CN112915215A - 一种用小鼠检验a型塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法 - Google Patents

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CN112915215A CN202110402776.6A CN202110402776A CN112915215A CN 112915215 A CN112915215 A CN 112915215A CN 202110402776 A CN202110402776 A CN 202110402776A CN 112915215 A CN112915215 A CN 112915215A
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宋晓飞
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周忠涛
李营
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张梦媛
张慧清
张青婵
王蕾
张连秀
徐龙涛
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Abstract

本发明涉及一种用小鼠检验A型塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法。基于本发明技术方案提供的用小鼠检验A型塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法可以有效使用小鼠代替实验猪建立A型塞内卡病毒灭活疫苗效力检验的替代方法，消除非洲猪瘟对生物制品研究猪舍生物安全影响，有效降低A型塞内卡病毒病灭活疫苗效力检验动物及饲料成本，缩短检验周期，且操作简单、易行。试验结果表明，使用小鼠替代试验猪进行A型塞内卡病毒病灭活疫苗，试验数据表明疫苗免疫试验猪和小鼠的效力检验结果一致，小鼠可以作为替代动物进行效力检验。

Description

一种用小鼠检验A型塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法
技术领域
本发明涉及一种用小鼠检验A型塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法，属于兽用生物制品 领域。
背景技术
A型塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)，前称塞内卡谷病毒(Seneca Valleyvirus，SVA) 是一种新兴的小核糖核酸病毒(Picornaviridae)，无膜包被，单股正链，分属于塞内卡属，是 该家族唯一成员，该病毒感染猪后可使感染猪出现水泡性病变和新生仔猪死亡，症状与口蹄疫 极为相似，容易发生混淆。在2014年之前，仅在美国和加拿大发现SVA；自2014年年底始， SVA在巴西、哥伦比亚、泰国、中国等北美以外的主要猪生产国家和地区相继爆发，北美地 区也出现新的病例，与之前低感染率和致死率相比较，新爆发的病症更加猛烈，影响范围更广， 对当地养猪业的生产和发展造成更大的威胁。且作为一种新的病原体，SVA迅速传播，其临 床症状与其它引起猪水泡性症状的病毒感染难以区分，已造成显著的经济损失。
对A型塞内卡病毒的防控主要以预防为主，然而，目前尚没有可有效防控A型塞内卡病 毒病商品化疫苗上市，疫苗正处于研发阶段。A型塞内卡病毒试验苗的效力检验主要依靠猪体 进行，在疫苗的研制和后续检验过程中，试验阴性猪筛选成本很大，筛选时间较长。另受到非 洲猪瘟疫情影响，试验猪价格较高且存在较高的生物安全风险。因此，需要建立一种A型塞 内卡病毒病灭活疫苗效力检验的替代方法。
在我们实验室研究过程中，我们发现A型塞内卡病毒攻毒小鼠，病毒在小鼠体内分布及 病毒血症消长规律与猪平行性极好，小鼠是一种很好的A型塞内卡病毒致病性替代动物模型。 我们在后续实验室研究过程中，进一步证实猪和小鼠保护效果存在免疫保护相关性。
小鼠免疫攻毒作为A型塞内卡病毒病灭活疫苗效力检验方法，简单、易行，且可有效节 约检验成本，极大降低生物安全风险。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，即疫苗正处于研发阶段。A型塞内卡病毒试 验苗的效力检验主要依靠猪体进行，在疫苗的研制和后续检验过程中，试验阴性猪筛选成本很 大，筛选时间较长。另受到非洲猪瘟疫情影响，试验猪价格较高且存在较高的生物安全风险。 因此，需要建立一种A型塞内卡病毒病灭活疫苗效力检验的替代方法。本发明的技术方案为：
