JP5959201B2 - 化学的に反応性の非天然アミノ酸を使用するキャリア−ペプチド接合体の製造 - Google Patents

化学的に反応性の非天然アミノ酸を使用するキャリア−ペプチド接合体の製造 Download PDF

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Description

関連出願とのクロスリファレンス
本出願は、「ＩＮ ＶＩＶＯ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＩＮ ＴＨＥ ＭＥＴＨＹＬＯＴＲＯＰＨＩＣ ＹＥＡＳＴ ＰＩＣＨＩＡ ＰＡＳＴＯＲＩＳ」と題するＴｒａｖｉｓ Ｙｏｕｎｇらによる特許文献１；「ＩＮ ＶＩＶＯ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＩＮ ＴＨＥ ＭＥＴＨＹＬＯＴＲＯＰＨＩＣ ＹＥＡＳＴ ＰＩＣＨＩＡ ＰＡＳＴＯＲＩＳ」と題するＴｒａｖｉｓ Ｙｏｕｎｇらによる特許文献２；及び「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｒｒｉｅｒ−Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ」と題するＴｒａｖｉｓ Ｙｏｕｎｇらによる特許文献３の優先権及び利益を主張する；これらの内容は、その全体が参照により本明細書に加入される。
連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述
本発明は、エネルギー省材料科学部からの助成番号ＤＥ−ＦＧ０３−００ＥＲ４６０５１として政府助成下に行われた。米国政府は本発明に所定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、タンパク質化学の分野に関する。キャリアポリペプチド変異体中に組み入れられた第一の非天然アミノ酸を、標的ポリペプチド変異体中に組み入れられた第二の非天然アミノ酸と反応させる、キャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を製造するための方法が本明細書において記載される。これらの方法により製造された組成物もまた記載される。
発明の背景
様々な制限が治療用途のペプチドの開発を妨げている。例えば、治療用ペプチドは一般的にインビボで低い安定性を示し、そしてしばしば、被験体へのそれらの投与後に化学的又は酵素的分解により、例えば数分から２〜３時間内に、すなわちいずれかの治療効果が達成され得る前に、急速に除去されてしまう。結果として、低いバイオアベイラビリティーは、活性を維持するためにかなり高い用量での、しばしば注射による頻繁なペプチドの投与を必要とし得る。このような高い用量は、望ましくない副作用をもたらし得る。さらに、治療用ペプチドの送達は、膜障壁（例えば腸及び血液脳関門）の選択的透過性により制限され得る。細胞へのそれらの送達を促進するため、それらの半減期を増加させるため、かつ／又はそれらの活性を維持するために、対象となるポリペプチド、例えば低分子治療用ポリペプチドを、キャリアポリペプチド（例えば、特定のリガンド又はリガンド群、例えば糖、ヌクレオシド、塩、アミノ酸、脂肪酸又は他の分子に対して高い親和性を有し得る種々のポリペプチドのいずれか）と共有結合でカップリングすることができる。キャリアポリペプチドは典型的に、細胞外液中で（例えば血液中で）又は細胞膜を横切る、例えば細胞内区画へのこのようなリガンドの輸送を容易にする。従って、キャリアタンパク質は有利に、共有結合で連結された標的ポリペプチドの細胞への送達を促進し、それらの毒性を低減し、かつ／またはキャリア−標的接合体の被験体への投与後にそれらの安定性及び／若しくは活性を延長することができる。
低分子ペプチドをキャリアポリペプチドに化学的にカップリングするための現在の方法は、非特異的試薬、例えばグルタルアルデヒド又はカルボジイミド活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの使用から、キャリアポリペプチド−キャリアポリペプチド又は標的−ポリペプチド−標的ポリペプチド接合体の形成を回避することができる高度に特異的なヘテロ二官能化架橋剤にまで及ぶ。しかし、このような試薬は限られた数のアミノ酸残基（例えばアミン、ケト、チオール、スルフヒドリル又はカルボキシル基）を含むアミノ酸を修飾するためにしか使用することができない。このような架橋剤を使用してキャリアポリペプチドを標的ポリペプチドに接合することにより、キャリアポリペプチド、標的ポリペプチド又は得られるキャリア−標的ポリペプチド接合体のコンホメーションが乱され、それにより接合体の安定性、生物学的活性、薬物動態活性などが減少し得る。これらの架橋試薬を利用するカップリング反応は、キャリア−ポリペプチド−標的ポリペプチド接合体の不均質集団を生じ、製造効率を減少させ、かつ品質管理を複雑化し得る。
米国特許出願第１２／３１６，３７０号（２００８年１２月１０日出願） 国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１３５６８号（２００８年１２月１０日出願） 米国仮特許出願第６１／２０８，１４１号（２００９年２月２０日出願）
キャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体の均質集団の、効率的で費用効果的で大規模な製造のための方法及び組成物が当該分野で必要とされている。以下の開示を検討すると明らかなように、本発明は、これら及び他の必要物を提供する。
発明の要旨
本発明は、増加したバイオアベイラビリティー、薬理活性、生物学的活性、半減期及び／又は免疫原性を示し得るキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を製造するための方法及び組成物を提供する。本発明は、第一及び第二の非天然アミノ酸のそれぞれキャリアポリペプチド及び標的ポリペプチド中への直接組み入れを利用する。次いでキャリア及び標的ポリペプチド変異体中に存在する第一及び第二の非天然アミノ酸を反応させて本発明の接合体を生じ得る。このような接合体は治療的又は医薬用途を見出し得、そしてこれらは複雑な翻訳後修飾を含む生物学的に活性な異種タンパク質を製造し得る低コストの発現系において有利に製造することができる。
一局面において、本発明はキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を製造する方法を提供する。この方法は、キャリアポリペプチドの合成又は翻訳の間に第一の非天然アミノ酸残基をキャリアポリペプチド中に組み入れること、標的ポリペプチドの合成又は翻訳の間に第二の非天然アミノ酸残基を標的ポリペプチド中に組み入れること、及び第一の残基と第二の残基とを反応させて、キャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を生成することを含む。第一及び第二の非天然アミノ酸を、以下のうち１つ又はそれ以上により場合により反応させ得る：求電子剤−求核剤反応、求核剤とケトンの反応、オキシム連結反応、求核剤とアルデヒドの反応、カルボニル基と求核剤との間の反応、スルホニル基と求核剤との間の反応、エステル化反応、立体障害エステル基と求核剤との間の反応、チオエステル基と求核剤との間の反応、安定イミン基と求核剤との間の反応、エポキシド基と求核剤との間の反応、アジリジン基と求核剤との間の反応、求電子剤と脂肪族若しくは芳香族アミンとの間の反応、求電子剤とヒドラジドとの間の反応、求電子剤とカルボヒドラジドとの間の反応、求電子剤とセミカルバジドとの間の反応、求電子剤とチオセミカルバジドとの間の反応、求電子剤とカルボニルヒドラジドとの間の反応、求電子剤とチオカルボニルヒドラジドとの間の反応、求電子剤とスルホニルヒドラジドとの間の反応、求電子剤とカルバジドとの間の反応、求電子剤とチオカルバジドとの間の反応、求電子剤とヒドロキシルアミンとの間の反応、ヒドロキシル若しくはジオールのような一つ若しくは複数の求核剤とボロン酸若しくはエステルとの間の反応、遷移金属触媒反応、パラジウム触媒反応、銅触媒ヘテロ原子アルキル化反応、付加環化反応、１，３付加環化反応、２，３付加環化反応、アルキン−アジド反応、ディールズアルダー（Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ）反応、又はスズキカップリング反応。好ましい実施態様において、接合体が生成される反応は、５０％より高い、７０％より高い、又は９０％より高い効率で場合により進行する。
第一の非天然アミノ酸を翻訳の間にキャリアポリペプチド中に組み入れることは、第一の非天然アミノ酸、直交性ｔＲＮＡ−合成酵素（Ｏ−ＲＳ）、Ｏ−ＲＳにより第一の非天然アミノ酸で特異的にアミノアシル化される直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、及びキャリアペプチドをコードする核酸［ここで該核酸はＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む］を含む翻訳系を備えること；ならびに核酸を翻訳し、それにより翻訳の間に第一の非天然アミノ酸をキャリアポリペプチド中に組み入れることを場合により含み得る。
場合により、キャリアポリペプチド（又は標的ポリペプチド）は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）細胞、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）細胞、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属細胞、又はトルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）細胞において翻訳の間に産生され得る。
本方法の特定の実施態様において、第一の非天然アミノ酸をキャリアポリペプチド中に組み入れることにより、第一の非天然アミノ酸を含むＨＳＡ変異体、例えば、ｐ−アセチルフェニルアラニンを含むＨＳＡ変異体が生じる。場合により、第一の非天然アミノ酸は、翻訳の間にＨＳＡ変異体中に組み入れられ得る。例えば、第一の非天然アミノ酸は、場合によりＨＳＡ変異体中にアミノ酸位置３７において組み入れられ得、ここでアミノ酸位置の番号は、配列番号１のアミノ酸位置と比較したものである。しかし、第一の非天然アミノ酸が組み込まれるキャリアポリペプチドは場合により、様々なポリペプチドのいずれかであっても、これらに対して相同であってもよく、これらのポリペプチドとしては、限定されないが、例えば抗体（例えばＯＫＴ３抗体、ＨＥＲ２抗体など）、抗体フラグメント（例えば、Ｆｃ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）、アルブミン、血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、ｃ反応性タンパク質、コンアルブミン、ラクトアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、イオンキャリアタンパク質、アシルキャリアタンパク質、シグナル伝達アダプタータンパク質、アンドロゲン結合タンパク質、カルシウム結合タンパク質、カルモジュリン結合タンパク質、セルロプラスミン、コレステロールエステル輸送タンパク質、ｆボックスタンパク質、脂肪酸結合タンパク質、フォリスタチン、フォリスタチン関連タンパク質、ＧＴＰ結合タンパク質、インスリン様増殖因子結合タンパク質、鉄結合タンパク質、潜在型ＴＧＦベータ結合タンパク質、集光性タンパク質複合体、リンパ球抗原、膜輸送タンパク質、ニューロフィジン、周辺質結合タンパク質、リン酸結合タンパク質、ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質、リン脂質輸送タンパク質、レチノール結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ｓ期キナーゼ関連タンパク質、性ホルモン結合グロブリン、チロキシン結合タンパク質、トランスコバラミン、トランスコルチン、トランスフェリン結合タンパク質、及び／又はビタミンＤ結合タンパク質が挙げられる。
本発明の特定の実施態様において、第二の非天然アミノ酸を標的ポリペプチド中に組み入れることにより、第二の非天然アミノ酸を含むＴＳＰ−１変異体、例えばε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンを含むＴＳＰ−１変異体が生じる。ε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンは場合により、ＴＳＰ−１変異体中にアミノ酸位置６において、又はアミノ酸位置１において組み入れられ得、ここでアミノ酸位置の番号は配列番号２のアミノ酸位置と比較したものである。本方法の他の実施態様において、第二の非天然アミノ酸を標的ポリペプチド中に組み入れることにより、第二の非天然アミノ酸を含むＡＢＴ−５１０変異体、例えばε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンを含むＡＢＴ−５１０変異体が生じる。ε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンは場合により、ＡＢＴ−５１０変異体中にアミノ酸位置６において、又はアミノ酸位置１において組み入れられ、ここでアミノ酸位置の番号は配列番号３のアミノ酸位置と比較したものである。場合により、ε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンは、合成の間にＴＳＰ−１変異体又はＡＢＴ−５１０変異体中に組み入れられる。しかし、第二の非天然アミノ酸が組み入れられる標的ポリペプチドは場合により、例えばＴＳＰ−１、ＡＢＴ−５１０、グルカゴン（ｇｌｕｇａｃｏｎ）様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）、アンジオスタチン、エキセンディン（Ｅｘｅｄｉｎ）−４、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球走化性タンパク質−１、単球走化性タンパク質−２、単球走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０リガンド、補体阻害剤、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯΥ、ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β、ＭＣＰ−１、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、表皮剥脱毒素、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ２１、Ｇ−ＣＳＦ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヒルジン、ＬＦＡ−１、ヒトインスリン、ヒトインスリン様増殖因子（ｈＩＧＦ）、ｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩ、ヒトインターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、白血病抑制因子、ニュールツリン、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロフィン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｎ）、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、レラキシン、ソマトスタチン、スーパーオキシドジムスターゼ、チモシンアルファ１、ヒト腫瘍壊死因子（ｈＴＮＦ）、ヒト腫瘍壊死因子アルファ、ヒト腫瘍壊死因子ベータ、Ｒａｓ、Ｔａｔ、炎症性分子、シグナル伝達分子、ウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）、及び／又はＢＰ３２０抗原であるか、又はこれらに対して相同であり、ここで標的ポリペプチドは第二の非天然アミノ酸を含む。当然のことながら、前記リストは本明細書における実施態様を限定することを意図されない。
例えば、上記の方法を使用して、ｐ−アセチルフェニルアラニンを翻訳の間にＨＳＡ変異体中にアミノ酸位置３７において組み入れることができ、ここでＨＳＡにおけるアミノ酸位置の番号は配列番号１に対してであり、ε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンを、合成の間にＴＳＰ−１変異体中にアミノ酸位置６において組み入れることができ、ここでＴＳＰ−１におけるアミノ酸位置の番号は配列番号２に対してであり、そしてｐ−アセチルフェニルアラニン及びε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンをオキシム連結反応を介して反応させてＨＳＡ−ＴＳＰ−１接合体を生成させることができる。場合により、上記の方法を使用して、ｐ−アセチルフェニルアラニンを翻訳の間にＨＳＡ変異体中にアミノ酸位置３７において組み入れることができ、ここでＨＳＡにおけるアミノ酸位置の番号は配列番号１に対してであり、ε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンを合成の間にＡＢＴ−５１０変異体中にアミノ酸位置６において組み入れることができ、ここでＡＢＴ−５１０におけるアミノ酸位置の番号は配列番号３に対してであり、そしてｐ−アセチルフェニルアラニン及びε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンをオキシム連結反応を介して反応させてＨＳＡ−ＡＢＴ−５１０接合体を生成させることができる。
関連する局面において、本発明は、上記の方法により製造されたキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を提供する。場合により、本発明のキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体は、標的ポリペプチドよりも長い血清半減期を示す。本発明の接合体は、上記のキャリアポリペプチドのいずれか１つ又はそれ以上、及び上記の標的ポリペプチドのいずれか１つ又はそれ以上を場合により含み得る。しかし、当然のことながら、本発明の接合体は、上記のキャリアポリペプチド及び標的ポリペプチドを含むものに限定されない。
接合体は、少なくとも第一の非天然アミノ酸を含むＨＳＡ変異体であるキャリアポリペプチド及び第二の非天然アミノ酸を含むＴＳＰ−１変異体又はＡＢＴ−５１０変異体である標的ポリペプチドを場合により含み得る。第一の非天然アミノ酸は、場合により、例えば翻訳の間に、例えばＨＳＡ変異体中にアミノ酸位置３７において組み入れられたｐ−アセチルフェニルアラニンであり得、ここでアミノ酸位置の番号は配列番号１のアミノ酸位置と比較したものである。第二の非天然アミノ酸は場合により、例えば合成の間に、例えばＴＳＰ−１変異体中のアミノ酸位置６に組み入れられたε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンであり得、ここでアミノ酸位置の番号は配列番号２のアミノ酸位置と比較したものである。第二の非天然アミノ酸は場合により、例えば合成の間に、例えばＡＢＴ−５１０変異体のアミノ酸位置６に組み入れられたε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンであり得、ここでアミノ酸位置の番号は配列番号３のアミノ酸位置と比較したものである。
例えば、本発明の接合体は、ｐ−アセチルフェニルアラニンをアミノ酸位置３７に含むＨＳＡ変異体であるキャリアポリペプチド［ここでアミノ酸位置の番号は配列番号１のアミノ酸位置と比較したものである］、及びε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンをアミノ酸位置６に含むＴＳＰ−１変異体である標的ポリペプチド［ここでアミノ酸位置の番号は配列番号２のアミノ酸位置と比較したものである］を含み得る。あるいは、本発明の接合体は、ｐ−アセチルフェニルアラニンをアミノ酸位置３７に含むＨＳＡ変異体であるキャリアポリペプチド［ここでアミノ酸位置の番号は配列番号１のアミノ酸位置と比較したものである］、及びε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンをアミノ酸位置６に含むＡＢＴ−５１０変異体である標的ポリペプチド［ここでアミノ酸位置の番号は配列番号３のアミノ酸位置と比較したものである］を含み得る。これらの実施態様において、接合体はｐ−アセチルフェニルアラニン及びε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンをオキシム連結を介して反応させることにより生成させる。
関連して、本発明は、第一の非天然アミノ酸残基を含むキャリアポリペプチドドメイン、及び第二のアミノ酸残基を含む標的ポリペプチドドメインを含むキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を提供し、ここでキャリアポリペプチドドメイン及び標的ポリペプチドドメインは、第一の非天然アミノ酸残基及び第二の非天然アミノ酸残基を通して接合されている。本接合体のキャリアポリペプチドドメインは、本明細書に記載されるキャリアポリペプチドのいずれかを場合により含み得、そして本接合体の標的ポリペプチドは、本明細書に記載される標的ポリペプチド変異体のいずれか１つ（又はそれ以上）を場合により含み得る。
特定の実施態様において、キャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体のキャリアポリペプチドドメインはＨＳＡを含み、第一の非天然アミノ酸残基はｐ−アセチルフェニルアラニンであり、標的ポリペプチドドメインはＴＳＰ−１を含み、そして第二の非天然アミノ酸残基はε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンである。他の実施態様において、キャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体のキャリアポリペプチドドメインはＨＳＡを含み、第一の非天然アミノ酸残基はｐ−アセチルフェニルアラニンであり、標的ポリペプチドドメインはＡＢＴ−５１０を含み、そして第二の非天然アミノ酸残基はε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンである。場合により、第一の非天然アミノ酸残基は、メチロトローフ酵母細胞、例えばカンジダ属細胞、ハンゼヌラ属細胞、ピキア属細胞、又はトルロプシス属細胞において翻訳の間にキャリアポリペプチドドメイン中に組み入れられる。キャリアポリペプチド及び標的ポリペプチドは場合により、第一の非天然アミノ酸及び第二の非天然アミノ酸を本明細書に記載される反応のいずれか１つ又はそれ以上で反応させることにより共有結合でカップリングされ得る。
本明細書に記載されるキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を含む細胞もまた本発明により提供される。例えば、このような細胞は、接合体のキャリアポリペプチドドメインが、第一の非天然アミノ酸（例えばｐ−アセチルフェニルアラニン）を含むＨＳＡ変異体を含む、ポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を場合により含み得る。本発明の細胞は、接合体の標的ポリペプチドドメインが、第二の非天然アミノ酸（例えばε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジン）を含むＴＳＰ−１変異体を含む、ポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）得る。他の実施態様において、本発明の細胞は、接合体の標的ポリペプチドドメインが、第二の非天然アミノ酸（例えばε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジン）を含むＡＢＴ−５１０変異体を含む、ポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）得る。
キットもまた本発明の特徴である。例えばキットは、本発明により提供されるいずれかの１つ又はそれ以上の組成物を場合により含み得る。あるいは、またさらに、キットは、第一の化学的に反応性の非天然アミノ酸を含むキャリアポリペプチド及び／又は第二の化学的に反応性の非天然アミノ酸を含む標的ポリペプチド（例えば低分子治療用ペプチド）の合成のための試薬を含み得る。このような試薬には、例えば、反応性非天然アミノ酸、宿主細胞、例えば非天然アミノ酸を含むキャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチドの産生に適した直交性翻訳系構成要素を含むメチロトローフ酵母細胞、本発明の接合体を生成する連結反応を行うための溶媒、本発明の１つ又はそれ以上の接合体を含む治療用製剤を製造するための試薬、培地などが含まれ得る。本発明のキットは、例えば、非天然アミノ酸を含むキャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチドを発現することができるメチロトローフ酵母菌株を構築するため、化学的連結反応を行ってキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を生成するためなどの指示書のようなさらなる構成要素を含み得る。キットは、キット構成要素を保持するための容器、本明細書中のいずれかの方法又は方法のいずれかの組み合わせを実施するための教材、キットで提供される細胞（例えばメチロトローフ酵母細胞）を例えば化学的に反応性の非天然アミノ酸を選択されたアミノ酸位置に含む対象となるキャリア及び／又は標的ポリペプチドを産生するように使用するための指示書を含み得る。
当業者には当然のことながら、本発明により提供される方法、キット及び組成物は、単独で使用しても組み合わせて使用してもよい。例えば、本発明の方法を使用して、本発明のキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を製造することができる。当業者は本明細書において示される本発明の特徴のさらなる組み合わせを理解するだろう。
定義
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定の生物系に限定されず、当然のことながら変更し得るということが理解されるべきである。また当然のことながら、本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を記載する目的のみであり、限定することを意図されない。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容が明確に別のことを示していなければ複数の指示対象を含む。従って例えば、「アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＲＳ）」への言及は２つ又はそれ以上のＲＳ分子の組み合わせを場合により含み；「キャリアポリペプチド」又は「メチロトローフ酵母細胞」への言及は、実際的には複数のそのキャリアポリペプチド又は多くのメチロトローフ酵母細胞を場合により含む。
別の定義がなければ、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似か又は等しいいずれの方法及び材料も本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい材料及び方法は本明細書に記載される。本発明を記載し特許請求する際に、以下の用語は以下に述べる定義にしたがって使用される。
キャリアポリペプチド：用語「キャリアポリペプチド」は、例えば本明細書において提供される方法を使用して標的ポリペプチドに接合することができる種々のポリペプチドのいずれか１つを指す。キャリアポリペプチドは、例えば共有結合で連結された標的ポリペプチドの細胞への送達を促進するため、それらの毒性を減少させるため、かつ／又は、キャリア−標的接合体を被験体に投与した後のそれらの安定性及び／若しくは活性を延長するために有利に使用することができる。キャリアタンパク質の好ましい特徴には、高い溶解度及び長い半減期が含まれ得るが；キャリアポリペプチドがいずれかの特定の生物学的活性を有するか有していないかによって限定されることは意図されない。一般的に使用されるキャリアタンパク質としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；６６ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；６７ｋＤａ）、抗体フラグメント、例えばＦｃ（４５ｋＤａ）、及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；４．５ｘ１０5−１．３ｘ１０7Ｄａ）が挙げられる。以下に記載される１つの有用な実施例では、共有結合で治療用ペプチドＡＢＴ−５１０をキャリアポリペプチドＨＳＡに連結することにより、ペプチドの血清半減期を増加させることができる。
キャリアポリペプチドは、場合により、例えば非天然アミノ酸を含有することにより改変された、上記ポリペプチドの改変されたバージョンであってもよい。非天然アミノ酸が組み入れられているキャリアポリペプチドは、本明細書において「キャリアポリペプチド変異体」と呼ばれる。
同族：用語「同族」は、共に機能するか、又は互いに対して特異性の特性を有する構成要素を指し、例えば直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び直交性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）であり、ここでＯ−ＲＳは非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを特異的にアミノアシル化する。
から誘導される：本明細書で使用される、用語「から誘導される」は、特定の分子若しくは生物から単離されるか、特定の分子若しくは生物又は特定の分子若しくは生物からの配列情報を使用して作製される構成要素を指す。例えば、第二のポリペプチドから誘導されたポリペプチドは、第二のポリペプチドと同一か又は実質的に類似のアミノ酸配列を含み得る。ポリペプチドの場合、誘導された種は、例えば天然に存在する変異原性、人工的に指向された変異原性、又は人工的な無作為の変異原性により得ることができる。ポリペプチドを誘導するために使用される変異原性は、意図的に指向されるか若しくは意図的に無作為であるか、又は各々の混合であり得る。最初のものから誘導された異なるポリペプチドを作製するためのポリペプチドの変異原性は、例えばポリメラーゼの非忠実性（ｉｎｆｉｄｅｌｉｔｙ）により引き起こされる無作為な事象であり得、そして誘導されたポリペプチドの同定は、例えば本明細書に引用される参考文献において考察されるような適切なスクリーニング方法により行われ得る。ポリペプチドの変異原性は、典型的にはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの操作を必要とする。
コードする：本明細書で使用される、用語「コードする」は、第一の分子又は配列とは異なる第二の分子又は配列の産生を方向付けるためにポリマー高分子又は配列中の情報を使用するいずれかのプロセスを指す。本明細書で使用される場合、この用語は広範に使用され、様々な適用を有し得る。いくつかの局面において、用語「コードする」は、半保存的ＤＮＡ複製のプロセスを記載し、ここで二本鎖ＤＮＡ分子の１つの鎖が、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより新しく合成される相補姉妹染色分体（ｓｉｓｔｅｒ ｓｔｒａｎｄ）をコードするテンプレートとして使用される。別の局面において、用語「コードする」は、それにより１つの分子における情報が、第一の分子と異なる化学的性質を有する第二の分子の産生を方向づけるために使用されるいずれかのプロセスを指す。例えば、ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を組み込んだ転写プロセスによりＲＮＡ分子をコードし得る。また、ＲＮＡ分子は翻訳プロセスのようにポリペプチドをコードし得る。翻訳プロセスを記載するために使用される場合、用語「コードする」はまた、アミノ酸をコードするトリプレットコドンにまで及ぶ。いくつかの局面において、ＲＮＡ分子は、例えばＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを組み込んだ逆転写プロセスにより、ＤＮＡ分子をコードし得る。別の局面において、ＤＮＡ分子はポリペプチドをコードし得、その場合に使用される「コードする」は、転写及び翻訳の両方のプロセスを組み込むと理解される。
非天然アミノ酸を組み入れること：本明細書で使用される、例えばキャリア又は標的ポリペプチド中に「非天然アミノ酸を組み入れること」は、キャリア又は標的ポリペプチドの一次構築（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）の間に、例えば翻訳又は化学合成により、伸長するポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を直接加えることを指す。
に応じて：本明細書で使用される用語「に応じて」は、本発明のＯ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、そして伸長するポリペプチド鎖中への非天然アミノ酸（ｔＲＮＡに結合している）の組み入れを媒介するプロセスを指す。
非真核生物：本明細書で使用される用語「非真核生物」は、モネラ界に属する生物（原核生物（Ｐｒｏｋａｒｙａ）とも呼ばれる）を指す。非真核生物、例えば原核生物は、一般的に、それらの単細胞構成、出芽又は分裂による無性生殖、膜結合核又は他の膜結合小器官の欠如、環状染色体、オペロンの存在、イントロン、メッセージキャップ及びポリ−Ａ ｍＲＮＡが存在しないこと、並びに他の生化学的特性（例えば特徴的なリボソーム構造）によって真核生物と区別できる。原核生物には、真正細菌及び古細菌亜界（「古細菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）」と呼ばれることもある）が含まれる。シアノバクテリア（ラン藻類）及びマイコプラズマは、モネラ界下で別に分類されることもある。いずれにせよ、真正細菌、古細菌、シアノバクテリア、及びマイコプラズマは、全て非真核生物であると理解される。
直交性：本明細書で使用される用語「直交性」は、細胞若しくは翻訳系に対して内因性の対応する分子と比較して減少した効率で細胞の内因性構成要素と共に機能するか、または細胞の内因性構成要素と共に機能しない分子、例えば直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ））を指す。ｔＲＮＡ及びアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の文脈において、直交性は、直交性ｔＲＮＡが内因性ｔＲＮＡ合成酵素と共に機能できないか、若しくは内因性ｔＲＮＡ合成酵素と機能する内因性ｔＲＮＡと比較して減少した効率、例えば２０％未満の効率、１０％未満の効率、５％未満の効率、若しくは１％未満の効率で機能するか、又は直交性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が内因性ｔＲＮＡ共に機能できないか、若しくは内因性ｔＲＮＡ共に機能する内因性ｔＲＮＡ合成酵素と比較して減少した効率、例えば２０％未満の効率、１０％未満の効率、５％未満の効率、若しくは１％未満の効率で機能することを指す。直交性分子には、細胞中の機能的に正常な内因性相補的分子がない。例えば、細胞中の直交性ｔＲＮＡは、内因性ＲＳによる内因性ｔＲＮＡのアミノアシル化と比較した場合に減少した効率で又はゼロの効率で細胞のいずれかの内因性ＲＳによりアミノアシル化される。別の例では、直交性ＲＳは対象となる細胞の内因性ｔＲＮＡを、内因性ＲＳによる内因性ｔＲＮＡのアミノアシル化と比較して、減少した効率又はゼロの効率でアシル化する。第一の直交性分子と共に機能する第二の直交性分子が細胞中に導入され得る。例えば、直交性ｔＲＮＡ／ＲＳ対は、細胞中で共に機能する導入された相補的構成要素を含み、これはコントロール、例えば対応するｔＲＮＡ／ＲＳ内因性対又は活性直交性対の効率と比較して、例えば、効率４５％、効率５０％、効率６０％、効率７０％、効率７５％、効率８０％、効率９０％、効率９５％、若しくは効率９９％又はそれ以上の効率で機能する。
直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素：本明細書において使用される、直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）は、対象となる翻訳系においてアミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する酵素である。Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡ上に負荷するアミノ酸は、天然でも非天然でも人口でも、いずれのアミノ酸でもよく、本明細書では限定されない。合成酵素は、場合により天然に存在するチロシルアミノ酸合成酵素と同じか若しくは相同であり、又はＯ−ＲＳとして設計された合成酵素と同じか若しくは相同である。
直交性ｔＲＮＡ：本明細書で使用される直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）は、対象となる翻訳系に対して直交性であるｔＲＮＡであり、ここでｔＲＮＡは、例えば、（１）天然に存在するｔＲＮＡと同一であるか若しくは実質的に類似であり、（２）天然に存在するｔＲＮＡから天然若しくは人工の変異誘発により誘導され、（３）（１）若しくは（２）の野生型若しくは変異ｔＲＮＡ配列の配列を考慮に入れるいずれかのプロセスにより誘導され、（４）野生型若しくは変異ｔＲＮＡに対して相同であり；（５）直交性ｔＲＮＡ合成酵素の基質として設計されるいずれかの例のｔＲＮＡに対して相同であるか、又は（６）直交性ｔＲＮＡ合成酵素の基質として設計されるいずれかの例のｔＲＮＡの保存的変異体である。Ｏ−ｔＲＮＡは、アミノ酸をチャージされて（ｃｈａｒｇｅｄ）又はチャージされていない状態で存在し得る。また当然のことながら、「Ｏ−ｔＲＮＡ」は場合により、同族合成酵素により非天然アミノ酸をチャージされる（アミノアシル化される）。実際に、当然のことながら、本発明のＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンに応じて、翻訳の間に伸長するポリペプチド中に本質的に任意の非天然アミノ酸を挿入するために有利に使用される。
ポリペプチド：ポリペプチドは、アミノ酸残基（天然若しくは非天然、又はそれらの組み合わせ）の、限定的ではないが典型的にはペプチド共有結合により結合された、任意の長さのオリゴマーである。ポリペプチドは、いずれの供給源由来であってもよく、例えば天然に存在するポリペプチド、組み換え分子遺伝子工学により製造されたポリペプチド、細胞若しくは翻訳系由来のポリペプチド、又は無細胞合成手段により製造されたポリペプチドである。ポリペプチドは、そのアミノ酸配列、例えばその構成アミノ酸残基の一次構造により特徴づけられる。本明細書で使用される場合、ポリペプチドのアミノ酸配列は全長配列に限定されないが、部分的でも完全な配列でもよい。さらに、ポリペプチドがいずれかの特定の生物学的活性を有するか有していないかにより限定されることは意図されない。本明細書で使用される用語「タンパク質」はポリペプチドと同義である。用語「ペプチド」は、低分子ポリペプチド（例えば限定されないが、２〜２５個のアミノ酸長）を指す。
優先的にアミノアシル化する：直交性翻訳系に関連して本明細書で使用される場合、Ｏ−ＲＳは、発現系においていずれかの内因性ｔＲＮＡにチャージするよりも効率的にＯ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡにアミノ酸をチャージする場合に、同族Ｏ−ｔＲＮＡを「優先的にアミノアシル化する」。すなわち、Ｏ−ｔＲＮＡ及びいずれかの所定の内因性ｔＲＮＡが翻訳系にほぼ等しいモル比で存在する場合に、Ｏ−ＲＳは、内因性ｔＲＮＡにチャージするよりも頻繁にＯ−ｔＲＮＡにチャージする。好ましくは、Ｏ−ＲＳによりチャージされた内因性ｔＲＮＡに対する、Ｏ−ＲＳによりチャージされたＯ−ｔＲＮＡの相対比は高く、好ましくはＯ−ｔＲＮＡ及び内因性ｔＲＮＡが翻訳系に等モル濃度で存在する場合に、結果としてＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡのみをチャージするか、ほとんどＯ−ｔＲＮＡのみをチャージする。Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合のＯ−ＲＳによりチャージされるＯ−ｔＲＮＡと内因性ｔＲＮＡとの間の相対比は、１：１より高く、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、なおより好ましくは１０：１、さらにより好ましくは２０：１、なおより好ましくは５０：１、さらにより好ましくは７５：１、なおより好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
