CN106924726A - 一种用于预防猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于预防猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于预防猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物，其中，该疫苗组合物包括免疫量的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株的抗原以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原，以及药学上可接受的载体。本发明提供的疫苗组合物能有效抵抗新流行株和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的攻击，且对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原的保护效果产生了协同作用，增加了其免疫抵抗能力。

Description

一种用于预防猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物及其制备方法和应 用
技术领域
本发明属于兽用疫苗领域，具体涉及预防猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物及其制备方法和应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以母猪发热、流产，断奶前、后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。该病最早发现于美国的北卡罗来纳州(1987年)，此后相继在加拿大(1998年)、德国(1990年)、英国(1991年)发现此病。1992年国际兽医局(OIE)将此病命名为猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)。我国于1996年也报道了此病的流行，2006年更是爆发了变异的高致病性PRRSV引起的猪繁殖与呼吸综合征，给养猪业造成了巨大的经济损失。
近一年来，多地区流行病学调查发现，有新的PRRSV流行，与以往的流行株相比，其基因序列发生较大改变。而现有的疫苗在临床上的预防效果不甚理想，而且，新的PRRSV流行株与高致病性PRRSV混合感染，造成临床上病情的复杂性，因此，需要研发出针对我国最新临床情况的疫苗组合物，以有效防止我国新的猪繁殖与呼吸综合征的流行。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于预防猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物，所述疫苗组合物由猪繁殖与呼吸综合征病毒株制得，该猪繁殖与呼吸综合征病毒株制得的疫苗组合物可以对流行野毒株提供有效的免疫保护，显示出显著的免疫特性。
本发明的一个方面在于提供一种用于预防猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株的抗原以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原，以及药学上可接受的载体。
本发明的一个方面在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：分别增殖培养所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株和猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株NVDC-JXA1株，灭活，加入佐剂，搅拌均匀；其中，所述增殖培养所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的步骤为将猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株接种于各自的易感细胞，并培养所述接种后的易感细胞，收获细胞培养物；所述易感细胞包括传代细胞系和原代细胞，所述传代细胞系包括ST细胞系、非洲绿猴肾细胞Marc-145细胞系、牛肾细胞MDBK细胞系、牛鼻甲骨细胞BT细胞系、Vero细胞系、BHK-21细胞系、猪肾传代细胞系IBRS-2、兔肾传代细胞系RK，所述原代细胞包括鸡胚成纤维细胞、PAM细胞和猪肾细胞。
本发明的一个方面在于提供所述的疫苗组合物在制备预防猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。
发明优点
本发明采用目前猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株及猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株，制备混合疫苗，具有良好的免疫原性，接种猪只后，能够刺激机体快速地产生免疫力，产生较高的中和抗体水平。本发明制备的混合疫苗能够有效地保护流行毒株及变异株引起的单感染或混合感染的现象，可以有效地保护猪群抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株引起的相关疾病，提高猪群的生产力。
序列表中：
序列1为猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株Nsp2基因核苷酸序列；
序列2为猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株GP2蛋白核苷酸序列；
序列3为猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株GP5蛋白核苷酸序列；
序列4为猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株GP5蛋白氨基酸序列。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明的一个方面在于提供一种用于预防猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株的抗原以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原，以及药学上可接受的载体。
猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株(Porcine reproductive andrespiratory Syndrome virus,strain HNjz15)保藏号为：CCTCCNO.V201540，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年9月21日。该猪繁殖与呼吸综合征病毒株具有序列表SEQ NO.1所示核苷酸序列编码的Nsp2基因，具有序列表SEQ NO.2所示核苷酸序列编码的GP2蛋白，具有序列表SEQ NO.3所示核苷酸序列编码的GP5蛋白，所述序列表SEQ NO.3所示核苷酸序列编码序列表SEQ NO.4所示的蛋白。
