CN101487020B - 重组金针菇免疫调节蛋白的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种使用巴斯德毕赤酵母进行表达的重组金针菇免疫调节蛋白的制备方法及应用。包括下述步骤：(1)编码FIP-fve基因的克隆；(2)重组巴斯德毕赤酵母表达载体的构建；(3)重组巴斯德毕赤酵母转化子的获得；(4)重组FIP-fve的诱导表达和纯化。本发明通过克隆编码金针菇免疫调节蛋白，构建巴斯德毕赤酵母表达载体，获得大量高产率和高纯度的重组金针菇免疫调节蛋白，5升发酵工艺获得的重组蛋白产量达300mg/L～350mg/L，纯度达90％以上，经纯化后检测其生物学特点和免疫生理活性与天然金针菇免疫调节蛋白相同，具有凝血活性，促进小鼠淋巴细胞增殖及分泌白介素和干扰素的功能，并能诱导肿瘤细胞凋亡。

Description

重组金针菇免疫调节蛋白的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种重组金针菇免疫调节蛋白，尤其是涉及一种使用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)进行表达的重组金针菇免疫调节蛋白的制备方法及应用，属于生物药工程领域。

背景技术

真菌免疫调节蛋白(Fungal immunomodulatory protein，FIP)最早是从灵芝子实体中提取获得的一种小分子蛋白质(命名为LZ-8，Kino et al.，1989，J Biol Chem，264：472-478)，具有刺激外周血淋巴细胞增殖，诱导白介素和干扰素等细胞因子分泌，促进核酸和蛋白质合成，抑制过敏反应，进而增强机体免疫力等功能。目前已从六种食、药用真菌中获得了这种真菌免疫调节蛋白质，分别是赤灵芝(LZ-8)，松杉灵芝(FIP-gts)，金针菇(FIP-fve；Ko et al.，Eur J Biochem，1995，228：244-249)，草菇(FIP-vvo)，紫芝(FIP-gja)和小孢子灵芝(FIP-gmi)，形成了FIP家族。这六种真菌免疫调节蛋白之间有较高的同源性(60％～70％)和相似的免疫学活性，具有与凝集素和免疫球蛋白相似的结构。真菌免疫调节蛋白能够凝集血细胞，促进小鼠脾淋巴细胞和人外周血淋巴细胞增殖，抑制多种过敏性反应，降低抗体产生，对抗小鼠足垫水肿和移植组织的排斥反应。其免疫调节活性主要表现为可促进免疫细胞增殖并促进T淋巴细胞分泌多种细胞因子(白介素-2、肿瘤坏死因子和干扰素IFN-γ等)。另外，真菌免疫调节蛋白具有抗病毒和细菌感染，对多种肿瘤细胞具有抑制生长或者直接杀伤作用。

金针菇免疫调节蛋白FIP-Fve由114个氨基酸残基组成，分子量为12704Da，不含组氨酸，半胱氨酸和甲硫氨酸。其一级和二级结构与人类免疫球蛋白重链可变区相似，为单纯蛋白质，不含糖基。利用NaBr渗透对FIP-fve进行单向不规则的晶体衍射方法揭示报道了其结构，发现对于FIP-fve活性起重要作用的二聚化是由于N端α螺旋的三维交换形成，其二聚化主要靠疏水作用稳定(Paaventhan et al.2003，J Mol Biol，332：461-470)。

FIP-fve是一种有丝分裂原，作为一种激活剂，具有促进外周血单核细胞周期G0/G1向细胞周期S发展，进而促进淋巴细胞的分裂和增殖(Ko et al.2008，Process Biochemistry 43：423-430)。FIP-fve能够激活和诱导人外周血淋巴细胞和T淋巴细胞分泌白介素IL-2、干扰素IFN-γ、肿瘤坏死因子TNF-α等细胞因子以及粘附因子ICAM-1，后者可促进不同的白细胞与靶细胞牢固结合，在上皮细胞发生炎症的调控、免疫反应和组织修复中起重要作用。在非特异性免疫方面，FIP-fve还可以提高TNF-β和一氧化氮的产量，显著地提高腹腔细胞对患癌细胞的杀灭能力，提高罹患小鼠血清中特异性抗体的浓度。还能有效抑制鼠类系统性过敏毒素反应，鼠足垫水肿反应。研究表明FIP-fve对食物过敏和过敏性呼吸道类疾病也有较好的治疗效果，可以对抗器官移植后的排异现象以及抑制对自体免疫所引起的糖尿病，通过减少IL-5α受体以及凋亡信号蛋白表达诱导嗜酸性粒细胞凋亡而有效抑制炎症和过敏反应。因此，FIP-fve是一种潜在的非常有效的免疫调节类药用蛋白。

由台湾发明人申请的专利“真菌免疫调节蛋白之用途”(中国200610127042.7)公开了天然和重组的灵芝免疫调节蛋白的免疫调节和抗肿瘤作用。其中提到天然金针菇免疫调节蛋白对降低糖尿病患者血糖的作用。由台湾发明人申请的专利“用敏感贴剂对过敏性鼻炎进行鼻腔局部免疫治疗”(Localnasal immunotherapy with allergen strip for allergic rhinitis；美国US Patent20040071718)阐述了天然金针菇免疫调节蛋白可以治疗过敏性鼻炎。由新加坡发明人申请的专利“分子”(Molecule；美国20060275312USPTO)公开了天然金针菇免疫调节蛋白的晶体结构，并以天然和细菌重组的融合蛋白为例阐述了金针菇免疫调节蛋白在治疗和诊断免疫疾病方面的用途。

