguiente: cobaya =/> conejo> hámster/perro > rata/ratón > burro > humano > bovino > cabra/oveja > pollo. Estos datos muestran que las albúminas animales tienen diferentes afinidades por shFcRn.
Ejemplo 6. Cinética de la variante de HSA para shFcRn
Las constantes de unión de las variantes de acuerdo con la invención se determinaron de acuerdo con los procedimientos descritos en Materiales y procedimientos.
Tabla 11: Constantes de unión de variantes de HSA para shFcRn
Variante de albúmina Ka (103/Ms) kd (10-3/s) KD (pM) KD Req (pM)
WT 3,2 ± 0,2 15,5 ± 2,5 4,8 5,4
D494N 1,7 ± 0,0 18,6 ± 0,0 10,9 11,8
D494A 2,3 ± 0,1 53,4 ± 0,3 23,2 17,0
D494Q 2,1 ± 0,0 58,2 ± 3,8 27,7 ND
E495Q 2,5 ± 0,0 24,1 ± 0,2 9,6 10,9
E495A 2,1 ± 0,0 14,0 ± 0,0 7,0 8,6
D494N T496A 2,5 ± 0,0 11,0 ± 0,0 4,4 5,5
T496A 2,3 ± 0,0 11,7 ± 0,5 5,1 7,1
E492G 4,1 ± 0,0 11,0 ± 0,0 2,7 ND
Las KD se generaron utilizando el software BIAevaluation 4.1. Se utilizó un modelo de ligando Langmuir 1:1 en todas partes. Los valores cinéticos representan el promedio de triplicados. ND significa no determinado.
Los resultados se corresponden con las conclusiones del ejemplo 3 basadas en los datos de SPR y ELISA, pero además muestran que E492G ha aumentado la afinidad por su receptor.
Ejemplo 7. Análisis competitivo de las variantes de HSA
El análisis competitivo de las variantes de HSA preparadas en el ejemplo 1 y WT HSA se realizó usando los procedimientos descritos en el ejemplo 4. Los resultados se muestran en la figura 15.
Los resultados muestran que la variante E492G, a diferencia de E492H, E492P y E492G+V493P, tiene una unión más fuerte a shFcRn que HSA.
Ejemplo 8. Análisis de las sustituciones Q417
Usando el procedimiento del ejemplo 1, se construyeron variantes de HSA que tienen las sustituciones Q417A y D494E+Q417H. Las propiedades cinéticas de estas variantes se sometieron a prueba usando los procedimientos descritos en Materiales y procedimientos y se muestran en la tabla 12.
Tabla 12: Constantes de unión de variantes de HSA para shFcRn
Variante de albúminaa ka (103/Ms) kd (10-3/s) KDb (pM) KD Reqc (pM)
WT 3,2 ± 0,2 15,5 ± 2,5 4,8 5,4
Q417A 3,2 ± 0,1 26,0 ± 0,0 ND
D494E Q417H 3,1 ± 0,1 20,5 ± 0,5 6,6 ND
a: Las diluciones de las variantes de HSA se inyectaron sobre shFcRn inmovilizado (~1500 RU).
b: Las constantes de velocidad cinética se obtuvieron usando un modelo simple de interacción bimolecular de primer orden (1:1).
c: La constante de afinidad en estado estacionario se obtuvo usando un modelo de unión en equilibrio (Req) suministrado por el software BIAevaluation 4.1. Los valores cinéticos representan el promedio de triplicados. d: No determinado (ND).
Los datos muestran que las variantes Q417A y D494E+Q417H se unen más débilmente al receptor que la HSA natural.
Ejemplo 9. Análisis de variantes de HSA en la posición 499, 500, 536, 537, 538 y 573
Usando el procedimiento del ejemplo 1, se construyeron variantes de HSA que tienen las sustituciones P499A, K500A, K536A, P537A, K538A y K573A. Las propiedades de unión al receptor de estas variantes se sometieron a prueba como se describe en Materiales y procedimientos. Los resultados se muestran en la figura 11.
Los datos demostraron que las variantes P499A, K536A, P537A y K538A tenían una afinidad de unión reducida a shFcRn con relación a HSA. La variante K500A había perdido casi por completo su capacidad de unirse a shFcRn y K573A tenía una afinidad de unión a shFcRn aumentada con respecto a HSA.
Ejemplo 10. Análisis de variantes en la posición 501 de HSA
Usando el procedimiento del ejemplo 1, se construyeron variantes de HSA que tienen las sustituciones E501A y E501Q. Las propiedades cinéticas de estas variantes se sometieron a prueba como se describe en Materiales y procedimientos.
Tabla 13: Constantes de unión de variantes de HSA para shFcRn
Variante de albúminaa ka (103/Ms) kd (10-3/s) KDb (pM) KD Reqc (pM)
WT 3,2 ± 0,2 15,5 ± 2,5 4,8 5,4
E501A 3,3 ± 0,0 26,0 ± 0,0 7,8 ND
E501Q 2,7 ± 0,1 15,5 ± 0,5 5,7 ND
a: Las diluciones de las variantes de HSA se inyectaron sobre shFcRn inmovilizado (~1500 RU).
b: Las constantes de velocidad cinética se obtuvieron usando un modelo simple de interacción bimolecular de primer orden (1:1).
c: La constante de afinidad en estado estacionario se obtuvo usando un modelo de unión en equilibrio (Req) suministrado por el software BIAevaluation 4.1. Los valores cinéticos representan el promedio de triplicados. d: No determinado (ND).
Los datos muestran que las variantes E501A y E501Q tienen una afinidad de unión a shFcRn ligeramente disminuida con respecto a HSA.
Ejemplo 11. Análisis de variantes de HSA en la posición 573
Usando el procedimiento del ejemplo 1, se construyeron variantes de HSA que tienen una sustitución en la posición 573. Todas las variantes en la posición 573 se generaron y las propiedades de unión al receptor de estas variantes se sometieron a prueba como se describe en Materiales y procedimientos, pero con el análisis por SPR realizado a pH 5,5. Los resultados se muestran en la tabla 14 siguiente y en las figuras 12 y 13.
Tabla 14: Cinética de mutantes HSA K573 de punto único
Variante de albúminaa ka (103/Ms) kd (10-3/s) KDb (nM)
Variante de albúmina9 ka (103/Ms) kd (10-3/s) KDb (nM)
WT 9,0 ± 0,0 6,9 ± 0,1 766
K573A 7,4 ± 0,0 2,2 ± 0,0 297
K573C 4,2 ± 0,0 1,1 ± 0,2 262
K573D 7,9 ± 0,2 4,1 ± 0,3 518
K573E 9,0 ± 0,0 2,9 ± 0,0 322
K573F 7,8 ± 0,1 0,5 ± 0,1 74
K573G 8,5 ± 0,0 1,8 ± 0,1 212
K573H 12,0 ± 0,2 0,8 ± 0,0 68
K573I 8,6 ± 0,0 0,8 ± 0,2 99
K573L 5,1 ± 0,2 2,3 ± 0,1 451
K573M 8,6 ± 0,0 1,9 ± 0,0 221
K573N 7,3 ± 0,2 1,1 ± 0,3 151
K573P 9,8 ± 0,0 0,6 ± 0,1
K573Q 7,7 ± 0,2 2,6 ± 0,0 338
K573R 8,5 ± 0,0 3,0 ± 0,2 353
K573S 7,9 ± 0,2 1,2 ± 0,2 152
K573T 8,7 ± 0,2 1,1 ± 0,1 126
K573V 8,1 ± 0,0 0,6 ± 0,2 80
K573W 15,0 ± 0,2 0,4 ± 0,3 29
K573Y 22,0 ± 0,1 0,5 ± 0,1 23
K573STOP ND ND 141000
a: Las diluciones de las variantes de HSA se inyectaron sobre shFcRn inmovilizado (~1500 RU).
b: Las constantes de velocidad cinética se obtuvieron usando un modelo simple de interacción bimolecular de primer orden (1:1).
c: La constante de afinidad en estado estacionario se obtuvo usando un modelo de unión en equilibrio (Req) suministrado por el software BIAevaluation 4.1. Los valores cinéticos representan el promedio de duplicados. d: No determinado (ND).
Los resultados muestran que todas las variantes que tienen sustitución en la posición 573 tienen una unión mejorada a shFcRn en comparación con WT HSA. En particular, las variantes K573F, K573H, K573P, K573W y K573Y tienen KD a shFcRn más de 10 veces menor que la HSA original. La variante K573STOP es una albúmina truncada que tiene un codón de parada en la posición 573. El sensograma para la variante K573STOP muestra una unión significativamente reducida en comparación con la WT HSA y generó una alta KD. La afinidad incrementada que hemos mostrado por la variante K573E, una variante natural caracterizada por Otagiri (2009) Biol. Pharm. Bull. 32(4) 527-534, se predice que tiene una semivida aumentada in vivo.
Ejemplo 12. Análisis de otras variantes de HSA
Usando el procedimiento del ejemplo 1, se construyeron variantes de HSA con las sustituciones E492G, E492G+N503H, N503H, D550E, E492G+N503K, E542P, H440Q, K541G, K541D, D550N E492G+K538H+K541N+E542D, E492T+N503K+K541A, E492P+N503K+K541G+E542P, E492H+E501P+N503H+E505D+T506S+T540S+K541E, A490D+E492T+V493L+E501P N503D+A504E+E505K+T506F+K541D y E492G+V493P+K538H+K541N+E542D. Las propiedades de unión al receptor de estas variantes se sometieron a prueba como se describe en Materiales y procedimientos, y los resultados se muestran en la tabla 15 y la figura 14.