1.一种用小鼠检验A型塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法，包括以下步骤：
使用A型塞内卡病毒病灭活疫苗对若干小鼠进行免疫接种；免疫接种21～28d后，使用A 型塞内卡病毒液对已免疫小鼠进行攻毒；攻毒后7～14天剖杀小鼠，取小鼠组织进行病毒分离， 免疫小鼠内脏病毒分离阴性率≥90％，即可判定A型塞内卡病毒病灭活疫苗保护效力合格。
2.如权利要求1所述的一种用小鼠检验A型塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法，其特征 在于，所述小鼠为Balb/C小鼠或昆明小鼠；小鼠免疫接种的剂量为至少0.1mL，接种途径采 用腿部肌肉或腹腔注射；对已免疫小鼠进行攻毒的毒量为至少0.1×104.5TCID50。
3.如权利要求1所述的一种用小鼠检验A型塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法，其特征 在于所述病毒分离方法，病毒分离需传代包括但不限于3代；所述病毒分离组织包括但不限于 皮肤、心、肝、脾、肺、肾、脑等组织及血清。
本发明新的技术效果
本发明涉及一种用小鼠检验A型塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法。基于本发明技术方案 提供的用小鼠检验A型塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法可以有效使用小鼠代替实验猪建立 A型塞内卡病毒灭活疫苗效力检验的替代方法，消除非洲猪瘟对生物制品研究猪舍生物安全影 响，有效降低A型塞内卡病毒病灭活疫苗效力检验动物及饲料成本，缩短检验周期，且操作 简单、易行。试验结果表明，使用小鼠替代试验猪进行A型塞内卡病毒病灭活疫苗，试验数 据表明疫苗免疫试验猪和小鼠的效力检验结果一致，小鼠可以作为替代动物进行效力检验。
本发明涉及的生物材料资源信息
本发明涉及的毒株：A型塞内卡病毒(Seneca Valley Virus，SVV)SVV-SD-2018株为本 发明人由我国山东分离获得，该病毒已于2020年10月30日送交北京市朝阳区北辰西路1号 院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号 为CGMCC No.20715(请见申请号为202011237451.9一种猪塞内卡病毒疫苗及其制备方法)。
具体实施方式
本发明旨在建立一种用小鼠代替猪的A型塞内卡病毒病灭活疫苗的效力检验方法，为新 型A型塞内卡病毒疫苗的效力检验提供新的替代动物效力检验方法。
通过以下具体实施方式详细说明本发明。
实施例
以下实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具 体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是 广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程， 实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。
实施例1——A型猪塞内卡病毒灭活疫苗的制备
该实施例选择使用SVV-SD-2018 CGMCC No.20715(CN112294951A)作为毒株制备A型塞内卡病毒液，经灭活、乳化后获得以下实施例中的疫苗，具体包括以下步骤：
本发明使用的生物反应器为APPLIKON公司30L～2000L细胞生物反应器。BHK-2014S 株全悬浮细胞为齐鲁动物保健品有限公司使用BHK-21细胞(BHK-21细胞，CVCCNo.CL6， 购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)驯化获得(CN112294951A)。
1.BHK-21全悬浮细胞的制备
(1)细胞摇瓶培养：细胞复苏后以8.0×105个细胞/mL的密度接入到125mL三角培养瓶 中，以120r/min转速于37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞生长至4.0×106个细胞/mL时， 进行传代，按照比例补加新鲜培养基，使细胞初始密度为8.0×105个细胞/mL。
(2)细胞接种及放大培养：将细胞培养罐清洗干净，121℃灭菌30min，灭菌结束后，完 成空罐溶氧电极的100％点校正。选择生长旺盛的BHK-21细胞，接种细胞培养罐，接种密度 为8.0×105～1.3×106个细胞/mL，37℃培养，待细胞密度高于4.0×106个细胞/mL时，补加培养 基，继续培养至细胞密度达到4.0×106个细胞/mL时，将细胞培养罐内细胞悬液转移至新细胞 培养罐培养，接种密度为8.0×105～1.3×106个细胞/mL。