从天然金针菇菌体中提取真菌免疫调节蛋白的产率很低，约为30mg/kg干重。因此应用基因工程将FIP-fve基因转入到相应的宿主中表达获得大量重组蛋白，进而开发应用是非常有意义和前景的。已有报道FIP-fve在大肠杆菌TG1和昆虫细胞Sf21中的重组表达(Ko et al.1997，J Formos Med Assoc，96：517-524；Jinn et al.2006，Biosci Biotechnol Biochem，70：2627-2634)，但产量较低仅为15mg/L和6.25mg/L。尽管细菌表达具有简单快速的特点，但是对于目的蛋白的高级修饰不完善，生物学活性低于天然蛋白；而昆虫细胞表达的重组蛋白接近天然蛋白的生物学活性，但比较费时且成本较高。

发明内容

本发明就是针对上述现有技术存在的问题提出的，目的是利用巴斯德毕赤酵母的重组表达，通过设计和构建，获得高产率和高纯度的重组金针菇免疫调节蛋白，5升发酵工艺表达量300mg/L～350mg/L，具有与天然金针菇菌体中提取真菌免疫调节蛋白相同的免疫生理功能，且成本低、容易实现的重组金针菇免疫调节蛋白的制备方法。

本发明的另一个目的是重组金针菇免疫调节蛋白在免疫制剂中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：重组金针菇免疫调节蛋白的制备方法，包括下述步骤：

(1)、编码FIP-fve基因的克隆：取干燥金针菇菌丝体在液氮研磨后，加入DNA提取液，获得基因组DNA，根据GenBank中已登录FIP-fve蛋白质序列(Accession P80412)设计PCR引物，在引物上游加入ATG以便增强重组免疫蛋白的表达效率和准确性；

(2)、重组巴斯德毕赤酵母表达载体的构建：将克隆的目的基因与载体pPIC9一起经过酶切，回收和连接，然后转化至大肠杆菌中，提取质粒pPIC9-FIP-fve；

(3)、重组巴斯德毕赤酵母转化子的获得：将上述构建好的重组酵母表达载体pPIC9-FIP-fve用BglII酶切线性化，采用电转法将目的基因转入酵母GS115中表达，经转化后的酵母菌液涂布于HIS缺失的选择培养基MD上，28℃至少培养3天分别挑至MM和MD培养基对比，提取转化子酵母的总DNA；

(4)、重组FIP-fve的诱导表达和纯化：选取正确的酵母转化子，首先用摇瓶500-1000ml振摇培养诱导重组蛋白表达，确定其有表达后，挑选其中表达量高的酵母菌进行5L发酵罐大量培养，发酵上清经透析后SDS-PAGE检测，并用君意凝胶分析系统测定目的蛋白产量，摇瓶发酵的产量至少为158.2mg/L，5L发酵罐的产量至少为300mg/L～350mg/L，样品进一步通过超滤系统超滤浓缩，4℃的低温透析后用血细胞凝集实验确定其活性，并进行DEAE-A25离子柱层析纯化，再进一步用高效液相色谱进行纯化，收集具有生理学活性的目的蛋白，最后检测重组FIP-fve的纯度。

步骤(1)所述的设计PCR引物为：上游，5`-ca gaattc atg tcc gcc acg tcg ctcacc-3`；下游，5`-ag gaattc ggatcc tca agt ctt ctt cca ctc agc-3`。

所述重组金针菇免疫调节蛋白在免疫制剂中的应用。

本发明的优点和有益效果如下：

本发明的重组金针菇免疫调节蛋白，是通过克隆编码金针菇免疫调节蛋白的基因，构建巴斯德毕赤酵母表达载体，并经应用证明，通过工程菌发酵表达获得大量高产率和高纯度的重组金针菇免疫调节蛋白，经纯化后检测其生物特性和免疫生理活性。5升发酵工艺获得的重组蛋白产量可达300mg/L～350mg/L，纯度达到90％以上，生物学特点和免疫生理活性与天然金针菇免疫调节蛋白相同，具有凝血活性，促进小鼠淋巴细胞增殖及分泌白介素和干扰素的功能，并能诱导肿瘤细胞凋亡。具体说明如下：

1.重组FIP-fve和天然的FIP-fve氨基酸组分一致：采取酸水解方法分析重组FIP蛋白的氨基酸组分，对氨基酸组分进行分析，证明重组蛋白的正确性。

2.重组FIP-fve和天然蛋白同样具有相似的低含量α-螺旋和较多的β-结构：对圆二色谱(CD)进行分析，重组FIP-fve的α-螺旋，β-折叠和β-转角的含量分别为11.3％，34.3％和11.9％，相对比例为1∶3∶1，与天然的FIP-fve三者比例接近。

3.重组FIP-fve发生了糖基化修饰：通过对重组真菌免疫调节蛋白糖含量分析，证明巴斯德毕赤酵母系统表达的重组FIP-fve发生了糖基化修饰，而天然的FIP-fve不含糖成分，重组FIP-fve经过一定的糖修饰，得到了正确的折叠而具有生物学活性。

4.重组FIP-fve与细胞的相互作用：经荧光显微镜下观察的结果表明重组FIP-fve与三种细胞(人外周血淋巴细胞HPBL，人胚肾细胞293T，人肺癌细胞A549)孵育后，重组金针菇免疫调节蛋白能够进入这三种细胞内(正常淋巴细胞和肿瘤细胞)，进而发挥其生物学功能，对作用细胞没有特异选择性。

