CN106367422A - 一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法，包括：将重组大肠杆菌BL21/pET‑32a‑rShIFNtau发酵后提取总蛋白，用透析复性、亲和层析和透析置换缓冲液三步法纯化，冷冻干燥，即得。按照本方法制备的重组羊τ型干扰素生物学活性标准品工作效价为1.0×106U/mL；SDS‑PAGE电泳和HPLC检测其纯度＞95％；相对分子量为36KD；N‑末端氨基酸序列从第十个氨基酸开始为CYLSQRLMLDARENL。

Description

一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法

技术领域

本发明提供一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法，是一种用于重组羊干扰素τ特性鉴别和效价测定的生物学活性参考标准品。

背景技术

畜牧业作为我国重要的产业，已经成为国民经济的重要支柱，它与人民生活息息相关。随着改革开放的进程，人类社会的发展和生活水平在不断提高，畜牧业也得到了长足的发展。养羊业是我国畜牧业中的重要支柱产业之一，也是现代农业中优势产业之一，羊肉更是我国穆斯林群众生活的必需品和城乡居民重要的菜篮子产品，生羊养殖一直是农民增收的重要途径和手段。但长期以来，畜禽传染病不仅给从事养殖业的农民造成了重大损失，而且对群众健康造成了严重的威胁。最近一段时期以来，畜禽传染性疾病呈高度爆发趋势，影响恶劣。消费群体从自身健康角度出发，开始减少或者杜绝购买禽畜产品，促使禽畜市场销售份额极急剧下降，给畜禽类养殖户带来了巨额经济损失。我国每年因各种病毒性疾病引起畜禽死亡率高达15％～20％。据报道仅2013年初至当年7月间，小反刍兽疫暴发导致的活羊禁止调运，影响规模化育肥企业效益同比大幅度下降，甚至亏损严重。

目前对羊类传染病等人畜共患病的预防和治疗途径主要是通过疫苗接种防疫，使用抗病毒药治疗，但是这些方法存在着如下局限：1、病毒产生的耐药性增加；2、疫苗种类有限且血清型单一；3、难以大批量生产等种种局限。因此，使用无任何毒副作用的干扰素来治疗和预防羊类病毒性疾病将是当前较为关注的问题。

干扰素(interferon，IFN)是病毒感染诱导机体产生的一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖及发挥抗肿瘤的活性。干扰素被认为是当今应用前景最为广阔的生物制剂之一，目前全球有60多个国家和地区应用人干扰素制剂治疗大约30多种病毒性疾病。按照干扰素的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥的作用不同，分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三大类。Ⅰ型干扰素在体内外能发挥广谱、高效抗病毒作用机制主要是抑制病毒蛋白质的合成，并能选择性地作用于受感染细胞，而对正常宿主细胞无作用或作用微弱，使用后无任何药物残留。

据国内外相关研究资料显示，羊干扰素中对羊干扰素τ的研究较多且较深入。羊干扰素τ是一种由反刍动物怀孕第12～22天时滋养层所分泌的Ⅰ型干扰素。它具有Ⅰ型干扰素(IFN-τ、IFN-β、IFN-ω)的共同特性，如：拥有共同受体、基因内无内含子、抗细胞增殖等特性。干扰素τ除了具有以上特性外，还有一些其他型干扰素不具备的特性，如：它对反刍动物的繁殖起到重要的作用，它被作为一种怀孕识别信号，可抑制雌激素受体α基因的转录，可调节子宫内膜的雌激素、催产素等激素的受体，而且还具有延长黄体寿命的功能。它不是由病毒诱导产生，却有很强的抗病毒活性，可特异地抑制水疱性口炎病毒、人乳头瘤病毒、羊的慢病毒；猫和人免疫缺陷病毒等；并且具有其他型别干扰素所不具备的优良生物学特性，即在较高浓度使用时无细胞毒性，安全性极高。

为了有效预防和控制人畜共患病,减少病毒性疾病对养羊业带来的损失，自2000年以来，针对羊病防控工作需要，本实验室项目组采用基因工程技术进行了重组羊干扰素τ项目研发，本实验室已经构建了可高效表达具有生物学活性的重组羊干扰素τ(rShIFN-τ)的重组菌。

