CN107098978A - 一种抗肿瘤和免疫增强双重功效融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双重功效融合蛋白（Tɑ1‑Fc）及其抗肿瘤及免疫活性。将IgG1Fc基因与人Tɑ1基因融合在一起，构建含有Tɑ1‑Fc基因的大肠杆菌（E.coli）基因工程菌，制备获得Tɑ1‑Fc融合蛋白。本发明所述的融合蛋白既具有胸腺肽ɑ1的效应功能又具有抗体的一系列功能，可以达到高效且副作用低的治疗肿瘤的目的。本发明适用于预防和治疗各种腺癌及其转移癌以及治疗免疫缺陷，可与抗病毒药物、促细胞生长素联合用药或者与化疗药物配伍使用。

Description

一种抗肿瘤和免疫增强双重功效融合蛋白

技术领域

本发明涉及肿瘤生物治疗中主动特异性免疫技术，尤其是提供了一种重组人Tɑ1-Fc融合蛋白抗肿瘤药物及制备工艺，以达到预防和治疗肿瘤的目的，属于生物工程技术领域。

背景技术

胸腺肽ɑ1由28个氨基酸组成，主要分布在胸腺组织，尤其是胸腺上皮细胞中，另外，也存在于淋巴组织(如脾、淋巴结)和非淋巴组织(如肺、肾和脑)中，其分泌和释放并不受其他激素或者释放因子所调节。胸腺肽ɑ1可以增强Tregs、IL-1β、TNF-ɑ和IL-6等免疫作用，调节机体免疫功能，降低促炎症因子水平，减轻炎症介质作用，抗肿瘤作用，对其他疾病也有显著的治疗效果。但胸腺肽ɑ1在体内易被降解失活，体内半衰期很短(<2h)。

Fc是抗体经木瓜蛋白酶/胃蛋白酶水解后的一个片段。据报道Fc片段能显著性提高与之结合的生物活性蛋白的半衰期。Fc融合蛋白赋予所融合功能蛋白类似抗体的特性，包括延长其血浆半衰期以及Fc片段特有的一系列特有的效应功能，可广泛应用于免疫治疗、免疫诊断、抗体纯化及蛋白分析定量等生物医学研究中。

发明内容：

本发明利用基因工程的方法，提供一种重组人Tɑ1-Fc融合蛋白、制备方法及用途。本发明所述Tɑ1-Fc融合蛋白能够用于肿瘤生物治疗中特异性免疫，达到高效且副作用低的治疗肿瘤的目的。

本发明将IgG1Fc基因与人Tɑ1基因融合在一起，导入原核表达载体，在大肠杆菌中直接高效诱导表达Tɑ1-Fc融合蛋白。得到的Tɑ1-Fc融合蛋白既具有胸腺肽ɑ1的效应功能又具有抗体的一系列功能。

本发明的具体技术方案如下：

一种双重功效融合蛋白，由胸腺肽α1通过连接肽或者直接与免疫球蛋白恒定区连接而成，所述融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的另一目的在于提供本发明所述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)设计合成并克隆得到本发明所述融合蛋白的编码基因；

(2)构建成表达质粒后转化大肠杆菌宿主菌中进行表达；

(3)收集菌泥及破壁，收集破壁液上清，分离纯化后得到。

本发明一个具体的方案如下，

(1)将将Fc基因连在Tɑ1基因之后，构建原核表达载体pET-32a，通过酶切鉴定重组载体的正确性。

(2)表达Tɑ1-Fc融合蛋白的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，在乳糖的诱导下，表达融合蛋白Tɑ1-Fc，通过SDS-PAGE和Western blot鉴定其正确性。

(3)常规基因测序测定Tɑ1-Fc融合蛋白的基因序列。

(4)大量培养重组大肠杆菌，经超声破碎提取全菌上清液，通过HisTrapTM-HP柱/Protein A柱→HisTrapTMDesalting柱获得较纯的Tɑ1-Fc融合蛋白。通过SDS-PAGE得到鉴定。