Tabla 15: Constantes de unión de variantes de HSA para shFcRn
Variante de albúminaa Ka (103/Ms) kd (10-3/s) KDb (pM) KD Reqc (pM)
Variante de albúminaa Ka (103/Ms) kd (10-3/s) KDb (pM) KD Reqc (pM) WT 3,2 ± 0,2 15,5 ± 2,5 4,8 5,4
E492G 4,1 ± 0,0 11,0 ± 0,0 2,7 ND
E492G/N503H 6,9 ± 0,1 14,5 ± 0,5 2,1 ND
N503H 5,4 ± 0,0 24,0 ± 0,1 4,4 ND
D550E 3,2 ± 0,4 11,8 ± 0,0 3,6 ND
E492G/N503K 5,9 ± 0,1 16,0 ± 0,0 2,7 ND
E542P 3,4 ± 0,0 15,7 ± 0,2 15,7 ± 0,24,7 ND
H440Q 3,2 ± 0,1 20,8 ± 0,0 6,5 ND
K541G 3,2 ± 0,0 23,0 ± 0,0 7,1 ND
K541D 2,6 ± 0,0 24,0 ± 0,0 9,2 ND
D550N 2,5 ± 0,0 30,0 ± 0,0 12,0 ND
a: Las diluciones de las variantes de HSA se inyectaron sobre shFcRn inmovilizado (~1500 RU).
b: Las constantes de velocidad cinética se obtuvieron usando un modelo simple de interacción bimolecular de primer orden (1:1).
c: La constante de afinidad en estado estacionario se obtuvo usando un modelo de unión en equilibrio (Req) suministrado por el software BIAevaluation 4.1. Los valores cinéticos representan el promedio de triplicados. d: No determinado (ND).
Los resultados muestran que, para la posición 550, una sustitución por E da como resultado una afinidad incrementada, mientras que una sustitución por N da como resultado una afinidad reducida por shFcRn a pH 6,0. Sin embargo, cuando se repitió este análisis para la sustitución D550E a pH 5,5, no se observó un aumento observable en la afinidad. La sustitución de un aminoácido ácido (E) mantiene y mejora la unión. Sin embargo, la sustitución de un aminoácido amida no cargada reduce la unión a pH 6,0. En base a esta observación, se predeciría que, para esta posición, las sustituciones de aminoácidos básicos (H, K y R) darían como resultado reducciones adicionales en la unión.
Ejemplo 13. Mutaciones en residuos de His
Las siguientes variantes se generaron usando los procedimientos descritos en el ejemplo 1: H440Q, H464Q, H510Q y H535Q. La figura 15 muestra los sensogramas de SPR de estas variantes que interactúan con shFcRn como se describe en Materiales y procedimientos.
Se encontró que la variante H440Q se unió con una afinidad comparable a la de HSA. Por el contrario, H464Q, H510Q y H535Q tenían una afinidad significativamente reducida por shFcRn. Esto apoya las observaciones publicadas anteriormente de que la mutagénesis de estos residuos de histidina reduce significativamente la unión de HSA a shFcRn (Wu et al. (2010) PEDS, 23(10) 789-798). Wu et al. muestran una semivida reducida para una proteína de fusión de diacuerpo (scFv-DIII)2 en ratones con un orden de eliminación de más lento a más rápido: Db-DIII WT > H535A > H510A > H464A > Db. En base a la afinidad por shFcRn y en comparación con smFcRn (ejemplo 5), se predeciría que el orden de eliminación en humanos es (para sustituciones por glutamina (Q)) WT > H440Q > H510Q > H464Q > H535Q.
Ejemplo 14. Otras variantes
Las siguientes variantes se generaron usando los procedimientos descritos en el ejemplo 1: K574N y Q580K en HSA. La unión de las variantes a FcRn se sometió a prueba usando el ensayo de SPR como se describe en Materiales y procedimientos y los resultados se muestran en la tabla 16.
Los resultados muestran que las variantes K574N y Q580K se unieron más fuertemente a shFcRn.
Tabla 16: Datos cinéticos para estas variantes
Variante de albúmina ka (103/Ms) kd (10-3/s) KD (pM)
WT 9,7 ± 0,0 30,0 ± 0,1 3,1
K574N 4,9 ± 0,1 8,4 ± 0,1 1,7
Variante de albúmina ka (103/Ms) kd (10-3/s) KD (pM)
Q580K 6,0 ± 0,0 9,3 ± 0,0 1,5
Ejemplo 15. Análisis de variantes de HSA en la posición 500
Usando el procedimiento del ejemplo 1, se construyeron variantes de HSA que tienen una sustitución en la posición 500. Se generaron todas las variantes en la posición 500 y se sometieron a prueba las propiedades de unión al receptor de estas variantes. Se usaron Biacore X, Biacore X100 y Sensor Chip CM5 para todos los análisis, todos suministrados por GE Healthcare. El shFcRn producido por GeneArt AG (Alemania) (diluido a 10 pg/ml en acetato de sodio 10 mM a pH 5,0 (GE Healthcare)) se inmovilizó en la celda de flujo 2 (FC2) a niveles entre 1600 y 2200 unidades de respuesta (RU) mediante acoplamiento de amina estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare). Se realizó una inmovilización en blanco en la celda de flujo 1 (FC1) para que sirviera como una célula de referencia. Para estabilizar el ensayo, se realizaron primero 3-5 ciclos de inicio con tampón de migración (tampón fosfato 67 mM, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,005% a pH 5,75 ± 0,25) solamente, seguido de regeneración. WT rHA y las variantes de la colección para la posición K500 se inyectaron a diversas concentraciones (1 pM - 150 pM) durante 90 s a un caudal constante de 30 pl/min a 25 °C, seguido de la regeneración de la superficie con tampón HBS-EP pH 7,4 (GE Healthcare) hasta que se restauró el valor de referencia inicial aproximado de RU (por lo general, el pulso de 12 s sería suficiente).
Los resultados se muestran en la tabla 17 y la figura 16.
Tabla 17: Cinética de mutantes HSA K500 de punto único
Variante de albúmina ka (103/Ms) kd (10-3/s) KDb (pM) KD Reqc (pM)
K500R 4,42 7,21 1,63
K500I 5,18 10,9 2,1
WT 4,24 9,2 2,2a
K500L 3,73 11,9 3,2
K500Q 1,07 3,4 3,2
K500V 3,29 11,0 3,3
K500Y 3,97 14,6 3,7
K500M 2,48 21,5 8,7
K500T 1,2 13,4 11,2
K500W 0,5 5,4 11,7
K500N 1,3 18,2 14
K500F 5,17 73,7 14,3
K500H 4 63,8 16
K500P ND ND ND 51*
K500C 2,38 124 52
K500S ND ND ND 70,2*
K500A 2,61 208 79,9
K500D ND ND ND 83,3*
K500G ND ND ND 95,4*
K500E KD no calculable, ver figura 16
K500STOP Ningún aglutinante
a: Media de 4 valores.
b: Las constantes de velocidad cinética se obtuvieron usando un modelo simple de interacción bimolecular de primer orden (1:1).
c: La constante de afinidad en estado estacionario se obtuvo usando un modelo de unión en equilibrio (Req) suministrado por el software BIAevaluation 4.1.
Los resultados muestran que las variantes K500R y K500I tienen una afinidad aumentada y comparable por shFcRn en comparación con WT HSA, respectivamente. La variante K500E se unió fuertemente a shFcRn inmovilizado, pero aún demostró la dependencia de pH característica de la interacción a FcRn. Este complejo era muy estable, por lo que el análisis cinético no fue posible (figura 16). Todas las demás variantes tienen una unión reducida a shFcRn en comparación con WT rHA.
Todas las variantes se unieron a shFcRn (hasta cierto punto) a pH 5,5. No se detectó ninguna unión a shFcRn de las variantes de la colección para la posición K500 a pH 7,4.
Ejemplo 16. Polipéptidos de fusión
La generación de fusiones de albúmina que contienen muteínas de albúmina.
Plásmidos que contienen casetes de expresión para la producción de scFv (vHvL) genéticamente fusionados a HSA, en el extremo N o C o ambos (descrito en Evans et al., 2010 Protein Expression and Purification. 73, 113-124) se modificaron para permitir la producción de fusiones de albúmina usando clonación in vivo (descrito anteriormente). Es decir, pDB3017 (figura 17), pDB3021 (figura 18), pDB3056 (figura 19) se digirieron con NsiI/SpeI, y los fragmentos de NsiI correspondientes a 9511 kb, 9569 kb y 8795 kb, respectivamente, se purificaron utilizando técnicas estándar. Los fragmentos purificados de NsiI se autoligaron y se usaron para transformar E. coli DH5a químicamente competente para producir pDB4168, pDB4169 y pDB4170, respectivamente (tabla 18).
De forma similar, pDB3165 (que contiene la fusión bivalente) (figura 20) se digirió con NotI y el casete de expresión (fragmento de 4506 kb) se purificó antes de ligarlo a pDB3927 digerido con Notl para producir pDB4172 (figura 21, tabla 18).
Los fragmentos de ADN sintéticos Sall/Bsu36l (269 pb), que contienen mutaciones puntuales dentro de la secuencia de nucleótidos codificante de albúmina para introducir sustituciones de aminoácidos correspondientes a K500A, o D550N o K573P en la secuencia de la proteína de albúmina traducida, se generaron mediante ensamblaje de genes (GeneArt AG, Alemania). Los fragmentos Sall/Bsu36l se ligaron individualmente en plásmidos pDB4168 a pDB4170 y pDB4172 digeridos con Sall/Bsu36l y se usaron para transformar E. coli DH5a químicamente competente usando técnicas estándar para generar los plásmidos pDB4265 a pDB4276 (tabla 18).