5.重组FIP-fve体外促脾淋巴细胞增殖活性：用MTT法检测其在体外刺激小鼠淋巴细胞的增殖，结果表明重组FIP-fve在促小鼠脾淋巴细胞增殖的活性和天然蛋白相类似。另外，重组FIP-fve还和刀豆蛋白ConA共同作用刺激小鼠淋巴细胞增殖，结果表明重组FIP-fve主要是针对T型淋巴细胞起作用。

6.重组FIP-fve促进细胞的白介素-2和γ-干扰素分泌：用ELISA方法检测，结果表明重组FIP-fve明显的增强了小鼠脾淋巴细胞分泌白介素2(IL-2)和γ-干扰素的水平，具有和天然蛋白以及昆虫细胞表达的重组蛋白相似的功能。

7.重组FIP-fve抑制肿瘤细胞的生长：对体外抗肿瘤活性检测，结果表明重组FIP-fve对NB-4有明显的抑制作用，在浓度为8μg/ml时的抑制率为38.5％和45％。显微镜下观察加入重组FIP-fve的肿瘤细胞明显有聚集和破裂现象，说明重组FIP-fve诱导肿瘤细胞死亡，可以通过诱导癌细胞的凋亡而抑制肿瘤细胞的生长。

附图说明

图1是本发明表达重组金针菇免疫调节蛋白载体的示意图。

图2是本发明巴斯德毕赤酵母表达的重组金针菇免疫调节蛋白电泳图。

图3是本发明荧光标记FITC重组金针菇免疫调节蛋白与细胞的相互作用照片。

图4是本发明重组金针菇免疫调节蛋白促进小鼠脾细胞增殖柱状图。

图5是本发明自重组金针菇免疫调节蛋白诱导小鼠淋巴细胞分泌白介素-2和γ-干扰素柱状图。

图6是本发明重组金针菇免疫调节蛋白诱导肿瘤细胞NB4凋亡显微镜观察图。

图7是本发明重组金针菇免疫调节蛋白诱导肿瘤细胞NB4凋亡的流式细胞仪记录图。

具体实施方式

下面参见本发明的图1至图7并结合具体实施例对本发明进行进一步详细说明，但本发明的保护范围不受具体的实施例所限制，以权利要求书为准。另外，以不违背本发明技术方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

金针菇子实体购自市场。巴斯德毕赤酵母GS115和质粒pPIC9购自美国Invitrogen生命技术公司。限制性内切酶，质粒提取及DNA回收试剂盒以及相关生化试剂均购自大连宝生物公司，引物由上海生工公司合成。

(1)、编码FIP-fve基因的克隆：取0.5g干燥的菌丝体在液氮中研磨，加入15ml DNA提取液，然后加入K⁺，从而有效的去除多糖，同时用酚、氯仿和异戊醇抽提2次，最后得到并提取较纯的基因组DNA，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其结果。克隆编码FIP-fve基因的引物设计为：上游，5`-ca gaattc atg tcc gcc acgtcg ctc acc-3`，下游，5`-ag gaattc ggatcc tca agt ctt ctt cca ctc agc-3`；PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测并回收。根据GenBank中已登录FIP-fve蛋白序列(Accession P80412)设计PCR引物，在引物上游加入ATG以便增强重组免疫蛋白的表达效率和准确性。PCR扩增产物经1.2％琼脂糖电泳，出现了约350bp的DNA片段，与设计碱基大小相符。

(2)、重组巴斯德毕赤酵母表达载体的构建：表达载体pPIC-9上可用的多克隆位点很少，而NotI位点碱基在目的片段基因端点很难被酶切识别，所以用单酶切连接，将克隆的目的基因与pPIC9分别用EcoR I酶切后16℃连接，然后转化至大肠杆菌中，挑取大肠杆菌转化子，挑取单菌落提取质粒pPIC9-FIP-fve，并用多组酶切检测和测序，用基因本身和载体上都有的酶切位点BamHI或KpnI鉴定构建结果为正确的重组子，获得的正确表达载体。如图1所示为表达重组金针菇免疫调节蛋白载体的示意图。

用酶切电泳方法获得正确的重组表达载体后，为了更进一步的证明基因的准确和载体构建的正确性，将重组质粒测序，以5’/3’AOX为引物，结果与GenBank中已登录的FIP-fve序列比对后，证明完全正确。

Gaattcatgtccgccacgtcgctcaccttccagcttgcctacttggtgaagaagatcgatttcgactacacccccaactg

gggccgtggtaccccaagcagctacatcgacaaccttaccttccccaaggttctcaccgacaaaaaatactcgtaccg

cgtcgtggtcaatggctctgaccttggcgtcgagtccaacttcgcagtgacaccgtccggtgggcagaccatcaacttc

ctccagtacaacaaggggtatggtgtcgcggacaccaaaacgattcaagttttcgttgtcattccagataccggcaact

cggaggagtacatcatcgctgagtggaagaagacttgaggatccgaattcc。

(3)、重组巴斯德毕赤酵母转化子的获得：

将上述构建好的重组巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9-FIP-fve用BglII酶切线性化，采用电转法将目的基因转入酵母GS115中表达，含目的基因的线性质粒DNA片段上有HIS密码基因，而野生型的巴斯德毕赤酵母GS115不能合成该基因，经转化后的酵母菌液涂布于HIS缺失的选择培养基MD上，28℃培养3天长出酵母单克隆菌落，再分别挑至MM和MD培养基对比，鉴定表型。如果在二者上酵母菌生长相似，菌落大小一样，说明目的片段为单点插入整合，表型为His⁺Mut⁺，如果在MD上生长的菌落大小明显比MM上的要大，说明基因片段为双点替换整合，表型为His⁺Mut^s。获得的金针菇FIP-fve的酵母转化子，经过MM和MD培养后观察结果，从表型上鉴定都为His⁺Mut^s型。