对于生物制品来说，其质量评价的有效性指标多采用生物学方法，如动物法和细胞法等进行检测。这些方法本身变异性较大，因此标准品是生产中必不可少的组成部分，在生物制品标准化、质量控制和效力评价中标准品是药品质量评价的标尺，起着非常重要的作用。然而目前国际国内均没有rShIFN-τ的标准品，这给实际研究工作带来很多不便。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法，使采用该方法制备而得的重组羊干扰素τ纯度高、质量稳定，可以用作生物学活性检测用标准品。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品。

为了解决上述技术问题，本发明提出如下技术方案：

一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：将重组大肠杆菌BL21/pET-32a-rShIFNtau发酵后提取总蛋白，用透析复性、亲和层析和透析置换缓冲液三步法纯化，冷冻干燥，即得。

优选的，所述重组大肠杆菌BL21/pET-32a-rShIFNtau的构建方法为：将扩增出的羊干扰素Tau基因克隆重组于原核表达载体pET-32α中，以大肠埃希菌BL21作为原核表达的宿主；所述羊干扰素Tau基因的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。

优选的，所述重组大肠杆菌BL21/pET-32a-rShIFNtau发酵、提取总蛋白的步骤如下：

(1)将工程菌接种于含有氨苄青霉素的固体LB培养基上，37℃培养过夜；

(2)挑取阳性克隆接种至3ml含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床震荡培养18h，转速为220r/min；

(3)再将得到的菌液按1：100的体积比接种至200ml LB培养基中，置37℃摇床，转速为220r/min，震荡培养18h，作为发酵种子；

(4)将进气过滤器、取样器、NaOH补料瓶、消泡剂补料瓶高压灭菌；

(5)将配好的LB培养基20L加到罐体内后连接好pH探针、溶氧探针进行原位灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；

(6)将准备好的发酵种子按1：100的比例接种20ml到发酵罐中，设置温度为37℃、溶氧为30％、转速为270r/min、pH为7.4的条件下发酵；

(7)当OD600达到0.6-0.8时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，调温度至32℃，诱导表达5h；

(8)诱导结束后收集发酵液；

(9)将发酵液4℃条件下4000r/min离心10min，收集菌体，用200mlPBS重悬；

(10)将PBS重悬的菌体1000bar压力下高压细胞破碎，重复破碎两次；

(11)4℃条件下12000r/min离心10min，收集沉淀即为羊干扰素τ包涵体。

优选的，所述透析复性的步骤为：将包涵体用Buffer A洗涤，离心，离心后的沉淀以1g:10mL的比例溶解于Buffer B中，待其完全溶解后，离心，弃沉淀得到蛋白变性液，将所得到的变性液先用Buffer C稀释一倍后，再在Buffer C4℃环境中透析6h，6h后逐步降低透析液中盐酸胍的浓度，最后在20mM PBS缓冲液中透析，将透析袋中的液体离心，弃沉淀，收集上清，即为重组羊干扰素τ粗制品；所述Buffer A的组成为：20mM PBS，2mM尿素，0.1％EDTA，pH7.4；所述Buffer B的组成为20mM PBS，7M盐酸胍，1％β-巯基乙醇，pH7.4；所述Buffer C的组成为20mM PBS，3.5M盐酸胍，1％β-巯基乙醇，pH7.4。

优选的，所述一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法，其特征在于所述亲和层析的步骤为：将粗制品重组羊干扰素τ用微孔滤膜过滤后，上样通过连接在AKTA explorer 100蛋白纯化系统上的His亲和层析柱，用20mMPBS缓冲液洗去未结合的蛋白，直到A280nm稳定，再用Elution bufferⅠ洗脱，收集蛋白峰；所述Elution bufferⅠ的组成为：20mM PBS,300mM imidazole,pH7.4。

优选的，所述透析置换缓冲液的步骤为：将亲和层析收集到的样品装入透析袋中，放置在20mM PBS缓冲液中透析6-8小时；收集透析后的样品并高速离心，收集上清即为重组羊干扰素τ标准品原液。

优选的，所述冷冻干燥的步骤为：将重组羊干扰素τ标准品原液用微孔滤膜过滤除菌，用10mmol/L磷酸缓冲液稀释后无菌过滤，在无菌室用分装机分装；分装量为：每支0.5ml重组羊干扰素τ半成品+5％脱脂羊奶1.5ml；冻干。