对本发明所述融合蛋白Tɑ1-Fc抗肿瘤及免疫活性进行了测定，包括：

(1)Tɑ1-Fc抗鼠乳腺癌活性：将鼠乳腺癌细胞4T1皮下注射到Balb/c小鼠体内，10天后给药并测量肿瘤体积。持续3周左右。

(2)Tɑ1-Fc抗人乳腺癌活性：将人乳腺癌细胞MCF-7皮下注射到裸鼠体内，10天后给药并测量肿瘤体积。持续4周左右。

(3)Tɑ1-Fc免疫增强活性：将40mg/kg氢化可的松(HC)皮下注射到六周龄雄性ICR小鼠体内，持续7天左右，构建小鼠免疫抑制模型，给药7天，测脾和胸腺指数及血清中细胞因子含量。

实验结果表明本发明所述融合蛋白Tɑ1-Fc相较于胸腺肽ɑ1具有优越的抗肿瘤和免疫增强活性。

本发明的另一目的在于提供本发明所述融合蛋白在制备治疗原发性或继发性T细胞缺陷病、自身免疫性疾病，细胞免疫功能低下疾病及癌症药物中的应用。

所述原发性或继发性T细胞缺陷病、自身免疫性疾病，细胞免疫功能低下疾病包括重症肝炎、慢性活动性肝炎、慢性迁延性肝炎及肝硬化、带状疱疹、生殖器疱疹、尖锐湿疣、支气管炎、支气管哮喘、肺结核、上呼吸道感染、红斑狼疮、风湿性及类风湿性疾病、强直性脊柱炎、格林巴利综合症、再生障碍性贫血、白血病、血小板减少症、病毒性角膜炎、病毒性结膜炎、过敏性鼻炎、老年性早衰、妇女更年期综合症、多发性疖肿及面部皮肤痤疮等，银屑病、扁平苔癣、鳞状细胞癌及上皮角化症、儿童先天性免疫缺陷症等。

所述癌症优选为各种腺癌及其转移癌。

本发明的另一目的在于提供包括本发明所述融合蛋白及药学上可接受的载体的药物组合物。

进一步的，所述药物组合物还包括抗病毒药物、促细胞生长素或化疗药物。

本发明适用于下述医疗用途：

1.预防和治疗各种腺癌及其转移癌。

2.治疗免疫缺陷。

3.与抗病毒药物联合用药。

4.与促细胞生长素联合用药。

5.与化疗药物配伍使用。

本发明优点：

目前肿瘤治疗采取综合疗法包括手术、放疗和化疗。癌症患者在接受手术或放化疗后免疫系统会受到不同程度的的损伤。胸腺肽ɑ1是从胸腺中获得的重要免疫增强剂，已成功用于临床肿瘤辅助治疗，可以降低血液及神经毒性，有助于免疫抑制的逆转，推迟复发时间和延长存活时间。但胸腺肽ɑ1在体内易被降解失活，体内半衰期很短(<2h)。本发明利用Fc片段赋予所融合功能蛋白类似抗体的特性，得到的融合蛋白Tɑ1-Fc相较于胸腺肽ɑ1具有更优越的抗肿瘤和免疫增强活性。可广泛应用于免疫治疗、免疫诊断、抗体纯化及蛋白分析定量等生物医学研究中。

附图说明

图1是Tɑ1-Fc融合蛋白的SDS-PAGE图及Western blot鉴定。(图1-1M表示蛋白Mark；1表示未加入诱导剂时菌体破碎上清；2表示加入诱导剂后菌体破碎上清；箭头指示目的蛋白位置；图1-2B为是融合蛋白SDS-PAGE图片，1-2A是检测融合蛋白Tɑ1部分，1-2C是检测融合蛋白IgG1FC片段)。

图2是Tɑ1-Fc融合蛋白的纯化图(M表示蛋白Mark；1是未加入诱导剂时菌体破碎上清；2是加入5mM乳糖时菌体破碎液上清；3-4是100mM咪唑洗脱液；5是200mM咪唑洗脱液)。