（ａ）内因性ｔＲＮＡと比較して、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する場合、及び（ｂ）Ｏ−ＲＳによるＯ−ｔＲＮＡのいずれかの天然アミノ酸でのアミノアシル化と比較して、そのアミノアシル化が非天然アミノ酸に特異的である場合に、Ｏ−ＲＳは「Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する」。すなわち、非天然及び天然のアミノ酸がＯ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡを含む翻訳系に等モル量で存在する場合に、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに非天然アミノ酸を、天然アミノ酸よりも頻繁に負荷する。好ましくは、天然アミノ酸でチャージされたＯ−ｔＲＮＡに対する、非天然アミノ酸でチャージされたＯ−ｔＲＮＡの相対比は高い。より好ましくは、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸のみでチャージするか、又はほとんど非天然アミノ酸のみでチャージする。天然アミノ酸及び非天然アミノ酸の両方が翻訳系に等モル濃度で存在する場合に、非天然アミノ酸でのＯ−ｔＲＮＡのチャージと天然アミノ酸でのＯ−ｔＲＮＡのチャージの間の相対比は、１：１より高く、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、なおより好ましくは１０：１、さらにより好ましくは２０：１、なおより好ましくは５０：１、さらにより好ましくは７５：１、なおより好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
セレクターコドン：用語「セレクターコドン」は、翻訳プロセスにおいてＯ−ｔＲＮＡに認識され、内因性ｔＲＮＡには認識されないコドンを指す。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループは、ｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そしてそのアミノ酸、例えば非天然アミノ酸をポリペプチドのこの部位に組み入れる。セレクターコドンには、例えば、ナンセンスコドン、例えば停止コドン、例えば、アンバー、オーカー、及びオパールコドン；４つ又はそれ以上の塩基のコドン；レアコドン；天然又は非天然の塩基対から誘導されるコドンなどが含まれ得る。
抑制作用：本明細書で使用される用語「抑制作用」は、一般的に、ｔＲＮＡ、例えばサプレッサｔＲＮＡが、コドン（例えばアンバーコドン又は４若しくはそれ以上の塩基コドンであるセレクターコドン）の翻訳読み過しを可能にする能力を指し、そうでなければ翻訳の終了又は誤訳、例えばフレームシフトを生じる。サプレッサｔＲＮＡの抑制作用は、第二のサプレッサｔＲＮＡと比較して、又はコントロール系、例えばＯ−ＲＳのないコントロール系と比較した場合に観察される翻訳読み過し作用のパーセントとして表され得る。
抑制効率は、当該分野で公知の多数のアッセイのうちいずれかにより決定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイが使用され得、例えば誘導体化されたｌａｃＺプラスミド（ここで構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンを有する）が、本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に適切な生物（例えば直交性構成要素が使用され得る生物）由来の細胞中に導入される。同族合成酵素もまた（ポリペプチドとして又は発現された場合に同族合成酵素をコードするポリヌクレオチドのいずれかとして）導入され得る。細胞を所望の密度、例えばＯＤ600約０．５まで培地中で増殖させて、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒTMβ−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを行う。抑制パーセントは、比較可能なコントロール、例えば誘導体化ｌａｃＺ構築物（ここで構築物はセレクターコドンよりもむしろ対応するセンスコドンを所望の位置に有する）と比較したサンプルについての活性パーセントとして計算することができる。
サプレッサｔＲＮＡ：サプレッサｔＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の所定の翻訳系における読み取りを、ポリペプチドの翻訳の間に典型的には停止コドンに応じてアミノ酸の取り込みを可能にすることにより変更する（すなわち「読み過す」）ｔＲＮＡである。いくつかの局面において、本発明のセレクターコドンはサプレッサコドン、例えば停止コドン、例えばアンバー、オーカー又はオパールコドン、四塩基コドン、レアコドンなどである。
標的ポリペプチド：用語「標的ポリペプチド」は、例えばそのバイオアベイラビリティー、薬理活性、生物学的活性、半減期、免疫原性などが、キャリアポリペプチドに共有結合で連結された場合に維持されるか又は改善される、対象となるポリペプチドを指す。標的ポリペプチドは場合により、治療用低分子ペプチド、例えば、ＴＳＰ−１又はＡＢＴ−５１０であり得る。あるいは、またさらに、標的ポリペプチドは外来生物、自己タンパク質（ｓｅｌｆ−ｐｒｏｔｅｉｎ）、又は合成ポリペプチドから誘導される、免疫原性であり得る。標的ポリペプチドがいずれかの生物学的活性を有するか有していないかで限定されることは意図されない。本発明で使用され得る治療用低分子ペプチドの例としては、例えば、ＴＳＰ−１ポリペプチド又はその誘導体、ＡＢＴ−５１０、グルカゴン（ｇｌｕｇａｃｏｎ）様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、エキセンディン（Ｅｘｅｄｉｎ）−４、及び例えば本明細書において示されるような多数の他のものが挙げられる。
標的ポリペプチドは場合により、例えば非天然アミノ酸を含むことにより改変されたようなポリペプチドの改変バージョンであり得る。非天然アミノ酸が組み入れられている標的ポリペプチドは、本明細書において「標的ポリペプチド変異体」と呼ばれる。
翻訳系：用語「翻訳系」は、アミノ酸を伸長するポリペプチド鎖（タンパク質）中に組み入れる構成要素を指す。翻訳系の構成要素には、例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、合成酵素、ｍＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡなどが含まれ得る。
非天然アミノ酸：本明細書で使用される用語「非天然アミノ酸」は、２０の一般的な天然に存在するアミノ酸でも稀な天然に存在するアミノ酸（例えばセレノシステイン又はピロールリジン）でもない、いずれかのアミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体を指す。
変異体：本明細書で使用される用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」は、少なくとも１つの化学的に反応性の非天然アミノ酸を含み、かつ典型的には非天然アミノ酸を含まない対応する「天然」ポリペプチドから誘導されたポリペプチドを指す。例えば、キャリアポリペプチド変異体（又は標的ポリペプチド変異体）は、その変異体が化学的に反応性の非天然アミノ酸を含む、「天然」キャリアポリペプチド（又は「天然」標的ポリペプチド）の変異体（ｍｕｔａｎｔ）である。キャリアポリペプチド変異体及び／又は標的ポリペプチド変異体中の化学的に反応性の非天然アミノ酸は場合により、キャリア及び／又は標的ポリペプチドの一次配列において天然アミノ酸を置き換えてもよい。あるいは、又はさらに、１つ（又はそれ以上）の非天然アミノ酸を、キャリア又は標的ポリペプチドの一次配列に加えてもよい。キャリア又は標的ポリペプチド変異体中に組み入れられる化学的に反応性の非天然アミノ酸は、（非天然アミノ酸を含まない「天然」キャリア又は標的ポリペプチドにおける対応する天然アミノ酸と比較して）保存的置換でも非保存的置換でもよい。
本発明での用途が見出される種々のプラスミドの略図を提供する。 非天然アミノ酸ｐ−アセチルフェニルアラニンがセレクターコドンに応じてアミノ酸位置３７においてＨＳＡ中に組み入れられる忠実性及び特異性を決定するために行った実験の結果を示す。 非天然アミノ酸ｐ−アセチルフェニルアラニンがセレクターコドンに応じてアミノ酸位置３７においてＨＳＡ中に組み入れられる忠実性及び特異性を決定するために行った実験の結果を示す。 ｐＡｐａＲＳ発現及びアンバー抑圧を最適化するためにプロモーターを比較するために行われた実験の結果を示す。 培地中のｒＨＳＡE37pApaレベルにより検定した場合の、ＰAOX2、ＰYPT1、ＰICL1、ＰFLD1、ＰGAP、又はＰAOX1で促進されるａａＲＳを用いたアンバー抑圧レベルを決定するために行われた実験の結果を示す。 Ａは、ＡＢＴ−５１０ペプチドのｒＨＳＡE37pApaへのオキシム連結反応の概略図を示す。Ｂは、接合の程度を決定するために行われたＭＡＬＤＩ質量分析の結果を示す。 本発明の直交性翻訳系を使用してｐＡｐａ以外の非天然アミノ酸（例えば構造３〜９）をｒＨＳＡE37X中にＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて組み入れることができるということを明らかにするために行われた実験を示す。 ｐＰＩＣ３．５ｋ及びｐＲＥＡＶカセットがＧＳ２００−ｒＨＳＡE37X／ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳに首尾よく組み入れられたか否かを決定するために４つの形質転換体で行われたＰＣＲの結果を示す。 単一の形質転換からのＧＳ２００−ｒＨＳＡE37X／ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳの４つの別々のクローンにおけるｐＡｐａＲＳ−His6xについてのウェスタンブロットを示す。 ｒＨＳＡE37XがＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｍｕｔ+変異体においてより確実に発現されるか否かを決定するために行われた実験の結果を示す。 種々のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子プロモーターを増幅するために行われたＰＣＲの結果を示す。 プロモーター促進ｐＡｐａＲＳ産生の関数としてｒＨＳＡE37pApaにおけるアンバー抑圧を示す図４の結果の棒グラフ図を提供する。 ２５μｌのＢＳＡ標準又は試験タンパク質発現からの未精製ｒＨＳＡWT培地を展開したタンパク質ゲルを示す。 図６ｆのレーン２からのキモトリプシン消化ｒＨＳＡE37DMNB-Cタンパク質のＬＣ−ＭＳ／ＭＳを示す。 実施例１における株及びプラスミド構築に使用されるオリゴヌクレオチドの配列を提供する。
概論
本発明は、キャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を製造するための現在利用可能な架橋試薬の使用の有益な代替を提供する。本明細書に提供される方法は、キャリアポリペプチド変異体中に直接組み入れられている第一の化学的に反応性の非天然アミノ酸残基を、標的ポリペプチド変異体中に直接組み入れられている第二の化学的に反応性の非天然アミノ酸残基と反応させて、安定で明確に定義された接合体を生成することを含む。このような接合体は場合により、新規な若しくは改善された生物学的特性、減少した毒性、増強された活性、及び／又は増加した半減期を有する治療剤としての用途を見出し得る。これらの方法は有利に、例えばそれぞれ同一の化学量論及び連結部位を含む、接合体の均質な集団の一貫した産生を可能にすることにより、収量を最大にし、かつ費用を最少にすることができる。
本明細書の記載から明らかなように、本発明の種々の実施態様は、第一の反応性非天然アミノ酸を含む多種多様なキャリアポリペプチド変異体のいずれか、及び第二の反応性非天然アミノ酸を含む多種多様な標的ポリペプチド変異体のいずれかを含み得、ここで第一及び第二の非天然アミノ酸を反応させて、安定な、共有結合で連結されたキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を形成する。キャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチドは場合により、治療用、免疫原性、外来生物から誘導、自己タンパク質、合成などであってもよい。対象となる特定のキャリアポリペプチドを本明細書の以下で詳細に説明する。本発明での用途を見出す標的ポリペプチドとしては、限定されないが、ＴＳＰ−１、ＡＢＴ−５１０、ＧＬＰ−１、エキセンディン（Ｅｘｅｄｉｎ）−４、上述のもののペプチド誘導体などのような低分子治療用ペプチドが挙げられ、これらは本明細書の他所でさらに詳細に説明される。
本明細書に記載される特定の実施態様において、非天然アミノ酸は、直交性ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素対を使用して、例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａとしても知られる）、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、及びトルロプシス属種（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｓｐｐ）のようなメチロトローフ酵母において、キャリア又は標的ポリペプチド変異体中に高い効率及び高い忠実性で部位特異的に組み入れられ得る。メチロトローフ酵母は、治療上有用な異種タンパク質のための組み換え発現系としての使用のための魅力的な候補である（Ｌｉｎ−Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２４：４５−６６；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１３５６８号、２００８年１２月１０日出願、表題「Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ」；及び米国特許出願公開第２００９／０１９７３３９号、２００８年１２月１０日出願、表題「Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ ＡｃｉｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ」）。メチロトローフ酵母の真核生物細胞内構成により、哺乳動物由来の生物学的に活性なキャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチドを合成するために必要とされる翻訳後の折り畳み、プロセシング及び修飾の事象の多くを行うことが可能となる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて発現されたタンパク質と異なり、メチロトローフ酵母（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａとしても知られる）、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、及びトルロプシス属種）により産生されたタンパク質は、異種発現された糖タンパク質の下流プロセシングを妨害し得る高マンノースグリカン構造を含む可能性が低い。さらに有利なことに、メチロトローフ酵母において合成されたキャリア及び／又は標的ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたタンパク質にはしばしば特徴的である発熱性及び抗原性の化合物を含まない。最も重要なことには、メチロトローフ酵母発現系は、大規模合成に特に有用である。例えば、メチロトローフ酵母における直交性翻訳系は、非天然アミノ酸をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、細菌、昆虫、又は哺乳動物系よりも１０〜１００倍高いレベルで含む組み換えキャリア及び／又は標的ポリペプチドの発現を可能にし得る。さらに、メチロトローフ酵母は、単純で確定された塩培地中で容易に培養することができ、バキュロウイルス発現系に必要な高価な培地補充剤及び装置の必要性がなくなる。メチロトローフ酵母における直交性翻訳系の使用に関するさらなる詳細は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１３５６８号、２００８年１２月１０日出願、表題「Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ」及び米国特許出願公開第２００９／０１９７３３９号、２００８年１２月１０日、表題「Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ」に見出され得る。
第一及び第二の非天然アミノ酸は、当該分野で公知の多数の方法のいずれかを使用して、キャリアポリペプチド及び標的ポリペプチドのそれぞれに直接組み入れることができる。多くの実施態様は、非天然アミノ酸の直接的な組み入れの経路として直交性翻訳系を、例えばＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（以下を参照のこと）又は他のメチロトローフ酵母（例えば、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（又はＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａとしても知られる）、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、及びトルロプシス属種）において利用するが、他の直接的組み入れ方法（例えばインビトロ翻訳系、固相合成など）も場合により使用され得る。当然のことながら、本明細書の典型的な実施態様において、非天然アミノ酸は、ポリペプチドの構築の間にキャリア及び／又は標的ポリペプチド中に組み入れられるのであり、翻訳後の化学的誘導体化により加えられるのではない。
一つの説明に役立つ例において、本発明は、ＨＳＡ−ＡＢＴ−５１０接合体の製造に有用な方法及び組成物を提供する。ＡＢＴ−５１０は、ヒトにおいて強力な抗腫瘍活性を示すヒトトロンボスポンジンから誘導された抗血管新生ペプチド模倣物であるが、これは静脈内投与された場合に腎臓による急速なクリアランスという欠点を有する（Ｈｏｅｋｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２００５）「Ｐｈａｓｅ Ｉ ｓａｆｅｔｙ、ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ、ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１−ｍｉｍｅｔｉｃ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＡＢＴ−５１０ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃａｎｃｅｒ」Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３： ５１８８−５１９７；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）「Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１ ｐｅｐｔｉｄｅ ＡＢＴ−５１０ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７：１７１６−１７２４；Ｒｅｉｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ」Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９８：６８２−６８９）。ＨＳＡは、１９日の半減期を有する十分に特徴付けされた可溶性血清タンパク質であり、主にステロイド、脂肪酸、及び甲状腺ホルモンのキャリアタンパク質として機能する。ＨＳＡは、例えば、Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号ＡＡＡ９８７９７．１も参照のこと）においてエントリ１０３６００に記載される。ＨＳＡ変異体中のアミノ酸位置３７に組み入れられたｐ−アセチルフェニルアラニン残基、及びＡＢＴ−５１０変異体中のアミノ酸位置６に組み入れられたε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジン残基は、選択的オキシム連結反応を介して反応してＨＳＡ−ＡＢＴ−５１０接合体を生じる。ＨＳＡへの接合は、接合したペプチドの半減期を延長し、それ故、その治療上の有用性を増加させる。ＨＳＡ変異体中のアミノ酸位置３７に組み入れられたｐ−アセチルフェニルアラニン残基、及びＡＢＴ−５１０変異体中のアミノ酸位置１に組み入れられたε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジン残基もまたオキシム連結反応を介して反応して有用な接合体を生じ得る。
詳細な説明をまとめると、本発明により提供される方法及び組成物を使用して化学的に連結され得る種々のキャリアポリペプチド及び標的ポリペプチドを最初に詳述する。次に、それぞれ第一及び第二の反応性非天然アミノ酸を含むキャリアポリペプチド変異体及び／又は標的ポリペプチド変異体を製造する方法に関する詳細を記載する。次いで、キャリアポリペプチド変異体を標的ポリペプチド変異体に接合するために使用することができる化学カップリング反応を詳述する。本発明の接合体を含む医薬組成物及びそれらの投与に関する詳細をこの後記載する。最後に、本発明の接合体を含むキット及び／又はそれらの製造方法を記載する。
対象となるキャリアポリペプチド及び標的ポリペプチド
上記のように、本発明は、キャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体の製造のための方法及び組成物を提供し、ここでキャリアポリペプチド及び標的ポリペプチド中に直接組み入れられた、それぞれ独特の化学官能基を有する第一及び第二の非天然アミノ酸残基を反応させて定義された接合体の均質な集団を生じる。 キャリア及び標的ポリペプチド変異体中に存在する反応性非天然アミノ酸は場合により、ポリペプチド内のいずれの位置にあってもよい。キャリア及び標的ポリペプチド変異体中の非天然アミノ酸の配置は、場合により、例えば、その位置の配置が、それらが誘導された「天然」ポリペプチドに対してキャリア及び／又は標的ポリペプチド変異体の例えばコンホメーション、生物学的活性、薬理活性又は他の関連する特性を変化するか否かに基づいて選択される。化学的に反応性の非天然アミノ酸のキャリア及び標的ポリペプチド中の配置が場合により選択される別の基準は、それらの配置が、反応性非天然アミノ酸がアクセス可能であること（例えば、２つの非天然アミノ酸が安定な接合体を生じる連結反応に参加できる）を可能にするか否かなどである。
キャリア及び標的ポリペプチド変異体中にそれぞれ組み入れられる第一及び第二のアミノ酸は、（非天然アミノ酸を含まない「天然の」キャリア及び標的ポリペプチド中の対応する天然アミノ酸と比較して）保存的置換でも非保存的置換でもよい。キャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチド中の化学的に反応性の非天然アミノ酸は場合により、キャリア及び／又は標的ポリペプチドの一次配列中の天然アミノ酸と置き換わり得る。あるいは、又はさらに、１つ（又はそれ以上）の反応性非天然アミノ酸をキャリア又は標的ポリペプチドの一次配列に加えることができる。
第一及び第二の非天然アミノ酸をそれぞれ含むキャリア及び標的ポリペプチドは、伸長するポリペプチド鎖中へ非天然アミノ酸を直接組み入れることを伴う多数の方法のいずれかで構築することができる。多くの実施態様は直交性翻訳を例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（以下を参照のこと）又は他のメチロトローフ酵母、例えばＰ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａとしても知られる）、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、及びトルロプシ属種において、非天然アミノ酸の直接組み入れの経路として利用するが、他の直接組み入れ方法（例えば、インビトロ翻訳系、固相合成など）も場合により使用することができ、又はこれらの方法を組み合わせて使用することができる。しかし、メチロトローフ酵母における発現の利点には、それらの遺伝子操作の容易さ、それらの組み換えタンパク質産生の経済性、及び典型的には真核生物タンパク質に付随する複雑な翻訳後修飾を行うそれらの能力が含まれる。メチロトローフ酵母における組み換えタンパク質発現のこれら及び他の利点は以下でさらに詳細に説明される。
特定の実施態様において、キャリアポリペプチドは、例えば本明細書に記載される連結化学の１つ又はそれ以上を使用して１つより多くの標的ポリペプチドに連結されて、例えば、治療上有用なキャリア−標的接合体、例えば多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）を生じ得る。反対に、標的ポリペプチドは、場合により複数のキャリアポリペプチドに接合され得る。
本発明の局面を説明するために、ＨＳＡ及びＡＢＴ−５１０をそれぞれキャリアポリペプチド及び標的ポリペプチドとして選択した。ＨＳＡは、１９日の血清半減期を有する十分に特徴付けされた血清タンパク質であり、天然の血管新生阻害剤であるトロンボスポンジン−１のペプチド誘導体であるＡＢＴ−５１０は、ヒトにおいて強力な抗腫瘍活性を示すが、静脈内投与された場合に腎臓による急速なクリアランスという欠点を有する（Ｈｏｅｋｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２００５）「Ｐｈａｓｅ Ｉ ｓａｆｅｔｙ、ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ、ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１−ｍｉｍｅｔｉｃ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＡＢＴ−５１０ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃａｎｃｅｒ」Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３： ５１８８−５１９７；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）「Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１ ｐｅｐｔｉｄｅ ＡＢＴ−５１０ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７：１７１６−１７２４；Ｒｅｉｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ」Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９８：６８２−６８９）。以下の実施例において記載されるように、ＨＳＡ又はＨＳＡ変異体中に組み入れられたｐ−アセチルフェニルアラニンを、ＡＢＴ−５１０又はＡＢＴ−５１０変異体中に組み入れられたε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンと、例えばオキシム連結反応を介して反応させることができる。当然のことながら、以下の実施例における説明だけが本発明の実施態様ではない。本明細書における記載から明らかなように、本発明の種々の実施態様は、第一の反応性非天然アミノ酸を含む多種多様なキャリアポリペプチド変異体のうちのいずれか、及び第二の反応性非天然アミノ酸を含む多種多様な標的ポリペプチド変異体のうちのいずれかを含み得、ここで第一及び第二の非天然アミノ酸を反応させて、共有結合で連結された安定なキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を形成する。したがって、種々の実施態様において、キャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチドは場合により治療用、免疫原性、外来生物から誘導、自己タンパク質、合成などであり得る。特定の対象となるキャリア及び標的ポリペプチドを以下に記載する。
対象となるキャリアポリペプチド
本明細書の他所で記載されるように、キャリアタンパク質は、標的ポリペプチドの細胞への送達を促進するため、その血清半減期を増加させるため、その活性を維持安定化するため、被験体への投与後のその凝集を防止するなどのために、本発明により提供される（ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂｅ）方法を使用して、標的ポリペプチド、例えばＡＢＴ−５１０のような治療用ペプチドに有利に連結され得る。キャリアタンパク質の好ましい特徴としては、高い溶解性及び長い半減期を挙げることができるが；本発明で使用されるキャリアポリペプチドがいずれかの特定の生物学的活性を有するか有していないかによって限定されることは意図されない。
キャリアポリペプチドは場合により、例えば、抗体（例えばＯＫＴ３抗体、ＨＥＲ２抗体など）、抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｃなど）、アルブミン、血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、ｃ反応性タンパク質、コンアルブミン、ラクトアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、イオンキャリアタンパク質、アシルキャリアタンパク質、シグナル伝達アダプタータンパク質、アンドロゲン結合タンパク質、カルシウム結合タンパク質、カルモジュリン結合タンパク質、セルロプラスミン、コレステロールエステル輸送タンパク質、ｆボックスタンパク質、脂肪酸結合タンパク質、フォリスタチン、フォリスタチン関連タンパク質、ＧＴＰ結合タンパク質、インスリン様増殖因子結合タンパク質、鉄結合タンパク質、潜在型ＴＧＦベータ結合タンパク質、集光性タンパク質複合体、リンパ球抗原、膜輸送タンパク質、ニューロフィジン、周辺質結合タンパク質、リン酸結合タンパク質、ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質、リン脂質輸送タンパク質、レチノール結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ｓ期キナーゼ関連タンパク質、性ホルモン結合グロブリン、チロキシン結合タンパク質、トランスコバラミン、トランスコルチン、トランスフェリン結合タンパク質、及び／又はビタミンＤ結合タンパク質を含んでいても、これらであっても、これらに対して相同であってもよい。
しかし、当然のことながら、本発明の方法及び組成物は、上に列挙されたポリペプチドに限定されない。本発明のキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体は場合により、当該分野で周知のいずれかのキャリアポリペプチドを含み得る。
対象となる標的ポリペプチド
標的ポリペプチドは、その半減期、薬理活性、生物学的活性、バイオアベイラビリティーが標的ポリペプチドのキャリアタンパク質への化学的連結により安定化されるか改善され得る、いずれかの対象となるポリペプチドを含み得る。標的ポリペプチドは、場合により治療用、免疫原性、外来生物由来、自己タンパク質、合成などであり得る。特に有用な実施態様において、標的ポリペプチドは治療用低分子ペプチドであり得る（以下を参照のこと）。しかし、標的ポリペプチドがいずれか特定の生物学的活性を有するか有していないかにより限定されるということは意図されない。本明細書における実施態様において、標的ポリペプチドは、例えばＴＳＰ−１、ＡＢＴ−５１０、グルカゴン（ｇｌｕｇａｃｏｎ）様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、エキセンディン（Ｅｘｅｄｉｎ）−４、リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）、アンジオスタチン、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球走化性タンパク質−１、単球走化性タンパク質−２、単球走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０リガンド、補体阻害剤、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯΥ、ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β、ＭＣＰ−１、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、表皮剥脱毒素、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ２１、Ｇ−ＣＳＦ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヒルジン、ＬＦＡ−１、ヒトインスリン、ヒトインスリン様増殖因子（ｈＩＧＦ）、ｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩ、ヒトインターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、白血病抑制因子、ニュールツリン、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロフィン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｎ）、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、レラキシン、ソマトスタチン、スーパーオキシドジムスターゼ、チモシンアルファ１、ヒト腫瘍壊死因子（ｈＴＮＦ）、ヒト腫瘍壊死因子アルファ、ヒト腫瘍壊死因子ベータ、Ｒａｓ、Ｔａｔ、炎症性分子、シグナル伝達分子、ウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）、又はＢＰ３２０抗原を含んでいても、これらの変異体であっても、又はこれらに対して相同であってもよい。再び、当然のことながら、本発明の方法及び組成物は、上に列挙された標的ポリペプチドに限定されない。
キャリアポリペプチド変異体及び／又は標的ポリペプチド変異体の製造方法
例えば、反応して本発明の接合体を生じるキャリアポリペプチド変異体及び／又は標的ポリペプチド変異体は、伸長するポリペプチド鎖中への非天然アミノ酸の直接組み入れを伴う種々の方法のいずれかを使用して製造され得る。従って、説明及び実施例は、化学的に反応性の第一及び第二の非天然アミノ酸をキャリアポリペプチド変異体及び標的ポリペプチド変異体にそれぞれ組み入れるための、メチロトローフ酵母、（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（以下を参照のこと）、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａとしても知られる）、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、及びトルロプシス属種）における直交性翻訳系の使用に主に焦点を当てるが、他の直交性翻訳系及び／又は他の非直交性直接組み入れ方法を場合により使用して、上記非天然アミノ酸を含む標的及びキャリアポリペプチド変異体を製造することができる。いくつかの実施態様において、化学的に反応性の非天然アミノ酸は、キャリアポリペプチド変異体又は標的ポリペプチド変異体、例えば治療用低分子ペプチド中に、そのポリペプチドが作製される間、例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を使用した翻訳の間、化学合成（ｃｈｅｍｉｃｏ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）法を使用するインビトロ合成の間などに、組み入れられ得る。従って、例えば直交性翻訳系をメチロトローフ酵母において使用する、非天然アミノ酸を含むキャリア及び／又は標的ポリペプチド変異体を構築する特定の方法が本明細書において詳述されるが、必ずしもそのように限定されると解釈されるべきではない。非天然アミノ酸をキャリア及び／又はポリペプチド中に一次構築の間に直接組み入れる他の方法も多くの実施態様で本明細書に含まれる。
例えば本明細書以下で詳述される方法のいずれかを使用して、反応性の第一及び第二の非天然アミノ酸をそれぞれキャリアポリペプチド及び標的ポリペプチド中に組み入れた後、キャリアポリペプチド変異体中に存在する第一の非天然アミノ酸を、標的ポリペプチド変異体中に存在する第二の非天然アミノ酸と、例えば本明細書の他所で記載される連結化学のいずれか１つにより反応させて、安定で確定された接合体を形成することができる。
当然のことながら、安定なキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を形成する前の、キャリアポリペプチド及び標的ポリペプチド中への非天然アミノ酸の遺伝的組み入れ（例えば本明細書において記載及び参照されるような直交性翻訳系による）は、いくつかの実施態様において、現在利用可能な方法を使用するキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体の生成を超える利点を提供する。例えば、標的ポリペプチドのキャリアＨＳＡへの接合のための１つの現在の方法論は、その単一の遊離システイン（残基３４）をマレイミド連結により利用することを含む。この方策は、マレイミドの抗原性及び内因性酸化窒素、遊離システイン、グルタチオン又は糖によるシステイン３４の頻繁な修飾を含むいくつかの欠点を有し、これは変動するカップリング効率をもたらし得る。
インビボ直交性翻訳系を使用するキャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチド中への非天然アミノ酸の遺伝的組み入れは、生物学的かつ／又は薬理学的に活性なキャリアポリペプチド変異体及び／又は標的ポリペプチド変異体を生成し得るが、非天然アミノ酸の直接組み入れにより導入された加えられた活性／官能基が含まれ、これらの官能基を反応させて安定なキャリア−標的ポリペプチド接合体を生成し得る。さらに、非天然アミノ酸のインビボ組み入れの新しいバイオテクノロジーツールの使用は、適切な天然のコンホメーションの、非天然アミノ酸を含むキャリア及び／又は標的ポリペプチドを高収率低コストで製造するのに役立ち得る。さらに、キャリア及び標的ポリペプチド変異体中にそれぞれ組み入れられる第一及び第二の非天然アミノ酸の反応性は、分子リンカー長、反応条件、生じたリンカーが切断可能かどうかなどのような基準に基づいて慎重に選択され得る。
対照的に、固相ペプチド合成のような他のインビトロ方法を使用する、非天然アミノ酸を含むキャリア又は標的ポリペプチド変異体の全合成は、いくつかの実施態様において、より短い分子（例えば約６０〜１００アミノ酸）を対象とし得、さらには変性タンパク質をより低い収率で生成する。
特定の実施態様において、メチロトローフ酵母における直交性翻訳系を使用して、標的ポリペプチド変異体（例えば、ＴＳＰ−１又はＡＢＴ−５１０）中の第二の非天然アミノ酸（例えば、ε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジン）と反応して安定なキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を生成し得る、非天然アミノ酸（例えばｐ−アセチルフェニルアラニン）を含むキャリアポリペプチド変異体（例えば、ＨＳＡ）を生成する。メチロトローフ酵母（例えばＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（以下を参照のこと）、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａとしても知られる）、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、及びトルロプシス属種）におけるＯ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡ対の使用は、他の直交性系、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、又は哺乳動物細胞におけるものよりも、上記タンパク質の産生に関するいくつかの有利な利点を特徴とする。本明細書以下でさらに記載されるように、それらの遺伝子操作の容易さ、それらの組み換えタンパク質産生の経済性、及び典型的に真核生物タンパク質に伴う翻訳後修飾を行うそれらの能力により、メチロトローフ酵母は異種タンパク質、例えば非天然アミノ酸を含むキャリアポリペプチド変異体及び／又は標的ポリペプチド変異体の発現について有利な系となる。
直交性ｔＲＮＡ／直交性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素技術
