CN101012455B

CN101012455B - 一种生化物质的灭活方法、一种心肌肽素的制备方法及其用途

Info

Publication number: CN101012455B
Application number: CN2006101381769A
Authority: CN
Inventors: 李恕; 王日升; 梁强; 阮忠生
Original assignee: Dalian Zhen Ao Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Dalian Zhen Ao Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2005-11-14
Filing date: 2006-11-14
Publication date: 2011-05-18
Anticipated expiration: 2026-11-14
Also published as: CN101012455A

Abstract

本发明公开了一种生化物质的灭活方法，特别是生化提取物的灭活方法，以及一种心肌肽素的制备方法及其用途。具体地说，本发明涉及从除人以外的健康哺乳动物的心脏中提取的心肌肽素的制备方法及其在制备治疗或预防心脑血管疾病方面的药物应用。本发明的生化提取物的灭活方法包括取不包括人的动物器官或组织，提取其中的生物活性组分，其特征在于将提取的活性成分的溶液在60-85℃下加热10-120分钟灭活病毒，优选在75-85℃下加热20-80分钟灭活病毒。

Description

一种生化物质的灭活方法、一种心肌肽素的制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及一种生化物质的灭活方法，特别是生化提取物的灭活方法，以及一种心肌肽素的制备方法及其用途，具体地说，本发明涉及从除人以外的健康哺乳动物的心脏中提取的心肌肽素制备方法及其用途，属于生化技术领域。

背景技术

健康哺乳动物的器官中，含有多种生物活性物质，提取该类活性物质用于各种疾病的治疗，可突破传统药物束缚，从加强诱导体内细胞本身抗损伤潜能出发，提供一种具有里程碑意义的疾病的治疗药物，近二十年来越来越得到科学家的重视。

从健康哺乳动物的肝脏中提取的生物活性物质用于治疗肝脏疾病已经用于临床，并得到了良好的效果。

但从健康幼年哺乳动物的其它器官中提取的生物活性物质虽然进行了广泛研究，但至今尚没有可用于临床应用的产品。

例如，下述对比文献涉及从健康幼年哺乳动物的心脏中提取生物活性物质的产品和/或方法：

ZL94102798公开了一种心肌细胞生长刺激肽及其制备方法，选取健康幼年哺乳动物的心脏，采用机械方式捣碎、-20℃深冻-溶解后加热60-100℃，再-20℃深冻-溶解后离心3000rpm，经负压截留柱-除菌-分装-冻干-包装，得到分子量小于20000道尔顿的多肽类活性物质。

ZL94102799公开了一种具有刺激原代培养的心肌细胞的DNA合成和蛋白质合成的心肌细胞生长刺激肽(GMGSP)，是从健康幼年哺乳动物的心脏中制备提取，在pH2-9范围内稳定；在加热95-100℃10分钟，60-70℃30分钟下生物活性不改变；在多种蛋白水解酶，37℃2小时条件下生物活性丧失；在水溶液22℃-30℃条件下可形成聚合体但生物活性改变不明显；在加入3％-8％甘露醇冻干密封条件下，室温贮存1.5年，4℃贮存2年，-20℃贮存3年，生物活性不改变；HPLC分析表明：所述GMGSP由四个组分组成，各组分相对峰及保留时间分别为：10.4％(2.88分)，6.4％(3.93分)，36.3％(5.09分)，7.3％(7.41分)，每个组分均具有生物活性；经SDS-PAGE分析显示的两条带分子量分别为8500Da、10800Da，HPLC分析数均分子量9800Da，重均分子量10500Da，2个组分均有生物活性。

ZL031413528、031371337分别公开了一种改良的心肌肽素及其制备工艺，所述心肌肽素是从不包括人的健康哺乳动物的心脏中提取的多肽，其多肽含量为75％～90％，游离氨基酸为6％～15％，核糖核酸含量小于2％，脱氧核糖核酸含量小于7.5％，重均分子量小于10000道尔顿。优选的重均分子量为2000～8000道尔顿，最优选的重均分子量为2000～5000道尔顿，该心肌肽素在pH3-8范围内生物活性稳定，对蛋白酶K敏感，85℃10min生物活性不改变，在冷冻或冻干条件下稳定。等电聚焦电泳显示2-6条染色带，优选等电聚焦电泳显示2条带，其中pI为10.92带着色较深，所述心肌肽素在紫外吸收光谱190-210nm处有一稳定的最大吸收峰，优选在紫外吸收光谱200±2nm处有一最大吸收峰，活力至少为2.2。其制备方法为：将不包括人的健康哺乳动物的心室肌洗净、切碎，加灭菌蒸馏水匀浆，匀浆液反复冷冻、解冻3～4次，加热至65～95℃过滤除渣，用板框滤器过滤得到粗滤液，再用中空纤维柱超滤，得到精滤液，用超滤膜超滤，截留重均分子量小于10000Da的心肌肽素溶液，最后经过滤除菌，冷冻干燥得成品。其中灭菌蒸馏水的加入量为哺乳动物的心室肌的0.5～4倍；所述匀浆的转速为1000～5000rpm/min；冷冻为在低于-5℃的温度下冷冻24～72小时，优选的为在-20℃～-30℃下冷冻36～48小时；所述加热方式为采用隔水加热或直接加热，温度为70～90℃，时间为不超过2小时，优选的为采用隔水加热，温度为75℃～80℃，时间为不超过1小时。

上述心肌肽素与ZL94102798和ZL94102799公开的心肌细胞生长刺激肽(GMGSP)比较，具有明显高的体外生物活性，其活性单位是心肌细胞生长刺激肽的3-5倍，体内药效对比数据显示，其对心肌缺血—再灌流损伤所致心肌磷酸肌酸激酶释放及乳酸脱氢酶活性与游离脂肪酸和丙二醛含量具有明显有利影响。

但是，上述产品或方法还存在着如下问题：

1.所述产品的纯度及每一部分的活性不够确定且没有一个标准；

2.该产品为动物提取物，没有经过灭活，作为药物或保健品，存在对人体潜在的影响。

上述问题的存在使其难以发展为有实用价值的药品或保健品。

另外，上述问题也是生化产品或用于保护心脑血管的生化制品普遍存在且长期没有解决的问题。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种生化物质的灭活方法，特别是生化提取物的灭活方法，该方法既能够保证生化物质或提取物的活性，又能够将其中的病毒、细菌灭活的简单、有效的方法。

本发明的第二个目的在于提供一种心肌肽素的制备工艺，所述的制备工艺充分提取除人以外的健康哺乳动物的生物活性组分，而将非生物活物成分、杂质、蛋白病毒去除，制备方法重现性好，适合大规模工业化生产。

本发明的第三个目的在于提供一种心肌肽素在制备治疗或预防心脑血管疾病方面的药物用途。

为了实现本发明的第一个目的，本发明提供一种生化物质灭活方法，特别是生化提取物的灭活方法，该方法包括取动物的器官或组织，提取其中的生物活性组分，将体取的活性成分的溶液在60-85℃下加热10-120分钟，优选75-85℃下加热20-80分钟。

灭活后的溶液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

本发明所述的取动物器官或组织中的生物活性组分可以采用现有技术中通常采用的方法。

生物提取物的生物安全的一项重要的工作是工艺的病毒灭活。病毒灭活一般是两个方面来源的病毒，一是原料来源(如乳猪酮体携带)的病毒，二是在运输、屠宰、加工、生产制备过程中污染的病毒。由于提取所用很多动物是人类驯化和饲养了几千年的家畜，长期的生物演化，在其身上存在许多人畜共患的疾病，特别是病毒类的疾病。根据中国农业部1999年2月12日发布的第96号公告，公布的一、二、三类动物疫病病种名录，有关的一类动物疫病为口蹄疫、猪水泡病、猪瘟、非洲猪瘟。二类的为伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪细小病毒病。人畜共患的病毒有许多种类如口蹄疫病毒FMD，用巴斯德消毒法，可灭活病毒。现在一些上市药物，如猪抗人T淋巴细胞免疫球蛋白，凝血酶，肝素钠，促肝细胞生长素等等，都是猪源性的药物，采用了不同的病毒灭活工艺。但是巴斯德消毒法严重影响动物提取物的生物活性。

本发明在病毒工艺灭活的研究发现：

(1)在75℃-80℃，30分钟即可失去活性，因此我们在制备工艺上采用此法。

(2)一般病毒的分子量比较大，在几万—几十万以上，我们在最后用截留分子量1.5万以下的Milipore膜过滤，亦可有效的去除病毒。

由于“血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则”文件规定，膜过滤法只有在滤膜的孔径比病毒有效直径小时才能有效的除去病毒，不能作为单独的去除病毒的方法使用，因此只作为辅助的方法使用。

本发明人经过长期反复实验发现常见的一些病毒及其灭活情况如下：

猪口蹄疫病毒(FMDVs)属小RNA病毒科，口疱病毒属。病毒呈16面体立体对称，粒子直径很小约20~25nm，无囊膜，对酸敏感，pH7.0以下不稳定。单股RNA，有4种结构蛋白及一组具活性的非结构蛋白，有七个血清主型，分子量约13.5~30KD，对热不稳定，在酸碱条件下易灭活。

猪瘟病毒(classical swine fever virus)，属黄病毒科瘟病毒属。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列入A类16种法定传染病之一。CSFV是一小的有囊膜病毒，其基因组为单股正链RNA，总长约12.3kb，含有单一的开放阅读框(ORF)，编码为一个由约4000个氨基酸残基组成的多聚蛋白。推算分子量约为438KD。病毒粒子呈球状，核衣壳为20面立方对称，直径38n。病毒对外界环境适应力低，在自然干燥的情况下，病毒易死亡，2％氢氧化钠、5％-10％的漂白粉、3％来苏能很快将其灭活。水浴加热60~70℃ 1小时失去活性。