“核苷酸序列”在本申请中是指一种DNA序列，其能够被转录得到相应的RNA序列。PRRSV是正链RNA病毒，其基因的编码序列为DNA，其能够被转录成正链RNA,该正链RNA与病毒本身的基因组中的序列相同。
作为本发明的一种实施方式，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株的抗原包括猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株或其培养物的灭活抗原、减毒抗原、亚单位抗原或合成肽抗原。“培养物”是病毒的不同代次传代培养物，本领域技术人员知晓不同代次之间其基因序列仅可能会发生微小的变异。
“疫苗组合物”系指含有猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫原性的药物组合物。该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫反应。疫苗组合物包括免疫量的猪繁殖与呼吸综合征病毒株的灭活疫苗。
“灭活抗原”，也称作失活抗原，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活抗原的例子包括全病毒灭活抗原和裂解型抗原。使用已知方法可以很容易地产生灭活抗原。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活抗原。裂解型抗原可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。
“减毒抗原”指的是以毒力已经减弱但仍可在宿主体内或细胞上复制的病毒。本发明所用的术语“减毒”用于指以使病原丧失致病性、但保持免疫原性的方式对基因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过UV辐射、化学处理或体外连续高阶继代培养实现减毒。人工的基因改变，例如将已知序列中的特定核苷酸缺失以使毒力减弱。
“亚单位抗原”指的是利用基因工程方法将病原体的保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的抗原。它比全病毒抗原引起副反应的可能性小。
“合成肽抗原”指的是一种仅含免疫决定簇组分的小肽,即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽,与载体连接后加佐剂所制成的抗原。
本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
作为本发明的一种实施方式，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为NVDC-JXA1株抗原、NVDC-JXA1-R株抗原、TJM株抗原、TJ株抗原、GD株抗原、GDr株抗原、HuN4株抗原、HuN4-F112株抗原。高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株公开于中国专利申请CN101045917A；高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1-R株公开于中国专利申请CN101307305A；高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJM株和TJ株公开于中国专利申请CN101633909A；高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GD株和GDr株公开于中国专利申请CN102304496A；高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株和HuN4-F112株公开于中国专利申请CN101280292A。
作为本发明的一种实施方式，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株的抗原为HNjz15株或其培养物的灭活抗原，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为NVDC-JXA1株或其培养物的灭活抗原。优选地，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为灭活抗原。
优选地，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为全病毒灭活抗原，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒灭活抗原选自猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株NVDC-JXA1，公开于中国专利申请CN101045917A。
作为本发明的一种实施方式，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株的抗原含量为灭活前≥106.0TCID50/ml的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株或其培养物灭活抗原，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为灭活前≥106.0TCID50/ml的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒或其培养物的灭活抗原。
作为本发明的一种优选实施方式，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株的抗原含量为灭活前106.0～108.0TCID50/ml的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株或其培养物灭活抗原，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为灭活前106.0～108.0TCID50/ml的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒或其培养物的灭活抗原。
作为本发明的一种最优选实施方式，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株的抗原含量为灭活前107.0TCID50/ml的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株或其培养物灭活抗原，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为灭活前107.0TCID50/ml的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒或其培养物的灭活抗原。