图3是Tɑ1-Fc融合蛋白对小鼠乳腺癌4T1模型的抗肿瘤活性(图3-1是小鼠乳腺癌4T1模型中不同组的肿瘤重量，图3-2是不同时间肿瘤体积的变化)。

图4是Tɑ1-Fc融合蛋白对人乳腺癌MCF-7模型的抗肿瘤活性(图4-1是人乳腺癌MCF-7模型中不同组的肿瘤重量，图4-2是不同时间肿瘤体积的变化)。

具体实施方式

实施例一Tɑ1-Fc融合蛋白重组载体的表达与鉴定

1.重组基因的诱导表达

将融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的序列转换成所对应的核苷酸序列其互补序列进行基因合成，合成的序列两端设计了NcoI和HindIII酶切位点，将合成的基因与原核表达载体pET-32a进行连接，再将正确连接的pET-32a-Tɑ1-Fc质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，并将其涂布在含有氨苄青霉素的LB培养基平板中，37℃过夜培养；从LB固体平板中挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；将250μL的过夜培养物接种于25mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，摇床37℃200rpm培养3个小时，至菌达到其对数生长期，加入5mM乳糖诱导4个小时，离心沉淀细菌，弃上清，沉淀保存于-20℃；重悬沉淀，然后加入10倍菌体湿重的菌悬液重悬菌体，将菌体重悬液与上样缓冲液按同体积混合，80-100℃高温变性5分钟，离心，取上清10-15μL加入到SDS-PAGE上电泳鉴定蛋白的表达情况。由图1-1可以看出，诱导后，在破碎液上清中表达出本发明所述Tɑ1-Fc融合蛋白。

2.大量积累Tɑ1-Fc融合蛋白

将冻存的含有pET-32a-Tɑ1-Fc质粒的大肠杆菌BL21(DE3)接种于25mL LB液体培养基中，摇床37℃200rpm过夜；次日，将培养液按1:100接种于新LB液体培养基中；离心沉淀，弃上清，将沉淀保存于-20℃；加入5mM乳糖诱导4个小时；离心沉淀，弃上清，将沉淀保存于-20℃。

3.聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS—PAGE)

安装电泳玻璃板装置；配置5％浓缩胶和15％分离胶；将细菌用菌悬液重悬后，2×上样缓冲液与菌体重悬液1:1混合，100℃高温变性5分钟；安装电泳槽；离心取上清10-15μl加入15％SDS—PAGE；设恒压80V，30Min 120V 1.5h；剥下凝胶，考马斯亮蓝R-250振摇染色1h；在40％乙醇，10％乙酸，水溶液中脱色2h。

4.Western blot

先SDS-PAGE电泳。然后转膜：电泳结束前，剪膜，甲醇泡5Min后，转入转印缓冲液中平衡15Min；结束电泳，切胶；先把胶放在双蒸水中荡一下，转入转印缓冲液中平衡10Min，与此同时泡上8片滤纸；敷膜；转膜80-100mA 1-2h。封闭：转膜结束后，将膜取下，用洗涤液洗5Min×2；吸干膜表面的洗涤液，用5％脱脂奶粉封闭2h；封闭结束后，用洗涤液洗5Min×2。一抗孵育过夜：吸干膜表面的洗涤液，分别夹入封口膜中，鼠抗人Tɑ1和鼠抗人Fc一抗封闭过夜。洗涤一抗：用洗涤液洗10三分钟，洗涤三次。孵育二抗：吸干膜表面的洗涤液，分别夹入封口膜中用山羊抗鼠、兔抗鼠Fc二抗室温孵育2h。洗涤二抗：用洗涤液洗10三分钟，洗涤三次。曝光：将膜表面的洗涤液轻轻拭干；按照1:1(显色A液：B液)的比例配制发光液，缓缓加入到膜上，凝胶成像仪曝光。由图1-2所示，图1-2B是融合蛋白SDS-PAGE图片，图1-2A是检测融合蛋白Tɑ1部分，如图所示，凝胶成像仪曝光后，在PVDF膜上显示的条带，其大小和形状均与SDS-PAGE图片上目的蛋白一致，说明该蛋白中含有Tɑ1片段；图1-2C是检测融合蛋白IgG1Fc片段，如图所示，凝胶成像仪曝光后，在PVDF膜上显示的条带，其大小和形状均与SDS-PAGE图片上目的蛋白一致，说明该蛋白中含有IgG1F_C片段。综上所述，该融合蛋白在结构上包含有Tɑ1片段和IgG1Fc片段，是本发明设计的目的蛋白。