特定の実施態様において、化学的連結反応（例えば本明細書の他所に記載されるもの）に参加し得る化学的に反応性の第一及び第二の非天然アミノ酸は、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）系により化学的連結反応の前に、それぞれキャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチド中に組み入れられる。従って、本発明により提供される組成物及び方法の理解は、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対に関連する活性の理解によりさらに発展する。一般的に、非天然アミノ酸を遺伝暗号に加えるために、宿主翻訳機構において有効に機能し得るが、問題の翻訳系に対して「直交性」である、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素及び適切なｔＲＮＡを含む新しい直交性対が必要とされる。従って、直交性部分は、翻訳系に対して内因性の合成酵素及びｔＲＮＡから独立して機能する。直交性対の所望の特徴としては、特定のコドン、例えばセレクターコドン、例えばアンバー停止コドンのみを解読又は認識し、いずれの内因性ｔＲＮＡにも解読されないｔＲＮＡ、及び唯一の特異的な非天然アミノ酸でその同族ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化又は「チャージ」するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素が挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡはまた、内因性合成酵素により、典型的にはアミノアシル化されないか、又は不十分にアミノアシル化、すなわちチャージされる。
本発明における１つ又はそれ以上の非天然アミノ酸を含むタンパク質を作製するために適した直交性翻訳系の一般的原理は、当該分野で公知であり、直交性翻訳系を製造するための一般的な方法と同様である。例えば、国際公開：ＷＯ２００２／０８６０７５、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ ＰＡＩＲＳ」；ＷＯ２００２／０８５９２３、表題「ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ」；ＷＯ ２００４／０９４５９３、表題「ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ」；ＷＯ ２００５／０１９４１５、２００４年７月７日出願；ＷＯ ２００５／００７８７０、２００４年７月７日出願；ＷＯ ２００５／００７６２４、２００４年７月７日出願；ＷＯ ２００６／１１０１８２、２００５年１０月２７日出願、表題「ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＩＮ ＶＩＶＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ」；ＷＯ ２００７／１０３４９０、２００７年３月７日出願、表題「ＳＹＳＴＥＭＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ ＩＮ ＥＵＢＡＣＴＥＲＩＡＬ ＨＯＳＴ ＣＥＬＬＳ」、及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１３５６８号、２００８年１２月１０日出願、表題「Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ」を参照のこと。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」 Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：２３９−２４４；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１８６８ 表題「Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｂｏｒｏｎａｔｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ，」、２００８年１０月３０日出願；ＷＯ２００７／０４７３０１ 表題「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｇｅ−Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，」２００６年１０月１１日出願；及びＷＯ２００６／１１０１８２ 表題「Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，」２００５年１０月２７日出願も参照のこと。上述の出願のそれぞれが参照により全体として本明細書に加入される。非天然アミノ酸を組み入れる直交性翻訳系、並びにそれらの製造及び使用の方法の考察については、Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００５）「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ」 Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ Ｅｄ ４４：３４−６６；Ｘｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００５）「Ａｎ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ」 Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２２７−２３８；Ｘｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００５）「Ａｄｄｉｎｇ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ」 Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９：５４８−５５４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ」 Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ ３５：２２５−２４９；Ｄｅｉｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｌｋｙｎｅ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」 Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １５：１５２１−１５２４；Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐ−Ａｚｉｄｏ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」 Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２４：９０２６−９０２７；及び国際公開第ＷＯ２００６／０３４３３２号、２００５年９月２０日出願も参照のこと。これらの書類のそれぞれの内容が参照によりその全体として加入される。直交性翻訳系のさらなる詳細は、米国特許第７，０４５，３３７号；同第７，０８３，９７０号；同第７，２３８，５１０号；同第７，１２９，３３３号；同第７，２６２，０４０号；同第７，１８３，０８２号；同第７，１９９，２２２号；及び同第７，２１７，８０９号に見出され得る。
本明細書で使用される非天然アミノ酸は、２０の遺伝的にコードされるアルファ−アミノ酸以外の、いずれかのアミノ酸、修飾されたアミノ酸又はアミノ酸類似体を指す。本明細書で使用される、セレノシステイン又はピロールリジンは、キャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチドに組み入れられ得る。例えば、２０の天然アミノ酸の構造については、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ、３rd ｅｄ．１９８８、Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。非天然アミノ酸は、天然アミノ酸とは異なる側鎖基を有するが、非天然アミノ酸は、２０のタンパク新生アルファ−アミノ酸以外の天然に存在する化合物であってもよい。本発明での用途を見出す非天然アミノ酸としては、ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン、ｐ−メトキシフェニルアラニン、ダンシルアラニン、ＤＭＮＢ−セリン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、Ｏ−プロパルギル−Ｌ−チロシン、Ｌ−ドパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｙｎｌ）、エーテル、チオール、スルホニル、スルホ、セレノ、エステル、チオ酸、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、複素環式、エノン、イミン、アルデヒド、アルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ケト、若しくはアミノ置換アミノ酸、又はそれらのいずれかの組み合わせ；光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光性アミノ酸；新規な官能基を含むアミノ酸；共有結合又は非共有結合で別の分子と相互作用するアミノ酸；金属結合アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；光ケージ化（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）及び／又は光異性化可能アミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は炭水化物修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学的に切断可能又は光開裂性（ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ）アミノ酸；長い側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含有するアミノ酸；糖置換アミノ酸、例えば、糖置換セリンなど；炭素連結糖含有アミノ酸；糖置換システイン；酸化還元活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，α二置換アミノ酸；β−アミノ酸；スルホチロシン、４−ボロノ−フェニルアラニン、アミノオキシアミノ酸、アミノオキシリジン、アミノオキシオルニチン、アミノオキシチロシン、又はプロリン以外の環状アミノ酸が挙げられる。
例えば、標的及び／又はキャリアポリペプチド中に組み入れられ得る他の非天然アミノ酸としては、限定されないが、以下の官能基のいずれか１つ又はそれ以上を含む非天然アミノ酸が挙げられる：アルデヒド部分、ケト部分、ベータ−ジケト部分、アルコキシアミン部分、アシルヒドラジド部分、デヒドロアラニン部分、チオエステル部分、エステル部分、ボロネート部分、アジド部分、アセチレン部分、オレフィン部分、隣接チオールアミン部分など。このような官能基を含む標的又はキャリアポリペプチド中に存在する非天然アミノ酸は、例えばそれぞれキャリア又は標的ポリペプチド中に存在する、反応性求核剤及び／又は求電子剤（例えば、ケト部分、アルデヒド部分、アルコキシアミン、アシルヒドラジド部分、アジド部分、アルキン部分、オレフィン部分、アミノ部分、チオール部分、アミノフェノール部分、ヨードフェニル部分など）を含む第二の非天然アミノ酸と反応し得る。
直交性翻訳系
直交性翻訳系は一般的に、細胞、例えば原核生物細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ；及び真核細胞、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、哺乳動物細胞、及びメチロトローフ酵母細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａとしても知られる）、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、及びトルロプシス属種）などを含み、これらは直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）、及び非天然アミノ酸を含み、ここでＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。直交性対はＯ−ｔＲＮＡ、例えばサプレッサｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡなど、及び同族Ｏ−ＲＳを含み得る。典型的にＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含む、本明細書におけるキャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチド変異体を生成するために使用され得る直交性系は、細胞又は無細胞環境を含み得る。
一般に、直交性対がセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応じてアミノ酸を負荷する場合、直交性対はセレクターコドンを「抑制する」と言われる。すなわち、翻訳系の内因性機構により認識されないセレクターコドンは通常チャージされず、これにより、そうでなければ核酸から翻訳されるポリペプチドの産生の遮断を生じる。直交性対系において、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを特定の非天然アミノ酸、例えば本明細書の実施例において使用されるような、ｐ−アセチルフェニルアラニンでアミノアシル化する。チャージされたＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識して、セレクターコドンにより引き起こされる翻訳ブロックを抑制し、例えばｐ−アセチルフェニルアラニンを例えばアミノ酸位置３７に含むＨＳＡ変異体を生成する。
翻訳系は、例えば目的のポリペプチド（例えばキャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを介して、非天然アミノ酸を伸長するポリペプチド鎖中に組み入れるためにＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を使用し、ここでこのポリヌクレオチドは、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。特定の系において、細胞は１つ又はそれ以上のさらなるＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含み得、ここでさらなるＯ−ｔＲＮＡはさらなるＯ−ＲＳにより異なる非天然アミノ酸を負荷される。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡのうちの１つは４塩基コドンを認識することができ、そして他のＯ−ｔＲＮＡは停止コドンを認識することができる。あるいは、複数の異なる停止コドン、複数の異なる４塩基コドン、複数の異なる、複数の異なるレアコドン及び／又は複数の異なる非コードコドンを同じコード核酸において使用することができる。従って、単一のポリペプチド、例えばキャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチド変異体は、複数の非天然アミノ酸を含み得る。あるいは、またはさらに、この系において生成された異なるキャリア及び／又は標的ポリペプチド又はポリペプチド変異体は、異なる非天然アミノ酸を含み得る。利用可能なＯ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡ同族対及びそれらの使用に関するさらなる詳細については、例えば本明細書の他所に示される参考文献を参照のこと。
従って、いくつかの翻訳系は複数のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含み得、これにより、１つより多くの非天然アミノ酸をキャリアポリペプチド変異体及び／又は標的ポリペプチド変異体中に組み入れることが可能となる。例えば、翻訳系は、さらなる異なるＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対及び第二の非天然アミノ酸をさらに含み得、ここでこのさらなるＯ−ｔＲＮＡは第二のセレクターコドンを認識し、そしてこのさらなるＯ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを第二の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含み、そこでＯ−ｔＲＮＡが例えばアンバーセレクターコドンを認識する細胞は、第二の直交性対をさらに含んでいてもよく、ここで第二のＯ−ｔＲＮＡは異なるセレクターコドン、例えばオパールコドン、オーカーコドン、４塩基コドン、レアコドン、非コードコドンなどを認識する。いくつかの系において、異なる直交性対は異なる供給源から誘導され、これにより異なるセレクターコドンの認識が容易に成り得る。
特定の翻訳系は、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）、非天然アミノ酸、並びに目的のポリペプチド、例えばキャリアポリペプチド変異体及び／又は標的ポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、哺乳動物細胞、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、又はメチロトローフ酵母細胞（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ細胞、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（又はＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）細胞、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ細胞、又はトルロプシス属種細胞）のような細胞を含み得、ここでポリヌクレオチドは、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。直交性翻訳系は非天然アミノ酸を有するタンパク質を生成するために培養された細胞を利用することができるが、本明細書において使用される直交性翻訳系がインタクトな生存細胞を必要とするということは意図されない。例えば、直交性翻訳系は、細胞抽出物の存在下で無細胞系を利用し得る。実際、タンパク質産生のための無細胞のインビトロ転写／翻訳系の使用は、十分に確立された技術である。本明細書に記載される直交性翻訳系構成要素を使用する、非天然アミノ酸を有するタンパク質を産生するためのこれらのインビトロ系の適応は、十分に本発明の範囲内である。
Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは、天然に存在するものでもよく、又は例えば天然に存在するｔＲＮＡ及び／若しくはＲＳの変異により、例えば種々の生物のいずれか由来のｔＲＮＡのライブラリー及び／若しくはＲＳのライブラリーを生成することにより、並びに／又は種々の利用可能な変異ストラテジーのいずれかを使用することにより、誘導され得る。例えば、直交性ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素対を製造するための１つのストラテジーは、ｔＲＮＡ／合成酵素対が使用される翻訳系以外の供給源又は複数の供給源から、その対が機能する系に対して異種であるｔＲＮＡ／合成酵素対を移入することを含む。異種合成酵素候補の特性としては、例えばいずれの宿主細胞ｔＲＮＡもチャージしないことが挙げられ、そして異種ｔＲＮＡ候補の特性としては、例えばいずれの宿主細胞合成酵素によってもアミノアシル化されないことが挙げられる。さらに、異種ｔＲＮＡは全ての宿主細胞合成酵素に対して直交性である。直交性対を生成するための第二のストラテジーは、変異ライブラリーを作製してそこからＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをスクリーニング及び／又は選択することを含む。このようなストラテジーを組み合わせることもできる。
直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）は、望ましくは、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド中への非天然アミノ酸の組み入れを、例えばインビボ又はインビトロで媒介する。
従って、Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は、直交性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）をさらに含み得、ここでＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。Ｏ−ｔＲＮＡを含むこのような組成物は、インビトロ又はインビボでの翻訳系をさらに含み得る。目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸は細胞中に存在していてもよく、ここでポリヌクレオチドは、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドン、又はこれらの１つ若しくはそれ以上の組み合わせを含む。
組み換え直交性ｔＲＮＡを製造し、そしてセレクターコドンに応じて非天然アミノ酸をポリペプチド中に組み入れることに関するその効率をスクリーニングする方法は、例えば、国際出願公開ＷＯ ２００２／０８６０７５、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ｔＲＮＡ ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ ＰＡＩＲＳ」；ＷＯ ２００４／０９４５９３、表題「ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ」；及びＷＯ ２００５／０１９４１５、（２００４年７月７日出願）に見出され得る。Ｆｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｄｅ ｎｏｖｏ」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １００：６３５３−６３５７；及びＦｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔＲＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｈａｎｇｅ」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １００：５６７６−５６８１も参照のこと。さらなる詳細は米国特許第７，０４５，３３７号；同第７，０８３，９７０号；同第７，２３８，５１０号；同第７，１２９，３３３号；同第７，２６２，０４０号；同第７，１８３，０８２号；同第７，１９９，２２２号；及び同第７，２１７，８０９号に見出され得る。
直交性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）
非天然アミノ酸を含むキャリア及び／又は標的ポリペプチド変異体を産生するために使用される系のＯ−ＲＳは、インビトロ又はインビボのいずれかで、非天然アミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。Ｏ−ＲＳは、Ｏ−ＲＳを含むポリペプチドにより、及び／又はＯ−ＲＳ若しくはその部分をコードするポリヌクレオチドにより翻訳系に供給され得る。
Ｏ−ＲＳを製造すること、そのアミノアシル化効率を検定すること、及び／又はその基質特異性を変更することについての全体的な詳細は、国際公開第ＷＯ ２００２／０８６０７５号、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ ｔＲＮＡ ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ ＰＡＩＲＳ」；及び同第ＷＯ２００４／０９４５９３号、表題「ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ ＴＨＥ ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ ＧＥＮＥＴＩＣ ＣＯＤＥ」に見出され得る。Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００５）「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ」Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ Ｅｄ ４４：３４−６６；及びＨｏｂｅｎ ａｎｄ Ｓｏｌｌ（１９８５） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １１３：５５−５９も参照のこと（これらの内容はその全体が参照により加入される）。このような系に関するさらなる詳細は、米国特許第７，０４５，３３７号；同第７，０８３，９７０号；同第７，２３８，５１０号；同第７，１２９，３３３号；同第７，２６２，０４０号；同第７，１８３，０８２号；同第７，１９９，２２２号；及び同第７，２１７，８０９号に見出され得る。
供給源及び宿主生物
例えば、反応して本発明の安定なキャリア−標的接合体を形成する、非天然アミノ酸を含むキャリアポリペプチド変異体及び標的ポリペプチド変異体を作製するために場合により使用され得る直交性翻訳構成要素（Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）は、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ構成要素及び宿主系が直交性様式で機能するということを条件として、いずれかの他の種からの宿主翻訳系における使用について、いずれの生物又は生物の組み合わせ由来であってもよい。直交性対からのＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳとが同じ生物由来であることは必要条件ではない。例えば、直交性構成要素は、真正細菌宿主系における使用について古細菌遺伝子由来であってもよい。
さらに、直交性Ｏ−ｔＲＮＡは、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、ハロバクテリウム属、例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びハロバクテリウム属種（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）ＮＲＣ−１、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍなど、又はユーバクテリウム属、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓなどのような古細菌由来であってもよく、一方、直交性Ｏ−ＲＳは、生物又は生物の組み合わせ、例えば、古細菌、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、ハロバクテリウム属、例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びハロバクテリウム属種ＮＲＣ−１、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍなど、又はユーバクテリウム属、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓなどに由来し得る。他の系において、真核生物供給源、例えば、植物、藻類、原生生物、真菌類、酵母、動物、例えば、哺乳動物、昆虫、節足動物などもＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの供給源として使用することができる。さらに、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の個々の構成要素は、同じ生物由来でも異なる生物由来でもよい。
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は、インビボ若しくはインビトロで選択若しくはスクリーニングしてもよく、かつ／又は細胞、例えば真正細菌細胞において非天然アミノ酸を含むポリペプチドを産生するために使用してもよい。使用される真正細菌としては、限定されず、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓなどを挙げることができる。
セレクターコドン
種々のセレクターコドンは、タンパク質生合成機構の遺伝的コドンフレームワークを拡大する。例えば、セレクターコドンは、例えば、独特の３塩基コドン、ナンセンスコドン、例えば停止コドン、例えばアンバーコドン（ＵＡＧ）、又はオパールコドン（ＵＧＡ）、非天然コドン、少なくとも４つの塩基のコドン、レアコドンなどを含み得る。多数のセレクターコドンを、所望の遺伝子中に、例えば１つ又はそれ以上、２つ又はそれ以上、３つより多くなど導入することができる。従来の部位特異的変異誘発を使用して、セレクターコドンを、目的のポリペプチド（例えば、被験体の自己抗原）をコードするポリヌクレオチド中の目的の部位に導入することができる。例えば、Ｓａｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）「５'，３' Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」 Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １６：７９１−８０２を参照のこと。異なるセレクターコドンを使用することにより、複数の直交性ｔＲＮＡ／合成酵素対を使用することができ、これにより、これらの異なるセレクターコドンを使用して、複数の非天然アミノ酸（例えば少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む）を同時に部位特異的に組み入れることが可能となる。
非天然アミノ酸はまた、レアコドンでコードされ得る。例えば、インビトロタンパク質合成反応におけるアルギニン濃度を減少させると、レアアルギニンコドンＡＧＧが、アラニンでの合成ｔＲＮＡアシル化によるＡｌａの挿入に有効であることが分かっている。例えば、Ｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔＲＮＡAla ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｃｏｄｏｎｓ」 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：７９３９−７９４５を参照のこと。このような場合において、合成ｔＲＮＡは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中に少ない種として存在する天然に存在するｔＲＮＡArgと競合する。さらに、いくつかの生物は、全てのトリプレットコドンを使用するわけではない。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓにおける割り当てられていないコドンＡＧＡは、インビトロ転写／翻訳抽出物におけるアミノ酸の挿入に利用されている。例えば、Ｋｏｗａｌ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅｒ（１９９７）「Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｕｎａｓｓｉｇｎｅｄ ｃｏｄｏｎｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ ｆｏｒ ｔＲＮＡ−ｂａｓｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」 Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ２５：４６８５−４６８９を参照のこと。
セレクターコドンはまた、拡張（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）コドン、例えば、４つ又はそれ以上の塩基のコドン、例えば、４、５、６又はそれ以上の塩基のコドンも含み得る。４塩基コドンの例としては、例えば、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵなどが挙げられる。５塩基コドンの例としては、例えば、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣなどが挙げられる。非天然アミノ酸をタンパク質、例えば本明細書の他所に記載されるキャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチド中に組み入れる特定の方法は、フレームシフト抑制に基づいて拡張コドンを使用することを含み得る。４つ又はそれ以上の塩基のコドンは、例えば１つ又は複数の非天然アミノ酸を同じタンパク質中に挿入し得る。他の例において、アンチコドンループは、例えば、少なくとも４つの塩基のコドン、少なくとも５塩基のコドン、又は少なくとも６塩基のコドン又はそれ以上を解読し得る。２５６の可能な４塩基コドンがあるので、複数の非天然アミノ酸が４つ又はそれ以上の塩基のコドンを使用して同じ細胞にコードされ得る。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ Ｓｉｚｅ」 Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９：２３７−２４４；Ｍａｇｌｉｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ｏｆ Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ「Ｓｈｉｆｔｙ」 Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ Ｃｏｄｏｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０７：７５５−７６９；Ｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔＲＮＡAla ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｃｏｄｏｎｓ」 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：７９３９；Ｈｏｈｓａｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ Ｌａｒｇｅ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎｔｏ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｉｎ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ」Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２１：３４−４０；及びＭｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）「Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ Ｃｏｄｏｎｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｃｏｄｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｔｅｐ Ｓｉｚｅ」Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９８：１９５−２０９も参照のこと。４塩基コドンは、種々の直交系においてセレクターコドンとして使用されてきた。例えば、ＷＯ ２００５／０１９４１５；ＷＯ ２００５／００７８７０；及びＷＯ ２００５／０７６２４を参照のこと。Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ、（２００５）「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ」 Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ Ｅｄ ４４：３４−６６もまた参照のこと。
所定の系について、セレクターコドンはまた、天然の３塩基コドンの１つを含み得、ここで内因性の系は天然塩基コドンを使用しない（又はまれにしか使用しない）。例えば、天然の３塩基コドンを認識するｔＲＮＡが無い系、及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系が含まれ得る。
セレクターコドンは、非天然塩基対を場合により含む。本明細書における方法及び組成物と共に使用するために適合され得る非天然塩基対の説明としては、例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ａｎ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｆｏｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：１７７−１８２が挙げられる。Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ」Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２４：１４６２６−１４６３０も参照のこと。
直交性翻訳系をメチロトローフ酵母において使用する、非天然アミノ酸を含むキャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチドの発現及び精製
実施例において記載される実施態様において、第一の非天然アミノ酸、ｐ−アセチルフェニルアラニンを含むキャリアポリペプチドＨＳＡは、例えばメチロトローフ酵母Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて直交性翻訳系を使用して第二の非天然アミノ酸を含む標的ポリペプチドへの接合のために製造される。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて使用される直交性構成要素には、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＯ−ＲＳ チロシルｔＲＮＡ合成酵素、及びＯ−ｔＲＮＡ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の変異チロシルｔＲＮＡCUAアンバーサプレッサが含まれ、これらは宿主Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞において直交性対として機能する。
メチロトローフ酵母におけるＯ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡ対の使用は、非天然アミノ酸を含むキャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチドの産生について、他の直交性系、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、又は哺乳動物細胞よりも有益ないくつかの利点により特徴づけられる。第一に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、及びトルロプシス属種のようなメチロトローフ酵母の真核生物細胞内構造は、生物活性のために複雑な翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、ジスルフィド結合形成、硫酸化、アセチル化、プレニル化、及びタンパク質分解プロセシング）を必要とするタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びヒト中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）のような哺乳動物タンパク質）中へのＵＡＡの組み入れを可能にする。従って、細菌系において最後には不活性な封入体になってしまう多くのタンパク質は、メチロトローフ酵母において生物学的に活性な分子として産生され得る。第二に、メチロトローフにおいて発現され、そしてメチロトローフから製造される、ＵＡＡを含むタンパク質は、治療用途用に明確に設計されたタンパク質の有効性を妨害し得る、高濃度の発熱物質（例えば、リポ多糖類）、又は抗原（例えば、高マンノースオリゴ糖）を含有しない。第三に、多くの十分に確立された技術及び方法、例えば、遺伝子ターゲティング、高頻度ＤＮＡ形質転換、機能的相補性によるクローニングが、メチロトローフにおける外来遺伝子の遺伝子操作に利用可能である（Ｌｉｎ−Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ、（２００２）「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３：３２９−３３２）。内因性誘導性プロモーター及び選択可能マーカーの利用可能性が、メチロトローフ酵母宿主において製造され得るＵＡＡを含むタンパク質の範囲に柔軟性を加える。