对巴斯德毕赤酵母转化子的PCR进行鉴定，采用HIS选择培养基初步鉴定后，参照表达手册方法提取转化子酵母的总DNA。再用FIP-fve基因的引物进行PCR检测，结果表明所有的酵母转化子均为阳性结果，说明目的基因已经成功转入酵母GS115中。

(4)、重组FIP-fve的诱导表达和纯化：先选取正确的酵母转化子之后，

i、摇瓶发酵

挑取新鲜活化的Muts型酵母转化子至50ml BMGY中，30℃振摇过夜培养；

取500μl菌液至含有250ml BMGY的摇瓶中，30℃振摇培养16-18h，至OD₆₀₀＝2-6；

将菌液倒入灭菌离心管，4000rpm室温离心5分钟，收集酵母细胞；

无菌条件下将菌沉淀重悬浮于5-10倍体积的BMM中，放到含有500mlBMM培养基的摇瓶中继续培养；

每隔24h，补加0.5％(v/v)甲醇，共诱导培养4天；

收集发酵液，12000rpm室温离心5分钟，保留上清；

将上清液放入6000透析袋中4℃透析，每2h更换蒸馏水，共5次；

SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。

ii、重组FIP-fve的5升发酵罐发酵

发酵罐为WKT-J-7D/O型发酵罐(江苏绿扬电子集团威科特)；罐体总容积5升；装液系数75％；材质为不锈钢；搅拌方式为平叶/斜叶；在位灭菌；温度控制在30℃；转速控制在200rpm，专用发酵软件。

从新鲜YPD平板挑重组FIP-fve酵母工程菌单菌落接种于10mL BMGY种子培养基，30℃振荡培养至OD₆₀₀为5-6；

转接于400mL BMGY培养基中，30℃振荡培养至OD₆₀₀达6-8作为发酵菌种；

按10％接种量转入5L发酵罐的基础培养基中，进行甲醇诱导发酵96h；

收集发酵液经6000rpm室温25min离心，收集上清；

将上清液放入6000透析袋中4℃透析24h备用；

SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。

从图2中可以看出，1为标准蛋白；2，3为空白菌对照；4，5，6，7，8分别为诱导培养2，3，4，5，6天的样品；9为纯化后的样品，与野生型毕赤酵母相比，转化酵母上清SDS-PAGE分析出现15-20kD的2个蛋白带，所述的蛋白带与重组蛋白的不同修饰水平有关。样品透析后电泳检测，并取3等分50ml样品透析后SDS-PAGE电泳并用君意凝胶扫描和分析系统(JYO4S-3C)粗略分析目的蛋白产量，分析目的蛋白泳道和条带，与蛋白marker做比对，分析系统自动给出蛋白带的OD值，换算重组FIP-fve的产量。摇瓶发酵的产量为158.2mg/L，5L发酵罐的产量为300mg/L～350mg/L。

以摇瓶发酵为例，计算目的蛋白方法为：如上样量为15μl，稀释倍数为1.8(50ml→90ml)，Marker蛋白带为0.5μg，即：

[(0.846+0.812+0.856+0.818+0.833+0.806)/3]/[(0.433+0.510)/2]×0.5×1.8/20＝0.1582μg/μl，相当于158.2mg/L。

iii、超滤纯化

离心收集后的酵母发酵液上清用PALL超滤系统5kD的滤膜对透析后的发酵上清液进行超滤，加入蒸馏水，最终收集滤膜膜上浓缩液约100ml，整个过程中更换冰袋放入滤液缸，保持4℃的低温操作。

iv、离子柱纯化

取处理好的DEAE-Sephadex-A25凝胶，装柱(2×20cm)，用pH 8.0，10mMTris·HCl磷酸缓冲液过夜平衡；

将浓缩的超滤发酵液12000rpm离心2分钟，上清液上柱；

用pH 8.0、10mM Tris·HCl缓冲液300ml过夜洗涤凝胶柱；

用0-0.4M NaCl的Tris·HCl缓冲液对凝胶柱进行线性离子梯度洗脱，洗脱流速为40ml/h，每管收集10ml；

收集洗脱峰的洗脱液，透析后取微量用于SDS-PAGE电泳检测结果，同时检测其血细胞凝集活性；

其余透析液低温冻干备用。

由于FIP-fve的等电点为6.2，所以重组FIP-fve显负性，进行DEAE-A25离子柱层析分离时，重组FIP-fve被挂柱，然后用0-0.4M NaCl的Tris·HCl缓冲液进行线性盐浓度梯度洗脱，从层析图看出，有小部分的杂蛋白在不同时间被洗脱，但是目的蛋白的吸收峰明显高，准确收集峰洗脱液，透析后样品进行血细胞凝集实验表明其确实有活性。

v、HPLC纯化

取离子凝胶柱层析洗脱后的目的蛋白冻干样溶于pH 8.0、10mM Tris·HCl磷酸缓冲液，调节样品浓度为3mg/ml；

高效液相色谱纯化采用日本SHIMADZU LC-10AVP系统，检测器：SHIMADZU LC-10AVP，工作站：CLASS-Vp，色谱柱：TSK-GEL，G3000PWXL，流动相为pH 8.0、10mM PBS磷酸缓冲液，流速为0.5ml/min，柱温为4℃，柱压为1.6mpa；

对照收集的蛋白峰和记录峰，结果有两个活性峰出现，峰1量较大，峰2较小，分别准确收集两个峰的洗脱液，进行SDS-PAGE电泳和血细胞凝集活性实验检测，确定1峰为目的蛋白；