作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物包括灭活前≥106.0TCID50/ml的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株或其培养物灭活抗原，以及灭活前≥106.0TCID50/ml的猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株NVDC-JXA1株或其培养物灭活抗原。
作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物包括灭活前106.0～108.0TCID50/ml的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株或其培养物灭活抗原，以及灭活前106.0～108.0TCID50/ml的猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株NVDC-JXA1株或其培养物灭活抗原。
作为本发明的一种最优选实施方式，所述疫苗组合物包括灭活前107.0TCID50/ml的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株或其培养物灭活抗原，以及灭活前107.0TCID50/ml的猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株NVDC-JXA1株或其培养物灭活抗原。
当猪繁殖与呼吸综合征病毒以少于106.0TCID50的量使用时，疫苗不能有效刺激抗体产生。另一方面，超过的量可能是不经济的。
作为本发明的一种实施方式，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括白油、德雷克油(Drakeoil)，以及其他动物油、植物油或矿物油；或氢氧化铝、磷酸铝及其它金属盐；MontanideTM Gel、卡波姆、角鲨烷或角鲨烯、ISA206佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂。
本发明的疫苗组合物可使用本领域公知技术来调配，优选为兽药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。因此，本发明中，所述可药用疫苗佐剂包括油佐剂，其选自白油、角鲨烷或角鲨烯、德雷克油(Drakeoil)，以及其他动物油、植物油或矿物油。上述油佐剂既可以是来源，也可以是经过人工合成获得的。本发明中，所述疫苗组合物为水包油乳液、油包水乳液或双重乳液，所述双重乳液通常表现为水包油包水乳液。
在本发明的一个实施方式中，所述疫苗组合物还包括助悬剂、表面活性剂、抗原灭活剂或防腐剂。所述助悬剂可包括，例如，硬脂酸铝，以及所属技术领域可用的其他助悬剂。所述表面活性剂可包括，例如，脱水山犁醇单油酸酯(TWEEN系列)，司本(SPAN)，以及所属技术领域可用的其他表面活性剂。所述抗原灭活剂包括(但不限于)，例如福尔马林、β－丙内酯等等。所述防腐剂包括，例如硫柳汞。上述物质的使用方法及用量均为本领域技术人员所熟知。
基于油佐剂会对动物体带来一定的副反应，还可以选择本领域的其它佐剂，包括氢氧化铝、磷酸铝及其它金属盐，来制备混悬液，减少免疫刺激。
本发明的一个方面是提供一种制备所述疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：分别增殖培养所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株和猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株NVDC-JXA1株，灭活，加入佐剂，搅拌均匀；其中，所述增殖培养所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的步骤为将猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株接种于各自的易感细胞，并培养所述接种后的易感细胞，收获细胞培养物；所述易感细胞包括传代细胞系和原代细胞，所述传代细胞系包括ST细胞系、非洲绿猴肾细胞Marc-145细胞系、牛肾细胞MDBK细胞系、牛鼻甲骨细胞BT细胞系、Vero细胞系、BHK-21细胞系、猪肾传代细胞系IBRS-2、兔肾传代细胞系RK，所述原代细胞包括鸡胚成纤维细胞、PAM细胞和猪肾细胞。
具体地，所述方法为：(1)将猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株接种于各自的易感细胞，并培养所述接种后的易感细胞；收获细胞培养物；
(2)用甲醛溶液、BPL(β-丙内酯)或BEI(二乙烯亚胺)处理来自步骤(1)的病毒；
所述易感细胞可以是传代细胞系，也可以是原代细胞。适合于猪繁殖与呼吸综合征病毒的易感细胞包括但不限于，ST细胞系(ATCC编号：CRL-1746)、PK-15细胞系(ATCC编号：CCL-33)、非洲绿猴肾细胞Marc-145细胞系(ATCC编号：CRL-12219)、牛肾细胞MDBK细胞系(ATCC编号：CCL-22)、牛鼻甲骨细胞BT细胞系(ATCC编号：CRL-1390)、Vero细胞系(ATCC编号：CCL-81)、BHK-21细胞系(ATCC编号：CCL-10)、猪肾传代细胞系(如：IBRS-2，见例如，DECASTRO，M.P.1964.Behavior offoot and mouth disease virus in cell culture：susceptibility of the IB-RS-2swine cell line.ArquivosInstitutoBiologica 31：63-78)、兔肾传代细胞系(RK，如：ATCC编号：CCL-106)等传代细胞系，或者鸡胚成纤维细胞、PAM细胞和猪肾细胞等原代细胞。原代细胞可以通过本领域公知的方法，用动物体内的组织进行分离和制备。
可将根据本发明的疫苗组合物制备成口服剂型或非口服剂型。优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。
本发明的一个方面是提供所述的疫苗组合物在制备预防猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。
“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染或推迟疾病发作的所有行为。
“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起的症状减轻或好转的所有行为。
“猪繁殖与呼吸综合征”指PRRSV感染猪后引起的一系列生理和病理的症状。这些症状包括，但不限于，发热、嗜睡、食欲不振、倦怠、呼吸困难、咳嗽、母猪繁殖障碍、仔猪生长缓慢、死亡等。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明中的术语“头份”是指每头猪注射的疫苗量。