非洲猪瘟病毒(ASF)，60℃，30分钟即失活，分子量约170-190KD。

猪脑心肌炎病毒(EMCN)分子量约2600KD，60℃，30分钟可失去活性。

猪日本乙型脑炎病毒(JEV)属于披膜病毒科，黄病毒属。病毒呈球囊状，有囊膜，是具有20面体核衣壳的单股RNA病毒。乙脑病毒对外界环境抵抗力不大，56℃，5分钟可失去活性。

猪细小病毒(Porcine Parvovirus PPV)属细小病毒科，细小病毒属，核酸为单股DNA，直径为18~26nm，分子量约5300KD。对热和酸均稳定，对外部环境抵抗力强，干热65℃，2小时不能完全将其杀灭，在80℃，5分钟可灭活。

猪伪狂犬病毒(Perudorabiesvirus PRV)属于猪疱疹病毒I型，是家畜和野生动物伪狂犬病的病原体，对猪的危害性最大。PRV的基因是双线形DNA，分子量约150KD。病毒对低温、干燥的环境存活力较强，对热敏感，56℃，5分钟或100℃，1分钟可使病毒完全灭活。

猪呼吸冠状病毒(PRCV)，七种冠状病毒平均分子量约170~220KD。

猪流感病毒(SIV)属正粘病毒科，A型流感病毒属。病毒粒子多型态，多数呈球状，直径为80-120nm。具有囊膜，由双层类脂膜、糖蛋白突起和基脂蛋白组成。囊膜表面有许多防射状排列的突起，即纤突和刺突，其长度为12-14nm。病毒粒内为核衣壳，呈螺旋对称，直径为10nm。两端具有环状结构，存在于病毒的囊膜内。SIV和其他有囊膜的病毒相似，对乙醚、丙酮等有机溶剂敏感，60℃，20min可使病毒完全丧失活性。

猪水疱病病毒(水泡痘)属微RNA病毒科，水疱病毒属16面体立体对称，粒子直径20~25nm，无囊膜，单股RNA，有七个血清主型，在酸碱条件下易灭活。

Sindbis virus(新必斯病毒) 披膜病毒科甲病毒属。病毒呈球状，直径为40-80mm，由核衣壳包裹一正链单股RNA，分子量约4300KD，不耐热，对乙醚，去氧胆盐和酸均敏感。

本发明的方法，可以将上述所有病毒以及动物的其他常见病毒灭活，同时保证提取物的生物活性。

本发明的方法特别适合于本发明所述的心肌肽素的灭活。

本发明所述的心肌肽素的技术方案为：一种心肌肽素，是从不包括人的健康哺乳动物的心脏中提取的多肽，其溶液的HPLC色谱图中，至少包括三个吸收峰，按峰面积归一化法计算，其中峰面积最大的三个主峰按出峰时间顺序由小至大其峰面积分别不得小于总峰面积的10％、40％、12％，该三个主峰峰面积之和不得小于总峰面积的75％，小于100％。

本发明所述的心肌肽素的重均分子量为2000～8000道尔顿，优选的重均分子量为2000～5000道尔顿。10％大分子部分重均分子量小于等于7500道尔顿，分子量分布系数大于1.5小于4.0，优选10％大分子部分重均分子量大于3000小于等于7500道尔顿。

本发明所述的心肌肽素中游离氨基酸总量小于15wt％。

本发明所述的不包括人的健康哺乳动物包括猪、牛、羊、兔、马；优选幼年哺乳动物，包括乳猪、乳牛、乳羊、乳兔、乳马，最优选为乳猪。

所述心肌肽素在紫外-可见分光光度法测定200±3nm处有最大吸收峰。

本发明的心肌肽素活性值至少为2.2，活力单位为1025～1250。

按照本发明的第二个方面，本发明提供了一种心肌肽素的制备方法：取不包括人的健康哺乳动物的心室肌洗净、切碎，加灭菌蒸馏水匀浆，过滤除渣，用板框滤器过滤得到粗滤液，再用中空纤维柱超滤，得到精滤液，用超滤膜超滤，截留重均分子量为2000～8000道尔顿的心肌肽素溶液，将所述心肌肽素溶液在60-85℃下加热灭活10-120分钟，以反渗透浓缩柱浓缩，最后经过滤除菌，冷冻干燥得成品。

优选加热灭活在水浴下进行，优选的灭活条件为：75--85℃加热30-120分钟。

所述的制备工艺中过滤除菌为灭活后溶液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

如果需要，将匀浆冷冻，冷冻为在低于-5℃的温度下冷冻24～72小时，优选的为在-20℃～-30℃下冷冻36～48小时；

本发明所述的健康哺乳动物为不包括人的健康哺乳动物包括猪、牛、羊、兔、马等，优选幼年哺乳动物，包括乳猪、乳牛、乳羊、乳兔、乳马等，最优选乳猪。

其中所述灭菌蒸馏水的加入量为不包括人的健康哺乳动物的心室肌的0.5～4倍；所述匀浆的转速为1000～5000rpm/min；

所述心肌肽素灭活后，经除菌过滤、冷冻干燥可以制成药学上可接受的冻干粉针。本发明

所述的心肌肽素冻干粉针中还可包括赋形剂，其重量比组成为：

心肌肽素15～20

赋形剂100～375

优选心肌肽素∶赋形剂为18～20∶200～375

赋形剂可为甘露醇、海藻糖、乳糖、蔗糖或其它冻干用辅料，优选为甘露醇

为了除热源目的，本发明所述心肌肽素中还可包括活性炭，其含量在0.1％左右。

本发明所述的心肌肽素是从不包括人的健康哺乳动物的心脏中提取的多肽，其多肽含量为75％～90％，游离氨基酸为6％～15％，核糖核酸含量小于2％，脱氧核糖核酸含量小于7.5％，重均分子量为2000～8000道尔顿。

所述心肌肽素优选的重均分子量为2000～5000道尔顿。

所述心肌肽素在pH3-8范围内生物活性稳定，对蛋白酶K敏感，85℃10min生物活性不改变，在冷冻或冻干条件下稳定。

所述心肌肽素等电聚焦电泳显示2-6条染色带，优选等电聚焦电泳显示2条带，其中pI为10.92带着色较深者。

所述心肌肽素在紫外吸收光谱190-210nm处有一稳定的最大吸收峰，优选在紫外吸收光谱200±2nm处有一最大吸收峰者。

采用磺基水杨酸法鉴定显示所述心肌肽素中不含有蛋白质。

本发明的心肌肽素活力至少为2.2。

本发明所述心肌肽素经FPLC分析，心肌肽素主要有5个组份峰，相对百分面积相加为90％～95％，经活性检查，5个组份峰均能促进原代培养心肌细胞及缺氧再给氧心肌细胞琥珀酸脱氢酶活力，其中P1峰活性较强。

采用上述制备方法，经板框滤器过滤、中空纤维柱超滤和超滤膜超滤的过滤方式，可得到本发明所述的重均分子量为2000～8000道尔顿的心肌肽素，与背景技术中ZL 94102798相比，工作时间短，产品的处理量多，得到产品的浓度高，活性大，不易产生热原。

由于在制备过程中采用了中空纤维柱超滤及超滤膜超滤的精滤方式，得以除去大分子蛋白，因此不易产生过敏反应，心肌肽素可直接作用于心肌细胞，促进心肌在多种损伤因素下损伤的修复，如缺血、药物中毒等；促进蛋白质合成、降低氧自由基损伤、降低钙超载、诱导内源性保护、提高心肌代谢功能的药物，为减轻心脏手术中心肌的损伤，促进损伤的修复提供一条新的途径。

本发明所述的心肌肽素的制备方法也可以为将不包括人的健康哺乳动物的心室肌洗净、切碎匀浆、过滤提取截留重均分子量为2000～8000道尔顿的心肌肽素溶液，将所述的心肌肽素溶液60-85℃下灭活10-120分钟。

优选灭活在水浴下进行，优选灭活条件为75--85℃搅拌30-120分钟，更优选80℃±2℃搅拌60分钟。

所述的制备工艺还包括灭活后溶液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

所述的制备工艺还包括过滤除菌后进行冷冻干燥得成品。

所述制备方法中，心室肌的制备包括：将猪心去除包膜、血管、心脏瓣膜、肌腱及心房，将心室肌以蒸馏水清洗干净后切碎成约1cm³的小块，再用冷注射用水清洗一次。

所述制备方法中匀浆液的制备包括：按心室肌∶注射用水＝1∶1(质量比)比例投料，用胶体磨重复匀浆三次(1000-10000rpm/min离心，每次5分钟，间隔5分钟)，得匀浆液。匀浆液盛于不锈钢桶中，每桶装量不超过5000ml，-20℃冻存。

此项操作应在10万级层流条件下进行，温度16℃～18℃，湿度50％～60％。

质控标准：手指研磨应光滑，无颗粒感，光学显微镜下观察无完整细胞。

所述过滤包括粗滤、精滤和超滤。

本发明用板框滤器过滤得到粗滤液，用中空纤维柱超滤后得到分子量小于12kDa的精滤液；再用超滤膜超滤截流得到分子量小于10kDa的精滤液。

所述制备方法中，粗滤液的制备包括：将冻存≥24小时的匀浆液流水融解后，置75℃水浴中恒温10分钟，用纱布过滤除渣，收集滤液，再用5μm板框滤器过滤一次，得粗滤液。