2.制苗用毒液(生产种毒)的制备
(1)接毒：待BHK-2014S株全悬浮培养至密度约4.0×106个细胞/mL，补加含0.5％～1％ 新生牛血清的BHK-21培养基(约占培养基体积的1/3)，将细胞密度稀释至2.0×106个细胞/mL～3.0×106个细胞/mL，按MOI＝0.01～0.5比例接种SVV-SD-2018株病毒(CGMCCNo.20715)。
(2)收获病毒液：在生物反应器中继续培养悬浮细胞，待细胞活率降至50％以下时，收获 细胞培养毒液作为生产用毒种。
3.病毒液的纯化将收获的病毒液经澄清或连续流离心除去细胞碎片等杂质，根据SVA 的大小，选用100KD分子截留值的超滤膜得到纯化病毒液(抗原)。
4.病毒液(抗原)灭活制备的病毒液(抗原)按照《中华人民共和国兽药典》(中国兽药 典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中 国兽药典》)附录进行纯净性检验，应无细菌、霉菌、支原体，且SVV-SD-2018SVV-SD-2018 株病毒含量≥109.5TCID50/mL。使用BEI灭活，检验合格后，进行乳化配苗。将检验合格的 SVV-SD-2018株病毒置于容器内，加入工作浓度为0.1％～0.5％的BEI，30～37℃灭活24～48 小时，灭活结束后，向病毒液中添加终浓度为0.2％的硫代硫酸钠溶液，搅拌1小时终止灭活。 将SVV-SD-2018株灭活样品取样，按5％接种量接种BHK-21细胞，盲传3代进行灭活检测。
5.乳化配苗将水包油佐剂缓缓注入到制得的SVV-SD-2018株病毒灭活抗原中，按抗原: 佐剂体积比9:1进行混合乳化，配制成A型塞内卡病毒灭活疫苗。
6.疫苗成品检验《中国兽药典》
(1)无菌检验按《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
(2)安全性试验用14～21日龄仔猪5头，每头肌肉注射疫苗2.0mL，连续观察14日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
按照上述方法共制备3批疫苗，疫苗批号分别为201901001、201901002、201901003，2～8℃ 保存。
实施例2——A型塞内卡病毒液的制备
该实施例选择使用SVV-SD-2018SVV-SD-2018SVV-SD-2018CGMCC No.20715(CN112294951A)作为毒株制备A型塞内卡病毒液，用于以下实施例中的攻毒用毒，具体包括以下步骤：
将A型塞内卡病毒毒株接种于长满单层的BHK-21细胞(BHK-21细胞，CVCC No.CL6，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)，置37℃的5％CO2培养箱中培养3日，反复冻融3次收获病毒培养液，记为F1代，置-20℃保存。取收获的病毒培养液F1代，按照0.1％(V/V)的含量接种已长满单层的BHK-21细胞，置于37℃的5％CO2培养箱中培养，每日观察细胞病变(CPE)，接种后48小时收获病毒培养液，记为F2代。继续按上述方法传代，传至出现典 型病变(表现为细胞圆缩、聚合、出现空洞，甚至脱落)为止，该实施例中培养至F2代即出 现典型病变。收获病毒液，测定病毒含量为109.5TCID50/mL。
实施例3——小鼠攻毒剂量的确定
该实施例利用上述实施例2获得的A型塞内卡病毒液对小鼠进行攻毒试验，以确定小鼠 的攻毒剂量，具体包括以下步骤：
1.选取试验动物：选取9～11周Balb/C小鼠40只，购自北京维通利华试验动物技术有限 公司；
2.攻毒用毒制备：以实施例2制备的病毒含量为109.5TCID50/mL的病毒液进行稀释，获 得病毒含量为105.5TCID50/mL、104.5TCID50/mL、103.5TCID50/mL，分别对小鼠进行攻毒；
3.腹腔注射攻毒9～11周Balb/C小鼠40只随机分为4组，每组10只，第1组腹腔注射105.5TCID50/mL病毒液0.1mL；第2组腹腔注射104.5TCID50/mL病毒液0.1mL；第3组腹腔注 射103.5TCID50/mL病毒液0.1mL；第4组腹腔注射生理盐水0.1mL。攻毒后第7日，全部剖杀， 分别取皮肤、心、肝、脾、肺、肾、肠、脑，各组织按照每0.1g组织加入0.5mL DMEM比例 加入DMEM，研磨处理。组织研磨液反复冻融3次，12000rpm，离心10min，取上清，0.22 μm过滤。