これらの利点に加えて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（又はＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、及びトルロプシス属種のようなメチロトローフはまた、ＵＡＡを含む複雑なタンパク質の低コストな大規模合成十分適している。メチロトローフ酵母は、簡単な確定されている塩培地で容易に培養され、例えば、バキュロウイルス発現系又は哺乳動物組織培養に必要な高価な培地補助剤及び費用のかかる機材の必要性が除かれる。一般に、メチロトローフは、非常に高い細胞密度まで増殖することができ、そして理想的な条件下では、メチロトローフ酵母は、細胞懸濁液がペーストの稠度になる程度まで増殖し得る。それらの高い増殖速度により、組み換えメチロトローフ酵母株が、ＵＡＡを含むキャリア及び／又は標的ポリペプチドを高レベル、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅより１０倍から１００倍高いレベルで産生することが可能となる。それらの遺伝子操作の容易さ、それらの組み換えタンパク質産生の経済性、及び真核生物タンパク質に典型的に伴う翻訳後修飾を行うそれらの能力が、メチロトローフ酵母を、ＵＡＡを含む異種タンパク質の発現に有利な系にしている。
メチロトローフ酵母の４つの公知の属、例えば、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、及びトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）は、唯一の炭素源としてメタノールを使用することを可能にする共通の代謝経路を共有する。メタノール誘導に対する転写的に調節される応答において、いくつかの酵素は急速に高レベルで合成される。これらの遺伝子の発現を制御するプロモーターは、最も強くそして最も厳密に調節される酵母プロモーターの一員であるので、メチロトローフ酵母は、組み換えタンパク質の大規模産生のための宿主として非常に魅力的なものとなった。これらのメチロトローフ酵母の細胞は急速に高密度まで増殖することができ、そして生成物の発現レベルは、培地の簡単な操作により調節することができる。これまでに（ｔｈｉｓ ｆａｒ）発現系がＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（又はＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）及びＣａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉにおいて開発されており、そしてこれらの系は、例えば、Ｈｏｕａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｎｏｎ−ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｙｅａｓｔｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｇｅｎｅｒａ」Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８４：１０８９−１０９３；Ｇｅｌｌｉｓｏｎ（２００２） Ｈａｎｓｅｎｕｌａ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１ｓｔ Ｅｄ．、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ＮＹ；米国特許第６，６４５，７３９号；Ｇｅｌｌｉｓｅｎ（２０００）「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔｓ」Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５４：７４１−７５０においてさらに詳しく説明されている。これらの系の多くは市販されており、例えば、学術及び産業の研究用のＡｒｔｅｓ ＢｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙからのＨａｎｓｅｎｕｌａキット 及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＰｉｃｈｉａキットがある。
１つ（又はそれ以上）の非天然アミノ酸を含むキャリアポリペプチド変異体及び／又は標的ポリペプチド変異体は、メチロトローフ酵母から発現及び精製され得る。本明細書の他所で記載されるように、外来遺伝子を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてアルコールオキシダーゼ（ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ）１（ＡＯＸ１）プロモーターから発現させることができ、その調節特性はこの目的によく適している。ＡＯＸ１プロモーターは、大部分の炭素源、例えばグリセロール、グルコース、又はエタノールでの酵母の増殖の間に厳重に抑制されるが、メタノールでの増殖の間は高度に誘導される（Ｔｓｃｈｏｒｐ ｅｔ ａｌ．（１９８７）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｃＺ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５：３８５９−３８７６）。例えばＰAOX1により調節される遺伝子によりコードされるキャリアポリペプチド変異体及び／又は標的ポリペプチド変異体は、典型的に、メタノールで増殖されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞における可溶性タンパク質の総量の３０％以上に達し得る。組み換えキャリア及び／又は標的ポリペプチド変異体の産生のために、ＰAOX1制御発現株を、抑制炭素源で最初に増殖させてバイオマスを生成し、例えば培養密度を最大にして、次いで唯一のエネルギー源としてメタノールを含有する培地（例えばＢＭＧＹ、ＢＭＭＹ、又はＢＭＭ）に切り替えて、外来遺伝子の発現を誘導する。
しかし、メタノールにより誘導されないプロモーターもまた、キャリアポリペプチド若しくはポリペプチド変異体及び／又は標的ポリペプチド若しくはポリペプチド変異体をコードする異種遺伝子の発現に有利であり得る。この発現系におけるＡＯＸ１プロモーターの代替プロモーターは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＡＰ、ＦＬＤ１、ＡＯＸ２、ＩＬＣ１、及びＹＰＴ１プロモーターである。これらのプロモーターの調節、これらのプロモーターから外来遺伝子を発現させるために最も有益であり得る条件、及びこれらのプロモーターによるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける外来タンパク質の発現に関するさらなる詳細は、例えば、Ｓｅａｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）「Ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｓｅｔ ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」Ｙｅａｓｔ １４：７８３−７９０；Ｖａｓｓｉｌｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２００１）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＧＡＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ」Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８８：２１−３５；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）「Ａ ｓｔｒｏｎｇ ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｓｏｕｒｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」Ｇｅｎｅ ２１６：９３−１０２；Ｌｉｎ−Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｖｏｌ．２３ １st Ｅｄ．Ｅｄ．Ｊａｎｅ Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ＮＹ：（２００５）において考察される。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ又は他のメチロトローフ酵母におけるキャリア及び／又は標的ポリペプチド変異体の発現はフラスコ震盪培養で行ってもよいが、この系において発現されるタンパク質のレベルは、典型的に発酵槽培養よりもかなり高く、これは発酵槽において、ｐＨ、エアレーション、及び炭素源供給速度が、超高密度の細胞（例えば、＞１００ｇ／Ｌ 乾燥細胞重量；＞４００ｇ／Ｌ 湿性細胞重量、＞５００ ＯＤ600単位／ｍｌ）を達成するように制御され得るからである（例えば、Ｌｉｎ−Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３：３２９−３３２を参照のこと。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現系の特質は、発現株を震盪フラスコから高密度発酵槽培養までスケールアップする容易さである。
３工程のプロセスを典型的に使用して、遺伝子によりコードされるキャリア及び／又は標的ポリペプチド変異体をＰ−AOX1の転写制御下にてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ又は他のメチロトローフ酵母の発酵槽培養において発現させ得る。第一の工程において、操作されたメチロトローフ酵母発現株を、細胞増殖を可能にする非発酵性ＰAOX1抑制炭素源を含む簡単で確定されている培地で培養する。第二の工程は移行期を含み、この間にグリセロールを増殖を制限する程度で培地に供給し、培養のバイオマスをさらに増加させ、そして細胞を誘導のために準備する。第三の工程の間、細胞をメタノールの代謝に生理的に馴化させる程度で培養にメタノールを加えて組み換えタンパク質を合成させる。次いでメタノール供給速度を、所望の増殖速度及びタンパク質発現速度が達成されるまで、周期的に上方に調節する（Ｌｉｎ−Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｖｏｌ．２３ １st Ｅｄ．Ｅｄ．Ｊａｎｅ Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ＮＹ：（２００５））。
メチロトローフ酵母を増殖させることができる培地は安価でかつ確定されており、炭素源、例えば、グリセロール及び／又はメタノール、ビオチン、塩、微量元素、並びに水からなる。この培地は発熱物質及び毒素を含まず、従ってヒトに使用する薬剤の製造に適合する。
メチロトローフ酵母において発現される組み換えキャリアポリペプチド変異体及び／又は標的ポリペプチド変異体は、細胞内又は細胞外のいずれかで産生され得る。メチロトローフ酵母は低レベルの内因性タンパク質しか分泌しないので、分泌された組み換えタンパク質は培地中のタンパク質の大部分を構成し得る。従って、組み換えキャリア及び／又は標的ポリペプチド変異体を培地中に導くことがタンパク質精製の第一段階として役立ち得、厳しい酵母溶解プロトコルに従う必要性がなくなり、内因性酵母タンパク質による組み換えタンパク質の汚染の可能性が避けられる。しかし、タンパク質の安定性及び折り畳みの要件に起因して、異種タンパク質の培地への分泌は、典型的には、通常それらの天然の宿主細胞により分泌されるタンパク質のみにとどめられる。いずれにせよ、キット、例えば、Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｐｙ Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が利用可能であり、これらにおいて予め作製された発現カセットにより、実施者は、培地への分泌を可能にするその天然の分泌シグナル、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α−ファクタープレプロペプチド、又はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓサンホスファターゼ（ＰＨＯ１）シグナルをコードする配列とインフレームで目的の遺伝子をクローニングすることが可能となる。メチロトローフからの細胞内組み換えタンパク質の回収のための多数の技術も開発されている（Ｓｈｅｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｂｙ ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ」Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９９：１４９−１６０；米国特許第６，８２１，７５２号）。
メチロトローフ酵母からの異種タンパク質の精製のための一般的方法
種々のタンパク質精製方法が当該分野で周知であり、そしてメチロトローフ酵母で発現されたＵＡＡを含むキャリア及び／又は標的ポリペプチド及びポリペプチド変異体の精製及び分析に適用することができる。これらの技術、及びポリペプチドの分析に必要なその他のものとしては、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７） Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６） Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ；Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ（１９９０） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ（１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ＮＹ；及びＷａｌｋｅｒ（１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ ＣＤ−ＲＯＭ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ；並びにこれらに引用される参考文献に記載されるものが挙げられる。
メチロトローフ酵母における株構築のための方法及びストラテジー
Ｅ．ｃｏｌｉにおける複製に適したシャトルベクターを、目的の遺伝子、例えば、セレクターコドンを含むキャリアポリペプチド及び／若しくは標的ポリペプチド又はそれらの変異体をコードする遺伝子を、高度に誘導性のメチロトローフ酵母プロモーターの制御下に配置するように核酸構築物を操作するために典型的に使用する。プラスミドはメチロトローフ酵母において比較的不安定であるため、次いで通常は発現構築物を直線化し、そして例えばピキア属細胞、ハンゼヌラ属細胞、カンジダ属細胞、又はトルロプシス属細胞中に形質転換し、そしてゲノムに組み込む。組み込みは一般的には部位特異的であるが；高頻度の非相同組み込みがＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおいて観察されている（Ａｇａｐｈｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）「Ｄｅｆｅｃｔ ｏｆ ｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ」ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓｅａｃｈ ５：１０２９−１０３５）。メチロトローフ酵母の、一般的な分子操作、例えば形質転換、遺伝子ターゲティング、機能的相補性によるクローニング、利用可能な選択可能マーカーの使用などに関するさらなる詳細は、例えば；Ｐｅｂｅｒｄｙ、Ｅｄ．（１９９１） Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＵＫ；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１ｓｔ Ｅｄ．、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｃｒｅｇｇ．Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１st Ｅｄ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９８）；及びこれらに引用される参考文献に見出され得る。
好ましい実施態様において、キャリアポリペプチド変異体及び／又は標的ポリペプチド変異体、例えば本明細書の他所に詳細に記載されるものは、メチロトローフＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現される。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける大部分外来遺伝子の発現は、以下の３つの基本的な工程に従って行われ得る：キャリア又は標的ポリペプチドをコードする遺伝子の発現ベクターへの挿入；発現ベクターのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムへの導入；及び外来遺伝子により発現されたキャリア又は標的ポリペプチド変異体の産生について推定発現株の分析（このための方法は上で記載される）。幸運にも、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの分子遺伝子操作のための技術、例えば、ＤＮＡ媒介形質転換、遺伝子ターゲティング、遺伝子置き換え、及び機能的相補性によるクローニングは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについて記載されるものと同様である。しかしＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと対照的に、プラスミドはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて不安定であり、そして目的のタンパク質をコードする発現構築物は、代わりに相同組み換えによりＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノム中に組み込まれる。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの分子遺伝子操作のためのプロトコルは、例えば、Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．（１９８５）「Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ａｓ ａ ｈｏｓｔ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」Ｍｏｌｅｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ５：３３７６−３３８５；Ｌｉｎ−Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｖｏｌ．２３ １st Ｅｄ．Ｅｄ．Ｊａｎｅ Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ＮＹ：（２００５）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｃｒｅｇｇ．Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１st Ｅｄ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９８）；Ｌｉｎ−Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２４：４５−６６、及びこれらに引用される参考文献において詳細に考察されている。
種々のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主株及び発現ベクターが利用可能である。実質的に全てのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現株がＮＲＲＬ−Ｙ １１１４３０（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐｅｏｒｉａ、ＩＬ）に由来する。大部分の発現株は、適切な相補性マーカーを含む発現ベクターの選択を可能にする１つ又はそれ以上の栄養要求性マーカーを有する。宿主株は、ＡＯＸ１、ＡＯＸ２、又は両方の欠失のためにメタノールを代謝するそれらの能力が異なり得る。実際に、ＡＯＸ１及び／又はＡＯＸ２における変異を有する株は、野生型株よりも良好な外来タンパク質の産生株であり得る（Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）「Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：４７９−４８５；Ｃｈｉｒｕｖｏｌｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｉｎ ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ」Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ ２１：２７７−２８３）。それにもかかわらず、ａｏｘ１-株でさえＡＯＸ１プロモーターから高レベルの外来タンパク質の発現を誘導する能力を保持している。特定の組み換えタンパク質の発現がより有益であり得る宿主株（プロテアーゼ欠損宿主株を含む）のより詳細な情報は、例えば、Ｂｒｉｅｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）「Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−１（ＩＧＦ−１）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １０３：１４９−１７７；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）「Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ：ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｘｔｈ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｏｆ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ３８８」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ８：１１７７−１１８７において入手可能である。
大部分のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける維持のための複製起点、及び一方若しくは両方の生物において機能性である選択可能マーカー（例えばＡＲＧ４、ＨＩＳ４、ＡＤＥ１、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１）並びにＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて選択可能な特定の抗生物質（例えば、ＺｅｏｃｉｎTM及びＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標））、及び／又はＥ．ｃｏｌｉにおいて選択可能な多数の抗生物質耐性マーカーのいずれかを含有する、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓシャトルベクターとして設計されている。典型的には、発現ベクターは５’ＡＯＸ１プロモーター配列及び転写終結のためのＡＯＸ１誘導配列を含み、これらの間には、多重クローニング部位がある。ＡＯＸ１プロモーターは多数の外来タンパク質を発現させるために首尾よく使用されてきたが、このプロモーターの使用が適切でないかもしれない状況、例えば食品の製造がある。この発現系におけるＡＯＸ１プロモーターに対する代替のプロモーターは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸ２、ＩＣＬ１、ＧＡＰ、ＦＬＤ１、及びＹＰＴ１プロモーターである。上述のプロモーターのいずれかを含む発現ベクターの一般化された図解及び可能なベクター構成要素のリストも、例えばＬｉｎ−Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｖｏｌ．２３ １st Ｅｄ．Ｅｄ．Ｊａｎｅ Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ＮＹ：（２００５）及びＬｉｎ−Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ、ｅｔ ａｌ．（２０００）「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２４：４５−６６に示される。さらに、多くのベクターのＤＮＡ配列は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのウェブサイト（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）に見出され得、そしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから個別に、及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現キットで入手可能である。
一般的分子クローニング方法及び技術
例えば、目的の遺伝子、例えば、キャリアポリペプチド変異体又は標的ポリペプチド変異体をコードする遺伝子を、上記のような発現構築物にクローニングするための準備において核酸を単離、クローニング及び増幅するための手順は文献に十分にあり、例えば本発明において目的の遺伝子をメチロトローフ酵母、例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで提供及び発現させるために使用され得る。これらの技術のさらなる詳細は、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．）、Ｖｏｌ．１−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｒａｌｐｈ Ｒａｐｌｅｙ（ｅｄ）（２０００） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ（Ｒａｐｌｅｙ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、（２００７年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄ） ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌｕｍｅ １９２） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｉｎ Ｖｉｌｊｏｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＰＣＲ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；及びＤｅｍｉｄｏｖ ａｎｄ Ｂｒｏｕｄｅ（ｅｄｓ）（２００５） ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ、ＵＫにおいて見出され得る。例えば、細胞単離及び培養について、例えばその後の核酸単離についての他の有用な参考文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ、ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｌｅｙ− Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びここに引用される参考文献；Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ）（１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）並びにＡｔｌａｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ（ｅｄｓ） Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３） ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬが挙げられる。
多くのキットも、プラスミド又は細胞由来の他の関連核酸の精製用に市販されている（例えば、ＥａｓｙＰｒｅｐTM、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐTM、（両方ともＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから）；ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎTM（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから）；ＱＩＡｐｒｅｐTM（Ｑｉａｇｅｎから）を参照のこと）。単離及び／又は精製された核酸は、さらにそ操作されて他の核酸を生じ、細胞をトランスフェクトするために使用され、発現のために生物を感染させるために関連するベクターに組み入れられるなどされ得る。典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、転写及び翻訳開始配列、並びに特定の標的核酸の発現の調節に有用なプロモターを含む。ベクターは、少なくとも１つに独立ターミネーター配列を含有する遺伝子発現カセット、真核生物若しくは原核生物又は両方においてそのカセットの複製を可能にする配列（例えば、シャトルベクター）、並びに原核生物及び真核生物系の両方のための選択マーカーを場合により含む。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ及びＢｅｒｇｅｒを参照のこと。さらに、本質的にいずれの核酸も慣用又は標準的であり、種々の供給源（例えばＯｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ））のいずれかから注文することができる。
当然のことながら、例えば、直交性翻訳系をメチロトローフ酵母において使用する、化学的に反応性の非天然アミノ酸を含むキャリア及び／又は標的ポリペプチド変異体を構築する特定の方法が本明細書において詳述されるが、それらはかならずしも限定的と解釈されるべきではない。第一の反応性アミノ酸を含むキャリアポリペプチド変異体及び／又は第二の反応性アミノ酸を含む標的ポリペプチド変異体は、直交性翻訳系を使用して、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、哺乳動物細胞などにおいて構築され得る。さらに、他の、例えば非直交性の、非天然アミノ酸を有するキャリア及び／又は標的ポリペプチドを構築する方法もまた本明細書において多くの実施態様に含まれる。このような方法は、以下でさらに詳細に記載される。
非天然アミノ酸のキャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチドへの直接組み入れのための非直交性の方法
上述のように、本発明の種々の実施態様において、キャリアポリペプチド及び標的ポリペプチド又はキャリアポリペプチド変異体及び標的ポリペプチド変異体（それぞれ反応性の非天然アミノ酸を含み、これは他方の非天然アミノ酸と反応した場合に安定なキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を形成する）は、直交性翻訳系のような直接組み入れ方法により構築され得る。これは、部位特異的に非天然アミノ酸を組み入れられた、高収量の正確に折り畳まれ、かつ翻訳後修飾されたポリペプチドを産生する直交系の能力に起因して、好ましい実施態様に相当する。しかしあるいは、又はさらに、非天然アミノ酸のポリペプチド鎖中への直接組み入れのための他のストラテジーを使用して、第一及び第二の非天然アミノ酸をそれぞれキャリアポリペプチド変異体及び／又は標的ポリペプチド変異体中に導入することができる。当然のことながら、本明細書における典型的な実施態様において、非天然アミノ酸は、キャリア及び／又は標的ポリペプチド中にポリペプチドの構築の間に組み入れられるのであり、翻訳後の化学的誘導体化を介して加えられるのではない。
例えば、非天然アミノ酸を、例えばキャリア及び／又は標的ポリペプチド中に一次構築の間に組み入れるための１つの一般的なインビトロ生合成方法は、所望の非天然アミノ酸で化学的にアシル化されているナンセンス又はフレームシフトサプレッサｔＲＮＡを使用し、次いでこれをタンパク質生合成を支持し得る抽出物中に（ｔｏ ａｎ ｉｎ）加え、そしてこれは所望のアンバーナンセンス変異を含む遺伝子を含む。このストラテジーは、１００を超える非天然アミノ酸を、事実上任意のサイズの種々のタンパク質に部位特異的に組み入れるために使用されており、そして本明細書では非天然アミノ酸を含むキャリア及び／又は標的ポリペプチド変異体を作製するために使用され得る。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９５）「Ｐｒｏｂｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ」Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３４：６２１−６３３；Ｎｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１８２−１８８；ａｎｄ Ｂａｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）「Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」ＪＡＣＳ １１１：８０１３−８０１４を参照のこと。
他の実施態様において、非天然アミノ酸は、より小さなキャリア及び／又は標的ポリペプチド（６０〜１００個のアミノ酸の範囲）中に化学合成により直接組み入れられ得る。固相ペプチド合成は、非天然アミノ酸を含むペプチド及び小さなタンパク質を化学的に合成するために広く使用される方法であり（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ」ＪＡＣＳ ８５：２１４９−２１５４を参照のこと）、そしてこの方法は、反応して安定な接合体を生成し得る非天然アミノ酸を含むキャリア及び／又は標的ポリペプチドを製造するために適合され得る。この技術は典型的に２つの段階を含む：第一段階の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、保護されたアミノ酸誘導体を使用してポリマー支持体上でカップリング−脱保護を繰り返すサイクルによりペプチド鎖を組み立てることを含む。次いで固相に結合したペプチドの遊離Ｎ末端アミンを、単一のＮ保護アミノ酸単位、例えば非天然アミノ酸にカップリングさせ得る。次いでこの単位を脱保護して新しいＮ末端アミンをあらわにし、これにさらなるアミノ酸を付加し得る。通常ペプチドは段階的な方法により合成されているが、全ての可溶性試薬は、ペプチド固体支持体マトリックスから各カップリング工程の終わりにろ過し洗い流すことにより除去することができる。ＳＰＰＳの第二の段階において、ペプチドを支持体から切断し、そして側鎖保護基を除去して、ペプチド、例えば１つ又はそれ以上の非天然アミノ酸を含むキャリア又は標的ポリペプチドを生じる。固相ペプチド合成の２つの主な使用される形態がある：Ｆｍｏｃ（Ｃａｒｐｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９７２）「９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ａｍｉｎｏ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ」Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ ３７：３４０４−３４０９）、［ここでは塩基に不安定なアルファ−アミノ保護基が使用される］、及びｔ−Ｂｏｃ、［ここでは酸に不安定な保護基が使用される］。各方法は異なる樹脂並びにアミノ酸側鎖保護及び結果としての切断／脱保護工程を含む。ペプチド合成に関するさらなる詳細については、以下の刊行物及びその中に引用される参考文献を参照のこと：Ｃｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９６１）「Ｇｅｎｅｒａｌ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｎａｔｕｒｅ １９２：１２２７−１２３２；Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９６６）「Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＸＸＸＶＩ．Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐｙｒａｚｏｌｅ−Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｓ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ａｎ Ｓ−Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ1-3」ＪＡＣＳ ８８：５９１４−５９１９；Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ」Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ ２２：４７−５４；Ｎａｋａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）「Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｇｍｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｔｈｉｏｌｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ」ＪＡＣＳ １０９：３８０８−３８１０；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｄｏｖｅｔａｉｌｉｎｇ ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＨＩＶ ｐｒｏｔｅａｓｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ５０５４：２２１−２２５；Ｃｈａｉｋｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）「Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１：２５５−３０１；Ｏｆｆｏｒｄ（１９８７）「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅａｎｓ？」 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １：１５１−１５７；及びＪａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．「Ａ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｓｅ ｆｏｒ ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａ ｗｉｔｈ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ５１８４：２４３−２４７。
キャリアポリペプチド及び標的ポリペプチド変異体を接合するために使用され得る化学的カップリング反応