质控标准：溶液应澄清、透明，显微红色。

所述制备方法中，精滤液的制备包括：将粗滤液经三柱串联的中空纤维柱，正压过滤三次(截留分子量≤12KD，蠕动泵压力0.2MPa，透过液流速5±3ml/min)，初始液50ml弃去，得精滤液。

操作条件：此项操作应在10万级层流条件下进行，温度16℃～18℃，湿度50％～60％，3小时内完成。

所述制备方法中，超滤液的制备包括：将精滤液再用密滤膜超滤、截留(超滤分子量＜10KD，截留分子量＜1KD，压力1.5～2.0MPa，透过液流速应500ml±30ml/min)，得超滤液。

操作条件：此项操作应在1万级层流条件下进行，16℃～18℃，湿度50％～60％。

所述心肌肽素灭活后，取Vml心肌肽素溶液(相当于多肽20克)及120克甘露醇，加水溶解并搅拌均匀，使成4000ml(多肽含量为5.0mg/ml)；用蔡氏滤器加混合纤维素酯微孔滤膜(0.22μm)负压过滤除菌，经灌装、冷冻干燥可以制成药学上可接受的冻干粉针。可根据生产需要按上述比例发放大。

所述的心肌肽素是从不包括人的健康哺乳动物的心脏中提取的多肽，其溶液的HPLC色谱图中，至少包括三个吸收峰，按峰面积归一化法计算，其中峰面积最大的三个主峰按出峰时间顺序由小至大其峰面积分别不得小于总峰面积的10％、40％、12％，该三个主峰峰面积之和不得小于总峰面积的75％，小于100％。

所述的心肌肽素的重均分子量为2000～8000道尔顿，优选的重均分子量为2000～5000道尔顿。10％大分子部分重均分子量小于等于7500道尔顿，分子量分布系数大于1.5小于4.0，优选10％大分子部分重均分子量大于3000小于等于7500道尔顿。

本发明的心肌肽素中游离氨基酸总量小于15wt％。

本发明的心肌肽素述不包括人的健康哺乳动物包括猪、牛、羊、兔、马；优选幼年哺乳动物，包括乳猪、乳牛、乳羊、乳兔、乳马，最优选为乳猪。

本发明的心肌肽素活性值至少为2.2，活力单位为1025～1250。

采用本发明的制备方法所得心肌肽素与专利ZL94102798和ZL94102799公开的心肌细胞生长刺激肽(GMGSP)比较，具有明显高的体外生物活性，本发明所述心肌肽素活性单位是心肌细胞生长刺激肽的3-5倍，体内药效对比数据显示，其对心肌缺血-再灌流损伤所致心肌磷酸肌酸激酶释放及乳酸脱氢酶活性与游离脂肪酸和丙二醛含量具有明显有利影响。

本发明的第三个目的在于提供一种心肌肽素在制备治疗或预防心脑血管疾病药物方面上的用途，具体的是对于急慢性冠心病：心绞痛、心肌梗塞、心律失常及其它缺血性心脏疾病、心肌炎、风湿性心脏病均有良好的预防和治疗效果(见实施例10、实施例11、实施例12)；还可以为适应于心血管外科围术期的心肌保护(见实施例13)。

附图说明

图1为心肌肽素组(n＝442)和GIK组(n＝215)围术期CK变化值(PP分析集)。

图2为心肌肽素组(n＝442)和GIK组(n＝215)围术期CK变化率(PP分析集)。

图3为心肌肽素组(n＝442)和GIK组(n＝215)围术期CK-MB变化值(PP分析集)

图4为心肌肽素组(n＝442)和GIK组(n＝215)围术期CK-MB变化率(PP分析集)

图5为心肌肽素组(n＝442)和GIK组(n＝215)围术期LDH变化值(PP分析集)

图6为心肌肽素组(n＝442)和GIK组(n＝215)围术期LDH变化率(PP分析集)

图7为心肌肽素组(n＝319)和GIK组(n＝174)围术期TnT变化值(PP分析集)

图8为心肌肽素组(n＝319)和GIK组(n＝174)围术期TnT变化率(PP分析集)

图9为心肌肽素组(n＝123)和GIK组(n＝41)围术期TnI变化值(PP分析集)

图10为心肌肽素组(n＝123)和GIK组(n＝41)围术期TnI变化率(PP分析集)

图11为瓣膜置换病人心肌肽素组(n＝338)和GIK组(n＝113)CK变化值(PP分析集)

图12为瓣膜置换病人心肌肽素组(n＝338)和GIK组(n＝113)CK变化率(PP分析集)

图13为瓣膜置换病人心肌肽素组(n＝338)和GIK组(n＝113)CK-MB变化值

图14为瓣膜置换病人心肌肽素组(n＝338)和GIK组(n＝113)CK-MB变化率

图15为瓣膜置换病人心肌肽素组(n＝338)和GIK组(n＝113)LDH变化值

图16为瓣膜置换病人心肌肽素组(n＝338)和GIK组(n＝113)LDH变化率

图17为瓣膜置换病人心肌肽素组(n＝338)和GIK组(n＝113)TnT变化值

图18为瓣膜置换病人心肌肽素组(n＝338)和GIK组(n＝113)TnT变化率

图19为瓣膜置换病人心肌肽素组(n＝123)和GIK组(n＝41)TnI变化值

图20为瓣膜置换病人心肌肽素组(n＝123)和GIK组(n＝41)TnI变化率

图21为冠脉搭桥病人心肌肽素组(n＝104)和GIK组(n＝102)CK变化值

图22为冠脉搭桥病人心肌肽素组(n＝104)和GIK组(n＝102)CK变化率

图23为冠脉搭桥病人心肌肽素组(n＝104)和GIK组(n＝102)CK-MB变化值

图25为冠脉搭桥病人心肌肽素组(n＝104)和GIK组(n＝102)LDH变化值

图26为冠脉搭桥病人心肌肽素组(n＝104)和GIK组(n＝102)LDH变化率

图27为冠脉搭桥病人心肌肽素组(n＝104)和GIK组(n＝102)TnT变化值

图28为冠脉搭桥病人心肌肽素组(n＝104)和GIK组(n＝102)TnT变化率

图29为本发明实施例1得到的心肌肽素的HPLC图

图30为心肌肽素加热法灭活PRV效果动力曲线

图31为75-80℃、1小时灭活PPV病毒效果动力学曲线

图32为75-80℃、1小时灭活Sindbis病毒效果动力学曲线

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。

实施例1

心肌肽素溶液的制备：心肌肽素溶液系从健康幼龄猪心室肌中提取的具有活性的小分子多肽溶液。

一、原料(猪心)质量控制

选广东、广西、湖南等地杂种猪，生猪出生后30天±6天，体重＜10公斤，心脏重量35g±5g，统一饲养场地，统一配饲料，统一饲养时间，统一收购。应提供：《动物产地检疫合格证明》或《出县境动物检疫合格证明》、《动物、动物产品运载工具消毒证明》和《非疫区证明》。

生猪宰杀前后，按《生猪屠宰厂(场)的检疫操作规程》由国家正规防疫检疫站进行生猪宰杀前后检疫。

生猪活杀后取心脏，并在低温条件下运输，猪心表面应光洁，无结节，色泽新鲜，心脏剖面无异常。1％随机抽检猪心的组织学结构，进行心房、心室切片，连续切片各5张，光学显微镜下观察组织结构应无异常。依法检查挥发性盐基氮(国家标准GB/T 5009.44-2003)，应符合规定。

二、制备

1、原料(猪心)的初步处理：将猪心去除包膜、血管、心脏瓣膜、肌腱及心房，将心室肌以蒸馏水清洗干净后切碎成约1cm³的小块，再用冷注射用水清洗一次。

2、匀浆液的制备：按心室肌∶注射用水＝1∶1(质量比)比例投料，胶体磨重复匀浆三次(3000rpm/min离心，每次5分钟，间隔5分钟)，得匀浆液。匀浆液盛于不锈钢桶中，每桶装量不超过5000ml，-20℃冻存。

3、粗滤液的制备：将冻存24小时的匀浆液解冻后，置75℃水浴中恒温10分钟，用纱布过滤除渣，收集滤液，再用5μm板框滤器过滤一次，得粗滤液。质控标准：溶液应澄清、透明，显微红色。

4、精滤液的制备：将粗滤液过三柱串联的中空纤维柱，正压过滤三次(截留分子量≤12KD，蠕动泵压力0.2MPa，透过液流速5±3ml/min，初始液50ml弃去)，得精滤液。质控标准：溶液应澄清透明，显微黄色；pH值6.4±0.2；蛋白质检查应呈阴性(按注射用心肌肽质量标准中的蛋白质项下方法进行检查)。

上述1-4项操作应在10万级层流条件下进行，温度16℃～18℃，湿度50％～60％，3小时内完成。

5、超滤液的制备：将精滤液过Millipore超滤膜超滤、截留(超滤分子量＜10KD，截留分子量＜1KD，压力1.5～2.0MPa，透过液流速应500ml±30ml/min)，得超滤液。

优选操作在1万级层流条件下进行，16℃～18℃，湿度50％～60％。

6、病毒灭活：将超滤液置80℃±2℃水浴中搅拌1小时。病毒灭活后溶液经0.22μm微孔滤膜除菌过滤，分装于无热原、无菌不锈钢桶内，装量≤5000ml/桶，密封，-20℃贮存。优选操作在百级层流条件下操作，温度16℃～18℃，湿度50％～60％。