严格收集第一活性峰，彻底透析，低温冻干后得到重组免疫调节蛋白纯品，保存备用。

vi、重组FIP-fve的纯度测定

重组蛋白产量测定：取15μl或20μl发酵上清的透析液，SDS-PAGE凝胶电泳后，用君意凝胶扫描和分析系统(JYO4S-3C)分析和计算重组蛋白的产量。

纯化的重组蛋白纯度测试：取高效液相纯化后样品，溶于pH 8.0、10mMPBS中，调节浓度为1-2mg/ml。用BCA蛋白检测试剂盒(PIERCE)检测蛋白纯度，BSA作标准。分别取待测样品和标准品0.1ml和2ml BCA工作液，混匀后放置37℃，30分钟，于560nm下测定吸光值，以BSA制作标准曲线，以纯品BSA作对照和标准，得到的标准曲线为：Y＝0.0009X+0.0962(R²＝0.9668，P＜0.001)，Y为吸收OD值，X为样品蛋白浓度(μg/ml)，代入平均OD(1.208)，最后计算出重组FIP-fve的纯度为92.4％。

对重组金针菇免疫调节蛋白进行理化特征检测如下：

一、方法：

1.重组FIP-fve的氨基酸分析

采取酸水解方法分析重组蛋白的氨基酸组分。准确称量纯化的重组FIP-fve10mg，溶于2ml 6M HCL，充分溶解后转入到5ml水解管中，严密封口后110℃水解反应20-24小时，吸出水解液至蒸发皿中，沸水浴蒸干驱尽HCL，样品送至吉林大学分析测试中心，在Agilent 1100型氨基酸自动分析仪分析氨基酸组分。

2.重组FIP-fve的圆二色谱(CD)分析

重组FIP-fve的二级结构单元分析采用圆二色谱(CD)检测。准确称量1.3mg纯品重组蛋白，溶于1ml灭菌4℃水中，然后稀释10倍，调节最终蛋白终浓度至10^-6-10^-7M。样品送至吉林大学分析测试中心，在J-810型圆二色谱仪上检测和记录。分析结果数据用Origin 6.0软件作图，同时把测试结果的数据用Chen和Yang的方法计算各二级结构单元含量。

3.重组FIP-fve的糖含量分析

用苯酚-硫酸法测定重组FIP-fve的可溶性中性糖含量。准确称量1.5mg纯品重组FIP-fve，溶于1mlpH 8.0、10mM PBS缓冲液，调节最终蛋白浓度为0.25mg/ml。取1ml稀释蛋白液至大试管(2×15cm)中，用移液管准确加入6％苯酚0.5ml，振荡混匀后，延试管壁缓慢准确加入2.5ml浓硫酸，振荡混匀后沸水浴煮沸10分钟，然后放置冷却至室温，在723型可见光分度计于490nm测定每管OD值，平行做3管，取平均值。同时，取1ml灭菌蒸馏水做负对照，1ml不同浓度葡萄糖(10，20，30，40，50，60，70，80，90和100μg/ml)PBS溶液做正对照和标准。制作标准曲线，并计算重组FIP-fve的糖含量。

二、结果：

1.重组FIP-fve氨基酸组分分析

采取酸水解方法分析重组FIP-fve蛋白的氨基酸组分。根据检测结果，计算各种测试氨基酸的重量百分比含量，与已发表的氨基酸组分进行比对，重组FIP-fve和天然的氨基酸组分一致，证明重组FIP-fve的正确性。

2.重组FIP-fve圆二色谱(CD)分析

功能蛋白的正确折叠对蛋白活性很关键，而FIP-fve的二级结构的形成尤其是α-螺旋对二聚体形成和生物活性至关重要。采用圆二色谱(CD)对重组FIP-fve的二级结构进行了测定，确定其形成二级结构单元和可能的正确折叠。用Yang等人的方法，通过换算计算各二级结构单元的含量，重组FIP-fve的α-螺旋，β-折叠和β-转角的含量分别为11.3％，34.3％和11.9％，相对比例为1∶3∶1，天然的FIP-fve三者比为3∶6∶1，和天然蛋白一样具有相似的低含量α-螺旋和较多的β-结构。

3.重组FIP-fve糖含量分析

重组FIP-fve的糖含量用苯酚-硫酸方法测定，以纯品葡萄糖作标准曲线，回归方程为：Y＝0.01553X+0.00518(R2＝0.923，P＜0.01)，Y为490nm吸收值，X为样品糖浓度，然后代入重组FIP-fve样品，最后算出重组FIP-fve糖含量为1.2％。天然的FIP-fve不含糖成分，而重组FIP-fve糖含量，说明用巴斯德毕赤酵母系统表达的重组FIP-fve发生了糖基化修饰。重组FIP-fve得到了一定的修饰，可能使重组FIP-fve得到正确的折叠从而具有生物活性。

对重组金针菇免疫调节蛋白免疫生理活性的检测如下：

一、方法

1.FITC荧光素标记蛋白和显微镜观察

材料仪器：异硫氰酸荧光素(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte，FITC)，购自吉尔生化(上海)；二甲基亚砜；碳酸盐缓冲液(pH 8-9.5)；磷酸盐缓冲液(PBS)；Desalting Hiprep 26/10脱盐柱；AKTApurifier；IMDM细胞培养液(Hyclone)，胎牛血清(FBS，Gibco)，日立分光光度计，激光扫描共聚焦显微镜80i(Nikon)。