按照本方法制备的重组羊τ型干扰素生物学活性标准品。其工作效价为1.0×10⁵U/瓶；SDS-PAGE电泳和HPLC检测其纯度＞95％；相对分子量为36KD；N-末端氨基酸序列从第十个氨基酸开始为CYLSQRLMLDARENL。

本发明所取得的技术效果还可以通过实施例记载的数据证明。

下文实施例将结合附图对本发明作进一步的说明，本发明所要求保护的范围并不局限下述实施例。

附图说明

图1为纯化后重组羊干扰素τ蛋白SDS-PAGE检测结果。

泳道1：蛋白Marker；

泳道2：亲和层析收集产物。

图2为重组羊干扰素τHPLC XBrideg Protein BEH SEC 200A柱蛋白纯度检测结果图。

图3为重组羊干扰素τ标准品效价测定结果；

A1-A10为递增4倍稀释人干扰素溶液；

B1-B10为A1-A10复孔；

C1-C10为递增4倍稀释重组羊干扰素τ标准品溶液；

D1-D10/E1-E10/F1-F10为C1-C10复孔；

C列：MDBK细胞对照；

V列：VSV病毒对照。

具体实施方式

实施例1：重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备

一、原液制造

重组大肠杆菌BL21(pET-32a-rShIFNtau)的发酵及蛋白提取：

将工程菌在Bioengineering NLF22 30L发酵罐中进行发酵，过程如下：

1、将工程菌接种于含有氨苄青霉素的固体LB培养基上，37℃培养过夜。

2、挑取阳性克隆接种至3ml含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床震荡培养18h，转速为220r/min。

3、再将得到的菌液按1：100(体积比)接种至200ml LB培养基中，置37℃摇床，转速为220r/min，震荡培养18h，作为发酵种子。

4、将进气过滤器、取样器、NaOH补料瓶、消泡剂补料瓶等高压灭菌。

5、将配好的LB培养基20L加到罐体内后连接好pH探针、溶氧探针等进行原位灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min。

6、将准备好的菌种按1：100的比例接种20ml到发酵罐中，设置温度为37℃、溶氧为30％、转速为270r/min、pH为7.4条件下发酵。

7、当OD600达到0.6-0.8时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，调温度至32℃，诱导表达5h。

8、诱导结束后收集发酵液，清洗罐体。

9、将发酵液4℃条件下4000r/min离心10min，收集菌体，用200mlPBS重悬。

10、将PBS重悬的菌体1000bar压力下高压细胞破碎，重复破碎两次。

11、4℃条件下12000r/min离心10min，收集沉淀即为羊干扰素τ包涵体。

二、重组羊干扰素τ的纯化：

1 包涵体的复性

将包涵体用Buffer A(20mM PBS，2mM尿素，0.1％EDTA，pH7.4)洗涤，离心10000r/min，10min。离心后的沉淀以1g:10mL的比例溶解于Buffer B(20mM PBS，7M盐酸胍，1％β-巯基乙醇，pH7.4)中，待其完全溶解后，离心12000r/min，15min，弃沉淀得到蛋白变性液。将所得到的变性液先用Buffer C(20mM PBS，3.5M盐酸胍，1％β-巯基乙醇，pH7.4)稀释一倍后，再在Buffer C4℃环境中透析6h。6h后逐步降低透析液中盐酸胍的浓度，最后在20mM PBS缓冲液中透析6h以上。后将透析袋中的液体以12000r/min，离心15min后弃沉淀，收集上清，即为重组羊干扰素τ粗制品。

2 His亲和层析

将粗制品重组羊干扰素τ用0.22μm孔径的滤膜过滤后，上样通过连接在AKTAexplorer 100蛋白纯化系统上，在Binding BufferⅠ(20mM PBS)平衡好的His亲和层析柱，用20mMPBS缓冲液洗去未结合的蛋白，直到A280nm稳定，再用Elution bufferⅠ(20mM PBS,300mM imidazole,pH7.4)洗脱，收集蛋白峰。

3 透析

将亲和层析收集到的样品装入透析袋中，放置样品体积20倍体积的20mM PBS缓冲液中透析6～8小时。收集透析后的样品并高速离心收集上清即为重组羊干扰素τ标准品原液。