7、要求乳猪猪心离体至加工成匀浆液不应超过6小时；自粗滤始至病毒灭活应连续操作，总时间控制＜7小时。

三、成品检验

按心肌肽溶液质量标准进行全检，合格后-20℃冻存。

所述心肌肽素经分析，多肽含量为90％，游离氨基酸含量5％，核糖核酸含量为1％，脱氧核糖核酸含量为3％，重均分子量为3000道尔顿；分子量分布系数为3。HPLC分析见图1及表a。

实施例2

一、原料(猪心)质量控制同实施例1

二、制备：参照实施例1的方法，其中：

2、匀浆液的制备：按心室肌∶注射用水＝1∶1(质量比)比例投料，胶体磨重复匀浆三次(5000rpm/min离心，每次5分钟，间隔5分钟)，得匀浆液。匀浆液盛于不锈钢桶中，每桶装量不超过5000ml，-20℃冻存。

3、粗滤液的制备：将冻存36小时的匀浆液解冻后反复3次，置75℃水浴中恒温10分钟，用纱布过滤除渣，收集滤液，再用5μm板框滤器过滤一次，得粗滤液。

4、精滤液的制备：将粗滤液过三柱串联的中空纤维柱，正压过滤三次(截留分子量≤12KD，蠕动泵压力0.2MPa，透过液流速5±3ml/min，初始液50ml弃去)，得精滤液。

6、病毒灭活：将超滤液置75-85℃水浴中搅拌80分钟。病毒灭活后溶液经0.22μm微孔滤膜除菌过滤，分装于无热原、无菌不锈钢桶内，装量≤5000ml/桶，密封，-20℃贮存。

三、成品检验：按心肌肽溶液质量标准进行全检，合格后-20℃冻存。

所述心肌肽素经分析，多肽含量为88％，游离氨基酸含量5％，核糖核酸含量为1％，脱氧核糖核酸含量为3％，重均分子量为2000道尔顿；分子量分布系数为1.5；HPLC分析见表a。

实施例3

一、原料(猪心)质量控制同实施例1

二、制备：参照实施例1的方法，其中：

2、匀浆液的制备：按心室肌∶注射用水＝1∶2(质量比)比例投料，胶体磨重复匀浆三次(4000rpm/min离心，每次5分钟，间隔5分钟)，得匀浆液。匀浆液盛于不锈钢桶中，每桶装量不超过5000ml，-20℃冻存。

3、粗滤液的制备：将冻存30小时的匀浆液解冻后反复3次，置75℃水浴中恒温10分钟，用纱布过滤除渣，收集滤液，再用5μm板框滤器过滤一次，得粗滤液。

6、病毒灭活：将超滤液置65-75℃水浴中搅拌100分钟。病毒灭活后溶液经0.22μm微孔滤膜除菌过滤，分装于无热原、无菌不锈钢桶内，装量≤5000ml/桶，密封，-20℃贮存。

所述心肌肽素经分析，多肽含量为85％，游离氨基酸含量8％，核糖核酸含量为2％，脱氧核糖核酸含量为6％，重均分子量为4000道尔顿；分子量分布系数为2，HPLC分析见表a。

实施例4

同实施例1，不同的是原料采用健康乳牛心室肌，截留重均分子量为5000道尔顿的心肌肽素溶液，所述心肌肽素经分析，多肽含量为78％，游离氨基酸含量15％，核糖核酸含量为2％，脱氧核糖核酸含量为5％，重均分子量为5000道尔顿；分子量分布系数为2HPLC分析见表a。

实施例5

同实施例1，不同的是原料采用健康乳兔心室肌，截留重均分子量为4000道尔顿的心肌肽素溶液，所述心肌肽素经分析，多肽含量为84％，游离氨基酸含量6％，核糖核酸含量为2％，脱氧核糖核酸含量为6％，重均分子量为4000道尔顿；分子量分布系数为3.5HPLC分析见表a。

实施例6

同实施例1，不同的是原料采用健康乳马心室肌，截留重均分子量为5000道尔顿的心肌肽素溶液，所述心肌肽素经分析，多肽含量为80％，游离氨基酸含量12％，核糖核酸含量为2％，脱氧核糖核酸含量为5％，重均分子量为6000道尔顿；分子量分布系数为2.5；HPLC分析见表a。

实施例7

同实施例3，不同的是原料采用健康乳牛心室肌，截留重均分子量为8000道尔顿的心肌肽素溶液，所述心肌肽素经分析，多肽含量为82％，游离氨基酸含量11％，核糖核酸含量为2％，脱氧核糖核酸含量为5％，重均分子量为8000道尔顿；分子量分布系数为2.2。HPLC分析见表a。

实施例8

同实施例2，不同的是原料采用健康乳牛心室肌，截留重均分子量为5000道尔顿的心肌肽素溶液，所述心肌肽素经分析，多肽含量为80％，游离氨基酸含量14％，核糖核酸含量为2％，脱氧核糖核酸含量为5％，重均分子量为5000道尔顿；分子量分布系数为2.9；HPLC分析见表a。

表a各主峰相对百分峰面积

百分面积％
									主峰	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6	实施例7	实施例8
P1P2P3	15.419.141.5	17.316.743.8	18.816.248.0	15.715.948.6	16.515.244.1	12.618.147.5	13.716.247.9	14.411.649.3

实施例9

本实施例涉及灭活实验

材料：

3.1心肌肽素(本发明实施例1，实施例2，实施例3)

3.2三种病毒的来源及生物学和理化特性

3.2.1受试病毒：

3.2.1.1猪细小病毒(PPV，TCID₅₀＞10⁵/O_r1ml)，PPV株来自中国兽药监察所，由本实验室传后代保存。

猪细小病毒(Pig Parvovirus，PPV)属细小病毒科，细小病毒属，核酸为单股DNA，直径为18-26nm，分子量约5、3×10⁸D。猪是唯一已知的易感动物。对热和酸均稳定，对环境抵抗力极强，70℃ 2小时仍不能将其杀灭，在80℃ 5分钟才能将其杀灭。

3.2.1.2猪伪狂犬病病毒(PPV，CID₅₀＞10⁶/ml)，PPV株来自广东一发病猪场分离并鉴定的，毒种保存于华南农业大学兽医学院传染病学教研室。

伪狂犬病毒(pesudorabiesvirus，PRV)属于猪疱疹病毒I型，是家畜和野生动物伪狂犬病的病原体，尤以对猪的危害性最大，PRV的基因是双股线性DNA，大小约150kb。病毒对低温、干燥的抵抗力较强，对热敏感，56℃5分钟或100℃1分钟可使病毒完全灭活。

3.2.1.3猪瘟病毒(HCV)，猪瘟弱毒来自中国兽药监察所，由本实验室传后代保存。

猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV或称Hog Cholera Verus，HCV)属黄病毒科(Flaviviridae)，瘟病毒属(pestivirus).为有包膜的正链RNA病毒。直径为40-60nm。CSFV是一小的有囊膜病毒，其基因组为单股正链RNA，总长约12、3kb，分子量约438KD，强毒力的CSFV导致的急性猪瘟引起高热、大量内出血，致死率几乎是100％。猪瘟病毒对热抵抗力不强，76℃1小时可使病毒失去感染力，在干燥条件下，病毒容易死亡。猪瘟弱毒可引起兔体的定型热反应。

3.2.2动物细胞的选择

3.2.2.1主肾细胞(PK15)、细胞株来源于广州进出口检验检疫局中心实验室。细胞按常规方法培养。

3.2.2.2猴肾细胞(Vero)和狗肾细胞(MDCK)细胞株，来源于广州进出口检验检疫局中心实验室。细胞按常规方法培养。

3.2.3细胞培养液及细胞培养板DMEM细胞培养液(sigma)，3％FBS(国产，杭州四季青公司)，24孔细胞培养板(Costar)。

4.方法：

4.1观察加热对心肌肽素生物学活性的影响。

包括加热温度的选择、心肌肽素制剂生物学活性检测方法以及结果判定。

4.2观察加热心肌肽素生产工艺对三种动物源性病毒的灭活作用。

包括各实施例心肌肽素原料中三种动物源性病毒的检测、加热对三种动物源性病毒的影响、温度选择(同4.1的方法)。主要是为了研究影响去除/灭活病毒效果的参数(包括机械参数和理化参数)和允许变化的幅度。检测三个心肌肽素原料。

4.2.1指示病毒选择

猪细小病毒，毒株病滴度测定应≥10⁵，才进行下一步实验；猪伪狂犬病毒，毒株病滴度测定应≥10⁵，才进行下一步实验；猪瘟病毒，毒株病滴度测定应≥10⁵，才进行下一步实验。

4.2.2细胞培养及接毒条件：按常规细胞培养方法，用DMEM培养液加10％无牛病毒性腹泻病毒抗体的胎牛血清作为PK细胞的培养液(ph7.2)；DMEM培养液加20％的胎牛血清作为PK15细胞培养液(ph7.2)。待细胞接近长满单层时接毒，于37℃感染1h后，经Hands洗涤，加维持液(phwei 7.6-7.8)培养，维持掖含2％-4％的胎牛血清。

4.2.3病毒滴度测定方法：毒株经双抗处理，分别做10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5……10^-9倍稀释，按常规方法接种于敏感细胞。培养3-6天并观察CPE(包括细胞变圆、细胞核固缩和细胞溶解)，按照Reech-Mud的方法测定病毒的半数组织感染量(TCID₅₀)。