標的ポリペプチド変異体（例えば、治療用低分子ペプチド変異体）をキャリアポリペプチド変異体に化学的カップリングさせるための現在の方法は、非特異的試薬（例えば、グルタルアルデヒド又はカルボジイミド活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）から、キャリアポリペプチド−キャリアポリペプチド又は標的ポリペプチド−標的ポリペプチド接合体の形成を回避することができる高度に特異的なヘテロ二官能性架橋剤までに及ぶ。しかし、限られた数のアミノ酸しかこのような試薬で化学修飾することができない（例えば、アミン、ケト、チオール、スルフヒドリル、又はカルボキシル基を含むアミノ酸）。これらの試薬をキャリアポリペプチドの標的ポリペプチドへのカップリングで使用することにより、キャリアポリペプチド、標的ポリペプチド、又は結果として生じるキャリア−標的ポリペプチド接合体のコンホメーションが混乱し得、従って接合体の安定性、生物学的活性、薬物動態活性などが低減し得る。このような試薬を使用することにより、しばしば、キャリアポリペプチド−標的ポリペプチド複合体の不均質集団が結果として生成され得、これは分離することが困難であり得、製造効率を低減し、かつ品質管理を複雑化する。
対照的に、本発明の接合体は、例えばメチロトローフ酵母細胞において直交性翻訳系を使用してキャリアポリペプチド変異体中に組み入れられた第一の非天然アミノ酸を、標的ポリペプチド変異体中に組み入れられた第二の非天然アミノ酸と、直交性カップリング反応、例えば以下に記載される化学的連結反応のいずれか１つで反応させることにより生成される。これらの反応は、適切な反応条件に依存してインビトロでおこなわれてもインビボで行われてもよい。キャリア及び標的ポリペプチド変異体に存在する非天然アミノ酸のみが連結反応に参加するので、本発明の方法は、十分に確定されたキャリア−ポリペプチド−標的ポリペプチド接合体（例えば、規定された化学量論及び規定された連結部位を含む）の均質な集団を高い効率で生成するために、信頼して使用することができる。種々の化学的に反応性の（ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ）第一及び第二の非天然アミノ酸のいずれかが、それぞれキャリア及び標的ポリペプチド変異体に場合により組み入れられ得るので、キャリア−標的ポリペプチド接合体の生成は、特定の化学連結反応が進行し得る条件、例えば標的ポリペプチド変異体、キャリアポリペプチド変異体、又は生じたキャリア−標的接合体が不安定になり得る条件にのみ限定されるわけではない。さらに、既存の技術は、非天然アミノ酸をポリペプチド中の任意のアミノ酸位置への組み入れを有利に可能にする。従って、それぞれキャリア及び標的ポリペプチドにおける第一及び第二の化学的に反応性の非天然アミノ酸の配置は、場合により、例えば、その位置の配置が、キャリアポリペプチド、標的ポリペプチド、又は得られるキャリア−標的ポリペプチド接合体の、例えば、コンホメーション、生物学的活性、薬理活性、安定性、バイオアベイラビリティー、又は他の特性を変更するかどうかに基づいて選択され得る。
以下により詳細に記載される、１つの説明に役立つが非限定的な実施例において、ＨＳＡ中に組み入れられているｐ−アセチルフェニルアラニンを、ＡＢＴ−５１０中に組み入れられているε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンと、オキシム連結反応を介して反応させて、増加した血清半減期を有するＨＳＡ−ＡＢＴ−５１０接合体を得ることができる。当然のことながら、以下の実施例における説明は本発明の唯一の実施態様ではない。本明細書における記載から明らかなように、多種多様な化学連結反応のいずれかを使用して、第一の反応性非天然アミノ酸を含むキャリアポリペプチドを、第二の反応性非天然アミノ酸を含む標的ポリペプチドとカップリングさせることができ、ここでカップリングは第一の非天然アミノ酸と第二の非天然アミノ酸とを反応させることを伴う。
本発明の種々の実施態様において、第一及び第二の非天然アミノ酸を、場合により求電子剤−求核剤反応、オキシム連結反応、求核剤とケトンの反応、求核剤とアルデヒドの反応、カルボニル基と求核剤との間の反応、スルホニル基と求核剤との間の反応、エステル化反応、立体障害エステル基と求核剤との間の反応、チオエステル基と求核剤との間の反応、安定イミン基と求核剤との間の反応、エポキシド基と求核剤との間の反応、アジリジン基と求核剤との間の反応、求電子剤と脂肪族若しくは芳香族アミンとの間の反応、求電子剤とヒドラジドとの間の反応、求電子剤とカルボヒドラジドとの間の反応、求電子剤とセミカルバジドとの間の反応、求電子剤とチオセミカルバジドとの間の反応、求電子剤とカルボニルヒドラジドとの間の反応、求電子剤とチオカルボニルヒドラジドとの間の反応、求電子剤とスルホニルヒドラジドとの間の反応、求電子剤とカルバジドとの間の反応、求電子剤とチオカルバジドとの間の反応、求電子剤とヒドロキシルアミンとの間の反応、ヒドロキシル若しくはジオールのような一つ若しくは複数の求核剤とボロン酸若しくはエステルとの間の反応、遷移金属触媒反応、パラジウム触媒反応、銅触媒ヘテロ原子アルキル化反応、付加環化反応、１，３付加環化反応、２，３付加環化反応、アルキン−アジド反応、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応、又はＳｕｚｕｋｉカップリング反応のうちの１つ又はそれ以上により反応させる。これらの反応のいくつかは以下でさらに詳細に記載される。
オキシム連結
オキシム連結は、１０ｋＤより大きい分子量の制御された構造の合成高分子を生成する目的のために、非保護ポリペプチドの化学選択的連結において最初に使用された（Ｒｏｓｅ（１９９４）「Ｆａｃｉｌｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」ＪＡＣＳ １１６：３０−３３）。第一の工程において、アルデヒド基を有する精製されたポリペプチドと、アミノオキシ基を有する第二の精製されたポリペプチドを準備する。第二の工程において、これら２つのポリペプチドは、非常に穏やかな条件下でオキシム結合の形成により自発的に自己組織化する。生じたオキシムは水中で室温にてｐＨ２〜７で安定である。
以下の実施例に記載されるように、ＨＳＡ−ＡＢＴ−５１０接合体を、ＡＢＴ−５１０変異体中のε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジン残基のアミノオキシ基を、ＨＳＡ変異体中のｐ−アセチルフェニルアラニン残基のケト基とｐＨ＜５で反応させることにより製造した。アミノオキシ（ａｍｉｎｎｏｏｘｙ）基はケト基と選択的オキシム連結してε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンをｐ−アセチルフェニルアラニンに連結し、従ってＨＳＡをＡＢＴ−５１０に共有結合でカップリングする。
１，３−双極子付加環化反応
「クリック」ケミストリーとしても知られる１，３−双極子付加環化は、１，３−双極子と求双極子剤（例えば置換アルケン）との間の反応であり、５員環を形成する。１，３双極子付加環化の１つの有用な例は、アジド−アルキンＨｕｉｓｇｅｎ付加環化、例えば、アジドと末端又は内部アルキンとの間の１，３−双極子付加環化であり、１，２，３−トリアゾールを生じる。この銅（Ｉ）触媒反応は穏やかで非常に効率的であり、保護基を必要とせず、そして多くの場合には精製を必要としない（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ａ Ｓｔｅｐｗｉｓｅ Ｈｕｉｓｇｅｎ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ：Ｃｏｐｐｅｒ（Ｉ）−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｚｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ａｌｋｙｎｅｓ」 Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ４１：２５９６−２５９９）。この反応は求核置換ではなく付加環化を含むので、タンパク質は非常に高い選択性で修飾され得る。この反応は、触媒量のＣｕ（Ｉ）塩を反応混合物に加えることにより、室温にて水性条件で優れた位置選択性で（１，４＞１，５）行うことができる。例えば、Ｔｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ｐｅｐｔｉｄｏｔｒｉａｚｏｌｅｓ ｏｎ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ：［１，２，３］−ｔｒｉａｚｏｌｅｓ ｂｙ ｒｅｇｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｐｐｅｒ（ｉ）−ｃａｔａｌｙｚｅｄ １，３−ｄｉｐｏｌａｒ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｌｋｙｎｅｓ ｔｏ ａｚｉｄｅｓ」Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ ６７：３０５７−３０６４；ａｎｄ Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ａ Ｓｔｅｐｗｉｓｅ Ｈｕｉｓｇｅｎ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ：Ｃｏｐｐｅｒ（Ｉ）−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｚｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ａｌｋｙｎｅｓ」 Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ４１：２５９６−２５９９を参照のこと。アジド及びアルキン官能基は、生体分子及び水性環境に対して概して不活性であり、このことにより、アジド−アルキンＨｕｉｓｇｅｎ付加環化を例えばキャリアポリペプチドの標的ポリペプチドへのカップリングにおいて使用することが可能となる。トリアゾールは、天然に見出される遍在するアミド部分に対する類似性を有するが、アミドと異なり、切断感受性ではない。さらに、トリアゾール類に酸化や還元を行うのはほとんど不可能である。
Ｓｕｚｕｋｉカップリング反応
表面が露出した非天然アミノ酸を含む標的ポリペプチド変異体（又はキャリアポリペプチド変異体）とヨウ化アリールとを、パラジウム触媒Ｓｕｚｕｋｉカップリングにより表面が露出したボロン酸非天然アミノ酸残基（例えば、ｐ−ボロノフェニルアラニン、ｍ−ボロノフェニルアラニン、又はｏ−ボロノフェニルアラニン）を含むキャリアポリペプチド変異体（又は標的ポリペプチド変異体）に共有結合で結合することができる。この化学の説明については、例えば、Ｍｉｙａｕｒａ ａｎｄ Ｓｕｚｕｋｉ（１９９５）「Ｐａｌｌａｄｉｕｍ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｏｂｏｒｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」 Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９５：２４５７及びＳｕｚｕｋｉ（１９９９）「Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｒｏｓｓ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｏｂｏｒｏｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｗｉｔｈ ｏｒｇａｎｉｃ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅｓ、１９９５−１９９８，」 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５７６：１４７を参照のこと。ヨウ化アリールは、有機金属化学における種々の用途（シリル化、アミノカルボニル化、Ｈｅｃｋアリール化、ビニル化、アリーアセチレンとのクロスカップリング、及びその他の多くのものが含まれる）を有する反応性の基である。Ｓｕｚｕｋｉカップリング反応における非天然アミノ酸の使用に関するさらなる詳細は、米国特許出願第１２／２６２，０２５号、表題「Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｂｏｒｏｎａｔｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ」（２００８年１０月３０日出願）及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１８６８ 表題「Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｂｏｒｏｎａｔｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ」（２００８年１０月３０日出願）において詳述される。
銅触媒ヘテロ原子アルキル化反応
ボロネート基を含む非天然アミノ酸残基を含む標的ポリペプチド変異体又はキャリアポリペプチド変異体は、銅触媒ヘテロ原子アルキル化反応（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ｃｏｐｐｅｒ ｐｒｏｍｏｔｅｄ Ｃ−−−Ｎ ａｎｄ Ｃ−−−Ｏ ｂｏｎｄ ｃｒｏｓｓ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐｈｅｎｙｌ ａｎｄ ｐｙｒｉｄｙｌｂｏｒｏｎａｔｅｓ」Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４４：３８６３）、不斉還元（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ（２０００）「Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ ｗｉｔｈ ｂｏｒａｎｅ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｃｈｉｒａｌ ｏｘａｚａｂｏｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｌ−ａ−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３０：２４２３）、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応（Ｉｓｈｉｈａｒａ ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ（１９９９）「Ａｒｙｌｂｏｒｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｓ Ａｃｉｄ Ｃａｔａｌｙｓｔｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３：５２７−５３８）、さらには種々の他の変換に参加し得る。
キャリア又は標的ポリペプチド変異体の表面に存在するボロン酸非天然アミノ酸残基を使用して、アルコール基、ジオール、アミノ−アルコール、又はジアミン含有部分を含む対応する標的又はキャリアポリペプチド変異体上の非天然アミノ酸残基と可逆性ボロン酸エステルを形成することもできる。例えば、ボロン酸はジオールと可逆性共有結合複合体を形成する。この化学の初期の記載に関しては、Ｌｏｒａｎｄ ａｎｄ Ｅｄｗａｒｄｓ（１９５９）「Ｐｏｌｙｏｌ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｅｎｚｅｎｅｂｏｒｏｎａｔｅ Ｉｏｎ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４：７６９−７７４を参照のこと。可逆性複合体はアミノアルコール（Ｓｐｒｉｎｇｓｔｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）「Ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｓｅｎｓｏｒｓ ｆｏｒ Ｂｏｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄｓ」Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：２５９−２７０）、アミノ酸（Ｍｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｃｚａｒｎｉｋ（１９９４）「Ａｌｐｈａ−Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｌａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ Ａｒｙｌｂｏｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ．［書類に対する訂正がＣＡ１１９（１７）：１８１１７１ａで言及される］」ＪＡＣＳ １１６：２２３３；Ｍｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｃｚａｒｎｉｋ（１９９３）「Ａｌｐｈａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄ Ｃｈｅｌａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ Ａｒｙｌｂｏｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ，」 ＪＡＣＳ １１５：７０３７−７０３８）、アルコキシド（Ｃａｍｍｉｄｇｅ ａｎｄ Ｃｒｅｐｙ（２００４）「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｈｉｒａｌ ｂｉｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｓｕｚｕｋｉ ｒｅａｃｔｉｏｎ」Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ６０：４３７７−４３８６）、及びヒドロキサム酸（Ｌａｍａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９８０）「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｅｔ ａｃｉｄｉｔｅ ｄｅ ｃｏｍｐｏｓｅｓ ａ ａｔｏｍｅ ｄｅ ｂｏｒｅ ｅｔ ｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｅ ｈｙｐｅｒｃｏｏｒｄｏｎｎｅｓ」 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２９：１−２９）とも形成することができる。ボロン酸アミノ酸の化学的連結反応における有用性に関するさらなる詳細は、米国特許出願第１２／２６２，０２５号、表題「Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｂｏｒｏｎａｔｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ」（２００８年１０月３０日）；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１８６８ 表題「Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｂｏｒｏｎａｔｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ」（２００８年１０月３０日）；及びこれらで引用される参考文献に見出され得る。
［２＋３］付加環化反応
特定の実施態様において、第一の非天然アミノ酸を含むキャリアポリペプチド変異体を、第二の非天然アミノ酸を含む標的ポリペプチド変異体と［２＋３］付加環化によりカップリングすることができる。一実施態様において、第一の非天然アミノ酸はアルキニル又はアジド部分を含み、そして第二の非天然アミノ酸はアジド又はアルキニル部分を含む。例えば、第一の非天然アミノ酸はアルキニル部分を含み（例えば、非天然アミノ酸ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンにおいて）、そして第二の非天然アミノ酸はアジド部分を含む。別の例において、第一の非天然アミノ酸はアジド部分を含み（例えば、非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンにおいて）、そして第二の非天然アミノ酸はアルキニル部分を含む。非天然アミノ酸の［２＋３］付加環化反応における使用は、米国特許出願第１０／８２６，９１９号、表題「Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ Ａｄｄｉｔｉｏｎｓ」（２００４年４月４日出願）に記載される。
求電子剤−求核剤反応
いくつかの実施態様において、キャリアポリペプチド変異体（又は標的ポリペプチド変異体）中に組み入れられた非天然アミノ酸に存在する反応性基の１つは求電子性部分であり、そして標的ポリペプチド変異体（又はキャリアポリペプチド変異体）中に組み入れられた第二の非天然アミノ酸中に存在する反応性基は求核性部分である。求核性部分と反応して共有結合を形成する適切な求電子性部分は糖業者に公知である。このような求電子性部分としては、限定されないが、例えば、カルボニル基、スルホニル基、アルデヒド基、ケトン基、立体障害エステル基、チオエステル基、安定イミン基、エポキシド基、アジリジン基などが挙げられる。
求核剤と求電子剤との間の反応の生成物には、典型的には、元々例えば求核性部分に存在する原子が組み入れられている。いくつかの実施態様において、求電子剤はアルデヒド又はケトンであり、使用される求核性部分及びその求核性部分と反応する求電子性部分（例えば、アルデヒド、ケトン及び／又は同様のもの）に依存して、求核性部分を含む反応生成物は、例えばオキシム、アミド、ヒドラゾン、還元された（ｒｅｄｕｃｅｄ）ヒドラゾン、カルボヒドラゾン、チオカルボヒドラゾン、スルホニルヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、又は類似の官能基である。カルボン酸との連結は、典型的にはカルボヒドラジド又はヒドロキサム酸と呼ばれる。スルホン酸との連結は、典型的にはスルホニルヒドラジド又はＮ−スルホニルヒドロキシルアミンと呼ばれる。生じた連結は、その後化学的還元により安定化され得る。
アルデヒド及びケトンと反応して共有結合を形成し得る適切な求核性部分は当業者に公知である。このような求核剤としては、例えば、脂肪族又は芳香族のアミン類、例えばエチレンジアミンが挙げられる。他の実施態様において、非天然アミノ酸は、−ＮＲ1−ＮＨ2（ヒドラジド）、−ＮＲ1（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ2ＮＨ2（セミカルバジド）、−ＮＲ1（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ2ＮＨ2（チオセミカルバジド）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ1ＮＨ2（カルボニルヒドラジド）、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ1ＮＨ2（チオカルボニルヒドラジド）、−（ＳＯ2）ＮＲ1ＮＨ2（スルホニルヒドラジド）、−ＮＲ1ＮＲ2（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ3ＮＨ2（カルバジド）、−ＮＲ1ＮＲ2（Ｃ＝Ｓ）ＮＲ3ＮＨ2（チオカルバジド）、又は−Ｏ−ＮＨ2（ヒドロキシルアミン）、［ここでＲ1、Ｒ2、及びＲ3はそれぞれ独立して、Ｈ、又は１〜６個の炭素を有するアルキルであり、好ましくはＨである］のような反応性基を含み得る。本発明の一局面において、反応性基は、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、カルボヒドラジド又はスルホニルヒドラジドである。
さらに他の反応化学も本発明での用途を見出し、これらとしては、限定されないが、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ連結及びオレフィンメタセシス化学が挙げられる（例えば、Ｍａｈａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１１２５−１１２８を参照のこと）。多くの他のカップリング化学もまた適用可能であり、そしてキャリア及び標的ポリペプチドに組み入れられる非天然アミノ酸に依存して使用され得る。このような反応は当業者（ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｓｋｉｌｌ ｉｎ ｔｈｅ ａｒｅ）に周知であり、そして例えば、Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６−７７９；Ｌｅｍｉｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９９８）「Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｓ」ＴＩＢＳ １６：５０６−５１３；Ｋｎｉｐｅ、Ｃｈｒｉｓ．Ｏｒｇａｎｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ、２００４．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ、２００４；及びその他においてさらに詳細に記載される。
医薬組成物及びそれらの投与
本発明のキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体は場合により、例えば適切な製薬用担体と組み合わせて、治療用途に使用される。このような組成物は、例えば治療有効量の本接合体、及び薬学的に許容しうる担体又は賦形剤を含む。このような担体又は賦形剤としては、限定されないが、生理食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及び／又はそれらの組み合わせが挙げられる。製剤は、投与様式に適するように作製される。一般に、タンパク質を投与する方法は当該分野で周知であり、本発明の接合体の投与に適用され得る。
本発明の１つ又はそれ以上のキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を含む治療用組成物は場合により、当該分野で周知の方法にしたがって、有効性、組織代謝を確認するため、そして投薬量を推定するために、１つ又はそれ以上の適切なインビトロ及び／又はインビボの疾患動物モデルにおいて試験される。特に、投薬量は、非接合標的タンパク質に対する本明細書における非天然物（ｕｎｎａｔｕｒａｌ）の活性、安定性又は他の適切な尺度により（例えば、キャリアポリペプチド−標的ペプチド接合体、例えばＨＳＡ−ＴＳＰ−１接合体（又はＨＳＡ−ＡＢＴ−５１０接合体）の、ＨＳＡに接合しておらず、かついずれの非天然アミノ酸も含まないＴＳＰ（ＡＢＴ−５１０）に対する比較）、すなわち関連アッセイにおいて、最初に決定され得る。
投与は、分子を導入して最終的に血液又は組織細胞と接触させるために通常使用される経路のいずれかによる。本発明のキャリア−ペプチド／標的ポリペプチド接合体は、任意の適切なやり方で、場合により１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる担体と共に投与される。本発明の文脈における上記接合体の患者への適切な投与方法は利用可能であるが、１つより多くの経路を特定の組成物を投与するために使用することができ、特定の経路はしばしば、別の経路よりも迅速でより効果的な作用又は応答をもたらし得る。
薬学的に許容しうる担体は、部分的には投与される特定の組成物により、さらには組成物を投与するために使用される特定の方法により決定される。従って、本発明の医薬組成物の多種多様な適切な処方がある。薬学的に許容しうる担体及び賦形剤は当該分野で周知であり、そして本発明の１つ又はそれ以上の接合体は、周知の方法により医薬組成物へと製剤化され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（２００５）；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ ａｎｄ Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ、Ｅｄｓ．、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）；及びＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａ．Ｋｉｂｂｅ、Ｅｄ．、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照のこと）。
本発明のキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を、多数の経路により投与することができ、これらとしては、限定されないが：経口、静脈内、腹腔内、筋内、経皮、皮下、局所、舌下、又は直腸の手段が挙げられる。キャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を、リポソームを介して投与することもできる。このような投与経路及び適切な製剤は、当業者に一般的に知られている。
本発明の接合体は、単独で、又は他の適切な成分と組み合わせて、吸入により投与するためのエアロゾル製剤（すなわち、これらは「噴霧」され得る）に製造され得る。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などのような加圧された容認される噴霧剤中に入れることできる。
例えば、関節内（関節中）、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、及び皮下の経路のような、非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、及び製剤を対象のレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有し得る水性及び非水性の等張性滅菌注射液、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び保存料を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。包装された核酸の製剤は、単回用量又は複数回用量の密封された容器、例えばアンプル及びバイアル中で提供され得る。
非経口投与及び静脈内投与は、好ましい投与方法である。特に、キャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体治療に既に使用されている投与経路は、現在使用されている製剤と共に、本発明の接合体の好ましい投与経路及び製剤を提供する。
本発明の文脈において、患者に投与される用量は、適用に依存して、時間とともに患者において有益な治療応答を達成するため、又は例えば、病原体による感染を抑制するため、疾患状態の症状を低減若しくは予防するため、又は他の適切な活性を達成するために十分である。用量は、特定の組成物／製剤の有効性、並びに使用されるキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体の活性、安定性又は血清半減期、並びに患者の状態、さらには処置される患者の体重又は表面積により決定される。用量の大きさは、特定の患者における、特定の組成物／製剤の投与に伴ういずれかの有害な副作用の存在、性質及び程度などによっても決定される。
疾患（例えば、癌、遺伝性疾患、糖尿病、ＡＩＤＳなど）の処置又は予防において投与しようとする組成物／製剤の有効量を決定する際に、医師は、循環血漿レベル、製剤の毒性、疾患の進行、及び／又は関連する場合は抗非天然アミノ酸 ポリペプチド抗体の産生を評価する。
例えば７０キログラムの患者に投与される用量は、典型的には現在使用される治療用タンパク質の投薬量と同じ範囲内であり、関連するキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体の変更された活性又は半減期に対して調整される。本発明の組成物／製剤は、いずれかの公知の従来の治療（抗体投与、ワクチン投与、細胞傷害性薬物、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体、生物的反応修飾物質の投与などを含む）による処置条件を補完し得る。
投与について、本発明の接合体の製剤は、関連製剤のＬＤ−５０、及び／又は例えば患者の主要部（ｍａｓｓ）及び全体の健康に適用された場合に、種々の濃度でのキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体いずれかの副作用の観測により決定される程度で投与される。投与は、単回又は分割された用量により達成され得る。投与可能な組成物を製造するための一般的な方法は当業者に公知であり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（２００５）により詳細に記載される。
本発明の１つ又はそれ以上の接合体を含む製剤の注入を受けている患者が発熱、悪寒、又は筋痛を発生した場合、彼／彼女は適切な用量のアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン又は他の疼痛／熱制御薬を投与される。発熱、筋痛、及び悪寒のような注入に対する応答を経験する患者は、その後の注入の３０分前にアスピリン、アセトアミノフェン、又は例えば、ジフェンヒドラミンで前投薬される。メペリジンは、解熱剤及び抗ヒスタミン薬に迅速に応答しないより重篤な悪寒及び筋痛のために使用される。応答の重症度に依存して処置を遅くするか又は中断する。
種々の被験体が、本発明により提供されるキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体によりもたらされる治療的処置及び／又は予防的処置から恩恵を受け得る。ヒト、並びに限定されないが家畜、例えばウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、及び／又は他の一般的な家畜などのような動物に、本明細書に記載される接合体を含む組成物及び製剤を投与し得る。一般的な家庭のペット、例えばネコ、イヌ、オウム、インコなども治療的又は予防的なキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を投与されることから恩恵を受け得る。
生物医学的試験及び獣医学的処置における動物モデル及び動物被験体の使用に関するさらなる詳細は、例えば、Ｎｇ、Ｃｈｏｗ、ａｎｄ Ｏｇｄｅｎ、ｅｄｓ．Ｕｓｉｎｇ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ａ Ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ．Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ：Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、２００８；Ｃｏｎｎ、ｅｄ．Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００８；Ｗｏｏｄｈｅａｄ、ｅｄ．Ｎｏｎｍａｍｍａｌｉａｎ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｖｏｌ １）．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０において詳述される。また、例えば、Ａｄａｍｓ、ｅｄ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｅｉｇｈｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳＡ：Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、２００１；Ｋａｈｎ ａｎｄ Ｌｉｎｅ、Ｅｄｓ．Ｍｅｒｃｋ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳＡ：Ｍｅｒｃｋ、２００５；及びこれらに引用される参考文献も参照のこと。
本発明により提供されるキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体は、被験体、例えばヒトにおいて疾患状態を処置するためだけではなく、処置の有効性の試験、さらには代謝試験、毒性学試験、及びキャリアペプチド−標的ポリペプチド接合体の生殖機能若しくは胚毒性に対する作用を決定するため、又はそれらの発癌可能性を決定するための特定の試験を行うために投与され得る。このような観察に基づく研究を行うことは、種々の動物被験体への本発明の接合体の投与を必要とし得る。当業者は、本発明の接合体を含む組成物／製剤を投与される動物被験体の選択において役立つ多数の医学的試験及び判定に非常に詳しい。このような動物被験体としては、限定されないが、例えば、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、ウマ、ハムスター、非ヒト霊長類（カニクイザル、ヒヒ、旧世界ザル、及びチンパンジーを含むサル）、モルモット、ラット、マウス、及び／又はネコのような哺乳動物が挙げられる。鳥類、例えば、家禽（ニワトリ、シチメンチョウ）、オカメインコ、オウム科の鳥、並びにかご及び／又は鳥小屋で飼う鳥、さらには鳥胎仔もまた、本明細書により提供されるキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体の研究開発、製造、品質管理、又は安全試験に使用され得る。
魚類、例えばゼブラフィッシュ、プラティ、及びカブトガニ；両生類（例えばカエル及びサンショウウオを含む）；並びには虫類（ヘビ、とかげ、及びカメ）もまた、本明細書に記載される組成物及び／又はそれらの投与方法の安全性、有効用量、及び／又は毒性学を決定するための多種多様な試験において使用され得る。例えば、Ｂａｒｒｙ、ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｆｏｒ Ｒｅｐｔｉｌｅｓ、Ａｍｐｈｉｂｉａｎｓ、Ｆｉｓｈ、ａｎｄ Ｃｅｐｈａｌｏｐｏｄｓ Ｕｓｅｄ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、及びこれに引用される参考文献を参照のこと。
キット及び製品
キットも本発明の特徴である。例えば、キットは本発明により提供されるいずれか１つ又はそれ以上のキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を場合により含み得る。あるいは、又はさらに、キットは、第一の化学的に反応性の非天然アミノ酸を含むキャリアポリペプチド変異体及び／又は第二の化学的に反応性の非天然アミノ酸を含む標的ポリペプチド変異体（例えば、治療用低分子ペプチド）の合成のための試薬を含み得る。このような試薬としては、例えば、反応性の非天然アミノ酸、宿主細胞、例えば非天然アミノ酸を含むキャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチド変異体の産生に適した直交性翻訳系構成要素を含むメチロトローフ酵母細胞、本発明の接合体を生じる連結反応を行うための溶液、本発明の１つ又はそれ以上の接合体を含む治療用製剤を製造するための試薬、培地などが挙げられる。本発明のキットは、例えば、非天然アミノ酸を含むキャリアポリペプチド及び／又は標的ポリペプチドを発現することができるメチロトローフ酵母株を構築するため、化学的連結反応を行ってキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を生成するためなどの指示書のようなさらなる構成要素を含み得る。キットは、キットの構成要素を保持するための容器、本明細書におけるいずれかの方法又は方法のいずれかの組み合わせを実施するための教材、例えば化学的に反応性の非天然アミノ酸を選択されたアミノ酸位置に含む目的のキャリア及び／又は標的ポリペプチドを生成するための、キットと共に提供される細胞（例えば、メチロトローフ酵母細胞）を使用するための指示書を含み得る。
以下の実施例は、特許請求された発明を説明するために提供されるが、限定するものではない。本明細書に記載される実施態様は、説明に役立つ目的のみのためであり、それらを考慮した様々な改変又は変更は、当業者に示唆され、そして本出願の精神及び範囲、並びに添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されるということが理解される。
メチロトローフ酵母、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの遺伝子レパートリーの拡大