荧光标记蛋白：将纯化的重组FIP-fve(7.5mg·ml^-1)20ml溶于碳酸盐缓冲液(pH8.3)透析过夜，称取3.75mg FITC，加入二甲亚砜(DMSO)3.75ml配制成FITC-DMSO溶液。在50ml小烧杯中先放入重组FIP-fve溶液，加入逐滴FITC-DMSO溶液，再用PBS加至30ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌4h，用Desalting Hiprep 26/10脱盐柱于AKTApurifier系统上除去游离荧光素，75mlPBS洗脱，280和495nm检测，峰收集。将制备的FITC-重组FIP-fve(10倍稀释)于220-520nm扫描，A₄₉₅＝0.445，A₂₈₀＝0.67，计算标记效率(F/P)为3.80。

细胞培养：将不同种类的细胞以2×10⁶接种于24孔培养板中，每孔0.5ml，以IMDM(2％FBS)培养液配制FITC-重组FIP-fve为100ng·ml^-1，每孔0.5ml孵育(37℃)，设空白对照组和24h实验组。24h后取出细胞加入至1.5mlEP管中，1000rpm离心，弃上清，以PBS清洗3次，洗净重悬，制片。

细胞观察：于激光扫描共聚焦显微镜下观察，照相记录。

2.促小鼠脾淋巴细胞增殖活性测定

采用MTT法测定重组FIP-fve对小鼠脾淋巴细胞的促分裂作用，所用抗生素，重组FIP-fve样，ConA，LPS和MTT都用0.22μm超滤膜过滤，-20℃保存。

取4-6周无致敏环境下生长的BalB/C小鼠，断颈处死小鼠，75％酒精浸泡3分钟，在超净工作台中无菌条件下取脾脏；

采用研磨法，用4-6层灭菌纱布，分离脾淋巴细胞；

用3ml RPMI1640培养液(不含BSA和双抗)悬浮脾细胞，2000rpm离心2分钟；

小心吸取上清，重复上一步骤3-5次；

将脾细胞悬浮于1ml配制好的RPMI1640培养液(含有10％BSA，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)中，稀释浓度至1×10⁶细胞/ml；

在96孔培养板上每孔加入100μl脾淋巴细胞悬浮液，加入重组FIP-fve PBS溶液(终浓度1，2，4，8，16和32μg/ml)，重组FIP-fve PBS溶液(终浓度10，20，40，60，80和100μg/ml)，同时加pH7.2，10mM PBS，ConA(终浓度5μg/ml)和LPS(终浓度2μg/ml)分别做为负对照和正对照；

将培养板封口，放置于5％CO₂，37℃培养箱中培养48-72小时，在显微镜下观察细胞增殖效果；

沿培养板孔内壁小心加入20μl MTT的PBS液，轻轻振荡30秒混匀，继续培养4-5小时；

小心吸取上清，尽量吸干细胞培养液，加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，轻轻振荡10分钟后，放入酶标仪(Model 680，Bio-Rad)，于570nm测定吸光值，记录读数，制作重组金针菇免疫调节蛋白促进小鼠脾细胞增殖反应-曲线柱状图，如图4所示。

3.促细胞因子白介素IL-2和干扰素分泌活性测定

通过ELISA方法检测重组FIP-fve促进小鼠脾淋巴细胞分泌白介素(IL-2)和γ-干扰素的作用以测定其免疫调节活性。

BalB/C小鼠脾淋巴细胞悬浮液制备同上，最终稀释于配制好的RPMI1640培养液(含有10％BSA，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)中，稀释浓度至1×10⁷细胞/ml；

在96孔培养板加入100μl细胞悬浮液，100μl重组FIP-fve液终工作浓度为1，2，4，8，16和32μg/ml，同时加100μl ConA(5μg/ml)和pH7.2，10mM PBS做正负对照。每个样品做2个平行孔。密封好后，轻轻震荡混匀，放于5％CO₂，37℃培养箱中培养48小时；

吸出细胞培养液，2000rpm室温离心5分钟，收集上清。以下步骤用小鼠IL-2定量ELISA试剂盒操作；

加入100μl样品上清，同时取标准品小鼠IL-2和干扰素，分别稀释至终浓度为15.6，31.2，62.5，125，250，500和1000pg/ml作为正对照和制作标准，用PBS做负对照，加入100μl标准品和PBS，每个样品做2个平行孔；

轻微震荡混匀后，放于37℃培养箱中培养2小时，小心吸出上清液，用洗涤液每孔200μl洗涤5次，倒置滤纸上尽量空干液体；

每孔加入一抗50μl，放于37℃培养箱中培养1小时，洗涤液洗板同上；

加入二抗(酶标抗体)100μl，放于37℃培养箱中培养1小时，洗板同上。

每孔加入底物工作液100μl，放于37℃培养箱中暗反应10分钟，每孔加入50μl终止反应液；

将培养板放入酶标仪，于492nm测定吸光值，记录读数，制备标准曲线并计算样品IL-2含量。

4.MTT法测定体外抗肿瘤活性

采用MTT方法和流式细胞术(FCM)测定重组FIP-fve的抗肿瘤活性。首先用MTT法粗测定重组FIP-fve对人白血病细胞NB4和小鼠肉瘤细胞S-180的作用。

NB4和S-180细胞由吉林大学再生医学所提供，在高糖DMEM中传代培养后，测量细胞浓度直到其浓度为5×10⁵细胞/ml；

在96孔培养板内每孔加入100μl肿瘤细胞悬浮液，100μl重组蛋白样品，重组FIP-fve终浓度为1，2，4，8，16，32，64和128μg/ml，同时加入5-氟尿嘧啶(5μg/ml、10μg/ml)做正对照。每个样品做3个平行孔；