本发明中所述的“TCID50”(50％tissue culture infective dose)是指半数细胞培养物感染量，是表示病毒感染力的一种表示方式。
DMEM液体培养基(液)用购自美国Life Technologies公司的DMEM干粉培养基按照其说明书配制。
本发明的DMEM培养基参照GB/T18641-2002附录A配制方法配制。
本发明中所述的“PBS”是指磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline)的英文缩写，本发明中使用的是0.01mM的pH7.4的PBS，按《分子克隆》第三版所述配制。
实施例1 病毒的采集分离
从来自河南的疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的样本中分离，无菌采集猪扁桃体淋巴组织，以1∶10(体积比)加入DMEM培养液，研磨，制备组织悬液，经反复3次冻融后，12000r/min离心15min，收集上清液，再经0.22μm滤膜滤器过滤，在PAM细胞上传代37℃培养1h，换加含2％犊牛血清的DMEM培养液，37℃培养5日。收获含毒培养液，经2次冻融后，收毒，换加含2％犊牛血清的DMEM培养液。采用猪繁殖与呼吸综合征病毒PCR检测试剂盒(北京世纪元亨动物防疫技术有限公司)检测猪繁殖与呼吸综合征病毒，结果为阳性；对分离的病毒利用利用PCR试剂盒进行外源病毒的检测，分别检测猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒，(猪伪狂犬病病毒RT-PCR检测试剂盒、猪细小病毒PCR检测试剂盒、猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒均为北京世纪元亨动物防疫技术有限公产品)，PCR检测结果均为阴性，表明毒种纯净。
将分离到的猪繁殖与呼吸综合征病毒命名为HNjz15株，提交保藏。
实施例2 分离病毒的遗传特性
通过基因分析来确定实施例1中分离的病毒的遗传特性。利用在PAM细胞上分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组做模板，反转录成cDNA，使用表1所示的引物进行PCR。分别使用Primer Premier 5.0来设计用于扩增GP5、GP2、Nsp2基因的引物序列。
PCR扩增体系如下：模板cDNA1μl，PrimerSTAR HS DNAPolymerase(2.5U/μl)0.5μl，5×PrimeSTARTM Buffer10μl，上下游引物各1μl(10pmol/μl)，dNTP Mix(2.5mM each)4μl，并用ddH2O将体积补足50μl。进行两步PCR反应：在98℃2min；98℃10s，55℃1min，72℃1mim/kb，30cycles；72℃5min。通过在含有溴化乙锭的1％的琼脂糖凝胶上进行电泳分析所得的PCR产物。PCR产物进行序列测定。猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株GP5核苷酸序列如SEQ NO.1所示，GP2核苷酸序列如SEQ NO.3所示，Nsp2核苷酸序列如SEQ NO.4所示。
表1 PCR引物序列
实施例3 商品化疫苗对猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株的免疫保护试验
将43日龄PRRSV抗原抗体阴性仔猪15头随机分成3组，5头/组，按照表2注射疫苗，对照组接种DMEM培养基2ml/头。商品化活疫苗由猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株制备，病毒含量为106.0TCID50/ml；商品化灭活疫苗由猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株制备，病毒含量为灭活前106.0TCID50/ml。
表2商品化疫苗的免疫保护试验动物分组
组别 注射疫苗 免疫剂量
1 商品化活疫苗 2ml/头
2 商品化灭活疫苗 2ml/头
3 DMEM培养基 2ml/头
免疫后28日攻毒，攻毒剂量为猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株病毒105.0TCID50/头，观察临床症状见表3，攻毒后每日测定仔猪体温。
表3商品化疫苗免疫仔猪后的攻毒情况
表3结果显示，用现有的商品化猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗及灭活疫苗免疫仔猪，均不能完全阻断病毒感染，只能提供部分保护作用，而对照组仔猪攻毒后全部出现临床症状；进一步通过剖检发现，免疫商品化活疫苗和灭活疫苗组剖检后依然存在不同程度的肺病变。
实施例4 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原的制备
将实施例1中分离到的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株培养物接种于PAM细胞，按照病毒培养液量的1％(V/V)接入形成单层的PAM细胞培养物中，置37℃培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收毒，测定毒价。加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2％(V/V)，37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次搅拌10min，灭活完全后备用。
将猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株(公开于中国专利申请CN101045917A)培养物接种于Marc-145细胞，按照病毒培养液量的1％(V/V)接入形成单层的Marc-145细胞培养物中，置37℃培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收毒，测定毒价。加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2％(V/V)，37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次搅拌10min，灭活完全后备用。
实施例5 猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物的制备
将实施例4制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株灭活抗原与NVDC-JXA1株灭活抗原按比例混合，再与206佐剂(法国SEPPIC公司产品)按照体积比50:50混合，在30℃条件下120转/分钟搅拌15分钟。具体配比见表4。
表4猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物配比
实施例6 猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物免疫原性试验