4.2.4研究病毒灭活动力学，包括病毒灭活速率和灭活曲线。

4.2.4.1病毒灭活速率的测定

加入的病毒与待验证样品体积比不能高于1∶9。

三种恒温温度对病毒灭活速率的影响，实验中应考虑应试品在温度上升过程多耗费的时间。

升温后时间点的选择：2，5，8，10，20，30，45，60分钟。

如可能，验证过程中每步取出的样品应尽快直接进行病毒滴定，不做进一步处理。

4.2.4.2检测方法：检测方法可包括蚀斑形成、细胞病变(如合胞体或灶形成)、终点滴定或其他方法。这些方法应该有适宜的灵敏度和可重复性，每一个取样点取3份样品并没有对照以保证结果的准确性。

4.2.4.3猪瘟病毒的灭活检测试验

现用30只家兔测定猪瘟病毒毒种的最小敏感量RID₅₀。

A组：处理前的样品。样品中加入猪瘟病毒，终浓度为每毫升500RID₅₀(兔体反应量。)收集样品。

B组：处理后的样品。样品中加入猪瘟病毒，终浓度为每毫升500RID₅₀(兔体反应量)，经加工工艺(加热)处理后，收集样品。

将收集的A、B两组样品用双抗处理，每个样品肌肉注射接种家兔3只，每只2ml(共1000RID50)，连续测量体温并观察3天。记录定型热的出现。

C组：为对照组。取家兔3只，接种生理盐水，记录定型热的出现。

4.2.4.4观察指标

4.2.4.4.1病毒方面

(1)去除/灭活病毒滴度：经灭活后样品的TCID50大于或等于4个滴度，说明病毒灭活完全。例如：未经灭活的样品接种细胞出现CPE的最大稀释度为10⁶，那么如果该样品灭活后再接种细胞，这时测出来的能出现CPE的最大稀释度为10^-2或更小，我们就可以判定该样品的灭活有效。

(2)灭活病毒速率、灭活曲线、以列表和做图形式报告严验证结果。

(3)猪瘟病毒的灭活检测试验

灭活完全：A组出现定型热反应、B组和C组没有定型热反应。

灭活未完全：A组、B组出现定型热反应、C组没有定型热反应。

附：根据兔的体温变化情况，按如下标准判定结果。

①定型热：潜伏期24-48h，体温上升呈明显曲线，超过常温1℃以上至少3个温次，并稽留18-36h；

②轻热反应：潜伏期24-72h，体温上升有一定去，超过常温0.5℃以上至少2个温次，并稽留12-36h；

③可疑反应：潜伏期不到24h，或者72h以上，体温曲线起伏不定或稽留不到12h或稽留超过36h而不下降。

④无变化，体温正常。

4.2.5病毒去除/灭活各参数允许变化范围

4.2.6心肌肽素生物学活性方面

4.2.7效果的判定

判断病毒去除/灭活的有效性须综合考虑，不能仅以病毒去除/灭活的量来确定。在确定有效之前，必须考虑如下因素，审慎评价每次验证结果。

验证试验所选择的病毒是否适宜，病毒验证的设计是否合理。

病毒降低量(log10)≥4logs，表示该步骤去除/灭活病毒有效。如因检测方法造成病毒降低量＜4logs时，应盲传三代，如无病毒检出，可认定是有效的灭活病毒方法。

病毒灭活动力学可更好的显示病毒灭活的效果。病毒灭活通常不是简单的一级反应。往往是起始反应速率快，其后变慢。如果病毒灭活速率随时间明显降低，表示该方法可能无效，或者残留的指示病毒对该灭活方法有抵抗力，说明该步病毒灭活方法无效。

病毒的实际滴度为基础病毒，指示病毒与样品1∶9的比例混匀后零点取样的病毒滴度，通过与经去除/灭活病毒后的测定的实际病毒残留量的比较，作为该病毒去除/灭活方法(步骤)实际的灭活病毒的量。

病毒检测敏感度的限值。

4.2.8生产工艺去除/灭活能力的验证

4.2.9去除/灭活病毒方法的再验证

5.结果(病毒去除/灭活方法验证结果)：经中国药品生物制品检定所鉴定，结果如下：

心肌肽素加热法灭活伪狂犬病毒(PRV)效果验证报告

一、验证目的

根据本发明的病毒灭活工艺，验证加热法(水浴75-80℃；1小时)对所选指示病毒PRV的灭活效果。

二、验证样品：样品为本发明实施例中加热法处理之前一步，于-20℃保存。

三、指示病毒及其培养

伪狂犬病毒(PRV) 滴度：8.88LgTCHID₅₀/ml，-70℃保存备用。

培养用细胞：PK-15细胞滴定方法：96孔细胞病变法

四、病毒灭活验证步骤

1.样品于20-25℃水浴解冻，完全融化后充分混悬，除菌过滤。

2.取样：

(1)三批样品(实施例1，实施例2，实施例3)各取36ml，分别加入4ml PRV液(9∶1)，混匀。

(2)将样品—素混合液分装于小离心管，每管1.2ml。留取零时样本。其余进行76.2-76.4℃恒温水浴加热处理，分别于5分、15分、30分、1小时取样。

各样本取出后立刻于-70℃冻存备测。每批样本须至少重复测定二次。

五、病毒滴定方法：

96孔细胞病变法，计算按Karber法。

六、验证结果(详见表b、图30)：

三批样品进行加热(水浴75-80℃；1小时)病毒灭活后，残余PRV滴度均低于本试验最低检测限(0.50LgTCID₅₀/0.1ml)。

可灭活所加入指示病PRV分别为实施例1/6.62LgTCID₅₀/0.1ml；实施例2/6.50LgTCID₅₀/0.1ml，实施例3/6.38LgTCID₅₀/0.1ml。

采用类似方法检查实施例4-8的产品，结果基本相同。

注射用心肌肽素加热法灭猪细小病毒(PPV)效果验证报告

一：验证目的：根据本发明的病毒灭活工艺，验证加热法(75-80℃、1小时)灭活PPV病毒效果。

二：验证用样品：样品为本发明实施例中加热法处理之前一步，-20℃保存。

三：指示病毒及细胞培养：指示病毒：PPV病毒，滴度：7.13LgTCID₅₀/0.1ml，培养细胞：PK-15细胞，滴定方法：96孔盘微量细胞病变法。

四：灭活病毒步骤：

1：各取三批样品(实施例1，实施例2，实施例3)25℃水浴融化后用0.22um滤器除菌过滤。

2：取三批样品27ml，分别加入3mlPPV病毒，混均。分装置尖离管中，每管1.2ml，每取样点4管。放入76.0-76.5℃水浴。于0.5分钟、15分钟、30分钟、60分钟。取样置-70℃冻存。

3：留存部分病毒对照。

五：病毒检测方法：采用96孔盘微量细胞病变法。

六：病毒滴度结果：见表c、图31。

七：结果：三批样品入指示病毒PPV后经76.0-76.5℃、1小时处理，可灭活该病毒滴度为：

实施例1≥5.38LgTCID₅₀/0.1ml

实施例2≥5.25LgTCID₅₀/0.1ml

实施例3≥5.50LgTCID₅₀/0.1ml。

采用类似方法检查实施例4-8的产品，结果基本相同。

注射用心肌肽素加热法灭活Sindbis病毒效果验证报告

一：验证目的：根据本发明的病毒灭活工艺，验证加热法(75-80℃、1小时)灭活Sindbis病毒效果。

二：验证用样品：送验样品-20℃保存。

三：指示病毒及细胞培养：指示病毒：Sindbis病毒，滴度：7.48LgPFU/ml，培养细胞：BHK-21细胞，滴定方法：6孔盘蚀斑法。

四：灭活病毒步骤：

2：各取三批样品27ml，分别加入3ml Sindbis病毒，混均。分装置尖离管中，每管1.2ml，每取样点4管。放入76.0-76.5℃水浴。于0、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟。取样置-70℃冻存。

3：留存部分病毒对照。

五：病毒检测方法：采用6孔盘蚀斑法。

六：病毒滴度结果：见表d、图32。

七：结果：三批样品加入指示病毒Sindbis后经76.0-76.5℃、1小时处理，可灭活该病毒滴度为：

实施例1≥6.10LgPFU/ml

实施例2≥6.12LgPFU/ml

实施例3≥6.08LgPFU/ml

加热法灭活病毒效果验证，该方法属有效灭活病毒的方法。

采用类似方法检查实施例4-8的产品，结果基本相同。

实施例10

冠心病临床效果

经心电图及其它检查确诊后，选择冠心病患者228例，男147例，女81例；年龄30～75岁，平均(52.2±4.7)岁，随机分组，如下：

■用药组(心肌肽)：114例，剂量3mg/kg，给药方式为静脉滴注，连续用药3天。

■对照组(GIK液)：114例，剂量及给药方式同上。

连续用药3天后对照组/用药组各项指标变化情况

组别

CK(ng/mL)

CK-MB(ng/mL)

LDH(ng/mL)

LDH-1(ng/mL)

ST段偏移(mv)

TnI(ng/mL)

心功能(NYHA)

耗氧量(ml/min.g)

对照组

243.38±105.43

37.67±16.56

229.67±45.05

82.82±27.08

2.4±1.4

4.25±0.33

III

244.35±63.61

用药组

实施例1

196.20±79.01

34.65±21.33

216.±57.82

66.64±22.09

*1.8±0.6

**1.21±1.32

*168.14±13.15

I

实施例2

**106.43

*30.45

*196.