Tabla 18: Fusiones de variantes de albúmina
Plásmido Construcción
pDB3017 scFv (anti-FITC) - HSA - FLAG
pDB3021 HSA - conector GS - scFv (anti-FITC) - FLAG
pDB3056 HSA - FLAG
pDB3165 scFv (anti-FITC) - HSA - conector GS - scFv (anti-FITC) - FLAG
pDB4168 scFv (anti-FITC) - HSA - FLAG
pDB4169 HSA - conector GS - scFv (anti-FITC) - FLAG
pDB4170 HSA - FLAG
pDB4172 scFv (anti-FITC) - HSA - conector GS - scFv (anti-FITC) - FLAG
pDB4265 scFv (anti-FITC) - HSA K500A - FLAG
pDB4266 scFv (anti-FITC) - HSA D550N - FLAG
pDB4267 scFv (anti-FITC) - HSA K573P - FLAG
pDB4268 HSA K500A - conector GS - scFv (anti-FITC) - FLAG
DB4269 HSA D550N - conector GS - scFv (anti-FITC) - FLAG
DB4270 HSA K573P - conector GS - scFv (anti-FITC) - FLAG
pDB4271 HSA K500A - FLAG
pDB4272 HSA D550N - FLAG
pDB4273 HSA K573P - FLAG
pDB4274 scFv (anti-FITC) - HSA K500A - conector GS - scFv (anti-FITC) - FLAG
pDB4275 scFv (anti-FITC) - HSA D550N - conector GS - scFv (anti-FITC) - FLAG
pDB4276 scFv (anti-FITC) - HSA K573P - conector GS - scFv (anti-FITC) - FLAG
Plásmido Construcción
pDB4277 scFv (anti-FITC) - HSA K573A - FLAG
pDB4278 HSA K573A - conector GS - scFv (anti-FITC) - FLAG
pDB4279 HSA K573A - FLAG
pDB4280 scFv (anti-FITC) - HSA K573A - conector GS - scFv (anti-FITC) - FLAG
pDB4281 HSA K500A - conector GS - scFv (anti-FITC)
pDB4282 HSA D550N - conector GS - scFv (anti-FITC)
pDB4283 HSA K573P - conector GS - scFv (anti-FITC)
pDB4284 HSA - conector GS - scFv (anti-FITC)
pDB2613 HSA - conector GS - IL1RA (N84Q)
pDB4285 HSA K573A - conector GS - IL1RA (N84Q)
pDB4286 HSA D550N - conector GS - IL1 RA (N84Q)
pDB4287 HSA K500A - conector GS - IL1 RA (N84Q)
pDB4288 HSA K573P - conector GS - IL1RA (N84Q)
De forma similar, se generó un fragmento de ADN mediante PCR (usando técnicas estándar) para introducir una sustitución K573A en la secuencia de proteína de albúmina traducida. La PCR se realizó usando el kit New England Biolabs Phusion usando pDB4267 (figura 22) como molde de ADN y oligonucleótidos xAP238 (SEQ ID NO: 53) y xAP239 (SEQ ID NO: 54).
La tabla 19 describe el ciclaje de PCR.
Tabla 19: Ciclaje de PCR
98 °C durante 2 min 1 ciclo
98 °C durante 10 s 35 ciclos
57 °C durante 30 s
72 °C durante 10 s
72 °C durante 5 min 1 ciclo
El producto de PCR se purificó, se digirió con SalI/Bsu36I y el fragmento aislado (269 pb) se ligó en pDB4168-pDB4170 y pDB4172 digeridos con SalI/Bsu36I y se utilizó para transformar E. coli DH5a químicamente competente. Los plásmidos resultantes (pDB4277 a pDB4280) se enumeran en la tabla 18.
La secuencia de nucleótidos que codifica la etiqueta FLAG se eliminó de los plásmidos pDB4168 y pDB4268 a pDB4270 (plásmidos para la expresión de scFv fusionados en el extremo N a HSA y muteínas de HSA K500A, D550N y K573P, respectivamente. Los plásmidos pDB4168 y pDB4268 a pDB4270 (tabla 18) se digirieron con Bsu36I/SphI para eliminar un producto de 231 pb que comprende la región 3' del gen que codifica HSA, la secuencia de nucleótidos que codifica la etiqueta FLAG y la región 5' del terminador ADH1. Un fragmento Bsu36I/SphI (207 pb), que comprende la región 3' del gen que codifica HSA y la región 5' del terminador mADH1 (SEQ ID NO: 1) de pDB4181 se ligó en pDB4168 y pDB4268-pDB4270 digeridos con Bsu36I/SphI usando estándar técnicas. Se usaron mezclas de ligación para transformar E. coli DH5a químicamente competente utilizando técnicas estándar para generar los plásmidos pDB4281-pDB4284 (tabla 18).
Se digirieron pDB4265-pDB4284 con BstEII/BsrBI y las moléculas de ADN linealizadas se purificaron usando técnicas estándar. Cien muestras de ADN BstEII/BsrBI ng se mezclaron con 100 ng de pDB3936 digerido con ^cc65I/BamHI y se utilizaron para transformar S. cerevisiae BXP10cir0 utilizando el kit de transformación de levadura Sigma descrito a continuación. En cada caso, el plásmido de expresión se generó en la levadura mediante recombinación homóloga (clonación in vivo) entre el plásmido que contiene fusión de albúmina (pDB4265-pDB4280) (tabla 18) y pDB3936.
Los plásmidos pDB3017, pDB3021, pDB3056 y pDB3165 (fusiones de HSA natural, descritos por Evans et al., 2010. Protein Expression and Purification. 73, 113-124) se usaron para transformar la cepa Acir0 de S. cerevisiae (descrita en el documento WO 2005/061718) usando el kit de transformación de levadura Sigma descrito a continuación.
La secuencia de nucleótidos que codifica IL-1RA humana (antagonista del receptor de interleucina-1) (número de acceso: CAA59087) se podría generar sintéticamente mediante ensamblaje de genes. La secuencia de nucleótidos del fragmento sintético de 708 pb (fragmento Bsu36I/SphI) se da en la SEQ ID NO: 55 e incluye la región 3' del gen que codifica HSA, la secuencia de nucleótidos que codifica un conector GS, la secuencia de nucleótidos que codifica IL-1RA humana (N84Q para suprimir el motivo de glicosilación unido a N) y la región 5' del terminador ADH1. El fragmento de ADN sintético se podría ligar en pDB3927 digerido con Bsu36I/SphI para producir pDB2588.
Los plásmidos que contienen los casetes de expresión para la producción de IL-1RA genéticamente fusionados al extremo C de hSa y las variantes de HSA K500A, D550N, K573A y K573P se prepararon de la siguiente manera. El pDB2588 se digirió con Bsu36I/SphI y un fragmento de 705 pb que contiene la región 3' del gen que codifica HSA, la secuencia de nucleótidos que codifica un conector GS, la secuencia de nucleótidos que codifica IL1-RA humana (N84Q) y la región 5' de un terminador ADH1 de S. cerevisiae modificado (SEQ ID NO: 3) se purificó utilizando técnicas estándar y a continuación se ligó en pDB4006 (que contiene el casete de expresión HSA K573A), pDB4010 (que contiene casete de expresión HSA D550N), pDB4086 (que contiene casete de expresión HSA K500A) y pDB4110 (conteniendo HSA Casete de expresión K573P) digeridos con Bsu36I/SphI para generar pDB4287, pDB4286, pDB4285 y pDB4288, respectivamente (para un ejemplo, véase la figura 23). Los pDB4285-pDB4288 se digirieron con NsiI/PvuI y las moléculas de ADN linealizadas se purificaron usando técnicas estándar. Se mezclaron 100 ng de muestras de ADN digeridas con NsiI/PvuI con 100 ng de pDB3936 digerido con ^cc65I/BamHI (9721 pb) (es decir, clonación in vivo) y se usaron para transformar S. cerevisiae (es decir, mediante clonación in vivo) usando el kit de transformación de levadura Sigma descrito a continuación.
La preparación de una cepa de S. cerevisiae que expresa HSA natural genéticamente fusionada a un conector GS e IL1-RA (N84Q) (véase la tabla 18) también se podría generar siguiendo los procedimientos descritos anteriormente. Los polipéptidos de fusión se analizaron por su unión a FcRn usando el procedimiento de SPR descrito anteriormente y se obtuvieron los siguientes resultados:
Tabla 20: Cinética de las variantes de fusión de HSA
Variante de albúmina9 ka (103/Ms) kd (10-3/s) KDb (pM)
HSA WT 9,7 ± 0,0 30,0 ± 0,1 3,1
K574N 4,9 ± 01 8,4 ± 0,1 1,7
Q580K 6,0 ± 0,0 1,5
K573P 2,8 ± 0,0 0,4 ± 0,0 0,1
HSA-WT-FLAG 8,2 ± 0,2 24,0 ± 0,2 2,9
HSA-D550N-FLAG 5,9 ± 0,0 49,0 ± 0,1 8,3
HSA-K500A-FLAG NDc ND ND
HSA-K573A-FLAG 6,1 ± 0,1 7,1 ± 0,1 1,1
HSA-K573P-FLAG 6,2 ± 0,1 1,2 ± 0,1 0,2
HSA-WT-IL1RA 6,2 ± 0,0 25,0 ± 0,2 4,0
HSA-K500A-IL1RA ND ND ND
HSA-D550N-IL1RA 7,3 ± 0,2 38,0 ± 0,0 5,2
HSA-K573A-IL1RA 6,1 ± 0,0 7,1 ± 0,1 1,1
HSA-K573P-IL1RA 6,2 ± 0,1 1,3 ± 0,1 0,2
scFv-HSA-K500A-FLAG ND ND ND
scFv-HSA-D550N-FLAG 6,2 ± 0,0 18,0 ± 0,0 2,9
scFv-HSA-K573A-FLAG 6,4 ± 0,1 5,7 ± 0,2 0,9
scFv-HSA-K573P-FLAG 5,8 ± 0,0 1,1 ± 0,1 0,2
scFv-HSA-WT-scFv-FLAG 7,5 ± 0,0 15,0 ± 0,2 2,0
scFv-HSA-K500A-scFv-FLAG ND ND ND
scFv-HSA-D550N-scFv-FLAG 4,1 ± 0,1 27,0 ± 0,2 6,6
scFv-HSA-K573P-scFv-FLAG 6,0 ± 0,2 0,7 ± 0,1 0,1
HSA-K500A-scFv-FLAG ND ND ND
Variante de albúminaa ka (103/Ms) kd (10-3/s) KDb (pM)
HSA-D550N-scFv-FLAG 7,3 ± 0,1 42,0 ± 0,3 5,8
HSA-K573A-scFv-FLAG 6,4 ± 0,1 5,7 ± 0,1 0,9
HSA-K573P-scFv-FLAG 4,7 ± 0,1 0,7 ± 0,1 0,1
scFv-HSA-K500A ND ND ND
scFv-HSA-D550N 7,5 ± 0,1 19,0 ± 0,2 2,5
scFv-HSA-K573P 7,4 ± 0,1 0,8 ± 0,1 0,1 I
a: Las diluciones de las variantes de HSA se inyectaron sobre shFcRn inmovilizado (~1500 RU).
b: Las constantes de velocidad cinética se obtuvieron usando un modelo simple de interacción bimolecular de primer orden (1:1). Los valores cinéticos representan el promedio de duplicados.
c: No determinado debido a una unión débil (ND).
En el ejemplo 8 se demostró que la variante K500A no se unía significativamente a shFcRn, en el ejemplo 10 se demostró que las variantes K573P y K573A se unen a shFcRn más fuertemente que HSA y en el ejemplo 11 se demostró que la variante D550N se une a FcRn más débilmente que HSA.