非天然アミノ酸でのタンパク質変異誘発の実用性を増大させるために、メチロトローフ酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける組み換え発現系を開発した。前もってＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて非天然アミノ酸に対して特異的であるようにしておいたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素／サプレッサｔＲＮＡ（ａａＲＳ／ｔＲＮＡCUA）対を、真核生物転写制御エレメント間に挿入し、そしてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノム中に安定に組み入れた。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉチロシル−及びロイシル−ＲＳ／ｔＲＮＡCUA対の両方がＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて直交性である
ことが示され、これらをアンバーコドンに応じて８つの非天然アミノ酸を高い収率及び忠実性で組み入れるために使用した。一例により、ケトアミノ酸（ｐ−アセチルフェニルアラニン）を含有する（図６ｂ、構造１）組み換えヒト血清アルブミン変異体がこの系において効率良く発現され得、そしてオキシム連結により、ε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジン残基を含有する治療用ペプチド模倣物に選択的に接合され得ることが示された。さらに、メチロトローフ酵母における非天然アミノ酸発現を、震盪フラスコ中過剰の１５０ｍｇ／Ｌで変異ヒト血清アルブミンを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて報告されているよりも良好な１桁多い大きさで発現させるように、ａａＲＳレベルの変調により体系的に最適化した。この方法論は、その発現が既存の系では実用的でない、非天然アミノ酸を含む複雑なタンパク質の高収量の産生を可能にするはずである。
近年、原核生物及び真核生物の両方において新規な特性（フルオロフォア、金属イオンキレート剤、光ケージ化及び光架橋する基、ＮＭＲ、結晶学的及びＩＲプローブ、並びに翻訳後修飾されたアミノ酸を含む）を有する多種多様な非天然アミノ酸を遺伝的にコードすることを可能にする方法論が開発された（Ｘｉｅ＆Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００６）「Ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｏｏｌｋｉｔ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−−ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ」Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７：７７５−７８２；Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−９６７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ」Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ ３５：２２５−２４９）。これは、所望の非天然アミノ酸をナンセンスコドン又はフレームシフトコドンに応じて選択的に挿入するよう設計された、直交性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素／サプレッサｔＲＮＡ（ａａＲＳ／ｔＲＮＡCUA）対の開発により達成される。これまでこの方法論は、４０より多くの非天然アミノ酸をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びいくつかの哺乳動物細胞系統の遺伝子レパートリーに加えるために使用されてきた（Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−９６７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ」Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ ３５：２２５−２４９；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：２３９−２４４）。これらの系における直交性は、相異なるｔＲＮＡ同一性エレメントを有する直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡCUA対を、宿主アミノアシル化機構と移植されたａａＲＳ／ｔＲＮＡ対との間に交差アミノアシル化が起こらないように（一方で翻訳における機能は維持したまま）、宿主生物に移植することにより達成される。現在の系において、これにより、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシル−ＲＳ／ｔＲＮＡCUA対から誘導されたａａＲＳ／ｔＲＮＡCUA対をＥ．ｃｏｌｉにおいて使用して（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ 直交性ｔＲＮＡｓ」Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ８：８８３−８９０）及びＥ．ｃｏｌｉチロシル−又はロイシル−ＲＳ／ｔＲＮＡCUA対をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて使用して（Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−９６７；Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ」Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １０：５１１−５１９）又は哺乳動物細胞において使用して（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：２３９−２４４）、最も成功することが証明されている。次いで指向性進化（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を使用して、直交性ａａＲＳの特異性を、それが目的の非天然アミノ酸を認識し、かつ内因性アミノ酸を認識しないように変更する。
この方法論を細菌宿主において容易に発現されないタンパク質を大量に産生するために適用するために、組み換え系は、低コスト、拡張可能性、及び複雑な翻訳後修飾されたタンパク質を産生する能力を伴うことが所望される。１つのこのような宿主はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓであり、これはＥ．ｃｏｌｉの収率に匹敵する収率で哺乳動物タンパク質を産生することができる（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２４：４５−６６）。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、破傷風毒素フラグメントＣ（ＴＴＣ）、及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような治療用タンパク質は、 高密度発酵において＞１０ｇＬ-1の発現レベルを生じている（Ｓｈｅｋｈａｒ（２００８）「Ｐｉｃｈｉａ ｐｏｗｅｒ：Ｉｎｄｉａ’ｓ ｂｉｏｔｅｃｈ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｐｕｔｓ ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｙｅａｓｔ ｔｏ ｗｏｒｋ」Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １５：２０１−２０２；Ｃｌａｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）「Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔａｎｄｅｍ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） ９：４５５−４６０；Ｏｈｙａ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｂｙ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９０：８７６−８８７；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）「Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：４１１７−４１２５）。このような収率でタンパク質を産生するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの能力は、公知の最も高度に調節され、かつ最も強いプロモーターの１つであるそのアルコールオキシダーゼ１（ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ １）プロモーター（ＰAOX1）に起因する（Ｃｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）「Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ５：１７）。さらに、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにはＥ．ｃｏｌｉにおいて発現される治療用タンパク質に混入し得る内毒素が無く、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが生成するような抗原性のα１，３グリカン連結を生成しない（Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３）「Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） １１：９０５−９１０）。さらに、シアリル化の制御を含む、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるグリコシル化パターンを調節することが今や可能である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＩｇＧｓ ｉｎ ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４：２１０−２１５）。これらの理由から、本発明者らは、非天然アミノ酸がＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて遺伝的にコードされることを可能にする方法論の開発に着手した。ここで本発明者らは、８つの非天然アミノ酸が、この宿主において高い収率及び忠実性で発現された組み換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）中に部位特異的に導入されたことを報告する。
材料
本明細書に記載される実験を行うために使用されるＤＮＡプライマー（例えば、表１及び以下に列挙されるもの）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。以下に記載される構築物を製造するために使用される制限酵素をＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した。ｐＰＩＣ３．５ｋベクター（マップはｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｐｐｉｃ３．５ｋｐａｏ＿ｍａｎ．ｐｄｆで入手可能）並びに酵母適格性、形質転換、及び培地配合のプロトコルをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｐｙ Ｐｉｃｈｉａ発現キットバージョンＦマニュアル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ、Ｔ．、Ｖｏｌ．Ｋ１７５０−０１、Ｅｄｎ．Ｆ ８５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ９２００８；２００５））はｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｐｉｃｈｍｕｌｔｉ＿ｍａｎ．ｐｄｆで入手可能である。ＤＮＡはＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、又は示されている場合は、プラチナｐｆｘを使用するＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増幅した。ｒＨＳＡ遺伝子（受入番号ＢＣ０３４０２３）をＭａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）から得た。全てのＤＮＡ構築物を、ＤＮＡ配列決定（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）により確認した。二重栄養要求性Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株、ＧＳ２００（ｈｉｓ４、ａｒｇ４）、及びｐＢＬＡＲＧベクターは親切にもＪａｍｅｓ Ｃｒｅｇｇ研究室（Ｋｅｃｋ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）から贈与されたものであった。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ及びＥ．ｃｏｌｉの形質転換は、２及び１ｍｍのエレクトロポレーションキュベット（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用してＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で行った。タンパク質分析のためのＴｒｉｓ−グリシン（４−２０％）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＲＮＡをＰｕｒｅｌｉｎｋ ｍｉＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＲｉｂｏ−ｐｕｒｅ−ｙｅａｓｔキット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）に添付のプロトコル及び試薬により採取した。全ての相対的ゲルバンド密度をＰｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ２（Ａｄｏｂｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して決定した。
２遺伝子カセット発現系の設計
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて自発的に複製するプラスミドの相対的な不安定性に起因して（Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １０３：１−１５）、目的の標的遺伝子（例えば、ｒＨＳＡ）及びａａＲＳ／ｔＲＮＡCUA対が２つの別個のプラスミド上のカセットにおいてコードされ、そしてゲノムに安定に組み込まれている系を考え出した。図１は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてアンバー抑制のためのカセットを構築するために使用したベクターを示す。各プラスミド上の選択可能なマーカーは白い矢印で示されている。複製起点は黒い矢印で示される。プロモーター及び転写終結エレメントは縦縞の矢印で示される。二重栄養要求性Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＧＳ２００（ａｒｇ４、ｈｉｓ４）をタンパク質発現の宿主株として使用し、そして目的の遺伝子、例えば、ＨＳＡを市販のｐＰＩＣ３．５ｋプラスミド（ＨＩＳ４、ＧｅｎR）（図１ａ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ、Ｔ．、Ｖｏｌ．Ｋ１７５０−０１、Ｅｄｎ．Ｆ ８５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ９２００８；２００５））中に挿入した。
短寿命の治療用ポリペプチドの血清半減期を増大する融合タンパク質又はペプチドバイオコンジュゲート（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）の製造におけるその有用性を鑑みて、ｒＨＳＡをモデルタンパク質として使用した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ １−ａｌｂｕｍｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅ ｔｈｅ ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ」Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２：７５１−７５９；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｅｘｅｎｄｉｎ−４ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」Ｊ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ １４：５８８−５９５；Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ」Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １９：５６９−５７７）。ｒＨＳＡのＥ．ｃｏｌｉ及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現は、タンパク質の複雑なジスルフィド架橋に起因して実用的でない。しかし、このような翻訳後修飾をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓでは行うことができる。さらに、ＨＳＡの２４個のアミノ酸の哺乳動物「プレ−プロ」リーダー配列（図１ｅ）はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現と十分に適合性であり、成熟蛋白質の培地への排出を可能にする（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ（２００６）「Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ３４：５５−５９）。プレ−プロリーダーペプチドは、輸送の間に切断されて成熟蛋白質（例えば、ｒＨＳＡE37X）を生じる。配列番号１と比較してｒＨＳＡにおける３７番目の残基は、アンバーコドンに応じて組み入れられた非天然アミノ酸を示す。
最初に、ＧＳ２００を形質転換するために使用され得るｒＨＳＡWT及びｒＨＳＡE37Xをコードするカセットを準備した。ｐＰＩＣ３．５Ｋ−ｒＨＳＡ（野生型ｒＨＳＡ）構築物を以下のように製造した：野生型ｒＨＳＡ遺伝子をＭａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＩＨ）、遺伝子受入番号ＢＣ０３４０２３から入手した。ｐＰＩＣ３．５ｋ直線化（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ、Ｔ．、Ｖｏｌ．Ｋ１７５０−０１、Ｅｄｎ．Ｆ ８５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ９２００８；２００５））との適合性のために、ＢｇｌＩＩ部位を、修正したＱｕｉｋ Ｃｈａｎｇｅ変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）プロトコル（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）「Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｓｉｔｅ−ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２：ｅ１１５）によりプライマー（ＩＤＴ）：ＢｇｌＩＩ781について、−ＢｇｌＩＩ １Ｆ、５’−ＧＡＣ ＡＧＡ ＣＣＴ ＴＡＣ ＣＡＡ ＡＧＴ ＣＣＡ ＣＡＣ ＧＧＡ ＡＴＧ ＣＴＧ ＣＣＡ ＴＧ−３'及び−ＢｇｌＩＩ １Ｒ、５’−ＧＧＴ ＡＡＧ ＧＴＣ ＴＧＴ ＣＡＣ ＴＡＡ ＣＴＴ ＧＧＡ ＡＡＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＡＡＡ ＣＴＣ ＡＧＣ ＴＴＴ ＧＧＧ−３'、並びにＢｇｌＩＩ817について−ＢｇｌＩＩ ２Ｆ、５’−ＣＡＴ ＧＧＡ ＧＡＣ ＣＴＧ ＣＴＴ ＧＡＡ ＴＧＴ ＧＣＴ ＧＡＴ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＣＧ Ｇ−３'及び−ＢｇｌＩＩ ２Ｒ、５’−ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＧＴ ＣＴＣ ＣＡＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＡＴＴ ＣＣＧ ＴＧＴ ＧＧＡ Ｃ−３'を使用してｒＨＳＡから除去してｒＨＳＡWTを形成した。ｒＨＳＡWTを、プライマー：ＨＳＡ Ｆｏｒｗａｒｄ、５’−ＡＴＣ ＣＧＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＡＡ ＣＧＡ ＴＧＡ ＡＧＴ ＧＧＧ ＴＡＡ ＣＣＴ ＴＴＡ ＴＴＴ ＣＣＣ ＴＴＣ ＴＴＴ ＴＴＣ−３'及びＨＳＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ、５’−ＧＣＴ ＡＡＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＴＴ ＡＴＡ ＡＧＣ ＣＴＡ ＡＧＧ ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＡＣ ＴＴＧ ＣＡＧ Ｃ−３'を使用して増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）で消化し、そして同様に消化されたｐＰＩＣ３．５ｋベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ベクターマップはｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｐｐｉｃ３．５ｋｐａｏ＿ｍａｎ．ｐｄｆにおいて入手可能）に連結してｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡWT（又はｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡE37X、以下に記載されるとおり）を作製した。構築物をＤＮＡ配列決定により確認してＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増幅した。
Ｇｌｕ３７ＴＡＧ変異体ｒＨＳＡ（ｒＨＳＡE37X）構築物をＰＣＲ変異誘発により生成した。Ｇｌｕ３７コドンを、修正したＱｕｉｋ Ｃｈａｎｇｅプロトコール及びプライマー：Ｇｌｕ３７ Ｆ’、５’−ＧＡＴ ＴＧＣ ＣＴＴ ＴＧＣ ＴＣＡ ＧＴＡ ＴＣＴ ＴＣＡ ＧＣＡ ＧＴＧ ＴＣＣ ＡＴＴ ＴＴＡ ＧＧＡ ＴＣＡ Ｔ−３'及びＧｌｕ３７ Ｒ’、５’−ＧＴＴ ＴＴＴ ＧＣＡ ＡＡＴ ＴＣＡ ＧＴＴ ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＴＣ ＡＣＴ ＡＡＴ ＴＴＴ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＣＣ ＴＡＡ ＡＡＴ ＧＧ−３'を使用してアンバーコドンＴＡＧと置き換えた。Ｇｌｕ３７は溶媒がアクセス可能ならせんであり、これはこの部位に導入された化学的に反応性の非天然アミノ酸（すなわち、ｐ−アセチルフェニルアラニン、図６ｂ、構造１）に対するペプチドの接合を容易にし、かつ天然のタンパク質構造及び折り畳みを最小限にしか乱さない比較的嵩高い基の組み入れを確実にする。次いでｒＨＳＡE37Xをプライマー：ＨＳＡ Ｆｏｒｗａｒｄ、５’−ＡＴＣ ＣＧＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＡＡ ＣＧＡ ＴＧＡ ＡＧＴ ＧＧＧ ＴＡＡ ＣＣＴ ＴＴＡ ＴＴＴ ＣＣＣ ＴＴＣ ＴＴＴ ＴＴＣ−３'及びＨＳＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ、５’−ＧＣＴ ＡＡＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＴＴ ＡＴＡ ＡＧＣ ＣＴＡ ＡＧＧ ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＡＣ ＴＴＧ ＣＡＧ Ｃ−３'を使用して増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）で消化し、そしてＨＳＡWTについて上で記載したように、同様に消化されたｐＰＩＣ３．５ｋベクターに連結し、ＡＯＸ１プロモーター及びターミネーターの転写制御下にＨＳＡE37Xを配置した。ｒＨＳＡE37X構築物、ｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡE37Xを上記のように、ＤＮＡ配列決定により確認した。
ｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡE37X又はｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡWTの５’ＡＯＸ１プローモーターにおける直線化により、形質転換されたカセットの１つ又はそれ以上のコピーのゲノム組み込みが可能となり；一般的にはより多くのコピーは標的タンパク質をより高い全収率で生じる（Ｂｕｃｋｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．（１９９１）「Ｙｅａｓｔ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１０６７−１０７２）。このやり方での組み込みは、ＡＯＸ１遺伝子をインタクトなままにし、メタノールを迅速に利用する酵母の能力を維持する（Ｍｕｔ+表現型）。あるいは、遺伝子置き換えを、ＡＯＸ１遺伝子のいずれかの側で直線化して、ｐＰＩＣ３．５ｋベクターによるＡＯＸ１遺伝子の置き換えを生じることにより行うことができる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ、Ｔ．、Ｖｏｌ．Ｋ１７５０−０１、Ｅｄｎ．Ｆ ８５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ９２００８；２００５））。ＡＯＸ１を欠く酵母は、メタノール利用をより弱いＡＯＸ２遺伝子に依存し、これは表現型的にはｍｕｔsである。ｒＨＳＡの発現は一般的にはｍｕｔs酵母により行われるので（Ｋｕｐｃｓｕｌｉｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｂｙ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎｄ ｆｏｒｍａｌ ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｎ ＨＳＡ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｍｕｔ（Ｓ） ｓｔｒａｉｎ」Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｑ １９：９９−１０８）、ｐＰＩＣ３．５ｋ ＨＳＡE37X及びｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡWTを直線化し、そしてＡＯＸ１遺伝子を置き換えるために使用してＧＳ２００−ｒＨＳＡE37X又はＧＳ２００−ｒＨＳＡWTを得た（両方の系統はＨＩＳ４、ａｒｇ４、ＧｅｎR、ｍｕｔsである）。成功した形質転換体は、通常はヒスチジンを含まない最少培地プレート、及び０．２５ｍｇ／ｍＬまでのアミノグリコシド抗生物質Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）を含有する富栄養培地（ｒｉｃｈ ｍｅｄｉａ）プレートで増殖した。
ＧＳ２００をｐＰＩＣ３．５ｋ ＨＳＡE37X又はｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡWTカセットで形質転換するために、ｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡE37X又はｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡWT ２０μｇをＢｇｌＩＩ（ＮＥＢ）で直線化し、エタノール沈降により１０μｌまで濃縮し、新鮮な（ｆｒｅｓｈｌｙ）コンピテントＧＳ２００ ８０μｌに２ｍｍエレクトロポレーションキュベット（Ｆｉｓｈｅｒ）で加え、そしてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ設定（２０００Ｖ、２５μＦ、２００Ω）を用いてＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ）でエレクトロポレーションを行った。細胞を１ｍｌ冷１Ｍソルビトール中に回収した。回収した細胞２５０μｌを４ｍｇ ｍｌ-1 Ｌ−アルギニン（ａｒｇ）を追加した再生デキストロースＢａｃｔｏ寒天（ＲＤＢ）プレート（１５ｃｍ）上にプレーティングし、そして３０℃でインキュベートした。３日後、酵母ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）培地１ｍｌを含む９６ウェル２ｍｌブロック（Ｎｕｎｃ）培地中に採取し、そして終夜増殖させた（２９．２℃、３００ｒ．ｐ．ｍ．）。培養物を１：１００希釈し、そして１−２μｌのレプリカを、０．２５ｍｇ ｍｌ-1 Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＹＰＤ寒天プレート上にプレーティングして３０℃でインキュベートした。４日後、ＧＳ２００−ｒＨＳＡE37X形質転換体Ｇ３は良好な増殖を示し、選別してコンピテントにした。良好な増殖を示したＧＳ２００−ｒＨＳＡWTクローンも選別した。
直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡCUA対をゲノムに組み込むために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける最適化されたアンバー抑制及び組み換え過剰発現のために以前に開発した
Figure 0005959201
 ベクター（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）「Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７１：１１２−１２２）（図１ｂ）を一部変更した。前もってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで進化させた（ｅｖｏｌｖｅｄ）（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ａ ｎｅｗ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｖｉｖｏ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２、６７３５−６７４６）、ｐ−アセチルフェニルアラニン−（ｐＡｐａ、図６ｂ、構造１）特異的アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ｐＡｐａＲＳ）を、その発現について検定するために、アルコールデヒドロゲナーゼ１プロモーター（ＰADH1）とターミネーター（ＴADH1）の間にＨｉｓ6−タグと共に挿入した。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムへの組み込みのためにａａＲＳ／ｔＲＮＡCUA対を準備するため、ｐＡｐａＲＳを有する
Figure 0005959201
 ベクター（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）「Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７１：１１２−１２２）をＰＣＲにより増幅し、ＴＲＰ及び２μ起始領域を除いて、制限部位ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩをプライマー：ｐＥＳＣ Ｆ、５’−ＴＡＣ ＣＡＣ ＴＡＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＡＴ ＡＣＣ ＧＣＡ ＴＣＡ ＧＧＡ ＡＡＴ ＴＧＴ ＡＡＡ ＣＧＴ−３'及びｐＥＳＣ Ｒ、５’−ＧＴＧ ＡＧＧ ＧＣＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＴＴ ＣＴＧ ＴＡＡ ＡＡＡ ＴＧＣ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＡＴ ＴＣＴ ＴＴＧ ＴＴＴ Ｇ−３’を用いて加え、そしてＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩ（ＮＥＢ）で消化した。ＡＲＧ４コード領域をｐＢＬＡＲＧ（Ｊａｍｅｓ Ｃｒｅｇｇ研究室、Ｋｅｃｋ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ、ＣＡから贈与）からプライマー：ＡＲＧ４ Ｆ ｎｅｗ、５’−ＡＡＡ ＴＡＴ ＧＧＴ ＡＣＣ ＴＧＣ ＣＣＴ ＣＡＣ ＧＧＴ ＧＧＴ ＴＡＣ ＧＧＴ−３'及びＡＲＧ４ Ｒ ｎｅｗ、５’− ＣＡＴ ＴＴＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＧＴＧ ＧＴＡ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＴＧ ＴＡＣ ＣＧＧ ＴＴＴ ＡＣ−３'を用いて増幅し、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして同様に消化された
Figure 0005959201
 ＰＣＲ産物に連結して組み換え真核生物ＡＲＧ４ベクター、ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳを生成した。ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳをＰＣＲにより増幅し、ＰADH1−ｐＡｐａＲＳ−ＴADH1領域を除いて制限部位ＡｓｃＩ及びＡｆｌＩＩをプライマー：ｐＥＳＣ−ＡＯＸ−ＫＥＴＯ Ｆ、５’−ＡＴＣ ＧＴＡ ＣＴＴ ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＧＣ
ＧＴＡ ＣＴＣ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＣＡ ＡＣＣ ＡＴＴ ＴＣＣ−３'及びｐＥＳＣ−ＡＯＸ−ＫＥＴＯ Ｒ、５’−ＴＴＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＣＧ ＣＣＡ ＴＣＧ ＣＣＣ ＴＴＣ ＣＣＡ ＡＣＡ ＧＴＴ ＧＣＧ−３'を用いて加えた。構築物をサイズマッピング及び配列決定により確認した。
５’ＣＣＡを欠いた同族Ｅ．ｃｏｌｉ
Figure 0005959201
 を３つのタンデム反復としてホスホグリセレートキナーゼ１プロモーター（ＰPGK1）の後方に挿入した。転写後プロセシングにおいて補助するために、ｔＲＮＡに酵母サプレッサｔＲＮＡ遺伝子、ＳＵＰ４からの領域を、以前に記載されたように隣接させた（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）「Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７１：１１２−１２２）。真核生物下流プロセシングにより、ｔＲＮＡ機能に必要な５’ＣＣＡが加えられた。
Figure 0005959201
 の２μ起点及びホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ｉｓｏｌｍｅｒａｓｅ）（ＴＲＰ）マーカーをアルギニノコハク酸分解酵素（ＡＲＧ４）コード領域で置き換えて組み換え真核生物ＡＲＧ４ベクター（ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳ）（図１ｃ）を得た。このカセットの増殖は、それが真核生物複製起点を欠いているためゲノム組み入れの場合にのみ可能である。ＧＳ２００−ｒＨＳＡE37X／ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳを作製するための形質転換を、Ｌ−ヒスチジン及びアルギニンを欠いたＲＤＢプレートに、回収した細胞をプレーティングしたことを除いて、コンピテントＧ３（例えばコンピテントＧＳ２００−ｒＨＳＡE37X形質転換体）を用いて上に記載されたプロトコルを使用して行った。３日後にコロニーを９６ウェル２ｍｌブロック中に採取し、そして０．２５ｍｇ ｍｌ-1Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）に対する耐性について上記ののように再スクリーニングした。ＧＳ２００−ｒＨＳＡWT／ｐＲＥＡＶ ＰADH1−ｐＡｐａＲＳ（ＨＩＳ４、ＡＲＧ４、ＧｅｎR、ｍｕｔs）を、同じやり方で作製してコロニーＦ２を単離した。従って、ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳのＡＲＧ４コード領域における直線化、及びその後のＧＳ２００−ＨＳＡE37X及びＧＳ２００−ＨＳＡWTへの形質転換により、十分に原栄養体性のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ２００−ＨＳＡE37X／ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳ及びＧＳ２００−ＨＳＡWT／ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳ系統をそれぞれ得た（両方の系統がＨＩＳ４、ＡＲＧ４、ＧｅｎR、ｍｕｔsである）。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるアンバー抑制
全てのタンパク質発現実験は、Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｐｙ Ｐｉｃｈｉａ発現キットにおいて見出されるｍｕｔsについてのプロトコルに従った（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ、Ｔ．、Ｖｏｌ．Ｋ１７５０−０１、Ｅｄｎ．Ｆ ８５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ９２００８；２００５））。ＧＳ２００−ｒＨＳＡE37X／ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳ又はＧＳ２００−ｒＨＳＡWT／ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳについて１４のコロニーを、０．２５ｍｇ ｍｌ-1 Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）を含有するプレートから採取し、そして飽和近く（ＯＤ600≒１２−１８）まで緩衝化グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）１０ｍｌ中で増殖させた（２９．２℃、３００ｒ．ｐ．ｍ．）。培養物を１５００ｇで遠心分離し（１０分）、そして緩衝化メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）２ｍｌ中に２ｍＭ ｐＡｐａアミノ酸（ＳｙｎＣｈｅｍ、Ｄｅｓ Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ）と共に再懸濁した。メタノールを０．５％まで２４時間ごとに補給しながら増殖を６日間続けた。培地又は滅菌水２００μｌ（１０％培養体積）を、蒸発分に相当するように２４時間ごとに加えた。培地５０μｌを２４時間ごとに取り出し、そして３０００ｇでの遠心分離（５分）により細胞を除いた。清澄化した培地２５μｌをＳＤＳローディングバッファ１２．５μｌ中に加え、１分間９５℃で加熱し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で展開した（１５０Ｖ１時間）。