**50.68

**1.3

3.26

201.35

II

实施例3

±55.06*156.65±71.46

±31.56**20.67±20.36

±77.84200.±27.35

±32.02**47.34±45.03

±1.22.1±0.3

±0.733.78±2.32

±13.21**157.35±35.11

II

注：CK：磷酸激酶：CK-MB：磷酸激酶-MB；LDH：乳酸脱氢酶；LDH-1：乳酸脱氢酶-1，TnI：肌钙蛋白I

*p＜0.05，**p＜0.01.

结果：由上表可见，三个批次的心肌肽在连续用药3天后，各项指标较对照组均有所改善，且两组间差异显著，有统计学意义；

用药组心功能好转率为50.34％，对照组心功能好转率仅为23.45％。

实施例11

风湿性心脏病临床效果

经临床检查确诊后，选择风湿性心脏病患者100例，男67例，女33例；年龄15～55岁，平均(31.14±5.73)岁。

■用药组(心肌肽)：60例，每批次各20例。剂量3mg/kg，给药方式为静脉滴注，连续用药3天。

■对照组(葛根素)：40例，剂量及给药方式同上。

风心病患者用药组与对照组各项指标变化情况

组别

心功能(NYHA)

ST段偏移(mv)

耗氧量(ml/min.g)

心率(次/min)

24h心律失常(例)

治愈率

有效率

总有效率

对照组

IV

6.4±0.4

434.31±13.6

86

5

89.5％

85.2％

88.6％

用药组

实施例4

I

5.6±1.1

**220.35±34.62

78

2

95.2％

90.5％

92.3％

实施例5

I

**2.2±0.4

344.35±53.63

*69

2

89.8％

84.6％

89.4％

实施例6

II

*4.1±0.3

**274.36±13.62

75

2

93.5％

88.2％

95％

注：CK-MB：磷酸激酶-MB；LDH-1：乳酸脱氢酶-1；TnI：肌钙蛋白I

*p＜0.05，**p＜0.01.

结果：由上表可见，心肌肽组的各项指标较对照组均有所改善，且两组间差异显著，有统计学意义；

用药组心功能好转率为57.5％，对照组心功能好转率仅为30.4％；

用药组的总有效率为92.23％，而对照组总有效率为88.6％。

实施例12

心肌炎临床效果

选择经实验室检查确诊的心肌炎患者66例，男42例，女24例；年龄16～55岁，平均(35.4±8.1)岁。

■用药组(心肌肽)：48例，每批次各16例。剂量3mg/kg，给药方式为静脉滴注，连续用药3天。

■对照组(1，6-二磷酸果糖)：18例，剂量及给药方式同上。

心肌炎患者用药组与对照组各项指标变化情况

组别

CK-MB恢复正常例数(n)

TnI恢复正常例数(n)

BNP(pg/mL)

LVEDD(cm)

LVEF(％)

抗心肌抗体(治疗后-例数)

心律失常(n)

有效率

对照组

10(55.6％)

12(66.7％)

45.3±12.3

5.6±0.4

55.4

6

10

78％

用药组

实施例7

10(62.5％)

*32.3±4.2

5.4±1.2

4

65.7

6

76％

实施例8

8(50％)

11(68.8％)

38.1±11.2

*4.5±0.6

0

70.2

5

86％

实施例1

12(75％)

9(56.3％)

**29.6±9.8

*4.6±0.9

2

63.1

8

81％

注：CK-MB：磷酸激酶-MB；LDH-1：乳酸脱氢酶-1；TnI：肌钙蛋白I；BNP：脑钠肽；LVEDD：左心室舒张末期直径；LVEF：左室射血分数

*p＜0.05，**p＜0.01.

用药组的总有效率为81％，而对照组总有效率为78％。

实施例13

心肌肽素能促进因缺血、缺氧、中毒、变态反应等所致的心肌细胞损伤的修复，稳定细胞膜，增强心肌细胞合成蛋白质的能力。可用于静脉滴注或加入心脏停跳液中。适用于降低心脏手术心肌的损伤，促进心肌损伤的修复或加入心脏停跳液中作为对心脏手术的保护手段之一，临床研究证明了心肌肽素的心肌保护作用。

1.适应症范围及确定研究对象

心肌肽素适应于心血管外科围术期的心肌保护。心血管外科手术中，阻断心肌血供以便手术操作为必不可少的步骤，心肌则不可避免地遭受缺血缺氧性打击和再灌注损伤。最易遭受这些损伤的手术为心脏瓣膜置换术和冠状动脉搭桥术等手术。故本试验选择瓣膜性心脏病及冠状动脉粥样硬化性心脏病患者作为研究对象。

2.分组方法

2.1选择瓣膜性心脏病患者用药组330例，阳性对照组110例，共440例。

2.2选择冠状动脉粥样硬化心脏病患者用药组110例，阳性对照组110例，共220例，均在非体外循环下完成手术。

3.受试药物

按实施例1方法制备的心肌肽素溶液

4.对照药物

GIK液，组成成分为：10％葡萄糖500ml，胰岛素8u，15％氯化钾10ml

5.给药方案

心肌肽素的给药剂量为3mg/kg/日，GIK每日用量为10％葡萄糖500ml，内含15％KCL 10ml，胰岛素8U。滴注速度：1～2ml/min，严重心功能不全者液体量减半。

6.统计处理

6.1分别在术前、术中、术后对心脏手术患者的血清心肌酶学、心脏功能、超声心动图及各项实验室检查、不适症状与体征检查的结果及安全性评价指标进行分类分析、t检验、方差分析或秩和检验。

6.2比较手术前后各项实验室检查指标和临床观察客观指标。以P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有非常显著性差异。

7.试验步骤

麻醉后，静脉滴注心肌肽素1mg/kg，30分钟给药完毕；第1次灌注时在停跳液中一次性加入心肌肽素2mg/kg。术后1～3日每日静脉滴注心肌肽素3mg/kg。心肌肽素溶于500ml液体中，滴注速度：1～2ml/min，严重心功能不全者液体量减半。

非体外循环手术，麻醉后，静脉滴注心肌肽素3mg/kg，至手术结束，术后1～3日静脉滴注心肌肽素3mg/kg。

阳性对照组：在麻醉、手术全程中不给心肌肽素，给阳性对照药GIK液，GIK的用量为10％葡萄糖500ml，内含15％KCL10ml，胰岛素8U，术后连用3日。滴注速度：1～2ml/min，严重心功能不全者液体量减半。手术全过程其他处理同给药组。

8.主要和次要观察指标与观察时间

主要观察指标与观察时间：1、手术和住院死亡率。统计术中和术后的死亡率。2、心功能变化。观察时间为术前和术后5~7天。3、心肌组织形态学变化：由于心肌肽素II期临床研究中的心肌组织形态学检查已明确揭示，体外循环下在心脏停跳液中给予心肌肽素能明显减轻瓣膜置换和冠脉搭桥病人的心肌形态学损伤，本试验研究仅取自非体外循环下冠脉搭桥术患者的心肌组织作心肌形态学观察。观察时间为心包切开心脏暴露后(给药前)、心肌血运恢复后5~10min(给药后)。4、心肌酶学和肌钙蛋白。测定项目为肌酸磷酸肌酶(CK)、肌酸磷酸肌酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、乳酸脱氢酶同工酶(LDH-1)和TnT(TnI)。观察时间，体外循环下手术为：升主动脉阻断前、复灌后6h，24h、48h、72h、5-7天各测定一次。非体外循环下手术为：心包切开心脏暴露后、心肌血运恢复后6h，24h、48h、72h、5-7天各测定一次。

9.安全性观察指标

①对血液动力学的影响：是否影响心率(律)和血压。

②有无过敏或类过敏反应：过敏性肺水肿、支气管哮喘、荨麻疹、皮疹等。

③肝、肾功能损害。

④术后恶心呕吐。

10.疗效评定标准

①与阳性对照药GIK液比较，不增加或降低手术和住院死亡率。

②与阳性对照药GIK液比较，能改善术后病人的心功能。

③与阳性对照药GIK液比较，减少心肌酶和肌钙蛋白的漏出量。

④与阳性对照药GIK液比较，明显减轻心肌组织形态学损伤。

11.试验结果

11.1实际病例数及分配

本试验入选受试者随机化人数669例(瓣膜置换手术454例、非体外循环下冠脉搭桥手术215例)。由于1例瓣膜置换手术观察指标参数缺失，被剔出，试验观察病例668例。668例中9例患者因违背试验方案，不列入统计学处理。1例非体外循环下冠脉搭桥患者(GIK液对照组)术后4小时发生急性心肌梗死，抢救无效死亡；1例先天性心脏病、二尖瓣脱垂患者合并高血压病史10年，瓣膜置换术后发生急性肾功能不全，经利尿、透析等治疗无效，术后5日出现多脏器功能衰竭，术后15日死亡外，实际观察统计病例657例。

657例中瓣膜置换组451例，其中心肌肽素组338例、GIK对照组113例。非体外循环冠脉搭桥组206例中心肌肽素组104例、GIK对照组102例。

受试病例中除2例发生严重不良事件导致死亡外，另有12例发生一般不良事件。一般不良事件包括心脏瓣膜置换术和冠脉搭桥术常见的心力衰竭、心房纤颤、术后出血、心包填塞、冠脉桥血栓形成、术中血压下降、术后恶心呕吐、痛风等。两例严重不良事件死亡病例经试验者仔细评述，判断为与心肌肽素无关。一般不良事件中的心力衰竭、心房纤颤、术后出血、心包填塞、冠脉桥血栓形成、术中血压下降、术后痛风等由于原因复杂，干扰因素较多，试验者难以判断与心肌肽素有关。但1例病人术后出现的恶心呕吐则可能与心肌肽素有关。

11.2受试者基本情况分析及可比性分析

受试入选病例心肌肽素组和GIK组年龄、性别、身高、体重和体重指数、均数±标准差

见表1。

组别	年龄(岁)	性别	身高(cm)	体重(kg)	体重指数
						心肌肽素组	48.45±11.39	男262/女190	165.50±7.91	64.62±12.47	23.49±3.69
GIK组	50.44±11.47	男138/女79	166.76±8.03	67.21±13.35	24.00±3.60

P值

0.0349^*

0.1631

0.0544

0.0143^*

0.0959

P＜0.05

两组术前心功能分级见表2。

组别	心功能分级
					I级	II级	III级	IV级
	心肌肽素组	34	186	215					17
GIK组					27	112	69	9
	P值	x²＝16.31	p＝0.0010^**

**P＜0.01

两组术前血液学和血生化检查均数±标准差

见表3。

组别

血红蛋白(g/L)

白细胞(10⁹/L)

尿素氮(mmol/L)

血肌酐(umol/L)

总胆红素(umol/L)

SGOT(u/L)

SGPT(u/L)

心肌肽

137.39±1

6.64±1.