En el presente ejemplo se muestra que estas diferencias observadas en las propiedades de unión también se reflejan en polipéptidos de fusión en diferentes configuraciones: fusiones C terminales con un resto pequeño (HSA-FLAG), fusiones C terminales con un polipéptido más grande (HSA-IL1RA); fusiones N terminales con polipéptido (scFv-HSA); fusiones N y C terminales (scFv-HSA-FLAG y scFv-HSA-scFv-FLAG).
Ejemplo 17. Conjugación de la proteína de peroxidasa de rábano picante con la albúmina y la variante K573P Para el análisis de conjugación se usó albúmina recombinante comercialmente disponible (Recombumin™) como molécula de control. Para este ejemplo se purificó una variante final de albúmina K573P de 200 mg/ml de la invención obtenida de una fermentación discontinua alimentada por los medios descritos en Materiales y procedimientos. Se llevó a cabo una purificación en dos etapas.
La primera etapa usó una columna (volumen del lecho de aproximadamente 400 ml, altura del lecho de 11 cm) empaquetada con matriz AlbuPure™ (ProMetic). Esta se equilibró con acetato de sodio 50 mM, pH 5,3 y se cargó con sobrenadante de cultivo puro a aproximadamente pH 5,5-6,5, a aproximadamente 20 mg/ml de matriz. La columna se lavó entonces con aproximadamente 5 volúmenes de columna cada uno de acetato de sodio 50 mM a pH 5,3, fosfato de sodio 50 mM a pH 6,0, fosfato de sodio 50 mM a pH 7,0 y acetato de amonio 50 mM a pH 8,0, respectivamente. La proteína unida se eluyó usando aproximadamente dos volúmenes de columna de acetato de amonio 50 mM, octanoato 10 mM, pH 7,0. El caudal para toda la purificación fue de 154 ml/min.
Para la segunda etapa, el eluato de la primera etapa se diluyó aproximadamente dos veces con agua para dar una conductividad de 2,5±0,5mS/cm después del ajuste a pH 5,5 ±0,3 con ácido acético. Esto se cargó en una columna DEAE-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) (volumen del lecho de aproximadamente 400 ml, altura del lecho de 11 cm), equilibrada con acetato de sodio 80 mM, octanoato 5 mM, pH 5,5. La carga fue de aproximadamente 30 mg de proteína / ml de matriz. La columna se lavó con aproximadamente 5 volúmenes de columna de acetato de sodio 80 mM, octanoato 5 mM a pH 5,5, seguido por aproximadamente 10 volúmenes de columna de tetraborato de potasio 15,7 mM a pH 9,2. La proteína unida se eluyó usando dos volúmenes de columna de tetraborato de potasio 110 mM, cloruro de sodio 200 mM, aproximadamente pH 9,0. El caudal fue de 183 ml/min durante las etapas de carga y lavado, y de 169 ml/min durante la etapa de elución.
El eluato se concentró y se diafiltró frente a NaCl 145 mM usando una membrana Pall Centramate Omega 10000 MWCO nominal para dar una concentración de proteína final de aproximadamente 200 mg/ml.
Ambas soluciones madre de 200 mg/ml de rHA y la albúmina variante K573P se diluyeron hasta 5 mg/ml usando solución salina tamponada con fosfato (PBS) y el pH se ajustó a pH 6,5-6,7. Esto aseguró un entorno de pH favorable para que el grupo reactivo de maleimida de la peroxidasa de rábano picante activada con maleimida EZ-Link® (Thermo Scientific) reaccionara con el sulfhidrilo libre para formar un enlace tioéster estable. Se mezclaron bien 2 mg de la peroxidasa de rábano picante (HRP) activada con maleimida EZ-Link® con 1 ml de rHA o la variante de albúmina K573P 5 mg/ml. Esta mezcla aseguró un exceso molar aproximado de 2 veces de la albúmina o de la albúmina variante K573P. La mezcla se incubó mínimamente a 4 °C durante 24 horas. En las mezclas de reacción se verificó a continuación la conjugación usando GP-HPLC.
Para separar las especies no conjugadas (rHA o variante de albúmina K573P y HRP sin reaccionar) de las especies conjugadas correspondientes, las muestras se concentraron primero (Vivaspin20, PES 10000 MWCO, Sartorius) y, a continuación, se aplicaron individualmente a una columna Tricorn Superdex™ 200, 10/300 GL (GE Healthcare),
que se ejecutó a un caudal de 45 cm/h en PBS. El pico de elución se fraccionó y se analizó mediante GP-HPLC. Las fracciones que contenían las especies conjugadas se agruparon, concentraron y diafiltraron frente a NaCl 50 mM y se analizaron mediante GP-HPLC (figura 24).
Estas muestras se analizaron a continuación usando el procedimiento de Biacore descrito en el presente documento (tabla 21). Este ejemplo demuestra que el K573P mantiene su afinidad aumentada por shFcRn en comparación con WT HSA.
Ejemplo 18. Conjugación de fluoresceína con la albúmina y la variante K573P
Las dos mismas muestras de albúmina usadas en el ejemplo 17 también fueron los materiales de partida para este ejemplo, es decir, aproximadamente 200 mg/ml de rHA o la variante de albúmina K573P.
Se disolvió fluoresceína-5-maleimida, Thermo Scientific (F5M), en dimetilformamida para dar una concentración final de 25 mg/ml. A continuación, esto se diluyó adicionalmente en 18 ml de PBS y el pH se ajustó a aproximadamente pH 6,5. A esta solución se añadió 1 ml de rha 200 mg/ml o 1 ml de variante K573P 200 mg/ml. Esto dio un exceso molar final aproximado de 20 veces de F5M. Estas muestras se incubaron y se dejaron conjugar durante la noche a 4 °C, en la oscuridad, para permitir que los grupos maleimida de F5M reaccionaran predominantemente con el sulfhidrilo libre, presente en ambas especies de albúmina.
Después de una noche de incubación, alícuotas de las mezclas de reacción se diafiltraron ampliamente frente a NaCl 50 mM para eliminar la F5M no conjugada (Vivaspin20, PES 10000 MWCO, Sartorius). La conjugación se confirmó mediante visualización ultravioleta de fluoresceína::albúminas conjugadas según SDS-PAGE estándar (figura 25).
Estas muestras diafiltradas se analizaron a continuación usando el procedimiento de Biacore descrito en el presente documento (tabla 21). Este ejemplo demuestra que la conjugación de una molécula pequeña con rHA o una variante, por ejemplo, K573P, no afecta a la tendencia en las afinidades de unión a shFcRn.
Tabla 21: Se obtuvieron valores de KD representativos del ensayo Biacore de rHA o una variante (K573P) conjugada cuando se une a shFcRn inmovilizado.
Analito KD (pM)
rHA::HRP 3,6
K573P::HRP 0,02
rHA::F5M 7,3
K573P::F5M 2,5
Ejemplo 19. Otras variantes de albúmina
Las siguientes variantes se generaron usando los procedimientos descritos en el ejemplo 1: E492T, N503D, E492T+N503D, K538H, E542D, D494N+E495Q+T496A, E495Q+T496A, N403K, K541A y K541N. El análisis por SPR se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 15 y los resultados se presentaron en la figura 26 y la figura 27. Las figuras 30A y 30B muestran el efecto sobre la unión a shFcRn de las variantes de albúmina.
Las sustituciones N503D, D494N+E495Q+T496A E492T+N503D, E495Q+T496A dentro de HSA tuvieron un impacto negativo sobre la unión a shFcRn a pH 5,5.
Ejemplo 20. Variantes de albúmina en el extremo C
Las siguientes variantes se generaron usando los procedimientos descritos en el ejemplo 1. La unión al shFcRn se determinó como se describe en Materiales y procedimientos y los resultados se presentan en la tabla 22.
Tabla 22: Cinética de las interacciones con shFcRn de variantes de HSA con cambios en el extremo C Variante de albúminaa ka (103/Ms) kd (10-3/s) KDb (pM)
HSA 4,4 ± 0,0 24,0 ± 0,1 5,4
MacSA 3,1 ± 0,1 8,6 ± 0,1 2,7
HSA-MacC 4,1 ± 0,1 5,6 ± 0,0 1,3
SA ratónc 3,8 ± 0,0 3,1 ± 0,1 0,8
HSA-C ratón 3,7 ± 0,1 1,3 ± 0,0 0,3
Variante de albúminaa ka (103/Ms) kd (10-3/s) KDb (pM)
SA conejod 1,9 ± 0,3 1,7 ± 0,1 0,9
HSA-C conejo 3,5 ± 0,0 1,6 ± 0,0 0,4
SA oveja ND ND ND
HSA-C oveja 3,3 ± 0,0 2,1 ± 0,0 0,6
a: Las diluciones de las variantes de HSA se inyectaron sobre shFcRn inmovilizado (~1500 RU).
b: Las constantes de velocidad cinética se obtuvieron usando un modelo simple de interacción bimolecular de primer orden (1:1).
c: Datos de la tabla 2.
d: Datos de la tabla 3.
No determinado debido a unión débil (ND).
Este ejemplo demuestra que, para todos los cambios C terminales en albúmina humana sometidos a prueba, se observó un aumento en la unión con respecto a la albúmina donante. Todas las secuencias donantes contienen la sustitución K573P que se muestra que aumenta significativamente la unión, pero es menos que la K573P sola (tabla 20).
Ejemplo 21. Análisis de unión competitiva de fusiones de albúmina variante
Los estudios de unión competitiva, usando fusiones de albúmina variante y una selección de albúminas variantes preparadas como se describe en el ejemplo 1, se realizaron como se describe en el ejemplo 4. Los resultados se muestran en las figuras 28-31.
La clasificación de unión competitiva de las fusiones de variantes de HSA-FLAG y de scFv HSA-FLAG N y C terminal fue idéntica a la clasificación de los datos de afinidad de las variantes de HSA individuales (no fusionadas y fusionadas). Para las variantes de IL1Ra, K573P, K573A y K500A fueron como se preveía; sin embargo, D550N parece inhibir más eficientemente que la fusión WT.
Ejemplo 22. Otras variantes de HSA
Las siguientes variantes se generaron usando los procedimientos descritos en el ejemplo 1: HSA E492G+K573A, HSA E492G+N503K+K573A, HSA E492G+N503H+K573A, HSA E492G+K573P, HSA E492G+N503K+K573P, HSA E492G+N503H+K573P. El análisis por SPR se realizó como se describe en Materiales y procedimientos. Los resultados (figura 32) mostraron que todas las variantes de HSA se unían más fuertemente a shFcRn en comparación con HSA natural a pH 5,5. No se observó unión a pH 7,4.