混匀后，放于5％CO₂，37℃培养箱中培养12-72小时，每隔12小时显微镜观察抗肿瘤结果；

24小时后，沿培养板孔内壁小心加入20μl MTT的PBS液，轻轻振荡30秒混匀，继续培养4-5小时；

小心吸取上清，尽量吸干细胞培养液，加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，轻轻振荡10分钟后，放入酶标仪(Model 680，Bio-Rad)，于570nm测定吸光值，记录读数。制作反应-曲线柱状图。计算重组FIP-fve对肿瘤细胞的抑制率。

5.流式细胞术(FCM)测定抗肿瘤活性

在用MTT法初步确定重组FIP-fve的抗肿瘤活性后，采用FCM法进一步准确测定重组FIP-fve的抗肿瘤活性。

在5％CO₂，37℃培养箱中用高糖DMEM培养液培养NB4细胞，使其生长至浓度为1×10⁶细胞/ml；

在12孔培养板中每孔加入0.8ml肿瘤细胞悬浮液，加入0.2ml终浓度为8，16和32μg/ml的重组FIP-fve，以正常生长的NB-4细胞做负对照，每个样品浓度做2个平行孔。在5％CO₂，37℃培养箱中培养24小时；

用3000rpm室温离心5分钟，收集肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞的凋亡率用Annexin-V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒测定；

用pH7.2、10mM PBS洗涤NB-4细胞，3000rpm室温离心5分钟，共2次，确保最终收集细胞为1-5×10⁵；

加入试剂盒内结合缓冲液500μl，混匀；再加入2μl Annexin-V-EGFP，混匀，最后加入5μl碘化丙啶(PI)，充分混匀；

室温避光暗处反应10-15分钟，在1个小时内送至流式细胞仪进行测试；

FCM采用488nm激发波长，530nm发射波长；Annexin-V-EGFP的绿色荧光通过FITC通道(FL1)，PI红色荧光通过PI通道(FL3)；

以未经PI和EGFP染色的正常生长的NB4细胞做纯阴性对照，记录所有被荧光标记的肿瘤细胞，同时计算诱导细胞凋亡率。

二、结果

1.重组金针菇免疫调节蛋白一与细胞的相互作用

荧光显微镜下观察，经FITC标记的重组FIP-fve(6.25μg/ml)与三种细胞(人外周血淋巴细胞HPBL，人胚肾细胞293T，人肺癌细胞A549)孵育24h后，细胞内绿色荧光都增强，标记蛋白大部分进入细胞内，未标记蛋白处理的细胞无绿色荧光，如图3是本发明荧光标记FITC重组金针菇免疫调节蛋白与细胞的相互作用照片，结果表明重FIP-fve能够进入这三种细胞内(正常细胞和肿瘤细胞)，进而发挥其生物学功能，对作用细胞没有特异性选择。

2.促脾淋巴细胞增殖活性检测

天然的FIP-fve被证明可以促进小鼠脾淋巴细胞或者是人外周血淋巴细胞的增殖，用MTT法检测重组FIP-fve在体外刺激小鼠淋巴细胞的增殖。结果表明，加入了重组FIP-fve的小鼠脾淋巴细胞明显数目增多，虽然比LPS作用弱相比，但是在某些浓度时比ConA还要强，如图4所述本发明重组金针菇免疫调节蛋白促进小鼠脾细胞增殖柱状图，正常脾淋巴细胞作为负对照，LPS和ConA作为正对照，重组FIP-fve浓度分别从10-320μg/mL，(**)表示P＜0.01。重组FIP-fve在80μg/mL时最大限度促进细胞增殖；而天然的FIP-fve在100μg/mL达到最有效浓度，说明重组FIP-fve和天然蛋白一样具有促小鼠脾淋巴细胞增殖的功能。另外，重组FIP-fve还和ConA共同作用刺激小鼠淋巴细胞增殖，其最有效浓度为8μg/mL，说明重组FIP-fve主要是针对T型淋巴细胞起作用。

3.促白介素-2和γ-干扰素分泌活性检测

以前的研究报道指出FIP-fve可以在体内或体外诱导小鼠脾淋巴细胞和人血淋巴细胞分泌产生多种细胞因子，该活性与FIP-fve的免疫调节和抗肿瘤功能密切相关。测定了重组FIP-fve促细胞增殖活性后又用ELISA方法检测了其增强小鼠脾淋巴细胞分泌细胞白介素2(IL-2)和γ-干扰素的能力。结果表明重组FIP-fve明显的增强了小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2和γ-干扰素的水平，如图5是本发明自重组金针菇免疫调节蛋白诱导小鼠淋巴细胞分泌白介素-2和γ-干扰素柱状图，以已知的PBS和ConA分别作为负对照和正对照，重组FIP-fve的浓度从1-16μg/mL，ConA诱导水平为1032.8pg/ml，与已发表的结论一致。重组FIP-fve在16，8和4μg/mL时诱导IL-2分泌水平为618，430和316pg/ml，而来自昆虫细胞表达的重组FIP-fve在15，10和5μg/mL时诱导IL-2水平分别为668，503和349pg/ml，这说明从巴斯德毕赤酵母中表达的重组FIP-fve具有和天然蛋白以及昆虫细胞表达的重组FIP-fve相似的增强IL-2胞因子分泌水平的活性。