实施例二Tɑ1-Fc融合蛋白的纯化

1.大肠杆菌超声破碎

每克湿菌体加入10-30mL0.1M Tris缓冲液重悬菌体，制成细菌悬液。冰浴中超声破碎细菌，超声功率设定60％W，超声3s，间隔3s，总时间15Min。溶液变为澄清且不粘稠，4℃8000r/min离心10min，保留上清，SDS-PAGE电泳鉴定。由图1-1可以看出，诱导后，在破碎液上清中表达出本发明所述Tɑ1-Fc融合蛋白。

2.Tɑ1-Fc融合蛋白分离纯化

将镍柱内的胶液吹打均匀，使琼脂糖凝胶重悬；待胶床恒定后加5倍柱体积去离子水洗去20％乙醇；加10倍柱体积Binding buffer(含30mM咪唑)平衡柱子，控制流速2s/d；加入菌体超声破碎上清，流速20s/d，流出液分管保存；依次用咪唑浓度依次升高的Washingbuffer(含0mM咪唑、30mM咪唑、80mM、100mM、200mM咪唑)洗涤柱子，每个梯度用量10mL，洗出液分别分管保存。流速控制10s/d；用双蒸水冲洗柱子，加入20％乙醇放4℃保存；收集的蛋白质进行SDS-PAGE电泳分析。如图2所示：泳道1是未加入诱导剂时破碎液的上清，泳道2是加入诱导剂后的菌体破碎液的上清，3、4是100mM咪唑洗脱液，5是200mM咪唑洗脱液，由图可以看出100mM和200mM咪唑含有本发明所述Tɑ1-Fc融合蛋白，且目的蛋白纯度高。

3.Tɑ1-Fc融合蛋白的脱盐及冻干

蛋白的脱盐及冻干使用葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析，步骤如下：柱平衡。去掉顶盖打开下端封口，倒出柱贮存液，加入10mL的NH₄HCO₃冲洗柱子，控制流速5s/d；上样。样品上样体积0.5mL，样品进入柱内接入缓冲液洗脱，根据洗脱图谱收集含有目的蛋白的流出液；洗柱。用约8mLNH₄HCO₃缓冲液冲洗柱子。将收集的样品－20℃预冻，在冻干机中冻干，得到白色絮状蛋白粉末。

实施例三Tɑ1-Fc融合蛋白抗肿瘤及免疫活性的测定

1.1构建小鼠乳腺癌肿瘤模型

利用小鼠活体肿瘤模型，检测融合蛋白的抗肿瘤效果。购买实验用小鼠Balb/c，在其前肢左侧皮下注射小鼠乳腺癌细胞4T1，至成瘤80mm³-100mm³时，在前肢右侧皮下注射Tɑ1-Fc融合蛋白，阳性对照为注射紫杉醇(Docetaxel)，阴性对照注射PBS。每天注射一次，给药21天，每隔一天测量肿瘤大小，观察肿瘤变化趋势。