Las variantes HSA E492G+K573A, HSA E492G+N503K+K573A, a diferencia de HSA E492G+N503H+K573A, tenían una unión marginalmente mejorada con respecto a de HSA K573A. Las variantes de combinación que contienen K573P no mostraron una unión mejorada con respecto a la variante única K573P.
Claims (17)
1. Una variante de albúmina o fragmento de la misma que comprende dicha variante de albúmina o fragmento de la misma, que comprende una sustitución en una posición correspondiente a la posición 573 en la SEQ ID NO: 2, en la que:
(i) la variante o fragmento tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2;
(ii) la sustitución es a A, C, D, F, G, H, I, L, M, N, P, R, S, V, W o Y; y
(iii) la variante o fragmento tiene una afinidad de unión a FcRn más fuerte y/o una semivida plasmática más prolongada que una albúmina original que comprende la SEQ ID NO: 2 o fragmento de la misma, en la que la afinidad de unión más fuerte se define como la variante de albúmina o fragmento que tiene un coeficiente de unión (KD) a FcRn inferior a 0,9X el coeficiente de unión de la SEQ ID NO: 2, o fragmento correspondiente de SEQ ID NO: 2, a FcRn.
2. La variante de albúmina o fragmento de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la sustitución en la posición correspondiente a 573 en la SEQ ID NO: 2 es a Y, W, P, H, F, V o I.
3. La variante de albúmina o fragmento de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la sustitución en la posición correspondiente a 573 en la SEQ ID NO: 2 es a Y, W, P o H.
4. La variante de albúmina o fragmento de la misma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una o más alteraciones adicionales que generan un grupo tiol en la superficie.
5. La variante de albúmina o fragmento de la misma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la identidad de secuencia de la variante de albúmina o fragmento de la misma con la SEQ ID NO: 2 es superior a un 99 %.
6. El fragmento de una variante de albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que el fragmento comprende al menos 200 aminoácidos, más preferentemente al menos 300 aminoácidos, más preferentemente al menos 400 aminoácidos y lo más preferentemente al menos 500 aminoácidos.
7. Un conjugado que comprende la albúmina variante o fragmento de la misma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un resto terapéutico beneficioso.
8. Una albúmina variante o fragmento de la misma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 unida no covalentemente a un resto terapéutico beneficioso.
9. Un polipéptido de fusión que comprende una albúmina variante o fragmento de la misma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un polipéptido asociado de fusión.
10. La variante de albúmina o fragmento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el conjugado de acuerdo con la reivindicación 7 o el polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el coeficiente de unión de la variante de albúmina o fragmento a FcRn es inferior a 0,5X KD para HSA o fragmento correspondiente de HSA, más preferentemente inferior a 0,1X KD para HSA o fragmento correspondiente de HSA, incluso más preferentemente inferior a 0,05X KD para HSA o fragmento correspondiente de HSA, incluso más preferentemente inferior a 0,02X KD para HSA o fragmento correspondiente de HSA y lo más preferentemente inferior a 0,01X KD para HSA o fragmento correspondiente de HSA.
11. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 7 o el polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el coeficiente de unión del conjugado o polipéptido de fusión es inferior a 0,9X KD para un correspondiente conjugado o polipéptido de fusión que comprende HSA, más preferentemente inferior a 0,5X KD para el correspondiente conjugado o polipéptido de fusión, más preferentemente inferior a 0,1X KD para el correspondiente conjugado o polipéptido de fusión, incluso más preferentemente inferior a 0,05X KD para el correspondiente conjugado o polipéptido de fusión, incluso más preferentemente inferior a 0,02X KD para el correspondiente conjugado o polipéptido de fusión y lo más preferentemente inferior a 0,01X KD para el correspondiente conjugado o polipéptido de fusión.
12. Una composición que comprende una albúmina variante o un fragmento de la misma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 8 o 10, un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7, 10 o 1, o un polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10.
13. La composición de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende además un compuesto que comprende un dominio de unión a albúmina (ABD) y un resto farmacéuticamente beneficioso.
14. La composición de acuerdo con la reivindicación 12 o 13 que es una composición farmacéutica.
15. Una variante de albúmina, fragmento, polipéptido de fusión o un conjugado o composición que comprende el fragmento variante o polipéptido de fusión de acuerdo con cualquier reivindicación precedente para uso como medicamento.
16. Un ácido nucleico que codifica la variante de albúmina, fragmento de la misma o polipéptido de fusión que comprende dicha albúmina variante o fragmento de la misma de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o 9 a 11.
17. Un procedimiento para preparar una variante de albúmina, fragmento de la misma o polipéptido de fusión que comprende dicha albúmina variante o fragmento de la misma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o 9 a 11, que comprende las siguientes etapas:
a. Proporcionar un ácido nucleico que codifica la variante de albúmina, fragmento de la misma o polipéptido de fusión que comprende dicha albúmina variante o fragmento de la misma;
b. Introducir la secuencia modificada de la etapa a, en una célula huésped adecuada;
c. Cultivar las células en un medio de cultivo adecuado en condiciones que conducen a la expresión de la variante de albúmina, fragmentos de la misma o polipéptido de fusión que comprende dicha albúmina variante o fragmento de la misma; y
d. Recuperar la variante de albúmina, fragmentos de la misma o polipéptido de fusión que comprende dicha albúmina variante o fragmento de la misma del medio de cultivo.
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| UY35463A (es) | 2013-03-15 | 2014-10-31 | Biogen Idec Inc | Formulaciones de polipéptido fc-factor ix. |
| MX2015010937A (es) | 2013-03-15 | 2015-10-29 | Ampio Pharmaceuticals Inc | Composiciones para la movilizacion, autodireccion, expansion y diferenciacion de celulas madre y metodos para usar las mismas. |
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| CN103408669B (zh) | 2013-08-01 | 2016-01-20 | 江苏泰康生物医药有限公司 | Glp-1类似物融合蛋白，及其制备方法和用途 |
| EP3038642A4 (en) | 2013-08-30 | 2017-01-18 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders |
| ES2759252T3 (es) | 2013-10-31 | 2020-05-08 | Resolve Therapeutics Llc | Fusiones y métodos terapéuticos de nucleasa-albúmina |
| CA2928700C (en) | 2013-11-01 | 2019-01-15 | University Of Oslo | Albumin variants and uses thereof |
| WO2015070060A1 (en) | 2013-11-11 | 2015-05-14 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders |
| WO2015077717A1 (en) | 2013-11-25 | 2015-05-28 | The Broad Institute Inc. | Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer by means of the dna methylation status |
| WO2015085147A1 (en) | 2013-12-05 | 2015-06-11 | The Broad Institute Inc. | Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data |
| JP7060324B2 (ja) | 2013-12-20 | 2022-04-26 | ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド | ネオ抗原ワクチンによる併用療法 |
| WO2015187295A2 (en) | 2014-06-02 | 2015-12-10 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of lowering serum cholesterol |
| TW201609812A (zh) | 2014-07-31 | 2016-03-16 | 安美基研究（慕尼黑）公司 | 最佳化之跨物種特異性雙特異性單鏈抗體構築體 |
| WO2016025645A1 (en) | 2014-08-12 | 2016-02-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Synergistic tumor treatment with il-2, a therapeutic antibody, and an immune checkpoint blocker |
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| CA2963989A1 (en) | 2014-10-14 | 2016-04-21 | Armo Biosciences, Inc. | Interleukin-15 compositions and uses thereof |
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| EP3234130B1 (en) | 2014-12-19 | 2020-11-25 | The Broad Institute, Inc. | Methods for profiling the t-cell- receptor repertoire |
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| ES2839211T3 (es) | 2015-03-12 | 2021-07-05 | Medimmune Llc | Método para purificar proteínas de fusión a albúmina |
| JP2016179951A (ja) * | 2015-03-23 | 2016-10-13 | 学校法人 中央大学 | 遺伝子組換え動物血清アルブミン、ヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体、人工血漿増量剤及び人工酸素運搬体 |
| IL255076B2 (en) | 2015-04-17 | 2023-10-01 | Amgen Res Munich Gmbh | CDH3 and CD3 bispecific antibody constructs |
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| WO2016209969A1 (en) | 2015-06-22 | 2016-12-29 | Ampio Pharmaceuticals, Inc. | Use of low molecular weight fractions of human serum albumin in treating diseases |
| TWI796283B (zh) | 2015-07-31 | 2023-03-21 | 德商安美基研究（慕尼黑）公司 | Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體 |