取长成良好单层的BHK-21细胞12孔板，按照10％(V/V)比例接入组织研磨液，置37℃ 的5％CO2培养箱中培养5日，反复冻融3次收获病毒培养液，记为F1代，置-20℃保存。取收获的病毒培养液F1代，按照10％(V/V)的比例接种已长满单层的BHK-21细胞12孔板， 置于37℃的5％CO2培养箱中培养，每日观察细胞CPE，接种后48小时收获病毒培养液液， 记为F2代。F2代收获病毒液按照10％(V/V)的比例接种已长满单层的BHK-21细胞12孔板， 置于37℃的5％CO2培养箱中培养，每日观察细胞CPE，接种后48小时收获病毒培养液液， 记为F3代，每日观察细胞是否出现细胞圆缩、聚合、融合、脱落等典型CPE。
F3代细胞出现典型细胞病变，使用PCR进行验证。F3细胞出现典型细胞病变，使用PCR 进行验证。
PCR引物：
SVA-P1：cactctggcc tctctctgga 20，
SVA-P2：gttctggagg tattcaatct g 21
扩增基因片段大小为580bp；RT-PCR扩增体系：2×One Step Mix 12.5μL、PrimeScript One Step Enzyme Mix 1.0μL、10μmol/L的上下游引物各0.5μL，模板2.0μL，补足灭菌ddH2O至25μL； 扩增程序为：50℃反转录30min；94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸 1min，35个循环；72℃延伸10min。
本次攻毒结果如表1所示。
表1攻毒剂量试验结果
Figure BDA0003020991070000061
F3代细胞收获后进行PCR检测，结果PCR结果与细胞病变结果相符。
由表1数据可见，腹腔注射途径攻毒，0.1×104.5TCID50、0.1×105.5TCID50攻毒剂量组小鼠 病毒分离阳性率均为10/10，0.1×103.5TCID50病毒分离阳性率为7/10。
4.肌肉注射攻毒9～11周Balb/C小鼠40只随机分为4组，每组10只，第1组肌肉注射105.5TCID50/mL病毒液0.mL；第2组肌肉注射104.5TCID50/mL病毒液0.mL；第3组肌肉注射103.5TCID50/mL病毒液0.mL；第4组肌肉注射生理盐水0.mL。攻毒后第7日，全部剖杀，分 别取皮肤、心、肝、脾、肺、肾、肠、脑，各组织按照每0.1g组织加入0.5mL DMEM比例加 入DMEM，研磨处理。组织研磨液反复冻融3次，12000r/min，离心10min，取上清，0.22μm 过滤。
取长成良好单层的BHK-21细胞12孔板，按照10％(V/V)比例接入组织研磨液，置37℃ 的5％CO2培养箱中培养5日，反复冻融3次收获病毒培养液，记为F1代，置-20℃保存。取收获的病毒培养液F1代，按照10％(V/V)的比例接种已长满单层的BHK-21细胞12孔板， 置于37℃的5％CO2培养箱中培养，每日观察细胞CPE，接种后48小时收获病毒培养液液， 记为F2代。F2代收获病毒液按照10％(V/V)的比例接种已长满单层的BHK-21细胞12孔 板，置于37℃的5％CO2培养箱中培养，每日观察细胞CPE，接种后48小时收获病毒培养液 液，记为F3代，每日观察细胞是否出现细胞圆缩、聚合、融合、脱落等典型病变(CPE)。
F3细胞出现典型细胞病变，使用PCR进行验证。
PCR引物(SVA-P1和SVA-P2)，扩增基因片段大小为580bp；RT-PCR扩增体系：2×OneStep Mix 12.5μL、PrimeScript One Step Enzyme Mix 1.0μL、10μmol/L的上下游引物各0.5μL， 模板2.0μL，补足灭菌ddH2O至25μL；扩增程序为：50℃反转录30min；94℃预变性5min； 94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
本次攻毒后病毒分离结果如表2所示。
表2攻毒剂量试验结果
Figure BDA0003020991070000071
F3代细胞收获后进行PCR检测，结果PCR结果与细胞病变结果相符。
由表2数据可见，肌肉注射途径攻毒0.1×104.5TCID50、0.1×105.5TCID50攻毒剂量组小鼠病 毒分离阳性率均为10/10，0.1×103.5TCID50病毒分离阳性率为7/10。
5.滴鼻途径攻毒9～11周Balb/C小鼠40只随机分为4组，每组10只，第1组滴鼻105.5TCID50/mL病毒液0.1mL；第2组滴鼻104.5TCID50/mL病毒液0.1mL；第3组滴鼻103.5TCID50/mL病毒液0.1mL；第4组滴鼻生理盐水0.1mL。攻毒后第7日，全部剖杀，分别 取皮肤、心、肝、脾、肺、肾、肠、脑，各组织按照每0.1g组织加入0.5mL DMEM比例加入 DMEM，研磨处理。组织研磨液反复冻融3次，12000r/min，离心10min，取上清，0.22μm过 滤。