三、配伍冻干

西林瓶洗涤灭菌：用6.0mol/L Hcl浸泡过夜，甩干机上甩干后在洗涤机上冲洗6次以上甩干，放干烤箱180℃干烤2h。

5％脱脂奶粉悬液的配制：在无菌室进行。

重组羊干扰素τ的除菌过滤：将纯化后的蛋白用0.22μm的滤头或滤膜进行无菌过滤。

分装：在无菌室用分装机分装；分装量：每支0.5ml重组羊干扰素τ半成品+5％脱脂羊奶1.5ml。

冻干：每支2ml，置入冻干机冻干、包装后即可得到重组羊干扰素τ。

实施例2标准品鉴定

1.蛋白质含量测定

对上述纯化后的重组羊干扰素τ样品用Lowry法检测蛋白浓度，其蛋白含量为1.5mg/ml。

2.SDS-PAGE进行纯度鉴定

对蛋白表达条件优化及工程菌发酵得到的蛋白样品进行SDS-PAGE鉴定纯度及分子量。

2.1按照分子克隆试验指南进行制备5％的浓缩胶和的12％分离胶。

2.2灌胶按照仪器使用说明安装好垂直板SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳装置，迅速在两层玻璃板间灌入分离胶，并在胶面上用少量蒸馏水覆盖；待分离胶完全聚合后，倒出表面的蒸馏水，以少量1×SDS-PAGE缓冲液(25mmol Tris-Cl pH8.0，250mmol甘氨酸，0.1％SDS)冲洗表面。以滤纸吸去凝胶表面液体，迅速加入适量浓缩胶并插入梳齿，室温静置，待浓缩胶聚合完全后拔出梳齿。

2.3上样以10μl低分子量蛋白标准作为电泳分子量指示，取样品10μl与等体积上样缓冲液混合(4％SDS,20％甘油，10％β-琉基乙醇，125mmol/L Tris-HCl pH6.8,0.1溴酚蓝)，100℃煮沸5分钟，短暂离心后以微量加样器依次上样。

2.4电泳将适量1×SDS-PAGE缓冲液(25mmo1Tris-Cl pH8.0,250mmol甘氨酸，0.1％SDS)倒入电泳槽，连接好电源。电泳条件为恒压方式，电压调为8V/cm，待样品进入分离胶后，升至15V/cm，当指示剂抵达分离胶底部时关闭电源。

2.5固定、染色及脱色取下凝胶，以5倍体积的考马斯亮蓝R-250染色液(0.25g考马斯亮蓝溶解于100m1甲醇/冰醋酸溶液中，甲醇:水:冰醋酸＝45：45：10)浸泡凝胶，室温下缓慢摇动4小时。回收染色液，以脱色液(45％甲醇，10％冰醋酸)浸泡凝胶，缓慢摇动脱色，其间更换脱色液3次，待凝胶背景清晰后，观察结果。

2.6 SDS-PAGE鉴定其纯度为95％。(图1)

3.HPLC纯度鉴定

纯化后的ShIFN-τ做HPLC纯度鉴定。

3.1清洗：用双蒸水洗去纯化系统管道中的保存液，再用2-3个柱体积的双蒸水清洗分子筛层析柱，流速为0.5ml/min。

3.2平衡：用2-3个柱体积的20mM PBS缓冲液平衡分子筛层析柱，流速为0.5ml/min。

3.3上样：将样品用0.45μm的滤头过滤后上样10μl。

3.4洗脱：20mM PBS淋洗加洗脱。

3.5洗柱：用双蒸水清洗柱子，流速1ml/min。

3.6保存：用20％乙醇过柱，流速为1ml/min。

3.7结果：经HPLC鉴定纯化后的ShIFN-τ其纯度为97.22％。

纯化后的重组羊干扰素τ经XBridge Protein BEH SEC 200A凝胶柱进行分析只得到一个主吸收峰如图2，有1个峰为杂峰。通过计算峰面积得出主峰面积占总面积的97.22％。(图2)