培养肿瘤细胞：将4T1细胞复苏，分别以含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基孵育，37℃，5％CO₂培养箱中培养，换液，至细胞长至对数期时，进行传代，获得足够的细胞数量；收集小鼠乳腺癌4T1细胞，胰酶消化，1000rpm离心5分钟，PBS清洗三次，用生理盐水(0.9％NaCl)重悬细胞，在显微镜下进行细胞计数，稀释成1×10⁷个/mL的细胞悬液。在每只Balb/c小鼠前肢左侧皮下注射0.1mL细胞悬液，十天左右，接瘤处出现80mm³-100mm³肿瘤块；小鼠按照瘤块体积大小分组，分别为给药组、对照组。每天在小鼠前肢右侧皮下给药0.1mL，并且每隔一天统计利用游标卡尺测量肿瘤的长与宽，称量小鼠体重，持续21天。处死小鼠，取血、脾和胸腺，解剖肿瘤，称量瘤重，4％多聚甲醛固定保存肿瘤组织进行分析；统计数据：利用Excel处理上述数据，分别对肿瘤大小变化、小鼠体重变化及瘤重大小进行统计学分析，肿瘤体积公式：体积＝0.5×长×宽²。在本次小鼠乳腺癌模型实验中，采用小鼠乳腺癌4T1细胞进行建模，细胞密度为1×10⁷个/mL。皮下注射肿瘤细胞十天左右，小鼠前肢左侧的接瘤处出现80mm³-100mm³肿瘤块，小鼠按照瘤块体积大小分组，分别为给药组、对照组。给药组为(Tɑ1和Tɑ1-Fc)组，对照组为阳性对照组(紫杉醇组)和阴性对照组(PBS组)。分组后给药组和阴性对照组每天给药一次，Tɑ1的给药剂量为0.082umol/kg，Tɑ1-Fc的给药剂量为0.082umol/kg；阳性药为紫杉醇，每二天给药一次，给药剂量为10mg/kg。给药11天后，与阴性对照组相比阳性对照组表现出明显的肿瘤抑制作用，但同时表现出一些副作用，如小鼠体重开始降低，精神萎靡等。同时其他给药组均表现出一定的抑制作用。

如图3-1所示，给药21天以后，Tɑ1给药组小鼠乳腺癌平均肿瘤体积为0.996±0.224cm³，与阴性对照PBS组小鼠无显著性差异；Tɑ1-Fc给药组小鼠乳腺癌平均肿瘤体积为0.758±0.105cm³，与阴性对照PBS组小鼠有显著性差异(P<0.05)，由此可以初步推断Tɑ1-Fc具有肿瘤抑制作用且其抗肿瘤效果强于Tɑ1。将小鼠处死取出肿瘤组织后称重如图3-2所示，Tɑ1给药组小鼠乳腺癌平均肿瘤重量为1.5998±0.5035g，Tɑ1-Fc组肿瘤重量均值为1.3445±0.2691g，阳性对照组肿瘤均值为1.2131±0.4996g，阴性对照组(PBS)肿瘤均值重量为1.8475±0.6462g。其中与阴性对照组(PBS)相比，Tɑ1组无显著性差异；Tɑ1-Fc(P<0.05)和阳性对照组(P<0.01)均有显著性差异。由此可见，Tɑ1-Fc比Tɑ1有着更好肿瘤抑制作用。

1.2ELISA检测细胞因子IFN-γ和IL-2的变化。

用荷瘤4T1的Balb/c小鼠，分对照组、给药组，给药持续21天，处死小鼠，取血，室温静置30min，4000rpm离心5分钟，收集上清血清，保存于-70℃冰箱；配制标准品，分别按梯度稀释1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml和空白孔，每孔加入50μl待测样品血清。空白孔加相同体积PBS；封板膜封板，置恒温培养箱37℃孵育30min。弃去液体甩干，每孔加洗涤液300μl，静置30s，甩干，重复5次；除空白孔外，其他每孔加入50μlHRP标记的抗体，封板膜封板，置恒温培养箱37℃孵育30min，弃去液体甩干，每孔加洗涤液300μl，静置30s，甩干，重复5次；每孔加入显色液(A和B)100μl，置恒温培养箱37℃避光孵育10min；每孔加终止液50μl，此时蓝色立马转为黄色。以空白孔调零，450nm波长下测OD值，由一系列梯度的标准品OD值计算出IL-2和IFN-γ的标准曲线，由标准曲线计算出待测样品的IL-2和IFN-γ的浓度，如表1-1所示，与阴性对照组PBS相比，融合蛋白Tɑ1-Fc的IFN-γ和IL-2含量显著提高，结果显示Tɑ1-Fc比Tɑ1具有更好的免疫调节效果。