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| AU2016312510A1 (en) | 2015-08-25 | 2018-03-08 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using Interleukin-10 for treating diseases and disorders |
| EP3865147A1 (en) | 2015-10-02 | 2021-08-18 | Silver Creek Pharmaceuticals, Inc. | Bi-specific therapeutic proteins for tissue repair |
| CA3005953A1 (en) | 2015-12-22 | 2017-06-29 | Albumedix Ltd | Improved protein expression strains |
| US20200270335A1 (en) | 2015-12-23 | 2020-08-27 | Biogen Ma Inc. | Dkk2 cysteine rich domain 2 containing proteins and uses thereof |
| MX2018008337A (es) | 2016-01-07 | 2018-09-17 | CSL Behring Lengnau AG | Factor de von willebrand truncado mutado. |
| EA039859B1 (ru) | 2016-02-03 | 2022-03-21 | Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх | Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3 |
| US20190346442A1 (en) | 2016-04-18 | 2019-11-14 | The Broad Institute, Inc. | Improved hla epitope prediction |
| US11110122B2 (en) * | 2016-06-03 | 2021-09-07 | New York University | Methods and reagents for modulating macrophage phenotype |
| ES2761854T3 (es) | 2016-10-04 | 2020-05-21 | Albumedix Ltd | Usos de albúmina de suero recombinante obtenida a partir de levadura |
| JP2020500306A (ja) | 2016-11-04 | 2020-01-09 | オーフス ウニベルシテット | 新生児Ｆｃ受容体の過剰発現により特徴づけられる腫瘍の同定と治療 |
| WO2018096396A1 (en) * | 2016-11-22 | 2018-05-31 | University Of Oslo | Albumin variants and uses thereof |
| US10268924B2 (en) * | 2016-12-05 | 2019-04-23 | Sap Se | Systems and methods for integrated cargo inspection |
| WO2018115953A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Prometic Pharma Smt Limited | Methods and compositions for preventing or minimizing epithelial-mesenchymal transition |
| EP3574116A1 (en) | 2017-01-24 | 2019-12-04 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide |
| WO2018148671A1 (en) | 2017-02-12 | 2018-08-16 | Neon Therapeutics, Inc. | Hla-based methods and compositions and uses thereof |
| EP3642343B1 (en) | 2017-06-20 | 2021-12-08 | Albumedix Ltd. | Improved protein expression strains |
| BR112019026743A2 (pt) | 2017-06-22 | 2020-06-30 | CSL Behring Lengnau AG | modulação da imunogenicidade de fviii através de vwf truncado |
| DK3661954T3 (da) | 2017-08-03 | 2022-04-19 | Amgen Inc | Interleukin-21-muteiner og fremgangsmåder til behandling |
| US11485781B2 (en) | 2017-08-17 | 2022-11-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Multiple specificity binders of CXC chemokines |
| EP3679040B1 (en) | 2017-09-08 | 2022-08-03 | Amgen Inc. | Inhibitors of kras g12c and methods of using the same |
| KR20200067158A (ko) * | 2017-10-18 | 2020-06-11 | 씨에스엘 리미티드 | 인간 혈청 알부민 변이체 및 이의 용도 |
| ES2939461T3 (es) | 2017-11-29 | 2023-04-24 | Csl Ltd | Método para tratar o prevenir la lesión por isquemia-reperfusión |
| KR20200110358A (ko) | 2018-01-12 | 2020-09-23 | 암젠 인크 | 항-pd-1 항체 및 치료 방법 |
| US20210238238A1 (en) | 2018-05-16 | 2021-08-05 | Csl Limited | Soluble complement receptor type i variants and uses thereof |
| AU2019314999A1 (en) | 2018-08-03 | 2021-02-11 | Amgen Inc. | Antibody constructs for CLDN18.2 and CD3 |
| JP7437385B2 (ja) | 2018-09-06 | 2024-02-22 | バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ | 保管が改善されたポックスウイルス組成物 |
| US20210382068A1 (en) | 2018-10-02 | 2021-12-09 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Hla single allele lines |
| BR112021005578A2 (pt) * | 2018-10-25 | 2021-06-29 | Nippon Steel Corporation | líquido de revestimento para formação de revestimento de isolamento para chapas de aço elétrico de grãos orientados, chapa de aço elétrico de grãos orientados, e método de produção da chapa de aço elétrico de grãos orientados |
| MA54070A (fr) | 2018-10-29 | 2021-09-08 | Biogen Ma Inc | Variants fc5 humanisés et stabilisés pour l'amélioration du transport à travers la barrière hémato-encéphalique |
| WO2020131586A2 (en) | 2018-12-17 | 2020-06-25 | The Broad Institute, Inc. | Methods for identifying neoantigens |
| EP3899954A4 (en) | 2018-12-21 | 2022-09-14 | BioNTech US Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR PREDICTING HLA CLASS II SPECIFIC EPITOPES AND CHARACTERIZING CD4+ T CELLS |
| JP2022525921A (ja) | 2019-03-18 | 2022-05-20 | バイオエヌテック セル アンド ジーン セラピーズ ゲーエムベーハー | 免疫エフェクタ細胞の特異的活性化のためのインターロイキン２受容体（ｉｌ２ｒ）およびインターロイキン２（ｉｌ２）バリアント |
| WO2020200481A1 (en) | 2019-04-05 | 2020-10-08 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Treatment involving interleukin-2 (il2) and interferon (ifn) |
| KR20220062488A (ko) | 2019-06-12 | 2022-05-17 | 바이오엔테크 유에스 인크. | 신생항원 조성물 및 이의 용도 |
| CN114302896A (zh) | 2019-09-06 | 2022-04-08 | 诺华股份有限公司 | 治疗性融合蛋白 |
| EP3819007B1 (en) | 2019-11-11 | 2024-07-10 | Amgen Research (Munich) GmbH | Dosing regimen for anti-bcma agents |
| EP4069200A1 (en) | 2019-12-04 | 2022-10-12 | Albumedix Ltd | Methods and compositions produced thereby |
| US20230093169A1 (en) | 2020-01-22 | 2023-03-23 | Amgen Research (Munch) Gmbh | Combinations of antibody constructs and inhibitors of cytokine release syndrome and uses thereof |
| AU2021233167A1 (en) | 2020-03-12 | 2022-09-22 | Bavarian Nordic A/S | Compositions improving poxvirus stability |
| WO2021183861A1 (en) | 2020-03-12 | 2021-09-16 | Amgen Inc. | Method for treatment and prophylaxis of crs in patients comprising a combination of bispecifc antibodies binding to cds x cancer cell and tnfalpha or il-6 inhibitor |
| US20230405046A1 (en) | 2020-03-16 | 2023-12-21 | Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh | Antigen-specific t cell receptors and t cell epitopes |
| GB202004514D0 (en) | 2020-03-27 | 2020-05-13 | Inst De Medicina Molecular Joaeo Lobo Antunes | Treatment of Immunosuppressive Cancer |
| AU2021275049A1 (en) | 2020-05-19 | 2022-12-22 | Amgen Inc. | MAGEB2 binding constructs |
| MX2023003041A (es) | 2020-09-16 | 2023-05-09 | Amgen Inc | Métodos para administrar dosis terapéuticas de moléculas de acoplamiento a células t biespecíficas para el tratamiento de cáncer. |
| EP4240407A1 (en) | 2020-11-06 | 2023-09-13 | Amgen Inc. | Antigen binding domain with reduced clipping rate |
| WO2022096700A1 (en) | 2020-11-06 | 2022-05-12 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Polypeptide constructs selectively binding to cldn6 and cd3 |
| JP2023547661A (ja) | 2020-11-06 | 2023-11-13 | アムジエン・インコーポレーテツド | Ｃｄ３に結合するポリペプチド構築物 |
| WO2022103781A1 (en) | 2020-11-10 | 2022-05-19 | Amgen Inc. | Methods for administering a bcma x cd3 binding molecule |
| KR20230142704A (ko) | 2020-12-14 | 2023-10-11 | 바이오엔테크 유에스 인크. | 암 면역요법을 위한 조직 특이적 항원 |
| WO2024015892A1 (en) | 2022-07-13 | 2024-01-18 | The Broad Institute, Inc. | Hla-ii immunopeptidome methods and systems for antigen discovery |
| WO2024077044A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-11 | Amgen Inc. | Combination therapies comprising t-cell redirecting therapies and agonistic anti-il-2r antibodies or fragments thereof |
| WO2024077256A1 (en) | 2022-10-07 | 2024-04-11 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions for high-throughput discovery ofpeptide-mhc targeting binding proteins |
| WO2024089258A1 (en) | 2022-10-28 | 2024-05-02 | Aarhus Universitet | Albumin conjugated to cpg oligodeoxynucleotides as super-boosters of immune response |
Family Cites Families (166)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9019919D0 (en) | 1990-09-12 | 1990-10-24 | Delta Biotechnology Ltd | Purification of proteins |
| US5625041A (en) | 1990-09-12 | 1997-04-29 | Delta Biotechnology Limited | Purification of proteins |
| US2714586A (en) | 1951-06-25 | 1955-08-02 | Phillips Petroleum Co | Washing urea and thiourea containing adducts |
| US4302386A (en) | 1978-08-25 | 1981-11-24 | The Ohio State University | Antigenic modification of polypeptides |
| US4741900A (en) | 1982-11-16 | 1988-05-03 | Cytogen Corporation | Antibody-metal ion complexes |
| US4757006A (en) | 1983-10-28 | 1988-07-12 | Genetics Institute, Inc. | Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production |
| JPS60169498A (ja) | 1984-02-10 | 1985-09-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 成人ｔ細胞白血病ウイルス抗原ペプチド誘導体 |
| AU5772886A (en) | 1985-04-12 | 1986-11-05 | Genetics Institute Inc. | Novel procoagulant proteins |
| GR860984B (en) | 1985-04-17 | 1986-08-18 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
| ES2052712T3 (es) | 1987-04-09 | 1994-07-16 | Delta Biotechnology Ltd | Vector de levadura. |
| EP0305216B1 (en) | 1987-08-28 | 1995-08-02 | Novo Nordisk A/S | Recombinant Humicola lipase and process for the production of recombinant humicola lipases |
| GB8725529D0 (en) | 1987-10-30 | 1987-12-02 | Delta Biotechnology Ltd | Polypeptides |
| IL88326A (en) | 1987-11-18 | 1993-03-15 | Gist Brocades Nv | Purification of serum albumin |
| US5075222A (en) | 1988-05-27 | 1991-12-24 | Synergen, Inc. | Interleukin-1 inhibitors |
| US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
| GB8909916D0 (en) | 1989-04-29 | 1989-06-14 | Delta Biotechnology Ltd | Polypeptides |
| US5766883A (en) | 1989-04-29 | 1998-06-16 | Delta Biotechnology Limited | Polypeptides |