将43日龄PRRSV抗原抗体阴性仔猪45头随机分成9组，5头/组，按照表5注射疫苗，对照组接种DMEM培养基2ml/头。
表5免疫原性试验动物分组
组别 注射疫苗 免疫剂量
4 疫苗1 2ml/头
5 疫苗1 2ml/头
6 疫苗2 2ml/头
7 疫苗2 2ml/头
8 疫苗3 2ml/头
9 疫苗3 2ml/头
10 DMEM培养基 2ml/头
11 DMEM培养基 2ml/头
12 DMEM培养基 2ml/头
免疫后28天攻毒，第4组、第6组、第8组和第10组用猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株攻毒，第5组、第7组、第9组和第11组用猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株攻毒，攻毒剂量均为105.0TCID50/头，观察临床症状见表6，攻毒后每日测定仔猪体温见表7。
表6猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物免疫仔猪后的攻毒情况
表7猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物免疫仔猪攻毒后体温变化
表6和表7的结果显示，本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物免疫仔猪，能阻断病毒感染(出现临床症状)，为仔猪提供100％(5/5)保护，而攻毒对照仔猪攻毒后全部出现临床症状，部分猪只死亡，因此，本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物无论对新的流行株还是高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒均具有很好的保护力。
实施例7 猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物免疫原性对比试验
将43日龄PRRSV抗原抗体阴性仔猪35头随机分成7组，5头/组，按照表8注射疫苗，对照组接种DMEM培养基2ml/头。
表8免疫原性对比试验动物分组
组别 注射疫苗 免疫剂量
13 疫苗2 2ml/头
14 疫苗2 2ml/头
15 疫苗4 2ml/头
16 疫苗5 2ml/头
17 DMEM培养基 2ml/头
18 DMEM培养基 2ml/头
19 DMEM培养基 2ml/头
免疫后28天攻毒，第13组、第15组和第17组用猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株攻毒，第14组、第16组和第18组用猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株攻毒，攻毒剂量均为105.0TCID50/头，观察临床症状见表9，攻毒后每日测定仔猪体温见表10。
表9免疫原性对比试验攻毒情况
结果显示，本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物免疫仔猪，无论是用HNjz15株攻毒，还是用NVDC-JXA1株攻毒，均能阻断病毒感染(出现临床症状)，为仔猪提供100％(5/5)保护；猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株单苗亦能阻断HNjz15株攻毒病毒感染(出现临床症状)，为仔猪提供100％(5/5)保护；而猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株单苗不能完全阻断NVDC-JXA1株攻毒病毒感染(出现临床症状)，为仔猪提供60％(3/5)保护；攻毒对照仔猪攻毒后全部出现临床症状，部分猪只死亡；阴性对照无异常。因此，本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物无论是对猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株攻击还是NVDC-JXA1株攻击均具有很好的保护力；猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株单苗也能够提供对猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株攻击具有很好的保护力；而猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株单苗能提供对猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株攻击猪只存活，部分猪只依然会发生临床反应，不能提供完全的保护作用。
上述实验证明了本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物两种抗原成分协同作用，提供了对猪繁殖与呼吸综合征病毒攻击良好的保护作用，尤其是对猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株攻击，提供了优于单苗的保护效果。
表10免疫原性对比试验攻毒后体温变化
结果显示，本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物免疫仔猪，无论是用HNjz15株攻毒，还是用NVDC-JXA1株攻毒，均能阻断病毒感染(出现临床症状)，体温无异常；猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株单苗亦能阻断HNjz15株攻毒病毒感染(出现临床症状)，体温无异常；而猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株单苗不能完全阻断NVDC-JXA1株攻毒病毒感染(出现临床症状)，其中两头猪体温超过40.5℃，为体温异常；攻毒对照组存活猪只全部体温异常；阴性对照组体温无异常。因此，本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物无论是对猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株攻击还是NVDC-JXA1株攻击均具有很好的保护力；猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株单苗也能够提供对猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株攻击具有很好的保护力；而猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株单苗能提供对猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株攻击部分保护，部分猪只依然会发生临床反应，不能提供完全的保护作用。