アンバー抑制は、メタノール及びｐＡｐａアミノ酸（ｐＡｐａ ＡＡ）を用いて増殖されたの両方のベクターを含む酵母においてのみ起こる。ＧＳ２００−ＨＳＡWT／ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳから単離されたクローンは、メタノール誘導条件下で増殖させた場合に２〜３日後に、クーマシー染色（４０％メタノール、１０％酢酸、５０％水、０．１％（ｗ／ｖ）クーマシーブリリアントブルーＲ２５０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））によりドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル−電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲル上で可視化される全長ｒＨＳＡWT（６６．５ｋＤａ）を産生した。ｒＨＳＡWTの発現は６日後がピークであった。ＧＳ２００−ｒＨＳＡWT／ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳについてのクローンＦ２−ｗｔは最も高い発現を示し、そしてこれをさらなる比較に使用した。対照的に、ＧＳ２００−ＨＳＡE37X／ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳからのクローンは、主要炭素源としてのメタノール及びｐＡｐａアミノ酸補給とともに６日間増殖させた場合に全長ｒＨＳＡE37pApaを産生しなかった（例えば、図２ｂ；レーン２はＧＳ２００であり；レーン３はＧＳ２００−ＨＳＡE37Xであり；レーン４はＧＳ２００−ｐＲＥＡＶ−ＰAOX1−ｐＡｐａＲＳであり；レーン５−７はＧＳ２００−ＨＳＡE37X／ｐＲＥＡＶ−ＰAOX1−ｐＡｐａＲＳであり；そしてレーン８はＧＳ２００−ＨＳＡWT／ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳである）。
全ての構築物のゲノム組み込みをゲノムＰＣＲで確認した（図７；４つのクローンを１つの形質転換から選択し、１〜４とラベルをつけた）。期待されたＰＣＲ産物はｒＨＳＡ（１８５１ｂｐ）、ｐＡｐａＲＳ（１３１７ｂｐ）、及びｔＲＮＡカセット（１１００ｂｐ）であった。クローン２においてｐＡｐａＲＡ増幅が欠けているのは技術的な人為的なものと思われる。図２ａの下側のゲルは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ＋ｐＰＲ１−ＰPGK1−３ＳＵＰ４−ｔＲＮＡ（レーン１）及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ＋ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳ（レーン２）におけるｔＲＮＡCUA発現を検定するために行ったノーザンブロットの結果を示す。ネガティブコントロールについては、レーン３及び４はそれぞれベクターを欠いているＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓであった。図２ａの上側のゲルは、内因性セリンｔＲＮＡについてのノーザンブロットを示し、そして全てのサンプルにおける同等のｍｉＲＮＡ製造を説明する。
簡単には、ｔＲＮＡCUAの転写を確認するためのノーザンブロットを以下のように行った：２つのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓクローン、Ｇ３−２及びＧＳ２００、並びに２つのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅクロン、ＳＣＹ４−ｐＰＲ１−ＰPGK1＋２ＳＵＰ４−ｔＲＮＡ、及びＳＣＹ４をそれらの個別の条件下で増殖させ、そしてミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を採取した。各サンプルからのＲＮＡ ２μｇを６％ Ｎｏｖｅｘ ＴＢＥ−尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードし、そして１８０Ｖで１時間展開した。ＲＮＡをＢｉｏｄｙｎｅ Ｂナイロン膜（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に０．５ｘＴＢＥ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でＸＣｅｌｌ ｓｕｒｅｌｏｃｋ ｍｉｎｉ−ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び添付のプロトコルを使用して移した。これらの膜をＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて自己架橋させた。ハイブリダイゼーション及び検出を、Ｎｏｒｔｈ２Ｓｏｕｔｈ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に見出されるプロトコル及び試薬を用いて行った。１つのブロットをｔＲＮＡserに特異的なビオチン化プローブ：ｔＲＮＡｓｅｒ ｃｅｒｅ １、５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＣＡＴ ＴＴＣ ＡＡＧ ＡＣＴ ＧＴＣ ＧＣＣ ＴＴＡ ＡＣＣ ＡＣＴ ＣＧＧ ＣＣＡ Ｔ−３'、ｔＲＮＡｓｅｒ ｃｅｒｅ ２、５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＧＡＡ ＣＣＡ ＧＣＧ ＣＧＧ ＧＣＡ ＧＡＧ ＣＣＣ ＡＡＣ ＡＣＡ ＴＴＴ ＣＡＡ Ｇ−３'、ｔＲＮＡｓｅｒ ｐｉｃｈ １、５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＣＴＧ ＣＡＴ ＣＣＴ ＴＣＧ ＣＣＴ ＴＡＡ ＣＣＡ ＣＴＣ ＧＧＣ ＣＡＴ ＣＧＴ Ａ−３'、ｔＲＮＡｓｅｒ ｐｉｃｈ ２、５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＡＣＡ ＣＧＡ ＧＣＡ ＧＧＧ ＴＴＣ ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＣＧ ＣＧＧ ＧＣＡ ＧＡＧ Ｃ−３'とともにインキュベートし、そして第二のブロットを
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 に特異的なビオチン化プローブ：ｔＲＮＡ ５’ ｂｉｏｔ、５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＧＧＡ ＡＧＧ ＡＴＴ ＣＧＡ ＡＣＣ ＴＴＣ ＧＡＡ ＧＴＣ ＧＡＴ ＧＡＣ ＧＧ−３'及びｔＲＮＡ ３’ ｂｉｏｔ、５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＣＴ ＧＣＴ ＣＣＣ ＴＴＴ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＣＧ ＧＧＡ ＡＣＣ ＣＣＡ ＣＣ−３'と共にインキュベートした。プローブを終夜５５℃でインキュベートし、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合体に結合させて、ルミノール／エンハンサー−安定な過酸化物溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出した（図２ａ）。相対的なｔＲＮＡの量をバンドの密度から決定した。図２の結果は、ｔＲＮＡCUAの転写がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける同じカセットよりもＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ＋ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳにおいて約１．５倍高いということがノーザンブロット分析によりわかったということを示す（図２ａ）。
これらの結果にもかかわらず、ｐＡｐａＲＳは、ＧＳ２００−ＨＳＡE37X／ｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳ株におけるＨｉｓ6x−についてはウェスタンブロットにより検出可能ではなかった（図８）。単一の形質転換からの４つの別々のクローンを試験した。これらの結果は、アンバー抑制がないことがｐＡｐａＲＳの不十分な組み入れと関連付けられるということを示した。（ウェスタンブロットは本明細書の他所に記載されるように行った）。
ｐＡｐａＲＳの不十分な発現に対処するため、強力なＰAOX1プロモーターでｐＡｐａＲＳの発現が促進されるようにｐＲＥＡＶを改変し、そしてＫｏｚａｋ コンセンサス配列（ＡＣＣＡＴＧＧ）（Ｋｏｚａｋ（１９９０）「Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｔｏｒ ｃｏｄｏｎｓ ｂｙ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：８３０１−８３０５）をｐＡｐａＲＳ遺伝子の５’末端に加えることによりｐＡｐａＲＳ発現をさらに増強した。最終構築物ｐＲＥＡＶ−ＰAOX1−ｐＡｐａＲＳ（図１ｄ）において、ＡＤＨ１ターミネーター（ＴADH1）もまたＡＯＸ１ターミネーター（ＴAOX1）で置き換えた。ｐＲＥＡＶ−ＰAOX1−ｐＡｐａＲＳを作製するために、ＡＯＸ１プロモーター及びターミネーター配列をｐＰＩＣ３．５ｋから誘導した。ｐＡｐａＲＳをプライマー：ＫＥＴＯ−Ｋｏｚ−Ｆ、５’−ＴＴＣ ＴＧＡ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＣＡ ＡＧＣ ＡＧＴ ＡＡＣ ＴＴＧ ＡＴＴ ＡＡＡ ＣＡＡ ＴＴＧ Ｃ−３'及びＫｅｔｏＲＳ Ｒ ６ｘＨｉｓ、５’−ＴＡＧ ＧＣＴ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＴＴ ＡＧＴ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＴＣＣ ＡＧＣ ＡＡＡ ＴＣＡ ＧＡＣ ＡＧＴ ＡＡＴ ＴＣＴ ＴＴＴ ＴＡＣ−３'を用いて増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ（ＮＥＢ）を用いて消化し、そして同様に消化したｐＰＩＣ３．５ｋに連結してｐＰＩＣ３．５ｋ−ｐＡｐａＲＳを作製した。ＰAOX1−ｐＡｐａＲＳ−ＴAOX1コード領域をｐＰＩＣ３．５ｋ−ｐＡｐａＲＳからプライマー：ｐＰＩＣ−ｋｅｔｏ ＡＯＸ５ Ｆ、５’−ＡＴＣ ＧＴＡ ＣＴＴ ＡＡＧ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＡＣ ＡＴＣ ＣＡＡ ＡＧＡ ＣＧＡ ＡＡＧ ＧＴＴ ＧＡＡ ＴＧＡ ＡＡＣ−３'及びｐＰＩＣ−ｋｅｔｏ ＡＯＸＴＴ Ｒ、５’−ＴＧＣ ＡＣＡ ＧＧＣ ＧＣＧ ＣＣＡ ＡＧＣ ＴＴＧ ＣＡＣ ＡＡＡ ＣＧＡ ＡＣＴ ＴＣＴ ＣＡＣ ＴＴＡ ＡＴＣ ＴＴＣ−３'を用いて増幅し、ＡｓｃＩ及びＡｆｌＩＩ（ＮＥＢ）で消化し、そして 同様に消化したｐＲＥＡＶ−ＰADH1−ｐＡｐａＲＳ ＰＣＲ産物に連結してｐＲＥＡＶ−ＰAOX1−ｐＡｐａＲＳを作製した。構築物を上記のように、サイズマッピング及び配列決定により確認した。
ＧＳ２００−ｐＲＥＡＶ−ＰAOX1−ｐＡｐａＲＳ（ｈｉｓ４、ＡＲＧ４、ＧｅｎR、ｍｕｔs）系統を、ｐＲＥＡＶ−ＰAOX1−ｐＡｐａＲＳをＧＳ２００に形質転換することにより構築したが、４ｍｇ ｍｌ-1ヒスチジンを追加したＲＤＢプレートにプレーティングし、そしてＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）耐性についてはさらにスクリーニングしなかった。ＧＳ２００−ｒＨＳＡE37X／ｐＲＥＡＶ−ＰAOX1−ｐＡｐａＲＳ（ＨＩＳ４、ＡＲＧ４、ＧｅｎR、ｍｕｔs）を作製するための形質転換を、回収した細胞をＬ−ヒスチジン（Ｈｉｓ）及びＡｒｇを含まないＲＤＢプレートにプレーティングしたこと以外は上記のプロトコールを使用してコンピテントＧ３（例えば、ＧＳ２００−ｒＨＳＡE37X）を用いて行った。この形質転換からのクローンは、メタノール及びｐＡｐａアミノ酸の存在下でのみ、ｒＨＳＡWTを含む同一クローン約１０〜２０％のレベルで全長ｒＨＳＡE37pApaを産生した。タンパク質は、メタノール誘導の２〜３日後にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより可視化され、そして０．５％までのメタノール補給を２４時間ごとに行いながら、発現の６日後がピークであった（図２ｂ）。ｐＲＥＡＶカセット、ｐＰＩＣ３．５ｋカセット、メタノール補給、又はｐＡｐａアミノ酸の無い酵母は、クーマシー染色で検出可能なタンパク質を産生できなかった。ｐＡｐａアミノ酸の不在下でタンパク質発現が無いことは、交差アミノアシル化が
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 対と内因性アミノアシル化機構との間で起こらないことを示している。ｐＡｐａのｒＨＳ
ＡE37Xへの部位特異的組み入れをトリプシン消化、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより確認した（図２ｃ）。ｐＡｐａ（図２ｃにおいてＥ＊と示される）を成熟ｒＨＳＡE37pApaの残基３７に組み入れた。この置換はフラグメントイオン系列が観測されたことにより明確に支持される。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行うために十分なｒＨＳＡE37pApaタンパク質を発現させるために、上記のタンパク質発現分析条件を変更した。簡単には、１ＬのＢＭＧＹにＹＰＤ中の飽和Ｇ３−２培養物２０ｍｌを播種し、ＯＤ600≒１２−１８まで増殖させた（約２４時間、２９．２℃、３００ｒ．ｐ．ｍ．）。培養物を１５００ｇで遠心分離し、そして１０％ＢＭＭＹ及び２ｍＭ ｐＡｐａを追加された緩衝化最少メタノール（ＢＭＭ）２００ｍｌ中に再懸濁した。増殖（２９．２℃、３００ｒ．ｐ．ｍ．メタノール及び体積補充をしながら）の６日後に培養物を３０００ｇで遠心分離し、細胞を廃棄し、そして上清を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に通した。上清にＮＨ4ＳＯ4をゆっくりと撹拌しながら４℃で飽和の５０％まで（５８．２ｇ）加えて硫酸アンモニウム（ＮＨ4ＳＯ）沈降させて、２０，０００ｇで２０分間遠心分離し、そして再びＮＨ4ＳＯ4を飽和の７５％まで（３１．８ｇ）加え、そして２０，０００ｇで２０分間遠心分離した。二度目の沈殿はｒＨＳＡE37pApaを含有しており、これをＦＰＬＣ緩衝液Ａ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、ＣＨ）、ｐＨ＝８．５）に再懸濁した。再可溶化されたタンパク質をＭｏｎｏＱ ５／５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ ＦＰＬＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で精製した（２０−３５％緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋１ Ｍ ＮａＣｌ）で溶出）。フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析して混合し、３０ ＭＷＣＯ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＰＢＳに対して透析し、そしてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ ＦＰＬＣで精製した（ＰＢＳ中０．５ｍｌ ｍｉｎ-1で１４分後に溶出）。フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析し、混合し、そしてＣ８ Ｖｙｄａｃ ＨＰＬＣカラム（３００ｍｍ、２００Å、５μｍ、Ｇｒａｃｅ）を用いてＤｙｎａｍａｘ ＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ、Ｏａｋｌａｎｄ）で精製した（水中４０−４６％ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡで溶出）。フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、そしてｒＨＳＡE37pApaを含有するフラクションを急速冷凍し、そして凍結乾燥して白色粉末とした。Ｆ２−ｗｔからのｒＨＳＡWTの精製を類似のやり方で行った。
トリプシン消化及びナノ−ＲＰ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行うために、精製したｒＨＳＡE37Xをトリプシンを用いて終夜還元条件下（１０ｍＭ ＴＣＥＰ、１ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭトリエタノールアミンＨＣｌ、ｐＨ＝７．８）で消化した。消化物をＳｅｐ−Ｐａｋ、Ｃ１８、（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いた逆相固相抽出により精製し、そして凍結乾燥した。システインのシステイン酸ヘの酸化及びメチオニンのメチオニンスルホンへの酸化を、凍結乾燥したペプチドを過ギ酸（９部の濃ギ酸＋１部の３０％Ｈ2Ｏ2）（Ｍａｔｔｈｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）「Ｕｓｅ ｏｆ ｐｅｒｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｔｏ ｅｘｐａｎｄ ｔｈｅ ｍａｓｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｙｐｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７６、６８４８−６８５２）とともに１時間氷上でインキュベートすることにより行った。過剰のメルカプトエタノールを加えることにより反応をクエンチし、水で２０ｘ希釈した。ナノ−ＲＰ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを、ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐハイブリッド質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を備えたＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて行った。トリプシン消化物をベント付きカラム設定（Ｌｉｃｋｌｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｎｏｓｃａｌｅ ｍｉｃｒｏｃａｐｉｌｌａｒｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｗｉｔｈ ａ ｖｅｎｔｅｄ ｃｏｌｕｍｎ」Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７４：３０７６−３０８３）のプレカラム（４ｃｍ、１００μｍ内径、５μｍ、Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｃ１８、Ｃｏｌｕｍｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）に約２μｌ 分-1の流量でロードした。１０分のロード／洗浄期間の後、グラジエント溶出を、プレカラムを直列の（ｉｎ ｌｉｎｅ）分析用カラム（１０ｃｍ、７５μｍ内径、５μｍ Ｃ１８）と切り替えることにより開始した。クロマトグラフィープロフィールは、１００％溶媒Ａ（０．１％酢酸水溶液）から５０％溶媒Ｂ（アセトニトリル中０．１％酢酸）を４０分で約１００ｎｌ分-1であった。データ依存ＭＳ／ＭＳ収集をトップ（ｔｏｐ）１０スキームにしたがって行い、ここで質量分析計は、最初に高分解能Ｏｒｂｉｔｒａｐスキャン（ｍ／ｚ ５００−２，０００）、続いて１０のデータ依存性ＭＳ／ＭＳスキャン（相対的衝突エネルギー＝３５％；３Ｄａ分離窓（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｗｉｎｄｏｗ））を記録するようにプログラムされていた。生データをＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ５１．６データベースに対してＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）を使用して、可変修飾としてｐＡｐａを含むタンパク質の同定のために検索した。
発現の最適化
ｒＨＳＡE37pApaの発現を最適化するために、ＧＳ２００−ｒＨＳＡE37X／ｐＲＥＡＶ−ＰAOX1−ｐＡｐａＲＳ（ＨＩＳ４、ＡＲＧ４、ＧｅｎR）急速メタノール利用（Ｍｕｔ+）変異体を、ｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡE37XをＡＯＸ１遺伝子座の５’領域（これはＡＯＸ１遺伝子の完全性を保持している）に挿入することにより作製した。このやり方でのゲノム挿入は、多量体化をもたらし得、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）耐性マーカー及び目的の遺伝子の両方のタンデムコピーを生じる（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２４：４５−６６）。ＧＳ２００−ｒＨＳＡE37X／ｐＲＥＡＶ−ＰAOX1−ｐＡｐａＲＳ（ＨＩＳ４、ＡＲＧ４、ＧｅｎR、Ｍｕｔ+）を作製するために、ｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡE37X ２０μｇをＳａｃＩ又はＳａｌＩ（ＮＥＢ）を用いて直線化し、そして以前に記載されるように新鮮なコンピテントＧＳ２００に形質転換した。細胞を冷１Ｍソルビトール１ｍｌ中に回収し、そして０．４ｍｇ ｍｌ-1アルギニンを追加したＲＤＢプレートにプレーティングした。コロニーを１ｍｌ ＹＰＤを含む２ｍｌ ９６ウェルブロック中に取り、飽和まで増殖させ（２９．２℃、３００ｒ．ｐ．ｍ．）、１：１００に希釈して、レプリカを０〜３．０ｍｇ ｍｌ-1Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）を含有するプレートにプレーティングした。１．０ｍｇ ｍｌ-1までのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）で生存していたクローン１Ｄ１２をコンピテントにし、ｐＲＥＡＶ−ＰAOX1−ｐＡｐａＲＳを用いて以前に記載されたように形質転換し、そしてＡｒｇ及びＨｉｓを含まないＰＤＢプレートにプレーティングした。コロニーを１ｍｌ ９６ウェルブロックに取り、飽和まで増殖させて、１：１００に希釈し、そしてＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）１．０ｍｇ ｍｌ-1プレートで再スクリーニングした。１４の生存しているクローンを選び、そしてｒＨＳＡE37pApa発現についてｐＡｐａアミノ酸及びメタノールの存在下で試験した。ｍｕｔsプロトコルを上記のように使用した。クローンＫ５は最も高いタンパク質発現を示し、試験発現におけるＧ３−２に匹敵していた（図９）。ＧＳ２００−ｒＨＳＡE37X／ｐＲＥＡＶ−ＰAOX1−ｐＡｐａＲＳ（ｍｕｔ+）培養物（図９、レーン１）及びＧＳ２００−ｒＨＳＡE37X／ｐＲＥＡＶ−ＰAOX1−ｐＡｐａＲＳ（ｍｕｔS）培養物（図９、レーン２）からの清澄化した培地２５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、そしてクーマシーで染色した。得られたクローンＫ５は、１ｍｇ ｍｌ-1までのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）に対する耐性を示したが；一方、上述のｍｕｔsクローンＧ３−２は０．２５ｍｇ ｍｌ-1を超えるＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）で死滅し、このカセットの複数のコピーの組み入れと一致した（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２４：４５−６６；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ９２００８；２００５）。メタノール及びｐＡｐａアミノ酸の存在下での単離されたクローンからの全長ｒＨＳＡE37pApa発現の分析により、ｍｕｔsカウンターパートよりも約１．５〜２．０倍多いタンパク質が産生されたことが示された（図９）。タンパク質の相対量はバンド密度により決定した。
ｒＨＳＡE37pApaの収率をさらに増加させるために、６つの異なるプロモーター（ＰAOX1を含む）を、ｐＲＥＡＶベクターにおけるｐＡｐａＲＳ転写を促進するそれらの能力について比較した。転写ｍＲＮＡレベル、ｐＡｐａＲＳタンパク質レベル、及び全体のｒＨＳＡE37pApa収率を検定した。酵母、ＧＴＰ結合タンパク質Ｉ（ＹＰＴ１）（Ｓｅａｒｓ
ｅｔ ａｌ．（１９９８）「Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｓｅｔ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」Ｙｅａｓｔ １４：７８３−７９０；Ｓｅｇｅｖ ｅｔ ａｌ．（１９８８）「Ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ＹＰＴ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ」Ｃｅｌｌ ５２：９１５−９２４）；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）（Ｃｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）「Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ５：１７；Ｗａｔｅｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｉｔｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ」Ｇｅｎｅ １８６：３７−４４）から誘導された２つの構成的プロモーター；アルコールオキシダーゼＩＩ（ＡＯＸ２）（Ｏｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）「Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸ２ ｇｅｎｅ」Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２４３：４８９−４９９）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼＩ（ＦＬＤ１）（Ｃｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）「Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ５：１７）；及びイソクエン酸リアーゼＩ（ＩＣＬ１）（Ｃｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）「Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ５：１７）由来の３つのメタノール誘導性プロモーターを、メタノール誘導とのそれらの適合性に基づいて選択した。２つのレプレッサ結合配列のうち１つを欠失させることによりプロモーターを増強するＰAOX2の切断バージョンを使用した（Ｏｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）「Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸ２ ｇｅｎｅ」Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２４３：４８９−４９９）。いくらか弱いＰYPT1及びＰGAPプロモーターの使用（Ｓｅａｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）「Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｓｅｔ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」Ｙｅａｓｔ １４：７８３−７９０）は、合成酵素の過剰産生が酵母に対して毒性であるか、又は細胞エネルギーをｒＨＳＡE37Xの産生から隔離する際に有用であり得る。
全てのプロモーターを、ＰＣＲによりＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡからそれらの非翻訳５’領域と共に増幅した（図１０）。ＰAOX2、ＰYPT1、ＰICL1、ＰFLD1、及びＰGAPを、ＰＣＲによりゲノムＤＮＡ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ２００）からそれぞれ以下のプライマーを使用して別々に増幅した：ＰＡＯＸ２ Ｆ、５’−ＧＴＡ ＴＣＧ ＣＴＴ ＡＡＧ ＴＣＣ ＡＡＧ ＡＴＡ ＧＧＣ ＴＡＴ ＴＴＴ ＴＧＴ ＣＧＣ ＡＴＡ ＡＡＴ ＴＴＴ ＴＧＴ Ｃ−３’及びＰＡＯＸ２ Ｒ、５’−ＣＧＴ ＴＡＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＴＴＴ ＴＣＴ ＣＡＧ ＴＴＧ ＡＴＴ ＴＧＴ ＴＴＧ ＴＧＧ ＧＧＡ ＴＴＴ ＡＧＴ ＡＡＧ ＴＣＧ−３'；ＰＹＰＴ１ Ｆ、５’−ＧＴＡ ＴＣＧ ＣＴＴ ＡＡＧ ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＧＴ ＣＡＣ ＡＡＴ ＣＴＧ ＣＴＴ ＣＣＡ ＣＡＧ ＡＣＧ ＡＧ−３'及びＰＹＰＴ１ Ｒ、５’−ＣＧＴ ＴＡＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＧＡＣ ＴＧＣ ＴＡＴ ＴＡＴ ＣＴＣ ＴＧＴ ＧＴＧ ＴＡＴ ＧＴＧ ＴＧＴ ＡＴＴ ＧＧＧ Ｃ−３'；ＰＩＣＬ１ Ｆ、５’−ＧＴＡ ＴＣＧ ＣＴＴ ＡＡＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＧＡ ＣＡＡ ＡＴＧ ＴＧＣ ＴＧＴ ＴＣＣ ＧＧＴ ＡＧＣ ＴＴＧ−３'及びＰＩＣＬ１ Ｒ、５’−ＣＧＴ ＴＡＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＴＣＴ ＴＧＡ ＴＡＴ ＡＣＴ ＴＧＡ ＴＡＣ ＴＧＴ ＧＴＴ ＣＴＴ ＴＧＡ ＡＴＴ ＧＡＡ ＡＧ−３'；ＰＦＬＤ１ Ｆ、５’−ＧＴＡ ＴＣＧ ＣＴＴ ＡＡＧ ＧＣＡ ＴＧＣ ＡＧＧ ＡＡＴ ＣＴＣ ＴＧＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＧＣＴ ＡＡＴ ＧＧ−３'及びＰＦＬＤ１ Ｒ、５’−ＣＧＴ ＴＡＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＴＧＴ ＧＡＡ ＴＡＴ ＣＡＡ ＧＡＡ ＴＴＧ ＴＡＴ ＧＡＡ ＣＡＡ ＧＣＡ ＡＡＧ ＴＴＧ Ｇ−３'；ＰＧＡＰ１ Ｆ、５’−ＧＴＡ ＴＣＧ ＣＴＴ ＡＡＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＴ ＴＴＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＡＴＧ ＴＣＴ ＴＧＧ ＴＧＴ ＣＣＴ ＣＧＴ Ｃ−３'及びＰＧＡＰ１ Ｒ、５’−ＣＧＴ ＴＡＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＴＧＴ ＧＴＴ ＴＴＧ ＡＴＡ ＧＴＴ ＧＴＴ ＣＡＡ ＴＴＧ ＡＴＴ ＧＡＡ ＡＴＡ ＧＧＧ ＡＣ−３'。図１０は、臭化エチジウム染色したゲルを１ｋｂ＋のはしご形（ｌａｄｄｅｒ）でＰＣＲ産物を挟んで示す。ＰＣＲ産物の期待される長さは、ＰＡＯＸ２ ３４２ｂｐ、ＰＹＰＴ１ ５０８ｂｐ、ＰＩＣＬ１ ６８３ｂｐ、ＰＦＬＤ１ ５９７ｂｐ、及びＰＧＡＰ ４９３ｂｐである。ＰＣＲで増幅されたフラグメントをＡｆｌＩＩ及びＮｃｏＩ（ＮＥＢ）で消化し、そして同様に消化されたｐＲＥＡＶ−ＰAOX1−ｐＡｐａＲＳに連結して（ＰAOX2コード領域をアガロースゲル精製により除去した後）、ｐＲＥＡＶ−ＰPromoter−ｐＡｐａＲＳを作製した。
配列を確認した後、各プロモーターをＰAOX1の代わりにｐＡｐａＲＳのｐＲＥＡＶベクター５’にクローン化し、そして以前に作製されたＭｕｔ+ ＧＳ２００−ＨＳＡE37Xに形質転換した。ターミネーターはＴAOX1のままであった。図３ａは、変更されるプロモーター領域を説明するｐＲＥＡＶ−ＰPromoter−ｐＡｐａＲＳの直線マップを提供する。プロモーターを（その結果が図７に示される実験のように）ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。プラスミド（以前に記載された構築物ｐＲＥＡＶ−ＰAOX1−ｐＡｐａＲＳと同様）をＡａｔＩＩで直線化し、新鮮なコンピテントＧＳ２００−ｒＨＳＡE37X（クローン１Ｄ１２）に形質転換し、そしてＧＳ２００−ｒＨＳＡE37X／ｐＲＥＡＶ−ＰPromoter−ｐＡｐａＲＳ（ＨＩＳ４、ＡＲＧ４、ＧｅｎR、Ｍｕｔ+）を作製するために以前に記載したように、Ａｒｇ及びＨｉｓを含まないＲＤＢプレートにプレーティングした。生存しているクローンをＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）耐性について０．７５及び１．０ｍｇ ｍｌ-1
でスクリーニングした。各プロモーターに対応する４８のクローンをＢＭＧＹを含有する１ｍＬ ９６ウェルブロックに取り、そして飽和まで増殖させた（２９．２℃、２４時間、３００ｒ．ｐ．ｍ．）。飽和した培養物を１５００ｇで１０分間遠心分離し、そして細胞を２００μＬ ＢＭＭＹ＋２ｍＭ ｐＡｐａアミノ酸中に再懸濁した。６日後（２９．２℃、３００ｒ．ｐ．ｍ．、補給しながら）、培地を３０００ｇで１０分間遠心分離することにより清澄化し、そして清澄化した培地１〜２μＬを、９６ウェルピンツールを使用して０．４５ミクロンニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にスポッティングした。この膜を、ＨＳＡ抗体［１Ａ９］ＨＲＰ接合体（Ａｂｃａｍ）を用いて標準的なウェスタンブロット技術（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ（１９８１）「Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ：ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ ｔｏ ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ」Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１２：１９５−２０３）を使用して精査し、そしてＥＣＬ ＨＲＰ化学発光検出試薬及びプロトコル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出した。各プロモーターに対応する２つの最も高く発現したクローン（ＡＯＸ２：Ａ６及びＢ７；ＹＰＴ１：Ｄ１１及びＢ７；ＩＣＬ１：Ｅ５、及びＨ３；ＦＬＤ１：Ｅ１１及びＦ３；ＧＡＰ：Ｂ７及びＢ１０；並びにＡＯＸ１：Ｅ３及びＥ７）を平行試験発現のために選択した（図３及び４）。
Ｐ−Promoter−ｐＡｐａＲＳ発現レベルをノーザンブロット及びウェスタンブロットによりメタノール誘導の６日後にモニタリングし、そしてＰAOX1−ｐＡｐａＲＳと比較した（図３ｂ）。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓに固有の発現変動性に起因して、２つのクローンをウェスタンブロット分析のために選択した。ＧＳ２００−ｒＨＳＡE37XのｐＲＥＡＶ−ＰPromoter−ｐＡｐａＲＳを用いた各形質転換からの２つのクローンを、主要炭素源としてメタノールを用いて６日間増殖させ、溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した（図３ｂ、上側のゲル）。等しいローディングを検証するためにゲルをクーマシーで染色した。溶解物をウェスタンブロットによりｐＡｐａＲｓ−Ｈｉｓ6xについて分析した（図３ｂ、下側のゲル）。
ウェスタンブロットを行うために、クローンＡＯＸ２：Ａ６及びＢ７；ＹＰＴ１：Ｄ１１及びＢ７；ＩＣＬ１：Ｅ５及びＨ３；ＦＬＤ１：Ｅ１１及びＦ３；ＧＡＰ：Ｂ７及びＢ１０；並びにＡＯＸ１：Ｅ３及びＥ７を試験発現条件下で培養し、ペレット化し（３０００ｇ、１０分）、そして２ｍｌ ＹｅａｓｔＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）＋１０ｍＭ β−メルカプトエタノール及びＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌタブレット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて溶解した。サンプルを２０，０００ｇで清澄化し、そして溶解物１５μｌを４−２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１：１５時間、１５０Ｖ）で展開した。タンパク質を０．４５ミクロンニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ ｓｅｍｉ−ｄｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してＴｏｂｉｎの転写緩衝液（２４ｍＭトリス塩基、１９２ｍＭグリシン、２０％エタノール）中で移した（２時間、２０ Ｖ、１００ ｍＡｍｐ）。ゲル上の残留タンパク質をクーマシーで染色して（図３ｂ、上側）等しいローディングを確認した。膜を標準的なウェスタンブロット技術（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ（１９８１）「Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ：ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ ｔｏ ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ」Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１２：１９５−２０３）を使用して抗Ｈｉｓ6x−ＨＲＰ接合抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてブロットし、そしてＥＣＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ＨＲＰ化学発光検出試薬及びプロトコルを用いて検出した（図３ｂ、下側）。相対的発現率をバンド密度により決定した。
ＰFLD1は、ｐＡｐａＲＳ転写をｍＲＮＡレベルでＰAOX1よりも４倍よく促進し、そして５倍多くｐＡｐａＲＳタンパク質を産生した。ＰGAP、ＰYPT1、ＰICL1、及びＰAOX2は全てＰFLD1よりも低いｐＡｐａＲＳ発現を示した。この結果と一致して、全体のアンバー抑制は、培地中へのｒＨＳＡE37pApa発現により測定した場合にＰFLD1−ｐＡｐａで最も高かった（図４）。図４に示されるように、各プロモーター系からの２つのクローンは、主要炭素源としてのメタノール及びｐＡｐａアミノ酸を用いて６日間独立して増殖させた。清澄化した培地２５μｌを変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで展開し、そしてクーマシーで染色した。ｒＨＳＡWT（レーン１５）は、ＢＳＡコントロールを用いてバンド密度により３５１．６ｍｇ ｌ-1と計算された。密度により、ＰFLD1（レーン９及び１０平均）は４３％に等しいタンパク質、すなわち１５１．２ｍｇ ｌ-1を発現した。最大収率は＞１５０ｍｇ Ｌ-1、すなわち約４３％のｒＨＳＡWT収率（３５２ｍｇ Ｌ-1）であった（図１１）。図１１は、ｐＡｐａＲＳ産生を促進するプロモーターの関数としてｒＨＳＡE37pApaにおけるアンバー抑制を示す、図４を棒グラフで表現したものを提供する。タンパク質産生を、図４に示されるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのクーマシーバンド密度により決定した。図４におけるｒＨＳＡWTタンパク質を、以下に記載されるように定量した：ＢＳＡ標準又は試験タンパク質発現からの未精製ｒＨＳＡWT培地２５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル展開した（図１２を参照のこと）。レーン７はｒＨＳＡWT試験タンパク質発現培地の１：１希釈であった。ＢＳＡ標準のバンド密度（レーン２〜５）をプロットし、そして線形フィッティングした。ｒＨＳＡWTバンド（２ｘレーン７及びレーン８）の密度は平均して８３．３３又は、３５１．５５ｍｇ ｍｌ-1となった。非天然タンパク質の収率（他の図面においてｒＨＳＡE37X）を同じｒＨＳＡWTサンプルのパーセントとして決定した。