| FR2650598B1 (fr) | 1989-08-03 | 1994-06-03 | Rhone Poulenc Sante | Derives de l'albumine a fonction therapeutique |
| US5073627A (en) | 1989-08-22 | 1991-12-17 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
| US5208020A (en) | 1989-10-25 | 1993-05-04 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
| GB8927722D0 (en) | 1989-12-07 | 1990-02-07 | British Bio Technology | Proteins and nucleic acids |
| DE4000939A1 (de) | 1990-01-15 | 1991-07-18 | Brem Gottfried Prof Dr Dr | Verfahren zur antikoerpergewinnung |
| JP3230091B2 (ja) | 1990-06-25 | 2001-11-19 | ウェルファイド株式会社 | ヒト血清アルブミンの着色抑制方法 |
| US5698426A (en) | 1990-09-28 | 1997-12-16 | Ixsys, Incorporated | Surface expression libraries of heteromeric receptors |
| IL99552A0 (en) | 1990-09-28 | 1992-08-18 | Ixsys Inc | Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof |
| CA2058820C (en) | 1991-04-25 | 2003-07-15 | Kotikanyad Sreekrishna | Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells |
| US5264586A (en) | 1991-07-17 | 1993-11-23 | The Scripps Research Institute | Analogs of calicheamicin gamma1I, method of making and using the same |
| FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| US5663060A (en) | 1992-04-07 | 1997-09-02 | Emory University | Hybrid human/animal factor VIII |
| ZA932522B (en) | 1992-04-10 | 1993-12-20 | Res Dev Foundation | Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens |
| DE4226971C2 (de) | 1992-08-14 | 1997-01-16 | Widmar Prof Dr Tanner | Modifizierte Pilzzellen und Verfahren zur Herstellung rekombinanter Produkte |
| US5728553A (en) | 1992-09-23 | 1998-03-17 | Delta Biotechnology Limited | High purity albumin and method of producing |
| DK0669836T3 (da) | 1992-11-13 | 1996-10-14 | Idec Pharma Corp | Terapeutisk anvendelse af kimære og radioaktivt mærkede antistoffer og humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantigen til behandling af B-cellelymfom |
| WO1995003402A1 (en) | 1993-07-22 | 1995-02-02 | Merck & Co., Inc. | EXPRESSION OF HUMAN INTERLEUKIN-1β IN A TRANSGENIC ANIMAL |
| DE4343591A1 (de) | 1993-12-21 | 1995-06-22 | Evotec Biosystems Gmbh | Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes |
| US6811773B1 (en) | 1993-12-22 | 2004-11-02 | Human Genome Sciences, Inc. | Human monocyte colony inhibitory factor (M-CIF) polypeptides |
| US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
| GB9404270D0 (en) * | 1994-03-05 | 1994-04-20 | Delta Biotechnology Ltd | Yeast strains and modified albumins |
| US5773001A (en) | 1994-06-03 | 1998-06-30 | American Cyanamid Company | Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis |
| US7597886B2 (en) | 1994-11-07 | 2009-10-06 | Human Genome Sciences, Inc. | Tumor necrosis factor-gamma |
| US5714586A (en) | 1995-06-07 | 1998-02-03 | American Cyanamid Company | Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates |
| US5712374A (en) | 1995-06-07 | 1998-01-27 | American Cyanamid Company | Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates |
| US5955349A (en) | 1996-08-26 | 1999-09-21 | Zymogenetics, Inc. | Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica |
| US5716808A (en) | 1995-11-09 | 1998-02-10 | Zymogenetics, Inc. | Genetic engineering of pichia methanolica |
| GB9526733D0 (en) | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
| US6509313B1 (en) | 1996-02-28 | 2003-01-21 | Cornell Research Foundation, Inc. | Stimulation of immune response with low doses of cytokines |
| US5736383A (en) | 1996-08-26 | 1998-04-07 | Zymogenetics, Inc. | Preparation of Pichia methanolica auxotrophic mutants |
| US5854039A (en) | 1996-07-17 | 1998-12-29 | Zymogenetics, Inc. | Transformation of pichia methanolica |
| US6274305B1 (en) | 1996-12-19 | 2001-08-14 | Tufts University | Inhibiting proliferation of cancer cells |
| US6605699B1 (en) | 1997-01-21 | 2003-08-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Galectin-11 polypeptides |
| US7053190B2 (en) | 1997-03-07 | 2006-05-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Secreted protein HRGDF73 |
| US7196164B2 (en) | 1997-07-08 | 2007-03-27 | Human Genome Sciences, Inc. | Secreted protein HHTLF25 |
| US6506569B1 (en) | 1997-05-30 | 2003-01-14 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies to human tumor necrosis factor receptor TR10 |
| US5948609A (en) | 1997-12-03 | 1999-09-07 | Carter; Daniel C. | Oxygen-transporting albumin-based blood replacement composition and blood volume expander |
| WO2000008207A1 (en) | 1998-08-06 | 2000-02-17 | Syntron Bioresearch, Inc. | Uric acid assay device with stabilized uricase reagent composition |
| EP1141376A4 (en) | 1998-12-23 | 2002-03-13 | Human Genome Sciences | PEPTIDOGLYCANE RECOGNITION PROTEINS |
| GB9902000D0 (en) | 1999-01-30 | 1999-03-17 | Delta Biotechnology Ltd | Process |
| AU761591B2 (en) | 1999-05-17 | 2003-06-05 | Conjuchem Biotechnologies Inc. | Long lasting fusion peptide inhibitors of viral infection |
| CA2371912C (en) | 1999-05-21 | 2010-02-16 | American Bioscience, Inc. | Protein stabilized pharmacologically active agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof |
| AU5471501A (en) | 2000-03-22 | 2001-10-03 | Octagene Gmbh | Production of recombinant blood clotting factors in human cell lines |
| EP1276756A4 (en) | 2000-04-12 | 2004-06-09 | Human Genome Sciences Inc | ALBUMIN FUSION PROTEINS |
| US20030091565A1 (en) | 2000-08-18 | 2003-05-15 | Beltzer James P. | Binding polypeptides and methods based thereon |
| CA2419894A1 (en) | 2000-09-15 | 2002-03-21 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Process for high throughput screening of cpg-based immuno-agonist/antagonist |
| US7615537B2 (en) | 2000-10-25 | 2009-11-10 | Genzyme Corporation | Methods for treating blood coagulation disorders |
| US6992234B2 (en) | 2000-11-06 | 2006-01-31 | The Jackson Laboratory | FcRn-based therapeutics for the treatment of auto-immune disorders |
| CA2716959A1 (en) | 2000-12-07 | 2002-06-13 | Eli Lilly And Company | Glp-1 fusion proteins |
| US7175988B2 (en) | 2001-02-09 | 2007-02-13 | Human Genome Sciences, Inc. | Human G-protein Chemokine Receptor (CCR5) HDGNR10 |
| US7507413B2 (en) | 2001-04-12 | 2009-03-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| EP2228389B1 (en) | 2001-04-13 | 2015-07-08 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies against vascular endothelial growth factor 2 |
| AUPR446701A0 (en) | 2001-04-18 | 2001-05-17 | Gene Stream Pty Ltd | Transgenic mammals for pharmacological and toxicological studies |
| WO2002102830A1 (en) | 2001-06-15 | 2002-12-27 | New Century Pharmaceuticals, Inc. | Human albumin animal models for drug evaluation, toxicology and immunogenicity studies |
| AUPR622301A0 (en) | 2001-07-09 | 2001-08-02 | Novapharm Research (Australia) Pty Ltd | Infection control system |
| US7314712B2 (en) | 2001-07-27 | 2008-01-01 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Systems for in vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides |
| CN1405182A (zh) * | 2001-08-10 | 2003-03-26 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 血清白蛋白与粒细胞集落刺激因子的融合蛋白 |
| ES2545090T3 (es) | 2001-12-21 | 2015-09-08 | Human Genome Sciences, Inc. | Proteínas de fusión de albúmina y GCSF |
| WO2003059934A2 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US20080167238A1 (en) | 2001-12-21 | 2008-07-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin Fusion Proteins |
| KR20040095217A (ko) | 2002-02-07 | 2004-11-12 | 델타 바이오테크놀로지 리미티드 | 알부민-융합 항-혈관신생 펩타이드 |
| WO2003076567A2 (en) | 2002-03-05 | 2003-09-18 | Eli Lilly And Company | Heterologous g-csf fusion proteins |
| WO2003102136A2 (en) | 2002-05-30 | 2003-12-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies that specifically bind to neurokinin b |
| CN1241946C (zh) | 2002-07-01 | 2006-02-15 | 美国福源集团 | 对多种细胞具刺激增生作用的人血清白蛋白重组融合蛋白 |
| GB0217347D0 (en) * | 2002-07-26 | 2002-09-04 | Univ Edinburgh | Novel albumins |
| AU2003257032A1 (en) | 2002-08-02 | 2004-02-23 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies against c3a receptor |
| JP4638350B2 (ja) | 2002-11-19 | 2011-02-23 | ディーアールジー・インターナショナル，インコーポレイテッド | ヒトまたは動物の組織、血液もしくは体液中のヘプシジンの存在または量を検出する方法 |
| EP1594530A4 (en) | 2003-01-22 | 2006-10-11 | Human Genome Sciences Inc | HYBRID PROTEINS OF ALBUMIN |
| CA2516409A1 (en) | 2003-02-17 | 2004-08-26 | Upperton Limited | Conjugates for medical imaging comprising carrier, targeting moiety and a contrast agent |
| GB0305989D0 (en) | 2003-03-15 | 2003-04-23 | Delta Biotechnology Ltd | Agent |
| WO2004082640A2 (en) | 2003-03-19 | 2004-09-30 | New Century Pharmaceuticals, Inc. | Human serum albumin conjugates with therapeutic compounds |
| WO2004092405A2 (en) | 2003-04-15 | 2004-10-28 | Xenon Pharmaceuticals Inc. | Juvenile hemochromatosis gene (hfe2a), expression products and uses thereof |
| US20050079546A1 (en) | 2003-05-01 | 2005-04-14 | Dasa Lipovsek | Serum albumin scaffold-based proteins and uses thereof |
| WO2005007121A2 (en) | 2003-07-18 | 2005-01-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Mutant interleukin-2(il-2) polypeptides |