证明了本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物两种抗原成分协同作用，提供了对猪繁殖与呼吸综合征病毒攻击良好的保护作用，尤其是对猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株攻击，提供了优于单苗的保护效果。
实施例8 猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物免疫仔猪后血清抗体比较试验
将43日龄PRRSV抗原抗体阴性仔猪20头随机分成4组，5头/组，按照表11注射疫苗，对照组接种DMEM培养基2ml/头。
表11血清抗体比较试验动物分组
组别 注射疫苗 免疫剂量
20 疫苗2 2ml/头
21 疫苗4 2ml/头
22 疫苗5 2ml/头
23 DMEM培养基 2ml/头
免疫后28天，各免疫组及对照组采集血清，测定中和抗体效价。结果见表12。
表12血清抗体比较试验结果
结果显示，本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物免疫仔猪，免疫28天无论是对HNjz15株，还是对NVDC-JXA1株均具有较高的血清中和效价；与猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株单苗对HNjz15株的血清中和效价相当或更高，而远高于猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株单苗对NVDC-JXA1株的血清中和效价。
证明了本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物两种抗原成分协同作用，提供了对猪繁殖与呼吸综合征病毒良好的中和抗体，尤其是对猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株的中和抗体，提供了优于单苗的保护效果。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种用于预防猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株的抗原以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原，以及药学上可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株的抗原包括猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株或其培养物的灭活抗原、减毒抗原、亚单位抗原或合成肽抗原。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为NVDC-JXA1株抗原、NVDC-JXA1-R株抗原、TJM株抗原、TJ株抗原、GD株抗原、GDr株抗原、HuN4株抗原、HuN4-F112株抗原。
4.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株的抗原为HNjz15株或其培养物的灭活抗原，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为NVDC-JXA1株或其培养物的灭活抗原。
5.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株的抗原含量为灭活前≥106.0TCID50/ml的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株或其培养物灭活抗原，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为灭活前≥106.0TCID50/ml的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒或其培养物的灭活抗原。
6.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株的抗原含量为灭活前106.0～108.0TCID50/ml的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株或其培养物灭活抗原，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为灭活前106.0～108.0TCID50/ml的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒或其培养物的灭活抗原。
7.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株的抗原含量为灭活前107.0TCID50/ml的猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株或其培养物灭活抗原，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为灭活前107.0TCID50/ml的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒或其培养物的灭活抗原。
8.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括白油、德雷克油，以及其他动物油、植物油或矿物油；或氢氧化铝、磷酸铝及其它金属盐；或MontanideTM Gel、卡波姆、角鲨烷或角鲨烯、ISA206佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂。
9.一种制备权利要求1所述疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：分别增殖培养所述猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株和猪繁殖与呼吸综合征病毒超强变异株NVDC-JXA1株，灭活，加入佐剂，搅拌均匀；其中，所述增殖培养所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的步骤为将猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株接种于各自的易感细胞，并培养所述接种后的易感细胞，收获细胞培养物；所述易感细胞包括传代细胞系和原代细胞，所述传代细胞系包括ST细胞系、非洲绿猴肾细胞Marc-145细胞系、牛肾细胞MDBK细胞系、牛鼻甲骨细胞BT细胞系、Vero细胞系、BHK-21细胞系、猪肾传代细胞系IBRS-2、兔肾传代细胞系RK，所述原代细胞包括鸡胚成纤维细胞、PAM细胞和猪肾细胞。
10.权利要求1～8任一项所述的疫苗组合物在制备预防猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。
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