取长成良好单层的BHK-21细胞12孔板，按照10％(V/V)比例接入组织研磨液，置37℃ 的5％CO2培养箱中培养5日，反复冻融3次收获病毒培养液，记为F1代，置-20℃保存。取收获的病毒培养液F1代，按照10％(V/V)的比例接种已长满单层的BHK-21细胞12孔板， 置于37℃的5％CO2培养箱中培养，每日观察细胞的CPE，接种后48小时收获病毒培养液液， 记为F2代。F2代收获病毒液按照10％(V/V)的比例接种已长满单层的BHK-21细胞12孔 板，置于37℃的5％CO2培养箱中培养，每日观察细胞的CPE，接种后48小时收获病毒培养 液液，记为F3代，每日观察细胞是否出现细胞圆缩、聚合、融合、脱落等典型CPE。
F3代细胞出现典型细胞病变，使用PCR进行验证。F3细胞出现典型细胞病变，使用PCR 进行验证。
PCR引物：SVA-P1和SVA-P2(序列1和序列2)。
扩增基因片段大小为580bp；RT-PCR扩增体系：2×One Step Mix 12.5μL、PrimeScript One Step Enzyme Mix 1.0μL、10μmol/L的上下游引物各0.5μL，模板2.0μl，补足灭菌ddH2O至25μL； 扩增程序为：50℃反转录30min；94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸 1min，35个循环；72℃延伸10min。本次攻毒结果如表3所示。
表3攻毒剂量试验结果
Figure BDA0003020991070000081
F3代细胞收获后进行PCR检测，结果PCR结果与细胞病变结果相符。
由表3数据可见，滴鼻途径攻毒，0.1×104.5TCID50、0.1×105.5TCID50攻毒剂量组小鼠病毒 分离阳性率均为10/10，0.1×103.5TCID50病毒分离阳性率为7/10。
由表1、表2、表3可见，小鼠攻毒后，心、肝、脾、肺、肾、肠、脑、皮肤等组织均可 分离到A型塞内卡病毒，各组织病毒分离阳性率差异不明显。肌肉注射、腹腔注射、滴鼻途 径分别使用0.1×104.5TCID50、0.1×105.5TCID50、0.1×103.5TCID50剂量攻毒，小鼠组织病毒分离阳 性率无差异，分别为10/10、10/10、7/10，因此3种攻毒途径均可使用。因此，确定用于以下 实施例中检验灭活疫苗效力的最小攻毒剂量定为0.1×104.5TCID50，即病毒含量为104.5TCID50的A型塞内卡病毒液，0.1mL/只，采用滴鼻、肌肉注射或腹腔注射方式攻毒。
实施例4——用小鼠和猪对A型塞内卡病毒病灭活疫苗进行免疫效力检验
实施例1中制备的批号为201901001、201901002、201901003批等3批A型塞内卡病毒 病灭活疫苗进行效力检验；选取实验动物为：6～8周龄Balb/C小鼠40只，购自北京维通利华 试验动物技术有限公司；检验用A型塞内卡病毒为实施例2制备的病毒含量为109.5TCID50/mL 的病毒液稀释获得。
具体操作包括以下步骤：
4.1动物分组免疫9～11周Balb/C小鼠40只随机分为4组，每组10只。第1～3组，分别肌肉注射批号为201901001、201901002、201901003批疫苗，0.1mL/至。第4组肌肉注射生理盐水，0.1mL/只，第4组作为对照组。免疫后在相同饲养条件下饲养。
4.2攻毒免疫后21日，用104.5TCID50/mL的攻毒用毒对已免疫小鼠进行攻击，攻毒剂量为0.1mL/只，攻毒方式采用腹腔注射途径。
4.3病毒分离攻毒后7日，剖杀所有小鼠，分别取心、肝、脾、肺、肾、肠、脑、皮 肤等组织，各组织按照每0.1g组织加入0.5mL DMEM比例加入DMEM，研磨处理。组织研磨 液反复冻融3次，12000r/min，离心10min，取上清。
取长成良好单层的BHK-21细胞12孔板，按照10％(V/V)比例接入组织研磨液，置37℃ 的5％CO2培养箱中培养5日，反复冻融3次收获病毒培养液，记为F1代，置-20℃保存。取收获的病毒培养液F1代，按照10％(V/V)的比例接种已长满单层的BHK-21细胞12孔板，置于37℃的5％CO2培养箱中培养，每日观察细胞的CPE，接种后48小时收获病毒培养液，记 为F2代。F2代收获病毒液按照10％(V/V)的比例接种已长满单层的BHK-21细胞12孔板，置 于37℃的5％CO2培养箱中培养，每日观察细胞的CPE，接种后48小时收获病毒培养液液， 记为F3代，每日观察细胞是否出现细胞圆缩、聚合、融合、脱落等典型CPE。观察结果如表 4所示。