以上结果表明，通过蛋白质的复性、His亲和层洗和透析后，最终得到纯度为97.22％的重组羊干扰素τ。

4.N-端氨基酸序列测定

4.1酶切：取纯化后的ShIFN-τ200μg，加4单位重组肠激酶，与酶切缓冲液中4℃条件下酶切16小时。

4.2 SDS-PAGE电泳：取酶切产物进行SDS-PAGE电泳，上样前先将配置好的聚丙烯酰胺凝胶装到垂直电泳仪上，用50V恒压空跑30min。

4.3转膜：将蛋白电转到PVDF膜上，电转缓冲液用CAPS缓冲液。

4.4立春红染色：将PVDF膜放到立春红染液中染色，待看到蛋白条带后拿出，用水洗去背景颜色。

4.5将目的条带剪下放于Eppendorf管中，-20℃保存，用Edman降解法进行N端氨基酸测序。

4.6 N-末端氨基酸序列从第十个氨基酸开始为CYLSQRLMLDARENL。

5.效价滴定

5.1rhIFN－α标准参考品：购自北京中国药品生物制品研究所，干扰素α国家标准品，批号：97/04，下称标化干扰素。

5.2细胞：牛肾细胞(MDBK)株。

5.3病毒：攻击病毒为水疱性口炎病毒(VSV)。

5.4方法：采用微量细胞病变抑制法

测定干扰素抗病毒活性，以实际测得的效价即干扰素的工作单位表示。工作单位经修正后以国际单位表示，必须有标化国际单位的IFN同时滴定，测定的标化干扰素国际单位除以标化单位即可得到一系数，将此系数乘以工作单位。

5.4.1先将待检重组羊τ干扰素100倍稀释，再二倍递增系列稀释于板孔上：根据需要横排做：100倍稀释后的10个稀释度(1：2…….1：1024)；第11孔为病毒对照；第12孔为细胞对照，若竖排做：为6个稀释度(1：2……1：64)；第7孔病毒对照，第8孔细胞对照，亦可用四倍递增系列稀释IFN；每个批号IFN需作复孔；标化干扰素以同上方法稀释10孔或6孔。10％牛血清MEM液作为IFN稀释液，每个稀释度每孔100μl可在96孔板上用100μl加样器直接稀释，最终每孔100μl。病毒对照和细胞对照不加干扰素。

5.4.2制备MDBK细胞悬液：MDBK为处于对数生长期，即传代后18～24h已形成单层，镜下观察时，细胞透亮，立体感强。

5.4.3用pH7.4PBS洗涤细胞二次，倒去PBS加入3～5mlVTP消化液室温作用3min后→倒去VTP→静透5min→待细胞从玻璃瓶表面滑下，加入10％小牛血清RPMI 1640培养液，调整细胞数为1～3×10⁵/ml，每孔100μl与不同稀释度rIFN混合。病毒对照，细胞对照孔均加100μl细胞悬液。混匀后将该96孔板置5％CO₂37℃孵箱培养16～18h,(IFN在细胞上诱导抗病毒蛋白的时间控制在16-18h若要快速亦不能少于6h)。

5.4.4.VSV攻击：IFN与细胞共孵育16～18h后，倒去96孔板的液体加入配制合适浓度的VSV 100μl/孔(预先滴定VSV TCID₅₀，以24h可使MDBK细胞完全破碎的TCID₅₀为合适浓度)。

5.4.5结果观察与分析

通常VSV攻击后24h，镜检病毒对照孔细胞破碎达100％而细胞对照正常时，即可用结晶紫染色，水洗后肉眼观察记录，细胞完整良好呈紫色如细胞对照孔，干扰素保护孔均呈紫色(一)100％病变细胞为细胞全脱落故无色，如病毒对照孔和无干扰素保护的孔均无色(100％CPE++++)举例如下：

表1.某批重组羊τ干扰素标准品结果以“+”“－”记号记录形式

表2.50％保护细胞的干扰素稀释度计算(Reed Muench计算)

50％保护为400×2⁸，即1:102400，即本rIFN的工作单位(U)为102400U。

5.4.6.工作单位修正以国际单位(IU)表示

每次设立有标化国际单位的IFN同时测定，若标化的IFN为1000IU，而本次实验滴定标化干扰素的工作单位为512U，以下面公式算出系数，乘以实际滴定的每个样本工作单位，即为该rIFN国际单位。