4.体外抗肿瘤活性检测

用MTT法测定重组FIP-fve对白血病细胞NB-4和小鼠肉瘤细胞S-180的抑制作用，结果发现重组FIP-fve对NB-4和S-180有明显的抑制作用，在浓度为8μg/ml时最大抑制率为38.5％。显微镜下观察到加入重组FIP-fve的细胞明显有聚集和破裂现象，说明重组蛋白诱导癌细胞NB-4和S-180的死亡，如图6是本发明重组金针菇免疫调节蛋白诱导肿瘤细胞NB4凋亡显微镜观察图片，显微镜(20×16)下观察正常NB-4细胞和重组FIP-fve诱导死亡的癌细胞；图7是本发明重组金针菇免疫调节蛋白诱导肿瘤细胞NB4凋亡的流式细胞仪记录图，a为正常生长的NB-4细胞作为负对照。B、c、d表示不同浓度重组FIP-fve(64、32和16μg/ml)诱导NB-4细胞凋亡结果。B1：I染色的癌细胞，机械和自然死亡的细胞；B2：被PI和EGFP双染色的癌细胞，表示正常死亡和诱导凋亡的细胞；B3：不被染色的细胞，即活的癌细胞；B4：被EGFP染色的细胞，即被诱导凋亡的癌细胞。

为了进一步更准确的检测其抗肿瘤活性，用流式细胞术检测重组FIP-fve诱导NB-4细胞凋亡。结果可以看出，作为负对照的正常生长的NB-4细胞的活细胞占62.3％，而加入了重组FIP-fve的NB-4活细胞比例分明下降到54.8，43.1和48.8％；另外，凋亡的NB-4细胞的比例明显增加，由正常的17.3％增加到32.4％，表明重组FIP-fve具有明显的诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

重组金针菇免疫调节蛋白免疫制剂的应用

1、重组FIP-fve用于提高免疫力的保健口服液：以重组FIP-fve为活性剂，有效含量为200mg/L，制备口服液，具体用法：成人每日两次、每次服用20mL，对化疗后病人用药2-3周就有提高人体免疫力功效，特别是具有升高白细胞的功效。

2、重组FIP-fve治疗过敏症药物：以重组FIP-fve为活性剂，有效浓度35％，制成外用喷剂鼻腔喷入给药，成人每次每鼻孔2-3揿，每日三次、使用1-3就有预防和治疗过敏性鼻炎的作用。

3、重组FIP-fve升高白细胞治疗制剂：以重组FIP-fve为活性剂，有效含量为200mg/Kg，制成口服药物和非肠道药物，具体用法：成人每日三次、每次服用20mg，用于各种原因引发的白细胞减少症的治疗。

4、重组FIP-fve作为艾滋病药物或疫苗佐剂：以重组FIP-fve为活性剂，有效浓度60％，制成防治和治疗艾滋病的免疫药物或疫苗佐剂，重组FIP-fve和艾滋病病毒都作用于T淋巴细胞，但效果拮抗。艾滋病病毒通过受感染的T细胞在死亡前产生病毒粒子来慢慢损耗健康的白细胞，造成机体免疫力低下。而FIP-fve主要作用于T淋巴细胞，促进其增殖和分泌细胞因子，提高免疫力。FIP-fve能有效地抵抗和防御艾滋病病毒对T淋巴细胞的侵害和对免疫系统的破坏。

5、重组FIP-fve作为抗肿瘤药物：以重组FIP-fve为活性剂，有效含量为300mg/Kg，制成口服药物和非肠道药物用于肿瘤的治疗，特别是用于淋巴系统肿瘤的治疗。具体用法：成人每日三次、每次服用20mg。重组FIP-fve可以通过诱导免疫细胞分泌γ-干扰素，白介素-2和肿瘤坏死因子等，并且可以诱导肿瘤细胞凋亡，达到直接或间接杀伤肿瘤细胞，提高机体免疫力的目的。

Claims (1)

1.重组金针菇免疫调节蛋白的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)、编码FIP-fve基因的克隆：取干燥金针菇菌丝体在液氮研磨后，加入DNA提取液，获得基因组DNA，根据GenBank中已登录的Accession P80412的FIP-fve蛋白质序列设计PCR引物，在引物上游加入ATG以便增强重组免疫蛋白的表达效率和准确性；

(2)、重组巴斯德毕赤酵母表达载体的构建：将克隆的目的基因与载体pPIC9一起经过酶切，回收和连接，然后转化至大肠杆菌中，提取质粒pPIC9-FIP-fve；

(3)、重组巴斯德毕赤酵母转化子的获得：将上述构建好的重组酵母表达载体pPIC9-FIP-fve用BglII酶切线性化，采用电转法将目的基因转入酵母GS115中表达，经转化后的酵母菌液涂布于HIS缺失的选择培养基MD上，28℃至少培养3天分别挑至MM和MD培养基对比，提取转化子酵母的总DNA；

(4)、重组FIP-fve的诱导表达和纯化：选取正确的酵母转化子，首先用摇瓶500-1000ml振摇培养诱导重组蛋白表达，确定其有表达后，挑选其中表达量高的酵母菌进行5L发酵罐大量培养，发酵上清经透析后SDS-PAGE检测，并用君意凝胶分析系统测定目的蛋白产量，摇瓶发酵的产量至少为158.2mg/L，5L发酵罐的产量为300mg/L～350mg/L，样品进一步通过超滤系统超滤浓缩，4℃的低温透析后用血细胞凝集实验确定其活性，并进行DEAE-A25离子柱层析纯化，再进一步用高效液相色谱进行纯化，收集具有生理学活性的目的蛋白，最后检测重组FIP-fve的纯度；

步骤(1)所述的设计PCR引物为：上游，5`-ca gaattc atg tcc gcc acg tcg ctcacc-3`；下游，5`-ag gaattc ggatcc tca agt ctt ctt cca ctc agc-3`。

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