5.99±1.

81.15±19.

16.28±9.

26.32

29.22±21.

素组

7.87

85

65

93

34

±18.62

14

GIK组

137.67±18.26

6.65±1.81

5.86±1.64

80.66±20.37

14.01±7.28

25.36±19.18

32.42±30.70

P值

p＞0.05

两组术前心电图检查均数±标准差

见表4.

从表1-4的术前检查结果可见，心肌肽素组术前心功能劣于GIK组，心率快于GIK组。心肌肽素组心率偏快与心功能较差相吻合。其它术前各项检查结果两组具有较好的可比性。

11.3主要观察指标结果及分析

①手术和住院死亡率：入选669例中死亡2例，总死亡率为0.3％，远远低于国际上瓣膜置换2％左右的死亡率和冠脉搭桥1.5％～2％的死亡率。死亡病例与心肌肽素无关。

②心功能变化：术前心肌肽素组心功能劣于GIK组(p＝0.0010)，但术后5～7天心功能检查两组无明显差异，说明心肌肽素较GIK液可明显改善瓣膜病人和冠心病人的心功能。

③心肌组织形态学变化：均取自非体外循环下冠脉搭桥患者的心肌组织。心肌肽素和GIK液给药前后两组心肌病变分值见表5。

表5心肌肽素组和GIK组给药前后心肌病变分值

组别	给药前	给药后
			心肌肽素组	1.31±0.72^##	0.79±0.49^××##
GIK组	0.97±0.61	1.39±0.72^××

组内比较：^××P＜0.0001，组间比较：^##P＜0.0001。

④心肌酶学和肌钙蛋白：由于心肌肽素组术前心功能劣于GIK组，心肌酶学和肌钙蛋白的基础值心肌肽素组均高于GIK组。具体变化为：

观察指标资料完整的657例中，心肌肽素组442例，GIK组215例。由于心肌肽素组术前心功能分级劣于GIK组，故心肌酶学、肌钙蛋白和形态学病变分值在心肌血运阻断前均高于GIK组(p＜0.05～p＜0.0001)。两组CK在术后6小时即明显升高(p＜0.0001)，24小时达峰值，然后逐渐下降，但直到术后5～7天仍高于心肌血运阻断前(p＜0.0001)。各中心结果一致性的协方差分析表明，各试验中心的心肌肽素和GIK液对CK变化值的影响的研究结果无明显差异(p＝0.1152～0.7738)，即心肌肽素和GIK对CK的影响无明显差异(p＝0.0539～0.7530)。两组CK变化率及各中心对CK变化率的影响一致性的协方差分析结果类似于CK变化值，见图1、图2。CK-MB在心肌肽素组和GIK组的变化完全类似于CK的变化，见图3、图4。

LDH的变化在心肌肽素组和GIK组类似于CK的变化，即在术后6小时明显升高(p＜0.0001)，24小时达峰值。但直至术后5～7天均持续在高水平。各中心结果一致性的协方差分析结果类似于CK，见图5、图6。

肌钙蛋白的测定分两种，即TnT和TnI。TnT检测心肌肽素组受试病例数据完整者为319例，GIK组为174例；TnI检测心肌肽素组受试病例数据完整者为123例，GIK组为41例。

心肌肽素组TnT在心肌血运阻断前(6.34±12.44)明显高于GIK组(0.06±0.24)(P＜0.0001)。术后6小时GIK组TnT明显升高(P＜0.0001)，并持续到术后5～7天。而心肌肽素组术后6小时TnT较前明显降低(P＜0.0001)，直至术后5～7天均显著低于心肌血运阻断前水平(P＜0.0001)(图7)，此可能与心肌血运阻断前基础值较高的缘故。TnT在心肌肽素和GIK给药前后变化值各中心结果一致性的协方差分析表明，各中心的研究结果无明显差异(p＝0.1591～0.6289)，在术后6、24、48、72小时和5～7天TnT的变化值在心肌肽素组和GIK组之间有明显差异(p＝0.0118～0.0001)。变化率在各中心结果一致性的协方差分析结果类似于变化值(p＝0.0387～0.0010)(图8)。TnT变化率在心肌肽素组和GIK组之间的差异提示围术期使用心肌肽素可使心肌损伤较快得到恢复。

心肌肽素组和GIK组TnI在术后6小时较心肌血运阻断前明显升高(P＜0.0001)，并达峰值，然后逐渐下降。TnI在心肌肽素和GIK给药前后变化值各中心结果一致性的协方差分析表明，各中心的研究结果无明显差异(p＝0.1619～0.8171)，在术后5～7天心肌肽素组TnI明显低于GIK组，两组之间有明显差异(P＝0.0017)(图9)。TnI的变化率(图10)各中心结果一致性的协方差分析结果表明，术后5～7天心肌肽素组和GIK组差异非常显著(p＝0.0132)。TnI变化值和TnI变化率在心肌肽素组和GIK组之间的差异提示围术期使用心肌肽素可使心肌损伤较快得到恢复。

11.4.瓣膜置换组和冠脉搭桥组

11.4.1瓣膜置换组

心肌肽素组和GIK组术前心功能分级无明显差异(p＝0.5362)。术后5～7天的心功能检查分级两组均明显好于术前(p＜0.0001)，但组间比较无明显差异(p＝0.8724)。

CK在术后两组均明显升高(p＜0.0001)，变化趋势类似，无明显差异(p＞0.05)，即术后24小时达峰值，然后缓慢下降，术后5～7天仍高于心肌血运阻断前(p＜0.0001)(图11)。CK变化率两组亦呈现类似变化(图12)。各试验中心结果一致性的协方差分析结果表明，各试验中心对心肌肽素和GIK液对CK的影响的研究结果无明显差异(p＞0.05)。CK-MB在心肌肽素组和GIK组术后6小时达峰值，然后缓慢下降，术后5～7天仍高于术前(p＜0.0001)(图13)。CK-MB的其它变化及各试验中心结果一致性的协方差分析结果类似于CK(图14)。

LDH的变化在心肌肽素组和GIK组完全类似于CK-MB(图15、16)。各试验中心结果一致性的协方差分析结果表明，各试验中心对心肌肽素和GIK液对LDH的影响的研究结果无明显差异(p＞0.05)。

瓣膜置换组肌钙蛋白的测定分两种，即TnT和TnI。瓣膜置换组TnT检测心肌肽素受试病例数据完整者为215例，GIK组为72例；TnI检测心肌肽素受试病例数据完整者为123例，GIK组为41例。

心肌肽素组TnT在心肌血运阻断前(5.26±9.96)明显高于GIK组(0.13±0.36，P＜0.0001)。术后6小时GIK组TnT明显升高(P＜0.0001)，并持续到术后5～7天。而心肌肽素组术后6小时TnT较前明显降低(P＜0.0001)，直至术后5～7天均低于心肌血运阻断前水平(P＜0.0001)(图17)。TnT的变化率在术后6、24、48、72小时和5～7天两组之间均有明显差异(P＜0.0001)。瓣膜置换组TnT在心肌肽素和GIK给药前后变化值各中心结果一致性的协方差分析表明，各中心的研究结果无明显差异(P＞0.05)，在术后6、24、48小时和5～7天心肌肽素组和GIK组之间有明显差异(P＜0.05)。变化率在各中心结果一致性的协方差分析结果类似于变化值(图18)。

其它地区心肌肽素组和GIK组TnI在术后6小时较心肌血运阻断前明显升高(P＜0.0001)，并达峰值，然后逐渐下降(图19)。TnI在心肌肽素和GIK给药前后变化值各中心结果一致性的协方差分析表明，各中心的研究结果无明显差异(P＞0.05)，在术后5～7天心肌肽素组TnI明显低于GIK组，两组之间有明显差异(P＝0.0017)。TnI的变化率各中心结果一致性的协方差分析结果类似于变化值(图20)。

11.4.2冠脉搭桥手术组：

受试者心肌肽素组和GIK对照组基本临床资料(年龄、性别、身高和体重)组间比较无显著差异(p＞0.05)。

心肌肽素组和GIK组术前心功能分级无明显差异(p＝0.3992)。术后5～7天的心功能检查分级两组均明显好于术前(p＜0.0001)，但组间比较无明显差异(p＝0.5192)。

CK在心肌血运恢复后两组均明显升高(p＜0.0001)，变化趋势类似，无明显差异(p＞0.05)，即术后24小时达峰值，然后缓慢下降，术后5～7天仍高于心肌血运阻断前(p＜0.0001)(图21)。CK变化率两组亦呈现类似变化(图22)。各试验中心结果一致性的协方差分析结果表明，各试验中心对心肌肽素和GIK液对CK的影响的研究结果无明显差异(p＞0.05)。CK-MB的变化类似于CK(图23、24)。