标化IFN1000IU/本次实测512U＝1.95,所有样本工作单位×1.95，如：102400×1.95

所以每次滴定干扰素必需加上标化干扰素，使所测干扰素的工作单位加以修正，并以国际单位(IU)表示。

5.4.7经过测试，制备的重组羊τ干扰素标准品效价达到1.0×10⁵U/瓶。

上述实施例旨在说明本发明的技术构思和特点，其目的在于让本领域的技术人员能够理解并实施，并不能据此来限制本发明所要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：将重组大肠杆菌BL21/pET-32a-rShIFNtau发酵后提取总蛋白，用透析复性、亲和层析和透析置换缓冲液三步法纯化，冷冻干燥，即得。

2.根据权利要求1所述一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法，其特征在于所述重组大肠杆菌BL21/pET-32a-rShIFNtau的构建方法为：将扩增出的羊干扰素Tau基因克隆重组于原核表达载体pET-32α中，以大肠埃希菌BL21作为原核表达的宿主；所述羊干扰素Tau基因的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法，其特征在于所述重组大肠杆菌BL21/pET-32a-rShIFNtau发酵、提取总蛋白的步骤如下：

(1)将工程菌接种于含有氨苄青霉素的固体LB培养基上，37℃培养过夜；

(2)挑取阳性克隆接种至3ml含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床震荡培养18h，转速为220r/min；

(3)再将得到的菌液按1：100的体积比接种至200ml LB培养基中，置37℃摇床，转速为220r/min，震荡培养18h，作为发酵种子；

(4)将进气过滤器、取样器、NaOH补料瓶、消泡剂补料瓶高压灭菌；

(5)将配好的LB培养基20L加到罐体内后连接好pH探针、溶氧探针进行原位灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；

(6)将准备好的发酵种子按1：100的比例接种20ml到发酵罐中，设置温度为37℃、溶氧为30％、转速为270r/min、pH为7.4的条件下发酵；

(7)当OD600达到0.6-0.8时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，调温度至32℃，诱导表达5h；

(8)诱导结束后收集发酵液；

(9)将发酵液4℃条件下4000r/min离心10min，收集菌体，用200mlPBS重悬；

(10)将PBS重悬的菌体1000bar压力下高压细胞破碎，重复破碎两次；

(11)4℃条件下12000r/min离心10min，收集沉淀即为羊干扰素τ包涵体。

4.根据权利要求3所述一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法，其特征在于所述透析复性的步骤为：将包涵体用Buffer A洗涤，离心，离心后的沉淀以1g:10mL的比例溶解于Buffer B中，待其完全溶解后，离心，弃沉淀得到蛋白变性液，将所得到的变性液先用Buffer C稀释一倍后，再在Buffer C4℃环境中透析6h，6h后逐步降低透析液中盐酸胍的浓度，最后在20mM PBS缓冲液中透析，将透析袋中的液体离心，弃沉淀，收集上清，即为重组羊干扰素τ粗制品；所述Buffer A的组成为：20mM PBS，2mM尿素，0.1％EDTA，pH7.4；所述Buffer B的组成为20mM PBS，7M盐酸胍，1％β-巯基乙醇，pH7.4；所述Buffer C的组成为20mM PBS，3.5M盐酸胍，1％β-巯基乙醇，pH7.4。

5.根据权利要求4所述一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法，其特征在于所述亲和层析的步骤为：将粗制品重组羊干扰素τ用微孔滤膜过滤后，上样通过连接在AKTA explorer 100蛋白纯化系统上的His亲和层析柱，用20mMPBS缓冲液洗去未结合的蛋白，直到A_280nm稳定，再用Elution buffer Ⅰ洗脱，收集蛋白峰；所述Elution bufferⅠ的组成为：20mM PBS,300mM imidazole,pH7.4。

6.根据权利要求5所述一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法，其特征在于所述透析置换缓冲液的步骤为：将亲和层析收集到的样品装入透析袋中，放置在20mM PBS缓冲液中透析6-8小时；收集透析后的样品并高速离心，收集上清即为重组羊干扰素τ标准品原液。

7.根据权利要求6所述一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法，其特征在于所述冷冻干燥的步骤为：将重组羊干扰素τ标准品原液用微孔滤膜过滤除菌，用10mmol/L磷酸缓冲液稀释后无菌过滤，在无菌室用分装机分装；分装量为：每支0.5ml重组羊干扰素τ半成品+5％脱脂羊奶1.5ml；冻干。

8.权利要求1-7任一项所述一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法制备而得的重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品。