表1-1.Tɑ1-Fc对小鼠乳腺癌4T1模型中IFN-γ和IL-2的影响

组别	IFN-γ(ng/L)	IL-2(ng/L)
			PBS	44.395±22.8	78.88±13.04
Tɑ1	119.153±13.91*	102.88±17.14
			Tɑ1-Fc	151.181±5.64**	293.03±99.95*
紫杉醇	78.091±3.08	256.06±93.84*

^*p<0.05；^**p<0.01

2.构建裸鼠乳腺癌肿瘤模型

利用裸鼠活体肿瘤模型，检测融合蛋白对人乳腺癌的治疗效果。购买实验用裸鼠Balb/c，在其前肢左侧皮下注射人乳腺癌细胞MCF-7，至成瘤80mm³-100mm³时，在前肢右侧皮下注射Tɑ1-Fc融合蛋白或Tɑ1，剂量为0.082umol/kg，每日一次，阳性对照为注射紫杉醇(Docetaxel)，剂量为10mg/kg，每二日一次；阴性对照注射PBS，每天注射一次，给药21天，每隔一天测量肿瘤大小，观察肿瘤变化趋势。

肿瘤细胞培养，获得足够量的MCF-7细胞。操作步骤同上；胰酶消化收集人乳腺癌MCF-7细胞，1000rpm离心5分钟，PBS清洗三次，用生理盐水(0.9％NaCl)重悬细胞，在显微镜下用血细胞计数板进行细胞计数，稀释成5×10⁶个/mL的细胞悬液。在每只Balb/c小鼠前肢左侧皮下注射0.1mL细胞悬液，十天左右，接瘤处出现80mm³-100mm³肿瘤块；测量小鼠肿瘤大小，同上；小鼠颈椎脱臼，剖出肿瘤称量，4％多聚甲醛固定保存肿瘤组织；统计数据：肿瘤体积公式：体积＝0.5×长×宽²。实验结果如图4-1所示，给药12天后，与阴性对照组相比，给药组Tɑ1和Tɑ1-Fc均表现出一定的肿瘤抑制作用，而阳性对照组(紫杉醇组)具有较好的肿瘤抑制作用，但其小鼠体重开始减轻，27后，小鼠平均体重降至14.2g。因人乳腺癌肿瘤生长缓慢，给药周期为27天，27天后，阴性对照组肿瘤体积为0.716±0.258cm³，Tɑ1组肿瘤体积为0.468±0.164cm³，与阴性对照组相比，肿瘤抑制率为34.6％；Tɑ1-Fc组肿瘤体积为0.373±0.129cm³，与阴性对照组相比，肿瘤抑制率为47.9％，与阴性对照组有显著性差异(P<0.05)，可以显著抑制肿瘤生长；阳性对照组肿瘤体积为0.269±0.048cm³，与阴性对照组相比，肿瘤抑制率为62.4％，与阴性对照组有显著性差异(P<0.01)。将小鼠处死取出肿瘤组织后称重，如图4-2所示，Tɑ1给药组平均肿瘤重量为0.454±0.174g，肿瘤抑制率为40.1％，与阴性对照组有显著性差异(P<0.05)；Tɑ1-Fc组肿瘤重量均值为0.375±0.1241g，肿瘤抑制率为50.5％，与阴性对照组有强显著性差异(P<0.01)；阳性对照组肿瘤均值为0.215±0.032g，肿瘤抑制率为71.6％，与阴性对照组有显著性差异(P<0.01)；阴性对照组(PBS)肿瘤均值重量为0.757±0.324g。结果充分表明Tɑ1-Fc抑制乳腺癌生长的效果远优于Tɑ1。

3.构建小鼠免疫缺陷模型

购买8周龄ICR雄性小鼠，按照40mg/kg的氢化可的松(HC)药物剂量皮下注射，持续8天，每天称量小鼠体重、观察小鼠精神状态。当小鼠出现萎靡不振，体重下降、毛发直立无光泽等症状，说明免疫损伤模型成功；将小鼠分为给药组、阴性对照组、空白对照组(未造模组)；持续给药7天，小鼠眼球取血，检测血清中相关细胞因子含量。取脾与胸腺，称重计算脏器指数。结果显示，与空白对照组相比，阴性对照组小鼠的脾脏指数和胸腺指数均明显降低，说明免疫抑制模型建立成功。与阴性对照组相比，给药组(Tɑ1和Tɑ1-Fc组)的脾脏指数和胸腺指数均升高，如表1-2所示。说明药物Tɑ1和Tɑ1-Fc能升高免疫低下小鼠的脾脏指数和胸腺指数，且Tɑ1-Fc作用效果比Tɑ1好。