| US6949961B2 (en) | 2003-10-06 | 2005-09-27 | Semiconductor Components Industries, L.L.C. | Power switch structure with low RDSon and low current limit |
| WO2005082423A2 (en) | 2003-11-18 | 2005-09-09 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Serum albumin conjugated to fluorescent substances for imaging |
| GB0329722D0 (en) | 2003-12-23 | 2004-01-28 | Delta Biotechnology Ltd | Modified plasmid and use thereof |
| GB0329681D0 (en) | 2003-12-23 | 2004-01-28 | Delta Biotechnology Ltd | Gene expression technique |
| US7166577B2 (en) | 2003-12-26 | 2007-01-23 | Nipro Corporation | Albumin having enhanced antimicrobial activity |
| JP4649954B2 (ja) | 2003-12-26 | 2011-03-16 | ニプロ株式会社 | 抗菌作用が増強されたアルブミン |
| KR100671005B1 (ko) | 2004-01-15 | 2007-01-18 | 고려대학교 산학협력단 | Ｐａｈ 노출 여부 진단용 바이오 마커 단백질 |
| HUE027902T2 (en) | 2004-02-09 | 2016-11-28 | Human Genome Sciences Inc Corp Service Company | Albumin fusion proteins |
| RU2369404C2 (ru) * | 2004-02-09 | 2009-10-10 | Хьюман Дженом Сайенсиз, Инк. | Слитые белки альбумина |
| JP4492156B2 (ja) | 2004-03-03 | 2010-06-30 | ニプロ株式会社 | 血清アルブミンドメインを含む蛋白質 |
| US20060018859A1 (en) | 2004-07-16 | 2006-01-26 | Carter Daniel C | Modified human serum albumin with reduced or eliminated affinity to chemical or biological contaminants at Cys 34 |
| EP1788084A4 (en) | 2004-08-06 | 2007-11-07 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | YEAST PROMOTER |
| US20060051859A1 (en) * | 2004-09-09 | 2006-03-09 | Yan Fu | Long acting human interferon analogs |
| ES2579805T3 (es) | 2004-09-23 | 2016-08-16 | Genentech, Inc. | Anticuerpos y conjugados modificados por ingeniería genética con cisteína |
| JP2008523829A (ja) | 2004-12-22 | 2008-07-10 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 血清アルブミンの組換え生成 |
| EP1831375B1 (en) | 2004-12-23 | 2014-07-16 | Novozymes Biopharma DK A/S | Gene expression technique |
| JPWO2006073195A1 (ja) | 2005-01-07 | 2008-06-12 | 敏一 吉川 | 糖尿病の予知・診断方法および糖尿病予知・診断用キット |
| US20060178301A1 (en) | 2005-02-04 | 2006-08-10 | Mathias Jurs | Albumin-fused ciliary neurotrophic factor |
| EP1879920A2 (en) | 2005-04-29 | 2008-01-23 | The Jackson Laboratory | Fcrn antibodies and uses thereof |
| GB0512707D0 (en) | 2005-06-22 | 2005-07-27 | Delta Biotechnology Ltd | Gene expression technique |
| AU2006280312A1 (en) * | 2005-08-12 | 2007-02-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| CN101287750A (zh) * | 2005-08-12 | 2008-10-15 | 人类基因科学公司 | 清蛋白融合蛋白 |
| US8008257B2 (en) * | 2005-10-20 | 2011-08-30 | University Of Ottawa Heart Institute | ANF fusion proteins |
| US20070269863A1 (en) | 2005-12-22 | 2007-11-22 | Bridon Dominique P | Process for the production of preformed conjugates of albumin and a therapeutic agent |
| EP1816201A1 (en) | 2006-02-06 | 2007-08-08 | CSL Behring GmbH | Modified coagulation factor VIIa with extended half-life |
| WO2007112940A2 (en) | 2006-03-31 | 2007-10-11 | Ablynx N.V. | Albumin-derived amino acid sequence, use thereof for increasing the half-life of therapeutic proteins and of other therapeutic compounds and entities, and constructs comprising the same |
| EP2474318A1 (en) | 2006-06-07 | 2012-07-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| KR101641899B1 (ko) | 2006-06-14 | 2016-08-01 | 체에스엘 베링 게엠베하 | 혈액 응고 인자를 포함하는 단백질분해적으로 절단가능한 융합 단백질 |
| JP5670634B2 (ja) | 2006-07-13 | 2015-02-18 | アッパートン リミティド | タンパク質性物質の粒子の製造方法 |
| JP4983148B2 (ja) | 2006-08-18 | 2012-07-25 | ニプロ株式会社 | 糖鎖含有アルブミン、その製造方法およびその用途 |
| CA2663083A1 (en) | 2006-09-08 | 2008-03-13 | Ambrx, Inc. | Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and their uses |
| US20100129846A1 (en) | 2006-12-07 | 2010-05-27 | Power3 Medical Products, Inc. | Isoform specificities of blood serum proteins and their use as differentially expressed protein biomarkers for diagnosis of breast cancer |
| CN101835801B (zh) | 2007-08-08 | 2014-09-10 | 诺维信生物制药丹麦公司 | 转铁蛋白变体和偶联物 |
| US8906356B2 (en) | 2007-11-05 | 2014-12-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Mutant interleukin-2 (IL-2) polypeptides |
| CA2611540C (en) | 2007-11-09 | 2017-05-30 | Nipro Corporation | Sugar chain-containing albumin as a drug carrier to the liver |
| BRPI0822099A2 (pt) | 2007-12-21 | 2017-05-23 | Medimmune Ltd | membro de ligação isolado, uso de um membro de ligação isolado, método parav tratar um distúrbio, molécula de ácido nucléico isolada, célula hospedeira, e, método para produzir um membro de ligação |
| EA022201B1 (ru) | 2008-04-11 | 2015-11-30 | Мерримак Фармасьютикалз, Инк. | Агент, способный связываться с опухолевой клеткой, содержащий линкер на основе hsa, и его применение |
| US20110112040A1 (en) | 2008-04-28 | 2011-05-12 | President And Fellows Of Harvard College | Supercharged proteins for cell penetration |
| CA2731216A1 (en) | 2008-07-18 | 2010-01-21 | Oragenics, Inc. | Compositions for the detection and treatment of colorectal cancer |
| WO2010059315A1 (en) * | 2008-11-18 | 2010-05-27 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Human serum albumin linkers and conjugates thereof |
| US20120009123A1 (en) | 2008-12-05 | 2012-01-12 | Abraxis Bioscience, Llc | Albumin binding peptide-mediated disease targeting |
| JP5959201B2 (ja) | 2008-12-10 | 2016-08-02 | ザ スクリプス リサーチ インスティテュート | 化学的に反応性の非天然アミノ酸を使用するキャリア−ペプチド接合体の製造 |
| JP5936112B2 (ja) * | 2009-02-11 | 2016-06-15 | アルブミディクス アクティーゼルスカブ | アルブミン変異体及び複合体 |
| EP2419120A4 (en) | 2009-04-08 | 2016-01-06 | Univ California | HUMAN PROTEIN CONCERNS WITH CONTROLLED SERUM PHARMACOKINETICS |
| WO2010129023A2 (en) | 2009-04-28 | 2010-11-11 | President And Fellows Of Harvard College | Supercharged proteins for cell penetration |
| WO2010138814A2 (en) | 2009-05-29 | 2010-12-02 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Disrupting fcrn-albumin interactions |
| ES2548030T3 (es) | 2009-06-01 | 2015-10-13 | Medimmune, Llc | Moléculas con semividas prolongadas y usos de las mismas |
| KR101286721B1 (ko) | 2009-06-05 | 2013-07-16 | 한국과학기술연구원 | 폴리-시스테인 펩티드 융합 재조합 알부민 및 이의 제조방법 |
| TWI557224B (zh) | 2009-07-20 | 2016-11-11 | 國立成功大學 | 具αｖβ３整合蛋白選擇性且與人類血清白蛋白（ＨＳＡ）變體結合之多肽及其於醫藥上之用途 |
| US20120269765A1 (en) | 2009-07-24 | 2012-10-25 | Garcia K Christopher | Cytokine compositions and methods of use thereof |
| US9295729B2 (en) | 2009-08-10 | 2016-03-29 | Ucl Business Plc | Reversible covalent linkage of functional molecules |
| UY32920A (es) | 2009-10-02 | 2011-04-29 | Boehringer Ingelheim Int | Moleculas de unión biespecíficas para la terapia anti-angiogénesis |
| US20130064788A1 (en) | 2009-10-10 | 2013-03-14 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Il-17 family cytokine compositions and uses |
| CA2776241A1 (en) * | 2009-10-30 | 2011-05-05 | Novozymes Biopharma Dk A/S | Albumin variants |
| BR112012015188A8 (pt) | 2009-12-23 | 2016-08-09 | Univ Nat Cheng Kung | composição e método para o tratamento e/ou a prevenção de uma doença ocular relacionada à angiogênese |
| CN101875693B (zh) | 2010-01-22 | 2012-07-18 | 成都正能生物技术有限责任公司 | 具备抗血管生成活性的白蛋白变异体及其制备方法 |
| WO2011103076A1 (en) | 2010-02-16 | 2011-08-25 | Medlmmune, Llc | Hsa-related compositions and methods of use |
| WO2011124718A1 (en) | 2010-04-09 | 2011-10-13 | Novozymes A/S | Albumin derivatives and variants |
| ES2674567T3 (es) | 2010-05-21 | 2018-07-02 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Proteínas de fusión biespecíficas |
| WO2011161127A1 (en) | 2010-06-21 | 2011-12-29 | Medimmune, Llc | Protease variants of human neprilysin |
| WO2012020143A1 (en) | 2010-08-13 | 2012-02-16 | Glaxo Group Limited | Improved anti-serum albumin binding variants |
| EP2635598A1 (en) | 2010-11-01 | 2013-09-11 | Novozymes Biopharma DK A/S | Albumin variants |
| US9045564B2 (en) | 2011-02-15 | 2015-06-02 | Medimmune, Llc | HSA-related compositions and methods of use |
| KR20140012094A (ko) | 2011-02-15 | 2014-01-29 | 메디뮨 엘엘씨 | Hsa 관련 조성물 및 사용 방법 |
| CA2830660A1 (en) * | 2011-05-05 | 2012-11-08 | Novozymes Biopharma Dk A/S | Albumin variants |
| KR20140053991A (ko) | 2011-07-18 | 2014-05-08 | 아츠 바이올로직스 에이/에스 | 장기간 작용하는 황체 형성 호르몬 (ｌｈ) 화합물 |
| EP2780364A2 (en) | 2011-11-18 | 2014-09-24 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Proteins with improved half-life and other properties |
| EP3330283A3 (en) | 2012-03-16 | 2018-07-11 | Albumedix A/S | Albumin variants |
| WO2014005596A1 (en) | 2012-07-03 | 2014-01-09 | Aarhus Universitet | Modified payload molecules and their interactions and uses |
| EP2917233A1 (en) | 2012-11-08 | 2015-09-16 | Novozymes Biopharma DK A/S | Albumin variants |
| WO2014125082A1 (en) | 2013-02-16 | 2014-08-21 | Novozymes Biopharma Dk A/S | Pharmacokinetic animal model |
| WO2014179657A1 (en) | 2013-05-03 | 2014-11-06 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Albumin variants binding to fcrn |
| EP3044232A1 (en) | 2013-09-13 | 2016-07-20 | Novozymes Biopharma DK A/S | Albumin variants |
| CA2928700C (en) * | 2013-11-01 | 2019-01-15 | University Of Oslo | Albumin variants and uses thereof |
| WO2017029407A1 (en) | 2015-08-20 | 2017-02-23 | Albumedix A/S | Albumin variants and conjugates |
-
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