図３ｂにおいて最も多くのタンパク質を産生したクローンをノーザンブロットによりｐＡｐａＲＳ ｍＲＮＡ転写について分析した（図３ｃ下側のゲル）。ノーザンブロットを行うために、上側の発現しているクローンＡＯＸ２、Ｂ７；ＹＰＴ１、Ｄ１１；ＩＣＬ１、Ｈ３；ＦＬＤ１、Ｅ１１；ＧＡＰ、Ｂ７；及びＡＯＸ１、Ｅ３を試験発現条件下で６日間増殖させた。３ｘ１０8個の細胞（ＯＤ600＝１．０で２．５ｍｌ）を採取し、そして全ＲＮＡをＲｉｂｏＰｕｒｅ−Ｙｅａｓｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）試薬及びプロトコルにより単離した。各ＲＮＡサンプル１３μｇを２％ホルムアルデヒドゲル（２％アガロース、２０ｍＭ ＭＯＰＳ、８ｍＭ酢酸ナトリウム、２．２ｍＭホルムアルデヒド、ｐＨ＝７．０）にロードした。３体積のＮｏｒｔｈｅｒｎＭａｘホルムアルデヒドロード色素（ｌｏａｄ ｄｙｅ）（Ａｍｂｉｏｎ）を１体積のＲＮＡと混合し、６５℃に１５分間加熱し、そしてロードする前に５分間氷上で冷却した。ゲルを電気泳動し（５０Ｖ２時間）、そし等しいローディングとＲＮＡ完全性を１８Ｓ及び２８Ｓ ｒＲＮＡの臭化エチジウム染色により確認した（図３ｃ、上側）。ＲＮＡをＢｉｏｄｙｎｅ Ｂナイロン膜（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）上に１０ｘＳＳＣ緩衝液（１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ＝７．０）中に標準的なブロッティング装置により取り出した。この膜を２ｘＳＳＣ緩衝液でリンスし、乾燥し、そしてＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて自己架橋させた。ハイブリダイゼーション及び検出をＮｏｒｔｈ２Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）からのプロトコル及び試薬により行った。簡単には、ビオチン化プローブ４００−５００μｇ：ｋｅｔｏＲＳ３ ｂｉｏｔ ５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＧＡ ＧＡＣ ＧＣＴ ＧＣＴ ＴＡＡ ＣＣＧ ＣＴＴ Ｃ−３'及びｋｅｔｏＲＳ４ ｂｉｏｔ ５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＡＡ ＡＧＡ ＡＧＴ ＡＴＴ ＣＡＧ ＧＡＴ ＣＧＧ ＡＣＴ Ｇ−３を終夜５５℃でインキュベートし、ストレプトアビジン−ＨＲＰ接合体に結合させ、そしてルミノール／エンハンサー−安定過酸化物溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出した（図３ｃ、下側）。相対的ｍＲＮＡ力価をバンド密度により決定した。
ｒＨＳＡ E37pApa へのオキシム連結
生理活性ペプチドのためのキャリアとしてのこの修飾ｒＨＳＡの有用性を実証するために、オキシム連結をｒＨＳＡE37pApaの独特のケト側鎖と抗血管新生ペプチドＡＢＴ−５１０との間で行った（図５）。この連結反応の略図を図５ａに提供する。ＡＢＴ−５１０ペプチドはε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンを６番目の残基として有する。以下にさらに詳細に記載されるように、７５μＭ ｒＨＳＡE37pApa（図５ａ、上側の反応）を２．２５ｍＭペプチドと共に終夜３７℃にてインキュベーションすることにより、オキシム連結が形成する。同じ条件下でｒＨＳＡWTとの反応は起こらない（図５ａ、下側の反応）。このトロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）プロペルジン１型反復模倣物は、強力な抗腫瘍活性をヒトにおいて示すが、静脈内投与された場合の腎臓による急速なクリアランスという欠点を有する（Ｈｏｅｋｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２００５）「Ｐｈａｓｅ Ｉ ｓａｆｅｔｙ、ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ、ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１−ｍｉｍｅｔｉｃ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＡＢＴ−５１０ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃａｎｃｅｒ」Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３：５１８８−５１９７；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）「Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１ ｐｅｐｔｉｄｅ ＡＢＴ−５１０ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ」 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７：１７１６−１７２４；Ｒｅｉｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ」Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９８：６８２−６８９）。９つのアミノ酸のペプチド模倣物を、６番目のＬ−ノルバリン残基の代わりに独特なε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンＵＡＡを用いて合成した（Ａｎａｓｐｅｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）。このペプチドの配列は：Ａｃ−Ｓａｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｄ−ａｌｏＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（Ａｏａ）−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＥｔ ＭＷｚ１０９７．３Ｄａ）であった。ＴＳＰ−１の既知の構造−活性の関係に基づいて、この位置における修飾は生物学的活性を有意に変更しないと予想される（Ｈａｖｉｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）「Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１ ｍｉｍｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ：ｄｅｓｉｇｎ、ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４８：２８３８−２８４６）。オキシム連結を行うために、２．２５ｍＭ（０．５ｍｇ）のペプチドを、オキシム連結緩衝液（１．５Ｍ塩化ナトリウム、５００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ＝４．４）２００μｌ中で７５μＭ ｒＨＳＡE37pApa又はｒＨＳＡWT（１．０ｍｇ）に加え、そして終夜３７℃でインキュベートした。ｐＨ＜５にてアミノオキシ基はｐＡｐａのケト基との選択的オキシム連結を受けてＡＢＴ−５１０ペプチドをｒＨＳＡE37pApaの残基３７に共有結合で連結する（図５ａ、上側の反応）。反応混合物をＣ８ Ｖｙｄａｃ ＨＰＬＣカラム（３００ｍｍ、２００Å、５μｍ、Ｇｒａｃｅ）を用いてＤｙｎａｍａｘ ＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ）（溶出４０−４６％水中アセトニトリル、０．１％）で精製した。フラクションを集めて混合し、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析した。インタクトなタンパク質の質量測定を行い、そしてｒＨＳＡE37pApaのペプチドでの誘導体化の程度を、リニアＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ Ｂｉｆｌｅｘ ＩＩＩ（Ｂｕｒｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）機器を使用してシナピン酸マトリックスを用いてマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析を行った（図５ｂ）。ｒＨＳＡWTの質量は、タンパク質の処理の前後でごくわずかしか変化せず、ｒＨＳＡWT（残基３７にグルタミン酸）をアミノ−オキシ修飾ＡＢＴ−５１０ペプチドで同じ条件下で処理した場合に、接合がＭＡＬＤＩ質量分析により観測されないということを示す。
ｒＨＳＡWT＋ペプチドとｒＨＳＡE37pApa＋ペプチドとの間の質量差異は、Ｅ３７ｐＡｐａ変異に起因して６０Ｄａより小さく（９０５Ｄａより６０Ｄａ小さい＝８４５Ｄａ）、これを連結効率（約７７％）を決定するために使用した。以前の接合プロトコルは、アニリン触媒を効率的な連結のために使用したが（Ｄｉｒｋｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）「Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｘｉｍｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ」Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ４５：７５８１−７５８４；Ｄｉｒｋｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）「Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｙｄｒａｚｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｉｍｉｎａｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｙｎａｍｉｃ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２８：１５６０２−１５６０３）；しかし、ｒＨＳＡE37pApaへのオキシムカップリングは、約７５μＭ ｒＨＳＡE37pApa及び３０倍過剰のペプチドを使用する終夜反応においてアニリンを使用する事無く約７７％の収率で進行した。
遺伝子レパートリーへの８つのＵＡＡの付加
この新たに作製された組み換え発現系の一般性を説明するために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ方法論により進化された非天然ａａＲＳｓをｐＲＥＡＶ−ＰFLD1に挿入した。図６ａは、Ｅ．ｃｏｌｉチロシル−ＲＳ遺伝子（ａａＲＳ）及びチロシルサプレッサｔＲＮＡカセット（ｔＲＮＡCUA）を含む最適化されたｐＲＥＡＶ−PFLD1ベクターの概略図を提供する。ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ、光架橋剤、図６ｂ、構造３、Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ．「Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−９６７）；ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚａｐａ、光架橋剤、化学的に反応性、図６ｂ、構造４、Ｄｅｉｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ａｄｄｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２５：１１７８２−１１７８３）；ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン（ｐＰｐａ、化学的に反応性、図６ｂ、構造５、Ｄｅｉｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ａｄｄｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２５：１１７８２−１１７８３）；ｐ−メトキシフェニルアラニン（ｐＭｐａ、構造／機能プローブ、図６ｂ、構造６、Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ．「Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−９６７）；及びｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩｐａ、重原子、図６ｂ、構造７、Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４−９６７）に特異的なａａＲＳを全て、最適化されたｐＲＥＡＶ−ＰFLD1ベクター中のＰFLD1の後方に挿入した（図６ａ及び６ｂ）。比較のために、野生型Ｅ．ｃｏｌｉチロシル−ＲＳ（ｗｔ、図６ｂ、構造２）も新しい発現ベクターに挿入した。チロシン（ｗｔ）、ｐＢｐａ、ｐＡｚａｐａ、ｐＰｐａ、ｐＭｐａ、及びｐＩｐａに特異的な非天然ａａＲＳを、プライマー：ＫＥＴＯ−Ｋｏｚ−Ｆ及びＫｅｔｏＲＳ Ｒ ６ｘＨｉｓ（上記）を使用してＰＣＲにより増幅し、ＮｃｏＩ及びＥａｇＩ（ＮＥＢ）を用いて消化し、そして同様に消化したｐＲＥＡＶ−ＰFLD1−ｐＡｐａＲＳに（アガロースゲル精製によりｐＡｐａＲＳ領域を除去した後）連結した。配列を確認した後、プラスミドをＧＳ２００−ｒＨＳＡE37Xクローン１Ｄ１２に以前に記載されたように形質転換して、ＧＳ２００−ｒＨＳＡE37X／ｐＲＥＡＶ−ＰFLD1−（合成酵素tyr）（ＨＩＳ４、ＡＲＧ４、ＧｅｎR、Ｍｕｔ+）を作製した。１２クローンを各形質転換から選択し、そして以前に記載されるように９６ウェル形式でドットブロットによりスクリーニングした。最良の産生株を各々から（ｔｙｒ、Ａ９；ｐＢｐａ、Ｂ７；ｐＡｚａｐａ Ｃ９；ｐＰｐａ、Ｄ６；ｐＭｐａ、Ｅ６；及びｐＩｐａ、Ｆ６）選択し、そしてＦＬＤ１（すなわち、ｐＲＥＡＶ−ＰFLD1−ｐＡｐａＲＳを有する系統）Ｅ１１と上記のようにｒＨＳＡ発現実験において比較し、ｒＨＳＡE37x（ここでＸは非天然アミノ酸として定義される）中の位置３７におけるアンバー変異を、非天然アミノ酸１、３−７の存在下（＋）及び存在しない場合（−）においてそれらの対応するａａＲＳを用いて抑制するそれらの能力を決定した。これらの実験の結果を図６ｃに示す。未精製の清澄化した培地２５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで展開し、そしてクーマシー染色した。レーン２は野生型（ｗｔ）チロシル−ＲＳを用いたｒＨＳＡE37Y発現である。レーン１５はｒＨＳＡWTの発現である。抑制収率は、ｐＡｐａ及びｐＡｚａｐａ変異体と同様であり（ｒＨＳＡWTの収率の４０〜４５％）；ｐＩｐａ以外の全ての他の変異体がｒＨＳＡWTの収率の＞２０％で発現された（図６ｃ）。相対的なタンパク質収率をバンド密度により決定した。同族アミノ酸が存在しない場合はタンパク質発現が観測されず、この新しい系の高い直交性が実証された。
近年、第二の直交性Ｅ．ｃｏｌｉロイシル誘導ＲＳ／ｔＲＮＡCUA対（ＬｅｕＲＳと示されるａａＲＳ）が、さらなる非天然アミノ酸をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてタンパク質に組み入れるために生成された（Ｌｅｍｋｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ」Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ３：７６９−７７２；Ｓｕｍｍｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）「Ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３：９７８５−９７８９）。新しいＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現系においてこの直交性対から誘導された非天然ＬｅｕＲＳを適応させるために、ｐＲＥＡＶ−ＰFLD1プラスミドのｔＲＮＡ領域を修正した。ＰPGK1の下流に存在する
Figure 0005959201
 カセットを切除し、そして以前に記載されたように、５’ＣＣＡを欠き、そしてＳＵＰ４セグメントにより隔てられた
Figure 0005959201
 の３つのタンデム反復に対応するコード領域で置き換えてｐＲＥＡＶleu−ＰFLD1を作製した。４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジルセリン（ＤＭＮＢ−Ｓ、光ケージ化セリン、図６ｅ、構造８、Ｌｅｍｋｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ」Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ３：７６９−７７２）及び２−アミノ−３−（５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１スルホンアミド）プロパン酸（ダンシルアラニン、ダンシルフルオロフォア、図６ｅ、構造９、Ｓｕｍｍｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）「Ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３：９７８５−９７８９）に特異的なＬｅｕＲＳ変異体をＰFLD1の後方に挿入してｐＲＥＡＶleu−ＰFLD1−ＬｅｕＲＳを作製した（図６ｄ及び６ｆ）。
図６ｄは、Ｅ．ｃｏｌｉロイシル−ＲＳ遺伝子及びロイシルサプレッサｔＲＮＡカセット（ｌｅｕ−ｔＲＮＡ（ＣＵＡ）を含む最適化されたｐＲＥＡＶleu−ＰFLD1ベクターの
概略図を提供する。ｐＲＥＡＶleu−ＰFLD1を作製するために、５’ＣＣＡを欠き、そしてＳＵＰ４セグメントで隔てられた
Figure 0005959201
 の３つのタンデム反復に対応する部分を合成し（ＤＮＡ ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）、そしてプライマー：Ｌｅｕ ｔＲＮＡ Ｆ、５’−ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＣＴ ＡＧＣ ＣＴＣ ＴＴＴ ＴＴＣ ＡＡＴ ＴＧＴ ＡＴＡ ＴＧＴ Ｇ−３'及びＬｅｕ ｔＲＮＡ Ｒ、５’−ＣＧＴ ＡＣＡ ＣＧＣ ＧＴＣ ＴＧＴ ＡＣＡ ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＡＡ ＡＡＡ ＴＴＴ Ｇ−３'を使用してＰＣＲ増幅した。得られた６４３塩基対の産物をＮｈｅＩ及びＭｌｕＩ（ＮＥＢ）で消化し、そして同様に消化されたｐＲＥＡＶ−ＰFLD1−ｐＡｐａＲＳ（チロシルｔＲＮＡをアガロースゲル精製により除去した後）に連結して、ｐＲＥＡＶleu−ＰFLD1−ｐＡｐａＲＳを作製した。ＤＭＮＢ−Ｓ及びダンシル非天然アミノ酸に対する特異性を有するａａＲＳを、プライマー：ＬｅｕＲＳ Ｆ、５’−ＡＴＴ ＣＡＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＡ ＧＡＧ ＣＡＡ ＴＡＣ ＣＧＣ ＣＣＧ ＧＡＡ ＧＡＧ−３'及びＬｅｕＲＳ Ｒ、５’−ＴＴＡ ＡＴＴ ＣＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＴＡ ＧＣＣ ＡＡＣ ＧＡＣ ＣＡＧ ＡＴＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＴＴ ＡＣＣ ＴＧ−３'を使用して増幅し、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で消化し、そして同様に消化されたｐＲＥＡＶleu−ＰFLD1−ｐＡｐａＲＳ（アガロースゲル精製によりｐＡｐａＲＳコード領域を除去した後）に連結してｐＲＥＡＶleu−ＰFLD1−ＤＭＮＢ−Ｓ又はｐＲＥＡＶleu−ＰFLD1−ダンシルを作製した（図６ｄ）。配列を確認した後、プラスミドをＧＳ２００−ｒＨＳＡE37X（クローン１Ｄ１２）に形質転換し、そして９６ウェルドットブロット形式で記載されるようにスクリーニングした。クローンＡ：Ａ５（ＤＭＮＢ−Ｓ）及びＢ：Ｇ１２（ダンシル）を、試験発現条件下で緩衝化（ｂｕｆｆｅｒ）最少メタノール（ＢＭＭ）培地中で誘導後３日間増殖して成功した産生株と同定した。ｒＨＳＡWTをＢＭＭＹ中で３日間、比較のために発現させた（図６ｆ）。図６ｆは、ｒＨＳＡE37Xの発現を非天然アミノ酸の存在下（＋）及び存在しない場合（−）で試験するために行った実験の結果を提供する。各タンパク質発現からの未精製の清澄化した培地２５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、クーマシー染色した。レーン４は３日後のｒＨＳＡWTの発現である。
ＤＭＮＢ−Ｓに特異的なＬｅｕＲＳ変異体は、ＤＭＮＢ−Ｓのシステイン類似体（ＤＭＮＢ−Ｃ）を容認することが最近示され、これはより容易な合成の利便性に起因してこれらの発現実験において使用された。少量の全長タンパク質（ＤＭＮＢ−ＳについてｒＨＳＡE37DMNB-Sの３５％及びダンシルについてｒＨＳＡE37dansylの６％のバックグラウンド）が、同族アミノ酸の存在しない場合に産生され、トリプシン消化のＬＣ−ＭＳ／Ｍにより対応する非天然アミノ酸の存在下での系の高い忠実性が確認された（図１３）。図１３に示されるように、図６ｆのレーン２からのｒＨＳＡE37DMNB-Cタンパク質をトリプシン消化にかけて、続いて消化においてキモトリプシンでトリプシンを置き換えたこと以外は上記のようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行った。一番上のクロマトグラム（黒色）は、２４．４５分と６０．０５分の間で行ったＬＣ−ＭＳ／ＭＳの全イオンカウント（ＴＩＣ）を示す。３番目と４番目のクロマトグラムは、キモトリプシンペプチド、ＸＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦ、［ここでＸ（ｒＨＳＡの３７番目の残基）はＤＭＮＢ−Ｃである（ピーク下の全面積、「ＭＡ」＝２２４５８２２０４）］に対応する、それぞれ２＋及び３＋に荷電した化学種についてのイオン抽出である。５番目及び６番目のクロマトグラムは、キモトリプシンペプチド、ＸＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦである［ここでＸはロイシンのイソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ ｏｆ ｌｅｕｃｉｎｅ）（ピーク下の全面積「ＭＡ」＝２００２９３９７）]に対応する、それぞれ２＋及び３＋に荷電した化学種についてのイオン抽出である。以下のように計算を行った：Ｅ３７ＤＭＮＢ−Ｃのパーセント＝２２４５８２２０４／（２２４５８２２０４＋２００２９３９７）＊１００＝９１．８％及びＥ３７Ｌのパーセント＝２００２９３９７／（２２４５８２２０４＋２００２９３９７）＊１００＝８．２％。Ｘにおける他の天然アミノ酸の組み入れに対応するイオン種は、感知される量では検出されなかった。
実際に、ナンセンスコドンの非特異的読み過しは、アミノアシル化サプレッサｔＲＮＡの存在によりしばしば抑制される。抑制収率は、発現の３日後にｒＨＳＡE37DMNB-CについてｒＨＳＡWTの約３７％そしてｒＨＳＡE37dansylについてｒＨＳＡWTの収率の２３％であった。
非天然アミノ酸を含むタンパク質の発現をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて最適化しようとする以前の試みは、モデル系において８〜１５ｍｇ Ｌ-1の最大収率という、本明細書で開発されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ系で実証されたよりも１桁も少ないという結果となった。Ｗａｎｇ研究室における研究は、酵母におけるナンセンス変異媒介ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）経路のノックダウンがタンパク質発現を２倍まで増加させ得るということを最近示した（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｗａｎｇ（２００８）「Ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄｓ ｅｎａｂｌｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ」Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３０：６０６６−６０６７）。ｔＲＮＡCUA転写を促進するためのＳＮＲ５２から誘導されたプロモーターの使用と相まって、これらは以前にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで産生された変異体タンパク質（約１５ｍｇ Ｌ-1）の収率よりも３００倍高い収率を達成することができた（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｗａｎｇ（２００８）「Ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄｓ ｅｎａｂｌｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ」Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３０：６０６６−６０６７）。従って、ＮＭＤ経路のＵＰＦ１遺伝子のノックアウト及びＳＮＲ５２−ｔＲＮＡCUAプロモーター系の使用は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける収率をさらに増加させるかもしれない。さらに、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ研究室における研究は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓからのｒＨＳＡWTの収率が、標準的な震盪フラスコよりも流加発酵において発現された場合に１桁よりも多くなる（＞１０ｇＬ-1）ことを実証した（Ｏｈｙａ（２００５）「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｂｙ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９０：８７６−８８７）。
要約すると、本発明者らは、非天然アミノ酸のメチロトローフ酵母への生合成的組み入れの方法論を拡大した。２つのａａＲＳ／ｔＲＮＡCUA対は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて直交性であることが示され、そしてｒＨＳＡE37Xの残基３７におけるアンバーコドンに応じて８つの異なる非天然アミノ酸を有する変異タンパク質を発現するために使用された。変異タンパク質は震盪フラスコにおいて優れた忠実性で高レベルに発現された。これらの結果は、この発現系がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて現在進化される合成酵素を用いて多くの他の非天然アミノ酸に影響を受けやすく、そして本明細書で考察される非天然アミノ酸又はａａＲＳ／ｔＲＮＡCUAに限定されないということを示唆する。この新しい系の高い収率及び忠実性により、独特の生物学的及び薬理学的特性を有する有用な量の治療用タンパク質を得ることが可能となる。例えば、オキシム連結又は銅触媒１，３−付加環化反応のような化学（「クリック化学」）は、タンパク質を部位特異的にＰＥＧ化するか又は架橋するために利用され得、金属イオン結合アミノ酸は放射性同位体を結合するために組み入れられ得、そしてペプチド、毒素又はｓｉＲＮＡ接合体は、ＨＳＡのようなキャリアタンパク質又は抗体のような標的化タンパク質から作製され得る。さらに、上述のｒＨＳＡE37pApa−ＡＢＴ−５１０接合体は、インビトロ抗血管新生アッセイにおいて試験されているところである。内因性日免疫原性キャリアとしてのｒＨＳＡE37pApaの使用は、他の急速にクリアされるペプチド（グルカゴン様ペプチド１模倣物（ＧＬＰ−１）
及び副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）ペプチドを含む）に適用され得る。
前述の発明は明確化及び理解の目的のためにいくらか詳細に記載されてきたが、形態及び詳細における種々の変更が本発明の真の範囲から逸脱することなく為され得るということは、本開示を読めば当業者に明らかだろう。例えば、上記の全ての技術及び装置は、様々な組み合わせで使用され得る。本出願において引用される全ての刊行物、特許、特許出願及び／又は他の書類は、各々個々の刊行物、特許、特許出願及び／又は他の書類が本明細書において参照により加入されると個別に示されると同じ程度まで本明細書においてそれら全体が参照により加入される。
成熟ＨＳＡのアミノ酸配列（シグナル配列又はプロペプチド配列を含まない） 配列番号１
DAHKSE VAHRFKDLGE ENFKALVLIA FAQYLQQCPF EDHVKLVNEV TEFAKTCVAD ESAENCDKSL
HTLFGDKLCT VATLRETYGE MADCCAKQEP ERNECFLQHK DDNPNLPRLV RPEVDVMCTA
FHDNEETFLK KYLYEIARRH PYFYAPELLF FAKRYKAAFT ECCQAADKAA CLLPKLDELR
DEGKASSAKQ RLKCASLQKF GERAFKAWAV ARLSQRFPKA EFAEVSKLVT DLTKVHTECC
HGDLLECADD RADLAKYICE NQDSISSKLK ECCEKPLLEK SHCIAEVEND EMPADLPSLA
ADFVESKDVC KNYAEAKDVF LGMFLYEYAR RHPDYSVVLL LRLAKTYETT LEKCCAAADP
HECYAKVFDE FKPLVEEPQN LIKQNCELFE QLGEYKFQNA LLVRYTKKVP QVSTPTLVEV
SRNLGKVGSK CCKHPEAKRM PCAEDYLSVV LNQLCVLHEK TPVSDRVTKC CTESLVNRRP
CFSALEVDET YVPKEFNAET FTFHADICTL SEKERQIKKQ TALVELVKHK PKATKEQLKA
VMDDFAAFVE KCCKADDKET CFAEEGKKLV AASQAALGL
成熟ＴＳＰ−１のアミノ酸配列（シグナル配列を含まない） 配列番号２
NR IPESGGDNSV FDIFELTGAA RKGSGRRLVK GPDPSSPAFR IEDANLIPPV
PDDKFQDLVD AVRAEKGFLL LASLRQMKKT RGTLLALERK DHSGQVFSVV SNGKAGTLDL
SLTVQGKQHV VSVEEALLAT GQWKSITLFV QEDRAQLYID CEKMENAELD VPIQSVFTRD
LASIARLRIA KGGVNDNFQG VLQNVRFVFG TTPEDILRNK GCSSSTSVLL TLDNNVVNGS
SPAIRTNYIG HKTKDLQAIC GISCDELSSM VLELRGLRTI VTTLQDSIRK VTEENKELAN
ELRRPPLCYH NGVQYRNNEE WTVDSCTECH CQNSVTICKK VSCPIMPCSN ATVPDGECCP
RCWPSDSADD GWSPWSEWTS CSTSCGNGIQ QRGRSCDSLN NRCEGSSVQT RTCHIQECDK
RFKQDGGWSH WSPWSSCSVT CGDGVITRIR LCNSPSPQMN GKPCEGEARE TKACKKDACP
INGGWGPWSP WDICSVTCGG GVQKRSRLCN NPTPQFGGKD CVGDVTENQI CNKQDCPIDG
CLSNPCFAGV KCTSYPDGSW KCGACPPGYS GNGIQCTDVD ECKEVPDACF NHNGEHRCEN
TDPGYNCLPC PPRFTGSQPF GQGVEHATAN KQVCKPRNPC TDGTHDCNKN AKCNYLGHYS
DPMYRCECKP GYAGNGIICG EDTDLDGWPN ENLVCVANAT YHCKKDNCPN LPNSGQEDYD
KDGIGDACDD DDDNDKIPDD RDNCPFHYNP AQYDYDRDDV GDRCDNCPYN HNPDQADTDN
NGEGDACAAD IDGDGILNER DNCQYVYNVD QRDTDMDGVG DQCDNCPLEH NPDQLDSDSD
RIGDTCDNNQ DIDEDGHQNN LDNCPYVPNA NQADHDKDGK GDACDHDDDN DGIPDDKDNC
RLVPNPDQKD SDGDGRGDAC KDDFDHDSVP DIDDICPENV DISETDFRRF QMIPLDPKGT
SQNDPNWVVR HQGKELVQTV NCDPGLAVGY DEFNAVDFSG TFFINTERDD DYAGFVFGYQ
SSSRFYVVMW KQVTQSYWDT NPTRAQGYSG LSVKVVNSTT GPGEHLRNAL WHTGNTPGQV
RTLWHDPRHI GWKDFTAYRW RLSHRPKTGF IRVVMYEGKK IMADSGPIYD KTYAGGRLGL
FVFSQEMVFF SDLKYECRDP
ＡＢＴ−５１０ペプチドのアミノ酸配列 配列番号３
(N−Ac−Sar)−Gly−Val−(D−alloIle)−Thr−Nva−Ile−Arg−(Pro−NHEt)

Claims (5)

  1. 共有結合でカップリングされたキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を製造する方法であって、
    メチロトローフ酵母細胞においてキャリアポリペプチドの翻訳の間に第一の非天然アミノ酸残基をキャリアポリペプチド中に、特定の位置に組み入れること、ここで当該酵母細胞はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母細胞であり、当該組み入れは以下の工程を含む、
    （ａ）（ｉ）第一の非天然アミノ酸、
    （ii）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の直交性ｔＲＮＡ−合成酵素（Ｏ−ＲＳ）、
    （iii）当該Ｏ−ＲＳにより第一の非天然アミノ酸で特異的にアミノアシル化される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の直交性ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、及び
    （iv） キャリアペプチドをコードする核酸［ここで該核酸は当該Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む］
    を含む翻訳系をメチロトローフ酵母細胞中に備えること；ならびに
    （ｂ）核酸を翻訳し、それにより翻訳の間に第一の非天然アミノ酸をキャリアポリペプチド中に、特定の位置に組み入れること；
    標的ポリペプチドの合成又は翻訳の間に第二の非天然アミノ酸残基を標的ポリペプチド中に組み入れること；及び
    第一の非天然アミノ酸残基と第二の非天然アミノ酸残基とを反応させて、共有結合でカップリングしたキャリアポリペプチド−標的ポリペプチド接合体を生成させること、
    を含む、上記方法。
  2. キャリアポリペプチドが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、抗体、ＨＥＲ２抗体、及びＯＫＴ３抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂ、Ｆｃ、ｓｃＦｖ、アルブミン、血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、ｃ反応性タンパク質、コンアルブミン、ラクトアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、イオンキャリアタンパク質、アシルキャリアタンパク質、シグナル伝達アダプタータンパク質、アンドロゲン結合タンパク質、カルシウム結合タンパク質、カルモジュリン結合タンパク質、セルロプラスミン、コレステロールエステル輸送タンパク質、ｆボックスタンパク質、脂肪酸結合タン
    パク質、フォリスタチン、フォリスタチン関連タンパク質、ＧＴＰ結合タンパク質、インスリン様増殖因子結合タンパク質、鉄結合タンパク質、潜在型ＴＧＦベータ結合タンパク質、集光性タンパク質複合体、リンパ球抗原、膜輸送タンパク質、ニューロフィジン、周辺質結合タンパク質、リン酸結合タンパク質、ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質、リン脂質輸送タンパク質、レチノール結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ｓ期キナーゼ関連タンパク質、性ホルモン結合グロブリン、チロキシン結合タンパク質、トランスコバラミン、トランスコルチン、トランスフェリン結合タンパク質、又はビタミンＤ結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  3. 標的ポリペプチドが、ＴＳＰ−１、ＡＢＴ−５１０、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）、アンジオスタチン、エキセンディン−４、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球走化性タンパク質−１、単球走化性タンパク質−２、単球走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０リガンド、補体阻害剤、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯΥ、ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β、ＭＣＰ−１、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、表皮剥脱毒素、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ２１、Ｇ−ＣＳＦ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヒルジン、ＬＦＡ−１、ヒトインスリン、ヒトインスリン様増殖因子（ｈＩＧＦ）、ｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩ、ヒトインターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、白血病抑制因子、ニュールツリン、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロフィン、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、レラキシン、ソマトスタチン、スーパーオキシドジムスターゼ、チモシンアルファ１、ヒト腫瘍壊死因子（ｈＴＮＦ）、ヒト腫瘍壊死因子アルファ、ヒト腫瘍壊死因子ベータ、Ｒａｓ、Ｔａｔ、炎症性分子、シグナル伝達分子、ウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）、又はＢＰ３２０抗原である、請求項１に記載の方法。
  4. 第一の非天然アミノ酸と第二の非天然アミノ酸とを：求電子剤−求核剤反応、求核剤とケトンの反応、オキシム連結反応、求核剤とアルデヒドの反応、カルボニル基と求核剤との間の反応、スルホニル基と求核剤との間の反応、エステル化反応、立体障害エステル基と求核剤との間の反応、チオエステル基と求核剤との間の反応、安定イミン基と求核剤との間の反応、エポキシド基と求核剤との間の反応、アジリジン基と求核剤との間の反応、求電子剤と脂肪族若しくは芳香族アミンとの間の反応、求電子剤とヒドラジドとの間の反応、求電子剤とカルボヒドラジドとの間の反応、求電子剤とセミカルバジドとの間の反応、求電子剤とチオセミカルバジドとの間の反応、求電子剤とカルボニルヒドラジドとの間の反応、求電子剤とチオカルボニルヒドラジドとの間の反応、求電子剤とスルホニルヒドラジドとの間の反応、求電子剤とカルバジドとの間の反応、求電子剤とチオカルバジドとの間の反応、求電子剤とヒドロキシルアミンとの間の反応、ヒドロキシル若しくはジオールのような一つ若しくは複数の求核剤とボロン酸若しくはエステルとの間の反応、遷移金属触媒反応、パラジウム触媒反応、銅触媒ヘテロ原子アルキル化反応、付加環化反応、１，３付加環化反応、２，３付加環化反応、アルキン−アジド反応、ディールズアルダー反応、又はスズキカップリング反応のうちの１つ又はそれ以上を介して反応させる、請求項１に記載の方法。
  5. 上記接合反応の効率が変異体キャリアポリペプチド接合体と野生型キャリアポリペプチドの間の収量の質量差異により決定され、そして、上記反応が、５０％より高い効率である、請求項４に記載の方法。
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