表1-2 Tɑ1-Fc对免疫抑制小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响

3.1 ELISA检测细胞因子IFN-γ和IL-2的变化。

将眼眶采集的血液标本，室温静置30min，4000rpm离心5分钟，收集上层血清，保存于-70℃冰箱；配制标准品，分别按梯度稀释1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml和空白孔，每孔加入50μl待测样品血清。空白孔加相同体积PBS；封板膜封板，置恒温培养箱37℃孵育30min。弃去液体甩干，每孔加洗涤液300μl，静置30s，甩干，重复5次；除空白孔外，其他每孔加入50μl HRP标记的抗体，封板膜封板，置恒温培养箱37℃孵育30min，弃去液体甩干，每孔加洗涤液300μl，静置30s，甩干，重复5次；每孔按顺序加入显色液A、B各50μl，置恒温培养箱37℃避光反应10min；每孔加终止液50μl，此时蓝色立马转为黄色。以空白孔调零，450nm波长下测OD值。实验结果如表1-3所示，与阴性对照组PBS相比Tɑ1和Tɑ1-Fc组均能促进IL-2和IFN-γ表达，并且Tɑ1-Fc能使外周血中IL-2和IFN-γ含量分别升高38％、44％，较Tɑ1效果好。结果充分表明Tɑ1-Fc的免疫增强效果优于Tɑ1。

表1-3.Tɑ1-Fc对免疫抑制小鼠血清中IFN-γ和IL-2的影响

组别	IFN-γ(ng/L)	IL-2(ng/L)
			PBS	16.88±0.43	19.98±1.76
Control	19.41±0.26	21.64±0.59
			Tɑ1	21.26±0.77	26.25±2.32
Tɑ1-Fc	24.27±0.66	27.61±2.34

<110> 中国药科大学

<120> 一种抗肿瘤和免疫增强双重功效融合蛋白

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 420

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala

Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu

Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Glu Pro Lys Ser

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

Ser Pro Gly Lys

Claims (7)

1.一种双重功效融合蛋白，其特征在于由胸腺肽α1通过连接肽或者直接与免疫球蛋白恒定区连接而成，所述融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1) 设计合成并克隆得到如权利要求1所述融合蛋白的编码基因；

(2) 构建成表达质粒后转化大肠杆菌宿主菌中进行表达；

(3) 收集菌泥及破壁，收集破壁液上清，分离纯化后得到。

3.如权利要求1所述融合蛋白在制备治疗原发性或继发性 T 细胞缺陷病、自身免疫性疾病，细胞免疫功能低下疾病及癌症药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述原发性或继发性 T 细胞缺陷病、自身免疫性疾病，细胞免疫功能低下疾病包括重症肝炎、慢性活动性肝炎、慢性迁延性肝炎及肝硬化、带状疱疹、生殖器疱疹、尖锐湿疣、支气管炎、支气管哮喘、肺结核、上呼吸道感染、红斑狼疮、风湿性及类风湿性疾病、强直性脊柱炎、格林巴利综合症、再生障碍性贫血、白血病、血小板减少症、病毒性角膜炎、病毒性结膜炎、过敏性鼻炎、老年性早衰、妇女更年期综合症、多发性疖肿及面部皮肤痤疮等，银屑病、扁平苔癣、鳞状细胞癌及上皮角化症、儿童先天性免疫缺陷症等。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述癌症为各种腺癌及其转移癌。

6.一种药物组合物，其特征在于包括如权利要求1所述融合蛋白及药学上可接受的载体。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物还包括抗病毒药物、促细胞生长素或化疗药物。