结果判定标准：攻毒小鼠任一组织研磨液接种BHK-21细胞12孔板，在病毒传代过程中 出现典型细胞病变(细胞圆缩、聚合、融合、脱落等典型细胞的CPE，即可判定为病毒分离阳 性。疫苗免疫组应至少9/10病毒分离阴性，未免疫疫苗对照组应至少9/10病毒分离阳性。
表4免疫攻毒试验结果
分组 疫苗批号 病毒分离结果(阳性个体/总数) 保护率 结果
1 1901001 0/10 100％ 合格
2 1901002 0/10 100％ 合格
3 1901003 0/10 100％ 合格
4 / 10/10 0％ 成立
由表4结果可见，3批A型塞内卡病毒病灭活疫苗(1901001、1901002、1901003)对小鼠保护率均为100％，根据以上结果判定标准，所检测疫苗效力检验均合格。
4.2、该步骤利用试验猪对上述4.1的A型塞内卡病毒病灭活疫苗的效力检验结果进行验 证，其中使用的试验猪为60日龄以上猪，检测A型塞内卡病毒血清中和抗体＜1:4，购自济南 唐王猪场；采用的攻毒用毒为上述实施例2获得的A型塞内卡病毒液(病毒含量为109.5TCID50/mL)。具体操作包括以下步骤：
1)免疫：将20只猪随机分为4组，每组5只。第1～3组分别免疫批号为201901001、201901002、201901003的A型塞内卡病毒病灭活疫苗，颈部肌肉注射剂量为1.0mL/头。第4组颈部肌肉注射生理盐水，1.0mL/头，作为对照组。相同环境饲养。
2)攻毒：免疫后第21天，用病毒含量为107.5TCID50mL的攻毒用毒对猪进行攻毒，攻毒 剂量为2.0mL/只，攻毒方式采用滴鼻1.0mL、肌肉注射1.0mL，攻毒后每日定时观察3次，连 续观察14天。观察结果如下表5所示。
3)结果判定标准：攻毒猪出现轻微跛行；攻毒后猪鼻吻及周边，猪蹄掌、冠状带出现水 疱、破溃或结痂，且取样进行PCR鉴定为A型塞内卡病毒阳性，其中PCR引物：SVA-P1\SVA-P2 (序列1和序列2)，扩增基因片段大小为580bp；RT-PCR扩增体系：2×One Step Mix12.5μL、 PrimeScript One Step Enzyme Mix 1.0μL、10μmol/L的上下游引物各0.5μL，模板2.0μL，补足 灭菌ddH2O至25μL；扩增程序为：50℃反转录30min；94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃ 退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。攻毒猪观察14日内出现上述任一症 状可判为发病；无上述症状判定为保护。
表5猪免疫攻毒效力检验结果
分组 疫苗批号 攻毒保护结果(发病数/总数) 保护率 结果
1 1901001 0/5 100％ 合格
2 1901002 0/5 100％ 合格
3 1901003 0/5 100％ 合格
4 / 5/5 0％ 成立
由表5数据可见，使用的3批疫苗(批号为2019003、2019004、2019005的A型塞内卡病 毒病灭活疫苗)免疫猪后，用病毒含量为107.5TCID50/1mL的A型塞内卡病毒攻击，免疫猪未见 明显临床症状，判定为保护；而对照组猪全部发病，判定为不保护，试验成立，证明使用的塞 内卡病毒灭活疫苗的效力检验合格。
由实施例4结果可知，用小鼠进行免疫攻毒试验与用猪进行免疫攻毒试验的结果是一致的， 表明可以用小鼠代替猪评价A型塞内卡病毒病灭活疫苗的免疫效力。

Claims (3)

1.一种用小鼠检验A型塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法，包括以下步骤：
使用A型塞内卡病毒病灭活疫苗对若干小鼠进行免疫接种；免疫接种21～28d后，使用A型塞内卡病毒液对已免疫小鼠进行攻毒；攻毒后7～14天剖杀小鼠，取小鼠组织进行病毒分离，免疫小鼠内脏病毒分离阴性率≥90％，即可判定A型塞内卡病毒病灭活疫苗保护效力合格。
2.如权利要求1所述的一种用小鼠检验A型塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法，其特征在于，所述小鼠为Balb/C小鼠或昆明小鼠；小鼠免疫接种的剂量为至少0.1mL，接种途径采用腿部肌肉或腹腔注射；对已免疫小鼠进行攻毒的毒量为至少0.1×104.5TCID50。
3.如权利要求1所述的一种用小鼠检验A型塞内卡病毒病灭活疫苗效力的方法，其特征在于所述病毒分离方法，病毒分离需传代包括但不限于3代；所述病毒分离组织包括但不限于皮肤、心、肝、脾、肺、肾、脑等组织及血清。
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