分析集)

LDH在心肌血运恢复后两组均明显升高(p＜0.0001)，变化趋势类似，无明显差异(p＞0.05)。但两组变化趋势不同于CK和CK-MB，即术后一直持续在高水平(图25、26)。

TnT在两组的变化趋势相同，组间无明显差异(p＞0.05)(图27、28)。各试验中心结果一致性的协方差分析结果表明，各试验中心对心肌肽素和GIK液对TnT的影响的研究结果无明显差异(p＞0.05)。但TnT的变化趋势即不同于CK、CK-MB、也不同于LDH，即峰值时间在术后72小时，术后5～7天明显下降，但仍高于基础值(p＜0.0001)。

心肌组织形态学的变化明显不同于酶学和肌钙蛋白的变化。用药前心肌肽素组心肌组织病变分值(1.31±0.72)明显高于GIK组(0.97±0.61，P＝0.0013)，而用药后(0.79±0.49)则明显低于GIK组(1.39±0.72，P＜0.0001)；心肌肽素组和GIK组用药前后心肌组织病变分值的变化率有明显差异(p＜0.0001)。各试验中心对心肌肽素和GIK用药前后心肌组织病变分值及变化率结果一致性的协方差分析结果表明，各试验中心对心肌肽素和GIK液对心肌组织形态学的影响的研究结果无明显差异(p＝0.0940～0.2246)，心肌肽素与GIK相比，能明显减轻心肌组织的形态学损伤(p＜0.0001)。另心肌肽素组和GIK组用药前后各组内心肌组织病变分值的变化为：心肌肽素组用药后心肌组织病变分值(0.79±0.49)较用药前(1.31±0.72)显著降低(P＜0.0001)；而GIK组用药后心肌组织病变分值(1.39±0.72)较用药前(0.97±0.61)显著升高(P＜0.0001)(表6)。

表6心肌肽素组和GIK组心肌形态学病变分值

组别	用药前	用药后
			心肌肽素组GIK组	1.31±0.720.97±0.61	0.79±0.49**1.39±0.72**

组内比较：****p＜0.0001 ****p＜0.0001

11.5有效性小结

①从手术前后心功能变化看，术前心肌肽素组心功能劣于GIK组(p＝0.0010)，但术后5～7天心功能检查两组之间已无差异，提示心肌肽素对瓣膜置换和冠脉搭桥病人的心肌保护作用优于GIK液。

②从非体外循环下冠脉搭桥病人给药前后心肌组织病变分值看，术中静脉滴注心肌肽素对冠脉搭桥病人的心肌保护作用优于GIK液。

③根据对肌钙蛋白TnT(TnI)指标的统计分析，其变化率在心肌肽素组和GIK组之间的差异提示围术期使用心肌肽素可使心肌损伤较快得到恢复，证明注射用心肌肽素对心肌损伤有一定的保护作用。

11.6安全性分析

①入选受试669例中围术期死亡2例，均与心肌肽素无关。

②12例发生一般不良事件。一般不良事件包括心脏瓣膜置换术和冠脉搭桥术常见的心力衰竭、心房纤颤、术后出血、心包填塞、冠脉桥血栓形成、术中血压下降、术后恶心呕吐、痛风等。一般不良事件中的心力衰竭、心房纤颤、术后出血、心包填塞、冠脉桥血栓形成、术中血压下降、术后痛风等由于原因复杂，干扰因素较多，难以判断与心肌肽素有关。

③1例病人术后出现的恶心呕吐则可能与心肌肽素有关。

④心肌肽素和GIK液对肝肾功能和血液学的影响见表7。

表7两组术后5～7天血液学和血生化检查

组别

血红蛋白(g/L)

白细胞(10⁹/L)

尿素氮(mmol/L)

血肌酐(umol/L)

总胆红素(umol/L)

SGOT(u/L)

SGPT(u/L)

心肌肽素组GIK组

119.35±17.71119.41±16.54

10.25±3.679.70±3.24

7.64±3.527.88±3.69

80.91±42.2581.33±24.42

16.84±8.4916.13±8.83

40.03±50.4739.31±35.55

46.03±58.0541.59±40.05

P值

p＞0.05

未见心肌肽素对肝、肾功能和血液学的损害。

11.7安全性小结

心肌肽素在围术期使用是安全的，无严重不良反应。偶有病人可出现恶心呕吐的不良反应，但停药后可自行消失。

12.讨论与结论

心肌肽素在心脏瓣膜置换术和冠状动脉旁路移植术患者围术期使用是安全的，未见明显严重不良反应。术后静注心肌肽素偶有患者可发生恶心呕吐的不良反应。心肌肽素在心脏瓣膜置换术和冠状动脉旁路移植术患者围术期对心肌的保护作用优于阳性对照药GIK液。

综上所述，通过药学研究、药理毒理研究和临床研究证明本品安全、有效、质量可控。

心肌肽素加热法

处理灭活伪狂犬病毒(PRV)结果

样本于76.2～76.4℃加热时间	残余PRV滴度(LgTCID₅₀/0.1ml)
				实施例1	实施例2	实施例3
	零时5分15分30分1小时	7.12≤030≤0.50≤0.50≤0.50	7.00≤0.50≤0.50≤0.50≤0.50				6.88≤0.50≤0.50≤0.50≤0.50

本试验样本中病毒最低检测限为：0.50LgTCID₅₀/0.1ml。

表b

76.0-76.5、1小时灭活心肌肽素中PPV病毒效果

处理时间(分)	实施例1	实施例2	实施例3
				残余滴度	残余滴度	残余滴度
	05153060	5.883.002.632.50≤0.50	5.753.132.752.13≤0.50				6.003.252.882.25≤0.50

病毒滴度单位：LgTCID₅₀/0.1ml

表c

76.0-76.5、1小时灭活心肌肽素中Sindbis病毒效果

处理时间(分)	实施例1	实施例2	实施例3
				残余滴度	残余滴度	残余滴度
	05153060	6.10＜0.00＜0.00＜0.00＜0.00	6.12＜0.00＜0.00＜0.00＜0.00				6.08＜0.00＜0.00＜0.00＜0.00

病毒滴度单位：LgPFU/ml

表d

Claims

1.一种生化物质的灭活方法，该方法包括取宰杀后的动物器官或组织，提取其中的生物活性组分，其特征在于将提取的活性成分的溶液在75-85℃下加热20-80分钟灭活猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒或Sindbis病毒。

2.根据权利要求1所述的灭活方法，其特征在于，所述的生化物质为生化提取物。

3.根据权利要求1所述的灭活方法，还包括灭活后的溶液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

4.一种心肌肽素的制备方法，其特征在于取宰杀后的健康哺乳动物的心室肌洗净、切碎，加灭菌蒸馏水匀浆，匀浆液反复冷冻、解冻3～4次，加热至65～95℃过滤除渣，用板框滤器过滤得到粗滤液，再用中空纤维柱超滤后得到精滤液，再用超滤膜超滤，截留重均分子量为2000～8000道尔顿的心肌肽素溶液，将所述心肌肽素溶液在60-85℃下加热10-120分钟灭活猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒或Sindbis病毒，以反渗透浓缩柱浓缩，最后经过滤除菌，冷冻干燥得成品。

5.一种心肌肽素的制备方法，其特征在于取宰杀后的健康哺乳动物的心室肌洗净、切碎，加灭菌蒸馏水匀浆，过滤提取重均分子量为2000～8000道尔顿的心肌肽素溶液，将所述心肌肽素溶液在60-85℃下加热10-120分钟灭活猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒或Sindbis病毒，然后过滤除菌，冷冻干燥得成品。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，所述灭活在水浴下进行，灭活条件为75--85℃搅拌30-120分钟。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述灭活条件为80℃±2℃搅拌60分钟。

8.根据权利要求4或5所述的制备方法，其中过滤除菌为灭活后的溶液经0.22μm微孔滤膜进行。

9.根据权利要求6所述的制备方法，匀浆液的制备包括：按心室肌∶注射用水＝1∶1(质量比)比例投料，所述匀浆的转速为1000-10000rpm/min。

10.根据权利要求5所述的制备方法，所述过滤包括将冻存24小时后的匀浆液解冻后，置75℃水浴中恒温10分钟，用纱布过滤除渣，收集滤液，再用5μm板框滤器过滤一次，得粗滤液。

11.根据权利要求10所述的制备方法，所述过滤还包括将粗滤液经过三柱串联的中空纤维正压过滤三次，得精滤液。

12.根据权利要求11所述的制备方法，所述过滤还包括将精滤液过密滤膜超滤、截留得重均分子量为2000～8000道尔顿的心肌肽素溶液。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述截留为截留得重均分子量为2000～5000道尔顿的心肌肽素溶液。

14.根据权利要求4或5所述的制备方法，其中所述健康哺乳动物包括猪、牛、羊、兔、马。

15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述的健康哺乳动物为幼年哺乳动物，包括乳猪、乳牛、乳羊、乳兔、乳马。

16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述的幼年哺乳动物为乳猪。

17.按权利要求4-16任一项所述的制备方法制得的心肌肽素在制备治疗或预防心脑血管疾病药物上的用途，所述的心脑血管疾病为急慢性冠心病、其它缺血性心脏疾病、心肌炎及风湿性心脏病、或为适应于心血管外科围术期的心肌保护。

18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述的急慢性冠心病为心绞痛、心肌梗塞、心律失常。